CN113150164A - 多特异性抗体、多特异性可活化抗体及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明主要涉及特异性地结合两种或更多种不同的抗原或表位的多特异性抗体和多特异性可活化抗体，以及制备和在各种治疗、诊断和预防适应症中使用这些多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的方法。

Description

多特异性抗体、多特异性可活化抗体及其使用方法
本申请是与母案发明名称相同的分案申请，母案的中国申请号是201480052778.5，国际申请号是PCT/US2014/048289，申请日是2014年7月25日。
相关申请
本申请要求提交于2013年7月25日的美国临时申请号61/858,402的权益，其内容通过引用以其整体结合到本文中。
发明领域
本发明主要涉及特异性地结合两种或更多种不同的靶标或表位的多特异性抗体和多特异性可活化抗体，以及制备和在各种治疗、诊断和预防适应症中使用这些多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的方法。
发明背景
单克隆抗体作为多种病症的治疗性干预的分子出现。然而，靶向或中和单一蛋白不总是足以有效治疗某些病症，这限制了单特异性单克隆抗体的治疗用途。此外，基于抗体的疗法已经证明有效治疗一些疾病，但在某些情况下，由宽泛的靶标表达导致的毒性限制了它们的治疗功效。此外，基于抗体的疗法已经显示其它局限性，例如在给药后从循环中快速清除。
因此，存在对这样的抗体和疗法的需要，所述抗体和疗法使得能够用单一分子靶向多种靶标和/或多种表位，并且还提供对预期靶标增加的选择性和在给药时不良作用的降低。
发明概述
本公开内容提供多特异性抗体和多特异性可活化抗体。本文提供的多特异性抗体是识别两种或更多种不同的抗原或表位的抗体。本文提供的多特异性可活化抗体是这样的多特异性抗体，其包括至少一个掩蔽部分(MM)，所述掩蔽部分与多特异性抗体的至少一个抗原或表位结合结构域连接，使得MM的偶联降低抗原或表位结合结构域结合其靶标的能力。在一些实施方案中，MM经由起蛋白酶的底物的作用的可裂解部分(CM)与多特异性抗体的抗原或表位结合结构域偶联。本文提供的可活化多特异性抗体在循环中是稳定的，在预期的治疗和/或诊断部位处被活化，但在正常(即健康)组织中不被活化，并且当被活化时显示同相应的未修饰的多特异性抗体至少相当的与靶标的结合。
在一些实施方案中，多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体经设计以接合免疫效应细胞，在本文中亦称为免疫效应器接合多特异性抗体和/或免疫效应器接合多特异性可活化抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体经设计以接合白细胞，在本文中亦称为白细胞接合多特异性抗体和/或白细胞接合多特异性可活化抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体经设计以接合T细胞，在本文中亦称为T-细胞接合多特异性抗体和/或T-细胞接合多特异性可活化抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体接合白细胞(例如T细胞、天然杀伤(NK)细胞、骨髓单核细胞、巨噬细胞和/或另一种免疫效应细胞)上的表面抗原。在一些实施方案中，免疫效应细胞是白细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞是T细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞是NK细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞是单核细胞，例如骨髓单核细胞。在一些实施方案中，多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体经设计以与超过一种靶标和/或超过一种表位结合或以其它方式相互作用，在本文中亦称为多抗原靶向抗体和/或多抗原靶向可活化抗体。如本文所用的，术语“靶标”和“抗原”可互换使用。
在一些实施方案中，免疫效应细胞接合多特异性抗体包括靶向抗体或其抗原结合片段和免疫效应细胞接合抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，免疫效应细胞接合多特异性抗体包括癌症靶向抗体或其抗原结合片段和免疫效应细胞接合抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，免疫效应细胞接合多特异性抗体包括癌症靶向IgG抗体或其抗原结合片段和免疫效应细胞接合scFv。在一些实施方案中，免疫效应细胞是白细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞是T细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞是NK细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞是骨髓单核细胞。
在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性抗体包括靶向抗体或其抗原结合片段和T-细胞接合抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性抗体包括癌症靶向抗体或其抗原结合片段和T-细胞接合抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性抗体包括癌症靶向IgG抗体或其抗原结合片段和T-细胞接合scFv。在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性抗体包括抗-CD3 ε (CD3ε，在本文中亦称为CD3e和CD3) scFv和靶向抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性抗体包括抗-CD3ε scFv和癌症靶向抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性抗体包括抗-CD3ε scFv和癌症靶向IgG抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性抗体包括抗-CD3 ε (CD3ε) scFv，其衍生自OKT3。在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性抗体包括抗-CTLA-4 scFv。
在一些实施方案中，本公开内容的免疫效应细胞接合多特异性可活化抗体包括靶向抗体或其抗原结合片段和免疫效应细胞接合抗体或其抗原结合部分，其中靶向抗体或其抗原结合片段和/或免疫效应细胞接合抗体或其抗原结合部分中的至少一种被掩蔽。在一些实施方案中，免疫效应细胞接合抗体或其抗原结合片段包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其结合第一免疫效应细胞接合靶标，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合第一靶标的能力。在一些实施方案中，靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二靶标的能力。在一些实施方案中，免疫效应细胞接合抗体或其抗原结合片段包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其结合第一免疫效应细胞接合靶标，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合第一靶标的能力；靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二靶标的能力。在一些实施方案中，非免疫效应细胞接合抗体是癌症靶向抗体。在一些实施方案中非免疫细胞效应器抗体是IgG。在一些实施方案中免疫效应细胞接合抗体是scFv。在一些实施方案中靶向抗体(例如，非免疫细胞效应器抗体)是IgG和免疫效应细胞接合抗体是scFv。在一些实施方案中，免疫效应细胞是白细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞是T细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞是NK细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞是骨髓单核细胞。
在一些实施方案中，本公开内容的T-细胞接合多特异性可活化抗体包括靶向抗体或其抗原结合片段和T-细胞接合抗体或其抗原结合部分，其中靶向抗体或其抗原结合片段和/或T-细胞接合抗体或其抗原结合部分中的至少一种被掩蔽。在一些实施方案中，T-细胞接合抗体或其抗原结合片段包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其结合第一T-细胞接合靶标，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合第一靶标的能力。在一些实施方案中，靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二靶标的能力。在一些实施方案中，T-细胞接合抗体或其抗原结合片段包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其结合第一T-细胞接合靶标，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接使得MM1的偶联降低AB1结合第一靶标的能力；靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接使得MM2的偶联降低AB2结合第二靶标的能力。
在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性可活化抗体包括癌症靶向抗体或其抗原结合片段和T-细胞接合抗体或其抗原结合部分，其中癌症靶向抗体或其抗原结合片段和/或T-细胞接合抗体或其抗原结合部分中的至少一种被掩蔽。在一些实施方案中，T-细胞接合抗体或其抗原结合片段包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其结合第一T-细胞接合靶标，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接使得MM1的偶联降低AB1结合第一靶标的能力。在一些实施方案中，癌症靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二癌症相关靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接使得MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关靶标的能力。在一些实施方案中，T-细胞接合抗体或其抗原结合片段包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其结合第一T-细胞接合靶标，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接使得MM1的偶联降低AB1结合第一靶标的能力；癌症靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二癌症相关靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接使得MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关靶标的能力。
在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性可活化抗体包括癌症靶向IgG抗体或其抗原结合片段和T-细胞接合scFv，其中癌症靶向IgG抗体或其抗原结合片段和/或T-细胞接合抗体或其抗原结合部分中的至少一种被掩蔽。在一些实施方案中，T-细胞接合抗体或其抗原结合片段包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其结合第一T-细胞接合靶标，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接使得MM1的偶联降低AB1结合第一靶标的能力。在一些实施方案中，癌症靶向IgG抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二癌症相关靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接使得MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关靶标的能力。在一些实施方案中，T-细胞接合抗体或其抗原结合片段包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其结合第一T-细胞接合靶标，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接使得MM1的偶联降低AB1结合第一靶标的能力；癌症靶向IgG抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二癌症相关靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接使得MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关靶标的能力。
在免疫效应细胞接合多特异性可活化抗体的一些实施方案中，一种抗原通常是存在于肿瘤细胞或与疾病相关的其它细胞类型的表面上的抗原，例如但不限于表1中所列的任何靶标，例如但不限于EGFR、erbB2、EpCAM、Jagged、PD-L1、B7H3或CD71 (转铁蛋白受体)，另一种抗原通常是存在于T-细胞、天然杀伤(NK)细胞、骨髓单核细胞、巨噬细胞和/或其它免疫效应细胞的表面上的刺激性或抑制性受体，例如但不限于B7-H4、BTLA、CD3、CD4、CD8、CD16a、CD25、CD27、CD28、CD32、CD56、CD137、CTLA-4、GITR、HVEM、ICOS、LAG3、NKG2D、OX40、PD-1、TIGIT、TIM3或VISTA。在一些实施方案中，抗原是存在于T细胞或NK细胞的表面上的刺激性受体；这样的刺激性受体的实例包括但不限于CD3、CD27、CD28、CD137 (亦称为4-1BB)、GITR、HVEM、ICOS、NKG2D和OX40。在一些实施方案中，抗原是存在于T-细胞的表面上的抑制性受体；这样的抑制性受体的实例包括但不限于BTLA、CTLA-4、LAG3、PD-1、TIGIT、TIM3和NK-表达的KIR。赋予对T-细胞表面抗原的特异性的抗体结构域也可被结合T-细胞受体、NK-细胞受体、巨噬细胞受体和/或其它免疫效应细胞受体的配体或配体结构域置换，所述配体或配体结构域例如但不限于B7-1、B7-2、B7H3、PD-L1、PD-L2或TNFSF9。
本公开内容的一个实施方案是多特异性可活化抗体，其在癌症微环境中是可活化的，并包括针对肿瘤靶标的抗体(例如IgG或scFv)和针对在活化T细胞或NK细胞的表面上表达的共刺激性受体的激动剂抗体(例如IgG或scFv)，其中癌症靶标抗体和/或激动剂抗体的至少一种被掩蔽。共刺激性受体的实例包括但不限于CD27、CD137、GITR、HVEM、NKG2D和OX40。在该实施方案中，多特异性可活化抗体一旦被肿瘤相关的蛋白酶活化，将以肿瘤依赖性的方式有效交叉连接和活化T细胞或NK细胞表达的共刺激性受体，以提高经由其内源T细胞抗原或NK-活化受体响应于任何肿瘤抗原的T细胞的活性。这些T细胞或NK细胞共刺激性受体的活化依赖性特性将活化的多特异性可活化抗体的活性集中在肿瘤特异性T细胞，而不活化不依赖于其抗原特异性的所有T细胞。在一个实施方案中，至少多特异性可活化抗体的共刺激性受体抗体被掩蔽，以阻止可存在于组织中的自体反应T细胞的活化，所述T细胞也表达被多特异性可活化抗体中的针对肿瘤靶标的抗体识别的抗原，但其活性因缺少共受体接合而受到限制。
本公开内容的一个实施方案是多特异性可活化抗体，其在特征为T细胞过度刺激的疾病中是可活化的，所述疾病例如但不限于自身免疫疾病或炎性疾病微环境。这样的多特异性可活化抗体包括针对包含在自身免疫或炎性疾病中由T细胞靶向的组织中表达的表面抗原的靶标的抗体(例如IgG或scFv)和针对在T细胞或NK细胞的表面上表达的抑制性受体的抗体(例如IgG或scFv)，其中疾病组织靶标抗体和/或T细胞抑制性受体抗体中的至少一种被掩蔽。抑制性受体的实例包括但不限于BTLA、CTLA-4、LAG3、PD-1、TIGIT、TIM3和NK-表达的KIR。在自身免疫疾病中的被T细胞靶向的组织抗原的实例包括但不限于在多发性硬化的髓鞘或神经细胞上表达的表面抗原，或在1型糖尿病的胰岛细胞上表达的表面抗原。在该实施方案中，多特异性可活化抗体当位于在自身免疫攻击或炎症下的组织中时被活化并共接合T细胞或NK细胞抑制性受体，以抑制经由其内源TCR或活化受体响应于任何疾病组织靶向的抗原的自体反应性T细胞的活性。在一个实施方案中，至少一种或多种抗体被掩蔽以阻止在也可表达靶标抗原的非疾病组织中所需的T细胞反应的抑制。
在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性可活化抗体包括抗-CD3 ε (CD3ε，在本文中亦称为CD3e和CD3) scFv和靶向抗体或其抗原结合片段，其中抗-CD3ε scFv和/或靶向抗体或其抗原结合部分中的至少一种被掩蔽。在一些实施方案中，CD3ε scFv包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其结合CD3ε，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力。在一些实施方案中，靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接使得MM2的偶联降低AB2结合第二靶标的能力。在一些实施方案中，CD3ε scFv包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其结合CD3ε，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力；靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接使得MM2的偶联降低AB2结合第二靶标的能力。
在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性可活化抗体包括抗-CD3ε scFv和癌症靶向抗体或其抗原结合片段，其中抗-CD3ε scFv和/或癌症靶向抗体或其抗原结合部分中的至少一种被掩蔽。在一些实施方案中，CD3ε scFv包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其结合CD3ε，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力。在一些实施方案中，癌症靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二癌症相关靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接使得MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关靶标的能力。在一些实施方案中，CD3ε scFv包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其结合CD3ε，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力；癌症靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二癌症相关靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接使得MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关靶标的能力。
在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性可活化抗体包括抗-CD3ε scFv和癌症靶向IgG抗体或其抗原结合片段，其中抗-CD3ε scFv和/或癌症靶向IgG抗体或其抗原结合部分中的至少一种被掩蔽。在一些实施方案中，CD3ε scFv包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其结合CD3ε，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力。在一些实施方案中，癌症靶向IgG抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二癌症相关靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接使得MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关靶标的能力。在一些实施方案中，CD3ε scFv包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其结合CD3ε，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力；癌症靶向抗体IgG或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二癌症相关靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接使得MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关靶标的能力。
在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性可活化抗体包括抗-CD3 ε (CD3ε)scFv，其衍生自OKT3，其中靶向抗体或其抗原结合片段和/或OKT3 scFv或OKT3-衍生的scFv中的至少一种被掩蔽。在一些实施方案中，OKT3 scFv或OKT3-衍生的scFv包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其结合CD3ε，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力。在一些实施方案中，靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接使得MM2的偶联降低AB2结合第二靶标的能力。在一些实施方案中，OKT3 scFv或OKT3-衍生的scFv包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其结合CD3ε，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力；靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接使得MM2的偶联降低AB2结合第二靶标的能力。
在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性可活化抗体包括OKT3 scFv或OKT3-衍生的scFv和癌症靶向抗体或其抗原结合片段，其中OKT3 scFv或OKT3-衍生的scFv和/或癌症靶向抗体或其抗原结合部分中的至少一种被掩蔽。在一些实施方案中，OKT3 scFv或OKT3-衍生的scFv包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其结合CD3ε，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力。在一些实施方案中，癌症靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二癌症相关靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接使得MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关靶标的能力。在一些实施方案中，OKT3 scFv或OKT3-衍生的scFv包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其结合CD3ε，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力；癌症靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二癌症相关靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接使得MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关靶标的能力。
在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性可活化抗体包括OKT3 scFv或OKT3-衍生的scFv和癌症靶向IgG抗体或其抗原结合片段，其中OKT3 scFv或OKT3-衍生的scFv和/或癌症靶向IgG抗体或其抗原结合部分中的至少一种被掩蔽。在一些实施方案中，OKT3 scFv或OKT3-衍生的scFv包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其结合CD3ε，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力。在一些实施方案中，癌症靶向IgG抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二癌症相关靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接使得MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关靶标的能力。在一些实施方案中，OKT3 scFv或OKT3-衍生的scFv包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其结合CD3ε，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力；癌症靶向抗体IgG或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二癌症相关靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接使得MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关靶标的能力。
在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性可活化抗体包括抗-CTLA-4 scFv，其中靶向抗体或其抗原结合片段和/或抗-CTLA-4 scFv中的至少一种被掩蔽。在一些实施方案中，抗-CTLA-4 scFv包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其结合CTLA-4，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接使得MM1的偶联降低AB1结合CTLA-4的能力。在一些实施方案中，靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接使得MM2的偶联降低AB2结合第二靶标的能力。在一些实施方案中，抗-CTLA-4 scFv包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其结合CTLA-4，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接使得MM1的偶联降低AB1结合CTLA-4的能力；靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接使得MM2的偶联降低AB2结合第二靶标的能力。
在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性可活化抗体包括抗-CTLA-4 scFv和靶向IgG抗体或其抗原结合片段，其中抗-CTLA-4 scFv和/或靶向IgG抗体或其抗原结合部分中的至少一种被掩蔽。在一些实施方案中，抗-CTLA-4 scFv包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其结合CTLA-4，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接使得MM1的偶联降低AB1结合CTLA-4的能力。在一些实施方案中，靶向IgG抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接使得MM2的偶联降低AB2结合第二靶标的能力。在一些实施方案中，抗-CTLA-4 scFv包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其结合CTLA-4，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接使得MM1的偶联降低AB1结合CTLA-4的能力；靶向抗体IgG或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接使得MM2的偶联降低AB2结合第二靶标的能力。
在一些实施方案中，多抗原靶向抗体和/或多抗原靶向可活化抗体至少包括结合第一靶标和/或第一表位的第一抗体或其抗原结合片段和结合第二靶标和/或第二表位的第二抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，多抗原靶向抗体和/或多抗原靶向可活化抗体结合两种或更多种不同的靶标。在一些实施方案中，多抗原靶向抗体和/或多抗原靶向可活化抗体结合在相同靶标上的两种或更多种不同的表位。在一些实施方案中，多抗原靶向抗体和/或多抗原靶向可活化抗体结合两种或更多种不同的靶标和在相同的靶标上的两种或更多种不同的表位的组合。
本公开内容的多特异性可活化抗体的各种实施方案显示在图3A和5-9中。在一些实施方案中，包含IgG的多特异性可活化抗体的IgG可变结构域被掩蔽。在一些实施方案中，包含scFv的多特异性可活化抗体的scFv结构域被掩蔽。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体具有IgG可变结构域和scFv结构域两者，其中至少一个IgG可变结构域与掩蔽部分偶联。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体具有IgG可变结构域和scFv结构域两者，其中至少一个scFv结构域与掩蔽部分偶联。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体具有IgG可变结构域和scFv结构域两者，其中至少一个IgG可变结构域与掩蔽部分偶联，和至少一个scFv结构域与掩蔽部分偶联。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体具有IgG可变结构域和scFv结构域两者，其中每个IgG可变结构域和scFv结构域与其自己的掩蔽部分偶联。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体的一个抗体结构域具有对靶标抗原的特异性和另一个抗体结构域具有对T-细胞表面抗原的特异性。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体的一个抗体结构域具有对靶标抗原的特异性，另一个抗体结构域具有对另一靶标抗原的特异性。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体的一个抗体结构域具有对靶标抗原的表位的特异性，另一抗体结构域具有对所述靶标抗原的另一表位的特异性。
在多特异性可活化抗体中，scFv可与IgG可活化抗体的重链的羧基末端、与IgG可活化抗体的轻链的羧基末端、或与IgG可活化抗体的重链和轻链两者的羧基末端融合。在多特异性可活化抗体中，scFv可与IgG可活化抗体的重链的氨基末端、与IgG可活化抗体的轻链的氨基末端、或与IgG可活化抗体的重链和轻链两者的氨基末端融合。在多特异性可活化抗体中，scFv可与IgG可活化抗体的一个或多个羧基末端和一个或多个氨基末端的任何组合融合。在一些实施方案中，与可裂解部分(CM)连接的掩蔽部分(MM)连接至IgG的抗原结合结构域并使之掩蔽。在一些实施方案中，与可裂解部分(CM)连接的掩蔽部分(MM)连接至至少一个scFv的抗原结合结构域并使之掩蔽。在一些实施方案中，与可裂解部分(CM)连接的掩蔽部分(MM)连接至IgG的抗原结合结构域并使之掩蔽，与可裂解部分(CM)连接的掩蔽部分(MM)连接至至少一个scFv的抗原结合结构域并使之掩蔽。
本公开内容提供多特异性可活化抗体结构的实例，其包括但不限于以下：(VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2; (VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH*-L3-VL*)2;(MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL*-L3-VH*)2; (VL-CL)2:(MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL)2:(MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2: (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*)2: (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2;(VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2;或(VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2，其中：VL和VH表示IgG中包含的具有第一特异性的轻链和重链可变结构域；VL*和VH*表示scFv中包含的具有第二特异性的可变结构域；L1是连接掩蔽部分(MM)和可裂解部分(CM)的接头肽；L2是连接可裂解部分(CM)和抗体的接头肽；L3是连接scFv的可变结构域的接头肽；L4是连接具有第一特异性的抗体与具有第二特异性的抗体的接头肽；CL是轻链恒定结构域；和CH1、CH2、CH3是重链恒定结构域。第一和第二特异性可针对任何抗原或表位。
在T-细胞接合多特异性可活化抗体的一些实施方案中，一种抗原通常是存在于肿瘤细胞或与疾病相关的其它细胞类型的表面上的抗原，例如但不限于表1中所列的任何靶标，例如但不限于EGFR、erbB2、EpCAM、Jagged、PD-L1、B7H3或CD71 (转铁蛋白受体)，和另一种抗原通常是存在于T-细胞、天然杀伤(NK)细胞、骨髓单核细胞、巨噬细胞和/或其它免疫效应细胞的表面上的刺激性(在本文中亦称为活化)或抑制性受体，例如但不限于B7-H4、BTLA、CD3、CD4、CD8、CD16a、CD25、CD27、CD28、CD32、CD56、CD137 (亦称为TNFRSF9)、CTLA-4、GITR、HVEM、ICOS、LAG3、NKG2D、OX40、PD-1、TIGIT、TIM3或VISTA。赋予对T-细胞表面抗原的特异性的抗体结构域也可被与T-细胞受体、NK-细胞受体、巨噬细胞受体和/或其它免疫效应细胞受体结合的配体或配体结构域置换，所述配体或配体结构域例如但不限于B7-1、B7-2、B7H3、PD-L1、PD-L2或TNFSF9。在多抗原靶向可活化抗体的一些实施方案中，一种抗原选自表1中所列的靶标组，另一种抗原选自表1中所列的靶标组。
在一些实施方案中，靶向抗体是抗-EGFR抗体。在一些实施方案中，靶向抗体是C225v5，其特异性结合EGFR。在一些实施方案中，靶向抗体是C225，其特异性结合EGFR。在一些实施方案中，靶向抗体是C225v4，其特异性结合EGFR。在一些实施方案中，靶向抗体是C225v6，其特异性结合EGFR。在一些实施方案中，靶向抗体是抗-Jagged抗体。在一些实施方案中，靶向抗体是4D11，其特异性结合人和小鼠Jagged 1和Jagged 2。在一些实施方案中，靶向抗体是4D11v2，其特异性结合人和小鼠Jagged 1和Jagged 2。
在一些实施方案中，靶向抗体可呈可活化抗体的形式。在一些实施方案中，scFv可呈Pro-scFv的形式(参见例如WO 2009/025846、WO 2010/081173)。
在一些实施方案中，scFv特异性结合CD3ε，并且是或衍生自结合CD3ε的抗体或其片段，例如，CH2527、FN18、H2C、OKT3、2C11、UCHT1或V9。在一些实施方案中，scFv特异性结合CTLA-4 (在本文中亦称为CTLA和CTLA4)。
在一些实施方案中，抗-CD3ε scFv包括选自表7和/或实施例5中所示的那些序列的序列。在一些实施方案中，抗-CD3ε scFv包括与选自表7和/或实施例5中的那些序列的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，scFv特异性结合一种或多种T-细胞、一种或多种NK-细胞和/或一种或多种巨噬细胞。在一些实施方案中，scFv特异性结合选自B7-H4、BTLA、CD3、CD4、CD8、CD16a、CD25、CD27、CD28、CD32、CD56、CD137、CTLA-4、GITR、HVEM、ICOS、LAG3、NKG2D、OX40、PD-1、TIGIT、TIM3或VISTA的靶标。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体、多特异性可活化抗体、缀合的多特异性抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性地结合Jagged靶标，例如，Jagged 1和/或Jagged 2，并包含VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列的组合，其中VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列的至少一个选自至少包括氨基酸序列SYAMS (SEQ ID NO: 6)的VH CDR1序列；至少包括氨基酸序列SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO: 7)的VH CD2序列；至少包括氨基酸序列DIGGRSAFDY(SEQ ID NO: 8)的VH CDR3序列，和其组合。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体、多特异性可活化抗体、缀合的多特异性抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性地结合Jagged靶标，例如，Jagged 1和/或Jagged 2，并包含VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的至少一个选自至少包括氨基酸序列RASQSISSY (SEQ ID NO: 9)的VL CDR1序列；至少包括氨基酸序列AASSLQS (SEQ ID NO: 10)的VL CDR2序列；至少包括氨基酸序列QQTVVAPPL (SEQ ID NO:11)的VL CDR3序列，和其组合。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体、多特异性可活化抗体、缀合的多特异性抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性地结合Jagged靶标，例如，Jagged 1和/或Jagged 2，并包含VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列的组合，其中VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列的至少一个选自包括与氨基酸序列SYAMS (SEQ ID NO: 6)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VH CDR1序列；包括与氨基酸序列SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQID NO: 7)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VH CD2序列；包括与氨基酸序列DIGGRSAFDY (SEQ ID NO: 8)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VH CDR3序列，和其组合。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体、多特异性可活化抗体、缀合的多特异性抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性地结合Jagged靶标，例如，Jagged 1和/或Jagged 2，并包含VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的至少一个选自包括与氨基酸序列RASQSISSY (SEQ ID NO: 9)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VL CDR1序列；包括与氨基酸序列AASSLQS (SEQ IDNO: 10)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VLCDR2序列；和包括与氨基酸序列QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 11)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VL CDR3序列，和其组合。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体、多特异性可活化抗体、缀合的多特异性抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性地结合Jagged靶标，例如，Jagged 1和/或Jagged 2，并包含VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中VH CDR1序列至少包括氨基酸序列SYAMS (SEQ ID NO: 6)；VH CD2序列至少包括氨基酸序列SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO: 7)；VH CDR3序列至少包括氨基酸序列DIGGRSAFDY (SEQID NO: 8)；VL CDR1序列至少包括氨基酸序列RASQSISSY (SEQ ID NO: 9)；VL CDR2序列至少包括氨基酸序列AASSLQS (SEQ ID NO: 10)；和VL CDR3序列至少包括氨基酸序列QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 11)。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体、多特异性可活化抗体、缀合的多特异性抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性地结合Jagged靶标，例如，Jagged 1和/或Jagged 2，并包含VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中VH CDR1序列包括与氨基酸序列SYAMS (SEQ ID NO: 6)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的序列；VH CD2序列包括与氨基酸序列SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO:7)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的序列；VH CDR3序列包括与氨基酸序列DIGGRSAFDY (SEQ ID NO: 8)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的序列；VL CDR1序列包括与氨基酸序列RASQSISSY (SEQID NO: 9)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的序列；VLCDR2序列包括与氨基酸序列AASSLQS (SEQ ID NO: 10)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的序列；和VL CDR3序列包括与氨基酸序列QQTVVAPPL(SEQ ID NO: 11)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的序列。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体、多特异性可活化抗体、缀合的多特异性抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性地结合表皮生长因子受体(EGFR)和包含VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列的组合，其中VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列的至少一个选自至少包括氨基酸序列NYGVH (SEQ ID NO: 12)的VH CDR1序列；至少包括氨基酸序列VIWSGGNTDYNTPFTS (SEQID NO: 13)的VH CD2序列；至少包括氨基酸序列ALTYYDYEFAY (SEQ ID NO: 14)的VH CDR3序列；和其组合。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体、多特异性可活化抗体、缀合的多特异性抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性地结合EGFR和包含VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的至少一个选自至少包括氨基酸序列RASQSIGTNIH (SEQID NO: 15)的VL CDR1序列；至少包括氨基酸序列KYASESIS (SEQ ID NO: 16)的VL CDR2序列;和至少包括氨基酸序列QQNNNWPTT (SEQ ID NO: 17)的VL CDR3序列，和其组合。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体、多特异性可活化抗体、缀合的多特异性抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性地结合EGFR和包含VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列的组合，其中VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列的至少一个选自包括与氨基酸序列NYGVH (SEQ ID NO:12)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VH CDR1序列；包括与氨基酸序列VIWSGGNTDYNTPFTS (SEQ ID NO: 13)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VH CD2序列；包括与氨基酸序列ALTYYDYEFAY (SEQ ID NO: 14)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VH CDR3序列；和其组合。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体、多特异性可活化抗体、缀合的多特异性抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性地结合EGFR和包含VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的至少一个选自包括与氨基酸序列RASQSIGTNIH (SEQID NO: 15)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VL CDR1序列；包括与氨基酸序列KYASESIS (SEQ ID NO: 16)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VL CDR2序列；和包括与氨基酸序列QQNNNWPTT (SEQ ID NO: 17)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VL CDR3序列，和其组合。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体、多特异性可活化抗体、缀合的多特异性抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性地结合EGFR和包含VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中VH CDR1序列至少包括氨基酸序列NYGVH (SEQ ID NO:12)；VH CD2序列至少包括氨基酸序列VIWSGGNTDYNTPFTS (SEQ ID NO: 13)；VH CDR3序列至少包括氨基酸序列ALTYYDYEFAY (SEQ ID NO: 14)；VL CDR1序列至少包括氨基酸序列RASQSIGTNIH (SEQ ID NO: 15)；VL CDR2序列至少包括氨基酸序列KYASESIS (SEQ ID NO:16)；和VL CDR3序列至少包括氨基酸序列QQNNNWPTT (SEQ ID NO: 17)。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体、多特异性可活化抗体、缀合的多特异性抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性地结合EGFR和包含VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中VH CDR1序列包括与氨基酸序列NYGVH (SEQ ID NO: 12)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列；VH CD2序列包括与氨基酸序列VIWSGGNTDYNTPFTS (SEQ ID NO: 13)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列；VH CDR3序列包括与氨基酸序列ALTYYDYEFAY(SEQ ID NO: 14)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列；VL CDR1序列包括与氨基酸序列RASQSIGTNIH (SEQ ID NO: 15)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列；VL CDR2序列包括与氨基酸序列KYASESIS (SEQ ID NO: 16)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列；和VL CDR3序列包括与氨基酸序列QQNNNWPTT (SEQ ID NO: 17)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体、多特异性可活化抗体、缀合的多特异性抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体至少包括选自表7和/或实施例5 (包括其中的表11)中所示的那些序列的重链氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体、多特异性可活化抗体、缀合的多特异性抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体至少包括选自表7和/或实施例5 (包括其中的表11)中所示的那些序列的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体、多特异性可活化抗体、缀合的多特异性抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体至少包括选自表7和/或实施例5 (包括其中的表11)中所示的那些序列的重链氨基酸序列，和选自表7和/或实施例5 (包括其中的表11)中所示的那些序列的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体、多特异性可活化抗体、缀合的多特异性抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体至少包括与选自表7和/或实施例5 (包括其中的表11)中所示的那些序列的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的重链氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体、多特异性可活化抗体、缀合的多特异性抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体至少包括与选自表7和/或实施例5 (包括其中的表11)中所示的那些序列的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体、多特异性可活化抗体、缀合的多特异性抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体至少包括与选自表7和/或实施例5 (包括其中的表11)中所示的那些序列的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的重链氨基酸序列，和与选自表7和/或实施例5 (包括其中的表11)中所示的那些序列的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体还包括与AB缀合的试剂。在一些实施方案中，试剂是治疗剂。在一些实施方案中，试剂是抗肿瘤剂。在一些实施方案中，试剂是毒素或其片段。在一些实施方案中，试剂经由接头与多特异性抗体缀合。在一些实施方案中，接头是不可裂解接头。在一些实施方案中，试剂是微管抑制剂。在一些实施方案中，试剂是核酸破坏剂，例如DNA烷化剂或DNA嵌入剂，或其它DNA破坏剂。在一些实施方案中，接头是可裂解接头。在一些实施方案中，试剂是选自表4中所列的组的试剂。在一些实施方案中，试剂是多拉司他汀。在一些实施方案中，试剂是阿里他汀或其衍生物。在一些实施方案中，试剂是阿里他汀E或其衍生物。在一些实施方案中，试剂是单甲基阿里他汀E(MMAE)。在一些实施方案中，试剂是单甲基阿里他汀D (MMAD)。在一些实施方案中，试剂是类美登素或类美登素衍生物。在一些实施方案中，试剂是DM1或DM4。在一些实施方案中，试剂是倍癌霉素或其衍生物。在一些实施方案中，试剂是卡奇霉素或其衍生物。在一些实施方案中，试剂是吡咯并苯并二氮杂 。
在一些实施方案中，多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体还包括可检测部分。在一些实施方案中，可检测部分是诊断剂。
在一些实施方案中，多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体天然包含一个或多个二硫键。在一些实施方案中，多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体可经工程改造以包括一个或多个二硫键。
本公开内容还提供编码本文描述的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的分离的核酸分子，以及包括这些分离的核酸序列的载体。本公开内容提供通过在导致表达抗体的条件下培养细胞产生多特异性抗体的方法，其中所述细胞包含这样的核酸分子。在一些实施方案中，所述细胞包含这样的载体。
本公开内容还提供多特异性可活化抗体和/或多特异性可活化抗体组合物，其至少包括特异性地结合第一靶标或第一表位的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)和结合第二靶标或第二表位的第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其中至少AB1与掩蔽部分(MM1)偶联或以其它方式连接，使得MM1的偶联降低AB1结合其靶标的能力。在一些实施方案中，MM1经由第一可裂解部分(CM1)序列与AB1偶联，所述序列包括蛋白酶的底物，所述蛋白酶例如与AB1的靶标在受试者的治疗部位或诊断部位处共定位的蛋白酶。本文提供的多特异性可活化抗体在循环中是稳定的，在预期的治疗和/或诊断部位处被活化，但在正常(即健康)组织中不被活化，并且当被活化时显示同相应的未修饰的多特异性抗体至少相当的与AB1的靶标结合。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体包含在MM1和CM1之间的连接肽。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体包含在CM1和AB1之间的连接肽。
在一些实施方案中，可活化抗体包含第一连接肽(LP1)和第二连接肽(LP2)，和多特异性可活化抗体的至少一部分具有在未裂解状态下如下的从N-端至C-端的结构排列：MM1-LP1-CM1-LP2-AB1或AB1-LP2-CM1-LP1-MM1。在一些实施方案中，两个连接肽不需要彼此相同。
在一些实施方案中，LP1或LP2中的至少一个包括选自(GS)n、(GGS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO: 18)和(GGGS)n (SEQ ID NO: 19)的氨基酸序列，其中n是至少1的整数。在一些实施方案中，LP1或LP2的至少一个包括选自GGSG (SEQ ID NO: 20)、GGSGG (SEQ ID NO:21)、GSGSG (SEQ ID NO: 22)、GSGGG (SEQ ID NO: 23)、GGGSG (SEQ ID NO: 24)和GSSSG(SEQ ID NO: 25)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体至少包括特异性地结合第一靶标或第一表位的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)和特异性地结合第二靶标或第二表位的第二抗体或其抗原结合片段(AB2)。在一些实施方案中，在多特异性可活化抗体中各个AB独立地选自单克隆抗体、结构域抗体、单链、Fab片段、F(ab')2片段、scFv、scAb、dAb、单一结构域重链抗体和单一结构域轻链抗体。在一些实施方案中，在多特异性可活化抗体中各个AB是啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)、嵌合、人源化或全人单克隆抗体。
在一些实施方案中，在多特异性可活化抗体中各个AB对于与其相应的靶标或表位的结合，具有大约100 nM或更低的平衡解离常数。
在一些实施方案中，MM1对于与其相应的AB的结合的平衡解离常数大于AB与其相应的靶标或表位的平衡解离常数。
在一些实施方案中，MM1对于与其相应的AB的结合的平衡解离常数不超过AB与其相应的靶标或表位的平衡解离常数。
在一些实施方案中，当所述多特异性可活化抗体在裂解状态下时，MM1不干扰其相应的AB与相应的靶标或表位的结合或不与其相应的AB竞争结合相应的靶标或表位。
在一些实施方案中，MM1是大约2-40个氨基酸长的多肽。在一些实施方案中，在多特异性可活化抗体中各个MM是不超过40个氨基酸长的多肽。
在一些实施方案中，MM1的多肽序列不同于相应的AB的靶标的序列。
在一些实施方案中，MM1的多肽序列与相应的AB的任何天然的结合配偶体具有不超过50%同一性。在一些实施方案中，MM1的多肽序列与相应的AB的任何天然的结合配偶体具有不超过25%同一性。在一些实施方案中，MM1的多肽序列与相应的AB的任何天然的结合配偶体具有不超过10%同一性。
在一些实施方案中，MM1的偶联降低相应的AB结合其靶标或表位的能力，使得当与MM1偶联时AB对其相应的靶标或表位的解离常数(Kd)是当不与MM1偶联时AB对其相应的靶标或表位的Kd的至少20倍。
在一些实施方案中，MM1的偶联降低相应的AB结合其靶标或表位的能力，使得当与MM1偶联时AB对其相应的靶标或表位的解离常数(Kd)是当不与MM1偶联时AB对其相应的靶标或表位的Kd的至少40倍。
在一些实施方案中，MM1的偶联降低相应的AB结合其靶标或表位的能力，使得当与MM1偶联时AB对其相应的靶标或表位的解离常数(Kd)是当不与MM1偶联时AB对其相应的靶标或表位的Kd的至少100倍。
在一些实施方案中，MM1的偶联降低相应的AB结合其靶标或表位的能力，使得当与MM1偶联时AB对其相应的靶标或表位的解离常数(Kd)是当不与MM1偶联时AB对其相应的靶标或表位的Kd的至少1000倍。
在一些实施方案中，MM1的偶联降低相应的AB结合其靶标或表位的能力，使得当与MM1偶联时AB对其相应的靶标或表位的解离常数(Kd)是当不与MM1偶联时AB对其相应的靶标或表位的Kd的至少10,000倍。
在一些实施方案中，MM1是选自在本文提供的实施例中所示的MM的氨基酸序列。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体至少包括：第二掩蔽部分(MM2)，其当所述多特异性可活化抗体在未裂解状态下时抑制AB2与其靶标结合；和与AB2偶联的第二可裂解部分(CM2)，其中CM2是起第二蛋白酶的底物作用的多肽。在一些实施方案中，CM2是不超过15个氨基酸长的多肽。在一些实施方案中，第二蛋白酶与第二靶标或表位在组织中共定位，和其中当多特异性可活化抗体暴露于第二蛋白酶时第二蛋白酶裂解多特异性可活化抗体中的CM2。在一些实施方案中，第一蛋白酶和第二蛋白酶在组织中与第一靶标或表位和第二靶标或表位共定位。在一些实施方案中，第一蛋白酶和第二蛋白酶是相同的蛋白酶。在一些实施方案中，CM1和CM2是对于所述相同的蛋白酶而言不同的底物。在一些实施方案中，蛋白酶选自表3中所示的那些。在一些实施方案中，第一蛋白酶和第二蛋白酶是不同的蛋白酶。在一些实施方案中，第一蛋白酶和第二蛋白酶是选自表3中所示的那些的不同的蛋白酶。
在一些实施方案中，在多特异性可活化抗体中各个MM (例如MM1和至少MM2)与其相应的AB结合的平衡解离常数大于AB与其相应的靶标或表位的平衡解离常数。
在一些实施方案中，在多特异性可活化抗体中各个MM与其相应的AB结合的平衡解离常数不超过AB与其相应的靶标或表位的平衡解离常数。
在一些实施方案中，当所述多特异性可活化抗体在裂解状态下时，在多特异性可活化抗体中各个MM不干扰其相应的AB结合相应的靶标或表位或不与其相应的AB竞争结合相应的靶标或表位。
在一些实施方案中，在多特异性可活化抗体中各个MM是大约2-40个氨基酸长的多肽。在一些实施方案中，在多特异性可活化抗体中各个MM是不超过40个氨基酸长的多肽。
在一些实施方案中，在多特异性可活化抗体中各个MM的多肽序列不同于相应的AB的靶标的序列。
在一些实施方案中，在多特异性可活化抗体中各个MM的多肽序列与相应的AB的任何天然的结合配偶体具有不超过50%同一性。在一些实施方案中，在多特异性可活化抗体中各个MM的多肽序列与相应的AB的任何天然的结合配偶体具有不超过25%同一性。在一些实施方案中，在多特异性可活化抗体中各个MM的多肽序列与相应的AB的任何天然的结合配偶体具有不超过10%同一性。
在一些实施方案中，各个MM的偶联降低相应的AB结合其靶标或表位的能力，使得当与MM偶联时AB对其相应的靶标或表位的解离常数(Kd)是当不与MM偶联时AB对其相应的靶标或表位的Kd的至少20倍。
在一些实施方案中，各个MM的偶联降低相应的AB结合其靶标或表位的能力，使得当与MM偶联时AB对其相应的靶标或表位的解离常数(Kd)是当不与MM偶联时AB对其相应的靶标或表位的Kd的至少40倍。
在一些实施方案中，各个MM的偶联降低相应的AB结合其靶标或表位的能力，使得当与MM偶联时AB对其相应的靶标或表位的解离常数(Kd)是当不与MM偶联时AB对其相应的靶标或表位的Kd的至少100倍。
在一些实施方案中，各个MM的偶联降低相应的AB结合其靶标或表位的能力，使得当与MM偶联时AB对其相应的靶标或表位的解离常数(Kd)是当不与MM偶联时AB对其相应的靶标或表位的Kd的至少1000倍。
在一些实施方案中，各个MM的偶联降低相应的AB结合其靶标或表位的能力，使得当与MM偶联时AB对其相应的靶标或表位的解离常数(Kd)是当不与MM偶联时AB对其相应的靶标或表位的Kd的至少10,000倍。
在一些实施方案中，各个MM是选自本文提供的实施例中所示的MM的氨基酸序列。
在一些实施方案中，裂解第一可裂解部分(CM1)序列的蛋白酶与多特异性可活化抗体的AB1的靶标在组织中共定位，当所述多特异性可活化抗体暴露于所述蛋白酶时所述蛋白酶裂解多特异性可活化抗体的CM1。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体包括超过一个可裂解部分序列，裂解至少一个可裂解部分序列的蛋白酶与多特异性可活化抗体的至少一个AB区的靶标在组织中共定位，和当所述多特异性可活化抗体暴露于所述蛋白酶时所述蛋白酶裂解多特异性可活化抗体中的CM。
在一些实施方案中，各个CM (例如，CM1和至少CM2)置于多特异性可活化抗体中，使得在未裂解状态下多特异性可活化抗体与AB区之一的靶标的结合被降低至平衡解离常数是未修饰的AB与其靶标结合的平衡解离常数的至少20倍，而在裂解状态下所述AB结合其靶标。
在一些实施方案中，各个CM置于多特异性可活化抗体中，使得在未裂解状态下多特异性可活化抗体与AB区之一的靶标的结合被降低至平衡解离常数是未修饰的AB与其靶标结合的平衡解离常数的至少40倍，而在裂解状态下所述AB结合其靶标。
在一些实施方案中，各个CM置于多特异性可活化抗体中，使得在未裂解状态下多特异性可活化抗体与AB区之一的靶标的结合被降低至平衡解离常数是未修饰的AB与其靶标结合的平衡解离常数的至少50倍，而在裂解状态下所述AB结合其靶标。
在一些实施方案中，各个CM置于多特异性可活化抗体中，使得在未裂解状态下多特异性可活化抗体与AB区之一的靶标的结合被降低至平衡解离常数是未修饰的AB与其靶标结合的平衡解离常数的至少100倍，而在裂解状态下所述AB结合其靶标。
在一些实施方案中，各个CM置于多特异性可活化抗体中，使得在未裂解状态下多特异性可活化抗体与AB区之一的靶标的结合被降低至平衡解离常数是未修饰的AB与其靶标结合的平衡解离常数的至少200倍，而在裂解状态下所述AB结合其靶标。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的各个CM是至多15个氨基酸长的多肽。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的至少一个CM包括氨基酸序列LSGRSDNH (SEQ ID NO: 26)。在一些实施方案中，至少一个可裂解部分经选择与特定的蛋白酶一起使用，所述蛋白酶例如已知与多特异性可活化抗体的至少一个靶标共定位的蛋白酶。例如，用于本公开内容的多特异性可活化抗体的合适的可裂解部分被至少蛋白酶例如尿激酶、legumain和/或基质蛋白酶(matriptase) (在本文中亦称为MT-SP1或MTSP1)裂解。在一些实施方案中，合适的可裂解部分包括至少一个以下序列：TGRGPSWV (SEQ ID NO:27); SARGPSRW (SEQ ID NO: 28); TARGPSFK (SEQ ID NO: 29); LSGRSDNH (SEQ ID NO:26); GGWHTGRN (SEQ ID NO: 30); HTGRSGAL (SEQ ID NO: 31); PLTGRSGG (SEQ ID NO:32); AARGPAIH (SEQ ID NO: 33); RGPAFNPM (SEQ ID NO: 34); SSRGPAYL (SEQ ID NO:35); RGPATPIM (SEQ ID NO: 36); RGPA (SEQ ID NO: 37); GGQPSGMWGW (SEQ ID NO:38); FPRPLGITGL (SEQ ID NO: 39); VHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 40); SPLTGRSG (SEQ IDNO: 41); SAGFSLPA (SEQ ID NO: 42); LAPLGLQRR (SEQ ID NO: 43); SGGPLGVR (SEQID NO: 44);和/或PLGL (SEQ ID NO: 45)。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的各个CM是选自表3中所示的那些的蛋白酶的底物。在一些实施方案中，所述蛋白酶选自uPA、legumain、MT-SP1、ADAM17、BMP-1、TMPRSS3、TMPRSS4、中性粒细胞弹性蛋白酶、MMP-7、MMP-9、MMP-12、MMP-13和MMP-14。在一些实施方案中，蛋白酶是组织蛋白酶，例如但不限于组织蛋白酶S。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的各个CM是选自uPA (尿激酶纤溶酶原激活物)、legumain和MT-SP1 (基质蛋白酶)的蛋白酶的底物。在一些实施方案中，蛋白酶包含uPA。在一些实施方案中，蛋白酶包含legumain。在一些实施方案中，蛋白酶包含MT-SP1。在一些实施方案中，蛋白酶包含基质金属蛋白酶(MMP)。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的至少一个CM是至少两种蛋白酶的底物。在一些实施方案中，各个蛋白酶选自表3中所示的那些。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的至少一个CM是至少两种蛋白酶的底物，其中蛋白酶之一选自uPA、legumain和MT-SP1，另一蛋白酶选自表3中所示的那些。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的至少一个CM是选自uPA、legumain和MT-SP1的至少两种蛋白酶的底物。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体至少包括第一CM (CM1)和第二CM(CM2)。在一些实施方案中，CM1和CM2是连接MM与AB的单一可裂解接头的一部分。在一些实施方案中，CM1是连接MM1与AB1的可裂解接头的一部分，和CM2是连接MM2与AB2的分开的可裂解接头的一部分。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体包含超过两个CM。在一些实施方案中，这样的多特异性可活化抗体包含超过两个CM和超过两个MM。在一些实施方案中，CM1和CM2各自是不超过15个氨基酸长的多肽。在一些实施方案中，第一CM和第二CM的至少一个是起选自表3中所列的那些的蛋白酶的底物作用的多肽。在一些实施方案中，第一CM和第二CM的至少一个是起选自uPA、legumain和MT-SP1的蛋白酶的底物作用的多肽。在一些实施方案中，第一CM在靶标组织中被选自uPA、legumain和MT-SP1的第一裂解剂裂解，第二CM在靶标组织中被第二裂解剂裂解。在一些实施方案中，另一蛋白酶选自表3中所示的那些。在一些实施方案中，第一裂解剂和第二裂解剂是选自表3中所列的那些的相同的蛋白酶，第一CM和第二CM是所述酶的不同的底物。在一些实施方案中，第一裂解剂和第二裂解剂是选自uPA、legumain和MT-SP1的相同的蛋白酶，第一CM和第二CM是所述酶的不同的底物。在一些实施方案中，第一裂解剂和第二裂解剂是选自表3中所列的相同的蛋白酶，第一CM和第二CM是相同的底物。在一些实施方案中，第一裂解剂和第二裂解剂是不同的蛋白酶。在一些实施方案中，第一裂解剂和第二裂解剂是选自表3中所示的那些的不同的蛋白酶。在一些实施方案中，第一裂解剂和第二裂解剂在靶标组织中共定位。在一些实施方案中，第一CM和第二CM在靶标组织中被至少一种裂解剂裂解。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体暴露于蛋白酶并被蛋白酶裂解，使得在活化或裂解状态下，活化的多特异性可活化抗体包括在蛋白酶裂解CM后包含LP2和/或CM序列的至少一部分的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体还包括信号肽。在一些实施方案中，信号肽经由间隔区与多特异性可活化抗体缀合。在一些实施方案中，间隔区在缺少信号肽时与多特异性可活化抗体缀合。在一些实施方案中，间隔区直接连接至多特异性可活化抗体的至少一个MM。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体在未裂解状态下包含直接连接至第一MM的间隔区，并具有从N-端至C-端为间隔区-MM1-CM-AB1的结构排列。在一些实施方案中，间隔区至少包括氨基酸序列QGQSGQ (SEQ ID NO: 46)。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体的血清半寿期比相应的多特异性抗体的血清半寿期更长；例如，多特异性可活化抗体的pK比相应的多特异性抗体的pK更长。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体的血清半寿期类似于相应的多特异性抗体的血清半寿期。在一些实施方案中，当给予生物体时，多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少15天。在一些实施方案中，当给予生物体时，多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少12天。在一些实施方案中，当给予生物体时，多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少11天。在一些实施方案中，当给予生物体时，多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少10天。在一些实施方案中，当给予生物体时，多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少9天。在一些实施方案中，当给予生物体时，多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少8天。在一些实施方案中，当给予生物体时，多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少7天。在一些实施方案中，当给予生物体时，多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少6天。在一些实施方案中，当给予生物体时，多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少5天。在一些实施方案中，当给予生物体时，多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少4天。在一些实施方案中，当给予生物体时，多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少3天。在一些实施方案中，当给予生物体时，多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少2天。在一些实施方案中，当给予生物体时，多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少24小时。在一些实施方案中，当给予生物体时，多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少20小时。在一些实施方案中，当给予生物体时，多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少18小时。在一些实施方案中，当给予生物体时，多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少16小时。在一些实施方案中，当给予生物体时，多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少14小时。在一些实施方案中，当给予生物体时，多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少12小时。在一些实施方案中，当给予生物体时，多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少10小时。在一些实施方案中，当给予生物体时，多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少8小时。在一些实施方案中，当给予生物体时，多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少6小时。在一些实施方案中，当给予生物体时，多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少4小时。在一些实施方案中，当给予生物体时，多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少3小时。
本公开内容还提供包括多特异性可活化抗体的组合物和方法，所述多特异性可活化抗体至少包括特异性地结合靶标的第一抗体或抗体片段(AB1)和第二抗体或抗体片段(AB2)，其中在多特异性可活化抗体中至少第一AB与降低AB1结合其靶标的能力的掩蔽部分(MM1)偶联。在一些实施方案中，各个AB与降低其相应的AB对各个靶标的能力的MM偶联。例如，在双特异性可活化抗体实施方案中，AB1与降低AB1结合其靶标的能力的第一掩蔽部分(MM1)偶联，AB2与降低AB2结合其靶标的能力的第二掩蔽部分(MM2)偶联。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体包含超过两个AB区；在这样的实施方案中，对于多特异性可活化抗体中的各个AB，AB1与降低AB1结合其靶标的能力的第一掩蔽部分(MM1)偶联，AB2与降低AB2结合其靶标的能力的第二掩蔽部分(MM2)偶联，AB3与降低AB3结合其靶标的能力的第三掩蔽部分(MM3)偶联等等。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体还包括作为蛋白酶的底物的至少一个可裂解部分(CM)，其中CM连接MM与AB。例如，在一些实施方案中，多特异性可活化抗体至少包括特异性地结合靶标的第一抗体或抗体片段(AB1)和第二抗体或抗体片段(AB2)，其中在多特异性可活化抗体中至少第一AB经由第一可裂解部分(CM1)与降低AB1结合其靶标的能力的掩蔽部分(MM1)偶联。在一些双特异性可活化抗体实施方案中，AB1经由CM1与MM1偶联，和AB2经由第二可裂解部分(CM2)与降低AB2结合其靶标的能力的第二掩蔽部分(MM2)偶联。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体包含超过两个AB区；在这些实施方案的一些中，对于多特异性可活化抗体中的各个AB，AB1经由CM1与MM1偶联，AB2经由CM2与MM2偶联，和AB3经由第三可裂解部分(CM3)与降低AB3结合其靶标的能力的第三掩蔽部分(MM3)偶联等等。
本文提供的组合物和方法使一种或多种试剂能够与在任何AB区中的一个或多个半胱氨酸残基连接，而不损害多特异性可活化抗体的活性(例如，掩蔽、活化或结合活性)。在一些实施方案中，本文提供的组合物和方法使一种或多种试剂能够与在任何AB区中的一个或多个半胱氨酸残基连接，而不还原或以其它方式打断在任何MM内的一个或多个二硫键。本文提供的组合物和方法产生与一种或多种试剂例如各种治疗剂、诊断剂和/或预防剂的任一种缀合的多特异性可活化抗体，优选没有任何试剂与多特异性可活化抗体的任何MM缀合。本文提供的组合物和方法产生缀合的多特异性可活化抗体，其中在未裂解状态下各个MM保留有效和高效掩蔽多特异性可活化抗体的其相应的AB的能力。本文提供的组合物和方法产生缀合的多特异性可活化抗体，其中在可裂解CM的蛋白酶的存在下可活化抗体仍被活化，即被裂解。
多特异性可活化抗体具有用于试剂的至少一个缀合点，但在本文提供的方法和组合物中少于所有可能的缀合点可用于缀合试剂。在一些实施方案中，一个或多个缀合点是二硫键中所包括的硫原子。在一些实施方案中，一个或多个缀合点是链间二硫键中所包括的硫原子。在一些实施方案中，一个或多个缀合点是链间二硫键中所包括的硫原子，但不是链内二硫键中所包括的硫原子。在一些实施方案中，一个或多个缀合点是半胱氨酸或包含硫原子的其它氨基酸残基的硫原子。这样的残基可天然存在于抗体结构中或可通过定点诱变、化学转变或错误掺入非天然氨基酸而掺入至抗体。
还提供制备多特异性可活化抗体的缀合物的方法，所述抗体具有在一个或多个AB中的一个或多个链间二硫键和在相应的MM中的一个或多个链内二硫键，并提供与游离巯基反应的药物。所述方法通常包括用还原剂例如TCEP部分地还原可活化抗体中的链间二硫键；和将与游离巯基反应的药物与部分地还原的可活化抗体缀合。如本文所用的，术语部分还原是指其中多特异性可活化抗体与还原剂接触和少于所有的二硫键(例如少于所有可能的缀合位点)被还原的情况。在一些实施方案中，少于99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%或少于5%的所有可能的缀合位点被还原。
在仍其它的实施方案中，提供还原多特异性可活化抗体和缀合试剂例如药物至多特异性可活化抗体的方法，其产生在试剂的放置中的选择性。所述方法通常包括用还原剂部分地还原多特异性可活化抗体，使得可活化抗体的任何掩蔽部分或其它非AB部分中的任何缀合位点不被还原，和将试剂与多特异性可活化抗体的一个或多个AB区的链间巯基缀合。选择缀合位点以允许所需要的试剂放置，使缀合在所需位点处发生。还原剂为例如TCEP。还原反应条件，例如还原剂与可活化抗体的比率、孵育长度、孵育期间的温度、还原反应溶液的pH等，通过鉴定产生缀合的可活化抗体的条件来确定，其中MM保留在未裂解状态下有效和高效掩蔽可活化抗体的AB的能力。还原剂与多特异性可活化抗体的比率将根据可活化抗体而改变。在一些实施方案中，还原剂与多特异性可活化抗体的比率的范围为大约20:1至1:1、大约10:1至1:1、大约9:1至1:1、大约8:1至1:1、大约7:1至1:1、大约6:1至1:1、大约5:1至1:1、大约4:1至1:1、大约3:1至1:1、大约2:1至1:1、大约20:1至1:1.5、大约10:1至1:1.5、大约9:1至1:1.5、大约8:1至1:1.5、大约7:1至1:1.5、大约6:1至1:1.5、大约5:1至1:1.5、大约4:1至1:1.5、大约3:1至1:1.5、大约2:1至1:1.5、大约1.5:1至1:1.5或大约1:1至1:1.5。在一些实施方案中，比率范围为大约5:1至1:1。在一些实施方案中，比率范围为大约5:1至1.5:1。在一些实施方案中，比率范围为大约4:1至1:1。在一些实施方案中，比率范围为大约4:1至1.5:1。在一些实施方案中，比率范围为大约8:1至大约1:1。在一些实施方案中，比率范围为大约2.5:1至1:1。
在一些实施方案中，提供还原多特异性可活化抗体的一个或多个AB区的链间二硫键和将试剂例如包含巯基的试剂例如药物与得到的链间巯基缀合以选择性定位试剂在AB上的方法。所述方法通常包括用还原剂部分地还原一个或多个AB区以形成至少两个链间巯基，而不在可活化抗体中形成所有可能的链间巯基；和将试剂与部分还原的AB的链间巯基缀合。例如，多特异性可活化抗体的一个或多个AB区在大约37℃以所需的还原剂:可活化抗体比率被部分地还原大约1小时。在一些实施方案中，还原剂与可活化抗体的比率范围为大约20:1至1:1、大约10:1至1:1、大约9:1至1:1、大约8:1至1:1、大约7:1至1:1、大约6:1至1:1、大约5:1至1:1、大约4:1至1:1、大约3:1至1:1、大约2:1至1:1、大约20:1至1:1.5、大约10:1至1:1.5、大约9:1至1:1.5、大约8:1至1:1.5、大约7:1至1:1.5、大约6:1至1:1.5、大约5:1至1:1.5、大约4:1至1:1.5、大约3:1至1:1.5、大约2:1至1:1.5、大约1.5:1至1:1.5或大约1:1至1:1.5。在一些实施方案中，比率范围为大约5:1至1:1。在一些实施方案中，比率范围为大约5:1至1.5:1。在一些实施方案中，比率范围为大约4:1至1:1。在一些实施方案中，比率范围为大约4:1至1.5:1。在一些实施方案中，比率范围为大约8:1至大约1:1。在一些实施方案中，比率范围为大约2.5:1至1:1。
包含巯基的试剂可以是例如半胱氨酸或N-乙酰基半胱氨酸。还原剂可以是例如TCEP。在一些实施方案中，在缀合之前，还原的可活化抗体可以使用例如柱色谱、透析或渗滤进行纯化。或者，在部分还原后和缀合之前，还原的抗体不经过纯化。
本公开内容还提供部分还原的多特异性可活化抗体，其中多特异性可活化抗体的至少一个链间二硫键被还原剂还原而不打断多特异性可活化抗体的任何链内二硫键，其中多特异性可活化抗体至少包括特异性地结合靶标的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)、抑制在未裂解状态下的多特异性可活化抗体的AB1与靶标结合的第一掩蔽部分(MM1)、与AB1偶联的第一可裂解部分(CM1) (其中CM1是起蛋白酶的底物作用的多肽)、和特异性地结合第二靶标的第二抗体或其抗原结合片段(AB2)。在一些实施方案中，MM1经由CM1与AB1偶联。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体的一个或多个链内二硫键不被还原剂打断。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体内的MM1的一个或多个链内二硫键不被还原剂打断。在一些实施方案中，还原剂是TCEP。
在一些实施方案中，本文描述的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体与一种或多种另外的试剂或另外的试剂的组合结合使用。合适的另外的试剂包括用于预期应用例如癌症的当前药物和/或手术疗法。例如，多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体可与另外的化学治疗剂或抗肿瘤剂结合使用。
在一些实施方案中，多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体和另外的试剂配制在单一治疗组合物中，多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体和另外的试剂同时给予。或者，多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体和另外的试剂彼此分开，例如，各自配制在分开的治疗组合物中，多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体和另外的试剂同时给予，或多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体和另外的试剂在治疗方案期间在不同的时间给予。例如，多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体在给予另外的试剂之前给予，多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体在给予另外的试剂之后给予，或多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体和另外的试剂以交替的方式给予。如本文所述的，抗-多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体和另外的试剂以单剂量或多剂量给予。
本公开内容还提供编码本文所述的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的分离的核酸分子，以及包括这些分离的核酸序列的载体。本公开内容提供通过在导致表达多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的条件下培养细胞来产生多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的方法，其中所述细胞包含这样的核酸分子。在一些实施方案中，所述细胞包含这样的载体。
本公开内容还提供如下制备本公开内容的多特异性抗体和/或本公开内容的多特异性可活化抗体的方法：通过(a)在导致表达多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的条件下培养包含编码多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的核酸构建体的细胞，和(b)回收多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体。
本公开内容还提供通过给予本公开内容的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体至需要这样的治疗或预防的受试者，治疗、预防一种或多种病理的症状、延迟一种或多种病理的症状的进展或以其它方式改善一种或多种病理的症状，或减轻与这样的病理相关的症状的方法。待治疗的受试者是例如人或其它哺乳动物。在一些实施方案中，所述受试者是非人哺乳动物，例如非人灵长类动物、伴侣动物(例如，猫、狗、马)、家畜、耕畜或动物园动物。在一些实施方案中，所述受试者是啮齿动物。
本公开内容还提供通过给予本公开内容的多特异性可活化抗体至需要这样的诱导的受试者，诱导靶标依赖性T-细胞活化和杀灭靶标细胞的方法，其中当多特异性可活化抗体呈裂解状态，例如，多特异性可活化抗体的各掩蔽部分不再连接或以其它方式缔合相应的AB结构域时，发生靶标依赖性T-细胞活化和杀灭靶标细胞，和当多特异性可活化抗体呈未裂解状态，例如多特异性可活化抗体的至少一个掩蔽部分连接或以其它方式缔合相应的AB结构域时，靶标依赖性T-细胞活化和杀灭靶标细胞减少或以其它方式受到抑制。本文所述的任何多特异性可活化抗体适合用于这样的方法。待治疗的受试者是例如人或其它哺乳动物。在一些实施方案中，所述受试者是非人哺乳动物，例如非人灵长类动物、伴侣动物(例如，猫、狗、马)、家畜、耕畜或动物园动物。在一些实施方案中，所述受试者是啮齿动物。
在这些方法和用途的任何实施方案中使用的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体可在任何疾病阶段和/或需要T-细胞活化和杀灭靶标细胞的任何阶段给予。例如，这样的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体可给予患有任何阶段的癌症(从早期至转移)的患者。术语受试者和患者在本文可互换使用。在这些方法和用途的任何实施方案中使用的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体可用于包含新辅助疗法的治疗方案。在这些方法和用途的任何实施方案中使用的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体可单独或与一种或多种另外的试剂组合给予，所述另外的试剂包括小分子抑制剂、基于其它抗体的疗法、基于多肽或肽的疗法、基于核酸的疗法和/或其它生物制剂。
本公开内容还提供在各种诊断和/或预防适应症中使用多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的方法和药盒。例如，本公开内容提供用于如下检测受试者或样品中裂解剂和目的靶标的存在或不存在的方法和药盒：通过(i)使受试者或样品与多特异性可活化抗体接触，所述多特异性可活化抗体包括至少第一掩蔽部分(MM1)、被裂解剂裂解的第一可裂解部分(CM1)、和至少第一抗原结合结构域或其片段(AB1)和第二抗原结合结构域或其片段(AB2)，所述AB1特异性地结合目的靶标，所述AB2特异性地结合第二靶标和/或第二表位，(a)其中MM1是抑制AB1与靶标结合的肽，和其中MM1不具有AB1的天然存在的结合配偶体的氨基酸序列和不是AB1的修饰形式的天然结合配偶体；和(b)其中在未裂解的非活化状态下，MM1干扰AB1与靶标的特异性结合，和在裂解的活化状态下，MM1不干扰或竞争AB1与靶标的特异性结合；和(ii)测量在受试者或样品中活化的多特异性可活化抗体的水平，其中在受试者或样品中可检测水平的活化的多特异性可活化抗体表明裂解剂和靶标存在于受试者或样品中，和其中在受试者或样品中不可检测水平的活化的多特异性可活化抗体表明裂解剂、靶标或裂解剂和靶标两者不存在和/或不充分地存在于受试者或样品中。
在一些实施方案中，可活化多特异性可活化抗体是治疗剂与其缀合的可活化多特异性可活化抗体。在一些实施方案中，可活化多特异性可活化抗体不与试剂缀合。在一些实施方案中，可活化多特异性可活化抗体包含可检测标记。在一些实施方案中，可检测标记位于AB1上。在一些实施方案中，测量受试者或样品中的可活化多特异性可活化抗体的水平使用特异性地结合活化的多特异性可活化抗体的第二试剂实现，其中所述试剂包含可检测标记。在一些实施方案中，第二试剂是包含可检测标记的抗体。
在这些方法和药盒的一些实施方案中，可活化多特异性可活化抗体包括可检测标记。在这些方法和药盒的一些实施方案中，可检测标记包括成像剂、造影剂、酶、荧光标记、发色团、染料、一种或多种金属离子或基于配体的标记。在这些方法和药盒的一些实施方案中，成像剂包含放射性同位素。在这些方法和药盒的一些实施方案中，放射性同位素是铟或锝。在这些方法和药盒的一些实施方案中，造影剂包含碘、钆或氧化铁。在这些方法和药盒的一些实施方案中，酶包含辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶。在这些方法和药盒的一些实施方案中，荧光标记包含黄色荧光蛋白(YFP)、蓝绿色荧光蛋白(CFP)、绿色荧光蛋白(GFP)、修饰的红色荧光蛋白(mRFP)、红色荧光蛋白tdimer2 (RFP tdimer2)、HCRED或铕衍生物。在这些方法和药盒的一些实施方案中，发光标记包含N-甲基吖啶
Figure 367077DEST_PATH_IMAGE002
(methylacrydium)衍生物。在这些方法的一些实施方案中，标记包含Alexa Fluor®标记，例如Alex Fluor® 680或Alexa Fluor® 750。在这些方法和药盒的一些实施方案中，基于配体的标记包含生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素或一种或多种半抗原。
在这些方法和药盒的一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在这些方法和药盒的一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者是非人哺乳动物，例如非人灵长类动物、伴侣动物(例如，猫、狗、马)、家畜、耕畜或动物园动物。在一些实施方案中，受试者是啮齿动物。
在这些方法的一些实施方案中，所述方法是体内方法。在这些方法的一些实施方案中，所述方法是原位方法。在这些方法的一些实施方案中，所述方法是离体方法。在这些方法的一些实施方案中，所述方法是体外方法。
在方法和药盒的一些实施方案中，所述方法或药盒用于鉴定或以其它方式精选适合于用本公开内容的多特异性可活化抗体治疗的患者群。例如，对靶标和裂解这些方法中所测试的多特异性可活化抗体的第一可裂解部分(CM1)中的底物的蛋白酶两者测试阳性的患者被鉴定为用包含这样的CM1的这样的多特异性可活化抗体进行治疗的合适的候选者。同样，对靶标和裂解使用这些方法所测试的多特异性可活化抗体的CM1中的底物的蛋白酶两者测试阴性的患者可被鉴定为对另一形式的疗法合适的候选者。
在一些实施方案中，方法或药盒用于鉴定或以其它方式精选适合于用本公开内容的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体(例如，治疗剂与其缀合的多特异性可活化抗体)治疗的患者群，接着通过给予有需要的受试者多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体进行治疗。例如，对靶标和裂解这些方法中所测试的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体的第一可裂解部分(CM1)中的底物的蛋白酶两者测试阳性的患者被鉴定为用包含这样的CM1的多特异性可活化抗体和/或包含这样的CM1的缀合的多特异性可活化抗体治疗的合适的候选者，然后给予所述患者治疗有效量的所测试的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体。同样，对靶标和裂解使用这些方法所测试的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体的CM1中的底物的蛋白酶中的任一或两者测试阴性的患者可被鉴定为对另一形式的疗法合适的候选者。
在一些实施方案中，所述患者可用其它多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体进行测试，直到用于治疗的合适的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体得以鉴定，例如，包含在疾病部位处被患者裂解的CM的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体。在一些实施方案中，然后给予所述患者治疗有效量的患者对其测试阳性的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体。
本公开内容的药物组合物可包括本公开内容的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体和载体。这些药物组合物可包括在药盒例如诊断药盒中。
本领域技术人员将理解，本公开内容的抗体具有多种用途。例如，本公开内容的蛋白用作多种病症的治疗剂。本公开内容的抗体还用作诊断药盒中的试剂或用作诊断工具，或这些抗体可用于竞争测定法以产生治疗试剂。
附图简述
图1是描述各种双特异性抗体形式的示意图(自Chan和Carter, Nat. Rev.Immunol. 2010改编)。
图2A-2C是描述适合用于本公开内容的组合物和方法的各种多特异性抗体形式的一系列示意图。在双特异性抗体中，scFv可与IgG抗体的重链(Hc)的羧基末端融合(图2A)；与轻链(Lc)的羧基末端融合(图2B)；或与重链和轻链两者的羧基末端融合(图2C)。图2D是用于表达多特异性抗体融合物的单一基因构建体的图。
图3A是描述适合用于本公开内容的组合物和方法的各种多特异性可活化抗体形式的一系列示意图。图3B是用于表达多特异性可活化抗体融合物的基因构建体的图。
图4，子图A-J，是本公开内容的多特异性抗体的所选的一组可能的排列的一系列示意图。灰色阴影框覆盖了图2中所示的构型，包括在此处用于完整性和比较。
图5，子图A-J，是本公开内容的多特异性可活化抗体的所选的一组可能的排列的一系列示意图。灰色阴影框覆盖了图3中所示的构型，包括在此处用于完整性和比较。具体而言，该图显示其中第一抗原结合位点被掩蔽(即，可活化的)和另外的抗原结合结构域未被掩蔽的多特异性可活化抗体。
图6，子图A-J，是一组多特异性可活化抗体的一系列示意图，其中所有抗原结合结构域被掩蔽。
图7，子图A-J，是一组多特异性可活化抗体的一系列示意图，其中第二抗原结合结构域被掩蔽和另外的抗原结合结构域未被掩蔽。
图8，子图A-J，是一组多特异性可活化抗体的一系列示意图，其中大部分而非所有的抗原结合结构域被掩蔽和至少一个另外的抗原结合结构域未被掩蔽。
图9，子图A-D，是一组多特异性可活化抗体的一系列示意图，其中第一抗原结合结构域和另一抗原结合结构域被掩蔽，和剩余的抗原结合结构域未被掩蔽。
图10是显示多特异性抗体和多特异性可活化抗体的PAGE分析的照片，其显示与各自的单特异性抗体或可活化抗体(样品9-11)比较的scFv融合的重链(样品1-8)的分子量。
图11是描述多特异性抗体特异性地结合其同源抗原的能力的图。
图12A-12B是描述多特异性抗体和多特异性可活化抗体(包括抗人CTLA-4 scFv)特异性地结合(A)小鼠和(B)人CTLA-4的能力的一系列图。
图13是描述在ELISA结合实验中包含OKT3的多特异性可活化抗体(在本文称为抗-EGFR多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5—OKT3和抗-Jagged多特异性可活化抗体5342-1204-4D11v2—OKT3)特异性地结合人CD3ε的能力的图。
图14是描述uPA消化物的PAGE分析的一系列照片，其表明多特异性可活化抗体的活化而无重链scFv融合物的裂解。
图15是描述活化的多特异性可活化抗体结合各种靶标的能力的一系列图。
图16A是描述本公开内容的多特异性抗体与CD3ε-阳性Jurkat T细胞的结合的图。
图16B是描述本公开内容的多特异性抗体与CD3ε-阳性Jurkat T细胞和EGFR的共结合的图。
图17是描述通过本公开内容的多特异性抗体进行的Jurkat T细胞的EGFR-依赖性活化的一系列图。
图18A是描述通过本公开内容的多特异性抗体进行的原代CD8+ T细胞的EGFR-依赖性活化的图。
图18B是描述通过本公开内容的多特异性抗体进行的靶标细胞的EGFR-依赖性杀伤的图。
图18C是描述与EGFR-阴性U266细胞中的最少活化相比，在表达EGFR的SW480细胞中通过多特异性抗体C225v5-OKT3m-H-N进行的原代T细胞的CD69活化的一系列图。
图18D是描述与在EGFR-阴性U266细胞中可忽略的杀伤相比，在表达EGFR的SW480细胞中通过多特异性抗体C225v5-OKT3m-H-N进行的靶标细胞的EGFR-依赖性杀伤的一系列图。
图19是描述与EGFR-阴性U266细胞系不存在溶解相比，通过多特异性抗体C225v5-OKT3m-H-N进行的一组表达EGFR的细胞系的原代T细胞的溶解的一系列图。
图20A和图20B是描述与通过多特异性抗体C225v5-OKT3m-H-N的EGFR结合相比，多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N与表达EGFR的细胞的结合减少的一系列图。此外，图20A和20B显示基质蛋白酶(在本文中亦称为MTSP1或MT-SP1)对多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N的蛋白酶活化恢复EGFR结合至等于多特异性抗体C225v5-OKT3m-H-N显示的水平。图20A和20B还显示，这样的多特异性可活化抗体和多特异性抗体以类似于各自的单特异性可活化抗体和单特异性抗体的方式结合EGFR。
图21A和图21B是描述多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N、活化的多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N和多特异性抗体C225v5-OKT3m-H-N与CD3ε-阳性Jurkat T细胞的结合的一系列图。
图22是描述与通过多特异性抗体C225v5-OKT3m-H-N的活化相比，通过多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N进行的Jurkat T细胞的EGFR-依赖性活化减少的图。此外，该图显示基质蛋白酶对多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N的蛋白酶活化恢复EGFR-依赖性活化至等于通过多特异性抗体C225v5-OKT3m-H-N显示的水平。
图23A是描述与通过多特异性抗体C225v5-OKT3m-H-N的活化相比，通过多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N进行的原代CD8+ T细胞的EGFR-依赖性活化减少的图。此外，该图显示基质蛋白酶对多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N的蛋白酶活化恢复EGFR-依赖性活化至等于通过多特异性抗体C225v5-OKT3m-H-N显示的水平。
图23B是描述与通过多特异性抗体C225v5-OKT3m-H-N的杀伤相比，通过多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N进行的靶标细胞的EGFR-依赖性杀伤减少的图。此外，该图显示基质蛋白酶对多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N的蛋白酶活化恢复EGFR-依赖性靶标细胞杀伤至等于通过多特异性抗体C225v5-OKT3m-H-N显示的水平。
详细描述
本公开内容提供多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体。如本文所用的，多特异性抗体是识别两种或更多种不同的抗原或表位的抗体，和多特异性可活化抗体是这样的多特异性抗体，其包括与多特异性抗体的至少一个抗原或表位结合结构域连接的至少一个掩蔽部分(MM)，使得MM的偶联降低抗原或表位结合结构域结合其靶标的能力。本文提供的可活化多特异性抗体在循环中是稳定的，在预期的治疗和/或诊断部位处被活化，但在正常(即，健康)组织中不被活化，并且当被活化时，显示与靶标的结合至少相当于相应的未修饰的多特异性抗体。
多特异性抗体的非限制性实例包括双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体和其它多特异性抗体。本文提供的多特异性抗体也是多价的；如本文所用的，多价是指抗体上的结合位点的总数量，不管所述结合位点是否识别相同或不同的抗原或表位。多特异性可活化抗体的非限制性实例包括双特异性可活化抗体、三特异性可活化抗体、四特异性可活化抗体和其它多特异性可活化抗体。本文提供的多特异性可活化抗体也是多价的。
在一些实施方案中，多特异性抗体或其片段和/或多特异性可活化抗体或其片段经设计以接合T细胞和/或其它免疫效应细胞。接合T细胞的多特异性可活化抗体或其片段在本文中亦称为T-细胞接合多特异性抗体或其片段和/或T-细胞接合多特异性可活化抗体或其片段。接合免疫效应细胞的多特异性可活化抗体或其片段在本文中亦称为免疫效应细胞接合多特异性抗体或其片段和/或免疫效应细胞接合多特异性可活化抗体或其片段。在一些实施方案中，多特异性抗体或其片段和/或多特异性可活化抗体或其片段经设计以与超过一种靶标和/或超过一种表位结合或以其它方式相互作用，在本文中亦称为多抗原靶向抗体或其片段和/或多抗原靶向可活化抗体或其片段。
在一些实施方案中，多特异性抗体或其片段包括IgG结构域和scFv结构域。在一些实施方案中，多特异性抗体或其片段包括IgG可变结构域和scFv结构域。在一些实施方案中，多特异性抗体或其片段的一个抗体结构域具有对靶标抗原的特异性，和另一抗体结构域具有对T-细胞表面抗原的特异性。在一些实施方案中，多特异性抗体或其片段的一个抗体结构域具有对靶标抗原的特异性，和另一抗体结构域具有对另一靶标抗原的特异性。在一些实施方案中，多特异性抗体或其片段的一个抗体结构域具有对靶标抗原的表位的特异性和另一抗体结构域具有对相同靶标抗原的另一表位的特异性。
本公开内容的多特异性可活化抗体或其片段的各种实施方案显示在图3A和5-9。在一些实施方案中，包含IgG的多特异性可活化抗体或其片段的IgG可变结构域被掩蔽。在一些实施方案中，包含scFv的多特异性可活化抗体或其片段的scFv结构域被掩蔽。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体或其片段具有IgG可变结构域和scFv结构域两者，其中至少一个IgG可变结构域与掩蔽部分偶联。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体或其片段具有IgG可变结构域和scFv结构域两者，其中至少一个scFv结构域与掩蔽部分偶联。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体或其片段具有IgG可变结构域和scFv结构域两者，其中至少一个IgG可变结构域与掩蔽部分偶联和至少一个scFv结构域与掩蔽部分偶联。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体或其片段具有IgG可变结构域和scFv结构域两者，其中每个IgG可变结构域和scFv结构域与其自己的掩蔽部分偶联。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体或其片段的一个抗体结构域具有对靶标抗原的特异性，和另一抗体结构域具有对T-细胞表面抗原的特异性。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体或其片段的一个抗体结构域具有对靶标抗原的特异性，和另一抗体结构域具有对另一靶标抗原的特异性。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体或其片段的一个抗体结构域具有对靶标抗原的表位的特异性，和另一抗体结构域具有对相同靶标抗原的另一表位的特异性。
在一些实施方案中，本公开内容的多特异性抗体或其片段至少包括(i) T-细胞接合抗体或其片段，其包括结合第一T-细胞接合靶标的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，所述靶标是T细胞上的表面抗原；和(ii)第二抗体或其片段，其包括结合第二靶标的第二抗体或其抗原结合片段(AB2)。在一些实施方案中，第一和第二靶标是相同的抗原。在一些实施方案中，第一和第二靶标是不同的抗原。在一些实施方案中，第一和第二靶标是相同的抗原上的不同的表位。在一些实施方案中，T-细胞接合抗体或其片段连接靶标特异性抗体的重链的N-末端。在一些实施方案中，T-细胞接合抗体或其片段连接靶标特异性抗体的重链的C-末端。在一些实施方案中，T-细胞接合抗体或其片段连接靶标特异性抗体的轻链的N-末端。在一些实施方案中，T-细胞接合抗体或其片段连接靶标-特异性抗体的轻链的C-末端。在一些实施方案中，多特异性抗体包含与多特异性抗体的一个或多个N-末端和/或一个或多个C-末端的组合连接的T-细胞接合抗体或其片段。本公开内容还包括包含另一免疫效应细胞接合抗体或其片段(例如结合天然杀伤(NK)细胞、单核细胞例如骨髓单核细胞、巨噬细胞和/或其它免疫效应细胞的表面抗原的另一免疫效应细胞接合抗体或其片段)的多特异性抗体。
在一些实施方案中，本公开内容的多特异性抗体或其片段包括至少两个接合一个或多个T细胞活化受体的T-细胞接合抗体或其片段，例如T-细胞接合scFv片段，包括但不限于OX40/GITR、CD137/ GITR、CD137/OX40、CD27/NKG2D和活化受体的另外组合；和一个靶标结合抗体，使得T-细胞接合scFv片段与靶标结合抗体的两个臂连接。在一些实施方案中，本公开内容的多特异性抗体或其片段包括接合一个或多个T细胞抑制性受体的两个T-细胞接合抗体或其片段，和一个靶标结合抗体，使得T-细胞接合scFv片段与靶标结合抗体的两个臂连接。在一些实施方案中，两个T-细胞接合抗体片段结合相同的T-细胞接合靶标。在一些实施方案中，两个T-细胞接合抗体片段结合不同的T-细胞接合靶标。在一些实施方案中，两个T-细胞接合抗体片段结合在相同的T-细胞接合靶标上的不同的表位。
在一些实施方案中，本公开内容的多特异性抗体或其片段至少包括(i) 包含T-细胞接合抗体的抗原结合片段的第一臂，所述抗体包括结合第一T-细胞接合靶标的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)；和(ii) 包含靶标结合抗体的抗原结合片段的第二臂，所述抗体包括结合第二靶标的第二抗体或其抗原结合片段(AB2)。在一些实施方案中，多特异性抗体或其片段包括(iii) 靶标结合抗体的至少第三抗原结合片段，所述抗体包括结合第三靶标的第三抗体或其抗原结合片段(AB3)。在一些实施方案中，第二和第三或更多靶标是相同的抗原。在一些实施方案中，第二和第三或更多靶标是不同的抗原。在一些实施方案中，第二和第三或更多靶标是相同的抗原上的不同的表位。
在一些实施方案中，本公开内容的多特异性可活化抗体或其片段至少包括(i) T-细胞接合抗体或其片段，其包括结合第一T-细胞接合靶标的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，所述靶标是T细胞上的表面抗原，其中AB1与掩蔽部分(MM)连接，使得MM的偶联降低AB1结合第一靶标的能力；和(ii) 第二抗体或其片段，其包括结合第二靶标的第二抗体或其抗原结合片段(AB2)。在一些实施方案中，第一和第二靶标是相同的抗原。在一些实施方案中，第一和第二靶标是不同的抗原。在一些实施方案中，第一和第二靶标是相同的抗原上的不同的表位。在一些实施方案中，T-细胞接合抗体或其片段连接靶标特异性抗体的重链的N-末端。在一些实施方案中，T-细胞接合抗体或其片段连接靶标特异性抗体的重链的C-末端。在一些实施方案中，T-细胞接合抗体或其片段连接靶标特异性抗体的轻链的N-末端。在一些实施方案中，T-细胞接合抗体或其片段连接靶标特异性抗体的轻链的C-末端。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体包含与多特异性可活化抗体的一个或多个N-末端和/或一个或多个C-末端的组合连接的T-细胞接合抗体或其片段。本公开内容还包括包含另一免疫效应细胞接合抗体或其片段(例如结合天然杀伤(NK)细胞、单核细胞例如骨髓单核细胞、巨噬细胞和/或其它免疫效应细胞的表面抗原的另一免疫效应细胞接合抗体或其片段)多特异性可活化抗体。
在一些实施方案中，本公开内容的多特异性可活化抗体或其片段至少包括(i) 接合一个或多个T细胞活化受体的两个T-细胞接合抗体或其抗体片段，例如T-细胞接合scFv片段，包括但不限于OX40/GITR、CD137/ GITR、CD137/OX40、CD27/NKG2D和活化受体的另外组合，其中一个T-细胞接合抗体片段的AB1与掩蔽部分(MM)连接，使得MM的偶联降低AB1结合其各自T-细胞接合靶标的能力，和(ii) 一个靶标结合抗体，使得T-细胞接合scFv片段与靶标结合抗体的两个臂连接。在一些实施方案中，本公开内容的多特异性抗体或其片段包括接合一个或多个T细胞抑制性受体的两个T-细胞接合抗体或其片段，和一个靶标结合抗体，使得T-细胞接合scFv片段与靶标结合抗体的两个臂连接。在一些实施方案中，两个T-细胞接合抗体片段结合相同的T-细胞接合靶标。在一些实施方案中，两个T-细胞接合抗体片段结合不同的T-细胞接合靶标。在一些实施方案中，两个T-细胞接合抗体片段结合在相同的T-细胞接合靶标上的不同的表位。
在一些实施方案中，本公开内容的多特异性可活化抗体或其片段至少包括(i) 接合一个或多个T细胞活化受体的两个T-细胞接合抗体或其抗体片段，例如T-细胞接合scFv片段，包括但不限于OX40/GITR、CD137/ GITR、CD137/OX40、CD27/NKG2D和活化受体的另外组合，其中T-细胞接合抗体片段的每个AB1与其自己的掩蔽部分(MM)连接，使得每个MM与其各自的AB1的偶联降低AB1结合其各自的T-细胞接合靶标的能力；和(ii) 一个靶标结合抗体，使得T-细胞接合scFv片段与靶标结合抗体的两个臂连接。在一些实施方案中，本公开内容的多特异性抗体或其片段包括接合一个或多个T细胞抑制性受体的两个T-细胞接合抗体或其片段，和一个靶标结合抗体，使得T-细胞接合scFv片段与靶标结合抗体的两个臂连接。在一些实施方案中，两个T-细胞接合抗体片段结合相同的T-细胞接合靶标。在一些实施方案中，两个T-细胞接合抗体片段结合不同的T-细胞接合靶标。在一些实施方案中，两个T-细胞接合抗体片段结合相同的T-细胞接合靶标上的不同的表位。在一些实施方案中，T-细胞接合抗体或其片段接合一个或多个T细胞抑制性受体，而不是一个或多个T细胞活化受体。
在一些实施方案中，本公开内容的多特异性可活化抗体或其片段至少包括(i) 包含T-细胞接合抗体的抗原结合片段的第一臂，所述抗体包括结合第一T-细胞接合靶标的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM)连接，使得MM的偶联降低AB1结合第一靶标的能力；和(ii) 包含靶标结合抗体的抗原结合片段的第二臂，所述抗体包括结合第二靶标的第二抗体或其抗原结合片段(AB2)。在一些实施方案中，第一和第二靶标是相同的抗原。在一些实施方案中，第一和第二靶标是不同的抗原。在一些实施方案中，第一和第二靶标是相同的抗原上的不同的表位。在一些实施方案中，T-细胞接合抗体或其片段接合一个或多个T细胞抑制性受体，而不是一个或多个T细胞活化受体。
在一些实施方案中，本公开内容的多特异性可活化抗体或其片段至少包括(i) T-细胞接合抗体或其片段，其包括结合第一T-细胞接合靶标的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，所述靶标是T细胞上的表面抗原；和(ii) 第二抗体或其片段，其包括结合第二靶标的第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其中AB2与掩蔽部分(MM)连接，使得MM的偶联降低AB2结合第二靶标的能力。在一些实施方案中，第一和第二靶标是相同的抗原。在一些实施方案中，第一和第二靶标是不同的抗原。在一些实施方案中，第一和第二靶标是相同的抗原上的不同的表位。在一些实施方案中，T-细胞接合抗体或其片段与靶标特异性抗体的重链的N-末端连接。在一些实施方案中，T-细胞接合抗体或其片段与靶标特异性抗体的重链的C-末端连接。在一些实施方案中，T-细胞接合抗体或其片段与靶标特异性抗体的轻链的N-末端连接。在一些实施方案中，T-细胞接合抗体或其片段与靶标特异性抗体的轻链的C-末端连接。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体包含与多特异性可活化抗体的一个或多个N-末端和/或一个或多个C-末端的组合连接的T-细胞接合抗体或其片段。本公开内容还包括包含另一免疫效应细胞接合抗体或其片段(例如结合天然杀伤(NK)细胞、单核细胞例如骨髓单核细胞、巨噬细胞和/或其它免疫效应细胞的表面抗原的另一免疫效应细胞接合抗体或其片段)的多特异性可活化抗体。
在一些实施方案中，本公开内容的多特异性可活化抗体或其片段至少包括(i) 接合一个或多个T细胞活化受体的两个T-细胞接合抗体或其抗体片段，例如T-细胞接合scFv片段，包括但不限于OX40/GITR、CD137/ GITR、CD137/OX40、CD27/NKG2D和活化受体的另外组合；和(ii) 一个靶标结合抗体，其包括结合第二靶标的第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其中AB2与掩蔽部分(MM)连接，使得MM的偶联降低AB2结合第二靶标的能力，其中T-细胞接合scFv片段与靶标结合抗体的两个臂连接。在一些实施方案中，本公开内容的多特异性抗体或其片段包括接合一个或多个T细胞抑制性受体的两个T-细胞接合抗体或其片段，和一个靶标结合抗体，使得T-细胞接合scFv片段与靶标结合抗体的两个臂连接。在一些实施方案中，两个T-细胞接合抗体片段结合相同的T-细胞接合靶标。在一些实施方案中，两个T-细胞接合抗体片段结合不同的T-细胞接合靶标。在一些实施方案中，两个T-细胞接合抗体片段结合相同的T-细胞接合靶标上的不同的表位。在一些实施方案中，T-细胞接合抗体或其片段接合一个或多个T细胞抑制性受体，而不是一个或多个T细胞活化受体。
在一些实施方案中，本公开内容的多特异性可活化抗体或其片段至少包括(i) 包含T-细胞接合抗体的抗原结合片段的第一臂；和(ii) 包含靶标结合抗体的抗原结合片段的第二臂，所述抗体包括结合第二靶标的第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其中AB2与掩蔽部分(MM)连接，使得MM的偶联降低AB2结合第二靶标的能力。在一些实施方案中，第一和第二靶标是相同的抗原。在一些实施方案中，第一和第二靶标是不同的抗原。在一些实施方案中，第一和第二靶标是相同的抗原上的不同的表位。在一些实施方案中，T-细胞接合抗体或其片段接合一个或多个T细胞抑制性受体，而不是一个或多个T细胞活化受体。
在一些实施方案中，本公开内容的多特异性可活化抗体或其片段包括至少(i) T-细胞接合抗体或其片段，其包括结合第一T-细胞接合靶标的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，所述靶标是T细胞上的表面抗原，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接使得MM1的偶联降低AB1结合第一靶标的能力；和(ii) 第二抗体或其片段，其包括结合第二靶标的第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接使得MM2的偶联降低AB2结合第二靶标的能力。在一些实施方案中，第一和第二靶标是相同的抗原。在一些实施方案中，第一和第二靶标是不同的抗原。在一些实施方案中，第一和第二靶标是相同的抗原上的不同的表位。在一些实施方案中，T-细胞接合抗体或其片段与靶标特异性抗体的重链的N-末端连接。在一些实施方案中，T-细胞接合抗体或其片段与靶标特异性抗体的重链的C-末端连接。在一些实施方案中，T-细胞接合抗体或其片段与靶标特异性抗体的轻链的N-末端连接。在一些实施方案中，T-细胞接合抗体或其片段与靶标特异性抗体的轻链的C-末端连接。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体包含与多特异性可活化抗体的一个或多个N-末端和/或一个或多个C-末端的组合连接的T-细胞接合抗体或其片段。本公开内容还包括包含另一免疫效应细胞接合抗体或其片段(例如结合天然杀伤(NK)细胞、单核细胞例如骨髓单核细胞、巨噬细胞和/或其它免疫效应细胞的表面抗原的另一免疫效应细胞接合抗体或其片段)的多特异性可活化抗体。
在一些实施方案中，本公开内容的多特异性可活化抗体或其片段至少包括(i) 接合一个或多个T细胞活化受体的两个T-细胞接合抗体或其抗体片段，例如T-细胞接合scFv片段，包括但不限于OX40/GITR、CD137/ GITR、CD137/OX40、CD27/NKG2D和活化受体的另外组合，其中一个T-细胞接合抗体片段的AB1与掩蔽部分(MM)连接使得MM的偶联降低AB1结合其各自的T-细胞接合靶标的能力，和(ii) 包括结合第二靶标的第二抗体或其抗原结合片段(AB2)的一个靶标结合抗体，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接使得MM2的偶联降低AB2结合第二靶标的能力，其中T-细胞接合scFv片段与靶标结合抗体的两个臂连接。在一些实施方案中，本公开内容的多特异性抗体或其片段包括接合一个或多个T细胞抑制性受体的两个T-细胞接合抗体或其片段，和一个靶标结合抗体，使得T-细胞接合scFv片段与靶标结合抗体的两个臂连接。在一些实施方案中，两个T-细胞接合抗体片段结合相同的T-细胞接合靶标。在一些实施方案中，两个T-细胞接合抗体片段结合不同的T-细胞接合靶标。在一些实施方案中，两个T-细胞接合抗体片段结合相同的T-细胞接合靶标上的不同的表位。在一些实施方案中，T-细胞接合抗体或其片段接合一个或多个T细胞抑制性受体，而不是一个或多个T细胞活化受体。
在一些实施方案中，本公开内容的多特异性可活化抗体或其片段至少包括(i) 接合一个或多个T细胞活化受体的两个T-细胞接合抗体或其抗体片段，例如T-细胞接合scFv片段，包括但不限于OX40/GITR、CD137/ GITR、CD137/OX40、CD27/NKG2D和活化受体的另外组合，其中T-细胞接合抗体片段的每个AB1与其自己的掩蔽部分(MM1)连接，使得每个MM1与其各自的AB1的偶联降低AB1结合其各自的T-细胞接合靶标的能力，和(ii) 包括结合第二靶标的第二抗体或其抗原结合片段(AB2)的一个靶标结合抗体，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接使得MM2的偶联降低AB2结合第二靶标的能力，其中T-细胞接合scFv片段与靶标结合抗体的两个臂连接。在一些实施方案中，本公开内容的多特异性抗体或其片段包括接合一个或多个T细胞抑制性受体的两个T-细胞接合抗体或其片段，和一个靶标结合抗体，使得T-细胞接合scFv片段与靶标结合抗体的两个臂连接。在一些实施方案中，两个T-细胞接合抗体片段结合相同的T-细胞接合靶标。在一些实施方案中，两个T-细胞接合抗体片段结合不同的T-细胞接合靶标。在一些实施方案中，两个T-细胞接合抗体片段结合相同的T-细胞接合靶标上的不同的表位。在一些实施方案中，T-细胞接合抗体或其片段接合一个或多个T细胞抑制性受体，而不是一个或多个T细胞活化受体。
在一些实施方案中，本公开内容的多特异性可活化抗体或其片段至少包括(i) 包含T-细胞接合抗体的抗原结合片段的第一臂，所述抗体包括结合第一T-细胞接合靶标的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接使得MM的偶联降低AB1结合第一靶标的能力；和(ii) 包含靶标结合抗体的抗原结合片段的第二臂，所述抗体包括结合第二靶标的第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接使得MM的偶联降低AB2结合第二靶标的能力。在一些实施方案中，第一和第二靶标是相同的抗原。在一些实施方案中，第一和第二靶标是不同的抗原。在一些实施方案中，第一和第二靶标是相同的抗原上的不同的表位。在一些实施方案中，T-细胞接合抗体或其片段接合一个或多个T细胞抑制性受体，而不是一个或多个T细胞活化受体。
在一些实施方案中，靶标抗原是在正常的健康组织和患病组织两者上均高表达的抗原。在一些实施方案中，靶标抗原是来自表1的抗原，其在正常的健康组织和患病组织两者上均高表达。
在一些实施方案中，靶标抗原是在患病组织上高表达的抗原，但在正常的健康组织上不高表达。在一些实施方案中，靶标抗原是来自表1的抗原，其在患病组织上高表达，但在正常的健康组织上不高表达。靶标抗原可在正常的健康组织上表达，但其在正常的健康组织上不高度过度表达或以其它方式过度表达。
在一些实施方案中，掩蔽部分(MM)与抗体或其抗原结合片段(AB)经由起蛋白酶的底物作用的可裂解部分(CM)偶联。用于本公开内容的多特异性可活化抗体的合适的蛋白酶基于在预期的治疗和/或诊断部位处的蛋白酶表达来确定。在一些实施方案中，蛋白酶是u-型纤溶酶原激活物(uPA，亦称为尿激酶)、legumain和/或基质蛋白酶(亦称为MT-SP1或MTSP1)。在一些实施方案中，蛋白酶是基质金属蛋白酶(MMP)。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体经工程改造以包括与抗体或其抗原结合片段(AB)经由不可裂解接头偶联的掩蔽部分(MM)。例如，在一些实施方案中，多特异性可活化抗体是T-细胞接合多特异性可活化抗体，其包括靶向抗体或其抗原结合片段和T-细胞接合抗体或其抗原结合部分，其中T-细胞接合抗体或其抗原结合片段包括结合第一T-细胞接合靶标的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1经由不可裂解接头与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM的偶联降低AB1结合第一靶标的能力，和靶向抗体或其抗原结合片段未被掩蔽。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体是T-细胞接合多特异性可活化抗体，其包括靶向抗体或其抗原结合片段和T-细胞接合抗体或其抗原结合部分，其中T-细胞接合抗体或其抗原结合片段包括结合第一T-细胞接合靶标的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1经由不可裂解接头与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM的偶联降低AB1结合第一靶标的能力，和靶向抗体或其抗原结合片段包括结合第二靶标的第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其中AB2经由可裂解接头与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM的偶联降低AB2结合第二靶标的能力。
双特异性抗体的一般概念在至少50年前首先提出(Nisonoff, A.和Mandy, W.J.,Nature 194, 355-359 (1962)，如在Chan, A.C.和Carter, P.J., Nature ReviewsImmunol. 10, 301-316 (2010)中所引用)。
已描述了多种双特异性平台(参见例如，图1；Liu, M.A.,等, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 82, 8648-8652 (1985)；Kroesen, B.J.,等 Adv. Drug Delivery Rev. 31,105-129 (1998)的综述；Marvin, J.S.和Zhu, Z., Acta Pharm. Sinica 26, 649-658(2005)；Chan和Carter, Nat. Rev. Immunol. 2010；Fitzgerald和Lugovsky, MAbs. 3(3):299-309 (2011)；Riethmuller, G., Cancer Immunity 12, 12-18 (2012))。双特异性抗体的构建的一般概念是将蛋白结合结构域(通常基于多个免疫球蛋白结构域)连接在一起，以构建能够结合两种或更多种靶标抗原的分子，并显示IgG样生理分布、药代动力学和效应子功能。后者可包括抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、T-细胞募集(BiTEs™) (参见例如，Baeuerle, P.A.和Reinhardt, C., Cancer Res. 69,4941-4944 (2009),和TandAbs™ (参见Cochlovius等, Cancer Res. 60, 4336-4341(2000))和/或递送呈化学缀合部分的形式的细胞毒素有效负载，例如呈抗体-药物缀合物(ADC)的形式的微管抑制剂、DNA烷化剂或其它毒素。许多双特异性抗体形式正在研究，常规的异二聚体IgG和BiTEs™表示最新临床进展，尽管它们亚最佳的生产和药理学性质(参见Chan和Carter, Nat. Rev. Immunol. 2010)。根据具体形式的特异性特征和所选的靶标抗原，双特异性抗体具有许多潜在的用途；不是所有的双特异性形式均适于所有的应用。例如，二合一(Two-in-one) Fab形式(Bostrom, J.,等, Science 323, 1610-1614 (2009))由以二者择一的方式结合抗原A和B的单一结合结构域组成；因此，该类型的双特异性可接合两个拷贝的抗原A、两个拷贝的抗原B或一个拷贝的各抗原。另一方面，DVD形式(Wu, C.,等, Nature Biotechnol. 25, 1290-1297 (2007))提供除了两个拷贝的抗原B之外的两个拷贝的抗原A的接合。对于以使得赋予预期活性的方式接合多个抗原，各结合结构域的间隔和相对取向也可能是重要的—例如交联受体(Jackman, J.,等, J. Biol. Chem. 285,20850-20859 (2010))，其中需要接合一个拷贝的各受体，可能需要与两种不同抗原的每种进行单价相互作用。
机制上不同的领域的双特异性抗体应用包括通过构建接合针对细胞毒性靶向的细胞(例如，肿瘤细胞)的表面抗原和细胞毒性免疫细胞(例如T-细胞)的表面抗原两者的双特异性抗体，募集免疫效应细胞(例如细胞毒性T-淋巴细胞、NK细胞和/或骨髓效应细胞)以攻击肿瘤细胞。Catumaxomab是临床确认的双特异性抗体的实例，其靶向癌细胞上的肿瘤抗原EpCAM和通过结合T-细胞表面上的CD3而募集细胞毒性T-细胞(Linke, R., Klein, A.,和Seimetz, D., mAbs 2, 129-136 (2010))；然而，其用途是有限的且其需要腹膜内给予。BiTE™抗体是以具有不同的药理学性质的不同形式实现T-细胞募集的双特异性抗体(Baeuerle, P.A.和Reinhardt, C., Anti-Cancer Res. 69, 4941-4944 (2009))—具体而言，BiTE抗体包括两个单链可变片段(scFv)和具有非常短的药理学体内半寿期；因此它们需要经由持续输注递送。一个类似的形式，称为TandAb™，是四价的双特异性双抗体构建体，其中两个可变结构域结合靶标抗原和两个可变结构域结合T-细胞表面上的CD3(Cochlovius等, Cancer Res. 60, 4336-4341 (2000))。该形式表明靶标抗原和T-细胞表面抗原的二价接合可用于T-细胞接合和抗原指向的细胞毒性。然而，TandAb形式也具有非常短的体内半寿期。
T-细胞接合双特异性抗体的一般局限性涉及以下事实：T-细胞细胞毒性可能非常有效和可被细胞表面上的相对低水平的靶标抗原活化。因此，在健康组织中甚至不高水平的靶标抗原表达例如EGFR可导致显著的毒性，这限制或阻止临床治疗应用(Lutterbuese,R.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107, 12605-12610 (2010))。因此，对显示改进的安全性例如毒性降低的有效的基于抗体的疗法仍有需要。
本公开内容的多特异性可活化抗体比多特异性(例如，双特异性)抗体更安全，这是因为多特异性可活化抗体活性限制在局部的疾病环境。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体是免疫效应细胞接合多特异性可活化抗体。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体是T-细胞接合多特异性可活化抗体。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体识别两种或更多种靶标。在一些实施方案中，包含IgG-scFv形式的多特异性可活化抗体赋予IgG的长的半寿期性质。在一些实施方案中，这样的多特异性可活化抗体通过使用FcRn结合位点的Fc突变进一步调节(Petkova, S. B.等, Intl. Immunol. 18, 1759-1769 (2006));Deng, R.等, mAbs 4, 101-109 (2012)); Olafson, T Method Mol. Biol. 907, 537-556 (2012))。在一些实施方案中，这样的多特异性可活化抗体包括Fc结构域中的突变，例如N297A突变(Lund, J.等, Mol. Immunol. 29, 53-39 (1992))，其降低IgG效应子功能(ADCC和CDC)以降低脱靶的毒性。
多特异性可活化抗体大大影响作为多种疾病状态的标志而广泛认识的蛋白酶活性的增量调节，以实现这样的疗法的疾病-组织-特异性靶向。可活化抗体基于使用IgG抗体或其片段，例如scFv区、Fab区、单一VH或VL结构域，其经修饰以包括通过可裂解部分(CM)(例如蛋白酶可裂解部分(参见例如，2009年2月26日公开的PCT国际公布号WO 2009/025846；2010年7月15日公开的PCT国际公布号WO 2010/081173))与抗体连接的掩蔽部分(MM)。或者，非抗体蛋白结构域(参见例如，2010年8月26日公开的PCT国际公布号WO 2010/096838；Boersma, Y.L.等, J. Biol. Chem. 286, 41273-41285 (2011))可用于实现一种或多种结合特异性。多特异性抗体如常规的IgG，可用作起点以产生多特异性可活化抗体。这样的多特异性可活化抗体将允许高亲和力靶向被亲本多特异性抗体所识别的所有抗原，但具有被选择性活化的可裂解接头所支配的组织特异性。根据所用的多特异性形式，MM和CM可位于适当的结构域的N-或C-末端。
多特异性可活化抗体包含对第一抗原具有特异性的至少一个IgG-衍生的结构域，其经合成或生物合成与具有结合第二抗原的特异性的另一结构域(其可衍生自IgG或其它蛋白)连接。另外的特异性可通过连接这样的多特异性可活化抗体与赋予对第一抗原、第二抗原或另外的抗原的另外的结合特异性的一个或多个另外的结构域而加入。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体具有一个或多个被合适的掩蔽部分(MM)掩蔽的这些结构域。图1描述的各种多特异性形式可潜在地通过掩蔽一个或多个免疫球蛋白结构域的一个或多个抗原结合部分而转换成多特异性可活化抗体。合适的多特异性可活化抗体形式的实例显示在图3A和5-9中。
赋予对特定抗原的特异性的scFv结构域的使用允许多特异性抗体和多特异性可活化抗体的模块构建。之前描述了使用与IgG重链或轻链的末端融合的scFv结构域以构建双特异性抗体(参见例如，Orcutt, K.D.等, Prot. Eng. Design Select. 23, 221-228(2010)); Dong等, (2011))。该形式(“IgG-scFv”)允许常规IgG转换成双特异性抗体，其中第一特异性在IgG的可变结构域中编码和第二特异性在通过柔性接头区连接的scFv结构域中编码。该形式的变化包括在重链或轻链的N-或C-末端融合scFv结构域；scFv可具有相同或不同的抗原结合特异性(Spangler, J. B.等, J. Mol. Biol. 422, 532-544 (2012))。此外，通过使用重链异二聚体(例如，使用隆突-孔(knob-hole)或类似构建体)，具有不同特异性的scFv可与各重链的N-或C-末端连接。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体的IgG可变结构域被掩蔽。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体的scFv结构域被掩蔽。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体的IgG可变结构域和scFv结构域两者均被掩蔽。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体的一个抗体结构域具有对靶标抗原的特异性和另一抗体结构域具有对T-细胞表面抗原的特异性。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体的一个抗体结构域具有对靶标抗原的特异性和另一抗体结构域具有对另一靶标抗原的特异性。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体的一个抗体结构域具有对靶标抗原表位的特异性和另一抗体结构域具有对靶标抗原的另一表位的特异性。
本公开内容提供多特异性可活化抗体结构的实例，其包括但不限于以下：(VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2; (VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH*-L3-VL*)2;(MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL*-L3-VH*)2; (VL-CL)2:(MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL)2:(MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2: (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*)2: (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2;(VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2;或(VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2，其中：VL和VH表示IgG中包含的具有第一特异性的轻链和重链可变结构域；VL*和VH*表示scFv中包含的具有第二特异性的可变结构域；L1是连接掩蔽部分(MM)和可裂解部分(CM)的接头肽；L2是连接可裂解部分(CM)和抗体的接头肽；L3是连接scFv的可变结构域的接头肽；L4是连接具有第一特异性的抗体和具有第二特异性的抗体的接头肽；CL是轻链恒定结构域；和CH1、CH2、CH3是重链恒定结构域。第一和第二特异性可针对任何抗原或表位。另外的结构包括但不限于以下：(VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL--L4-VL*-L3-VH*)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2;(VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2;或(MM-L1-CM-L2-VL-CL--L4-VL*-L3-VH*)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2。
在一些实施方案中，包含IgG的多特异性可活化抗体的IgG可变结构域被掩蔽。在一些实施方案中，包含scFv的多特异性可活化抗体的scFv结构域被掩蔽。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体具有IgG可变结构域和scFv结构域两者，其中至少一个IgG可变结构域与掩蔽部分偶联。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体具有IgG可变结构域和scFv结构域两者，其中至少一个scFv结构域与掩蔽部分偶联。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体具有IgG可变结构域和scFv结构域两者，其中至少一个IgG可变结构域与掩蔽部分偶联和至少一个scFv结构域与掩蔽部分偶联。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体具有IgG可变结构域和scFv结构域两者，其中各个IgG可变结构域和scFv结构域与其自己的掩蔽部分偶联。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体的一个抗体结构域具有对靶标抗原的特异性和另一抗体结构域具有对T-细胞表面抗原的特异性。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体的一个抗体结构域具有对靶标抗原的特异性和另一抗体结构域具有对另一靶标抗原的特异性。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体的一个抗体结构域具有对靶标抗原表位的特异性和另一抗体结构域具有对靶标抗原的另一表位的特异性。
在免疫效应细胞接合多特异性可活化抗体例如T-细胞接合多特异性可活化抗体的一些实施方案中，一种抗原通常是存在于肿瘤细胞或与疾病相关的其它细胞类型的表面上的抗原，例如但不限于表1中所列的任何靶标，例如但不限于EGFR、erbB2、EpCAM、Jagged、PD-L1、B7H3或CD71 (转铁蛋白受体)，另一种抗原通常是存在于T-细胞、天然杀伤(NK)细胞、骨髓单核细胞、巨噬细胞和/或其它免疫效应细胞的表面上的刺激性或抑制性抗原，例如但不限于B7-H4、BTLA、CD3、CD4、CD8、CD16a、CD25、CD27、CD28、CD32、CD56、CD137、CTLA-4、GITR、HVEM、ICOS、LAG3、NKG2D、OX40、PD-1、TIGIT、TIM3或VISTA。赋予对T-细胞表面抗原的特异性的抗体结构域还可被结合T-细胞受体、NK-细胞受体、巨噬细胞受体和/或其它免疫效应细胞受体的配体或配体结构域置换，所述配体或配体结构域例如但不限于B7-1、B7-2、B7H3、PD-L1、PD-L2或TNFSF9。在多抗原靶向可活化抗体的一些实施方案中，一种抗原选自表1中所列的靶标组，和另一种抗原选自表1中所列的靶标组。
在一些实施方案中，对结合T-细胞表面展示的靶标有特异性的单链可变结构域与结合细胞表面抗原的全人IgG1抗体(靶向抗体)的羧基末端融合。scFv可融合至重链的羧基末端、轻链的羧基末端或两条链(图2)。在一些实施方案中，对结合T-细胞表面展示的靶标有特异性的单链可变结构域与结合细胞表面抗原的全人IgG1抗体(靶向抗体)的氨基末端融合。scFv可融合至重链的氨基末端、轻链的氨基末端或两条链。融合物作为单一遗传构建体来构建和在培养的细胞中表达。靶向抗体可对结合一种或多种肿瘤表面抗原或针对耗尽靶向的任何细胞有特异性。scFv可对相同或不同的抗原有特异性。
在一些实施方案中，靶向抗体是抗-EGFR抗体。在一些实施方案中，靶向抗体是C225v5，其特异性结合EGFR。在一些实施方案中，靶向抗体是C225，其特异性结合EGFR。在一些实施方案中，靶向抗体是C225v4，其特异性结合EGFR。在一些实施方案中，靶向抗体是C225v6，其特异性结合EGFR. 在一些实施方案中，靶向抗体是抗-Jagged抗体。在一些实施方案中，靶向抗体是4D11，其特异性结合人和小鼠Jagged 1和Jagged 2。在一些实施方案中，靶向抗体是4D11v2，其特异性结合人和小鼠Jagged 1和Jagged 2。
在一些实施方案中，靶向抗体可呈可活化抗体的形式。在一些实施方案中，scFv可呈Pro-scFv的形式(参见例如，WO 2009/025846、WO 2010/081173)。
在一些实施方案中，scFv特异性结合CD3ε，例如，OKT3。在一些实施方案中，scFv特异性结合CTLA-4 (在本文中亦称为CTLA和CTLA4)。
在一些实施方案中，scFv特异性结合一种或多种T-细胞、一种或多种NK-细胞和/或一种或多种巨噬细胞。在一些实施方案中，scFv特异性结合选自B7-H4、BTLA、CD3、CD4、CD8、CD16a、CD25、CD27、CD28、CD32、CD56、CD137、CTLA-4、GITR、HVEM、ICOS、LAG3、NKG2D、OX40、PD-1、TIGIT、TIM3或VISTA和其组合的靶标。
定义
除非另外定义，否则与本公开内容结合使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数和复数术语应包括单数。通常，与本文描述的细胞和组织培养、分子生物学和蛋白和寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交结合使用的命名法及其技术是本领域熟知和通常使用的那些。标准技术用于重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养和转化(例如，电穿孔、脂转染)。酶反应和纯化技术按照制造商的说明书或本领域通常实践或本文所述进行。前述技术和程序通常按照本领域熟知的常规方法和如本说明书各处中引用和论述的各种通用和较特定的参考文献中所述进行。参见例如，Sambrook等Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))。与本文描述的分析化学、合成有机化学和医用和药用化学结合使用的命名法及其实验室程序和技术是本领域熟知和通常使用的那些。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送，和治疗患者。
如根据本公开内容所用的，除非另外说明，否则以下术语应理解具有以下含义：
如本文所用的，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即，含有特异性地结合抗原(与其免疫反应)的抗原结合位点的分子。“特异性地结合”或“与…免疫反应”或“免疫特异性地结合”意指抗体与所需抗原的一个或多个抗原决定簇反应和不与其它多肽反应或以低得多的亲和力结合(Kd > 10-6)。抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、全人抗体、结构域抗体、单链、Fab和F(ab')2片段、scFv和Fab表达文库。
基础抗体结构单位已知包含四聚体。各四聚体由两个相同的多肽链对构成，每一对具有一个“轻”链(大约25 kDa)和一个“重”链(大约50-70 kDa)。各链的氨基末端部分包括大约100-110或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。各链的羧基末端部分限定了恒定区，其主要负责效应子功能。通常，获自人的抗体分子涉及类别IgG、IgM、IgA、IgE和IgD中的任一类别，它们彼此不同之处在于分子中存在的重链的性质。某些类别还具有亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等。此外，在人中，轻链可以是κ链或λ链。
如本文所用的术语“单克隆抗体” (mAb)或“单克隆抗体组合物”，是指仅包含一个分子种类的抗体分子的抗体分子群，所述抗体分子由独特的轻链基因产物和独特的重链基因产物组成。具体而言，单克隆抗体的互补决定区(CDR)在所述群的所有分子中相同。MAb包含能够与抗原的特定表位起免疫反应的抗原结合位点，特征在于对抗原有独特的结合亲和力。
术语“抗原结合位点”或“结合部分”是指免疫球蛋白分子的一部分，其参与抗原结合。抗原结合位点由重(“H”)和轻(“L”)链的N端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。在重链和轻链的V区内的三个高度不同的区段，被称为“超变区”，间插在称为“框架区”或“FR”的较保守的侧翼区段之间。因此，术语“FR”是指天然存在于免疫球蛋白的超变区之间并与其邻近的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个超变区和重链的三个超变区在三维空间中彼此相对排列，以形成抗原结合表面。抗原结合表面与结合的抗原的三维表面互补，重链和轻链各自的三个超变区被称为“互补决定区”或“CDR”。指定氨基酸至各结构域按照KabatSequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes ofHealth, Bethesda, Md. (1987和1991))或Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917(1987), Chothia等Nature 342:878-883 (1989)中的定义来进行。
如本文所用的，术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白、scFv或T-细胞受体的任何蛋白决定簇。术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或T-细胞受体的任何蛋白决定簇。表位决定簇通常由分子例如氨基酸或糖侧链的化学活性表面簇组成，和通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，抗体可以针对多肽的N-端或C-端肽产生。当解离常数是≤ 1 µM；例如，在一些实施方案中≤ 100 nM和在一些实施方案中≤ 10 nM时，认为抗体特异性地结合抗原。
如本文所用的，术语“特异性结合”、“免疫结合”和“免疫结合性质”是指在免疫球蛋白分子和免疫球蛋白对其具有特异性的抗原之间形成的类型的非共价相互作用。免疫结合相互作用的强度或亲和力可表示为相互作用的解离常数(Kd)，其中Kd越小表示亲和力越大。选择的多肽的免疫结合性质可使用本领域众所周知的方法定量测定。一个这样的方法要求测定抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中这些速率取决于复合物配偶体的浓度、相互作用的亲和力和在两个方向上同等影响速率的几何参数。因此，“结合速率常数” (Kon)和“解离速率常数” (Koff)可通过计算浓度和缔合和解离的实际速率来测定。(参见Nature 361:186-87 (1993))。Koff /Kon之比使得能够消除与亲和力不相关的所有参数，和等于解离常数Kd。(一般参见Davies等 (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473)。当平衡结合常数(Kd)是≤1 μM，例如在一些实施方案中≤ 100 nM，在一些实施方案中≤10 nM和在一些实施方案中≤ 100 pM至大约1 pM时，认为本公开内容的抗体特异性地结合EGFR，如通过测定法例如放射配体结合测定法或本领域技术人员已知的类似测定法所测量的。
本文使用的术语“分离的多核苷酸”应意指基因组、cDNA或合成来源的多核苷酸，或其一些组合，根据其来源，“分离的多核苷酸” (1)不缔合“分离的多核苷酸”天然存在于其中的多核苷酸的全部或一部分，(2)与天然不与其连接的多核苷酸可操作连接，或(3)不作为较大序列的一部分天然存在。根据本公开内容的多核苷酸包括编码本文所示的重链免疫球蛋白分子的核酸分子，和编码本文所示的轻链免疫球蛋白分子的核酸分子。
本文提及的术语“分离的蛋白”是指cDNA、重组RNA或合成来源的蛋白或其一些组合，根据其来源或衍生源，“分离的蛋白” (1)不缔合天然存在的蛋白，(2)不含相同来源的其它蛋白，例如，不含鼠蛋白，(3)通过不同物种的细胞表达，或(4)不天然存在。
本文作为通称使用的术语“多肽”是指具有多肽序列的天然蛋白、片段或类似物。因此，天然蛋白片段和类似物是多肽上位概念的下位概念。根据本公开内容的多肽包含本文所示的重链免疫球蛋白分子和本文所示的轻链免疫球蛋白分子，以及由包含重链免疫球蛋白分子与轻链免疫球蛋白分子例如κ轻链免疫球蛋白分子的组合(和反之亦然)形成的抗体分子以及其片段和类似物。
本文使用的术语“天然存在的”在应用于物体时是指物体可天然存在的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中的、可自天然来源分离的和未在实验室中经人为有意修饰或以其它方式修饰的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
本文使用的术语“可操作连接”是指所述组分的位置处于允许它们以其预期方式起作用的关系中。与编码序列“可操作连接”的控制序列以使得编码序列的表达在与控制序列相容的条件下实现的方式连接。
本文使用的术语“控制序列”是指实现与它们连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。这样的控制序列的性质取决于宿主生物体而不同，在原核生物中这样的控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列，在真核生物中通常这样的控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”意欲最少包括其存在是表达和加工所必需的所有元件，和还可包括其存在是有利的其它元件，例如前导序列和融合物配偶体序列。本文提及的术语“多核苷酸”意指至少10个碱基长的核苷酸，为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型的核苷酸的修饰形式。该术语包括单链和双链形式的DNA。
本文提及的术语寡核苷酸包括通过天然存在的和非天然存在的寡核苷酸连键连接在一起的天然存在的和修饰的核苷酸。寡核苷酸是通常包含长度200个或更少的碱基的多核苷酸子集。在一些实施方案中，寡核苷酸是10-60个碱基长，例如在一些实施方案中12、13、14、15、16、17、18、19或20-40个碱基长。寡核苷酸通常是单链的，例如对于探针，但寡核苷酸也可以是双链的，例如用于构建基因突变体。本公开内容的寡核苷酸为有义或反义寡核苷酸。
本文提及的术语“天然存在的核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本文提及的术语“修饰的核苷酸”包括具有修饰的或取代的糖基团等的核苷酸。本文提及的术语“寡核苷酸连键”包括寡核苷酸连键，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(phosphoraniladate)、氨基磷酸酯等。参见例如，LaPlanche等Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec等 J.Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984), Stein等Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988), Zon等Anti Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon等Oligonucleotides and Analogues: APractical Approach,第87-108页(F. Eckstein编辑, Oxford University Press,Oxford England (1991)); Stec等美国专利号5,151,510; Uhlmann和Peyman ChemicalReviews 90:543 (1990)。如果需要的话，寡核苷酸可包括用于检测的标记。
如本文所用的，20种常规氨基酸和其缩写按常规使用。参见Immunology - ASynthesis (第2版, E.S. Golub和D.R. Gren编辑, Sinauer Associates, Sunderland7Mass. (1991))。20种常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)、非天然氨基酸例如α-,α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其它非常规氨基酸也可以是本公开内容的多肽的合适的组分。非常规氨基酸的实例包括：4羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸和其它类似的氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟基脯氨酸)。在本文使用的多肽符号中，按照标准用法和惯例，左手方向是氨基末端方向和右手方向是羧基末端方向。
类似地，除非另外说明，否则单链多核苷酸序列的左手末端是5'端，双链多核苷酸序列的左手方向被称为5'方向。新RNA转录物的5'至3'加入方向被称为转录方向，具有与RNA相同的序列和为5'至RNA转录物的5'末端的DNA链上的序列区被称为“上游序列”，具有与RNA相同的序列和为3'至RNA转录物的3'末端的DNA链上的序列区被称为“下游序列”。
应用于多肽时，术语“基本同一性”意指，两个肽序列当例如通过程序GAP或BESTFIT使用默认的空位权重最佳比对时，共有至少80%的序列同一性，例如在一些实施方案中，至少90%的序列同一性，在一些实施方案中至少95%的序列同一性，和在一些实施方案中至少99%的序列同一性。
在一些实施方案中，不相同的残基位置因保守氨基酸置换而不同。
如本文所述，抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列的较少变化预期包括在本公开内容中，前体是氨基酸序列中的所述变化保持至少75%，例如在一些实施方案中至少80%、90%、95%，和在一些实施方案中99%。具体而言，预期保守氨基酸替换。保守替换是在在其侧链上相关的氨基酸家族中发生的那些。遗传编码氨基酸通常分为以下家族：(1)酸性氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性氨基酸是赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸是丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电荷的极性氨基酸是甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。亲水氨基酸包括精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸。疏水氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。氨基酸的其它家族包括(i)丝氨酸和苏氨酸，其为脂肪族羟基家族；(ii)天冬酰胺和谷氨酰胺，其为包含酰胺的家族；(iii)丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，其为脂肪族的家族；和(iv)苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，其为芳香族的家族。例如，可合理预期单独替换亮氨酸为异亮氨酸或缬氨酸、天冬氨酸为谷氨酸、苏氨酸为丝氨酸或类似替换氨基酸为结构相关的氨基酸，不将对得到的分子的结合或性质具有主要影响，尤其是如果所述替换不涉及框架位点内的氨基酸。氨基酸变化是否产生功能肽可通过测定多肽衍生物的特定活性而容易地确定。本文详细描述了测定法。抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物可通过本领域普通技术人员容易地制备。在一些实施方案中，片段或类似物的氨基末端和羧基末端出现在功能结构域的边界附近。结构和功能结构域可通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公开的或专有的序列数据库比较来鉴定。计算机比较方法用于鉴定出现在具有已知结构和/或功能的其它蛋白中的序列基序或预测的蛋白构象结构域。鉴定折叠成已知三维结构的蛋白序列的方法是已知的。Bowie等Science 253:164 (1991)。因此，前述实例证实，本领域技术人员可识别可用于定义按照本公开内容的结构和功能结构域的序列基序和结构构象。
在一些实施方案中，氨基酸置换为以下那些氨基酸置换，其：(1)降低对蛋白水解的易感性，(2)降低对氧化的易感性，(3)改变形成蛋白复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，和(4)赋予或修改这样的类似物的其它物理化学或功能性质。类似物可包括具有并非天然存在的肽序列的序列的各种突变型蛋白。例如，可在天然存在的序列中，例如在形成分子间接触的结构域外的多肽部分中进行单一或多个氨基酸置换(例如保守氨基酸置换)。保守氨基酸置换不应基本上改变母体序列的结构特征(例如，替换氨基酸不应倾向于中断在母体序列中出现的螺旋，或破坏母体序列所特有的其它类型的二级结构)。本领域公认的多肽二级和三级结构的实例描述于Proteins, Structures and Molecular Principles(Creighton编辑, W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction toProtein Structure (C. Branden和J. Tooze编辑, Garland Publishing, New York,N.Y. (1991));和Thornton等Nature 354:105 (1991)。
本文使用的术语“多肽片段”是指具有氨基末端和/或羧基末端缺失和/或一个或多个内部缺失的多肽，但其中剩余的氨基酸序列与从例如全长cDNA序列中推论的天然存在的序列的相应的位置相同。片段通常为至少5、6、8或10个氨基酸长，例如在一些实施方案中至少14个氨基酸长，在一些实施方案中至少20个氨基酸长，通常至少50个氨基酸长，和在一些实施方案中至少70个氨基酸长。本文使用的术语“类似物”是指由至少25个氨基酸的区段构成的多肽，所述区段与推论的氨基酸序列的一部分具有基本同一性和在合适的结合条件下与EGFR特异结合。通常，多肽类似物包含相对于天然存在的序列的保守氨基酸置换(或添加或缺失)。类似物通常为至少20个氨基酸长，例如在一些实施方案中至少50个氨基酸长或更长，和通常可长至全长的天然存在的多肽。
术语“试剂”在本文用于表示化合物、化合物的混合物、生物大分子或自生物材料制备的提取物。
如本文所用的，术语“标记”或“标记的”是指掺入可检测标记物，例如，通过掺入放射性标记的氨基酸或与可通过标记的抗生物素蛋白(例如，包含可通过光学或量热方法检测的荧光标记或酶活性的链霉抗生物素)检测的生物素基部分的多肽连接。在某些情况下，标记或标记物也可以是治疗性的。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域已知的和可被使用。用于多肽的标记的实例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光标记(例如，荧光团、若丹明、镧系元素磷光体)、酶标记(例如，辣根过氧化物酶、p-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光、生物素基团、被第二报告分子识别的预定的多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在一些实施方案中，标记通过各种长度的间隔区臂连接以减少潜在的空间位阻。本文使用的术语“药剂或药物”是指当恰当给予患者时能够产生所需的治疗效果的化合物或组合物。
如本文所用的，“基本上纯的”意指对象种类是存在的主要种类(即，在摩尔基础上它比组合物中的任何其它个别种类更丰富)，基本上纯化的部分是其中对象种类占存在的所有大分子种类的至少大约50% (在摩尔基础上)的组合物。
通常，基本上纯的组合物将包含组合物中存在的超过大约80%的所有大分子种类，例如，在一些实施方案中，超过大约85%、90%、95%和99%。在一些实施方案中，对象种类经纯化至基本均质(通过常规检测方法在组合物中不能检出污染物种类)，其中组合物基本上由单一大分子种类组成。
术语患者包括人和兽医受试者。
本文的其它化学术语按照本领域的常规用法使用，如由The McGraw-HillDictionary of Chemical Terms (Parker, S.编辑, McGraw-Hill, San Francisco(1985))所举例的。
多特异性抗体和多特异性可活化抗体
本公开内容的示例性的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体包括例如本文提供的实施例中显示的那些和其变体。
在一些非限制性的实施方案中，多特异性抗体中的至少一个AB是表1中所列的任一靶标的结合配偶体。
表1：示例性的靶标
Figure 18638DEST_PATH_IMAGE003
Figure 798375DEST_PATH_IMAGE004
在一些非限制性的实施方案中，多特异性抗体的至少一个AB是或源自于本文提供的实施例的表7中所列的序列。
在一些非限制性的实施方案中，多特异性抗体的至少一个AB是或源自于表2中所列的抗体。
表2：示例性的AB来源
抗体商品名(抗体名) 靶标
Avastin™ (贝伐单抗) VEGF
Lucentis™ (雷珠单抗) VEGF
Erbitux™ (西妥昔单抗) EGFR
Vectibix™ (帕尼单抗) EGFR
Remicade™ (英夫利昔单抗) TNFα
Humira™ (阿达木单抗) TNFα
Tysabri™ (那他珠单抗) 整联蛋白α4
Simulect™ (巴利昔单抗) IL2R
Soliris™ (艾库组单抗) 补体C5
Raptiva™ (伊伐珠单抗) CD11a
Bexxar™ (托西莫单抗) CD20
Zevalin™ (替伊莫单抗) CD20
Rituxan™ (利妥昔单抗) CD20
奥瑞珠单抗(Ocrelizumab) CD20
Arzerra™ (奥法木单抗) CD20
Obinutuzumab CD20
Zenapax™ (达珠单抗) CD25
Adcetris™ (brentuximab vedotin) CD30
Myelotarg™ (吉姆单抗) CD33
Mylotarg™ (吉姆单抗奥佐米星) CD33
Campath™ (阿仑单抗) CD52
ReoPro™ (阿昔单抗) 糖蛋白受体IIb/IIIa
Xolair™ (奥马珠单抗) IgE
Herceptin™ (曲妥单抗) Her2
Kadcyla™ (曲妥单抗 emtansine) Her2
Synagis™ (帕利珠单抗) RSV的F蛋白
(易普利姆玛) CTLA-4
(替西木单抗(tremelimumab)) CTLA-4
Hu5c8 CD40L
(帕妥珠单抗) Her2-neu
(ertumaxomab) CD3/Her2-neu
Orencia™ (阿巴西普) CTLA-4
(他尼珠单抗(tanezumab)) NGF
(巴维昔单抗) 磷脂酰丝氨酸
(zalutumumab) EGFR
(mapatumumab) EGFR
(matuzumab) EGFR
(尼妥珠单抗) EGFR
ICR62 EGFR
mAb 528 EGFR
CH806 EGFR
MDX-447 EGFR/CD64
(依决洛单抗) EpCAM
RAV12 RAAG12
huJ591 PSMA
Enbrel™ (依那西普) TNF-R
Amevive™ (alefacept) 1-92-LFA-3
Antril™, Kineret™ (阿那白滞素) IL-1Ra
GC1008 TGFβ
Notch, 例如, Notch 1
Jagged 1或Jagged 2
(阿德木单抗) EpCAM
(figitumumab) IGF1R
(tocilizumab) IL-6受体
Stelara™ (ustekinumab) IL-12/IL-23
Prolia™ (地舒单抗) RANKL
本公开内容还包括与本文所述的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体结合相同的表位的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体。
本领域技术人员将认识到，有可能通过确定前者是否阻止后者结合靶标而在无需过度实验的情况下确定多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体是否具有与本公开内容的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体相同或类似的特异性。如果所测试的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体与本公开内容的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体竞争，如通过本公开内容的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的结合降低所示，则这两种多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体结合相同的或紧密相关的表位。
用于确定多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体是否具有与本公开内容的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体相同或类似的特异性的一个实施方案是用可溶性靶标预孵育本公开内容的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体(所述抗体与所述靶标正常反应)，然后加入所测试的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体以确定所测试的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体在其结合靶标的能力上是否受到抑制。如果所测试的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体受到抑制，则很可能其具有与本公开内容的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体相同或功能上等同的表位特异性。
使用例如下文提供的实施例中描述的程序，产生多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体。多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体也可使用多种本领域公认的用于抗体生产和/或纯化的技术中的任一种产生。
用于多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的抗体片段，例如Fv、F(ab’)2和Fab，可通过裂解完整蛋白，例如，通过蛋白酶或化学裂解来制备。或者，设计截短的基因。例如，编码F(ab’)2片段的一部分的嵌合基因将包括编码H链的CH1结构域和铰链区的DNA序列，之后是转录终止密码子，以得到截短的分子。
表达载体包括质粒、逆转录病毒、YAC、EBV来源的附加体等。适宜的载体是编码功能上完整的人CH或CL免疫球蛋白序列的载体，其具有工程改造的合适的限制位点以使任何VH或VL序列可容易地插入和表达。在这样的载体中，剪接通常发生在插入的J区的剪接供体位点和人C区之前的剪接受体位点之间，也发生在人CH外显子内存在的剪接区。多腺苷酸化和转录终止发生在编码区下游的天然染色体位点。得到的抗体可以与任何强启动子连接，所强启动子述包括逆转录病毒LTR，例如，SV-40早期启动子(Okayama等Mol. Cell. Bio.3:280 (1983))、劳斯肉瘤病毒LTR (Gorman等P.N.A.S. 79:6777 (1982))和莫洛尼鼠白血病病毒LTR (Grosschedl等Cell 41:885 (1985))。如将意识到的是，也可使用天然Ig启动子等。
此外，多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体可使用本领域众所周知的技术通过展示类型技术(包括但不限于噬菌体展示、逆转录病毒展示、核糖展示和其它技术)产生，得到的分子可进行另外的成熟，例如亲和力成熟，因为这样的技术是本领域众所周知的。Wright等Crit, Reviews in Immunol. 12125-168 (1992), Hanes和Plückthun PNAS USA94:4937-4942 (1997) (核糖体展示), Parmley和Smith Gene 73:305-318 (1988) (噬菌体展示), Scott, TIBS, 第17卷:241-245 (1992), Cwirla等PNAS USA 87:6378-6382(1990), Russel等Nucl. Acids Research 21:1081-1085 (1993), Hoganboom等Immunol.Reviews 130:43-68 (1992), Chiswell和McCafferty TIBTECH; 10:80-8A (1992)和美国专利号5,733,743。
针对效应子功能修饰本公开内容的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体以增强或降低这样的功能来改进抗体在治疗疾病和病症中的功效可能是需要的。例如，可将半胱氨酸残基引入至Fc区，从而允许链间二硫键在该区中形成。由此产生的同型二聚体抗体可具有改进的内在化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。(参见Caron等, J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992)和Shopes, J. Immunol.,148: 2918-2922 (1992))。或者，抗体可经工程改造以具有双Fc区，从而可具有增强的补体溶解和ADCC能力。(参见Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989))。在一些实施方案中，进行Fc突变以除去糖基化位点，从而降低Fc功能。
多特异性可活化抗体
本文提供的多特异性可活化抗体和多特异性可活化抗体组合物至少包含特异性地结合第一靶标和/或第一表位的第一抗体或其抗体片段(在本公开内容全文中统称为AB1)和特异性地结合第二靶标和/或第二表位的第二抗体或其抗体片段(在本公开内容全文中统称为AB2)，其中至少一个AB被掩蔽部分(MM)修饰。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体的各AB被其自己的掩蔽部分修饰。
当多特异性可活化抗体中的至少一个AB被MM修饰和处于其靶标存在的情况下时，与未经MM修饰的AB的特异性结合或母体AB与靶标的特异性结合相比，AB与其靶标的特异性结合被降低或抑制。
用MM修饰的AB对靶标的Kd是未经MM修饰的AB或母体AB对靶标的Kd的至少5、10、20、25、40、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000倍或更大，或5-10、10-100、10-1,000、10-10,000、10-100,000、10-1,000,000、10-10,000,000、100-1,000、100-10,000、100-100,000、100-1,000,000、100-10,000,000、1,000-10,000、1,000-100,000、1,000-1,000,000、1000-10,000,000、10,000-100,000、10,000-1,000,000、10,000-10,000,000、100,000-1,000,000或100,000-10,000,000倍。相反地，用MM修饰的AB对靶标的结合亲和力是未经MM修饰的AB或母体AB对靶标的结合亲和力的至多1/5、1/10、1/20、1/25、1/40、1/50、1/100、1/250、1/500、1/1,000、1/2,500、1/5,000、1/10,000、1/50,000、1/100,000、1/500,000、1/1,000,000、1/5,000,000、1/10,000,000、1/50,000,000或更低，或1/5-10、1/10-100、1/10-1,000、1/10-10,000、1/10-100,000、1/10-1,000,000、1/10-10,000,000、1/100-1,000、1/100-10,000、1/100-100,000、1/100-1,000,000、1/100-10,000,000、1/1,000-10,000、1/1,000-100,000、1/1,000-1,000,000、1/1000-10,000,000、1/10,000-100,000、1/10,000-1,000,000、1/10,000-10,000,000、1/100,000-1,000,000或1/100,000-10,000,000。
MM对多特异性可活化抗体中的至少一个AB的解离常数(Kd)通常大于AB对靶标的Kd。MM对AB的Kd可以是AB对靶标的Kd的至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、100,000、1,000,000或甚至10,000,000倍。相反地，MM对AB的结合亲和力通常低于AB对靶标的结合亲和力。MM对AB的结合亲和力可以是AB对靶标的结合亲和力的至多1/5、1/10、1/25、1/50、1/100、1/250、1/500、1/1,000、1/2,500、1/5,000、1/10,000、1/100,000、1/1,000,000或甚至1/10,000,000。
当多特异性可活化抗体中的至少一个AB被MM修饰和处于靶标存在的情况下时，与未经MM修饰的AB与靶标的特异性结合或母体AB与靶标的特异性结合相比，AB与其靶标的特异性结合被降低或抑制。与未经MM修饰的AB与靶标的结合或母体AB与靶标的结合相比，当在体内或在体外测定法中测量时，用MM修饰时的AB结合靶标的能力可降低至少50%、60%、70%、80%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%和甚至100%达至少2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84或96小时，或5、10、15、30、45、60、90、120、150或180天，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或更长。
MM抑制多特异性可活化抗体中的至少一个AB与其靶标的结合。MM结合AB的抗原结合结构域和抑制AB与其靶标的结合。MM可在空间上抑制AB与靶标的结合。MM可在变构上抑制AB与其靶标的结合。在这些实施方案中，与未经MM修饰的AB、母体AB或未与MM偶联的AB与靶标的结合相比，当AB经MM修饰或与MM偶联和在靶标存在的情况下时，当在体内或在体外测定法中测量时，不存在AB与靶标的结合或基本上无AB与靶标的结合，或不超过0.001%、0.01%、0.1%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%或50%的AB与靶标的结合，达至少2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84或96小时，或5、10、15、30、45、60、90、120、150或180天，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或更长。
当多特异性可活化抗体中的至少一个AB与MM偶联或经MM修饰时，MM“掩蔽”或降低或以其它方式抑制AB与其靶标的特异性结合。当多特异性可活化抗体中的至少一个AB与MM偶联或经MM修饰时，这样的偶联或修饰可实现降低或抑制AB特异性地结合其靶标的能力的结构改变。
在多特异性可活化抗体中，当至少一个AB与MM偶联或经MM修饰时，多特异性可活化抗体的至少一部分可由下式表示(以从氨基(N)末端区至羧基(C)末端区的顺序)：
(MM)-(AB)
(AB)-(MM)
(MM)-L-(AB)
(AB)-L-(MM)
当MM是掩蔽部分时，AB是抗体或抗体其片段，和L是接头。在许多实施方案中，插入一个或多个接头，例如，柔性接头至组合物中以提供柔性可能是需要的。
在某些实施方案中，MM不是AB的天然结合配偶体。在一些实施方案中，MM不包含或基本上不包含与AB的任何天然结合配偶体的同源性。在其它实施方案中，MM与AB的任何天然结合配偶体具有不超过5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或80%的相似性。在一些实施方案中，MM与AB的任何天然结合配偶体具有不超过5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或80%的同一性。在一些实施方案中，MM与AB的任何天然结合配偶体具有不超过25%的同一性。在一些实施方案中，MM与AB的任何天然结合配偶体具有不超过50%的同一性。在一些实施方案中，MM与AB的任何天然结合配偶体具有不超过20%的同一性。在一些实施方案中，MM与AB的任何天然结合配偶体具有不超过10%的同一性。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体包括经MM修饰的AB和还包括一个或多个可裂解部分(CM)。这样的多特异性可活化抗体显示与AB的靶标的可活化/可变换结合。多特异性可活化抗体通常包括被掩蔽部分(MM)和可修饰或可裂解部分(CM)修饰或与MM和CM偶联的至少一个抗体或抗体片段(AB)。在一些实施方案中，CM包含起目的蛋白酶的底物作用的氨基酸序列。
多特异性可活化抗体的元件经排列，使得各MM和CM经安置以致在裂解(或者相对活性)状态下和在靶标存在的情况下，相应的AB结合靶标，而在未裂解(或者相对无活性)状态下在靶标存在的情况下，AB与其靶标的特异性结合被降低或抑制。AB与其靶标的特异性结合可因AB特异性地结合其靶标的能力被MM抑制或掩蔽而降低。
经MM和CM修饰的各AB对靶标的Kd为未经MM和CM修饰的AB或母体AB对靶标的Kd的至少5、10、20、25、40、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000倍或更大，或5-10、10-100、10-1,000、10-10,000、10-100,000、10-1,000,000、10-10,000,000、100-1,000、100-10,000、100-100,000、100-1,000,000、100-10,000,000、1,000-10,000、1,000-100,000、1,000-1,000,000、1000-10,000,000、10,000-100,000、10,000-1,000,000、10,000-10,000,000、100,000-1,000,000或100,000-10,000,000倍。相反地，经MM和CM修饰的各AB对靶标的结合亲和力为未经MM和CM修饰的AB对靶标或母体AB对靶标的结合亲和力的至多1/5、1/10、1/20、1/25、1/40、1/50、1/100、1/250、1/500、1/1,000、1/2,500、1/5,000、1/10,000、1/50,000、1/100,000、1/500,000、1/1,000,000、1/5,000,000、1/10,000,000、1/50,000,000或更低，或1/5-10、1/10-100、1/10-1,000、1/10-10,000、1/10-100,000、1/10-1,000,000、1/10-10,000,000、1/100-1,000、1/100-10,000、1/100-100,000、1/100-1,000,000、1/100-10,000,000、1/1,000-10,000、1/1,000-100,000、1/1,000-1,000,000、1/1000-10,000,000、1/10,000-100,000、1/10,000-1,000,000、1/10,000-10,000,000、1/100,000-1,000,000或1/100,000-10,000,000。
当至少一个AB被MM和CM修饰和在靶标存在的情况下但不在修饰试剂(例如蛋白酶)存在的情况下时，与未经MM和CM修饰的AB或母体AB与靶标的特异性结合相比，AB与其靶标的特异性结合被降低或抑制。当与母体AB与其靶标的结合或未经MM和CM修饰的AB与其靶标的结合相比，当在体内或在体外测定法中测量时，经MM和CM修饰时的AB结合靶标的能力可降低至少50%、60%、70%、80%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%和甚至100%达至少2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84或96小时或5、10、15、30、45、60、90、120、150或180天或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或更长。
如本文所用的，术语裂解状态是指在CM被蛋白酶修饰后多特异性可活化抗体的状况。如本文所用的，术语未裂解状态是指在不存在CM被蛋白酶裂解的情况下多特异性可活化抗体的状况。如上所述，术语“多特异性可活化抗体”在本文用于指呈其未裂解(天然)状态以及呈其裂解状态的多特异性可活化抗体。对普通技术人员显而易见的是，在一些实施方案中，由于CM被蛋白酶裂解导致至少MM的释放所致，裂解的多特异性可活化抗体可缺少MM (例如，其中MM未与多特异性可活化抗体通过共价键(例如，在半胱氨酸残基之间的二硫键)连接)。
可活化或可变换的意指多特异性可活化抗体当在抑制、掩蔽或未裂解状态下(即，第一构象)时显示与靶标的第一结合水平，和在未抑制、未掩蔽和/或裂解状态下(即，第二构象)时显示与靶标的第二结合水平，其中第二靶标结合水平大于第一结合水平。通常，靶标对多特异性可活化抗体的相应AB的接近在存在能够裂解CM的裂解剂的情况下比在缺少这样的裂解剂的情况下大。因此，当多特异性可活化抗体在未裂解状态下时，至少一个AB受到抑制免于靶标结合和可受到掩蔽免于靶标结合(即，第一构象使得AB不能结合靶标)，和在裂解状态下，对靶标结合，AB不受抑制或未被掩蔽。
多特异性可活化抗体的CM和AB经选择以使第一AB表示第一靶标和/或表位的结合部分，和CM表示在受试者的治疗部位或诊断部位处与靶标共定位的蛋白酶的底物。本文公开的多特异性可活化抗体特别用于其中例如能够裂解CM的位点的蛋白酶以比非治疗部位的组织(例如健康组织)相对更高的水平存在于治疗部位或诊断部位的包含靶标的组织中的情况。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体提供降低的毒性和/或不良副作用，如果AB未经掩蔽或以其它方式受到抑制免于结合其靶标，则所述毒性和/或作用可以其它方式由在非治疗部位处第一AB的结合产生。
通常，多特异性可活化抗体可通过选择目的第一AB和构建可活化抗体的剩余部分使得当构象上受到限制时，MM提供AB的掩蔽或AB与其靶标的结合降低，来设计。可考虑结构设计标准以提供该功能特征。
提供对在抑制构象对比非抑制构象中的靶标结合显示所需动态范围的可变换表型的多特异性可活化抗体。动态范围通常是指以下比率：(a)在第一组条件下参数的最大检测水平与(b)在第二组条件下该参数的最小检测值的比率。例如在多特异性可活化抗体的背景下，动态范围是指以下比率：(a)在存在能够裂解可活化抗体的CM的蛋白酶的情况下与多特异性可活化抗体结合的靶标蛋白的最大检测水平与(b)在缺少蛋白酶的情况下与多特异性可活化抗体结合的靶标蛋白的最小检测水平的比率。多特异性可活化抗体的动态范围可计算为多特异性可活化抗体裂解剂(例如，酶)处理的平衡解离常数与可活化抗体裂解剂处理的平衡解离常数的比率。多特异性可活化抗体的动态范围越大，可活化抗体的可变换表型越好。具有相对更高的动态范围值(例如，大于1)的可活化抗体显示更加合乎需要的变换表型，使得在存在能够裂解可活化抗体的CM的裂解剂(例如，酶)的情况下比在缺少裂解剂的情况下，可活化抗体的靶标蛋白结合以更大的程度发生(例如主要发生)。
多特异性可活化抗体可以各种结构构型提供。多特异性可活化抗体的至少一部分的示例性的结构式在下文提供。特别预期，第一AB、相应的MM和CM的N-至C-末端的顺序可在可活化抗体内反转。还特别预期，CM和MM的氨基酸序列可重叠，例如，使得CM包含在MM内。
例如，多特异性可活化抗体的至少一部分可由下式表示(按从氨基(N)末端区至羧基(C)末端区的顺序)：
(MM)-(CM)-(AB)
(AB)-(CM)-(MM)
其中MM是掩蔽部分，CM是可裂解部分，和AB是第一抗体或其片段。应注意，尽管MM和CM在上式中表示为不同的组分，但在本文公开的所有的示例性实施方案(包括结构式)中预期MM和CM的氨基酸序列可重叠，例如，使得CM完全或部分地包含在MM内。此外，上式提供另外的氨基酸序列，其可位于可活化抗体元件的N-末端或C-末端。
在某些实施方案中，MM不是AB的天然结合配偶体。在一些实施方案中，MM不包含或基本上不包含与AB的任何天然结合配偶体的同源性。在其它实施方案，MM与AB的任何天然结合配偶体具有不超过5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或80%的相似性。在一些实施方案中，MM与AB的任何天然结合配偶体具有不超过5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或80%的同一性。在一些实施方案中，MM与AB的任何天然结合配偶体具有不超过50%的同一性。在一些实施方案中，MM与AB的任何天然结合配偶体具有不超过25%的同一性。在一些实施方案中，MM与AB的任何天然结合配偶体具有不超过20%的同一性。在一些实施方案中，MM与AB的任何天然结合配偶体具有不超过10%的同一性。
在许多实施方案中，插入一个或多个接头例如柔性接头至多特异性可活化抗体构建体中以在MM-CM接点、CM-AB接点或两者的一个或多个处提供柔性可能是合乎需要的。例如，AB、MM和/或CM可不包含足够数量的残基(例如，Gly、Ser、Asp、Asn，尤其是Gly和Ser，特别是Gly)以提供需要的柔性。因此，这样的多特异性可活化抗体构建体的可变换表型可获益于为提供柔性接头而引入一个或多个氨基酸。此外，如下文所述，在作为构象上受限的构建体提供多特异性可活化抗体的情况下，可可操作性插入柔性接头，以促进形成和维持未裂解的多特异性可活化抗体的环状结构。
例如，在某些实施方案中，多特异性可活化抗体包含下式之一(其中下式表示以N-至C-末端方向或C-至N-末端方向的氨基酸序列)：
(MM)-L1-(CM)-(AB)
(MM)-(CM)-L2-(AB)
(MM)-L1-(CM)-L2-(AB)
其中MM、CM和AB如上文所定义；其中L1和L2各自独立地和任选地存在或缺失，是相同或不同的柔性接头，其包括至少1个柔性氨基酸(例如，Gly)。此外，上式提供另外的氨基酸序列，其可位于多特异性可活化抗体元件的N-末端或C-末端。实例包括但不限于靶向部分(例如，靶标组织中存在的细胞受体的配体)和血清半寿期延长部分(例如，结合血清蛋白例如免疫球蛋白(例如，IgG)或血清白蛋白(例如，人血清白蛋白(HAS)的多肽)。
在一些非限制性的实施方案中，多特异性可活化抗体中的至少一个AB是表1中所列的任一靶标的结合配偶体。
在一些非限制性的实施方案中，多特异性可活化抗体的至少一个AB包含、是或源自于本文提供的实施例的表7中所列的序列。
在一些非限制性的实施方案中，多特异性可活化抗体中的至少一个AB包含、是或源自于本文提供的实施例的实施例5中所列的序列。在一些非限制性的实施方案中，多特异性可活化抗体中的至少一个AB包含、是或源自于本文提供的实施例的表11中所列的序列。
在一些非限制性的实施方案中，多特异性可活化抗体中的至少一个AB是或源自于表2中所列的抗体。
在一些实施方案中，掩蔽部分经选择用于与特异性抗体或抗体片段一起使用。例如，与结合EGFR的抗体一起使用的合适的掩蔽部分包括包含序列CISPRG (SEQ ID NO: 75)的MM。作为非限制性实例，MM可包括序列例如CISPRGC (SEQ ID NO: 339)；CISPRGCG (SEQID NO: 76)；CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 77)；CISPRGCPDGPYVM (SEQ ID NO: 78)；CISPRGCEPGTYVPT (SEQ ID NO: 79)和CISPRGCPGQIWHPP (SEQ ID NO: 80)。其它合适的掩蔽部分包括PCT公布号WO 2010/081173中公开的任何EGFR-特异性的掩蔽物，例如作为非限制性实例，GSHCLIPINMGAPSC (SEQ ID NO: 81)；CISPRGCGGSSASQSGQGSHCLIPINMGAPSC(SEQ ID NO: 82)；CNHHYFYTCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 83)；ADHVFWGSYGCISPRGCPG (SEQID NO: 84)；CHHVYWGHCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 85)；CPHFTTTSCGCISPRGCPG (SEQ IDNO: 86)；CNHHYHYYCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 87)；CPHVSFGSCGCISPRGCPG (SEQ ID NO:88)；CPYYTLSYCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 89)；CNHVYFGTCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 90)；CNHFTLTTCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 91)；CHHFTLTTCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 92)；YNPCATPMCCISPRGCPG (SEQ ID NO: 93)；CNHHYFYTCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 94)；CNHHYHYYCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 95)；CNHVYFGTCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 96)；CHHVYWGHCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 97)；CPHFTTTSCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 98)；CNHFTLTTCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 99)；CHHFTLTTCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 100)；CPYYTLSYCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 101)；CPHVSFGSCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 102)；ADHVFWGSYGCISPRGCG (SEQ ID NO: 103)；YNPCATPMCCISPRGCG (SEQ ID NO: 104)；CHHVYWGHCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 105)；C(N/P)H(H/V/F)(Y/T)(F/W/T/L)(Y/G/T/S)(T/S/Y/H)CGCISPRGCG (SEQ ID NO: 106)；CISPRGCGQPIPSVK (SEQ ID NO: 107)；CISPRGCTQPYHVSR (SEQ ID NO: 108)；和/或CISPRGCNAVSGLGS (SEQ ID NO: 109)。
作为非限制性实例，与结合Jagged靶标例如Jagged 1和/或Jagged 2的抗体一起使用的合适的掩蔽部分包括包含以下序列的掩蔽部分：例如QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQG (SEQID NO: 338)；QGQSGQGQQQWCNIWINGGDCRGWNG (SEQ ID NO: 110)；PWCMQRQDFLRCPQP (SEQID NO: 111)；QLGLPAYMCTFECLR (SEQ ID NO: 112)；CNLWVSGGDCGGLQG (SEQ ID NO:113)；SCSLWTSGSCLPHSP (SEQ ID NO: 114)；YCLQLPHYMQAMCGR (SEQ ID NO: 115)；CFLYSCTDVSYWNNT (SEQ ID NO: 116)；PWCMQRQDYLRCPQP (SEQ ID NO: 117)；CNLWISGGDCRGLAG (SEQ ID NO: 118)；CNLWVSGGDCRGVQG (SEQ ID NO: 119)；CNLWVSGGDCRGLRG (SEQ ID NO: 120)；CNLWISGGDCRGLPG (SEQ ID NO: 121)；CNLWVSGGDCRDAPW (SEQ ID NO: 122)；CNLWVSGGDCRDLLG (SEQ ID NO: 123)；CNLWVSGGDCRGLQG (SEQ ID NO: 124)；CNLWLHGGDCRGWQG (SEQ ID NO: 125)；CNIWLVGGDCRGWQG (SEQ ID NO: 126)；CTTWFCGGDCGVMRG (SEQ ID NO: 127)；CNIWGPSVDCGALLG (SEQ ID NO: 128)；CNIWVNGGDCRSFEG (SEQ ID NO: 129)；YCLNLPRYMQDMCWA (SEQ ID NO: 130)；YCLALPHYMQADCAR (SEQ ID NO: 131)；CFLYSCGDVSYWGSA (SEQ ID NO: 132)；CYLYSCTDSAFWNNR (SEQ ID NO: 133)；CYLYSCNDVSYWSNT (SEQ ID NO: 134)；CFLYSCTDVSYW (SEQ ID NO: 135)；CFLYSCTDVAYWNSA (SEQ ID NO: 136)；CFLYSCTDVSYWGDT (SEQ ID NO: 137)；CFLYSCTDVSYWGNS (SEQ ID NO: 138)；CFLYSCTDVAYWNNT (SEQ ID NO: 139)；CFLYSCGDVSYWGNPGLS (SEQ ID NO: 140)；CFLYSCTDVAYWSGL (SEQ ID NO: 141)；CYLYSCTDGSYWNST (SEQ ID NO: 142)；CFLYSCSDVSYWGNI (SEQ ID NO: 143)；CFLYSCTDVAYW (SEQ ID NO: 144)；CFLYSCTDVSYWGST (SEQ ID NO: 145)；CFLYSCTDVAYWGDT (SEQ ID NO: 146)；GCNIWLNGGDCRGWVDPLQG (SEQ ID NO: 147)；GCNIWLVGGDCRGWIGDTNG (SEQ ID NO: 148)；GCNIWLVGGDCRGWIEDSNG (SEQ ID NO: 149)；GCNIWANGGDCRGWIDNIDG (SEQ ID NO: 150)；GCNIWLVGGDCRGWLGEAVG (SEQ ID NO: 151)；GCNIWLVGGDCRGWLEEAVG (SEQ ID NO: 152)；GGPALCNIWLNGGDCRGWSG (SEQ ID NO: 153)；GAPVFCNIWLNGGDCRGWMG (SEQ ID NO: 154)；GQQQWCNIWINGGDCRGWNG (SEQ ID NO: 155)；GKSEFCNIWLNGGDCRGWIG (SEQ ID NO: 156)；GTPGGCNIWANGGDCRGWEG (SEQ ID NO: 157)；GASQYCNLWINGGDCRGWRG (SEQ ID NO: 158)；GCNIWLVGGDCRPWVEGG (SEQ ID NO: 159)；GCNIWAVGGDCRPFVDGG (SEQ ID NO: 160)；GCNIWLNGGDCRAWVDTG (SEQ ID NO: 161)；GCNIWIVGGDCRPFINDG (SEQ ID NO: 162)；GCNIWLNGGDCRPVVFGG (SEQ ID NO: 163)；GCNIWLSGGDCRMFMNEG (SEQ ID NO: 164)；GCNIWVNGGDCRSFVYSG (SEQ ID NO: 165)；GCNIWLNGGDCRGWEASG (SEQ ID NO: 166)；GCNIWAHGGDCRGFIEPG (SEQ ID NO: 167)；GCNIWLNGGDCRTFVASG (SEQ ID NO: 168)；GCNIWAHGGDCRGFIEPG (SEQ ID NO: 169)；GFLENCNIWLNGGDCRTG (SEQ ID NO: 170)；GIYENCNIWLNGGDCRMG (SEQ ID NO: 171)；和/或GIPDNCNIWINGGDCRYG (SEQ ID NO: 172)。
作为非限制性实例，与结合白介素6靶标例如白介素6受体(IL-6R)的抗体一起使用的合适的掩蔽部分包括包含以下序列的掩蔽部分：例如QGQSGQYGSCSWNYVHIFMDC (SEQID NO: 174)；QGQSGQGDFDIPFPAHWVPIT (SEQ ID NO: 175)；QGQSGQMGVPAGCVWNYAHIFMDC(SEQ ID NO: 176)；YRSCNWNYVSIFLDC (SEQ ID NO: 177)；PGAFDIPFPAHWVPNT (SEQ IDNO: 178)；ESSCVWNYVHIYMDC (SEQ ID NO: 179)；YPGCKWNYDRIFLDC (SEQ ID NO: 180)；YRTCSWNYVGIFLDC (SEQ ID NO: 181)；YGSCSWNYVHIFMDC (SEQ ID NO: 182)；YGSCSWNYVHIFLDC (SEQ ID NO: 183)；YGSCNWNYVHIFLDC (SEQ ID NO: 184)；YTSCNWNYVHIFMDC (SEQ ID NO: 185)；YPGCKWNYDRIFLDC (SEQ ID NO: 186)；WRSCNWNYAHIFLDC (SEQ ID NO: 187)；WSNCHWNYVHIFLDC (SEQ ID NO: 188)；DRSCTWNYVRISYDC (SEQ ID NO: 189)；SGSCKWDYVHIFLDC (SEQ ID NO: 190)；SRSCIWNYAHIHLDC (SEQ ID NO: 191)；SMSCYWQYERIFLDC (SEQ ID NO: 192)；YRSCNWNYVSIFLDC (SEQ ID NO: 193)；YGSCSWNYVHIFMDC (SEQ ID NO: 194)；SGSCKWDYVHIFLDC (SEQ ID NO: 195)；YKSCHWDYVHIFLDC (SEQ ID NO: 196)；YGSCTWNYVHIFMEC (SEQ ID NO: 197)；FSSCNWNYVHIFLDC (SEQ ID NO: 198)；WRSCNWNYAHIFLDC (SEQ ID NO: 199)；YGSCQWNYVHIFLDC (SEQ ID NO: 200)；YRSCNWNYVHIFLDC (SEQ ID NO: 201)；NMSCHWDYVHIFLDC (SEQ ID NO: 202)；FGPCTWNYARISWDC (SEQ ID NO: 203)；XXsCXWXYvhIfXdC (SEQ ID NO: 204)；MGVPAGCVWNYAHIFMDC (SEQ ID NO: 205)；RDTGGQCRWDYVHIFMDC (SEQ ID NO: 206)；AGVPAGCTWNYVHIFMEC (SEQ ID NO: 207)；VGVPNGCVWNYAHIFMEC (SEQ ID NO: 208)；DGGPAGCSWNYVHIFMEC (SEQ ID NO: 209)；AVGPAGCWWNYVHIFMEC (SEQ ID NO: 210)；CTWNYVHIFMDCGEGEGP (SEQ ID NO: 211)；GGVPEGCTWNYAHIFMEC (SEQ ID NO: 212)；AEVPAGCWWNYVHIFMEC (SEQ ID NO: 213)；AGVPAGCTWNYVHIFMEC (SEQ ID NO: 214)；SGASGGCKWNYVHIFMDC (SEQ ID NO: 215)；MGVPAGCVWNYAHIFMDC (SEQ ID NO: 216)；TPGCRWNYVHIFMECEAL (SEQ ID NO: 217)；VGVPNGCVWNYAHIFMEC (SEQ ID NO: 218)；PGAFDIPFPAHWVPNT (SEQ ID NO: 219)；RGACDIPFPAHWIPNT (SEQ ID NO: 220)；QGDFDIPFPAHWVPIT (SEQ ID NO: 221)；XGafDIPFPAHWvPnT (SEQ ID NO: 222)；RGDGNDSDIPFPAHWVPRT (SEQ ID NO: 223)；SGVGRDRDIPFPAHWVPRT (SEQ ID NO: 224)；WAGGNDCDIPFPAHWIPNT (SEQ ID NO: 225)；WGDGMDVDIPFPAHWVPVT (SEQ ID NO: 226)；AGSGNDSDIPFPAHWVPRT (SEQ ID NO: 227)；ESRSGYADIPFPAHWVPRT (SEQ ID NO: 228)；和/或RECGRCGDIPFPAHWVPRT (SEQ ID NO: 173)。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体的可裂解部分(CM)包括可起蛋白酶(通常为胞外蛋白酶)的底物作用的氨基酸序列。CM可基于与多特异性可活化抗体的至少一个AB的所需靶标共定位于组织中的蛋白酶进行选择。其中目的靶标与蛋白酶共定位的各种不同的条件是已知的，其中所述蛋白酶的底物是本领域已知的。在癌症的实例中，靶标组织可以是癌组织，特别是实体瘤的癌组织。文献中有报道，在许多癌症(例如，实体瘤)中具有已知底物的蛋白酶的水平增加。参见例如，La Rocca等(2004) British J. of Cancer 90(7): 1414-1421。疾病的非限制性实例包括：所有类型的癌症(乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、黑素瘤、头颈癌、胰腺癌等)、类风湿性关节炎、克罗恩病、SLE、心血管损伤、缺血等。例如，适应症包括白血病，包括T-细胞急性成淋巴细胞性白血病(T-ALL)；成淋巴细胞性疾病，包括多发性骨髓瘤；和实体瘤，包括肺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺癌和乳腺癌，包括三重阴性乳腺癌。例如，适应症包括骨疾病或癌转移，无论原发肿瘤源如何；乳腺癌，包括作为非限制性实例的ER/PR+乳腺癌、Her2+乳腺癌、三重阴性乳腺癌；结肠直肠癌；子宫内膜癌；胃癌；成胶质细胞瘤；头颈癌，例如食管癌；肺癌，例如作为非限制性实例的非小细胞肺癌；多发性骨髓瘤；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；肉瘤，例如骨肉瘤；肾癌，例如作为非限制性实例的肾细胞癌；和/或皮肤癌，例如作为非限制性实例的鳞状细胞癌、基底细胞癌或黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是鳞状细胞癌。在一些实施方案中，癌症是皮肤鳞状细胞癌。在一些实施方案中，癌症是食管鳞状细胞癌。在一些实施方案中，癌症是头颈鳞状细胞癌。在一些实施方案中，癌症是肺鳞状细胞癌。
CM被酶以大约0.001-1500 x 104 M-1S-1或至少0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、7.5、10、15、20、25、50、75、100、125、150、200、250、500、750、1000、1250或1500 x104 M-1S-1的速率特异性地裂解。
对于被酶特异性裂解，在酶和CM之间进行接触。当至少包含与MM和CM偶联的第一AB的多特异性可活化抗体在存在靶标和足够的酶活性的情况下，CM可被裂解。足够的酶活性可指酶与CM进行接触和进行裂解的能力。可容易预期，酶可在CM的附近，但因为其它细胞因子或酶的蛋白修饰导致不能裂解。
示例性的底物包括但不限于可被一种或多种以下表3中的酶或蛋白酶裂解的底物：
表3：示例性的蛋白酶和/或酶
Figure 193585DEST_PATH_IMAGE005
例如，在一些实施方案中，底物被一种或多种以下酶或蛋白酶裂解：uPA、legumain、MT-SP1、ADAM17、BMP-1、TMPRSS3、TMPRSS4、MMP-9、MMP-12、MMP-13和/或MMP-14。在一些实施方案中，蛋白酶选自uPA、legumain和MT-SP1。在一些实施方案中，蛋白酶是基质金属蛋白酶。在一些实施方案中，蛋白酶包含uPA。在一些实施方案中，蛋白酶包含legumain。在一些实施方案中，蛋白酶包含MT-SP1。
在一些实施方案中，CM经选择与特定的蛋白酶一起使用。在一些实施方案中，CM是选自以下的至少一种蛋白酶的底物：ADAM 17、BMP-1、半胱氨酸蛋白酶例如组织蛋白酶、HtrA1、legumain、基质蛋白酶(MT-SP1)、基质金属蛋白酶(MMP)、中性粒细胞弹性蛋白酶、TMPRSS例如TMPRSS3或TMPRSS4、凝血酶和u-型纤溶酶原激活物(uPA，亦称为尿激酶)。
在一些实施方案中，CM是ADAM17的底物。在一些实施方案中，CM是BMP-1的底物。在一些实施方案中，CM是组织蛋白酶的底物。在一些实施方案中，CM是半胱氨酸蛋白酶的底物。在一些实施方案中，CM是HtrA1的底物。在一些实施方案中，CM是legumain的底物。在一些实施方案中，CM是MT-SP1的底物。在一些实施方案中，CM是MMP的底物。在一些实施方案中，CM是中性粒细胞弹性蛋白酶的底物。在一些实施方案中，CM是凝血酶的底物。在一些实施方案中，CM是TMPRSS的底物。在一些实施方案中，CM是TMPRSS3的底物。在一些实施方案中，CM是TMPRSS4的底物。在一些实施方案中，CM是uPA的底物。
在一些实施方案中，可裂解部分经选择与特定的蛋白酶例如已知与可活化抗体的靶标共定位的蛋白酶一起使用。例如，用于本公开内容的可活化抗体的合适的可裂解部分包括序列TGRGPSWV (SEQ ID NO: 27)；SARGPSRW (SEQ ID NO: 28)；TARGPSFK (SEQ IDNO: 29)；LSGRSDNH (SEQ ID NO: 26)；GGWHTGRN (SEQ ID NO: 30)；HTGRSGAL (SEQ IDNO: 31)；PLTGRSGG (SEQ ID NO: 32)；AARGPAIH (SEQ ID NO: 33)；RGPAFNPM (SEQ IDNO: 34)；SSRGPAYL (SEQ ID NO: 35)；RGPATPIM (SEQ ID NO: 36)；RGPA (SEQ ID NO:37)；GGQPSGMWGW (SEQ ID NO: 38)；FPRPLGITGL (SEQ ID NO: 39)；VHMPLGFLGP (SEQ IDNO: 40)；SPLTGRSG (SEQ ID NO: 41)；SAGFSLPA (SEQ ID NO: 42)；LAPLGLQRR (SEQ IDNO: 43)；SGGPLGVR (SEQ ID NO: 44)；和/或PLGL (SEQ ID NO: 45)。
在一些实施方案中，CM是至少一种基质金属蛋白酶(MMP)的底物。MMP的实例包括MMP1；MMP2；MMP3；MMP7；MMP8；MMP9；MMP10；MMP11；MMP12；MMP13；MMP14；MMP15；MMP16；MMP17；MMP19；MMP20；MMP23；MMP24；MMP26；和MMP27。在一些实施方案中，CM是MMP9、MMP14、MMP1、MMP3、MMP13、MMP17、MMP11和MMP19的底物。在一些实施方案中，CM是MMP7的底物。在一些实施方案中，CM是MMP9的底物。在一些实施方案中，CM是MMP14的底物。在一些实施方案中，CM是两种或更多种MMP的底物。在一些实施方案中，CM是至少MMP9和MMP14的底物。在一些实施方案中，CM包含相同的MMP的两种或更多种底物。在一些实施方案中，CM包含至少两种或更多种MMP9底物。在一些实施方案中，CM包含至少两种或更多种MMP14底物。
在一些实施方案中，CM是MMP的底物和包括序列ISSGLLSS (SEQ ID NO: 316)；QNQALRMA (SEQ ID NO: 317)；AQNLLGMV (SEQ ID NO: 318)；STFPFGMF (SEQ ID NO:319)；PVGYTSSL (SEQ ID NO: 320)；DWLYWPGI (SEQ ID NO: 321)；MIAPVAYR (SEQ ID NO:322)；RPSPMWAY (SEQ ID NO: 21)；WATPRPMR (SEQ ID NO: 323)；FRLLDWQW (SEQ ID NO:324)；LKAAPRWA (SEQ ID NO: 325)；GPSHLVLT (SEQ ID NO: 326)；LPGGLSPW (SEQ ID NO:327)；MGLFSEAG (SEQ ID NO: 328)；SPLPLRVP (SEQ ID NO: 329)；RMHLRSLG (SEQ ID NO:330)；LAAPLGLL (SEQ ID NO: 331)；AVGLLAPP (SEQ ID NO: 332)；LLAPSHRA (SEQ ID NO:333)；PAGLWLDP (SEQ ID NO: 334)；和/或ISSGLSS (SEQ ID NO: 335)。
在一些实施方案中，本公开内容的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体可使用重组DNA技术和在真核或原核物种中表达来生物合成制备。对于多特异性可活化抗体，编码掩蔽部分、接头序列(其可包括可裂解部分(CM)和抗体链(重链或轻链))的cDNA可以5’至3’ (翻译产物的N-至C-末端)顺序连接，以产生核酸构建体，其按常规抗体表达方法表达为多特异性可活化抗体蛋白。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体可通过表达CM-抗体和然后在蛋白的N-末端处或其附近化学偶联掩蔽物，经半合成产生。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体可如下产生：通过表达抗体和然后在蛋白的N-末端处或其附近化学偶联掩蔽物和CM，使得多特异性可活化抗体在未裂解状态下具有从N-端至C-端如下的结构排列：MM-CM-AB或AB-CM-MM。
适合用于本文所述的组合物的接头通常是提供修饰的AB或多特异性可活化抗体的柔性以促进至少第一AB与靶标的结合的抑制的接头。这样的接头通常称为柔性接头。合适的接头可容易地选择，和可具有任何合适的不同长度，例如1个氨基酸(例如，Gly)至20个氨基酸、2个氨基酸至15个氨基酸、3个氨基酸至12个氨基酸，包括4个氨基酸至10个氨基酸、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸或7个氨基酸至8个氨基酸，和可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸长。
示例性的柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如，(GS)n、(GSGGS)n (SEQ ID NO: 18)和(GGGS)n (SEQ ID NO: 19)，其中n是至少1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域已知的其它柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物相对无结构，因此可能能够用作各组分之间的中性连接物。甘氨酸获得比甚至丙氨酸显著更多的phi-psi空间，和比具有更长侧链的残基受到少得多的限制(参见Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992))。示例性的柔性接头包括但不限于Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 20)、Gly-Gly-Ser-Gly-Gly (SEQ ID NO: 21)、Gly-Ser-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 22)、Gly-Ser-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 23)、Gly-Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 24)、Gly-Ser-Ser-Ser-Gly (SEQ ID NO: 25)等。普通技术人员将认识到，可活化抗体的设计可包括全部或部分柔性的接头，使得接头可包括柔性接头以及赋予较少柔性结构的一个或多个部分，以提供需要的多特异性可活化抗体结构。
除了上述元件之外，多特异性可活化抗体可包含另外的元件，例如多特异性可活化抗体的氨基酸序列的N-或C-末端。例如，多特异性可活化抗体可包括靶向部分，以促进递送至目的细胞或组织。多特异性可活化抗体可与试剂缀合，所述试剂例如治疗剂、抗肿瘤剂、毒素或其片段、可检测部分或诊断剂。本文公开了试剂的实例。
多特异性可活化抗体还可包括与本公开内容的多特异性抗体联合的缀合的试剂、接头和本文所述的其它组分中的任一种，包括作为非限制性实例的表4中所列的任何试剂和/或表5和/或表6中所列的任何接头。
缀合的多特异性抗体和缀合的多特异性可活化抗体
本公开内容还涉及免疫缀合物，其包含与细胞毒性剂例如毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素(即，放射性缀合物)缀合的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体。合适的细胞毒性剂包括例如多拉司他汀和其衍生物(例如阿里他汀E、AFP、MMAD、MMAF、MMAE)。例如，细胞毒性剂是单甲基阿里他汀E (MMAE)。在一些实施方案中，试剂是单甲基阿里他汀D (MMAD)。在一些实施方案中，试剂是选自表4中所列的试剂。在一些实施方案中，试剂是多拉司他汀。在一些实施方案中，试剂是阿里他汀或其衍生物。在一些实施方案中，试剂是阿里他汀E或其衍生物。在一些实施方案中，试剂是单甲基阿里他汀E (MMAE)。在一些实施方案中，试剂是类美登素或类美登素衍生物。在一些实施方案中，试剂是DM1或DM4。在一些实施方案中，试剂是倍癌霉素或其衍生物。在一些实施方案中，试剂是卡奇霉素或其衍生物。在一些实施方案中，试剂是吡咯并苯并二氮杂
Figure 7957DEST_PATH_IMAGE001
。
可使用的酶活性毒素和其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、朔莲根毒素A链、α-帚曲霉素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美国商陆(Phytolaca Americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、肥阜草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯类(tricothecenes)。各种放射性核素可用于制备放射性缀合的抗体。实例包括212Bi、64Cu、125I、131I、131In、99mTc、90Y、186Re和89Zr。
抗体和细胞毒性剂的缀合物使用各种双官能蛋白偶联剂制备，所述双官能蛋白偶联剂例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基联硫基)丙酸盐(SPDP)、亚氨基硫杂环戊烷(thiolane) (IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(例如二甲基己二酰亚胺酸酯HCL)、活性酯(例如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛类(例如戊二醛)、双-叠氮基化合物(例如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双-重氮盐衍生物(例如双-(对重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯类(例如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)中所述制备。碳-14-标记的1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(MX-DTPA)是将放射性核素(radionucleotide)与抗体缀合的示例性螯合剂。(参见WO94/11026)。
表4列举了可用于本文所述的公开内容的一些示例性的药剂，但其绝不意指为详尽的列表。
表4：用于缀合的示例性药剂
Figure 830419DEST_PATH_IMAGE006
Figure 97453DEST_PATH_IMAGE007
Figure 93091DEST_PATH_IMAGE008
本领域普通技术人员将认识到，很多可能的部分可与本公开内容的所得多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体偶联。(参见例如“Conjugate Vaccines”, Contributionsto Microbiology and Immunology, J. M. Cruse和R. E. Lewis, Jr (编辑), CargerPress, New York, (1989)，其完整内容通过引用结合到本文中)。
偶联可通过结合两个分子的任何化学反应进行，只要抗体和另一部分保持它们各自的活性。该连键可包括许多化学机制，例如共价结合、亲和力结合、嵌入、配位结合和络合。然而在一些实施方案中，优选的结合是共价结合。共价结合可通过现有侧链的直接缩合或通过掺入外部的桥接分子实现。许多二价或多价连接剂可用于将蛋白分子，例如本公开内容的抗体，与其它分子偶联。例如，代表性的偶联剂可包括有机化合物，例如硫代酸酯、碳二亚胺、琥珀酰亚胺酯、二异氰酸酯、戊二醛、重氮苯和六亚甲基二胺。该列表不意欲穷尽本领域已知的各种类别的偶联剂，而是较常见偶联剂的例示。(参见Killen和Lindstrom,Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984); Jansen等, Immunological Reviews 62:185-216(1982);和Vitetta等, Science 238:1098 (1987)。
在一些实施方案中，除了本文提供的组合物和方法，缀合的可活化抗体还可通过插入或以其它方式包括在可活化抗体序列中的修饰的氨基酸序列，经修饰用于位点特异性缀合。这些修饰的氨基酸序列经设计以允许在缀合的可活化抗体内受控的放置和/或定量给予缀合的试剂。例如，可活化抗体可经工程改造以在轻链和重链的位置上包括半胱氨酸置换，其提供反应性巯基和不负面影响蛋白折叠和装配，也不改变抗原结合。在一些实施方案中，可活化抗体可经工程改造以在可活化抗体内包括或以其它方式引入一个或多个非天然氨基酸残基，以提供用于缀合的合适位点。在一些实施方案中，可活化抗体可经工程改造以在可活化抗体序列内包括或以其它方式经酶促引入可活化肽序列。
合适的接头描述于文献中(参见例如Ramakrishnan, S.等, Cancer Res. 44:201-208 (1984)，描述使用MBS (M-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)。亦参见美国专利号5,030,719，描述使用通过寡肽接头与抗体偶联的卤代乙酰基酰肼衍生物。特别合适的接头包括：(i) SMPT (4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-联硫基)-甲苯(Pierce Chem. Co., Cat. (21558G)；(ii) SPDP (琥珀酰亚胺基-6 [3-(2-吡啶基联硫基)丙酰胺基]己酸酯(Pierce Chem. Co., Cat #21651G)；和(iii) 磺基-LC-SPDP (磺基琥珀酰亚胺基6 [3-(2-吡啶基联硫基)-丙酰胺]己酸酯(Pierce Chem. Co. Cat. #2165-G。另外的接头包括但不限于SMCC、磺基-SMCC、SPDB或磺基-SPDB。
上述接头包含具有不同属性的元件，因此产生具有不同物理化学性质的缀合物。例如，接头SMPT包含空间阻碍的二硫键，和可形成具有增加的稳定性的缀合物。二硫键通常比其它连键更不稳定，因为二硫键被体外裂解，导致较少的可获得缀合物。
以羧酸和伯胺或仲胺开始，试剂EDC (1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐可用于产生羧酰胺。因此，EDC可用于连接抗体中的赖氨酸残基与接头或毒素中的羧酸，或连接抗体中的天冬氨酸或谷氨酸残基与接头或毒素中的胺。这样的利用EDC的缀合反应可通过加入NHS (N-羟基琥珀酰亚胺)或磺基-NHS (N-羟基-3-氧基磺酰基琥珀酰亚胺)而增强。加入NHS或磺基-NHS至这样的缀合反应中可增强缀合反应的速率、完全性、选择性和/或再现性。
在一些实施方案中，接头是可裂解的。在一些实施方案中，接头是不可裂解的。在一些实施方案中，存在两个或更多个接头。所述两个或更多个接头全都相同，例如是可裂解的或不可裂解的，或所述两个或更多个接头是不同的，例如至少一个可裂解和至少一个不可裂解。
本公开内容利用数种方法来将试剂连接至多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的Ab：(a) 连接至AB的碳水化合物部分，或(b) 连接至AB的巯基，或(c) 连接至AB的氨基，或(d) 连接至AB的羧酸基团。根据本公开内容，AB可通过具有至少两个反应性基团的中间体接头共价连接至试剂，一个基团与AB反应和一个基团与所述试剂反应。可包括任何相容的有机化合物的接头可经选择使得与AB (或试剂)的反应不会不利地影响AB的反应性和选择性。此外，连接接头至试剂，可能不破坏试剂的活性。对于与氧化的抗体或氧化的抗体片段反应，合适的接头包括包含胺的那些，所述胺选自伯胺、仲胺、肼、酰肼、羟胺、苯肼、氨基脲和氨基硫脲基团。这样的反应性官能团可作为接头结构的部分存在，或可通过不包含这样的基团的接头的合适化学修饰引入。
根据本公开内容，用于连接至多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的还原的AB的合适的接头包括具有能够与还原抗体或片段的巯基反应的某些反应性基团的那些。这样的反应性基团包括但不限于：反应性卤代烷基(包括例如，卤代乙酰基)、p-汞基苯甲酸酯基团和能够Michael-型加成反应的基团(包括例如，马来酰亚胺和Mitra和Lawton, 1979,J. Amer. Chem. Soc. 101: 3097-3110描述的类型的基团)。
根据本公开内容，用于连接至多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的非氧化也非还原的AB的合适的接头包括具有能够与存在于AB的未经修饰的赖氨酸残基中的伯氨基反应的某些官能团的那些。这样的反应性基团包括但不限于NHS羧酸或碳酸酯、磺基-NHS羧酸或碳酸酯、4-硝基苯基羧酸或碳酸酯、五氟苯基羧酸或碳酸酯、酰基咪唑、异氰酸酯和异硫氰酸酯。
根据本公开内容，用于连接至非氧化也非还原的AB的合适的接头包括具有能够与存在于AB的天冬氨酸或谷氨酸残基中的羧酸基团反应的某些官能团的那些，所述羧酸基团已被合适的试剂活化。合适的活化试剂包括EDC (具有或不具有加入的NHS或磺基-NHS)和用于羧酰胺形成的其它脱水剂。这些实例中，存在于合适的接头中的官能团包括伯胺和仲胺、肼、羟胺和酰肼。
所述试剂可在接头与AB连接之前或之后与接头连接。在某些应用中，首先产生AB-接头中间体可能是需要的，其中接头不包含相关的试剂。根据具体的应用，特定的试剂可然后与接头共价连接。在其它实施方案中，AB首先与MM、CM和相关的接头连接，和然后与用于缀合目的的接头连接。
分支接头：在特定的实施方案中，利用具有多个试剂连接位点的分支接头。对于多位点接头，与AB的单一共价连接将产生能够在多个位点上结合试剂的AB-接头中间体。所述位点可以是醛基团或巯基或试剂可连接的任何化学位点。
或者，通过在AB的多个位点上连接单一位点接头，可获得较高的特异活性(或较高的试剂:AB比)。通过两种方法的任一种，该多个位点可引入至AB中。第一，可在同一AB上产生多个醛基团和/或巯基。第二，可连接AB的醛或巯基与具有用于随后连接接头的多个功能位点的"分支接头"。分支接头或多位点接头的功能位点可以是醛基团或巯基，或可以是接头可连接的任何化学位点。还更高的特异活性可通过组合这两种方法获得，即在AB的数个位点上连接多位点接头。
可裂解的接头：在本公开内容的一个实施方案中，可使用易于被补体系统的酶(例如但不限于尿激酶、组织纤溶酶原激活物、胰蛋白酶、纤溶酶或具有蛋白水解活性的另一种酶)裂解的肽接头。根据本公开内容的一种方法，试剂经由对补体裂解易感的接头连接。抗体选自可激活补体的类别。因此，抗体-试剂缀合物激活补体级联和在靶标位点上释放试剂。根据本公开内容的另一种方法，试剂经由易于被具有蛋白水解活性的酶(例如尿激酶、组织纤溶酶原激活物、纤溶酶或胰蛋白酶)裂解的接头连接。这些可裂解的接头可用于缀合的可活化抗体，其包括胞外毒素，例如作为非限制性实例的表4中所示的任何胞外毒素。
可裂解的接头序列的非限制性实例提供于表5中。
表5：用于缀合的示例性接头序列
Figure 761969DEST_PATH_IMAGE009
Figure 755333DEST_PATH_IMAGE010
此外，试剂可经由二硫键(例如半胱氨酸分子上的二硫键)与AB连接。因为许多肿瘤天然释放高水平的谷胱甘肽(还原剂)，所以这可还原二硫键，随后在递送位点上释放试剂。在某些具体的实施方案中，修饰CM的还原剂也将修饰缀合的可活化抗体的接头。
间隔区和可裂解的元件：在又一实施方案中，以使得优化试剂和可活化抗体的AB之间的间隔的方式构建接头可能是必需的。这可通过使用以下通式结构的接头实现：
W – (CH2)n – Q
其中
W是--NH--CH2--或--CH2--；
Q是氨基酸、肽；和
N是0-20的整数。
在仍其它实施方案中，接头可包含间隔区元件和可裂解的元件。间隔区元件用于定位可裂解的元件远离AB的核心，使得可裂解的元件更易接近负责裂解的酶。上述的某些分支接头可用作间隔区元件。
在整个论述中，应理解接头与试剂(或间隔区元件与可裂解的元件、或可裂解的元件与试剂)的连接不需要是特定的连接或反应模式。提供具有合适的稳定性和生物相容性的产物的任何反应都是可接受的。
血清补体和接头选择：根据本公开内容的一种方法，当需要试剂释放时，使用作为可激活补体的类型的抗体的AB。得到的缀合物同时保留结合抗原和激活补体级联的能力。因此，根据本公开内容的该实施方案，试剂连接可裂解的接头或可裂解的元件的一个末端，和接头基团的另一末端与AB上的特定位点连接。例如，如果试剂具有羟基或氨基，其可与肽、氨基酸或其它合适选择的接头的羧基末端分别经由酯或酰胺键连接。例如，这样的试剂可与接头肽经由碳二亚胺反应连接。如果试剂包含会干涉接头连接的官能团，这些干涉官能团可在连接之前被封闭和在产物缀合物或中间体制备后解封闭。接头的相对或氨基端然后直接或在进一步修饰后用于结合能够激活补体的AB。
接头(或接头的间隔区元件)可具有任何需要的长度，其一个末端可与可活化抗体的AB的特定位点共价连接。接头或间隔区元件的另一末端可与氨基酸或肽接头连接。
因此，当这些缀合物在补体的存在下结合抗原时，连接试剂与接头的酰胺或酯键将被裂解，导致释放呈其活性形式的试剂。这些缀合物当给予受试者时，将在靶标位点上实现试剂的递送和释放，和对于药剂、抗生素、抗代谢物、抗增殖药等(如在表4中(但不限于此)提供的那些)的体内递送特别有效。
用于无补体激活下的释放的接头：在靶向递送的又一种应用中，无补体激活的试剂释放是需要的，因为补体级联的激活将最终溶解靶细胞。因此，当试剂的递送和释放应在不杀死靶细胞的情况下实现时该方法是有用的。这是当需要递送细胞介质例如激素、酶、皮质类固醇、神经递质、基因或酶至靶细胞时的目标。这些缀合物可通过将试剂与不能激活补体的AB经由接头连接制备，所述接头对通过血清蛋白酶的裂解轻度易感。当将该缀合物给予个体时，抗原-抗体复合物将快速形成，而试剂的裂解将缓慢发生，因此导致在靶标位点上释放化合物。
生物化学交叉接头：在其它实施方案中，使用某些生物化学交叉接头，可活化抗体可与一种或多种治疗剂缀合。交叉连接试剂形成分子桥，其将两个不同分子的官能团系在一起。为了以逐步方式连接两个不同的蛋白，可使用杂合-双官能交叉-接头，其排除不需要的均聚物形成。
还可使用通过溶酶体蛋白酶可裂解的肽基接头，例如Val-Cit、Val-Ala或其它二肽。此外，可使用在溶酶体的低pH环境中可裂解的酸不稳定性接头，例如：双-唾液酸醚。其它合适的接头包括组织蛋白酶不稳定性底物，特别是在酸性pH下显示最佳功能的那些。
示例性的杂合-双官能交叉-接头在表6中提及。
表6：示例性的杂合-双官能交叉接头
Figure 509662DEST_PATH_IMAGE011
Figure 512254DEST_PATH_IMAGE012
非可裂解的接头或直接连接：在本公开内容的仍其它实施方案中，缀合物可经设计，使得所述试剂被递送至靶标而不释放。这可通过将试剂与AB直接或经由非可裂解的接头连接实现。
这些非可裂解的接头可包括氨基酸、肽、D-氨基酸或可经修饰以包括可随后用于通过本文所述的方法连接AB的官能团的其它有机化合物。这样的有机接头的通式可以是
W – (CH2)n – Q
其中
W是--NH--CH2--或--CH2--；
Q是氨基酸、肽；和
n是0-20的整数。
非可裂解的缀合物：或者，化合物可与不激活补体的AB连接。当使用不能补体激活的AB时，该连接可使用对激活的补体的裂解易感的接头或使用对激活的补体的裂解不易感的接头来实现。
本文公开的抗体还可被配制为免疫脂质体。包含抗体的脂质体通过本领域已知的方法制备，例如Epstein等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang等,Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980);和美国专利号4,485,045和4,544,545中描述的方法。具有提高的循环时间的脂质体公开于美国专利号5,013,556。
特别有用的脂质体可用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物通过反相蒸发方法产生。脂质体通过限定孔径的滤器挤出，以得到具有所需直径的脂质体。本公开内容的抗体的Fab’片段可按Martin等, J. Biol. Chem.,257: 286-288 (1982)中所述，经由二硫化物交换反应与脂质体缀合。
具有非结合空间部分或非结合空间部分的结合配偶体的多特异性可活化抗体
本公开内容还提供包括非结合空间部分(NB)或非结合空间部分的结合配偶体(BP)的多特异性可活化抗体，其中BP募集或以其它方式吸引NB至多特异性可活化抗体。本文提供的多特异性可活化抗体包括例如，包括非结合空间部分(NB)、可裂解接头(CL)和结合第一靶标或表位的至少第一抗体或抗体片段(AB1)的多特异性可活化抗体；包括非结合空间部分(BP)的结合配偶体、CL和AB1的多特异性可活化抗体；和包括NB所募集的BP、CL和结合第一靶标或表位的AB1的多特异性可活化抗体。其中NB与CL和AB1共价连接或通过与CL和AB1共价连接的BP相互作用而缔合的多特异性可活化抗体在本文被称为“包含NB的多特异性可活化抗体”。可活化或可变换的是指可活化抗体当可活化抗体在抑制、掩蔽或未裂解状态(即，第一构象)时，显示与靶标的第一结合水平，和当可活化抗体在未抑制、未掩蔽和/或裂解状态(即，第二构象，即，活化的抗体)时显示与靶标的第二结合水平，其中第二靶标结合水平大于第一靶标结合水平。与常规抗体疗法相比，多特异性可活化抗体组合物可显示增加的生物利用度和更有利的生物分布。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体提供降低的毒性和/或不利的副作用，如果多特异性可活化抗体未被掩蔽或以其它方式抑制免于结合非治疗部位和/或非诊断部位的话，所述毒性和/或副作用否则可因在这样的部位上多特异性可活化抗体的结合而产生。
在一个实施方案中，多特异性可活化抗体包括非结合空间部分(NB)；可裂解接头(CL)；和特异性地结合第一靶标或表位的至少第一抗体或抗体片段(AB1)，其中NB是不特异性地结合AB1的多肽；CL是包括酶的底物(S)的多肽；CL经放置使得在未裂解状态下NB干扰AB1与其靶标的结合和在裂解状态下NB不干扰AB1与其靶标的结合；和NB不抑制CL被酶裂解。如本文和全文所用的，术语多肽是指包括至少两个氨基酸残基的任何多肽，包括较大的多肽、全长蛋白和其片段，和术语多肽不限于单链多肽和可包括多个单元(例如多链)多肽。在其中多肽具有较短长度例如总共少于50个氨基酸的情况下，术语肽和多肽在本文可互换使用，和在其中多肽具有较长长度例如50个氨基酸或更长的情况下，术语多肽和蛋白在本文可互换使用。
在一个实施方案中，多特异性可活化抗体包括非结合空间部分(NB)；可裂解接头(CL)；和特异性地结合第一靶标或表位的至少第一抗体或抗体片段(AB1)，其中(i) NB包括不特异性地结合AB1的多肽；(ii) CL是至多50个氨基酸长的多肽，其包括酶的底物(S)；(iii) CL经放置使得在未裂解状态下NB干扰AB1与其靶标的结合和在裂解状态下NB不干扰AB1与其靶标的结合；和(iv) NB不抑制CL被酶裂解。例如，CL具有至多15个氨基酸的长度、至多20个氨基酸的长度、至多25个氨基酸的长度、至多30个氨基酸的长度、至多35个氨基酸的长度、至多40个氨基酸的长度、至多45个氨基酸的长度、至多50个氨基酸的长度、范围为10-50个氨基酸的长度、范围为15-50个氨基酸的长度、范围为20-50个氨基酸的长度、范围为25-50个氨基酸的长度、范围为30-50个氨基酸的长度、范围为35-50个氨基酸的长度、范围为40-50个氨基酸的长度、范围为45-50个氨基酸的长度、范围为10-40个氨基酸的长度、范围为15-40个氨基酸的长度、范围为20-40个氨基酸的长度、范围为25-40个氨基酸的长度、范围为30-40个氨基酸的长度、范围为35-40个氨基酸的长度、范围为10-30个氨基酸的长度、范围为15-30个氨基酸的长度、范围为20-30个氨基酸的长度、范围为25-30个氨基酸的长度、范围为10-20个氨基酸的长度或范围为10-15个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，多特异性可活化抗体包括非结合空间部分(NB)；可裂解接头(CL)；和特异性地结合第一靶标或表位的至少第一抗体或抗体片段(AB1)，其中(i) NB包括不特异性地结合AB1的多肽；(ii) CL是包括酶的底物(S)的多肽；(iii) CL经放置使得在未裂解状态下NB干扰AB1与其靶标的结合和在裂解状态下NB不干扰AB1与其靶标的结合；(iv)NB不抑制CL被酶裂解；和(v) 多特异性可活化抗体的至少一部分具有在未裂解状态下如下的从N-端至C-端的结构排列：NB-CL-AB1或AB1-CL-NB。
在一个实施方案中，多特异性可活化抗体包括非结合空间部分(NB)；可裂解接头(CL)；和特异性地结合第一靶标或表位的至少第一抗体或抗体片段(AB1)，其中(i) NB包括不特异性地结合AB1的多肽；(ii) CL是包括酶的底物(S)的多肽；(iii) CL经放置使得在未裂解状态下NB干扰AB1与其靶标的结合和在裂解状态下NB不干扰AB1与其靶标的结合，和其中与裂解的AB1结合其靶标的能力相比，在未裂解的可活化抗体中的NB降低AB1结合其靶标的能力至少50%、例如至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少100%；和(iv) NB不抑制CL被酶裂解。AB结合其靶标的能力的降低使用例如本文描述的测定法或体外靶标置换测定法例如描述于PCT公布号WO2009/025846和WO 2010/081173中的测定法来测定。
在一个实施方案中，多特异性可活化抗体包括非结合空间部分(NB)的结合配偶体(BP)；可裂解接头(CL)；和特异性地结合第一靶标和/或表位的至少第一抗体或抗体片段(AB1)，其中BP是当暴露于NB时结合NB的多肽；NB不特异性地结合AB1；CL是包括酶的底物(S)的多肽；CL经放置使得在未裂解状态下在存在NB的情况下NB干扰AB与靶标的结合和在裂解状态下NB不干扰AB与靶标的结合和BP不干扰AB与靶标的结合；和NB和BP不抑制CL被酶裂解。在该实施方案的一些实例中，可活化抗体的BP任选地与NB结合。在一个实施方案中，NB被可活化抗体的BP在体内募集。
在任何这些多特异性可活化抗体实施方案的一些实例中，多特异性可活化抗体被配制为组合物。在这些实施方案的一些中，组合物还包括NB，其中NB与包括BP、CL和AB的多特异性可活化抗体共配制。在该实施方案的一些实例中，BP选自白蛋白结合肽、纤维蛋白原结合肽、纤连蛋白结合肽、血红蛋白结合肽、转铁蛋白结合肽、免疫球蛋白结构域结合肽和其它血清蛋白结合肽。
在任何这些多特异性可活化抗体实施方案的一些实例中，NB是可溶性球蛋白。在任何这些多特异性可活化抗体实施方案的一些实例中，NB是在血流中循环的蛋白。在任何这些多特异性可活化抗体实施方案的一些实例中，NB选自白蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白、血红蛋白、转铁蛋白、免疫球蛋白结构域和其它血清蛋白。
在任何这些多特异性可活化抗体实施方案的一些实例中，CL是包括蛋白酶的底物(S)的多肽。在任何这些多特异性可活化抗体实施方案的一些实例中，蛋白酶与其靶标在组织中共定位，和当所述多特异性可活化抗体暴露于所述蛋白酶时，蛋白酶裂解多特异性可活化抗体中的CL。在任何这些多特异性可活化抗体实施方案的一些实例中，CL是至多50个氨基酸长的多肽。在任何这些多特异性可活化抗体实施方案的一些实例中，CL是包括具有至多15个氨基酸长例如3个氨基酸长、4个氨基酸长、5个氨基酸长、6个氨基酸长、7个氨基酸长、8个氨基酸长、9个氨基酸长、10个氨基酸长、11个氨基酸长、12个氨基酸长、13个氨基酸长、14个氨基酸长或15个氨基酸长的底物(S)的多肽。
在任何这些多特异性可活化抗体实施方案的一些实例中，多特异性可活化抗体的至少一部分具有在未裂解状态下如下的从N-端至C-端的结构排列：NB-CL-AB、AB-CL-NB、BP-CL-AB或AB-CL-BP。在其中多特异性可活化抗体包括BP和多特异性可活化抗体在存在相应的NB的情况下的实施方案中，多特异性可活化抗体的至少一部分在未裂解状态下具有从N-端至C-端如下的结构排列：NB:BP-CM-AB或AB-CM-BP:NB，其中“:”表示相互作用，例如，在NB和BP之间结合。
在任何这些多特异性可活化抗体实施方案的一些实例中，多特异性可活化抗体包括特异性地结合其靶标的抗体或其抗原结合片段，并且是单克隆抗体、结构域抗体、单链、Fab片段、F(ab')2片段、scFv、scab、dAb、单一结构域重链抗体和单一结构域轻链抗体。在一些实施方案中，结合其靶标的这样的抗体或其免疫活性片段是小鼠、嵌合、人源化或完全人单克隆抗体。
在任何这些多特异性可活化抗体实施方案的一些实例中，多特异性可活化抗体还包括与AB缀合的试剂。在一些实施方案中，试剂是治疗剂。在一些实施方案中，试剂是抗肿瘤剂。在一些实施方案中，试剂是毒素或其片段。在一些实施方案中，试剂与AB经由接头缀合。在一些实施方案中，接头是可裂解接头。在一些实施方案中，试剂是选自表4中所列的组的试剂。在一些实施方案中，试剂是多拉司他汀。在一些实施方案中，试剂是阿里他汀或其衍生物。在一些实施方案中，试剂是阿里他汀E或其衍生物。在一些实施方案中，试剂是单甲基阿里他汀E (MMAE)。在一些实施方案中，试剂是单甲基阿里他汀D (MMAD)。在一些实施方案中，试剂是类美登素或类美登素衍生物。在一些实施方案中，试剂是DM1或DM4。在一些实施方案中，试剂是倍癌霉素或其衍生物。在一些实施方案中，试剂是卡奇霉素或其衍生物。在一些实施方案中，试剂是吡咯并苯并二氮杂
Figure 134775DEST_PATH_IMAGE001
。
在任何这些多特异性可活化抗体实施方案的一些实例中，多特异性可活化抗体还包括可检测部分。在一些实施方案中，可检测部分是诊断剂。
在任何这些多特异性可活化抗体实施方案的一些实例中，多特异性可活化抗体还包括间隔区。在任何这些多特异性可活化抗体实施方案的一些实例中，多特异性可活化抗体还包括信号肽。在一些实施方案中，信号肽与多特异性可活化抗体经由间隔区缀合。在任何这些多特异性可活化抗体实施方案的一些实例中，间隔区与多特异性可活化抗体的MM直接连接。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体的血清半寿期比相应的多特异性抗体的血清半寿期长；例如，多特异性可活化抗体的pK比相应的多特异性抗体的pK长。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体的血清半寿期类似于相应的多特异性抗体。在一些实施方案中，当给予生物体时多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少15天。在一些实施方案中，当给予生物体时多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少12天。在一些实施方案中，当给予生物体时多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少11天。在一些实施方案中，当给予生物体时多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少10天。在一些实施方案中，当给予生物体时多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少9天。在一些实施方案中，当给予生物体时多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少8天。在一些实施方案中，当给予生物体时多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少7天。在一些实施方案中，当给予生物体时多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少6天。在任何这些多特异性可活化抗体实施方案的一些实例中，当给予生物体时多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少5天。在一些实施方案中，当给予生物体时多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少4天。在一些实施方案中，当给予生物体时多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少3天。在一些实施方案中，当给予生物体时多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少2天。在一些实施方案中，当给予生物体时多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少24小时。在一些实施方案中，当给予生物体时多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少20小时。在一些实施方案中，当给予生物体时多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少18小时。在一些实施方案中，当给予生物体时多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少16小时。在一些实施方案中，当给予生物体时多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少14小时。在一些实施方案中，当给予生物体时多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少12小时。在一些实施方案中，当给予生物体时多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少10小时。在一些实施方案中，当给予生物体时多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少8小时。在一些实施方案中，当给予生物体时多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少6小时。在一些实施方案中，当给予生物体时多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少4小时。在一些实施方案中，当给予生物体时多特异性可活化抗体的血清半寿期是至少3小时。
本公开内容还提供编码任何这些多特异性可活化抗体的分离的核酸分子以及包括这些分离的核酸序列的载体。本公开内容提供通过在导致表达多特异性可活化抗体的条件下培养细胞产生多特异性可活化抗体的方法，其中所述细胞包含这样的核酸序列。在一些实施方案中，细胞包含这样的载体。
包含NB的多特异性可活化抗体对靶标的解离常数(Kd)大于当其不与NB或NB:BP缔合时AB对靶标的Kd。包含NB的多特异性可活化抗体对靶标的解离常数(Kd)大于母体AB对靶标的Kd。例如，包含NB的多特异性可活化抗体对靶标的Kd为当其不与NB或NB:BP缔合时AB对靶标的Kd或母体AB对靶标的Kd的至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000倍或更大，或5-10、10-100、10-1,000、10-10,000、10-100,000、10-1,000,000、10-10,000,000、100-1,000、100-10,000、100-100,000、100-1,000,000、100-10,000,000、1,000-10,000、1,000-100,000、1,000-1,000,000、1000-10,000,000、10,000-100,000、10,000-1,000,000、10,000-10,000,000、100,000-1,000,000或100,000-10,000,000倍。相反地，包含NB的多特异性可活化抗体对靶标的结合亲和力比当其不与NB或NB:BP缔合时AB对靶标的结合亲和力低，或比母体AB对靶标的结合亲和力低。例如，包含NB的多特异性可活化抗体对靶标的结合亲和力为当其不与NB或NB:BP缔合时AB对靶标的结合亲和力或比母体AB对靶标的结合亲和力的至多1/5、1/10、1/25、1/50、1/100、1/250、1/500、1/1,000、1/2,500、1/5,000、1/10,000、1/50,000、1/100,000、1/500,000、1/1,000,000、1/5,000,000、1/10,000,000、1/50,000,000或更低，或1/5-10、1/10-100、1/10-1,000、1/10-10,000、1/10-100,000、1/10-1,000,000、1/10-10,000,000、1/100-1,000、1/100-10,000、1/100-100,000、1/100-1,000,000、1/100-10,000,000、1/1,000-10,000、1/1,000-100,000、1/1,000-1,000,000、1/1000-10,000,000、1/10,000-100,000、1/10,000-1,000,000、1/10,000-10,000,000、1/100,000-1,000,000或1/100,000-10,000,000。
与当其不与NB或NB:BP缔合时AB的特异性结合相比，当包含NB的多特异性可活化抗体在存在其靶标的情况下时，AB与其靶标的特异性结合被降低或抑制。与母体AB与其靶标的特异性结合相比，当包含NB的多特异性可活化抗体在存在其靶标的情况下时，AB与其靶标的特异性结合被降低或抑制。当在体外和/或体内测量时，当与未与NB或NB:BP缔合的AB与其靶标的结合或母体AB与其靶标的结合相比，包含NB的多特异性可活化抗体结合其靶标的能力被降低，例如至少50%、60%、70%、80%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至100%达至少2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84或96小时或5、10、15、30、45、60、90、120、150或180天或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或更长。
当包含NB的多特异性可活化抗体在存在其靶标的情况下，但不在存在修饰试剂(例如蛋白酶或其它酶)的情况下时，与当其不与NB或NB:BP缔合时AB的特异性结合相比，AB与其靶标的特异性结合被降低或抑制。当包含NB的多特异性可活化抗体在存在其靶标的情况下，但不在存在修饰试剂(例如蛋白酶、其它酶、还原试剂或光)的情况下时，与母体AB与其靶标的特异性结合相比，AB与其靶标的特异性结合被降低或抑制。当在体外和/或体内测量时，当与不与NB或NB:BP缔合的AB与其靶标的结合或母体AB与其靶标的结合相比，包含NB的多特异性可活化抗体结合其靶标的能力被降低，例如至少50%、60%、70%、80%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至100%达至少2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84或96小时或5、10、15、30、45、60、90、120、150或180天或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或更长。
在任何这些多特异性可活化抗体实施方案的一些实例中，多特异性可活化抗体包括与AB缀合的试剂以产生多特异性可活化抗体缀合物。在多特异性可活化抗体缀合物的一些实施方案中，试剂是治疗剂。在一些实施方案中，试剂是诊断剂。在一些实施方案中，试剂是可检测标记。在多特异性可活化抗体缀合物的一些实施方案中，试剂是抗肿瘤剂。在多特异性可活化抗体缀合物的一些实施方案中，试剂是毒素或其片段。在多特异性可活化抗体缀合物的一些实施方案中，试剂与AB经由接头缀合。在多特异性可活化抗体缀合物的一些实施方案中，接头是可裂解接头。在一些实施方案中，试剂是选自表4中所列的组的试剂。在一些实施方案中，试剂是多拉司他汀。在一些实施方案中，试剂是阿里他汀或其衍生物。在一些实施方案中，试剂是阿里他汀E或其衍生物。在一些实施方案中，试剂是单甲基阿里他汀E (MMAE)。在一些实施方案中，试剂是单甲基阿里他汀D (MMAD)。在一些实施方案中，试剂是类美登素或类美登素衍生物。在一些实施方案中，试剂是DM1或DM4。在一些实施方案中，试剂是倍癌霉素或其衍生物。在一些实施方案中，试剂是卡奇霉素或其衍生物。在一些实施方案中，试剂是吡咯并苯并二氮杂
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。
在任何这些多特异性可活化抗体实施方案的一些实例中，多特异性可活化抗体是双靶标结合多特异性可活化抗体。这样的双靶标结合多特异性可活化抗体包含两个Ab，其可结合相同或不同的靶标。在特定的实施方案中，双靶向多特异性可活化抗体包含双特异性抗体或抗体片段。
双靶标结合多特异性可活化抗体经设计使得具有可被裂解剂裂解的CL，所述裂解剂与能够结合多特异性可活化抗体的AB的靶标之一或两者共定位在靶标组织中。对相同或不同的靶标具有超过一个AB的双靶标结合多特异性可活化抗体可经设计以具有超过一个CL，其中第一CL可被第一靶标组织中的裂解剂裂解和其中第二CL可被第二靶标组织中的裂解剂裂解，其中一个或多个靶标与多特异性可活化抗体的AB结合。在一个实施方案中，第一和第二靶标组织在空间上是分开的，例如在生物体的不同部位中。在一个实施方案中，第一和第二靶标组织是暂时分开的相同组织，例如在两个不同的时间点的相同组织，例如第一时间点是在组织是早期阶段肿瘤时，和第二时间点是在组织是晚期阶段肿瘤时。
本公开内容还提供编码本文所述的多特异性可活化抗体的核酸分子。本公开内容还提供包括这些核酸的载体。本文所述的多特异性可活化抗体通过在导致表达多特异性可活化抗体的条件下培养细胞产生，其中所述细胞包括这些核酸分子或载体。
本公开内容还提供制备多特异性可活化抗体的方法。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)在导致表达多特异性可活化抗体的条件下培养包括编码多特异性可活化抗体的核酸构建体的细胞，其中多特异性可活化抗体包括(i)非结合空间部分(NB)；(ii)可裂解接头(CL)；和(iii)特异性地结合靶标的抗体或其抗原结合片段(AB)，其中(1)NB不特异性地结合AB；(2) CL是包括酶的底物(S)的多肽；(3) CL经放置使得在未裂解状态下NB干扰AB与靶标的结合和在裂解状态下NB不干扰AB与靶标的结合；和(4) NB不抑制CL被酶裂解；和(b)回收多特异性可活化抗体。
在另一实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)在导致表达多特异性可活化抗体的条件下培养包括编码多特异性可活化抗体的核酸构建体的细胞，其中多特异性可活化抗体包括(i)非结合空间部分(NB)的结合配偶体(BP)；(ii)可裂解接头(CL)；和(iii)特异性地结合靶标的抗体或其抗原结合片段(AB)，其中(1) NB不特异性地结合AB；(2) CL是包括酶的底物(S)的多肽；(3) CL经放置使得在未裂解状态下在存在NB的情况下NB干扰AB与靶标的结合，在裂解状态下NB不干扰AB与靶标的结合和BP不干扰AB与靶标的结合；和(4) NB和BP不抑制CL被酶裂解；和(b)回收多特异性可活化抗体。在该实施方案的一些实例中，多特异性可活化抗体的BP与NB结合。
多特异性抗体和多特异性可活化抗体的用途
应理解，本公开内容的治疗实体的给予将与合适的载体、赋形剂和掺入至制剂中以提供改进的传递、递送、耐受性等的其它试剂一起给予。大多数合适的制剂可见于所有制药化学家已知的药典：Remington's Pharmaceutical Sciences (第15版, MackPublishing Company, Easton, PA (1975))，特别是其中Blaug, Seymour的第87章。这些制剂包括例如，粉剂、糊剂、软膏剂、凝胶剂、蜡、油、脂质、含脂质(阳离子或阴离子)的囊泡(例如Lipofectin™)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳剂、乳剂聚乙二醇(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和包含聚乙二醇的半固体混合物。任何前述的混合物可适合于本公开内容的治疗和疗法，只要制剂中的活性成分未被制剂失活和制剂与给予途径在生理学上是相容和耐受的。对于与制药化学家众所周知的制剂、赋形剂和载体有关的其它信息，还参见Baldrick P. “Pharmaceutical excipient development: the need forpreclinical guidance (药学赋形剂开发：临床前指导的需要)” Regul. ToxicolPharmacol. 32(2):210-8 (2000)；Wang W. “Lyophilization and development ofsolid protein pharmaceuticals (固体蛋白药物的冻干和开发)” Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000)；Charman WN “Lipids, lipophilic drugs, and oral drugdelivery-some emerging concepts (脂质、亲脂药物和口服药物递送——一些新出现的概念)” J Pharm Sci.89(8):967-78 (2000)；Powell等“Compendium of excipients forparenteral formulations (胃肠外制剂的赋形剂概要)” PDA J Pharm Sci Technol.52:238-311 (1998)和其中的引文。
在一个实施方案中，本公开内容的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体可用作治疗剂。这样的试剂通常用于诊断、预测、监测、治疗、减轻和/或预防受试者的疾病或病理。使用标准方法通过鉴定受试者例如患有病症(或处于发生病症的风险)的人患者或其它哺乳动物，进行治疗方案。将多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体制剂，例如在一些实施方案中，对其两种或更多种靶标抗原具有高特异性和高亲和力的制剂，给予受试者和其通常由于其与靶标结合而具有效果。给予多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体可废除或抑制或干扰一个或多个靶标的信号转导功能。给予多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体可废除或抑制或干扰一个或多个靶标与其天然结合的内源配体的结合。
通常，缓解或治疗疾病或病症包括减轻与所述疾病或病症有关的一个或多个症状或医学问题。例如，在癌症的情况下，治疗有效量的药物可实现以下方面的一个或其组合：减少癌细胞数；减少肿瘤大小；抑制(即，在某种程度上降低和/或终止)癌细胞侵润至周围器官；抑制肿瘤转移；在某种程度上抑制肿瘤生长；和/或在某种程度上缓解与癌症有关的一个或多个症状。在一些实施方案中，本公开内容的组合物可用于预防受试者(例如，人或其它哺乳动物例如非人灵长类动物、伴侣动物(例如，猫、狗、马)、家畜、耕畜或动物园动物)的疾病或病症的发作或复发。术语受试者和患者在本文可互换使用。
治疗有效量的本公开内容的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体通常涉及实现治疗目标所需要的量。如上文所述，这可以是多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体和其靶标抗原之间的结合相互作用，其在某些情况下干扰靶标的功能。此外，需要给予的量将取决于多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体对其特定抗原的结合亲和力，和还将取决于给予的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体从其所给予的自由体积其它受试者中耗尽的速度。本公开内容的多特异性抗体和/或抗体片段和/或多特异性可活化抗体的治疗有效剂量的常见范围可以是作为非限制性实例的大约0.1 mg/kg体重至大约50 mg/kg体重。常见的给药频率范围可以是例如每天两次至每周一次。
结合用于诊断或治疗特定病症的任何已知的方法，确定治疗的有效性。用于筛选具有所需特异性的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的方法包括但不限于酶联免疫吸附测定法(ELISA)和本领域内已知的其它免疫学介导的技术。
在另一实施方案中，针对两种或更多种靶标的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体用于本领域中已知的涉及靶标的定位和/或定量的方法(例如，用于测量合适的生理学样品中一种或多种靶标的水平，用于诊断方法，用于将蛋白成像等)。在给定的实施方案中，针对两种或更多种靶标的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体，或其包含抗体衍生的抗原结合结构域的衍生物、片段、类似物或同源物，用作药理学活性化合物(下文称为“治疗剂”)。
在另一实施方案中，针对两种或更多种靶标的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体用于通过标准技术，例如免疫亲和力、色谱或免疫沉淀分离一种或多种靶标。针对两种或更多种靶标(或其片段)的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体在诊断上用于监测组织中的蛋白水平，作为临床检验程序的一部分，例如，以检测给定治疗方案的功效。可通过偶联(即，物理连接)抗体与可检测物质促进检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质和放射性物质。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉抗生物素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光物质的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三吖嗪基胺荧光素、丹酰氯或藻红蛋白；发光物质的实例包括鲁米诺；生物发光物质的实例包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；和合适的放射性物质的实例包括125I、131I、35S或3H。
在又一个实施方案中，针对两种或更多种靶标的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体可用作检测样品中一种或多种靶标(或其片段)的存在情况的试剂。在一些实施方案中，抗体包含可检测标记。抗体是多克隆的，或在一些实施方案中，是单克隆的。使用完整抗体或其片段(例如Fab、scFv或F(ab)2)。对于探针或抗体，术语“标记的”意欲包括通过偶联(即物理连接)可检测的物质与探针或抗体直接标记探针或抗体，以及通过与直接标记的另一试剂的反应性间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的第二抗体检测第一抗体，和用生物素末端标记抗体使得其可用荧光标记的链霉亲和素检测。术语“生物样品”意欲包括自受试者分离的组织、细胞和生物流体，以及在受试者内存在的组织、细胞和流体。因此，血液和血液级分或组分(包括血清、血浆或淋巴)包括在术语“生物样品”的用法内。即，本公开内容的检测方法可用于体外以及体内检测生物样品中的蛋白。例如，用于检测分析物蛋白的体外技术包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀和免疫荧光。用于进行免疫测定的程序描述于例如“ELISA: Theory and Practice: Methodsin Molecular Biology (ELISA：理论和实践：分子生物学方法)”, Vol. 42, J. R.Crowther (编辑) Human Press, Totowa, NJ, 1995；“Immunoassay (免疫测定法)”, E.Diamandis和T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996；和“Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (酶免疫测定法的实践和理论)”, P.Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985。此外，用于检测分析物蛋白的体内技术包括将标记的抗分析物蛋白抗体引入至受试者。例如，抗体可用放射性标记物进行标记，在受试者中所述标记物的存在和位置可通过标准成像技术检测。
本公开内容的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体还可用于各种诊断性和预防性制剂。在一个实施方案中，将多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体给予处于发生一种或多种前述病症的风险的患者。患者或器官对一种或多种病症的素因可使用基因型、血清学或生物化学标记物确定。
在本公开内容的另一实施方案中，将多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体给予诊断患有与一种或多种前述病症有关的临床适应症的人个体。在诊断后，给予多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体以减轻或逆转临床适应症的影响。
多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体还可用于检测患者样品中的一种或多种靶标和因此可用作诊断剂。例如，本公开内容的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体用于体外测定法，例如，ELISA，以检测患者样品中的一种或多种靶标水平。
在一个实施方案中，多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体固定在固体支持物(例如，微量滴定板的孔)上。固定的抗体和/或可活化抗体用作试验样品中可存在的任何靶标的捕获抗体。将固定的多特异性抗体和/或固定的多特异性可活化抗体与患者样品接触之前，将固体支持物清洗，和用封闭试剂例如奶蛋白或白蛋白处理以防止分析物的非特异性吸附。
随后，将孔用疑似包含抗原的试验样品或用包含标准量的抗原的溶液处理。这样的样品是例如来自疑似具有被认为是病理诊断的循环抗原水平的受试者的血清样品。在洗去试验样品或标准品后，固体支持物用经可检测标记的第二抗体处理。标记的第二抗体用作检测抗体。测量可检测标记的水平，试验样品中靶标抗原的浓度通过与自标准样品产生的标准曲线相比较来测定。
应理解，根据在体外诊断测定法中使用多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体获得的结果，有可能根据靶标抗原的表达水平将受试者的疾病分期。对于给定的疾病，自诊断为处于疾病进展中的各种阶段和/或处于疾病的治疗处理中的各个点的受试者获取血液样品。使用对进展或治疗的各阶段提供统计学显著结果的一组样品，指定可被认为是各阶段的特征的抗原的浓度范围。
多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体还可用于诊断和/或成像方法。在一些实施方案中，这样的方法为体外方法。在一些实施方案中，这样的方法为体内方法。在一些实施方案中，这样的方法为原位方法。在一些实施方案中，这样的方法为离体方法。例如，具有酶促可裂解的CM的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体可用于检测能够裂解CM的酶的存在或不存在。这样的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体可用于诊断，其可包括通过在给定宿主生物体的给定细胞或组织中测量的多特异性可活化抗体(即，由多特异性可活化抗体的裂解所产生的抗体)的积聚，体内检测(例如定性或定量)酶活性(或者在一些实施方案中，还原电位增加的环境，例如其可提供二硫键的还原)。活化的多特异性抗体的这样的积聚不仅表明所述组织表达酶活性(或增加的还原电位，取决于CM的性质)，而且还表明所述组织表达活化的抗体结合的至少一种靶标。
例如，可选择CM为在肿瘤部位处、在病毒或细菌感染部位处、在生物学限制的部位处(例如在脓肿中、在器官中等)等存在的蛋白酶的蛋白酶底物。至少一个AB可以是结合靶标抗原的AB。使用本领域技术人员熟悉的方法，可检测的标记(例如荧光标记或放射性标记或放射性示踪剂)可与AB或多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的其它区域缀合。合适的可检测的标记在上述筛选方法的文中进行论述，和其它具体的实例在下文提供。使用对疾病状态的蛋白或肽有特异性的至少一个AB以及在目标疾病组织中其活性升高的蛋白酶，可活化抗体将显示相对于其中CM特异性的酶不以可检测的水平存在或以比在疾病组织中低的水平存在或无活性(例如，呈酶原形式或与抑制剂复合)的组织，对疾病组织的结合率增加。因为小的蛋白和肽从血液中通过肾过滤系统快速清除，和因为对CM有特异性的酶不以可检测的水平存在(或在非疾病组织中以较低水平存在或以无活性构象存在)，在疾病组织中活化的多特异性抗体的积聚相对于非疾病组织提高。
在另一实例中，可活化多特异性抗体可用于检测样品中裂解剂的存在或不存在。例如，在多特异性可活化抗体包含对酶裂解易感的CM的情况下，多特异性可活化抗体可用于检测(定性地或定量地)样品中酶的存在。在另一实例中，在多特异性可活化抗体包含对还原剂裂解易感的CM的情况下，多特异性可活化抗体可用于检测(定性地或定量地)样品中还原条件的存在。为便于在这些方法中分析，多特异性可活化抗体可经可检测地标记，和可结合至支持物(例如，固体支持物，例如玻片或珠)。可检测的标记可置于在裂解后不释放的可活化抗体的部分上，例如可检测的标记可以是直到发生裂解时才可检测的淬灭的荧光标记或其它标记。测定法可如下进行：例如通过使固定的可检测标记的多特异性可活化抗体与疑似含有酶和/或还原剂的样品接触足以发生裂解的一段时间，然后洗涤以除去过量的样品和污染物。然后通过在与样品接触之前多特异性可活化抗体的可检测信号的变化，例如由于样品中的裂解剂裂解多特异性可活化抗体导致的可检测信号的存在和/或增加，评价在样品中裂解剂(例如酶或还原剂)的存在或不存在。
这样的检测方法可适合于还提供当裂解时能够结合多特异性可活化抗体的至少一个AB的靶标的存在或不存在的检测。因此，所述测定法可适合于评价裂解剂的存在或不存在和目标靶标的存在或不存在。裂解剂的存在或不存在可通过上述多特异性可活化抗体的可检测的标记的存在和/或增加来检测，和靶标的存在或不存在可通过检测靶标-AB复合物，例如通过使用可检测标记的抗靶标抗体来检测。
多特异性可活化抗体还可用于原位成像以验证可活化抗体激活(例如通过蛋白酶裂解)和与特定靶标的结合。原位成像是能够在生物样品例如细胞培养物或组织切片中定位蛋白水解活性和靶标的技术。使用该技术，有可能基于可检测的标记(例如荧光标记)的存在证实与给定靶标的结合和蛋白水解活性两者。
这些技术可用于源自疾病部位(例如肿瘤组织)或健康组织的任何冷冻细胞或组织。这些技术还可用于新鲜细胞或组织样品。
在这些技术中，可活化抗体用可检测的标记进行标记。可检测的标记可以是荧光染料(例如荧光团、异硫氰酸荧光素(FITC)、异硫氰酸若丹明(TRITC)、Alexa Fluor®标记)、近红外(NIR)染料(例如Qdot®纳米晶体)、胶体金属、半抗原、放射性标记物、生物素和放大试剂例如链霉亲和素或酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)。
与标记的多特异性可活化抗体孵育的样品中标记的检测指示，样品包含靶标和包含对多特异性可活化抗体的CM有特异性的蛋白酶。在一些实施方案中，蛋白酶的存在可使用广谱蛋白酶抑制剂例如本文描述的那些和/或通过使用对蛋白酶有特异性的试剂(例如抗体例如A11，其对蛋白酶基质蛋白酶(MT-SP1)有特异性并抑制MT-SP1的蛋白水解活性；参见例如，公开于2010年11月11日的国际公开号WO 2010/129609)来证实。使用广谱蛋白酶抑制剂例如本文描述的那些和/或通过使用更有选择性的抑制剂的相同方法可用于鉴定对可活化抗体的CM有特异性的一种蛋白酶或一类蛋白酶。在一些实施方案中，靶标的存在可使用对靶标有特异性的试剂来证实，或可检测的标记可与未标记的靶标竞争。在一些实施方案中，未标记的可活化抗体可用于通过标记的第二抗体或更复杂的检测系统进行的检测。
类似的技术也可用于体内成像，其中在受试者(例如哺乳动物，包括人类)中荧光信号的检测指示疾病部位包含靶标和包含对多特异性可活化抗体的CM有特异性的蛋白酶。
这些技术还可用于试剂盒和/或用作试剂以基于多特异性可活化抗体中的蛋白酶特异性CM在各种细胞、组织和生物体中检测、鉴定或表征蛋白酶活性。
多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的治疗性给予和制剂
应理解，给予本公开内容的治疗实体将与掺入至制剂中以提供改进的转移、递送、耐受等的合适的载体、赋形剂和其它试剂一起给予。大多数合适的制剂可在所有制药化学家已知的药典中找到：Remington’s Pharmaceutical Sciences (第15版, MackPublishing Company, Easton, PA (1975))，特别是其中Blaug, Seymour的第87章。这些制剂包括例如粉剂、糊剂、软膏剂、凝胶剂、蜡、油、脂质、包含脂质(阳离子或阴离子)的囊泡(例如Lipofectin™)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳剂、聚乙二醇乳剂(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和包含聚乙二醇的半固体混合物。任何前述混合物可适合于本公开内容的治疗和疗法，条件是制剂中的活性成分未被制剂失活，和制剂与给药途径是生理学上相容和耐受的。对于与制药化学家熟知的制剂、赋形剂和载体相关的其它信息，还参见Baldrick P. “Pharmaceutical excipient development: the need forpreclinical guidance.” Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000)；Wang W.“Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.” Int. J.Pharm. 203(1-2):1-60 (2000)；Charman WN “Lipids, lipophilic drugs, and oraldrug delivery-some emerging concepts.” J Pharm Sci.89(8):967-78 (2000)；Powell等“Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA J Pharm SciTechnol. 52:238-311 (1998)和其中的引文。
在一些实施方案中，多特异性抗体、多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体组合物与一种或多种另外的试剂或另外的试剂的组合结合给予。合适的另外的试剂包括用于预期应用的当前的药物和/或手术疗法。例如，多特异性抗体、多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体组合物可与另外的化学治疗剂或抗肿瘤剂结合使用。例如，多特异性抗体、多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体组合物和另外的试剂配制成单一治疗组合物，多特异性抗体、多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体组合物和另外的试剂同时给予。或者，多特异性抗体、多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体组合物和另外的试剂彼此分开，例如，各自配制成单独的治疗组合物，和多特异性抗体、多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体组合物和另外的试剂同时给予，或多特异性抗体、多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体组合物和另外的试剂在治疗方案期间在不同的时间给予。例如，多特异性抗体、多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体组合物在给予另外的试剂之前给予，多特异性抗体、多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体组合物在给予另外的试剂之后给予，或多特异性抗体、多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体组合物和另外的试剂以交替的方式给予。如本文所述的，多特异性抗体、多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体组合物和另外的试剂以单剂量或多个剂量给予。
在一些实施方案中，另外的试剂与多特异性抗体、多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体组合物偶联或以其它方式连接。
合适的另外的试剂按照预期应用的目的(即，杀死、防止细胞增殖、激素疗法或基因疗法)进行选择。这样的试剂可包括但不限于例如，药剂、毒素、毒素的片段、烷化剂、酶、抗生素、抗代谢物、抗增殖剂、激素、神经递质、DNA、RNA、siRNA、寡核苷酸、反义RNA、适体、诊断剂、不透射线染料、放射性同位素、发荧光化合物、磁性标记、纳米粒、标记化合物、凝集素、改变细胞膜通透性的化合物、光化学化合物、小分子、脂质体、胶束、基因疗法载体、病毒载体等。最后，可使用试剂的组合或不同类别的试剂的组合。
本公开内容的多特异性抗体、多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体组合物(在本文中亦称为“活性化合物”)和其衍生物、片段、类似物和同源物，可掺入至适合于给药的药物组合物中。制备这样的组合物中涉及的原理和考虑以及成分选择的指导提供于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences：The Science and Practice OfPharmacy第19版(Alfonso R. Gennaro,等编辑) Mack Pub. Co., Easton, Pa. : 1995；Drug Absorption Enhancement : Concepts, Possibilities, Limitations, andTrends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994；和Peptide andProtein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M.Dekker, New York。
这样的组合物通常包含多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体和药学上可接受的载体。在多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体包括AB结构域的片段时，可使用特异性地结合靶标蛋白的结合结构域的AB的最小片段。例如，根据抗体的可变区序列，可设计保留AB结合靶标蛋白序列的能力的肽分子。这样的肽可经化学合成和/或通过重组DNA技术产生。(参见例如，Marasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993))。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”意图包括与药物给予相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣料、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。合适的载体描述于最新版的Remington’s Pharmaceutical Sciences，其为本领域的标准参考科教书，其通过引用结合到本文中。这样的载体或稀释剂的合适的实例包括但不限于水、盐水、林格溶液、葡萄糖溶液和5%人血清白蛋白。脂质体和非水溶媒例如固定油亦可使用。用于药物活性物质的这样的介质和试剂的使用是本领域众所周知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，考虑其在组合物中的使用。
用于体内给予的制剂必须是无菌的。这通过无菌滤膜过滤容易实现。
本公开内容的药物组合物经配制以与其预期给予途径相容。给予途径的实例包括胃肠外，例如静脉内、皮内、皮下、经口(例如吸入)、经皮(即局部)、经粘膜和直肠给予。用于胃肠外、皮内或皮下施用的溶液或混悬液可包括以下组分：无菌稀释剂例如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂、抗细菌剂例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂例如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，和用于调节张力的试剂例如氯化钠或葡萄糖。可用酸或碱例如盐酸或氢氧化钠调节pH。可将胃肠外制剂包封在用玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
合适于注射使用的药物组合物包括无菌水性溶液(在水溶性的情况下)或分散体和用于临时配制无菌注射溶液或分散体的无菌粉剂。对于静脉内给予，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的，和应该是流动的至存在容易可注射性的程度。在制备和贮存的条件下其必须是稳定的，和必须针对微生物例如细菌和真菌的污染作用而防腐。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其合适的混合物。可保持合适的流动性，例如通过使用包衣料例如卵磷脂，在分散体的情况下通过保持所需的粒度和通过使用表面活性剂。预防微生物作用可通过各种抗细菌和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等实现。在许多情况下，合适的是在组合物中包括等渗剂例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨醇、氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包括延长吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶产生。
无菌可注射溶液可通过将所需量的活性化合物掺入含上文列举的成分之一或成分的组合(按需要)的合适的溶剂中，接着无菌过滤而制备。通常，分散体通过将活性化合物掺入包含基础分散介质和来自上文列举的那些的所需的其它成分的无菌溶媒制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，制备方法为真空干燥和冷冻干燥，其自它们之前的无菌过滤溶液产生活性成分加任何其它所需成分的粉末。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。它们可包封在明胶胶囊中或压制成片剂。为口服治疗给予的目的，活性化合物可掺有赋形剂和以片剂、锭剂或胶囊剂的形式使用。口服组合物还可使用液体载体制备，用作漱口剂，其中液体载体中的化合物经口施用，并漱口和吐出或咽下。药学上相容的粘合剂和/或辅助材料可作为组合物的一部分包括在内。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可包含任何以下成分或具有类似性质的化合物：粘合剂例如微晶纤维素、西黄蓍胶或明胶；赋形剂例如淀粉或乳糖；崩解剂例如藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂例如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂例如胶态二氧化硅；甜味剂例如蔗糖或糖精；或矫味剂例如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调料。
对于通过吸入给予，化合物以气溶胶喷雾剂的形式从包含合适的抛射剂例如气体例如二氧化碳的加压容器或分配器，或喷雾器递送。
系统给予还可通过经粘膜或经皮方式进行。对于经粘膜或经皮给予，适合于待渗透屏障的渗透剂用于制剂中。这样的渗透剂通常是本领域已知的，和对于经粘膜给予，包括例如去污剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜给予可通过使用经鼻喷雾剂或栓剂实现。对于经皮给予，将活性化合物配制成本领域通常已知的软膏剂、油膏剂、凝胶剂或霜剂。
化合物还可以用于直肠递送的栓剂(例如，用常规栓剂基料例如可可脂和其它甘油酯)或滞留灌肠剂的形式制备。
在一个实施方案中，活性化合物用将保护化合物免于快速从身体清除的载体制备，例如持续/控制释放制剂，包括植埋剂和微囊递送系统。可使用可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这样的制剂的方法对本领域技术人员而言是显而易见的。
例如，活性成分可被包封在微囊中，微囊在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米粒和纳米囊)或大乳剂中例如通过凝聚技术或通过界面聚合(例如分别为羟甲基纤维素或明胶-微囊和聚-(异丁烯酸甲酯)微囊)制备。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适的实例包括包含抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质呈成型物的形式，例如，膜或微囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-异丁烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-羟乙酸共聚物例如LUPRON DEPOT TM (由乳酸-羟乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。尽管聚合物例如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羟乙酸能够释放分子超过100天，但某些水凝胶释放蛋白较短的时间。
所述材料还可市售获自Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals, Inc。脂质体混悬液(包括具有针对病毒抗原的单克隆抗体的靶向感染细胞的脂质体)也可用作药学上可接受的载体。这些可按照本领域技术人员已知的方法制备，例如如美国专利号4,522,811中所述。
为易于给予和剂量均匀，特别有利的是以剂量单位形式配制口服或胃肠外组合物。如本文所用的剂量单位形式是指作为单元剂量适合于待治疗的受试者的物理离散单位；各单位包含经计算以产生所需治疗效果的预定量的活性化合物以及所需药用载体。本公开内容的剂量单位形式的规格由活性化合物的独特性质和待实现的特定治疗效果以及配制这样的活性化合物用于治疗个体的本领域固有的限制来支配，并直接依赖于它们。
所述药物组合物以及用于给予的说明书可包括在容器、包或分配器中。
所述制剂还可包含所治疗的特定适应症所必需的超过一种活性化合物，例如具有补充活性的那些，它们不会不利地彼此影响。备选地或另外，组合物可包含提高其功能的试剂，例如细胞毒性剂、细胞因子、化学治疗剂或生长抑制剂。这样的分子以对预期目的有效的量合适地组合存在。
在一个实施方案中，活性化合物以组合疗法给予，即，与其它试剂(例如，治疗剂)组合，所述试剂可用于治疗病理性病况或病症，例如自身免疫性病症和炎性疾病。在该背景下，术语“组合”意指基本上同期(同时或序贯)给予试剂。如果序贯给予，在开始给予第二化合物时，两种化合物的第一种仍可在治疗部位处以有效浓度检出。
例如，组合疗法可包括本公开内容的一种或多种抗体，其与一种或多种另外的治疗剂共配制和/或与一种或多种另外的治疗剂共给予，所述另外的治疗剂例如一种或多种细胞因子和生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎剂、代谢抑制剂、酶抑制剂和/或细胞毒性或细胞生长抑制剂，如下文更详细所述。此外，本文所述的一种或多种抗体可与两种或更多种本文所述的治疗剂组合使用。这样的组合疗法可有利地使用较低剂量的所给予的治疗剂，从而避免与各种单一疗法有关的可能的毒性或并发症。
在其它实施方案中，本公开内容的一种或多种抗体可与一种或多种抗炎药、免疫抑制剂或代谢或酶抑制剂共配制和/或与一种或多种抗炎药、免疫抑制剂或代谢或酶抑制剂共给予。可与本文所述的抗体组合使用的药物或抑制剂的非限制性实例包括但不限于以下的一种或多种：非甾类抗炎药(NSAID)，例如，布洛芬、替尼达普、萘普生、美洛昔康、吡罗昔康、双氯芬酸和吲哚美辛；柳氮磺吡啶；皮质类固醇例如泼尼松龙；细胞因子抑制性抗炎药(CSAID)；核苷酸生物合成的抑制剂，例如，嘌呤生物合成的抑制剂、叶酸拮抗剂(例如，甲氨喋呤(N-[4-[[(2,4-二氨基-6-蝶啶基)甲基]甲基氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸)；和嘧啶生物合成的抑制剂，例如，二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)抑制剂。与本公开内容的抗体组合使用的合适的治疗剂包括NSAID、CSAID、(DHODH)抑制剂(例如，来氟米特)和叶酸拮抗剂(例如，甲氨喋呤)。
另外的抑制剂的实例包括以下的一种或多种：皮质类固醇(口服、吸入和局部注射)；免疫抑制剂，例如，环孢霉素、他克莫司(FK-506)；和mTOR抑制剂，例如，西罗莫司(雷帕霉素 - RAPAMUNETM或雷帕霉素衍生物，例如，可溶性雷帕霉素衍生物(例如，酯雷帕霉素衍生物，例如，CCI-779)；干扰通过促炎细胞因子例如TNFα或IL-1的信号转导的试剂(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)；COX2抑制剂，例如，塞来考昔、罗非考昔和其变体；磷酸二酯酶抑制剂，例如，R973401 (磷酸二酯酶IV型抑制剂)；磷脂酶抑制剂，例如，细胞溶质磷脂酶2 (cPLA2)的抑制剂(例如，三氟甲基酮类似物)；血管内皮细胞生长因子或生长因子受体的抑制剂，例如，VEGF抑制剂和/或VEGF-R抑制剂；和血管发生的抑制剂。与本公开内容的抗体组合使用的合适的治疗剂是免疫抑制剂，例如，环孢霉素、他克莫司(FK-506)；mTOR抑制剂，例如，西罗莫司(雷帕霉素)或雷帕霉素衍生物，例如，可溶性雷帕霉素衍生物(例如，酯雷帕霉素衍生物，例如，CCI-779)；COX2抑制剂，例如，塞来考昔和其变体；和磷脂酶抑制剂，例如，细胞溶质磷脂酶2 (cPLA2)的抑制剂，例如，三氟甲基酮类似物。
可与本公开内容的抗体组合的治疗剂的另外的实例包括以下的一种或多种：6-巯基嘌呤(6-MP)；硫唑嘌呤柳氮磺吡啶；美沙拉秦；奥沙拉秦；氯喹/羟氯喹(PLAQUENIL®)；青霉胺；aurothiornalate (肌内和口服)；硫唑嘌呤；秋水仙碱；β-2肾上腺素受体激动剂(沙丁胺醇、特布他林、沙美特罗)；黄嘌呤(茶碱、氨茶碱)；色甘酸酯；奈多罗米；酮替芬；异丙托铵和氧托品(oxitropium)；麦考酚酸莫酯；腺苷激动剂；抗凝血剂；补体抑制剂；和肾上腺素能剂。
本文引用的所有出版物和专利文件通过引用结合到本文中，如同各个这样的出版物或文件具体且单独地指出通过引用结合到本文中一样。出版物和专利文件的引用不意欲承认任何是相关的现有技术，也不构成关于出版物和专利文件的内容或日期的任何承认。本发明现在已通过书面描述的方式进行了描述，本领域技术人员将认识到，本发明可以各种实施方案实施，和前述描述和下文的实施例为说明的目的，并不限制所附的权利要求。
实施例
表7中所示的以下序列包括贯穿本文提供的实施例中使用的序列。
表7：示例性的序列
抗人CTLA-4 scFv抗体:
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抗人CD3 ε OKT3 scFv抗体:
GGAGGTGGATCTGGAGGTGGCGGTTCAGGCTCTGGCGGAGGCTCAGGTGGTGGAGGATCAGGCGGAGGTCAGGTTCAGCTGCAGCAGAGCGGTGCAGAACTGGCACGTCCGGGTGCAAGCGTTAAAATGAGCTGTAAAGCAAGCGGTTATACCTTTACCCGTTATACCATGCATTGGGTTAAACAGCGTCCGGGTCAGGGTCTGGAATGGATTGGTTATATCAATCCGAGCCGTGGTTATACCAACTACAACCAGAAATTCAAAGATAAAGCAACCCTGACCACCGATAAAAGCAGCAGCACCGCCTATATGCAGCTGAGCAGCCTGACCTCAGAGGATAGCGCAGTTTATTACTGTGCACGCTATTATGATGATCACTATTGCCTGGATTATTGGGGTCAGGGCACCACCCTGACCGTTAGCAGCGGTGGTGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGTTCAGGCGGTGGCGGTAGCCAGATTGTTCTGACCCAGAGTCCGGCAATTATGAGCGCAAGTCCGGGTGAAAAAGTTACCATGACCTGTAGCGCCAGCAGCAGCGTTAGCTATATGAATTGGTATCAGCAGAAAAGCGGCACCAGCCCGAAACGTTGGATTTATGATACCAGCAAACTGGCAAGCGGTGTTCCGGCACATTTTCGTGGTAGCGGTAGCGGCACCTCATATAGCCTGACCATTAGCGGTATGGAAGCAGAAGATGCAGCAACCTATTATTGTCAGCAGTGGTCAAGCAATCCGTTTACCTTTGGTAGTGGCACCAAACTGGAAATTAATCGT (SEQ ID NO: 231)
GGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGGQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR (SEQ ID NO: 232)
抗人Jagged 4D11v2抗体：重链
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EVHLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIDPEGRQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:234)
抗人Jagged 4D11v2抗体：轻链
Gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattagcagctatttaaattggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatgcggcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcaacagacggttgtggcgcctccgttattcggccaagggaccaaggtggaaatcaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgancaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt (SEQ ID NO: 235)
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抗人Jagged 4D11抗体：重链
gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttagcagctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtgtcaagtattgacccggaaggtcggcagacatattacgcagactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtatattactgtgcgaaagacatcggcggcaggtcggcctttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO:237)
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抗Jagged可活化抗体5342-1204-4D11v2：轻链
caaggccagtctggccagtgcaatatttggctcgtaggtggtgattgcaggggctggcaggggggctcgagcggtggcagcggtggctctggtggtctgagcggccgttccgataatcatggcggcggttctgacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattagcagctatttaaattggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatgcggcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcaacagacggttgtggcgcctccgttattcggccaagggaccaaggtggaaatcaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt (SEQ ID NO: 239)
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抗Jagged 4D11v2 –抗CD3 OKT3多特异性抗体：重链
GAGGTGCACCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGTCAAGTATTGACCCGGAAGGTCGGCAGACATATTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGACATCGGCGGCAGGTCGGCCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGAGGTGGATCTGGAGGTGGCGGTTCAGGCTCTGGCGGAGGCTCAGGTGGTGGAGGATCAGGCGGAGGTCAGGTTCAGCTGCAGCAGAGCGGTGCAGAACTGGCACGTCCGGGTGCAAGCGTTAAAATGAGCTGTAAAGCAAGCGGTTATACCTTTACCCGTTATACCATGCATTGGGTTAAACAGCGTCCGGGTCAGGGTCTGGAATGGATTGGTTATATCAATCCGAGCCGTGGTTATACCAACTACAACCAGAAATTCAAAGATAAAGCAACCCTGACCACCGATAAAAGCAGCAGCACCGCCTATATGCAGCTGAGCAGCCTGACCTCAGAGGATAGCGCAGTTTATTACTGTGCACGCTATTATGATGATCACTATTGCCTGGATTATTGGGGTCAGGGCACCACCCTGACCGTTAGCAGCGGTGGTGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGTTCAGGCGGTGGCGGTAGCCAGATTGTTCTGACCCAGAGTCCGGCAATTATGAGCGCAAGTCCGGGTGAAAAAGTTACCATGACCTGTAGCGCCAGCAGCAGCGTTAGCTATATGAATTGGTATCAGCAGAAAAGCGGCACCAGCCCGAAACGTTGGATTTATGATACCAGCAAACTGGCAAGCGGTGTTCCGGCACATTTTCGTGGTAGCGGTAGCGGCACCTCATATAGCCTGACCATTAGCGGTATGGAAGCAGAAGATGCAGCAACCTATTATTGTCAGCAGTGGTCAAGCAATCCGTTTACCTTTGGTAGTGGCACCAAACTGGAAATTAATCGT (SEQ ID NO: 241)
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抗-Jagged 4D11v2 –抗-CD3 OKT3多特异性抗体：轻链
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACGGTTGTGGCGCCTCCGTTATTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGANCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTGGAGGTGGATCTGGAGGTGGCGGTTCAGGCTCTGGCGGAGGCTCAGGTGGTGGAGGATCAGGCGGAGGTCAGGTTCAGCTGCAGCAGAGCGGTGCAGAACTGGCACGTCCGGGTGCAAGCGTTAAAATGAGCTGTAAAGCAAGCGGTTATACCTTTACCCGTTATACCATGCATTGGGTTAAACAGCGTCCGGGTCAGGGTCTGGAATGGATTGGTTATATCAATCCGAGCCGTGGTTATACCAACTACAACCAGAAATTCAAAGATAAAGCAACCCTGACCACCGATAAAAGCAGCAGCACCGCCTATATGCAGCTGAGCAGCCTGACCTCAGAGGATAGCGCAGTTTATTACTGTGCACGCTATTATGATGATCACTATTGCCTGGATTATTGGGGTCAGGGCACCACCCTGACCGTTAGCAGCGGTGGTGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGTTCAGGCGGTGGCGGTAGCCAGATTGTTCTGACCCAGAGTCCGGCAATTATGAGCGCAAGTCCGGGTGAAAAAGTTACCATGACCTGTAGCGCCAGCAGCAGCGTTAGCTATATGAATTGGTATCAGCAGAAAAGCGGCACCAGCCCGAAACGTTGGATTTATGATACCAGCAAACTGGCAAGCGGTGTTCCGGCACATTTTCGTGGTAGCGGTAGCGGCACCTCATATAGCCTGACCATTAGCGGTATGGAAGCAGAAGATGCAGCAACCTATTATTGTCAGCAGTGGTCAAGCAATCCGTTTACCTTTGGTAGTGGCACCAAACTGGAAATTAATCGT(SEQ ID NO: 243)
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抗-Jagged—抗-CD3多特异性可活化抗体5342-1204-4D11v2—CD3 OKT3：轻链
CAAGGCCAGTCTGGCCAGTGCAATATTTGGCTCGTAGGTGGTGATTGCAGGGGCTGGCAGGGGGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGTCTGAGCGGCCGTTCCGATAATCATGGCGGCGGTTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACGGTTGTGGCGCCTCCGTTATTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGANCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTGGAGGTGGATCTGGAGGTGGCGGTTCAGGCTCTGGCGGAGGCTCAGGTGGTGGAGGATCAGGCGGAGGTCAGGTTCAGCTGCAGCAGAGCGGTGCAGAACTGGCACGTCCGGGTGCAAGCGTTAAAATGAGCTGTAAAGCAAGCGGTTATACCTTTACCCGTTATACCATGCATTGGGTTAAACAGCGTCCGGGTCAGGGTCTGGAATGGATTGGTTATATCAATCCGAGCCGTGGTTATACCAACTACAACCAGAAATTCAAAGATAAAGCAACCCTGACCACCGATAAAAGCAGCAGCACCGCCTATATGCAGCTGAGCAGCCTGACCTCAGAGGATAGCGCAGTTTATTACTGTGCACGCTATTATGATGATCACTATTGCCTGGATTATTGGGGTCAGGGCACCACCCTGACCGTTAGCAGCGGTGGTGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGTTCAGGCGGTGGCGGTAGCCAGATTGTTCTGACCCAGAGTCCGGCAATTATGAGCGCAAGTCCGGGTGAAAAAGTTACCATGACCTGTAGCGCCAGCAGCAGCGTTAGCTATATGAATTGGTATCAGCAGAAAAGCGGCACCAGCCCGAAACGTTGGATTTATGATACCAGCAAACTGGCAAGCGGTGTTCCGGCACATTTTCGTGGTAGCGGTAGCGGCACCTCATATAGCCTGACCATTAGCGGTATGGAAGCAGAAGATGCAGCAACCTATTATTGTCAGCAGTGGTCAAGCAATCCGTTTACCTTTGGTAGTGGCACCAAACTGGAAATTAATCGT (SEQ ID NO: 245)
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抗-Jagged 4D11v2—抗-CTLA-4多特异性抗体：重链
GAGGTGCACCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGTCAAGTATTGACCCGGAAGGTCGGCAGACATATTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGACATCGGCGGCAGGTCGGCCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGAGGTGGATCTGGAGGTGGCGGTTCAGGCTCTGGCGGAGGCTCAGGTGGTGGAGGATCAGGCGGAGGTGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTTCCGGAGGGTCGACCATAACTTCGTATAATGTATACTATACGAAGTTATCCTCGAGCGGTACCCAGGTGCAGCTGGTGCAGACTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATCCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGACAAACTCCCTTTACTGGTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACTGTCTCTTCAGC (SEQ ID NO: 247)
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抗-Jagged 4D11v2—抗-CTLA-4多特异性抗体：轻链
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抗-Jagged—抗-CTLA-4多特异性可活化抗体5342-1204-4D11v2—CTLA-4：轻链
CAAGGCCAGTCTGGCCAGTGCAATATTTGGCTCGTAGGTGGTGATTGCAGGGGCTGGCAGGGGGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGTCTGAGCGGCCGTTCCGATAATCATGGCGGCGGTTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCGGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACGGTTGTGGCGCCTCCGTTATTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGANCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTGGAGGTGGATCTGGAGGTGGCGGTTCAGGCTCTGGCGGAGGCTCAGGTGGTGGAGGATCAGGCGGAGGTGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTTCCGGAGGGTCGACCATAACTTCGTATAATGTATACTATACGAAGTTATCCTCGAGCGGTACCCAGGTGCAGCTGGTGCAGACTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATCCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGACAAACTCCCTTTACTGGTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACTGTCTCTTCAGCTAGC (SEQ ID NO: 251)
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抗-EGFR C225v5抗体：重链
caggtgcagctgaaacagagcggcccgggcctggtgcagccgagccagagcctgagcattacctgcaccgtgagcggctttagcctgaccaactatggcgtgcattgggtgcgccagagcccgggcaaaggcctggaatggctgggcgtgatttggagcggcggcaacaccgattataacaccccgtttaccagccgcctgagcattaacaaagataacagcaaaagccaggtgttttttaaaatgaacagcctgcaaagccaggataccgcgatttattattgcgcgcgcgcgctgacctattatgattatgaatttgcgtattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcgcggctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgaactgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga (SEQ IDNO: 253)
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抗-EGFR C225v5抗体：轻链
CAGATCTTGCTGACCCAGAGCCCGGTGATTCTGAGCGTGAGCCCGGGCGAACGTGTGAGCTTTAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCATTGGCACCAACATTCATTGGTATCAGCAGCGCACCAACGGCAGCCCGCGCCTGCTGATTAAATATGCGAGCGAAAGCATTAGCGGCATTCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGAGCATTAACAGCGTGGAAAGCGAAGATATTGCGGATTATTATTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCGACCACCTTTGGCGCGGGCACCAAACTGGAACTGAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT (SEQ ID NO: 255)
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抗-EGFR C225v5抗体：重链
caggtgcagctgaaacagagcggcccgggcctggtgcagccgagccagagcctgagcattacctgcaccgtgagcggctttagcctgaccaactatggcgtgcattgggtgcgccagagcccgggcaaaggcctggaatggctgggcgtgatttggagcggcggcaacaccgattataacaccccgtttaccagccgcctgagcattaacaaagataacagcaaaagccaggtgttttttaaaatgaacagcctgcaaagcaacgataccgcgatttattattgcgcgcgcgcgctgacctattatgattatgaatttgcgtattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcgcggctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagcgcgttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgaactgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO:257)
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抗-EGFR C225v5抗体：轻链
Ggcggtacccagatcttgctgacccagagcccggtgattctgagcgtgagcccgggcgaacgtgtgagctttagctgccgcgcgagccagagcattggcaccaacattcattggtatcagcagcgcaccaacggcagcccgcgcctgctgattaaatatgcgagcgaaagcattagcggcattccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgagcattaacagcgtggaaagcgaagatattgcggattattattgccagcagaacaacaactggccgaccacctttggcgcgggcaccaaactggaactgaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagcg (SEQ ID NO: 259)
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抗-EGFR C225v4抗体：重链
caggtgcagctgaaacagagcggcccgggcctggtgcagccgagccagagcctgagcattacctgcaccgtgagcggctttagcctgaccaactatggcgtgcattgggtgcgccagagcccgggcaaaggcctggaatggctgggcgtgatttggagcggcggcaacaccgattataacaccccgtttaccagccgcctgagcattaacaaagataacagcaaaagccaggtgttttttaaaatgaacagcctgcaaagcaacgataccgcgatttattattgcgcgcgcgcgctgacctattatgattatgaatttgcgtattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcgcggctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgaactgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga (SEQ IDNO: 261)
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抗-EGFR C225v4抗体：轻链
Cagatcttgctgacccagagcccggtgattctgagcgtgagcccgggcgaacgtgtgagctttagctgccgcgcgagccagagcattggcaccaacattcattggtatcagcagcgcaccaacggcagcccgcgcctgctgattaaatatgcgagcgaaagcattagcggcattccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgagcattaacagcgtggaaagcgaagatattgcggattattattgccagcagaacaacaactggccgaccacctttggcgcgggcaccaaactggaactgaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag (SEQ ID NO: 263)
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抗-EGFR C225v6抗体：重链
caggtgcagctgaaacagagcggcccgggcctggtgcagccgagccagagcctgagcattacctgcaccgtgagcggctttagcctgaccaactatggcgtgcattgggtgcgccagagcccgggcaaaggcctggaatggctgggcgtgatttggagcggcggcaacaccgattataacaccccgtttaccagccgcctgagcattaacaaagataacagcaaaagccaggtgttttttaaaatgaacagcctgcaaagccaggataccgcgatttattattgcgcgcgcgcgctgacctattatgattatgaatttgcgtattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcgcggctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacgccagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgaactgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga (SEQ IDNO: 265)
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抗-EGFR C225v6抗体：轻链
Cagatcttgctgacccagagcccggtgattctgagcgtgagcccgggcgaacgtgtgagctttagctgccgcgcgagccagagcattggcaccaacattcattggtatcagcagcgcaccaacggcagcccgcgcctgctgattaaatatgcgagcgaaagcattagcggcattccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgagcattaacagcgtggaaagcgaagatattgcggattattattgccagcagaacaacaactggccgaccacctttggcgcgggcaccaaactggaactgaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag (SEQ ID NO: 267)
QILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQID NO: 268)
抗-EGFR可活化抗体3954-1204-C225v5：轻链:
[间隔区(SEQ ID NO: 283)][掩蔽物(SEQ ID NO: 284)][ 接头1 (SEQ ID NO:285)][1204底物(SEQ ID NO: 286)][ 接头2 (SEQ ID NO: 287)][C225v5轻链(SEQ ID NO:255)]
[caaggccagtctggccag][tgcatctcacctcgtggttgtccggacggcccatacgtcatgtacgg ctcgagcggtggcagcggtggctctggtggatccggt ][ctgagcggccgttccgataatcat][ ggcagtagcggtacc ][cagatcttgctgacccagagcccggtgattctgagcgtgagcccgggcgaacgtgtgagctttagctgccgcgcgagccagagcattggcaccaacattcattggtatcagcagcgcaccaacggcagcccgcgcctgctgattaaatatgcgagcgaaagcattagcggcattccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgagcattaacagcgtggaaagcgaagatattgcggattattattgccagcagaacaacaactggccgaccacctttggcgcgggcaccaaactggaactgaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag] (SEQ ID NO: 269)
[间隔区(SEQ ID NO: 46)][掩蔽物(SEQ ID NO: 77)][ 接头1 (SEQ ID NO:288)][1204底物(SEQ ID NO: 26)][ 接头2 (SEQ ID NO: 289)][C225v5 (SEQ ID NO:256)]
[QGQSGQ][CISPRGCPDGPYVMY][ GSSGGSGGSGGSG ][LSGRSDNH][ GSSGT ][QILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*] (SEQ ID NO: 270)
抗-EGFR C225v5 –抗-CD3 OKT3多特异性抗体：重链
CAGGTGCAGCTGAAACAGAGCGGCCCGGGCCTGGTGCAGCCGAGCCAGAGCCTGAGCATTACCTGCACCGTGAGCGGCTTTAGCCTGACCAACTATGGCGTGCATTGGGTGCGCCAGAGCCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATTTGGAGCGGCGGCAACACCGATTATAACACCCCGTTTACCAGCCGCCTGAGCATTAACAAAGATAACAGCAAAAGCCAGGTGTTTTTTAAAATGAACAGCCTGCAAAGCCAGGATACCGCGATTTATTATTGCGCGCGCGCGCTGACCTATTATGATTATGAATTTGCGTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCGGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAACTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGAGGTGGATCTGGAGGTGGCGGTTCAGGCTCTGGCGGAGGCTCAGGTGGTGGAGGATCAGGCGGAGGTCAGGTTCAGCTGCAGCAGAGCGGTGCAGAACTGGCACGTCCGGGTGCAAGCGTTAAAATGAGCTGTAAAGCAAGCGGTTATACCTTTACCCGTTATACCATGCATTGGGTTAAACAGCGTCCGGGTCAGGGTCTGGAATGGATTGGTTATATCAATCCGAGCCGTGGTTATACCAACTACAACCAGAAATTCAAAGATAAAGCAACCCTGACCACCGATAAAAGCAGCAGCACCGCCTATATGCAGCTGAGCAGCCTGACCTCAGAGGATAGCGCAGTTTATTACTGTGCACGCTATTATGATGATCACTATTGCCTGGATTATTGGGGTCAGGGCACCACCCTGACCGTTAGCAGCGGTGGTGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGTTCAGGCGGTGGCGGTAGCCAGATTGTTCTGACCCAGAGTCCGGCAATTATGAGCGCAAGTCCGGGTGAAAAAGTTACCATGACCTGTAGCGCCAGCAGCAGCGTTAGCTATATGAATTGGTATCAGCAGAAAAGCGGCACCAGCCCGAAACGTTGGATTTATGATACCAGCAAACTGGCAAGCGGTGTTCCGGCACATTTTCGTGGTAGCGGTAGCGGCACCTCATATAGCCTGACCATTAGCGGTATGGAAGCAGAAGATGCAGCAACCTATTATTGTCAGCAGTGGTCAAGCAATCCGTTTACCTTTGGTAGTGGCACCAAACTGGAAATTAATCGT (SEQ ID NO: 271)
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSQDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGGQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR (SEQ ID NO: 272)
抗-EGFR C225v5 –抗-CD3 OKT3多特异性抗体：轻链
CAGATCTTGCTGACCCAGAGCCCGGTGATTCTGAGCGTGAGCCCGGGCGAACGTGTGAGCTTTAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCATTGGCACCAACATTCATTGGTATCAGCAGCGCACCAACGGCAGCCCGCGCCTGCTGATTAAATATGCGAGCGAAAGCATTAGCGGCATTCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGAGCATTAACAGCGTGGAAAGCGAAGATATTGCGGATTATTATTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCGACCACCTTTGGCGCGGGCACCAAACTGGAACTGAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTGGAGGTGGATCTGGAGGTGGCGGTTCAGGCTCTGGCGGAGGCTCAGGTGGTGGAGGATCAGGCGGAGGTCAGGTTCAGCTGCAGCAGAGCGGTGCAGAACTGGCACGTCCGGGTGCAAGCGTTAAAATGAGCTGTAAAGCAAGCGGTTATACCTTTACCCGTTATACCATGCATTGGGTTAAACAGCGTCCGGGTCAGGGTCTGGAATGGATTGGTTATATCAATCCGAGCCGTGGTTATACCAACTACAACCAGAAATTCAAAGATAAAGCAACCCTGACCACCGATAAAAGCAGCAGCACCGCCTATATGCAGCTGAGCAGCCTGACCTCAGAGGATAGCGCAGTTTATTACTGTGCACGCTATTATGATGATCACTATTGCCTGGATTATTGGGGTCAGGGCACCACCCTGACCGTTAGCAGCGGTGGTGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGTTCAGGCGGTGGCGGTAGCCAGATTGTTCTGACCCAGAGTCCGGCAATTATGAGCGCAAGTCCGGGTGAAAAAGTTACCATGACCTGTAGCGCCAGCAGCAGCGTTAGCTATATGAATTGGTATCAGCAGAAAAGCGGCACCAGCCCGAAACGTTGGATTTATGATACCAGCAAACTGGCAAGCGGTGTTCCGGCACATTTTCGTGGTAGCGGTAGCGGCACCTCATATAGCCTGACCATTAGCGGTATGGAAGCAGAAGATGCAGCAACCTATTATTGTCAGCAGTGGTCAAGCAATCCGTTTACCTTTGGTAGTGGCACCAAACTGGAAATTAATCGT(SEQ ID NO: 273)
QILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGGQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR (SEQ ID NO: 274)
抗-EGFR –抗-CD3多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5-OKT3：轻链
CAAGGCCAGTCTGGCCAGTGCATCTCACCTCGTGGTTGTCCGGACGGCCCATACGTCATGTACGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGATCCGGTCTGAGCGGCCGTTCCGATAATCATGGCAGTAGCGGTACCCAGATCTTGCTGACCCAGAGCCCGGTGATTCTGAGCGTGAGCCCGGGCGAACGTGTGAGCTTTAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCATTGGCACCAACATTCATTGGTATCAGCAGCGCACCAACGGCAGCCCGCGCCTGCTGATTAAATATGCGAGCGAAAGCATTAGCGGCATTCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGAGCATTAACAGCGTGGAAAGCGAAGATATTGCGGATTATTATTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCGACCACCTTTGGCGCGGGCACCAAACTGGAACTGAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTGGAGGTGGATCTGGAGGTGGCGGTTCAGGCTCTGGCGGAGGCTCAGGTGGTGGAGGATCAGGCGGAGGTCAGGTTCAGCTGCAGCAGAGCGGTGCAGAACTGGCACGTCCGGGTGCAAGCGTTAAAATGAGCTGTAAAGCAAGCGGTTATACCTTTACCCGTTATACCATGCATTGGGTTAAACAGCGTCCGGGTCAGGGTCTGGAATGGATTGGTTATATCAATCCGAGCCGTGGTTATACCAACTACAACCAGAAATTCAAAGATAAAGCAACCCTGACCACCGATAAAAGCAGCAGCACCGCCTATATGCAGCTGAGCAGCCTGACCTCAGAGGATAGCGCAGTTTATTACTGTGCACGCTATTATGATGATCACTATTGCCTGGATTATTGGGGTCAGGGCACCACCCTGACCGTTAGCAGCGGTGGTGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGTTCAGGCGGTGGCGGTAGCCAGATTGTTCTGACCCAGAGTCCGGCAATTATGAGCGCAAGTCCGGGTGAAAAAGTTACCATGACCTGTAGCGCCAGCAGCAGCGTTAGCTATATGAATTGGTATCAGCAGAAAAGCGGCACCAGCCCGAAACGTTGGATTTATGATACCAGCAAACTGGCAAGCGGTGTTCCGGCACATTTTCGTGGTAGCGGTAGCGGCACCTCATATAGCCTGACCATTAGCGGTATGGAAGCAGAAGATGCAGCAACCTATTATTGTCAGCAGTGGTCAAGCAATCCGTTTACCTTTGGTAGTGGCACCAAACTGGAAATTAATCGT (SEQ ID NO:275)
QGQSGQCISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGLSGRSDNHGSSGTQILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGGQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR(SEQ ID NO: 276)
抗-Egfr C225v5-抗-CTLA-4多特异性抗体：重链
CAGGTGCAGCTGAAACAGAGCGGCCCGGGCCTGGTGCAGCCGAGCCAGAGCCTGAGCATTACCTGCACCGTGAGCGGCTTTAGCCTGACCAACTATGGCGTGCATTGGGTGCGCCAGAGCCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATTTGGAGCGGCGGCAACACCGATTATAACACCCCGTTTACCAGCCGCCTGAGCATTAACAAAGATAACAGCAAAAGCCAGGTGTTTTTTAAAATGAACAGCCTGCAAAGCCAGGATACCGCGATTTATTATTGCGCGCGCGCGCTGACCTATTATGATTATGAATTTGCGTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCGGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAACTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGAGGTGGATCTGGAGGTGGCGGTTCAGGCTCTGGCGGAGGCTCAGGTGGTGGAGGATCAGGCGGAGGTGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTTCCGGAGGGTCGACCATAACTTCGTATAATGTATACTATACGAAGTTATCCTCGAGCGGTACCCAGGTGCAGCTGGTGCAGACTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATCCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGACAAACTCCCTTTACTGGTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACTGTCTCTTCAGCTAGC (SEQ ID NO: 277)
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSQDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGGGTKVEIKRSGGSTITSYNVYYTKLSSSGTQVQLVQTGGGVVQPGRSLRLSCAASGSTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATNSLYWYFDLWGRGTLVTVSSAS (SEQ ID NO: 278)
抗-Egfr C225v5-抗-CTLA-4多特异性抗体：轻链
CAGATCTTGCTGACCCAGAGCCCGGTGATTCTGAGCGTGAGCCCGGGCGAACGTGTGAGCTTTAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCATTGGCACCAACATTCATTGGTATCAGCAGCGCACCAACGGCAGCCCGCGCCTGCTGATTAAATATGCGAGCGAAAGCATTAGCGGCATTCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGAGCATTAACAGCGTGGAAAGCGAAGATATTGCGGATTATTATTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCGACCACCTTTGGCGCGGGCACCAAACTGGAACTGAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTGGAGGTGGATCTGGAGGTGGCGGTTCAGGCTCTGGCGGAGGCTCAGGTGGTGGAGGATCAGGCGGAGGTGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTTCCGGAGGGTCGACCATAACTTCGTATAATGTATACTATACGAAGTTATCCTCGAGCGGTACCCAGGTGCAGCTGGTGCAGACTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATCCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGACAAACTCCCTTTACTGGTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACTGTCTCTTCAGCTAGC (SEQ ID NO: 279)
QILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGGGTKVEIKRSGGSTITSYNVYYTKLSSSGTQVQLVQTGGGVVQPGRSLRLSCAASGSTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATNSLYWYFDLWGRGTLVTVSSAS (SEQ ID NO: 280)
抗-Egfr - 抗-CTLA-4多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5-CTLA-4：轻链
CAAGGCCAGTCTGGCCAGTGCATCTCACCTCGTGGTTGTCCGGACGGCCCATACGTCATGTACGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGATCCGGTCTGAGCGGCCGTTCCGATAATCATGGCAGTAGCGGTACCCAGATCTTGCTGACCCAGAGCCCGGTGATTCTGAGCGTGAGCCCGGGCGAACGTGTGAGCTTTAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCATTGGCACCAACATTCATTGGTATCAGCAGCGCACCAACGGCAGCCCGCGCCTGCTGATTAAATATGCGAGCGAAAGCATTAGCGGCATTCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGAGCATTAACAGCGTGGAAAGCGAAGATATTGCGGATTATTATTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCGACCACCTTTGGCGCGGGCACCAAACTGGAACTGAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTGGAGGTGGATCTGGAGGTGGCGGTTCAGGCTCTGGCGGAGGCTCAGGTGGTGGAGGATCAGGCGGAGGTGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTTCCGGAGGGTCGACCATAACTTCGTATAATGTATACTATACGAAGTTATCCTCGAGCGGTACCCAGGTGCAGCTGGTGCAGACTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATCCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGACAAACTCCCTTTACTGGTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACTGTCTCTTCAGCTAGC (SEQ ID NO: 281)
QGQSGQCISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGLSGRSDNHGSSGTQILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGGGTKVEIKRSGGSTITSYNVYYTKLSSSGTQVQLVQTGGGVVQPGRSLRLSCAASGSTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATNSLYWYFDLWGRGTLVTVSSAS (SEQ ID NO: 282)
实施例1：多特异性抗体的制备
本实施例显示抗-Jagged – CD3、抗-Jagged – CTLA-4、抗-EGFR – CD3和抗-EGFR– CTLA-4多特异性抗体的构建、表达和纯化。
使用载体表达上文显示的抗-Jagged (4D11v2)重链、5342-1204-4D11v2轻链、抗-EGFR C225v5重链和3954-1204-C225v5轻链序列。这样的载体描述于2013年4月26日提交的同时待审的申请PCT/US2013/038540 (标题“Activatable Antibodies That BindEpidermal Growth Factor Receptor And Methods Of Use Thereof”)和2013年6月21日提交的PCT/US2013/047109 (标题“Anti-Jagged Antibodies, Activatable Anti-JaggedAntibodies and Methods of Use Thereof”)，这些申请各自的内容通过引用以其整体结合到本文中。
将载体用限制酶NheI和NotI消化，载体片段通过凝胶电泳分离。插入物如下制备。人IgG CH2CH3片段在反应1中自Pop Hygro 4D11v2使用引物HCForNhe (表8, SEQ ID NO:3)和引物HCRevOL (表8, SEQ ID NO: 4)扩增，CTLA-4 scFv在反应2中自CTLA-4 scFvcDNA (SEQ ID NO: 229)使用引物CTRevNot (表8, SEQ ID NO: 1)和引物CTForOL (表8,SEQ ID NO: 2)扩增，OKT3 scFv在反应3中自OKT3 scFv cDNA (SEQ ID NO: 231)使用引物OKRevNot (表8, SEQ ID NO: 5)和引物CTForOL (表8, SEQ ID NO: 2)扩增。人IgG,CH2CH3/CTLA-4 scFv融合物通过合并反应1的10%、反应2的10%，和用引物HCForNhe和CTRevNot扩增来制备。
表8：引物序列
Figure 275086DEST_PATH_IMAGE013
扩增后，得到的DNA用限制酶NheI和NotI消化，CH2CH3/CTLA-4 scFv融合物DNA通过凝胶电泳分离。人IgG, CH2CH3/OKT3 scFv融合物通过合并反应1的10%、反应3的10%和用引物HCForNhe和CTRevNot扩增来制备。扩增后，得到的DNA用限制酶NheI和NotI消化，CH2CH3/CTLA-4 scFv融合物DNA通过凝胶电泳分离。
为插入CH2CH3/scFv片段至表达载体中，将表9中显示的以下组合用T4 DNA连接酶(Invitrogen Inc., Carlsbad, CA)连接过夜。连接后，将DNA转化至大肠杆菌菌株MC106和针对氨苄青霉素抗性进行筛选。DNA测序鉴定了包含编码正确的多特异性抗体或多特异性可活化抗体的DNA插入物的克隆，制备了DNA用于哺乳动物细胞转染。
表9：连接反应
Figure 550210DEST_PATH_IMAGE014
实施例2：多特异性抗体和多特异性可活化抗体的制备
全人IgG自瞬时转染的HEK-293细胞表达。用表10中显示的不同的重链和轻链表达载体共转染使得能够表达多特异性可活化抗体。
表10
转染编号 轻链载体 重链载体
1 抗-EGFR C225v5 LC C225v5-OKT3 HC
2 3954-1204-C225v5 LC C225v5-OKT3 HC
3 C225v5 LC C225v5-CTLA HC
4 3954-1204-C225v5 LC C225v5-CTLA HC
5 抗-Jagged 4D11v2 LC 4D11v2-OKT3 HC
6 5342-1204-4D11v2 LC 4D11v2-OKT3 HC
7 4D11v2 LC 4D11v2-CTLA HC
8 5342-1204-4D11v2 LC 4D11v2-CTLA HC
在HEK-293细胞中表达的多特异性抗体和多特异性可活化抗体通过蛋白A色谱纯化。
结合测定法：如图11所示，ELISA-结合实验揭示，抗-Jagged—CTLA-4和抗-Jagged—OKT3多特异性抗体和多特异性可活化抗体结合人Jagged 1，和抗-EGFR—CTLA-4和抗-EGFR—OKT3多特异性抗体和多特异性可活化抗体特异性地结合人EGFR。
将人Jagged 1-Fc (R&D Systems; Cat # 1277-JG-050)和人EGFR (R&DSystems, Cat # 344-ER-050)吸附到96-孔ELISA板的不同的孔。将纯化的抗-Jagged—CTLA和抗-Jagged—OKT3、抗-EGFR—CTLA或抗-EGFR—OKT3抗体施用于板并允许结合。结合的抗体用抗人IgG-HRP缀合物(Fab特异性的, Sigma, St Louis, MO; Cat # A0293-1ML)可视化，和用发色底物TMB显色。
如图12A和12B中所示，ELISA-结合实验揭示，抗-Jagged—CTLA-4和抗-EGFR—CTLA-4 特异性地结合人和小鼠CTLA-4两者(抗人CTLA-4抗体与小鼠和人CTLA-4两者交叉反应)：将人CTLA-4 (R&D Systems; Cat # 325-CT-200/CF)或小鼠CTLA-4 (R&D Systems,Cat # 434-CT-200/CF)吸附至单独的96-孔ELISA板的孔中。将纯化的抗-Jagged 4D11v2—CTLA-4、抗-Jagged可活化抗体5342-1204-4D11v2—CTLA-4、抗-EGFR C225v5—CTLA-4或可活化抗体3954-1204-C225v5—CTLA-4施用至板并允许结合。结合的抗体用抗人IgG-HRP缀合物(Fab特异性的, Sigma, St Louis, MO; Cat # A0293-1ML)可视化和用发色底物TMB显色。结合的特异性通过对人CD3ε特异性的抗体—OKT3融合物不能结合来证实。
实施例3：OKT3与CD3ε结合
如图13中所示，ELISA-结合实验揭示，抗-EGFR多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5—OKT3和抗-Jagged多特异性可活化抗体5342-1204-4D11v2—OKT3特异性地结合人CD3ε。将人CD3ε (NovoProtein, Cat# C578)吸附至96-孔ELISA板的孔中。将纯化的抗-EGFR多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5—CTLA-4、抗-EGFR多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5—OKT3、抗-Jagged多特异性可活化抗体5342-1204-4D11v2—CTLA-4或抗-Jagged多特异性可活化抗体5342-1204-4D11v2—OKT3施用至板并允许结合。结合的抗体用抗人IgG-HRP缀合物(Fab特异性的, Sigma, St Louis, MO; Cat # A0293-1ML)可视化，和用发色底物TMB显色。
实施例4：多特异性可活化抗体的蛋白酶活化
活化
将多特异性抗体和多特异性可活化抗体稀释在PBS中至终浓度0.8 mg/ml。加入重组人uPA (R&D Systems, 目录1310-SE)至终浓度700 nM和在37℃孵育~20 h。取出和制备消化液等份部分用于如下所述的SDS-PAGE分析，和在PBS; 0.05% Tween20和10 mg/mL牛血清白蛋白中稀释至100 nM用于在结合ELISA测定法中分析。
对于PAGE，将样品在1x LDS样品缓冲液中在70℃变性10分钟，加入TCEP至终浓度40 mM，然后电泳。将6 µg抗体上样到NuPAGE 10% Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上，使用MOPS电泳缓冲液将蛋白按大小分开。电泳后，凝胶用考马斯蓝染色和结果显示在图14中。在存在uPA的情况下抗-EGFR可活化抗体3954-1204-C225v5、抗-EGFR多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5—CTLA-4、抗-Jagged可活化抗体5342-1204-4D11v2和抗-Jagged多特异性可活化抗体5342-1204-4D11v2—CTLA-4轻链的迁移率的变化证实多特异性可活化抗体的蛋白水解活化。缺少重链融合物的迁移率的任何变化证实对蛋白酶裂解的抵抗。
结合测定法
图15的子图A通过ELISA显示抗-EGFR多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5—CTLA-4以与C225v5 (3 nM)或C225v5—CTLA-4 (0.33 nM)相比较低的亲和力(Kd = 12.8nM)结合EGFR。然而，一旦被uPA活化，抗-EGFR多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5—CTLA-4以与C225v5 (0.21 nM)和C225v5—CTLA4 (0.33 nM)相比类似的亲和力(0.45 nM)结合EGFR。重要的是，uPA不裂解与重链的羧基末端融合的抗-CTLA4 scFv：如图15的子图B所示，uPA处理没有影响与人CTLA4的结合。
类似地，通过ELISA，抗-Jagged多特异性可活化抗体5342-1204-4D11v2—CTLA-4以与4D11v2 (0.44 nM)或4D11v2—CTLA4 (0.77 nM)相比较低的亲和力(15 nM)结合人Jagged 1。一旦被活化，抗-Jagged多特异性可活化抗体5342-1204-4D11v2—CTLA-4以与4D11v2 (0.54 nM)和4D11v2—CTLA4 (0.92 nM)类似的亲和力结合人Jagged 1 (图15，子图C)。uPA处理没有影响CTLA4结合(图15，子图D)。ELISA结合测量如下进行。将人Jagged 1-Fc (R&D Systems; Cat # 1277-JG-050)、人EGFR (R&D Systems, Cat#344-ER-050)或人CTLA4 (R&D Systems; Cat # 325-CT-200/CF)吸附到96-孔ELISA板的孔上。将以100 nM开始三倍稀释的未处理和uPA处理的抗体、多特异性抗体或多特异性可活化抗体施用至板并允许与板结合的抗原缔合1小时。结合后，结合的抗体用抗人IgG-HRP缀合物(Fab特异性的,Sigma, St Louis, MO; Cat # A0293-1ML)可视化，和用发色底物TMB显色。
实施例5：另外的多特异性抗体和多特异性可活化抗体序列
本实施例提供另外的多特异性抗体和多特异性可活化抗体的序列。
抗体OKT3m scFv
氨基酸序列
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR (SEQ ID NO: 306)
核苷酸序列
CAGGTTCAGCTGCAGCAGAGCGGTGCAGAACTGGCACGTCCGGGTGCAAGCGTTAAAATGAGCTGTAAAGCAAGCGGTTATACCTTTACCCGTTATACCATGCATTGGGTTAAACAGCGTCCGGGTCAGGGTCTGGAATGGATTGGTTATATCAATCCGAGCCGTGGTTATACCAACTACAACCAGAAATTCAAAGATAAAGCAACCCTGACCACCGATAAAAGCAGCAGCACCGCCTATATGCAGCTGAGCAGCCTGACCTCAGAGGATAGCGCAGTTTATTACTGTGCACGCTATTATGATGATCACTATAGCCTGGATTATTGGGGTCAGGGCACCACCCTGACCGTTAGCAGCGGTGGTGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGTTCAGGCGGTGGCGGTAGCCAGATTGTTCTGACCCAGAGTCCGGCAATTATGAGCGCAAGTCCGGGTGAAAAAGTTACCATGACCTGTAGCGCCAGCAGCAGCGTTAGCTATATGAATTGGTATCAGCAGAAAAGCGGCACCAGCCCGAAACGTTGGATTTATGATACCAGCAAACTGGCAAGCGGTGTTCCGGCACATTTTCGTGGTAGCGGTAGCGGCACCTCATATAGCCTGACCATTAGCGGTATGGAAGCAGAAGATGCAGCAACCTATTATTGTCAGCAGTGGTCAAGCAATCCGTTTACCTTTGGTAGTGGCACCAAACTGGAAATTAATCGT (SEQ ID NO: 307)
抗体OKT3m scFv Lv
氨基酸序列
qivltqspaimsaspgekvtmtcsasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtsklasgvpahfrgsgsgtsysltisgmeaedaatyycqqwssnpftfgsgtkleinr (SEQ ID NO: 308)
核苷酸序列
CAGATTGTTCTGACCCAGAGTCCGGCAATTATGAGCGCAAGTCCGGGTGAAAAAGTTACCATGACCTGTAGCGCCAGCAGCAGCGTTAGCTATATGAATTGGTATCAGCAGAAAAGCGGCACCAGCCCGAAACGTTGGATTTATGATACCAGCAAACTGGCAAGCGGTGTTCCGGCACATTTTCGTGGTAGCGGTAGCGGCACCTCATATAGCCTGACCATTAGCGGTATGGAAGCAGAAGATGCAGCAACCTATTATTGTCAGCAGTGGTCAAGCAATCCGTTTACCTTTGGTAGTGGCACCAAACTGGAAATTAATCGT (SEQ ID NO: 309)
抗体OKT3m scFv Hv
氨基酸序列
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 310)
核苷酸序列
CAGGTTCAGCTGCAGCAGAGCGGTGCAGAACTGGCACGTCCGGGTGCAAGCGTTAAAATGAGCTGTAAAGCAAGCGGTTATACCTTTACCCGTTATACCATGCATTGGGTTAAACAGCGTCCGGGTCAGGGTCTGGAATGGATTGGTTATATCAATCCGAGCCGTGGTTATACCAACTACAACCAGAAATTCAAAGATAAAGCAACCCTGACCACCGATAAAAGCAGCAGCACCGCCTATATGCAGCTGAGCAGCCTGACCTCAGAGGATAGCGCAGTTTATTACTGTGCACGCTATTATGATGATCACTATAGCCTGGATTATTGGGGTCAGGGCACCACCCTGACCGTTAGCAGC (SEQ ID NO:311)
抗体OKT3m scFv具有长接头允许连接至抗体或可活化抗体的重链(HC)或轻链(LC)的C-末端以分别产生多特异性抗体或可活化抗体
氨基酸序列
GGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGGQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR* (SEQ ID NO: 290)
核苷酸序列
GGAGGTGGATCTGGAGGTGGCGGTTCAGGCTCTGGCGGAGGCTCAGGTGGTGGAGGATCAGGCGGAGGTCAGGTTCAGCTGCAGCAGAGCGGTGCAGAACTGGCACGTCCGGGTGCAAGCGTTAAAATGAGCTGTAAAGCAAGCGGTTATACCTTTACCCGTTATACCATGCATTGGGTTAAACAGCGTCCGGGTCAGGGTCTGGAATGGATTGGTTATATCAATCCGAGCCGTGGTTATACCAACTACAACCAGAAATTCAAAGATAAAGCAACCCTGACCACCGATAAAAGCAGCAGCACCGCCTATATGCAGCTGAGCAGCCTGACCTCAGAGGATAGCGCAGTTTATTACTGTGCACGCTATTATGATGATCACTATAGCCTGGATTATTGGGGTCAGGGCACCACCCTGACCGTTAGCAGCGGTGGTGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGTTCAGGCGGTGGCGGTAGCCAGATTGTTCTGACCCAGAGTCCGGCAATTATGAGCGCAAGTCCGGGTGAAAAAGTTACCATGACCTGTAGCGCCAGCAGCAGCGTTAGCTATATGAATTGGTATCAGCAGAAAAGCGGCACCAGCCCGAAACGTTGGATTTATGATACCAGCAAACTGGCAAGCGGTGTTCCGGCACATTTTCGTGGTAGCGGTAGCGGCACCTCATATAGCCTGACCATTAGCGGTATGGAAGCAGAAGATGCAGCAACCTATTATTGTCAGCAGTGGTCAAGCAATCCGTTTACCTTTGGTAGTGGCACCAAACTGGAAATTAATCGTTGA (SEQ ID NO: 291)
抗体OKT3m scFv具有短接头以允许连接至抗体或可活化抗体的HC的N-末端以分别产生多特异性抗体或可活化抗体
氨基酸序列
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRGGGGS (SEQ ID NO: 292)
核苷酸序列
CAGGTTCAGCTGCAGCAGAGCGGTGCAGAACTGGCACGTCCGGGTGCAAGCGTTAAAATGAGCTGTAAAGCAAGCGGTTATACCTTTACCCGTTATACCATGCATTGGGTTAAACAGCGTCCGGGTCAGGGTCTGGAATGGATTGGTTATATCAATCCGAGCCGTGGTTATACCAACTACAACCAGAAATTCAAAGATAAAGCAACCCTGACCACCGATAAAAGCAGCAGCACCGCCTATATGCAGCTGAGCAGCCTGACCTCAGAGGATAGCGCAGTTTATTACTGTGCACGCTATTATGATGATCACTATAGCCTGGATTATTGGGGTCAGGGCACCACCCTGACCGTTAGCAGCGGTGGTGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGTTCAGGCGGTGGCGGTAGCCAGATTGTTCTGACCCAGAGTCCGGCAATTATGAGCGCAAGTCCGGGTGAAAAAGTTACCATGACCTGTAGCGCCAGCAGCAGCGTTAGCTATATGAATTGGTATCAGCAGAAAAGCGGCACCAGCCCGAAACGTTGGATTTATGATACCAGCAAACTGGCAAGCGGTGTTCCGGCACATTTTCGTGGTAGCGGTAGCGGCACCTCATATAGCCTGACCATTAGCGGTATGGAAGCAGAAGATGCAGCAACCTATTATTGTCAGCAGTGGTCAAGCAATCCGTTTACCTTTGGTAGTGGCACCAAACTGGAAATTAATCGTGGAGGTGGTGGATCC (SEQ ID NO:293)
多特异性抗体C225v5-OKT3m-H-N重链(与抗体C225v5 HC的N-末端连接的抗体OKT3m)
氨基酸序列
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRGGGGSQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSQDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK* (SEQ ID NO: 294)
核苷酸序列
CAGGTTCAGCTGCAGCAGAGCGGTGCAGAACTGGCACGTCCGGGTGCAAGCGTTAAAATGAGCTGTAAAGCAAGCGGTTATACCTTTACCCGTTATACCATGCATTGGGTTAAACAGCGTCCGGGTCAGGGTCTGGAATGGATTGGTTATATCAATCCGAGCCGTGGTTATACCAACTACAACCAGAAATTCAAAGATAAAGCAACCCTGACCACCGATAAAAGCAGCAGCACCGCCTATATGCAGCTGAGCAGCCTGACCTCAGAGGATAGCGCAGTTTATTACTGTGCACGCTATTATGATGATCACTATAGCCTGGATTATTGGGGTCAGGGCACCACCCTGACCGTTAGCAGCGGTGGTGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGTTCAGGCGGTGGCGGTAGCCAGATTGTTCTGACCCAGAGTCCGGCAATTATGAGCGCAAGTCCGGGTGAAAAAGTTACCATGACCTGTAGCGCCAGCAGCAGCGTTAGCTATATGAATTGGTATCAGCAGAAAAGCGGCACCAGCCCGAAACGTTGGATTTATGATACCAGCAAACTGGCAAGCGGTGTTCCGGCACATTTTCGTGGTAGCGGTAGCGGCACCTCATATAGCCTGACCATTAGCGGTATGGAAGCAGAAGATGCAGCAACCTATTATTGTCAGCAGTGGTCAAGCAATCCGTTTACCTTTGGTAGTGGCACCAAACTGGAAATTAATCGTGGAGGTGGTGGATCCCAGGTGCAGCTGAAACAGAGCGGCCCGGGCCTGGTGCAGCCGAGCCAGAGCCTGAGCATTACCTGCACCGTGAGCGGCTTTAGCCTGACCAACTATGGCGTGCATTGGGTGCGCCAGAGCCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATTTGGAGCGGCGGCAACACCGATTATAACACCCCGTTTACCAGCCGCCTGAGCATTAACAAAGATAACAGCAAAAGCCAGGTGTTTTTTAAAATGAACAGCCTGCAAAGCCAGGATACCGCGATTTATTATTGCGCGCGCGCGCTGACCTATTATGATTATGAATTTGCGTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCGGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 295)
多特异性抗体C225v5-OKT3m-H-C重链(与抗体C225v5 HC的C-末端连接的抗体OKT3m)
氨基酸序列
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSQDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGGQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR* (SEQ ID NO: 296)
核苷酸序列
CAGGTGCAGCTGAAACAGAGCGGCCCGGGCCTGGTGCAGCCGAGCCAGAGCCTGAGCATTACCTGCACCGTGAGCGGCTTTAGCCTGACCAACTATGGCGTGCATTGGGTGCGCCAGAGCCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATTTGGAGCGGCGGCAACACCGATTATAACACCCCGTTTACCAGCCGCCTGAGCATTAACAAAGATAACAGCAAAAGCCAGGTGTTTTTTAAAATGAACAGCCTGCAAAGCCAGGATACCGCGATTTATTATTGCGCGCGCGCGCTGACCTATTATGATTATGAATTTGCGTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCGGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGAGGTGGATCTGGAGGTGGCGGTTCAGGCTCTGGCGGAGGCTCAGGTGGTGGAGGATCAGGCGGAGGTCAGGTTCAGCTGCAGCAGAGCGGTGCAGAACTGGCACGTCCGGGTGCAAGCGTTAAAATGAGCTGTAAAGCAAGCGGTTATACCTTTACCCGTTATACCATGCATTGGGTTAAACAGCGTCCGGGTCAGGGTCTGGAATGGATTGGTTATATCAATCCGAGCCGTGGTTATACCAACTACAACCAGAAATTCAAAGATAAAGCAACCCTGACCACCGATAAAAGCAGCAGCACCGCCTATATGCAGCTGAGCAGCCTGACCTCAGAGGATAGCGCAGTTTATTACTGTGCACGCTATTATGATGATCACTATAGCCTGGATTATTGGGGTCAGGGCACCACCCTGACCGTTAGCAGCGGTGGTGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGTTCAGGCGGTGGCGGTAGCCAGATTGTTCTGACCCAGAGTCCGGCAATTATGAGCGCAAGTCCGGGTGAAAAAGTTACCATGACCTGTAGCGCCAGCAGCAGCGTTAGCTATATGAATTGGTATCAGCAGAAAAGCGGCACCAGCCCGAAACGTTGGATTTATGATACCAGCAAACTGGCAAGCGGTGTTCCGGCACATTTTCGTGGTAGCGGTAGCGGCACCTCATATAGCCTGACCATTAGCGGTATGGAAGCAGAAGATGCAGCAACCTATTATTGTCAGCAGTGGTCAAGCAATCCGTTTACCTTTGGTAGTGGCACCAAACTGGAAATTAATCGTTGA (SEQ ID NO: 297)
多特异性抗体C225v5-OKT3m-L-C轻链(与抗体C225v5 LC的C-末端连接的抗体OKT3m)
氨基酸序列
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGGQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR* (SEQ ID NO: 298)
核苷酸序列
GACATCTTGCTGACCCAGAGCCCGGTGATTCTGAGCGTGAGCCCGGGCGAACGTGTGAGCTTTAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCATTGGCACCAACATTCATTGGTATCAGCAGCGCACCAACGGCAGCCCGCGCCTGCTGATTAAATATGCGAGCGAAAGCATTAGCGGCATTCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGAGCATTAACAGCGTGGAAAGCGAAGATATTGCGGATTATTATTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCGACCACCTTTGGCGCGGGCACCAAACTGGAACTGAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTGGAGGTGGATCTGGAGGTGGCGGTTCAGGCTCTGGCGGAGGCTCAGGTGGTGGAGGATCAGGCGGAGGTCAGGTTCAGCTGCAGCAGAGCGGTGCAGAACTGGCACGTCCGGGTGCAAGCGTTAAAATGAGCTGTAAAGCAAGCGGTTATACCTTTACCCGTTATACCATGCATTGGGTTAAACAGCGTCCGGGTCAGGGTCTGGAATGGATTGGTTATATCAATCCGAGCCGTGGTTATACCAACTACAACCAGAAATTCAAAGATAAAGCAACCCTGACCACCGATAAAAGCAGCAGCACCGCCTATATGCAGCTGAGCAGCCTGACCTCAGAGGATAGCGCAGTTTATTACTGTGCACGCTATTATGATGATCACTATAGCCTGGATTATTGGGGTCAGGGCACCACCCTGACCGTTAGCAGCGGTGGTGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGTTCAGGCGGTGGCGGTAGCCAGATTGTTCTGACCCAGAGTCCGGCAATTATGAGCGCAAGTCCGGGTGAAAAAGTTACCATGACCTGTAGCGCCAGCAGCAGCGTTAGCTATATGAATTGGTATCAGCAGAAAAGCGGCACCAGCCCGAAACGTTGGATTTATGATACCAGCAAACTGGCAAGCGGTGTTCCGGCACATTTTCGTGGTAGCGGTAGCGGCACCTCATATAGCCTGACCATTAGCGGTATGGAAGCAGAAGATGCAGCAACCTATTATTGTCAGCAGTGGTCAAGCAATCCGTTTACCTTTGGTAGTGGCACCAAACTGGAAATTAATCGTTAG(SEQ ID NO: 299)
多特异性抗体C225v5(N297Q)-OKT3m-H-N重链
氨基酸序列
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRGGGGSQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSQDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK* (SEQ ID NO: 300)
核苷酸序列
CAGGTTCAGCTGCAGCAGAGCGGTGCAGAACTGGCACGTCCGGGTGCAAGCGTTAAAATGAGCTGTAAAGCAAGCGGTTATACCTTTACCCGTTATACCATGCATTGGGTTAAACAGCGTCCGGGTCAGGGTCTGGAATGGATTGGTTATATCAATCCGAGCCGTGGTTATACCAACTACAACCAGAAATTCAAAGATAAAGCAACCCTGACCACCGATAAAAGCAGCAGCACCGCCTATATGCAGCTGAGCAGCCTGACCTCAGAGGATAGCGCAGTTTATTACTGTGCACGCTATTATGATGATCACTATAGCCTGGATTATTGGGGTCAGGGCACCACCCTGACCGTTAGCAGCGGTGGTGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGTTCAGGCGGTGGCGGTAGCCAGATTGTTCTGACCCAGAGTCCGGCAATTATGAGCGCAAGTCCGGGTGAAAAAGTTACCATGACCTGTAGCGCCAGCAGCAGCGTTAGCTATATGAATTGGTATCAGCAGAAAAGCGGCACCAGCCCGAAACGTTGGATTTATGATACCAGCAAACTGGCAAGCGGTGTTCCGGCACATTTTCGTGGTAGCGGTAGCGGCACCTCATATAGCCTGACCATTAGCGGTATGGAAGCAGAAGATGCAGCAACCTATTATTGTCAGCAGTGGTCAAGCAATCCGTTTACCTTTGGTAGTGGCACCAAACTGGAAATTAATCGTGGAGGTGGTGGATCCCAGGTGCAGCTGAAACAGAGCGGCCCGGGCCTGGTGCAGCCGAGCCAGAGCCTGAGCATTACCTGCACCGTGAGCGGCTTTAGCCTGACCAACTATGGCGTGCATTGGGTGCGCCAGAGCCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATTTGGAGCGGCGGCAACACCGATTATAACACCCCGTTTACCAGCCGCCTGAGCATTAACAAAGATAACAGCAAAAGCCAGGTGTTTTTTAAAATGAACAGCCTGCAAAGCCAGGATACCGCGATTTATTATTGCGCGCGCGCGCTGACCTATTATGATTATGAATTTGCGTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCGGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACCAGAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 301)
多特异性抗体C225v5(N297Q)-OKT3m-H-C重链
氨基酸序列
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSQDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGGQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR* (SEQ ID NO: 302)
核苷酸序列
CAGGTGCAGCTGAAACAGAGCGGCCCGGGCCTGGTGCAGCCGAGCCAGAGCCTGAGCATTACCTGCACCGTGAGCGGCTTTAGCCTGACCAACTATGGCGTGCATTGGGTGCGCCAGAGCCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATTTGGAGCGGCGGCAACACCGATTATAACACCCCGTTTACCAGCCGCCTGAGCATTAACAAAGATAACAGCAAAAGCCAGGTGTTTTTTAAAATGAACAGCCTGCAAAGCCAGGATACCGCGATTTATTATTGCGCGCGCGCGCTGACCTATTATGATTATGAATTTGCGTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCGGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACCAGAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGAGGTGGATCTGGAGGTGGCGGTTCAGGCTCTGGCGGAGGCTCAGGTGGTGGAGGATCAGGCGGAGGTCAGGTTCAGCTGCAGCAGAGCGGTGCAGAACTGGCACGTCCGGGTGCAAGCGTTAAAATGAGCTGTAAAGCAAGCGGTTATACCTTTACCCGTTATACCATGCATTGGGTTAAACAGCGTCCGGGTCAGGGTCTGGAATGGATTGGTTATATCAATCCGAGCCGTGGTTATACCAACTACAACCAGAAATTCAAAGATAAAGCAACCCTGACCACCGATAAAAGCAGCAGCACCGCCTATATGCAGCTGAGCAGCCTGACCTCAGAGGATAGCGCAGTTTATTACTGTGCACGCTATTATGATGATCACTATAGCCTGGATTATTGGGGTCAGGGCACCACCCTGACCGTTAGCAGCGGTGGTGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGTTCAGGCGGTGGCGGTAGCCAGATTGTTCTGACCCAGAGTCCGGCAATTATGAGCGCAAGTCCGGGTGAAAAAGTTACCATGACCTGTAGCGCCAGCAGCAGCGTTAGCTATATGAATTGGTATCAGCAGAAAAGCGGCACCAGCCCGAAACGTTGGATTTATGATACCAGCAAACTGGCAAGCGGTGTTCCGGCACATTTTCGTGGTAGCGGTAGCGGCACCTCATATAGCCTGACCATTAGCGGTATGGAAGCAGAAGATGCAGCAACCTATTATTGTCAGCAGTGGTCAAGCAATCCGTTTACCTTTGGTAGTGGCACCAAACTGGAAATTAATCGTTGA (SEQ ID NO: 303)
多特异性抗体C225v5(N297Q)-OKT3m-L-C轻链
氨基酸序列
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGGQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR* (SEQ ID NO: 298)
核苷酸序列
GACATCTTGCTGACCCAGAGCCCGGTGATTCTGAGCGTGAGCCCGGGCGAACGTGTGAGCTTTAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCATTGGCACCAACATTCATTGGTATCAGCAGCGCACCAACGGCAGCCCGCGCCTGCTGATTAAATATGCGAGCGAAAGCATTAGCGGCATTCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGAGCATTAACAGCGTGGAAAGCGAAGATATTGCGGATTATTATTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCGACCACCTTTGGCGCGGGCACCAAACTGGAACTGAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTGGAGGTGGATCTGGAGGTGGCGGTTCAGGCTCTGGCGGAGGCTCAGGTGGTGGAGGATCAGGCGGAGGTCAGGTTCAGCTGCAGCAGAGCGGTGCAGAACTGGCACGTCCGGGTGCAAGCGTTAAAATGAGCTGTAAAGCAAGCGGTTATACCTTTACCCGTTATACCATGCATTGGGTTAAACAGCGTCCGGGTCAGGGTCTGGAATGGATTGGTTATATCAATCCGAGCCGTGGTTATACCAACTACAACCAGAAATTCAAAGATAAAGCAACCCTGACCACCGATAAAAGCAGCAGCACCGCCTATATGCAGCTGAGCAGCCTGACCTCAGAGGATAGCGCAGTTTATTACTGTGCACGCTATTATGATGATCACTATAGCCTGGATTATTGGGGTCAGGGCACCACCCTGACCGTTAGCAGCGGTGGTGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGTTCAGGCGGTGGCGGTAGCCAGATTGTTCTGACCCAGAGTCCGGCAATTATGAGCGCAAGTCCGGGTGAAAAAGTTACCATGACCTGTAGCGCCAGCAGCAGCGTTAGCTATATGAATTGGTATCAGCAGAAAAGCGGCACCAGCCCGAAACGTTGGATTTATGATACCAGCAAACTGGCAAGCGGTGTTCCGGCACATTTTCGTGGTAGCGGTAGCGGCACCTCATATAGCCTGACCATTAGCGGTATGGAAGCAGAAGATGCAGCAACCTATTATTGTCAGCAGTGGTCAAGCAATCCGTTTACCTTTGGTAGTGGCACCAAACTGGAAATTAATCGTTAG(SEQ ID NO: 299)
抗体C225v5(N297Q)重链
氨基酸序列
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSQDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK* (SEQ ID NO: 336)
核苷酸序列
CAGGTGCAGCTGAAACAGAGCGGCCCGGGCCTGGTGCAGCCGAGCCAGAGCCTGAGCATTACCTGCACCGTGAGCGGCTTTAGCCTGACCAACTATGGCGTGCATTGGGTGCGCCAGAGCCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATTTGGAGCGGCGGCAACACCGATTATAACACCCCGTTTACCAGCCGCCTGAGCATTAACAAAGATAACAGCAAAAGCCAGGTGTTTTTTAAAATGAACAGCCTGCAAAGCCAGGATACCGCGATTTATTATTGCGCGCGCGCGCTGACCTATTATGATTATGAATTTGCGTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCGGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACCAGAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ IDNO: 337)
可活化抗体3954-1204-C225v5轻链
氨基酸序列
QGQSGQCISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGLSGRSDNHGSSGTQILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC* (SEQ ID NO: 304)
核苷酸序列
CAAGGCCAGTCTGGCCAGTGCATCTCACCTCGTGGTTGTCCGGACGGCCCATACGTCATGTACGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGATCCGGTCTGAGCGGCCGTTCCGATAATCATGGCAGTAGCGGTACCCAGATCTTGCTGACCCAGAGCCCGGTGATTCTGAGCGTGAGCCCGGGCGAACGTGTGAGCTTTAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCATTGGCACCAACATTCATTGGTATCAGCAGCGCACCAACGGCAGCCCGCGCCTGCTGATTAAATATGCGAGCGAAAGCATTAGCGGCATTCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGAGCATTAACAGCGTGGAAAGCGAAGATATTGCGGATTATTATTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCGACCACCTTTGGCGCGGGCACCAAACTGGAACTGAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTGGAGGTGGATCTGGAGGTGGCGGTTCAGGCTCTGGCGGAGGCTCAGGTGGTGGAGGATCAGGCGGAGGTCAGGTTCAGCTGCAGCAGAGCGGTGCAGAACTGGCACGTCCGGGTGCAAGCGTTAAAATGAGCTGTAAAGCAAGCGGTTATACCTTTACCCGTTATACCATGCATTGGGTTAAACAGCGTCCGGGTCAGGGTCTGGAATGGATTGGTTATATCAATCCGAGCCGTGGTTATACCAACTACAACCAGAAATTCAAAGATAAAGCAACCCTGACCACCGATAAAAGCAGCAGCACCGCCTATATGCAGCTGAGCAGCCTGACCTCAGAGGATAGCGCAGTTTATTACTGTGCACGCTATTATGATGATCACTATAGCCTGGATTATTGGGGTCAGGGCACCACCCTGACCGTTAGCAGCGGTGGTGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGTTCAGGCGGTGGCGGTAGCCAGATTGTTCTGACCCAGAGTCCGGCAATTATGAGCGCAAGTCCGGGTGAAAAAGTTACCATGACCTGTAGCGCCAGCAGCAGCGTTAGCTATATGAATTGGTATCAGCAGAAAAGCGGCACCAGCCCGAAACGTTGGATTTATGATACCAGCAAACTGGCAAGCGGTGTTCCGGCACATTTTCGTGGTAGCGGTAGCGGCACCTCATATAGCCTGACCATTAGCGGTATGGAAGCAGAAGATGCAGCAACCTATTATTGTCAGCAGTGGTCAAGCAATCCGTTTACCTTTGGTAGTGGCACCAAACTGGAAATTAATCGTTAG (SEQ IDNO: 305)
多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N，其包含轻链3954-1204-C225质粒和重链C225v5-OKT3m-H-N质粒
抗体C225v5轻链
氨基酸序列
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC* (SEQID NO: 314)
核苷酸序列
GACATCTTGCTGACCCAGAGCCCGGTGATTCTGAGCGTGAGCCCGGGCGAACGTGTGAGCTTTAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCATTGGCACCAACATTCATTGGTATCAGCAGCGCACCAACGGCAGCCCGCGCCTGCTGATTAAATATGCGAGCGAAAGCATTAGCGGCATTCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGAGCATTAACAGCGTGGAAAGCGAAGATATTGCGGATTATTATTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCGACCACCTTTGGCGCGGGCACCAAACTGGAACTGAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTGGAGGTGGATCTGGAGGTGGCGGTTCAGGCTCTGGCGGAGGCTCAGGTGGTGGAGGATCAGGCGGAGGTCAGGTTCAGCTGCAGCAGAGCGGTGCAGAACTGGCACGTCCGGGTGCAAGCGTTAAAATGAGCTGTAAAGCAAGCGGTTATACCTTTACCCGTTATACCATGCATTGGGTTAAACAGCGTCCGGGTCAGGGTCTGGAATGGATTGGTTATATCAATCCGAGCCGTGGTTATACCAACTACAACCAGAAATTCAAAGATAAAGCAACCCTGACCACCGATAAAAGCAGCAGCACCGCCTATATGCAGCTGAGCAGCCTGACCTCAGAGGATAGCGCAGTTTATTACTGTGCACGCTATTATGATGATCACTATAGCCTGGATTATTGGGGTCAGGGCACCACCCTGACCGTTAGCAGCGGTGGTGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGTTCAGGCGGTGGCGGTAGCCAGATTGTTCTGACCCAGAGTCCGGCAATTATGAGCGCAAGTCCGGGTGAAAAAGTTACCATGACCTGTAGCGCCAGCAGCAGCGTTAGCTATATGAATTGGTATCAGCAGAAAAGCGGCACCAGCCCGAAACGTTGGATTTATGATACCAGCAAACTGGCAAGCGGTGTTCCGGCACATTTTCGTGGTAGCGGTAGCGGCACCTCATATAGCCTGACCATTAGCGGTATGGAAGCAGAAGATGCAGCAACCTATTATTGTCAGCAGTGGTCAAGCAATCCGTTTACCTTTGGTAGTGGCACCAAACTGGAAATTAATCGTTAG(SEQ ID NO: 315)
表11显示重链(HC)和轻链(LC)序列配对以制备本公开内容的多特异性抗体或多特异性可活化抗体的实例。如本文所用，当提及轻链时，包含C225v5的抗体轻链亦称为包含C225的轻链。
表11：本公开内容的多特异性抗体和多特异性可活化抗体
Figure 459260DEST_PATH_IMAGE015
vS是指C225的版本5
实施例6：多特异性抗体与Jurkat T细胞上的CD3结合
本实施例证实本公开内容的多特异性抗体结合T细胞的能力。
测试了三种形式的多特异性抗体：(1) C225v5-OKT3m-H-N，一种其中OKT3m scFv(其结合T细胞上的CD3ε (在本文中亦称为CD3e和CD3))与抗-EGFR抗体C225v5的重链的N-末端连接的多特异性抗体；(2) C225v5-OKT3m-H-C，一种其中OKT3m scFv与抗-EGFR抗体C225v5的重链的C-末端连接的多特异性抗体；和(3) C225v5-OKT3m-L-C，一种其中OKT3mscFv与抗-EGFR抗体C225v5的轻链的C-末端连接的多特异性抗体。这些多特异性抗体的氨基酸序列在本文中提供，C225v5和OKT3抗体的氨基酸序列亦是如此。还测试了同种型对照，即人IgG1同种型对照, Enzo, 目录ALX-804-133-C100。
为了确定这三种多特异性抗体形式是否可结合CD3ε-阳性的Jurkat T细胞(在本文中亦称为Jurkat细胞和Jurkat)，进行基于流式细胞术的结合测定法。根据ATCC指南，将Jurkat T细胞(克隆E6-1, ATCC, TIB-152)在含有GlutaMAX™ (Life Technologies, 目录72400-120)、10%热灭活的胎牛血清(HI-FBS, Life Technologies, 目录10438-026)、100 U/ml青霉素和100 µg/ml链霉素(Life Technologies, 目录15140-122)的RPMI-1640(在本文中亦称为完全培养基)中培养。通过离心收获细胞(200xg, 4℃, 5 min)和重悬浮于含2% HI-FBS的PBS (FACS缓冲液)。将大约250,000个Jurkat细胞/孔转移至96-孔U-底板，收获和重悬浮于50微升(在本文中亦称为µL或ul)的所测试的抗体中。抗体的起始浓度是100 nM (对于多特异性抗体)和166.7 nM (对于同种型对照)，接着是对各抗体进行5倍连续稀释，总共8个浓度。
将细胞和抗体在4℃摇振的情况下孵育大约1小时，收获和用200 µL FACS缓冲液洗涤三次。将得到的Jurkat细胞重悬浮于50 µl的AlexaFluor® 647缀合的抗人IgG (H+L)(Jackson ImmunoResearch, 目录709-606-149)和在4℃摇振的情况下孵育大约30分钟。收获得到的Jurkat细胞，用200 µL FACS缓冲液洗涤三次，和重悬浮于终体积为150 µL的含有2.5 µg/ml 7-AAD (BD Pharmigen, 目录559925)的FACS缓冲液。在BD Accuri C6流式细胞仪(BD Biosciences)上分析样品，和活细胞的中值荧光强度(MFI)使用FlowJo V10(Treestar)计算。7-AAD染色显示，前侧散射门足以鉴定活细胞。EC50值用GraphPad Prism 6通过曲线拟合数据至log(激动剂) vs.反应(三个参数)计算。
图16A显示，所有三种多特异性抗体形式结合Jurkat T细胞，其EC50值范围为单个数字nM至亚nM。
实施例7：多特异性抗体结合表达CD3ε的T细胞和重组人EGFR
本实施例显示本公开内容的多特异性抗体同时结合(在本文中亦称为共结合) T细胞和包含靶标抗原的细胞的能力。
为测定多特异性抗体C225v5-OKT3m-H-N、C225v5-OKT3m-H-C或C225v5-OKT3m-L-C是否能够结合CD3ε-阳性的Jurkat T细胞和EGFR，进行基于流式细胞术的共结合测定法。将Jurkat细胞用饱和浓度的各多特异性抗体预处理，接着用生物素化的EGFR滴定和用链霉抗生物素, R-藻红蛋白缀合物(SAPE)检测。还测试了同种型对照，即人IgG1同种型对照，Enzo, 目录ALX-804-133-C100。
如本文所述培养和收获Jurkat细胞。将大约500,000个Jurkat细胞/孔转移至U-底板，收获和重悬浮于50 µL的40 nM多特异性抗体或67 nM同种型抗体。将细胞在4℃摇振的情况下孵育大约1小时，收获和用200 µL FACS缓冲液洗涤三次。将得到的Jurkat细胞(结合本公开内容的多特异性抗体)重悬浮于50 µl生物素化的重组人EGFR蛋白(Abcam, 目录ab168702)，其以大约290 nM开始，接着5倍连续稀释，总共8个浓度。将细胞在4℃摇振的情况下孵育大约1小时，收获和用200 µL FACS缓冲液洗涤三次。将得到的Jurkat细胞重悬浮于50 µl 10 µg/ml链霉抗生物素, R-藻红蛋白缀合物(Life Technologies, S866)和在4℃摇振的情况下孵育大约1小时。收获细胞，用200 µL FACS缓冲液洗涤一次，和重悬浮于150 µL FACS缓冲液。在BD Accuri C6上分析样品和按本文所述计算MFI。EC50值用GraphPadPrism 6按本文所述计算。
图16B证实，所有三种多特异性抗体形式显示EGFR的浓度依赖性结合，其需要同时结合T细胞上的CD3ε。EC50值范围为亚nM至单一数字nM。
实施例8：多特异性抗体对T细胞的靶标依赖性活化
本实施例证实本公开内容的多特异性抗体以靶标依赖性方式活化T细胞的能力。
为测定多特异性抗体C225v5-OKT3m-H-N、C225v5-OKT3m-H-C或C225v5-OKT3m-L-C共接合Jurkat T细胞和EGFR-阳性的靶标细胞是否能够诱导Jurkat细胞的活化，进行基于流式细胞术的测定法。将Jurkat细胞和CFSE-标记的靶标细胞共培养大约15 h，和通过针对早期T细胞活化标记物CD69的表面表达进行染色来评价T细胞活化。
按照ATCC指南，将EGFR-阳性的SW480细胞(亦称为SW480细胞)(ATCC, 目录CCL-228)和EGFR-阴性的U266细胞(亦称为U266细胞)(ATCC, 目录TIB-196)各自在含GlutaMAX™、10% HI-FBS、100 U/ml青霉素和100 µg/ml链霉素的RPMI-1640 (称为完全培养基)中培养。收获这些靶标细胞，用PBS洗涤一次，和在PBS中以2x106个细胞/ml重悬浮。在DMSO中制备5 mM CFSE储液(Life Technologies, CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit,目录C34554)，然后在PBS中稀释至30 nM。立即使用PBS/CFSE工作储液。对于最终CFSE浓度15 nM和最终细胞密度1x106个细胞/ml，将相等体积的靶标细胞和CFSE储液合并。将细胞在37℃孵育15分钟。通过加入等体积的HI-FBS淬灭标记。收获孵育的靶标细胞，用完全培养基洗涤一次，和以5x105个细胞/ml重悬浮在完全培养基中。将50 µL的细胞悬浮液/孔加入至96-孔平底板中，总共25,000个靶标细胞/孔。
按本文所述培养Jurkat T细胞。收获Jurkat细胞，以1x106个细胞/ml重悬浮于完全培养基中，和将50 µL的细胞悬浮液/孔加入至包含靶标细胞的平底板，总共大约50,000个Jurkat细胞/孔。效应T细胞与靶标细胞的比率为2:1。
在完全培养基中制备三倍浓缩的抗体储液。使用的最高浓度是1.2 nM (对于各多特异性抗体形式)和1.5 nM (对于OKT3 (BioLegend, 目录317304)、C225v5 (其氨基酸序列在本文中提供)和同种型对照抗体)。在完全培养基中制备5倍连续稀释液，对于各抗体总共8个浓度。将50 µL的抗体/孔加入至包含T细胞和靶标细胞的平底板，对于起始浓度400pM (对于各多特异性抗体形式)或500 pM (对于各OKT3、C225v5和同种型抗体)，3倍稀释所有储液。
大约15 h后，将细胞转移至U-底板并收获。为使回收最大化，细胞培养物用150 µLFACS缓冲液洗涤，和将洗涤液转移至该U-底板。收获细胞，重悬于50 µL抗-CD69 PE缀合的抗体(BD Biosciences, 目录555531，以制造商推荐的浓度使用)，和在4℃摇振的情况下染色1 h。用200 µL FACS缓冲液洗涤细胞一次，然后以终体积为150 µL重悬浮。在BD AccuriC6上使用单色对照设置补偿。在前侧散射CFSE-阴性门中收集10,000个细胞和使用FlowJo计算MFI。用GraphPad Prism 6按本文所述计算EC50值。
图17显示，最有效的CD69活化，明显开始于亚pM浓度，取决于在存在Jurkat T细胞和EGFR-阳性SW480细胞两者的情况下共培养的各多特异性抗体形式。相比之下，通过与EGFR-阴性U266细胞共培养诱导的T细胞活化效率显著更低，显示亚nM EC50值和相对于通过EGFR-阳性细胞诱导的活化，最大CD69诱导降低75%。多特异性抗体的EGFR-非依赖性活化，如当使用U266细胞时所见的，类似于OKT3抗体的活化，用C225v5和同种型对照抗体观察到可忽略的CD69染色。
实施例9：多特异性抗体对原代CD8+ T细胞的靶标依赖性活化
本实施例证实本公开内容的多特异性抗体活化原代CD8阳性(CD8+) T细胞的能力。
为确定多特异性抗体C225v5-OKT3m-H-N、C225v5-OKT3m-H-C或C225v5-OKT3m-L-C是否能够介导原代人CD8+ T细胞的EGFR-依赖性活化，进行基于流式细胞术的测定法。将源自人外周血单核细胞(PBMC)的CD8+ T细胞和DDAO-SE标记的靶标细胞共培养过夜，和通过对早期活化标记物CD69染色评价活化。
EGFR-阳性SW480细胞除了以下例外外按本文所述进行培养和标记：(1) SW480靶标细胞用CellTrace™ FarRed DDAO-SE (Life Technologies, 目录C34553)标记和(2)完全培养基补充有25 U/ml IL-2 (R&D Systems, 目录202-IL-050/CF)。将50 µL的靶标细胞悬浮液(5x105个细胞/ml)/孔加入至96-孔平底板，总共25,000个靶标细胞/孔。
新鲜的正常外周血CD8+细胞毒性T细胞(AllCells, 目录PB009-3)获自AllCells(Alameda, CA)，通过离心收获(200xg, RT, 15 min)和以1.5x106个细胞/ml重悬浮于补充有25U/ml IL-2的完全培养基。将50 µL的细胞悬浮液/孔加入至包含靶标细胞的平底板，总共大约75,000个CD8+细胞毒性T细胞/孔和T细胞与靶标细胞的比率为3:1。
在补充有25U/ml IL-2的完全培养基中制备三倍浓缩的抗体储液。最高浓度是600pM，接着5倍连续稀释，对于各抗体，总共8个浓度。将50 µL的抗体/孔加入至包含CD8+细胞和靶标细胞的平底板，对于200 pM的起始浓度，稀释所有储液3倍。
在过夜孵育后，将平底板离心和取出100 µL的上清液用于本文所述的发光细胞毒性测定法。将剩余的上清液转移至U-底板，和将平底板中的细胞用0.25%胰蛋白酶(LifeTechnologies, 目录25200-056)离壁。通过加入3倍体积的FACS缓冲液淬灭胰蛋白酶活性，和将细胞悬浮液转移至U-底板。收获后，将细胞重悬浮于50 µL的抗-CD69 PE/抗-CD8 FITC混合物(抗-CD8 FITC, BD Biosciences, 目录561948)、FITC同种型对照(BDBioSciences, 目录340755)或PE同种型对照(BD BioSciences, 目录340761)。按制造商推荐的浓度使用所有抗体。将细胞在4℃摇振的情况下染色1 h，收获和在终体积150 µL的含2.5 µg/ml 7-AAD的FACS缓冲液中重悬浮。在BD Accuri C6上使用单色对照设定补偿，和收集固定体积的细胞悬浮液。对CD8+细胞的门控足以区分靶标细胞和活T细胞。将活化定量为高于PE同种型对照的表达CD69的T细胞的百分比。
图18A证实，所有三种多特异性抗体形式显示原代CD8+ T细胞的浓度依赖性活化，具有单一数字pM EC50值。用OKT3、C225v5或人IgG1同种型对照(Enzo)抗体处理产生可忽略的CD69诱导。
实施例10：多特异性抗体对靶标细胞的靶标依赖性杀伤
本实施例证实本公开内容的多特异性抗体诱导T细胞定向的靶标依赖性细胞溶解的能力。
为确定多特异性抗体C225v5-OKT3m-H-N、C225v5-OKT3m-H-C或C225v5-OKT3m-L-C是否能够诱导T细胞定向的靶标依赖性细胞溶解，如本文所述将SW480细胞与CD8+ T-细胞以3:1的效应细胞：靶标细胞比率共培养。在过夜孵育后，对于与细胞毒性有关的不同的蛋白酶活性，按制造商的方案(CytoTox-Glo™ Cytotoxicity Assay, 目录G9292, Promega)在白色壁96-孔板(Greiner Bio One 目录655098)分析100 μL的上清液，所述方案使用发光肽底物测量细胞释放的蛋白酶的活性，所述细胞已经失去膜完整性和随后经历细胞溶解。靶标细胞的多特异性抗体依赖性细胞毒性以未处理值减去背景后的发光表示，并在Prism中以曲线拟合分析log(激动剂) vs.反应(三个参数)作图。
图18B显示，所有三种多特异性抗体形式诱导T-细胞介导的SW480细胞杀伤。如所预期的，OKT3抗体单独不显示可检测的SW480细胞杀伤，表明对于有效的细胞毒性需要多特异性抗体共接合CD3和肿瘤靶标两者。
实施例11：多特异性抗体的靶标依赖性T-细胞活化和对靶标细胞的杀伤
本实施例证实本公开内容的多特异性抗体诱导T细胞定向的靶标依赖性活化CD8+ T细胞和杀伤靶标细胞的能力。
为确定观察到的T-细胞活化是否依赖于靶标细胞的EGFR表达，如上文所述将CFSE-标记的EGFR-阳性SW480细胞或EGFR-阴性U266细胞与人CD8+ T细胞在存在多特异性抗体C225v5-OKT3m-H-N或OKT3(自200 pM开始各自呈5倍稀释系列)的情况下共培养。使用本文所述的方法，靶标细胞的CFSE标记(30 nM)用于区分靶标细胞与T细胞。按制造商的说明，将冷冻的正常外周血CD8+细胞毒性T细胞(AllCells, 目录PB009-3F)解冻。过夜孵育后，按本文所述针对早期活化标记物CD69的表面表达分析T-细胞(CFSE阴性细胞)。简言之，从测定板取出细胞，贴壁细胞使用胰蛋白酶(Life Technologies)消散，和用FACS缓冲液洗涤细胞一次。用抗-CD69-PE (BD Bioscience)将细胞染色1小时。洗涤细胞和在BD AccuriC6上分析细胞表面CD69表达。按本文所述计算MFI值。将结果使用FCS Express分析软件表示为高于同种型对照的表达CD69的T细胞的百分比，并在Prism中以曲线拟合分析log(激动剂) vs.反应(三个参数)作图。
如图18C中所示，多特异性抗体C225v5-OKT3m-H-N显示以亚pM浓度在存在SW480细胞的情况下有效的T-细胞活化，和通过U266细胞的仅最少的T-细胞活化，甚至在为用于SW480细胞的浓度的超过3 log高的浓度下。OKT3抗体显示最少的T-细胞活化。这些结果显示，有效的T-细胞活化取决于靶标细胞的EGFR表达。
为确定靶标细胞杀伤的EGFR表达的依赖性，针对与细胞毒性有关的蛋白酶活性，测量100 μl的T细胞与SW480或U266细胞的共培养物的上清液(CytoTox-Glo, Promega)。结果以未减去背景的发光表示，以显示U266反应，并在Prism中以曲线拟合分析log(激动剂)vs.反应(三个参数)作图。
图18D说明多特异性抗体C225v5-OKT3m-H-N在亚pM浓度下引发表达EGFR的SW480细胞的细胞毒性，而无可识别的EGFR-阴性U266细胞杀伤被检出。OKT3抗体也显示无可识别的SW480或U266细胞杀伤。
实施例12：多特异性抗体接合T细胞以杀死一组表达EGFR的细胞系的能力
本实施例证实本公开内容的多特异性抗体接合T细胞以杀死一组表达EGFR的细胞系的能力。
为确定多特异性抗体C225v5-OKT3m-H-N是否能够诱导另外的表达EGFR的细胞系的细胞毒性，将人CD8+ T细胞在RPMI-1640、2%人血清中在白色壁96孔板中与以下表达EGFR的细胞系以5:1的效应器：靶标比率(除了U266细胞之外，其以3:1比率使用，在96-孔平底板中培养)和滴定量的多特异性抗体C225v5-OKT3m-H-N共培养：HEK-293、HCT-15、HCT 116、Hs766T、HT-29、NCI-H2405、SW480、SK-OV-3和EGFR阴性细胞系U266 (所有细胞系都来自ATCC)。抗-EGFR抗体C225v5 (200 pM)用作阴性对照。过夜孵育后，CytoTox-Glo™Cytotoxicity Assay (Promega)的发光肽底物直接加入至板(150 μl的上清液)以测量释放的蛋白酶活性，除了U266样品之外，其中100 μl的U266上清液用于测定蛋白酶活性。结果以未处理值减去背景后的发光表示并在Prism中以曲线拟合分析log(激动剂) vs.反应(三个参数)作图。
图19证实用多特异性抗体C225v5-OKT3m-H-N在存在CD8+ T细胞的情况下处理的所有表达EGFR的细胞系显示剂量依赖性的细胞毒性。相比之下，EGFR-阴性U266细胞保持不受多特异性抗体C225v5-OKT3m-H-N影响。无一用200 pM的抗-EGFR抗体C225v5处理的细胞系显示任何细胞毒性的迹象，无论其EGFR表达如何。
实施例13：多特异性可活化抗体的EGFR结合的削弱
本实施例证实，与本公开内容的多特异性抗体的EGFR结合相比，本公开内容的多特异性可活化抗体的EGFR结合被削弱。本实施例还证实，包括蛋白酶可裂解部分的多特异性可活化抗体的EGFR结合在多特异性可活化抗体被这样的蛋白酶裂解后得到恢复。
测试了多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N、活化的多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N和多特异性抗体C225v5-OKT3m-H-N结合表达EGFR的SW480细胞的能力。
多特异性可活化抗体的活化如下进行：在PBS中的825 µg多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N通过加入活性位点滴定的基质蛋白酶(在本文中亦称为MT-SP1和MTSP1；可获自R&D Systems, 目录3946-SE-010)至终浓度100 nM进行裂解。在37℃孵育消化物过夜，通过取出等份试样用于毛细管电泳分析(GX-II CapillaryElectrophoresis, Perkin Elmer)证实裂解。蛋白酶和裂解的掩蔽部分通过蛋白A纯化除去。简言之，将消化的样品用PBS稀释至2 ml和加样到平衡的MabSelect SuRe™珠(GEHealthcare Life Sciences,产品11-0026-01 AD)上。将珠用5倍柱体积(CV)的1xPBS洗涤，接着用5 CV的补充有5%异丙醇(IPA)的5xPBS洗涤，和最后用5 CV的1xPBS洗涤。抗体用10CV的0.1 M甘氨酸, pH 3.0洗脱，和各级分用1 M Tris, pH 8.0中和，合并，浓缩和缓冲液交换成PBS。
表达EGFR的SW480细胞用细胞解离缓冲液(Sigma, 目录C5789)离壁，洗涤和用5倍稀释的1000 nM多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N、活化的多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N、多特异性抗体C225v5-OKT3m-H-N、可活化抗体3954-1204-C225v5或抗体C225v5在FACS缓冲液中在冰上孵育1小时。用FACS缓冲液洗涤细胞三次和用1:400的第二抗体即抗人Fcγ特异性的AF488 (Jackson ImmunoResearch 目录109-546-098)在FACS缓冲液中在冰上孵育。用FACS缓冲液洗涤细胞三次，AF488的MFI在BDAccuri (BD Biosciences)流式细胞仪上读出。从实验MFI中减去仅包含第二抗体对照的样品的MFI和在Prism中以曲线拟合分析log(激动剂) vs.反应(三个参数)作图。
图20A证实，与多特异性抗体C225v5-OKT3m-H-N的EGFR结合相比，多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N的EGFR结合被削弱，但在多特异性可活化抗体被基质蛋白酶蛋白酶裂解后，多特异性可活化抗体的EGFR结合得到完全恢复。图20B显示抗体C225v5和可活化抗体3954-1204-C225v5的EGFR结合分别与多特异性抗体C225v5-OKT3m-H-N和多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N的EGFR结合相当，证实存在于多特异性形式中的抗-CD3ε部分未改变多特异性抗体或多特异性可活化抗体的EGFR结合特征。
实施例14：多特异性可活化抗体结合CD3+ T细胞的能力
本实施例证实，所有实施方案的多特异性可活化抗体、活化的多特异性可活化抗体和多特异性抗体各自能够结合CD3+ T细胞。
为确定CD3ε结合是否受抗-EGFR多特异性可活化抗体的EGFR结合位点的掩蔽的影响，如本文所述用多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N、活化的多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N和多特异性抗体C225v5-OKT3m-H-N进行Jurkat T-细胞结合测定法。Jurkat细胞用5倍稀释的1000 nM多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N、基质蛋白酶活化的多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N或多特异性抗体C225v5-OKT3m-H-N在FACS缓冲液中在4℃孵育1小时。洗涤细胞三次，和用第二抗体即1:400的抗人Fcγ特异性AF488 (Jackson ImmunoResearch)孵育。洗涤细胞三次，AF488的MFI在BD Accuri (BD Biosciences)流式细胞仪上读出。从实验MFI中减去仅包含第二抗体对照的样品的MFI，并在Prism中以曲线拟合分析log(激动剂) vs.反应(三个参数)作图。
图21A证实，多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N和多特异性抗体C225v5-OKT3m-H-N显示相等的Jurkat T细胞结合。图21B证实，多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N和活化的多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N显示相等的Jurkat T细胞结合。这些结果表明，多特异性可活化抗体的EGFR结合部分的掩蔽未影响多特异性可活化抗体接合T细胞的能力。
实施例15：多特异性可活化抗体的靶标依赖性T-细胞活化
本实施例证实，与本公开内容的多特异性抗体所示的活化相比，本公开内容的多特异性可活化抗体的靶标依赖性T-细胞活化被削弱。本实施例还证实，包括蛋白酶可裂解部分的多特异性可活化抗体的靶标依赖性T-细胞活化在多特异性可活化抗体被这样的蛋白酶裂解后得到恢复。
为确定抗-EGFR多特异性可活化抗体的EGFR结合位点的掩蔽是否削弱靶标依赖性T-细胞活化和为确定多特异性可活化抗体的蛋白酶活化是否恢复活化，按本文所述进行Jurkat活化测定法，其测试多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N、活化的多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N、多特异性抗体C225v5-OKT3m-H-N、抗-EGFR抗体C225v5和本文所述的Synagis (Medimmune)同种型对照。
图22证实，如通过与表达EGFR的SW480细胞共培养的Jurkat T细胞的CD69诱导测定的，多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N的EGFR-依赖性活化与多特异性抗体C225v5-OKT3m-H-N显示的EGFR-依赖性活化相比被削弱。该图还表明，在多特异性可活化抗体被基质蛋白酶蛋白酶裂解后多特异性可活化抗体的EGFR-依赖性活化得到完全恢复。抗-EGFR C225v5和同种型对照抗体都未显示T-细胞的活化。
实施例16：多特异性可活化抗体的靶标依赖性T-细胞活化和靶标细胞杀伤
本实施例证实，与本公开内容的多特异性抗体显示的活化相比，本公开内容的多特异性可活化抗体的靶标依赖性T-细胞活化和靶标细胞杀伤被削弱。本实施例还证实，包括蛋白酶可裂解部分的多特异性可活化抗体的靶标依赖性T-细胞活化和靶标细胞杀伤在多特异性可活化抗体被这样的蛋白酶裂解后得到恢复。
为确定抗-EGFR多特异性可活化抗体的EGFR结合位点的掩蔽是否削弱靶标依赖性活化和为确定多特异性可活化抗体的蛋白酶活化是否恢复活化，按本文所述进行Jurkat活化测定法，其测试多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N、活化的多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N、多特异性抗体C225v5-OKT3m-H-N、抗-CD3ε抗体OKT3、抗-EGFR抗体C225v5和本文所述的同种型对照。
为确定掩蔽抗-EGFR多特异性可活化抗体的EGFR结合位点对细胞毒性的影响和蛋白酶活化恢复活化的多特异性可活化抗体的细胞毒性活性的能力，将表达EGFR的SW480细胞与T-细胞以5:1的效应细胞：靶标细胞比率与自200 pM开始的5倍稀释系列的多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N、活化的多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N或多特异性抗体C225v5-OKT3m-H-N共培养。200 pM的OKT3、C225v5和同种型对照Synagis (Medimmune) IgG1抗体用作对照。孵育过夜后，在白色壁96-孔板中分析100 μL的上清液的与细胞毒性有关的不同的蛋白酶活性(CytoTox-Glo, Promega)。结果以未处理值减去背景后的发光表示，并在Prism中以曲线拟合分析log(激动剂) vs. 反应(三个参数)作图。
图23A证实，如通过与表达EGFR的SW480细胞共培养的原代T细胞的CD69诱导测定的，多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N的EGFR-依赖性活化与多特异性抗体C225v5-OKT3m-H-N显示的EGFR-依赖性活化相比被削弱。该图还表明，多特异性可活化抗体的EGFR-依赖性活化在多特异性可活化抗体被基质蛋白酶蛋白酶裂解后得到完全恢复。OKT3、抗-EGFR C225v5和Synagis IgG1同种型对照抗体显示可忽略的T-细胞活化。
图23B证实，多特异性可活化抗体3954-1204-C225v5-OKT3m-H-N对SW480细胞的EGFR-依赖性溶解与多特异性抗体C225v5-OKT3m-H-N显示的EGFR-依赖性细胞毒性相比被削弱。该图还表明，多特异性可活化抗体的EGFR-依赖性细胞毒性在多特异性可活化抗体被基质蛋白酶蛋白酶裂解后得到完全恢复。C225v5和OKT3和Synagis IgG1同种型对照抗体显示可忽略的细胞毒性。
其它实施方案
尽管本发明已经结合其详细描述进行了描述，但前面的描述意欲说明而非限制由随附权利要求书的范围限定的本发明的范围。其它方面、优点和改变在随附权利要求书的范围内。

Claims (21)

1.一种双特异性可活化抗体，其中所述双特异性可活化抗体包含：
(i)包含免疫效应细胞接合抗体的抗原结合片段的第一臂，所述抗体包括结合第一免疫效应细胞靶标的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，
(ii)包含靶标结合抗体的抗原结合片段的第二臂，所述抗体包括结合第二靶标的第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，
其中AB1与第一掩蔽部分(MM1)连接使得MM1和AB1的偶联降低AB1结合第一靶标的能力；
其中MM1通过第一可裂解部分（CM1）序列与AB1偶联，所述第一可裂解部分序列包括蛋白酶的底物；
其中AB2与第二掩蔽部分（MM2）连接使得MM2和AB2的偶联降低AB2结合第二靶标的能力；
其中MM2通过第二可裂解部分（CM2）序列与AB2偶联，所述第二可裂解部分序列包括蛋白酶的底物；和
其中处于未裂解状态的双特异性可活化抗体的第一臂具有从N末端到C末端如下结构排列：MM1-CM1-AB1和处于未裂解状态的双特异性可活化抗体的第二臂具有从N末端到C末端如下结构排列：MM2-CM2-AB2。
2.权利要求1的双特异性可活化抗体，其中所述第二靶标包括癌症相关靶标，其中所述癌症相关靶标是肿瘤，任选实体瘤。
3.权利要求1或2任一项的双特异性可活化抗体，其中AB1为：
免疫效应细胞接合抗体；
白细胞接合抗体；
T细胞接合抗体；
NK细胞接合抗体；
巨噬细胞接合抗体；或
单核细胞接合抗体。
4.前述权利要求中任一项的双特异性可活化抗体，其中所述免疫效应细胞接合抗体是T细胞接合抗体，并且其中所述第一免疫效应细胞靶标是T细胞靶标。
5.权利要求4的双特异性可活化抗体，其中所述T细胞靶标是CD3或CTLA-4。
6.前述权利要求中任一项的双特异性可活化抗体，其中所述第二靶标选自表1中的靶标组，任选其中所述第二靶标是Jagged或EGFR。
7.权利要求4的双特异性可活化抗体，其中所述T细胞靶标是CD3，且所述第二靶标是EGFR。
8.前述权利要求中任一项的双特异性可活化抗体，其中：
第一臂
在MM1和CM1之间包含连接肽；或
在CM1和AB1之间包含连接肽；或
包含第一连接肽（LP1）和第二连接肽（LP2），其中处于未裂解状态的双特异性可活化抗体具有如下的从N末端到C末端的结构排列：MM1-LP1-CM1-LP2-AB，任选其中两个连接肽不需要彼此相同；或
第一臂的CM1位于可活化抗体中，使得在未裂解状态下MM1干扰AB1与第一靶标的特异性结合。
9.前述权利要求中任一项的双特异性可活化抗体，其中：
MM1具有与AB1结合的平衡解离常数，所述平衡解离常数大于AB1与其靶标的平衡解离常数；
当双特异性可活化抗体处于裂解状态时，MM1不干扰或竞争AB1与第一靶标的结合；
MM1多肽序列与第一靶标的序列不同；
MM1多肽序列与AB1的任何天然结合伴侣的相似性不超过50％；和/或
MM1是长度不超过40个氨基酸的多肽。
10.前述权利要求中任一项的双特异性可活化抗体，其中：
第二臂
在MM2和CM2之间包含连接肽；或
在CM2和AB2之间包含连接肽；或
包含第一连接肽（LP1）和第二连接肽（LP2），其中处于未裂解状态的双特异性可活化抗体具有如下的从N末端到C末端的结构排列：MM2-LP1-CM2-LP2-AB2，任选其中两个连接肽不需要彼此相同；或
第二臂的CM2位于可活化抗体中，使得在未裂解状态下MM2干扰AB2与第一靶标的特异性结合。
11.前述权利要求中任一项的双特异性可活化抗体，其中：
MM2具有与AB2结合的平衡解离常数，所述平衡解离常数大于AB2与其靶标的平衡解离常数；
当双特异性可活化抗体处于裂解状态时，MM2不干扰或竞争AB2与第二靶标的结合；
MM2多肽序列与第二靶标的序列不同；
MM2多肽序列与AB2的任何天然结合伴侣的相似性不超过50％；和/或
MM2是长度不超过40个氨基酸的多肽。
12.前述权利要求中任一项的双特异性可活化抗体，其中AB1和/或AB2的抗原结合片段选自Fab片段，F（ab'）2片段，scFv，scAb，dAb，单结构域重链抗体和单结构域轻链抗体。
13.前述权利要求中任一项的双特异性可活化抗体，包含与抗体缀合的试剂，任选其中所述试剂是治疗剂，抗肿瘤剂，毒素或其片段，可检测部分或诊断剂，任选其中所述试剂通过接头与抗体缀合，任选其中接头是可裂解的接头或不可裂解的接头。
14.药物组合物，其包含前述权利要求中任一项的双特异性可活化抗体和载体。
15.权利要求14的药物组合物，包含另外的试剂；任选其中另外的试剂是治疗剂。
16.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1至12中任一项的双特异性可活化抗体。
17.一种载体，其包含权利要求16的分离的核酸分子。
18.一种通过在导致双特异性可活化抗体表达的条件下培养细胞来制备双特异性可活化抗体的方法，其中所述细胞包含权利要求16的核酸分子或权利要求17的载体，任选将试剂与双特异性可活化抗体缀合。
19.一种制备前述权利要求中任一项的双特异性可活化抗体的方法，该方法包括：
（a）在导致权利要求1至12中任一项所述的双特异性可活化抗体表达的条件下，培养包含编码权利要求1至12中任一项所述的双特异性可活化抗体的核酸构建体的细胞，和
（b）回收可活化的抗体；任选将试剂与回收的可活化抗体缀合。
20.权利要求1至13中任一项的双特异性可活化抗体，或权利要求14或15中任一项的药物组合物，或通过权利要求18或19中任一项的方法产生的双特异性可活化抗体，其用作药物。
21.权利要求1至13中任一项的双特异性可活化抗体，或权利要求14或15中任一项的药物组合物，或通过权利要求18或19中任一项的方法产生的双特异性可活化抗体，用于减轻与受试者疾病相关的临床适应症的症状，其中以足以减轻与疾病相关的临床适应症的症状的量向有此需要的受试者施用抗体，任选其中所述受试者是人，任选其中所述疾病是癌症。
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