NO301237B1 - Monoklonale antistoffer mot reseptor-fremkalte bindingsseter - Google Patents

Description

Teknisk område

Foreliggende oppfinnelse angår et monoklonalt antistoff som immunreagerer med et reseptorfremkalt bindingssete uttrykt av en ligand når angitte ligand er til stede i et reseptor-ligandkompleks, men som ikke immunreagerer med angitte ligand eller med angitte reseptor når enten angitte ligand eller angitte reseptor er fri i oppløsning.

Bakgrunn

Interaksjoner av ligander med celleoverflatereseptor-molekyler er kjennetegn for biologiske prosesser. Eksempler på slike interaksjoner er bindingen av liganden dannet av en del av kappeproteinet (gpl40) av AIDS-viruset (HIV) med CD4-reseptoren på T-celler, reseptorene av hoved-histo-forenlighetskomplekset som interagerer med et utall ligander i prosesser for selv/ikke-selvdiskriminering i det immunologiske system, og interaksjonen av fibrinogenliganden med GPIIb/IIIa cellulær reseptor på blodplater. Fibrinogen:GPIIb/IIIa-ligand-reseptorparet er av særlig interesse ved blodlevring, trombedannelse, og anvendes heretter som eksempler på ligander og reseptorer.

Fagområdet har lenge etterstrebet immunologiske metoder for å skille de bundne og ikke-bundne former av ligander og reseptorer fordi denne evne ville muliggjøre en bestemmelse av tilstanden av de fysiologiske mekanismer som formidles av reseptor: ligandkompleksdannelse. Inntil nylig er anstrengelser for å foreta slike bestemmelser ved immunologiske metoder blitt forstyrret fordi biologiske prøver kan inneholde ligander og reseptorer i både bundne (kompleksdannede) og frie former.

Eksempelvis inneholder vaskulaturen av individer som gjennomgår en trombotisk hendelse, ikke-bundne former av fibrinogen og GPIIb/IIIa, såvel som blodplater som har et fibrinogen:GPIIb/IIIa-kompleks på deres overflate. Fibrinogen :GPIIb/IIIa-komplekset uttrykker antigeniske determinanter felles for ikke-bundet fibrinogen og ikke-bundet GPIIb/IIIa, hvilket således gjør det vanskelig å identifisere en trombotisk tilstand eller trombelokalisering ved hjelp av eksis-terende, immunologiske metoder.

Nylig rapporterte Frelinger et al., J. Biol. Chem., 263:12397-12402 (1988) identifisering av en antigenisk determinant uttrykt av GPIIb/IIIa, bare når GPIIb/IIIa var bundet til en ligand. Det vil si at den antigeniske determinant beskrevet av Frelinger et al., ble uttrykt av reseptoren av reseptor:ligandkomplekset.

Andre har rapportert fremstilling av monoklonale antistoffer som immunreagerer med en antigenisk determinant uttrykt ved ligandbinding til kunstige, ikke-reseptor-overflater.

Soria et al., J. Colloid Interface Sei., 107:204-208

(1985) beskriver et bestemt monoklonalt antistoff angitt som DSB 2 som ble fremkalt ved lmmunisering med tverrbundet fibrinfragment og som binder til plastadsorbert fibrinogen og også til det såkalte fibrinogen D-fragment adsorbert på plast eller fritt i oppløsning, men som ikke binder til fibrinogen i løsningsfase eller det såkalte fibrinogen E-fragment når det foreligger i løsning.

Nilsson et al., Molec. Immunol., 24:487-94, 1987, beskriver fremstilling av monoklonale antistoffer som immunreagerer med komplement C3-fragmenter når de er partikkel-bundet til "Zymosan A", men ikke med løselige C3-fragmenter. Arten av proteinbinding til "Aymosan A" innbefatter covalente, kjemiske bindinger.

I en annen rapport diskuterer Abrams et al., Blood (Suppl. 1), 70:355a (des. 1987), kort et monoklonalt antistoff betegnet som 9F9 som er angitt i det publiserte sammendrag å bindes til blodplatebundet fibrinogen. Denne korte beskrivelse karakteriserer imidlertid ikke de spesifikke bind-ingsegenskaper av monoklonalt 9F9.

Utallige monoklonale antistoffer som immunreagerer med oppløseliggjort fibrinogen, er blitt rapportert. En slik rapport er Lindon et al., Blood, 68:355-362 (aug. 1988). Denne publikasjon rapporterte anvendelse av kommersielt til gjengelige anti-humane fibrinogen-monoklonale antistoffer såvel som affinitetsrensede, polyklonale antistoffer mot D-og E-fragmentene.

Kort sammendrag av oppfinnelsen

Det er nå funnet at ligander som spesifikt er bundet til en reseptor, kan skilles fra ikke-bundne ligander ved nærvær av et reseptorfremkalt, antistoffbindende sete (RIBS) uttrykt av den reseptorbundne ligand. Det vil si at en klasse av antigeniske determinanter er blitt oppdaget som uttrykkes når en ligand spesifikt bindes til en reseptor,

men uttrykkes ikke av den ikke-bundne reseptor eller den ikke-bundne ligand.

Et RIBS uttrykkes på én ligand på grunn av den spesifikke interaksjon av en ligandbinding til dens slektnings-reseptor. Et RIBS er ikke et antigenisk determinantsete som eksponeres når et protein interagerer ikke-spesifikt med en annen overflate, slik som et plast-absorbert protein, eller når et protein interagerer ved covalente, kjemiske bindinger med en overflate. Disse to sistnevnte eksempler er beskrevet i Soria et al.-, og Nilsson et al.-referansene beskrevet ovenfor, og innbefatter ikke spesifikk reseptor-ligandbindingsinteraksjon som fremkaller et RIBS som her beskrevet.

Foreliggende oppfinnelse angår antistoffmolekyler

som immunreagerer med en ligand, fortrinnsvis fibrinogen,

når den er bundet til en reseptor, men immunreagerer ikke med oppløselig fibrinogen slik som f.eks. i plasma.

Disse antistoffer gjenkjenner RIBS fremkalt som en konsekvens av fibrinogeninteraksjonen av proteiner, fortrinnsvis GPIIb/IIIa, på blodplater. Antistoffene ifølge oppfinnelsen virker selektivt med bundet-fibrinogen selv med et stort overskudd av plasmafibrinogen. De unike egenskaper av disse antistoffer muliggjør derfor et stort antall av diagnostiske systemer og terapeutiske anvendelsesmetoder.

En utførelsesform av foreliggende oppfinnelse tar derfor i betraktning et monoklonalt antistoff som immunreagerer med et reseptorfremkalt bindingssete uttrykt av en ligand når angitte ligand er til stede i et reseptor-ligand kompleks, men som ikke immunreagerer med angitte ligand eller med angitte reseptor når enten angitte ligand eller angitte reseptor er fri i oppløsning, kjennetegnet ved at reseptoren av angitte kompleks er GPIIb/IIIa som er et medlem av cyto-adhesinsuperfamilien av proteiner; liganden er fibrinogen; og antistoffet er utskilt av et hybridom valgt fra hybridom 2G5, hybridom 2F10, hybridom 3G11 og hybridom 4G10.

En annen utførelsesform ifølge oppfinnelsen angår et hybridom som produserer et antistoff som immunreagerer med et reseptorfremkalt bindingssete uttrykt i en ligand når angitte ligand er til stede i et reseptor-ligandkompleks, men som ikke immunreagerer med angitte ligand eller med angitte reseptor når enten angitte ligand eller angitte reseptor er fri i opp-løsning, kjennetegnet ved at angitte hybridom er valgt fra hybridom 2G5 med ATCC deponeringsnr. HB9847, hybridom 2F10 med ATCC deponeringsnr. HB9844, hybridom 3G11 med ATCC deponeringsnr. HB9845 og hybridom 4G10 med ATCC deponeringsnr. HB9846.

Ytterligere tatt i betraktning er et diagnostisk system for påvisning av nærvær av et reseptor-ligandkompleks hvori systemet omfatter et monoklonalt antistoff som immunreagerer med et reseptorfremkalt bindingssete uttrykt av et reseptorligandkompleks, men som ikke uttrykkes av den ikke-bundne reseptor eller den ikke-bundne ligand-Reseptorkomplekset er GPIIb/IIIa:fibrinogen. Også foretrukket er et diagnostisk system hvori det monoklonale antistoff er kjedet til et in vlvo diagnostisk middel.

En annen side ved oppfinnelsen er anvendelse av de monoklonale antistoffer i et system for bestemmelse av en vaskulær væskeprøve med hensyn til nærvær av GPIIb/IIIa:fibrinogenkomplekset, hvilket system omfatter et monoklonalt antistoff som immunreagerer med RIBS uttrykt av dette kompleks.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

A. Definisjoner

Reseptor: Reseptor og reseptorprotein er uttrykk anvendt her for å angi et biologisk aktivt proteinaktig molekyl som spesifikt bindes til (eller med) andre molekyler angitt som ligander, for å danne et reseptor-ligandprotein-kompleks.

Ligand og kognatligand: Ligand angir et molekyl som inneholder en strukturell del som er bundet ved spesifikk interaksjon med et bestemt reseptorprotein.

Reseptorfremkalt bindingssete ( RIBS): Et RIBS er en neoantigenisk determinant som uttrykkes av liganddelen av et reseptor-ligandkompleks, men som ikke uttrykkes av enten den ikke-bundne ligand eller den ikke-okkuperte reseptor.

Et RIBS kan være enten "strukturelt" eller "sekvensielt".

Et RIBS er resultatet av spesifikke forandringer av liganden fremkalt ved reseptorbinding, dvs. en "kryptisk, antigenisk determinant".

Kryptisk, antigenisk determinant: Angir en neoantigenisk determinant dannet ved forandringer i struktur av et ligand-protein etter binding til dets kognat- (spesifikke) reseptor. Således uttrykker en ligand beskrevet her, ikke en kryptisk, antigenisk determinant med mindre liganden er spesifikt bundet til en reseptor.

Antigenisk determinant eller antigen: Antigenisk determinant eller antigen angir den aktuelle, strukturelle del av antigenet som immunologisk bindes av et antistoffkombinerende sete. Uttrykkene anvendes også om hverandre med epitop.

Neoantigen: Et neoantigen som definert her, er en ny, antigenisk determinant som ikke uttrykkes av en ligand før binding til reseptorer, men som uttrykkes i ligand-reseptorkomplekset.

Antistoff: Uttrykket antistoff i dets forskjellige grammatikalske former anvendes her for å angi immunglobulinmolekyler og immunologisk aktive deler av immunglobulinmolekyler, dvs. molekyler som inneholder et antistoffkombinerende sete eller paratop. Eksempler på antistoffmolekyler er intakte immunglobulinmolekyler, hovedsakelig intakte immunglobulinmolekyler og deler av et immunglobulin-molekyl, innbefattende de deler som er kjent innen faget som Fab, Fab', F(ab')2og F(v).

Antstistoffkombinerende sete: Et antistoffkombinerende sete er den strukturelle del av et antistoffmolekyl omfattet av en tung og lett kjedevariabel og hypervariabel region som spesifikt binder (immunreagerer med) et antigen. Uttrykket immunreagerer i dets forskjellige former betyr spesifikk binding mellom et antigenisk determinant-holdig molekyl og et molekyl inneholdende et antistoffkombinerende sete slik som et helt antistoffmolekyl eller en del derav.

Monoklonalt antistoff: Uttrykket monoklonalt antistoff i dets forskjellige grammatikalske former angir en populasjon av antistoffmolekyler som inneholder bare én art av antistoffkombinerende sete som er i stand til å immunreagere med et bestemt antigen. Et monoklonalt antistoff utviser typisk en enkel bindingsaffinitet for et hvilket som helst antigen med hvilket det immunreagerer. Et monoklonalt antistoff kan derfor inneholde et antistoffmolekyl som har et flertall av antistoffkombinerende seter, hvert immunspesifikt for et forskjellig antigen, f.eks. et bi-spesifikt, monoklonalt antistoff.

Et monoklonalt antistoff er typisk sammensatt av antistoffmolekyler fremstilt av kloner av en enkelt celle slik som et hybridom som utskiller (produserer) bare én type antistoffmolekyl. Hybridomcellen dannes ved fusjonering av en antistoffproduserende celle og en myelom- eller annen selvbevarende cellelinje. Slike antistoffer ble først beskrevet av Kohler og Milstein, Nature 256:495-497 (1975), hvilken beskrivelse er inkorporert ved referanse.

B. Ligand- reseptorinteraksjoner

Som tidligere angitt, er ligand-reseptorkompleks-dannelse en hjertesak ved mange biologiske prosesser. Bortsett fra det faktum at det eksisterer slike interaksjoner, fører disse interaksjoner til etterfølgende hendelser som uttrykkes i de biologiske prosesser til hvilke kompleks-dannelse er et første trinn.

Det er nå blitt funnet at sammen med den biologiske funksjon som ledsager ligand-reseptordannelse, oppstår en annen, mer intrikat forandring. Denne forandring ligger i strukturen av ligandmolekylet som resulterer fra bindings- interaksjonen med reseptoren og kompleksdannelsen. Denne forandring i ligandstruktur resulterer i dannelse av et neoantigen som uttrykkes hovedsakelig bare etter dannelse av komplekset. Som tidligere angitt, er dette neoantigen angitt som et reseptorfremkalt bindingssete, eller RIBS.

RIBS uttrykt av komplekset dannet ved binding av fibrinogen som ligand til GPIIb/IIIa som reseptor, er anvendt illustrativt her som et eksempel på det RIBS-dannende feno-men. Monoklonale antistoffer som immunreagerer med fibrinogen-GPIIb/IIIa-komplekset, men som hovedsakelig ikke reagerer med enten liganden eller reseptoren når de ikke er til stede i komplekset, anvendes også her som eksempler på anti-RIBS- (eller enklere, RIBS) monoklonale antistoffer.

I tillegg til eksempelvise RIBS-og RIBS-monoklonale antistoffer spesifikt diskutert her, er flere ytterligere ligand-reseptorkomplekser rapportert i litteraturen. Disse komplekser danner også RIBS, og monoklonale antistoffer kan dannes mot disse RIBS under anvendelse av de her beskrevne teknikker. Disse monoklonale antistoffer immunreagerer bare med liganddelen av det ligandbundne reseptorkompleks og ikke med den frie reseptor eller frie ligand. Under anvendelse av slike RIBS-monoklonale antistoffer kan man nå foreta utprøvning med hensyn til nærvær og mengde av et ligand-reseptorkompleks; dvs. en okkupert reseptor eller okkupert ligand, i nærvær av hvilken som helst av eller både den frie ligand og den frie reseptor.

Eksempelvise, ytterligere par av RIBS-dannende ligander og reseptorer er angitt i tabell 1 i det etter-følgende. Disse par er også beregnet på å være illustrative og ikke begrensende for de RIBS som kan dannes.

C. Monoklonale antistoffer

Et monoklonalt antistoff (MAb) ifølge oppfinnelsen erkarakterisertsom å omfatte antistoffmolekyler som immunreagerer med en ligands reseptorfremkalte bindingssete.

Et reseptorfremkalt bindingssete (RIBS) er en neoantigenisk determinant som uttrykkes av en ligand når liganden er bundet av en reseptor, men som ikke utrykkes av den frie (ikke-bundne) ligand. Det vil si at et reseptor-ligandkompleks uttrykker et RIBS, men den ikke-okkuperte reseptor og den ikke-bundne ligand gjør det ikke. Et MAb ifølge oppfinnelsen immunreagerer med et RIBS, men immunreagerer hovedsakelig ikke med enten den ubundne (frie) ligand eller reseptor, dvs. når enten liganden eller reseptoren er fri i oppløsning, og kan derfor skille mellom de reseptorbundne og ubundne former av en ligand fordi det immunreagerer med den reseptorbundne ligand, men ikke med den frie ligand. Uttrykket "immunreagerer hovedsakelig ikke med enten den ubundne (frie) ligand eller reseptor ..." anvendes her for å angi at den monoklonale antistoff-(ligand-reseptor) immunreaksjon inhiberes med ikke mer enn ca. 15%, og fortrinnsvis mindre, ved konkurrerende binding med fri ligand eller reseptorer.

I en foretrukket utførelsesform omfatter foreliggende MAb antistoffmolekyler som immunreagerer med et RIBS uttrykt av et cytoadhesin-ligandkompleks. Cytoadhesin er et navn gitt en superfamilie av reseptormolekyler som alle binder til en ligand som inneholder aminosyrerestsekvensen av arginin-glycin-asparaginsyre eller RGD. Plow et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 83:6002 (1986). Denne superfamilie

er også gitt navnet Integrin. Rouslahti et al., Science, 238:491-497 (1987). Det bestemte cytoadhesin av eksempelvis interesse her er GPIIb/IIIa, også kjent som blodplate-reseptoren.

Et foretrukket, monoklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen utskilles (produseres) av hvert av de etterfølgende hybridomer: hybridom 2G5 med ATCC-betegnelse HB9847, hybridom 2F10 med ATCC-betegnelse HB9844, hybridom 3G11 med ATCC-betegnelse HB9845 og hybridom 4G10 med ATCC-betegnelse HB9846. De ovenfor angitte hybridomer ble deponert ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA, den 29. september 1988, i henhold til Budapesttraktaten.

D. Metoder for fremstilling av monoklonale antistoff-sammensetninger

En metode for dannelse av et monoklonalt antistoff som immunreagerer med et reseptorfremkalt bindingssete omfatter trinnene: (a) Immunisering av et dyr med et reseptor-ligandkompleks. Dette utføres typisk ved administrering av en immunologisk effektiv mengde, dvs. en mengde som er tilstrekkelig til å produsere en immunrespons, av immunogen til et immunologisk kompetent pattedyr. Fortrinnsvis er pattedyret en gnager slik som en kanin, rotte eller mus, selv om andre pattedyr slik som geiter, hester og aper, kan anvendes. Pattedyret opprettholdes deretter i et tidsrom tilstrekkelig til at pattedyret får produsere celler som utskiller antistoffmolekyler som immunreagerer med reseptor-ligandkomplekset. (b) En suspensjon av antistoffutskillende celler fjernet fra det immuniserte pattedyr, fremstilles deretter. Dette utføres typisk ved fjerning av milten av pattedyret og mekanisk separering av de individuelle miltceller i et fysiologisk tolererbart medium under anvendelse av metoder velkjente innen faget. (c) De suspenderte antistoffproduserende celler be-handles med et overføringsmiddel som er i stand til å frem-kalle en transformert ("udødeliggjort") cellelinje. Over-førende midler og deres anvendelse for å produsere udødelig-gjorte cellelinjer er velkjente innen faget og innbefatter DNA-virus slik som Epstein Barr-virus (EBV), Simian-

virus 40 (SV40), polyomavirus og lignende, RNA-virus slik som Moloney murint leukemivirus (Mo-MuLV), Rous sarcom-virus og lignende, myelomceller slik som P3X63-Ag8.653, Sp2/0-Agl4 og lignende.

I foretrukne utførelsesformer resulterer behandling med det overførende middel i produksjon av et hybridom ved fusjonering av de suspenderte miltceller med musemyelom celler fra en egnet cellelinje ved anvendelse av en egnet fusjonspromoter. Et foretrukket forhold er ca. 5 miltceller pr. myelomcelle. Et totalt volum på ca. 10 g splenocytter.

Den anvendte cellelinje skal fortrinnsvis være av såkalt "legemiddelresistent" type slik at de ufusjonerte myelomceller ikke overlever i et selektivt medium, mens hybrider vil overleve. Den vanligste klasse er 8-aza-guaninresistente cellelinjer som mangler enzymet hypoxanthin-guanin-fosforibosyltransferase og som således ikke under-støttes av HAT- (hypoxanthin, aminopterin og thymidin) medium. Det foretrekkes også generelt at den anvendte myelomcellelinje er av såkalt "ikke-utskillende" type, ved at den ikke i seg selv produserer noe antistoff selv om utskillende typer kan anvendes. I visse tilfeller kan imidlertid utskillende myelomlinjer være foretrukket. Selv om den foretrukne fusjonspromoter er polyethylenglycol med en midlere molekylvekt på fra ca. 1000 til ca. 4000 (kommersielt tilgjengelig som f.eks. PEG 1000), kan andre fusjonspromoterer kjent innen faget, anvendes. (d) De transformerte celler klones deretter, fortrinnsvis til monoklonalitet. Kloningen utføres fortrinnsvis i et vevkulturmedium som ikke vil understøtte ikke-transformerte celler. Når de transformerte celler er hybridomer, utføres dette typisk ved fortynning og dyrkning i separate beholdere, blandingen av ufusjonerte miltceller, ufusjonerte myelomceller og fusjonerte celler (hybridomer) i et selektivt medium som ikke understøtter de ufusjonerte myelomceller, i et tidsrom tilstrekkelig til å bevirke død hos de ufusjonerte celler (ca. 1 uke). Fortynningen og dyrkningen utføres i separate beholdere, og fortynningen kan være en begrensende fortynning hvori volumet av fortynningsmiddel beregnes statistisk for å isolere et visst antall celler (f.eks. 1-4) i hver separate beholder (f.eks. hver brønn av en mikrotiterplate). Mediet er et (f.eks. HAT-medium) som ikke understøtter den legemiddelresistente, (f.eks. 8-aza-guaninresistente) ufusjonerte myelomcellelinje. (e) Vevkulturmediet av de klonede transformanter bestemmes med hensyn til nærvær av utskilte antistoffmolekyler som ikke immunreagerer med en fri ligand, men som immunreagerer med liganden når den er til stede som en del av et reseptor-ligandkompleks. Bestemmelsen utføres under anvendelse av velkjente, immunologiske teknikker som beskrevet i det etterfølgende.

(f) Så snart en ønsket transformant er blitt identi-fisert i trinn (e), utvelges denne og dyrkes i et egnet vevkulturmedium i et egnet tidsrom, etterfulgt av gjenvinning av det ønskede antistoff fra kultursupernatanten. Det egnede medium og det egnede tidsrom for dyrkning er velkjent innen faget og kan lett bestemmes.

For å fremstille en meget større konsentrasjon av ubetydelig mindre rent, monoklonalt antistoff kan det ønskede hybridom injiseres i mus eller andre pattedyr i hvilke hybridomet kan vokse, fortrinnsvis syngeniske eller semisyngeniske mus. Hybridomet forårsaker dannelse av anti-stof f produserende tumorer etter en egnet inkubasjonstid, hvilket resulterer i en høy konsentrasjon av det ønskede antistoff (ca. 5-20 mg/ml) i blodstrømmen og peritonealt eksudat (ascites) i vertmusen.

Media som er anvendbare for fremstilling av disse sammensetninger, er velkjente innen faget og er kommersielt tilgjengelige og innbefatter syntetiske kulturmedia, inn-avlede mus og lignende. Et eksempel på et syntetisk medium er Dulbeccos minimale, essensielle medium [DMEM; Dulbecco et al., Virol. 8:396 (1959)] supplert med 4,5 g/l glucose, 20 mm glutamin og 20% kalvefosterserum. Et eksempel på innavlet musestamme er Balb/c.

Et monoklonalt antistoff produsert ved den ovenfor angitte metode, kan anvendes i diagnostiske modaliteter, diskutert mer i detalj i det etterfølgende, hvori dannelse av et RIBS-holdig immunreaksjonsprodukt er ønskelig. Slike anvendelser innbefatter f.eks. de diagnostiske systemer ifølge oppfinnelsen for å påvise fibrinogenbundne blodplater i en kroppsprøve for in vivo påvisning av en trombe.

Et RIBS-monoklonalt antistoff anvendes typisk i en vandig sammensetning. Denne sammensetning kan være vevkulturmediet eller ascitesvæsken som erholdt, eller i fortynnet form. Slike sammensetninger anvendes typisk in vitro.

For in vivo bruk renses det RIBS-monoklonale antistoff typisk slik som ved utfelling i ammoniumsulfat, affini-tetsrenseprosedyre og lignende, og anvendes deretter i en vandig sammensetning av et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel. Konsentrasjonen av RIBS-monoklonale antistoffer i denne vandige sammensetning justeres for å tilpasses den ønskede anvendelse.

E . Diagnostiske systemer

Et diagnostisk system i settform av foreliggende oppfinnelse innbefatter, i en mengde tilstrekkelig til minst én utprøvning, et RIBS-monoklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen, slik som et av de som produseres av et av de fire ATCC-deponerte hybridomer, som et separat forpakket reagens. En markør for indikering av nærvær av en immunreaksjon mellom RIBS- og RIBS-monoklonalt antistoff er fortrinnsvis også innbefattet i den samme eller en separat forpakning. Instruksjoner for bruk av.det forpakkede reagens er også typisk innbefattet.

Instruksjoner for bruk innbefatter typisk en hånd-gripelig beskrivelse som beskriver reagenskonsentrasjonen eller i det minste en prøvemetodeparameter slik som de rela-tive mengder av reagens og prøve som skal blandes, opprett-holdelsestidsperioder for reagens/prøveblandinger, tempera-tur, bufferbetingelser og lignende.

En utførelsesform av oppfinnelsen er et diagnostisk system i settform for bestemmelse av fibrinogenbundne blodplater i en blodplateholdig, vaskulær væskeprøve, slik som blod eller plasma. Systemet omfatter en forpakning inneholdende et monoklonalt antistoff som immunreagerer med et RIBS uttrykt av reseptor-ligandkomplekset. Fortrinnsvis er anti-RIBS-antistoffmolekylene av det monoklonale antistoff de som produseres av et av de følgende hybridomer: hybridom 2G5, hybridom 2F10, hybridom 3G11 og hybridom 4G10. Fortrinnsvis er antistoffmolekylene til stede som et monoklonalt antistoffpreparat som inneholder mer enn ett bestemt, monoklonalt antistoff. Ytterligere foretrukket er sett hvori antistoffmolekylene er kjedet til en radionuklid-markør, fortrinnsvis et<125>I-merket eller annet merket antx- stoffmolekyl. Egnede markører er diskutert i det etter-følgende .

I en annen utførelsesform er et diagnostisk system ifølge foreliggende oppfinnelse egnet for bestemmelse av nærvær av en trombe in vivo. Systemet omfatter en forpakning inneholdende monoklonale antistoffmolekyler som immunreagerer med et RIBS uttrykt av et reseptor-ligandkompleks. Fortrinnsvis er de tilstedeværende antistoffmolekyler de som utskilles av et hybridom valgt fra gruppen bestående av 2G5, 2F10, 3G11 og 4G10. Antistoffmolekylene er fortrinnsvis kjedet til en in vivo markør eller et indikerende middel.

Selv om et sett for in vivo avbildning ofte kan anvendes for in vitro bestemmelser, skal det forstås at det omvendte ikke behøver å være tilfelle. Eksempelvis skal de monoklonale antistoffer som anvendes for in vivo arbeide, være frie for pyrogener som også ethvert buffersalt i vandige preparater og reagenser. Frihet fra pyrogeninnhold er ikke nødvendig for in vitro bestemmelser. I tillegg er de indikerende midler som er anvendbare for in vivo avbildning, typisk forskjellige fra de som anvendes in vitro, som diskutert i det etterfølgende. Således er bestemmelsessystemet "egnet" for in vivo avbildning, og "egnede" buffersalter, vandige løsninger og indikerende midler kan tilføres som en del av settet i de samme eller separate forpakninger.

I foretrukne utførelsesformer innbefatter et diagnostisk system ifølge oppfinnelsen ytterligere en markør eller et indikerende middel som er i stand til å signalisere dannelsen av et kompleks inneholdende et antistoffmolekyl ifølge oppfinnelsen.

Som anvendt her, angir uttrykkene markør og indikerende middel i deres forskjellige grammatikalske former, enkle atomer og molekyler som er enten direkte eller indirekte involvert i produksjonen av et påvisbart signal for å indikere nærvær av et kompleks. In vivo markører eller indikerende midler er de som er anvendbare i kroppen av et menneske og innbefatter "'""'""''In, ^Tc, ^^Ga, "'"^Re,

132T 111. ,.

I og indium.

Enhver markør eller ethvert indikerende middel kan kjedes til eller inkorporeres i et antistoffmolekyl som er en del av et konjugat eller monoklonalt antistoffpreperat ifølge oppfinnelsen, og disse atomer eller molekyler kan anvendes alene eller i forbindelse med ytterligere reagenser. Slike markører er i seg selv velkjente innen klinisk diagnostisk kjemi og utgjør en del av foreliggende oppfinnelse så lenge som de anvendes med de ellers nye proteinmetoder og/eller systemer.

Kjedingen av markører, dvs. merking av antistoffer, er vel kjent innen faget. Eksempelvis kan antistoffmolekyler produsert av et hybridom, merkes ved metabolisk inkorporering av radioisotopholdige aminosyrer tilveiebrakt som en kom-ponent i kulturmediet. Se f.eks. Galfre et al., Meth. Enzymol., 73:3-46 (1981). Teknikkene for proteinkonjugasjon eller kopling via aktiverte, funksjonelle grupper, er særlig anvendbare. Se f.eks. Aurameas et al., Scand. J. Immunol., vol. 8, Suppl. 7:7-23 (1978), Rodwell et al., Biotech., 3:889-894 (1984), og US patentskrift nr. 4.493.795.

In vitro diagnostiske systemer kan også innbefatte, fortrinnsvis som en separat forpakning, et spesifikt bindingsmiddel. Et "spesifikt bindingsmiddel" er en molekylær enhet som er i stand til selektivt å binde et monoklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen, men som i seg selv ikke er et antistoffmolekyl ifølge oppfinnelsen. Eksempler på spesifikke bindingsmidler er andre antistoffmolekyler, komplement-proteiner eller fragmenter derav, S. aureus protein A og lignende. Det spesifikke bindingsmiddel binder det RIBS-monoklonale antistoffmolekyl ifølge oppfinnelse når dette monoklonale antistoff er til stede som en del av et immunkompleks med ligand-reseptorkomplekset. I foretrukne utfør-elsesformer er det spesifikke bindingsmiddel merket. Når imidlertid det diagnostiske system innbefatter et spesifikt bindingsmiddel som ikke er merket, anvendes det spesifikke bindingsmiddel typisk som et forsterkende middel eller reagens, og et andre reagens som er merket, binder til det spesifikke bindingsmiddel (forsterkende middel). I disse utførelsesformer er det merkede, andre reagens i stand til spesifikt å binde forsterkningsmidlet når forsterkningsmidlet er bundet til et RIBS-monoklonalt, antistoffholdig immunkompleks.

De diagnostiske sett ifølge oppfinnelsen kan anvendes i et "ELISA"-format for å påvise nærvær av eller mengden av ligand-reseptorkompleks slik som fibrinogen-bundne blodplater i en kroppsvæskeprøve slik som serum, plasma eller urin. "ELISA" angir en enzymkjedet immuno-sorbentbestemmelse som anvender et antistoff eller antigen bundet (her, det RIBS-holdige ligand-reseptorkompleks) til en fast fase-matriks som danner en fast bærer, og et enzym-antigen eller enzym-antistoffkonjugat for å påvise og kvanti-fisere mengden av et antigen eller antistoff tilstedeværende i en prøve. En beskrivelse av ELISA-teknikken finnes i kapittel 22 av den 4. utgave av Basic and Clinical Immuno-logy av D.P. Sites et al., publisert av Lange Medical Publi-cations, Los Altos, CA i 1982 og i US patentskrifter nr. 3.654.090, 3.850.752 og 4.016.043, som alle er inkorporert her ved henvisning.

I foretrukne ELISA-sett-utførelsesformer er antistoffmolekylene ifølge oppfinnelsen festet til en fast matriks under dannelse av en fast bærer som er separat forpakket i de angjeldende, diagnostiske systemer. Antistoffene er typisk festet til den faste matriks ved adsorpsjon fra et vandig medium selv om andre metoder for festing, velkjente innen faget, kan anvendes.

Et merket, spesifikt bindingsmiddel som binder til komplekset eller dets bestanddeler, eller et umerket, spesifikt bindingsmiddel pluss et merket, andre reagens som binder til det spesifikke bindingsmiddel, er også innbefattet i én eller to separate forpakninger i settet. Under anvendelse av et av de monoklonale antistoffer produsert av et av de ATCC-deponerte hybridomer som eksempler på matriks-bundet antistoff, er merkede anti-fibrinogen-antistoffer som er kommersielt tilgjengelige, eksempler på det spesifikke bindingsmiddel.

Anvendbare, faste matriser er velkjente innen faget. Slike materialer innbefatter det tverrbundne dextran som er tilgjengelig under varemerket "Sephadex" fra Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, NJ); agarose; perler av polystyren-perler med 1 mikron til 5 millimeter i diameter, tilgjengelige fra Abbott Laboratories, North Chicago, IL; polyvinyl klorid, polystyren, tverrbundet polyacrylamid, nitro-cellulose- eller nylon-baserte vever slik som ark, remser eller pinner; eller rør, plater eller brønnene av en mikrotiterplate slik som de som fremstilles fra polystyren eller polyvinylklorid.

De monoklonale antistoffer (merkede eller umerkede), merket, spesifikt bindingsmiddel eller forsterkningsreagens av et hvilket som helst diagnostisk system beskrevet her,

kan tilveiebringes i oppløsning, som en væskedispersjon eller som et hovedsakelig tørt pulver, f.eks. i lyofilisert form. Hvor det indikerende middel er et enzym, kan enzymets substrat også være tilveiebrakt i en separat forpakning av et settsystem. En fast bærermatriks slik som den ovenfor beskrevne mikrotiterplate og én eller flere buffere, kan også være innbefattet som separat forpakkede elementer i dette diagnostiske utprøvningssystem.

Forpakningene diskutert her i relasjon til diagnostiske systemer, er de som vanligvis anvendes i diagnostiske systemer. Slike forpakninger innbefatter glass- og plast-(f.eks. polyethylen, polypropylen og polycarbonat) flasker, ampuller, plast og plastfolielaminerte konvolutter og lignende.

F. Prøvemetoder

Foreliggende oppfinnelse tar i betraktning anvendelse av antistoffene ifølge oppfinnelsen i en metode for påvisning av et reseptor-ligandkompleks, slik som f.eks. finnes i en trombe eller i fibrinogen-bundne blodplater, fortrinnsvis GPIIb/IIIa:fibrinogen. Metoden utnytter ekspresjon av et reseptorfremkalt bindingssete (RIBS) og et monoklonalt antistoffmolekyl som immunreagerer med RIBS i liganddelen av reseptor-ligandkomplekset, men som ikke reagerer med ikke-bundet reseptor eller ikke-bundet ligand. Fagmannen vil forstå at det er utallige velkjente kliniske, diagnostiske, kjemiske prosedyrer som kan anvendes for å danne disse immunkomplekser. Selv om eksempelvise prøvemetoder er beskrevet her, er oppfinnelsen således ikke begrenset til disse.

1. Trombepåvisninq

Nærmere spesifikt tas en metode i betraktning for påvisning av nærvær av en trombe i et pattedyr. Et vandig preparat inneholdende en avbildningseffektiv mengde av et monoklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen inneholdende antistoffmolekyler kjedet til et in vivo indikerende middel, administreres intravenøst til et pattedyr slik som et menneske med behov for slik behandling.

Det administrerte pattedyr opprettholdes i et på forhånd bestemt tidsrom tilstrekkelig til at det merkede antistoffmolekyl får immunreagere med det blodplatebundne fibrinogenkompleks tilstedeværende som en del av en trombe. Angjeldende pattedyr bestemmes deretter med hensyn til nærvær og fortrinnsvis lokalisering av et hvilket som helst merket immunkompleks som dannes, og påviser tromben og dens lokalisering. Da de merkede RIBS-monoklonale antistoffer normalt inneholder radionuklider som markør eller indikerende middel, utføres avbildningsutprøvningen etter vanlige, velkjente radioavbildningsteknikker. Slike teknikker kan skille den relativt høye konsentrasjon av radiomarkør ved tromben fra den relativt lavere systemiske mengde av radio-markør. Hvor relativt langlivede radioisotoper anvendes,

kan det administrerte pattedyr opprettholdes i et tidsrom tilstrekkelig til hovedsakelig systemisk fjerning av det merkede, monoklonale antistoff for derved å tilveiebringe en relativt enda lavere mengde av bakgrunnssignal fra radio-markøren.

2. Påvisning av fibrinogenbundne blodplater i en

kroppsprøve

Forskjellige heterogene og homogene prøveprotokoller kan anvendes, enten konkurrerende eller ikke-konkurrerende, for påvisning av nærvær og fortrinnsvis mengde av fibrinogen-bundne blodplater i en blodplateholdig og/eller fri fibrino-genholdig kroppsprøve, fortrinnsvis en kroppsvæskeprøve slik som blod eller en blodplateholdig del av blod. Eksempelvis blandes en heparinkonservert (ikke-levret) blod-

125

prøve og en l-form av ett av de tidligere beskrevne, deponerte RIBS-antistoffmolekyler. Mengder og konsentra-

sjoner av prøve og merket, monoklonalt antistoff anvendes selvsagt slik at et meningsfylt resultat kan erholdes. Den således dannede immunreaksjonsblanding opprettholdes under biologiske prøvebetingelser i et tidsrom tilstrekkelig til at fibrinogenbundne blodplater tilstedeværende i prøven, får immunreagere med de merkede antistoffer og danne et merket immunreaksjonsprodukt. Det merkede immunreaksjonsprodukt - når dette er tilstedeværende - separeres deretter fra ethvert ikke-omsatt, merket antistoff som kan være til stede. I homogene bestemmelser foretas separasjonen typisk ved sentrifugering tilstrekkelig til å pelletisere alle blodplater tilstedeværende i prøven. I heterogene bestemmelser slik som en ELISA er immunreaksjonsproduktet bundet til den faste bærer, og separasjonen utføres typisk ved et vasketrinn hvori ethvert ubundet RIBS-antistoff kastes og det faste bærerbundne immunreaksjonsprodukt bibeholdes.

Det skal forstås at hvor et umerket RIBS-monoklonalt antistoff anvendes for å immunreagere med et RIBS-holdig ligand-reseptorkompleks, dannes en andre blanding mellom det tidligere beskrevne, separerte immunkompleks og et merket bindingsreagens eller umerket bindingsreagens anvendt som et forsterkningsmiddel. Denne reaksjonsblanding opprettholdes under biologiske betingelser i et tidsrom tilstrekkelig til at et andre bindingskompleks får dannes mellom det først dannede immunkompleks og det spesifikke bindingsreagens. (Hvor det spesifikke bindingsreagens omfatter antistoffmolekyler, er dette andre bindingskompleks et andre immunkompleks. Hvor f.eks. S. aureus protein A anvendes, beror det andre bindingskompleks ikke på binding etter anti-stof fbindingssetet, og dette kompleks angis best som et bindingskompleks. Da et immunkompleks er et spesifikt bindingskompleks, er komplekset dannet mellom det spesifikke bindingsreagens og førstnevnte immunkompleks, et andre bindingskompleks) . Det andre bindingskompleks separeres deretter fra ethvert uomsatt, spesifikt bindingsreagens som kan være til stede, som ved en tidligere nevnt teknikk, og nærvær av markør og derved immunkompleks bestemmes, og for-

trinnsvis kvantifiseres.

Hvor det spesifikke bindingsreagens ikke er merket og anvendes som et forsterkningsmiddel, dannes en tredje blanding fra det ovenfor separerte, andre bindingskompleks når dette er til stede, og et markørholdig, andre bindingsreagens. Nærvær av markør i det andre bindingskompleks bestemmes selvsagt ikke i den ovenfor angitte metode hvori intet merket reagens ble tilblandet. De ovenfor beskrevne opprettholdelses- og separasjonstrinn gjentas for dette aspekt av metoden hvor et markørholdig, tredje bindingskompleks dannes og bibeholdes. Nærvær og fortrinnsvis mengden av markør bestemmes deretter.

I hvert av de ovenfor beskrevne aspekter ved denne bestemmelse tilveiebringer således nærvær og fortrinnsvis mengden av markør basis for bestemmelse av nærvær og fortrinnsvis mengden av fibrinogenbundne blodplater.

Det skal bemerkes at den person som utfører den ovenfor beskrevne bestemmelse, vanligvis ikke vil kjenne til hvorvidt ett eller flere av immunkomplekset eller bindings-kompleksene virkelig er blitt dannet før mengden av tilstedeværende markør bestemmes. Ikke desto mindre utføres alle trinn av en gitt prøveprosedyre som om det RIBS-holdige kompleks virkelig var tilstedeværende.

Det skal understrekes at på grunn av den unike spesifisitet av de RIBS-monoklonale antistoffer kan den ovenfor beskrevne bestemmelse med hensyn til fibrinogen-bundne blodplater og den ovenfor beskrevne avbildnings-bestemmelse med hensyn til en trombe, fortrinnsvis utføres i nærvær av både frie blodplater og fritt fibrinogen, dvs. ikke-kompleksdannede blodplater og fibrinogen. Som et resultat behøver spesielle håndteringsprosedyrer slik som separasjoner og vasketrinn, ikke utføres på kroppsprøve før anvendelse av denne prøve i en bestemmelse. Dette trekk er felles for alle bestemmelser under anvendelse av RIBS-monoklonale antistoffer.

Biologiske utprøvningsbetingelser er de som opprett-holder den biologiske aktivitet av antistoffmolekylene ifølge oppfinnelsen og de fibrinogenbundne blodplater eller annet RIBS-holdig kompleks som skal bestemmes. Disse betingelser innbefatter et temperaturområde på fra ca. 4°C

til ca. 45°C, fortrinnsvis ca. 37°C, et pH-verdiområde på ca. 5 til ca. 9, fortrinnsvis ca. 7, og en ionestyrke varierende fra den til destillert vann til den til ca. 1 molar natriumklorid, fortrinnsvis den til fysiologisk saltvann. Metoder for optimalisering av slike betingelser er velkjente innen faget.

Eksempler

De etterfølgende eksempler er beregnet på å illustrere foreliggende oppfinnelse.

1. Hybridom- og monoklonalt antistoff- produksjon

Monoklonale antistoffer ble fremstilt under anvendelse av standard hybridomteknologi. Kort angitt, bleBalb/c-mus immunisert og deretter boosterbehandlet tre ganger med ca. 50 mikrogram (ug) pr. mus av fibrin D-dimer-immunogen fremstilt hovedsakelig som beskrevet i Cierniewski et al., Thromb. Haemostas., 48:33-37 (1982).

Deretter ble 1,23 x 10 o splenocyttceller fra én immunisert mus hvis antistoffer immunreagerte med immuno-genet, blandet med 2,46 x 10 7 P3Ag8653.1 musemyelomceller i nærvær av cellefusjonspromoteren polyethylenglycol 4000. De således transformerte, antistoffproduserende celler ble overført til 96-brønns mikrotiterplater til en densitet på ca. 3 x 10 4celler pr. brønn og ble dyrket.

Vevkultursupernatanter fra 235 brønner som syntes å inneholde levedyktige hybridomer eller 14 dagers dyrkning, ble screenet ved radioimmunbestemmeIse med hensyn til nærvær av anti-RIBS-antistoffmolekyler. Kort angitt, ble 100 mikro-liter (ul) av fosfatbufret saltvann (PBS) inneholdende enten 1 ug/ml fibrinogen eller lipoprotein med lav densitet (LDL) (kontroll), blandet i brønnene av flatbunnede 96-brønns polyvinylmikrotiterplater som fast-fase-matriks. Platene ble deretter opprettholdt i ca. 16-20 timer ved 4°C for å muliggjøre at fibrinogen eller LDL fikk adsorbere på overflaten av brønnene under dannelse av en fast bærer. Belegningsløsningen ble deretter fjernet ved risting, brønnene ble skyllet, og 100 ul blokkeringsløsning (PBS inneholdende 5% normalt geiteserum) ble tilblandet til hver brønn for å blokkere overskudd av proteinbindingsseter.

Brønnene ble opprettholdt i ca. 30 minutter ved 3 7°C hvoretter blokkeringsløsningen ble fjernet. I hver brønn ble det deretter tilblandet 100 ul av enten (a) hybridom-vevkultursupernatant fortynnet 1:10 i PBS, eller (b) hybri-domsupernatant fortynnet 1:10 i PBS inneholdende 100 ug/ml fibrinogen som en konkurrerende inhibitor. De således dannede immunreaksjonsblandinger ble opprettholdt ved rom-temperatur i ca. 16-20 timer ved 4°C for å muliggjøre dannelse av et fast-fase-bundet immunreaksjonsprodukt og en væskefase, innbefattende ethvert ikke-bundet, monoklonalt antistoffmolekyl.

Til hver brønn ble det deretter tilblandet 100 ul 125 I-merket geite-anti-muse-IgG. Den således dannede, merkende immunreaksjonsblanding ble opprettholdt i ca.

6-20 timer ved 4°C for å muliggjøre dannelse av et -<*-2>5i-merket, andre, fast-fase-immunreaksjonsprodukt. De faste og væskeformige faser ble separert for å fjerne ethvert ikke-bundet I-geite-anti-muse-IgG. Mengden av I-bundet til hver brønn ble bestemt ved gammascintillasjon.

Nærvær av minst 3 ganger mengden av ikke-spesifikt bundet<125>I, som bestemt fra de LDL-belagte brønner, i en fibrinogenbelagt brønn, indikerte nærvær av anti-fibrinogen-antistoffer i en vevkultursupernatant. En reduksjon av fast-fase-bundet<125>I med ikke mer enn 15% ved nærvær av væskefase-fibrinogenkonkurrent i immunreaksjonsblandingen [del (b) ovenfor] indikerte nærvær av anti-RIBS-antistoffer i vevkultursupernatanten.

Den ovenfor angitte screeningsprosedyre resulterte

i identifisering av 4 hybridomer, betegnet som 2G5, 2F10, 3G11 og 4G10, som produserer anti-RIBS-antistoffer som binder et fibrinogen:GPIIb/IIIa-kompleks.

Hvert av de fire ovenfor beskrevne hybridomer ble klonet to ganger ved begrensende fortynning og deretter anvendt for å fremstille ascitesvæske. Antistoffene ble deretter isolert fra ascitesvæskene ved anvendelse av protein A "Sepharose".

Materialer inneholdende Fab-fragmenter av det monoklonale antistoff (Mab) 2F10, ble fremstilt ved oppslutning av protein A "Sepharose" - isolert Mab 2F10 med papain (200:1 vekt pr. vekt av Mab til papain) i 6 timer ved 37°C ved å følge metodene ifølge Mage et al., Methods in Enzymology, 70:142-50 (1980). Uoppsluttet antistoff og Fc-fragmenter ble fjernet fra Fab-fragmentene ved kromato-

grafi på protein A "Sepharose". De resulterende Fab-fragmenter ble oppsamlet fra "Sepharose" under dannelse av et 2F10 Fab-preparat.

2. Påvisning av fibrinogen:GPIIb/ IIIa RIBS på

aktiverte blodplater

Monoklonale antistoffer produsert av hybridomer 2G5, 2F10 og 3G11, dvs. MAb 2G5, MAb 2F10 og MAb 3G11, ble undersøkt med hensyn til deres evne til å immunreagere med et celleoverflatebundet RIBS. Hvert av de fire monoklonale

125

antistoffer ble I-merket under anvendelse av standard kloramin-T-metodologi. Greenwood et al., Bio. Chem.

J., 89:114-123 (1963). 60 milliliter (ml) av humant .helb^ejå^ble^opps-a^l^tS;.^!,-i 5 ml ACD (0,065 M sitronsyre, 0,08"5 M ^ S^ r^^^ r^ f^ W^^''^ dextrose) inneholdende hirudin (Sigma Chemical Co.,

St. Louis, MO) til en formelkonsentrasjon på 0,06 enheter pr. ml (U/ml) og ble sentrifugert i 15 minutter ved 120 x g.

Den resulterende supernatant betegnet som blodplaterikt plasma, ble gjenvunnet, isolert og ytterligere sentrifugert i 15 minutter ved 1200 x g under dannelse av en pellet av isolerte blodplater.

De isolerte blodplater ble resuspendert i 2 ml kalsiumfri Tyrodes buffer (0,13 M NaCl, 0,0026 M KCI,

0,002 M MgCl2-6H20, 5 mM Hepes, 0,012 M NaHC03, pH 7,2) inneholdende 1 mg/ml kvegserumalbumin (BSA) og 1 mg/ml dextrose. Blodplatesuspensjonen ble deretter anbrakt på en "Sepharose CL2B"-kolonne (40 ml totalt sjiktvolum; Pharmacia Inc.,

Piscataway, NJ) ekvilibrert med den samme Tyrodes buffer. Vaskede blodplater ble gjenvunnet fra hulvolumet av CL2B-kolonnen i et sluttvolum på ca. 4 til 5 ml.

Prøver av de vaskede blodplater ble deretter stimulert (aktivert) ved tilblanding med enten adenosindifosfat (ADP) til en konsentrasjon på 10 mikromolar (uM), eller trombin til en konsentrasjon på 0,1 enheter/ml. Noen prøver av de ADP-stimulerte blodplater ble også tilblandet med fibrinogen til en fibrinogenkonsentrasjon på 1 mM.

Til hver prøve av blodplater innbefattende noen ikke-125 stimulerte kontrollprøver, ble det tilblandet et I-merket MAb til en konsentrasjon på 10 nanomolar (nM). Den således dannede immunreaksjonsblanding ble opprettholdt i 30 minutter ved 22°C for å muliggjøre immunreaksjonsprodukt-dannelse. Immunreaksjonsproduktene ble separert fra ikke-125

bundet I-MAb ved sentrifugermg gjennom 0,5 ml 20%

125

sucrose. Mengden av I-MAb assosiert med blodplate-pelleten, ble bestemt ved scintillasjonsspektrometri.

Resultatene av denne studie vist i tabell 1, indikerer at anti-RIBS-monoklonale antistoffer hovedsakelig ikke immunreagerer med ikke-stimulerte blodplater. Når platene imidlertid ble stimulert med en agonist slik som ADP eller trombin, ble en signifikant immunreaksjon av MAb-ene med fibrinogen:GPIIb/IIIa-komplekset på cellene erholdt. Stimul-ering av blodplatene med ADP eller trombin resulterer i ut-skillelse og overflatebinding av GPIIb/IIIa av det blod-plateendogene fibrinogen. Tilsetning av eksogent fibrinogen

125 nøytraliserte ikke (inhiberte) bindingen av I-MAb til de stimulerte blodplater som således indikerte at MAb-ene er RIBS-spesifikke, dvs. at de ikke immunreagerer med fritt fibrinogen i oppløsning. Lignende resultater ble erholdt med MAb 4G10.

For å understreke det punkt at eksogent tilsatt fibrinogen ikke er celleassosiert (dvs. ikke en del av cellereseptor-ligandkomplekset), men likevel ikke nøytral-iserer immunreaktiviteten av MAb 2G5, 2F10, 3G11 og 4G10 med fibrinogen:GPIIb/IIIa-komplekset, ble immunreaktiviteten av MAb-ene med blodplatene undersøkt under anvendelse av blodplaterikt plasma inneholdende 2-3 mg/ml fibrinogen.

Som vist i tabell 2, til tross for det store overskudd av fritt fibrinogen, immunreagerte hvert av de fire<125>I-MAb-ene med fibrinogen:GPIIb/IIIa-RIBS på blodplate-overflaten.

Som en ytterligere indikasjon på spesifisitet av de fire deponerte Mab-ene med hensyn til RIBS, ble en lignende

Mab-bindingsstudie utført under anvendelse av celler inneholdende en Mac-l-reseptor snarere enn blodplater med GPIIb/IIIa-blodplateglycoproteinreseptoren. Både Mac-1 og GPIIb/IIIa binder spesifikt til fibrinogen på en reséptor-ligandmåte, men de to interaksjoner produserer distinkte, biologiske resultater. I bindingsstudiene utviste ikke de fire deponerte RIBS noen immunreaksjon med fibrinogen-Mac-1-kompleks, men immunreagerte med fibrinogen i et fibrinogen-GPIIb/IIIa-kompleks. Derfor immunreagerte de fire testede Mab-er spesifikt med RIBS på fibrinogen kompleksdannet med Mac-1.

3. Inhibering av blodplateaggregering med RIBS-antistoffer

200 ul isolerte blodplater fremstilt som beskrevet i eksempel 2, ble blandet med 190 ul Tyrodes buffer inneholdende BSA og dextrose (hver til 1 mg/ml), fibrinogen

(1 mM), kalsium (5 mM) og et Fab-fragment av Mab 2F10, fremstilt i eksempel 2 og tilstedeværende i varierende mengder som indikert i tabell 3. 10 ul ADP (80 uM i Tyrodes buffer) ble deretter tilblandet for å stimulere blodplateaggregering. Blandingen ble opprettholdt ved 37°C mens forandringer i lystransmisjonen av blandingen ble overvåket over tid under anvendelse av et "Dual Sample Aggregation Meter" (modell DP-24 7E, Sienco Inc., Morrison, CO).

Aggregeringsmåleren ble kalibrert under anvendelse av en løsning inneholdende 200 ul PRP og 200 ul Tyrodes buffer for å fastsette en lav grunnlinje for lystransmisjon på 5% for kontrollaggregeringer og 10% for aggregeringer i nærvær av antistoff. Den øvre grense på 100 ml PRP og 300 ul Tyrodes buffer ble anvendt.

Resultatene erholdt ved måling av blodplateaggreger-ingsinhibering av antistoff er vist i tabell 3 og er uttrykt som en prosent av lystransmisjon (100%) erholdt i fravær av antistoff når den ble målt 3 til 4 minutter etter at ADP var tilblandet.

Resultatene i tabell 3 viser at Mab 2F10-fragmentet produserte en doseavhengig inhibering av blodplateaggregering. Således indikerer resultatene de effektive doser som er anvendbare for å inhibere blodplateaggregering og prosesser innbefattende blodplateaggregering, slik som trombedannelse, under anvendelse av antistoffer ifølge oppfinnelsen som immunreagerer med et RIBS spesifikt for fibrinogen:GPJIb/IIIa-kompleks.

Den foregående beskrivelse innbefattende den spesifikke utførelsesform er beregnet på å være illustrerende for foreliggende oppfinnelse.

Claims (8)

1. Monoklonalt antistoff som immunreagerer med et reseptorfremkalt bindingssete uttrykt av en ligand når angitte ligand er til stede i et reseptor-ligandkompleks, men som ikke immunreagerer med angitte ligand eller med angitte reseptor når enten angitte ligand eller angitte reseptor er fri i opp-løsning, karakterisert vedat reseptoren av angitte kompleks er GPIIb/IIIa som er et medlem av cytoadhesinsuper-familien av proteiner; liganden er fibrinogen; og antistoffet er utskilt av et hybridom valgt fra hybridom 2G5, hybridom 2F10, hybridom 3G11 og hybridom 4G10.

2. Hybridom som utskiller et monoklonalt antistoff ifølge krav 1 som immunreagerer med et reseptorfremkalt bindingssete uttrykt i en ligand når angitte ligand er til stede i et reseptor-ligandkompleks, men som ikke immunreagerer med angitte ligand eller med angitte reseptor når enten angitte ligand eller angitte reseptor er fri i oppløsning,karakterisert vedat angitte hybridom er valgt fra hybridom 2G5 med ATCC deponeringsnr. HB9847, hybridom 2F10 med ATCC deponeringsnr. HB9844, hybridom 3G11 med ATCC deponeringsnr. HB9845 og hybridom 4G10 med ATCC deponeringsnr. HB9846.

3. Diagnostisk system i settform omfattende monoklonale antistoffer ifølge krav 1 som immunreagerer med et reseptorfremkalt bindingssete uttrykt i en ligand når angitte ligand er til stede i et reseptor-ligandkompleks, men som ikke immunreagerer med angitte ligand eller med angitte reseptor når angitte ligand eller angitte reseptor er fri i oppløsning,karakterisert vedat de monoklonale antistoffer er til stede i en forpakning i en mengde tilstrekkelig til å utføre minst én bestemmelse.

4. Diagnostisk system ifølge krav 3,karakterisert vedat angitte, monoklonale antistoffer er kjedet til en markør.

5. Diagnostisk system ifølge krav 4,karakterisert vedat angitte markør er forpakket separat for angitte, monoklonale antistoffer.

6. Diagnostisk system ifølge krav 4,karakterisert vedat angitte markør er. kjedet til angitte, monoklonale antistoffer og er et in vivo-diagnostiseringsmiddel.

7. Anvendelse av antistoffene ifølge krav 1 for utprøv-ing med hensyn til nærvær av et reseptor-ligandkompleks i en vaskulær væskeprøve hvori angitte kompleks inneholder en celleoverflatereseptor spesifikt bundet til en ligand, omfattende de følgende trinn: a) dannelse av en immunreaksjonsblanding ved blanding av en vaskulær væskeprøve med en monoklonal antistoffsammen-setning inneholdende antistoffmolekyler som immunreagerer med et reseptorfremkalt bindingssete på liganden i angitte reseptor-ligandkompleks, men som ikke immunreagerer med celle-overf latereseptoren eller liganden når den ene eller andre er i ikke-bundet form; b) opprettholdelse av blandingen i et tidsrom tilstrekkelig til at angitte antistoffer får immunreagere med ethvert reseptor-ligandkompleks tilstedeværende i prøven, og danne et immunreaksjonsprodukt; og c) påvisning av nærvær av ethvert immunreaksjonsprodukt dannet i trinn (b) og derved nærvær av angitte kompleks i angitte prøve.

8. Anvendelse ifølge krav 7, hvori angitte ligand er fibrinogen og angitte reseptor er blodplate-glycoprotein-GPIIb/IIIa.