NO324181B1 - Monoklonalt antistoff spesifikt for human IL-5 og fragmenter derav, hybridoma cellelinjer, endret antistoff, immunolglobulin-tungkjede-komplementaritetsbestemmende region, nukleinsyremolekyl, kimaert antistoff, farmasoytisk preparat omfattende endret antistoff, anvendelse av antistoff, isolert nukleinsyresekvens, rekombinant plasmid, vertcelle, fremgangsmate for a fremstille et endret antistoff og metoder for a bestemme human IL-50. - Google Patents

Abstract

Kimære, humaniserte og andre IL-5 mAber; som er avledet fra høy-affinitet nøytraliserende mAber, farmasøytiske preparater som omfatter det samme, metoder for behandling og diagnostikk er tilveiebragt.

Description

Den foreliggende oppfinnelsen angår monoklonalt antistoff spesifikt for human IL-5 og fragmenter derav, hybridoma cellelinjer, endret antistoff, immunglobulin-tungkjede-komplementaritetsbestemmende region, nukleinsyremolekyl, kimært antistoff, farmasøytisk preparat omfattende endret antistoff, anvendelse av antistoff, isolert nukleinsyresekvens, rekombinant plasmid, vertscelle, fremgangsmåte for å fremstille et endret antistoff og metoder for å bestemme human IL-50.

Oppfinnelsen angår generelt feltet antistoffer og endrede antistoffer som er nyttige ved behandling og diagnose av tilstander som er mediert av IL-5, og overskuddsproduksjon av eosinofiler, og mer spesifikt til mAb'er, Fab'er, kimære og humaniserte antistoffer.

Eosinofiler er antatt å være implisert i en lang rekke inflammatoriske sykdomsstadier omfattende allergiske forstyrrelser assosiert med hypersensitivitetsreaksjoner i lungevevet (Butterfield et al., I: Immunopharmacology of Eosinophils, H. Smith and R. Cook, red. s.151-192, Academic Press, London (1993)). Et viktig eksempel er astma, en sykdom som er karakterisert ved reversibel obstruksjon av luftveiene som fører til en ikke-spesifikk bronkial hyperresponsitivitet. Dette er igjen avhengig av dannelsen av en kronisk inflammasjonsreaksjon i bronkieslimhinnene, og en karakteristisk infiltrering av makrofager, lymfocytter og eosinofiler. Eosinofilene ser ut til å spille en sentral rolle ved initieringen av den mukosale skaden som er typisk for denne sykdommen (Corrigan et al., Immunol. Today, 13:501-507 (1992)). Økt antall aktiverte eosinofiler er rapportert i sirkulasjonen, bronkiale sekreter og lunge-parenkyma hos pasienter med kronisk astma, og alvorlighetsgraden av sykdommen, som målt ved en rekke lungefunksjonstester, korrelerer med blodtallet av eosinofiler (Griffen et al., J. Aller. Clin. Immunol., 67:548-557

(1991)). Økt antall eosinofiler, ofte i ferd med degranulering, er også funnet i bronkoalveolær utskyllings- (BAL) væske fra pasienter som gjennomgår sene astmatiske reaksjoner, og reduserte eosinofil-tall, vanligvis som en konsekvens av steroid-terapi, følger forbedringer i kliniske symptomer (Bousquet et al., N. Eng. J. Med. 323:1033-1039 (1990)).

Interleukin 5 (IL-5) er et homodimert glykoprotein som hovedsakelig produseres av aktiverte CD4+-T-lymfocytter. Hos mennesket er IL-5 i stor grad ansvarlig for kontroll av veksten og differensieringen av eosinofiler. Forhøyede nivåer av IL-5 er detektert i bronkoalveolære utskyllingsvaskinger fra astmatikere (Motojima et al., Allergy, 48:98 (1993)). Mus som er transgene for IL-5 viser en betydelig eosinofili i perifert blod og vev ved fravær av antigen-stimulering (Dent et al., J. Exp. Med., 172:1425 (1990)), og anti-mus IL-5 monoklonale antistoffer er vist å ha en effekt for å redusere eosinifili i blod og vev hos mus (Hitoshi et al., Int. Immunol., 3:135 (1991)), så vel som eosinofili assosiert med parasitt-infeksjon og allergen-utfordring hos forsøksdyr (Coffman et al., Science 245:308-310 (1989), Sher et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 83:61-65 (1990), Chand et al., Eur. J. Pharmacol., 211:121-123(1992).

WO 93/16184 omhandler antistoff mot IL-5 og US 5096704 beskriver en metode for å forhindre eosinofili ved å tilføre en pasient antagonister mot IL-5. Under søknadens behandlng er det også trukket frem NO 964808 som omhandler antistoff mot IL-5 og WO 9004979 som omhandler metode for å behandle eosinofili ved å blokkere effekten av IL-5.

Antistoffene i foreliggende søknad har en annen epitop enn dem i WO 93/16184 og US 5096704, og ingen av de siterte mothold beskriver eller foreslår et antistoff som binder human IL-5 med en bindingsaffinitet kjennetegnet ved en dissosiasjonskonstant lik eller mindre enn omtrent 3,5 x 10"<11>M.

Til tross for at kortikosteroider er ekstremt effektive til å undertrykke eosinofil-tall og andre inflammatoriske komponenter ved astma er det bekymring omkring bivirkningene deres, både ved sterk astma og mer nylig ved mild til moderat astma. Den eneste andre store anti-inflammatoriske medikament-terapien - kromoglykater (kromolyn-natrium og nedocromil) - er betydelig mindre effektive enn kortikosteroidene, og deres presise virkningsmekansime er enda ukjent.

Mer nylige utviklinger har fokusert på nye inhalerbare steroider, lengre-virkende bronkodilatorer og midler som virker på nye biokjemiske eller farmakologiske mål (f.eks kaliumkanal-aktivatorer, leukotrien-antagonister, 5-lipoksygenase- (5-LO) inhibitorer osv.). Et egnet medikament vil være et som kombinerer effetiviteten av steroider med tryggheten assosiert med kromolyn-natrium, men som fremdeles har økt selektivitet og en raskere virkningsstart. Nøytraliserende IL-5-antistoffer kan muligens være anvendelige for å lette eosinofili-relaterte symptomer hos mennesker.

Det er derfor et behov innen feltet for en høy-affinitets IL-5-antagonist, så som et nøytraliserende monoklonalt antistoff mot human interleukin-5, som vil redusere eosinofil-differensiering og -proliferasjon (dvs. akkumulering av eosinofiler) og derved eosinofil-inflammasjon.

Ved et første aspekt tilveiebringer foreliggede oppfinnelse nøytraliserende monoklonalt gnagerantistoff som er spesifikt for human interleukin-5, og som har en bindingsaffinitet som er kjennetegnet ved en dissosiasjonskonstant som er lik eller mindre enn omtrent 3,5 x 10"<11> M, hvor nevnte antistoff omfatter tre komplementaritetsbestemmende regioner av den tunge kjeden omfattende;

(a) SEKV ID NR: 7, 8 og 9 eller

(b) SEKV ID NR: 7, 8 og 14

og tre komplementaritetsbestemmende regioner av den lette kjeden omfattende;

(a) SEKV ID NR: 10,11 og 12 eller

(b) SEKV ID NR: 10, 11 og 13.

Eksempler på slike monoklonale antistoffer er de murine monoklonale antistoffene 2B6, 2E6 og 2F2, og rotte monoklonale antistoffer så som 4A6. Et annet aspekt ved oppfinnelsen er hybridomer så som SK119-2B6,206,75 (1), SK119-2E3,39,40,2, SK119-2F2,37,80,12 eller 4A6(1)G1F7.

Ved et relatert aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse nøytraliserende Fab-fragmenter eller F(ab')2-fragmenter derav, som er spesifikke for human interleukin-5, som er produsert ved å deletere Fc-regionen av det gnager nøytraliserende monoklonale antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse.

Ved nok et annet relatert aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse nøytraliserende Fab-fragmenter eller F(ab<x>)2-fragmenter derav, som er spesifikk for human interleukin-5, som er produsert ved en kjede-shufflings-teknikk hvor et tung- (eller lett-) kjede-immunoglobulin, isolert fra gnager nøytraliserende monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen, er uttrykt med et hhv. lettkjede (eller tungkjede) immunoglobulin-bibliotek isolert fra interleukin-5 immuniserte gnagere, i et filamentøst fag Fab-display-bibliotek.

Ved nok et relatert aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et endret antistoff som er spesifikt for human interleukin-5 som omfatter en lettkjede og en tungkjede kjennetegnet ved at rammeverkregionene til nevnte tung- og lettkjeder er avledet fra i det minste ett valgt antistoff og aminosyresekvensene fra de

komplementaritetsbestemmende regionene til hver nevnte kjede er avledet fra

det monoklonale antistoffet ifølge krav 1. Videre omfatter oppfinnelsen en immunglobulin-tungkjede-komplementaritetsbestemmende region (CDR), kjennetegnet ved at aminosyresekvensen fra denne er valgt fra gruppen bestående av:

(a) SEKV ID NR: 7,

(b) SEKV ID NR: 8,

(c) SEKV ID NR: 9 og

(d) SEKV ID NR: 14,

og nukleinsyremolekyler som koder for den samme. Når det endrede antistoffet er et humanisert antistoff er sekvensen som koder for

komplementaritetsbestemmende regioner (CDR'er) fra et ikke-humant immunoglobulin satt inn i en første immunoglobulinpartner, hvor i det minste én, eller fortrinnsvis alle de komplementaritetsbestemmede regionene (CDR'er) fra den første immunoglobulinpartneren er erstattet med CDR'er fra det ikke-humane monoklonale antistoffet. Det er foretrukket at den første immunoglobulinpartneren er operativt koblet til en andre immunoglobulinpartner i tillegg, som omfatter hele eller en del av en immunoglobulin konstant kjede.

Ved nok et annet aspekt er det tilveiebragt et kimært antistoff som omfatter en tung- og en lettkjede kjennetegnet ved at nevnte antistoff har en dissosiasjonskonstant lik med eller mindre enn omtrent 3,5 x 10"<11> M for human interleukin-5, hvor de konstante regionene av nevnte tung- og lettkjeder er avledet fra i det minste ett valgt antistoff, og aminosyresekvensene fra de variable regionen av hver nevnte kjede er avledet fra det monoklonale antistoffet ifølge krav 1.

Ved nok et annet aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et farmasøytisk preparat som omfatter et endret antistoff som omfatter en lettkjede og en tungkjede, kjennetegnet ved at rammeverkregionene tii nevnte tung- og lettkjeder er avledet fra i det minste ett valgt antistoff og aminosyresekvensene fra de komplementaritetsbestemmende regionene til hver nevnte kjede er avledet fra det monoklonale antistoffet ifølge krav 1 og en farmasøytisk aksepterbar bærer.

Ved et videre aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en anvendelse av et antistoff ifølge krav 10, for fremstilling av et medikament for å behandle forstyrrelser som er assosiert med overskuddsproduksjon av eosinofiler hos et menneske.

I foretrukne anvendelser ifølge foreliggende oppfinnelse er nevnte forstyrrelse; astma, allergisk rinitt, atopisk dermatatitt, hypereosinofilt syndrom, eosinofil gastroenteritt, Churg-Strauss syndrom og eosinofilt myalgisyndrom.

Ved nok et annet aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse isolert nukleinsyresekvens kjennetegnet ved at den er valgt fra gruppen bestående av: (a) en nukleinsyresekvens som koder for det endrede antistoffet ifølge krav 10;

(b) en nukleinsyresekvens som er komplementær med (a); og

(c) et fragment av eller en analog av (a) eller (b) som koder for et protein som er karakterisert ved at det har spesifisitet for human interleukin-5;

hvor nevnte sekvens eventuelt omfatter et restriksjonssete.

Foretrukne nukleinsyresekvenser ifølge oppfinnelsen er kjennetegnet ved at sekvensen koder for den humaniserte tungkjede variable regionen som omfatter nukleinsyresekvensen SEKV ID NR: 18, eventuelt som omfatter nukleinsyresekvensen SEKV ID NR: 61. Andre foretrukne utførelser av isolert nukleinsyresekvens kjennetegnes ved at sekvensen koder for den humaniserte lettkjede variable regionen som omfatter nukleinsyresekvensen SEKV ID NR: 20 eventuelt som omfatter nukleinsyresekvens SEKV ID NR: 69.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også rekombinant plasmid kjennetegnet ved at det omfatter nukleinsyresekvensen ifølge krav 28 og vertsceller som er transfektert med det rekombinante plasmidet.

En fremgangsmåte for å fremstille et endret antistoff som er spesifikt for human IL-5 ifølge foreliggende oppfinnelse kjennetegnes ved at den omfatter dyrking av en cellelinje som er transfektert med det rekombinante plasmidet ifølge krav 33, under kontroll av valgte regulatoriske sekvenser som kan styre ekspresjonen av dette i nevnte celler.

Nok et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse er en metode for å måle tilstedeværelse eller fravær av human IL-5 hos et menneske, kjennetegnet ved at den omfatter å tilveiebringe en prøve av biologisk væske fra en pasient og la det monoklonale antistoffet ifølge krav 1 komme i kontakt med en slik prøve under betingelser som er slik at et IL-5/monoklonalt antistoffkompleks kan dannes, og detektere tilstedeværelse eller fravær av nevnte IL-5/monoklonale antistoffkompleks.

I et annet aspekt av oppfinnelsen omfattes en metode for hjelp ved diagnose av allergier og andre tilstander som følger med overskuddsproduksjon av eosinofiler, kjennetegnet at den omfatter trinnene å bestemme mengden av human IL-5 i en prøve fra en pasient i samsvar med metoden ifølge krav 36, og sammenligne denne med den gjennomsnittlige mengden av human IL-5 i normalpopulasjonen, hvor tilstedeværelsen av betydelig forhøyet nivå av human IL-5 hos pasienten er en indikasjon på allergier og andre forstyrrelser som følger med overskuddsproduksjon av eosinofiler.

I et ytterligere aspekt angår foreliggende oppfinnelse et humanisert nøytraliserende monoklonalt antistoff spesifikt for human interleukin-5, kjennetegnet ved at antistoffet omfatter en tungkjede variabel region av SEKV ID NR: 19 og en lettkjede variabel region av SEKV ID NR: 21.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 [SEKV ID NR. 1 og 15] illustrerer den tungkjede variable regionen for det murine antistoffet 2B6 og det murine/humane 2B6 kimære antistoffet. De innboksede områdene indikerer CDR'ene. Fig. 2 [SEKV ID NR. 2 og 16] illustrerer den lettkjede variable regionen for det murine antistoffet 2B6 og det murine/humane 2B6 kimære antistoffet. De innboksede områdene indikerer CDR'ene. Fig. 3 [SEKV ID NR. 3] illustrerer den tungkjede variable regionen for det murine antistoffet 2F2. De innboksede områdene indikerer CDR'ene. Fig. 4 [SEKV ID NR. 4] illustrerer den lettkjede variable regionen for det murine antistoffet 2F2. De innboksede områdene indikerer CDR'ene. Fig. 5 [SEKV ID NR. 5] illustrerer den tungkjede variable regionen for det murine antistoffet 2E3. De innboksede områdene indikerer CDR'ene. Fig. 6 [SEKV ID NR. 6] illustrerer den lettkjede variable regionen for det murine antistoffet 2E3. De innboksede områdene indikerer CDR'ene. Fig. 7 [SEKV ID NR. 7-14] illustrerer de tung- og lettkjede CDR'ene fra de murine antistoffene 2B6, 2F2 OG 2E3. Fig. 8 [SEKV ID NR. 18,19] illustrerer den tungkjede variable regionen for det humaniserte antistoffet 2B6. De innboksede områdene indikerer CDR'ene. Fig. 9 [SEKV ID NR. 20, 21] illustrerer den lettkjede variable regionen for det humaniserte antistoffet 2B6. De innboksede områdene indikerer CDR'ene. Fig. 10 er en skjematisk tegning av plasmid pCDIL5HZHC1,0 som er anvendt for å uttrykke et humanisert tungkjedegen i mammalske celler. Plasmidet inneholder et beta-laktamase gen (BETA LAC), en SV40-origo for replikasjon (SV40), en cytomegalovirus promoter-sekvens (CMV), en signalsekvens, den humaniserte tungkjeden, et polyA-signal fra bovint veksthormon (BGH), en betaglobin-promoter (beta glopro), et dihydrofolat-reduktase gen (DHFR) og et BGH-sekvens polyA-signal i en pUC19-bakgrunn. Fig. 11 er en skjematisk tegning av plasmid pCNIL5HZLC1,0 som er anvendt for å uttrykke et humanisert lettkjedegen i mammalske celler. Fig. 12 [SEKV ID NR: 61, 62] illustrerer den NewM-tungkjede variable regionen for det humaniserte antistoffet 2B6. De innboksede områdene indikerer CDR'ene. Fig. 13 [SEKV ID NR. 69, 70] illustrerer den REI-lettkjede variable regionen for det humaniserte antistoffet 2B6. De innboksede områdene indikerer CDR'ene.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en rekke antistoffer, endrede antistoffer og fragmenter derav, som er karakterisert ved human IL-5 bindingsspesifisitet, nøytraliserende aktivitet og høy affinitet for human IL-5 som eksemplifisert i murint monoklonalt antistoff 2B6. Antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse ble preparert ved konvensjonelle hybridoma-teknikker, fag-display kombinatoriske biblioteker, immunoglobulin-kjede-shuffling og humaniseringsteknikker for å generere nye nøytraliserende antistoffer. Disse produktene er nyttige i terapeutiske og farmasøytiske preparater for å behandle IL-5-medierte forstyrrelser, så som astma. Disse produktene er også nyttige ved diagnosen av IL-5-medierte sykdommer ved måling (f.eks enzym-koblet immunosorbent test (ELISA)) av endogene IL5-nivåer hos mennesker eller IL-5 frigjort ex vivo ira aktiverte celler.

1. Definisjoner

"Endret antistoff" angir et protein som er kodet av en endret immunoglobulin-kodende region, som kan bli oppnådd ved ekspresjon i en valgt vertscelle. Slike endrede antistoffer er konstruerte antistoffer (f.eks kimære eller

humaniserte antistoffer) eller antistoff-fragmenter som mangler hele eller deler av en immunoglobulin konstant region, f.eks Fv, Fab eller F(ab)2 og lignende.

"Endret immunoglobulin kodende region" angir en nukleinsyresekvens som koder for endret antistoff ifølge oppfinnelsen. Når det endrete antistoffet er et CDR-overført eller humanisert antistoff, er sekvensene som koder for de komplementaritetsbestemmende regionene (CDR'er) fra et ikke-humant immunoglobulin, satt inn i en første immunoglobulinpartner som omfatter humane variable rammeverk-sekvenser. Eventuelt er den første

immunoglobulinpartneren operativt koblet med en andre immunoglobulinpartner.

"Første immunoglobulinpartner" refererer til en nukleinsyresekvens som koder for et humant rammeverk eller en human immunoglobulin variabel region hvor de native (eller naturlig forekommende) CDR-kodende regionene er erstattet med CDR- kodende regioner fra et donor-antistoff. Den humane variable regionen kan være en immunoglobulin-tungkjede, en lettkjede (eller begge kjeder), en analog eller et funksjonelt fragment derav. Slike CDR-regioner, lokalisert innen den variable regionen til antistoffer (immunoglobuliner) kan bli bestemt ved kjente metoder innen feltet. F.eks Kabat et al., (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4.utg., US Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)) beskriver regler for å lokalisere CDR'er. I tillegg er det kjent dataprogrammer som er nyttige for å identifisere CDR-regioner/-strukturer.

"Nøytralisering" refererer til et antistoff som hemmer IL-5-aktivitet ved å forhindre bindingen av human IL-5 til dens spesifikke reseptor, eller ved å hindre signalet fra IL-5 gjennom dens reseptor hvis binding skulle forekomme. Et mAb er nøytraliserende hvis det er 90% effektivt, fortrinnsvis 95% og mest foretrukket 100% effektivt ved inhibering av IL-5-aktivitet, som målt i B13-cellebiotesten (IL-5 nøytraliseringstest, se eks. 2c).

Begrepet "høy affinitet" refererer til et antistoff som har en bindingsaffinitet som er karakterisert ved en Kd lik med eller mindre enn 3,5 x 10"<11> M for human IL-5, som bestemt ved optisk biosensor-analyse (se eksempel 2d).

Med "bindingsspesifisitet for human IL-5" menes en høy affinitet for human, ikke murin, IL-5.

"Andre immunoglobulinpartner" refererer til en annen nukleotidsekvens som koder for et protein eller et peptid med hvilket den første

immunoglobulinpartneren er fusert i ramme eller ved hjelp av en konvensjonell linkersekvens (dvs. operativt koblet). Fortrinnsvis er det et immunoglobulingen. Den andre immunoglobulinpartneren kan omfatte en nukleinsyresekvens som koder for hele den konstante regionen for det samme (dvs. homologt - de første og andre endrede antistoffene er avledet fra den samme kilden) eller et ytterligere (dvs. heterologt) antistoff av interesse. Det kan være en immunoglobulin tungkjede eller lettkjede (eller begge kjeder som en del av et enkelt polypeptid). Den andre immunoglobulinpartneren er ikke begrenset til en spesiell immunoglobulinklasse eller isotype. I tillegg kan den andre immunoglobulinpartneren omfatte en del av en immunoglobulin konstant region, slik som funnet i en Fab eller F(ab)2 (dvs. en diskret del av en egnet human konstant region eller rammeverk-region). En slik andre immunoglobulinpartner kan også omfatte en sekvens som koder for et integrert membranprotein som er eksponert på den ytre overflaten til en vertscelle, f.eks som en del av et fag-display-bibliotek, eller en sekvens som koder for et protein for analytisk eller diagnostisk deteksjon, f.eks pepperot-peroksidase, (5-galaktosidase osv.

Begrepene Fv, Fc, Fd, Fab eller F(ab)2 er her anvendt med deres standard betydninger (se f.eks Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)).

Som anvendt her beskriver "konstruert antistoff" en type endret antistoff, dvs. et fullengde syntetiskt antistoff (f.eks et kimært eller et humanisert antistoff, i motsetning til et antistoff-f ragment) hvor en del av de lett- og/eller tungkjede variable domenene fra et valgt akseptor-antistoff er erstattet med analoge deler frå ett eller flere donor-antistoffer, som har spesifisitet for den valgte epitopen. For eksempel kan slike molekyler omfatte antistoffer som er karakterisert ved en humanisert tungkjede assosiert med en umodifisert lettkjede (eller kimer-lettkjede) eller vice versa. Konstruerte antistoffer kan også være karakterisert ved endring av nukleinsyresekvensen som koder for akseptor-antistoff lette og/eller tunge variable domene-rammeverk-regioner for å bevare donor-antistoff-bindingsspesifisiteten. Disse antistoffene kan omfatte erstatninger av en eller flere CDFTer (fortrinnsvis alle) fra akseptor-antistoffet med CDFTer fra et donor-antistoff som er beskrevet her.

Et "kimært antistoff" refererer til en type av konstruerte antistoffer som omfatter naturlig forekommende variable regioner (lettkjeder og tungkjeder) avledet fra et donor-antistoff i assosiasjon med lett- og tungkjede konstante regioner avledet fra et akseptor-antistoff.

Et "humanisert antistoff" refererer til en type av konstruerte antistoffer som har sine CDR'er avledet fra et ikke-humant donor-immunoglobulin, og de resterende immunoglobulin-avledete delene av molekylet er avledet fra ett (eller flere) humant(humane) immunoglobulin(er). I tillegg kan rammeverk-støtteenheter være endret for å beholde bindingsaffinitet (se f.eks Queen et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421 (1991)).

Begrepet "donor-antistoff" refererer til et antistoff (monoklonalt eller rekombinant) som bidrar med nukleinsyresekvensene til dens variable regioner, CDR'er, eller andre funksjonelle fragmenter, eller analoger derav, til en første immunoglobulinpartner, for slik å gi den endrede immunoglobulin-kodende-regionen og resulterende uttrykte endrede antistoff med antigenspesifisiteten og den nøytraliserende aktivitet som var karakteristisk for donor-antistoffet. Ett donor-antistoff som er egnet for anvendelse ved denne oppfinnelsen er et ikke-humant nøytraliserende monoklonalt antistoff (dvs. murint) betegnet som 2B6. Antistoffet 2B6 er definert som et høy-affinitets, human IL-5-spesifikt (dvs. gjenkjenner ikke murin IL-5), nøytraliserende antistoff av isotype Igd som har den variable lettkjede-DNA- og aminosyresekvensene til hhv. SEKV. ID. Nr 2 og 16, og variable tungkjede-DNA- og aminosyresekvensene til hhv. SEKV. ID. Nr 1 og 15 på en egnet murin IgG konstant-region.

Begrepet "akseptor-antistoff" refererer til et antistoff (monoklonalt eller rekombinant) som er heterologt med donor-antistoffet, som omfatter hele (eller hvilken som helst del, men fortrinnsvis hele) av nukleinsyresekvensene som koder for dens tung- og/eller lettkjede rammeverk-regioner og/eller dens tung-og/eller lettkjede konstante regioner til den første immunoglobulinpartneren. Fortrinnsvis er et humant antistoff akseptor-antistoffet.

"CDR'er" er definert som de komplementaritetsbestemmende region aminosyresekvensene til et antistoff, som er de hypervariable regionene til immunoglobulin tung- og lettkjeder. Se f.eks Kabat et al., (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4.utg., US. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987). Det er tre tungkjede- og tre lettkjede-CDR'er (eller CDR-regioner) i den variable delen av et immunoglobulin.

"CDR'er" som anvendt her refererer således til alle tre tungkjede-CDR'ene, eller alle tre lettkjede-CDR'ene (eller både alle tung- og alle lettkjede-CDR'ene dersom dette er passende).

CDR'er tilveiebringer det meste av kontaktenhetene for bindingen av antistoffet til antigenet eller epitopen. CDR'er som er interessante i denne oppfinneslen er avledet fra donor-antistoff variable tung- og lettkjede-sekvensene, og omfatter analoger av de naturlig forekommende CDR'ene, hvor analogene også deler eller beholder den samme antigen-bindingsspesifisiteten og/eller nøytraliserende evne som det donor-antistoffet fra hvilket de var avledet fra.

Med "deling av antigen-bindingsspesifisiteten eller nøytraliserende evne" menes f.eks at selv om mAb 2B6 kan være karakterisert av et visst nivå av antigenaffinitet kan en CDR som er kodet av en nukleinsyresekvens fra 2B6 i et passende strukturelt miljø ha en lavere eller høyere affinitet. Det er forventet at CDR'er fra 2B6 i slike omgivelser uansett vil gjenkjenne den(de) samme epitopen(e) som 2B6. Eksempel-tungkjede-CDR'er fra 2B6 omfatter SEKV. ID. Nr: 7, SEKV. ID. Nr: 8, SEKV. ID. Nr: 9 og eksempel-lettkjede-CDR'er f ra 2B6 omfatter SEKV. ID. Nr: 10, SEKV. ID. Nr: 11, SEKV. ID. Nr: 12.

Et "funksjonelt fragment" er en delvis tung- eller lettkjede variabel sekvens (f.eks mindre delesjoner ved amino- eller karboksy-terminalene til den immunoglobulin variable regionen) som beholder den samme antigen-bindingsspesifisiteten og/eller nøytraliserende evne som det antistoffet som fragmentet var avledet fra.

En "analog" er en aminosyresekvens som er modifisert med i det minste én aminosyre, hvor nevnte modifikasjon kan være kjemisk eller en substitusjon eller en rearrangering av noen få aminosyrer (dvs. ikke flere enn ti), hvor modifikasjonen tillater aminosyresekvensen å beholde de biologiske karakteristikkene, f.eks antigenspesifisitet og høy-affinitet fra den umodifiserte sekvensen. F.eks (stille) mutasjoner kan konstrueres, via substitusjoner når visse endonuklease-restriksjonsseter er skapt innen eller omkring CDR-kodende regioner.

Analoger kan også oppstå som alleliske variasjoner. En "allelisk variasjon eller modifikasjon" er en endring i nukleinsyresekvensen som koder for aminosyren eller peptidsekvensen ifølge oppfinnelsen. Slike variasjoner eller modifikasjoner kan være på grunn av degenererthet i den genetiske koden, eller kan være laget med vilje for å gi ønskede karakteristikker. Disse variasjonene eller modifikasjonene kan eller kan ikke resultere i endringer i hvilken som helst kodet aminosyresekvens.

Begrepet "effektor-midler" refererer til ikke-protein-bærermolekyler med hvilke de endrede antistoffene, og/eller naturlige eller syntetiske lett- eller tungkjeder fra donor-antistoffer eller andre fragmenter av donorantistoffet, kan være assosiert ved konvensjonelle midler. Slike ikke-proteinbærere kan omfatte konvensjonelle bærere som er anvendt på det diagnostiske feltet, f.eks polystyren eller andre plastikk-kuler, polysakkarider, f.eks som anvendt i BIAcore-[Pharmacia] systemet, eller andre ikke-proteinsubstanser som er nyttige på det medisinske feltet, og trygge ved administrering til mennesker og dyr. Andre effektormidler kan omfatte en makrosyklisk gruppe, for å chelatere et tungmetall-atom eller radioisotoper. Slike effektormidler kan også være nyttige for å øke halveringstiden til de endrede antistoffene, f.eks polyetylenglykol.

//. Høy- affinitet IL- 5 monoklonale antistoffer

For anvendelse ved konstruksjon av antistoffer, endrede antistoffer og fragmenter ifølge denne oppfinnelsen, kan en ikke-human art (f.eks bovin, ovin, ape, kylling, gnager (f.eks mus og rotte) osv.) bli anvendt for å generere et ønsket immunoglobulin ved presentasjon av nativt human IL-5 eller en peptidepitope av denne. Konvensjonelle hybridomateknikker er anvendt for å gi hybridoma-cellelinjer som sekreerer et ikke-humant mAb mot IL-5. Slike hybridomer er så undersøkt for binding ved å anvende IL-5-bekledde 96-brønners-plater, som beskrevet i eksempel-avsnittet, eller alternativt med biotinylert IL-5 bundet til en streptavidin-kledd-plate.

Ett eksempel på et høyaffinitet, nøytraliserende mAb ifølge foreliggende oppfinnelse er mAb 2B6, et murint antistoff som kan bli anvendt for utviklingen av et kimært eller humanisert antistoff, beskrevet mer detaljert i eksempel 1 nedenfor. 2B6 mAb'et er karakterisert ved en antigenspesifisitet for human IL-5, med en Kd på mindre enn 3,5 x 10'<11>M) (omtrent 2,2 x 10 *11 M) for IL-5. Kdfor IL-5 av et Fab-fragment fra 2B6 (se eksempel 3H) er estimert å være omtrent 9 x 10'11M som bestemt ved optisk biosensor. MAb 2B6 ser ut til å blokkere bindingsinteraksjonen mellom human IL-5 og a-kjeden til den humane IL-5-reseptoren.

Et annet ønskelig donor-antistoff er det murine mAb 2E3. Dette mAb er karakterisert ved at det er isotype lgG2a, og har en dissosiasjonskonstant for hlL-5 på mindre enn 3,5 x 10'<11>M (omtrent 2,0 x 10 "11 M).

Nok et annet ønskelig donor-antistoff er rotte mAb 4A6. Dette mAb'et er karakterisert ved at det har en dissosiasjonskonstant for hlL-5 på mindre enn 3,5 x 10"11M (omtrent 1,8 x 10 11 M). I tillegg ser mAb 4A6 ut til å blokkere bindingsinteraksjonen mellom human IL-5 og (3-kjeden av IL-5-reseptoren.

Denne oppfinnelsen er ikke begrenset til anvendelsen av 2B6 mAb, 2E3 mAb eller deres hypervariable (dvs. CDR) sekvenser. Ethvert annet egnet høy-affinitet IL-5-antistoff som er karakterisert ved at det har en dissosiasjonskonstant lik eller mindre enn 3,5 x 10'<11> M for human IL-5, og korresponderende anti-IL-5-CDR kan derfor bli anvendt istedet. Overalt hvor donor-antistoffet i den følgende beskrivelsen er identifisert som 2B6 eller 2E3 er denne betegnelsen kun gitt som en illustrasjon, og for å forenkle beskrivelsen.

/// Antistoff- fragmenter

Den foreliggende oppfinnelsen omfatter også anvendelse av Fab-fragmenter eller F(ab')2-fragmenter som er avledet fra mAb'er som er rettet mot human IL-5. Disse fragmentene er nyttige som midler som er beskyttende in vivo mot IL-5 og eosinofil-medierte forstyrrelser eller in vitro som del av en IL-5-diagnostikk. Et Fab-fragment omfatter hele lettkjeden og amino-terminal del av tungkjeden; og et F(ab')2-fragment er fragmentet som er formet av to Fab-fragmenter bundet sammen av disulfidbindinger. MAb 2B6, 2E3 og andre lignende høy-affinitet IL-5-bindende antistoffer gir kilder for Fab-fragmenter og F(ab')2-fragmenter som kan oppnås ved konvensjonelle metoder, f.eks spalting av mAb'et med egnede proteolytiske enzymer, papain og/eller pepsin, eller ved rekombinante metoder. Disse Fab- og F(ab<v>)2-fragmentene er selv nyttige som terapeutiske, forebyggende eller diagnostiske agens, og som donorer for sekvenser som omfatter de variable regionene og CDR-sekvensene som er nyttige i dannelsen av rekombinante eller humaniserte antistoffer som beskrevet her.

Fab- og F(ab')2-fragmenter kan bli konstruert via et kombinatorisk fag-bibliotek (se f.eks Winteret al., Ann.Rev. Immunol., 12:433-455 1994)) eller via immunoglobulin kjede-shuffling (se f.eks Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992), som begge herved er tatt med som referanse i deres helhet) hvor Fd eller VH-immunoglobulinet fra et valgt antistoff (f.eks 2B6) tillates å assosiere med et repertoar av lettkjede-immunoglobuliner, Vl (eller VK) for å danne nye FAB'er. Lettkjede immunoglobulinet fra et valgt antistoff kan tillates å assosiere med et repertoar av tungkjede immunoglobuliner, Vh (eller Fd) for å danne nye FAB'er. Nøytraliserende IL-5-FAB'er ble oppnådd når Fd av mAb 2B6 ble tillatt å assosiere med et repertoar av lettkjede-immunoglobuliner, som beskrevet mer detaljert i eksempel-avsnittet. Man kan altså gjenvinne nøytraliserende FAB'er med unike sekvenser (nukleotid og aminosyre) med kjede-shuffling-teknikken.

IV Interessante anti- IL- 5 aminosyre- og nukleotidsekvenser

mAb 2B6 eller andre antistoffer som er beskrevet ovenfor kan gi sekvenser, så som variable tung og/eller lettkjede peptidsekvenser, rammeverksekvenser, CDR-sekvenser, funksjonelle fragmenter og analoger derav, og nukleinsyresekvenser som koder for disse, som kan være nyttige ved design og anskaffelse av ulike endrede antistoffer som er karakterisert ved antigenbindingsspesifisiteten til donor-antistoffet.

Som et eksempel tilveiebringer således foreliggende oppfinnelse variable lettkjede og variable tungkjede-sekvenser fra det murine IL-5-antistoffet 2B6 og sekvenser avledet derfra. Den tungkjede variable regionen fra 2B6 er illustrert i fig. 1. De CDR-kodende regionene er indikert ved de innboksede områdene og er gitt i SEKV. ID. Nr: 7, SEKV. ID. Nr. 8 og SEKV. ID. Nr. 9. Den lettkjede-klon variable regionen til 2B6 er illustrert i fig. 2. De CDR-kodende regionene er gitt i SEKV. ID. Nr. 10, SEKV. ID. Nr. 11 og SEKV. ID. Nr: 12.

En humanisert tungkjede variabel region er illustrert i fig. 8 [SEKV. ID. Nr: 18 og 19]. Signalsekvensen er også gitt i SEKV. ID. Nr: 17. Andre egnede signalsekvenser, kjent av fagfolk innen feltet, kan erstatte signalsekvensene gitt her som eksempler. CDR-aminosyresekvensene i dette konstruktet er identisk med native murine og kimære tungkjede-CDR'ene, og er gitt ved SEKV. ID. Nr: 7, SEKV. ID. Nr: 8 og SEKV. ID. Nr: 9. Et eksempel på (syntetisk) humanisert lettkjede variable sekvens er illustrert i fig. 9 [SEKV. ID. Nr: 20 og 21].

Nukleinsyresekvensene ifølge denne oppfinnelsen, eller fragmenter derav, som koder for de variable lettkjede- og tungkjede-peptidsekvensene er også nyttige for mutagen introduksjon av spesifikke endringer innen nukleinsyresekvenser som koder for CDR'er eller rammeverk-regioner, og for inkorporering av den resulterende modifiserte eller fusjon-nukleinsyresekvensen i et plasmid for ekspresjon. F.eks ble stille substitusjoner i nukleotidsekvens til rammeverk-og CDR-kodende regioner anvendt for å skape restriksjonsenzymseter som forenkler insersjon av mutageniserte CDR- (og/eller rammeverk) regioner. Disse CDR-kodende regionene ble anvendt ved konstruksjonen av et humanisert antistoff ifølge denne oppfinnelsen.

I betraktning av degenerertheten av den genetiske koden kan ulike kodende sekvenser bli konstruert som koder for de variable tung- og lettkjede-aminosyresekvensene, og CDR-sekvensene ifølge oppfinnelsen så vel som funksjonelle fragmenter og analoger derav som deler antigenspesifisiteten til donor-antistoffet. De isolerte nukleinsyresekvensene ifølge denne oppfinnelsen, eller fragmenter derav, som koder for de variable kjede peptidsekvensene eller CDR'ene kan bli anvendt for å produsere endrede antistoffer, f.eks kimære eller humaniserte antistoffer, eller andre konstruerte antistoffer ifølge denne oppfinnelsen når de er operativt koblet til en andre immunoglobulinpartner.

Det skal bemerkes at i tillegg isolerte nukleinsyresekvenser som koder for deler av det endrede antisoffet og antistoffer beskrevet her, er andre slike nukleinsyresekvenser omfattet av foreliggende oppfinnelse, slik som de som er komplementære med de native CDR-kodende sekvensene eller komplementære med de modifiserte humane rammeverk-regionene som ligger omkring de CDR-kodende regionene. Nyttige DNA-sekvenser omfatter de sekvensene som hybridiserer til DNA-sekvensene under stringente hybridiseringsbetingelser [se T. Maniatis et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), sidene 387 til 389]. Et eksempel på en slik stringent hybridiseringsbetingelse er hybridisering ved 4xSSC ved 65°C, fulgt av vasking i 0,1xSSC ved 65°C i en time. Alternativt er et eksempel på stringent hybridiseringsbetingelse 50%formamid, 4xSSC ved 42°C. Fortrinnsvis er disse hybridiserende DNA-sekvensene minst 18 nukleotider lange, dvs. omtrent på størrelse med en CDR.

V. Endrede immunoglobulinmolekyler og endrede antistoffer

Endrede immunoglobulinmolekyler kan kode for endrede antistoffer som omfatter konstruerte antistoffer, så som kimære antistoffer og humaniserte antistoffer. En ønsket endret immunoglobulin-kodende region omfatter CDR-kodende regioner som koder for peptider som har antigenspesifisiteten til et IL-5-antistoff, fortrinnsvis et høy-affinitets antistoff så som de anskaffet ved foreliggende oppfinnelse, satt inn i en første immunoglobulinpartner (et humant rammeverk eller en human immunoglobulin variabel region).

Fortrinnsvis er den første immunoglobulinpartneren operativt koblet med en andre immunoglobulinpartner. Den andre immunoglobulinpartneren er definert ovenfor, og kan omfatte en sekvens som koder for et andre interessant antistoff, f.eks en Fc-region. Andre immunoglobulinpartnere kan også omfatte sekvenser som koder for et annet immunoglobulin, med hvilket den lett- eller tungkjede konstante regionen er fusert i ramme eller ved hjelp av en linkersekvens. Konstruerte antistoffer rettet mot funksjonelle fragmenter eller analoger av IL-5 kan bli designet for å utløse en økt binding med det samme antistoffet.

Den andre immunoglobulinpartneren kan også være assosiert med effektor-midler som definert ovenfor, omfattende ikke-protein-bærermolekyler, til hvilke den andre immunoglobulinpartneren kan være operativt koblet ved konvensjonelle midler.

Fusjon eller kobling mellom den andre immunoglobulinpartneren, f.eks antistoff-sekvenser, og effektormidlet kan gjøres ved alle egnede midler, f.eks konvensjonelle kovalente- eller ionebindinger, proteinfusjoner eller hetero-bifunksjonelle krysskoblere, f.eks karbodiimid-glutaraldehyd og liknende. Slike teknikker er kjent innen feltet, og lett beskrevet i konvensjonelle kjemi- og biokjemitekster.

I tillegg kan konvensjonelle linker-sekvenser som bare gir en ønsket mengde rom mellom den andre immunoglobulinpartneren og effektormidlet også være konstruert i den endrede immunoglobulin-kodende regionen. Designet av slike linkere er godt kjent for fagfolk innen feltet.

I tillegg kan signalsekvenser for molekylene ifølge oppfinnelsen bli modifisert for å øke ekspresjonen. Som et eksempel har det 2B6 humaniserte antistoffet med signalsekvensen og CDR'ene avledet fra den murine tungkjede-sekvensen, den originale signalsekvensen erstattet med en annen signalsekvens [SEKV ID NR: 17].

Et eksempel på et endret antistoff omfatter variabel tung- og/eller lettkjede peptid eller protein som har antigenspesifisiteten til mAb 2B6, f.eks Vh og Vi_-kjedene. Nok et annet ønskelig endret antistoff er karakterisert ved at aminosyresekvensen omfatter i det minste én, og fortrinnsvis alle CDR'ene fra den variable regionen av tung- og/eller lettkjedene fra det murine antistoff-molekylet 2B6 med de resterende sekvensene avledet fra en human kilde, eller et funksjonelt fragment eller en analog derav. Se f.eks de humaniserte VH- og Vi_-regionene (fig. 8 og 9).

Ved nok en ytterligere utførelsesform kan det konstruerte antistoffet ha festet til seg et ytterligere agens. For eksempel kan prosedyren av rekombinant DNA-teknologi bli anvendt for å produsere et konstruert antistoff ifølge oppfinnelsen, hvor Fc-fragmentet eller CH2 CH3-domenet fra et komplett antistoffmolekyl er erstattet med et enzym eller et annet detekterbart molekyl (dvs. et polypeptid-effektor- eller rapportør-molekyl).

Den andre immunoglobulinpartneren kan også være operativt koblet med et ikke-immunoglobulinpeptid, protein eller et fragment derav som er heterologt med de CDR-inneholdende sekvensene som har antigenspesifisiten til murin 2B6. Det resulterende proteinet kan utvise både anti-IL-5-antigen-spesifisitet og karakteristikker fra ikke-immunoglobulinet ved ekspresjon. Disse fusjonspartner-karakteristikkene kan f.eks være en funksjonell karakteristikk slik som et annet bindings- eller reseptordomene eller en terapeutisk karakteristikk hvis fusjonspartneren selv er et terapeutisk protein, eller ytterligere antigene karakteristikker.

Et annet ønskelig protein kan omfatte et fullstendig antistoffmolekyl, med fullengde tung- og lettkjeder, eller hvilke som helst diskrete fragmenter derav, så som Fab- eller F(ab,)2-fragmenter, en tungkjede-dimer eller hvilke som helst andre minimale rekombinante fragmenter derav, så som en Fv eller et enkel-kjede antistoff (SCA) eller hvilket som helst annet molekyl med den samme spesifisiteten som det valgte donor mAb, f.eks mAb 2B6 eller 2E3. Slike proteiner kan bli anvendt i form av et endret antistoff eller bli anvendt i ikke-fusert form.

Når den andre immunoglobulinpartneren er avledet fra et antistoff som er forskjellig fra donor-antistoffet, f.eks hvilken som helst isotype eller klasse av immunoglobulin-rammeverket eller konstante regioner, resulterer det i et konstruert antistoff. Konstruerte antistoffer kan omfatte immunoglobulin- (lg) konstante regioner og variable rammeverk-regioner fra en kilde, f.eks akseptor-antistoffet, og én eller flere (fortrinnsvis alle) CDR'ene fra donor-antistoffet, f.eks anti-IL-5-antistoffet som er beskrevet her. I tillegg kan endringer, f.eks delesjoner, substitusjoner eller addisjoner i akseptor-mAb lett og/eller tung variable domene rammeverk-regioner på nukleinsyre- eller aminosyrenivåer eller donor-CDR-regionene, bli laget for å beholde donor-antistoffets antigen-bindingsspesifisitet.

Slike konstruerte antistoffer er designet for å anvende en (eller begge) de variable tung- og/eller lettkjedene fra IL-5 mAb'et (eventuelt modifisert som beskrevet) eller en eller flere av de nedenfor identifiserte tung- eller lettkjede-CDR'ene (se også fig. 7). De konstruerte antistoffene ifølge oppfinnelsen er nøytraliserende, dvs. de blokkerer ønskelig binding til reseptoren for IL-5-proteinet og de blokkerer eller forhindrer også proliferasjon av IL-5-avhengige celler.

Slike konstruerte antistoffer kan omfatte et humanisert antistoff som inneholder rammeverk-regionene til et valgt humant immunoglobulin eller subtype, eller et kimært antistoff som inneholder de humane tung- og lettkjede konstante regionene fusert med IL-5-antistoff-funksjonelle fragmenter. Et egnet humant (eller annet dyr) akseptor-antistoff kan være ett valgt fra en konvensjonell database, f.eks KABAT®-database, Los Alamos-database og Swiss Protein database, ved homologi med nukleotid- og aminosyresekvensene til donor-antistoffet. Et humant antistoff som er karakterisert ved en homologi med rammeverk-regionene til donor-antistoffet (på aminosyrebasis) kan være egnet for å tilveiebringe en tungkjede konstant region og/eller en tungkjede variabel rammeverk-region for å sette inn donor CDR'er. Et egnet akseptor-antistoff som kan donere lettkjede konstante eller variable rammeverk-regioner kan bli valgt på en lignende måte. Det skal bemerkes at akseptor-antistoffets tung- og lettkjeder ikke må stamme fra det samme akseptor-antistoffet.

Det er ønskelig at de heterologe rammeverk- og konstante regionene er valgt fra humane immunoglobulinklasser og isotyper, så som IgG (subtypene 1 til 4), IgM, IgA og IgE. Akseptor-antistoffet behøver imidlertid ikke å omfatte bare humane immunoglobulinproteinsekvenser. Et gen kan for eksempel bli konstruert hvor en DNA-sekvens som koder for en del av en human immunoglobulin-kjede er fusert med en DNA-sekvens som koder for en ikke-immunoglobulin-aminosyresekvens slik som et polypeptid-effektor- eller repportør-molekyl.

Et eksempel på et spesielt egnet humanisert antistoff omfatter CDR'er fra 2B6 satt inn i rammeverk-regionene til en valgt human antistoff-sekvens. For nøytraliserende humaniserte antistoffer er en, to eller fortrinnsvis tre CDR'er fra IL-5 antistoff-tungkjede og/eller lettkjede variable regioner satt inn i rammeverk-regionene til den valgte humane antistoff-sekvensen, og erstatter den(de) native CDRen(e) til det siste antistoffet.

Det er foretrukket at et humanisert antistoff har de variable domenene fra både humane tung- og lettkjeder satt sammen av én eller flere CDR-erstatninger. Det er mulig å anvende alle seks CDR'ene, eller ulike kombinasjoner med færre enn seks CDR'er. Fortrinnsvis er alle seks CDR'ene erstattet. Det er mulig å bare erstatte CDR'ene i den humane tungkjeden, og anvende som lettkjede den umodifiserte lettkjeden fra det humane akseptorantistoffet. Som nok en mulighet kan en kompatibel lettkjede bli valgt fra et annet humant antistoff ved å anvende den konvensjonelle antistoff-databasen. Resten av det konstruerte antistoffet kan være avledet fra hvilket som helst egnet humant akseptor-immunoglobulin.

Det konstruerte humaniserte antistoffet har således en struktur som et naturlig humant antistoff eller et fragment derav, og utviser kombinasjonen av egenskaper som trengs for effektive terapeutiske anvendelser, f.eks behandling av IL-5-medierte inflammatoriske sykdommer hos mennesker, eller for diagnostiske formål.

Som et annet eksempel kan et konstruert antistoff omfatte tre CDR'er fra den variable lettkjede-regionen til 2E3 [SEKV ID NR 10, 11 og 13] og tre CDR'er fra den variable tungkjede-regionen til 2B6 [SEKV ID NR 7, 8 og 9]. Det resulterende humaniserte antistoffet blir karakterisert av den samme antigen-bindingsspesifisiteten og høy-affiniteten som mAb 2B6.

Fagfolk innen feltet vil forstå at et konstruert antistoff kan videre bli modifisert ved endringer i variabel domene aminosyrer uten nødvendigvis å påvirke spesifisiteten og høy-affiniteten fra donor-antistoffet (dvs. en analog). Det er forventet at tung- og lettkjede-aminosyrer kan bli erstattet med andre aminosyrer enten i de variable domene-rammeverkene eller CDFTene eller begge deler.

I tillegg kan den konstante regionen bli endret for å øke eller redusere valgte egenskaper til molekylene ifølge oppfinnelsen. For eksempel dimerisering, binding til Fc-reseptorer eller evnen til å binde og aktivere komplement (se f.eks Angal et al., Mol. Immunol 30:105-108 (1993), Xu et al., J. Biol. Chem, 269:3469-3474 (1994), Winter et al., EP 307, 434-B).

Et endret antistoff som er et kimært antistoff skiller seg fra de humaniserte antistoffene beskrevet ovenfor ved å tilveiebringe hele de ikke-humane donor-antistoff tungkjede og lettkjede variable regioner, inklusive rammeverk-regioner, i assosiasjon med humane immunoglobulin konstante regioner for begge kjedene. Det er forventet at kimære antistoffer som beholder ytterligere ikke-humane sekvenser i forhold til humaniserte antistoffer ifølge denne oppfinnelsen kan utløse en signifikant immunrespons hos mennesker.

Slike antistoffer er nyttige ved forebyggingen og behandlingen av IL-5-medierte forstyrrelser, som diskutert nedenfor.

VI. Produksjon av endrede antistoffer og konstruerte antistoffer

Fortrinnsvis er de variable lett- og/eller tungkjede-sekvensene og CDR'ene fra mAb 2B6 eller andre egnede donor-mAb'er (f.eks 2E3, 2F2, 4A6 etc.) og deres kodende nukleinsyresekvenser, anvendt ved konstruksjonen av endrede antistoffer, fortrinnsvis humaniserte antistoffer, ifølge foreliggende oppfinnelse, ved den følgende prosessen. Den samme eller lignende teknikker kan også bli anvendt for å generere andre utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse.

Et hybridoma som produserer et valgt donor-mAb, f.eks det murine antistoffet 2B6, er konvensjonelt klonet, og DNA'et for dets tung- og lettkjede variable regioner er oppnådd ved teknikker som er kjent for fagfolk innen feltet, f.eks teknikkene beskrevet i Sambrook et al., (Molecular Cloning (A Laboratory Manual) 2. utg, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)). De variable tunge og lette regionene av 2B6 som omfatter i det minste de CDR-kodende regionene og de deler av akseptor-mAb lette og/eller tunge variable domene rammeverk-regionene som er nødvendige for å beholde donor-mAb-bindingsspesifisiteten, så vel som de resterende immunoglobulin-avledete delene av antistoffkjeden som er avledet fra et humant immunoglobulin, er oppnådd ved å anvende polynukleotid-primere og revers-transkriptase. De CDR-kodende regionene er identifisert ved å anvende en kjent database, og ved sammenligning med andre antistoffer.

Et mus/menneske kimært antistoff kan så bli preparert og testet for bindingsevnen. Et slikt kimært antistoff omfatter hele de ikke-humane donor-antistoff VH- og VL-regionene, i assosiasjon med human lg-konstante regioner for begge kjedene.

Homologe rammeverk-regioner fra en tungkjede variabel region fra et humant antistoff ble identifisert ved å anvende elekroniske databaser, f.eks KABAT®, og et humant antistoff som har homologi med 2B6 ble valgt som akseptor-antistoffet. Sekvensene fra syntetiske tungkjede variable regioner som omfatter 2B6 CDR-kodende regioner innen de humane antistoff rammeverkene ble designet med optimale nukleotiderstatninger i rammeverk-regionene for å inkorporere restriksjonsseter. Denne designede sekvensen ble så syntetisert ved å anvende lange syntetiske oligomerer. Alternativt kan den designede sekvensen bli syntetisert med overlappende oligonukleotider, amplifisert ved polymerase-kjede-reaksjon (PCR), og korrigert forfeil.

En egnet lettkjede variabel rammeverk-region ble designet på en lignende måte.

Et humanisert antistoff kan bli avledet fra det kimære antistoffet, eller fortrinnsvis laget syntetisk ved å sette inn de donor-mAb CDR-kodende regionene fra tung- og lettkjedene riktig innen det valgte tung- og lettkjede rammeverket. Alternativt kan et humanisert antistoff ifølge oppfinnelsen bli laget ved å anvende standard mutageneseteknikker. Det resulterende humaniserte antistoffet omfatter således humane rammeverk-regioner og donor-mAb CDR-kodende regioner. Det kan bli gjort flere senere manipulasjoner på rammeverk-enheter. Det resulterende humaniserte antistoffet kan bli uttrykt i rekombinante vertsceller, f.eks COS-, CHO- eller myelomaceller. Andre humaniserte antistoffer kan bli fremstilt ved å anvende denne teknikken på andre egnede IL-5-spesifikke, nøytraliserende, høy-affinitet ikke-humane antistoffer.

En konvensjonell ekspresjonsvektor eller et rekombinant plasmid blir produsert ved å plassere disse kodende sekvensene for det endrede antistoffet i operativ assosiasjon med konvensjonelle regulatoriske kontrollsekvenser som kan kontrollere replikasjonen og eksepresjonen i, og/eller sekresjonen fra, en vertscelle. Regulatoriske sekvenser omfatter promotersekvenser, f.eks CMV-promoter, og signalsekvenser, som kan bli avledet fra andre kjente antistoffer. En andre ekspresjonsvektor kan på lignende vis bli produsert som har en DNA-sekvens som koder for en komplementær antistoff lett- eller tungkjede. Fortrinnsvis er denne andre ekspresjonsvektoren identisk med den første, bortsett fra de kodende sekvensene og selekterbare markører, for å sikre så langt som mulig at hver polypeptidkjede er funksjonelt uttrykt. Alternativt kan tung- og lettkjede-kodende sekvenser for det endrede antistoffet sitte på en enkel vektor.

En valgt vertscelle er ko-transfektert ved konvensjonelle teknikker med både den første og andre vektoren (eller bare transfektert med en enkelt vektor) for å skape den transfekterte vertscellen ifølge oppfinnelsen som omfatter både de rekombinante eller syntetiske lett- og tungkjedene. Den transfekterte cellen blir så dyrket ved konvensjonelle teknikker for å produsere det konstruerte antistoffet ifølge oppfinnelsen. Det humaniserte antistoffet som inkluderer assosiasjonen av både den rekombinante tungkjeden og/eller iettkjeden er undersøkt i kulturen ved egnede tester, så som ELISA eller RIA. Lignende konvensjonelle teknikker kan bli anvendt for å konstruere andre endrede antistoffer og molekyler ifølge denne oppfinnelsen.

Egnede vektorer for kloningen og subkloningstrinnene anvendt ved metodene og konstruksjonen av preparatet ifølge denne oppfinnelsen kan bli valgt av fagfolk innen feltet. F. eks kan de konvensjonelle pUC-seriene av kloningsvektorer bli anvendt. En anvendt vektor er pUC19, som er kommersielt tilgjengelig fra leverandører, så som Amersham (Buckinghamshire, United Kingdom) eller Pharmacia (Uppsala, Sverige). I tillegg kan alle vektorer som replikerer raskt, har mange kloningsseter og selekterbare gener (f.eks antibiotika-resistens) og som er enkle å manipulere bli anvendt for kloning. Valget av kloningsvektor er således ikke en begrensende faktor ved denne oppfinnelsen.

På lignende vis kan vektorene som er anvendt for ekspresjon av de konstruerte antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse bli valgt av fagfolk innen feltet fra hvilken som helst konvensjonell vektor. Vektorene inneholder også valgte regulatoriske sekvenser (så som CMV-promotere) som styrer replikasjonen og ekspresjonen av heterologe DNA-sekvenser i valgte vertsceller. Disse vektorene omfatter de ovenfor beskrevne DNA-sekvensene som koder for de konstruerte antistoffene eller endrede immunglobulin-kodende-regioner. I tillegg kan vektorene inkorporere de valgte immunoglobulinsekvensene som er modifisert ved insersjonen av ønskede restriksjonsseter for enkel manipulering.

Ekspresjonsvektorene kan også bli karakterisert ved gener som er egnet for å amplifisere ekspresjonen av de heterologe DNA-sekvensene, f.eks det mammalske dihydrofolat-reduktasegenet (DHFR). Andre foretrukne vektorsekvenser omfatter en polyA-signalsekvens, slik som fra bovint veksthormon (BGH) og betaglobin-promotersekvensen (betaglopro). Ekspresjonsvektorene som er nyttige her kan bli syntetisert ved teknikker som er velkjent for fagfolk innen feltet.

Komponentene i slike vektorer, f.eks replikoner, seleksjonsgener, enhancere, promotere, signalsekvenser og lignende kan bli oppnådd fra kommersielle eller naturlige kilder, eller syntetisert ved kjente prosedyrer, for anvendelse ved dirigering av ekspresjon og/eller sekresjon av produktet fra det rekombinante DNAet hos en valgt vert. Andre egnede ekspresjonsvektorer av ulike typer kjent innen feltet pattedyr-, bakterie-, insekt-, gjær- og sopp-ekspresjon kan også bli valgt for dette formålet.

Den foreliggende oppfinnelsen omfatter også en cellelinje som er transfektert med et rekombinant plasmid som inneholder de kodende sekvensene for de konstruerte antistoffene eller endrede immunoglobulinmolekyler derav. Vertsceller som er nyttige ved kloningen og andre manipulasjoner av disse kloningsvektorene er også konvensjonelle. Det er imidlertid mest ønskelig at celler fra ulike stammer av E. coli anvendes for replikasjon av kloningsvektoren og andre trinn ved konstruksjonen av endrede antistoffer ifølge denne oppfinnelsen.

Egnede vertsceller eller cellelinjer for ekspresjon av det konstruerte antistoffet eller endrede antistoff ifølge oppfinnelsen, er fortrinnsvis mammalske celler så som CHO-, COS-, fibroblastcelle (f.eks 3T3) og myeloide celler, og mest foretrukket en CHO eller en myeloid celle. Humane celler kan bli anvendt, og således sikre molekylet å bli modifisert med humant glykosyleringsmønster. Alternativt kan andre eukaryote cellelinjer bli benyttet. Seleksjonen av egnede mammalske vertsceller og metoder for transformasjon, dyrking, amplifikasjon, undersøkelse og produktproduksjon og rensing er velkjent i feltet. Se f.eks Sambrook et al., referert ovenfor.

Bakterieceller kan vise seg nyttig som vertsceller som er egnet for ekspresjon av de rekombinante Fab'ene ifølge foreliggende oppfinnelse (se f.eks Pluckthun, A., Immunol. Rev., 130:151-188 (1992)). På grunn av tendensen proteiner som er uttrykt i bakterieceller har til å være i en ikke-foldet eller galt foldet form eller i en ikke-glykosylert form, vil imidlertid hvilken som helst rekombinant Fab som er produsert i en bakteriecelle måtte bli undersøkt for opprettholdelse av antigen-bindingsevne. Hvis molekylet som var uttrykt fra bakterieceller var produsert i en riktig foldet form vil bakteriecellen være en ønskelig vert. F. eks er ulike stammer av E. coli som er anvendt for ekspresjon velkjent som vertsceller på feltet bioteknologi. Ulike stammer av B. subtilis, Streptomyces, andre bacilli og lignende, kan også bli anvendt ved denne metoden.

Når det er ønskelig er også stammer av gjærceller kjent for fagfolk innen feltet tilgjengelig som vertsceller, så vel som insektsceller, f. eks Drosophila og Lepidoptera og virale ekspresjonssystemer. Se f.eks Miller et al., Genetic Engineering 8:277-298, Plenum Press (1986) og referanser der.

De generelle metodene ved hvilke vektorene ifølge oppfinnelsen kan bli konstruert, transfeksjonsmetodene som trengs for å produsere vertscellene ifølge oppfinnelsen og dyrkingsmetoder som er nødvendige for å produsere det endrede antistoffet ifølge oppfinnelsen fra slike vertsceller, er alle konvensjonelle teknikker. Likeledes, når de er produsert kan de endrede antistoffene ifølge oppfinnelsen bli renset fra cellekulturinnholdet i samsvar med standard prosedyrer innen feltet, omfattende ammoniumsulfat-presipitering, affinitetskolonner, kolonnekromatografi, gel-elektroforese og lignende. Slike teknikker er kjent for fagfolk innen feltet og begrenser ikke denne oppfinnelsen.

Nok en annen metode for å uttrykke de humaniserte antistoffene kan utnytte ekspresjonen i et transgent dyr, slik som beskrevet i US patentsøknad nr. 4 873 316. Dette angår et ekspresjonssystem som anvender dyrets kasein-promoter som når den er transgent inkorporert i et pattedyr tillater hunnen å produsere det ønskede rekombinante proteinet i sin melk.

Når det er produsert ved den ønskede metoden blir det konstruerte antistoffet undersøkt for in wYro-aktivitet ved anvendelse av en egnet test. Nåværende konvensjonelle ELISA-testformater er anvendt for å måle kvalitativ og kvantitativ binding av det konstruerte antistoffet til IL-5. I tillegg kan andre in v/Yro-tester også bli anvendt for å bekrefte nøytraliseringseffektiviteten forut for påfølgende humane klinikk-studier som er utført for å evaluere bevaringen av det konstruerte antistoffet i kroppen til tross for de normale rensemekanismene.

Ved å følge prosedyrene som er beskrevet for humaniserte antistoffer produsert fra 2B6, kan fagfolk innen feltet også konstruere humaniserte antistoffer fra andre donor-IL-5-antistoffer, variable regionsekvenser og CDR-peptider beskrevet her. Konstruerte antistoffer kan bli produsert med variable region-rammeverk som har mulighet til å bli gjenkjent som "selv" av mottagere av det konstruerte antistoffet. Mindre modifikasjoner i de variable region-rammeverkene kan bli innført for å gi en større økning i antigenbinding uten å nevneverdig øke immunogenisiteten for mottageren. Slike konstruerte antistoffer kan effektivt behandle et menneske for IL-5-medierte tilstander. Slike antistoffer kan også være nyttige ved diagnose av slike tilstander.

VII. Terapeutiske/ forebyggende anvendelser

Det beskrives også en metode for å behandle mennesker som har eosinofili-relaterte symptomer, så som astma, som omfatter administrering av en effektiv dose antistoffer, inklusive ett eller flere av de konstruerte antistoffene eller endrede antistoffene beskrevet her, eller fragmenter derav.

Den terapeutiske responsen som blir fremkalt ved anvendelse av molekylene ifølge denne oppfinnelsen er produsert ved bindingen til human IL-5, og blokkerer således eosinofil-stimulering. Molekylene ifølge foreliggende oppfinnelse, når de er i preparater og formularer som er egnet for terapeutisk anvendelse, er således meget nyttige for de personene som har en allergisk og/eller atopisk respons, eller en respons som er assosiert med eosinofili, så som, men ikke begrenset til, allergisk rinitt, astma, kronisk eosinofil-lungebetennelse, allergisk bronkopulmonar aspergillose, cøliaki, eosinofil gastroenteritt, Churg-Strauss-syndrom (periarteritt nodosa pluss atopi), eosinofil myalgi-syndrom, hypereosinofil-syndrom, ødemreaksjoner omfattende episodisk angiodema, innvollsorm-infeksjoner, hvor eosinofiler kan ha en beskyttende rolle, onkocercal dermatitt og atopisk dermatitt.

De endrede antistoffene, antistoffene og fragmenter derav ifølge denne oppfinnelsen kan også bli anvendt sammen med andre antistoffer, spesielt humane mAb'er som er reaktive mot andre markører (epitoper) som er ansvarlige for forstyrrelsen som det konstruerte antistoffet i oppfinnelsen er rettet mot.

De terapeutiske agensene ifølge foreliggende oppfinnelse er antatt å være nyttige ved behandling av allergiske tilstander fra omtrent 2 dager til omtrent 3 uker, eller ved behov. Lengre behandlinger kan f.eks være ønskelig ved behandling av sesong-rinitt eller lignende. Dette representerer en betydelig fordel fremfor den nåværende anvendte infusjonsprotokollen med kjente behandlinger av IL-5-medierte sykdommer. Dosen og varigheten av behandlingen relaterer seg til den relative varigheten av molekylene ifølge foreliggende oppfinnelse i den human sirkulasjonen, og kan bli tilpasset av fagfolk innen feltet, avhengig av tilstanden som behandles og pasientens generelle helse.

Administreringsmåten for det terapeutiske midlet ifølge oppfinnelsen kan være en hvilken som helst egnet rute som avleverer midlet til verten. De endrede antistoffene, antistoffene, konstruerte antistoffene og fragmentene derav og farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen er spesielt nyttige for parenteral administrering, dvs. subkutant, intramuskulært, intravenøst eller intranasalt.

Terapeutiske midler ifølge oppfinnelsen kan bli fremstilt som farmasøytiske preparater som omfatter en effektiv mengde av det konstruerte (f.eks humaniserte) antistoffet ifølge oppfinnelsen som en aktiv ingrediens i en farmasøytisk aksepterbar bærer. I det forebyggende midlet ifølge oppfinnelsen er en vandig suspensjon eller løsning som omfatter det konstruerte antistoffet, fortrinnsvis buffret ved fysiologisk pH, i en form som er enkel å injisere foretrukket. Preparatene for parenteral administrering vil vanligvis omfatte en løsning av det konstruerte antistoffet ifølge oppfinnelsen eller en blanding av disse løst i en farmasøytisk aksepterbar bærer, fortrinnsvis en vandig bærer. En rekke vandige bærere kan bli anvendt, f.eks 0,4% saltløsning, 0,3% glycin og lignende. Disse løsningene er sterile og generelt fri for partikler. Disse løsningene kan bli sterilisert ved konvensjonelle, velkjente steriliseringsteknikker (f.eks filtrering). Preparatene kan omfatte farmasøytisk aksepterbare hjelpesubstanser som nødvendig for å få tilnærmet fysiologiske betingelser, så som pH-justerende og buffrende midler, osv. Konsentrasjonen av antistoffet ifølge oppfinnelsen i et slikt farmasøytisk preparat kan variere vidt, dvs. fra mindre enn omtrent 0,5%, vanligvis ved eller i det minste omtrent 1% til så mye som 15 eller 20% av vekten, og vil bli valgt primært utifrå væskevolumer, viskositet osv, i samsvar med den valgte måten å adminstrere på.

Et farmasøytisk preparat ifølge oppfinnelsen for intramuskulær injeksjon kan således bli fremstilt til å inneholde 1 ml_ sterilt buffret vann, og mellom omtrent 1ng til omtrent 100 mg, f.eks omtrent 50 ng til omtrent 30 mg, eller mer foretrukket omtrent 5 mg til omtrent 25 mg av det konstruerte antistoffet ifølge oppfinnelsen. På lignende vis kan et farmasøytisk preparat ifølge oppfinnelsen for intravenøs infusjon bli laget til å inneholde omtrent 250 ml steril Ringers løsning, og omtrent 1 til omtrent 30, og foretrukket 5 mg til omtrent 25 mg av et konstruert antistoff ifølge oppfinnelsen. Aktuelle metoder for å fremstille parenterale administrerbare preparater er velkjent eller vil være klare for fagfolk innen feltet, og er beskrevet mer detaljert i f.eks Remington's Pharmaceutical Science, 15.utg, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.

Det er foretrukket at det terapeutiske midlet ifølge oppfinnelsen, når det er

i et farmasøytisk preparat, er tilstede i enhetsdoseformer. Den egnede terapeutisk effektive dosen kan lett bli bestemt av fagfolk innen feltet. For effektivt å behandle en inflammatorisk forstyrrelse hos et menneske eller et annet dyr bør en dose på omtrent 0,1 mg til omtrent 20 mg per 70 kg kroppsvekt av et protein eller et antistoff ifølge denne oppfinnelsen administreres parenteralt, fortrinnsvis /.veller i.m. (intramuskulært). En slik dose kan hvis nødvendig bli repetert ved egnede tidsintervaller valgt som passende av en lege under inflammasjonsresponsen.

De endrede antistoffene og konstruerte antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også bli anvendt ved diagnostiske regimer, så som for bestemmelse av IL-5-medierte forstyrrelser eller for å følge progresjonen ved behandling av slike forstyrrelser. Som diagnostiske reagenser kan disse endrede antistoffene være konvensjonelt merket for anvendelse i ELISA og andre konvensjonelle testformater for måling av IL-5-nivåer i serum, plasma eller andre egnede vev, eller frigjøring av humane celler i kultur. Typen tester ved hvilke de endrede antistoffene anvendes er konvensjonelle.

En utførelsesform av foreliggende oppfinnelse angår således en metode for å hjelpe diagnose av allergier og andre forstyrrelser assosiert med overskuddsproduksjon av eosinofiler hos en pasient som omfatter trinnene bestemmelse av mengden av human IL-5 i prøven (plasma eller vev) tatt fra nevnte pasient, og sammenligne nevnte bestemte mengde med den gjennomsnittelige mengden av human IL-5 i normal-populasjonen, idet tilstedeværelse av en signifikant forhøyet mengde av IL-5 i pasientens prøve er en indikajson på allergier og andre forstyrrelser som er assosiert med en overskuddsproduksjon av eosinofiler.

Antistoffer, endrede antistoffer eller fragmenter derav som er beskrevet her kan bli lyofilisert for lagring, og rekonstituert i en egnet bærer før bruk. Denne teknikken har vist seg å være effektiv med konvensjonelle immunoglobuliner, og lyofiliserings- og rekonstitueringsteknikker som er kjent innen feltet kan bli anvendt.

De følgende eksemplene illustrerer ulike aspekter av denne oppfinnelsen, omfattende konstruksjonen av eksempler på konstruerte antistoffer og ekspresjon av dette i egnede vektorer og vertsceller, og er ikke å bli forstått som begrensende for omfanget av denne oppfinnelsen. Alle aminosyrer er identifisert ved konvensjonelle tre-bokstav- eller enkel-bokstavkoder. Alle nødvendige restriksjonsenzymer, plasmider og andre reagenser og materialer ble anskaffet fra kommersielle kilder dersom ikke annet er angitt. All generell kloningsligering og annen rekombinant DNA-metodikk ble utført som i T. Maniatis et al., sitert ovenfor, eller den andre utgaven av denne (1989) red. Sambrook et al., av den samme utgiveren ("Sambrook et al.,")

Eksempel 1 - Produksjon av mAb' er mot hlL- 5

Human IL-5 ble uttrykt i Drosophila Schneider 2- (S2) celler og renset til homogenitet. Murin IL-5 ble uttrykt i Baculovirus ved å anvende Spodoptera frugiperda 21 - (Sf21) celler og renset til homogenitet. Monoklonalt antistoff TRFK-5 (et nøytraliserende rotte anti-mus IL5-antistoff) ble anskaffet fra Genzyme Corp. (Cambridge, MA).

A. Immuniseringsprosedyre:

Rekombinant human IL-5 (IL-5) ble anvendt som immunogenet for et panel på syv CAF1 hunnmus (Charles River, Wilmington, MA). Dyrene mottok tre subkutane injeksjoner av IL-5 i fosfat-buffret saltløsning (PBS) emulgert i en til en forhold av TiterMAX™ (CytoRx Corp., Norcross, GA) over en periode på fire månder. Den primende antigen-dosen var på 50 jag (mikrogram) og booster var 25 og 10|ig (mikrogram). Etter boostingen ble serumprøver samlet og testet både for binding til IL-5 og for nøytraliserende aktivitet via reseptorbindingsinhiberingstesten og B13-proliferasjonstesten (eller IL-5 nøytraliserende test (eksempel 2C)). Alle musene produserte serum-prøver som bandt IL-5. Dyr valgt som milt-donorer ble boostet intravenøst med 10 |xg (mikrogram) rekombinant-IL5 tre dager før eutanasi.

B. Hybridomautvikling:

Fusjonsprosedyren, først rapportert av Kohler et al., (Nature, 256:495

(1975)) ble anvendt med modifikasjoner for å utføre teknikken som anvender et monolag av celler (Kennet et al., red., "Hybridomas: A new dimension in biological analysis", s. 368-377, Plenum Press, New York). Miltceller fra to donor-mus ble samlet og fusjoner utført ved å anvende et forhold på 50 millioner miltceller til ti millioner SP2/0/Ag14-myelomaceller. Supernatanter fra fusjonspositive brønner ble testet for binding til IL-5 ved ELISA. Brønner som inneholder celler som produserer antistoff mot IL-5 ble ekspandert, og supernatanter undersøkt i en IL-5-reseptorbinding-inhiberingstest og en B13-(nøytralisering) proliferasjonstest (beskrevet nedenfor).

Seksten hybridomer ble isolert som sekreterte mAb'er som var reaktive mot IL-5. Hybridoma-supernatantene ble blandet med jodert IL-5, satt til et membranekstrakt preparert fra Drosophila- ceWer som uttrykker a-kjeden av IL-5-reseptoren (IL-5R), og testet for inhibering av reseptorbinding. Elleve av hybridomsupernatantene inhiberte med mer enn 60% bindingen av jodert IL-5 til a-kjeden av IL-5-reseptoren. Tre av mAb'ene, 2B6, 2E3 og 2F2, inhiberte også med mer enn 70% proliferasjonen av murine B13-celler som respons på human, men ikke murin, IL-5. Fem av hybridomene, hvorav fire blokkerte binding og/eller proliferasjon (1C6, 2B6, 2E3 og 2F2) og en var ikke-nøytraliserende (24G9) ble gjentatt subklonet i soft-agar for å danne stabile klonale cellelinjer. Supernatanter fra de klonede linjene ble undersøkt for kryssreaktivitet ved ELISA, og bandt ikke human IL-1a, IL-1p\ IL-4, IL-8, M-CSF eller TGFa. mAb'ene ble renset og bindingsaffinitetene ble estimert fra optisk biosensor-(BIAcore) analyse til å ligge fra 10 til 100 pM. Supernatanter fra de linjene ble isotypet ved å anvende murine isotype reagenser (PharMingen, San Diego, CA). Et sammendrag av affinitetene og IC5o for nøytraliserende aktiviteter av mAb'ene er gitt i tabell I (eksempel 2).

Ved lignende metoder ble rotte-hybridomer avledet fra immuniserte rotter, ved å anvende en sammenlignbar immuniseringsprotokoll og rotte-myelomer, for fusjonen som beskrevet for musen. To rotte-hybridomer, 4A6 og 5D3 ble identifisert som produserte mAb'er som bandt IL-5. Som for mAb'ene 2B6, 2E3 og 2F2 ble mAb'ene 4A6 og 5D3 funnet å være nøytraliserende i B13-testen beskrevet nedenfor.

C. Hybridomdeponering

Hybridomcellelinjen SK119-2B6,206,75(1) som produserer monoklonalt antistoff 2B6 ble deponert i American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA med aksesjonsnummer HB 11783, og er akseptert som patent-deponert i samsvar med Budapest-traktaten av 1977 som dekker deponering av mikroorganismer for patentprosedyre.

Hybridomcellelinjen SK119-2E3,39,40,2 som produserer monoklonalt antistoff 2E3 ble deponert i American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA med aksesjonsnummer HB 11782, og er akseptert som patent-deponert i samsvar med Budapest-traktaten av 1977 som dekker deponering av mikroorganismer for patentprosedyre.

Hybridomcellelinjen SK119-2F2,37,80,12 som produserer monoklonalt antistoff 2F2 ble deponert i American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA med aksesjonsnummer HB 11781, og er akseptert som patent-deponert i samsvar med Budapest-traktaten av 1977 som dekker deponering av mikroorganismer for patentprosedyre.

Hybridomcellelinjen SK119-24G9,8,20,5 som produserer monoklonalt antistoff 14G9 ble deponert i American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA med aksesjonsnummer HB 11780, og er akseptert som patent-deponert i samsvar med Budapest-traktaten av 1977 som dekker deponering av mikroorganismer for patentprosedyre.

Hybridomcellelinjen 4A6(1)G1F17 som produserer monoklonalt antistoff 4A6 ble deponert i American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA med aksesjonsnummer HB 11943, og er akseptert som patent-deponert i samsvar med Budapest-traktaten av 1977 som dekker deponering av mikroorganismer for patentprosedyre.

Hybridomcellelinjen 5D3(1)F5D6 som produserer monoklonalt antistoff 5D3 ble deponert i American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA med aksesjonsnummer HB 11942, og er akseptert som patent-deponert i samsvar med Budapest-traktaten av 1977 som dekker deponering av mikroorganismer for patentprosedyre.

Eksempel 2 - Tester

A. ELISA:

Individuelle brønner av MaxiSorb™ immunoplater (Nunc, Naperville, IL) ble kledd med 0,2 jag IL-5 i 0.05M karbonatbuffer pH 9,6. Etter inkubering over natt ved 4°C ble platene renset med PBS som inneholder 0,025% Tween® 20, og blokkert med 1% BSA i PBS med 0,025% Tween® 20 i to timer ved romtemperatur. Ufortynnede hybridsupernatanter ble satt til de IL-5-kledde brønnene og inkubert ved romtemperatur i to timer. Etter at platene var skyllet ble peroksidase-merket geit anti-mus IgG & IgM (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) satt til ved 1/7500-fortynning i PBS med 1% BSA og 0,025% Tween® 20. To timer senere ble platene vasket og 0,2 ml 0,1 M citratbuffer pH 4,75 omfattende 0,1% urea-peroksid og 1 mg/ml ortofenylendiamin satt til. Etter 15 minutter ble platene lest ved 450 nm på en VMax™ mikrotiterplate-leser

(Molecular Devices, Menlo Park, CA)

B. Reseptorbinding- inhiberingstest:

Membranekstrakter fra Drosophila- S2- ce\\ er som uttrykker a-kjeden fra den humane IL-5-reseptoren (IL-5R) ble anvendt for å måle effekten av antistoff på IL-5-binding til reseptoren. For å preparere membranene ble 10<9> celler pelletert ved 1000 x g ved 4°C i 10 minutter. Cellepelleten ble frosset i et tørris/etanol-bad i 15 minutter. Pelleten ble tint, resuspendert i 10 ml PBS ved

4°C og pelletert ved 1000 x g i 10 minutter. Cellepelleten ble vasket 2X i PBS og resuspendert i 13,5 ml hypotonisk buffer (10mM Tris pH 7,5, 3mM MgCI2, 1 mM ditiotreitol, 1 mM fenylmetylsulfonyl-fluorid, 1 |iM leupeptin, 1 \ iM pepstatin A) og inkubert på is i fem minutter. Cellesuspensjonen ble homogenisert i en 15 ml Dounce homogenisator og gitt en endelig konsentrasjon på 0,25 M sukrose med

en løsning på 2,5 M sukrose. Celleavfall ble fjernet ved 15 minutter sentrifugering ved 1000 x g. Cellemembraner ble pelletert ved 100.000 x g ved 4°C i 90 minutter, og resuspendert i 50 ml 10mM Tris pH 7,5, 3 mM MgCl2, 250 mM sukrose, og lagret ved -70°C.

Tester med DrosopMa-membraner som inneholder reseptor ble utført i MultiscreenGV™-plater (Millipore Corp., Bedford, MA) ved å anvende Drosophila vevskultur-medium M3 (Lindquist et al., Drosophila Inf. Serv., 58:163 (1982)) omfattende 25 mM HEPES-buffer pH 7,2 og 0,1% BSA (bindingsbuffer). Brønner ble pre-blokkert med 0,1 ml bindingsbuffer. 50uJ av testprøven, i triplikat, ble satt til brønnene, fulgt av 25 uJ jodert (<125>l) IL-5. Etter 20 minutters inkubering ved romtemperatur ble 25 jil av membran-ekstraktet fra Drosophila-S2-celler som uttrykker a-kjeden av den humane IL-5R satt til brønnene. Etter 1 time videre inkubering ble membranene samlet ved vakuum-filtrering og vasket tre ganger med bindingsbuffer. Filterene ble tørket og tellet.

C. IL- 5- nøytraliseringstest:

Den murine IL-5/IL-3-avhengige cellelinjen LyH7.B13 (B13) ble anskaffet fra R. Palacios, Basel Institute of Immunology, Sveits. Cellene ble sub-dyrket to ganger i uken i RPMI 1640-medium (GibcoBRL, Renfrewshire, UK), tilsatt L-glutamin, ikke-essenielle aminosyrer, natrium-pyruvat, penicillin-streptomycin (alt fra GibcoBRL), pluss 2-merkaptoetanol (5 x 10'<5>M, Sigma), 10% fetalt kalveserum (Globepharm, Surrey, UK) og 1 -10 enheter murin IL-5. For testing ble celler dyrket i 48 timer i triplikater (5000 celler/brønn) i 96-brønner rund-bunn-plater ved tilstedeværelse av passende fortynnede testprøver og pulset med 0,5 u.Ci <3>H-tymidin (Amersham, Bucks, UK) i de siste fire timene. De ble analysert ved scintillasjonstelling i en 1205 Betaplate (LKB Wallac, Beds, UK.

D. Optisk biosensor:

Kinetikk og likevektsbindingsegenskaper med immobilisert hlL-5 og antistoffer ble målt ved å anvende en BIAcore optisk biosensor (Pharmacia Biosensor, Uppsala, Sverige). Kinetikk-data ble evaluert ved å anvnede forhold som er beskrevet tidligere (Karlsson et al., J. Immunol. Meth. 145:229-240

(1991)) og som herved er tatt med som referanse i sin helhet.

Tre av de nøytraliserende mAb'ene, 2B6, 2E3 og 2F2 hadde veldig like egenskaper ved inhibering av <125>l-IL-5-binding til membranreseptor og nøytralisering av B-celle-proliferasjon, og hadde også veldig like affiniteter for IL-5- (se tabell I). Nukleotidsekvensen til VH og VL fra disse tre mAb'ene, hhv. 2 IgGi og 1 lgG2a, ble bestemt. Sekvensene oppnådd var veldig like, bare ulike ved noen få enheter.

Eksempel 3: Isolering oa karakterisering av IL- 5- Fab' er fra kombinatoriske biblioteker

A. PCR og kombinatorisk bibliotekkonstruksjon:

RNA renset fra miltene fra tre mus ble revers transkribert med en cDNApakke -(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) ved å anvende enten primeren (dT)15 som var levert med pakken eller 3Td (lgG1, lgG2a & lgG3) og kappa lettkjede-primere som beskrevet av Huse et al., (Science, 246:1275

(1989)) og Kang, S.A. (Methods: Companion Methods Enzymol., 2:111 (1991)) som herved er tatt med som referanse i deres helhet. Immunoglobulin cDNA ble amplifisert ved PCR ved å anvende primerene og de varmesyklus-betingelsene som beskrevet (Huse et al., supra). Hot sfarf-teknikken ved å anvende AmpliWax™ PCR Gem 100- (Perkin Eimer Cetus, Norwalk, CT) kuler og leverandørens protokoller ble anvendt for alle reaksjonene. PCR-produktene ble gel-renset, kuttet og ligert i pMKFabGene3-vektoren (Ames et al., J. Immunol., 152:4572 (1994)). Bibliotek-titeren etter ligering med Fd cDNA var 5,1 X 10<7 >CFU, og etter ligering med kappa cDNA s 1,5 X 10<6> CFU. XL1-Blue-celler (Stratagene, La Jolla, CA) som var transformert med fagmid-biblioteket, ble infisert med hjelpefag VCSM13 (Stratagene) og fag ble preparert som beskrevet av Barbas and Lemer (Methods: Companion Methods Enzymol., 2:119 (1991)).

B. Biopanning:

Fire mikrotiter-brønner (Immulon II Removal Strips, Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, VA) ble kledd natten over ved 4°C med IL-5 (1 u.g/brønn) i 0,1 M bikarbonat pH 8,6. Brønnene ble vasket med vann og blokkert med PBS inneholdende 3% BSA ved 37°C i en time. Blokkeringsløsningen ble fjernet og biblioteket satt til mikrotiter-brønnene (50 uJ/brønn) og inkubert ved 37°C i to timer. Brønnene ble vasket 10 ganger med TBS/Tween® (50mM Tris-HCI, pH 7,5,150 mM NaCI, 0,5% Tween® 20) og en gang med H20 før eluering av den adherente fagen med 0,1 M HCI, justert til pH 2,2 med glycin, omfattende 1 mg/ml BSA.

C. Koloni- løft

Koloni-løft fra kloner som var isolert fra den tredje- og fjerde runden med biopanning ble behandlet som beskrevet (Barbas and Lerner, supra). Filtere ble inkubert i en time ved romtemperatur med 0,5 -1,0 uCi <125>l-IL-5, som var jodert ved å anvende Bolton-Hunter-reagenset (NEN, Billerica, MA) ved å følge leverandørens prosedyre, i PBS inneholdende 1% BSA, vasket med PBS 0,25% Tween og eksponert til Kodak XAR-film. Kolonier som uttrykker IL-5-reaktive FAB'er ble detektert ved audioradiografi.

D. Fremstilling av løselige FAB' er

Fagmid-DNA ble kuttet med Nhel og Spel for å fjerne gen III og ligert med seg selv. XL1-Blue-celler ble transformert og isolerte kloner ble dyrket natten over ved 37°C i 5,0 ml super broth- (SB) medium (30 g trypton, 20 g gjær-ekstrakt, 10 g 3-[N-morfolino]propansulfonsyre, MOPS med pH justert til 7) omfattende 1% glukose og 50 fig/ml carbenicillin. Celler fra 1 ml av denne kulturen ble pelletert ved 3500 rpm i 10 minutter i Beckman GS-6R-sentrifuge, og anvendt for å inokulere 5 ml SB omfattende 50 (ig/ml carbenicillin. Kulturene ble ristet i en time ved 37°C, isopropyl-b-D-tiogalaktopyranosid (IPTG; 1mM) ble tilsatt og kulturene ble overført til 28°C natten over. Løselige Fab'er ble preparert fra periplasmatiske ekstrakter ved å lysere cellepelleten i 20 minutter ved 4°C i 20% sukrose, suspendert i 30 mM Tris pH 8,0, fulgt av sentrifugering i en mikrofuge i 10 minutter. Fab-konsentrasjoner ble estimert ved Western-blott ved sammenligning med prøver med kjente mengder murin Fab. De forskjellige bakterielle periplasmatiske ekstraktene inneholdt lignende konsentrasjoner av Fab, i området fra 1 til 20 |ig/ml, som beregnet ved Western-blott-analyse.

E. Rensing av FAB' er:

Et chelaterende peptid ble konstruert på den karboksyterminale enden av tungkjeden til hjelp ved proteinrensingen. Etter fjerning av den M13-genlll-kodende regionen, via kutting med Nhel og Spel, ble et par med overlappende oligonukleotider:

[SEKV ID NR: 43] 5-CTAGCCACCACCACCACCACCACTAA-3<*>

[SEKV ID NR: 44] 3'-GGTGGTGGTGGTGGTGGTGATTGATC-5' som koder for seks histidin-enheter subklonet inn i Fab-ekspresjonsvektoren. Induksjon av Fab-ekspresjon ble utført som beskrevet ovenfor. Etter overnatt induksjon ved 28°C ble periplasmatisk lysat av cellepelleten preparert ved 30 min. inkubering ved 4°C i 20% sukrose, 30 mM TRIS pH 8,0. Urea og Brij-35-detergent ble satt til den rensede supernatanten til endelige konsentrasjoner på hhv. 2M og 1%. Etter omrøring ved romtemperatur i 1 time ble den behandlede og klarede supernatanten ved 0,5 ml/min satt direkte på en 5 ml Nikkel-NTA metall-chelaterende kolonne (1,5 x 3 cm) ekvilibrert med buffer A (100 mM Na-fosfat, 10 mM Tris, 0,3 M NaCI, 2 M urea, pH 8,0). Etter en 4 x kolonnevolum (20 ml) vask ble bundet materiale eluert med 6 kolonnevolum (30ml) revers-pH-gradient fra

pH 8 til pH 4 i den samme bufferen som ovenfor. De rensede Fabene ble eluert fra kolonnen med en skarp symmetrisk topp ved pH 5,5. De var > 90% rene, og frie for DNA.

F. FAB ELISA:

Immulon ll-plater (Dynatech) ble belagt over natt ved 4°C med protein suspendert (1 mg/ml; 50 ml pr. brønn) i 0,1 M bikarbonat-buffer, pH 8,6. Fortynninger og vasker ble utført i PBS med 0,05% Tween™ 20. Plater ble

vasket og blokkert i en time med PBS inneholdende 1% BSA ved romtemperatur. Ulike fortynninger av bakteriesupernatantene som inneholder løslige Fab'er, eller rensede FAB'er, ble satt til platene. Etter en times inkubering ble platene vasket og biotinylert geit anti-mus kappa (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL) satt tii (1:2000 fortynning, 50 u.l/brønn) i en time. Platene ble vasket og streptavidin-merket pepperot-peroksidase satt til (1:2000 fortynning, 50 |il/brønn) i en time. Platene ble vasket og ABTS-peroksidase-substrat ble satt til (100 uJ/brønn; Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD), og den optiske tettheten ved 405 nm ble lest på en UVmax™ (Molecular Devices) mikroplate-leser.

G. Isolering og karakterisering av Fab' er fra et kombinatorisk bibliotek:

Fag som bærer Fab'er for IL-5 ble valgt fra biblioteket ved flere runder med biopanning mot mikrotiter-brønner som er kledd med IL-5. Etter fire runder med seleksjon ble IL-5-reaktive FAB'er identifisert ved en koloni-løft-test ved å anvende <125>l-IL-5. Trettifire kolonier fra den tredje runden og fire kolonier fra den fjerde runden ble identifisert som bandt merket-IL-5. Binding til IL-5 ble bekreftet ved direkte binding-ELISA ved å anvende kultursupernatanter som uttrykker Fab-genlll-fusjonsproteinet. DNA ble isolert fra disse koloniene og etter fjerning av den kodende regionen av M13-genlll ble løselig Fab-ekspresjon indusert. Periplasmatiske fraksjoner ble fremtilt og testet ved ELISA for binding til IL-5. Fab'ene binder IL-5 spesifikt, uten noen demonstrerbar binding til et annet protein, rC5a.

De ufortynnede periplasmatiske ekstraktene (omfattende 1 til 20 u.g/ml Fab) ble testet i IL-5-binding-inhiberingstesten (eksempel 2). Ingen av Fab'ene inhiberte binding av jodert IL-5 til lL-5Ra med mer enn 35%.

H. Omdannelse av nøytraliserende mAb til et FAB:

Fd og k cDNA'er til mAb (2B6) ble isolert ved PCR ved å anvende betingelsene beskrevet ovenfor. De gelrensede fragmentene ble subklonet i pMKFabGene3-vektoren som er modifisert til å omfatte den seks-His-sekvensen 3^ for genlll-cDNAet, hvilket resulterte i plasmidet pMKFabGene3H. En funksjonell IL-5-bindende Fab-klon omfattende de 2B6 tung- og lettkjedene ble identifisert ved koloni-løft-test. Etter fjerning av genlll via Nhel/Spel-kutting og religering med seg selv ble tungkjeden fusert i ramme med seks-His, noe som tillater rensing som beskrevet ovenfor. På en dose-avhengig måte inhiberte denne Fab reseptor-binding med en IC5o på omtrent 7,5 |ig/ml, på lignende vis som den til forløper mAb'et, murin 2B6.

I. Konstruksjon og undersøkelse av kjede- shufflet bibliotek

cDNA'et som koder for Fd fra det nøytraliserende mAb 2B6 ble subklonet som et Xhol/Spel-fragment i pMKFabGene3H som inneholdt et Sstl/Xbal-fragment i stede for en lettkjede-cDNA. Dette fagmidet ble kuttet med Sstl og Xbal og ligert med det Sstl/Xbal-kuttede lettkjede PCR-produktet som var avledet fra den IL-5-immuniserte musen (beskrevet ovenfor). Bibliotek-titeret etter ligering var 4 X 105 CFU. Biopanning og koloni-løft-test ble utført som beskrevet ovenfor for det kombinatoriske biblioteket.

Biblioteket ble konstruert ved å pare cDNA'et som koder for Fd fra det nøytraliserende mAb 2B6 med det samme lettkjede repertoaret, gjenvunnet fra den IL-5-immuniserte musen, anvendt for å generere det kominatoriske biblioteket. Dette kjede-shufflete biblioteket ble underlagt fire runder med biopanning mot immobilisert IL-5, og de resulterende koloniene ble testet for IL-5-reaktivitet ved å anvende koloni-løft-testen. Positive kolonier, som bandt jodert IL-5 ble videre testet ved ELISA og IL-5Ra-bindingstesten. To av Fab'ene, 2 og 15, gjenvunnet fra det kjede-shufflede-biblioteket blokkerte binding av IL-5 til IL-5Ra, og inhiberte IL-5-avhengig proliferasjon i B13-testen. Sekvensene til disse 2 Vk'ene var lignende med sekvensen tii 2B6 Vk, den originale lettkjede-partneren for 2B6 VH. Lettkjede-sekvensene for Fab 2 og 15 er hhv. SEKV ID NR: 45 og 46. For Fab 2 er CDR'ene hhv. SEKV ID NR :10, 11 og 47. For Fab 15erCDR'ene hhv. SEKV ID NR :10, 11 og 48.

Alle antistoff-aminosyresekvensene som er oppført nedenfor i eksemplene 4 og 5 anvender KABAT-nummereringssystemet som tillater variabilitet i CDR- og rammeverk-lengdene. Det vil si nøkkel-aminosyrer er alltid betegnet med det samme nummeret uavhengig av det virkelige nummeret av aminosyrer som er foran dem. F.eks er cystein som er foran CDR1 i alle lettkjeder, alltid i KABAT posisjon 23, og tryptofanenheten som følger etter CDR1 er alltid KABAT-posisjon 35, selv om CDR1 kan omfatte opptil 17 aminosyrer.

Eksempel 4 - Humanisert antistoff

Et humanisert antistoff ble designet for å inneholde murine CDR'er i et humant antistoff-rammeverk. Denne humaniserte versjonen av det IL-5-spesifikke mus antistoffet 2B6 ble fremstilt ved å utføre de følgende manipuleringene.

A. Gen- kloning:

mRNA ble isolert fra hver av de respektive 2B6-, 2F2- og 2E3-hybridom-cellelinjene (se eksempel 1) med en pakke anskaffet fra Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN), og så revers transkribert ved å anvende primeren (dT)15 som var levert med en cDNA-pakke (Boehringer Mannheim) for å lage cDNA. PCR-primere som er spesifikke for muse immunoglobulinet ble anvendt for å amplifisere DNA som koder for domener som strekker seg fra aminosyre nr. 9 (KABAT-nummereringsystem) av den tungkjede variable regionen til hengsel-regionen og fra aminosyre nr. 9 (KABAT-nummereringsystem) av den lettkjede variable regionen til enden av den konstante regionen. Flere kloner av hver antistoff-kjede ble oppnådd ved uavhengige PCR-reaksjoner. Mus gamma 1 hengsel-region primeren som er anvendt er [SEKV ID NR: 22]

5' GTACATATGCAAGGCTTACAACCACAATC 3<*>.

Mus gamma 2a hengsel-region primeren som er anvendt er [SEKV ID NR : 23]

5'GGACAGGGCTTACTAGTGGGCCCTCTGGGCTC 3'

Mus tungkjede variabel-region primeren som er anvendt er [SEKV ID NR : 24]

5'AGGT(C eller G)(C eller A)A(G eller A)CT(G eller T)TCTCGAGTC(T eller A)GG 3'

Mus kappakjede konstant-region primeren som er anvendt er [SEKV ID NR : 25]

. 5XTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAATGGG 3'

Mus lettkjede variabel-region primeren som er anvendt er [SEKV ID NR : 26]

5' CCAG ATGTG AGCTCGTG ATG ACCCAG ACTCCA 3*

PCR-fragmentene ble klonet i plasmidene pGEM7f+ (Promega) som så ble transformert i E. coli DH5a (Bethesda Research Labs).

B. DNA- sekvensering:

De tung- og lettkjede murine cDNA-klonene fra del A ovenfor ble sekvensert. Resultatene fra sekvenseringen av de variable regionene fra disse klonene er vist i SEKV ID NR: 1-6 (Fig. 1-6). Hver klon inneholdt aminosyrer som er kjent for å være konserverte blant muse tungkjede variable regioner eller lettkjede variable regioner. CDR-aminosyresekvensene er oppført nedenfor.

CDR-regionene for 2B6-tungkjeden er SEKV ID NR: 7, 8 og 9. Se figur 7. Disse sekvensene er kodet av SEKV ID NR: 1. CDR-regionene for lettkjeden er SEKV ID NR: 10, 11 og 12. Se fig. 7. Disse sekvensene er kodet av SEKV ID NR: 2.

CDR-regionene for 2F2-tungkjeden er SEKV ID NR: 7, 8 og 9. Se figur 7. Disse sekvensene er kodet av SEKV ID NR: 3. CDR-regionene for lettkjeden er SEKV ID NR: 10, 11 og 13. Se fig. 7. Disse sekvensene er kodet av SEKV ID NR: 4.

CDR-regionene for 2E3-tungkjeden er SEKV ID NR: 7, 8 og 14. Se figur 7. Disse sekvensene er kodet av SEKV ID NR: 5. CDR-regionene for lettkjeden er SEKV ID NR: 10,11 og 13. Se fig. 7. Disse sekvensene er kodet av SEKV ID NR: 6.

C. Seleksjon av humane rammeverk:

Etter kloningen av 2B6 ble aminoyre-sekvensene fra de variable tung- og lettkjedene (fig. 1 og 2) (hhv. SEKV ID NR: 15 og 16) sammenlignet med de kjente murine immunoglobulinsekvensene i KABAT og SWISS-PROT (Nuc. Acids. Res., 20: 2019-2022 (1992)) proteinsekvensdatabaser for å benevne aminosyrene i de N-terminale enhetene. De 2B6 tung- og lettkjede variable region deduserte aminosyresekvensene ble deretter sammenlignet med de humane immunoglobulin proteinsekvensdatabasene for å identifisere et humant rammeverk for både tung- og lettkjedene som vil best mulig passe den murine sekvensen. I tillegg ble tung- og lettkjedene evaluert med en posisjonsdatabase generert fra strukturelle modeller av Fab-domenet for å måle mulige konflikter på grunn av aminosyrer som kan influere CDR-presentasjon. Konflikter ble løst under syntese av de humaniserte variabel region rammeverkene ved substitusjon av den korresponderende musaminosyren ved den lokalisasjonen.

De tungkjede rammeverk-regionene fra et antistoff som er oppnådd fra et humant myelom-immunoglobulin (COR) ble anvendt (E.M. Press and N.M. Hogg, Biochem. J., 117: 641-660 (1970)). Den humane tungkjede rammeverk aminosyre-sekvensen ble funnet å være omtrent 66% homolog med 2B6-rammeverket.

For et egnet lettkjede variabel region rammeverk ble lettkjede variable rammeverk sekvensen fra Bence-Jones-proteinet (LEN) (Schneider et al., Hoppe-Seylefs Z Physiol. Chem., 356: 507-557 (1975)) anvendt. De humane lettkjede rammeverk-regionene var omtrent 82% homologe med de murine 2B6 lettkjede rammeverk-regionene på aminosyrenivå.

De valgte humane rammeverkene ble tilbake-translatert for å gi en DNA-sekvens.

D. Konstruksjon av humaniserte mAb gener:

Gitt 2B6 tungkjede CDR'ene [Fig. 7 og SEKV ID NR: 1-2] og rammeverk-sekvensene fra de humane antistoffene ble en syntetisk tungkjede variabel region laget [SEKV ID NR18] Denne ble laget ved å anvende fire syntetiske oligonukleotider [SEKV ID NR: 27 og 28] [SEKV ID NR: 29 og 30] som når de er koblet sammen koder for aminosyrene nr. 21-nr. 106 (KABAT-nummerering). Oligonukleotidene ble så ligert i Hpal-Kpnl-restriksjonssetene i et pUC18-basert plasmid som inneholder sekvenser som er avledet fra en annen humanisert tungkjede basert på COR-rammeverket { supra). Dette plasmidet gir en signalsekvens [SEKV ID NR: 17] og den resterende variable regionsekvensen. Eventuelle feil i den kartlagte sekvensen ble korrigert ved PCR med mutagene primere eller ved tilsetning av syntetiske linkere i eksisterende restriksjonsseter.

Signalsekvensen og den humaniserte tungkjede variable regionen ble tatt ut fra det pUC-baserte plasmidet som et EcoRI-Apal-fragment og ligert i ekspresjonsvektoren pCD som inneholdt en IgGi human konstant region. De syntetiske tungkjede variable region-nukleotidene og aminosyresekvensene er gitt i fig. 8 [SEKV ID NR: 18 og 19]. De humane rammeverk-enhetene er aminosyrene 1-30, 36-49, 66-97 og 109-119 av SEKV ID NR: 19. Aminosyresekvensene av CDR'ene er identiske med de murine 2B6-CDR'ene. Den resulterende ekspresjonsvektoren, pCDIL5HZHC1,0 er vist i fig. 10.

Gitt 2B6 lettkjede CDR'ene [Fig. 7 og SEKV ID NR: 10,11 og 12] og rammeverk-sekvensen fra det humane antistoffet ble en syntetisk lettkjede variabel region laget [SEKV ID NR: 20]. Fire syntetiske oligonukleotider som koder for aminosyrene nr. 27- nr. 58 (KABAT-nummerering) [SEKV ID NR: 31 og 32] og aminosyrene nr. 80- nr. 109 [SEKV ID NR: 33 og 34] fra det humaniserte VL med hhv. Sacl-Kpnl- og Pstl-Hindlll-ender ble satt inn i et pUC18-basert plasmid som inneholder sekvenser som er avledet fra et annet humant lettkjede rammeverk (B17) (Marsh et al., Nuc. Acids Res., 13: 6531-6544 (1985)) som har en høy grad av homologi med LEN-rammeverket. Dette plasmidet tilveiebringer den resterende variable region-sekvensen. Eventuelle feil i den kartlagte sekvensen og den ene aminosyre-forskjellen mellom LEN- og B17-rammeverkene ble korrigert ved PCR med mutagene primere eller ved tilsetning av syntetiske linkere i eksisterende restrikjonsseter.

Den humaniserte lettkjede variable regionen ble isolert fra pUC-plasmidet som et EcoRV-Narl-fragment og ligert i ekspresjonsvektoren pCN som inneholdt en signalsekvens [SEKV ID NR: 17] sammen med en kappa human konstant region. Det syntetiske lettkjede variable region-nukleotid og aminosyre-sekvensene er gitt i fig. 9 [SEKV ID NR: 20 og 21]. De humane rammeverk-enhetene er aminosyrene 1 -23, 41 -55, 63-94 og 104-113 av SEKV ID NR: 21. Aminosyresekvensene av CDR'ene er identiske med de murine 2B6-CDR'ene. De kodende sekvensene for disse CDR'ene skiller seg imidlertid fra de murine 2B6-kodende sekvensene for å tillate dannelse av restriksjonsenzym-seter. En av de resulterende ekspresjonsvektorene, pCNIL5HZLC1,0 er vist i fig. 11. Disse syntetiske variable lett- og/eller tungkjede-sekvensene er anvendt ved konstruksjonen av et humanisert antistoff.

E. Ekspresjon av humanisert mAb:

Den humaniserte tungkjeden, avledet fra en IgGi-isotype, anvender en syntetisk tungkjede variabel region som gitt i SEKV ID NR: 19. Denne syntetiske VH som inneholder 2B6 tungkjede CDR'ene ble designet og syntetisert som beskrevet ovenfor.

Den humaniserte lettkjeden, en human kappa-kjede, anvender en syntetisk lettkjede variabel region som gitt i SEKV ID NR: 21. Denne syntetiske VL som inneholder 2B6 lettkjede CDR'ene ble designet og syntetisert som beskrevet ovenfor. DNA-fragmentene som koder for de humaniserte variable regionene ble satt inn i pUC19-baserte mammalske celle-ekspresjonsplasmider som utnytter en signalsekvens og som inneholder CMV-promotere og de humane tungkjede eller humane lettkjede konstante regioner fra kimæren fremstilt i eksempel 5 under, ved konvensjonelle metoder (Maniatis et al., referert ovenfor) for å gi plasmidene pCDIL5HZHC1,0 (tungkjede) [SEKV ID NR: 49, se også fig 10] og pCNIL5HZLC1,0 (lettkjede) [SEKV ID NR: 50, se også fig. 11]. Plasmidene ble ko-transfektert i COS-celler og supernatantene testet etter hhv. tre og fem dager, ved ELISA som beskrevet i eksempel 5 for tilstedeværelse av humant antistoff.

Eksemplet ovenfor beskriver fremstillingen av et eksempel på et konstruert antistoff. Lignende prosedyrer kan bli fulgt for utviklingen av andre konstruerte antistoffer, ved å anvende andre anti-IL-5-antistoffer (f.eks 2F2, 2E3, 4A6, 5D3, 24G9 osv.) som er utviklet med konvensjonelle midler.

F. Rensing:

Rensing av CHO-uttrykt kimært og humanisert 2B6 kan bli oppnådd ved konvensjonell protein-A (eller G) affinitetskromotografi etterfulgt av ionebyttings-og molekylsiktkromatografi. Lignende prosesser er med suksess anvendt for rensing til >95% renhet for andre mAb'er (f.eks. for respiratorisk synsytialt virus, interleukin-4 og malaria circumsporozoitt-antigener).

G. Ytterligere humaniserte mAb' er og ekspresjonsplasmider:

Gitt plasmidet pCDIL5HZHC1,0 [SEKV ID NR: 49] ble ekspresjonsplasmidet pCDIL5HZHC1,1 laget, som erstatter treonin med asparagin ved rammeverk-posisjon 73. Dette ble gjort ved å ligere en syntetisk linker med EcoRV- og Xhol-ender [SEKV ID NR: 51 og SEKV ID NR: 52] i identisk kuttet pCDIL5HZHC1,0. På lignende vis erstatter ekspresjonsplasmidet pCDIL5HZHC1,2 isoleucin for valin ved rammeverk-posisjon 37. Dette ble gjort ved å ligere en syntetisk linker med Hpal- og Xbal-ender [SEKV ID NR: 53 og SEKV ID NR: 54] i identisk kuttet pCDIL5HZHC1,0. Ekspresjonsplasmidet pCDIL5HZHC1,3 ble også laget ved å ligere en syntetisk linker med Hpal- og Xbal-ender [SEKV ID NR: 53 og SEKV ID NR: 54] i identisk kuttet pCDIL5HZHC1,1.

Gitt det pUC18-baserte plasmidet som er beskrevet tidligere som omfatter DNA-sekvenser av fire syntetiske oligonukleotider [SEKV ID NR: 31, 32, 33 og 34] ble en humanisert lettkjede variabel region laget hvor rammeverk-posisjon nr. 15 er endret fra leucin til alanin. Dette plasmidet ble kuttet med Nhel- og Sacl-restriksjonsendonukleaser, og en syntetisk linker [SEKV ID NR: 55 og 56] satt inn. Et EcoRV-Narl-fragment ble så isolert og ligert i den identisk kuttete ekspresjonsvektoren pCNIL5HZLC1,0 for å skape pCNIL5HZLC1,1.

En syntetisk variabel region ble laget ved å anvende tungkjede-rammeverkregionene oppnådd fra immunoglobulin (NEW) (Saul et al., J. Biol. Chem. 253:585-597 (1978)) og 2B6 tungkjede CDR'ene [Fig. 7 og SEKV ID NR: 1-2]. Rammeverk-aminosyrer som kan påvirke CDR-presentasjon ble identifisert og substitusjoner ble gjort ved å anvende metoder som er beskrevet tidligere. Fire overlappende syntetiske oligonukleotider ble generert [SEKV ID NR: 57, 58, 59 og 60], som når de anneales og forlenges koder for aminosyrer som representerer en signal-sekvens [SEKV ID NR: 17] og en tungkjede variabel region. Dette syntetiske genet ble så amplifisert ved å anvende PCR-primere [SEKV ID NR: 63 og 64] og ligert som et BstXI-Hindlll-restriksjonsfragment inn i pUC18-basert plasmid som omfatter sekvenser som er avledet fra en annen humanisert tungkjede basert på COR-rammeverket. En fenylalanin til tyrosin rammeverk-substitusjon ble gjort ved aminosyre-posisjon 91 (Kabat-nummereringsystemet) (ekvivalent med posisjon 94 i fig. 12) ved å sette inn en syntetisk oligonukleotid-linker [SEKV ID NR: 75 og 76] i Sadl- og Kpnl-restriksjonsseter. Den resulterende tungkjede variable regionen [Fig. 12 og SEKV ID NR: 61, 62] er referert til som NEWM-humanisert tungkjede.

Eventuelle feil i den kartlagte sekvensen ble korrigert ved PCR med mutagene primere eller ved tilsetning av syntetiske linkere i eksisterende restriksjonsseter. Signalsekvensen og humanisert tungkjede variabel regionen ble tatt ut fra det pUC-baserte plasmidet som et EcoRI-Apal-fragment og ligert i ekspresjonsvektoren pCD som inneholdt en human lgGrkonstant region for å skape plasmidet pCDIL5NEWM. Aminosyresekvensene fra CDR'ene er identiske med de murine 2B6 tungkjede-CDR'ene.

En syntetisk variabel region ble laget ved å anvende de lettkjede rammeverk-regionene som var oppnådd fra immunoglobulin (REI) (Palm et al., Hoppe-Seyler s Z. Physiol. Chem. 356:167-191 (1975)) og 2B6 lettkjede-CDR'ene [Fig. 7 og SEKV ID NR: 10,11 og 12]. Rammeverk-aminosyrer som kan påvirke CDR-presentasjon ble identifisert, og erstatninger gjort ved å anvende metoder beskrevet tidligere. Fire overlappende syntetiske oligonukleotider ble generert [SEKV ID NR: 65, 66, 67 og 68], som når de anneales og forlenges koder for aminosyrer som representerer en lettkjede variabel region [Fig 13 og SEKV ID NR: 69, 70] referert til som REI-humanisert lettkjede. Dette syntetiske genet ble så amplifisert ved å anvende PCR-primerene [SEKV ID NR: 71 og 72] og ligert som et EcoRI- Hindlll-restriksjonsfragment i pGEM-7Zf(+) (Promega Corporation, Madison, Wl).

Eventuelle feil i den kartlagte sekvensen ble korrigert ved PCR med mutagene primere eller ved tilsetning av syntetiske linkere i eksisterende restriksjonsseter. Den humaniserte lettkjede variable regionen ble kuttet ut fra det pGEM-7Zf(+)-baserte plasmidet som et EcoRV-Narl-fragment og ligert inn i ekspresjonsvektoren pCN som inneholdt en signalsekvens [SEKV ID NR: 17] sammen med en human Kappa konstant region for å skape plasmidet pCNIL5REI. Aminosyre-sekvensene for CDR'ene er identiske med de murine 2B6 lettkjede CDR'ene. De kodende sekvensene for disse CDR'ene skiller seg imidlertid fra de murine 2B6-kodende sekvensene for å tillate dannelsen av restriksjonsenzymseter. Disse syntetiske variable lett- og/eller tungkjede-sekvensene blir anvendt ved konstruksjonen av et humanisert antistoff.

Gitt det pGEM-7Zf(+)-baserte plasmidet beskrevet ovenfor, kan en humanisert lettkjede variabel region bli laget hvor rammeverk-posisjon #15 er endret fra valin til aianin. Dette plasmidet kan bli kuttet med Nhel- og Sacl-restriksjonsendonukleasene, og en syntetisk linker [SEKV ID NR: 73 og 74] er satt inn. Et EcoRV-Narl-fragment kan så bli isolert og ligert inn i den identiske kuttede ekspresjonsvektoren pCNIL5HZREI for å skape plasmidet pCNIL5REIv1 5A-

Eksempel 5 . Konstruksjon av et kimært antistoff

DNA som koder for aminosyrene nr. 9- nr. 104 (KABAT-nummerering) fra den murine mAb 2B6 tungkjede variable regionen ble isolert som et Avall-Styl-restriksjonsfragment fra en pGEM7Zf+-basert PCR-klon fra cDNA generert fra 2B6 hybridomacellelinjen (se eksempel 4). De flankerende tungkjede variable region-sekvensene og en signalsekvens [SEKV ID NR: 17] ble anskaffet ved å kombinere dette fragmentet sammen med fire små syntetiske oligomer-linkere [SEKV ID NR: 35 og 36] [SEKV ID NR: 37 og 38s] i et pUC18-basert plasmid som er kuttet med BstXI-Hindlll. En konsensus av N-terminale aminosyrer som er avledet fra nært beslektede murine tungkjeder ble gitt for de første åtte VH-enhetene, og er kodet innen SEKV ID NR: 35 og 36. Den deduserte aminosyre-sekvensen fra tungkjeden ble verifisert ved sekvensering av de første 15 N-terminale aminosyrene fra 2B6-tungkjeden.

Et EcoRI-Apal-f ragment som inneholder sekvenser for signal- og Vh-regioner ble isolert og ligert i plasmid pCD som allerede koder for den humane IgGi-konstante regionen.

DNA som koder for aminosyrene nr.12 - nr. 99 (KABAT-nomenklatur) fra det murine mAb lettkjede variable regionen ble isolert som et Ddel-Aval-restriksjonsfragment fra en pGEM7Zf-basert PCR-klon fra cDNA som var generert fra 2B6-hybridomacellelinjen (se eksempel 4). De flankerende lettkjede variable region-sekvensene ble anskaffet ved å kombinere dette fragmentet sammen med fire små syntetiske oligomer-linkere [SEKV ID NR: 39 og 40]

[SEKV ID NR: 41 og 42] i et pUC18-basert plasmid som er kuttet med EcoRV-Hindlll. En konsensus av N-terminale aminosyrer som er avledet fra nært beslektede murine lettkjeder ble gitt for de første åtte VL-enhetene, og er kodet innen SEKV ID NR: 39 og 40. Den deduserte aminosyresekvensen fra lettkjeden ble verifisert ved sekvensering av de første 15 N-terminale aminosyrene fra 2B6-lettkjeden. Den variable regionen ble så isolert som et EcoRV-Narl-fragment og ligert i ekspresjonvektoren pCN, som allerede inneholdt den humane kappa-regionen og en signalsekvens.

Ekspresjon av et kimært antistoff ble utført ved ko-transfeksjon av de pCD-og pCN-baserte plasmidene i COS-celler. Kultursupernatanter ble samlet tre og fem dager senere og testet etter immunoglobulinekspresjon ved ELISA beskrevet som følger: Hvert trinn bortsett fra det siste er fulgt av PBS-vasker. Mikrotiterplater ble kledd natten over med 100ng/50uJ/brønn av et geite-antistoff som er spesifikt for Fc-regionen av humane antistoffer. Kultursupernatantene ble satt til og inkubert i en time. Pepperot-peroksidase konjugert geit anti human IgG-antistoff ble så tilsatt og tillatt å inkubere i en time. Dette ble fulgt av tilsetning av ABTS-peroksidase substrat (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., Gaithersburg, MD). Etter en time inkubering ble absorbansen ved 405 nm lest på en mikrotiterplate-leser (Molecular Devices Corporation, Menlo Park, CA). Ekspresjon av det kimære antistoffet ble detektert. Ved en lignende ELISA bandt COS-cellesupernatantene, som inneholdt det kimære antistoffet, spesifikt til mikrotiterplater som var kledd med human IL-5-protein. Dette resultatet bekreftet at genene som koder for et antistoff mot IL-5 var syntetisert og uttrykt.

Eksemplene ovenfor illustrerer fremstilling av et eksempel på et konstruert antistoff. Lignende prosedyrer kan følges for utviklingen av andre konstruerte antistoffer, ved å anvende andre anti-IL-5-donor antistoffer (f.eks 2F2, 2E3, 4A6, 5D3, 24G9 osv.) som er utviklet ved konvensjonelle midler.

Claims (38)

1. Nøytraliserende monoklonalt gnager antistoff som er spesifikt for human interleukin-5, karakterisert ved at det har en bindingsaffinitet med en dissosiasjonskonstant lik eller mindre enn omtrent 3,5 x 10'<11> M, hvor nevnte antistoff omfatter tre komplementaritetsbestemmende regioner av den tunge kjeden omfattende; (a) SEKV ID NR: 7, 8 og 9 eller (b) SEKV ID NR: 7, 8 og 14 og tre komplementaritetsbestemmende regioner av den lette kjeden omfattende; (a) SEKV ID NR: 10, 11 og 12 eller (b) SEKV ID NR: 10, 11 og 13.

2. Monoklonalt antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at det er et monoklonalt murint antistoff.

3. Monoklonalt antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at det er et monoklonalt rotte antistoff.

4. Monoklonalt antistoff ifølge krav 2, karakterisert ved at det omfatter lettkjede aminosyresekvensen til SEKV ID NR: 16, og tungkjede aminosyresekvensen til SEKV ID NR: 15.

5. Monoklonalt antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at det har de identifiserende karakteristika til 2B6, 2E3, 2F2 eller 4A6.

6. Hybridoma, karakterisert ved at den har de identifiserende karakteristika til cellelinje SK119-2B6,206,75(1), SK119-2E3,39,40,2, SK119-2F2,37,80,12 eller 4A6(1)G1F7.

7. Nøytraliserende Fab-fragment eller F(ab<*>)2-fragment derav, karakterisert ved at det er produsert ved delesjon av Fc-regionen av det monoklonale antistoffet ifølge krav 1.

8. Nøytraliserende Fab-fragment eller F(ab')2-fragment derav, karakterisert ved at det er produsert ved kjede-shuffling, hvor Fd-tungkjeden fra det monoklonale antistoffet ifølge krav 1 er uttrykt i et murint lettkjede filamentøst fag Fab-display-bibliotek.

9. Nøytraliserende Fab-fragment eller F(ab')2-fragment derav, karakterisert ved at det er produsert ved kjede-shuffling hvor lettkjeden fra det monoklonale antistoffet ifølge krav 1 er uttrykt i et murint tungkjede-filamentøst fag Fab-display-bibliotek.

10. Endret antistoff, som omfatter en lettkjede og en tungkjede, karakterisert ved at rammeverkregionene til nevnte tung- og lettkjeder er avledet fra i det minste ett valgt antistoff og aminosyresekvensene fra de komplementaritetsbestemmende regionene til hver nevnte kjede er avledet fra det monoklonale antistoffet ifølge krav 1.

11. Endret antistoff ifølge krav 10, karakterisert ved at nevnte aminosyresekvenser fra de komplementaritetsbestemmende regionene av tungkjeden er: (a) SEKV ID NR: 7, 8, 9 eller (b) SEKV ID NR: 7, 8, 14.

12. Endret antistoff ifølge krav 10, karakterisert ved at nevnte aminosyresekvenser fra de komplementaritetsbestemmende regionene av lettkjeden er: (a) SEKV ID NR: 10, 11, 12 eller (b) SEKV ID NR: 10, 11, 13.

13. Endret antistoff ifølge krav 10, karakterisert ved at nevnte rammeverkregioner fra nevnte tungkjede omfatter: aminosyrene 1-30, 36-49, 66-97 og 109-119 fra SEKV ID NR: 19.

14. Endret antistoff ifølge krav 10, karakterisert ved at nevnte rammeverkregioner f ra nevnte lettkjede omfatter: aminosyrene 1-23, 41-55, 63-94 og 104-113 fra SEKV ID NR: 21.

15. Immunoglobulin-tungkjede-komplementaritetsbestemmende region (CDR), karakterisert ved at aminosyresekvensen fra denne er valgt fra gruppen bestående av: (a) SEKV ID NR: 7, (b) SEKV ID NR: 8, (c) SEKV ID NR: 9 og (d) SEKV ID NR: 14.

16. Nukleinsyremolekyl, karakterisert ved at det koder for immunoglobulin-komplementaritetsbestemmede region (CDR) ifølge krav 15.

17. Kimært antistoff som omfatter en tungkjede og en lettkjede, karakterisert ved at nevnte antistoff har en dissosiasjonskonstant lik med eller mindre enn omtrent 3,5 x 10"<11> M for human interleukin-5, hvor de konstante regionene av nevnte tung- og lettkjeder er avledet fra i det minste ett valgt antistoff, og aminosyresekvensene fra de variable regionen av hver nevnte kjede er avledet fra det monoklonale antistoffet ifølge krav 1.

18. Antistoff ifølge krav 17, karakterisert ved at de konstante regionene er valgt fra humane immunoglobuliner.

19. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter det endrede antistoffet ifølge krav 10 og en farmasøytisk aksepterbar bærer.

20. Anvendelse av et antistoff ifølge krav 10, for fremstilling av et medikament for å behandle forstyrrelser som er assosiert med overskuddsproduksjon av eosinofiler hos et menneske.

21. Anvendelse ifølge krav 20, hvor nevnte forstyrrelse som er assosiert med overskuddsproduksjon av eosinofiler, er astma.

22. Anvendelse ifølge krav 20, hvor nevnte forstyrrelse som er assosiert med overskuddsproduksjon av eosinofiler, er allergisk rinitt.

23. Anvendelse ifølge krav 20, hvor nevnte forstyrrelse som er assosiert med overskuddsproduksjon av eosinofiler, er atopisk dermatitt.

24. Anvendelse av et antistoff ifølge krav 20, hvor nevnte forstyrrelse assosiert med overskuddsproduksjon av eosinofiler, er hypereosinofilt syndrom.

25. Anvendelse av et antistoff ifølge krav 20, hvor nevnte forstyrrelse assosiert med overskuddsproduksjon av eosinofiler, er eosinofil gastroenteritt.

26. Anvendelse av et antistoff ifølge krav 20, hvor nevnte forstyrrelse assosiert med overskuddsproduksjon av eosinofiler, er Churg-Strauss-syndrom.

27. Anvendelse av et antistoff ifølge krav 20, hvor nevnte forstyrrelse assosiert med overskuddsproduksjon av eosinofiler, er eosinofilt myalgisyndrom.

28. Isolert nukleinsyresekvens, karakterisert ved at den er valgt fra gruppen bestående av: (a) en nukleinsyresekvens som koder for det endrede antistoffet ifølge krav 10; (b) en nukleinsyresekvens som er komplementær med (a); og (c) et fragment av eller en analog av (a) eller (b) som koder for et protein som er karakterisert ved at det har spesifisitet for human interleukin-5; hvor nevnte sekvens eventuelt omfatter et restriksjonssete.

29. Isolert nukleinsyresekvens ifølge krav 28, karakterisert ved at sekvensen koder for den humaniserte tungkjede variable regionen som omfatter nukleinsyresekvensen SEKV ID NR: 18.

30. Isolert nukleinsyresekvens ifølge krav 28, karakterisert ved at sekvensen koder for den humaniserte tungkjede variable regionen som omfatter nukleinsyresekvensen SEKV ID NR: 61.

31. Isolert nukleinsyresekvens ifølge krav 28, karakterisert ved at sekvensen koder for den humaniserte lettkjede variable regionen som omfatter nukleinsyresekvensen SEKV ID NR: 20.

32. Isolert nukleinsyresekvens ifølge krav 28, karakterisert ved at sekvensen koder for den humaniserte lettkjede variable regionen som omfatter nukleinsyresekvensen SEKV ID NR: 69.

33. Rekombinant plasmid, karakterisert ved at det omfatter nukleinsyresekvensen ifølge krav 28.

34. Vertscelle som er transfektert med det rekombinante plasmidet ifølge krav 33.

35. Fremgangsmåte for å fremstille et endret antistoff som er spesifikt for human interleukin-5, karakterisert ved at den omfatter dyrking av en cellelinje som er transfektert med det rekombinante plasmidet ifølge krav 33, under kontroll av valgte regulatoriske sekvenser som kan styre ekspresjonen av dette i nevnte celler.

36. Metode for å måle tilstedeværelse eller fravær av human IL-5 hos et menneske, karakterisert ved at den omfatter å tilveiebringe en prøve av biologisk væske fra en pasient og la det monoklonale antistoffet ifølge krav 1 komme i kontakt med en slik prøve under betingelser som er slik at et IL-5/monoklonalt antistoffkompleks kan dannes, og detektere tilstedeværelse eller fravær av nevnte IL-5/monoklonale antistoffkompleks.

37. Metode for hjelp ved diagnose av allergier og andre tilstander som følger med overskuddsproduksjon av eosinofiler, karakterisert ved at den omfatter trinnene å bestemme mengden av human IL-5 i en prøve fra en pasient i samsvar med metoden ifølge krav 36, og sammenligne denne med den gjennomsnittlige mengden av human IL-5 i normalpopulasjonen, hvor tilstedeværelsen av betydelig forhøyet nivå av human IL-5 hos pasienten er en indikasjon på allergier og andre forstyrrelser som følger med overskuddsproduksjon av eosinofiler.

38. Humanisert nøytraliserende monoklonalt antistoff spesifikt for human interleukin-5, karakterisert ved at antistoffet omfatter en tungkjede variabel region av SEKV ID NR: 19 og en lettkjede variabel region av SEKV ID NR: 21.