DK173787B1 - Hybridomaer, som producerer en receptor, som immunoreagerer med thrombospondin, sådanne receptorer, diagnostisk stedspecifikt billeddannelsesreagens omfattende sådanne receptorer, in-vitro-metode til påvisning og skelnen mellem stimulerede - Google Patents

Description

i DK 173787 B1

Den foreliggende opfindelse angår et diagnostisk stedspecifikt billeddannelsesreagens, som bindes til et specifikt pattedyrscellemembran-associeret antigen på cellemembranen af en stimuleret aktiveret blodplade, 5 men i det væsentlige ikke bindes· til en ikke-stimuleret hvilende blodplade, og dets anvendelse i et diagnostisk system til påvisning, indicering og lokalisering af stimulerede blodplader. Den foreliggende opfindelse angår nærmere bestemt monoclonale receptorer, som bindes til thrombospon- 10 din, og deres anvendelse til diagnosticering.

Pattedyrblod indeholder små celler, som er kendt som blodplader. Humane blodplader er kerneløse cirkulerende partikler med en diameter på ca. 2-4 Mm.

Blodplader, som cirkulerer frit gennem blodkarrene 15 som fritflydende celler, er kendte som "hvilende" blodplader".

Intakte hvilende blodplader er normalt ikke-adhæsive og udviser begrænset vekselvirkning med intakt endothelium eller med andre blodlegemer. Imidlertid omdannes disse 20 blodplader hurtigt fra fritflydende celler til en adhæsiv aggregeret masse af intakte blodplader, der er kendt som "aktiverede blodplader", ved hæmostase eller under dannelse af thromber.

Når væggen af et blodkar beskadiges, f.eks.

25 ved et slag eller som et resultat af en anden karmæssig begivenhed, udløses der hurtigt en hæmostatisk reaktion for at forhindre et for stort blodtab. Denne reaktion, således som den har udviklet sig hos højere organismer, udløses for at bevirke en effektiv forsegling og 30 lokalisering af hæmostase ved fælles virkning af blodplader og koagulationssystemet. I modsætning hertil kan aktiverede blodplader i kar, som er beskadiget af kroniske sygdomme, f.eks. atheroschlerose, hæfte til hinanden og til karvæggen, hvilket fører til 35 2 DK 173787 B1 thrombotisk okklusion. Sådanne fænomener forekommer ved hjerteanfald og slagtilfælde med venøs emboli.

Blodplader transporteres til det beskadigede sted og aggregeres til dannelse af en hæmostatisk prop.

5 Fibrinogen medvirker derefter til dannelse af et koage1.

Blodpladernes involvering i primær hæmostase og thrombose startes ved overfladekontakt-vekselvirkninger og er betinget af de adhæsive egenskaber af blodplade-10 cellerne. Tre generelle fænomener indgår i en adhæsiv begivenhed: 1) binding af blodplader til underlaget, såsom den subendotheliale matriks, 2) spredning af blodpladen, hvilket giver yderligere kontaktsteder med underlaget, og 3) rekruttering af yderligere blodplader til dannelse 15 af aggregater. Blodpladeaggregation kan stimuleres ved udsættelse af cellen for adenosin-5'-diphosphat (ADP), ADP/fibrinogen, epinephrin, thrombin, serotonin, kollagen og visse arachidonsyre-metabolitter.

Fremkomsten af adhæsive egenskaber af hvilende 20 humane blodplader initieres derfor af en passende stimulus, som regulerer den adhæsive reaktion. Stimuleringen omdanner blodpladerne fra en ikke-adhæsiv "hvilende" tilstand til en adhæsiv "aktiveret” tilstand, som fremmer vedhæftningen af blodpladerne til blodkar 25 og hinanden til dannelse af thromber. Ændringen af de adhæsive egenskaber af disse celler spiller således en afgørende rolle for værts-organismens forsvarsmekanismer og ved patogenesen af thromboembolisk sygdom.

Udtrykkene "ikke-stimuleret blodplade" og 30 "hvilende blodplade" anvendes ensbetydende i den foreliggende beskrivelse til betegnelse af en normal frit-strømmende blodplade, der ikke er blevet udsat for en fysiologisk stimulus som ovenfor beskrevet, og som derfor foreligger i en "ikke-adhæsiv" eller "intakt" 35 tilstand. I modsætning hertil anvendes udtrykkene "stimuleret blodplade" og "aktiveret blodplade" ens- 3 DK 173787 B1 betydende i den foreliggende beskrivelse til betegnelse af en blodplade, der er blevet udsat for en fysiologisk stimulus som ovenfor beskrevet, og som derfor foreligger i en "adhæsiv” tilstand.

Det er kendt, at hvilende blodplader ved hæmo-stase og thrombose ændres morphologisk i form og biokemisk i celleoverflade-membransammensætning under aggregation og sekretion. Blodpladerne ændrer fom fra skiver til sfærer med lange pseudopodier, som aggregeres med tilstø-10 dende blodplader. De aktiverede blodplader udskiller deres granula-indhold i omgivelserne, fremskynder plasmakoagulering, binder fibrinstrenge som er under dannelse, og giver stødet til dannelse af koagel.

En undersøgelse af blodpladeoverflademembran-15 -forandringer, som følger efter stimulering af hvilende blodplader med thrombin, viser, at de væsentlige blodplade-overflade-membranforandringer sker efter sekretion, men ikke efter reversibel aggregation, jfr. George et al., J. Clin. Invest., 66, 1 (1980).

20 En anden undersøgelse af indvirkningen af thrombin på intakte humane blodplader vedrører tilstedeværelsen af et nyt cellemembran-associeret protein, som ikke er fibrinogen, jfr. Baenziger et al., Proc. Natl. Acad.

Sci. (USA) , 6_8, 240 (1971) . Dette nye membranprotein er 25 siden blevet identificeret som "thrombospondin" og er tildels også kendt som "thrombinfølsomt protein" eller "glycoprotein G".

Thrombospondin er et filamentformigt makromolekyle, som måler ca. 7 x 70 nm, og som synes at være en 30 væsentlig subcellulær blodproteinkomponent, jfr.

Lawler et al., J. Biol. Chem., 2_3' 8609 (1978).

Lawler et al. har også rapporteret, at thrombospondin indeholder tre disulfid-forbundne kæder på hver ca.

142.000 til ca. 190.000 dalton, som kan være ens eller 35 forskellige, thrombospondin indeholder ca. 4 vægtprocent kulhydrat, med neutrale sukkerarter, aminosukkerarter og sialinsyre (N-acetylneuraminsyre) i et vægtprocentforhold 4 DK 173787 B1 på ca. 4:3:1,5 og indeholder ingen hexuronsyre.

Ud fra undersøgelser af patienter med kvantitative defekter vedrørende visse plasmaproteiner antages det, at blodplade-adhæsiviteten medieres eller moduleres 5 af udvalgte "adhæsive proteiner” udover den ovennævnte nødvendige stimulus.

Adhæsive proteiner er cofaktor-proteiner, som udtrykkes ved den ydre celleoverflade af en aktiveret blodplade. Disse proteiner er sædvanligvis 10 enten fuldstændig fraværende fra den ydre celleoverflade af intakte hvilende blodplader eller er kun tilstede i minimale mængder. Det antages således, at cellemembran-associerede adhæsive proteiner primært udtrykkes som intracellulære komponenter og i nogle 15 tilfælde som ekstracellulære komponenter.

Adhæsive proteiner, som er blevet identificeret på den ydre cellemembranoverflade af aktiverede blodplader, omfatter fibrinogen, fibronectin, von Willebrand-faktor (også kendt som faktor VIII) og thrombospondin.

20 Disse fire proteiner har fælles egenskaber, idet de 1) normalt ikke er tilstede på den ydre celleoverflade af hvilende blodplader, 2) vekselvirker minimalt med ikke-stimulerede intakte blodplader, 3) udtrykkes ved celleoverfladen efter blodpladestimulering, og 25 4) har grove strukturelle ligheder. Foreslåede mekanismer for udtrykkeisen af disse fire adhæsive proteiner ved den ydre cellemembran-blodpladeoverflade diskuteres af Ginsberg og Plow, J. Supramolecular Structure and Cellular Biochem., 17, 81 (1981).

30 Selvom om de primære sekvens-homologier mellem proteinerne ikke er fuldstændig kendte, er udvalgte strukturelle træk af de fire proteiner lig hinanden.

Alle de fire ovenfor beskrevne adhæsive proteiner er glycosylerede makromolekyler, som har et element af 35 intern symmetri i deres multimere tilstand. Nærmere bestemt har fibrinogen en molekylvægt på ca. 340.000 dal- 5 DK 173787 B1 ton og har en dimer struktur dannet af en flerhed af underheder med mo lekyl væg-te på ca. 48.000, 56.000 og 65.000 dalton. Fibronectin har en molekylvægt på ca. 450.000 dalton og cirkulerer primært som en 5 dimer af to disulfid-forbundne underenheder, der ligner hinanden meget, men ikke er identiske, og har en molekylvægt på henholdsvis ca. 220.000 og 230.000 dalton. Det er kendt, at højere multimere af fibronectin forekommer i plasma og kan dominere i 10 matrixen. Thrombospondin eksisterer som en trimer med en molekylvægt på ca. 450.000 dalton med tre disul-fid-forbundne underenheder, der har størrelser meget lig hinanden og har en molekylvægt fra ca. 142.000 til ca.

190.000 dalton, von Willebrand-faktoren er sammensat af 15 underenheder på 220.000 dalton, der multimeriseres således, at der fås en molekylvægt på ca. 1.000.000 til ca.

20.000.000 dalton.

Plasma og ekstracellulære matrixer antages at udgøre de primære exogene kilder til de ovennævnte fire 20 adhæsive proteiner. Med undtagelse af thrombospondin er plasma den væsentlige potentielle kilde til de andre tre adhæsive proteiner. Det er rapporteret, at forekomsten af thrombospondin er 3 til 5 størrelsesordener mindre end forekomsten af fibronectin eller 25 fibrinogen ved en koncentration på 20-130 ng/ml i blodplasma, jfr. Saglio et al., Blood, 59^ 162 (1982).

Det' er kendt, at blodplader ved udsættelse for thrombin mobiliserer visse submembrane cytoplasmiske oplagringsgranula (alfa-granula), som frigør deres indhold 30 til omgivelserne. Blodplade-oplagringsgranula indeholder et antal proteiner, som normalt ikke er tilstede på celleoverfladen af en hvilende blodplade, men er tilstede som celleoverflade-associerede membranproteiner af thrombin-stimulerede "aktiverede" blodplader. Det an-35 tages endvidere, at de adhæsive proteiner, især thrombospondin, primært foreligger i endogene pools i alfa-granulerne i blodpladerne.

6 DK 173787 B1

Udtrykkeisen af de adhæsive proteiner på blodplade-celleoverfladen afhænger af en blodplade-stimulering, som fremkalder udskillelse og frigørelse af alfa-granula-komponenter. Herved frigøres de adhæsive 5 proteiner til det ekstracellulære miljø og fremkommer på celleoverfladen. Da adhæsive proteiner normalt er minimalt associeret med overfladen af hvilende blodplader antages det desuden, at mekanismerne for celle-overflade-udtrykkelse af adhæsive proteiner fra exogene 10 kilder også initieres af og afhænger af blodpladestimulering.

Da blodpladeaktivering og -lokalisering er fundamentale begivenheder ved beskadigelse af blodkar, foreligger der et behov for metoder og reagenser, der er i stand til at påvise og skelne mellem aktiverede 15 blodplader og hvilende blodplader. Muligheden for at påvise aktiverede blodplader, der kan reagere selektivt med beskadigede blodkarvægge, vil især være en hjælp ved lokalisering af stedet for beskadigelse af blødt væv, især når der er tale om skader, hvor patienten 20 ikke har nogen ydre tegn på skader.

I øjeblikket bestemmes cirkulerende aktiverede blodplader in vitro ved anvendelse af den velkendte blodpladeaggregatforholds;est, hvorved passende fortyndinger af en ukendt antistofholdig prøve inkuberes 25 med antigenbærende celler, og antistofkoncentrationen (titeren) bestemmes ved sammenligning af de resulterende agglutinationsreaktioner med reaktioner, som fås med en standardprøve indeholdende antistof med kendt titer. Denne prøve er imidlertid ofte besværlig og 30 upålidelig.

En gængs metode til billeddannelse af blodplader in vivo involverer en tidskrævende og ubekvem procedure, hvorved der anvendes ^^indium-mærkede blodplader. Proceduren omfatter isolering af blodplader fra en patient, 35 mærkning af blodpladerne med radionucleotidet in vitro og derefter injektion af de radiomærkede blodplader i 7 DK 173787 B1 patienten. De ^^indium-mærkede blodplader kan først anvendes til billeddannelse, efter at der er gået et tilstrækkeligt tidsrum til nedsættelse af baggrund-signal-interferens.

5 Således vil et diagnostisk stedspecifikt billed dannelsesreagens, som er i stand til selektiv binding til og billeddannelse af et specifikt cellemembran-associeret adhæsivt protein have en ønskelig klinisk anvendelighed til hurtig indicering af stedet for stimulerede aktiverede 10 blodplader og kan være anvendeligt til at skelne mellem sådanne blodplader og hvilende blodplader.

Nærmere bestemt kan et diagnostisk stedspecifikt billedddannelsesreagens, som omfatter et antistof eller et antistoffragment, som bindes til en specifik blodplade-15 -proteinkomponent (når den udtrykkes som et celleoverfladeantigen på en blodplade, som er i en stimuleret aktiveret tilstand), eliminere mange af de teknisk komplekse, ubekvemme og tidskrævende aspekter af de i øjeblikket tilgængelige diagnostiske procedurer in vitro og in vivo.

20 Der er beskrevet et monoclonalt antistof mod thrombin-aktiverede blodplader, der ikke krydsreagerer med hvilende blodplader, jfr. Nieuwenhu.is et al., Thrombosis and Haemostasis, .5_0, 100 (1983). Det monoclonale antistof er fremstillet mod aktiverede blodplader ved anvendelse af 25 miltceller fra mus, som er immuniseret med thrombinaktiverede humane blodplader fusioneret til en muse-myelom-cellelinie til dannelse af en hybridon. Der produceres antistoffer mod blodplader, og en hybridom. producerer antistoffer, som bindes til et ukendt antigen på thrombin- eller 30 ADP-aktiverede blodplader. Imidlertid har antistoffet ingen funktionelle egenskaber ved aggregationsundersøgelser med blodplader stimuleret af ADP, epinephrin, collagen, thrombin eller antibiotikummet restocetin. Antigenet, til hvilket antistoffet bindes, viser sig at være placeret 35 i en speciel underklasse af blodpladegranuler, som er forskellige fra a-granuler.

8 DK 173787 B1

Der er også beskrevet produktion af monoclonale antistoffer, som er specifikke for thrombin-aktiverede blodplader, og som fremstilles ud fra muse-hybridcmer ved anvendelse af standardmetoder, jfr. Hsu-Lin et al., 5 Blood, 6j2 (Suppl. 1), (1983). Antistofferne er speci fikke mod en ikke-identificeret enkeltproteinkomponent, som vandrer mellem glycoprotein Ilb og glycoprotein Illa ved separation ved Western-blotting-procedurer. Det ikke-identificerede protein afledes af enten solubili-10 serede aktiverede blodplader eller af hvilende blodplader og har en tilsyneladende molekylvægt på mellem ca. 93.000 og 120.000 dalton.

Det er beskrevet, at et monoclonalt antistof mod blodplademembran-glycoprotein Ila kun bindes 15 til aktiverede blodplader, jfr. McEver et al., Blood, 62, (Suppl. 1), (1983). Hybridomet fremstillet ud fra miltceller fra mus immuniseret med thrombinaktiverede humane blodplader bindes specifikt til thrombinaktiverede blodplader, men ikke til perifere mononucleære blod-20 legemer. Antistoffet er specifikt overfor et protein med en tilsyneladende molekylvægt på ca. 138.000 (ikke-reduceret) og 148.000 (reduceret) dalton og opfylder visse kriterier for glycoprotein Ila, som antages at være et plasma-membranmolekyle, som ændrer konformation efter 25 blodpladeaktivering, eller for en granula-membrankom- ponent, som fusioneres med plasmamembranen under frigørelsesreaktionen. Imidlertid er funktionen af proteinet ikke kendt.

Der foreligger således et behov for et i forvejen 30 mærket antistof for en blodproteinkomponent, især en komponent lokaliseret i de subcellulære α-granuler, der er i stand til at indicere blodkomponenten som et udtrykt celleoverfladeantigen ved billeddannelse af stedet som et middel til påvisning og lokalisering af blodkomponenten.

35 Et indikerende stedspecifikt diagnostisk reagens kan udgøre et hurtigt klinisk vurderingsmiddel ved scanning for blodplade-thromber.

9 DK 173787 B1

Der foreligger et særligt behov for en ikke--invasiv hurtig klinisk metode til identificering og lokalisering af tilstedeværelsen af thromber, især hos patienter med hjerteanfald og slagtilfælde, og 5 til styring in situ af thrombolytisk behandling hos patienter, som har akut myocardieinfarkt.

Der foreligger også et behov for påvisning in vivo af steder med beskadigede blodkarvægge efter læsioner eller til undersøgelse for symptomfri coronararteriesygdom hos 10 personer med risiko herfor.

Den foreliggende opfindelse angår hybridomaeme ATCC HB 8680 og HB 8681. Disse hybridomaer producerer en receptor, som immunoreagerer med thrombospondin. Opfindelsen angår også sådanne receptorer produceret af hybridomaeme ATCC 15 HB 8680 og HB 8681.

I et andet aspekt angår opfindelsen også et diagnostisk stedspecifikt billeddannelsesreagens omfattende en receptor produceret af en af hybridomaeme ATCC HB 8680 og HB 8681 og indicerende middel, der mærker receptoren, hvorved 20 receptoren er i stand til selektiv binding til en blodplade i en stimuleret tilstand, men i det væsentlige er ikke-bin-dende til en ikke stimuleret blodplade.

I et yderligere aspekt angår opfindelsen en fremgangsmåde in vitro til påvisning af og skelnen mellem stimu-25 lerede blodplader og ikke-stimulerede blodplader, hvilken fremgangsmåde omfatter følgende trin: a) blanding af en blodpladeholdig prøve med det ovenfor beskrevne diagnostiske stedspecifikke billeddannelsesreagens , 30 b) bibeholdelse af blandingen i et tilstrækkeligt tidsrum til, at reagenset immunoreagerer med eventuelt tilstedeværende stimulerede blodplader og danner et kompleks, og c) bestemmelse af tilstedeværelsen af et kompleks og 35 dermed stimulerede blodplader ved hjælp af et signal fra det indicerende middel af reagenset.

10 DK 173787 B1

Opfindelsen angår også et diagnostisk system til påvisning af en thrombe in vivo hos et pattedyr i form af et sæt omfattende i i det mindste en pakning en effektiv mængde anti-thrombospondin-receptorer mærket med et in vivo-5 -indicerende middel, hvor receptorerne er i stand til at binde til en blodplade i en stimuleret tilstand, men i det væsentlige ikke binder til en ikke-stimuleret blodplade.

opfindelsen angår yderligere en anti-thrombospondin--receptor til anvendelse ved en diagnosticeringsmetode, 10 hvilken metode omfatter påvisning og skelnen mellem stimulerede blodplader og ikke-stimulerede blodplader, hvor receptoren er mærket med indicerende middel og er i stand til at binde til en blodplade i en stimuleret tilstand, men i det væsentlige ikke binder til en ikke-stimuleret blodplade.

15 I et yderligere aspekt angår opfindelsen anvendelsen af en anti-thrombospondin-receptor ved fremstilling af et reagens til anvendelse ved en metode til påvisning af tilstedeværelsen af en thrombe hos et pattedyr, hvor anti-thrombo-spondin-receptoren er mærket med et in vivo-indicerende 20 middel, og binder til en blodplade i en stimuleret tilstand, men i det væsentlige ikke binder til en ikke-stimuleret blodplade, hvilken metode omfatter felgende trin: a) intravenøs injektion i pattedyret af en effektiv mængde af receptoren, 25 b) bibeholdelse af pattedyret i et forudbestemt tidsrum, som er tilstrækkeligt til, at receptoren reagerer med thrombospondin, som er til stede i pattedyret på overfladen af blodplader i en thrombe, og danner et kompleks, og 30 c) bestemmelse af tilstedeværelsen af eventuelt kompleks dannet i trin b).

Thrombospondin udgør et cellemembran-associeret antigen, som er til stede ved den ydre celleoverflade af en blodplade, når blodpladen er i en stimuleret ”aktiv” til-35 stand, og i det væsentlige er fraværende fra den ydre celleoverflade af en blodplade, som er i en ikke-stimuleret, 11 DK 173787 B1 normal eller "hvilende” intakt tilstand som ovenfor beskrevet.

Betegnélsen "antigen" er blevet anvendt indenfor teknikken til at omfatte materialer, som er immunogene.

5 Ifølge nyere sprogbrug defineres et antigen imidlertid som det, hvortil en receptor, såsom et helt antistof, bindes, og et immunogen defineres som det, der inducerer produktion af antistoffer in vivo. Et antistof er et protein, der produceres af immunsystemet hos et værtsdyr som 10 reaktion på tilstedeværelsen af et fremmed stof, og er også kendt som et immunoglobulin (Ig). Specificiteten af et antistof er rettet mod det immunogen, som det er dannet mod. Som anvendt i den foreliggende beskrivelse omfatter udtrykket "antigen" en specifik intracellulær 15 eller ekstracellulær blodproteinkomponent, som er anvendt til dannelse af et antistof, samt proteiner, hvortil antistoffet bindes, og udtrykket "receptor" omfatter et antistof, dannet hos et værtsdyr mod denne komponent.

Ifølge sagens natur må en receptor være tilgængelig 20 ved den ydre celleoverflade. Udtrykket "ydre celleoverflade" refererer til den ydre celleoverflade i modsætning til den cytoplasmiske overflade under membranen.

En intracellulær komponent af antigenet omfatter et protein, som er tilstede i de subcellulære blodplade-25 granuler, især α-granulerne, og er i det væsentlige ikke til stede i plasma. En ekstracellulær blodproteinkomponent omfatter et protein, som er tilstede i normalt plasma.

Monoclonale receptorer til anvendelse i diagnosticeringsmidlet ifølge opfindelsen kan dannes ved dyrkning af et 30 passende hybridoma in vitro i et egnet medium og udvinding af antistoffet fra den ovenstående væske fra hybridomaeme ved metoder, som er velkendte inden for teknikken. Dette er kendt som et cellekultursystem. Alternativt kan hybridomaeme injiceres i et værtsdyr, og antistoffet kan udvindes fra 35 værtdyrets ascitesvæske. Dette er kendt som et helt dyresystem. Sådanne hele dyresystemer er tilbøjelige til at 12 DK 173787 B1 producere mere antistof pr. enhedsvolumen end cellekultursystemer, men hele dyresystemer er undertiden vanskelige at anvende, hvis der ønskes store mængder antistof.

En fordel ved et diagnostisk stedspecifikt 5 billeddannelsesreagens ifølge opfindelsen er, at blodpladethromber hurtigt kan scannes til diagnosticering af thromboemboli, som forekommer hos patienter med hjerteanfald, slagtilfælde, dyb venethrombose og lungeemboli, til lettere identifikation og lokalisering 10 af stedet for sådanne thromber til akut thrombolytisk terapi in situ.

En anden fordel ved den foreliggende opfindelse er, at reagenset kan anvendes til scanning for og billeddannelse af beskadigede karvægge, hvor thrombo-15 spondin er blevet frigjort i den endotheliale matrix som følge af karbeskadigelse hos personer med risiko for symptomfri coronararterie-sygdom.

Endnu en fordel ved opfindelsen er, at cirkulerende aktiverede blodplader kan påvises in vitro i blodprøver 20 fra personer, som indtager prothrombotiske lægemidler, såsom orale svangerskabsforebyggende midler.

En fordel ved opfindelsen er, at den påviser aktiverede blodplader hurtigere og mere pålideligt end den velkendte blodpladeaggregat-forholds-test.

25 En yderligere fordel er, at et reagens ifølge opfin delsen kan anvendes til at lokalisere et blodkoagel med det formål at forbedre det terapeutiske forhold af et in situ-thrombolytisk middel, såsom vævsplasminogenak-tivator, som er det naturlige koagel-opløcende middel.

30 Andre fordele ved den foreliggende opfindelse vil fremgå for en fagmand af den følgende beskrivelse af opfindelsen og af kravene.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til at påvise og skelne mellem stimulerede og ikke-stimu-35 lerede blodplader in vitro. Opfindelsen vedrører dannelsen og anvendelsen af monoclonale receptorer til thrompospondin, ,r ·._ .·*ν·· 13 DK 173787 B1 som frigøres fra α-granuleme af hvilende blodplader/ når pladerne stimuleres med en agonist og udtrykkes som et ydre celleoverflade-antigen på de aktiverede blodplader. Receptoren bindes til en aktiveret blodplade, som har det cel-5 lemebran-associerede antigen derpå og krydsreagerer ikke med normale hvilende blodplader som beskrevet i den foreliggende beskrivelse.

Den foreliggende opfindelse angår endvidere et diagnostisk stedspecifikt billeddannelsesreagens til 10 pattedyr omfattende en receptor som ovenfor beskrevet og et indikator-mærkningsmiddel til identificering af stedet for det celleoverflade-udtrykte antigen.

Thrombospondin er tilstede i minimale mængder på den ydre celleoverflade af hvilende blodplader, men udtrykkes i 15 påviselige mængder på den ydre celleoverflade af aktiverede blodplader. Det er tilstede i den endogene intracellulære of-granula-pool af blodplader. I modsætning hertil er ca.

0,1% cirkulerende thrombospondin frit i plasma.

Der er som beskrevet i den foreliggende beskrivelse 20 blevet dannet monoclonale receptorer, som er specifikke for thrombospondin og ikke krydsreagerer med andre plasmaproteiner. Endvidere bindes mærkede receptorer, som yderligere beskrevet i den foreliggende beskrivelse, til thrombin- stimulerede blodplader og er i det væsentlige ikke-bin-25 dende til ikke-stimulerede blodplader. Således kan en receptor ifølge opfindelsen udgøre et billeddannelsesreagens ifølge opfindelsen, som detekterer og skelner aktiverede blodplader fra hvilende blodplader på en stedspecifik måde.

30 35 14 DK 173787 B1 I. Introduktion

Blodproteinkomponenter, som udtrykkes på den ydre celleoverflade af aktiverede blodplader som adhæsive proteiner, kan fås fra den endogene intracellulære a-granula-pool eller fra exogene kilder, såsom plasma eller den subendothelial matrix. En sammenligning mellem de tilnærmelsesvise mængder af adhæsive proteiner, der er tilstede i disse potentielle kilder, er anført i tabel I.

10

Tabel I

Adhæsivt protein Blodpladeindhold Plasmaindhold (pg/lO9 blodplader) (Mg/ml)

Fibrinogen 50 3.000 15 Fibronectin 3 300 von Willebrand- -faktor 2 20

Thrombospondin 20 0,02 20 Plasma er således en ubetydelig kilde til thrombospondin og en væsentlig kilde til fibrinogen, fibronectin og von Willebrand-faktor. Under antagelse af en ubegrænset affinitet vil fuldstændig binding af thrombospondin til blodplader kun placere ca. 50-300 mole-25 kyler af blodproteinkomponenten pr. celle.

På den anden side er thrombospondin en væsentlig blodpladekomponent af α-granula-poolen, der vides at være celleoverflade-udtrykt efter thrombinstimulering af cellen. Overfladeudtrykning af thrombospondin fore- 30 kommer i nærværelse af divalente metalioner, såsom calcium og magnesium, men nedsættes af ethylendiamin-tetraeddikesyre (EDTA). Serumniveauerne af thrombospondin er ca. 10.000-30.000 ng/ml, hvilket antyder et 9 blodpladeindhold på ca, 20.000 ng/10 celler.

35 DK 173787 B1

X J

Cellerne af den endotheliale matrix udgør en exogen kilde til fibronectin, von Willebrand-faktor og thrombospondin. Thrombospondin syntetiseres af endotheliale celler, glatte muskelceller, monocytter 5 og fibroblaster og inkorporeres i den subcellulære matrix. Undersøgelser med indre mærkning viser, at thrombospondin syntetiseres med en hastighed på ca.

4 10-71 ng/10 celler over et tidsrum på 18 timer som rapporteret af Raugi et al., "Thrombospondin: Synthesis 10 and Detection by Cells in Culture", J. Cell. Biol.

95, 351 (1982). Andre undersøgelser findes i Mosher et al.. "Synthesis and Secretion of Thrombospondin by Cultured Endothelial Cells”, J. Cell. Biol. 343 (1982) (i det følgende Mosher et a])., og i Jaffe et al., "Cultured Human 15 Fibroblasts Synthesize and Secrete Thrombospondin and Incorporate it into Extracellular Matrix", Proc. Natl.

Acad. Sci. (USA) , j30, 998 (1983) (i det følgende Jaffe et al. (1983)).

Thrombospondins rolle ved blodpladeaggregation er 20 ikke fuldstændig forstået, men det vides at være det molekyle på den stimulerede blodpladeoverflade der er ansvarligt for agglutinin-aktivitet. Dette er rapporteret af Jaffe et al., "Thrombospondin is the Endogenous Lectin of Human Platelets", Nature 295, 246 (1982) (i det 25 følgende Jaffe et al. (1982)).

Det antages, at thrombospondin spiller en rolle ved blodpladeaggregation via en vekselvirkning med fibrinogen, da fibrinogen kan støtte blodpladeaggragation i fraværelse af blodplade-sekretion, hvor thrombospondin ikke er til-30 gængeligt eller kun er tilgængeligt i begrænsede mængder i blodpladerne (f.eks. Gray-blodplader). I modsætning hertil har Nurden et al. imidlertid rapporteret "Inhibition of Thrombin-induced Platelet Aggregation of a Rabbit Antibody Against Human Platelet Thrombospondin", i 35‘ Thrombosis and Haemostosis, ^0, (Abst.) 401 (1983).

16 DK 173787 B1

Funktionen af thrombospondin syntetiseret af fibroblaster er også uklar. Ved anvendelse af muse--monoclonalt anti-thrombospodin og kanin-polyclonalt anti-thrombospondin har Jaffe et al. (1983) lokaliseret 5 thrombospondin til den fibrillære ekstracellulære matrix af dyrkede humane fibroblaster ved hjælp af iiranunofluorescens-mikroskopi. Det er rapporteret, at humane forhudsfibroblaster og fosterlungefibroblaster henholdsvis udskiller thrombospondin på en tidsafhængig 10 med en hastighed på ca. 15,7 og 5,8 pg pr. ΙΟ** oeller pr. 24 timers periode i kulturmediet som bestemt ved ensymbundet immunoabsorbensbestemmelse (i det følgende betegnet ELISA).

15 II. Generel diskussion

Med udtrykket "receptor" menes i den foreliggende beskrivelse et biologisk aktivt molekyle, som bindes til et antigen. Et receptormolekyle ifølge den foreliggende op- 20 findelse er et intakt antistof, et i det væsentlige intakt antistof eller en idiotype-holdig polypeptiddel af et antistof i i det væsentlige ren form, såsom i ascites- væske eller serum fra et immuniseret dyr.

Biologisk aktivitet af et receptormolekyle viser 25 sig ved binding af receptoren til antigen-liganden ved blanding af disse i et vandigt medium, i det mindste ved fysiologiske pH-værdier og ionstyrker. Fortrinsvis bindes receptorarne også til antigen-liganden indenfor et pH-værdiområde på ca. 5 til ca. 9 og ved ionstyrker fra 30 ionstyrken af destilleret vand til styrken af ca. 1 natriumchloridopløsning.

35 17 DK 173787 B1

Idiotype-holdige polypeptiddele (antistof-kombinerende steder) af antistoffer er de dele af antistofmolekyler, der indeholder ideotypen og bindes til liganden og omfatter Pab-, Fab'- og F(ab1)2~delene af antistofferne.

5 Fab- og F(ab1)2~delene af antistoffer er velkendte og fremstilles ved omsætning af henholdsvis papain og pepsin med i det væsentlige intakte antistoffer ved velkendte metoder, jfr. f.eks. US-patentskrift nr. 4.342.566.

Fab'-antistofdele er også velkendte og fremstilles 10 ud fra F (ab*) 2_clele efter reduktion af disulf idbindingerne, der forbinder de to tunge kædedele, f.eks. med mercaptoethanol og derefter alkylering af det fremkomne proteinmercaptan med et reagens som iodacetamid. Intakte antistoffer foretrækkes og vil blive anvendt til illu-15 strering af receptormolekylerne ifølge opfindelsen.

Anti-thrombospondin-receptorer, i det følgende betegnet anti-tSP, til anvendelse ved diagnosticering med billeddannelsesreagenset ifølge den foreliggende opfindelse, er monoclonale receptorer. En "monoclonal receptor" (Mab) er 20 en receptor produceret af doner af en enkelt celle betegnet et hybridom, som kun udskiller en art af receptormolekyle.

En "polyclonal" receptor (Pab) er en receptor, der produceres af doner afledt af forskellige celler, som udskiller forskellige antistoffer, der bindes til flere epitoper af det 25 immunogene molekyle.

Hybridomcellen fusioneres ud fra en antistofpro-ducerende celle og en myelomcelle eller en anden "udødelig" cellelinie. Sådanne receptorer blev først beskrevet af Kohler and Milstein, Nature 256, 495 (1975). Monoclonale 30 receptorer fås typisk fra hybridom-vævskulturer, hvilket er den foretrukne metode til fremstilling af en monoclonal receptor ifølge opfindelsen, eller alternativt fra ascitesvæske fra varmblodede værtsdyr, hvori hybridom-vævet er indført.

35 18 DK 173787 B1

Antistoffer udskilles af specialiserede celler, der betegnes B-celler (benmarv-afledte lymphocytter).

Hver B-celle udskiller en type af antistof, der har en enkelt specificitet, således at de forskellige antistoffer 5 med forskellige specificiteter hver især udskilles af forskellige B-celler. B-cellerne klones til dannelse af en kilde til antistofferne. Imidlertid dør B-cellerne i løbet af få dage i kulturmedier og skal gøres relativt "udødelige", således at der kan fås en forsyning af de ønskede 10 antistoffer. Dette opnås ved at fjerne B-cellerne fra dyret, typisk fra milten, fusionere B-cellerne med en cancercelle eller myeiomcelle til dannelse af en cellehybrid (betegnet en hybridom) og efterfølgende dyrkning af hybridomerne.

Begge metoder beskrives nedenfor. Til dannelse af et 15 hybridom, som producerer en monoclonal receptor, fusioneres en myelomcellelinie med en antistofproducerende celle, der producerer antistoffer, som reagerer med en blodpro-teinkomponent, såsom miltceller fra et pattedyr, der er •.mmuniseret med thrombospondin som immunogen.

20 Det foretrækkes, at myelomcellelinien er fra samme art som de antistofproducerende celler. Derfor anvendes der typisk fusionerede hybrider som muse-muse-hybrider (Shulman et al., Nature 276, 269 (1978)) eller rotte--rotte-hybrider (Galfre et al., Nature, 277, 131 (1979)).

25 Visse rotte-muse-hybrider er Imidlertid også blevet anvendt med held til dannelse af hybridomer [Goding, "Production of Monoclonal Antibodies by Cell Fusion",

Antibody as a Tool, Marchalonis et al. eds., John Wiley & Sons Ltd., 273-289 (1982), i det følgende Marchalonis 30 et al.]. Egnede myelom-linier til anvendelse ved den foreliggende opfindelse omfatter MPC-11 (ATCC CRL 167), P3X63-Ag8.653 (ATCC CRL 1580), Sp 2/0-Agl4 (ATCC CRL 1581), P3X6 3Ag8U.1 (ATCC CRL 1597), Y3-Agl.2.3 (deponeret hos Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Paris, 35 Frankrig, nummer 1-078) og P3X63Ag8 (ATCC TIB9). Myelom- -linie X63.657 er foretrukket til anvendelse ved den foreliggende opfindelse.

19 DK 173787 B1

Monoclonale anti-thrombospondin-receptorer (anti-TSP- -receptorer) dannes som beskrevet i den foreliggende beskrivelse ud fra muse-myeloma-linier. De monoclonale anti- TSP-reagenser har fået følgende betegnelser til reference-5 formål og er deponeret hos American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland den 12. december 1984 under følgende deponeringsnumre:

Monoclonale ATCC-Deponeringsnummer 10 TSP 1-1 (14E7) HB 8680 TSP 1-2 (9D7) HB 8681

Receptorer anvendes sammen med et indikatormærknings-middel eller "indikerende gruppe" eller "mærkestof". Den 15 indikerende gruppe eller mærkestoffet anvendes sammen mec receptoren som middel til bestemmelse af stedet for et specifikt celleoverflade-udtrykt antigen og i nogle tilfælde til bestemmelse af omfanget af en reaktion mellem receptoren og antigenet.

20 Udtrykkene "indikatormærkningsmiddel", "indikerende gruppe " eller "mærkestof" omfatter i den foreliggende beskrivelse enkeltatomer og molekyler, der er bundet til receptoren eller anvendes separat, og hvadenten disse atomer eller molekyler anvendes alene eller sammen med yder-25 ligere reagenser. Sådanne indikerende grupper eller mærkestoffer er i sig selv velkendte inden for immunokemien og udgør kun en del af den foreliggende opfindelse, for så vidt de anvendes sammen med i øvrigt hidtil ukendte receptorer, fremgangsmåder og/eller systemer.

30 Indikatormærkningsmidlet kan være et fluorescensmærk ningsmiddel, som bindes kemisk til antistoffer eller antigener uden denaturering af disse til dannelse af et fluo-rochrom (farvestof), som er et anvendeligt immunoflucres-cens-sporstof. Egnede fluorescensmærkningsmidler er sådanne 35 fluorochromer som fluorescein-isocyanat (FIC), fluorescein- 20 DK 173787 B1 -isothiocyanat (FITC), dimethylamino-naphthalen-S-sulfo-nylchlorid (DANSC), tetramethylrhodamin-isothiocyanat (TRITC), lissamin, rhodamin-B200-sulfonylchlorid (RB 200 SC) og lignende. En beskrivelse af immunofluorescens-ana-5 lysemetoder findes i Marchalonis et al., "Immunofluorescence Analysis", s. 189-231.

Den indikerende gruppe kan også være et enzym, såsom peberrods-peroxidase (HRP) eller glucoseoxidase eller lignende. Når den væsentlige indikerende gruppe er et enzym, 10 såsom HRP eller glucoseoxidase, kræves yderligere reagenser til at vise, at der er dannet et receptor-ligand-kom-pleks. Sådanne yderligere reagenser for HRP omfatter hy-drogenperoxid og en oxidationsfarvestof-forløber, såsom diaminobenzidin. Et yderligere reagens, som er anvendeligt 15 sammen med glucoseoxidase, er 2,2'-azino-di-{3-ethylbenz-thiazolin-6-sulfonsyre) (ABTS).

Et særligt foretrukket fluorescensmærkningsmiddel er fluorescein-isothiocyanat. Cellebundet fluorochrom bestemmes ved fluorescens-mikroskopi under anvendelse af 20 et apparat til sortering af aktiverede celler (FACS), såsom det, der sælges af Ortho Diagnostics, Westwood, Ma. Udtrykkeisen af blodproteinantigen på den ydre celleoverflade af aktiverede blodplader forøger fluorescein-fluo-rescens-intensiteten på grund af bindingen af en mærket 2® receptor ifølge opfindelsen som beskrevet nedenfor.

Et eksempel på et radiomærkningsmiddel er et radioaktivt grundstof, som udsender gammastråler. Grundstoffer, som selv udsender gammastråler, såsom i?4I, 1251, 1281, 1311, 1321 og 51Cr, udgør en klasse af indikerende grupper 30 af radioaktive grundstoffer, der giver udsendelse af gammastråler. Særlig foretrukket er 125j. En anden klasse af anvendelige indikerende grupper er de grundstoffer, såsom 11C, 18F, 150 og 13N, som selv udsender positroner. De således udsendte positroner danner gammastråler, når de 35 møder elektroner, som er til stede i dyrets krop. Anven- 21 DK 173787 B1 delige er også grundstoffer, der udsender (3-stråling, såsom 111-indium.

En foretrukket, radioaktivt mærket monoclonal receptor kan fremstilles ved dyrkning af hybridomceller i 5 et medium indeholdende radioaktive aminosyrer, som det er velkendt, samt ved isolering af den monoclonale receptor og efterfølgende mærkning af den monoclonale receptor med et af de ovenfor anførte radioaktive grundstoffer som beskrevet i US-patentskrift nr. 4.381.292.

10 En radiomærket receptor, såsom anti-TSP eller en idiotype-holdig polypeptiddel deraf indføres derefter, f.eks. ved injektion, i blodbanen hos et pattedyr, som har en karsygdom, især en arteriel thrombose eller en karvægsbeskadigelse. Den mærkede receptor danner et kompleks med 15 thrombospondinet på den ydre celleoverflade af thrombin-stimulerede aktiverede blodplader, og disses steder kan bestemmes efter et passende forudbestemt tidsrum (ca. 18 til ca. 24 timer) for at muliggøre fjernelse af ikke--bundet mærket receptor fra kroppen.

20 Pattedyret sfcannes med en aammastråleemissionsdetek tor, såsom den aksiale tomocrafiske scanner, der kan fås kommercielt under betegnelsen CT (80-800 CT/T) fra General Electric Company (Milwaukee, WI), eller med en positrons-emissions-transaksial tomografi-scanner, såsom apparatet 25 betegnet Pett VI, der findes på Brookhaven National Laboratory. En sådan scanning giver et billede af de aktiverede blodplader samt information om stederne og størrelserne af blodkoageler eller beskadiget blødt væv på grund af specificiteten af den anvendte radiomærkede receptor.

30 Ifølge en anden udførelsesform kan en receptor mærkes med en indikerende gruppe, der indeholder et grundstof, som er aktivt ved kernemagnetisk resonansspektroskopi (NMR), dvs. et NMR-aktivt grundstof. Mange af sådanne grundstoffer er kommercielt tilgængelige foruden de mere sædvanlige 35 13C, 15M, 19F og lignende.

22 DK 173787 B1

Det er sarligt foretrukket at anvende en indikerende gruppe indeholdende det NMR-aktive 19F-atom eller en flerhed af sådanne atomer, for så vidt som (i) i det væsentlige 19 alle de naturligt forekommende fluoratomer er F-isotopen, 5 og således i det væsentlicre alle fluorholdiae forbindelser er NMR-aktive, (ii) mange kemisk aktive polyfluorerede forbindelser, såsom trifluoreddikesyreanhydrid, er kommerciel tilgængelige til relativ lav pris, og (iii) mange fluorerede forbindelser har vist sig at være medicinsk acceptable 10 til anvendelse på mennesker, såsom perfluorerede polyethere, der anvendes til at bære oxygen som haanoglobinerstatninger.

En anden særlig fordel ved anvendelsen af fluorholdige NMR-aktive indikerende grupper er, at en pattedyrkrop indeholder megét lidt fluor under normale betingelser. Ved an-15 vendelse af et NMR-aktivt grundstof, som ellers i det væsentlige ikke er til stede i pattedyret, er baggrundssignaler på grund af fluoratcmer i kroppen følgelig i alt væsentlige fraværende. Hovedsignalerne, der observeres, skyldes således et mærket receptor-blodproteinkomponent-kompleks.

20 Ifølge en udførelsesform mærkes en receptor, såsom an- ti-TSP, fortrinsvis med et fluorholdigt materiale, såsom tri-fluoreddikesyreanhydrid eller hexafluorethanol, til dannelse åf henholdsvis et fluoreret amidderivat eller esterderivat. Derefter indføres den fluorerede receptor, f.eks. ved injek-25 tion, i blodstrømmen hos et pattedyr, der har en karskade. Efter en forudbestemt inkuberingstid til dannelse af et kompleks af den mærkede receptor med udtrykt thrombospondin på den aktiverede blodpladeoverflade og til fjernelse af eventuelt ikke kompleksbundet receptor fra kroppen gennemføres 30 en såkaldt '’helkrop " -NMR-bestemmelse ved anvendelse af et aooarat som et af de, der er'beskrevet af Pykett, Scientific American, 246, 78 (1982) til lokalisering og billeddannelse af aktiverede blodplader.

Indikerende midler eller mærkestoffer, som er radio-35 aktive i sig selv, såsom de ovenfor nævnte gammastråle-, 23 DK 173787 B1 betastråle- og positronemittere, og de NMR-aktive grundstoffer anvendes fortrinsvis i kroppen hos pattedyret, der skal undersøges, og de kan således betegnes in vivo-mærkestoffer eller -indikeringsmidler. De mere generelle udtryk "indi-5 keringsmiddel'?, "indikerende gruppe” og "mærkestof" anvendes i den foreliggende beskrivelse, hvor et in vivo-mærke-stof eller et mærkestof, som er mindre anvendeligt i kroppen hos det undersøgte dyr, såsom et fluorochrom-farvestof eller enzym, tilsigtes anvendt.

10 Det indikerende middel kan være bundet til receptoren, f.eks. når et antistof er mærket med 1251. Midlet kan også udgøre al indikator eller en del af et separat molekyle eller atom, som reagerer med receptormolekylet, såsom HRP bundet til kanin-anti-muse-antistoffer, hvor antistofrecep-15 toren er dannet hos en mus, eller hvor et radioaktivt grundstof, såsom 1251, er bundet til protein A fra Staphyloccus aureus.

Et indikatormærkninosmiddel leveres fortrinsvis sammen med recentoren οσ kan emballeres sammen med denne eller 20 emballeres senarat. Yderligere reagenser, såsom hydrogen-peroxid og diaminobenzidin, kan også inkluderes i systemet, når der anvendes en indikerende gruppe, såsom HRP. Sådanne materialer er let tilgængelige i handelen, lige så mange indikerende grupper, og behøver ikke at blivere leveret sam-25 men med det diagnostiske system. Desuden kan visse reagenser, såsom hydrogenperoxid, sønderdeles ved henstand eller er på anden måde kortlivede, som visse radioaktive grundstoffer, og det er bedre, at disse tilvejebringes af brugeren.

30 De ovenfor anførte fremgangsmåder til påvisning af stedet for aktiverede blodplader in vivo i et pattedyr omfatter således følgende trin: (a) Tilvejebringelse af et præparat, der indeholder en effektiv mængde af en receptor ifølge den foreliggende 35 opfindelse, hvor receptoren, såsom anti-TSP/ er bundet til 24 DK 173787 B1 en in vivo-indikerende gruppe. Typiske præparater indeholder ca. 1 til ca. 100 mg af den mærkede receptor i et vandigt, fysiologisk acceptabelt medium, såsom vand alene, en vandig saltopløsning, phosphatpufret saltopløsning (PBS) el-5 ler en anden vandig pufferopløsning. Den anvendte mængde receptor afhænger bl.a. af pattedyret, den karstimulerende begivenhed og klassen af receptor, når der anvendes et intakt antistof. Anvendelige indikerende grupper omfatter grundstoffer, som udsender gammastråler, NMR-aktive grund-10 stoffer og lignende som ovenfor anført.

(b) Det således dannede præparat indføres f.eks. ved injektion i blodstrømmen hos et pattedyr, der skal undersøges for tilstedeværelsen af aktiverede blodplader, som produceres ved en thromtodisk karstimulerende begivenhed.

15 (c) Pattedyret, som har modtaget denne injektion, holdes i et forudbestemt tidsrum, som er tilstrækkeligt til, at receptoren, som er forsynet med indikerende grupper imærket), danner et kompleks på overfladen af de aktiverede blodplader, og eventuelt ikke-kompleksbundet mærket recep-20 tor fjernes fra kroppen.

(d) Pattedyret scannes derefter med en anordning til påvisning af placeringen af den kompleksbundne, mærkede receptor. Typiske detektionsanordninger omfatter sædvanligt anvendte g^mmastråleemissionsdetektorer,' maskiner, som an-25 vendes ved positronsemissions-tomografi, og såkaldte "helkrop"-NMR-spektrometre, som i praksis kun kan scanne en del af kroppen ad gangen.

Den foreliggende opfindelse angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af en receptor ifølge opfindelsen, 30 en bestemmelsesmetode med anvendelse af en sådan receptor og et diagnostisk system, som omfatter en receptor ifølge opfindelsen i emballeret form. Den følgende diskussion beskriver flere specifikke, illustrerende udførelsesformer for den foreliggende opfindelse med hovedvægt på særligt fore-35 trukne receptorer, deres fremstilling og anvendelse som eksempler på den mere generelle opfindelse.

25 DK 173787 B1 III. Specifikke udførelsesformer

A. Dannelse af monoclonalt anti-TSP

Humant blodplade-thrombospondin frigøres fra et 5 1-3 dage gammelt blodpladekoncentrat, der fås fra blod- pladekoncentrat ved at aktivere blodpladerne med thrombin, isolere throxnbospondinet og rense det som beskrevet af Lawler et al., J. Biol. Chem. 2_3, 8609 (1978). Kort fortalt isoleres stabilt opløseligt thrombospondin i fysio- 10 logisk saltopløsning ved en kombination af eksklusions- og affinitetschromatografi. Renheden af præparatet af thrombospondin (TSP) er større end 95% som bestemt ved isoelek-trisk fokusering og natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgel--elektroforese (SDS-PAGE).

15 Monoclonalt anti-TSP dannes ved anvendelse af standard- -hybridomteknikken ifølge Kohier et al., Nature, 256, 495 (1975). Kort fortalt immuniseres PAL3/c-mus ved intra-peritoneal injektion med ca. 25^,ug pr. mus af thrombo-spondinpræparatet emulgeret i komplet Freund's adjuvans.

20 Musene genimmuniseres med 25^,ug af thrombospondinpræparatet i et lige så stort volumen ukomplet Freund's adjuvans på dagene 14, 26, 36 og 47.

Derefter afblødes hver mus fra den retroorbitale plexus. De opnåede sera screenes for anti-thrombospondin- 25 -antistoffer ved anvendelse af en fastfase-radioimmuno- 125 bestemmelse med I -gede-anti-muse-immuhoglobulin (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO) som antistof-identifi-cerende middel og 2,5^,ug pr. ml thrombospondin som overtræk på hvert hul som fastfase-antigen.

30 De to mus med de højeste titere af anti-TSP-anti- stoffer udvælges til yderligere immunisering og genimmuniseres på dag nr. 90 efter den første immunisering med 20^ug af TSP-præparatet intravenøst og 20^,ug af TSP-præ-paratet intraperitonealt. Musene immuniseres igen på dag 35 nr. 93 med 40^ug af thrombospondinpræparatet, og musen med 26 DK 173787 B1 den højeste titer af anti-TSP-antistoffer udvælges til cellefusionen .

Musen aflives tre dage efter den sidste immunisering.

Milten hos denne mus fjernes, og miltcellerne isoleres og 5 suspenderes i et egnet medium. Denne eksperimentelle teknik er velkendt. Et egnet medium er HAT (hypoxanthin, aminopterin og thymidin) og ca. 1 ml medium pr. milt er tilstrækkeligt. Et andet egnet medium er Dulbecco's Modified Eagle's Medium indeholdende 10% kalvefosterserum (CFS).

g 10 Miltcellerne pooles, hvorved der fås 1,5 x 10 totale celler. Cellerne fusioneres derefter med en ikke-fusioneret muse-myelom-cellelinie X63.657 i nærværelse af et egnet cellefusions-fremmende middel, hvorved der fås et præparat, som indeholder ikke-fusion<rede miltceller, ikke-fusionerede 15 myelomceller og fusionerede hybridomceller. Et egnet fusionsfremmende middel er en polyethylenglyeol (PEG) med en molekylvægt fra ca. 1000 til ca. 4000 (tilgængelig i handelen som PEG 1000 og PEG 4000 fra Sigma Chemical Co., S t. Louis , MO) .

20 Et totalt volumen på ca. 0,5-1,0 ml fusionsmedium

O

er typisk passende til 10 miltceller fusioneret med ca.

3 x 107 myelomceller. Et foretrukket forhold er ca. 1 mye-lomcelle pr. 10 miltceller som beskrevet af Curtiss et al., J. Biol. Chem. 257, 15213 (1982).

25 Mange muse-myelomcellelinier er kendte og kan fås fra forskellige deponeringsinstitutioner, såsom Salk Institute Cell Distribution Center, La Jolla, ca. Ifølge accepteret praksis bør muse-myelomcellelinien fortrinsvis være af den såkaldt lægemiddelresistente type, således at 30 ikke-fusionerede myelomceller ikke overlever i et selektivt medium, medens hybrider overlever. Den mest almindelige klasse er 8-azaguanin-resistente cellelinier, som mangler enzymet hypoxanthin-guanin-phosphoribosyl-trans-ferase og derfor ikke vil overleve i HAT-medium.

35 27 DK 173787 B1

Blandingen af ikke-fusionerede miltceller, ikke--fusionerede myelomceller og fusionerede celler fortyndes og dyrkes i separate beholdere i det selektive HAT--medium i et tilstrækkeligt tidsrum (ca. 10-14 dage) 5 til, at de ikke-fusionerede celler dør. Udtrykket "beholder" refererer her især til et hul i en mikrotiter-plade eller vævskulturplade, selv om andre egnede beholdere også kan anvendes.

Nærmere bestemt udplades levedygtige celler tre 10 dage efter fusionen i 96-huls vævskulturplader med 4 2 x 10 levedygtige celler pr. hul (i alt ca. 3.500 huller) i HAT-medium. De udpladede celler fødes 7 dage efter fusionen med HAT-medium og med intervaller på ca.

4-5 dage derefter efter behov. Væksten følges mikrosko-15 pisk, og ovenstående væske fra kulturen, som indeholder antistoffer, opsamles på dag nr. 14 efter fusionen til bestemmelse af produktionen af antigenspecifikt antistof ved fastfase-radioimmunobestemmelse (RIA). På dag nr. 14 indeholder 700 af de 3.500 huller kolonier af 20 levedygtige celler.

25 huller eller mindre end 1% af de ovenstående væsker fra kulturen reagerer med humant thrombospondin (indeholder anti-TSP) som målt ved fastfase-immunobestem-melse under anvendelse af gede-anti-muse-immunoglobulin.

25 Seks af disse 25 huller (betegnet 9D3, 11F3, 14E7, 9D7, 11D7 og 13F5) udvælges 22 dage efter fusionen til differential screening, dvs. ingen reaktion med normale humane hvilende blodplader, men god reaktion med humane aktiverede blodplader, og reclones ved grænsefortynding, 30 hvorved volumenet af fortyndingsmiddel beregnes statistisk til isolering af et vist antal celler (f.eks. 1-4) i hver separat beholder (f.eks. hvert hul i en mikrotiterplade).

Efter et passende tidsrum til hybridomvækst og antistofudskillelse (14-28 dage) vurderes de fremkomne 35 ovenstående væsker i hver beholder for isotypen af det 28 DK 173787 B1 udskilte anti-TSP med et Litton Bionetics Kit (Litton Bionetics, Kensington, MD) som beskrevet i instruktionerne til sættet. Den ønskede hybridom udvælges, og anti-TSP udvindes fra den ovenstående væske fra kulturen.

5 Clonede hybridomer dyrkes i et medium indeholdende 10% kalvefosterserum (FCS) og opbevares i frosset tilstand i flydende nitrogen som beskrevet af Kennedy et al.,

Diabetes yi (Suppl. 3), 52 (1982).

Når den ønskede hydridom er udvalgt og clonet, kan 10 det resulterende antistof fremstilles på en af to måder.

Det mere rene monoclonale antistof fremstilles ved dyrkning in vitro af den ønskede hybridom i et egnet medium i et passende tidsrum efterfulgt af udvinding af det ønskede antistof fra den ovenstående væske. Et egnet medium og en i5 egnet dyrkningstid er kendt eller kan let bestemmes. In vitro- teknikken giver receptorer, som i det væsentlige er frie for andre specifikke immunoglobuliner, som immunoreagerer med et humant-afledt antigen (anti-humant immunoglobulin) .

Der er en lille mængde af andre immunoglobuliner til stede, 20 fordi mediet indeholder eksogent serum (f.eks. kalvefosterserum) . Denne fremgangsmåde in vitro giver imidlertid eventuelt ikke en tilstrækkelig mængde eller koncentration af antistof til visse formål.

Til produktion af en meget større koncentration af 25 antistof med en lidt lavere renhed kan den ønskede hybridom injiceres i pristanbehandlede (Aldrich Chem. Co., Milwaukee, WI) mus, fortrinsvis mus, som er syngene eller semi-syngene med musen, hvorfra miltcellerne blev isoleret. Hybridomet bevirker dannelse af antistof-producerende tumorer efter en 30 passende inkuberingstid, hvilket medfører en relativ høj koncentration af det ønskede antistof i blodbanen og det peritoneale ekssudat (ascitesvæske) hos værtsmusen. Selv om disse værtsmus også har normale antistoffer i deres blod eller ascitesvæske, er koncentrationen af disse nor-male antistoffer kun ca. 5% af koncentrationen af mono-clonalt antistof. Da disse normale antistoffer overvejende 29 DK 173787 B1 ikke har en anti-human specificitet, er de monoclonale antistoffer fra den udvundneascitesvæske eller fra serum endvidere i det væsentlige fri for eventuelt forurenende anti-humant immunoglobulin.

5 De tunge og lette kæder af immunoglubolinet i anti stofferne udskilt af de clonede hybridomer typebestemmes ved anvendelse af et Mono AB-ID EIA Kit A (Lot Number 20920, Zymed Labs Inc., San Francisco, CA). Bestemmelserne gennemføres med ovenstående væske fra hybridomkulturer io som beskrevet af producenten.

Der tilvejebringes ascitesvæske ved hjælp af fem af de ovenfor anførte seks cellelinier (9D3, 11F3, 14E7, 9D7 og 11D7). For alle antistofferne undtagen antistofferne fra 9D3 observeres der et enkelt bånd ved celluloseacetat-15 -elektroforese, hvilket bekræfter monoclonaliteten yderligere.

Ved 9D3 observeres der tre bånd. Af denne grund sub-clones denne cellelinie, og der tilvejebringes ascitesvæske fra to af de oprindelige doner og to af subclonerne.

20 i alle tilfælde observeres der det nævnte mønster af tre bånd, hvilket antyder, at denne linie også er monoclonal.

De tre bånd skyldes formentlig en rekombination af de tunge og lette kæder af antistoffet med myelomproteiner produceret af udgangs-myelomlinien.

25 Cellelinien 14E7 (ATCC HB 8680) typebestemmes som producerende et IgG~ -antistof (Mab TSP 1-1) med en kappa- 6 α -let kæde ved Ouchterlony-immunodiffusion. Mab TSP 1-1 har en titer ved fastfase-radioimmunobestemmelse (som be- g skrevet i afsnit III C) mod humant thrombospondin på 10 , 30 og det reagerer ikke med humant fibrinogen eller fibronec-tin. Desuden udviser Mab TSP 1-1 et enkelt hovedbånd med gamma-mobilitet ved celluloseacetat-elektroforese. På "Western blots" af renset thrombospondin eller humane blodplader reagerer antistoffet med et enkelt polypeptid med 35 en tilsyneladende molekylvægt af underenheden på 180.000 30 DK 173787 B1 dalton, hvilket stemmer overens med den kendte underenheds -molekylvægt af thrombospondin. Ved immunofluorescens-farvning (se afsnit III D ¢1)) farver antistoffet blod-plade-a-granuler, som vides at være opbevaringsstedet 5 for thrombospondin.

Cellelinie 9D7 (ATCC HB 8681) producerer et mono-clonalt antistof betegnet Mab TSP 1-2, som udviser lignende egenskaber som Mab TSP 1-1, men gengælder en særskilt epitop.

10 C. Fastfase-radioimmunobestemmelse (RIA)

Bestemmelserne gennemføres i fleksibel rundbundede polyvinylchlorid-mikrotiterplader (Falcon, Micro Test III, Becton Dickinson & Co., Oxnard, California). Hullerne overtrækkes med thrombospondin-antigen ved tilsætning af 15 0,05 ml thrombospondin i PBS og inkubering af pladerne i 3 timer ved stuetemperatur, således at der fås en konstant slutkoncentration af fastfase-bundet antigen. Alle antigener overtrækkes med l^ug pr. ml. Hullerne efterover-trækkes i 30 minutter med 0,25 ml PBS indeholdende 3% 20 kvægserumalbumin (BSA) og 3% normalt gedeserum til blokering af de tilbageværende aktive steder.

Til bestemmelserne fortyndes vandige medier indeholdende 0,05 ml museserum eller ovenstående væske fra hybridomkultur til 0,25 ml med en opløsning af PBS inde-25 holdende 3% BSA, 3% gedeserum og 0,05% polyoxyethylen-- (20)-sorbitanmonolaurat ("TWEEN-20") sættes til hvert hul til kontaktering af det fastfase-bundne antigen og dannelse af en blanding af fast fase og væskefase. Blandingen af fast fase og væskefase holdes (inkuberes) i et 30 tilstrækkeligt tidsrum til, at anti-TSP-antistofferne, som er til stede i serum eller ovenstående væske, immu-noreagerer med antigenet (18 timer ved 4°C). Den faste og -den flydende fase adskilles, og den faste fase vaskes.

Efter vaskning påvises immunoreageret muse-antistof, 35 dvs. antistof, som er bundet til fastfase-antigenet, ved 31 DK 173787 B1 blanding med et præparat indeholdende 10 ng pr. hul af immunokemisk renset, radioioderet gode-anti-museimmuno-globulin (3-4 uCi/Mg)til dannelse af en anden blanding af fast og flydende fase. Den anden blanding af fast og 5 flydende fase holdes i et tilstrækkeligt tidsrum til, at gede.-anti-museantistofferne immunoreagerer med og bindes til eventuelt tilstedeværende fastfase-bundet antistof, f.eks. i 4 timer ved 4°C som beskrevet af Curtiss et al., se ovenfor.

>0 Den anden blanding af fast og flydende fase adskil les, og den fraskilte faste fase vaskes typisk til fjernelse af eventuelt vedhæftende, ikke-specifikt bundet radioioderet gede-anti-muse-antistof. Mængden af gede--anti-muse-antistoffer bundet til den faste fase bestem-15 mes derefter, og titerne fås ved anvendelse af velkendte standardmetoder.

Kompetitive bestemmelser gennemføres på lignende måde og indeholder 0,025 ml kompetetitor fortyndet i PBS indeholdende 3% kvægserumalbumin, 3% gedeserum og 20 0,05% "TWEEN-20" og 0,025 ml ovenstående væske fra kul tur indeholdende begrænsende mængder af monoclonalt antistof. Ikke-specifik binding bestemmes ved at erstatte specifikke ovenstående væsker fra hybridomkultur med lignende fortyndinger af ovenstående væske fra kultur af 25 ikke-relaterede hybridomer, som producerer imnunoglo-buliner med den samme type tung kæde.

Den maksimale mængde 125 I-(andet antistof) bundet af specifikt antistof (Bq) bestemmes i fraværelse af kompetitor. Resultaterne beregnes som B/BQ, hvor B be-30 tyder det gennemsnitlige antal tællinger pr. minut af antistof bundet ved en given koncentration af kompetitor.

Et monoclonalt kontrol-antistof er anti-apolipoprotein B.

35 32 DK 173787 B1 D . Fremstil li Jig af billeddannelsesreagens.

1) Fluorescensprocedure.

Immunofluorescens-farvning gennemføres på blodplader fikseret med 2% formaldehyd på polylysinovertrukne 5 cirkulære dækglas. Cellerne behandles i ca. 3 minutter med 0,1% "Triton X-100" for at gøre dem permeable for antistof og inkuberes i ca. 20 minutter med anti-TSP-antistof. Cellerne skylles med PBS og farves i ca. 20 minutter med rhodamin-mærket kanin-F (ab') 2-anti-gf»de*'immunoglobulin 10 (Cappel Laboratories, Cochranville, PA). Blodpladerne betragtes med et Zeiss-universalmikroskop udstyret med en HBO 50W kviksølvlampe og en IVFI epifluorescens-konden-sator (Carl Zeiss, Inc., New York).

2) Radiomærkningsprocedure.

15 Anti-TSP-antistof radiomærkes med 1251 til en spe cifik aktivitet på ca. 0,5^,uCi^ug, og en dobbelt anti-stof-radioimmunobestemmelse gennemføres i det væsentlige som beskrevet af Plow et al., J.. Immunol 107, 1495 (1971).

Bestemmelserne gennemføres i siliconebehandlede 20 plastrør ved ca. 22°C med 1251-mærket antistof ved en slutkoncentration på ca. 15 ng/ml i en puffersystem af 0,025 M natriumchlorid, 0,04 M natriumborat og 1 mM EDTA ved en pH-værdi på ca. 8,3.

E. Diagnostiske systemer.

25 Et diagnostisk system, fortrinsvis i form af et sæt, udgør endnu en udførelsesform for opfindelsen. Dette system er anvendeligt til at påvise og skelne mellem aktiverede og hvilende blodplader i blod med celleoverflade--udtrykt blodproteinkomponent. Dette system omfatter mindst 30 én emballage, som indeholder en effektiv mængde af en biologisk aktiv receptor ifølge opfindelsen, dvs. en receptor, som bindes til aktiverede blodplader, men ikke til hvilende blodplader.

En forudbestemt mængde af receptoren blandes med en 35 forudbestemt mængde af blodpladeholdig blodprøve i nær- 33 DK 173787 B1 værelse af et passende indikerende middel. Blandingen holdes i et tilstrækkeligt tidsrum til, at receptoren immu-noreagerer med aktiverede blodplader som kan være til stede i prøven, dvs. blandingen holdes i tilstrækkelig tid til, 5 at der dannes et kompleks mellem receptoren og det celle-overflade-udtrykte protein, som receptoren er dannet mod.

Det indikerende middel anvendes til at vise dannelsen af komplekset, efter at blodpladerne er blevet skilt fra den resterende prøve.

10 En vandig opløsning af receptoren i hybridom-oven- stående væske, ascitesvæske eller puffer kan blandes med indikatormærkningsmidlet og derefter blandes som flydende reagens med blodprøven. Alternativt kan reagenset påføres som overtræk på væggene af en mikrotiterplade og derefter 15 blandes med en thrombinstimuleret blodprøve, eller den thrombinstimulerede blodprøve kan påføres som overtræk på mikrotiterpladevægge eller på et nitrocelluloseark eller kan være til stede i ovenstående væske fra vævssnit-hy-bridomer, ascitesvæske eller en pufferopløsning indehold-20 ende reagenset blandet dermed.

Resultaterne omtalt i den foreliggende beskrivelse er opnået med monoclonale antistoffer produceret af hy-bridomerne ATCC HB 8680 og HB 8681 ifølge opfindelsen.

25 30 35

Claims (22)

1. 2. Hybridoma med ATCC-deponeringsnummeret HB 8681, som producerer en receptor, som immunoreagerer med thrombospondin.
2. 3. Hybridoma ifølge krav l, kendetegnet ved, at det er i et næringsmedium.
3. 4. Hybridoma ifølge krav 2, kendetegnet ved, at det er i et næringsmedium.
4. 5. Receptor, som immunoreagerer med thrombospondin, produceret af hybridomaet ATCC HB 8680.
5. 6. Receptor, som immunoreagerer med thrombospondin, 15 produceret af hybridomaet ATCC HB 8681.
6. 7. Diagnostisk stedspecifikt billeddannelsesreagens omfattende en receptor produceret af et hybridoma valgt blandt hybridomaerne ifølge krav 1 eller 2 og indicerende middel, der mærker receptoren, hvorved receptoren er i stand 20 til selektiv binding til en blodplade i en stimuleret tilstand, men er i det væsentlige ikke-bindende til en ikke-stimuleret blodplade.
7. 8. Reagens ifølge krav 7, hvor det indicerende middel er et fluorescerende mærkningsmiddel.
8. 9. Reagens ifølge krav 7, hvor det indicerende middel er et radiomærkningsmiddel.
9. 10. Reagens ifølge krav 7, hvor det indicerende middel er 111-indium. II. Reagens ifølge krav 7, hvor det indicerende middel 30 er 125-iod.
10. 12. In vitro-metode til påvisning og skelnen mellem stimulerede blodplader og ikke-stimulerede blodplader, kendetegnet ved følgende trin: a) blanding af en blodpladeholdig prøve med det diagno- 35 stiske stedspecifikke billeddannelsesreagens ifølge krav 7, DK 173787 B1 b) bibeholdelse af blandingen i et tidsrum, som er til strækkeligt til, at reagenset immunoreagerer med eventuelt tilstedeværende stimulerede blodplader til dannelse af et kompleks, og 5 c) bestemmelse af tilstedeværelsen af et kompleks og dermed stimulerede blodplader ved hjælp af et signal fra det indicerende middel af reagenset.
11. 13. Metode ifølge krav 12, kendetegnet ved, at de stimulerede blodplader er thrombin-stimulerede.
12. 14. Diagnostisk system til påvisning af en thrombe in vivo hos et pattedyr, i form af et sæt indeholdende i i det mindste én pakning en effektiv mængde anti-thrombospondin- receptorer mærket med et in vivo-indicerende middel, hvor receptorerne er i stand til at binde til en blodplade i en 15 stimuleret tilstand, men er i det væsentlige ikke-bindende til en ikke-stimuleret blodplade.
13. 15. Diagnostisk system ifølge krav 14, hvor anti-thrombospondin-receptorerne er sådanne produceret af hybrido-maet ATCC HB 8680. 2 0 16. Diagnostisk system ifølge krav 14, hvor anti- thrombospondin-receptorerne er sådanne produceret af hybrido-maet ATCC HB 8681.
14. 17. Diagnostisk system ifølge ethvert af kravene 14- 16, hvor anti-thrombospondin-receptorerne er i en vandig 25 puffer.
15. 18. Diagnostisk system ifølge ethvert af kravene 14- 17, hvor det indicerende middel indeholder et NMR-aktivt element, som ellers er i det væsentlige fraværende fra pattedyret, som diagnosticeres for en thrombe.
16. 19. Diagnostisk system ifølge krav 18, hvor det indicerende middel er valgt blandt 13C, Qg 19f.
17. 20. Diagnostisk system ifølge ethvert af kravene 14-17, hvor det indicerende middel er 111-indium.
18. 21. Anti-thrombospondin-receptor ifølge krav 5 og 6 35 til anvendelse ved en metode til diagnosticering, hvilken metode omfatter påvisning og skelnen mellem stimulerede DK 173787 B1 blodplader og ikke-stimulerede blodplader, hvorved receptoren, er mærket med indicerende middel og er i stand til at binde til en blodplade i en stimuleret tilstand, men er i det væsentlige ikke-bindende til en ikke-stimuleret blodplade.
19. 22. Anvendelse af anti-thrombospondin-receptor ifølge krav 5 og 6 ved fremstilling af et reagens til anvendelse ved en metode til påvisning af tilstedeværelsen af en thrombe hos et pattedyr, hvor anti-thrombospondin-receptorerne er mærket med et in vivo-indicerende middel og binder til en 10 blodplade i en stimuleret tilstand, men i det væsentlige ikke binder til en ikke-stimuleret blodplade, hvilken metode omfatter følgende trin: a) intravenøs injektion i et pattedyr af en effektiv mængde af receptorerne, 15 b) bibeholdelse af pattedyret i et forudbestemt tidsrum, som er tilstrækkeligt til, at receptorerne reagerer med thrombospondin, som er til stede i pattedyret på overfladen af blodplader i en thrombe og danner et kompleks, og 20 c) bestemmelse af tilstedeværelsen af eventuelt dannet kompleks i trin b).
20. 23. Anvendelse af anti-thrombospondin-receptorer ifølge krav 22, hvorved receptorerne er sådanne produceret af hybridomaet ATCC HB 8680.
21. 24. Anvendelse af anti-thrombospondin-receptorer ifølge krav 22, hvorved receptorerne er sådanne produceret hybridomaet ATCC HB 8681.
22. 25. Anvendelse af anti-thrombospondin-receptorer ifølge krav 22-24, hvorved metoden yderligere omfatter, at 30 dyret, der har modtaget en injektion og bibeholdes som anført i trin b) til bestemmelse ifølge c), bibeholdes i et forudbestemt tidsrum, som er tilstrækkeligt til, at eventuel ikke-komplekseret mærket receptor fjernes fra dyrets krop. 35