DK173362B1 - Monoklonalt antistof, hybridoma, som udskiller antistoffet, cellekulturpræparat indeholdende et sådant hybridoma, diagnosti - Google Patents

Description

DK 173362 B1

Den foreliggende opfindelse angår et monoklonalt antistof som imtminoreagerer med et receptor-fremkaldt bindingssted udtrykt af en ligand, når denne ligand er bundet 5 af en receptor til dannelse af et receptor-ligand-kompleks. Opfindelsen angår endvidere et hybridoma, som udskiller et sådant antistof, et cellekulturpræparat indeholdende et sådant hybridoma, et diagnostisk system omfattende et sådant antistof, et antistof præparat omfattende sådanne antistoffer, 10 en fremgangsmåde til fremstilling af et sådant antistof og en fremgangsmåde til undersøgelse for tilstedeværelse af et receptor-ligand-kompleks, hvorved der anvendes et sådant antistof.

Liganders vekselvirkninger med celleoverfladerecep-15 tormolekyler er kendetegnende for biologiske processer. Eksempler på sådanne vekselvirkninger er bindingen af liganden dannet af en del af hylsterproteinet (gpl40) af AIDS-viruset (HIV) med CD4-receptoren på T-celler, de receptorer af det overordnede histokompatibilitetkompleks, der veksel-20 virker med adskillige ligander i processer for selv/ikke--selv diskrimination i det immunologiske system samt vekselvirkningen mellem fibrinogenliganden og GPIIb/IIIa cellereceptoren på blodplader. Fibrinogen:GPIIb/IIIa-ligand-recep-torparret er af særlig interesse ved blodstørkning, throm-25 bedannelse og anvendes i det følgende som eksempel på ligander og receptorer.

Inden for området har man længe søgt efter immunologiske metoder for at skelne mellem de bundne og ikke-bundne former for ligander og receptorer, idet en sådan evne ville 30 muliggøre bestemmelse af tilstanden for de fysiologiske mekanismer formidlet af receptor:ligand-kompleksdannelse.

Indtil fornylig er forsøg på at gennemføre sådanne bestemmelser ved hjælp af immunologiske metoder slået fejl, fordi biologiske prøver kan indeholde ligander og receptorer i 35 både bundne (komplekse) og frie former.

DK 173362 B1 2

Vaskulaturen hos individer, der udsættes for en trom-botisk tilstand, indeholder f.eks. ikke-bundne former for fibrinogen og GPIIb/IIIa samt blodplader med fibrinogen:-GPIIb/IIIa-kompleks på deres overflade. Fibrinogen:GPIIb/ 5 Illa-komplekset udtrykker antigene determinanter, der er fælles for ikke-bundet fibrinogen og ikke-bundet GPIIb/IIIa, hvilket således gør det vanskeligt at identificere en throm-betilstand eller thrombelokation ved hjælp af eksisterende immunologiske metoder.

10 Frelinger et al., J. Biol. Chem.. 263:12397-12402 (1988) har for nylig beskrevet en identificering af en antigen determinant, som kun udtrykkes af GPIIb/IIIa, når GPIIb/IIIa er bundet til en ligand. Dvs. den antigene determinant beskrevet af Frelinger et al er udtrykt af receptoren 15 i receptor:ligand-komplekset.

Andre litteratursteder beskriver frembringelsen af monoklonale antistoffer, som immunoreagerer med en antigen determinant udtrykt efter ligandbinding til kunstige, ikke-receptoroverflader.

20 Soria et al., J. Colloid Interface Sci.. 107:204-208 (1985) beskriver et særligt monoklonalt antistof betegnet DSB2, som fremkaldes ved immunisering med tværbundet fibrin-fragment og binder til plastadsorberet fibrinogen og også til det såkaldte fibrinogen D fragment adsorberet på plast 25 eller frit i opløsning, men som ikke binder til opløsningsfasef ibrinogen eller det såkaldte fibrinogen E fragment, når dette er i opløsning.

Nilsson et al., Molec.Immunul.. 24:487-94, 1987, beskriver frembringelsen af monoklonale antistoffer, som im-30 munoreagerer med komplement C3 fragmenter, når de er partikelbundet til Zymosan A, men ikke med opløselige C3 fragmenter. Arten af proteinbinding til Aymosan A indebærer co-valente kemiske bindinger.

I en anden artikel beskriver Abrams et al., Blood 35 (SudpI. 1) 70:355a (dec. 1987) kort et monoklonalt antistof betegnet 9F9, som i det offentliggjorte sammendrag siges at 3 DK 173362 B1 binde til blodplade-bundet fibrinogen. Denne korte beskrivelse karakteriserer imidlertid ikke de specifikke bindingsegenskaber for monoklonalt 9F9.

Talrige monoklonale antistoffer, som immunoreagerer 5 med opløseliggjort fibrinogen, er blevet beskrevet. Et sådant litteratursted er Lindon et al., Blood. 68:355-362 (aug.

1988). Heri beskrives, anvendelsen af kommercielt tilgængelige, anti-humane, monoklonale fibrinogenantistoffer samt affinitets-rensede, polyklonale antistoffer til D- og E-frag-10 menterne.

Man har nu fundet frem til, at ligander, der er specifikt bundet til en receptor, kan skelnes fra ikke-bundne ligander ved tilstedeværelsen af et receptor-fremkaldt antistofbindingssted (RIBS) udtrykt ved hjælp af den receptor-15 bundne ligand. Dvs. man har fundet frem til en klasse af antigene determinanter, som udtrykkes, når en ligand specifikt binder til en receptor, men som ikke udtrykkes af den ikke-bundne receptor eller den ikke-bundne ligand.

Et RIBS udtrykkes på en ligand på grund af den spe-20 cifikke vekselvirkning af en ligandbinding over for dens cognatreceptor. Et RIBS er ikke et antigenisk determinant-sted, som blotlægges, når et protein vekselvirker ikke-spe-cifikt med en anden overflade, f.eks. et plastabsorberet protein, eller når et protein ved hjælp af covalente kemiske 25 bindinger vekselvirker med en overflade. Disse sidstnævnte to eksempler er beskrevet i de ovenfor anførte litteratursteder, Soria et al., og Nilsson et al., og resulterer ikke i en specifik receptorligandbindingsvekselvirkning, som producerer et RIBS som heri beskrevet.

30 Den foreliggende opfindelse angår således et mono klonalt antistof, som er ejendommeligt ved, at det immunoreagerer med et receptor-fremkaldt bindingssted udtrykt af en ligand, når liganden er til stede i et receptor-ligandkompleks, med ikke immunoreagerer med liganden eller med 35 receptoren, når enten 1iganden eller receptoren er fri i opløsning.

4 DK 173362 B1

Det monoklonale antistof ifølge opfindelsen er især et sådant, hvor liganden er fibinogen.

Et sådant antistof immunoreagerer med fibrinogen, når det er bundet til en receptor, men immunoreagerer ikke 5 med opløseligt fibrinogen, f.eks. i plasma.

Et sådant antistof erkender RIBS fremkaldt som følge af fibrinogenvekselvirkningen for proteiner, fortrinsvis GPIIb/IIIa, på blodplader. Det vekselvirker selektivt med bundet fibrinogen, selv med et stort overskud af plasma-10 fibrinogen.

Den foreliggende opfindelse angår også et hybridoma, som er ejendommeligt ved, at det udskiller et monoklonalt antistof, der immunoreagerer med et receptor-fremkaldt bindingssted udtrykt i en ligand, når liganden er til stede i 15 et receptor-ligand-kompleks, men som ikke immunoreagerer med liganden eller med receptoren, når enten liganden eller receptoren er fri i opløsning.

Hybridomaet ifølge opfindelsen er fortrinsvis valgt blandt gruppen bestående af hybridoma 2G5, hybridoma 2F10, 20 hybridoma 3G11 og hybridoma 4G10.

Opfindelsen angår desuden et cellekulturpræparat, der er ejendommeligt ved, at det består af a) et hybridoma, der der udskiller et monoklonalt antistof, som immunoreagerer med et receptor-fremkaldt bindings- 25 sted udtrykt i en ligand, når liganden er til stede i et receptor-ligand-kompleks, men som ikke immunoreagerer med liganden eller receptoren, når enten liganden eller receptoren er fri i opløsning; b) antistofmolekyler udskilt af dette hybridoma; og 30 c) et kulturmedium for dette hybridoma.

Opfindelsen angår endvidere et diagnostisk system i form af et prøvesæt, som er ejendommeligt ved, at det omfatter monoklonale antistoffer, som immunoreagerer med et receptor-fremkaldt bindingssted udtrykt i en ligand, når 35 liganden er til stede i et receptor-ligand-kompleks, men som ikke immunoreagerer med liganden eller med receptoren,

T I

5 DK 173362 B1 når enten liganden eller receptoren er fri i opløsning, idet de monoklonale antistoffer er til stede i en pakning i en mængde, der er tilstrækkelig til at gennemføre mindst én analyse.

5 Opfindelsen angår yderligere et antistofpræparat, som er ejendommeligt ved, at det omfatter mindst to mono-klonale antistoffer udskilt af et hybridoma blandt gruppen bestående af hybridoma 2G5, hybridoma 2F10, hybridoma 3G11 og hybridoma 4G10.

10 Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til dannelse af et monoklonalt antistofmolekyle, der immunoreagerer med et receptor-fremkaldt bindingssted udtrykt af et ligand-holdigt receptor-ligand-kompleks, hvor komplekset indeholder en celleoverfladereceptor specifikt bundet til en ligand, 15 hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man: a) immuniserer et pattedyr med et præparat indehodlende komplekset ? b) fjerner antistof-producerende celler fra det immuniserede pattedyr og fremstiller en suspension af cellerne; 20 c) behandler cellerne med et transformationsmiddel til tilvejebringelse af transformerede, antistofproducerende celler; d) kloner cellerne behandlet i trin c) ved hjælp af en begrænsende fortynding i et vævskulturmedium, som ikke vil 25 opretholde ikke-omdannede celler, til tilvejebringelse af klonede transformanter; e) undersøger vævskulturmediet af de klonede transformanter for at spore tilstedeværelsen af udskilte antistofmolekyler, der immunoreagerer med et receptor-fremkaldt i 30 bindingssted, derer til stede på liganden i recept or-ligand komplekset, men som ikke immunoreagerer med celleoverfladereceptoren eller liganden, når en af disse er i ikke-bundet form, hvorved man identificerer en klonet transformant, der producerer disse antistofmolekyler; 35 f) dyrker den identificerede, klonede transformant i et vævskulturmedium under betingelser for produktion af de 6 DK 173362 B1 udskilte antistofmolekyler; og g) høster de udskilte antistofmolekyler fra kulturmediet i trin (f).

Opfindelsen angår endelig også en fremgangsmåde til 5 undersøgelse for tilstedeværelsen af et receptor-ligandkompleks i en vaskulær væskeprøve, hvori komplekset indeholder en celleoverfladereceptor, der specifikt er bundet til en ligand, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man 10 a) tilvejebringer en immunoreakt ionsbi ånding ved at blande en vaskulær væskeprøve med et monoklonalt antistofpræparat indeholdende antistofmolekyler, som immunoreagerer med et receptor-fremkaldt bindingssted på liganden i receptor- ligand-komplekset, men som ikke immunoreagerer med celle- 15 overfladereceptoren eller liganden, når en af disse er i ikke-bundet form; b) holder blandingen i et tidsrum, der er tilstrækkeligt for antistofferne til at immunoreagerer med et eventuelt i prøven tilstedeværende receptor-ligand-kompleks og danne et 20 immunoreaktionsprodukt; og c) sporer tilstedeværelsen af et eventuelt i trin (b) dannet immunoreaktionsprodukt og derved tilstedeværelsen af komplekset i prøven.

A. Definitioner 25 Receptor: Receptor og receptorprotein er udtryk, der anvendes i den foreliggende tekst for at angive et biologisk aktivt, proteinholdigt molekyle, der specifikt binder til (eller med) andre molekyler, betegnet ligander, til dannelse af et receptor-ligand-proteinkompleks.

30 Ligand og cognatligand: Ligand henviser til et mole kyle, der indeholder en strukturel del, som er bundet ved hjælp af specifik vekselvirkning med et specielt receptorprotein.

Receptorfremkaldt bindingssted (RIBS): Et RIBS er 35 en neo-antigen determinant, som er udtrykt ved hjælp af liganddelen i et receptor-ligand-kompleks, men ikke er ud-

I I

7 DK 173362 B1 trykt hverken af den ikke-bundne ligand eller den ikke-be-satte receptor. Et RIBS kan enten være "konformationelt" eller "sekventielt". Et RIBS er resultatet af specifikke ændringer af liganden fremkaldt af receptorbinding, dvs.

5 en "kryptisk antigen determinant".

Krvntisk antigen determinant: Betegner en neo-antigen determinant fremkaldt ved hjælp af ændringer i konformationen af et ligandprotein ved binding til dets cognat (specifikke) receptor. Den heri beskrevne ligand udtrykker således ikke 10 en kryptisk antigen determinant, medmindre liganden er specifikt bundet til en receptor.

"Enhedsdosis", som vedrører de her omhandlede antistoffer, henviser til fysisk adskilte enheder, der er egnede som enhedsdoser til dyr, idet hver enhed indeholder en i 15 forvejen bestemt mængde aktivt materiale, der er beregnet til at frembringe den ønskede immunogene virkning sammen med det nødvendige fortyndingsmiddel, dvs. et bærestof eller grundmasse. Specifikationerne for en sådan enhedsdosis er dikteret af og direkte afhængig af (a) de særegne karak-20 teristika for det aktive materiale og den særlige immunologiske virkning, "der^ønskés opnået, og (b) de begrænsninger, der ligger inden for området med at blande et sådant aktivt materiale til immunologisk anvendelse i dyr som beskrevet i detaljer heri.

25 Enhedsdosisformer fremstilles typisk ud fra frosset eller tørret antistof ved dispergering i et fysiologisk tåleligt (acceptabelt) fortyndingsmiddel eller grundmasse, f.eks. vand, fysiologisk saltopløsning eller phosphat-pufret saltopløsning, til dannelse af et vandigt præparat. Sådanne 30 fortyndingsmidler er velkendte inden for området og er f.eks. beskrevet i Remington's Pharmaceutical Sciences. 16. udgave,

Mack Publishing Company, Easton, PA (1980), side 1465-1467.

Dosisformer kan også omfatte et hjælpestof som en del af fortyndingsmidlet. Hjælpestoffer, f.eks. komplet 35 Freund's adjuvans (CFA), ukomplet Freund's adjuvans (IFA) og alun er stoffer, der er velkendte inden for området, og 8 DK 173362 B1 som er kommercielt tilgængelige fra mange kilder.

Antigenisk determinant eller antigen: Antigenisk determinant eller antigen henviser til den faktiske struk-5 tureile del af antigenet, som er immunologisk bundet ved hjælp af et antistofforbindelsessted. Udtrykkene anvendes også i flæng med epitop.

Neo-antigen: Et neo-antigen, som defineret i den foreliggende tekst, er en ny antigenisk determinant, som 10 ikke blev udtrykt af en ligand forud for binding med receptoren, men som udtrykkes i ligand-receptor-komplekset.

Antistof: Udtrykket antistof i dets forskellige grammatiske former anvendes i den foreliggende tekst for at betegne immunoglobulinmolekyler og immunologisk aktive dele 15 af immunoglobulinmolekyler, dvs. molekyler, som indeholder et antistofforbindelsessted eller paratop. Eksempler på antistofmolekyler er intakte immunoglobulinmolekyler, praktisk taget intakte immunoglobulinmolekyler og dele af et immunoglobulinmolekyle, herunder sådanne dele, der kendes 20 inden for området som Fab, Fab', F(ab')2 °9 F(v).

Antistofforbindelsessted: Et antistofforbindelsessted er den strukturelle del af et antistofmolekyle sammensat af en tung og let kædevariabel og hypervariable regioner, som specifikt binder (immunoreagerer med) et antigen. Udtrykket 25 immunoreagerer i dets forskellige former betyder specifik binding mellem et antigenisk, determinant-holdigt molekyle og et molekyle indeholdende et antistofforbindelsessted, f.eks. et helt antistofmolekyle eller en del deraf.

Monoklonalt antistof: Udtrykket monoklonalt antistof 30 i dets forskellige grammatiske former betegner en population af antistofmolekyler, der kun indeholder én art antistofforbindelsessted, der er i stand til at immunoreagere med et særligt antigen. Således udviser et monoklonalt antistof typisk en enkelt bindingsaffinitet for hvert antigen, med 35 hvilket det immunoreagerer. Et monoklonalt antistof kan derfor indeholde et antistofmolekyle med adskillige anti-

I I

9 DK 173362 B1 stof forbindelsessteder, hvert sted immunospecifikt for et forskelligt antigen, f .eks. et bispecifikt, monoklonalt antistof.

Et monoklonalt antistof er typisk sammensat af anti-5 stofmolekyler frembragt af kloner i en enkelt celle, f.eks. et hybridoma, men som kun af sondrer (producerer) én slags antistofmolekyle. Hybridomacellen er dannet ved at fusionere en antistof-producerende celle og et myeloma eller anden selv-bevarende cellelinie. Sådanne antistoffer blev 10 første gang beskrevet af Kohier og Milstein, Nature 256:495-497 (1975), hvortil der her skal henvises.

B. Vekselvirkninger mellem ligand οσ receptor

Som tidligere angivet er ligand-receptor-kompleks -dannelse central for mange biologiske processer. Bortset 15 fra det faktum, at der eksisterer sådanne vekselvirkninger, fører sådanne vekselvirkninger til efterfølgende hændelser, som er tydelige i de biologiske processer, hvortil kompleksdannelsen er et indledende trin.

Man har nu fundet frem til, at der sammen med den 20 biologiske funktion, som ledsager ligand-receptor-dannelsen, indtræder en mere subtil ændring. Denne ændring ligger i konformationen af ligandmolekylet, som er et resultat af bindingsvekselvirkningen med receptoren og kompleksdannelsen.

Denne ændring i ligandkonformationen resulterer i dannelsen 25 af et neo-antigen, som praktisk taget kun udtrykkes efter dannelse af komplekset. Som tidligere anført betegnes neo-antigenet et receptor-fremkaldt bindingssted eller RIBS.

RIBS udtrykt ved hjælp af komplekset dannet ved binding af fibrinogen som ligand til GPIIb/IIIa som receptor 30 anvendes illustrativt heri som eksempel på det RIBS-dannende fænomen. Monoklonale antistoffer, som immunoreagerer med fibrinogen-GPIIb/IIla-komplekset, men som praktisk talt ikke reagerer med hverken liganden eller receptoren, når disse ikke er til stede i komplekset, anvendes også i den 35 foreliggende tekst som eksempler på monoklonale anti-RIBS--antistoffer (eller mere enkelt, RIBS).

10 DK 173362 B1

Foruden de som eksempel angivne RIBS og monoklonale RIBS-antistoffer, der specifikt er angivet heri, er adskillige ligand-receptor-komplekser beskrevet i litteraturen. Sådanne komplekser danner også RIBS, og monoklonale anti-5 stoffer kan frembringes imod sådanne RIBS ved anvendelse af de heri beskrevne metoder. Sådanne monoklonale antistoffer immunoreagerer udelukkende med liganddelen i det ligand-bundne receptorkompleks og ikke med den frie receptor eller frie ligand. Ved at anvende sådanne monoklonale RIBS er det 10 nu muligt at analysere tilstedeværelsen og mængden af et ligand-receptor-kompleks, dvs. en optaget receptor eller optaget ligand, ved tilstedeværelsen af enten den frie ligand eller frie receptor eller begge.

Som eksempler er yderligere par af RIBS-dannende 15 ligander og receptorer anført i den efterfølgende tabel I.

Disse par tjener til illustrering og er ikke-begrænsende for det RIBS, der kan dannes.

I I

11 DK 173362 B1

TABEL I

LIGAND-RECEPTOR-PAR

Ligand Receptor Reference 5 nr.

Von WiIdebrand-faktor GPIIb/IIIa 1

Vitronectin GPIIb/IIIa 1 10 Fibronectin Fibronectin 1 receptor ICAM-1 LFA-1 1

Laminin CSAT 2

Collagen VLA-2 3 15 C3bi CR3-komplementreceptor 4 C3d CR2-komplementreceptor 5 HIV-gpl40 CD4 T-celle- 20 receptor 6 FSH-frigivelsesprotein FRP-receptor 7

Apo B-100 Apolipoprotein- receptor 8 IL-2 Interleukin- 25 receptor 9

Immunoglobuliner Fc-receptor 10

Choriongonadotrophin Somatostatin- receptor 11 PDGF PDGF-receptor 12 30 Transferrin Transferrin- receptor 13 12 DK 173362 B1 1 Ruoslahti et al., Science. 238:491-497 (1987).

2 Horwitz et al.f J. Cell. Biol.. 101:2134-2144 (1985).

3 Nieuwenhuis et al., Nature. 318:470-472 (1985).

4 Wright et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84:1965- 5 -1968 (1987).

5 Nemerow et al., J. Virol. 55:347-351 (1985).

6 Guyader et al., Nature. 320:662-669 (1987).

7 Yu et al., Nature. 330:765-67 (1987).

8 Yamada et al., J. Clin. Invest.. 80:507 (1987).

10 9 Dower et al., Immunol. Todav. 8:46 (1987).

10 Anderson et al., J. Immunol. 138:2254 (1987).

11 Kim et al., J. Biol. Chem.. 262:470 (1987).

12 Keating et al., J. Biol. Chem. 252:7932 (1987).

13 Kohgo et al., Blood. 70:1955 (1987).

15 C. Monoklonale antistoffer

Et monoklonalt antistof (MAb) ifølge den foreliggende opfindelse er karakteriseret som omfattende antistof-molekyler, der immunoreagerer med det receptorfremkaldte 20 bindingssted på en ligand.

Et receptor-fremkaldt bindingssted (RIBS) er en neo-antigen determinant, som er udtrykt ved hjælp af en ligand, når liganden er bundet af en receptor, men som ikke er udtrykt af den frie (ikke-bundne) ligand. Dvs. et receptor-25 ligand-kompleks udtrykker et RIBS, men den ikke-okkuperede receptor og den ikke-bundne ligand gør ikke. Et MAb ifølge den foreliggende opfindelse immunoreagerer med et RIBS, men immunoreagerer praktisk talt ikke med hverken den ikke-bundne (frie) ligand eller receptor, dvs. når enten liganden eller 30 receptoren er fri i opløsning, og kan derfor skelne mellem receptor-bundne og ikke-bundne former for en ligand, fordi det immunoreagerer med den receptorbundne ligand, men ikke med den frie ligand. Udtrykket "immonoreagerer praktisk talt ikke med hverken den ikke-bundne (frie) ligand eller 35 receptor ... " betyder i den foreliggende tekst, at mono klonalt antistof - (ligand-receptor)-immunoreaktionen inhiberes 13 DK 173362 B1 med ikke over ca. 15%, og fortrinsvis derunder, af konkurrerende binding med en fri ligand eller receptorer.

I en foretrukken udførelsesform omfatter et MAb ifølge den foreliggende opfindelse antistofmolekyler, som immuno-5 reagerer med et RIBS udtrykt af et cytoadhesin-ligand-kom-pleks. Cytoadhesin er et navn, man har givet en superfamilie af receptormolekyler, som alle binder til en ligand, der indeholder aminosyrerestsekvensen arginin-glycin-asparagin-syre eller RGD, jfr. Plow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA.

10 83:6002 (1986). Denne superfamilie har også fået navnet

Integrin, jfr. Rouslahti et al., Science. 238:491-497 (1987).

Dette særlige cytoadhesin af eksempelvis interesse heri er GPIIb/IIIa, også kendt som blodpladereceptor.

Et foretrukket monoklonalt antistof ifølge den fore-15 liggende opfindelse afsondres (produceres) af hver af de følgende hybridomaer: hydridoma 2G5 med ATCC-betegnelsen HB9847, hybridoma 2F10 med ATCC-betegnelsen HB9844, hybridoma 3G11 med ATCC-betegnelsen HB9845 og hybridoma 4G10 med ATCC-betegnelsen HB9846. Ovennævnte hybridomaer blev deponeret i 20 the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, US den 29. september 1988 ifølge Budapest -Traktaten .

D. Metoder til frembringelse af monoklonale antistofpræparater 25 Den foreliggende opfindelse angår som nævnt en fremgangsmåde til dannelse af et monoklonalt antistof, som immunoreagerer med et receptor-fremkaldt bindingssted. Fremgangsmåden omfatter f.eks. følgende trin: (a) Immunisering af et dyr med et receptor-ligand-30 kompleks. Dette gennemføres typisk ved indgift af en immunologisk effektiv mængde, dvs. en mængde, der er tilstrækkelig til frembringelse af en immunoreaktion, immunogen til et immunologisk kompetent pattedyr. Pattedyret er fortrinsvis en gnaver, f.eks. en kanin, rotte eller mus, selv om andre 35 pattedyr, f.eks. geder, heste og aber, kan anvendes. Pattedyret holdes derpå i et tidsrum, der er tilstrækkeligt i S ,Λ· 14 DK 173362 B1 for dyret til at frembringe celler, der udskiller antistofmolekyler, som immunoreagerer med receptor-1 igand-komplekset.

(b) En suspension af antistof-udskillende celler fjernet fra det immuniserede pattedyr fremstilles derpå.

5 Dette gennemføres typisk ved at fjerne milten hos pattedyret og mekanisk adskille de individuelle miltceller i et fysiologisk acceptabelt medium ifølge metoder, der er velkendte inden for området.

(c) De suspenderede, antistof-producerende celler 10 behandles med et transformationsmiddel, der er i stand til at frembringe en transformeret ("udødeliggjort") cellelinie. Transformationsmidler og deres anvendelse til frembringelse af udødeliggjorte cellelinier er velkendte inden for området og omfatter DNA-vira, f.eks. Epstein-Barr-virus (EBV), abe-15 virus 40 (SV4 0), polyomavirus o.lign., RNA-vira, f.eks. Moloney-museleukæmivirus (Mo-MuLV), Rous-sarcomavirus o.lign., myelomaceller, f.eks. P3X63-Ag8.653, Sp2/0-Agl4 o.lign.

I foretrukne udførelsesformer resulterer behandling 20 med transformationsmidlet i frembringelse af et hybridoma ved at fusionere de suspenderede miltceller med musemyeloma-celler fra en hensigtsmæssig cellelinie ved anvendelse af en egnet fusionspromotor. Det foretrukne forhold er ca. 5 miltceller pr. myelomacelle. Et totalt volumen på ca. 108 25 splenocyter.

Den anvendte cellelinie skal fortrinsvis være af den såkaldte "medikamentresistente" type, således at ikke-fusionerede myelomaceller ikke overlever i et selektivt medium, medens hybrider vil overleve. Den mest almindelige klasse 30 er 8-azaguanin-resistente cellelinier, som mangler enzym-hypoxanthinguaninphosphoribosyltransferase og derfor ikke understøttes af HAT-(hypoxanthin, aminopterin og thymidin)--medium. Det foretrækkes sædvanligvis også, at den anvendte myelomacellelinie er af den såkaldte "ikke-udsondrende" 35 type, forstået på den måde, at den ikke selv producerer noget antistof, selv om udsondrende typer kan anvendes. I visse 15 DK 173362 B1 tilfælde foretrækker man imidlertid udsondrende myelomali-nier. Selv om den foretrukne fusionspromotor er polyethylen-glycol med en gennemsnitlig molekylvægt i området fra ca.

1000 til ca. 4000 (kommercielt tilgængeligt som f.eks.PEG 5 1000) kan andre fusionspromotorer, der er kendte inden for området, anvendes.

(d) De transformerede celler klones derpå, fortrinsvis til monoklonalitet. Kloningen gennemføres fortrinsvis i et vævskulturmedium, som ikke vil understøtte ikke-transfor-10 merede celler. Når de transformerede celler er hybridomaer, gennemføres kloningen typisk ved fortynding og dyrkning i separate beholdere af blandingen af ikke-fusionerede milt-celler, ikke-fusionerede myelomaceller og fusionerede celler (hydridomaer) i et selektivt medium, som ikke understøtter 15 de ikke-fusionerede myelomaceller i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til at medføre død for de ikke-fusionerede celler (ca. én uge). Fortynding og dyrkning gennemføres i separate beholdere, og fortyndingen kan være en begrænsende fortynding, hvori volumenet af fortyndingsmiddel statistisk bereg-20 nes til at isolere et vist antal celler (f.eks. 1-4) i hver separat beholder TfTeKsT hvert hul i en mikrotiterplade). Mediet er et sådant (f.eks. HAT-medium), som ikke understøtter den "medikamentresistente” (f.eks. 8-azaguanin-resistente) , ikke-fusionerede myelomacellelinie.

25 (e) Vævskulturmediet i de klonede transformanter bedømmes for tilstedeværelsen af udsondrede antistofmolekyler, som ikke immunoreagerer med en fri ligand, men som imtnunoreagerer med liganden, når den er til stede som del af et receptor-1igand-kompleks. Bedømmelsen gennemføres 30 under anvendelse af velkendte immunologiske metoder, som beskrevet i det følgende.

(f) Når først en ønsket transformant er identificeret i trin (e) , udvælges den og dyrkes i et egnet vævskulturmedium i et tilstrækkeligt tidsrum, efterfulgt af udvinding 35 af det ønskede antistof fra den ovenstående kulturvæske.

Det egnede medium og den hensigtsmæssige varighed af dyrk- 16 DK 173362 B1 ningstiden er velkendt inden for området og bestemmes let.

Til frembringelse af en meget større koncentration af en smule mindre rent monoklonalt antistof kan det ønskede hydridoma injiceres i mus eller andre pattedyr, hvor hybri-5 domaet kan vokse, fortrinsvis syngeniske eller semisyngeniske mus. Hybridomaet forårsager dannelse af antistof-producerende tumorer efter en passende inkubationstid, hvilket resulterer i en høj koncentration af det ønskede antistof (ca. 5-20 mg/ml) i blodstrømmen og peritonealt exudat (ascites) i 10 værtsmusen.

Midler, der er anvendelige til fremstilling af disse præparater, er både velkendte inden for området og kommercielt tilgængelige og omfatter syntetiske dyrkningsmedier, indavlede mus o.lign. Et eksempel på syntetisk medium er 15 Dulbeccos's minimale essentielle medium [DMEM; Dulbecco et al., Virol. 8:396 (1959)] suppleret med 4,5 g/liter glucose, 20 mm glutamin og 20% kalvefosterserum. Et eksempel på en indavlet musestamme er Balb/c.

Et monoklonalt antistof produceret ved hjælp af oven-20 nævnte metode kan f .eks. anvendes diagnostisk og terapeutisk, som det er beskrevet mere detaljeret i det følgende, hvor dannelse af et RIBS-holdigt immunoreaktionsprodukt ønskes. Sådanne anvendelser omfatter f.eks. de diagnostiske fremgangsmåder og systemer til sporing af fibrinogen-bundne 2 5 blodplader i en legemsprøve, til in vivo detektering af en thrombe, nedbrydning af en thrombe eller thrombebilleddan-nelse.

Et monoklonalt RIBS-antistof anvendes typisk i et vandigt præparat. Dette præparat kan være et vævskulturmedium 30 eller ascitesvæske som opnået eller i fortyndet form. Sådanne præparater anvendes typisk in vitro.

Til in vivo anvendelser renses det monoklonale RIBS--antistof typisk ved udfældning i ammoniumsulfat, affinitetsrensningsmetoder o. lign. og anvendes derpå i et vandigt 35 præparat af et farmaceutisk acceptabelt fortyndingsmiddel. Koncentrationen af monoklonale RIBS-antistoffer i et sådant

I I

17 DK 173362 B1 : vandigt præparat tilpasses den ønskede anvendelse.

E. Terapeutiske metoder og præparater

Monoklonale antistoffer udskilt af en hvilken som helst af de ovenfor beskrevne, deponerede hybridomaer og 5 antistoffer med en lignende immunospecificitet, er især værdifulde i områder, der har relation til klumper af størknet blod eller thromber. Dette skyldes, at sådanne typer monoklonale anti-RIBS-antistoffer immunoreagerer med det fibrinogen-GPIIb/IIIa-receptor-kompleks, som er til stede på 10 aktiverede blodplader, der indeholder bundet fibrinogen, og blodplade-bundet fibrinogen er involveret i thrombedannelse.

Da disse monoklonale RIBS-antistoffer pr. definition ikke immunoreagerer med opløseligt fibrinogen, som er til stede in vivo i cirkulerende blod, kan man desuden opnå ekstrem 15 specificitet af immunoreaktion ved anvendelse af et eller flere af disse monoklonale antistoffer.

1. Thrombenedbrydning

Antistofferne ifølge den foreliggende opfindelse er anvendelige til nedbrydning af en thrombe. Herved bindes 20 antistofmolekylerne i et monoklonalt antistof produceret ved hjælp af mindst ét af de hos ATCC deponerede hybridoma kemisk til et piasminogen-aktiverende enzym til dannelse af et konjugat, hvori bindingen af antistofdelen i konjugatet til dets RIBS er praktisk talt usvækket, og den plasminogen-25 aktiverende aktivitet af enzymet er praktisk taget usvækket. Metoder til fremstilling af antistof-protein-konjugat, hvori aktiviteterne af begge dele af konjugatet er praktisk taget usvækket, er velkendte for en fagmand.

Et plasminogenaktiverende enzym henviser til gruppen 30 af fibrinolytiske medikamenter inden for klassen af pro-thrombolyse, f.eks. vævsplasminogenaktivatorer, der fremkalder thrombolyse uden systemisk fibrinolyse eller fibri-nogennedbrydning. Andre fibrinolytiske medikamenter er sådanne, der vekselvirker med proaktivatorplasminogenet og 35 omfatter, men er ikke begrænset til, streptokinase, urokinase (u-PA) og vævsplasminogenaktivator (t-PA).

18 DK 173362 B1

Til nedbrydning af en thrombe indgiver man et farmaceutisk acceptabelt, vandigt præparat indeholdende en thrombe-nedbrydende mængde af et i det foregående beskrevet konjugat, f.eks. ved intravenøs injektion eller infusion, 5 til et pattedyr, f.eks. et menneske, der har en thrombe, der skal nedbrydes. Det således behandlede pattedyr (injicerede pattedyr) holdes i et tidsrum, der er tilstrækkeligt for antistofdelen i konjugatet til at immunoreagere med det blodplade-bundne fibrinogenkompleks, der er til stede i 10 thromben, og for den plasminogen-aktiverende enzymdel i konjugatet til at aktivere plasminogen. Da fjernelse af konjugatet ville være en vanskelig og tidskrævende opgave, holdes det behandlede pattedyr i et tidsrum, der er tilstrækkeligt for dets egen organisme til at udskille konjugatet 15 på sædvanlig måde.

2. Inhiberina af thrombedannelse

Antistofferne ifølge den foreliggende opfindelse kan også anvendes ved en anden behandlingsmetode, som er værdifuld for pattedyr, der kan risikere at danne thromber, 20 f.eks. personer i de første mange dage efter en stor operation, f.eks. en coronar-bypass-operation.

Herved indgiver man en thrombe-inhiberende mængde af et monoklonalt antistof indeholdende antistofmolekyler produceret af mindst ét hos ATCC deponeret hybridoma 2G5, 2F10, 25 3G11 eller 4C10, som er til stede i et farmaceutisk accep tabelt, vandigt præparat, til et pattedyr, f.eks. et menneske, hvor man vil forhindre dannelse af en thrombe. De behandlede pattedyr (injicerede pattedyr) holdes i et tidsrum, der er tilstrækkeligt for de indgivne monoklonale RIBS-30 -antistoffer til at blive udskilt fra organismen på gængs måde.

Ved denne metode inhiberer immunoreaktionen af monoklonale RIBS-antistoffer med aktiverede blodplader indeholdende bundet fibrinogen thrombedannelse. Da et monoklonalt 35 RIBS-antistof immmunoreagerer med fibrinogen-GPIIb/IIIa-komplekset på blodpladen og ikke med fibrinogenet i blodet,

I I

19 DK 173362 B1 svækkes den normale funktion hos det behandlede dyr naturligvis ikke.

Ved en relateret metode inhiberes blodpladeaggrege-ring ved, at man til en blodpladeholdig opløsning indgiver 5 et farmaceutisk acceptabelt, vandigt præparat indeholdende monoklonale antistofmolekyler frembragt af mindst ét i ATCC deponeret hybridoma 2G5, 2F10, 3G11 eller 4C10. En blodplade-aggregations-inhiberende mængde antistof indgives in vivo til et pattedyr, hvori inhibering af blodpladeaggregation 10 ønskes, eller blandes in vitro med en blodpladeholdig opløsning, f.eks. plasma eller blod. Invmunoreaktion af monoklonale RIBS-antistoffer med fibrinogen-GPIIb/Hla-kompleks på blodpladerne danner et immunoreaktionsprodukt, som inhiberer blodpladeaggregation.

15 Et enkelt, ovenfor beskrevet, monoklonalt RIBS-anti stof kan anvendes i hver af ovennævnte fremgangsmåder, eller en blanding indeholdende mere end et kan anvendes. Selv om hvert af de monoklonale antistoffer produceret af de fire ATCC-deponerede hybridomaer, deler den egenskab at være et 20 monoklonalt RIBS-antistof, immunoreagerer hvert antistofbindingssted ikke med samme epitop. Man kan således opnå en fordel ved at anvende en blanding af disse monoklonale antistoffer (alene eller i konjugatet), således at en flerdob-belt binding af forbindelsesstederne til et enkeltbundet 25 fibrinogenmolekyle kan opnås.

Det skal forstås, at selv om de to ovennævnte metoder er blevet beskrevet med henvisning til monoklonale RIBS-antistof fer!, der immunoreagerer specifikt med fibrinogen-GPIIb/IIIa-komplekset, er lignende metoder anvendelige for 30 andre ligand-receptor-komplekser, som indeholder RIBS.

Fremstillingen af et farmaceutisk acceptabelt, vandigt præparat, som indeholder antistofmolekyler som aktive bestanddele, er velkendt inden for området. Sådanne præparater fremstilles typisk som injicerbare opløsninger, enten som 35 flydende opløsninger eller suspensioner. Faste former, der er egnet til opløsning i, eller suspension i, en vandig 20 DK 173362 B1 væske inden injektion, kan imidlertid også fremstilles. Præparatet kan også være emulgeret.

Konjugatet eller det monoklonale antistof alene blandes ofte med ekscipienter, som er farmaceutisk acceptable 5 og forenelige med konjugatet eller det monoklonale antistof, således som det er velkendt inden for området. Egnede ekscipienter er f .eks. vand, fysiologisk saltopløsning, dextrose, glycerol, ethanol eller lignende og kombinationer deraf. Om ønsket kan præparatet desuden indeholde mindre mængder hjæl-10 pestoffer, f.eks. fugte- eller emulgeringsmidler, pH-puf-ringsmidler, som forøger effektiviteten af den aktive bestanddel .

Et konjugat eller monoklonalt antistof kan formuleres til ovennævnte vandige præparat som neutraliserede, far-15 maceutisk acceptable saltformer. Farmaceutisk acceptable salte omfatter syreadditionssalte (dannet med de frie amino-grupper i enzymet eller antistofmolekylet), som dannes med uorganiske syrer, såsom salt- eller phosphorsyre, eller sådanne organiske syrer som eddike-, vin- og mandelsyre.

2 0 Salte dannet med de frie carboxylgrupper kan også være afledt fra uorganiske baser, såsom natrium-, kalium-, ammonium-, calcium- eller ferrihydroxider, og sådanne organiske baser som isopropylamin, trimethylamin, 2-ethylaminoethanol, hist idin, procain o.lign.

25 De terapeutiske, antistofmolekylholdige præparater indgives konventionelt intravenøst, f.eks. ved injektion af en enhedsdosis. Et præparat indgives på en måde, der er forenelig med dosisformuleringen, og i en terapeutisk effektiv, dvs. thrombe-nedbrydende eller thrombe-inhiberende, 3 0 mængde.

Den mængde, der skal indgives, afhænger bl.a. af den dyreart, der skal behandles, det pågældende dyrs størrelse, størrelsen på thromben (hvis denne er kendt), mængden af tilstedeværende, fibrinogen-bundne blodplader og af det in-35 divid, der skal drage nytte af konjugatet eller det monoklonale antistof. Nøjagtige mængder konjugat eller mono- ϊ * 21 DK 173362 B1 klonalt antistof, der kræves indgivet, afhænger af den praktiserende læges bedømmelse og er individuelt for hvert individ, især når det er mennesker, der er de behandlede pattedyr. Dosisområder kan imidlertid være karakteriseret ved 5 en terapeutisk effektiv blodkoncentration og kan være i området fra en koncentration af antistofholdigt konjugat eller antistof alene ifølge den foreliggende opfindelse fra I ca. 0.01 μΜ til ca. ΓθΟ~μΜ, fortrinsvis ca. 0,1 μΜ til 10 μΜ.

! Egnede skemaer til begyndelsesindgift og boosterinjek- 10 tioner varierer også, men er typisk en begyndelsesindgift efterfulgt af gentagne doser i intervaller på 1 eller flere timer ved en efterfølgende injektion eller anden indgift. Alternativt falder en kontinuerlig intravenøs infusion, der er tilstrækkelig til at opretholde terapeutisk effektive 15 koncentrationer i blodet. inden for rammerne af den foreliggende opfindelse.

F. Diagnostiske systemer

Et diagnostisk system i form af et prøvesæt ifølge den foreliggende opfindelse omfatter, i en mængde, der er 20 tilstrækkelig til i det mindste én analyse, et monoklonalt RIBS-antistof ifølge den foreliggende opfindelse, f.eks. et sådant, der produceres ved hjælp af et af de fire ATCC-depo-nerede hydridomaer, som et separat emballeret reagens. Et mærkestof til indikering af tilstedeværelsen af en immuno-25 reaktion mellem RIBS og monoklonalt RIBS-antistof er fortrinsvis indeholdt i samme eller en separat emballering. Vejledninger til anvendelse af det pakkede reagens er typisk også omfattet.

Anvendelsesvejledninger består typisk af konkrete 30 udtryk, der beskriver reagenskoncentrationen eller i det mindste én analysernetodeparameter, f.eks. de relative mængder reagens og prøver, der skal blandes, overholdelse af tidsperioder for reagéns/prøve-blåndinger, temperatur, pufferbetingelser o.lign.

35 En udførelsesform ifølge den foreliggende opfindelse er et diagnostisk system i form af et prøvesæt til under- 22 DK 173362 B1 søgelse for fibrinogen-bundne blodplader i en blodpladehol-dig, vaskulær væskeprøve, f.eks. blod eller plasma. Systemet omfatter en pakning indeholdende et monoklonalt antistof, der immunoreagerer med et RIBS udtrykt ved hjælp af receptor-5 1igand-komplekset. Anti-RIBS-antistofmolekylerne i det mono- klonale antistof er fortrinsvis sådanne, der er produceret af et af følgende hydridomaer: hybridoma 2G5, hybridoma 2F10, hybridoma 3G11 og hybridoma 4G10. Antistofmolekylerne er fortrinsvis til stede som et monoklonalt antistofpræparat, 10 som indeholder mere end ét særligt monoklonalt antistof. Desuden foretrækkes prøvesæt, hvor antistofmolekylerne er bundet til et radionuklidmærkestof, fortrinsvis ^-2^I-mærkede eller på anden måde mærkede antistofmolekyler. Anvendelige mærkestoffer beskrives i det følgende.

15 I en anden udførelsesform er et diagnostisk system ifølge den foreliggende opfindelse egnet til undersøgelse for tilstedeværelsen af en thrombe in vivo. Systemet omfatter en pakning, der indeholder monoklonale antistofmolekyler, som immunoreagerer med et RIBS udtrykt ved hjælp af et re-20 ceptor-ligand-kompleks. De tilstedeværende antistofmolekyler er fortrinsvis sådanne, der er udskilt af et hybridoma valgt blandt gruppen bestående af 2G5, 2F10, 3G11 og 4010. Antistofmolekylerne er fortrinsvis bundet til et in vivo mærkestof eller indikerende middel.

25 Selv om et prøvesæt til in vivo-billeddannelse ofte kan anvendes til in vitro-afprøvninger, skal det forstås, at det omvendte ikke behøver at være tilfældet. F.eks. skal de monoklonale antistoffer, der anvendes til in vivo-under-søgelse være fri for pyrogener ligesom alle puffersalte af 30 vandige præparater og reagenser. Frihed fra pyrogenindhold er ikke en nødvendighed for in vitro-analyser. Desuden er det indikerende middel, der er anvendeligt til in vivo-billeddannelse, typisk forskelligt fra det indikerende middel, der anvendes in vitro, hvilket fremgår af det følgende.

35 Afprøvningssystemet er således "egnet" til in vivo-billeddannelse, og "egnede" puffersalte, vandige opløsninger og

i I

23 DK 173362 B1 indikerende midler kan leveres som en del af prøvesættet i 7 samme eller separate‘pakninger.

I foretrukne udførelsesformer omfatter et diagnostisk system ifølge den foreliggende opfindelse desuden et mærke-5 stof eller indikeringsmiddel, der er i stand til at signalere dannelse af et kompleks, der indeholder et antistofmolekyle ifølge den foreliggende opfindelse.

Som anvendt i den foreliggende tekst betyder udtrykkene mærkestof og indikeringsmidler i deres forskellige gram-10 matiske former enkelte atomer og molekyler, som enten er direkte eller indirekte involveret i produktionen af et signal, der kan spores, til indikering af tilstedeværelsen af et kompleks. In vivo-mærkestoffer eller indikeringsmidler er sådanne, der er anvendelige i organismen hos et pattedyr og 15 omfatter ^^In, 99Tc, 67Ga, l®®Re, 132j 0g Ulindium.

Ethvert mærkestof eller indikeringsmiddel kan være bundet til eller inkorporeret i et antistofmolekyle, som er en del af et konjugat eller monoklonalt antistofpræparat, og sådanne atomer eller molekyler kan anvendes alene eller 20 sammen med yderligere reagenser. Sådanne mærkestoffer er i sig selv velkendte inden for den kliniske, diagnostiske kemi.

Binding af mærkestoffer, dvs. mærkning af, antistoffer er velkendt inden for området. Antistofmolekyler produ-25 ceret af et hybridoma kan f.eks. mærkes ved metabolisk inkorporering af radioisotop-holdige aminosyrer frembragt som en komponent i dyrkningsmediet. Se f.eks. Galfre et al.,

Meth. Enzvmol.. 73:3-46 (1981). Metoderne til proteinkon- jugering eller -kobling gennem aktiverede funktionelle grup-30 per er især egnede. Se f.eks. Aurameas, et al., Scand. J. Immunol. bind 8, suppl. 7:7-23 (1978), Rodwell et al., Biotech. . 3:889-894 (1984) , og US-patentskrift nr. 4.493.795.

In vitro diagnostiske systemer kan også omfatte, fortrinsvis som en separat pakning, et specifikt bindings-35 middel. Et "specifikt bindingsmiddel" er en molekylær helhed, der er i stand til selektivt at binde et monoklonalt antistof 24 DK 173362 B1 ifølge den foreliggende opfindelse, men som ikke i sig selv er et antistofmolekyle ifølge opfindelsen. Eksempler på specifikke bindingsmidler er sekundære antistofmolekyler, komplementproteiner eller fragmenter deraf, S. aureus protein 5 A o.lign. Det specifikke bindingsmiddel binder det her omhandlede monoklonale RIBS-antistofmolekyle, når dette mono-klonale antistof er til stede som del af et immunokompleks med ligand-receptor-komplekset. I foretrukne udførelsesformer er det specifikke bindingsmiddel mærket. Når det diagnostiske 10 system omfatter et specifikt bindingsmiddel, som ikke er mærket, anvendes det specifikke bindingsmiddel imidlertid typisk som et forstærkende middel eller reagens og et sekundært reagens, som er mærket, binder til det specifikke bindingsmiddel (forstærkende middel). I disse udførelsesformer 15 er det mærkede, andet reagens i stand til specifikt at binde det forstærkende middel, når dette er bundet til et mono-klonalt, RIBS-antistofholdigt immunokompleks.

Det her omhandlede diagnostiske prøvesæt kan anvendes i et "ELISA"-format til at spore tilstedeværelsen eller 20 kvantiteten af et ligand-receptor-kompleks, f.eks. fibrino-genbundne blodplader i en legemsvæskeprøve, f.eks. serum, plasma eller urin. "ELISA" betyder en enzym-bundet immuno-sorbentprøve, som anvender et antistof eller antigen bundet (her RIBS-holdigt ligand-receptor-kompleks) til en fastfase-2 5 matrix, som danner et fast underlag, og et enzym-antigeneller enzym-antistof-konjugat til sporing og kvantitetsbestemmelse af mængden af et antigen eller antistof, der er til stede i en prøve. En beskrivelse af ELISA-metoden findes i D.P. Sites et al.: Basic and Clinical Immunology. 4. udg.

30 kapitel 22, udgivet af Lange Medical Publications of Los Altos, CA, i 1982 og i US-patentskrifter nr. 3.654.090, nr. 3.850.752 og nr. 4.016.043, hvortil der her skal henvises.

Ved foretrukne udførelsesformer for ELISA-prøvesæt fæstnes de her omhandlede antistofmolekyler til en fast 35 matrix til dannelse af et fast underlag, som pakkes separat i de pågældende diagnostiske systemer. Antistofferne sættes

i I

25 DK 173362 B1 typisk til den faste matrix ved adsorption fra et vandigt medium, selv om andre tilsætningsmetoder, der er velkendte for en fagmand, kan anvendes.

Et mærket, specifikt bindingsmiddel, som binder til 5 komplekset eller til dets bestanddele eller et umærket, specifikt bindingsmiddel plus et mærket, andet reagens, som binder til det specifikke bindingsmiddel, er også indeholdt i én hhv. to separate pakninger i prøvesættet. Ved anvendelse af et af de monoklonale- antistoffer produceret ved et af de 10 ATCC-deponerede hybridomaer som eksempel på det matrix- -bundne antistof, er mærkede anti-fibrinogen-antistoffer, som er kommercielt tilgængelige, eksempler på det specifikke bindingsmiddel.

Anvendelige, faste matrixer er velkendte inden for 15 området. Sådanne materialer omfatter det tværbundne dextran, der er tilgængeligt under varemærket "SEPHADEXAn fra Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, NJ); agarose; perler af polystyrenperler, der er ca. 1 μττι til ca. 5 mm i diameter og tilgængelige fra Abbott Laboratories, North Chicago, IL; 20 polyvinylchlorid, polystyren, tværbundet polyacrylamid, *' nitrocellulose- eller nylon-baserede væv, f.eks. plader, strimler eller rørepinde, eller rør, plader eller væggene i en mikrotiterplade, f.eks. sådanne, der er fremstillet af polystyren eller polyvinylchlorid.

25 De monoklonale antistoffer (mærkede eller umærkede), et mærket, specifikt bindingsmiddel eller forstærkende reagens i et hvilket som helst diagnostisk system beskrevet i den foreliggende tekst kan tilvejebringes i opløsning, som en flydende dispersion eller som et praktisk taget tørt 30 pulver, f.eks. i lyofiliseret form. Hvor det indikerende middel er et enzym, kan enzymets substrat også tilvejebringes i en separat pakning i et prøvesætsystem. En fast underlags-matrix, f.eks. den ovenfor beskrevne mikrotiterplade, og en eller flere pufre kan også være indeholdt som separat em-35 ballerede elementer i dette diagnostiske prøvesystem.

26 DK 173362 B1

De i den foreliggende tekst beskrevne pakninger i relation til diagnostiske systemer er sådanne, der sædvanligvis anvendes i diagnostiske systemer. Sådanne pakninger omfatter glas- og plast- (f.eks. polyethylen, polypropylen 5 og polycarbonat) -flasker, hætteglas, plast- og plast-folie--laminerede hylstre o.lign.

G. Undersøgelsesmetoder

Ved detektering af et receptor-ligand-kompleks, f.eks. som det, der findes i en thrombe eller i fibrinogen-10 bundne blodplader, fortrinsvis GPIIb/IIIa:fibrinogen, anvendes ekspressionen af et receptor-tilskyndet bindingssted (RIBS) og et monoklonalt antistofmolekyle, der immunoreagerer med RIBS i liganddelen i receptor-ligand-komplekset, men som ikke reagerer med en ikke-bundet receptor eller ikke-15 bundet ligand. En fagmand vil forstå, at der er talrige, velkendte kliniske, diagnostiske, kemiske processer, som kan anvendes til dannelse af sådanne immunokomplekser.

1. Thrombe-sporing

Ved sporing af tilstedeværelsen af en thrombe i et 20 pattedyr, f.eks. et menneske, indgives et vandigt præparat indeholdende en effektiv mængde til billeddannelse af et monoklonalt antistof ifølge opfindelsen indeholdende antistofmolekyler bundet til et in vivo indikerende middel intravenøst til et pattedyr, f.eks. et menneske, der har 25 behov for en sådan behandling.

Pattedyret, der har modtaget den indgivne mængde, holdes i et i forvejen bestemt tidsrum, der er tilstrækkeligt for det mærkede antistofmolekyle til at immunoreagere med det blodplade-bundne fibrinogenkompleks, der er til stede 3 0 som del af en thrombe. Det pågældende pattedyr undersøges derpå for tilstedeværelsen og fortrinsvis placeringen af et hvilket som helst dannet, mærket immunokompleks, og derved spores thromben og dens lokalisering. Da de mærkede, mono-klonale RIBS-antistoffer sædvanligvis indeholder radionu-35 clider som mærkestof eller indikerende middel, gennemføres billedanalysen ifølge gængse, velkendte radiobiliedmetoder.

27 DK 173362 B1 Sådanne metoder kan skelne den relativt høje koncentration af radiomærkning ved thromben fra den relativt lavere, systemiske mængde radiomærkning. I de tilfælde, hvor radioisotoper med forholdsvis lang levetid anvendes, kan det pattedyr, 5 der modtager behandling, holdes i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til væsentlig systemisk udskillelse af det mærkede, monoklonale antistof for derved at tilvejebringe en forholdsvis endnu mindre mængde baggrundssignal fra radio-mærkestoffet.

10 2. Snoring af fibrinogen-bundne blodplader i en legemsnrøve

Forskellige heterogene og homogene analyseprotokoller kan anvendes, enten konkurrerende eller ikke-konkur-15 rerende, til sporing af tilstedeværelsen og især mængden af fibrinogen-bundne blodplader i en blodpladeholdig og/eller frit fibrinogenholdig legemsprøve, især en legemsvæskeprøve, f.eks. blod eller en blodplade-holdig del af blodet. F.eks. blandes en heparin-konserveret {ikke-koaguleret) blodprøve 20 og en 12-mærket form af et af de ovenfor beskrevne, deponerede RIBS-antistofmolekyler. Mængder og koncentrationer af prøven og mærket monoklonalt antistof anvendes naturligvis således, at et meningsfyldt resultat kan opnås. Den således dannede immunoreaktionsbiånding holdes under biologiske 25 analysebetingelser i et tidsrum, der er tilstrækkeligt for de i prøven tilstedeværende, fibrinogen-bundne blodplader til at immunoreagere med de mærkede antistoffer og til dannelse af et mærket immunoreakt i onsprodukt. Det mærkede immunoreakt ionsprodukt skilles derpå, når det er til stede, 30 fra alle ikke-reagerede mærkede antistoffer, som kan være til stede. I homogene "analyser gennemføres adskillelsen typisk ved centrifugering, der er tilstrækkelig til at pel-lettere alle blodplader, der er til stede i prøven. I heterogene analyser, f.eks. en ELISA, er immunoreakt ionsproduktet 35 bundet til det faste underlag, og adskillelsen gennemføres typisk ved et vasketrin, hvori eventuelt ikke-bundet RIBS- 28 DK 173362 B1 antistof kasseres, og det faste, til underlaget bundne im-munoreaktionsprodukt holdes tilbage.

Det skal forstås, at i de tilfælde, hvor et umærket, monoklonalt RIBS-antistof anvendes til at immunoreagere med 5 et RIBS-holdigt ligand-receptor-kompleks, dannes en anden blanding mellem det ovenfor beskrevne, fraskilte immunokom-pleks og et mærket bindingsreagens eller umærket bindingsreagens, der anvendes som et forstærkende middel. Denne reaktionsblanding holdes under biologiske betingelser i et 10 tidsrum, der er tilstrækkeligt for et andet bindingskompleks til at dannes mellem det først dannede immunokompleks og det specifikke bindingsreagens. (Hvor dette specifikke bindingsreagens indeholder antistofmolekyler, er dette andet bindingskompleks et andet immunokompleks. Hvor S. aureus 15 protein A anvendes, er det andet bindingskompleks f.eks. ikke afhængigt af binding på antistofbindingsstedet, og dette kompleks betegnes bedst et bindingskompleks. Da et immunokompleks er et specifikt bindingskompleks, er det kompleks, der dannes mellem det specifikke bindingsreagens 20 og det førstnævnte immunokompleks et andet bindingskompleks.)

Det andet bindingskompleks skilles derpå fra et hvilket som helst ureageret specifikt bindingsreagens, som kan være til stede, ifølge en tidligere nævnt metode, og tilstedeværelsen af mærkestoffet og dermed immunokomplekset bestemmes og 25 kvantificeres fortrinsvis.

I de tilfælde, hvor det specifikke bindingsreagens ikke er mærket og anvendes som et forstærkende middel, dannes en tredje blanding fra ovennævnte, fraskilte andet bindingskompleks, når dette er til stede, og et mærkes tof hol digt 30 andet bindingsreagens. Tilstedeværelsen af mærkestoffet i det andet bindingskompleks er naturligvis ikke bestemt i ovennævnte metode, hvor intet mærket reagens iblandes. Ovennævnte bibeholdelses- og fraskillelsestrin gentages for dette aspekt i metoden, idet et mærkestofholdigt, tredje bin-35 dingskompleks dannes og tilbagebeholdes. Tilstedeværelsen og især mængden af mærkestoffet bestemmes herefter.

f I — 29 DK 173362 B1 I hvert af de ovenfor beskrevne aspekter for denne analyse skaber tilstedeværelsen og især mængden af mærkestoffet således basis for bestemmelse af tilstedeværelsen og især mængden af fibrinogen-bundne blodplader.

5 Det skal understreges, at den fagmand, der gennemfører en i det foregående beskrevet analyse, almindeligvis ikke vil have kendskab til, om et eller flere af immunokomplek-serne eller bindingskomplekserne i virkeligheden er dannet, indtil mængden af tilstedeværende mærkestof er bestemt. Ikke 10 desto mindre gennemføres alle trin i en given analyseproces, som om det RIBS-holdige kompleks virkelig er til stede.

Det skal understreges, at på grund af den enestående specificitet for de monoklonale RIBS-antistoffer kan den ovenfor beskrevne analyse for fibrinogen-bundne blodplader 15 og den ovenfor beskrevne bi 11 eddannende analyse for en throm-be gennemføres og bliver fortrinsvis gennemført i nærværelse af både frie blodplader og frit fibrinogen, dvs. ikke-kom-plekse blodplader og fibrinogen. Som et resultat heraf er det ikke nødvendigt at gennemføre en speciel håndterings-20 procedure, såsom fraskillelses- og vasketrin, på legemsprøven inden anvendelse af danne prøve i en analyse. Dette træk er - ~ <-· Jfi'i · F ··· · ! fælles for alle anåXyser, der anvender monoklonale RIBS- antistoffer.

Biologiske analysebetingelser er sådanne, der bibe-25 holder den biologiske aktivitet af antis tof molekylerne ifølge den foreliggende opfindelse og de fibrinogen-bundne blodplader eller et andet RIBS-holdigt kompleks, der søges analyseret. Sådanne betingelser omfatter et temperaturområde på ca. 4°C til ca. 45°C, fortrinsvis ca. 37eC, en pH-værdi 3 0 i området fra ca. 5 til ca. 9, fortrinsvis ca. 7, og en ionstyrke, der varierer fra ionstyrken for destilleret vand til styrken for ca. 1 molær natriumchlorid, fortrinsvis ionstyrken for en fysiologisk saltopløsning. Metoder til at gøre sådanne betingelser optimale er velkendte inden for 35 området.

30 DK 173362 B1

EKSEMPLER

De følgende eksempler skal illustrere, men ikke begrænse, den foreliggende opfindelse.

5 1. Hvdridoma- og monoklonal antistofproduktion

Monoklonale antistoffer produceres ved anvendelse af standard-hydridomateknologi. Kort fortalt immuniseres Balb/c mus og boosterinj iceres derpå 3 gange med ca. 50 /xg pr. mus fibrin D-dimer immunogen i det væsentlige fremstillet 10 som beskrevet i Cierniewski et al., Thromb. Haemostas. 48:33--37 (1982) .

Derpå blandes 1,23 x 10® splenocytceller fra en immuniseret mus, hvis antistoffer immonoreagerer med immuno-genet, med 2,46 x 107 P3Ag8653.1 musemyelomaceller i nær-15 værelse af cellefusionspromotoren polyethylenglycol 4000.

De således transformerede, antistofproducerende celler overføres til mikrotiterplader med 96 huller med en tæthed på ca. 3 x 104 celler pr. hul og dyrkes.

Ovenstående vævskulturvæsker fra 235 huller, som 20 viser sig at indeholde levedygtige hybridomaer efter ca. 14 dages dyrkning, screenes ifølge radioimmunoanalyse for tilstedeværelsen af anti-RIBS-antistofmolekyler. Kort fortalt fyldes 100 μΙ^βΓ phosphat-pufret fysiologisk saltopløsning (PBS) indeholdende enten 1 μg/ml fibrinogen eller lipoprotein 25 med lav vægtfylde (LDL) (kontrol) i hullerne i fladbundede polyvinylmikrotiterplader med 96 huller som fastfasematrix. Pladerne holdes derpå i ca. 16-20 timer ved 4°C for at gøre det muligt for fibrinogenet eller LDL at adsorbere på overfladen af hullerne til dannelse af et fast underlag. Over-30 træksopløsningen fjernes ved rystning, hullerne skylles, og 100 μΐί^τ blokeringsopløsning (PBS indeholdende 5% normalt gedeserum) fyldes i hvert hul til blokering af overskydende proteinbindingssteder.

Hullerne holdes i ca. 30 minutter ved 37°C, og derpå 35 fjernes blokeringsopløsningen. I hvert hul tilsættes derpå 100 μΐϊίβτο af enten (a) en ovenstående hybridoma vævskul tur- i i 31 DK 173362 B1 væske fortyndet 1:10 i PBS eller (b) en ovenstående hybri-domavæske fortyndet 1:10 i PBS indeholdende 100 μ9/τη1 fibrinogen som konkurrerende inhibitor. De således dannede im-munoreakt ionsblandinger holdes ved stuetemperatur i ca.

5 16-20 timer ved 4°C for at tillade dannelse af et fastfase- -bundet immunoreaktionsprodukt og en flydende fase, herunder alle ikke-bundne, monoklonale antistofmolekyler.

Til hvert hul sættes derpå 100 μϋί&τ 125I-mærket gede-anti-muse-IgG. Den således dannede, mærkende immunore-10 aktionsblanding holdes i ca. 6-20 timer ved 4°C for at muliggøre dannelse af et 125I-mærket, andet fastfase-immuno-reaktionsprodukt. De faste og flydende faser adskilles derpå til fjernelse af et hvilket som helst ikke-bundet 125I-gede-anti-muse-IgG. Mængden af 125I-bundet gede-anti-muse-IgG 15 til hvert hul bestemmes ved hjælp af i-scintillation.

Tilstedeværelsen af mindst ca. 3 gange mængden af ikke-specifikt bundet 125-I, som bestemt ud fra LDL-over-trukne huller, i et fibrinogen-overtrukket hul indikerer tilstedeværelsen af anti-fibrinogen-antistoffer i en oven-20 stående vævskulturvæske. En reduktion af fastfase-bundet 125I med ikke mere end ca. 15% ved tilstedeværelsen af flydende fase-fibrinogenkonkurrent i immunoreaktionsblandingen [afsnit (b) ovenfor] angiver tilstedeværelsen af anti-RIBS-antistoffer i den ovenstående vævskulturvæske.

25 Den ovenfor beskrevne screeningsproces resulterer i identificering af 4 hybridomaer, betegnet 2G5, 2F10, 3G11 og 4G10, som producerer anti-RIBS-antistoffer, der binder et fibrinogen:GPIIb/IIIa-kompleks.

Hvert af de fire ovenfor beskrevne hybridomaer klones 30 to gange ved begrænsende fortynding og anvendes derpå til tilvejebringelse af åscitesvæske. Antistofferne isoleres derpå fra ascitesvæskeme ved anvendelse af protein A "Sepha-roseA".

Præparater indeholdende Fab-fragmenter af det mono-35 klonale antistof (Mab) 2F10 fremstilles ved digerering af protein A "SepharoseA"-isoleret Mab 2F10 med papain (i et 32 DK 173362 B1 forhold mellem Mab og papain på 200:1 vægt/vægt) i 6 timer ved 37°C ifølge de af Mage et al., Methods in Enzvmology. 70: 142-50 (1980), beskrevne metoder. Ufordøjet antistof og Fc--fragmenter fjernes fra Fab-fragmenterne ved chromatografi 5 på protein A "SepharoseAn. De resulterende Fab-fragmenter opsamles fra "SepharoseA" til dannelse af et 2F10-Fab-præparat.

2. Detektering, af_ et fibrinogen:GPIIb/IIIa-RIBS på aktiverede blodplader

Monoklonale antistoffer produceret af hybridoma 10 2G5, 2F10 og 3G11, dvs. MAb 2G5, MAb 2F10 og MAb 3G11, under søges for deres evne til at immunoreagere med et celleoverfladebundet RIBS. Hver af de fire monoklonale antistoffer 125I-mærkes ved anvendelse af standard-chloramin-T-metodologi, jfr. Greenwood et al., Bio. Chem. J.. 89:114-123 15 (1963).

60 ml humant helblod opsamles i 5 ml ACD (0,065 M citronsyre, 0,085 M natriumcitrat, 2% dextrose) indeholdende hirudin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) i en formelkoncentration på 0,06 enheder pr. ml (E/ml) og centrifugeres i 20 15 minutter ved 120 G. Den resulterende ovenstående væske, betegnet blodpladerig plasma, fjernes, isoleres og centrifugeres yderligere i 15 minutter ved 1200 G til dannelse af en pellet af isolerede blodplader.

De isolerede blodplader resuspenderes i 2 ml calcium-25 fri Tyrode's puffer (0,13 M NaCl, 0,0026 M KC1, 0,002 M

MgCl2-61*20, 5mM Hepes, 0,012 NaHC03, pH-værdi 7,2) indeholdende 1 mg/ml kvægserumalbumin (BSA) og 1 mg/ml dextrose. Blodpladesuspensionen påføres derpå en "SepharoseA CL2B"-kolonne (40 ml totalt massevolumen; Pharmacia Inc., Pis-30 cataway, NJ) ækvilibreret med samme Tyrode's puffer. Vaskede blodplader udvindes fra hulrumsvolumenet i "CL2B"-kolonnen i et slutvolumen på ca. 4 til 5 ml.

Prøver af vaskede blodplader stimuleres (aktiveres) derpå ved blanding med enten adenosindiphosphat (ADP) til 35 en koncentration på 10 μΜ eller thrombin til en koncentration på 0,1 enheder/ml. Nogle prøver af ADP-stimulerede blodplader I 1 33 DK 173362 B1 blandes også med fibrinogen til en fibrinogenkoncentration på 1 mM.

Til hver blodpladeprøve, herunder nogle ikke-stimulerede kontrolprøver, sættes et 125I-mærket MAb til en kon-5 centration på 10 nM. Den således dannede immunoreaktions-blanding holdes i 30 minutter ved 22°C til dannelse af et immunoreaktionsprodukt. Immunoreaktionsprodukterne skilles fra ikke-bundet ^^JL-MAb ved centrifugering gennem 0,3 ml 20%’s saccharose. Mængden af ^2^I-MAb associeret med blod-10 pladepelleten bestemmes ved hjælp af scintillationspektro- I · · · —Ί3«;« · · >· metri.

Resultaterne af dette forsøg, vist i tabel I, angiver, at de monoklonale anti-RIBS-antistoffer ikke immunoreagerer væsentligt med ikke-stimulerede blodplader. Når blodplademe 15 stimuleres med en antagonist, f.eks. ADP eller thrombin, opnås imidlertid en signifikant immunoreaktion af Mab'erne med fibrinogen:GPlIb/IIIa-komplekset på cellerne. Stimulering af blodpladerne med ADP eller thrombin resulterer i, at det blodplade-endogene fibrinogen udskilles og overfladebindes 20 af GPIIb/IIIa. Tilsætning af exogent fibrinogen neutraliserer (inhiberer) ikke bindingen af 125I-MAb til de stimulerede blodplader, hvilket således angiver, at MAB'erne er RIBS-specifikke, dvs. de immunoreagerer ikke med frit fibrinogen i opløsning. Lignende resultater opnås med MAb 4G10.

25

TABEL I

125I-MAb-bundet (cpm/blodplade) 30 Blodplader 2G5 2F10 3G11

Ikke - stimuleret. ... 1.200 2.800 1.300 ADP-Stimuleret 33.750 43.600 31.500 35 ADP-stimuleret + fibrinogen 35.600 51.300 30.150

Thrombin- -stimuleret 28.620 32.000 28.400 40 -- 34 DK 173362 B1

For at understrege, at exogent tilsat fibrinogen ikke er celle-associeret (dvs. ikke er en del af cellereceptor-ligand-komplekset) , men dog ikke neutraliserer immunore-5 aktiviteten af MAb'er 2G5, 2F10, 3G11 og 4G10 med fibrino-gen:GPIIb/IIIa-komplekset, undersøges immunoreaktiviteten for MAB'erne med blodplademe under anvendelse af blodplade-rigt plasma, der indeholder 2-3 mg/ml fibrinogen.

Som vist i tabel II immunoreagerer hvert af de fire 10 ^·2^Ι-ΜΑΒ· er, til trods for det meget store overskud af frit fibrinogen, med fibrinogen:GPIIb/IIla-RIBS på blodpladeoverfladen.

TABEL II

15 125I-MAb-bundet (cpm/blodplade)

Blodplader 2G5 2F10 3G11 4G10

Ikke-stimuleret 174 662 218 678 20 ADP-Stimuleret 17.823 7.471 20.382 19.540

Som en yderligere angivelse af specificitet af de fire deponerede Mab'er for RIBS gennemføres lignende Mab--bindingsundersøgelser ved anvendelse af celler, der in-25 deholder en Mac-1-receptor i stedet for blodplader med GPIIb/-IIIa-blodpladeglycoproteinreceptor. Både Mac-1 og GPIIb/IIIa binder specifikt til fibrinogen på receptor-li-gand-måde, men de to vekselvirkninger frembringer forskellige biologiske resultater. I bindingsundersøgelserne udviser de 30 fire deponerede RIBS ikke immunoreaktion med fibrinogen-Mac-1-kompleks, men immunoreagerer med fibrinogen i et fi-brinogen-GPIIb/IIIa-kompleks. Derfor immunoreagerer de fire undersøgte Mab'er specifikt med RIBS på fibrinogen ekspri-meret i kompleks med GPIIb/IIIa, men ikke med RIBS på fibri-35 nogen, når dette er komplekseret med Mac-1.

35 DK 173362 B1 ! . 3. Inhibering af blodoladeaggregation ved hjælp af RIBS-antistoffer 200 μΙ^βΓ isolerede blodplader fremstillet som beskrevet i eksempel 2 blandes med 190 /rliter Tyrode's puffer 5 indeholdende BSA og dexgrose (begge i en mængde på 1 mg/ml), fibrinogen (1 mM), calcium (5 mM) og et Fab-fragment af Mab 2F10, fremstillet i eksempel 2 og til stede i varierende mængder som angivet i tabel III. 10 μΙ^βΓ ADP (80 μΜ i Tyrode's puffer) tilsættes derpå for at stimulere blodplade-10 aggregation. Blandingen holdes ved 37°C, medens ændringer i lystransmission for blandingen overvåges i en periode ved anvendelse af et "Dual Sample"-aggregationsmeter (model DP-247E, Sienco Inc., Morrison, CO).

Aggregationsmetret kalibreres ved anvendelse af en 15 opløsning indeholdende 200 μϋίβΓ PRP og 200 μΙϊίβΓ Tyrode's puffer til fastlæggelse af en lav basislinie for lystransmission ved 5% for kontrolaggregat ioner og ved 10% for aggregationer i nærværelse af antistof. Den øvre grænse er 100 ml PRP og 3 00 μϋίβΓ Tyrode's puffer.

20 De opnåede resultater ved måling af blodpladeaggre- gationsinhibering vecfhjælp af antistof er vist i tabel III og udtrykkes som en procentmængde af den lystransmission (100%), som er opnået i fravær af antistof, ved måling ca.

3-4 minutter efter tilsætning af ADP.

25

TABEL III

INHIBERING AF BLODPLADEAGGREGATION VED HJÆLP AF MONOKLONALT ANTISTOF 2F10 % 30 [FAB] transmission 0 μΜ 100 0,25 μΜ 79 35 0,5 μΜ 62,5 1,25 μΜ 34,5 1,87 μΜ 17,5 36 DK 173362 B1

Resultaterne i tabel III viser, at Mab 2F10-fragmentet producerer en dosis-afhængig inhibering for blodpladeaggre-gation. Resultaterne angiver således de effektive doser, der er anvendelige til inhibering af blodpladeaggregation 5 og processer, der medfører blodpladeaggregation, f.eks. thrombedannelse, ved anvendelse af de her omhandlede antistoffer, som immunoreagerer med et RIBS, der er specifikt for fibrinogen:GPIIb/IIIa-kompleks.

i i

Claims (21)

1. Monoklonalt antistof, kendetegnet ved, at det immunoreagerer med et receptor-fremkaldt bindingssted udtrykt af en ligand, når liganden er til stede i et recep- 5 tor-ligand-kompleks, men ikke immunoreagerer med liganden eller med receptoren, når enten liganden eller receptoren er fri i opløsning.

2. Monoklonalt antistof ifølge krav 1, kende tegnet ved, at receptoren i komplekset er et medlem 10 af cytoadhesinsuperfamilien af proteiner.

3. Monoklonalt antistof ifølge krav 2, kende tegnet ved, at receptoren er GPIIb/IIIa.

4. Monoklonalt antistof ifølge krav 3, kende tegnet ved, at liganden er fibrinogen.

5. Monoklonalt antistof ifølge krav 4, kende tegnet ved, at antistoffet er udskilt af et hybridoma valgt blandt gruppen bestående af hybridoma 2G5, hybridoma 2F10, hybridoma 3G11 og hybridoma 4G10.

6. Hybridoma, kendetegnet ved, at det 20 udskiller et monoklonalt antistof, der immunoreagerer med et receptor-fremkaldt bindingssted udtrykt i en ligand, når liganden er til stede i et receptor-ligand-kompleks, men som ikke immunoreagerer med liganden eller med receptoren, når enten liganden eller receptoren er fri i opløs-25 ning.

7. Hybridoma ifølge krav 4, kendetegnet ved, at det er valgt "blandt gruppen bestående af hybridoma 2G5, hybridoma 2F10,-hybridoma 3G11 og hybridoma 4G10.

8. Cellekulturpræparat, kendetegnet ved, 30 at det består af a) et hybridoma, der udskiller et monoklonalt antistof, som immunoreagerer med et receptor-fremkaldt bindingssted udtrykt i en ligand, når liganden er til stede i et receptor-1 igand-kompleks, men som ikke immunoreagerer med liganden 35 eller receptoren, når enten liganden eller receptoren er fri i opløsning; DK 173362 B1 b) antistofmolekyler udskilt af dette hybridoma; og c) et kulturmedium for dette hybridoma.

9. Præparat ifølge krav 8, kendetegnet ved, at hybridomaet er valgt blandt gruppen bestående af hy- 5 bridoma 2G5, hybridoma 2F10, hybridoma 3G11 og hybridoma 4G10.

10. Diagnostisk system i form af et prøvesæt, kendetegnet ved, at det omfatter monoklonale antistoffer, som immunoreagerer med et receptor-fremkaldt bindings- 10 sted udtrykt i en ligand, når liganden er til stede i et receptor-ligand-kompleks, men som ikke immunoreagerer med liganden eller med receptoren, når enten liganden eller receptoren er fri i opløsning, idet de monoklonale antistoffer er til stede i en pakning i en mængde, der er tilstræk-15 kelig til at gennemføre mindst én analyse.

11. Diagnostisk system ifølge krav 10, kende tegnet ved, at receptor-ligand-komplekset er GPIIb/-Illa: fibrinogen.

12. Diagnostisk system ifølge krav 11, kende- 20 tegnet ved, at de monoklonale antistoffer er udskilt af et hybridoma valgt blandt gruppen bestående af hybridoma 2G5, hybridoma 2F10, hybridoma 3G11 og hybridoma 4G10.

13. Diagnostisk system ifølge krav 12, kende tegnet ved, at de monoklonale antistoffer er bundet 25 til et indikerende middel.

14. Diagnostisk system ifølge krav 13, kende tegnet ved, at det indikerende middel er pakket separat fra de monoklonale antistoffer.

15. Diagnostisk system ifølge krav 13, kende- 30 tegnet ved, at det indikerende middel er bundet til de monoklonale antistoffer og er et in vivo indikerende middel.

16. Antistofpræparat, kendetegnet ved, at det omfatter mindst to monoklonale antistoffer udskilt af et 35 hybridoma valgt blandt gruppen bestående af hybridoma 2G5, hybridoma 2F10, hybridoma 3G11 og hybridoma 4G10. i I DK 173362 B1

17. Fremgangsmåde til dannelse af et monoklonalt , antistofmolekyle, der immunoreagerer med et receptor-frem kaldt bindingssted udtrykt af et ligand-holdigt receptorligand -kompleks, hvor komplekset indeholder en celleover- 5 fladereceptor specifikt bundet til en ligand, kendetegnet ved, at man: a) immuniserer et “pattedyr med et præparat indeholdende komplekset; b) fjerner antistof-producerende celler fra det immuni-10 serede pattedyr og fremstiller en suspension af cellerne; c) behandler cellerne med et transformationsmiddel til tilvejebringelse af transformerede, antistofproducerende celler; d) kloner cellerne behandlet i trin c) ved hjælp af en 15 begrænsende fortynding i et vævskulturmedium, som ikke vil opretholde ikke-omdannede celler, til tilvejebringelse af klonede transformanter; e) undersøger vævskulturmediet af de klonede transformanter for at spore tilstedeværelsen af udskilte antistof- 20 molekyler, der immunoreagerer med et receptor-fremkaldt I bindingssted, der er til stede på liganden i receptor-ligand- komplekset, men som ikke immunoreagerer med celleoverfladereceptoren eller liganden, når en af disse er i ikke-bundet form, hvorved man identificerer en klonet transformant, der 25 producerer disse antistofmolekyler,· f) dyrker den identificerede, klonede transformant i et vævskulturmedium under betingelser for produktion af de udskilte antistofmolekyler; og g) høster de udskilte antistofmolekyler fra kulturmediet 30 i trin (f) .

18. Fremgangsmåde ifølge krav 17, kendetegnet ved, at liganden er fibrinogen, og at receptoren er GPIIb/IIla-blodplade-glycoproteinreceptor.

19. Fremgangsmåde til undersøgelse for tilstedeværel-35 sen af et receptor-ligånd-kompleks i en vaskulær væskeprøve, hvori komplekset indeholder en celleoverfladereceptor, der DK 173362 B1 specifikt er bundet til en ligand, kendetegnet ved, at man a) tilvejebringer en immunoreaktionsblanding ved at blande en vaskulaer væskeprøve med et monoklonalt antistof-5 præparat indeholdende antistofmolekyler, som immunoreagerer med et receptor-fremkaldt bindingssted på liganden i receptor- ligand-komplekset, men som ikke immunoreagerer med celleoverfladereceptoren eller liganden, når en af disse er i ikke-bundet form; 10 b) holder blandingen i et tidsrum, der er tilstrækkeligt for antistofferne til at immunoreagere med et eventuelt i prøven tilstedeværende receptor-ligand-kompleks og danne et immunoreaktionsprodukt; og c) sporer tilstedeværelsen af et eventuelt i trin (b) 15 dannet immunoreaktionsprodukt og derved tilstedeværelsen af komplekset i prøven.

20. Fremgangsmåde ifølge krav 19, kendetegnet ved, at liganden er fibrinogen, og at receptoren er blodpladeglycoproteinet GPIIb/IIIa.

21. Fremgangsmåde ifølge krav 20, kendeteg net ved, at antistofmolekylerne er de antistofmolekyler, der er produceret af et hybridoma valgt blandt gruppen bestående af hybridoma 2G5, hybridoma 2F10, hybridoma 3G11 og hybridoma 4G10. i