JPH10257893A - ガングリオシドｇｍ２に対するヒト型相補性決定領域（ｃｄｒ）移植抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒト型キメラ抗体と同程度のGM2に対する結
合活性、結合特異性およびGM2陽性細胞に対する抗腫瘍
効果を有するIgGクラスのGM2に対するヒト型CDR移植抗
体の製造方法、さらには、すべての抗体に適応可能なヒ
ト型CDR移植抗体の製造方法の確立が望まれている。 【解決手段】 ヒト型CDR移植抗体のH鎖およびL鎖V領域
のフレームワークのうち、少なくともどちらか一方がヒ
ト抗体の各サブグループに由来する共通配列HMHCSから
選択されたアミノ酸配列を含み、H鎖およびL鎖V領域のF
Rにおいて、１個以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換
されたアミノ酸配列を有する、抗GM2ヒト型CDR移植抗体
およびその製造方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ガングリオシドGM
2（以下GM2と表記する）に対するヒト型相補性決定領域
（Complementarity Determining Region、以下CDRと表
記する）移植抗体に関する。本発明はさらに、上記の抗
体、特にその可変領域（以下V領域と表記する）をコー
ドするDNAに関する。本発明は、該DNAを含んでなる発現
ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された
宿主に関する。本発明はさらに、GM2に対するヒト型CDR
移植抗体の製造方法、およびその治療および診断上の用
途に関する。

【０００２】

【従来の技術】一般にマウス抗体をヒトに投与した場
合、ヒト体内において、マウス抗体は異物として認識さ
れるため、マウス抗体に対するヒト抗体（Human Anti M
ouse Antibody、以下HAMAと表記する）が惹起され、そ
れらは投与されたマウス抗体と反応し、副作用を引き起
こすこと（Dillman, R. O.らのJ. Clin. Oncol., 2, 88
1,1984；Meeker, T. C. らのBlood, 65, 1349, 1985；L
oBuglio, A. F. らのJ. Natl. Cancer Inst., 80, 932,
1988；Houghton, A. N. らのProc. Natl. Acad.Sci.
U.S.A, 82, 1242, 1985）、また、投与されたマウス抗
体がはやくクリアランスされ（Pimm, M. V. らのJ. Nuc
l. Med., 26, 1011, 1985；Meeker, T. C.らのBlood, 6
5, 1349, 1985；Khazaeli, M. B. らのJ. Natl. Cancer
Inst., 80, 937, 1988）、抗体の効果を減じてしまう
ことなどが知られている（Shawler,D. L.らのJ. Immuno
l., 135, 1530, 1985；Courtenay−Luck, N. S. らのCa
ncerRes., 46, 6489, 1986）。

【０００３】これらの問題を解決するため、遺伝子組換
え技術を利用してマウス抗体をヒト型キメラ抗体あるい
はヒト型CDR移植抗体のようなヒト化抗体にすることが
試みられている。ヒト型キメラ抗体とは、抗体V領域が
ヒト以外の動物の抗体由来で定常領域（以下C領域と表
記する）がヒト抗体由来である抗体であり（Morrison,
S. L. らのProc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 81, 6851,
1984）、ヒトに投与した場合、HAMAはほとんど惹起され
ず、血中半減期が6倍伸びることが報告されている（LoB
uglio, A. F. らのProc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 86,
4220, 1989）。ヒト型CDR移植抗体とは、ヒト抗体のCD
Rをヒト以外の動物の抗体由来のCDRと置換した抗体のこ
とであり（Jones, P. T.らのNature, 321, 522, 198
6）、再形成ヒト抗体(reshaped human antibody)ともい
われている。ヒト型CDR移植抗体は、サルを用いた実験
でマウス抗体に比べ免疫原性が低下し、血中半減期が4
〜5倍伸びることが報告されている（Hakimi, J.らのJ.
Immunol., 147, 1352, 1991）。

【０００４】また、抗体の細胞障害活性に関しても、マ
ウス抗体Fc領域よりも、ヒト抗体Fc領域の方がヒト補体
やヒトエフェクター細胞を活性化することが報告されて
いる。例えば、GD2に対するマウス抗体は、ヒト抗体Fc
領域を有するヒト型キメラ抗体に変換することにより、
ヒトエフェクター細胞を介した抗腫瘍効果が上昇するこ
とが報告されており（Mueller, B. M.らのJ. Immunol.,
144, 1382, 1990）、また、CAMPATH-1 抗原に対するヒ
ト型CDR移植抗体についても同様の結果が報告されてい
る（Reichmann, L. らのNature, 332, 323, 1988）。
これらの結果は、ヒトの臨床に使用する抗体としては、
ヒト化抗体の方がマウス抗体より望ましいことを示して
いる。

【０００５】シアル酸を有する糖脂質の一種であるガン
グリオシドは動物の細胞膜を構成しており、親水性側鎖
である糖鎖と、疎水性側鎖であるスフィンゴシンおよび
脂肪酸とから構成される分子である。ガングリオシドの
種類と発現量は、細胞種、臓器種、動物種等によって異
なることが知られている。さらに細胞が癌化する過程に
おいては、ガングリオシドの発現が量的および質的に変
化を起こすことも知られている（Hakomori, S.らのCanc
er Res., 45, 2405, 1985）。例えば、悪性度が高いと
いわれている神経外胚葉系腫瘍である神経芽細胞腫、肺
小細胞癌およびメラノーマでは、正常細胞にはほとんど
認められないガングリオシドGD2、GD3、GM2 等が発現し
ていることが報告されており（Pukel, C. S.らのJ. Ex
p. Med.,155, 1133, 1982；、Nudelman, E.らのJ. Bio
l. Chem., 257, 12752, 1982；Werkmeister, J. A.らの
Cancer Res., 47, 225, 1987；Mujoo, K. らのCancer R
es., 47, 1098, 1987；Cheung, N. V. らのCancer Re
s., 45, 2642, 1985；Tai, T.らのProc. Natl. Acad. S
ci. U.S.A, 80, 5392, 1983）、これらガングリオシド
に対する抗体はヒトの様々な癌の診断および治療に有用
であると考えられている。

【０００６】GM2 に対するヒト抗体は、ヒトメラノーマ
の治療に有用であることが示されている（Irie, R. F.
らのLancet, I, 786, 1989）。しかし、現在までに報告
されたGM2に対する抗体は、ヒト以外の動物由来か、ヒ
ト抗体ではIgMクラスの抗体のみである（Natoli, E. J.
らのCancer Res., 46, 4116, 1986；Miyake, M.らのCa
ncer Res., 48, 6154, 1988；Cahan, L. D.らのProc. N
atl. Acad. Sci. U.S.A, 79, 7629, 1982；Fredman, P.
らのJ. Biol. Chem., 264, 12122, 1989）。IgMクラス
の抗体は、分子量約15万であるIgGクラスの抗体と比較
して、分子量が大きく（約90万）５量体構造を有してお
り、精製が難しい等の問題に加えて、血中半減期が短
い、抗腫瘍効果が弱い（Bernstein, I. D.ら、Monoclon
al Antibodies, Plenum Press, p.275, 1980）等の問題
があり、ヒトへの応用には不適である。

【０００７】以上のことから、ヒトへの応用にあたり、
体内でHAMAが惹起されず、副作用が減少し、血中半減期
が延長し、さらには抗腫瘍効果が増大し、ヒト癌に対す
る高い診断および治療効果が期待される、IgGクラスのG
M2に対するヒト化抗体が望まれる。本発明者らは、特開
平06-205694 においてヒト癌の診断および治療に有用
な、GM2に特異的に反応するIgGクラスのヒト型キメラ抗
体およびヒト型CDR移植抗体の製造方法を開示してい
る。しかし、ヒト型キメラ抗体と同程度のGM2に対する
結合活性、結合特異性およびGM2陽性細胞に対する抗腫
瘍効果を有するヒト型CDR移植抗体はこれまでのところ
得られていない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】前述したように、ヒト
型CDR移植抗体はヒト癌等の診断および治療に有用であ
ると考えられる。しかし、ヒト抗体の重鎖（以下、H鎖
と表記する）V領域および軽鎖（以下、L鎖と表記する）
V領域のCDRのみをヒト以外の動物抗体のH鎖可変領域お
よびL鎖可変領域のCDRに置換しただけでは、抗体活性が
低下するため、ヒト型キメラ抗体と同程度のGM2に対す
る結合活性、結合特異性およびGM2陽性細胞に対する抗
腫瘍効果を有するIgGクラスのGM2に対するヒト型CDR移
植抗体（以下抗GM2ヒト型CDR移植抗体と表記する）の製
造方法、さらには、すべての抗体に適応可能なヒト型CD
R移植抗体の製造方法の確立が望まれている。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、抗体のH鎖V領
域のCDR１〜３が、配列番号１〜３記載のアミノ酸配
列、抗体のL鎖V領域のCDR１〜３が、配列番号４〜６記
載のアミノ酸配列からなり、H鎖およびL鎖V領域のフレ
ームワーク（以下、FRと表記する）のうち、少なくとも
どちらか一方がヒト抗体の各サブグループに由来する共
通配列(Human Most Homologous Consensus Sequence ；
以下、HMHCSと表記する、Kabat, E. A.らのSequences o
f Proteins of Immunological Interest, US Dept. Hea
lth and Human Services, 1991）から選択されたアミノ
酸配列を含む、抗GM2ヒト型CDR移植抗体に関する。さら
に、該ヒト型CDR移植抗体のH鎖およびL鎖V領域のFRにお
いて、１個以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換された
アミノ酸配列からなり、かつ、ガングリオシドGM2に特
異的に反応するヒト以外の動物由来モノクローナル抗体
のV 領域領域を有するヒト型キメラ抗体と同程度の抗原
結合活性、結合特異性および抗体依存性細胞傷害活性
（ADCC）、さらに、補体依存性細胞傷害活性（CDC）を
有する、Ｈ鎖Ｃ領域がヒト抗体IgGクラスであるヒト型C
DR移植抗体に関する。

【００１０】

【発明の実施の形態】ヒト型CDR移植抗体は、H鎖および
L鎖V領域のCDRのみがヒト以外の動物由来の抗体のアミ
ノ酸配列からなり、H鎖およびL鎖のV領域のFRおよびC領
域がヒト抗体のアミノ酸配列からなる。ヒト以外の動物
としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、
ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかな
るものでもよい。

【００１１】H鎖およびL鎖のV領域のFRについては、既
知のヒト抗体のアミノ酸配列であればいかなるものでも
よいが、例えば、Protein Data Bankに登録されている
ヒト抗体のアミノ酸配列、HMHCS から選択されたアミノ
酸配列等があげられる。好ましくは、ヒト以外の動物由
来モノクローナル抗体のFRと高い相同性を有したHMHCS
のFRのアミノ酸配列を用いる。

【００１２】前述したように、ヒト抗体のH鎖V領域およ
びL鎖V領域のCDRをヒト以外の動物抗体のH鎖V領域およ
びL鎖V領域のCDRに置換しただけでは、抗体活性が低下
してしまう。そこで、本発明は、ヒト型CDR移植抗体のH
鎖またはL鎖V領域のFRにおいて、１個以上のアミノ酸を
他のアミノ酸で置換することにより、ガングリオシドGM
2に特異的に反応するヒト以外の動物由来モノクローナ
ル抗体のV領域を有するヒト型キメラ抗体と同程度の抗
原結合活性、結合特異性および抗体依存性細胞傷害活性
（ADCC）、さらには補体依存性細胞傷害活性（CDC）を
有するヒト型CDR移植抗体およびその方法に関する。

【００１３】本発明のヒト型CDR移植抗体のH鎖およびL
鎖V領域のFRにおいて、１個以上のアミノ酸を置換する
とは、ヒト抗体のアミノ酸配列を有しているヒト型CDR
移植抗体のH鎖およびL鎖V領域のFR中の置換したいアミ
ノ酸残基を、ガングリオシドGM2に特異的に反応するヒ
ト以外の動物由来モノクローナル抗体のH鎖およびL鎖V
領域のFRの相当する位置のアミノ酸残基に置換すること
である。H鎖およびL鎖V領域のFRの置換アミノ酸残基の
位置としては、具体的には、H鎖V領域のFR中、38位、40
位、67位、72位、84位、98位、L鎖V領域のFR中、4位、1
1位、15位、35位、42位、46位、59位、69位、70位、71
位、72位、76位、77位、103位などがあげられる。

【００１４】ガングリオシドGM2に特異的に反応するヒ
ト以外の動物由来モノクローナル抗体の一例としては、
抗GM2マウスモノクローナル抗体KM796(FERM BP-3340、
特開平4-311385)があげられる。ガングリオシドGM2に特
異的に反応するヒト以外の動物由来モノクローナル抗体
のV領域を有するヒト型キメラ抗体の一例としては、抗G
M2キメラ抗体KM966(FERM BP-3931、特開平6-205694)が
あげられる。

【００１５】ガングリオシドGM2に特異的に反応するヒ
ト以外の動物由来モノクローナル抗体のV領域を有する
ヒト型キメラ抗体と同程度の抗原結合活性、結合特異性
および抗体依存性細胞傷害活性（ADCC）を有する抗体の
一例としては、形質転換株KM8966（FERM BP-5105）の生
産するKM8966、形質転換株KM8967（FERM BP-5106）の生
産するKM8967および形質転換株KM8970（FERM BP-5528）
の生産するKM8970があげられる。

【００１６】ガングリオシドGM2に特異的に反応するヒ
ト以外の動物由来モノクローナル抗体のV領域を有する
ヒト型キメラ抗体と同程度の抗原結合活性、結合特異
性、抗体依存性細胞傷害活性（ADCC）および補体依存性
細胞傷害活性（CDC）を有する抗体の例としては、形質
転換株KM8969（FERM BP-5527）の生産するKM8969があげ
られる。

【００１７】以下に、抗GM2ヒト型CDR移植抗体の製造法
を示す。 1.ヒト化抗体発現用ベクターの構築 ヒト化抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体のH鎖およびL
鎖のC領域をコードするcDNAが組み込まれた動物細胞用
発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗
体のH鎖およびL鎖のC領域をコードするcDNAをそれぞれ
挿入する、あるいは単一の動物細胞用発現ベクターにヒ
ト抗体のH鎖およびL鎖のC領域をコードするcDNAを挿入
することにより（このようなベクターをタンデムカセッ
トベクターと称す）、構築することができる。ヒト抗体
のC領域は任意のヒト抗体H鎖およびL鎖C領域であること
ができ、例えば、ヒト抗体H鎖のγ1型C領域（以下、Cγ
1と表記する）やCγ4型C領域（以下、Cγ4と表記する）
あるいはヒト抗体L鎖のκ型C領域（以下、Cκと表記す
る）等があげられる。動物細胞用発現ベクターとして
は、ヒト抗体C領域をコードするcDNAを組込み発現でき
るものであればいかなるものでも用いることができる。
例えば、pAGE107 （Miyaji, H.らのCytotechnology, 3,
133, 1990）、pAGE103 （Mizukami, T.らのJ. Bioche
m., 101, 1307,1987）、pHSG274 （Brady, G. らのGen
e, 27, 223, 1984）、pKCR（O'Hare, K.らのProc. Nat
l. Acad. Sci. U.S.A., 78, 1527, 1981）、pSG1βd2-4
（Miyaji, H.らのCytotechnology, 4, 173, 1990）等
があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモ
ーターとエンハンサーとしては、SV40の初期プロモータ
ーとエンハンサー（Mizukami, T.らのJ. Biochem., 10
1, 1307, 1987）、モロニーマウス白血病ウイルスのLTR
プロモーターとエンハンサー（Kuwana, Y.らのBiochem.
Biophys. Res. Comun., 149, 960, 1987）、免疫グロ
ブリンＨ鎖のプロモーター（Mason, J. O.らのCell, 4
1, 479, 1985）とエンハンサー（Gillies, S. D.らのCe
ll, 33, 717, 1983）等があげられる。構築したヒト化
抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体およびヒト型
CDR移植抗体の動物細胞での発現に使用できる。

【００１８】2.ヒト以外の動物抗体のV領域をコードす
るcDNAの取得 GM2に対するヒト以外の動物抗体のH鎖V領域およびL鎖V
領域をコードするcDNAは以下のようにして取得する。抗
GM2モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞m
RNAを抽出し、cDNAを合成する。合成したcDNAより、ベ
クターとしてファージあるいはプラスミドを用いてライ
ブラリーを作製する。該ライブラリーより、マウス抗体
の各鎖のC領域部分のcDNAあるいはV領域部分のcDNAをプ
ローブとして用い、H鎖V領域をコードするcDNAを有する
組換えファージあるいは組換えプラスミドおよびL鎖V領
域をコードするcDNAを有する組換えファージあるいは組
換えプラスミドを単離し、組換えファージあるいは組換
えプラスミド上の目的とする抗体のH鎖V領域およびL鎖V
領域の全塩基配列を決定する。塩基配列からH鎖V領域お
よびL鎖V領域の全アミノ酸配列を推定する。

【００１９】抗GM2モノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマ細胞の一例としてはKM796（FERM BP-3340 、
特開平4-311385 ）が挙げられる。ハイブリドーマ細胞K
M796から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン
酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［Methods
in Enzymol.,154,3(1987) ］、また全ＲＮＡからポリ
（Ａ）⁺ ＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄ
Ｔ）固定化セルロースカラム法［モレキュラー・クロー
ニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（第２版）］な
どがあげられる。また、ハイブリドーマ細胞KM796からm
RNAを調製するキットとしては、ファースト・トラック
・mRNA・アイソレーション・キット（Fast Track mRNA
Isolation Kit;インビトロジェン社製）、クイック・プ
レップ・mRNA・ピュリフィケーション・キット（Quick
Prep mRNA Purification Kit；ファルマシア社製）など
があげられる。

【００２０】ｃＤＮＡの合成およびｃＤＮＡライブラリ
ー作製法としては、モレキュラー・クローニング：ア・
ラボラトリー・マニュアル（第２版）やカレント・プロ
トコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、サプ
ルメント１〜３４等に記載された方法、あるいは市販の
キット、例えばスーパースクリプト・プラスミド・シス
テム・フォー・cDNA・シンセシス・アンド・プラスミド
・クローニング（Super Script^TM Plasmid System for
cDNA Synthesis and Plasmid Cloning、ライフテクノロ
ジーズ社製）やザップ-cDNA ・シンセシス・キット［ZA
P-cDNA Synthesis Kit、ストラタジーン社製］を用いる
方法などがあげられる。ｃＤＮＡライブラリーの作製の
際、ハイブリドーマ細胞KM796から抽出したｍＲＮＡを
鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該
ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるもので
も用いることができる。例えば、ZAP Express〔ストラ
テジーズ(Strategies) 5, 58 (1992)〕、pBluescript I
I SK(+)〔ヌクレイック・アシッド・リサーチ(Nucleic
Acids Research) 17, 9494 (1989)〕、λzap II（スト
ラタジーン社製）、λgt10、λgt11〔DNA クローニン
グ、ア・プラクティカル・アプローチ(DNA Cloning,A P
ractical Approach), Vol.1,49 (1985)〕、Lambda Blue
Mid（クローンテック社製）、λExCell、pT7T3 18U
（ファルマシア社製）、pcD2〔モレキュラー・アンド・
セルラー・バイオロジー(Mol. Cell. Biol.),3, 280 (1
983)〕およびpUC18 〔ジーン(Gene)，33，103 (1985)〕
等が用いられる。

【００２１】ベクターにより構築されるｃＤＮＡライブ
ラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリ
ーを導入、発現および維持できるものであればいかなる
ものでも用いることができる。たとえばXL1-Blue MRF'
〔ストラテジーズ(Strategies), 5, 81 (1992)〕、C600
〔ジェネティックス(Genetics), 39, 440 (1954)〕、Y1
088 、Y1090 〔サイエンス(Science), 222, 778 (198
3)〕、NM522 〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ
オロジー(J. Mol. Biol.), 166, 1 (1983)〕、K802〔ジ
ャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J. Mol.
Biol.), 16, 118(1966)〕およびJM105 〔ジーン(Gen
e)，38, 275(1985) 〕等が用いられる。ｃＤＮＡライブ
ラリーより、ヒト以外の抗体のＨ鎖およびＬ鎖のＶ領域
をコードするｃＤＮＡクローンの選択は、アイソトープ
あるいは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイ
ブリダイゼーション法あるいはプラーク・ハイブリダイ
ゼーション法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボ
ラトリー・マニュアル 第２版］により行うことができ
る。また、プライマーを調製し、ポリ(A) ⁺ RNA あるい
はｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライ
ブラリーを鋳型として、ポリメラーゼ・チェイン・リア
クション（Polymerase chain reaction;以下、ＰＣＲと
表記する）法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボ
ラトリー・マニュアル（第２版）、カレント・プロトコ
ールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、サプルメ
ント１〜３４] によりＨ鎖およびＬ鎖のＶ領域をコード
するＤＮＡを調製することもできる。

【００２２】上記方法により選択されたｃＤＮＡクロー
ンを、適当な制限酵素などで切断後、pBluescript SK
(-) （ストラタジーン社製）等のプラスミドにクローニ
ングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばSang
erらのジデオキシ法［Proc. Natl. Acad. Sci.,U.S.A.,
74, 5463(1977) ］等によって分析することにより、該
ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。塩基配列の
分析は、塩基配列自動分析装置、例えば３７３Ａ・ＤＮ
Ａシークエンサー（アプライド・バイオシステムズ社
製）等を用いて行うことができる。

【００２３】3.ヒト以外の動物抗体のCDRの同定 抗体のH鎖およびL鎖の各V領域は抗原結合部位を形成す
る。H鎖およびL鎖の各V領域は配列の比較的保存された4
個のFRとそれらを連結する配列の変化に富んだ3個のCDR
からなっている（Kabat, E. A.らのSequences of Prote
ins of Immunological Interest, US Dept. Health and
Human Services, 1991）。そして各CDRは、既知の抗体
のV領域のアミノ酸配列（Kabat, E. A.らのSequences o
f Proteins of Immunological Interest, US Dept. Hea
lth and Human Services, 1991）と比較することによっ
て見出すことができる。

【００２４】4.ヒト型CDR移植抗体のV領域をコードする
DNA配列の構築 抗GM2ヒト型CDR移植抗体のH鎖V領域およびL鎖V領域をコ
ードするDNA配列は以下のようにして取得する。まず、G
M2に対するヒト以外の動物抗体のV領域のCDRを移植する
ためのヒト抗体のV領域のアミノ酸配列をH鎖、L鎖各々
について選択する。ヒト抗体V領域のアミノ酸配列とし
ては、既知のヒト抗体由来のV領域のアミノ酸配列であ
ればいかなるものでも用いることができる。例えば、Pr
otein Data Bankに登録されているヒト抗体のV領域のア
ミノ酸配列、HMHCS から選択されたアミノ酸配列等があ
げられるが、GM2に対する結合活性、結合特異性、ある
いはGM2陽性細胞に対する抗腫瘍効果など目的の活性を
有するヒト型CDR移植抗体を創製するためには、創製の
もととなるヒト以外の動物由来のモノクローナル抗体の
V領域のアミノ酸配列と高い相同性を有することが望ま
しい。続いて、選択したヒト抗体のV領域のアミノ酸配
列のうちFRをコードするDNA配列と創製のもととなるヒ
ト以外の動物由来のモノクローナル抗体のV領域のCDRの
アミノ酸配列をコードするDNA配列を連結させ、H鎖、L
鎖各々のV領域のアミノ酸配列をコードするDNA配列をデ
ザインする。デザインしたDNA配列をカバーするように
各鎖について6本の合成DNAを設計し、それらを用いてPC
Rを行う。あるいは、デザインしたDNA配列をカバーする
ように35〜84塩基からなるアンチセンスおよびセンスDN
A配列を各々6〜7本合成し、それらをアニーリングし、2
本鎖DNAとした後に、連結反応を行う。増幅反応産物あ
るいは連結反応産物を適当なベクターにサブクローニン
グ後、その塩基配列を決定し、目的のヒト型CDR移植抗
体の各鎖のV領域のアミノ酸配列をコードするDNA配列を
含むプラスミドを取得する。

【００２５】5.ヒト型CDR移植抗体のV領域のアミノ酸配
列の改変 ヒト型CDR移植抗体のV領域のアミノ酸配列の改変はPCR
を用いた変異導入法により行う。具体的には、改変後の
アミノ酸残基をコードするDNA配列を含む20〜40塩基か
らなるセンス変異プライマーおよびアンチセンス変異プ
ライマーを合成し、改変すべきV領域のアミノ酸配列を
コードするDNA配列を含むプラスミドを鋳型としてPCRを
行う。増幅断片を適当なベクターにサブクローニング
後、その塩基配列を決定し、目的の変異が導入されたDN
A配列を含むプラスミドを取得する。

【００２６】6.ヒト型CDR移植抗体発現ベクターの構築 前記1のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のH鎖およ
びL鎖のC領域のcDNAの上流に、前記4および5で取得した
ヒト型CDR移植抗体のH鎖およびL鎖のV領域をコードする
DNA配列を挿入し、ヒト型CDR移植抗体発現ベクターを構
築することができる。例えば、ヒト型CDR移植抗体のH鎖
およびL鎖のV領域のアミノ酸配列をコードするDNA配列
を構築するためのPCRの際に5’−および3’−末端の合
成DNAの末端に適当な制限酵素の認識配列を導入するこ
とで、所望のヒト抗体C領域のcDNAの上流にそれらが適
切な形で発現するように挿入する。

【００２７】7.ヒト型CDR移植抗体の発現、活性評価 前記6のヒト型CDR移植抗体発現ベクターを適当な宿主細
胞に導入することによりヒト型CDR移植抗体を生産する
形質転換株を得ることができる。

【００２８】宿主細胞への発現ベクターの導入法として
は、エレクトロポレーション法〔特開平02-257891 、Mi
yaji, H.らのCytotechnology, 3,133, 1990）等があげ
られる。ヒト型CDR移植抗体発現ベクターを導入する宿
主細胞としては、ヒト型CDR移植抗体を発現させること
ができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いるこ
とができる。例えば、マウスSP2/0-Ag14 細胞（ATCC CR
L1581、以下SP2/0細胞と表記する）、マウスP3X63-Ag8.
653 細胞（ATCC CRL1580）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝
子（以下DHFR遺伝子と表記する）が欠損したCHO細胞（U
rlaub, G.らのProc.Natl. Acad. Sci. U.S.A, 77, 421
6, 1980）、ラットYB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞（ATCC
CRL1662、以下YB2/0細胞と表記する）等があげられる。

【００２９】ベクターの導入後、ヒト型CDR移植抗体を
生産する形質転換株は、特開平02-257891 に開示されて
いる方法に従い、Geneticin（ギブコ社製、以下G418と
表記する）および牛胎児血清（Fetal Calf Serum、以下
FCSと表記する）を含むRPMI1640培地により選択する。
得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清
中にヒト型CDR移植抗体を生産蓄積させることができ
る。培養上清中のヒト型CDR移植抗体の活性は酵素免疫
測定法（以下ELISA法と表記する、Harlow, E.らのAntib
odies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab
oratory, Chapter 14,1988）等により測定する。また、
形質転換株は、特開平02-257891 に開示されている方法
に従い、DHFR遺伝子増幅系等を利用してヒト型CDR移植
抗体の生産量を上昇させることができる。

【００３０】ヒト型CDR移植抗体は、上記培養上清より
プロテインAカラムを用いて精製することができる（Har
low, E.らのAntibodies, A Laboratory Manual, Cold S
pringHarbor Laboratory, Chapter 8, 1988）。また、
その他に、通常の蛋白質で用いられる精製方法を使用す
ることができる。例えば、ゲル濾過およびイオン交換ク
ロマトグラフィー、限外濾過等を組合せて行い、精製す
ることができる。精製したヒト型CDR移植抗体のH鎖、L
鎖あるいは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（以下SDS-PAGE と表記する、Laemmli,
U. K.らのNature, 227, 680, 1970）やウエスタンブロ
ッティング法（Harlow, E.らのAntibodies, A Laborato
ry Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter
12, 1988）等で測定する。

【００３１】精製したヒト型CDR移植抗体の抗原との反
応性および培養癌細胞株に対する結合活性はELISA法お
よび蛍光抗体法等により各々測定する。培養癌細胞株に
対する補体依存性細胞障害（Complement Dependent Cyt
otoxicity、以下CDCと表記する）活性および抗体依存性
細胞障害（Antibody Dependent Cell Mediated Cytotox
icity、以下ADCCと表記する）活性はShitara, K. らの
方法（Cancer Immunol.Immunother., 36, 373, 1993）
により測定する。

【００３２】本発明のヒト型CDR移植抗体はヒト由来培
養癌細胞株と特異的に結合し、かつCDC活性およびADCC
活性等の細胞障害活性を示すため、ヒト癌等の診断、治
療において有用である。また、ヒト以外の動物由来のモ
ノクローナル抗体に比べ、ヒト抗体のアミノ酸配列に由
来する部分がほとんどであるため、ヒト体内で強い抗腫
瘍効果を発揮し、かつ免疫原性を示さず、その効果が長
期間にわたり持続することが期待される。

【００３３】本発明のヒト型CDR移植抗体は単独でまた
は少なくとも1種以上の製剤上許容される補助剤と共に
抗腫瘍組成物として用いることができる。例えば、ヒト
型CDR移植抗体を、生理食塩水やグルコース、ラクトー
ス、マンニトール等の水溶液に溶解して適当な医薬組成
物とする。または、ヒト型CDR移植抗体を常法に従って
凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによっ
て粉末注射剤を作成する。本医薬組成物は必要に応じ、
製剤分野で周知の添加剤、例えば、製剤上許容される塩
等を含有することができる。

【００３４】本医薬組成物の投与量は、患者の年齢、症
状等によって異なるが、ヒトを含む哺乳動物に対し、ヒ
ト型CDR移植抗体を0.2〜20mg/kg/日投与する。投与は、
1日1回（単回投与または連日投与）または間歇的に1週
間に1〜3回、2、3週間に1回静脈注射により行う。

【００３５】

【実施例】以下に、本発明の実施例を示すが、これによ
り本発明の範囲が限定されるものではない。 実施例１．タンデムカセット型のヒト化抗体発現用ベク
ター、pKANTEX93の構築 ヒト型CDR移植抗体のH鎖V領域をコードするcDNA断片お
よびヒト型CDR移植抗体のL鎖V領域をコードするcDNA断
片を、それぞれヒト抗体Cγ1 cDNAおよびヒト抗体Cκ c
DNAの上流に挿入し、ヒト型CDR移植抗体を動物細胞中で
発現させるためのタンデムカセット型のヒト化抗体発現
用ベクター、pKANTEX93を特開平2-257891に記載のプラ
スミドpSE1UK1SEd1-3 を基にして以下のようにして構築
した。構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キ
メラ抗体の動物細胞での発現にも使用できる。

【００３６】1.ラビットβ−グロビン遺伝子スプライシ
ング、ポリAシグナルに存在する制限酵素ApaIおよびEco
RI部位の改変 ヒト化抗体発現用ベクターにヒト化抗体のV領域を制限
酵素NotI−ApaI断片（H鎖）およびEcoRI−SplI断片（L
鎖）でカセット式に挿入してヒト化抗体発現ベクターを
構築可能とするために、プラスミドpSE1UK1SEd1-3のラ
ビットβ−グロビン遺伝子スプライシング、ポリAシグ
ナルに存在する制限酵素ApaIおよびEcoRI部位の改変を
以下のようにして行なった。

【００３７】プラスミドpBluescript SK(−)（ストラタ
ジーン社製）の3μgを10μlの10mMトリス−塩酸（pH7.
5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mMジチオスレイトー
ル（以下DTTと表記する）からなる緩衝液に加え、更に1
0単位の制限酵素ApaI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時
間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、DNA Blun
ting Kit（宝酒造社製）を用い、ApaI消化によって生じ
た3’突出末端を平滑末端に変えた後、DNA Ligation Ki
t（宝酒造社製）を用いて連結した。このようにして得
られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株
を形質転換し、図1に示したプラスミドpBSAを得た。

【００３８】さらに得られたプラスミドpBSAの3μgを10
μlの50mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウ
ム、100mM塩化ナトリウムおよび1mM DTT からなる緩衝
液に加え、更に10単位の制限酵素EcoRI（宝酒造社製）
を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノー
ル沈殿し、DNA Blunting Kit（宝酒造社製）を用い、Ec
oRI消化によって生じた5’突出末端を平滑末端に変えた
後、DNA Ligation Kit（宝酒造社製）を用いて連結し
た。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液
を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、図2に示したプラ
スミドpBSAEを得た。

【００３９】次に、上記で得られたプラスミドpBSAEの3
μgを10μlの10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マ
グネシウム、50mM塩化ナトリウムおよび1mM DTTからな
る緩衝液に加え、更に10単位の制限酵素HindIII（宝酒
造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液を
エタノール沈殿し、20μlの10mMトリス−塩酸（pH7.
5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT からなる緩
衝液に溶解し、10μlずつに分け、一つには更に10単位
の制限酵素SacII（東洋紡績社製）を加え、もう一つに
は更に10単位の制限酵素KpnI（宝酒造社製）を加えて各
々37℃で1時間反応させた。両反応液をアガロースゲル
電気泳動にて分画し、各々約2.96kbのHindIII−SacII断
片と約2.96kbのKpnI−HindIII断片を約0.3μg回収し
た。

【００４０】次に、プラスミドpSE1UK1SEd1-3の3μgを1
0μlの10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシ
ウムおよび1mM DTT からなる緩衝液に加え、更に10単位
の制限酵素SacII（東洋紡績社製）と10単位の制限酵素K
pnI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該
反応液をエタノール沈殿し、10μlの10mMトリス−塩酸
（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、50mM塩化ナトリウ
ムおよび1mM DTT からなる緩衝液に溶解し、更に10単位
の制限酵素HindIII（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間
反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分
画し、約2.42kbのHindIII−SacII断片と約1.98kbのKpnI
−HindIII断片を各々約0.2μg回収した。

【００４１】次に、上記で得られたpSE1UK1SEd1-3のHin
dIII−SacII断片0.1μgとpBSAEのHindIII−SacII断片0.
1μgを全量20μlの滅菌水に溶解し、Ready-To-Go T4 DN
A Ligase（ファルマシア バイオテク社製）を用いて連
結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA
溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、図3に示した
プラスミドpBSH-Sを得た。また、上記で得られたpSE1UK
1SEd1-3のKpnI−HindIII断片0.1μgとpBSAEのKpnI−Hin
dIII断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に溶解し、Ready-T
o-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア バイオテク社製）
を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラ
スミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、図
4に示したプラスミドpBSK-Hを得た。

【００４２】次に、上記で得られたプラスミドpBSH-Sお
よびpBSK-Hの3μgを各々10μlの10mMトリス−塩酸（pH
7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT からなる
緩衝液に加え、更に10単位の制限酵素ApaI（宝酒造社
製）を加えて37℃で1時間反応させた。両反応液をエタ
ノール沈殿し、各々DNA Blunting Kit（宝酒造社製）を
用い、ApaI消化によって生じた3’突出末端を平滑末端
に変えた後、DNA LigationKit（宝酒造社製）を用いて
連結した。このようにして得られた各々の組換えプラス
ミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、図5
に示したプラスミドpBSH-SAおよびpBSK-HAを得た。

【００４３】次に、上記で得られたプラスミドpBSH-SA
およびpBSK-HAの5μgを各々10μlの50mMトリス−塩酸
（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、100mM塩化ナトリウ
ムおよび1mM DTT からなる緩衝液に加え、更に1単位の
制限酵素EcoRI（宝酒造社製）を加えて37℃で10分間反
応させ、部分消化した。両反応液をエタノール沈殿し、
各々DNA Blunting Kit（宝酒造社製）を用い、EcoRI消
化によって生じた5’突出末端を平滑末端に変えた後、
アガロースゲル電気泳動にて分画し、各々約5.38kbの断
片と約4.94kbの断片を約0.5μg回収した。回収した各々
の断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に溶解し、Ready-To-
Go T4 DNA Ligase（ファルマシア バイオテク社製）を
用いて連結した。このようにして得られた各々の組換え
プラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換
し、図6に示したプラスミドpBSH-SAEおよびpBSK-HAEを
得た。

【００４４】次に、上記で得られたプラスミドpBSH-SAE
およびpBSK-HAEの3μgを各々10μlの50mMトリス−塩酸
（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム、100mM塩化ナトリウ
ムおよび1mM DTT からなる緩衝液に加え、更に10単位の
制限酵素EcoRI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応
させた。両反応液をエタノール沈殿し、各々DNA Blunti
ng Kit（宝酒造社製）を用い、EcoRI消化によって生じ
た5’突出末端を平滑末端に変えた後、DNA Ligation Ki
t（宝酒造社製）を用いて連結した。このようにして得
られた各々の組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌H
B101株を形質転換し、図7に示したプラスミドpBSH-SAEE
およびpBSK-HAEEを得た。得られた各プラスミドの10μg
を用い、AutoRead Sequencing Kit（ファルマシア バ
イオテク社製）に添付の処方に従って反応後、A.L.F. D
NA Sequencer（ファルマシア バイオテク社製）により
電気泳動し、塩基配列を決定した結果、上記改変により
ApaI、EcoRI部位ともに消失したことを確認した。

【００４５】2.ラビットβ−グロビン遺伝子スプライシ
ング、ポリAシグナルおよびSV40初期遺伝子ポリAシグナ
ルの下流への制限酵素SalI部位の導入 ヒト化抗体発現用ベクターの抗体H鎖、L鎖の発現プロモ
ーターを任意のプロモーターに変換可能とするために、
プラスミドpSE1UK1SEd1-3のラビットβ−グロビン遺伝
子スプライシング、ポリAシグナルおよびSV40初期遺伝
子ポリAシグナルの下流への制限酵素SalI部位の導入を
以下のようにして行った。

【００４６】上記実施例1の1項で得られたプラスミドpB
SK-HAEEの3μgを10μlの10mMトリス−塩酸（pH7.5）、1
0mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT からなる緩衝液に
加え、更に10単位の制限酵素NaeI（宝酒造社製）を加え
て37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿
し、20μlの50mMトリス−塩酸（pH9.0）、1mM塩化マグ
ネシウムからなる緩衝液に溶解し、更に1単位のアルカ
リフォスファターゼ（E.coli C75、宝酒造社製）を加え
て37℃で1時間反応させ、5’末端を脱リン酸化した。更
に該反応液をフェノール−クロロホルム抽出後、エタノ
ール沈殿を行ない、20μlの10mMトリス−塩酸（pH8.
0）、1mMエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムからなる
緩衝液（以下TE緩衝液と表記する）に溶解した。該反応
液の1μlと0.1μgのリン酸化SalIリンカー（宝酒造社
製）を全量が20μlとなるように滅菌水に加え、Ready-T
o-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア バイオテク社製）
を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラ
スミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、図
8に示したプラスミドpBSK-HAEESal を得た。得られたプ
ラスミドの10μgを用い、AutoRead Sequencing Kit（フ
ァルマシア バイオテク社製）に添付の処方に従って反
応後、A.L.F. DNA Sequencer（ファルマシアバイオテク
社製）により電気泳動し、塩基配列を決定した結果、ラ
ビットβ−グロビン遺伝子スプライシング、ポリAシグ
ナルおよびSV40初期遺伝子ポリAシグナルの下流に一箇
所の制限酵素SalI部位が導入されたことを確認した。

【００４７】3.ヘルペスシンプレックスウイルスチミジ
ンキナーゼ（以下HSVtkと表記する）遺伝子のポリAシグ
ナルに存在する制限酵素ApaI部位の改変 プラスミドpSE1UK1SEd1-3のTn5 カナマイシンフォスホ
トランスフェラーゼ遺伝子下流のHSVtk遺伝子ポリAシグ
ナルに存在する制限酵素ApaI部位の改変を以下のように
して行った。

【００４８】上記実施例1の1項で得られたプラスミドpB
SAの3μgを10μlの10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩
化マグネシウムおよび1mM DTT からなる緩衝液に加え、
更に10単位の制限酵素SacII（東洋紡績社製）を加えて3
7℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、
10μlの50mMトリス−塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリ
ウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT からなる緩
衝液に加え、更に10単位の制限酵素XhoI（宝酒造社製）
を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロー
スゲル電気泳動にて分画し、約2.96kbのSacII−XhoI断
片を約1μg回収した。

【００４９】次に、プラスミドpSE1UK1SEd1-3の5μgを1
0μlの10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシ
ウムおよび1mM DTT からなる緩衝液に加え、更に10単位
の制限酵素SacII（東洋紡績社製）を加えて37℃で1時間
反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、10μlの50m
Mトリス−塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM
塩化マグネシウムおよび1mM DTT からなる緩衝液に加
え、更に10単位の制限酵素XhoI（宝酒造社製）を加えて
37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電
気泳動にて分画し、約4.25kbのSacII−XhoI断片を約1μ
g回収した。

【００５０】次に、上記で得られたpBSAのSacII−XhoI
断片0.1μgとpSE1UK1SEd1-3のSacII−XhoI断片を全量20
μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファ
ルマシア バイオテク社製）を用いて連結した。このよ
うにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大
腸菌HB101株を形質転換し、図9に示したプラスミドpBSX
-Sを得た。

【００５１】次に、上記で得られたプラスミドpBSX-Sの
3μgを10μlの10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マ
グネシウムおよび1mM DTT からなる緩衝液に加え、更に
10単位の制限酵素ApaI（宝酒造社製）を加えて37℃で1
時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、DNA Bl
unting Kit（宝酒造社製）を用い、ApaI消化によって生
じた3’突出末端を平滑末端に変えた後、DNA Ligation
Kit（宝酒造社製）を用いて連結した。このようにして
得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101
株を形質転換し、図10に示したプラスミドpBSX-SA を得
た。得られたプラスミドの10μgを用い、AutoRead Sequ
encing Kit（ファルマシア バイオテク社製）に添付の
処方に従って反応後、A.L.F. DNA Sequencer（ファルマ
シアバイオテク社製）により電気泳動し、塩基配列を決
定した結果、HSVtk遺伝子ポリAシグナルの制限酵素ApaI
部位が消失したことを確認した。

【００５２】4.ヒト化抗体L鎖発現ユニットの構築 モロニーマウス白血病ウイルスの末端反復配列のプロモ
ーター/エンハンサーの下流にヒト抗体CκcDNAが存在
し、かつヒト化抗体L鎖V領域をカセット式に挿入可能な
ヒト化抗体L鎖発現ユニットを有するプラスミドpMohCκ
を以下のようにして構築した。

【００５３】プラスミドpBluescript SK(−)（ストラタ
ジーン社製）の3μgを10μlの10mMトリス−塩酸（pH7.
5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT からなる緩
衝液に加え、更に10単位の制限酵素SacI（宝酒造社製）
を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノー
ル沈殿し、10μlの10mMトリス−塩酸（pH7.5）、50mM塩
化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT か
らなる緩衝液に加え、更に10単位の制限酵素ClaI（宝酒
造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液を
エタノール沈殿し、DNA Blunting Kit（宝酒造社製）を
用い、SacIおよびClaI消化によって生じた突出末端を平
滑末端に変えた後、アガロースゲル電気泳動にて分画
し、約2.96kbのDNA断片を約1μg回収した。回収したDNA
断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T
4 DNA Ligase（ファルマシア バイオテク社製）を用い
て連結した。このようにして得られた組換えプラスミド
DNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、図11に示
したプラスミドpBSSCを得た。

【００５４】次に、上記で得られたプラスミドpBSSCの3
μgを10μlの10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マ
グネシウムおよび1mM DTT からなる緩衝液に加え、更に
10単位の制限酵素KpnI（宝酒造社製）を加えて37℃で1
時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、10μl
の50mMトリス−塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、
10mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT からなる緩衝液に
溶解し、更に10単位の制限酵素XhoI（宝酒造社製）を加
えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲ
ル電気泳動にて分画し、約2.96kbのKpnI−XhoI断片を約
1μg回収した。

【００５５】次に、特開平6-205694に記載のプラスミド
pAGE147の5μgを10μlの10mMトリス−塩酸（pH7.5）、1
0mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT からなる緩衝液に
加え、更に10単位の制限酵素KpnI（宝酒造社製）を加え
て37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿
し、10μlの50mMトリス−塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナ
トリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT からな
る緩衝液に溶解し、更に10単位の制限酵素XhoI（宝酒造
社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をア
ガロースゲル電気泳動にて分画し、モロニーマウス白血
病ウイルスの末端反復配列のプロモーター/エンハンサ
ーを含む約0.66kbのKpnI−XhoI断片を約0.3μg回収し
た。

【００５６】次に、上記で得られたpBSSCのKpnI−XhoI
断片0.1μgとpAGE147のKpnI−XhoI断片0.1μgを全量20
μlの滅菌水に溶解し、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（フ
ァルマシア バイオテク社製）を用いて連結した。この
ようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて
大腸菌HB101株を形質転換し、図12に示したプラスミドp
BSMoを得た。

【００５７】次に、上記で得られたプラスミドpBSMoの3
μgを10μlの10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マ
グネシウムおよび1mM DTT からなる緩衝液に加え、更に
10単位の制限酵素KpnI（宝酒造社製）を加えて37℃で1
時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、10μl
の10mMトリス−塩酸（pH7.5）、50mM塩化ナトリウム、1
0mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT からなる緩衝液に
溶解し、更に10単位の制限酵素HindIII（宝酒造社製）
を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロー
スゲル電気泳動にて分画し、約3.62kbのKpnI−HindIII
断片を約1μg回収した。

【００５８】次に、配列番号12、13に記載の塩基配列を
有する合成DNAを自動DNA合成機（380A、アプライド バ
イオシステムズ社製）を用いて合成した。得られた合成
DNAの0.3μgずつを15μlの滅菌水に加え、65℃で5分間
加熱した。該反応液を室温にて30分間放置した後、2μl
の10倍緩衝液[500mMトリス−塩酸（pH7.6）、100mM塩化
マグネシウム、50mM DTT] と2μlの10mM ATP を加え、
更に10単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼを加えて37℃
で30分間反応させ、5’末端をリン酸化した。上記で得
られたプラスミドpBSMo由来のKpnI−HindIII断片（3.66
kb）0.1μgとリン酸化合成DNA0.05μgを全量20μlの滅
菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシ
ア バイオテク社製）を用いて連結した。このようにし
て得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB1
01株を形質転換し、図13に示したプラスミドpBSMoSを得
た。得られたプラスミドの10μgを用い、AutoRead Sequ
encing Kit（ファルマシア バイオテク社製）に添付の
処方に従って反応後、A.L.F.DNA Sequencer（ファルマ
シア バイオテク社製）により電気泳動し、塩基配列を
決定した結果、目的の合成DNAが導入されたことを確認
した。

【００５９】次に、特開平5-304989に記載のプラスミド
pChiIgLA1の3μgを10μlの50mMトリス−塩酸（pH7.
5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよ
び1mM DTT からなる緩衝液に溶解し、更に10単位ずつの
制限酵素EcoRI（宝酒造社製）およびEcoRV（宝酒造社
製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガ
ロースゲル電気泳動にて分画し、約9.70kbのEcoRI−Eco
RV断片を約1μg回収した。

【００６０】次に、配列番号14、15に記載の塩基配列を
有する合成DNAを自動DNA合成機（380A、アプライド バ
イオシステムズ社製）を用いて合成した。得られた合成
DNAの0.3μgずつを15μlの滅菌水に加え、65℃で5分間
加熱した。該反応液を室温にて30分間放置した後、2μl
の10倍緩衝液[500mMトリス−塩酸（pH7.6）、100mM塩化
マグネシウム、50mM DTT] と2μlの10mM ATPを加え、更
に10単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼを加えて37℃で
30分間反応させ、5’末端をリン酸化した。上記で得ら
れたプラスミドpChiIgLA1由来のEcoRI−EcoRV断片（9.7
0kb）0.1μgとリン酸化合成DNA0.05μgを全量20μlの滅
菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシ
ア バイオテク社製）を用いて連結した。このようにし
て得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB1
01株を形質転換し、図14に示したプラスミドpChiIgLA1S
を得た。

【００６１】次に、上記で得られたプラスミドpBSMoSの
3μgを10μlの20mMトリス−塩酸（pH8.5）、100mM塩化
カリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mM DTTからな
る緩衝液に溶解し、更に10単位の制限酵素HpaI（宝酒造
社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエ
タノール沈殿し、10μlの50mMトリス−塩酸（pH7.5）、
100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mM
DTTからなる緩衝液に溶解し、更に10単位の制限酵素Ec
oRI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該
反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約3.66kb
のHpaI−EcoRI断片を約1μg回収した。

【００６２】次に、上記で得られたプラスミドpChiIgLA
1Sの10μgを10μlの20mMトリス−酢酸（pH7.9）、50mM
酢酸カリウム、10mM酢酸マグネシウム、1mM DTT および
100μg/ml牛血清アルブミン（以下BSAと表記する）から
なる緩衝液に溶解し、更に10単位の制限酵素NlaIV（ニ
ューイングランド バイオラブズ社製）を加えて37℃で
1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、10μl
の50mMトリス−塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、
10mM塩化マグネシウムおよび1mM DTTからなる緩衝液に
溶解し、更に10単位の制限酵素EcoRI（宝酒造社製）を
加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロース
ゲル電気泳動にて分画し、約0.41kbのNlaIV−EcoRI断片
を約0.3μg回収した。

【００６３】次に、上記で得られたpBSMoSのHpaI−EcoR
I断片を0.1μgとpChiIgLA1SのNlaIV−EcoRI断片0.1μg
を全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Liga
se（ファルマシア バイオテク社製）を用いて連結し
た。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液
を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、図15に示したプ
ラスミドpMohCκを得た。

【００６４】5.ヒト化抗体H鎖発現ユニットの構築 モロニーマウス白血病ウイルスの末端反復配列のプロモ
ーター/エンハンサーの下流にヒト抗体Cγ1cDNAが存在
し、かつヒト化抗体H鎖V領域をカセット式に挿入可能な
ヒト化抗体H鎖発現ユニットを有するプラスミドpMohCγ
1を以下のようにして構築した。

【００６５】上記実施例1の4項で得られたプラスミドpB
SMoの3μgを10μlの50mMトリス−塩酸（pH7.5）、100mM
塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT
からなる緩衝液に加え、更に10単位の制限酵素XhoI（宝
酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液
をエタノール沈殿し、10μlの30mM酢酸ナトリウム（pH
5.0）、100mM塩化ナトリウム、1mM酢酸亜鉛および10%グ
リセロールからなる緩衝液に溶解し、更に10単位のマン
グビーンヌクレアーゼ（宝酒造社製）を加えて37℃で10
分間反応させた。該反応液をフェノール−クロロホルム
抽出後、エタノール沈殿を行ない、DNA Blunting Kit
（宝酒造社製）を用い、突出末端を平滑末端に変えた
後、DNA Ligation Kit（宝酒造社製）を用いて連結し
た。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液
を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、図16に示したプ
ラスミドpBSMoSalを得た。 得られたプラスミドの10μ
gを用い、AutoRead Sequencing Kit（ファルマシア バ
イオテク社製）に添付の処方に従って反応後、A.L.F. D
NA Sequencer（ファルマシア バイオテク社製）により
電気泳動し、塩基配列を決定した結果、モロニーマウス
白血病ウイルスの末端反復配列のプロモーター/エンハ
ンサーの上流の制限酵素XhoI部位が消失したことを確認
した。

【００６６】次に、上記で得られたプラスミドpBSMoSal
の3μgを10μlの10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化
マグネシウムおよび1mM DTTからなる緩衝液に加え、更
に10単位の制限酵素KpnI（宝酒造社製）を加えて37℃で
1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、10μl
の10mMトリス−塩酸（pH7.5）、50mM塩化ナトリウム、1
0mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT からなる緩衝液に
溶解し、更に10単位の制限酵素HindIII（宝酒造社製）
を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロー
スゲル電気泳動にて分画し、約3.66kbのKpnI−HindIII
断片を約1μg回収した。

【００６７】次に、配列番号16、17に記載の塩基配列を
有する合成DNAを自動DNA合成機（380A、アプライド バ
イオシステムズ社製）を用いて合成した。得られた合成
DNAの0.3μgずつを15μlの滅菌水に加え、65℃で5分間
加熱した。該反応液を室温にて30分間放置した後、2μl
の10倍緩衝液[500mMトリス−塩酸（pH7.6）、100mM塩化
マグネシウム、50mM DTT] と2μlの10mM ATPを加え、更
に10単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼを加えて37℃で
30分間反応させ、5’末端をリン酸化した。上記で得ら
れたプラスミドpBSMoSal由来のKpnI−HindIII断片（3.6
6kb）0.1μgとリン酸化合成DNA0.05μgを全量20μlの滅
菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシ
ア バイオテク社製）を用いて連結した。このようにし
て得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB1
01株を形質転換し、図17に示したプラスミドpBSMoSalS
を得た。得られたプラスミドの10μgを用い、AutoRead
Sequencing Kit（ファルマシア バイオテク社製）に添
付の処方に従って反応後、A.L.F. DNA Sequencer（ファ
ルマシア バイオテク社製）により電気泳動し、塩基配
列を決定した結果、目的の合成DNAが導入されたことを
確認した。

【００６８】次に、特開平5-304989に記載のプラスミド
pChiIgHB2の10μgを10μlの50mMトリス−塩酸（pH7.
5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよ
び1mMDTTからなる緩衝液に溶解し、更に10単位の制限酵
素Eco52I（東洋紡績社製）を加えて37℃で1時間反応さ
せた。該反応液をエタノール沈殿し、10μlの30mM酢酸
ナトリウム（pH5.0）、100mM塩化ナトリウム、1mM酢酸
亜鉛および10%グリセロールからなる緩衝液に溶解し、
更に10単位のマングビーンヌクレアーゼ（宝酒造社製）
を加えて37℃で10分間反応させた。該反応液をフェノー
ル−クロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行ない、DN
A Blunting Kit（宝酒造社製）を用い、突出末端を平滑
末端に変えた。エタノール沈殿後、10μlの10mMトリス
−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT
からなる緩衝液に溶解し、更に10単位の制限酵素ApaI
（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反
応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.99kbの
ApaI−平滑末端断片を約0.7μg回収した。

【００６９】次に、プラスミドpBluescript SK(−)（ス
トラタジーン社製）の3μgを10μlの10mMトリス−塩酸
（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT から
なる緩衝液に加え、更に10単位の制限酵素ApaI（宝酒造
社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエ
タノール沈殿し、10μlの33mMトリス−酢酸（pH7.9）、
10mM酢酸マグネシウム、66mM酢酸カリウム、0.5mMDTTお
よび100μg/mlBSAからなる緩衝液に加え、更に10単位の
制限酵素SmaI（宝酒造社製）を加えて30℃で1時間反応
させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画
し、約3.0kbのApaI−SmaI断片を約1μg回収した。

【００７０】次に、上記で得られたpChiIgHB2のApaI−
平滑末端断片0.1μgとpBluescript SK(−)のApaI−SmaI
断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To -Go
T4 DNA Ligase （ファルマシア バイオテク社製）を用
いて連結した。このようにして得られた組換えプラスミ
ドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、図18に
示したプラスミドpBShCγ1を得た。

【００７１】次に、上記で得られたプラスミドpBShCγ1
の5μgを10μlの10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化
マグネシウムおよび1mM DTT からなる緩衝液に溶解し、
更に10単位の制限酵素ApaI（宝酒造社製）を加えて37℃
で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、10
μlの10mMトリス−塩酸（pH7.5）、50mM塩化ナトリウ
ム、10mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT からなる緩衝
液に溶解し、更に10単位の制限酵素SpeI（宝酒造社製）
を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロー
スゲル電気泳動にて分画し、約1.0kbのApaI−SpeI断片
を約1μg回収した。

【００７２】次に、上記で得られたプラスミドpBSMoSal
Sの3μgを10μlの10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩
化マグネシウムおよび1mM DTT からなる緩衝液に溶解
し、更に10単位の制限酵素ApaI（宝酒造社製）を加えて
37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿
し、10μlの10mMトリス−塩酸（pH7.5）、50mM塩化ナト
リウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT からなる
緩衝液に溶解し、更に10単位の制限酵素SpeI（宝酒造社
製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガ
ロースゲル電気泳動にて分画し、約3.66kbのApaI−SpeI
断片を約1μg回収した。

【００７３】次に、上記で得られたpBShCγ1のApaI−Sp
eI断片0.1μgとpBSMoSalSのApaI−SpeI断片0.1μgを全
量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase
（ファルマシア バイオテク社製）を用いて連結した。
このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用
いて大腸菌HB101株を形質転換し、図19に示したプラス
ミドpMohCγ1を得た。

【００７４】6.タンデムカセット型のヒト化抗体発現用
ベクター、pKANTEX93の構築 上記実施例1の1項から5項で得られた各種プラスミドを
用いてタンデムカセット型のヒト化抗体発現用ベクタ
ー、pKANTEX93を以下のようにして構築した。上記実施
例1の1項で得られたプラスミドpBSH-SAEEの3μgを10μl
の10mMトリス−塩酸（pH7.5）、50mM塩化ナトリウム、1
0mM塩化マグネシウムおよび1mM DTTからなる緩衝液に加
え、更に10単位の制限酵素HindIII（宝酒造社製）を加
えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈
殿し、10μlの50mMトリス−塩酸（pH7.5）、100mM塩化
ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT から
なる緩衝液に溶解し、更に10単位の制限酵素SalI（宝酒
造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液を
アガロースゲル電気泳動にて分画し、約5.42kbのHindII
I−SalI断片を約1μg回収した。

【００７５】次に、実施例1の1項で得られたプラスミド
pBSK-HAEEの5μgを10μlの10mMトリス−塩酸（pH7.
5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT からなる緩
衝液に加え、更に10単位の制限酵素KpnI（宝酒造社製）
を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノー
ル沈殿し、10μlの10mMトリス−塩酸（pH7.5）、50mM塩
化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT か
らなる緩衝液に溶解し、更に10単位の制限酵素HindIII
（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反
応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ラビットβ
−グロビン遺伝子スプライシング、ポリAシグナル、SV4
0初期遺伝子ポリAシグナルおよびSV40初期遺伝子プロモ
ーターを含む約1.98kbのKpnI−HindIII断片を約0.8μg
回収した。

【００７６】次に、実施例1の5項で得られたプラスミド
pMohCγ1の5μgを10μlの10mMトリス−塩酸（pH7.5）、
10mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT からなる緩衝液に
加え、更に10単位の制限酵素KpnI（宝酒造社製）を加え
て37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿
し、10μlの50mMトリス−塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナ
トリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT からな
る緩衝液に溶解し、更に10単位の制限酵素SalI（宝酒造
社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をア
ガロースゲル電気泳動にて分画し、ヒト型CDR移植抗体H
鎖発現ユニットを含む約1.66kbのKpnI−SalI断片を約0.
8μg回収した。

【００７７】次に、上記で得られたpBSH-SAEEのHindIII
−SalI断片0.1μgとpBSK-HAEEのKpnI−HindIII断片0.1
μgとpMohCγ1のKpnI−SalI断片0.1μgを全量20μlの滅
菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシ
ア バイオテク社製）を用いて連結した。このようにし
て得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB1
01株を形質転換し、図20に示したプラスミドpMoγ1SPを
得た。

【００７８】次に、上記で得られたプラスミドpMoγ1SP
の3μgを10μlの50mMトリス−塩酸（pH7.5）、100mM塩
化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT か
らなる緩衝液に加え、更に10単位の制限酵素SalI（宝酒
造社製）および制限酵素XhoI（宝酒造社製）を加えて37
℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気
泳動にて分画し、約9.06kbのSalI−XhoI断片を約1μg回
収した。

【００７９】次に、実施例1の2項で得られたプラスミド
pBSK-HAEESalの5μgを10μlの10mMトリス−塩酸（pH7.
5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT からなる緩
衝液に加え、更に10単位の制限酵素KpnI（宝酒造社製）
を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノー
ル沈殿し、10μlの50mMトリス−塩酸（pH7.5）、100mM
塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT
からなる緩衝液に溶解し、更に10単位の制限酵素SalI
（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反
応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、ラビットβ
−グロビン遺伝子スプライシング、ポリAシグナルおよ
びSV40初期遺伝子ポリAシグナルを含む約1.37kbのKpnI
−SalI断片を約0.7μg回収した。

【００８０】次に、実施例1の4項で得られたプラスミド
pMohCκの5μgを10μlの10mMトリス−塩酸（pH7.5）、1
0mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT からなる緩衝液に
加え、更に10単位の制限酵素KpnI（宝酒造社製）を加え
て37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿
し、10μlの50mMトリス−塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナ
トリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT からな
る緩衝液に溶解し、更に10単位の制限酵素XhoI（宝酒造
社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をア
ガロースゲル電気泳動にて分画し、ヒト型CDR移植抗体L
鎖発現ユニットを含む約1.06kbのKpnI−XhoI断片を約0.
7μg回収した。

【００８１】次に、上記で得られたpMoγ1SPのSalI−Xh
oI断片0.1μgとpBSK-HAEESalのKpnI−SalI断片0.1μgと
pMohCκのKpnI−XhoI断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に
加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア バ
イオテク社製）を用いて連結した。このようにして得ら
れた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を
形質転換し、図21に示したプラスミドpMoκγ1SPを得
た。

【００８２】次に、上記で得られたプラスミドpMoκγ1
SPの3μgを10μlの50mMトリス−塩酸（pH7.5）、100mM
塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT
からなる緩衝液に溶解し、更に10単位の制限酵素XhoI
（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反
応液をエタノール沈殿し、10μlの10mMトリス−塩酸（p
H7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT からなる
緩衝液に加え、更に1単位の制限酵素SacII（東洋紡績社
製）を加えて37℃で10分間反応させ、部分消化した。該
反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約8.49kb
のSacII−XhoI断片を約0.2μg回収した。

【００８３】次に、実施例1の3項で得られたプラスミド
pBSX-SA の3μgを10μlの10mMトリス−塩酸（pH7.5）、
10mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT からなる緩衝液に
加え、更に10単位の制限酵素SacII（東洋紡績社製）を
加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール
沈殿し、10μlの50mMトリス−塩酸（pH7.5）、100mM塩
化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT か
らなる緩衝液に溶解し、更に10単位の制限酵素XhoI（宝
酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液
をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約4.25kbのSacI
I−XhoI断片を約1μg回収した。

【００８４】次に、上記で得られたpMoκγ1SPのSacII
−XhoI断片0.1μgとpBSX-SA のSacII−XhoI断片0.1μg
を全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Liga
se（ファルマシア バイオテク社製）を用いて連結し
た。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液
を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、図22に示したプ
ラスミドpKANTEX93を得た。

【００８５】実施例２．抗GM2ヒト型キメラ抗体の発現 1.ヒト化抗体発現用ベクター、pKANTEX93を用いた抗GM2
ヒト型キメラ抗体の発現 上記実施例1に記載のヒト化抗体発現用ベクター、pKANT
EX93を用いて抗GM2ヒト型キメラ抗体の発現を以下のよ
うにして行った。 （1）抗GM2マウス抗体KM796のH鎖V領域cDNAが存在する
プラスミドpBSH3の構築 プラスミドpBluescript SK(−)（ストラタジーン社製）
の3μgを10μlの10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化
マグネシウムおよび1mM DTT からなる緩衝液に加え、更
に10単位の制限酵素SacII（東洋紡績社製）およびKpnI
（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反
応液をエタノール沈殿し、DNA Blunting Kit（宝酒造社
製）を用い、制限酵素消化によって生じた3’突出末端
を平滑末端に変えた。該反応液をエタノール沈殿し、20
μlの50mMトリス−塩酸（pH9.0）、1mM塩化マグネシウ
ムからなる緩衝液に溶解し、更に1単位のアルカリフォ
スファターゼ（E.coli C75、宝酒造社製）を加えて37℃
で1時間反応させ、5’末端を脱リン酸化した後、アガロ
ースゲル電気泳動にて分画し、約2.95kbのDNA断片を約1
μg回収した。

【００８６】次に、配列番号18、19に記載の塩基配列を
有する合成DNAを自動DNA合成機（380A、アプライド バ
イオシステムズ社製）を用いて合成した。得られた合成
DNAの0.3μgずつを15μlの滅菌水に加え、65℃で5分間
加熱した。該反応液を室温にて30分間放置した後、2μl
の10倍緩衝液[500mMトリス−塩酸（pH7.6）、100mM塩化
マグネシウム、50mM DTT] と2μlの10mM ATPを加え、更
に10単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼを加えて37℃で
30分間反応させ、5’末端をリン酸化した。上記で得ら
れたプラスミドpBluescript SK(−)由来のDNA断片（2.9
5kb）0.1μgとリン酸化合成DNA0.05μgを全量20μlの滅
菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシ
ア バイオテク社製）を用いて連結した。このようにし
て得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB1
01株を形質転換し、図23に示したプラスミドpBSNAを得
た。得られたプラスミドの10μgを用い、AutoRead Sequ
encing Kit（ファルマシア バイオテク社製）に添付の
処方に従って反応後、A.L.F. DNA Sequencer（ファルマ
シア バイオテク社製）により電気泳動し、塩基配列を
決定した結果、目的の合成DNAが導入されたことを確認
した。

【００８７】次に、上記で得られたプラスミドpBSNAの3
μgを10μlの10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マ
グネシウムおよび1mM DTT からなる緩衝液に加え、更に
10単位の制限酵素ApaI（宝酒造社製）を加えて37℃で1
時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、10μl
の50mMトリス−塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、
10mM塩化マグネシウム、1mM DTT 、100μg/mlBSAおよび
0.01%トライトンX-100からなる緩衝液に加え、更に10単
位の制限酵素NotI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間
反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分
画し、約2.95kbのDNA断片を約1μg回収した。

【００８８】次に、特開平6-205694に記載のプラスミド
pChi796HM1の10μgを10μlの10mMトリス−塩酸（pH7.
5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT からなる緩
衝液に加え、更に10単位の制限酵素ApaI（宝酒造社製）
を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノー
ル沈殿し、10μlの50mMトリス−塩酸（pH7.5）、100mM
塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウム、1mM DTT 、10
0μg/mlBSAおよび0.01%トライトンX-100 からなる緩衝
液に加え、更に10単位の制限酵素NotI（宝酒造社製）を
加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロース
ゲル電気泳動にて分画し、約0.45kbのDNA断片を約0.3μ
g回収した。

【００８９】次に、上記で得られたpBSNAのApaI−NotI
断片0.1μgとpChi796HM1のApaI−NotI断片0.1μgを全量
20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（フ
ァルマシア バイオテク社製）を用いて連結した。この
ようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて
大腸菌HB101株を形質転換し、図24に示したプラスミドp
BSH3を得た。

【００９０】（2）抗GM2マウス抗体KM796のL鎖V領域cDN
Aが存在するプラスミドpBSL3の構築 プラスミドpBluescript SK(−)（ストラタジーン社製）
の3μgを10μlの10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化
マグネシウムおよび1mM DTT からなる緩衝液に加え、更
に10単位の制限酵素KpnI（宝酒造社製）を加えて37℃で
1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、DNA B
lunting Kit（宝酒造社製）を用い、KpnI消化によって
生じた3’突出末端を平滑末端に変えた後、更にエタノ
ール沈殿し、10μlの10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM
塩化マグネシウムおよび1mM DTT からなる緩衝液に加
え、更に10単位の制限酵素SacI（宝酒造社製）を加えて
37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電
気泳動にて分画し、約2.95kbのDNA断片を約1μg回収し
た。

【００９１】次に、配列番号20、21に記載の塩基配列を
有する合成DNAを自動DNA合成機（380A、アプライド バ
イオシステムズ社製）を用いて合成した。得られた合成
DNAの0.3μgずつを15μlの滅菌水に加え、65℃で5分間
加熱した。該反応液を室温にて30分間放置した後、2μl
の10倍緩衝液[500mMトリス−塩酸（pH7.6）、100mM塩化
マグネシウム、50mM DTT] と2μlの10mM ATP を加え、
更に10単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼを加えて37℃
で30分間反応させ、5’末端をリン酸化した。上記で得
られたプラスミドpBluescript SK(−)由来のDNA断片
（2.95kb）0.1μgとリン酸化合成DNA0.05μgを全量20μ
lの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファル
マシア バイオテク社製）を用いて連結した。このよう
にして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸
菌HB101株を形質転換し、図25に示したプラスミドpBSES
を得た。得られたプラスミドの10μgを用い、AutoRead
Sequencing Kit（ファルマシア バイオテク社製）に添
付の処方に従って反応後、A.L.F. DNA Sequencer（ファ
ルマシア バイオテク社製）により電気泳動し、塩基配
列を決定した結果、目的の合成DNAが導入されたことを
確認した。

【００９２】次に、上記で得られたプラスミドpBSESの3
μgを10μlの50mMトリス−塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナ
トリウム、10mM塩化マグネシウム、1mM DTT および100
μg/mlBSAからなる緩衝液に加え、更に10単位の制限酵
素EcoRI（宝酒造社製）および制限酵素SplI（宝酒造社
製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガ
ロースゲル電気泳動にて分画し、約2.95kbのDNA断片を
約1μg回収した。

【００９３】次に、特開平6-205694に記載のプラスミド
pKM796L1の5μgを10μlの50mMトリス−塩酸（pH7.5）、
10mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT からなる緩衝液に
加え、更に10単位の制限酵素EcoRI（宝酒造社製）およ
び制限酵素AflIII（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間
反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分
画し、約0.39kbのEcoRI−AflIII断片を約0.3μg回収し
た。 次に、配列番号22、23に記載の塩基配列を有する
合成DNAを自動DNA合成機（380A、アプライドバイオシス
テムズ社製）を用いて合成した。得られた合成DNAの0.3
μgずつを15μlの滅菌水に加え、65℃で5分間加熱し
た。該反応液を室温にて30分間放置した後、2μlの10倍
緩衝液[500mMトリス−塩酸（pH7.6）、100mM塩化マグネ
シウム、50mM DTT] と2μlの10mM ATP を加え、更に10
単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼを加えて37℃で30分
間反応させ、5’末端をリン酸化した。

【００９４】次に、上記で得られたpBSES由来のEcoRI−
SplI断片（2.95kb）0.1μgとpKM796L1由来のEcoRI−Afl
III0.1μgとリン酸化合成DNA0.05μgを全量20μlの滅菌
水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア
バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして
得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101
株を形質転換し、図26に示したプラスミドpBSL3を得
た。得られたプラスミドの10μgを用い、AutoRead Sequ
encing Kit（ファルマシア バイオテク社製）に添付の
処方に従って反応後、A.L.F. DNA Sequencer（ファルマ
シア バイオテク社製）により電気泳動し、塩基配列を
決定した結果、目的の合成DNAが導入されたことを確認
した。

【００９５】（3）抗GM2ヒト型キメラ抗体発現ベクタ
ー、pKANTEX796の構築 上記実施例1で得られたヒト化抗体発現用ベクター、pKA
NTEX93および実施例2の1項（1）、（2）で得られたプラ
スミドpBSH3、pBSL3を用いて抗GM2ヒト型キメラ抗体発
現ベクター、pKANTEX796を以下のようにして構築した。

【００９６】プラスミドpBSH3の3μgを10μlの10mMトリ
ス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mM D
TT からなる緩衝液に加え、更に10単位の制限酵素ApaI
（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反
応液をエタノール沈殿し、10μlの50mMトリス−塩酸（p
H7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウ
ム、1mM DTT 、100μg/mlBSAおよび0.01%トライトンX-1
00からなる緩衝液に加え、更に10単位の制限酵素NotI
（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反
応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.46kbの
ApaI−NotI断片を約0.3μg回収した。

【００９７】次に、プラスミドpKANTEX93の3μgを10μl
の10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム
および1mM DTT からなる緩衝液に加え、更に10単位の制
限酵素ApaI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応さ
せた。該反応液をエタノール沈殿し、10μlの50mMトリ
ス−塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マ
グネシウム、1mM DTT 、100μg/mlBSAおよび0.01%トラ
イトンX-100からなる緩衝液に加え、更に10単位の制限
酵素NotI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させ
た。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約
12.75kbのApaI−NotI断片を約1μg回収した。

【００９８】次に、上記で得られたpBSH3由来のApaI−N
otI断片0.1μgとpKANTEX93由来のApaI−NotI断片0.1μg
を全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Liga
se（ファルマシア バイオテク社製）を用いて連結し
た。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液
を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、図27に示したプ
ラスミドpKANTEX796Hを得た。

【００９９】次に、プラスミドpBSL3の3μgを10μlの50
mMトリス−塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM
塩化マグネシウム、1mM DTT および100μg/ml BSAから
なる緩衝液に加え、更に10単位の制限酵素EcoRI（宝酒
造社製）および制限酵素SplI（宝酒造社製）を加えて37
℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気
泳動にて分画し、約0.4kbのEcoRI−SplI断片を約0.3μg
回収した。

【０１００】次に、上記で得られたプラスミドpKANTEX7
96Hの3μgを10μlの50mMトリス−塩酸（pH7.5）、100mM
塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウム、1mM DTT およ
び100μg/ml BSAからなる緩衝液に加え、更に10単位の
制限酵素EcoRI（宝酒造社製）および制限酵素SplI（宝
酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液
をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約13.20kbのEco
RI−SplI断片を約1μg回収した。

【０１０１】次に、上記で得られたpBSL3由来のEcoRI−
SplI断片0.1μgとpKANTEX796H由来のEcoRI−SplI断片0.
1μgを全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA
Ligase（ファルマシア バイオテク社製）を用いて連結
した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶
液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、図28に示した
プラスミドpKANTEX796を得た。

【０１０２】（4）pKANTEX796を用いた抗GM2ヒト型キメ
ラ抗体のYB2/0細胞での発現 YB2/0細胞（ATCC CRL1662）へのプラスミドの導入は、
エレクトロポレーション法（Miyaji, H.らのCytotechno
logy, 3, 133, 1990）にて行った。実施例2の1項（3）
で得られたpKANTEX796の4μgを4×10⁶細胞のYB2/0細胞
へ導入後、40mlのRPMI1640-FCS（10）培地［FCSを10%、
7.5%炭酸水素ナトリウム溶液を適量、200mM L−グルタ
ミン溶液（ギブコ社製）を3%、ペニシリン・ストレプト
マイシン溶液（ギブコ社製、5000U/mlペニシリンおよび
5mg/mlストレプトマイシン含有）を0.5%含むRPMI1640培
地（日水製薬社製）］に懸濁し、96ウエルマイクロプレ
ートに200μlずつ分注した。37℃、5%CO₂インキュベー
ター内で24時間培養後、G418を終濃度が0.5mg/mlになる
ように添加して1〜2週間培養した。形質転換株のコロニ
ーが出現したウエルより培養上清を回収し、上清中の抗
GM2ヒト型キメラ抗体活性を下記（5）に記載のELISA法
にて測定した。活性が認められたウエルの細胞について
は以下のようにして遺伝子増幅を行い、キメラ抗体発現
量の上昇を試みた。まず、細胞をG418を0.5mg/ml、メソ
トレキセート（シグマ社製、以下MTXと表記する）を50n
M含むRPMI1640-FCS（10）培地に1〜2×10⁵細胞/mlにな
るように懸濁し、24ウエルプレートに2mlずつ分注し
た。37℃、5%CO₂インキュベーター内で1〜2週間培養し
て、50nM MTX耐性細胞を誘導した。50nM MTX耐性細胞が
出現したウエルについてはさらに、MTXの終濃度を100n
M、200nMと順次上昇させ、ELISA法による発現量の評価
の後、最も高い発現量を示した細胞を選択した。選択し
た細胞は限界希釈法によるクローニングを2回行った後
に、最終的なキメラ抗体安定発現細胞として確立した。
確立した抗GM2ヒト型キメラ抗体安定発現細胞は約1〜2
μg/mlの発現量を示し、pKANTEX93を用いて効率的かつ
安定なヒト化抗体の発現が可能であることが確認され
た。

【０１０３】（5）ELISA法 2ngのガングリオシドを5ngのフォスファチジルコリン
（シグマ社製）と2.5ngのコレステロール（シグマ社
製）とを含む2mlのエタノール溶液に溶解した。この溶
液20μlまたはこの溶液の希釈液20μlを96ウェルマイク
ロプレート（グライナー社製）の各ウェルにそれぞれ分
注し、風乾後、1%BSAを含むリン酸緩衝液（以下PBSと表
記する）でブロッキングを行った。これに形質転換株の
培養上清、精製したマウスモノクローナル抗体、精製し
たヒト型キメラ抗体または精製したヒト化抗体を50〜10
0μl加え、1〜2時間室温で反応させた。反応後、各ウェ
ルをPBSで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウ
スIg抗体（ダコ社製：400倍希釈で使用）あるいはペル
オキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトγ鎖抗体（キルケガード&
ペリー ラボラトリー社製：1000倍希釈で使用）を50〜
100μl加え、1〜2時間室温で反応させた。PBSで洗浄
後、ABTS基質液［2,2'アジノビス（3−エチルベンゾチ
アゾリン−6−スルホン酸）の550mgを1リットルの0.1M
クエン酸緩衝液(pH4.2)に溶解し、使用直前に過酸化水
素1μl/mlを加えた溶液］を50〜100μl加えて発色さ
せ、OD415を測定した。

【０１０４】2.COS-7細胞（ATCC CRL1651）を用いた抗G
M2ヒト型キメラ抗体の一過性発現 抗GM2ヒト型CDR移植抗体の各種バージョンの活性評価を
より迅速に行なうために、pKANTEX796およびその改変体
を用いてCOS-7 細胞における抗GM2ヒト型キメラ抗体の
一過性発現をリポフェクトアミン法を用いて以下のよう
にして行なった。

【０１０５】（1）pKANTEX796の改変体の構築 動物細胞における一過性発現の効率は導入された発現ベ
クターのコピー数に依存していることから、より大きさ
の小さい発現ベクターの方が発現効率がよいことが考え
られた。そこでpKANTEX796のヒト化抗体発現に影響を及
ぼさないと考えられる領域を欠失させ、より小さなヒト
化抗体発現ベクター、pT796を以下のようにして構築し
た。

【０１０６】プラスミドpKANTEX796の3μgを10μlの10m
Mトリス−塩酸（pH7.5）、50mM塩化ナトリウム、10mM塩
化マグネシウムおよび1mM DTT からなる緩衝液に加え、
更に10単位の制限酵素HindIII（宝酒造社製）を加えて3
7℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、
10μlの50mMトリス−塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリ
ウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT からなる緩
衝液に加え、更に10単位の制限酵素MluI（宝酒造社製）
を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノー
ル沈殿し、DNA Blunting Kit（宝酒造社製）を用い、制
限酵素消化によって生じた5’突出末端を平滑末端に変
えた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、
約9.60kbのDNA断片を約1μg回収した。回収したDNA断片
0.1μgを全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DN
A Ligase（ファルマシア バイオテク社製）を用いて連
結した。このようにして得られた組換えプラスミドDNA
溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、図29に示し
たプラスミドpT796を得た。

【０１０７】（2）pKANTEX796、pT796を用いた抗GM2ヒ
ト型キメラ抗体の一過性発現 COS-7細胞を1×10⁵細胞/mlで6穴プレート（ファルコン
社製）に2mlずつ分注し、37℃で一晩培養した。100μl
のOPTI-MEM 培地（ギブコ社製）にpKANTEX796あるいはp
T796の2μgを加え、更に100μlのOPTI-MEM 培地（ギブ
コ社製）に10μlのLIPOFECTAMINE Reagent（ギブコ社
製）を添加した溶液を加え、室温で40分間反応させ、DN
A−リポソームの複合体を形成させた。一晩培養したCOS
-7 細胞を2mlのOPTI-MEM培地（ギブコ社製）で2回洗浄
後、複合体を含む溶液を添加し、37℃で7時間培養後、
溶液を除去し、2mlの10%のFCSを含有するDMEM培地（ギ
ブコ社製）を添加し、37℃で培養した。培養後、24時
間、48時間、72時間、96時間、120時間の時点で培養上
清を回収し、必要に応じて濃縮操作を行ない、実施例2
の1項（5）に記載のELISA法により培養上清中の抗GM2ヒ
ト型キメラ抗体の活性評価を行なった。その結果を図30
に示した。図30に示したようにpT796の方がpKANTEX796
よりも高い抗GM2ヒト型キメラ抗体の一過性発現が認め
られ、その発現量は72時間から96時間で最も高く、約30
ng/ml（GM2結合活性値で換算）の濃度であった。以上の
結果より、pKANTEX93の大きさを小さくしたベクターを
作製し、COS-7細胞に導入することで一過性発現系で発
現ベクター由来のヒト化抗体の活性評価を行うことが可
能であることが明らかとなった。また、後述する各種バ
ージョンの抗GM2ヒト型CDR移植抗体の活性を正確に比較
するために、下記（3）に記載のサンドイッチELISA法に
より一過性発現培養上清中の抗体濃度を測定した。

【０１０８】（3）サンドイッチELISA法による各種培養
上清中のヒト化抗体濃度の測定 ヤギ抗ヒトγ鎖抗体（医学生物学研究所製）をPBSにて4
00倍希釈した溶液を50μlずつ96穴マイクロプレートに
分注し、4℃にて一晩反応させた。抗体溶液を除去後、1
00μlの1%BSAを含むPBSで37℃、1時間ブロッキングを行
なった。これに一過性発現培養上清、精製した抗GM2ヒ
ト型キメラ抗体または精製した抗GM2ヒト化抗体を50μl
加え、室温で1時間反応させた。反応後、溶液を除去
し、PBSで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識マウス抗ヒト
κ鎖抗体（ザイメット社製）をPBSにて500倍希釈した溶
液を50μl加え、室温で1時間反応させた。PBSで洗浄
後、ABTS基質液を50μl加えて発色させ、OD415を測定し
た。

【０１０９】実施例３. 抗GM2ヒト型CDR移植抗体の製造
I 特開平6-205694の実施例2に記載の抗GM2ヒト型CDR移植
抗体よりもGM2との結合活性が高い抗GM2ヒト型CDR移植
抗体を以下のようにして製造した。 1.抗GM2ヒト型CDR移植抗体H鎖およびL鎖V領域をコード
するDNA配列の構築 （1）特開平6-205694の実施例2の1項（1）に記載の抗GM
2ヒト型CDR移植抗体H鎖V領域の改変 特開平6-205694の実施例2に記載の抗GM2ヒト型CDR移植
抗体H鎖V領域のFRのいくつかのアミノ酸残基を元のマウ
ス抗体KM796のアミノ酸残基に戻したバージョンをコー
ドするDNAを以下のようにして構築した。置換させるア
ミノ酸残基としてはマウス抗体KM796のV領域のコンピュ
ーターモデルに基づき、置換により抗原結合活性が回復
すると期待された残基を選択した。まず、配列番号24、
25の塩基配列を有するDNAを自動DNA合成機（380A、アプ
ライド バイオシステムズ社製）を用いて合成した。

【０１１０】次に、特開平6-205694の実施例2の1項
（1）の配列番号27の合成DNAの代わりに配列番号24の合
成DNAを用いて同様の反応を行い、78位のグルタミンが
スレオニンに、79位のフェニルアラニンがアラニンに、
80位のセリンがチロシンに置換した配列番号26で示した
ヒト型CDR移植抗体H鎖V領域のバージョン2を構築した。
次に、特開平6-205694の実施例2の1項（1）の配列番号2
5の合成DNAの代わりに配列番号25の合成DNAを用いて同
様の反応を行い、27位のフェニルアラニンがチロシン
に、30位のセリンがスレオニンに、40位のプロリンがセ
リンに、41位のプロリンがヒスチジンに置換した配列番
号27で示したヒト型CDR移植抗体H鎖V領域のバージョン4
を構築した。

【０１１１】（2）既知のヒト抗体H鎖V領域のHMHCSを用
いた抗GM2ヒト型CDR移植抗体H鎖V領域の構築 カバットらは、文献（「Sequences of Proteins of Imm
unological Interest」, US Dept. of Health and Huma
n Services, 1991 ）において、各種ヒト抗体のアミノ
酸配列を開示しており、さらに、これら既知のヒト抗体
H鎖V領域について、そのFRの相同性からサブグループI
〜III（Human Sub Group I〜III; 以下、HSG と表記す
る）に分類し、各サブグループ毎に共通配列を同定し
た。本発明者らは、それら共通配列から一義的にHMHCS
を決定し、HMHCSを基礎として抗GM2ヒト型CDR移植抗体H
鎖V領域を構築した。まず、基礎とするHMHCSを選択する
ために、マウス抗体KM796H鎖V領域のFRと、各サブグル
ープのヒト抗体H鎖V領域のHMHCSのFRとの間の相同性を
調べた（表1）。

【０１１２】

【表１】

【０１１３】その結果、サブグループIと最も類似して
いることが確認され、サブグループIのHMHCSを基礎とし
て抗GM2ヒト型CDR移植抗体H鎖V領域をPCR法を用いて以
下のようにして構築した。配列番号28から33の塩基配列
を有する合成DNAを自動DNA合成機（380A、アプライド
バイオシステムズ社製）を用いて合成した。合成した各
DNAを最終濃度が0.1μMとなるように50μlの10mMトリス
−塩酸（pH8.3）、50mM塩化カリウム、1.5mM塩化マグネ
シウム、0.001%ゼラチン、200μM dNTP、0.5μM M13pri
mer RV（宝酒造社製）、0.5μM M13primer M4（宝酒造
社製）および2単位のTaKaRa Taq DNAポリメラーゼより
なる緩衝液に加え、50μlの鉱油で覆い、DNAサーマルサ
イクラー（PJ480、パーキン エルマー社製）にセット
し、94℃にて2分間、55℃にて2分間、72℃にて2分間の3
0サイクルを行なった。該反応液をQIAquick PCR Purifi
cation Kit（キアジェン社製）を用いて精製後、30μl
の10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウム
および1mM DTT からなる緩衝液とし、更に10単位の制限
酵素ApaI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させ
た。該反応液をエタノール沈殿し、10μlの50mMトリス
−塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグ
ネシウム、1mM DTT 、100μg/mlBSAおよび0.01%トライ
トンX-100 からなる緩衝液に加え、更に10単位の制限酵
素NotI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させ
た。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約
0.44kbのApaI−NotI断片を約0.2μg回収した。

【０１１４】次に、上記実施例2の1項（1）で得られた
プラスミドpBSH3の3μgを10μlの10mMトリス−塩酸（pH
7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT からなる
緩衝液に加え、更に10単位の制限酵素ApaI（宝酒造社
製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタ
ノール沈殿し、10μlの50mMトリス−塩酸（pH7.5）、10
0mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウム、1mM DTT
、100μg/ml BSAおよび0.01%トライトンX-100 からな
る緩衝液に加え、更に10単位の制限酵素NotI（宝酒造社
製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガ
ロースゲル電気泳動にて分画し、約2.95kbのApaI−NotI
断片を約1μg回収した。

【０１１５】次に、上記で得られた抗GM2ヒト型CDR移植
抗体H鎖V領域のApaI−NotI断片0.1μgとpBSH3のApaI−N
otI断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-G
o T4 DNA Ligase（ファルマシア バイオテク社製）を
用いて連結した。このようにして得られた組換えプラス
ミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換した。形
質転換株の10個のクローンより各プラスミドDNAを調製
し、塩基配列の決定を行なった結果、目的の塩基配列を
含む図31に示したプラスミドpBSH10を得た。pBSH10に含
まれる抗GM2ヒト型CDR移植抗体H鎖V領域のアミノ酸配列
および塩基配列を配列番号7に示した。構築した抗GM2ヒ
ト型CDR移植抗体H鎖V領域のアミノ酸配列においてはマ
ウス抗体KM796の抗原結合性を保持する目的で、V領域の
コンピューターモデルから選択したFR中の67位のアルギ
ニン、72位のアラニン、84位のセリン、98位のアルギニ
ンの各アミノ酸残基をマウス抗体KM796のH鎖V領域に見
いだされるアミノ酸残基であるリジン、バリン、ヒスチ
ジン、スレオニンにそれぞれ換えている。

【０１１６】（3）特開平6-205694の実施例2の1項（2）
に記載の抗GM2ヒト型CDR移植抗体L鎖V領域の改変 まず、配列番号34の塩基配列を有するDNAを自動DNA合成
機（380A、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて
合成し、特開平6-205694の実施例2の1項（2）の配列番
号35の合成DNAの代わりに用いて同様の反応を行い、3’
末端が制限酵素SplIの対合末端である抗GM2ヒト型CDR移
植抗体L鎖V領域cDNAを構築した。

【０１１７】次に、実施例2の1項（2）で得られたプラ
スミドpBSL3の3μgを10μlの50mMトリス−塩酸（pH7.
5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウム、1m
M DTTおよび100μg/ml BSAからなる緩衝液に加え、更に
10単位の制限酵素EcoRI（宝酒造社製）および制限酵素S
plI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該
反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約2.95kb
のEcoRI−SplI断片を約1μg回収した。

【０１１８】次に、上記で得られた抗GM2ヒト型CDR移植
抗体L鎖V領域cDNAのEcoRI−SplI断片0.1μgとpBSL3のEc
oRI−SplI断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に加え、Read
y-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア バイオテク社
製）を用いて連結した。このようにして得られた組換え
プラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換
し、図32に示したプラスミドpBSL16を得た。

【０１１９】次に、上記で得られたプラスミドpBSL16に
含まれる抗GM2ヒト型CDR移植抗体L鎖V領域のFRのいくつ
かのアミノ酸残基を元のマウス抗体KM796のアミノ酸残
基に戻したバージョンをコードするDNAを以下のようにP
CRによる変異導入法を用いて構築した（図33）。置換さ
せるアミノ酸残基としてはマウス抗体KM796のV領域のコ
ンピューターモデルに基づき、置換により抗原結合活性
が回復すると期待された残基を選択した。

【０１２０】変異を導入するためのアンチセンスおよび
センスのDNAプライマーを自動DNA合成機（380A、アプラ
イド バイオシステムズ社製）を用いて合成し、pBSL16
の1ngを鋳型として最終濃度0.5μMのM13 Primer RV（宝
酒造社製）とアンチセンスDNAプライマーおよびM13 Pri
mer M4（宝酒造社製）とセンスDNAプライマーを用いて
第一PCR反応を実施例3の1項（2）と同様にして行なっ
た。各反応溶液をQIAquick PCR Purification Kit（キ
アジェン社製）を用いて20μlの10mMトリス−塩酸（pH
8.0）で溶出、精製した後、各溶出液の5μlを用いて第
二PCR反応を実施例3の1項（2）と同様にして行なった。
該反応液をQIAquick PCR Purification Kit（キアジェ
ン社製）を用いて精製後、30μlの50mMトリス−塩酸（p
H7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウ
ム、1mM DTT および100μg/ml BSAからなる緩衝液と
し、更に10単位の制限酵素EcoRI（宝酒造社製）および
制限酵素SplI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応
させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画
し、約0.39kbの抗GM2ヒト型CDR移植抗体L鎖V領域の各種
置換バージョンのEcoRI−SplI断片を約0.2μg回収し
た。

【０１２１】次に、得られた抗GM2ヒト型CDR移植抗体L
鎖V領域の各種置換バージョンのEcoRI−SplI断片0.1μg
とpBSL3のEcoRI−SplI断片0.1μgを全量20μlの滅菌水
に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア
バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得
られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株
を形質転換し、形質転換株のクローンより各プラスミド
DNAを調製し、塩基配列の決定を行ない、目的の変異を
有する塩基配列を含むプラスミドを得た。

【０１２２】実際には、アンチセンス変異プライマーと
して配列番号35、センス変異プライマーとして配列番号
36の合成DNAを用いて、上記反応を行なうことにより配
列番号37に示した抗GM2ヒト型CDR移植抗体L鎖V領域バー
ジョン1を含むプラスミドpBSLV1を得た。構築した抗GM2
ヒト型CDR移植抗体L鎖V領域バージョン1のアミノ酸配列
においてはマウス抗体KM796の抗原結合性を保持する目
的で、FR中の15位のバリンをマウス抗体KM796のL鎖V領
域に見いだされるアミノ酸残基であるプロリンに換えて
いる。

【０１２３】アンチセンス変異プライマーとして配列番
号38、センス変異プライマーとして配列番号39の合成DN
Aを用いて、上記反応を行なうことにより配列番号40に
示した抗GM2ヒト型CDR移植抗体L鎖V領域バージョン2を
含むプラスミドpBSLV2を得た。構築した抗GM2ヒト型CDR
移植抗体L鎖V領域バージョン2のアミノ酸配列において
はマウス抗体KM796の抗原結合性を保持する目的で、FR
中の46位のロイシンをマウス抗体KM796のL鎖V領域に見
いだされるアミノ酸残基であるトリプトファンに換えて
いる。

【０１２４】アンチセンス変異プライマーとして配列番
号41、センス変異プライマーとして配列番号42の合成DN
Aを用いて、上記反応を行なうことにより配列番号43に
示した抗GM2ヒト型CDR移植抗体L鎖V領域バージョン3を
含むプラスミドpBSLV3を得た。構築した抗GM2ヒト型CDR
移植抗体L鎖V領域バージョン3のアミノ酸配列において
はマウス抗体KM796の抗原結合性を保持する目的で、FR
中の79位のプロリン、82位のイソロイシンをともにマウ
ス抗体KM796のL鎖V領域に見いだされるアミノ酸残基で
あるアラニンに換えている。

【０１２５】次に、バージョン1とバージョン2の置換を
併せ持つ抗GM2ヒト型CDR移植抗体L鎖V領域を含むプラス
ミドpBSLV1+2を以下のようにして構築した。上記で得ら
れたプラスミドpBSLV1の3μgを10μlの10mMトリス−塩
酸（pH7.5）、50mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシ
ウムおよび1mM DTT からなる緩衝液に加え、更に10単位
の制限酵素EcoRI（宝酒造社製）および制限酵素HindIII
（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反
応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.20kbの
EcoRI−HindIII断片を約0.2μg回収した。

【０１２６】次に、上記で得られたプラスミドpBSLV2の
3μgを10μlの10mMトリス−塩酸（pH7.5）、50mM塩化ナ
トリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT からな
る緩衝液に加え、更に10単位の制限酵素EcoRI（宝酒造
社製）および制限酵素HindIII（宝酒造社製）を加えて3
7℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気
泳動にて分画し、約3.2kbのEcoRI−HindIII断片を約1μ
g回収した。

【０１２７】次に、上記で得られたpBSLV1のEcoRI−Hin
dIII断片0.1μgとpBSLV2のEcoRI−HindIII断片0.1μgを
全量20μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase
（ファルマシア バイオテク社製）を用いて連結した。
このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用
いて大腸菌HB101株を形質転換し、図34に示したプラス
ミドpBSLV1+2を得た。

【０１２８】次に、上記で得られたプラスミドpBSLV1+2
の1ngを鋳型として配列番号44の塩基配列を有する合成D
NAをアンチセンス変異プライマーとして、また、配列番
号45の塩基配列を有する合成DNAをセンス変異プライマ
ーとして上記したPCR反応を行なうことにより配列番号4
6に示した抗GM2ヒト型CDR移植抗体L鎖V領域バージョン4
を含むプラスミドpBSLV4を得た。構築した抗GM2ヒト型C
DR移植抗体L鎖V領域バージョン4のアミノ酸配列におい
てはマウス抗体KM796の抗原結合性を保持する目的で、F
R中の15位のバリン、46位のロイシン、69位のアスパラ
ギン酸、70位のフェニルアラニン、71位のスレオニンの
各アミノ酸残基をマウス抗体KM796のL鎖V領域に見いだ
されるアミノ酸残基であるプロリン、トリプトファン、
セリン、チロシン、セリンにそれぞれ換えている。

【０１２９】次に、上記で得られたプラスミドpBSLV1+2
の1ngを鋳型として配列番号47の塩基配列を有する合成D
NAをアンチセンス変異プライマーとして、また、配列番
号48の塩基配列を有する合成DNAをセンス変異プライマ
ーとして上記したPCR反応を行なうことにより配列番号4
9に示した抗GM2ヒト型CDR移植抗体L鎖V領域バージョン8
を含むプラスミドpBSLV8を得た。構築した抗GM2ヒト型C
DR移植抗体L鎖V領域バージョン8のアミノ酸配列におい
てはマウス抗体KM796の抗原結合性を保持する目的で、F
R中の15位のバリン、46位のロイシン、69位のアスパラ
ギン酸、70位のフェニルアラニン、71位のスレオニン、
76位のセリン、77位のロイシン、78位のグルタミンの各
アミノ酸残基をマウス抗体KM796のL鎖V領域に見いださ
れるアミノ酸残基であるプロリン、トリプトファン、セ
リン、チロシン、セリン、アルギニン、メチオニン、グ
ルタミン酸にそれぞれ換えている。

【０１３０】次に、上記で得られたプラスミドpBSLV4の
1ngを鋳型として配列番号50の塩基配列を有する合成DNA
をアンチセンス変異プライマーとして、また、配列番号
51の塩基配列を有する合成DNAをセンス変異プライマー
として上記したPCR反応を行なうことにより配列番号52
に示した抗GM2ヒト型CDR移植抗体L鎖V領域バージョンLm
-2 を含むプラスミドpBSLm-2 を得た。構築した抗GM2ヒ
ト型CDR移植抗体L鎖V領域バージョンLm-2 のアミノ酸配
列においてはマウス抗体KM796の抗原結合性を保持する
目的で、FR中の15位のバリン、35位のチロシン、46位の
ロイシン、69位のアスパラギン酸、70位のフェニルアラ
ニン、71位のスレオニンの各アミノ酸残基をマウス抗体
KM796のL鎖V領域に見いだされるアミノ酸残基であるプ
ロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリン、
チロシン、セリンにそれぞれ換えている。

【０１３１】次に、上記で得られたプラスミドpBSLV4の
1ngを鋳型として配列番号53の塩基配列を有する合成DNA
をアンチセンス変異プライマーとして、また、配列番号
54の塩基配列を有する合成DNAをセンス変異プライマー
として上記したPCR反応を行なうことにより配列番号55
に示した抗GM2ヒト型CDR移植抗体L鎖V領域バージョンLm
-8 を含むプラスミドpBSLm-8を得た。構築した抗GM2ヒ
ト型CDR移植抗体L鎖V領域バージョンLm-8のアミノ酸配
列においてはマウス抗体KM796の抗原結合性を保持する
目的で、FR中の15位のバリン、46位のロイシン、69位の
アスパラギン酸、70位のフェニルアラニン、71位のスレ
オニン、72位のフェニルアラニン、76位のセリンの各ア
ミノ酸残基をマウス抗体KM796のL鎖V領域に見いだされ
るアミノ酸残基であるプロリン、トリプトファン、セリ
ン、チロシン、セリン、ロイシン、アルギニンにそれぞ
れ換えている。

【０１３２】次に、バージョンLm-2 とバージョンLm-8
の置換を併せ持つ抗GM2ヒト型CDR移植抗体L鎖V領域を含
むプラスミドpBSLm-28を以下のようにして構築した。上
記で得られたプラスミドpBSLm-2 の3μgを10μlの50mM
トリス−塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩
化マグネシウムおよび1mM DTT からなる緩衝液に加え、
更に10単位の制限酵素EcoRI（宝酒造社製）を加えて37
℃で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、1
0μlの10mMトリス−塩酸（pH7.5）、50mM塩化ナトリウ
ム、10mM塩化マグネシウム、1mM DTT および100μg/ml
BSAからなる緩衝液に加え、更に10単位の制限酵素XbaI
（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反
応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.24kbの
EcoRI−XbaI断片を約0.2μg回収した。

【０１３３】次に、上記で得られたプラスミドpBSLm-8
の3μgを10μlの50mMトリス−塩酸（pH7.5）、100mM塩
化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT か
らなる緩衝液に加え、更に10単位の制限酵素EcoRI（宝
酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液
をエタノール沈殿し、10μlの10mMトリス−塩酸（pH7.
5）、50mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウム、1mM
DTT および100μg/ml BSAからなる緩衝液に加え、更に
10単位の制限酵素XbaI（宝酒造社製）を加えて37℃で1
時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動に
て分画し、約3.16kbのEcoRI−XbaI断片を約1μg回収し
た。次に、上記で得られたpBSLm-2のEcoRI−XbaI断片0.
1μgとpBSLm-8のEcoRI−XbaI断片0.1μgを全量20μlの
滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマ
シア バイオテク社製）を用いて連結した。このように
して得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌H
B101株を形質転換し、図35に示したプラスミドpBSLm-28
を得た。プラスミドpBSLm-28に含まれる抗GM2ヒト型CDR
移植抗体L鎖V領域バージョンLm-28を配列番号8に示し
た。構築した抗GM2ヒト型CDR移植抗体L鎖V領域バージョ
ンLm-28のアミノ酸配列においてはマウス抗体KM796の抗
原結合性を保持する目的で、FR中の15位のバリン、35位
のチロシン、46位のロイシン、69位のアスパラギン酸、
70位のフェニルアラニン、71位のスレオニン、72位のフ
ェニルアラニン、76位のセリンの各アミノ酸残基をマウ
ス抗体KM796のL鎖V領域に見いだされるアミノ酸残基で
あるプロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、セ
リン、チロシン、セリン、ロイシン、アルギニンにそれ
ぞれ換えている。

【０１３４】（4）既知のヒト抗体L鎖V領域のHMHCSを用
いた抗GM2ヒト型CDR移植抗体L鎖V領域の構築 カバットらは、文献（「Sequences of Proteins of Imm
unological Interest」, US Dept. of Health and Huma
n Services, 1991）において、各種ヒト抗体のアミノ酸
配列を開示しており、さらに既知のヒト抗体L鎖V領域に
ついて、そのFRの相同性からHSG I〜IVに分類し、各サ
ブグループ毎にHMHCSが同定した。本発明者らは、それ
ら共通配列から一義的にHMHCSを決定し、HMHCSを基礎と
して抗GM2ヒト型CDR移植抗体L鎖V領域を構築した。ま
ず、基礎とするHMHCSを選択するために、マウス抗体KM7
96L鎖V領域のFRと、各サブグループのヒト抗体L鎖V領域
のHMHCSのFRとの間の相同性を調べた（表2）。

【０１３５】

【表２】

【０１３６】その結果、サブグループIと最も類似して
いることが確認され、サブグループIのHMHCSを基礎とし
て抗GM2ヒト型CDR移植抗体L鎖V領域をPCR法を用いて以
下のようにして構築した。配列番号56から61の塩基配列
を有する合成DNAを自動DNA合成機（380A、アプライド
バイオシステムズ社製）を用いて合成した。合成した各
DNAを最終濃度が0.1μMとなるように50μl の10mMトリ
ス−塩酸（pH8.3）、50mM塩化カリウム、1.5mM塩化マグ
ネシウム、0.001%ゼラチン、200μMdNTP、0.5μM M13pr
imer RV（宝酒造社製）、0.5μM M13primer M4（宝酒造
社製）および2単位のTaKaRa Taq DNAポリメラーゼより
なる緩衝液に加え、50μlの鉱油で覆い、DNAサーマルサ
イクラー（PJ480、パーキン エルマー社製）にセット
し、94℃にて2分間、55℃にて2分間、72℃にて2分間の3
0サイクルを行なった。該反応液をQIAquick PCR Purifi
cation Kit（キアジェン社製）を用いて精製後、30μl
の50mMトリス−塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、
10mM塩化マグネシウム、1mM DTT および100μg/mlBSAか
らなる緩衝液とし、更に10単位の制限酵素EcoRI（宝酒
造社製）および制限酵素SplI（宝酒造社製）を加えて37
℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気
泳動にて分画し、約0.39kbのEcoRI−SplI断片を約0.2μ
g回収した。

【０１３７】次に、上記で得られた抗GM2ヒト型CDR移植
抗体L鎖V領域のEcoRI−SplI断片0.1μgとpBSL3のEcoRI
−SplI断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に加え、Ready-T
o-GoT4 DNA Ligase（ファルマシア バイオテク社製）
を用いて連結した。このようにして得られた組換えプラ
スミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形質転換した。
形質転換株の10個のクローンより各プラスミドDNAを調
製し、塩基配列の決定を行なった結果、目的の塩基配列
を含む図36に示したプラスミドpBSHSGLを得た。pBSHSGL
に含まれる抗GM2ヒト型CDR移植抗体L鎖V領域のアミノ酸
配列および塩基配列を配列番号9に示した。構築した抗G
M2ヒト型CDR移植抗体L鎖V領域のアミノ酸配列において
はマウス抗体KM796の抗原結合性を保持する目的で、V領
域のコンピューターモデルから選択したFR中の4位のメ
チオニン、11位のロイシン、15位のバリン、35位のチロ
シン、42位のアラニン、46位のロイシン、69位のアスパ
ラギン酸、70位のフェニルアラニン、71位のスレオニ
ン、77位のロイシン、103位のバリンの各アミノ酸残基
をマウス抗体KM796のL鎖V領域に見いだされるアミノ酸
残基であるロイシン、メチオニン、プロリン、フェニル
アラニン、セリン、トリプトファン、セリン、チロシ
ン、セリン、メチオニン、ロイシンにそれぞれ換えてい
る。

【０１３８】2.各種置換バージョンの抗GM2ヒト型CDR移
植抗体の一過性発現による活性評価 上記実施例3の1項（1）から（4）で構築した各種置換を
有する抗GM2ヒト型CDR移植抗体H鎖、L鎖V領域からなる
各種置換バージョンの抗GM2ヒト型CDR移植抗体を以下の
ようにして一過性発現にて活性評価を行った。まず、各
種置換を有する抗GM2ヒト型CDR移植抗体H鎖V領域の評価
を行うために、実施例2の2項（1）で得られた抗GM2ヒト
型キメラ抗体一過性発現ベクター、pT796のマウス抗体H
鎖V領域を各種置換を有する抗GM2ヒト型CDR移植抗体H鎖
V領域で置換した発現ベクター、pT796HCDRHV2、pT796HC
DRHV4、pT796HCDRH10を以下のようにして構築した。ま
た、比較のため特開平6-205694 の実施例2の1項（1）で
得られた抗GM2ヒト型CDR移植抗体H鎖V領域で置換した発
現ベクター、pT796HCDRも構築した。

【０１３９】プラスミドpT796の3μgを10μlの50mMトリ
ス−塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マ
グネシウム、1mM DTT および100μg/mlBSAからなる緩衝
液に加え、更に10単位の制限酵素EcoRI（宝酒造社製）
および制限酵素SplI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時
間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて
分画し、約9.20kbのEcoRI−SplI断片を約1μg回収し
た。 次に、実施例3の1項（3）で得られたプラスミドp
BSL16の3μgを10μlの50mMトリス−塩酸（pH7.5）、100
mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウム、1mM DTT お
よび100μg/mlBSAからなる緩衝液に加え、更に10単位の
制限酵素EcoRI（宝酒造社製）および制限酵素SplI（宝
酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液
をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.39kbのEcoR
I−SplI断片を約0.3μg回収した。

【０１４０】次に、上記で得られたpT796のEcoRI−SplI
断片0.1μgとpBSL16のEcoRI−SplI断片0.1μgを全量20
μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファ
ルマシア バイオテク社製）を用いて連結した。このよ
うにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大
腸菌HB101株を形質転換し、図37に示したプラスミドpT7
96LCDRを得た。

【０１４１】次に、上記で得られたプラスミドpT796LCD
Rの3μgを10μlの10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩
化マグネシウムおよび1mM DTT からなる緩衝液に加え、
更に10単位の制限酵素ApaI（宝酒造社製）を加えて37℃
で1時間反応させた。該反応液をエタノール沈殿し、10
μlの50mMトリス−塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウ
ム、10mM塩化マグネシウム、1mM DTT 、100μg/ml BSA
および0.01%トライトンX-100 からなる緩衝液に加え、
更に10単位の制限酵素NotI（宝酒造社製）を加えて37℃
で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳
動にて分画し、約9.11kbのApaI−NotI断片を約1μg回収
した。

【０１４２】次に、特開平6-205694の実施例2の1項
（1）で得られた抗GM2ヒト型CDR移植抗体H鎖V領域およ
び実施例3の1項（1）で得られた抗GM2ヒト型CDR移植抗
体H鎖V領域の置換バージョン2、バージョン4の各0.1μg
とpT796LCDRのApaI−NotI断片0.1μgを全量20μlの滅菌
水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア
バイオテク社製）を用いて連結した。このようにして得
られた各組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101
株を形質転換し、図38に示したプラスミドpT796HLCDR、
pT796HLCDRHV2およびpT796HLCDRHV4を得た。

【０１４３】次に、実施例3の1項（2）で得られたプラ
スミドpBSH10の3μgを10μlの10mMトリス−塩酸（pH7.
5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT からなる緩
衝液に加え、更に10単位の制限酵素ApaI（宝酒造社製）
を加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をエタノー
ル沈殿し、10μlの50mMトリス−塩酸（pH7.5）、100mM
塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウム、1mM DTT 、10
0μg/mlBSAおよび0.01%トライトンX-100 からなる緩衝
液に加え、更に10単位の制限酵素NotI（宝酒造社製）を
加えて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロース
ゲル電気泳動にて分画し、約0.44kbのApaI−NotI断片を
約0.3μg回収した。

【０１４４】次に、pBSH10のApaI−NotI断片0.1μgとpT
796LCDRのApaI−NotI断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に
加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア バ
イオテク社製）を用いて連結した。このようにして得ら
れた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を
形質転換し、図39に示したプラスミドpT796HLCDRH10を
得た。

【０１４５】次に、上記で得られた各プラスミド、pT79
6HLCDR、pT796HLCDRHV2、pT796HLCDRHV4、pT796HLCDRH1
0の3μgを10μlの50mMトリス−塩酸（pH7.5）、100mM塩
化ナトリウム、10mM塩化マグネシウム、1mM DTT および
100μg/ml BSAからなる緩衝液に加え、更に10単位の制
限酵素EcoRI（宝酒造社製）および制限酵素SplI（宝酒
造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。各反応液を
アガロースゲル電気泳動にて分画し、各々約9.15kbのEc
oRI−SplI断片を約1μg回収した。

【０１４６】次に、実施例2の1項（2）で得られたプラ
スミドpBSL3の5μgを10μlの50mMトリス−塩酸（pH7.
5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウム、1m
M DTTおよび100μg/ml BSAからなる緩衝液に加え、更に
10単位の制限酵素EcoRI（宝酒造社製）および制限酵素S
plI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該
反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.39kb
のEcoRI−SplI断片を約0.4μg回収した。

【０１４７】次に、pT796HLCDR、pT796HLCDRHV2、pT796
HLCDRHV4、pT796HLCDRH10のEcoRI−SplI断片各0.1μgと
pBSL3のEcoRI−SplI断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に
加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア バ
イオテク社製）を用いて連結した。このようにして得ら
れた各組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株
を形質転換し、図40に示したプラスミドpT796HCDR、pT7
96HCDRHV2、pT796HCDRHV4、pT796HCDRH10を得た。

【０１４８】次に、得られたプラスミドpT796HCDR、pT7
96HCDRHV2、pT796HCDRHV4、pT796HCDRH10の2μgを用い
て実施例2の1項（5）および2項（2）、（3）に記載の方
法に従って、抗GM2ヒト型CDR移植抗体の一過性発現およ
び培養上清中の抗GM2ヒト型CDR移植抗体の活性評価を行
った。各プラスミドの導入後、72時間後に培養上清を回
収し、培養上清中のGM2結合活性および抗体濃度より、
陽性コントロールであるキメラ抗体の活性を100%とした
時の相対活性値を算出した。図41に結果を示した。

【０１４９】その結果、置換バージョン2および4のアミ
ノ酸残基の置換のみでは抗GM2ヒト型CDR移植抗体の抗原
結合活性の回復にほとんど影響を与えないが、pBSH10由
来の抗GM2ヒト型CDR移植抗体H鎖V領域すなわち、既知の
ヒト抗体H鎖V領域のHMHCSを基礎として構築した抗GM2ヒ
ト型CDR移植抗体H鎖V領域を用いることで抗原結合活性
が回復することが明らかとなった。

【０１５０】以上の結果から、新しい抗GM2ヒト型CDR移
植抗体H鎖V領域として配列番号7に示した既知のヒト抗
体H鎖V領域のHMHCSを基礎として構築した抗GM2ヒト型CD
R移植抗体H鎖V領域を選択した。次に、各種置換を有す
る抗GM2ヒト型CDR移植抗体L鎖V領域の評価を行うため
に、上記で得られた抗GM2ヒト型CDR移植抗体一過性発現
ベクター、pT796HCDRH10のマウス抗体L鎖V領域を各種置
換を有する抗GM2ヒト型CDR移植抗体L鎖V領域で置換した
発現ベクター、pT796HLCDRLV1、pT796HLCDRLV2、pT796H
LCDRLV3、pT796HLCDRLV4、pT796HLCDRLV8、pT796HLCDRL
m-2 、pT796HLCDRLm-8 、pT796HLCDRLm-28、pT796HLCDR
HSGLを以下のようにして構築した。

【０１５１】プラスミドpT796HCDRH10の3μgを10μlの5
0mMトリス−塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10m
M塩化マグネシウム、1mM DTT および100μg/ml BSAから
なる緩衝液に加え、更に10単位の制限酵素EcoRI（宝酒
造社製）および制限酵素SplI（宝酒造社製）を加えて37
℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気
泳動にて分画し、約9.15kbのEcoRI−SplI断片を約1μg
回収した。

【０１５２】次に、実施例3の1項（3）、（4）で得られ
た各プラスミドpBSLV1、pBSLV2、pBSLV3、pBSLV4、pBSL
V8、pBSLm-2 、pBSLm-8 、pBSLm-28 、pBSHSGLの3μgを
10μlの50mMトリス−塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリ
ウム、10mM塩化マグネシウム、1mM DTT および100μg/m
lBSAからなる緩衝液に加え、更に10単位の制限酵素EcoR
I（宝酒造社製）および制限酵素SplI（宝酒造社製）を
加えて37℃で1時間反応させた。各反応液をアガロース
ゲル電気泳動にて分画し、各々約0.39kbのEcoRI−SplI
断片を約0.3μg回収した。

【０１５３】次に、上記で得られたpT796HCDRH10のEcoR
I−SplI断片0.1μgと各種置換バージョンの抗GM2ヒト型
CDR移植抗体L鎖V領域のEcoRI−SplI断片0.1μgを全量20
μlの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファ
ルマシア バイオテク社製）を用いて連結した。このよ
うにして得られた各組換えプラスミドDNA溶液を用いて
大腸菌HB101株を形質転換し、図42に示したプラスミドp
T796HLCDRLV1、pT796HLCDRLV2、pT796HLCDRLV3、pT796H
LCDRLV4、pT796HLCDRLV8、pT796HLCDRLm-2、pT796HLCDR
Lm-8 、pT796HLCDRLm-28 、pT796HLCDRHSGLを得た。

【０１５４】次に、得られたプラスミドpT796HLCDRLV
1、pT796HLCDRLV2、pT796HLCDRLV3、pT796HLCDRLV4、pT
796HLCDRLV8、pT796HLCDRLm-2 、pT796HLCDRLm-8 、pT7
96HLCDRLm-28 、pT796HLCDRHSGLおよび上記で得られた
特開平6-205694の実施例2に記載の抗GM2ヒト型CDR移植
抗体を発現するプラスミドpT796HLCDRの各2μgを用いて
実施例2の1項（5）および2項（2）、（3）に記載の方法
に従って、抗GM2ヒト型CDR移植抗体の一過性発現および
培養上清中の抗GM2ヒト型CDR移植抗体の活性評価を行っ
た。各プラスミドの導入後、72時間後に培養上清を回収
し、培養上清中のGM2結合活性および抗体濃度より、陽
性コントロールであるキメラ抗体の活性を100%とした時
の相対活性値を算出した。図43に結果を示した。

【０１５５】その結果、置換バージョン1、2、3、4およ
び8のアミノ酸残基の置換のみでは抗GM2ヒト型CDR移植
抗体の抗原結合活性の回復にほとんど影響を与えない
が、置換バージョンLm-2 、Lm-8 のアミノ酸残基の置換
により抗GM2ヒト型CDR移植抗体の抗原結合活性が回復す
ることが明らかとなった。そしてさらに、Lm-2とLm-8の
アミノ酸残基の置換を併せ持つ置換バージョンLm-28で
はキメラ抗体とほぼ同等の高い抗原結合活性が見られ、
Lm-28において置換させたアミノ酸残基が抗原結合活性
において極めて重要であったことが明らかとなった。

【０１５６】以上の結果から、新しい抗GM2ヒト型CDR移
植抗体L鎖V領域の第一番目として配列番号8に示した抗G
M2ヒト型CDR移植抗体L鎖V領域バージョンLm-28を選択し
た。また、pBSHSGL由来の抗GM2ヒト型CDR移植抗体L鎖V
領域すなわち、既知のヒト抗体L鎖V領域のHMHCSを基礎
として構築した抗GM2ヒト型CDR移植抗体L鎖V領域を用い
ることでも抗原結合活性が回復することが明らかとなっ
た。

【０１５７】以上の結果から、新しい抗GM2ヒト型CDR移
植抗体L鎖V領域の第二番目として配列番号9に示した既
知のヒト抗体L鎖V領域のHMHCSを基礎として構築した抗G
M2ヒト型CDR移植抗体L鎖V領域を選択した。なお、GM2に
対して高い結合活性を示した抗GM2ヒト型CDR移植抗体L
鎖V領域においては既知のヒト型CDR移植抗体の製造例か
らは推測できないアミノ酸残基をマウス抗体L鎖V領域に
見いだされるアミノ酸残基に換えており、それらアミノ
酸残基の同定が抗GM2ヒト型CDR移植抗体の製造において
極めて重要であったことが明らかとなった。

【０１５８】また、既知のヒト抗体V領域のHMHCSを基礎
とした抗GM2ヒト型CDR移植抗体H鎖、L鎖V領域を有する
抗GM2ヒト型CDR移植抗体が高い抗原結合活性を示したこ
とから、本法はヒト型CDR移植抗体の製造において有用
であることが示された。

【０１５９】3.抗GM2ヒト型CDR移植抗体の安定発現株の
取得 上記実施例3の2項（5）の結果より、特開平6-205694の
実施例2に記載の抗GM2ヒト型CDR移植抗体よりも高い抗
原結合活性を持つ抗GM2ヒト型CDR移植抗体として、H鎖V
領域として配列番号7記載のアミノ酸配列を有し、L鎖V
領域として配列番号8記載のアミノ酸配列を有するKM896
6およびH鎖V領域として配列番号7記載のアミノ酸配列を
有し、L鎖V領域として配列番号9記載のアミノ酸配列を
有するKM8967を安定に発現する細胞株KM8966およびKM89
67を以下のようにして取得した。

【０１６０】上記実施例3の2項（5）で得られたプラス
ミドpT796HLCDRLm-28 およびpT796HLCDRHSGLの3μgを10
μlの20mMトリス−塩酸（pH8.5）、100mM塩化カリウ
ム、10mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT からなる緩衝
液に加え、更に10単位の制限酵素BamHI（宝酒造社製）
を加えて37℃で1時間反応させた。各反応液をエタノー
ル沈殿し、10μlの50mMトリス−塩酸（pH7.5）、100mM
塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT
からなる緩衝液に加え、更に10単位の制限酵素XhoI（宝
酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。各反応液
をアガロースゲル電気泳動にて分画し、各々約4.93kbの
BamHI−XhoI断片を約1μg回収した。

【０１６１】次に、実施例1で得られたプラスミドpKANT
EX93の3μgを10μlの20mMトリス−塩酸（pH8.5）、100m
M塩化カリウム、10mM塩化マグネシウムおよび1mM DTT
からなる緩衝液に加え、更に10単位の制限酵素BamHI
（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反
応液をエタノール沈殿し、10μlの50mMトリス−塩酸（p
H7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウム
および1mM DTT からなる緩衝液に加え、更に10単位の制
限酵素XhoI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応さ
せた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、
約8.68kbのBamHI−XhoI断片を約1μg回収した。

【０１６２】次に、上記で得られたpT796HLCDRLm-28お
よびpT796HLCDRHSGLのBamHI−XhoI断片0.1μgとpKANTEX
93のBamHI−XhoI断片0.1μgを全量20μlの滅菌水に加
え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア バイ
オテク社製）を用いて連結した。このようにして得られ
た各組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を
形質転換し、図44に示したプラスミドpKANTEX796HLCDRL
m-28 およびpKANTEX796HLCDRHSGLを得た。

【０１６３】次に、上記で得られたプラスミドpKANTEX7
96HLCDRLm-28 およびpKANTEX796HLCDRHSGLの各4μgを用
いて実施例2の1項（4）に記載の方法に従って、YB2/0細
胞（ATCC CRL1662）を形質転換し、最終的にG418（0.5m
g/ml）およびMTX（200nM）による選択を行い、約40μg/
mlのpKANTEX796HLCDRLm-28由来の抗GM2ヒト型CDR移植抗
体、KM8966を産生する形質転換株KM8966および約30μg/
mlのpKANTEX796HLCDRHSGL由来の抗GM2ヒト型CDR移植抗
体、KM8967を産生する形質転換株KM8967を取得した。KM
8966とKM8967は平成7年5月23日付で、工業技術院生命工
学工業技術研究所( 茨城県つくば市東一丁目１番３号、
以下所在地は同様）にそれぞれFERM BP-5105、FERM BP-
5106 として寄託されている。

【０１６４】4.抗GM2ヒト型CDR移植抗体KM8966およびKM
8967の精製 上記実施例3の3項で得られた形質転換株、KM8966および
KM8967を、G418を0.5mg/ml、MTXを200nM含むGIT培地
（日本製薬社製）に懸濁し、特開平6-205694の実施例1
の11項に記載の方法に従い、約0.5リットルの培養液か
ら精製抗GM2ヒト型CDR移植抗体KM8966を18mg、KM8967を
12mg取得した。得られた精製抗GM2ヒト型CDR移植抗体お
よび抗GM2ヒト型キメラ抗体KM966の各3μgを、公知の方
法（Laemli,U. K.らのNature, 227, 680, 1970）に従っ
て電気泳動し、分子量を調べた。その結果を図45に示し
た。図45に示したように、還元条件下では抗体H鎖の分
子量は約50キロダルトン、抗体L鎖の分子量は約25キロ
ダルトンであり、正しい分子量のH鎖およびL鎖の発現が
確認された。また、非還元条件下では抗GM2ヒト型CDR移
植抗体の分子量は約150キロダルトンであり、2本のH鎖
および2本のL鎖からなる正しい大きさの抗体の発現が確
認された。また、各抗GM2ヒト型CDR移植抗体のH鎖、L鎖
のN末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサー（470
A、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて自動エ
ドマン分解により解析した結果、構築したV領域のDNA配
列から予想されるアミノ酸配列が得られた。

【０１６５】5.抗GM2ヒト型CDR移植抗体KM8966およびKM
8967のin vitroにおけるGM2との反応性 抗GM2ヒト型キメラ抗体KM966および精製した抗GM2ヒト
型CDR移植抗体KM8966、KM8967とGM2との反応性を実施例
2の1項（5）に記載のELISA法を用いて測定した結果を図
46に示した。GM2（N−アセチルGM2）は培養細胞株HPB−
ALL（大星らの蛋白質核酸酵素, 23, 697, 1978）より公
知の方法（Hanai, N.らのJ. Biol. Chem., 263, 10915,
1988）に準じて精製したものを用いた。図46より精製
抗GM2ヒト型CDR移植抗体KM8966は抗GM2ヒト型キメラ抗
体KM966と同等の結合活性を示した。一方、精製抗GM2ヒ
ト型CDR移植抗体KM8967は抗GM2ヒト型キメラ抗体KM966
の約1/4〜1/5の結合活性を示した。

【０１６６】6.抗GM2ヒト型CDR移植抗体KM8966およびKM
8967の反応特異性 ガングリオシドGM1、N−アセチルGM2、N−グリコリルGM
2、N−アセチルGM3、N−グリコリルGM3、GD1a、GD1b
（ヤトロン社製）、GD2、GD3（ヤトロン社製）、GQ1b
（ヤトロン社製）に対する抗GM2ヒト型キメラ抗体KM966
および抗GM2ヒト型CDR移植抗体KM8966、KM8967の反応性
を実施例2の1項（5）に記載のELISA法を用いて測定した
結果を図47に示した。なお、GM1とGD1aはウシ脳より、N
−アセチルGM2は培養細胞株HPB−ALL（大星らの蛋白質
核酸酵素, 23, 697, 1978）より、N−グリコリルGM2とN
−グリコリルGM3はマウス肝臓より、N−アセチルGM3は
イヌ赤血球より、GD2は培養細胞株IMR32（ATCC CCL12
7）よりそれぞれ公知の方法（Hanai, N.らのJ. Biol. C
hem., 263, 10915, 1988）に準じて精製した。

【０１６７】また、抗体溶液の濃度は10μg/mlで行っ
た。図47に示したように、抗GM2ヒト型CDR移植抗体KM89
66およびKM8967は抗GM2ヒト型キメラ抗体KM966と同様に
GM2（N−アセチルGM2、N−グリコリルGM2）に特異的に
反応することが確認された。 7.抗GM2ヒト型CDR移植抗体KM8966およびKM8967の癌細胞
との反応性 ヒト肺小細胞癌培養細胞株SBC−3（JCRB 0818）の1×10
⁶細胞をPBSに懸濁させ、マイクロチューブ（トレフ社
製）に取り、遠心分離（1,200rpm 、2分間）して細胞を
洗浄後、抗GM2ヒト型キメラ抗体KM966または精製した抗
GM2ヒト型CDR移植抗体KM8966またはKM8967を50μl（50
μg/ml）加えて撹拌し、4℃で1時間反応させた。反応
後、PBSで3回遠心分離して洗浄した後、フルオレッセイ
ンイソシアネートで蛍光標識したプロテインA（30倍希
釈、ベーリンガー マンハイム社製）20μlを加えて撹
拌後、4℃で1時間反応させた。反応後、PBSで3回遠心分
離して洗浄した後、さらにPBSに懸濁し、フローサイト
メーター、EPICS Elite（コールター社製）で解析を行
った。対照（コントロール）として抗GM2ヒト型CDR移植
抗体無添加で上記と同様の操作を行い、解析した。その
結果を図48に示した。抗GM2ヒト型CDR移植抗体KM8966お
よびKM8967は抗GM2ヒト型キメラ抗体KM966と同様にヒト
肺小細胞癌株SBC−3と強い反応を示した。

【０１６８】8.抗GM2ヒト型CDR移植抗体KM8966およびKM
8967のin vitro抗腫瘍効果：CDC活性 （1）標的細胞の調製 RPMI1640-FCS（10）培地にて培養した標的細胞SBC−3を
5×10⁶細胞/500μlに調製し、Na₂ ⁵¹CrO₄（第一化学薬品
社製）を3.7MBq添加し、37℃で1時間反応後、培地で3回
洗浄した。次いで4℃で30分間培地中に放置し、遠心分
離後、培地を加え、1×10⁶細胞/mlに調製した。 （2）補体の調製 健常人血清を調製し、ヒト補体源として用いた。

【０１６９】（3）CDC活性の測定 96ウエルU字底プレートに抗GM2ヒト型キメラ抗体KM966
または精製した抗GM2ヒト型CDR移植抗体KM8966またはKM
8967を各最終濃度0.05〜50μg/mlとなるように加え、各
々に（1）で調製した標的細胞を50μl（5×10⁴細胞/ウ
エル）添加した。室温で1時間反応後、遠心分離し、上
清を除去し、（2）で得たヒト補体を最終濃度15% V/Vと
なるように添加し、37℃で1時間反応させた。遠心分離
後、上清の ⁵¹Cr量をγ−カウンターにて測定した。自然
解離⁵¹Cr量は、標的細胞に抗体、補体溶液の代わりに培
地のみを添加し、上記と同様に上清の⁵¹Cr量を測定する
ことによって求めた。全解離⁵¹Cr量は、標的細胞に抗
体、補体溶液の代わりに1規定の塩酸を添加し、上記と
同様に上清の⁵¹Cr量を測定することによって求めた。CD
C活性は下式により求めた。

【０１７０】

【数１】

【０１７１】その結果を図49に示した。抗GM2ヒト型CDR
移植抗体KM8966およびKM8967のCDC活性は抗GM2ヒト型キ
メラ抗体KM966に比べ低いことが明らかとなった。

【０１７２】9.抗GM2ヒト型CDR移植抗体KM8966およびKM
8967のin vitro抗腫瘍効果：ADCC活性 （1）標的細胞の調製 RPMI1640-FCS（10）培地にて培養した標的細胞SBC−3を
1×10⁶細胞/500μlに調製し、Na₂ ⁵¹CrO₄（第一化学薬品
社製）を3.7MBq添加し、37℃で1時間反応後、培地で3回
洗浄した。次いで4℃で30分間培地中に放置し、遠心分
離後、培地を加え、2×10⁵細胞/mlに調製した。 （2）エフェクター細胞の調製 健常人静脈血50mlを採血し、ヘパリンナトリウム（武田
薬品社製、1,000U/ml）0.5mlを加え穏やかに混ぜた。こ
れをPolymorphprep（ナイコメッド社製）に重層後、遠
心分離し、リンパ球層（PBMC）を分離した。リンパ球を
RPMI1640-FCS（10）培地にて3回遠心分離、洗浄後、培
地に再懸濁し（5×10⁶細胞/ml）、エフェクター細胞と
した。

【０１７３】（3）ADCC活性の測定 96ウエルU字底プレートに抗GM2ヒト型キメラ抗体KM966
または精製した抗GM2ヒト型CDR移植抗体KM8966またはKM
8967を各最終濃度0.05〜50μg/mlとなるように加え、各
々に（1）で調製した標的細胞50μl（1×10⁴細胞/ウエ
ル）および（2）で調製したエフェクター細胞100μl（5
×10⁵細胞/ウエル）を添加した。37℃で4時間反応さ
せ、遠心分離後、上清の⁵¹Cr量をγ−カウンターにて測
定した。自然解離⁵¹Cr量は、標的細胞に抗体、エフェク
ター細胞の代わりに培地のみを添加し、上記と同様に上
清の⁵¹Cr量を測定することによって求めた。全解離⁵¹Cr
量は、標的細胞に抗体、エフェクター細胞の代わりに1
規定の塩酸を添加し、上記と同様に上清の⁵¹Cr量を測定
することによって求めた。ADCC活性は下式により求め
た。

【０１７４】

【数２】

【０１７５】その結果を図50に示した。抗GM2ヒト型CDR
移植抗体KM8966は抗GM2ヒト型キメラ抗体KM966と同程度
のADCC活性を示し、一方、抗GM2ヒト型CDR移植抗体KM89
67は抗GM2ヒト型キメラ抗体KM966に比べ若干低いADCC活
性を示した。

【０１７６】実施例４．抗GM2ヒト型CDR移植抗体の製造
II 実施例3で製造した抗GM2ヒト型CDR移植抗体KM8966およ
びKM8967は抗GM2ヒト型キメラ抗体KM966と同程度の抗原
結合活性、結合特異性、ADCC活性を示したが、一方、ヒ
ト補体を用いたCDC活性が低いことが明らかとなった。
そこでより高いCDC活性を有する抗GM2ヒト型CDR移植抗
体を以下のようにして製造した。

【０１７７】1.抗GM2ヒト型CDR移植抗体KM8966のH鎖V領
域の改変 実施例3で製造した抗GM2ヒト型CDR移植抗体のうち、よ
り高いCDC活性を示したKM8966のH鎖V領域（配列番号7）
のアミノ酸残基を置換させ、CDC活性の上昇を検討し
た。置換させたアミノ酸残基としては実施例3の各種置
換の結果およびマウス抗体KM796のV領域のコンピュータ
ーモデルを参考としてランダムに選択した。置換の導入
方法としては実施例3の1項（2）で得られた抗GM2ヒト型
CDR移植抗体H鎖V領域を含むプラスミドpBSH10の1ngを鋳
型として実施例3の1項（3）に記載の変異を有するアン
チセンスおよびセンスの合成DNAをプライマーとするPCR
法により行った。

【０１７８】実際には、アンチセンス変異プライマーと
して配列番号62、センス変異プライマーとして配列番号
63の合成DNAを用いて実施例3の1項（3）に記載の反応を
行うことにより配列番号64に示した抗GM2ヒト型CDR移植
抗体H鎖V領域バージョンHM1を含むプラスミドpBSHM1を
得た。HM1のアミノ酸配列においては配列番号7のFR中の
38位のアルギニン、40位のアラニン、43位のグルタミ
ン、44位のグリシンの各アミノ酸残基をマウス抗体KM79
6H鎖V領域に見い出されるアミノ酸残基であるリジン、
セリン、リジン、セリンにそれぞれ換えている。

【０１７９】また、アンチセンス変異プライマーとして
配列番号65、センス変異プライマーとして配列番号66の
合成DNAを用いて実施例3の1項（3）に記載の反応を行う
ことにより配列番号10に示した抗GM2ヒト型CDR移植抗体
H鎖V領域バージョンHM2を含むプラスミドpBSHM2を得
た。HM2のアミノ酸配列においては配列番号7のFR中の38
位のアルギニン、40位のアラニンの各アミノ酸残基をマ
ウス抗体KM796H鎖V領域に見い出されるアミノ酸残基で
あるリジン、セリンにそれぞれ換えている。

【０１８０】また、アンチセンス変異プライマーとして
配列番号67、センス変異プライマーとして配列番号68の
合成DNAを用いて実施例3の1項（3）に記載の反応を行う
ことにより配列番号69に示した抗GM2ヒト型CDR移植抗体
H鎖V領域バージョンHM3を含むプラスミドpBSHM3を得
た。HM3のアミノ酸配列においては配列番号7のFR中の68
位のバリン、70位のイソロイシンの各アミノ酸残基をマ
ウス抗体KM796H鎖V領域に見い出されるアミノ酸残基で
あるアラニン、ロイシンにそれぞれ換えている。

【０１８１】また、プラスミドpBSHM3の1ngを鋳型とし
て、アンチセンス変異プライマーとして配列番号62、セ
ンス変異プライマーとして配列番号63の合成DNAを用い
て実施例3の1項（3）に記載の反応を行うことにより配
列番号70に示した抗GM2ヒト型CDR移植抗体H鎖V領域バー
ジョンHM31を含むプラスミドpBSHM31を得た。HM31のア
ミノ酸配列においてはHM3のFR中の38位のアルギニン、4
0位のアラニン、43位のグルタミン、44位のグリシンの
各アミノ酸残基をマウス抗体KM796H鎖V領域に見い出さ
れるアミノ酸残基であるリジン、セリン、リジン、セリ
ンにそれぞれ換えている。

【０１８２】また、プラスミドpBSHM3の1ngを鋳型とし
て、アンチセンス変異プライマーとして配列番号65、セ
ンス変異プライマーとして配列番号66の合成DNAを用い
て実施例3の1項（3）に記載の反応を行うことにより配
列番号71に示した抗GM2ヒト型CDR移植抗体H鎖V領域バー
ジョンHM32を含むプラスミドpBSHM32を得た。HM32のア
ミノ酸配列においてはHM3のFR中の38位のアルギニン、4
0位のアラニンの各アミノ酸残基をマウス抗体KM796H鎖V
領域に見い出されるアミノ酸残基であるリジン、セリン
にそれぞれ換えている。

【０１８３】2.各種置換の抗GM2ヒト型CDR移植抗体H鎖V
領域を有する抗GM2ヒト型CDR移植抗体のCDC活性の評価 （1）発現ベクターの構築 上記実施例4の1項で得られた各種置換を有する抗GM2ヒ
ト型CDR移植抗体H鎖V領域とKM8966L鎖V領域（配列番号
8）を有する各種抗GM2ヒト型CDR移植抗体の発現ベクタ
ーを以下のようにして取得した。

【０１８４】上記実施例4の1項で得られたプラスミドpB
SHM1、pBSHM2、pBSHM3、pBSHM31、pBSHM32の各3μgを10
μlの10mMトリス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウ
ムおよび1mM DTT からなる緩衝液に加え、更に10単位の
制限酵素ApaI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応
させた。該反応液をエタノール沈殿し、10μlの50mMト
リス−塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化
マグネシウム、1mM DTT、100μg/ml BSAおよび0.01%ト
ライトンX-100 からなる緩衝液に加え、更に10単位の制
限酵素NotI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応さ
せた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、
約0.44kbのApaI−NotI断片を約0.2μg回収した。

【０１８５】次に、上記実施例3の3項で得られたプラス
ミドpKANTEX796HLCDRLm-28の各3μgを10μlの10mMトリ
ス−塩酸（pH7.5）、10mM塩化マグネシウムおよび1mM D
TT からなる緩衝液に加え、更に10単位の制限酵素ApaI
（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反
応液をエタノール沈殿し、10μlの50mMトリス−塩酸（p
H7.5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウ
ム、1mM DTT 、100μg/ml BSAおよび0.01%トライトンX-
100 からなる緩衝液に加え、更に10単位の制限酵素NotI
（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該反
応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約13.14kb
のApaI−NotI断片を約1μg回収した。

【０１８６】次に、上記で得られたpBSHM1、pBSHM2、pB
SHM3、pBSHM31、pBSHM32のApaI−NotI断片各0.1μgとpK
ANTEX796HLCDRLm-28のApaI−NotI断片0.1μgを全量20μ
lの滅菌水に加え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファル
マシア バイオテク社製）を用いて連結した。このよう
にして得られた各組換えプラスミドDNA溶液を用いて大
腸菌HB101株を形質転換し、図51に示したプラスミドpKA
NTEX796HM1Lm-28、pKANTEX796HM2Lm-28、pKANTEX796HM3
Lm-28、pKANTEX796HM31Lm-28、pKANTEX796HM32Lm-28を
得た。

【０１８７】（2）各種置換を有する抗GM2ヒト型CDR移
植抗体の発現 上記実施例4の2項（1）で得られたプラスミドpKANTEX79
6HM1Lm-28、pKANTEX796HM2Lm-28、pKANTEX796HM3Lm-2
8、pKANTEX796HM31Lm-28、pKANTEX796HM32Lm-28の各4μ
gを用いて実施例2の1項（4）に記載の方法に従って、YB
2/0細胞（ATCC CRL1662）を形質転換し、最終的にG418
（0.5mg/ml）およびMTX（200nM）による選択を行い、約
2〜5μg/mlの各種発現ベクターに由来する抗GM2ヒト型C
DR移植抗体を産生する形質転換株を取得した。

【０１８８】（3）各種置換を有する抗GM2ヒト型CDR移
植抗体の精製 上記実施例4の2項（2）で得られた各種形質転換株をG41
8を0.5mg/ml、MTXを200nM含むGIT培地（日本製薬社製）
に懸濁し、特開平6-205694の実施例1の11項に記載の方
法に従い、約0.6リットルの培養液から各種の精製抗GM2
ヒト型CDR移植抗体を約1〜3mg取得した。なお、各種発
現ベクターに由来する抗GM2ヒト型CDR移植抗体は以後、
便宜的に以下の名称で記述した（pKANTEX796HM1Lm-28：
M1-28 、pKANTEX796HM2Lm-28：M2-28 、pKANTEX796HM3L
m-28：M3-28 、pKANTEX796HM31Lm-28：M31-28 、pKANTE
X796HM32Lm-28：M32-28 ）。得られた各種精製抗GM2ヒ
ト型CDR移植抗体、抗GM2ヒト型CDR移植抗体KM8966およ
び抗GM2ヒト型キメラ抗体KM966の各4μgを、公知の方法
（Laemli, U. K. らのNature, 227, 680, 1970）に従っ
て電気泳動し、分子量を調べた。その結果を図52に示し
た。図52に示したように、還元条件下では抗体H鎖の分
子量は約50キロダルトン、抗体L鎖の分子量は約25キロ
ダルトンであり、正しい分子量のH鎖およびL鎖の発現が
確認された。また、非還元条件下では抗GM2ヒト型CDR移
植抗体の分子量は約150キロダルトンであり、2本のH鎖
および2本のL鎖からなる正しい大きさの抗体の発現が確
認された。 また、各種精製抗GM2ヒト型CDR移植抗体の
H鎖、L鎖のN末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサ
ー（470A、アプライド バイオシステムズ社製）を用い
て自動エドマン分解により解析した結果、構築したV領
域のDNA配列から予想されるアミノ酸配列が得られた。

【０１８９】（4）各種置換を有する抗GM2ヒト型CDR移
植抗体のCDC活性 上記実施例4の2項（3）で得られた各種置換を有する抗G
M2ヒト型CDR移植抗体、抗GM2ヒト型CDR移植抗体KM8966
および抗GM2ヒト型キメラ抗体KM966のCDC活性を上記実
施例3の8項に記載の方法に従って測定した結果を図53に
示した。図53に示したように、各種置換を有する抗GM2
ヒト型CDR移植抗体のうち、発現ベクターpKANTEX796HM2
Lm-28 に由来する抗GM2ヒト型CDR移植抗体M2-28 が最も
高いCDC活性を示し、その活性は実施例3で製造した抗GM
2ヒト型CDR移植抗体KM8966よりも高いことが明らかとな
った。この事実は実施例4の1項で作製した各種置換のう
ちバージョンHM2で置換させたアミノ酸残基がCDC活性の
上昇に極めて重要であったことを示している。バージョ
ンHM2で置換させたアミノ酸残基はマウス抗体KM796V領
域のコンピューターモデルから、L鎖V領域との相互作用
面に位置し、その置換はV領域全体の構造に影響を与え
ることが示唆されたが、そのようなアミノ酸残基は個々
の抗体により異なることが最近のヒト型CDR移植抗体の
製造において示されており、それらを正確に予測する方
法は未だ確立されておらず、本実施例は今後のヒト型CD
R移植抗体の製造において非常に重要な知見を与えるも
のである。

【０１９０】なお、発現ベクターpKANTEX796HM2Lm-28に
由来する抗GM2ヒト型CDR移植抗体M2-28 はKM8970と命名
し、KM8970を産生する形質転換株KM8970は平成8年5月9
日付で、工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM BP-
5528 として寄託されている。

【０１９１】3.抗GM2ヒト型CDR移植抗体KM8966のL鎖V領
域の改変 実施例3で製造した抗GM2ヒト型CDR移植抗体KM8966のL鎖
V領域（配列番号8）のアミノ酸残基を置換させ、CDC活
性の上昇を検討した。置換させたアミノ酸残基としては
実施例3の各種置換の結果からCDR2の構造を支持するこ
とが本ヒト型CDR移植抗体の活性に重要であることが示
唆されたため、59位のセリン残基を選択した。置換の導
入方法としては実施例3の1項（3）で得られた抗GM2ヒト
型CDR移植抗体L鎖V領域を含むプラスミドpBSLm-28の1ng
を鋳型として実施例3の1項（3）に記載の変異を有する
アンチセンスおよびセンスの合成DNAをプライマーとす
るPCR法により行った。

【０１９２】実際には、アンチセンス変異プライマーと
して配列番号72、センス変異プライマーとして配列番号
73の合成DNAを用いて実施例3の1項（3）に記載の反応を
行うことにより配列番号11に示した抗GM2ヒト型CDR移植
抗体L鎖V領域バージョンLm-28No.1 を含むプラスミドpB
SLm-28No.1 を得た。Lm-28No.1 のアミノ酸配列におい
ては配列番号83のFR中の59位のセリンをマウス抗体KM79
6L鎖V領域に見い出されるアミノ酸残基であるアラニン
に換えている。

【０１９３】4.新しい置換を持つ抗GM2ヒト型CDR移植抗
体L鎖V領域を有する抗GM2ヒト型CDR移植抗体のCDC活性
の評価 （1）発現ベクターの構築 上記実施例4の3項で得られた置換を有する抗GM2ヒト型C
DR移植抗体L鎖V領域と各種抗GM2ヒト型CDR移植抗体H鎖V
領域からなる各種抗GM2ヒト型CDR移植抗体の発現ベクタ
ーを以下のようにして取得した。

【０１９４】上記実施例4の3項で得られたプラスミドpB
SLm-28No.1の6μgを10μlの50mMトリス−塩酸（pH7.
5）、100mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウム、1m
M DTTおよび100μg/ml BSAからなる緩衝液に加え、更に
10単位の制限酵素EcoRI（宝酒造社製）および制限酵素S
plI（宝酒造社製）を加えて37℃で1時間反応させた。該
反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.39kb
のEcoRI−SplI断片を約0.4μg回収した。

【０１９５】次に、上記実施例3の3項で得られたプラス
ミドpKANTEX796HLCDRLm-28および上記実施例4の2項
（1）で得られたプラスミドpKANTEX796HM1Lm-28、pKANT
EX796HM2Lm-28、pKANTEX796HM3Lm-28の各3μgを10μlの
50mMトリス−塩酸（pH7.5）、100mM塩化ナトリウム、10
mM塩化マグネシウム、1mM DTT および100μg/ml BSAか
らなる緩衝液に加え、更に10単位の制限酵素EcoRI（宝
酒造社製）および制限酵素SplI（宝酒造社製）を加えて
37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電
気泳動にて分画し、約13.19kbのEcoRI−SplI断片を約1
μg回収した。

【０１９６】次に、上記で得られたpBSLm-28No.1のEcoR
I−SplI断片0.1μgとpKANTEX796HLCDRLm-28、pKANTEX79
6HM1Lm-28、pKANTEX796HM2Lm-28、pKANTEX796HM3Lm-28
のEcoRI−SplI断片各0.1μgを全量20μlの滅菌水に加
え、Ready-To-Go T4 DNA Ligase（ファルマシア バイ
オテク社製）を用いて連結した。このようにして得られ
た組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌HB101株を形
質転換し、図54に示したプラスミドpKANTEX796HLm-28N
o.1、pKANTEX796HM1Lm-28No.1、pKANTEX796HM2Lm-28No.
1、pKANTEX796HM3Lm-28No.1を得た。

【０１９７】（2）L鎖V領域に置換を有する抗GM2ヒト型
CDR移植抗体の発現 上記実施例4の4項（1）で得られたプラスミドpKANTEX79
6HLm-28No.1、pKANTEX796HM1Lm-28No.1、pKANTEX796HM2
Lm-28No.1、pKANTEX796HM3Lm-28No.1の各4μgを用いて
実施例2の1項（4）に記載の方法に従って、YB2/0細胞
（ATCC CRL1662）を形質転換し、最終的にG418（0.5mg/
ml）およびMTX（200nM）による選択を行い、約2〜5μg/
mlの各種発現ベクターに由来する抗GM2ヒト型CDR移植抗
体を産生する形質転換株を取得した。

【０１９８】（3）L鎖V領域に置換を有する抗GM2ヒト型
CDR移植抗体の精製 上記実施例4の4項（2）で得られた各種形質転換株をG41
8を0.5mg/ml、MTXを200nM含むGIT培地（日本製薬社製）
に懸濁し、特開平6-205694の実施例1の11項に記載の方
法に従い、約0.6リットルの培養液から各種の精製抗GM2
ヒト型CDR移植抗体を約1〜3mg取得した。なお、各種発
現ベクターに由来する抗GM2ヒト型CDR移植抗体は以後、
便宜的に以下の名称で記述した（pKANTEX796HLm-28No.
1：h796H-No.1、pKANTEX796HM1Lm-28No.1：M1-No.1 、p
KANTEX796HM2Lm-28No.1：M2-No.1、pKANTEX796HM3Lm-28
No.1：M3-No.1 ）。得られた各種精製抗GM2ヒト型CDR移
植抗体および抗GM2ヒト型キメラ抗体KM966の各4μgを、
公知の方法（Laemli, U. K. らのNature, 227, 680, 19
70）に従って電気泳動し、分子量を調べた。その結果を
図55に示した。図55に示したように、還元条件下では抗
体H鎖の分子量は約50キロダルトン、抗体L鎖の分子量は
約25キロダルトンであり、正しい分子量のH鎖およびL鎖
の発現が確認された。また、非還元条件下では抗GM2ヒ
ト型CDR移植抗体の分子量は約150キロダルトンであり、
2本のH鎖および2本のL鎖からなる正しい大きさの抗体の
発現が確認された。また、各種精製抗GM2ヒト型CDR移植
抗体のH鎖、L鎖のN末端アミノ酸配列をプロテインシー
ケンサー（470A、アプライドバイオシステムズ社製）を
用いて自動エドマン分解により解析した結果、構築した
V領域のDNA配列から予想されるアミノ酸配列が得られ
た。

【０１９９】（4）L鎖V領域に置換を有する抗GM2ヒト型
CDR移植抗体のCDC活性 上記実施例4の4項（3）で得られたL鎖V領域に置換を有
する各種抗GM2ヒト型CDR移植抗体、抗GM2ヒト型CDR移植
抗体KM8970、抗GM2ヒト型CDR移植抗体KM8966および抗GM
2ヒト型キメラ抗体KM966のCDC活性を上記実施例3の8項
に記載の方法に従って測定した結果を図56に示した。図
56に示したように、L鎖V領域にのみ置換を導入すること
により、そのCDC活性が上昇することが明らかとなった
（KM8966とh796H-No.1の活性の比較から明らかであ
る）。そしてさらにL鎖V領域の置換と共にH鎖V領域を置
換させた場合には、M2-No.1 即ち、実施例4の2項で得ら
れた抗GM2ヒト型CDR移植抗体KM8970のH鎖V領域との組み
合わせの抗体が最も高いCDC活性を示し、その活性はKM8
970と同等以上であることが明らかとなった。これらの
事実は、実施例4の3項で置換させたL鎖V領域のアミノ酸
残基がCDC活性の上昇に極めて重要であり、またKM8970
で置換させたH鎖V領域のアミノ酸残基とCDC活性の上昇
に対して協調的に作用することを示している。L鎖V領域
バージョンLm-28No.1で置換させたアミノ酸残基はマウ
ス抗体KM796V領域のコンピューターモデルからは、抗原
であるGM2との直接的な作用や各CDR残基との相互作用へ
の関与は考えられなかったが、本実施例の結果から、V
領域全体の構造維持に極めて重要であったことが示唆さ
れた。このような知見は既存のヒト化抗体製造法からは
予測不可能であり、今後のヒト型CDR移植抗体製造に対
して非常に重要な示唆を与えるであろう。

【０２００】なお、発現ベクターpKANTEX796HM2Lm-28N
o.1に由来する抗GM2ヒト型CDR移植抗体M2-No.1はKM8969
と命名し、KM8969を産生する形質転換株KM8969は平成8
年5月9日付で、工業技術院生命工学工業技術研究所にFE
RM BP-5527として寄託されている。

【０２０１】5.抗GM2ヒト型CDR移植抗体KM8969およびKM
8970のin vitroにおけるGM2との反応性 抗GM2ヒト型キメラ抗体KM966および抗GM2ヒト型CDR移植
抗体KM8969、KM8970とGM2との反応性を実施例2の1項
（5）に記載のELISA法を用いて測定した結果を図57に示
した。図57より抗GM2ヒト型CDR移植抗体KM8969およびKM
8970は抗GM2ヒト型キメラ抗体KM966と同等の結合活性を
示した。

【０２０２】6.抗GM2ヒト型CDR移植抗体KM8969およびKM
8970の反応特異性 各種ガングリオシドに対する抗GM2ヒト型キメラ抗体KM9
66および抗GM2ヒト型CDR移植抗体KM8969、KM8970の反応
性を実施例3の6項に記載の方法を用いて測定した結果を
図58に示した。図58に示したように、抗GM2ヒト型CDR移
植抗体KM8969およびKM8970は抗GM2ヒト型キメラ抗体KM9
66と同様にGM2（N−アセチルGM2、N−グリコリルGM2）
に特異的に反応することが確認された。

【０２０３】7.抗GM2ヒト型CDR移植抗体KM8969およびKM
8970の癌細胞との反応性 ヒト肺小細胞癌培養細胞株SBC−3（JCRB 0818）に対す
る抗GM2ヒト型キメラ抗体KM966および抗GM2ヒト型CDR移
植抗体KM8969、KM8970の反応性を二次抗体としてフルオ
レッセインイソシアネートで蛍光標識したウサギ抗ヒト
IgG抗体（ダコ社製）を用いて実施例3の7項に記載の方
法により測定した結果を図59に示した。図59に示したよ
うに、抗GM2ヒト型CDR移植抗体KM8969およびKM8970は抗
GM2ヒト型キメラ抗体KM966と同様にヒト肺小細胞癌株SB
C−3と強い反応を示した。

【０２０４】8.抗GM2ヒト型CDR移植抗体KM8969およびKM
8970のin vitro抗腫瘍効果：ADCC活性 ヒト肺小細胞癌培養細胞株SBC−3（JCRB 0818）に対す
る抗GM2ヒト型キメラ抗体KM966および抗GM2ヒト型CDR移
植抗体KM8966、KM8969、KM8970のADCC活性を実施例3の9
項に記載の方法に従って測定した結果を図60に示した。
図60に示したように、抗GM2ヒト型CDR移植抗体KM8969お
よびKM8970はヒト肺小細胞癌培養細胞株SBC−3に対して
抗GM2ヒト型キメラ抗体KM966と同程度のADCC活性を示し
た。

【０２０５】9.抗GM2ヒト化抗体のin vitro抗腫瘍活性
の比較：CDC活性の比較 上記実施例3、4で確立した各種の抗GM2ヒト化抗体（KM9
66、KM8966、KM8969、KM8970）のCDC活性を反応時間を
延長して比較した。具体的には上記実施例3の8項に記載
の方法のヒト補体を添加してからの反応時間を4時間と
して行った。その結果を図61に示した。図61に示したよ
うに、4時間の反応によりいずれのヒト化抗体のCDC活性
も上昇し、抗体濃度が5μg/ml以上の条件下では、抗GM2
ヒト型キメラ抗体KM966と抗GM2ヒト型CDR移植抗体KM896
6、KM8969およびKM8970は同程度のCDC活性を示すことが
明らかとなった。特に、KM8969は最も高いCDC活性を示
し、その活性は抗GM2ヒト型キメラ抗体KM966の約1/2程
度であり、実施例4の検討により、CDC活性のより高い抗
GM2ヒト型CDR移植抗体を製造することができたことが明
らかとなった。

【０２０６】以上、抗GM2ヒト型CDR移植抗体の製造およ
びその各種の活性評価を記述してきたが、それらの結果
は確立した抗GM2ヒト型CDR移植抗体がヒトの癌治療上有
用であることを示している。

【０２０７】

【発明の効果】本発明により、ヒト型キメラ抗体と同程
度のGM2に対する結合活性、結合特異性およびガングリ
オシドGM2陽性細胞に対する抗腫瘍効果を有する、ガン
グリオシドGM2に対するヒト型CDR移植抗体およびその製
造方法が提供される。

【０２０８】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【０２０９】配列番号：2 配列の長さ：17 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Tyr Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Ser 17

【０２１０】配列番号：3 配列の長さ：11 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【０２１１】配列番号：4 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【０２１２】配列番号：5 配列の長さ：7 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【０２１３】配列番号：6 配列の長さ：9 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【０２１４】配列番号：7 配列の長さ：433 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴： 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：-19..-1 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：domain 存在位置：31..35 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域1 特徴を表す記号：domain 存在位置：50..66 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域2 特徴を表す記号：domain 存在位置：99..109 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域3 配列： ATG GGA TGG AGC TGG ATC TTT CTC TTC CTC CTG TCA GGA ACT GCA GGT 48 Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 GTC CTC TCT GAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGA GCA GAG GTG AAG AAG 96 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTC TCC TGC AAG GCT TCC GGA TAC ACC TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 ACT GAC TAC AAC ATG GAC TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTC 192 Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 GAG TGG ATG GGA TAT ATT TAT CCT AAC AAT GGT GGT ACT GGC TAC AAC 240 Glu Trp Met Gly Tyr Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn 65 70 75 80 CAG AAG TTC AAG AGC AAG GTC ACC ATT ACC GTA GAC ACA TCC ACG AGC 288 Gln Lys Phe Lys Ser Lys Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 ACA GCC TAC ATG GAG CTG CAC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu His Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 TAT TAC TGT GCG ACC TAC GGT CAT TAC TAC GGC TAC ATG TTT GCT TAC 384 Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Gly His Tyr Tyr Gly Tyr Met Phe Ala Tyr 115 120 125 TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA GCC TCC ACC AAG GGC 442 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 144 C 443

【０２１５】配列番号：8 配列の長さ：390 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴： 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：-22..-1 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：domain 存在位置：24..33 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域1 特徴を表す記号：domain 存在位置：49..55 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域2 特徴を表す記号：domain 存在位置：86..96 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域3 配列： ATG CAT TTT CAA GTG CAG ATT TTC AGC TTC CTG CTA ATC AGT GCC TCA 48 Met His Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 GTC ATA ATG TCC AGA GGA GAT ATC CAG CTG ACC CAG AGC CCA AGC AGC 96 Val Ile Met Ser Arg Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 CTG AGC GCT AGC CCA GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACG TGC AGT GCC AGC 144 Leu Ser Ala Ser Pro Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser 35 40 45 TCA AGT GTA AGT TAC ATG CAC TGG TTC CAG CAG AAA CCA GGT AAG GCT 192 Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 50 55 60 CCA AAG CTT TGG ATC TAC AGC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGT GTG CCA 240 Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 TCT AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACA TCT TAC TCT CTC ACC ATC 288 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile 85 90 95 AGC CGA CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCT ACA TAC TAC TGC CAG CAA AGG 336 Ser Arg Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg 100 105 110 AGT AGT TAC CCG TAC ACG TTC GGC GGG GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA 384 Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 CGT ACG 390 Arg Thr 130

【０２１６】配列番号：9 配列の長さ：390 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴： 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：-22..-1 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：domain 存在位置：24..33 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域1 特徴を表す記号：domain 存在位置：49..55 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域2 特徴を表す記号：domain 存在位置：86..96 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域3 配列： ATG CAT TTT CAA GTG CAG ATT TTC AGC TTC CTG CTA ATC AGT GCC TCA 48 Met His Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 GTC ATA ATG TCC AGA GGA GAC ATC CAG CTG ACC CAG TCT CCA TCC TCC 96 Val Ile Met Ser Arg Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 ATG TCT GCA TCT CCA GGA GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGT AGT GCA AGT 144 Met Ser Ala Ser Pro Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser 35 40 45 TCA AGT GTA AGT TAC ATG CAC TGG TTT CAG CAG AAA CCA GGG AAA TCA 192 Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser 50 55 60 CCT AAG CTC TGG ATC TAC TCA ACT TCA AAT TTA GCT TCT GGT GTG CCA 240 Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 TCT AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACA TCT TAC TCT CTC ACC ATC 288 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile 85 90 95 AGC AGC ATG CAG CCT GAA GAT TTT GCA ACT TAT TAC TGT CAG CAA AGG 336 Ser Ser Met Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg 100 105 110 AGT AGT TAC CCG TAC ACG TTC GGC CAG GGG ACC AAG CTG GAA ATC AAA 384 Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 CGT ACG 390 Arg Thr 130

【０２１７】配列番号：10 配列の長さ：433 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴： 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：-19..-1 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：domain 存在位置：31..35 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域1 特徴を表す記号：domain 存在位置：50..66 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域2 特徴を表す記号：domain 存在位置：99..109 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域3 配列： ATG GGA TGG AGC TGG ATC TTT CTC TTC CTC CTG TCA GGA ACT GCA GGT 48 Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 GTC CTC TCT GAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGA GCA GAG GTG AAG AAG 96 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTC TCC TGC AAG GCT TCC GGA TAC ACC TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 ACT GAC TAC AAC ATG GAC TGG GTG AAG CAG AGC CCT GGA CAA GGG CTC 192 Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 GAG TGG ATG GGA TAT ATT TAT CCT AAC AAT GGT GGT ACT GGC TAC AAC 240 Glu Trp Met Gly Tyr Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn 65 70 75 80 CAG AAG TTC AAG AGC AAG GTC ACC ATT ACC GTA GAC ACA TCC ACG AGC 288 Gln Lys Phe Lys Ser Lys Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 ACA GCC TAC ATG GAG CTG CAC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu His Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 TAT TAC TGT GCG ACC TAC GGT CAT TAC TAC GGC TAC ATG TTT GCT TAC 384 Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Gly His Tyr Tyr Gly Tyr Met Phe Ala Tyr 115 120 125 TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA GCC TCC ACC AAG GGC 432 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 144 C 433

【０２１８】配列番号：11 配列の長さ：390 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴： 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：-22..-1 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：domain 存在位置：24..33 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域1 特徴を表す記号：domain 存在位置：49..55 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域2 特徴を表す記号：domain 存在位置：86..96 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域3 配列： ATG CAT TTT CAA GTG CAG ATT TTC AGC TTC CTG CTA ATC AGT GCC TCA 48 Met His Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 GTC ATA ATG TCC AGA GGA GAT ATC CAG CTG ACC CAG AGC CCA AGC AGC 96 Val Ile Met Ser Arg Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 CTG AGC GCT AGC CCA GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACG TGC AGT GCC AGC 144 Leu Ser Ala Ser Pro Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser 35 40 45 TCA AGT GTA AGT TAC ATG CAC TGG TTC CAG CAG AAA CCA GGT AAG GCT 192 Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 50 55 60 CCA AAG CTT TGG ATC TAC AGC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGT GTG CCA 240 Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 GCT AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACA TCT TAC TCT CTC ACC ATC 288 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile 85 90 95 AGC CGA CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCT ACA TAC TAC TGC CAG CAA AGG 336 Ser Arg Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg 100 105 110 AGT AGT TAC CCG TAC ACG TTC GGC GGG GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA 384 Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 CGT ACG 390 Arg Thr 130

【０２１９】配列番号：12 配列の長さ：32 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： CACTCAGTGT TAACTGAGGA GCAGGTGAAT TC 32

【０２２０】配列番号：13 配列の長さ：40 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： AGCTGAATTC ACCTGCTCCT CAGTTAACAC TGAGTGGTAC 40

【０２２１】配列番号：14 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： AATTCGTACG GTGGCTGCAC C 21

【０２２２】配列番号：15 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： GGTGCAGCCA CCGTACG 17

【０２２３】配列番号：16 配列の長さ：26 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： CTCGCGACTA GTGGGCCCGC GGCCGC 26

【０２２４】配列番号：17 配列の長さ：34 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： AGCTGCGGCC GCGGGCCCAC TAGTCGCGAG GTAC 34

【０２２５】配列番号：18 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： GTGGCGGCCG CTTGGGCCCG 20

【０２２６】配列番号：19 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： CGGGCCCAAG CGGCCGCCAC 20

【０２２７】配列番号：20 配列の長さ：36 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： CATGAATTCT TCGTACGGTT CGATAAATCG ATACCG 36

【０２２８】配列番号：21 配列の長さ：40 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： CGGTATCGAT TTATCGAACC GTACGAAGAA TTCATGAGCT 40

【０２２９】配列番号：22 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： CACGTTCGGA GGGGGGACCA AGCTGGAAAT AAAAC 35

【０２３０】配列番号：23 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： GTACGTTTTA TTTCCAGCTT GGTCCCCCCT CCGAA 35

【０２３１】配列番号：24 配列の長さ：61 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： TCGACACCAG CAAGAACACA GCCTACCTGA GACTCAGCAG CGTGACAGCC GCCGACACCG 60 C 61

【０２３２】配列番号：25 配列の長さ：60 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： CCGGATACAC ATTCACTGAC TACAACATGG ACTGGGTGAG ACAGAGCCAT GGACGAGGTC 60

【０２３３】配列番号：26 配列の長さ：442 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴： 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：-19..-1 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：domain 存在位置：31..35 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域1 特徴を表す記号：domain 存在位置：50..66 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域2 特徴を表す記号：domain 存在位置：99..109 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域3 配列： GGCCGCACC ATG GGA TGG AGC TGG ATC TTT CTC TTC CTC CTG TCA GGA ACT 51 Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr 1 5 10 GCT GGT GTC CTC TCT CAG GTC CAA CTG CAG GAG AGC GGT CCA GGT CTT 99 Ala Gly Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu 15 20 25 30 GTG AGG CCT AGC CAG ACC CTG AGC CTG ACC TGC ACC GTG TCC GGA TTC 147 Val Arg Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe 35 40 45 ACC TTC AGC GAC TAC AAC ATG GAC TGG GTG AGA CAG CCA CCT GGA CGA 195 Thr Phe Ser Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg 50 55 60 GGT CTC GAG TGG ATT GGA TAT ATT TAT CCT AAC AAT GGT GGT ACT GGC 243 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Thr Gly 65 70 75 TAC AAC CAG AAG TTC AAG AGC AGA GTG ACA ATG CTG GTC GAC ACC AGC 291 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Val Asp Thr Ser 80 85 90 AAG AAC ACA GCC TAC CTG AGA CTC AGC AGC GTG ACA GCC GCC GAC ACC 339 Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr 95 100 105 110 GCG GTC TAT TAT TGT GCA ACC TAC GGT CAT TAC TAC GGC TAC ATG TTT 387 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Gly His Tyr Tyr Gly Tyr Met Phe 115 120 125 GCT TAC TGG GGT CAA GGT ACC ACC GTC ACA GTC TCC TCA GCC TCC ACC 435 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 AAG GGC C 442 Lys Gly 144

【０２３４】配列番号：27 配列の長さ：442 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴： 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：-19..-1 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：domain 存在位置：31..35 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域1 特徴を表す記号：domain 存在位置：50..66 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域2 特徴を表す記号：domain 存在位置：99..109 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域3 配列： GGCCGCACC ATG GGA TGG AGC TGG ATC TTT CTC TTC CTC CTG TCA GGA ACT 51 Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr 1 5 10 GCT GGT GTC CTC TCT CAG GTC CAA CTG CAG GAG AGC GGT CCA GGT CTT 99 Ala Gly Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu 15 20 25 30 GTG AGG CCT AGC CAG ACC CTG AGC CTG ACC TGC ACC GTG TCC GGA TAC 147 Val Arg Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr 35 40 45 ACC TTC ACT GAC TAC AAC ATG GAC TGG GTG AGA CAG AGC CAT GGA CGA 195 Thr Phe Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ser His Gly Arg 50 55 60 GGT CTC GAG TGG ATT GGA TAT ATT TAT CCT AAC AAT GGT GGT ACT GGC 243 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Thr Gly 65 70 75 TAC AAC CAG AAG TTC AAG AGC AGA GTG ACA ATG CTG GTC GAC ACC AGC 291 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Val Asp Thr Ser 80 85 90 AAG AAC CAG TTC AGC CTG AGA CTC AGC AGC GTG ACA GCC GCC GAC ACC 339 Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr 95 100 105 110 GCG GTC TAT TAT TGT GCA ACC TAC GGT CAT TAC TAC GGC TAC ATG TTT 387 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Gly His Tyr Tyr Gly Tyr Met Phe 115 120 125 GCT TAC TGG GGT CAA GGT ACC ACC GTC ACA GTC TCC TCA GCC TCC ACC 435 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 AAG GGC C 442 Lys Gly 144

【０２３５】配列番号：28 配列の長さ：100 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： CAGGAAACAG CTATGACGCG GCCGCCACCA TGGGATGGAG CTGGATCTTT CTCTTCCTCC 60 TGTCAGGAAC TGCAGGTGTC CTCTCTGAGG TGCAGCTGGT 100

【０２３６】配列番号：29 配列の長さ：100 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： AGTCAGTGAA GGTGTATCCG GAAGCCTTGC AGGAGACCTT CACTGAGGCC CCAGGCTTCT 60 TCACCTCTGC TCCAGACTGC ACCAGCTGCA CCTCAGAGAG 100

【０２３７】配列番号：30 配列の長さ：100 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： CGGATACACC TTCACTGACT ACAACATGGA CTGGGTGCGA CAGGCCCCTG GACAAGGGCT 60 CGAGTGGATG GGATATATTT ATCCTAACAA TGGTGGTACT 100

【０２３８】配列番号：31 配列の長さ：94 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： AGCTCCATGT AGGCTGTGCT CGTGGATGTG TCTACGGTAA TGGTGACCTT GCTCTTGAAC 60 TTCTGGTTGT AGCCAGTACC ACCATTGTTA GGAT 100

【０２３９】配列番号：32 配列の長さ：96 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： AGCACAGCCT ACATGGAGCT GCACAGCCTG AGATCTGAGG ACACGGCCGT GTATTACTGT 60 GCGACCTACG GTCATTACTA CGGCTACATG TTTGCT 96

【０２４０】配列番号：33 配列の長さ：90 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： GTTTTCCCAG TCACGACGGG CCCTTGGTGG AGGCTGAGGA GACGGTGACC AGGGTTCCCT 60 GGCCCCAGTA AGCAAACATG TAGCCGTAGT 90

【０２４１】配列番号：34 配列の長さ：68 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： GTACTACTGC CAGCAAAGGA GTAGTTACCC GTACACGTTC GGCGGGGGGA CCAAGGTGGA 60 AATCAAAC 68

【０２４２】配列番号：35 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： ACTCTGTCAC CTGGGCTAGC GCTCA 25

【０２４３】配列番号：36 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： TGAGCGCTAG CCCAGGTGAC AGAGT 25

【０２４４】配列番号：37 配列の長さ：390 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴： 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：-22..-1 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：domain 存在位置：24..33 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域1 特徴を表す記号：domain 存在位置：49..55 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域2 特徴を表す記号：domain 存在位置：86..96 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域3 配列： ATG CAT TTT CAA GTG CAG ATT TTC AGC TTC CTG CTA ATC AGT GCC TCA 48 Met His Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 GTC ATA ATG TCC AGA GGA GAT ATC CAG CTG ACC CAG AGC CCA AGC AGC 96 Val Ile Met Ser Arg Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 CTG AGC GCT AGC CCA GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACG TGC AGT GCC AGC 144 Leu Ser Ala Ser Pro Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser 35 40 45 TCA AGT GTA AGT TAC ATG CAC TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGT AAG GCT 192 Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 50 55 60 CCA AAG CTT CTG ATC TAC AGC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGT GTG CCA 240 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 TCT AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACA GAC TTC ACC TTC ACC ATC 288 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile 85 90 95 AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCT ACA TAC TAC TGC CAG CAA AGG 336 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg 100 105 110 AGT AGT TAC CCG TAC ACG TTC GGC GGG GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA 384 Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 CGT ACG 390 Arg Thr 130

【０２４５】配列番号：38 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： GTGCTGTAGA TCCAAAGCTT TGGAG 25

【０２４６】配列番号：39 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： CTCCAAAGCT TTGGATCTAC AGCAC 25

【０２４７】配列番号：40 配列の長さ：390 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴： 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：-22..-1 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：domain 存在位置：24..33 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域1 特徴を表す記号：domain 存在位置：49..55 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域2 特徴を表す記号：domain 存在位置：86..96 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域3 配列： ATG CAT TTT CAA GTG CAG ATT TTC AGC TTC CTG CTA ATC AGT GCC TCA 48 Met His Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 GTC ATA ATG TCC AGA GGA GAT ATC CAG CTG ACC CAG AGC CCA AGC AGC 96 Val Ile Met Ser Arg Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 CTG AGC GCT AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACG TGC AGT GCC AGC 144 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser 35 40 45 TCA AGT GTA AGT TAC ATG CAC TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGT AAG GCT 192 Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 50 55 60 CCA AAG CTT TGG ATC TAC AGC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGT GTG CCA 240 Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 TCT AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACA GAC TTC ACC TTC ACC ATC 288 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile 85 90 95 AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCT ACA TAC TAC TGC CAG CAA AGG 336 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg 100 105 110 AGT AGT TAC CCG TAC ACG TTC GGC GGG GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA 384 Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 CGT ACG 390 Arg Thr 130

【０２４８】配列番号：41 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： ACGTAGCAGC ATCTTCAGCC TGGAG 25

【０２４９】配列番号：42 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： CTCCAGGCTG AAGATGCTGC TACGT 25

【０２５０】配列番号：43 配列の長さ：390 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴： 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：-22..-1 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：domain 存在位置：24..33 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域1 特徴を表す記号：domain 存在位置：49..55 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域2 特徴を表す記号：domain 存在位置：86..96 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域3 配列： ATG CAT TTT CAA GTG CAG ATT TTC AGC TTC CTG CTA ATC AGT GCC TCA 48 Met His Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 GTC ATA ATG TCC AGA GGA GAT ATC CAG CTG ACC CAG AGC CCA AGC AGC 96 Val Ile Met Ser Arg Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 CTG AGC GCT AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACG TGC AGT GCC AGC 144 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser 35 40 45 TCA AGT GTA AGT TAC ATG CAC TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGT AAG GCT 192 Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 50 55 60 CCA AAG CTT CTG ATC TAC AGC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGT GTG CCA 240 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 TCT AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACA GAC TTC ACC TTC ACC ATC 288 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile 85 90 95 AGC AGC CTC CAG GCT GAA GAT GCT GCT ACA TAC TAC TGC CAG CAA AGG 336 Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg 100 105 110 AGT AGT TAC CCG TAC ACG TTC GGC GGG GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA 384 Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 CGT ACG 390 Arg Thr 130

【０２５１】配列番号：44 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： ATGGTGAAAG AGTAAGATGT ACCGC 25

【０２５２】配列番号：45 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： GCGGTACATC TTACTCTTTC ACCAT 25

【０２５３】配列番号：46 配列の長さ：390 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴： 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：-22..-1 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：domain 存在位置：24..33 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域1 特徴を表す記号：domain 存在位置：49..55 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域2 特徴を表す記号：domain 存在位置：86..96 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域3 配列： ATG CAT TTT CAA GTG CAG ATT TTC AGC TTC CTG CTA ATC AGT GCC TCA 48 Met His Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 GTC ATA ATG TCC AGA GGA GAT ATC CAG CTG ACC CAG AGC CCA AGC AGC 96 Val Ile Met Ser Arg Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 CTG AGC GCT AGC CCA GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACG TGC AGT GCC AGC 144 Leu Ser Ala Ser Pro Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser 35 40 45 TCA AGT GTA AGT TAC ATG CAC TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGT AAG GCT 192 Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 50 55 60 CCA AAG CTT TGG ATC TAC AGC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGT GTG CCA 240 Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 TCT AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACA TCT TAC TCT TTC ACC ATC 288 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Phe Thr Ile 85 90 95 AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCT ACA TAC TAC TGC CAG CAA AGG 336 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg 100 105 110 AGT AGT TAC CCG TAC ACG TTC GGC GGG GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA 384 Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 CGT ACG 390 Arg Thr 130

【０２５４】配列番号：47 配列の長さ：40 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： TCTGGCTCCA TTCGGCTGAT GGTGAAAGAG TAAGATGTAC 40

【０２５５】配列番号：48 配列の長さ：40 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： GTACATCTTA CTCTTTCACC ATCAGCCGAA TGGAGCCAGA 40

【０２５６】配列番号：49 配列の長さ：390 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴： 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：-22..-1 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：domain 存在位置：24..33 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域1 特徴を表す記号：domain 存在位置：49..55 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域2 特徴を表す記号：domain 存在位置：86..96 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域3 配列： ATG CAT TTT CAA GTG CAG ATT TTC AGC TTC CTG CTA ATC AGT GCC TCA 48 Met His Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 GTC ATA ATG TCC AGA GGA GAT ATC CAG CTG ACC CAG AGC CCA AGC AGC 96 Val Ile Met Ser Arg Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 CTG AGC GCT AGC CCA GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACG TGC AGT GCC AGC 144 Leu Ser Ala Ser Pro Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser 35 40 45 TCA AGT GTA AGT TAC ATG CAC TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGT AAG GCT 192 Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 50 55 60 CCA AAG CTT TGG ATC TAC AGC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGT GTG CCA 240 Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 TCT AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACA TCT TAC TCT TTC ACC ATC 288 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Phe Thr Ile 85 90 95 AGC CGA ATG GAG CCA GAG GAC ATC GCT ACA TAC TAC TGC CAG CAA AGG 336 Ser Arg Met Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg 100 105 110 AGT AGT TAC CCG TAC ACG TTC GGC GGG GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA 384 Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 CGT ACG 390 Arg Thr 130

【０２５７】配列番号：50 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： TTCTGCTGGA ACCAGTGCAT 20

【０２５８】配列番号：51 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： ATGCACTGGT TCCAGCAGAA 20

【０２５９】配列番号：52 配列の長さ：390 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴： 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：-22..-1 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：domain 存在位置：24..33 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域1 特徴を表す記号：domain 存在位置：49..55 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域2 特徴を表す記号：domain 存在位置：86..96 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域3 配列： ATG CAT TTT CAA GTG CAG ATT TTC AGC TTC CTG CTA ATC AGT GCC TCA 48 Met His Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 GTC ATA ATG TCC AGA GGA GAT ATC CAG CTG ACC CAG AGC CCA AGC AGC 96 Val Ile Met Ser Arg Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 CTG AGC GCT AGC CCA GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACG TGC AGT GCC AGC 144 Leu Ser Ala Ser Pro Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser 35 40 45 TCA AGT GTA AGT TAC ATG CAC TGG TTC CAG CAG AAA CCA GGT AAG GCT 192 Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 50 55 60 CCA AAG CTT TGG ATC TAC AGC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGT GTG CCA 240 Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 TCT AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACA TCT TAC TCT TTC ACC ATC 288 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Phe Thr Ile 85 90 95 AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCT ACA TAC TAC TGC CAG CAA AGG 336 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg 100 105 110 AGT AGT TAC CCG TAC ACG TTC GGC GGG GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA 384 Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 CGT ACG 390 Arg Thr 130

【０２６０】配列番号：53 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： TGGAGTCGGC TGATGGTGAG AGAGT 25

【０２６１】配列番号：54 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： ACTCTCTCAC CATCAGCCGA CTCCA 25

【０２６２】配列番号：55 配列の長さ：390 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴： 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：-22..-1 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：domain 存在位置：24..33 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域1 特徴を表す記号：domain 存在位置：49..55 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域2 特徴を表す記号：domain 存在位置：86..96 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域3 配列： ATG CAT TTT CAA GTG CAG ATT TTC AGC TTC CTG CTA ATC AGT GCC TCA 48 Met His Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 GTC ATA ATG TCC AGA GGA GAT ATC CAG CTG ACC CAG AGC CCA AGC AGC 96 Val Ile Met Ser Arg Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 CTG AGC GCT AGC CCA GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACG TGC AGT GCC AGC 144 Leu Ser Ala Ser Pro Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser 35 40 45 TCA AGT GTA AGT TAC ATG CAC TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGT AAG GCT 192 Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 50 55 60 CCA AAG CTT TGG ATC TAC AGC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGT GTG CCA 240 Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 TCT AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACA TCT TAC TCT CTC ACC ATC 288 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile 85 90 95 AGC CGA CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCT ACA TAC TAC TGC CAG CAA AGG 336 Ser Arg Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg 100 105 110 AGT AGT TAC CCG TAC ACG TTC GGC GGG GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA 384 Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 CGT ACG 390 Arg Thr 130

【０２６３】配列番号：56 配列の長さ：94 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： CAGGAAACAG CTATGACGAA TTCCACCATG CATTTTCAAG TGCAGATTTT CAGCTTCCTG 60 CTAATCAGTG CCTCAGTCAT AATGTCCAGA GGAG 94

【０２６４】配列番号：57 配列の長さ：88 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： ACAAGTGATG GTGACTCTGT CTCCTGGAGA TGCAGACATG GAGGATGGAG ACTGGGTCAG 60 CTGGATGTCT CCTCTGGACA TTATGACT 88

【０２６５】配列番号：58 配列の長さ：92 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： ACAGAGTCAC CATCACTTGT AGTGCAAGTT CAAGTGTAAG TTACATGCAC TGGTTTCAGC 60 AGAAACCAGG GAAATCACCT AAGCTCTGGA TC 92

【０２６６】配列番号：59 配列の長さ：87 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： AAGATGTACC GCTACCGCTA CCGCTGAATC TAGATGGCAC ACCAGAAGCT AAATTTGAAG 60 TTGAGTAGAT CCAGAGCTTA GGTGATT 87

【０２６７】配列番号：60 配列の長さ：89 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： TAGCGGTAGC GGTACATCTT ACTCTCTCAC CATCAGCAGC ATGCAGCCTG AAGATTTTGC 60 AACTTATTAC TGTCAGCAAA GGAGTAGTT 89

【０２６８】配列番号：61 配列の長さ：84 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： GTTTTCCCAG TCACGACCGT ACGTTTGATT TCCAGCTTGG TCCCCTGGCC GAACGTGTAC 60 GGGTAACTAC TCCTTTGCTG ACAG 84

【０２６９】配列番号：62 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： ACTCGAGGCT CTTTCCAGGG CTCTGCTTCA CCCAG 35

【０２７０】配列番号：63 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： CTGGGTGAAG CAGAGCCCTG GAAAGAGCCT CGAGT 35

【０２７１】配列番号：64 配列の長さ：433 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴： 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：-19..-1 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：domain 存在位置：31..35 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域1 特徴を表す記号：domain 存在位置：50..66 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域2 特徴を表す記号：domain 存在位置：99..109 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域3 配列： ATG GGA TGG AGC TGG ATC TTT CTC TTC CTC CTG TCA GGA ACT GCA GGT 48 Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 GTC CTC TCT GAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGA GCA GAG GTG AAG AAG 96 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTC TCC TGC AAG GCT TCC GGA TAC ACC TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 ACT GAC TAC AAC ATG GAC TGG GTG AAG CAG AGC CCT GGA AAG AGC CTC 192 Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Lys Ser Leu 50 55 60 GAG TGG ATG GGA TAT ATT TAT CCT AAC AAT GGT GGT ACT GGC TAC AAC 240 Glu Trp Met Gly Tyr Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn 65 70 75 80 CAG AAG TTC AAG AGC AAG GTC ACC ATT ACC GTA GAC ACA TCC ACG AGC 288 Gln Lys Phe Lys Ser Lys Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 ACA GCC TAC ATG GAG CTG CAC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu His Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 TAT TAC TGT GCG ACC TAC GGT CAT TAC TAC GGC TAC ATG TTT GCT TAC 384 Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Gly His Tyr Tyr Gly Tyr Met Phe Ala Tyr 115 120 125 TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA GCC TCC ACC AAG GGC 432 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 144 C 433

【０２７２】配列番号：65 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： TGTCCAGGGC TCTGCTTCAC CCAG 24

【０２７３】配列番号：66 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： CTGGGTGAAG CAGAGCCCTG GACA 24

【０２７４】配列番号：67 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： TCTACGGTCA AGGTGGCCTT GCTCT 25

【０２７５】配列番号：68 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： AGAGCAAGGC CACCTTGACC GTAGA 25

【０２７６】配列番号：69 配列の長さ：433 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴： 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：-19..-1 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：domain 存在位置：31..35 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域1 特徴を表す記号：domain 存在位置：50..66 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域2 特徴を表す記号：domain 存在位置：99..109 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域3 配列： ATG GGA TGG AGC TGG ATC TTT CTC TTC CTC CTG TCA GGA ACT GCA GGT 48 Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 GTC CTC TCT GAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGA GCA GAG GTG AAG AAG 96 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTC TCC TGC AAG GCT TCC GGA TAC ACC TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 ACT GAC TAC AAC ATG GAC TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTC 192 Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 GAG TGG ATG GGA TAT ATT TAT CCT AAC AAT GGT GGT ACT GGC TAC AAC 240 Glu Trp Met Gly Tyr Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn 65 70 75 80 CAG AAG TTC AAG AGC AAG GCC ACC TTG ACC GTA GAC ACA TCC ACG AGC 288 Gln Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 ACA GCC TAC ATG GAG CTG CAC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu His Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 TAT TAC TGT GCG ACC TAC GGT CAT TAC TAC GGC TAC ATG TTT GCT TAC 384 Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Gly His Tyr Tyr Gly Tyr Met Phe Ala Tyr 115 120 125 TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA GCC TCC ACC AAG GGC 432 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 144 C 433

【０２７７】配列番号：70 配列の長さ：433 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴： 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：-19..-1 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：domain 存在位置：31..35 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域1 特徴を表す記号：domain 存在位置：50..66 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域2 特徴を表す記号：domain 存在位置：99..109 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域3 配列： ATG GGA TGG AGC TGG ATC TTT CTC TTC CTC CTG TCA GGA ACT GCA GGT 48 Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 GTC CTC TCT GAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGA GCA GAG GTG AAG AAG 96 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTC TCC TGC AAG GCT TCC GGA TAC ACC TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 ACT GAC TAC AAC ATG GAC TGG GTG AAG CAG AGC CCT GGA AAG AGC CTC 192 Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Lys Ser Leu 50 55 60 GAG TGG ATG GGA TAT ATT TAT CCT AAC AAT GGT GGT ACT GGC TAC AAC 240 Glu Trp Met Gly Tyr Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn 65 70 75 80 CAG AAG TTC AAG AGC AAG GCC ACC TTG ACC GTA GAC ACA TCC ACG AGC 288 Gln Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 ACA GCC TAC ATG GAG CTG CAC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu His Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 TAT TAC TGT GCG ACC TAC GGT CAT TAC TAC GGC TAC ATG TTT GCT TAC 384 Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Gly His Tyr Tyr Gly Tyr Met Phe Ala Tyr 115 120 125 TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA GCC TCC ACC AAG GGC 432 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 144 C 433

【０２７８】配列番号：71 配列の長さ：433 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴： 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：-19..-1 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：domain 存在位置：31..35 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域1 特徴を表す記号：domain 存在位置：50..66 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域2 特徴を表す記号：domain 存在位置：99..109 特徴を決定した方法：S 他の情報：超可変部領域3 配列： ATG GGA TGG AGC TGG ATC TTT CTC TTC CTC CTG TCA GGA ACT GCA GGT 48 Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 GTC CTC TCT GAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGA GCA GAG GTG AAG AAG 96 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTC TCC TGC AAG GCT TCC GGA TAC ACC TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 ACT GAC TAC AAC ATG GAC TGG GTG AAG CAG AGC CCT GGA CAA GGG CTC 192 Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 GAG TGG ATG GGA TAT ATT TAT CCT AAC AAT GGT GGT ACT GGC TAC AAC 240 Glu Trp Met Gly Tyr Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn 65 70 75 80 CAG AAG TTC AAG AGC AAG GCC ACC TTG ACC GTA GAC ACA TCC ACG AGC 288 Gln Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 ACA GCC TAC ATG GAG CTG CAC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu His Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 TAT TAC TGT GCG ACC TAC GGT CAT TAC TAC GGC TAC ATG TTT GCT TAC 384 Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Gly His Tyr Tyr Gly Tyr Met Phe Ala Tyr 115 120 125 TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA GCC TCC ACC AAG GGC 432 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 144 C 433

【０２７９】配列番号：72 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： TGAATCTAGC TGGCACACCA 20

【０２８０】配列番号：73 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： TGGTGTGCCA GCTAGATTCA 20

【図面の簡単な説明】

【図1】はプラスミドpBSAの造成工程を示した図であ
る。

【図2】はプラスミドpBSAEの造成工程を示した図であ
る。

【図3】はプラスミドpBSH-Sの造成工程を示した図であ
る。

【図4】はプラスミドpBSK-Hの造成工程を示した図であ
る。

【図5】はプラスミドpBSH-SAおよびpBSK-HAの造成工程
を示した図である。

【図6】はプラスミドpBSH-SAEおよびpBSK-HAEの造成工
程を示した図である。

【図7】はプラスミドpBSH-SAEEおよびpBSK-HAEEの造成
工程を示した図である。

【図8】はプラスミドpBSK-HAEESalの造成工程を示した
図である。

【図9】はプラスミドpBSX-Sの造成工程を示した図であ
る。

【図10】はプラスミドpBSX-SAの造成工程を示した図で
ある。

【図11】はプラスミドpBSSCの造成工程を示した図であ
る。

【図12】はプラスミドpBSMoの造成工程を示した図であ
る。

【図13】はプラスミドpBSMoSの造成工程を示した図であ
る。

【図14】はプラスミドpChiIgLA1Sの造成工程を示した図
である。

【図15】はプラスミドpMohCκの造成工程を示した図で
ある。

【図16】はプラスミドpBSMoSalの造成工程を示した図で
ある。

【図17】はプラスミドpBSMoSalSの造成工程を示した図
である。

【図18】はプラスミドpBShCγ1の造成工程を示した図で
ある。

【図19】はプラスミドpMohCγ1の造成工程を示した図で
ある。

【図20】はプラスミドpMoγ1SPの造成工程を示した図で
ある。

【図21】はプラスミドpMoκγ1SPの造成工程を示した図
である。

【図22】はプラスミドpKANTEX93の造成工程を示した図
である。

【図23】はプラスミドpBSNAの造成工程を示した図であ
る。

【図24】はプラスミドpBSH3の造成工程を示した図であ
る。

【図25】はプラスミドpBSESの造成工程を示した図であ
る。

【図26】はプラスミドpBSL3の造成工程を示した図であ
る。

【図27】はプラスミドpKANTEX796Hの造成工程を示した
図である。

【図28】はプラスミドpKANTEX796の造成工程を示した図
である。

【図29】はプラスミドpT796の造成工程を示した図であ
る。

【図30】はプラスミドpKANTEX796およびpT796による抗G
M2ヒト型キメラ抗体の一過性発現を示した図である。縦
軸はGM2結合活性を示した抗体濃度、横軸はプラスミド
を導入してからの時間をそれぞれ示す。

【図31】はプラスミドpBSH10の造成工程を示した図であ
る。

【図32】はプラスミドpBSL16の造成工程を示した図であ
る。

【図33】はPCRによる変異導入法および変異の導入され
たDNA断片のクローニング工程を示した図である

【図34】はプラスミドpBSLV1+2の造成工程を示した図で
ある。

【図35】はプラスミドpBSLm-28の造成工程を示した図で
ある。

【図36】はプラスミドpBSHSGLの造成工程を示した図で
ある。

【図37】はプラスミドpT796LCDRの造成工程を示した図
である。

【図38】はプラスミドpT796HLCDR、pT796HLCDRHV2、pT7
96HLCDRHV4の造成工程を示した図である。

【図39】はプラスミドpT796HLCDRH10の造成工程を示し
た図である。

【図40】はプラスミドpT796HCDR、pT796HCDRHV2、pT796
HCDRHV4、pT796HCDRH10の造成工程を示した図である。

【図41】はプラスミドpT796、pT796HCDR、pT796HCDRHV
2、pT796HCDRHV4、pT796HCDRH10を用いた抗GM2ヒト型CD
R移植抗体の一過性発現による活性評価を示した図であ
る。縦軸に用いたプラスミド、横軸にキメラ抗体の活性
を100%とした時の相対活性値をそれぞれ示す。

【図42】はプラスミドpT796HLCDRLV1、pT796HLCDRLV2、
pT796HLCDRLV3、pT796HLCDRLV4、pT796HLCDRLV8、pT796
HLCDRLm-2、pT796HLCDRLm-8、pT796HLCDRLm-28、pT796H
LCDRHSGLの造成工程を示した図である。

【図43】はプラスミドpT796、pT796HLCDR、pT796HLCDRL
V1、pT796HLCDRLV2、pT796HLCDRLV3、pT796HLCDRLV4、p
T796HLCDRLV8、pT796HLCDRLm-2、pT796HLCDRLm-8、pT79
6HLCDRLm-28、pT796HLCDRHSGLを用いた抗GM2ヒト型CDR
移植抗体の一過性発現による活性評価を示した図であ
る。縦軸に用いたプラスミド、横軸にキメラ抗体の活性
を100%とした時の相対活性値をそれぞれ示す。

【図44】はプラスミドpKANTEX796HLCDRLm-28、pKANTEX7
96HLCDRHSGLの造成工程を示した図である。

【図45】は抗GM2ヒト型キメラ抗体KM966と精製した抗GM
2ヒト型CDR移植抗体KM8966およびKM8967のSDS-PAGE（4
〜15%グラジエントゲルを使用）の電気泳動パターンを
示した図である。左側が非還元条件、右側が還元条件で
それぞれ電気泳動を行った図である。レーンの左側よ
り、高分子マーカー、KM966、KM8966、KM8967、低分子
マーカー、KM966、KM8966、KM8967の泳動パターンをそ
れぞれ示す。

【図46】は抗GM2ヒト型キメラ抗体KM966と精製した抗GM
2ヒト型CDR移植抗体KM8966およびKM8967のGM2との結合
活性を示した図である。縦軸はGM2との結合活性、横軸
は抗体濃度をそれぞれ示す。

【図47】は抗GM2ヒト型キメラ抗体KM966と精製した抗GM
2ヒト型CDR移植抗体KM8966およびKM8967の各種ガングリ
オシドとの反応性を示した図である。縦軸にガングリオ
シドの種類、横軸に結合活性をそれぞれ示す。AcGM2はN
-アセチルGM2、GcGM2はN-グリコリルGM2、AcGM3はN-ア
セチルGM3、GcGM3はN-グリコリルGM3を示す。

【図48】は抗GM2ヒト型キメラ抗体KM966と精製した抗GM
2ヒト型CDR移植抗体KM8966およびKM8967のヒト肺小細胞
癌株SBC-3との反応性を示した図である。縦軸に細胞
数、横軸に蛍光強度をそれぞれ示す。下段より、コント
ロール、KM8967、KM8966、KM966の反応性をそれぞれ示
す。

【図49】は抗GM2ヒト型キメラ抗体KM966と精製した抗GM
2ヒト型CDR移植抗体KM8966およびKM8967のヒト肺小細胞
癌株SBC-3に対するCDC活性を示した図である。縦軸に細
胞障害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。

【図50】は抗GM2ヒト型キメラ抗体KM966と精製した抗GM
2ヒト型CDR移植抗体KM8966およびKM8967のヒト肺小細胞
癌株SBC-3に対するADCC活性を示した図である。縦軸に
細胞障害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。

【図51】はプラスミドpKANTEX796HM1Lm-28、pKANTEX796
HM2Lm-28、pKANTEX796HM3Lm-28、pKANTEX796HM31Lm-2
8、pKANTEX796HM32Lm-28の造成工程を示した図である。

【図52】は抗GM2ヒト型キメラ抗体KM966、抗GM2ヒト型C
DR移植抗体KM8966および各種置換を有する抗GM2ヒト型C
DR移植抗体のSDS-PAGE（4〜15%グラジエントゲルを使
用）の電気泳動パターンを示した図である。左側が非還
元条件、右側が還元条件でそれぞれ電気泳動を行った図
である。Mが分子量マーカー（矢印で示した、上から205
Kd、140Kd、83Kd、45Kd、32.6Kd、18Kd、7.5Kdを示
す）、1がKM966、2がKM8966、3がM1-28、4がM2-28、5が
M3-28、6がM31-28、7がM32-28の泳動パターンをそれぞ
れ示す。

【図53】は抗GM2ヒト型キメラ抗体KM966、抗GM2ヒト型C
DR移植抗体KM8966および各種置換を有する抗GM2ヒト型C
DR移植抗体のヒト肺小細胞癌株SBC-3に対するCDC活性を
示した図である。縦軸に細胞障害活性、横軸に抗体濃度
をそれぞれ示す。

【図54】はプラスミドpKANTEX796HLm-28No.1、pKANTEX7
96HM1Lm-28No.1、pKANTEX796HM2Lm-28No.1、pKANTEX796
HM3Lm-28No.1の造成工程を示した図である。

【図55】は抗GM2ヒト型キメラ抗体KM966および各種置換
を有する抗GM2ヒト型CDR移植抗体のSDS-PAGE（4〜15%グ
ラジエントゲルを使用）の電気泳動パターンを示した図
である。左側が非還元条件、右側が還元条件でそれぞれ
電気泳動を行った図である。Mが分子量マーカー（矢印
で示した、上から205Kd、140Kd、83Kd、45Kd、32.6Kd、
18Kd、7.5Kdを示す）、1がKM966、2がh796H-No.1、3がM
1-No.1、4がM2-No.1、5がM3-No.1の泳動パターンをそれ
ぞれ示す。

【図56】は抗GM2ヒト型キメラ抗体KM966、抗GM2ヒト型C
DR移植抗体KM8966、KM8970および各種置換を有する抗GM
2ヒト型CDR移植抗体のヒト肺小細胞癌株SBC-3に対するC
DC活性を示した図である。縦軸に細胞障害活性、横軸に
抗体濃度をそれぞれ示す。

【図57】は抗GM2ヒト型キメラ抗体KM966と抗GM2ヒト型C
DR移植抗体KM8969およびKM8970のGM2との結合活性を示
した図である。縦軸はGM2との結合活性、横軸は抗体濃
度をそれぞれ示す。

【図58】は抗GM2ヒト型キメラ抗体KM966と抗GM2ヒト型C
DR移植抗体KM8969およびKM8970の各種ガングリオシドと
の反応性を示した図である。縦軸にガングリオシドの種
類、横軸に結合活性をそれぞれ示す。AcGM2はN-アセチ
ルGM2、GcGM2はN-グリコリルGM2、AcGM3はN-アセチルGM
3、GcGM3はN-グリコリルGM3を示す。

【図59】は抗GM2ヒト型キメラ抗体KM966と抗GM2ヒト型C
DR移植抗体KM8969およびKM8970のヒト肺小細胞癌株SBC-
3との反応性を示した図である。縦軸に細胞数、横軸に
蛍光強度をそれぞれ示す。下段より、コントロール、KM
966、KM8970、KM8969の反応性をそれぞれ示す。

【図60】は抗GM2ヒト型キメラ抗体KM966と抗GM2ヒト型C
DR移植抗体KM8966、KM8969およびKM8970のヒト肺小細胞
癌株SBC-3に対するADCC活性を示した図である。縦軸に
細胞障害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。

【図61】は抗GM2ヒト型キメラ抗体KM966と抗GM2ヒト型C
DR移植抗体KM8966、KM8969およびKM8970のヒト肺小細胞
癌株SBC-3に対するCDC活性をヒト補体を加えてからの反
応時間が1時間と4時間で比較した図である。縦軸に細胞
障害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。(1) とは、
反応時間が１時間を示し、(4) とは、反応時間が４時間
を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/531 Ａ 33/531 33/574 Ａ 33/574 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 抗体の重鎖（H鎖）可変領域（V領域）の
   CDR１〜３が、配列番号１〜３記載のアミノ酸配列、抗
   体の軽鎖（L鎖）V領域のCDR１〜３が、配列番号４〜６
   記載のアミノ酸配列からなり、H鎖およびL鎖V領域のフ
   レームワーク（FR）のうち、少なくともどちらか一方が
   ヒト抗体の各サブグループに由来する共通配列（HMHCS;
   Human Most Homologous Consensus Sequence) から選択
   されたアミノ酸配列を含む、ガングリオシドGM2に特異
   的に反応するヒト型CDR移植抗体。
2. 【請求項２】 請求項１記載のFRが、ガングリオシドGM
   2に特異的に反応するヒト以外の動物由来モノクローナ
   ル抗体のFRと高い相同性を有したHMHCSのFRのアミノ酸
   配列である、ガングリオシドGM2に特異的に反応するヒ
   ト型CDR移植抗体。
3. 【請求項３】 請求項１記載のヒト型CDR移植抗体のH鎖
   またはL鎖V領域のFRにおいて、１個以上のアミノ酸が他
   のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列からなり、かつ、
   ガングリオシドGM2に特異的に反応するヒト以外の動物
   由来モノクローナル抗体の可変領域を有するヒト型キメ
   ラ抗体と同程度の抗原結合活性および結合特異性を有す
   るヒト型CDR移植抗体。
4. 【請求項４】 請求項１記載のヒト型CDR移植抗体のH鎖
   またはL鎖V領域のFRにおいて、１個以上のアミノ酸が他
   のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列からなり、かつ、
   ガングリオシドGM2に特異的に反応するヒト以外の動物
   由来モノクローナル抗体の可変領域を有するヒト型キメ
   ラ抗体と同程度の抗体依存性細胞傷害活性（ADCC）を有
   するヒト型CDR移植抗体。
5. 【請求項５】 請求項１記載のヒト型CDR移植抗体のH鎖
   またはL鎖V領域のFRにおいて、１個以上のアミノ酸が他
   のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列からなり、かつ、
   ガングリオシドGM2に特異的に反応するヒト以外の動物
   由来モノクローナル抗体の可変領域を有するヒト型キメ
   ラ抗体と同程度の補体依存性細胞傷害活性（CDC）を有
   するヒト型CDR移植抗体。
6. 【請求項６】 請求項３〜５において、他のアミノ酸
   が、ヒト以外の動物由来のモノクローナル抗体のFRの相
   当する部位のアミノ酸から選ばれるものである、ヒト型
   CDR移植抗体。
7. 【請求項７】 請求項３〜５において、H鎖V領域のFR
   中、38位、40位、67位、72位、84位、98位、L鎖V領域の
   FR中、4位、11位、15位、35位、42位、46位、59位、69
   位、70位、71位、72位、76位、77位、103位の１カ所以
   上のアミノ酸残基が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸
   配列からなるヒト型CDR移植抗体。
8. 【請求項８】 請求項１〜７記載の抗体のＨ鎖Ｃ領域が
   ヒト抗体IgGクラスに属する抗体に由来するヒト型CDR移
   植抗体。
9. 【請求項９】 抗体のH鎖V領域が配列番号7、L鎖V領域
   が配列番号8記載のアミノ酸配列からなる請求項１〜
   ４、６〜８記載の抗体KM8966。
10. 【請求項１０】 抗体のH鎖V領域が配列番号7、L鎖V領
    域が配列番号9記載のアミノ酸配列からなる請求項１〜
    ４、６〜８記載の抗体KM8967。
11. 【請求項１１】 抗体のH鎖V領域が配列番号10、L鎖V領
    域が配列番号8記載のアミノ酸配列からなる請求項１〜
    ４、６〜８記載の抗体KM8970。
12. 【請求項１２】 抗体のH鎖V領域が配列番号10、L鎖V領
    域が配列番号11記載のアミノ酸配列からなる請求項１〜
    ８記載の抗体KM8969。
13. 【請求項１３】 請求項１〜１２記載の抗体のH鎖V領域
    およびL鎖V領域のアミノ酸配列をコードするDNA。
14. 【請求項１４】 請求項１３記載のDNAまたはその一部
    を含む組換えベクター。
15. 【請求項１５】 請求項１４記載の組換えベクターが、
    ヒト型キメラ抗体およびヒト型CDR移植抗体発現用タン
    デムカセットベクター、pKANTEX93に由来する組換えベ
    クター。
16. 【請求項１６】 請求項１４または１５記載の組換えベ
    クターを含有する形質転換体。
17. 【請求項１７】 請求項９記載の抗体KM8966を生産する
    形質転換株KM8966（FERMBP-5105）。
18. 【請求項１８】 請求項１０記載の抗体KM8967を生産す
    る形質転換株KM8967（FERM BP-5106）。
19. 【請求項１９】 請求項１１記載の抗体KM8970を生産す
    る形質転換株KM8970（FERM BP-5528）。
20. 【請求項２０】 請求項１２記載の抗体KM8969を生産す
    る形質転換株KM8969（FERM BP-5527）。
21. 【請求項２１】 請求項１７〜２０記載の形質転換体を
    用いた請求項１〜１２記載の抗体の製造法。
22. 【請求項２２】 請求項１〜１２記載の抗体を有効成分
    として含有する抗腫瘍剤。
23. 【請求項２３】 請求項１〜１２記載の抗体を有効成分
    として含有する癌の診断薬。