PL194312B1 - Przeciwciało monoklonalne neutralizujące gryzoni,linia hybrydoma, humanizowane przeciwciało, region CDR ciężkiego łańcucha immunoglobuliny, region CDR lekkiego łańcucha immunoglobuliny, cząsteczki kwasu nukleinowego, przeciwciało chimeryczne, kompozycja farmaceutyczna, izolowana sekwencja kwasu nukleinowego, rekombinowany plazmid i komórka gospodarza oraz sposób wytwarzania humanizowanego przeciwciała i sposób wspomagania diagnostyki alergii - Google Patents

Przeciwciało monoklonalne neutralizujące gryzoni,linia hybrydoma, humanizowane przeciwciało, region CDR ciężkiego łańcucha immunoglobuliny, region CDR lekkiego łańcucha immunoglobuliny, cząsteczki kwasu nukleinowego, przeciwciało chimeryczne, kompozycja farmaceutyczna, izolowana sekwencja kwasu nukleinowego, rekombinowany plazmid i komórka gospodarza oraz sposób wytwarzania humanizowanego przeciwciała i sposób wspomagania diagnostyki alergii

Info

Publication number
PL194312B1
PL194312B1 PL95321088A PL32108895A PL194312B1 PL 194312 B1 PL194312 B1 PL 194312B1 PL 95321088 A PL95321088 A PL 95321088A PL 32108895 A PL32108895 A PL 32108895A PL 194312 B1 PL194312 B1 PL 194312B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
seq
antibody
nucleic acid
light chain
acid sequence
Prior art date
Application number
PL95321088A
Other languages
English (en)
Other versions
PL321088A1 (en
Inventor
Robert S. Ames
Edward Robert Appelbaum
Irwin M. Chaiken
Richard M. Cook
Mitchell Stuart Gross
Holme
Original Assignee
Smithkline Beecham Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27408594&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL194312(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from US08/470,110 external-priority patent/US5693323A/en
Application filed by Smithkline Beecham Corp filed Critical Smithkline Beecham Corp
Publication of PL321088A1 publication Critical patent/PL321088A1/xx
Publication of PL194312B1 publication Critical patent/PL194312B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5409—IL-5
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6869—Interleukin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/026—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a baculovirus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)

Abstract

1. Przeciwcialo monoklonalne neutralizujace gryzoni, swoiste wobec ludzkiej interleukiny-5, obejmujace sekwencje aminokwasowa lekkiego lancucha okreslona Identyfikatorem Sekw. nr 16 i se- kwencje aminokwasowa ciezkiego lancucha okreslona Identyfikatorem Sekw. nr 15. 4. Przeciwcialo monoklonalne 2B6 albo 2E3 albo 2F2. 5. Linia hybrydoma zdolna do wytwarzania przeciwcial monoklonalnych 2B6 albo 2E3 albo 2F2. 12.Region determinujacy komplementarnosc (CDR) lekkiego lancucha immunoglobuliny, zna- mienny tym, ze jego sekwencja aminokwasowa jest wybrana z grupy skladajacej sie z: (a) Identyfikatora Sekw. nr 10, (b) Identyfikatora Sekw. nr 12, (c) Identyfikatora Sekw. nr 13, (d) Identyfikatora Sekw. nr 47 i (e) Identyfikatora Sekw. nr 48. 25. Sposób wytwarzania humanizowanego przeciwciala swoistego wobec ludzkiej interleukiny-5, znamienny tym, ze obejmuje hodowanie linii komórkowej transfekowanej rekombinowanym plazmi- dem okreslonym w zastrz. 23 pod kontrola wybranych sekwencji regulatorowych zdolnych do kiero- wania jego ekspresja w tych komórkach. PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest przeciwciało monoklonalne neutralizujące gryzoni, linia hybrydoma, humanizowane przeciwciało, region CDR ciężkiego łańcucha immunoglobuliny, region CDR lekkiego łańcucha immunoglobuliny, cząsteczki kwasu nukleinowego, przeciwciało chimeryczne, kompozycja farmaceutyczna, izolowana sekwencja kwasu nukleinowego, rekombinowany plazmid i komórka gospodarza oraz sposób wytwarzania humanizowanego przeciwciała i sposób wspomagania diagnostyki alergii.
Wynalazek dotyczy ogólnie dziedziny przeciwciał i zmienionych przeciwciał, przydatnych w leczeniu i diagnozowaniu stanów, w których bierze udział IL-5i nadmiernie wytwarzane są granulocyty kwasochłonne, a konkretnie mAb, przeciwciał chimerycznych i humanizowanych.
Granulocyty kwasochłonne (eozynofile) związane są z patogenezą licznych chorób zapalnych, w tym chorób alergicznych związanych z nadmierną reaktywnością w tkance płucnej (Butterfield i in., Immunopharmacology of Eosinophils, wyd. Smith i Cook, str. 151-192, Academic Press, Londyn (1993)). Wartym odnotowania przykładem jest astma, choroba charakteryzująca się odwracalnym skurczem dróg oddechowych, prowadzącym do nieswoistej nadreaktywności oskrzeli. To z kolei jest zależne od wywołania przewlekłej reakcji zapalnej na poziomie śluzówki oskrzeli i charakterystycznych nacieków makrofagów, limfocytów i eozynofilów. Okazuje się, że eozynofile odgrywają centralną rolę w zapoczątkowywaniu uszkodzenia śluzówki typowego dla choroby (Corrigan i in., Immunology Today, 13: 501-507 (1992)). Donoszono o zwiększonej liczbie aktywnych eozynofilów we krwi obwodowej, wydzielinie oskrzeli i śródmiąższu płuc pacjentów z przewlekłą astmą, zaś ciężkość choroby, mierzona różnymi testami czynności płuc, koreluje z liczbą eozynofilów we krwi (Griffen i in., J. Aller. Clin. Immunol., 67:548-557 (1991)). Zwiększoną liczbę eozynofilów, często w procesie degranulacji, otrzymywano w popłuczynach oskrzelikowo-pęcherzykowych (BAL) pacjentów w stanie późnej reakcji astmatycznej, zaś zmniejszenie liczby eozynofilów, zwykle z powodu leczenia sterydami, związane jest zpolepszeniem objawów klinicznych (Bousquet i in., N. Engl. J. Med. 323: 1033-1039 (1990)).
Interleukina 5 (IL-5) jest homodimeryczną glikoproteiną wytwarzaną przede wszystkim przez aktywowane limfocyty T CD4+. U ludzi IL-5 jest odpowiedzialna głównie za kontrolowanie wzrostu i różnicowania eozynofilów. Podwyższony poziom IL-5 stwierdza się w popłuczynach oskrzelowo-pęcherzykowych astmatyków (Motojima i in., Allergy, 48: 98, (1993)). Myszy transgeniczne pod względem IL-5 wykazują znaczną eozynofilię we krwi obwodowej i tkankach bez pobudzenia antygenem (Dent i in., J. Exp. Med., 172:1425, (1990)) zaś przeciwciała monoklonalne przeciwko mysiej IL-5 zmniejszają, jak wykazano, eozynofilię krwi obwodowej i tkanek myszy (Hitoshi i in., Int. Immunol., 3: 135 (1991)), jak również eozynofilię związaną z zakażeniem pasożytniczym i ekspozycją na alergen u zwierząt doświadczalnych (Coffman i in., Science, 245: 308, (1989), Sher i in., PNAS USA, 83:61 (1990), Chand i in., Eur. J. Pharmacol., 211: 121 (1992)).
Jakkolwiek sterydy niezwykle skutecznie zmniejszają liczbę eozynofilów i innych składników zapalnych astmy, istnieją obawy dotyczące ich efektów ubocznych, zarówno w ciężkiej astmie, jak i w łagodniejszych postaciach. Jedyna inna główna terapia lekiem przeciwzapalnym - kromoglikanami (kromolan sodu i nedokromil) -jest znacznie mniej skuteczna niż kortykosterydy i ich mechanizm działania pozostaje nieznany.
Wiele ostatnich opracowań skupiało się na nowych sterydach w postaci wziewnej, bronchodylatatorach o przedłużonym dzianiu i czynnikach działających na nowe biochemiczne i farmakologiczne cele (np. aktywatory kanałów potasowych, antagoniści leukotrienu, inhibitory 5-lipoksygenazy (5-LO) i inne).
Idealny lek powinien łączyć skuteczność sterydów z bezpieczeństwem związanym z kromolanem sodu, przy zwiększonej wybiórczości i szybszym początku działania. Przeciwciała neutralizujące IL-5 mogą być potencjalnie przydatne w łagodzeniu objawów związanych z eozynofilią u ludzi.
Tak więc, w stanie techniki istnieje zapotrzebowanie na antagonistów IL-5o wysokim powinowactwie, takich jak neutralizujące przeciwciała monoklonalne wobec ludzkiej IL-5, które powinny zmniejszyć różnicowanie i proliferację eozynofilów (tj. gromadzenie eozynofilów) i w ten sposób zmniejszyć stan zapalny wywołany eozynofilami.
Przeciwciało przeciwko IL-5 znane jest z publikacji WO 93/16184, jednak przeciwciało to nie zapewnia wystarczająco długiego okresu hamowania wiązania z IL-5, który jest wynikiem powinowactwa przeciwciała do receptora i trwałości wiązania z receptorem IL-5, wyrażanej stałą dysocjacji.
PL 194 312 B1
Nieoczekiwanie uzyskano monoklonalne przeciwciało przeciwko IL-5, które wykazuje dłuższy czas hamowania i lepszą trwałość wiązania z receptorem IL-5.
Przeciwciało według wynalazku jest monoklonalnym przeciwciałem neutralizującym pochodzącym od gryzoni (np. szczurów i myszy) swoistym wobec ludzkiej IL-5 i wykazującym powinowactwo wiązania charakteryzujące się stałą dysocjacji równą albo niższą niż około 3,5 x 10-11 M. Przykładami takich przeciwciał są mysie przeciwciała monoklonalne 2B6, 2E6 i 2F2 oraz szczurze przeciwciała monoklonalne, takie jak 4A6. Przeciwciało według wynalazku obejmuje sekwencję aminokwasową lekkiego łańcucha określoną Identyfikatorem Sekw. nr 16 i sekwencję aminokwasową ciężkiego łańcucha określoną Identyfikatorem Sekw. nr 15, korzystnie jest to przeciwciało monoklonalne, które wykazuje charakterystykę identyfikującą 4A6. W zakres wynalazku wchodzą też linie hybrydoma zdolne do wytwarzania przeciwciał monoklonalnych 2B6 albo 2E3, albo 2F2, takie jak SK119-2B6.206.75(1), SK119-2E3.39.40.2, SK119-2F2.37.80.12, 4A6(1)G1F7 i 5D3(1)F5D6.
W zakres wynalazku wchodzi też hybrydoma posiadająca identyfikującą charakterystykę linii komórkowej SK119-24G9.8.20.5 lub 5D3(1)F5D6 oraz przeciwciało monoklonalne produkowane przez tę hybrydoma, a także hybrydoma posiadająca identyfikującą charakterystykę linii komórkowej 4A6(1)G1F7.
Z przeciwciała według wynalazku można usunąć region Fc i uzyskać neutralizujące fragmenty Fab albo fragmenty F(ab')2 swoiste wobec ludzkiej interleukiny-5.
Takie neutralizujące fragmenty Fab lub ich fragmenty F(ab')2, które są swoiste dla ludzkiej interleukiny-5 można też wytwarzać techniką mieszania łańcuchów, w której ciężki (lub lekki) łańcuch immunoglobuliny izolowany z neutralizujących monoklonalnych przeciwciał gryzoni według wynalazku, jest wyrażany wraz z łańcuchem lekkim (lub odpowiednio z łańcuchem ciężkim) immunoglobuliny pochodzącym z biblioteki izolowanej z gryzoni immunizowanych interleukiną-5, w bibliotece Fab faga filamentarnego.
W zakres wynalazku wchodzą też zmienione przeciwciała swoiste dla ludzkiej interleukiny-5, to znaczy przeciwciało humanizowane i przeciwciało chimeryczne. Humanizowane przeciwciało zawiera regiony determinujące komplementarność CDR pochodzące z nie ludzkich monoklonalnych przeciwciał neutralizujących (mAb) według wynalazku charakteryzowanych stałą dysocjacji, której wartość wynosi dokładnie lub mniej niż około 3,5 x 10-11 Mdla ludzkiej interleukiny-5.
Humanizowane przeciwciało według wynalazku zawiera regiony zrębowe łańcuchów ciężkiego i łańcucha lekkiego pochodzące przynajmniej z jednego przeciwciała, a co najmniej jedna z obecnych w nim reszt podpierających zrąb została zmieniona, zaś sekwencje aminokwasowe regionów determinujących komplementarność każdego z wymienionych łańcuchów pochodzą z przeciwciała monoklonalnego według wynalazku.
W humanizowanym przeciwciele według wynalazku korzystne sekwencje aminokwasowe regionów łańcucha ciężkiego determinujących komplementarność są określone w:
(a) Identyfikatorze Sekw. nr 7, 8, 9 lub (b) Identyfikatorze Sekw. nr 7, 8, 14, a korzystne sekwencje aminokwasowe regionów łańcucha lekkiego determinujących komplementarność są określone w:
(a) Identyfikatorze Sekw. nr 10, 12 lub (b) Identyfikatorze Sekw. nr 10, 13, natomiast regiony zrębowe łańcucha ciężkiego obejmują aminokwasy 1-30, 36-49, 66-97 i 109-119 Identyfikatora Sekw. nr 19, a regiony zrębowe łańcucha lekkiego obejmują aminokwasy 1-23, 41-55, 63-94 i 104-113 Identyfikatora Sekw. nr 21.
Wynalazek obejmuje też kompozycję farmaceutyczną, która jako substancję czynną zawiera humanizowane przeciwciało według wynalazku i zawiera także farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
W zakres wynalazku wchodzi też region determinujący komplementarność (CDR) ciężkiego łańcucha immunoglobuliny, którego sekwencja aminokwasowa jest wybrana z grupy składającej się z:
(a) IdentyfikatoraSekw.nr 7, (b) IdentyfikatoraSekw.nr 8, (c) IdentyfikatoraSekw.nr 9 i (d) IdentyfikatoraSekw.nr 14 oraz region determinujący komplementarność (CDR) lekkiego łańcucha immunoglobuliny, którego sekwencja aminokwasowa jest wybrana z grupy składającej się z:
(a) Identyfikatora Sekw. nr 10,
PL 194 312 B1 (b) Identyfikatora Sekw. nr 12, (c) Identyfikatora Sekw. nr 13, (d) Identyfikatora Sekw. nr 47 i (e) Identyfikatora Sekw. nr 48, a także cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące te regiony CDR.
Przeciwciało chimeryczne według wynalazku obejmuje ciężki i lekki łańcuch i charakteryzuje się stałą dysocjacji równą lub mniejszą niż około 3,5 x 10-11 M dla ludzkiej interleukiny-5, a stałe regiony łańcuchów ciężkich i lekkich pochodzą z przynajmniej jednego przeciwciała akceptorowego, zaś sekwencja aminokwasowa regionów zmiennych każdego łańcucha pochodzi z przeciwciała monoklonalnego według wynalazku.
Korzystnie stałe regiony w przeciwciele chimerycznym są wybrane z ludzkich immunoglobulin.
Wynalazek dotyczy też izolowanej sekwencji kwasu nukleinowego wybranej z grupy składającej się z:
(a) sekwencji kwasu nukleinowego kodującej humanizowane przeciwciało określone w zastrz. 6;
(b) sekwencji kwasu nukleinowego komplementarnej do (a); i (c) fragmentu lub analogu (a) lub (b), który koduje białko charakteryzujące się swoistością wobec ludzkiej interleukiny-5, przy czym sekwencja ewentualnie zawiera miejsca restrykcyjne, w której sekwencja kodująca zmienne regiony humanizowanych łańcuchów ciężkich obejmuje sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną w Identyfikatorze Sekw. nr 18 lub nr 61, natomiast sekwencja kodująca zmienne regiony humanizowanych łańcuchów lekkich obejmuje sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną w Identyfikatorze Sekw. nr 20 lub nr 69.
W zakres wynalazku wchodzi też rekombinowany plazmid obejmujący izolowaną sekwencję kwasu nukleinowego według wynalazku oraz komórka gospodarza transfekowana tym rekombinowanym plazmidem.
Wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania humanizowanego przeciwciała swoistego wobec ludzkiej interleukiny-5, który obejmuje hodowanie linii komórkowej transfekowanej rekombinowanym plazmidem według wynalazku pod kontrolą wybranych sekwencji regulatorowych zdolnych do kierowania jego ekspresją w tych komórkach.
Wynalazek obejmuje ponadto sposób wspomagania diagnostyki alergii i innych stanów związanych z nadmierną produkcją granulocytów kwasochłonnych, w którym w próbce płynu ustrojowego pobranej od pacjenta określa się ilość IL-5 przez skontaktowanie jej z przeciwciałem monoklonalnym według wynalazku i wykrywa się obecność lub nieobecność kompleksu IL-5/przeciwciało monoklonalne i porównuje się średnią ilość IL-5 ze średnią ilością IL-5 w populacji zdrowej, przy czym obecność znacząco zwiększonej ilości ludzkiej IL-5 u pacjentów wskazuje na alergię i inne stany związane ze zwiększoną produkcją granulocytów kwasochłonnych.
Krótki opis rysunków
Figura 1 (IDENTYFIKATOR SEKW. NR: l i 15) pokazuje regiony zmienne łańcuchów ciężkich mysiego przeciwciała 2B6 i chimerycznego przeciwciała mysio/ludzkiego 2B6. Obszary w ramkach wskazują na CDR.
Figura 2 (IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 2 i 16) pokazuje regiony zmienne łańcuchów lekkich mysiego przeciwciała 2B6 i chimerycznego przeciwciała mysio/ludzkiego 2B6. Obszary w ramkach wskazują na CDR.
Figura 3 (IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 3) pokazuje region zmienny łańcucha ciężkiego mysiego przeciwciała 2F2. Obszary w ramkach wskazują na CDR.
Figura 4 (IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 4) pokazuje region zmienny łańcucha lekkiego mysiego przeciwciała 2F2. Obszary w ramkach wskazują na CDR.
Figura 5 (IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 5) przedstawia region zmienny łańcucha ciężkiego mysiego przeciwciała 2E3. Obszary w ramkach wskazują na CDR.
Figura 6 (IDENTYFIKATOR SEKWENCJI NR: 6) pokazuje region zmienny łańcucha lekkiego mysiego przeciwciała 2E3. Obszary w ramkach wskazują na CDR.
Figura 7 (IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 7-14) pokazuje CDR łańcuchów lekkich i ciężkich mysich przeciwciał 2B6, 2F2 i 2E3.
Figura 8 (IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 18, 19) pokazuje regiony zmienne łańcuchów ciężkich humanizowanego przeciwciała 2B6. Obszary w ramkach wskazują na CDR.
Figura 9 (IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 20, 21) pokazuje regiony zmienne łańcuchów lekkich humanizowanego przeciwciała 2B6. Obszary w ramkach wskazują na CDR.
PL 194 312 B1
Figura 10 jest schematycznym rysunkiem plazmidu pCDILSHZHC1.0 użytego do ekspresji genu humanizowanego łańcucha ciężkiego w komórkach ssaków. Plazmid zawiera gen beta laktamazy (BETA LAC), początek replikacji SV40 (SV40), sekwencję promotora wirusa cytomegalii (CMV), sekwencję sygnałową, humanizowany ciężki łańcuch, sygnał poli A z bydlęcego hormonu wzrostu (BGH), promotor betaglobiny (beta glopro), gen reduktazy dihydrofolianowej i drugą sekwencję poli A BGH w pUC19.
Figura 11 jest schematycznym rysunkiem plazmidu pCNILSHZLC1.0 użytego do ekspresji genu humanizowanego łańcucha lekkiego w komórkach ssaków.
Figura 12 (IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 61 i 62) pokazuje regiony zmienne łańcuchów ciężkich NewM humanizowanego przeciwciała 2B6. Obszary w ramkach wskazują na CDR.
Figura 13 (IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 69, 70) pokazuje regiony zmienne łańcuchów lekkich REI humanizowanego przeciwciała 2B6. Obszary w ramkach wskazują na CDR.
Niniejszy wynalazek dostarcza różnych przeciwciał, zmienionych przeciwciał i ich fragmentów, które są charakteryzowane przez specyficzność wiązania z ludzką IL-5, aktywność neutralizującą i wysokie powinowactwo do IL-5, jak jest to wykazane na przykładzie mysich przeciwciał monoklonalnych. Przeciwciała według niniejszego wynalazku są wytworzone konwencjonalną techniką hybrydoma, techniką kombinatoryjnych bibliotek fagowych, techniką mieszania łańcuchów przeciwciał i techniką humanizacji celem otrzymania nowych przeciwciał neutralizujących. Te produkty znajdują zastosowanie w terapeutycznych i farmaceutycznych kompozycjach do leczenia chorób, gdzie mediatorem jest interleukina-5, np. astmy. Te produkty są również przydatne w diagnostyce tych schorzeń przez pomiar (np. enzymatycznym testem immunosorbcji (ELISA)) poziomu endogennej interleukiny-5 uludzi lub interleukiny-5 uwolnionej ex vivoz aktywowanych komórek.
I. Definicje „Zmienione przeciwciało” odnosi się do białka kodowanego przez zmieniony region kodujący immunoglobulinę, które może być uzyskane przez ekspresję w wybranych komórkach gospodarza. Takie zmienione przeciwciała są przeciwciałami rekombinowanymi (np. chimeryczne lub humanizowane przeciwciała) lub fragmentami przeciwciał pozbawionymi całego lub części stałego regionu immunoglobuliny np. Fv, Fab, F(ab)2 itp.
„Zmieniony region kodujący immunoglobulinę” odnosi się do sekwencji kwasu nukleinowego kodującego zmienione przeciwciało według wynalazku. Kiedy zmienione przeciwciało ma przeszczepione CDR lub jest przeciwciałem humanizowanym, sekwencje, które kodują regiony determinujące komplementarneść (CDR) z nie pochodzących od ludzi immunoglobulin są wstawione do pierwszego składnika immunoglobuliny obejmującego ludzkie zmienne sekwencje zrębowe. Ewentualnie, pierwszy składnik immunoglobuliny jest funkcyjnie przyłączony do drugiego składnika immunoglobuliny.
„Pierwszy składnik immunoglobuliny” odnosi się do sekwencji kwasów nukleinowych kodujących ludzki region zrębowy lub zmienny region ludzkiej immunoglobuliny, w którym natywne (naturalnie występujące) regiony kodujące CDR są zastąpione przez regiony kodujące CDR przeciwciała donorowego. Ludzki region zmienny może być łańcuchem ciężkim immunoglobuliny, łańcuchem lekkim (lub oboma łańcuchami), analogiem lub ich funkcjonalnym fragmentem. Takie regiony CDR, zlokalizowane wewnątrz zmiennych regionów przeciwciał (immunoglobulin) mogą być określone znanymi w stanie techniki metodami. Na przykład Kabat i wsp., (Sequences of Proteins of Lmmunological Interest, 4th ED., U. S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)) ujawnia zasady umieszczania CDR. Dodatkowo, znane w stanie techniki programy komputerowe mogą być użyteczne do identyfikacji regionów/struktur CDR.
„Neutralizujące” odnosi się do przeciwciał, które hamują funkcje IL-5 przez zapobieganie wiązaniu ludzkiej IL-5 ze specyficznym receptorem lub przez blokowanie zjawisk, wywoływanych przez przyłączenie się IL-5 do receptora. mAb określane są jako neutralizujące jeśli są efektywne w 90%, korzystnie w 95%, a najkorzystniej w 100% w hamowaniu aktywności IL-5 mierzonej testem biologicznym komórek B13 (test neutralizacji IL-5, zobacz przykład 2C).
Termin „wysokie powinowactwo” odnosi się do przeciwciał mających powinowactwo wiązania charakteryzowane przez KD, która jest równa lub mniejsza niż 3,5x 10-11 dla ludzkiej IL-5, jak określano przez analizę przy użyciu optycznego biosensora (zobacz przykład 2D).
Przez „swoistość wiązania ludzkiej IL-5” należy rozumieć wysokie powinowactwo wobec ludzkiej, nie mysiej, IL-5.
„Drugi składnik immunoglobuliny” odnosi się do innej sekwencji kodującej białko lub peptyd, które poddano fuzji z pierwszym składnikiem immunoglobuliny w ramce lub za pomocą ewentualnej se6
PL 194 312 B1 kwencji linkera (tj. związano funkcjonalnie). Korzystnie jest to gen immunoglobuliny. Drugi składnik immunoglobuliny może zawierać kwas nukleinowy kodujący sekwencję całego regionu stałego tego samego (tj. homologicznego - pierwsze i drugie zmienione przeciwciało pochodzą z tego samego źródła) lub dodatkowego (tj. heterologicznego) interesującego przeciwciała. Może on być łańcuchem ciężkim lub łańcuchem lekkim immunoglobuliny (lub oboma łańcuchami jako część pojedynczego polipeptydu). Drugi składnik immunoglobuliny nie jest ograniczony do żadnej szczególnej klasy lub izotypu immunoglobulin. Dodatkowo, drugi składnik immunoglobuliny może zawierać część regionu stałego immunoglobuliny, takiego jak znajdowany w Fab lub w F(ab)2 (tj. ciągła część odpowiedniego ludzkiego regionu stałego lub region zrębowego). Taki drugi składnik przeciwciała może również zawierać sekwencję kodującą integralne białko błonowe eksponowane na zewnętrznej powierzchni komórki gospodarza, np. jako część biblioteki fagowej lub sekwencji kodującej białko wymagane do wykrywania i diagnostyki, np. peroksydaza chrzanowa, β-galaktozydaza itp.
Terminy Fv, Fc, Fd, Fab lub F(ab)2 są używane wich standardowych znaczeniach (patrz np. Harlow i wsp., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)).
Używane tutaj określenie „przeciwciało rekombinowane”oznacza typ zmienionego przeciwciała, tj. syntetyczne przeciwciało pełnej długości (chimeryczne lub humanizowane przeciwciało w przeciwieństwie do fragmentu przeciwciała), w którym część domen zmiennych łańcucha lekkiego i/lub ciężkiego wybranego przeciwciała akceptorowego jest zastępowana przez analogiczne części jednego lub więcej przeciwciał donorowych, które wykazują swoistość do wybranego epitopu. Na przykład, takie cząsteczki mogą obejmować przeciwciała charakteryzowane przez humanizowane ciężkie łańcuchy związane z niemodyfikowanym łańcuchem lekkim (lub chimerycznym łańcuchem lekkim) lub na odwrót. Rekombinowane przeciwciała mogą również być charakteryzowane przez zmianę sekwencji kwasu nukleinowego przeciwciała akceptorowego kodującego lekkie i/lub ciężkie domeny zmienne regionów zrębowych w celu otrzymania swoistości wiązania przeciwciała donorowego. W takich przeciwciałach jeden lub więcej CDR (korzystnie wszystkie) z przeciwciała akceptorowego może być zastąpionych CDR z przeciwciała donorowego opisanego powyżej.
„Przeciwciało chimeryczne” odnosi się do typu rekombinowanego przeciwciała, który zawiera naturalnie występujący region zmienny (łańcuch lekki i łańcuchy ciężkie) pochodzący z przeciwciała donorowego w połączeniu z regionami stałymi lekkich i ciężkich łańcuchów pochodzącymi z przeciwciała akceptorowego.
„Humanizowane przeciwciało” odnosi się do typu przeciwciała rekombinowanego posiadającego CDR pochodzące z immunoglobulin donorowych, nie pochodzących od ludzi, a pozostałe części cząsteczki pochodzące z immunoglobulin pochodzą od jednej lub więcej ludzkich immunoglobulin. Dodatkowo, reszty podpierające zrąb mogą być zmienione celem zachowania powinowactwa wiązania (patrz np. Queen i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10032 (1989), Hodgson i wsp., Bio/Technology, 9: 421 (1991)).
Termin „przeciwciało donorowe”odnosi się do przeciwciała (monoklonalnego lub rekombinowanego), które wnosi sekwencję kwasu nukleinowego regionów zmiennych, CDR lub innych fragmentów funkcyjnych lub ich analogów do pierwszego składnika immunoglobuliny, celem zapewnienia zmiany regionu kodującego immunoglobulinę, co powoduje ekspresję zmienionego przeciwciała ze specyficznością i aktywnością neutralizującą charakterystyczną dla przeciwciała donorowego. Przeciwciało donorowe odpowiednie do zastosowania w wynalazku jest monoklonalnym przeciwciałem neutralizującym nie pochodzącym od ludzi (np. mysim) oznaczonym jako 2B6. Przeciwciało 2B6 jest określone jako posiadające wysokie powinowactwo, swoistość wobec ludzkiej IL-5 (tj. nie rozpoznaje mysiej IL-5), neutralizujące przeciwciało izotypu IgG posiadające zmieniony lekki łańcuch DNA i sekwencję aminokwasową określoną odpowiednio Identyfikatorem Sekw. Nr2 i 16 i zmienny ciężki łańcuch DNA i sekwencję aminokwasową określoną odpowiednio Identyfikatorem Sekw. Nr 1 i 15 na odpowiednich stałych regionach mysiego IgG.
Termin „przeciwciało akceptorowe (akceptor)”odnosi się do przeciwciała (monoklonalnego lub rekombinowanego) heterologicznego z przeciwciałem donorowym, które zawiera wszystkie (lub jakikolwiek składnik, korzystnie wszystkie) sekwencje kwasu nukleinowego kodującego ich regiony zrębowe łańcuchów ciężkich i/lub lekkich, i/lub ich ciężkie, i/lub lekkie łańcuchy stałych regionów pierwszego składnika immunoglobuliny. Korzystnie ludzkie przeciwciało jest przeciwciałem akceptorowym.
„CDR” są określane jako regiony determinujące komplementarność sekwencji aminokwasowej przeciwciała, które są hiperzmiennymi regionami łańcuchów ciężkich i lekkich, patrz np. Kabat i wsp., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed.,U. S. Department of Health and Human SerPL 194 312 B1 vices, National Institutes of Health (1987). Są trzy CDR (lub regiony CDR) łańcuchów ciężkich i trzy łańcuchów lekkich w zmiennych częściach immunoglobuliny. Tak więc, „CDR” używane tutaj odnosi się do wszystkich trzech CDR łańcuchów ciężkich lub do wszystkich trzech CDR łańcuchów lekkich (lub zarówno do wszystkich ciężkich i wszystkich lekkich, w zależności od kontekstu).
W CDR znajduje się większość reszt kontaktowych do wiązania przeciwciała z antygenem lub epitopem. CDR interesujące w świetle wynalazku pochodzą ze zmiennych sekwencji łańcuchów ciężkich i lekkich przeciwciała donorowego i obejmują analogi naturalnie występujących CDR, które posiadają wspólną lub zachowują tę samą swoistość wiązania antygenu lub zdolność neutralizującą, jak przeciwciało donorowe, z którego pochodzą.
Przez „posiadanie wspólnej swoistości wiązania antygenu lub zdolności neutralizującej” rozumie się, że np. aczkolwiek mAb 2B6 może być charakteryzowane przez określony stopień powinowactwa, to CDR kodowane przez sekwencję kwasu nukleinowego 2B6 w odpowiednim strukturalnym otoczeniu ma mniejsze lub większe powinowactwo. Jak należało oczekiwać, CDR 2B6 w takim otoczeniu będzie pomimo to rozpoznawać taki(e) sam(e) epitop(y) jak 2B6. Przykłady CDR ciężkich łańcuchów 2B6 obejmują Identyfikator Sekw. Nr 7; Identyfikator Sekw. Nr 8; Identyfikator Sekw. Nr 9, a przykłady CDR lekkich łańcuchów 2B6 obejmują Identyfikator Sekw. Nr 10; Identyfikator Sekw. Nr 11; Identyfikator Sekw. Nr 12.
„Fragment funkcjonalny” oznacza częściową sekwencję zmienną łańcucha ciężkiego albo lekkiego (np. niewielkie delecje na końcu aminowym albo karboksylowym regionu zmiennego immunoglobuliny), która zachowuje tę samą swoistość wiązania antygenu i/lub zdolność neutralizacji, co przeciwciało z którego otrzymano fragment.
„Analog” oznacza sekwencję aminokwasową zmodyfikowaną przez jeden aminokwas, przy czym modyfikacja może być chemiczna albo może być zastąpieniem albo rearanżacją kilku aminokwasów (tj. nie więcej niż 10), z zachowaniem charakterystyki biologicznej sekwencji aminokwasowej niemodyfikowanej, np. swoistości antygenowej i wysokiego powinowactwa. Przykładowo, (nieme) mutacje mogą być konstruowane, przez zastąpienia, gdy konkretne miejsca restrykcyjne są tworzone w lub dookoła regionów kodujących CDR.
Analogi mogą również powstać jako odmiany alleliczne. „Odmiana albo modyfikacja alleliczna” jest zmianą sekwencji kwasu nukleinowego kodującego sekwencje peptydowe według wynalazku. Takie odmiany albo modyfikacje mogą być spowodowane degeneracją kodu genetycznego albo mogą być zaprojektowane celowo w celu zapewnienia pożądanej charakterystyki. Te odmiany i modyfikacje mogą, choć nie muszą, powodować zmiany w kodowanej sekwencji aminokwasowej.
Określenie „czynnik efektorowy” dotyczy nie białkowej cząsteczki nośnika, z którą zmienione przeciwciało, i/lub naturalne albo ciężkie łańcuchy przeciwciała donorowego albo inne fragmenty przeciwciała donorowego mogą być wiązane konwencjonalnymi sposobami. Takie nie białkowe nośniki mogą obejmować konwencjonalne nośniki stosowane w dziedzinie diagnostyki, np. perełki polistyrenowe albo z innego tworzywa sztucznego, polisacharydy, np. jak stosowane w układzie BIAcore (Pharmacia), albo inne nie białkowe substancje przydatne w dziedzinie medycyny i bezpieczne przy podawaniu ludziom i zwierzętom. Inne cząsteczki efektorowe mogą obejmować związki makrocykliczne, do chelatowania atomów metali ciężkich albo radioizotopów. Takie cząsteczki efektorowe mogą być również przydatne do zwiększania okresu półtrwania zmienionych przeciwciał, np. glikol polietylenowy.
II. Przeciwciała monoklonalne o wysokim powinowactwie do IL-5
Do zastosowania w konstruowaniu przeciwciał i zmienionych przeciwciał według wynalazku i ich fragmentów, do wywoływania pożądanych immunoglobulin po immunizacji natywną ludzką IL-5 albo jej epitopami peptydowymi mogą być wykorzystane gatunki inne niż człowiek (przykładowo krowa, małpa, kura, gryzonie (np. myszy albo szczury) itp.). Konwencjonalna technika hybrydoma jest stosowana w celu dostarczenia linii komórkowej hybrydoma wydzielającej mAb przeciwko IL-5. Takie hybrydoma są badane przsiewowo pod kątem wiązania z użyciem IL-5 związanej na płytkach 96-studzienkowych, jak to opisano w przykładach albo biotynylowanej IL-5 związanej z płytką opłaszczoną streptawidyną.
Przykładowo, neutralizującym mAb o wysokim powinowactwie według wynalazku jest mAb 2B6, mysie przeciwciało, które może być zastosowane do opracowania przeciwciał chimerycznych albo humanizowanych, opisanych szczegółowo w przykładzie 1. mAb 2B6 charakteryzuje się swoistością wiązania z ludzką IL-5 o KD niższej niż 3,5 x 10-11 M (około 2,3 x 10-11 M). KD wobec IL-5 dla fragmentu Fab z 2B6 (patrz przykład 3H) określono na około 9 x 10-11 M, na podstawie biosensora
PL 194 312 B1 optycznego. Wydaje się, że mAb 2B6 blokuje wiązanie pomiędzy ludzką IL-5 i łańcuchem a receptorem dla ludzkiej IL-5.
Innym pożądanym przeciwciałem donorowym jest mysie mAb 2E3. To mAb charakteryzuje się izotypem IgG2a i ma stałą dysocjacji dla hIL-5 niższą niż 3,5x 10-11 M (około 2,0 x 10-11 M).
Jeszcze innym pożądanym przeciwciałem donorowym jest szczurze mAb 4A6. Przeciwciało to charakteryzuje się stałą dysocjacji dla hIL-5 niższą niż 3,5 x 10-11 M (około 1,8 x 10-11 M). Ponadto wydaje się, że 4A6 blokuje oddziaływanie pomiędzy ludzką IL-5 i łańcuchem β receptora dla ludzkiej IL-5.
Wynalazek nie jest ograniczony do zastosowania mAb 2B6, 2E3 albo ich sekwencji hiperzmiennych (tj. CDR). Mogą je zastąpić dowolne inne przeciwciała przeciwko IL-5 charakteryzujące się stałą dysocjacji niższą niż 3,5 x 10-11 M wobec ludzkiej IL-5 i odpowiedni CDR przeciwko IL-5. Gdziekolwiek w niniejszym opisie przeciwciało donorowe określane jest jako 2B6 albo 2E3, oznaczenie to jest zrobione wyłącznie dla celów zilustrowania i uproszczenia opisu.
III. Fragmenty przeciwciał
Z mAb skierowanych przeciwko ludzkiej IL-5 według wynalazku można otrzymać fragmenty Fab albo F(ab')2. Fragmenty te są przydatne jako czynniki zabezpieczające in vivo przed IL-5 i stanami wywołanymi przez eozynofile albo in vitro jako część diagnostyki IL-5. Fragmenty Fab obejmują cały łańcuch lekki i część końca N łańcucha ciężkiego; zaś fragment F(ab')2 jest fragmentem utworzonym z dwóch fragmentów Fab połączonych wiązaniem dwusiarczkowym. mAb 2B6, 2E3 i inne przeciwciała wiążące IL-5 o podobnym wysokim powinowactwie, zapewniają źródło fragmentów Fab i F(ab')2, które mogą być otrzymywane konwencjonalnymi sposobami, np. cięciem mAb przy użyciu odpowiedniego enzymu proteolitycznego, papainy i/lub pepsyny albo metodami rekombinacji. Te fragmenty Fab i F(ab')2 są przydatne same jako środki lecznicze, profilaktyczne albo diagnostyczne oraz jako dawcy sekwencji obejmujących regiony zmienne i sekwencji CDR przydatne w wytwarzaniu rekombinowanych albo hymanizowanych przeciwciał, jak to opisano.
Fragmenty Fab i F(ab')2 mogą być konstruowane metodą kombinatoryjnych bibliotek fagowych (patrz np. Winter i in., Ann. Rev. Immunol., 12: 433 (1994)) albo metodą „mieszania” (shuffling) łańcuchów immunoglobulin (patrz np. Marks i in., Bio/Technology 10:779, (1992)), w których Fd albo vH immunoglobuliny z wybranego przeciwciała (np. 2B6) łączy się z repertuarem łańcuchów lekkich immunoglobulin, vL (albo vk) w celu wytworzenia nowych Fab. I odwrotnie, łańcuch lekki immunoglobuliny może być wiązany z repertuarem łańcuchów ciężkich immunoglobulin, vH (albo Fd) w celu wytworzenia nowych Fab. Fab neutralizujące IL-5 mogą być otrzymywane gdy umożliwi się łączenie Fd z mAb 2B6 z repertuarem łańcuchów lekkich immunoglobulin, jak to opisano w przykładach. Można również otrzymać Fab o unikalnych sekwencjach (nukleotydowych i aminokwasowych) dzięki technice mieszania łańcuchów.
IV. Interesujące sekwencje aminokwasowe i nukleotydowe przeciwciał przeciwko IL-5 mAb 2B6 albo inne przeciwciała opisane wyżej mogą dostarczyć sekwencji takich jak sekwencje peptydowe części zmiennych łańcuchów ciężkich i/lub lekkich, sekwencji zrębowych, sekwencji CDR, ich fragmentów funkcjonalnych albo analogów oraz kodujących je sekwencji nukleotydowych, przydatnych w projektowaniu i uzyskiwaniu zmienionych przeciwciał charakteryzujących się swoistością wiązania przeciwciał donorowych.
Jako jeden z przykładów, niniejszy wynalazek dostarcza sekwencji zmiennych łańcuchów ciężkich i lekkich mysiego przeciwciała przeciwko IL-5 2B6 i uzyskanych z nich sekwencji. Region zmienny łańcucha ciężkiego 2B6 pokazano na figurze 1. Regiony kodujące CDR zaznaczono ramkami i przedstawiono jako Identyfikator Sekw. Nr 7, Identyfikator Sekw. Nr 8 i Identyfikator Sekw. Nr 9. Klonowany region łańcucha lekkiego 2B6 przedstawiono na figurze 2. Regiony kodujące CDR przedstawiono jako Identyfikator Sekw. Nr 10, Identyfikator Sekw. Nr 11 i Identyfikator Sekw. Nr 12.
Humanizowane regiony zmienne łańcuchów ciężkich pokazano na figurze 8 (Identyfikator Sekw. Nr 18 i 19). Sekwencję sygnałową pokazano również jako Identyfikator Sekw. Nr 17. Inne odpowiednie sekwencje sygnałowe znane specjalistom mogą być podstawione w miejsce przedstawionych tu przykładowych sekwencji sygnałowych. Sekwencje aminokwasów CDR tych konstruktów są identyczne z CDR natywnych mysich i chimerycznych łańcuchów ciężkich i są przedstawione jako Identyfikator Sekw. Nr 7, Identyfikator Sekw. Nr 8 i Identyfikator Sekw. Nr 9. Przykładowe (syntetyczne) sekwencje zmienne humanizowanych łańcuchów lekkich przedstawione są na figurze 9 (Identyfikator Sekw. Nr 20 i 21).
Sekwencje kwasu nukleinowego według wynalazku albo ich fragmenty kodujące sekwencje peptydowe części zmiennych łańcucha ciężkiego i lekkiego, są również przydatne do mutagennego
PL 194 312 B1 wprowadzania pewnych zmian w sekwencjach kwasów nukleinowych kodujących regiony CDR i zrębowe oraz do wprowadzania powstałych zmodyfikowanych albo fuzyjnych sekwencji do plazmidów wcelu ekspresjonowania. Przykładowo, nieme zastąpienia w sekwencji nukleotydowej regionów kodujących CDR i fragmenty zrębowe, zastosowano w celu stworzenia miejsc restrykcyjnych, ułatwiających wprowadzanie mutagenizowanych regionów CDR (i/lub zrębowych). Te regiony kodujące CDR zastosowano w konstruowaniu humanizowanych przeciwciał według wynalazku.
Biorąc pod uwagę degenerację kodu genetycznego mogą być konstruowane różne sekwencje kodujące sekwencje aminokwasowe regionów zmiennych łańcuchów ciężkich i lekkich i sekwencje CDR według wynalazku, jak również ich funkcjonalne fragmenty i analogi, wykazujące swoistość antygenową przeciwciała donorowego. Izolowane sekwencje kwasu nukleinowego według wynalazku albo ich fragmenty kodujące sekwencje peptydowe regionów zmiennych albo CDR mogą być zastosowane do wytwarzania zmienionych przeciwciał, np. przeciwciał chimerycznych albo humanizowanych według wynalazku, albo innych przeciwciał rekombinowanych po funkcjonalnym połączeniu z drugim składnikiem immunoglobuliny.
Należy zaznaczyć, że izolowane sekwencje kwasu nukleinowego kodujące części zmienionych przeciwciał i przeciwciał opisanych tu, inne niż sekwencje kwasu nukleinowego są również objęte niniejszym wynalazkiem, takie jak komplementarne do natywnych sekwencji kodujących CDR albo komplementarne do zmodyfikowanych sekwencji regionów zrębowych otaczających regiony kodujące CDR. Przydatne sekwencje DNA obejmują sekwencje hybrydyzujące w surowych warunkach hybrydyzacji (patrz, Maniatis i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982), str. 387-389) z sekwencjami DNA. Przykładem surowych warunków hybrydyzacji jest hybrydyzacja w 4xSSC w 65°C, a następnie płukanie w 0,1 xSSC w 65°C przez godzinę. Ewentualnie, przykładem surowych warunków hybrydyzacji jest hybrydyzacja w 50% formamidzie, 4 x SSC w 42°C. Korzystnie, takie hybrydyzujące sekwencje DNA mają długość co najmniej około 18 nukleotydów, tj. przybliżoną wielkość CDR.
V. Zmienione cząsteczki immunoglobuliny i zmienione przeciwciała
Zmienione cząsteczki immunoglobuliny mogą kodować zmienione przeciwciała, które obejmują przeciwciała rekombinowane, takie jak przeciwciała chimeryczne i humanizowane. Pożądane regiony kodujące zmienionych immunoglobulin zawierają regiony kodujące CDR, tak, że kodują peptydy wykazujące swoistość antygenową przeciwciała przeciwko IL-5, korzystnie przeciwciała o wysokim powinowactwie, takiego jak dostarczone przez niniejszy wynalazek, wprowadzone do pierwszego składnika immunoglobuliny (ludzki region zrębowy albo region zmienny ludzkiej immunoglobuliny).
Korzystnie, pierwszy składnik immunoglobuliny jest połączony funkcjonalnie z drugim składnikiem immunoglobuliny. Drugi składnik immunoglobuliny jest określony powyżej i może obejmować sekwencję kodującą drugi interesujący region przeciwciała, przykładowo region Fc. Drugie składniki immunoglobuliny mogą również obejmować sekwencje kodujące inną immunoglobulinę, z którą połączono region stały łańcucha lekkiego i ciężkiego, w jednej ramce odczytu albo sekwencją łącznika. Rekombinowane przeciwciała skierowane przeciwko fragmentom funkcjonalnym albo analogom IL-5 mogą być również przeznaczone do wywoływania zwiększonego wiązania z tym samym przeciwciałem.
Drugi składnik immunoglobuliny może być również związany z czynnikiem efektorowym, jak to określono powyżej, w tym z cząsteczką nośnika nie będącego białkiem, z którym drugi składnik immunoglobuliny może być połączony funkcjonalnie standardowymi sposobami.
Fuzja albo połączenie pomiędzy drugimi składnikami immunoglobuliny, np. sekwencjami przeciwciała i czynnikiem efektorowym może zachodzić dowolnym konwencjonalnym sposobem, np. przez wiązanie kowalencyjne albo jonowe, fuzję białek albo łączniki heterobifunkcjonalne, np. karbodiimid, glutaraldehyd i inne. Techniki takie są znane i opisane w standardowych publikacjach z dziedziny chemii i biochemii.
Oprócz tego, konwencjonalne sekwencje łącznikowe zapewniające odstęp pomiędzy drugim składnikiem immunoglobuliny i czynnikiem efektorowym mogą być również skonstruowane w regionie kodującym zmienioną immunoglobulinę. Projektowanie takich łączników jest znane specjalistom.
Oprócz tego, sekwencje sygnałowe dla cząsteczek według wynalazku mogą być modyfikowane, w celu zwiększenia ekspresji. Przykładowo, przeciwciało humanizowane 2B6 posiadające sekwencję sygnałową i CDR uzyskane z sekwencji mysiego łańcucha ciężkiego, ma oryginalną sekwencję sygnałową zastąpioną przez inną (Identyfikator Sekw. Nr 17).
Przykładowe zmienione przeciwciało zawiera sekwencję peptydu albo białka regionu zmiennego łańcucha lekkiego i/lub ciężkiego o swoistości antygenowej mAb 2B6, np. łańcuchy VH i VL. Jesz10
PL 194 312 B1 cze inne pożądane zmienione przeciwciało według wynalazku charakteryzuje się sekwencją aminokwasową zawierającą przynajmniej jeden, a korzystnie wszystkie CDR regionu zmiennego łańcuchów ciężkich i/lub lekkich cząsteczki mysiego przeciwciała 2B6 z pozostałymi sekwencjami uzyskanymi ze źródła ludzkiego, albo ich fragmenty funkcjonalne albo analogi. Patrz humanizowane regiony VH i VL (fig. 8 i 9).
W jeszcze innym wykonaniu, rekombinowane przeciwciało według wynalazku może być połączone z dodatkowym czynnikiem. Przykładowo, można zastosować procedurę rekombinacji DNA wcelu wytworzenia rekombinowanego przeciwciała według wynalazku, w którym fragment Fc albo domena CH2CH3 kompletnej cząsteczki przeciwciała została zastąpiona przez enzym albo inną cząsteczkę możliwą do wykrycia (tj. efektor polipeptydowy albo cząsteczka reporterowa).
Drugi składnik immunoglobuliny może być również połączony funkcjonalnie z peptydem immunoglobuliny, białka albo ich fragmentem heterologicznym dla sekwencji obejmującej CDR, wykazującej swoistość antygenową mysiego 2B6. Powstałe białko może wykazywać po ekspresji zarówno swoistość antygenową przeciwko IL-5, jak i charakterystykę nie immunoglobulinową. Taka charakterystyka składnika fuzji może być np. charakterystyką funkcjonalną innej wiążącej domeny albo receptora, albo charakterystyką leczniczą, jeżeli składnik fuzji jest białkiem przydatnym terapeutycznie, albo dodatkową charakterystykąantygenową.
Inne pożądane białko według wynalazku może obejmować kompletną cząsteczkę przeciwciała, posiadającą łańcuchy ciężkie i lekkie pełnej długości albo ich dowolny ciągły fragment, taki jak fragmenty Fab albo F(ab')2, dimer łańcuchów ciężkich, albo ich dowolny minimalny rekombinowany fragment,taki jak Fv, albo przeciwciało jednołancuchowe (SCA),albo inną dowolną cząsteczkę o tej samej swoistości co wybrane mAb donorowe, np. mAb 2B6 albo 2E3. Białko takie może być zastosowane w postaci przeciwciała zmienionego albo w postaci niefuzyjnej.
Jakkolwiek drugi składnik immunoglobuliny otrzymany jest z przeciwciała innego niż przeciwciało donorowe, np. regiony zrębowe albo stałe dowolnego izotypu, albo klasy immunoglobulin. Przeciwciała rekombinowane mogą obejmować regiony stałe immunoglobulin (Ig) i zmienne regiony zrębowe z dowolnego źródła, np. przeciwciała akceptorowego i jeden lub wiele (korzystnie wszystkie) CDR z przeciwciała donorowego, np. opisanego tu przeciwciała przeciwko IL-5. Oprócz tego, mogą być dokonane zmiany, np. delecje, zastąpienia albo addycje na poziomie kwasu nukleinowego, albo aminokwasowego, w regionach zmiennych domeny zrębowej łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego przeciwciała akceptorowego albo w donorowych regionach CDR w celu zachowania swoistości wiązania przeciwciała donorowego.
Takie przeciwciała rekombinowane są zaprojektowane tak, że obejmują jeden (albo oba) region zmienny łańcucha lekkiego i/lub ciężkiego mAb przeciwko IL-5 (ewentualnie zmodyfikowanego jak to opisano) albo jeden albo więcej z opisanych niżej CDR łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego (patrz również fig. 7). Rekombinowane przeciwciała według wynalazku są neutralizujące, tj. blokują w pożądany sposób wiązanie z receptorem białka IL-5,jak również blokują albo zapobiegają proliferacji komórek zależnych od IL-5.
Takie rekombinowane przeciwciała obejmują przeciwciało humanizowane obejmujące regiony zrębowe wybranej ludzkiej immunoglobuliny albo podtypu, albo chimeryczne przeciwciało zawierające regiony stałe ludzkich łańcuchów lekkich i/lub ciężkich poddane fuzji z funkcjonalnym fragmentem przeciwciała przeciwko IL-5. Odpowiednie ludzkie (albo zwierzęce) przeciwciało akceptorowe może być wybrane z konwencjonalnych baz danych, np. baza danych KABAT, baza danych Los Alamos ibaza danych Swiss Prot, przez homologię sekwencji nukleotydowych i aminokwasowych przeciwciała donorowego. Przeciwciało ludzkie, charakteryzujące się homologią regionów zrębowych przeciwciała donorowego (w oparciu o sekwencję aminokwasową) może być odpowiednie do dostarczenia regionów stałych łańcucha ciężkiego i/lub regionów zmiennych zrębowych łańcucha ciężkiego do wprowadzenia CDR donorowych. Odpowiednie przeciwciało donorowe zdolne do dostarczenia regionów stałych łańcucha lekkiego albo zmiennych regionów zrębowych może być wybrane w podobny sposób. Należy zaznaczyć, że łańcuchy ciężkie i lekkie przeciwciała akceptorowego nie muszą pochodzić z tego samego przeciwciała akceptorowego.
Pożądane jest, aby heterologiczne regiony zrębowe i stałe były wybrane z ludzkich klas i izotypów immunoglobulin, takich jak IgG (podtypy od 1do 4), IgM, IgA i IgE. Jednakże, przeciwciało akceptorowe nie musi zawierać tylko sekwencji ludzkich immunoglobulin. Przykładowo, można skonstruować gen, w którym sekwencje DNA kodujące część ludzkiego łańcucha immunoglobuliny poddano
PL 194 312 B1 fuzji z sekwencjami DNA kodującymi sekwencje aminokwasowe nie immunoglobulinowe, takie jak polipeptyd efektorowy albo cząsteczka reporterowa.
Przykład szczególnie pożądanego przeciwciała humanizowanego obejmuje CDR 2B6 wprowadzone do regionów zrębowych sekwencji wybranego przeciwciała ludzkiego. W przypadku przeciwciał neutralizujących, jeden, dwa, a korzystnie trzy CDR z regionów zmiennych łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego przeciwciała są wprowadzone do regionów zrębowych sekwencji wybranego przeciwciała ludzkiego zastępując natywne CDR przeciwciała ludzkiego.
Korzystnie, w przeciwciele humanizowanym domeny zmienne w obu łańcuchach: ciężkim i lekkim, zostały przekonstruowane przez zastąpienie jednego lub wielu CDR. Możliwe jest zastosowanie wszystkich sześciu CDR albo różnych kombinacji mniej niż sześciu CDR. Korzystnie, zastąpione są wszystkie sześć CDR. Możliwe jest zastąpienie CDR tylko w łańcuchu ciężkim, stosując jako łańcuch lekki niemodyfikowany łańcuch lekki ludzkiego przeciwciała akceptorowego. Jeszcze inaczej, kompatybilny łańcuch lekki może być wybrany z innych przeciwciał ludzkich przez poszukiwanie w konwencjonalnych bazach danych przeciwciał. Pozostałą część rekombinowanego przeciwciała można uzyskać z odpowiedniej ludzkiej immunoglobuliny akceptorowej.
Rekombinowane przeciwciało humanizowane ma więc korzystnie budowę naturalnego przeciwciała ludzkiego albo jego fragmentu i posiada kombinację właściwości wymaganych do skutecznego zastosowania terapeutycznego, np. leczenia stanów zapalnych wywołanych IL-5u ludzi i zastosowań diagnostycznych.
Jako inny przykład, rekombinowane przeciwciało może zawierać trzy CDR regionu zmiennego łańcucha lekkiego 2E3 (Identyfikator Sekw. Nr 10, 11 i13) i trzy CDR regionu zmiennego łańcucha ciężkiego 2B6 (Identyfikator Sekw. Nr 7, 8 i 9). Powstałe humanizowane przeciwciało powinno charakteryzować się tą samą swoistością wiązania i wysokim powinowactwem mAb 2B6.
Dla specjalistów w dziedzinie jest jasne, że rekombinowane przeciwciała mogą być dalej modyfikowane przez zmiany w aminokwasach domen zmiennych bez niekorzystnego wpływu na swoistość i wysokie powinowactwo przeciwciała donorowego (tj. analog). Oczekuje się, że aminokwasy łańcucha ciężkiego i lekkiego mogą być zastąpione przez inne aminokwasy zarówno w regionach zrębowych, jak i w CDR albo w obu.
Oprócz tego region stały może być zmieniany w celu zwiększenia lub zmniejszenia pewnych właściwości cząsteczek według wynalazku. Przykładowo, dimeryzacja, wiązanie z receptorem Fc albo zdolność do wiązania i aktywacji dopełniacza (patrz, np. Angal i in., Mol. Immunol., 30:105, (1993), Xu iin., J. Biol. Chem., 269:3469 (1994), Winter i in., EP 307,434-B).
Zmienione przeciwciało, będące przeciwciałem chimerycznym różni się od przeciwciała humanizowanego opisanego wyżej, przez dostarczenie całych nie pochodzących od człowieka regionów zmiennych łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego, włącznie z regionami zrębowymi, w połączeniu z ludzkimi regionami stałymi immunoglobuliny dla obu łańcuchów. Oczekuje się, że przeciwciała chimeryczne, które zachowują dodatkowe sekwencje nie pochodzące od człowieka w porównaniu z przeciwciałami humanizowanymi według wynalazku, mogą wywoływać znaczną odpowiedź odpornościową u ludzi.
Przeciwciała takie są przydatne w zapobieganiu i leczeniu chorób wywołanych IL-5, jak to opisano wyżej.
VI. Wytwarzanie zmienionych przeciwciał i przeciwciał rekombinowanych
Korzystnie, sekwencje zmienne łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego oraz CDR mAb 2B6 albo innych odpowiednich donorowych mAb (np. 2E3, 2F2, 4A6 itp.) i kodujące je sekwencje kwasów nukleinowych są wykorzystywane w konstruowaniu zmienionych przeciwciał, korzystnie przeciwciał humanizowanych według wynalazku w poniższym procesie. Techniki takie same albo podobne mogą być zastosowane w innych wykonaniach niniejszego wynalazku.
Hybrydoma wytwarzająca wybrane donorowe mAb, np. mysie przeciwciało 2B6 jest klonowana, zaś DNA dla regionów zmiennych łańcuchów lekkich i ciężkich uzyskiwany jest technikami znanymi specjalistom, np. techniką opisana przez Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wydanie 2, Cold Spring Harbor Laboratory (1989). Regiony zmienne ciężkie i lekkie 2B6 zawierające przynajmniej regiony kodujące CDR i te części regionów zrębowych domen zmiennych łańcuchów ciężkich i/lub lekkich, wymagane do zachowania swoistości wiązania donorowego mAb, jak również pozostałych części uzyskanych z immunoglobuliny uzyskiwane są przy użyciu starterów polinukleotydowych i odwrotnej transkryptazy. Regiony kodujące CDR identyfikuje się stosując znane bazy danych i przez porównanie z innymi przeciwciałami.
PL 194 312 B1
Przeciwciało chimeryczne mysio/ludzkie może być wytworzone i badane pod kątem zdolności wiązania. Takie przeciwciało chimeryczne zawiera całe regiony VH i VL donorowego przeciwciała nie pochodzącego od człowieka, w połączeniu z regionami stałymi ludzkiej Ig dla obu łańcuchów.
Homologiczne regiony zrębowe regionów zmiennych łańcucha ciężkiego przeciwciała ludzkiego były identyfikowane przy użyciu komputerowych baz danych, np. KABAT i jako przeciwciało akceptorowe wybrano przeciwciało ludzkie wykazujące homologię z 2B6. Zaprojektowano sekwencje syntetyczne regionów zmiennych łańcucha ciężkiego, zawierające regiony kodujące CDR 2B6 wewnątrz regionów zrębowych przeciwciała ludzkiego, stosując ewentualne zastąpienia nukleotydów w regionie zrębowym tak, by zawierały miejsca restrykcyjne. Taką zaprojektowaną sekwencję syntetyzowano stosując długie oligomery syntetyczne. Ewentualnie, zaprojektowana sekwencja może być syntetyzowana przez nakładające się oligonukleotydy, amplifikowana reakcją łańcuchową polimerazy (PGR) i korygowana w przypadku błędów. Odpowiednie zmienne regiony zrębowe łańcucha lekkiego można zaprojektować w podobny sposób.
Przeciwciało humanizowane może być otrzymane z przeciwciała chimerycznego albo korzystnie wytworzone syntetycznie przez wprowadzanie regionów kodujących donorowe CDR z łańcuchów lekkich i ciężkich do regionów zrębowych odpowiednich łańcuchów lekkich i ciężkich. Ewentualnie, przeciwciało humanizowane według wynalazku może być wytworzone z użyciem standardowych technik mutagenezy. Tak więc, powstałe przeciwciało humanizowane zawiera ludzkie regiony zrębowe i regiony kodujące CDR donorowego mAb. Możliwe są dalsze manipulacje w resztach zrębowych. Powstałe przeciwciało humanizowane może być ekspresjonowane w rekombinowanych komórkach gospodarza, np. komórkach COS, CHO albo szpiczaka. Inne przeciwciała humanizowane mogą być wytwarzane z użyciem tej techniki na innych odpowiednich przeciwciałach swoistych wobec IL-5, neutralizujących, o wysokim powinowactwie i nie pochodzących od człowieka.
Konwencjonalny wektor ekspresyjny albo plazmid rekombinowany jest wytwarzany przez umieszczenie tych sekwencji kodujących zmienione przeciwciało w funkcjonalnym połączeniu z konwencjonalnymi kontrolnymi sekwencjami regulatorowymi zdolnymi do kontrolowania replikacji i ekspresji, np. promotorem CMV i sekwencjami sygnałowymi, które mogą być uzyskane z innych znanych przeciwciał. Podobnie, może być wytworzony drugi wektor ekspresyjny zawierający sekwencje DNA kodujące komplementarny łańcuch lekki albo ciężki przeciwciała. Korzystnie, ten drugi wektor ekspresyjny jest identyczny z pierwszym pod względem sekwencji kodujących i wybiórczych znaczników tak, aby zapewnić funkcjonalną ekspresję każdego z łańcuchów polipeptydowych. Ewentualnie, sekwencje kodujące łańcucha lekkiego i ciężkiego dla zmienionego przeciwciała mogą znajdować się na jednym wektorze.
Wybrana komórka gospodarza jest kotransfekowana techniką konwencjonalną oboma wektorami (albo po prostu transfekowana pojedynczym wektorem) tworząc transfekowaną komórkę gospodarza według wynalazku obejmującą rekombinowane albo syntetyczne łańcuchy lekki i ciężki. Transfekowana komórka jest następnie hodowana konwencjonalnymi technikami w celu wytworzenia rekombinowanego przeciwciała według wynalazku. Przeciwciało humanizowane, które obejmuje połączenie rekombinowanego łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego jest poszukiwane w hodowli odpowiednim testem, takim jak ELLSA albo RIA. Podobne konwencjonalne techniki mogą być zastosowane w celu skonstruowania innego przeciwciała zmienionego albo cząsteczki według wynalazku.
Odpowiednie wektory do etapów klonowania, wykorzystywane w sposobach i konstruowaniu kompozycji według wynalazku, mogą być wybrane przez specjalistę w dziedzinie. Przykładowo, mogą być zastosowane konwencjonalne wektory do klonowania szeregu pUC. Jednym ze stosowanych wektorów jest pUC19, dostępny w handlu od kilku dostawców, takich jak Amersham (Buckinghamshire, Zjednoczone Królestwo) albo Pharmacia (Uppsala, Szwecja). Oprócz tego, dowolny wektor zdolny do replikacji, posiadający liczne miejsca klonowania i geny selekcyjne (np. oporności na antybiotyki), może być zastosowany do klonowania. Tak więc, wybór wektorów do klonowania nie stanowi czynnika ograniczającego wynalazek.
Podobnie, wektory zastosowane do ekspresji rekombinowanych przeciwciał według wynalazku mogą być wybrane przez specjalistę spośród dowolnych konwencjonalnych wektorów. Wektory zawierają również wybrane sekwencje regulatorowe (takie jak promotor CMV), które kierują replikacją i ekspresją heterologicznych sekwencji DNA w komórce gospodarza. Wektory te zawierają wyżej opisane sekwencje DNA kodujące rekombinowane przeciwciała albo regiony kodujące zmienione immunoglobuliny. Oprócz tego, wektory mogą obejmować wybrane sekwencje immunoglobulin zmodyfikowane przez wprowadzenie pożądanych miejsc restrykcyjnych do łatwej manipulacji.
PL 194 312 B1
Wektory ekspresyjne mogą się również charakteryzować genami odpowiednimi do amplifikacji ekspresji heterologicznych sekwencji DNA, np. genem reduktazy dihydrofolianowej ssaków (DHFR). Inne korzystne sekwencje wektora obejmują sekwencję sygnału poli A, takie jak pochodzące z sekwencji bydlęcego hormonu wzrostu (BGH) i sekwencji promotora betaglobiny (betaglopro). Wektory ekspresyjne przydatne tu mogą być syntetyzowane znanymi technikami specjalistom w dziedzinie.
Składniki takich wektorów, np. replikony, geny selekcji, wzmacniacze, promotory, sekwencje sygnałowe itp. mogą być uzyskane w handlu albo ze źródeł naturalnych, albo syntetyzowane znanymi procedurami w celu zastosowania w kierowaniu ekspresją i/lub wydzielaniem produktu rekombinowanego DNA w komórkach gospodarza. Inne odpowiednie wektory ekspresyjne, których liczne przykłady są znane w dziedzinie ekspresji w komórkach ssaków, bakterii, owadów, drożdży i grzybów mogą być również wybrane do tego celu.
Niniejszy wynalazek dotyczy również linii komórkowej transfekowanej rekombinowanym plazmidem zawierającym sekwencje kodujące rekombinowanych przeciwciał albo ich zmienionych cząsteczek immunoglobulin. Komórki gospodarza przydatne w klonowaniu i innych manipulacjach na wektorach do klonowania są również konwencjonalne. Jednakże, korzystnie, do replikacji wektorów do klonowania i innych etapów konstruowania zmienionych przeciwciał według wynalazku, stosowane są różne szczepy E. coli.
Odpowiednie komórki gospodarza albo linie komórkowe do ekspresji rekombinowanego przeciwciała, albo zmienionego przeciwciała według wynalazku są korzystnie komórkami ssaków, takimi jak CHO, COS, fibroblastami (np. 3T3) i komórkami szpiku, korzystniej CHO albo komórkami szpiku. Mogą być stosowane komórki ludzkie, co pozwala na modyfikowanie cząsteczki według ludzkiego wzorca glikozylacji. Ewentualnie, mogą być wykorzystane inne linie komórek eukariotycznych. Wybór odpowiedniej komórki gospodarza i sposób transformacji, hodowli, amplifikacji, przesiewania i wytwarzania produktu oraz oczyszczania są znane w stanie techniki, patrz Sambrook i in., już cytowane.
Komórki bakteryjne mogą okazać się również przydatne jako komórki gospodarza, odpowiedniego do ekspresji rekombinowanych fragmentów Fab według wynalazku (patrz Pluckthun A., Immunol. Rev., 130:151 (1992)). Jednakże, z powodu tendencji białek ekspresjonowanych w komórkach bakteryjnych do braku fałdowania albo niewłaściwego fałdowania, albo do braku glikozylacji, każdy rekombinowany Fab wytwarzany w komórkach bakteryjnych powinien być badany pod kątem zachowania zdolności wiązania antygenu. Jeżeli cząsteczka ekspresjonowana w komórce bakteryjnej jest w postaci prawidłowo pofałdowanej, oznacza to, że komórka bakteryjna będzie właściwym gospodarzem. Przykładowo, różne szczepy E. coli stosowane do ekspresji są dobrze znanymi komórkami gospodarza w dziedzinie biotechnologii. Różne szczepy B. subtilis, Streptomyces, innych pałeczek itp. mogą być również zastosowane w tej metodzie.
Jeżeli to konieczne, szczepy drożdży znane specjalistom są również dostępne jako komórki gospodarza, podobnie jak komórki owadów, np. Drosophila i Lepidoptera oraz wirusowe układy ekspresyjne, patrz Miller i in., Genetic Engineering, 8: 277, Plenum Press (1986) oraz już cytowane odnośniki.
Ogólne metody, dzięki którym mogą być konstruowane wektory według wynalazku, metody transfekcji wymagane do wytwarzania komórek gospodarza według wynalazku oraz metody hodowli niezbędne do wytwarzania zmienionych przeciwciał według wynalazku w tych komórkach gospodarza, są technikami konwencjonalnymi. Podobnie, po wytworzeniu zmienione przeciwciała według wynalazku mogą być oczyszczane z zawartości hodowli standardowymi procedurami znanymi w stanie techniki, takimi jak precypitacja siarczanem amonu, kolumny powinowactwa, chromatografia kolumnowa, elektroforeza na żelu itp. Techniki takie mieszczą się w stanie techniki i nie ograniczają wynalazku.
W jeszcze innej metodzie ekspresji przeciwciał humanizowanych można wykorzystywać ekspresję w zwierzętach transgenicznych, takich jak opisane w patencie USA nr 4 873 316. Dotyczy to układu ekspresyjnego stosującego promotor kazeinowy zwierzęcia, który po transgenicznym włączeniu do organizmu ssaka umożliwia samicy wytwarzanie pożądanego białka rekombinowanego w jej mleku.
Po ekspresji pożądaną metodą, rekombinowane przeciwciało jest badane pod kątem aktywności przez zastosowanie odpowiedniego testu. Obecnie stosowany jest konwencjonalny format testu ELISA w celu określenia w sposób ilościowy i jakościowy wiązania rekombinowanego przeciwciała z IL-5. Oprócz tego, mogą być również zastosowane inne testy in vitro w celu sprawdzenia skuteczności neutralizacyjnej, przed badaniami klinicznymi na ludziach wykonywanymi w celu zbadania trwałości rekombinowanego przeciwciała w organizmie mimo zwykłych mechanizmów oczyszczania.
W oparciu o procedury opisane dla przeciwciał humanizowanych wytwarzanych 2B6, specjalista w dziedzinie może również skonstruować humanizowane przeciwciała z innych przeciwciał donoro14
PL 194 312 B1 wych skierowanych przeciwko IL-5, sekwencji regionów zmiennych i peptydów CDR opisanych tu. Rekombinowane przeciwciała mogą być wytwarzane ze zmiennymi regionami zrębowymi potencjalnie rozpoznawanymi jako „swoje” przez biorcę rekombinowanego przeciwciała. W zmiennym regionie zrębowym mogą być zastosowane drobne modyfikacje w celu zwiększenia wiązania antygenu bez istotnego zwiększenia immunogenności dla biorcy. Takie rekombinowane przeciwciała mogą skutecznie leczyć u ludzi stany wywołane IL-5. Przeciwciała takie mogą być również przydatne w diagnozowaniu takich stanów.
VIL. Zastosowania terapeutyczno-profilaktyczne
Przeciwciała i zmienione przeciwciała według wynalazku oraz fragmenty przeciwciał są odpowiednie do leczenia ludzi doświadczających objawów związanych z eozynofilią, takich jak astma.
Odpowiedź terapeutyczna wywołana przez zastosowanie cząsteczek według wynalazku, jest wywołana przez wiązanie z ludzką IL-5i w ten sposób blokowanie pobudzenia eozynofilów. Tak więc, cząsteczki według wynalazku, w preparatach albo formulacjach odpowiednich do zastosowania terapeutycznego, są niezwykle pożądane dla osób doświadczających reakcji alergicznej i/lub atopowej, albo reakcji związanej z eozynofilią, takich jak, ale nie wyłącznie, katar alergiczny, astma, przewlekłe eozynofilowe zapalenie płuc, alergiczna aspergiloza oskrzelowo-płucna, celiakia, eozynofilowe zapalenie żołądka i jelit, zespół Churg-Straussa (guzkowate zapalenia tętnic z atopią), eozynofilowy zespół bólów mięśniowych, zespół hipereozynofiłowy, reakcje obrzękowe, w tym napadowy obrzęk naczyniowy, zakażenia przywrami, gdzie eozynofile mogą odgrywać rolę ochronną, nicieniowe zapalenie skóry i atopowe zapalenie skóry.
Zmienione przeciwciała, przeciwciała według wynalazku i fragmenty przeciwciał mogą być również zastosowane z innymi przeciwciałami, szczególnie ludzkimi mAb reagującymi z innymi znacznikami (epitopami) odpowiedzialnymi za stany, przeciwko którym skierowane jest rekombinowane przeciwciało według wynalazku.
Czynniki terapeutyczne według wynalazku uważane są za pożądane do leczenia stanów alergicznych w okresie od około 2 dni do około 3 tygodni albo w zależności od potrzeby. Przykładowo, długie leczenie może być pożądane przy leczeniu sezonowych katarów itp. Stanowi to istotną zaletę w stosunku do protokołów infuzyjnych leków dotychczas stosowanych w leczeniu stanów wywołanych IL-5. Dawka i czas trwania leczenia zależy od względnego okresu pozostawania cząsteczek według wynalazku w krążeniu człowieka i mogą być dobrane przez specjalistę zależnie od leczonego stanu i ogólnego zdrowia pacjenta.
Sposób podawania czynnika terapeutycznego według wynalazku może odbywać się dowolną drogą podawania. Zmienione przeciwciała, przeciwciała, rekombinowane przeciwciała i ich fragmenty oraz kompozycje farmaceutyczne według wynalazku są szczególnie przydatne do podawania pozajelitowego, tj. podskórnie, domięśniowo, dożylnie lub donosowo.
Czynniki terapeutyczne według wynalazku mogą być przygotowane jako kompozycje farmaceutyczne zawierające skuteczną ilość rekombinowanego (np. humanizowanego) przeciwciała według wynalazku jako składnik czynny w dopuszczalnym farmaceutycznie nośniku. W przypadku czynnika profilaktycznego korzystna jest zawiesina wodna albo roztwór zawierający rekombinowane przeciwciało, korzystnie buforowane w fizjologicznym pH, w postaci gotowej do wstrzyknięcia. Kompozycje do podawania pozajelitowego powinny obejmować roztwór rekombinowanego przeciwciała według wynalazku albo ich mieszaninę rozpuszczoną w dopuszczalnym fizjologicznie nośniku, korzystnie nośniku wodnym. Można stosować wiele różnych nośników wodnych, np. 0,4% roztwór soli, 0,3% roztwór glicyny itp. Roztwory te są sterylne i na ogół pozbawione cząstek stałych. Roztwory te mogą być sterylizowane konwencjonalnymi, dobrze znanymi technikami (np. przez filtrowanie). Kompozycje mogą zawierać farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze, jeżeli jest to konieczne do osiągnięcia warunków fizjologicznych, takie jak czynniki regulujące pH i czynniki buforowe itp. Stężenie przeciwciała według wynalazku w takich kompozycjach farmaceutycznych może być w szerokim zakresie, tj. od mniej niż około 0,5%, zwykle od co najmniej około 1% do 15 albo 20% wagowych i powinno być dobrane głównie w oparciu o objętości płynów, lepkości itp., zależnie od wybranej konkretnej drogi podawania.
Tak więc, kompozycje farmaceutyczne według wynalazku do wstrzyknięć domięśniowych powinny być wytwarzane tak by zawierać 1ml sterylnej buforowanej wody i około 1ng do około 100 mg, np. od około 50ng do około 30 mg lub korzystnie od około 5 mg do około 25 mg rekombinowanego przeciwciała według wynalazku. Podobnie kompozycja farmaceutyczna według wynalazku do podawania dożylnego może zawierać około 250 ml sterylnego roztworu Ringera i od około 1do około 30,
PL 194 312 B1 korzystnie od około 5 do około 25 mg rekombinowanego przeciwciała według wynalazku. Obecne metody wytwarzania kompozycji do podawania pozajelitowego są dobrze znane i powinny być oczywiste dla specjalisty w dziedzinie, a opisane są szczegółowo, przykładowo, w Remington's Pharmaceutical Science, wydanie 15, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.
Korzystnie, czynnik terapeutyczny według wynalazku jako preparat farmaceutyczny jest w postaci jednostkowych dawek. Odpowiednia, skuteczna terapeutycznie dawka może być łatwo określona przez specjalistę w dziedzinie.
W celu skutecznego leczenia chorób zapalnych u ludzi i zwierząt, należy podać pozajelitowo, korzystnie i.v. albo i.m. (domięśniowo) jedną dawkę około 0,1 mg do około 20 mg białka albo przeciwciała według wynalazku na 70 kg ciężaru ciała. Taka dawka może być powtórzona, jeżeli to konieczne, w odpowiednich odstępach czasu dobranych odpowiednio przez lekarza podczas trwania reakcji zapalnej.
Zmienione przeciwciała i rekombinowane przeciwciała według wynalazku mogą być również stosowane w schematach diagnostycznych, jak na przykład do rozpoznawania chorób, w których bierze udział IL-5 albo do śledzenia postępów leczenia takich chorób. Jako odczynnik diagnostyczny, zmienione przeciwciała mogą być typowo znakowane do zastosowania w ELLSA i innych konwencjonalnych formatach testów do mierzenia poziomu IL-5 w surowicy, osoczu albo innej odpowiedniej tkance, albo do uwalniania przez ludzkie komórki w hodowli. Istota testu, w którym zmienione przeciwciała są stosowane jest konwencjonalna i nie ogranicza wynalazku.
Tak więc, jedno z wykonań niniejszego wynalazku dotyczy sposobu wspomagania rozpoznawania alergii i innych stanów związanych z nadmiarem wytwarzania eozynofilów w organizmie pacjenta, który obejmuje etapy oznaczania ilości ludzkiej IL-5 w próbce (osocza albo tkanki) uzyskanej od pacjenta i obejmuje porównanie ilości oznaczonej ze średnią ilością ludzkiej IL-5w populacji zdrowej, gdzie obecność istotnie podwyższonych ilości IL-5 w próbce od pacjenta jest wskaźnikiem alergii i innych stanów związanych z nadmiarem wytwarzania eozynofilów.
Opisane tu przeciwciała, zmienione przeciwciała albo ich fragmenty mogą być liofilizowane do przechowywania i rozpuszczane w odpowiednim nośniku przed zastosowaniem. Technika ta jest, jak wykazano, skuteczna w przypadku konwencjonalnych immunoglobulin i można zastosować znane w dziedzinie techniki liofilizacji i rekonstytucji.
Poniższe przykłady ilustrują różne aspekty wynalazku obejmujące konstruowanie przykładowych przeciwciał rekombinowanych i ich ekspresję w odpowiednich wektorach i komórkach gospodarza, i nie ograniczają zakresu wynalazku.
Wszystkie aminokwasy oznaczone są w konwencjonalnym kodzie trzyliterowym albo jednoliterowym.
Wszystkie niezbędne enzymy restrykcyjne, plazmidy, inne reagenty i materiały są możliwe do uzyskania w handlu, o ile nie zaznaczono inaczej.
Wszystkie ogólne metody klonowania, ligacji i inne metody rekombinacji DNA wykonano w oparciu o publikację Maniatis iin., cytowane wyżej albo o drugie wydanie (1989) Sambrook i in., ten sam wydawca („Sambrok i in.”).
Przykład 1. Wytwarzanie mAb przeciwko IL-5
Ludzką IL-5 wyrażano w komórkach Drosophila Schneider 2(S2) i oczyszczano do homogenności. Mysie IL-5 wyrażano w bakulowirusie stosując komórki Spodoptera frugiperda 21 (Sf21) i oczyszczano do homogenności. Przeciwciało monoklonalne TRFK-5 (neutralizujące szczurze przeciwciało przeciwko mysiej IL-5) uzyskano z Genzyme Corp. (Cambridge, MA).
A. Procedura immunizacji
Rekombinowaną ludzką IL-5 (IL-5) zastosowano jako immunogen dla panelu siedmiu samic myszy CAF1 (Charles River, Wilmington, MA).
Zwierzęta otrzymały trzy podskórne wstrzyknięcia IL-5 w roztworze soli buforowanym fosfora™ nem (PBS). Zemulgowanym w stosunku 1:1 z TiterMAK™ (CytoRx Corp., Norcross, GA) w ciągu czterech miesięcy.
Dawka uczulająca wynosiła 50 μg, zaś dawki przypominające wynosiły 25 i 10 μg. Po dawkach przypominających, zebrano próbki surowicy i badano na wiązanie z IL-5oraz na aktywność neutralizacji w teście hamowania wiązania z receptorem oraz w teście proliferacji B13 (albo w teście neutralizacji IL-5 (przykład 2C)).
Wszystkie próbki surowic myszy wiązały IL-5. Zwierzęta wybrane jako dawcy śledzion otrzymały dożylnie dawkę przypominającą 10 μg rekombinowanej ludzkiej IL-5 na trzy dni przed zabiciem.
PL 194 312 B1
B. Opracowanie hybrydoma
Zastosowano procedurę fuzji, opisaną przez Kohlera i in., (Nature 256: 495 (1975)) z modyfikacjami, w celu wykonania techniki z użyciem jednowarstwy komórek (Kennet i in., wyd., „Hybridomas: Anew dimension in biological analysis”, str. 368-377, Plenum Press, New York). Splenocyty od dwóch myszy połączono i poddano fuzji stosując stosunek 50 milionów splenocytów na 10 milionów komórek szpiczaka SP2/0/Ag14.
Supernatanty ze studzienek pozytywnych pod względem fuzji badano na wiązanie z IL-5 w teście ELISA. Studzienki zawierające komórki wytwarzające przeciwciało przeciwko IL-5 namnażano ibadano supernatant w teście na zahamowanie wiązania z receptorem IL-5oraz w teście proliferacji (neutralizacji) B13 (opisanym poniżej).
Izolowano szesnaście linii hybrydoma wydzielających mAb reagujące z IL-5. Supernatanty zhybrydoma zmieszano z jodowaną IL-5, dodano do ekstraktu błon wytworzonych z komórek Drosophila wyrażających łańcuch α receptora IL-5 (IL-5R) i badano na zahamowanie wiązania receptora. Jedenaście supernatantów hybrydoma hamowało wiązanie jodowanej IL-5 z łańcuchem α receptora więcej niż w 60%.
Trzy spośród monoklonalnych przeciwciał, 2B6, 2E3 i 2F2 również hamowało więcej niż w70% proliferację mysich komórek B13 w odpowiedzi na ludzką,ale nie mysią IL-5. Pięć spośród hybrydoma, z których cztery wydzielały mAb blokujące wiązanie i/lub proliferację (1C6, 2B6, 2E3 i2F2) oraz jedną produkującą przeciwciało, które nie było przeciwciałem neutralizującym (24G9) klonowano wsposób powtarzalny w miękkim agarze otrzymując stabilne linie komórkowe.
Supernatanty z klonowanych linii badano na aktywność krzyżową w teście ELISA i stwierdzono, że nie wiązały one ludzkiej IL-1a, IL-Ιβ, IL-4, IL-8, M-CSF oraz TGFa. mAb oczyszczano i określano powinowactwo wiązania przy użyciu biosensora (BIAcore) w zakresie od 10 do 100 pM.
Supernatanty z linii izotypowano stosując mysie reagenty do izotypowania(PharMingen, San Diego, CA). Zestawienie powinowactw iIC50 aktywności neutralizującej mAb przedstawiono w tabeli1 (przykład 2).
Podobnymi sposobamiotrzymano hybrydoma szczurze od immunizowanych szczurów, stosując porównywalny protokół immunizacji i szczurze szpiczaki do fuzji, jak to opisano dla myszy. Zidentyfikowano dwie szczurze hybrydoma, 4A6 i 5D3, wytwarzające mAb, które wiązały IL-5. Podobnie jak mAb 2B6, 2E3 i 2F2, mAb 4A6 i 5D3 były neutralizujące w teście B13 opisanym niżej.
C. Depozyt hybrydoma
Linia komórkowa hybrydoma SK119-2B6.206.75(1) wytwarzająca przeciwciało monoklonalne 2B6 została zdeponowana w American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA, pod numerem HB 11783 i została przyjęta jako depozyt patentowy zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim z1977r., dotyczącym deponowania mikroorganizmów dla celów patentowych.
Linia komórkowa hybrydoma SK119-2E3.39.40.2 wytwarzająca przeciwciało monoklonalne 2E3 została zdeponowana w American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA, pod numerem HB 11782 i została przyjęta jako depozyt patentowy zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim z 1977r., dotyczącym deponowania mikroorganizmów dla celów patentowych.
Linia komórkowa hybrydoma SK119-2F2.37.80.2 wytwarzająca przeciwciało monoklonalne 2F2 została zdeponowana w American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA, pod numerem HB 11781 i została przyjęta jako depozyt patentowy zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim z 1977r., dotyczącym deponowania mikroorganizmów dla celów patentowych.
Linia komórkowa hybrydoma SK119-24G9.8.20.5 wytwarzająca przeciwciało monoklonalne 24G9 została zdeponowana w American ype Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA, pod numerem HB 11780 i została przyjęta jako depozyt patentowy zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim z 1977r., dotyczącym deponowania mikroorganizmów dla celów patentowych.
Linia komórkowa hybrydoma 4A6(1)G1F7 wytwarzająca przeciwciało monoklonalne 4A6 została zdeponowana w American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA, pod numerem HB 11946 i została przyjęta jako depozyt patentowy zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim z 1977r., dotyczącym deponowania mikroorganizmów dla celów patentowych.
Linia komórkowa hybrydoma 5D3(1)F5D6 wytwarzająca przeciwciało monoklonalne 5D3 została zdeponowana w American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA, pod numerem HB 11942 i została przyjęta jako depozyt patentowy zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim z 1977r., dotyczącym deponowania mikroorganizmów dla celów patentowych.
PL 194 312 B1
Pr zy kł a d 2. Testy
A. ELISA
Pojedyncze studzienki płytki MaxiSorb™ (Nunc, Nepperville, IL) opłaszczano 0,2 μg IL-5 w 0,05 M buforze węglanowym pH 9,6. Po inkubacji przez noc w 4°C płytki przemywano PBS zawierającym 0,025% Tween 20 i blokowano 1% BSA w PBS z 0,025% Tween 20 przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Nie rozcieńczone supernatanty hybydoma dodawano do studzienek opłaszczonych IL5 i inkubowano w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Po przemyciu płytek, dodano kozie przeciwciało przeciw mysim IgG i IgM (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) w rozcieńczeniu 1:7500 wPBS zawierającym 1% BSAi 0,025% Tween 20.
Dwie godziny później płytki przepłukano i dodano 0,2 ml 0,1 M buforu cytrynianowego pH 4,75 zawierającego 0,1% nadtlenek mocznika i 1mg/ml orto-fenylenodiaminy. Po 15 minutach płytki odczy™ tano przy 450 nm w czytniku VMax™ Microplate Reader (Molecular Devices, Menlo Park, CA).
B. Test zahamowania wiązania z receptorem
Ekstrakty błon komórek Drosophila S2, wyrażających łańcuch α receptora ludzkiej IL-5 (IL-5R) zastosowano do zmierzenia wpływu przeciwciał na wiązanie IL-5 z receptorem.
W celu wytworzenia błon, 109 komórek zebrano przez odwirowanie przy 100 x g w 4°C przez 10 minut. Osad komórek zamrożono w łaźni suchy lód/etanol przez 15 minut.
Osad rozmrożono, zawieszono w 10 ml PBS w4°C i zwirowano przy 1000 x g przez 10 minut. Osad płukano 2 x w PBS i zawieszono w 13,5 ml buforu hipotonicznego (10 mM Tris pH 7,5, 3 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitolu, 1 mM fluorku fenylometylosulfonylu, 1 μM leupeptyny, 1 μM pepstatyny A) i inkubowano na lodzie przez 5 minut. Zawiesinę komórek homogenizowano w 15 ml homogenizatorze Dounce i doprowadzono do końcowego stężenia 0,25 M sacharozy 2,5 M roztworem sacharozy. Resztki komórkowe usunięto przez odwirowanie przez 15 minut przy 1000 x g. Błony komórkowe zebrano przez odwirowanie przy 100000 x g w 4°C przez 90 minut i zawieszono w 50 ml 10 mM Tris pH 7,5, 3 mM MgCl2, 250 mM sacharozy i przechowywano w -70°C.
Test z błonami Drosophila zawierającymi receptor przperowadzono na płytkach Multiscre™ enGW™ (Millipore Corp., Bedford, MA) stosując pożywkę hodowlaną Drosophila M3 (Lindquist i in., Drosophila Inf. Serv., 58:163 (1982)) zawierającą 25 mM HEPES pH 7,2 i 0,1% BSA(bufor do wiązania).
Studzienki blokowano 0,1 ml buforu do wiązania. 50 μl próbki badanej, w potrójnym powtórze125 niu, dodano do studzienek, po czym dodano 25 μl jodowanej ( I)IL-5. Po 20 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej, do studzienek dodano 25 μl ekstraktu błon Drosophila S2 wyrażających łańcuch α ludzkiego IL-5R.
Po dalszej godzinie inkubacji błony zebrano przez filtrowanie pod próżnią i płukano 3 x buforem do wiązania. Filtry wysuszono i liczono impulsy.
C. Test neutralizacji IL-5
Mysią linię LyH7.B13 (B13) zależną od IL-5/IL-3 otrzymano dzięki uprzejmości R. Palacios, Basel Institute of Immunology, Szwajcaria. Komórki klonowano dwa razy w tygodniu w RPMI 1640 (Gibco BRL, Renfrewshire, UK), z dodatkiem L-glutaminy, niezbędnych aminokwasów, pirogronianu sodu, penicyliny-streptomycyny (Gibco BRL) i 2-merkaptoetanolu (5 x 10-5M, Sigma), 10% cielęcej surowicy płodowej (Globepharm, Surrey, UK) i 1-10 jednostek mysiej IL-5. Do testu komórki hodowano przez 48 godzin w potrójnym powtórzeniu (5000 komórek/studzienkę) w 96-studzienkowych płytkach okrągłodennych w obecności odpowiednio rozcieńczonych próbek i pulsowano 0,5 μφ 3H-tymidyny (Amersham, Bucks, UK) przez ostatnie 4 godziny.
Następnie przygotowano je do zliczenia scyntylacji w czytniku 1205 Betaplate (LKB Wallac, Beds, UK).
D. Biosensor optyczny
Właściwości kinetyczne i równowagi wiązania z unieruchomioną hIL-5 i przeciwciałami mierzono stosując biosensor optyczny BIAcore (Pharmacia Biosensor, Uppsala, Szwecja).
Dane dotyczące kinetyki badano stosując zależności opisane uprzednio (Karlsson i in., J. Immunol. Meth., 145: 229-240 (1991)).
Trzy spośród mAb neutralizujących, konkretnie 2B6, 2E3 i 2F2, wykazywały bardzo podobną si125 łę zahamowania wiązania 125L-IL-5 z receptorem błonowym i neutralizacji proliferacji limfocytów B i bardzo zbliżone powinowactwo do IL-5 (patrz tabela 1).
Określono sekwencje nukleotydowe VH i VL tych trzech mAb, odpowiednio, 2 LgGi i 1 LgG2a. Uzyskane sekwencje były bardzo podobne, różniąc się jedynie kilkoma resztami.
PL 194 312 B1
Ta be l a 1
Powinowactwo i aktywność neutralizacji mAb reagujących z ludzką IL-5
mAb Kd(pM)a Wiązanie IC50(nM)b Neutralizacja Proliferacja ICs0c Zahamowanie 100%c
2B6 22 1 70 200
2E3 20 1 90 600
2F2 13 1 150 340
1C6 86 43 12200 ND
24G9 ND > 133 <100000 ND
4A6 18 > 88 28 100
5D3 ND ND 100 10000
a Określone w analizie biosensorem optycznym (BIAcore) (25°C) b Zahamowanie wiązania 125L-IL-5 z IL-5R (łańcuch α) z błon Drosophila c Zahamowanie proliferacji (w pM) komórek B13 w odpowiedzi na8 pM ludzkiej IL-5
ND = brak danych
P r z y k ł a d 3. Izolacja i charakteryzacja Fab wobec IL-5 z biblioteki kombinatoryjnej
A. PCR i konstruowanie biblioteki kombinatoryjnej
RNA oczyszczony ze śledzion trzech myszy poddano odwrotnej transkrypcji z zestawem cDNA (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) stosując starter (dT) 15 dostarczony w zestawie albo startery 3'Fd (IgG1, LgG2a i IgG3) i startery dla łańcuchów lekkich kappa, jak to opisano w Huse i in., (Science 246: 1275 (1989)) i Kang S.A, (Methods: Companion Methods Enzymol., 2: 111 (1991)). cDNA immunoglobulin amplifikowano przez PCR stosując opisane startery i warunki cyklu termicznego (Huse i in., ™ jak wyżej). Do wszystkich reakcji stosowano technikę „hot-start” stosując perełki AmpliWax™ PCR Gem 100 (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) i protokół producenta. Produkty PCR oczyszczono na żelu, trawiono i ligowano do wektora pMKFabGeneS (Ames i in., J. Immunol., 152: 4572 (1994)). Miano biblioteki po ligacji z cDNA Fd wynosiło 5,1 x 107 cfu, zaś po ligacji z cDNA kappa wynosiło 1,5x 106 cfu. Komórki XL1-Blue (Stratagene, La Jolla, CA) transformowane biblioteką fagemidową zakażono fagiem pomocniczym VCSM13 (Stratagene) i preparowano faga jak to opisano w Barbas i Lerner (Methods: Companion Methods Enzymol., 2:119 (1991)).
B. Biopanning
Cztery studzienki do mikromiareczkowania (Immulon II Removawell Strips, Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, VA) opłaszczano przez noc w 4°C IL-5 (1 μg/studzienkę) w 0,1 M wodorowęglanie pH 8,6. Studzienki płukano wodą i blokowano PBS zawierającym 3% BSA w 37°C przez godzinę. Roztwór do blokowania usunięto i dodano do studzienek bibliotekę (50 μl/studzienkę) i inkubowano w 37°C przez 2 godziny. Studzienki płukano 10-krotnie TBS/Tween (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5% Tween 20) i raz wodą, po czym eluowano przylegające fagi 0,1 M HCl, doprowadzonym do pH 2,2 glicyną, zawierającym 1 mg/ml BSA.
C. Odbitki kolonii
Odbitki kolonii klonów izolowanych po trzech i czterech rundach procesu biopanning, przygotowano jak to opisano (Barbas i Lerner, wyżej). Filtry inkubowano przez godzinę w temperaturze poko125 jowej z 0,5-1,0 μφ L-IL5, jodowanej reagentem Bolton-Huntera (NEN, Billerica, MA) w oparciu o protokół producenta, w PBS zawierającym 1% BSA, płukano PBS 0,24% Tween i eksponowano na kliszę Kodak XAR. Kolonie wyrażające Fab reagujące z IL-5 wykrywano techniką autoradiografii.
D. Wytwarzanie rozpuszczalnych Fab
DNA fagemidów trawiono Nhel i Spel w celu usunięcia genu III i samoligacji. Komórki XL1-Blue transformowano i wyizolowane klony hodowano przez noc w 37°C w 5 ml pożywki Super Broth (SB) (30 g tryptonu, 20 g ekstraktu drożdży, 10 g kwasu 3-(N-morfolino)propanosulfenowego, MOPS, pH 7) zawierającej 1% glukozy i 50 μg/ml karbenicyliny. Komórki z 1 ml hodowli zebrano przez odwirowanie przy 3500 obr./min. przez 10 minut w wirówce Beckman GS-6R i zastosowano do inokulacji 5 ml SB zawierającej 50 μg/ml karbenicyliny. Hodowle wytrząsano przez 1 godzinę w 37°C, dodano 1 mM izopropylo-b-D-tiogalaktopiranozydu, IPTG i przeniesiono hodowle do 28°C na noc. Rozpuszczalne Fab wytworzono z ekstraktów periplazmatycznych przez lizę osadu komórek w 20% sacharozie przez
PL 194 312 B1 minut w 4°C, zawieszono w 30 mM Tris pH 8,0, a następnie odwirowano w Microfuge przez 10 minut. Stężenie Fab określono w analizie Western blot, przez porównanie próbek zawierających znane ilości mysich Fab. Różne ekstrakty periplazmatyczne zawierały podobne stężenia Fab w zakresie od 1 do 20 μg/ml, jak określono analizą Western blot.
E. Oczyszczanie Fab
Na końcu karboksylowym łańcucha ciężkiego skonstruowano peptyd chelatujący, w celu ułatwienia oczyszczania. Po usunięciu regionu kodującego genu IIIM13 przez trawienie NheIi SpeI, parę nakładających się oligonukleotydów:
Identyfikator Sekw. Nr 43; 5'CTAGCCACCACCACCACCACCACTAA3' i
Identyfikator Sekw. Nr 44; 5'GTTGTTGTTGTTGTTGTTGATC3', kodujących sześć reszt histydynowych wklonowano do wektora ekspresyjnego Fab. Indukcję ekspresji Fab przeprowadzono jak to opisano wyżej.Po całonocnej hodowli w 28°C wytworzono lizaty periplazmatyczne z osadu komórkowego, przez 30 minutową inkubację w 4°C w 20% sacharozie, 30 mM Tris pH 8,0. Wcelu sklarowania supernatantu dodano mocznik i detergent Brij-35 w stężeniu końcowym, odpowiednio 2 M i 1%. Po mieszaniu w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, traktowane iklarowane supernatanty wprowadzono z prędkością 0,5 ml/min, bezpośrednio na 5 ml kolumnęchelatującą Nickel-NTA (1,5 x 3 cm) zrównoważoną buforem A (100 mM fosforan sodu, 10 mM Tris, 0,3 M NaCl, 2 M mocznik, pH 8,0). Po płukaniu czterokrotną objętością kolumny (20 ml) związany materiał eluowano w 6 objętościach kolumny (30 ml) odwrotnego gradientu pH, od pH 8 do pH 4 w powyższym buforze. Oczyszczone Fab eluowano z kolumny jako ostry symetryczny pik przy pH 5,5. Były one w>90% wolne od DNA.
F. ELISA Fab
Płytki Immulon II(Dynatech) opłaszczano przez noc w 4°C białkiem zawieszonym (1 mg/ml, 50ml/studzienkę) w 0,1 M buforze wodorowęglanowym pH 8,6. Rozcieńczenia i płukanie wykonywano w PBS zawierającym 0,05% Tween 20. Płytki płukano i blokowano przez 1godzinę PBS zawierającym 1% BSA w temperaturze pokojowej. Do płytek dodawano różne rozcieńczenia supernatantów bakteryjnych zawierających rozpuszczalne Fab albo oczyszczone Fab. Po godzinnej inkubacji płytki płukano, po czym dodano biotynylowane kozie przeciwciała przeciwko mysim łańcuchom kappa (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL) w rozcieńczeniu 1:2000; 50 μl/studzienkę przez godzinę. Płytki płukano, po czym dodano znakowanej streptawidyną peroksydazy chrzanowej (rozcieńczenie 1:2000; 50 μl/studzienkę) przez 1 godzinę. Płytki płukano, dodawano substrat ABTS (100 μl/studzienkę; Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) i mierzono gęstość optyczną ™ przy405 nm w czytniku płytek UVmax™(Molecular Devices).
G. Izolacja i charakteryzacja Fab z biblioteki kotnbinatoryjnej
Fagi niosące Fab dla IL-5 selekcjonowano z bibliotekiprzez wielokrotnie powtarzany biopanning w studzienkach opłaszczonych IL-5. Po czterech rundach selekcji, zidentyfikowano klony reagujące
125 zIL-5 w odbitkach kolonii przy użyciu 125I-IL-5. Zidentyfikowano 34 kolonie ztrzeciej rundy i 4 kolonie zczwartej rundy. Wiązanie z IL-5 potwierdzono przez bezpośrednie wiązanie ELISA przy użyciu supernatantów z hodowli wyrażających białko fuzyjne Fab-gen III. Izolowano DNA z tych kolonii i po usunięciu regionu kodującego gen III M13, indukowano ekspresję rozpuszczalnych Fab. Wytworzono frakcje periplazmatyczne i badano w teście ELISA na wiązaniez IL-5. Fab wiązały się swoiście z IL-5 bez istotnego wiązania z innym białkiem rC5a.
Nie rozcieńczone ekstrakty periplazmatyczne (zawierające 1 do 20 μg/ml Fab) badano w teście zahamowania wiązania IL-5R (przykład 2). Żaden z Fab nie hamował wiązania jodowanej IL-5z IL-5R bardziej niż w 35%.
H. Konwersja neutralizujących mAb do Fab cDNA Fd i .mAb (2B6) izolowano przez PGR stosując warunki opisane wyżej. Fragmenty oczyszczone na żelu klonowano do wektora pMKFabGene3, zmodyfikowanego przez wprowadzenie sekwencji heksa-His na końcu 3' cDNA genu III, uzyskując plazmid pMKFabGene3H. Funkcjonalny, wiążący IL-5klon Fab zawierający łańcuchy ciężkie i lekkie 2B6, zidentyfikowano przezodbitki kolonii. Po usunięciu genu IItrawieniem NheI/SpeI i samoligacją, łańcuch ciężki poddano fuzji w ramce z heksa-His, umożliwiającym oczyszczanie jak to opisano wyżej. W sposób zależny od dawki Fab hamował wiązanie z receptorem z IC50 rzędu 7,5 μg/ml, podobnie jak rodzicielskie przeciwciało mysie 2B6.
I. Konstruowanie i przeszukiwanie biblioteki mieszania łańcuchów cDNA kodujący Fd neutralizującego mAb 2B6 wklonowano jako fragment XhoI/SpeI do pMKFab-Gene3H zawierającego fragment SstI/XbaI w pobliżu cDNA łańcucha lekkiego. Ten fagemid
PL 194 312 B1 trawiono SstIi XbaIi poddano ligacji z trawionym SstI/XbaIłańcuchem lekkim produktu PCR uzyskanego od myszy uczulonej IL-5(opisano wyżej). Miano biblioteki po ligacji wynosiło 4 x 105 cfu. Biopanning iodbitki kolonii wykonano, jak to określono wcześniej dla bibliotek kombinatoryjnych.
Bibliotekę skonstruowano przez parowanie cDNA kodujących Fd przeciwciał neutralizujących 2B6 z tym samym repertuarem łańcuchów lekkich, uzyskanych od myszy immunizowanych IL-5. Tabiblioteka mieszanych łańcuchów poddana została 4 rundom biopanningu wobec unieruchomionej IL-5, zaś powstałe kolonie badane były na aktywność wobec IL-5w teście odbitek kolonii. Kolonie pozytywne, wiążące jodowaną IL-5 były dalej badane w teście ELLSA i wiązania IL-5Rα. Dwa z fragmentów Fab, 2 i 15, odzyskane z biblioteki mieszanych łańcuchów, blokowały wiązanie IL-5 z IL-5Rα ihamowały proliferację zależną od IL-5w teście B13. Sekwencje tych 2 Vks były podobne do sekwencji Vk 2B6, oryginalnego składnika łańcucha lekkiego dla VH 2B6. Sekwencje łańcuchów lekkich dla Fab 2 i15 pokazano w Identyfikatorze Sekw. Nr 45 i 46. Dla Fab2, CDR 1-3 pokazano w Identyfikatorze Sekw. Nr 10, 11 i 47. Dla Fab 15 CDR 1-2 pokazano w Identyfikatorze Sekw. Nr 10, 11 i 48.
Wszystkie reszty aminokwasowe przeciwciał podanych poniżej w przykładach 4 i 5 oznaczono według tego samego układu numeracji KABAT, który uwzględnia różnorodność długości CDR i fragmentów zrębowych. Oznacza to, że aminokwasy są zawsze oznaczane tym samym numerem niezależnie od rzeczywistej liczby poprzedzających aminokwasów. Przykładowo, cysteina poprzedzająca CDR1 wszystkich łańcuchów lekkich jest zawsze w pozycji KABAT 23, zaś tryptofan następujący po CDR1 ma zawsze pozycję KABAT 35, nawet gdy CDR1 zawiera 17 aminokwasów.
Przykład 4. Przeciwciała humanizowane
Zaprojektowano jedno humanizowane przeciwciało, które zawierało mysie CDR w ludzkich regionach zrębowych. Tę humanizowaną wersję mysiego 2B6 swoistego wobec IL-5 wytworzono przez wykonanie następujących czynności.
A. Klonowanie genu mRNA izolowano z każdej z linii 2B6, 2F2 i 2E3 (patrz przykład 1) zestawem uzyskanym zBoehringer Mannheim (Indianapolis, IN) a następnie poddano odwrotnej transkrypcji stosując starter (dT)15 dostarczony w zestawie (Boehringer Mannheim),tworząc cDNA. Startery PGR swoiste wobec mysiej immunoglobuliny zastosowano do amplifikacji DNA kodującego domeny ciągnące się od aminokwasu nr 9 (numeracja KABAT) regionu zmiennego łańcucha ciężkiego do regionu zawiasowego iod aminokwasu nr 9 (numeracja KABAT) regionu zmiennego łańcucha lekkiego do końca regionu stałego. W niezależnych reakcjach PGR uzyskano kilka klonów każdego z łańcuchów przeciwciał. Starterem zastosowanym do regionu zawiasowego mysiego gamma 1był (Identyfikator Sekw. Nr 22): 5'GTACATATGCAAGGCTTACAACCACAATC3'.
Starterem zastosowanym do regionu zawiasowego mysiego gamma 2a był (Identyfikator Sekw.
Nr 23): 5'GGACAGGGCTTACTAGTGGGCCCTCTGGGCTC3'.
Starterem zastosowanym do regionu zmiennego mysiego łańcuch ciężkiego był (Identyfikator Sekw. Nr 24): 5'AGGT(C albo G)(C albo A)A(G albo A)CT(G albo T)TCTCGAGTC(T albo A)GG3'.
Starterem zastosowanym do regionu stałego mysiego łańcucha kappa był (Identyfikator Sekw. Nr 25):5'CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAATGGG3'.
Starterem zastosowanym do regionu zmiennego mysiego łańcucha lekkiego był (Identyfikator Sekw. Nr 26): 5'CCAGATGTGAGCTCGTGATGACCCAGACTCCA3'.
Fragmenty PCR klonowano do plazmidów pGEM7f+ (Promega) które transformowano do E. coli DH5α (Bethesda Research Labs).
B. Sekwencjonowanie DNA
Sekwencjonowano klony cDNAmysich łańcuchów ciężkich i lekkich z części A. Wyniki sekwencjonowania regionów ciężkich tych klonów przedstawiono w Identyfikatorze Sekw. Nr od 1do 6 (fig. 1-6). Każdy z klonów zawierał aminokwasy, o których wiadomo, że są zakonserwowane wśród mysich regionów zmiennych łańcuchów ciężkich i regionów zmiennych łańcuchów lekkich. Sekwencje aminokwasów CDR podano poniżej.
Regiony CDR dla łańcucha ciężkiego 2B6 pokazano jako Identyfikator Sekw. Nr 7, 8 i 9,patrz fig. 7. Sekwencje te są kodowane przez Identyfikator Sekw. Nr 1.
Regiony CDR dla łańcucha lekkiego pokazano jako Identyfikator Sekw. Nr 10, 11 i 12,patrz fig.7. Sekwencje te są kodowane przez Identyfikator Sekw. Nr 2.
Regiony CDR dla łańcucha ciężkiego 2F2 pokazano jako Identyfikator Sekw. Nr 7, 8 i 9,patrz fig. 7. Sekwencje te są kodowane przez Identyfikator Sekw. Nr 3.
PL 194 312 B1
Regiony CDR dla łańcucha lekkiego pokazano jako Identyfikator Sekw. Nr 10, 11 i 13, patrz fig.7. Sekwencje te są kodowane przez Identyfikator Sekw. Nr 4.
Regiony CDR dla łańcucha ciężkiego 2E3 pokazano jako Identyfikator Sekw. Nr 7, 8 i 14,patrz fig. 7. Sekwencje te są kodowane przez Identyfikator Sekw. Nr 5.
Regiony CDR dla łańcucha lekkiego pokazano jako Identyfikator Sekw. Nr 10, 11 i 13, patrz fig.7. Sekwencje te są kodowane przez Identyfikator Sekw. Nr 6.
C. Wybór ludzkich regionów zrębowych
Po klonowaniu 2B6, sekwencje aminokwasowe regionów zmiennych łańcuchów ciężkich i lekkich (fig. 1i 2) (Identyfikator Sekw. Nr 15 i 16) porównywano ze znanymi sekwencjami mysich immunoglobulin w bazach danych sekwencji białek KABAT i SWISS-PROT (Nucl. Acids. Res., 20: 2019 (1992)), w celu uzyskania aminokwasów końca aminowego. Domniemana sekwencja aminokwasowa regionu zmiennego łańcucha ciężkiego i lekkiego 2B6 została porównana z sekwencjami bazy danych ludzkich immunoglobulin w celu identyfikacji ludzkich regionów zrębowych dla łańcuchów ciężkich i lekkich, które najbliżej przypominałyby sekwencje mysie. Oprócz tego, łańcuchy ciężkie i lekkie badano pozycyjną bazą danych z modeli strukturalnych domen Fab, w celu oceny potencjalnych konfliktów z powodu aminokwasów, które mogłyby wpływać na prezentację CDR. Konflikty te rozwikłano podczas syntezy humanizowanych regionów zmiennych zrębu przez podstawienie odpowiednich aminokwasów w te położenia.
Zastosowano regiony zrębowe łańcucha ciężkiego przeciwciała uzyskanego z immunoglobuliny ludzkiego szpiczaka (COR) (Press E.M. i Hogg N.M., Biochem. J. 117:641 (1970)). Ludzka sekwencja aminokwasowa regionu zrębowego łańcucha ciężkiego była, jak stwierdzono, w 66% homologiczna z regionem zrębowym 2B6.
Jako odpowiedni region zrębowy łańcucha lekkiego zastosowano sekwencję zrębową łańcucha lekkiego białka Bence-Jones'a (LEN) (Schneider i in., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 356: 507 (1975)). Ludzkie regiony zrębowe łańcucha lekkiego były w około 82% homologiczne na poziomie aminokwasowym z mysimi regionami zrębowymi łańcucha lekkiego 2B6. Wybrane ludzkie regiony zrębowe poddano odwrotnej translacji w celu otrzymania sekwencji DNA.
D. Konstruowanie genów humanizowanych mAb
W oparciu o CDR łańcucha ciężkiego 2B6 (fig. 7 i Identyfikator Sekw. Nr 1-2) oraz sekwencje zrębowe przeciwciał ludzkich, wytworzono syntetyczny region zmienny łańcucha ciężkiego (Identyfikator Sekw.Nr 18). Wykonano to stosując cztery oligonukleotydy syntetyczne (Identyfikator Sekw. Nr 27 i 28) (Identyfikator Sekw. Nr 29 i 30), które po połączeniu kodowały aminokwasy nr 21-106 (numeracja KABAT). Oligonukleotydy poddano ligacji w miejscu Hpal-KpnI plazmidu opartego na pUC18, zawierającego sekwencje otrzymane z innego humanizowanego łańcucha ciężkiego opartego na regionie zrębowym COR (wyżej). Plazmid ten dostarczał sekwencji sygnałowej (Identyfikator Sekw. Nr 17) i pozostałych sekwencji regionu zmiennego. Wszelkie błędy w mapowanej sekwencji zostały poprawione przez PGR ze starterami mutagennymi albo przez dodanie łączników w istniejących miejscach restrykcyjnych.
Sekwencja sygnałowa i humanizowany region zmienny łańcucha ciężkiego wycięto z plazmidu opartego na pUC jako fragment EcoRI-ApaI i poddano ligacji do wektora ekspresyjnego pCD zawierającego region stały ludzkiego IgG1. Syntetyczny nukleotyd regionu zmiennego łańcucha ciężkiego isekwencje aminokwasowe podano na fig. 8 (Identyfikator Sekw. Nr 18 i 19). Ludzkie reszty zrębowe stanowią aminokwasy 1-30, 34-49, 66-97 i 109-119 Identyfikatora Sekw. Nr 19. Sekwencje aminokwasowe CDR są identyczne jak dla CDR mysiego 2B6. Uzyskany wektor ekspresyjny pCDLLBHZHC1.0 przedstawiono na fig. 10.
W oparciu o CDR łańcucha lekkiego 2B6 (fig. 7 i Identyfikator Sekw. Nr 10, 11 i 12) oraz sekwencje zrębowe przeciwciała ludzkiego,wytworzono syntetyczny region zmienny łańcucha lekkiego (Identyfikator Sekw. Nr 20). Cztery oligonukleotydy syntetyczne kodujące aminokwasy nr 27-109 (numeracja KABAT) (Identyfikator Sekw. Nr 31 i 32) i aminokwasy nr 80-109 (Identyfikator Sekw. Nr 33 i34) humanizowanego VL z końcami, odpowiednio, SacI-KpnIi PstI-HindlII, wprowadzono do plazmidu opartego na pUC18 zawierającego sekwencje uzyskane z innego regionu zrębowego łańcucha lekkiego (B17) (Marsh i in., Nucl. Acids Res., 1 3: 6531 (1985)), który wykazywał istotny stopień homologii ze zrębem LEN. Plazmid zapewnił pozostałe sekwencje regionu zmiennego. Wszelkie błędy w mapowanej sekwencji zostały poprawione przez PCR ze starterami mutagennymi albo przez dodanie łączników w istniejących miejscach restrykcyjnych.
PL 194 312 B1
Humanizowany region zmienny łańcucha lekkiego izolowano z plazmidu pUC jako fragment
EcoRV-Narl i ligowano do wektora ekspresyjnego pCN zawierającego sekwencję sygnałową (Identyfikator Sekw. Nr 17) wraz z ludzkim regionem stałym kappa.
Syntetyczny nukleotyd regionu zmiennego łańcucha lekkiego i sekwencje aminokwasowe pokazane są na fig. 9 (Identyfikator Sekw. Nr 20 i 21). Reszty ludzkiego regionu zrębowego są aminokwasami 1-23, 41-55, 63-94 i 104-113 Identyfikatora Sekw. Nr 21. Sekwencje aminokwasowe CDR są identyczne z mysimi CDR 2B6. Jednakże, sekwencje kodujące tych CDR różnią się od mysich sekwencji kodujących 2B6 umożliwiając tworzenie miejsc restrykcyjnych. Jeden z uzyskanych wektorów ekspresyjnych, pCNILSHZLC1.0 pokazany jest na fig. 11. Te syntetyczne sekwencje zmienne łańcuchów lekkich i/lub ciężkich są stosowane w konstruowaniu przeciwciał humanizowanych.
E. Ekspresja humanizowanych mAb
Humanizowany łańcuch ciężki, uzyskany z izotypu IgG1, wykorzystuje syntetyczny region zmienny łańcucha ciężkiego, jak to pokazano na Identyfikatorze Sekw. Nr 19. Ten syntetyczny VH zawierający CDR łańcucha ciężkiego 2B6 został zaprojektowany i syntetyzowany jak to opisano wyżej.
Humanizowany łańcuch lekki, ludzki łańcuch kappa, wykorzystuje syntetyczne regiony zmienne łańcucha lekkiego, jak pokazane w Identyfikatorze Sekw. Nr 21. Syntetyczny VL zawierający CDR łańcucha lekkiego 2B6 został zaprojektowany i syntetyzowany jak to opisano wyżej. Fragmenty DNA kodujące humanizowane regiony zmienne zostały wprowadzone do plazmidów ekspresyjnych opartych na pUC19, które wykorzystywały sekwencje sygnałowe i zawierały promotor CMV i regiony ludzkiego łańcucha ciężkiego i ludzkiego łańcucha lekkiego chimery wytworzonej w przykładzie 5 poniżej, metodami konwencjonalnymi (Maniatis i in., wyżej) otrzymując plazmidy pCDILSHZHC1.0 (łańcuch ciężki) (Identyfikator Sekw. Nr 49, fig. 10) i pC-NIL5HZLC1.0 (łańcuch lekki) (Identyfikator Sekw. Nr 50, fig. 11). Plazmidy kotransfekowano do komórek COS i badano supernatanty po trzech i pięciu dniach testem ELISA, jak to opisano w przykładzie 5 na obecność przeciwciała ludzkiego.
Powyższy przykład opisuje przykładowo wytwarzanie rekombinowanych przeciwciał. Podobne procedury mogą być zastosowane w opracowaniu innych przeciwciał rekombinowanych, stosując inne przeciwciała przeciwko IL-5 (np. 2F2, 2E3, 4A6, 5D3, 24G9 itp.) otrzymanych konwencjonalnymi sposobami.
F. Oczyszczanie
Oczyszczanie ekspresjonowanych w CHO chimerycznych i humanizowanych 2B6 można prowadzić przez konwencjonalną chromatografię powinowactwa białka A (albo G), a następnie chromatografię jonowymienną i żelową. Podobne procesy zostały z powodzeniem zastosowane do oczyszczania do > 95% czystości innych przeciwciał (np. przeciwko wirusowi oddechowemu, interleukinie 4 i antygenom sporozoitów zarodźca malarii).
G. Dodatkowe humanizowane mAb i plazmidy ekspresyjne
W oparciu o plazmid pCDILSHZHC1.0 (Identyfikator Sekw. Nr 49) wytworzono plazmid ekspresyjny pCDLLSHZHC1.1, przez zastąpienie asparaginą treoniny w pozycji 73. Wykonano to przez ligację syntetycznego łącznika z końcami EcoRV i XhoI (Identyfikator Sekw. Nr 51 i Identyfikator Sekw. Nr 52) do identycznie trawionego pCDILSHZHC1.0.
Podobnie wytworzono plazmid ekspresyjny pCDILSHZHC1.2, przez zastąpienie waliny izoleucyną w pozycji 37. Wykonano to przez ligację syntetycznego łącznika z końcami Hpal i Xbal (Identyfikator Sekw. Nr 53 i Identyfikator Sekw. Nr 54) do identycznie trawionego pCDILSHZHC1.0.
Podobnie wytworzono plazmid ekspresyjny pCDILSHZHC1.3, przez ligację syntetycznego łącznika z końcami Hpal i XbaL (Identyfikator Sekw. Nr 53 i Identyfikator Sekw. Nr 54) do identycznie trawionego pCDILSHZHC1.1.
W oparciu o plazmid oparty na pUCIS opisany wcześniej, który zawierał sekwencje DNA czterech syntetycznych oligonukleotydów (Identyfikator Sekw. Nr 31, 32, 33 i 34), wytworzono humanizowany region zmienny łańcucha lekkiego, w którym zrąb w pozycji 15 zmieniono z leucyny na alaninę. Plazmid ten trawiono Nhel i SacI, po czym wprowadzono syntetyczny łącznik (Identyfikator Sekw. Nr 55 i 56).
Fragment EcorV-NarI izolowano i ligowano do identycznie trawionego wektora ekspresyjnego pCNILSHZLC1.0 tworząc pCNILSHZLC1.1.
Syntetyczny region zmienny wytworzono stosując regiony zrębowe łańcucha ciężkiego uzyskane z immunoglobuliny (NEW) (Saul i in., J. Biol. Chem., 253: 585 (1978)) i CDR łańcucha ciężkiego 2B6 (fig. 7 i Identyfikator Sekw. Nr 1-2). Aminokwasy zrębowe, które mogą wpływać na prezentację CDR zidentyfikowano i wykonano zastąpienia stosując uprzednio opisane sposoby. Wytworzono cztery nakładające się oligonukleotydy syntetyczne (Identyfikator Sekw. Nr 57, 58, 59 i 60), które po połączeniu
PL 194 312 B1 i wydłużeniu kodowały aminokwasy stanowiące sekwencję sygnałową (Identyfikator Sekw. Nr 17) oraz region zmienny łańcucha ciężkiego. Ten syntetyczny gen amplifikowano stosując startery PGR (Identyfikator Sekw. Nr 63 i 64) i ligowano jako fragment restrykcyjny StXI-HindIII do plazmidu opartego na pUC zawierającego sekwencje uzyskane z innego przeciwciała humanizowanego opartego na zrębie COR. Wykonano zastąpienia fenyloalaniny na tyrozynę w zrębie w pozycji 91 (numeracja Kabat) (równoważnik pozycji 94 na fig. 12) przez wprowadzenie syntetycznego łącznika oligonukleotydowego (Identyfikator Sekw. Nr 75 i 76) w miejsca restrykcyjne SacII i KpnI. Powstały region zmienny łańcucha ciężkiego (fig. 12 i Identyfikator Sekw. Nr 61 i 62) określany jest jako łańcuch humanizowany NEWM.
Wszelkie błędy w mapowanej sekwencji zostały poprawione przez PCR ze starterami mutagennymi albo przez dodanie łączników w istniejących miejscach restrykcyjnych.
Sekwencja sygnałowa i humanizowany region zmienny łańcucha ciężkiego wycięto z plazmidu opartego na pUC jako fragment EcoRI-Apal i poddano ligacji do wektora ekspresyjnego pCD zawierającego region stały ludzkiego IgG1, tworząc plazmid pCDLLBNEWM. Sekwencja aminokwasowa CDR jest identyczna z CDR mysiego łańcucha ciężkiego 2B6.
Syntetyczny region zmienny wytworzono stosując regiony zrębowe łańcucha lekkiego uzyskanego z immunoglobuliny (REI) (Palm i in., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 356: 167 (1975)) i CDR łańcucha lekkiego 2B6 (fig. 7 i Identyfikator Sekw. Nr 10, 11 i 12). Aminokwasy zrębu, które mogą wpływać na prezentację CDR zidentyfikowano i wykonano zastąpienia stosując uprzednio opisane sposoby. Wytworzono cztery nakładające się oligonukleotydy syntetyczne (Identyfikator Sekw. Nr 65, 66, 67 i 68) które po połączeniu i wydłużeniu kodowały aminokwasy stanowiące sekwencję regionu zmiennego łańcucha lekkiego (Identyfikator Sekw. Nr 69 i 70) określanego jako humanizowany łańcuch lekki REI. Ten syntetyczny gen amplifikowano stosując startery PGR (Identyfikator Sekw. Nr 71 i72) i poddano ligacji jako fragment restrykcyjny EcoRI-Hindlll do pGem-7Zf(+) (Promega Corp., Madison, WI). Wszelkie błędy w mapowanej sekwencji zostały poprawione przez PGR ze starterami mutagennymi albo przez dodanie łączników w istniejących miejscach restrykcyjnych. Humanizowane regiony zmienne łańcucha lekkiego wycięto z plazmidu opartego na pGEM-7Zf(+) jako fragment EcoRV-NarI i ligowano do wektora ekspresyjnego pCN zawierającego sekwencję sygnałową (Identyfikator Sekw. Nr 17) wraz z ludzką sekwencją stałą kappa, tworząc plazmid pCNILSREI. Sekwencje aminokwasowe CDR są identyczne z mysimi CDR 2B6. Jednakże, sekwencje kodujące tych CDR różnią się od mysich sekwencji kodujących 2B6 umożliwiając tworzenie miejsc restrykcyjnych. Te syntetyczne sekwencje zmienne łańcucha lekkiego i/lub ciężkiego stosowane są do konstruowania przeciwciał humanizowanych.
W oparciu o plazmid oparty na pGEM-7Zf(+) opisany powyżej, może być wytworzony humanizowany region zmienny łańcucha lekkiego, w którym zrąb w pozycji 15 jest zmieniony z waliny na alaninę. Plazmid ten może być trawiony Nhel i SacI, po czym wprowadzany jest łącznik syntetyczny (Identyfikator Sekw. Nr 73 i 74). Fragment EcoRV-NarI może być następnie izolowany i ligowany do trawionego identycznie wektora ekspresyjnego pCNLLSHZREl tworząc plazmid pCNLL5REIv15A.
Przykład 5. Konstruowanie przeciwciała chimerycznego
DNA kodujący aminokwasy 9-104 (numeracja Kabat) regionu zmiennego łańcucha ciężkiego mysiego mAb 2B6 izolowano jako fragment AvaI-StyI z opartego na pGEM7Zf(+) klonu PCR cDNA wytworzonego z linii komórkowej hybrydoma 2B6 (przykład 4). Sekwencje flankujące region zmienny łańcucha ciężkiego i sekwencja sygnałowa (Identyfikator Sekw. Nr 17) dostarczone zostały przez połączenie fragmentu z czterema małymi łącznikami syntetycznymi (Identyfikator Sekw. Nr 35 i 36) (Identyfikator Sekw. Nr 37 i 38) w plazmidzie opartym na pUCIS trawionym BstXI-HindIII. Sekwencja zgodności aminokwasów końca N wywnioskowana ze spokrewnionego mysiego łańcucha ciężkiego została uzyskana dla pierwszych ośmiu reszt VH i jest kodowana przez Identyfikator Sekw. Nr 35 i 36. Wywnioskowana sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego została potwierdzona przez sekwencjonowanie pierwszych 15 aminokwasów N-końcowych łańcucha ciężkiego 2B6.
Wyizolowano fragment EcoRI-Apal zawierający sekwencję sygnałową i regiony VH, po czym ligowano do pCD, który już kodował region stały ludzkiej IgC1.
DNA kodujący aminokwasy 12-99 (nazewnictwo Kabat) regionu zmiennego łańcucha lekkiego mysiego mAb 2B6 izolowano jako fragment DDeI-AvaI z opartego na pGEM7Zf(+) klonu PCR cDNA wytworzonego z linii hybrydoma 2B6 (przykład 4). Sekwencje flankujące region zmienny łańcucha ciężkiego i sekwencja sygnałowa (Identyfikator Sekw. Nr 17) dostarczone zostały przez połączenie fragmentu z czterema małymi łącznikami syntetycznymi (Identyfikator Sekw. Nr 39 i 40) (Identyfikator
PL 194 312 B1
Sekw. Nr 41 i 42) w plazmidzie opartym na pUCIS trawionym EcoRV-Hindlll. Sekwencja zgodności aminokwasów końca N wywnioskowana ze spokrewnionego mysiego łańcucha lekkiego zostało uzyskanadla pierwszych ośmiu reszt VLi jest kodowana przez Identyfikator Sekw. Nr 39 i 40. Wywnioskowana sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego została potwierdzona przez sekwencjonowanie pierwszych 15 aminokwasów N-końcowych łańcucha ciężkiego 2B6. Ten region zmienny izolowano jako fragment EcoRV-NarI i ligowano do wektora ekspresyjnego pCN zawierającego już ludzki region kappa i sekwencję sygnałową.
Ekspresję przeciwciała chimerycznego uzyskano przez kotransfekcję plazmidów opartych na pCD i pCN do komórek COS. Supernatanty z hodowli zbierano w trzy i pięć dni później i badano na ekspresję immunoglobuliny przez ELLSAjak to opisano niżej: wszystkie etapy z wyjątkiem ostatniego kończone były płukaniem w PBS. Płytki do mikromiareczkowania opłaszczane były przez noc 100 ng/50 pl/studzienkę kozim przeciwciałem swoistym dla regionu Fc ludzkich przeciwciał. Supernatanty z hodowli dodawano i inkubowano przez godzinę. Następnie dodawano kozie przeciwciało przeciwko ludzkim IgG koniugowane z peroksydazą chrzanową i pozostawiano na godzinę. Następnie dodawano substrat peroksydazy ABTS (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., Gaithersburg, MD). Po 1godzinie inkubacji odczytywano absorbancję przy 405 nm w czytniku płytek (Molecular Devices, Menlo Park, CA). Wykryto ekspresję chimerycznego przeciwciała. W podobnym teście supernatanty komórek COS zawierające przeciwciała chimeryczne, wiązały się swoiście z płytkami opłaszczonymi ludzką IL-5. Wynik ten pokazał, że geny kodujące przeciwciało przeciwko IL-5 zostały zsyntetyzowane i wyrażone.
W powyższym przykładzie opisano wytwarzanie przykładowego przeciwciała rekombinowanego. Podobne procedury mogą być stosowane do opracowania innych przeciwciał rekombinowanych, stosując inne przeciwciała przeciwko IL-5 (np. 2F2, 2E3, 4A6, 5D3, 24G9 itp.) wytworzone standardowymi sposobami.
Listasekwencji (1) Informacjeogólne (i) Zgłaszający:Ames, Robert S.
Appelbaum Edward R.
Chaiken Lrvin M.
Cook Richard M.
Gross Mitchell S.
Holmes Stephen D.
McMillan Lynette J.
Theisen Timothy W.
(ii) Tytułwynalazku:Rekombinowani antagoniści IL-5 przydatni w leczeniu chorób wywołanych IL-5 (iii) Liczba sekwencji:76 (iv) Adresdo korespondencji (A) Adresat:SmithKline Beecham Corp./Corporate (B) Ulica: PO Box: 1539-UW2220 (C) Miasto: King of Prussia (D) Stan:Pennsylvania (E) Kraj:USA (F) Kod: 19406-0939 (v) postać możliwa do odczytania przez komputer (A) Rodzaj nośnika: Dyskietka (B) Komputer:IBM PC (C) System operacyjny: PC-DOS/MS-DOS (D) Oprogramowanie:PatentIn rel. 1.0, wer. 1.30 (vi) Danedot. obecnego zgłoszenia (A) Numerzgłoszenia (B) Data zgłoszenia (C) Klasyfikacja (vii) Danedot. poprzedniego zgłoszenia (A) Numerzgłoszenia (B) Data zgłoszenia
PL 194 312 B1 (C) Klasyfikacja (vii) Danedot. poprzedniego zgłoszenia A) Numer zgłoszenia (B) Data zgłoszenia (C) Klasyfikacja (vii) Dane dot. poprzedniego zgłoszenia A) Numer zgłoszenia (B) Data zgłoszenia (C) Klasyfikacja (viii) Informacjeo rzeczniku (A) Nazwisko: Sutton Jeffrey A.
(B) Numerrejestracyjny:34,028 (C) Numer sprawy: P50282-2 (ix) Informacjatelekomunikacyjna (A) Telefon:610-270-5024 (B) Telefax: 61 0-270-5090 (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. nr:1 (i) Charakterystykasekwencji:
(A) Długość: 334 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (ix) Cecha:
(A) Nazwa/klucz: misc_feature (B) Pozycja:1...334 (D) Inna informacja: (uwaga= „pierwsza zasada odpowiada pozycji wg Kabat 24”) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr:1 acctggcctg gtggcgccct
ATTAACCAGC TATAGTGTAC
GGGAGTAATA TGGGCTAGTG
CATCAGCAAA GACAACTCCA
TGACACAGCC ATGTACTACT
CTGGGGCCAA GGCACCACTC
CACAGAGCCT
ACTGGGTTCG
GAGGCACAGA
AGAGCCAAGT
GTGCCAGAGA
TCACAGTCTC
GTCCATCACT
CCAGCCTCCA
TTATAATTCG
TTTCTTAAAA
TCCCCCTTCT
CTCA
TGCACTGTCT
GGAAAGGGTC
GCTCTCATGT
CTGAACAGTC
TCCTTACTAC
CTGGGTTTTC
TGGAGTGGCT
CCAGACTGAG
TGCAAACTGA
GGCTTGACTA
120
180
240
300
334 (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. nr:2 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 315par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (ix) Cecha:
(A) Nazwa/klucz: misc_feature
PL 194 312 B1 (B) Pozycja:1...315 (D) Inna informacja: (uwaga = „pierwsza zasada odpowiada pozycji wg Kabat 24”) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 2
TCCTCCCTGA GTGTGTCAGC AGGAGAGAAG GTCACTATGA GCTGCAAGTC CAGTCAGAGT 60
CTGTTAAACA GTGGAAATCA AAAGAACTAC TTGGCCTGGT ACCAGCAGAA ACCAGGGCAG 120
CCTCCTAAAC TTTTGATCTA CGGGGCATCC ACTAGGGAAT CTGGGGTCCC TGATCGCTTC 180
ACAGGCAGTG GATCTGGAAC CGATTTCACT CTTTCCATCA GCAGTGTGCA GGCTGAAGAC 240
CTGGCAGTTT ATTACTGTCA GAATGTTCAT AGTTTTCCAT TCACGTTCGG CTCGGGGACA 300
GAGTTGGAAA TAAAA 315 (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. nr: 3 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 334 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (ix) Cecha:
(A) Nazwa/klucz: misc_feature (B) Pozycja:1... 334 (D) Inna informacja: (uwaga = „pierwsza zasada odpowiada pozycji wg Kabat 24”) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 3
ACCTGGCCTG GTGGCGCCCT CACAGAGCCT GTCCATCACT TGCACTGTCT CTGGGTTTTC 60
ATTAACCAGT TATAGTGTAC ACTGGGTTCG CCAGCCTCCA GGAAAGGGTC TGGAGTGGCT 120
GGGAGTAATA TGGGCTAGTG GAGGCACAGA TTATAATTCG GCTCTCATGT CCAGACTGAG 180
CATCAGCAAA GACAACTCCA AGAGCCAAGT TTTCTTAAAA CTGAACAGTC TGCGAACTGA 240
TGACACAGCC ATGTACTACT GTGCCAGAGA TCCCCCTTCT TCCTTACTAC GGCTTGACTA 300
CTGGGGCCAA GGCACCACTC TCACAGTCTC CTCA 334 (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. nr: 4 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 315 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza
PL 194 312 B1 (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (ix) Cecha:
(A) Nazwa/klucz: misc_feature (B) Pozycja:1...315 (D) Inna informacja: (uwaga = „pierwsza zasada odpowiada pozycji wg Kabat 25”) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr:4
TCCTCCCTGA GTGTGTCAGC AGGAGAGAAG GTCACTATGA GCTGGAAGTC CAGTCAGAGT 60
CTATTAAACA GTGGAAATCA AAAGAACTAC TTGGCCTGGT ACCAACAGAA ACCAGGGCAG 120
CCTCCTAAAC TTTTGATCTA CGGGGCATCC ACTAGGGAAT CTGGGGTCCC TGATCGCTTC 180
ACAGGCAGTG GATCTGGAAC CGATTTCACT CTTACCATCA GCAGTGTGCA GGCTGAAGAC 240
CTGGCAGTTT ATTACTGTCA GAATGATCAT AGTTTTCCAT TCACGTTCGG CTCGGGGACA 300
GAGTTGGAAA TAAAA 315 (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. nr:5 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 334 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (ix) Cecha:
(A) Nazwa/klucz: misc_feature (B) Pozycja:1...334 (D) Inna informacja: (uwaga = „pierwsza zasada odpowiada pozycji wg Kabat 24”) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr:5
ACCTGGCCTG GTGGCGCCCT CACAGAGCCT GTCCATCACT TGCACTGTCT CTGGGTTTTC 60
ATTAACCAGC TATAGTGTAC ACTGGGTTCG CCAGCCTCCA GGAAAGGGTC TGGAGTGGCT 120
GGGAGTAATC TGGGCTAGTG GAGGCACAGA TTATAATTCG GCTCTCATGT CCAGACTGAG 180
CATCAGCAAA GACAACTCCA AGAGCCAAGT TTTCTTAAAA CTGAACAGTC TGCAAACTGA 240
TGACGCAGCC ATGTACTACT GTGCCAGAGA TCCCCCTTTT TCCTTACTAC GGCTTGACTT 300
CTGGGGCCAA GGCACCACTC TCACAGTCTC CTCA 334
PL 194 312 B1 (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. nr:6 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 315par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (ix) Cecha:
(A) Nazwa/klucz: misc_feature (B) Pozycja:1...315 (D) Inna informacja: (uwaga= „pierwsza zasada odpowiada pozycji wg Kabat 25”) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr:6
TCCTCTCTGA GTGTGTCAGC AGGAGAGAAG GTCACTATGA GCTGCAAGTC CAGTCAGAGT 60
CTGTTAAACA GTGGAAATCA AAAAAACTAC TTGGCCTGGT ACCAGCAGAA ACCAGGGCAG 120
CCTCCTAAAC TTTTGATCTA CGGGGCATCC ACTAGGGAAT CTGGGGTCCC TGATCGCTTC 180
ACAGGCAGTG GATCTGGAAC CGATTTCACT CTTACCATCA GCAGTGTGCA GGCTGAAGAC 240
CTGGCAGTTT ATTACTGTCA GAATGATCAT AGTTTTCCAT TCACGTTCGG CTCGGGGACA 300
GAGTTGGAAA TAAAA 315 (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. nr:7 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 5 aminokwasów (B) Rodzaj: aminokwas (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr:7
Ser Tyr Ser Val His
5 (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. nr:8 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 16aminokwasów (B) Rodzaj: aminokwas (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr:8
Val Ile Trp Ala Ser Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser 15 10 15
PL 194 312 B1 (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. nr: 9 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 11 aminokwasów (B) Rodzaj: aminokwas (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 9
Asp Pro Pro Ser Ser Leu Leu Arg Leu Asp Tyr
10 (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. nr: 10 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 17 aminokwasów (B) Rodzaj: aminokwas (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 10
Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gin Lys Asn Tyr Leu 15 10 15
Ala (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. nr: 11 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 7 aminokwasów (B) Rodzaj: aminokwas (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 11
Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5
2) Informacja do Identyfikatora Sekw. nr:12 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 9 aminokwasów (B) Rodzaj: aminokwas (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 12
Gin Asn Val His Ser Phe Pro Phe Thr
5
PL 194 312 B1 (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. nr: 13 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 9 aminokwasów (B) Rodzaj: aminokwas (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 13
Gin Asn Asp His Ser Phe Pro Phe Thr 1 5
2) Informacja do Identyfikatora Sekw. nr:14 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 11 aminokwasów (B) Rodzaj: aminokwas (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 14
Asp Pro Pro Phe Ser Leu Leu Arg Leu Asp Phe 15 10 (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 15
Gin Val 1 Gin Leu Lys 5 Glu Ser Gly Pro Gly 10 Leu Val Ala Pro Ser 15 Gin
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Ser Val His Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ala Ser Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Leu Asn Ser Leu Gin Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Pro Pro Ser Ser Leu Leu Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
PL 194 312 B1
2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 16 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 113 aminokwasów (B) Rodzaj: aminokwas (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 16
Asp 1 Ile Val Met Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Val Ser Ala 15 Gly
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Asn
85 90 95
Val His Ser Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Glu Leu Glu Ile
100 105 110
Lys (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 17 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) Długość: 60 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 17
ATGGTGTTGC AGACCCAGGT CTTCATTTCT CTGTTGCTCT GGATCTCTGG TGCCTACGGG 60
PL 194 312 B1 (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 19 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) Długość: 357 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) To pologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 18
CAGGTTACCC TGCGTGAATC CGGTCCGGCA CTAGTTAAAC CGACCCAGAC CCTGACGTTA 60
ACCTGCACCG TCTCCGGTTT CTCCCTGACG AGCTATAGTG TACACTGGGT CCGTCAGCCG 120
CCGGGTAAAG GTCTAGAATG GCTGGGTGTA ATATGGGCTA GTGGAGGCAC AGATTATAAT 180
TCGGCTCTCA TGTCCCGTCT GTCGATATCC AAAGACACCT CCCGTAACCA GGTTGTTCTG 240
ACCATGACTA ACATGGACCC GGTTGACACC GCTACCTACT ACTGCGCTCG AGATCCCCCT 300
TCTTCCTTAC TACGGCTTGA CTACTGGGGT CGTGGTACCC CAGTTACCGT GAGCTCA 357
2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr:19 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 119 aminokwasów (B) Rodzaj: aminokwas ((C) Niciowość: pojedyncza (D) To pologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 19
PL 194 312 B1
Gin Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gin 15 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 20 25 30
Ser Val His Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45
Gly Val Ile Trp Ala Ser Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gin Val Val Leu
70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
90 95
Arg Asp Pro Pro Ser Ser Leu Leu Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Arg Gly 100 105 110
Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115 (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 20 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 339 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 20
GATATCGTGA TGACCCAGTC TCCAGACTCG CTAGCTGTGT CTCTGGGCGA GAGGGCCACC 60
ATCAACTGCA AGAGCTCTCA GAGTCTGTTA AACAGTGGAA ATCAAAAGAA CTACTTGGCC 120
TGGTATCAGC AGAAACCCGG GCAGCCTCCT AAGTTGCTCA TTTACGGGGC GTCGACTAGG 180
GAATCTGGGG TACCTGACCG ATTCAGTGGC AGCGGGTCTG GGACAGATTT CACTCTCACC 240
ATCAGCAGCC TGCAGGCTGA AGATGTGGCA GTATACTACT GTCAGAATGT TCATAGTTTT 300
CCATTCACGT TCGGCGGAGG GACCAAGTTG GAGATCAAA 339
PL 194 312 B1
2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr:21 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 113 aminokwasów (B) Rodzaj: aminokwas (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr:21
Asp Ile Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu 15 Gly
1 5 10
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Asn
85 90 95
Val His Ser Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110 ((2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 22 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 29par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 22
GTACATATGC AAGGCTTACA ACCACAATC
PL 194 312 B1 (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 23 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 32 pary zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 23
GGACAGGGCT TACTAGTGGG CCCTCTGGGC TC (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 24 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 23 pary zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 24
AGGTSMARCT KTCTCGAGTC WGG (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 25 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 36 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 25
CTAACACTCA TTCCTGTTGA AGCTCTTGAC AATGGG (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 26 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 32 pary zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 26
CCAGATGTGA GCTCGTGATG ACCCAGACTC CA (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 27 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 140 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 27
PL 194 312 B1
AACCTGCACC GTCTCCGGTT TCTCCCTGAC GAGCTATAGT GTACACTGGG TCCGTCAGCC 60
GCCGGGTAAA GGTCTAGAAT GGCTGGGTGT AATATGGGCT AGTGGAGGCA CAGATTATAA 120
TTCGGCTCTC ATGTCCCGTC 14q (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 28 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 149 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 28
ATATCGACAG ACGGGACATG AGAGCCGAAT TATAATCTGT GCCTCCACTA GCCCATATTA 60
CACCCAGCCA TTCTAGACCT TTACCCGGCG GCTGACGGAC CCAGTGTACA CTATAGCTCG 120
TCAGGGAGAA ACCGGAGACG GTGCAGGTT (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 29 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 139 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 29
TGTCGATATC CAAAGACACC TCCCGTAACC AGGTTGTTCT GACCATGACT AACATGGACC 60
CGGTTGACAC CGCTACCTAC TACTGCGCTC GAGATCCCCC TTCTTCCTTA CTACGGCTTG 120
ACTACTGGGG TCGTGGTAC 139 (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 30 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 126 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 30
CACGACCCCA GTAGTCAAGC CGTAGTAAGG AAGAAGGGGG ATCTCGAGCG CAGTAGTAGG 60
TAGCGGTGTC AACCGGGTCC ATGTTAGTCA TGGTCAGAAC AACCTGGTTA CGGGAGGTGT 120
CTTTGG 126
PL 194 312 B1 (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 31 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 117 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 31
CTCAGAGTCT GTTAAACAGT GGAAATCAAA AGAACTACTT GGCCTGGTAT CAGCAGAAAC 60
CCGGGCAGCC TCCTAAGTTG CTCATTTACG GGGCGTCGAC TAGGGAATCT GGGGTAC 117 (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 32 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 117 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 32
CCCAGATTCC CTAGTCGACG CCCCGTAAAT GAGCAACTTA GGAGGCTGCC CGGGTTTCTG 60
CTGATACCAG GCCAAGTAGT TCTTTTGATT TCCACTGTTT AACAGACTCT GAGAGCT 117 (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 33 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 102 pary zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 33
GCTGAAGATG TGGCAGTATA CTACTGTCAG AATGTTCATA GTTTTCCATT CACGTTCGGC 60
GGAGGGACCA AGTTGGAGAT CAAACGTACT GTGGCGGCGC CA 102 (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 34 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 111 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 34
AGCTTGGCGC CGCCACAGTA CGTTTGATCT CCAACTTGGT CCCTCCGCCG AACGTGAATG 60
GAAAACTATG AACATTCTGA CAGTAGTATA CTGCCACATC TTCAGCCTGC A 111
PL 194 312 B1 (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 35 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 82 pary zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 35 ATGGTGTTGC AGACCCAGGT CTTCATTTCT CTGTTGCTCT GGATCTCTGG TGCCTACGGG
CAGGTTCAAC TGAAAGAGTC AG (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 36 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 89 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 36
GTCCTGACTC TTTCAGTTGA ACCTGCCCGT AGGCACCAGA GATCCAGAGC AACAGAGAAA
TGAAGACCTG GGTCTGCAAC ACCATGTTG (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 37 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 45 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 37
CAAGGCACCA CTCTCACAGT CTCCTCAGCT AGTACGAAGG GCCCA (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 38 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 43 pary zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 38
AGCTTGGGCC CTTCGTACTA GCTGAGGAGA CTGTGAGTGG TGC (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 39 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 28 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza
PL 194 312 B1 (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 39
ATCGTGATGA CCCAGTCTCC ATCCTCCC (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 40 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 31 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 40 TCAGGGAGGA TGGAGACTGG GTCATCACGA T (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 41 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 43 pary zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 41 TCGGGGGACA GAGTTGGAAA TAAAACGTAC TGTGGCGGCG CCA (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 42 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 42 pary zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 42
AGCTTGGCGC CGCCACAGTA CGTTTTATTT CCAACTCTGT CC (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 43 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 26 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 43
CTAGCCACCA CCACCACCAC CACTAA (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 44 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 26 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza
PL 194 312 B1 (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 44
CTAGTTAGTG GTGGTGGTGG TGGTGG 26
2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr:45 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 113 aminokwasów (B) Rodzaj: aminokwas (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 45
Glu Leu Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly 15 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30
Gly Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
70 75 80
Ile Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Asn
90 95
Asp His Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 HO
2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr:46 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 113 aminokwasów (B) Rodzaj: aminokwas (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa
PL 194 312 B1 (ii) Rodzaj cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr:46
Glu Leu Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly 1.5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30
Gly Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
70 75 80
Ile Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Asn
90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 HO
Lys
2) Informacjado Identyfikatora Sekw. Nr:47 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 9 aminokwasów (B) Rodzaj: aminokwas (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr:47
Gin Asn Asp His Ser Tyr Pro Phe Thr 1 5
2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr:48 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 9 aminokwasów (B) Rodzaj: aminokwas (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa
PL 194 312 B1 (ii) Rodzaj cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 48
Gin Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr 1 5 (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 49 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 6285 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 49
GACGTCGCGG CCGCTCTAGG CCTCCAAAAA AGCCTCCTCA CTACTTCTGG AATAGCTCAG 60
AGGCCGAGGC GGCCTCGGCC TCTGCATAAA TAAAAAAAAT TAGTCAGCCA TGCATGGGGC 120
GGAGAATGGG CGGAACTGGG CGGAGTTAGG GGCGGGATGG GCGGAGTTAG GGGCGGGACT 180
ATGGTTGCTG ACTAATTGAG ATGCATGCTT TGCATACTTC TGCCTGCTGG GGAGCCTGGG 240
GACTTTCCAC ACCTGGTTGC TGACTAATTG AGATGCATGC TTTGCATACT TCTGCCTGCT 300
GGGGAGCCTG GGGACTTTCC ACACCCTAAC TGACACACAT TCCACAGAAT TAATTCCCGG 360
GGATCGATCC GTCGACGTAC GACTAGTTAT TAATAGTAAT CAATTACGGG GTCATTAGTT 420
CATAGCCCAT ATATGGAGTT CCGCGTTACA TAACTTACGG TAAATGGCCC GCCTGGCTGA 480
CCGCCCAACG ACCCCCGCCC ATTGACGTCA ATAATGACGT ATGTTCCCAT AGTAACGCCA 540
ATAGGGACTT TCCATTGACG TCAATGGGTG GACTATTTAC GGTAAACTGC CCACTTGGCA 600
GTACATCAAG TGTATCATAT GCCAAGTACG CCCCCTATTG ACGTCAATGA CGGTAAATGG 660
CCCGCCTGGC ATTATGCCCA GTACATGACC TTATGGGACT TTCCTACTTG GCAGTACATC 720
TACGTATTAG TCATCGCTAT TACCATGGTG ATGCGGTTTT GGCAGTACAT CAATGGGCGT 780
PL 194 312 B1
GGATAGCGGT TTGACTCACG GGGATTTCCA AGTCTCCACC CCATTGACGT CAATGGGAGT 840
TTGTTTTGGC ACCAAAATCA ACGGGACTTT CCAAAATGTC GTAACAACTC CGCCCCATTG 900
ACGCAAATGG GCGGTAGGCG TGTACGGTGG GAGGTCTATA TAAGCAGAGC TGGGTACGTG 960
AACCGTCAGA TCGCCTGGAG ACGCCATCGA ATTCGAGGAC GCCAGCAACA TGGTGTTGCA 1020
GACCCAGGTC TTCATTTCTC TGTTGCTCTG gatctctggt GCCTACGGGC AGGTTACCCT 1080
GCGTGAATCC GGTCCGGCAC TAGTTAAACC GACCCAGACC CTGACGTTAA CCTGCACCGT 1140
CTCCGGTTTC TCCCTGACGA GCTATAGTGT ACACTGGGTC CGTCAGCCGC CGGGTAAAGG 1200
TCTAGAATGG CTGGGTGTAA TATGGGCTAG TGGAGGCACA GATTATAATT CGGCTCTCAT 1260
GTCCCGTCTG TCGATATCCA AAGACACCTC CCGTAACCAG GTTGTTCTGA CCATGACTAA 1320
CATGGACCCG GTTGACACCG CTACCTACTA CTGCGCTCGA GATCCCCCTT CTTCCTTACT 1380
ACGGCTTGAC TACTGGGGTC GTGGTACĆCC AGTTACCGTG AGCTCAGCTA GTACCAAGGG 1440
CCCATCGGTC TTCCCCCTGG CACCCTCCTC CAAGAGCACC TCTGGGGGCA CAGCGGCCCT 1500
GGGCTGCCTG GTCAAGGACT ACTTCCCCGA ACCGGTGACG GTGTCGTGGA ACTCAGGCGC 1560
CCTGACCAGC GGCGTGCACA CCTTCCCGGC TGTCCTACAG TCCTCAGGAC TCTACTCCCT 1620
CAGCAGCGTG GTGACCGTGC CCTCCAGCAG CTTGGGCACC CAGACCTACA TCTGCAACGT 1680
GAATCACAAG CCCAGCAACA CCAAGGTGGA CAAGAGAGTT GAGCCCAAAT CTTGTGACAA 1740
AACTCACACA TGCCCACCGT GCCCAGCACC TGAACTCCTG GGGGGACCGT CAGTCTTCCT 1800
CTTCCCCCCA AAACCCAAGG ACACCCTCAT GATCTCCCGG ACCCCTGAGG TCACATGCGT 1860
GGTGGTGGAC GTGAGCCACG AAGACCCTGA GGTCAAGTTC AACTGGTACG TGGACGGCGT 1920
PL 194 312 B1
GGAGGTGCAT AATGCCAAGA CAAAGCCGCG GGAGGAGCAG TACAACAGCA CGTACCGTGT 1980
GGTCAGCGTC CTCACCGTCC TGCACCAGGA CTGGCTGAAT GGCAAGGAGT ACAAGTGCAA 2040
GGTCTCCAAC AAAGCCCTCC CAGCCCCCAT CGAGAAAACC ATCTCCAAAG CCAAAGGGCA 2100
GCCCCGAGAA CCACAGGTGT ACACCCTGCC CCCATCCCGG GAGGAGATGA CCAAGAACCA 2160
GGTCAGCCTG ACCTGCCTGG TCAAAGGCTT CTATCCCAGC GACATCGCCG TGGAGTGGGA 2220
GAGCAATGGG CAGCCGGAGA ACAACTACAA GACCACGCCT CCCGTGCTGG ACTCCGACGG 2280
CTCCTTCTTC CTCTATAGCA AGCTCACCGT GGACAAGAGC AGGTGGCAGC AGGGGAACGT 2340
CTTCTCATGC TCCGTGATGC ATGAGGCTCT GCACAACCAC TACACGCAGA AGAGCCTCTC 2400
CCTGTCTCCG GGTAAGTGAG TGTAGTCTAG ATCTACGTAT GATCAGCCTC GACTGTGCCT 2460
TCTAGTTGCC AGCCATCTGT TGTTTGCCCC TCCCCCGTGC CTTCCTTGAC CCTGGAAGGT 2520
GCCACTCCCA CTGTCCTTTC CTAATAAAAT GAGGAAATTG CATCGCATTG TCTGAGTAGG 2580
TGTCATTCTA TTCTGGGGGG TGGGGTGGGG CAGGACAGCA AGGGGGAGGA TTGGGAAGAC 2640
AATAGCAGGC ATGCTGGGGA TGCGGTGGGC TCTATGGAAC CAGCTGGGGC TCGACAGCGC 2700
TGGATCTCCC GATCCCCAGC TTTGCTTCTC AATTTCTTAT TTGCATAATG AGAAAAAAAG 2760
GAAAATTAAT TTTAACACCA ATTCAGTAGT TGATTGAGCA AATGCGTTGC CAAAAAGGAT 2820
GCTTTAGAGA CAGTGTTCTC TGCACAGATA aggacaaaca TTATTCAGAG GGAGTACCCA 2880
GAGCTGAGAC TCCTAAGCCA GTGAGTGGCA CAGCATTCTA GGGAGAAATA TGCTTGTCAT 2940
CACCGAAGCC TGATTCCGTA GAGCCACACC TTGGTAAGGG CCAATCTGCT CACACAGGAT 3000
PL 194 312 B1
AGAGAGGGCA GGAGCCAGGG CAGAGCATAT AAGGTGAGGT AGGATCAGTT GCTCCTCACA 3060
TTTGCTTCTG ACATAGTTGT GTTGGGAGCT TGGATAGCTT GGACAGCTCA GGGCTGCGAT 3120
TTCGCGCCAA ACTTGACGGC AATCCTAGCG TGAAGGCTGG TAGGATTTTA TCCCCGCTGC 3180
CATCATGGTT CGACCATTGA ACTGCATCGT CGCCGTGTCC CAAAATATGG GGATTGGCAA 3240
GAACGGAGAC CTACCCTGGC CTCCGCTCAG GAACGAGTTC AAGTACTTCC AAAGAATGAC 3300
CACAACCTCT TCAGTGGAAG GTAAACAGAA TCTGGTGATT ATGGGTAGGA AAACCTGGTT 3360
CTCCATTCCT GAGAAGAATC GACCTTTAAA GGACAGAATT AATATAGTTC TCAGTAGAGA 3420
ACTCAAAGAA CCACCACGAG GAGCTCATTT TCTTGCCAAA AGTTTGGATG atgccttaag 3480
ACTTATTGAA CAACCGGAAT TGGCAAGTAA AGTAGACATG GTTTGGATAG TCGGAGGCAG 3540
TTCTGTTTAC CAGGAAGCCA TGAATCAACC AGGCCACCTT AGACTCTTTG TGACAAGGAT 3600
CATGCAGGAA TTTGAAAGTG ACACGTTTTT CCCAGAAATT GATTTGGGGA AATATAAACT 3660
TCTCCCAGAA TACCCAGGCG TCCTCTCTGA GGTCCAGGAG GAAAAAGGCA TCAAGTATAA 3720
GTTTGAAGTC TACGAGAAGA AAGACTAACA GGAAGATGCT TTCAAGTTCT CTGCTCCCCT 3780
CCTAAAGCTA TGCATTTTTA TAAGACCATG ggacttttgc TGGCTTTAGA TCAGCCTCGA 3840
CTGTGCCTTC TAGTTGCCAG CCATCTGTTG TTTGCCCCTC CCCCGTGCCT TCCTTGACCC 3900
TGGAAGGTGC CACTCCCACT GTCCTTTCCT AATAAAATGA GGAAATTGCA TCGCATTGTC 3960
TGAGTAGGTG TCATTCTATT CTGGGGGGTG GGGTGGGGCA GGACAGCAAG GGGGAGGATT 4020
GGGAAGACAA TAGCAGGCAT GCTGGGGATG CGGTGGGCTC TATGGAACCA GCTGGGGCTC 4080
GATCGAGTGT ATGACTGCGG CCGCGATCCC GTCGAGAGCT TGGCGTAATC ATGGTCATAG 4140
PL 194 312 B1
CTGTTTCCTG TGTGAAATTG TTATCCGCTC ACAATTCCAC ACAACATACG AGCCGGAAGC 4200
ATAAAGTGTA AAGCCTGGGG TGCCTAATGA GTGAGCTAAC TCACATTAAT TGCGTTGCGC 4260
TCACTGCCCG CTTTCCAGTC GGGAAACCTG TCGTGCCAGC TGCATTAATG AATCGGCCAA 4320
CGCGCGGGGA GAGGCGGTTT GCGTATTGGG CGCTCTTCCG CTTCCTCGCT CACTGACTCG 4380
CTGCGCTCGG TCGTTCGGCT GCGGCGAGCG GTATCAGCTC ACTCAAAGGC GGTAATACGG 4440
TTATCCACAG AATCAGGGGA TAACGCAGGA AAGAACATGT GAGCAAAAGG CCAGCAAAAG 4500
GCCAGGAACC GTAAAAAGGC CGCGTTGCTG GCGTTTTTCC ATAGGCTCCG CCCCCCTGAC 4560
GAGCATCACA AAAATCGACG CTCAAGTCAG AGGTGGCGAA ACCCGACAGG ACTATAAAGA 4620
TACCAGGCGT TTCCCCCTGG AAGCTCCCTC GTGCGCTCTC CTGTTCCGAC CCTGCCGCTT 4680
ACCGGATACC TGTCCGCCTT TCTCCCTTCG GGAAGCGTGG CGCTTTCTCA ATGCTCACGC 4740
TGTAGGTATC TCAGTTCGGT GTAGGTCGTT CGCTCCAAGC TGGGCTGTGT GCACGAACCC 4800
CCCGTTCAGC CCGACCGCTG CGCCTTATCC GGTAACTATC GTCTTGAGTC CAACCCGGTA 4860
AGACACGACT TATCGCCACT GGCAGCAGCC ACTGGTAACA GGATTAGCAG AGCGAGGTAT 4920
GTAGGCGGTG CTACAGAGTT CTTGAAGTGG TGGCCTAACT ACGGCTACAC TAGAAGGACA 4980
GTATTTGGTA TCTGCGCTCT GCTGAAGCCA GTTACCTTCG GAAAAAGAGT TGGTAGCTCT 5040
TGATCCGGCA AACAAACCAC CGCTGGTAGC GGTGGTTTTT TTGTTTGCAA GCAGCAGATT 5100
ACGCGCAGAA AAAAAGGATC TCAAGAAGAT CCTTTGATCT TTTCTACGGG GTCTGACGCT 5160
CAGTGGAACG AAAACTCACG TTAAGGGATT TTGGTCATGA GATTATCAAA AAGGATCTTC 5220
PL 194 312 B1
ACCTAGATCC TTTTAAATTA AAAATGAAGT TTTAAATCAA TCTAAAGTAT ATATGAGTAA 5280
ACTTGGTCTG ACAGTTACCA ATGCTTAATC AGTGAGGCAC CTATCTCAGC GATCTGTCTA 5340
TTTCGTTCAT CCATAGTTGC CTGACTCCCC GTCGTGTAGA TAACTACGAT ACGGGAGGGC 5400
TTACCATCTG GCCCCAGTGC TGCAATGATA CCGCGAGACC CACGCTCACC GGCTCCAGAT 5460
TTATCAGCAA TAAACCAGCC AGCCGGAAGG GCCGAGCGCA GAAGTGGTCC TGCAACTTTA 5520
TCCGCCTCCA TCCAGTCTAT TAATTGTTGC CGGGAAGCTA GAGTAAGTAG TTCGCCAGTT 5580
AATAGTTTGC GCAACGTTGT TGCCATTGCT ACAGGCATCG TGGTGTCACG CTCGTCGTTT 5640
GGTATGGCTT CATTCAGCTC CGGTTCCCAA CGATCAAGGC GAGTTACATG ATCCCCCATG 5700
TTGTGCAAAA AAGCGGTTAG CTCCTTCGGT CCTCCGATCG TTGTCAGAAG TAAGTTGGCC 5760
GCAGTGTTAT CACTCATGGT TATGGCAGCA CTGCATAATT CTCTTACTGT CATGCCATCC 5820
GTAAGATGCT TTTCTGTGAC TGGTGAGTAC TCAACCAAGT CATTCTGAGA ATAGTGTATG 5880
CGGCGACCGA GTTGCTCTTG CCCGGCGTCA ATACGGGATA ATACCGCGCC ACATAGCAGA 5940
ACTTTAAAAG TGCTCATCAT TGGAAAACGT TCTTCGGGGC GAAAACTCTC AAGGATCTTA 6000
CCGCTGTTGA GATCCAGTTC GATGTAACCC ACTCGTGCAC CCAACTGATC TTCAGCATCT 6060
TTTACTTTCA CCAGCGTTTC TGGGTGAGCA AAAACAGGAA GGCAAAATGC CGCAAAAAAG 6120
GGAATĄAGGG CGACACGGAA ATGTTGAATA CTCATACTCT TCCTTTTTCA ATATTATTGA 6180
AGCATTTATC AGGGTTATTG TCTCATGAGC GGATACATAT TTGAATGTAT TTAGAAAAAT 6240
AAACAAATAG GGGTTCCGCG CACATTTCCC CGAAAAGTGC CACCT 6285
PL 194 312 B1 (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 50 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 5073 pary zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 50
GACGTCGCGG CCGCTCTAGG CCTCCAAAAA AGCCTCCTCA CTACTTCTGG AATAGCTCAG 60
AGGCCGAGGC GGCCTCGGCC TCTGCATAAA TAAAAAAAAT TAGTCAGCCA TGCATGGGGC 120
GGAGAATGGG CGGAACTGGG CGGAGTTAGG GGCGGGATGG GCGGAGTTAG GGGCGGGACT 180
ATGGTTGCTG ACTAATTGAG ATGCATGCTT TGCATACTTC TGCCTGCTGG GGAGCCTGGG 240
GACTTTCCAC ACCTGGTTGC TGACTAATTG AGATGCATGC TTTGCATACT TCTGCCTGCT 300
GGGGAGCCTG GGGACTTTCC ACACCCTAAC TGACACACAT TCCACAGAAT TAATTCCCGG 360
GGATCGATCC GTCGACGTAC GACTAGTTAT TAATAGTAAT CAATTACGGG GTCATTAGTT 420
CATAGCCCAT ATATGGAGTT CCGCGTTACA TAACTTACGG TAAATGGCCC GCCTGGCTGA 480
CCGCCCAACG ACCCCCGCCC ATTGACGTCA ATAATGACGT atgttcccat AGTAACGCCA 540
ATAGGGACTT TCCATTGACG TCAATGGGTG GACTATTTAC GGTAAACTGC CCACTTGGCA 600
GTACATCAAG TGTATCATAT GCCAAGTACG CCCCCTATTG ACGTCAATGA CGGTAAATGG 660
CCCGCCTGGC ATTATGCCCA GTACATGACC TTATGGGACT TTCCTACTTG GCAGTACATC 720
PL 194 312 B1
TACGTATTAG TCATCGCTAT TACCATGGTG ATGCGGTTTT GGCAGTACAT CAATGGGCGT 780
GGATAGCGGT TTGACTCACG GGGATTTCCA AGTCTCCACC CCATTGACGT CAATGGGAGT 840
TTGTTTTGGC ACCAAAATCA ACGGGACTTT CCAAAATGTC GTAACAACTC CGCCCCATTG 900
ACGCAAATGG GCGGTAGGCG TGTACGGTGG GAGGTCTATA TAAGCAGAGC TGGGTACGTG 960
AACCGTCAGA TCGCCTGGAG ACGCCATCGA ATTCATTGAT AGGATCCAGC AAGATGGTGT 1020
TGCAGACCCA GGTCTTCATT TCTCTGTTGC TCTGGATCTC TGGTGCCTAC GGGGATATCG 1080
TGATGACCCA GTCTCCAGAC TCGCTAGCTG TGTCTCTGGG CGAGAGGGCC ACCATCAACT 1140
GCAAGAGCTC TCAGAGTCTG TTAAACAGTG GAAATCAAAA GAACTACTTG GCCTGGTATC 1200
AGCAGAAACC CGGGCAGCCT CCTAAGTTGC TCATTTACGG GGCGTCGACT AGGGAATCTG 1260
GGGTACCTGA CCGATTCAGT GGCAGCGGGT CTGGGACAGA TTTCACTCTC ACCATCAGCA 1320
GCCTGCAGGC TGAAGATGTG GCAGTATACT ACTGTCAGAA TGTTCATAGT TTTCCATTCA 1380
CGTTCGGCGG AGGGACCAAG TTGGAGATCA AACGTACTGT GGCGGCGCCA TCTGTCTTCA 1440
TCTTCCCGCC ATCTGATGAG CAGTTGAAAT CTGGAACTGC CTCTGTTGTG TGCCTGCTGA 1500
ATAACTTCTA TCCCAGAGAG GCCAAAGTAC AGTGGAAGGT GGATAACGCC CTCCAATCGG 1560
GTAACTCCCA GGAGAGTGTC ACAGAGCAGG ACAGCAAGGA CAGCACCTAC AGCCTCAGCA 1620
GCACCCTGAC GCTGAGCAAA GCAGACTACG AGAAACACAA AGTCTACGCC TGCGAAGTCA 1680
CCCATĆAGGG CCTGAGCTCG CCCGTCACAA AGAGCTTCAA CAGGGGAGAG TGTTAATTCT 1740
AGATCCGTTA TCTACGTATG ATCAGCCTCG ACTGTGCCTT CTAGTTGCCA GCCATCTGTT 1800
GTTTGCCCCT CCCCCGTGCC TTCCTTGACC CTGGAAGGTG CCACTCCCAC TGTCCTTTCC 1860
PL 194 312 B1
TAATAAAATG AGGAAATTGC ATCGCATTGT CTGAGTAGGT gtcattctat TCTGGGGGGT 1920
GGGGTGGGGC AGGACAGCAA GGGGGAGGAT TGGGAAGACA ATAGCAGGCA TGCTGGGGAT 1980
GCGGTGGGCT CTATGGAACC AGCTGGGGCT CGACAGCTCG AGCTAGCTTT GCTTCTCAAT 2040
TTCTTATTTG CATAATGAGA AAAAAAGGAA AATTAATTTT AACACCAATT CAGTAGTTGA 2100
TTGAGCAAAT GCGTTGCCAA AAAGGATGCT TTAGAGACAG TGTTCTCTGC ACAGATAAGG 2160
ACAAACATTA TTCAGAGGGA GTACCCAGAG CTGAGACTCC TAAGCCAGTG AGTGGCACAG 2220
cattctaggg AGAAATATGC TTGTCATCAC CGAAGCCTGA TTCCGTAGAG CCACACCTTG 2280
GTAAGGGCCA ATCTGCTCAC ACAGGATAGA GAGGGCAGGA GCCAGGGCAG AGCATATAAG 2340
GTGAGGTAGG ATCAGTTGCT CCTCACATTT GCTTCTGACA TAGTTGTGTT GGGAGCTTGG 2400
ATCGATCCAC CATGGTTGAA CAAGATGGAT TGCACGCAGG TTCTCCGGCC GCTTGGGTGG 2460
AGAGGCTATT CGGCTATGAC TGGGCACAAC AGACAATCGG CTGCTCTGAT GCCGCCGTGT 2520
TCCGGCTGTC AGCGCAGGGG CGCCCGGTTC TTTTTGTCAA GACCGACCTG TCCGGTGCCC 2580
TGAATGAACT GCAGGACGAG GCAGCGCGGC TATCGTGGCT GGCCACGACG GGCGTTCCTT 2640
GCGCAGCTGT GCTCGACGTT GTCACTGAAG CGGGAAGGGA CTGGCTGCTA TTGGGCGAAG 2700
TGCCGGGGCA GGATCTCCTG TCATCTCACC TTGCTCCTGC CGAGAAAGTA TCCATCATGG 2760
CTGATGCAAT GCGGCGGCTG CATACGCTTG ATCCGGCTAC CTGCCCATTC GACCACCAAG 2820
CGAAACATCG CATCGAGCGA GCACGTACTC GGATGGAAGC CGGTCTTGTC GATCAGGATG 2880
ATCTGGACGA AGAGCATCAG GGGCTCGCGC CAGCCGAACT GTTCGCCAGG CTCAAGGCGC 2940
PL 194 312 B1
GCATGCCCGA CGGCGAGGAT CTCGTCGTGA CCCATGGCGA TGCCTGCTTG CCGAATATCA 3000
TGGTGGAAAA TGGCCGCTTT TCTGGATTCA TCGACTGTGG CCGGCTGGGT GTGGCGGACC 3060
GCTATCAGGA CATAGCGTTG GCTACCCGTG ATATTGCTGA AGAGCTTGGC GGCGAATGGG 3120
CTGACCGCTT CCTCGTGCTT TACGGTATCG CCGCTCCCGA TTCGCAGCGC ATCGCCTTCT 3180
ATCGCCTTCT TGACGAGTTC TTCTGAGCGG GACTCTGGGG TTCGAAATGA CCGACCAAGC 3240
GACGCCCAAC CTGCCATCAC GAGATTTCGA TTCCACCGCC GCCTTCTATG AAAGGTTGGG 3300
CTTCGGAATC GTTTTCCGGG ACGCCGGCTG GATGATCCTC CAGCGCGGGG ATCTCATGCT 3360
GGAGTTCTTC GCCCACCCCA ACTTGTTTAT TGCAGCTTAT AATGGTTACA AATAAAGCAA 3420
TAGCATCACA AATTTCACAA ATAAAGCATT TTTTTCACTG CATTCTAGTT GTGGTTTGTC 3480
CAAACTCATC AATGTATCTT ATCATGTCTG GATCGCGGCC GCGATCCCGT CGAGAGCTTG 3540
GCGTAATCAT GGTCATAGCT GTTTCCTGTG TGAAATTGTT ATCCGCTCAC AATTCCACAC 3600
AACATACGAG CCGGAAGCAT AAAGTGTAAA GCCTGGGGTG CCTAATGAGT GAGCTAACTC 3660
ACATTAATTG CGTTGCGCTC ACTGCCCGCT TTCCAGTCGG GAAACCTGTC GTGCCAGCTG 3720
CATTAATGAA TCGGCCAACG CGCGGGGAGA GGCGGTTTGC GTATTGGGCG CTCTTCCGCT 3780
TCCTCGCTCA CTGACTCGCT GCGCTCGGTC GTTCGGCTGC GGCGAGCGGT ATCAGCTCAC 3840
TCAAAGGCGG TAATACGGTT ĄTCCACAGAA TCAGGGGATA ACGCAGGAAA GAACATGTGA 3900
GCAAAAGGCę AGCAAAAGGę CAGGAACCGT AAAAAGGCCG CGTTGCTGGC GTTTTTCCAT 3960
AGGCTCCGCC CCCCTGACGA GCATCACAAA AATCGACGCT CAAGTCAGAG GTGGCGAAAC 4020
CCGACAGGAC TATAAAGATA CCAGGCGTTT CCCCCTGGAA GCTCCCTCGT GCGCTCTCCT 4080
PL 194 312 B1
GTTCCGACCC TGCCGCTTAC CGGATACCTG TCCGCCTTTC TCCCTTCGGG AAGCGTGGCG 4140
CTTTCTCAAT GCTCACGCTG TAGGTATCTC AGTTCGGTGT AGGTCGTTCG CTCCAAGCTG 4200
GGCTGTGTGC ACGAACCCCC CGTTCAGCCC GACCGCTGCG CCTTATCCGG TAACTATCGT 4260
CTTGAGTCCA ACCCGGTAAG ACACGACTTA TCGCCACTGG CAGCAGCCAC TGGTAACAGG 4320
ATTAGCAGAG CGAGGTATGT AGGCGGTGCT ACAGAGTTCT TGAAGTGGTG GCCTAACTAC 4380
GGCTACACTA GAAGGACAGT atttggtatc TGCGCTCTGC TGAAGCCAGT TACCTTCGGA 4440
AAAAGAGTTG GTAGCTCTTG ATCCGGCAAA CAAACCACCG CTGGTAGCGG TGGTTTTTTT 4500
GTTTGCAAGC AGCAGATTAC GCGCAGAAAA aaaggatctc AAGAAGATCC TTTGATCTTT 4560
TCTACGGGGT CTGACGCTCA GTGGAACGAA AACTCACGTT AAGGGATTTT GGTCATGAGA 4620
TTATCAAAAA GGATCTTCAC CTAGATCCTT TTAAATTAAA AATGAAGTTT TAAATCAATC 4680
TAAAGTATAT ATGAGTAAAC TTGGTCTGAC AGTTACCAAT GCTTAATCAG TGAGGCACCT 4740
ATCTCAGCGA TCTGTCTATT TCGTTCATCC ATAGTTGCCT GACTCCCCGT CGTGTAGATA 4800
ACTACGATAC GGGAGGGCTT ACCATCTGGC CCCAGTGCTG CAATGATACC GCGAGACCCA 4860
CGCTCACCGG CTCCAGATTT ATCAGCAATA AACCAGCCAG CCGGAAGGGC CGAGCGCAGA 4920
AGTGGTCCTG CAACTTTATC CGCCTCCATC CAGTCTATTA ATTGTTGCCG GGAAGCTAGA 4980
GTAAGTAGTT CGCCAGTTAA TAGTTTGCGC AACGTTGTTG CCATTGCTAC AGGCATCGTG 5040
GTGTCACGCT CGTCGTTTGG TATGGCTTCA TTCAGCTCCG GTTCCCAACG ATCAAGGCGA 5100
GTTACATGAT CCCCCATGTT GTGCAAAAAA GCGGTTAGCT CCTTCGGTCC TCCGATCGTT 5160
PL 194 312 B1
GTCAGAAGTA AGTTGGCCGC AGTGTTATCA CTCATGGTTA TGGCAGCACT GCATAATTCT
CTTACTGTCA TGCCATCCGT AAGATGCTTT TCTGTGACTG GTGAGTACTC AACCAAGTCA
TTCTGAGAAT AGTGTATGCG GCGACCGAGT TGCTCTTGCC CGGCGTCAAT ACGGGATAAT
ACCGCGCCAC ATAGCAGAAC TTTAAAAGTG CTCATCATTG GAAAACGTTC TTCGGGGCGA aaactctcaa ggatcttacc GCTGTTGAGA tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc
AACTGATCTT CAGCATCTTT TACTTTCACC AGCGTTTCTG GGTGAGCAAA AACAGGAAGG
CAAAATGCCG CAAAAAAGGG AATAAGGGCG ACACGGAAAT GTTGAATACT CATACTCTTC
CTTTTTCAAT ATTATTGAAG CATTTATCAG GGTTATTGTC TCATGAGCGG ATACATATTT
GAATGTATTT AGAAAAATAA ACAAATAGGG GTTCCGCGCA CATTTCCCCG AAAAGTGCCA
CCT (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 51 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 81 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 51
ATCCAAAGAC AACTCCCGTA ACCAGGTTGT TCTGACCATG ACTAACATGG ACCCGGTTGA
5220
5280
5340
5400
5460
5520
5580
5640
5700
5703
CACCGCTACC TACTACTGCG C (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 52 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 82 pary zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 52
TCGAGCGCAG TAGTAGGTAG CGGTGTCAAC CGGGTCCATG TTAGTCATGG TCAGAACAAC
CTGGTTACGG GAGTTGTCTT TGGAT
PL 194 312 B1 (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 53 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 73 pary zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 53
AACCTGCACC GTCTCCGGTT TCTCCCTGAC GAGCTATAGT GTACACTGGA TCCGTCAGCC
GCCGGGTAAA GGT (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 54 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 77par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 54
CTAGACCTTT ACCCGGCGGC TGACGGATCC AGTGTACACT ATAGCTCGTC AGGGAGAAAC
CGGAGACGGT GCĄGGTT (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 55 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 46par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 55
CTAGCTGTGT CAGCTGGCGA GAGGGCCACC ATCAACTGCA AGAGCT (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 56 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 38par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 56
CTTGCAGTTG ATGGTGGCCC TCTCGCCAGC TGACACAG
PL 194 312 B1 (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 57 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 140par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 57
(2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 58 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 138par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 58
(2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 59 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 143paryzasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 59
PL 194 312 B1 (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 60 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 136 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 60
CCAGTGCCAA GCTTGGGCCC TTGGTGGAGG CGCTCGAGAC GGTGACCGTG GTACCTTGTC 60
CCCAGTAGTC AAGCCGTAGT AAGGAAGAAG GGGGATCTCG AGCACAGAAA TAGACCGCGG 120
TGTCGGCGGC TGTCAC i g c (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 61 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 357par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia : liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 61
CAGGTCCAAC TGCAGGAGAG CGGTCCAGGT CTTGTGAGAC CTAGCCAGAC CCTGAGCCTG 60
ACCTGCACCG TCTCGGGCTT CTCCCTCACC AGCTATAGTG TACACTGGGT GAGACAGCCA 120
CCTGGACGAG GTCTAGAGTG GCTTGGAGTA ATATGGGCTA GTGGAGGCAC AGATTATAAT 180
TCGGCTCTCA TGTCCAGACT GAGTATACTG AAAGACAACA GCAAGAACCA GGTCAGCCTG 240
AGACTCAGCA GCGTGACAGC CGCCGACACC GCGGTCTATT ACTGTGCTCG GGATCCCCCT 300
TCTTCCTTAC TACGGCTTGA CTACTGGGGA CAAGGTACCA CGGTCACCGT CTCGAGC 357
2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr:62 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 119 aminokwasów (B) Rodzaj: aminokwas ((C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia : liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr:62
PL 194 312 B1
Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser 15 Gin
1 5 10
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Ser Val His Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ala Ser Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Leu Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gin Val Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Pro Pro Ser Ser Leu Leu Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 63 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 28par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 63
AGGACGCCAG CAACATGGTG TTGCAGAC (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 64 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 36par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 64
TGCCAAGCTT GGGCCCTTGG TGGAGGCGCT CGAGAC
PL 194 312 B1 (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 65 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 121 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 65
GACCATGATT ACGAATTCGT AGTCGGATAT CGTGATGACC CAGAGCCCAA GCAGCCTGAG 60
CGCTAGCGTG GGTGACAGAG TGACCATCAC CTGTAAGAGC TCTCAGAGTC TGTTAAACAG 120 T 121 (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 66 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 116 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 66
AGATTCCCTA GTCGATGCCC CGTAGATCAG CAGCTTTGGA GCCTTACCGG GTTTCTGCTG 60
ATACCAGGCC AAGTAGTTCT TTTGATTTCC ACTGTTTAAC AGACTCTGAG AGCTCT 116 (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 67 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 116 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 67
TCTACGGGGC ATCGACTAGG GAATCTGGGG TACCAGATAG ATTCAGCGGT AGCGGTAGCG 60
GAACCGACTT CACCTTCACC ATCAGCAGCC TGCAGCCAGA GGACATCGCC ACCTAC 116 (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 68 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 117 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 68
TCGATGCCAA GCTTGGCGCC GCCACAGTAC GTTTGATCTC CACCTTGGTC CCTTGTCCGA 60
ACGTGAATGG AAAACTATGA ACATTCTGGC AGTAGTAGGT GGCGATGTCC TCTGGCT 117
PL 194 312 B1 (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 69 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 339 par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 69
GATATCGTGA TGACCCAGAG CCCAAGCAGC CTGAGCGCTA GCGTGGGTGA CAGAGTGACC 60
ATCACCTGTA AGAGCTCTCA GAGTCTGTTA AACAGTGGAA ATCAAAAGAA CTACTTGGCC 120
TGGTATCAGC AGAAACCCGG TAAGGCTCCA AAGCTGCTGA TCTACGGGGC ATCGACTAGG 180
GAATCTGGGG TACCAGATAG ATTCAGCGGT AGCGGTAGCG GAACCGACTT CACCTTCACC 24C
ATCAGCAGCC TGCAGCCAGA GGACATCGCC ACCTACTACT GCCAGAATGT TCATAGTTTT 300
CCATTCACGT TCGGACAAGG GACCAAGGTG GAGATCAAA 339
2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 70 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 113 aminokwasów (B) Rodzaj: aminokwas (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 70
Asp Ile Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Asn
85 90 95
Val His Ser Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
PL 194 312 B1 (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 71 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 24 pary zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 71
GATTACGAAT TCGTAGTCGG ATAT ((2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 72 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 24 pary zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 72
TGCCAAGCTT GGCGCCGCCA CAGT (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 73 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 39par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 73
CTAGTGCGGG TGACCGAGTG ACCATCACCT GTAAGAGCT (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 74 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 31par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 74
CTTACAGGTG ATGGTCACTC GGTCACCCGC A (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 75 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 66par zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 75
GGTCTATTAC TGTGCTCGGG ATCCCCCTTC TTCCTTACTA CGGCTTGACT ACTGGGGACA
AGGTAC
PL 194 312 B1 (2) Informacja do Identyfikatora Sekw. Nr: 76 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 64 pary zasad (B) Rodzaj: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Rodzaj cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: Identyfikator Sekw. Nr: 76

Claims (30)

1. Przeciwciało monoklonalne neutralizujące gryzoni, swoiste wobec ludzkiej interleukiny-5, obejmujące sekwencję aminokwasową lekkiego łańcucha określoną Identyfikatorem Sekw. nr 16 isekwencję aminokwasową ciężkiego łańcucha określoną Identyfikatorem Sekw. nr 15.
2. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 1, znamienne tym, że jest mysim monoklonalnym przeciwciałem.
3. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 1, znamienne tym, że jest szczurzym monoklonalnym przeciwciałem.
4. Przeciwciało monoklonalne 2B6 albo 2E3 albo 2F2.
5. Linia hybrydoma zdolna do wytwarzania przeciwciał monoklonalnych 2B6 albo 2E3 albo 2F2.
6. Humanizowane przeciwciało zawierające łańcuch ciężki i łańcuch lekki, którego regiony zrębowe łańcuchów ciężkiego i łańcucha lekkiego pochodzą przynajmniej z jednego przeciwciała akceptorowego i w którym co najmniej jedna z reszt podpierających zrąb została zmieniona, a sekwencje aminokwasowe regionów determinujących komplementarność każdego z wymienionych łańcuchów pochodzą z przeciwciała monoklonalnego określonego w zastrz. 1.
7. Humanizowane przeciwciało według zastrz. 6, znamienne tym, że sekwencje aminokwasowe regionów łańcucha ciężkiego determinujących komplementarność są określone w:
(a) Identyfikatorze Sekw. nr 7, 8, 9 lub (b) Identyfikatorze Sekw. nr 7, 8, 14.
8. Humanizowane przeciwciało według zastrz. 6, znamienne tym, że sekwencje aminokwasowe regionów łańcucha lekkiego de terminujących komplementarność są określone w:
(a) Identyfikatorze Sekw. nr 10, 12, lub (b) Identyfikatorze Sekw. nr 10, 13.
9. Humanizowane przeciwciało według zastrz. 6, znamienne tym, że regiony zrębowe łańcucha ciężkiego obejmują aminokwasy 1-30, 36-49, 66-97 i 109-119 Identyfikatora Sekw. nr 19.
10. Humanizowane przeciwciało według zastrz. 6, znamienne tym, że regiony zrębowe łańcucha lekkiego obejmują aminokwasy 1-23, 41-55, 63-94 i 104- 113 Identyfikatora Sekw. nr 21.
11. Region determinujący komplementarność (CDR) ciężkiego łańcucha immunoglobuliny, znamienny tym, że jego sekwencja aminokwasowa jest wybrana z grupy składającej się z:
(a) Identyfikatora Sekw. nr 7, (b) Identyfikatora Sekw. nr 8, (c) Identyfikatora Sekw. nr 9 i (d) Identyfikatora Sekw. nr 14.
12. Region determinujący komplementarność (CDR) lekkiego łańcucha immunoglobuliny, znamienny tym, że jego sekwencja aminokwasowa jest wybrana z grupy składającej się z:
(a) Identyfikatora Sekw. nr 10, (b) Identyfikatora Sekw. nr 12, (c) Identyfikatora Sekw. nr 13, (d) Identyfikatora Sekw. nr 47 i (e) Identyfikatora Sekw. nr 48.
PL 194 312 B1
13. Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca region determinujący komplementarność (CDR) określony w zastrz. 11.
14. Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca region determinujący komplementarność (CDR) określony w zastrz. 12.
15. Przeciwciało chimeryczne obejmujące ciężki i lekki łańcuch, charakteryzujące się stałą dysocjacji równą lub mniejszą niż około 3,5x 10-11 M dla ludzkiej interleukiny-5, w którym stałe regiony łańcuchów ciężkich i lekkich pochodzą z przynajmniej jednego przeciwciała akceptorowego, a sekwencja aminokwasowa regionów zmiennych każdego łańcucha pochodzi z przeciwciała monoklonalnego określonego w zastrz. 1.
16. Przeciwciało według zastrz. 15, znamienne tym, że stałe regiony są wybrane z ludzkich immunoglobulin.
17. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję czynną i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera humanizowane przeciwciało określone w zastrz. 6.
18. Izolowana sekwencja kwasu nukleinowego wybrana z grupy składającej się z:
(a) sekwencji kwasu nukleinowego kodującej humanizowane prze ciwciało określone w zastrz. 6;
(b) sekwencji kwasu nukleinowego komplementarnej do (a); i (c) fragmentu lub analogu (a) lub (b), który koduje białko charakteryzujące się swoistością wobec ludzkiej interleukiny-5, przy czym sekwencja ewentualnie zawiera miejsca restrykcyjne.
19. Izolowana sekwencja kwasu nukleinowego według zastrz. 18, w której sekwencja kodująca zmienne regiony humanizowanych łańcuchów ciężkich obejmuje sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną w Identyfikatorze Sekw. nr 18.
20. Izolowana sekwencja kwasu nukleinowego według zastrz. 18, w której sekwencja kodująca zmienne regiony humanizowanych łańcuchów ciężkich obejmuje sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną w Identyfikatorze Sekw. nr 61.
21. Izolowana sekwencja kwasu nukleinowego według zastrz. 18, w której sekwencja kodująca zmienne regiony humanizowanych łańcuchów lekkich obejmuje sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną w Identyfikatorze Sekw. nr 20.
22. Izolowana sekwencja kwasu nukleinowego według zastrz. 18, w której sekwencja kodująca zmienne regiony humanizowanych łańcuchów lekkich obejmuje sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną w Identyfikatorze Sekw. nr 69.
23. Rekotnbinowany plazmid obejmujący sekwencję kwasu nukleinowego określonego w zastrz. 18.
24. Komórka gospodarza transfekowana rekombinowanym plazmidem określonym w zastrz. 23.
25. Sposób wytwarzania humanizowanego przeciwciała swoistego wobec ludzkiej interleukiny-5, znamienny tym, że obejmuje hodowanie linii komórkowej transfekowanej rekombinowanym plazmidem określonym w zastrz. 23 pod kontrolą wybranych sekwencji regulatorowych zdolnych do kierowania jego ekspresją w tych komórkach.
26. Sposób wspomagania diagnostyki alergii i innych stanów związanych z nadmierną produkcją granulocytów kwasochłonnych, znamienny tym, że w próbce płynu ustrojowego pobranej od pacjenta określa się ilość IL-5 przez skontaktowanie jej z przeciwciałem monoklonalnym określonym w zastrz. 1i wykrywa się obecność lub nieobecność kompleksu IL-5/przeciwciało monoklonalne i porównuje się średnią ilość IL-5 ze średnią ilością IL-5 w populacji zdrowej, przy czym obecność znacząco zwiększonej ilości ludzkiej IL-5 u pacjentów wskazuje na alergię i inne stany związane ze zwiększoną produkcją granulocytów kwasochłonnych.
27. Hybrydoma posiadająca identyfikującą charakterystykę linii komórkowej SK119-24G9.8.20.5 lub 5D3(1)F5D6.
28. Przeciwciało monoklonalne produkowane przez hybrydoma określoną w zastrz. 27.
29. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 1, znamienne tym, że wykazuje charakterystykę identyfikującą 4A6.
30. Hybrydoma posiadająca identyfikującą charakterystykę linii komórkowej 4A6(1)G1F7.
PL95321088A 1994-12-23 1995-12-22 Przeciwciało monoklonalne neutralizujące gryzoni,linia hybrydoma, humanizowane przeciwciało, region CDR ciężkiego łańcucha immunoglobuliny, region CDR lekkiego łańcucha immunoglobuliny, cząsteczki kwasu nukleinowego, przeciwciało chimeryczne, kompozycja farmaceutyczna, izolowana sekwencja kwasu nukleinowego, rekombinowany plazmid i komórka gospodarza oraz sposób wytwarzania humanizowanego przeciwciała i sposób wspomagania diagnostyki alergii PL194312B1 (pl)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US36313194A 1994-12-23 1994-12-23
US08/470,110 US5693323A (en) 1994-12-23 1995-06-06 Recombinant IL-5 antagonists useful in treatment of IL-5 mediated disorders
US08/467,420 US5683892A (en) 1994-12-23 1995-06-06 DNA encoding recombinant IL-5 antagonists useful in treatment of IL-5 mediated disorders
PCT/US1995/017082 WO1996021000A2 (en) 1994-12-23 1995-12-22 Recombinant il-5 antagonists useful in treatment of il-5 mediated disorders

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL321088A1 PL321088A1 (en) 1997-11-24
PL194312B1 true PL194312B1 (pl) 2007-05-31

Family

ID=27408594

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL95321088A PL194312B1 (pl) 1994-12-23 1995-12-22 Przeciwciało monoklonalne neutralizujące gryzoni,linia hybrydoma, humanizowane przeciwciało, region CDR ciężkiego łańcucha immunoglobuliny, region CDR lekkiego łańcucha immunoglobuliny, cząsteczki kwasu nukleinowego, przeciwciało chimeryczne, kompozycja farmaceutyczna, izolowana sekwencja kwasu nukleinowego, rekombinowany plazmid i komórka gospodarza oraz sposób wytwarzania humanizowanego przeciwciała i sposób wspomagania diagnostyki alergii

Country Status (22)

Country Link
US (1) US6129913A (pl)
EP (1) EP0800536B1 (pl)
JP (2) JP2001523083A (pl)
CN (1) CN100391977C (pl)
AT (1) ATE346867T1 (pl)
AU (1) AU708951B2 (pl)
BR (1) BR9510499B1 (pl)
CA (1) CA2208503C (pl)
CZ (1) CZ297045B6 (pl)
DE (1) DE69535319T2 (pl)
DK (1) DK0800536T3 (pl)
ES (1) ES2277336T3 (pl)
FI (1) FI119374B (pl)
HK (1) HK1003651A1 (pl)
HU (1) HU222992B1 (pl)
LU (1) LU92912I2 (pl)
MX (1) MX9704779A (pl)
NL (1) NL300787I1 (pl)
NO (2) NO324181B1 (pl)
NZ (1) NZ301916A (pl)
PL (1) PL194312B1 (pl)
WO (1) WO1996021000A2 (pl)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5683892A (en) * 1994-12-23 1997-11-04 Smithkline Beecham Corporation DNA encoding recombinant IL-5 antagonists useful in treatment of IL-5 mediated disorders
US5783184A (en) * 1994-12-23 1998-07-21 Smithkline Beecham Corporation Method for treatment and diagnosis of IL-5 mediated disorders
ES2568899T3 (es) * 1999-04-09 2016-05-05 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
US6946292B2 (en) * 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
MXPA04009418A (es) * 2002-03-29 2005-06-08 Schering Corp Anticuerpos monoclonales humanos par interleucina-5, y metodos y composiciones que comprenden los mismos.
JPWO2003084569A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物含有医薬
EP1682571A4 (en) * 2003-10-27 2006-12-06 Medvet Science Pty Ltd BICOORDIN PATTERN AND METHODS OF USE
ATE541585T1 (de) * 2004-10-28 2012-02-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Antikörper gegen il-5-rezeptor zur verwendung in der behandlung von endometriose.
EP2606906A1 (en) 2007-04-30 2013-06-26 GlaxoSmithKline LLC Methods for administering anti-IL-5 antibodies
JP4335286B2 (ja) 2008-02-08 2009-09-30 ファナック株式会社 部品保護機能を備えたロボット制御装置及びロボット制御方法
MX2010010667A (es) * 2008-03-28 2010-11-09 Glaxosmithkline Llc Metodos de tratamiento.
KR20130028055A (ko) * 2010-01-28 2013-03-18 글락소 그룹 리미티드 Ｃｄ １２７ 결합 단백질
US9505826B2 (en) 2010-12-22 2016-11-29 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Modified antibody with improved half-life
CN116327921A (zh) 2015-08-24 2023-06-27 葛兰素史密斯克莱知识产权（第2 号）有限公司 生物医药组合物
US11046782B2 (en) * 2016-03-30 2021-06-29 Musc Foundation For Research Development Methods for treatment and diagnosis of cancer by targeting glycoprotein A repetitions predominant (GARP) and for providing effective immunotherapy alone or in combination
PE20191662A1 (es) * 2016-12-23 2019-11-11 Cephalon Inc Anticuerpos anti-il-5
NZ760380A (en) * 2017-05-26 2023-07-28 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Biopharmaceutical compositions and related methods
EP3689906A4 (en) * 2017-09-29 2021-04-07 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. IL-5 ANTIBODIES, ANTIGIBINDING FRAGMENT THEREOF, AND MEDICAL USES THEREOF
CN109942706A (zh) * 2017-12-21 2019-06-28 三生国健药业（上海）股份有限公司 结合人il-5的单克隆抗体、其制备方法和用途
US20220010008A1 (en) * 2018-12-12 2022-01-13 Shanghai Pharmaexplorer Co., Ltd. Anti-human interleukin 5(il-5) monoclonal antibody and use thereof
WO2020200099A1 (zh) * 2019-03-29 2020-10-08 江苏恒瑞医药股份有限公司 包含抗il-5抗体的药物组合物及其用途

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8800397D0 (en) * 1988-01-08 1988-02-10 Sandoz Ltd Improvements in/relating to organic compounds
KR960002183B1 (ko) * 1988-11-03 1996-02-13 쉐링 코포레이션 호산구증다증 억제또는 경감을 위한 약제학적 조성물
US5096704A (en) * 1988-11-03 1992-03-17 Schering Corporation Method of treating eosinophilia
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
ZA929328B (en) * 1991-12-02 1993-07-20 Fluor Corp Apparatus and method for economic use of excess compressed air when firing low caloric-value gas in a combustion gas turbine.
AU683836B2 (en) * 1992-02-06 1997-11-27 Schering Corporation Design, cloning and expression of humanized monoclonal antibodies against human interleukin-5
JPH06141885A (ja) * 1992-11-05 1994-05-24 Chemo Sero Therapeut Res Inst モノクローナル抗体
AU1289795A (en) * 1993-11-19 1995-06-06 Baylor College Of Medicine Monoclonal antibodies specific for human interleukin-5
GB9412230D0 (en) * 1994-06-17 1994-08-10 Celltech Ltd Interleukin-5 specific recombiant antibodies
US5683892A (en) * 1994-12-23 1997-11-04 Smithkline Beecham Corporation DNA encoding recombinant IL-5 antagonists useful in treatment of IL-5 mediated disorders
US5783184A (en) * 1994-12-23 1998-07-21 Smithkline Beecham Corporation Method for treatment and diagnosis of IL-5 mediated disorders
WO2001012646A1 (en) * 1999-08-19 2001-02-22 Smithkline Beecham Corporation Sialoadhesin factor-1 agonist and antagonist antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
MX9704779A (es) 1997-09-30
AU4745096A (en) 1996-07-24
HU222992B1 (hu) 2004-01-28
ES2277336T3 (es) 2007-07-01
NL300787I2 (pl) 2016-04-05
CA2208503A1 (en) 1996-07-11
WO1996021000A3 (en) 1996-09-06
WO1996021000A2 (en) 1996-07-11
FI972703A0 (fi) 1997-06-23
BR9510499B1 (pt) 2009-05-05
US6129913A (en) 2000-10-10
NO324181B1 (no) 2007-09-03
CZ196397A3 (en) 1997-10-15
NO972913D0 (no) 1997-06-20
JP2001523083A (ja) 2001-11-20
NZ301916A (en) 1999-05-28
EP0800536A2 (en) 1997-10-15
FI972703A (fi) 1997-08-22
DE69535319T2 (de) 2007-07-19
DE69535319D1 (de) 2007-01-11
BR9510499A (pt) 1999-03-30
ATE346867T1 (de) 2006-12-15
DK0800536T3 (da) 2007-04-02
EP0800536B1 (en) 2006-11-29
AU708951B2 (en) 1999-08-19
NL300787I1 (pl) 2016-04-05
CN1175263A (zh) 1998-03-04
CA2208503C (en) 2009-12-01
FI119374B (fi) 2008-10-31
JP2008029355A (ja) 2008-02-14
NO972913L (no) 1997-08-19
CZ297045B6 (cs) 2006-08-16
NO2015027I1 (no) 2015-12-18
LU92912I2 (fr) 2016-02-16
PL321088A1 (en) 1997-11-24
NO2015027I2 (no) 2016-01-04
CN100391977C (zh) 2008-06-04
HUT78055A (hu) 1999-07-28
EP0800536A4 (en) 2004-12-01
HK1003651A1 (en) 1998-11-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100511544B1 (ko) Ｉｌ－5 매개된 질환의 치료에 유용한 재조합 ｉｌ－5길항제
FI119374B (fi) Rekombinantti IL-5-antagonisteja, jotka ovat käyttökelpoisia hoidettaessa IL-5:een liittyviä sairauksia
WO1996021000A9 (en) Recombinant il-5 antagonists useful in treatment of il-5 mediated disorders
WO1997048418A1 (en) Improved method for treatment and diagnosis of il-5 mediated disorders
EP2426143B1 (en) Method of providing disease-specific binding molecules and targets
EP2440578B1 (en) Use of an anti-tau ps422 antibody for the treatment of brain diseases
WO1998005787A1 (en) A method for inhibiting immunoglobulin-induced toxicity resulting from the use of immunoglobulins in therapy and in vivo diagnosis
WO1998005787A9 (en) A method for inhibiting immunoglobulin-induced toxicity resulting from the use of immunoglobulins in therapy and in vivo diagnosis
KR101989551B1 (ko) IL-1β 억제제 조성물 및 이의 용도
AU2015310671B2 (en) Anti-Hepatitis C antibodies and antigen binding fragments thereof
US11155600B2 (en) Human IL1-R1 derived inhibitor of IL-1β
US20210403534A1 (en) IL1-R1 DERIVED INHIBITOR OF IL-1b AND USE THEREOF
AU775429B2 (en) A method for inhibiting immunoglobulin-induced toxicity resulting from the use of immunoglobulins in therapy and in vivo diagnosis
CN115768787A (zh) IL1-R1衍生的IL-1β抑制剂及其用途
KR20230082623A (ko) 벡터화된 항체 및 그 용도