KR20230057428A - 어댑터를 포함하는 약물 치료제의 개발 및 이의 용도 - Google Patents

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KR20230057428A
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Abstract

CD20 및 CD3에 결합하는 이중특이성 항체 및 이의 용도가 제공된다. 상기 이중특이성 항체는 표적 세포의 표면 상의 CD20에 결합하는 제1 결합 도메인 및 T 세포의 표면 상의 CD3에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함한다. 이중특이성 항체는 잘 관용되고 저 용량 조건하에 B 세포를 효과적으로 제거할 수 있고 유사한 항체보다 우수한 효능 및 안정성 둘 다를 갖는다.

Description

어댑터를 포함하는 약물 치료제의 개발 및 이의 용도
본 발명은 이중특이성 항체 및 이의 용도, 및 특히 CD20 및 CD3에 결합하는 이중특이성 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
CD20은 B 림프구의 표면에 발현되는 글리코실화된 막 단백질이고, 인간 B 세포는 전구체 B 세포 및 말단 형질 세포를 제외한 거의 전체 분화 사이클에 CD20 항원을 발현한다(문헌[Tedder et al. J. Immunol. 135(2): 973-979, 1985]). 또한, CD20은 B 세포 종양-관련 항원이고, B 세포 비-호지킨 림프종(B-NHL) 및 기타 B 세포 악성 종양의 95% 초과에서 발현된다(문헌[Anderson et al. Blood 63(6): 1424-1433, 1984]). CD20-특이성 키메라 항체 리툭시맙은 1997년에 승인되었다. 리툭시맙 및 기타 약물의 조합 치료를 받는 환자의 5년 평균 생존률은 60 내지 70%에 달할 수 있다. 2세대 CD20-특이성 항체 오파투무맙(문헌[Teeling et al. Blood 104(6): 1793-800, 2004]) 및 3세대 CD20-특이성 항체, 예컨대 오비누투주맙 및 오크렐리주맙은 만성 림프구 백혈병 또는 다발성 경화증의 치료를 위해 개발되었다. CD20-특이성 단클론 항체는 B-NHL을 갖는 대부분의 환자에게 효과적이지만, 환자 중 10% 초과는 원발성이고 치료가 어렵다. 또한, 리툭시맙에 의해 치료되는 환자 중 약 30 내지 40%는 2 내지 3년 이내에 재발을 겪고, 치료에 내성이 되고, 단지 6.3개월의 평균 생존 시간을 갖는다. 따라서, 이러한 환자에게 필요한 신규한 메커니즘을 갖는 치료 약물을 개발하는 것이 긴급하다.
A T 세포 이중특이성 항체(또는 T 세포 어댑터(adaptor)로도 지칭됨)은 하나의 단부(항원 팔(arm))가 표적 세포의 표면에서 항원을 인식하고 다른 단부(CD3 팔)가 T 세포의 CD3 수용체에 결합하는, 인공적으로 구축된 특수한 항체 분자이다. CD3ε 쇄를 표적으로 하는 항체를 사용함으로써, T 세포 상의 CD3은 TCR/펩티드/HLA와 유사한 방식으로 응집되어, T 세포를 활성화시키고 종양을 살해한다. 이중특이성 항체에 의한 종양 세포의 살해는 1980년(문헌[Nature. 1985 Apr 18-24; 314 (6012): 628-31]; [Nature. 1985 Jul 25-31; 316 (6026): 354-6])에 보고되었고, 2005년에 갈(Gall) 등은 CD20XCD3 이중특이성 항체를 사용함으로써 리툭시맙-내성 종양 세포를 살해하는 것을 보고하였다(문헌[2005 Experimental Hematology 33: 452]). 유사한 보고는 스탱글마이어(Stanglmaier) 등에 의해 마우스 및 래트 IgG로부터 구축된 이중특이성 항체 Bi20/FBTA05(문헌[Int. J. Cancer: 123, 1181, 2008]), 우(Wu) 등에 의해 개발된 신규한 DVD-Ig 항체(문헌[Nat Biotechnol. 25: 1290-1297, 2007]), 선(Sun) 등에 의해 개발된, CD3 항체 UCHT1을 기반으로 하는 CD20-TDB 이중특이성 항체(문헌[Science translational medicine. 2015; 7: 287ra270-287ra270]), 샘에 의해 개발된, 벨로크이뮨(VelocImmune) 마우스를 기반으로 하는 REGN1979(문헌[Clin Trans Immunol. 2015; 4: e31]) 등을 포함한다.
CD20XCD3 이중특이성 분자는 B 세포에 발현되는 CD20 및 T 세포에 제시되는 CD3ε 쇄(CD3e)를 표적으로하는 T 세포 이중특이성(TCB) 항체이다. CD20XCD3 이중특이성 분자의 작용의 메커니즘은 CD20+ B 세포 및 CD3+ T 세포에 동시적으로 결합하는 것을 포함하여 T 세포의 활성화 및 T 세포-매개되는 B 세포 살해를 유도한다.
정상 면역 반응 동안, TCR은, 낮은 친화도(약 1 내지 100 μM)로, 형질감염된 세포 또는 돌연변이 세포 상의 외인성 펩티드-인간 백혈구 항원(HLA) 복합체에 결합하고 CD3을 통해 핵으로 활성화 신호를 전달하여, 전사 인자 및 이의 다운스트림 단백질(사이토카인, 그랜자임, 퍼포린 등)의 발현을 활성화시키고, TCR 복합체에 의해 생성되는 신호의 강도는 T 세포의 운명을 결정할 것이다. 신호 변환 복합체의 ε, γ, δ, 및 ζ 서브유닛(subunit)은 서로 회합되어 CD3ε-γ 이종이량체, CD3ε-δ 이종이량체, 및 CD3ζ-ζ 동종이량체를 형성한다. 그러나, 초기 개발된 CD3 이중특이성 항체의 대부분은 높은 친화도를 갖는 소수의 뮤린 항체 예컨대 OKT3, L2K, UCHT1 및 TR66을 기반으로 하였다. 임상 연구를 통해, CD3-특이성 항체의 지나치게 높은 친화도가 t 세포의 과활성화 및 다량의 사이토카인의 방출을 야기하여 사이토카인 스톰(storm) 증후군을 형성하는 한편, 또한, 높은 친화도가 2차 림프 기관 내의 이중 특이성 항체의 농축을 야기하여 종양 조직 내에서의 노출을 감소시키는 것이 밝혀졌다. 항체의 Fc 부분의 Fcγ 수용체 결합 능력은 약물 안정성에 영향을 주는 또다른 중요 인자인데, 이는, Fc를 통해 세포 막 상의 Fcγ 수용체로의 이중특이성 항체 후, Fcγ 수용체가 다수의 정상 조직에 발현되어, 다른 단부에 결합된 CD3 수용체의 가교-연결(cross-linking) 및 활성화가 Fcγ 수용체의 응집에 의해 야기되어 심한 표적외(off-target) 독성을 야기할 것임에 기인한다. 예를 들어, 조기 승인된 카투막소맙은 간 쿠퍼(Kupffer) 세포에 의해 발현되는 Fcγ 수용체에 대한 Fc 단편의 결합에 기인하여 사이토카인의 신속한 방출을 촉발한다. 약한 Fcγ 수용체 결합 능력을 갖는 인간 IgG2 서브타입 또는 IgG4 서브타입이 사용되거나, CH2 상의 상응하는 자리에서 추가의 아미노산이 치환되는데, 예컨대 아머(Armour) 등은 IgG1 및 IgG4과 상응하는 IgG2 서열 상의 제233(EU 서열 일련 번호) 자리를 제236 자리로 치환하여 Fcγ 수용체에 대한 결합을 감소시키고(문헌[Eur. J. Immunol. 1999]), 뉴먼(Newman) 등은 Ser228Pro 및 Leu235Glu를 IgG4로 도입하여 IgG4 구조를 안정화시키는 동시에 Fcγ 수용체에 대한 결합을 감소시키고(문헌[Clin Immunol. 2001]), 이두서지(Idusogie) 등은 Asp270, Lys322, Pro329 또는 Pro331을 Ala로 치환하는 것이 상보적 C1q에 대한 IgG1의 결합을 감소시킬 수 있음을 밝혔다(문헌[J Immunol. 2000]).
선행기술의 문제들을 해결하기 위해, 본 발명은 전장 IgG 구성을 채용하는 신규한 CD20-CD3 κλ 이중특이성 항체를 제공한다. 전하의 도입 및 친화도의 최적화를 통해, κλ 이중특이성 항체는 CD20+ 종양 조직에 선호적으로 국소화되고, 저 농도로 T 세포를 채용 및 활성화시켜 효과적으로 표적 세포를 사살할 수 있고, 표적 세포가 없는 경우에는 T 세포를 활성화시키지 않을 것인 한편, κλ 이중특이성 항체는 수용체, 예컨대 FcγRI, FcγRIIA, 및 FcγRIIIA에 결합하지 않아 사이토카인 스톰의 위험을 감소시킬 것이다. 극도로 낮은 용량의 신규한 CD20-CD3 κλ 이중특이성 항체를 검증하는 효능 시험은 면역 재구성된 마우스에서 종양 성장을 억제하고 이식 종양의 성장을 효과적으로 억제할 수 있다. 시노몰거스 원숭이에서의 독성학 연구는 또한 신규한 CD20-CD3 κλ 이중특이성 항체가 동물에 의해 잘 관용되고 저-용량 조건 하에 B 세포를 효과적으로 제거할 수 있고, 신규한 CD20-CD3 κλ 이중특이성 항체의 효능 및 안정성이 유사한 항체의 것보다 우수함을 밝혔다.
따라서, 본 발명은 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 전술한 양상의 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 암호화하는 핵산을 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 전술한 양상의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 전술한 양상의 핵산 또는 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
전술한 양상 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 부분에 따라, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 인간화된다.
한 양상에서, 본 발명은 전술한 양상 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 부분 또는 상기 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 암호화하는 핵산 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물 또는 키트를 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 치료 모이어티(therapeutic moiety)에 공유결합으로 부착되는 전술한 양상 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 이중특이성 또는 다중특이성 분자를 포함하는 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate)를 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 CD20-관련 질환을 치료하는 방법을 제공한다: 치료 효과량의 전술한 양상 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 핵산, 벡터, 세포 및/또는 약학 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계.
한 양상에서, 본 발명은 포유동물에서 CD20-관련 질환을 치료하기 위한 약물 또는 키트의 제조에서의 전술한 양상 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 핵산, 벡터, 세포 및/또는 약학 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 항체는 다양한 적용례, 예컨대 CD20 단백질의 검출, 및 CD20-관련 질환의 진단, 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
도 1은 인간 및 원숭이 CD20으로 안정하게 형질감염된 세포(인간 CD20으로 안정하게 형질감염된 세포(CHO-hCD20-3G6) 및 원숭이 CD20으로 안정하게 형질감염된 세포(CHO-cyCD20-1G9) 둘 다 높은 수준의 CD20을 발현함)의 결과를 도시한 것이다.
도 2는 재조합 CD3εγ-Fc 단백질의 SDS-PAGE 결과를 도시한 것이다.
도 3은 인간화된 CD3 항체의 재조합 CD3εγ-Fc 단백질에 대한 결합을 도시한 것이다.
도 4는 인간화된 CD3 항체의 Jurkat 세포에 대한 결합을 도시한 것이다.
도 5는 인간화된 CD20 항체의 Raji 세포에 대한 결합을 도시한 것이다.
도 6은 인간화된 CD20 항체의 Daudi 세포에 대한 결합을 도시한 것이다.
도 7은 CD20XCD3 항체 조합의 Raji 세포에 대한 결합을 도시한 것이다.
도 8은 CD20XCD3 항체 조합의 Jurkat 세포에 대한 결합을 도시한 것이다.
도 9는 상이한 CD20XCD3 항체 조합의 Raji 세포에 대한 살해 활성 및 T 세포의 활성화를 도시한 것으로서, 도 9A는 TDCC 살해 효과가 상이한 CD20XCD3 항체 조합에 의해 매개됨을 도시하고, 도 9B는 CD20XCD3 항체 조합이 TDCC 살해 동안 T 세포 활성화 마커 CD69 및 CD25의 상향조절을 자극할 수 있음을 도시한다.
도 10은 상이한 CD20XCD3 항체 조합에 의한 NFAT 경로의 특이적 활성화를 도시한 것이다.
도 11은 본 발명의 CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체를 도시한 것이다.
도 12는 CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체의 모세관 전기영동 결과를 도시한 것이다.
도 13은 CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체의 정제를 도시한 것이다.
도 14는 CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체의 질량 스펙트럼 분석 결과를 도시한 것이다.
도 15는 D20XCD3 κλ 이중특이성 항체의 CD20으로 안정하게 형질감염된 세포에 대한 결합을 도시한 것이다.
도 16는 CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체가 높은 친화도로 CD20+ 종양 세포에 결합함을 도시한 것이다.
도 17은 CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체의 재조합 인간 및 시노몰거스 원숭이 CD3εγ 항원에 대한 결합을 도시한 것이다.
도 18은 CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체의 Jurkat 세포에 대한 결합을 도시한 것이다.
도 19는 CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체의 인간 말초 혈액 T 세포에 대한 결합을 도시한 것이다.
도 20은 Nalm-6 세포의 살해 및 CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체에 의한 T 세포의 활성화를 도시한 것으로서, 도 20A는 Nalm-6 세포의 살해를 도시하고, 도 20B는 T 세포의 활성화를 도시한다.
도 21은 TMD-8 세포의 살해 및 CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체에 의한 T 세포의 활성화를 도시한 것으로서, 도 21A은 TMD-8 세포의 살해를 도시하고, 도 21B는 T 세포의 활성화를 도시한다.
도 22는 Toledo 세포의 살해 및 CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체에 의한 T 세포의 활성화를 도시한 것으로서, 도 22A는 Toledo 세포의 살해를 도시하고, 도 22B는 T 세포의 활성화를 도시한다.
도 23은 CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체에 의한 T 세포의 활성화 신호전달 경로를 도시한 것이다.
도 24 내지 도 26은 CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체가 사이토카인의 방출을 활성화함을 도시한 것으로서, 도 24는 상기 과정 중 CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체의 Raji 세포 및 T 세포의 활성화에 대한 TDCC 활성을 도시하고, 도 25는 상기 과정 중 CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체 및 T 세포의 활성화에 의한 자가 B 세포의 제거를 도시하고, 도 26은 Raji 세포의 살해 및 자가 B 세포의 제거 동안 관련된 사이토카인의 방출을 도시한 것이다.
도 27은 CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체의 피하 Raji 이식 종양의 면역결핍 마우스 모델에 대한 억제 효과를 도시한 것이다.
도 28 및 도 29는 CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체의 인간 PBMC 및 Raji로 접종된 피하 이식 종양의 면역결핍 마우스 모델에 대한 억제 효과를 도시한 것이다.
도 30은 시노몰거스 원숭이 B 세포가 CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체의 투여 후 빠르게 제거됨을 도시한 것이다.
I. 정의
본 발명에서, 달리 특정되지 않는 한, 본원에 사용된 과학 및 기술 용어는 당업자에게 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 또한, 본원에 사용된 단백질 및 핵산 화학, 분자 생물학, 세포 및 조직 배양, 미생물학 및 면역학-관련 용어 및 실험 절차는 상응하는 분야에 널리 사용되는 용어 및 통상적인 절차이다. 한편, 본 발명을 더 잘 이해하기 위해, 관련 용어의 정의 및 설명이 하기 제공된다.
CD20(B 림프구 항원 CD20, B 림프구 표면 항원 B1, Leu-16, Bp35, BM5 또는 LF5로 지칭됨; 유니프롯(UniProt) 데이터베이스 엔트리(entry) P11836에 특성규명된 인간 단백질)은 전구체 B 및 성숙 B 림프구 상에 발현되고 약 35 Kd의 분자량을 갖는 소수성 막관통 단백질이다(문헌[Valentine, M.A. et al., J. Biol. Chem. 264 (1989) 11282-11287]; [Tedder, T.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (1988) 208-212]; [Stamenkovic, I. et al., J. Exp. Med. 167 (1988) 1975-1980]; [Einfeld, D.A. et al., EMBO J. 7 (1988) 711-717]; [Tedder, T.F. et al., J. Immunol. 142 (1989) 2560-2568]). 상응하는 인간 유전자는 막-스패닝(spanning) 4-도메인, 서브패밀리 A, 멤버 1(MS4A1로도 지칭됨)이다. 상기 유전자는 막-스패닝 4A 유전자 패밀리의 멤버를 암호화한다. 초기 단백질 패밀리의 멤버는 공통의 구조적 특징 및 유사한 인트론/엑손 스플라이스 경계에 의해 특성규명되고, 조혈 세포 및 비-림프 조직 사이에서의 특유의 발현 패턴을 나타낸다. 상기 유전자는 B 세포의 형질 세포로의 발달 및 분화에 중요한 역할을 하는 B 림프구 표면 분자를 암호화한다. 패밀리 멤버는 패밀리 멤버들의 클러스터 사이에서 11q12에 국소화된다. 상기 유전자의 대체(alternative)의 스플라이싱은 동일한 단백질을 암호화하는 2개의 전사 변이체를 야기한다.
본원에 사용된 용어 "CD20"은 달리 특정되지 않는 한 임의의 척추동물, 예컨대 포유동물, 예를 들어 영장류(예컨대 인간) 및 설치류(예컨대 마우스 및 래트)를 지칭한다. 용어는 세포로부터 유래된 미가공된 CD20 및 임의의 형태의 가공된 CD20을 포괄한다. 또한, 상기 용어는 CD20의 자연 발생 변이체, 예컨대 스플라이스 변이체 및 대립 유전자 변이체를 포괄한다. 한 양태에서, CD20은 인간 CD20이다. 인간 CD20의 예시적인 아미노산 서열은 서열번호 1이다.
용어 "항-CD20 항체" 및 "CD20-결합 항체"는 항체가 진단 및/또는 치료제로서 CD20을 표적적으로 하기에 유용하도록 하는 충분한 친화도로 CD20에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 한 양태에서, 항-CD20 항체의 비-관련 비-CD20 단백질에 결합하는 능력은 상기 항체의 CD20에 결합하는 능력의 약 10% 미만이고, 이는 예를 들어 방사능면역분석(RIA)에 의해 측정된다. 특정 양태에서, CD20-결합 항체는 해리 상수(Kd) ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM 또는 ≤0.001 nM(예컨대 10-8 M 또는 예컨대 10-8 내지 10-13 M, 및 10-9 내지 10-13 M)을 갖는다. 특정 양태에서, 항-CD20 항체는 상이한 종으로부터의 CD20 사이에서도 보존적 CD20 에피토프에 결합한다.
"CD3"은 달리 특정되지 않는 한 임의의 척추동물, 예컨대 포유동물, 예를 들어 영장류(예컨대 인간), 비-인간 영장류(예컨대 마카카 파시큘라리스(Macaca fascicularis)) 및 설치류(예컨대 마우스 및 래트)로부터의 임의의 자연 CD3를 지칭한다. 상기 용어는 세포로부터 유래된 미가공된 CD3 및 임의의 형태의 가공된 CD3을 포괄한다. 또한, 상기 용어는 CD3의 자연 발생 변이체, 예컨대 스플라이스 변이체 및 대립 유전자 변이체를 포괄한다. 한 양태에서, CD3은 인간 CD3, 특히 인간 CD3의 ε 서브유닛(CD3ε)이다. 인간 CD3ε의 아미노산 서열은 유니프롯(www.uniprot.org) 접근 번호 P07766(버전 144) 또는 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_000724.1에 제시되어 있다. 시노몰거스 원숭이 CD3ε의 아미노산 서열은 NCBI 진뱅크(GenBank) 번호 BAB71849.1에 제시되어 있다.
용어 "세포 표면"은 당업계에서 이의 통상적인 의미에 따라 사용되고, 따라서, 단백질 및 다른 분자에 대한 결합을 통해 접근가능한 세포의 외부를 포함한다.
본원에 사용된 달리 특정되지 않는 한, 용어 "약" 또는 "대략"은 제시된 값 또는 범위의 + 또는 - 10% 이내를 의미힌다. 정수가 요구되는 경우, 상기 용어는 제시된 값 또는 범위의 + 또는 - 10% 이내의 가장 가까운 정수로 올림 또는 내림된다.
항체 쇄 폴리펩티드 서열과 관련하여, 상기 어구는 참조 폴리펩티드 서열에 대해 항체 쇄의 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성으로서 이해되는 바와 실질적으로 동일하다. 핵산 서열과 관련하여, 상기 용어는 참조 핵산 서열에 대해 뉴클레오티드 서열의 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%를 초과하거나 그 이상의 서열 동일성으로서 이해되는 바와 실질적으로 동일하다.
서열 "동일성"은 당업계에서 인식되는 의미를 갖고, 2개의 핵산 또는 폴리펩티드 분자 또는 영역 사이의 서열 동일성의 %는 개시된 기술에 의해 계산될 수 있다. 서열 동일성은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전장을 따라 또는 분자의 영역을 따라 측정될 수 있다. 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 사이의 동일성을 측정하는 다수의 방법이 존재하지만, 용어 "동일성"은 당업자에게 주지되어 있다(문헌[Carrillo, H. & Lipman, D., SIAM J Applied Math 48: 1073 (1988)]).
"치환" 변이체는 서열로부터 하나 이상의 아미노산 잔기를 제거하고 동일한 자리에 상이한 아미노산을 삽입함에 의해 수득되는 변이체를 지칭한다. 치환은 단일 치환이거나(즉 분자에서 단 1개의 아미노산이 치환됨), 치환은 다중 치환일 수 있다(동일한 분자 내의 2개 이상의 아미노산이 치환됨). 다중 치환은 연속적인 자리에 있을 수 있다. 유사하게, 아미노산은 다수의 잔기로 치환될 수 있고, 따라서, 이러한 변이체는 치환 및 삽입을 포함한다. 삽입 변이체는 자연 서열에서 특정 자리의 아미노산에 바로 인접한 하나 이상의 아미노산을 삽입함으로써 수득되는 변이체이다. "아미노산에 바로 인접한"은 아미노산의 α-카복실 또는 α-아미노 작용기에 의한 연결을 의미한다. "결실" 변이체는 자연 아미노산 서열로부터 하나 이상의 아미노산을 제거함으로써 수득되는 변이체를 지칭한다. 통상적으로, 결실 변이체는 이의 분자의 특정 영역 내에 1 또는 2개의 아미노산을 갖는다.
항체의 가변 도메인과 관련하여, 용어 "가변"은 항체 사이에 광범위한 서열 차이를 갖는 관련 분자의 특정 부분을 지칭하고, 특이적 항체의 이의 특이적 표적에 대한 특이적 인식 및 결합에 사용된다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 걸쳐 균일하게 분포되지는 않는다. 가변성은 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인 내에 위치하는 상보성-결정 영역(CDRs; 즉 CDR1, CDR2, 및 CDR3) 또는 초가변 영역으로 공지되어 있는 3개의 분절 내에 집중되어 있다. 가변 도메인 내의 더 보존적인 부분은 프레임워크 영역(FR) 또는 프레임워크 서열로서 지칭된다. 자연 중쇄 또는 경쇄의 각각의 가변 도메인은 4개의 FR을 포함하고, 이는 주로 β-폴딩된 구성을 채용하고 3개의 CDR을 통해 함께 연결되고, CDR은 루프(loop)를 형성하고, 루프는 β-폴딩된 구성과 연결되고 특정 경우 β-폴딩된 구성의 부분을 형성한다. 각각의 쇄의 CDR은 통상적으로 FR 영역에 의해 인접하게 연결되고, 다른 쇄로부터의 CDR에 기인하여 항체의 표적 결합 자리(에피토프 또는 결정인자)의 형성에 기여한다. 본원에 사용된 면역글로불린의 아미노산 잔기의 넘버링(numbering)은 달리 특정되지 않는 한 카밧(Kabat) 등에 의해 개발된 면역글로불린의 아미노산 잔기의 넘버링 시스템에 근거한다. CDR은 동계(cognate) 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 가질 수 있다. 본원에 사용된 "항체 단편" 또는 항체의 "항원-결합 단편"은, 전장 항체보다 짧고, 항원에 결합하는 항체의 부분적인 가변 영역(예컨대 하나 이상의 CDRs 및/또는 하나 이상의 항체-결합 자리)을 적어도 포함하고, 따라서, 결합 특이성 및 전장 항체의 적어도 부분적인 특이적 결합 능력을 보유하는, 전장 항체의 임의의 부분을 지칭한다. 따라서, 항원-결합 단편은 항체 단편이 유래되는 항체와 동일한 항원에 결합하는 항원-결합 부분을 포함하는 항체 단편을 지칭한다. 항체 단편은 전장 항체의 효소적 처리에 의해 생성되는 항체 유도체, 및 합성된 유도체, 예컨대 재조합 유도체를 포함한다. 항체는 항체 단편을 포함한다. 항체 단편의 예는 비제한적으로 Fab, Fab', F(ab')2, 단일-가닥 Fv(scFv), Fv, dsFv, 이중 항체, Fd 및 Fd' 단편, 및 기타 단편(개질된 단편 포함)을 포함한다. 단편은, 예컨대 다이설파이드 결합 및/또는 펩티드 어댑터를 통해 함께 연결되는 다중 쇄를 포함할 수 있다. 일반적으로, 항체 단편은 약 50개 이상의 아미노산, 전형적으로 약 200개 이상의 아미노산을 포함한다. 항원-결합 단편은 임의의 항체 단편을 포함하고, 이는 항체 프레임워크에 (예컨대 상응하는 영역을 대체함으로써) 삽입되어 항원에 특이적으로 결합하는(즉 약 107 내지 108M-1의 Ka로 결합하는) 항체가 수득된다. "작용성 단편" 또는 " 항-CD20 항체의 유사체"는 리간드에 결합하거나 신호 변환을 개시하는 수용체의 능력을 방지 또는 실질적으로 감소시킬 수 있는 단편 또는 유사체이다. 일반적으로, 본원에 사용된 작용성 단편은 항체 단편과 동일한 의미를 갖고, 항체와 관련하여, 이는 수용체가 리간드에 결합하는 것 또는 신호 변환을 개시하는 것을 방지하거나, 리간드에 결합하거나 신호 변환을 개시하는 수용체의 능력을 실질적으로 감소시킬 수 있다. Fv 단편은 중쇄의 가변 도메인과 경쇄의 가변 영역의 비-공유 결합에 의해 형성된 이량체(VH-VL 이량체)로 구성된다. 이러한 구성에서, 3개의 각각의 가변 도메인의 3개의 CDR은 온전한 항체의 경우에서와 같이 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상의 표적 결합 자리를 정의한다. 6개의 CDR은 함께 표적 결합 특이성을 온전한 항체에 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인(또는 3개의 표적-특이성 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)은 표적을 인식하고 이에 결합하는 능력을 여전히 가질 수 있다.
본원에 사용된 용어 "이중특이성 항체(BsAb)"는 2개의 상이한 항원 결정인자에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 및/또는 항원-결합 분자를 지칭하고, 통상적으로, 이중특이성 항체 및/또는 항원-결합 분자는 각각이 상이한 항원 결정인자에 특이적인 2개의 항원-결합 자리를 포함한다. 특정 양태에서, 이중특이성 항체 및/또는 항원-결합 분자는 동시에 2개의 항원 결정인자, 특히 2개의 상이한 유형의 세포에 발현된 2개의 항원 결정인자에 결합할 수 있다.
본원에 사용된 "단클론 항체"는 동일한 항체의 집단을 지칭하고, 이는 단클론 항체의 집단 내의 각각의 개별 항체 분자가 다른 항체 분자에 동일함을 의미한다. 이러한 특징은, 다양한 상이한 서열을 갖는 항체를 포함하는 항체의 다클론 항체의 집단의 특징과는 대조적이다. 단클론 항체는 다수의 주지된 방법에 의해 제조될 수 있다(문헌[Smith et al. (2004) J.Clin. Pathol. 57, 912-917]; 및 [Nelson et al., J Clin Pathol (2000), 53, 111-117]). 예컨대, 단클론 항체는 B 세포를 불멸화(immortalizing)하여, 예컨대 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마 세포를 생성하거나 B 세포를 바이러스, 예컨대 EBV에 의해 감염시킴으로써 제조될 수 있다. 또한, 재조합은 항체를 암호화하는 뉴클레오티드의 인공 서열을 보유하는 플라스미드에 의해 형질전환시킴으로써 숙주 세포의 단클론 집단으로부터 항체를 시험관 내 제조하는 데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "하이브리도마" 또는 "하이브리도마 세포"는 항체를 생성하는 림프구와 항체를 생성하지 않는 암세포를 융합함으로써 생성된 세포 또는 세포주(통상적으로 골수종 또는 림프종 세포)를 지칭한다. 당업자에게 공지되어 있는 바와 같이, 하이브리도마는 증식하고, 특이적 단클론 항체를 계속하여 공급 및 생성할 수 있다. 하이브리도마를 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 용어 "하이브리도마" 또는 "하이브리도마 세포"로 지칭되는 경우, 이는 또한 하이브리도마의 서브클론 및 자손 세포를 포함한다.
본원에 사용된 전장 항체는 2개의 전장 중쇄(예컨대 VH-CH1-CH2-CH3 및 VH-CH1-CH2-CH3-CH4), 2개의 전장 경쇄(VL-CL), 및 힌지 영역를 갖는 항체, 예컨대 항체-분비 B 세포에 의해 자연적으로 생성된 항체 및 동일한 도메인을 갖는 합성된 항체이다.
용어 "키메라 항체"는 종으로부터 유도된 가변 영역 서열 및 다른 종으로부터 유래된 불변 영역 서열을 포함하는 항체를 지칭한다. 예컨대, 가변 영역 서열은 마우스 항체로부터 유래되고, 불변 영역 서열은 인간 항체로부터 유래된다.
"인간화된" 항체는, 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 포함하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 이의 단편(예컨대 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 서브서열)인, 비-인간(예컨대 마우스) 항체 형태를 지칭한다. 바람직하게는, 인간화된 항체는 인간 면역글로불린(수용(recipient) 항체)이고, 수용 항체의 상보적 결정 영역(CDR) 내의 잔기는 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비-인간 종, 예컨대 마우스, 래트 및 토끼 내의 CDR 잔기로 치환된다.
또한, 인간화 동안, VH 및/또는 VL의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기는 돌연변이되어, 하나 이상의 결합 특징(예컨대 친화도)가 개선될 수 있다. 돌연변이는, 예컨대 PCR-매개되는 돌연변이를 수행함으로써 도입될 수 있고, 항체 결합 또는 기타 작용성 특징에 대한 이의 영향은 본원에 기재된 시험관 내 또는 생체 내 분석을 사용하여 평가될 수 있다. 통상적으로, 보존적 돌연변이가 도입된다. 이러한 돌연변이는 아미노산 치환, 첨가 또는 결실일 수 있다. 또한, 통상적으로, CDR 내에 1 또는 2개가 넘는 돌연변이가 존재하지 않는다. 따라서, 본 발명의 인간화된 항체는 또한 CDR이 1 또는 2개의 아미노산 돌연변이를 포함하는 항체를 포괄한다.
본원에 사용된 용어 "CDR"은 상보성-결정 영역을 지칭하고, 공지된 항체 분자의 각각의 중쇄 또는 경쇄는 항체의 각각의 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역 내에 존재하는 초가변 영역으로서 지칭되고, CDR의 1차 구조는 매우 높은 가변성을 갖는 자리를 갖는다. 상기 설명에서, 중쇄의 CDR은 중쇄의 아미노-말단 서열의 아미노-말단으로부터 유래되는 CDR1, CDR2, 및 CDR3으로 대표되고, 경쇄의 CDR은 경쇄의 아미노-말단 서열의 아미노-말단으로부터 유래되는 CDR1, CDR2, 및 CDR3에 의해 대표된다. 이러한 자리는 3차 구조에서 서로 인접하고, 항체가 결합하는 항원의 특이성을 결정한다.
본원에 사용된 용어 "에피토프"는 항체의 파라토프가 결합하는 항원 상의 임의의 항원 결정인자를 지칭한다. 에피토프 결정인자 통상적으로 화학적 활성 표면 유형의 분자, 예컨대 아미노산 및 당 측쇄를 포함하고, 통상적으로, 특이적 3차원 구조 특징 및 특이적 전하 특징을 갖는다.
본원에 사용된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 "특이적 결합" 또는 "면역특이적 결합"은 본원에서 상호대체가능하고, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 항체와 항원의 항체-결합 자리의 비-공유 상호작용을 통해 동일한 항원과의 하나 이상의 비-공유 결합을 형성하는 능력을 지칭한다. 항원은 분리된 항원이거나, 종양 세포 내에 존재할 수 있다. 통상적으로, 항원에 면역특이적으로 결합하는(또는 특이적으로 결합하는) 항체는 항원에 약 1x107 M-1 또는 1x108 M-1 또는 그 초과의 친화도 상수 Ka(또는 1x10-7 M 또는 1x10-8 M 또는 그 미만의 해리 상수(Kd))로 결합한다. 친화도 상수는 항체 반응에 대한 표준적인 동적 방법, 예컨대 면역분석, 표면 플라즈몬 공명(SPR)([Rich and Myszka (2000) Curr. Opin. Biotechnol 11: 54]; 및 [Englebienne (1998) Analyst. 123: 1599]), 등온 적정 열량분석(ITC), 및 당업계에 공지된 다른 동역학적 상호작용에 의해 측정될 수 있다(또한, 항체의 결합 친화도를 계산하는 예시적인 SPR 및 ITC가 기재된 US7,229,619를 참조함). 결합률의 실시간 검출 및 모니터링을 위한 계기 및 방법은 공지되어 있고 상업적으로 이용가능하다(문헌[BiaCore 2000, Biacore AB, Upsala, Sweden and GE Healthcare Life Sciences]; [Malmqvist (2000) Biochem. Soc. Trans. 27: 335] 참조).
본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산 분자"는 통상적으로 포스포다이에스터 결합을 통해 함께 연결된 2개 이상의 연결된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체, 예컨대 데옥시리보헥산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함하는 올리고머 또는 중합체를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하도록 의도된다. DNA 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있고, Cdna일 수 있다.
본원에 사용된 분리된 핵산 분자는 핵산 분자의 자연 공급원 중 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리된 핵산 분자이다. "분리된" 핵산 분자, 예컨대 cDNA 분자는 재조합에 의해 제조될 때 다른 세포 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없거나, 화학적으로 합성될 때 화학 전구체 또는 다른 화학 성분이 실질적으로 없는 것일 수 있다. 본원에 제공된 예시적인 분리된 핵산 분자는 제공되는 항체 또는 항원-결합 단편을 암호화하는 분리된 핵산 분자를 포함한다.
본원에 사용된 핵산 서열, 영역, 요소 또는 도메인의 "작동적으로 연결되는"은 핵산 영역이 서로 작용적으로 관련됨을 의미한다. 예컨대, 프로모터는 프로모터가 핵산의 전사를 조절하거나 매개하도록 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 작동적으로 연결될 수 있다.
본원에서의 서열목록에서의 서열의 "보존적 서열 변형", 즉 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되거나 항원에 대한 아미노산 서열을 포함하는 항체의 결합을 제거하지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 변형이 또한 제공된다. 이러한 보존적 서열 변형은 보존적 뉴클레오티드 및 아미노산 치환, 뉴클레오티드 및 아미노산 첨가, 및 결실을 포함한다. 예컨대, 변형은 당업계에 공지된 표준적인 기술(예컨대 자리-유도되는 돌연변이생성 및 PCR-매개되는 돌연변이생성)에 의해 본원의 서열목록에 도입될 수 있다. 보존적 서열 변형은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환되는 아미노산 치환을 포함한다. 동일한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 정의되어 있다. 상기 패밀리는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예컨대 라이신, 아르기닌 및 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예컨대 아스파트산 및 글루탐산), 비-하전된 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예컨대 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인 및 트립토판), 비-극성 측쇄를 갖는 아미노산(예컨대 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌 및 메티오닌), β 분지 측쇄를 갖는 아미노산(예컨대 트레오닌 발린 및 이소류신), 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예컨대 티로신, 페닐알라닌, 트립토판 및 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 항-CD20 항체 내의 예측되는 비-필수 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 또다른 아미노산 잔기로 치환된다. 항원에 대한 결합을 제거하지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 보존적 치환을 확인하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어 문헌[Brummell et al., Biochem. 32: (1180-1187 (1993))]; [Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999)]; [Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417 (1997)] 참고).
또다른 옵션으로서, 또다른 양태에서, 돌연변이는, 예컨대 포화 돌연변이생성에 의해 항-CD20 항체의 전부 또는 부분 코딩 서열을 따라 무작위로 도입될 수 있고, 수득된 변형된 항-CD20 항체는 개선된 결합 활성에 대해 스크리닝될 수 있다.
본원에 사용된 "발현"은 폴리뉴클레오티드의 전사 및 번역에 의한 폴리펩티드의 생성 과정을 지칭한다. 폴리펩티드의 발현 수준은 당업계에 공지된 임의의 방법, 예컨대 숙주 세포에 의해 생성된 폴리펩티드의 양의 측정 방법에 의해 평가될 수 있다. 이러한 방법은 비제한저으로 ELISA에 의한 세포 용해물 중 폴리펩티드의 정량분석, 겔 전기영동 후 쿠마시 블루 염색, 로리(Lowry) 단백질 분석, 및 브래드포드(Bradford) 단백질 분석을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "숙주 세포"는 벡터를 수용, 유지, 복제 및 증폭하기 위한 세포이다. 또한, 숙주 세포는 벡터에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 발현하는 데 사용될 수 있다. 숙주 세포가 분할할 때, 벡터에 포함된 핵산은 상기 핵산이 증폭되도록 복제될 수 있다. 숙주 세포는 진핵 세포 또는 원핵 세포일 수 있다. 적합한 숙주 세포는 비제한적으로 CHO 세포, 다양한 COS 세포, HeLa 세포, 및 HEK 세포 예컨대 HEK 293 세포를 포함한다.
본원에 사용된 "벡터"는 복제가능한 핵산이고, 이로부터 하나 이상의 이종 단백질이, 벡터가 적절한 숙주 세포로 형질전환될 때 발현될 수 있다. 벡터는 폴리펩티드 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산이, 통상적으로 제한 소화(restriction digestion) 및 리게이션(ligation)에 의해 도입될 수 있는 이러한 벡터를 포함한다. 또한, 벡터는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 이러한 벡터를 포함한다. 벡터가 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 숙주 세포로 도입하는 데 사용되어, 핵산을 증폭하거나 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 발현/디스플레잉(displaying)한다. 통상적으로, 벡터는 자유롭되, 게놈의 염색체로 유전자 또는 이의 부분의 통합을 허용하도록 설계될 수 있다. 인공 염색체, 예컨대 효모 인공 벡터 및 포유동물 인공 염색체를 위한 벡터가 고려된다. 이러한 중간물(intermedium)의 선택 및 사용은 당업자에게 주지되어 있다.
또한, 본원에 사용된 벡터는 "바이러스 벡터" 또는 "바이러스의 벡터"를 포함한다. 바이러스의 벡터는 외인성 유전자를 (중간물 또는 셔틀(shuttle)로서) 세포에 전달하도록 외인성 유전자에 작동적으로 연결되는 조작된 바이러스이다.
본원에 사용된 "발현 벡터"는 DNA를 발현할 수 있는 벡터를 포함하고, DNA는 이러한 DNA 단편, 예컨대 프로모터에 영향을 줄 수 있는 조절성 서열에 작동적으로 연결된다. 이러한 추가적인 단편은 프로모터 및 터미네이터 서열을 포함할 수 있고, 임의적으로, 하나 이상의 복제 원점, 하나 이상의 선택가능한 마커, 인핸서, 폴리아데닐화 신호 등을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 통상적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나, 둘 다의 요소를 포함할 수 있다. 따라서, 발현 벡터는 재조합 DNA 또는 RNA 구축물, 예컨대 플라스미드, 파지, 재조합 바이러스 및 기타 벡터를 지칭하고, 이는 적절한 숙주 세포에 도입될 때 클로닝된 DNA를 발현한다. 적절한 발현 벡터는 당업자에게 주지되어 있고, 진핵 세포 및/또는 원핵 세포 내에 복제될 수 있는 발현 벡터, 자유 발현 벡터, 및 숙주 세포의 게놈으로의 통합을 위한 발현 벡터를 포함한다.
본원에 사용된 개체의 질환 또는 병태의 "치료"는 개체의 증상이 부분적으로 또는 완전히 완화되거나, 치료 후 불변으로 남아 있음을 의미한다. 따라서, 치료는 예방, 치료 및/또는 치유를 포함한다. 예방은 기저 질환의 방지 및/또는 증상 악화 또는 질환 달달의 방지를 지칭한다. 또한, 치료는 본원에 제공되는 임의의 제공되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 조성의 임의의 약학적 사용을 포함한다.
본원에 사용된 "치료 효과"는 개체의 치료로부터 야기되는 효과를 의미하고, 이는 질환 또는 병태의 증상을 변경, 통상적으로 완화시키거나, 질환 또는 병태를 치유한다.
본원에 사용된 "치료 효과량" 또는 "치료 효과 용량"은 대상에게 투여될 ?? 치료 효과를 생성하기에 적어도 충분한 물체(substance), 화합물, 물질 또는 화합물을 포함하는 조성물의 양을 지칭한다. 따라서, 이는 질환 또는 장에의 증상을 예방, 치유, 경감, 정지 또는 부분적으로 정지시킴에 필요한 양이다.
본원에 사용된 "예방 효과량" 또는 "예방 효과 용량"은 대상에게 투여될 때 목적하는 예방적 효과, 예컨대 질환 또는 증상의 개시 또는 재발을 방지하거나 지연시키는 것, 및 질환 또는 증상의 개시 또는 재발의 가능성을 감소시키는 것을 갖는, 물체, 화합물, 물질, 또는 화합물을 포함하는 조성물의 양을 지칭한다. 완전 예방 효과 용량이 하나의 용량을 투여함에 의해 발생할 필요는 없고, 일련의 투여 후에만 발생할 수 있다. 따라서, 예방 효과량은 하나 이상의 투여로 투여될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "환자"는 포유동물, 예컨대 인간을 지칭한다.
II. 특이적 양태의 상세한 설명
한 양상에서, 본 발명은 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제공하고, 이는 표적 세포의 표면 상의 CD20에 결합하는 제1 결합 도메인 및 T 세포의 표면 상의 CD3에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함한다. 제1 결합 도메인은 제1 경쇄 및 제1 중쇄를 포함하고, 제1 경쇄는 아미노산 서열 서열번호 56, 57, 58, 61, 62, 63, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 경쇄 CDR을 포함하고/하거나, 제1 중쇄는 아미노산 서열 서열번호 66, 67, 68, 71, 76, 77, 78, 85, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 중쇄 CDR을 포함한다.
전술한 양상의 항체 또는 이의 항원-결합 부분에 따라, 제1 결합 도메인의 제1 경쇄는 아미노산 서열 서열번호 56, 61, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 경쇄 CDR1, 아미노산 서열 서열번호 57, 62, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 경쇄 CDR2, 아미노산 서열 서열번호 58, 63, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 경쇄 CDR3을 포함하고/하거나; 제1 결합 도메인의 제1 중쇄는 아미노산 서열 서열번호 66, 76, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 중쇄 CDR1, 아미노산 서열 서열번호 67, 77, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 중쇄 CDR2, 아미노산 서열 서열번호 68, 71, 78, 85, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 중쇄 CDR3을 포함한다.
전술한 양상의 항체 또는 이의 항원-결합 부분에 따라, 제1 결합 도메인은 하기로부터 선택되는 경쇄 및 중쇄 CDR 조합을 포함한다:
(1) 각각 서열번호 56 내지 58을 포함하는 제1 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열번호 66 내지 68을 포함하는 제1 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
(2) 각각 서열번호 56 내지 58을 포함하는 제1 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열번호 66, 67 및 71을 포함하는 제1 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3;
(3) 각각 서열번호 61 내지 63을 포함하는 제1 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열번호 76 내지 78을 포함하는 제1 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열; 및
(4) 각각 서열번호 61 내지 63을 포함하는 제1 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및/또는 각각 서열번호 서열번호 76, 77 및 85를 포함하는 제1 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3.
전술한 양상의 항체 또는 이의 항원-결합 부분에 따라, 제1 결합 도메인은 아미노산 서열 서열번호 54, 59, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 경쇄 가변 영역, 및/또는 아미노산 서열 서열번호 64, 69, 72, 74, 79, 81, 83, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 양태에서, 제1 결합 도메인은 아미노산 서열 서열번호 54 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 64 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 양태에서, 제1 결합 도메인은 아미노산 서열 서열번호 54 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 69 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 양태에서, 제1 결합 도메인은 아미노산 서열 서열번호 54 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 72 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 양태에서, 제1 결합 도메인은 아미노산 서열 서열번호 59 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 74 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 양태에서, 제1 결합 도메인은 아미노산 서열 서열번호 59 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 79 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 양태에서, 제1 결합 도메인은 아미노산 서열 서열번호 59 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 81 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 양태에서, 제1 결합 도메인은 아미노산 서열 서열번호 59 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 83 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역을 포함한다.
전술한 양상의 항체 또는 이의 항원-결합 부분에 따라, 제2 결합 도메인은 아미노산 서열 서열번호 7, 14, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 제2 경쇄 CDR1, 아미노산 서열 서열번호 8, 15, 20, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 제2 경쇄 CDR2, 및 아미노산 서열 서열번호 9, 21, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 제2 경쇄 CDR3; 및/또는 아미노산 서열 서열번호 26, 31, 46, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 제2 중쇄 CDR1, 아미노산 서열 서열번호 27, 47, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 제2 중쇄 CDR2, 및 아미노산 서열 28, 34, 37, 40, 43, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 제2 중쇄 CDR3을 포함한다.
일부 양태에서, 제2 결합 도메인은 제2 경쇄 및 제2 중쇄를 포함하고, 제2 결합 도메인은 하기로부터 선택되는 경쇄 및 중쇄 CDR 조합을 포함한다:
(1) 각각 서열번호 7, 8 및 9를 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 26, 27 및 28을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
(2) 각각 서열번호 7, 8 및 9를 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 28을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
(3) 각각 서열번호 7, 8 및 9를 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 34를 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
(4) 각각 서열번호 7, 8 및 9를 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 37을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
(5) 각각 서열번호 7, 8 및 9를 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 40을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
(6) 각각 서열번호 7, 8 및 9를 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 43을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
(7) 각각 서열번호 7, 8 및 9를 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 46, 47 및 28을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
(8) 각각 서열번호 14, 15 및 9를 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 26, 27 및 28을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
(9) 각각 서열번호 14, 15 및 9를 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 28을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
(10) 각각 서열번호 14, 15 및 9를 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 34를 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
(11) 각각 서열번호 14, 15 및 9를 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 37을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
(12) 각각 서열번호 14, 15 및 9를 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 40을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
(13) 각각 서열번호 14, 15 및 9를 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 43을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
(14) 각각 서열번호 14, 15 및 9를 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 46, 47 및 28을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
(15) 각각 서열번호 7, 8 및 21을 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 26, 27 및 28을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
(16) 각각 서열번호 7, 8 및 21을 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 28을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
(17) 각각 서열번호 7, 8 및 21을 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 34를 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
(18) 각각 서열번호 7, 8 및 21을 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 37을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
(19) 각각 서열번호 7, 8 및 21을 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 40을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
(20) 각각 서열번호 7, 8 및 21을 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 43을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
(21) 각각 서열번호 7, 8 및 21을 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 46, 47 및 28을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
(22) 각각 서열번호 7, 20 및 21을 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 26, 27 및 28을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
(23) 각각 서열번호 7, 20 및 21을 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 28을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
(24) 각각 서열번호 7, 20 및 21을 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 34를 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
(25) 각각 서열번호 7, 20 및 21을 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 37을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
(26) 각각 서열번호 7, 20 및 21을 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 40을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
(27) 각각 서열번호 7, 20 및 21을 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 43을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
(28) 각각 서열번호 7, 20 및 21을 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 46, 47 및 28을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열.
일부 양태에서, 제2 결합 도메인은 아미노산 서열 서열번호 5, 10, 12, 16, 18, 22, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 경쇄 가변 영역, 및/또는 아미노산 서열 서열번호 24, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 48, 50, 52, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 양태에서, 제2 결합 도메인은 아미노산 서열 서열번호 5 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 48 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 양태에서, 제2 결합 도메인은 아미노산 서열 서열번호 5 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 50 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 양태에서, 제2 결합 도메인은 아미노산 서열 서열번호 10 및 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 50 및 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 양태에서, 제2 결합 도메인은 아미노산 서열 서열번호 12 및 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 50 및 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 양태에서, 제2 결합 도메인은 아미노산 서열 서열번호 18 및 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 24 및 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 양태에서, 제2 결합 도메인은 아미노산 서열 서열번호 18 및 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 48 및 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 양태에서, 제2 결합 도메인은 아미노산 서열 서열번호 18 및 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 50 및 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄 가변 영역을 포함한다.
전술한 양상의 항체 또는 이의 항원-결합 부분에 따라, 제1 경쇄는 서열번호 88, 96, 100, 102, 110, 118, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 경쇄를 포함하고, 제1 중쇄는 서열번호 86, 94, 98, 104, 112, 120, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 중쇄를 포함한다.
전술한 양상의 항체 또는 이의 항원-결합 부분에 따라, 제2 경쇄는 서열번호 92, 106, 114, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 경쇄를 포함하고, 제2 중쇄는 서열번호 90, 108, 116, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 중쇄를 포함한다.
일부 양태에서, 제1 결합 도메인은 아미노산 서열 서열번호 88 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 86 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄를 포함한다.
일부 양태에서, 제1 결합 도메인은 아미노산 서열 서열번호 96 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 94 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄를 포함한다.
일부 양태에서, 제1 결합 도메인은 아미노산 서열 서열번호 100 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 98 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄를 포함한다.
일부 양태에서, 제1 결합 도메인은 아미노산 서열 서열번호 102 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 104 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄를 포함한다.
일부 양태에서, 제1 결합 도메인은 아미노산 서열 서열번호 110 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 112 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄를 포함한다.
일부 양태에서, 제1 결합 도메인은 아미노산 서열 서열번호 118 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 120 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄를 포함한다.
일부 양태에서, 제2 결합 도메인은 아미노산 서열 서열번호 92 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 90 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄를 포함한다.
일부 양태에서, 제2 결합 도메인은 아미노산 서열 서열번호 106 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 108 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄를 포함한다.
일부 양태에서, 제2 결합 도메인은 아미노산 서열 서열번호 114 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 116 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄를 포함한다.
일부 양태에서, 이중특이성 항체는 아미노산 서열 서열번호 88 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄, 아미노산 서열 서열번호 86 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄, 아미노산 서열 서열번호 92 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 90 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄를 포함한다.
일부 양태에서, 이중특이성 항체는 아미노산 서열 서열번호 96 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄, 아미노산 서열 서열번호 94 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄, 아미노산 서열 서열번호 92 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 90 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄를 포함한다.
일부 양태에서, 이중특이성 항체는 아미노산 서열 서열번호 100 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄, 아미노산 서열 서열번호 98 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄, 아미노산 서열 서열번호 92 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 90 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄를 포함한다.
일부 양태에서, 이중특이성 항체는 아미노산 서열 서열번호 102 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄, 아미노산 서열 서열번호 104 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄, 아미노산 서열 서열번호 106 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄, 아미노산 서열 서열번호 108 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄를 포함한다.
일부 양태에서, 이중특이성 항체는 아미노산 서열 서열번호 110 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄, 아미노산 서열 서열번호 112 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄, 아미노산 서열 서열번호 114 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 116 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄를 포함한다.
일부 양태에서, 이중특이성 항체는 아미노산 서열 서열번호 118 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄, 아미노산 서열 서열번호 120 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄, 아미노산 서열 서열번호 114 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 116 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄를 포함한다.
일부 양태에서, 이중특이성 항체는 아미노산 서열 서열번호 110 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄, 아미노산 서열 서열번호 112 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄, 아미노산 서열 서열번호 106 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄, 아미노산 서열 서열번호 108 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄를 포함한다.
일부 양태에서, 이중특이성 항체는 아미노산 서열 서열번호 102 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄, 아미노산 서열 서열번호 104 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄, 아미노산 서열 서열번호 114 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 116 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄를 포함한다.
전술한 양상 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 부분과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 초과 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 CD20-결합 항체 또는 이의 항원-결합 부분이 제공된다.
전술한 양상 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 부분과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 초과 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 전술한 양상 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 암호화하는 핵산, 또는 핵산 분자가 제공된다.
일부 양태에서, 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 55, 60, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 핵산 서열이다.
일부 양태에서, 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 65, 70, 73, 75, 80, 82, 84, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 핵산 서열이다.
일부 양태에서, 제2 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 6, 11, 13, 17, 19, 23, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 핵산 서열이다.
일부 양태에서, 제2 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 25, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 49, 51, 53, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 핵산 서열이다.
일부 양태에서, 제1 경쇄를 암호화하는 핵산은 서열번호 89, 97, 101, 103, 111, 119, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 핵산 서열이다.
일부 양태에서, 제1 중쇄를 암호화하는 핵산은 서열번호 87, 95, 99, 105, 113, 121, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 핵산 서열이다.
일부 양태에서, 제2 경쇄를 암호화하는 핵산은 서열번호 93, 107, 115, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 핵산 서열이다.
일부 양태에서, 제2 중쇄를 암호화하는 핵산은 서열번호 91, 109, 117, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 핵산 서열이다.
상기 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다.
상기 핵산 또는 벡터를 포함하는 세포가 제공된다.
이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 핵산, 벡터 및/또는 세포를 포함하는 조성물이 제공된다.
치료 모이어티에 공유결합으로 부착되는 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하는 항체-약물 접합체가 제공된다.
바람직하게는, 치료 모이어티는 세포독성 모이어티, 화학치료제, 사이토카인, 면역억제제, 면역자극제, 용해성 펩티드, 및 방사성 동위원소로부터 선택된다.
본 발명의 항체는 CD20이 바람직하지 않게 발현되거나 발견되는 다양한 질환을 위한 치료 또는 진단 도구로서 사용된다.
CD20-관련 질환의 한 양태에서, CD20의 발현은 건강한 조직 또는 기관에서의 상태에 비해 질환이 있는 조직 또는 기관의 세포 내에서 증가된다. 증가는 적어도 10%, 특히 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 적어도 1000%, 적어도 10000% 또는 심지어 그 이상의 증가를 지칭한다. 한 양태에서, 발현은 질환이 있는 조직에서만 발견되고, 상응하는 건강한 조직에서의 발현은 저하된다. 본 발명에 따라, CD20-관련 질환은 B 세포 질환, 예컨대 B 세포 증식성 장애, 특히 CD20-양성 B 세포 장애를 포함한다.
"B 세포 증식성 장애"는 환자에서 B 세포의 개수가, 건강한 대상에서의 B 세포의 개수에 비해 증가되고, 특히 B 세포의 증가된 개수가 질환의 요인 또는 마커인, 질환을 의미한다. "CD20-양성 B 세포 증식성 장애"는 B 세포, 특히 악성 B 세포(정상 B 세포 제외)가 CD20을 발현하는 B 세포 증식성 장애이다.
예시적인 B 세포 증식성 장애는 비-호지킨 림프종(NHL), 급성 림프모구 백혈병(ALL), 만성 림프구 백혈병(CLL), 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 여포 림프종(FL), 외투 세포 림프종(MCL), 변연부 림프종(MZL), 및 일부 유형의 다발성 골수종(MM) 및 호지킨 림프종(HL)을 포함한다.
본 발명의 방법은 사용되는 치료제에 따라 다양한 질환에 적용가능하다. 그러나, 이러한 방법은 B 세포 증식성 장애, 특히 CD20-양성 B 세포 장애((CD20-양성) B 세포가 다수 존재함(즉 건강한 대상에 비해 장애를 갖는 대상에서, 증가된 개수의 B 세포가 존재함))의 치료에 특히 유용하다. 따라서, 한 양태에서, 질환은 B 세포 증식성 장애, 특히 CD20-양성 B 세포 장애이다.
일부 양태에서, 치료제는 암의 치료를 위해 지시되는 항체를 포함한다. 한 양태에서, 치료제는 암의 치료를 위해 지시된다. 한 양태에서, 암은 B 세포 증식성 장애이다. 한 양태에서, 암은 CD20-양성 B 세포 증식성 장애이다. 한 양태에서 암은 비-호지킨 림프종(NHL), 급성 림프모구 백혈병(ALL), 만성 림프구 백혈병(CLL), 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 여포 림프종(FL), 외투 세포 림프종(MCL), 변연부 림프종(MZL), 다발성 골수종(MM), 및 호지킨 림프종(HL)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 양태에서, 치료제는 면역치료제이다.
일부 양태에서, 치료제는 활성화된 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.
한 양태에서, 치료제는 CD3, 특히 CD3ε에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.
특이적 양태에서, 질환은 NHL, 특히 재발성/난치성(r/r) NHL이다. 한 양태에서, 질환은 DLBCL이다. 한 양태에서, 질환은 FL이다. 한 양태에서, 질환은 MCL이다. 한 양태에서, 질환은 MZL이다.
본 발명의 항-CD20 항체에 의해 질환 또는 장애를 치료하는 방법은 하기 단계를 포함한다: 치료 효과량의 전술한 양상 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 핵산 분자 또는 벡터 또는 세포 또는 약학 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계.
일부 양태에서, 본 발명은 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하고, 이는 하기 단계를 포함한다: CD20에 결합할 수 있는 항체가 환자에게 투여되어, 적어도 40 μg/mL의 혈청 수준을 제공함. 상이한 양태에서, 항체가 투여되어 적어도 50 μg/mL, 적어도 150 μg/mL, 적어도 300 μg/mL, 적어도 400 μg/mL 또는 적어도 500 μg/mL의 혈청 수준을 제공한다. 상이한 양태에서, 항체가 투여되어 800 μg/mL 이하, 700 μg/mL 이하, 600 μg/mL 이하, 550 μg/mL 이하 또는 500 μg/mL 이하 의 혈청 수준을 제공한다. 한 양태에서, 제공되는 혈청 수준은 40 μg/mL 내지 700 μg/mL, 바람직하게는 40 μg/mL 내지 600 μg/mL, 바람직하게는 50 μg/mL 내지 500 μg/mL, 예컨대 150 μg/mL 내지 500 μg/mL 및 300 μg/mL 내지 500 μg/mL이다. 본 설명에 사용된 용어 "혈청 수준"은 혈청 중 논의되는 물체의 농도를 지칭한다. 한 양태에서, 혈청 수준은 적어도 7 일 또는 적어도 14 일 동안 제공된다. 한 양태에서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: 항체를 적어도 300 mg/m2, 예컨대 적어도 600 mg/m2, 바람직하게는 1500 mg/m2 이하, 1200 mg/m2 이하 또는 1000 mg/m2 이하의 용량으로 투여함.
일부 양태에서, 본 발명은 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하고, 이는 하기 단계를 포함한다: CD20에 결합할 수 있는 항체를 환자에게 적어도 300 mg/m2, 예컨대 적어도 600 mg/m2, 및 바람직하게는 1500 mg/m2 이하, 1200 mg/m2 이하 또는 1000 mg/m2 이하의 용량으로 투여함.
일부 양태에서, 본 발명은 암을 치료 또는 예방하기 위한 방법을 제공하고, 이는 하기 단계를 포함한다: CD20에 결합할 수 있는 항체를 적어도 50%, 바람직하게는 60%, 70%, 80% 또는 90%의 암 세포가 CD20에 양성이고/이거나 적어도 40%, 바람직하게는 50% 또는 60%의 암 세포가 CD20의 표면 발현에 양성인 환자에 투여하는 단계. 이러한 양상에서, 본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다: a. 환자의 적어도 50%, 바람직하게는 60%, 70%, 80% 또는 90%의 CD20-양성 암 세포 및/또는 적어도 40%, 바람직하게는 50% 또는 60%의 암 세포가 확인 및 제시되고, 암 세포가 CD 20의 표면 발현에 양성인, 단계; 및 b. CD20에 결합할 수 있는 항체를 상기 환자에게 투여하는 단계. 한 양태에서, 환자의 적어도 95% 또는 적어도 98%의 암 세포는 CD20에 양성이다. 한 양태에서, 환자의 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%의 암 세포는 CD20의 표면 발현에 양성이다.
본원에 기재된 임의의 양상의 방법의 한 양태에서, 암 치료의 성과는 질환 안정화를 성취하는 것이다. 한 양태에서, 질환 안정화는 적어도 2개월, 적어도 3개월 또는 적어도 6개월 동안 성취된다.
일부 양태에서, 본 발명은 암 환자의 질환 안정화를 성취하는 방법을 제공하고, 이는 하기 단계를 포함한다: CD20에 결합할 수 있는 항체를 환자에게 투여하는 단계. 한 양태에서, 질환 안정화는 적어도 2개월, 적어도 3개월 또는 적어도 6개월 동안 성취된다.
본원에 기재된 임의의 양상의 방법의 한 양태에서, 항체는 단일 용량 또는 다중 용량으로 투여된다.
일부 양태에서, 본 발명은 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하고, 이는 하기 단계를 포함한다: CD20에 결합할 수 있는 항체를 환자에게 다중 용량으로 투여하는 단계.
본 발명에 따라 항체가 다중 용량으로 투여되는 경우, 항체는 바람직하게는 적어도 3 용량, 적어도 4개 용량, 적어도 5개 용량, 적어도 6개 용량, 적어도 7개 용량, 적어도 8개 용량, 적어도 9개 용량 또는 적어도 10개 용량, 및 바람직하게는 30개 이하 용량, 25개 이하 용량, 20개 이하 용량, 15개 이하 용량 또는 10개 이하 용량으로 투여된다. 항체의 용량은 바람직하게는 적어도 7 일, 적어도 10 일, 적어도 14 일 또는 적어도 20 일 간격으로 투여된다. 항체의 용량은 바람직하게는 7 내지 30 일 또는 10 내지 20 일, 바람직하게는 약 14 일 간격으로 투여된다.
한 양태에서, 항체는 적어도 40 μg/mL의 혈청 수준을 제공하도록 투여된다. 상이한 양태에서, 항체는 적어도 50 μg/mL, 적어도 150 μg/mL, 적어도 300 μg/mL, 적어도 400 μg/mL 또는 적어도 500 μg/mL의 혈청 수준을 제공하도록 투여된다. 상이한 양태에서, 항체는 800 μg/mL 이하, 700 μg/mL 이하, 600 μg/mL 이하, 550 μg/mL 이하 또는 500 μg/mL 이하의 혈청 수준을 제공하도록 투여된다. 한 양태에서, 제공되는 혈청 수준은 40 μg/mL 내지 700 μg/mL, 바람직하게는 40 μg/mL 내지 600 μg/mL, 바람직하게는 50 μg/mL 내지 500 μg/mL, 예컨대 150 μg/mL 내지 500 μg/mL 또는 300 μg/mL 내지 500 μg/mL이다. 한 양태에서, 혈청 수준은 적어도 7 일 또는 적어도 14 일 동안 제공된다. 한 양태에서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: 항체를 적어도 300 mg/m2 예컨대 적어도 600 mg/m2, 및 바람직하게는 1500 mg/m2 이하, 1200 mg/m2 이하 또는 1000 mg/m2 이하의 용량으로 투여하는 단계.
포유동물의 CD20-관련 장애를 치료하기 위한 약물의 제조에서의 전술한 양상 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 핵산 또는 벡터 또는 세포 또는 약학 조성물의 용도가 제공된다.
전술한 양상 중 임의의 하나에 따라, 항체는 다른 약물, 예컨대 표지된 또는 세포독성 접합체에 접합된다.
한 양상에서, 본 발명은 또한 키트를 포함한다. 예컨대, 키트는 본 발명의 항체 또는 단편, 또는 이의 동족체 또는 유도체, 항체 작동 설명서, 특정 유형의 세포를 살해하는 접합체 등을 포함한다. 설명서는 시험관 내, 생체 내 또는 생체 외에서 항체, 접합체 등을 사용함에 대한 지침을 포함할 수 있다. 항체는 액체 또는 고체의 형태일 수 있고, 통상적으로 동결건조된다. 이러한 키트는 다른 적절한 시약, 예컨대 희석제, 재구성 용액, 및 의도되는 사용에 필요한 기타 성분을 포함할 수 있다. 선결된 용량으로 패키징된 시약 조합 및 이의 사용에 대한 설명서가 고려되고, 용도는, 예컨대 치료 용도 또는 진단 분석이다. 항체가, 예컨대 효소에 의해 표지되는 경우, 키트는 상기 효소에 필요한 기질 및 보조 인자(예컨대 검출가능한 발색단 및 형광단을 제공하는 기질 전구체)를 포함할 수 있다. 또한, 기타 첨가제, 예컨대 안정화제 및 완충제(예컨대 블로킹(blocking) 완충제 및 용해 완충제)가 포함될 수 있다. 다양한 시약의 상대적 양은 사용자 융통성, 공간 절약, 시약 절약 등을 성취하는 시약 용액의 농도가 제공되도록 변경될 수 있다. 이러한 시약은 또한 건조 분말 형태, 통상적으로 동결건조된 형태, 예컨대 부형제로 제공될 수 있고, 이는 용해될 때 시약 용액을 적절한 농도로 제공할 수 있다.
CD20에 대한 결합을 억제하기 위한 시약의 제조에서의 전술한 양상 중 어느 하나의 항체 또는 작용성 단편 또는 핵산 또는 벡터 또는 세포 또는 약학 조성물 또는 키트의 용도가 제공된다.
또한, 본 발명의 항체는 또한 이의 면역글로불린 또는 단편을 사용한 면역분석, 정제 방법 및 기타 방법에 사용될 수 있다. 이러한 사용은 당업자에게 주지되어 있다.
상응하게, 본 발명은 또한 본 발명의 항-CD20 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물을 제공하고, 항체는 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 통상적으로 조합되고, 이는 당업계에서 통상적인 실시이다.
용어 "약학 조성물"은 다양한 조제의 제제를 지칭한다. 치료 효과량의 다가 항체를 포함하는 제제는 멸균 액체 용액, 액체 현탁액 또는 동결건조된 형태이다(임의적으로 안정화제 또는 부형제를 포함함).
본 발명의 항체는 단독으로 투여되는 조성물로서 사용되거나 다른 활성제와의 조합으로 사용될 수 있다.
일부 양태에서, 인간화된 본 발명의 항체는 치료 모이어티(즉 약물)에 접합된다. 치료 모이어티는, 예컨대 세포독소, 화학치료제, 사이토카인, 면역억제성 약물, 면역자극제, 용해성 펩티드 또는 방사성 동위원소일 수 있다. 이러한 접합체는 본원에서 "항체-약물 접합체" 또는 "ADC"로서 지칭된다.
일부 양태에서, 항체는 세포독성 모이어티에 접합된다. 세포독성 모이어티는, 예컨대, 파클리탁셀; 사이토칼라신 B; 그라미시딘 D; 에티듐 브로마이드; 에메틴; 미토마이신; 에토포시드; 테니포시드; 빈그리스틴; 빈블라스틴; 콜키신; 독소루비신; 다우노루비신; 다이하이드록시 안트렌다이온; 튜블린 억제제, 예컨대 메이탄신, 또는 이의 유사체 또는 유도체; 유사분열 방지제, 예컨대 모노메틸 어우리스타틴 E 또는 F, 또는 이의 유사체 또는 유도체; 돌라스틴 10 또는 15, 또는 이의 유사체; 이리노테칸, 또는 이의 유사체; 미톡산트론; 미트라마이신; 액티노마이신 D; 1-데하이드로테스토스테론; 당질코르티코이드; 프로카인; 테트라카인; 리도카인; 프로프라놀올; 퓨로마이신; 칼리케아마이신, 또는 이의 유사체 또는 유도체; 항-대사물질, 예컨대 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 사이타라빈, 플루다라빈, 5-플루오로우라실, 데카바진, 하이드록시우레, 아스파라기나제, 겜시타빈, 또는 클라드리빈; 알킬화제, 예컨대 다이클로로메틸다이에틸아민, 티오퓨린, 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU), 로무스틴(CCNU), 사이클로포스파미드, 부설판, 다이브로모만니톨, 스트렙토조토신, 다카바진(DTIC), 프로카바진, 또는 미토마이신 C; 백금 유도체, 예컨대 시스플라틴 또는 카보플라틴; 듀오카마이신 A, 듀오카마이신 SA, 라첼마이신(CC-1065), 또는 이의 유사체 또는 유도체; 항생제, 예컨대 액티노마이신, 블레오마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 이다루비신, 미트라마이신, 미토마이신, 미톡산트론, 페리마이신, 안트라마이신(AMC); 피롤로[2,1-c][1,4]-벤조다이아제핀(PDB); 디프테리아 독소 및 관련 분자, 예컨대 디프테리아 쇄 및 이의 활성 단편 및 하이브리드 분자, 리신 예컨대, 리신 또는 데글리코실화된 리신 쇄 독소, 콜레라 독소, 쉬가-유사(Shiga-like) 독소, 예컨대 SLT I, SLT II, SLT IIV, LT 독소, C3 독소, 쉬가 독소, 백일해 독소, 파상풍 독소, 대두 보우만-버크(Bowman-Birk) 프로테아제 억제제, 슈도모나스 외독소, 알로린, 사포린, 모덱신, 젤라닌, 아브린 쇄, 모덱신 쇄, α-사르신, 알루라이츠 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 다이안틴 단백질, 피토락카 아메리카나(Phytolacca americana) 단백질, 예컨대 PAPI, PAPII 및 PAP-S, 모모르디카 차란티아(Momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사포나리아 오피시날리스(Sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토마이신, 리스트릭토신, 페노마이신, 및 에노마이신 독소; 리보뉴클레아제(RNase); DNase I, 스타필로코커스 내독소 A; 미국자리공(pokeweed) 항바이러스 단백질; 디프테리아 독소 및 슈도모나스 내독소로부터 선택될 수 있다.
일부 양태에서, 항체는 어우리스타틴, 또는 이의 펩티드 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 어우리스타틴이 미세소관 동역학, GTP 가수분해, 및 핵 및 세포 분열에 간섭하고, 항암 및 항진균 활성을 가는 것이 밝혀진 바 있다. 예컨대, 어우리스타틴 E는 p-아세틸벤조산 또는 벤조일발레르산과 반응하여 각각 AEB 및 AEVB를 생성할 수 있다. 기타 전형적인 어우리스타틴 유도체는 AFP, 모노메틸 어우리스타틴 F(MMAF), 및 모노메틸 어우리스타틴 E(MMAE)를 포함한다. 적절한 어우리스타틴, 및 이의 유사체, 유도체 및 전구약물, 및 어우리스타틴을 항체에 접합하기에 적절한 어댑터는 US5,635,483, 5,780,588 및 6,214,345, 및 WO02088172, WO2004010957, WO2005081711, WO2005084390, WO2006132670, WO03026577, WO200700860, WO207011968 및 WO205082023에 기재되어 있다.
일부 양태에서, 항체는 피롤로[2,1-c][1,4]-벤조다이아제핀(PDB), 이의 펩티드 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 적절한 PDB 및 PDB 유도체, 및 관련 기술은, 예컨대 문헌[Hartley J. A. et al., Cancer Res 2010; 70 (17): 6849-6858]; [Antonow D. et al., Cancer J 2008; 14 (3): 154-169]; [Howard P. W. et al., Bioorg Med Chem Lett 2009; 19: 6463-6466]; 및 [Sagnou et al., Bioorg Med Chem Lett 2000; 10 (18): 2083-2086]에 기재되어 있다.
일부 양태에서, 항체는 안트라사이클린, 메이탄신, 칼리케아마이신, 듀오카마이신, 라파마이신(CC-1065), 돌라스틴 10, 돌라스틴 15, 이리노테칸, 모노메틸 어우리스타틴 E, 모노메틸 어우리스타틴 F, PDB, 또는 이의 임의의 유사체, 유도체 또는 전구약물의 세포독성 모이어티에 접합된다.
일부 양태에서, 항체는 안트라사이클린, 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 일부 양태에서, 항체는 메이탄신, 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 일부 양태에서, 항체는 칼리케아마이신, 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 일부 양태에서, 항체는 듀오카마이신, 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 일부 양태에서, 항체는 라파마이신(CC-1065), 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 일부 양태에서, 항체는 돌라스틴 10, 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 일부 양태에서, 항체는 돌라스틴 15, 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 일부 양태에서, 항체는 모노메틸 어우리스타틴 E, 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 일부 양태에서, 항체는 모노메틸 어우리스타틴 F, 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 일부 양태에서, 항체는 피롤로[2,1-c][1,4]-벤조다이아제핀, 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다. 일부 양태에서, 항체는 이리노테칸, 또는 이의 유사체, 유도체 또는 전구약물에 접합된다.
일부 양태에서, 항체는 사이토카인(예컨대 IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNa, IFN3, IFNy, GM-CSF, CD40L, Flt3 리간드, 줄기 세포 인자, 안세스팀, 및 TNFa)에 접합된다.
일부 양태에서, 항체는 방사성 동위원소 또는 방사성 동위원소를 포함하는 킬레이트에 접합된다. 예컨대, 항체는 킬레이트 어댑터(예컨대 DOTA, DTPA, 및 티아세탐)에 접합되고, 이는 항체가 방사성 동위원소와 복합화될 수 있게 한다. 항체는 또한 또는 임의적으로, 하나 이상의 방사성 표지된 아미노산 또는 기타 방사성 표지된 분자를 포함할 수 있거나, 방사성 표지된 아미노산 또는 방사성 표지된 분자에 접합된다. 방사성 동위원소는 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 125I, 131I, 186Re, 213Bi, 225Ac, 및 227Th를 포함한다. 치료 목적을 위해, β 또는 α 입자 복사를 방출하는 방사성 동위원소, 예컨대 131I, 90Y, 211At, 212Bi, 67Cu, 186Re, 188Re, 및 212Pb가 사용될 수 있다.
분자를 항체에 접합시키는 기술은 당업계에 주지되어 있다. 통상적으로, 핵산 분자는 N-하이드록시숙신이미드 에스터 또는 말레이미드 작용기를 통해 항체의 라이신 또는 시스테인에 공유결합으로 연결된다. 접합체의 균질성이 조작된 시스테인을 사용하거나 비-자연 아미노산을 통합하는 접합 방법에 의해 개선될 수 있음이 보고되었다. 특히, 당업자는 또한 아실 공여체로서 작용하는 글루타민을 포함하는 태그(예컨대 Gin 펩티드 및 Q-태그를 포함하는 태그) 또는 폴리펩티드 조작(예컨대 폴리펩티드에서 아미노산 결실, 삽입, 치환 및 돌연변이)을 사용하여 반응성 내인성 글루타민 조작된 Fc-포함 폴리펩티드를 생성하는 것을 기대할 수 있다. 이어서, 트랜스글루타미나제는 아민 공여제(donor agent)(예컨대 반응성 아민을 포함하거나 이에 연결되는 소분자)와 공유결합으로 가교-연결되어 안정하고 균질한 조작된 Fc-포함 폴리펩티드 접합체의 집단을 형성할 수 있고, 이때 아실 공여제는 아실 공여체 태그 또는 접근가능한/노출된/반응성 내인성 글루타민 자리로서 작용하는 태그 포함 글루타민을 통해 Fc-포함 폴리펩티드에 특이적으로 접합된다(WO2012059882).
기재된 양태에 따른 치료제가 전달, 운송, 관용성 등을 제공하도록 제제에 혼입되는 적합한 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 기타 시약과 함께 투여될 것임이 이해되어야 한다. 다수의 적절한 제제는 모든 의약 화학자들에게 공지된 약전에서 찾을 수 있다: 문헌[the 15th edition, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1975)], 특이 여기서 블라우그 및 세이머르(Blaug and Seymour)의 챕터 87. 이러한 제제는, 예컨대 분말, 페이스트, 연고, 겔, 왁스, 오일, 지질, 지질-포함(양이온 또는 음이온) 담체(예컨대 LipofectinTM), DNA 접합체, 무수 슬러리, 수-중-유 및 유-중-수 에멀젼, 에멀젼 폴리에틸렌 글리콜(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고체 겔 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 반고체 혼합물을 포함한다. 임의의 상기 혼합물은, 제제의 활성 성분이 제제에 의해 불활성화되지 않고, 제제가 투여 경로와 호환되고 이를 관용하는, 조건하에 본 발명에 따른 치료 또는 요법에 적용가능하다.
한 양태에서, 항체는 치료제로서 사용될 수 있다. 이러한 치료제는 통상적으로 대상의 비정상 CD20 발현, 활성 및/또는 신호전달과 관련된 질환 또는 병리를 치료, 완화 및/또는 예방하는 데 사용된다. 치료법은 CD20-관련 증상, 예컨대 비정상 CD20 발현, 활성 및/또는 신호전달과 관련된 질환 또는 장애를 앓는(또는 발달 위험이 있는) 대상, 예컨대 인간 환자를 확인함에 의한 표준적인 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 항체 제제, 바람직하게는 이의 표적 항원에 대한 높은 특이성 및 높은 친화도를 갖는 항체 제제가 대상에게 투여되고, 일반적으로, 표적에 대한 이의 결합에 기인하는 효과를 생성할 것이다. 투여되는 항체는 표적(예컨대 CD20)의 발현, 활성 및/또는 신호 변환 기능을 제거, 억제 또는 방해할 수 있다. 투여되는 항체는 표적(예컨대 CD20)이 자연적으로 결합하는 내인성 리간드에 대한 상기 표적의 결합을 제거, 억제 또는 방해할 수 있다. 예컨대, 항체는 표적에 결합하여, 다른 방식으로 CD20의 발현, 활성 및/또는 신호 변환을 조절, 차단, 억제, 감소, 길항, 중화 및/또는 방해한다. 일부 양태에서, 비정상 CD20 발현-관련 질환 또는 장애를 치료하기 위해, 중쇄 및 경쇄 CDR를 갖는 항체가 대상에게 투여될 수 있다.
또다른 양태에서, CD20에 대한 항체는 CD20 국소화 및/또는 정량분석과 관련하여 당업계에 공지된 방법(예컨대 적절한 생리학적 샘플, 진단 방법 및 단백질 이미징에서 CD20 및/또는 CD20 수준의 측정)에서 사용될 수 있다. 제시된 양태에서, CD20, 또는 이의 유도체, 단편, 유사체 또는 동족체에 대한 특이성을 갖고 항체로부터 유도된 항원-결합 도메인을 포함하는 항체는 약학적 활성 화합물(본원에서 이후로 "치료제"로서 지칭됨)로서 사용된다.
또다른 양태에서, CD20에 대한 특이성을 갖는 항체는 표준적인 기술, 예컨대 면역친화도, 크로마토그래피 및 면역침전을 통해 CD20 폴리펩티드를 분해하는데 사용된다. CD20 단배질에 대한 항체(또는 이의 단편)은 생물학 샘플에서 단백질을검출하는 데 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 생물학 샘플에서 CD20의 검출은 임상 시험 절차의 부분으로서, 예컨대 제시된 치료법의 효능을 측정하는 데 사용될 수 있다. 검출은 항체를 검출가능한 물치에 접합(즉 물리적 연결)시킴으로써 용이해질 수 있다. 검출가능한 물체의 예는 다양한 효소, 예컨대 보결분자단(prosthetic group), 형광 물질, 발광 물질, 생체발광 물질, 및 방사능 물질을 포함한다. 적합한 효소의 예는 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제 및 아세틸콜린에스터라제를 포함하고, 적합한 보결분자단의 예는 스트렙타비딘/비?甸? 및 아비딘/비오틴을 포함하고, 적합한 형광 물질의 예는 엄브렐리페론(umbelliferone), 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 다이클로로트라이아진 플루오레세인, 단실 클로라이드 및 피코에리트린을 포함하고, 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하고, 생체발광 물질의 예는 루시퍼라제, 플루오레세인 및 에쿼린을 포함하고, 적합한 방사능 물질의 예는 125I, 131I, 35S, 및 3H를 포함한다.
또다른 양태에서, 본 발명의 항체는 샘플에서 CD20 또는 이의 단백질 단편의 존재를 검출하기 위한 시약으로서 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 항체는 검출가능한 표지를 포함한다. 항체는 다클론 항체, 더 바람직하게는 단클론 항체이다. 전체 항체 또는 단편(예컨대 Fab, scFv, 및 F(ab')2)이 사용된다. 항체와 관련하여 용어 "표지"는 항체에 검출가능한 물체를 접합(즉 물리적 연결)함에 의한 항체의 직접 표지, 및 또다른 직접 표지된 시약과의 반응에 의한 항체의 간접 표지를 포함하도록 의도된다. 간접 표지의 예는 형광-표지된 2차 항체에 의한 1차 항체의 검출, 및 형광-표지된 스트렙타비딘에 의한 검출을 가능하게 하는 비오틴에 의한 항체의 단부-표지를 포함한다. 용어 "생물학 샘플"은 대상으로부터 분리된 조직, 세포 및 생물학 유체, 및 대상 내에 존재하는 조직, 세포 및 유체를 포함하도록 의도된다. 따라서, 사용된 용어 "생물학 샘플"은 혈액 및 분획, 또는 혈액의 성분, 예컨대 혈청, 혈장 및 림프를 포함한다. 즉, 양태의 검출 방법은 시험관 내 및 생체 내 둘 다에서 생물학 샘플 내의 피분석물 mRNA, 단백질 또는 게놈 DNA를 검출하는 데 사용될 수 있다. 예컨대, 피분석물 mRNA 시험관 내 검출 기술은 노던 하이브리드화(Norhtern hybridization) 및 동일 반응계 하이브리드화를 포함한다. 피분석물 단백질 시험관 내 검출 기술은 효소-연결된 면역흡착 분석(ELISA), 웨스턴 블롯, 면역침전 및 면역형광을 포함한다. 피분석물 게놈 DNA 시험관 내 검출 기술은 서던 하이브리드화를 포함한다. 면역분석 절차는, 예컨대 문헌[ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology", Volume 42, J. R. Crowther (editor) Human Press, Totowa, N. J., 1995]; ["Immunoassay", E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, Calif., 1996]; 및 ["Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985]에 기재되어 있다. 또한, 피분석물 단백질 시험관 내 검출 기술은 표지된 항-피분석물 단백질 항체를 대상에 도입하는 것을 포함한다. 예컨대, 항체는 방사성 표지로 표지될 수 있고, 대상에서 방사성 표지의 존재 및 위치는 표준적인 이미징 기술에 의해 검출된다.
본원에 기재된 항체, 또는 이의 유도체, 단편, 유사체 및 동족체는 투여에 적합한 약학 조성물에 혼입될 수 있다. 이러한 조성물의 제제와 관련된 원리 및 고찰, 및 성분을 선택함에 대한 안내는 당업계에 주지되어 있고, 예컨대 [Remington's Pharmaceutical Sciences: The Science And Practice Of Pharmacy, 19th edition (Alfonso R. Gennaro et al. eds) Mack Pub. Co., Easton, Pa.: 1995]; [Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994]; 및 [Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Volume 4), 1991, M. Dekker, New York]을 참조한다.
통상적으로, 이러한 조성물은 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 항체 단편이 사용되는 경우, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 최소 억제성 단편이 선호될 수 있다. 예컨대, 항체의 가변 영역을 기준으로, 표적 단백질의 서열에 결합하는 능력을 보유하는 펩티드 분자가 설계될 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적으로 합성되고/되거나 DNA 재조합에 의한 것일 수 있다(예컨대 문헌[Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)] 참조).
본원에 사용된 용어 "약학적으로 허용되는 담체"는 약학 투여와 호환되는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항바이러스제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함하도록 의도된다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences]의 최신판에 기재되어 있고, 이는 당업계에서의 표준 참조 문헌이고 본원에 참조로 혼입된다. 이러한 담체 또는 희석제의 바람직한 예는 비제한적으로 물, 염수, 링거액, 덱스트로스 용액, 및 5% 인간 혈청 알부민을 포함한다. 리포솜 및 비-수성 담체, 예컨대 부동화된 오일 또한 사용될 수 있다. 약학적 활성 물체를 위한 이러한 매질 및 시약은 당업계에 주지되어 있다. 이의 항체와의 비호환성을 제외하여, 조성물 중 임의의 통상적인 배지 또는 시약의 사용이 구상된다.
양태의 약학 조성물은 이의 의도되는 투여 경로와 호환되도록 제조된다. 투여 경로의 예는 비경구 투여, 예컨대 정맥내, 피내, 피하, 경구(예컨대 흡입), 경피(즉 국소), 경점막 및 직장 투여를 포함한다. 비경구, 피내 또는 피하 투여를 위한 용액 또는 현탁액은 하기 성분을 포함할 수 있다: 주사를 위한 멸균 희석제, 예컨대 물, 염수 용액, 고정된 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성된 용매; 항바이러스 제제, 예컨대 벤질 알코올 또는 메틸파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 나트륨 바이설파이트; 킬레이트제, 예컨대 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA); 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트; 및 삼투압을 조절하는 시약, 예컨대 나트륨 클로라이드 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 나트륨 하이드록사이드에 의해 조절될 수 있다. 비경구 투여는 앰플, 일회용 주사기, 또는 유리 또는 플라스틱 다중-용량 바이알에 의해 조절될 수 있다.
주사에 적합한 약학 조성물은 멸균 수용액(본원에서 수용성) 또는 분산액, 및 멸균 주사가능 용액 또는 분산액의 즉석 제제를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여의 경우, 적합한 약학적으로 허용되는 담체는 정상 염수, 정균수, Cremophor ELTM(BASF, 미국 뉴저지주 패리스패니) 또는 포스페이트 완충된 염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우, 조성물은 멸균되어야 하고 주사하기에 용이한 정도로 유체여야 한다. 조성물은 제조 및 보관 조건 하에 안정해야하고 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염을 방지하여야 한다. 담체는, 예컨대 물, 에탄올 및 폴리올(예컨대 글리세린, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜)을 포함하는 용매 또는 분산액 매질일 수 있다. 예컨대, 분산액의 경우, 필요한 입자 크기는 코팅, 예컨대 레시틴을 통해 유지되고, 적절한 유동성이 계면활성제를 통해 유지될 수 있다. 미생물의 작용은 다수의 항박테리아 및 항진균 제제, 예컨대 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산 및 티메로스알을 통해 방지될 수 있다. 다수의 경우, 조성물은 바람직하게는 등장화제, 예컨대 사카라이드, 폴리올(예컨대 만니톨 및 소르비톨), 및 나트륨 클로라이드를 포함한다. 주사를 위한 조성물의 흡수는 조성물 중 지연 흡수를 위한 시약, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 첨가함으로써 연장될 수 있다.
필요에 따라, 멸균 주사가능한 용액은 필요량의 항체를 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합(필요에 따라)을 갖는 적합한 용매에 혼입하고 여과하고 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 항체를 알칼리성 분산액 매질 및 상기 열거된 것 중 필요한 기타 성분을 포함하는 멸균 담체에 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사가능 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 진공-건조 및 동결-건조하여 전술한 상기 상분의 멸균-여과된 용액으로부터의 활성 성분 및 임의의 추가적인 원하는 성분을 포함하는 분말을 수득하는 것이다.
흡입 투여의 경우, 화합물은 적합한 추진제, 예컨대 기체, 예를 들어 이산화탄소를 포함하는 가압된 용기로부터의 에어로졸 스프레이, 디스펜서 또는 분무기로서 전달된다.
전신 투여 또한 경점막 또는 경피 투여를 통해 수행될 수 있다. 경점막 또는 경피 투여의 경우, 장벽에 투과되기에 적합한 침투제가 제조에 사용된다. 이러한 침투제는 당업계에 일반적으로 공지되어 있고, 예컨대 경점막 투여를 위한 세제, 담즙산 염 및 후시드산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 코 스프레이 또는 좌약을 사용하여 수행될 수 있다. 경피 투여의 경우, 하나 이상의 항체는 당업계에 일반적으로 공지된 페이스트, 연고, 겔 또는 크림으로 제조될 수 있다.
또한, 화합물은 직장을 통한 전달을 위한 좌약(예컨대 통상적인 좌약 베이스, 예컨대 코코아 버터 및 기타 글리세리드를 가짐) 또는 관장약의 형태로 제조될 수 있다.
한 양태에서, 항체는 신체로부터의 빠른 제거로부터 항체를 보호할 담체에 의해, 예컨대 지속 방출/제어 방출 제제, 예를 들어 임플란트 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템으로 제조될 수 있다. 생분해성 또는 생호환성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드리드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스터 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제제의 제조 방법은 당업자에게 명확하다.
투여의 용이함 및 용량의 균일성을 위해 용량 단위 형태로 비경구 조성물을 제조하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 용량 단위 형태는 치료되는 대상에게 단위 용량으로서 적합한 물리적으로 분리가능한 단위로 지칭되고, 각각의 단위는 필요한 약물 담체와의 조합으로 사용될 때 원하는 치료 효과를 성취하도록 계산되는 하나 이상의 항체의 선결될 양을 포함한다. 양태의 용량 단위 형태에 대한 사양은 항체의 고유한 특징 및 성취되는 특정 치료 효과, 및 개체의 치료를 위한 이러한 항체의 제형화의 분야에 고유한 제한에 의해 지시되거나 이에 직접적으로 의존한다.
약학 조성물은 용기, 팩 또는 디스펜서에 투여를 위한 설명서와 함께 위치될 수 있다.
본원에 기재된 제제는 또한 치료되는 특정 조건에 따라 하나 초과의 항체, 바람직하게는 서로 유해한 영향을 주지 않는 상보적 활성을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 다르게 또는 추가적으로, 조성물은, 예컨대 이의 기능을 강화하는 제제, 예컨대 세포독성제, 사이토카인, 화학치료제, 또는 성장 억제제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도되는 목적에 대한 효과량으로 함께 적절히 존재한다. 예컨대, 분자는 키트로 함께 존재하게나 함께 사용될 수 있다.
한 양태에서, 하나 이상의 항체는 조합 치료로 투여, 즉 다른 제제, 예컨대 치료제(병태 또는 장애, 예컨대 다양한 형태의 암, 자가면역 장애 및 염증성 질환을 치료하는 데 사용될 수 있음)와의 조합으로 투여될 수 있다. 본원에서 용어 "조합"은 시약의 실질적으로 동기적인(synchronous), 동시적인 또는 순차적인 추여를 지칭한다. 순차적 투여의 경우, 제2 화합물이 투여되기 시작할 때, 2개의 화합물 중 제1 화합물은 바람직하게는 여전히 치료 부위에서 효과적인 농도로 검출된다. 한 경우에서, "조합"은 또한 본 발명의 항체 및 다른 치료제를 둘 다 포함하는 키트일 수 있다.
예를 들어, 조합 치료는 본원에 기재된 하나 이상의 항체 및 하나 이상의 추가적인 치료제(예컨대 하나 이상의 사이토카인 및 성장 인자 억제제, 면역억제제, 항염증제, 대사 억제제, 효소 억제제, 및/또는 세포독소 또는 세포증식 억제제, 하기 보다 더 상세히 기재됨)의 동반-제조 및/또는 동반-투여를 포함할 수 있다. 이러한 조합 치료는 더 적은 용량의 투여되는 치료제를 유리하게 이용할 수 있고, 따라서, 다양한 단일요법과 관련된 가능한 독성 또는 합병증을 피한다.
한 양태에서, 항-CD20 항체 및 치료제의 투여는 대상에서 B 세포의 개수를 감소시킬 수 있다.
한 양태에서, 항-CD20 항체의 투여에 의하지 않는 상응하는 치료법에 비해, 상기 치료법은 대상에서 사이토카인 방출을 효과적으로 감소시키고, 이는 T 세포 활성화 치료제의 투여와 관련이 있다.
설명의 명확함 및 간결함을 위해, 특징은 동일한 또는 별개 양태의 부분으로서 기재된다. 그러나, 본 발명의 범주가 기재된 특징 중 모두 또는 일부의 조합을 갖는 일부 양태를 포함할 수 있다.
실시예 1: CD20으로 안정하게 형질감염된 세포 및 재조합 CD3 항원
1. 인간 또는 원숭이 CD20으로 안정하게 형질감염된 주(line)의 구축
인간 CD20 또는 시노몰거스 원숭이 CD20 전장 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터 플라스미드(Sino Biological로부터 구입한 cDNA, HG11007-UT, CG90052-G)를 구축하고, 구축된 렌티바이러스 플라스미드 및 패키징 플라스미드를 렌티바이러스 패키징 키트(Lenti-Pac HIV 발현 패키징 키트, Gene Copoeia, #HPK-LvTR-20)를 사용하여 HEK293T 세포에 동반-형질감염시키고, 상청액을 48시간 후 수집하였다. 렌티바이러스 입자를 포함하는 10 μL의 배양 상청액을 로그적 성장기에 있는 CHO 세포에 첨가하고, 2 일 후, 10 μg/mL 퓨로마이신을 스크리닝을 위해 첨가하였다. 내성 클론을 제한 희석하여 인간 또는 원숭이 CD20을 고도로 발현하는 안정하게 형질감염된 세포주 CHO-인간 CD20(클론 3G6) 또는 CHO-시노몰거스 원숭이 CD20(클론 1G9)을 추가 수득하였다.
도 1은 비-형질감염된 CHO 세포에 비해 인간 CD20으로 안정하게 형질감염된 세포(CHO-hCD20-3G6) 및 원숭이 CD20으로 안정하게 형질감염된 세포(CHO-cyCD20-1G9)는 CD20을 높은 수준으로 발현하는 APC-표지된 CD20 항체(BioLegend #302309)의 유세포 분석 결과를 도시한 것이다.
2. 인간 또는 원숭이 CD3εγ 이종이량체의 구축
인간 CD3γ(유니프롯 P09693, Gln23-Asn116) 및 CD3ε(유니프롯 P07766, Gln23-Asp126)의 세포외 영역의 뉴클레오티드 서열을 합성하고, C-말단을 각각 인간 IgG Fc 홀(hole) 또는 Fc 놉(knob)과 융합하고, 인간 CD3εγ-Fc 이종이량체를 발현에 의해 형성하였다(인간 CD3γ IgG Fc(홀)의 아미노산 서열은 서열번호 1에 제시되고, 인간 CD3ε IgG Fc(놉)의 아미노산 서열은 서열번호 2에 제시됨). 유사하게, 시노몰거스 원숭이 CD3γ(유니프롯 Q95LI7, Gln23-Asn110) 및 CD3ε(유니프롯 Q95LI5, Gln22-Asp117)을 합성하고, C-말단을 각각 시노몰거스 원숭이 IgG Fc 홀 또는 Fc 놉과 융합하고, 시노몰거스 원숭이 CD3εγ-Fc 이종이량체를 발현에 의해 형성하였다(시노몰거스 원숭이 CD3γ IgG Fc(홀)의 아미노산 서열은 서열번호 3에 제시되고, 시노몰거스 원숭이 CD3γ IgG Fc(놉)의 아미노산 서열은 서열번호 4에 제시됨). CD3γ-Fc 및 CD3ε-Fc를 발현하는 재조합 플라스미드를 3 mg/mL PEI(Polysciences, #24765-2)와 혼합하고, HEK293E 세포(배양 배지 OPM-293 CD03 DPM)에 동반-형질감염시키고, 37℃ 및 120 rpm에서 5% CO2하에 7일 동안 배양하고, 배양 상청액을 수집하고 단백질 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하여 95% 초과의 SDS-PAGE 순도를 갖는 재조합 인간 또는 시노몰거스 원숭이 CD3εγ-Fc 단백질을 수득하였다(도 2 참고).
실시예 2: 인간화된 항-CD3 항체
뮤린 항-하이브리도마 CD3 항체(EMBO J.1985. 4 (2): 337-344; J. Immunol. 1986, 137 (4): 1097-100; J. Exp. Med. 1991, 174: 319-326; J. Immunol. 1991,147 (9): 3047-52)는 인간 및 원숭이 CD3 수용체를 인식하고, 이의 서열은 하기와 같다:
항-CD3 마우스 단클론 항체의 경쇄의 아미노산 서열(서열번호 122):
QAVVTQESALTTSPGETVTLTCR SSTGAVTTSNYAN WVQQKPDHLFTGLIG GTNKRAP GVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCA LWYSNLWV FGGGTKLTVL
항-CD3 마우스 단클론 항체의 중쇄의 아미노산 서열(서열번호 123):
EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFN TYAMN WVRQAPGKGLEWVAR IRSKYNNYATYYADS VKDRFTISRDDSQSILYLQMNNLKTEDTAMYYCVR HGNFGNSYVSWFAY WGQGTLVTVSS
항-CD3 마우스 단클론 항체를 인간화하였다. 가장 높은 상동성을 갖는 인간 생식세포계열 유전자 IMGT_hVL7-43을 경쇄 CDR 이식을 위해 선택하고, 인간 IGLJ3*02를 FM4로서 선택하였다. 인간 IMGT_hVH3-73을 중쇄 CDR 이식을 위해 선택하고, 인간 IGHJ4*01을 FM4로서 선택하였다. 상이한 중쇄 변이체 및 경쇄 변이체를 설계하고 수득하였다(표 1 및 2 참고).
인간화된 항-CD3 항체의 경쇄 가변 영역 서열
인간화된 항-CD3 항체 서열번호 5 내지 23
LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3
아미노산 서열 뉴클레오티드 서열 아미노산
서열		 아미노산
서열		 아미노산
서열
hVL1 5 6 7 8 9
hVL2 10 11 7 8 9
hVL3 12 13 14 15 9
hVL4 16 17 14 15 9
hVL5 18 19 7 8 21
hVL6 22 23 7 20 21
hVL1:
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTC RSSTGAVTTSNYAN WVQQKPGQAPRGLI GGTNKRAP WTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYC ALWYSNLWV FGGGTKLTVL
hVL2:
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTC RSSTGAVTTSNYAN WVQEKPGQAPRGLI GGTNKRAP WTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYC ALWYSNLWV FGGGTKLTVL
hVL3:
EAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTC ESSDGAVTTSNYAN WVQEKPGQAPRGLI GGTNKEAP WTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYC ALWYSNLWV FGGGTKLTVL
hVL4:
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTC ESSDGAVTTSNYAN WVQEKPGQAPRGLI GGTNKEAP WTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYC ALWYSNLWV FGGGTKLTVL
hVL5:
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTC RSSTGAVTTSNYAN WVQEKPGQAPRGLI GGTNKRAP WTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEAEYYC VLWYSNLWV FGGGTKLTVL
hVL6:
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTC RSSTGAVTTSNYAN WFQEKPGQAPRGLI YGTNKRAP WTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQAEDEAEYYC VLWYSNLWV FGGGTKLTVL
인간화된 항-CD3 항체의 중쇄 가변 영역 서열
인간화된 항-CD3 항체 서열번호 24 내지 53
HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3
아미노산 서열 뉴클레오티드 서열 아미노산
서열		 아미노산
서열		 아미노산
서열
hVH1 24 25 26 27 28
hVH2 29 30 31 27 28
hVH3 32 33 31 27 34
hVH4 35 36 31 27 37
hVH5 38 39 31 27 40
hVH6 41 42 31 27 43
hVH7 44 45 46 47 28
hVH8 48 49 26 27 28
hVH9 50 51 26 27 28
hVH10 52 53 26 27 28
hVH1:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF NTYAMN WVRQAPGKGLEWVSR IRSKYNNYATYYADSVKD RFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVR HGNFGNSYVSWFAY WGQGTLVTVSS
hVH2:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF STYAMN WVRKAPGKGLEWVSR IRSKYNNYATYYADSVKD RFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVR HGNFGNSYVSWFAY WGQGTLVTVSS
hVH3:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF STYAMN WVRKAPGKGLEWVSR IRSKYNNYATYYADSVKD RFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVR HGNFGESYVSWFAY WGQGTLVTVSS
hVH4:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF STYAMN WVRKAPGKGLEWVSR IRSKYNNYATYYADSVKD RFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVR HGNFGQSYVSWFAY WGQGTLVTVSS
hVH5:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF STYAMN WVRKAPGKGLEWVSR IRSKYNNYATYYADSVKD RFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVR HGNFGDSYVSWFAY WGQGTLVTVSS
hVH6:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF STYAMN WVRKAPGKGLEWVSR IRSKYNNYATYYADSVKD RFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVR HGNFGTSYVSWFAY WGQGTLVTVSS
hVH7:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF SDYAMN WVRKAPGKGLEWVSR IRSKYNNYATYYADSVED RFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVR HGNFGNSYVSWFAY WGQGTLVTVSS
hVH8:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF NTYAMN WVRKAPGKGLEWVGR IRSKYNNYATYYADSVKD RFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCAR HGNFGNSYVSWFAY WGQGTLVTVSS
hVH9:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF NTYAMN WVRKAPGKGLEWVGR IRSKYNNYATYYADSVKD RFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVR HGNFGNSYVSWFAY WGQGTLVTVSS
hVH10:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF NTYAMN WVRKAPGKGLEWVAR IRSKYNNYATYYADSVKD RFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVR HGNFGNSYVSWFAY WGQGTLVTVSS
완전한 서열이 각각 합성된 후, 인간화된 경쇄 및 중쇄 변이체를 항체 λ 경쇄 불변 영역 또는 인간 IgG4 중쇄 불변 영역 CH1-CH3를 포함하는 진행성 발현 벡터에 클로닝하고, HEK293E 세포에 동반-형질감염시키고, 37℃ 및 120 rpm로 5% CO2하에 5 내지 6일 동안 배양하고, 배양 상청액을 수집하고 단백질 크로마토그래피 컬럼을 통해 정제하였다.
ELISA 친화도 분석
인간 CD3εγ 단백질을 플레이트 위에 코팅하고 4℃에서 밤새 두었다. 인간 CD3εγ 단백질을 2% 탈지유로 차단하고, 상이한 희석비를 갖는 CD3 항체를 웰에 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 인큐베이션하고, HPR-표지된 염소 항-인간 IgG Fc를 2차 항체로서 첨가하고, TMB 용액을 색상 발달을 위해 첨가하고, 반응을 농축된 황산에 의해 종결하고, 450 nm에서의 흡수를 판독하였다(결과를 도 3에 도시함).
도 3은 인간 CD3εγ 단백질에 결합하는 인간화된 항-CD3 항체(including aCD3-hVH8/VL1, aCD3-hVH9/VL1, aCD3-hVH9/VL2, aCD3-hVH9/VL3, aCD3-hVH1/VL5, aCD3-hVH8/VL5, 및 aCD3-hVH9/VL5), 및 인간화된 항-CD3 항체의 조합이 재조합 CD3εγ 단백질에 높은 친화도로 결합함을 도시한 것이다.
Jurkat T 세포 친화도 분석
로그적 성장기에 있는 Jurkat 세포를 취하고, 3% BSA로 30분 동안 차단하고 96-웰 U자형 플레이트에 웰당 5x104 세포의 밀도에 따라 첨가하고 원심분리하고, 상청액을 버리고, 50 μL의 구배-희석된 항체(30 μg/mL의 초기 농도, 3-배 희석, 5개 구배)를 각각의 웰에 첨가하고, 혼합물을 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1차 항체를 세척해 낸 후, 1:300으로 희석된 Alexa Fluro647-표지된 염소 항-인간 IgG Fc(Jackson ImmunoResearch, 109-606-170)를 2차 항체로서 첨가하고, 혼합물을 4℃에서 45분 동안 인큐베이션하고, 세척 후, 각각의 웰의 세포를 FACS(iQue, Intellicyt)를 위해 50 μL의 PBS 중 재현탁시켰다(결과를 도 4에 도시함).
도 4는 Jurkat 세포에 결합하는 인간화된 항-CD3 항체와 인간화된 항-CD3 항체 hVH9/VL5(aCD3-hVH9/VL5)의 조합이 Jurkat 세포에 중간의 친화도로 결합함을 도시한다.
실시예 3: 인간화된 항-CD20 항체
뮤린 항-CD20 항체 또는 대조군 항체를 문서 US5736137 및 US8529902를 참조하여 합성하였다. 항체의 가변 영역의 아미노산 서열은 하기와 같다:
CD20-2B8:
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSA
CD20-2F2:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPITFGQGTRLEIK
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYAMHWVRQAPGKGLEWVSTISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKKSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDIQYGNYYYGMDVWGQGTTVTVSS
CD20-11B8:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSDWPLTFGGGTKVEIK
EVQLVQSGGGLVHPGGSLRLSCTGSGFTFSYHAMHWVRQAPGKGLEWVSIIGTGGVTYYADSVKGRFTISRDNVKNSLYLQMNSLRAEDMAVYYCARDYYGAGSFYDGLYGMDVWGQGTTVTVSS
CDR 이식 및 점 돌연변이를 통해, 항-CD20 항체를 최적으로 설계하고, 등전점을 낮추었다: 뮤린 또는 대조군 항-CD20 항체의 경쇄 CDR을 인간 항체 생식세포계열 유전자 Vk3-20의 프레임 워크에 이식하고, 인간 KJ2*01을 Joint 영역으로서 사용하였다. 중쇄 CDR을 인간 VH1-69 또는 VH3-23의 프레임워크에 이식하고, 돌연변이, 예컨대 Lys77Asn을 도입하여 Fv 영역의 전하 밀도를 감소시키고, 인간 HJ4*01를 Joint 영역으로서 사용하였다. 이에 따라, 인간화된 Mab001 항체, Mab002 항체, Mab003 항체, Mab004 항체, Mab005 항체, Mab006 항체, 및 Mab007 항체 Mab007가 각각 수득되었다(표 3 및 4 참고).
경쇄 가변 영역을 κ 경쇄 불변 영역을 포함하는 진핵성 발현 벡터에 클로닝하고, 중쇄 가변 영역을 IgG4 CH1-3 불변 영역을 포함하는 진핵성 발현 벡터에 클로닝하였다. HEK293E 세포를 형질감염시키고, 발현 5 내지 6일 후, 배양 상청액을 수집하고 단백질 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하고, 항체 농도를 Nanodrop 스펙트럼광도계를 사용하여 이론적 흡수를 기반으로 측정하였다.
인간화된 항-CD20 항체의 경쇄 가변 영역 서열
인간화된 항-CD20 항체 서열번호 54 내지 63
LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3
아미노산 서열 뉴클레오티드 서열 아미노산
서열		 아미노산
서열		 아미노산
서열
Mab001 54 55 56 57 58
Mab002 54 55 56 57 58
Mab003 54 55 56 57 58
Mab004 59 60 61 62 63
Mab005 59 60 61 62 63
Mab006 59 60 61 62 63
Mab007 59 60 61 62 63
인간화된 항-CD20 항체의 중쇄 가변 영역 서열
인간화된 항-CD20 항체 서열번호 64 내지 85
HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3
아미노산 서열 뉴클레오티드 서열 아미노산
서열		 아미노산
서열		 아미노산
서열
Mab001 64 65 66 67 68
Mab002 69 70 66 67 71
Mab003 72 73 66 67 68
Mab004 74 75 76 77 78
Mab005 79 80 76 77 78
Mab006 81 82 76 77 78
Mab007 83 84 76 77 85
Mab001 항체 경쇄 가변 영역(VK)의 아미노산 서열은 서열번호 54로서 제시되고, Mab001 항체 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 55로서 제시되고, Mab001 항체 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 서열번호 56 내지 58로서 제시된다.
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC RASSSVSYIH WFQQKPGQAPRPLIY ATSNLAS GIPDRFSGSGSGTDYTLTISRLEPEDFAVYYC QQWTSNPPT FGQGTKLEIK
Mab001 항체 중쇄 가변 영역(VH)의 아미노산 서열은 서열번호 64로서 제시되고, Mab001 항체 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 65로서 제시되고, Mab001 항체 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 서열번호 66 내지 68로서 제시된다.
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFT SYNMH WVRQAPGQGLEWMG AIYPGNGDTSYNQKFQG RVTLTADKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR STYYGGDWYFNV WGQGTLVTVSS
Mab002 항체 경쇄 가변 영역(VK)의 아미노산 서열은 서열번호 54로서 제시되고, Mab002 항체 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 55로서 제시되고, Mab002 항체 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 서열번호 56 내지 58로서 제시된다.
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC RASSSVSYIH WFQQKPGQAPRPLIY ATSNLAS GIPDRFSGSGSGTDYTLTISRLEPEDFAVYYC QQWTSNPPT FGQGTKLEIK
Mab002 항체 중쇄 가변 영역(VH)의 아미노산 서열은 서열번호 69로서 제시되고, Mab002 항체 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 70로서 제시되고, Mab002 항체 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 서열번호 66, 67 및 71로서 제시된다.
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFT SYNMH WVRQAPGQGLEWMG AIYPGNGDTSYNQKFQG RVTLTADKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR STYYGGDWYFDY WGQGTLVTVSS
Mab003 항체 경쇄 가변 영역(VK)의 아미노산 서열은 서열번호 54로서 제시되고, Mab003 항체 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 55로서 제시되고, Mab003 항체 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 서열번호 56 내지 58로서 제시된다.
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC RASSSVSYIH WFQQKPGQAPRPLIY ATSNLAS GIPDRFSGSGSGTDYTLTISRLEPEDFAVYYC QQWTSNPPT FGQGTKLEIK
Mab003 항체 중쇄 가변 영역(VH)의 아미노산 서열은 서열번호 72로서 제시되고, Mab003 항체 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 73으로서 제시되고, Mab003 항체 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 서열번호 66 내지 68로서 제시된다.
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFT SYNMH WVRQAPGQGLEWMG AIYPGNGDTSYNQKFQG RVTLTADKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR STYYGGDWYFNV WGQGTLVTVSS
Mab004 항체 경쇄 가변 영역(VK)의 아미노산 서열은 서열번호 59로서 제시되고, Mab004 항체 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 60으로서 제시되고, Mab004 항체 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 서열번호 61 내지 63으로서 제시된다.
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC RASQSVSSYLA WYQQKPGQAPRLLIY DASNRAT GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC QQRSNWPIT FGQGTKLEIK
Mab004 항체 중쇄 가변 영역(VH)의 아미노산 서열은 서열번호 74로서 제시되고, Mab004 항체 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 75로서 제시되고, Mab004 항체 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 서열번호 76 내지 78로서 제시된다.
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFN DYAMH WVRQAPGKGLEWVS TISWNSGSIGYADSVKG RFTISRDNAKKTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK DIQYGNYYYGMDV WGQGTLVTVSS
Mab005 항체 경쇄 가변 영역(VK)의 아미노산 서열은 서열번호 59로서 제시되고, Mab005 항체 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 60으로서 제시되고, Mab005 항체 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 서열번호 61 내지 63으로서 제시된다.
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC RASQSVSSYLA WYQQKPGQAPRLLIY DASNRAT GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC QQRSNWPIT FGQGTKLEIK
Mab005 항체 중쇄 가변 영역(VH)의 아미노산 서열은 서열번호 79로서 제시되고, Mab005 항체 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 80으로서 제시되고, Mab005 항체 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 서열번호 76 내지 78로서 제시된다.
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFN DYAMH WVRQAPGKGLEWVS TISWNSGSIGYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK DIQYGNYYYGMDV WGQGTLVTVSS
Mab006 항체 경쇄 가변 영역(VK)의 아미노산 서열은 서열번호 59로서 제시되고, Mab006 항체 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 60으로서 제시되고, Mab006 항체 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 서열번호 61 내지 63으로서 제시된다.
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC RASQSVSSYLA WYQQKPGQAPRLLIY DASNRAT GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC QQRSNWPIT FGQGTKLEIK
Mab006 항체 중쇄 가변 영역(VH)의 아미노산 서열은 서열번호 81로서 제시되고, Mab006 항체 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 82로서 제시되고, Mab006 항체 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 서열번호 76 내지 78로서 제시된다.
EVQLLESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTF NDYAMH WVRQAPGKGLEWVS TISWNSGSIGYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK DIQYGNYYYGMDV WGQGTLVTVSS
Mab007 항체 경쇄 가변 영역(VK)의 아미노산 서열은 서열번호 59로서 제시되고, Mab007 항체 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 60으로서 제시되고, Mab007 항체 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 서열번호 61 내지 63으로서 제시된다.
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC RASQSVSSYLA WYQQKPGQAPRLLIY DASNRAT GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC QQRSNWPIT FGQGTKLEIK
Mab007 항체 중쇄 가변 영역(VH)의 아미노산 서열은 서열번호 83으로서 제시되고, Mab007 항체 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산은 서열번호 84로서 제시되고, Mab007 항체 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 서열번호 76, 77 및 85로서 제시된다.
EVQLLESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTF NDYAMH WVRQAPGKGLEWVS TISWNSGSIGYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK DIQYGNYYYGMDY WGQGTLVTVSS
인간화된 항-CD20 항체의 종양 세포에 대한 결합
로그적 성장기에 있는 림프종 세포주 Raji 및 Daudi 세포를 취하고, 200 μg/mL 마우스 IgG(Jackson ImmunoResearch)를 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 차단하였다. 5x104 세포 및 50 μL의 구배-희석된 항체(200 nM 의 초기 농도, 5-배 희석, 총 8개 구배)를 96-웰 U자형 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고 빙상에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 세척한 후, 50 μL의 Alexa Fluro647-표지된 염소 항-인간 IgG Fc(1:300 희석)를 각각의 웰에 첨가하고, 혼합물을 빙상에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 60 μL의 PI(Sigma, P4170)를 각각의 웰에 첨가하고, 혼합물을 5분 동안 인큐베이션하고 유세포 분석을 사용하여 검출하였다(iQue Screener). 도 5는 인간화된 항-CD20 항체의 Raji 세포에 대한 결합을 도시하고, 도 6은 인간화된 항-CD20 항체의 Daudi 세포에 대한 결합을 도시한다.
실시예 4: 인간화된 항-CD20 항체 및 항-CD3 항체의 조합 스크리닝
1. 항체 조합 스크리닝을 위한 2작용성 항체
등전전의 최적화 후 수득된 인간화된 항-CD20 항체 Mab002, Mab005 및 Mab007, 및 인간화된 항-CD3 항체를 선택하여 이중특이성 항체를 구축하였다. 문헌[Schaefer W et al. (PNAS, 2011)]을 참조하여, 인간화된 항-CD20 항체와 항-CD3 항체의 조합을 스크리닝하였다: 인간화된 항-CD20 항체의 경쇄 가변 영역을 κ 경쇄 불변 영역을 포함하는 진핵성 발현 벡터에 클로닝하고, 중쇄 가변 영역을 돌연변이 인간 IgG4 불변 영역을 포함하는 진핵성 발현 벡터에 클로닝하고, 인간화된 항-CD3 항체의 경쇄 가변 영역을 λ 경쇄 불변 영역을 포함하는 진핵성 발현 벡터에 클로닝하고, 항-CD3 항체의 중쇄 힌지 영역, 및 불변 영역 CH2 및 CH3, 및 중쇄 가변 영역을 인간 CH1 불변 영역을 포함하는 진핵성 발현 벡터에 클로닝하고, 경쇄 및 중쇄 유전자를 암호화하는 4개의 플라스미드를 1:1:1:1의 비로 혼합하고 HEK293E 세포에 동반-형질감염시키고 5 내지 6일 동안 발현시키고, 배양 상청액을 수집하고 단백질 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다. SEC-HPLC 결과는 상기 방법에 의해 제조된 2작용성 항체, 즉 Mab002XCD3, Mab005XCD3, 및 Mab007XCD3에서, 단량체 함량이 55% 초과임을 나타냈고, 이를 표적 세포 및 살해 효과에 대한 하기 결합의 상대적 활성 평가에 사용하였다.
항체 조합 스크리닝에 대한 2작용성 항체 서열은 표 5에 제시된다.
항체 조합 스크리닝에 대한 2작용성 항체 서열
2작용성 항체 CD20 항체 CD3 항체
Mab002XCD3,서열번호 86-93,
하기 CD20 항원 팔 및 CD3 팔에 도입된 전하 변이체를 가짐:
VκCD20: Gln37Lys; VHCD20: Gln39Glu; VλCD3: Gln40Glu; VHCD3: Gln39Lys		 쇄 1: 쇄 1의 아미노산 서열은 서열번호 86으로서 제시되고, 쇄 1을 암호화하는 핵산은 서열번호 87로서 제시됨
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYNMHWVREAPGQGLEWMGAIYPGNGDTSYNQKFQGRVTLTADKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSTYYGGDWYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDERVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK*
쇄 2: 쇄 2의 아미노산 서열은 서열번호 88로서 제시되고, 쇄 2을 암호화하는 핵산은 서열번호 89로서 제시됨
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASSSVSYIHWFQKKPGQAPRPLIYATSNLASGIPDRFSGSGSGTDYTLTISRLEPEDFAVYYCQQWTSNPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDKKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*		 쇄 3: 쇄 3의 아미노산 서열은 서열번호 90으로서 제시되고, 쇄 3을 암호화하는 핵산은 서열번호 91로서 제시됨
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEAEYYCVLWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECSESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK*
쇄 4: 쇄 4의 아미노산 서열은 서열번호 92로서 제시되고, 쇄 4을 암호화하는 핵산은 서열번호 93으로서 제시됨
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRKAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV*
Mab005XCD3,서열번호 90-97,
하기 CD20 항원 팔 및 CD3 팔에 도입된 전하 변이체를 가짐:
VκCD20: Gln38Lys; VHCD20: Gln39Glu; VλCD3: Gln40Glu; VHCD3: Gln39Lys		 쇄 1: 쇄 1의 아미노산 서열은 서열번호 94으로서 제시되고, 쇄 1을 암호화하는 핵산은 서열번호 95로서 제시됨
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNDYAMHWVREAPGKGLEWVSTISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIQYGNYYYGMDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDERVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK*
쇄 2: 쇄 2의 아미노산 서열은 서열번호 96으로서 제시되고, 쇄 2을 암호화하는 핵산은 서열번호 97로서 제시됨
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQKKPGQAPRLLIYDASNRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQRSNWPITFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDKKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*		 쇄 3: 쇄 3의 아미노산 서열은 서열번호 90으로서 제시되고, 쇄 3을 암호화하는 핵산은 서열번호 91로서 제시됨
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEAEYYCVLWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECSESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK*
쇄 4: 쇄 4의 아미노산 서열은 서열번호 92로서 제시되고, 쇄 4을 암호화하는 핵산은 서열번호 93으로서 제시됨
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRKAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV*
Mab007XCD3,서열번호 98-101 및 90-93,
하기 CD20 항원 팔 및 CD3 팔에 도입된 전하 변이체를 가짐:
VκCD20: Gln38Lys; VHCD20: Gln39Glu; VλCD3: Gln40Glu; VHCD3: Gln39Lys		 쇄 1: 쇄 1의 아미노산 서열은 서열번호 98로서 제시되고, 쇄 1을 암호화하는 핵산은 서열번호 99로서 제시됨
EVQLLESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFNDYAMHWVREAPGKGLEWVSTISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIQYGNYYYGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDERVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK*
쇄 2: 쇄 2의 아미노산 서열은 서열번호 100으로서 제시되고, 쇄 2을 암호화하는 핵산은 서열번호 101로서 제시됨
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQKKPGQAPRLLIYDASNRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQRSNWPITFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDKKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*		 쇄 3: 쇄 3의 아미노산 서열은 서열번호 90으로서 제시되고, 쇄 3을 암호화하는 핵산은 서열번호 91로서 제시됨
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEAEYYCVLWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECSESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK*
쇄 4: 쇄 4의 아미노산 서열은 서열번호 92로서 제시되고, 쇄 4을 암호화하는 핵산은 서열번호 93으로서 제시됨
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRKAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV*
2. CD20+ 세포 및 Jurkat 세포의 인식
로그적 성장기에 있는 Raji 세포 및 인간 말초 혈액 백혈병 T 세포주 Jurkat 세포를 취하고, 200 μg/mL 마우스 IgG를 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 차단하였다. 5x104 세포 및 50 μL의 구배-희석된 항체(1800 nM의 초기 농도, 5-배 희석, 총 8개 구배)를 96-웰 U자형 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고 빙상에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 1차 항체를 세척해 낸 후, 50 μL의 Alexa Fluro647-표지된 염소 항-인간 IgG Fc(1:300 희석)를 각각의 웰에 첨가하고, 혼합물을 빙상에서 45분 동안 인큐베이션하였다, 60 μL의 PI를 각각의 웰에 첨가하고, 혼합물을 5분 동안 인큐베이션하고 유세포 분석을 사용하여 검출하였다.
도 7은 항-CD20XCD3 항체 조합의 Raji 세포에 결합을 도시하고, 도 8은 항-CD20XCD3 항체 조합의 Jurkat 세포에 대한 결합을 도시한다.
3. T 세포 의존적 세포의 세포독성(TDCC) 분석
새롭게 분리된 PBMC를 로그적 성장기에 있는 Raji 세포와 혼합하고(효과기/표적 세포=10:1), 50 μL의 구배-희석된 항체(66.7 nM의 초기 농도, 10-배 희석, 8개 구배)를 각각의 웰에 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 5% CO2하에 24시간 동안 인큐베이션하였다. 배양을 완료한 후, 혼합물을 1000 rpm으로 3분 동안 원심분리하고, 상청액을 LDH 방출 분석을 위해 수집하고, 50 μL의 상청액을 흑색 ELISA 플레이트로 옮기고, 50 μL의 LDH 검출 기질을 각각의 웰에 첨가하고, 반응을 10분 후 완결하고, LDH을 검출하고(Biotek Synergy HT), 살해율을 하기 식에 따라 계산하였다. 상청액을 버린 후, 웰 내에 남은 세포를 4%의 소 혈청으로 2회 세척하고, 100 μg/mL 인간 IgG를 첨가하고, 혼합물을 10분 동안 차단하고, T 세포 초기 활성화 마커 CD69 및 후기 마커 CD25 검출 항체(CD25-PE, CD4-APC, CD69-FITC, 및 CD8-APC)를 첨가하고, 혼합물을 빙상에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 완료 후, 200 μL의 4% 소 혈청을 각각의 웰에 첨가하고 3회 세척하고, 상청액을 버리고, 60 μL의 PI(1:200 희석)를 각각의 웰에 첨가하고, 혼합물을 인큐베이션하였다빙상에서 5분 동안 및 유세포 분석을 사용하여 검출하였다(BD FACS celesta).
살해율을 계산하기 위한 식은 하기와 같다:
Figure pct00001
도 9A는 Raji 세포에서 상이한 항-CD20XCD3 항체에 의해 매개되는 TDCC 살해 효과를 도시하고; 도 9B는 TDCC 살해 동안, 항-CD20XCD3 항체 조합이 T 세포를 자극하여 활성화 마커 CD69 및 CD25를 상향조절할 수 있음을 도시한다.
4. T 세포 신호전달 경로의 활성화
루시퍼라제 리포터 플라스미드 pGL4.30[luc2P/NFAT-RE/Hygro](Promega, E8481)을 Jurkat 세포에 형질감염시키고, 200 μg/mL 히그로마이신 B를 스크리닝을 위해 첨가하고, 이에 따라, Jurkat-NFAT luc로 안정하게 형질감염된 리포터 세포를 수득하였다. CD20+ 표적 세포, 항-CD20XCD3 항체, 및 Jurkat-NFAT-luc 리포터 세포를 동반-인큐베이션하고, 항-CD20XCD3 항체가 표적 세포에 결합되 후, 항-CD20XCD3 항체의 다른 단부가 Jurkat 세포의 표면 상의 CD3 수용체에 결합하여 CD3 세포내 신호전달 모티프의 축적을 야기하였고, 활성화 신호가 NFAT 경로를 통해 핵에 전송되었는데, 이는 결과적으로 리포터 유전자 루시퍼라제의 발현의 상향조절을 야기하였다. 로그적 성장기에 있는 Jurkat-NFAT-luc 리포터 세포 및 Raji 세포를 각각 취하고, 1000 rpm으로 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 버리고, 세포를 2x106 세포/mL의 농도로 재현탁시켰다. 50 μL의 Raji 세포 현탁액을 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고 300 g로 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 버리고, 50 μL의 Jurkat-NFAT-luc 세포 현탁액 및 50 μL의 구배-희석된 항체(20 μg/mL의 초기 농도, 10-배 희석, 10개 구배)를 각각의 웰에 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 5% CO2하에 6시간 동안 배양하였다. 배양을 완료한 후, ONE-Glo Luciferase Assay System(Promega)의 매뉴얼을 참고하여, 100 μL의 검출 시약을 각각의 웰에 첨가하고, 혼합물을 실온에 3분 동안 두고, 형광 신호를 검출하였다(Biotek Synergy HT).
도 10은 Raji 세포와의 동반-배양 후, 각각의 항-CD20XCD3 항체는 Jurkat 세포의 NFAT 신호전달 경로를 활성화시킬 수 있고, 표적 세포가 없는 경우, 항-CD20XCD3 항체가 Jurkat 세포의 NFAT 신호전달 경로를 활성화시키지 않음을 도시한다.
실시예 5: 상이한 유형의 경쇄에 의해 형성된 CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체의 구축
인간화된 CD3 팔(λ 경쇄 및 패어링된(paired) 중쇄) 및 인간화된 CD20 항원 팔(κ 경쇄 및 패어링된 중쇄)을 사용하여 자연 IgG 구성을 갖는 신규한 CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체를 구성하였다. 자유 조합의 경우, κ 경쇄 또는 λ 경쇄는 통상적으로 동종 중쇄와 패어링되는 경향이 있다. 따라서, CD20XCD3 κλ001을 구축하여 CD3 팔 및 CD20 항원 팔의 자연 서열을 보유하게 하였다. 한편, 가능한 불일치를 추가로 감소시키기 위해, κ 및 λ 경쇄와 동종 중쇄의 패어링을 기반으로, Fv를 안정화사키기 위한 전하 변이체(문헌[Tan et al., 1998])를 도입하거나, 상보적 전하 짝 Glu123Lys/Gln124Lys 및 Lys152Glu/Lys218Glu를 CH1/Cκ 사이에 도입하고, 하기 5 CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체를 설계하고 구축하였다:
(1) CD3 팔 및 CD20 항원 팔의 자연 서열을 보유하는 CD20XCD3 κλ001;
(2) CD20 항원 팔 및 CD3 팔 둘 다에 도입된 전하 변이체를 갖는 CD20XCD3 κλ002(VκCD20: Gln38Lys; VHCD20: Gln39Glu; VλCD3: Gln40Glu; VHCD3: Gln39Lys);
(3) CD20XCD3 κλ002를 기초로 CH1/Cκ 사이에 추가된 상보적 전하 짝을 갖는 CD20XCD3 κλ003(Vκ-CkCD20: Gln38Lys\Glu123Lys\Gln124Lys; VH-CH1CD20: Gln39Glu\Lys152Glu\Lys218Glu; VλCD3: Gln40Glu; VHCD3: Gln39Lys);
(4) CD20 항원 팔에 도입된 Fv를 안정화시키기 위한 전하 변이체를 갖는 CD20XCD3 κλ004(VκCD20: Gln38Lys; VHCD20: Gln39Glu); 및
(5) CD3 팔에 도입된 전하 변이체를 갖는 CD20XCD3 κλ005(VλCD3: Gln40Glu; VHCD3: Gln39Lys).
인간 IgG4 놉-인투-홀 구조에
CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체의 Fc 부분은 인간 IgG4 놉-인투-홀 구조를 채용하여 이종이량체 패어링을 성취하였고(문헌[Atwell et al., 1997]), 힌지 영역이 안정하게 유지되었고 Fcγ 수용체와 C1q의 상화작용이 Ser228Pro, Leu235Glu 및 Pro329Ala 돌연변이에 의해 약화되었다. 도 11은 신규한 CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체를 도시한다.
CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체의 서열은 표 6에 제시된다.
CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체의 서열
CD20 팔 CD3 팔
CD20XCD3 κλ001(서열번호 102 내지 109):
κ 경쇄: κ 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 102로서 제시되고, κ 경쇄를 암호화하는 핵산은 서열번호 103으로서 제시됨
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQRSNWPITFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*
중쇄 1: 중쇄 1의 아미노산 서열은 서열번호 104으로서 제시되고, 중쇄 1을 암호화하는 핵산은 서열번호 105로서 제시됨
EVQLLESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFNDYAMHWVRQAPGKGLEWVSTISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIQYGNYYYGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLASSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK*
 λ 경쇄: λ 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 106으로서 제시되고, λ 경쇄를 암호화하는 핵산은 서열번호 107로서 제시됨
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEAEYYCVLWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS*
중쇄 2: 중쇄 2의 아미노산 서열은 서열번호 108로서 제시되고, 중쇄 2을 암호화하는 핵산은 서열번호 109로서 제시됨
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLASSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK*
CD20XCD3 κλ002(서열번호 110 내지 117): VκCD20: Gln38Lys; VHCD20: Gln39Glu; VλCD3: Gln40Glu; VHCD3: Gln39Lys
κ 경쇄: κ 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 110으로서 제시되고, κ 경쇄를 암호화하는 핵산은 서열번호 111로서 제시됨
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQKKPGQAPRLLIYDASNRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQRSNWPITFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*
중쇄 1: 중쇄 1의 아미노산 서열은 서열번호 112로서 제시되고, 중쇄 1을 암호화하는 핵산은 서열번호 113으로서 제시됨
EVQLLESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFNDYAMHWVREAPGKGLEWVSTISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIQYGNYYYGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLASSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK*
 λ 경쇄: λ 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 114으로서 제시되고, λ 경쇄를 암호화하는 핵산은 서열번호 115로서 제시됨
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEAEYYCVLWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS*
중쇄 2: 중쇄 2의 아미노산 서열은 서열번호 116으로서 제시되고, 중쇄 2을 암호화하는 핵산은 서열번호 117로서 제시됨
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRKAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLASSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK*
CD20XCD3 κλ003(서열번호 114 내지 121): Vκ-CkCD20: Gln38Lys\Glu123Lys\Gln124Lys; VH-CH1CD20: Gln39Glu\Lys152Glu\Lys218Glu; VλCD3: Gln40Glu; VHCD3: Gln39Lys
κ 경쇄: κ 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 118로서 제시되고, κ 경쇄를 암호화하는 핵산은 서열번호 119로서 제시됨
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQKKPGQAPRLLIYDASNRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQRSNWPITFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDKKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*
중쇄 1: 중쇄 1의 아미노산 서열은 서열번호 120으로서 제시되고, 중쇄 1을 암호화하는 핵산은 서열번호 121로서 제시됨
EVQLLESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFNDYAMHWVREAPGKGLEWVSTISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIQYGNYYYGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDERVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLASSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK*		 λ 경쇄: λ 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 114으로서 제시되고, λ 경쇄를 암호화하는 핵산은 서열번호 115로서 제시됨
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEAEYYCVLWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS*
중쇄 2: 중쇄 2의 아미노산 서열은 서열번호 116으로서 제시되고, 핵산 of 중쇄 2을 암호화하는 핵산은 서열번호 117로서 제시됨
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRKAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLASSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK*
CD20XCD3 κλ004(서열번호 106 내지 113): VκCD20: Gln38Lys; VHCD20: Gln39Glu
κ 경쇄: κ 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 110으로서 제시되고, κ 경쇄를 암호화하는 핵산은 서열번호 111로서 제시됨
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQKKPGQAPRLLIYDASNRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQRSNWPITFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*
중쇄 1: 중쇄 1의 아미노산 서열은 서열번호 112로서 제시되고, 중쇄 2을 암호화하는 핵산은 서열번호 113으로서 제시됨
EVQLLESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFNDYAMHWVREAPGKGLEWVSTISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIQYGNYYYGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLASSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK*
 λ 경쇄: λ 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 106으로서 제시되고, λ 경쇄를 암호화하는 핵산은 서열번호 107로서 제시됨
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEAEYYCVLWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS*
중쇄 2: 중쇄 2의 아미노산 서열은 서열번호 108로서 제시되고, 중쇄 2을 암호화하는 핵산은 서열번호 109로서 제시됨
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLASSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK*
CD20XCD3 κλ005(서열번호 102 내지 105, 및 114 내지 117): VλCD3: Gln40Glu; VHCD3: Gln39Lys
κ 경쇄: κ 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 102로서 제시되고, κ 경쇄를 암호화하는 핵산은 서열번호 103으로서 제시됨
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQRSNWPITFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*
중쇄 1: 중쇄 1의 아미노산 서열은 서열번호 104으로서 제시되고, 중쇄 1을 암호화하는 핵산은 서열번호 105로서 제시됨
EVQLLESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFNDYAMHWVRQAPGKGLEWVSTISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIQYGNYYYGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLASSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK*
 λ 경쇄: λ 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 114으로서 제시되고, λ 경쇄를 암호화하는 핵산은 서열번호 115로서 제시됨
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEAEYYCVLWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS*
중쇄 2: 중쇄 2의 아미노산 서열은 서열번호 116으로서 제시되고, 중쇄 2을 암호화하는 핵산은 서열번호 117로서 제시됨
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRKAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLASSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK*
CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체의 발현 및 정제
상응하는 항체 단편을 암호화하는 플라스미드를 κ 경쇄:λ 경쇄:중쇄 1:중쇄 2의 비가 2:2:1:1이 되도록 혼합하고, 3 mg/mL의 PEI와 혼합하고, CHO-S 세포에 동반-형질감염시키고, 500 mL의 CD CHO AGT 배지(Gibco#12490-001)에서 37℃에서 및 150 rpm 5% CO2하에 배양하고, 4% CHO Feed C+ 보충제(Gibco #A25031-05)를 일시적 형질감염의 2, 4 및 6일에 첨가하였다. 세포 생존률이 약 85%로 감소한 후, 발효 브로스(broth)를 수확하고 여과하고 단백질 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 세포 용액을 농축하고 PBS 중 재현탁시키고, 흡수를 측정하고(Nanodrop), 및 단백질 농도를 이론적 흡광 계수를 기준으로 계산하였다.
CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체에서 SEC-HPLC 및 모세관 전기영동 결과는 단량체의 순도가 90% 이상에 가까움을 나타냈고(표 7 참고), κ 경쇄 대 λ 경쇄의 비는 1:1에 가깝다(도 12 참고).
CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체 단량체(SEC-HPLC)의 순도
κλ 이중특이성 항체 SEC-HPLC(%)
중합체 단량체 단편
CD20XCD3 κλ001 4.1 92.5 3.5
CD20XCD3 κλ002 4.6 90.8 4.5
CD20XCD3 κλ003 3.1 88.3 8.6
CD20XCD3 κλ004 4.8 91.1 4.0
CD20XCD3 κλ005 6.0 90.5 3.5
CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체를 추가로 정련하고 Capto S ImpAct 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하고, 용리 피크를 구배 용리를 통해 합쳤다. SEC-HPLC 결과는 단량체 함량이 99% 초과임을 나타낸다(도 13 참고). 정제된 CD20XCD3 κλ002 및 CD20XCD3 κλ003 샘플에서, 경쇄 불일치율은 극히 낮았고(<1%), CD3 동종이량체 또는 CD20 동종이량체가 검출되지 않았다(도 14 참고).
실시예 6: CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체의 결합 활성
이중특이성 항체의 CD20 항원 팔의 친화도를 CD20 또는 CD20+ 종양 세포를 과발현하는 안정하게 형질감염된 세포에 대한 결합을 검출함으로써 측정하고, 이중특이성 항체의 CD3 팔의 친화도를 재조합 CD3 항원, Jurkat 세포 또는 새롭게 분리된 말초 혈액 T 세포에 대한 결합을 검출함으로써 측정하였다. 검출 결과는 신규한 CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체의 종양 세포에 대한 친화도가 T 세포에 대한 친화도보다 약 3 내지 5배 높음을 나타냈다. 양성 대조군 항체 bsAB1을 합성하고 문서 US20170174781을 참조하여 발현시켰다.
1. CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체의 인간 및 원숭이 CD20으로 안정하게 형질감염된 세포에 대한 결합
실시예 1에서 제조된 로그적 성장기에 있는 CHO-인간 CD20 및 CHO-원숭이 CD20으로 안정하게 형질감염된 세포를 취하고 4% 소 혈청(Hy클론, SH30626.06)에 의해 5x105 세포/mL의 농도로 조정하고, 100 μL의 세포 현탁액을 96-웰 U자형 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고 300 g로 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 버리고, 100 μL의 구배-희석된 항체(1800 nM의 초기 농도, 3-배 희석, 12개 구배)를 각각의 웰에 첨가하고, 혼합물을 4℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 50 μL의 Alexa Fluro647-표지된 염소 항-인간 IgG Fc(1:300 희석)를 2차 항체로서 각각의 웰에 첨가하고, 혼합물을 빙상에서 20분 동안 인큐베이션하고 1회 세척하고, 50 μL의 PI 용액(1:300)을 각각의 웰에 첨가하고, 혼합물을 5분 동안 인큐베이션하고 유세포 분석을 사용하여 검출하였다.
도 15 및 표 8은 CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체가 세포 상의 CD20 수용체에 높은 친화도로 결합하고, 인간 및 원숭이 CD20으로 안정하게 형질감염된 세포에 대한 친화도가 등가임을 나타낸다.
CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체의 CD20으로 안정하게 형질감염된 세포에 대한 결합
EC50 인간 CD20-CHO 원숭이 CD20-CHO
CD20XCD3 κλ001 10 nM 12 nM
CD20XCD3 κλ002 9 nM 8 nM
CD20XCD3 κλ003 7 nM 8 nM
CD20XCD3 κλ004 8 nM 10 nM
CD20XCD3 κλ005 9 nM 14 nM
KLHXCD3 결합하지 않음 결합하지 않음
2. CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체의 인간 CD20+ 종양 세포에 대한 결합
로그적 성장기에 있는 SU-DHL-4, Raji 및 NALM-6 세포를 취하고, 200 μg/mL 마우스 IgG(Jackson ImmunoResearch, 115-005-03)를 첨가하고, 혼합물을 빙욕에서 30분 동안 차단하고, 세포를 4% 소 혈청에 의해 5x105 세포/mL의 농도로 조정하였다, 100 μL의 세포 현탁액을 96-웰 U자형 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고 300 g로 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 버리고, 100 μL의 구배-희석된 항체(1800 nM의 초기 농도, 3-배 희석, 12개 구배)를 각각의 웰에 첨가하고, 혼합물을 4℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 1차 항체를 세척해 내고, 50 μL의 Alexa Fluro647-표지된 염소 항-인간 IgG Fc(1:300 희석)를 각각의 웰에 첨가하고, 혼합물을 빙상에서 20분 동안 인큐베이션하고 1회 세척하고, 50 μL의 PI를 각각의 웰에 첨가하고, 혼합물을 5분 동안 인큐베이션하고 유세포 분석을 사용하여 검출하였다.
검출 결과는 도 16 및 표 9에 제시되고, CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체는 CD20+ 종양 세포 SU-DHL-4, Raji 및 NALM-6에 높은 친화도로 결합한다.
CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체의 CD20+ 종양 세포에 대한 결합
EC50(nM) SU-DHL-4 Raji NALM-6
CD20XCD3 κλ002 7 23 10
CD20XCD3 κλ003 6 25 8
bsAB1 19 115 48
KLHXCD3 결합하지 않음 결합하지 않음 결합하지 않음
3. CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체의 재조합 인간 및 원숭이 CD3 항원에 대한 결합
1 μg/mL의 재조합 인간 또는 원숭이 CD3γ/ε 항원을 플레이트 위에 코팅하고 및 4℃에서 밤새 위치시켰다. 재조합 인간 또는 원숭이 CD3γ/ε 항원을 탈지유로 차단한 후, 100 μL의 항체(60 μg/mL의 초기 농도, 3-배 희석, 총 12개 구배)를 각각의 웰에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 100 μL의 염소 항-인간 F'(ab)2(1:4000 희석)를 2차 항체로서 각각의 웰에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. TMB를 색상 발달을 위해 첨가하고, 50 μL의 농축된 황산을 첨가하여 반응을 종결시키고, 450 nm의 광학 밀도를 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 판독하고, 3-매개변수 피팅(fitting) 곡선을 Graphpad 소프트웨어를 사용하여 도시하였다.
검출 결과는 도 17에 제시되고, CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체는 재조합 인간 및 시노몰거스 원숭이 CD3εγ 항원을 등가의 친화도로 인식한다.
4. 재조합 CD3 항원에 대한 CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체의 친화도 분석
10 μg/mL 재조합 인간 또는 원숭이 CD3εγ 항원은 아미노 커플링에 의해 CM5 칩(GE healthcare)에 결합하였고, 항원의 결합량을 약 200 RU이 되도록 제어하였다. 기준선이 안정해진 후, 구배-희석된 항체(10 μg/mL의 초기 농도, 2-배 희석, 7개 구배)는 30 μL/분의 유속으로 칩을 통해, 350초의 결합 시간 및 600초의 해리 시간으로 유동하였다. 운동 상수를 Biacore T200 평가 소프트웨어를 사용하여 1:1 결합 모델에 대해 데이터를 피팅함으로써 계산하였다. 친화도 분석 결과는 표 10에 제시된다.
CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체의 재조합 CD3 항원에 대한 친화도
KD(nM) 인간 CD3εγ 원숭이 CD3εγ
CD20XCD3 κλ002 24.2 31.5
CD20XCD3 κλ003 26.4 34.3
KLHXCD3 21.6 21.6
5. CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체의 Jurkat 세포에 대한 결합
로그적 성장기에 있는 Jurkat 세포를 취하고, 200 μg/mL 마우스 IgG(Jackson ImmunoResearch, 115-005-03)를 첨가하고, 혼합물을 빙상에서 30분 동안 두었다. 세포를 4% 소 혈청에 의해 5x105 세포/mL의 농도로 조정하고, 100 μL의 세포 현탁액을 96-웰 U자형 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고 300 g로 원심분리하고, 상청액을 원심분리하고, 100 μL의 구배-희석된 항체(1800 nM의 초기 농도, 3-배 희석, 12개 구배)를 각각의 웰에 첨가하고, 혼합물을 4℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 50 μL의 Alexa Fluro647-표지된 염소 항-인간 IgG Fc(1:300 희석)를 2차 항체로서 각각의 웰에 첨가하고, 혼합물을 빙상에서 20분 동안 인큐베이션하고 1회 세척하고, 50 μL의 PI를 각각의 웰에 첨가하고, 혼합물을 5분 동안 인큐베이션하고 유세포 분석을 사용하여 검출하였다(BD C6).
검출 결과는 도 18 및 표 11에 제시된다, CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체는 인간 백혈병 T 세포주 Jurkat 세포에 중간의 친화도로 결합하고, EC50은 약 71 내지 120 nM이고, 이는 CD20 수용체에 대한 CD20의 결합력보다 10배 낮다.
CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체의 Jurkat 세포에 대한 결합
EC50 Jurkat
CD20XCD3 κλ002 71 nM
CD20XCD3 κλ003 120 nM
bsAB1 ND
KLHXCD3 33 nM
ND: 고농도에서 포화에 도달하지 않음
6. CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체의 인간 또는 시노몰거스 원숭이 말초 혈액 T 세포에 대한 결합
신선한 인간 또는 시노몰거스 원숭이 말초 혈액을 취하고 Ficoll.Paque Plu(GE, 17-1440-03)에 의해 분리하여 PBMC를 수득하였다. PBMC를 4% 소 혈청(Hyclone, SH30626.06)에 의해 5x105 세포/mL 의 농도로 조정하고, 100 μL의 세포 현탁액을 96-웰 U자형 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고 원심분리하고, 상청액을 버리고, 100 μL의 구배-희석된 항체(1800 nM의 초기 농도, 3-배 희석, 11개 구배)를 각각의 웰에 첨가하고, 혼합물을 4℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 50 μL의 Alexa Fluro647-표지된 염소 항-인간 IgG Fc(1:300 희석)를 2차 항체로서 각각의 웰에 첨가하고, 혼합물을 빙욕에서 20분 동안 두고 1회 세척하고, 50 μL의 PI를 각각의 웰에 첨가하고, 혼합물을 5분 동안 인큐베이션하고 유세포 분석을 사용하여 검출하였다(BD C6).
검출 결과는 도 19 및 표 12에 제시되고, CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체는 인간 또는 시노몰거스 원숭이 말초 혈액 CD4+T 및 CD8+T 세포를 인식하고, 인간 T 세포에 대한 친화도는 약 65 내지 98 nM이고, 시노몰거스 원숭이 T 세포에 대한 친화도는 약 89 내지 124 nM이고, 친화도는 등가이고, CD20 수용체에 대한 CD20 항원 팔의 결합력보다 10배 약하고, 이는 이중특이성 항체의 종양 세포에 대한 우선적인 농축과 대조적이다.
CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체의 말초 혈액 T 세포에 대한 결합
EC50(nM) 인간 CD4+T 인간 CD8+T 원숭이 CD4+T 원숭이 CD8+T
CD20XCD3 κλ002 73 98 97 124
CD20XCD3 κλ003 69 65 89 120
bsAB1 25 22 ND 150
KLH-CD3 62 65 69 85
ND: 고농도에서 포화에 도달하지 않음
실시예 7: CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체-매개되는 TDCC
새롭게 분리된 PMBC를 취하고 로그적 성장기에 있는 표적 세포 NALM-6, TMD-8 및 Toledo와 각각 8:1의 효과기/표적 세포 비로 혼합하고, 50 μL의 구배-희석된 항체(66.7 nM의 초기 농도, 10-배 희석, 8개 구배)를 각각의 웰에 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 5% CO2하에 24시간 동안 배양하였다. 배양을 완료한 후, 50 μL의 상청액을 신규한 흑색 ELISA 플레이트로 옮기고, 50 μL의 LDH 검출 기질을 각각의 웰에 첨가하고, 반응을 10분 후 완결하고, LDH 방출을 검출하고, 웰 내에 남은 세포를 4%의 소 혈청으로 2회 세척하고, 100 μg/mL 인간 IgG를 첨가하고, 혼합물을 10분 동안 인큐베이션하고, T 세포 활성화 검출 항체(CD25-PE, CD4-APC, CD69-FITC, 및 CD8-APC)를 첨가하고, 혼합물을 빙상에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 혼합물을 세척하고, 상청액을 버리고, 60 μL의 PI를 각각의 웰에 첨가하고, 혼합물을 인큐베이션하였다빙상에서 5분 동안 및 유세포 분석을 사용하여 검출하였다.
도 20 및 도 20B는 각각 인간 림프 백혈병 세포 Nalm-6의 살해 및 CD20×CD3 κλ 이중특이성 항체에 의한 T 세포의 활성화를 도시한다. 도 21A 및 도 21B는 각각 TMD-8 세포의 살해 및 CD20×CD3 κλ 이중특이성 항체에 의한 T 세포의 활성화를 도시한다. 도 22A 및 도 22B는 각각 Toledo 세포의 살해 및 CD20×CD3 κλ 이중특이성 항체에 의한 T 세포의 활성화를 도시한다. 상이한 CD20 발현 수준을 갖는 종양 세포 Nalm-6, TMD-8 및 Toledo의 경우, CD20XCD3 κλ002 및 CD20XCD3 κλ003 둘 다는 효과적인 T 세포 살해를 매개할 수 있고, 살해 활성은 대조군 항체 bsAB1의 것에 등가이거나 약간 더 강하고, T 세포에 대한 활성화 효과는 후자의 것보다 약한 온화하다.
실시예 8: T 세포 활성화 경로 by CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체의 활성화
로그적 성장기에 있는 Jurkat-NFAT-luc 리포터 세포 및 CD20-양성 표적 세포(SU-DHL-4, Raji 및 NALM-6 세포)를 취하고 및 원심분리하고, 상청액을 버리고, 세포를 2x106 세포/mL의 농도로 재현탁시켰다. 50 μL의 표적 세포를 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 접종하고 300 g로 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 버리고, 50 μL의 Jurkat-NFAT-luc 리포터 세포를 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 접종하고, 50 μL의 구배-희석된 CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체 또는 대조군 항체 KLHXCD3(20 μg/mL의 초기 농도, 10-배 희석, 10개 구배)를 각각의 웰에 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 5% CO2하에 6시간 동안 인큐베이션하였다. 배양을 완료한 후, ONE-Glo Luciferase Assay System의 매뉴얼을 참고하여, 100 μL의 검출 시약을 각각의 웰에 첨가하고, 혼합물을 실온에 3분 동안 두고 마이크로플레이트 판독기(Biotek Synergy HT)를 사용하여 검출하였다.
검출 결과는 도 23 및 표 13에 제시되고, 상이한 CD20 발현 수준을 갖는 종양 세포가 표적 세포로서 작용하는 경우, 모든 CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체는 T 세포의 NFAT 신호전달 경로를 활성화시킬 수 있다.
CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체에 의한 T 세포 NFAT 경로의 활성화
EC50(nM) SU-DHL-4 Raji NALM-6
CD20XCD3 κλ002 0.10 0.02 0.14
CD20XCD3 κλ003 0.11 0.02 0.14
KLHXCD3 - - -
실시예 9: CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체에 의한 사이토카인 방출의 활성화
B-NHL 종양 세포 Raji 또는 자가 B 세포의 살해를 매개할 때, CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체는 T 세포를 활성화하고 PBMC 중 관련 사이토카인의 방출을 자극할 수 있다. 2x105개의 신선한 PBMC를 1x105개의 Raji 세포 및 50 μL의 구배-희석된 항체(66.7 nM의 초기 농도, 10-배 희석, 8개 구배)와 혼합하고, 혼합물을 37℃에서 5% CO2하에 24시간 동안 인큐베이션하였다. 배양 상청액 중 IL-2, IL-6, IFN-γ, TNF-α, 등의 함량을 마이크로 샘플을 위한 다지수(multi-index) 유동 단백질 정량분석(Cytometric Bead Array, CBA)에 의해 검출하였다. 웰 내의 상청액을 버리고, 웰 내에 남은 세포를 4%의 소 혈청으로 2회 세척하고, 100 μg/mL 인간 IgG를 첨가하고, 혼합물을 10분 동안 차단하고, T 세포 활성화 검출 시약(CD25-PE, CD4-APC, CD69-FITC 및 CD8-APC)을 첨가하고, 혼합물을 빙상에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 혼합물을 세척하고, 상청액을 버리고, 60 μL의 PI를 각각의 웰에 첨가하고, 혼합물을 5분 동안 인큐베이션하고, CD4+ 및 CD8+T 세포 활성화 마커를 유세포 분석을 사용하여 검출하였다(BD FACS celesta). 자가 B 세포에서의 살혜 시험의 단계는 상기와 동일하였지만, 인큐베이션 동안 Raji 세포를 첨가하지 않았다.
도 24는 상기 과정 중 Raji 세포 및 T 세포의 활성화에 대한 CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체의 TDCC 활성을 도시한다. 도 25는 상기 과정 중 CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체 및 T 세포의 활성화에 의한 자가 B 세포의 제거를 도시한다. 도 26은 Raji 세포의 살해 또는 자가 B 세포의 제거 동안 관련 사이토카인의 방출을 도시한다. CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체가 CD20 및 PBMC를 고도로 발현하는 Raji 세포와 동반-인큐베이션되는 경우, 또는 PBMC만으로 인큐베이션되는 경우, Raji 세포 또는 자가 B 세포에 대한 CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체-매개되는 살해 활성은 대조군 항체 bsAB1의 것과 등가이거나 약간 더 강하다. 그러나, TDCC 과정 중 활성화 효과에 대한 T 세포는 상대적으로 더 온화하고, 마커 CD69 및 CD25의 발현의 상향조절은 대조군 항체보다 현저히 낮거나, 높지 않았다. 유사하게, 사이토카인 IL-6, INF-γ, IL-2 및 TNF-α의 자극된 분비량은 후자의 것보다 현저히 덜하거나, 더 크지 않고, IL-6, INF-γ 등의 막대한 방출은 심각한 사이토카인 스톰 증후군을 촉발할 수 있다.
실시예 10: CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체의 Fcγ 수용체에 대한 결합
50 μg/mL His-Tag 항체를 아미노 기를 통해 CM5 칩에 접합하고, His 태그(Sino Biological, #10256-H08H/10374-H08H1/10389-H08H1)를 갖는 재조합 단백질 FcγRI, FcγRIIAH131 및 FcγRIIIAV158을 각각 40초의 포획 시간 동안 10 μL/분의 유속으로 포획하였다. 기준선이 안정화된 후, 구배-희석된 항체(37.5 μg/mL의 초기 농도, 2-배 희석)가 칩을 통해 30 μL/분의 유속으로 120초의 결합 시간 및 200초의 해리 시간 동안 유동하였고, 친화도 상수를 Biacore 평가 소프트웨어에 의한 피팅에 의해 수득하였다.
표 14에서, CD20XCD3 κλ 항체가 FcγRI, FcγRIIAH131 및 FcγRIIIAV158에 결합하지 않고 야생형 IgG4 대조군 항체가 FcγRI에 높은 친화도로 결합하고 FcγRIIAH131에 약하게 결합함을 볼 수 있다.
CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체의 Fcγ 수용체에 대한 친화도
KD FcγRI FcγRIIAH131 FcγRIIIAV158
CD20XCD3 κλ002 결합하지 않음 결합하지 않음 결합하지 않음
CD20XCD3 κλ003 결합하지 않음 결합하지 않음 결합하지 않음
IgG4 이소형(isotype) 대조군 14 nM 약함 결합하지 않음
실시예 11: 피하 Raji 이식 종양 면역 재구성된 마우스 모델
6 내지 8-주령 암컷 B-NGD 마우스(Biocytogen)를 선택하고 3x106 Raji 세포로 피하 접종하고, 종양이 60 mm3으로 자란 후, 마우스를 무작위로 군으로 나누고, 이를 각각 3.0 mg/kg 투여 군, 0.6 mg/kg 투여 군, 0.12 mg/kg 투여 군, 및 음성 대조군 군(KLHXCD3, 3 mg/kg)으로 설정하였다. 1x107개의 PBMC 세포를 각각의 마우스에 꼬리 정맥을 통해 주사하고, 마우스에게 3일 후 처음으로 투여하고, 5일마다 총 3회 투여를 수행하였다. 마우스의 종양 부피 및 체중을 모니터링하였다. 실험이 완료된 후, 마우스를 경추 탈구에 의해 살해하고, 종양을 취하고 칭량하고 기록하였다.
결과는 도 27에 제시되고, CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체의 생체 내 효능은 용량-의존적이고, 중간 용량 및 고 용량의 종양 억제율은 각각 82% 및 89%이다. 종양-보유 마우스는 유해한 반응, 예컨대 체중 손실 없이 상기 용량을 잘 관용하였다. 도 28은 CD20XCD3 κλ 002가 저 용량 군(0.12 mg/kg)에서 4마리의 마우스에서 종양 억제(n=5)를 성취함을 도시한다.
실시예 12: 피하 Raji 및 인간 PBMC 혼합된 종양의 면역결핍 마우스 모델
6 내지 8-주령 암컷 B-NGD 마우스(Biocytogen)를 선택하고, Raji(3x106) 및 인간 PBMC(5x106)를 혼합하고 마우스에 피하 접종하고, 종양 부피가 60 내지 100 mm3에 도달 한 후, 마우스를 무작위로 군으로 나누었다. 상기 군을 각각 3.0 mg/mL 투여 군, 0.6 mg/mL 투여 군, 0.12 mg/mL 투여 군, 및 음성 군(KLHXCD3, 3 mg/kg)으로서 설정하였다. 투여를 5일마다 총 2회 수행하였다. 마우스의 종양 부피 및 체중을 모니터링하였다. 실험을 완료하고, 마우스를 경추 탈구에 의해 살해하고, 종양을 취하고 칭량하고 기록하였다.
결과는 도 29에 제시되고, CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체의 생체 내 효능은 용량-의존적이고, 저, 중간 및 고 용량의 종양 억제율은 각각 65%, 98% 및 162%이고, 고 및 중간 용량 군에서 종양은 완저히 억제되거나 퇴행하였다.
실시예 13: 시노몰거스 원숭이에서 CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체의 효능
8마리의 시노몰거스 원숭이를 용량 군당 2마리의 원숭이(1마리는 수컷 1마리는 암컷)으로 4개의 용량 군으로 나누었다. 용량 군에 투여된 CD20XCD3 κλ002 이중특이성 항체의 용량은 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg(3주 동안 주 1회, 4회), 및 1 mg/kg(단일 투여)였다. 투여법은 표 15에 제시된다. 투여 기간 및 회복 기간 동안, 각각의 군의 모든 원숭이는 독성 반응, 사망 및 임사(near-death) 없이 우수한 일반적 상태에 있었다. 각각의 용량군에서 체온에서의 뚜렷한 비정상적인 변화는 없었고, 납(II) 심전도의 파형은 정상이었다. 지표, 예컨대 심박수, R-R 간격, P-R 간격, QT 간격, QRS 지속시간, 수축기 혈압에서의 뚜렷한 비정상은 없었다. 투여후 상이한 시점에서, 말초 혈액 중 B 및 T 세포 군집의 개수의 변화를 유세포 분석에 의해 분석하였다. B 세포를 세포 표면 마커 CD20(CD20+ 세포)에 의해 확인하고, T 세포를 CD3(CD3+ 세포)에 의해 분석하였다. 투여 8시간 후, 말초 혈액 중 B 세포를 빠르게 제거하고, 투여 25시간 후, B 세포의 개수는 검출의 하한치보다 적었다(도 30 참고).
CD20XCD3 κλ 이중특이성 항체의 투여법
군 용량 투여 경로 및 빈도 성별 동물 번호
저 용량 군 0.3 mg/kg IV, 주 1회/3주
D1, D8, D15, 및 D22		 수컷 2016221
암컷 2016222
중간 용량 군 1 mg/kg IV, 주 1회/3주
D1, D8, D15, 및 D22		 수컷 2016223
암컷 2016224
고 용량 군 3 mg/kg IV, 주 1회/3주
D1, D8, D15, 및 D22		 수컷 2016225
암컷 2016226
배지 용량 군 1 mg/kg IV, D1 단일 투여 암컷 2016227
수컷 2016228
SEQUENCE LISTING <110> BEIJING TIANNUOJIANCHENG PHARMA TECH CO., LTD. <120> DEVELOPMENT OF DRUG THERAPEUTIC AGENT CONTAINING ADAPTOR AND USE THEREOF <130> 20200807 <140> PCT/CN2021/114847 <141> 2021-08-26 <150> CN 202010873215.X <151> 2020-08-26 <160> 123 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 306 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gln Ser Ile Lys Gly Asn His Leu Val Lys Val Tyr Asp Tyr Gln Glu 1 5 10 15 Asp Gly Ser Val Leu Leu Thr Cys Asp Ala Glu Ala Lys Asn Ile Thr 20 25 30 Trp Phe Lys Asp Gly Lys Met Ile Gly Phe Leu Thr Glu Asp Lys Lys 35 40 45 Lys Trp Asn Leu Gly Ser Asn Ala Lys Asp Pro Arg Gly Met Tyr Gln 50 55 60 Cys Lys Gly Ser Gln Asn Lys Ser Lys Pro Leu Gln Val Tyr Tyr Arg 65 70 75 80 Met Cys Gln Asn Cys Ile Glu Leu Asn Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly 85 90 95 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 100 105 110 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 115 120 125 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 130 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Met Ile Ser 100 105 110 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 115 120 125 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 130 135 140 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 145 150 155 160 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 165 170 175 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys 180 185 190 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr 195 200 205 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser 210 215 220 Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 225 230 235 240 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 245 250 255 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 260 265 270 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 275 280 285 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 290 295 300 Lys 305 <210> 4 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens 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cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642 <210> 112 <211> 449 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 112 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Glu Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser 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Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 445 Lys <210> 113 <211> 1347 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 113 gaagtgcagc tgctggaatc tggtggcgga gttgttcagc ctggcggctc tctgagactg 60 tcttgtgctg ccagcggctt caccttcaac gactacgcta tgcactgggt ccgagaggcc 120 cctggcaaag gacttgaatg ggtgtccacc atcagctgga acagcggctc tatcggctac 180 gccgattccg tgaagggcag attcaccatc tccagagaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actactgtgc caaggacatc 300 cagtacggca actactacta cggcatggac tactggggcc agggaacact ggttaccgtt 360 agctctgcta gcaccaaggg ccccagcgtg ttccccctgg ccccttgcag cagaagcacc 420 agcgagagca cagccgccct gggctgcctg gtgaaggact acttccccga gcccgtgacc 480 gtgtcctgga acagcggcgc tctgaccagc ggcgtgcata ccttccccgc cgtgctccag 540 agcagcggac tgtactccct gagcagcgtg gtgaccgtgc cttccagcag cctgggcacc 600 aagacctaca cctgcaacgt ggaccacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtg 660 gagagcaagt acggccctcc ctgcccccct tgccctgccc ccgagttcga gggcggacct 720 agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagcag aacccccgag 780 gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtcccag gaggaccccg aggtccagtt taattggtac 840 gtggacggcg tggaagtgca taacgccaag accaagccca gagaggagca gttcaacagc 900 acctacagag tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggaa 960 tacaagtgca aggtctccaa caagggcctg gccagcagca tcgagaagac catcagcaag 1020 gccaagggcc agccacggga gccccaggtc tgcaccctgc cacctagcca agaggagatg 1080 accaagaacc aggtgtccct gagctgtgcc gtgaaaggct tctatcccag cgatatcgcc 1140 gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg 1200 gacagcgacg gcagcttctt cctggtttcc aagctgaccg tggacaagtc cagatggcag 1260 gagggcaacg tcttcagctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 1320 aagtccctga gcctgagcct gggcaag 1347 <210> 114 <211> 215 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 114 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro 100 105 110 Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu 115 120 125 Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro 130 135 140 Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala 145 150 155 160 Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala 165 170 175 Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg 180 185 190 Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr 195 200 205 Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215 <210> 115 <211> 645 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 115 caggctgtgg tcacacaaga gcctagcctg acagtgtctc ctggcggcac agtgaccctg 60 acctgtagat cttctacagg cgccgtgacc accagcaact acgctaattg ggtgcaggag 120 aagcccggcc aggctcctag aggactgatc ggcggaacaa acaagagagc cccttggaca 180 cccgccagat tctctggatc tctgctcggc ggaaaggccg ctctgacaat cactggtgct 240 caggctgagg acgaggccga gtactattgt gtgctgtggt acagcaacct gtgggtgttc 300 ggcggaggca ccaaactgac agttctgggt cagcccaagg cggcgccctc ggtcactctg 360 ttcccgccct cctctgagga gcttcaagcc aacaaggcca cactggtgtg tctcataagt 420 gacttctatc cgggagccgt gacagtggcc tggaaggcag atagcagccc cgtcaaggcg 480 ggagtggaga ccaccacacc ctccaaacaa agcaacaaca agtacgcggc cagcagctac 540 ctgagcctga cgcctgagca gtggaagtcc cacagaagct acagctgcca ggtcacgcat 600 gaagggagca ccgtggagaa gacagtggcc cctacagaat gttca 645 <210> 116 <211> 452 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 116 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Lys Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser 130 135 140 Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 170 175 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 180 185 190 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys 195 200 205 Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 210 215 220 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu 225 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270 Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 290 295 300 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Ala Ser Ser 325 330 335 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365 Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445 Ser Leu Gly Lys 450 <210> 117 <211> 1356 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 117 gaggtgcagc tggttgaatc tggcggagga ctggttcagc ctggcggatc tctgagactg 60 tcttgtgccg ccagcggctt caccttcaac acctacgcta tgaactgggt ccgaaaggcc 120 cctggcaaag gactggaatg ggtgggaaga atcaggtcca agtacaacaa ctacgccacc 180 tactacgccg acagcgtgaa ggacagattc accatcagca gggacgacag caagaacagc 240 ctgtacctgc agatgaacag cctgaaaacc gaggacaccg ccgtgtacta ctgtgtcaga 300 cacggcaact tcggcaacag ctatgtgtct tggtttgcct actggggcca gggcacactg 360 gtcacagtta gctctgctag caccaagggc cccagcgtgt tccccctggc cccttgcagc 420 agaagcacca gcgagagcac agccgccctg ggctgcctgg tgaaggacta cttccccgag 480 cccgtgaccg tgtcctggaa cagcggcgct ctgaccagcg gcgtgcatac cttccccgcc 540 gtgctccaga gcagcggact gtactccctg agcagcgtgg tgaccgtgcc ttccagcagc 600 ctgggcacca agacctacac ctgcaacgtg gaccacaagc ccagcaacac caaggtggac 660 aagagagtgg agagcaagta cggccctccc tgcccccctt gccctgcccc cgagttcgag 720 ggcggaccta gcgtgttcct gttccccccc aagcccaagg acaccctgat gatcagcaga 780 acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac gtgtcccagg aggaccccga ggtccagttt 840 aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcat aacgccaaga ccaagcccag agaggagcag 900 ttcaacagca cctacagagt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac 960 ggcaaggaat acaagtgcaa ggtctccaac aagggcctgg ccagcagcat cgagaagacc 1020 atcagcaagg ccaagggcca gccacgggag ccccaggtct acaccctgcc accttgtcaa 1080 gaggagatga ccaagaacca ggtgtccctg tggtgtctgg tgaaaggctt ctatcccagc 1140 gatatcgccg tggagtggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc 1200 cctgtgctgg acagcgacgg cagcttcttc ctgtactcca agctgaccgt ggacaagtcc 1260 agatggcagg agggcaacgt cttcagctgc tccgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1320 tacacccaga agtccctgag cctgagcctg ggcaag 1356 <210> 118 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 118 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Lys Lys Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 119 <211> 642 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 119 gagatcgtgc tgacacagag ccctggcaca ctgtcactgt ctccaggcga gagagccaca 60 ctgagctgta gagccagcca gagcgtgtcc tcttacctgg cctggtatca gaagaagcct 120 ggacaggctc ccagactgct gatctacgac gccagcaaca gagccacagg catccccgat 180 agattcagcg gctctggctc tggcaccgac ttcaccctga caatcagcag actggaaccc 240 gaggacttcg ccgtgtacta ctgccagcag agaagcaact ggcccatcac attcggccag 300 ggcaccaagc tggaaatcaa gcgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgataaga aattgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642 <210> 120 <211> 449 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 120 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Glu Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Arg Val Glu Ser Lys Tyr 210 215 220 Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Ala Ser Ser Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser 355 360 365 Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 445 Lys <210> 121 <211> 1347 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 121 gaagtgcagc tgctggaatc tggtggcgga gttgttcagc ctggcggctc tctgagactg 60 tcttgtgctg ccagcggctt caccttcaac gactacgcta tgcactgggt ccgagaggcc 120 cctggcaaag gacttgaatg ggtgtccacc atcagctgga acagcggctc tatcggctac 180 gccgattccg tgaagggcag attcaccatc tccagagaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actactgtgc caaggacatc 300 cagtacggca actactacta cggcatggac tactggggcc agggaacact ggttaccgtt 360 agctctgcta gcaccaaggg ccccagcgtg ttccccctgg ccccttgcag cagaagcacc 420 agcgagagca cagccgccct gggctgcctg gtggaggact acttccccga gcccgtgacc 480 gtgtcctgga acagcggcgc tctgaccagc ggcgtgcata ccttccccgc cgtgctccag 540 agcagcggac tgtactccct gagcagcgtg gtgaccgtgc cttccagcag cctgggcacc 600 aagacctaca cctgcaacgt ggaccacaag cccagcaaca ccaaggtgga cgagagagtg 660 gagagcaagt acggccctcc ctgcccccct tgccctgccc ccgagttcga aggcggacct 720 agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagcag aacccccgag 780 gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtcccag gaggaccccg aggtccagtt taattggtac 840 gtggacggcg tggaagtgca taacgccaag accaagccca gagaggagca gttcaacagc 900 acctacagag tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggaa 960 tacaagtgca aggtctccaa caagggcctg gccagcagca tcgagaagac catcagcaag 1020 gccaagggcc agccacggga gccccaggtc tgcaccctgc cacctagcca agaggagatg 1080 accaagaacc aggtgtccct gagctgtgcc gtgaaaggct tctatcccag cgatatcgcc 1140 gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg 1200 gacagcgacg gcagcttctt cctggtttcc aagctgaccg tggacaagtc cagatggcag 1260 gagggcaacg tcttcagctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 1320 aagtccctga gcctgagcct gggcaag 1347 <210> 122 <211> 109 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 122 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 123 <211> 125 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 123 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125

Claims (13)

  1. 표적 세포의 표면 상의 CD20에 결합하는 제1 결합 도메인 및 T 세포의 표면 상의 CD3에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 부분으로서, 제1 결합 도메인이 제1 경쇄 및 제1 중쇄를 포함하고, 및 제1 결합 도메인이
    (1) 각각 서열번호 56, 57 및 58을 포함하는 제1 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 66, 67 및 68을 포함하는 제1 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
    (2) 각각 서열번호 56, 57 및 58을 포함하는 제1 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 66, 67 및 71을 포함하는 제1 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
    (3) 각각 서열번호 61, 62 및 63을 포함하는 제1 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 76, 77 및 78을 포함하는 제1 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열; 및
    (4) 각각 서열번호 61, 62 및 63을 포함하는 제1 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 76, 77 및 85를 포함하는 제1 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열
    로부터 선택되는 경쇄 및 중쇄 상보성-결정 영역(CDR) 조합을 포함하는, 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  2. 제1항에 있어서,
    제1 결합 도메인이 아미노산 서열 서열번호 54, 59, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 64, 69, 72, 74, 79, 81, 83, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 중쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 아미노산 서열 서열번호 54 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 64 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 아미노산 서열 서열번호 54 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 69 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 아미노산 서열 서열번호 54 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 72 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 아미노산 서열 서열번호 59 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 74 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 아미노산 서열 서열번호 59 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 79 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 아미노산 서열 서열번호 59 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 81 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 아미노산 서열 서열번호 59 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 83 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄 가변 영역을 포함하는,
    이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    제2 결합 도메인이 제2 경쇄 및 제2 중쇄를 포함하고, 제2 결합 도메인이
    (1) 각각 서열번호 7, 8 및 9를 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 26, 27 및 28을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
    (2) 각각 서열번호 7, 8 및 9를 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 28을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
    (3) 각각 서열번호 7, 8 및 9를 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 34를 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
    (4) 각각 서열번호 7, 8 및 9를 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 37을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
    (5) 각각 서열번호 7, 8 및 9를 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 40을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
    (6) 각각 서열번호 7, 8 및 9를 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 43을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
    (7) 각각 서열번호 7, 8 및 9를 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 46, 47 및 28을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
    (8) 각각 서열번호 14, 15 및 9를 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 26, 27 및 28을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
    (9) 각각 서열번호 14, 15 및 9를 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 28을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
    (10) 각각 서열번호 14, 15 및 9를 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 34를 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
    (11) 각각 서열번호 14, 15 및 9를 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 37을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
    (12) 각각 서열번호 14, 15 및 9를 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 40을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
    (13) 각각 서열번호 14, 15 및 9를 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 43을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
    (14) 각각 서열번호 14, 15 및 9를 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 46, 47 및 28을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
    (15) 각각 서열번호 7, 8 및 21을 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 26, 27 및 28을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
    (16) 각각 서열번호 7, 8 및 21을 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 28을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
    (17) 각각 서열번호 7, 8 및 21을 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 34를 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
    (18) 각각 서열번호 7, 8 및 21을 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 37을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
    (19) 각각 서열번호 7, 8 및 21을 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 40을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
    (20) 각각 서열번호 7, 8 및 21을 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 43을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
    (21) 각각 서열번호 7, 8 및 21을 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 46, 47 및 28을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
    (22) 각각 서열번호 7, 20 및 21을 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 26, 27 및 28을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
    (23) 각각 서열번호 7, 20 및 21을 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 28을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
    (24) 각각 서열번호 7, 20 및 21을 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 34를 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
    (25) 각각 서열번호 7, 20 및 21을 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 37을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
    (26) 각각 서열번호 7, 20 및 21을 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 40을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
    (27) 각각 서열번호 7, 20 및 21을 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 31, 27 및 43을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열; 및
    (28) 각각 서열번호 7, 20 및 21을 포함하는 제2 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열번호 46, 47 및 28을 포함하는 제2 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열
    로부터 선택되는 경쇄 및 중쇄 CDR 조합을 포함하는, 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 결합 도메인이 아미노산 서열 서열번호 5, 10, 12, 16, 18, 22, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 24, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 48, 50, 52, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 중쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제2 결합 도메인이 아미노산 서열 서열번호 5 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 48 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제2 결합 도메인이 아미노산 서열 서열번호 5 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 50 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제2 결합 도메인이 아미노산 서열 서열번호 10 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 50 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제2 결합 도메인이 아미노산 서열 서열번호 12 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 50 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제2 결합 도메인이 아미노산 서열 서열번호 18 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 24 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제2 결합 도메인이 아미노산 서열 서열번호 18 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 48 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제2 결합 도메인이 아미노산 서열 서열번호 18 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 서열번호 50 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄 가변 영역을 포함하는,
    이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 경쇄가 서열번호 88, 96, 100, 102, 110, 118, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 경쇄를 포함하고, 제1 중쇄가 서열번호 86, 94, 98, 104, 112, 120, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 중쇄를 포함하는, 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 경쇄가 서열번호 92, 106, 114, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 경쇄를 포함하고, 제2 중쇄가 서열번호 90, 108, 116, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 중쇄를 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 아미노산 서열 서열번호 88 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 86 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄를 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 아미노산 서열 서열번호 96 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 94 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄를 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 아미노산 서열 서열번호 100 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 98 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄를 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 아미노산 서열 서열번호 102 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 104 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄를 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 아미노산 서열 서열번호 110 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 112 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄를 포함하고;
    바람직하게는, 제1 결합 도메인이 아미노산 서열 서열번호 118 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 120 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄를 포함하고;
    바람직하게는, 제2 결합 도메인이 아미노산 서열 서열번호 92 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 90 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄를 포함하고;
    바람직하게는, 제2 결합 도메인이 아미노산 서열 서열번호 106 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 108 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄를 포함하고;
    바람직하게는, 제2 결합 도메인이 아미노산 서열 서열번호 114 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 116 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄를 포함하고;
    더 바람직하게는, 이중특이성 항체는 아미노산 서열 서열번호 88 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄, 아미노산 서열 서열번호 86 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄, 아미노산 서열 서열번호 92 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 90 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄를 포함하고;
    더 바람직하게는, 이중특이성 항체는 아미노산 서열 서열번호 96 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄, 아미노산 서열 서열번호 94 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄, 아미노산 서열 서열번호 92 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 90 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄를 포함하고;
    더 바람직하게는, 이중특이성 항체는 아미노산 서열 서열번호 100 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄, 아미노산 서열 서열번호 98 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄, 아미노산 서열 서열번호 92 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 90 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄를 포함하고;
    더 바람직하게는, 이중특이성 항체는 아미노산 서열 서열번호 102 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄, 아미노산 서열 서열번호 104 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄, 아미노산 서열 서열번호 106 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 108 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄를 포함하고;
    더 바람직하게는, 이중특이성 항체는 아미노산 서열 서열번호 110 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄, 아미노산 서열 서열번호 112 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄, 아미노산 서열 서열번호 114 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 116 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄를 포함하고;
    더 바람직하게는, 이중특이성 항체는 아미노산 서열 서열번호 118 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄, 아미노산 서열 서열번호 120 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄, 아미노산 서열 서열번호 114 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 116 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄를 포함하고;
    더 바람직하게는, 이중특이성 항체는 아미노산 서열 서열번호 110 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄, 아미노산 서열 서열번호 112 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄, 아미노산 서열 서열번호 106 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 108 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄를 포함하고;
    더 바람직하게는, 이중특이성 항체는 아미노산 서열 서열번호 102 또는 이의 임의의 변이체의 제1 경쇄, 아미노산 서열 서열번호 104 또는 이의 임의의 변이체의 제1 중쇄, 아미노산 서열 서열번호 114 또는 이의 임의의 변이체의 제2 경쇄, 및 아미노산 서열 서열번호 116 또는 이의 임의의 변이체의 제2 중쇄를 포함하는,
    이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 암호화하는 핵산;
    바람직하게는, 서열번호 55, 60, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 핵산 서열인 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산;
    바람직하게는, 서열번호 65, 70, 73, 75, 80, 82, 84, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 핵산 서열인 제1 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산;
    바람직하게는, 서열번호 6, 11, 13, 17, 19, 23, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 핵산 서열인 제2 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산;
    바람직하게는, 서열번호 25, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 49, 51, 53, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 핵산 서열인 제1 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산;
    바람직하게는, 서열번호 89, 97, 101, 103, 111, 119, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 핵산 서열인 제1 경쇄를 암호화하는 핵산;
    바람직하게는, 서열번호 87, 95, 99, 105, 113, 121, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 핵산 서열인 제1 중쇄를 암호화하는 핵산;
    바람직하게는, 서열번호 93, 107, 115, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 핵산 서열인 제2 경쇄를 암호화하는 핵산; 및
    바람직하게는, 서열번호 91, 109, 117, 또는 이의 임의의 변이체로부터 선택되는 핵산 서열인 제2 중쇄를 암호화하는 핵산.
  8. 제7항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
  9. 제7항에 따른 핵산 또는 제8항에 따른 벡터를 포함하는 세포.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 제7항에 따른 핵산, 제8항에 따른 벡터 및/또는 제9항에 따른 세포를 포함하는 조성물.
  11. 치료 모이어티(therapeutic moiety)에 공유결합으로 부착되는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하는 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate)로서,
    바람직하게는, 상기 치료 모이어티가 세포독성 모이어티, 화학치료제, 사이토카인, 면역억제제, 면역자극제, 용해성 펩티드, 및 방사성 동위원소로부터 선택되고;
    바람직하게는, 상기 세포독성 모이어티가 파클리탁셀; 사이토칼라신 B; 그라미시딘 D; 에티듐 브로마이드; 에메틴; 미토마이신; 에토포시드; 테니포시드; 빈그리스틴; 빈블라스틴; 콜키신; 독소루비신; 다우노루비신; 다이하이드록시 안트렌다이온; 튜블린 억제제, 예컨대 메이탄신, 또는 이의 유사체 또는 유도체; 유사분열 방지제, 예컨대 모노메틸 어우리스타틴 E 또는 F, 또는 이의 유사체 또는 유도체; 돌라스틴 10 또는 15, 또는 이의 유사체; 이리노테칸, 또는 이의 유사체; 미톡산트론; 미트라마이신; 액티노마이신 D; 1-데하이드로테스토스테론; 당질코르티코이드; 프로카인; 테트라카인; 리도카인; 프로프라놀올; 퓨로마이신; 칼리케아마이신, 또는 이의 유사체 또는 유도체; 항-대사물질, 예컨대 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 사이타라빈, 플루다라빈, 5-플루오로우라실, 데카바진, 하이드록시우레, 아스파라기나제, 겜시타빈, 또는 클라드리빈; 알킬화제, 예컨대 다이클로로메틸다이에틸아민, 티오퓨린, 클로람부실, 멜팔란, 로무스틴(CCNU), 사이클로포스파미드, 부설판, 다이브로모만니톨, 스트렙토조토신, 다카바진(DTIC), 프로카바진, 미토마이신 C; 백금 유도체, 예컨대 시스플라틴 또는 카보플라틴; 듀오카마이신 A, 듀오카마이신 SA, 라첼마이신(CC-1065), 또는 이의 유사체 또는 유도체; 항생제, 예컨대 액티노마이신, 블레오마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 이다루비신, 미트라마이신, 미토마이신, 미톡산트론, 페리마이신, 안트라마이신(AMC); 피롤로[2,1-c][1,4]-벤조다이아제핀(PDB); 디프테리아 독소 및 관련 분자, 예컨대 디프테리아 쇄 및 이의 활성 단편 및 하이브리드 분자, 리신 예컨대, 리신 또는 데글리코실화된 리신 쇄 독소, 콜레라 독소, 쉬가-유사(Shiga-like) 독소, 예컨대 SLT I, SLT II, SLT IIV, LT 독소, C3 독소, 쉬가 독소, 백일해 독소, 파상풍 독소, 대두 보우만-버크(Bowman-Birk) 프로테아제 억제제, 슈도모나스 외독소, 알로린, 사포린, 모덱신, 젤라닌, 아브린 쇄, 모덱신 쇄, α-사르신, 알루라이츠 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 다이안틴 단백질, 피토락카 아메리카나(Phytolacca americana) 단백질, 예컨대 PAPI, PAPII 및 PAP-S, 모모르디카 차란티아(Momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사포나리아 오피시날리스(Sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토마이신, 리스트릭토신, 페노마이신, 및 에노마이신 독소; 리보뉴클레아제(RNase); DNase I, 스타필로코커스 내독소 A; 미국자리공(pokeweed) 항바이러스 단백질; 디프테리아 독소 및 슈도모나스 내독소로부터 선택되고;
    바람직하게는, 상기 사이토카인이 IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNa, IFN3, IFNy, GM-CSF, CD40L, Flt3 리간드, 줄기 세포 인자, 안세스팀, 및 TNFa로부터 선택되고;
    바람직하게는, 상기 방사성 동위원소가 3H, 14C, 15N, 35S, 67Cu, 90Y, 99Tc, 125I, 131I, 186Re, 188Re, 211At, 212Bi, 212Pb, 213Bi, 225Ac, 및 227Th로부터 선택되는,
    항체-약물 접합체.
  12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 제7항에 따른 핵산, 제8항에 따른 벡터, 제9항에 따른 세포, 제10항에 따른 조성물 및/또는 제11항에 따른 항체-약물 접합체를 포함하는 키트.
  13. CD20-관련 질환, 바람직하게는, B 세포 질환 예컨대 B 세포 증식성 장애를 포함하는 CD20-관련 질환, 특히 CD20-양성 B 세포 장애를 진단, 치료 또는 예방하기 위한 약물 또는 키트의 제조에서의 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 제7항에 따른 핵산, 제8항에 따른 벡터, 제9항에 따른 세포, 제10항에 따른 조성물 및/또는 제11항에 따른 항체-약물 접합체의 용도로서,
    바람직하게는, 상기 질환이 비-호지킨 림프종(NHL), 급성 림프모구 백혈병(ALL), 만성 림프구 백혈병(CLL), 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 여포 림프종(FL), 외투 세포 림프종(MCL), 변연부 림프종(MZL), 다발성 골수종(MM), 및 호지킨 림프종(HL)인, 용도.
KR1020237010150A 2020-08-26 2021-08-26 어댑터를 포함하는 약물 치료제의 개발 및 이의 용도 KR20230057428A (ko)

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