PT91889B - Processo de preparacao de anticorpos contra sitios de ligacao induzidos por receptor - Google Patents

Description

MEMORIA DESCRITIVA

Aspectos Técnicos presente invento refere-se a um centro de ligação de ari ticorpo que é induzido num ligando quando esse ligando é ligado por um receptor de modo a formar um complexo receptor-ligando. 0 presente invento refere-se também a anticorpos monoclonais que imuno-reagem com o centro de ligação induzido pelo receptor, bem como a métodos terapêuticos e de diagnóstico usando anticorpos mo noclonais.

A ntecedentes

As interacçães de ligandos com moléculas receptoras da sjj perfície celular são fenómenos fundamentais nos processos biolóqi cos. Como exemplo destas interacçães temos a ligação de um ligaji do formado por uma porção de proteína do envelope (gpl40) do vírus da SIDA (HIV) com o receptor CD4 nas células T, os receptores do complexo da histocompatibilidade principal que interactuam com numerosos ligandos nos processos de auto/não auto-discriminação no sistema imunológico, e a interacção do ligando de fibrinogénio com o receptor celular GPIIb/lIIa nas plaquetas. 0 par lrgando-receptor fibrinogénio:GPIIb/lII é de interesse particular na coa gulação do sangue e na formação de trombos, e é utilizado aqui co mo exemplificativo de ligandos e receptores.

Na arte procuram-se desde há muito métodos imunológicos p_a ra distinguir as formas ligadas e não ligadas de ligandos e de receptores devido a esta possibilidade permitir a determinação do estado dos mecanismos fisiológicos mediados pela formação do complexo receptor: ligando. Até há pouco tempo, os esforços para realizar tais determinações por métodos imunológicos foram frustrados porque as amostras biológicas podem conter ligandos e receptores em ambas as formas ligadas (complexadas) e livres.

Por exemplo, a vasculatura de indivíduos sujeitos a uma ocorrência trombótica contêm formas não ligadas de fibrinogénio e GPIIb/lIIa bem como plaquetas com um complexo fibrinogénio:GPIIb/

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SCR 0252-SCRF 163.1 /illa na sua superfície. 0 complexo fibrinogénio: GPIIb/l Ila expri. me determinantes antigénicos comuns a fibrinogénio não ligado e a GPIIb/lIIa não ligado, tornando-se difícil a identificação da cori dição trombótica ou a localização dos trombos por métodos imunolÇ gicos existentes.

Recentemente, Ferlinger et al., 0. Biol♦ Chem., 263:12397-12402 (1988) revelaram a identificação de um determinante antigé^ nico, expresso pelo GPIIb/lIIa, apenas quando o GPIIb/lIIa estava ligado a um ligando. Isto é, o determinante antigénico descrito por Frelinger et al. foi expresso pelo receptor do complexo receptor: ligando.

Outros autores têm referido a preparação de anticorpos mo noclonais que imuno-reagem com um determinante antigénico após lj. gação do ligando a superfícies não receptoras artificiais.

Soria et al., 0. Colloid Interface Sei., 107:204-208 (1985), descrevem um anticorpo monoclonal particular designado 2 por DSB que foi induzido por imunização com um fragmento de fibrina de ligações cruzadas e que se liga ao fibrinogénio adsorvido em plástico e também ao chamado fragmento 0 de fibrinogénio adsoruido sobre plástico ou livre em solução, mas que não -se liga a fibrinogénio na fase solúvel ou ao chamado fragmento E de fibr_i nogénio quando em solução.

Nilsson et al., Molec. Immunul., 24:487-94, 1987, descreve a preparação de anticorpos monoclonais que imunorreagem com fragmentos de complemento C3 quando as partículas se ligam a Zymo san A, mas não com fragmentos C3 solúveis. A natureza da ligação das proteínas ao Zymosan A envolve ligações químicas covalentes.

Noutra publicação Abrams et al., Blood (Suppl. 1), 70:355a (D ec. 1987) discutem brevemente um anticorpo monoclonal designado por 9F9, onde no resumo publicado se refere que este anticorpo se liga a fibrinogénio ligado a plaquetas. Essa breve descrição, contudo não caracterizou as propriedades de ligação específicas do anticorpo monoclonal 9F9.

Têm sido descritos numerosos anticorpos monoclonais que

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-4imunorreagem com fibrinogênio solubilizado. Uma destas descrições é Lindon et al., Blood, 68:355-362 (Ago. 1988). Esta publicação descreve o uso de anticorpos monoclonais anti-fibrinogênio humano comercialmente disponíveis, bem como anticorpos policlonais purificados, por afinidade, em relação aos fragmentos D e E.

Breve sumário do invento

Verificou-se agora que os ligandos que se ligam especificamente a um receptor podem ser distinguidos dos ligandos não ligados pela presença de um local de ligação de anticorpo induzido pelo receptor (RIBS) expresso pelo ligando ligado ao receptor. Is. to é, constatou-se a existência de uma classe de determinantes ari tigénicos que são expressos quando um ligando se liga especificamente a um receptor mas que nãa são expressos pelo receptor não ligado ou pelo ligando não ligado.

Um RIBS é expresso num ligando devido à interacção expeci. fica de um ligando que se liga ao seu receptor cognato. Um RIBS não é um local de determinante antigénico que está exposto quando uma proteína interactua não especificamente com outra superfície, tal como uma proteína adsorvida em plástico, ou quando uma prote_í na interactua, por ligações químicas coualentes com a superfície. Estes dois últimos exemplos estão descritos nas referências de S_o ria et al., e Nilsson et al., anteriormente referidas e não envol. vem a interacção de ligação específica ligando-receptor que produz um RIBS tal como aqui se descreve.

presente invento refere-se a moléculas de anticorpos que imunorreagem com um ligando, de preferência o fibrinogênio, quando ele está ligado a um receptor, mas não imunorreage com fibrinogénio solúvel, como por exemplo no plasma.

Estes anticorpos reconhecem os RIBS induzidos como uma consequência da interacção de proteínas com fibrinogênio, preferencialmente GPIIb/lIIa, nas plaquetas. Os anticorpos do presente invento reagem selectivamente com o fibrinogênio ligado mesmo com um grande excesso de fibrinogênio do plasma. As propriedades únicas destes anticorpos permitem assim uma grande variedade de

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-5sistemas de diagnóstico e métodos terapêuticos.

Deste modo, uma concretização do presente invento contempla um anticorpo monoclonal que imunorreage com um local de ligação induzido por um receptor expresso por um complexo receptor-ligando. 0 anticorpo monoclonal é seleccionado, de preferência, de entre o grupo consistindo de 2G5, 2F10, 3G11 e 4G10.

D anticorpo monoclonal é produzido por um hibridoma seleç^ cionado de entre o grupo consistindo do hibridoma 2G5, hibridoma 2F10, hibridoma 3G11 e hibridoma 4G10.

Outra concretização deste invento é uma composição de cul tura de células que compreende:

a) um hibridoma que produz um anticorpo que imunorreage com um local de ligação induzido por um receptor expresso por um complexo GP11b/l11a:fibrinogénio, sendo o hibridoma seleccionado do grupo consistindo no hibridoma 2G5, hibridoma 2F10, hibridoma 3G11 e hibridoma 4G10;

b) moléculas de anticorpo segregadas pelo hibridoma; e

c) um meio de cultura para o hibridoma.

Contempla-se ainda um método para detecção da presença de um complexo receptor-ligando em que o sistema compreende um anticorpo monoclonal que imunorreage com um local de ligação induzido por um receptor, expresso por um complexo receptor-ligando, mas que não é expresso pelo receptor não-ligado ou pelo ligando não ligado. Preferencialmente o complexo receptor é GP 11 b/l 11 a: f ibri. nogénio. Prefere-se também o método no qual o anticorpo monoclonal está ligado a um meio de detecção in vivo.

Num seu outro aspecto, o presente invento refere-se a um sistema de diagnóstico, na forma de um conjunto de diagnóstico, para a análise de uma amostra de fluido vascular, no que diz respeito à presença do complexo GPIIb/l11 a:fibrinogénio, sistema este, que compreende um anticorpo monoclonal que imunorreage com um RIBS expresso por esse complexo.

Outra concretização deste invento consiste no método de

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-6dispersar um trombo, in vivo, num mamífero que compreende:

a) a administração intravenosa ao referido mamífero de uma quantidade eficaz de um conjugado de enzima activadora de plasminogénio-anticorpo monoclonal em que o anticorpo monoclonal do conjugado imunorreage com um local de ligação induzido por receptor expresso por um complexo GPIIb/lI Ia:fibrinogénio.

De preferência, a enzima activadora de plasminogénio é activadora do plasminogénio de tecido e o anticorpo monoclonal é seleccionado de entre o grupo consistindo de 2G5, 2F10, 3G11 e 4G10.

Outra utilização das capacidades de diagnóstico e terapêuticas in vivo dos anticorpos do presente invento consiste no método de detecção e localização de um trombo num mamífero que compreende os passos de:

a) administração intravenosa a um mamífero, de uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal que imunorreage com um local de ligação induzido por receptor expresso por um complexo GPIIb/lIIa;

b) manutenção da administração ao mamífero por um perlo do de tempo predeterminado, suficiente para que, o anticorpo imjj norreaja com o complexo e forme um produto da imunorreacção; e

c) determinação da presença de qualquer produto de imunorreacção formado no passo b e, deste modo, a presença de um trombo.

De preferência, o anticorpo está ligado a um meio de detecção in vivo.

Descrição detalhada do invento

A. Definições

Receptor: receptor e proteína receptora são termos aqui utilizados para indicar uma molécula proteica biologicamente acti va que se liga especificamente a (ou com) outras moléculas, designa das por ligandos para formar um complexo proteico receptor-ligando.

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-7Liqando ou ligando cognato: ligando rsfere-se a uma moljê cuia que contém uma porção estrutural que se liga por interacção especifica a uma proteína receptora particular.

Local de ligação induzido por receptor (RIBS): um RIBS é um determinante neo-antigénico que é expresso pelo ligando de um complexo receptor-1igando mas que não é expresso nem pelo ligando não ligado nem pelo receptor não ocupado. Um RIBS pode ser quer conformacional quer sequencial. Um RIBS é o resultado de alteraçães específicas do ligando induzidas pela ligação ao receptor isto é, um determinante antigênico críptico.

Determinante antigênico críptico: refere-se a um determ_i nante neo-antigénico formado por modificaçães na conformação de um ligando proteico durante a ligação ao seu cognato (específico) receptor. Como tal um ligando aqui descrito não exprime um deter, minante antigênico críptico a menos que o ligando se tenha espec_i ficamente ligado a um receptor.

Dose unitária tal como aqui se refere em relação ao inó culo do presente invento designa unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para animais, contendo cada un_i dade uma quantidade predeterminada de material activo, calculada para produzir o efeito imunogénico desejado, em associação com o diluente requerido, isto é, transportador, ou veículo. As especi ficaçães para a nova dose unitária, do presente invento, são determinadas por, e são directamente dependentes (a) das caracterís. ticas particulares do material activo e do efeito imunológica pa.r ticular a atingir, e (b) das limitaçães inerentes à técnica de composição de tal material activo para utilização imunológica em animais, como aqui se descreve em pormenor, sendo estes, aspectos do presente invento.

As formas de dosagem unitárias são preparadas tipicamente a partir de anticorpos congelados ou secos por dispersão num diluente ou veículo fisiologicamente tolerável (aceitável) tal como água, solução salina ou solução salina tamponizada com fosfato de modo a formar uma composição aquosa. Tais diluentes são conheci70 039

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.£

-8dos na arte e são discutidos, por exemplo, em Reminqton's Pharmaceutical Sciences, 16§. Cd., Marck Publishing Company, Easton, PA (1980) nas págs. 1465-1467.

As formas de dosagem podem também incluir um adjuvante co mo parte do diluente. Adjuvantes como o adjuvante de Freund completo (CFA), adjuvante de Freund incompleto (IFA) e sulfato de alumínio, são materiais bem conhecidos na arte e são adquiríveis comercialmente de várias fontes.

Determinante antiqénico ou Antiqénio: um determinante ari tigénico ou antigénio refere-se à parte estrutural do antigénio que está realmente, imunologicamente ligada a um local de combinação do anticorpo. Estes termos são também usados intermutavelmente com o termo epítopo.

Neo-antiqénio: um neo-antigénio, tal como é aqui definido, é um novo determinante antigénico que não foi expresso par um ligando antes da ligação ao receptor mas que é expresso no comple^ xo ligando-receptor.

Anticorpo: o termo anticorpo nas suas variadas formas gramaticais é aqui utilizado para designar moléculas de imunoglobulina e partes imunologicamente activas de moléculas de imunoglo bulina, isto é, moléculas que contêm um local de combinação de a_n ticorpo ou paratopo. São exemplos de moléculas de anticorpos as moléculas de imunoglobulina intactas, moléculas de imunoglobulina substancialmente intactas e partes de moléculas de imunoglobulina, incluindo as partes conhecidas na arte como Fab, Fab’, FÍab’^ e F(v).

Local de combinação de anticorpo; um local de combinação de anticorpo é a parte estrutural de uma molécula de anticorpo compreendendo regiães, variáveis hipervariáueis, de cadeia longa e curta, que se liga especificamente (imunorreagem com) um antiqé nio. 0 termo imunorreagem nas suas várias formas significa ligação específica entre uma molécula contendo um determinante antiqé nico e uma molécula contendo um local de combinação de anticorpo tal como uma molécula de anticorpo inteira ou uma parte dela.

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Anticorpo monoclonal: a designação anticorpo monoclonal, nas suas várias formas gramaticais, refere-se a uma população de moléculas de anticorpo que contém apenas um tipo de local de combinação de anticorpo capaz dB imunorreagir com um antigénio parti cular. Um anticorpo monoclonal, exibe assim, tipicamente, uma af_i nidade de ligação única por qualquer antigénio com o qual imunorreage. Um anticorpo monoclonal pode pois conter uma molécula de anticorpo que possua uma pluralidade de locais de combinação do anticorpo, cada um imuno-especifico para um antigénio diferente, isto é, um anticorpo monoclonal bi-especifico.

Um anticorpo monoclonal é tipicamente composto por molécLj las de anticorpo produzidas por clones de uma célula única tal como um hibridoma que segrega (produz) um só tipo de molécula de anticorpo. A célula de hibridoma é formada por fusão de uma céljj la produtora de um anticorpo com um mieloma ou com outra linhagem de células auto-prepetuantes. Estes anticorpos foram pela primei^ ra vez descritos por Kohler e Milstein, Nature 256:495-497 (1975), descrição esta que se incorpora aqui para referência.

B. Interacções liqando-receptor

Como se referiu anteriormente, a formação do complexo ligando-receptor é o cerne de muitos processos biológicos. Para lá do facto da existência de tais interacções, elas conduzem a acontecimentos subsequentes que se manifestam nos processos biológicos dos quais a formação do complexo é o passo inicial.

Verificou-se agora, que conjuntamente com a função biológica que acompanha a formação de ligando-receptor, ocorrem outras mudanças mais subtis. Essa mudança reside na conformação da mol.é cuia de ligando que resulta da interacção de ligação com o receptor e da formação do complexo. Essa mudança na conformação do ligando resulta na formação de um neo-antigénio que é expresso substajn cialmente apenas após a formação do complexo, tal como anteriormente se referiu; esse neo-antigénio é designado como local de ligação induzido por um receptor ou RIBS.

RIBS expresso pelo complexo formado pela ligação do fi70 039

SCR 0252-SCRF 163.1 •x” .»·

-10brinogênio, como ligando, a GPIIb/lIIa, como receptor é usado aqui ilustrativamente como exemplificativo do fenómeno de formação do RI0S. Os anticorpos monoclonais que imunorreagem com o compl_e xo fibrinogénio-GPIIb/l11 a mas que não reagem substancialmente nem com o ligando nem com o receptor, quando não estão presentes no complexo, são também utilizados aqui como exemplificativos de anticorpos monoclonais anti-RIBS (ou mais simplesmente, RIBS).

Adicionalmente aos exemplos RIBS e anticorpos monoclonais RIBS aqui especificamente discutidos, são encontrados na literatu ra vários outros complexos receptor-ligando. Esses complexos tam bém formam RIBS e podem desenvolver-se anticorpos monoclonais em relação a esses RIBS, usando técnicas aqui descritas. Esses ant_i corpos monoclonais imunorreagem apenas com a parte ligando do com plexo receptor ligado a ligando e não com o ligando ou receptor livres. Usando estes RIBS monoclonais, pode-se agora determinar a presença e a quantidade de um complexo 1igando-receptor; isto é, um receptor ocupado ou ligando ocupado, na presença do ligando l_i vre e do receptor livre ou de ambos.

Exemplificativamente, na Tabela 1 que se segue, enumeram-se pares de ligandos e receptores formadores de RIBS. Estes pares são também supostos ser ilustrativos e não limitativos dos RIBS que se podem formar.

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-11- Tabela 1 PARES LIGAN00 RECEPTOR
Ligando	Recep tor	Citação N9.
Factor Von Wildebrand	GPIIb/lIIa	1
Vitronectina	GPIIb/lIIa	1
F ibronectina	Receptor de fibro. nectina	1
ICAM-1	LFA-1	1
Laminina	CSAT	2
Colagénio	VLA-2	3
C3bi	Receptor de compl.e mento CR3	4
C3d	Receptor de campl_e mento CR2	5
HIV-gpl40	Receptor de Célul_a las T CD4	6
Proteína libertadora	Receptor FRP	7
de Apo B-100	Receptor de apolipo-	8
	proteína
IL-2	Receptor de interleci cina	9
Imunoglobulinas	Receptor FC	10
Gonadotrofina coriónica	Receptor de somatos- tatina	11
PDGF	Receptor PDGF	12
T rans ferrina	Receptor de transfer rina	13
1 Ruoslahti et al., Science	, 238:491-497 (1987).
2 Horwitz et al., 0. Cell.	Biol., 101:2134-2144	(1985).
3 Nieuuienhuis et al., Nature, 310:470-472 (1985)	•
4 Wriqht et al., Proc. Natl	. Acad. Sei. USA, 84:	1965-1968 (1987)
5 Nemerotu et al. , J. Virol.	, 55:347-351 (1985).

Guyader et al., Nature, 320:662-669 (1987).

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-127 Yu et al., Natu re, 330:765-67 (1987).

Yamada et al., 0. Clin. Invest., 80:507 (1987).

Douier et al., Immunol. Today, 8:46 (1987).

Anderson et al., 0. Immunol, 138:2254 (1987).

Kim et al., 0. Biol. Chem., 262:470 (1987).

Keating et al., 0. Biol. Chem, 252:7932 (1987).

Kohgo et al., Blood, 70:1955 (1987).

C. Anticorpos monoclonais

Um anticorpo monoclonal (MAb) do presente invento é caracterizado por compreender moléculas de anticorpo que imunorreagem com o local de ligação do ligando induzido pelo receptor.

local de ligação induzido pelo receptor (RI8S) é um determinante neo-antigénico que é expresso por um ligando quando o ligando se liga a um receptor, mas que não é expresso pelo ligando livre (não ligado). Isto é o complexo receptor-ligando exprime o RIBS, mas o receptor não ocupado e o ligando não ligado, não. Um MAb do presente invento imunorreage com um RIBS, mas não imuno_r reage substancialmente, com o ligando ou receptor não ligado (livre), isto é, quando o ligando ou receptor estão livres em solução e pode como tal distinguir entre as Formas de um ligando liga, das e não ligadas ao receptor porque imunorreage com o ligando l_i gado ao receptor, mas não com o ligando livre. A frase não imunorreage substancialmente com o ligando ou receptor não ligado (livre) ... é aqui utilizada para significar que a imunorreacção anticorpo monoclonal-(ligando-receptor) é inibida em não mais que 15 por cento e de preferência menos, através de ligação campetiti va com os ligandos ou receptores livres.

Numa concretização preferida, um MAb compreende moléculas de anticorpo que imunorreagem com um RIBS expresso por um complexo citoadesina-ligando. Citoadesina é um nome dado a uma super família de moléculas receptoras que se ligam todas a um ligando que contém a sequência de resíduos de aminoácidos arginina-glicina-ácido aspártico ou RGD. PIouj et al., Proc. Natl. Acad. Sei.

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-13U5A, 83:6002 (1986). Esta super família também tem o nome de I ntegrin. Rouslahti et al., Science, 238:491-497 (1987). A citoadesina particular de interesse no presente invento é a GPIIb/ /illa, também conhecida por receptor de plaquetas.

Um anticorpo monoclonal preferido deste invento é segrega do (produzido) por cada um dos seguintes hibridomas: hibridoma 2G5 com a designação ATCC HB9847, o hibridoma 2F10 com a designação ATCC HB9844, hibridoma 3G11 com a designação ATCC HB9845 e hi bridoma 4G10 com a designação ATCC HB9846. Os hibridomas acima foram depositados na American Type Culture Collection, 12301 ( Parklauin Drive, Rockville, MD, 20852 , E.U.A. em 29 de Setembro de

1988, conforme o tratado de Budapeste.

D. Processo de preparação de composições de anticorpos monoclonais presente invento contempla um processo de preparação de um anticorpo monoclonal que imunorreage com um local de ligação induzido por um receptor. 0 método compreende os seguintes passos:

(a) Imunização de um animal com um complexo receptor-ligando. Isto é tipicamente realizado por administração de uma ( quantidade imunologicamente eficaz, isto é, uma quantidade sufici.

ente para produzir uma resposta imunológica, de imunogénio a um mamífero imunologicamente competente. De preferência, o mamífero é um roedor, tal como um coelho, ratazana ou ratinho, embora outros mamíferos como cabras, cavalos e símios possam ser usados. 0 mamífero é então mantido durante um período de tempo suficiente para que o mamífero produza células que segregam moléculas de anticorpo que imunorreajam com o complexo receptor-1igando.

(b) Prepara-se então uma suspensão de células segregado, ras de anticorpos removidas do mamífero imunizado. Isto é tipica^ mente realizado por remoção do baço do mamífero e por separação me cênica das células de baço individuais num meio fisiologicamente tolerável usando métodos bem conhecidos na arte.

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-14(c) As células produtoras de anticorpos em suspensão são tratadas com um agente de transformação capaz de produzir uma linhagem de células transformadas (mortalizadas). Os agentes de transformação e a sua utilização para produzir linhagens de células imortalizadas, são bem conhecidos na arte, e incluem virus de ADN tais como o vírus de Epstein Bar (EBV), Virus Simian 40 (SV40), Virus do Polioma e similares, virus de ARN tais como o Virus da Leucemia de ratinho Moloney (Mo-MuLV), Virus Sarcoma Rous e similares, células de mieloma tais como P3X63-Ag8.653, Sp2/0-Agl4 e similares.

Em concretizaçães preferidas, o tratamento com o agente transformante resulta na produção de um hibridoma por fusão das células de baço em suspensão com células de mieloma de ratinho de uma linhagem de células adequada através da utilização de um promotor de fusão, adequado. A proporção preferida é de cerca de 5 células de baço por célula de mieloma. 0 volume total é de cerca g

de 10 esplenócitos.

A linhagem de células utilizada deverá ser pref erencialmeri te do tipo resistente a drogas, de modo a que o mieloma não furi didos não sobrevivam num meio selectivo, enquanto os híbridos sobreviverão. A classe mais comum são as linhagens de células resistentes à 8-azaguanina que não possuem a enzima hipoxantina gua nina fosforibosil transferase e como tal não são suportadas por meio HAT (hipoxantina, aminopterina e timidina). E também geralmente preferido que a linhagem de células de mieloma utilizada se ja do tipo não-segregante, no aspecto de que não produza ela própria qualquer anticorpo, embora se possam usar tipos segregantes. Em certos casos, contudo, as linhagens de mieloma segregantes podem ser preferidas. Embora o promotor de fusão preferido seja polietilenoglicol com um peso molecular médio de cerca de 1000 a cerca de 4000 (comercialmente disponível tal como o PEG 1000, por exemplo), podem empregar-se outros promotores de fusão conhecidos na arte.

(d) As células transformadas são então clonadas, preferencialmente, monoclonamente . A clonação realiza-se preferível.

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-15mente num meio de cultura de tecidos que não suportará as células não-transformadas. Quando as células transformadas são hibri domas, esta operação é tipicamente realizada por diluição e cultij ra em recipientes separados, a mistura de células de baço não fundidas, as células de mieloma não-fundidas e as células fundidas (hibridomas) num meio selectivo que não suporte as células de mieloma não fundidas durante um tempo suficiente para permitir a morte das células não fundidas (cerca de uma semana). A diluição e cultura realiza-se em recipientes separados, e a diluição pode ser uma diluição limitante em que o volume de diluente é estatisticamente calculado de forma a isolar um certo número de células (por ex., 1-4) em cada recipiente separado (por ex., cada cavidade de uma placa de microtitulação). 0 meio ê tal (por ex. meio HAT), que não suporte a linhagem de células de mieloma não fundida resistente a drogas (por ex., resistente à 8-azaguanina).

(e) 0 meio de cultura de tecidos dos clones transformados ê testado quanto à presença de moléculas de anticorpos segregados por moléculas que não imunorreajam com um ligando livre mas que imunorreajam com o ligando quando ele estiver presente como parte do complexo receptor-ligando. A avaliação realiza-se util_i zando técnicas imunológicas bem conhecidas como se descreve a seguir.

(f) Assim que um transformante desejado é identificado no passo (e), é seleccionado e cultivado num meio de cultura de tecidos adequado durante um período de tempo adequado, seguindo-se a recuperação do anticorpo desejado a partir do subrenadante da cultura. 0 meio de cultura adequado e o tempo de incubação adequado são bem conhecidos na arte e são facilmente determinados .

Para produzir uma concentração muito maior de um anticorpo monoclonal um pouco menos puro, o hibridoma desejado pode ser injectado em ratinhos ou outros mamíferos em que o hibridoma possa crescer, de preferência ratinhos consanguíneos ou em semi-consanguíneos. 0 hibridoma causa a formação de tumores produtores de anticorpos após um tempo de incubação adequado, o que resulta

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-16numa concentração alta do anticorpo desejado (cerca de 5-20 mg/ml) na corrente sanguínea e exudato peritoneal (ascite) do ratinho hospedeiro.

Os meios úteis para a preparação destas composições são bem conhecidos na arte e estão comercial mente disponíveis e incluem meios de cultura sintéticas, ratinhos da mesma ninhada e similares. Um meio sintético que pode servir de exemplo é o meio essencial mínimo de Dulbecco /ÕMEM; Dulbecco et al., Virol. 0:396 (1959)_7 suplementado com 4,5 g/l de glucose, 20 g de glutamina e 20% de soro de vitelo fetal. Uma estirpe,exemplificativa, de ratinhos consanguíneos é a estirpe Balb/c.

Pode usar-se um anticorpo monoclonal produzido pelo método anterior, por exemplo, nas modalidades de diagnóstico e terapia que se discutem com maior detalhe a seguir, onde se pretende a formação de um produto de imunorreacção contendo RIBS. Estas utilizações incluem, por exemplo, os métodos e sistemas de diagnójs tico do presente invento para detectar plaquetas ligadas ao fibri nogênio numa amostra corporal, para detecção in vivo, de um trombo, para a dispersão de um trombo ou para visualização de um trombo.

Um anticorpo monoclonal RIBS é tipicamente utilizado numa composição aquosa. Essa composição pode ser o meio de cultura de tecidos ou fluido ascítico tal como é obtido ou numa forma diluída. Estas composições são tipicamente utilizadas in vitro.

Para utilizações in vivo, o anticorpo monoclonal RIBS é tipicamente purificado por precipitação em sulfato de amónio, por procedimentos de purificação por afinidade e por técnicas similares e depois é utilizado numa composição aquosa com um diluente farmacêutico aceitável. A concentração de anticorpos monoclonais RIBS nessa composição aquosa é ajustada por forma a adequar-se ao uso desejado.

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-17E. Métodos e composições terapêuticas

Os anticorpos monoclonais segregados por qualquer dos hibridomas depositados antes referidos são particularmente úteis em áreas relacionadas com coágulos sanguíneos ou trombos. Isto porque estes quatro anticorpos monoclonais anti-RIBS imunorreagem com o complexo fibrinogénio-receptor GPIIb/lIIa que está presente em plaquetas activadas contendo fibrinogénio ligado, e o fibrinogénio ligado às plaquetas está envolvido na formação de trombos.

Mais ainda, uma vez que, por definição, estes quatro anticorpos monoclonais RIBS não imunorreagem com o fibrinogénio solúvel, tal como está presente in vivo no sangue em circulação, pode obter-se uma especificidade extrema da imunorreacção através do uso de um ou mais destes anticorpos monoclonais.

1. Dispersão de trombos

Como tal, um aspecto deste invento contempla um método p_a ra a dispersão de um trombo. Aqui, as moléculas de anticorpo de um anticorpo monoclonal produzidas por pelo menos um dos hibridoma s depositados na ATCC está quimicamente ligado a uma enzima activadora do plasminogénio de modo a formar um conjugado no qual a ligação da porção anticorpo do conjugado ao seu RIBS nãõ é subs. tancialmente prejudicada e a actividade activadora de plasminogénio da enzima não é substancial mente prejudicada. Os processos de preparação dos conjugados anticorpo-proteína em que as actividades de ambas as porções do conjugado não são substancialmente não pre judicadas são bem conhecidas dos peritos na arte.

Uma enzima activadora do plasminogénio refere-se ao grupo de drogas, fibrinolíticas na classe da protrombolise, tal como os activadores do plasminogénio dos tecidos que induzem a trombolise sem a fibrinólise sistémica ou sem a desagregação do fibrinogénio. Outras drogas fibrinolíticas contempladas são aquelas que interactuam com o p ro-activador do plasminogénio e incluem, mas não es. tão limitadas a, a estreptoquinase, a uroquinase Çtt-PA) e o activador de plasminogénio de tecido (t-PA).

De acordo com este método, administra-se uma composição

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-18aquosa farmaceuticamente aceitável contendo uma quantidade dispe_r sante do trombo de um conjugado anteriormente descrito, tal como por injecção intravenosa ou infusão, a um mamífero, tal como o ho mem, que possua um trombo a dispersar. 0 mamífero assim tratado (mamífero administrado) é mantido durante um periodo de tempo suficiente para a porção anticorpo do conjugado imunorreagir com o complexo de fibrinogénio ligado às plaquetas presente no trombo e para que a porção enzimática activadora de plasminogénio do conjjj gado active o plasminogénio. Uma vez que a remoção do conjugado seria uma tarefa difícil e morosa, o mamífero é mantido durante um período de tempo suficiente para que o seu corpo elimine o conjugado pelos meios habituais.

2. Inibição da formação de trombos

No presente invento é contemplado outro método de tratamento útil para indivíduos animais que estão em risco de formação de um trombo, por exemplo indivíduos nos primeiros dias após uma operação de vulto, tal como uma operação de by-pass às coronárias .

Aqui, uma quantidade inibidora de um trombo de um antico_r po monoclonal, contendo moléculas de anticorpo produzidas'por pelo menos um dos hibridomas depositados na ATCC, 2G5, 2F10, 3G11 ou 4C10, presentes numa composição farmacêutica aquosa aceitável, é administrada a um mamífero, tal como o homem, a quem se pretende inibir a formação do trombo. 0 mamífero tratado (mamífero admJL nistrado) é mantido durante um período de tempo suficiente para que os anticorpos monoclonais RIBS administrados sejam eliminados do seu corpo pelos meios usuais.

Neste método, a imunorreacção dos anticorpos monoclonais RIBS com as plaquetas activadas contendo fibrinogénio ligado, in_i be a formação do trombo. Claro que, uma vez que o anticorpo mono clonal RIBS imunorreage com o complexo fibrinogénio-GPIIb/lI Ia na plaqueta e não com o fibrinogénio no sangue, as funçães normais do animal tratado não são prejudicadas.

Numa concretização relacionada contempla-se um método de

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ZÁ-19inibição da agregação de plaquetas que compreende a administração, a uma solução contendo plaquetas, de uma composição aquosa farmaceuticamente aceitável contendo moléculas de anticorpo monoclonal produzidas por pelo menos um dos hibridomas depositados na ATCC 2G5, 2F10, 3G11 ou 4C1Q. Administra-se uma quantidade de anticojç po inibidora da agregação de plaquetas, in vivo a um sujeito animal no qual se deseja inibir a agregação de plaquetas ou mistura-se in vitro com uma solução contendo plaquetas tal como plasma ou sangue. A imunorreacção dos anticorpos monoclonais RIBS com complexo fibrinogénio-GPIIb/lI Ia nas plaquetas forma um produto de imunorreacção que inibe a agregação de plaquetas.

Pode usar-se um único anticorpo monoclonal RIBS, como se descreveu anteriormente em cada um dos métodos anteriores, ou uma mistura contendo mais do que um. Assim, embora cada um dos anticorpos monoclonais produzidos pelos quatro hibridomas depositados na ATCC tenham a propriedade de ser anticorpos monoclonais RIBS, cada local de combinação do anticorpo não imunorreage com o mesmo epitopo. Assim, pode ser vantajoso o uso de misturas de anticorpos monoclonais (isolados ou no conjugado) de modo a que se possa obter a ligação múltipla dos locais de combinação a uma molécula de fibrinogénio com uma só ligação.

Deve entender-se que, embora os dois métodos acima refer_i dos tenham sido descritos em termos de anticorpos monoclonais RIBS que imunorreagem especificamente com o complexo fibrinogénio-GPIIb/lIIa, métodos semelhantes podem ser aplicados para outros complexos ligando-receptor que contenham RIBS.

A preparação de uma composição aquosa farmaceuticamente aceitável que contenha moléculas de anticorpos como ingredientes activos é bem conhecida na arte. Tipicamente, estas composições são preparadas como injectáveis, como soluções liquidas ou susperi sões, mas, contudo, podem também preparar-se formas sólidas adequa^ das para solução ou suspensão num líquido aquosa antes de serem injectadas. A preparação pode também estar na forma de uma emulsão .

conjugado ou o anticorpo monoclonal isolado é muitas ví3

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-20zes misturado com excipientes que são farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o conjugado ou anticorpo monoclonal, como é bem conhecido. Excipientes adequados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol ou similares, e suas comb_i nações. Adicionalmente, se desejado, a composição pode conter quantidades pequenas de substâncias auxiliares tais como agentes molhantes ou emulsionantes, agentes de tamponização do pH, que aumentem a eficácia do ingrediente activo.

Um anticorpo monoclonal ou conjugado pode ser formulado na composição aquosa acima referida na forma de sais neutralizados farmaceuticamente aceitáveis. Os sais farmaceuticamente ace_i táveis incluem os sais de adição de ácido (formados com os grupos amino livres da enzima ou da molécula de anticorpo) que são forma dos com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico ou com ácidos orgânicos como o ácido acético, tartárico, mandélico e similares. Os sais formados com os grupos carboxilo livres podem também ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amónio, cál. cio ou hidróxidos férricos e de bases orgânicas tais como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína e similares.

As composições terapêuticas contendo moléculas de antico_r po são convenci o nal mente administradas intravenosamente por i n j ec ção de uma dose unitária, por exemplo. Uma composição é administrada de forma compatível com a formulação de dosagem e numa qua_n tidade terapeuticamente eficaz, isto é, dispersora ou inibidora do trombo.

A quantidade a administrar depende, entre outros factores, de espécie animal a tratar, do tamanho do animal, do tamanho do trombo (se conhecido), da quantidade de plaquetas ligadas ao fibrinogénio presente, e da capacidade do sujeito utilizar o conjugado ou o anticorpo monoclonal. As quantidade precisas de conjugado ou de anticorpo monoclonal necessárias para administração d_e pendem do julgamento do especialista e são caracteristicas de cada indivíduo, particularmente quando são humanos os animais a tratar. As gamas de dosagem, contudo, podem ser caracterizadas por

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-21uma concentração sanguínea terapeuticamente eficaz e podem variar para a concentração do conjugado contendo o anticorpo ou anticorpo deste invento isolado, desde cerca de 0,01 a cerca de 100 yxK, preferivelmente de cerca de 0,1 a 10

0s regimes adequados para administração inicial e as injecções de reforço são também variáveis, mas são tipificados por uma administração inicial seguida de doses repetidas, em um ou mais intervalos de uma hora, por uma injecção subsequente ou por outra forma de administração. Alternativamente, contempla-se uma infusão intravenosa continua suficiente para manter concentrações terapeuticamente eficazes no sangue.

F. Sistemas de diagnóstico

Um sistema de diagnóstico em forma de conjunto de diagnós_ tico do presente invento inclui numa quantidade suficiente para pelo menos uma determinação, um anticorpo monoclonal RIBS do presente invento, tal como um dos que é produzido por um dos quatro hibridomas depositados na ATCC, na forma de um reagente embalado separadamente. Um marcador para indicar a presença de uma imunorreacção entre o RIBS e o anticorpo monoclonal RIBS é também incluída, de preferência, na mesma, ou em embalagens separadas. Incluem-se também, tipicamente, instruções para o uso do reagente embalado.

As instruções para uso incluem tipicamente uma expressão tangível descrevendo a concentração do reagente ou pelo menos um parâmetro do método de determinação, tal como as quantidades relja tivas de reagente e amostra a ser misturadas, os tempos de conser vação das misturas reagentes/amostra, temperatura, condições tampão e similares.

Uma concretização deste invento é um sistema de diagnóst_i co em forma de conjunto para determinação do fibrinogénio ligado a plaquetas em amostras de fluido vascular contendo plaquetas, tais como sangue ou plasma. D sistema compreende uma embalagem contendo um anticorpo monoclonal que imunorreage com um RIBS expresso pelo complexo receptor ligando. De preferência, as molé70 039

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Fi

A ···-· ·-*·—

-22culas de anticorpos anti-RIBS do anticorpo monoclonal são as que são produzidas por um dos seguintes hibridomas: hibridoma 2G4, hibridoma 2F10, hibridoma 3G11, e hibridoma 4G10. De preferência as moléculas de anticorpo estão presentes como uma composição de anticorpos monoclonais que contém mais do que um anticorpo monoclonal particular. São ainda preferidos os conjuntos de diagnóstico em que as moléculas de anticorpo estão ligadas a um marcador de radionuclido, de preferência moléculas de anticorpos marcadas 125 com I ou outros. Descrevem-se seguidamente marcadores úteis.

Noutra concretização, um sistema de diagnóstico do presen te invento é adequado para determinação da presença de um trombo in vivo. 0 sistema compreende uma embalagem contendo moléculas de anticorpos monoclonais que imunorreagem com um complexo receptojr -ligando expresso por RIBS. De preferência, as moléculas de ant_i corpo presentes são as que são segregadas por um hibridoma seleccionado de entre o grupo consistindo de 2G5, 2F10, 3G11 e 4G10.

As moléculas de anticorpo estão preferencialmente ligadas a um marcador in vivo ou a meios de detecção.

Embora se possa utilizar um conjunto de diagnóstico para visualização in vivo para determinações in vitro, deve entender-se que o inverso não é necessariamente verdade. Por exemplo, os anticorpos monoclonais utilizados para trabalho in vivo, deverão estar isentos de pirogénios bem como o deveriam estar todos os sais de tampão das composições aquosas e reagentes. A ausência de pirogénios não é necessária para as determinações in vitro. Adicionalmente, os meios de detecção úteis para a visualização in vivo são tipicamente diferentes dos utilizados in vitro, como se discute a seguir. Como tal, o sistema de determinação é adequado para a visualização in vivo e os sais de tampão, soluções aquosas e meios de indicação adequados podem ser fornecidos como parte do conjunto de diagnóstico na mesma ou em embalagem separada.

Em concretizações preferidas, um sistema de diagnóstico do presente invento, inclui ainda um marcador ou meios de detecção capazes de sinalizar a formação de um complexo contendo uma molécula de anticorpo do presente invento.

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-23Tal como são aqui utilizados, os termos marcador e meios de detecção nas suas várias formas gramaticais, referem-se a átomos e moléculas isolados que estejam directa ou indirectamente e_n volvidas na produção de um sinal detectável para indicar a presejn ça de um complexo. Os marcadores ou meios de detecção in vivo são os que são úteis no corpo de um sujeito humano e incluem

111_T 99 67 186 132_T 111. _

In, Tc, Ga, Re, I e indium.

Qualquer marcador ou meio de detecção pode ser ligado ou incorporado numa molécula de anticorpo que faça parte de uma composição de conjugado ou de anticorpos monoclonais do presente invento e esses átomos ou moléculas podem ser usados isoladamente ou em conjunção com reagentes adicionais. Esses marcadores são eles próprios bem conhecidos em química de diagnóstico clínico e constituem parte deste invento até ao ponto em que sejam utilizados apenas com outros métodos e/ou sistemas proteicos novos.

A ligação dos marcadores, isto é, marcação, dos anticorpos é bem conhecida na arte. Por exemplo, as moléculas de anticorpo produzidas por um hibridoma podem ser marcadas por incorporação metabólica de aminoácidos contendo os radio-isótopos fornecj^ dos como um componente do meio de cultura. Ver, por exemplo, Gal. fre et al. , Mgth. Enzymol. , 73:3-46 (1981). As técnicas de conjjj gação proteica ou de acoplagem através de grupos funcionais activados são partícularmente aplicáveis. Ver, por exemplo, Aurameas, et al., 5cand. Q. Immunol. , Vol. Θ Suppl. 7:7-23 (1978), Rodurell et al., Biotech. 3:889-894 (1984) e Pat. dos E.U.A. N9.4493 795.

Os sistemas de diagnóstico in vitro podem também incluir, preferencialmente numa embalagem separada, um agente de ligação específico. Um agente de ligação específico é uma entidade mol_e cular capaz de se ligar selectivamente a um anticorpo monoclonal do presente invento, mas que não é ele próprio uma molécula de a_n ticorpo do presente invento. Exemplos de agentes de ligação especifica são outras moléculas de anticorpo, proteínas de complemento ou os seus fragmentos, proteína A do 5. aureus e similares.

agente de ligação específica liga-se à molécula de anticorpo rno noclonal RIBS deste invento, quando esse anticorpo monoclonal está

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-24presente como parte de um imuno-complexo, com o complexo ligando-receptor.

Em concretizações preferidas, o agente de ligação especifico está marcado. Contudo quando o sistema de dignóstico inclui um agente de ligação específico que não está marcado, o agente de ligação específico é tipicamente usado como meio de amplificação ou como reagente e um segundo reagente que está marcado liga-se ao agente de ligação específico (meio de amplificação). Nestas concretizações, o segundo reagente marcado é capaz de se ligar e_s peeificamente ao meio de amplificação quando o meio de amplificação está ligada ao imuno-complexo contendo o anticorpo monoclonal RIBS. Os conjuntos de diagnóstico do presente invento podem ser usados num formato ELISA para detectar a presença ou quantidade de complexo ligando-receptor, tal como o fibrinogénio ligado às plaquetas numa amostra de fluído orgânico tal como soro, plasma ou urina. ELISA refere-se a um ensaio de imuno-sorvente ligado a enzima que utiliza um anticorpo ou antigénio ligado (aqui, o con plexo ligando-receptor contendo RIBS) a um matriz de fase sólida que forma um suporte sólido e um conjugado enzima-antigénio ou eri zima-anticorpo para detectar e quantificar a quantidade de um antigénio ou de um anticorpo presentes numa amostra. A descrição de uma técnica ELISA é encontrada no Capítulo 22 da . edição de Basic and Clinc Immunoloqy por D.P. Sites et al., publicado por Lange Medicai Publications de Los Altos, CA, E.U.A., em 1982 e nas Patentes Americanas NQ. 3 654 090; NQ. 3 850 752, e NQ.

016 043 que são todas incorporadas aqui para referência.

Em concretizações preferidas do conjunto ELISA, as molécij las de anticorpo do presente invento são fixadas a uma matrix sól_i da de modo a formar um suporte sólido que é embalado separadamente no referido sistema de diagnóstico. 0s anticorpos são fixados tipicamente à matriz sólida por adsorção a partir de um meio aquo so embora se possam usar outros modos de fixação, bem conhecidos dos especialistas.

Um agente de ligação específicamente ligado que se liga a um complexo ou aos seus constituintes, ou um agente de ligação ejs

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-25pecífico não marcado juntamente com um segundo reagente que se liga a um agente de ligação especifico estão também incluídos em uma ou duas embalagens separadas, respectivamente, no conjunto. Usando um dos anticorpos monoclonais produzidos por um dos hibridomas depositados na ATCC como exemplificativos do anticorpo liga do à matrix, os anticorpos anti-fibrinogénio marcados, tal como existem comercialmente disponíveis, são exemplificativos do agente de ligação específico.

As matrizes sólidas são bem conhecidas na especialidade. Estes materiais incluem dextrano de ligações cruzadas disponível sob a marca registada de SEPHADEX de Pharmacia Fine Chemicals (Piscataiuay, N.3., E.U.A.); agarose; esferas de poliestireno de cerca de 1 micron a cerca de 5 milímetros de diâmetro disponível a partir de Abbott Laboratories of North Chicago, IL, E.U.A.; cl£ reto de polivinilo, poliestireno, poliacrilamida de ligações cruza das, teias de nitrocelulose ou nilão tais como folhas, tiras ou almofadas; ou tubos, placas ou cavidades de placas de microtitulação tal como as que são feitas de poliestireno ou cloreto de p.o livinilo.

Os anticorpos monoclonais (marcados ou não marcados), agentes de ligação específicos marcados ou reagentes de amplifica^ ção de qualquer sistema de diagnóstico, aqui descrito, podem ser fornecidos em solução, na forma de uma dispersão líquida ou como um pó substancialmente seco, por ex. na forma liofilizada. Quando o meio de detecção é uma enzima, o substrato enzimático pode também ser fornecido numa embalagem separada de um sistema de diagnó^ tico. Uma matriz de suporte sólida tal como a placa de microtitjj lação antes descrita e um ou mais tampões podem também ser inclu_í dos como elementos embalados separadamente neste sistema de dete_r minação para diagnóstico.

As embalagens discutidas aqui relacionadas com os sistemas de diagnóstico são as habitualmente usadas nos sistemas de diagnóstico. Estas embalagens incluem garrafas de vidro e plásti. co (por ex. polietileno, polipropileno e policarbonato), frascos, envelopes de plástico ou de plástico laminado a alumínio e simil_a res.

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-26G. Métodos de determinação presente invento contempla um método para detectar um complexo de receptor-ligando, como, por exemplo, se encontra num trombo ou em plaquetas ligadas a fibrinogénio, preferencialmente, GP11b/l11 a:fibrinogénio. 0 método utiliza a expressão de um local de ligação induzido por um receptor (RIBS) e uma molécula de anticorpo monoclonal que imunorreage com o RIBS na parte ligando do complexo receptor-ligando, mas não reage com um receptor não ligado ou um ligando não ligado. Os especialistas na arte compre enderão que há numerosos procedimentos químicos de diagnóstico clínico bem conhecidos que podem ser utilizados para formar os re feridos imuno-complexos. Assim, embora se descrevam aqui métodos de determinação exemplificativos, não se pretende que o invento seja por eles limitado.

1. Detecção de trombos

Mais especificamente, contempla-se um método para detectar a presença de um trombo num mamífero tal como o homem. Uma composição aquosa contendo uma quantidade eficaz na visualização de um anticorpo monoclonal do presente invento contendo moléculas de anticorpo ligadas a um meio de detecção in vivo é administrada intravenosamente a um mamífero tal como um ser humano em necessidade de tratamento.

mamífero administrado é mantido durante um período de tempo predeterminado suficiente para que a molécula de anticorpo marcada imunorreaja com o complexo de fibrinogénio ligado a plaquetas presente como parte de um trombo. 0 mamífero em causa é então sujeito à determinação da presença e preferencialmente da localização de qualquer imuno-complexo marcado, formado, e deste modo detecta-se o trombo e sua localização. Uma vez que os anticorpos monoclonais RIBS marcados contêm normalmente radionuclidos como marcadores ou como meios de detecção, o ensaio de visualização é realizado por técnicas habituais e bem conhecidas de radio-visualização. Tais técnicas podem distinguir concentraçães rela tivamente altas de marcas radioactivas no trombo das quantidades

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-27- . ‘ sistémias relativamente baixas de marcas radioactivas. Nos casos em que se usam radioisótopos com um tempo de vida relativameri te longo, o mamífero administrado pode ser mantido durante um período de tempo suficiente para que não haja interferências sistémicas no anticorpo monoclonal marcado de modo a se obter uma quari tidade ainda relativamente menor do sinal de fundo da marca radiçg activa.

2. Detecção de plaquetas ligadas a fibrinogénio numa amostra corporal

Vários protocolos de determinação heterogeneos e homogene os podem ser empregues quer competitivos quer não competitivos, para detectar a presença e preferivelmente a quantidade de fibrinogénio ligado a plaquetas numa amostra corporal contendo plaquetas e/ou fibrinogénio livre, de preferência numa amostra de fluido corporal, tal como sangue ou numa porção de sangue contendo plaquetas. Por exemplo, misturam-se uma amostra de sangue preser i 2 5 vado por heparina (não coagulado) e uma forma marcada com ± de uma das moléculas de anticorpos RIBS depositados antes referidas. Utilizam-se obviamente quantidades e concentrações de amostra e de anticorpos monoclonais marcados de modo a obter-se um Fesultado significativo. A mistura de imunoreacção assim formada é mantida sobre condições de determinação biológica durante um período de tempo suficiente para que as plaquetas ligadas ao fibrinogénio presentes na amostra, imunorreajam com os anticorpos marcados e formem um produto de imunorreacção marcado. 0 produto de imunorreacção marcado, quando presente, é então separado de quaisquer anticorpos marcados não reagidos que possam estar presentes. Fm determinações homogéneas, a separação é efectuada tipicamente por centrifugação de modo a sedimentar todas as plaquetas presentes na amostra. Nas determinações heterogeneas tais como no ELISA, o produto da imunorreacção é ligado a um suporte sólido e a separação é tipicamente realizada por um passo de lavagem em que qualquer anticorpo RIBS não ligado é eliminado e o produto sólido de imunorreacção ligado ao suporte é retido.

Deve entender-se que quando se usa um anticorpo monoclo70 039

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-2Θnal RIBS não marcado para imunorreagir com um complexo ligando-receptor contendo RIBS, forma-se uma segunda mistura entre o, anteriormente descrito, imuno-complexo separado e um reagente de ligação marcado ou reagente de ligação não marcado usado como meio de amplificação. Esta mistura reaccional é mantida sobre condições biológicas durante um período de tempo suficiente para que se formem um segundo complexo de ligação entre o primeiro imuno-complexo formado e o reagente de ligação específico. (Quando o reagente específico de ligação compreende moléculas de anticorpo, esse segundo complexo de ligação ê um segundo imuno-complexo. Quando se usa uma proteína A da 5. aureus, por exemplo, o segundo complexo de ligação não usa para ligação o local de ligação do a_n ticorpo, e esse complexo é de forma mais correcta, designado por complexo de ligação. Uma vez que um imuno-complexo é um complexo de ligação especifica, o complexo formado entre o reagente de ligação especifica e o designado por primeiro imuno-complexo é um segundo complexo de ligação). Q segundo complexo de ligação é e_n tão separado de qualquer reagente de ligação específica não reagi do que possa estar presente, por uma técnica anteriormente referi da, e a presença do marcador e como tal do imuno-complexo, é determinada e de preferência quantificada.

Quando o reagente de ligação específico não estiver marcai do e for usado como meio de amplificação, uma terceira mistura é formada a partir do segundo complexo de ligação separado referido acima, quando presente, e de um segundo reagente de ligação contendo o marcador. A presença do marcador no segundo complexo de ligação não é, evidentemente determinada no método acima citado onde não se misturou qualquer reagente marcado. Os passos de manutenção e separação acima descritos são repetidos no que diz res. peito a este aspecto do método com a formação e retenção de um terceiro complexo de ligação contendo um marcador. Determina-se depois a presença e, preferivelmente, a quantidade do marcador.

Como tal, em cada um dos aspectos desta determinação acima descritos, a presença e preferencialmente a quantidade de marcador fornece a base para a determinação da presença e preferencialmente da quantidade de plaquetas ligadas a fibrinógénio.

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-29Note-se que o técnico que realiza a determinação acima descrita, normalmente não saberá se um ou mais imuno-complexos ou complexos de ligação se formaram de facto até que a quantidade de marcador presente seja determinada. Contudo, todos os passos de um dado procedimento de determinação são realizados como se o coni plexo contendo RIBS estivesse de facto presente.

Deve notar-se que devido à especificidade única dos anticorpos monoclonais RIBS, a determinação , acima descrita, das pl_a quetas ligadas a fibrinogénio e o ensaio de visualização de um trombo acima referido podem ser e devem de preferência ser realizados na presença tanto das plaquetas livres e fibrinogénio livre, isto é, plaquetas e fibrinogénio não complexado. Como resultado, os procedimentos de manuseamento especiais tais como os passos de separação e lavagem não necessitam de ser realizados na amostra corporal antes do uso dessa amostra na determinação. Este aspecto é comum a todas as determinações que usam anticorpos monoclonais RIBS.

As condições para determinações biológicas são aquelas em que se mantém a actividade biológica das moléculas de anticorpo deste invento e das plaquetas ligadas ao Fibrinogénio ou a outro complexo contendo RIBS que se pretenda determinar. Estas condições incluem uma gama de temperaturas de cerca de 4 graus C a cer ca de 45 graus C, de preferência 37 graus C, um valor de pH de cerca de 5 a cerca de 9, de preferência cerca de 7 e uma força ió nica que varia desde a da água destilada até a do cloreto de sódio um molar, de preferência a um valor próximo da força iónica do soro fisiológico. Os métodos para optimizar estas condições são bem conhecidos na arte.

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos são supostos ilustrar, embora não 1imitatiuamente, o presente invento.

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-301. Produção de hibridoma e anticorpos monoclonais

Produziram-se anticorpos monoclonais usando a tecnologia dos hibridomas convencional. Brevemente, imunizaram-se ratinhos

Balb/c e subsequentemente administraram-se 3 doses de reforço de cerca 50 microgramas Ç^g) por ratinho de imunogénio de D-dlmero da fibrina preparado substancialmente como se descreveu em Ciernieuski et al., Thromb. Haemostas., 48:33-37 (1982). Subsequeng temente, 1,23 x 10 células de baço de um ratinho imunizado cujos anticorpos imunorreagiram com o imunogénio foram misturados com 7

2,46 x 10 células de mieloma de ratinho P3Ag8653.1 na presença do promotor de fusão celular polietileno glicol 4000. As células produtoras de anticorpos assim transformadas foram transferidas para placas de microtitulação de 96 cavidades com uma densidade 4 de cerca de 3 x 10 células por cavidade e cultivadas.

Os sobrenadantes da cultura de tecidos de 235 cavidades que aparentavam conter hibridomas viáveis após cerca de 14 dias de cultura foram testados por radio-imuno-ensaio para determinar a presença de moléculas de anticorpos anti-RIBS. Brevemente, 100 microlitros Q*1) de soro tamponizado com fosfato (PBS) contendo quer 1 yv».g/ml de fibrinogénio quer lipoproteina de baixa densidade (LDL) (controlo) foram misturados nas cavidades de placas de microtitulação de fundo liso, polivinilo e de 96 cavidades,como matriz de fase sólida. As placas foram então mantidas durante 16-20 horas a 420 de modo a permitir que o fibrinogénio ou o LDL se adsorvessem à superfície das cavidades de modo a formar um suporte sólido. A solução de revestimento foi removida por agitação, os orifícios foram enxaguados e introduziram-se 100 yxl de s_o lução de bloqueio (PBS contendo 5% de soro de cabra normal) em c_a da cavidade para bloquear os locais de ligação de proteína em excesso.

As cavidades foram mantidas durante 30 minutos a 3720 e a solução de bloqueio foi removida. Em cada cavidade foram então introduzidos IOO^aI de (a) sobrenadante de uma cultura de tecidos de hibridomas diluídos 1:10 em PBS ou (b) sobrenadante de hibrid_o ma diluído 1:10 em PBS contendo 100 ^g/ml de fibrinogénio como

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-31inibidor competitivo. As misturas de imunoreacção assim formadas foram mantidas à temperatura ambiente durante cerca de 16-20 horas a 490 de modo a permitir a formação de um produto de imunorreacção ligado a fase sólida e uma fase líquida, incluindo quaisquer moléculas de anticorpos monoclonais não ligadas.

A cada cavidade foram então adicionados 100 r*l de IgG an125 ' ti-ratinho de cabra marcado com I. A mistura imunorreacção marcada assim formada foi mantida cerca de 6-20 horas a 490 para permitir a formação de um segundo produto de imunorreacção em fa125 se sólida marcado com I. As fases sólida e líquida foram sepa radas para remover qualquer IgG anti-ratinho de cabra marcado com

2.2 3 12 5

I não ligado. A quantidade de I ligado a cada cavidade foi determinada por cintilação gama.

A presença de pelo menos cerca de 3 vezes a quantidade 125 não especificamente ligada de I, como foi determinada a partir oe cavidades revestidas por LDL, numa cavidade revestida por fibrinogénio indicou a presença de anticorpos anti-fibrinogénio num

125 sobrenadante de uma cultura de tecido. Uma redução do I ligado à fase sólida em não mais do que cerca de 15/° pela presença de um competidor do fibrinogénio em fase líquida na mistura imunorreaccional /parte (b) anterior_/ indicou a presença de anticorpos anti-RIBS no sobrenadante da cultura de tecido.

G procedimento de análise anterior resultou na identifica^ ção de 4 hibridomas, designados por 2G5, 2F10, 3G11 e 4G10, que produzem anticorpos RIBS que ligam um complexo fibrinogénio:GPIIb/ /Illa.

Cada um dos quatro hibridomas acima descritos foi cionado duas vezes limitando a diluição e subsequentemente usado para pro duzir o fluido ascítico. 0s anticorpos foram então isolados a par tir dos fluidos ascíticos usando a proteína A Sepharose.

As composições contendo fragmentos Fab do anticorpo monoclo. nal (Mab) 2F1O foram preparadas por digestão de Mab 2F1O isolado em proteína A Sepharose com papaína (200:1, peso/peso de Mab para papai na), durante 6 horas a 37°C seguindo os métodos de Mage et al., Mehods in Fnzymolog.y, 70:142-50 (1980) . 0 anticorpo nâo digerido e os

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-32fragmentos Fc foram removidos dos fragmentos Fab por cromatografia em proteína A Sepharose. Os fragmentos Fab resultantes foram recolhidos da Sepharose obtendo-se uma preparaçao de 2F1O Fab.

2. Detecção de um RIBS fibrinoqénio-GPIIb/lI Ia em plaquetas activadas □s anticorpos monoclonais produzidos pelos hibridomas 2G5, 2F10 e 3G11, isto é, Mab 2G5, Mab 2F10 e Mab 3G11, respectivamente, foram examinados quanto à sua capacidade de imunorreaqir com o RIBS liqado à superfície celular. Cada um dos quatro anti125

-corpos monoclonais foi marcado com I usando a metodologia cori vencional de Cloramina-T. Greenuiood, et al., Bio, Chem. 0. , B9: :114-123 (1963).

Recolheram-se sessenta mililitros (ml) de sangue humano i_n teiro em 5 ml de ACD (ácido cítrico 0,065 M, citrato de sódio 0,005 M, dextrose 2%) contendo hirudina (Sigma Chemical Co., St. Louis, M0, E.U.A.) numa concentração de fórmula de 0,06 unidades por ml (U/ml) e centrifugou-se durante 15 minutos a 120 x g. 0 sobrenadante resultante, designado por plasma rico em plaquetas, foi recolhido, isolado e centrifugado adicionalmente durante 15 minutos a 1200 x g de modo a formar sedimento de plaquetas isoladas .

As plaquetas isoladas foram ressuspensas em 2 ml de tampão de Tyrodes isento de cálcio (NaCl 0,13 M, KCI 0,0026 M, MgCl^-óH^O 0,02 Μ, Hepes 5 mM, NaHCO^ 0,012 M, pH 7,2) contendo 1 mg/ml de albumina de soro de bovino (BSA) e 1 mg/ml de dextrose.

A suspensão de plaquetas foi então aplicada a uma coluna Sepharose CL2B (14 ml de volume total de leito; Pharmacia Inc., Piscataujay, N0, E.U.A.) equilibrada com o mesmo tampão Tyrodes. As plaquetas lavadas foram recolhidas do volume vazio da coluna CL2B num volume final de cerca de 4 a 5 ml.

Amostras de plaquetas lavadas foram então estimuladas

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-33(actiuadas) por mistura quer com difosfato de adenosina (ADP) a uma concentração de 10 micromolar ÇwM), quer com trombina a uma concentração de 0,1 unidades/ml. Algumas amostras de plaquetas estimuladas por ADP foram também misturadas com fibrinogénio a uma concentração de fibrinogénio de 1 mM.

A cada amostra de plaquetas, incluindo algumas amostras 12 5 de controlo não estimuladas, adicionou-se um Mab marcado com I numa concentração de 10 nanomolar (nM). A mistura imunorreàccional assim formada foi mantida durante 30 minutos a 229C de modo a permitir a formação do produto da imunorreacção. 0s produtos 125 de imunorreacção foram separados do Ι-Mab não é ligado por ceri trifugação através de 0,3 ml de sucrose 20%. A quantidade de 125

Ι-Mab associado com o sedimento de plaquetas foi determinada por espectrometria de cintilação.

0s resultados deste estudo, mostrados na Tabela 2, indicam que os anticorpos monoclonais anti-RIBS não imunorreagem subs. tancialmente com plaquetas não estimuladas. Contudo, quando as plaquetas são estimuladas com um agonista tal como ADP ou trombina, obtém-se uma imunorreacção significativa dos Mabs com c complexo fibrinogénio:GPIIb/l11 a nas células. A estimulação _das pia. quetas com ADP ou trombina resulta na secreção e ligação superficial pele GPIIb/lIIa do fibrinogénio endogénio das plaquetas. A adição de fibrinogénio exogeno não neutralizou (inibiu) a ligação 125 de Ι-Mab às plaquetas estimuladas, indicando assim que os Mabs são específicos dos RIBS, isto é, não imunorreagem com o fibrinogénio livre em solução. Resultados idênticos foram obtidos com o MAb 4G10.

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-34TABELA 2

Plaquetas

2G5

5

Ι-MAb ligado (cpm/plaqueta) 2F10 3G11

Não estimulado

Estimulado com A DP

Estimulado com ADP + fibrino gênio

Estimulado com trombina

200

750

600

2Θ 620

800

600

300

000

300

550

150

400

Para realçar o facto de que o fibrinogénio adicionado exo genamente não está associado às células (isto é, não faz parte do complexo celular receptor-ligando) e ainda, não neutraliza a imunorreactiuidade dos MAbs 2G5, 2F10, 3011 e 4G10 com o complexo de fibrinogénio:GPIIb/l11 a a imunorreactividade dos MAbs com*as plaquetas foi examinada usando plasma rico em plaquetas contendo 2-3 mg/ml de fibrinogénio.

Como se mostra na Tabela 3, apesar do grande excesso de 12 5 fibrinogénio livre, cada um dos quatro I-MAbs imunorreagir com os RIBS de fibrinogénio:GPIIb/lI Ia na superfície das plaquetas.

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-35TABELA 3

Plaquetas

2G5 2F10

5 i-MAb ligado (cpm/pIaqueta)

3G11 4G10

Não estimuladas

174 662

Estimuladas com ADP

823

218 678

471 20 38219 540

Como uma outra indicação da especificidade, em relação a RIBS, dos quatro Mabs depositados, realizaram-se estudos de ligação de Mab semelhantes, utilizando células contendo um receptor Mac-1 em lugar de plaquetas possuindo o receptor de glicoproteína GPIl/lIIa. Ambos, Mac-1 e GPIIb/lIIa, se ligam especificamente ao fibrinogénio num estilo receptor-ligando, mas as duas interacçães produzem resultados biológicos distintos. Nos estudos de l_i gação, os quatro Mabs depositados não exibiram imunorreacção com o complexo fibrinogénio-Mac-1, mas imunorreagiram com o fibrinoqé nio de um complexo fibrinogénio-GP11b/lIIa. Assim, os quatro Mabs testados imunorreagiram especificamente com RIBS no fibrinogénio expresso num complexo com GPIIb/lIIa mas não imunorreagiram com RIBS no fibrinogénio complexado com Mac-1.

3. Inibição da agregação de plaquetas por anticorpos

RIBS

Misturaram-se duzentos de plaquetas isoladas, preparadas como no exemplo 2, com 190 yi de tampão de Tyrode contendo B5A e dextrose (cada a 1 mg/ml), fibrinogénio (l mM), cálcio (5 mM) e fragmento Fab de Mab 2F10, preparado no exemplo 2 e presente em quantidades variáveis como indicado na Tabela 4. Em seguida misturaram-se dez yxl de ADP (80 ^aM em tampão Tyrode) para estimular a agregação das plaquetas. A mistura foi mantida a 373C, controlando variaçães na transmissão de luz pela mistura em relação ao tempo utilizando um Dual Sample Aggregation Meter (Model DP-247E, Sienco Inc., Morrison, C0).

medidor de agregação foi calibrado utilizando uma solu7,0 0 39

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-36ção contendo 200 ynl de PRP e 2 00 ^1 de tampão Tyrode para estabelecer uma linha de base da transmissão da luz, baixa, a 5%, de mo do a controlar as agregações e a 10% para as agregações em presen ça de anticorpos. 0 limite superior foi de 100 ml de PRP e 300 χ*1 de tampão Tyrode.

Na Tabela 4 são mostrados os resultados obtidos quando se mediu a inibição da agregação das plaquetas pelos anticorpos e são expressas como a percentagem de transmissão de luz (100%) obtida na ausência de anticorpo, quando medidos cerca de 3 a 4 mi. nutos após a mistura de ADP.

TABELA 4

Inibição da agregação das plaquetas pelo anticorpo monoclonal

2F10

Percentagem de

FAB 7 transmissão /«M

0,25

0,5

1,25 pM 1,87

100

62.5

34.5

17.5

Os resultados da Tabela 4 mostram que o fragmento de Mab 2F10 produz uma inibição da agregação das plaquetas dependente da dose. Assim os resultados indicam as dosagens eficazes, úteis para inibir a agregação das plaquetas e processos envolvendo a agregação das plaquetas, tais como formação de trombos, quando se utilizam anticorpos do presente invento que imunorreagem com um RIBS específico num complexo de fibrinogénio:GP11b/l11 a.

A especificação anterior, incluindo a concretização específica, pretende ser ilustrativa do presente invento e não deve ser tomada como limitadora. Podem ser efectuadas numerosas varia ções e modificações sem haver afastamento do verdadeiro espirito e âmbito dos novos conceitos deste invento.

Claims (19)

1. REIVINDICAÇÕES

   1 - Processo de preparação de um anticorpo monoclonal, caracterizado por imunorreagir com um sítio de ligação induzido pelo receptor expresso por um ligando, quando o dito ligando está presente num complexo receptor-ligando, mas não imunorreage com o dito ligando ou com o dito receptor quando quer o dito ligando quer o dito receptor está livre em solução.
2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o receptor do dito complexo ser um membro da super família de proteínas citoadesina.
3. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracteriza do por o dito receptor ser GPIIb/lIIa.
4. 4 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracteriza do por o dito ligando ser fibrinogênio.
5. 5 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracteriza do por o dito anticorpo ser segregado por um hibridoma selecciona do a partir do grupo consistindo em hibridoma 2G5, hibridoma 2710, hibridoma 3G11 e hibridoma 4G10.
6. 6 - Processo de preparação de um hibridoma, caracterizado por segregar um anticorpo monoclonal que imunorreage com um sítio de ligação induzido pelo receptor expresso num ligando quando o dito ligando está presente num complexo receptor-ligando, mas não imunorreage com o dito ligando ou com o dito receptor quando, quer o dito ligando quer o dito receptor está livre em solução.
7. 7 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracteriza do por o dito hibridoma ser seleccionado a partir do grupo consis. tindo em hibridoma 2G5, hibridoma 2F10, hibridoma 3G11 e hibridoma 4G1D.
8. 8 - Processo de preparação de uma cultura de células, caracterizado por se associar:

   a) um hibridoma que segrega um anticorpo monoclonal que imunorreage com um sítio de ligação induzido pelo receptor expres

   7fl 039

   SCR 0252-SCRF 163.1

   -38so num ligando quando o dito ligando está presente num complexo receptor-ligando, mas não imunorreage com o dito ligando ou com o dito receptor quando, quer o dito ligando quer o dito receptor,está livre em solução; com

   b) moléculas de anticorpo segregadas pelo dito hibridoma e com

   c) um meio de cultura para o dito hibridoma.
9. 9 - Processo de acordo com a reivindicação B, caracteriza do por o dito hibridoma ser seleccionado a partir do grupo consis tindo em hibridoma 2G5, hibridoma 2F10, hibridoma 3G11 e hibridoma 4G10.
10. 10 - Processo de formação de uma molécula de anticorpo mo noclonal que imunorreage com um sítio de ligação induzido pelo re ceptor, expresso por um complexo ligando-receptor contendo ligando, contendo o dito complexo um receptor da superfície da célula, especificamente ligado a um ligando, caracterizado por compreender:

    a) proporcionar células produtoras de anticorpos e prep.a rar uma suspensão das ditas células;

    b) tratamento das ditas células com um agente de transformação para produzir células produtoras de anticorpos transfoj? madas >

    c) clonação das células tratadas no passo b) por dilui_ _t nsntem çao limitante num meio de cultura de tecido que não/células não transformadas, para produzir transformantes cionados;

    d) ensaio do meio de cultura de tecido dos transformantes cionados para detectar a presença de moléculas de anticorpo segregadas que imunorreagem com um sítio de ligação induzido pelo receptor, presente no ligando no dito complexo ligando-receptor, mas que não imunorreage com o receptor da superfície da célula ou com o ligando quando está na forma não ligada, identificando por conseguinte um transformante cionado produzindo as ditas moléculas de anticorpo;

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    -39e) crescimento do dito transformante clonado identificado, no meio de cultura de tecido, sob condições para produzir as ditas moléculas de anticorpo segregadas; e

    f) colheita das ditas moléculas de anticorpo segregadas a partir do meio de cultura do passo (e).
11. 11 - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracteri zado por o referido ligando ser fibrinogénio e por o referido receptor ser o receptor de glicoproteína das plaquetas, GPIIb/lIIa.
12. 12 - Processo de determinação da presença de um complexo ligando-receptor numa amostra de fluido vascular, contendo o refe rido complexo um receptor da superfície da célula especificamente ligado a um ligando, caracterizado por compreender os passos de:

    a) formação de uma mistura reaccional por mistura de uma amostra de fluido vascular com uma composição de anticorpos monoclonais contendo moléculas de anticorpo que imunorreagem com um sitio de ligação induzido pelo receptor, mas que não imunorreagem com o receptor da superfície da célula ou com o ligando quando qualquer um deles está na forma não ligada;

    b) conservação da mistura durante um período de tempo sju cue ficiente para/os ditos anticorpos imunorreajam com qualquer complexo ligando-receptor presente na amostra e para formar um produ. to de imunorreacção; e

    c) detectar a presença de qualquer produto de imunorreaç. ção formado no passo b) e, assim, a presença do referido complexo na referida amostra.
13. 13 - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracteri zado por o referido ligando ser fibrinogénio e por o referido receptor ser a glicoproteína das plaquetas GPIIb/lIIa.
14. 14 - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracteri zado por as referidas moléculas de anticorpo serem moléculas de anticorpo produzidas por um hibridoma seleccionado do grupo consistindo em hibridoma 2G5, hibridoma 2F10, hibridoma 3G11 e hibr_i doma 4G10.

    70 039 'SCR 0252-SCRF 163.1

    -4015 - Processo de preparação de um conjunto de diagnóstico, caracterizado por compreender anticorpos monoclonais que imunorrea gem com um sítio de ligação induzido por receptor expresso num li. gando, quando o dito ligando está presente num complexo receptor-ligando, mas não imunorreagem com o dito ligando ou com o dito receptor quando, quer o dito ligando quer o dito receptor está l_i vre em solução, estando os ditos anticorpos monoclonais presentes numa embalagem, numa quantidade suficiente para realizar pelo menos um ensaio.
15. 16 - Processo de preparação de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o dito complexo receptor-ligando ser GPIIb/ /illa:fibrinogénio.
16. 17 - Processo de preparação de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por os ditos anticorpos monoclonais serem segregados por um hibridoma seleccionado a partir do grupo consis. tindo em hibridoma 2G5, hibridoma 2F10, hibridoma 3G11 e hibridoma 4G10.
17. 18 - Processo de preparação de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por os ditos anticorpos monoclonais estarem ligados a um meio de detecção.
18. 19 - Processo de preparação de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por o dito meio de detecção ser embalado se paradamente dos ditos anticorpos monoclonais.
19. 20 - Processo de preparação de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por o dito meio de detecção estar ligado aos ditos anticorpos monoclonais e ser um meio de detecção in vivo.