KR20160035065A - 다중특이성 항체, 다중특이성 활성화 가능한 항체 및 그의 사용 방법 - Google Patents

다중특이성 항체, 다중특이성 활성화 가능한 항체 및 그의 사용 방법 Download PDF

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KR20160035065A
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헨리 버나드 로우만
제임스 윌리엄 웨스트
포트 쉐리 린 라
브라이언 앨런 어빙
다니엘 로버트 호스테터
치헌트 웡
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싸이톰스 테라퓨틱스, 인크.
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Abstract

본 발명은 일반적으로 2개 이상의 상이한 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 다중특이성 항체, 및 다중특이성 활성화 가능한 항체뿐만 아니라, 다양한 치료학적, 진단적 및 예방적 적응증에서 상기 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체를 제조 및 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

다중특이성 항체, 다중특이성 활성화 가능한 항체 및 그의 사용 방법 {MULTISPECIFIC ANTIBODIES, MULTISPECIFIC ACTIVATABLE ANTIBODIES AND METHODS OF USING THE SAME}
관련 출원
본 출원은 2013년 7월 25일 출원된 미국 가출원 번호 제61/858,402호의 이점을 주장하고, 그의 내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 일반적으로 2개 이상의 상이한 표적 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 다중특이성 항체, 및 다중특이성 활성화 가능한 항체뿐만 아니라, 다양한 치료학적, 진단적 및 예방적 적응증에서 상기 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체를 제조 및 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 배경
단일클론 항체는 각종 장애에서 치료학적 개입을 위한 분자로서 부상하였다. 그러나, 단일 단백질을 표적화하거나, 또는 중화시키는 것이, 단일특이성 단일클론 항체의 치료학적 사용을 제한하는 특정 장애를 효과적으로 치료하는 데 있어 항상 충분한 것은 아니다. 더욱이, 항체 기반 요법은 일반 질환에 대해서는 효과적인 치료법인 것으로 입증되었지만, 일부 사례에서는 광범위한 표적 발현에 기인한 독성이 그의 치료학적 유효성을 제한하였다. 추가로, 항체 기반 요법은, 예컨대, 투여 후 순환으로부터의 신속한 제거와 같은 다른 한계를 보였다.
따라서, 단일 분자를 이용하여 다중 표적 및/또는 다중 에피토프를 표적화할 수 있고, 또한 의도된 표적에 대한 선택성을 증가시키고, 투여시 역효과를 감소시키는 항체 및 치료제가 요구되고 있다.
본 발명의 요약
본 개시내용은 다중특이성 항체 및 다중특이성 활성화 가능한 항체를 제공한다. 본원에서 제공하는 다중특이성 항체는 2개 이상의 상이한 항원 또는 에피토프를 인식하는 항체이다. 본원에서 제공하는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 마스킹 모이어티(MM: masking moiety)의 커플링이 항원 또는 에피토프 결합 도메인이 그의 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 다중특이성 항체의 1개 이상의 항원 또는 에피토프 결합 도메인에 연결된 1개 이상의 MM을 포함하는 다중특이성 항체이다. 일부 실시양태에서, MM은 프로테아제에 대한 기질로서 기능하는 절단가능한 모이어티(CM: cleavable moiety)를 통해 다중특이성 항체의 항원 또는 에피토프 결합 도메인에 커플링된다. 본원에서 제공하는 활성화 가능한 다중특이성 항체는 순환 중 안정적이고, 치료 및/또는 진단의 의도된 부위에서 활성화되지만, 정상적인, 즉, 건강한 조직에서는 그렇지 않으며, 활성화되었을 때에는 상응하는, 비변형된 다중특이성 항체와 적어도 유사한 표적에의 결합을 보인다.
일부 실시양태에서, 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 면역 효과기 세포에 인게이징(engaging)하도록 디자인되며, 이는 또한 본원에서 면역 효과기 인게이징 다중특이성 항체 및/또는 면역 효과기 인게이징 다중특이성 활성화 가능한 항체로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 백혈구에 인게이징하도록 디자인되며, 이는 또한 본원에서 백혈구 인게이징 다중특이성 항체 및/또는 백혈구 인게이징 다중특이성 활성화 가능한 항체로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 T 세포에 인게이징하도록 디자인되며, 이는 또한 본원에서 T 세포 인게이징 다중특이성 항체 및/또는 T 세포 인게이징 다중특이성 활성화 가능한 항체로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 백혈구 상의, 예컨대, T 세포 상의, 자연살(NK: natural killer) 세포 상의, 골수성 단핵 세포 상의, 대식세포 상의, 및/또는 또 다른 면역 효과기 세포 상의 표면 항원에 인게이징한다. 일부 실시양태에서, 면역 효과기 세포는 백혈구이다. 일부 실시양태에서, 면역 효과기 세포는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역 효과기 세포는 NK 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역 효과기 세포는 단핵 세포, 예컨대, 골수성 단핵 세포이다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 1개 초과의 표적 및/또는 1개 초과의 에피토프에 결합하거나, 또는 다르게는 그와 상호작용하도록 디자인되며, 이는 또한 본원에서 다중 항원 표적화 항체 및/또는 다중 항원 표적화 활성화 가능한 항체로 지칭된다. 본원에서 사용되는 바, "표적" 및 "항원"이라는 용어는 상호교환적으로 사용된다.
일부 실시양태에서, 면역 효과기 세포 인게이징 다중특이성 항체로는 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 면역 효과기 세포 인게이징 항체 또는 그의 항원 결합부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 효과기 세포 인게이징 다중특이성 항체로는 암 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 면역 효과기 세포 인게이징 항체 또는 그의 항원 결합부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 효과기 세포 인게이징 다중특이성 항체로는 암 표적화 IgG 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 면역 효과기 세포 인게이징 scFv를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 효과기 세포는 백혈구이다. 일부 실시양태에서, 면역 효과기 세포는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역 효과기 세포는 NK 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역 효과기 세포는 골수성 단핵 세포이다.
일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 다중특이성 항체로는 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 T 세포 인게이징 항체 또는 그의 항원 결합부를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 다중특이성 항체로는 암 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 T 세포 인게이징 항체 또는 그의 항원 결합부를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 다중특이성 항체로는 암 표적화 IgG 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 T 세포 인게이징 scFv를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 다중특이성 항체로는 항CD3 엡실론(CD3ε, 이는 또한 본원에서 CD3e 및 CD3으로도 지칭) scFv 및 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 다중특이성 항체로는 항CD3ε scFv 및 암 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 다중특이성 항체로는 항CD3ε scFv 및 암 표적화 IgG 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 다중특이성 항체로는 OKT3으로부터 유래된 항CD3 엡실론(CD3ε) scFv를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 다중특이성 항체로는 항CTLA-4 scFv를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 면역 효과기 세포 인게이징 다중특이성 활성화 가능한 항체로는 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및/또는 면역 효과기 세포 인게이징 항체 또는 그의 항원 결합부 중 1개 이상이 마스킹되어 있는 것인, 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 면역 효과기 세포 인게이징 항체 또는 그의 항원 결합부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 효과기 세포 인게이징 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 마스킹 모이어티(MM1)의 커플링이 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)이 제1 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB1이 MM1에 부착되어 있는 것인, 제1, 면역 효과기 세포 인게이징 표적에 결합하는 AB1을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 마스킹 모이어티(MM2)의 커플링이 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)이 제2 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB2가 MM2에 부착되어 있는 것인, 제2 표적에 결합하는 AB2를 포함하는 제2 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 효과기 세포 인게이징 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 마스킹 모이어티(MM1)의 커플링이 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)이 제1 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB1이 MM1에 부착되어 있는 것인, 제1, 면역 효과기 세포 인게이징 표적에 결합하는 AB1을 포함하고, 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 마스킹 모이어티(MM2)의 커플링이 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)이 제2 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB2가 MM2에 부착되어 있는 것인, 제2 표적에 결합하는 AB2를 포함하는 제2 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비면역 효과기 세포 인게이징 항체는 암 표적화 항체이다. 일부 실시양태에서, 비면역 세포 효과기 항체는 IgG이다. 일부 실시양태에서, 면역 효과기 세포 인게이징 항체는 scFv이다. 일부 실시양태에서, 표적화 항체(예컨대, 비면역 세포 효과기 항체)는 IgG이고, 면역 효과기 세포 인게이징 항체는 scFv이다. 일부 실시양태에서, 면역 효과기 세포는 백혈구이다. 일부 실시양태에서, 면역 효과기 세포는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역 효과기 세포는 NK 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역 효과기 세포는 골수성 단핵 세포이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 T 세포 인게이징 다중특이성 활성화 가능한 항체는 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및/또는 T 세포 인게이징 항체 또는 그의 항원 결합부 중 1개 이상이 마스킹되어 있는 것인, 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 T 세포 인게이징 항체 또는 그의 항원 결합부를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 마스킹 모이어티(MM1)의 커플링이 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)이 제1 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB1이 MM1에 부착되어 있는 것인, 제1, T 세포 인게이징 표적에 결합하는 AB1을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 마스킹 모이어티(MM2)의 커플링이 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)이 제2 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB2가 MM2에 부착되어 있는 것인, 제2 표적에 결합하는 AB2를 포함하는 제2 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 마스킹 모이어티(MM1)의 커플링이 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)이 제1 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB1이 MM1에 부착되어 있는 것인, 제1, T 세포 인게이징 표적에 결합하는 AB1을 포함하고, 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 마스킹 모이어티(MM2)의 커플링이 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)이 제2 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB2가 MM2에 부착되어 있는 것인, 제2 표적에 결합하는 AB2를 포함하는 제2 항체 또는 그의 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 다중특이성 활성화 가능한 항체는 암 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및/또는 T 세포 인게이징 항체 또는 그의 항원 결합부 중 1개 이상이 마스킹되어 있는 것인, 암 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 T 세포 인게이징 항체 또는 그의 항원 결합부를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 마스킹 모이어티(MM1)의 커플링이 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)이 제1 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB1이 MM1에 부착되어 있는 것인, 제1, T 세포 인게이징 표적에 결합하는 AB1을 포함한다. 일부 실시양태에서, 암 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 마스킹 모이어티(MM2)의 커플링이 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)이 제2 암 관련 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB2가 MM2에 부착되어 있는 것인, 제2 암 관련 표적에 결합하는 AB2를 포함하는 제2 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 마스킹 모이어티(MM1)의 커플링이 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)이 제1 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB1이 MM1에 부착되어 있는 것인, 제1, T 세포 인게이징 표적에 결합하는 AB1을 포함하고, 암 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 마스킹 모이어티(MM2)의 커플링이 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)이 제2 암 관련 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB2가 MM2에 부착되어 있는 것인, 제2 암 관련 표적에 결합하는 AB2를 포함하는 제2 항체 또는 그의 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 다중특이성 활성화 가능한 항체는 암 표적화 IgG 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및/또는 T 세포 인게이징 항체 또는 그의 항원 결합부 중 1개 이상이 마스킹되어 있는 것인, 암 표적화 IgG 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 T 세포 인게이징 scFv를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 마스킹 모이어티(MM1)의 커플링이 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)이 제1 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB1이 MM1에 부착되어 있는 것인, 제1, T 세포 인게이징 표적에 결합하는 AB1을 포함한다. 일부 실시양태에서, 암 표적화 IgG 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 마스킹 모이어티(MM2)의 커플링이 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)이 제2 암 관련 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB2가 MM2에 부착되어 있는 것인, 제2 암 관련 표적에 결합하는 AB2를 포함하는 제2 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 마스킹 모이어티(MM1)의 커플링이 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)이 제1 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB1이 MM1에 부착되어 있는 것인, 제1, T 세포 인게이징 표적에 결합하는 AB1을 포함하고, 암 표적화 IgG 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 마스킹 모이어티(MM2)의 커플링이 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)이 제2 암 관련 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB2가 MM2에 부착되어 있는 것인, 제2 암 관련 표적에 결합하는 AB2를 포함하는 제2 항체 또는 그의 단편을 포함한다.
면역 효과기 세포 인게이징 다중특이성 활성화 가능한 항체의 일부 실시양태에서, 한 항원은 전형적으로 종양 세포 또는 질환과 관련된 다른 세포 유형의 표면 상에 존재하는 항원, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 하기 표 1에 열거되어 있는 임의의 표적, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, EGFR, erbB2, EpCAM, Jagged, PD-L1, B7H3, 또는 CD71(트랜스페린 수용체)이고, 또 다른 항원은 전형적으로 T 세포, 자연살(NK) 세포, 골수성 단핵 세포, 대식세포, 및/또는 다른 면역 효과기 세포의 표면 상에 존재하는 자극성 또는 억제성 수용체, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, B7-H4, BTLA, CD3, CD4, CD8, CD16a, CD25, CD27, CD28, CD32, CD56, CD137, CTLA-4, GITR, HVEM, ICOS, LAG3, NKG2D, OX40, PD-1, TIGIT, TIM3, 또는 VISTA이다. 일부 실시양태에서, 항원은 T 세포 또는 NK 세포의 표면 상에 존재하는 자극성 수용체이고; 상기 자극성 수용체의 예로는 CD3, CD27, CD28, CD137(4-1BB로도 지칭된다), GITR, HVEM, ICOS, NKG2D, 및 OX40을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 항원은 T 세포의 표면 상에 존재하는 억제성 수용체이고; 상기 억제성 수용체의 예로는 BTLA, CTLA-4, LAG3, PD-1, TIGIT, TIM3, 및 NK 발현 KIR을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. T 세포 표면 항원에의 특이성을 부여하는 항체 도메인은 또한 T 세포 수용체, NK 세포 수용체, 대식세포 수용체, 및/또는 다른 면역 효과기 세포 수용체, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, B7-1, B7-2, B7H3, PD-L1, PD-L2, 또는 TNFSF9에 결합하는 리간드 또는 리간드 도메인에 의해 치환될 수 있다.
본 개시내용의 한 실시양태는 암 미세환경에서 활성 가능하고, 암 표적 항체 및/또는 효능제 항체 중 1개 이상이 마스킹되어 있는 것인, 종양 표적에 대한 항체, 예를 들어, IgG 또는 scFv를 포함하고, 활성화된 T 세포 또는 NK 세포의 표면 상에서 발현된 공동 자극성 수용체에 대한 효능제 항체, 예를 들어, IgG 또는 scFv를 포함하는, 다중특이성 활성화 가능한 항체이다. 공동 자극성 수용체의 예로는 CD27, CD137, GITR, HVEM, NKG2D, 및 OX40을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 일단 종양 관련된 프로테아제에 의해 활성화되고 나면, 종양에 의존하는 방식으로 효과적으로 T 세포 또는 NK 세포 발현된 공동 자극성 수용체에 가교결합하고, 그를 활성화시킴으로써 임의의 종양 항원의 내인성 T 세포 항원 또는 NK 활성화 수용체를 통하여 그에 반응하는 T 세포의 활성을 증진시킬 것이다. 상기 T 세포 또는 NK 세포 공동 자극성 수용체의 활성화 의존성 성질은 그의 항원 특이성과 관계 없이 T 세포 모두를 활성화시키지 않으면서, 종양 특이 T 세포에 대한 활성화된 다중특이성 활성화 가능한 항체의 활성에 집중될 것이다. 한 실시양태에서, 적어도 다중특이성 활성화 가능한 항체의 공동 자극성 수용체 항체는 다중특이성 활성화 가능한 항체 중 종양 표적에 대한 항체에 의해 인식되는 항원 또한 발현하는 조직에 존재할 수 있는 자가반응성 T 세포의 활성화를 막기 위해 마스킹되며, 그의 활성은 공동 수용체 인게이징의 결핍에 의해 제한된다.
본 개시내용의 한 실시양태는 T 세포 과자극을 특징으로 하는 질환, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 자가면역 질환 또는 염증성 질환 미세환경에서 활성화 가능한 다중특이성 활성화 가능한 항체이다. 상기 다중특이성 활성화 가능한 항체는 자가면역 또는 염증성 질환에서 T 세포에 의해 표적화되는 조직에서 발현되는 표면 항원을 포함하는 표적에 대한 항체, 예를 들어, IgG 또는 scFv, 및 T 세포 또는 NK 세포의 표면 상에서 발현되는 억제성 수용체에 대한 항체, 예를 들어, IgG 또는 scFv를 포함하며, 여기서, 질환 조직 표적 항체 및/또는 T 세포 억제성 수용체 항체 중 1개 이상은 마스킹되어 있는 것을 포함한다. 억제성 수용체의 예로는 BTLA, CTLA-4, LAG3, PD-1, TIGIT, TIM3, 및 NK 발현 KIR을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 자가면역 질환에서 T 세포에 의해 표적화되는 조직 항원의 예로는 다발성 경화증에서 미엘린 또는 신경 세포 상에서 발현되는 표면 항원, 또는 1형 당뇨병에서 췌장 섬 세포 상에서 발현되는 표면 항원을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 실시양태에서, 자가면역 공격 또는 염증 하에 조직에 국재화될 때 다중특이성 활성화 가능한 항체는 활성화되고, T 세포 또는 NK 세포 억제성 수용체에 공동 인게이징하여 그의 내인성 TCR 또는 활성화 수용체를 통해 임의의 질환 조직 표적화된 항원에 반응하는 자가반응성 T 세포의 활성을 억제시킨다. 한 실시양태에서, 표적 항원 또한 발현될 수 있는 비질환 조직에서 원하는 T 세포 반응의 억제를 막기 위해 1개 이상의 또는 다중 항체는 마스킹된다.
일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 다중특이성 활성화 가능한 항체는 항CD3ε scFv 및/또는 표적화 항체 또는 그의 항원 결합부 중 1개 이상이 마스킹된 것인, 항CD3 엡실론(CD3ε, 이는 또한 본원에서 CD3e 및 CD3으로 지칭된다) scFv 및 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD3ε scFv는 마스킹 모이어티(MM1)의 커플링이 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)이 CD3ε에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB1이 MM1에 부착된 것인, CD3ε에 결합하는 AB1을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 마스킹 모이어티(MM2)의 커플링이 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)이 제2 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB2가 MM2에 부착된 것인, 제2 표적에 결합하는 AB2를 포함하는 제2 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD3ε scFv는 마스킹 모이어티(MM1)의 커플링이 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)이 CD3ε에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB1이 MM1에 부착된 것인, CD3ε에 결합하는 AB1을 포함하고, 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 마스킹 모이어티(MM2)의 커플링이 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)이 제2 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB2가 MM2에 부착된 것인, 제2 표적에 결합하는 AB2를 포함하는 제2 항체 또는 그의 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 다중특이성 활성화 가능한 항체는 항CD3ε scFv 및/또는 암 표적화 항체 또는 그의 항원 결합부 중 1개 이상이 마스킹된 것인, 항CD3ε scFv 및 암 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD3ε scFv는 마스킹 모이어티(MM1)의 커플링이 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)이 CD3ε에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB1이 MM1에 부착된 것인, CD3ε에 결합하는 AB1을 포함한다. 일부 실시양태에서, 암 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 마스킹 모이어티(MM2)의 커플링이 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)이 제2 암 관련 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB2가 MM2에 부착된 것인, 제2 암 관련 표적에 결합하는 AB2를 포함하는 제2 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD3ε scFv는 마스킹 모이어티(MM1)의 커플링이 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)이 CD3ε에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB1이 MM1에 부착된 것인, CD3ε에 결합하는 AB1을 포함하고, 암 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 마스킹 모이어티(MM2)의 커플링이 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)이 제2 암 관련 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB2가 MM2에 부착된 것인, 제2 암 관련 표적에 결합하는 AB2를 포함하는 제2 항체 또는 그의 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 다중특이성 활성화 가능한 항체는 항CD3ε scFv 및/또는 암 표적화 IgG 항체 또는 그의 항원 결합부 중 1개 이상이 마스킹된 것인, 항CD3ε scFv 및 암 표적화 IgG 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD3ε scFv는 마스킹 모이어티(MM1)의 커플링이 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)이 CD3ε에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB1이 MM1에 부착된 것인, CD3ε에 결합하는 AB1을 포함한다. 일부 실시양태에서, 암 표적화 IgG 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 마스킹 모이어티(MM2)의 커플링이 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)이 제2 암 관련 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB2가 MM2에 부착된 것인, 제2 암 관련 표적에 결합하는 AB2를 포함하는 제2 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD3ε scFv는 마스킹 모이어티(MM1)의 커플링이 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)이 CD3ε에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB1이 MM1에 부착된 것인, CD3ε에 결합하는 AB1을 포함하고, 암 표적화 항체 IgG 또는 그의 항원 결합 단편은 마스킹 모이어티(MM2)의 커플링이 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)이 제2 암 관련 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB2가 MM2에 부착된 것인, 제2 암 관련 표적에 결합하는 AB2를 포함하는 제2 항체 또는 그의 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 다중특이성 활성화 가능한 항체는 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및/또는 OKT3 scFv 또는 OKT3 유래의 scFv 중 1개 이상이 마스킹된 것인, OKT3으로부터 유래된 항CD3 엡실론(CD3ε) scFv를 포함한다. 일부 실시양태에서, OKT3 scFv 또는 OKT3 유래의 scFv는 마스킹 모이어티(MM1)의 커플링이 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)이 CD3ε에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB1이 MM1에 부착된 것인, CD3ε에 결합하는 AB1을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 마스킹 모이어티(MM2)의 커플링이 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)이 제2 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB2가 MM2에 부착된 것인, 제2 표적에 결합하는 AB2를 포함하는 제2 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, OKT3 scFv 또는 OKT3 유래의 scFv는 마스킹 모이어티(MM1)의 커플링이 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)이 CD3ε에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB1이 MM1에 부착된 것인, CD3ε에 결합하는 AB1을 포함하고, 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 마스킹 모이어티(MM2)의 커플링이 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)이 제2 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB2가 MM2에 부착된 것인, 제2 표적에 결합하는 AB2를 포함하는 제2 항체 또는 그의 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 다중특이성 활성화 가능한 항체는 OKT3 scFv 또는 OKT3 유래의 scFv 및/또는 암 표적화 항체 또는 그의 항원 결합부 중 1개 이상이 마스킹된 것인, OKT3 scFv 또는 OKT3 유래의 scFv 및 암 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, OKT3 scFv 또는 OKT3 유래의 scFv는 마스킹 모이어티(MM1)의 커플링이 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)이 CD3ε에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB1이 MM1에 부착된 것인, CD3ε에 결합하는 AB1을 포함한다. 일부 실시양태에서, 암 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 마스킹 모이어티(MM2)의 커플링이 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)이 제2 암 관련 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB2가 MM2에 부착된 것인, 제2 암 관련 표적에 결합하는 AB2를 포함하는 제2 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, OKT3 scFv 또는 OKT3 유래의 scFv는 마스킹 모이어티(MM1)의 커플링이 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)이 CD3ε에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB1이 MM1에 부착된 것인, CD3ε에 결합하는 AB1을 포함하고, 암 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 마스킹 모이어티(MM2)의 커플링이 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)이 제2 암 관련 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB2가 MM2에 부착된 것인, 제2 암 관련 표적에 결합하는 AB2를 포함하는 제2 항체 또는 그의 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 다중특이성 활성화 가능한 항체는 OKT3 scFv 또는 OKT3 유래의 scFv 및/또는 암 표적화 IgG 항체 또는 그의 항원 결합부 중 1개 이상이 마스킹된 것인, OKT3 scFv 또는 OKT3 유래의 scFv 및 암 표적화 IgG 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, OKT3 scFv 또는 OKT3 유래의 scFv는 마스킹 모이어티(MM1)의 커플링이 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)이 CD3ε에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB1이 MM1에 부착된 것인, CD3ε에 결합하는 AB1을 포함한다. 일부 실시양태에서, 암 표적화 IgG 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 마스킹 모이어티(MM2)의 커플링이 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)이 제2 암 관련 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB2가 MM2에 부착된 것인, 제2 암 관련 표적에 결합하는 AB2를 포함하는 제2 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, OKT3 scFv 또는 OKT3 유래의 scFv는 마스킹 모이어티(MM1)의 커플링이 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)이 CD3ε에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB1이 MM1에 부착된 것인, CD3ε에 결합하는 AB1을 포함하고, 암 표적화 항체 IgG 또는 그의 항원 결합 단편은 마스킹 모이어티(MM2)의 커플링이 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)이 제2 암 관련 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB2가 MM2에 부착된 것인, 제2 암 관련 표적에 결합하는 AB2를 포함하는 제2 항체 또는 그의 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 다중특이성 활성화 가능한 항체는 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및/또는 항CTLA-4 scFv 중 1개 이상이 마스킹된 것인, 항CTLA-4 scFv를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항CTLA-4 scFv는 마스킹 모이어티(MM1)의 커플링이 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)이 CTLA-4에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB1이 MM1에 부착된 것인, CTLA-4에 결합하는 AB1을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 마스킹 모이어티(MM2)의 커플링이 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)이 제2 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB2가 MM2에 부착된 것인, 제2 표적에 결합하는 AB2를 포함하는 제2 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항CTLA-4 scFv는 마스킹 모이어티(MM1)의 커플링이 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)이 CTLA-4에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB1이 MM1에 부착된 것인, CTLA-4에 결합하는 AB1을 포함하고, 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 마스킹 모이어티(MM2)의 커플링이 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)이 제2 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB2가 MM2에 부착된 것인, 제2 표적에 결합하는 AB2를 포함하는 제2 항체 또는 그의 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 다중특이성 활성화 가능한 항체는 항CTLA-4 scFv 및/또는 표적화 IgG 항체 또는 그의 항원 결합부 중 1개 이상이 마스킹된 것인, 항CTLA-4 scFv 및 표적화 IgG 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항CTLA-4 scFv는 마스킹 모이어티(MM1)의 커플링이 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)이 CTLA-4에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB1이 MM1에 부착된 것인, CTLA-4에 결합하는 AB1을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 IgG 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 마스킹 모이어티(MM2)의 커플링이 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)이 제2 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB2가 MM2에 부착된 것인, 제2 표적에 결합하는 AB2를 포함하는 제2 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항CTLA-4 scFv는 마스킹 모이어티(MM1)의 커플링이 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)이 CTLA-4에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB1이 MM1에 부착된 것인, CTLA-4에 결합하는 AB1을 포함하고, 표적화 항체 IgG 또는 그의 항원 결합 단편은 마스킹 모이어티(MM2)의 커플링이 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)이 제2 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 AB2가 MM2에 부착된 것인, 제2 표적에 결합하는 AB2를 포함하는 제2 항체 또는 그의 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, 다중 항원 표적화 항체 및/또는 다중 항원 표적화 활성화 가능한 항체는 제1 표적 및/또는 제1 에피토프에 결합하는 적어도 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 제2 표적 및/또는 제2 에피토프를 결합하는 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중 항원 표적화 항체 및/또는 다중 항원 표적화 활성화 가능한 항체는 2개 이상의 상이한 표적에 결합한다. 일부 실시양태에서, 다중 항원 표적화 항체 및/또는 다중 항원 표적화 활성화 가능한 항체는 동일한 표적 상의 2개 이상의 상이한 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 다중 항원 표적화 항체 및/또는 다중 항원 표적화 활성화 가능한 항체는 동일한 표적 상의 2개 이상의 상이한 표적 및 2개 이상의 상이한 에피토프의 조합에 결합한다.
본 개시내용의 다중특이성 활성화 가능한 항체의 다양한 실시양태는 도 3a, 및 5-9에 제시되어 있다. 일부 실시양태에서, IgG를 포함하는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 마스킹된 IgG 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, scFv를 포함하는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 마스킹된 scFv 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 IgG 가변 도메인 중 1개 이상이 마스킹 모이어티에 커플링된 것인, IgG 가변 도메인 및 scFv 도메인, 둘 모두를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 scFv 도메인 중 1개 이상이 마스킹 모이어티에 커플링된 것인, IgG 가변 도메인 및 scFv 도메인, 둘 모두를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 IgG 가변 도메인 중 1개 이상이 마스킹 모이어티에 커플링되고, scFv 도메인 중 1개 이상이 마스킹 모이어티에 커플링된 것인, IgG 가변 도메인 및 scFv 도메인, 둘 모두를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 IgG 가변 도메인 및 scFv 도메인이 각각 그 자신의 마스킹 모이어티에 커플링된 것인, IgG 가변 도메인 및 scFv 도메인, 둘 모두를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 한 항체 도메인은 표적 항원에 대한 특이성을 가지고, 또 다른 항체 도메인은 T 세포 표면 항원에 대한 특이성을 가진다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 한 항체 도메인은 표적 항원에 대한 특이성을 가지고, 또 다른 항체 도메인은 또 다른 표적 항원에 대한 특이성을 가진다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 한 항체 도메인은 표적 항원의 에피토프에 대한 특이성을 가지고, 또 다른 항체 도메인은 표적 항원의 또 다른 에피토프에 대한 특이성을 가진다.
다중특이성 활성화 가능한 항체에서, scFv는 IgG 활성화 가능한 항체의 중쇄의 카복실 말단에, IgG 활성화 가능한 항체의 경쇄의 카복실 말단에, 또는 IgG 활성화 가능한 항체의 중쇄 및 경쇄, 둘 모두의 카복실 말단에 융합될 수 있다. 다중특이성 활성화 가능한 항체에서, scFv는 IgG 활성화 가능한 항체의 중쇄의 아미노 말단에, IgG 활성화 가능한 항체의 경쇄의 아미노 말단에, 또는 IgG 활성화 가능한 항체의 중쇄 및 경쇄, 둘 모두의 아미노 말단에 융합될 수 있다. 다중특이성 활성화 가능한 항체에서, scFv는 IgG 활성화 가능한 항체의 하나 이상의 카복실 말단 및 하나 이상의 아미노 말단의 임의의 조합에 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 절단가능한 모이어티(CM)에 연결된 마스킹 모이어티(MM)는 IgG의 항원 결합 도메인에 부착되어 그를 마스킹시킨다. 일부 실시양태에서, 절단가능한 모이어티(CM)에 연결된 마스킹 모이어티(MM)는 1개 이상의 scFv의 항원 결합 도메인에 부착되어 그를 마스킹시킨다. 일부 실시양태에서, 절단가능한 모이어티(CM)에 연결된 마스킹 모이어티(MM)는 IgG의 항원 결합 도메인에 부착되어 그를 마스킹시키고, 절단가능한 모이어티(CM)에 연결된 마스킹 모이어티(MM)는 1개 이상의 scFv의 항원 결합 도메인에 부착되어 그를 마스킹시킨다.
본 개시내용은 하기의 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다중특이성 활성화 가능한 항체 구조의 일례를 제공한다: (VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2; (VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH*-L3-VL*)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL*-L3-VH*)2; (VL-CL)2:(MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL)2:(MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2: (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*)2: (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; 또는 (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2(여기서, VL 및 VH는 IgG에 포함되어 있는, 제1 특이성의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 나타내고; VL* 및 VH*는 scFv에 포함되어 있는, 제2 특이성의 가변 도메인을 나타내고; L1은 마스킹 모이어티(MM)와 절단가능한 모이어티(CM)를 연결하는 링커 펩티드이고; L2는 절단가능한 모이어티(CM)와 항체를 연결하는 링커 펩티드이고; L3은 scFv의 가변 도메인을 연결하는 링커 펩티드이고; L4는 제1 특이성의 항체를 제2 특이성의 항체에 연결하는 링커 펩티드이고; CL은 경쇄 불변 도메인이고; CH1, CH2, CH3은 중쇄 불변 도메인이다). 제1 및 제2 특이성은 임의의 항원 또는 에피토프에 대한 것일 수 있다.
T 세포 인게이징 다중특이성 활성화 가능한 항체의 일부 실시양태에서, 한 항원은 전형적으로 종양 세포 또는 질환과 관련된 다른 세포 유형의 표면상에 존재하는 항원, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 하기 표 1에 열거된 임의의 표적, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, EGFR, erbB2, EpCAM, Jagged, PD-L1, B7H3, 또는 CD71(트랜스페린 수용체)이고, 또 다른 항원은 전형적으로 T 세포, 자연살(NK) 세포, 골수성 단핵 세포, 대식세포, 및/또는 다른 면역 효과기 세포의 표면상에 존재하는 자극성(이는 또한 본원에서 활성화로 지칭된다) 또는 억제성 수용체, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, B7-H4, BTLA, CD3, CD4, CD8, CD16a, CD25, CD27, CD28, CD32, CD56, CD137(이는 또한 TNFRSF9로 지칭된다), CTLA-4, GITR, HVEM, ICOS, LAG3, NKG2D, OX40, PD-1, TIGIT, TIM3, 또는 VISTA이다. T 세포 표면 항원에 특이성을 부여하는 항체 도메인은 또한 T 세포 수용체, NK 세포 수용체, 대식세포 수용체, 및/또는 다른 면역 효과기 세포 수용체에 결합하는 리간드 또는 리간드 도메인, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, B7-1, B7-2, B7H3, PD-L1, PD-L2, 또는 TNFSF9에 의해 치환될 수 있다. 다중 항원 표적화 활성화 가능한 항체의 일부 실시양태에서, 한 항원은 하기 표 1에 열거된 표적 군으로부터 선택되고, 또 다른 항원은 하기 표 1에 열거된 표적 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 표적화 항체는 항EGFR 항체이다. 일부 실시양태에서, 표적화 항체는 EGFR에의 결합에 대하여 특이적인 C225v5이다. 일부 실시양태에서, 표적화 항체는 EGFR에의 결합에 대하여 특이적인 C225이다. 일부 실시양태에서, 표적화 항체는 EGFR에의 결합에 대하여 특이적인 C225v4이다. 일부 실시양태에서, 표적화 항체는 EGFR에의 결합에 대하여 특이적인 C225v6이다. 일부 실시양태에서, 표적화 항체는 항Jagged 항체이다. 일부 실시양태에서, 표적화 항체는 인간 및 마우스 Jagged 1 및 Jagged 2에의 결합에 대하여 특이적인 4D11이다. 일부 실시양태에서, 표적화 항체는 인간 및 마우스 Jagged 1 및 Jagged 2에의 결합에 대하여 특이적인 4D11v2이다.
일부 실시양태에서, 표적화 항체는 활성화 가능한 항체 형태일 수 있다. 일부 실시양태에서, scFv(들)는 프로scFv 형태일 수 있다(예컨대, WO　2009/025846, WO 2010/081173 참조).
일부 실시양태에서, scFv는 CD3ε에의 결합에 대하여 특이적이고, CD3ε에 결합하는 항체 또는 그의 단편, 예컨대, CH2527, FN18, H2C, OKT3, 2C11, UCHT1, 또는 V9이거나, 또는 그로부터 유래된 것이다. 일부 실시양태에서, scFv는 CTLA-4(이는 또한 본원에서 CTLA 및 CTLA4로 지칭된다)에의 결합에 대하여 특이적이다.
일부 실시양태에서, 항CD3ε scFv는 하기 표 7에 및/또는 실시예 5에 제시된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항CD3ε scFv는 표 7에 및/또는 실시예 5에 제시된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, scFv는 하나 이상의 T 세포, 하나 이상의 NK 세포 및/또는 하나 이상의 대식세포에의 결합에 대하여 특이적이다. 일부 실시양태에서, scFv는 B7-H4, BTLA, CD3, CD4, CD8, CD16a, CD25, CD27, CD28, CD32, CD56, CD137, CTLA-4, GITR, HVEM, ICOS, LAG3, NKG2D, OX40, PD-1, TIGIT, TIM3, 또는 VISTA로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적에의 결합에 대하여 특이적이다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공하는 다중특이성 항체, 다중특이성 활성화 가능한 항체, 컨쥬게이트된(conjugated) 다중특이성 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체는 Jagged 표적, 예컨대, Jagged 1 및/또는 Jagged 2에 특이적으로 결합하고, VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, 및 VH CDR3 서열의 조합을 함유하며, 여기서, VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, 및 VH CDR3 서열 중 1개 이상은 적어도 아미노산 서열 SYAMS(서열번호 6)를 포함하는 VH CDR1 서열; 적어도 아미노산 서열 SIDPEGRQTYYADSVKG(서열번호 7)를 포함하는 VH CD2 서열; 적어도 아미노산 서열 DIGGRSAFDY(서열번호 8)를 포함하는 VH CDR3 서열, 및 그의 조합으로부터 선택되는 것인, 적어도 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공하는 다중특이성 항체, 다중특이성 활성화 가능한 항체, 컨쥬게이트된 다중특이성 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체는 Jagged 표적, 예컨대, Jagged 1 및/또는 Jagged 2에 특이적으로 결합하고, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열, 및 VL CDR3 서열의 조합을 함유하며, 여기서, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열, 및 VL CDR3 서열 중 1개 이상은 적어도 아미노산 서열 RASQSISSY(서열번호 9)를 포함하는 VL CDR1 서열; 적어도 아미노산 서열 AASSLQS(서열번호 10)를 포함하는 VL CDR2 서열; 적어도 아미노산 서열 QQTVVAPPL(서열번호 11)을 포함하는 VL CDR3 서열, 및 그의 조합으로부터 선택되는 것인, 적어도 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공하는 다중특이성 항체, 다중특이성 활성화 가능한 항체, 컨쥬게이트된 다중특이성 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체는 Jagged 표적, 예컨대, Jagged 1 및/또는 Jagged 2에 특이적으로 결합하고, VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, 및 VH CDR3 서열의 조합을 함유하며, 여기서, VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, 및 VH CDR3 서열 중 1개 이상은 아미노산 서열 SYAMS(서열번호 6)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 VH CDR1 서열; 아미노산 서열 SIDPEGRQTYYADSVKG(서열번호 7)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 VH CD2 서열; 아미노산 서열 DIGGRSAFDY(서열번호 8)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 VH CDR3 서열, 및 그의 조합으로부터 선택되는 것인, 적어도 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공하는 다중특이성 항체, 다중특이성 활성화 가능한 항체, 컨쥬게이트된 다중특이성 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체는 Jagged 표적, 예컨대, Jagged 1 및/또는 Jagged 2에 특이적으로 결합하고, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열, 및 VL CDR3 서열의 조합을 함유하며, 여기서, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열, 및 VL CDR3 서열 중 1개 이상은 아미노산 서열 RASQSISSY(서열번호 9)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 VL CDR1 서열; 아미노산 서열 AASSLQS(서열번호 10)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 VL CDR2 서열; 및 아미노산 서열 QQTVVAPPL(서열번호 11)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 VL CDR3 서열, 및 그의 조합으로부터 선택되는 것인, 적어도 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공하는 다중특이성 항체, 다중특이성 활성화 가능한 항체, 컨쥬게이트된 다중특이성 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체는 Jagged 표적, 예컨대, Jagged 1 및/또는 Jagged 2에 특이적으로 결합하고, VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, VH CDR3 서열, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열, 및 VL CDR3 서열의 조합을 함유하며, 여기서, VH CDR1 서열은 적어도 아미노산 서열 SYAMS(서열번호 6)를 포함하고; VH CD2 서열은 적어도 아미노산 서열 SIDPEGRQTYYADSVKG(서열번호 7)를 포함하고; VH CDR3 서열은 적어도 아미노산 서열 DIGGRSAFDY(서열번호 8)를 포함하고; VL CDR1 서열은 적어도 아미노산 서열 RASQSISSY(서열번호 9)를 포함하고; VL CDR2 서열은 적어도 아미노산 서열 AASSLQS(서열번호 10)를 포함하고; VL CDR3 서열은 적어도 아미노산 서열 QQTVVAPPL(서열번호 11)을 포함하는 것인, 적어도 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공하는 다중특이성 항체, 다중특이성 활성화 가능한 항체, 컨쥬게이트된 다중특이성 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체는 Jagged 표적, 예컨대, Jagged 1 및/또는 Jagged 2에 특이적으로 결합하고, VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, VH CDR3 서열, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열, 및 VL CDR3 서열의 조합을 함유하며, 여기서, VH CDR1 서열은 아미노산 서열 SYAMS(서열번호 6)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 서열을 포함하고; VH CD2 서열은 아미노산 서열 SIDPEGRQTYYADSVKG(서열번호 7)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 서열을 포함하고; VH CDR3 서열은 아미노산 서열 DIGGRSAFDY(서열번호 8)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 서열을 포함하고; VL CDR1 서열은 아미노산 서열 RASQSISSY(서열번호 9)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 서열을 포함하고; VL CDR2 서열은 아미노산 서열 AASSLQS(서열번호 10)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 서열을 포함하고; VL CDR3 서열은 아미노산 서열 QQTVVAPPL(서열번호 11)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 것인, 적어도 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공하는 다중특이성 항체, 다중특이성 활성화 가능한 항체, 컨쥬게이트된 다중특이성 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체는 표피 성장 인자 수용체(EGFR: Epidermal Growth Factor Receptor)에 특이적으로 결합하고, VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, 및 VH CDR3 서열의 조합을 함유하며, 여기서, VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, 및 VH CDR3 서열 중 1개 이상은 적어도 아미노산 서열 NYGVH(서열번호 12)를 포함하는 VH CDR1 서열; 적어도 아미노산 서열 VIWSGGNTDYNTPFTS(서열번호 13)를 포함하는 VH CD2 서열; 적어도 아미노산 서열 ALTYYDYEFAY(서열번호 14)를 포함하는 VH CDR3 서열; 및 그의 조합으로부터 선택되는 것인, 적어도 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공하는 다중특이성 항체, 다중특이성 활성화 가능한 항체, 컨쥬게이트된 다중특이성 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체는 EGFR에 특이적으로 결합하고, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열, 및 VL CDR3 서열의 조합을 함유하며, 여기서, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열, 및 VL CDR3 서열 중 1개 이상은 적어도 아미노산 서열 RASQSIGTNIH(서열번호 15)를 포함하는 VL CDR1 서열; 적어도 아미노산 서열 KYASESIS(서열번호 16)를 포함하는 VL CDR2 서열; 및 적어도 아미노산 서열 QQNNNWPTT(서열번호 17)를 포함하는 VL CDR3 서열, 및 그의 조합으로부터 선택되는 것인, 적어도 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공하는 다중특이성 항체, 다중특이성 활성화 가능한 항체, 컨쥬게이트된 다중특이성 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체는 EGFR에 특이적으로 결합하고, VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, 및 VH CDR3 서열의 조합을 함유하며, 여기서, VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, 및 VH CDR3 서열 중 1개 이상은 아미노산 서열 NYGVH(서열번호 12)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 VH CDR1 서열; 아미노산 서열 VIWSGGNTDYNTPFTS(서열번호 13)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 VH CDR2 서열; 아미노산 서열 ALTYYDYEFAY(서열번호 14)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 VH CDR3 서열; 및 그의 조합으로부터 선택되는 것인, 적어도 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공하는 다중특이성 항체, 다중특이성 활성화 가능한 항체, 컨쥬게이트된 다중특이성 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체는 EGFR에 특이적으로 결합하고, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열, 및 VL CDR3 서열의 조합을 함유하며, 여기서, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열, 및 VL CDR3 서열 중 1개 이상은 아미노산 서열 RASQSIGTNIH(서열번호 15)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 VL CDR1 서열; 아미노산 서열 KYASESIS(서열번호 16)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 VL CDR2 서열; 및 아미노산 서열 QQNNNWPTT(서열번호 17)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 VL CDR3 서열, 및 그의 조합으로부터 선택되는 것인, 적어도 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공하는 다중특이성 항체, 다중특이성 활성화 가능한 항체, 컨쥬게이트된 다중특이성 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체는 EGFR에 특이적으로 결합하고, VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, VH CDR3 서열, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열, 및 VL CDR3 서열의 조합을 함유하며, 여기서, VH CDR1 서열은 적어도 아미노산 서열 NYGVH(서열번호 12)를 포함하고; VH CD2 서열은 적어도 아미노산 서열 VIWSGGNTDYNTPFTS(서열번호 13)를 포함하고; VH CDR3 서열은 적어도 아미노산 서열 ALTYYDYEFAY(서열번호 14)를 포함하고; VL CDR1 서열은 적어도 아미노산 서열 RASQSIGTNIH(서열번호 15)를 포함하고; VL CDR2 서열은 적어도 아미노산 서열 KYASESIS(서열번호 16)를 포함하고; VL CDR3 서열은 적어도 아미노산 서열 QQNNNWPTT(서열번호 17)를 포함하는 것인, 적어도 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공하는 다중특이성 항체, 다중특이성 활성화 가능한 항체, 컨쥬게이트된 다중특이성 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체는 EGFR에 특이적으로 결합하고, VH CDR1 서열, VH CDR2 서열, VH CDR3 서열, VL CDR1 서열, VL CDR2 서열, 및 VL CDR3 서열의 조합을 함유하며, 여기서, VH CDR1 서열은 아미노산 서열 NYGVH(서열번호 12)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 서열을 포함하고; VH CD2 서열은 아미노산 서열 VIWSGGNTDYNTPFTS(서열번호 13)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 서열을 포함하고; VH CDR3 서열은 아미노산 서열 ALTYYDYEFAY(서열번호 14)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 서열을 포함하고; VL CDR1 서열은 아미노산 서열 RASQSIGTNIH(서열번호 15)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 서열을 포함하고; VL CDR2 서열은 아미노산 서열 KYASESIS(서열번호 16)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 서열을 포함하고; VL CDR3 서열은 아미노산 서열 QQNNNWPTT(서열번호 17)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 것인, 적어도 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공하는 다중특이성 항체, 다중특이성 활성화 가능한 항체, 컨쥬게이트된 다중특이성 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체는 적어도, 하기 표 7에 및/또는 그 안에 표 11을 포함하는 것인 실시예 5에 제시된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공하는 다중특이성 항체, 다중특이성 활성화 가능한 항체, 컨쥬게이트된 다중특이성 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체는 적어도, 하기 표 7에 및/또는 그 안에 표 11을 포함하는 것인 실시예 5에 제시된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공하는 다중특이성 항체, 다중특이성 활성화 가능한 항체, 컨쥬게이트된 다중특이성 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체는 적어도, 하기 표 7에 및/또는 그 안에 표 11을 포함하는 것인 실시예 5에 제시된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 아미노산 서열, 및 적어도, 하기 표 7에 및/또는 그 안에 표 11을 포함하는 것인 실시예 5에 제시된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공하는 다중특이성 항체, 다중특이성 활성화 가능한 항체, 컨쥬게이트된 다중특이성 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체는 적어도, 하기 표 7에 및/또는 그 안에 표 11을 포함하는 것인 실시예 5에 제시된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 중쇄 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공하는 다중특이성 항체, 다중특이성 활성화 가능한 항체, 컨쥬게이트된 다중특이성 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체는 적어도, 하기 표 7에 및/또는 그 안에 표 11을 포함하는 것인 실시예 5에 제시된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공하는 다중특이성 항체, 다중특이성 활성화 가능한 항체, 컨쥬게이트된 다중특이성 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체는 적어도, 하기 표 7에 및/또는 그 안에 표 11을 포함하는 것인 실시예 5에 제시된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 중쇄 아미노산 서열, 및 적어도, 하기 표 7에 및/또는 그 안에 표 11을 포함하는 것인 실시예 5에 제시된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 또한 AB에 컨쥬게이트된 작용제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 작용제는 치료제이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 항신생물제이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 독소 또는 그의 단편이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 링커를 통해 다중특이성 항체에 컨쥬게이트된다. 일부 실시양태에서, 링커는 비절단가능한 링커이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 미세소관 억제제이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 핵산 손상제, 예컨대, DNA 알킬화제 또는 DNA 인터컬레이터, 또는 다른 DNA 손상제이다. 일부 실시양태에서, 링커는 절단가능한 링커이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 하기 표 4에 열거되어 있는 군으로부터 선택되는 작용제이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 돌라스타틴이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 아우리스타틴 또는 그의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 아우리스타틴 E 또는 그의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 모노메틸 아우리스타틴 D(MMAD)이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 메이탄시노이드 또는 메이탄시노이드 유도체이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 DM1 또는 DM4이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 듀오카르마이신 또는 그의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 칼리키아미신 또는 그의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 피롤로벤조디아제핀이다.
일부 실시양태에서, 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 또한 검출가능한 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 모이어티는 진단제이다.
일부 실시양태에서, 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 천연적으로 하나 이상의 이황화 결합을 함유한다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 하나 이상의 이황화 결합을 포함하도록 조작될 수 있다.
본 개시내용은 또한 본원에 기술된 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자뿐만 아니라, 상기 단리된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 본 개시내용은 세포를 항체 발현을 유도하는 조건 하에서 배양함으로써 다중특이성 항체를 제조하는 방법으로서, 여기서, 세포는 상기 핵산 분자를 포함하는 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 상기 벡터를 포함한다.
본 개시내용은 또한 적어도, 제1 표적 또는 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1), 및 제2 표적 또는 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)을 포함하는 다중특이성 활성화 가능한 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체 조성물로서, 여기서, 마스킹 모이어티(MM1)의 커플링이 AB1가 그의 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 적어도 AB1이 MM1에 커플링되거나, 또는 다르게는 부착되어 있는 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, MM1은 예를 들어, 피험체에서의 치료 부위 또는 진단 부위에서 AB1의 표적과 공국재화(co-localize)되는 프로테아제와 같은 프로테아제에 대한 기질을 포함하는 제1 절단가능한 모이어티(CM1) 서열을 통해 AB1에 커플링된다. 본원에서 제공하는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 순환 중 안정적이고, 치료 및/또는 진단의 의도된 부위에서 활성화되지만, 정상적인, 즉, 건강한 조직에서는 그렇지 않으며, 활성화되었을 때에는 상응하는, 비변형된 다중특이성 항체와 적어도 유사한 AB1의 표적에의 결합을 보인다.
일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 MM1과 CM1 사이에 연결 펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 CM1과 AB1 사이에 연결 펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 활성화 가능한 항체는 제1 연결 펩티드(LP1: first linking peptide) 및 제2 연결 펩티드(LP2: 제2 linking peptide)를 포함하고, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 적어도 일부는 절단되지 않은 상태에서 N 말단에서 C 말단으로 하기 순서로의 구조적 배열을 가진다: MM1-LP1-CM1-LP2-AB1 또는 AB1-LP2-CM1-LP1-MM1. 일부 실시양태에서, 두 연결 펩티드는 서로 동일할 필요는 없다.
일부 실시양태에서, LP1 또는 LP2 중 적어도 하나는 (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n(서열번호 18) 및 (GGGS)n(서열번호 19)(여기서, n은 1 이상인 정수이다)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, LP1 또는 LP2 중 적어도 하나는 GGSG(서열번호 20), GGSGG(서열번호 21), GSGSG(서열번호 22), GSGGG(서열번호 23), GGGSG(서열번호 24), 및 GSSSG(서열번호　25)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 적어도 제1 표적 또는 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1) 및 제2 표적 또는 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체 중의 각각의 AB는 독립적으로 단일클론 항체, 도메인 항체, 단일 쇄, Fab 단편, F(ab')2 단편, scFv, scAb, dAb, 단일 도메인 중쇄 항체, 및 단일 도메인 경쇄 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체 중의 각각의 AB는 설치류(예컨대, 마우스 또는 래트), 키메라, 인간화된 또는 완전한 인간 단일클론 항체이다.
일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체 중의 각각의 AB는 그의 상응하는 표적 또는 에피토프에의 결합에 대하여 약 100 nM 이하의 평형 해리 상수를 가진다.
일부 실시양태에서, MM1은 그의 상응하는 AB에의 결합에 대하여, AB의 그의 상응하는 표적 또는 에피토프에의 평형 해리 상수보다 큰 평형 해리 상수를 가진다.
일부 실시양태에서, MM1은 그의 상응하는 AB에의 결합에 대하여, AB의 그의 상응하는 표적 또는 에피토프에의 평형 해리 상수 이하의 평형 해리 상수를 가진다.
일부 실시양태에서, MM1은 다중특이성 활성화 가능한 항체가 절단된 상태일 때에는 상응하는 표적 또는 에피토프에의 결합에 대하여 그의 상응하는 AB를 방해하거나 그와 경쟁하지 않는다.
일부 실시양태에서, MM1은 길이가 약 2 내지 40개의 아미노산인 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체 중 각각의 MM은 길이가 40개 이하의 아미노산인 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, MM1은 상응하는 AB의 표적의 것과 상이한 폴리펩티드 서열을 가진다.
일부 실시양태에서, MM1은 상응하는 AB의 임의의 천연 결합 파트너와 50% 이하로 동일한 폴리펩티드 서열을 가진다. 일부 실시양태에서, MM1은 상응하는 AB의 임의의 천연 결합 파트너와 25% 이하로 동일한 폴리펩티드 서열을 가진다. 일부 실시양태에서, MM1은 상응하는 AB의 임의의 천연 결합 파트너와 10% 이하로 동일한 폴리펩티드 서열을 가진다.
일부 실시양태에서, MM1의 커플링은, MM1에 커플링되었을 때, 그의 상응하는 표적 또는 에피토프로의 AB의 해리 상수(Kd)가 MM1에 커플링되지 않았을 때, 그의 상응하는 표적 또는 에피토프로의 AB의 Kd보다 20배 이상 더 크도록, 상응하는 AB가 그의 표적 또는 에피토프에 결합할 수 있는 능력을 감소시킨다.
일부 실시양태에서, MM1의 커플링은, MM1에 커플링되었을 때, 그의 상응하는 표적 또는 에피토프로의 AB의 해리 상수(Kd)가 MM1에 커플링되지 않았을 때, 그의 상응하는 표적 또는 에피토프로의 AB의 Kd보다 40배 이상 더 크도록, 상응하는 AB가 그의 표적 또는 에피토프에 결합할 수 있는 능력을 감소시킨다.
일부 실시양태에서, MM1의 커플링은, MM1에 커플링되었을 때, 그의 상응하는 표적 또는 에피토프로의 AB의 해리 상수(Kd)가 MM1에 커플링되지 않았을 때, 그의 상응하는 표적 또는 에피토프로의 AB의 Kd보다 100배 이상 더 크도록, 상응하는 AB가 그의 표적 또는 에피토프에 결합할 수 있는 능력을 감소시킨다.
일부 실시양태에서, MM1의 커플링은, MM1에 커플링되었을 때, 그의 상응하는 표적 또는 에피토프로의 AB의 해리 상수(Kd)가 MM1에 커플링되지 않았을 때, 그의 상응하는 표적 또는 에피토프로의 AB의 Kd보다 1,000배 이상 더 크도록, 상응하는 AB가 그의 표적 또는 에피토프에 결합할 수 있는 능력을 감소시킨다.
일부 실시양태에서, MM1의 커플링은, MM1에 커플링되었을 때, 그의 상응하는 표적 또는 에피토프로의 AB의 해리 상수(Kd)가 MM1에 커플링되지 않았을 때, 그의 상응하는 표적 또는 에피토프로의 AB의 Kd보다 10,000배 이상 더 크도록, 상응하는 AB가 그의 표적 또는 에피토프에 결합할 수 있는 능력을 감소시킨다.
일부 실시양태에서, MM1은 본원에서 제공하는 실시예에 제시된 MM으로부터 선택되는 아미노산 서열이다.
일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 적어도, 다중특이성 활성화 가능한 항체가 절단되지 않은 상태일 때, AB2의 그의 표적에의 결합을 억제하는 제2 마스킹 모이어티(MM2), 및 제2 절단가능한 모이어티(CM2)는 제2 프로테아제에 대한 기질로서 기능하는 폴리펩티드인 것인, AB2에 커플링된 CM2를 포함한다. 일부 실시양태에서, CM2는 길이가 15개 이하의 아미노산 길이인 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 제2 프로테아제는 조직 내에서 제2 표적 또는 에피토프와 함께 공국재화되며, 여기서, 제2 프로테아제는 다중특이성 활성화 가능한 항체가 제2 프로테아제에 노출될 때, 다중특이성 활성화 가능한 항체 내의 CM2를 절단한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로테아제 및 제2 프로테아제는 조직 내에서 제1 표적 또는 에피토프 및 제2 표적 또는 에피토프와 함께 공국재화된다. 일부 실시양태에서, 제1 프로테아제 및 제2 프로테아제는 동일한 프로테아제이다. 일부 실시양태에서, CM1 및 CM2는 동일한 프로테아제에 대해 상이한 기질이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 하기 표 3에 제시된 것으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 제1 프로테아제 및 제2 프로테아제는 상이한 프로테아제이다. 일부 실시양태에서, 제1 프로테아제 및 제2 프로테아제는 하기 표 3에 제시된 것으로 이루어진 군으로부터 선택되는 상이한 프로테아제이다.
일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체 중의 각각의 MM, 예컨대, MM1 및 적어도 MM2는 AB의 그의 상응하는 표적 또는 에피토프에의 평형 해리 상수보다 더 큰, 그의 상응하는 AB에의 결합에 대한 평형 해리 상수를 가진다.
일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체 중의 각각의 MM은 AB의 그의 상응하는 표적 또는 에피토프에의 평형 해리 상수 이하인, 그의 상응하는 AB에의 결합에 대한 평형 해리 상수를 가진다.
일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체 중의 각각의 MM은 다중특이성 활성화 가능한 항체가 절단된 상태일 때, 상응하는 표적 또는 에피토프에의 결합에 대하여 그의 상응하는 AB를 방해하거나 그와 경쟁하지 않는다.
일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체 중의 각각의 MM은 길이가 길이가 약 2 내지 40개의 아미노산 길이인 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체 중의 각각의 MM은 길이가 40개 이하의 아미노산 길이인 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체 중의 각각의 MM은 상응하는 AB의 표적과 상이한 폴리펩티드 서열을 가진다.
일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체 중의 각각의 MM은 상응하는 AB의 임의의 천연 결합 파트너와 50% 이하로 동일한 폴리펩티드 서열을 가진다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체 중의 각각의 MM은 상응하는 AB의 임의의 천연 결합 파트너와 25% 이하로 동일한 폴리펩티드 서열을 가진다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체 중의 각각의 MM은 상응하는 AB의 임의의 천연 결합 파트너와 10% 이하로 동일한 폴리펩티드 서열을 가진다.
일부 실시양태에서, 각 MM의 커플링은, MM에 커플링되었을 때, 그의 상응하는 표적 또는 에피토프로의 AB의 해리 상수(Kd)가 MM에 커플링되지 않았을 때, 그의 상응하는 표적 또는 에피토프로의 AB의 Kd보다 20배 이상 더 크도록, 상응하는 AB가 그의 표적 또는 에피토프에 결합할 수 있는 능력을 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 각 MM의 커플링은, MM에 커플링되었을 때, 그의 상응하는 표적 또는 에피토프로의 AB의 해리 상수(Kd)가 MM에 커플링되지 않았을 때, 그의 상응하는 표적 또는 에피토프로의 AB의 Kd보다 40배 이상 더 크도록, 상응하는 AB가 그의 표적 또는 에피토프에 결합할 수 있는 능력을 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 각 MM의 커플링은, MM에 커플링되었을 때, 그의 상응하는 표적 또는 에피토프로의 AB의 해리 상수(Kd)가 MM에 커플링되지 않았을 때, 그의 상응하는 표적 또는 에피토프로의 AB의 Kd보다 100배 이상 더 크도록, 상응하는 AB가 그의 표적 또는 에피토프에 결합할 수 있는 능력을 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 각 MM의 커플링은, MM에 커플링되었을 때, 그의 상응하는 표적 또는 에피토프로의 AB의 해리 상수(Kd)가 MM에 커플링되지 않았을 때, 그의 상응하는 표적 또는 에피토프로의 AB의 Kd보다 1,000배 이상 더 크도록, 상응하는 AB가 그의 표적 또는 에피토프에 결합할 수 있는 능력을 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 각 MM의 커플링은, MM에 커플링되었을 때, 그의 상응하는 표적 또는 에피토프로의 AB의 해리 상수(Kd)가 MM에 커플링되지 않았을 때, 그의 상응하는 표적 또는 에피토프로의 AB의 Kd보다 10,000배 이상 더 크도록, 상응하는 AB가 그의 표적 또는 에피토프에 결합할 수 있는 능력을 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 각 MM은 본원에서 제공하는 실시예에 제시된 MM으로부터 선택되는 아미노산 서열이다.
일부 실시양태에서, 제1 절단가능한 모이어티(CM1) 서열을 절단하는 프로테아제는 조직 내에서 다중특이성 활성화 가능한 항체 중의 AB1의 표적과 함께 공국재화되며, 프로테아제는 다중특이성 활성화 가능한 항체가 프로테아제에 노출될 때, 다중특이성 활성화 가능한 항체 내의 CM1을 절단한다.
일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 1개 초과의 절단가능한 모이어티 서열을 포함하고, 1개 이상의 절단가능한 모이어티 서열을 절단하는 프로테아제는 조직 내에서 다중특이성 활성화 가능한 항체 중의 AB 영역 중 1개 이상의 것의 표적과 함께 공국재화되며, 프로테아제는 다중특이성 활성화 가능한 항체가 프로테아제에 노출될 때, 다중특이성 활성화 가능한 항체 내의 CM을 절단한다.
일부 실시양태에서, 각각의 CM, 예컨대, CM1 및 적어도 CM2는, 절단되지 않은 상태에서 다중특이성 활성화 가능한 항체의 AB 영역 중 하나의 표적에의 결합이 그의 표적에의 비변형된 AB 결합의 평형 해리 상수보다 20배 이상 더 큰 평형 해리 상수로 이루어지도록 감소되고, 반면, 절단된 상태에서는 AB가 그의 표적에 결합하도록 다중특이성 활성화 가능한 항체 내에 배치되어 있다.
일부 실시양태에서, 각각의 CM은, 절단되지 않은 상태에서 다중특이성 활성화 가능한 항체의 AB 영역 중 하나의 표적에의 결합이 그의 표적에의 비변형된 AB 결합의 평형 해리 상수보다 40배 이상 더 큰 평형 해리 상수로 이루어지도록 감소되고, 반면, 절단된 상태에서는 AB가 그의 표적에 결합하도록 다중특이성 활성화 가능한 항체 내에 배치되어 있다.
일부 실시양태에서, 각각의 CM은, 절단되지 않은 상태에서 다중특이성 활성화 가능한 항체의 AB 영역 중 하나의 표적에의 결합이 그의 표적에의 비변형된 AB 결합의 평형 해리 상수보다 50배 이상 더 큰 평형 해리 상수로 이루어지도록 감소되고, 반면, 절단된 상태에서는 AB가 그의 표적에 결합하도록 다중특이성 활성화 가능한 항체 내에 배치되어 있다.
일부 실시양태에서, 각각의 CM은, 절단되지 않은 상태에서 다중특이성 활성화 가능한 항체의 AB 영역 중 하나의 표적에의 결합이 그의 표적에의 비변형된 AB 결합의 평형 해리 상수보다 100배 이상 더 큰 평형 해리 상수로 이루어지도록 감소되고, 반면, 절단된 상태에서는 AB가 그의 표적에 결합하도록 다중특이성 활성화 가능한 항체 내에 배치되어 있다.
일부 실시양태에서, 각각의 CM은, 절단되지 않은 상태에서 다중특이성 활성화 가능한 항체의 AB 영역 중 하나의 표적에의 결합이 그의 표적에의 비변형된 AB 결합의 평형 해리 상수보다 200배 이상 더 큰 평형 해리 상수로 이루어지도록 감소되고, 반면, 절단된 상태에서는 AB가 그의 표적에 결합하도록 다중특이성 활성화 가능한 항체 내에 배치되어 있다.
일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체 중 각각의 CM은 길이가 15개 이하의 아미노산 길이인 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체 중 1개 이상의 CM은 아미노산 서열 LSGRSDNH(서열번호 26)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 절단가능한 모이어티는 특정 프로테아제, 예를 들어, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 1개 이상의 표적과 함께 공국재화되는 것으로 공지된 프로테아제와 함께 사용하기 위해 선택된다. 예를 들어, 본 개시내용의 다중특이성 활성화 가능한 항체에서 사용하는 데 적합한 절단가능한 모이어티는 1개 이상의 프로테아제, 예컨대, 우로키나제, 레구마인, 및/또는 마트립타제(이는 또한 본원에서 MT-SP1 또는 MTSP1로 지칭된다)에 의해 절단된다. 일부 실시양태에서, 적합한 절단가능한 모이어티는 하기 서열: TGRGPSWV(서열번호 27); SARGPSRW(서열번호 28); TARGPSFK(서열번호 29); LSGRSDNH(서열번호 26); GGWHTGRN(서열번호 30); HTGRSGAL(서열번호 31); PLTGRSGG(서열번호 32); AARGPAIH(서열번호 33); RGPAFNPM(서열번호 34); SSRGPAYL(서열번호 35); RGPATPIM(서열번호 36); RGPA(서열번호 37); GGQPSGMWGW(서열번호 38); FPRPLGITGL(서열번호 39); VHMPLGFLGP(서열번호 40); SPLTGRSG(서열번호 41); SAGFSLPA(서열번호 42); LAPLGLQRR(서열번호 43); SGGPLGVR(서열번호 44); 및/또는 PLGL(서열번호 45) 중 1개 이상의 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체 중 각각의 CM은 하기 표 3에 제시된 것으로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로테아제에 대한 기질이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 uPA, 레구마인, MT-SP1, ADAM17, BMP-1, TMPRSS3, TMPRSS4, 호중성 엘라스타제, MMP-7, MMP-9, MMP-12, MMP-13, 및 MMP-14로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 카텝신, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 카텝신 S이다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체 중 각각의 CM은 uPA(우로키나제 플라스미노겐 활성인자), 레구마인 및 MT-SP1(마트립타제)로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로테아제에 대한 기질이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 uPA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 레구마인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 MT-SP1을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP: matrix metalloprotease)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체 중 1개 이상의 CM은 2개 이상의 프로테아제에 대한 기질이다. 일부 실시양태에서, 각 프로테아제는 하기 표 3에 제시된 것으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체 중 1개 이상의 CM은 2개 이상의 프로테아제에 대한 기질이며, 여기서, 프로테아제 중 하나는 uPA, 레구마인 및 MT-SP1로 이루어진 군으로부터 선택되고, 나머지 다른 프로테아제는 하기 표 3에 제시된 것으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체 중 1개 이상의 CM은 uPA, 레구마인 및 MT-SP1로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 프로테아제에 대한 기질이다.
일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 적어도 제1 CM(CM1) 및 제2 CM(CM2)을 포함한다. 일부 실시양태에서, CM1 및 CM2는 MM을 AB에 연결시키는 단일 절단가능한 링커의 일부이다. 일부 실시양태에서, CM1은 MM1을 AB1에 연결시키는 절단가능한 링커의 일부이고, CM2는 MM2를 AB2에 연결시키는 별개의 절단가능한 링커의 일부이다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 2개 초과의 CM을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 다중특이성 활성화 가능한 항체는 2개 초과의 CM 및 2개 초과의 MM을 포함한다. 일부 실시양태에서, CM1 및 CM2는 각각 길이가 15개 이항의 아미노산 길이인 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 제1 CM 및 제2 CM 중 적어도 하나는 하기 표 3에 열거된 것으로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로테아제에 대한 기질로서 기능하는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 제1 CM 및 제2 CM 중 적어도 하나는 uPA, 레구마인, 및 MT-SP1로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로테아제에 대한 기질로서 기능하는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 제1 CM은 표적 조직에서 uPA, 레구마인, 및 MT-SP1로 이루어진 군으로부터 선택되는 제1 절단제에 의해 절단되고, 제2 CM은 표적 조직에서 제2 절단제에 의해 절단된다. 일부 실시양태에서, 나머지 다른 한 프로테아제는 하기 표 3에 제시된 것으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 제1 절단제 및 제2 절단제는 하기 표 3에 열거된 것으로 이루어진 군으로부터 선택되는 동일한 프로테아제이고, 제1 CM 및 제2 CM은 효소에 대하여 상이한 기질이다. 일부 실시양태에서, 제1 절단제 및 제2 절단제는 uPA, 레구마인, 및 MT-SP1로 이루어진 군으로부터 선택되는 동일한 프로테아제이고, 제1 CM 및 제2 CM은 효소에 대하여 상이한 기질이다. 일부 실시양태에서, 제1 절단제 및 제2 절단제는 하기 표 3에 열거된 군으로부터 선택되는 동일한 프로테아제이고, 제1 CM 및 제2 CM은 동일한 기질이다. 일부 실시양태에서, 제1 절단제 및 제2 절단제는 상이한 프로테아제이다. 일부 실시양태에서, 제1 절단제 및 제2 절단제는 하기 표 3에 제시된 것으로 이루어진 군으로부터 선택되는 상이한 프로테아제이다. 일부 실시양태에서, 제1 절단제 및 제2 절단제는 조직 내에서 공국재화된다. 일부 실시양태에서, 제1 CM 및 제2 CM은 표적 조직에서 1개 이상의 절단제에 의해 절단된다.
일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 프로테아제에 노출되고, 그에 의해 절단되며, 이로써, 활성화된 또는 절단된 상태에서, 활성화된 다중특이성 활성화 가능한 항체는 프로테아제가 CM을 절단한 후, LP2 및/또는 CM 서열의 적어도 일부를 포함하는 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 또한 신호 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 신호 펩티드는 스페이서를 통해 다중특이성 활성화 가능한 항체에 컨쥬게이트된다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 신호 펩티드의 부재하에 다중특이성 활성화 가능한 항체에 컨쥬게이트된다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 다중특이성 활성화 가능한 항체의 MM 중 1개 이상의 것에 직접 연결된다.
일부 실시양태에서, 절단되지 않은 상태에서 다중특이성 활성화 가능한 항체는 제1 MM에 직접 연결된 스페이서를 포함하고, N 말단에서 C 말단으로 스페이서-MM1-CM-AB1의 구조적 배열을 가진다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 적어도 아미노산 서열 QGQSGQ(서열번호　46)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 상응하는 다중특이성 항체의 것보다 길고;, 예컨대, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 pK는 상응하는 다중특이성 항체의 것보다 길다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 상응하는 다중특이성 항체의 것과 유사하다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에게 투여되었을 때, 15일 이상이다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에게 투여되었을 때, 12일 이상이다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에게 투여되었을 때, 11일 이상이다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에게 투여되었을 때, 10일 이상이다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에게 투여되었을 때, 9일 이상이다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에게 투여되었을 때, 8일 이상이다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에게 투여되었을 때, 7일 이상이다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에게 투여되었을 때, 6일 이상이다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에게 투여되었을 때, 5일 이상이다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에게 투여되었을 때, 4일 이상이다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에게 투여되었을 때, 3일 이상이다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에게 투여되었을 때, 2일 이상이다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에게 투여되었을 때, 24시간 이상이다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에게 투여되었을 때, 20시간 이상이다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에게 투여되었을 때, 18시간 이상이다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에게 투여되었을 때, 16시간 이상이다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에게 투여되었을 때, 14시간 이상이다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에게 투여되었을 때, 12시간 이상이다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에게 투여되었을 때, 10시간 이상이다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에게 투여되었을 때, 8시간 이상이다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에게 투여되었을 때, 6시간 이상이다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에게 투여되었을 때, 4시간 이상이다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 유기체에게 투여되었을 때, 3시간 이상이다.
본 개시내용은 또한 표적에 특이적으로 결합하는 적어도 제1 항체 또는 항체 단편(AB1) 및 제2 항체 또는 항체 단편(AB2)을 포함하는 다중특이성 활성화 가능한 항체를 포함하며, 여기서, 다중특이성 활성화 가능한 항체 중의 적어도 제1 AB는 그의 표적에 결합할 수 있는 AB1의 능력을 감소시키는 마스킹 모이어티(MM1)에 커플링된 것인, 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 각각의 AB는 각 표적에 결합할 수 있는 그의 상응하는 AB의 능력을 감소시키는 MM에 커플링된다. 예를 들어, 이중특이성 활성화 가능한 항체 실시양태에서, AB1은 그의 표적에 결합할 수 있는 AB1의 능력을 감소시키는 제1 마스킹 모이어티(MM1)에 커플링되고, AB2는 그의 표적에 결합할 수 있는 AB2의 능력을 감소시키는 제2 마스킹 모이어티(MM2)에 커플링된다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 2개 초과의 AB 영역을 포함하고; 상기 실시양태에서, AB1은 그의 표적에 결합할 수 있는 AB1의 능력을 감소시키는 제1 마스킹 모이어티(MM1)에 커플링되고, AB2는 그의 표적에 결합할 수 있는 AB2의 능력을 감소시키는 제2 마스킹 모이어티(MM2)에 커플링되고, AB3은 그의 표적에 결합할 수 있는 AB3의 능력을 감소시키는 제3 마스킹 모이어티(MM3)에 커플링되며, 다중특이성 활성화 가능한 항체 중 각 AB에 대하여 상기와 같이 이루어진다.
일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 프로테아제에 대한 기질인 1개 이상의 절단가능한 모이어티(CM)로서, 여기서, CM은 MM을 AB에 연결하는 것인 CM을 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 표적에 특이적으로 결합하는 적어도 제1 항체 또는 항체 단편(AB1) 및 제2 항체 또는 항체 단편(AB2)을 포함하고, 여기서, 다중특이성 활성화 가능한 항체 중의 적어도 제1 AB는 제1 절단가능한 모이어티(CM1)를 통해 그의 표적에 결합할 수 있는 AB1의 능력을 감소시키는 마스킹 모이어티(MM1)에 커플링된다. 일부 이중특이성 활성화 가능한 항체 실시양태에서, AB1은 CM1을 통해 MM1에 커플링되고, AB2는 제2 절단가능한 모이어티(CM2)를 통해 그의 표적에 결합할 수 있는 AB2의 능력을 감소시키는 제2 마스킹 모이어티(MM2)에 커플링된다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 2개 초과의 AB 영역을 포함하고; 본 실시양태 중 일부에서, AB1은 CM1을 통해 MM1에 커플링되고, AB2는 CM2를 통해 MM2에 커플링되고, AB3은 제3 절단가능한 모이어티(CM3)를 통해 그의 표적에 결합할 수 있는 AB2의 능력을 감소시키는 제3 마스킹 모이어티(MM3)에 커플링되며, 다중특이성 활성화 가능한 항체 중 각 AB에 대하여 상기와 같이 이루어진다.
본원에서 제공하는 조성물 및 방법을 통해 다중특이성 활성화 가능한 항체의 활성(예컨대, 마스킹, 활성화 또는 결합 활성)을 손상시키지 않으면서, AB 영역 중 임의의 것 중의 하나 이상의 시스테인 잔기에 하나 이상의 작용제를 부착시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공하는 조성물 및 방법을 통해 MM 중 임의의 것 내의 하나 이상의 이황화 결합을 환원 또는 다르게는 파괴시키지 않으면서 AB 영역 중 임의의 것 중의 하나 이상의 시스테인 잔기에 하나 이상의 작용제를 부착시킬 수 있다. 본원에서 제공하는 조성물 및 방법을 통해 바람직하게는 다중특이성 활성화 가능한 항체의 MM 중 임의의 것에 컨쥬게이트된 작용제(들) 없이도, 하나 이상의 작용제, 예컨대, 다양한 치료제, 진단제 및/또는 예방제 중 임의의 것에 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체가 제조된다. 본원에서 제공하는 조성물 및 방법을 통해 각각의 MM이 절단되지 않은 상태의 다중특이성 활성화 가능한 항체의 그의 상응하는 AB를 효과적으로 및 효율적으로 마스킹시킬 수 있는 능력을 보유하는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체가 제조된다. 본원에서 제공하는 조성물 및 방법을 통해 활성화 가능한 항체가 CM을 절단할 수 있는 프로테아제의 존재 하에서 여전히 활성화된 상태인, 즉, 절단된 상태인 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체가 제조된다.
다중특이성 활성화 가능한 항체는 작용제에 대하여 1개 이상의 컨쥬게이션 지점을 가지지만, 본원에서 제공하는 방법 및 조성물에서, 작용제에의 컨쥬게이션을 위해서는 모든 가능한 컨쥬게이션 지점보다 적게 이용가능하다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 컨쥬게이션 지점은 이황화 결합에 관여하는 황 원자이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 컨쥬게이션 지점은 쇄간 이황화 결합에 관여하는 황 원자이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 컨쥬게이션 지점은 쇄간 황화 결합에 관여하는 황 원자이지만, 쇄내 이황화 결합에 관여하는 황 원자는 아니다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 컨쥬게이션 지점은 시스테인 또는 황 원자를 함유하는 다른 아미노산 잔기의 황 원자이다. 상기 잔기는 항체 구조에서 천연적으로 발생될 수 있거나, 또는 부위 지정 돌연변이유발법, 화학적 전환, 또는 비천연 아미노산의 오도입(mis-incorporation)에 의해 항체 내로 도입될 수 있다.
AB 중 하나 이상의 것에 하나 이상의 쇄간 이황화 결합을 가지고, 상응하는 MM 중에 하나 이상의 쇄내 이황화 결합을 가지는 다중특이성 활성화 가능한 항체의 컨쥬게이트를 제조하는 방법 또한 제공하고, 유리 티올과 반응성인 약물을 제공한다. 본 발명은 일반적으로 환원제, 예컨대, TCEP로 활성화 가능한 항체 중의 쇄간 이황화 결합을 환원시키고; 유리 티올과 반응성인 약물을 부분적으로 환원된 활성화 가능한 항체에 컨쥬게이트시키는 것을 포함한다. 본원에서 사용되는 바, 부분적 환원이라는 용어는 다중특이성 활성화 가능한 항체를 환원제를 접촉시키고, 모든 이황화 결합보다 적게, 예컨대, 모든 가능한 컨쥬게이션 부위보다 적게 환원되는 상황을 의미한다. 일부 실시양태에서, 모든 가능한 컨쥬게이션 부위의 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 미만, 또는 5% 미만이 환원된다.
추가의 다른 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체를 환원시키고, 그에 작용제, 예컨대, 약물을 컨쥬게이트시켜 작용제의 배치에 선택성을 부여하는 방법을 제공한다. 본 방법은 일반적으로 활성화 가능한 항체의 마스킹 모이어티 또는 다른 비AB 부분 중 임의의 것에서 임의의 컨쥬게이션이 환원되지 않도록 환원제로 다중특이성 활성화 가능한 항체를 부분적으로 환원시키고, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 AB 영역 중 하나 이상의 것에서 작용제를 쇄간 티올에 컨쥬게이트시키는 것을 포함한다. 컨쥬게이션 부위(들)는 컨쥬게이션이 원하는 부위에서 이루어질 수 있게 작용제가 원하는 곳에 배치되도록 선택된다. 환원제는 예를 들어, TCEP이다. 환원 반응 조건, 예컨대, 환원제 대 활성화 가능한 항체의 비율, 인큐베이션 기간, 인큐베이션 동안의 온도, 환원 반응액의 pH 등은 MM이 절단되지 않은 상태의 활성화 가능한 항체의 AB를 효과적으로 및 효율적으로 마스킹시킬 수 있는 능력을 보유하는, 컨쥬게이트된 활성화 가능한 항체를 제조하는 조건을 확인함으로써 결정된다. 환원제 대 다중특이성 활성화 가능한 항체의 비율은 활성화 가능한 항체에 따라 달라질 것이다. 일부 실시양태에서, 환원제 대 다중특이성 활성화 가능한 항체의 비율은 약 20:1 내지 1:1, 약 10:1 내지 1:1, 약 9:1 내지 1:1, 약 8:1 내지 1:1, 약 7:1 내지 1:1, 약 6:1 내지 1:1, 약 5:1 내지 1:1, 약 4:1 내지 1:1, 약 3:1 내지 1:1, 약 2:1 내지 1:1, 약 20:1 내지 1:1.5, 약 10:1 내지 1:1.5, 약 9:1 내지 1:1.5, 약 8:1 내지 1:1.5, 약 7:1 내지 1:1.5, 약 6:1 내지 1:1.5, 약 5:1 내지 1:1.5, 약 4:1 내지 1:1.5, 약 3:1 내지 1:1.5, 약 2:1 내지 1:1.5, 약 1.5:1 내지 1:1.5, 또는 약 1:1 내지 1:1.5 범위가 될 것이다. 일부 실시양태에서, 비율은 약 5:1 내지 1:1 범위이다. 일부 실시양태에서, 비율은 약 5:1 내지 1.5:1 범위이다. 일부 실시양태에서, 비율은 약 4:1 내지 1:1 범위이다. 일부 실시양태에서, 비율은 약 4:1 내지 1.5:1 범위이다. 일부 실시양태에서, 비율은 약 8:1 내지 약 1:1 범위이다. 일부 실시양태에서, 비율은 약 2.5:1 내지 1:1 범위이다.
일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 AB 영역 중 하나 이상의 것에서 쇄간 이황화 결합을 환원시키고, 작용제, 예컨대, 티올 함유 작용제, 예컨대, 약물을 생성된 쇄간 티올에 컨쥬게이트시켜 AB 상에 작용제(들)를 선택적으로 국재화시키는 방법을 제공한다. 본 방법은 일반적으로 환원제로 AB 영역 중 하나 이상의 것을 부분적으로 환원시켜 활성화 가능한 항체 중의 모든 가능한 쇄간 티올을 형성하지 않으면서, 2개 이상의 쇄간 티올을 형성하고; 작용제를 부분적으로 환원된 AB의 쇄간 티올에 컨쥬게이트시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 AB 영역 중 하나 이상의 것을 원하는 비율의 환원제:활성화 가능한 항체로 약 37℃에서 약 1시간 동안 부분적으로 환원시킨다. 일부 실시양태에서, 환원제 대 활성화 가능한 항체의 비율은 약 20:1 내지 1:1, 약 10:1 내지 1:1, 약 9:1 내지 1:1, 약 8:1 내지 1:1, 약 7:1 내지 1:1, 약 6:1 내지 1:1, 약 5:1 내지 1:1, 약 4:1 내지 1:1, 약 3:1 내지 1:1, 약 2:1 내지 1:1, 약 20:1 내지 1:1.5, 약 10:1 내지 1:1.5, 약 9:1 내지 1:1.5, 약 8:1 내지 1:1.5, 약 7:1 내지 1:1.5, 약 6:1 내지 1:1.5, 약 5:1 내지 1:1.5, 약 4:1 내지 1:1.5, 약 3:1 내지 1:1.5, 약 2:1 내지 1:1.5, 약 1.5:1 내지 1:1.5, 또는 약 1:1 내지 1:1.5 범위가 될 것이다. 일부 실시양태에서, 비율은 약 5:1 내지 1:1 범위이다. 일부 실시양태에서, 비율은 약 5:1 내지 1.5:1 범위이다. 일부 실시양태에서, 비율은 약 4:1 내지 1:1 범위이다. 일부 실시양태에서, 비율은 약 4:1 내지 1.5:1 범위이다. 일부 실시양태에서, 비율은 약 8:1 내지 약 1:1 범위이다. 일부 실시양태에서, 비율은 약 2.5:1 내지 1:1 범위이다.
티올 함유 시약은 예를 들어, 시스테인 또는 N-아세틸 시스테인일 수 있다. 환원제는 예를 들어, TCEP일 수 있다. 일부 실시양태에서, 환원된 활성화 가능한 항체는 예를 들어, 컬럼 크로마토그래피, 투석, 또는 투석 여과를 이용하여 컨쥬게이션 이전에 정제될 수 있다. 별법으로, 환원된 항체는 부분 환원 이후 및 컨쥬게이션 이전에 정제되지 않는다.
본 개시내용은 또한 다중특이성 활성화 가능한 항체 중 1개 이상의 쇄간 이황화 결합이 다중특이성 활성화 가능한 항체 중 임의의 쇄내 이황화 결합은 파괴하지 않으면서 환원제로 환원된 것인 부분적으로 환원된 다중특이성 활성화 가능한 항체로서, 여기서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 표적에 특이적으로 결합하는 적어도 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1), 절단되지 않은 상태의 다중특이성 활성화 가능한 항체의 AB1의 표적에의 결합을 억제하는 제1 마스킹 모이어티(MM1), AB1에 커플링된 제1 절단가능한 모이어티(CM1)(여기서, CM1은 프로테아제에 대한 기질로서 기능하는 폴리펩티드이다), 및 제2 표적에 특이적으로 결합하는 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)을 포함하는 것인, 부분적으로 환원된 다중특이성 활성화 가능한 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, MM1은 CM1을 통해 AB1에 커플링된다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 하나 이상의 쇄내 이황화 결합(들)은 환원제에 의해 파괴되지 않는다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체 내의 MM1의 하나 이상의 쇄내 이황화 결합(들)은 환원제에 의해 파괴되지 않는다. 일부 실시양태에서, 환원제는 TCEP이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 하나 이상의 추가의 작용제와 함께 또는 추가의 작용제의 조합물로 사용된다. 적합한 추가의 작용제는 의도된 적용을 위한, 예컨대, 암을 위한 현행 제약 요법 및/또는 수술 요법을 포함한다. 예를 들어, 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 추가의 화학요법제 또는 항신생물제와 함께 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체 및 추가의 작용제는 단일 치료학적 조성물로 제제화되고, 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체 및 추가의 작용제는 동시에 투여된다. 별법으로, 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체 및 추가의 작용제는 서로 별개의 것이며, 예컨대, 각각은 별개의 치료학적 조성물로 제제화되고, 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체 및 추가의 작용제는 동시에 투여되거나, 또는 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체 및 추가의 작용제는 치료 요법 동안 상이한 시점에 투여된다. 예를 들어, 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 추가의 작용제 투여 이전에 투여되거나, 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 추가의 작용제 투여 이후에 투여되거나, 또는 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체 및 추가의 작용제는 교대로 투여되는 방식으로 투여된다. 본원에 기술된 바와 같이, 항다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체 및 추가의 작용제는 단일 용량으로 또는 다회 용량으로 투여된다.
본 개시내용은 또한 본원에 기술된 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자뿐만 아니라, 상기 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 본 개시내용은 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체의 발현을 유도하는 조건 하에서 세포를 배양하며, 여기서, 세포는 상기 핵산 분자를 포함하는 것인, 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 상기 벡터를 포함한다.
본 개시내용은 또한 (a) 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체의 발현을 유도하는 조건 하에서 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체를 코딩하는 핵산 구성물을 포함하는 세포를 배양하고, 및 (b) 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체를 회수함으로써, 본 개시내용의 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 본 치료 또는 예방을 필요로 하는 피험체에게 본 개시내용의 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체를 투여함으로써 하나 이상의 병상의 증상을 치료하거나, 예방하거나, 그의 진행을 지연시키거나, 또는 다르게는 그를 호전시키거나, 또는 상기 병상과 관련된 증상을 경감시키는 방법을 제공한다. 치료하고자 하는 피험체는, 예컨대, 인간 또는 다른 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 피험체는 비인간 포유동물, 예컨대, 비인간 영장류, 반려 동물(예컨대, 고양이, 개, 말), 농장 동물, 노동 동물, 또는 동물원 동물이다. 일부 실시양태에서, 피험체는 설치류이다.
본 개시내용은 또한 본 유도를 필요로 하는 피험체에게 본 개시내용의 다중특이성 활성화 가능한 항체를 투여함으로써 표적 의존성 T 세포 활성화 및 표적 세포의 사멸을 유도하는 방법으로서, 여기서, 다중특이성 활성화 가능한 항체가 절단된 상태일 때, 예컨대, 다중특이성 활성화 가능한 항체 중의 각 마스킹 모이어티가 상응하는 AB 도메인에 더 이상 부착되어 있지 않거나, 또는 다르게는 그와 결합되어 있지 않을 때, 표적 의존성 T 세포 활성화 및 표적 세포의 사멸이 이루어지고, 다중특이성 활성화 가능한 항체가 절단되지 않은 상태일 때, 예컨대, 다중특이성 활성화 가능한 항체 중의 1개 이상의 마스킹 모이어티가 상응하는 AB 도메인에 부착되어 있거나, 또는 다르게는 그와 결합되어 있을 때, 표적 의존성 T 세포 활성화 및 표적 세포의 사멸이 감소되거나, 또는 다르게는 억제되는 것인 방법을 제공한다. 본원에 기술된 다중특이성 활성화 가능한 항체 중 임의의 것은 상기 방법에서 사용하는 데 적합하다. 치료하고자 하는 피험체는, 예컨대, 인간 또는 다른 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 피험체는 비인간 포유동물, 예컨대, 비인간 영장류, 반려 동물(예컨대, 고양이, 개, 말), 농장 동물, 노동 동물, 또는 동물원 동물이다. 일부 실시양태에서, 피험체는 설치류이다.
본 방법 및 용도의 실시양태 중 임의의 것에서 사용되는 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 질환의 임의의 단계에서 및/또는 T 세포 활성화 및 표적 세포의 사멸이 요구되는 임의의 단계에서 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 조기 단계부터 전이 단계까지, 임의 병기의 암을 앓는 환자에게 투여될 수 있다. 피험체 및 환자라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 본 방법 및 용도의 실시양태 중 임의의 것에서 사용되는 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 네오애주번트 요법을 포함하는 치료 요법에서 사용될 수 있다. 본 방법 및 용도의 실시양태 중 임의의 것에서 사용되는 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 단독으로 투여될 수 있거나, 또는 소분자 억제제를 비롯한, 하나 이상의 추가의 작용제, 다른 항체 기반 요법, 폴리펩티드 또는 펩티드 기반 요법, 핵산 기반 요법 및/또는 다른 생물학적 제제와 함께 조합하여 투여될 수 있다.
본 개시내용은 또한 다양한 진단학적 및/또는 예방학적 적응증에서 중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체를 사용하기 위한 방법 및 키트를 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용은 (i) 피험체 또는 샘플을 적어도 제1 마스킹 모이어티(MM1), 절단제에 의해 절단되는 제1 절단가능한 모이어티(CM1), 및 관심의 대상이 되는 표적에 특이적으로 결합하는 적어도 제1 항원 결합 도메인 또는 그의 단편(AB1) 및 제2 표적 및/또는 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인 또는 그의 단편(AB2)을 포함하는 다중특이성 활성화 가능한 항체와 접촉시키는 단계로서, (a) 여기서, MM1은 AB1의 표적에의 결합을 억제하는 펩티드이고, 여기서, MM1은 AB1의 천연적으로 발생된 결합 파트너의 아미노산 서열을 가지지 않고, AB1의 천연 결합 파트너의 변형된 형태가 아니고; (b) 여기서, 절단되지 않은, 활성화되지 않은 상태에서 MM1은 AB1의 표적에의 특이 결합을 방해하고, 절단된, 활성화된 상태에서 MM1은 AB1의 표적에의 특이 결합을 방해하거나 그와 경쟁하지 않는 것인 단계; 및 (ii) 피험체 또는 샘플에서 활성화된 다중특이성 활성화 가능한 항체의 수준을 측정하는 단계로서, 여기서, 피험체 또는 샘플에서 활성화된 다중특이성 활성화 가능한 항체의 검출가능한 수준은 절단제 및 표적이 피험체 또는 샘플에 존재함을 나타내고, 여기서, 피험체 또는 샘플에서 활성화된 다중특이성 활성화 가능한 항체가 검출가능한 수준으로 존재하지 않는 것은 절단제, 표적 또는 절단제 및 표적, 둘 모두가 피험체 또는 샘플에 부재하고/거나, 충분하게 존재하지 않는다는 것을 나타내는 것인 단계에서 의해, 피험체 또는 샘플에서 관심의 대상이 되는 절단제 및 표적의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 방법 및 키트를 제공한다.
일부 실시양태에서, 활성화 가능한 다중특이성 활성화 가능한 항체는 치료제가 컨쥬게이트된 활성화 가능한 다중특이성 활성화 가능한 항체이다. 일부 실시양태에서, 활성화 가능한 다중특이성 활성화 가능한 항체는 작용제에 컨쥬게이트되지 않는 것이다. 일부 실시양태에서, 활성화 가능한 다중특이성 활성화 가능한 항체는 검출가능한 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 표지는 AB1 상에 배치되어 있다. 일부 실시양태에서, 피험체 또는 샘플에서 활성화된 다중특이성 활성화 가능한 항체의 수준을 측정하는 단계는 활성화된 다중특이성 활성화 가능한 항체에 특이적으로 결합하는 제2 시약을 사용함으로써 달성되며, 여기서, 시약은 검출가능한 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 시약은 검출가능한 표지를 포함하는 항체이다.
본 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 활성화 가능한 다중특이성 활성화 가능한 항체는 검출가능한 표지를 포함한다. 본 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 검출가능한 표지는 영상화제, 조영제, 효소, 형광성 표지, 발색단, 염료, 하나 이상의 금속 이온, 또는 리간드 기반 표지를 포함한다. 본 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 영상화제는 방사성 동위원소를 포함한다. 본 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 방사성 동위원소는 인듐 또는 테크네튬이다. 본 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 조영제는 요오드, 가돌리늄 또는 철 산화물을 포함한다. 본 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 효소는 홀스래디쉬 퍼옥시다아제, 알칼리성 포스파타제, 또는 β-갈락토시다아제를 포함한다. 본 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 형광성 표지는 황색 형광성 단백질(YFP: yellow fluorescent protein), 청록색 형광성 단백질(CFP: cyan fluorescent protein), 녹색 형광성 단백질(GFP: green fluorescent protein), 변형된 적색 형광성 단백질(mRFP: modified red fluorescent protein), 적색 형광성 단백질 tdimer2 (RFP tdimer2), HCRED, 또는 유로퓸 유도체를 포함한다. 본 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 발광성 표지는 N-메틸아크리듐 유도체를 포함한다. 본 방법의 일부 실시양태에서, 표지는 알렉스플루오르(AlexFluor)® 표지, 예컨대, 알렉스 플루오르® 680 또는 알렉스 플루오르® 750을 포함한다. 본 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 리간드 기반 표지는 비오틴, 아비딘, 스트렙트아비딘 또는 하나 이상의 합텐을 포함한다.
본 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 피험체는 포유동물이다. 본 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 피험체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 피험체는 비인간 포유동물, 예컨대, 비인간 영장류, 반려 동물(예컨대, 고양이, 개, 말), 농장 동물, 노동 동물, 또는 동물원 동물이다. 일부 실시양태에서, 피험체는 설치류이다.
본 방법의 일부 실시양태에서, 본 방법은 생체내 방법이다. 본 방법의 일부 실시양태에서, 본 방법은 계내 방법이다. 본 방법의 일부 실시양태에서, 본 방법은 생체외 방법이다. 본 방법의 일부 실시양태에서, 본 방법은 시험관내 방법이다.
본 방법 및 키트의 일부 실시양태에서, 본 방법 또는 키트는 본 개시내용의 다중특이성 활성화 가능한 항체를 이용하여 치료하는 데 적합한 환자 집단을 확인하거나, 또는 다르게는 그를 정련하는 데 사용된다. 예를 들어, 본 방법에서 시험되는 다중특이성 활성화 가능한 항체 중 제1 절단가능한 모이어티(CM1)에서 기질을 절단하는 프로테아제 및 표적, 둘 모두에 대하여 양성 반응을 보이는 환자는 상기 CM1을 포함하는 상기 다중특이성 활성화 가능한 항체를 이용한 치료에 대해 적합한 후보인 것으로 확인된다. 유사하게, 본 방법에서 시험되는 다중특이성 활성화 가능한 항체 중 CM1에서 기질을 절단하는 프로테아제 및 표적, 둘 모두에 대하여 음성 반응을 보이는 환자는 또 다른 형태의 요법에 대해 적합한 후보인 것으로 확인될 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법 또는 키트는 본 개시내용의 다중특이성 활성화 가능한 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체(예컨대, 치료제가 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체)를 이용하여 치료한 후, 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체를 그를 필요로 하는 피험체에게 투여함으로써 치료하는 데 적합한 환자 집단을 확인하거나, 또는 다르게는 그를 정련하는 데 사용된다. 예를 들어, 본 방법에서 시험되는 다중특이성 활성화 가능한 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체 중 제1 절단가능한 모이어티(CM1)에서 기질을 절단하는 프로테아제 및 표적, 둘 모두에 대하여 양성 반응을 보이는 환자는 상기 CM1을 포함하는 다중특이성 활성화 가능한 항체 및/또는 상기 CM1을 포함하는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체를 이용한 치료에 대해 적합한 후보인 것으로 확인되고, 이어서, 환자는 시험된 치료학상 유효량의 다중특이성 활성화 가능한 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체를 투여받는다. 유사하게, 본 방법을 사용하여 시험된 다중특이성 활성화 가능한 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체 중 CM1에서 기질을 절단하는 프로테아제 및 표적, 둘 모두에 대하여 음성 반응을 보이는 환자는 또 다른 형태의 요법에 대해 적합한 후보인 것으로 확인될 수 있다.
일부 실시양태에서, 치료에 적합한 다중특이성 활성화 가능한 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체, 예컨대, 환자에 의해 질환 부위에서 절단되는 CM을 포함하는 다중특이성 활성화 가능한 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체가 확인될 때까지, 상기 환자는 다른 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체로 시험될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이어서, 환자는 환자가 양성 반응을 보인 다중특이성 활성화 가능한 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체를 치료학상 유효량으로 투여받는다.
본 개시내용에 따른 제약 조성물은 본 개시내용의 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체 및 담체를 포함할 수 있다. 본 제약 조성물은 키트, 예컨대, 진단용 키트에서 사용될 수 있다.
당업자는 본 개시내용의 항체가 다양한 용도를 가진다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 본 개시내용의 단백질은 다양한 장애에 대한 치료제로서 사용된다. 본 개시내용의 항체는 또한 진단용 키트에서 시약으로서 또는 진단 도구로서 사용되거나, 상기 항체는 치료학적 시약을 생성하는 경쟁 검정법에서 사용될 수 있다.
도 1a-1b는 (문헌 [Chan and Carter, Nat. Rev. Immunol. 2010]으로부터 개조된) 다양한 다양한 이중특이성 항체 포맷을 도시한 도해이다.
도 2a-2c는 본 개시내용의 조성물 및 방법에서 사용하는 데 적합한 다양한 다중특이성 항체 포맷을 도시한 일련의 도해이다. 이중특이성 항체에서, scFv는 IgG 항체의 중쇄(Hc)의 카복실 말단에(도 2a); 경쇄(Lc)의 카복실 말단에(도 2b); 또는 중쇄 및 경쇄, 둘 모두의 카복실 말단에(도 2c)에 융합될 수 있다. 도 2d는 다중특이성 항체 융합체의 발현을 위한 단일 유전적 구성물의 다이어그램이다.
도 3a는 본 개시내용의 조성물 및 방법에서 사용하는 데 적합한 다양한 다중특이성 활성화 가능한 항체 포맷을 도시한 일련의 도해이다. 도 3b는 다중특이성 활성화 가능한 항체 융합체의 발현을 위한 유전적 구성물의 다이어그램이다.
도 4, 패널 a-j는 본 개시내용의 다중특이성 항체의 가능한 순열의 선택된 세트에 관한 일련의 개략적 다이어그램이다. 회색 음영 표시된 박스는 도 2에 제시된 입체구조에 적용되고, 이는 완전성 및 비교를 위해 본원에 포함된다.
도 5, 패널 a-j는 본 개시내용의 다중특이성 활성화 가능한 항체의 가능한 순열의 선택된 세트에 관한 일련의 개략적 다이어그램이다. 회색 음영 표시된 박스는 도 3에 제시된 입체구조에 적용되고, 이는 완전성 및 비교를 위해 본원에 포함된다. 특히, 본 도면은 일차 항원 결합 부위는 마스킹되고(즉, 활성 가능하고), 추가의 항원 결합 도메인(들)은 마스킹되지 않은 다중특이성 활성화 가능한 항체를 보여주는 것이다.
도 6, 패널 a-j는 항원 결합 도메인 모두가 마스킹된 다중특이성 활성화 가능한 항체의 어레이에 관한 일련의 개략적 다이어그램이다.
도 7, 패널 a-j는 이차 항원 결합 도메인은 마스킹되고, 추가의 항원 결합 도메인(들)은 마스킹되지 않은 다중특이성 활성화 가능한 항체의 어레이에 관한 일련의 개략적 다이어그램이다.
도 8, 패널 a-j는 항원 결합 도메인 전부는 아니지만, 대다수가 마스킹되고, 1개 이상의 추가의 항원 결합 도메인(들)은 마스킹되지 않은 다중특이성 활성화 가능한 항체의 어레이에 관한 일련의 개략적 다이어그램이다.
도 9, 패널 a-d는 일차 항원 결합 도메인 및 또 다른 항원 결합 도메인은 마스킹되고, 남은 항원 결합 도메인(들)은 마스킹되지 않은 다중특이성 활성화 가능한 항체의 어레이에 관한 일련의 개략적 다이어그램이다.
도 10은 각 단일특이성 항체 또는 활성화 가능한 항체, 샘플 9-11와 비교하여, scFv 융합된 중쇄, 샘플 1-8의 분자량을 입증하는, 다중특이성 항체 및 다중특이성 활성화 가능한 항체의 PAGE 분석을 도시한 사진이다.
도 11은 그의 동족체 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 다중특이성 항체의 능력을 도시하는 그래프이다.
도 12a-12b는 (a) 마우스 및 (b) 인간 CTLA-4에 특이적으로 결합할 수 있는, 항인간 CTLA-4 scFv를 포함하는 다중특이성 항체 및 다중특이성 활성화 가능한 항체의 능력을 도시하는 일련의 그래프이다.
도 13은 ELIS결합 실험에서 인간 CD3ε에 특이적으로 결합할 수 있는, 본원에서 항EGFR 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-OKT3 및 항Jagged 다중특이성 활성화 가능한 항체 5342-1204-4D11v2-OKT3으로 지칭되는 OKT3 함유 다중특이성 활성화 가능한 항체의 능력을 도시하는 그래프이다.
도 14a-14b는 중쇄 scFv 융합체의 절단 없이 다중특이성 활성화 가능한 항체의 활성화를 입증하는 uPA 분해물의 PAGE 분석을 도시한 일련의 사진이다.
도 15는 다양한 표적에 결합할 수 있는 활성화된 다중특이성 활성화 가능한 항체의 능력을 도시한 일련의 그래프이다.
도 16a는 본 개시내용의 다중특이성 항체의 CD3ε 양성 주르카트(Jurkat) T 세포에의 결합을 도시하는 그래프이다.
도 16b는 본 개시내용의 다중특이성 항체의 CD3ε 양성 주르카트 T 세포 및 EGFR에의 공동 결합을 도시하는 그래프이다.
도 17은 본 개시내용의 다중특이성 항체에 의한 주르카트 T 세포의 EGFR 의존성 활성화를 도시하는 일련의 그래프이다.
도 18a는 본 개시내용의 다중특이성 항체에 의한 일차 CD8+ T 세포의 EGFR 의존성 활성화를 도시한 그래프이다.
도 18b는 본 개시내용의 다중특이성 항체에 의한 표적 세포의 EGFR 의존성 사멸을 도시한 그래프이다.
도 18c는 EGFR 음성 U266 세포에서의 최소 활성화와 비교하여, EGFR을 발현하는 SW480 세포에서의 다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-H-N에 의한 일차 T 세포의 CD69 활성화를 도시한 일련의 그래프이다.
도 18d는 EGFR 음성 U266 세포에서의 무시해도 될 정도의 사멸과 비교하여, EGFR을 발현하는 SW480 세포에서의 다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-H-N에 의한 표적 세포의 EGFR 의존성 사멸을 도시한 일련의 그래프이다.
도 19는 EGFR 음성 U266 세포주에서는 용해가 없는 것과 비교하여, 다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-H-N에 의한 EGFR을 발현하는 세포주 패널의 일차 T 세포 용해를 도시한 일련의 그래프이다.
도 20a 및 도 20b는 다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-H-N에 의한 EGFR 결합과 비교하여 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N의 EGFR을 발현하는 세포에의 결합이 감소되었음을 도시한 일련의 그래프이다. 추가로, 도 20a 및 도 20b는 마트립타제(이는 또한 본원에서 MTSP1 또는 MT-SP1로도 지칭된다)에 의한 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N의 프로테아제 활성화가 EGFR 결합을 다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-H-N에 의해 나타나는 것과 등가인 수준으로 회복시킨다는 것을 입증한다. 도 20a 및 도 20b는 또한 상기 다중특이성 활성화 가능한 항체 및 다중특이성 항체가 각각의 개별 단일특이성 활성화 가능한 항체 및 단일특이성 항체의 것과 유사한 방식으로 EGFR에 결합한다는 것을 입증한다.
도 21a 및 도 21b는 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, 활성화된 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, 및 다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-H-N의 CD3ε 양성 주르카트 T 세포에의 결합을 도시한 일련의 그래프이다.
도 22는 다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-H-N에 의한 활성화와 비교하여, 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N에 의한 주르카트 T 세포의 EGFR 의존성 활성화가 감소되었음을 도시한 그래프이다. 추가로, 본 도면은 마트립타제에 의한 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N의 프로테아제 활성화가 EGFR 의존성 활성화를 다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-H-N에 의해 나타나는 것과 등가인 수준으로 회복시킨다는 것을 입증한다.
도 23a는 다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-H-N에 의한 활성화와 비교하여 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N에 의한 일차 CD8+ T 세포의 EGFR 의존성 활성화가 감소되었음을 도시한 그래프이다. 추가로, 본 도면은 마트립타제에 의한 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N의 프로테아제 활성화가 EGFR 의존성 활성화를 다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-H-N에 의해 나타나는 것과 등가인 수준으로 회복시킨다는 것을 입증한다.
도 23b는 다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-H-N에 의한 사멸과 비교하여 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N에 의한 표적 세포의 EGFR 의존성 사멸이 감소되었음을 도시한 그래프이다. 추가로, 본 도면은 마트립타제에 의한 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N의 프로테아제 활성화가 EGFR 의존성 표적 세포 사멸을 다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-H-N에 의해 나타나는 것과 등가인 수준으로 회복시킨다는 것을 입증한다.
본 개시내용은 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체를 제공한다. 본원에서 사용되는 바, 다중특이성 항체는 2개 이상의 상이한 항원 또는 에피토프를 인식하는 항체이고, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 마스킹 모이어티(MM)의 커플링이 항원 또는 에피토프 결합 도메인이 그의 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 다중특이성 항체의 1개 이상의 항원 또는 에피토프 결합 도메인에 연결된 1개 이상의 MM을 포함하는 다중특이성 항체이다. 본원에서 제공하는 활성화 가능한 다중특이성 항체는 순환 중 안정적이고, 치료 및/또는 진단의 의도된 부위에서 활성화되지만, 정상적인, 즉, 건강한 조직에서는 그렇지 않으며, 활성화되었을 때에는 상응하는, 비변형된 다중특이성 항체와 적어도 유사한 표적에의 결합을 보인다.
다중특이성 항체의 비제한적인 예로는 이중특이성 항체, 삼중특이성 항체, 사중특이성 항체, 및 다른 다중특이성 항체를 포함한다. 본원에서 제공하는 다중특이성 항체는 또한 다가이고; 본원에서 사용되는 바, 다가란, 결합 부위가 동일하거나 상이한 항원 또는 에피토프를 인식하는지 여부와는 상관없이, 항체 상의 결합 부위의 총 개수를 나타낸다. 다중특이성 활성화 가능한 항체의 비제한적인 예로는 이중특이성 활성화 가능한 항체, 삼중특이성 활성화 가능한 항체, 사중특이성 활성화 가능한 항체, 및 다른 다중특이성 활성화 가능한 항체를 포함한다. 본원에서 제공하는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 또한 다가이다.
일부 실시양태에서, 다중특이성 항체 또는 그의 단편 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체 또는 그의 단편은 T 세포 및/또는 다른 면역 효과기 세포에 인게이징하도록 디자인된다. T 세포에 인게이징하는 다중특이성 활성화 가능한 항체 또는 그의 단편 또한 본원에서 T 세포 인게이징 다중특이성 항체 또는 그의 단편 및/또는 T 세포 인게이징 다중특이성 활성화 가능한 항체 또는 그의 단편으로 지칭된다. 면역 효과기 세포에 인게이징하는 다중특이성 활성화 가능한 항체 또는 그의 단편 또한 본원에서 면역 효과기 세포 인게이징 다중특이성 항체 또는 그의 단편 및/또는 면역 효과기 세포 인게이징 다중특이성 활성화 가능한 항체 또는 그의 단편으로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 항체 또는 그의 단편 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체 또는 그의 단편은 1개 초과의 표적 및/또는 1개 초과의 에피토프에 결합하거나, 또는 다르게는 그와 상호작용하도록 디자인되며, 이는 또한 본원에서 다중 항원 표적화 항체 또는 그의 단편 및/또는 다중 항원 표적화 활성화 가능한 항체 또는 그의 단편으로 지칭된다.
일부 실시양태에서, 다중특이성 항체 또는 그의 단편은 IgG 도메인 및 scFv 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 항체 또는 그의 단편은 IgG 가변 도메인 및 scFv 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 항체 또는 그의 단편의 한 항체 도메인은 표적 항원에 대한 특이성을 가지고, 또 다른 항체 도메인은 T 세포 표면 항원에 대한 특이성을 가진다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 항체 또는 그의 단편의 한 항체 도메인은 표적 항원에 대한 특이성을 가지고, 또 다른 항체 도메인은 또 다른 표적 항원에 대한 특이성을 가진다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 항체 또는 그의 단편의 한 항체 도메인은 표적 항원의 에피토프에 대한 특이성을 가지고, 또 다른 항체 도메인은 동일한 표적 항원의 또 다른 에피토프에 대한 특이성을 가진다.
본 개시내용의 다중특이성 활성화 가능한 항체 또는 그의 단편의 다양한 실시양태는 도 3a, 및 5-9에 제시되어 있다. 일부 실시양태에서, IgG를 포함하는 다중특이성 활성화 가능한 항체 또는 그의 단편은 마스킹된 IgG 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, scFv를 포함하는 다중특이성 활성화 가능한 항체 또는 그의 단편은 마스킹된 scFv 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체 또는 그의 단편은 IgG 가변 도메인 중 1개 이상이 마스킹 모이어티에 커플링된 것인, IgG 가변 도메인 및 scFv 도메인, 둘 모두를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체 또는 그의 단편은 scFv 도메인 중 1개 이상이 마스킹 모이어티에 커플링된 것인, IgG 가변 도메인 및 scFv 도메인, 둘 모두를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체 또는 그의 단편은 IgG 가변 도메인 중 1개 이상이 마스킹 모이어티에 커플링되고, scFv 도메인 중 1개 이상이 마스킹 모이어티에 커플링된 것인, IgG 가변 도메인 및 scFv 도메인, 둘 모두를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체 또는 그의 단편은 IgG 가변 도메인 및 scFv 도메인이 각각 그 자신의 마스킹 모이어티에 커플링된 것인, IgG 가변 도메인 및 scFv 도메인, 둘 모두를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체 또는 그의 단편의 한 항체 도메인은 표적 항원에 대한 특이성을 가지고, 또 다른 항체 도메인은 T 세포 표면 항원에 대한 특이성을 가진다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체 또는 그의 단편의 한 항체 도메인은 표적 항원에 대한 특이성을 가지고, 또 다른 항체 도메인은 또 다른 표적 항원에 대한 특이성을 가진다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체 또는 그의 단편의 한 항체 도메인은 표적 항원의 에피토프에 대한 특이성을 가지고, 또 다른 항체 도메인은 동일한 표적 항원의 또 다른 에피토프에 대한 특이성을 가진다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 다중특이성 항체 또는 그의 단편은 적어도 (i) T 세포 상의 표면 항원인 제1, T 세포 인게이징 표적에 결합하는 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)을 포함하는 T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편 및 (ii) 제2 표적에 결합하는 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)을 포함하는 제2 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 표적은 동일한 항원이다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 표적은 상이한 항원이다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 표적은 동일한 항원 상의 상이한 에피토프이다. 일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편은 표적 특이 항체의 중쇄의 N 말단에 부착된다. 일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편은 표적 특이 항체의 중쇄의 C 말단에 부착된다. 일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편은 표적 특이 항체의 경쇄의 N 말단에 부착된다. 일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편은 표적 특이 항체의 경쇄의 C 말단에 부착된다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 항체는 다중특이성 항체의 하나 이상의 N 말단 및/또는 하나 이상의 C 말단의 조합에 부착된 면역 효과기 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 본 개시내용은 또한 자연살(NK) 세포, 단핵 세포, 예컨대, 골수성 단핵 세포, 대식세포, 및/또는 다른 면역 효과기 세포의 표면 항원에 결합하는 것을 포함하는 다중특이성 항체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 다중특이성 항체 또는 그의 단편은 OX40/GITR, CD137/ GITR, CD137/OX40, CD27/NKG2D 및 활성화 수용체의 추가의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는 하나 이상의 T 세포 활성화 수용체에 인게이징하는 2개 이상의 T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편, 예컨대, T 세포 인게이징 scFv 단편, 및 T 세포 인게이징 scFv 단편이 표적 결합 항체의 두 아암 모두에 연결되어 있는 것인 한 표적 결합 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 다중특이성 항체 또는 그의 단편은 하나 이상의 T 세포 억제성 수용체에 인게이징하는 2개의 T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편, 및 T 세포 인게이징 scFv 단편이 표적 결합 항체의 두 아암 모두에 연결되어 있는 것인 한 표적 결합 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 2개의 T 세포 인게이징 항체 단편은 동일한 T 세포 인게이징 표적에 결합한다. 일부 실시양태에서, 2개의 T 세포 인게이징 항체 단편은 상이한 T 세포 인게이징 표적에 결합한다. 일부 실시양태에서, 2개의 T 세포 인게이징 항체 단편은 동일한 T 세포 인게이징 표적 상의 상이한 에피토프에 결합한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 다중특이성 항체 또는 그의 단편은 적어도 (i) 제1, T 세포 인게이징 표적에 결합하는 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)을 포함하는 T 세포 인게이징 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 제1 아암, 및 (ii) 제2 표적에 결합하는 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)을 포함하는 표적 결합 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 제2 아암을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 항체 또는 그의 단편은 (iii) 적어도 제3 표적에 결합하는 제3 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB3)을 포함하는 표적 결합 항체의 제3 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 및 제3 또는 그 이상의 표적은 동일한 항원이다. 일부 실시양태에서, 제2 및 제3 또는 그 이상의 표적은 상이한 항원이다. 일부 실시양태에서, 제2 및 제3 또는 그 이상의 표적은 동일한 항원 상의 상이한 에피토프이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 다중특이성 활성화 가능한 항체 또는 그의 단편은 적어도 (i) T 세포 상의 표면 항원인 제1, T 세포 인게이징 표적에 결합하는 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)을 포함하는 T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편으로서, 여기서, AB1은 마스킹 모이어티(MM)의 커플링이 AB1가 제1 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 MM에 부착되어 있는 것인, T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편 및 (ii) 제2 표적에 결합하는 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)을 포함하는 제2 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 표적은 동일한 항원이다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 표적은 상이한 항원이다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 표적은 동일한 항원 상의 상이한 에피토프이다. 일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편은 표적 특이 항체의 중쇄의 N 말단에 부착되어 있다. 일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편은 표적 특이 항체의 중쇄의 C 말단에 부착되어 있다. 일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편은 표적 특이 항체의 경쇄의 N 말단에 부착되어 있다. 일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편은 표적 특이 항체의 경쇄의 C 말단에 부착되어 있다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 다중특이성 활성화 가능한 항체의 하나 이상의 N 말단 및/또는 하나 이상의 C 말단의 조합에 부착된 T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 본 개시내용은 또한 또 다른 면역 효과기 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편, 예컨대, 자연살(NK) 세포, 단핵 세포, 예컨대, 골수성 단핵 세포, 대식세포, 및/또는 다른 면역 효과기 세포의 표면 항원에 결합하는 것을 포함하는 다중특이성 활성화 가능한 항체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 다중특이성 활성화 가능한 항체 또는 그의 단편은 적어도 (i) OX40/GITR, CD137/ GITR, CD137/OX40, CD27/NKG2D, 및 활성화 수용체의 추가의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 하나 이상의 T 세포 활성화 수용체에 인게이징하는 2개의 T 세포 인게이징 항체 또는 그의 항체 단편, 예컨대, T 세포 인게이징 scFv 단편으로서, 여기서, T 세포 인게이징 항체 단편 중 하나의 AB1은 마스킹 모이어티(MM)의 커플링이 AB1가 그의 각 T 세포 인게이징 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 MM에 부착되어 있는 것인, 2개의 T 세포 인게이징 항체 또는 그의 항체 단편, 및 (ii) T 세포 인게이징 scFv 단편이 표적 결합 항체의 두 아암 모두에 연결되어 있는 것인 한 표적 결합 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 다중특이성 항체 또는 그의 단편은 하나 이상의 T 세포 억제성 수용체에 인게이징하는 2개의 T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편 및 T 세포 인게이징 scFv 단편이 표적 결합 항체의 두 아암 모두에 연결되어 있는 것인 한 표적 결합 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 2개의 T 세포 인게이징 항체 단편은 동일한 T 세포 인게이징 표적에 결합한다. 일부 실시양태에서, 2개의 T 세포 인게이징 항체 단편은 상이한 T 세포 인게이징 표적에 결합한다. 일부 실시양태에서, 2개의 T 세포 인게이징 항체 단편은 동일한 T 세포 인게이징 표적 상의 상이한 에피토프에 결합한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 다중특이성 활성화 가능한 항체 또는 그의 단편은 적어도 (i) OX40/GITR, CD137/ GITR, CD137/OX40, CD27/NKG2D 및 활성화 수용체의 추가의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는 하나 이상의 T 세포 활성화 수용체에 인게이징하는 2개의 T 세포 인게이징 항체 또는 그의 항체 단편으로서, 여기서, T 세포 인게이징 항체 단편의 각각의 AB1은 각 마스킹 모이어티(MM)의 그의 각 AB1에의 커플링이 AB1가 그의 각 T 세포 인게이징 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 그 자신의 MM에 부착되어 있는 것인, 2개의 T 세포 인게이징 항체 또는 그의 항체 단편, 및 (ii) T 세포 인게이징 scFv 단편이 표적 결합 항체의 두 아암 모두에 연결되어 있는 것인 한 표적 결합 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 다중특이성 항체 또는 그의 단편은 하나 이상의 T 세포 억제성 수용체에 인게이징하는 2개의 T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편 및 T 세포 인게이징 scFv 단편이 표적 결합 항체의 두 아암 모두에 연결되어 있는 것인 한 표적 결합 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 2개의 T 세포 인게이징 항체 단편은 동일한 T 세포 인게이징 표적에 결합한다. 일부 실시양태에서, 2개의 T 세포 인게이징 항체 단편은 상이한 T 세포 인게이징 표적에 결합한다. 일부 실시양태에서, 2개의 T 세포 인게이징 항체 단편은 동일한 T 세포 인게이징 표적 상의 상이한 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편은 하나 이상의 T 세포 활성화 수용체 대신 하나 이상의 T 세포 억제성 수용체에 인게이징한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 다중특이성 활성화 가능한 항체 또는 그의 단편은 적어도 (i) 제1, T 세포 인게이징 표적에 결합하는 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)을 포함하는 T 세포 인게이징 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 제1 아암으로서, 여기서, AB1은 마스킹 모이어티(MM)의 커플링이 AB1가 제1 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 MM에 부착되어 있는 것인 제1 아암 및 (ii) 제2 표적에 결합하는 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)을 포함하는 표적 결합 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 제2 아암을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 표적은 동일한 항원이다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 표적은 상이한 항원이다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 표적은 동일한 항원 상의 상이한 에피토프이다. 일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편은 하나 이상의 T 세포 활성화 수용체 대신 하나 이상의 T 세포 억제성 수용체에 인게이징한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 다중특이성 활성화 가능한 항체 또는 그의 단편은 적어도 (i) T 세포 상의 표면 항원인 제1, T 세포 인게이징 표적에 결합하는 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)을 포함하는 T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편, 및 (ii) 제2 표적에 결합하는 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)을 포함하는 제2 항체 또는 그의 단편으로서, 여기서, AB2는 마스킹 모이어티(MM)의 커플링이 AB2가 제2 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 MM에 부착되어 있는 것인, 제2 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 표적은 상이한 항원이다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 표적은 동일한 항원 상의 상이한 에피토프이다. 일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편은 표적 특이 항체의 중쇄의 N 말단에 부착되어 있다. 일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편은 표적 특이 항체의 중쇄의 C 말단에 부착되어 있다. 일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편은 표적 특이 항체의 경쇄의 N 말단에 부착되어 있다. 일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편은 표적 특이 항체의 경쇄의 C 말단에 부착되어 있다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 다중특이성 활성화 가능한 항체의 하나 이상의 N 말단 및/또는 하나 이상의 C 말단의 조합에 부착된 T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 본 개시내용은 또한 또 다른 면역 효과기 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편, 예컨대, 자연살(NK) 세포, 단핵 세포, 예컨대, 골수성 단핵 세포, 대식세포, 및/또는 다른 면역 효과기 세포의 표면 항원에 결합하는 것을 포함하는 다중특이성 활성화 가능한 항체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 다중특이성 활성화 가능한 항체 또는 그의 단편은 적어도 (i) OX40/GITR, CD137/ GITR, CD137/OX40, CD27/NKG2D, 및 활성화 수용체의 추가의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는 하나 이상의 T 세포 활성화 수용체에 인게이징하는 2개의 T 세포 인게이징 항체 또는 그의 항체 단편, 및 (ii) 제2 표적에 결합하는 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)을 포함하는 한 표적 결합 항체로서, 여기서, AB2는 마스킹 모이어티(MM)의 커플링이 AB2가 제2 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 MM에 부착되어 있고, 여기서, T 세포 인게이징 scFv 단편은 표적 결합 항체의 두 아암 모두에 연결되어 있는 것인 2개의 T 세포 인게이징 항체 또는 그의 항체 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 다중특이성 항체 또는 그의 단편은 하나 이상의 T 세포 억제성 수용체에 인게이징하는 2개의 T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편, 및 T 세포 인게이징 scFv 단편이 표적 결합 항체의 두 아암 모두에 연결되어 있는 것인 한 표적 결합 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 2개의 T 세포 인게이징 항체 단편은 동일한 T 세포 인게이징 표적에 결합한다. 일부 실시양태에서, 2개의 T 세포 인게이징 항체 단편은 상이한 T 세포 인게이징 표적에 결합한다. 일부 실시양태에서, 2개의 T 세포 인게이징 항체 단편은 동일한 T 세포 인게이징 표적 상의 상이한 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편은 하나 이상의 T 세포 활성화 수용체 대신 하나 이상의 T 세포 억제성 수용체에 인게이징한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 다중특이성 활성화 가능한 항체 또는 그의 단편은 적어도 (i) T 세포 인게이징 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 제1 아암 및 (ii) 제2 표적에 결합하는 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)을 포함하는 표적 결합 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 제2 아암으로서, 여기서, AB2는 마스킹 모이어티(MM)의 커플링이 AB2가 제2 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 MM에 부착되어 있는 것인, 제2 아암을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 표적은 동일한 항원이다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 표적은 상이한 항원이다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 표적은 동일한 항원 상의 상이한 에피토프이다. 일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편은 하나 이상의 T 세포 활성화 수용체 대신 하나 이상의 T 세포 억제성 수용체에 인게이징한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 다중특이성 활성화 가능한 항체 또는 그의 단편은 적어도 (i) T 세포 상의 표면 항원인 제1, T 세포 인게이징 표적에 결합하는 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)을 포함하는 T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편으로서, 여기서, AB1은 마스킹 모이어티(MM1)의 커플링이 AB1이 제1 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 MM1에 부착되어 있는 것인 T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편, 및 (ii) 제2 표적에 결합하는 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)을 포함하는 제2 항체 또는 그의 단편으로서, 여기서, AB2는 마스킹 모이어티(MM2)의 커플링이 AB2가 제2 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 MM2에 부착되어 있는 것인, 제2 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 표적은 동일한 항원이다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 표적은 상이한 항원이다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 표적은 동일한 항원 상의 상이한 에피토프이다. 일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편은 표적 특이 항체의 중쇄의 N 말단에 부착되어 있다. 일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편은 표적 특이 항체의 중쇄의 C 말단에 부착되어 있다. 일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편은 표적 특이 항체의 경쇄의 N 말단에 부착되어 있다. 일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편은 표적 특이 항체의 경쇄의 C 말단에 부착되어 있다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 다중특이성 활성화 가능한 항체의 하나 이상의 N 말단 및/또는 하나 이상의 C 말단의 조합에 부착된 T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 본 개시내용은 또한 또 다른 면역 효과기 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편, 예컨대, 자연살(NK) 세포, 단핵 세포, 예컨대, 골수성 단핵 세포, 대식세포, 및/또는 다른 면역 효과기 세포의 표면 항원에 결합하는 것을 포함하는 다중특이성 활성화 가능한 항체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 다중특이성 활성화 가능한 항체 또는 그의 단편은 적어도 (i) OX40/GITR, CD137/ GITR, CD137/OX40, CD27/NKG2D, 및 활성화 수용체의 추가의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 하나 이상의 T 세포 활성화 수용체에 인게이징하는 2개의 T 세포 인게이징 항체 또는 그의 항체 단편, 예컨대, T 세포 인게이징 scFv 단편으로서, 여기서, T 세포 인게이징 항체 단편 중 하나의 AB1은 마스킹 모이어티(MM)의 커플링이 AB1가 그의 각 T 세포 인게이징 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 MM에 부착되어 있는 것인, 2개의 T 세포 인게이징 항체 또는 그의 항체 단편, 및 (ii) 제2 표적에 결합하는 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)을 포함하는 한 표적 결합 항체로서, 여기서, AB2는 마스킹 모이어티(MM2)의 커플링이 AB2가 제2 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 MM2에 부착되어 있고, 여기서, T 세포 인게이징 scFv 단편이 표적 결합 항체의 두 아암 모두에 연결되어 있는 것인 한 표적 결합 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 다중특이성 항체 또는 그의 단편은 하나 이상의 T 세포 억제성 수용체에 인게이징하는 2개의 T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편, 및 T 세포 인게이징 scFv 단편이 표적 결합 항체의 두 아암 모두에 연결되어 있는 것인 한 표적 결합 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 2개의 T 세포 인게이징 항체 단편은 동일한 T 세포 인게이징 표적에 결합한다. 일부 실시양태에서, 2개의 T 세포 인게이징 항체 단편은 상이한 T 세포 인게이징 표적에 결합한다. 일부 실시양태에서, 2개의 T 세포 인게이징 항체 단편은 동일한 T 세포 인게이징 표적 상의 상이한 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편은 하나 이상의 T 세포 활성화 수용체 대신 하나 이상의 T 세포 억제성 수용체에 인게이징한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 다중특이성 활성화 가능한 항체 또는 그의 단편은 적어도 (i) OX40/GITR, CD137/ GITR, CD137/OX40, CD27/NKG2D, 및 활성화 수용체의 추가의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는 하나 이상의 T 세포 활성화 수용체에 인게이징하는 2개의 T 세포 인게이징 항체 또는 그의 항체 단편, 예컨대, T 세포 인게이징 scFv 단편으로서, 여기서, T 세포 인게이징 항체 단편의 각각의 AB1은 각 마스킹 모이어티(MM1)의 그의 각 AB1에의 커플링이 AB1가 그의 각 T 세포 인게이징 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 그 자신의 MM1에 부착되어 있는 것인, 2개의 T 세포 인게이징 항체 또는 그의 항체 단편, 및 (ii) 제2 표적에 결합하는 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)을 포함하는 한 표적 결합 항체로서, 여기서, AB2는 마스킹 모이어티(MM2)의 커플링이 AB2가 제2 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 MM2에 부착되어 있고, 여기서, T 세포 인게이징 scFv 단편이 표적 결합 항체의 두 아암 모두에 연결되어 있는 것인 한 표적 결합 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 다중특이성 항체 또는 그의 단편은 하나 이상의 T 세포 억제성 수용체에 인게이징하는 2개의 T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편, 및 T 세포 인게이징 scFv 단편이 표적 결합 항체의 두 아암 모두에 연결되어 있는 것인 한 표적 결합 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 2개의 T 세포 인게이징 항체 단편은 동일한 T 세포 인게이징 표적에 결합한다. 일부 실시양태에서, 2개의 T 세포 인게이징 항체 단편은 상이한 T 세포 인게이징 표적에 결합한다. 일부 실시양태에서, 2개의 T 세포 인게이징 항체 단편은 동일한 T 세포 인게이징 표적 상의 상이한 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편은 하나 이상의 T 세포 활성화 수용체 대신 하나 이상의 T 세포 억제성 수용체에 인게이징한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 다중특이성 활성화 가능한 항체 또는 그의 단편은 적어도 (i) 제1, T 세포 인게이징 표적에 결합하는 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)을 포함하는 T 세포 인게이징 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 제1 아암으로서, 여기서, AB1은 마스킹 모이어티(MM)의 커플링이 AB1가 제1 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 MM1에 부착되어 있는 것인 제1 아암 및 (ii) 제2 표적에 결합하는 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)을 포함하는 표적 결합 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 제2 아암으로서, 여기서, AB2는 마스킹 모이어티(MM)의 커플링이 AB2가 제2 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 MM2에 부착되어 있는 것인 제2 아암을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 표적은 동일한 항원이다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 표적은 상이한 항원이다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 표적은 동일한 항원 상의 상이한 에피토프이다. 일부 실시양태에서, T 세포 인게이징 항체 또는 그의 단편은 하나 이상의 T 세포 활성화 수용체 대신 하나 이상의 T 세포 억제성 수용체에 인게이징한다.
일부 실시양태에서, 표적 항원은 정상적인, 건강한 조직 상, 및 이환된 조직 상, 둘 모두에서 고도로 발현되는 항원이다. 일부 실시양태에서, 표적 항원은 정상적인, 건강한 조직 상, 및 이환된 조직 상, 둘 모두에서 고도로 발현되는, 표 1로부터의 항원이다.
일부 실시양태에서, 표적 항원은 이환된 조직 상에서는 고도로 발현되지만, 정상적인, 건강한 조직 상에서는 고도로 발현되지 않는 항원이다. 일부 실시양태에서, 표적 항원은 이환된 조직 상에서는 고도로 발현되지만, 정상적인, 건강한 조직 상에서는 고도로 발현되지 않는, 표 1로부터의 항원이다. 표적 항원은 정상적인, 건강한 조직 상에서는 발현될 수 있지만, 정상적인, 건강한 조직 상에서는 고도로 또는 다르게는 과다발현되지 않는다.
일부 실시양태에서, 마스킹 모이어티(MM)는 프로테아제에 대한 기질로서 기능하는 절단가능한 모이어티(CM)를 통해 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB)에 커플링된다. 본 개시내용의 다중특이성 활성화 가능한 항체에서 사용하기에 적합한 프로테아제는 의도된 치료 및/또는 진단 부위에서의 프로테아제 발현에 기초하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 u형 플라스미노겐 활성인자(uPA: u-type plasminogen activator, 이는 또한 우로키나제로도 지칭된다), 레구마인, 및/또는 마트립타제(이는 또한 MT-SP1 또는 MTSP1로도 지칭된다)이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP)이다.
일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 비절단가능한 링커를 통해 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB)에 커플링된 마스킹 모이어티(MM)를 포함하도록 조작된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는, T 세포 인게이징 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 제1, T 세포 인게이징 표적에 결합하는 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)을 포함하고, 여기서, AB1은, MM의 커플링이 AB1가 제1 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 비절단가능한 링커를 통해 마스킹 모이어티(MM1)에 부착되어 있고, 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 마스킹되지 않은 것인, 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 T 세포 인게이징 항체 또는 그의 항원 결합부를 포함하는 T 세포 인게이징 다중특이성 활성화 가능한 항체이다.
일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 T 세포 인게이징 다중특이성 활성화 가능한 항체로서, 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 T 세포 인게이징 항체 또는 그의 항원 결합부를 포함하고, 여기서, T 세포 인게이징 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 제1, T 세포 인게이징 표적에 결합하는 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1)을 포함하고, 여기서, AB1은 MM의 커플링이 AB1가 제1 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 비절단가능한 링커를 통해 마스킹 모이어티(MM1)에 부착되어 있고, 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 제2 표적에 결합하는 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2)을 포함하고, 여기서, AB2는 MM의 커플링이 AB2가 제2 표적에 결합할 수 있는 능력을 감소시킬 수 있도록 절단가능한 링커를 통해 마스킹 모이어티(MM2)에 부착되어 있다.
이중특이성 항체의 일반적인 개념은 문헌 [Chan, A.C. and Carter, P.J., Nature Reviews Immunol. 10, 301-316 (2010)]에 인용된 바와 같이 적어도 50년 전에 최초로 도입되었다(문헌 [Nisonoff, A. and Mandy, W.J., Nature 194, 355-359 (1962)).
다양한 이중특이성 플랫폼이 기술되어 있다(예컨대, 도 1; 문헌 [Liu, M.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 8648-8652 (1985)] 참조; 문헌 [Kroesen, B.J., et al. Adv. Drug Delivery Rev. 31, 105-129 (1998)]; [Marvin, J.S. and Zhu, Z., Acta Pharm. Sinica 26, 649-658 (2005)]; [Chan and Carter, Nat. Rev. Immunol. 2010]; [Fitzgerald and Lugovsky, MAbs. 3(3):299-309 (2011)]; [Riethmuller, G., Cancer Immunity 12, 12-18 (2012)]에 의해 리뷰). 이중특이성 항체를 구성하기 위한 일반 개념은 2개 이상의 표적 항원에 결합할 수 있는 분자를 구성하기 위해 일반적으로 다중 면역글로불린 도메인에 기초하여 단백질 결합 도메인과 함께 연결시키는 것이며, 이는 IgG 유사 생리학적 분포, 약동학적 성질, 및 효과기 기능을 입증한다. 후자의 것으로는 항체 의존성 세포독성(ADCC: antibody-dependent cytotoxicity), 보체 의존성 세포독성(CDC: complement-dependent cytotoxicity), T 세포 동원(BiTE™)(예컨대, 문헌 [Baeuerle, P.A. and Reinhardt, C., Cancer Res. 69, 4941-4944 (2009)] 참조), 및 TandAb™(예컨대, 문헌 [Cochlovius et al., Cancer Res. 60, 4336-4341 (2000)] 참조)), 및/또는 항체 약물 컨쥬게이트(ADC: antibody-drug conjugate) 형태로 화학적으로 컨쥬게이트된 모이어티, 예컨대, 미세소관 억제제, DNA 알킬화제, 또는 다른 독소의 형태로 세포독성 페이로드의 전달을 포함할 수 있다. 다수의 이중특이성 항체 포맷이 연구되고 있으며, 여기서, 그의 차선적 생산 및 약리학적 특성에도 불구하고 종래 이종이량체 IgG 및 BiTE™는 임상적으로 가장 진보된 것을 나타낸다(문헌 [Chan and Carter, Nat. Rev. Immunol. 2010] 참조). 이중특이성 항체는 선택된 특정 포맷 및 표적 항원의 구체적인 특징에 기초하여 다수의 잠재적인 용도를 가지며; 모든 이중특이성 포맷 모두가 모든 적용에 적절한 것은 아니다. 예를 들어, 투 인 원(Two-in-one) Fab 포맷(문헌 [Bostrom, J., et al., Science 323, 1610-1614 (2009)])은 어느 한 방식/또는 그러한 방식으로 항원 A 및 B에 결합하기 위한 단일 결합 도메인으로 구성되며; 따라서, 이러한 유형의 이중특이성은 2 카피수의 항원 A, 2 카피수의 항원 B, 또는 각 항원 중 한 카피에 인게이징할 수 있다. 한편, DVD 포맷(문헌 [Wu, C., et al., Nature Biotechnol. 25, 1290-1297 (2007)])은 2 카피수의 항원 B 이외에도 2 카피수의 항원 A의 인게이징을 위해 제공한다. 각 결합 도메인의 이격화 및 상대적인 배향 또한 의도된 활성-예를 들어, 수용체 가교 결합을 부여하도록 하는 방식으로 다양한 항원의 인게이징에 중요할 수 있으며(문헌 [Jackman, J., et al., J. Biol. Chem. 285, 20850-20859 (2010)]), 각 수용체 중 한 카피의 인게이징이 필요한 경우, 2개의 상이한 항원 각각의 것과 1가 상호작용을 필요로 할 수 있다.
이중특이성 항체 적용 중 기계적으로 상이한 분야로는 세포독성에 대하여 표적화되는 세포(예컨대, 종양 세포)의 표면 상의 항원, 및 세포독성 면역 세포(예컨대, T 세포)의 표면 상의 항원, 둘 모두에 인게이징하는 이중특이성을 구성함으로써 면역 효과기 세포(예컨대, 세포독성 T 림프구, NK 세포, 및/또는 골수성 효과기 세포)를 동원하여 종양 세포를 공격하는 것을 포함한다. 카투막소맙은 암 세포 상에서 종양 항원 EpCAM을 표적화하고, T 세포 표면 상의 CD3에의 결합을 통해 세포독성 T 세포를 동원하는, 임상적으로 입증된 이중특이성 항체의 일례이지만(문헌 [Linke, R., Klein, A., and Seimetz, D., mAbs 2, 129-136 (2010)]); 그러나, 그의 사용은 제한되어 왔고, 이는 복강내 투여를 필요로 한다. BiTE™ 항체는 다른 약리학적 특성을 가지는 상이한 포맷으로 T 세포 동원을 달성하는 이중특이성 항체이며(문헌 [Baeuerle, P.A. and Reinhardt, C., Anti-Cancer Res. 69, 4941-4944 (2009)])-특히, BiTE 항체는 2개의 단일 쇄 가변 단편(scFv)으로 구성되고, 생체내에서 매우 짧은 약리학적 반감기를 가지며; 따라서, 연속적인 주입을 통한 전달을 필요로 한다. TandAb™로 지칭되는 유사한 포맷은 2개의 가변 도메인이 표적 항원에 결합하고, 2개의 가변 도메인은 T 세포의 표면 상의 CD3에 결합하는 것인, 4가, 이중특이성 디아바디 구성물이다(문헌 [Cochlovius et al., Cancer Res. 60, 4336-4341 (2000)]). 상기와 같은 포맷은 표적 항원 및 T 세포 표면 항원, 둘 모두에의 2가 인게이징이 T 세포 인게이징 및 항원에 대한 세포독성을 위해 사용될 수 있다는 것을 보여준다. 그러나, TandAb 포맷은 또한 생체 내에서 매우 짧은 반감기를 가진다.
T 세포 인게이징 이중특이성 항체의 일반적인 한계는 T 세포 세포독성이 극도로 강력할 수 있고, 세포 표면 상의 상대적으로 낮은 수준의 표적 항원에 의해 활성화될 수 있다는 사실과 관련된다. 그러므로, 건강한 조직 상에서 예컨대, EGFR과 같은 표적 항원이 심지어 중간 정도의 수준으로 발현된 경우에도 유의적인 독성이 일어날 수 있으며, 이는 임상의 치료학적 적용을 제한하거나, 막을 수 있다(문헌 [Lutterbuese, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107, 12605-12610 (2010)]). 따라서, 안전성이 개선된, 예컨대, 독성이 감소된 효과적인 항체 기반 치료제가 요구되고 있다.
본 개시내용의 다중특이성 활성화 가능한 항체는 다중특이성 활성화 가능한 항체 활성이 국재화된 질환 환경으로 한정되기 때문에, 다중특이성(예컨대, 이중특이성) 항체보다 안전하다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 면역 효과기 세포 인게이징 다중특이성 활성화 가능한 항체이다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 T 세포 인게이징 다중특이성 활성화 가능한 항체이다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 2개 이상의 표적을 인식한다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 IgG의 장기간의 반감기 특성을 부여하는 IgG-scFv 포맷을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 다중특이성 활성화 가능한 항체는 FcRn 결합 부위에서의 Fc 돌연변이 사용을 통해 추가로 변조될 수 있다(문헌 [Petkova, S. B. et al., Intl. Immunol. 18, 1759-1769 (2006))]; [Deng, R. et al., mAbs 4, 101-109 (2012))]; [Olafson, T Methods Mol. Biol. 907, 537-556 (2012)]). 일부 실시양태에서, 상기 다중특이성 활성화 가능한 항체는 Fc 도메인 중에, 표적에서 벗어난 독성은 감소시키기 위하여 IgG 효과기 기능(ADCC 및 CDC)을 감소시키는 돌연변이, 예컨대, N297A 돌연변이를 포함한다(문헌 [Lund, J. et al., Mol. Immunol. 29, 53-39 (1992)]).
다중특이성 활성화 가능한 항체는 다중의 질환 상태의 특징으로 널리 인정되는 프로테아제 활성의 상향 조절에 영향을 미침으로써 상기 치료제의 질환 조직 특이 표적화를 달성할 수 있다. 활성화 가능한 항체는 절단가능한 모이어티(CM), 예컨대, 프로테아제-절단가능한 모이어티를 통해 항체에 연결된, 마스킹 모이어티(MM)를 포함하도록 변형된 IgG 항체, 또는 그의 단편, 예컨대, scFv 영역, Fab 영역, 단일 VH 또는 VL 도메인의 사용에 기초한다(예컨대, PCT 국제 공개 번호 WO 2009/025846(2009년 2월 26일 공개); PCT 국제 공개 번호 WO 2010/081173(2010년 7월 15일 공개) 참조). 별법으로, 비항체 단백질 도메인(예컨대, PCT 국제 공개 번호 WO 2010/096838(2010년 8월 26일 공개); [Boersma, Y.L. et al., J. Biol. Chem. 286, 41273-41285 (2011)] 참조)은 하나 이상의 결합 특이성을 달성하는 데 사용될 수 있다. 다중특이성 항체, 예컨대, 종래 IgG는 다중특이성 활성화 가능한 항체 제조를 위한 출발점으로서 사용될 수 있다. 상기 다중특이성 활성화 가능한 항체를 통해 모체 다중특이성 항체에 의해 인식되는 모든 항원에 대한 고친화성 표적화를 달성할 수 있지만, 조직 특이성은 선택적으로 활성화된 절단가능한 링커에 의해 지배될 수 있다. 사용되는 다중특이성 포맷에 따라, MM 및 CM은 적절한 도메인의 N 또는 C 말단에 배치될 수 있다.
다중특이성 활성화 가능한 항체는 제2 항원에의 결합에 대한 특이성을 가지는 (IgG 또는 다른 단백질로부터 유래된 것일 수 있는) 또 다른 도메인에 합성적으로 또는 생합성적으로 연결된, 제1 항원에 대한 특이성을 가지는 1개 이상의 IgG 유래 도메인을 포함한다. 추가의 특이성은 상기 다중특이성 활성화 가능한 항체를 제1 항원, 제2 항원 또는 추가의 항원에 대한 추가의 결합 특이성을 부여하는 하나 이상의 추가의 도메인에 연결시킴으로써 부가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 적절한 마스킹 모이어티(MM)에 의해 마스킹된 상기 도메인 중 하나 이상의 것을 포함한다. 도 1a-1b에 기술된 각각의 다중특이성 포맷은 잠재적으로는 면역글로불린 도메인 중 하나 이상의 것의 항원 결합 모이어티 중 하나 이상의 것을 마스킹시킴으로써 다중특이성 활성화 가능한 항체로 전환될 수 있다. 적합한 다중특이성 활성화 가능한 항체 포맷의 예는 도 3a, 및 5-9에 제시되어 있다.
특이 항원에 대한 특이성을 부여하는 scFv 도메인을 사용함으로써 다중특이성 항체 및 다중특이성 활성화 가능한 항체를 모듈식으로 구성할 수 있다. 이중특이성 항체의 구성을 위해 IgG 중쇄 또는 경쇄의 말단에 융합된 scFv 도메인(들)을 사용하는 것은 앞서 기술된 바 있다(예컨대, 문헌 [Orcutt, K.D. et al., Prot. Eng. Design Select. 23, 221-228 (2010))]; [Dong et al., (2011)] 참조). 상기 포맷("IgG-scFv")을 통해 IgG는, 제1 특이성은 IgG의 가변 도메인에서 코딩되고, 제2 특이성은 가요성 링커 영역을 통해 부착된 scFv 도메인에서 코딩되는 것인, 이중특이성 항체로 전환될 수 있다. 상기 포맷의 변형은 scFv 도메인을 중쇄 또는 경쇄의 N 또는 C 말단에 융합시키는 것을 포함하며; scFv는 동일한 또는 상이한 항원 결합 특이성을 가질 수 있다(문헌 [Spangler, J. B. et al., J. Mol. Biol. 422, 532-544 (2012)]). 추가로, 중쇄 이종이량체를 사용함으로써(예를 들어, 놉-홀(knob-hole) 또는 유사 구성물을 사용함으로써), 상이한 특이성의 scFv는 각 중쇄의 N 또는 C 말단에 부착될 수 있다.
일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 마스킹된 IgG 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 마스킹된 scFv 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 마스킹된 IgG 가변 도메인 및 scFv 도메인, 둘 모두를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 한 항체 도메인은 표적 항원에 대한 특이성을 가지고, 또 다른 항체 도메인은 T 세포 표면 항원에 대한 특이성을 가진다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 한 항체 도메인은 표적 항원에 대한 특이성을 가지고, 또 다른 항체 도메인은 또 다른 표적 항원에 대한 특이성을 가진다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 한 항체 도메인은 표적 항원의 에피토프에 대한 특이성을 가지고, 또 다른 항체 도메인은 표적 항원의 또 다른 에피토프에 대한 특이성을 가진다.
본 개시내용은 하기를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다중특이성 활성화 가능한 항체 구조의 일례를 제공한다: (VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2; (VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH*-L3-VL*)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL*-L3-VH*)2; (VL-CL)2:(MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL)2:(MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2: (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*)2: (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; 또는 (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2(여기서, VL 및 VH는 IgG에 포함되어 있는, 제1 특이성의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 나타내고; VL* 및 VH*는 scFv에 포함되어 있는, 제2 특이성의 가변 도메인을 나타내고; L1은 마스킹 모이어티(MM)와 절단가능한 모이어티(CM)를 연결하는 링커 펩티드이고; L2는 절단가능한 모이어티(CM)와 항체를 연결하는 링커 펩티드이고; L3은 scFv의 가변 도메인을 연결하는 링커 펩티드이고; L4는 제1 특이성의 항체를 제2 특이성의 항체에 연결하는 링커 펩티드이고; CL은 경쇄 불변 도메인이고; CH1, CH2, CH3은 중쇄 불변 도메인이다). 제1 및 제2 특이성은 임의의 항원 또는 에피토프에 대한 것일 수 있다. 추가의 구조로는 하기의 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다: (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL--L4-VL*-L3-VH*)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; 또는 (MM-L1-CM-L2-VL-CL--L4-VL*-L3-VH*)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2.
일부 실시양태에서, IgG를 포함하는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 마스킹된 IgG 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, scFv를 포함하는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 마스킹된 scFv 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 IgG 가변 도메인 중 1개 이상이 마스킹 모이어티에 커플링된 것인, IgG 가변 도메인 및 scFv 도메인, 둘 모두를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 scFv 도메인 중 1개 이상이 마스킹 모이어티에 커플링된 것인, IgG 가변 도메인 및 scFv 도메인, 둘 모두를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 IgG 가변 도메인 중 1개 이상이 마스킹 모이어티에 커플링되고, scFv 도메인 중 1개 이상이 마스킹 모이어티에 커플링된 것인, IgG 가변 도메인 및 scFv 도메인, 둘 모두를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 IgG 가변 도메인 및 scFv 도메인이 각각 그 자신의 마스킹 모이어티에 커플링된 것인, IgG 가변 도메인 및 scFv 도메인, 둘 모두를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 한 항체 도메인은 표적 항원에 대한 특이성을 가지고, 또 다른 항체 도메인은 T 세포 표면 항원에 대한 특이성을 가진다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 한 항체 도메인은 표적 항원에 대한 특이성을 가지고, 또 다른 항체 도메인은 또 다른 표적 항원에 대한 특이성을 가진다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 한 항체 도메인은 표적 항원의 에피토프에 대한 특이성을 가지고, 또 다른 항체 도메인은 표적 항원의 또 다른 에피토프에 대한 특이성을 가진다.
면역 효과기 세포 인게이징 다중특이성 활성화 가능한 항체, 예컨대, T 세포 인게이징 다중특이성 활성화 가능한 항체의 일부 실시양태에서, 한 항원은 전형적으로 종양 세포 또는 질환과 관련된 다른 세포 유형의 표면 상에 존재하는 항원, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 표 1에 열거되어 있는 임의의 표적, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, EGFR, erbB2, EpCAM, Jagged, PD-L1, B7H3, 또는 CD71(트랜스페린 수용체)이고, 또 다른 항원은 전형적으로 T 세포, 자연살(NK) 세포, 골수성 단핵 세포, 대식세포, 및/또는 다른 면역 효과기 세포의 표면 상에 존재하는 자극성 또는 억제성 항원, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, B7-H4, BTLA, CD3, CD4, CD8, CD16a, CD25, CD27, CD28, CD32, CD56, CD137, CTLA-4, GITR, HVEM, ICOS, LAG3, NKG2D, OX40, PD-1, TIGIT, TIM3, 또는 VISTA이다. T 세포 표면 항원에의 특이성을 부여하는 항체 도메인은 또한 T 세포 수용체, NK 세포 수용체, 대식세포 수용체, 및/또는 다른 면역 효과기 세포 수용체, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, B7-1, B7-2, B7H3, PD-L1, PD-L2, 또는 TNFSF9에 결합하는 리간드 또는 리간드 도메인에 의해 치환될 수 있다. 다중 항원 표적화 활성화 가능한 항체의 일부 실시양태에서, 한 항원은 표 1에 열거된 표적으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 또 다른 항원은 표 1에 열거된 표적으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, T 세포 표면 제시 표적에의 결합에 대해 특이적인 단일 쇄 가변 도메인은 세포 표면 항원에 결합하는 완전한 인간 IgG1 항체(표적화 항체)의 카복실 말단에 융합된다. scFv는 중쇄의 카복실 말단에, 경쇄의 카복실 말단에, 또는 상기 두 쇄 모두에 융합될 수 있다(도 2). 일부 실시양태에서, T 세포 표면 제시 표적에의 결합에 대해 특이적인 단일 쇄 가변 도메인은 세포 표면 항원에 결합하는 완전한 인간 IgG1 항체(표적화 항체)의 아미노 말단에 융합된다. scFv는 중쇄의 아미노 말단에, 경쇄의 아미노 말단에, 또는 상기 두 쇄 모두에 융합될 수 있다. 융합체는 단일 유전적 구성물로서 구성되고, 배양물 중 세포에서 발현된다. 표적화 항체는 하나 이상의 종양 표면 항원, 또는 고갈에 대해 표적화된 임의의 세포에의 결합에 대해 특이적일 수 있다. scFv는 동일한 또는 상이한 항원에 대해 특이적일 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적화 항체는 항EGFR 항체이다. 일부 실시양태에서, 표적화 항체는 EGFR에의 결합에 대하여 특이적인 C225v5이다. 일부 실시양태에서, 표적화 항체는 EGFR에의 결합에 대하여 특이적인 C225이다. 일부 실시양태에서, 표적화 항체는 EGFR에의 결합에 대하여 특이적인 C225v4이다. 일부 실시양태에서, 표적화 항체는 EGFR에의 결합에 대하여 특이적인 C225v6이다. 일부 실시양태에서, 표적화 항체는 항Jagged 항체이다. 일부 실시양태에서, 표적화 항체는 인간 및 마우스 Jagged 1 및 Jagged 2에의 결합에 대하여 특이적인 4D11이다. 일부 실시양태에서, 표적화 항체는 인간 및 마우스 Jagged 1 및 Jagged 2에의 결합에 대하여 특이적인 4D11v2이다.
일부 실시양태에서, 표적화 항체는 활성화 가능한 항체 형태일 수 있다. 일부 실시양태에서, scFv(들)는 프로scFv 형태일 수 있다(예컨대, WO 2009/025846, WO 2010/081173 참조).
일부 실시양태에서, scFv는 예컨대, OKT3과 같이 CD3ε에의 결합에 대하여 특이적이다. 일부 실시양태에서, scFv CTLA-4(이는 또한 본원에서 CTLA 및 CTLA4로도 지칭된다)에의 결합에 대하여 특이적이다.
일부 실시양태에서, scFv는 하나 이상의 T 세포, 하나 이상의 NK 세포 및/또는 하나 이상의 대식세포에의 결합에 대하여 특이적이다. 일부 실시양태에서, scFv는 B7-H4, BTLA, CD3, CD4, CD8, CD16a, CD25, CD27, CD28, CD32, CD56, CD137, CTLA-4, GITR, HVEM, ICOS, LAG3, NKG2D, OX40, PD-1, TIGIT, TIM3, 또는 VISTA, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적에의 결합에 대하여 특이적이다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 개시내용과 관련되어 사용되는 과학 용어 및 기술 용어는 당업계의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가져야 한다. 추가로, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수 용어를 포함하여야 하고, 복수 용어는 단수 용어를 포함하여야 한다. 일반적으로, 본원에서 기술하는 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 및 단백질 및 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 화학법 및 하이브리드화와 관련되어 이용되는 명명법 및 기법은 당업계에 주지되고, 통상적으로 사용되는 것이다. 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 및 조직 배양 및 형질전환(예를 들면, 전기천공, 리포펙션)을 위해 표준 기법이 사용된다. 효소 반응 및 정제 기법은 제조사의 설명서에 따라 수행되거나, 또는 당업계에서 통상적으로 수행되거나 또는 본원에 기술된 바와 같이 수행된다. 상기 기법 및 방법은 일반적으로 당업계에 주지된 종래 방법에 따라 및 본 명세서 전역에 걸쳐 인용되고, 논의되는 다양한 일반 및 더욱 구체적인 참고 문헌에 기술된 바와 같이 수행된다. 예컨대, 문헌 [Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))]를 참조할 수 있다. 본원과 관련되어 이용된 명명법 및 본원에 기술된 실험실 방법 및 기술, 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의학 및 제약 화학은 당업계에 주지이고 통용되는 것이다. 화학 합성, 화학 분석, 제약 제제, 제제, 및 전달 및 환자 치료에는 표준 기법이 이용된다.
본 개시내용에 따라 사용되는 바, 달리 명시되지 않는 한, 하기 용어는 하기 의미를 가지는 것으로 이해하여야 한다:
본원에서 사용되는 바, "항체"라는 용어는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린(Ig) 분자의 면역학적 활성인 부분, 즉, 항원과 특이적으로 결합하는(면역 반응하는) 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 의미한다. "특이적으로 결합하다" 또는 "~와 면역 반응하다" 또는 "면역특이적으로 결합하다"라는 것은 항체가 원하는 항원의 하나 이상의 항원 결정기와 반응하고, 다른 폴리펩티드와는 반응하지 않거나, 또는 훨씬 더 낮은 친화도((Kd > 10-6)으로 결합한다는 것을 의미한다. 항체는 다중클론, 단일클론, 키메라, 완전한 인간, 도메인 항체, 단일 쇄, Fab, 및 F(ab')2 단편s, scFvs, 및 Fab 발현 라이브러리를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
기본적인 항체 구조 단위는 사량체를 포함하는 것으로 알려져 있다. 각 사량체는 각 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25 kDa) 및 하나의 "중쇄"(약 50-70 kDa)를 가지는 것인, 2개의 동일한 폴리펩티드 쇄 쌍으로 구성된다. 각 쇄의 아미노 말단부는 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산으로 이루어진 가변 영역을 포함한다. 각 쇄의 카르복시 말단부는 주로 효과기 기능을 담당하는 불변 영역을 정의한다. 일반적으로, 인간으로부터 수득된 항체 분자는 분자 내 존재하는 중쇄의 성질이 서로 상이한, 임의의 IgG, IgM, IgA, IgE 및 IgD 부류와 관련된다. 특정 부류는 또한, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 다른 하위부류를 갖는다. 추가로, 인간에서 경쇄는 카파 쇄 또는 람다 쇄일 수 있다.
"단일클론 항체"(mAb) 또는 "단일클론 항체 조성물"이라는 용어는 본원에서 사용되는 바, "단일클론 항체"(mAb) 또는 "단일클론 항체 조성물"은 고유한 경쇄 유전자 생성물 및 고유한 중쇄 유전자 생성물로 이루어진 항체 분자의 오직 한 분자종을 함유하는 항체 분자 집단을 의미한다. 특히, 단일클론 항체의 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region)은 집단의 모든 분자에서 동일하다. MAb는 그에 대한 고유한 결합 친화도를 특징으로 하는 항원의 특정 에피토프와 면역 반응할 수 있는 항원 결합 부위를 함유한다.
"항원 결합 부위" 또는 "결합부"라는 용어는 항원 결합에 참여하는 면역글로불린 분자의 일부를 의미한다. 항원 결합 부위는 중쇄("H") 및 경쇄("L")의 N 말단 가변("V") 영역의 아미노산 잔기에 의해 형성된다. "초가변성 영역"으로 지칭되는 중쇄 및 경쇄의 V 영역내 3개의 고도의 분기성 스트레치가 "프레임워크 영역" 또는 "FR"이라고 알려져 있는 더욱 보존적인 측면에 인접하는 스트레치 사이에 삽입되어 있다. 따라서, "FR"이라는 용어는 면역글로불린내 초가변 영역 사이 및 그 옆에서 자연적으로 존재하는 아미노산 서열을 의미한다. 항체 분자에서, 경쇄의 3개 초가변 영역 및 중쇄의 3개 초가변 영역은 항원 결합 표면을 형성하도록 3차원적 공간에서 서로에 대해 상대적으로 배치되어 있다. 항원 결합 표면은 결합된 항원의 3차원 표면에 상보적이고, 각 중쇄 및 경쇄의 3개 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로 지칭된다. 각 도메인에 대한 아미노산 정렬은 문헌 [Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))], 또는 [Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)], [Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989)]의 정의에 따라 이루어진다.
본원에서 사용되는 바, "에피토프"라는 용어는 면역글로불린, scFv, 또는 T 세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정기를 포함한다. "에피토프"라는 용어는 면역글로불린 또는 T 세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정기를 포함한다. 에피토프 결정기는 일반적으로 분자, 예컨대, 아미노산 또는 당 측쇄의 화학적으로 활성인 표면 그룹화로 이루어지고, 일반적으로 특이적인 3차원 구조 특징뿐만 아니라, 특이적인 전하 특징을 가진다. 예를 들어, 항체는 폴리펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 대해 생성될 수 있다. 항체는 해리 상수가 ≤ 1 μM일 경우 특이적으로 결합한다고 할 수 있으며, 예를 들어, 일부 실시양태에서 ≤ 100 nM일 때, 일부 실시양태에서 ≤ 10 nM일때 특이적으로 결합한다고 한다.
본원에서 사용되는 바, "특이적 결합," "면역학적 결합" 및 "면역학적 결합 특성"이라는 용어는 면역글로불린 분자와 그 면역글로불린이 특이적인 항체 간에 발생하는 유형의 비공유적 상호작용을 의미한다. 면역학적 결합 상호작용의 강도, 또는 친화도는 상호작용의 해리 상수(Kd)라는 용어로 표현될 수 있으며, 여기서, Kd가 작을수록 친화도는 더 크다는 것을 나타낸다. 선택된 폴리펩티드의 면역학적 결합 특성은 당업계에 주지된 방법을 이용하여 정량될 수 있다. 이러한 한 방법은 항원 결합 부위/항원 복합체 형성 및 해리 속도를 측정하는 것을 포함하고, 여기서, 이들 속도는 복합체 파트너의 농도, 상호작용의 친화도, 및 양 방향 속도에 균등하게 영향을 미치는 기하학적 파라미터에 따라 좌우된다. 따라서, "온 속도 상수"(K온) 및 "오프 속도 상수"(K오프)는 농도, 및 실제 해리 및 회합 속도를 계산하여 측정될 수 있다(문헌 [Nature 361:186-87 (1993)]). K오프/K온의 비율은 친화도와 관련없는 모든 파라미터를 취소시킬 수 있고, 해리 상수 Kd와 동일하다(일반적으로, 문헌 [Davies et al.(1990) Annual Rev Biochem 59:439-473] 참조). 본 개시내용의 항체는 검정법, 예컨대, 방사성 리간드 결합 검정법 또는 당업자에게 공지된 유사한 검정법을 통해 측정시, 평형 결합 상수(Kd)가 ≤1 μM일 때, 예를 들어, 일부 실시양태에서 ≤ 100 nM, 일부 실시양태에서 ≤ 10 nM, 및 일부 실시양태에서 ≤ 100 pM 내지 약 1 pM일 때 EGFR에 특이적으로 결합한다고 할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "단리된 폴리뉴클레오티드"라는 용어는 게놈, cDNA, 또는 합성 기원 또는 그의 일부 조합의 폴리뉴클레오티드를 의미하며, 그의 기원에 기인하여, "단리된 폴리뉴클레오티드는 (1) "단리된 폴리뉴클레오티드"가 자연에서 발견되는 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전부와 회합되지 않거나, (2) 자연적으로 연결되지 않은 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되거나, 또는 (3) 보다 큰 서열의 부분으로서 자연에서 발생되지 않는다. 본 개시내용에 따른 폴리뉴클레오티드는 본원에 제시된 중쇄 면역글로불린 분자를 코딩하는 핵산 분자, 및 본원에 제시된 경쇄 면역글로불린 분자를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "단리된 단백질"이라는 용어는 cDNA, 재조합 RNA, 또는 합성 기원의 단백질 또는 그의 일부 조합을 의미하며, 그의 기원, 또는 유도화의 공급원에 따라, "단리된 단백질"은 (1)은 자연에서 발견되는 단백질과 회합되지 않거나, (2) 동일한 공급원 유래의 다른 단백질이 없거나, 예컨대, 뮤린 단백질이 없거나, (3) 상이한 종 유래의 세포에 의해 발현되거나, 또는 (4) 자연적으로 발생하지 않는다.
본원에서 사용되는 "폴리펩티드"라는 용어는 일반 용어로서 천연 단백질, 단편, 또는 폴리펩티드 서열의 유사체를 의미한다. 따라서, 천연 단백질 단편, 및 유사체는 폴리펩티드 속의 종이다. 본 개시내용에 따른 폴리펩티드는 본원에 제시된 중쇄 면역글로불린 분자, 및 본원에 제시된 경쇄 면역글로불린 분자뿐만 아니라, 중쇄 면역글로불린 분자와 경쇄 면역글로불린 분자, 예컨대, 카파 경쇄 면역글로불린 분자를 포함하는 조합에 의해 또는 그의 반대 조합에 의해 형성된 항체 분자와, 그의 단편 및 유사체를 포함한다.
객체에 적용하는 바와 같이 본원에서 사용되는 "천연적으로 발생된"이라는 용어는 객체가 자연에 존재할 수 있다는 사실을 의미한다. 예를 들어, 자연 공급원에서 단리될 수 있고, 실험실 등에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은 유기체(바이러스 포함) 내에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 천연적으로 발생된 것이다.
본원에서 사용되는 바, "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 그렇게 기술된 성분의 위치가 의도하는 방식으로 그들이 기능할 수 있는 관계로 존재함을 의미한다. 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 제어 서열은 코딩 서열의 발현이 제어 서열과 호환되는 조건 하에서 코딩 서열의 발현이 이루어지도록 결찰된다.
본원에서 사용되는 바, "제어 서열"이라는 용어는 그들이 결찰되는 코딩 서열의 발현 및 프로세싱을 실행하는 데 필수적인 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 이러한 제어 서열의 성질은 원핵생물내 숙주 유기체에 따라 상이하며, 이러한 제어 서열은 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 부위, 진핵생물내 전사 종결 서열을 포함하고, 일반적으로 이러한 제어 서열을 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. "제어 서열"이라는 용어는 최소한으로, 그 존재가 발현 및 프로세싱에 본질적인 모든 성분들을 포함하고자 하는 의도이며, 또한 그 존재가 유리한 추가 성분, 예를 들면, 리더 서열 및 융합 파트너 서열을 포함한다. 본원에서 언급되는 용어 "폴리뉴클레오티드"는 길이가 10개 이상의 염기로 이루어진 뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드 또는 이들 뉴클레오티드 유형의 변형된 형태를 의미한다. 이 용어는 DNA의 단일 가닥 형태 및 이중 가닥 형태를 포함한다.
본원에서 언급하는 용어 올리고뉴클레오티드는 천연적으로 발생된, 및 비천연적으로 발생된 올리고뉴클레오티드 연결에 의해 함께 연결된 천연적으로 발생된, 및 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 200개 이하의 염기 길이를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서브세트이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 길이는 10 내지 60개의 염기 길이이다. 예를 들면, 일부 실시양태에서 길이는 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 내지 40개의 염기 길이이다. 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 예를 들어, 프로브의 경우는 단일 가닥이지만, 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 유전자 돌연변이체의 구성에 사용하기 위해서는 이중 가닥일 수 있다. 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
본원에서 언급하는 "천연적으로 발생된 뉴클레오티드"라는 용어는 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함한다. 본원에서 언급되는 "변형된 뉴클레오티드"라는 용어는 변형되거나, 치환된 당 기 등을 가지는 뉴클레오티드를 포함한다. 본원에서 언급하는 용어 "올리고뉴클레오티드 연결"은 올리고뉴클레오티드 연결, 예컨대, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레로에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐라데이트, 포스포론미데이트 등을 포함한다. 예컨대, 문헌 [LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986)]; [Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984)], [Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988)], [Zon et al. Anti Cancer Drug Design 6:539 (1991)]; [Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford Engl및 (1991))]; 미국 특허 번호 제5,151,510호(Stec 등); [Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990)]을 참조할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 원하는 경우, 검출을 위해 표지를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 20개의 통상적인 아미노산 및 그 약어는 통상의 용법에 따른다. 문헌 [Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland7 Mass. (1991))]을 참조할 수 있다. 20개의 통상적인 아미노산의 입체이성질체(예를 들면, D-아미노산), 비천연 아미노산, 예컨대, α,α-이중치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산, 및 다른 비통상의 아미노산도 또한 본 개시내용의 폴리펩티드에 대해 적합한 성분일 수 있다. 비통상적인 아미노산의 예에는 4 하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트, ε-N, N,N-트리메틸리신, ε-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-하이드록시리신, σ-N-메틸아르기닌, 및 다른 유사한 아미노산 및 이미노산(예를 들면, 4-하이드록시프롤린)을 포함한다. 본원에서 사용되는 폴리펩티드 표기법에서는, 표준 용법 및 관례에 따라서, 왼쪽 방향은 아미노 말단 방향이고, 오른쪽은 카복시 말단 방향이다.
유사하게, 달리 명시되지 않는 한, 단일 가닥 폴리뉴클레오티드의 왼쪽 단부는 5'이고, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 왼쪽 방향은 5' 방향으로 언급된다. 초기 RNA 전사체의 5'에서 3' 부가 방향은 전사 방향을 의미하며, RNA와 동일한 서열을 갖고 5'인 DNA 가닥 상의 서열 영역에서 RNA 전사체의 5' 말단을 "상류 서열"이라 하고, RNA와 동일한 서열을 가지며 3'인 DNA 가닥 상의 서열 영역에서 RNA 전사체의 3' 말단까지를 "하류 서열"이라고 한다.
폴리펩티드에 대해 적용되는 용어 "실질적인 동일성"은 예컨대, 디폴트 갭 가중치를 이용하는 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 정렬되었을 때, 2개 펩티드가 80% 이상의 서열 동일성, 예를 들어, 일부 실시양태에서, 90% 이상의 서열 동일성, 일부 실시양태에서, 95% 이상의 서열 동일성, 및 일부 실시양태에서, 99% 이상의 서열 동일성을 공유함을 의미한다.
일부 실시양태에서, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환과 다르다.
본원에서 논의되는 바와 같이, 항체 또는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열에서 소수의 변이는, 아미노산 서열 중 그러한 변이가 적어도 75%, 예를 들면, 적어도 80%, 90%, 95%, 및 일부 실시양태에서 99%를 유지하는 한, 본 발명에 포함되는 것으로 간주한다. 구체적으로 보존적 아미노산 치환을 고려한다. 보존적 치환은 그들의 측쇄와 관련된 아미노산 패밀리 내에서 일어나는 것이다. 유전적으로 코딩된 아미노산은 일반적으로 다음의 패밀리로 나뉘어진다: (1) 산성 아미노산은 아스파르테이트, 글루타메이트이다; (2) 염기성 아미노산은 리신, 아르기닌, 히스티딘이다; (3) 비극성 아미노산은 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판이다; 그리고 (4) 비하전된 극성 아미노산은 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신이다. 친수성 아미노산은 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르테이트, 글루타민, 글루타메이트, 히스티딘, 리신, 세린 및 트레오닌을 포함한다. 소수성 아미노산은 알라닌, 시스테인, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 티로신 및 발린을 포함한다. 아미노산의 다른 패밀리는 (i) 지방족 하이드록시 패밀리인 세린 및 트레오닌; (ii) 아미드 함유 패밀리인 아스파라긴 및 글루타민; (iii) 지방족 패밀리인 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신; 및 (iv) 방향족 패밀리인 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신을 포함한다. 예를 들면, 이소류신 또는 발린으로 단리된 치환, 글루타메이트로 아스파르테이트 치환, 세린으로 트레오닌 치환, 또는 구조적으로 관련 있는 아미노산으로의 아미노산의 유사 치환은 특히 그러한 치환이 프레임워크 부위 내 아미노산을 포함하지 않으면, 최종 분자의 결합 또는 특성에 주요한 효과를 갖지 않을 것으로 예측하는 것이 타당하다. 아미노산 변화가 기능성 펩티드를 생성하는지 여부는 폴리펩티드 유도체의 비활성을 분석하여 용이하게 결정할 수 있다. 분석 검정법은 본원에 상세하게 기술한다. 항체 또는 면역글로불린 분자의 단편 또는 유사체는 당업자가 쉽게 제조할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단편 또는 유사체의 아미노 말단 및 카복시 말단은 기능성 도메인의 경계 근처에서 존재한다. 구조 및 기능 도메인은 공공 또는 사유 서열 데이타 염기와 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 데이타를 비교하여 확인할 수 있다. 전산화된 비교 방법을 사용하여 공지된 구조 및/또는 기능의 다른 단백질에서 존재하는 서열 모티프 또는 예상되는 단백질 입체구조 도메인을 확인한다. 공지된 3차 구조로 폴딩되는 단백질 서열을 확인하는 방법은 공지되어 있다. 문헌 [Bowie et al. Science 253:164(1991)]를 참조한다. 따라서, 상기 예들은 당업자가 본 개시내용에 따라 구조 및 기능적 도메인을 정의하는데 사용할 수 있는 서열 모티프 및 구조적 입체구조를 확인할 수 있음을 보여준다.
일부 실시양태에서, 아미노산 치환은 (1) 단백질분해에 대한 감수성을 감소시키고, (2) 산화에 대한 감수성을 감소시키며, (3) 단백질 복합체를 형성하기 위한 결합 친화성을 변경시키며, (4) 결합 친화성을 변경시키고, (4) 이러한 유사체의 다른 물리화학적 또는 기능적 특성을 부여하거나 또는 변형시킨다. 유사체는 천연적으로 발생된 펩티드 서열이 아닌 다른 서열의 다양한 돌연변이 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일 또는 다중의 아미노산 치환(예컨대, 보존적 아미노산 치환)은 천연적으로 발생된 서열에서(예컨대, 분자간의 접촉을 형성하는 도메인(들) 외부의 폴리펩티드 부분에서) 이루어질 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 모체 서열의 구조적 특징을 실질적으로 변화시키면 안된다(예컨대, 치환 아미노산은 모체 서열 내에 존재하는 나선을 파괴하거나, 또는 모체 서열을 특징짓는 다른 유형의 2차 구조를 파괴하는 경향을 보여서는 안된다). 당업계에 알려져 있는 폴리펩티드 2차 및 3차 구조의 예는 문헌 [Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984))]; [Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991))]; 및 [Thornton et at. Nature 354:105 (1991)]에 기술되어 있다.
본원에서 사용되는 바, "폴리펩티드 단편"이라는 용어는 아미노 말단 및/또는 카복시 말단 결실 및/또는 하나 이상의 내부 결실(들)을 가지지만, 남은 아미노산 서열은 예를 들어, 전장의 cDNA 서열로부터 추론되는 천연적으로 발생된 서열내 상응하는 위치와 동일한 폴리펩티드를 의미한다. 단편의 길이는 전형적으로 5, 6, 8 또는 10개 이상의 아미노산 길이, 예를 들어, 일부 실시양태에서, 14개 이상의 아미노산 길이, 일부 실시양태에서, 20개 이상의 아미노산 길이, 일반적으로 50개 이상의 아미노산 길이, 및 일부 실시양태에서, 70개 이상의 아미노산 길이이다. 본원에서 사용되는 바, "유사체"라는 용어는 추론된 아미노산 서열의 일부분과 실질적으로 동일하고, 적합한 결합 조건 하에서 EGFR과 특이적으로 결합하는 25개 이상의 아미노산으로 이루어진 세그먼트로 구성된 폴리펩티드를 의미한다. 전형적으로, 폴리펩티드 유사체는 천연적으로 발생된 서열에 대해 보존적 아미노산 치환(또는 부가 또는 결실)을 포함한다. 유사체는 전형적으로 20개 이상의 아미노산 길이, 예를 들어, 일부 실시양태에서, 적어도 50개 이상의 아미노산 길이이고, 대개는 전장의 천연적으로 발생된 폴리펩티드만큼 장쇄일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "작용제"라는 용어는 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대 분자 또는 생물학적 물질 유래의 추출물을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "표지" 또는 "표지화된"이라는 용어는 예컨대, 방사성 표지화된 아미노산의 도입에 의해 또는 마킹된 아비딘(예컨대, 광학 또는 열량측정 방법으로 검출될 수 있는 효소 활성 또는 형광성 마커를 함유하는 스트렙트아비딘)에 의해 검출할 수 있는 비오티닐화된 모이어티를 폴리펩티드에 부착하여 검출가능한 마커를 도입하는 것을 의미한다. 특정 상황하에서, 표지 또는 마커는 또한 치료적인 것일 수 있다. 폴리펩티드 및 당단백질을 표지화하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 사용될 수 있다. 폴리펩티드에 대한 표지의 예로는 하기의 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다: 방사성 동위원소 또는 방사성핵종(예컨대, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), 형광성 표지(예컨대, 형광단, 로다민, 란탄계 인광체), 효소적 표지(예컨대, 홀스래디쉬 퍼옥시다아제, β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리성 포스파타제), 화학발광제, 비오티닐 기, 2차 리포터에 의해 인식되는 미리 결정된 폴리펩티드 에피토프(예컨대, 류신 지퍼쌍 서열, 2차 항체용 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그). 일부 실시양태에서, 표지는 잠재적인 입체 방해를 감소시키도록 다양한 길이의 스페이서 아암에 의해 부착된다. 본원에서 사용되는 바, "제약 제제 또는 약물"이라는 용어는 환자에게 적절하게 투여되었을 때, 원하는 치료적 효능을 유도할 수 있는 화학적 화합물 또는 조성물을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "실질적으로 순수한"이란 목적하는 종이 존재하는 우세한 종(즉, 몰 기준으로 조성물 중 임의의 다른 개별 종보다 더 풍부)이고, 실질적으로 정제된 분획은 목적하는 종이 존재하는 전체 거대 분자 종의 약 50%(몰 기준) 이상을 포함하는 조성물이다.
일반적으로, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물에 존재하는 전체 거대분자 종의 약 80% 초과, 예를 들어, 일부 실시양태에서, 약 85%, 90%, 95%, 및 99% 초과를 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 목적 종은 본질적으로 균질하게 정제되고(오염 종은 통상의 검출 방법으로는 조성물 중에서 검출할 수 없다), 여기서, 조성물은 본질적으로 단일 거대 분자 종으로 이루어진다.
환자라는 용어는 인간 및 수의학적 피험체를 포함한다.
본원의 다른 화학 용어는 문헌 [The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985))]에 예시된 바와 같은 당업계의 통상적인 용법에 따라 사용된다.
다중특이성 항체 및 다중특이성 활성화 가능한 항체
본 개시내용의 예시적인 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 예를 들어, 본원에서 제공하는 실시예에 제시되어 있는 것, 및 그의 변이체를 포함한다.
일부 비제한적인 실시양태에서, 다중특이성 항체에서 다중특이성 항체 중 하나 이상은 하기 표 1에 열거되어 있는 임의의 표적에 대한 결합 파트너이다.
Figure pct00001
Figure pct00002
일부 비제한적인 실시양태에서, 다중특이성 항체의 AB 중 하나 이상은 본원에서 제공하는 실시예에서 표 7에 기재되어 있는 서열이거나, 그로부터 유래된 것이다.
일부 비제한적인 실시양태에서, 다중특이성 항체의 AB 중 하나 이상은 하기 표 2에 열거된 항체이거나, 또는 그로부터 유래된 것이다.
Figure pct00003
Figure pct00004
본원에 기술된 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체아 동일한 에피토프에 결합하는 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체 또한 본 개시내용에 포함된다.
과도한 실험 없이도 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체가 본 개시내용의 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체와 동일하거나, 또는 유사한 특이성을 가지는지 여부는 전자가 후자가 표적에 결합하는 것을 방해하는지를 확인함으로써 측정할 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 본 개시내용의 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체에 의한 결합 감소로 제시되는 바와 같이, 시험되는 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체가 본 개시내용의 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체와 경쟁하는 경우, 이때 두 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 동일한, 또는 매우 밀접한 관련이 있는 에피토프에 결합한다.
다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체가 본 개시내용의 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체와 동일하거나, 또는 유사한 특이성을 가지는지 여부를 측정하는 한 실시양태는 본 개시내용의 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체를 일반적인 반응성을 띠는 가용성 표적과 함께 미리 인큐베이션시키고, 시험되는 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체를 첨가하여 시험되는 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체의 표적에 결합할 수 있는 그의 능력이 억제되었는지 여부를 측정하는 것이다. 시험되는 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체가 억제된 경우에는 아마다 이는 본 개시내용의 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체와 동일하거나, 또는 기능상 등가인 에피토프 특이성을 가지는 것이다.
다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 예를 들어, 하기 제공하는 실시예에 기술된 방법을 사용하여 생성된다. 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 또한 항체 제조 및/또는 정제에 대하여 당업계에 알려져 있는 다수의 기법들 중 임의의 것을 사용하여 생성될 수 있다.
다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체에서 사용하기 위한 항체 단편, 예컨대, Fv, F(ab')2 및 Fab는 예컨대, 프로테아제 또는 화학적 절단에 의해 온전한 단백질의 절단에 의해 제조될 수 있다. 별법으로, 절두된 유전자가 디자인된다. 예를 들어, F(ab')2 단편의 일부를 코딩하는 키메라 유전자는 H 쇄의 CH1 도메인 및 힌지 영역, 및 후속하여 번역 종격 코돈을 포함하며, 이로써 절두된 분자를 수득할 수 있다.
발현 벡터는 플라스미드, 레트로바이러스, YAC, EBV 유래 에피솜 등을 포함한다. 편리한 벡터는 임의의 VH 또는 VL 서열이 쉽게 삽입되어 발현될 수 있도록 조작된 적절한 제한효소와 함께, 기능적으로 완전한 인간 CH 또는 CL 면역글로불린 서열을 코딩하는 것이다. 상기 벡터에서, 스플라이싱은 일반적으로 삽입된 J 영내 스플라이싱 도너 부위와 인간 C 영역에 선행하는 스플라이싱 억셉트 부위 사이에서 일어나고, 또한 인간 CH 엑손 내 존재하는 스플라이스 영역에서 일어난다. 폴리아데닐화 및 전사 종결은 코딩 영역의 하류에 천연 염색체 부위에서 일어난다. 생성된 항체는 레트로바이러스 LTR, 예를 들어, SV-40 조기 프로모터(문헌 [Okayama et al. Mol. Cell. Bio. 3:280 (1983)]), 루이스 육종 바이러스 LTR(문헌 [Gorman et al. P.N.A.S. 79:6777 (1982)), 및 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 LTR(문헌 [Grosschedl et al. Cell 41:885 (1985)])을 비롯한 임의의 강력한 프로모터에 연결될 수 있다. 또한, 이해할 수 있느 바와 같이, 천연 Ig 프로모터 등이 사용될 수 있다.
추가로, 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 당업계에 주지된 기법을 이용하여, 제한 없이, 파지 디스플레이, 레트로바이러스 디스플레이, 리보솜 디스플레이, 및 다른 기법을 비롯한, 디스플레이 유형 기술을 통해 생성될 수 있고, 생성된 분자에 대해 추가의 성숙화, 예컨대, 당업계에 주지된 기법 등과 같은, 친화성 성숙화가 수행될 수 있다(문헌 [Wright et al. Crit, Reviews in Immunol. 12125-168 (1992)], [Hanes and Pluckthun PNAS USA 94:4937-4942 (1997)](리보솜 디스플레이), [Parmley and Smith Gene 73:305-318 (1988)](vkwl 디스플레이), [Scott, TIBS, vol. 17:241-245 (1992)], [Cwirla et al. PNAS USA 87:6378-6382 (1990)], [Russel et al. Nucl. Acids Research 21:1081-1085 (1993)], [Hoganboom et al. Immunol. Reviews 130:43-68 (1992)], [Chiswell and McCafferty TIBTECH; 10:80-8A (1992)], 및 미국 특허 번호 제5,733,743호).
질환 및 장애를 치료하는 데 항체의 효능을 개선시키기 위해 효과기 기능을 증진시키거나, 감소시키기 위한 목적으로 효과기 기능에 대해 본 개시내용의 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역에 도입하여 이 영역에 쇄간 이황화 결합이 형성될 수 있게 할 수 있다. 이렇게 생성된 동종이량체 항체는 내재능 및/또는 증가된 보체 매개 세포 사멸 및 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC: antibody-dependent cellular cytotoxicity)을 개선시킬 수 있다(문헌 [Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992)] 및 [Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)] 참조). 별법으로, 항체는 이중 Fc 영역을 가지도록 조작될 수 있으며, 이로써, 보체 용해 및 ADCC 능력이 증진될 수 있다(문헌 [Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)]). 일부 실시양태에서, 당화 부위를 제거하여 Fc 기능을 감소시키는 Fc 돌연변이가 제조될 수 있다.
다중특이성 활성화 가능한 항체
본원에서 제공하는 다중특이성 활성화 가능한 항체 및 다중특이성 활성화 가능한 항체 조성물은 제1 표적 및/또는 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 적어도 제1 항체 또는 그의 항체 단편(이는 통틀어 본 개시내용 전역에 걸쳐 AB1로 지칭된다) 및 제2 표적 및/또는 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 항체 또는 그의 항체 단편(이는 통틀어 본 개시내용 전역에 걸쳐 AB2로 지칭된다)을 포함하며, 여기서, AB 중 하나 이상은 마스킹 모이어티(MM)에 의해 변형된다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체에서 각 AB는 그 자신의 마스킹 모이어티에 의해 변형된다.
다중특이성 활성화 가능한 항체에서 AB 중 1개 이상의 것이 MM으로 변형되고, 그의 표적의 존재 하에 있을 때, AB의 그의 표적에의 특이적인 결합은 MM으로 변형되지 않은 AB의 표적에의 특이적인 결합 또는 모체 AB의 표적에의 특이적인 결합과 비교하였을 때, 감소되거나, 또는 억제되어 있다.
MM으로 변형된 AB의 표적에의 Kd는 MM으로 변형되지 않은 AB의 표적에의, 또는 모체 AB의 표적에의 Kd보다 적어도 5, 10, 20, 25, 40, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 500,000, 1,000,000, 5,000,000, 10,000,000, 50,000,000배 이상, 5-10, 10-100, 10-1,000, 10-10,000, 10-100,000, 10-1,000,000, 10-10,000,000, 100-1,000, 100-10,000, 100-100,000, 100-1,000,000, 100-10,000,000, 1,000-10,000, 1,000-100,000, 1,000-1,000,000, 1000-10,000,000, 10,000-100,000, 10,000-1,000,000, 10,000-10,000,000, 100,000-1,000,000, 또는 100,000-10,000,000배 더 크다. 반대로, MM으로 변형된 AB의 표적에의 결합 친화도는 MM으로 변형되지 않은 AB의 표적에의, 또는 모체 AB의 표적에의 결합 친화도보다 적어도 5, 10, 20, 25, 40, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 500,000, 1,000,000, 5,000,000, 10,000,000, 50,000,000배 이상, 또는 5-10, 10-100, 10-1,000, 10-10,000, 10-100,000, 10-1,000,000, 10-10,000,000, 100-1,000, 100-10,000, 100-100,000, 100-1,000,000, 100-10,000,000, 1,000-10,000, 1,000-100,000, 1,000-1,000,000, 1000-10,000,000, 10,000-100,000, 10,000-1,000,000, 10,000-10,000,000, 100,000-1,000,000, 또는 100,000-10,000,000배 더 낮다.
다중특이성 활성화 가능한 항체에서 AB 중 1개 이상의 것에 대한 MM의 해리 상수(Kd)는 일반적으로 표적에의 AB의 Kd보다 더 크다. AB에의 MM의 Kd는 표적에의 AB의 Kd보다 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000, 100,000, 1,000,000 또는 심지어 10,000,000배 이상 더 클 수 있다. 반대로, AB에의 MM의 결합 친화도는 일반적으로 표적에의 AB의 결합 친화도보다 더 낮다. AB에의 MM의 결합 친화도는 표적에의 AB의 결합 친화도보다 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000, 100,000, 1,000,000 또는 심지어 10,000,000배 이상 더 낮을 수 있다.
다중특이성 활성화 가능한 항체에서 AB 중 1개 이상의 것이 MM으로 변형되고, 표적의 존재 하에 있을 때, AB의 그의 표적에의 특이적인 결합은 MM으로 변형되지 않은 AB의 표적에의 특이적인 결합 또는 모체 AB의 표적에의 특이적인 결합과 비교하였을 때, 감소되거나, 또는 억제되어 있다. MM으로 변형되지 않은 AB의 표적에의 결합 또는 모체 AB의 표적에의 결합과 비교하였을 때, MM으로 변형된 경우의 AB의 표적에 결합할 수 있는 능력은 생체내 또는 시험관내 검정법으로 측정되었을 때, 적어도 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, 또는 96시간, 또는 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 또는 180일, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월 이상 동안 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 심지어 100% 이상만큼 감소될 수 있다.
MM은 다중특이성 활성화 가능한 항체에서 AB 중 1개 이상의 것의 그의 표적에의 결합을 억제시킨다. MM은 AB의 항원 결합 도메인에 결합하고, AB의 그의 표적에의 결합을 억제시킨다. MM은 AB의 표적에의 결합을 입체적으로 억제시킬 수 있다. MM은 AB의 표적에의 결합을 알로스테릭하게 억제시킬 수 있다. AB가 MM으로 변형되거나, 또는 그에 커플링되고, 표적의 존재 하에 있을 때, 이러한 실시양태에서, 생체내 또는 시험관내 검정법으로 측정되었을 때, 적어도 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, 또는 96시간, 또는 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 또는 180일, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월 이상 동안 AB의 표적에의 결합은 없거나, 또는 실질적으로 없거나, 또는 상기 AB의 표적에의 결합은 MM으로 변형되지 않은 AB, 모체 AB, 또는 MM에 커플링되지 않은 AB의 표적에의 결합과 비교하였을 때, 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 또는 50% 이하이다.
다중특이성 활성화 가능한 항체에서 AB 중 1개 이상의 것이 MM에 커플링되거나, 또는 그에 의해 변형되었을 때, MM은 AB의 그의 표적에의 특이적이 결합을 '마스킹'시키거나, 또는 감소시키거나, 또는 다르게는 억제시킨다. 다중특이성 활성화 가능한 항체에서 AB 중 1개 이상의 것이 MM에 커플링되거나, 또는 그에 의해 변형되었을 때, 상기 커플링 또는 변형은 AB가 그의 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 감소시키거나, 또는 억제시키는 구조적 변화를 일으킬 수 있다.
다중특이성 활성화 가능한 항체에서, 1개 이상의 AB가 MM에 커플링되거나, 또는 그에 의해 변형되었을 때, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 적어도 일부는 하기 식으로 표현될 수 있다(아미노(N) 말단 영역에서 카복시(C) 말단 영역의 순서로):
(MM)-(AB)
(AB)-(MM)
(MM)-L-(AB)
(AB)-L-(MM)
여기서, MM은 마스킹 모이어티이고, AB는 항체 또는 그의 항체 단편이고, L은 링커이다. 다수의 실시양태에서, 가요성을 제공하기 위해 하나 이상의 링커, 예컨대, 가요성 링커를 조성물 내로 바람직할 수 있다.
특정 실시양태에서, MM은 AB의 천연 결합 파트너가 아니다. 일부 실시양태에서, MM은 AB의 어느 천연 결합 파트너와의 상동성도 함유하지 않거나, 또는 실질적으로 함유하지 않는다. 다른 실시양태에서, MM은 AB의 어느 천연 결합 파트너와 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 80% 이하로 유사한 것이다. 일부 실시양태에서, MM은 AB의 어느 천연 결합 파트너와 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 80% 이하로 동일한 것이다. 일부 실시양태에서, MM은 AB의 어느 천연 결합 파트너와 25% 이하로 동일한 것이다. 일부 실시양태에서, MM은 AB의 어느 천연 결합 파트너와 50% 이하로 동일한 것이다. 일부 실시양태에서, MM은 AB의 어느 천연 결합 파트너와 20% 이하로 동일한 것이다. 일부 실시양태에서, MM은 AB의 어느 천연 결합 파트너와 10% 이하로 동일한 것이다.
일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 MM에 의해 변형된 AB를 포함하고, 하나 이상의 절단가능한 모이어티(CM) 또한 포함한다. 상기 다중특이성 활성화 가능한 항체는 AB의 표적에의 활성화 가능한/전환 가능한 결합을 보인다. 다중특이성 활성화 가능한 항체는 일반적으로 마스킹 모이어티(MM) 및 변형가능한 또는 절단가능한 모이어티(CM)에 의해 변형된, 또는 그의 커플링된 1개 이상의 항체 또는 항체 단편(AB)을 포함한다. 일부 실시양태에서, CM은 관심의 대상이 되는 프로테아제에 대한 기질로서의 역할을 하는 아미노산 서열을 함유한다.
절단된(또는 상대적으로 활성인) 상태이고, 표적의 존재 하에 있을 때, 상응하는 AB가 표적에 결합하고, 반면 절단되지 않은 (또는 상대적으로 비활성인) 상태이고, 표적의 존재 하에 있을 때, AB의 그의 표적에의 특이적인 결합은 감소되거나, 억제되도록 각 MM 및 CM이 배치되게 다중특이성 활성화 가능한 항체의 요소는 배열된다. AB의 그의 표적에의 특이적인 결합은 그의 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 AB의 능력의 MM에 의한 억제 또는 마스킹에 기인하여 감소될 수 있다.
MM 및 CM으로 변형된 각 AB의 표적에의 Kd는 MM 및 CM으로 변형되지 않은 AB의 표적에의, 또는 모체 AB의 표적에의 Kd보다 적어도 5, 10, 20, 25, 40, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 500,000, 1,000,000, 5,000,000, 10,000,000, 50,000,00050,000,000배 이상, 또는 5-10, 10-100, 10-1,000, 10-10,000, 10-100,000, 10-1,000,000, 10-10,000,000, 100-1,000, 100-10,000, 100-100,000, 100-1,000,000, 100-10,000,000, 1,000-10,000, 1,000-100,000, 1,000-1,000,000, 1000-10,000,000, 10,000-100,000, 10,000-1,000,000, 10,000-10,000,000, 100,000-1,000,000, 또는 100,000-10,000,000배 더 크다. 반대로, MM 및 CM으로 변형된 각 AB의 표적에의 결합 친화도는 MM 및 CM으로 변형되지 않은 AB의 표적에의, 또는 모체 AB의 표적에의 결합 친화도보다 적어도 5, 10, 20, 25, 40, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 500,000, 1,000,000, 5,000,000, 10,000,000, 50,000,000배 이상, 또는 5-10, 10-100, 10-1,000, 10-10,000, 10-100,000, 10-1,000,000, 10-10,000,000, 100-1,000, 100-10,000, 100-100,000, 100-1,000,000, 100-10,000,000, 1,000-10,000, 1,000-100,000, 1,000-1,000,000, 1000-10,000,000, 10,000-100,000, 10,000-1,000,000, 10,000-10,000,000, 100,000-1,000,000, 또는 100,000-10,000,000배 더 낮다.
1개 이상의 AB가 MM 및 CM으로 변형되고, 표적의 존재 하에 있지만, 변형제(예를 들어, 프로테아제)의 존재 하에 있지 않을 때, AB의 그의 표적에의 특이적인 결합은 MM 및 CM으로 변형되지 않은 AB의 표적에의 특이적인 결합 또는 모체 AB의 표적에의 특이적인 결합과 비교하였을 때, 감소되거나, 또는 억제되어 있다. 모체 AB의 그의 표적에의 결합 또는 MM 및 CM으로 변형되지 않은 AB의 그의 표적에의 결합과 비교하였을 때, MM 및 CM으로 변형된 경우의 AB의 표적에 결합할 수 있는 능력은 생체내 또는 시험관내 검정법으로 측정되었을 때, 적어도 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, 또는 96시간, 또는 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 또는 180일, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월 이상 동안 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 심지어 100% 이상만큼 감소될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 절단된 상태라는 용어는 프로테아제에 의한 CM의 변형 이후의 다중특이성 활성화 가능한 항체의 상태를 의미한다. 본원에서 사용되는 바, 절단되지 않은 상태라는 용어는 프로테아제에 의한 CM의 절단이 없는 다중특이성 활성화 가능한 항체의 상태를 의미한다. 상기 논의된 바와 같이, "다중특이성 활성화 가능한 항체"라는 용어는 본원에서 그의 절단되지 않은(천연) 상태뿐만 아니라, 그의 절단된 상태, 둘 모두의 다중특이성 활성화 가능한 항체를 의미하는 것으로 사용된다. 일부 실시양태에서, 절단된 다중특이성 활성화 가능한 항체는 프로테아제에 의한 CM의 절단으로 인해 MM이 결여되어 있으며, 이로써, 적어도 MM은 유리될 수 있다는 것(예컨대, MM이 공유 결합(예컨대, 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합)에 의해 다중특이성 활성화 가능한 항체에 연결되지 않은 경우)은 당업계의 숙련가에게 자명할 것이다.
활성화 가능한 또는 전환 가능한이라는 것은 다중특이성 활성화 가능한 항체가 억제, 마스킹 또는 절단되지 않은 상태(즉, 제1 입체 구조)일 때, 표적에 대해 제1 결합 수준을 보이고, 비억제, 비마스킹 및/또는 절단된 상태(즉, 제2 입체구조) 에서는 표적에 대해 제2 결합 수준을 보이는 것을 의미하며, 여기서, 제2 표적 결합 수준은 제1 결합 수준보다 크다. 일반적으로, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 상응하는 AB에 대한 표적의 접근성은 상기 절단제 부재시보다 CM을 절단할 수 있는 절단제 존재시에 더 크다. 따라서, 다중특이성 활성화 가능한 항체가 절단되지 않은 상태일 때, 1개 이상의 AB는 표적 결합이 억제되고, 표적 결합이 마스킹될 수 있으며(즉, 제1 입체구조는 AB가 표적에 결합할 수 없는 것이다), 절단 상태에서는 AB는 표적 결합에 대해 억제되지 않거나 또는 마스킹되지 않는다.
다중특이성 활성화 가능한 항체의 CM 및 AB는 제1 AB가 제1 표적 및/또는 에피토프에 대한 결합 모이어티를 나타내고, CM이 피험체에서 치료 부위 또는 진단 부위에서 표적과 함께 공국재화되는 프로테아제에 대한 기질을 나타내도록 선택된다. 본원에 개시된 다중특이성 활성화 가능한 항체는 예를 들어, CM 내 부위를 절단할 수 있는 프로테아제가 비치료 부위의 조직(예를 들어, 건강한 조직내)에서보다 치료 부위 또는 진단 부위의 표적 함유 조직에서 상대적으로 더 높은 수준으로 존재하는 경우 특정 용도가 발견된다.
일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 AB가 마스킹되지 않았거나, 또는 다르게는 그의 표적에의 결합이 억제되지 않는 경우, 독성 및/또는 다르게는 비치료 부위에서 제1 AB의 결합으로 인해 발생될 수 있는 유해한 부작용을 감소된 값으로 제공한다.
일반적으로, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 입체구조적으로 제한되는 경우, MM이 AB를 마스킹시키거나, 또는 AB의 그의 표적에의 결합을 감소시키도록 관심의 대상이 되는 제1 AB를 선택하고, 활성화 가능한 항체의 나머지 부분을 구성함으로써 디자인될 수 있다. 구조적 디자인 기준은 상기와 같은 기능적 특징을 제공하는 것을 고려하여야 한다.
억제되지 않은 입체구조 대비 억제시 표적 결합에 대해 원하는 동적 범위의 전환 가능한 표현형을 나타내는 다중특이성 활성화 가능한 항체를 제공한다. 동적 범위는 일반적으로 (a) 제1 조건 세트하에서 파라미터의 최대 검출 수준 대 (b) 제2 조건 세트 하에서 상기 파라미터의 최소 검출 값의 비율을 의미한다. 예를 들어, 다중특이성 활성화 가능한 항체와 관련하여, 동적 범위란활성화 가능한 항체의 CM을 절단할 수 있는 프로테아제 존재 하에서 다중특이성 활성화 가능한 항체에 결합하는 표적 단백질의 최대 검출 수준 대 (b) 프로테아제 부재하에서 다중특이성 활성화 가능한 항체에 결합하는 표적 단백질의 최소 검출 수준의 비율을 의미한다. 다중특이성 활성화 가능한 항체의 동적 범위는 활성화 가능한 항체 절단제 처리의 평형 해리 상수에 대한 다중특이성 활성화 가능한 항체 절단제(예컨대, 효소) 처리의 평형 해리 상수의 비율로서 계산할 수 있다. 다중특이성 활성화 가능한 항체의 동적 범위가 클수록, 활성화 가능한 항체의 전환 가능한 표현형은 양호화된다. 동적 범위 값이 상대적으로 더 높은(예를 들어, 1 초과) 활성화 가능한 항체는 더욱 바람직한 전환성 표현형을 나타내며, 이로써, 활성화 가능한 항체에 의한 표적 단백질 결합이 절단제 부재시보다 활성화 가능한 항체의 CM을 절단할 수 있는 절단제(예를 들어, 효소) 존재 하에서 더욱 큰 정도로 일어난다(예컨대, 대부분 일어난다).
다중특이성 활성화 가능한 항체는 다양한 구조적 입체구조로 제공될 수 있다. 다중특이성 활성화 가능한 항체의 적어도 일부에 대한 예시적인 식은 하기에 제공되어 있다. 제1 AB, 상응하는 MM 및 CM의 N 말단에서 C 말단으로의 순서는 활성화 가능한 항체 내에서 역전될 수 있다는 것을 특히 고려한다. 또한, 예컨대, CM은 MM 내에 함유되도록 CM 및 MM은 아미노산 서열 내에서 중복될 수 있다는 것도 특히 고려한다.
예를 들어, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 적어도 일부는 하기 식으로 표현될 수 있다(아미노(N) 말단 영역에서 카복시(C) 말단 영역의 순서로):
(MM)-(CM)-(AB)
(AB)-(CM)-(MM)
여기서, MM은 마스킹 모이어티이고, CM은 절단가능한 모이어티이고, AB는 제1 항체 또는 그의 단편이다. MM 및 CM이 상기 식에서 개별 성분으로 표시되었지만, MM 및 CM의 아미노산 서열은 예컨대, CM이 완전하게 또는 부분적으로 MM 내에 함유되도록 중복될 수 있음을 고려한다는 것에 주의하여야 한다. 추가로, 상기 식은 활성화 가능한 항체 요소에 대해 N 말단 또는 C 말단에 배치될 수 있는 추가의 아미노산 서열을 제공한다.
특정 실시양태에서, MM은 AB의 천연 결합 파트너가 아니다. 일부 실시양태에서, MM은 AB의 어느 천연 결합 파트너와의 상동성도 함유하지 않거나, 또는 실질적으로 함유하지 않는다. 다른 실시양태에서, MM은 AB의 어느 천연 결합 파트너와 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 80% 이하로 유사한 것이다. 일부 실시양태에서, MM은 AB의 어느 천연 결합 파트너와 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 80% 이하로 동일한 것이다. 일부 실시양태에서, MM은 AB의 어느 천연 결합 파트너와 50% 이하로 동일한 것이다. 일부 실시양태에서, MM은 AB의 어느 천연 결합 파트너와 25% 이하로 동일한 것이다. 일부 실시양태에서, MM은 AB의 어느 천연 결합 파트너와 20% 이하로 동일한 것이다. 일부 실시양태에서, MM은 AB의 어느 천연 결합 파트너와 10% 이하로 동일한 것이다.
다수의 실시양태에서, MM-CM 접합부, CM-AB 접합부, 또는 둘 모두 중 하나 이상의 것에서 가요성을 제공하도록 다중특이성 활성화 가능한 항체 구성물에 하나 이상의 링커, 예컨대, 가요성 링커를 삽입하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, AB, MM, 및/또는 CM은 원하는 가요성을 제공하도록 충분한 개수의 잔기(예컨대, Gly, Ser, Asp, Asn, 특히, Gly 및 Ser, 특히, Gly)를 함유하지 않을 수 있다. 따라서, 상기 다중특이성 활성화 가능한 항체 구성물의 전환 가능한 표현형은 가요성 링커를 제공하도록 하나 이상의 아미노산의 도입이 도움이 될 수 있다. 추가로, 하기 기술되는 바와 같이, 다중특이성 활성화 가능한 항체가 입체구조적으로 제한된 구성물로서 제공되는 경우, 가요성 링커는 절단되지 않은 다중특이성 활성화 가능한 항체 내의 고리 구조의 형성 및 유지가 용이하도록 작동가능하게 삽입될 수 있다.
예를 들어, 특정 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 하기 식 중 하나를 포함한다(여기서, 하기 식은 N 말단에서 C 말단 방향 또는 C 말단에서 N 말단 방향으로의 아미노산 서열을 나타낸다):
(MM)-L1-(CM)-(AB)
(MM)-(CM)-L2-(AB)
(MM)-L1-(CM)-L2-(AB)
여기서, MM, CM, 및 AB는 하기 정의된 바와 같고; 여기서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 및 임의적으로 존재하거나 또는 부재하고, 1개 이상의 가요성 아미노산(예컨대, Gly)을 포함하는 동일하거나, 또는 상이한 가요성 링커이다. 추가로, 상기 식은 다중특이성 활성화 가능한 항체 요소에 대하여 N 말단 또는 C 말단에 배치될 수 있는 추가의 아미노산 서열을 제공한다. 예로는 표적화 모이어티(예컨대, 표적 조직에 존재하는 세포의 수용체에 대한 리간드) 및 혈청 반감기 연장 모이어티(예컨대, 혈청 단백질, 예컨대, 면역글로불린(예컨대, IgG) 또는 혈청 알부민(예컨대, 인간 혈청 알부민(HAS: human serum albumin))에 결합하는 폴리펩티드)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 비제한적인 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체에서 AB 중 하나 이상은 표 1에 열거된 임의 표적에 대한 결합 파트너이다.
일부 비제한적인 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체에서 AB 중 하나 이상은 본원에서 제공하는 실시예 중 하기 표 7에 기재되어 있는 서열을 포함하거나, 그 서열이거나, 또는 그로부터 유래된 것이다.
일부 비제한적인 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체에서 AB 중 하나 이상은 본원에서 제공하는 실시예 중 실시예 5에 기재되어 있는 서열을 포함하거나, 그 서열이거나, 또는 그로부터 유래된 것이다. 일부 비제한적인 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체에서 AB 중 하나 이상은 본원에서 제공하는 실시예 중 하기 표 11에 기재되어 있는 서열을 포함하거나, 그 서열이거나, 또는 그로부터 유래된 것이다.
일부 비제한적인 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체에서 AB 중 하나 이상은 표 2에 열거된 항체로부터 유래된 것이다.
일부 실시양태에서, 마스킹 모이어티는 특정 항체 또는 항체 단편과의 사용을 위해 선택된다. 예를 들어, EGFR에 결합하는 항체와 함께 사용되는 데 적합한 마스킹 모이어티로는 서열 CISPRG(서열번호 75)을 포함하는 MM을 포함한다. 비제한적인 일례로, MM은 서열, 예컨대, CISPRGC(서열번호 339), CISPRGCG(서열번호 76); CISPRGCPDGPYVMY(서열번호 77); CISPRGCPDGPYVM(서열번호 78), CISPRGCEPGTYVPT(서열번호 79) 및 CISPRGCPGQIWHPP(서열번호 80)를 포함할 수 있다. 다른 적합한 마스킹 모이어티로는 PCT 공개 번호 WO 2010/081173에 개시된 EGFR 특이 마스크 중 임의의 것, 예컨대, 비제한적인 일례로, GSHCLIPINMGAPSC(서열번호 81); CISPRGCGGSSASQSGQGSHCLIPINMGAPSC(서열번호 82); CNHHYFYTCGCISPRGCPG(서열번호 83); ADHVFWGSYGCISPRGCPG(서열번호 84); CHHVYWGHCGCISPRGCPG(서열번호 85); CPHFTTTSCGCISPRGCPG(서열번호 86); CNHHYHYYCGCISPRGCPG(서열번호 87); CPHVSFGSCGCISPRGCPG(서열번호 88); CPYYTLSYCGCISPRGCPG(서열번호 89); CNHVYFGTCGCISPRGCPG(서열번호 90); CNHFTLTTCGCISPRGCPG(서열번호 91); CHHFTLTTCGCISPRGCPG(서열번호 92); YNPCATPMCCISPRGCPG(서열번호 93); CNHHYFYTCGCISPRGCG(서열번호 94); CNHHYHYYCGCISPRGCG(서열번호 95); CNHVYFGTCGCISPRGCG(서열번호 96); CHHVYWGHCGCISPRGCG(서열번호 97); CPHFTTTSCGCISPRGCG(서열번호 98); CNHFTLTTCGCISPRGCG(서열번호 99); CHHFTLTTCGCISPRGCG(서열번호 100); CPYYTLSYCGCISPRGCG(서열번호 101); CPHVSFGSCGCISPRGCG(서열번호 102); ADHVFWGSYGCISPRGCG(서열번호 103); YNPCATPMCCISPRGCG(서열번호 104); CHHVYWGHCGCISPRGCG(서열번호 105); C(N/P)H(H/V/F)(Y/T)(F/W/T/L)(Y/G/T/S)(T/S/Y/H)CGCISPRGCG(서열번호 106); CISPRGCGQPIPSVK(서열번호 107); CISPRGCTQPYHVSR(서열번호 108); 및/또는 CISPRGCNAVSGLGS(서열번호 109)를 포함한다.
Jagged 표적, 예컨대, Jagged 1 및/또는 Jagged 2에 결합하는 항체와 함께 사용하기에 적합한 마스킹 모이어티로는 비제한적인 일례로, 서열, 예컨대, QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQG(서열번호 338); QGQSGQGQQQWCNIWINGGDCRGWNG(서열번호 110); PWCMQRQDFLRCPQP(서열번호 111); QLGLPAYMCTFECLR(서열번호 112); CNLWVSGGDCGGLQG(서열번호 113); SCSLWTSGSCLPHSP(서열번호 114); YCLQLPHYMQAMCGR(서열번호 115); CFLYSCTDVSYWNNT(서열번호 116); PWCMQRQDYLRCPQP(서열번호 117); CNLWISGGDCRGLAG(서열번호 118); CNLWVSGGDCRGVQG(서열번호 119); CNLWVSGGDCRGLRG(서열번호 120); CNLWISGGDCRGLPG(서열번호 121); CNLWVSGGDCRDAPW(서열번호 122); CNLWVSGGDCRDLLG(서열번호 123); CNLWVSGGDCRGLQG(서열번호 124); CNLWLHGGDCRGWQG(서열번호 125); CNIWLVGGDCRGWQG(서열번호 126); CTTWFCGGDCGVMRG(서열번호 127); CNIWGPSVDCGALLG(서열번호 128); CNIWVNGGDCRSFEG(서열번호 129); YCLNLPRYMQDMCWA(서열번호 130); YCLALPHYMQADCAR(서열번호 131); CFLYSCGDVSYWGSA(서열번호 132); CYLYSCTDSAFWNNR(서열번호 133); CYLYSCNDVSYWSNT(서열번호 134); CFLYSCTDVSYW(서열번호 135); CFLYSCTDVAYWNSA(서열번호 136); CFLYSCTDVSYWGDT(서열번호 137); CFLYSCTDVSYWGNS(서열번호 138); CFLYSCTDVAYWNNT(서열번호 139); CFLYSCGDVSYWGNPGLS(서열번호 140); CFLYSCTDVAYWSGL(서열번호 141); CYLYSCTDGSYWNST(서열번호 142); CFLYSCSDVSYWGNI(서열번호 143); CFLYSCTDVAYW(서열번호 144); CFLYSCTDVSYWGST(서열번호 145); CFLYSCTDVAYWGDT(서열번호 146); GCNIWLNGGDCRGWVDPLQG(서열번호 147); GCNIWLVGGDCRGWIGDTNG(서열번호 148); GCNIWLVGGDCRGWIEDSNG(서열번호 149); GCNIWANGGDCRGWIDNIDG(서열번호 150); GCNIWLVGGDCRGWLGEAVG(서열번호 151); GCNIWLVGGDCRGWLEEAVG(서열번호 152); GGPALCNIWLNGGDCRGWSG(서열번호 153); GAPVFCNIWLNGGDCRGWMG(서열번호 154); GQQQWCNIWINGGDCRGWNG(서열번호 155); GKSEFCNIWLNGGDCRGWIG(서열번호 156); GTPGGCNIWANGGDCRGWEG(서열번호 157); GASQYCNLWINGGDCRGWRG(서열번호 158); GCNIWLVGGDCRPWVEGG(서열번호 159); GCNIWAVGGDCRPFVDGG(서열번호 160); GCNIWLNGGDCRAWVDTG(서열번호 161); GCNIWIVGGDCRPFINDG(서열번호 162); GCNIWLNGGDCRPVVFGG(서열번호 163); GCNIWLSGGDCRMFMNEG(서열번호 164); GCNIWVNGGDCRSFVYSG(서열번호 165); GCNIWLNGGDCRGWEASG(서열번호 166); GCNIWAHGGDCRGFIEPG(서열번호 167); GCNIWLNGGDCRTFVASG(서열번호 168); GCNIWAHGGDCRGFIEPG(서열번호 169); GFLENCNIWLNGGDCRTG(서열번호 170); GIYENCNIWLNGGDCRMG(서열번호 171); 및/또는 GIPDNCNIWINGGDCRYG(서열번호 172)를 포함하는 마스킹 모이어티를 포함한다.
인터류킨 6 표적, 예컨대, 인터류킨 6 수용체(IL-6R)에 결합하는 항체와 함께 사용하기에 적합한 마스킹 모이어티로는 비제한적인 일례로, 서열, 예컨대, QGQSGQYGSCSWNYVHIFMDC(서열번호 174); QGQSGQGDFDIPFPAHWVPIT(서열번호 175); QGQSGQMGVPAGCVWNYAHIFMDC(서열번호 176); YRSCNWNYVSIFLDC(서열번호 177); PGAFDIPFPAHWVPNT(서열번호 178); ESSCVWNYVHIYMDC(서열번호 179); YPGCKWNYDRIFLDC(서열번호 180); YRTCSWNYVGIFLDC(서열번호 181); YGSCSWNYVHIFMDC(서열번호 182); YGSCSWNYVHIFLDC(서열번호 183); YGSCNWNYVHIFLDC(서열번호 184); YTSCNWNYVHIFMDC(서열번호 185); YPGCKWNYDRIFLDC(서열번호 186); WRSCNWNYAHIFLDC(서열번호 187); WSNCHWNYVHIFLDC(서열번호 188); DRSCTWNYVRISYDC(서열번호 189); SGSCKWDYVHIFLDC(서열번호 190); SRSCIWNYAHIHLDC(서열번호 191); SMSCYWQYERIFLDC(서열번호 192); YRSCNWNYVSIFLDC(서열번호 193); YGSCSWNYVHIFMDC(서열번호 194); SGSCKWDYVHIFLDC(서열번호 195); YKSCHWDYVHIFLDC(서열번호 196); YGSCTWNYVHIFMEC(서열번호 197); FSSCNWNYVHIFLDC(서열번호 198); WRSCNWNYAHIFLDC(서열번호 199); YGSCQWNYVHIFLDC(서열번호 200); YRSCNWNYVHIFLDC(서열번호 201); NMSCHWDYVHIFLDC(서열번호 202); FGPCTWNYARISWDC(서열번호 203); XXsCXWXYvhIfXdC(서열번호 204); MGVPAGCVWNYAHIFMDC(서열번호 205); RDTGGQCRWDYVHIFMDC(서열번호 206); AGVPAGCTWNYVHIFMEC(서열번호 207); VGVPNGCVWNYAHIFMEC(서열번호 208); DGGPAGCSWNYVHIFMEC(서열번호 209); AVGPAGCWWNYVHIFMEC(서열번호 210); CTWNYVHIFMDCGEGEGP(서열번호 211); GGVPEGCTWNYAHIFMEC(서열번호 212); AEVPAGCWWNYVHIFMEC(서열번호 213); AGVPAGCTWNYVHIFMEC(서열번호 214); SGASGGCKWNYVHIFMDC(서열번호 215); MGVPAGCVWNYAHIFMDC(서열번호 216); TPGCRWNYVHIFMECEAL(서열번호 217); VGVPNGCVWNYAHIFMEC(서열번호 218); PGAFDIPFPAHWVPNT(서열번호 219); RGACDIPFPAHWIPNT(서열번호 220); QGDFDIPFPAHWVPIT(서열번호 221); XGafDIPFPAHWvPnT(서열번호 222); RGDGNDSDIPFPAHWVPRT(서열번호 223); SGVGRDRDIPFPAHWVPRT(서열번호 224); WAGGNDCDIPFPAHWIPNT(서열번호 225); WGDGMDVDIPFPAHWVPVT(서열번호 226); AGSGNDSDIPFPAHWVPRT(서열번호 227); ESRSGYADIPFPAHWVPRT(서열번호 228); 및/또는 RECGRCGDIPFPAHWVPRT(서열번호 173)를 포함하는 마스킹 모이어티를 포함한다.
일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 절단가능한 모이어티(CM)는 프로테아제, 일반적으로 세포외 프로테아제에 대한 기질로서의 역할을 할 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. CM은 다중특이성 활성화 가능한 항체의 1개 이상의 AB의 원하는 표적과 조직에 함께 공국재화되는 프로테아제에 기초하여 선택될 수 있다. 프로테아제의 기질이 당업계에 공지되어 있는 것인 프로테아제와 함께 관심의 대상이 되는 표적이 공국재화되는 다양한 상이한 조건이 공지되어 있다. 암의 예에서, 표적 조직은 암성 조직, 특히, 고형 종양의 암성 조직일 수 있다. 수많은 암, 예컨대, 고형 종양 중 공지된 기질을 가지는 증가된 수준의 프로테아제가 문헌상으로 보고되어 있다. 예컨대, 문헌 [La Rocca et al, (2004) British J. of Cancer 90(7): 1414-1421]을 참조할 수 있다. 질환의 비제한적인 예로는 모든 유형의 암(유방암, 폐암, 결장직장암, 전립샘암, 흑색종, 두부경부암, 췌장암 등), 류마티스성 관절염, 크론병, SLE, 심혈관 손상, 허혈 등을 포함한다. 예를 들어, 적응증으로는 T 세포 급성 림프아구성 백혈병(T-ALL: T-cell acute lymphoblastic leukemia)을 비롯한 백혈병, 다발성 골수종을 비롯한 림프아구성 질환, 및 폐암, 결장직장암, 전립샘암, 췌장암 및 삼중 음성 유방암을 비롯한 유방암을 포함한, 고형 종양을 포함한다. 예를 들어, 적응증은 골 질환 또는 원발성 종양이 기원과 상관없이, 암의 전이; 비제한적인 일례로, ER/PR+ 유방암, Her2+ 유방암, 삼중 음성 유방암을 비롯한 유방암; 결장직장암; 자궁내막암; 위암; 아교모세포종; 두부경부암; 예컨대, 식도암; 폐암, 예컨대, 비제한적인 일례로, 비소세포 폐암; 다발성 골수종 난소암; 췌장암; 전립샘암; 육종, 예컨대, 골육종; 신장암, 예컨대, 비제한적인 일례로, 신장 세포 암종; 및/또는 피부암, 예컨대, 비제한적인 일례로, 편평 세포암, 기저 세포 암종, 흑색종을 포함한다. 일부 실시양태에서, 암은 편평 세포암이다. 일부 실시양태에서, 암은 피부 편평 세포 암종이다. 일부 실시양태에서, 암은 편평 세포 암종이다. 일부 실시양태에서, 암은 두부경부 편평 세포 암종이다. 일부 실시양태에서, 암은 폐 편평 세포 암종이다.
CM은 약 0.001-1500 x 104　M-1S-1 또는 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2.5, 5, 7.5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 500, 750, 1000, 1250, 또는 1500 x 104 M-1S-1 이상의 속도로 효소에 의해 특이적으로 절단된다.
효소에 의한 특이적인 절단을 위해, 효소와 CM 사이의 접촉이 이루어진다. MM 및 CM에 커플링된 적어도 제1 AB를 포함하는 다중특이성 활성화 가능한 항체가 표적 및 충분한 효소 활성의 존재 하에 있을 때, CM은 절단될 수 있다. 충분한 효소 활성이란 CM과 접촉할 수 있고, 절단할 수 있는 효소의 능력을 의미할 수 있다. 효소는 CM 인근에 있을 수 있지만, 다른 세포성 인자 또는 효소의 단백질 변형으로 인해 절단될 수 없다는 것도 쉽게 구상될 수 있다.
예시적인 기질로는 하기 표 3에의 하기 효소 또는 프로테아제 중 하나 이상의 것에 의해 절단가능한 기질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다:
Figure pct00005
Figure pct00006
예를 들어, 일부 실시양태에서, 기질은 하기 효소 또는 프로테아제: uPA, 레구마인, MT-SP1, ADAM17, BMP-1, TMPRSS3, TMPRSS4, MMP-9, MMP-12, MMP-13, 및/또는 MMP-14 중 하나 이상의 것에 의해 절단가능한 것이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 uPA, 레구마인, 및 MT-SP1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 매트릭스 메탈로프로테이나제이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 uPA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 레구마인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 MT-SP1을 포함한다.
일부 실시양태에서, CM은 특정 프로테아제와의 사용을 위해 선택된다. 일부 실시양태에서, CM은 ADAM 17, BMP-1, 시스테인 프로테아제, 예컨대, 카텝신, HtrA1, 레구마인, 마트립타제(MT-SP1), 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP), 호중성 엘라스타제, TMPRSS, 예컨대, TMPRSS3 또는 TMPRSS4, 트롬빈, 및 u형 플라스미노겐 활성인자(uPA, 이는 또한 우로키나제로도 지칭된다)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 프로테아제에 대한 기질이다.
일부 실시양태에서, CM은 ADAM17에 대한 기질이다. 일부 실시양태에서, CM은 BMP-1에 대한 기질이다. 일부 실시양태에서, CM은 카텝신에 대한 기질이다. 일부 실시양태에서, CM은 시스테인 프로테아제에 대한 기질이다. 일부 실시양태에서, CM은 HtrA1에 대한 기질이다. 일부 실시양태에서, CM은 레구마인에 대한 기질이다. 일부 실시양태에서, CM은 MT-SP1에 대한 기질이다. 일부 실시양태에서, CM은 MMP에 대한 기질이다. 일부 실시양태에서, CM은 호중성 엘라스타제에 대한 기질이다. 일부 실시양태에서, CM은 트롬빈에 대한 기질이다. 일부 실시양태에서, CM은 TMPRSS에 대한 기질이다. 일부 실시양태에서, CM은 TMPRSS3에 대한 기질이다. 일부 실시양태에서, CM은 TMPRSS4에 대한 기질이다. 일부 실시양태에서, CM은 uPA에 대한 기질이다.
일부 실시양태에서, 절단가능한 모이어티는 특정 프로테아제, 예를 들어, 활성화 가능한 항체의 표적과 함께 공국재화되는 것으로 알려져 있는 프로테아제와의 사용을 위해 선택된다. 예를 들어, 본 개시내용의 활성화 가능한 항체에서 사용하는 데 적합한 절단가능한 모이어티로는 서열 TGRGPSWV(서열번호 27); SARGPSRW(서열번호 28); TARGPSFK(서열번호 29); LSGRSDNH(서열번호 26); GGWHTGRN(서열번호 30); HTGRSGAL(서열번호 31); PLTGRSGG(서열번호 32); AARGPAIH(서열번호 33); RGPAFNPM(서열번호 34); SSRGPAYL(서열번호 35); RGPATPIM(서열번호 36); RGPA(서열번호 37); GGQPSGMWGW(서열번호 38); FPRPLGITGL(서열번호 39); VHMPLGFLGP(서열번호 40); SPLTGRSG(서열번호 41); SAGFSLPA(서열번호 42); LAPLGLQRR(서열번호 43); SGGPLGVR(서열번호 44); 및/또는 PLGL(서열번호 45)을 포함한다.
일부 실시양태에서, CM은 1개 이상의 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP)에 대한 기질이다. MMP의 예로는 MMP1; MMP2; MMP3; MMP7; MMP8; MMP9; MMP10; MMP11; MMP12; MMP13; MMP14; MMP15; MMP16; MMP17; MMP19; MMP20; MMP23; MMP24; MMP26; 및 MMP27을 포함한다. 일부 실시양태에서, CM은 MMP9, MMP14, MMP1, MMP3, MMP13, MMP17, MMP11, 및 MMP19에 대한 기질이다. 일부 실시양태에서, CM은 MMP7에 대한 기질이다. 일부 실시양태에서, CM은 MMP9에 대한 기질이다. 일부 실시양태에서, CM은 MMP14에 대한 기질이다. 일부 실시양태에서, CM은 2개 이상의 MMP에 대한 기질이다. 일부 실시양태에서, CM은 적어도 MMP9 및 MMP14에 대한 기질이다. 일부 실시양태에서, CM은 동일한 MMP에 대한 2개 이상의 기질을 포함한다. 일부 실시양태에서, CM은 적어도 2개 이상의 MMP9 기질을 포함한다. 일부 실시양태에서, CM은 적어도 2개 이상의 MMP14 기질을 포함한다.
일부 실시양태에서, CM은 MMP에 대한 기질이고, 서열 ISSGLLSS(서열번호 316); QNQALRMA(서열번호 317); AQNLLGMV(서열번호 318); STFPFGMF(서열번호 319); PVGYTSSL(서열번호 320); DWLYWPGI(서열번호 321); MIAPVAYR(서열번호 322); RPSPMWAY(서열번호 21); WATPRPMR(서열번호 323); FRLLDWQW(서열번호 324); LKAAPRWA(서열번호 325); GPSHLVLT(서열번호 326); LPGGLSPW(서열번호 327); MGLFSEAG(서열번호 328); SPLPLRVP(서열번호 329); RMHLRSLG(서열번호 330); LAAPLGLL(서열번호 331); AVGLLAPP(서열번호 332); LLAPSHRA(서열번호 333); PAGLWLDP(서열번호 334); 및/또는 ISSGLSS(서열번호 335)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 재조합 DNA 기술 및 진핵성 또는 원핵성 종에서의 발현을 사용하여 생합성적으로 제조될 수 있다. 다중특이성 활성화 가능한 항체의 경우, 마스킹 모이어티, (절단가능한 모이어티(CM), 및 항체 쇄(중쇄 또는 경쇄)를 포함할 수 있는) 링커 서열을 코딩하는 cDNA는 5'→3' (번역된 생성물에서 N 말단에서 C 말단) 서열로 연결되어 핵산 구성물을 생성할 수 있고, 이 핵산 구성물은 종래의 항체 발현 프로세스 후 다중특이성 활성화 가능한 항체 단백질로서 발현된다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 CM-항체을 발현한 후, 상기 단백질의 N 말단에서, 또는 그 부근에서 화학적으로 마스크와 커플링함으로써 반합성적으로 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 항체를 발현한 후, 다중특이성 활성화 가능한 항체가 절단되지 않은 상태에서 N 말단에서 C 말단으로 하기: MM-CM-AB 또는 AB-CM-MM와 같은 구조적 배열을 가지도록 상기 단백질의 N 말단에서, 또는 그 부근에서 화학적으로 마스크 및 CM과 커플링함으로써 제조될 수 있다.
본원에 기술된 조성물에서 사용되는 데 적합한 링커는 일반적으로 변형된 AB 또는 다중특이성 활성화 가능한 항체의 가요성을 제공하여 적어도 제1 AB의 표적에의 결합의 억제를 촉진시키는 것이다. 상기 링커는 일반적으로 가용성 링커로서 지칭된다. 적합한 링커는 쉽게 선택될 수 있으며, 예컨대, 1개의 아미노산(예컨대, Gly) 내지 20개의 아미노산, 2개의 아미노산 내지 15개의 아미노산, 3개의 아미노산 내지 12개의 아미노산(4개의 아미노산 내지 10개의 아미노산, 5개의 아미노산 내지 9개의 아미노산, 6개의 아미노산 내지 8개의 아미노산, 또는 7개의 아미노산 내지 8개의 아미노산 포함)과 같이, 상이한 길이의 적합한 것 중 임의의 것일 수 있으며, 그의 길이는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 아미노산 길이일 수 있다.
예시적인 가요성 링커로는 글리신 중합체 (G)n, 글리신-세린 중합체(예를 들어, (GS)n, (GSGGS)n(서열번호 18) 및 (GGGS)n(서열번호 19)(여기서, n은 1 이상인 정수이다) 포함)), 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체, 및 당업계에 공지된 다른 가요성 링커를 포함한다. 글리신 및 글리신-세린 중합체는 상대적으로 비구조적이며, 따라서, 성분 사이의 중성 테더로서의 역할을 할 수 있다. 글리신은 심지어 알라닌보다도 유의적으로 더욱 phi-psi 공간에 접근하며, 보다 긴 측쇄를 가지는 잔기보다 훨씬 더 적게 제약된다 (문헌 [Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)] 참조). 예시적인 가요성 링커로는 Gly-Gly-Ser-Gly(서열번호 20), Gly-Gly-Ser-Gly-Gly(서열번호 21), Gly-Ser-Gly-Ser-Gly(서열번호 22), Gly-Ser-Gly-Gly-Gly(서열번호 23), Gly-Gly-Gly-Ser-Gly(서열번호 24), Gly-Ser-Ser-Ser-Gly(서열번호 25) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 당업계의 숙련가는 활성화 가능한 항체의 디자인이 모두 또는 부분적으로 가요성인 링커를 포함할 수 있으며, 이로써, 링커는 원하는 다중특이성 활성화 가능한 항체 구조를 제공하기 위해 가용성 링커뿐만 아니라, 덜 가요성인 구조를 부여하는 하나 이상의 일부분을 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
상기 기술된 요소 이외에도, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 추가의 요소, 예컨대, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 아미노산 서열 N 또는 C 말단을 함유할 수 있다. 예를 들어, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 관심의 대상이 되는 세포 또는 조직으로의 전달을 촉진시키기 위해 표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 다중특이성 활성화 가능한 항체는 작용제, 예컨대, 치료제, 항신생물제, 독소 또는 그의 단편, 검출가능한 모이어티 또는 진단제에 컨쥬게이트될 수 있다. 작용제의 예는 본원에 개시되어 있다.
다중특이성 활성화 가능한 항체는 또한 비제한적인 일례의 것을 비롯하여, 본 개시내용의 다중특이성 항체와 함께 컨쥬게이트된 작용제, 링커 및 본원에 기술된 다른 성분들 중 임의의 것, 하기 표 4에 열거된 작용제 중 임의의 것 및/또는 하기 표 5 및/또는 표 6에 열거된 링커 중 임의의 것을 포함할 수 있다.
컨쥬게이트된 다중특이성 항체 및 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체
본 개시내용은 또한 세포독성제, 예컨대, 독소(예컨대, 박테리아, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소(즉, 방사성 컨쥬게이트)에 컨쥬게이트된 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체를 포함하는 면역컨쥬게이트에 관한 것이다. 적합한 세포독성제로는 예를 들어, 돌라스타틴 및 그의 유도체(예컨대, 아우리스타틴 E, AFP, MMAD, MMAF, MMAE)를 포함한다. 예를 들어, 세포독성제는 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 모노메틸 아우리스타틴 D(MMAD)이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 하기 표 4에 열거되어 있는 군으로부터 선택되는 작용제이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 돌라스타틴이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 아우리스타틴 또는 그의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 아우리스타틴 E 또는 그의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 메이탄시노이드 또는 메이탄시노이드 유도체이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 DM1 또는 DM4이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 듀오카르마이신 또는 그의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 칼리키아미신 또는 그의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 피롤로벤조디아제핀이다.
사용될 수 있다 효소적으로 활성인 독소 및 그의 단편으로는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄(슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파 사르신, 유동나무(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 미국 자리공(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 여주(momordica charantia) 억제제, 커신, 크로틴, 사파오나리 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 젤로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 다양한 방사성핵종이 방사성 컨쥬게이트된 항체의 제조에 이용가능하다. 그 예로는 212Bi, 64Cu, 125I, 131I, 131In, 99mTc, 90Y, 186Re, 및 89Zr을 포함한다.
항체 및 세포독성제의 컨쥬게이트는 다양한 이작용성 단백질 커플링제, 예컨대, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트(SPDP), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이작용성 유도체(예컨대, 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르(예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예컨대, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예컨대, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예컨대, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조된다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987)]에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지화된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 방사성뉴클레오티드의 항체에의 컨쥬게이트를 위한 예시적인 킬레이트화제이다(WO94/11026 참조).
하기 표 4에는 본원에 기술된 기술내용에서 사용될 수 있는 예시적인 제약 제제의 일부가 열거되어 있지만, 이는 어느 방식으로든 배타적인 목록을 의미하는 것은 아니다.
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
당업계의 숙련가는 매우 다양한 가능성이 있는 모이어티가 본 개시내용의 생성된 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체에 커플링될 수 있다는 것을 이해할 것이다(예를 들어, 문헌 ["Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989)](상기 문헌은 그 내용 전문이 본원에서 참조로 포함된다) 참조).
커플링은 항체 및 다른 모이어티가 그의 개별 활성을 보유하는 한 2개 분자에 결합하게 되는 임의의 화학 반응에 의해 달성될 수 있다. 이러한 연결은 많은 화학 기전, 예를 들어, 공유 결합, 친화성 결합, 인터칼레이션, 배위 결합 및 착체화를 포함할 수 있다. 그러나, 일부 실시양태에서, 바람직한 결합은 공유 결합이다. 공유 결합은 존재하는 측쇄의 직접적인 축합에 의해서 또는 외부 가교 분자의 도입에 의해 획득될 수 있다. 다수의 2가 또는 다가 연결제는 단백질 분자, 예컨대, 본 개시내용의 항체를 다른 분자에 커플링하는 데 유용하다. 예를 들어, 대표적인 커플링제로는 유기 화합물, 예컨대, 티오에스테르, 카보디이미드, 숙신이미드 에스테르, 디이소시아네이트, 글루타르알데하이드, 디아조벤젠 및 헥사메틸렌 디아민을 포함한다. 상기 목록은 당업계에 공지된 다양한 부류의 커플링제를 배제하고자 하는 것이 아니며, 단지 보다 일반적인 커플링제에 대한 예이다(문헌 [Killen and Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984)]; [Jansen et al., Immunological Reviews 62:185-216 (1982)]; 및 [Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)] 참조).
일부 실시양태에서, 본원에서 제공하는 조성물 및 방법 이외에도, 컨쥬게이트된 활성화 가능한 항체는 또한 부위 특이 컨쥬게이션을 위해 활성화 가능한 항체 서열에 삽입된, 또는 다르게는 포함된 변형된 아미노산 서열을 통해 변형될 수 있다. 상기 변형된 아미노산 서열은 컨쥬게이트된 활성화 가능한 항체 내에서 컨쥬게이트된 작용제의 배치 및/또는 투여량이 제어될 수 있도록 디자인된다. 예를 들어, 활성화 가능한 항체는 반응성 티올 기를 제공하며, 단백질 폴딩 및 조립에는 부정적인 영향을 미치지도 않고, 항원 결합도 변경시키지 않는, 경쇄 및 중쇄 상의 위치에 시스테인 치환을 포함하도록 조작될 수 있다. 일부 실시양태에서, 활성화 가능한 항체는 컨쥬게이션을 위해 적합한 부위를 제공하기 위하여 활성화 가능한 항체 내에 하나 이상의 비천연 아미노산 잔기를 포함하거나, 또는 다르게는 그를 도입하도록 조작될 수 있다. 일부 실시양태에서, 활성화 가능한 항체는 활성화 가능한 항체 서열 내에 효소적으로 활성화 가능한 펩티드 서열을 포함하거나, 또는 다르게는 그를 도입하도록 조작될 수 있다.
적합한 링커는 문헌에 기술되어 있다(예를 들어, MBS(M-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르)의 사용을 기술하는 문헌 [Ramakrishnan, S. et al., Cancer Res. 44:201-208 (1984)]참조). 또한, 올리고펩티드 링커에 의해 항체에 커플링된 할로겐화된 아세틸 하이드라지드 유도체의 사용을 기술하는 미국 특허 번호 제5,030,719호를 참조할 수 있다. 특히 적합한 링커로는 (i) SMPT(4-숙신이미딜옥시카보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜-디티오)-톨루엔(피어스 켐. 컴퍼니(Pierce Chem. Co.), 카탈로그 (21558G); (ii) SPDP(숙신이미딜-6 [3-(2-피리딜디티오) 프로피온아미도]헥사노에이트(피어스 켐. 컴퍼니, 카탈로그 번호 21651G); 및 (iii) 술포-LC-SPDP(술포숙신이미딜 6 [3-(2-피리딜디티오)-프로피안아미드]헥사노에이트 (피어스 켐. 컴퍼니, 카탈로그 번호 2165-G)를 포함한다. 추가의 링커로는 SMCC, 술포-SMCC, SPDB, 또는 술포-SPDB를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 기술된 링커는 상이한 속성을 가지는 성분을 함유하며, 이로써, 물리화학적 특성이 상이한 컨쥬게이트가 생성된다. 예를 들어, 링커 SMPT는 입체 장애 이황화 결합을 함유하고, 안정성이 증가된 컨쥬게이트를 형성할 수 있다. 이황화 결합은 시험관내에서는 절단되기 때문에 이황화 결합은 일반적으로 다른 결합보다는 덜 안정적인 바, 이에 컨쥬게이트는 덜 이용된다.
시약 EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드는 카복실산 및 1차 및 2차 아민으로 출발하여 카복스아미드를 생성하는 데 유용하다. 따라서, EDC는 항체 중 리신 잔기를 링커 또는 독소 중의 카복실산과 연결시키는 데, 또는 항체 중 아스파르테이트 또는 글루타메이트 잔기를 링커 또는 독소 중의 아민과 연결시키는 데 사용될 수 있다. EDC를 사용하는 상기 컨쥬게이션 반응은 NHS(N-하이드록시숙신이미드) 또는 술포-NHS(N-하이드록시-3-옥시술포닐숙신이미드) 첨가에 의해 증진될 수 있다. 상기 컨쥬게이션 반응에 NHS 또는 술포-NHS를 첨가하면 컨쥬게이션 반응의 속도, 완전성, 선택성, 및/또는 재현가능성은 증진될 수 있다.
일부 실시양태에서, 링커는 절단가능한 것이다. 일부 실시양태에서, 링커는 비절단가능한 것이다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 링커가 존재한다. 2개 이상의 링커는 모두 동일한 것으로, 예컨대, 절단가능하거나, 또는 비절단가능한 것이거나, 또는 2개 이상의 링커는 상이한 것으로, 예컨대, 1개 이상은 절단가능한 것이고, 1개 이상은 비절단가능한 것이다.
본 개시내용은 작용제를 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체의 Ab에 부착시키는 데 수개의 방법을 사용한다: (a) AB의 탄수화물 모이어티에의 부착, 또는 (b) AB의 술프하이드릴 기에의 부착, 또는 (c) AB의 아미노 기에의 부착, 또는 (d) AB의 카복실 기에의 부착. 본 개시내용에 따라, AB는 하나는 AB와 반응하고, 하나는 작용제와 반응하는 2개 이상의 반응성 기를 가지는 중간 링커를 통해 작용제에 공유적으로 부착될 수 있다. 임의의 상용성 유기 화합물을 포함할 수 있는 링커는 AB(또는 작용제)와의 반응이 AB 반응성 및 선택성에 부정적인 영향을 미치지 않도록 선택될 수 있다. 추가로, 링커의 작용제에의 부착은 작용제의 활성을 파괴시키지 않을 수 있다. 산화된 항체 또는 산화된 항체 단편과 반응하기 적합한 링커는 1차 아민, 2차 아민, 하이드라진, 하이드라지드, 하이드록실아민, 페닐하이드라진, 세미카바지드 및 티오세미카바지드 기로 이루어진 군으로부터 선택된 아민을 함유하는 것을 포함한다. 상기 반응성 작용기는 링커의 구조의 일부분으로서 존재하거나, 또는 상기 기를 함유하지 않는 링커의 적합한 화학적 변형에 의해 도입될 수 있다.
본 개시내용에 따라, 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체의 환원된 AB에의 부착에 적합한 링커로는 환원된 항체 또는 단편의 술프하이드릴 기와 반응할 수 있는 특정 반응성 기를 가지는 것을 포함한다. 이러한 반응성 기로는 반응성 할로알킬 기(예를 들어, 할로아세틸 기 포함), p-머큐리벤조에이트 기 및 미카엘 유형 부가 반응을 수행할 수 있는 기(예를 들어, 말레이미드 및 문헌 [Mitra and Lawton, 1979, J. Amer. Chem. Soc. 101: 3097-3110]에 기술된 유형의 기 포함)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 개시내용에 따라, 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체의 산화된 AB도 아닌, 환원된 AB도 아닌 것에의 부착에 적합한 링커로는 AB내 변형되지 않은 리신 잔기 내 존재하는 1차 아미노 기와 반응할 수 있는 특정 작용기를 가지는 것을 포함한다. 이러한 반응기는 NHS 카복실산 또는 카본산 에스테르, 술포-NHS 카복실산 또는 카본산 에스테르, 4-니트로페닐 카복실산 또는 카본산 에스테르, 펜타플루오로페닐 카복실산 또는 카본산 에스테르, 아실 이미다졸, 이소시아네이트, 및 이소티오시아네이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 개시내용에 따라, 본 개시내용에 따라, 산화된 AB도 아닌, 환원된 AB도 아닌 것에의 부착에 적합한 링커로는 적합한 시약으로 활성화된, AB내 아스파르테이트는 글루타메이트 잔기에 존재하는 카복실산 기와 반응할 수 있는 특정 작용기를 가지는 것을 포함한다. 적합한 활성화 시약은 부가된 NHS 또는 술포-NHS가 있거나 또는 없는, EDC, 및 카복스아미드 형성에 이용되는 다른 탈수화제를 포함한다. 이러한 예에서, 적합한 링커에 존재하는 작용기는 1차 및 2차 아민, 하이드라진, 하이드록실아민, 및 하이드라지드를 포함한다.
작용제는 링커가 AB가 부착되기 이전 또는 이후에 링커에 부착될 수 있다. 특정 적용에서, 링커가 회합된 작용제가 없는 AB 링커 중간체를 먼저 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 적용에 따라, 이어서, 특정 작용제를 링커에 공유적으로 부착시킬 수 있다. 다른 실시양태에서 AB는 먼저 MM, CM 및 회합된 링커에 결합된 후 컨쥬게이션 목적용 링커에 부착된다.
분지형 링커: 구체적인 실시양태에서, 작용제 부착을 위한 다중 부위를 가지는 분지형 링커가 이용된다. 다중 부위 링커를 위해, AB에의 단일 공유 부착으로 다수 부위에서 작용제에 결합할 수 있는 AB-링커 중간체가 생성될 수 있다. 부위들은 알데히드 또는 술프히드릴 기이거나, 또는 작용제가 부착될 수 있는 임의의 화학 부위일 수 있다.
별법으로, 보다 높은 비활성(또는 AB에 대한 작용제의 보다 높은 비율)은 AB 상에 복수 개의 부위에서 단일 부위 링커의 결합에 의해 달성될 수 있다. 이러한 복수 개의 부위는 2가지 방법 중 어느 하나에 의해 AB에 도입될 수 있다. 첫번째, 동일한 AB 내에 다중의 알데히드 기 및/또는 술프히드릴 기를 생성시킬 수 있다. 두번째, 링커에의 후속 부착을 위한 복수 개의 작용 부위를 가지는 "분지형 링커"를 AB의 알데히드 또는 술프히드릴에 부착시킬 수 있다. 분지형 링커 또는 다중 부위 링커의 작용성 부위는 알데히드 또는 술프히드릴 기이거나, 또는 링커가 부착될 수 있는 임의의 화학 부위일 수 있다. 훨씬 더 높은 비활성은 이들 2가지 접근법을 조합하여, 즉, AB 상의 수개의 부위에서 다중 부위 링커를 부착시킴으로써 얻을 수 있다.
절단가능한 링커: 보체계의 효소, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 우로키나아제, 조직 플라스미노겐 활성인자, 트립신, 플라스민, 또는 단백질분해 활성을 가지는 다른 효소에 의한 절단에 감수성인 펩티드 링커는 본 개시내용의 한 실시양태에서 사용될 수 있다. 본 개시내용의 한 방법에 따라서, 작용제는 보체에 의한 절단에 감수성인 링커를 통해 부착된다. 항체는 보체를 활성화시킬 수 있는 부류로부터 선택된다. 따라서, 항체-작용제 컨쥬게이트는 보체 캐스캐이드를 활성화시키고, 표적 부위에서 작용제를 유리시킨다. 본 개시내용의 또 다른 방법에 따라, 작용제는 단백질분해 활성을 가지는 효소, 예컨대, 우로키나아제, 조직 플라스미노겐 활성인자, 플라스민, 또는 트립신에 의한 절단에 감수성인 링커를 통해 부착된다. 이러한 절단가능한 링커는 세포외 독소, 예컨대, 비제한적인 일례로, 표 4에 제시된 것 중 임의의 세포외 독소를 포함하는 컨쥬게이트된 활성화 가능한 항체에서 유용하다.
절단가능한 링커 서열의 비제한적인 예를 하기 표 5에 제공하고 있다.
Figure pct00010
추가로, 작용제는 이황화 결합(예를 들어, 시스테인 분자 상의 이황화 결합)을 통해 AB에 부착될 수 있다. 다수의 종양은 천연적으로 고수준의 글라타티온(환원제)를 방출하는 바, 이는 이황화 결합을 환원시키고, 이어서, 전달 부위에서 작용제를 유리시킨다. 특정의 구체적인 실시양태에서, CM을 변형시킬 수 있는 환원제는 또한 컨쥬게이트된 활성화 가능한 항체의 링커도 변형시킬 수 있다.
스페이서 및 절단가능한 요소: 추가의 또 다른 실시양태에서, 활성화 가능한 항체의 작용제 및 AB 사이의 이격화를 최적화시키도록 위해 링커를 구성하는 것인 필요할 수 있다. 이는 하기 일반식의 링커를 이용하여 수행될 수 있다:
W - (CH2)n - Q
여기서,
W는 --NH--CH2-- 또는 --CH2--이고;
Q는 아미노산, 펩티드이고
n은 정수 0 내지 20이다.
추가의 다른 실시양태에서, 링커는 스페이서 요소 및 절단가능한 요소를 포함할 수 있다. 스페이서 요소는 절단가능한 성분이 절단을 담당하는 효소에 보다 접근가능하도록 AB의 코어로부터 멀리 떨어져 있는 곳에 절단가능한 성분을 배치하는 역할을 한다. 상기 기술된 특정의 분지형 링커는 스페이서 요소로서의 역할을 할 수 있다.
본 논의 전역에 걸쳐, 링커의 작용제에의 부착(또는 스페이서 요소의 단가능한 요소에의 부착, 또는 단가능한 요소의 작용제에의 부착)은 특정 방식의 부착 또는 반응을 필요로 하지 않음을 이해하여야 한다. 적합한 안정성 및 생물학적 상용성을 가지는 생성물을 제공하는 임의의 반응이 허용가능하다.
혈청 보체 및 링커의 선택: 본 개시내용의 한 방법에 따라, 작용제의 유리가 바람직한 경우, 보체를 활성화시킬 수 있는 부류의 항체인 AB가 사용된다. 생성된 컨쥬게이트는 항원에 결합하는 능력 및 보체 캐스캐이드를 활성화시키는 능력 둘 모두를 보유한다. 따라서, 본 개시내용의 이러한 실시양태에 따라, 작용제는 절단가능한 링커 또는 절단가능한 요소의 한쪽 단부에 연결되고, 링커 기의 다른 나머지 한 단부는 AB 상의 특이 부위에 부착된다 . 예를 들어, 작용제가 하이드록시 기 또는 아미노 기를 가지는 경우, 각각 에스테르 또는 아미드 결합을 통해 펩티드, 아미노산 또는 다른 적합하게 선택된 링커의 카복시 말단에 부착될 수 있다. 예를 들어, 상기 작용제는 카보디이미드 반응을 통해 링커 펩티드에 부착될 수 있다. 작용제가 링커와의 부착을 방해하는 작용기를 함유하면, 이들 방해 작용기는 일단 생성물 컨쥬게이트 또는 중간체가 제조되고 나면, 부착 및 탈차단 이전에 차단될 수 있다. 이어서, 링커의 반대 또는 아미노 말단은 바로 또는 보체를 활성화할 수 있는 AB와의 결합을 위한 추가 변형 이후에 사용된다.
링커(또는 링커의 스페이서 요소)는 임의의 바람직한 길이일 수 있고, 이중 한쪽 단부는 활성화 가능한 항체의 AB 상의 특이 부위에 공유적으로 부착될 수 있다. 링커 또는 스페이서 요소의 다른 단부는 아미노산 또는 펩티드 링커에 부착될 수 있다.
따라서, 이들 컨쥬게이트가 보체 존재 하에서 항원에 결합할 경우, 링커에 작용제를 부착시키는 아미드 또는 에스테르 결합은 절단될 것이며, 이로써, 활성 형태인 작용제가 유리될 것이다. 이러한 컨쥬게이트는 피험체에 투여되었을 때, 표적 부위에 작용제의 전달 및 유리를 수행할 것이고, 제한 없이 표 4에 제시된 바와 같은 제약 제제, 항생제, 항대사산물, 항증식제 등의 생체내 전달에 특히 효과적이다.
보체 활성화가 없이 방출을 위한 링커: 표적화된 전달의 추가의 또 다른 용도에서, 보체 활성화 없이 작용제의 유리는 보체 캐스캐이드의 활성화가 궁극적으로 표적 세포를 용해시키는 바, 이에 바람직하다. 따라서, 상기 접근법은 작용제의 전달 및 방출이 표적 세포를 사멸하지 않고 수행되어야 할 때 유용하다. 세포 매개인자, 예컨대 ,호르몬, 효소, 코르티코스테로이드, 신경전달인자, 유전자 또는 효소를 표적 세포로 전달하는 것이 바람직할 때, 이러한 것이 목표가 된다. 이들 컨쥬게이트는 혈청 프로테아제에 의한 절단에 중간 정도로 감수성인 링커를 통해 보체를 활성화시킬 수 없는 AB에 작용제를 부착시킴으로써 제조될 수 있다. 이러한 컨쥬게이트를 개체에게 투여할 때, 항원-항체 복합체는 신속하게 형성되지만, 작용제의 절단은 서서히 일어나느 바, 이로써, 표적 부위로 화합물이 유리된다.
생화학적 가교 링커: 다른 실시양태에서, 활성화 가능한 항체는 특정의 생화학적 가교 링커를 이용하여 하나 이상의 치료제에 컨쥬게이트될 수 있다. 가교 결합 시약은 2종의 상이한 분자의 작용기를 함께 연결하는 분자 브릿지를 형성한다. 단계식 방식으로 2종의 상이한 단백질을 연결하기 위해서, 이종이중작용성 가교 링커는 원치않는 동종중합체 형성을 제거하는데 사용될 수 있다.
리소좀 프로테아제에 의해 절단가능한 펩티딜 링커 또한 유용하고, 예로는, Val-Cit, Val-Ala 또는 다른 이중펩티드가 있다. 추가로, 리소좀의 낮은 pH 환경에서 절단가능한 산 불안정성 링커가 사용될 수 있고, 그 예로는 비스-시알릴 에테르가 있다. 다른 적합한 링커는 카텝신 불안정성 기질, 특히, 산성 pH에서 최적의 기능을 나타내는 것을 포함한다 .
예시적인 이종이작용성 가교 링커는 하기 표 6에 언급되어 있다.
Figure pct00011
비절단가능한 링커 또는 직접 부착: 본 개시내용의 추가의 다른 실시양태에서, 컨쥬게이트는 작용제가 표적에 전달되지만, 방출되지 않도록 디자인될 수 있다. 이는 직접 또는 비절단가능한 링커를 통해 AB에 작용제를 부착시킴으로써 수행될 수 있다.
이러한 비절단가능한 링커는 아미노산, 펩티드, D-아미노산 또는 후속하여 본원에 기술된 방법에 의해 AB에의 부착에 사용될 수 있는 작용기를 포함하도록 변형될 수 있는 다른 유기 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 유기 링커에 대한 일반식은 하기와 같을 수 있다:
W - (CH2)n - Q
여기서,
W은 --NH--CH2-- 또는 --CH2--이고;
Q는 아미노산, 펩티드이고;
n은 정수 0 내지 20이다.
비절단가능한 컨쥬게이트: 별법으로, 화합물은 보체를 활성화시키는 않는 AB에 부착될 수 있다. 보체 활성화를 할 수 없는 AB를 이용하는 경우, 이러한 부착은 활성화된 보체에 의한 절단에 감수성인 링커를 이용하거나 또는 활성화된 보체에 의한 절단에 비감수성인 링커를 이용하여 수행될 수 있다.
본원에서 개시된 항체는 또한 면역리포솜으로서 제제화될 수 있다. 항체를 함유하는 리포솜은 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 문헌 [Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985)]; [Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980)]; 및 미국 특허 번호 제4,485,045호 및 제4,544,545호에 개시된 방법에 의해 제조된다. 순환 시간이 증진된 리포솜은 미국 특허 번호 제5,013,556호에 기술되어 있다.
특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤, 및 PEG 유도화된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 이용한 역상 증발법에 의해 생성될 수 있다. 리포솜은 정해진 공극 크기의 필터를 통해 압출시킴으로써 원하는 직경을 가지는 리포솜을 수득할 수 있다. 본 개시내용의 항체의 Fab' 단편은 문헌 [Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)]에 기술되어 있는 바와 같이 이황화-상호교환 반응을 통해 리포솜에 컨쥬게이트될 수 있다.
비결합 입체 모이어티 또는 비결합 입체 모이어티에 대한 결합 파트너를 가지는 다중특이성 활성화 가능한 항체
본 개시내용은 또한 비결합 입체 모이어티(NB: non-binding steric moieties) 또는 비결합 입체 모이어티에 대한 결합 파트너(BP: binding partner)를 포함하는 다중특이성 활성화 가능한 항체로서, 여기서, BP는 NB를 다중특이성 활성화 가능한 항체로 동원하거나, 또는 다르게는 유인하는 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체를 제공한다. 본원에서 제공하는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 예를 들어, 비결합 입체 모이어티(NB), 절단가능한 링커 (CL) 및 적어도 제1 표적 또는 에피토프에 결합하는 제1 항체 또는 항체 단편(AB1)을 포함하는 다중특이성 활성화 가능한 항체; 비결합 입체 모이어티(BP)에 대한 결합 파트너, CL 및 AB1을 포함하는 다중특이성 활성화 가능한 항체; 및 NB를 동원하는 BP, CL 및 제1 표적 또는 에피토프에 결합하는 AB1을 포함하는 다중특이성 활성화 가능한 항체를 포함한다. NB가 CL 및 AB1에 공유적으로 연결되어 있거나, 또는 AB 및 CL에 공유적으로 연결된 BP와 상호작용에 의해 회합된 다중특이성 활성화 가능한 항체는 본원에서 "NB 함유 다중특이성 활성화 가능한 항체"로 지칭된다. 활성화 가능한 또는 전환 가능한이란, 활성화 가능한 항체가 억제, 마스킹 또는 절단되지 않은 상태일 때(즉, 제1 입체구조일 때), 활성화 가능한 항체는 표적에의 결합에 대해 제1 수준을 나타내며, 활성화 가능한 항체가 비억제, 비마스킹 및/또는 절단된 상태일 때(즉, 제2 입체구조일 때, 즉, 활성화된 항체일 때), 표적에의 결합에 대해 제2 결합 수준을 나타내는 것을 의미하고, 여기서, 표적 결합의 제2 수준은 표적 결합의 제2 수준보다 크다. 다중특이성 활성화 가능한 항체 조성물은 종래 항체 치료제에 비하여 증가된 생체이용률 및 더욱 바람직한 생체분포를 나타낼 수 있다.
일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 다중특이성 활성화 가능한 항체가 마스킹되지 않았거나, 또는 다르게는 상기 부위에의 결합이 억제되었다면, 비치료 부위 및/또는 비진단 부위에서 다중특이성 활성화 가능한 항체의 결합으로 인해 발생할 수 있는 낮은 독성 및/또는 유해한 부작용을 제공한다.
한 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 비결합 입체 모이어티(NB); 절단가능한 링커 (CL); 및 제1 표적 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 적어도 제1 항체 또는 항체 단편(AB1)을 포함하고, 여기서, NB는 AB1에 특이적으로 결합하지 않는 폴리펩티드이고; CL은 효소에 대한 기질(S)을 포함하는 폴리펩티드이고; CL은 절단되지 않은 상태에서는 NB가 AB1의 그의 표적에의 결합을 방해하고, 절단된 상태에서는 NB가 AB1의 그의 표적에의 결합을 방해하지 않도록 배치되고; NB는 효소에 의한 CL의 절단을 억제하지 않는다. 본원 전역에 걸쳐 사용되는 바, 폴리펩티드라는 용어는 거대 폴리펩티드, 전장의 단백질 및 그의 단편을 비롯한, 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 임의의 폴리펩티드를 의미하며, 폴리펩티드라는 용어는 단일 쇄 폴리펩티드로 한정되지 않고, 다중 단위, 예컨대, 다중 쇄 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 폴리펩티드가 길이가 짧은 경우, 예를 들어, 총 50개 미만의 아미노산인 경우, 펩티드 및 폴리펩티드라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되면, 폴리펩티드가 보다 긴 경우, 예를 들어, 50개 이상의 아미노산인 경우, 폴리펩티드 및 단백질이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
한 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 비결합 입체 모이어티(NB); 절단가능한 링커(CL); 및 제1 표적 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 적어도 제1 항체 또는 항체 단편(AB1)를 포함하고, 여기서, (i) NB는 AB1에 특이적으로 결합하지 않는 폴리펩티드를 포함하고; (ii) CL은 길이가 50개 이하의 아미노산인 폴리펩티드로서, 효소에 대한 기질(S)를 포함하는 것이고; (iii) CL은 절단되지 않은 상태에서는 NB가 AB1의 그의 표적에의 결합을 방해하고, 절단된 상태에서는 NB가 AB1의 그의 표적에의 결합을 방해하지 않도록 배치되고; (iv) NB는 효소에 의한 CL의 절단을 억제하지 않는다. 예를 들어, CL의 길이는 15개 이하의 아미노산, 길이는 20개 이하의 아미노산, 길이는 25개 이하의 아미노산, 길이는 30개 이하의 아미노산, 길이는 35개 이하의 아미노산, 길이는 40개 이하의 아미노산, 길이는 45개 이하의 아미노산, 길이는 50개 이하의 아미노산, 길이는 10-50개의 아미노산 범위, 길이는 15-50개의 아미노산 범위, 길이는 15-50개의 아미노산 범위, 길이는 20-50개의 아미노산 범위, 길이는 25-50개의 아미노산 범위, 길이는 30-50개의 아미노산 범위, 길이는 35-50개의 아미노산 범위, 길이는 40-50개의 아미노산 범위, 길이는 45-50개의 아미노산 범위, 길이는 10-40개의 아미노산 범위, 길이는 15-40개의 아미노산 범위, 길이는 20-40개의 아미노산 범위, 길이는 25-40개의 아미노산 범위, 길이는 30-40개의 아미노산 범위, 길이는 35-40개의 아미노산 범위, 길이는 10-30개의 아미노산 범위, 길이는 15-30개의 아미노산, 아미노산 범위, 길이는 20-30개의 아미노산 범위, 길이는 25-30개의 아미노산 범위, 길이는 10-20개의 아미노산 범위, 또는 길이는 10-15개의 아미노산 범위이다.
한 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 비결합 입체 모이어티(NB); 절단가능한 링커 (CL); 및 제1 표적 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 적어도 제1 항체 또는 항체 단편(AB1)을 포함하고, 여기서, (i) NB는 AB1에 특이적으로 결합하지 않는 폴리펩티드를 포함하고; (ii) CL은 효소에 대한 기질(S)을 포함하는 폴리펩티드이고; (iii) CL은 절단되지 않은 상태에서는 NB가 AB1의 그의 표적에의 결합을 방해하고, 절단된 상태에서는 NB가 AB1의 그의 표적에의 결합을 방해하지 않도록 배치되고; (iv) NB는 효소에 의한 CL의 절단을 억제하지 않고; (v) 다중특이성 활성화 가능한 항체의 적어도 일부는 절단되지 않은 상태에서 하기와 같이 N 말단에서 C 말단으로 구조적 배열을 가진다: NB-CL-AB1 또는 AB1-CL-NB.
한 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 비결합 입체 모이어티(NB); 절단가능한 링커 (CL); 및 제1 표적 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 적어도 제1 항체 또는 항체 단편(AB1)을 포함하고, 여기서 (i) NB는 AB1에 특이적으로 결합하지 않는 폴리펩티드를 포함하고; (ii) CL은 효소에 대한 기질(S)을 포함하는 폴리펩티드이고; (iii) CL은 절단되지 않은 상태에서는 NB가 AB1의 그의 표적에의 결합을 방해하고, 절단된 상태에서는 NB가 AB1의 그의 표적에의 결합을 방해하지 않도록 배치되고, 여기서, 절단되지 않은 활성화 가능한 항체에서 NB는 AB1의 그의 표적에 결합할 수 있는 능력을 절단된 AB1의 그의 표적에 결합할 수 있는 능력과 비교하여 50% 이상만큼, 예를 들어, 60% 이상만큼, 70% 이상만큼, 75% 이상만큼, 80% 이상만큼, 85% 이상만큼, 90% 이상만큼, 95% 이상만큼, 96% 이상만큼, 97% 이상만큼, 98% 이상만큼, 99% 이상만큼, 100% 이상만큼 감소시키고; (iv) NB는 효소에 의한 CL의 절단을 억제하지 않는다. AB의 그의 표적에 결합할 수 있는 능력의 감소는 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 검정법, 또는 시험관내 표적 치환 검정법, 예컨대, PCT 공개 번호 WO　2009/025846 및 WO 2010/081173에 기술된 검정법을 사용하여 측정된다.
한 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 비결합 입체 모이어티(NB)에 대한 결합 파트너(BP); 절단가능한 링커 (CL); 및 제1 표적 및/또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 적어도 제1 항체 또는 항체 단편(AB1)을 포함하고, 여기서, BP는 그에 노출되었을 때 NB에 결합하는 폴리펩티드이고; NB는 AB1에 특이적으로 결합하지 않고; CL은 효소에 대한 기질(S)을 포함하는 폴리펩티드이고; CL은 절단되지 않은 상태에서 NB의 존재 하에서는 NB가 AB의 표적에의 결합을 방해하고, 절단된 상태에서는 NB가 AB의 표적에의 결합을 방해하지 않도록 배치되고, BP는 AB의 표적에의 결합을 방해하지 않고; NB 및 BP는 효소에 의한 CL의 절단을 억제하지 않는다. 본 실시양태의 일부 예에서, 활성화 가능한 항체의 BP는 임의적으로 NB에 결합한다. 한 실시양태에서, NB는 생체내에서 활성화 가능한 항체의 BP에 의해 동원된다.
상기 다중특이성 활성화 가능한 항체 실시양태 중 임의의 것의 일부 예에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 조성물로서 제제화된다. 상기 실시양태 중 일부에서, 조성물은 또한 NB를 포함하며, 여기서, NB는 BP, CL, 및 AB를 포함하는 다중특이성 활성화 가능한 항체와 함께 공동으로 제제화된다. 본 실시양태의 일부 예에서, BP는 알부민 결합 펩티드, 피브리노겐 결합 펩티드, 피브로넥틴 결합 펩티드, 헤모글로빈 결합 펩티드, 트랜스페린 결합 펩티드, 면역글로불린 도메인 결합 펩티드, 및 다른 혈청 단백질 결합 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 다중특이성 활성화 가능한 항체 실시양태 중 임의의 것의 일부 예에서, NB는 가용성인 구형 단백질이다. 상기 다중특이성 활성화 가능한 항체 실시양태 중 임의의 것의 일부 예에서, NB는 혈류로 순환하는 단백질이다. 상기 다중특이성 활성화 가능한 항체 실시양태 중 임의의 것의 일부 예에서, NB는 알부민, 피브리노겐, 피브로넥틴, 헤모글로빈, 트랜스페린, 면역글로불린 도메인, 및 다른 혈청 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 다중특이성 활성화 가능한 항체 실시양태 중 임의의 것의 일부 예에서, CL은 프로테아제에 대한 기질(S)을 포함하는 폴리펩티드이다. 상기 다중특이성 활성화 가능한 항체 실시양태 중 임의의 것의 일부 예에서, 프로테아제는 조직 중 그의 표적과 함께 공국재화되고, 프로테아제는 다중특이성 활성화 가능한 항체가 프로테아제에 노출될 때, 다중특이성 활성화 가능한 항체 중 CL을 절단한다. 상기 다중특이성 활성화 가능한 항체 실시양태 중 임의의 것의 일부 예에서, CL은 길이가 50개 이하의 아미노산인 폴리펩티드이다. 상기 다중특이성 활성화 가능한 항체 실시양태 중 임의의 것의 일부 예에서, CL은 길이가 최대 15개의 아미노산, 예컨대, 3개의 아미노산 길이, 4개의 아미노산 길이, 5개의 아미노산 길이, 6개의 아미노산 길이, 7개의 아미노산 길이, 8개의 아미노산 길이, 9개의 아미노산 길이, 10개의 아미노산 길이, 11개의 아미노산 길이, 12개의 아미노산 길이, 13개의 아미노산 길이, 14개의 아미노산 길이, 또는 15개의 아미노산 길이인 것인, 기질(S)을 포함하는 폴리펩티드이다.
상기 다중특이성 활성화 가능한 항체 실시양태 중 임의의 것의 일부 예에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 적어도 일부는 절단되지 않은 상태에서 하기와 같이 N 말단에서 C 말단으로 구조적 배열을 가진다: NB-CL-AB, AB-CL-NB, BP-CL-AB 또는 AB-CL-BP. 다중특이성 활성화 가능한 항체가 BP를 포함하고, 다중특이성 활성화 가능한 항체가 상응하는 NB의 존재 하에 있는 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 적어도 일부는 절단되지 않은 상태에서 하기와 같이 N 말단에서 C 말단으로 구조적 배열을 가진다: NB:BP-CM-AB 또는 AB-CM-BP:NB(여기서, ":"은 상호작용, 예컨대, NB와 BP 사이의 결합을 나타낸다).
상기 다중특이성 활성화 가능한 항체 실시양태 중 임의의 것의 일부 예에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 그의 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하고, 단일클론 항체, 도메인 항체, 단일 쇄, Fab 단편, F(ab')2 단편, scFv, scab, dAb, 단일 도메인 중쇄 항체, 및 단일 도메인 경쇄 항체이다. 일부 실시양태에서, 그의 표적에 결합하는 상기 항체 또는 그의 면역학상 활성인 단편은 마우스, 키메라, 인간화된 또는 완전한 인간 단일클론 항체이다.
상기 다중특이성 활성화 가능한 항체 실시양태 중 임의의 것의 일부 예에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 또한 AB에 컨쥬게이트된 작용제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 작용제는 치료제이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 항신생물제이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 독소 또는 그의 단편이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 링커를 통해 AB에 컨쥬게이트된다. 일부 실시양태에서, 링커는 절단가능한 링커이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 표 4에 열거되어 있는 군으로부터 선택되는 작용제이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 돌라스타틴이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 아우리스타틴 또는 그의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 아우리스타틴 E 또는 그의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 모노메틸 아우리스타틴 D(MMAD)이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 메이탄시노이드 또는 메이탄시노이드 유도체이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 DM1 또는 DM4이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 듀오카르마이신 또는 그의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 칼리키아미신 또는 그의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 피롤로벤조디아제핀이다.
상기 다중특이성 활성화 가능한 항체 실시양태 중 임의의 것의 일부 예에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 또한 검출가능한 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 모이어티는 진단제이다.
상기 다중특이성 활성화 가능한 항체 실시양태 중 임의의 것의 일부 예에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 또한 스페이서를 포함한다. 상기 다중특이성 활성화 가능한 항체 실시양태 중 임의의 것의 일부 예에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 또한 신호 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 신호 펩티드는 스페이서를 통해 다중특이성 활성화 가능한 항체에 컨쥬게이트된다. 상기 다중특이성 활성화 가능한 항체 실시양태 중 임의의 것의 일부 예에서, 스페이서는 다중특이성 활성화 가능한 항체의 MM에 직접적으로 연결된다.
일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 상응하는 다중특이성 항체의 것보다 더 길고; 예컨대, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 pK는 상응하는 다중특이성 항체의 것보다 더 길다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 상응하는 다중특이성 항체의 것과 유사하다. 일부 실시양태에서, 유기체에게 투여되었을 때, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 15일 이상이다. 일부 실시양태에서, 유기체에게 투여되었을 때, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 12일 이상이다. 일부 실시양태에서, 유기체에게 투여되었을 때, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 11일 이상이다. 일부 실시양태에서, 유기체에게 투여되었을 때, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 10일 이상이다. 일부 실시양태에서, 유기체에게 투여되었을 때, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 9일 이상이다. 일부 실시양태에서, 유기체에게 투여되었을 때, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 8일 이상이다. 일부 실시양태에서, 유기체에게 투여되었을 때, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 7일 이상이다. 일부 실시양태에서, 유기체에게 투여되었을 때, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 6일 이상이다. 일부 실시양태에서, 유기체에게 투여되었을 때, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 5일 이상이다. 일부 실시양태에서, 유기체에게 투여되었을 때, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 4일 이상이다. 일부 실시양태에서, 유기체에게 투여되었을 때, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 3일 이상이다. 일부 실시양태에서, 유기체에게 투여되었을 때, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 2일 이상이다. 일부 실시양태에서, 유기체에게 투여되었을 때, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 24시간 이상이다. 일부 실시양태에서, 유기체에게 투여되었을 때, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 20시간 이상이다. 일부 실시양태에서, 유기체에게 투여되었을 때, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 18시간 이상이다. 일부 실시양태에서, 유기체에게 투여되었을 때, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 16시간 이상이다. 일부 실시양태에서, 유기체에게 투여되었을 때, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 14시간 이상이다. 일부 실시양태에서, 유기체에게 투여되었을 때, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 12시간 이상이다. 일부 실시양태에서, 유기체에게 투여되었을 때, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 10시간 이상이다. 일부 실시양태에서, 유기체에게 투여되었을 때, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 8시간 이상이다. 일부 실시양태에서, 유기체에게 투여되었을 때, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 6시간 이상이다. 일부 실시양태에서, 유기체에게 투여되었을 때, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 4시간 이상이다. 일부 실시양태에서, 유기체에게 투여되었을 때, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 혈청 반감기는 3시간 이상이다.
본 개시내용은 또한 상기 다중특이성 활성화 가능한 항체 중 임의의 것을 코딩하는 단리된 핵산 분자뿐만 아니라, 이러한 단리된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 본 개시내용은 세포를 다중특이성 활성화 가능한 항체의 발현을 유도하는 조건 하에서 배양함으로써 다중특이성 활성화 가능한 항체를 제조하는 방법으로서, 여기서, 세포는 상기 핵산 서열을 포함하는 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 상기 벡터를 포함한다.
NB 함유 다중특이성 활성화 가능한 항체의 표적에의 해리 상수(Kd)는 NB 또는 NB:BP와 회합되지 않은 경우의 AB의 표적에의 Kd보다 더 크다. NB 함유 다중특이성 활성화 가능한 항체의 표적에의 해리 상수(Kd)는 모체 AB의 표적에의 Kd보다 더 크다. 예를 들어, NB 함유 다중특이성 활성화 가능한 항체의 표적에의 Kd는 NB 또는 NB:BP와 회합되지 않은 경우의 AB의, 또는 모체 AB의 표적에의 Kd보다 적어도 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 500,000, 1,000,000, 5,000,000, 10,000,000, 50,000,000배 이상, 또는 5-10, 10-100, 10-1,000, 10-10,000, 10-100,000, 10-1,000,000, 10-10,000,000, 100-1,000, 100-10,000, 100-100,000, 100-1,000,000, 100-10,000,000, 1,000-10,000, 1,000-100,000, 1,000-1,000,000, 1000-10,000,000, 10,000-100,000, 10,000-1,000,000, 10,000-10,000,000, 100,000-1,000,000, 또는 100,000-10,000,000배 더 크다. 반대로, NB 함유 다중특이성 활성화 가능한 항체의 표적에의 결합 친화도는 NB 또는 NB:BP와 회합되지 않은 경우의 AB의 표적에의 결합 친화도보다 낮거나, 또는 모체 AB의 표적에의 결합 친화도보다 낮다. 예를 들어, NB 함유 다중특이성 활성화 가능한 항체의 표적에의 결합 친화도는 적어도 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 500,000, 1,000,000, 5,000,000, 10,000,000, 50,000,000배 이상, 또는 5-10, 10-100, 10-1,000, 10-10,000, 10-100,000, 10-1,000,000, 10-10,000,000, 100-1,000, 100-10,000, 100-100,000, 100-1,000,000, 100-10,000,000, 1,000-10,000, 1,000-100,000, 1,000-1,000,000, 1000-10,000,000, 10,000-100,000, 10,000-1,000,000, 10,000-10,000,000, 100,000-1,000,000, 또는 100,000-10,000,000배로 NB 또는 NB:BP와 회합되지 않은 경우의 AB의 표적에의 결합 친화도보다 낮거나, 또는 모체 AB의 표적에의 결합 친화도보다 낮다.
NB 함유 다중특이성 활성화 가능한 항체가 그의 표적의 존재 하에 있을 때, NB 또는 NB:BP와 회합되지 않은 경우의 AB의 특이적인 결합과 비교하여, AB의 그의 표적에의 특이적인 결합은 감소 또는 억제된다. NB 함유 다중특이성 활성화 가능한 항체가 그의 표적의 존재 하에 있을 때, 모체 AB의 그의 표적에의 특이적인 결합과 비교하여, AB의 그의 표적에의 특이적인 결합은 감소 또는 억제된다. NB 또는 NB:BP와 회합되지 않은 경우의 AB의 표적에의 결합, 또는 모체 AB의 그의 표적에의 결합과 비교하였을 때, NB 함유 다중특이성 활성화 가능한 항체의 그의 표적에 결합할 수 있는 능력은 생체내 또는 시험관내 검정법으로 측정되었을 때, 적어도 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, 또는 96시간, 또는 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 또는 180일, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월 이상 동안 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 이상만큼 감소된다.
NB 함유 다중특이성 활성화 가능한 항체가 그의 표적의 존재 하에 있지만, 변형제(예를 들어, 프로테아제 또는 다른 효소)의 존재 하에 있지 않을 때, NB 또는 NB:BP와 회합되지 않은 경우의 AB의 특이적인 결합과 비교하여, AB의 그의 표적에의 특이적인 결합은 감소 또는 억제된다. NB 함유 다중특이성 활성화 가능한 항체가 그의 표적의 존재 하에 있지만, 변형제(예를 들어, 프로테아제, 다른 효소, 환원제, 또는 빛)의 존재 하에 있지 않을 때, 모체 AB의 그의 표적에의 특이적인 결합과 비교하여, AB의 그의 표적에의 특이적인 결합은 감소 또는 억제된다. NB 또는 NB:BP와 회합되지 않은 경우의 AB의 표적에의 결합, 또는 모체 AB의 그의 표적에의 결합과 비교하였을 때, NB 함유 다중특이성 활성화 가능한 항체의 그의 표적에 결합할 수 있는 능력은 생체내 또는 시험관내 검정법으로 측정되었을 때, 적어도 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, 또는 96시간, 또는 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 또는 180일, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월 이상 동안 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 이상만큼 감소된다.
상기 다중특이성 활성화 가능한 항체 실시양태 중 임의의 것의 일부 예에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 AB에 컨쥬게이트된 작용제를 포함하며, 이로써, 다중특이성 활성화 가능한 항체 컨쥬게이트가 제조된다. 다중특이성 활성화 가능한 항체 컨쥬게이트의 일부 실시양태에서, 작용제는 치료제이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 진단제이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 검출가능한 마커이다. 다중특이성 활성화 가능한 항체 컨쥬게이트의 일부 실시양태에서, 작용제는 항신생물제이다. 다중특이성 활성화 가능한 항체 컨쥬게이트의 일부 실시양태에서, 작용제는 독소 또는 그의 단편이다. 다중특이성 활성화 가능한 항체 컨쥬게이트의 일부 실시양태에서, 작용제는 링커를 통해 AB에 컨쥬게이트된다. 다중특이성 활성화 가능한 항체 컨쥬게이트의 일부 실시양태에서, 링커는 절단가능한 링커이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 표 4에 열거되어 있는 군으로부터 선택되는 작용제이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 돌라스타틴이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 아우리스타틴 또는 그의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 아우리스타틴 E 또는 그의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 모노메틸 아우리스타틴 D(MMAD)이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 메이탄시노이드 또는 메이탄시노이드 유도체이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 DM1 또는 DM4이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 듀오카르마이신 또는 그의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 칼리키아미신 또는 그의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 피롤로벤조디아제핀이다.
상기 다중특이성 활성화 가능한 항체 실시양태 중 임의의 것의 일부 예에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 이중 표적 결합 다중특이성 활성화 가능한 항체이다. 상기 이중 표적 결합 다중특이성 활성화 가능한 항체는 동일한 또는 상이한 표적에 결합할 수 있는 2개의 Ab를 함유한다. 구체적인 실시양태에서, 이중 표적화 다중특이성 활성화 가능한 항체는 이중특이성 항체 또는 항체 단편을 함유한다.
이중 표적 결합 다중특이성 활성화 가능한 항체는 다중특이성 활성화 가능한 항체의 AB에 결합할 수 있는 표적 중 하나 또는 둘 모두와 표적 조직 내에 공국재화되는 절단제에 의해 절단가능한 CL을 가지도록 디자인된다. 동일하거나 또는 상이한 표적에 대해 1개 초과의 AB를 가지는 이중 표적 결합 다중특이성 활성화 가능한 항체는 1개 초과의 CL을 가지도로 디자인될 수 있고, 여기서, 제1 CL은 제1 표적 조직에서 절단제에 의해 절단가능하고 여기서, 제2 CL은 제2 표적 조직에서 절단제에 의해 절단가능하며, 표적 중 하나 이상의 것은 활성화 가능한 항체의 AB에 결합한다. 한 실시양태에서, 제1 및 제2 표적 조직은 공간적으로 분리되어 있으며, 예를 들어, 유기체에서 다른 부위에 존재한다. 한 실시양태에서, 제1 및 제2 표적 조직은 시간상 분리된 동일한 조직, 예를 들어, 상이한 두 시점의 동일한 조직, 예를 들어, 제1 시점은 조직이 조기 단계의 종양일 때이고, 제2 시점은 말기 단계의 종양일 때이다.
본 개시내용은 또한 본원에 기술된 다중특이성 활성화 가능한 항체를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 본 개시내용은 또한 상기 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 본원에 기술된 다중특이성 활성화 가능한 항체는 세포를 다중특이성 활성화 가능한 항체 발현을 유도하는 조건 하에서 배양함으로써 제조되며, 여기서, 세포는 상기 핵산 분자 또는 벡터를 포함한다.
본 개시내용은 또한 다중특이성 활성화 가능한 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 방법은 (a) 다중특이성 활성화 가능한 항체를 코딩하는 핵산 구성물을 포함하는 세포를 다중특이성 활성화 가능한 항체 발현을 유도하는 조건 하에서 배양하는 단계로서, 여기서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 (i) 비결합 입체 모이어티(NB); (ii) 절단가능한 링커 (CL); 및 (iii) 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB)을 포함하고, 여기서 (1) NB는 AB에 특이적으로 결합하지 않고; (2) CL은 효소에 대한 기질(S)을 포함하는 폴리펩티드이고; (3) CL은 절단되지 않은 상태에서는 NB가 AB의 표적에의 결합을 방해하고, 절단된 상태에서는 NB가 AB의 표적에의 결합을 방해하지 않도록 배치되고; (4) NB는 효소에 의한 CL의 절단을 억제하지 않는 것인 단계; 및 (b) 다중특이성 활성화 가능한 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 방법은 (a) 다중특이성 활성화 가능한 항체를 코딩하는 핵산 구성물을 포함하는 세포를 다중특이성 활성화 가능한 항체 발현을 유도하는 조건 하에서 배양하는 단계로서, 여기서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 (i) 비결합 입체 모이어티(NB)에 대한 결합 파트너(BP); (ii) 절단가능한 링커 (CL); 및 (iii) 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB)을 포함하고, 여기서, (1) NB는 AB에 특이적으로 결합하지 않고; (2) CL은 효소에 대한 기질(S)을 포함하는 폴리펩티드이고; (3) CL은 절단되지 않은 상태에서 NB의 존재 하에서는 NB가 AB의 표적에의 결합을 방해하고, 절단된 상태에서는 NB가 AB의 표적에의 결합을 방해하지 않고, BP가 AB의 표적에의 결합을 방해하지 않도록 배치되고; (4) NB 및 BP는 효소에 의한 CL의 절단을 억제하지 않는 것인 단계; 및 (b) 다중특이성 활성화 가능한 항체를 회수하는 단계를 포함한다. 본 실시양태의 일부 예에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 BP는 NB에 결합한다.
다중특이성 항체 및 다중특이성 활성화 가능한 항체의 용도
본 개시내용에 따른 치료학적 엔티티의 투여는 적합한 담체, 부형제, 및 개선된 이송, 전달, 내성 등을 제공하기 위해 제제로 도입되는 다른 작용제와 함께 투여된다는 것을 이해할 것이다. 다수의 적절한 제제는 모든 약사에게 알려진 처방서인 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975))], 특히, 문헌 내의 (Blaug, Seymour)에 의한 87장에서 살펴볼 수 있다. 이들 제제는 예를 들어, 분말, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 지질(양이온성 또는 음이온성) 함유 소포체(예컨대, 리포펙틴(Lipofectin)™), DNA 컨쥬게이트, 무수 수착 페이스트, 수중유 및 유중수 에멀젼, 에멀젼 카보왁스(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고형 겔, 카보왁스를 함유하는 반고형 혼합물을 포함한다. 상기 혼합물 중 임의의 것은 본 개시내용에 따른 치료 및 요법에서 적절할 수 있지만, 단, 제제 중 활성 성분은 제제에 의해 불활성화되지 않고, 제제는 투여 경로와 생리적으로 상용성이고, 내성인 것을 조건으로 한다. 또한, 문헌 [Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance." Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000)], [Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000)], [Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts." J Pharm Sci.89(8):967-78 (2000)], [Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998)] 및 약사에게 주지된 제제, 부형제 및 담체와 관련된 추가 정보에 대한 문헌내 인용부를 참조할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 치료제로서 사용될 수 있다. 상기 작용제는 일반적으로 피험체에서 질환 또는 병상을 진단, 예후, 모니터, 치료, 경감, 및/또는 예방하는 데 사용될 수 있다. 치료학적 요법은 표준 방법을 이용하여 장애를 앓는 (또는 장애가 발병될 위험이 있는) 피험체, 예컨대, 인간 환자 또는 다른 포유동물을 확인함으로써 수행된다. 일부 실시양태에서, 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체 제제, 예를 들어, 그의 2개 이상의 표적 항원에 대하여 고도한 특이성 및 고도한 친화성을 가지는 것이 피험체에게 투여되고, 이는 일반적으로 표적과의 그의 결합에 기인하여 효과를 발휘하게 될 것이다. 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체 투여는 하나 이상의 표적의 신호전달 기능을 폐지, 또는 억제, 또는 방해할 수 있다. 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체 투여는 그에 천연적으로 결합하는 내인성 리간드와 하나 이상의 표적의 결합을 폐지, 또는 억제, 또는 방해할 수 있다.
일반적으로, 질환 또는 장애의 경감 또는 치료는 질환 또는 장애와 관련된 하나 이상의 증상 또는 의학적 문제를 줄이는 것을 포함한다. 예를 들어, 암인 경우, 치료학상 유효량의 약물은 하기 중 하나 또는 그의 조합을 실행할 수 있다: 암세포수 감소; 종양 크기 축소; 주변 기관으로의 암 세포 침윤 억제(즉, 어느 정도 감소시키고/시키거나 중지); 종양 전이 억제; 어느 정도로 종양 성장 억제; 및/또는 암과 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도 완화. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 피험체, 예컨대, 인간 또는 다른 포유동물, 예컨대, 비인간 영장류, 반려 동물(예컨대, 고양이, 개, 말), 농장 동물, 노동 동물, 또는 동물원 동물에서 질환 또는 장애의 발병 또는 재발을 예방하는 데 사용될 수 있다. 피험체 및 환자라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본 개시내용의 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체의 치료학상 유효량은 일반적으로 치료학적 목적을 달성하는 데 필요한 양에 관한 것이다. 상기 언급한 바와 같이, 이는 일부 경우에서 표적의 기능을 방해하는, 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체와 그긔 표적 항원 사이의 결합 상호작용일 수 있다. 투여에 필요한 양은 추가로 그의 특이 항원에 대한 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체의 결합 친화도에 의존적이며, 또한 투여되는 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체가 자유 부피로부터 투여받는 다른 피험체로 격감되는 속도에 따라 좌우된다. 본 개시내용의 다중특이성 항체 및/또는 항체 단편 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체의 치료학상 유효 투약을 위한 일반적인 범위는 비제한적인 일례로 약 0.1 mg/kg(체중) 내지 약 50 mg/kg(체중)일 수 있다. 일반적인 투약 빈도는 예를 들어, 1일 2회 내지 주 1회 범위일 수있다.
치료 유효성은 특정 장애를 진단 또는 치료하는 임의의 공지 방법과 관련하여 측정된다. 원하는 특이성을 가지는 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체를 스크리닝하는 방법으로는 효소 연결 면역흡착 검정법(ELISA: enzyme linked immunosorbent assay) 및 당업계에 공지된 다른 면역학적으로 매개된 기법을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 2개 이상의 표적에 대한 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 표적의 국재화 및/또는 정량화와 관련된 당업계에 공지된 방법에서 사용된다(예를 들어, 적절한 생리학적 샘플 내 하나 이상의 표적의 수준을 측정하는 데, 진단 방법에서 사용하는 데, 단백질을 영상화하는 데 있어서의 용도 등을 위해 사용). 주어진 실시양태에서, 2개 이상의 표적에 대한 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체, 또는 항체 유래의 항원 결합 도메인을 함유하는, 항체의 유도체, 단편, 유사체 또는 상동체는 약리학상 활성인 화합물(이하 "치료제"로서 지칭된다)로서 사용된다.
또 다른 실시양태에서, 2개 이상의 표적에 대한 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 표준 기법, 예컨대, 면역친화법, 크로마토그래피 또는 면역침강법에 의해 하나 이상의 표적을 단리시키는 데 사용될 수 있다. 2개 이상의 표적에 대한 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체(또는 그의 단편)은, 예컨대, 주어진 치료 요법의 효능을 측정하기 위해 임상 검사 방법의 일부로서 조직 중내 단백질 수준을 진단적으로 모니터링하는 데 사용된다. 항체를 검출가능한 물질에 커플링(즉, 물리적으로 연결)시킴으로써 검출을 촉진시킬 수 있다. 검출가능한 물질의 예로는 다양한 효소, 보결기, 형광성 물질, 발광성 물질, 생물발광성 물질, 및 방사성 물질을 포함한다. 적합한 효소의 예로는 홀스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스터라제를 포함하고; 적합한 보결기 착체의 예로는 스트렙트아비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하고; 적합한 형광성 물질의 예로는 엄벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하고; 발광성 물질의 예로는 루미놀을 포함하고; 생물발광성 물질의 예로는 루시퍼라제, 루시페린, 및 에쿠오린을 포함하고; 적합한 방사성의 예로는 125I, 131I, 35S 또는 3H를 포함한다.
추가의 또 다른 실시양태에서, 2개 이상의 표적에 대한 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 샘플에서 하나 이상의 표적(또는 그의 단편)의 존재를 검출하기 위한 작용제로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 검출가능한 표지를 함유한다. 항체는 다중클론이거나, 또는 일부 실시양태에서, 단일클론이다. 온전한 항체, 또는 그의 단편(예컨대, Fab, scFv, 또는 F(ab)2)이 사용된다. 프로브 또는 항체와 관련하여 "표지화된"이라는 용어는 항체 또는 프로브에 검출가능한 물질을 커플링(즉, 물리적으로 연결)하여 프로브 또는 항체를 직접 표지화하는 것뿐만 아니라, 직접적으로 표지화된 또 다른 시약과의 반응성에 의해 프로브 또는 항체를 간접 표지화하는 것을 포함하는 것으로 한다. 간접 표지화의 예로는 형광 표지화된 스트렙트아비딘으로 검출될 수 있도록 비오틴으로 항체를 말단 표지하는 것과 형광 표지된 2차 항체를 이용해 1차 항체를 검출하는 것을 포함한다. "생물학적 샘플"이라는 용어는 피험체로부터 단리된 조직, 세포 및 생물학적 유체뿐만 아니라, 피험체 내에 존재하는 조직, 세포 및 유체를 포함하는 것으로 한다. 따라서 "생물학적 샘플"이라는 용어의 용법에는 혈액 및 혈청, 혈장, 또는 림프를 포함하는 혈액의 성분 또는 분획이 포함된다. 즉, 본 개시내용의 검출 방법은 생체내 및 시험관내 생물학적 샘플에서 단백질을 검출하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 피분석물 단백질의 검출을 위한 시험관내 기법으로는 효소 연결 면역흡착 검정법(ELISA), 웨스턴 블롯, 면역침강법, 및 면역형광법을 포함한다. 면역검정법을 수행하는 방법은 예를 들어, 문헌 ["ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology", Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995]; ["Immunoassay", E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996]; 및 ["Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985]에 기술되어 있다. 추가로, 피분석물 단백질의 검출을 위한 생체내 기법으로는 피험체 내로 표지화된 항피분석물 단백질 항체를 도입하는 것을 포함한다. 예를 들어, 항체는 피험체 내에서 그의 존재 및 위치가 표준 영상화 기법을 통해 검출될 수 있는 방사성 마커로 표지화될 수 있다.
본 개시내용의 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 또한 다양한 진단학적 및 예방학적 제제에서 유용하다. 한 실시양태에서, 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 상기 언급된 장애 중 하나 이상의 것의 발생 위험이 있는 환자에게 투여된다. 하나 이상의 장애에 대한 환자 또는 기관의 소인은 유전형, 혈청학적 또는 생화학적 마커를 이용하여 측정될 수 있다.
본 개시내용의 또 다른 실시양태에서, 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 상기 언급된 장애 중 하나 이상의 것과 관련된 임상 적응증으로 진단받은 인간 개체에게 투여된다. 진단시, 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 임상 적응증의 효과를 완화시키거나 또는 역전시키기 위해 투여된다.
다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 또한 환자 샘플 중 하나 이상의 표적을 검출하는 데 유용하며, 따라서, 진단제로서 유용하다. 예를 들어, 본 개시내용의 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 환자 샘플 중 하나 이상의 표적 수준을 검출하기 위한 시험관내 검정법, 예컨대, ELISA에서 이용된다.
한 실시양태에서, 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체를 고체 지지체(예컨대, 마이크로티터 플레이트의 웰(들)) 상에 고정화시킨다. 고정화된 항체 및/또는 활성화 가능한 항체는 시험 샘플 중에 존재할 수 있는 임의의 표적(들)에 대한 포획 항체로서의 역할을 한다. 고정화된 다중특이성 항체 및/또는 고정화된 다중특이성 활성화 가능한 항체를 환자 샘플과 접촉시키기 전에, 고체 지지체를 세정하고, 차단제, 예컨대, 우유 단백질 또는 알부민으로 처리하여 피분석물의 비특이적인 흡착을 막는다.
이어서, 웰을 항원을 함유하는 것으로 의심되는 시험 샘플로 처리하거나, 또는 표준량의 항원을 함유하는 용액으로 처리한다. 상기 샘플은 예컨대, 병상의 진단에 고려되는 수준으로 순환 항원을 가지는 것으로 의심되는 피험체로부터의 혈청 샘플이다. 시험 샘플 또는 표준물을 세정한 후, 고체 지지체를 검출가능하게 표지화된 2차 항체로 처리한다. 표지화된 2차 항체는 검출 항체로서의 역할을 한다. 검출가능한 표지의 수준을 측정하고, 시험 샘플 중 표적 항원(들)의 농도는 표준 샘플로부터 얻은 표준 곡선과 비교하여 측정된다.
시험관내 진단 검정법에서 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체를 사용하여 수득한 결과에 기초하여, 표적 항원(들)의 발현 수준에 기초하여 피험체에서의 질환 병기를 확인할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 주어진 질환의 경우, 혈액 샘플은 질환의 치료적 처치시 다양한 시점, 및/또는 질환의 진행시 다양한 병기에서 그러한 것으로 진단받은 피험체로부터 채취한다. 각 진행기 또는 요법에 대해 통계학상 유의적인 결과를 제공하는 샘플 집단을 이용하여, 각 병기의 특징인 것으로 간주될 수 있는 항원 농도 범위를 지정한다.
다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 또한 진단 및/또는 영상화 방법에서도 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 시험관내 방법이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 생체내 방법이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 계내 방법이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 생체외 방법이다. 예를 들어, 효소적으로 절단가능한 CM을 가지는 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체를 사용하여 CM을 절단할 수 있는 효소의 존재 또는 부재를 검출할 수 있다. 상기 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체는 주어진 숙주 유기체의 조직 또는 주어진 세포내에서 다중특이성 활성화된 항체(즉, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 절단으로부터 생성된 항체)의 측정된 축적을 통해 효소 활성(또는 일부 실시양태에서, 이황화 결합을 감소시킬 수 있는 증가된 환원 가능성의 환경)의 생체내 검출(예를 들어, 정성 또는 정량)을 포함할 수 있는 진단에서 사용될 수 있다. 상기와 같은 활성화된 다중특이성 항체의 축적은 조직이 효소 활성(또는 CM의 성질에 따라 좌우되는 증가된 환원 가능성)을 발현할 뿐만 아니라, 조직이 활성화된 항체가 결합하는 1개 이상의 표적을 발현함을 의미한다.
예를 들어, CM은 생물학상 제한된 부위(예컨대, 종기, 기관 등)에서 바이러스 또는 박테리아 감염 부위에서, 종양 부위에서 발견되는 프로테아제에 대한 프로테아제 기질로 선택될 수 있다. AB 중 하나 이상은 표적 항원에 결합하는 것일 수 있다. 당업자에게 친숙한 방법을 이용하여, 검출가능한 표지(예컨대, 형광성 표지 또는 방사성 표지 또는 방사성 추적자)는 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체의 AB 또는 다른 영역에 컨쥬게이트될 수 있다. 적합한 검출가능한 표지는 상기 스크리닝 방법과 관련하여 논의되며, 추가의 구체적인 예는 하기에 제공한다. 그 활성이 관심의 대상이 되는 질환 조직에서 상승한 프로테아제와 함께, 질환 상태의 단백질 또는 펩티드에 특이적인 1개 이상의 AB를 이용하여, 활성화 가능한 항체는 CM 특이 효소가 검출가능한 수준으로 존재하지 않거나, 또는 질환 조직에서 보다 낮은 수준으로 존재하거나, 또는 불활성(예를 들어, 자이모겐 형태 또는 억제제와의 복합체로 존재하는 경우)인 조직에 비하여 질환 조직에 대한 결합 비율은 증가된 비율로 나타나게 될 것이다. 소형 단백질 및 펩티드는 신장 여과 시스템에 의해 혈액으로부터 신속하게 제거되고, CM에 대해 특이적인 효소가 검출가능한 수준으로 존재하지 않기 때문에(또는 비질환 조직에서는 낮은 수준으로 존재하거나 또는 불활성 입체구조로 존재하기 때문에), 질환 조직에서 활성화된 다중특이성 항체의 축적은 비질환 조직에 비해 증진된다.
또 다른 예에서, 활성화 가능한 다중특이성 항체는 샘플 내 절단제의 존재 또는 부재를 검출하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 다중특이성 활성화 가능한 항체가 효소에 의한 절단에 감수성인 CM을 함유하는 경우, 활성화가능한 다중특이성 항체는 샘플 내 효소의 존재를 검출(정량적으로 또는 정성적으로)하는 데 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, 다중특이성 활성화 가능한 항체가 환원제에 의한 절단에 감수성인 CM을 함유하는 경우, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 샘플 내 환원 상태의 존재를 검출(정량적으로 또는 정성적으로)하는 데 사용될 수 있다. 이들 방법에서의 분석을 촉진시키기 위해, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 검출가능하게 표지될 수 있고, 지지체(예컨대, 고체 지지체, 예컨대, 슬라이드 또는 비드)에 결합될 수 있다. 검출가능한 표지는 절단 후 유리되지 않는 활성화 가능한 항체의 부분 상에 위치할 수 있으며, 예를 들어, 검출가능한 표지는 켄칭된 형광성 표지이거나, 또는 절단이 일어날 때까지는 검출가능되지 않는 다른 표지일 수 있다. 검정법은 예를 들어, 고정화된, 검출가능하게 표지화된 다중특이성 활성화 가능한 항체를 절단이 일어나기에 충분한 시간 동안 효소 및/또는 환원제를 함유하는 것으로 의심되는 샘플과 접촉시킨 후, 세척하여 과량의 샘플 및 오염물을 세척함으로써 수행될 수 있다. 이어서, 샘플 내 절단제(예를 들어, 효소 또는 환원제)의 존재 또는 부재는 샘플과 접촉 이전의 다중특이성 활성화 가능한 항체의 검출가능한 신호 변화, 예컨대, 샘플 내 절단제에 의한 다중특이성 활성화 가능한 항체의 절단에 의한 검출가능한 신호의 증가 및/또는 그러한 신호의 존재에 의해 평가된다.
상기 검출 방법은 절단된 경우 다중특이성 활성화 가능한 항체의 1개 이상의 AB에 결합할 수 있는 표적의 존재 또는 부재도 또한 검출할 수 있도록 적합화될 수 있다. 따라서, 본 검정법은 절단제의 존재 또는 부재 및 관심의 대상이 되는 표적의 존재 또는 부재를 평가하도록 적합화될 수 있다. 절단제의 존재 또는 부재는 상기 기술된 바와 같이 다중특이성 활성화 가능한 항체의 검출가능한 표지의 존재 및/또는 증가에 의해 검출될 수 있고, 표적의 존재 또는 부재는 예컨대, 검출가능하게 표지화된 항표적 항체를 사용하여, 표적-AB 복합체의 검출에 의해 검출될 수 있다.
다중특이성 활성화 가능한 항체는 또한 예컨대, 프로테아제 절단, 및 특정 표적에의 결합에 의해 활성화 가능한 항체 활성화를 입증하기 위한 계내 영상화에 유용하다. 계내 영상화는 생물학적 샘플, 예컨대, 세포 배양물 또는 조직 섹션 중 표적 및 단백질분해 활성의 국재화를 가능하게 하는 기법이다. 이러한 기법을 이용하여 검출가능한 표지(예컨대, 형광성 표지)의 존재를 기반으로 주어진 표적에의 결합 및 단백질분해 활성, 둘 모두를 확인할 수 있다.
이들 기법은 건강한 조직 또는 질환 부위(예컨대, 종양 조직)에서 유래된 임의의 냉동 세포 또는 조직을 이용하는 데 유용하다. 이들 기법은 또한 신선한 세포 또는 조직 샘플을 이용하는 데 유용하다.
이러한 기법에서, 활성화 가능한 항체는 검출가능한 표지로 표지화된다. 검출가능한 표지는 형광성 염료(예컨대, 형광단, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC: Fluorescein Isothiocyanate), 로다민 이소티오시아네이트(TRITC), 알렉스 플루오르(Alexa Fluor)® 표지), 근적외선(NIR: near infrared) 염료(예컨대, Q도트(Qdot)® 나노크리스탈), 콜로이드성 금속, 합텐, 방사성 마커, 비오틴 및 증폭 시약, 예컨대, 스트렙트아비딘, 또는 효소(예컨대, 홀스래디쉬 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제)일 수 있다.
표지화된, 다중특이성 활성화 가능한 항체와 함께 인큐베이션된 샘플 내 표지의 검출은 샘플이 표적을 함유하고, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 CM에 대해 특이적인 프로테아제를 함유한다는 것을 나타내는 것이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제의 존재는 본원에 기술된 바와 같은 광범위 스펙트럼 프로테아제 억제제를 사용하여, 및/또는 프로테아제에 특이적인 작용제, 예를 들어, 항체, 예컨대, 프로테아제 마트립타아제(MT-SP1)에 특이적이고, MT-SP1의 단백질분해 활성을 억제시키는 A11을 이용함으로써 확인할 수 있다; 예컨대, 2010년 11월 11일 공개된 국제 공개 번호 WO 2010/129609를 참조할 수 있다. 예컨대, 본원에 기술된 것과 같은 광범위 스펙트럼 프로테아제 억제제를 상하는 것이고/거나, 선택성이 더욱 큰 억제제를 이용함으로써 이루어지는 동일한 접근법을 이용하여 활성화 가능한 항체의 CM에 특이적인 프로테아제 또는 프로테아제 부류를 확인할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적의 존재는 표적에 특이적인 작용제를 사용하여 확인할 수 있거나, 또는 검출가능한 표지는 표지화되지 않은 표적과 경쟁할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표지화되지 않은 활성화 가능한 항체를 이용할 수 있는데, 표지화된 2차 항체 또는 보다 복잡한 검출 시스템을 이용해 검출할 수 있다.
유사한 기법 또한 피험체, 예컨대, 인간을 비롯한 포유동물에서의 형광성 신호의 검출이 질환 부위가 표적을 함유하고, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 CM에 특이적인 프로테아제를 함유한다는 것을 나타내는 생체내 영상화에 유용하다.
이들 기법은 또한 다중특이성 활성화 가능한 항체 중의 프로테아제 특이 CM에 기초하여 다양한 세포, 조직, 및 유기체에서 프로테아제 활성을 검출, 확인 또는 특징 규명하기 위한 시약으로서 및/또는 키트에서 유용하다.
다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체의 치료학적 투여 및 제제
본 개시내용에 따른 치료학적 엔티티의 투여는 적합한 담체, 부형제, 및 개선된 이송, 전달, 내성 등을 제공하기 위해 제제로 도입되는 다른 작용제와 함께 투여된다는 것을 이해할 것이다. 다수의 적절한 제제는 모든 약사에게 알려진 처방서인 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)], 특히, 문헌 내의 (Blaug, Seymour)에 의한 87장에서 살펴볼 수 있다. 이들 제제는 예를 들어, 분말, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 지질(양이온성 또는 음이온성) 함유 소포체(예컨대, 리포펙틴™), DNA 컨쥬게이트, 무수 수착 페이스트, 수중유 및 유중수 에멀젼, 에멀젼 카보왁스(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고형 겔, 카보왁스를 함유하는 반고형 혼합물을 포함한다. 상기 혼합물 중 임의의 것은 본 개시내용에 따른 치료 및 요법에서 적절할 수 있지만, 단, 제제 중 활성 성분은 제제에 의해 불활성화되지 않고, 제제는 투여 경로와 생리적으로 상용성이고, 내성인 것을 조건으로 한다. 또한, 문헌 [Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance." Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000)], [Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000)], [Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts." J Pharm Sci.89(8):967-78 (2000)], [Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998)] 및 약사에게 주지된 제제, 부형제 및 담체와 관련된 추가 정보에 대한 문헌내 인용부를 참조할 수 있다.
일부 실시양태에서, 다중특이성 항체, 다중특이성 활성화 가능한 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체 조성물은 하나 이상의 추가의 작용제와 함께 또는 추가의 작용제의 조합물로 투여된다. 적합한 추가의 작용제는 의도된 적용을 위한 현행 제약 요법 및/또는 수술 요법을 포함한다. 예를 들어, 다중특이성 항체, 다중특이성 활성화 가능한 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체 조성물은 추가의 화학요법제 또는 항신생물제와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 다중특이성 항체, 다중특이성 활성화 가능한 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체 조성물 및 추가의 작용제는 단일 치료학적 조성물로 제제화되고, 다중특이성 항체, 다중특이성 활성화 가능한 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체 조성물 및 추가의 작용제는 동시에 투여된다. 별법으로, 다중특이성 항체, 다중특이성 활성화 가능한 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체 조성물 및 추가의 작용제는 서로 별개의 것이며, 예컨대, 각각은 별개의 치료학적 조성물로 제제화되고, 다중특이성 항체, 다중특이성 활성화 가능한 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체 조성물 및 추가의 작용제는 동시에 투여되거나, 다중특이성 항체, 다중특이성 활성화 가능한 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체 조성물 및 추가의 작용제는 치료 요법 동안 상이한 시점에 투여된다. 예를 들어, 다중특이성 항체, 다중특이성 활성화 가능한 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체 조성물은 추가의 작용제의 투여 이전에 투여되거나, 다중특이성 항체, 다중특이성 활성화 가능한 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체 조성물은 추가의 작용제 투여 이후에 투여되거나, 또는 다중특이성 항체, 다중특이성 활성화 가능한 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체 조성물 및 추가의 작용제는 교대로 투여되는 방식으로 투여된다. 본원에 기술된 바와 같이, 다중특이성 항체, 다중특이성 활성화 가능한 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체 조성물 및 추가의 작용제는 단일 용량으로 또는 다회 용량으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 추가의 작용제는 다중특이성 항체, 다중특이성 활성화 가능한 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체 조성물에 커플링되거나, 또는 다르게는 부착된다.
적합한 추가의 작용제는 의도된 적용 목적(즉, 사멸, 세포 증식 예방, 호르몬 요법 또는 유전자 요법)에 따라 선택된다. 상기 작용제로는 예를 들어, 제약 제제, 독소, 독소의 단편, 독소, 독소의 단편, 알킬화제, 효소, 항생제, 항대사산물, 항증식제, 호르몬, 신경전달물질, DNA, RNA, siRNA, 올리고뉴클레오티드, 안티센스 RNA, 앱타머, 진단제, 방사성 불투과성 염료, 방사성 동위원소, 형광원 화합물, 자성 표지, 나노입자, 마커 화합물, 렉틴, 세포막 투과성을 변경하는 화합물, 광화학 화합물, 소형 분자, 리포솜, 미셀, 유전자 요법 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 마지막으로, 제제의 조합 또는 상이한 부류의 작용제의 조합이 이용될 수 있다.
다중특이성 항체, 본 개시내용의 다중특이성 활성화 가능한 항체 및/또는 컨쥬게이트된 다중특이성 활성화 가능한 항체 조성물(이는 또한 본원에서 "활성 화합물"로도 지칭된다), 및 그의 유도체, 단편, 유사체 또는 상동체는 투여에 적합한 제약 조성물 내로 혼입될 수 있다. 이러한 조성물을 제조하는 데 관여하는 원리 및 고려사항뿐만 아니라, 화합물 선택 가이드가 예를 들어, 하기 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences: The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa.:1995]; [Drug Absorption Enhancement:Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994]; 및 [Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, New York]에 제공되어 있다.
상기 조성물은 전형적으로 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체 및 제약상 허용되는 담체는 포함한다. 다중특이성 항체 및/또는 다중특이성 활성화 가능한 항체가 AB 도메인의 단편을 포함하는 경우, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 AB의 가장 작은 단편이 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체의 가변 영역 서열을 기반으로, 펩티드 분자는 표적 단백질 서열에 결합하는 AB의 능력을 보유하도록 디자인될 수 있다. 상기 펩티드는 재조합 DNA 기술에 의해 화학적으로 합성되거나, 제조될 수 있다(예컨대, 문헌 [Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)] 참조).
본원에서 사용되는 바, "제약상 허용되는 담체"라는 용어는 제약 투여와 상용성인, 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함하는 것으로 한다. 적합한 담체는 당업계의 표준 참고서인 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences](상기 문헌은 본원에서 참조로 포함된다)의 최신판에 기술되어 있다. 상기 담체 또는 희석제의 적합한 예로는 물, 염수, 링거액, 덱스트로스액 및 5% 인간 혈청 알부민을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 리포솜 및 비수성 비히클, 예컨대, 고정유 또한 사용될 수 있다. 제약상 활성인 물질에 대한 상기 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 주지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 비상용성이라는 것을 제외하고, 조성물에서의 그의 사용을 고려한다.
생체내 투여에 사용하고자 하는 제제는 멸균성이어야 한다. 이는 멸균 여과막을 통한 여과를 통해 쉽게 달성된다.
본 개시내용의 제약 조성물은 의도하는 투여 경로와 상용성이 되도록 제제화된다. 투여 경로의 예로는 비경구, 예컨대, 정맥내, 피내, 피하, 경구(예컨대, 흡입), 경피(즉, 국소), 경점막 및 직장 투여를 포함한다. 비경구, 피내, 또는 피하 적용을 위해 사용되는 액제 또는 현탁제는 하기 성분을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예컨대, 주사용수, 염수액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항박테리아제, 예컨대, 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대, 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이트화제, 예컨대, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA); 완충제, 예컨대, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트, 및 등장성 조정제, 예컨대, 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기, 예컨대, 염산 또는 수산화나트륨을 이용하여 조정할 수 있다. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰플, 1회용 시린지 또는 다회 투약용 바이알 내로 봉입될 수 있다.
주사용으로 적합한 제약 조성물은 멸균된 수용액(수용성) 또는 분산액 및 멸균 주사액 또는 분산액의 즉석 조제용 멸균 분제를 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체로는 생리적 염수, 정균수, 크레모포어 EL(Cremophor EL™)(BASF: 미국 뉴저지주 파시퍼니) 또는 포스페이트 완충처리된 염수(PBS: phosphate buffered saline)를 포함한다. 모든 경우에서, 조성물은 멸균성이어야 하고, 용이한 주사능이 존재하는 정도로 유동성이어야 한다. 제조 및 보관 조건 하에서 안정적이어야하며, 미생물, 예컨대, 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적합한 유동성은 예를 들어, 코팅제, 예컨대, 레시틴의 이용에 의해, 분산제인 경우, 요구되는 입자 크기 유지에 의해, 및 계면활성제 이용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에서, 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알콜, 예컨대, 만닛톨, 소르비톨, 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 적합하다. 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 주사 조성물은 장기간 흡수될 수 있게 만들 수 있다.
멸균 주사액은 상기 열거된 성분들 중 하나 또는 그의 조합과 함께 활성 화합물을 필요한 양으로 적절한 용매 중에 혼입시킨 후, 필요할 경우, 여과 멸균시킴으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기초 분산 매질 및 상기 열거된 것 에서 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 활성 화합물을 혼입시킴으로써 제조될 수 있다. 멸균 주사액의 제조를 위한 멸균 분제인 경우, 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조시켜 그의 사전 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분과 임의의 추가의 원하는 성분의 분제를 수득하는 것이다.
경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 이들은 젤라틴 캡슐에 봉입되어 정제로 압착될 수 있다. 경구 치료 투여 목적을 위해, 활성 화합물은 부형제와 함께 혼입되고, 정제, 트로키, 또는 캡슐제 형태로 사용될 수 있다. 경구 조성물은 또한 구강 세척제로 사용하기 위한 유동성 담체를 사용해 제조할 수 있으며, 여기서, 유동성 담체 중 화합물은 경구적으로 적용되고, 스위싱(swished)하고 뱉거나, 삼킬 수 있다. 제약상 상용성인 결합제, 및/또는 애주번트 물질이 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 환제, 캡슐제, 트로키 등은 하기 성분 중 임의의 것, 또는 성질이 유사한 화합물을 함유할 수 있다: 결합제, 예컨대, 미세결정질 셀룰로스, 검 트라가칸트 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대, 전분 또는 락토스, 붕해제, 예컨대, 알긴산, 프리모겔 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예컨대, 마그네슘 스테아레이트, 스테로트; 활액제, 예컨대, 콜로이드성 이산화규소; 감미제, 예컨대, 수크로스 또는 사카린; 또는 향미제, 예컨대, 페퍼민트, 메틸 살리실레이트, 또는 오렌지 향미제.
흡입에 의한 투여를 위해, 화합물은 적합한 추진제, 예컨대, 가스, 예컨대 이산화탄소를 함유하는 압축 용기 또는 분배기, 또는 분무기로부터 에어로졸 분무 형태로 전달된다.
전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의해 이루어질 수 있다. 경점막 또는 경피 투여를 위해서, 투과되는 장벽에 적절한 투과제가 제제에 사용된다. 이러한 투과제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 경점막 투여를 위해서, 계면활성제, 담즙염, 및 후시드산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비내 분무 또는 좌제의 사용을 통해 수행될 수 있다. 경피 투여를 위해서, 활성 화합물은 일반적으로 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 연고, 고약, 겔, 또는 크림으로 제제화된다.
화합물은 또한 좌제(예를 들어, 종래의 좌제 베이스, 예컨대, 코코아 버터 및 다른 글리세리드와 함께 사용) 또는 직장 전달용 보류 관장 형태로 제조될 수 있다.
한 실시양태에서, 활성 화합물은 임플란트 및 미세캡슐화된 절단 시스템을 비롯한, 예컨대, 지효성/방출 조절현 제제와 같이, 체내에서의 신속한 제거로부터 화합물을 보호할 수 있는 담체와 함께 제조된다. 생체분해성, 생체상용성 중합체, 예컨대, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산 등이 사용될 수 있다. 상기 제제의 제조 방법은 당업자에게 자명할 것이다.
예를 들어, 활성 성분은 예를 들어, 코아세르베이션 기법에 의해 또는 계면 중합화에 의해 제조된 미세캡슐, 예를 들어, 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴 미세캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미세캡슐에, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 미세구, 미세에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에, 또는 마크로에멀젼에 포획될 수 있다.
지효성 방출 제제가 제조될 수 있다. 지효성 방출 제제의 적합한 예는 매트릭스가 성형품, 예컨대, 필름 또는 미세캡슐 형태인, 항체를 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함한다. 지효성 방출 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 하이드로겔(예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드(미국 특허 번호 제3,773,919호), L-글루탐산 및 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대, 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™(락트산-글리콜산 공중합체 및 루프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사용 미세구), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다. 중합체, 예컨대, 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산은 100일 이상 동안에 걸쳐 분자를 방출시킬 수 있고, 특정 하이드로겔은 보다 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다.
물질은 또한 알자 코포레이션(Alza Corporation) 및 노바 파마슈티칼즈, 인크(Nova Pharmaceuticals, Inc.)으로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 리포솜 현탁제(바이러스 항원에 대한 단일클론 항체로 감염된 세포로 표적화되는 리포솜 포함)은 또한 제약상 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 이는 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어, 미국 특허 번호 제4,522,811호에 기술된 바와 같은 방법에 따라 제조될 수 있다.
투여 용이성 및 투약 균일성을 위해 투여 단위 형태로 경구 또는 비경구 조성물을 제제화하는 것이 특히 이로울 것이다. 본원에서 사용되는 바 투여 단위 형태란 치료하고자 하는 피험체를 위한 단위 투약물로 적합화된 물리적으로 분리된 단위를 의미하며; 각 단위는 필요한 제약 담체와 함께 원하는 치료학적 효과를 발휘하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유한다. 본 개시내용의 투여 단위 형태에 관한 상세사항은 활성 화합물의 고유한 특징 및 얻고자 하는 특정 치료 효과, 및 개체의 치료를 위한 활성 화합물을 배합하는 분야에서의 고유한 제약 에 의해 좌우되고, 그에 직접적으로 의존한다.
제약 조성물은 투여 설명서와 함께 용기, 팩, 또는 분배기에 포함될 수 있다.
제제는 또한 치료하고자 하는 특정 적응증에 필요한 1개 초과의 활성 화합물, 예를 들어, 예를 들어, 서로 악영향을 주지 않는 상보적인 활성을 가지는 것을 포함할 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 조성물은 그 작용을 증진시키는 작용제, 예컨대, 세포독성제, 사이토카인, 화학요법제, 성장 억제제를 포함할 수 있다. 상기 분자는 의도하는 목적에 효과적인 양으로 조합되어 적절하게 존재한다.
한 실시양태에서, 활성 화합물은 조합 요법으로, 즉, 다른 작용제, 예컨대, 병적 상태 또는 장채, 예컨대, 자가면역 장애 및 염증성 질환을 치료하는 데 유용한 치료제와 함께 조합하여 투여된다. 상기 맥락에서 "조합하여"라는 용어는 작용제가 실질적으로 동시발생적으로, 동시에 또는 순차적으로 제공된다는 것을 의미한다. 순차적으로 제공되는 경우, 제2 화합물의 투여를 개시할 때, 2종 화합물 중 제1 화합물은 치료 부위에서 효과적인 농도로 여전히 검출가능하다.
예를 들어, 조합 요법은 하기에서 더욱 상세하게 기술되는 바와 같이, 하나 이상의 추가의 치료제, 예컨대, 하나 이상의 사이토카인 및 성장 인자 억제제, 면역억제제, 항염증제, 대사 억제제, 효소 억제제, 및/또는 세포독성제 또는 세포분열 억제제와 함께 공동 제제화되고/거나, 공동 투여되는 본 개시내용의 하나 이상의 항체를 포함할 수 있다. 추가로, 본원에 기술된 하나 이상의 항체는 본원에 기술된 2종 이상의 치료제와 함께 조합하여 사용될 수 있다. 상기 조합 요법은 유리하게는 투여되는 치료제를 보다 낮은 투여량으로 이용할 수 있으며, 이로써, 다양한 단일요법과 관련된 가능한 독성 또는 합병증을 피할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 하나 이상의 항체는 하나 이상의 항염증성 약물, 면역억제제, 또는 대사 또는 효소 억제제와 함께 공동 제제화되고/거나, 공동 투여될 수 있다. 본원에 기술된 항체와 함께 조합하여 사용될 수 있는 약물 또는 억제제의 비제한적인 예로는 하기의 것 중 하나 이상의 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다: 비스테로이드성 항염증성 약물(들)(NSAID: nonsteroidal anti-inflammatory drug), 예를 들어, 이부프로펜, 테니답, 나프록센, 멜록시캄, 피록시캄, 디클로페낙, 및 인도메타신; 술파살라진; 코르티코스테로이드, 예컨대, 프레드니솔론; 사이토카인 억제성 항염증증 약물(들)(CSAID: cytokine suppressive anti-inflammatory drug); 뉴클레오티드 생합성 억제제, 예컨대, 퓨린 생합성 억제제, 폴레이트 길항제(예컨대, 메토트렉세이트 (N-[4-[[(2,4-디아미노-6-프테리디닐)메틸]메틸아미노]벤조일]-L글루탐산); 및 피리미딘 생합성 억제제, 예컨대, 디하이드로오로테이트 데하이드로게나제(DHODH: dihydroorotate dehydrogenase) 억제제. 본 개시내용의 항체와 함께 조합하여 사용하는 데 적합한 치료제로는 NSAID, CSAID, (DHODH) 억제제(예컨대, 레플루노미드), 및 폴레이트 길항제(예컨대, 메토트렉세이트)를 포함한다.
추가의 억제제의 예로는 하기 중 하나 이상의 것을 포함한다: 코르티코스테로이드(경구, 흡입 및 국소 주사); 면역억제제, 예컨대, 사이클로스포린, 타클로리무스(FK-506); 및 mTOR 억제제, 예컨대, 시롤리무스(라파마이신-라파뮨(RAPAMUNE)™ 또는 라파마이신 유도체, 예컨대, 가용성 라파마이신 유도체(예컨대, 에스테르 라파마이신 유도체, 예컨대, CCI-779); 염증유발성 사이토카인, 예컨대, TNFα 또는 IL-1에 의한 신호전달을 방해하는 작용제(예컨대, IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나제 억제제); COX2 억제제, 예컨대, 셀레콕시브, 로페콕시브, 및 그의 변이체; 포스포디에스터라제 억제제, 예컨대, R973401(포스포디에스터라제 IV형 억제제); 포스포리파제 억제제, 예컨대, 세포질 포스포리파제 2(cPLA2)의 억제제(예컨대, 트리플루오로메틸 케톤 유사체); 혈관 내피 세포 성장 인자 또는 성장 인자 수용체의 억제제, 예컨대, VEGF 억제제 및/또는 VEGF-R 억제제; 및 혈관신생의 억제제. 본 개시내용의 항체와 조합하여 사용하기 적합한 치료제는 면역억제제, 예컨대, 사이클로스포린, 카를로리무스(FK-506); mTOR 억제제, 예컨대, 시롤리무스(라파마이신) 또는 라파마이신 유도체, 예컨대, 가용성 라파마이신 유도체(예컨대, 에스테르 라파마이신 유도체, 예컨대, CCI-779); COX2 억제제, 예컨대, 셀레콕시브 및 그의 변이체; 및 포스포리파제 억제제, 예컨대, 세포질 포스포리파제 2(cPLA2)의 억제제, 예컨대, 트리플루오로메틸 케톤 유사체이다.
본 개시내용의 항체와 함께 조합될 수 있는 치료제의 추가의 예로는 하기 중 하나 이상의 것을 포함한다: 6-머캅토퓨린(6-MP); 아자티오프린, 술파살라진; 메살라진; 올살라진; 클로로퀸/하이드록시클로로퀸(플라케닐(PLAQUENIL)®); 펜실라민; 아우로티오르날레이트(근육내 및 경구); 아자티오프린; 코이키신; 베타-2 아드레날린수용체 효능제(살부타몰, 터부탈린, 살메테랄); 크잔틴(테오필린, 아르니노필린); 크로모글리케이트; 네도크로밀; 케토티펜; 이프라트로피움 및 옥시트로피움; 마이코페놀레이트 모페틸; 아데노신 효능제; 항트롬빈제; 보체 억제제; 및 아드레날린 작용제.
본원에서 인용된 모든 공개문헌 및 특허 문헌은 마치 상기 공개문헌 또는 문헌이 각각 구체적이고 개별적으로 본원에서 참조로 포함되어 있는 것으로 명시되어 있는 것과 같이 본원에서 참조로 포함된다. 공개문헌 및 특허 문헌을 인용하는 것은 상기 중 임의의 것이 적절한 선행 기술임을 인정하고자 하는 것도 아니며, 동일 내용 또는 동일 일자에 관하여 어떤 승인도 포함하고자 하는 것도 아니다. 여기서, 본 발명은 기재된 설명에 의해 기술되었지만, 당업자는 본 발명이 다양한 실시양태로 실시될 수 있고, 하기 설명 및 하기 실시예는 예시 목적의 것이며, 하기의 청구범위를 제한하고자 하는 것이 아님을 이해할 것이다.
실시예
하기 표 7에 제시된 하기 서열은 본원에서 제공하는 실시예 전역에 걸쳐 사용된 서열을 포함한다:
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
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Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
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Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
실시예 1: 다중특이성 항체 제조
본 실시예는 항Jagged-CD3, 항Jagged-CTLA-4, 항EGFR-CD3 및 항EGFR-CTLA-4 다중특이성 항체의 구성, 발현, 및 정제를 입증한다.
벡터를 사용하여 상기 제시된 항Jagged(4D11v2) 중쇄, 5342-1204-4D11v2 경쇄, 항EGFR C225v5 중쇄, 및 3954-1204-C225v5 경쇄 서열을 발현시켰다. 상기 벡터는 2013년 4월 26일 출원된 공계류 중인 출원 PCT/US2013/038540(발명의 명칭: "Activatable Antibodies That Bind Epidermal Growth Factor Receptor And Methods Of Use Thereof") 및 2013년 6월 21일 출원된 공계류 중인 PCT/US2013/047109(발명의 명칭: "Anti-Jagged Antibodies, Activatable Anti-Jagged Antibodies and Methods of Use Thereof")(상기 출원은 각각 그 내용 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있다.
벡터를 제한 효소 NheI 및 NotI로 분해하고, 벡터 단편을 겔 전기영동으로 단리시켰다. 삽입체를 하기와 같이 제조하였다. 인간 IgG CH2CH3 단편을 포프 하이드로 4D11v2(Pop Hygro 4D11v2)로부터 프라이머 HCForNhe(표 8, 서열번호 3) 및 프라이머 HCRevOL(표 8, 서열번호 4)을 이용하여 반응 1에서 증폭시키고, CTLA-4 scFv는 CTLA-4 scFv cDNA(서열번호 229)로부터 프라이머 CTRevNot(표 8, 서열번호 1) 및 프라이머 CTForOL(표 8, 서열번호 2)을 이용하여 반응 2에서 증폭시키고, OKT3 scFv는 OKT3 scFv cDNA(서열번호 231)로부터 프라이머 OKRevNot(표 8, 서열번호 5) 및 프라이머 CTForOL(표 8, 서열번호 2)을 이용하여 반응 3에서 증폭시켰다. 10%의 반응물 1, 10%의 반응물 2를 조합하고, 프라이머, HCForNhe 및 CTRevNot로 증폭시켜 인간 IgG, CH2CH3/CTLA-4 scFv 융합체를 제조하였다.
Figure pct00040
증폭 후, 생성된 DNA를 제한 효소 NheI 및 NotI로 분해시키고, CH2CH3/CTLA-4 scFv 융합체 DNA를 겔 전기영동에 의해 단리시켰다. 10%의 반응물 1, 10%의 반응물 3을 조합하고, 프라이머, HCForNhe 및 CTRevNot로 증폭시켜 인간 IgG, CH2CH3/OKT3 scFv 융합체를 제조하였다. 증폭 후, 생성된 DNA를 제한 효소 NheI 및 NotI로 분해시키고, CH2CH3/CTLA-4 scFv 융합체 DNA를 겔 전기영동에 의해 단리시켰다.
CH2CH3/scFv 단편을 발현 벡터 내로 삽입하기 위해, 하기 표 9에 제시된 하기 조합을 T4 DNA 리가제(인비트로겐 인크(Invitrogen Inc.: 미국 캘리포니아주 칼즈배드))와 함께 밤새도록 결찰시켰다. 결찰시킨 후, DNA를 E. 콜라이(E. coli) 균주 MC106 내로 형질전환시키고, 암피실린 저항성에 대해 선별하였다. DNA 서열분석을 통해 올바른 다중특이성 항체 또는 다중특이성 활성화 가능한 항체를 코딩하는 DNA 삽입체를 함유하는 클론을 확인하고, 포유동물 세포 형질감염을 위해 DNA를 제조하였다.
Figure pct00041
실시예 2: 다중특이성 항체 및 다중특이성 활성화 가능한 항체 제조
일시적으로 형질감염된 HEK-293 세포로부터 완전한 인간 IgG를 발현시켰다. 하기 표 10에 제시된, 상이한 중쇄 및 경쇄 발현 벡터로 공동 형질감염시켜 다중특이성 활성화 가능한 항체를 발현시킬 수 있었다.
Figure pct00042
HEK-293 세포에서 발현된 다중특이성 항체 및 다중특이성 활성화 가능한 항체를 프로테인 A(Protein A) 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
결합 검정법: 도 11에 제시된 바와 같이, ELIS결합 실험을 통해 항Jagged-CTLA-4 및 항Jagged-OKT3 다중특이성 항체 및 다중특이성 활성화 가능한 항체가 인간 Jagged 1에 결합하였고, 항EGFR-CTLA-4 및 항EGFR-OKT3 다중특이성 항체 및 다중특이성 활성화 가능한 항체가 인간 EGFR에 특이적으로 결합하였다는 것이 밝혀졌다.
인간 Jagged 1-Fc(R&D 시스템즈(R&D Systems); 카탈로그 번호 1277-JG-050) 및 인간 EGFR(R&D 시스템즈, 카탈로그 번호 344-ER-050)을 96 웰 ELISA 플레이트의 상이한 웰에 흡착시켰다. 정제된 항Jagged-CTLA 및 항Jagged-OKT3, 항EGFR-CTLA 또는 항EGFR-OKT3 항체를 플레이트에 적용시키고, 결합할 수 있도록 하였다. 항인간 IgG-HRP 컨쥬게이트(Fab 특이, 시그마(Sigma): 미국 미주리주 세인트 루이스; 카탈로그 번호 A0293-1ML)를 이용하여 결합된 항체를 시각화하고, 발색성 기질 TMB로 현상시켰다.
도 12a 및 도 12b에 제시된 바와 같이, ELIS결합 실험을 통해 항Jagged-CTLA-4 및 항EGFR-CTLA-4가 인간 및 마우스 CTLA-4, 둘 모두에 특이적으로 결합하였다는 것이 밝혀졌다(항인간 CTLA-4 항체는 마우스 및 인간 CTLA-4, 둘 모두에 교차 반응한다): 인간 CTLA-4(R&D 시스템즈; 카탈로그 번호 325-CT-200/CF) 또는 마우스 CTLA-4(R&D 시스템즈, 카탈로그 번호 434-CT-200/CF) 중 하나를 별개의 96 웰 ELISA 플레이트의 웰에 부착시켰다. 정제된 항Jagged 4D11v2-CTLA-4, 항Jagged 활성화 가능한 항체 5342-1204-4D11v2-CTLA-4, 항EGFR C225v5-CTLA-4 또는 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-CTLA-4를 플레이트에 적용시키고, 결합할 수 있도록 하였다. 항인간 IgG-HRP 컨쥬게이트(Fab 특이, 시그마: 미국 미주리주 세인트 루이스; 카탈로그 번호 A0293-1ML)를 이용하여 결합된 항체를 시각화하고, 발색성 기질 TMB로 현상시켰다. 인간 CD3ε에 특이성인 항체-OKT3 융합체의 결합하지 못하는 무능력함에 의해 결합 특이성이 입증되었다.
실시예 3: CD3ε에의 OKT3 결합
도 13에 제시된 바와 같이, ELISA-결합 실험을 통해 항EGFR 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-OKT3 및 항Jagged 다중특이성 활성화 가능한 항체 5342-1204-4D11v2-OKT3이 인간 CD3ε에 특이적으로 결합한다는 것이 밝혀졌다. 인간 CD3ε(노보프로테인(NovoProtein), 카탈로그 번호 C578)을 96 웰 ELISA 플레이트의 웰에 부착시켰다. 정제된 항EGFR 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-CTLA-4, 항EGFR 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-OKT3, 항Jagged 다중특이성 활성화 가능한 항체 5342-1204-4D11v2-CTLA-4, 또는 항Jagged 다중특이성 활성화 가능한 항체 5342-1204-4D11v2-OKT3을 플레이트에 적용시키고, 결합할 수 있도록 하였다. 항인간 IgG-HRP 컨쥬게이트(Fab 특이, 시그마: 미국 미주리주 세인트 루이스; 카탈로그 번호 A0293-1ML)를 이용하여 결합된 항체를 시각화하고, 발색성 기질 TMB로 현상시켰다.
실시예 4: 다중특이성 활성화 가능한 항체의 프로테아제 활성화
활성화
다중특이성 항체 및 다중특이성 활성화 가능한 항체를 PBS 중에서 최종 농도 0.8 mg/ml로 희석시켰다. 재조합 인간 uPA(R&D 시스템즈, 카탈로그 1310-SE)를 최종 농도 700 nM으로 첨가하고, 37℃에서 ~20 h 동안 인큐베이션시켰다. 하기 기술되는 바와 같이 SDS-PAGE 분석을 위해 분해물 분취물을 제거하고, 제조하고, 결합 ELISA 검정법으로 분석하기 위해 PBS; 0.05% 트윈 20 및 10 mg/mL 우혈청 알부민 중에서 100 nM으로 희석시켰다.
PAGE를 위해, 샘플을 1xLDS 샘플 완충체 중에서 70℃에서 10 min 동안 변성시키고, TCEP를 최종 농도 40 mM으로 첨가한 후, 전기영동시켰다. 6 ㎍의 항체를 NuPAGE 10% 비스-트리스 겔(인비트로겐) 상에 로딩시키고, MOPS 전기영동 완충제를 사용하여 크기에 의해 단백질을 분리하였다. 전기영동 후, 겔을 쿠마시 블루(Coomassie blue)로 염색시키고, 결과는 도 14a-14b에 제시되어 있다. uPA 존재 하에서의 항EGFR 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5, 항EGFR 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-CTLA-4, 항Jagged 활성화 가능한 항체 5342-1204-4D11v2, 및 항Jagged 다중특이성 활성화 가능한 항체 5342-1204-4D11v2-CTLA-4 경쇄 이동도 변화는 다중특이성 활성화 가능한 항체의 단백질 분해 활성화를 입증한다. 중쇄 융합체의 임의의 이동도 변화 부족은 프로테아제 절단에 대한 저항성을 입증한다.
결합 검정법
도 15의 패널 a는 항EGFR 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-CTLA-4가 EGFR에 결합하였는데, ELISA에 의하면, C225v5(3 nM)또는 C225v5-CTLA-4(0.33 nM)에 비하여 더 낮은 친화도(Kd = 12.8 nM)로 결합하였다는 것을 보여주는 것이다. 그러나, 일단 uPA에 의해 활성화되고 나면, 항EGFR 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-CTLA-4는 C225v5 (0.21 nM) 및 C225v5-CTLA4(0.33 nM)와 비교하여 유사한 친화도(0.45 nM)로 EGFR에 결합하에 결합하였다. uPA는 중쇄의 카복실 말단에 융합된 항CTLA4 scFv를 절단하지 않았다는 점이 중요하다: 도 15의 패널 b에서 도시된 바와 같이, uPA 처리가 인간 CTLA4에의 결합에는 어떤 영향도 미치지 않았다.
유사하게, 항Jagged 다중특이성 활성화 가능한 항체 5342-1204-4D11v2-CTLA-4는 인간 Jagged 1에 결합하였는데, ELISA에 의하면, 4D11v2(0.44 nM) 또는 4D11v2-CTLA4(0.77 nM)에 비하여 더 낮은 친화도(15 nM)로 결합하였다. 일단 활성화되고 나면, 항Jagged 다중특이성 활성화 가능한 항체 5342-1204-4D11v2-CTLA-4는 4D11v2(0.54 nM) 및 4D11v2-CTLA4(0.92 nM)와 유사한 친화도로 인간 Jagged 1에 결합하였다(도 15, 패널 C). uPA 처리가 CTLA4 결합에는 어떤 영향도 미치지 않았다(도 15, 패널 d). ELIS결합 측정은 하기와 같이 수행하였다. 인간 Jagged 1-Fc(R&D 시스템즈; 카탈로그 번호 1277-JG-050), 인간 EGFR(R&D 시스템즈, Cat#344-ER-050) 또는 인간 CTLA4(R&D 시스템즈; 카탈로그 번호 325-CT-200/CF)를 96 웰 ELISA 플레이트의 웰 상에 흡착시켰다. 비처리된 항체 및 uPA 처리된 항체인 다중특이성 항체 또는 다중특이성 활성화 가능한 항체를 100 nM을 출발로 하여 3배 희석된 희석액을 플레이트에 적용시키고, 1시간 동안 플레이트 결합된 항원과 결합할 수 있도록 하였다. 결합 후, 항인간 IgG-HRP 컨쥬게이트(Fab 특이, 시그마: 미국 미주리주 세인트 루이스; 카탈로그 번호 A0293-1ML)를 이용하여 결합된 항체를 시각화하고, 발색성 기질 TMB로 현상시켰다.
실시예 5: 추가의 다중특이성 항체 및 다중특이성 활성화 가능한 항체 서열
본 실시예는 추가의 다중특이성 항체 및 다중특이성 활성화 가능한 항체의 서열을 제공한다.
Figure pct00043
Figure pct00044
각각 다중특이성 항체 또는 활성화 가능한 항체를 제조하기 위해 항체 또는 활성화 가능한 항체의 중쇄(HC) 또는 경쇄(LC)의 C 말단에 부착될 수 있도록 허용하는 장쇄의 링커를 포함하는 항체 OKT3m scFv.
Figure pct00045
Figure pct00046
각각 다중특이성 항체 또는 활성화 가능한 항체를 제조하기 위해 항체 또는 활성화 가능한 항체의 HC의 N 말단에 부착될 수 있도록 허용하는 단쇄의 링커를 포함하는 항체 OKT3m scFv.
Figure pct00047
다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-H-N 중쇄(항체 C225v5 HC의 N 말단에 부착된 항체 OKT3m)
Figure pct00048
Figure pct00049
다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-H-C 중쇄(항체 C225v5 HC의 C 말단에 부착된 항체 OKT3m)
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-L-C 경쇄(항체 C225v5 LC의 C 말단에 부착된 항체 OKT3m)
Figure pct00053
Figure pct00054
다중특이성 항체 C225v5(N297Q)-OKT3m-H-N 중쇄
Figure pct00055
Figure pct00056
다중특이성 항체 C225v5(N297Q)-OKT3m-H-C 중쇄
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
다중특이성 항체 C225v5(N297Q)-OKT3m-L-C 경쇄
Figure pct00060
Figure pct00061
항체 C225v5(N297Q) 중쇄
Figure pct00062
Figure pct00063
활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5 경쇄
Figure pct00064
Figure pct00065
경쇄 3954-1204-C225 플라스미드 및 중쇄 C225v5-OKT3m-H-N 플라스미드를 포함하는, 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N.
Figure pct00066
Figure pct00067
하기 표 11은 본 개시내용의 다중특이성 항체 또는 다중특이성 활성화 가능한 항체를 제조하기 위한 중쇄(HC) 및 경쇄(LC) 서열의 쌍 형성의 일례를 보여주는 것이다. 본원에서 사용되는 바, 경쇄를 언급하는 경우, C225v5를 포함하는 항체 경쇄는 또한 C225를 포함하는 경쇄로도 지칭된다.
Figure pct00068
실시예 6: 주르카트 T 세포 상의 CD3ε에의 다중특이성 항체의 결합
본 실시예는 본 개시내용의 다중특이성 항체의 T 세포에 결합할 수 있는 능력을 입증한다.
3가지 포맷의 다중특이성 항체를 시험하였다: (1) (T 세포 상의 CD3ε(이는 또한 본원에서 CD3ε 및 CD3으로도 지칭된다)에 결합하는) OKT3m scFv가 항EGFR 항체 C225v5의 중쇄의 N 말단에 부착되어 있는 다중특이성 항체인 C225v5-OKT3m-H-N; (2) OKT3m scFv가 항EGFR 항체 C225v5의 중쇄의 C 말단에 부착되어 있는 다중특이성 항체인 C225v5-OKT3m-H-C; 및 (3) OKT3m scFv가 항EGFR 항체 C225v5의 경쇄의 C 말단에 부착되어 있는 다중특이성 항체인 C225v5-OKT3m-L-C. 상기 다중특이성 항체의 아미노산 서열은, C225v5 및 OKT3 항체의 아미노산 서열과 같이 본원에 제공되어 있다. 이소형 대조군, 즉, 인간 IgG1 이소형 대조군, 엔조(Enzo), 카탈로그 ALX-804-133-C100 또한 시험하였다.
3개의 다중특이성 항체 포맷이 CD3ε 양성 주르카트 T 세포(이는 또한 본원에서 주르카트 세포 및 주르카트로도 지칭된다)에 결합할 수 있는지 여부를 측정하기 위해, 유세포 분석법 기반 검정법을 수행하였다. 주르카트 T 세포(클론 E6-1, ATCC, TIB-152)를 글루타맥스(GlutaMAX)™(라이프 테크놀러지즈(Life Technologies), 카탈로그 72400-120), 10% 열 불활성화된 우태아 혈청(HI-FBS: Heat Inactivated-Fetal Bovine Serum, 라이프 테크놀러지즈, 카탈로그 10438-026), 100 U/ml 페니실린, 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신(라이프 테크놀러지즈, 카탈로그 15140-122)을 포함하는 RPMI-1640(이는 또한 본원에서 완전 배지로 지칭된다) 중에서 ATCC의 가이던스에 따라 배양하였다. 원심분리(200xg, 4℃, 5 min)에 의해 세포를 수거하고, 2% HI-FBS를 포함하는 PBS(FACS 완충제) 중에 재현탁시켰다. 웰당 약 250,000개의 주르카트 세포를 96 웰 U 바닥 플레이트로 옮기고, 수거하고, 시험하고자 하는 항체 50 마이크로리터(이는 또한 본원에서 ㎕ 또는 ul로도 지칭된다) 중에 재현탁시켰다. 항체의 출발 농도는 다중특이성 항체의 경우, 100 nM이고, 이소형 대조군의 166.7 nM이었고, 이어서, 각 항체에 대하여 총 8개의 농도로 5배로 일련으로 희석시켰다.
세포 및 항체를 약 1시간 동안 진탕시키면서 4℃에서 인큐베이션시키고, 수거하고, 200 ㎕의 FACS 완충제로 3회에 걸쳐 세척하였다. 생성된 주르카트 세포를 50 ㎕의 알렉사플루오르® 647 컨쥬게이트된 항인간 IgG(H+L)(잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch), 카탈로그 709-606-149) 중에 재현탁시키고, 약 30 min 동안 진탕시키면서 4℃에서 인큐베이션시켰다. 생성된 주르카트 세포를 수거하고, 200 ㎕의 FACS 완충제로 3회에 걸쳐 세척하고, 2.5 ㎍/ml 7-AAD(BD 파르미겐(BD Pharmigen), 카탈로그 559925)를 포함하는 최종 부피 150 ㎕의 FACS 완충제 중에 재현탁시켰다. 샘플를 BD 어큐리 C6(BD Accuri C6) 유세포 분석기(BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences)) 상에 분석하고, 플로우조(FlowJo) V10(트리스타(Treestar))를 이용하여 생존가능한 세포의 정중 형광 강도(MFI: median fluorescence intensity)를 계산하였다. 7-AAD 염색은 전방 측방 산란 게이트가 생존가능한 T 세포를 확인는 데 충분하였다는 것을 보여주었다. EC50 값은 그래프패드 프리즘 6(GraphPad Prism 6)에서 데이터를 로그(효능제) 대 반응(3개의 파라미터)으로 곡선 피팅하여 계산하였다.
도 16a는 3개의 다중특이성 항체 포맷이 모두 주르카트 T 세포에 결합하였으며, EC50 값은 한 자릿수의 nM 내지 nM 이하인 범위인 것을 입증하는 것이다.
실시예 7: 다중특이성 항체는 CD3ε 발현 T 세포 및 재조합 인간 EGFR에 결합한다.
본 실시예는 T 세포 및 표적 항원 함유 세포, 둘 모두에 결합할 수 있는(이는 또한 본원에서 공동 결합으로 지칭된다) 본 개시내용의 다중특이성 항체의 능력을 입증한다.
다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-H-N, C225v5-OKT3m-H-C, 또는 C225v5-OKT3m-L-C가 CD3ε 양성 주르카트 T 세포 및 EGFR에 결합할 수 있는지 여부를 측정하기 위해, 유세포 분석법 기반 검정법을 수행하였다. 주르카트 세포를 포화 농도의 다중특이성 항체로 전처리한 후, 비오티닐화된 EGFR로 적정하고, 스트렙트아비딘, R-피코에리트린 컨쥬게이트(SAPE: Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate)로 검출하였다. 이소형 대조군, 즉, 인간 IgG1 이소형 대조군, 엔조, 카탈로그 ALX-804-133-C100 또한 시험하였다.
주르카트 세포를 본원에 기술된 바와 같이 배양하고, 수거하였다. 웰당 약 500,000개의 주르카트 세포를 U 바닥 플레이트로 옮기고, 수거하고, 50 ㎕의 40 nM 다중특이성 항체 또는 67 nM 이소타입 항체 중에 재한탁시켰다. 세포를 약 1시간 동안 진탕시키면서 4℃에서 인큐베이션시키고, 수거하고, 200 ㎕의 FACS 완충제로 3회에 걸쳐 세척하였다. (본 개시내용의 다중특이성 항체에 결합하는) 생성된 주르카트 세포를 50 ㎕의 비오티닐화된 재조합 인간 EGFR 단백질(앱캠(Abcam), 카탈로그 ab168702)에 출발 농도를 약 290 nM으로 하여 총 8개의 농도로 5배로 일련으로 희석시켜 재현탁시켰다. 세포를 약 1시간 동안 진탕시키면서 4℃에서 인큐베이션시키고, 수거하고, 200 ㎕의 FACS 완충제로 3회에 걸쳐 세척하였다. 생성된 주르카트 세포를 50 ㎕ 10 ㎍/ml 스트렙트아비딘, R-피코에리트린 컨쥬게이트(라이프 테크놀러지즈, S866) 중에 재현탁시키고, 약 1시간 동안 진탕시키면서 4℃에서 인큐베이션시켰다. 세포를 수거하고, 200 ㎕ FACS 완충제로 1회 세척하고, 150 ㎕ FACS 완충제 중에 재현탁시켰다. 본원에 기술된 바와 같이 샘플을 BD 어큐리 C6 상에서 분석하고, MFI를 계산하였다. EC50 값은 본원에 기술된 바와 같이 그래프패드 프리즘 6에서 계산하였다.
도 16b는 3개의 다중특이성 항체 포맷 모두가 T 세포 상의 CD3ε에의 동시 결합을 필요로 한, 농도 의존성 EGFR 결합을 보였다는 것을 입증하는 것이다. EC50 값은 nM 이하 내지 한 자릿수의 nM 범위였다.
실시예 8: 다중특이성 항체에 의한 T 세포의 표적 의존성 활성화
본 실시예는 표적 의존성 방식으로 T 세포를 활성화시킬 수 있는 본 개시내용의 다중특이성 항체의 능력을 입증한다.
다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-H-N, C225v5-OKT3m-H-C, 또는 C225v5-OKT3m-L-C에 의한 주르카트 T 세포 및 EGFR-양성 표적 세포의 공동 인게이징이 주르카트 세포의 활성화를 유도할 수 있는지 여부를 측정하기 위하여, 유세포 분석법 기반 검정법을 사용하였다. 주르카트 세포 및 CFSE 표지화된 표적 세포를 약 15 h 동안 공동 배양하고, 염색하여 조기 T 세포 활성화 마커인, CD69의 표면 발현에 대해 T 세포 활성화를 평가하였다.
SW480 세포로도 또한 지칭되는 EGFR-양성 SW480 세포(ATCC, 카탈로그 CCL-228) 및 U266 세포로도 또한 지칭되는 EGFR 음성 U266 세포(ATCC, 카탈로그 TIB-196)를 각각 글루타맥스™, 10% HI-FBS, 100 U/ml 페니실린, 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신을 포함하는 RPMI-1640(이는 완전 배지로 지칭된다) 중에서 ATCC의 가이던스에 따라 배양하였다. 상기 표적 세포를 수거하고, PBS로 1회에 걸쳐 세척하고, PBS 중에 2x106개의 세포/ml로 재현탁시켰다. 5 mM CFSE 스톡(라이프 테크놀러지즈, 셀트레이스™ CFSE 셀 프로리러페이션 키트(CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit), 카탈로그 C34554)을 DMSO 중에서 제조하고, PBS 중에서 30 nM으로 희석시켰다. PBS/CFSE 작업용 스톡을 즉시 사용하였다. 동량의 표적 세포 및 CFSE 스톡을 최종 CFSE 농도 15 nM 및 최종 세포 밀도 1x106개의 세포/ml로 조합하였다. 세포를 37℃에서 15 min 동안 인큐베이션시켰다. 동량의 HI-FBS를 첨가하여 표지화를 켄칭하였다. 인큐베이션된 표적 세포를 수거하고, 완전 배지로 1회에 걸쳐 세척하고, 완전 배지 중에 5x105개의 세포/ml로 재현탁시켰다. 웰당 50 ㎕의 세포 현탁액을 웰당 총 25,000개의 표적 세포로 96 웰 평평한 바닥 플레이트에 첨가하였다.
주르카트 T 세포를 본원에 기술된 바와 같이 배양하였다. 주르카트 세포를 수거하고, 완전 배지 중에 1x106개의 세포/ml로 재현탁시키고, 웰당 50 ㎕의 세포 현탁액을 웰당 총 50,000 주르카트 세포로 표적 세포를 함유하는 평평한 바닥 플레이트에 첨가하였다. 효과기 T 세포 대 표적 세포의 비율은 2:1이었다.
3회에 걸쳐 농축된 항체 스톡을 완전 배지 중에서 제조하였다. 최고 농도는 각 다중특이성 항체 포맷의 경우, 1.2 nM이고, OKT3(바이오레젼드(BioLegend), 카탈로그 317304), C225v5(그의 아미노산 서열은 본원에 제공되어 있다), 및 이소형 대조군 항체의 경우, 1.5 nM이었다. 각 항체에 대하여 총 8개의 농도로 완전 배지 중에서 5배의 일련의 희석액을 제조하였다. 각 다중특이성 항체 포맷의 경우, 출발 농도를 400 pM으로 하여, 또는 OKT3, C225v5, 및 이소타입 항체 각각의 경우, 출발 농도를 500 pM으로 하여 모든 스톡을 3배로 희석시켜, 웰당 50 ㎕의 항체를 T 세포 및 표적 세포를 함유하는 평평한 바닥 플레이트에 첨가하였다.
약 15 h 경과 후, 세포를 U 바닥 플레이트로 옮기고, 수거하였다. 회수율을 최대화시키기 위해, 세포 배양 플레이트를 150 ㎕ FACS 완충제로 세척하고, 세액을 U 바닥 플레이트로 옮겨 놓았다. 세포를 수거하고, 50 ㎕ 항CD69 PE 컨쥬게이트된 항체(BD 바이오사이언시즈, 카탈로그 555531, 제조사의 권고 농도로 사용) 중에 재현탁시키고, 4℃에서 1 h 동안 진탕시키면서 염색시켰다. 세포를 200 ㎕ FACS 완충제로 1회에 걸쳐 세척하고, 최종 부피 150 ㎕ 중에 재현시켰다. 단일 색상 대조군을 사용하여 BD 어큐리 C6 상에서 보정하였다. 10,000개의 세포를 전방 측장 산란기에서 수집하고, 플로우조를 이용하여 CFSE 음성 게이트 및 MFI를 계산하였다. EC50 값은 본원에 기술된 바와 같이 그래프패드 프리즘 6에서 계산하였다.
도 17은 pM 농도 이하의 농도를 시작으로 입증된 바, 가장 강력한 CD69 활성화는 주르카트 T 세포 및 EGFR-양성 SW480 세포, 둘 모두의 존재 하에서 공동 배양된 각 다중특이성 항체 포맷에 의존한다는 것을 입증한다. 대조적으로, EGFR 음성 U266 세포와 함께 공동 배양하여 유도된 T 세포 활성화는 유의적으로 덜 효과적이었고, 이는 EGFR 양성 세포에 의해 유도된 활성화와 비교하여 최대 CD69 유도는 75% 감소 및 nM 이하의 EC50 값을 보였다. U266 세포가 사용되었을 때와 같이, 다중특이성 항체의 EGFR 비의존적 활성화는 OKT3 항체의 것과 유사하였고, C225v5 및 이소형 대조군 항체의 경우, 무시해도 될 정도의 CD69 염색이 관찰되었다.
실시예 9: 다중특이성 항체에 의한 일차 CD8 + T 세포의 표적 의존성 활성화
본 실시예는 일차 CD8 양성(CD8+) T 세포를 활성화시킬 수 있는 본 개시내용의 다중특이성 항체의 능력을 입증한다.
다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-H-N, C225v5-OKT3m-H-C, 또는 C225v5-OKT3m-L-C가 일차 인간 CD8+ T 세포의 EGFR 의존성 활성화를 매개할 수 있는지 여부를 측정하기 위하여, 유세포 분석법 기반 검정법을 수행하였다. 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC: human peripheral blood mononuclear cell)로부터 유래된 CD8+ T 세포 및 DDAO-SE 표지화된 표적 세포를 밤새도록 공동으로 배양하고, 조기 활성화 마커인, CD69에 대해 염색하여 활성화를 평가하였다.
EGFR-양성 SW480 세포를 배양하고, 본원에 기술된 바와 같이 표지화하되, 단, 하기를 예외로 하였다: (1) SW480 표적 세포를 셀트레이스™ 파레드(CellTrace™ FarRed) DDAO-SE(라이프 테크놀러지즈, 카탈로그 C34553)로 표지화하였고, (2) 완전 배지를 25 U/ml IL-2(R&D 시스템즈, 카탈로그 202-IL-050/CF)로 보충하였다. 웰당 총 25,000개의 표적 세포를 위해 웰당 50 ㎕의 표적 세포 현탁액(5x105개의 세포/ml)을 96 웰, 평평한 바닥 플레이트에 첨가하였다.
신선한 정상적인 말초 혈액 CD8+ 세포독성 T 세포(올셀즈(AllCells), 카탈로그 PB009-3)를 올셀즈(미국 캘리포니아주 알라메다)로부터 입수하고, 원심분리(200xg, RT, 15 min)에 의해 수거하고, 25 U/ml IL-2로 보충된 완전 배지 중에 1.5x106개의 세포/ml로 재현탁시켰다. 웰당 총 약 75,000개의 CD8+ 세포독성 T 세포 및 3:1 비율의 T 세포 대 표적 세포를 위해 표적 세포를 함유하는 평평한 바닥 플레이트에 웰당 50 ㎕의 세포 현탁액을 첨가하였다.
25 U/ml IL-2로 보충된 완전 배지 중에서 3회 농축된 항체 스톡을 제조하였다. 최고 농도는 600 pM이었고, 이어서, 각 항체에 대하여 총 8개의 농도로 5배로 일련으로 희석시켰다. CD8+ 세포 및 표적 세포를 함유하는 평평한 바닥 플레이트에 웰당 50 ㎕의 항체를 첨가하고, 출발 농도를 200 pM으로 하여 모든 스톡을 3배로 희석시켰다.
밤새도록 인큐베이션시킨 후, 본원에 기술된 발광성 세포독성 검정법을 위해 평평한 바닥 플레이트를 원심분리시키고, 100 ㎕의 상청액을 제거하였다. 남은 상청액을 U 바닥 플레이트로 옮기고, 평평한 바닥 플레이트 중의 세포를 0.25% 트립신(라이프 테크놀러지즈, 카탈로그 25200-056)으로 분리시켰다. 3 부피의 FACS 완충제를 첨가하여 트립신 활성을 켄칭시키고, 세포 현탁액을 U 바닥 플레이트로 옮겼다. 수거한 후, 세포를 50 ㎕의, 항CD69 PE/항CD8 FITC 칵테일(항CD8 FITC, BD 바이오사이언시즈, 카탈로그 561948), FITC 이소형 대조군(BD 바이오사이언시즈, 카탈로그 340755), 또는 PE 이소형 대조군(BD 바이오사이언시즈, 카탈로그 340761) 중 하나에서 재현탁시켰다. 모든 항체는 제조사가 권고하는 농도로 사용하였다. 세포를 4℃에서 1 h 동안 진탕시키면서 염색시키고, 수거하고, 2.5 ㎍/ml 7-AAD를 포함하는 최종 부피 150 ㎕의 FACS 완충제 중에 재현탁시켰다. 단일 색상 대조군을 사용하여 BD 어큐리 C6 상에서 보정하고, 고정 부피의 세포 현탁액을 수집하였다. CD8+ 세포에 대한 게이팅은 표적 세포와 생존가능한 T 세포를 구별하는 데 충분하였다. 활성화는 PE 이소형 대조군 이상으로 CD69를 발현하는 T 세포의 비율(%)로서 정량화하였다.
도 18a는 3개의 다중특이성 항체 포맷 모두가 한 자릿수의 pM EC50 값인, 일차 CD8+ T 세포의 농도 의존성 활성화를 입증하였다. OKT3, C225v5, 또는 인간 IgG1 이소형 대조군(엔조) 항체로 처리한 결과, CD69는 무시해도 될 정도로 유도되었다.
실시예 10: 다중특이성 항체에 의한 표적 세포의 표적 의존성 사멸
본 실시예는 T 세포 지정 표적 의존성 세포 용해를 유도할 수 있는 본 개시내용의 다중특이성 항체의 능력을 입증한다.
다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-H-N, C225v5-OKT3m-H-C, 또는 C225v5-OKT3m-L-C가 T 세포 지정 표적 의존성 세포 용해를 유도할 수 있는지 여부를 측정하기 위해, SW480 세포를 본원에 기술된 바와 같이 3:1의 효과기 대 표적 세포 비율로 CD8+ T 세포와 함께 공동 배양하였다. 밤새도록 인큐베이션시킨 후, 100 ㎕의 막 완전성을 상실한 후, 이어서 세포용해가 이루어지는 세포에 의해 방출되는 세포에 의해 방출되는 프로테아제의 활성을 측정하기 위해 발광성 펩티드 기질을 사용하는 제조사의 프로토콜(사이토톡스-글로™ 사이토톡시티 어세이(CytoTox-Glo™ Cytotoxicity Assay), 카탈로그 G9292, 프로메가(Promega))에 따라 세포독성과 관련된 뚜렷한 프로테아제 활성에 대하여 백색 벽 96 웰 플레이트(가르니에 바이오 원(Greiner Bio One) 카탈로그 655098)에서 검정하였다. 표적 세포의 다중특이성 항체 의존성 세포독성은 비처리된 값의 배경 감산 후에 발광으로 표현하였고, 프리즘(Prism)에서 곡선 피팅 분석하여 로그(효능제) 대 반응(3개의 파라미터)으로 플롯팅하였다.
도 18b는 3개의 다중특이성 항체 포맷은 모두 SW480 세포의 T 세포 매개 사멸을 유도하였다는 것을 입증한다. 예상대로, OKT3 항체 단독의 것은 SW480 세포의 검출가능한 정도의 사멸을 보이지 않았고, 이는 다중특이성 항체에 의한 효과적인 세포독성을 위해서는 CD3 및 종양 표적, 둘 모두의 공동 인게이징이 필요하다는 것을 제안하는 것이다.
실시예 11: 다중특이성 항체에 의한 표적 의존성 T 세포 활성화 및 표적 세포의 사멸
본 실시예는 CD8+ T 세포의 T 세포 지정 표적 의존성 활성화 및 표적 세포의 사멸을 유도할 수 있는 본 개시내용의 다중특이성 항체의 능력을 입증한다.
관찰된 T 세포 활성화가 표적 세포에 의한 EGFR 발현에 의존하는지 여부를 측정하기 위해, CFSE 표지화된 EGFR-양성 SW480 세포 또는 EGFR 음성 U266 세포를 각각 상기 기술된 바와 같이 200 pM을 출발로 하여 5배 희석된, 다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-H-N 또는 OKT3의 존재 하에서 인간 CD8+ T 세포와 함께 공동 배양하였다. 본원에 기술된 방법을 사용하여 T 세포로부터 표적 세포를 구별하기 위해 표적 세포(30 nM)의 CFSE 표지화를 사용하였다. 냉동된 정상 말초 혈액 CD8+ 세포독성 T 세포(올셀즈, 카탈로그 PB009-3F)를 제조사가 지시한 바와 같이 해동시켰다. 밤새도록 인큐베이션시킨 후, T 세포(CFSE 음성 세포)를 본원에 기술된 바와 같이 조기 활성화 마커인 CD69의 표면 발현에 대해 검정하였다. 간략하면, 세포를 검정용 플레이트로부터 제거하고, 트립신(라이프 테크놀러지즈)을 이용하여 부착성 세포를 제거하고, FACS 완충제로 세포를 1회에 걸쳐 세척하였다. 세포를 1시간 동안 항CD69-PE(BD 바이오사이언시즈)로 염색하였다. 세포를 세척하고, 세포 표면 CD69 발현에 대하여 BD 어큐리 C6 상에서 분석하였다. 본원에 기술된 바와 같이 MFI 값을 계산하였다. 결과는 FCS 익스프레스(FCS Express) 분석용 소프트웨어를 이용하여 이소형 대조군 이상으로 CD69를 발현하는 T 세포의 비율(%)로서 표현하고, 프리즘에서 곡선 피팅 분석하여 로그(효능제) 대 반응(3개의 파라미터)으로 플롯팅하였다.
도 18c에 제시된 바와 같이, 다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-H-N은 SW480 세포의 존재 하에서 pM 농도 이하의 농도에서 강력한 T 세포 활성화, 및 U266 세포에 의해서는 심지어 SW480 세포와 함께 사용된 농도보다 3 로그 더 높은 더 큰 농도에서도 단지 최소의 T 세포 활성화를 입증하였다. OKT3 항체는 최소의 T 세포 활성화를 보였다. 상기 결과는 효과적인 T 세포 활성화는 표적 세포의 EGFR 발현에 의존한다는 것을 입증하였다.
표적 세포 사멸을 위한 EGFR 발현의 의존을 측정하기 위해 SW480 또는 U266 세포와 함께 공동 배양된 100 ㎕의 T 세포 상청액을 세포독성과 관련된 프로테아제 활성에 대하여 측정하였다(사이토톡스-글로, 프로메가). U266 반응을 제시하기 위해 배경 감산을 수행하지 않고 결과를 발광으로 표현하고, 프리즘에서 분석 로그(효능제) 대 반응(3개의 파라미터)을 피팅하는 곡선으로 플롯팅하였다.
도 18d는 다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-H-N이 pM 농도 이하의 농도에서 EGFR을 발현하는 SW480 세포의 세포독성을 유도하지만, EGFR 음성 U266 세포의 인식가능한 정도의 사멸은 검출되지 않았다는 것을 도시하는 것이다. OKT3 항체는 또한 SW480 또는 U266 세포의 어떤 인식가능한 정도의 사멸도 보이지 않았다.
실시예 12: T 세포에 인게이징하여 EGFR을 발현하는 세포주 패널을 사멸시킬 수 있는 다중특이성 항체의 능력
본 실시예는 T 세포에 인게이징하여 EGFR을 발현하는 세포주 패널을 사멸시킬 수 있는 본 개시내용의 다중특이성 항체의 능력을 입증한다.
다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-H-N이 추가의 EGFR을 발현하는 세포주의 세포독성을 유도할 수 있는지 여부를 측정하기 위해, 인간 CD8+ T 세포를 하기 EGFR을 발현하는 세포주와 함께 5:1 효과기 대 표적 비율로(단, 예외적으로, U266 세포는 96 웰 평평한 바닥 플레이트에서 3:1 비율로 배양하여 사용하였다) 및 다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-H-N의 적정으로 백색 벽 96 웰 플레이트 중 RPMI-1640, 2% 인간 혈청에서 공동 배양하였다: HEK-293, HCT-15, HCT 116, Hs 766T, HT-29, NCI-H2405, SW480, SK-OV-3, 및 EGFR 음성 세포주인 U266(모든 세포주는 ATCC로부터 입수). 항EGFR 항체 C225v5(200 pM)를 음성 대조군으로서 사용하였다. 밤새도록 인큐베이션시킨 후, 사이토톡스-글로™ 사이토톡시티 어세이의 발광성 펩티드 기질을 직접 플레이트(150 ㎕의 상청액)에 첨가하여 방출된 프로테아제의 활성을 측정하였고, 단, 예외적으로, U266 샘플의 경우, 100 ㎕의 U266 상청액을 사용하여 프로테아제 활성에 대해 검정하였다. 결과는 비처리된 값의 배경 감산 후에 발광으로 표현하였고, 프리즘에서 곡선 피팅 분석하여 로그(효능제) 대 반응(3개의 파라미터)으로 플롯팅하였다.
도 19는 다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-H-N으로 처리된 EGFR을 발현하는 세포주는 모두 CD8+ T 세포의 존재 하에서 용량 의존성 세포독성을 보였다는 것을 입증하는 것이다. 대조적으로, EGFR 음성 U266 세포는 다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-H-N에 의해 어떤 영향도 받지 않은 상태 그대로 유지되었다. 200 pM의 항EGFR 항체 C225v5로 처리된 세포주 중 어느 것도 그의 EGFR 발현과는 상관없이 세포독성에 관한 어떤 증거도 보이지 않았다.
실시예 13: 다중특이성 활성화 가능한 항체에 의한 EGFR 결합 약화
본 실시예는 본 개시내용의 다중특이성 항체에 의한 EGFR 결합과 비교하여 본 개시내용의 다중특이성 활성화 가능한 항체에 의한 EGFR 결합이 약화되었음을 입증한다. 본 실시예는 또한 프로테아제 절단가능한 모이어티를 포함하는 다중특이성 활성화 가능한 항체의 EGFR 결합이 상기 프로테아제에 의한 다중특이성 활성화 가능한 항체의 절단시에 회복된다는 것을 입증한다.
다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, 활성화된 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, 및 다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-H-N을 EGFR을 발현하는 SW480 세포에 결합할 수 있는 그의 능력에 대하여 시험하였다.
다중특이성 활성화 가능한 항체의 활성화를 하기와 같이 수행하였다: 활성 부위 적정된 마트립타제(본원에서 MT-SP1 및 MTSP1로 지칭; R&D 시스템즈로부터 입수, 카탈로그 3946-SE-010)를 100 nM의 최종 농도로 첨가하여 PBS 중 825 ㎍의 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N을 절단하였다. 분해물을 37℃ 밤새도록 인큐베이션시키고, 모세관 전기영동 분석(GX-II 캐필러리 일렉트로포레시스(GX-II GX-II Capillary Electrophoresis), 퍼킨 엘머(Perkin Elmer))을 위해 분취량을 제거함으로써 절단을 확인하였다. 프로테인 A 정제에 의해 프로테아제 및 절단된 마스킹 모이어티를 제거하였다. 간략하면, PBS를 이용하여 분해된 샘플을 2 ml로 희석시키고, 평형화된 Mab셀렉트 슈레(MabSelect SuRe)™ 비드(GE 헬쓰케어 라이프 사이언시즈(GE Healthcare Life Sciences), 제품 11-0026-01 AD) 상에 로딩하였다. 비드를 5 칼럼 부피(CV: column volume)의 1xPBS로 세척한 후, 5% 이소프로필 알콜(IPA: isopropyl alcohol)로 보충된 5 CV의 5xPBS로 세척하고, 최종적으로 5 CV의 1xPBS로 세척하였다. 항체를 10 CV의 0.1 M 글리신(pH 3.0)으로 용리시키고, 분획을 1 M 트리스(pH 8.0)로 중화시키고, 풀링하고, 농축시키고, 완충제를 PBS로 교체하였다.
EGFR을 발현하는 SW480 세포를 세포 해리 완충제(시그마, 카탈로그 C5789)로 제거하고, 세척하고, FACS 완충제 중 1000 nM의 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, 활성화된 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, 다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-H-N, 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5, 또는 항체 C225v5의 5배 희석된 희석액과 함께 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 FACS 완충제로 3회에 걸쳐 세척하고, FACS 완충제 중에서 2차 항체, 즉, 항인간 Fc감마 특이 AF488(잭슨 이뮤노리서치 카탈로그 109-546-098)과 함께 1:400으로 얼음 상에서 인큐베이션시켰다. 세포를 FACS 완충제로 3회에 걸쳐 세척하고, AF488의 MFI를 BD 어큐리(BD 바이오사이언시즈) 유세포 분석기 상에서 판독하였다. 오직 이차 항체 대조군만을 포함하는 샘플의 MFI를 실험상 MFI로부터 감산하고, 프리즘에서 곡선 피팅 분석하여 로그(효능제) 대 반응(3개의 파라미터)으로 플롯팅하였다.
도 20a는 다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-H-N에 의한 EGFR 결합과 비교하여 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N에 의한 EGFR 결합이 약화되었지만, 다중특이성 활성화 가능한 항체의 EGFR 결합은 마트립타제에 의한 다중특이성 활성화 가능한 항체의 프로테아제 절단시에는 완전하게 회복되었다는 것을 입증한다. 도 20b는 항체 C225v5에 의한, 및 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5에 의한 EGFR 결합이 각각 다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-H-N 및 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N에 의한 EGFR 결합과 유사하였다는 것을 보여주는 것이며, 이는 다중특이성 포맷에 존재하는 항CD3ε 모이어티는 다중특이성 항체 또는 다중특이성 활성화 가능한 항체 중 어느 하나의 EGFR 결합 프로파일을 변경시키지 않았다는 것을 입증하는 것이다.
실시예 14: CD3 + T 세포에 결합할 수 있는 다중특이성 활성화 가능한 항체의 능력
본 실시예는 본 실시양태 모두인 다중특이성 활성화 가능한 항체, 활성화된 다중특이성 활성화 가능한 항체, 및 다중특이성 항체는 각각 CD3+ T 세포에 결합할 수 있다는 것을 입증한다.
CD3ε 결합은 항EGFR 다중특이성 활성화 가능한 항체의 EGFR 결합 부위의 마스킹에 영향을 받는지 여부를 측정하기 위해, 본원에 기술된 바와 같이 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, 활성화된 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, 및 다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-H-N을 이용하여 주르카트 T 세포 결합 검정법을 수행하였다. 주르카트 세포를 FACS 완충제 중 1000 nM의 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, 마트립타제 활성화된 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, 또는 다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-H-N의 5배 희석된 희석액과 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 3회에 걸쳐 세척하고, 2차 항체, 즉, 항인간 Fc감마 특이 AF488(잭슨 이뮤노리서치)과 함께 1:400으로 인큐베이션시켰다. 세포를 3회에 걸쳐 세척하고, AF488의 MFI를 BD 어큐리(BD 바이오사이언시즈) 유세포 분석기 상에서 판독하였다. 오직 이차 항체 대조군만을 포함하는 샘플의 MFI를 실험상 MFI로부터 감산하고, 프리즘에서 곡선 피팅 분석하여 로그(효능제) 대 반응(3개의 파라미터)으로 플롯팅하였다.
도 21a는 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N 및 다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-H-N이 주르카트 T 세포에 대하여 등가인 결합을 보였다는 것을 입증한다. 도 21b는 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N and 활성화된 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N이 주르카트 T 세포에 대하여 등가인 결합을 보였다는 것을 입증한다. 본 결과는 다중특이성 활성화 가능한 항체의 EGFR 결합 모이어티의 마스킹이 T 세포에 인게이징할 수 있는 다중특이성 활성화 가능한 항체의 능력에는 영향을 미치지 않는다는 것을 시사한다.
실시예 15: 다중특이성 활성화 가능한 항체에 의한 표적 의존성 T 세포 활성화
본 실시예는 본 개시내용의 다중특이성 항체에 의해 나타나는 활성화와 비교하여 본 개시내용의 다중특이성 활성화 가능한 항체의 표적 의존성 T 세포 활성화가 약화되었다는 것을 입증한다. 본 실시예는 또한 프로테아제 절단가능한 모이어티를 포함하는 다중특이성 활성화 가능한 항체에 의한 표적 의존성 T 세포 활성화가 상기 프로테아제에 의한 다중특이성 활성화 가능한 항체의 절단시에 회복된다는 것을 입증한다.
항EGFR 다중특이성 활성화 가능한 항체의 EGFR 결합 부위의 마스킹이 표적 의존성 T 세포 활성화를 약화시키는지 여부를 측정하기 위해, 및 다중특이성 활성화 가능한 항체의 프로테아제 활성화가 활성화를 회복시키는지 여부를 측정하기 위해, 본원에 기술된 바와 같이 주르카트 활성화 검정법을 수행하여, 본원에 기술된 바와 같이, 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, 활성화된 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, 다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-H-N, 항EGFR 항체 C225v5, 및 시나기스(Synagis)(메디이뮨(Medimmune)) 이소형 대조군을 시험하였다.
도 22는 EGFR을 발현하는 SW480 세포와 함께 공동 배양된 주르카트 T 세포의 CD69 유도에 의해 측정된 바, 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N에 의한 EGFR 의존성 활성화는 다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-H-N에 ? 나타난 EGFR 의존성 활성화와 비교하였을 때 약화되었다는 것을 입증한다. 본 도면은 또한 다중특이성 활성화 가능한 항체에 의한 EGFR 의존성 활성화가 마트립타제에 의한 다중특이성 활성화 가능한 항체의 프로테아제 절단시에 완전하게 회복되었다는 것을 나타낸다. 항EGFR C225v5 및 이소형 대조군 항체, 어느 것도 T 세포의 활성화를 나타내지 않았다.
실시예 16: 다중특이성 활성화 가능한 항체에 의한 표적 의존성 T 세포 활성화 및 표적 세포의 사멸
본 실시예는 본 개시내용의 다중특이성 항체에 의하 나타난 활성과 비교하여 본 개시내용의 다중특이성 활성화 가능한 항체에 의한 표적 의존성 T 세포 활성화 및 표적 세포의 사멸이 약화되었음을 입증한다. 본 실시예는 또한 프로테아제 절단가능한 모이어티를 포함하는 다중특이성 활성화 가능한 항체의 표적 의존성 T 세포 활성화 및 표적 세포의 사멸이 상기 프로테아제에 의한 다중특이성 활성화 가능한 항체의 절단시에 회복된다는 것을 입증한다.
항EGFR 다중특이성 활성화 가능한 항체의 EGFR 결합 부위의 마스킹이 표적 의존성 활성화를 약화시키는지 여부를 측정하기 위해, 및 다중특이성 활성화 가능한 항체의 프로테아제 활성화가 활성화를 회복시키는지 여부를 측정하기 위해, 본원에 기술된 바와 같이 주르카트 활성화 검정법을 수행하여, 본원에 기술된 바와 같이, 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, 활성화된 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, 다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-H-N, 항CD3ε 항체 OKT3, 항EGFR 항체 C225v5, 및 이소형 대조군을 시험하였다.
항EGFR 다중특이성 활성화 가능한 항체의 EGFR 결합 부위의 마스킹이 세포독성에 미치는 영향, 및 활성화된 다중특이성 활성화 가능한 항체의 세포독성 활성을 회복시킬 수 있는 프로테아제 활성화의 능력을 측정하기 위해, EGFR을 발현하는 SW480 세포를 T 세포와 함께 5:1 효과기 대 표적 세포 비율로 200 pM을 출발로 하여 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, 활성화된 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N, 또는 다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-H-N의 5배 희석된 일련의 희석액을 이용하여 공동 배양하였다. 200 pM의 OKT3, C225v5, 및 이소형 대조군 시나기스(메디이뮨) IgG1 항체를 대조군으로서 사용하였다. 밤새도록 인큐베이션시킨 후, 100 ㎕의 상청액을 백색 벽 96 웰 플레이트에서 세포독성과 관련된 뚜렷한 프로테아제 활성에 대하여 검정하였다(사이토톡스-글로, 프로메가). 결과는 비처리된 값의 배경 감산 후에 발광으로 표현하였고, 프리즘에서 곡선 피팅 분석하여 로그(효능제) 대 반응(3개의 파라미터)으로 플롯팅하였다.
도 23a는 EGFR을 발현하는 SW480 세포와 함께 공동 배양된 일차 T 세포의 CD69 유도에 의해 측정된 바, 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N에 의한 EGFR 의존성 활성화가 다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-H-N에 의해 나타난 EGFR 의존성 활성화와 비교하여 약화되었음을 입증한다. 본 도면은 또한 다중특이성 활성화 가능한 항체에 의한 EGFR 의존성 활성화가 마트립타제에 의한 다중특이성 활성화 가능한 항체의 프로테아제 절단시에 완전하게 회복되었다는 것을 나타낸다. OKT3, 항EGFR C225v5, 및 시나기스 IgG1이소형 대조군 항체는 T 세포의 활성화를 무시해도 될 정도로 나타내었다.
도 23b는 다중특이성 활성화 가능한 항체 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N에 의한 SW480 세포의 EGFR 의존성 용해는 다중특이성 항체 C225v5-OKT3m-H-N에 의한 나타난 EGFR 의존성 세포독성과 비교하여 약화되었다는 것을 입증한다. 본 도면은 또한 다중특이성 활성화 가능한 항체에 의한 EGFR 의존성 세포독성이 마트립타제에 의한 다중특이성 활성화 가능한 항체의 프로테아제 절단시에 완전하게 회복되었다는 것을 나타낸다. C225v5 및 OKT3 및 시나기스 IgG1 이소형 대조군 항체는 무시해도 될 정도의 세포독성을 보였다.
다른 실시양태
본 발명은 그의 상세한 설명과 함께 기술되었지만, 상기 설명은 본 발명의 범주를 예시하고자 하는 것이지, 제한하고자 하는 것이 아니며, 본 발명의 범주는 첨부된 청구범위의 범주에 의해 정의된다. 다른 측면, 이점, 및 변형도 하기 청구범위의 범주 내에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> CytomX Therapeutics, Inc. Lowman, Henry Bernard West, James William La Porte, Sherry Lynn Irving, Bryan Allen Hostetter, Daniel Robert Wong, Chihunt <120> MULTISPECIFIC ANTIBODIES, MULTISPECIFIC ACTIVATABLE ANTIBODIES AND METHODS OF USING THE SAME <130> CYTM-025/001WO 322001-2133 <140> PCT/US14/48289 <141> 2014-07-25 <150> US 61/858,402 <151> 2013-07-25 <160> 339 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer CTRevNot <400> 1 tcgagcggcc gctcaactag ctgaagagac agtg 34 <210> 2 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer CTForOL <400> 2 gccctctaga ctcgatctag ctagctgaag agacagtgac cagg 44 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer HCForNhe <400> 3 ctcagctagc accagggccc atcggtc 27 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer HCRevOL <400> 4 ctttacccgg agacagggag aggctcttct gc 32 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer OKREVNot <400> 5 ctcgagcggc cgctcaacga ttaatttcca gtttg 35 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-Jagged VH CDR1 <400> 6 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-Jagged VH CDR2 <400> 7 Ser Ile Asp Pro Glu Gly Arg Gln Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-Jagged VH CDR3 <400> 8 Asp Ile Gly Gly Arg Ser Ala Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-Jagged VL CDR1 <400> 9 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-Jagged VL CDR2 <400> 10 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-Jagged VL CDR3 <400> 11 Gln Gln Thr Val Val Ala Pro Pro Leu 1 5 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-EGFR VH CDR1 <400> 12 Asn Tyr Gly Val His 1 5 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-EGFR VH CDR2 <400> 13 Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser 1 5 10 15 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-EGFR VH CDR3 <400> 14 Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-EGFR VL CDR1 <400> 15 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His 1 5 10 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-EGFR VL CDR2 <400> 16 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-EGFR VL CDR3 <400> 17 Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr 1 5 <210> 18 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linking peptide <220> <221> REPEAT <222> (1)..(5) <223> May be repeated <400> 18 Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 19 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linking peptide <220> <221> REPEAT <222> (1)..(4) <223> May be repeated <400> 19 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 20 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linking peptide <400> 20 Gly Gly Ser Gly 1 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linking peptide <400> 21 Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 22 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linking peptide <400> 22 Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linking peptide <400> 23 Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linking peptide <400> 24 Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linking peptide <400> 25 Gly Ser Ser Ser Gly 1 5 <210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 26 Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His 1 5 <210> 27 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 27 Thr Gly Arg Gly Pro Ser Trp Val 1 5 <210> 28 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 28 Ser Ala Arg Gly Pro Ser Arg Trp 1 5 <210> 29 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 29 Thr Ala Arg Gly Pro Ser Phe Lys 1 5 <210> 30 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 30 Gly Gly Trp His Thr Gly Arg Asn 1 5 <210> 31 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 31 His Thr Gly Arg Ser Gly Ala Leu 1 5 <210> 32 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 32 Pro Leu Thr Gly Arg Ser Gly Gly 1 5 <210> 33 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 33 Ala Ala Arg Gly Pro Ala Ile His 1 5 <210> 34 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 34 Arg Gly Pro Ala Phe Asn Pro Met 1 5 <210> 35 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 35 Ser Ser Arg Gly Pro Ala Tyr Leu 1 5 <210> 36 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 36 Arg Gly Pro Ala Thr Pro Ile Met 1 5 <210> 37 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 37 Arg Gly Pro Ala 1 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 38 Gly Gly Gln Pro Ser Gly Met Trp Gly Trp 1 5 10 <210> 39 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 39 Phe Pro Arg Pro Leu Gly Ile Thr Gly Leu 1 5 10 <210> 40 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 40 Val His Met Pro Leu Gly Phe Leu Gly Pro 1 5 10 <210> 41 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 41 Ser Pro Leu Thr Gly Arg Ser Gly 1 5 <210> 42 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 42 Ser Ala Gly Phe Ser Leu Pro Ala 1 5 <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 43 Leu Ala Pro Leu Gly Leu Gln Arg Arg 1 5 <210> 44 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 44 Ser Gly Gly Pro Leu Gly Val Arg 1 5 <210> 45 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 45 Pro Leu Gly Leu 1 <210> 46 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> spacer peptide <400> 46 Gln Gly Gln Ser Gly Gln 1 5 <210> 47 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable linker sequence <400> 47 Pro Arg Phe Lys Ile Ile Gly Gly 1 5 <210> 48 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable linker sequence <400> 48 Pro Arg Phe Arg Ile Ile Gly Gly 1 5 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable linker sequence <400> 49 Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu Asp 1 5 <210> 50 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable linker sequence <400> 50 Arg Lys Ser Ser Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu 1 5 10 <210> 51 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable linker sequence <400> 51 Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala 1 5 10 15 <210> 52 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable linker sequence <400> 52 Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Arg Gly Asp Asp Ala 1 5 10 15 <210> 53 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable linker sequence <400> 53 Ile Glu Gly Arg 1 <210> 54 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable linker sequence <400> 54 Ile Asp Gly Arg 1 <210> 55 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable linker sequence <400> 55 Gly Gly Ser Ile Asp Gly Arg 1 5 <210> 56 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable linker sequence <400> 56 Pro Leu Gly Leu Trp Ala 1 5 <210> 57 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable linker sequence <400> 57 Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln 1 5 <210> 58 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable linker sequence <400> 58 Gly Pro Gln Gly Leu Leu Gly Ala 1 5 <210> 59 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable linker sequence <400> 59 Gly Ile Ala Gly Gln 1 5 <210> 60 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable linker sequence <400> 60 Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Ile 1 5 <210> 61 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable linker sequence <400> 61 Gly Pro Glu Gly Leu Arg Val Gly 1 5 <210> 62 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable linker sequence <400> 62 Tyr Gly Ala Gly Leu Gly Val Val 1 5 <210> 63 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable linker sequence <400> 63 Ala Gly Leu Gly Val Val Glu Arg 1 5 <210> 64 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable linker sequence <400> 64 Ala Gly Leu Gly Ile Ser Ser Thr 1 5 <210> 65 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable linker sequence <400> 65 Glu Pro Gln Ala Leu Ala Met Ser 1 5 <210> 66 <211> 8 <212> 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cleavable linker sequence <400> 73 Ala Gln Phe Val Leu Thr Glu Gly 1 5 <210> 74 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable linker sequence <400> 74 Pro Val Gln Pro Ile Gly Pro Gln 1 5 <210> 75 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 75 Cys Ile Ser Pro Arg Gly 1 5 <210> 76 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 76 Cys Ile Ser Pro Arg Gly Cys Gly 1 5 <210> 77 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 77 Cys Ile Ser Pro Arg Gly Cys Pro Asp Gly Pro Tyr Val Met Tyr 1 5 10 15 <210> 78 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 78 Cys Ile Ser Pro Arg Gly Cys Pro Asp Gly Pro Tyr Val Met 1 5 10 <210> 79 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 79 Cys Ile Ser Pro Arg Gly Cys Glu Pro Gly Thr Tyr Val Pro Thr 1 5 10 15 <210> 80 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 80 Cys Ile Ser Pro Arg Gly Cys Pro Gly Gln Ile Trp His Pro Pro 1 5 10 15 <210> 81 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 81 Gly Ser His Cys Leu Ile Pro Ile Asn Met Gly Ala Pro Ser Cys 1 5 10 15 <210> 82 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 82 Cys Ile Ser Pro Arg Gly Cys Gly Gly Ser Ser Ala Ser Gln Ser Gly 1 5 10 15 Gln Gly Ser His Cys Leu Ile Pro Ile Asn Met Gly Ala Pro Ser Cys 20 25 30 <210> 83 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 83 Cys Asn His His Tyr Phe Tyr Thr Cys Gly Cys Ile Ser Pro Arg Gly 1 5 10 15 Cys Pro Gly <210> 84 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 84 Ala Asp His Val Phe Trp Gly Ser Tyr Gly Cys Ile Ser Pro Arg Gly 1 5 10 15 Cys Pro Gly <210> 85 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 85 Cys His His Val Tyr Trp Gly His Cys Gly Cys Ile Ser Pro Arg Gly 1 5 10 15 Cys Pro Gly <210> 86 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 86 Cys Pro His Phe Thr Thr Thr Ser Cys Gly Cys Ile Ser Pro Arg Gly 1 5 10 15 Cys Pro Gly <210> 87 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 87 Cys Asn His His Tyr His Tyr Tyr Cys Gly Cys Ile Ser Pro Arg Gly 1 5 10 15 Cys Pro Gly <210> 88 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 88 Cys Pro His Val Ser Phe Gly Ser Cys Gly Cys Ile Ser Pro Arg Gly 1 5 10 15 Cys Pro Gly <210> 89 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 89 Cys Pro Tyr Tyr Thr Leu Ser Tyr Cys Gly Cys Ile Ser Pro Arg Gly 1 5 10 15 Cys Pro Gly <210> 90 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 90 Cys Asn His Val Tyr Phe Gly Thr Cys Gly Cys Ile Ser Pro Arg Gly 1 5 10 15 Cys Pro Gly <210> 91 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 91 Cys Asn His Phe Thr Leu Thr Thr Cys Gly Cys Ile Ser Pro Arg Gly 1 5 10 15 Cys Pro Gly <210> 92 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 92 Cys His His Phe Thr Leu Thr Thr Cys Gly Cys Ile Ser Pro Arg Gly 1 5 10 15 Cys Pro Gly <210> 93 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 93 Tyr Asn Pro Cys Ala Thr Pro Met Cys Cys Ile Ser Pro Arg Gly Cys 1 5 10 15 Pro Gly <210> 94 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 94 Cys Asn His His Tyr Phe Tyr Thr Cys Gly Cys Ile Ser Pro Arg Gly 1 5 10 15 Cys Gly <210> 95 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 95 Cys Asn His His Tyr His Tyr Tyr Cys Gly Cys Ile Ser Pro Arg Gly 1 5 10 15 Cys Gly <210> 96 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 96 Cys Asn His Val Tyr Phe Gly Thr Cys Gly Cys Ile Ser Pro Arg Gly 1 5 10 15 Cys Gly <210> 97 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 97 Cys His His Val Tyr Trp Gly His Cys Gly Cys Ile Ser Pro Arg Gly 1 5 10 15 Cys Gly <210> 98 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 98 Cys Pro His Phe Thr Thr Thr Ser Cys Gly Cys Ile Ser Pro Arg Gly 1 5 10 15 Cys Gly <210> 99 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 99 Cys Asn His Phe Thr Leu Thr Thr Cys Gly Cys Ile Ser Pro Arg Gly 1 5 10 15 Cys Gly <210> 100 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 100 Cys His His Phe Thr Leu Thr Thr Cys Gly Cys Ile Ser Pro Arg Gly 1 5 10 15 Cys Gly <210> 101 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 101 Cys Pro Tyr Tyr Thr Leu Ser Tyr Cys Gly Cys Ile Ser Pro Arg Gly 1 5 10 15 Cys Gly <210> 102 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 102 Cys Pro His Val Ser Phe Gly Ser Cys Gly Cys Ile Ser Pro Arg Gly 1 5 10 15 Cys Gly <210> 103 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 103 Ala Asp His Val Phe Trp Gly Ser Tyr Gly Cys Ile Ser Pro Arg Gly 1 5 10 15 Cys Gly <210> 104 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 104 Tyr Asn Pro Cys Ala Thr Pro Met Cys Cys Ile Ser Pro Arg Gly Cys 1 5 10 15 Gly <210> 105 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 105 Cys His His Val Tyr Trp Gly His Cys Gly Cys Ile Ser Pro Arg Gly 1 5 10 15 Cys Gly <210> 106 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa may be Asn or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa may be His, Val or Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa may be Tyr or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa may be Phe, Trp, Thr or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa may be Tyr, Gly, Thr or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa may be Thr, Ser, Tyr or His <400> 106 Cys Xaa His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Gly Cys Ile Ser Pro Arg Gly 1 5 10 15 Cys Gly <210> 107 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 107 Cys Ile Ser Pro Arg Gly Cys Gly Gln Pro Ile Pro Ser Val Lys 1 5 10 15 <210> 108 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 108 Cys Ile Ser Pro Arg Gly Cys Thr Gln Pro Tyr His Val Ser Arg 1 5 10 15 <210> 109 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 109 Cys Ile Ser Pro Arg Gly Cys Asn Ala Val Ser Gly Leu Gly Ser 1 5 10 15 <210> 110 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 110 Gln Gly Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Gln Trp Cys Asn Ile Trp Ile 1 5 10 15 Asn Gly Gly Asp Cys Arg Gly Trp Asn Gly 20 25 <210> 111 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 111 Pro Trp Cys Met Gln Arg Gln Asp Phe Leu Arg Cys Pro Gln Pro 1 5 10 15 <210> 112 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 112 Gln Leu Gly Leu Pro Ala Tyr Met Cys Thr Phe Glu Cys Leu Arg 1 5 10 15 <210> 113 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 113 Cys Asn Leu Trp Val Ser Gly Gly Asp Cys Gly Gly Leu Gln Gly 1 5 10 15 <210> 114 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 114 Ser Cys Ser Leu Trp Thr Ser Gly Ser Cys Leu Pro His Ser Pro 1 5 10 15 <210> 115 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 115 Tyr Cys Leu Gln Leu Pro His Tyr Met Gln Ala Met Cys Gly Arg 1 5 10 15 <210> 116 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 116 Cys Phe Leu Tyr Ser Cys Thr Asp Val Ser Tyr Trp Asn Asn Thr 1 5 10 15 <210> 117 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 117 Pro Trp Cys Met Gln Arg Gln Asp Tyr Leu Arg Cys Pro Gln Pro 1 5 10 15 <210> 118 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 118 Cys Asn Leu Trp Ile Ser Gly Gly Asp Cys Arg Gly Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 119 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 119 Cys Asn Leu Trp Val Ser Gly Gly Asp Cys Arg Gly Val Gln Gly 1 5 10 15 <210> 120 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 120 Cys Asn Leu Trp Val Ser Gly Gly Asp Cys Arg Gly Leu Arg Gly 1 5 10 15 <210> 121 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 121 Cys Asn Leu Trp Ile Ser Gly Gly Asp Cys Arg Gly Leu Pro Gly 1 5 10 15 <210> 122 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 122 Cys Asn Leu Trp Val Ser Gly Gly Asp Cys Arg Asp Ala Pro Trp 1 5 10 15 <210> 123 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 123 Cys Asn Leu Trp Val Ser Gly Gly Asp Cys Arg Asp Leu Leu Gly 1 5 10 15 <210> 124 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 124 Cys Asn Leu Trp Val Ser Gly Gly Asp Cys Arg Gly Leu Gln Gly 1 5 10 15 <210> 125 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 125 Cys Asn Leu Trp Leu His Gly Gly Asp Cys Arg Gly Trp Gln Gly 1 5 10 15 <210> 126 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 126 Cys Asn Ile Trp Leu Val Gly Gly Asp Cys Arg Gly Trp Gln Gly 1 5 10 15 <210> 127 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 127 Cys Thr Thr Trp Phe Cys Gly Gly Asp Cys Gly Val Met Arg Gly 1 5 10 15 <210> 128 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 128 Cys Asn Ile Trp Gly Pro Ser Val Asp Cys Gly Ala Leu Leu Gly 1 5 10 15 <210> 129 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 129 Cys Asn Ile Trp Val Asn Gly Gly Asp Cys Arg Ser Phe Glu Gly 1 5 10 15 <210> 130 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 130 Tyr Cys Leu Asn Leu Pro Arg Tyr Met Gln Asp Met Cys Trp Ala 1 5 10 15 <210> 131 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 131 Tyr Cys Leu Ala Leu Pro His Tyr Met Gln Ala Asp Cys Ala Arg 1 5 10 15 <210> 132 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 132 Cys Phe Leu Tyr Ser Cys Gly Asp Val Ser Tyr Trp Gly Ser Ala 1 5 10 15 <210> 133 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 133 Cys Tyr Leu Tyr Ser Cys Thr Asp Ser Ala Phe Trp Asn Asn Arg 1 5 10 15 <210> 134 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 134 Cys Tyr Leu Tyr Ser Cys Asn Asp Val Ser Tyr Trp Ser Asn Thr 1 5 10 15 <210> 135 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 135 Cys Phe Leu Tyr Ser Cys Thr Asp Val Ser Tyr Trp 1 5 10 <210> 136 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 136 Cys Phe Leu Tyr Ser Cys Thr Asp Val Ala Tyr Trp Asn Ser Ala 1 5 10 15 <210> 137 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 137 Cys Phe Leu Tyr Ser Cys Thr Asp Val Ser Tyr Trp Gly Asp Thr 1 5 10 15 <210> 138 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 138 Cys Phe Leu Tyr Ser Cys Thr Asp Val Ser Tyr Trp Gly Asn Ser 1 5 10 15 <210> 139 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 139 Cys Phe Leu Tyr Ser Cys Thr Asp Val Ala Tyr Trp Asn Asn Thr 1 5 10 15 <210> 140 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 140 Cys Phe Leu Tyr Ser Cys Gly Asp Val Ser Tyr Trp Gly Asn Pro Gly 1 5 10 15 Leu Ser <210> 141 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 141 Cys Phe Leu Tyr Ser Cys Thr Asp Val Ala Tyr Trp Ser Gly Leu 1 5 10 15 <210> 142 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 142 Cys Tyr Leu Tyr Ser Cys Thr Asp Gly Ser Tyr Trp Asn Ser Thr 1 5 10 15 <210> 143 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 143 Cys Phe Leu Tyr Ser Cys Ser Asp Val Ser Tyr Trp Gly Asn Ile 1 5 10 15 <210> 144 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 144 Cys Phe Leu Tyr Ser Cys Thr Asp Val Ala Tyr Trp 1 5 10 <210> 145 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 145 Cys Phe Leu Tyr Ser Cys Thr Asp Val Ser Tyr Trp Gly Ser Thr 1 5 10 15 <210> 146 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 146 Cys Phe Leu Tyr Ser Cys Thr Asp Val Ala Tyr Trp Gly Asp Thr 1 5 10 15 <210> 147 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 147 Gly Cys Asn Ile Trp Leu Asn Gly Gly Asp Cys Arg Gly Trp Val Asp 1 5 10 15 Pro Leu Gln Gly 20 <210> 148 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 148 Gly Cys Asn Ile Trp Leu Val Gly Gly Asp Cys Arg Gly Trp Ile Gly 1 5 10 15 Asp Thr Asn Gly 20 <210> 149 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 149 Gly Cys Asn Ile Trp Leu Val Gly Gly Asp Cys Arg Gly Trp Ile Glu 1 5 10 15 Asp Ser Asn Gly 20 <210> 150 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 150 Gly Cys Asn Ile Trp Ala Asn Gly Gly Asp Cys Arg Gly Trp Ile Asp 1 5 10 15 Asn Ile Asp Gly 20 <210> 151 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 151 Gly Cys Asn Ile Trp Leu Val Gly Gly Asp Cys Arg Gly Trp Leu Gly 1 5 10 15 Glu Ala Val Gly 20 <210> 152 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 152 Gly Cys Asn Ile Trp Leu Val Gly Gly Asp Cys Arg Gly Trp Leu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Gly 20 <210> 153 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 153 Gly Gly Pro Ala Leu Cys Asn Ile Trp Leu Asn Gly Gly Asp Cys Arg 1 5 10 15 Gly Trp Ser Gly 20 <210> 154 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 154 Gly Ala Pro Val Phe Cys Asn Ile Trp Leu Asn Gly Gly Asp Cys Arg 1 5 10 15 Gly Trp Met Gly 20 <210> 155 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 155 Gly Gln Gln Gln Trp Cys Asn Ile Trp Ile Asn Gly Gly Asp Cys Arg 1 5 10 15 Gly Trp Asn Gly 20 <210> 156 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 156 Gly Lys Ser Glu Phe Cys Asn Ile Trp Leu Asn Gly Gly Asp Cys Arg 1 5 10 15 Gly Trp Ile Gly 20 <210> 157 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 157 Gly Thr Pro Gly Gly Cys Asn Ile Trp Ala Asn Gly Gly Asp Cys Arg 1 5 10 15 Gly Trp Glu Gly 20 <210> 158 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 158 Gly Ala Ser Gln Tyr Cys Asn Leu Trp Ile Asn Gly Gly Asp Cys Arg 1 5 10 15 Gly Trp Arg Gly 20 <210> 159 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 159 Gly Cys Asn Ile Trp Leu Val Gly Gly Asp Cys Arg Pro Trp 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Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 195 Ser Gly Ser Cys Lys Trp Asp Tyr Val His Ile Phe Leu Asp Cys 1 5 10 15 <210> 196 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 196 Tyr Lys Ser Cys His Trp Asp Tyr Val His Ile Phe Leu Asp Cys 1 5 10 15 <210> 197 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 197 Tyr Gly Ser Cys Thr Trp Asn Tyr Val His Ile Phe Met Glu Cys 1 5 10 15 <210> 198 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 198 Phe Ser Ser Cys Asn Trp Asn Tyr Val His Ile Phe Leu Asp Cys 1 5 10 15 <210> 199 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 199 Trp Arg Ser Cys Asn Trp Asn Tyr Ala His Ile Phe Leu Asp Cys 1 5 10 15 <210> 200 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 200 Tyr Gly Ser Cys Gln Trp Asn Tyr Val His Ile Phe Leu Asp Cys 1 5 10 15 <210> 201 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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<213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 217 Thr Pro Gly Cys Arg Trp Asn Tyr Val His Ile Phe Met Glu Cys Glu 1 5 10 15 Ala Leu <210> 218 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 218 Val Gly Val Pro Asn Gly Cys Val Trp Asn Tyr Ala His Ile Phe Met 1 5 10 15 Glu Cys <210> 219 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 219 Pro Gly Ala Phe Asp Ile Pro Phe Pro Ala His Trp Val Pro Asn Thr 1 5 10 15 <210> 220 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 220 Arg Gly Ala Cys Asp Ile Pro Phe Pro Ala His Trp Ile Pro Asn Thr 1 5 10 15 <210> 221 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 221 Gln Gly Asp Phe Asp Ile Pro Phe Pro Ala His Trp Val Pro Ile Thr 1 5 10 15 <210> 222 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa may be any amino acid <400> 222 Xaa Gly Ala Phe Asp 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660 ttcaccatct ccagagacaa ttccaagaac acgctgtatc tgcaaatgaa cagcctgaga 720 gccgaggaca cggccgtata ttactgtgcg acaaactccc tttactggta cttcgatctc 780 tggggccgtg gcaccctggt cactgtctct tcagctagc 819 <210> 230 <211> 273 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-human CTLA-4 scFv Antibody <400> 230 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly 20 25 30 Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala 35 40 45 Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 65 70 75 80 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 100 105 110 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 115 120 125 Glu Ile Lys Arg Ser Gly Gly Ser Thr Ile Thr Ser Tyr Asn Val Tyr 130 135 140 Tyr Thr Lys Leu Ser Ser Ser Gly Thr Gln Val Gln Leu Val Gln Thr 145 150 155 160 Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 165 170 175 Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln 180 185 190 Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly 195 200 205 Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 210 215 220 Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 225 230 235 240 Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Asn Ser Leu Tyr Trp 245 250 255 Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 260 265 270 Ser <210> 231 <211> 792 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-human CD3 epsilon OKT3 scFv Antibody <400> 231 ggaggtggat ctggaggtgg cggttcaggc tctggcggag gctcaggtgg tggaggatca 60 ggcggaggtc aggttcagct gcagcagagc ggtgcagaac tggcacgtcc gggtgcaagc 120 gttaaaatga gctgtaaagc aagcggttat acctttaccc gttataccat gcattgggtt 180 aaacagcgtc cgggtcaggg tctggaatgg attggttata tcaatccgag ccgtggttat 240 accaactaca accagaaatt caaagataaa gcaaccctga ccaccgataa aagcagcagc 300 accgcctata tgcagctgag cagcctgacc tcagaggata gcgcagttta ttactgtgca 360 cgctattatg atgatcacta ttgcctggat tattggggtc agggcaccac cctgaccgtt 420 agcagcggtg gtggtggtag tggtggcggt ggttcaggcg gtggcggtag ccagattgtt 480 ctgacccaga gtccggcaat tatgagcgca agtccgggtg aaaaagttac catgacctgt 540 agcgccagca gcagcgttag ctatatgaat tggtatcagc agaaaagcgg caccagcccg 600 aaacgttgga tttatgatac cagcaaactg gcaagcggtg ttccggcaca ttttcgtggt 660 agcggtagcg gcacctcata tagcctgacc attagcggta tggaagcaga agatgcagca 720 acctattatt gtcagcagtg gtcaagcaat ccgtttacct ttggtagtgg caccaaactg 780 gaaattaatc gt 792 <210> 232 <211> 264 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-human CD3 epsilon OKT3 scFv Antibody <400> 232 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala 20 25 30 Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser 35 40 45 Gly Tyr Thr 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tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780 gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1080 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1347 <210> 234 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-human Jagged 4D11v2 Antibody Heavy Chain <400> 234 Glu Val His Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 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313 cagatcttgc tgacccagag cccggtgatt ctgagcgtga gcccgggcga acgtgtgagc 60 tttagctgcc gcgcgagcca gagcattggc accaacattc attggtatca gcagcgcacc 120 aacggcagcc cgcgcctgct gattaaatat gcgagcgaaa gcattagcgg cattccgagc 180 cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga gcattaacag cgtggaaagc 240 gaagatattg cggattatta ttgccagcag aacaacaact ggccgaccac ctttggcgcg 300 ggcaccaaac tggaactgaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645 <210> 314 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Multispecific activatable antibody 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N <400> 314 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 315 <211> 1437 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Multispecific activatable antibody 3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N <400> 315 gacatcttgc tgacccagag cccggtgatt ctgagcgtga gcccgggcga acgtgtgagc 60 tttagctgcc gcgcgagcca gagcattggc accaacattc attggtatca gcagcgcacc 120 aacggcagcc cgcgcctgct gattaaatat gcgagcgaaa gcattagcgg cattccgagc 180 cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga gcattaacag cgtggaaagc 240 gaagatattg cggattatta ttgccagcag aacaacaact ggccgaccac ctttggcgcg 300 ggcaccaaac tggaactgaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gtggaggtgg atctggaggt 660 ggcggttcag gctctggcgg aggctcaggt ggtggaggat caggcggagg tcaggttcag 720 ctgcagcaga gcggtgcaga actggcacgt ccgggtgcaa gcgttaaaat gagctgtaaa 780 gcaagcggtt atacctttac ccgttatacc atgcattggg ttaaacagcg tccgggtcag 840 ggtctggaat ggattggtta tatcaatccg agccgtggtt ataccaacta caaccagaaa 900 ttcaaagata aagcaaccct gaccaccgat aaaagcagca gcaccgccta tatgcagctg 960 agcagcctga cctcagagga tagcgcagtt tattactgtg cacgctatta tgatgatcac 1020 tatagcctgg attattgggg tcagggcacc accctgaccg ttagcagcgg tggtggtggt 1080 agtggtggcg gtggttcagg cggtggcggt agccagattg ttctgaccca gagtccggca 1140 attatgagcg caagtccggg tgaaaaagtt accatgacct gtagcgccag cagcagcgtt 1200 agctatatga attggtatca gcagaaaagc ggcaccagcc cgaaacgttg gatttatgat 1260 accagcaaac tggcaagcgg tgttccggca cattttcgtg gtagcggtag cggcacctca 1320 tatagcctga ccattagcgg tatggaagca gaagatgcag caacctatta ttgtcagcag 1380 tggtcaagca atccgtttac ctttggtagt ggcaccaaac tggaaattaa tcgttag 1437 <210> 316 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 316 Ile Ser Ser Gly Leu Leu Ser Ser 1 5 <210> 317 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 317 Gln Asn Gln Ala Leu Arg Met Ala 1 5 <210> 318 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 318 Ala Gln Asn Leu Leu Gly Met Val 1 5 <210> 319 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 319 Ser Thr Phe Pro Phe Gly Met Phe 1 5 <210> 320 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 320 Pro Val Gly Tyr Thr Ser Ser Leu 1 5 <210> 321 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 321 Asp Trp Leu Tyr Trp Pro Gly Ile 1 5 <210> 322 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 322 Met Ile Ala Pro Val Ala Tyr Arg 1 5 <210> 323 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 323 Trp Ala Thr Pro Arg Pro Met Arg 1 5 <210> 324 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 324 Phe Arg Leu Leu Asp Trp Gln Trp 1 5 <210> 325 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 325 Leu Lys Ala Ala Pro Arg Trp Ala 1 5 <210> 326 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 326 Gly Pro Ser His Leu Val Leu Thr 1 5 <210> 327 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 327 Leu Pro Gly Gly Leu Ser Pro Trp 1 5 <210> 328 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 328 Met Gly Leu Phe Ser Glu Ala Gly 1 5 <210> 329 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 329 Ser Pro Leu Pro Leu Arg Val Pro 1 5 <210> 330 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 330 Arg Met His Leu Arg Ser Leu Gly 1 5 <210> 331 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 331 Leu Ala Ala Pro Leu Gly Leu Leu 1 5 <210> 332 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 332 Ala Val Gly Leu Leu Ala Pro Pro 1 5 <210> 333 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 333 Leu Leu Ala Pro Ser His Arg Ala 1 5 <210> 334 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 334 Pro Ala Gly Leu Trp Leu Asp Pro 1 5 <210> 335 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cleavable moiety <400> 335 Ile Ser Ser Gly Leu Ser Ser 1 5 <210> 336 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody C225v5 N297Q heavy chain <400> 336 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Gln Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 337 <211> 1350 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody C225v5 N297Q heavy chain <400> 337 caggtgcagc tgaaacagag cggcccgggc ctggtgcagc cgagccagag cctgagcatt 60 acctgcaccg tgagcggctt tagcctgacc aactatggcg tgcattgggt gcgccagagc 120 ccgggcaaag gcctggaatg gctgggcgtg atttggagcg gcggcaacac cgattataac 180 accccgttta ccagccgcct gagcattaac aaagataaca gcaaaagcca ggtgtttttt 240 aaaatgaaca gcctgcaaag ccaggatacc gcgatttatt attgcgcgcg cgcgctgacc 300 tattatgatt atgaatttgc gtattggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcgcggct 360 agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 600 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 660 tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 720 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780 gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtaccagagc 900 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1080 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga 1350 <210> 338 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 338 Gln Gly Gln Ser Gly Gln Cys Asn Ile Trp Leu Val Gly Gly Asp Cys 1 5 10 15 Arg Gly Trp Gln Gly 20 <210> 339 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> masking moiety <400> 339 Cys Ile Ser Pro Arg Gly Cys 1 5

Claims (72)

  1. 활성화된 상태에서, 2개 이상의 표적, 또는 2개 이상의 에피토프, 또는 2개 이상의 표적과 2개 이상의 에피토프의 조합에 결합하는 다중특이성 활성화 가능한 항체로서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는
    제1 표적 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 적어도 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1);
    제2 표적 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2);
    다중특이성 활성화 가능한 항체가 절단되지 않은 상태일 때, AB1의 그의 표적에의 결합을 억제하는 적어도 제1 마스킹 모이어티(MM1); 및
    AB1에 커플링된 적어도 제1 절단가능한 모이어티(CM1)로서, CM1은 프로테아제에 대한 기질로서 기능하는 폴리펩티드인 CM1을 포함하는 것인, 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  2. 제1항에 있어서, MM1은, AB1에의 결합에 대하여, AB1의 그의 표적 또는 에피토프에의 평형 해리 상수보다 더 큰 평형 해리 상수를 가지는 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  3. 제1항에 있어서, MM1은 다중특이성 활성화 가능한 항체가 절단된 상태일 때, 그의 표적 또는 에피토프에의 결합에 대해 AB1을 방해하거나 AB1과 경쟁하지 않는 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  4. 제1항에 있어서, 프로테아제는 조직 내에서 제1 표적 또는 에피토프와 함께 공국재화(co-localize)되고, 프로테아제는 다중특이성 활성화 가능한 항체가 프로테아제에 노출될 때, 다중특이성 활성화 가능한 항체 내의 CM을 절단하는 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  5. 제1항에 있어서, 절단되지 않은 상태의 다중특이성 활성화 가능한 항체의 적어도 일부는 N 말단에서 C 말단으로 하기와 같은 구조적 배열: MM1-CM1-AB1 또는 AB1-CM1-MM1을 가지는 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  6. 제1항에 있어서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 MM1와 CM1 사이에 연결 펩티드를 포함하는 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  7. 제1항에 있어서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 CM1과 AB1 사이에 연결 펩티드를 포함하는 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  8. 제1항에 있어서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 제1 연결 펩티드(LP1) 및 제2 연결 펩티드(LP2)를 포함하고, 절단되지 않은 상태의 다중특이성 활성화 가능한 항체는 N 말단에서 C 말단으로 하기와 같은 구조적 배열: MM1-LP1-CM1-LP2-AB1 또는 AB1-LP2-CM1-LP1-MM1을 가지는 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  9. 제8항에 있어서, 2개의 연결 펩티드는 서로 동일할 필요가 없는 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  10. 제8항에 있어서, LP1 및 LP2는 각각 길이가 약 1 내지 20개의 아미노산 길이의 펩티드인 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  11. 제1항에 있어서, MM1은 길이가 약 2 내지 40개의 아미노산 길이의 폴리펩티드인 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  12. 제1항에 있어서, MM1 폴리펩티드 서열은 제1 표적의 것과 상이하고, MM1 폴리펩티드 서열은 AB1의 임의의 천연 결합 파트너와 50% 이하로 동일한 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  13. 제1항에 있어서, CM1은 길이가 15개 이하의 아미노산 길이의 폴리펩티드인 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  14. 제1항에 있어서, AB1 및/또는 AB2의 그의 항원 결합 단편은 Fab 단편, F(ab')2 단편, scFv, scab, dAb, 단일 도메인 중쇄 항체, 및 단일 도메인 경쇄 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  15. 제1항에 있어서, CM1은 표 3에 열거된 프로테아제로부터 선택되는 프로테아제에 대한 기질인 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  16. 제1항에 있어서, 다중특이성 활성화 가능한 항체가 절단되지 않은 상태일 때, AB2의 그의 표적에의 결합을 억제하는 제2 마스킹 모이어티(MM2), 및 AB2에 커플링된 제2 절단가능한 모이어티(CM2)를 포함하며, CM2는 제2 프로테아제에 대한 기질로서 기능을 하는 폴리펩티드인 것인, 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  17. 제16항에 있어서, CM2는 길이가 15개 이하의 아미노산 길이의 폴리펩티드인 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  18. 제16항에 있어서, 제2 프로테아제는 조직 내에서 제2 표적 또는 에피토프와 함께 공국재화되고, 제2 프로테아제는 다중특이성 활성화 가능한 항체가 제2 프로테아제에 노출될 때, 다중특이성 활성화 가능한 항체 내의 CM2를 절단하는 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  19. 제18항에 있어서, 제1 프로테아제 및 제2 프로테아제는 조직 내에서 제1 표적 또는 에피토프 및 제2 표적 또는 에피토프와 함께 공국재화되는 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  20. 제18항에 있어서, 제1 프로테아제 및 제2 프로테아제는 동일한 프로테아제인 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  21. 제20항에 있어서, CM1 및 CM2는 동일한 프로테아제에 대한 상이한 기질인 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 프로테아제는 표 3에 제시된 것으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  23. 제18항에 있어서, 제1 프로테아제 및 제2 프로테아제는 상이한 프로테아제인 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  24. 제23항에 있어서, 제1 프로테아제 및 제2 프로테아제는 표 3에 제시된 것으로 이루어진 군으로부터 선택되는 상이한 프로테아제인 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  25. 제1항에 있어서, AB1 및 AB2 중 하나 이상에 컨쥬게이트된 작용제를 포함하는 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  26. 제25항에 있어서, 작용제는 치료제, 항신생물제, 독소 또는 그의 단편, 검출가능한 모이어티 또는 진단제인 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  27. 제25항에 있어서, 작용제는 링커를 통해 AB1 및 AB2 중 하나 이상에 컨쥬게이트된 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  28. 제27항에 있어서, 링커는 절단가능한 링커인 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  29. 제27항에 있어서, 링커는 비절단가능한 링커인 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  30. 제1항에 있어서, AB1 및 AB2 중 하나 이상은 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  31. 제1항에 있어서, AB1 및 AB2 중 하나 이상은 면역 효과기 세포 인게이징(engaging) 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  32. 제1항에 있어서, AB1 및 AB2 중 하나 이상은 백혈구 인게이징 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  33. 제1항에 있어서, AB1 및 AB2 중 하나 이상은 T 세포 인게이징 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  34. 제1항에 있어서, AB1 및 AB2 중 하나 이상은 NK 세포 인게이징 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  35. 제1항에 있어서, AB1 및 AB2 중 하나 이상은 대식세포 인게이징 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  36. 제1항에 있어서, AB1 및 AB2 중 하나 이상은 단핵 세포 인게이징 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  37. 제1항에 있어서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 (a) 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 (b) 면역 효과기 세포 인게이징 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  38. 제1항에 있어서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 (a) 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 (b) T 세포 인게이징 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  39. 제1항에 있어서, 다중특이성 활성화 가능한 항체는 2개 이상의 표적화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  40. 제1항에 있어서, AB1 및 AB2 중 하나 이상은 scFv인 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  41. 제37항에 있어서, 표적화 항체는 IgG이고, 면역 효과기 세포 인게이징 항체는 scFv인 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  42. 제38항에 있어서, 표적화 항체는 IgG이고, T 세포 인게이징 항체는 scFv인 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  43. 제1항에 있어서, AB1 및 AB2 중 하나 이상은 항CD3 엡실론 scFv인 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  44. 제43항에 있어서, 항CD3 엡실론 scFv는 OKT3으로부터 유래된 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  45. 제1항에 있어서, AB1 및 AB2 중 하나 이상은 표 1 중의 표적 군으로부터 선택되는 표적에 결합하는 항체이거나, 또는 그로부터 유래된 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  46. 제1항에 있어서, AB1 및 AB2 중 하나 이상은 항Jagged 항체 또는 항EGFR 항체이거나, 또는 그로부터 유래된 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  47. 제1항에 있어서, AB1 및 AB2 중 하나 이상은 항EGFR 항체이거나, 또는 그로부터 유래된 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  48. 제1항에 있어서, AB1 및 AB2 중 하나 이상은 항Jagged 항체이거나, 또는 그로부터 유래된 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  49. 제1항에 있어서, AB1 중 하나 이상은 항Jagged 항체 또는 항EGFR 항체이거나, 또는 그로부터 유래된 것이고, AB2 중 하나 이상은 항CD3 엡실론 scFv이거나, 또는 그로부터 유래된 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  50. 제1항에 있어서, AB1 중 하나 이상은 항EGFR 항체이거나, 또는 그로부터 유래된 것이고, AB2 중 하나 이상은 항CD3 엡실론 scFv이거나, 또는 그로부터 유래된 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  51. 제1항에 있어서, AB1 중 하나 이상은 항Jagged 항체이거나, 또는 그로부터 유래된 것이고, AB2 중 하나 이상은 항CD3 엡실론 scFv이거나, 또는 그로부터 유래된 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  52. 제1항에 있어서, AB1 및 AB2 중 하나 이상은 표 7에 제시된 아미노산 서열의 적어도 일부를 포함하는 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  53. 제1항에 있어서, AB1 및 AB2 중 하나 이상은 서열번호 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 314 또는 336에 기재된 아미노산 서열의 적어도 일부 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  54. 제1항에 있어서, AB1은 제1 표적에 결합하고, AB2는 제2 표적에 결합하고, 제1 표적 및 제2 표적은 상이한 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  55. 제1항에 있어서, AB1은 제1 에피토프에 결합하고, AB2는 제2 에피토프에 결합하는 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  56. 제55항에 있어서, 제1 에피토프 및 제2 에피토프는 동일한 표적 상에 존재하는 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  57. 제55항에 있어서, 제1 에피토프 및 제2 에피토프는 상이한 표적 상에 존재하는 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체.
  58. 제1항의 다중특이성 활성화 가능한 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  59. 제58항의 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  60. 다중특이성 활성화 가능한 항체의 발현을 유도하는 조건 하에서 세포를 배양하여, 다중특이성 활성화 가능한 항체를 제조하는 방법으로서, 세포는 제58항의 핵산 분자를 포함하는 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체를 제조하는 방법.
  61. 2개 이상의 표적에 결합하는 단리된 다중특이성 항체로서, 항체는 서열번호 242, 244, 248, 250, 270, 272, 274, 278, 280, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 314 또는 336에 기재된 서열 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 항체.
  62. 제61항에 있어서, 항체에 컨쥬게이트된 작용제를 포함하는 항체.
  63. 제61항에 있어서, 작용제는 치료제, 항신생물제, 독소 또는 그의 단편, 검출가능한 모이어티 또는 진단제인 것인 항체.
  64. 제61항에 있어서, 작용제는 링커를 통해 항체에 컨쥬게이트된 것인 항체.
  65. 제64항에 있어서, 링커는 절단가능한 링커인 것인 항체.
  66. 제64항에 있어서, 링커는 비절단가능한 링커인 것인 항체.
  67. 활성화된 상태에서, 2개 이상의 표적, 또는 2개 이상의 에피토프, 또는 2개 이상의 표적과 2개 이상의 에피토프의 조합에 결합하는 다중특이성 활성화 가능한 항체를 제조하는 방법으로서,
    (a) 다중특이성 활성화 가능한 항체의 발현을 유도하는 조건 하에서 다중특이성 활성화 가능한 항체를 코딩하는 핵산 구성물을 포함하는 세포를 배양하는 단계로서, 활성화 가능한 항체는 제1 표적 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 적어도 제1 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB1), 제2 표적 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 항체 또는 그의 항원 결합 단편(AB2), 다중특이성 활성화 가능한 항체가 절단되지 않은 상태일 때, AB1의 그의 표적에의 결합을 억제하는 적어도 제1 마스킹 모이어티(MM1), 및 AB1에 커플링된 적어도 제1 절단가능한 모이어티(CM1)를 포함하는 것인 단계, 및
    (b) 활성화 가능한 항체를 회수하는 단계
    를 포함하는, 다중특이성 활성화 가능한 항체를 제조하는 방법.
  68. 제67항에 있어서, CM1은 프로테아제에 대한 기질로서 기능하는 폴리펩티드인 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체를 제조하는 방법.
  69. 제67항에 있어서, CM1은, 절단되지 않은 상태에서는 MM1이 AB1의 제1 표적 또는 제1 에피토프에의 특이적인 결합을 방해하고, 절단된 상태에서는 MM1이 AB1의 제1 표적 또는 제1 에피토프에의 특이적인 결합을 방해하거나 그와 경쟁하지 않도록 활성화 가능한 항체 내에 배치되어 있는 것인 다중특이성 활성화 가능한 항체를 제조하는 방법.
  70. 장애와 관련된 임상적 적응증의 증상 경감을 필요로 하는 피험체에게 제1항의 다중특이성 활성화 가능한 항체 또는 제61항의 다중특이성 항체를 장애와 관련된 임상적 적응증의 증상을 경감시키는 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 피험체에서 장애와 관련된 임상적 적응증의 증상을 경감시키는 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 피험체는 인간인 것인 장애와 관련된 임상적 적응증의 증상을 경감시키는 방법.
  72. 제70항에 있어서, 장애는 암인 것인 장애와 관련된 임상적 적응증의 증상을 경감시키는 방법.
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