DE69333524T2

DE69333524T2 - Humanisierte Antikörper, die mit dem GM2-Gangliosid reagieren

Info

Publication number: DE69333524T2
Application number: DE69333524T
Authority: DE
Inventors: Kazuyasu Machida-shi Nakamura; Masamichi Machida-shi Koike; Kenya Shitara; Nobuo Sagamihara-shi Hanai; Yoshihisa Machida-shi Kuwana; Mamoru Kawasaki-shi Hasegawa
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: Kyowa Kirin Co Ltd
Priority date: 1992-09-07
Filing date: 1993-09-07
Publication date: 2005-06-16
Anticipated expiration: 2013-09-08
Also published as: EP0598998B1; EP0598998A2; CA2105618A1; EP0598998A3; CA2105618C; US5874255A; DE69333524D1; AU669379B2; AU4618193A; US5830470A

Description

ERFINDUNGSGEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft humanisierte Antikörper, die mit dem GM₂-Gangliosid reagieren. Die humanisierten Antikörper verursachen, anders als monoklonale Mausantikörper, nicht die Produktion von anti-Maus-Immunoglobulinen im Körper des Patienten; negative Auswirkungen, die möglicherweise durch diese verursacht werden, treten seltener auf, ihre Bluthalbwertszeiten sind länger, und außerdem ist ihre Antitumor-Effektor-Wirkung größer. Deshalb geht man davon aus, dass die humanisierten Antikörper verglichen mit monoklonalen Mausantikörpern zu verbesserten therapeutischen Wirkungen führen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Wenn Mausantikörper an Menschen verabreicht werden, werden sie im Allgemeinen als Fremdkörper wahrgenommen, wobei im menschlichen Körper die Produktion von anti-Maus-Immunoglobulin-Antikörpern induziert wird. Es ist bekannt, dass die ersteren Antikörper mit den letzteren Antikörpern reagieren und zu negativen Auswirkungen führen [J. Clin. Oncol., 2, 881 (1984), Blood, 65, 1349 (1985); J. Natl. Cancer Inst., 80, 932 (1988); Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, 1242 (1985)], und dass die Mausantikörper einer schnellen Clearance unterliegen [J. Nucl. Med., 26, 1011 (1985); Blood, 65, 1349 (1985); J. Natl. Cancer Inst., 80, 937 (1988)], wodurch sie nur eine verringerte Wirksamkeit zeigen [J. Immunol., 135, 1530 (1985); Cancer Res., 46, 6489 (1986)]. Man hat versucht, diese Probleme zu lösen, indem man chimäre humane Antikörper oder CDR (komplementäre Determinationsregion)-transplantierte Antikörper (umgestaltete Antikörper) gentechnisch von monoklonalen Mausantikörpern herleitete (siehe EP-A 0 314 161). In einem humanen chimären Antikörper stammen die variablen Regionen von der Maus und die konstanten Regionen vom Menschen [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 81, 6851 (1984)]; ein solcher Antikörper soll, wenn er dem Menschen verabreicht wird, eine geringe Produktion von humanem anti-Maus-Immunoglobulin-Antikörper verursachen, wobei seine Bluthalbwertszeit 6-mal länger ist [Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A, 86, 4220 (1989)]. Die CDR-transplantierten Antikörper sind Antikörper, die man erhält, indem man in einem humanen Antikörper nur die CDR durch die CDR von einem anderen Tier als dem Menschen ersetzt [Nature, 321, 522 (1986)]; in einem Experiment mit Affen zeigten solche Antikörper eine verringerte Immunogenizität und 4- bis 5-fach höhere Serum-Halbwertszeiten verglichen mit Mausantikörpern [J. Immunol., 147, 1352 (1991)].
Hinsichtlich der cytozidalen Aktivität von Antikörpern soll die Fc-Region eines humanen Antikörpers wirksamer bei der Aktivierung des humanen Komplementsystems und humaner Eftektorzellen sein als die Fc-Region eines Mausantikörpers. Somit verstärkt z.B. ein chimärer Antikörper, der von einem monoklonalen Mausantikörper gegen das CD₂-Gangliosid abgeleitet ist und eine Fc-Region eines humanen Antikörpers enthält, die durch humane Effektorzellen vermittelte Antitumor-Wirkung [J. Immunol., 144, 1382 (1990)]. Ähnliche Ergebnisse werden für CDR-transplantierte Antikörper berichtet [Nature, 332, 323 (1988)]. Solche Ergebnisse zeigen, dass humanisierte monoklonale Antikörper gegenüber monoklonalen Mausantikörpern bei der klinischen Verwendung bevorzugt sind.
Die Antikörper-Klassen schließen IgA, IgM, IgG, IgD und IgE ein, und bei Mäusen schließt die Klasse IgG vier Unterklassen ein, nämlich IgG, IgG₂a, IgG₂b und IgG₃ (in Menschen IgG₁, IgG₂, IgG₃ und IgG₄). Wenn Antigene an Tiere verabreicht werden, gehören die erzeugten Antikörper hauptsächlich zu den Klassen IgM oder IgG. IgG-Moleküle besitzen ein Molekulargewicht von etwa 160.000 Dalton und eine dimäre Struktur und sind relativ leicht handzuhaben. IgM-Moleküle sind groß, mit einem Molekulargewicht von ungefähr 900.000 Dalton und treten in Form einer komplizierten pentamären Struktur, gekuppelt mit der Joining-(J)-Kette auf, folglich haben sie die folgenden Nachteile: sie sind schwierig aufzureinigen; sie neigen dazu, zu agglutinieren, folglich sind sie schwierig aufzubewahren; sie werden leicht durch partiellen Abbau in Gegenwart einer Protease inaktiviert, folglich ist es schwierig, Fab-Fragmente herzustellen; und sie verlieren in vielen Fällen ihre Bindungsaktivität bei chemischer Modifikation, z.B. bei chemischer Anbindung eines Antikrebsmittels oder eines Toxins [J. W. Goding: Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986]. Bezüglich der Frage, ob monoklonale Antikörper der IgG-Klasse oder monoklonale Antikörper der IgM-Klasse bessere therapeutische Wirksamkeit gegen Krebs aufweisen, kann auf eine detaillierte Studie von Bernstein et al. verwiesen werden, die einen monoklonalen Antikörper der IgG-Klasse und einen monoklonalen Antikörper der IgM-Klasse gegen das Lymphozyten-Thy-1-Antigen verwendet haben [Monoclonal Antibodies, herausgegeben von R.H. Kennet, T.J. Mckearn und K. B. Bechtol, Plenum Press, 1980, S. 275]. Gemäß dieser Literaturstelle wurden ein monoklonaler Antikörper der IgG-Klasse und ein monoklonaler Antikörper der IgM-Klasse, welche hinsichtlich der Reaktivität gegenüber Thy-1-Antigen-positiven Lymphozyten vergleichbar sind, hinsichtlich der Antitumor-Wirkung verglichen. Während der IgM-monoklonale Antikörper besser in der in vitro Komplement-abhängigen Antitumor-Wirksamkeit war, zeigte der monoklonale Antikörper der IgG-Klasse eine beträchtliche Antitumor-Wirkung in vivo in Mäusen mit Krebs, wobei bei dem monoklonalen Antikörper der IgM-Klasse keine Antitumor-Wirkung beobachtet wurde. Es wurde ferner herausgefunden, dass der monoklonale Antikörper der IgM-Klasse verglichen mit dem monoklonalen Antikörper der IgG-Klasse nach der Verabreichung in Isotopenmarkierter Form an Mäuse eine sehr kurze Halbwertszeit im Blut zeigte. Diese Ergebnisse zeigen, dass monoklonale Antikörper, die bei Menschen klinisch verwendet werden sollen, vorzugsweise von der IgG-Klasse sein sollten.
Ganglioside, eine Klasse von Glycolipiden, sind Bestandteile der Zellmembranen von Tieren. Diese Moleküle setzen sich aus einer Kohlenhydratkette, welche eine hydrophile Seitenkette darstellt, und Sphingosin sowie einer Fettsäure zusammen, welche hydrophobe Seitenketten darstellen. Es ist bekannt, dass sich die exprimierten Gangliosid-Spezies und die Menge davon unter anderem zwischen Zellarten, Organarten und Tierarten voneinander unterscheiden. Ferner wurde berichtet, dass sich das exprimierte Gangliosid während des Krebsentwicklungsprozesses quantitativ und qualitativ veränderte (Cancer Res., 45, 2405 (1985)]. Zum Beispiel wurde von der Expression der Ganglioside GD₂, GD₃ und GM₂ in Neuroblastomen, kleinzelligen Lungenkarzinomen und Melanomen berichtet, welche hochgradig maligne neurale ektodermale Tumore sind [J. Exp. Med., 155, 1133 (1982); J. Biol. Chem., 257, 12752 (1982); Cancer Res., 47, 225 (1987); ibid., 47, 1098 (1987); ibid., 45, 2642 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 80, 5392 (1983)].
GM₂, eines der Ganglioside, welche Sialinsäurerest-enthaltende Glycolipide sind, tritt in normalen Zellen nur in Spuren auf, wird aber in erhöhten Mengen in Krebszellen bei kleinzelligen Lungenkarzinomen, Melanomen und Neuroblastomen etc. gefunden. Von monoklonalen Antikörpern gegen GM₂ wird angenommen, dass sie nützlich bei der Behandlung solcher Krebsarten sind [Lancet, 48, 6154 (1988)]. Jedoch sind die monoklonalen Antikörper gegenüber GM₂, von denen bis jetzt berichtet wurde, aus der Klasse humaner IgM oder der Klasse der Ratten-IgM, Maus-IgM oder Maus-IgG [Cancer Res., 46, 4116 (1986); Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 79, 7629 (1982), Cancer Res., 48, 6154 (1988); J. Biol. Chem., 264, 12122 (1989)].
Wenn monoklonale anti-Gangliosid-GM₂-Antikörper in Form humanisierter Antikörper, z.B. chimärer humaner Antikörper oder CDR-transplantierter Antikörper, hergestellt werden, die vermutlich keine anti-Maus-Immunoglobulin-Antikörperproduktion im Körper des Patienten induzieren, rufen sie weniger nachteilige Auswirkungen hervor und zeigen eine verlängerte Bluthalbwertszeit sowie verbesserte Antitumor-Effektor-Wirkung. Diese Antikörper besitzen daher vermutlich eine gegenüber den entsprechenden monoklonalen Mausantikörpern überlegene therapeutische Wirkung.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, humanisierte Antikörper gegen das Gangliosid GM₂ (hiernach "humanisierte anti-GM₂-Antikörper") bereitzustellen, welche unter anderem bei der Behandlung von Krebsarten, die ihren Ursprung im neuralen Ektoderm haben, nützlich sind.
Demgemäß bezieht sich die vorliegende Erfindung auf humanisierte Antikörper, die spezifisch für das Gangliosid GM₂ sind, wobei die CDRs der variablen Region der H-Kette Aminosäure-Sequenzen wie in SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 und SEQ ID NO:8 dargestellt, und die CDRs der variablen Region der L-Kette Aminosäure-Sequenzen wie in SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 und SEQ ID NO:11 dargestellt besitzen.
Ferner bezieht sich die vorliegende Erfindung auf humanisierte Antikörper, die spezifisch für das Gangliosid GM₂ sind, worin die variable Region der H-Kette Aminosäuren 1-120 der SEQ ID NO:1 und die variable Region der L-Kette Aminosäuren 1-107 der SEQ ID NO:2 enthält.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben die cDNA der variablen Region der schweren Kette (hiernach "H-Kette") des Antikörpers (hiernach "V_H") und cDNAs der variablen Region der leichten Kette (hiernach "L-Kette") des Antikörpers (hiernach "V_L") aus mRNAs, die von den Hybridomen KM750 und KM796 isoliert wurden, die in EP-A-0508472 beschrieben sind, hergestellt. Diese Hybridomen erzeugen gegen das Gangliosid GM₂ gerichtete monoklonale Mausantikörper der IgG₃-Klasse. Es wurden auch V_H- und V_L-cDNAs von mRNAs hergestellt, die von dem Hybridom KM603 isoliert wurden, welches einen gegen das Gangliosid GM₂ gerichteten monoklonalen Rattenantikörper der IgM-Klasse erzeugt. Expressionsvektoren für chimäre humane Antikörper wurden aufgebaut, indem die cDNA in einen Expressionsvektor insertiert wurde, welcher Sequenzen enthält, die für die konstante Region der H-Kette (hiernach "C_H") eines humanen Antikörpers oder für die konstante Region der L-Kette (hiernach "C_L") eines humanen Antikörpers kodieren. Solche Vektoren wurden dann in Tierzellen eingeführt, um die Erzeugung von chimären humanen anti-Gangliosid GM₂-Antikörpern zu bewirken.
Von den erzeugten humanisierten Antikörpern wurde gefunden, dass der chimäre humane anti-Gangliosid GM₂-Antikörper KM966 mit dem Gangliosid GM₂ reagiert und cytozidale Wirksamkeit zeigt. Die variable Region der H-Kette von KM966 enthält ein durch SEQ ID NO:1 definiertes Aminosäuresequenz-Segment und schließt die Aminosäuren 1 bis 120 dieser Sequenz ein, und die variable Region der L-Kette von KM966 enthält ein durch SEQ ID NO:2 definiertes Aminosäuresequenz-Segment und schließt die Aminosäuren 1 bis 107 dieser Sequenz ein. Die vorliegende Erfindung basiert zumindest zum Teil auf diesen Erkenntnissen.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich somit auf einen humanisierten Antikörper, der mit dem Gangliosid GM₂ reagiert.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 veranschaulicht Plasmide, pKM796H1 und pKM796L1.
2 veranschaulicht Plasmide, pKM750H1 und pKM750L1.
3 veranschaulicht Plasmide, pKM603H1 und pKM603L1.
4 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, pAGE147.
5 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, pAGE148.
6 zeigt ein Konstruktionsschema für Plasmide, pChi796HM1 und pChi750HM1.
7 zeigt ein Konstruktionsschema für Plasmide, pChi796HMS1 und pChi750HMS1.
8 zeigt ein Konstruktionsschema für Plasmide, pChi796LI1 und pChi750LI1.
9 zeigt ein Konstruktionsschema für Plasmide, pChi796LM1 und pChi750LM1.
10 zeigt ein Konstruktionsschema für Plasmide, pChi796LMS1 und pChi750LMS1.
11 zeigt ein Konstruktionsschema für Plasmide, pChi796H107 und pChi750H107.
12 zeigt ein Konstruktionsschema für Plasmide, pChi796HL1 und pChi750HL1.
13 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, pChi603HM1.
14 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, pChi603HMS1.
15 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, pChi603LI1.
16 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, pChi603LM1.
17 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, pChi603LMS1.
18 zeigt die Elektrophoresemuster von SDS-PAGE (unter Verwendung von Gelen mit einem Gradienten von 4–15 %) von aufgereinigten chimären humanen anti-GM₂-Antikörpern, KM966 und KM967. Die unter reduzierenden Bedingungen erhaltene Muster sind auf der linken Seite, und die, die unter nicht-reduzierenden Bedingungen erhalten wurden, sind auf der rechten Seite gezeigt. Von der linken Seite schließen die Bahnen Marker mit niedrigem Molekulargewicht, KM967 und KM966 (reduzierende Bedingungen) und KM967 und KM966 (nicht-reduzierende Bedingungen) ein.
19 zeigt die Elektrophoresemuster von SDS-PAGE (unter Verwendung von Gelen mit einem Gradienten von 4–15 %) eines aufgereinigten chimären humanen anti-GM₂-Antikörpers, KM968. Das unter reduzierenden Bedingungen erhaltene Muster ist auf der linken Seite, und das unter nicht-reduzierenden Bedingungen erhaltene ist auf der rechten Seite gezeigt. Von links schließen die Bahnen Marker mit hohem Molekulargewicht, Marker mit niedrigem Molekulargewicht, einen humanen Standard-IgG, KM968 (reduzierende Bedingungen), die gleichen Marker mit niedrigem Molekulargewicht, den humanen Standard-IgG und KM968 (nicht-reduzierende Bedingungen) ein.
20 zeigt graphisch die CDC (Komplement-abhängige Cytotoxizität)-Aktivitäten von KM966 gegen die humanen Kleinzelllungenkarzinom zelllinien SBC-3 und LU-135. Die Ordinate gibt die cytotoxische Aktivität und die Abszisse die Konzentration des zugegebenen Antikörpers an. Die ausgemalten Balken zeigen die CDC-Aktivitäten von KM-696 und die schraffierten Balken die CDC-Aktivitäten von KM966.
21 zeigt graphisch die CDC-Aktivitäten von KM966 gegen die humane Lungenplattenepithelzellkarzinomzelllinie PC-10 und die humane Lungenadenokarzinomzelllinie RERF-LC-MS. Die Ordinate gibt die Cytotoxizität und die Abszisse die Konzentration des zugegebenen Antikörpers an. Die ausgemalten Balken zeigen die CDC-Aktivitäten von KM-696 und die schraffierten Balken die CDC-Aktivitäten von KM966.
22 zeigt graphisch die CDC-Aktivitäten von KM966 gegen die humane Großzelllungenkarzinomzelllinie PC-13 und die humane Neuroblastomzelllinie NAGAI. Die Ordinate gibt die cytotoxische Aktivität und die Abszisse die Konzentration des zugegebenen Antikörpers an. Die ausgemalten Balken zeigen die CDC-Aktivitäten von KM-696 an und die schraffierten Balken die CDC-Aktivitäten von KM966.
23 zeigt graphisch die CDC-Aktivitäten von KM966 gegen die humane Neuroblastomzelllinie GOTO und die humane Gehirntumorzelllinie A172. Die Ordinate gibt die cytotoxische Aktivität und die Abszisse die Konzentration des zugegebenen Antikörpers an. Die ausgemalten Balken zeigen die CDC-Aktivitäten von KM696 und die schraffierten Balken die CDC-Aktivitäten von KM966.
24 zeigt graphisch die ADCC (Antikörper-abhängige Zell-vermittelte Cytotoxizität)-Aktivitäten von KM966 gegen die humanen Kleinzelllungenkarzinomzelllinien SBC-3 und LU-135. Die Ordinate gibt die cytotoxische Aktivität und die Abszisse die Konzentration des zugegebenen Antikörpers an. Die ausgemalten Balken zeigen die ADCC-Aktivitäten von KM-696 und die schraffierten Balken die ADCC-Aktivitäten von KM966.
25 zeigt graphisch die ADCC-Aktivitäten von KM966 gegen die humane Lungenplattenepithelzellkarzinomzelllinie PC-10 und die humane Lungenadenokarzinomzelllinie RERF-LC-MS. Die Ordinate gibt die cytotoxische Aktivität und die Abszisse die Konzentration des zugegebenen Antikörpers an. Die ausgemalten Balken zeigen die ADCC-Aktivitäten von KM-696 und die schraffierten Balken die ADCC-Aktivitäten von KM966.
26 zeigt graphisch die ADCC-Aktivitäten von KM966 gegen die humane Großzelllungenkarzinomzelllinie PC-13 und die humane Neuroblastomzelllinie NAGAI. Die Ordinate gibt die cytotoxische Aktivität und die Abszisse die Konzentration des zugegebenen Antikörpers an. Die ausgemalten Balken zeigen die ADCC-Aktivitäten von KM-696 und die schraffierten Balken die ADCC-Aktivitäten von KM966.
27 zeigt graphisch die ADCC-Aktivitäten von KM966 gegen die humane Neuroblastomzelllinie GOTO und die humane Gehirntumorzelllinie A172. Die Ordinate gibt die Cytotoxizität und die Abszisse die Konzentration des zugegebenen Antikörpers an. Die ausgemalten Balken zeigen die ADCC-Aktivitäten von KM-696 und die schraffierten Balken die ADCC-Aktivitäten von KM966.
28 zeigt eine Restriktionsenzym-Spaltungskarte eines 9,3 kb Xbal-Fragments der chromosomalen DNA einer KM50-Zelle.
29 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, pKMB11.
30 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, pKMD6.
31 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, pEPKMA1.
32 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, pEPKMB1.
33 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, pAGE501.
34 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, pAGE109.
35 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, pAGE502.
36 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, pAGE503.
37 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, pSEd1.
38 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, pSE1D2.
39 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, plg1SE1d2.
40 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, plg1SE1d3.
41 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, plg1SE1d4.
42 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, pPMOL2.
43 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, pPMOL3.
44 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, pchCKA7.
45 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, pchCKB1.
46 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, pckCKC1.
47 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, pChilgHB2.
48 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, pChilgLA1.
49 zeigt ein Konstruktionsschema für Plasmide, pKM641HA3 und pKM641LA2.
50 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, pChi641HA1.
51 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, pKM641HE1.
52 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, pKM641HF1.
53 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, pChi641HA1.
54 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, pChi641HAM1.
55 zeigt ein Konstruktionsschema für eine DNA, hKM796H.
56 zeigt ein Konstruktionsschema für eine DNA, hKM796L.
57 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, phKM796HM1.
58 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, phKM796HMS1.
59 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, phKM796LI1.
60 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, phKM796LM1.
61 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, phKM796LMS1.
62 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, phKM796H107.
63 zeigt ein Konstruktionsschema für ein Plasmid, phKM796HL1.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf humanisierte Antikörper, die spezifisch für das Gangliosid GM₂ sind. Die Antikörper können von jeder der Immunoglobulin (Ig)-Klassen sein, es ist jedoch bevorzugt, dass die Antikörper Antikörper des IgG-Typs sind. Der Ausdruck "humanisierter Antikörper", wie er hierin verwendet wird, schließt in seiner Bedeutung chimäre humane Antikörper und CDR-transplantierte Antikörper ein. Chimäre humane Antikörper der Erfindung schließen die V_H und V_L eines Antikörpers von einem Tier, das vom Menschen verschieden ist, und die C_H und C_L eines humanen Antikörpers ein. Die CDR-transplantierten Antikörper der Erfindung entstehen durch Ersetzen der CDRs der V_H und V_L eines humanen Antikörpers mit solchen der V_H bzw. V_L eines Antikörpers von einem Tier, das vom Menschen verschieden ist.
Ein Beispiel eines chimären humanen Antikörpers der Erfindung ist ein Antikörper, worin die V_H ein wie durch SEQ ID NO:1 definiertes Aminosäuresequenz-Segment enthält, einschließlich der Aminosäuren 1 bis 120 dieser Sequenz, und worin die V_L ein wie durch SEQ ID NO:2 definiertes Aminosäuresequenz-Segment enthält, einschließlich der Aminosäuren 1 bis 107 dieser Sequenz.
Ein Beispiel eines CDR-transplantierten Antikörpers der Erfindung ist ein Antikörper, worin die V_H-CDRs die durch SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 und SEQ ID NO:8 definierten Aminosäuresequenzen besitzen, und worin die V_L-CDR die durch SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 und SEQ ID NO:11 definierten Aminosäuresequenzen besitzen.
Die chimären humanen Antikörper der Erfindung können auf folgende Weise erzeugt werden:
(1) Herstellung von cDNAs, die für die V_H und V_L eines nichthumanen Tierantikörpers kodieren
cDNAs, die für die V_H und V_L eines nichthumanen Antikörpers kodieren, z.B. eines monoklonalen anti-GM₂ Mausantikörpers, können wie folgt erzeugt werden.
mRNAs können von Hybridomen, die den monoklonalen anti-GM₂ Mausantikörper erzeugen, extrahiert werden, z.B. Hybridomen, die den monoklonalen anti-GM₂ Mausantikörper KM796 erzeugen, und die cDNAs können davon revers transkribiert werden. Unter Verwendung der cDNAs kann eine Bibliothek aufgebaut werden, indem Phagen- oder Plasmidvektoren verwendet werden. Der rekombinante Phage oder das rekombinante Plasmid, die die für die V_H kodierende cDNA enthalten, und der rekombinante Phage oder das rekombinante Plasmid, die die für die V_L kodierende cDNA enthalten, können aus der Bibliothek isoliert werden, indem ein Teil der konstanten Region oder ein Teil der variablen Region eines Antikörpers von einem nichthumanen Tier, z.B. eines Mausantikörpers, als Sonde verwendet wird. Dann können die Basensequenzen der V_H-kodierenden cDNA und der V_L-kodierenden cDNA in dem rekombinanten Phagen oder rekombinanten Plasmid bestimmt werden. Beispiele für nichthumane Tiere schließen Mäuse, Ratten, Hamster und Affen ein.
(2) Konstruktion eines Vektors für die Expression eines chimären humanen Antikörpers
Die Expression der H-Kette und L-Ketten eines chimären humanen Antikörpers kann unter Verwendung von Expressionsvektoren erreicht werden, die zur Verwendung in Tierzellen geeignet sind, in welche die für die humane C_H und C_L kodierenden cDNAs insertiert werden. Jedweder Expressionsvektor, der zur Verwendung in Tierzellen geeignet ist, kann verwendet werden, vorausgesetzt, dass er eine Integration und Expression der für die konstante Region des humanen Antikörpers kodierenden cDNAs erlaubt. Beispiele schließen unter anderem pAGE107 [Cytotechnology, 3, 133 (1990)], pAGE103 [J. Biochem., 101, 1307 (1987)], pHSG274 [Gene, 27, 223 (1984)], pKCR [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 78, 1527 (1981)] und pSG1βd2-4 [Cytotechnology, 4, 173 (1990)] ein. Beispiele für Promotoren und Enhancer, die zur Verwendung in solchen Expressionsvektoren geeignet sind, schließen den frühen Promotor und Enhancer von SV40 [J. Biochem., 101, 1307 (1987)], den Moloney-Maus-Leukämievirus LTR (long terminal repeat=lange terminale Wiederholungseinheit)-Promotor und -Enhancer [Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960 (1987)] und den Immunoglobulin-H-Ketten-Promotor [Cell, 41, 479 (1985)] und -Enhancer [Cell, 33, 717 (1983)] ein. Die Promotoren und Enhancer sind in dem Expressionsvektor in operabler Verknüpfung mit den kodierenden Sequenzen lokalisiert.
(3) Konstruktion eines Expressionsvektors für einen chimären humanen Antikörper
Der Vektor für die Expression der H-Kette und L-Kette eines chimären humanen Antikörpers, wie unter (2) erhalten, ist mit einer Klonierungstelle stromaufwärts der humanen konstanten Region zur Insertion einer cDNA, die für die variable Region eines Antikörpers von einem nichthumanen Tier kodiert, ausgestattet. Die Insertion der cDNA, die für die variable Region eines nichthumanen Tierantikörpers kodiert, an dieser Klonierungsstelle, unter Verwendung einer synthetischen DNA, die eine 5'-terminale Basensequenz der konstanten Region eines humanen Antikörpers und eine 3'-terminale Basensequenz der variablen Region eines nichthumanen Tierantikörpers umfasst und an beiden Enden Restriktionsenzymstellen enthält, ergibt einen Expressionsvektor für einen chimären humanen Antikörper, worin die cDNA, die für die konstante Region des humanen Antikörpers kodiert, und die cDNA, die für die variable Region des nichthumanen Tierantikörpers kodiert, über die synthetische DNA zusammen insertiert sind, um geeignete Restriktionsenzymstellen zu erzeugen. Die synthetische DNA kann unter Verwendung eines DNA-Synthesizers basierend auf der 5'-terminalen Basensequenz der konstanten Region des humanen Antikörpers und der Basensequenz der 3'-terminalen Basensequenz der variablen Region des nichthumanen Tierantikörpers synthetisiert werden.
(4) Konstruktion eines Expressionsvektors für eine H-Kette eines chimären humanen Antikörpers
Ein Vektor für die Expression der H-Kette eines chimären humanen Antikörpers wird z.B. aufgebaut, indem der Teil der cDNA, die für die C_H des humanen Antikörpers kodiert, welcher von der Apal-Stelle in der Nähe des 5'-Terminus bis zum 3'-Terminus reicht, ausgeschnitten wird, und indem dieser Teil in einen Expressionsvektor insertiert wird, der zur Verwendung in Tierzellen geeignet ist. Dieser Vektor für die Expression einer H-Kette eines chimären humanen Antikörpers ist mit einer Klonierungsstelle zur Insertion einer cDNA, die für eine nichthumane tierische V_H kodiert, ausgestattet. cDNA, die für die nichthumane tierische V_H kodiert, welche unter Verwendung eines geeigneten Restriktionsenzyms ausgeschnitten wurde, wird unter Verwendung einer synthetischen DNA, welche den Teil des humanen Antikörper-C_H-Gens umfasst, welcher vom 5'-Terminus zu der ApaI-Stelle reicht und die Basensequenz eines 3'-terminalen Teils des nichthumanen Tierantikörper-V_H-Gens umfasst und an beiden Enden Restriktionsenzymstellen besitzt, an der Klonierungsstelle in den Vektor insertiert, um einen Expressionsvektor für die H-Kette eines chimären humanen Antikörpers zu ergeben, welcher keine Veränderung der Aminosäuresequenz von V_H bei der Expression davon erlaubt und geeignete Restriktionsenzymstellen besitzt.
(5) Konstruktion eines Expressionsvektors für eine L-Kette eines chimären humanen Antikörpers
Ein Vektor für die Expression der L-Kette eines chimären humanen Antikörpers wird z.B. durch Einführen einer EcoRV-Stelle in die cDNA, die für die C_L eines humanen Antikörpers kodiert, in Nähe des 5'-Terminus durch Mutagenese, Ausschneiden des Teils, welcher von der EcoRV-Stelle zum 3'-Terminus reicht und Insertion dieses Teils in ein Plasmid, wie das Plasmid plg1SE1d4, aufgebaut. Dieser Vektor für die Expression der L-Kette eines chimären humanen Antikörpers wird mit einer Klonierungsstelle für die Insertion der cDNA, welche für die nichthumane tierische V_L kodiert, ausgestattet. Die cDNA, die für die V_L eines nichthumanen Tierantikörpers kodiert, welche mit einem geeigneten Restriktionsenzym ausgeschnitten wurde, wird unter Verwendung einer synthetischen DNA, die den Teil des humanen Antikörpers C_L-Gens, welcher von dem 5'-Terminus zur EcoRV-Stelle reicht, und die Basensequenz eines 3'-terminalen Teils des nichthumanen Tierantikörper-V_L-Gens umfasst und an beiden Enden Restriktionsenzymstellen besitzt, an der Klonierungsstelle in den Vektor insertiert, um einen Expressionsvektor für die L-Kette eines chimären humanen Antikörpers zu ergeben, welcher keine Veränderung in der Aminosäuresequenz der V_L bei der Expression davon erlaubt.
(6) Einführen der Expressionsvektoren für den chimären humanen Antikörper in Wirtszellen
Die Einführung des Expressionsvektors für die H-Kette eines chimären humanen Antikörpers und des Expressionsvektors für die L-Kette eines chimären humanen Antikörpers in Wirtszellen ergibt eine Transformante, die den chimären humanen Antikörper erzeugt. Bei der Einführung der Vektoren in Wirtszellen kann zur mRNA-Stabilisierung ein Splicingsignal in die Expressionsvektoren für die H-Kette und L-Kette des chimären humanen Antikörpers eingeführt werden [Cell, 17, 737 (1979)].
Die Vektoren der H-Kette und L-Kette des chimären humanen Antikörpers können z.B. simultan durch Elektroporation in Wirtszellen eingeführt werden [JP-A-2-257891 (der Ausdruck "JP-A", der hierin verwendet wird, steht für eine nicht geprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung); Cytotechnology, 3, 133 (1990)]. Außerdem kann ein Expressionsvektor, der Gene enthält, die für sowohl die H-Kette als auch die L-Kette eines chimären humanen Antikörpers kodieren [Tandemexpressionsvektor] in Wirtszellen eingeführt werden [BIO/TECHNOLOGY, 9, 64 (1991)]. Die Verwendung eines Tandemexpressionsvektors ist bevorzugt, da dadurch ein höheres Ausmaß an Expression des chimären humanen Antikörpers erreicht werden kann, wobei die Expressionsniveaus der H-Kette und der L-Kette ungefähr gleich sind.
Ein Beispiel für ein Verfahren zur Herstellung von CDR-transplantierten Antikörpern der Erfindung wird im Folgenden beschrieben.
Zuerst kann ein Expressionsvektor für einen CDR-transplantierten Antikörper durch das Verfahren von Winter et al. wie folgt hergestellt werden [Nature, 332, 323 (1988)].
Drei synthetische DNAs werden so gestaltet, dass sie die cDNAs umfassen, die für drei CDR-Peptide der V_H eines nichthumanen Tierantikörpers kodieren, z.B. Peptide mit den Aminosäuresequenzen, die durch die SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 und SEQ ID NO:8 definiert sind, wobei DNAs, die für Aminosäuresequenzen kodieren, welche mehrere Aminosäuren von beiden Enden der entsprechenden CDRs der V_H eines humanen Antikörpers umfassen, an den entsprechenden beiden Enden der cDNAs lokalisiert sind, die DNA-Synthese wird mit einem Plasmid durchgeführt, das das Gen der humanen Antikörper-V_H als Templat enthält. Ein Beispiel des Plasmids, das das Gen der humanen Antikörper-V_H enthält, ist das M13-Plasmid, das eine von dem Gen des humanen Antikörpers NEW abgeleitete Sequenz enthält [J. Biol. Chem., 253, 585 (1978); Nature, 332, 323 (1988)].
Die erhaltene DNA wird in den Vektor für die Expression der H-Kette eines chimären humanen Antikörpers auf gleiche Weise eingeführt, wie bei dem Aufbau des Expressionsvektors für einen chimären humanen Antikörper, der oben erwähnt ist, um einen Expressionsvektor für eine H-Kette eines CDR-transplantierten Antikörpers zu ergeben.
Entsprechend wird unter Verwendung von drei synthetischen DNAs als Primer, die so gestaltet sind, dass sie die cDNAs, die für drei CDR-Peptide der V_L eines nichthumanen Tierantikörpers kodieren, z.B. die Peptide mit den Aminosäuren, die durch SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 und SEQ ID NO:11 definiert sind, wobei die DNAs, die für Aminosäuresequenzen kodieren, welche mehrere Aminosäuren von beiden Enden der entsprechenden CDRs der V_L des humanen Antikörpers umfassen, an den entsprechenden beiden Enden der cDNAs lokalisiert sind, umfassen, die DNA-Synthese mit einem Plasmid als Templat durchgeführt, das ein Gen für die V_L eines humanen Antikörpers enthält. Ein Beispiel für das das Gen der humanen Antikörper-V_L enthaltende Plasmid ist das M13-Plasmid, das eine Sequenz enthält, die von dem Gen eines humanen Myelom-Proteins (Bence-Jones-Protein) REI abgeleitet ist [Eur. J. Biochem., 45, 513 (1974); Nature, 332, 323 (1988)].
Indem die erhaltene DNA in einen Vektor für die Expression der chimären humanen L-Kette auf gleiche Weise insertiert wird, wie es im Zusammenhang mit dem Aufbau des Expressionsvektors für den chimären humanen Antikörper beschrieben ist, kann ein Expressionsvektor für eine L-Kette eines CDR-transplantierten Antikörpers aufgebaut werden.
Es ist auch möglich, die Expressionsvektoren für die H-Kette und L-Kette eines CDR-transplantierten Antikörpers aufzubauen, indem DNAs synthetisiert werden, die für die Peptide kodieren, welche Aminosäuresequenzen besitzen, die durch Ersetzen der drei CDRs von jeweils der H-Kette und der L-Kette eines humanen Antikörpers durch die entsprechenden CDRs der H-Kette und L-Kette eines nichthumanen Tierantikörpers erhalten werden, und indem dann die DNAs in einen Vektor für die Expression der H-Kette oder L-Kette eines chimären humanen Antikörpers auf gleiche Weise insertiert werden, wie es im Zusammenhang mit dem Aufbau des oben erwähnten Expressionsvektors für den chimären humanen Antikörper beschrieben ist.
Der Expressionsvektor für den CDR-transplantierten Antikörper kann auf gleiche Weise in Wirtszellen eingeführt werden, wie der Expressionsvektor für den chimären humanen Antikörper, um eine Transformante zu ergeben, die den CDR-transplantierten Antikörper erzeugt.
Bei den Wirtszellen, die geeignet sind, den Expressionsvektor für einen chimären humanen Antikörper oder CDR-transplantierten Antikörper einzuführen, kann es sich um beliebige Wirtszellen handeln, vorausgesetzt, dass der Chimäre humane Antikörper oder CDR-transplantierte Antikörper darin exprimiert werden kann. Beispiele schließen Maus SP2/0-Ag14-Zellen (ATCC CRL1581; hiernach "SP2/0-Zellen" genannt), Maus-P3X63-Ag8.653-Zellen (ATCC CRL1580), CHO-Zellen, denen das Dihydrofolatreduktase-Gen fehlt (hiernach "dhfr" genannt) [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77, 4216 (1980)] und Ratten- YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20-Zellen (ATCC CRL1662; hiernach "YB2/0-Zellen" genannt) ein, wobei YB2/0-Zellen bevorzugt sind.
Die Transformanten, die den chimären humanen Antikörper oder den CDR-transplantierten Antikörper erzeugen, werden durch das in JP-A-2-257891 offenbarte Verfahren unter Verwendung des PRM11640-Mediums selektiert, das G418 und fötales Kälberserum enthält. Ein spezielles Beispiel für die den chimären humanen Antikörper erzeugende Transformante ist die Transformante KM966, die einen chimären Antikörper erzeugt, der mit dem Gangliosid GM₂ reagiert. KM966 wurde beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology von 1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305 JAPAN am 15. Juli 1992 unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-3931 hinterlegt.
Wenn die erhaltene Transformante in einem Medium kultiviert wird, kann der chimäre humane Antikörper oder CDR-transplantierte Antikörper erzeugt und im Kulturfluid akkumuliert werden. Die Aktivität des chimären humanen Antikörpers oder CDR-transplantierten Antikörpers im Medium kann durch einen Enzymgekoppelten Immunosorbent-Assay bestimmt werden (ELISA; E. Harlow et al. (Hrsg.): Antibodies – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Die Antikörper-Produktivität der Transformante kann erhöht werden, indem ein dhfr-Amplifikationssystem verwendet wird, wie es in JP-A-2-257891 offenbart ist.
Der chimäre humane Antikörper und CDR-transplantierte Antikörper können von den erhaltenen Kulturüberständen, die oben erwähnt werden, unter Verwendung einer Protein-A-Säule aufgereinigt werden (E. Harlow et al., (Hrsg): Antibodies – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Wie oben bemerkt, ist der chimäre humane Antikörper KM966, der mit dem Gangliosid GM₂ reagiert, ein spezielles Beispiel der so erhaltenen chimären humanen Antikörper und CDR-transplantierten Antikörper.
Die Reaktivität des chimären humanen Antikörpers oder CDR-transplantierten Antikörpers der Erfindung kann mittels ELISA überprüft werden. Das Molekulargewicht der aufgereinigten H-Kette oder L-Kette eines Antikörpers oder des ganzen Antikörpermoleküls kann mittels Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) oder Western Blotting bestimmt werden (E. Harlow et al., (Hrsg.): Antibodies – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
Die Bindungsaktivität des chimären humanen Antikörpers oder CDR-transplantierten Antikörpers, welcher mit dem Gangliosid GM₂ von kultivierten Krebszellen reagiert, kann z.B. durch die Fluoreszenzantikörper-Technik oder mittels ELISA bestimmt werden. Die Komplement-abhängige cytotoxische Aktivität (CDC-Aktivität) und die Antikörper-abhängige Zell-vermittelte cytotoxische Aktivität (ADCC-Aktivität) des chimären humanen Antikörpers oder CDR-transplantierten Antikörpers werden durch die in der Monographie "Menekigaku Jikken Nyumon (A Manual of Experiments in Immunology)" (Matsuhashi et al., veröffentlicht von Gakkai Shuppan Center, 1981) beschriebenen Verfahren gemessen.
Die humanisierten Antikörper der Erfindung binden spezifisch an humane Krebszellen und zeigen eine CDC-Aktivität und ADCC-Aktivität gegenüber humanen Krebszellen und sind daher unter anderem bei der Behandlung von humanen Krebsarten nützlich.
Die humanisierten Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung können alleine als Antikrebsmittel eingesetzt werden. Sie können zusammen mit mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Träger in eine Antikrebs-Zusammensetzung formuliert werden. Zum Beispiel werden die humanisierten Antikörper in physiologischer Salzlösung, einer wässrigen Lösung von Glucose, Lactose oder Mannit und dgl. gelöst. Das Pulver der humanisierten Antikörper zur Injektion kann gemäß dem konventionellen Verfahren durch Lyophylisieren der humanisierten Antikörper und Mischen der lyophilisierten Produkte mit Natriumchlorid hergestellt werden. Die Antikrebs-Zusammensetzung kann ferner Additive enthalten, die herkömmlicherweise im Fachgebiet der medizinischen Zubereitungen verwendet werden, z.B. pharmazeutisch verträgliche Salze.
Die humanisierten Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung können in Form der oben beschriebenen Antikrebs-Zusammensetzung an Säuger einschließlich Menschen in einer Dosis von 0,2 bis 20 mg/kg/Tag verabreicht werden. Die Dosis kann abhängig vom Alter, dem Zustand etc. der Patienten variieren. Die Verabreichung der Antikrebs-Zusammensetzung kann durch intravenöse Injektion einmal am Tag (Einzelverabreichung oder aufeinanderfolgende Verabreichung) oder intermittierend ein- bis dreimal in der Woche oder einmal alle zwei oder drei Wochen durchgeführt werden.
Es wird angenommen, dass die Antikrebs-Zusammensetzung nützlich ist zur Behandlung von Krebs, wie einem Melanom, Neuroblastom und Gliom.
Die folgenden Beispiele und Vergleichsbeispiele sollen die vorliegende Erfindung weiter veranschaulichen, sind aber nicht so auszulegen, dass sie den Umfang der vorliegenden Erfindung beschränken.
BEISPIEL 1
Herstellung von chimären humanen anti-GM₂-Antikörpern
1. Isolierung von mRNAs von Hybridomzellen, die den monoklonalen anti-GM₂-Mausantikörper KM-796 oder KM-750 erzeugen, und von Hybridomzellen, die den monoklonalen anti-GM₂-Rattenantikörper KM-603 erzeugen.
mRNAs wurden unter Verwendung des mRNA-Extraktionskits Fast Track (Produktnummer K1593-02), hergestellt von Invitrogen, und unter Einhalten der Beschreibung des dem Kit beiliegenden Handbuches aus jeweils 1 × 10⁸ Zellen von der den monoklonalen anti-GM₂-Mausantikörper KM-796 erzeugenden Hybridomzelllinie (FERM BP-3340), der den monoklonalen anti-GM₂-Mausantikörper KM-750 erzeugenden Hybridomzelllinie (FERM BP-3339) und der den monoklonalen anti-GM₂-Rattenantikörper KM-603-erzeugenden Hybridomzelllinie (FERM BM-2636) isoliert.
2. Aufbau von cDNA-Bibliotheken der H-Kette und L-Kette der monoklonalen Antikörper KM-796 und KM-750
Unter Verwendung des cDNA-Synthesis Kit (Produktnummer 27-9260-01), hergestellt von Pharmacia, und unter Einhalten des dem Kit beiliegenden Handbuches wurde cDNA, die den EcoRI-Adapter an beiden Enden enthält, aus jeweils 5 μg der von den KM-796 und KM-750 abgeleiteten mRNAs, wie unter Paragraph 1 oben beschrieben, synthetisiert. Ungefähr 6 μg von jedem erhaltenen cDNA-Produkt wurden in 10 μl von sterilisiertem Wasser gelöst und mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurden ein cDNA-Fragment (ungefähr 1,8 kb), das der H-Kette eines IgG-Antikörpers entspricht, und ein cDNA-Fragment (ungefähr 1,0 kb), das der L-Kette entspricht, gewonnen (ungefähr jeweils 0,1 μg). Dann wurden 0,1 μg jedes cDNA-Fragments mit ungefähr 1,8 kb bzw. 0,1 μg jedes cDNA-Fragments mit ungefähr 1,0 kb in 11,5 μl T4-Ligasepuffer zusammen mit 1 μg des Lambda ZAPII-Vektors (mit EcoRI gespalten und dann mit alkalischer intestinaler Phosphatase vom Kalb behandelt; Produkt von Stratagene) gelöst. Nach der Zugabe von 175 Einheiten T4-DNA-Ligase wurde jede Lösung bei 12 °C für 24 Stunden und dann bei Raumtemperatur für 2 Stunden inkubiert. Eine Menge von 4-μl jeder Reaktionsmischung wurde einem Verpacken in dem Lambda-Phagen auf herkömmliche Weise [Maniatis et al., (Hrsg): Molecular Cloning, 2.95 Cold Spring Harbor Laboratory, 1989] unter Verwendung von Giga Pak Gold (Stratagene), gefolgt von Transfektion auf konventionelle Weise [Maniatis et al., (Hrsg): Molecular Cloning, 2.95–107, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989] des Escherichia coli-Stammes XL1-Blue [Biotechniques, 5, 376 (1978)], der mit Giga Pak Gold verbunden ist, unterzogen, um ungefähr 4000 Phagenklone jeweils als KM-796- oder KM-750-H-Ketten- oder L-Ketten-cDNA-Bibliothek zu erhalten. Dann wurden die Phagenklone jeder Bibliothek auf konventionelle Weise an einen Nitrocellulosefilter fixiert [Maniatis et al., (Hrsg): Molecular Cloning, 2.112, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989].
3. Aufbau von cDNA-Bibliotheken der KM-603-H-Kette und -L-Kette
Unter Verwendung von 5 μg der KM-603-mRNA, die wie oben unter Paragraph 1 erläutert erhalten wurde, und des cDNA-Synthesis Kit (Produktnummer 27-9260-01), hergestellt von Pharmacia, wurde cDNA synthetisiert, welche den EcoRI-Adapter an beiden Enden enthält. Ungefähr 6 μg der hergestellten cDNA wurden in 10 μl von sterilisiertem Wasser aufgelöst und mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert. Es wurden ein cDNA-Fragment (ungefähr 2,2 kb), das der H-Kette des IgG-Antikörpers entspricht, und ein cDNA-Fragment (ungefähr 1,0 kb), das der L-Kette entspricht, gewonnen (ungefähr jeweils 0,1 μg). Dann wurden 0,1 μg des cDNA-Fragments mit ungefähr 2,2 kb bzw. 0,1 μg des cDNA-Fragments mit ungefähr 1,0 kb zusammen mit 1 μg des Lambda-ZAPII-Vektors (mit EcoRI gespalten und dann mit alkalischer intestinaler Phosphatase vom Kalb behandelt; Produkt von Stratagene) in 11,5 μl T4-Ligasepuffer gelöst, und nach Zugabe von 175 Einheiten T4-DNA-Ligase wurde die resultierende Lösung bei 12 °C für 24 Stunden und dann bei Raumtemperatur für 2 Stunden inkubiert. Eine Menge von 4 μl jeder Reaktionsmischung wurde einem Verpacken in den Lambda-Phagen auf konventionelle Weise [Maniatis et al., (Hrsg.): Molecular Cloning, 2.95, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989] unter Verwendung des Giag Pak Gold (Stratagene), gefolgt von Transfektion auf konventionelle Weise [Maniatis et al., (Hrsg.): Molecular Cloning, 2.95–107, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989], des Escherichia coli-Stammes XL-Blue, der an dem Giga Pak Gold hängt, unterzogen, wobei ungefähr 10.000 Phagenklone jeweils als KM-603-H-Ketten- oder -L-Ketten-cDNA-Bibliothek erhalten wurden. Dann wurden die Phagenklone jeder Bibliothek auf konventionelle Weise an einen Nitrocellulosefilter fixiert [Maniatis et al., (Hrsg): Molecular Cloning, 2.112, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989].
4. Klonierung der cDNAs der KM-796- und KM-750-H-Kette und -L-Kette
Von den KM-796- und KM-750-H-Ketten-cDNA-Bibliotheken und L-Ketten-cDNA-Bibliotheken, die wie oben unter Paragraph 2 beschrieben hergestellt wurden, wurden Phagenklone, die bei 65 °C fest an eine Sonde banden, die hergestellt wurde, indem eine cDNA einer konstanten Region eines Maus-Immunoglobulins [das BamHl-XhoI-Fragment der Maus-Cγ3-cDNA für die H-Kette (Wels et al: EMBO J., 3, 2041–2046, 1984); das Hpal-XhoI-Fragment der Maus-Cκ-cDNA für die L-Kette (Hieter et al.: Cell, 22, 197–207, 1980)] mit ³²P markiert wurde, auf konventionelle Weise gewonnen [Maniatis et al.: Molecular Cloning, 2.108, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989]. Dann wurden Phagenklone unter Verwendung eines ZAP-cDNA-Synthesis Kit (cDNA-Synthesekit; Produktnummer sc200400), hergestellt von Stratagene, in pBluescript-Plasmide umgewandelt, und es wurden ein rekombinantes Plasmid (pKM796H1), das die cDNA der KM-796-H-Kette enthielt, und ein rekombinantes Plasmid (pKM796L1), das die cDNA der KM-796-L-Kette enthielt (1), sowie ein rekombinantes Plasmid (pKM750H1), das eine cDNA der KM-750-H-Kette enthielt, und ein rekombinantes Plasmid (pKM750L1), das eine cDNA der KM-750-L-Kette enthielt (2), erhalten. Spaltung von pKM796H1, pKM750H1, pKM796L1 und pKM750L1 mit EcoRI brachte hervor, dass ein cDNA-Fragment mit ungefähr 1,8 kb in pKM796H1 und pKM750H1 insertiert worden ist, und dass ein cDNA-Fragment mit ungefähr 0,9 kb in pKM796L1 und pKM750L1 insertiert worden ist.
5. Klonierung von cDNAs der KM-603-H-Kette und -L-Kette
Phagenklone, die bei 65 °C fest an eine Sonde banden, welche hergestellt wurde, indem ein chromosomales Gen einer konstanten Region eines Maus-Immunoglobulins [ein Maus-Cμ-Gen-enthaltendes Smal-Kpnl-Fragment mit ungefähr 11,5 kb (Kataoka et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 77, 919–923, 1980) und ein Maus-Cκ-Gen-enthaltendes HindIII-BamHI-Fragment mit ungefähr 3 kb (Sakano et al.: Nature, 280, 288, 1979)] mit ³²P markiert wurde, wurden von der cDNA-Bibliothek der KM-603-H-Kette und der cDNA-Bibliothek der L-Kette, die wie oben unter Paragraph 3 hergestellt wurden, auf konventionelle Weise isoliert [Maniatis et al. (Hrsg): Molecular Cloning, 2.108, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989]. Dann wurden Phagenklone unter Verwendung eines ZAP-cDNA-Synthesis Kit (Produktnummer sc200400, hergestellt von Stratagene, in pBluescript-Plasmide umgewandelt, und es wurden ein rekombinantes Plasmid, pKM603H1, das eine cDNA der KM-603-H-Kette enthielt und ein rekombinantes Plasmid, pKM603L1, das eine cDNA der KM-603-L-Kette enthielt, erhalten (3). Die Spaltung von pKM603H1 und pKM603L1 ergab, dass pKM603H1 ein cDNA-Fragment mit ungefähr 2,0 kb und das pKM603L1 ein cDNA-Fragment mit ungefähr 0,9 kb insertiert darin enthielt.
6. Basensequenzen der variablen Regionen der cDNA der H-Kette und cDNA der L-Kette
Die Basensequenzen der variablen Regionen der cDNA der H-Kette und cDNA der L-Kette, die wie oben unter den Paragraphen 4 und 5 erwähnt erhalten wurden, wurden mittels der Dideoxymethode [Maniatis et al. (Hrsg): Molecular Cloning, 13.42, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989] unter Verwendung des Sequenase Version 2.0-DNA-Sequencing Kit, hergestellt von United States Biochemical Corporation, bestimmt. Alle cDNAs wiesen ein Methionincodon, vermutlich das Startercodon ATG, am 5'-Terminus auf und waren Leitsequenzenthaltende cDNAs voller Länge. Basierend auf den Basensequenzen der entsprechenden cDNAs wurden die Aminosäuresequenzen der H-Kette und L-Kette von KM-796, KM-750 und KM-603 abgeleitet. Die Aminosäuresequenz der KM-796-H-Kette ist in SEQ ID NO:1, die der L-Kette von KM-796 und KM-750 in SEQ ID NO:2, die der KM-750-H-Kette in SEQ ID NO:3, die der KM-603-H-Kette in SEQ ID NO:4 und die der KM-603-L-Kette in SEQ ID NO:5 gezeigt.
7. Aufbau von Expressionsvektoren für die H-Kette und L-Kette eines von KM-796 und KM-750 abgeleiteten chimären humanen Antikörpers
(1) Aufbau eines Vektors, pAGE147, der den terminalen Wiederholungseinheit-Promotor/Enhancer des Moloney-Maus-Leukämievirus trägt
Das Plasmid pPMOL1 (2 μg), das in JP-A-1-63394 beschrieben ist, wurde in 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid und 6 mM 2-Mercaptoethanol enthielt, gelöst, es wurden 20 Einheiten Smal zugegeben, und bei 30 °C für 3 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Dann wurde Natriumchlorid bis zu einer Konzentration von 50 mM zugegeben, 20 Einheiten Clal wurden zugegeben, und bei 37 °C für 2 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde einer Agarosegelelektrophorese unterzogen, und es wurde ein DNA-Fragment (ungefähr 0,6 kb) gewonnen, das den terminalen Wiederholungseinheit-Promotor/Enhancer des Moloney-Maus-Leukämievirus enthielt.
Dann wurden die folgenden zwei synthetischen DNAs unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesizers (Modell 380A, hergestellt von Applied Biosystems Co., Ltd.) synthetisiert.
Die so erhaltenen synthetischen DNAs (jeweils 25 Picomol) wurden in 10 μl von 50 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,6), der 10 mM Magnesiumchlorid, 5 mM DTT (Dithiotreit), 0,1 mM EDTA und 0,5 mM Adenosintriphosphat (hiernach "ATP" genannt) enthielt, gelöst, es wurden 5 Einheiten T4-DNA-Kinase zugegeben, und bei 37 °C für 30 Minuten wurde eine 5'-Phosphorylierung durchgeführt.
Das vom Plasmid pPMOL1 abgeleitete Clal-Small-Fragment (0,6 kb, 0,05 μg) und zwei 5'-phosphorylierte synthetische DNAs (jeweils 1 Picomol), die wie oben beschrieben erhalten wurden, und ein HindIII-Linker (5'-pCAAGCTTG-3'; Takara Shuzo) (1 Picomol) wurden in 30 μl von 66 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6,6 mM Magnesiumchlorid, 10 mM DTT und 0,1 mM ATP enthielt, gelöst, es wurden 200 Einheiten T4-DNA-Ligase (Takara Shuzo; im Folgenden soll dies auch gelten) zugegeben, und bei 12 °C für 16 Stunden wurde eine Ligation durchgeführt. Das resultierende DNA-Fragment wurde mittels Ethanol-Präzipitation gewonnen und in 20 μl 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 6 mM 2-Mercaptoethanol enthielt, gelöst, es wurden 10 Einheiten HindIII und 10 Einheiten XhoI zugegeben, und bei 37 °C für 2 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Phenol-Chloroform-Extraktion beendet, und das DNA-Fragment wurde mittels Ethanol-Präzipitation gewonnen.
Getrennt wurde 1 μg des Plasmids pAGE107 [Cytotechnology, 3, 133 (1990)] in 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 6 mM 2-Mercaptoethanol enthielt, gelöst, es wurden 10 Einheiten HindIII und 10 Einheiten XhoI zugegeben, und bei 37 °C für 2 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde einer Agarosegelelektrophorese unterzogen, und es wurde ein DNA-Fragment (ungefähr 6,0 kb) gewonnen, das das G418-Resistenzgen und Ampicillin (hiernach "Ap" genannt)-Resistenzgen enthielt.
Das von dem Plasmid pAGE107 abgeleitete HindIII-XhoI-Fragment (6,0 kb, 0,3 μg) und das vom Plasmid pPMOL1 abgeleitete HindIII-XhoI-Fragment (0,63 kb, 0,01 μg), die wie oben erläutert erhalten wurden, wurden in 20 μl von 66 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6,6 mM Magnesiumchlorid, 10 mM DTT und 0,1 mM ATP enthielt, gelöst, es wurden 200 Einheiten T4-DNA-Ligase zugegeben, und bei 12 °C für 16 Stunden wurde eine Ligation durchgeführt. Die so erhaltene rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um Escherichia coli-HB101 zu transformieren, und es wurde das in 4 gezeigte Plasmid pAGE147 erhalten.
(2) Aufbau eines Vektors, pAGE148, der ein β-Globulin-3'-Splicingsignal (SP) trägt
Zum Einbau des β-Globulin-3'-Splicingsignals in den Expressionsvektor für einen chimären humanen Antikörper an einer Stelle stromabwärts von dem Gen der konstanten Region des Antikörpers wurde ein Vektor (pAGE148), welcher das β-Globulin-3'-Splicingsignal und die gleichen Gene wie die in dem Expressionsvektor für den chimären humanen Antikörper (mit der Ausnahme des Gens für die konstante Region des humanen Antikörpers) enthält, wie folgt aufgebaut.
Zwei μg pSE1UK1SEd1-3, beschrieben in JP-A-2-257851, wurden zu 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid, 50 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zugegeben. Nach der Zugabe von 10 Einheiten HindIII, wurde bei 37 °C für 4 Stunden ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen. Das Präzipitat wurde in 20 μl DNA-Polymerase I-Puffer gelöst, es wurden 5 Einheiten von Escherichia coli-abgeleitetem DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment zugegeben, und die durch HindIII-Verdau erzeugten 5'-Kohäsionsenden wurden durch Inkubation bei 22 °C für 30 Minuten stumpf (blunt) gemacht. Die Reaktionsmischung wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, es wurden 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, und 10 Einheiten KpnI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau erreicht. Die Reaktionsmischung wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, es wurden 30 μl von 50 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, und 10 Einheiten XhoI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurden zwei DNA-Fragmente mit einer Größe von ungefähr 6,67 kb und ungefähr 1,98 kb gewonnen (ungefähr jeweils 0,2 μg).
Dann wurden 2 μg von unter (1) erhaltenem pAGE147 zu 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zugegeben, es wurden 10 Einheiten LpnI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau erreicht. Die Reaktionsmischung wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, es wurden 30 μl von 50 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, und 10 Einheiten XhoI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurden ungefähr 0,2 μg eines DNA-Fragments mit ungefähr 0,66 kb gewonnen.
Dann wurden 0,1 μg des XhoI-HindIII-Fragments (ungefähr 6,67 kb) von pSE1UK1SEd1-3, wie oben erhalten, 0,1 μg des KpnI-HindIII-Fragments (ungefähr 1,98 kb), das oben erhalten wurde, und 0,1 μg des XhoI-KpnI-Fragments (ungefähr 0,66 kb) von pAGE147, wie oben erhalten, in einer Gesamtmenge von 20 μl T4-Ligasepuffer gelöst. Zu der Lösung wurden dreihundertfünfzig Einheiten T4-Ligase zugegeben, und bei 4 °C für 24 Stunden wurde eine Ligation durchgeführt. Die so erhaltene rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um Escherichia coli-HB101 zu transformieren, und es wurde das in 5 gezeigte Plasmid pAGE148 erhalten.
(3) Aufbau von Expressionvektoren für die H-Kette des von KM-796 und KM-750 abgeleiteten chimären humanen Antikörpers
Zunächst wurde die cDNA in dem Plasmid pKM796H1 oder pKM750H1, die für die variable Region des Antikörpers kodiert, durch Spaltung an der 5'-terminalen EcoRI-Stelle und der MaeIII-Stelle in der Nähe des 3'-Endes der cDNA ausgeschnitten und zusammen mit einer synthetischen DNA, die die in SEQ ID NO:12 gezeigte Basensequenz besitzt, wie folgt mit dem Expressionsvektor pChi641HAM1 für die H-Kette eines chimären humanen Antikörpers verbunden (6).
Drei μg pKM796H1 oder pKM750H1, die unter Paragraph (4) erhalten wurden, wurden zu 30 μl von 50 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zugegeben. Ferner wurden 10 Einheiten EcoRI und 10 Einheiten MaeIII zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurden ungefähr 0,3 μg eines DNA-Fragments mit ungefähr 0,43 kb gewonnen. Dann wurden 3 μg pChi641HAM1, das in Vergleichsbeispiel 2 erhalten wird, zu 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zugegeben, es wurden auch 10 Einheiten EcoRI und 10 Einheiten ApaI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurde ungefähr 1,0 μg eines DNA-Fragments mit ungefähr 9,0 kb gewonnen. Dann wurden 0,1 μg des EcoRI-MaeIII-Fragments (ungefähr 0,43 kb) von pKM796H1 oder pKM750H1, wie oben erhalten, 0,1 μg des EcoRI-ApaI-Fragments (ungefähr 9,0 kb) von pChi641HAM1, wie oben erhalten, und 0,3 μg einer synthetischen DNA, die die in SEQ ID NO:12 gezeigte Basensequenz besitzt, in einer Gesamtmenge von 20 μl T4-Ligasepuffer gelöst, es wurden ferner 350 Einheiten T4-Ligase zu der Lösung zugegeben, und bei 4 °C für 24 Stunden wurde eine Ligation durchgeführt. Die so erhaltene rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um Escherichia coli-HB101 zu transformieren. Auf diese Weise wurden die in 6 gezeigten Plasmide pChi796HM1 und pChi750HM1 erhalten.
Dann wurde das β-Globulin-3'-Splicingsignal durch das unten beschriebene Verfahren in die Plasmide pChi796HM1 und pChi750HM1 eingeführt, um Expressionsvektoren für die H-Kette des von KM796 und KM-750 abgeleiteten chimären humanen Antikörpers aufzubauen (7).
Drei μg pChi796HM1 oder pChi750HM1 wurden zu 30 μl von 33 mM Trisacetatpuffer (pH 7,9), der 10 mM Magnesiumacetat, 66 mM Kaliumacetat, 0,5 mM DTT und 0,01 % Rinderserumalbumin (hiernach "BSA" genannt) enthielt, zugegeben. Es wurden auch zehn Einheiten XhoI und 10 Einheiten KpnI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurden ungefähr 0,3 μg eines DNA-Fragments mit ungefähr 3,4 kb gewonnen. Dann wurden 3 μg pAGE148, das unter (2) erhalten wurde, zu 30 μl von 33 mM Trisacetatpuffer (pH 7,9), der 10 mM Magnesiumacetat, 66 mM Kaliumacetat, 0,5 mM DTT und 0,01 % BSA enthielt, zugegeben; es wurden ferner 10 Einheiten XhoI und 10 Einheiten KpnI zugegeben und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau erreicht. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurden ungefähr 0,3 μg eines DNA-Fragments mit ungefähr 8,7 kb gewonnen. Dann wurden 0,1 μg des XhoI-KpnI-Fragments von pChi796HM1 oder pKM750HM1 und 0,1 μg des XhoI-KpnI-Fragments von pAGE148 in einer Gesamtmenge von 20 μl T4-Ligasepuffer gelöst, es wurden ferner 350 Einheiten T4-Ligase zu der Lösung zugegeben, und bei 4 °C für 24 Stunden wurde eine Ligation durchgeführt. Die so erhaltene rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um Escherichia coli-HB101 zu transformieren. So wurden die in 7 gezeigten Plasmide pChi796HMS1 und pChi750HMS1 erhalten.
(4) Aufbau von Expressionsvektoren für die L-Kette des von KM-796 und KM-750 abgeleiteten chimären humanen Antikörpers
Zuerst wurde die cDNA in dem Plasmid pKM796L1 oder pKM750L1, die für die variable Region des Antikörpers kodiert, durch Spaltung an der 5'-terminalen EcoRI-Stelle und der AfIIII-Stelle in der Nähe des 3'-Endes der cDNA ausgeschnitten und zusammen mit einer synthetischen DNA, die die in SEQ ID NO:13 gezeigte Basensequenz besitzt, wie folgt mit dem Expressionsvektor pChilgLA1 für die L-Kette des chimären humanen Antikörpers verbunden (8).
Drei μg pKM796L1 oder pKM750L1 wurden zu 30 μl von 50 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zugegeben. Ferner wurden 10 Einheiten EcoRI und 10 Einheiten AfIIII zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau erreicht. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurden ungefähr 0,3 μg eines DNA-Fragments mit ungefähr 0,39 kb gewonnen. Dann wurden ferner 3 μg pChilgLA1, das in Vergleichsbeispiel 1 erhalten wird, zu 30 μl 50 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zugegeben, es wurden ferner 10 Einheiten EcoRI und 10 Einheiten EcoRV zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert und es wurden ungefähr 1 μg eines DNA-Fragments mit ungefähr 8,6 kb gewonnen.
Dann wurden 0,1 μg des EcoRI-AfIIII-Fragments von kPM796L1 oder pKM750L1, wie oben erhalten, 0,1 μg des EcoRI-EcoRV-Fragments von pChilgLA1, wie oben erhalten, und 0,3 μg einer synthetischen DNA, die die in SEQ ID NO:13 gezeigte Basensequenz besitzt, in einer Gesamtmenge von 20 μl T4-Ligasepuffer gelöst; es wurden ferner 350 Einheiten T4-Ligase zu der Lösung zugegeben, und bei 4 °C für 24 Stunden wurde eine Ligation durchgeführt. Die so erhaltene rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um Escherichia coli-HB101 zu transformieren. Auf diese Weise wurden die in 8 gezeigten Plasmide pChi796LI1 und pChi750LI1 erhalten.
Dann wurde der terminate Wiederholungseinheit-Promotor/Enhancer des Moloney-Maus-Leukämievirus auf folgende Weise in die Plasmide pChi796LI1 und pChi750LI1 eingeführt (9).
Drei μg pChi796LI1 und pChi750LI1 wurden zu 30 μl von 50 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zugegeben. Ferner wurden 10 Einheiten EcoRI und 10 Einheiten XhoI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau erreicht. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurden ungefähr 0,3 μg eines DNA-Fragments mit ungefähr 8,2 kb gewonnen. Dann wurden 3 μg des Expressionsvektors pChi641HAM1 für die H-Kette des chimären humanen Antikörpers, der in Vergleichsbeispiel 2 erhalten wird, zu 30 μl von 50 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zugegeben, es wurden ferner 10 Einheiten EcoRI und 10 Einheiten XhoI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurden ungefähr 0,3 μg eines DNA-Fragments mit ungefähr 0,6 kb gewonnen.
Dann wurden 0,1 μg des EcoRI-XhoI-Fragments von pChi796LI1 oder pKM750LI1, wie oben erhalten, und 0,1 μg des EcoRI-XhoI-Fragments von pChi641HAM1, wie oben erhalten, in einer Gesamtmenge von 20 μl T4-Ligasepuffer gelöst, es wurden ferner 350 Einheiten T4-Ligase zu der Lösung zugegeben, und bei 4 °C für 24 Stunden wurde eine Ligation durchgeführt. Die so erhaltene rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um Escherichia coli-HB101 zu transformieren. Auf diese Weise wurden die in 9 gezeigten Plasmide pChi796LM1 und pChi750LM1 erhalten.
Dann wurde das β-Globulin-3'-Splicingsignal wie oben beschrieben in die Plasmide pChi796LM1 und pChi750LM1 eingeführt, um Expressionsvektoren für die L-Kette des von KM-796 und KM-750 abgeleiteten chimären humanen Antikörpers aufzubauen (10).
Drei μg pChi796LM1 oder pChi750LM1 wurden zu 30 μl von 33 mM Trisacetatpuffer (pH 7,9), der 10 mM Magnesiumacetat, 66 mM Kaliumacetat, 0,5 mM DTT und 0,01 % BSA enthielt, zugegeben. Ferner wurden 10 Einheiten XhoI und 10 Einheiten KpnI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurden ungefähr 0,3 μg eines DNA-Fragments mit ungefähr 2,0 kb gewonnen. Dann wurden 3 μg pAGE148, das unter (2) erhalten wurde, zu 30 μl von 33 mM Trisacetatpuffer (pH 7,9), der 10 mM Magnesiumacetat, 66 mM Kaliumacetat, 0,5 mM DTT und 0,01 % BSA enthielt, zugegeben; es wurden ferner 10 Einheiten XhoI und 10 Einheiten KpnI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurden ungefähr 0,3 μg eines DNA-Fragments mit ungefähr 8,7 kb gewonnen. Dann wurden 0,1 μg des XhoI-KpnI-Fragments von pChi796LM1 oder pKM750LM1, wie oben erhalten, und 0,1 μg des XhoI-KpnI-Fragments von pAGE148 in einer Gesamtmenge von 20 μl T4-Ligasepuffer gelöst, es wurden ferner 350 Einheiten T4-Ligase zugegeben, und bei 4 °C für 24 Stunden wurde eine Ligation durchgeführt. Die so erhaltene rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um Escherichia coli-HB101 zu transformieren. Auf diese Weise wurden die in 10 gezeigten Plasmide pChi796LMS1 und pChi750LMS1 erhalten.
B. Aufbau von Tandemexpressionsvektoren für die H-Kette und L-Kette des von KM-796 und KM-750 abgeleiteten chimären humanen Antikörpers
Es wurden Tandemexpressionsvektoren aufgebaut, die die cDNA, welche für die H-Kette des chimären humanen Antikörpers kodiert und cDNA, welche für die L-Kette kodiert, an demselben Vektor enthalten (11 und 12).
Drei μg pChi796HMS1 oder pChi750HMS1, die unter Paragraph 7 erhalten wurden, wurden zu 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid, 50 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zugegeben. Ferner wurden 10 Einheiten MluI und 10 Einheiten SaII zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert. In jedem Fall wurden ungefähr 0,3 μg eines DNA-Fragments mit ungefähr 5,9 kb gewonnen. Dann wurden 2 μg pAGE107, beschrieben in EP-A-405 285, in 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid, 50 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, gelöst; es wurden ferner 10 Einheiten MluI und 10 Einheiten SaII zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurden ungefähr 0,2 μg eines DNA-Fragments mit ungefähr 3,55 kb gewonnen. Dann wurden 0,1 μg des MluI-SaII-Fragments von pChi796HMS1 oder pChi750HMS1 und 0,1 μg des MluI-SaII-Fragments von pAGE107 in einer Gesamtmenge von 20 μl T4-Ligasepuffer gelöst, es wurden 350 Einheiten T4-Ligase zugegeben, und bei 4 °C für 24 Stunden wurde eine Ligation durchgeführt. Die so erhaltene rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um Escherichia coli-HB101 zu transformieren, um das in 11 gezeigte Plasmid pChi796H107 oder pChi750H107 zu ergeben.
Dann wurden 3 μg pChi796H107 oder pChi750H107 zu 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid, 50 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zugegeben, es wurden ferner 10 Einheiten Clal zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen. Das Präzipitat wurde in 20 μl DNA-Polymerase I-Puffer gelöst, es wurden 5 Einheiten von Escherichia coli-abgeleitetem DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment zugegeben, und die Mischung wurde bei 22 °C für 30 Minuten inkubiert, um die durch ClaI-Verdau gebildeten kohäsiven Enden stumpf (blunt-ended) zu machen. Die Reaktionsmischung wurde ferner einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen. Zu dem Präzipitat wurden 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffers (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid, 50 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, und 10 Einheiten MluI zugegeben. Bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt, und die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert. In jedem Fall wurden ungefähr 0,3 μg eines DNA-Fragments mit ungefähr 7,5 kb gewonnen. Dann wurden 3 μg pChi769LMS1 oder pChi750LMS1 zu 30 μl von 20 mM Trishydrochloridpuffer (pH 8,5), der 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Kaliumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zugegeben, es wurden ferner 10 Einheiten XhoI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen. Das Präzipitat wurde in 20 μl DNA-Polymerase-I-Puffer gelöst, es wurden 5 Einheiten von Escherichia coli-abgeleitetem DNA-Polymerase-I-Klenow-Fragment zugegeben, und die Mischung wurde bei 22 °C für 30 Minuten inkubiert, um die durch XhoI-Verdau gebildeten kohäsiven Enden stumpf (blunt-ended) zu machen. Die Reaktionsmischung wurde ferner einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen. Zu dem Präzipitat wurden 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid, 50 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, sowie 10 Einheiten MluI zugegeben. Bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt, und die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert. In jedem Fall wurden ungefähr 0,3 μg eines DNA-Fragments mit ungefähr 9,3 kb gewonnen. Dann wurden 0,1 μg des MluI-ClaI-Fragments von pChi796H107 oder pChi750H107, wie oben erhalten, und 0,1 μg des MluI-XhoI-Fragments von pChi796LMS1 oder pChi750LMS1, wie oben erhalten, in einer Gesamtmenge von 20 μl T4-Ligasepuffer gelöst; es wurden ferner 350 Einheiten T4-Ligase zugegeben, und bei 4 °C für 24 Stunden wurde eine Ligation durchgeführt. Die so erhaltene rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um Escherichia coli-HB101 zu transformieren, und es wurde das in 12 gezeigte Plasmid pChi796HL1 oder pChi750HL1 erhalten.
9. Aufbau eines Expressionsvektors für die H-Kette eines von KM-603 abgeleiteten chimären humanen Antikörpers
Zunächst wurde die für die variable Region des Antikörpers kodierende cDNA des Plasmids pKM603H1 durch Spaltung an der 5'-terminalen EcoRI-Stelle und der StyI-Stelle in der Nähe des 3'-Endes der cDNA ausgeschnitten und zusammen mit einer synthetischen DNA mit der in SEQ ID NO:14 gezeigten Basensequenz auf folgende Weise mit dem Expressionsvektor pChi641HAM1 für die H-Kette des chimären humanen Antikörpers verbunden (13).
Drei μg pKM603H1, erhalten unter Paragraph 5, wurden zu 30 μl von 50 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zugegeben, gefolgt von weiterer Zugabe von 10 Einheiten EcoRI und 10 Einheiten Styl. Bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurden ungefähr 0,3 μg eines DNA-Fragments mit 0,4 kb gewonnen. Dann wurden 3 μg pChi641HAM1, erhalten in Vergleichsbeispiel 2, zu 30 μl von 10 mM Trishydrochlorid (pH 7,5), welches 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zugegeben, es wurden ferner 10 Einheiten EcoRI und 10 Einheiten ApaI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau erreicht. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurde ungefähr 1,0 μg eines DNA-Fragments mit ungefähr 9,0 kb gewonnen. Dann wurden 0,1 μg des EcoRI-StyI-Fragments (ungefähr 0,4 kb) von pKM603H1, wie oben erhalten, und 0,1 μg des EcoRI-ApaI-Fragments (ungefähr 9,0 kb) von pChi641HAM1, wie oben erhalten, zusammen mit 0,3 μg einer synthetischen DNA, die die in SEQ ID NO:14 gezeigte Basensequenz besitzt, in einer Gesamtmenge von 20 μl T4-Ligasepuffer gelöst; es wurden 350 Einheiten T4-Ligase zu der Lösung zugegeben, und bei 4 °C für 24 Stunden wurde eine Ligation erreicht. Die so erhaltene rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um Escherichia coli-HB101 zu transformieren, und es wurde das in 13 gezeigte Plasmid pChi603HM1 erhalten.
Dann wurde ein Expressionsvektor für die H-Kette eines von KM-603 abgeleiteten chimären humanen Antikörpers aufgebaut, indem das β-Globulin-3'-Splicingsignal in das Plasmid pChi603HM1 auf folgende Weise eingeführt wurde (14).
Drei μg pChi603HM1, das oben erhalten wurde, wurden zu 30 μl von 33 mM Trisacetatpuffer (pH 7,9), der 10 mM Magnesiumacetat, 66 mM Kaliumacetat, 0,5 mM DTT und 0,01 % BSA enthielt, zugegeben. Ferner wurden 10 Einheiten XhoI und 10 Einheiten KpnI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurden ungefähr 0,3 μg eines DNA-Fragments mit ungefähr 3,3 kb gewonnen.
Dann wurden 3 μg pAGE148, erhalten unter Paragraph 7 (2), zu 30 μl von 33 mM Trisacetatpuffer (pH 7,9), der 10 mM Magnesiumacetat, 66 mM Natriumacetat, 0,5 mM DTT und 0,01 % BSA enthielt, zugegeben; ferner wurden 10 Einheiten XhoI und 10 Einheiten KpnI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurden ungefähr 0,3 μg eines DNA-Fragments mit ungefähr 8,7 kb gewonnen. Dann wurden 0,1 μg des XhoI-KpnI-Fragments von pChi603HM1, wie oben erhalten, und 0,1 μg des XhoI-KpnI-Fragments von pAGE148, wie oben erhalten, in einer Gesamtmenge von 20 μl T4-Ligasepuffer gelöst; es wurden 350 Einheiten T4-Ligase zu der Lösung zugegeben, und bei 4 °C für 24 Stunden wurde eine Ligation durchgeführt. Die so erhaltene rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um Escherichia coli-HB101 zu transformieren, und es wurde das in 14 gezeigte Plasmid pChi603HMS1 erhalten.
10. Aufbau eines Expressionsvektors für die L-Kette eines von KM-603 abgeleiteten chimären humanen Antikörpers
Zuerst wurde die cDNA der variablen Region des Antikörpers in dem Plasmid pKM603L1 durch Spaltung an der 5'-terminalen EcoRI-Stelle und der AfIIII-Stelle in der Nähe des 3'-Endes ausgeschnitten und zusammen mit einer synthetischen DNA, die die durch SEQ ID NO:15 definierte Basensequenz besitzt (15), mit dem Expressionsvektor pChilgLA1 für die L-Kette des chimären humanen Antikörpers verbunden.
So wurden 3 μg pKM603L1, das unter Paragraph 5 erhalten wurde, zu 30 μl von 50 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zugegeben, es wurden ferner 10 Einheiten EcoRI und 10 Einheiten AfIIII zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurden ungefähr 0,3 μg eines DNA-Fragments mit ungefähr 0,4 kb gewonnen. Dann wurden 3 μg pChilgLA1, das in Vergleichsbeispiel 1 erhalten wird, zu 30 μl von 50 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zugegeben, es wurden ferner 10 Einheiten EcoRI und 10 Einheiten EcoRV zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurde ungefähr 1 μg eines DNA-Fragments mit ungefähr 8,6 kb gewonnen. Dann wurden 0,1 μg des EcoRI-AfIIII-Fragments von pKM603L1, wie oben erhalten, 0,1 μg des EcoRI-EcoRV-Fragments von pChilgLA1, wie oben erhalten, und 0,3 μg einer synthetischen DNA, die die durch SEQ ID NO:15 definierte Basensequenz besitzt, in einer Gesamtmenge von 20 μl T4-Ligasepuffer gelöst; es wurden 350 Einheiten T4-Ligase zu der Lösung zugegeben, und bei 4 °C für 24 Stunden wurde eine Ligation durchgeführt. Die so erhaltene rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um Escherichia coli-HB101 zu transformieren, und es wurde das in 15 gezeigte Plasmid pChi603LI1 erhalten.
Dann wurde der terminale Wiederholungseinheit-Promotor/Enhancer des Moloney-Maus-Leukämievirus auf folgende Weise in das Plasmid pChi603LI1 eingeführt (16).
So wurden 3 μg pChi603LI1, das oben erhalten wurde, zu 30 μl von 50 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zugegeben, es wurden ferner 10 Einheiten EcoRI und 10 Einheiten XhoI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurden ungefähr 0,3 μg eines DNA-Fragments mit ungefähr 8,3 kb gewonnen. Dann wurden 3 μg von in Vergleichsbeispiel 2 erhaltenem pChi641HAM1 zu 30 μl von 50 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zugegeben, es wurden ferner 10 Einheiten EcoRI und 10 Einheiten XhoI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau erreicht. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurden ungefähr 0,3 μg eines DNA-Fragments mit ungefähr 0,6 kb gewonnen. Dann wurden 0,1 μg des EcoRI- XhoI-Fragments von pChi603LI1, wie oben erhalten, und 0,1 μg des EcoRI-XhoI-Fragments von pChi641HAM1, wie oben erhalten, in einer Gesamtmenge von 20 μl T4-Ligasepuffer gelöst; es wurden 350 Einheiten T4-Ligase zu der Lösung zugegeben, und bei 4 °C für 24 Stunden wurde eine Ligation erreicht. Die so erhaltene rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um Escherichia coli-HB101 zu transformieren, um das in 16 gezeigte Plasmid pChi603LM1 zu ergeben.
Dann wurde ein Expressionsvektor für die L-Kette eines von KM-603 abgeleiteten chimären humanen Antikörpers aufgebaut, indem das β-Globulin-3'-Splicingsignal wie folgt in das Plasmid pChi603LM1 eingeführt wurde (17).
So wurden 3 μg pChi603LM1, das oben erhalten wurde, zu 30 μl von 33 mM Trisacetatpuffer (pH 7,9), der 10 mM Magnesiumacetat, 66 mM Kaliumacetat, 0,5 mM DTT und 0,01 % BSA enthielt, zugegeben, es wurden ferner 10 Einheiten XhoI und 10 Einheiten KpnI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau erreicht. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurden ungefähr 0,3 μg eines DNA-Fragments mit ungefähr 2,0 kb gewonnen. Dann wurden 3 μg von unter Paragraph 7 (2) erhaltenem pAGE148 zu 30 μl von 33 mM Trisacetatpuffer (pH 7,9), der 10 mM Magnesiumsacetat, 66 mM Kaliumacetat, 0,5 mM DTT und 0,01 % BSA enthielt, zugegeben, es wurden ferner 10 Einheiten XhoI und 10 Einheiten KpnI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau erreicht. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurden ungefähr 0,3 μg eines DNA-Fragments mit ungefähr 8,7 kb gewonnen. Dann wurden 0,1 μg des XhoI-KpnI-Fragments von pChi603LM1, wie oben erhalten, und 0,1 μg des XhoI-KpnI-Fragments von pAGE148, wie oben erhalten, in einer Gesamtmenge von 20 μl T4-Ligasepuffer gelöst; es wurden 350 Einheiten T4-Ligase zu der Lösung zugegeben, und bei 4 °C für 24 Stunden wurde eine Ligation durchgeführt. Die so erhaltene rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um Escherichia coli-HB101 zu transformieren, um das in 17 gezeigte Plasmid pChi603LMS1 zu ergeben.
11. Expression des von KM-796 und KM-750 abgeleiteten chimären humanen anti-GM₂-Antikörpers in YB2/0-Zellen
Die Plasmide wurden mittels des Elektroporationsverfahrens von Miyaji et al., [Cytotechnology, 3, 133–140 (1990)] in YB2/0-Zellen eingeführt.
Nach dem Einführen von 4 μg pChi750HL1 oder pChi796HL1, erhalten unter Paragraph 8, in 4 × 10⁶ YB2/0 (ATCC CRL1581)-Zellen, wurden die Zellen in 40 ml von RPMI-1640-FCS(10) suspendiert [RPMI1640-Medium (Nissui Pharmaceutical), das 10 % FCS, 1/40 Volumen von 7,5 % NaHCO₃, 3 % von 200 mM L-Glutamin-Lösung (Gibco) und 0,5 % von Penicillin-Streptomycin-Lösung (Gibco; enthaltend 5000 Einheiten/ml Penicillin und 5000 μg/ml Streptomycin) enthält], und die Suspension wurde in Anteilen von 200 μl in Wells von 96-Well-Mikrotiterplatten verteilt. Nach 24 Stunden Inkubation bei 37 °C in einem CO₂-Inkubator wurde G418 (Gibco) bis zu einer Konzentration von 0,5 mg/ml zugegeben, und dann wurde die Inkubation für 1 bis 2 Wochen fortgeführt. Es traten Kolonien von Transformanten auf, von jedem Well, in dem die Zellen bis zur Konfluenz gewachsen waren, wurde das Kulturfluid entnommen, und zur Untersuchung der Aktivität des chimären humanen anti-GM₂-Antikörpers wurde ein Enzym-gekoppelter Immunosorbent-Assay (ELISA) durchgeführt.
Enzym-gekoppelter Immunosorbent-Assay (ELISA)
In einer Lösung von 5 ng Phosphatidylcholin (Sigma) und 2,5 ng von Cholesterin (Sigma) in 2 ml Ethanol wurden 2 ng GM₂ (N-Acetyl-GM₂, Boehringer Mannheim) oder andere Ganglioside gelöst. Die Lösung bzw. Verdünnungen davon wurden in Portionen von 20 μl in Wells von 96-Well-Mikrotiterplatten (Greiner) verteilt, und nach dem Lufttrocknen wurde mit PBS, enthaltend 1 % BSA, eine Blockierung erreicht. Jeder Kulturüberstand für jede Transformante, jede Lösung von aufgereinigtem monoklonalem Mausantikörper und jede Lösung von aufgereinigtem chimärem humanem Antikörper wurde in Portionen von 50 bis 100 μl in den Wells verteilt, und man ließ die Reaktion für 1 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur ablaufen. Die Wells wurden dann mit PBS gewaschen, und dazu wurden 50 bis 100 μl Peroxidase-markierter Antikörper zugegeben, gefolgt von einer Reaktion bei Raumtemperatur für 1 bis 2 Stunden. Die Wells wurden mit PBS gewaschen, und es wurde eine ABTS-Substrat-Lösung [hergestellt, indem 550 mg 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure)-Diammoniumsalz in 0,1 M Citratpuffer (pH 4,2) gelöst wurden und kurz vor der Zugabe Wasserstoffperoxid bis zu einer Konzentration von 1 μl/ml zugegeben wurde] in Portionen von 50 bis 100 μl zu jedem Well zur Farbentwicklung zugegeben, gefolgt von OD₄₁₅-Messung.
Der Klon, der von den erhaltenen Klonen die höchste Aktivität im ELISA-Assay zeigte, ergab einen Gehalt an chimärem humanem anti-GM₂-Antikörper von ungefähr 1,0 μg/ml Kulturfluid.
Zellen des Klons, welcher die oben genannte Aktivität von chimärem humanem anti-GM₂-Antikörper zeigte, wurden in RPMI1640-FCS(10)-Medium, das 0,5 mg/ml G418 und 50 nM Methotrexat (hiernach "MTX") enthielt, auf eine Konzentration von 1 bis 2 × 10⁵ Zellen/ml suspendiert, und die Suspension wurde in Portionen von 2 ml in Wells von 24-Well-Platten verteilt. Die Inkubation wurde bei 37 °C in einem CO₂-Inkubator für 1 bis 2 Wochen durchgeführt, um 50 nM MTX-resistente Klone zu induzieren. Bei Konfluenz wurde die Aktivität von chimärem humanem anti-GM₂-Antikörper in jedem Kulturfluid mittels ELISA bestimmt. Der 50 nM MTX-resistente Klon, der von den erhaltenen Klonen die höchste Aktivität zeigte, zeigte einen Gehalt an chimärem humanem anti-GM₂-Antikörper von ungefähr 5,0 μg/ml.
Zellen des obigen 50 nM MTX-resistenten Klons wurden in RPMI1640-FCS(10)-Medium, das 0,5 mg/ml G418 und 200 nM MTX enthielt, bis zu einer Konzentration von 1 bis 2 × 10⁵ Zellen/ml suspendiert, und die Suspension wurde in Portionen von 2 ml in Wells einer 24-Well-Platte verteilt. Die Inkubation wurde bei 37 °C in einem CO₂-Inkubator für 1 bis 2 Wochen durchgeführt, um 200 nM MTX-resistente Klone zu induzieren. Bei Konfluenz wurde jeder Kulturfluid mittels ELISA auf die Aktivität von chimärem humanem anti-GM₂-Antikörper hin untersucht. Der 200 nM MTX-resistente Klon, der von den erhaltenen Klonen die höchste Aktivität zeigte, wies einen Gehalt an chimärem humanem anti-GM₂-Antikörper von ungefähr 10 μg/ml auf. Die 200 nM MTX-resistenten Klone, die von pChi750HL1 und pChi796HL1 erhalten wurden, wurden Transformante "KM966" (Stamm, der den von KM796 abgeleiteten chimären humanen Antikörper KM966 erzeugt) bzw. "KM967" (Stamm, der den von KM-750 abgeleiteten chimären humanen Antikörper KM967 erzeugt) genannt.
Die folgende SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) bestätigte, dass die obigen Transformanten KM966 und KM967 die entsprechenden chimären humanen anti-GM₂-Antikörper exprimieren.
Die Transformanten KM966 und KM967 wurden jeweils in GIT-Medium (Nippon Pharmaceutical), das 0,5 mg/ml G418 und 200 nM MTX enthielt, auf eine Konzentration von 1 bis 2 × 10⁵ Zellen/ml suspendiert. Jede Suspension wurde in Portionen von 100 ml in 175 cm²-Gefäße (Greiner) verteilt. Die Kultivierung wurde bei 37 °C in einem CO₂-Inkubator für 5 bis 7 Tage durchgeführt. Bei Konfluenz wurde das Kulturfluid gewonnen. Die Behandlung von ungefähr 1 Liter des Kulturfluids mit Affi-Gel Protein A-MAPS-II-Kit (Bio-Rad) ergab ungefähr 5 mg eines aufgereinigten chimären humanen anti-GM₂-Antikörpers für jede Transformante. Ungefähr 2 μg von dem aufgereinigten chimären humanen anti-GM₂-Antikörper KM966 oder KM967 wurden durch das herkömmliche Verfahren [Laemmli: Nature, 227, 680 (1970)] zur Überprüfung des Molekulargewichts elektrophoretisch behandelt. Die Ergebnisse sind in 18 gezeigt. Wie in 18 gezeigt, ergaben sowohl KM966 als auch KM967 ein Molekulargewicht der H-Kette des Antikörpers von ungefähr 50 Kilodalton und ein Molekulargewicht der L-Kette des Antikörpers von ungefähr 25 Kilodalton unter reduzierenden Bedingungen, was zeigt, dass das Molekulargewicht der exprimierten H-Kette und L-Kette korrekt ist. Für jede von KM966 und KM967 betrug das Molekulargewicht des chimären humanen Antikörpers unter nicht-reduzierenden Bedingungen ungefähr 150 Kilodalton, was zeigt, dass der exprimierte Antikörper aus zwei H-Ketten und zwei L-Ketten zusammengesetzt ist und dass die Größe stimmte.
12. Expression von KM-603-abgeleiteten chimären humanen anti-GM₂-Antikörpern in SP2/0-Zellen
Ein Anteil von 2 μg des unter Paragraph 9 erhaltenen Plasmids pChi603HMS1 oder pChi603LMS1 wurde durch Elektroporation auf gleiche Weise wie unter Paragraph 11 in 4 × 10⁶ Zellen von YB2/0 (ATCC CRL1581) eingeführt. Die Zellen wurden in 40 ml RPMI1640-FCS(10) suspendiert, und die Suspension wurde in Portionen von 200 μl in Wells von 96-Well-Mikrotiterplatten verteilt. Nach 24 Stunden der Inkubation in einem CO₂-Inkubator bei 37 °C, wurde G418 (Gibco) bis zu einer Konzentration von 0,5 mg/ml zugegeben, und die Inkubation wurde für 1 bis 2 Wochen weitergeführt. Es traten Kolonien von Transformanten auf. Von den konfluenten Wells wurde das Kulturfluid gewonnen, und die Aktivität von chimärem humanem anti-GM₂-Antikörper wurde wie oben beschrieben mittels ELISA gemessen. Der Klon, der von den erhaltenen Klonen die höchste Aktivität von chimärem humanem anti-GM₂-Antikörper zeigte, ergab einen Gehalt an chimärem humanem anti-GM₂-Antikörper von ungefähr 0,1 μg/ml Kulturfluid.
Zellen des Klons, der die oben genannte Aktivität von chimärem humanem anti-GM₂-Antikörper zeigte, wurden in RPMI1640-FSC(10)-Medium, das 0,5 mg/ml G418 und 50 nM MTX enthielt, bis zu einer Konzentration von 1 bis 2 × 10⁵ Zellen/ml suspendiert, und die Suspension wurde in Portionen von 2 ml in die Wells der 24-Well-Platten verteilt. Klone, die resistent gegenüber 50 nM MTX waren, wurden durch Inkubation in einem CO₂-Inkubator bei 37 °C für 2 bis 3 Wochen induziert. Bei Erreichen von Konfluenz wurden die Kulturfluide zur Messung der Aktivität von chimärem humanem anti-GM₂-Antikörper einem ELISA unterzogen. Von den erhaltenen 50 nM MTX-resistenten Klonen ergab der Klon, der die höchste Aktivität zeigte, einen Gehalt an chimärem humanem anti-GM₂-Antikörper von ungefähr 0,3 μg/ml Kulturfluid.
Zellen des obigen gegenüber 50 nM MTX resistenten Klons wurden in RPMI1640-FCS(10)-Medium, das 0,5 mg/ml G418 und 200 nM MTX enthielt, bis zu einer Konzentration von 1 bis 2 × 10⁵ Zellen/ml suspendiert, und die Suspensionen wurden in Portionen von 2 ml in Wells von 24-Well-Platten verteilt. Klone, die gegenüber 200 nM MTX resistent waren, wurden durch nachfolgende Inkubation in einem CO₂-Inkubator bei 37 °C für 2 bis 3 Wochen induziert. Bei Erreichen von Konfluenz wurde die Aktivität von chimärem humanem anti-GM₂-Antikörper in dem Kulturfluid mittels ELISA gemessen. Von den erhaltenen gegenüber 200 nM MTX resistenten Klonen ergab der Klon, der die höchste Aktivität zeigte, einen Gehalt an chimärem humanem anti-GM₂-Antikörper von ungefähr 0,5 μg/ml Kulturfluid.
Zellen des obigen gegenüber 200 nM MTX resistenten Klons wurden in RPMI1640-FCS(10)-Medium, das 0,5 mg/ml G418 und 500 nM MTX enthielt, bis zu einer Konzentration von 1 bis 2 × 10⁵ Zellen/ml suspendiert, und die Suspension wurde in Portionen von 2 ml in Wells von 24-Well-Platten verteilt. Klone, die gegenüber 500 nM MTX resistent waren, wurden durch nachfolgende Inkubation in einem CO₂-Inkubator bei 37 °C für 1 bis 2 Wochen induziert. Bei Erreichen von Konfluenz wurde die Aktivität von chimärem humanem anti-GM₂-Antikörper in dem Kulturfluid mittels ELISA bestimmt. Von den erhaltenen gegenüber 500 nM MTX resistenten Klonen ergab derjenige, der die höchste Aktivität zeigte, einen Gehalt an chimärem humanem anti-GM₂-Antikörper von ungefähr 1,0 μg/ml Kulturfluid. Dieser gegenüber 500 nM MTX resistente Klon wurde "Transformante KM968" genannt.
Die nachfolgende SDS-PAGE bestätigte die Expression eines chimären humanen anti-GM₂-Antikörpers in der obigen Transformante KM968.
Zellen der Transformante KM968 wurden in GIT-Medium (Nippon Pharmaceutical), das 0,5 mg/ml G418 und 500 nM MTX enthielt, bis zu einer Konzentration von 1 bis 2 × 10⁵ Zellen/ml suspendiert, und die Suspension wurde in Portionen von 100 ml in 175 cm²-Gefäßen verteilt (Greiner). Die Kultivierung wurde in einem CO₂-Inkubator bei 37 °C für 5 bis 7 Tage durchgeführt, und bei Erreichen von Konfluenz wurde das Kulturfluid gewonnen. Die Behandlung von ungefähr 3,0 Litern des Kulturfluids mit Affi-Gel Protein A MAPS-II Kit (Bio-Rad) ergab ungefähr 1 mg eines aufgereinigten chimären humanen anti-GM₂-Antikörpers. Ungefähr 2 μg dieses aufgereinigten chimären humanen anti-GM₂-Antikörpers KM968 wurden zur Überprüfung des Molekulargewichts durch das herkömmliche Verfahren [Laemmli: Nature, 227, 880 (1970)] elektrophoretisch behandelt. Die Ergebnisse sind in 19 gezeigt. Unter reduzierenden Bedingungen betrug das Molekulargewicht der H-Kette des Antikörpers ungefähr 50 Kilodalton und das Molekulargewicht der L-Kette des Antikörpers ungefähr 25 Kilodalton, was eine Expression der H-Kette und L-Kette mit dem richtigen Molekulargewicht bestätigte. Unter nicht-reduzierenden Bedingungen betrug das Molekulargewicht des chimären humanen Antikörpers ungefähr 150 Kilodalton, was bestätigte, dass der exprimierte Antikörper aus zwei H-Ketten und zwei L-Ketten zusammengesetzt war und dass seine Größe stimmte.
13. Reaktionsspezifität der chimären humanen anti-GM₂-Antikörper
Die Reaktivitäten der chimären anti-GM₂-Antikörper gegenüber Gangliosid GM₁, N-Acetyl-GM₂ (Boehringer Mannheim), N-Glycolyl-GM₂, N-Acetyl-GM₃, N-Glycolyl-GM₃, GD_1a, GD_1b (latron), GD₂, GD₃ (latron) und GQ_1b (latron) wurden mittels der ELISA-Technik untersucht. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 1 gezeigt. GM₁ und GD_1a wurden aus Rinderhirn, N-Glycolyl-GM₂ und N-Glycolyl-GM₃ aus Mäuseleber, N-Acetyl-GM₃ aus Hundeerythrocyten und GD₂ aus der kultivierten Zelllinie IMR32 (ATCC CCL127) durch ein bekanntes Verfahren [J. Biol. Chem., 263, 10915 (1988)] aufgereinigt.
Wie in Tabelle 1 gezeigt, wurde bestätigt, dass die chimären humanen anti-GM₂-Antikörper KM966 und KM967 spezifisch mit GM₂ reagieren. Die Reaktivität von KM966 war jedoch größer als die von KM967. Im Gegensatz dazu zeigte KM968 (von KM-603 abgeleiteter chimärer humaner Antikörper) keinerlei Reaktivität gegenüber GM₂.
Tabelle 1
14. Reaktivitäten der chimären humanen anti-GM₂-Antikörper KM966 und KM967 gegenüber Krebszellen (Fluoreszenzantikörper-Technik)
1 × 10⁶ Zellen einer kultivierten humanen Kleinzelllungenkarzinomzelllinie QC90 [Cancer Res., 49, 2683 (1989)], NCl-H69 (ATCC HTB119), NCl-H128 (ATCC HTB120), SBC-1 (JCRB 0816), SBC-2 (JCRB 0817), SBC-3 (JCRB 0818), SBC-5 (JCRB 0819), RERF-LC-MA (JCRB 0812), Lu-134-A-H (JCRB 0235), Lu-139 (RCB 469), Lu-130 (RCB 465), Lu-135 (RCB 468), Lu-134-B (RCB 467), Lu-140 (RCB 470), PC-6 [Naito et al.: Gann to Kagaku Ryoho (Cancer and Chemotherapy), 5 (suppl), 89 (1978)], einer kultivierten humanen Lungenplattenepithelkarzinomzelllinie PC-1 [Naito et al.: Gann to Kagaku Ryoho, 5 (suppl.), 89 (1978)], PC-10 [Naito et al.: Gann to Kagaku Ryoho, 5 (suppl.), 89 (1978)], Colo16 [Moor et al.: Cancer Res., 35, 2684 (1975)], Calu-1 (ATCC HTB54), SK-LC-4 [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 85, 4441 (1988)], einer kultivierten humanen Lungenadenokarzinomzelllinie PC-7 [Hayata et al.: Hito Gansaibo no Baiyo (Human Cancer Cell Culture), 131 (1975)], PC-9 [Kinjo et al.: Brit. J. Cancer, 39, 15 (1979)], PC-12 (ATCC CRL1721), RERF-LC-MS (JCRB 0081), HLC-1 (RCB 083), einer kultivierten humanen Lungenplättchepithelkarzinomzelllinie PC-13 [Ohya et al.: Tanpakushitsu, Kakusan, Koso (Protein, Nucleic Acid, Enzyme), 23, 697 (1978)], Lu65 (JCRB 0079), CALU-6 (ATCC HTB56), SK-LC-6 [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 85, 4441 (1988)], einer kultivierten humanen Neuroblastomzelllinie YT-nu [Ishikawa et al.: Acta Path. Jap., 27, 697 (1977)], NAGAI [Ishikawa et al.: Acta Path. Jap., 29, 289 (1979)], NB-1 [Ishikawa et al.: Acta Path. Jap., 27, 697 (1977)], IMR32 (ATCC CCL127), GOTO (JCRB 0612), NB-9 (RCB 477), SK-N-MC (ATCC HTB10), einer kultivierten humanen Gehirntumorzelllinie (Gliom) P122 [EMBO J., 6, 2939 (1987)], A172 (ATCC CRL1620), T98G (ATCC CRL1690), U-118MG (ATCC HTB15), einer kultivierten humanen Leukämiezelllinie HSB-2 (ATCC CCL120.1), ATN-1, U-937 (ATCC CRL1593), HPB-ALL [Ohya et al.: Tanpakushitsu, Kakusan, Koso, 23, 697 (1978)], CCRF-SB (ATCC CCL120), KOPN-K [Hanei et al.: Haigan (Lung Cancer), 25, 524 (1985)], TYH [Haranaka et al.: Int. J. Cancer, 36, 313 (1985)], MOLT-3 (ATCC CRL1552), CCRF-CEM (ATCC CCL119), TALL-1 (JCRB 0086), NALL-1 [Ohya et al.: Tanpakushitsu, Kakusan, Koso, 23, 697 (1978), CCRF-SB (JCRB 0032), THP-1 (ATCC TIB202), HEL92-1-7 (ATCC TIB180), einer kultivierten humanen malignen Melanomzelllinie C24·32 (EP-A-0 493 686, Khm-3/P [J. Natl. Cancer Inst., 59, 775 (1977)] oder G361 (ATCC CRL1424) wurden in PBS suspendiert. Die Suspension wurde in ein Mikroröhrchen (Tref) platziert und zentrifugiert (3000 U/min, 2 Minuten), um die Zellen zu waschen, es wurden 50 μl von KM966 oder KM967 (50 μg/ml) zugegeben, die Mischung wurde gerührt, und man ließ die Reaktion bei 4 °C für 1 Stunde ablaufen. Dann wurden die Zellen dreimal durch Zentrifugation mit PBS gewaschen, es wurden 20 μl von Fluorescein-Isocyanat-markiertem Protein A (30-fache Verdünnung; Boehringer Mannheim Yamanouchi) zugegeben, und nach Rühren ließ man die Reaktion bei 4 °C für 1 Stunde ablaufen. Dann wurden die Zellen dreimal durch Zentrifugation mit PBS gewaschen, dann in PBS suspendiert und unter Verwendung des Flusszytometers EPICS Elite (Coulter) einer Analyse unterzogen. In einem Kontrolllauf wurde die gleiche Vorgehensweise wie oben beschrieben durchgeführt, ohne dass der chimäre humane Antikörper zugegeben wurde. Die so erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Der Chimäre humane Antikörper KM966 reagierte mit 9 (NCl-H128, SBC-1, SBC-3, SBC-5, Lu-139, Lu-130, Lu-135, Lu-134-B und Lu-140) der 14 Kleinzelllungen-karzinomzelllinien, 2 (PC-10 und Calu-1) der 5 Lungenplattenepithelkarzinom-zelllinien, 2 (PC-9 und RERF-LC-MS) der 5 Lungenadenokarzinomzelllinien, 2 (PC-13 und SK-LC-6) der 4 Großzelllungenkarzinomzelllinien, 7 (YT-nu, NAGAI, NB-1, IMR32, GOTO, NB-9 und SK-N-MC) der 7 Neuroblastomzelllinien und 4 (P122, A172, T98G und U-118MG) der 4 Gehirntumorzelllinien (Gliom). Andererseits reagierte der chimäre humane Antikörper KM967 mit keiner der kultivierten Zelllinien. Die obigen Ergebnisse zeigen, dass der chimäre humane Antikörper KM966 u.a. nützlich zur Diagnose und Behandlung von Gehirntumoren, Tumoren des peripheralen Nervensystems und Lungenkrebs ist.
Tabelle 2
15. In vitro-Antitumoraktivität des chimären humanen anti-GM₂-Antikörpers KM966: Komplement-abhängige Cytotoxizität (CDC)
(1) Herstellung von Zielzellen
Die Zielzellen SBC-3, Lu-135, PC-10, RERF-LC-MS, PC-13, NAGAI, GOTO oder A172, kultiviert in RPMI1640-Medium, dem 10 % FCS zugesetzt war, wurden auf eine Zellkonzentration von 5 × 10⁶ Zellen/ml eingestellt, es wurde Na₂ ⁵¹CrO₄ bis zu einer Konzentration von 100 μCi/5 × 10⁶ Zellen zugegeben, dann ließ man die Reaktion bei 37 °C für 1 Stunde ablaufen, und die Zellen wurden dreimal mit dem Medium gewaschen. Man ließ die Zellen dann in dem Medium bei 4 °C für 30 Minuten zur spontanten Dissoziation stehen, und dann wurde, nach der Zentrifugation, das Medium zugegeben, um die Zellkonzentration auf 1 × 10⁶ Zellen/ml einzustellen.
(2) Herstellung des Komplements
Seren von drei gesunden Subjekten wurden vereinigt und als Komplement-Quelle verwendet.
(3) Messung der CDC-Aktivität
Der chimäre humane anti-GM₂-Antikörper KM966 oder der anti-GM₂-Mausantikörper KM696 (FERM BP-3337) wurde in Wells von 96-Well-Platten mit U-Boden innerhalb des Endkonzentrationsbereichs von 0,5 bis 50 μg/ml gegeben, und dann wurden 5 × 10⁴ Zellen/Well der unter (1) hergestellten Zielzellen zugegeben. Man ließ die Reaktion für 30 Minuten bei Raumtemperatur laufen. Nach der Zentrifugation wurden die Überstände entfernt, 150 μl des unter (2) erhaltenen humanen Serums wurden zu jedem Well zugegeben (Endkonzentration 15 % Vol/Vol), und man ließ die Reaktion bei 37 °C für 1 Stunde ablaufen. Nach der Zentrifugation wurde die Menge an ⁵¹Cr in jedem Überstand unter Verwendung eines Gammazählers bestimmt. Die Menge an spontan dissoziiertem ⁵¹Cr wurde bestimmt, indem zu den Zielzellen das Medium alleine anstelle der Antikörper- und Komplementlösungen zugegeben und die Menge an ⁵¹Cr in dem Überstand auf gleiche Weise wie oben erläutert gemessen wurde. Die Gesamtmenge an dissoziiertem ⁵¹Cr wurde bestimmt, indem zu den Zielzellen 5 N Natriumhydroxid anstelle der Antikörper- und Komplementlösungen zugegeben und die Menge an ⁵¹Cr in dem Überstand auf gleiche Weise wie oben erläutert gemessen wurde. Die CDC-Aktivität wurde wie folgt berechnet:
Die so erhaltenen Ergebnisse sind in den 20 bis 23 gezeigt. Es wurde gezeigt, dass der chimäre humane Antikörper KM966 gegenüber allen getesteten Zellen eine CDC-Aktivität zeigt.
16. In vitro-Antitumor-Aktivität des chimären humanen anti-GM₂-Antikörpers KM966: Antikörper-abhängige Zell-vermittelte Cytotoxizität (ADCC)
(1) Herstellung von Zielzellen
Die Zielzellen SBC-3, Lu-135, PC-10, RERF-LC-MS, PC-13, NAGAI, GOTO oder A172, kultiviert in RPMI1640-Medium, das mit mit 10 % FCS versetzt war, wurden auf eine Zellkonzentration von 1 × 10⁶ Zellen/ml eingestellt, es wurde Na₂ ⁵¹CrO₄ bis zu einer Konzentration von 50 μCi/1 × 10⁶ Zellen zugegeben, dann ließ man die Reaktion bei 37 °C für 1 Stunde ablaufen, und die Zellen wurden dreimal mit dem Medium gewaschen. Dann ließ man die Zellen in dem Medium bei 4 °C für 30 Minuten zur spontanen Dissoziation stehen, und dann wurde nach der Zentrifugation das Medium zugegeben, um die Zellkonzentration auf 2 × 10⁵ Zellen/ml einzustellen.
(2) Herstellung von Effektorzellen
Es wurde humanes venöses Blut (25 ml) gesammelt, 0,5 ml Natriumheparin (Takeda Chemical Industries; 1000 Einheiten/ml) wurden zugegeben, und die Mischung wurde leicht gerührt. Diese Mischung wurde unter Verwendung von Polymorphprep (Nycomed Pharma AS) zentrifugiert (1500 bis 1800 g, 30 Minuten), die Lymphozytschicht wurde abgetrennt und dreimal mittels Zentrifugation mit RPMI1640-Medium gewaschen (1500 bis 1800 g, 15 Minuten), und die Zellen wurden in RPMI1640-Medium, das mit 10 % FCS versetzt war, (5 × 10⁶ Zellen/ml) suspendiert, um als Effektorzellen verwendet zu werden.
(3) Messung der ADCC-Aktivität
Der chimäre humane anti-GM₂-Antikörper KM966 oder anti-GM₂-Mausantikörper KM696 wurde zu Wells von 96-Well-Platten mit U-Boden innerhalb des Endkonzentrationsbereiches von 0,05 bis 5 μg/ml zugegeben, und dann wurden 50 μl (1 × 10⁴ Zellen/Well) der unter (1) hergestellten Zielzellsuspension und 100 μl (5 × 10⁵ Zellen/Well) der unter (2) hergestellten Effektorzellsuspension zu jedem Well zugegeben (das Verhältnis zwischen Effektorzellen zu Zielzellen betrug 50:1). Man ließ die Reaktion bei 37 °C für 4 Stunden ablaufen, und nach der Zentrifugation wurde die Menge an ⁵¹Cr in jedem Überstand unter Verwendung eines Gammazählers gemessen. Die Menge an spontan dissoziiertem ⁵¹Cr wurde bestimmt, indem zu den Zielzellen das Medium alleine anstelle des Antikörpers und der Effektorzellen zugegeben und die Menge an ⁵¹Cr in dem Überstand auf gleiche Weise wie oben erläutert gemessen wurde. Die Gesamtmenge an dissoziiertem ⁵¹Cr wurde bestimmt, indem zu den Zielzellen 5 N Natriumhydroxid anstelle des Antikörpers und der Effektorzellen zugegeben und die Menge an ⁵¹Cr in dem Überstand auf gleiche Weise wie oben erläutert gemessen wurde. Die ADCC-Aktivität wurde wie folgt berechnet:
Die so erhaltenen Ergebnisse sind in den 24 bis 27 gezeigt. Der chimäre Antikörper KM966 zeigte gegenüber allen Zellen eine ADCC-Aktivität, wohingegen der anti-GM₂-Mausantikörper KM696 keine oder eine geringe ADCC-Aktivität zeigte. Die obigen Ergebnisse zeigen, dass der chimäre humane Antikörper KM966 wirksamer bei der Behandlung von humanem Krebs ist als der Mausantikörper KM-696.
VERGLEICHSBEISPIEL 1
Aufbau des Vektors pChilgLA1 zur Expression der L-Kette eines chimären humanen Antikörpers
1. Isolierung der von der KM50-Zelle abgeleiteten Promotor- und Enhancer-Gene der Immunoglobulin-H-Kette
(1) Herstellung von chromosomalen DNAs von KM50-Zellen, P3U1-Zellen und der Rattenniere
Chromosomale DNAs wurden mittels des herkömmlichen Verfahrens [Maniatis et al. (Hrsg.): Molecular Cloning, 1989, S. 9.16] wie folgt hergestellt.
KM50-Zellen (1,2 × 10⁸ Zellen), P3U1-Zellen (ATCC CRL1597) (2 × 10⁸ Zellen) und eine Rattennieren-Probe (bei –80 °C gefroren und dann in ausreichendem Ausmaß unter Verwendung eines Holzhammers zerkleinert) (1,6 g) wurden in 2 ml von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 150 mM Natriumchlorid und 10 mM Ethylendiamintetraessigsäuredinatriumsalz (hiernach "EDTA" genannt) enthielt, suspendiert, und es wurden 0,8 mg Proteinase K (Sigma) und 10 mg von Natriumlaurylsulfat (hiernach "SDS" genannt) zu jeder Suspension zugegeben, und die Suspension wurde bei 37 °C für 10 Stunden inkubiert. Dann wurde jede Mischung einmal mit dem gleichen Volumen Phenol, zweimal mit dem gleichen Volumen Chloroform und dann einmal mit dem gleichen Volumen Ether extrahiert und für 10 Stunden gegen 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 1 mM EDTA enthielt, dialysiert. Die DNA-Lösung wurde von den Dialyseröhrchen gewonnen, und es wurde Ribonuklease A (Sigma) bis zu einer Endkonzentration von 20 μg/ml zu der Lösung zugegeben. Jede resultierende Lösung wurde bei 37 °C für 6 Stunden für einen ausreichenden Abbau von RNA inkubiert, es wurden dann 15 mg SDS und 1 mg Proteinase K zugegeben, und die Mischung wurde bei 37 °C für 10 Stunden inkubiert. Die Mischung wurde dann zweimal mit dem gleichen Volumen Phenol, zweimal mit dem gleichen Volumen Chloroform und zweimal mit dem gleichen Volumen Ether extrahiert und dann für 10 Stunden gegen 10 mM Trishydrochlorid-Puffer (pH 7,5), der 1 mM EDTA enthielt, dialysiert. Die DNA-Lösung wurde zur Verwendung als Probe chromosomaler DNA von dem Dialyseröhrchen gewonnen. Die Messung der DNA-Konzentration, ausgedrückt als Extinktion bei 260 nm, ergab, dass die Ausbeute an chromosomaler DNA von 1,2 × 10⁸ KM50-Zellen 1,6 mg, die von 2 × 10⁸ P3U1-Zellen 1,5 mg und die von 1,6 g Rattenleber 1,9 mg betrug.
(2) Identifikation des Gens der aktiven Form der Immunoglobulin H-Kette mittels Southern-Blotting
Die unter (1) erhaltenen chromosomalen DNAs der KM50-Zelle, p3U1-Zelle und Rattenniere (jeweils 3 μg) wurden in 25 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid und 100 mM Natriumchlorid enthielt, gelöst, es wurden 15 Einheiten XbaI (Takara Shuzo; hiernach waren die verwendeten Restriktionsenzyme Produkte von Takara Shuzo) zugegeben, und es wurde bei 37 °C für 2 Stunden eine Inkubation durchgeführt, um die Spaltung an den XbaI-Stellen zu erreichen. Jede Reaktionsmischung wurde einer Agarosegel elektrophorese unterzogen, dann wurde der DNA-Transfer auf einen Nitrocellulosefilter mittels des Verfahrens von Southern et al. [J. Mol. Biol., 98, 503 (1975)] erreicht, und es wurde eine Hybridisierung mittels des herkömmlichen Verfahrens [Kameyama et al.: FEBS Letters, 244, 301–306 (1989)] unter Verwendung der in der zuletzt zitierten Literaturstelle beschriebenen Maus-JH-Sonde durchgeführt. Die DNA der KM50-Zelle alleine ergab eine Bande an einer Stelle, die ungefähr 9,3 kb entspricht. Daher wurde angenommen, dass die Immunoglobulin-XbaI-Fragment-DNA für die Immunoglobulin-H-Kette der aktiven Form in KM50-Zellen kodiert.
(3) Aufbau einer Bibliothek genomischer DNA einer KM50-Zelle
Ein Anteil von 60 μg der von der KM50-Zelle abgeleiteten chromosomalen DNA, die unter (1) erhalten wurde, wurde in 250 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffers (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid und 100 mM Natriumchlorid enthielt, gelöst, es wurden 150 Einheiten XbaI zugegeben, und bei 37 °C für 2 Stunden wurde eine Inkubation davon durchgeführt, um eine Spaltung an den XbaI-Stellen zu erreichen. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und eine Probe (ungefähr 2 μg) einer von einer KM50-Zelle abgeleiteten 9,3 kb-DNA-Fraktion wurde unter Verwendung z.B. des DEAE-Papierverfahrens (Maniatis et al. (Hrsg.): Molecular Cloning, 1989, S. 6.24] gewonnen. Getrennt wurden 3 μg von Lambda-ZAP (Stratagene) zur Verwendung als Vektor in 200 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid und 100 mM Natriumchlorid enthielt, gelöst, es wurden 50 Einheiten XbaI zugegeben, und die Mischung wurde bei 37 °C für 2 Stunden inkubiert, um eine Spaltung an den XbaI-Stellen zu erreichen. Die Reaktionsmischung wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, wobei ungefähr 3 μg DNA gewonnen wurden. Diese DNA wurde in 100 μl von 100 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5) gelöst, es wurde 1 Einheit alkalischer Phosphatase (Takara Shuzo) zugegeben, die Dephosphorylierung wurde an den Restriktionsenzym-Spaltungsenden der Vektor-DNA erreicht. Die Reaktionsmischung wurde einer Phenol-Chloroform- Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, wobei 2 μg DNA gewonnen wurden. Diese DNA wurde in 10 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 1 mM EDTA enthielt, zur Verwendung als Vektorprobe gelöst. Zwei Zehntel μg der Vektor-DNA-Probe und 0,2 μg der von der KM50-Zelle abgeleiteten 9,3 kb DNA-Probe wurden in 5 μl T4-Ligasepuffer gelöst, es wurden 175 Einheiten T4-Ligase (Takara Shuzo) zugegeben, und die Mischung wurde bei 4 °C für 3 Tage inkubiert. Ein Anteil von 2 μl dieser Mischung wurde durch das herkömmliche Verfahren [Maniatis et al. (Hrsg.): Molecular Cloning, 1989, S. 2.95] unter Verwendung von Giga Pak Gold (Stratagene) in den Lambda-Phagen verpackt, und die Verpackungsmischung wurde verwendet, um Escherichia coli-BB4 zu transfizieren, um 200.000 Phagenklone zu erhalten. Von diesen wurden 100.000 Klone mittels des herkömmlichen Verfahrens [Maniatis et al., (Hrsg).: Molecular Cloning, 1989, S. 2.112] an einen Nitrocellulosefilter fixiert.
(4) Selektion einer rekombinanten DNA, die das Gen für die variable Region der H-Kette eines Immunoglobulins enthält, das als aktive Form in KM50-Zellen auftritt (anti-humanes Serumalbumin)
Von der unter (3) aufgebauten Phagenbibliothek, die aus 100.000 Klonen besteht, wurden zwei Klone, die bei 65 °C stark mit der ³²P-markierten Maus-JH-Sonde assoziierbar waren [markiert durch das Verfahren von Kameyama et al. [FEBS Letters, 44, 301–306 (1989)]] isoliert. Die Phagen-DNA wurde davon durch das herkömmliche Verfahren [Maniatis et al. (Hrsg): Molecular Cloning, 1989, S.2.118–2.1691 gewonnen, woraufhin gefunden wurde, dass das 9,3 kb XbaI-Fragment der chromosomalen DNA, die von der KM50-Zelle abgeleitet war, darin insertiert worden ist.
(5) Basensequenz des Gens für die variable Region der H-Kette des Immunoglobulins, das als aktive Form in KM50-Zellen auftritt (anti-humanes Serumalbumin)
Für die zwei unter (4) erhaltenen Klone wurden Restriktionsenzym spaltungskarten erstellt, indem ein Verdau unter Verwendung verschiedener Restriktionsenzyme durchgeführt wurde, wobei gefunden wurde, dass das gleiche DNA-Fragment (9,3 kb) darin insertiert worden ist (28). Deshalb wurden die Teile dieses 9,3 kb DNA-Fragments, die für die Promotorregion und variable Region der H-Kette des Ratten-Immunoglobulins kodieren sollten, durch das Verfahren nach Sanger sequenziert [Sanger et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 74, 5463 (1977); AMERSHAM M13 Klonierungs- und Sequenzierungs-Handbuch]. In SEQ ID NO:16 wird von dem Teil, der die Octamersequenz wie ATGCAAAT und die TATA-Box-Sequenz wie TTGAAAA enthält, angenommen, dass er die Immunoglobulin-Promotorregion ist.
2. Aufbau von Expressionsvektoren eines heterologen Proteins unter Verwendung des Promotors und Enhancers des Gens der variablen Region der H-Kette für ein Immunoglobulin, das als aktive Form in KM50-Zellen auftritt (antihumanes Serumalbumin)
(1) Aufbau von pKMB11
Ein Anteil von 1 μg des unter Paragraph 1 (5) erhaltenen 9,3 kb Gen-Fragments der variablen Region der Immunoglobulin-H-Kette wurde in 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid und 100 mM Natriumchlorid enthielt, gelöst, es wurden jeweils 10 Einheiten BgIII und HindIII zugegeben, und die Mischung wurde bei 37 °C für 2 Stunden inkubiert, um eine Spaltung an den BgIII und HindIII-Stellen zu bewirken. Die Reaktionsmischung wurde einer Agarosegelelektrophorese unterzogen, und es wurden 0,01 μg eines DNA-Fragments gewonnen, das den 0,8 kb Immunoglobulin-Promotor enthielt. Dann wurde 1 μg des Plasmids pBR322-BgIII [Kuwana et al.: FEBS Letters, 219, 360 (1987)] in 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid und 100 mM Natriumchlorid enthielt, gelöst, es wurden 10 Einheiten BgIII und 10 Einheiten HindIII zugegeben, und die Mischung wurde bei 37 °C für 2 Stunden inkubiert, um eine Spaltung an den BgIII- und HindIII-Stellen zu bewirken. Die Reaktionsmischung wurde einer Agarosegelelektrophorese unterzogen, und es wurde ein DNA-Fragment mit einer Größe von ungefähr 4,2 kb gewonnen. Das so erhaltene von pBR322-BgIII abgeleitete DNA-Fragment (ungefähr 4,2 kb, 0,1 μg) und das den Immunoglobulin-Promotor enthaltende DNA-Fragment (0,01 μg) wurden in 20 μl T4-Ligasepuffer gelöst, es wurden 175 Einheiten T4-DNA-Ligase (Takara Shuzo) zugegeben, und die Mischung wurde bei 4 °C für 1 Tag inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde verwendet, um Escherichia coli-HB101 [J. Mol. Biol. 41, 459 (1969)) durch das Verfahren von Scott et al. [Masaru Shigesada: Saibo Kokagu (Cell Engineering), 2, 616 (1983)) zu transformieren, um eine Ap-resistente Kolonie zu erhalten. Von dieser Kolonie wurde die rekombinante Plasmid-DNA gewonnen. So wurde das in 29 gezeigte Plasmid pKMB11 erhalten.
(2) Aufbau von pKMD6
Um eine geeignete Restriktionsenzymstelle stromabwärts von dem Immunoglobulin-Promotor bereitzustellen, wurde das unter (1) aufgebaute Plasmid pKMB11 an der NcoI-Stelle unter Verwendung der Nuklease BAL31 verdaut. So wurden 10 μg des Plasmids pKMB11 in 100 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid und 50 mM Kaliumchlorid enthielt, gelöst, es wurden 30 Einheiten NcoI zugegeben, und die Mischung wurde bei 37 °C für 2 Stunden inkubiert, um eine Spaltung der NcoI-Stelle zu erreichen. Die Reaktionsmischung wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, die gesamte Menge an DNA-Fragment wurde in 100 μl BAL31-Puffer [20 mM Trishydrochloridpuffer (pH 8,0), der 600 mM Natriumchlorid, 12 mM Calciumchlorid, 12 mM Magnesiumchlorid und 1 mM EDTA enthielt] gelöst, es wurde eine Einheit von 0,25 von BAL31 [Bethesda Research Laboratories (BRL)) zugegeben, und bei 37 °C für 5 Sekunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Extraktion mit Phenol beendet und einer Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, und es wurde 1 μg DNA gewonnen. Ein Anteil von 0,1 μg dieser DNA und 0,01 μg eines synthetischen DNA-Linkers (SaII) wurden in 20 μl T4-Ligasepuffer gelöst, es wurden 175 Einheiten T4-DNA-Ligase zugegeben, und die Mischung wurde bei 4 °C für 1 Tag inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde verwendet, um Escherichia coli-HB101 durch das Verfahren von Scott et al. zu transformieren. Es wurde eine Ap-resistente Kolonie erhalten, und die rekombinante Plasmid-DNA wurde von dieser Kolonie gewonnen, um das in 30 gezeigte Plasmid pKMD6 zu erhalten. Für dieses Plasmid wurde der Teil des BAL31-Verdaus durch das Verfahren nach Sanger sequenziert, woraufhin eine Deletion zur dritten Base (Base 303 in SEQ ID NO:16) in Richtung des Aufwärtsstroms des Startercodons ATG für Immunoglobulin gefunden wurde.
(3) Aufbau von pEPKMA1, pEPKMB1 und pAG501
Die ursprünglichen Immunoglobulin-Promotor und -Enhancer sind räumlich getrennt. Deshalb war es notwendig, einen Vektor aufzubauen, der miteinander verbundene Promotor und Enhancer enthält, um diesen Vektor als Expressionsvektor für ein heterologes Protein zu verwenden. Demgemäß wurde die folgende Vorgehensweise angewandt.
So wurde 1 μg des unter Paragraph 1 (5) erhaltenen 9,3 kb Gens der variablen Region der Immunoglobulin-H-Kette in 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid und 100 mM Natriumchlorid enthielt, gelöst, es wurden 10 Einheiten EcoRV und 10 Einheiten XbaI zugegeben, und die Mischung wurde bei 37 °C für 2 Stunden inkubiert, um eine Spaltung an den EcoRV- und XbaI-Stellen zu erreichen. Die Reaktionsmischung wurde einer Agarosegelelektrophorese unterzogen und es wurden 0,1 μg eines DNA-Fragments (ungefähr 1 kb) gewonnen, das die Immunoglobulin-Enhancerregion enthielt. Separat wurde 1 μg des unter (2) erhaltenen Plasmids pKMD6 in 100 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid und 100 mM Natriumchlorid enthielt, gelöst, es wurden 10 Einheiten BgIII zugegeben, und die Mischung wurde bei 37 °C für 2 Stunden inkubiert, um eine Spaltung an der BgIII-Stelle zu bewirken. Nach einer Phenol-Chloroform-Extraktion wurde die DNA mit Ethanol präzipitiert und in einer Gesamtmenge von 40 μl DNA-Polymerase I- Puffer gelöst, es wurden 6 Einheiten von Escherichia coli-abgeleitetem DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment zugegeben, und man ließ die Reaktion bei 16 °C für 90 Minuten ablaufen, um die durch BgIII-Verdau gebildeten 5'-überhängenden Enden stumpf (blunt-ended) zu machen. Die Reaktion wurde durch Extraktion mit Phenol beendet, die Mischung wurde mit Chloroform extrahiert und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, die erhaltene DNA wurde in 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid und 50 mM Natriumchlorid enthielt, gelöst, es wurden 10 Einheiten HindIII zugegeben, und die Mischung wurde bei 37 °C für 2 Stunden inkubiert, um eine Spaltung an der HindIII-Stelle zu erreichen. Die Reaktionsmischung wurde einer Agarosegelelektrophorese unterzogen, und es wurden 0,1 μg eines DNA-Fragments (ungefähr 0,8 kb) gewonnen, das die Immunoglobulin-Promotor-Region enthielt. Dann wurden 0,2 μg des Plasmids pUC18 [Messing: Methods in enzymology 101, 20 (1983)] in 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid und 100 mM Natriumchlorid enthielt, gelöst, es wurden 10 Einheiten HindIII und 10 Einheiten XbaI zugegeben, und die Mischung wurde bei 37 °C für 2 Stunden inkubiert, um eine Spaltung an den HindIII- und XbaI-Stellen zu erreichen. Die Reaktionsmischung wurde einer Agarosegelelektrophorese unterzogen, und es wurden 0,1 μg eines DNA-Fragments mit einer Größe von ungefähr 2,7 kb gewonnen. Das so erhaltene von pPKMD6 abgeleitete 0,8 kb DNA-Fragment (0,1 μg), das Immunoglobulin-Enhancerregion-enthaltende DNA-Fragment (0,02 μg) und pUC18 (0,1 μg) wurden in 20 μl T4-Ligasepuffer gelöst, es wurden 175 Einheiten T4-DNA-Ligase zugegeben, und die Mischung wurde bei 4 °C für einen Tag inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde verwendet, um Escherichia coli-HB 101 zu transformieren, um eine Ap-resistente Kolonie zu ergeben. Von dieser Kolonie wurde die rekombinante Plasmid-DNA gewonnen, um das in 31 gezeigte pEPKMA1 zu ergeben.
Dann wurde 1 μg des Plasmids pEPKMA1 in 100 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid und 100 mM Natriumchlorid enthielt, gelöst, es wurden 10 Einheiten XbaI zugegeben, und die Mischung wurde bei 37 °C für 2 Stunden inkubiert, um eine Spaltung an der XbaI-Stelle zu erreichen. Nach einer Phenol-Chloroform-Extraktion wurde das resultierende DNA-Fragment mit Ethanol präzipitiert und in einer Gesamtmenge von 40 μl DNA-Polymerase I-Puffer gelöst, es wurden 6 Einheiten von Escherichia coli-abgeleitetem DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment zugegeben, und man ließ die Reaktion bei 16 °C für 90 Minuten ablaufen, um die durch XbaI-Verdau gebildeten kohäsiven Enden stumpf (blunt-ended) zu machen. Die Reaktion wurde durch Extraktion mit Phenol beendet, und das DNA-Fragment wurde nach einer Chloroform-Extraktion mittels Ethanol-Präzipitation gewonnen. Dieses DNA-Fragment und ein synthetischer DNA-Linker XhoI (Takara Shuzo) (0,01 μg) wurden in 20 μl T4-Ligasepuffer gelöst, es wurden 175 Einheiten T4-DNA-Ligase zugegeben, und die Mischung wurde bei 4 °C für 1 Tag inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde verwendet, um Escherichia coli-HB101 zu transformieren, um eine Ap-resistente Kolonie zu ergeben. Von dieser Kolonie wurde die rekombinante Plasmid-DNA gewonnen, um das in 32 gezeigte pEPKMB1 zu ergeben.
Dann wurden die frühen Genpromotor- und Enhancerregionen von SV40 (hiernach als P_SE abgekürzt) des heterologen Genexpressionsvektors pAGE107 zur Verwendung in Tieren (Miyaji et al.: Cytotechnology, 3, 133–140 (1990)] durch den von KM50 abgeleiteten Promotor und Enhancer der Immunoglobulin-H-Kette (hiernach als P_IH abgekürzt) von pEPKMB1 auf folgende Weise ersetzt.
Ein μg des Plasmids pAGE107 wurde in 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid und 150 mM Natriumchlorid enthielt, gelöst, es wurden 10 Einheiten SaII und 10 Einheiten XhoI zugegeben, und die Mischung wurde bei 37 °C für 2 Stunden inkubiert, um eine Spaltung an den SaII- und XhoI-Stellen zu erreichen. Die Reaktionsmischung wurde einer Agarosegelelektrophorese unterzogen, und es wurden unter anderem 0,5 μg eines DNA-Fragments (ungefähr 5,95 kb) gewonnen, das das G418-Resistenzgen enthielt. Dann wurde 1 μg des Plasmids pEPKMB1 in 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid und 150 mM Natriumchlorid enthielt, gelöst, es wurden 10 Einheiten SaII und 10 Einheiten XhoI zugegeben, und die Mischung wurde bei 37 °C für 2 Stunden inkubiert, um eine Spaltung an den SaII- und XhoI-Stellen zu erreichen. Die Reaktions-mischung wurde einer Agarosegelelektrophorese unterzogen, und es wurden 0,1 μg eines DNA-Fragments (ungefähr 1,7 kb) gewonnen, das die Immunoglobulin-Promotor- und Enhancerregionen enthielt. Das so erhaltene von pAGE107 abgeleitete 5,95 kb DNA-Fragment (0,1 μg) und das die Immunoglobulin-Promotor- und -Enhancer-Region enthaltende DNA-Fragment (0,02 μg) wurden in 20 μl T4-Ligasepuffer gelöst, es wurden 175 Einheiten T4-DNA-Ligase zugegeben, und die Mischung wurde bei 4 °C für 1 Tag inkubiert. Die Reaktions-mischung wurde verwendet, um Escherichia coli-HB101 zu transformieren. Es wurde eine Ap-resistente Kolonie isoliert und die rekombinante Plasmid-DNA davon gewonnen, um das in 33 gezeigte pAGE501 zu ergeben.
(4) Aufbau von pAGE109
Ein Plasmid, pAGE109, das von pAGE106 durch Deletion von einer der zwei EcoRI-Stellen in pAGE106 abgeleitet ist, wurde wie folgt aufgebaut.
So wurden 2 μg des heterologen Genexpressionsvektors pAGE106 zur Verwendung in Tierzellen wie in EP-A-0 405 285 beschrieben zu 100 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid und 50 mM Natriumchlorid enthielt, zugegeben; es wurden ferner jeweils 10 Einheiten EcoRI und SacI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurden ungefähr 1,5 μg eines DNA-Fragments (4,3 kb) gewonnen, das durch Spaltung von pAGE106 mit EcoRI und SacI entsteht, und das den frühen SV40-Genpromotor und das G418-Resistenzgen enthält. Dann wurde dieses DNA-Fragment in einer Gesamtmenge von 40 μl DNA-Polymerase I-Puffer gelöst, es wurden 5 Einheiten von einem Escherichia coli-abgeleiteten großen DNA-Polymerase I-Fragment zugegeben, und die Reaktion wurde bei 16 °C für 2 Stunden durchgeführt, um die 3'-überhängenden Enden, die durch SaII-Verdau gebildet wurden, und die 5'-überhängenden Enden, die durch EcoRI- Verdau gebildet wurden, stumpf (blunt-ended) zu machen. Die Reaktionsmischung wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, das Präzipitat wurde in 20 μl T4-Ligasepuffer gelöst; es wurden ferner 350 Einheiten T4-DNA-Ligase zu der vermischten Lösung zugegeben, und bei 4 °C für 4 Stunden wurde eine Ligation durchgeführt. Die so erhaltene rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um Escherichia coli-HB101 zu transformieren, um das in 34 gezeigte Plasmid pAGE109 zu ergeben.
(5) Aufbau von pAGE502
Um den SV40-Promotor und -Enhancer von pAGE107 mit dem Immunoglobulin-H-Ketten-Promotor und -Enhancer zu ersetzen, wurde ein Plasmid mit dem Namen pAGE502 wie folgt hergestellt.
Zwei μg pAGE107, das in EP-A-0 405 285 beschrieben ist, wurden zu 100 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid und 50 mM Natriumchlorid enthielt, zugegeben, es wurden ferner 10 Einheiten HindIII zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau erreicht. Die Reaktionsmischung wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, das Präzipitat wurde in einer Gesamtmenge von 40 μl DNA-Polymerase I-Puffer gelöst, es wurden 5 Einheiten von Escherichia coli-abgeleitetem DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment zugegeben, und die Reaktion wurde bei 16 °C für 2 Stunden durchgeführt, um die durch HindIII-Abbau gebildeten 5'-überhängenden Enden stumpf (blunt-ended) zu machen. Die Reaktionsmischung wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, das Präzipitat wurde zu 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid und 100 mM Natriumchlorid enthielt, zugegeben, es wurden ferner 10 Einheiten XhoI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau erreicht. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurden ungefähr 1,5 μg eines DNA-Fragments (ungefähr 5,95 kb) gewonnen, das durch Spaltung von pAGE107 mit XhoI und HindIII entsteht und das G418-Resistenzgen und Ap-Resistenz enthielt.
Zwei μg von unter (3) erhaltenem pAGE501 wurden zu 100 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid und 175 mM Natriumchlorid enthielt, zugegeben, es wurden ferner 10 Einheiten SaII zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, das Präzipitat wurde in einer Gesamtmenge von 40 μl DNA-Polymerase I-Puffer gelöst, es wurden 5 Einheiten von Escherichia coli-abgeleitetem DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment zugegeben, und die Reaktion wurde bei 16 °C für 2 Stunden durchgeführt, um die durch SaII-Verdau gebildeten 5'-überhängenden Enden stumpf (blunt-ended) zu machen. Die Reaktionsmischung wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, das Präzipitat wurde zu 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid und 100 mM Natriumchlorid enthielt, zugegeben, es wurden ferner 10 Einheiten XhoI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau erreicht. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurden ungefähr 0,2 μg eines DNA-Fragments (1,8 kb) gewonnen, das durch Spaltung von pAGE501 mit XhoI und SaII entsteht und Immunoglobulin-H-Ketten-Promotor und -Enhancer der KM50-Zelle enthielt.
Dann wurden 0,1 μg des oben erhaltenen HindIII-XhoI-Fragments (ungefähr 5,95 kb) von pAGE107 und 0,1 μg des SaII-XhoI-Fragments (ungefähr 1,8 kb) von pAGE501 in einer Gesamtmenge von 20 μl T4-Ligasepuffer gelöst; es wurden 350 Einheiten T4-DNA-Ligase zu der Lösung zugegeben, und die Mischung wurde bei 4 °C für 1 Tag inkubiert. Die so erhaltene rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um Escherichia coli-HB101 zu transformieren, um das in 35 gezeigte Plasmid pAGE502 zu ergeben.
(6) Aufbau von pAGE503
Ein pAGE503 genanntes Plasmid, das von pAGE502 durch Deletion einer der beiden EcoRI-Stellen abgeleitet ist, wurde wie folgt aufgebaut.
Zwei μg von unter (4) erhaltenem pAGE109 wurden zu 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid und 50 mM Natriumchlorid enthielt, zugegeben; es wurden ferner 10 Einheiten HindIII und 10 Einheiten Clal zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurden ungefähr 0,2 μg eines DNA-Fragments (ungefähr 1 kb) gewonnen, das durch Spaltung von pAGE109 mit Clal und HindIII entstanden ist und das Poly-A-Signalgen für die Betaglobulin- und die frühen Gene von SV40 enthielt.
Dann wurden 2 μg von unter (5) erhaltenem pAGE502 zu 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid und 50 mM Natriumchlorid enthielt, zugegeben, es wurden ferner 10 Einheiten HindIII und 10 Einheiten Clal zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurde ungefähr 1 μg eines DNA-Fragments (ungefähr 6,1 kb), das durch Spaltung von pAGE502 mit HindIII und ClaI enstanden ist und die Promotor- und Enhancer-Gene der Immunoglobulin-H-Kette der KM50-Zelle, das Ap-Resistenzgen und das G418-Resistenzgen enthielt, wurde über das DEAE-Papierverfahren gewonnen. Dann wurden 0,1 μg des HindIII-ClaI-Fragments (ungefähr 1 kb) von pAGE109, wie oben erhalten, und 0,1 μg des HindIII-ClaI-Fragments (ungefähr 6,1 kb) von pAGE502, wie oben erhalten, in einer Gesamtmenge von 20 μl T4-Ligasepuffer gelöst, es wurden 350 Einheiten T4-DNA-Ligase zu der Lösung zugegeben, und die Mischung wurde bei 4 °C für 1 Tag inkubiert. Die so erhaltene rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um Escherichia coli-HB101 zu transformieren, und es wurde das in 36 gezeigte Plasmid pAGE503 erhalten.
(7) Aufbau von pSE1d1
Es wurde ein pSE1d1 genanntes Plasmid durch Einbau des dhfr-Gens in pAGE107 wie folgt aufgebaut.
Zwei μg pAGE107, das in EP-A-0 405 285 beschrieben ist, wurden zu 100 μl von 100 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid und 50 mM Natriumchlorid enthielt, zugegeben, es wurden ferner 10 Einheiten EcoRI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau erreicht. Die Reaktionsmischung wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, das Präzipitat wurde in einer Gesamtmenge von 40 μl DNA-Polymerase I-Puffer gelöst, es wurden 5 Einheiten von Escherichia coli-abgeleitetem DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment zugegeben, und die Reaktion wurde bei 16 °C für 2 Stunden durchgeführt, um die durch EcoRI-Verdau gebildeten 5'-überhängenden Enden stumpf (blunt-ended) zu machen. Die Reaktionsmischung wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, das Präzipitat wurde zu 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid und 50 mM Natriumchlorid enthielt, zugegeben; es wurden ferner 10 Einheiten HindIII zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau erreicht. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurden ungefähr 1,5 μg eines DNA-Fragments (ungefähr 5,6 kb) gewonnen, das durch Spaltung von pAGE107 mit EcoRI und HindIII enstanden ist und das G418-Resistenzgen und das Ap-Resistenzgen enthielt.
Zwei μg pSV2-dhfr [Subramani et al.: Mol. Cell. Biol., 1, 854 (1981)] wurden zu 100 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid und 100 mM Natriumchlorid enthielt, zugegeben, es wurden ferner 10 Einheiten BgIII zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, das Präzipitat wurde in einer Gesamtmenge von 40 μl DNA-Polymerase I-Puffer gelöst, es wurden 5 Einheiten von Escherichia coli-abgeleitetem DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment zugegeben, und die Reaktion wurde bei 16 °C für 2 Stunden durchgeführt, um die durch BgIII-Verdau gebildeten 5'-überhängenden Enden stumpf (blunt-ended) zu machen. Die Reaktionsmischung wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, das Präzipitat wurde zu 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid und 100 mM Natriumchlorid enthielt, zugegeben, und es wurden ferner 10 Einheiten HindIII zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau erreicht. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurden ungefähr 0,2 μg eines pSV2-dhfr-DNA-Fragments (0,76 kb) gewonnen, das durch Spaltung mit BgIII und HindIII enstanden ist und das Dehydrofolatreduktase-(dhfr)-Gen enthielt.
Dann wurden 0,1 μg des HindIII-EcoRI-Fragments (ungefähr 5,6 kb) von pAGE107, wie oben erhalten, und 0,1 μg des BgIII-HindIII-Fragments (ungefähr 0,76 kb) von pSV2-dhfr, wie oben erhalten, in einer Gesamtmenge von 20 μl T4-Ligasepuffer gelöst; es wurden 350 Einheiten T4-DNA-Ligase zu der Lösung zugegeben, und die Mischung wurde bei 4 °C für 1 Tag inkubiert. Die so erhaltene rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um Escherichia coli-HB101 zu transformieren, und es wurde das in 37 gezeigte Plasmid pSE1d1 erhalten.
(8) Aufbau von pSE1d2
Ein pSE1d2 genanntes Plasmid wurde durch Deletion der HindIII-Spaltungsstelle von pSE1d1 wie folgt aufgebaut.
So wurden 2 μg von unter (7) erhaltenem pSE1d1 zu 100 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid und 50 mM Natriumchlorid enthielt, zugegeben, es wurden ferner 10 Einheiten HindIII zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, das Präzipitat wurde in einer Gesamtmenge von 40 μl DNA-Polymerase I-Puffer gelöst, es wurden 5 Einheiten von Escherichia coli-abgeleitetem DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment zugegeben, und die Reaktion wurde bei 16 °C für 2 Stunden durchgeführt, um die durch HindIII-Verdau gebildeten 5'-überhängenden Enden stumpf (blunt-ended) zu machen. Die Reaktionsmischung wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, das Präzipitat wurde in 20 μl T4-Ligasepuffer gelöst, es wurden 350 Einheiten T4-DNA-Ligase zu der Lösung zugegeben, und die Mischung wurde bei 4 °C für 1 Tag inkubiert. Die so erhaltene rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um Escherichia coli-HB101 zu transformieren, und es wurde das in 38 gezeigte Plasmid pSE1d2 erhalten.
(9) Aufbau von plg1SE1d2
Es wurde ein plg1SE1d2 genanntes Plasmid durch Einbau des dhfr-Gens in pAGE503 wie folgt aufgebaut.
Zwei μg von unter (6) erhaltenem pAGE503 wurden zu 100 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid und 50 mM Natriumchlorid enthielt, zugegeben, es wurden ferner 10 Einheiten Clal zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, das Präzipitat wurde in einer Gesamtmenge von 40 μl DNA-Polymerase I-Puffer gelöst, es wurden 5 Einheiten von Escherichia coli-abgeleitetem DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment zugegeben, und die Reaktion wurde bei 16 °C für 2 Stunden durchgeführt, um die durch ClaI-Verdau gebildeten 5'-überhängenden Enden stumpf (blunt-ended) zu machen. Die Reaktionsmischung wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, das Präzipitat wurde zu 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid und 50 mM Natriumchlorid enthielt, zugegeben; es wurden ferner 10 Einheiten MluI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau erreicht. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurde ungefähr 1 μg eines DNA-Fragments (ungefähr 5,4 kb) gewonnen, das durch Spaltung von pAGE503 mit Clal und MluI enstanden ist und den KM50-Immunoglobulin-H-Ketten-Promotor und -Enhancer enthielt.
Dann wurden 2 μg von unter (8) erhaltenem pSE1d2 zu 100 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid und 100 mM Natriumchlorid enthielt, zugegeben, es wurden ferner 10 Einheiten XhoI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, das Präzipitat wurde in einer Gesamtmenge von 40 μl DNA-Polymerase I-Puffer gelöst, es wurden 5 Einheiten von Escherichia coli-abgeleitetem DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment zugegeben, und die Reaktion wurde bei 16 °C für 2 Stunden durchgeführt, um die durch XhoI-Verdau gebildeten 5'-überhängenden Enden stumpf (blunt-ended) zu machen. Die Reaktionsmischung wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, das Präzipitat wurde zu 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid und 100 mM Natriumchlorid enthielt, zugegeben, es wurden ferner 10 Einheiten MluI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau erreicht. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurde ungefähr 1 μg eines DNA-Fragments (ungefähr 3,8 kb) gewonnen, das durch Spaltung von pSE1d2 mit XhoI und MluI enstanden ist und das dhfr-Gen enthielt.
Dann wurden 1 μg des ClaI-MluI-Fragments (ungefähr 5,4 kb) von pAGE503, wie oben erhalten, und 1 μg des XhoI-MluI-Fragments (ungefähr 3,8 kb) von pSE1d2, wie oben erhalten, in einer Gesamtmenge von 20 μl T4-Ligasepuffer gelöst, es wurden 350 Einheiten T4-DNA-Ligase zu der Lösung zugegeben, und die Mischung wurde bei 4 °C für 1 Tag inkubiert. Die so erhaltene rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um Escherichia coli-HB101 zu transformieren, und es wurde das in 39 gezeigte Plasmid plg1SE1d2 erhalten.
(10) Aufbau von plg1SE1d3
Ein plg1SE1d3 genanntes Plasmid wurde durch Deletion der ApaI-Spaltungsstelle von plg1SE1d2 wie folgt hergestellt.
Zwei μg von unter (9) erhaltenem plg1SE1d2 wurden zu 100 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid enthielt, zugegeben, es wurden ferner 10 Einheiten ApaI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, das Präzipitat wurde in einer Gesamtmenge von 40 μl DNA-Polymerase I-Puffer gelöst, es wurden 5 Einheiten von Escherichia coli-abgeleitetem DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment zugegeben, und die Reaktion wurde bei 16 °C für 2 Stunden durchgeführt, um die durch ApaI-Verdau gebildeten 3'-überhängenden Enden stumpf (blunt-ended) zu machen. Die Reaktionsmischung wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, das Präzipitat wurde in 20 μl T4-Ligasepuffer gelöst, es wurden 350 Einheiten T4-Ligase zu der Lösung zugegeben, und bei 4 °C für 24 Stunden wurde eine Ligation erreicht. Die so erhaltene rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um Escherichia coli-HB 101 zu transformieren, und es wurde das in 40 gezeigte Plasmid plg1SE1d3 erhalten.
(11) Aufbau von plg1SE1d4
Um plg1SE1d3 mit einer Klonierungsstelle zwischen der HindIII-Spaltungsstelle und der EcoRI-Spaltungstelle zu erhalten, wurde ein plg1SE1d4 genanntes Plasmid, das die durch SEQ ID NO:17 definierte synthetische DNA als Insert enthält, wie folgt aufgebaut.
Zwei μg von unter (10) erhaltenem plg1SE1d3 wurden zu 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid und 50 mM Natriumchlorid enthielt, zugegeben, es wurden ferner jeweils 10 Einheiten HindIII und EcoRI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurde ungefähr 1 μg eines DNA-Fragments (ungefähr 9,2 kb) gewonnen, das durch Spaltung von plg1SE1d3 mit HindIII und EcoRI enstanden ist und den KM50-Zell-Immunoglobulin-H-Ketten-Promotor, Enhancer, das Ap-Resistenzgen, das G418-Resistenzgen und das dhfr-Gen enthielt.
Dann wurden 0,1 μg des HindIII-EcoRI-Fragments (ungefähr 9,2 kb) von plg1SE1d3, wie oben erhalten, und 10 ng der synthetischen DNA (SEQ ID NO:17) in einer Gesamtmenge von 20 μl T4-Ligasepuffer gelöst, es wurden 350 Einheiten T4-DNA-Ligase zu der Lösung zugegeben, und die Mischung wurde bei 4 °C für 1 Tag inkubiert. Die so erhaltene rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um Escherichia coli HB101 zu transformieren, und es wurde das in 41 gezeigte Plasmid plg1SE1d4 erhalten.
3. Herstellung der langen terminalen Wiederholungseinheit des Moloney-Maus-Leukämievirus (hiernach als "MoLTR" abgekürzt)
Es ist bekannt, dass MoLTR Promotor- und Enhancer-Aktivität besitzt [Kuwana et al.: Biochem. Biopyhs. Res. Commun., 149, 960 (1987)]. Deshalb wurde zur Verwendung von MoLTR als ein Promotor und Enhancer in Vektoren zur Expression eines chimären humanen Antikörpers ein Plasmid, pPMOL3, das MoLTR enthält, wie folgt aufgebaut.
Drei μg pPMOL1, das in JP-A-1-63394 beschrieben ist, wurden zu 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 7 mM Magnesiumchlorid und 6 mM 2-Mercaptoethanol enthielt, zugegeben, es wurden ferner 10 Einheiten Clal zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, das Präzipitat wurde in einer Gesamtmenge von 40 μl DNA-Polymerase I-Puffer gelöst, es wurden 5 Einheiten von Escherichia coli-abgeleitetem DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment zugegeben, und die Reaktion wurde bei 16 °C für 2 Stunden durchgeführt, um die durch ClaI-Verdau gebildeten 5'-überhängenden Enden stumpf (blunt-ended) zu machen. Die Reaktion wurde durch Extraktion mit Phenol beendet, die Reaktionsmischung wurde einer Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, und es wurden 2 μg eines DNA-Fragments gewonnen. Dieses DNA-Fragment und 0,01 μg eines synthetischen DNA-Linkers XhoI (Takara Shuzo) wurden in 20 μl T4-Ligasepuffer gelöst, es wurden 175 Einheiten T4-DNA-Ligase zugegeben, und die Mischung wurde bei 4 °C für 1 Tag inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde verwendet, um Escherichia coli-HB101 zu transformieren, und es wurde das in 42 erhaltene Plasmid pPMOL2 erhalten. Dann wurden 3 μg pPMOL2 zu 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 7 mM Magnesiumchlorid, 10 mM Natriumchlorid und 6 mM 2-Mercaptoethanol enthielt, zugegeben, es wurden ferner 10 Einheiten Smal zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, und es wurden 2 μg eines DNA-Fragments gewonnen. Dieses DNA-Fragment und 0,01 μg eines synthetischen DNA-Linkers EcoRI; Takara Shuzo) wurden in 20 μl T4-Ligasepuffer gelöst, es wurden 175 Einheiten T4-DNA-Ligase zugegeben, und die Mischung wurde bei 4 °C für 1 Tag inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde verwendet, um Escherichia coli-HB101 zu transformieren, und es wurde das in 43 gezeigte Plasmid pPMOL3 erhalten.
4. Klonierung der cDNA der konstanten Region der H-Kette des humanen Immunoglobulins IgG1 (Cγ1) und der cDNA der konstanten Region der L-Kette (Cκ)
(1) Isolierung von mRNA von der den chimären Antikörper produzierenden Zelllinie SP2-PC Chimera-1
Unter Verwendung des mRNA-Extraktionskits Fast Track (Produktnummer K1593-02), hergestellt von Invitrogen, wurde mRNA (6,2 μg) von 1 × 10⁸ Zellen der den chimären Antikörper erzeugenden Zelllinie SP2-PC Chimera-1 isoliert, welche in FEBS Letters, 244, 301–306 (1989) beschrieben ist und in der Lage ist, einen chimären Antikörper zu erzeugen, der anti-Phosphorylcholin-Aktivität besitzt.
(2) Aufbau einer cDNA-Bibliothek von SP2-PC Chimera-1 und Klonierung der cDNA der konstanten Region der H-Kette des humanen Immunoglobulins (Cγ1) und der cDNA der konstanten Region der L-Kette (Cκ)
Ausgehend von 2 μg der unter (1) erhaltenen mRNA und unter Verwendung des cDNA-Synthesis Kit (Produktnummer 27-9260-01), hergestellt von Pharmacia, wurde ein Verbinden mit dem EcoRI-Adapter durchgeführt, gefolgt von Phosphorylierung. Die erhaltene cDNA-Lösung wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, und es wurden 4 μg cDNA gewonnen. Diese cDNA wurde in 20 μl sterilisiertem Wasser gelöst und dann mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurden jeweils ungefähr 0,3 μg von zwei DNA-Fragmenten mit einer Größe von ungefähr 1,8 kb und ungefähr 1,0 kb gewonnen.
Dann wurden 5 μg des Vektors pUC18 zu 100 μl von 100 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid und 100 mM Natriumchlorid enthielt, zugegeben, und es wurden ferner 50 Einheiten EcoRI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt, um die pUC18-DNA an der EcoRI-Stelle zu spalten. Die Reaktionsmischung wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, und es wurden ungefähr 3 μg eines DNA-Fragments gewonnen, das durch Spaltung von pUC18 an der EcoRI-Stelle davon enstanden ist.
Dann wurden 0,1 μg des EcoRI-Fragments (ungefähr 2,7 kb) von pUC18, wie oben erhalten, und jeweils 0,1 μg der 1,8 kb und 1,0 kb cDNA-Fragmente, die von SP2-PC Chimera-1-Zellen hergestellt wurden, in einer Gesamtmenge von 20 μl T4-Ligasepuffer gelöst; es wurden 350 Einheiten T4-DNA-Ligase zu der Lösung zugegeben, und bei 4 °C für 24 Stunden wurde eine Ligation erreicht.
Die so erhaltene rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um Escherichia coli-LE392 zu transformieren. Ungefähr 3000 erhaltene Kolonien wurden auf einen Nitrocellulosefilter fixiert. Von den Stämmen, die bei 65 °C fest an Sonden banden, die durch Markieren der chromosomalen Gene der konstanten Region von humanem Immunoglobulin (konstante Region der H-Kette Cγ1 und konstante Region der L-Kette Cκ von IgG1) [Kameyama et al.: FEBS Letters, 244, 301 (1989)] mit ³²P hergestellt wurden, wurden ein mit Cγ1 assoziierbares Plasmid (pPCVHhCGI1) und ein anderes, mit Cκ assoziierbares (pPCVLhCK1) isoliert.
(3) Einführen einer EcoRV-Stelle in das Gen der konstanten Region der humanen Igκ-Kette
Eine EcoRV-Stelle wurde in die konstante Region der humanen Igκ-Kette an eine Stelle in der Nähe des 5'-Endes davon durch ortsgerichtete Mutagenese unter Verwendung eines Kits (Katalognummer Q6210), der von Promega hergestellt wurde, eingebaut. Das Plasmid pPCVLhCK1 (2 μg) wurde zu 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid und 50 mM Natriumchlorid enthielt, zugegeben, es wurden ferner 10 Einheiten EcoRI und 10 Einheiten KpnI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurden ungefähr 0,2 μg eines DNA-Fragments (ungefähr 0,8 kb) gewonnen, das durch Spaltung von pPCVLhCK1 mit KpnI und EcoRI enstanden ist und das Gen der konstanten Region der L-Kette von humanem Immunoglobulin enthält.
Dann wurden 2 μg pSELECT1 (ein von Promega hergestellter Kit; Katalognummer Q6210) zu 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid und 50 mM Natriumchlorid enthielt, zugegeben, es wurden ferner jeweils 10 Einheiten EcoRI und KpnI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurde ungefähr 1 μg eines DNA-Fragments (ungefähr 5,7 kb) gewonnen, das durch Spaltung von pSELECT1 mit EcoRI und KpnI enstanden ist.
Danach wurden 0,1 μg des EcoRI-KpnI-Fragments (ungefähr 0,8 kb) von pPCVLhCK1, wie oben erhalten, und 0,1 μg des EcoRI-KpnI-Fragments (ungefähr 5,7 kb) von pSELECT1, wie oben erhalten, in einer Gesamtmenge von 20 μl T4-Ligasepuffer gelöst; es wurden 350 Einheiten T4-DNA-Ligase zu der Lösung zugegeben, und bei 4 °C für 24 Stunden wurde eine Ligation erreicht. Die so erhaltene rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um Escherichia coli-JM109 zu transformieren, und es wurde das in 44 gezeigte Plasmid pchCKA7 erhalten.
Dann wurde die Sequenz, die von der 12. Base zur 14. Base von dem N-Terminus der konstanten Region der L-Kette des humanen Immunoglobulins reicht, nämlich ACC, unter Verwendung von pchCKA7 und unter Verwendung der durch SEQ ID NO:18 definierten synthetischen DNA als mutagenem Primer zu GAT umgewandelt, und somit wurde an dieser Stelle eine EcoRV-Stelle eingeführt, um ein pchCKB1 genanntes Plasmid zu ergeben (45).
Dann wurde die EcoRV-Stelle von pchCKB1 auf folgende Weise zu einer HindIII-Spaltungsstelle umgewandelt.
So wurden 2 μg des Plasmids pchCKB1 zu 10 μl von 100 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid und 100 mM Natriumchlorid enthielt, zugegeben, und es wurden ferner 10 Einheiten EcoRI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, das Präzipitat wurde in einer Gesamtmenge von 40 μl DNA-Polymerase I-Puffer gelöst, es wurden 5 Einheiten von Escherichia coli-abgeleitetem Polymerase I-Klenow-Fragment zugegeben, und die Reaktion wurde bei 37 °C für 30 Minuten durchgeführt, um die durch EcoRI-Verdau gebildeten 5'-überhängenden Enden stumpf (blunt-ended) zu machen. Die Reaktionsmischung wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, das Präzipitat wurde zusammen mit 0,1 μg eines HindIII-Linkers (Takara Shuzo) in 20 μl T4-Ligasepuffer gelöst; es wurden 350 Einheiten T4-Ligase zu der Lösung zugegeben, und bei 4 °C für 24 Stunden wurde eine Ligation erreicht. Die so erhaltene rekombinate Plasmid-DNA wurde verwendet, um Escherichia coli-HB101 zu transformieren, und es wurde das in 46 gezeigte Plasmid pchCKC1 erhalten.
5. Aufbau von Vektoren für die Expression der H-Kette von einem chimären humanen Antikörper
(1) Aufbau eines Vektors, der zum Aufbau von Expressionsvektoren für die H-Kette eines chimären humanen Antikörpers verwendet werden soll (Vektor für die Expression der H-Kette eines chimären humanen Antikörpers)
Das unter Paragraph 2 (11) erhaltene Plasmid plg1SE1d4 (2 μg) wurde zu 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid und 100 mM Natriumchlorid enthielt, zugegeben, ferner wurden jeweils 10 Einheiten EcoRV und ApaI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau erreicht. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurden ungefähr 1,5 μg eines DNA-Fragments (ungefähr 9,2 kb) gewonnen, das durch Spaltung von plg1SE1d4 mit EcoRV und ApaI enstanden ist.
Dann wurden 2 μg von unter Paragraph 4 (2) erhaltenem pPCVHhCGI1 zu 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid enthielt, zugegeben, und es wurden ferner 10 Einheiten ApaI und 10 Einheiten Smal zugegeben, und bei 37 °C für 1 Stunde wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurden ungefähr 0,2 μg eines DNA-Fragments (ungefähr 1 kb) gewonnen, das durch Spaltung von pPCVHhCGI1 mit ApaI und Smal enstanden ist und das Gen für die konstante Region der H-Kette des humanen Immunoglobulins enthält.
Danach wurden 0,1 μg des EcoRV-ApaI-Fragments (ungefähr 9,2 kb) von plg1SE1d4, wie oben erhalten, und 0,1 μg des ApaI-SmaI-Fragments (ungefähr 1 kb) von pPCVHhCGI1, wie oben erhalten, in einer Gesamtmenge von 20 μl T4-Ligasepuffer gelöst; es wurden 350 Einheiten T4-DNA-Ligase zu der Lösung zugegeben, und bei 4 °C für 24 Stunden wurde eine Ligation durchgeführt. Die so erhaltene rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um Escherichia coli HB101 zu transformieren, und es wurde der Vektor pCHilgHB2 zur Expression der H-Kette eines chimären humanen Antikörpers wie in 47 gezeigt erhalten.
(2) Aufbau eines Vektors, der zum Aufbau von Expressionsvektoren für die L-Kette eines chimären humanen Antikörpers verwendet werden soll (Vektor für die Expression der L-Kette eines chimären humanen Antikörpers)
Das unter Paragraph 2 (11) erhaltene Plasmid plg1SE1d4 (2 μg) wurde zu 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 6 mM Magnesiumchlorid und 100 mM Natriumchlorid enthielt, zugegeben, es wurden ferner 10 Einheiten EcoRV und 10 Einheiten HindIII zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau erreicht. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurden ungefähr 1,5 μg eines DNA-Fragments (ungefähr 9,2 kb) gewonnen, das durch Spaltung von plg1SE1d4 mit EcoRV und HindIII enstanden ist.
Dann wurden 2 μg von unter Paragraph 4 (3) erhaltenem pckCKC1 zu 30 μl von 10 mM Trishydrochlorid (pH 7,5), das 6 mM Magnesiumchlorid und 100 mM Natriumchlorid enthielt, zugegeben, und es wurden ferner 10 Einheiten EcoRV und 10 Einheiten HindIII zugegeben, und bei 37 °C für 1 Stunde wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektro phorese fraktioniert, und es wurden ungefähr 0,2 μg eines DNA-Fragments (ungefähr 0,6 kb) gewonnen, das durch Spaltung von pPCVLhCK1 mit EcoRV und HindIII enstanden ist und das Gen der konstanten Region der L-Kette des humanen Immunoglobulins enthielt.
Danach wurden 0,1 μg des EcoRV-HindIII-Fragments (ungefähr 9,2 kb) von plg1SE1d4, wie oben erhalten, und 0,1 μg des EcoRV-HindIII-Fragments (ungefähr 0,6 kb) von pchCKC1, wie oben erhalten, in einer Gesamtmenge von 20 μl T4-Ligasepuffer gelöst, es wurden 350 Einheiten T4-DNA-Ligase zu der Lösung zugegeben, und bei 4 °C für 24 Stunden wurde eine Ligation durchgeführt. Die so erhaltene rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um Escherichia coli-HB101 zu transformieren, und es wurde der Vektor pChilgLA1 zur Expression der L-Kette eines chimären humanen Antikörpers wie in 48 gezeigt, erhalten.
VERGLEICHSBEISPIEL 2
Aufbau eines Expressionsvektors für die H-Kette eines chimären humanen Antikörpers, pChi641HA1
1. Isolierung von mRNA von Hybridomzellen, die den monoklonalen anti-GD₃-Mausantikörper KM-641 erzeugen.
Unter Verwendung des mRNA-Extraktionskits Fast Track (Produktnummer K1593-02), hergestellt von Invitrogen, wurden 34 μg von mRNA aus 1 × 10⁸ Hybridomzellen, die den monoklonalen anti-GD₃-Mausantikörper KM-641 erzeugen, die wie in Vergleichsbeispiel 1 beschrieben erhältlich sind, isoliert.
2. Aufbau einer cDNA-Bibliothek einer KM-641-H-Kette und einer cDNA-Bibliothek einer KM-641-L-Kette
Unter Verwendung von 3 μg der unter Paragraph 1 erhaltenen mRNA und unter Verwendung eines cDNA-Synthesis Kit ZAP-cDNA Synthesis Kit (Produktnummer sc200400), hergestellt von Stratagene, wurden eine cDNA mit einem EcoRI-Adapter an dem 5'-Terminus und eine cDNA mit einem XhoI-Adapter an dem 3'-Terminus synthetisiert. Ungefähr 6 μg jeder cDNA wurden in 10 μl sterilisiertem Wasser gelöst und mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert. Auf diese Weise wurden ungefähr 0,1 μg eines cDNA-Fragments, das eine Größe von ungefähr 1,8 kb aufwies und der H-Kette entsprach, und ein cDNA-Fragment, das eine Größe von ungefähr 1,0 kb aufwies und der L-Kette entsprach, gewonnen. Dann wurden 0,1 μg des cDNA-Fragments mit einer Größe von ungefähr 1,8 kb, 0,1 μg des cDNA-Fragments mit einer Größe von ungefähr 1,0 kb und 1 μg Uni-ZAP XR (Stratagene; abgeleitet von dem Lambda-ZAPII-Vektor durch Spaltung mit EcoRI und XhoI, gefolgt von Behandlung mit intestinaler alkalischer Phosphatase vom Kalb) zur Verwendung als Vektor in T4-Ligasepuffer gelöst; es wurden 175 Einheiten T4-DNA-Ligase zugegeben, und die Mischung wurde bei 12 °C für 10 Stunden und weiter bei Raumtemperatur für 2 Stunden inkubiert. Eine Portion von 4 μl der Reaktionsmischung wurde durch das herkömmliche Verfahren [Maniatis et al., (Hrsg): Molecular Cloning, 1989, S. 2.95] unter Verwendung des Giga Pak Gold (Stratagene) in den Lambda-Phagen verpackt, gefolgt von Transfektion von Escherichia coli-PLK-F mit der Verpackungsmischung durch das herkömmliche Verfahren [Maniatis et al., (Hrsg.): Molecular Cloning, 1989, S. 2.95–107]. Als H-Ketten-cDNA-Bibliothek bzw. als L-Ketten-cDNA-Bibliothek wurden ungefähr 10.000 Phagenklone erhalten. Die Phagen wurden dann durch das herkömmliche Verfahren [Maniatis et al. (Hrsg.): Molecular Cloning, 1989, S. 2.112] an Nitrocellulosefilter fixiert.
3. Klonierung der cDNAs der H-Kette und L-Kette des monoklonalen Antikörpers KM641
Unter Verwendung von Sonden, die durch Markierung eines ein Maus-Cγ1-Gen (chromosomales Gen der konstanten Region von Maus-Immunoglobulin) enthaltenden EcoRI-Fragments (ungefähr 6,8 kb) [Roeder et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 78, 474 (1981)] und eines Maus-Cκ-Gen-enthaltenden HindIII-BamHI- Fragments (ungefähr 3 kb) [Sakano et al.; Nature, 280, 288 (1979)] mit ³²P hergestellt wurden, wurden ein Phagenklon, der stark mit der ersteren Sonde bei 65 °C assoziierbar war, und ein Phagenklon, der stark mit der letzteren Sonde bei 65 °C assoziierbar war, von der H-Ketten-cDNA-Bibliothek und der L-Ketten-cDNA-Bibliothek, die unter Absatz 2 aufgebaut worden waren, gemäß dem herkömmlichen Verfahren isoliert [Maniatis et al. (Hrsg): Molecular Cloning, 1989, S. 2.108]. Dann wurden durch Umwandlung der Phagenklone in pBluescript-Plasmide unter Verwendung des cDNA-Synthesekits ZAP-cDNA Synthesis Kit (Produktnummer sc200400), hergestellt von Stratagene, ein die cDNA der KM-641-H-Kette enthaltendes rekombinantes Plasmid, pKM641HA3, und ein die cDNA der KM-641-L-Kette enthaltendes rekombinantes Plasmid, pKM641 LA2, erhalten. Die Spaltung von pKM641HA3 und pKM641 LA2 mit EcoRI und XhoI ergab, dass ein cDNA-Fragment mit ungefähr 1,6 kb bzw. ein cDNA-Fragment mit ungefähr 0,9 kb darin insertiert worden ist (49).
4. Basensequenzen der variablen Immunoglobulin-Regionen in der cDNA der KM-641-H-Kette (pKM641HA3) und der cDNA der KM-641-L-Kette (pKM641LA2)
Die Basensequenzen der Immunoglobulin-Regionen in pKM641HA3 und pKM641 LA2, die unter Paragraph 3 erhalten wurden, wurden mittels des Dideoxyverfahrens [Maniatis et al., (Hrsg).: Molecular Cloning, 1989, S. 13.42] unter Verwendung des Sequenase Version 2.0 DNA-Sequencing Kit (United States Biochemical Corporation) bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in SEQ ID NO:19 und SEQ ID NO:20 gezeigt. In pKM641LA2, wurde ein Methionincodon, vermutlich das Startercodon ATG, in Nähe des 5'-Terminus gefunden, und die cDNA war eine Leitsequenz-enthaltende Sequenz voller Länge. In pKM641HA3 wurde kein Methionin-Startercodon gefunden, und die Leitsequenz fehlte teilweise.
5. Aufbau eines Expressionsvektors für die H-Kette des von KM-641 abgeleiteten chimären humanen Antikörpers
Ein Expressionsvektor für die H-Kette eines chimären humanen Antikörpers wurde aufgebaut, indem das Gen der variablen Region der H-Kette, welches durch Spalten des Plasmids pKM641HA3 an der AluI-Stelle in Nähe des 5'-Terminus des Gens der variablen Region und an der StyI-Stelle in Nähe des 3'-Terminus des Gens der variablen Region erhalten wurde, mit dem Vektor für die Expression der H-Kette des chimären humanen Antikörpers, wie er in Vergleichsbeispiel 1 erhalten wird, unter Verwendung der durch SEQ ID NO:21 und SEQ ID NO:22 definierten synthetischen DNA verbunden wurde (50).
Zuerst wurde die durch SEQ ID NO:22 definierte DNA, die aus der Basensequenz von dem 3'-Terminus der variablen Region der Immunoglobulin-H-Kette in pKM641HA3 bis zur StyI-Spaltungsstelle in Nähe des 3'-Terminus und der Basensequenz von dem 5'-Terminus der konstanten Region der Immunoglobulin-H-Kette in pAGE28 bis zur ApaI-Spaltungsstelle in Nähe des 5'-Terminus zusammengesetzt ist und eine StyI-Spaltungsstelle und eine ApaI-Spaltungsstelle an den entsprechenden Termini besitzt (siehe 50), unter Verwendung eines DNA-Synthesizers synthetisiert. Diese synthetische DNA wurde dann auf folgende Weise in das Plasmid pKM641HA3 eingeführt.
Drei μg pKM641HA3 wurden zu 30 μl von 50 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid, 50 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zugegeben, es wurden ferner 10 Einheiten EcoRI und 10 Einheiten StyI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau erreicht. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurden ungefähr 0,3 μg eines 0,41 kb DNA-Fragments gewonnen. Dann wurden 3 μg pAGE28 [Mizukami et al.: J. Biochem., 101, 1307–1310 (1987)] zu 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 7 mM Magnesiumchlorid und 6 mM 2-Mercaptoethanol enthielt, zugegeben, es wurden ferner 10 Einheiten EcoRI und 10 Einheiten ApaI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurden ungefähr 2 μg eines 2,45 kb DNA-Fragments gewonnen. Dann wurden 0,1 μg des EcoRI-StyI-Fragments (ungefähr 0,41 kb) von pKM641HA3, wie oben erhalten, 0,1 μg des EcoRI-ApaI-Fragments (ungefähr 2,45 kb) von pAGE28, wie oben erhalten, und 0,3 μg der synthetischen DNA, definiert durch SEQ ID NO:22, in einer Gesamtmenge von 20 μl T4-Ligasepuffer gelöst; es wurden 350 Einheiten T4-Ligase zu der Lösung zugegeben, und bei 4 °C für 24 Stunden wurde eine Ligation durchgeführt. Die so erhaltene rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um Escherichia coli-HB101 zu transformieren, und es wurde das in 51 gezeigte Plasmid pKM641HE1 erhalten.
Da pKM641HE1 keine Leitsequenz enthielt, wurde die folgende Maßnahme unternommen, um den Mangel unter Verwendung der durch SEQ ID NO: 21 definierten synthetischen DNA auszugleichen.
pKM641HE1 (3 μg) wurde zu 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 7 mM Magnesiumchlorid und 6 mM 2-Mercaptoethanol enthielt, zugegeben, es wurden ferner 10 Einheiten EcoRI und 10 Einheiten ApaI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurden ungefähr 0,4 μg eines DNA-Fragments mit einer Größe von ungefähr 0,42 kb gewonnen. Das EcoRI-ApaI-Fragment (ungefähr 0,42 kb; 0,4 μg) von pKM641HE1 wurde zu 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 7 mM Magnesiumchlorid, 50 mM Natriumchlorid und 6 mM 2-Mercaptoethanol enthielt, zugegeben, es wurden ferner 10 Einheiten AluI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, und es wurden ungefähr 0,3 μg eines DNA-Fragments mit einer Größe von ungefähr 0,4 kb gewonnen.
Dann wurden 0,1 μg des AluI-ApaI-Fragments (ungefähr 0,4 kb) von pKM641HE1, wie oben erhalten, 0,1 μg des EcoRI-ApaI-Fragments (ungefähr 2,45 kb) von pAGE28, wie oben erhalten, und 0,3 μg der durch SEQ ID NO:21 definierten synthetischen DNA in einer Gesamtmenge von 20 μl T4-Ligasepuffer gelöst; 350 Einheiten T4-Ligase wurden zu der Lösung zugegeben, und bei 4 °C für 24 Stunden wurde eine Ligation durchgeführt. Die so erhaltene rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um Escherichia coli-HB101 zu transformieren, und es wurde das in 52 gezeigte Plasmid pKM641HF1 erhalten.
Dann wurde die variable Region der Immunoglobulin-H-Kette von pKM641HF1 in den Vektor pChilgHB2 zur Expression der H-Kette des chimären humanen Antikörpers wie folgt eingeführt.
PKM641HF1 (3 μg) wurde zu 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 7 mM Magnesiumchlorid und 6 mM 2-Mercaptoethanol enthielt, zugegeben, es wurden ferner 10 Einheiten EcoRI und 10 Einheiten ApaI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurden ungefähr 0,5 μg eines 0,44 kb DNA-Fragments gewonnen. Dann wurden 3 μg pChilgHB2 zu 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 7 mM Magnesiumchlorid und 6 mM 2-Mercaptoethanol enthielt, zugegeben, es wurden ferner 10 Einheiten EcoRI und 10 Einheiten ApaI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion unterzogen, und es wurden ungefähr 3 μg DNA gewonnen. Dann wurden 0,1 μg des EcoRI-ApaI-Fragments (ungefähr 0,44 kb) von pKM641HF1, wie oben erhalten, und 0,1 μg des EcoRI-ApaI-Fragments (ungefähr 10,1 kb) von pChilgHB2, wie oben erhalten, in einer Gesamtmenge von 20 μl T4-Ligasepuffer gelöst; es wurden 350 Einheiten T4-Ligase zu der Lösung zugegeben, und es wurde eine Ligation bei 4 °C für 24 Stunden durchgeführt. Die so erhaltene rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um Escherichia coli-HB101 zu transformieren, und es wurde das in 53 gezeigte Plasmid pChi641HA1 erhalten.
Dann wurde die Promotor- und Enhancer-Region der H-Kette des KM50-abgeleiteten Immunoglobulins von pChi641HA1 wie folgt durch MoLTR ersetzt. pChi641HA1 (3 μg) wurde zu 30 μl von 50 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid, 50 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zugegeben, es wurden ferner 10 Einheiten EcoRI und 10 Einheiten XhoI zugegeben, und es wurde ein Verdau bei 37 °C für 4 Stunden erreicht. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurden ungefähr 0,2 μg eines DNA-Fragments mit einer Größe von ungefähr 8,8 kb gewonnen. pPMOL3 (3 μg), das in Beispiel 1, Paragraph 2 erhalten wurde, wurde zu 30 μl von 50 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid, 50 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zugegeben; es wurden ferner 10 Einheiten EcoRI und 10 Einheiten XhoI zugegeben, und bei 37 °C für 4 Stunden wurde ein Verdau durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, und es wurden ungefähr 0,3 μg eines MoLTR-enthaltenden DNA-Fragments (0,63 kb) gewonnen. Dann wurden 0,1 μg des EcoRI-XhoI-Fragments von pChi641NA1 und 0,1 μg des EcoRI-XhoI-Fragments von pPMOL3 in 20 μl T4-Ligasepuffer gelöst, es wurden 175 Einheiten T4-DNA-Ligase zugegeben, und die Mischung wurde bei 4 °C für einen Tag inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde verwendet, um Escherichia coli-HB101 zu transformieren, und es wurde der in 54 gezeigte von KM-641 abgeleitete Expressionsvektor pChi641HAM1 für die chimäre humane H-Kette erhalten.
BEISPIEL 2
Herstellung von humanen CDR-transplantierten anti-GM₂-Antikörpern
1. Herstellung von DNAs, die jeweils für die variable Region der H-Kette eines humanen CDR-transplantierten anti-GM₂-Antikörpers und die variable Region der L-Kette eines humanen CDR-transplantierten anti-GM₂-Antikörpers kodieren
(1) Aufbau von DNA, die für die variable Region der H-Kette eines humanen CDR-transplantierten anti-GM₂-Antikörpers kodiert
Eine DNA, die für eine variable Region der H-Kette eines humanen CDR-transplantierten anti-GM₂-Antikörpers kodiert, hKM796H, welche die Aminosequenzen der SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 und SEQ ID NO:8 enthält, wurde wie folgt aufgebaut.
NEWM [Biotechnology, 9, 266 (1991)] wurde als für die variable Region der H-Kette eines humanen Antikörpers kodierende DNA verwendet, an welche die jeweilige CDR transplantiert werden sollte. Die DNAs, die in SEQ ID NO:23 bis NO:29 dargestellt sind, die NEWM entsprechen, worin jede CDR durch Aminosäuresequenzen der SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 und SEQ ID NO:8 ersetzt war, wurden unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesizers (Modell 380A, hergestellt von Applied Biosystems Co., Ltd.) synthetisiert. Die so erhaltenen synthetischen DNAs (jeweils 50 pmol) wurden in 20 μl von 50 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,6), der 10 mM Magnesiumchlorid, 5 mM DTT, 0,1 mM EDTA und 0,5 mM ATP enthielt, gelöst, es wurden 5 Einheiten T4-Polynukleotidkinase zugegeben, und bei 37 °C für 30 Minuten wurde eine 5'-Phosphorylierung durchgeführt.
Zehn Picomol von jeder der resultierenden phosphorylierten synthetischen DNAs, welche Restriktionsenzymstellen an beiden Enden besaßen, wurden in der Reihenfolge der SEQ ID (SEQ ID NO:23 bis NO:29) unter Verwendung eines DNA-Ligationskits (Takara Shuzo) gemäß den dem Kit beiliegenden Hersteller-Instruktionen ligiert, um eine DNA, hKM796H, die in 55 gezeigt ist, zu erhalten. Die Aminosäuresequenz, die hKM796H entspricht, ist in SEQ ID NO:36 gezeigt.
(2) Aufbau von DNA, die für die variable Region der L-Kette eines humanen CDR-transplantierten anti-GM₂-Antikörpers kodiert
Eine für eine variable Region der L-Kette eines humanen CDR-transplantierten anti-GM₂-Antikörpers kodierende DNA, hKM796L, welche die Aminosäuresequenzen der SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:10 und SEQ ID NO:11 enthält, wurde auf folgende Weise aufgebaut.
REI [Bio/Technology, 9, 266 (1991)] wurde als für die variable Region der L-Kette eines humanen Antikörpers kodierende DNA verwendet, an welche die jeweilige CDR transplantiert werden sollte. Die in SEQ ID NO:30 bis NO:35 dargestellten DNA, die REI entsprechen, worin jede CDR durch Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 und SEQ ID NO:11 ersetzt war, wurden unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesizers synthetisiert (Modell 380A, hergestellt von Applied Biosystems Co., Ltd.). Die so erhaltenen synthetischen DNA (jeweils 50 pmol) wurden in 20 μl von 50 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,6), der 10 mM Magnesiumchlorid, 5 mM DTT, 0,1 mM EDTA und 0,5 mM ATP enthielt, gelöst, es wurden 5 Einheiten T4-Polynukleotidkinase zugegeben, und bei 37 °C für 30 Minuten wurde eine 5'-Phosphorylierung durchgeführt. Zehn Picomol von jeder der resultierenden phosphorylierten synthetischen DNAs, welche an beiden Enden Restriktionsenzymstellen besaßen, wurden in der Reihenfolge der SEQ ID (SEQ ID NO:30 bis NO:35) unter Verwendung eines DNA-Ligationskits (Takara Shuzo) gemäß den dem Kit beiliegenden Hersteller-Instruktionen ligiert, um eine in 56 gezeigte DNA, hKM796L, zu erhalten. Die der hKM796L entsprechende Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO:37 gezeigt.
2. Aufbau eines Expressionsvektors einer H-Kette eines humanen CDR-transplantierten Antikörpers und eines Expressionsvektors einer L-Kette eines humanen CDR-transplantierten Antikörpers
(1) Aufbau eines Expressionsvektors einer H-Kette eines humanen CDR-transplantierten Antikörpers
Ein NotI-ApaI-Fragment der für die variable Region der H-Kette eines humanen CDR-transplantierten Antikörpers kodierenden DNA, welche unter Paragraph 1(1) von Beispiel 2 erhalten wurde, wurde auf folgende Weise an das Plasmid pChi796HM1, das unter Paragraph 7(3) von Beispiel 1 erhalten wurde, ligiert (57).
3 μg pChi696HM1, das unter Absatz 7(3) von Beispiel 1 erhalten wurde, wurden in 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, gelöst, dazu wurden 10 Einheiten ApaI zugegeben, und man ließ die Mischung bei 37 °C für 1 Stunde reagieren. Die resultierende Mischung wurde einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, und das so erhaltene Präzipitat wurde in 30 μl von 50 mM Trishydrochlorid-Puffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, gelöst. Dazu wurden 10 Einheiten NotI zugegeben, um die Mischung bei 37 °C für 1 Stunde reagieren zu lassen. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, um ungefähr 2 μg eines DNA-Fragments mit ungefähr 9,0 kb zu gewinnen. Dann wurden ungefähr 0,1 μg des so erhaltenen ApaI-NotI-Fragments von pChi706HM1 an 0,5 pmol des NotI-ApaI-Fragments der für die variable Region der H-Kette des humanen CDR-transplantierten Antikörpers kodierenden DNA, welche unter Paragraph 1(1) von Beispiel 2 erhalten wurde, unter Verwendung eines DNA-Ligationskits (Takara Shuzo) ligiert. Die resultierende rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um Escherichia coli-HB101 zu transformieren, und es wurde das in 57 gezeigte Plasmid phKM796HM1 erhalten.
Dann wurde ein Expressionsvektor für eine H-Kette eines humanen CDR-transplantierten Antikörpers aufgebaut, indem ein β-Globulin 3'-Splicingsignal auf folgende Weise in das Plasmid phKM796HM1 eingeführt wurde (58).
Drei μg phKM796HM1 wurden zu 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zugegeben, dazu wurde 1 Einheit KpnI zugegeben. Man ließ die Mischung bei 37 °C für 10 Minuten reagieren, um einen Teilverdau zu erreichen. Die resultierende Mischung wurde einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, und das so erhaltene Präzipitat wurde in 30 μl von 50 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, gelöst. Nach der Zugabe von 1 Einheit XhoI ließ man die Mischung bei 37 °C für 10 Minuten reagieren, um einen Teilverdau zu erreichen. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, um ungefähr 0,2 μg eines DNA-Fragments mit ungefähr 2,1 kb zu gewinnen. Getrennt wurden 3 μg pAGE148, das unter Paragraph 7(2) von Beispiel 1 erhalten wurde, zu 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zugegeben. Dazu wurden 10 Einheiten KpnI zugegeben, um die Mischung bei 37 °C für 1 Stunde reagieren zu lassen. Die Reaktionsmischung wurde einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, und das so erhaltene Präzipitat wurde in 30 μl von 50 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, gelöst. Nach der Zugabe von 10 Einheiten XhoI ließ man die Mischung bei 37 °C für 1 Stunde reagieren und fraktionierte dann mittels Agarosegelelektrophorese, um ungefähr 1 μg eines DNA-Fragments mit ungefähr 8,7 kb zu gewinnen. Ein Zehntel μg des so erhaltenen XhoI-KpnI-Fragments von phKM796HM1 wurde mit 0,1 μg des XhoI-KpnI-Fragments von pAGE148 unter Verwendung eines DNA-Ligationskits (Takara Shuzo) ligiert. Die so erhaltene rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um Escherichia coli HB101 zu transformieren, um das in 58 gezeigte Plasmid phKM796HMS1 zu erhalten.
(2) Aufbau eines Expressionsvektors für die L-Kette eines humanen CDR-transplantierten Antikörpers
Ein EcoRI-Fragment mit stumpfen Enden (blunt ends) der die variable Region der L-Kette des humanen CDR-transplantierten Antikörpers kodierenden DNA, die unter Paragraph 1(2) von Beispiel 2 erhalten wurde, wurde auf folgende Weise an den Expressionsvektor pChilgLA1 der L-Kette des chimären humanen Antikörpers ligiert (59).
Drei μg pChilgLA1, das in Vergleichsbeispiel 1 erhalten wurde, wurden zu 30 μl von 50 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zugegeben, dazu wurden 10 Einheiten EcoRI und 10 Einheiten EcoRV zugegeben, und man ließ die Mischung bei 37 °C für 1 Stunde reagieren. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, um ungefähr 1 μg eines DNA-Fragments mit ungefähr 8,6 kb zu gewinnen. Dann wurden ungefähr 0,1 μg des so erhaltenen EcoRI-EcoRV-Fragments von pChilgLA1 an 0,5 pmol des EcoRI-Fragments mit stumpfen Enden (blunt ends), welches von der für die variable Region der L-Kette des humanen CDR-transplantierten Antikörpers kodierenden DNA abgeleitet ist, welche unter Paragraph 1(2) von Beispiel 2 erhalten wurde, unter Verwendung eines DNA-Ligationskits (Takara Shuzo) ligiert. Die resultierende rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um Escherichia coli-HB101 zu transformieren, und es wurde das in 59 gezeigte Plasmid phKM796LI1 erhalten.
Dann wurde P_MO auf folgende Weise in das Plasmid phKM796LI1 eingeführt (60).
Drei μg phKM796LI1 wurden zu 30 μl von 50 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zugegeben, dazu wurden 10 Einheiten EcoRI und 10 Einheiten XhoI zugegeben, und man ließ die Mischung bei 37 °C für 1 Stunde reagieren. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, um ungefähr 1 μg eines DNA-Fragments mit ungefähr 8,2 kb zu gewinnen. Getrennt wurden 3 μg des Expressionsvektors pChi641HAM1 für die H-Kette des chimären humanen Antikörpers, der in Vergleichsbeispiel 2 erhalten wurde, zu 30 μl von 50 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zugegeben. Dazu wurden 10 Einheiten EcoRI und 10 Einheiten XhoI zugegeben, um die Mischung bei 37 °C für 1 Stunde reagieren zu lassen. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, um ungefähr 0,3 μg eines DNA-Fragments mit ungefähr 0,6 kb zu gewinnen. Ein Zehntel μg des so erhaltenen EcoRI-XhoI-Fragments von pChi641HAM1 wurden an 0,1 μg des EcoRI-XhoI-Fragments von phKM796LI1 unter Verwendung eines DNA-Ligationskits (Takara Shuzo) ligiert. Die so erhaltene rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um Escherichia coli-HB101 zu transformieren, um das in 60 gezeigte Plasmid phKM796LM1 zu erhalten.
Dann wurde ein Expressionsvektor für die L-Kette von humanem CDR-transplantiertem Antikörper aufgebaut, indem ein β-Globulin 3'-Splicingsignal auf folgende Weise in das Plasmid phKM796LM1 eingeführt wurde (61).
Drei μg phKM796LM1 wurden zu 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zugegeben, dazu wurden 10 Einheiten KpnI zugegeben, und man ließ die Mischung bei 37 °C für 1 Stunde reagieren. Die resultierende Mischung wurde einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, und das so erhaltene Präzipitat wurde in 30 μl von 50 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, gelöst. Nach der Zugabe von 10 Einheiten XhoI ließ man die Mischung bei 37 °C für 1 Stunde reagieren. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorse fraktioniert, um ungefähr 0,3 μg eines DNA-Fragments mit ungefähr 1,6 kb zu gewinnen. Getrennt wurden 3 μg pAGE148, das unter Paragraph 7(2) von Beispiel 1 erhalten wurde, zu 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zugegeben. Dazu wurden 10 Einheiten KpnI zugegeben, um die Mischung bei 37 °C für 1 Stunde reagieren zu lassen. Die Reaktionsmischung wurde einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, und das so erhaltene Präzipitat wurde in 30 μl von 50 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, gelöst. Nach der Zugabe von 10 Einheiten XhoI ließ man die Mischung bei 37 °C für 1 Stunde reagieren und fraktionierte dann mittels Agarosegelelektrophorese, um ungefähr 1 μg eines DNA-Fragments mit ungefähr 8,7 kb zu gewinnen. Ein Zehntel μg des so erhaltenen XhoI-KpnI-Fragments von phKM796LM1 wurde an 0,1 μg des XhoI-KpnI-Fragments von pAGE148 ligiert, wobei ein DNA-Ligationskit verwendet wurde (Takara Shuzo). Die so erhaltene rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um Escherichia coli-HB101 zu transformieren, um das in 61 gezeigte Plasmid phKM796LMS1 zu erhalten.
3. Aufbau eines Tandemexpressionsvektors für eine H-Kette und L-Kette eines humanen CDR-transplantierten Antikörpers
Ein Tandemexpressionsvektor, der sowohl cDNA, die für eine H-Kette eines humanen CDR-transplantierten Antikörpers kodiert, als auch cDNA, die für eine L-Kette eines humanen CDR-transplantierten Antikörpers kodiert, enthält, wurde auf folgende Weise aufgebaut (62 und 63).
Drei μg phKM796HMS1, das unter Paragraph 2(1) von Beispiel 2 erhalten wurde, wurden in 30 μl von 50 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, gelöst, dazu wurde 1 Einheit SaII zugegeben, und man ließ die Mischung bei 37 °C für 10 Minuten reagieren, um einen Teilverdau zu erreichen. Die resultierende Mischung wurde einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, und das so erhaltene Präzipitat wurde in 30 μl von 50 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, gelöst. Dazu wurden zehn Einheiten MluI zugegeben, um die Mischung bei 37 °C für 1 Stunde reagieren zu lassen. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, um ungefähr 0,2 μg eines DNA-Fragments mit ungefähr 5,9 kb zu gewinnen. Dann wurden ungefähr 2 μg pAGE107, wie in EP-A-0 405 285 beschrieben, zu 30 μl von 50 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, 10 Einheiten MluI und 10 Einheiten SaII hinzugegeben, und man ließ die Mischung bei 37 °C für 1 Stunde reagieren. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, um ungefähr 0,2 μg eines DNA-Fragments mit ungefähr 3,35 kb zu gewinnen. Dann wurden 0,1 μg des so erhaltenen MluI-SaII-Fragments von phKM796HMS1 an 0,1 μg des MluI-SaII-Fragments von pAGE107 ligiert, wobei ein DNA-Ligationskit verwendet wurde (Takara Shuzo). Die so erhaltene rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um Escherichia coli-HB101 zu transformieren, um das in 62 gezeigte Plasmid phKM796H107 zu erhalten.
Dann wurden 3 μg phKM796H107 zu 30 μl von 10 mM Trishydrochlorid (pH 7,5), das 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zugegeben, dazu wurden 10 Einheiten Clal zugegeben, und man ließ die Mischung bei 37 °C für 1 Stunde reagieren. Die Reaktionsmischung wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und einer Ethanol-Präzipitation unterzogen. Das resultierende Präzipitat wurde in 20 μl DNA-Polymerase I-Puffer gelöst, es wurden 5 Einheiten von Escherichia coli-abgeleitetem DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment zugegeben und die durch ClaI-Verdau erzeugten 5'-kohäsiven Enden wurden durch Inkubation bei 22 °C für 30 Minuten stumpf (blunt) gemacht. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, um ungefähr 0,2 μg eines DNA-Fragments mit ungefähr 3,35 kb zu gewinnen. Die Reaktionsmischung wurde auch einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen. Das resultierende Präzipitat wurde in 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, gelöst, dazu wurden 10 Einheiten MluI zugegeben, und man ließ die Mischung bei 37 °C für 1 Stunde reagieren. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, um ungefähr 0,3 μg eines DNA-Fragments mit ungefähr 7,5 kb zu gewinnen. Getrennt wurden 3 μg phKM796LLMS1 zu 30 μl von 50 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zugegeben, es wurden 10 Einheiten Xho zugegeben, und man ließ die Mischung bei 37 °C für 1 Stunde reagieren. Die Reaktionsmischung wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen. Das resultierende Präzipitat wurde in 20 μl DNA-Polymerase I-Puffer gelöst, es wurden 5 Einheiten von Escherichia coli-abgeleitetem DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment zugegeben, und die durch XhoI-Verdau erzeugten 5'-kohäsiven Enden wurden durch Inkubation bei 22 °C für 30 Minuten stumpf (blunt) gemacht. Die Reaktionsmischung wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion, gefolgt von einer Ethanol-Präzipitation unterzogen. Das resultierende Präzipitat wurde zu 30 μl von 10 mM Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 10 mM Magnesiumchlorid, 50 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zugegeben, dazu wurden 10 Einheiten MluI zugegeben, und man ließ die Mischung bei 37 °C für 1 Stunde reagieren. Die Reaktionsmischung wurde mittels Agarosegelelektrophorese fraktioniert, um ungefähr 0,3 μg eines DNA-Fragments mit ungefähr 9,3 kb zu gewinnen. Dann wurden 0,1 μg des so erhaltenen MluI-ClaI-Fragments von phKM796H107 an 0,1 μg des MluI-XhoI-Fragments von phKM796LMS1 unter Verwendung eines DNA-Ligationskits (Takara Shuzo) ligiert. Die so erhaltene rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um Escherichia coli-HB101 zu transformieren, um das in 63 gezeigte Plasmid phKM796HL1 zu erhalten.
4. Expression von humanem CDR-transplantiertem anti-GM₂-Antikörper in YB2/0-Zellen
Die Plasmide wurden mittels des Elektroporationsverfahrens von Miyaji et al. [Cytotechnology, 3, 133 (1990)] in YB2/0-Zellen eingeführt.
Nach dem Einführen von 4 μg phKM796HL1, das unter Paragraph 3 von Beispiel 2 erhalten wurde, in 4 × 10⁶ YB2/0 (ATCC CRL1581)-Zellen wurden die Zellen in 40 ml von RPMI1640-FCS(10) [RPMI1640-Medium (Nissui Pharmaceutical), das 10 % FCS, ¼ Volumen von 7,5 % NaHCO₃, 3 % von 200 mM L-Glutamin-Lösung (Gibco) und 0,5 % von Penicillin-Streptomycin-Lösung enthielt (Gibco; enthaltend 5.000 Einheiten/ml Penicillin und 5.000 μg/ml Streptomycin)] suspendiert, die Suspension wurde in 200 μl-Anteilen in Wells von 96-Well-Mikrotiterplatten verteilt. Nach 24 Stunden Inkubation bei 37 °C in einem CO₂-Inkubator wurde G418 (Gibco) bis zu einer Konzentration von 0,5 mg/ml zugegeben, und dann wurde die Inkubation für 1 bis 2 Wochen fortgesetzt. Es traten Kolonien von Transformanten auf, das Kulturfluid wurde von jedem Well, in dem die Zellen bis zur Konfluenz gewachsen waren, gewonnen, und es wurde ein unter Paragraph 11 von Beispiel 1 beschriebener Enzym-gekoppelter Immunosorbent-Assay (ELISA) zur Messung der Aktivität von anit-GM₂-humanem CDR-transplantiertem Antikörper durchgeführt.
Der Klon, der beim ELISA die höchste Aktivität von den erhaltenen Klonen zeigte, ergab einen Anteil an humanem CDR-transplantiertem anti-GM₂-Antikörper von ungefähr 0,1 μg/ml Kulturfluid.
Die Zellen des Klons, welcher die oben genannte Aktivität von humanem CDR-transplantiertem anti-GM₂-Antikörper zeigte, wurden in RPMI1640-FCS(10)-Medium, das 0,5 mg/ml G418 und 50 nM MTX enthielt, bis zu einer Konzentration von 1 bis 2 × 10⁵ Zellen/ml suspendiert, und die Suspension wurde in Portionen von 2 ml in Wells von 24-Well-Platten verteilt. Die Inkubation wurde bei 37 °C in einem CO₂-Inkubator für 1 bis 2 Wochen durchgeführt, um gegenüber 50 nM MTX resistente Klone zu induzieren. Bei Konfluenz wurde die Aktivität an humanem CDR-transplantiertem anti-GM₂-Antikörper in jedem Kulturfluid mittels ELISA bestimmt. Der gegenüber 50 nM MTX resistente Klon, der die höchste Aktivität von den erhaltenen Klonen zeigte, zeigte einen Gehalt an humanem CDR-transplantiertem anti-GM₂-Antikörper von ungefähr 1,0 μg/ml.
Zellen des obigen gegenüber 50 nM MTX resistenten Klons wurden in RPMI1640-FCS(10)-Medium, das 0,5 mg/ml G418 und 200 nM MTX enthielt, bis zu einer Konzentration von 1 bis 2 × 10⁵ Zellen/ml suspendiert, und diese Suspension wurde in Portionen von 2 ml in Wells von 24-Well-Platten verteilt. Die Inkubation wurde bei 37 °C in einem CO₂-Inkubator für 1 bis 2 Wochen durchgeführt, um gegenüber 200 nM MTX resistente Klone zu induzieren. Bei Konfluenz wurde jedes Kulturfluid mittels ELISA auf die Aktivität von humanem CDR-transplantiertem anti-GM₂-Antikörper hin untersucht. Der gegenüber 200 nM MTX resistente Klon, der die höchste Aktivität von den erhaltenen Klonen zeigte, wies einen Gehalt an humanem CDR-transplantiertem anti-GM₂-Antikörper von ungefähr 5,0 μg/ml auf.
Wie im Detail oben beschrieben, stellt die vorliegende Erfindung humanisierte Antikörper bereit, die mit dem Gangliosid GM₂ reagieren.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Humanisierter Antikörper, der für das Gangliosid GM₂ spezifisch ist, worin die CDRs der variablen Region der H-Kette die in SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 und SEQ ID NO:8 angebenen Aminosäuresequenzen, und die CDRs der variablen Region der L-Kette die in SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 und SEQ ID NO:11 angebenen Aminosäuresequenzen aufweisen.
Humanisierter Antikörper nach Anspruch 1, wobei der Antikörper die variable Region der H-Kette und die variable Region der L-Kette des monoklonalen Mausantikörpers KM 796 und die konstante Region der H-Kette und die konstante Region der L-Kette einen humanen Antikörpers aufweist.
Humanisierter Antikörper, der für das Gangliosid GM₂ spezifisch ist, worin die variable Region der H-Kette die Aminosäuren 1-120 aus SEQ ID NO:1 und die variable Region der L-Kette die Aminosäure 1-107 aus SEQ ID NO:2 enthalten.
Humanisierter Antikörper nach Anspruch 3, nämlich der mit dem Hybridom FERM BP-3931 erhältliche Antikörper KM966.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die wenigstens einen humanisierten Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger enthält.
Verwendung wenigstens eines humanisierten Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die geeignet ist, eine cytozidale Wirkung auf eine GM₂ aufweisende Zelle auszuüben.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Zelle eine Humanzelle ist.
Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Zelle eine Krebszelle ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei die Zelle eine neurale ektodermale Zelle ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei die Zelle eine Lungenkarzinomzelle ist.
Verwendung wenigstens eines humanisierten Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei der Krebs neuralen ektodermalen Ursprungs ist.
Verwendung nach Anspruch 11 oder 12, wobei der Krebs ausgewählt ist unter Melanomen, Neuroblastomen und Gliomen.
DNA-Sequenz, die den humanisierten Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4 kodiert.
Expressionsvektor, der die DNA-Sequenz nach Anspruch 14 in operativer Verknüpfung mit einem Promoter umfasst.
Zelle, die den Expressionsvektor nach Anspruch 15 umfasst.
Zelle nach Anspruch 16, wobei die Zelle eine Tierzelle ist.
Nichthumane Transformante, die den humanisierten Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4 produziert.
Verfahren zur Produktion humanisierter Antikörper, die für das Gangliosid GM₂ spezifisch sind, wobei das Verfahren beinhaltet, dass man die DNA-Sequenz nach Anspruch 14 in einer Zelle oder nichthumanen Transformanten nach einem der Ansprüche 16 bis 18 unter geeigneten Bedingungen exprimiert und den Antikörper gewinnt.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Zelle oder Transformante nach einem der Ansprüche 16 bis 18 unter Bedingungen kultiviert wird, bei denen der Antikörper akkumuliert wird.