DE69824234T2 - Menschliche"CDR-grafted"-Antikörper gegen Gangliosid GM2 - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen menschlichen Antikörper gegen Gangliosid GM2 (nachfolgend hier als „GM2" bezeichnet) mit verpflanzten komplementaritätsbestimmenden Regionen (nachfolgend als „CDR" bezeichnet). Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein DNA-Fragment, das den vorstehend beschriebenen Antikörper, insbesondere dessen variable Region (nachfolgend hier als „V-Region" bezeichnet) kodiert. Die vorliegende Erfindung betrifft einen Expressionsvektor, der das DNA-Fragment enthält, und einen Wirt, der mit dem Expressionsvektor transformiert ist. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung des humanen Graft-CDR-Antikörpers, der für GM2 spezifisch ist, und dessen therapeutische und diagnostische Verwendung.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Es ist allgemein bekannt, dass bei Verabreichung eines Maus-Antikörpers an einen Menschen der Maus-Antikörper als Fremdkörper in dem menschlichen Körper erkannt wird und somit einen humanen Antikörper gegen den Maus-Antikörper induziert (humaner Anti-Maus-Antikörper, der nachfolgend hier als „HAMA" bezeichnet wird), der mit dem verabreichten Maus-Antikörper reagiert, wodurch nachteilige Effekte hervorgerufen werden (Dillman, R.O. et al., J. Clin. Oncol., 2, 881 (1984); Meeker, T.C. et al., Blood, 65, 1349 (1985); LoBuglio, A.F. et al., J. Natl. Cancer Inst., 80, 932 (1988); Houghton, A.N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, 1242 (1985)), und der verabreichte Maus-Antikörper wird schnell entfernt (Pimm, M.V. et al., J. Nucl. Med., 26, 1011 (1985); Meeker, T.C. et al., Blood, 65, 1349 (1985); Khazaeli, M.B. et al., J. Natl. Cancer Inst., 80, 937 (1988)), um die Effekte des Antikörpers zu verringern (Shawler, D.L. et al., J. Immunol., 135, 1530 (1985); Courtenay-Luck, N.S. et al., Cancer Res., 46, 6489 (1986)).
  • Um diese Probleme zu lösen, wurden Versuche unternommen, um einen Maus-Antikörper in einen humanisierten Antikörper umzuwandeln, beispielsweise in einen humanen chimären Antikörper oder einen humanen Graft-CDR-Antikörper. Der humane chimäre Antikörper ist ein Antikörper, dessen V-Region von einem Antikörper eines nicht-menschlichen Tieres und dessen konstante Region (nachfolgend hier als „C-Region" bezeichnet) von einem humanen Antikörper stammen (Morrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 6851 (1984)). Weiterhin wurde berichtet, dass bei Verabreichung dieses Typs von Antikörper an Menschen HAMA kaum induziert wird und die Halbwertszeit des Antikörpers im Blut sich um das Sechsfache erhöht (LoBuglio, A.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86, 4220 (1989)). Der humane Graft-CDR-Antikörper ist ein Antikörper, bei dem die CDR eines humanen Antikörpers durch (oder gegen) eine andere, aus einem nicht-menschlichen Tier stammende CDR ersetzt (bzw. ausgetauscht) ist (Jones, P.T. et al., Nature, 321, 522 (1986)), und der auch als umgestalteter humaner Antikörper bezeichnet wird. Es wurde berichtet, dass bei einem Test eines humanen Graft-CDR-Antikörpers in Affen im Vergleich mit einem Maus-Antikörper dessen Immunogenizität verringert und dessen Halbwertszeit im Blut vier- bis fünffach erhöht ist (Hakimi, J. et al., J. Immunol., 147, 1352 (1991)).
  • Mit Hinblick auf die Zytotoxizität von Antikörpern wurde auch berichtet, dass die Fc-Region eines humanen Antikörpers das menschliche Komplement und menschliche Effektorzellen wirksamer aktiviert als die Fc-Region eines Maus-Antikörpers. Beispielsweise wurde berichtet, dass durch humane Effektorzellen vermittelte Antitumoreffekte eines Maus-Antikörpers gegen GD2 erhöht waren, wenn der Antikörper in einen humanen chimären, die Fc-Region eines humanen Antikörpers umfassenden Antikörper umgewandelt wurde (Mueller, B.M. et al., J. Immunol., 144, 1382 (1990)), und ähnliche Ergebnisse wurden für einen humanen Graft-CDR-Antikörper gegen das CAMPATH-1-Antigen berichtet (Reichmann, L. et al., Nature, 332, 323 (1988)). Diese Ergebnisse zeigen, dass für eine klinische Verwendung im Menschen humanisierte Antikörper wünschenswerter sind als Maus-Antikörper.
  • Gangliosid, ein Sialinsäure umfassendes Glykolipid, ist ein Molekül, das eine tierische Zellmembran aufbaut, und als hydrophile Seitenkette eine Kohlenhydratkette und als hydrophobe Seitenketten Sphingosin und Fettsäure umfasst. Es ist bekannt, dass die Arten und Expressionsmengen von Gangliosid in Abhängigkeit von der Zellart, der Organart und der Tierart variieren. Es ist ebenfalls bekannt, dass sich die Expression von Gangliosid im Verlauf der Krebsentwicklung von Zellen quantitativ und qualitativ ändert (Hakomori, S. et al., Cancer Res., 45, 2405 (1985)). Beispielsweise wurde berichtet, dass die Ganglioside GD2, GD3 und GM2, die in normalen Zellen kaum zu beobachten sind, in Tumoren des Nervenektodermsystems exprimiert werden, von denen man eine hohe Malignität annimmt, beispielsweise in Neuroblastom, kleinzelligem Lungenkarzinom und Melanom (Pukel, C.S. et al., J. Exp. Med., 155, 1133 (1982); Nudelmann, E. et al., J. Biol. Chem., 257, 12752 (1982); Werkmeister, J.A. et al., Cancer Res., 47, 225 (1987); Mujoo, K. et al., Cancer Res., 47, 1098 (1987); Cheung, N.V. et al., Cancer Res., 45, 2642 (1985); Tai, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, 5392 (1983)), und Antikörper gegen diese Ganglioside werden als brauchbar für die Diagnose und Behandlung verschiedener Krebsarten beim Menschen erachtet.
  • Es wurde gezeigt, dass menschliche Antikörper gegen GM2 für die Behandlung von menschlichen Melanomen brauchbar sind (Irie, R.F. et al., Lancet, I, 786 (1989)). Jedoch sind die bisher beschriebenen Antikörper gegen GM2 entweder solche, die von nicht-menschlichen Tieren stammen, oder humane Antikörper der IgM-Klasse (Natoli, E.J. et al., Cancer Res., 46, 4116 (1986); Miyake, M. et al., Cancer Res., 48, 6154 (1988); Cahan, L.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 79, 7629 (1982); Fredman, P. et al., J. Biol. Chem., 264, 12122 (1989)). Ein Antikörper der IgM-Klasse ist jedoch im Vergleich mit einem Antikörper der IgG-Klasse, der ein Molekulargewicht von ungefähr 150.000 aufweist, für die Verabreichung an Menschen ungeeignet, weil er eine pentamere Struktur mit einem großen Molekulargewicht (ca. 900.000) aufweist, was ein Problem bei dessen Aufreinigung darstellt, zusätzlich zu anderen Problemen, wie beispielsweise dessen kurzer Halbwertszeit im Blut und schwachen Antitumoreffekten (Bernstein, I.D. et al., Monoclonal Antibodies, Plenum Press, p. 275 (1980)).
  • Angesichts der vorstehenden Ausführungen ist es wünschenswert, einen humanisierten Antikörper der IgG-Klasse gegen GM2 zu entwickeln, der bei Anwendung am Menschen keine HAMA im menschlichen Körper induziert, weniger nachteilige Effekte auslöst, eine verlängerte Halbwertszeit im Blut zeigt und einen verbesserten Antitumoreffekt aufweist, so dass hohe diagnostische und therapeutische Effekte in Bezug auf menschliche Krebsarten erwartet werden können.
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung offenbaren in der JP-A-6-205694 (die der EP-A-0 598 998 entspricht) (der Begriff „JP-A" bedeutet hier eine „ungeprüfte, veröffentlichte japanische Patentanmeldung") ein Verfahren zur Herstellung eines humanen chimären Antikörpers der IgG-Klasse und einen humanen Graft-CDR-Antikörper, der spezifisch mit GM2 reagieren kann und für die Diagnose und Behandlung von Humankrebsarten brauchbar ist. Es existieren jedoch keine Berichte über einen humanen Graft-CDR-Antikörper, der bei Vergleich mit einem humanen chimären Antikörper einen ähnlichen Grad an Bindungsaktivität und Bindungsspezifität für GM2 und an Antitumoreffekten gegen GM2-positive Zellen aufweist.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Wie vorstehend beschrieben wird angenommen, dass humane Graft-CDR-Antikörper für die Diagnose und Behandlung von Humankrebsarten brauchbar sind. Die Antikörperaktivität ist jedoch verringert, wenn nur die CDRs der V-Region der schweren Kette (nachfolgend hier als „H-Kette" bezeichnet) und der V-Region der leichten Kette (nachfolgend hier als „L-Kette" bezeichnet) eines Antikörpers eines nicht-menschlichen Tieres die CDRs der H-Ketten-V-Region und L-Ketten-V-Region eines menschlichen Antikörpers ersetzen, so dass große Aufmerksamkeit auf die Erstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines zur IgG-Klasse gehörenden humanen Graft-CDR-Antikörpers gegen GM2 (nachfolgend hier als „humaner Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper" bezeichnet) gerichtet wurde, welcher bei Vergleich mit einem humanen chimären Antikörper ähnliche Grade an Bindungsaktivität und Bindungsspezifität bezüglich GM2 und an Antitumoreffekten gegen GM2-positive Zellen aufweist, ebenso wurde große Aufmerksamkeit auf ein Verfahren zur Herstellung eines menschlichen Graft-CDR-Antikörpers, das auf alle Antikörper angewendet werden kann, gerichtet.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen humanen Graft-CDR-Antikörper, der spezifisch mit dem Gangliosid GM2 reagiert, wobei der Antikörper umfasst: CDR 1, CDR 2 und CDR 3 einer H-Ketten-V-Region, welche die Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 und SEQ ID NO:3 umfassen; und CDR 1, CDR 2 und CDR 3 einer L-Ketten-V-Region, welche die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 und SEQ ID NO:6 umfassen; und Gerüstregionen (frameworks) (hier nachfolgend als „FR" bezeichnet) von Kabat's humaner Untergruppe (Kabat's Human Sub Group) (HSG), die eine Aminosäuresequenz umfassen, in der mindestens eine Aminosäure der Positionen 38, 40, 67, 84 und 98 in der FR der H-Ketten-V-Region und der Positionen 4, 11, 15, 35, 42, 46, 59, 69, 70, 71, 72, 76, 77 und 103 in der FR der L-Ketten-V-Region durch eine andere Aminosäure ersetzt ist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin den vorstehend genannten humanen Graft-CDR-Antikörper, wobei der Antikörper Antigen-bindende Aktivität, Bindungsspezifität, Antikörper-abhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) und Komplement-abhängige Zytotoxizität (CDC) aufweist, die mit denen eines humanen chimären Antikörpers vergleichbar sind, der die V-Region eines von einem nicht-menschlichen Tier stammenden monoklonalen, spezifisch mit dem Gangliosid GM2 reagierenden Antikörpers aufweist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin den vorstehend genannten humanen Graft-CDR-Antikörper, wobei die H-Ketten-C-Region des Antikörpers von einem zur Klasse der humanen IgG-Antikörper gehörenden Antikörper stammt.
  • KURZE ERKLÄRUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid mit der Bezeichnung pBSA.
  • 2 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid mit der Bezeichnung pBSAE.
  • 3 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid mit der Bezeichnung pBSH-S.
  • 4 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid mit der Bezeichnung pBSK-H.
  • 5 zeigt ein Konstruktionsschema für Plasmide mit den Bezeichnungen pBSH-SA und pBSK-HA.
  • 6 zeigt ein Konstruktionsschema für Plasmide mit den Bezeichnungen pBSH-SAE und pBSK-HAE.
  • 7 zeigt ein Konstruktionsschema für Plasmide mit den Bezeichnungen pBSH-SAEE und pBSK-HAEE.
  • 8 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid mit der Bezeichnung pBSK-HAEESal.
  • 9 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid mit der Bezeichnung pBSX-S.
  • 10 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid mit der Bezeichnung pBSX-SA.
  • 11 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid mit der Bezeichnung pBSSC.
  • 12 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid mit der Bezeichnung pBSMo.
  • 13 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid mit der Bezeichnung pBSMoS.
  • 14 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid mit der Bezeichnung pChiIgLA1S.
  • 15 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid mit der Bezeichnung pMohCκ.
  • 16 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid mit der Bezeichnung pBSMoSal.
  • 17 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid mit der Bezeichnung pBSMoSalS.
  • 18 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid mit der Bezeichnung pBShCγ1.
  • 19 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid mit der Bezeichnung pMohCγ1.
  • 20 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid mit der Bezeichnung pMoγ1SP.
  • 21 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid mit der Bezeichnung pMoκγ1SP.
  • 22 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid mit der Bezeichnung pKANTEX93.
  • 23 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid mit der Bezeichnung pBSNA.
  • 24 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid mit der Bezeichnung pBSH3.
  • 25 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid mit der Bezeichnung pBSES.
  • 26 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid mit der Bezeichnung pBSL3.
  • 27 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid mit der Bezeichnung pKANTEX796H.
  • 28 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid mit der Bezeichnung pKANTEX796.
  • 29 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid mit der Bezeichnung pT796.
  • 30 ist eine grafische Darstellung transienter Expression des chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörpers durch die Plasmide pKANTEX796 und pT796. Die Ordinate zeigt die Antikörperkonzentration, die GM2-Bindungsaktivität aufweist, und die Abszisse zeigt die Zeit nach Einführung des Plasmids.
  • 31 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid mit der Bezeichnung pBSH10.
  • 32 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid mit der Bezeichnung pBSL16.
  • 33 zeigt ein Verfahren zur Mutagenese durch PCR und ein Verfahren für die Klonierung des mutierten DNA-Fragments.
  • 34 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid mit der Bezeichnung pBSLV1+2.
  • 35 zeigt das Konstruktionsschema für ein Plasmid mit der Bezeichnung pBSLm-28.
  • 36 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid mit der Bezeichnung pBSHSGL.
  • 37 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid mit der Bezeichnung pT796LCDR.
  • 38 zeigt ein Konstruktionsschema für Plasmide mit den Bezeichnungen pT796HLCDR, pT796HLCDRHV2 und pT796HLCDRHV4.
  • 39 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid mit der Bezeichnung pT796HLCDRH10.
  • 40 zeigt ein Konstruktionsschema für Plasmide mit den Bezeichnungen pT796HCDR, pT796HCDRHV2, pT796HCDRHV4 und pT796HCDRH10.
  • 41 ist eine grafische Darstellung der Ergebnisse für die Beurteilung der Aktivität humaner Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper, die bei transienter Expression unter Verwendung der Plasmide pT796, pT796HCDR, pT796HCDRHV2, pT796HCDRHV4 und pT796HCDRH10 erhalten wurden. Die Ordinate zeigt das verwendete Plasmid, und die Abszisse zeigt den relativen Aktivitätswert, wobei die mit dem chimären Antikörper erhaltene Aktivität 100 % entspricht.
  • 42 zeigt ein Konstruktionsschema für Plasmide mit den Bezeichnungen pT796HLCDRLV1, pT796HLCDRLV2, pT796HLCDRLV3, pT796HLCDRLV4, pT796HLCDRLV8, pT796HLCDRLm-2, pT796HLCDRLm-8, pT796HLCDRLm-28 und pT796HLCDRHSGL.
  • 43 ist eine grafische Darstellung der Beurteilung der Aktivität humaner Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper, die bei transienter Expression unter Verwendung der Plasmide pT796, pT796HLCDR, pT796HLCDRLV1, pT796HLCDRLV2, pT796HLCDRLV3, pT796HLCDRLV4, pT796HLCDRLV8, pT796HLCDRLm-2, pT796HLCDRLm-8, pT796HLCDRLm-28 und pT796HLCDRHSGL erhalten wurden. Die Ordinate zeigt das verwendete Plasmid, und die Abszisse zeigt den relativen Aktivitätswert, wobei die mit dem chimären Antikörper erhaltene Aktivität 100 entspricht.
  • 44 zeigt ein Konstruktionsschema für Plasmide mit den Bezeichnungen pKANTEX796HLCDRLm-28 und pKANTEX796HLCDRHSGL.
  • 45 zeigt Elektrophoresemuster, die für den chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörper KM966 und die aufgereinigten humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8966 und KM8967 durch SDS-PAGE erhalten wurden (es wurden Gradientengele von 4 bis 15 % verwendet). Die auf der linken Seite gezeigten Muster wurden unter reduzierenden Bedingungen erhalten, und die auf der rechten Seite unter nicht-reduzierenden Bedingungen. Beginnend mit der linken Seite sind die Spuren mit den elektrophoretischen Mustern für Hochmolekulargewichtsmarker, KM966, KM8966, KM8967, Niedrigmolekulargewichtsmarker, KM966, KM8966 und KM8967 in dieser Reihenfolge gezeigt.
  • 46 ist eine grafische Darstellung der GM2-Bindungsaktivitäten des chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörpers KM966 und der aufgereinigten humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8966 und KM8967. Die Ordinate zeigt die GM2-Bindungsaktivität, und die Abszisse die Antikörperkonzentration.
  • 47 ist eine grafische Darstellung der Reaktivitäten des Maus-humanen chimären Anti-GM2-Antikörpers KM966 und der aufgereinigten humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8966 und KM8967 gegen verschiedene Ganglioside. Die Ordinate zeigt die Gangliosidart, und die Abszisse die Bindungsaktivität. AcGM2 steht für N-Acetyl-GM2, GcGM2 für N-Glykolyl-GM2, AcGM3 für N-Acetyl-GM3 und GcGM3 für N-Glykolyl-GM3.
  • 48 ist eine grafische Darstellung der Reaktivitäten des chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörpers KM966 und der aufgereinigten humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8966 und KM8967 gegen die humane kleinzellige Lungenkarzinomzelllinie SBC-3. Die Ordinate zeigt die Anzahl der Zellen, und die Abszisse die Fluoreszenzintensität. Beginnend mit dem untersten Graph sind die Reaktivitäten der Kontrolle, von KM8967, KM8966 und KM966 in dieser Reihenfolge gezeigt.
  • 49 zeigt grafisch die CDC-Aktivitäten des chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörpers KM966 und der aufgereinigten humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8966 und KM8967 gegen die humane kleinzellige Lungenkarzinomzelllinie SBC-3. Die Ordinate zeigt die zytotoxische Aktivität und die Abszisse die Konzentration des Antikörpers.
  • 50 zeigt grafisch die ADCC-Aktivitäten des chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörpers KM966 und der aufgereinigten humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8966 und KM8967 gegen die humane kleinzellige Lungenkarzinomzelllinie SBC-3. Die Ordinate zeigt die Zytotoxizität und die Abszisse die Konzentration des Antikörpers.
  • 51 zeigt ein Konstruktionsschema für die Plasmide pKANTEX796HM1Lm-28, pKANTEX796HM2Lm-28, pKANTEX796HM3Lm-28, pKANTEX796HM31Lm-28 und pKANTEX796HM32Lm-28.
  • 52 zeigt (unter Verwendung von 4-15 % Gradientengelen) die elektrophoretischen Muster im SDS-PAGE des chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörpers KM966, des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers KM8966 und humaner Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper mit jeweils verschiedenen Arten von Substitution. Das unter nicht-reduzierenden Bedingungen erhaltene Muster ist auf der linken Seite gezeigt, und das unter reduzierenden Bedingungen erhaltene Muster auf der rechten Seite. M steht für Molekulargewichtsmarker (die Pfeile zeigen von oben ein Molekulargewicht von 205 kD, 140 kD, 83 kD, 45 kD, 32,6 kD, 18 kD und 7,5 kD in dieser Reihenfolge) und 1, 2, 3, 4, 5, 6 und 7 stehen für die elektrophoretischen Muster von KM966, KM8966, M1-28, M2-28, M3-28, M31-28 bzw. M32-28.
  • 53 zeigt grafisch die CDC-Aktivitäten des chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörpers KM966, des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers KM8966 und humaner Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper mit jeweils verschiedenen Arten von Substitution gegen die humane kleinzellige Lungenkarzinomzelllinie SBC-3. Die Ordinate zeigt die zytotoxische Aktivität und die Abszisse die Konzentration des Antikörpers.
  • 54 zeigt ein Konstruktionsschema für die Plasmide pKANTEX796HLm-28 No.1, pKANTEX796HM1Lm-28 Nr.1, pKANTEX796HM2Lm-28 Nr.1 und pKANTEX796HM3Lm-28 Nr.1.
  • 55 zeigt die elektrophoretischen Muster im SDS-PAGE (unter Verwendung von 4-15 % Gradientengelen) des chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörpers KM966 und humaner Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper mit jeweils verschiedenen Arten von Substitution. Das unter nicht-reduzierenden Bedingungen erhaltene Muster ist auf der linken Seite und das unter reduzierenden Bedingungen erhaltene Muster auf der rechten Seite gezeigt. M steht für Molekulargewichtsmarker (von oben zeigen die Pfeile ein Molekulargewicht von 205 kD, 140 kD, 83 kD, 45 kD, 32,6 kD, 18 kD und 7,5 kD in dieser Reihenfolge) und 1, 2, 3, 4 und 5 stehen für die elektrophonetischen Muster von KM966, h796H-Nr.1, M1-Nr.1, M2-Nr.1 bzw. M3-Nr.1.
  • 56 zeigt grafisch die CDC-Aktivitäten des chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörpers KM966, der humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8966 und KM8970 und humaner Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper mit jeweils verschiedenen Arten von Substitution gegen die humane kleinzellige Lungenkarzinomzelllinie SBC-3. Die Ordinate zeigt die zytotoxische Aktivität und die Abszisse die Konzentration des Antikörpers.
  • 57 zeigt grafisch die GM2-Bindungsaktivitäten des chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörpers KM966 und der humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8969 und KM8970. Die Ordinate zeigt die GM2-Bindungsaktivität und die Abszisse die Konzentration des Antikörpers.
  • 58 zeigt grafisch die Reaktivitäten des chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörpers KM966 und der humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8969 und KM8970 gegen verschiedene Ganglioside. Die Ordinate zeigt die Gangliosidart und die Abszisse die Bindungsaktivität. AcGM2 steht für N-Acetyl-GM2, GcGM2 für N-Glykolyl-GM2, AcGM3 für N-Acetyl-GM3 und GcGM3 für N-Glykolyl-GM3.
  • 59 zeigt grafisch die Reaktivitäten des chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörpers KM966 und der humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8969 und KM8970 gegen die humane kleinzellige Lungenkarzinomzelllinie SBC-3. Die Ordinate zeigt die Anzahl der Zellen und die Abszisse die Fluoreszenzintensität. Beginnend mit dem untersten Graph werden die Reaktivitäten der Kontrolle, von KM966, KM8970 und KM8969 in dieser Reihenfolge gezeigt.
  • 60 zeigt grafisch die ADCC-Aktivitäten des chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörpers KM966 und der humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8966, KM8969 und KM8970 gegen die humane kleinzellige Lungenkarzinomzelllinie SBC-3. Die Ordinate zeigt die Zytotoxizität und die Abszisse die Konzentration des Antikörpers.
  • 61 zeigt grafisch CDC-Aktivitäten des chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörpers KM966 und der humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8966, KM8969 und KM8970 gegen die humane kleinzellige Lungenkarzinomzelllinie SBC-3, die erhalten wurde, wenn die Reaktion für die Dauer von 1 Stunde und 4 Stunden nach Zugabe des menschlichen Komplements durchgeführt wurde. Die Ordinate zeigt die Zytotoxizität und die Abszisse die Konzentration des Antikörpers.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Bei dem humanen Graft-CDR-Antikörper umfassen nur die CDRs der H-Ketten- und L-Ketten-V-Regionen Aminosäuresequenzen eines von einem nicht-menschlichen Tier stammenden Antikörpers, und die FRs der H- und L-Ketten-V-Regionen und die C-Region umfassen Aminosäuresequenzen eines humanen Antikörpers. Zu nicht-menschlichen Tiere gehören beispielsweise Maus, Ratte, Hamster, Kaninchen, solange von diesen ein Hybridom hergestellt werden kann.
  • Hinsichtlich der FR der V-Regionen der H-Kette und L-Kette kann jede Aminosäuresequenz bekannter humaner Antikörper verwendet werden, beispielsweise eine Aminosäuresequenz, die unter den humanen Antikörperaminosäuresequenzen, HMHCS, ausgewählt ist, die bei der Protein Data Bank registriert sind. Vorzugsweise kann eine Aminosäuresequenz der FR von HMHCS verwendet werden, die ein hohe Homologie mit der FR eines monoklonalen Antikörpers eines nicht-menschlichen Tieres aufweist.
  • Wie vorstehend beschrieben, ist die Antikörperaktivität verringert, wenn nur die CDRs der H-Ketten-V-Region und L-Ketten-V-Region eines Antikörpers eines nicht-menschlichen Tieres die CDRs der H-Ketten-V-Region und L-Ketten-V-Region eines humanen Antikörpers ersetzen. Die vorliegende Erfindung betrifft folglich einen humanen Graft-CDR-Antikörper, worin mindestens eine Aminosäure der zuvor erwähnten Positionen in der FR der H-Ketten- und L-Ketten-V-Regionen des humanen Graft-CDR-Antikörpers durch eine andere Aminosäure ersetzt ist, so dass er gewisse Grade an Antigenbindungsaktivität, Bindungsspezifität und Antikörperabhängiger zellvermittelter Zytotoxizität (ADCC) sowie Komplement-abhängiger Zytotoxizität (CDC) aufweisen kann, die vergleichbar mit denen eines humanen chimären Antikörpers sind, der die V-Region eines von einem nicht-menschlichen Tier stammenden monoklonalen Antikörpers aufweist, der spezifisch mit dem Gangliosid GM2 reagiert, und ein Verfahren zu dessen Herstellung.
  • Das Ersetzen (der Austausch) von mindestens einer Aminosäure in der FR der H-Ketten- und L-Ketten-V-Regionen des erfindungsgemäßen humanen Graft-CDR-Antikörpers bedeutet, dass die Aminosäurereste, die in der FR der H-Ketten- und L-Ketten-V-Regionen des humanen Graft-CDR-Antikörpers mit einer humanen Antikörperaminosäuresequenz ersetzt werden sollen, durch andere Aminosäurereste an entsprechenden Positionen der FR der H-Ketten- und L-Ketten-V-Regionen eines von einem nicht-menschlichen Tier stammenden monoklonalen Antikörpers ersetzt werden (gegen diese Aminosäurereste ausgetauscht werden), der spezifisch mit Gangliosid GM2 reagiert. Dementsprechend wird mindestens eine Aminosäure der Positionen 38, 40, 67, 72, 84 und 98 in der FR der H-Ketten-V-Region und der Positionen 4, 11, 15, 35, 42, 46, 59, 69, 70, 71, 72, 76, 77 und 103 der FR der L-Ketten-V-Region durch eine andere Aminosäure ersetzt.
  • Als Beispiel für einen von einem nicht-menschlichen Tier stammenden monoklonalen Antikörper, der spezifisch mit Gangliosid GM2 reagiert, kann der monoklonale Anti-GM2-Antikörper KM796 der Maus (FERM BP-3340, JP-A-4-311385) genannt werden. Ein chimärer Anti-GM2-Antikörper KM966 (FERM BP-3931, JP-A-6-205694) kann als Beispiel für den humanen chimären Antikörper genannt werden, der die V-Region eines monoklonalen Antikörpers aufweist, welcher von einem nicht-menschlichen Tier stammt und spezifisch mit dem Gangliosid GM2 reagiert.
  • Zu Beispielen für einen Antikörper mit gewissen Graden an Antigenbindungsaktivität, Bindungsspezifität und Antikörper-abhängiger zellvermittelter Zytotoxizität (ADCC), die vergleichbar sind mit denen eines humanen chimären Antikörpers mit einer V-Region eines von einem nicht-menschlichen Tier stammenden monoklonalen Antikörpers, der spezifisch mit dem Gangliosid GM2 reagiert, gehören der durch die Transformantenzelllinie KM8966 (FERM BP-5105) hergestellte KM8966, der durch die Transformantenzelllinie KM8967 (FERM BP-5106) hergestellte KM8967 und der durch die Transformantenzelllinie KM8970 (FERM BP-5528) hergestellte KM8970.
  • Der von der Transformantenzelllinie KM8969 (FERM-BP-5527) hergestellte KM8969 kann als Beispiel eines Antikörpers genannt werden, der gewisse Grade an Antigenbindungsaktivität, Bindungsspezifität, Antikörper-abhängiger zellvermittelter Zytotoxizität (ADCC) und Komplement-abhängiger Zytotoxizität (CDC) aufweist, die mit denen eines humanen chimären Antikörpers vergleichbar sind, der eine V-Region eines von einem nicht-menschlichen Tier stammenden monoklonalen Antikörpers aufweist, der spezifisch mit dem Gangliosid GM2 reagiert.
  • Ein Verfahren zur Herstellung des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers wird nachfolgend besprochen.
  • 1. Konstruktion eines Expressionsvektors für humanisierte Antikörper
  • Der Expressionsvektor für humanisierte Antikörper ist ein Expressionsvektor zur Verwendung in tierischen Zellen, in welchen cDNA-Moleküle integriert sind, welche die C-Regionen der H-Kette und L-Kette eines humanen Antikörpers kodieren, und kann durch Insertion der die C-Regionen der H-Kette und L-Kette eines humanen Antikörpers kodierenden cDNA-Moleküle in jeweilige Expressionsvektoren zur Verwendung in tierischen Zellen oder durch Insertion der cDNA-Moleküle, welche die C-Regionen der H-Kette und L-Kette eines humanen Antikörpers kodieren, in einen einzelnen Expressionsvektor zur Verwendung bei tierischen Zellen (ein solcher Vektor wird Tandemkassettenvektor genannt) konstruiert werden. Die C-Regionen des humanen Antikörpers können jeder beliebigen C-Region der H-Kette und L-Kette eines menschlichen Antikörpers entstammen, und zu Beispielen dafür gehören die C-Region vom γ1-Typ (nachfolgend hier als „Cγ1" bezeichnet) und die C-Region vom γ4-Typ (nachfolgend hier als „Cγ4" bezeichnet) der H-Kette eines humanen Antikörpers und die C-Region vom κ-Typ (nachfolgend hier als „Cκ" bezeichnet) der L-Kette des humanen Antikörpers. Jeder beliebige Expressionsvektor zur Verwendung bei tierischen Zellen kann verwendet werden, solange die cDNA, welche die C-Region des humanen Antikörpers kodiert, integriert und exprimiert werden kann. Zu Beispielen davon gehören pAGE107 (Miyaji, H. et al., Cytotechnology, 3, 133 (1990)), pAGE103 (Mizukami, T. et al., J. Biochem., 101, 1307 (1987)), pHSG274 (Brady, G. et al., Gene, 27, 223 (1984)), pKCR (O'Hare, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78, 1527 (1981)), und pSG1βd2-4 (Miyaji, H. et al., Cytotechnology, 4, 173 (1990)). Zu Beispielen für den Promotor und Enhancer zur Verwendung in dem Expressionsvektor für tierische Zellen gehören der frühe Promotor und Enhancer von SV40 (Mizukami, T. et al., J. Biochem., 101, 1397 (1987)), der Promotor und Enhancer des LTR des Moloney Mausleukämievirus (Kuwana, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Comun., 149, 960 (1987)) und der Promotor (Mason, J.O. et al., Cell, 41, 479 (1985)) und Enhancer (Gillies, S.D. et al., Cell, 33, 717 (1983)) der H-Kette von Immunglobulin. Der so konstruierte Expressionsvektor für humanisierte Antikörper kann zur Expression des humanen chimären Antikörpers und des humanen Graft-CDR-Antikörpers in tierischen Zellen verwendet werden.
  • 2. Herstellung der für die V-Region eines Antikörpers eines nicht-menschlichen Tieres kodierenden cDNA
  • Die cDNA, welche die H-Ketten-V-Region und L-Ketten-V-Region des Antikörpers eines nicht-menschlichen Tieres gegen GM2 kodiert, wird auf die folgende Weise erhalten.
  • cDNA-Moleküle werden durch Extraktion von mRNA aus Zellen eines den monoklonalen Anti-GM2-Antikörper produzierenden Hybridoms synthetisiert. Unter Verwendung eines Phagen oder eines Plasmids wird von der auf diese Weise synthetisierten cDNA eine Bibliothek hergestellt. Unter Verwendung der cDNA, welche dem Anteil der C-Region entspricht, oder von cDNA, welche dem Anteil der V-Region jeder Kette eines Maus-Antikörpers entspricht, als Probe wird ein rekombinanter Phage oder ein rekombinantes Plasmid mit einer cDNA, welche die V-Region der H-Kette kodiert, oder ein rekombinanter Phage oder ein rekombinantes Plasmid mit einer cDNA, welche die V-Region der L-Kette kodiert, aus der Bibliothek isoliert, und die vollständigen Nukleotidsequenzen der ins Auge gefassten H-Ketten-V-Region und L-Ketten-V-Region des Antikörpers auf dem rekombinanten Phagen oder dem rekombinanten Plasmid werden bestimmt. Die vollständigen Aminosäuresequenzen der H-Ketten-V-Region und L-Ketten-V-Region werden von der somit bestimmten Nukleotidsequenz abgeleitet.
  • KM796 (FERM BP-3340, JP-A-4-311385) kann als ein Beispiel für die Hybridomzellen angegeben werden, die den monoklonalen Anti-GM2-Antikörper herstellen.
  • Die Guanidinthiocyanatcäsiumtrifluoracetat-Methode [Methods in Enzymol., 154, 3 (1987)] kann als Beispiel für eine Methode zur Herstellung von Gesamt-RNA aus KM796-Hybridomzellen angegeben werden, und die Methode der Oligo(dT)-immobilisierten Zellulosesäule (Molecular Cloning; A Laboratory Manual (2. Aufl.)] kann als Beispiel für eine Methode zur Herstellung von poly(A)+ RNA aus Gesamt-RNA angeführt werden. Als Beispiel für einen Kit zur Verwendung bei der Herstellung von mRNA aus den KM796-Hybridomzellen können der Fast Track mRNA Isolation Kit (hergestellt von Invitrogen) oder der Quick Prep mRNA Purification Kit (hergestellt von Pharmacia) angegeben werden.
  • Hinsichtlich der Methode zur Synthese von cDNA und zur Herstellung einer cDNA-Bibliothek können die in Molecular Cloning; A Laboratory Manual (2. Aufl.) und Current Protocols in Molecular Biology, Ergänzungsband 1-34, beschriebenen Methoden oder eine Methode, die einen kommerziell erhältlichen Kit verwendet, wie beispielsweise das Super ScriptTM Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (hergestellt von Life Technologies) oder den Zap-cDNA Synthesis Kit (hergestellt von Stratagene) angegeben werden. Bei der Herstellung einer cDNA-Bibliothek kann jeder beliebige Vektor als der Vektor verwendet werden, in den die unter Verwendung der aus den KM796-Hybridomzellen extrahierten mRNA synthetisierte cDNA integriert werden soll, solange die cDNA darin integriert werden kann. Zu Beispielen für solche Vektoren gehören ZAP Express [Strategies, 5, 58 (1992)], pBluescript II SK(+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)], λzap II (hergestellt von Stratagene), λgt10, λgt11 [DNA Cloning, A Practical Approach, Bd. 1, 49 (1985)], Lambda BlueMid (hergestellt von Clontech), λExCell, pT7T3 18U (hergestellt von Pharmacia), pcD2 [Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)] und pUC18 (Gene, 33, 103 (1985)].
  • Von Escherichia coli, in das eine durch den Vektor konstruierte cDNA-Bibliothek eingeführt werden soll, kann jeder beliebige Stamm verwendet werden, solange die cDNA-Bibliothek eingeführt, exprimiert und erhalten werden kann. Zu Beispielen für solche Stämme gehören XL1-Blue NRF' [Strategies, 5, 81 (1992)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], Y1088, Y1090 [Science, 222, 778 (1983)], NM522 [J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)], K802 [J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)] und JM105 [Gene, 38, 275 (1985)]. Eine Selektion der cDNA-Klone aus der cDNA-Bibliothek, welche die V-Regionen der H-Kette und L-Kette des Antikörpers eines nicht-menschlichen Tieres kodieren, kann durch eine Koloniehybridisierungs- oder Plaquehybridisierungsmethode durchgeführt werden, bei der eine mit einem Isotop markierte oder eine Fluoreszenz-markierte Sonde verwendet wird [Molecular Cloning; A Laboratory Manual (2. Aufl.)]. Ein die V-Regionen der H-Kette und L-Kette kodierendes DNA-Fragment kann auch durch Herstellung von Primern und Durchführen der Polymerasekettenreaktionsmethode (nachfolgend hier als „PCR" bezeichnet) hergestellt werden [Molecular Cloning; A Laboratory Manual (2. Aufl.), Current Protocols in Molecular Biology, Ergänzungsband 1-34], wobei aus poly(A)+ RNA oder mRNA synthetisierte cDNA oder eine cDNA-Bibliothek als Templat verwendet werden.
  • Die Bestimmung der Nukleotidsequenz der DNA kann erfolgen über Verdauen des über die vorstehend genannten Methodem selektierten cDNA-Klons mit geeigneten Restriktionsenzymen, Klonieren der verdauten Produkte in ein Plasmid, wie beispielsweise pBluescript SK(-) (hergestellt von Stratagene), und anschließendes Analysieren der resultierenden Klone über eineallgemein verwendete Methode zur Sequenzanalyse von Nukleotiden, beispielsweise die Dideoxy-Methode von Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 74, 5463 (1977)). Die Analyse der Nukleotidsequenz kann unter Verwendung einer automatischen Nukleotidsequenzanalysiervorrichtung, wie beispielsweise des 373A DNA-Sequencers (hergestellt von Applied Biosystems) durchgeführt werden.
  • 3. Identifizierung einer CDR des Antikörpers eines nicht-menschlichen Tieres
  • Jede V-Region der H-Kette und L-Kette des Antikörpers bildet eine Antigenbindungsstelle. Jede der V-Regionen der H-Kette und L-Kette umfasst vier FRs, deren Sequenzen relativ stabil sind, und drei CDRs, welche diese verbinden und reich an Sequenzänderungen sind (Kabat, E.A. et al., „Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services, 1991). Jede CDR kann gefunden werden, indem sie mit der Aminosäuresequenz der V-Region bekannter Antikörper verglichen wird (Kabat, E.A. et al., „Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services, 1991).
  • 4. Konstruktion der CDR eines Antikörpers eines nicht-menschlichen Tieres
  • Die DNA-Sequenzen, welche die H-Ketten-V-Region und L-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers kodieren, werden auf folgende Weise erhalten.
  • Zunächst wird eine Aminosäuresequenz der V-Region jeder H-Kette und L-Kette des humanen Antikörpers für das Grafting (Verpflanzen) der CDR der V-Region des Anti-GM2-Antikörpers eines nicht-menschlichen Tieres ausgewählt. Als die Aminosäuresequenz der V-Region des humanen Antikörpers kann jede beliebige der bekannten Aminosäuresequenzen der V-Region, die von humanen Antikörpern stammt, verwendet werden. Beispielsweise kann eine Aminosäuresequenz verwendet werden, die unter Aminosäuresequenzen der V-Region humaner Antikörper, HMHCS, registriert in der Protein Data Bank, ausgewählt wird. Um jedoch einen humanen Graft-CDR-Antikörper mit gewünschten Aktivitäten, beispielsweise Bindungsaktivität und Bindungsspezifität bezüglich GM2 oder einen Antitumoreffekt gegenüber GM2-positiven Zellen, zu erzeugen, ist es wünschens wert, dass die Sequenz eine hohe Homologie zu der Aminosäuresequenz der V-Region eines von einem nicht-menschlichen Tier stammenden monoklonalen Antikörpers aufweist. In einem nächsten Schritt wird die DNA-Sequenz, welche die FR in der Aminosäuresequenz der V-Region des menschlichen Antikörpers kodierert, mit der DNA-Sequenz verbunden, welche die Aminosäuresequenz der zum Ausgangspunkt der Neukonstruktion werdenden CDR der V-Region des von einem nicht-menschlichen Tier stammenden monoklonalen Antikörpers kodiert, wobei eine DNA-Sequenz erstellt wird, welche die Aminosäuresequenz der V-Region sowohl der H-Kette als auch der L-Kette kodiert. Insgesamt werden sechs synthetische DNA-Fragmente für jede Kette auf solche Weise entworfen, dass sie die somit entworfene DNA-Sequenz überspannen, und PCR wird damit durchgeführt. Alternativ werden sechs oder sieben jeder der Antisense- und Sense-DNA-Sequenzen, von denen jede 35 bis 84 Basen umfasst, auf solche Weise synthetisiert, dass sie die somit entworfene DNA-Sequenz überspannen, und diese werden unter Bildung von doppelsträngigen DNA-Fragmenten aneinander gelagert, welche dann der Verknüpfungsreaktion unterworfen werden. Danach wird das Produkt der Amplifizierungsreaktion oder der Verknüpfungsreaktion in einen geeigneten Vektor subkloniert und dessen Nukleotidsequenz bestimmt, wodurch ein Plasmid erhalten wird, das die DNA-Sequenz enthält, welche die Aminosäuresequenz der V-Region jeder Kette des gewünschten humanen Graft-CDR-Antikörpers kodiert.
  • 5. Modifizierung einer Aminosäuresequenz der V-Region eines humanen Graft-CDR-Antikörpers
  • Die Modifizierung der Aminosäuresequenz der V-Region eines humanen Graft-CDR-Antikörpers wird unter Verwendung von PCR mit einem Verfahren durchgeführt, das eine Mutation einführt. Beispielsweise werden ein Sense-Mutationsprimer und ein Antisense-Mutationsprimer, die 20 bis 40 Basen umfassen und eine DNA-Sequenz enthalten, welche die Aminosäurereste nach der Modifizierung kodieren, synthetisiert und PCR wird unter Verwendung eines Plasmids als dem Templat durchgeführt, das eine DNA-Sequenz enthält, welche die Aminosäuresequenz der zu modifizierenden V-Region kodiert. Die amplifizierten Fragmente werden in einen geeigneten Vektor subkloniert und ihre Nukleotidsequenzen dann bestimmt, um ein Plasmid zu erhalten, das eine DNA-Sequenz umfasst, in welche die gewünschte Mutation eingeführt wurde.
  • 6. Konstruktion eines Expressionsvektors für einen humanen Graft-CDR-Antikörpes
  • Der Expressionsvektor für einen humanen Graft-CDR-Antikörper kann konstruiert werden durch die Insertion der in den vorstehenden Abschnitten 4 und 5 erhaltenen, die V-Regionen der H-Kette und L-Kette des humanen Graft-CDR-Antikörpers kodierenden DNA-Sequenzen stromaufwärts von der cDNA des im vorstehenden Abschnitt 1 hergestellten Expressionsvektors für humanisierten Antikörper, die den C-Regionen der H-Kette und L-Kette des humanen Antikörpers entspricht. Beispielsweise werden sie zur korrekten Expression stromaufwärts von der cDNA der gewünschten C-Regionen des menschlichen Antikörpers insertiert, indem geeignete Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme in die 5'- und 3'-Enden einer synthetischen DNA eingeführt werden, wenn man eine PCR durchführt, um eine DNA-Sequenz zu konstruieren, welche die Aminosäuresequenzen der V-Regionen der H-Kette und L-Kette des humanen Graft-CDR-Antikörpers kodiert.
  • 7. Expression des humanen Graft-CDR-Antikörpers und Bewertung seiner Aktivität
  • Eine Transformantenzelllinie, die den humanen Graft-CDR-Antikörper herzustellen vermag, kann durch Einführen des im vorstehenden Abschnitt 6 hergestellten Expressionsvektors für einen humanen Graft-CDR-Antikörper erhalten werden.
  • Als Methode für die Einführung des Expressionsvektors in Wirtszellen kann die Elektroporation (JP-A-2-257891; Miyaji, H. et al., Cytotechnology, 3, 133 (1990) verwendet werden.
  • Hinsichtlich der Wirtszellen, in die der Expressionsvektor für einen Graft-CDR-Antikörper eingeführt wird, kann jede beliebige Art von Wirtszellen verwendet werden, solange der humane Graft-CDR-Antikörper darin exprimiert werden kann. Zu Beispielen für solche Zellen gehören SP2/0-Ag14-Zellen (ATCC CRL1581, nachfolgend hier als „SP2/0-Zellen" bezeichnet), P3X63-Ag8.653-Zellen der Maus (ATCC CRL1580), für das (nachfolgend als „DHFR-Gen" bezeichnete) Dihydrofolatreduktase-Gen defiziente CHO-Zellen (Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77, 4216 (1980)), YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20-Zellen der Ratte (ATCC CRL1662, nachfolgend hier als „YB2/0-Zellen" bezeichnet).
  • Nach Einführung des Vektors wird eine zur Herstellung des humanen Graft-CDR-Antikörpers befähigte Zelllinie gemäß dem in JP-A-2-257891 offenbarten Verfahren selektiert, wobei das RPMI 1640-Medium verwendet wird, das Geneticin (hergestellt von Gibco, nachfolgend hier als „G418" bezeichnet) und fötales Kälberserum (nachfolgend hier als „FCS" bezeichnet) enthält. Durch Kultivieren der so erhaltenen Transformantenzelllinie in einem Medium kann der humane Graft-CDR-Antikörper hergestellt und im Kulturüberstand angereichert werden. Die Aktivität des humanen Graft-CDR-Antikörper im Kulturüberstand wird beispielsweise durch den Enzym-gebundenen Immunosorbentassay (nachfolgend hier als „ELISA-Methode" bezeichnet; Harlow, E. et al., Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Kapitel 14 (1988)) gemessen. Zusätzlich kann die Herstellung des humanen Graff-CDR-Antikörpers durch die Transformantenzelllinie gemäß dem in JP-A-2-257891 offengelegten Verfahren unter Verwendung eines DHFR-Genamplifizierenden Systems und dergleichen verbessert werden.
  • Der humane Graff-CDR-Antikörper kann aus dem vorstehend erwähnten Kulturüberstand unter Verwendung einer Protein A-Säule aufgereinigt werden (Harlow, E. et al., Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Kapitel 8 (1988)). Alternativ können andere übliche Aufreinigungsmethoden für Proteine verwendet werden. Beispielsweise kann über Gelfiltration, Ionenaustauschchromatographie und Ultrafiltration in einer geeigneten Kombination aufgereinigt werden. Das Molekulargewicht der H-Kette, der L-Kette oder des gesamten Antikörpermoleküls des somit aufgereinigten humanen Graft-CDR-Antikörpers wird beispielsweise über Polyacrlamidgelelektrophorese (nachfolgend hier als „SDS-PAGE" bezeichnet; Laemmli, U.K. et al., Nature, 227, 680 (1970)) oder die Western-Blot-Technik (Harlow, E. et al., Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Kapitel 12 (1988)) gemessen.
  • Die Reaktivität des aufgereinigten humanen Graft-CDR-Antikörpers mit Antigenen und dessen Bindungsaktivität gegenüber kultivierten Krebszelllinien werden über die ELISA-Methode oder unter Verwendung fluoreszierender Antikörper gemessen. Seine Komplement-abhängige Zytotoxizität (nachfolgend hier als „CDC" bezeichnet) und Antikörper-abhängige zellvermittelte Zytotoxizität (nachfolgend hier als „ADCC" bezeichnet) gegen kultivierte Krebszelllinien werden nach der Methode von Shitara, K. et al. (Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)) gemessen.
  • Da der humane Graft-CDR-Antikörper der vorliegenden Erfindung an kultivierte Krebszelllinien humanen Ursprungs in einer spezifischen Weise bindet und zytotoxische Aktivitäten, wie beispielsweise CDC-Aktivität und ADCC-Aktivität, zeigt, ist er für die Diagnose und Behandlung von Humankrebs brauchbar. Da die meisten Teile des Antikörpers von der Aminosäuresequenz eines humanen Antikörpers stammen, wird bei Vergleich mit monoklonalen Antikörpern tierischen, nicht-menschlichen Usprungs zusätzlich erwartet, dass er, ohne Immunogenizität zu zeigen einen staken Antitumoreffekt ausüben wird und dass der Effekt für eine lange Zeitdauer aufrechterhalten wird.
  • Der humane Graft-CDR-Antikörper der vorliegenden Erfindung kann, allein oder zusammen mit mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoff (Träger), als Antitumorzusammensetzung verwendet werden. Der humane Graft-CDR-Antikörper kann beispielsweise in eine geeignete pharmazeutische Zusammensetzung überführt werden, indem er in physiologischer Kochsalzlösung oder einer wässrigen Glukose-, Laktose- oder Mannitollösung gelöst wird. Alternativ wird der humane Graft-CDR-Antikörper auf übliche Weise gefriergetrocknet und dann mit Natriumchlorid gemischt, um Pulverinjektionen herzustellen. Je nach Bedarf kann die pharmazeutische Zusammensetzung pharmazeutisch verträgliche Salze und Additive enthalten, die auf dem Gebiet der pharmazeutischen Zubereitungen allgemein bekannt sind.
  • Wenngleich die Dosierung der pharmazeutischen Zubereitung in Abhängigkeit vom Alter und den Symptomen jedes Patienten variiert, wird der humane Graft-CDR-Antikörper Tieren, einschließlich Menschen, mit einer Dosis von 0,2 bis 20 mg/kg/Tag verabreicht. Die Verabreichung wird einmal pro Tag (einzelne Verabreichung oder tägliche Verabreichung) oder ein- bis dreimal pro Woche oder einmal in zwei bis drei Wochen über intravenöse Injektion vorgenommen.
  • Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele dargestellt, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
  • BEISPIEL 1
  • Konstruktion des Tandemkassettenvektors pKANTEX93 für die Expression von humanisiertem Antikörper:
  • Ein Tandemkassettenvektor für die Expression von humanisiertem Antikörper, pKANTEX93, wurde für die Expression von humanem Graft-CDR-Antikörper in tierischen Zellen auf der Grundlage des in der JP-A-2-257891 beschriebenen Plasmids pSE1UK1SEd1-3 durch Insertion eines für die H-Ketten-V-Region eines humanen Graft-CDR-Antikörpers kodierenden cDNA-Fragments und eines für die L-Ketten-V-Region eines humanen Graft-CDR-Antikörpers kodierenden cDNA-Fragments in den Vektor stromaufwärts von der cDNA des humanen Antikörpers Cγ1 bzw. der cDNA des humanen Antikörpers Cκ auf die nachfolgend beschriebene Weise konstruiert. Der auf diese Weise konstruierte Expressionsvektor für humanisierte Antikörper kann auch für die Expression eines chimären Maus-Mensch-Antikörpers verwendet werden.
  • 1. Modifizierung von ApaI- und EcoRI-Restriktionsschnittstellen, die in den Kaninchen-β-Globin-Gen-Spleiß- und Poly-A-Signalen auftauchen.
  • Um die Konstruktion eines Expressionsvektors für einen humanen Graft-CDR-Antikörper durch kassettenweise Insertion von V-Regionen humaner Graft-CDR-Antikörper in Form von NotI-ApaI(H-Kette) und EcoRI-SplI(L-Kette)-Restriktionsfragmenten in einen Vektor für die Expression eines humanisierten Antikörpers zu ermöglichen, wurden die ApaI- und EcoRI-Restriktionsschnittstellen, die in den Kaninchen-β-Globin-Gen-Spleiß- und poly-A-Signalen des Plasmids pSE1UK1SEd1-3 vorkommen, in folgender Weise modifiziert.
  • Zu 10 μl 10 mM Trishydrochlorid-Puffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, wurden 3 μg des Plasmids pBluescript® SK(-) (Stratagene) gegeben, weiterhin 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (Takara Shuzo), und die Verdauungsreaktion eine Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen und die durch den ApaI-Verdau entstehenden 3'-kohäsiven Enden wurden unter Verwendung des DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) glatt gemacht, worauf sich eine Ligation unter Verwendung des DNA Ligation Kit (Takara Shuzo) anschloss. Die dadurch erhaltene Lösung rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet. Dadurch wurde ein Plasmid, pBSA, erhalten, das in 1 gezeigt ist.
  • 3 μg des so erhaltenen Plasmids pBSA wurden zu 10 μl 50 mM Trishydrochlorid-Puffer (pH 7,5) gegeben, der 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI (Takara Shuzo) wurden weiter zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen und die durch den EcoRI-Verdau entstehenden 5'-kohäsiven Enden wurden unter Verwendung des DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) glatt gemacht, worauf sich eine Ligation unter Verwendung des DNA Ligation Kit (Takara Shuzo) anschloss. Die dadurch erhaltene Lösung rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet. Das dadurch erhaltene Plasmid pBSAE ist in 2 gezeigt.
  • Daraufhin wurden 3 μg des so erhaltenen Plasmids pBSAE zu 10 μl 10 mM Trishydrochlorid-Puffer (pH 7,5) gegeben, der 10 mM Magnesiumchlorid, 50 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, 10 Einheiten des Restriktionsenzyms HindIII (Takara Shuzo) wurden weiter zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen, das Präzipitat in 20 μl 10 mM Trishydrochlorid-Puffer (pH 7,5) gelöst, der 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, und die Lösung in zwei Aliquots von 10 μl aufgeteilt. Einem Aliquot wurden weiterhin 10 Einheiten des Restriktionsenzyms SacII (Toyobo) zugegeben, und dem anderen weiterhin 10 Einheiten des Restriktionsenzyms KpnI (Takara Shuzo), und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Beide Reaktionsgemische wurden über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, wobei jeweils 0,3 μg eines HindIII-SacII-Fragments (etwa 2,96 kb) und eines KpnI-HindIII-Fragments (etwa 2,96 kb) isoliert wurden.
  • Danach wurden 3 μg des Plasmids pSE1UK1SEd1-3 zu 10 μl 10 mM Trishydrochlorid-Puffer (pH 7,5) gegeben, der 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, 10 Einheiten des Restriktionsenzyms SacII (Toybo) und 10 Einheiten des Restriktionsenzyms KpnI (Takara Shuzo) wurden weiter zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen, das Präzipitat in 10 μl 10 mM Trishydrochlorid-Puffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid, 50 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, gelöst, weiterhin 10 Einheiten des Restriktionsenzyms HindIII (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, wobei jeweils etwa 0,2 μg eines HindIII-SacII-Fragments (etwa 2,42 kb) und eines KpnI-HindIII-Fragments (ungefähr 1,98 kb) isoliert wurden.
  • 0,1 μg des so erhaltenen HindIII-SacII-Fragments von pSE1UK1SEd1-3 und 0,1 μg des vorstehend genannten HindIII-SacII-Fragments von pBSAE wurden in einem Gesamtvolumen von 20 μl sterilisierten Wassers gelöst und unter Verwendung von Ready-To-Go T4 DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) miteinander ligiert. Die so erhaltene Lösung rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet und als Ergebnis das in 3 gezeigte Plasmid pBSH-S erhalten. Weiterhin wurden 0,1 μg des vorstehend genannten KpnI-HindIII-Fragments von pSE1UK1SEd1-3 und 0,1 μg des vorstehend genannten KpnI-HindIII-Fragments von pBSAE in einem Gesamtvolumen von 20 μl sterilisiertem Wasser gelöst und unter Verwendung von Ready-To-Go-T4 DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) miteinander ligiert. Die so erhaltene Lösung wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet und das in 4 gezeigte Plasmid pBSK-H erhalten.
  • Daraufhin wurden jeweils 3 μg der so erhaltenen Plasmide pBSH-S bzw. pBSK-H zu 10 μl-Aliquots eines 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (Takara Shuzo) wurden weiterhin jedem Gemisch zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Beide Reaktionsgemische wurden einer Ethanolfällung unterworfen. Bei jedem Präzipitat wurden die durch den ApaI-Verdau entstandenen 3'-kohäsiven Enden unter Verwendung des DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) glatt gemacht, worauf sich Ligation unter Verwendung des DNA Ligation Kit (Takara Shuzo) anschloss. Die so erhaltene Lösung rekombinanter DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet und die in 5 gezeigten Plasmide pBSH-SA und pBSK-HA erhalten.
  • 5 μg jedes der so erhaltenen Plasmide pBSH-SA bzw. pBSK-HA wurden dann zu 10 μl-Aliquots eines 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin eine Einheit des Restriktionsenzyms EcoRI (Takara Shuzo) jedem Gemisch zugegeben und die Reaktion für einen Partialverdau 10 Minuten bei 37 °C durchgeführt. Beide Reaktionsgemische wurden einer Ethanolfällung unterworfen. Bei jedem Präzipitat wurden die durch den EcoRI-Verdau entstandenen 5'-kohäsiven Enden unter Verwendung des DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) glatt gemacht, worauf sich eine Auftrennung über Agarosegelelektrophorese anschloss, wobei jeweils etwa 0,5 μg eines Fragments mit einer Länge von etwa 5,38 kb und eines Fragments mit einer Länge von etwa 4,94 kb isoliert wurden. Die auf diese Weise isolierten Fragmente (jeweils 0,1 μg) wurden in einem Gesamtvolumen von 20 μl sterilisiertem Wasser gelöst und unter Verwendung von Ready-To-Go T4 DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) ligiert. Die auf diese Weise erhaltenen Lösungen rekombinanter DNA wurden jeweils zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet, und die in 6 gezeigten Plasmide pBSH-SAE und pBSK-HAE wurden erhalten.
  • Anschließend wurden jeweils 3 μg der auf diese Weise erhaltenen Plasmide pBSH-SAE bzw. pBSK-HAE zu 10 μl-Aliquots eines 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI (Takara Shuzo) zu jedem Gemisch gegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Beide Reaktionsgemische wurden einer Ethanolfällung unterworfen. Bei jedem Präzipitat wurden die durch den EcoRI-Verdau entstandenen 5'-kohäsiven Enden unter Verwendung des DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) glatt gemacht, worauf sich eine Ligation unter Verwendung des DNA Ligation Kit (Takara Shuzo) anschloss. Die auf diese Weise erhaltenen Lösungen rekombinanter Plasmid-DNA wurden jeweils verwendet, um Escherichia coli HB101 zu transformieren, und zwei in 7 gezeigte Plasmide, pBSH-SAEE und pBSK-HAEE, wurden erhalten. 10 μg jedes der auf diese Weise erhaltenen Plasmide wurden gemäß den Anweisungen, die dem AutoRead Sequencing Kit (Pharmacia Biotech) beigefügt waren, einer Sequenzierungsreaktion unterworfen, worauf sich die Bestimmung der Basensequenz durch Elektrophorese auf einem A.L.F. DNA Sequencer (Pharmacia Biotech) anschloss, wodurch bestätigt wurde, dass sowohl die ApaI- als auch die EcoRI-Schnittstellen als Ergebnis der vorstehend beschriebenen Modifizierung verschwunden waren.
  • 2. Einführung einer SalI-Restriktionsschnittstelle stromabwärts von den Kaninchen-β-Globin-Gen-Spleiß- und poly-A-Signalen und vom poly-A-Signal des frühen Gens von SV40.
  • Um den Austausch der Expressionspromotoren der H-Kette und L-Kette des Antikörpers des Expressionsvektors für einen humanisierten Antikörper gegen einen beliebigen Promotor zu ermöglichen, wurde stromabwärts von den Kaninchen-β-Globin-Gen-Spleiß- und poly-A-Signalen und vom poly-A-Signal des frühen Gens von SV40 auf die nachfolgend beschriebene Weise eine SalI-Restriktionsschnittstelle eingeführt.
  • 3 μg des in Abschnitt 1 von Beispiel 1 erhaltenen Plasmids pBSK-HAEE wurde zu 10 μl eines 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms NaeI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen, das Präzipitat in 20 μl 1 mM Magnesiumchlorid enthaltendem 50 mM Trishydrochlorid-Puffer (pH 9,0) gelöst, weiterhin eine Einheit alkalische Phosphatase (E. coli C75, Takara Shuzo) zugegeben und für eine Dephosphorylierung an den 5'-Enden die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde weiterhin einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanolfällung unterworfen, und das Präzipitat in 1 mM Dinatriumethylendiamintetraacetat enthaltendem 10 mM Trishydrochlorid-Puffer (pH 8,0) (nachfolgend hier kurz als „TE-Puffer" bezeichnet) gelöst. 1 μl der Reaktionslösung und 0,1 μg eines phosphorylierten SalI-Linkers (Takara Shuzo) wurden bis auf ein Gesamtvolumen von 20 μl zu sterilisiertem Wasser gegeben, worauf sich eine Ligationsbehandlung unter Verwendung von Ready-To-Go T4 DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) anschloss. Die auf diese Weise erhaltene Lösung rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet, und ein in 8 gezeigtes Plasmid, pBSK-HAEESal, wurde erhalten. 10 μg des auf diese Weise erhaltenen Plasmids wurden gemäß Anweisungen, die dem AutoRead Sequencing Kit (Pharmacia Biotech) beigefügt waren einer Sequenzierungsreaktion unterworfen, worauf sich zur Bestimmung der Basensequenz eine Elektrophorese auf einen A.L.F. DNA Sequencer (Pharmacia Biotech) anschloss, wodurch bestätigt wurde, dass stromabwärts von den Kaninchen-β-Globin-Gen-Spleiß- und poly-A-Signalen und vom poly-A-Signal des frühen Gens von SV40 eine SalI-Restriktionsschnittstelle eingeführt worden war.
  • 3. Modifizierung der in einem poly-A-Signal des Thymidinkinase-Gens des Herpes simplex-Virus (nachfolgend hier als „HSVtk" bezeichnet) vorkommenden ApaI-Restriktionsschnittstelle
  • Die in dem poly-A-Signal des HSVtk-Gens stromabwärts vom Tn5-Kanamycinphosphotransferase-Gen des Plasmids pSE1UK1SEd1-3 vorkommende ApaI-Restriktionsschnittstelle wurde auf die nachfolgend beschriebene Weise modifiziert.
  • 3 μg des in Abschnitt 1 von Beispiel 1 erhaltenen Plasmids pBSA wurden zu 10 μl eines 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms SacII (Toyobo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen, das Präzipitat zu 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, worauf weiterhin 10 Einheiten des Restriktionsenzyms XhoI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion für 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, wodurch etwa 1 μg eines SacII-XhoI-Fragments (etwa 2,96 kb) isoliert wurden.
  • Danach wurden 5 μg des Plasmids pSE1UK1SEd1-3 zu 10 μl eines 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms SacII (Toyobo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen, das Präzipitat zu 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) zugegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms XhoI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, wodurch ungefähr 1 μg eines SacII-XhoI-Fragments (ungefähr 4,25 kb) isoliert wurden.
  • Danach wurden 0,1 μg des vorstehend genannten SacII-XhoI-Fragments von pBSA und des vorstehend genannten SacII-XhoI-Fragments von pSE1UK1SEd1-3 bei einem Gesamtvolumen von 20 μl zu sterilisiertem Wasser gegeben, worauf sich die Ligation unter Verwendung von Ready-To-Go T4 DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) anschloss. Die auf diese Weise erhaltene Lösung rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet und das in 9 gezeigte Plasmid pBSX-S erhalten.
  • Danach wurden 3 μg des auf diese Weise erhaltenen Plasmids pBSX-S zu 10 μl eines 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen, die beim ApaI-Verdau entstandenen 3'-kohäsiven Enden unter Verwendung des DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) glatt gemacht und die Ligation dann unter Verwendung des DNA Ligation Kit (Takara Shuzo) durchgeführt. Die auf diese Weise erhaltene Lösung rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet und das in 10 gezeigte Plasmid pBSX-SA erhalten. 10 μg des auf diese Weise erhaltenen Plasmids wurden gemäß den Anweisungen, die dem AutoRead Sequencing Kit (Pharmacia Biotech) beigefügt waren, einer Sequenzierungsreaktion unterworfen, worauf sich eine Elektrophorese auf einem A.L.F. DNA Sequencer (Pharmacia Biotech) zur Bestimmung der Basensequenz anschloss, wodurch bestätigt wurde, dass die ApaI-Restriktionsschnittstelle in dem poly-A-Signal des HSVtk-Gens verschwunden war.
  • 4. Konstruktion einer Expressionseinheit für die L-Kette eines humanisierten Antikörpers
  • Ein Plasmid mit der Bezeichnung pMohCκ, das die Cκ-cDNA eines menschlichen Antikörpers stromabwärts vom Promotor/Enhancer des langen terminalen Repeats des Moloney Maus-Leukämievirus umfasst und eine Expressionseinheit für die L-Kette eines humanisierten Antikörpers aufweist, welche die kassettenweise Insertion einer L-Ketten-V-Region eines humanisierten Antikörpers in die Expressionseinheit ermöglicht, wurde auf folgende Weise konstruiert.
  • 3 μg des Plasmids pBluescript® SK(-) (Stratagene) wurden zu 10 μl eines 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms SacI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion für 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen, das Präzipitat zu 10 μl eines 50 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ClaI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen und die durch den Verdau mit SacI und ClaI entstandenen kohäsiven Enden unter Verwendung des DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) glatt gemacht, worauf sich eine Auftrennung durch Agarosegelelektrophorese anschloss, wodurch etwa 1 μg eines DNA-Fragments mit einer Länge von etwa 2,96 kb isoliert wurde. Ein Aliquot von 0,1 μg des isolierten DNA-Fragments wurde bei einem Gesamtvolumen von 20 μl zu sterilisiertem Wasser gegeben und unter Verwendung von Ready-To-Go T4 DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) ligiert. Die auf diese Weise erhaltene Lösung rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet und das in 11 gezeigte Plasmid pBSSC erhalten.
  • 3 μg des auf diese Weise erhaltenen Plasmids pBSSC wurden dann zu 10 μl eines 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms KpnI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen, das Präzipitat in 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gelöst, weiterhin 10 Einheiten des Restriktionsenzyms XhoI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, wodurch etwa 1 μg eines KpnI-XhoI-Fragments (etwa 2,96 kb) isoliert wurden.
  • Daraufhin wurden 5 μg des in der JP-A-6-205694 beschriebenen Plasmids pAGE147 zu 10 μl eines 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffer (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms KpnI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolpräzipitation unterworfen und das Präzipitat in 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gelöst, 10 Einheiten des Restriktionsenzyms XhoI (Takara Shuzo) wurden weiterhin zugegeben und die Reaktion durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, wodurch etwa 0,3 μg eines den Promotor/Enhancer des langen terminalen Repeats des Moloney Maus-Leukämievirus enthaltenden KpnI-XhoI-Fragments (etwa 0,66 kb) isoliert wurden.
  • 0,1 μg des KpnI-XhoI-Fragments von pBSSC und 0,1 μg des KpnI-XhoI-Fragments von pAGE147, die jeweils wie vorstehend beschrieben erhalten wurden, wurden dann in sterilisiertem Wasser bei einem Gesamtvolumen von 20 μl gelöst und unter Verwendung von Ready-To-Go T4 DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) ligiert. Die auf diese Weise erhaltene Lösung rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet und das in 12 gezeigte Plasmid pBSMo erhalten.
  • 3 μg des vorstehend beschriebenen Plasmids pBSMo wurden dann 10 μl eines 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms KpnI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen, das Präzipitat in 10 μl eines 50 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gelöst, 10 Einheiten des Restriktionsenzyms HindIII (Takara Shuzo) wurden weiterhin zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, wodurch etwa 1 μg eines KpnI-HindIII-Fragments (etwa 3,62 kb) isoliert wurden.
  • Daraufhin wurden synthetische DNAs mit den in SEQ ID NO:12 bzw. SEQ ID NO:13 gezeigten Basensequenzen unter Verwendung einer automatischen DNA- Synthesevorrichtung (Applied Biosystems model 380a) synthetisiert. 0,3 μg jedes der auf diese Weise erhaltenen synthetischen DNAs wurden zu 15 μl sterilisiertem Wasser gegeben und das Gemisch 5 Minuten auf 65 °C erhitzt. Man ließ das Reaktionsgemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen und gab dann 2 μl eines 10fach konzentrierten Puffers [500 mM Trishydrochlorid (pH 7,6), 100 mM Magnesiumchlorid, 50 mM DTT] und 2 μl 10 mM ATP zu, gab weiterhin 10 Einheiten T4 Polynukleotidkinase zu und führte die Reaktion 30 Minuten bei 37 °C zur Phosphorylierung der 5'-Enden durch. Zu einem Gesamtvolumen von 20 μl sterilisierten Wassers wurden 0,1 μg des von dem Plasmid pBSMo stammenden vorstehend beschriebenen KpnI-HindIII-Fragments (3,66 kb) und 0,05 μg des posphorylierten synthetischen DNA-Paars gegeben und eine Ligation unter Verwendung von Ready-To-Go T4 DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) durchgeführt. Die auf diese Weise erhaltene Lösung rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet und das in 13 gezeigte Plasmid pBSMoS erhalten. 10 μg des auf diese Weise erhaltenen Plasmids wurden gemäß den Anweisungen, die dem AutoRead Sequencing Kit (Pharmacia Biotech) beigefügten waren, einer Sequenzierungsreaktion unterworfen, worauf sich eine Elektrophorese auf einem A.L.F. DNA Sequencer (Pharmacia Biotech) zur Bestimmung der Basensequenz anschloss, wodurch bestätigt wurde, dass das synthetische DNA-Paar, wie beabsichtigt, eingeführt worden war.
  • Daraufhin wurden 3 μg des in der JP-A-5-304989 beschriebenen Plasmids pChiIgLA1 in 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gelöst, weiterhin wurden jeweils 10 Einheiten der Restriktionsenzyme EcoRI (Takara Shuzo) und EcoRV (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, wodurch etwa 1 μg eines EcoRI-EcoRV-Fragments (etwa 9,70 kb) isoliert wurden.
  • Unter Verwendung einer automatischen DNA-Synthesevorrichtung (Applied Biosystems model 380A) wurden daraufhin synthetische DNAs mit den in SEQ ID NO:14 bzw. SEQ ID NO:15 gezeigten Sequenzen synthetisiert. 0,3 μg jeder der auf diese Weise erhaltenen synthetischen DNAs wurden zu 15 μl sterilisiertem Wasser gegeben und das Gemisch 5 Minuten auf 65 °C erhitzt. Man ließ das Reaktionsgemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Daraufhin wurden 2 μl eines 10fach konzentrierten Puffers [500 mM Trishydrochlorid (pH 7,6), 100 mM Magnesiumchlorid, 50 mM DTT] und 2 μl 01 mM ATP zugegeben, weiterhin 10 Einheiten T4 Polynukleotidkinase, und die Reaktion 30 Minuten bei 37 °C zur Phosphorylierung der 5'-Enden durchgeführt. 0,1 μg des vorstehend beschriebenen, vom Plasmid pChiIgLA1 stammenden EcoRI-EcoRV-Fragments (9,70 kb) und 0,05 μg der phosphorylierten synthetischen DNA wurden zu einem Gesamtvolumen von 20 μl sterilisiertem Wasser gegeben und die Reaktion unter Verwendung von Ready-To-Go T4 DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) durchgeführt. Die auf diese Weise erhaltene Lösung rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet und das in 14 gezeigte Plasmid pChiIgLA1S erhalten.
  • 3 μg des auf die vorstehend beschriebene Weise erhaltenen Plasmids pBSMoS wurden in 10 μl eines 100 mM Kaliumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 20 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 8,5) gelöst, weiterhin 10 Einheiten des Restriktionsenzyms HpaI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolpräzipitation unterworfen und das Präzipitat in 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gelöst, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, wodurch etwa 1 μg eines HpaI-EcoRI-Fragments (etwa 3,66 kb) isoliert wurden.
  • 10 μg des auf die vorstehend beschriebene Weise erhaltenen Plasmids pChiIgLA1S wurden dann in 10 μl eines 50 mM Kaliumacetat, 10 mM Magnesiumacetat, 1 mM DTT und 100 μg/ml BSA enthaltenden 20 mM Trisacetat-Puffers (pH 7,9) gelöst, 10 Einheiten des Restriktionsenzyms NlaIV (New England BioLabs) wurden weiterhin hinzugegeben, und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen, das Präzipitat in 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gelöst und weiterhin 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI (Takara Shuzo) zugegeben, und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, wodurch etwa 0,3 μg eines NlaIV-EcoRI-Fragments (etwa 0,41 kb) isoliert wurden.
  • 0,1 μg des vorstehend beschriebenen HpaI-EcoRI-Fragments von pBSMoS und 0,1 μg des vorstehend beschriebenen NlaIV-EcoRI-Fragments von pChiIgLA1S wurden dann in einem Gesamtvolumen von 20 μl zu sterilisiertem Wasser gegeben und eine Ligation unter Verwendung von Ready-To-Go T4 DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) durchgeführt. Die auf diese Weise erhaltene Lösung rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet und das in 15 gezeigte Plasmid pMohCκ erhalten.
  • 5. Konstruktion einer Expressionseinheit für die H-Kette eines humanisierten Antikörpers
  • Ein Plasmid mit der Bezeichnung pMohCγ1, das die Cγ1-cDNA eines humanen Antikörpers stromabwärts vom langen terminalen Repeat des Moloney Maus-Leukämievirus enthielt und eine Expressionseinheit für die H-Kette eines humanisierten Antikörpers aufwies, welche die kassettenweise Insertion einer H-Ketten-V-Region eines humanisierten Antikörpers in die Expressionseinheit ermöglichte, wurde auf die nachfolgend beschriebene Weise konstruiert.
  • 3 μg des in Abschnitt 4 von Beispiel 1 erhaltenen Plasmids pBSMo wurden zu 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) zugegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms XhoI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen, das Präzipitat in 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 1 mM Zinkacetat und 10 % Glyzerin enthaltenden 30 mM Natriumacetat-Puffers (pH 5,0) gelöst, weiterhin wurden 10 Einheiten Mung Bean-Nuklease (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 10 Minuten bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanolfällung unterworfen, die kohäsiven Enden des Präzipitats wurden unter Verwendung des DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) glatt gemacht und eine Ligation unter Verwendung des DNA Ligation Kit (Takara Shuzo) durchgeführt. Die auf diese Weise erhaltene Lösung rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet und das in 16 gezeigte Plasmid pBSMoSal erhalten. Gemäß den Anweisungen, die dem AutoRead Sequencing Kit (Pharmacia Biotech) beigefügten waren, wurde ein Aliquot von 10 μg des erhaltenen Plasmids einer Sequenzierungsreaktion unterworfen, worauf sich eine Elektrophorese auf einem A.L.F. DNA Sequencer (Pharmacia Biotech) zur Bestimmung der Basensequenz anschloss, wodurch bestätigt wurde, dass die stromaufwärts vom Promotor/Enhancer des langen terminalen Repeats des Moloney Maus-Leukämievirus befindliche XhoI-Restriktionsschnittstelle verschwunden war.
  • Zu 10 μl eines 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) wurden dann 3 μg des wie vorstehend beschrieben erhaltenen Plasmids pBSMoSal zugegeben, weiterhin 10 Einheiten des Restriktionsenzyms KpnI (Takara Shuzo), und die Reaktion wurde 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen, das Präzipitat in 10 μl eines 50 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gelöst, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms HindIII (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, wobei etwa 1 μg eines KpnI-HindIII-Fragments (etwa 3,66 kb) isoliert wurden.
  • Unter Verwendung einer automatischen DNA-Synthesevorrichtung (Applied Biosystems model 380A) wurden dann synthetische DNAs mit den in SEQ ID NO:16 bzw. SEQ ID NO:17 gezeigten Basensequenzen synthetisiert. 0,3 μg jeder der auf diese Weise erhaltenen synthetischen DNAs wurden zu 15 μl sterilisiertem Wasser gegeben und das Gemisch 5 Minuten auf 65 °C erhitzt. Man ließ das Reaktionsgemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Danach wurden 2 μl eines 10fach konzentrierten Puffers [500 mM Trishydrochlorid (pH 7,6), 100 mM Magnesiumchlorid, 50 mM DTT] und 2 μl 10 mM ATP zugegeben, weiterhin 10 Einheiten T4 Polynukleotidkinase, und die Reaktion zur Phosphorylierung der 5'-Enden 30 Minuten bei 37 °C durchgeführt. Einem Gesamtvolumen von 20 μl sterilisiertem Wasser wurden 0,1 μg des oben beschriebenen, vom Plasmid pBSMoSal stammenden KpnI-HindIII-Fragments (3,66 kb (und 0,05 μg der phosphorylierten synthetischen DNA zugegeben und eine Ligation unter Verwendung von Ready-To-Go T4 DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) durchgeführt. Die auf diese Weise erhaltene Lösung rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet und das in 17 gezeigte Plasmid pBSMoSalS erhalten. Gemäß den Anweisungen, die dem AutoRead Sequencing Kit (Pharmacia Biotech) beigefügten waren, wurde ein Aliquot von 10 μg des auf diese Weise erhaltenen Plasmids einer Sequenzierungsreaktion unterworfen, worauf sich eine Elektrophorese auf einem A.L.F. DNA Sequencer (Pharmacia Biotech) zur Bestimmung der Basensequenz anschloss, wodurch bestätigt wurde, dass die synthetische DNA wie beabsichtigt eingeführt worden war.
  • Danach wurden 10 μg des in der JP-A-5-304989 beschriebenen Plasmids pChiIgHB2 in 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gelöst, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms Eco52I (Toyobo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen, das Präzipitat in 10 μl eines 100 Natriumchlorid, 1 mM Zinkacetat und 10 % Glyzerin enthaltenden 30 mM Natriumacetat-Puffers (pH 5,0) gelöst, weiterhin wurden 10 Einheiten Mung Bean-Nuklease (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 10 Minuten bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanolfällung unterworfen, und die kohäsiven Enden unter Verwendung des DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) glatt gemacht. Nach Ethanolfällung wurde das Präzipitat in 10 μl eines 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gelöst, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, wodurch etwa 0,7 μg eines ApaI-Fragments mit glatten Enden (etwa 0,99 kb) isoliert wurden.
  • 3 μg des Plasmids pBluescript® SK(-) (Stratagene) wurden dann zu 10 μl eines 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) zugegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen, das Präzipitat in 10 μl eines 10 mM Magnesiumacetat, 66 mM Kaliumacetat, 0,5 mM DTT und 100 μg/ml BSA enthaltenden 33 mM Trisacetat-Puffers (pH 7,9) gelöst, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms SmaI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, wodurch etwa 1 μg eines ApaI-SmaI-Fragments (etwa 3,0 kb) isoliert wurden.
  • 0,1 μg des ApaI-Fragments von pChiIgHB2 mit glatten Enden und 0,1 μg des ApaI-SmaI-Fragments von pBluescript® SK(-), die jeweils wie vorstehend beschrieben erhalten wurden, wurden dann zu sterilisiertem Wasser bei einem Gesamtvolumen von 20 μl gegeben und unter Verwendung von Ready-To-Go T4 DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) miteinander ligiert. Die auf diese Weise erhaltene Lösung rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet und das in 18 gezeigte Plasmid pBShCγ1 erhalten.
  • 5 μg des vorstehend beschriebenen Plasmids pBShCγ1 wurden dann in 10 eines 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gelöst, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen, das Präzipitat in 10 μl eines 50 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gelöst, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms SpeI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, wodurch etwa 1 μg eines ApaI-SpeI-Fragments (etwa 1,0 kb) isoliert wurden.
  • 3 μg des Plasmids pBSMoSalS, das wie vorstehend beschrieben erhalten wurde, wurden dann in 10 μl eines 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gelöst, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen, das Präzipitat in 10 μl eines 50 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gelöst, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms SpeI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, wobei etwa 1 μg eines ApaI-SpeI-Fragments (etwa 3,66 kb) isoliert wurden.
  • 0,1 μg des ApaI-SpeI-Fragments von pBShCγ1 und 0,1 μg des ApaI-SpeI-Fragments von pBSMoSalS, die jeweils wie vorstehend beschrieben erhalten wurden, wurden dann sterilisiertem Wasser bei einem Gesamtvolumen von 20 μl zugegeben und unter Verwendung von Ready-To-Go T4 DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) miteinander ligiert. Die auf diese Weise erhaltene Lösung rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet und das in 19 gezeigte Plasmid pMohCγ1 erhalten.
  • 6. Konstruktion eines Tandemkassettenexpressionsvektors für humanisierte Antikörper, pKANTEX93
  • Ein Tandemkassettenexpressionsvektor für humanisierte Antikörper, pKANTEX, wurde unter Verwendung der verschiedenen in den Abschnitten 1 bis 5 von Beispiel 1 erhaltenen Plasmide auf die nachfolgend beschriebene Weise konstruiert.
  • 3 μg des in Abschnitt 1 von Beispiel 1 erhaltenen Plasmids pBSH-SAEE wurden zu 10 μl eines 50 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffer (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms HindIII (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen, das Präzipitat in 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gelöst, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms SalI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, wodurch etwa 1 μg eines HindIII-SalI-Fragments (etwa 5,42 kb) isoliert wurden.
  • 5 μg des in Absatz 1 von Beispiel 1 erhaltenen Plasmids pBSK-HAEE wurden dann zu 10 μl eines 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) zugegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms KpnI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen, das Präzipitat in 10 μl eines 50 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gelöst, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms HindIII (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, wobei etwa 0,8 μg eines KpnI-HindIII-Fragments (etwa 1,98 kb) isoliert wurden, das die Kaninchen-β-Globin-Gen-Spleiß- und poly-A-Signale, das poly A-Signal des frühen Gens von SV40 und den Promotor des früheren Gens von SV40 enthielt.
  • 5 μg des in Abschnitt 5 von Beispiel 1 erhaltenen Plasmids pMohCγ1 wurden dann zu 10 μl eines 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms KpnI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen, das Präzipitat in 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gelöst, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms SalI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, wobei etwa 0,8 μg eines KpnI-SalI-Fragments (etwa 1,66 kb) erhalten wurden, das eine Expressionseinheit für eine H-Kette eines humanen Graft-CDR-Antikörpers enthielt.
  • 0,1 μg des HindIII-SalI-Fragments von pBSH-SAEE, 0,1 μg des KpnI-HindIII-Fragments von pBSK-HAEE und 0,1 μg des KpnI-SalI-Fragments von pMohCγ1, die jeweils wie vorstehend beschrieben erhalten wurden, wurden zu sterilisiertem Wasser mit einem Gesamtvolumen von 20 μl gegeben und unter Verwendung von Ready-To-Go T4 DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) miteinander ligiert. Die auf diese Weise erhaltene Lösung rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet und das in 20 gezeigte Plasmid pMoγ1SP erhalten.
  • 3 μg des vorstehend beschriebenen Plasmids pMoγ1SP wurden dann zu 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms SalI (Takara Shuzo) und 10 Einheiten des Restriktionsenzyms XhoI zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, wodurch etwa 1 μg eines SalI-XhoI-Fragments (etwa 9,06 kb) isoliert wurden.
  • 5 μg des in Abschnitt 2 von Beispiel 1 erhaltenen Plasmids pBSK-HAEESal wurden dann zu 10 μl 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms KpnI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen, das Präzipitat in 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gelöst, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms SalI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, wodurch etwa 0,7 μg eines KpnI-SalI- Fragments (etwa 1,37 kb) isoliert wurden, das die Kaninchen-β-Globin-Gen-Spleiß- und poly-A-Signale und das poly A-Signal des frühen Gens von SV40 enthielt.
  • 5 μg des in Abschnitt 4 von Beispiel 1 erhaltenen Plasmids pMohCκ wurden dann zu 10 μl eines 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms KpnI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen, das Präzipitat in 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gelöst, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms XhoI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, wodurch 0,7 μg eines KpnI-Xhol-Fragments (etwa 1,06 kb) einer Expressionseinheit für die L-Kette eines humanen Graft-CDR-Antikörpers isoliert wurden.
  • 0,1 μg des SalI-XhoI-Fragments von pMoγ1SP, 0,1 μg des KpnI-SalI-Fragments von pBSK-HAEESal und 0,1 μg des KpnI-XhoI-Fragments von pMohCκ, die jeweils wie vorstehend beschrieben erhalten wurden, wurden dann bei einem Gesamtvolumen von 20 μl zu sterilisiertem Wasser gegeben und unter Verwendung Ready-To-Go T4 DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) miteinander ligiert. Die auf diese Weise erhaltene Lösung rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet und das in 21 gezeigte Plasmid pMoκγ1SP erhalten.
  • 3 μg des vorstehend genannten Plasmids pMoκγ1SP wurden dann zu 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms XhoI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen, das Präzipitat zu 10 μl eines 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurde 1 Einheit des Restriktionsenzyms SacII (Toyobo) zugegeben und für einen Partialverdau die Reaktion 10 Minuten bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und etwa 0,2 μg eines SacII-XhoI-Fragments (etwa 8,49 kb) wurden isoliert.
  • 3 μg des in Abschnitt 3 von Beispiel 1 erhaltenen Plasmids pBSX-SA wurden zu 10 μl eines 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms SacII (Toyobo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen, das Präzipitat in 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gelöst, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms XhoI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und etwa 1 μg eines SacII-XhoI-Fragments (etwa 4,25 kb) wurden isoliert.
  • 0,1 μg des SacII-XhoI-Fragments von pMoκγ1SP und 0,1 μg des SacII-XhoI-Fragments von pBSX-SA, die jeweils wie vorstehend beschrieben erhalten wurden, wurden dann bei einem Gesamtvolumen von 20 μl zu sterilisiertem Wasser gegeben und unter Verwendung von Ready-To-Go T4 DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) miteinander ligiert. Die auf diese Weise erhaltene Lösung rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet und das in 22 gezeigte Plasmid pKANTEX93 erhalten.
  • BEISPIEL 2
  • 1. Expression eines chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörpers
  • Die Expression eines chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörpers wurde unter Verwendung des vorstehend in Beispiel 1 beschriebenen Expressionsvektors pKANTEX93 auf die folgende Weise herbeigeführt.
  • (1) Konstruktion des die cDNA der H-Ketten-V-Region des Maus-Anti-GM2-Antikörpers KM796 enthaltenden Plasmids pBSH3
  • 3 μg des Plasmids pBluescript® SK(-) (Stratagene) wurden zu 10 μl eines 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltendem 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden jeweils 10 Einheiten der Restriktionsenzyme SacII (Toyobo) und KpnI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen und das Präzipitat unter Verwendung des DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) einer Behandlung zur Überführung der durch den Verdau mit Restriktionsenzymen entstandenen 3'-kohäsiven Enden in glatte Enden unterworfen. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol gefällt, das auf diese Weise erhaltene Präzipitat in 20 μl eines 50 mM Trishydrochlorid-Puffer (pH 9,0) und 1 mM Magnesiumchlorid enthaltenden Puffers gelöst, worauf man das auf diese Weise erhaltene Gemisch durch Zugabe von 1 Einheit Alkalische Phosphatase (E. coli C75, Takara Shuzo) 1 Stunde bei 37 °C zur Dephosphorylierung der 5'-Enden umsetzte. Anschließend wurde eine Auftrennung über Agarosegelelektrophorese durchgeführt und etwa 1 μg eines DNA-Fragments mit einer Größe von etwa 2,95 kb isoliert.
  • Daraufhin wurden unter Verwendung einer automatischen DNA-Synthesevorrichtung (Applied Biosystems model 380A) synthetische DNAs mit den in SEQ ID NO:18 bzw. SEQ ID NO:19 gezeigten synthetischen DNAs synthetisiert. 0,3 μg jeder der erhaltenen synthetischen DNAs wurden zu 15 μl sterilisiertem Wasser gegeben und das Gemisch 5 Minuten auf 65 °C erhitzt. Man ließ das Reaktionsgemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen und gab dann 2 μl eines 10fach konzentrierten Puffers [500 mM Trishydrochlorid (pH 7,6), 100 mM Magnesiumchlorid, 50 mM DTT] und 2 ml 10 mM ATP zu, weiterhin 10 Einheiten T4 Polynukleotidkinase und ließ die Reaktion zur Phosphorylierung der 5'-Enden 30 Minuten bei 37 °C ablaufen. 0,1 μg des vom Plasmid pBluescript® SK(-) stammenden DNA-Fragments (2,95 kb) und 0,05 μg der phosphorylierten synthetischen DNA, die jeweils wie oben beschrieben erhalten wurden, wurden in einem Gesamtvolumen von 20 μl zu sterilisiertem Wasser gegeben, worauf eine Ligation unter Verwendung von Ready-To-Go T4 DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) erfolgte. Die auf diese Weise erhaltene Lösung rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet und das in 23 gezeigte Plasmid pBSNA erhalten. 10 μg des erhaltenen Plasmids wurden gemäß den Anweisungen, die dem AutoRead Sequencing Kit (Pharmacia Biotech) beigefügt waren, einer Sequenzierungsreaktion unterzogen, worauf sich eine Elektrophorese auf einem A.L.F. DNA Sequencer (Pharmacia Biotech) zur Bestimmung der Basensequenz anschloss, wodurch bestätigt wurde, dass die synthetische DNA wie beabsichtigt eingeführt worden war.
  • Zu 10 μl eines 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) wurden dann 3 μg des wie vorstehend beschrieben erhaltenen Plasmids pBSNA gegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen, das Präzipitat zu 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT, 100 μg/ml BSA und 0,01 % Triton® X-100 enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffer (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms NotI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und etwa 1 μg eines DNA-Fragments mit einer Größe von etwa 2,95 kb wurde isoliert.
  • 10 μg des in der JP-A-6-205964 beschriebenen Plasmids pChi796HM1 wurden dann zu 10 μl eines 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen, das Präzipitat zu 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT, 100 μg/ml BSA und 0,01 % Triton® X-100 enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms NotI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und etwa 0,3 μg eines DNA-Fragments mit einer Größe von 0,45 kb wurden isoliert.
  • 0,1 μg des ApaI-NotI-Fragments von pBSNA und 0,1 μg des ApaI-NotI-Fragments von pChi796HM1, die jeweils wie vorstehend beschrieben erhalten wurden, wurden dann bei einem Gesamtvolumen von 20 μl zu sterilisiertem Wasser gegeben und unter Verwendung von Ready-To-Go T4 DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) miteinander ligiert. Die auf diese Weise erhaltene Lösung rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet und das in 24 gezeigte Plasmid pBSH3 erhalten.
  • (2) Konstruktion des die cDNA der L-Ketten-V-Region des Maus-Anti-GM2-Antikörpers KM796 enthaltenden Plasmids pBSL3
  • Zu 10 μl eines 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) wurden 3 μg des Plasmid pBluescript® SK(-) (Stratagene) gegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms KpnI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen, das Präzipitat unter Verwendung des DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) einer Behandlung zur Überführung der durch den KpnI-Verdau entstandenen 3'-kohäsiven Enden in glatte Enden und dann einer Ethanolfällung unterworfen, das Präzipitat zu 10 μl eines 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms SacI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, wodurch etwa 1 μg eines DNA-Fragments mit einer Größe von etwa 2,95 kb isoliert wurde.
  • Daraufhin wurden unter Verwendung einer automatischen DNA-Synthesevorrichtung (Applied Biosystems model 380A) synthetische DNAs mit den in SEQ ID NO:20 bzw. SEQ ID NO:21 gezeigten Sequenzen synthetisiert. 0,3 μg jeder der erhaltenen synthetischen DNAs wurden zu 15 μl sterilisiertem Wasser gegeben und das Gemisch 5 Minuten auf 65 °C erhitzt. Man ließ das Reaktionsgemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Dann wurden 2 μl eines 10fach konzentrierten Puffers [500 mM Trishydrochlorid (pH 7,5), 100 mM Magnesiumchlorid, 50 mM DTT] und 2 ml 10 mM ATP zugegeben, weiterhin 10 Einheiten T4 Polynukleotidkinase, und die Reaktion zur Phosphorylierung der 5'-Enden 30 Minuten bei 37 °C durchgeführt. 0,1 μg des vom Plasmid pBluescript® SK(-) stammenden DNA-Fragments (2,95 kb) und 0,05 μg der phosphorylierten synthetischen DNA, die jeweils wie oben beschrieben erhalten wurden, wurden bei einem Gesamtvolumen von 20 μl zu sterilisiertem Wasser gegeben und unter Verwendung von Ready-To-Go T4 DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) miteinander ligiert. Die auf diese Weise erhaltene Lösung rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet und das in 25 gezeigte Plasmid pBSES erhalten. 10 μg des erhaltenen Plasmids wurden gemäß den Anweisungen, die dem AutoRead Sequencing Kit (Pharmacia Biotech) beigefügt waren einer Sequenzierungsreaktion unterzogen, worauf sich eine Elektrophorese auf einem A.L.F. DNA Sequencer (Pharmacia Biotech) zur Bestimmung der Basensequenz anschloss, wodurch bestätigt wurde, dass die synthetische DNA, wie beabsichtigt, eingeführt worden war.
  • 3 μg des wie vorstehend beschrieben erhaltenen Plasmids pBSES wurden dann zu 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT und 100 μg/ml BSA enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden jeweils 10 Einheiten der Restriktionsenzyme EcoRI (Takara Shuzo) und SplI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und etwa 1 μg eines DNA-Fragments mit einer Größe von etwa 2,95 kb wurde isoliert.
  • 5 μg des in der JP-A-6-205694 beschriebenen Plasmids pKM796L1 wurden dann zu 10 μl eines 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) zugegeben, weiterhin wurden jeweils 10 Einheiten der Restriktionsenzyme EcoRI (Takara Shuzo) und AflIII (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und etwa 0,3 μg eines EcoRI-AflIII-Fragments mit einer Größe von etwa 0,39 kb isoliert. Dann wurden unter Verwendung einer automatischen DNA-Synthesevorrichtung (Applied Biosystems model 380A) synthetische DNAs mit den in SEQ ID NO:22 bzw. SEQ ID NO:23 gezeigten Sequenzen synthetisiert. 0,3 μg jeder der erhaltenen synthetischen DNAs wurden zu 15 μl sterilisiertem Wasser gegeben und das Gemisch 5 Minuten auf 65 °C erhitzt. Man ließ das Reaktionsgemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Dann wurden 2 μl eines 10fach konzentrierten Puffers [500 mM Trishydrochlorid (pH 7,6) 100 mM Magnesiumchlorid, 50 mM DTT] und 2 μl 10 mM ATP zugegeben, weiterhin 10 Einheiten T4 Polynukleotidkinase, und die Reaktion zur Phosphorylierung der 5'-Enden 30 Minuten bei 37 °C durchgeführt.
  • 0,1 μg des von pBSES stammenden EcoRI-SplI-Fragments (2,95 kb), 0,1 μg des von pKM796L1 stammenden EcoRI-AflIII-Fragments und 0,05 μg der phosphorylierten synthetischen DNA, die jeweils wie vorstehend beschrieben erhalten wurden, wurden dann bei einem Gesamtvolumen von 20 μl zu sterilisiertem Wasser gegeben und unter Verwendung von Ready-To-Go T4 DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) miteinander ligiert. Die auf diese Weise erhaltene Lösung rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet und das in 26 gezeigte Plasmid pBSL3 erhalten. 10 μg des erhaltenen Plasmids wurden gemäß den Anweisungen, die dem AutoRead Sequencing Kit (Pharmacia Biotech) beigefügt waren einer Sequenzierungsreaktion unterworfen, worauf sich Elektrophorese auf einem A.L.F. DNA Sequencer (Pharmacia Biotech) zur Bestimmung der Basensequenz anschloss, wodurch bestätigt wurde, dass die synthetische DNA wie beabsichtigt eingeführt worden war.
  • 3. Konstruktion eines Expressionsvektors für einen chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörper, pKANTEX796
  • Ein Expressionsvektor für einen chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörper, pKANTEX796, wurde unter Verwendung des in Beispiel 1 erhaltenen Plasmids pKANTEX93 und der in Abschnitt 1 (1) bzw. (2) von Beispiel 2 erhaltenen Plasmide pBSH3 bzw. pBSL3 auf folgende Weise erhalten.
  • 3 μg des Plasmids pBSH3 wurden zu 10 μl eines 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (Takara Shuzo), und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen, das Präzipitat in 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT, 100 μg/ml BSA und 0,01 % Triton® X-100 enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gelöst, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms NotI (Takara Shuzo) zugegeben, und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und etwa 0,3 μg eines ApaI-NotI-Fragments mit einer Größe von etwa 0,46 kb isoliert.
  • 3 μg des Plasmids pKANTEX93 wurden dann zu 10 μl eines 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (Takara Shuzo), und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen, das Präzipitat in 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT, 100 μg/ml BSA und 0,01 % Triton® X-100 enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gelöst, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms NotI (Takara Shuzo) zugegeben, und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, wodurch etwa 1 μg eines ApaI-NotI-Fragments mit einer Größe von etwa 12,75 kb isoliert wurden.
  • 0,1 μg des von pBSH3 stammenden ApaI-NotI-Fragments und 0,1 μg des von pKANTEX93 stammenden ApaI-NotI-Fragments, die jeweils wie vorstehend beschrieben erhalten wurden, wurden dann bei einem Gesamtvolumen von 20 μl zu sterilisiertem Wasser gegeben und unter Verwendung von Ready-To-Go T4 DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) miteinander ligiert. Die auf diese Weise erhaltene Lösung rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet und das in 27 gezeigte Plasmid pKANTEX796H erhalten.
  • 3 μg des Plasmids pBSL3 wurden dann zu 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT und 100 μg/ml BSA enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden jeweils 10 Einheiten der Restriktionsenzyme EcoRI (Takara Shuzo) zugegeben und SplI (Takara Shuzo), und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und etwa 0,3 μg eines EcoRI-SplI-Fragments mit einer Größe von etwa 0,4 kb isoliert.
  • 3 μg des Plasmids pKANTEX796H wurden dann zu 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT und 100 μg/ml BSA enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden jeweils 10 Einheiten der Restriktionsenzyme EcoRI (Takara Shuzo) zugegeben und SplI (Takara Shuzo), und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und etwa 1 μg eines EcoRI-SplI-Fragments mit einer Größe von etwa 13,20 kb isoliert.
  • 0,1 μg des von pBSL3 stammenden EcoRI-SplI-Fragments und 0,1 μg des von pKANTEX796H stammenden EcoRI-SplI-Fragments, die jeweils wie vorstehend beschrieben erhalten wurden, wurden dann bei einem Gesamtvolumen von 20 unter Verwendung von Ready-To-Go T4 DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) miteinander ligiert. Die auf diese Weise erhaltene Lösung rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet und das in 28 gezeigte Plasmid pKANTEX796 erhalten.
  • (4) Expression eines chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörpers in YB2/0-Zellen unter Verwendung von pKANTEX796
  • Die Einführung des Plasmids in YB2/0-Zellen (ATCC CRL1662) erfolgte über die Elektroporationsmethode (Miyaji, H. et al., Cytotechnology, 3, 133 (1990)). Ein in Absatz 1 (3) von Beispiel 2 erhaltenes Aliquot von 4 μg von pKANTEX796 wurde in 4 × 106 Zellen YB2/0-Zellen eingeführt, und die resultierenden Zellen in 40 ml RPMI1640-FCS (10)-Medium [RPMI1640-Medium (hergestellt von Nissui Pharmaceutical) das mit 10 % FCS, einer geeigneten Menge 7,5 % Natriumbikarbonatlösung, 3 % 200 mM L-Glutaminlösung (hergestellt von Gibco) und 0,5 % einer Penicillin-Streptomycin-Lösung (hergestellt von Gibco, enthält 5.000 U/ml Penizillin und 5 mg/ml Streptomycin)] supplementiert war, suspendiert und in Aliquots von 200 μl in die Wells einer 96-Well-Mikrotiterplatte gegeben. Nach 24-stündiger Kultivierung bei 37 °C in einem Inkubator mit 5 % CO2 wurde G418 bis auf eine Endkonzentration von 0,5 mg/ml zu jedem Well gegeben, und die Zellen 1 bis 2 Wochen kultiviert. Aus Wells, in denen sich Kolonien transformierter Zelllinien gebildet hatten, wurden Kulturüberstände gewonnen und die Aktivität des chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörpers in den Kulturüberständen über die in dem nachfolgenden Abschnitt (5) beschriebene ELISA-Methode gemessen. Zellen in Wells, in denen Aktivität gefunden wurde, wurden auf die nachfolgend beschriebene Weise in dem Versuch, die Expressionsmenge des chimären Antikörpers zu erhöhen, einer Genamplifikation unterworfen. Zuerst wurden die Zellen in mit 0,5 mg/ml G418 und 50 nM Methotrexat (hergestellt von Sigma und nachfolgend hier als „MTX" bezeichnet) supplementiertem RPM11640-FCS (10) auf eine Dichte von 1-2 × 105 Zellen/ml suspendiert, und die Suspension in Aliquots von 2 ml in Wells einer 24-Well-Platte gegeben. Die Zellen wurden 1 bis 2 Wochen bei 37 °C in einem Inkubator mit 5 % CO2 kultiviert, um gegen 50 nM MTX resistente Zellen zu induzieren. In den Wells, in denen sich gegen 50 nM MTX resistente Zellen gebildet hatten, wurde die Endkonzentration von MTX auf 100 nM und dann auf 200 nM erhöht und die Expressionsmenge über die ELISA-Methode beurteilt, um Zellen mit der höchsten Expressionsmenge zu selektieren. Die auf diese Weise selektierten Zellen wurden zweimal einer Klonierung über die Analyse limitierender Verdünnung unterworfen und dann als die endgültigen Zellen für die stabile Expression des chimären Antikörpers etabliert. Die auf diese Weise etablierten Zellen für die stabile Expression des chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörpers wiesen eine Expressionsmenge von ungefähr 1 bis 2 μg/ml auf, so dass bestätigt wurde, dass eine effiziente und stabile Expression des humanisierten Antikörpers durch die Verwendung von pKANTEX93 herbeigeführt werden kann.
  • (5) ELISA-Methode
  • Ein Aliquot von 2 ng Gangliosid wurde in 2 ml einer 5 ng Phosphatidylcholin (hergestellt von Sigma) und 2,5 ng Cholesterin (hergestellt von Sigma) enthaltenden Ethanollösung gelöst. Diese Lösung oder eine verdünnte Lösung davon wurde in Aliquots von 20 μl in die Wells einer 96-Well-Mikroplatte (hergestellt von Greiner) gegeben, luftgetrocknet und dann mit 1 % BSA enthaltendem Phosphatpuffer (nachfolgend hier als „PBS" bezeichnet) blockiert. Zur resultierenden Platte wurde Kulturüberstand einer transformierten Zelllinie, ein aufgereinigter monoklonaler Antikörper der Maus, ein aufgereinigter chimärer Maus-Mensch-Antikörper oder ein aufgereinigter humanisierter Antikörper in einer Menge von 50 bis 100 μl zugegeben, worauf nachfolgend eine 1- bis 2-stündige Reaktion bei Raumtemperatur durchgeführt wurde. Nach der Reaktion und nachfolgendem Waschen jedes Wells mit PBS wurden 50 bis 100 μl eines Peroxidase-markierten Kaninchen-Anti-Maus-IgG-Antikörpers (hergestellt von Dako, bei 400facher Verdünnung verwendet) oder Peroxidase-markierter Ziege-Anti-Mensch-γ-Ketten-Antikörpers (hergestellt von Kiyukegard & Perry Laboratory, in 1000facher Verdünnung verwendet) zugegeben und eine 1- bis 2-stündige Reaktion bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach Waschen mit PBS wurden 50 bis 100 μl einer ABTS-Substratlösung [eine Lösung, die durch Lösen von 550 mg 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-Sulfonsäure) in einem Liter 0,1 M Citratpuffer (pH 4,2) und Zugabe von 1 μl/ml Wasserstoffperoxid zur Lösung unmittelbar vor deren Verwendung hergestellt wurde] zu jedem Well zugegeben, um die Farbentwicklung herbeizuführen, die dann bei OD415 gemessen wurde.
  • 2. Transiente Expression eines chimären Maus-Mensch-Antikörpers in COS-7-Zellen (ATCC CRL 1651)
  • Um eine schnellere Beurteilung der Aktivität verschiedener Versionen humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper zu ermöglichen, wurde über die Lipofektamin-Methode unter Verwendung von pKANTEX796 und einer Variante davon auf die nachfolgend beschriebene Weise eine transiente Expression eines chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörpers in COS-7-Zellen herbeigeführt.
  • (1) Konstruktion einer Variante von pKANTEX796
  • Da die transiente Antikörperexpression in tierischen Zellen von der Kopienanzahl eines eingeführten Expressionsvektors abhängt, wurde angenommen, dass ein Expressionsvektor geringerer Größe eine höhere Expressionseffizienz aufweisen würde. Deshalb wurde ein kleinerer Expressionsvektor für humanisierte Antikörper, pT796, durch Deletion einer Region, die vermutlich keinen Effekt auf die Expression eines humanisierten Antikörpers aus pKANTEX796 heraus hat, auf die nachfolgend beschriebene Weise konstruiert.
  • 3 μg des Plasmids pKANTEX796 wurden zu 10 μl eines 50 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms HindIII (Takara Shuzo) zugegeben, und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen, das Präzipitat in 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gelöst, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms MluI (Takara Shuzo) zugegeben, und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen und die aus dem Enzymverdau resultierenden 5'-kohäsiven Enden unter Verwendung des DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) glatt gemacht. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und etwa 1 μg eines DNA-Fragments mit einer Größe etwa 9,60 kb isoliert. Ein Aliquot von 0,1 μg des auf diese Weise isolierten DNA-Fragments wurde bei einem Gesamtvolumen von 20 μl zu sterilisiertem Wasser gegeben und unter Verwendung von Ready-To-Go T4 DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) einer Ligationsbehandlung unterworfen. Die auf diese Weise erhaltene Lösung rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet und das in 29 gezeigte Plasmid pT796 erhalten.
  • (2) Transiente Expression eines chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörpers unter Verwendung von pKANTEX796 und pT796
  • Eine Suspension von COS-7-Zellen mit 1 × 105 Zellen/ml wurde in Aliquots von 2 ml in die Wells einer 6-Well-Platte (Falcon) verteilt und über Nacht bei 37 °C kultiviert. 2 μg pKANTEX796 oder pT796 wurden zu 100 μl OPTI-MEM-Medium (Gibco) gegeben, durch Zugabe von 10 μl LIPOFECTAMINE®-Reagenz (Gibco) zu 100 μl OPTI-MEM-Medium (Gibco) eine Lösung hergestellt, die ebenfalls zugegeben wurde, und eine Reaktion zur Bildung eines DNA-Liposomen-Komplexes 40 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Die über Nacht kultivierten COS-7-Zellen wurden zweimal mit 2 ml OPTI-MEM-Medium (Gibco) gewaschen, die Komplex-enthaltende Lösung zugegeben und die Zellen 7 Stunden bei 37 °C kultiviert. Die Lösung wurde dann entfernt, 2 ml 10 % FCS enthaltendes DMEM-Medium (Gibco) zu jedem Well gegeben und die Zellen bei 37 °C kultiviert. Nach 24 Stunden, 48 Stunden, 72 Stunden, 96 Stunden und 120 Stunden Kultivierung wurde der Kulturüberstand gewonnen und, je nach Bedarf nach Einengung, über die in Abschnitt 1 (5) von Beispiel 2 beschriebene ELISA-Methode auf Aktivität von chimärem Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörper in dem Kulturüberstand untersucht. Die Ergebnisse sind in 30 gezeigt. Wie in 30 gezeigt, wurden mit pT796 im Vergleich zu pKANTEX796 höhere Grade transienter Expression von chimärem Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörper festgestellt. Für pT796 war der Expressionsgrad bei 72 bis 86 Stunden am höchsten, wobei die Konzentration etwa 30 ng/ml (ausgedrückt als GM2-Bindungsaktivität) betrug. Die vorstehend genannten Ergebnisse zeigen, dass die Konstruktion eines von pKANTEX93 stammenden Vektors mit verringerter Größe und dessen Einführung in COS-7-Zellen die Aktivitätsbeurteilung von humanisierten Antikörpern in transienten Expressionssystemen, die von Expressionsvektoren stammen, ermöglichen. Für einen genauen Aktivitätsvergleich verschiedener Versionen humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers, wie nachfolgend hierin erwähnt, wurde weiterhin die nachfolgend unter (3) beschriebene ELISA-Methode verwendet, um die Antikörperkonzentrationen in Kulturüberständen bei transienter Expression zu bestimmen.
  • (3) Bestimmung der Konzentrationen humanisierter Antikörper in verschiedenen Kulturüberständen mittels Sandwich-ELISA
  • Man verteilte eine durch 400fache Verdünnung von Ziege-Anti-Mensch-γ-Ketten-Antikörper (Igaku Seibutugaku Kenkyusho) hergestellte Lösung in PBS wurde in Aliquots von 50 μl in die Wells einer 96-Well-Mikrotiterplatte und ließ zur Bindung an die Wells über Nacht bei 4 °C stehen. Nach Entfernen der Antikörperlösung wurde eine Blockierung mit 100 μl 1 % BSA enthaltenden PBS 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Man gab 50 μl Kulturüberstand aus transienter Expression oder aufgereinigten chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörper zu und ließ 1 Stunde bei Raumtemperatur reagieren. Danach wurde die Lösung entfernt, die Wells mit PBS gewaschen und 50 μl einer durch 500fache Verdünnung von Peroxidase-markiertem Maus-Anti-Mensch-κ-Ketten-Antikörper (Zymet) mit PBS hergestellte Lösung zugegeben, die man 1 Stunde bei Raumtemperatur reagieren ließ. Nach Waschen mit PBS wurden 50 μl einer ABTS-Substratlösung zur Herbeiführung der Farbentwicklung zugegeben und die OD415 gemessen.
  • BEISPIEL 3
  • Herstellung humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers I
  • Ein humaner Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper mit einer höheren GM2-Bindungsaktivität als der humane Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper, der in Beispiel 2 der JP-A-6-105694 beschrieben ist, wurde auf die nachfolgend beschriebene Weise hergestellt.
  • (1) Modifizierung der in Abschnitt 1 (1) von Beispiel 2 der JP-A-6-205694 beschriebenen H-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers
  • DNAs, die für einige Versionen der H-Ketten-V-Region des in Beispiel 2 beschriebenen humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers, die durch Ersetzen mehrerer Aminosäuren in der FR mit ursprünglichen Aminosäuren des Maus-Antikörpers abgeleitet wurden, kodierten, wurden auf folgende Weise konstruiert. Auf der Grundlage eines Computermodells für die V-Region des Maus-Antikörpers KM796 wurden diejenigen Aminosäurereste, von denen man annahm, sie würden bei Austausch zur Wiederherstellung der Antigenbindungsaktivität beitragen, als zu ersetzende Aminosäurereste ausgewählt. Zunächst wurden DNAs mit den Basensequenzen der SEQ ID NO:24 und SEQ ID NO:25 unter Verwendung einer automatischen DNA-Synthesevorrichtung (Applied Biosystems model 380A) synthetisiert.
  • Dann wurde eine Version (Version 2) der H-Ketten-V-Region, die in SEQ ID NO:26 gezeigt ist und Austausche in den Positionen 78 (Threonin anstelle von Glutamin), 79 (Alanin anstelle von Phenylalanin) und 80 (Tyrosin anstelle von Serin) aufwiesen, unter Verwendung der synthetischen DNA von SEQ ID NO:24 anstelle der synthetischen DNA von SEQ ID NO:27 der JP-A-6-205964 auf die gleiche Weise wie in Abschnitt 1 (1) von Beispiel 2 der JP-A-6-205964 konstruiert.
  • Dann wurde eine weitere Version (Version 4) der H-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Antikörpers, die in SEQ ID NO:27 gezeigt ist und Austausche in den Positionen 27 (Tyrosin anstelle von Phenylalanin), 30 (Threonin anstelle von Serin), 40 (Serin anstelle von Prolin) und 41 (Histidin anstelle von Prolin) aufweist, unter Verwendung der synthetischen DNA von SEQ ID NO:25 anstelle der synthetischen DNA von SEQ ID NO:25 der JP-A-6-205694 auf die gleiche Weise wie in Abschnitt 1 (1) von Beispiel 1 der JP-A-6-205694 konstruiert.
  • (2) Konstruktion einer H-Ketten-V-Region eines humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers unter Verwendung einer bekannten HMHCS einer H-Ketten-V-Region eines humanen Antikörpers
  • Nach Kabat et al. (Kabat E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. of Health and Human Services, 1991) können die H-Ketten-V-Regionen bekannter humaner Antikörper auf der Grundlage der Homologie ihrer FR-Regionen in die Untergruppen I bis III (humane Untergruppen (HSG) I bis III) eingeteilt werden, und gemeinsame Sequenzen wurden für die jeweiligen Untergruppen identifiziert. Erfindungsgemäß wurde HMHCS als eine Bedeutung aus den gemeinsamen Sequenzen identifiziert, und eine H-Ketten-V-Region eines humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers wurde auf der Grundlage der HMHCS konstruiert. Zur Selektion von HMHCS als Grundlage wurde zunächst die Homologie zwischen der FR der H-Ketten-V-Region des Maus-Antikörpers KM796 und der FR der H-Ketten-V-Region des HMHCS des humanen Antikörpers jeder Untergruppe untersucht (Tabelle 1). TABELLE 1 Homologie (%) zwischen der FR der H-Ketten-V-Region des Maus-Antikörpers KM796 und der FR der gemeinsamen Sequenz der H-Ketten-V-Region von humanem Antikörper
    Figure 00560001
  • Als Ergebnis wurde bestätigt, dass die Untergruppe I die größte Ähnlichkeit aufweist. Folglich wurde auf der Grundlage der HMHCS der Untergruppe I über die PCR-Methode auf folgende Weise eine H-Ketten-V-Region eines humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers konstruiert.
  • Unter Verwendung einer automatischen DNA-Synthesevorrichtung (Applied Systems model 380A) wurden synthetische DNAs mit den Basensequenzen der SEQ ID NO:28 bis SEQ ID NO:33 synthetisiert. Zu 50 μl eines 50 mM Kaliumchlorid, 1,5 mM Magnesiumchlorid, 0,001 % Gelatine, 200 μM dNTP, 0,5 μM M13-Primer RV (Takara Shuzo), 0,5 μM M13-Primer M4 (Takara Shuzo) enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 8,3) wurden die synthetisierten DNAs jeweils bis auf eine Endkonzentration von 0,1 μM zugegeben, 2 Einheiten TaKaRa Taq DNA Polymerase wurden zugegeben, das Gemisch mit 50 μl Mineralöl überschichtet, ein DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer model PJ480) mit dem Gemisch beladen und 30 PCR-Zyklen (pro Zyklus 2 Minuten bei 94 °C, 2 Minuten bei 55 °C und 2 Minuten bei 72 °C) durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Verwendung des QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) aufgereinigt und in 30 μl eines 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) in Lösung gebracht, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen, das Präzipitat zu 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT, 100 μg/ml BSA und 0,01 % Triton® X-100 enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, 10 Einheiten des Restriktionsenzyms NotI (Takara Shuzo) wurden weiter zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und etwa 0,2 μg eines ApaI-NotI-Fragments mit einer Größe von etwa 0,44 kb isoliert.
  • Dann wurden 3 μg des in Abschnitt 1 (1) von Beispiel 2 erhaltenen Plasmids pBSH3 zu 10 μl eines 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolpräzipitation unterworfen, das Präzipitat zu 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT, 100 μg/ml BSA und 0,01 % Triton® X-100 enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms NotI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und etwa 1 μg eines ApaI-NotI-Fragments mit einer Größe von etwa 2,95 kb isoliert.
  • Dann wurden 0,1 μg des ApaI-NotI-Fragments der H-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers und 0,1 μg des ApaI-NotI-Fragments von pBSH3, die jeweils wie vorstehend beschrieben erhalten wurden, bei einem Gesamtvolumen von 20 μl zu sterilisiertem Wasser gegeben und miteinander unter Verwendung von Ready-To-Go T4 DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) ligiert. Die auf diese Weise erhaltene Lösung rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet. Plasmid-DNAs wurden aus 10 Transformanten-Klonen hergestellt und deren Basensequenzen wurden bestimmt. Als ein Ergebnis wurde ein Plasmid, pBSH10, das in 31 gezeigt ist und die gewünschte Basensequenz aufweist, erhalten. Die Aminosäuresequenz und Basensequenz der H-Ketten-V-Region des in pBSH10 enthaltenen humanen Graft-CDR-Anti-GM2- Antikörpers sind in SEQ ID NO:7 gezeigt. In der Aminosäuresequenz der auf diese Weise konstruierten H-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers sind das auf der Grundlage eines Computermodells für die V-Region ausgewählte Arginin auf Position 67, das Alanin auf Position 72, das Serin auf Position 84 und das Arginin auf Position 98 in der FR durch Lysin, Valin, Histidin bzw. Threonin ersetzt, die in der H-Ketten-V-Region des Maus-Antikörpers KM796 vorgefunden werden. Dies dient dem Zweck des Erhalts des Antigenbindungsvermögens des Maus-Antikörpers KM796.
  • (3) Modifizierung der in Abschnitt 1 (2) von Beispiel 2 der JP-A-6-205694 beschriebenen L-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers
  • Zunächst wurde unter Verwendung einer automatischen DNA-Synthesevorrichtung (Applied Biosystems model 380A) eine DNA mit der Basensequenz der SEQ ID NO:34 synthetisiert, und eine cDNA der L-Ketten-V-Region eines humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers mit einem zur Zusammenlagerung mit dem Restriktionsenzym SplI befähigten 3'-Ende wurde unter Verwendung der synthetischen DNA anstelle der synthetischen DNA nach SEQ ID NO:35 der JP-A-6-205694 mit dem selben Reaktionsablauf konstruiert wie in Abschnitt 1 (2) von Beispiel 2 der JP-A-6-205694 beschrieben.
  • Dann wurden 3 μg des in Abschnitt 1 (2) von Beispiel 2 erhaltenen Plasmids pBSL3 zu 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT und 100 μg/ml BSA enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden jeweils 10 Einheiten der Restriktionsenzyme EcoRI (Takara Shuzo) und SplI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und etwa 1 μg eines EcoRI-SplI-Fragments mit einer Größe von etwa 2,95 kb isoliert.
  • Dann wurden 0,1 μg des wie vorstehend beschrieben erhaltenen EcoRI-SplI-Fragments der L-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers und 0,1 μg des vorstehend beschriebenen EcoRI-SplI-Fragments von pBSL3 bei einem Gesamtvolumen von 20 μl zu sterilisiertem Wasser gegeben und miteinander unter Verwendung von Ready-To-Go T4 DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) ligiert. Die auf diese Weise erhaltene Lösung rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet und das in 32 gezeigte Plasmid pBSL16 erhalten.
  • Dann wurden DNAs für bestimmte Versionen der in dem vorstehend genannten Plasmid pBSL16 enthaltenden L-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers durch Ersetzen einer gewissen Anzahl von Aminosäuren in der FR mit ursprünglichen Aminosäuren der Maus durch Mutagenese mittels PCR auf folgende Weise durchgeführt (33). Auf der Grundlage eines Computermodells für die V-Region des Maus-Antikörpers KM796 wurden diejenigen Aminosäurereste als die zu ersetzenden Aminosäurereste ausgewählt, von denen man annahm, dass sie als Ergebnis des Austausches zur Wiederherstellung der Antigenbindungsaktivität beitragen würden.
  • Unter Verwendung einer automatischen DNA-Synthesevorrichtung (Applied Biosystems model 380A) wurden Antisense- und Sense-DNA-Primer für das Einführen von Mutationen synthetisiert. Eine erste PCR-Reaktion wurde auf die gleiche Weise wie in Abschnitt 1 (2) von Beispiel 3 durchgeführt, wobei eine Endkonzentration von jeweils 0,5 μM des M13-Primers RV (Takara Shuzo) und des Antisense-DNA-Primers und des M13-Primers M4 (Takara Shuzo) und des Sense-DNA-Primers sowie 1 ng pBSL16 als Templat verwendet wurden. Jedes Reaktionsgemisch wurde unter Verwendung des QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) das durch Elution mit 20 μl 10 mM Trishydrochlorid (pH 8,0) aufgereinigt. Unter Verwendung von 5 μl jedes Eluats wurde eine zweite PCR-Reaktion auf die gleiche Weise wie in Abschnitt 1 (2) von Beispiel 3 durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Verwendung des QIAquick® PCR Purification Kit (Qiagen) aufgereinigt und dann in 30 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT und 100 μg/ml BSA enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) in Lösung gebracht, jeweils 10 Einheiten der Restriktionsenzyme EcoRI (Takara Shuzo) und SplI (Takara Shuzo) wurden weiter zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und etwa 0,2 μg eines EcoRI-SplI-Fragments (etwa 0,39 kb) jeder Ersatzversion der L-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers wurden isoliert.
  • Dann wurden 0,1 μg des vorstehend genannten EcoRI-SplI-Fragments jeder Ersatzversion der L-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers und 0,1 μg des EcoRI-SplI-Fragments von pBSL3 bei einem Gesamtvolumen von 20 μl zu sterilisiertem Wasser gegeben und unter Verwendung von Ready-To-Go T4 DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) miteinander ligiert. Die auf diese Weise erhaltene Lösung rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet, eine Plasmid-DNA aus einem Transformanten-Klon hergestellt und die Basensequenz des Plasmids bestimmt. Auf diese Weise wurden Plasmide erhalten, die eine Basensequenz umfassten, welche eine gewünschte Mutation bzw. gewünschte Mutationen aufwiesen.
  • Somit wurden ein Plasmid pBSLV1, das die in SEQ ID NO:37 gezeigte Version der L-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers umfasst nach der vorstehend beschriebenen Vorgehensweise unter Verwendung der synthetischen DNA nach SEQ ID NO:35 als dem mutierten Antisense-Primer und der synthetischen DNA nach SEQ ID NO:36 als dem mutierten Sense-Primer erhalten. In der Aminosäuresequenz der Version 1 der L-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers ist die Aminosäure Valin auf Position 15 in der FR durch das Prolin ersetzt, das in der L-Ketten-V-Region des Maus-Antikörpers KM796 vorgefunden wird. Dies dient dem Zweck des Erhalts des Antigenbindungsvermögens des Maus-Antikörpers KM796.
  • Ein Plasmid, pBSLV2, das die in SEQ ID NO:40 gezeigte Version 2 der L-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers enthält, wurde nach der vorstehend beschriebenen Vorgehensweise unter Verwendung der synthetischen DNA gemäß SEQ ID NO:38 als dem mutierten Antisense-Primer und der synthetischen DNA nach SEQ ID NO:39 als dem mutierten Sense-Primer erhalten. In der Aminosäuresequenz der Version 2 der L-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers ist die Aminosäure Leucin auf Position 46 in der FR durch das Tryptophan ersetzt, das in der L-Ketten-V-Region des Maus-Antikörpers KM796 vorgefunden wird. Dies dient dem Zweck des Erhalts des Antigenbindungsvermögens des Maus-Antikörpers KM796.
  • Ein Plasmid, pBSLV3, das die in SEQ ID NO:43 gezeigte Version 3 der L-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers enthält, wurde nach der vorstehend beschriebenen Vorgehensweise unter Verwendung der synthetischen DNA nach SEQ ID NO:41 als dem mutierten Antisense-Primer und der synthetischen DNA nach SEQ ID NO:42 als dem mutierten Sense-Primer erhalten. In der Aminosäuresequenz der Version 3 der L-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers sind das Prolin auf Position 79 und das Isoleucin auf Position 82 in der FR beide durch Alanin ersetzt, das in der L-Ketten-V-Region des Maus-Antikörpers MK796 vorgefunden wird. Dies dient dem Zweck des Erhalts des Antigenbindungsvermögens des Maus-Antikörpers KM796.
  • Ein Plasmid, pBSLV1+2, das eine L-Ketten-V-Region eines humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers mit den Austauschen sowohl nach Version 1 als auch nach Version 2 enthielt, wurde daraufhin auf die nachfolgend beschriebene Weise konstruiert.
  • 3 μg des wie vorstehend beschrieben erhaltenen Plasmids pBSLV1 wurden zu 10 μl eines 50 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) zugegeben, weiterhin wurden jeweils 10 Einheiten der Restriktionsenzyme EcoRI (Takara Shuzo) zugegeben und HindIII (Takara Shuzo), und die Reaktion wurde 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und etwa 0,2 μg eines EcoRI-HindIII-Fragments mit einer Größe von etwa 0,20 kb wurden isoliert.
  • Daraufhin wurden 3 μg des wie vorstehend beschrieben erhaltenen Plasmids pBSLV2 zu 10 μl eines 50 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden jeweils 10 Einheiten der Restriktionsenzyme EcoRI (Takara Shuzo) zugegeben und HindIII (Takara Shuzo), und die Reaktion wurde 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und etwa 1 μg eines EcoRI-HindIII-Fragments mit einer Größe von etwa 3,2 kb wurden isoliert.
  • 0,1 μg des EcoRI-HindIII-Fragments von pBSLV1 und 0,1 μg des EcoRI-HindIII-Fragments von pBSLV2, die jeweils wie vorstehend beschrieben erhaltenen wurden, wurden bei einem Gesamtvolumen von 20 μl zu sterilisiertem Wasser gegeben und unter Verwendung von Ready-To-Go T4 DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) miteinander ligiert. Die auf diese Weise erhaltene Lösung rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet und das in 34 erhaltene Plasmid pBSLV1+2 erhalten.
  • Unter Verwendung von 1 ng des wie vorstehend beschrieben erhaltenen Plasmids pBSLV1+2 als Templat, einer synthetischen DNA mit der Basensequenz nach SEQ ID NO:44 als dem mutierten Antisense-Primer und einer synthetischen DNA mit der Basensequenz nach SEQ ID NO:45 als dem mutierten Sense-Primer wurde dann nach der vorstehend erwähnten PCR-Reaktionsvorgehensweise ein Plasmid, pBSLV4, erhalten, das die in SEQ ID NO:46 dargestellte Version 4 der L-Ketten-V-Region eines humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers enthielt. In der Aminosäuresequenz der Version 4 der L-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers sind das Valin auf Position 15, das Leucin auf Position 46, die Asparaginsäure auf Position 69, das Phenylalanin auf Position 70 und das Threonin auf Position 71 der FR durch Prolin, Tryptophan, Serin, Tyrosin bzw. Serin ersetzt, die in der L-Ketten-V-Region des Maus-Antikörpers KM796 vorgefunden werden. Dies dient dem Zweck des Erhalts des Antigenbindungsvermögens des Maus-Antikörpers KM796.
  • Unter Verwendung von 1 ng des wie vorstehend beschrieben erhaltenen Plasmids pBSLV1+2 als Templat, einer synthetischen DNA mit der Basensequenz nach SEQ ID NO:47 als dem mutierten Antisense-Primer und einer synthetischen DNA mit der Basensequenz nach SEQ ID NO:48 als dem mutierten Sense-Primer wurde dann gemäß der vorstehend erwähnten PCR-Reaktionsvorgehensweise ein Plasmid, pBSLV8, erhalten, das eine in SEQ ID NO:49 dargestellte Version 8 der L-Ketten-V- Region eines humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers enthielt. In der Aminosäuresequenz der Version 8 der L-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers sind das Valin auf Position 15, das Leucin auf Position 46, die Asparaginsäure auf Position 69, das Phenylalanin auf Position 70 und das Threonin auf Position 71, das Serin auf Position 76, das Leucin auf Position 77 und das Glutamin auf Position 78 der FR durch Prolin, Tryptophan, Serin, Tyrosin, Serin, Arginin, Methionin bzw. Glutaminsäure ersetzt, die in der L-Ketten-V-Region des Maus-Antikörpers KM796 vorgefunden werden. Dies dient dem Zweck des Erhalts der Antigenbindungskapazität des Maus-Antikörpers KM796.
  • Unter Verwendung von 1 ng des wie vorstehend beschrieben erhaltenen Plasmids pBSLV4 als Templat, einer synthetischen DNA mit der Basensequenz nach SEQ ID NO:50 als dem mutierten Antisense-Primer und einer synthetischen DNA mit der Basensequenz nach SEQ ID NO:51 als dem mutierten Sense-Primer wurde dann gemäß der vorstehend erwähnten PCR-Reaktionsvorgehensweise ein Plasmid, pBSLm-2, erhalten, das eine Version Lm-2 der in SEQ ID NO:52 dargestellten L-Ketten-V-Region eines humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers enthielt. In der Aminosäuresequenz der Version Lm-2 der L-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers sind das Valin auf Position 15, das Tyrosin auf Position 35, das Leucin auf Position 46, die Asparaginsäure auf Position 69, das Phenylalanin auf Position 70 und das Threonin auf Position 71 der FR durch Prolin, Phenylalanin, Tryptophan, Serin, Tyrosin bzw. Serin ersetzt, die in der L-Ketten-V-Region des Maus-Antikörpers KM796 vorgefunden werden. Dies dient dem Zweck des Erhalts der Antigenbindungsfähigkeit des Maus-Antikörpers KM796.
  • Unter Verwendung von 1 ng des wie vorstehend beschrieben erhaltenen Plasmids pBSLV4 als Templat, einer synthetischen DNA mit der Basensequenz nach SEQ ID NO:53 als dem mutierten Antisense-Primer und einer synthetischen DNA mit der Basensequenz nach SEQ ID NO:54 als dem muterten Sense-Primer wurde dann gemäß der vorstehend beschriebenen PCR-Reaktionsvorgehensweise ein Plasmid, pBSLm-8, erhalten, das eine in SEQ ID NO:55 dargestellte Version Lm-8 der L-Ketten-V-Region eines humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers enthielt. In der Aminosäuresequenz der Version Lm-8 der L-Ketten-V-Region des humanen Graft- CDR-Anti-GM2-Antikörpers sind das Valin auf Position 15, das Leucin auf Position 46, die Asparaginsäure auf Position 69, das Phenylalanin auf Position 70, das Threonin auf Position 71, das Phenylalanin auf Position 72 und das Serin auf Position 76 der FR durch Prolin, Tryptophan, Serin, Tyrosin, Serin, Leucin bzw. Arginin ersetzt, die in der L-Ketten-V-Region des Maus-Antikörpers KM796 vorgefunden werden. Dies dient dem Zweck des Erhalts des Antigenbindungsvermögens des Maus-Antikörpers KM796.
  • Ein Plasmid, pBSLm-28, das eine L-Ketten-V-Region eines humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers mit sowohl dem Ersatz nach Version Lm-2 als auch nach Version Lm-8 enthielt, wurde dann auf die nachfolgend beschriebene Weise konstruiert.
  • 3 μg des wie vorstehend beschrieben erhaltenen Plasmids pBSLm-2 wurden zu 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen, das Präzipitat zu 10 μl eines 50 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT und 100 μg/ml BSA enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden 10 in Einheiten des Restriktionsenzyms XbaI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und etwa 0,2 μg eines EcoRI-XbaI-Fragments mit einer Größe von etwa 0,24 kb wurden isoliert.
  • Dann wurden 3 μg des wie vorstehend beschrieben erhaltenen Plasmids pBSLm-8 zu 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen, das Präzipitat zu 10 μl eines 50 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT und 100 μg/ml BSA enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin 10 Einheiten des Restriktionsenzyms XbaI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und etwa 1 μg eines EcoRI-XbaI-Fragments mit einer Größe von etwa 3,16 kb wurde isoliert.
  • Dann wurden 0,1 μg des EcoRI-XbaI-Fragments von pBSLm-2 und 0,1 μg des EcoRI-XbaI-Fragments von pBSLm-8, die jeweils wie vorstehend beschrieben erhaltenen wurden, bei einem Gesamtvolumen von 20 μl zu sterilisiertem Wasser gegeben und unter Verwendung von Ready-To-Go T4 DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) miteinander ligiert. Die auf diese Weise erhaltene Lösung rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet und das in 35 gezeigte Plasmid pBSLm-28 erhalten. Die Version Lm-28 der L-Ketten-V-Region eines humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers ist in SEQ ID NO:8 gezeigt. In der auf diese Weise konstruierten Version Lm-28 der L-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers sind das Valin auf Position 15, das Tyrosin auf Position 35, das Leucin auf Position 46, die Asparaginsäure auf Position 69, das Phenylalanin auf Position 70, das Threonin auf Position 71, das Phenylalanin auf Position 72 und das Serin auf Position 76 durch Prolin, Phenylalanin, Tryptophan, Serin, Tyrosin, Serin, Leucin bzw. Arginin ersetzt, die in der L-Ketten-V-Region des Maus-Antikörpers KM796 vorgefunden werden. Dies dient dem beabsichtigten Zweck des Erhalts des Antigenbindungsvermögens des Maus-Antikörpers KM796.
  • (4) Konstruktion einer L-Ketten-V-Region eines humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers unter Verwendung eines bekannten HMHCS einer L-Ketten-V-Region eines menschlichen Antikörpers
  • Nach Kabat et al. (Kabat E. A. et al., „Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. of Health and Human Services, 1991) sind L-Ketten-V-Regionen bekannter humaner Antikörper auf der Grundlage der Homologie ihrer FR-Regionen in die Untergruppen I bis IV einteilbar, und gemeinsame Sequenzen wurden für die jeweiligen Untergruppen identifiziert. Erfindungsgemäß wurde HMHCS als eine Bedeutung aus den gemeinsamen Sequenzen identifiziert, eine L-Ketten-V-Region eines humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers wurde auf der Grundlage des HMHCS konstruiert. Zum Auswählen gemeinsamer Sequenzen, die als die Grundlage dienen sollten, wurde zuerst die Homologie zwischen der FR der L-Ketten-V-Region des Maus-Antikörpers KM796 und der FR der HMHCS der L-Ketten-V-Region jeder Untergruppe des humanen Antikörpers untersucht (Tabelle 2). TABELLE 2 Homologie (%) zwischen der FR der L-Ketten-V-Region des Antikörpers KM796 der Maus und der FR der gemeinsamen Sequenz der L-Ketten-V-Region von menschlichem Antikörper
    Figure 00660001
  • Als Ergebnis wurde bestätigt, dass die Untergruppe I die größte Ähnlichkeit aufweist. Daher wurde in der nachfolgend beschriebenen Weise über die PCR-Methode eine L-Ketten-V-Region eines humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers auf der Grundlage der gemeinsamen Sequenz der Untergruppe I konstruiert.
  • Unter Verwendung einer automatischen DNA-Synthesevorrichtung (Applied Systems model 380A) wurden synthetische DNAs mit den Basensequenzen von SEQ ID NO:56 bis SEQ ID NO:61 synthetisiert. Die DNAs wurden jeweils bis auf eine Endkonzentration von 0,1 μM zu 50 μl eines 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 8,3) gegeben, der 50 mM Kaliumchlorid, 1,5 mM Magnesiumchlorid, 0,001 % Gelatine, 200 μM dNTP, 0,5 μM M13-Primer RV (Takara Shuzo), 0,5 μM M13-Primer M4 (Takara Shuzo) und 2 Einheiten TaKaRa Taq DNA Polymerase enthielt. Das Gemisch mit 50 μl Mineralöl überschichtet, ein DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer model PJ480) damit beladen und 30 PCR-Zyklen (pro Zyklus 2 Minuten bei 94 °C, 2 Minuten bei 55 °C und 2 Minuten bei 72 °C) durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Verwendung des QIAquick® PCR Purification Kit (Qiagen) aufgereinigt und dann in 30 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT und 100 μg/ml BSA enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) in Lösung gebracht, weiterhin wurden jeweils 10 Einheiten der Restriktionsenzyme EcoRI (Takara Shuzo) und SplI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und etwa 0,2 μg eines EcoRI-SplI-Fragments mit einer Größe von etwa 0,39 kb wurden isoliert.
  • Dann wurden 0,1 μg des vorstehend genannten EcoRI-SplI-Fragments der L-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers und 0,1 μg des EcoRI-SplI-Fragments von pBSL3 bei einem Gesamtvolumen von 20 μl zu sterilisiertem Wasser gegeben und unter Verwendung von Ready-To-Go T4 DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) miteinander ligiert. Die auf diese Weise erhaltene Lösung rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet. Von 10 Transformanten-Klonen wurden Plasmid-DNAs hergestellt und deren Rasensequenzen bestimmt. Als ein Ergebnis wurde das in 36 gezeigte Plasmid pBSHSGL erhalten, das die gewünschte Basensequenz aufwies. Die Aminosäuresequenz und Basensequenz der in pBSHSGL enthaltenen L-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers sind in SEQ ID NO:9 gezeigt. In der Aminosäuresequenz der auf diese Weise konstruierten L-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers sind das Methionin auf Position 4, das Leucin auf Position 11, das Valin auf Position 15, das Tyrosin auf Position 35, das Alanin auf Position 42, das Leucin auf Position 46, die Asparaginsäure auf Position 69, das Phenylalanin auf Position 70, das Threonin auf Position 71, das Leucin auf Position 77 und das Valin auf Position 103 in der auf der Grundlage eines Computermodells für die V-Region ausgewählten FR jeweils durch Leucin, Methionin, Prolin, Phenylalanin, Serin, Tryptophan, Serin, Tyrosin, Serin, Methionin bzw. Leucin ersetzt, die in der L-Ketten-V-Region des Maus-Antikörpers KM796 vorgefunden werden. Dies dient dem beabsichtigten Zweck des Erhalts des Antigenbindungsvermögens des Maus-Antikörpers KM796.
  • 2. Beurteilung der Aktivität der Austauschversionen des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers bei transienter Expression
  • Verschiedene Austauschversionen humaner Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper, die aus den in den Abschnitten 3 (1) bis (4) von Beispiel 3 konstruierten H-Ketten- und L-Ketten-V-Regionen des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers zusammengesetzt waren und verschiedene Austausche aufwiesen, wurden auf die nachfolgend beschriebene Weise auf ihre Aktivität hinsichtlich transienter Expression beurteilt.
  • Zunächst wurden zur Beurteilung der H-Ketten-V-Regionen des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers mit verschiedenen Austauschen die Expressionsvektoren pT796HCDRHV2, pT796HCDRHV4 und pT796HCDRH10 auf die nachfolgend beschriebene Weise konstruiert, indem die H-Ketten-V-Region der Maus des im Abschnitt 1 (1) von Beispiel 2 der JP-A-6-205694 erhaltenen transienten Expressionsvektors pT796 des chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörpers durch verschiedene Austausche aufweisende H-Ketten-V-Regionen des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers ersetzt wurden. Für einen Vergleich wurde der Expressionsvektor pT796HCDR konstruiert, indem die H-Ketten-V-Region der Maus von pT796 durch die in Abschnitt 1 (1) von Beispiel 2 erhaltene H-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers ersetzt wurde.
  • 3 μg des Plasmids pT796 wurden zu 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT und 100 μg/ml BSA enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden jeweils 10 Einheiten der Restriktionsenzyme EcoRI (Takara Shuzo) und SplI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und etwa 1 μg eines EcoRI-SplI-Fragments mit einer Größe von etwa 9,20 kb wurde isoliert. Dann wurden 3 μg des in Abschnitt 1 (3) von Beispiel 3 erhaltenen Plasmids pBSL16 zu 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT und 100 μg/ml BSA enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten der Restriktionsenzyme EcoRI (Takara Shuzo) und SplI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und etwa 0,3 μg eines EcoRI-SplI-Fragments mit einer Größe von etwa 0,39 kb wurden isoliert.
  • Dann wurden 0,1 μg des EcoRI-SplI-Fragments von pT796 und 0,1 μg des EcoRI-SplI-Fragments von pBSL16, die jeweils wie vorstehend beschrieben erhalten wurden, bei einem Gesamtvolumen von 20 μl zu sterilisiertem Wasser gegeben und unter Verwendung von Ready-To-Go T4 DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) miteinander ligiert. Die auf diese Weise erhaltene Lösung rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet, und das in 37 gezeigte Plasmid pT796LCDR erhalten.
  • Dann wurden 3 μg des vorstehend beschriebenen Plasmids pT796LCDR zu 10 μl eines 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (Takara Shuzo) zugegeben, und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen, das Präzipitat zu 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT, 100 μg/ml BSA und 0,01 % Triton® X-100 enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms NotI (Takara Shuzo) zugegeben, und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und etwa 1 μg eines ApaI-NotI-Fragments mit einer Größe von etwa 9,11 kb isoliert.
  • Dann wurden 0,1 μg der in Abschnitt 1 (1) von Beispiel 2 der JP-A-6-205694 erhaltenen H-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers oder der in Abschnitt 1 (1) von Beispiel 3 erhaltenen Austauschversion 2 oder 4 der H-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers und 0,1 μg des ApaI-NotI-Fragments von pT796LCDR bei einem Gesamtvolumen von 20 μl zu sterilisiertem Wasser gegeben und unter Verwendung von Ready-To-Go T4 DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) miteinander ligiert. Jede der auf diese Weise erhaltenen Lösungen rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet. Die in 38 gezeigten Plasmide pT796HLCDR, pT796HLCDRHV2 und pT796HLCDRHV4 wurden erhalten.
  • Dann wurden 3 μg des in Abschnitt 1 (2) von Beispiel 3 erhaltenen Plasmids pBSH10 zu 10 μl eines 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (Takara Shuzo) zugegeben, und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen, das Präzipitat zu 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT, 100 μg/ml BSA und 0,01 % Triton® X-100 enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms NotI (Takara Shuzo) zugegeben, und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und etwa 0,3 μg eines ApaI-NotI-Fragments mit einer Größe von etwa 0,44 kb wurden erhalten.
  • Dann wurden 0,1 μg des ApaI-NotI-Fragments von pBSM10 und 0,1 μg des ApaI-NotI-Fragments von pT796LCDR bei einem Gesamtvolumen von 20 μl zu sterilisiertem Wasser gegeben und unter Verwendung von Ready-To-Go T4 DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) miteinander ligiert. Die auf diese Weise erhaltene Lösung rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet und das in 39 gezeigte Plasmid pT796HLCDRH10 erhalten.
  • Dann wurden jeweils 3 μg der Plasmide pT796HLCDR, pT796HLCDRHV2, pT796HLCDRHV4 bzw. pT796HLCDRH10 zu 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT und 100 μg/ml BSA enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden jeweils 10 Einheiten der Restriktionsenzyme EcoRI (Takara Shuzo) und SplI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Jedes Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und etwa 1 μg eines EcoRI-SplI-Fragments mit einer Größe von etwa 9,15 kb isoliert.
  • Dann wurden 5 μg des in Abschnitt 1 (2) von Beispiel 2 erhaltenen Plasmids pBSL3 zu 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT und 100 μg/ml BSA enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden jeweils 10 Einheiten der Restriktionsenzyme EcoRI (Takara Shuzo) und SplI (Takara Shuzo) zugegeben, und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und etwa 0,4 μg eines EcoRI-SplI-Fragments mit einer Größe von etwa 0,39 kb wurden isoliert.
  • Dann wurden 0,1 μg des EcoRI-SplI-Fragments von jedem der Plasmide pT796HLCDR, pT796HLCDRHV2, pT796HLCDRHV4 bzw. pT796HLCDRH10 und 0,1 μg des EcoRI-SplI-Fragments von pBSL3 bei einem Gesamtvolumen von 20 μl zu sterilisiertem Wasser gegeben und unter Verwendung von Ready-To-Go T4 DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) miteinander ligiert. Jede der auf diese Weise erhaltenen Lösungen rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet. Auf diese Weise wurden die in 40 gezeigten Plasmide pT796HCDR, pT796HCDRHV2, pT796HCDRHV4 und pT796HCDRH10 erhalten.
  • Dann wurden 2 μg jedes der auf diese Weise erhaltenen Plasmide pT796HCDR, pT796HCDRHV2, pT796HCDRHV4 und pT796HCDRH10 für transiente Expression eines humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers und zur Bestimmung der Aktivität der Kulturüberstände von humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper über die in den Abschnitten 1 (5), 2 (2) und (3), von Beispiel 2 beschriebenen Verfahren verwendet. Nach Einführung jedes Plasmids wurde der Kulturüberstand nach 72 Stunden gewonnen, die GM2-Bindungsaktivität und die Antikörperkonzentration in dem Kulturüberstand mittels ELISA bestimmt und die relative Aktivität berechnet, wobei die Aktivität des chimären Antikörpers als positive Kontrolle mit 100 % angenommen wurde. Die Ergebnisse sind in 41 gezeigt.
  • Die Ergebnisse zeigten, dass in den Austauschversionen 2 und 4 die Aminosäureaustausche allein einen geringen Einfluss auf die Wiederherstellung der Antigenbindungsaktivität des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper haben, und dass jedoch die Verwendung der auf der bekannten HMHCS der H-Ketten-V-Region des humanen Antikörpers basierenden, von pBSH10 stammenden H-Ketten-V- Region des humanen Graft-CDR-Antikörpers zur Wiederherstellung der Antigenbindungsaktivität beiträgt.
  • Angesichts der vorstehend genannten Ergebnisse wurde die auf der Grundlage der bekannten HMHCS der in SEQ ID NO:7 gezeigten H-Ketten-V-Region des humanen Antikörpers konstruierte H-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers als neue H-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers ausgewählt.
  • Zur Beurteilung der verschiedene Austausche aufweisenden L-Ketten-V-Regionen des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers wurden daraufhin die Expressionsvektoren pT796HLCDRLV1, pT796HLCDRLV2, pT796HLCDRLV3, pT796NLCDRLV4, pT796HLCDRLV8, pT796HLCDRLm-2, pT796HLCDRLm-8, pT796HLCDRLm-28 und pT796HLCDRHSGL auf die nachfolgend beschriebene Weise konstruiert, indem die L-Ketten-V-Region der Maus aus dem Vektor pT796HCDRH10 für transiente Expression des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers, der wie vorstehend beschrieben erhalten wurde, durch L-Ketten-V-Regionen des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers ersetzt wurden, die verschiedene Austausche aufwiesen.
  • 3 μg des Plasmids pT796HCDRH10 wurden somit zu 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT und 100 μg/ml BSA enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden jeweils 10 Einheiten der Restriktionsenzyme EcoRI (Takara Shuzo) und SplI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und etwa 1 μg eines EcoRI-SplI-Fragments mit einer Größe von etwa 9,15 kb isoliert.
  • Dann wurden 3 μg der in Abschnitt 1 (3) oder (4) von Beispiel 3 erhaltenen Plasmide pBSLV1, pBSLV2, pBSLV3, pBSLV4, pBSLV8, pBSLm-2, pBSLm-8, pBSLm-28 oder pBSHSGL zu 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT und 100 μg/ml BSA enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten der Restriktionsenzyme EcoRI (Takara Shuzo) und SplI (Takara Shuzo) zugegeben, und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Jedes Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und etwa 0,3 μg eines EcoRI-SplI-Fragments mit einer Größe von etwa 0,39 kb wurden isoliert.
  • Dann wurden 0,1 μg des EcoRI-SplI-Fragments von pT796HCDRH10 und 0,1 μg des EcoRI-SplI-Fragments jeder der Austauschversionen der L-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers bei einem Gesamtvolumen von 20 μl zu sterilisiertem Wasser gegeben und unter Verwendung von Ready-To-Go T4 DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) miteinander ligiert. Jede der auf diese Weise erhaltenen Lösungen rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet. Auf diese Weise wurden die in 42 gezeigten Plasmide pT796HLCDRLV1, pT796HLCDRLV2, pT796HLCDRLV3, pT796HLCDRLV4, pT796HLCDRLV8, pT796HLCDRLm-2, pT796HLCDRLm-8, pT796HLCDRLm-28 und pT796HLCDRHSGL erhalten.
  • 2 μg jedes der auf diese Weise erhaltenen Plasmide pT796HLCDRLV1, pT796HLCDRLV2, pT796HLCDRLV3, pT796HLCDRLV4, pT796HLCDRLV8, pT796HLCDRLm-2, pT796HLCDRLm-8, pT796HLCDRLm-28 und pT796HLCDRHSGL und des in Beispiel 2 der JP-A-6-205694 beschriebenen Plasmids pT796HLCDR, das humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper zu exprimieren vermag, wurden dann für transiente Expression von humanem Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper und für die Beurteilung der Antikörperaktivität von humanem Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper im Kulturüberstand nach den in den Abschnitten 1 (5) und 2 (2) und (3) von Beispiel 2 beschriebenen Vorgehensweisen verwendet. Nach Einführung jedes Plasmids wurde der Kulturüberstand nach 72 Stunden gewonnen und die GM2-Bindungsaktivität und die Antikörperkonzentration in dem Kulturüberstand mittels ELISA bestimmt und die relative Aktivität berechnet, wobei die Aktivität des chimären Antikörpers als Positivkontrolle mit 100 % angenommen wurde. Die Ergebnisse sind in 43 gezeigt.
  • Die Ergebnisse zeigten, dass in den Austauschversionen 1, 2, 3, 4 und 8 die Austausche der Aminosäurereste allein einen geringen Einfluss auf die Wiederherstellung der Antigenbindungsaktivität des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers haben, die Austausche der Aminosäurereste in den Austauschversionen Lm-2 und Lm-8 dagegen zur Wiederherstellung der Antigenbindungsaktivität beitragen. Weiterhin zeigte die Version Lm-28, die beide Aminosäureaustausche von Lm-2 und Lm-8 aufwies, einen Grad an Antigenbindungsaktivität, der fast mit dem des chimären Antikörpers vergleichbar war, wodurch gezeigt wurde, dass diejenigen Aminosäurereste, die bei der Herstellung von Lm-28 ersetzt wurden, unter dem Gesichtspunkt der Antigenbindungsaktivität sehr wichtig waren.
  • Angesichts der vorstehend genannten Ergebnisse wurde die Version Lm-28 der L-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers, die in SEQ ID NO:8 gezeigt ist, als die erste neue L-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers ausgewählt.
  • Weiterhin wurde gezeigt, dass die Antigenbindungsaktivität wiederhergestellt werden kann, wenn die L-Ketten-V-Region des von pBSHSGL stammenden humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers, nämlich die auf der Grundlage der bekannten HMHCS der humanen L-Ketten-V-Region des humanen Antikörpers konstruierte L-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers verwendet wird.
  • Angesichts der vorstehend genannten Ergebnisse wurde die auf der Grundlage der bekannten HMHCS der in SEQ ID NO:9 dargestellten L-Ketten-V-Region des humanen Antikörpers konstruierte L-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers als die zweite neue L-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers ausgewählt.
  • Es muss erwähnt werden, dass bei jenen L-Ketten-V-Regionen des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers, die eine hohe Bindungsaktivität gegen GM2 zeigten, gewisse Aminosäurereste, die nicht durch Ableitung von bekannten Herstellungsbeispielen des humanen Graft-CDR-Antikörpers bestimmt werden können, durch in der L-Ketten-V-Region der Maus vorgefundene Aminosäurereste ersetzt wurden. Somit war es offenkundig bei der Produktion der humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper sehr wichtig, diese Aminosäurereste zu identifizieren.
  • Weiterhin ist die Tatsache, dass die humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper, die jene auf der bekannten HMHCS der V-Region des humanen Antikörpers basierende H-Ketten- und L-Ketten-V-Regionen aufweisen, eine hohe Antigenbindungsaktivität zeigten, ein Beweis für die Brauchbarkeit des vorliegenden Verfahrens bei der Herstellung humaner Graft-CDR-Antikörper.
  • 3. Erhalten von Zelllinien für die dauerhafte Herstellung humaner Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper
  • Auf der Grundlage der Ergebnisse von Abschnitt 2 (5) von Beispiel 3 wurden zwei Zelllinien, KM8966 und KM8967, jeweils als die humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper mit höherer Antigenbindungsaktivität als die im Beispiel 2 der JP-A-6-205694 beschriebenen humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper auf die nachfolgend beschriebene Weise erhalten, wobei die Zelllinie KM8966 KM8966, welcher die in SEQ ID NO:7 gezeigte Sequenz als die H-Ketten-V-Region und die in SEQ ID NO:8 gezeigte Sequenz als die L-Ketten-V-Region aufweist, zu exprimieren vermag und die Zelllinie KM8967 KM8967, welcher die in SEQ ID NO:7 gezeigte Sequenz als die H-Ketten-V-Region und die in SEQ ID NO:9 gezeigte Aminosäuresequenz als die L-Ketten-V-Region aufweist, zu exprimieren vermag.
  • 3 μg jedes der in Absatz 2 (5) von Beispiel 3 erhaltenen Plasmide pT796NLCDRLm-28 und pT796HLCDRHSGL wurden jeweils zu 10 μl eines 100 mM Kaliumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 20 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 8,5) gegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms BamHI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Jedes Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen, das Präzipitat 10 μl 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms XhoI (Takara Shuzo) zugegeben, und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Jedes Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und etwa 1 μg eines BamHI-XhoI-Fragments mit einer Größe von etwa 4,93 kb wurde isoliert.
  • Dann wurden 3 μg des in Beispiel 1 erhaltenen Plasmids pKANTEX93 zu 10 μl eines 100 mM Kaliumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltendem 20 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 8,5) gegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms BamHI (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen, das Präzipitat zu 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gegeben, weiterhin wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms XhoI (Takara Shuzo) zugegeben, und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und etwa 1 μg eines BamHI-XhoI-Fragments mit einer Größe von 8,68 kb isoliert.
  • Dann wurden 0,1 μg des BamHI-XhoI-Fragments von pT796HLCDRLm-28 oder pT796HLCDRHSGL und 0,1 μg des BamHI-XhoI-Fragments von pKANTEX93, die jeweils wie vorstehend beschrieben erhalten wurden, bei einem Gesamtvolumen von 20 μl zu sterilisiertem Wasser gegeben und unter Verwendung von Ready-To-Go T4 DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) miteinander ligiert. Jede der auf diese Weise erhaltenen Lösungen rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet. Auf diese Weise wurden die in 44 gezeigten Plasmide pKANTEX796HLCDRLm-28 und pKANTEX796HLCDRHSGL erhalten.
  • Dann wurden 4 μg jedes der vorstehend genannten Plasmide pKANTEX796HLCDRLm-28 bzw. pKANTEX796HLCDRHSGL zur Transformation von YB2/0(ATCC CRL 1581)-Zellen gemäß der in Abschnitt 1 (4) von Beispiel 2 beschriebenen Vorgehensweise verwendet und, nach letztendlicher Selektion unter Verwendung von G418 (0,5 mg/ml) und MTX (200 nM) eine Transformantenzelllinie, KM8966, die etwa 40 μg/ml KM8966, d.h. den von pKANTEX796HLCDRLm-28 stammenden humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper, herzustellen vermag, und eine Transformantenzelllinie, KM8967, die etwa 30 μg/ml KM8967, d.h. den von pKANTEX796HLCDRHSGL stammenden humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper herzustellen vermag, erhalten.
  • Die Transformanten KM8966 und KM8967 wurden beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (Higashi 1-1-3, Tsukuba, Ibaraki, Japan; nachfolgend ist hier die Adresse dieselbe wie diese) unter den Hinterlegungsnummern FERM BP-5105 bzw. FERM BP-5106 am 23. Mai 1995 hinterlegt.
  • 4. Aufreinigung der humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8966 und KM8967
  • Die in Abschnitt 3 von Beispiel 3 erhaltene Transformantenzelllinien KM8966 und 8967 wurden jeweils in GIT-Medium (Nippon Pharmaceutical) suspendiert, das 0,5 mg/ml G418 und 200 nM MTX enthielt, und nach der Vorgehensweise von Abschnitt 11 von Beispiel 1 der JP-A-6-205694 18 mg des aufgereinigten humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers KM8966 und 12 mg des aufgereinigten KM8967 aus etwa 0,5 Liter Kulturflüssigkeit erhalten. Jeweils 3 μg der erhaltenen aufgereinigten humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper und des chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörpers KM966 wurden einer Elektrophorese nach einer bekannten Methode [Laemli, U.K., Nature, 227, 680 (1979)] zur Bestimmung des Molekulargewichts unterworfen. Die Ergebnisse sind in 45 gezeigt. Wie in 45 gezeigt, zeigten unter reduzierenden Bedingungen beide H-Ketten der Antikörper ein Molekulargewicht von etwa 50 Kilodalton und beide L-Ketten der Antikörper ein Molekulargewicht von etwa 25 Kilodalton. Die Expression von H- und L-Ketten mit korrekten Molekulargewichten wurde somit bestätigt. Unter nicht-reduzierenden Bedingungen zeigten beide humane Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper ein Molekulargewicht von etwa 150 Kilodalton, und es wurde somit bestätigt, dass Antikörper exprimiert worden waren, von denen jeder aus zwei H-Ketten und zwei L-Ketten aufgebaut war und die korrekte Größe aufwies. Weiterhin wurden die H- und L-Ketten jedes humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers unter Verwendung einer Proteinsequenziervorrichtung (Applied Biosystems model 470A) mittels automatisierten Edman-Abbaus auf ihre N-terminate Aminosäuresequenz untersucht, wobei eine von der Basensequenz der DNA der V-Region ableitbare Aminosäuresequenz gezeigt wurde.
  • 5. In vitro-Reaktivität der humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8966 und KM8967 gegen GM2
  • Der chimäre Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörper KM966 und die aufgereinigten humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8966 und KM8967 wurden über ELISA auf Reaktivität gegen GM2 getestet, so wie es in Abschnitt 1 (5) von Beispiel 2 beschrieben wurde. Die Ergebnisse sind in 46 gezeigt. Aus der kultivierten Zelllinie HPB-ALL [Oboshi et al., Tanpakushitsu, Kakusan & Koso (Protein, Nucleic Acid & Enzyme), 23, 697 (1978)] wurde nach der bekannten Methode [J. Biol. Chem., 263, 10915 (1988)] GM2 (N-Acetyl-GM2) aufgereinigt. Wie gezeigt wird, fand man, dass der aufgereinigte humane Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8966 eine Bindungsaktivität aufwies, die der des chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörpers KM966 vergleichbar war. Dagegen betrug die Bindungsaktivität des aufgereinigten Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers KM8967 ungefähr 1/4 bis 1/5 der Bindungsaktivität des chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörpers KM966.
  • 6. Reaktionsspezifität der humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8966 und KM8967
  • Der chimäre Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörper KM966 und die humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8966 und KM8967 wurden mittels ELISA, wie in Abschnitt 1 (5) von Beispiel 2 beschrieben, auf Reaktivität gegenüber den Gangliosiden GM1, N-Acetyl-GM2, N-Glykolyl-GM2, N-Acetyl-GM3, N-Glykolyl-GM3, GD1a, GD1b (latron), GD2, GD3 (latron) und GQ1b (latron) getestet. Die Ergebnisse sind in 47 gezeigt. GM1 und GD1a wurden aus Rinderhirn, N-Acetyl-GM2 aus der kultivierten Zelllinie HPB-ALL [Oboshi et al., Tanpakushitsu, Kakusan & Koso (Protein, Nucleic Acid & Enzyme), 23, 697 (1978)], N-Glykolyl-GM2 und N-Glykolyl-GM3 aus Mäuseleber, N-Acetyl-GM3 aus Hundeerythrozyten und GD2 aus der kultivierten Zelllinie IMR32 (ATCC CCL127) über die per se bekannte Methode [J. Biol. Chem., 263, 10915 (1988)] augereinigt. Jeder Antikörper wurde bei einer Konzentration von 10 μg/ml verwendet.
  • Wie in 47 gezeigt, wurde bestätigt, dass die humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8966 und KM8967 wie der chimäre Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörper KM966 spezifisch mit GM2 (N-Acetyl-GM2 und N-Glykolyl-GM2) reagieren.
  • 7. Reaktivität der humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8966 und KM8967 gegen Krebszellen
  • Eine Kultur der humanen kleinzelligen Lungenkarzinomzelllinie SBC-3 (JCRB 0818) (1 × 106 Zellen) wurde in PBS suspendiert, die Suspension in ein Mikroröhrchen (TREF) gegeben und zentrifugiert (1200 U/min, 2 Minuten). Zu den auf diese Weise gewaschenen Zellen gab man 50 μl (50 μg/ml) des chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörpers KM966 oder des aufgereinigten humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers KM8966 oder KM8967 zu, worauf man rührte und 1 Stunde bei 4 °C stehen ließ. Nach dem vorstehend beschriebenen Reaktionsschritt wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen, wobei sich jedes Mal eine Zentrifugation anschloss. Dann wurden 20 μl mit Fluoresceinisocyanat-markiertes Protein A (30fache Verdünnung, Boehringer Mannheim) zugegeben und nach Rühren die Reaktion 1 Stunde bei 4 °C durchgeführt. Danach wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen, wobei sich jedes Mal eine Zentrifugation anschloss, und dann weiter in PBS suspendiert und unter Verwendung eines Durchflusszytometers, EPICS Elite (Coulter), analysiert. In einem Kontrolllauf führte man die vorstehend beschriebene Vorgehensweise ohne Zugabe des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers durch und analysierte dann. Die Ergebnisse sind in 48 gezeigt. Man fand, dass wie der chimäre Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörper KM966 auch die aufgereinigten humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8966 und KM8967 mit der Kultur der humanen kleinzelligen Lungenkarzinomzelllinie SBC-3 stark reagierten.
  • 8. In vitro-Antitumoraktivität der humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8966 und KM8967: CDC-Aktivität
  • (1) Herstellung der Zielzellen
  • Die in mit 10 % FCS supplementiertem RPM11640-FCS (10)-Medium kultivierten SBC-3 Zielzellen wurden auf eine Zellkonzentration von 5 × 106 Zellen/500 μl eingestellt, und 3,7 MBq Na2 51CrO4 (Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.) wurden zugegeben. Man ließ dann 1 Stunde bei 37 °C reagieren und wusch die Zellen dreimal mit dem Medium. Man ließ die Zellen dann 30 Minuten bei 4 °C stehen und gab nach Zentrifugation Medium hinzu, um die Zellkonzentration auf 1 × 106 Zellen/ml einzustellen.
  • (2) Herstellung des Komplements
  • Seren von gesunden Individuen wurden vereinigt und als Quelle für Komplement verwendet.
  • (3) Messung der CDC-Aktivität
  • Der chimäre Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörper KM966 oder der aufgereinigte humane Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8966 oder KM8967 wurde den Wells von 96-Well-Platten mit U-Boden im Endkonzentrationsbereich von 0,05 bis 50 μg/ml zugegeben und dann 50 μl (5 × 104 Zellen/Well) der in (1) hergestellten Zielzellen zu jedem Well zugegeben. Die Reaktion wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach Zentrifugation wurden die Überstände verworfen, das in (2) erhaltene menschliche Komplement jedem Well bis auf eine Endkonzentration von 15 % v/v zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 37 °C durchgeführt. Nach Zentrifugation wurde die Menge an 51Cr in jedem Überstand unter Verwendung eines Gammazählers bestimmt. Die Menge des spontan dissoziierten 51Cr wurde bestimmt, indem man den Zielzellen das Medium allein anstelle der Antikörper- und Komplementlösungen zugab und die Menge von 51Cr im Überstand auf die gleiche Weise wie vorstehen beschrieben bestimmte. Die Gesamtmenge von dissoziierten 51Cr wurde bestimmt, indem man den Zielzellen 1 N Salzsäure anstelle der Antikörper- und Komplementlösungen zugab und die Menge von 51Cr im Überstand auf die gleiche Weise wie vorstehend beschrieben bestimmte. Die CDC-Aktivität wurde folgendermaßen berechnet:
    Figure 00810001
  • Die auf diese Weise erhaltenen Ergebnisse sind in 49 gezeigt. Es wurde gezeigt, dass die CDC-Aktivität der humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM9866 und KM8967 geringer war als die des chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörpers KM966.
  • 9. In vitro-Antitumoraktivität der humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8966 und KM8967: ADCC-Aktivität
  • (1) Herstellung der Zielzellen.
  • Die in mit 10 % FCS supplementiertem RPM11640-FCS (10)-Medium kultivierten SBC-3 Zielzellen wurden auf eine Zellkonzentration von 1 × 106 Zellen/500 μl eingestellt und 3,7 MBq Na2 51CrO4 (Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.) wurden zugegeben. Man ließ dann 1 Stunde bei 37 °C reagieren und wusch die Zellen dreimal mit dem Medium. Dann ließ man die Zellen 30 Minuten bei 4 °C in dem Medium stehen und gab dann nach Zentrifugation Medium hinzu, um die Zellkonzentration auf 2 × 105 Zellen/ml einzustellen.
  • (2) Vorbereitung von Effektorzellen
  • Menschliches venöses Blut (50 ml) wurde abgenommen, 0,5 ml Heparin-Natrium (Takeda Chemical Industries; 1.000 Einheiten/ml) wurden zugegeben und das Gemisch sanft gerührt. Dieses Gemisch wurde auf Polymorphprep® (Nycomed) geschichtet und zentrifugiert, um die Lymphozytenschicht (PBMC) abzutrennen. Die resultierenden Lymphozyten wurden dreimal durch Zentrifugation mit RPM11640-Medium gewaschen, das mit 10 % FCS supplementiert war, und die Zellen zur Verwendung als Effektorzellen in dem Medium suspendiert (5 × 106 Zellen/ml).
  • (3) Messung der ADCC-Aktivität
  • Der chimäre Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörper KM966 oder die aufgereinigten humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8966 oder KM8967 wurden den Wells einer 96-Well-Platte mit U-Boden im Endkonzentrationsbereich von 0,05 bis 50 μg/ml zugegeben und dann 50 μl (1 × 104 Zellen/Well) der in (1) vorbereiteten Suspension von Zielzellen und 100 μl (5 × 105 Zellen/Well) der in (2) vorbereiteten Suspension von Effektorzellen zu jedem Well gegeben. Die Reaktion 4 Stunde bei 37 °C durchgeführt und nach Zentrifugation die Menge an 51Cr in jedem Überstand unter Verwendung eines Gammazählers gemessen. Die Menge an spontan dissoziiertem 51Cr wurde bestimmt, indem den Zielzellen Medium allein anstelle des Antikörpers und der Effektorzellen zugegeben und die Menge von 51Cr im Überstand auf die gleiche Weise wie vorstehend beschrieben gemessen wurde. Die Gesamtmenge an dissoziiertem 51Cr wurde bestimmt, indem den Zielzellen 1 N Salzsäure anstelle des Antikörpers und der Effektorzellen zugegeben und die Menge von 51Cr im Überstand auf die gleiche Weise wie vorstehend beschrieben gemessen wurde. Die ADCC-Aktivität wurde folgendermaßen berechnet:
    Figure 00820001
  • Die auf diese Weise erhaltenen Ergebnisse sind in 50 gezeigt. Der humane Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8966 zeigte eine ADCC-Aktivität, die mit der des chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörpers KM966 vergleichbar war, während der humane Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8967 eine geringfügig niedrigere ADCC-Aktivität zeigte als der chimäre Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörper KM966.
  • BEISPIEL 4
  • Herstellung der humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper II
  • Die humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8966 und KM8967 zeigten eine Antigenbindungsaktivität (ELISA), Bindungsspezifität und ADCC-Aktivität, die denen des chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörpers KM966 vergleichbar war, während deren CDC-Aktivität geringer war als die des chimären Antikörpers. Um die CDC-Aktivität zu erhöhen, wurden humane Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper auf die folgende Weise hergestellt.
  • 1. Modifizierung der H-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers KM8966
  • Unter den in Beispiel 3 hergestellten humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpern wurden bei dem eine höhere CDC-Aktivität aufweisenden Antikörper KM8966 Austausche von Aminosäureresten in der H-Ketten-V-Region (SEQ ID NO:7) durchgeführt, um die CDC-Aktivität zu erhöhen. Die zu ersetzenden Aminosäurereste wurden zufällig unter Bezugnahme auf die Ergebnisse verschiedener in Beispiel 3 erhaltener Austausche und eines Computermodells für die V-Region des Antikörpers KM796 der Maus ausgewählt. Die Austausche wurden über die PCR-Methode eingeführt, indem als Templat 1 ng des in Abschnitt 1 (2) von Beispiel 3 erhaltenen, die H-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers enthaltenden Plasmids pBSH10 und als Primer synthetische Antisense- und Sense-DNA, welche die in Abschnitt 1 (3) von Beispiel 3 beschriebenen Mutationen enthielten, verwendet wurden.
  • Die Reaktion wurde auf die gleiche Weise wie in Abschnitt 1 (3) von Beispiel 3 beschrieben durchgeführt, wobei die synthetische DNA nach SEQ ID NO:62 als der mutierte Antisense-Primer und die synthetische DNA nach SEQ ID NO:63 als mutierter Sense-Primer verwendet wurde, um das Plasmid pBSHM1 zu erhalten, das die in SEQ ID NO:64 gezeigte Version HM1 der H-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers enthält. In der Aminosäuresequenz der Version HM1 wurden das Arginin auf Position 38, das Alanin auf Position 40, das Glutamin auf Position 43 und das Glyzin auf Position 44 der in SEQ ID NO:7 gezeigten FR durch Lysin, Serin, Lysin bzw. Serin ersetzt, die in der H-Ketten-V-Region des Antikörpers KM796 der Maus vorgefunden werden.
  • Das Plasmid pBSHM2, das die in SEQ ID NO:10 gezeigte Version HM2 der H-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers enthält, wurde über die in Abschnitt 1 (3) von Beispiel 3 beschriebene Reaktion erhalten, wobei die synthetische DNA nach SEQ ID NO:65 als der mutierte Antisense-Primer und die synthetische DNA nach SEQ ID NO:66 als der mutierte Sense-Primer verwendet wurden. In der Aminosäuresequenz der Version HM2 wurden das Arginin auf Position 38 und das Alanin auf Position 40 der in SEQ ID NO:7 gezeigten FR durch Lysin bzw. Serin ersetzt, die in der H-Ketten-V-Region des Antikörpers KM796 der Maus vorgefunden werden.
  • Das Plasmid pBSHM3, das die in SEQ ID NO:69 gezeigte Version HM3 der H-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers enthält, wurde durch die in Abschnitt 1 (3) von Beispiel 3 beschriebene Reaktion erhalten, wobei die synthetische DNA nach SEQ ID NO:67 als der mutierte Antisense-Primer und die synthetische DNA nach SEQ ID NO:68 als der mutierte Sense-Primer verwendet wurden. In der Aminosäuresequenz der Version HM3 wurden das Valin auf Position 68 und das Isoleucin auf Position 70 der in SEQ ID NO:7 gezeigten FR durch Alanin bzw. Leucin ersetzt, die in der H-Ketten-V-Region des Antikörpers KM796 der Maus vorgefunden werden.
  • Das Plasmid pBSHM31, das die in SEQ ID NO:70 gezeigte Version HM31 der H-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers enthält, wurde über die in Abschnitt 1 (3) von Beispiel 3 beschriebene Reaktion erhalten, wobei 1 ng des Plasmids pBSHM3 als das Templat, die synthetische DNA nach SEQ ID NO:62 als der mutierte Antisense-Primer und die synthetische DNA nach SEQ ID NO:63 als der mutierte Sense-Primer verwendet wurden. In der Aminosäuresequenz der Version HM31 wurden das Arginin auf Position 38, das Alanin auf Position 40, das Glutamin auf Position 43 und das Glyzin auf Position 44 der FR der Version HM3 durch Lysin, Serin, Lysin bzw. Serin ersetzt, die in der H-Ketten-V-Region des Antikörpers KM796 der Maus vorgefunden werden.
  • Weiterhin wurde das Plasmid pBSHM32, das die in SEQ ID NO:71 gezeigte Version HM32 der H-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers enthält, über die in Abschnitt 1 (3) von Beispiel 3 beschriebene Reaktion erhalten, indem 1 ng des Plasmids pBSHM3 als das Template, die synthetische DNA nach SEQ ID NO:65 als der mutierte Antisense-Primer und die synthetische DNA nach SEQ ID NO:66 als der mutierte Sense-Primer verwendet wurden. In der Aminosäuresequenz der Version HM32 wurden das Arginin auf Position 38 und das Alanin auf Position 40 in der FR der Version HM3 durch Lysin bzw. Serin ersetzt, die in der H-Ketten-V-Region des Antikörpers KM796 der Maus vorgefunden werden.
  • 2. Untersuchung der CDC-Aktivität humaner Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper mit verschiedenen Austauschen in der H-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers
  • (1) Konstruktion von Expressionsvektoren
  • Expressionsvektoren für verschiedene humane Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper, welche die H-Ketten-V-Region humaner Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper mit verschiedenen in Abschnitt 1 von Beispiel 4 erhaltenen Austauschen und der L-Ketten-V-Region von KM8966 (SEQ ID NO:8) aufweisen, wurden auf die nachfolgend beschriebene Weise hergestellt.
  • 3 μg jedes der in Abschnitt 1 von Beispiel 4 erhaltenen Plasmide pBSHM1, pBSHM2, pBSHM3, pBSHM31 und pBSHM32 wurden in 10 μl eines 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gelöst, 10 Einheiten ApaI (Takara Shuzo) wurden zugegeben, und man ließ das Gemisch 1 Stunde bei 37 °C reagieren. Das resultierende Gemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen und das auf diese Weise erhaltene Präzipitat in 50 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT, 100 μg/ml BSA und 0,01 % Triton® X-100 enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gelöst. Weiterhin wurden 10 Einheiten NotI (Takara Shuzo) für eine einstündige Reaktion des Gemisches bei 37 °C zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, wobei etwa 0,2 μg des ApaI-NotI-Fragments mit einer Größe von etwa 0,44 kb isoliert wurden.
  • Daraufhin wurden 3 μg des in Abschnitt 3 (3) von Beispiel 3 erhaltenen Plasmids pKANTEX796HLCDRLm-28 in 10 μl eines 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthaltenden 10 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gelöst, 10 Einheiten ApaI (Takara Shuzo) wurden zugegeben, woraufhin man das Gemisch 1 Stunde bei 37 °C reagieren ließ. Das resultierende Gemisch wurde einer Ethanolfällung unterworfen und das auf diese Weise erhaltene Präzipitat in 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT, 100 μg/ml BSA und 0,01 % Triton® X-100 enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gelöst. Man gab 10 Einheiten NotI (Takara Shuzo) zu und ließ das Gemisch 1 Stunde bei 37 °C reagieren. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, wobei etwa 1 μg des ApaI-NotI-Fragments mit einer Größe von etwa 13,14 kb isoliert wurden.
  • Etwa 0,1 μg jedes der auf diese Weise erhaltenen ApaI-NotI-Fragmente von pBSHM1, pBSHM2, pBSHM3, pBSHM31 und pBSHM32 und 0,1 μg des ApaI-NotI-Fragments von pKANTEX796HLCDRLm-28 wurden bei einem Gesamtvolumen von 20 μl zu sterilisiertem Wasser gegeben und unter Verwendung von Ready-To-Go T4 DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) miteinander ligiert. Jede der resultierenden Lösungen rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet und die in 51 gezeigten Plasmide pKANTEX796HM1Lm-28, pKANTEX796HM2Lm-28, pKANTEX796HM3Lm-28, pKANTEX796HM31Lm-28 und pKANTEX796HM32Lm-28 wurden erhalten.
  • (2) Expression von Austauschversionen humaner Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper
  • 4 μg jedes der in Abschnitt 2 (1) von Beispiel 4 erhaltenen Plasmide pKANTEX796HM1Lm-28, pKANTEX796HM2Lm-28, pKANTEX796HM3Lm-28, pKANTEX796HM31Lm-28 und pKANTEX796HM32Lm-28 wurde zur Transformation von YB2/0-Zellen (ATCC CRL 1581) nach der in Abschnitt 1 (4) von Beispiel 2 beschriebenen Methode verwendet. Die Zellen wurden schließlich mit G418 (0,5 mg/ml) und MTX (200 nM) selektiert, wodurch etwa 2 bis 5 μg/ml Transformanten erhalten wurden, die von den entsprechenden Expressionsvektoren stammende humane Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper zu exprimieren vermochten.
  • (3) Aufreinigung der Austauschversionen humaner Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper
  • Zellen jeder in Abschnitt 2 (2) von Beispiel 4 erhaltenen Transformanten wurden in 0,5 mg/ml G418 und 200 nM MTX enthaltendem GIT-Medium (Nihon Pharmaceutical) suspendiert und nach der in Abschnitt 11 von Beispiel 1 der JP-A-6-205694 beschriebenen Methode aus 0,6 Liter der Kulturbrühe etwa 1 bis 3 mg aufgereinigte humane Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper erhalten. Die von den Plasmiden pKANTEX796HM1Lm-28, pKANTEX796HM2Lm-28, pKANTEX796HM3Lm-28, pKANTEX796HM31Lm-28 und pKANTEX796HM32Lm-28 stammenden humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper werden nachfolgend hier als „M1-28", „M2-28", „M3-28", „M31-28" bzw. „M32-28" bezeichnet. 4 μg jedes der aufgereinigten humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper, des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers KM8966 und des chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörpers KM966 wurden zur Überprüfung des Molekulargewichts über die herkömmliche Methode elektrophoretisch getrennt [Laemmli: Nature, 227, 680 (1970)]. Die Ergebnisse sind in 52 gezeigt. Wie in 52 gezeigt, betrug unter reduzierenden Bedingungen das Molekulargewicht der H-Kette des Antikörpers etwa 50 KDa und das Molekulargewicht der L-Kette des Antikörpers etwa 25 KDa, wodurch die Expression der H-Kette und der L-Kette mit dem korrekten Molekulargewicht bestätigt wurde. Unter nicht-reduzierenden Bedingungen betrug das Molekulargewicht der humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper etwa 150 KDa, wodurch bestätigt wurde, dass der exprimierte Antikörper aus zwei H-Ketten und zwei L-Ketten aufgebaut war und eine korrekte Größe aufwies. Die N-terminale Aminosäuresequenz der H- und L-Ketten jedes aufgereinigten humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers wurde mittels automatisierten Edman-Abbaus unter Verwendung einer Proteinsequenziervorrichtung (Applied Biosystems model 470A) untersucht. Als Ergebnis wurde bestätigt, dass die Aminosäuresequenz mit der aus der DNA-Sequenz der synthetisierten V-Region abgeleiteten Aminosäuresequenz übereinstimmte.
  • (4) CDC-Aktivität der Austauschversionen humaner Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper
  • Die CDC-Aktivität der Austauschversionen der in Abschnitt 2 (3) von Beispiel 4 erhaltenen humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper, des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers KM8966 und des chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörpers KM966 wurde nach der in Abschnitt 8 von Beispiel 3 beschriebenen Methode gemessen. Die Ergebnisse sind in 53 gezeigt. Wie in 53 gezeigt, fand man unter den Austauschversionen der humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper die höchste CDC-Aktivität beim vom Plasmid pKANTEX796HM2Lm-28 stammenden humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper M2-28, die höher war als die des in Beispiel 3 hergestellten humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers KM8966. Dieses Ergebnis zeigt, dass unter den verschiedenen in Abschnitt 1 von Beispiel 4 hergestellten Austauschversionen die ersetzten Aminosäurereste der Version HM2 eine wichtige Rolle für die Steigerung der CDC-Aktivität spielen. Aufgrund des Computermodells für die V-Region des Antikörpers KM796 der Maus wurde angenommen, dass der Austausch der Aminosäurereste der Version HM2 die gesamte Struktur der V-Region beeinflussen würde, weil diese Aminosäurereste an der Stelle lokalisiert sind, die mit der L-Ketten-V-Region in Wechselwirkung tritt. Neuere Untersuchungen zur Herstellung von humanem Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper zeigten, dass die Aminosäurereste, welche die Struktur des Antikörpers beeinflussen, bei jedem Antikörper variieren. Bisher wurde kein Verfahren für die genaue Vorhersage solcher Aminosäurereste entwickelt, und die vorstehend genannten Ergebnisse liefern eine wichtige Erkenntnis für die Herstellung des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers.
  • Der von dem Plasmid pKANTEX796HM2Lm-28 stammende humane Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper M2-28 wurde als KM8970 bezeichnet und die den Antikörper KM8970 herstellende Transformante KM8970 unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-5528 am 9. Mai 1996 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology hinterlegt.
  • 3. Modifizierung der L-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers KM8966
  • Beim in Beispiel 3 hergestellten humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8966 wurden Austausche von Aminosäureresten in der L-Ketten-V-Region (SEQ ID NO:8) vorgenommen, um die CDC-Aktivität zu steigern. Auf der Grundlage verschiedener in Abschnitt 1 (3) von Beispiel 3 erhaltener Ergebnisse verschiedener Austausche, die nahe legten, dass es für die Aktivität des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers wichtig war, die Struktur von CDR2 zu unterstützen, wurde als zu ersetztender Aminosäurerest der Serin-Rest auf Position 59 ausgewählt. Die Austausche wurden über die PCR-Methode unter Verwendung von 1 ng des Plasmids pBSLm-28, das die in Abschnitt 1 (3) von Beispiel 3 erhaltene L-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers enthielt, als Templat und einer synthetischen Primer-Antisense- und Sense-DNA, welche die in Abschnitt 1 (3) von Beispiel 3 beschriebenen Mutationen enthielten, eingeführt.
  • Die Reaktion wurde auf die gleiche Weise wie in Abschnitt 1 (3) von Beispiel 3 beschrieben unter Verwendung der synthetischen DNA nach SEQ ID NO:72 als dem mutierten Antisense-Primer und der synthetischen DNA nach SEQ ID NO:73 als dem mutierten Sense-Primer durchgeführt, wobei das Plasmid pBSLm-28 Nr. 1 erhalten wurde, das die in SEQ ID NO:11 gezeigte Version Lm-28 Nr. 1 der L-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers enthielt. In der Aminosäuresequenz der Version Lm-28 Nr. 1 wurde das Serin auf Position 59 der in SEQ ID NO:83 gezeigten FR durch Alanin ersetzt, das in der L-Ketten-V-Region des Antikörpers KM796 der Maus vorgefunden wird.
  • 4. Untersuchung der CDC-Aktivität von humanem Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper, der einen neuen Austausch in der L-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers aufweist
  • (1) Konstruktion von Expressionsvektoren
  • Expressionsvektoren für den humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper, der die L-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers mit dem in Abschnitt 3 von Beispiel 4 erhaltenen Austausch aufwies und die H-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper enthielt, wurden auf die nachfolgend beschriebene Weise erhalten.
  • 6 μg des in Abschnitt 3 von Beispiel 4 erhaltenen Plasmids pBSLm-28 Nr. 1 wurden in 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT und 100 μg/ml BSA enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gelöst. Man gab jeweils 10 Einheiten EcoRI (Takara Shuzo) und SplI (Takara Shuzo) zu und ließ das Gemisch 1 Stunde bei 37 °C reagieren. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, wobei etwa 0,4 μg des EcoRI-SplI-Fragments mit einer Größe von etwa 0,39 kb isoliert wurden.
  • Daraufhin wurden jeweils 3 μg des in Abschnitt 3 von Beispiel 3 erhaltenen Plasmids pKANTEX796HLCDRLm-28 und der in Abschnitt 2 (1) von Beispiel 4 erhaltenen Plasmide pKANTEX796HM1Lm-28, pKANTEX796HM2Lm-28 und pKANTEX796HM3Lm-28 in 10 μl eines 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT und 100 μg/ml BSA enthaltenden 50 mM Trishydrochlorid-Puffers (pH 7,5) gelöst, worauf man jeweils 10 Einheiten EcoRI (Takara Shuzo) und SplI zugab und das Gemisch 1 Stunde bei 37 °C reagieren ließ. Das Reaktionsgemisch wurde über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, wobei etwa 1 μg des EcoRI-SplI-Fragments mit einer Größe von etwa 13,19 kb isoliert wurde.
  • Ein Aliquot von 0,1 μg jedes der auf diese Weise erhaltenen EcoRI-SplI-Fragmente von pBSLm-28 Nr. 1 und 0,1 μg des EcoRI-SplI-Fragments von pKANTEX796HLCDRLm-28, pKANTEX796HM1Lm-28, pKANTEX796HM2Lm-28 und pKANTEX796HM3Lm-28 wurden bei einem Gesamtvolumen von 20 μl zu sterilisiertem Wasser gegeben und unter Verwendung von Ready-To-Go T4 DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) miteinander ligiert. Jede der resultierenden Lösungen rekombinanter Plasmid-DNA wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet und die in 54 gezeigten Plasmide pKANTEX796HLm-28 Nr. 1, pKANTEX796HM1Lm-28 Nr. 1, pKANTEX796HM2Lm-28 Nr. 1 und pKANTEX796HM3Lm-28 Nr. 1 wurden erhalten.
  • (2) Expression humaner Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper mit Austauschen in der L-Ketten-V-Region
  • Jeweils 4 μg der in Abschnitt 4 (1) von Beispiel 4 erhaltenen Plasmide pKANTEX796HM1Lm-28 Nr. 1, pKANTEX796HM2Lm-28 Nr. 1 und pKANTEX796HM3Lm-28 Nr. 1 wurden zur Transformation von YB2/0-Zellen (ATCC CRL 1581) nach dem in Absatz 11 von Beispiel 1 beschriebenen Methode verwendet. Die Zellen wurden schließlich mit G418 (0,5 mg/ml) und MTX (200 nM) selektiert, wobei etwa 2 bis 5 μg/ml Transformanten erhalten wurden, die von den entsprechenden Expressionsvektoren stammende humane Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper herzustellen vermochten.
  • (3) Aufreinigung humaner Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper mit Austauschen in der L-Ketten-V-Region
  • Zellen jeder in Abschnitt 4 (2) von Beispiel 4 erhaltenen Transformante wurden in GIT-Medium (Nihon Pharmaceutical) suspendiert, das 0,5 mg/ml G418 und 200 nM MTX enthielt, und nach der in Abschnitt 11 von Beispiel 1 der JP-A-6-205694 beschriebenen Methode wurden aus etwa 0,6 Liter der Kulturbrühe etwa 1 bis 3 mg aufgereinigte humane Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper erhalten. Die von den Plasmiden pKANTEX796HLm-28 Nr. 1, pKANTEX796HM1Lm-28 Nr. 1, pKANTEX796HM2Lm-28 Nr. 1 und pKANTEX796HM3Lm-28 Nr. 1 stammenden humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper werden nachfolgend hier als „h796H-Nr.1", „M1-Nr.1", „M2-Nr.1" bzw. „M3-Nr.1" bezeichnet. Zur Überprüfung des Molekulargewichts wurden jeweils 4 μg jedes der aufgereinigten humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper und des chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörpers KM966 nach der konventionellen Methode elektrophoretisch getrennt [Laemmli: Nature, 227, 680 (1979)]. Die Ergebnisse sind in 55 gezeigt. Wie in 55 gezeigt, betrug unter reduzierenden Bedingungen das Molekulargewicht der H-Kette des Antikörpers etwa 50 KDa und das Molekulargewicht der L-Kette des Antikörpers ungefähr 25 KDa, wodurch bestätigt wurde, dass eine Expression der H-Kette und L-Kette mit korrektem Molekulargewicht erfolgte. Unter nicht-reduzierenden Bedingungen betrug das Molekulargewicht der humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper etwa 150 KDa, wodurch bestätigt wurde, dass der exprimierte Antikörper aus zwei H-Ketten und zwei L-Ketten aufgebaut war und eine korrekte Größe aufwies. Die N-terminate Aminosäuresequenz der H- und L-Ketten jedes der aufgereinigten humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper wurde über automatisierten Edman-Abbau unter Verwendung einer Proteinsequenziervorrichtung (Applied Biosystems model 470A) untersucht. Als Ergebnis wurde bestätigt, dass die Aminosäuresequenz mit der von der DNA-Sequenz der synthetisierten V-Region abgeleiteten Aminosäuresequenz übereinstimmte.
  • (4) CDC-Aktivität humaner Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper mit Austauschen in der L-Ketten-V-Region
  • Die CDC-Aktivität der humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper mit den in Abschnitt 4 (3) von Beispiel 4 erhaltenen Austauschen in der L-Ketten-V-Region, des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers KM8970, des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers KM8966 und des chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörpers KM966 wurden nach der in Abschnitt 8 von Beispiel 3 beschriebenen Methode gemessen. Die Ergebnisse sind in 56 gezeigt. Bei einem Vergleich der CDC-Aktivität von KM8966 mit der von h796H-Nr.1 fand man, dass der Austausch, der nur in die L-Ketten-V-Region eingeführt worden war, die CDC-Aktivität steigerte. Unter den ausgetauschten Antikörpern mit Austauschen sowohl in der L-Ketten-V-Region als auch der H-Ketten-V-Region zeigte M2-Nr.1 mit dem in Abschnitt 2 von Beispiel 4 erhaltenen Austausch der H- und L-Ketten-V-Region des humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörpers KM8970 die höchste CDC-Aktivität, die mit der von KM8970 vergleichbar oder höher war. Diese Ergebnisse zeigen, dass der ersetzte Aminosäurerest auf Position 59 der FR der in Abschnitt 3 von Beispiel 4 hergestellten L-Ketten-V-Region eine wichtige Rolle bei der Verbesserung von deren CDC-Aktivität spielt und mit dem ersetzten Aminosäurerest der H-Ketten-V-Region von KM8970 unter kooperativer Verbesserung von deren CDC-Aktivität in Wechselwirkung tritt. Auf Grund des Computermodells der V-Region des Antikörpers KM796 der Maus wurde nicht angenommen, dass der Austausch des Aminosäurerestes auf Position 59 der FR der Version Lm-28 Nr.1 an einem direkten Vorgang mit dem Antigen GM2 und bei der Wechselwirkung mit jedem CDR-Rest beteiligt sein würde. Die vorstehend genannten Ergebnisse legen jedoch nahe, dass diese für die Aufrechterhaltung der Gesamtstruktur der gesamten V-Region sehr wichtig waren. Diese Erkenntnis kann aus dem bekannten Herstellungsverfahren für einen humanisierten Antikörper nicht vorhergesagt werden, und die oben genannten Erkenntnisse werden eine wichtige Angabe für die Herstellung humaner Graft-CDR-Antikörper bereitstellen.
  • Der von dem Plasmid pKANTEX796HM2Lm-28 Nr. 1 stammende humane Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper M2-Nr.1 wurde als KM8969 bezeichnet, und die den Antikörper KM8969 herstellende Transformante KM8969 am 9. Mai 1996 unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-5527 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, hinterlegt.
  • 5. In vitro-Reaktivität der humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8969 und KM8970 mit GM2
  • Die Reaktivitäten des chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörpers KM966 und der humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8969 und KM8970 mit GM2 wurden nach der in Abschnitt 1 (5) von Beispiel 2 beschriebenen Methode gemessen. Die Ergebnisse sind in 57 gezeigt. Wie in 57 gezeigt, wiesen die humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8969 und KM8970 eine Bindlungsaktivität auf, die mit der des chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörpers KM966 vergleichbar war.
  • 6. Reaktionsspezifität der humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8969 und KM8970
  • Der chimäre Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörper KM966 und die humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8969 und KM8970 wurden über die in Abschnitt 6 von Beispiel 3 beschriebene Methode auf Reaktivität mit verschiedenen Gangliosiden untersucht. Die Ergebnisse sind in 58 gezeigt. Wie in 58 gezeigt, fand man, dass die humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8969 und KM8970 wie der chimäre Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörper KM966 mit GM2 (N-Acetyl GM2 und N-Glykolyl-GM2) spezifisch reagierten.
  • 7. Reaktivität der humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8969 und KM8970 mit Krebszellen
  • Nach der in Abschnitt 7 von Beispiel 3 beschriebenen Methode wurden der Chimäre Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörper KM966 und die humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8969 und KM8970 unter Verwendung eines mit Fluorescein-Isocyanat markierten Kaninchen-Anti-Mensch-IgG-Antikörpers (Dako) als zweitem Antikörper auf Reaktivität mit der kleinzelligen Lungenkarzinomzelllinie SBC-3 (JCRB 0818) untersucht. Die Ergebnisse sind in 59 gezeigt. Wie in 59 gezeigt, reagierten die humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8969 und KM8970 wie der chimäre Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörper KM966 stark mit der humanen kleinzelligen Lungenkarzinomzelllinie SBC-3.
  • 8. In vitro-Antitumoreffekt der humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8969 und KM8970: Antikörper-abhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC)
  • Nach der in Abschnitt 9 von Beispiel 3 beschriebenen Methode wurden der chimäre Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörper KM966 und die humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8966, KM8969 und KM8970 auf ADCC-Aktivität gegenüber der humanen kleinzelligen Lungenkarzinomzelllinie SBC-3 (JCRB 0818) untersucht. Die Ergebnisse sind in 60 gezeigt. Wie in 60 gezeigt, wiesen die humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8969 und KM8970 eine mit der des chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörpers KM966 vergleichbare ADCC-Aktivität auf.
  • 9. Vergleich der in vitro-Antitumoraktivitäten humanisierter Anti-GM2-Antikörper: Vergleich der CDC-Aktivität
  • Die in den vorstehend genannten erfindungsgemäßen Beispielen 3 und 4 ermittelten CDC-Aktivitäten verschiedener humanisierter Anti-GM2-Antikörper (KM966, KM8966, KM8969 und KM8970) wurden unter Verlängerung der Reaktionszeit verglichen. Beispielhaft wurde die Reaktionszeit der unter Punkt 8 des erfindungsgemäßen Beispiels 3 beschriebenen Methode nach Zugabe des menschlichen Komplements auf 4 Stunden eingestellt. Die Ergebnisse sind in 61 gezeigt. Wie in 61 gezeigt, wurde ersichtlich, dass die CDC-Aktivität jedes dieser humanisierten Antikörper durch die vierstündige Reaktion gesteigert wird und der chimäre Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörper KM966 und die humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper KM8966, KM8969 und KM8970 bei einer Antikörperkonzentration von 5 μg/ml oder höher fast den selben Grad an CDC-Aktivität aufweisen. Insbesondere zeigte KM8969 die höchste CDC-Aktivität, die ungefähr 1/2 der des chimären Maus-Mensch-Anti-GM2-Antikörpers KM966 betrug, so dass gezeigt wurde, dass durch die Untersuchung nach dem erfindungsgemäßen Beispiel 4 ein humaner Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper mit weiterer hoher CDC-Aktivität herstellbar sein würde.
  • Das Herstellungsverfahren für humane Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper und die Beurteilung von deren verschiedenen Aktivitäten wurden somit beschrieben, und die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass die bereitgestellten humanen Graft-CDR-Anti-GM2-Antikörper für die Behandlung von Humankrebs brauchbar sind.
  • Durch die vorliegende Erfindung werden humane Graft-CDR-Antikörper gegen Gangliosid GM2, deren Bindungsaktivität und Bindungsspezifität für GM2 und deren Antitumoreffekt auf für Gangliosid GM2 positive Zellen größenordnungsmäßig mit denen chimärer humaner Antikörper vergleichbar sind und Herstellungsverfahren für solche Antikörper bereitgestellt. SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (23)

  1. Humaner Graft-CDR-Antikörper, der mit Gangliosid GM2 spezifisch reagiert, wobei der Antikörper umfasst: CDR1, CDR2 und CDR3 aus der variablen Region (V-Region) einer schweren Kette (H-Kette), welche die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 und SEQ ID NO:3 umfassen; und CDR1, CDR2 und CDR3 aus der V-Region einer leichten Kette (L-Kette), welche die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 und SEQ ID NO:6 umfassen; und Gerüstregionen (FR) aus Kabats humaner Untergruppe (HSG), welche eine Aminosäuresequenz umfassen, in der wenigstens eine Aminosäure an den Positionen 38, 40, 67, 72, 84 und 98 in der FR aus der H-Ketten-V-Region und an den Positionen 4, 11, 15, 35, 42, 46, 59, 69, 70, 71, 72, 76, 77 und 103 der FR aus der L-Ketten-V-Region durch eine andere Aminosäure ersetzt ist.
  2. Humaner Graft-CDR-Antikörper nach Anspruch 1, wobei die H-Ketten-C-Region des Antikörpers von einem zur humanen Antikörper-IgG-Klasse gehörenden Antikörper stammt.
  3. Humaner Graft-CDR-Antikörper nach Anspruch 2, wobei die H-Ketten-C-Region des Antikörpers eine Cγ1-Region und die L-Ketten-C-Region eine Cκ-Region ist.
  4. Humaner Graft-CDR-Antikörper nach Anspruch 3, wobei der Antikörper die H-Ketten-V-Region des Antikörpers mit einer Aminosäuresequenz SEQ ID NO:7 und die L-Ketten-V-Region des Antikörpers mit einer Aminosäuresequenz SEQ ID NO:8 umfasst.
  5. Humaner Graft-CDR-Antikörper nach Anspruch 3, wobei der Antikörper die H-Ketten-V-Region des Antikörpers mit einer Aminosäuresequenz SEQ ID NO:7 und die L-Ketten-V-Region des Antikörpers mit einer Aminosäuresequenz SEQ ID NO:9 umfasst.
  6. Humaner Graft-CDR-Antikörper nach Anspruch 3, wobei der Antikörper die H-Ketten-V-Region des Antikörpers mit einer Aminosäuresequenz SEQ ID NO:10 und die L-Ketten-V-Region des Antikörpers mit einer Aminosäuresequenz SEQ ID NO:8 umfasst.
  7. Humaner Graft-CDR-Antikörper nach Anspruch 3, wobei der Antikörper die H-Ketten-V-Region des Antikörpers mit einer Aminosäuresequenz SEQ ID NO:10 und die L-Ketten-V-Region des Antikörpers mit einer Aminosäuresequenz SEQ ID NO:11 umfasst.
  8. Humaner Graft-CDR-Antikörper nach Anspruch 1 oder 2, nämlich KM8966, der durch die hinterlegte Transformantenzelllinie mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-5105 erhältlich ist und die H-Ketten-V-Region des Antikörpers mit einer Aminosäuresequenz SEQ ID NO:7 und die L-Ketten-V-Region des Antikörpers mit einer Aminosäuresequenz SEQ ID NO:8 umfasst.
  9. Humaner Graft-CDR-Antikörper nach Anspruche 1 oder 2, nämlich KM8967, der durch die hinterlegte Transformantenzelllinie mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-5106 erhältlich ist und die H-Ketten-V-Region des Antikörpers mit einer Aminosäuresequenz SEQ ID NO:7 und die L-Ketten-V-Region des Antikörpers mit einer Aminosäuresequenz SEQ ID NO:9 umfasst.
  10. Humaner Graft-CDR-Antikörper nach Anspruch 1 oder 2, nämlich KM8970, der durch die hinterlegte Transformantenzelllinie mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-5528 erhältlich ist und die H-Ketten-V-Region des Antikörpers mit einer Aminosäuresequenz SEQ ID NO:10 und die L-Ketten-V-Region des Antikörpers mit einer Aminosäuresequenz SEQ ID NO:8 umfasst.
  11. Humaner Graft-CDR-Antikörper nach Anspruch 1 oder 2, nämlich KM8969, der durch die hinterlegte Transformantenzelllinie mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-5527 erhältlich ist und die H-Ketten-V-Region des Antikörpers mit einer Aminosäuresequenz SEQ ID NO:10 und die L-Ketten-V-Region des Antikörpers mit einer Aminosäuresequenz SEQ ID NO:11 umfasst.
  12. DNA-Fragment, das eine Aminosäuresequenz der H-Ketten-V-Region und L-Ketten-V-Region des Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 11 kodiert.
  13. Rekombinanter Vektor, der das DNA-Fragment nach Anspruch 12 umfasst.
  14. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 13, der von einem Tandemkassettenvektor für die Expression eines humanen chimären Antikörpers und eines humanen Graft-CDR-Antikörpers stammt.
  15. Transformante, die den rekombinanten Vektor nach Anspruch 13 oder 14 umfasst.
  16. Transformantenzelllinie KM8966 mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-5105, die den Antikörper KM8966 nach Anspruch 8 produziert.
  17. Transformantenzelllinie KM8967 mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-5106, die den Antikörper KM8967 nach Anspruch 9 produziert.
  18. Transformantenzelllinie KM8970 mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-5528, die den Antikörper KM8970 nach Anspruch 10 produziert.
  19. Transformantenzelllinie KM8969 mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-5527, die den Antikörper KM8969 nach Anspruch 11 produziert.
  20. Verfahren zur Herstellung der Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Transformante nach einem der Ansprüche 16 bis 20 verwendet wird.
  21. Antitumormittel, das den Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 11 als aktiven Inhaltsstoff umfasst.
  22. Mittel für die Krebsdiagnose, das den Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 11 als aktiven Inhaltsstoff umfasst.
  23. Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Humankrebs.
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