ES2277336T3 - Antagonistas de il-5 recombinantes utiles en el tratamiento de enfermadades mediadas por il-5. - Google Patents

Antagonistas de il-5 recombinantes utiles en el tratamiento de enfermadades mediadas por il-5. Download PDF

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Abstract

SE DESCRIBEN MABS DE IL - 5 QUIMERICOS, HUMANIZADOS Y OTROS, DERIVADOS DE MABS NEUTRALIZANTES DE ALTA AFINIDAD, COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE LOS CONTIENEN, ASI COMO METODOS DE TRATAMIENTO Y DE DIAGNOSTICO.

Description

Antagonistas de IL-5 recombinantes útiles en el tratamiento de enfermedades mediadas por IL-5.
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general al campo de los anticuerpos y de los anticuerpos alterados, útiles en el tratamiento y en la diagnosis de estados mediados por IL-5 y un exceso de producción de eosinófilos y más específicamente, se refiere a los anticuerpos humanizados.
Antecedentes de la invención
Los eosinófilos están implicados en la patogénesis de una amplia variedad de estados de enfermedades inflamatorias, incluyendo los trastornos alérgicos asociados con reacciones de hipersensibilidad en el tejido pulmonar (Butterfield y col., en: Immunopharmacology of Eosinophils, H. Smith y R. Cook, compiladores, págs. 151-192, Academic Press, Londres (1993)). Un ejemplo destacado es el asma, una enfermedad caracterizada por una obstrucción reversible de las vías respiratorias, que conduce a una hipersensibilidad bronquial no específica. Esto, a su vez, depende de la generación de una reacción inflamatoria crónica a nivel de la mucosa bronquial y una infiltración característica con macrófagos, linfocitos y eosinófilos. Los eosinófilos parece que tienen un papel central en el inicio de la lesión de la mucosa, típica de la enfermedad (Corrigan y col., Immunol. Today, 13:501-507 (1992)). Se han descrito cantidades en aumento de eosinófilos activados en la circulación, las secreciones bronquiales y el parénquima bronquial de pacientes con asma crónica y la gravedad de la enfermedad, tal y como se mide con una variedad de ensayos de la función pulmonar, tiene una correlación con el número de eosinófilos en sangre (Griffen y col., J. Aller. Clin. Immunol., 67:548-557 (1991)). Un incremento de la cantidad de eosinófilos, frecuentemente en el proceso de desgranulación, también se ha observado en fluidos de lavado bronquioalveolar (BAL) de pacientes que padecen reacciones asmáticas tardías y una disminución de la cantidad de eosinófilos, generalmente como consecuencia de una terapia esteroide, se asocia con mejoras de los síntomas clínicos (Bousquet y col., N. Eng. J. Med., 323:1033-1039 (1990)).
La interleucina 5 (IL-5) es una glicoproteína homodímera producida predominantemente por linfocitos T CD4+ activados. En los humanos, la IL-5 es en gran parte responsable del control del crecimiento y de la diferenciación de eosinófilos. Niveles elevados de IL-5 se detectan en lavados bronquioalveolares de asmáticos (Motojima y col., Allergy, 48:98 (1993)). Los ratones que son transgénicos para IL-5 muestran una marcada eosinofilia en la sangre periférica y en los tejidos, en ausencia de estimulación antigénica (Dent y col., J. Exp. Med., 172:1425 (1990)) y los anticuerpos monoclonales de IL-5 anti-múrido han mostrado tener un efecto reductor de la eosinofilia en la sangre y en los tejidos de ratones (Hitoshi y col., Int. Immunol., 3:135 (1991)) así como eosinofilia asociada con la infección de parásitos y la exposición a alérgenos en animales experimentales (Coffman y col., Science, 245:308-310 (1989), Sher y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:61-65 (1990), Chand y col., Eur. J. Pharmacol., 211:121-123 (1992)).
Aunque los corticoesteroides son extremadamente eficaces para eliminar eosinófilos y otros componentes inflamatorios del asma, existe una preocupación sobre sus efectos secundarios en asmáticos graves y más recientemente, en asmáticos leves hasta moderados. La única terapia alternativa con fármacos antiinflamatorios - cromoglicatos (cromolín sódico y nedocromil) - se considera menos eficaz que los corticoesteroides y su mecanismo de acción preciso sigue siendo desconocido.
Desarrollos más recientes han sido enfocados hacia nuevos esteroides inhalados, broncodilatadores de efecto más duradero y agentes que actúan sobre nuevas dianas bioquímicas o farmacológicas (p. ej., activadores de los canales de potasio, antagonistas de leucotrienos, inhibidores de la 5-lipoxigenasa (5-LO), etc.). Un fármaco ideal sería el que combinara la eficacia de los esteroides con la seguridad asociada al cromolín sódico, no obstante con selectividad incrementada y un inicio más rápido de la acción. Los anticuerpos neutralizantes de IL-5 pueden ser potencialmente útiles para mitigar los síntomas relacionados con la eosinofilia en el ser humano, tal y como se sugiere en el documento de patente WO9316184 que describe anticuerpos monoclonales humanizados anti-IL-5.
Por tanto, hay una necesidad en la técnica de antagonistas de IL-5 de alta afinidad, tales como un anticuerpo monoclonal neutralizante para la interleucina 5 humana, que pudiera reducir la diferenciación y la proliferación de eosinófilos (es decir, la acumulación de eosinófilos) y de este modo la inflamación por eosinófilos.
Compendio de la invención
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal neutralizante y humanizado, específico para la interleucina 5 humana, comprendiendo dicho anticuerpo una región variable en la cadena pesada de SEQ ID No. 19 y una región variable en la cadena ligera de SEQ ID No. 21.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que contiene uno (o varios) de los anticuerpos alterados descritos anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Otros aspectos y ventajas de la presente invención se describen a continuación en la descripción detallada y en sus realizaciones preferidas.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 [SEQ ID NOs: 1 y 15] ilustra la región variable de la cadena pesada para el anticuerpo de múridos 2B6 y el anticuerpo quimérico 2B6 múrido/humano. Las áreas en el recuadro indican las CDRs.
La Fig. 2 [SEQ ID NOs: 2 y 16] ilustra la región variable de la cadena ligera para el anticuerpo múrido 2B6 y el anticuerpo quimérico 2B6 múrido/humano. Las áreas en el recuadro indican las CDRs.
La Fig. 3 [SEQ ID NO:3] ilustra la región variable de la cadena pesada para el anticuerpo múrido 2F2. Las áreas en el recuadro indican las CDRs.
La Fig. 4 [SEQ ID NO:4] ilustra la región variable de la cadena ligera para el anticuerpo múrido 2F2. Las áreas en el recuadro indican las CDRs.
La Fig. 5 [SEQ ID NO:5] ilustra la región variable de la cadena pesada para el anticuerpo múrido 2E3. Las áreas en el recuadro indican las CDRs.
La Fig. 6 [SEQ ID NO:6] ilustra la región variable de la cadena ligera para el anticuerpo múrido 2E3. Las áreas en el recuadro indican las CDRs.
La Fig. 7 [SEQ ID NOs:7-14] ilustra las CDRs de la cadena pesada y ligera de los anticuerpos múrido 2B6, 2F2 y 2E3.
La Fig. 8 [SEQ ID NOs: 18, 19] ilustra la región variable de la cadena pesada para el anticuerpo humanizado 2B6. Las áreas en el recuadro indican las CDRs.
La Fig. 9 [SEQ ID NOs: 20, 21] ilustra la región variable de la cadena ligera para el anticuerpo humanizado 2B6. Las áreas en el recuadro indican las CDRs.
La Fig. 10 es un dibujo esquemático del plásmido pCDIL5HZHC1.0, empleado para expresar un gen de la cadena pesada humanizada en células de mamífero. El plásmido contiene un gen de la beta lactamasa (BETA LAC), un origen de replicación de SV-40 (SV40), una secuencia de promotor de citomegalovirus (CMV), una secuencia señal, la cadena pesada humanizada, una señal poli A de la hormona de crecimiento bovina (BGH), un promotor de betaglobina (beta glopro), un gen de la reductasa de dihidrofolato (DHFR) y otra señal poli A de la secuencia de BGH en una señal de fondo de pUC19.
La Fig. 11 es un dibujo esquemático del plásmido pCNIL5HZLC1.0 empleado para expresar un gen de la cadena ligera humanizada en células de mamífero.
La Fig. 12 [SEQ ID NOs: 61, 62] ilustra la región variable de la cadena pesada NewM para el anticuerpo humanizado 2B6. Las áreas en el recuadro indican las CDRs.
La Fig. 13 [SEQ ID NOs: 69, 70] ilustra la región variable de la cadena ligera REI para el anticuerpo humanizado 2B6. Las áreas en el recuadro indican las CDRs.
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona una variedad de anticuerpos, anticuerpos alterados y fragmentos de los mismos, que se caracterizan por la unión específica a IL-5 humana, la actividad neutralizante y la alta afinidad hacia IL-5 humana, tal y como se ilustra en el anticuerpo monoclonal múrido 2B6. Los anticuerpos de la presente invención se prepararon por técnicas convencionales de hibridomas, con genotecas de fagos con representación combinatoria, mezclando al azar las cadenas de inmunoglobulinas y con técnicas de humanización, para generar nuevos anticuerpos neutralizantes. Estos productos son útiles en composiciones terapéuticas y farmacéuticas para tratar enfermedades mediadas por IL-5, p. ej., el asma. Estos productos también son útiles en la diagnosis de estados mediados por IL-5, midiendo (p. ej., ensayo inmunoenzimático (ELISA)) los niveles endógenos de IL-5 en humanos o la IL-5 liberada ex vivo desde las células activadas.
I. Definiciones
"Un anticuerpo alterado" se refiere a una proteína codificada por una región codificadora de inmunoglobulinas alteradas que se puede obtener por expresión en una célula hospedadora seleccionada. Tales anticuerpos alterados son anticuerpos modificados genéticamente (p. ej., anticuerpos quiméricos o humanizados) o fragmentos de anticuerpos que carecen de toda o de parte de una región constante de la inmunoglobulina, p. ej., Fv, Fab, o F(ab)_{2} y similares.
"Una región codificadora de inmunoglobulina alterada" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo alterado de la invención. Cuando el anticuerpo alterado es un anticuerpo con injerto de CDR o un anticuerpo humanizado, las secuencias que codifican las regiones que determinan la complementariedad (CDRs) de una inmunoglobulina no humana, se insertan en una primera pareja de la inmunoglobulina que comprende secuencias humanas variables de la región armazón. Opcionalmente, la primera pareja de la inmunoglobulina está ligada funcionalmente con una segunda pareja de la inmunoglobulina.
"Una primera pareja de la inmunoglobulina" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de la inmunoglobulina de la región armazón humana o una región variable de inmunoglobulina humana, en la que las regiones que codifican las CDRs naturales (o presentes en la naturaleza), se sustituyen por regiones que codifican CDRs de un anticuerpo donante. La región variable humana puede ser una cadena pesada de la inmunoglobulina, una cadena ligera (o ambas cadenas), un análogo o fragmentos funcionales de las mismas. Tales regiones CDRs, localizadas dentro de la región variable de los anticuerpos (inmunoglobulinas), se pueden determinar por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, Kabat y col. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4ª ed., Departamento de Salud y de Servicios Humanos de EE.UU., Institutos Nacionales de la Salud (1987)) describen las normas para localizar CDRs. Además, se conocen programas de informático que son útiles para identificar regiones/estructuras CDRs.
"Neutralizar" se refiere a un anticuerpo que inhibe la actividad de IL-5 evitando la unión de IL-5 humana a su receptor específico o inhibiendo la transmisión de la señal de IL-5 a través de su receptor, si es que tiene lugar la unión. Un mAb es neutralizante si tiene una eficacia del 90%, preferentemente del 95% y lo más preferible del 100%, para inhibir la actividad de IL-5 tal y como se mide en el bioensayo con células B 13 (ensayo de neutralización de IL-5, véase el Ejemplo 2C).
La expresión "alta afinidad" se refiere a un anticuerpo que tiene una afinidad en la unión caracterizada por una K_{d} igual o menor que 3,5 x 10^{-11} M hacia IL-5 humana, tal y como se determina por análisis óptico con biosensor (véase el Ejemplo 2D).
"Especificidad en la unión de IL-5 humana" significa una afinidad alta hacia IL-5 humana, pero no la IL-5 de múrido.
"Segunda pareja de la inmunoglobulina" se refiere a otra secuencia de nucleótidos que codifica una proteína o un péptido al cual se fusiona en marco la primera pareja de la inmunoglobulina o se fusiona mediante una secuencia enlazadora opcional y convencional (es decir, ligada funcionalmente). Preferentemente, es un gen de inmunoglobulina. La segunda pareja de la inmunoglobulina puede incluir una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la región constante completa para la misma (es decir, homóloga - el primer y el segundo anticuerpos alterados se obtienen a partir de la misma fuente) o un anticuerpo adicional (es decir, heterólogo) de interés. Puede ser una cadena de inmunoglobulina pesada o ligera (o ambas cadenas como parte de un solo polipéptido). La segunda pareja de la inmunoglobulina no está limitada a una clase o un isotipo particular de inmunoglobulina. Además, la segunda pareja de la inmunoglobulina puede comprender parte de una región constante de la inmunoglobulina, tal como la que se encuentra en Fab, o en F(ab)_{2} (es decir, una parte discreta de una región constante humana o de una región armazón adecuada). Dicha segunda pareja de la inmunoglobulina también puede comprender una secuencia que codifica una proteína integral de la membrana, expuesta en la superficie externa de una célula hospedadora, p. ej., como parte de una genoteca de presentación de fagos, o una secuencia que codifica una proteína para la detección analítica o de diagnóstico, p. ej., la peroxidasa de rábano picante, la \beta-galactosidasa, etc.
Los términos Fv, Fc, Fd, Fab, o F(ab)_{2}, se emplean con sus significados convencionales (véase, p. ej., Harlow y col., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)).
Tal y como se emplea en esta memoria, un "anticuerpo modificado genéticamente" describe un tipo de anticuerpo alterado, es decir, un anticuerpo sintético de longitud completa (p. ej., un anticuerpo quimérico o humanizado en contraposición a un fragmento de anticuerpo) en el que una parte de los dominios variables de la cadena ligera y/o pesada de un anticuerpo aceptor seleccionado, se sustituye con partes análogas de uno o más anticuerpos donantes que tienen especificidad por el epítopo seleccionado. Por ejemplo, tales moléculas pueden incluir anticuerpos caracterizados por una cadena pesada humanizada, asociada con una cadena ligera no modificada (o una cadena ligera quimérica) o viceversa. Los anticuerpos modificados genéticamente también pueden estar caracterizados por la alteración de las secuencias de ácido nucleico que codifican las regiones de armazón del dominio variable de la cadena ligera o pesada del anticuerpo aceptor, para conservar la especificidad de la unión del anticuerpo donante. Estos anticuerpos pueden comprender la sustitución de una o varias CDRs (preferentemente todas) procedentes del anticuerpo aceptor, por CDRs procedentes de un anticuerpo donante, descrito en esta memoria.
Un "anticuerpo quimérico" se refiere a un tipo de anticuerpo modificado genéticamente que contiene una región variable presente en la naturaleza (la cadena ligera y las cadenas pesadas) obtenida a partir de un anticuerpo donante junto con las regiones constantes de las cadenas ligera y pesada, obtenidas a partir de un anticuerpo aceptor.
Un "anticuerpo humanizado" se refiere a un tipo de anticuerpo modificado genéticamente cuyas CDRs se obtienen a partir de una inmunoglobulina donante no humana, obteniéndose el resto de las partes de la molécula obtenidas a partir de la inmunoglobulina, a partir de una (o de varias) inmunoglobulina(s). Además, los residuos que mantienen el armazón se pueden alterar para conservar una afinidad en la unión (véase, p. ej., Queen y col., Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson y col., Bio/Technology, 9:421 (1991)).
La expresión "anticuerpo donante" se refiere a un anticuerpo (monoclonal o recombinante) que aporta las secuencias de ácido nucleico de sus regiones variables, CDRs, u otros fragmentos funcionales o análogos de los mismos a una primera pareja de la inmunoglobulina, de modo que proporciona la región codificadora alterada de la inmunoglobulina y da como resultado el anticuerpo alterado expresado con la especificidad antigénica y la característica de actividad neutralizante del anticuerpo donante. Un anticuerpo donante adecuado para el uso en esta invención es un anticuerpo monoclonal neutralizante no humano (es decir, de múrido) denominado 2B6. El anticuerpo 2B6 se define como un anticuerpo neutralizante de alta afinidad, específico de IL-5 humana (es decir, que no reconoce la IL-5 de múrido), con el isotipo IgG_{1} que tiene el ADN de la cadena ligera variable y las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 y 16, respectivamente, y el ADN de la cadena pesada variable y las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1 y 15, respectivamente, en una región constante de IgG de múrido adecuada.
La expresión "anticuerpo aceptor" se refiere a un anticuerpo (monoclonal o recombinante) heterólogo frente al anticuerpo donante que aporta todas (o cualquier parte, pero preferentemente todas) las secuencias de ácido nucleico que codifican sus regiones armazón de la cadena pesada y/o ligera, y/o sus regiones constantes de la cadena pesada y/o ligera para la primera pareja de la inmunoglobulina. Preferentemente, el anticuerpo aceptor es un anticuerpo humano.
Las "CDRs" se definen como las secuencias de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de un anticuerpo, las cuales son las regiones hipervariables de las cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas. Véase, p. ej., Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4ª ed., Departamento de Salud y de Servicios Humanos de EE.UU., Institutos Nacionales de Salud (1987). En la parte variable de una inmunoglobulina hay tres CDRs de cadena pesada y tres CDRs de cadena ligera (o regiones CDR). Por tanto, las "CDRs" tal y como se emplean en esta memoria, se refieren a las tres CDRs de la cadena pesada o a las tres CDRs de la cadena ligera (o, si es adecuado, a todas las CDRs de las cadenas pesadas y ligeras).
Las CDRs proporcionan la mayoría de los residuos de contacto para la unión del anticuerpo con el antígeno o el epítopo. Las CDRs de interés de esta invención se obtienen a partir de secuencias de la cadena pesada y ligera de la región variable del anticuerpo donante, e incluyen análogos de las CDRs presentes en la naturaleza, compartiendo o conservando también dichos análogos la misma especificidad de unión al antígeno y/o la capacidad neutralizante, que el anticuerpo donante a partir del cual se han obtenido.
"Compartir la especificidad de la unión al antígeno o la capacidad neutralizante" significa, por ejemplo, que aunque mAb 2B6 pueda estar caracterizado por un cierto nivel de afinidad hacia el antígeno, una CDR codificada por una secuencia de ácido nucleico de 2B6 en un entorno estructural adecuado, puede tener una afinidad menor o mayor. Se espera que las CDRs de 2B6 en tales entornos, reconozcan sin embargo el(los) mismo(s) epítopo(s) que 2B6. Las CDRs de 2B6 de la cadena pesada, a modo de ejemplo, incluyen SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; y las CDRs de 2B6 de la cadena ligera, a modo de ejemplo, incluyen SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; y SEQ ID NO: 12.
Un "fragmento funcional" es una secuencia parcial de la región variable de la cadena pesada o ligera (p. ej., deleciones menores en el extremo amino o carboxi terminal de la región variable de la inmunoglobulina) que conserva la misma especificidad en la unión al antígeno y/o la misma capacidad neutralizante que el anticuerpo a partir del cual se ha obtenido el fragmento.
Un "análogo" es una secuencia de aminoácidos, modificada al menos en un aminoácido, en donde dicha modificación puede ser química o una sustitución o una transposición de unos pocos aminoácidos (es decir, no más de 10), permitiendo dicha modificación que la secuencia de aminoácidos conserve las características biológicas, p. ej., la especificidad antigénica y la alta afinidad, de la secuencia sin modificar. Por ejemplo, se pueden construir mutaciones (silenciosas) mediante sustituciones, cuando se crean ciertos sitios de restricción para endonucleasas, dentro o alrededor de las regiones codificadoras de CDRs.
Los análogos pueden surgir también como variaciones alélicas. Una "variación o modificación alélica" es una alteración en la secuencia de ácido nucleico que codifica las secuencias de aminoácidos o de péptidos de la invención. Tales variaciones o modificaciones pueden ser debidas a la degeneración del código genético o se pueden modificar deliberadamente por ingeniería genética para proporcionar las características deseadas. Estas variaciones o modificaciones pueden dar como resultado o no, alteraciones en cualquier secuencia de aminoácidos codificada.
La expresión "agentes efectores" se refiere a moléculas vehículo no proteicas a las que se pueden asociar por medios convencionales, los anticuerpos alterados y/o las cadenas ligeras o pesadas, naturales o sintéticas del anticuerpo donante u otros fragmentos del anticuerpo donante. Tales vehículos no proteicos pueden incluir vehículos convencionales empleadas en el campo del diagnóstico, p. ej., perlas de poliestireno u otros plásticos, polisacáridos, p. ej., tal y como se emplean en el sistema BIAcore [Pharmacia] u otras sustancias no proteicas útiles en el campo de la medicina y seguras para la administración en humanos y en animales. Otros agentes efectores pueden incluir un macrociclo para quelar un átomo de metal pesado o radioisótopos. Tales agentes efectores pueden ser también útiles para incrementar la semi-vida de los anticuerpos alterados, p. ej., polietilenglicol.
II. Anticuerpos Monoclonales para IL-5 de Alta Afinidad
Para el uso en la construcción de anticuerpos, los anticuerpos alterados de esta invención, una especie no humana (por ejemplo, bovina, ovina, de mono, de pollo, de roedor (p. ej., múrido y rata), etc.) se pueden emplear para generar una inmunoglobulina deseable después de la presentación con IL-5 humana natural o un epítopo peptídico de la misma. Las técnicas de hibridoma convencionales se emplean para proporcionar una línea celular de hibridoma que secreta un mAb no humano para IL-5. Tales hibridomas se escrutan a continuación en busca de unión, empleando placas de 96 pocillos revestidas con IL-5, tal y como se describe en la sección de Ejemplos o, alternativamente, con IL-5 biotinilada unida a una placa revestida con estreptavidina.
Un mAb neutralizante y de alta afinidad a modo de ejemplo de esta presente invención, es mAb 2B6, un anticuerpo de múrido que se puede emplear para el desarrollo de un anticuerpo quimérico o humanizado, descrito con más detalle en el Ejemplo 1 a continuación. El mAb 2B6 se caracteriza por una especificidad en la unión con el antígeno frente a IL-5 humana, con una K_{d} menor de 3,5 x 10^{-11} M (aproximadamente 2,2 x 10^{-11} M) para IL-5. La K_{d} para IL-5 de un fragmento Fab procedente de 2B6 (véase, el Ejemplo 3H) se estima que es aproximadamente 9 x 10^{-11} M, tal y como se determina con un biosensor óptico. El mAb 2B6 parece bloquear la interacción de la unión entre IL-5 humana y la cadena \alpha del receptor de IL-5 humana.
Otro anticuerpo donante deseable es el mAb múrido 2E3. Este mAb se caracteriza por ser un isotipo IgG_{2a} y tener una constante de disociación para hIL-5 menor de 3,5 x 10^{-11} M (aproximadamente 2,0 x 10^{-11} M).
Aún otro anticuerpo donante deseable es el mAb de rata, 4A6. Este mAb se caracteriza por tener una constante de disociación para hIL-5 menor de 3,5 x 10^{-11} M (aproximadamente 1,8 x 10^{-11} M). Adicionalmente, el mAb 4A6 parece bloquear la interacción en la unión entre IL-5 humana y la cadena \beta del receptor de IL-5.
IV. Aminoácido anti-IL-5 y Secuencias de Nucleótidos de Interés
El mAb 2B6 descrito anteriormente puede aportar secuencias, tales como las secuencias peptídicas de la cadena pesada y/o ligera variables, las secuencias de armazón, las secuencias CDR, fragmentos funcionales y sus análogos y las secuencias de ácidos nucleicos que las codifican, útiles para diseñar y obtener diversos anticuerpos alterados que se caracterizan por la especificidad de la unión al antígeno del anticuerpo donante.
A modo de ejemplo, la presente invención pone de este modo a disposición las secuencias variables de la cadena pesada y de la cadena ligera procedentes del anticuerpo 2B6 múrido de IL-5 y las secuencias obtenidas a partir de las mismas. La región variable de la cadena pesada de 2B6 se ilustra en la Fig. 1. Las regiones que codifican CDR se indican con las áreas en el recuadro y se proporcionan en SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; y SEQ ID NO: 9. La región variable del clon de la cadena ligera de 2B6 se ilustra en la Fig. 2. Las regiones que codifican las CDRs se proporcionan en la SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; y SEQ ID NO: 12.
Una región variable de la cadena pesada humanizada se ilustra en la Fig. 8 [SEQ ID NOs: 18 y 19]. La secuencia señal también se proporciona en SEQ ID NO: 17. Otras secuencias señal adecuadas, conocidas por los expertos en la técnica, se pueden sustituir por las secuencias señal a modo de ejemplo en esta memoria. Las secuencias de aminoácidos de las CDRs de esta estructura artificial son idénticas a las CDRs de la cadena pesada natural de múridos y la quimérica y se proporcionan en SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, y SEQ ID NO: 9. Una secuencia variable de la cadena ligera humanizada, a modo de ejemplo (sintética) se ilustra en la Fig. 9 [SEQ ID NOs: 20 y 21].
Las secuencias de ácidos nucleicos de esta invención o sus fragmentos que codifican las secuencias peptídicas variables de la cadena ligera y de la cadena pesada, también son útiles para la introducción mutagénica de cambios específicos dentro de las secuencias de ácido nucleico que codifican las CDRs o las regiones de armazón, y para la incorporación de la secuencia de ácidos nucleicos resultante, modificada o fusionada en un plásmido para la expresión. Por ejemplo, las sustituciones silenciosas en la secuencia de nucleótidos de las regiones de armazón y las que codifican las CDRs, se emplearon para crear sitios de enzimas de restricción que facilitaban la inserción de regiones CDRs mutagenizadas (y/o de armazón). Estas regiones que codifican CDRs se emplearon en la construcción de un anticuerpo humanizado de esta invención.
Teniendo en cuenta la degeneración del código genético, se pueden construir diversas secuencias codificadoras que codifican las secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada y ligera y las secuencias de CDRs de la invención, así como fragmentos funcionales y sus análogos que comparten la especificidad antigénica del anticuerpo donante. Las secuencias aisladas de ácido nucleico de esta invención o sus fragmentos, que codifican las secuencias peptídicas de la cadena variable o las CDRs, se pueden utilizar para producir anticuerpos alterados, p. ej., anticuerpos quiméricos o humanizados, u otros anticuerpos modificados genéticamente de esta invención, cuando se combinan funcionalmente con una segunda pareja de la inmunoglobulina.
Se debe tener en cuenta, que además de las secuencias de ácido nucleico aisladas que codifican partes del anticuerpo alterado y los anticuerpos descritos en esta memoria, la presente invención incluye otras secuencias de ácido nucleico, tales como las complementarias a las secuencias que codifican las CDRs naturales o las complementarias a las regiones de armazón humano modificadas que rodean las regiones que codifican las CDRs. Las secuencias de ADN útiles, incluyen las secuencias que se hibridan bajo condiciones rigurosas de hibridación [véase, T. Maniatis y col., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), páginas 387 a 389] con las secuencias de ADN. Un ejemplo de una condición de hibridación rigurosa es la hibridación en 4 X SSC a 65°C, seguido de un lavado en 0,1 X SSC a 65°C durante una hora. Alternativamente, una condición de hibridación rigurosa a modo de ejemplo, es en formamida al 50%, 4 X SSC a 42°C. Preferentemente, estas secuencias de ADN que se hibridan tienen al menos aproximadamente 18 nucleótidos de longitud, es decir, aproximadamente el tamaño de una CDR.
V. Moléculas de Inmunoglobulinas Alteradas y Anticuerpos Alterados
Las moléculas de inmunoglobulinas alteradas pueden codificar anticuerpos alterados que incluyen anticuerpos modificados genéticamente, tales como anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados. Una región codificadora deseada de la inmunoglobulina alterada contiene regiones que codifican CDRs que codifican péptidos que tienen la especificidad antigénica de un anticuerpo de IL-5, preferentemente un anticuerpo de alta afinidad tal y como se proporciona en la presente invención, insertado en una primera pareja de la inmunoglobulina (una región variable de inmunoglobulina humana o de armazón humano).
Preferentemente, la primera pareja de la inmunoglobulina está ligada funcionalmente con una segunda pareja de la inmunoglobulina. La segunda pareja de la inmunoglobulina se define arriba y puede incluir una secuencia que codifica una segunda región del anticuerpo de interés, por ejemplo, una región Fc. Las segundas parejas de la inmunoglobulina también pueden incluir secuencias que codifican otra inmunoglobulina a la que se fusiona en marco la región constante de la cadena ligera o pesada o mediante una secuencia enlazadora. Los anticuerpos modificados genéticamente dirigidos contra fragmentos funcionales o análogos de la IL-5, se pueden diseñar para producir una unión mejorada con el mismo anticuerpo.
La segunda pareja de la inmunoglobulina también puede estar asociada con agentes efectores, tal y como se ha definido anteriormente, incluyendo moléculas vehículo no proteicas a las que la segunda pareja de la inmunoglobulina puede estar ligada funcionalmente por medios convencionales.
La fusión o el enlace entre las segundas parejas de la inmunoglobulina, p. ej., secuencias del anticuerpo y el agente efector, puede tener lugar mediante cualquier medio adecuado, p. ej., enlaces covalentes o iónicos convencionales, fusiones de proteínas o reticulaciones heterobifuncionales, p. ej., carbodiimida, glutaraldehído y similares. Tales métodos son conocidos en la técnica y están descritos de forma propicia en textos convencionales de química y de bioquímica.
Adicionalmente, las secuencias enlazadoras convencionales que proporcionan simplemente una cantidad deseada de espacio entre la segunda pareja de la inmunoglobulina y el agente efector, se puede construir también en la región codificadora de la inmunoglobulina alterada. El diseño de tales enlazadores es bien conocido por los expertos en la técnica.
Además, las secuencias señal para las moléculas de la invención, se pueden modificar para mejorar la expresión. A modo de ejemplo, en el anticuerpo humanizado 2B6 que tiene la secuencia señal y las CDRs obtenidas a partir de la secuencia de la cadena pesada de múrido, el péptido señal original estaba sustituido por otra secuencia señal [SEQ ID NO: 17].
Un anticuerpo alterado a modo de ejemplo contiene una secuencia variable peptídica o proteica de la cadena pesada y/o de la ligera, que tiene la especificidad antigénica de mAb 2B6, p. ej., las cadenas V_{H} y V_{L}. Aún otro anticuerpo alterado deseado de esta invención se caracteriza por la secuencia de aminoácidos que contiene al menos una y preferentemente todas las CDRs de la región variable de las cadenas pesada y/o ligeras de la molécula del anticuerpo 2B6 múrido, obteniéndose las secuencias restantes a partir de una fuente humana o un fragmento funcional o un análogo de las mismas. Véase, p. ej., las regiones humanizadas de V_{H} y V_{L} (Figs. 8 y 9).
En aún otra realización, el anticuerpo modificado genéticamente puede tener fijado a el mismo un agente adicional. Por ejemplo, el procedimiento de tecnología de ADN recombinante se puede utilizar para producir un anticuerpo modificado genéticamente, de la invención, en el que el fragmento Fc o el dominio CH2 CH3 de una molécula completa de anticuerpo, se sustituya por una enzima u otra molécula detectable (es decir, una molécula efectora o informadora polipeptídica).
La segunda pareja de la inmunoglobulina también puede estar ligada funcionalmente a un péptido, una proteína o un fragmento del mismo que no sea inmunoglobulina, heterólogo a la secuencia que contiene las CDRs que tiene la especificidad antigénica de 2B6 múrido. La proteína resultante puede mostrar la especificidad antigénica de IL-5 y también características de la expresión en no inmunoglobulinas. Esta característica de la pareja de fusión puede ser, p. ej., una característica funcional, tal como otro dominio de unión o de receptor, o una característica terapéutica si la pareja de la fusión es ella misma una proteína terapéutica o características antigénicas adicionales.
Siempre cuando la segunda pareja de la inmunoglobulina se obtiene a partir de un anticuerpo diferente del anticuerpo donante, p. ej., cualquier isotipo o clase de región armazón de la inmunoglobulina o regiones constantes, se obtiene como resultado un anticuerpo modificado genéticamente. Los anticuerpos modificados genéticamente pueden comprender las regiones constantes de la inmunoglobulina (Ig) y las regiones armazón variables procedentes de una fuente, p. ej., el anticuerpo aceptor y una o varias (preferentemente todas) las CDRs procedentes del anticuerpo donante, p. ej., el anticuerpo anti-IL-5 descrito en esta memoria. Además, las alteraciones, p. ej., deleciones, sustituciones o adiciones, de la región armazón del dominio variable de la cadena ligera y/o pesada del mAb aceptor, a nivel de ácido nucleico o de aminoácido, o las regiones CDRs donantes se puede preparar de modo que conserven la especificidad de la unión entre el antígeno y el anticuerpo donante.
Tales anticuerpos modificados genéticamente se diseñan para emplear una (o ambas) de las cadenas variables pesada y/o ligera del mAb de IL-5 (modificado opcionalmente tal y como se ha descrito) o una o varias de las CDRs de la cadena pesada o ligera, identificadas más abajo (véase también la Fig. 7). Los anticuerpos modificados genéticamente de la invención son neutralizantes, es decir, bloquean de forma deseable la unión con el receptor de la proteína IL-5 y también bloquean o evitan la proliferación de las células dependientes de IL-5.
Tales anticuerpos modificados genéticamente pueden incluir un anticuerpo humanizado que contiene las regiones armazón de una inmunoglobulina humana seleccionada o un subtipo, o un anticuerpo quimérico que contiene las regiones constantes de la cadena pesada y ligera humanas, fusionadas con los fragmentos funcionales del anticuerpo de IL-5. Un anticuerpo aceptor humano (o de otro animal) adecuado, puede ser uno seleccionado a partir de una base de datos convencional, p. ej., la base de datos KABAT®, Los Alamos y la base de datos Swiss Protein, por homología con las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos del anticuerpo donante. Un anticuerpo humano caracterizado por una homología entre las regiones del armazón del anticuerpo donante (o una base de aminoácidos) puede ser adecuado para proporcionar una región constante de la cadena pesada y/o una región armazón variable de la cadena pesada para la inserción de las CDRs donantes. Un anticuerpo aceptor adecuado, capaz de donar regiones armazón constantes o variables de la cadena ligera, se puede seleccionar de forma similar. Se debe tener en cuenta que las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo aceptor no son necesarias que sean originarias del mismo anticuerpo aceptor.
De forma deseable las regiones armazón y constantes heterólogas se seleccionan a partir de clases de inmunoglobulina humana e isotipos, tales como IgG (subtipos 1 a 4), IgM, IgA e IgE. Sin embargo el anticuerpo aceptor no tiene que comprender sólo secuencias proteicas de la inmunoglobulina humana. Por ejemplo, se puede construir un gen en el que una secuencia de ADN que codifica parte de una cadena de inmunoglobulina humana, se fusiona con una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos de no inmunoglobulina, tal como una molécula efectora o una molécula informadora polipeptídica.
Un ejemplo de un anticuerpo humanizado particularmente deseable contiene CDRs de 2B6 insertadas en las regiones del armazón de una secuencia de anticuerpo humano seleccionada. Para neutralizar los anticuerpos humanizados, uno, dos o preferentemente tres CDRs procedentes de las regiones variables de la cadena ligera y/o de la cadena pesada del anticuerpo de IL-5, se insertan en las regiones armazón de la secuencia del anticuerpo humano seleccionada, sustituyendo las CDRs naturales del anticuerpo anterior.
Preferentemente, en un anticuerpo humanizado, los dominios variables en ambas cadenas humanas pesada y ligera, se han modificado genéticamente mediante una o varias sustituciones de las CDRs. Es posible utilizar las seis CDRs o diversas combinaciones de menos de seis CDRs. Preferentemente, las seis CDRs están sustituidas. Es posible sustituir las CDRs sólo en la cadena pesada humana, utilizando como cadena ligera, la cadena ligera sin modificar procedente del anticuerpo aceptor humano. Aún más alternativamente, se puede seleccionar una cadena ligera compatible a partir de otro anticuerpo humano, recurriendo a las bases de datos convencionales de anticuerpos. El resto del anticuerpo modificado genéticamente se puede obtener a partir de cualquier inmunoglobulina humana adecuada y
aceptora.
El anticuerpo humanizado modificado genéticamente que tiene por tanto preferentemente la estructura de un anticuerpo humano natural o un fragmento del mismo, y posee la combinación de propiedades necesaria para un uso terapéutico eficaz, p. ej., el tratamiento de enfermedades inflamatorias mediadas por IL-5 en humanos, o para usos en diagnóstico.
Los expertos en la técnica entenderán que un anticuerpo modificado genéticamente se puede modificar adicionalmente por cambios en los aminoácidos del dominio variable sin afectar necesariamente a la especificidad y a la alta afinidad del anticuerpo donante (es decir, un análogo). Se anticipa que los aminoácidos de la cadena pesada y ligera se pueden sustituir por otros aminoácidos en los armazones del dominio variable o en las CDRs, o en ambos.
Además, la región constante se puede alterar para aumentar o disminuir las propiedades selectivas de las moléculas de la presente invención. Por ejemplo, la dimerización, la unión a receptores Fc o la capacidad de unirse y de activar el complemento (véase, p. ej., Angal y col., Mol. Immunol, 30:105-108 (1993), Xu y col., J. Biol. Chem, 269:3469-3474 (1994), Winter y col., documento EP 307.434-B).
Un anticuerpo alterado que es un anticuerpo quimérico, difiere de los anticuerpos humanizados descritos anteriormente, al proporcionar las regiones variables completas de la cadena pesada y de la cadena ligera del anticuerpo del donante no humano, incluyendo las regiones armazón, junto con las regiones constantes de la inmunoglobulina humana para ambas cadenas. Se anticipa que los anticuerpos quiméricos que conservan la secuencia adicional no humana, frente a los anticuerpos humanizados de esta invención, pueden producir una respuesta inmune significativa en humanos.
Tales anticuerpos son útiles en la prevención y el tratamiento de enfermedades mediadas por IL-5, tal y como se describe a continuación.
VI. Producción de Anticuerpos Alterados y de Anticuerpos Modificados Genéticamente
Preferentemente, las secuencias de las cadenas variables ligera y/o pesada y las CDRs de mAb 2B6 u otros mAbs donantes adecuados (p. ej., 2E3, 2F2, 4A6, etc.) y sus secuencias que codifican ácidos nucleicos, se emplean en la construcción de anticuerpos alterados, preferentemente anticuerpos humanizados de este invención, según el siguiente procedimiento. Las mismas técnicas o parecidas también se pueden emplear para generar otras realizaciones de esta invención.
Un hibridoma que produce un mAb donante seleccionado, p. ej., el anticuerpo 2B6 de múrido, se clona convencionalmente y el ADN de sus regiones variables de las cadenas pesada y ligera, obtenidas por técnicas conocidas por un experto en la técnica, p. ej., las técnicas descritas por Sambrook y col., (Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)). Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de 2B6 que contienen al menos las regiones que codifican las CDRs y las porciones de las regiones armazón del dominio variable ligero y/o pesado del mAb aceptor, necesarias para conservar la especificidad de la unión al mAb donante, así como las partes restantes de la cadena del anticuerpo, derivadas de la inmunoglobulina, obtenidas a partir de una inmunoglobulina humana, se obtienen empleando cebadores polinucleótidos y transcriptasa inversa. Las regiones que codifican las CDRs se identifican empleando una base de datos conocida y comparando con otros anticuerpos.
Un anticuerpo quimérico de ratón/humano se puede preparar a continuación y someter a ensayo su capacidad de unión. Tal anticuerpo quimérico contiene las regiones V_{H} y V_{L} completas del anticuerpo donante no humano, junto con las regiones constantes de Ig humanas para ambas cadenas.
Las regiones del armazón homólogas de una región variable de la cadena pesada procedente de un anticuerpo humano, se identificaron empleando bases de datos informatizadas, p. ej., KABAT® y un anticuerpo humano que es homólogo a 2B6, se seleccionó como anticuerpo aceptor. Las secuencias de las regiones variables de la cadena pesada sintética que contenían las regiones que codifican las CDRs de 2B6, dentro de los armazones del anticuerpo humano, se diseñaron con sustituciones opcionales de nucleótidos en las regiones del armazón, para incorporar sitios de restricción. Esta secuencia diseñada se sintetizó a continuación empleando oligómeros largos sintéticos. Alternativamente, la secuencia diseñada se puede sintetizar solapando oligonucleótidos, amplificar con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y corregir los errores.
Una región adecuada de armazón variable de la cadena ligera, se diseñó de forma similar.
Un anticuerpo humanizado se puede obtener a partir del anticuerpo quimérico o, preferentemente, se puede preparar sintéticamente insertando las regiones que codifican CDRs del mAb donante, procedentes de las cadenas pesada y ligera, de forma adecuada dentro del armazón seleccionado de la cadena pesada y ligera. Alternativamente, un anticuerpo humanizado de la invención se puede preparar empleando técnicas convencionales de mutagénesis. Por tanto, el anticuerpo humanizado resultante contiene regiones del armazón humano y regiones que codifican las CDRs del mAb donante. Puede haber una manipulación posterior de los residuos del armazón. El anticuerpo humanizado resultante se puede expresar en células hospedadoras recombinantes, p. ej., COS, CHO o células de mieloma. Otros anticuerpos humanizados se pueden preparar empleando esta técnica sobre otros anticuerpos adecuados específicos de IL-5, neutralizantes, de alta afinidad y no humanos.
Un vector de expresión convencional o un plásmido recombinante se produce colocando estas secuencias codificadoras del anticuerpo alterado, asociados funcionalmente con secuencias de control regulador convencionales, capaces de controlar la replicación y la expresión en una célula hospedadora y/o la secreción desde una célula hospedadora. Las secuencias reguladoras incluyen secuencias de promotor, p. ej., promotor CMV y secuencias señal que se pueden obtener a partir de otros anticuerpos conocidos. De forma similar, un segundo vector de expresión se puede producir de modo que tenga una secuencia de ADN que codifique una cadena complementaria ligera o pesada del anticuerpo. Preferentemente, este segundo vector de expresión es idéntico al primero, exceptuando lo que se refiera a las secuencias codificadoras y a los marcadores seleccionables, de modo que se asegure en lo posible que cada cadena polipeptídica se exprese funcionalmente. Alternativamente, las secuencias codificadoras de la cadena pesada y ligera del anticuerpo alterado pueden encontrarse en un vector aislado.
Una célula hospedadora seleccionada se cotransfecta por técnicas convencionales con ambos vectores primero y segundo (o simplemente se transfecta con un vector aislado) para crear la célula hospedadora transfectada de la invención que comprende las cadenas ligera y pesada recombinantes o sintéticas. La célula transfectada se cultiva a continuación por técnicas convencionales para producir el anticuerpo modificado genéticamente de la invención. El anticuerpo humanizado que incluye la asociación de la cadena pesada recombinante y/o de la cadena ligera, se rastrea en el cultivo mediante un ensayo adecuado, tal como ELISA o RIA. Se pueden emplear técnicas similares convencionales para construir otros anticuerpos y moléculas alteradas de esta invención.
Los vectores adecuados para las etapas de clonación y subclonación, empleados en los métodos y en la construcción de las composiciones de esta invención, pueden ser seleccionados por un experto en la técnica. Por ejemplo, se pueden utilizar las series convencionales pUC de vectores de clonación. Un vector empleado es pUC 19 que se puede obtener comercialmente en casas comerciales, tales como Amersham (Buckinghamshire, Reino Unido) o Pharmacia (Uppsala, Suecia). Adicionalmente, cualquier vector que sea capaz de replicarse con facilidad, que tenga una variedad de sitios de clonación y de genes seleccionables (p. ej., de resistencia a los antibióticos) y que se pueda manipular fácilmente, se puede emplear para la clonación. Por tanto, la selección del vector de clonación no es un factor limitante en esta invención.
De forma similar, los vectores empleados para la expresión de los anticuerpos modificados genéticamente, de acuerdo con esta invención, pueden ser seleccionados por un experto en la técnica a partir de cualquier vector convencional. Los vectores también contienen secuencias reguladoras seleccionadas (tales como promotores CMV) que dirigen la replicación y la expresión de las secuencias de ADN heterólogas en células hospedadoras seleccionadas. Estos vectores contienen las secuencias de ADN descritas anteriormente que codifican el anticuerpo modificado genéticamente o la región que codifica la inmunoglobulina alterada. Adicionalmente, los vectores pueden incorporar las secuencias de inmunoglobulina seleccionadas, modificadas por la inserción de sitios de restricción deseables para una manipulación más fácil.
Los vectores de expresión también se pueden caracterizar por genes adecuados para amplificar la expresión de las secuencias de ADN heterólogas, p. ej., el gen de la reductasa de dihidrofolato de mamífero (DHFR). Otras secuencias de vectores preferibles incluyen una secuencia señal poli A, tal como la de la hormona de crecimiento bovino (BGH) y la secuencia del promotor de la betaglobina (betaglopro). Los vectores de expresión útiles en esta memoria se pueden sintetizar por técnicas bien conocidas por los expertos en esta técnica.
Los componentes de tales vectores, p. ej., los replicones, los genes de selección, los potenciadores, los promotores, las secuencias señal y similares, se pueden obtener a partir de fuentes comerciales o naturales o se pueden sintetizar por métodos conocidos, para emplear en dirigir la expresión y/o la secreción del producto del ADN recombinante en un hospedador seleccionado. Otros vectores de expresión adecuados, de los que se conocen numerosos tipos, son conocidos en la técnica para la expresión en mamíferos, bacterias, insectos, levaduras y hongos, y también se pueden seleccionar para este fin.
La presente invención también comprende una línea celular transfectada con un plásmido recombinante que contiene las secuencias codificadoras de los anticuerpos modificados genéticamente o sus moléculas de inmunoglobulina alterada. Las células hospedadoras útiles para clonar y para otras manipulaciones de estos vectores de clonación, son también convencionales. Sin embargo, de forma más deseable, se emplean células procedentes de diversas cepas de E. coli para la replicación de los vectores de clonación y de otras etapas en la construcción de anticuerpos alterados de esta invención.
Las células hospedadoras o las líneas celulares adecuadas para la expresión del anticuerpo modificado genéticamente o el anticuerpo alterado de la invención, son preferentemente células de mamífero tales como CHO, COS, una célula de fibroblasto (p. ej., 3T3) y células mieloides y más preferentemente una célula CHO o una célula mieloide. Las células humanas se pueden utilizar, permitiendo de este modo modificar la molécula con patrones de glicosilación humana. Alternativamente, se pueden emplear otras líneas de células eucariotas. La selección de las células hospedadoras de mamífero adecuadas y de los métodos para la transformación, el cultivo, la amplificación, el escrutinio y la producción del producto y la purificación, se conocen en la técnica. Véase, p. ej., Sambrook y col., citado anteriormente.
Las células bacterianas se pueden mostrar útiles como células hospedadoras, adecuadas para la expresión de los Fabs recombinantes de la presente invención (véase, p. ej., Plückthun, A., Immunol. Rev., 130:151-188 (1992)). Sin embargo, debido a la tendencia que tienen las proteínas expresadas en células bacterianas de no estar en forma plegada o estar en forma indebidamente plegada o en forma no glicosilada, cualquier Fab recombinante producido en una célula bacteriana se tendría que escrutar en busca de la conservación de la capacidad de unión al antígeno. Si la molécula expresada por la célula bacteriana se produjo de forma que estaba adecuadamente plegada, esta célula bacteriana podría ser un hospedador deseable. Por ejemplo, diversas cepas de E. coli utilizadas para la expresión son bien conocidas como células hospedadoras en el campo de la biotecnología. Diversas cepas de B. subtilis, Streptomyces, otros bacilos y similares, también se pueden emplear en este método.
Si se desea, las cepas de células de levaduras conocidas por los expertos en la técnica, también están disponibles como células hospedadoras, así como las células de insectos, p. ej. Drosophila y Lepidoptera y los sistemas de expresión vírica. Véase, p. ej., Miller y col., Genetic Engineering, 8:277-298, Plenum Press (1986) y las referencias citadas en esta memoria.
Los métodos generales con los que se pueden construir los vectores de la invención, los métodos de transfección necesarios para producir las células hospedadoras de la invención y los métodos de cultivo necesarios para producir el anticuerpo alterado de la invención a partir de tal célula hospedadora, son todos técnicas convencionales. Igualmente, una vez producidos, los anticuerpos alterados de la invención se pueden purificar de los contenidos del cultivo celular, de acuerdo con los procedimientos convencionales en la técnica, incluyendo la precipitación con sulfato de amonio, las columnas de afinidad, la cromatografía en columna, la electroforesis en gel y similares. Tales métodos pertenecen al estado de la técnica y no limitan esta invención.
Aún en otro método de expresión de los anticuerpos humanizados, se puede utilizar la expresión en un animal transgénico, tal y como se describe en el documento de patente de EE.UU. nº 4.873.316. Este se refiere a un sistema de expresión que emplea el promotor de la caseína animal, el cual, cuando se incorpora transgénicamente en un mamífero, permite que la hembra produzca la proteína recombinante deseada en su leche.
Una vez expresado mediante el método deseado, el anticuerpo modificado genéticamente se examina a continuación en busca de actividad in vitro, empleando un ensayo adecuado. En la actualidad, se emplean formatos del ensayo ELISA convencional para determinar la unión cualitativa y cuantitativa del anticuerpo modificado genéticamente con IL-5. Adicionalmente, se pueden emplear otros ensayos in vitro también para verificar la eficacia neutralizante antes de estudios clínicos humanos posteriores, realizados para evaluar la persistencia del anticuerpo modificado genéticamente en el cuerpo, a pesar de los mecanismos usuales de aclaramiento.
Después de los procesos descritos para los anticuerpos humanizados preparados a partir de 2B6, un experto en la técnica puede construir también anticuerpos humanizados, a partir de otros anticuerpos de IL-5 donantes, las secuencias de la región variable y los péptidos CDR descritos en esta memoria. Los anticuerpos modificados genéticamente se pueden producir con armazones de la región variable, reconocidos potencialmente como "propios" por los receptores del anticuerpo modificado genéticamente. Se pueden implementar modificaciones menores en los armazones de la región variable para incrementar la unión al antígeno sin que la inmunogenicidad hacia el receptor se incremente de forma apreciable. Con tales anticuerpos modificados genéticamente se pueden tratar de forma eficaz los estados mediados por IL-5 en un ser humano. Tales anticuerpos también pueden ser útiles para la diagnosis de tales estados.
VII. Usos Terapéuticos/Profilácticos
Esta invención también pone a disposición un método para tratar los síntomas relacionados con la eosinofilia que padecen los seres humanos, tales como asma que comprende la administración de una dosis eficaz de anticuerpos que incluyen uno o varios de los anticuerpos modificados genéticamente o los anticuerpos alterados descritos en esta memoria.
La respuesta terapéutica inducida por el uso de las moléculas de esta invención, se produce por la unión a la IL-5 humana y, por tanto, el posterior bloqueo de la estimulación de eosinófilos. Por tanto, las moléculas de la presente invención, una vez que se encuentran en las preparaciones y en las formulaciones adecuadas para uso terapéutico, son altamente deseables para las personas que padecen una respuesta alérgica y/o atópica o una respuesta asociada con la eosinofilia, tales como, sin estar limitadas a las mismas, rinitis alérgica, asma, neumonía eosinófila crónica, aspergilosis broncopulmonar alérgica, enfermedad celiaca, gastroenteritis eosinófila, síndrome de Churg-Strauss (periarteritis nodosa más atopía), síndrome de mialgia eosinófila, síndrome hipereosinofílico, reacciones edematosas que incluyen angioedema episódico, infecciones con helmintos en donde los eosinófilos pueden tener un papel protector, dermatitis por oncocercosis y dermatitis atópica.
Los anticuerpos alterados, los anticuerpos y los fragmentos de los mismos de esta invención también se pueden emplear junto con otros anticuerpos, particularmente mAbs humanos que reaccionan con otros marcadores (epítopos) responsables del estado contra el que se dirige el anticuerpo modificado genéticamente de la invención.
Los agentes terapéuticos de esta invención se cree que son deseables para el tratamiento de estados alérgicos desde aproximadamente 2 días hasta aproximadamente 3 semanas, o lo que sea necesario. Por ejemplo, los tratamientos más largos pueden ser deseables cuando se trata una rinitis estacional o similares. Esto representa un avance considerable sobre el protocolo normal empleado con infusiones en los tratamientos de la técnica anterior de las enfermedades mediadas por IL-5. La dosis y la duración del tratamiento se refiere a la duración relativa de las moléculas de la presente invención en la circulación humana y un experto en la técnica puede ajustarla, dependiendo del estado que se va a tratar y de la salud general del paciente.
El modo de administración del agente terapéutico de la invención puede ser cualquier vía adecuada que suministre el agente al hospedador. Los anticuerpos alterados, los anticuerpos, los anticuerpos modificados genéticamente y fragmentos de los mismos y las composiciones farmacéuticas de la invención, son particularmente útiles para la administración parenteral, es decir, por vía subcutánea, intramuscular, intravenosa o intranasal.
Los agentes terapéuticos de la invención se pueden preparar como composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad eficaz del anticuerpo modificado genéticamente (p. ej., humanizado) de la invención como ingrediente activo en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En el agente profiláctico de la invención, se prefiere una suspensión o una solución acuosa que contenga el anticuerpo modificado genéticamente, preferentemente tamponada con un pH fisiológico, en una forma válida para inyección. Las composiciones para la administración por vía parenteral comprenden generalmente una solución del anticuerpo modificado genéticamente de la invención o una mezcla del mismo disuelta en un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferentemente un vehículo acuoso. Se puede emplear una variedad de vehículos acuosos, p. ej., solución salina al 0,4%, glicina al 0,3%, y similares. Estas soluciones son estériles y están generalmente exentas de materia en partículas. Estas soluciones se pueden esterilizar mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas (p. ej., filtración). Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, tal y como se requieren para adaptarse a las condiciones fisiológicas, tales como ajustar el pH y los agentes tamponadores, etc. La concentración del anticuerpo de la invención en dicha formulación farmacéutica puede variar ampliamente, es decir, desde menos de aproximadamente 0,5%, generalmente aproximadamente o al menos 1% hasta como máximo 15 o 20% en peso y se seleccionará principalmente basándose en los volúmenes de fluido, las viscosidades, etc., según el modo de administración seleccionado en particular.
Por consiguiente, una composición farmacéutica de la invención para inyección intramuscular, se podría preparar para que contenga 1 mL de agua estéril tamponada y entre aproximadamente 1 ng hasta aproximadamente 100 mg, p. ej., aproximadamente 50 ng hasta aproximadamente 30 mg o más preferentemente, aproximadamente 5 mg hasta aproximadamente 25 mg de un anticuerpo modificado genéticamente de la invención. De forma similar, una composición farmacéutica de la invención para infusión intravenosa se podría caracterizar para contener aproximadamente 250 ml de solución estéril de Ringer y aproximadamente 1 hasta aproximadamente 30 y preferentemente 5 mg hasta aproximadamente 25 mg de un anticuerpo modificado genéticamente de la invención. Los métodos reales para preparar composiciones administrables parenteralmente, son bien conocidos o serán evidentes para los expertos en la técnica y se describen con más detalle en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science, 15ª ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.
Se prefiere que el agente terapéutico de la invención, una vez que está en la preparación farmacéutica, esté presente en forma de dosis unitaria. La dosis adecuada, terapéuticamente eficaz la pueden determinar fácilmente los expertos en la técnica. Para tratar eficazmente una enfermedad inflamatoria en un ser humano o en otro animal, una dosis de aproximadamente 0,1 mg hasta aproximadamente 20 mg de una proteína o un anticuerpo de esta invención por 70 kg de peso corporal, se debe administrar parenteralmente, preferentemente por vía i.v. o i.m. (intramuscularmente). Tales dosis se pueden repetir, si es necesario, a intervalos adecuados, seleccionados de forma adecuada por un médico durante la respuesta inflamatoria.
Los anticuerpos, los anticuerpos alterados o los fragmentos de los mismos descritos en esta memoria, se pueden liofilizar para almacenar y reconstituir en un vehículo adecuado antes del uso. Esta técnica ha mostrado ser eficaz con inmunoglobulinas convencionales y se pueden emplear los métodos de liofilización y de reconstitución conocidos en la técnica.
Los siguientes ejemplos ilustran diversos aspectos de esta invención que incluyen la construcción de anticuerpos modificados genéticamente a modo de ejemplo y su expresión en vectores adecuados y en células hospedadoras y no se deben interpretar como un límite del alcance de esta invención. Todos los aminoácidos se identifican por los códigos convencionales de tres letras o de letras aisladas. Todas las enzimas de restricción, los plásmidos y otros reactivos y materiales necesarios, se obtuvieron a partir de fuentes comerciales, a no ser que se indique de otro modo. Toda la metodología general de clonación y ligación y otra metodología de ADN recombinante, se realizó según se indica en T. Maniatis y col., citado anteriormente, o su segunda edición (1989), compiladores Sambrook y col., por el mismo editor ("Sambrook y col.").
Ejemplo 1 Producción de mAbs para hIL-5
La IL-5 humana se expresaba en células de Drosophila Schneider 2 (S_{2}) y se purificó hasta homogeneidad. La IL-5 de múridos se expresaba en Baculovirus empleando células de Spodoptera frugiperda 21 (Sf21) y se purificó hasta homogeneidad. El anticuerpo monoclonal TRFK-5 (un anticuerpo de IL-5 neutralizante de rata anti-ratón) se obtuvo a partir de Genzyme Corp. (Cambridge, MA).
A. Procedimiento de Inmunización
La IL-5 humana recombinante (IL-5) se empleó como inmunógeno para un panel de siete ratones hembra CAF_{1} (Charles River, Wilmington, MA). Los animales recibieron tres inyecciones subcutáneas de IL-5 en solución salina tamponada con fosfato (PBS), emulsionada con una proporción uno a uno de TiterMAX^{TM} (CytoRx Corp., Norcross, GA) durante un periodo de cuatro meses. La dosis de antígeno para el cebado eran 50 \mug (microgramos) y los refuerzos eran de 25 y 10 \mug (microgramos). Después de los refuerzos, se recogieron muestras de suero y se sometió a ensayo la unión de IL-5 y la actividad neutralizante mediante el ensayo de inhibición de la unión al receptor y el ensayo de proliferación de B 13 (o el ensayo de neutralización de IL-5 (Ejemplo 2C)). Todos los ratones producían muestras de suero que se unían a IL-5. Los animales seleccionados como donantes de bazo se reforzaron por vía intravenosa con 10 \mug (microgramos) de IL-5 humana recombinante, tres días antes de la eutanasia.
B. Desarrollo de Hibridomas
El procedimiento de fusión, descrito en primer lugar por Kohler y col., (Nature, 256:495 (1975)), se empleó con modificaciones para realizar la técnica que emplea una monocapa celular (Kennet y col., compiladores, "Hybridomas: A new dimension in biological analysis", págs. 368-377, Plenum Press, Nueva York). Las células de bazo procedentes de dos ratones donantes, se reunieron y se realizaron fusiones empleando una proporción de 50 millones de células de bazo por diez millones de células de mieloma SP2/0/Ag14. El material sobrenadante procedente de los pocillos positivos para la fusión, se sometió a ensayo para estudiar la unión a IL-5 mediante ELISA. Los pocillos que contenían células que producían anticuerpos para IL-5, se expandieron y el material sobrenadante se escrutó en un ensayo de inhibición de la unión al receptor de IL-5 y un ensayo de proliferación (neutralización) con B 13 (descrito a continuación).
Se aislaron 16 hibridomas que secretaban mAbs reactivos con IL-5. El material sobrenadante de los hibridomas se mezcló con IL-5 yodada, se añadió a un extracto de membrana, preparado a partir de células de Drosophila que expresaban la cadena \alpha del receptor de IL-5 (IL-5R) y se sometió a ensayo la inhibición de la unión al receptor. Once casos de material sobrenadante de los hibridomas, inhibían en más de un 60% la unión de IL-5 yodada con la cadena \alpha del receptor de IL-5. Tres de los mAbs, 2B6, 2E3 y 2F2, también inhibían en más de un 70% la proliferación de las células B 13 de múrido, como respuesta a la IL-5 humana pero no a la de múrido. Cinco de los hibridomas, cuatro de los cuales bloqueaban la unión y/o la proliferación bloqueadas (1C6, 2B6, 2E3 y 2F2) y 1 de los cuales no era neutralizante (24G9), se subclonaron repetidamente en agar blando para generar líneas celulares clonadas y estables. El material sobrenadante de las líneas clonadas se escrutó en busca de reactividad cruzada mediante ELISA y no se unía a IL-1\alpha, IL-1\beta, IL-4, IL-8, M-CSF o TGF\alpha humanos. Los mAbs se purificaron y se estimaron las afinidades de unión mediante un análisis con un biosensor óptico (BIAcore) dentro del intervalo de 10 a 100 pM. El material sobrenadante procedente de las líneas se isotipificó empleando reactivos para isotipificación de múridos (PharMingen, San Diego, CA). Un resumen de las afinidades y de las CI_{50} de la actividad neutralizante de los mAbs, se presenta en la Tabla I (Ejemplo 2).
Con métodos similares, se obtuvieron hibridomas de rata a partir de ratas inmunizadas, empleando un protocolo de inmunización comparable y mielomas de rata, para la fusión tal y como se ha descrito para los ratones. Dos hibridomas de rata, 4A6 y 5D3, fueron identificados como productores de mAbs que se unían a IL-5. De forma similar a los mAbs 2B6, 2E3 y 2F2, se encontró que los mAbs 4A6 y 5D3 eran neutralizantes en el ensayo de B 13 descrito a continuación.
C. Depósito de Hibridomas
La línea de células de hibridoma SKI 19-2B6.206.75(1) que produce el anticuerpo monoclonal 2B6 fue depositada en la "American Type Culture Collection" (ATCC), Rockville, MD, EE.UU., con el número de orden HB 11783, y ha sido aceptada como un depósito de patente, de acuerdo con el Tratado de Budapest de 1977 que regula el depósito de microorganismos a efectos de procedimientos de patentes.
La línea celular del hibridoma SK119-2E3.39.40.2 que produce el anticuerpo monoclonal 2E3, fue depositada en la "American Type Culture Collection" (ATCC), Rockville, MD, EE.UU., con el número de orden HB 11782, y ha sido aceptada como un depósito de patente de acuerdo con el Tratado de Budapest de 1977 que regula el depósito de microorganismos a efectos de procedimientos de patentes.
La línea celular del hibridoma SK119-2F2.37.80.12 que produce el anticuerpo monoclonal 2F2, fue depositada en la "American Type Culture Collection" (ATCC), Rockville, MD, EE.UU., con el número de orden HB 11781, y ha sido aceptada como un depósito de patente de acuerdo con el Tratado de Budapest de 1977 que regula el depósito de microorganismos a efectos de procedimientos de patentes.
La línea de células de hibridoma SKI 19-24G9.8.20.5 que produce el anticuerpo monoclonal 24G9 fue depositada en la "American Type Culture Collection" (ATCC), Rockville, MD, EE.UU., con el número de orden HB 11780, y ha sido aceptada como un depósito de patente, de acuerdo con el Tratado de Budapest de 1977 que regula el depósito de microorganismos a efectos de procedimientos de patentes.
La línea celular del hibridoma 4A6(1)G1F7 que produce el anticuerpo monoclonal 4A6, fue depositada en la "American Type Culture Collection" (ATCC), Rockville, MD, EE.UU., con el número de orden HB 11943, y ha sido aceptada como un depósito de patente de acuerdo con el Tratado de Budapest de 1977 que regula el depósito de microorganismos a efectos de procedimientos de patentes.
La línea celular del hibridoma 5D3(1)F5D6 que produce el anticuerpo monoclonal 5D3, fue depositada en la "American Type Culture Collection" (ATCC), Rockville, MD, EE.UU., con el número de orden HB 11942, y ha sido aceptada como un depósito de patente de acuerdo con el Tratado de Budapest de 1977 que regula el depósito de microorganismos a efectos de procedimientos de patentes.
Ejemplo 2 Ensayos A. ELISA
Pocillos individuales de inmunoplacas MaxiSorb^{TM} (Nunc, Naperville, IL) se revistieron con 0,2 \mug de IL-5 en tampón carbonato 0,05 M pH 9,6. Después de incubar durante una noche a 4°C, las placas se lavaron con PBS que contenía 0,025% de Tween® 20 y se bloquearon con 1% de BSA en PBS con 0,025% de Tween® 20 durante dos horas a temperatura ambiente. Se añadió material sobrenadante híbrido no diluido a los pocillos revestidos con IL-5 y se incubaron a temperatura ambiente durante dos horas. Después de lavar las placas, se añadió IgG & IgM (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) de cabra anti-ratón, marcada con peroxidasa, en dilución de 1/7500 en PBS que contenía 1% de BSA y 0,025% de Tween® 20. Dos horas después, se lavaron las placas y se añadieron 0,2 ml de tampón citrato 0,1 M, pH 4,75 que contenía 0,1% de peróxido de urea y 1 mg/ml de ortofenilendiamina. Después de 15 min, las placas se leyeron con un lector VMax^{TM} Microplate Reader (Molecular Devices, Menlo Park, CA) a 450 nm.
B. Ensayo de Inhibición de la Unión al Receptor
Los extractos de membranas de las células de Drosophila S2 que expresaban la cadena \alpha del receptor humano de IL-5 (IL-5R) se emplearon para medir el efecto del anticuerpo sobre la unión de IL-5 al receptor. Para preparar las membranas, se sedimentaron 10^{9} células a 1000 x g a 4°C durante 10 min. El sedimento celular se congeló en un baño de hielo seco/etanol durante 15 min. El sedimento se descongeló, se resuspendió en 10 ml de PBS a 4ºC y se sedimentó a 1000 x g durante 10 min. El sedimento celular se lavó 2 X en PBS y se resuspendió en 13,5 ml de tapón hipotónico (Tris 10 mM pH 7,5, MgCl_{2} 3 mM, ditiotreitol 1 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM, leupeptina 1 \muM, pepstatina A 1 \muM) y se incubó sobre hielo durante 5 min. La suspensión celular se homogeneizó en un homogeneizador Dounce y se llevó hasta una concentración final de sacarosa 0,25 M con una solución de sacarosa 2,5 M. Los residuos celulares se retiraron mediante centrifugación durante 15 min a 1000 x g. Las membranas celulares se sedimentaron a 100.000 x g a 4°C durante 90 min y se resuspendieron en 50 ml de Tris 10 mM pH 7,5, MgCl_{2} 3 mM, sacarosa 250 mM y se almacenaron a -70°C.
Los ensayos con membranas de Drosophila que contenían el receptor se realizaron en placas MultiscreenGV^{TM} (Millipore Corp., Bedford, MA) usando medio de cultivo de tejido M3 de Drosophila (Lindquist y col., Drosophila Inf. Serv., 58: 163 (1982)) que contenía tampón HEPES 25 mM pH 7,2 y BSA al 0,1% (tampón de unión). Los pocillos se bloquearon previamente con 0,1 ml de tampón de unión. Se añadió a los pocillos 50 \mul de la muestra del ensayo, por triplicado, seguido de 25 \mul de IL-5 yodada (^{125}I). Después de incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente, se añadió a los pocillos 25 \mul del extracto de la membrana de las células de Drosophila S2 que expresaban la cadena \alpha del IL-5R humano. Después de continuar incubando durante 1 hora, se recogieron las membranas mediante filtración a vacío y se lavaron 3X con tampón de unión. Los filtros se secaron y se realizó el recuento.
C. Ensayo de Neutralización de IL-5
La línea celular de múrido dependiente de IL-5/IL-3, LyH7.B 13 (B 13) se obtuvo por cortesía de R. Palacios, Basel Institute of Immunology, Suiza. La células se subcultivaron dos veces a la semana en medio RPMI 1640 (GibcoBRL, Renfrewshire, GB), suplementado con L-Glutamina, aminoácidos no esenciales, piruvato sódico, penicilina-estreptomicina (todos de GibcoBRL), más 2-mercaptoetanol (5 x 10^{-5} M, Sigma), 10% de suero de ternera fetal (Globepharm, Surrey, GB) y 1-10 unidades de IL-5 de múrido. Para los ensayos, las células se cultivaron durante 48 horas por triplicado (5000 células/pocillo) en placas de 96 pocillos de fondo redondo, en presencia de muestras del ensayo diluidas adecuadamente y sometidas a impulsos con 0,5 \muCi de ^{3}H-timidina (Amersham, Bucks, GB) durante las últimas 4 horas. Se procesaron para el recuento de centelleo en una placa 1205 Betaplaca (LKB Wallac, Beds, GB).
D. Biosensor Óptico
Las propiedades cinéticas y de equilibrio de la unión con hIL-5 inmovilizada y los anticuerpos, se midieron empleando un biosensor óptico BIAcore (Pharmacia Biosensor, Uppsala, Suecia). Los datos de la cinética se evaluaron empleando proporciones descritas previamente (Karlsson y col., J. Immunol. Meth., 145:229-240 (1991)) y que se incorporan como referencia en esta memoria en su totalidad.
Tres de los mAbs neutralizantes, a saber 2B6, 2E3 y 2F2, tenían potencias de inhibición de la unión de ^{125}1-IL-5 muy similares al receptor de la membrana y la neutralización de la proliferación de los linfocitos B y también afinidades hacia IL-5 muy similares (véase Tabla I). Se determinaron las secuencias de nucleótidos de V_{H} y V_{L} procedentes de estos tres mAbs, 2 IgG1 y 1 IgG2a, respectivamente. Las secuencias obtenidas eran muy similares, difiriendo sólo en pocos residuos.
TABLA I Afinidad y actividad neutralizante de los mAbs reactivos con la IL-5 humana
mAb Kd (pM)^{a} CI_{50} (nM) de la unión^{b} Neutralización CI_{50} Inhibición al
de la Proliferación^{c} 100%^{c}
2B6 22 1 70 200
2E3 20 1 90 600
2F2 13 1 150 340
1C6 86 43 12.200 ND
24G9 ND > 133 >100.000 ND
4A6 18 >88 28 100
5D3 ND ND 100 10.000
^{a} Determinada por el análisis con el biosensor óptico (BIAcore) (25°C)
^{b} Inhibición de la unión de ^{125}I-IL-5 con IL-5R (cadena \alpha) en membranas de Drosophila
^{c} Inhibición de la proliferación (en pM) de las células B13 como respuesta a IL-5 humana 8 pM
\hskip0.1cm ND = Sin datos.
Ejemplo 3 Aislamiento y Caracterización de Fabs de IL-5 procedentes de Genotecas Combinatorias A. PCR y Construcción de una Genoteca Combinatoria
El ARN purificado procedente de los bazos de tres ratones, se transcribió de forma inversa con un equipo de reactivos de ADNc (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) usando el cebador (dT)_{15} provisto con el equipo de reactivos, o los cebadores de 3' Fd (IgG1, IgG2a & IgG3) y de la cadena ligera kappa, tal y como describen Huse y col. (Science, 246:1275 (1989)) y Kang, S.A. (Methods: Companion Methods Enzymol., 2:111 (1991)) que se incorporan en esta memoria como referencia en su totalidad. Los ADNc de las inmunoglobulinas se amplificaron con PCR empleando los cebadores y las condiciones de ciclación térmica descritas (Huse y col. supra). La técnica "Hot Start" que emplea perlas de AmpliWax^{TM} PCR Gem 100 (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) y el protocolo del fabricante, se emplearon para todas las reacciones. Los productos de la PCR se purificaron en gel, se digirieron y se ligaron en el vector pMKFabGene3 (Ames y col., J. Immunol., 152:4572 (1994)). El título de la genoteca después de la ligación de los ADNc de Fd, era 5,1 X 10^{7} CFU y después de la ligación de los ADNc de kappa, era 1,5 X 10^{6} CFU. Las células XL1-Blue (Stratagene, La Jolla, CA) transformadas con la genoteca de fagémidos, se infectaron con el fago coadyuvante VCSM13 (Stratagene) y los fagos se prepararon tal y como describen Barbas y Lerner (Methods: Companion Methods Enzymol., 2:119(1991)).
B. Bioseparación mediante adsorción
Cuatro pocillos de microtitulación (Immulon II Removawell Strips, Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, VA) se revistieron durante una noche a 4ºC con IL-5 (1 \mug/pocillo) en bicarbonato 0,1 M, pH 8,6. Los pocillos se lavaron con agua y se bloquearon con PBS que contenía BSA al 3% a 37°C durante 1 hora. La solución bloqueante se retiró y se añadió la genoteca a los pocillos de microtitulación (50 \mul/pocillo) y se incubaron a 37ºC durante 2 horas. Los pocillos se lavaron 10 veces con TBS/Tween® (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, 0,5% de Tween® 20) y una vez con H_{2}O, antes de la elución del fago adherido con HCl 0,1 M, ajustado a un pH 2,2 con glicina, que contenía 1 mg/ml de BSA.
C. Alzado de Colonias
El alzado de colonias procedentes de clones aislados, a partir de la tercera y la cuarta ronda de bioseparación, se procesó tal y como se ha descrito (Barbas y Lerner, supra). Los filtros se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con 0,5-1,0 \muCi de ^{125}I-IL-5, que se había yodado empleando el reactivo Bolton-Hunter (NEN, Billerica, MA), siguiendo el procedimiento recomendado por el fabricante, en PBS que contenía 1% de BSA, se lavaron con PBS y 0,25% de Tween y se expusieron a una película XAR de Kodak. Las colonias que expresaban Fabs reactivos con IL-5 fueron detectadas por autorradiografía.
D. Preparación de Fabs Solubles
Los ADNs de fagémidos se digirieron con NheI y SpeI para eliminar el gen III y se autoligaron. Las células XL1-Blue se transformaron y los clones aislados se dejaron crecer durante una noche a 37°C en 5,0 ml de medio de cultivo super (SB) (30 g de triptona, 20 g de extracto de levadura, 10 g de ácido 3-[N-morfolino]propanosulfónico, MOPS con el pH ajustado a 7) que contenía 1% de glucosa y 50 \mug/ml de carbenicilina. Las células procedentes de 1 ml de este cultivo se sedimentaron a 3500 rpm durante 10 min en una centrífuga GS-6R de Beckman y se emplearon para inocular 5 ml de SB que contenían 50 \mug/ml de carbenicilina. Los cultivos se agitaron durante 1 hora a 37ºC, se añadió isopropil-b-D-tiogalactopiranósido (IPTG; 1 mM) y los cultivos se transfirieron a 28°C durante una noche. El Fab soluble se preparó a partir de extractos periplásmicos, lisando el sedimento celular durante 20 min a 4ºC en sacarosa al 20%, suspendida en Tris 30 mM pH 8,0, seguido de centrifugación en una Microfuga durante 10 min. Las concentraciones de Fab se estimaron por transferencia de tipo western, comparando las muestras que contenían cantidades conocidas de Fab de múrido. Los diferentes extractos periplásmicos bacterianos contenían concentraciones similares de Fab, en el intervalo de 1 a 20 \mug/ml, tal y como se estimó por análisis de transferencia tipo western.
E. Purificación de los Fabs
Un péptido quelante se modificó genéticamente en el extremo carboxi terminal de la cadena pesada, para colaborar en la purificación de la proteína. Después de retirar la región codificadora del gen III de M13, mediante digestión con NheI y SpeI, una pareja de oligonucleótidos solapantes:
[SEQ ID NO: 43] 5'-CTAGCCACCACCACCACCACCACTAA-3';
[SEQ ID NO: 44] 3'-GGTGGTGGTGGTGGTGGTGATTGATC-5'
que codificaban seis residuos de histidina, se subclonaron en el vector de expresión de Fab. La inducción de la expresión de Fab se realizó tal y como se ha descrito anteriormente. Después de inducir durante una noche a 28ºC, se preparó el lisado periplásmico del sedimento celular mediante incubación durante 30 min a 4°C en sacarosa al 20%, Tris 30 mM pH 8,0. Se añadió urea y detergente Brij-35 al material sobrenadante purificado, hasta obtener concentraciones finales de 2 M y 1%, respectivamente. Después de agitar a temperatura ambiente durante 1 hora, el material sobrenadante tratado y purificado se cargó a 0,5 ml/min directamente sobre una columna de 5 ml de metal quelante Nickel-NTA (1,5 x 3 cm) equilibrada con tampón A (Na-fosfato 100 mM, Tris 10 mM, NaCl 0,3 M, urea 2 M, pH 8,0). Después de lavar con 4 volúmenes de columna (20 ml), se eluyeron los materiales unidos con un gradiente de pH inverso desde pH 8 hasta pH 4, con un volumen de 6 columnas (30 ml), en el mismo tampón que arriba. Los Fabs purificados eluían de la columna con un pico agudo simétrico, a un pH de 5,5. Tenían una pureza >90% y estaban exentos de ADN.
F. ELISA de FAB
Las placas Immulon II (Dynatech) se revistieron durante una noche a 4°C con proteína suspendida (1 mg/ml; 50 ml por pocillo) en tampón bicarbonato 0,1 M, pH 8,6. Las diluciones y los lavados se realizaron en PBS que contenía Tween^{TM} 20 al 0,05%. Las placas se lavaron y se bloquearon durante 1 hora con PBS que contenía 1% de BSA a temperatura ambiente. Se añadió a las placas diversas diluciones de material sobrenadante bacteriano que contenía Fabs solubles o Fabs purificados. Después de incubar durante una hora las placas, se lavaron y se añadió kappa de cabra anti-ratón biotinilada (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL) (dilución 1:2000; 50 \mul/pocillo) durante 1 hora. Las placas se lavaron y se añadió peroxidasa de rábano picante marcada con estreptavidina (dilución 1:2000; 50 \mul/pocillo) durante 1 hora. Las placas se lavaron, se añadió sustrato de peroxidasa ABTS (100 \mul/pocillo; Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) y se leyó la densidad óptica a 405 nm en un lector de microplacas UVmax^{TM} (Molecular Devices).
G. Aislamiento y Caracterización de los Fabs procedentes de la Genoteca Combinatoria
Los fagos portadores de Fabs para IL-5, fueron seleccionados de la genoteca mediante múltiples rondas de bioseparación frente a pocillos de microtitulación revestidos con IL-5. Después de 4 rondas de selección, se identificaron los Fabs reactivos con IL-5, mediante un ensayo de alzado de colonias empleando ^{125}I-IL-5. Se identificaron treinta y cuatro colonias en la tercera ronda y 4 colonias en la cuarta ronda, que se unían a la IL-5 marcada. La unión a IL-5 se confirmó por ELISA de unión directa, empleando el material sobrenadante de cultivos que expresaba la proteína de fusión Fab-gen III. El ADN se aisló de estas colonias y, después de eliminar la región codificadora del gen III de M13, se indujo la expresión de Fab soluble. Las fracciones periplásmicas se prepararon y se sometieron a ensayo mediante ELISA para estudiar la unión a IL-5. Los Fabs se unían específicamente a IL-5, sin una unión demostrable a otra proteína, rC5a.
Los extractos periplásmicos no diluidos (que contenían de 1 a 20 \mug/ml de Fab) se sometieron al ensayo de inhibición de la unión a IL-5R (Ejemplo 2). Ninguno de los Fabs inhibían la unión de IL-5 yodada al IL-5R\alpha en más del 35%.
H. Conversión de mAb Neutralizante en un Fab
El Fd y los ADNc de \kappa de mAb (2B6) se aislaron con PCR empleando las condiciones descritas anteriormente. Los fragmentos purificados en gel se subclonaron en el vector pMKFabGene3 que se había modificado para incluir la secuencia 3' hexa-His del ADNc del gen III, dando como resultado el plásmido pMKFabGene3H. Un clon funcional de Fab que se unía a IL-5 que contenía las cadenas pesada y ligera de 2B6, se identificó mediante un ensayo de alzado de colonias. Después de eliminar el gen III mediante la digestión con Nhe I/SpeI I y autoligación, la cadena pesada se fusionó en marco con hexa-His, permitiendo la purificación tal y como se ha descrito anteriormente. En una forma dependiente de la dosis, este Fab inhibía la unión del receptor con una CI50 de aproximadamente 7,5 \mug/ml, similar a la de mAb parental, 2B6 de múrido.
I. Construcción y Escrutinio de la Genoteca de Cadenas Mezcladas
El ADNc que codifica el Fd del mAb neutralizante 2B6 se subclonó como un fragmento XhoI/SpeI en pMKFabGene3H que contenía un fragmento SstI/XbaI, en lugar de un ADNc de la cadena ligera. Este fagémido se digirió con SstI y XbaI y se ligó con el producto de la PCR de la cadena ligera digerido con SstI/XbaI, obtenido a partir de ratones inmunizados con IL-5 (descrito anteriormente). El título de la genoteca era 4 X 10^{5} CFU. La bioseparación y el ensayo de alzado de colonias se realizaron tal y como se ha descrito anteriormente para la genoteca combinatoria.
La genoteca se construyó emparejando el ADNc que codifica el Fd del mAb neutralizante 2B6 con el mismo repertorio de la cadena ligera, recuperado a partir de ratones inmunizados con IL-5, usados para generar la genoteca combinatoria. Esta genoteca con cadenas mezcladas se sometió a 4 rondas de bioseparación frente a IL-5 inmovilizada y las colonias resultantes se sometieron a ensayo en busca de reactividad de IL-5, empleando el ensayo de alzado de colonias. Las colonias positivas que se unen a IL-5 yodada, se sometieron posteriormente a ensayo mediante ELISA y el ensayo de unión a IL-5R\alpha. Dos de los Fabs, 2 & 15, recuperados a partir de la genoteca con cadenas mezcladas, bloqueaban la unión de IL-5 con el IL-5R\alpha e inhibían la proliferación dependiente de IL-5 en el ensayo B 13. Las secuencias de estos 2 Vks eran similares a la secuencia de 2B6 Vk, la pareja original de la cadena ligera para 2B6 V_{H}. Las secuencias de la cadena ligera para Fab 2 & 15 son SEQ ID NOs: 45 y 46, respectivamente. Para Fab 2, CDRs 1-3 son SEQ ID NOs: 10, 11 y 47, respectivamente. Para Fab 15, CDRs 1-3 son SEQ ID NOs: 10, 11 y 48, respectivamente.
En todas las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos enumerados a continuación en los Ejemplos 4 y 5, se emplea el sistema de numeración KABAT que permite la variabilidad en las longitudes de la CDR y del armazón. Es decir, los aminoácidos clave se asignan siempre al mismo número, independientemente del número real de aminoácidos que los preceden. Por ejemplo, la cisteína que precede a CDR1 de todas las cadenas ligeras, es siempre la posición 23 de KABAT y el residuo triptófano que sigue a CDR1 es siempre la posición 35 de KABAT, incluso cuando CDR1 contiene hasta 17 aminoácidos.
Ejemplo 4 Anticuerpo Humanizado
Un anticuerpo humanizado se diseñó para contener CDRs de múrido dentro de un armazón del anticuerpo humano. Esta versión humanizada del anticuerpo 2B6 de ratón específico de IL-5, se preparó realizando las siguientes manipulaciones.
A. Clonación del Gen
El ARNm se aisló de cada una de las respectivas líneas celulares de hibridoma 2B6, 2F2 y 2E3 (véase el Ejemplo 1) con un equipo de reactivos obtenido de Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN) y se transcribió de forma inversa, empleando el cebador (dT)_{15} proporcionado con un equipo de reactivos de ADNc (Boehringer Mannheim) para preparar ADNc. Los cebadores de la PCR específicos para la inmunoglobulina de ratón, se emplearon para amplificar el ADN que codificaba los dominios que se extienden desde el aminoácido nº 9 (sistema de numeración KABAT) de la región variable de la cadena pesada hasta la región bisagra y desde el aminoácido nº 9 (sistema de numeración KABAT) de la región variable de la cadena ligera hasta el extremo de la región constante. Se obtuvieron diversos clones de cada cadena del anticuerpo mediante reacciones PCR independientes.
El cebador de la región bisagra 1 gamma de ratón empleado es [SEQ ID NO: 22]:
5' GTACATATGCAAGGCTTACAACCACAATC 3'.
El cebador de la región bisagra 2a gamma de ratón empleado es [SEQ ID NO: 23]:
5' GGACAGGGCTTACTAGTGGGCCCTCTGGGCTC 3'
El cebador de la región variable de la cadena pesada de ratón es [SEQ ID NO: 24]:
5' AGGT(C o G)(C o A)A(G o A)CT(G o T)TCTCGAGTC(T o A)GG 3'
El cebador de la región constante de la cadena kappa de ratón empleado es [SEQ ID NO: 25]:
5' CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAATGGG 3'
El cebador de la región variable de la cadena ligera de ratón es [SEQ ID NO: 26]:
5' CCAGATGTGAGCTCGTGATGACCCAGACTCCA 3'
Los fragmentos de la PCR se clonaron en plásmidos pGEM7f+ (Promega) que se transformaron a continuación en E. coli DH5a (Bethesda Research Labs).
B. Secuenciación del ADN
Los clones del ADNc de múrido de la cadena pesada y ligera procedentes del apartado A anterior, se secuenciaron. Los resultados de la secuenciación de las regiones variables de estos clones se muestran en SEQ ID NOs:1-6 (Fig. 1-6). Cada clon contenía aminoácidos conocidos por estar conservados entre las regiones variables de la cadena pesada de ratón o las regiones variables de la cadena ligera. Las secuencias de aminoácidos de las CDRs se enumeran a continuación.
Las regiones CDRs para la cadena pesada 2B6 son las SEQ ID NOs: 7, 8 y 9. Véase la Fig. 7. Estas secuencias están codificadas por la SEQ ID NO: 1. Las regiones CDRs para la cadena ligera son las SEQ ID NOs: 10, 11 y 12. Véase la Fig. 7. Estas secuencias están codificadas por la SEQ ID NO:2
Las regiones CDRs para la cadena pesada 2F2 son las SEQ ID NOs: 7, 8 y 9. Véase la Fig. 7. Estas secuencias están codificadas por la SEQ ID NO:3 Las regiones CDRs para la cadena ligera son las SEQ ID NOs: 10, 11 y 13. Véase la Fig. 7. Estas secuencias están codificadas por la SEQ ID NO:4
Las regiones CDRs para la cadena pesada 2E3 son las SEQ ID NOs: 7, 8 y 14. Véase la Fig. 7. Estas secuencias están codificadas por la SEQ ID NO:5 Las regiones CDRs para la cadena ligera son las SEQ ID NOs: 10, 11 y 13. Véase la Fig. 7. Estas secuencias están codificadas por la SEQ ID NO:6
C. Selección de los Armazones Humanos
Después de la clonación de 2B6, las secuencias de aminoácidos de la región variable de las cadenas pesada y ligera (Figs. 1 y 2) (SEQ ID NOs: 15 y 16, respectivamente) se compararon con las secuencias de inmunoglobulinas de múridos, conocidas en las bases de datos de secuencias proteicas KABAT y SWISS-PROT (Nuc. Acids Res., 20:2019-2022 (1992)) para asignar aminoácidos a los residuos N-terminales. Las secuencias de aminoácidos deducidas de la región variable de las cadenas pesada y ligera de 2B6 se compararon a continuación con las bases de datos de las secuencias proteicas de inmunoglobulinas humanas, para identificar un armazón humano para las cadenas pesada y ligera que se emparejara lo más estrechamente posible con la secuencia de múridos. Además, las cadenas pesada y ligera se evaluaron con una base de datos posicional, generada a partir de modelos estructurales del dominio Fab para determinar conflictos potenciales debidos a aminoácidos que pudieran influir sobre la presentación de CDRs. Los conflictos se resolvieron durante la síntesis de los armazones de la región variable humanizada por sustitución del aminoácido correspondiente en esa posición.
Se emplearon las regiones armazón de la cadena pesada de un anticuerpo obtenido a partir de una inmunoglobulina de mieloma humano (COR) (E. M. Press y N. M. Hogg, Biochem. J., 117:641-660 (1970)). La secuencia de aminoácidos del armazón de la cadena pesada humana se encontró que era homóloga en aproximadamente 66% al armazón de 2B6.
Para un armazón adecuado de la región variable de la cadena ligera, se empleó la secuencia del armazón de la región variable de la cadena ligera de la proteína Bence-Jones protein (LEN) (Schneider y col., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 356:507-557 (1975)). Las regiones armazón de la cadena ligera humana eran homólogas en aproximadamente 82% a las regiones armazón de la cadena ligera de 2B6 de múrido, a nivel de aminoácidos.
Los armazones humanos seleccionados se tradujeron de forma inversa para proporcionar una secuencia de ADN.
D. Construcción de Genes de mAb Humanizados
Con las CDRs de la cadena pesada de 2B6 [Fig. 7 y SEQ ID NOs: 1-2] y las secuencias del armazón de los anticuerpos humanos, se construyó una región variable sintética de la cadena pesada [SEQ ID NO: 18]. Esta se preparó empleando cuatro oligonucleótidos sintéticos [SEQ ID NOs: 27 y 28] [ SEQ ID NOs: 29 y 30] que cuando estaban unidos, codificaban los aminoácidos nº 21-nº 106 (numeración KABAT). Los oligonucleótidos se ligaron a continuación en los sitios de restricción HpaI-KpnI de un plásmido basado en pUC18 que contenía las secuencias obtenidas a partir de otra cadena pesada humanizada, basada en el armazón de COR (supra). Este plásmido proporciona una secuencia señal [SEQ ID NO: 17] y el resto de la secuencia de la región variable. Cualquier error en la secuencia cartografiada fue corregido con PCR con cebadores mutagénicos o añadiendo enlazadores sintéticos en los sitos de restricción existentes.
La secuencia señal y la región variable de la cadena pesada humanizada se escindieron del plásmido basado en pUC, en forma de un fragmento EcoRI-ApaI y se ligaron en el vector de expresión pCD que contenía la región constante humana de IgG_{1}. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la región variable sintética de la cadena pesada se proporcionan en la Fig. 8 [SEQ ID NOs: 18 y 19]. Los residuos del armazón humano son los aminoácidos 1-30, 36-49, 66-97 y 109-119 de SEQ ID NO: 19. Las secuencias de aminoácidos de las CDRs son idénticas a las CDRs de 2B6 de múrido. El vector de expresión resultante, pCDIL5HZHC1.0, se muestra en la Fig. 10.
Con las secuencias de las CDRs de la cadena ligera de 2B6 [Fig. 7 y SEQ ID NOs: 10, 11 y 12] y la secuencia del armazón del anticuerpo humano, se preparó una región variable sintética de la cadena ligera [SEQ ID NO: 20]. Cuatro oligonucleótidos sintéticos que codifican los aminoácidos nº 27-nº 58 (numeración KABAT) [SEQ ID NOs: 31 y 32] y los aminoácidos nº 80-nº 109 [SEQ ID NOs: 33 y 34] de V_{L} humanizada con los extremos SacI-KpnI y PstI-HindIII, respectivamente, fueron insertados en un plásmido basado en pUC18 que contenía las secuencias obtenidas a partir de otro armazón de la cadena ligera humana (B 17) (Marsh y col., Nuc. Acids Res., 13:6531-6544 (1985)) que comparte un alto grado de homología con el armazón LEN. Este plásmido proporciona la secuencia restante de la región variable. Cualquier error en la secuencia cartografiada y una simple diferencia en los aminoácidos entre los armazones LEN y B 17, fue corregido mediante PCR con cebadores mutagénicos o añadiendo enlazadores sintéticos en los sitios de restricción existentes.
La región variable de la cadena ligera humanizada se aisló a partir del plásmido pUC, en forma de un fragmento EcoRV-NarI y se ligó en el vector de expresión pCN que contenía una secuencia señal [SEQ ID NO: 17] junto con una región constante humana de kappa. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera sintética, se proporcionan en la Fig. 9 [SEQ ID NOs: 20 y 21]. Los residuos del armazón humano son los aminoácidos 1-23, 41-55, 63-94 y 104-113 de SEQ ID NO: 21. Las secuencias de aminoácidos de las CDRs son idénticas a las CDRs de 2B6 de múrido. Sin embargo, las secuencias codificadoras de estas CDRs difieren de las secuencias codificadoras de 2B6 de múrido para permitir la creación de sitios para enzimas de restricción. Una de los vectores de expresión resultantes, pCNIL5HZLC1.0, se muestra en la Fig. 11. Estas secuencias sintéticas de la cadena pesada y/o ligera variables se emplean en la construcción de un anticuerpo humanizado.
E. Expresión de mAb Humanizado
La cadena pesada humanizada, obtenida a partir de un isotipo IgG_{1}, emplea una región variable de la cadena sintética, tal y como se proporciona en SEQ ID NO: 19. Esta V_{H} sintética que contiene las CDRs de la cadena pesada de 2B6, se diseñó y se sintetizó tal y como se ha descrito anteriormente.
La cadena ligera humanizada, una cadena kappa humana, emplea una región variable de la cadena ligera sintética, tal y como se proporciona en SEQ ID NO: 21. Esta V_{L} sintética que contiene las CDRs de la cadena ligera 2B6 se diseñó y se sintetizó tal y como se ha descrito anteriormente. Los fragmentos de ADN que codifican las regiones variables humanizadas se insertaron en plásmidos de expresión de células de mamífero, basados en pUC19 que emplean una secuencia señal y que contienen promotores de CMV y las regiones constantes de la cadena pesada humana o de la cadena ligera humana de las quimeras producidas en el Ejemplo 5 siguiente, por métodos convencionales (Maniatis y col., citado anteriormente) para obtener los plásmidos pCDIL5HZHC1.0 (cadena pesada) [SEQ ID NO: 49, véase también la Fig. 10] y pCNIL5HZLC1.0 (cadena ligera) [SEQ ID NO: 50, véase también la Fig. 11]. Los plásmidos se cotransfectaron en células COS y el material sobrenadante se sometió a ensayo después de tres y cinco días, respectivamente, con el ELISA descrito en el Ejemplo 5, para estudiar la presencia de anticuerpo humano.
El ejemplo anterior describe la preparación de un anticuerpo modificado genéticamente a modo de ejemplo. Se pueden seguir procedimientos similares para el desarrollo de otros anticuerpos modificados genéticamente, empleando otros anticuerpos anti-IL-5 (p. ej., 2F2, 2E3, 4A6, 5D3, 24G9, etc.) desarrollados por medios convencionales.
F. Purificación
La purificación de 2B6 quimérica y humanizada que se expresaba en CHO, se puede conseguir mediante cromatografía de afinidad convencional de la proteína A (o G) seguida de intercambio iónico y cromatografía de tamiz molecular. Se han empleado con éxito procesos similares para la purificación, con una pureza >95% de otros mAbs (p. ej., del virus respiratorio sincitial, la interleucina-4 y los antígenos del circumsporozoíto de la malaria).
G. mAbs Humanizados Adicionales y Plásmidos de Expresión
Con el plásmido pCDIL5HZHC 1.0 [SEQ ID NO: 49] se preparó el plásmido de expresión pCDIL5HZHC 1.1, en el cual se sustituye una asparagina por treonina en la posición 73 del armazón. Esto se realizó ligando un enlazador sintético con los extremos EcoRV y XhoI [SEQ ID NO: 51, y SEQ ID NO: 52] en pCDIL5HZHC1.0 digerido de forma idéntica. De forma similar, en el plásmido de expresión pCDIL5HZHC1.2 se sustituye una isoleucina por valina en la posición 37 del armazón. Esto se realizó ligando un enlazador sintético con los extremos HpaI y XbaI [SEQ ID NO: 53, y SEQ ID NO: 54] en pCDIL5HZHC1.0 digerido de forma idéntica. El plásmido de expresión pCDIL5HZHC1.3 también se preparó ligando un enlazador sintético con los extremos HpaI y XbaI [SEQ ID NO: 53, y SEQ ID NO: 54] en pCDIL5HZHC1.1, digerido de forma idéntica.
Con el plásmido basado en pUC18 descrito previamente, que contiene secuencias de ADN de cuatro oligonucleótidos sintéticos [SEQ ID NOs: 31, 32, 33 y 34], se preparó una región variable de la cadena ligera humanizada, en donde en la posición nº 15 del armazón se cambia una leucina a alanina. Este plásmido se digirió con las endonucleasas de restricción NheI y SacI y se insertó un enlazador sintético [SEQ ID NOs: 55 y 56]. A continuación se aisló un fragmento EcoRV-NarI y se ligó en el vector de expresión pCNIL5HZLC 1.0, digerido de forma idéntica, para crear pCNIL5HZLC1.1.
Se preparó una región variable sintética empleando las regiones del armazón de la cadena pesada, obtenidas a partir de la inmunoglobulina (NEW) (Saul y col., J. Biol. Chem. 253:585-597(1978)) y las CDRs de la cadena pesada de 2B6 [Fig. 7 y SEQ ID NOs: 1-2]. Los aminoácidos del armazón que pueden influir en la presentación de las CDRs se identificaron y se realizaron sustituciones empleando los métodos descritos previamente. Se generaron cuatro oligonucleótidos sintéticos solapantes [SEQ ID NOs: 57, 58, 59 y 60], los cuales, cuando se reasocian y se extienden, codifican aminoácidos que representan una secuencia señal [SEQ ID NO: 17] y una región variable de la cadena pesada. Este gen sintético se amplificó a continuación empleando cebadores de PCR [SEQ ID NOs: 63 y 64] y se ligó como un fragmento de restricción BstXI-HindIII en un plásmido basado en pUC18 que contenía secuencias obtenidas a partir de otra cadena pesada humanizada basada en el armazón de COR. Una sustitución en el armazón de una fenilalanina por tirosina se realizó en el aminoácido en la posición 91 (sistema de numeración Kabat) (equivalente a la posición 94 de la Figura 12) insertando un enlazador oligonucleótido sintético [SEQ ID NOs: 75 y 76] en los sitios de restricción SacII y KpnI. La región variable de la cadena pesada resultante [Fig. 12 y SEQ ID NOs: 61, 62] se denomina la cadena pesada humanizada NEWM.
Cualquier error en la secuencia cartografiada fue corregido mediante PCR con cebadores mutagénicos o añadiendo enlazadores sintéticos en los sitos de restricción existentes. La secuencia señal y la región variable de la cadena pesada humanizada se escindieron del plásmido basado en pUC, como un fragmento EcoRI-ApaI y se ligó en el vector de expresión pCD que contenía una región constante de IgG_{1} humana, para crear el plásmido pCDIL5NEWM. Las secuencias de aminoácidos de las CDRs son idénticas a las CDRs de la cadena pesada de 2B6 de múrido.
Se preparó una región variable sintética empleando las regiones del armazón de la cadena ligera obtenida a partir de la inmunoglobulina (REI) (Palm y col., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 356:167-191(1975)) y las CDRs de la cadena ligera de 2B6 [Fig. 7 y SEQ ID NOs: 10, 11 y 12. Los aminoácidos del armazón que pueden influir en la presentación de las CDRs, se identificaron y se realizaron sustituciones empleando los métodos descritos previamente. Se generaron cuatro oligonucleótidos sintéticos solapantes [SEQ ID NOs: 65, 66, 67 y 68] que, cuando se reasociaban y se extendían, codificaban cuatro aminoácidos que representan una región variable de la cadena ligera [Fig. 13 y SEQ ID NOs: 69, 70] denominada la cadena ligera humanizada REI. Este gen sintético se amplificó a continuación empleando cebadores de PCR [SEQ ID NOs: 71 y 72] y se ligó como un fragmento de restricción EcoRI-HindIII en pGEM-7Zf(+) (Promega Corporation, Madison, WI).
Cualquier error en la secuencia cartografiada fue corregido mediante PCR con cebadores mutagénicos o añadiendo enlazadores sintéticos en los sitos de restricción existentes. La región variable de la cadena ligera humanizada se escindió del plásmido basado en pGEM-7Zf(+) como un fragmento EcoRV-NarI y se ligó en el vector de expresión pCN que contenía una secuencia señal [SEQ ID NO: 17] junto con una región constante kappa humana para crear el plásmido pCNIL5REI. Las secuencias de aminoácidos de las CDRs son idénticas a las CDRs de la cadena ligera de 2B6 de múrido. Sin embargo, las secuencias codificadoras de estas CDRs difieren de las secuencias codificadoras de 2B6 de múrido, para permitir la creación de sitios para enzimas de restricción. Estas secuencias sintéticas de la cadena pesada y/o ligera variables se emplean en la construcción de un anticuerpo humanizado.
Con el plásmido basado en pGEM-7Zf(+) descrito anteriormente, se puede preparar una región variable de la cadena ligera humanizada, en donde en la posición nº 15 del armazón, se cambia una valina por alanina. Este plásmido se puede digerir con las endonucleasas de restricción NheI y SacI y se inserta un enlazador sintético [SEQ ID NOs: 73 y 74]. A continuación, se puede aislar un fragmento EcoRV-NarI y ligarlo en el vector de expresión pCNIL5HZREI digerido de forma idéntica, para crear el plásmido pCNIL5REI_{V15A}.
Ejemplo 5 Construcción de un Anticuerpo Quimérico
El ADN que codifica los aminoácidos nº 9-nº 14 (numeración KABAT) de la región variable de la cadena pesada del mAb 2B6 de múrido, se aisló como un fragmento de restricción AvaII-StyI, procedente de un clon, obtenido con PCR basado en pGEM7Zf+, del ADNc generado a partir de la línea celular de hibridoma 2B6 (véase el Ejemplo 4). Las secuencias flanqueantes de la región variable de la cadena pesada y una secuencia señal [SEQ ID NO: 17) se proporcionaron combinando este fragmento junto con cuatro enlazadores oligómeros sintéticos y pequeños [SEQ ID NOs: 35 y 36] [SEQ ID NOs: 37 y 38] en un plásmido basado en pUC18, digerido con BstX1-HindIII. Un consenso de aminoácidos N-terminales, deducido de las cadenas pesadas de múrido estrechamente relacionadas, se asignó a los ocho primeros residuos de V_{H} y se codifican dentro de SEQ ID NOs: 35 y 36. La secuencia de aminoácidos deducida de la cadena pesada, se verificó por la secuenciación de los 15 primeros aminoácidos N-terminales de la cadena pesada de 2B6.
Un fragmento EcoRI-ApaI que contenía la secuencia para la señal y las regiones V_{H} se aisló y se ligó en el plásmido pCD que ya codifica la región constante de IgG_{1} humana.
El ADN que codifica los aminoácidos nº 12-nº 99 (numeración KABAT) de la región variable de la cadena ligera del mAb 2B6 de múrido, se aisló como un fragmento de restricción DdeI-AvaI procedente de un clon, obtenido con PCR basado en pGEM7Zf+, del ADNc generado por la línea celular de hibridoma 2B6 (véase el Ejemplo 4). Las secuencias flanqueantes de la región variable de la cadena ligera se proporcionaron combinando este fragmento junto con cuatro enlazadores oligómeros sintéticos y pequeños [SEQ ID NOs: 39 y 40] [SEQ ID NOs: 41 y 42] en un plásmido basado en pUC18, digerido con EcoRV-HindIII. Un consenso de aminoácidos N-terminales, deducido de las cadenas ligeras de múrido estrechamente relacionadas, se asignó a los ocho primeros residuos de V_{L} y se codifican dentro de SEQ ID NOs: 39 y 40. La secuencia de aminoácidos deducida de la cadena ligera, se verificó con la secuenciación de los 15 primeros aminoácidos N-terminales de la cadena ligera de 2B6. Esta región variable se aisló a continuación como un fragmento EcoRV-NarI y se ligó en el vector de expresión pCN que ya contenía la región kappa humana y una secuencia señal.
La expresión de un anticuerpo quimérico se realizó por cotransfección de los plásmidos basados en pCD y pCN en células COS. El material sobrenadante del cultivo se recogió tres y cinco días después y se sometió a ensayo la expresión de la inmunoglobulina mediante el ELISA, descrito a continuación: Cada etapa, excepto la última, van seguidas de lavados con PBS. Las placas de microtitulación se revistieron durante una noche con 100 ng/50 \mul/pocillo de un anticuerpo de cabra, específico de la región Fc de los anticuerpos humanos. El material sobrenadante del cultivo se añadió y se cultivó durante 1 hora. El anticuerpo IgG de cabra anti-humano, conjugado con peroxidasa de rábano picante, se añadió a continuación y se dejó incubar durante 1 hora. A esto siguió la adición de un sustrato de peroxidasa ABTS (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., Gaithersburg, MD). Después de incubar durante 1 hora, se leyó la absorbancia a 405 nm sobre un lector de placas de microtitulación (Molecular Devices Corporation, Menlo Park, CA). La expresión del anticuerpo quimérico se detectó. En un ELISA similar, el material sobrenadante de las células COS que contiene el anticuerpo quimérico, se unió específicamente a los pocillos de microtitulación, revestidos con la proteína IL-5 humana. Este resultado confirma que los genes que codifican un anticuerpo para IL-5, se habían sintetizado y expresado.
\newpage
El ejemplo anterior describe la preparación de un anticuerpo modificado genéticamente a modo de ejemplo. Se pueden seguir procedimientos similares para el desarrollo de otros anticuerpos modificados genéticamente, empleando otros anticuerpos donantes de anti-IL-5 (p. ej., 2F2, 2E3, 4A6, 5D3, 24G9, etc.) desarrollados por medios convencionales.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: Ames, Robert S.
\hskip3.9cm Appelbaum, Edward R.
\hskip3.9cm Chaiken, Irwin M.
\hskip3.9cm Cook, Richard M.
\hskip3.9cm Gross, Mitchell S.
\hskip3.9cm Holmes, Stephen D.
\hskip3.9cm McMillan, Lynette J.
\hskip3.9cm Theisen, Timothy W.
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Antagonistas de IL-5 recombinantes útiles en el tratamiento de enfermedades mediadas por IL-5
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 76
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: SmithKline Beecham Corp./Corporate
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: P.O. Box 1539-UW2220
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: King of Prussia
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Pennsylvania
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CP: 19406-0939
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: Compatible con PC IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.30
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/470110
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 06-JUN-1995
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/467420
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 06-JUN-1995
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/363131
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 23-DEC-1994
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN SOBRE EL APODERADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Sutton, Jeffrey A.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE INSCRIPCIÓN: 34.028
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
REFERENCIA/NÚMERO DE ORDEN: P50282-2
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: 610-270-5024
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: 610-270-5090
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 334 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1..334
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= "La primera base se corresponde con la posición 24 de Kabat"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
1 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 315 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1..315
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= "La primera base se corresponde con la posición 25 de Kabat"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
2 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 334 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1..334
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= "La primera base se corresponde con la posición 24 de Kabat"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
3 
\vskip1.000000\baselineskip
4 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 315 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1..315
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= "La primera base se corresponde con la posición 25 de Kabat"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
5 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 334 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1..334
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= "La primera base se corresponde con la posición 24 de Kabat"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
6 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 315 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1..315
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= "La primera base se corresponde con la posición 25 de Kabat"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
7 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Tyr Ser Val His}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Ile Trp Ala Ser Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Pro Pro Ser Ser Ley Leu Arg Ley Asp Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu}
\sac{Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Asn Val His Ser Phe Pro Phe Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Asn Asp His Ser Phe Pro Phe Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Pro Pro Phe Ser Leu Leu Arg Leu Asp Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 113 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.500000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:
8 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 113 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:
9 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 60 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATGGTGTTGC AGACCCAGGT CTTCATTTCT CTGTTGCTCT GGATCTCTGG TGCCTACGGG 
\hfill
60 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 357 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:
\vskip1.000000\baselineskip
10 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 119 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:
\vskip1.000000\baselineskip
11 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 339 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20:
\vskip1.000000\baselineskip
12 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 113 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:21:
13 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTACATATGC AAGGCTTACA ACCACAATC 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGACAGGGCT TACTAGTGGG CCCTCTGGGC TC 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGGTSMARCT KTCTCGAGTC WGG 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTAACACTCA TTCCTGTTGA AGCTCTTGAC AATGGG 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCAGATGTGA GCTCGTGATG ACCCAGACTC CA 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 140 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:27:
\vskip1.000000\baselineskip
14 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:28:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 149 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:28:
\vskip1.000000\baselineskip
15 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:29:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 139 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:29:
\vskip1.000000\baselineskip
16 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:30:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 126 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:30:
\vskip1.000000\baselineskip
17 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:31:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 117 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:31:
\vskip1.000000\baselineskip
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:32:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 117 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:32:
\vskip1.000000\baselineskip
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:33:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 102 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:33:
\vskip1.000000\baselineskip
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:34:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 111 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:34:
\vskip1.000000\baselineskip
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:35:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 82 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:35:
\vskip1.000000\baselineskip
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:36:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 89 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:36:
\vskip1.000000\baselineskip
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:37:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAAGGCACCA CTCTCACAGT CTCCTCAGCT AGTACGAAGG GCCA 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:38:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 43 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGCTTGGGCC CTTCGTACTA GCTGAGGAG CTGTGAGTGG TGC 
\hfill
43 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:39:
\vskip0.500000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:39:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATCGTGATGA CCCAGTCTCC ATCCTCCC 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:40:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:40:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCAGGGAGGA TGGAGACTGG GTCATCACGA T 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:41:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 43 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:41:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCGGGGGACA GAGTTGGAAA TAAAACGTAC TGTGGCGGCG CCA 
\hfill
43 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:42:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:42:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGCTTGGCGC CGCCACAGTA CGTTTTATTT CCAACTCTGT CC 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:43:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:43:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGCCACCA CCACCACCAC CACTAA 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:44:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:44:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTAGTTAGTG GTGGTGGTGG TGGTGG 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:45:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 113 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:45:
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:46:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 113 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:46:
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:47:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:47:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Asn Asp His Ser Tyr Pro Phe Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:48:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:48:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:49:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 6285 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: bicatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:49:
\vskip1.000000\baselineskip
26
27
28
29
30
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:50:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5703 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: bicatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:50:
\vskip1.000000\baselineskip
32
33
34
35
36
37 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:51:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 81 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:51:
\vskip1.000000\baselineskip
100 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:52:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 85 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:52:
\vskip1.000000\baselineskip
38 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:53:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 73 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:53:
\vskip1.000000\baselineskip
39 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:54:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 77 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.500000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:54:
\vskip1.000000\baselineskip
40 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:55:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:55:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTAGCTGTGT CAGCTGGCGA GAGGGCCACC ATCAACTGCA AGAGCT 
\hfill
46 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:56:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:56:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTTGCAGTTG ATGGTGGCCC TCTCGCCAGC TGACACAG 
\hfill
38 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:57:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 140 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:57:
\vskip1.000000\baselineskip
41 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:58:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 138 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:58:
\vskip1.000000\baselineskip
42 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:59:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 143 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:59:
\vskip1.000000\baselineskip
43 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:60:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 136 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:60:
\vskip1.000000\baselineskip
44 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:61:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 357 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: bicatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:61:
\vskip1.000000\baselineskip
45 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:62:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 119 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:62:
\vskip1.000000\baselineskip
46 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:63:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:63:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGGACGCCAG CAACATGGTG TTGCAGAC 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:64:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:64:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGCCAAGCTT GGGCCCTTGG TGGAGGCGCT CGAGAC 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:65:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 121 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:65:
\vskip1.000000\baselineskip
47 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:66:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 116 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:66:
\vskip1.000000\baselineskip
48 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:67:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 116 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:67:
\vskip1.000000\baselineskip
49 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:68:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 117 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:68:
\vskip1.000000\baselineskip
50 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:69:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 339 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: bicatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:69:
\vskip1.000000\baselineskip
51 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:70:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 113 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:70:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
52 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:71:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:71:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATTACGAAT TCGTAGTCGG ATAT 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:72:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:72:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGCCAAGCTT GGCGCCGCCA CAGT 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:73:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:73:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTAGTGCGGG TGACCAGTC ACCATCACCT GTAAGAGCT 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:74:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:74:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTTACAGGTG ATGGTCACTC GGTCACCCGC A 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:75:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:75:
\vskip1.000000\baselineskip
53 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:76:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 64 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:76:
\vskip1.000000\baselineskip
54

Claims (2)

1. Un anticuerpo monoclonal neutralizante humanizado, específico de la interleucina 5 humana, que comprende una región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO:19 y una región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO:21.
2. Uso del anticuerpo de la reivindicación 1, en la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad seleccionada entre el grupo consistente en: asma y síndrome hipereosinofílico.
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