HU222992B1 - IL-5 Mediált rendellenességek kezelésére használható rekombináns IL-5 antagonisták - Google Patents

IL-5 Mediált rendellenességek kezelésére használható rekombináns IL-5 antagonisták Download PDF

Info

Publication number
HU222992B1
HU222992B1 HU9901120A HU9901120A HU222992B1 HU 222992 B1 HU222992 B1 HU 222992B1 HU 9901120 A HU9901120 A HU 9901120A HU 9901120 A HU9901120 A HU 9901120A HU 222992 B1 HU222992 B1 HU 222992B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
seq
antibody
monoclonal antibody
nucleic acid
type
Prior art date
Application number
HU9901120A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT78055A (hu
Inventor
Robert S. Ames
Edward Robert Appelbaum
Irwin M. Chaiken
Richard M. Cook
Mitchell Stuart Gross
Stephen Dudley Holmes
Lynette Jane Mcmillan
Timothy Wayne Theisen
Original Assignee
Smithkline Beecham Corporation
Smithkline Beecham Plc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27408594&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU222992(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from US08/467,420 external-priority patent/US5683892A/en
Application filed by Smithkline Beecham Corporation, Smithkline Beecham Plc. filed Critical Smithkline Beecham Corporation
Publication of HUT78055A publication Critical patent/HUT78055A/hu
Publication of HU222992B1 publication Critical patent/HU222992B1/hu
Priority to HUS1500070C priority Critical patent/HUS1500070I1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5409—IL-5
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6869—Interleukin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/026—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a baculovirus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)

Abstract

A találmány tárgya egy humán interleukin–5-re specifikus rágcsálóneutralizáló monoklonális antitest, amelynek kötési affinitása3,5×10–11 M értékű vagy ennél kisebb disszociációs állandójú, és amelyaz ATCC HB 11 783 számon letétbe helyezett hibridóma sejtvonal általtermelt 2B6 monoklonális ellenanyag, ATCC HB 11 782 számon letétbehelyezett hibridóma sejtvonal által termelt 2E3 monoklonálisellenanyag, ATCC HB 11 781 számon letétbe helyezett hibridómasejtvonal által termelt 2F2 monoklonális ellenanyag vagy ATCC HB 11943 számon letétbe helyezett hibridóma sejtvonal által termelt 4A6monoklonális ellenanyag azonosítási jellemzőkkel rendelkezik. ŕ

Description

A találmány az IL-5 és a túlzott eozinofiltermelés által médiáit állapotok kezelésére és diagnosztizálására felhasználható antitestekre és módosított antitestekre, közelebbről monoklonális antitestekre (mAb), antigénkötő fragmentumokra (Fab), kiméra és humanizált antitestekre vonatkozik.
Az eozinofil sejtek számos gyulladásos betegség, köztük a túlérzékenységi reakciókkal együtt járó tüdőszöveti allergiás rendellenességek patogenezisébe beépültek [Butterfield et al., In: Immunopharmacology of Eosinophils, H. Smith and R. Cook, Eds., p. 151-192, Academic Press, London (1993)]. Az ilyen betegségek egyik jellegzetes példája az asztma, amelyet a légutak nemspecifikus bronchialis túlérzékenységhez vezető reverzibilis obstrukciója jellemez. A bronchialis túlérzékenység a bronchialis nyálkahártya krónikus gyulladásos reakciójában és jellegzetes makrofág-, limfocita- és eozinofilinfiltrációban nyilvánul meg. Úgy tűnik, hogy az eozinofil központi szerepet játszik a betegségre jellemző nyálkahártya-károsodás iniciálásában [Corrigan et al., Immunoi. Today, 13, 501-507 (1992)]. A korábbiakban beszámoltak arról, hogy a krónikus asztmában szenvedő betegek vérkeringésében, bronchialis szekrétumában és tüdőparenchymájában fokozott mennyiségű aktivált eozinofilt találtak, illetve a különféle tüdőfunkciós tesztekkel végzett mérések szerint a betegség súlyossága összefüggésben áll a vérben lévő eozinofilek számával [Griffen et al., J. Aller. Clin. Immunoi., 67, 548-557 (1991)]. Gyakran a degranulációs folyamatban megnövekedett számú eozinofil található a kései asztmatikus reakciókon átesett betegek bronchoalveolaris öblítő- (bronchoalveral lavage; BAL) folyadékaiban is, illetve a - szokásosan a szteroid terápia következményeként - csökkent eozinofilszám a klinikai tünetek javulásával jár együtt [Bousquet et al., N. Eng.
J. Med., 323, 1033-1039 (1990)].
Az interleukin-5 (IL—5) egy homodimer glikoprotein, amelyet túlnyomórészt aktivált CD4+ T-limfociták termelnek. Az ember szervezetében az IL-5 nagymértékben felelős az eozinofilek növekedésének és differenciálódásának szabályozásáért. Fokozott mennyiségű IL-5 észlelhető az asztmás betegek bronchoalveolaris öblítőfolyadékaiban [Motojima et al., Allergy, 48, 98 (1993)]. Az IL-5-re nézve transzgenikus egerek antigénes stimuláció hiányában kifejezett eozinofíliát mutatnak a perifériális vérben és szövetekben [Dent et al., J. Exp. Med., 172, 1425 (1990)], ugyanakkor az anti-murine IL-5 monoklonális antitestek hatására az eozinofília csökkent az egerek vérében és szöveteiben [Hitoshi et al., Int. Immunoi., 3, 135 (1991)], valamint a parazitainfekciónak és allergéneknek kitett kísérleti állatokban [Coffman et al., Science, 245, 308-310 (1989); Sher et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 61-65 (1990); valamint Chand et al., Eur. J. Pharmacol., 211, 121-123 (1992)].
Jóllehet a kortikoszteroidok rendkívül hatásosak az eozinofilek számának és az asztma egyéb gyulladásos komponenseinek a visszaszorításában, a súlyosan asztmás betegek, illetve az utóbbi időben az enyhén és közepesen súlyos asztmás betegek esetében tapasztalt mellékhatásaik igen aggasztóak. A kortikoszteroidokon kívüli egyetlen lényeges gyulladásellenes hatóanyag-terápia a kromoglikátok (kromolin-nátrium és nedokromil) alkalmazásán alapul, azonban az ilyen típusú terápia lényegesen kisebb hatékonyságú, mint a kortikoszteroidoké, ezenkívül a kromoglikátok pontos hatásmechanizmusa még ma sem tisztázott.
A legutóbbi időben folytatott kutatások, illetve fejlesztések új inhalált szteroidokra, hosszabb hatástartamú bronchodilatatorokra, valamint olyan hatóanyagokra irányultak, amelyek új biokémiai vagy farmakológiai targetekre [például káliumcsatoma-aktivátorokra, leukotriénantagonistákra, 5-lipoxigenáz (5-LO)-inhibitorokra stb.] gyakorolnak hatást. Az ideális hatóanyag olyan volna, amely egyesítené magában a szteroidok hatékonyságát és a kromolin-nátrium biztonságos alkalmazhatóságát, ugyanakkor fokozott szelektivitással és gyorsabb hatással is rendelkezne. A neutralizáló IL-5 antitestek potenciálisan felhasználhatók az eozinofíliával kapcsolatos tünetek enyhítésére emberben.
Jelentős igény van a szakterületen egy olyan, nagy affinitású IL-5 antagonista, például egy humán interleukin-5 neutralizáló monoklonális antitest iránt, amely csökkentené az eozinofildifferenciálódást és -proliferációt (azaz az eozinofilek akkumulációját), és ily módon az eozinofil gyulladást.
A jelen találmány első tárgya olyan rágcsáló (például patkány és egér) neutralizáló monoklonális antitestekre vonatkozik, amelyek specifikusak a humán interleukin-5-tel szemben, és amelyek legfeljebb körülbelül 3,5χ10-π M értékű disszociációs állandójú kötési affinitással rendelkeznek. Az ilyen monoklonális antitestek példái közé tartoznak a 2B6,2E6 és a 2F2 rágcsáló monoklonális antitestek, valamint a patkány monoklonális antitestek, amilyen például a 4A6 patkány monoklonális antitest. A találmánynak egy másik tárgya hibridómákra vonatkozik, amilyenek például a következők: SK119-2B6.206.75 (1), SK119-2E3.39.40.2, SK119-2F2.37.80.12,4A6 (1) G1F7 és 5D3 (1) F5D6.
A találmánynak egy további tárgya a találmány szerinti rágcsáló neutralizáló monoklonális antitestek Fc szakaszának deléciójával előállított, a humán interleukin-5-re specifikus neutralizáló Fab-fragmentumokra vagy ezek F(ab’)2-firagmentumaira vonatkozik.
A találmánynak egy ismét további tárgya a lánckeverési (chain shuffling) technikával előállított, a humán interleukin-5-re specifikus neutralizáló Fab-fragmentumokra vagy ezek F(ab’)2-fragmentumaira vonatkozik, ahol a lánckeverési technika eredményeként egy, a találmány szerinti rágcsáló neutralizáló monoklonális antitestekből izolált nehéz (vagy könnyű) lánc immunglobulin egy interleukin-5 immunizált rágcsálókból egy szálas fág Fab demonstrációs könyvtárban izolált könnyű lánc (illetve nehéz lánc) immunglobulinnal expresszálódik.
A találmány további tárgya egy olyan, a humán interleukin-5-re specifikus módosított antitestre vonatkozik, amely egy, a humán interleukin-5-re nézve legfeljebb körülbelül 3,5x10-11 M értékű disszociációs állandójú nem humán neutralizáló monoklonális antitestből (mAb)
HU 222 992 Bl származó komplementaritást meghatározó szakaszokat (complementarity determining regions; CDR-eket) tartalmaz, valamint az ezeket kódoló nukleinsavmolekulákra vonatkozik. Amennyiben a módosított antitest egy humanizált antitest, a szekvenciák, amelyek a nem humán immunglobulinból származó komplementaritást meghatározó szakaszokat (CDR-eket) kódolják, egy első, olyan immunglobulin-partnerbe vannak inszertálva, amelyben az első immunglobulin-partner legalább egy, előnyösen valamennyi komplementaritást meghatározó szakaszát (CDR-jét) a nem humán monoklonális antitestből származó CDR-ek helyettesítik. Előnyösen az első immunglobulin-partner operatív módon egy olyan, második immunglobulin-partnerhez kötődik, amely egy immunglobulin konstans lánc egészét vagy részét tartalmazza.
A találmány tárgyát képezik továbbá a humán interleukin-5-re nézve legfeljebb körülbelül 3,5 χ ΙΟ-11 M értékű disszociációs állandójú nem humán neutralizáló monoklonális antitestekből (mAb-kből) származó komplementaritást meghatározó szakaszok (CDR-ek), valamint az ilyen CDR-eket kódoló nukleinsavmolekulák is.
A találmány további tárgya humán nehéz és könnyű konstans szakaszokat, valamint a humán interleukin-5-re nézve legfeljebb körülbelül 3,5 χ ΙΟ-11 M értékű disszociációs állandójú nem humán neutralizáló monoklonális antitestekből származó nehéz és könnyű lánc variábilis szakaszokat tartalmazó kiméra antitestre vonatkozik.
A találmánynak egy ismét további tárgya egy olyan gyógyszerkészítményre vonatkozik, amely egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozót és egy (vagy több), a fentiekben ismertetett módosított antitestet tartalmaz.
A találmány további tárgya eljárás túlzott eozinofiltermeléssel kapcsolatos állapotok kezelésére emberekben, amelynek során a betegnek a találmány szerinti gyógyszerkészítmény hatásos mennyiségét adjuk be.
A találmánynak egy ismét további tárgya eljárás olyan módosított antitestek (például konstruált antitestek, CDR-ek, Fab- vagy F(ab)2-fragmentumok vagy ezek analógjai) rekombináns előállítására, amelyek a humán interleukin-5-re nézve legfeljebb körülbelül 3,5 χ ΙΟ-11 M értékű disszociációs állandójú nem humán neutralizáló monoklonális antitestekből származnak. A találmány kiterjed a módosított antitestek rekombináns előállítási eljárásában felhasználható komponensekre is. Az ilyen komponensek a következőket foglalják magukban: a módosított antitesteket kódoló izolált nukleinsavmolekulák, valamint olyan rekombináns plazmidok, amelyek a rekombináns plazmiddal transzfektált gazdasejtekben (előnyösen emlőssejtekben) az expresszió irányítására alkalmas szelektált regulátorszekvenciák kontrollja alatt tartalmazzák a nukleinsavszekvenciákat. Az előállítási eljárás során a találmány szerinti transzfektált gazdasejtvonalat olyan körülmények között tenyésztjük, amelyek lehetővé teszik, hogy a sejtekben egy módosított antitest, előnyösen egy humanizált antitest expresszálódjon, majd a sejtekből izoláljuk az expresszált terméket.
A találmánynak egy ismét további tárgya eljárás túlzott eozinofiltermeléssel kapcsolatos állapotok diagnosztizálására emberekben, amelynek során a beteg valamely biológiai folyadékából mintát veszünk, ezt követően a találmány szerinti antitesteket és módosított antitesteket olyan körülmények között érintkeztetjük a mintával, amelyek lehetővé teszik, hogy egy IL-5/(monoklonális vagy módosított) antitest komplex alakuljon ki, majd detektáljuk az IL-5/(monoklonális vagy módosított) antitest komplex jelenlétét vagy hiányát.
A találmány további tárgyait és előnyeit a kitanításban és az előnyös megoldásokon keresztül ismertetjük. Az ábrák rövid ismertetése
Az 1. ábra (1. számú szekvencia és 15. számú szekvencia) a 2B6 rágcsálóantitest és a rágcsáló/humán 2B6 kiméra antitest nehéz lánc variábilis szakaszt mutatja be. A bekeretezett területek a CDR-eket jelölik.
A 2. ábra (2. számú szekvencia és 16. számú szekvencia) a 2B6 rágcsálóantitest és a rágcsáló/humán 2B6 kiméra antitest könnyű lánc variábilis szakaszt mutatja be. A bekeretezett területek a CDR-eket jelölik.
A 3. ábra (3. számú szekvencia) a 2F2 rágcsálóantitest nehéz lánc variábilis szakaszt mutatja be. A bekeretezett területek a CDR-eket jelölik.
A 4. ábra (4. számú szekvencia) a 2F2 rágcsálóantitest könnyű lánc variábilis szakaszt mutatja be. A bekeretezett területek a CDR-eket jelölik.
Az 5. ábra (5. számú szekvencia) a 2E3 rágcsálóantitest nehéz lánc variábilis szakaszt mutatja be. A bekeretezett területek a CDR-eket jelölik.
A 6. ábra (6. számú szekvencia) a 2E3 rágcsálóantitest könnyű lánc variábilis szakaszt mutatja be. A bekeretezett területek a CDR-eket jelölik.
A 7. ábra (7-14. számú szekvencia) a 2B6, 2F2 és 2E3 rágcsálóantitestekből származó nehéz és könnyű lánc CDR-eket mutatja be.
A 8. ábra (18. számú szekvencia és 19. számú szekvencia) a 2B6 humanizált antitest nehéz lánc variábilis szakaszt mutatja be. A bekeretezett területek a CDR-eket jelölik.
A 9. ábra (20. számú szekvencia és 21. számú szekvencia) a 2B6 humanizált antitest könnyű lánc variábilis szakaszt mutatja be. A bekeretezett területek a CDR-eket jelölik.
A 10. ábra egy humanizált nehéz lánc gén emlőssejtekben történő expresszálásához alkalmazott pCDIL5HZHC1.0 plazmid diagramját mutatja be. A plazmid egy béta-laktamázgént (BÉTA LAC), egy SV-40 replikációs origót (SV-40), egy cytomegalovirus promoterszekvenciát (CMV), egy szignálszekvenciát, a humanizált nehéz láncot, egy bovin nö3
HU 222 992 Bl vekedési hormonból (BGH) származó poli-A szignált, egy béta-globin promotert (béta glopro), valamint egy másik BGH-szekvencia poli-A szignált tartalmaz egy pUC19 háttérben.
All. ábra egy humanizált nehéz lánc gén emlőssejtekben történő expresszálásához alkalmazott pCNIL5HZLC1.0 plazmid diagramját mutatja be.
A 12. ábra (61. számú szekvencia és 62. számú szekvencia) a 2B6 humanizált antitest esetén a NewM nehéz lánc variábilis szakaszt mutatja be. A bekeretezett területek a CDR-eket jelölik.
A 13. ábra (69. számú szekvencia és 70. számú szekvencia) a 2B6 humanizált antitest esetén az REI könnyű lánc variábilis szakaszt mutatja be. A bekeretezett területek a CDR-eket jelölik.
A jelen találmány olyan, különféle antitestekre, módosított antitestekre és ezek fragmentumaira vonatkozik, amelyeket humán IL-5 kötési specifitás, neutralizáló aktivitás és a humán IL-5-tel szembeni nagy affinitás jellemez, amilyen például a 2B6 rágcsáló monoklonális antitest. A találmány szerinti antitesteket hagyományos hibridómatechnikákkal, fág demonstrációs kombinációs könyvtárakkal, immunglobulin-lánckeveréssel (chain shuffiing), valamint humanizációs technikákkal állítottuk elő. A termékek felhasználhatók az IL-5-mediált rendellenességek, például az asztma terápiájában, illetve az ezek kezelésére szolgáló gyógyszerkészítményekben. A termékek ezenkívül emberekben az endogén IL-5-, illetve az aktivált sejtekből ex vivő felszabadult IL-5-mennyiségek [például ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) alkalmazásával végzett] mérése útján az IL-5-mediált állapotok diagnosztizálására is felhasználhatók.
I. Definíciók
A „módosított antitest” kifejezés egy olyan, módosított immunglobulin kódoló szakasz által kódolt proteinre vonatkozik, amelyet egy szelektált gazdasejtben történő expresszió útján nyerhetünk. Az ilyen módosított antitestek konstruált antitestek (például kiméra vagy humanizált antitestek) vagy olyan antitestfragmentumok, amelyekből teljes egészében vagy részben hiányzik egy immunglobulin konstans szakasz, például Fv, Fab vagy F(ab)2 stb.
A .módosított immunglobulin kódoló szakasz” kifejezés a találmány szerinti módosított antitestet kódoló nukleinsavszekvenciát jelöli. Amennyiben a módosított antitest egy CDR-graftolt vagy humanizált antitest, a szekvenciák, amelyek a nem humán immunglobulinból származó komplementaritást meghatározó szakaszokat (CDR-eket) kódolják, egy humán variábilis ffamework szekvenciákat tartalmazó első immunglobulin-partnerbe vannak inszertálva. Adott esetben az első immunglobulin-partner operatív módon egy második immunglobulin-partnerhez kötődik.
Az „első immunglobulin-partner” kifejezés egy olyan, humán ffamework vagy humán immunglobulin variábilis szakaszt kódoló nukleinsavszekvenciát jelöl, amelyben a natív (vagy természetes előfordulású) CDR-kódoló szakaszokat egy donorantitestnek a CDRkódoló szakaszai helyettesítenek. A humán variábilis szakasz egy immunglobulin nehéz lánc, egy immunglobulin könnyű lánc (vagy mindkettő), illetve ezeknek egy analógja vagy funkcionális fragmentuma lehet. Az antitestek (immunglobulinok) variábilis szakaszában elhelyezkedő ilyen CDR szakaszokat a szakterületen ismert eljárásokkal határozhatjuk meg. Például Kábát leírja a CDR-ek lokalizálási szabályait [Kábát et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U. S. Department of Health and Humán Services, National Institutes of Health (1987)]. Ezenkívül olyan számítógépprogramok is ismertek, amelyek alkalmasak a CDR szakaszok/struktúrák azonosítására.
A „neutralizáló” kifejezés egy olyan antitestre vonatkozik, amely gátolja az IL-5-aktivitást, egyrészt megakadályozva, hogy az IL-5 hozzákapcsolódjon a specifikus receptorához, másrészt gátolva az IL-5-nek a receptorán keresztüli szignalizációját. Egy monoklonális antitest (mAb) akkor neutralizáló, ha a B13 sejt bioassay (IL-5 neutralizációs assay, lásd: 2C. példa) során mérve 90%-os hatékonysággal, előnyösen 95%os hatékonysággal, legelőnyösebben 100%-os hatékonysággal gátolja az IL-5-aktivitást.
A „nagy affinitás” kifejezés egy olyan antitestre vonatkoztatható, amely optikai bioszenzor analízissel (lásd: 2D. példa) mérve humán IL-5 esetén legfeljebb 3,5 χ ΙΟ-11 M Kd-értékű kötési affinitással rendelkezik.
A „humán IL-5-re vonatkozó kötési specifitás” humán, nem rágcsáló-IL-5-re vonatkozó nagy affinitást jelent.
A „második immunglobulin-partner” kifejezés egy proteint vagy peptidet kódoló másik nukleotidszekvenciára vonatkozik, amelyhez az első immunglobulin-partner fúzióval vagy adott esetben konvencionális linker szekvencia segítségével (azaz operatív módon) hozzákapcsolódik. A második immunglobulin-partner előnyösen egy immunglobulingén. A második immunglobulin-partner magában foglalhat egy ugyanannak az antitestnek a teljes konstans szakaszát kódoló nukleinsavszekvenciát (homológok esetén az első és a második módosított antitest ugyanabból a forrásból származik), illetve egy további antitestnek a teljes konstans szakaszát kódoló nukleinsavszekvenciát (heterológok esetén). A második immunglobulin-partner egy immunglobulin nehéz lánc vagy könnyű lánc (vagy egyetlen peptid részeként mindkét lánc) lehet. A második immunglobulin-partner nem korlátozódik egy konkrét immunglobulin-osztályra vagy izotípusra. Ezen túlmenően a második immunglobulin-partner egy immunglobulin konstans szakasz részét (azaz egy megfelelő humán konstans szakasz vagy ffamework szakasz diszkrét részét) is tartalmazhatja, amint az például egy Fab vagy F(ab)2 esetén megtalálható. A második immunglobulin-partner továbbá magában foglalhat egy olyan szekvenciát is, amely például egy fág demonstrációs könyvtár részeként egy gazdasejt külső felületén lévő integrális membránproteint kódol, vagy egy olyan szekvenciát, amely
HU 222 992 Bl egy analitikai vagy diagnosztikai detektálási célokat szolgáló proteint, például torma-peroxidázt, β-galaktozidázt stb. kódol.
Az Fv, Fc, Fd, Fab és F(ab)2 jelöléseket a standard jelentéseiknek megfelelően használjuk [lásd például: Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)].
A jelen leírásban alkalmazott „konstruált antitest” kifejezés egy olyan, módosított antitesttípust, azaz teljes hosszában szintetikus antitestet ír le, amelyben egy kiválasztott akceptorantitest könnyű és/vagy nehéz lánc variábilis doménjeinek egy részét egy vagy több, a kiválasztott epitópra nézve specifikus donorantitestből származó analógok helyettesítik. Például az ilyen molekulák közé olyan antitestek tartozhatnak, amelyeket egy módosítatlan könnyű lánccal (vagy kiméra könnyű lánccal) társult humanizált nehéz lánc (vagy fordítva) jellemez. A konstruált antitestekre jellemző lehet az akceptorantitest könnyű és/vagy nehéz variábilis dómén framework szakaszokat kódoló nukleinsavszekvenciáknak a donorantitest kötési specifitásának visszatartása érdekében végzett módosítása is. Az ilyen antitestekben az akceptorantitestből származó egy vagy több (előnyösen valamennyi) CDR-t a fentiekben ismertetett donorantitestből származó CDR-ek helyettesítik.
A ,Jóméra antitest” kifejezés egy olyan, konstruált antitesttípust jelöl, amely egy akceptorantitestből származó könnyű és nehéz lánc konstans szakaszokkal kapcsolva egy donorantitestből származó, természetes előfordulású variábilis szakaszt (könnyű láncot és nehéz láncokat) tartalmaz.
A „humanizált antitest” kifejezés egy olyan, konstruált antitesttípust jelöl, amelynek CDR-jei egy nem humán donor-immunglobulinból származnak, a molekula további immunglobulin-eredetű részei pedig egy vagy több humán immunglobulinból származnak. Ezen túlmenően a framework támasztócsoportok is megváltoztathatók a kötési affinitás megőrzése érdekében [lásd például: Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 10029-10032 (1989); valamint Hodgson et al., Bio/Technology, 9, 421 (1991)].
A „donorantitest” kifejezés egy olyan (monoklonális vagy rekombináns) antitestet jelöl, amely a variábilis szakaszaival, CDR-jeivel vagy más funkcionális fragmentumaival, illetve ezek analógjaival oly módon járul hozzá egy első immunglobulin-partnerhez, amelynek eredményeként a módosított immunglobulin kódoló szakaszt, és így a donorantitest antigénspecifitásával és neutralizáló aktivitásával rendelkező expresszált módosított antitestet nyerjük. A találmány szerinti megoldásban történő felhasználásra alkalmas donorantitest egy 2B6 jelölésű nem humán (például rágcsáló) neutralizáló monoklonális antitest. A 2B6 antitest egy nagy affinitású, humán IL-5-specifikus (azaz a rágcsálóIL-5-öt nem felismerő), IgGj izotípusú neutralizáló antitest, amelynek a variábilis könnyű lánc DNS-e és aminosavszekvenciája - az előbbi sorrendben - a 2. számú szekvenciának és a 16. számú szekvenciának felel meg, valamint a variábilis nehéz lánc DNS-e és aminosavszekvenciája az 1. számú szekvenciának és a 15.
számú szekvenciának felel meg egy alkalmas rágcsálóIgG konstans szakaszon.
Az „akceptorantitest” kifejezés egy olyan, a donorantitesttel heterológ (monoklonális vagy rekombináns) antitestet jelöl, amely a nehéz és/vagy könnyű lánc framework szakaszait és/vagy nehéz és/vagy könnyű lánc konstans szakaszait kódoló nukleinsavszekvenciáinak egészével (vagy bármely részével, de előnyösen egészével) járul hozzá az első immunglobulin-partnerhez. Előnyösen egy humán antitest az akceptorantitest.
A „CDR-ek” egy antitestnek a komplementaritást meghatározó szakasz aminosavszekvenciáit jelölik, amelyek az immunglobulin nehéz és könnyű láncok hipervariábilis szakaszai [lásd például: Kábát et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U. S. Department of Health and Humán Services, National Institutes of Health (1987)]. Egy immunglobulinnak a variábilis részében három nehéz lánc és három könnyű lánc CDR (vagy CDR szakasz) van. Ennek megfelelően a jelen leírásban alkalmazott „CDR-ek” mindhárom nehéz lánc CDR-t vagy mindhárom könnyű lánc CDR-t (vagy megfelelő esetben valamennyi nehéz és valamennyi könnyű lánc CDR-t) jelölik.
A CDR-ek biztosítják az antitestnek az antigénhez vagy epitóphoz történő kötéséért felelős kontakt csoportok legnagyobb részét. A találmány szerinti megoldásban szereplő CDR-ek donorantitest variábilis nehéz és könnyű lánc szekvenciákból származnak, és a természetes előfordulású CDR-ek olyan analógjait foglalják magukban, amely analógok részesednek ugyanabból az antigénkötési specifitásból és/vagy neutralizáló képességből, illetve megtartják ugyanazt az antigénkötési specifitást és/vagy neutralizáló képességet, amellyel az a donorantitest rendelkezik, amelyből az analógok származnak.
„Az antigénspecifitásból vagy a neutralizáló képességből történő részesedés” kifejezés például azt jelenti, hogy bár a 2B6 monoklonális antitestre jellemző lehet bizonyos mértékű antigénaffinitás, egy 2B6 nukleinsavszekvencia által kódolt CDR-nek megfelelő környezetben kisebb vagy nagyobb aktivitása is lehet. Várható, hogy ilyen környezetben a 2B6 CDR-ek mégsem ismerik fel ugyanazokat az epitópokat, mint a 2B6. A 2B6 nehéz lánc CDR-jeinek példái közé tartozik a 7. számú szekvencia, a 8. számú szekvencia és a 9. számú szekvencia, míg a 2B6 könnyű lánc CDR-jeinek példái közé a 10. számú szekvencia, all. számú szekvencia és a 12. számú szekvencia tartozik.
Egy „funkcionális fragmentum” egy olyan, részleges nehéz vagy könnyű lánc variábilis szekvencia (amely az immunglobulin variábilis szakasz amino- vagy karboxiterminálásánál kialakított kisebb deléciók útján alakul ki), amely megtartja ugyanazt az antigénkötési specifitást és/vagy neutralizáló képességet, mint amellyel az az antitest rendelkezik, amelyből a fragmentum származik.
Egy „analóg” legalább egy aminosawal módosított aminosavszekvenciát jelöl, ahol a módosítás néhány (legfeljebb 10) aminosav olyan, kémiai vagy szubsztitúciós vagy átrendezési módosítását jelenti, amely módosítás lehetővé teszi a módosítatlan szekvencia biológiai jellemzőinek, például antigénspecifitásának és nagy af5
HU 222 992 Bl fínitásának a megtartását. Például szubsztitúcióval (csendes) mutációkat hozhatunk létre, ha a CDR-kódoló szakaszokon belül vagy azok környezetében bizonyos endonukleáz restrikciós helyeket alakítunk ki.
Analógok alléi variációk formájában is létrejöhetnek. Egy „alléi variáció vagy módosítás” a találmány szerinti aminosav- vagy peptidszekvenciákat kódoló nukleinsavszekvencia megváltoztatását jelenti. Az ilyen variációk vagy módosítások a genetikai kódban lévő degenerációnak vagy a kívánt jellemzők biztosítása érdekében végzett tudatos tervezésnek az eredményei. Az ilyen variációk, illetve módosítások vagy eredményeznek, vagy nem eredményeznek változásokat egy kódolt aminosavszekvenciában.
Az „effektorszerek” kifejezés olyan, nem protein hordozómolekulákat jelöl, amelyekhez a módosított antitestek és/vagy a donorantitest természetes vagy szintetikus könnyű vagy nehéz láncai vagy a donorantitest más fragmentumai hagyományos módszerekkel hozzákapcsolhatók. Az ilyen nem protein hordozók közé tartoznak a diagnosztika területén szokásosan alkalmazott hordozók, például polisztirol- vagy más műanyag gyöngyök, poliszacharidok, így a BIAcore (Pharmacia) rendszerben használtak, illetve a gyógyászat területén alkalmazott és az embereknek vagy állatoknak történő beadás szempontjából biztonságos más nem protein anyagok. A további effektorszerek közé tartozhatnak a nehézfématomokkal történő kelátképzésre alkalmas makrociklusok, illetve a radioizotópok. Az effektorszerek, például a polietilénglikol, felhasználhatók a módosított antitestek felezési idejének a meghosszabbítására is.
II. Nagy affinitása IL-5 monoklonális antitestek
A találmány szerinti antitestek, módosított antitestek és fragmentumok kialakításában történő felhasználáshoz egy nem humán [például szarvasmarha, birka, majom, csirke, rágcsáló (egér és patkány)] speciest alkalmazhatunk a natív humán IL-5-tel vagy egy ebből származó peptid epitóppal kapcsolatos kívánt immunglobulin létrehozásához. Egy, az IL-5-höz egy nem humán monoklonális antitestet szekretáló hibridóma sejtvonal kialakításához hagyományos hibridómatechnikákat alkalmazunk. Az ilyen hibridómákat ezt követően 96 vájatú lemezekre felkent IL-5 alkalmazásával (a Példák fejezetben ismertetetteknek megfelelően), illetve egy másik megoldás értelmében egy streptavidinbevonatú lemezhez kötött biotinilezett IL-5-tel a kötésre nézve szkrineljük.
Az egyik példaszerű megoldás szerint a találmány szerinti nagy affinitású, neutralizáló monoklonális antitest egy 2B6 mAb rágcsálóantitest, amelyet felhasználhatunk egy kiméra vagy humanizált antitest kifejlesztésére (ennek részletes leírása az alábbi 1. példában található). A 2B6 mAb-t az IL-5 esetén 3,5 xlO”11 M-nál kisebb (körülbelül 2,2 xlO-11 M) Kd-értékű humán IL-5 antigénkötési specifitás jellemzi. Egy 2B6-ból származó Fab-fragmentum (lásd a 3H. példát) IL-5-re vonatkozó Kd-értéke optikai bioszenzorral mérve körülbelül 9 χ ΙΟ-11 M. Úgy tűnik, hogy a 2B6 mAb a humán IL-5 és a humán IL-5 receptor α-lánca közötti kötési kölcsönhatást blokkolja.
Egy másik előnyös donorantitest a 2E3 rágcsálómAb. Ez a monoklonális antitest IgG2a izotípus, és hIL-5 disszociációs állandója 3,5 χ IO-11 Μ-nál kisebb (körülbelül 2,0 χ 10-n M).
Egy további előnyös donorantitest a 4A6 patkánymAb. Ez a monoklonális antitest 3,5 χ 10-n Μ-nál kisebb (körülbelül 1,8χ10~π M) disszociációs állandóval rendelkezik hIL-5 esetén. Úgy tűnik, hogy a 4A6 mAb a humán IL-5 és a humán IL-5 β-lánca közötti kötési kölcsönhatást blokkolja.
A jelen találmány nem korlátozódik a 2B6 mAb, a 2E3 mAb vagy hipervariábilis (azaz CDR) szekvenciáinak az alkalmazására. Az említettek bármely olyan, megfelelően nagy affinitású IL-5 antitesttel helyettesíthetők, amely a humán IL-5 és a megfelelő antiIL-5 CDR-ek esetén legfeljebb 3,5 xlO-11 M értékű disszociációs állandóval rendelkezik. Ha az alábbi leírásban bárhol a donorantitestet 2B6 vagy 2E3 jelöléssel azonosítjuk, ez a jelölés csak a leírás illusztrálására és egyszerűsítésére szolgál.
III. Antitestfragmentumok
A jelen találmány magában foglalja a humán IL-5 ellen irányuló monoklonális antitestekből származó Fabfragmentumok vagy F(ab)2-fragmentumok felhasználását is. Ezeket a fragmentumokat in vivő az IL-5-tel és az eozinofilmediált állapotokkal szembeni védőszerekként, illetve in vitro egy IL-5 diagnosztikum részeként alkalmazhatjuk. Egy Fab-fragmentum a teljes könnyű láncot és a nehéz lánc aminoterminális részét tartalmazza; egy F(ab)2-fragmentum a díszulfidhidakkal kötött két Fabfragmentum által képezett fragmentum. A 2B6,2E3 monoklonális antitestek és más hasonló, nagy affinitású, IL-5-kötő antitestek a Fab-fragmentumok és a F(ab)2ffagmentumok forrásaként szolgálnak. A fragmentumokat hagyományos módszerek alkalmazásával, például a monoklonális antitestnek a megfelelő proteolitikus enzimekkel, papainnal és/vagy pepszinnel végzett hasításával, illetve rekombináns módszerek felhasználásával nyerhetjük. A Fab- és F(ab)2-fragmentumokat önmagukban is felhasználhatjuk terápiás, profilaktikus vagy diagnosztikai szerekként, illetve a találmány szerinti rekombináns vagy humanizált antitestek kialakítására felhasználható szekvenciák, köztük a variábilis szakaszok és a CDR szekvenciák donoqaiként.
A Fab- és F(ab)2-fragmentumokat kombinációs fág könyvtár [lásd például: Winter et al., Ann. Rév. Immunoi., 12, 433-455 (1994)] vagy immunglobulin-lánckeverés [lásd például: Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783 (1992)] alkalmazásával állíthatjuk elő, ahol az új Fab-ok kialakításához egy kiválasztott (például 2B6) antitestből származó Fd vagy VH immunglobulint a könnyű láncú immunglobulinok [VL (vagy VK)] széles körével társítunk. Az új Fab-ok kialakításához egy kiválasztott antitestből származó könnyű láncú immunglobulint viszont nehéz láncú immunglobulinok [VH (vagy Fd)] széles körével társíthatunk. Neutralizáló IL-5 Fab-okat akkor nyertünk, ha a 2B6 monoklonális antitest Fd-jét könnyű láncú immunglobulinok széles körével társítottuk (ennek részleteit a Példák fejezetben ismertetjük). Ennek eredményeként lehetőség nyílik
HU 222 992 Bl arra, hogy a lánckeverési technika alkalmazása esetén egyedi (nukleotid- és aminosav-) szekvenciákkal rendelkező neutralizáló Fab-okat nyeljünk ki.
IV. Lényeges anti-IL-5 aminosav- és nukleotidszekvenciák
A 2B6 monoklonális antitest vagy más, a fentiekben ismertetett antitest hozzájárulhat azokhoz a szekvenciákhoz, például variábilis nehéz és/vagy könnyű lánc peptidszekvenciákhoz, ffamework szekvenciákhoz, CDR szekvenciákhoz, funkcionális fragmentumokhoz és ezek analógjaihoz, valamint a kódoló nukleinsavszekvenciákhoz, amelyek felhasználhatók különféle olyan, módosított antitestek tervezésére és előállítására, amelyeket a donorantitest antigénkötési specifitása jellemez.
Például a találmány szerinti megoldás az IL-5 2B6 rágcsálóantitestből származó variábilis könnyű lánc és variábilis nehéz lánc szekvenciákat, illetve az ezekből származó szekvenciákat biztosít. A 2B6 nehéz lánc variábilis szakaszát az 1. ábra mutatja be. A CDR-kódoló szakaszokat a bekeretezett területekkel jelöljük, illetve a 7. számú szekvencia, 8. számú szekvencia és 9. számú szekvencia formájában ismertetjük. A 2B6 könnyű lánc klón variábilis szakaszát a 2. ábra mutatja be. A CDR-kódoló szakaszokat a 10. számú szekvencia, 11. számú szekvencia és 12. számú szekvencia formájában adjuk meg.
A 8. ábra (18. és 19. számú szekvencia) egy humanizált nehéz lánc variábilis szakaszt mutat be. A szignálszekvenciát a 17. számú szekvencia formájában is megadjuk. A példaszerűen bemutatott szignálszekvenciákat más alkalmas, az ezen a területen jártas szakember számára ismert szignálszekvenciákkal is helyettesíthetjük. A konstrukció CDR aminosavszekvenciái azonosak a natív rágcsáló és kiméra nehéz lánc CDR-ekével; a szekvenciákat a 7. számú szekvencia, a 8. számú szekvencia és a 9. számú szekvencia ismerteti. A 9. ábra (20. és 21. számú szekvencia) egy példaszerű (szintetikus) humanizált könnyű lánc variábilis szekvenciát mutat be.
A variábilis könnyű lánc és nehéz lánc peptidszekvenciákat kódoló találmány szerinti nukleinsavszekvenciákat vagy ezek fragmentumait felhasználhatjuk specifikus változásoknak a CDR-eket vagy a framework szakaszokat kódoló nukleinsavszekvenciákba történő mutagén bevezetésére vagy a kapott módosított vagy fúziós nukleinsavszekvenciának egy expressziós plazmidba történő beépítésére is. Például a framework és CDR-kódoló szakaszok nukleotidszekvenciájában végzett csendes szubsztitúciókat alkalmaztunk olyan restrikciós enzimhelyek kialakítására, amelyek elősegítették a mutagenizált CDR (és/vagy framework) szakaszok inszercióját. Ezeket a CDR-kódoló szakaszokat használtuk egy találmány szerinti humanizált antitest összeállítására.
A genetikai kód degenerációjának figyelembevételével különféle kódolószekvenciákat konstruálhatunk, amelyek az olyan, találmány szerinti variábilis könnyű és nehéz lánc aminosavszekvenciákat és CDR szekvenciákat, valamint ezek funkcionális fragmentumait és analógjait kódolják, amelyek részesednek a donorantitest antigénspecifításából. A variábilis lánc peptidszekvenciákat vagy CDR-eket kódoló találmány szerinti izolált nukleinsavszekvenciákat vagy ezek fragmentumait egy második immunglobulin-partnerrel operatív módon történő kombinálással felhasználhatjuk módosított antitestek, például kiméra vagy humanizált antitestek, illetve más találmány szerinti konstruált antitestek előállítására.
Meg kívánjuk jegyezni, hogy a módosított antitest és a jelen leírásban ismertetett antitestek részeit kódoló izolált nukleinsavszekvenciákon kívül más nukleinsavszekvenciák is a találmány oltalmi körébe tartoznak. Ilyenek például azok a nukleinsavszekvenciák, amelyek a natív CDR-kódoló szekvenciák komplementerei vagy a CDR-kódoló szakaszokat körülvevő módosított humán framework szakaszok komplementerei. A felhasználható DNS-szekvenciák közé tartoznak például azok a szekvenciák, amelyek szigorú hibridizációs körülmények között a DNS-szekvenciákká hibridizálnak [lásd például: T. Maniatis etal., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), 387-389]. Az ilyen szigorú hibridizációs körülmények egyik példája szerint a hibridizációt 4XSSC mellett 65 °C hőmérsékleten végezzük, majd 0,lXSSC-ben 65 °C hőmérsékleten egyórás mosást végzünk. Egy másik megoldás értelmében a szigorú hibridizációs körülmények 50%-os formamidot, 4XSSC-t és 42 °C-os hőmérsékletet jelentenek. Előnyösen a hibridizáló DNSszekvenciák legalább 18 nukleotid hosszúságúak, azaz körülbelül azonosak egy CDR méretével.
V. Módosított immunglobulin-molekulák és módosított antitestek
A módosított immunglobulin-molekulák módosított antitesteket kódolhatnak, amelyek közé konstruált antitestek, például kiméra antitestek és humanizált antitestek tartoznak. Egy kívánt módosított immunglobulin kódoló szakasz tartalmazza azokat a CDR-kódoló régiókat, amelyek egy IL-5 antitestnek, előnyösen egy nagy affinitású antitestnek, előnyösen egy találmány szerinti antitestnek az antigénspecifitásával rendelkező, egy első immunglobulin-partnerbe (egy humán framework vagy humán immunglobulin variábilis szakaszba) inszertált pepiidet kódolnak.
Előnyösen az első immunglobulin-partner operatív módon egy második immunglobulin-partnerhez kapcsolódik. A második immunglobulin-partner a fentiekben meghatározott, és magában foglalhat egy második antitestszakaszt, például egy Fc szakaszt kódoló szekvenciát. A második immunglobulin-partnerek magukban foglalhatnak egy másik olyan immunglobulint kódoló szekvenciákat is, amelyhez a könnyű vagy nehéz lánc konstans szakasz egy keretben vagy egy linker szekvencia segítségével hozzákapcsolódik. Az IL-5 funkcionális fragmentumai vagy analógjai ellen irányuló mesterséges antitesteket úgy tervezhetjük, hogy azok ugyanazzal az antitesttel fokozott kötést nyújtsanak.
A második immunglobulin-partnert olyan, a fentiekben meghatározott effektorszerekkel, köztük nem protein hordozómolekulákkal is társíthatjuk, amelyekhez a második immunglobulin-partnert szokásos eszközökkel operatív módon kapcsolhatjuk.
HU 222 992 Bl
A második immunglobulin-partnerek, például antitestszekvenciák és az effektorszer közötti fúziót vagy kötést bármely alkalmas eszközzel, például hagyományos kovalens vagy ionos kötésekkel, proteinfúzióval vagy heterobifunkciós térhálósító szerekkel, például karbodiimiddel, glutáraldehiddel stb. kialakíthatjuk. Az ilyen technikák a szakterületen jól ismertek, és leírásuk megtalálható az általánosan használt kémiai és biokémiai kézikönyvekben.
Ezen túlmenően a módosított immunglobulin kódoló szakaszba beépíthetünk szokásos linker szekvenciákat is, amelyek egyszerűen biztosítják a második immunglobulin-partner és az effektorszer közötti kívánt tértávolságot. Az ilyen linkerek tervezése az ezen a területen jártas szakember számára jól ismert.
Az expresszió fokozása érdekében a találmány szerinti molekulák esetén a szignálszekvenciákat is módosíthatjuk. Például a rágcsáló nehéz lánc szekvenciából származó szignálszekvenciával és CDR-ekkel rendelkező 2B6 humanizált antitestben az eredeti szignálpeptidet egy másik szignálszekvenciával (17. számú szekvencia) helyettesítettük.
Az egyik módosított antitest a 2B6 monoklonális antitestnek az antigénspecifitásával rendelkező variábilis nehéz és/vagy könnyű lánc peptid vagy protein szekvenciát tartalmaz (például a VH és VL láncokat tartalmazza). Egy másik előnyös találmány szerinti módosított antitestre az jellemző, hogy az aminosavszekvencia a 2B6 rágcsálóantitest-molekula könnyű és/vagy nehéz láncainak a variábilis szakaszához tartozó legalább egy, előnyösen valamennyi CDR-t tartalmazza, míg a további szekvenciák egy humán forrásból vagy ennek egy funkcionális fragmentumából vagy analógjából származnak. Lásd például a humanizált VH és VL szakaszokat (8. és 9. ábra).
Egy másik megoldás értelmében a találmány szerinti konstruált antitesthez egy további ágens kapcsolódhat. Például a rekombináns DNS technológiai eljárást alkalmazhatjuk egy olyan találmány szerinti konstruált antitest előállításához, amelyben egy komplett antitestmolekulának az Fc fragmentumát vagy CH2 CH3 doménjét egy enzimmel vagy más detektálható molekulával (azaz egy polipeptideffektoiral vagy riportermolekulával) helyettesítettük.
A második immunglobulin-partnert operatív módon egy, a rágcsáló 2B6 antigénspecifitásával rendelkező CDR-tartalmú szekvenciával heterológ nem immunglobulin peptidhez, proteinhez vagy ennek egy fragmentumához is hozzákapcsolhatjuk. Az így nyert protein az expressziót követően egyidejűleg mutathatja az anti-IL-5 antigénspecifitást és a nem immunglobulin jellemzőket. A fúziós partnerre jellemző például egy funkcionális jellemző, így egy másik kötési vagy receptordomén, illetve ha a fúziós partner önmagában egy terápiás protein, egy terápiás jellemző, vagy egy vagy több további antigén jellemző lehet.
Egy másik előnyös találmány szerinti protein egy olyan, komplett antitestmolekulát tartalmazhat, amely teljes hosszúságú nehéz és könnyű láncokkal vagy ezek bármely diszkrét fragmentumával, például a Fab- vagy
F(ab’)2-fragmentumokkal, egy nehéz lánc dimerrel vagy ennek bármely minimális rekombináns fragmentumaival, például egy Fv-vel, vagy egy egyláncú antitesttel (single-chain antibody, SCA) rendelkezik, vagy bármely más olyan molekulát tartalmazhat, amelynek ugyanolyan specifitása van, mint a kiválasztott donor monoklonális antitestnek, például a 2B6 vagy a 2E3 monoklonális antitestnek. Az ilyen proteint egy módosított antitest formájában alkalmazhatjuk, illetve felhasználhatjuk fuzionálatlan formájában is.
Amikor a második immunglobulin-partner egy, a donorantitesttől eltérő antitestből, például az immunglobulin framework vagy konstans szakaszok bármely izotípusából vagy osztályából származik, egy konstruált antitest képződik. A konstruált antitestek egyetlen forrásból, például az akceptorantitestből származó immunglobulin (lg) konstans szakaszokat és variábilis framework szakaszokat, valamint a donorantitestből, például a jelen leírásban ismertetett anti-IL-5 antitestből származó egy vagy több CDR-t tartalmazhat (előnyösen valamennyi CDR-t tartalmazza). A donorantitest antigénkötési specifitás megtartása érdekében ezenkívül a nukleinsav- vagy aminosavszinten az akceptor monoklonális antitest könnyű és/vagy nehéz variábilis dómén framework szakasz, illetve a donor CDR szakasz módosításai, például deléciói, szubsztitúciói vagy addíciói is elvégezhetők.
Az ilyen konstruált antitesteket az (adott esetben módosított) IL-5 monoklonális antitest variábilis nehéz és/vagy könnyű láncai egyikének vagy mindegyikének, illetve egy vagy több, az alábbiakban azonosított nehéz vagy könnyű lánc CDR felhasználásával tervezzük (lásd még a 7. ábrát). A találmány szerinti konstruált antitestek neutralizálóak, azaz az ilyen antitestek kívánatos módon blokkolják az IL-5 protein receptorához történő kötődést, és ugyancsak blokkolják vagy gátolják az IL-5-függő sejtek proliferációját.
Az ilyen konstruált antitestek magukban foglalhatnak egy olyan, humanizált antitestet, amely egy kiválasztott humán immunglobulin vagy altípus framework régióit tartalmazza, illetve egy olyan kiméra antitestet, amely az IL-5 antitest funkcionális fragmentumokhoz kapcsolódó humán nehéz és könnyű lánc konstans szakaszokat tartalmazza. Egy alkalmas humán (vagy más állati) akceptorantitestet a donorantitest nukleotid- és aminosavszekvenciájához viszonyított homológia alapján egy hagyományos adatbázisból, például a KÁBÁT® adatbázisból, a Los Alamos adatbázisból vagy a Swiss Protein adatbázisból választhatunk ki. Egy, a donorantitest framework szakaszaival (az aminosavak alapján) homológ humán antitest alkalmas lehet arra, hogy biztosítson egy megfelelő nehéz lánc konstans szakaszt és/vagy egy nehéz lánc variábilis framework szakaszt a donor CDR-ek inszerciójához. A könnyű lánc konstans szakasz vagy variábilis framework szakaszok biztosítására alkalmas akceptorantitestek hasonló módon választhatók ki. Hangsúlyozni kívánjuk, hogy az akceptorantitest nehéz és könnyű láncainak nem kell szükségszerűen ugyanabból az akceptorantitestből származniuk.
A heterológ framework és konstans szakaszokat humán immunglobulin-osztályokból és izotípusokból vá8
HU 222 992 Bl lasztjuk ki, amilyen például az IgG (1-4 szubtípusok), az IgM, az IgA és az IgE. Ugyanakkor azonban az akceptorantitest nem csak humán immunglobulin protein szekvenciákból állhat. Például előállítható egy olyan gén is, amelyben egy humán immunglobulinláncnak egy részét kódoló DNS-szekvencia egy olyan DNSszekvenciához kapcsolódik, amely egy nem immunglobulin aminosavszekvenciát, például egy polipeptideffektort vagy riportermolekulát kódol.
Egy különösen előnyös humanizált antitest például egy kiválasztott humán antitestszekvenciának a framework szakaszaira inszertált 2B6 CDR-eket tartalmaz. Neutralizáló humanizált antitestek esetén a kiválasztott humán antitestszekvenciának a framework szakaszaiba az IL-5 antitest nehéz lánc és/vagy könnyű lánc variábilis szakaszaiból származó egy, kettő vagy előnyösen három CDR van inszertálva, ahol az egy, kettő vagy három CDR a kiválasztott humán antitest natív CDR-jeit helyettesíti.
Egy humanizált antitestben a humán nehéz és könnyű láncok mindegyikében a variábilis doméneket egy vagy több CDR-helyettesítéssel konstruáltuk meg. Lehetőség van mind a hat CDR, illetve hatnál kevesebb CDR esetén különféle kombinációk alkalmazására. Előnyösen mind a hat CDR-t kicseréljük. Arra is mód van, hogy csak a humán nehéz láncban lévő CDR-eket helyettesítsük, miközben könnyű láncként a humán akceptorantitestből származó módosítatlan könnyű láncot alkalmazzuk. Egy alternatív megoldás értelmében a szokásos antitest adatbázisok igénybevételével egy másik humán antitestből választhatunk ki egy kompatibilis könnyű láncot. A konstruált antitest további része bármely alkalmas akceptor humán immunglobulinból származhat.
A konstruált humanizált antitest előnyösen tehát egy természetes humán antitestnek vagy ennek egy fragmentumának a szerkezetével és ezzel egyidejűleg azon tulajdonságoknak a kombinációjával rendelkezik, amelyek a hatásos gyógyászati felhasználáshoz, például emberekben az IL-5-mediált gyulladásos betegségek kezeléséhez, illetve a diagnosztikai alkalmazásokhoz szükségesek.
Egy másik példa szerint egy konstruált antitest a 2E3 variábilis könnyű lánc szakaszának három CDR-jét (10., 11. és 13. számú szekvencia), valamint a 2B6 variábilis nehéz lánc szakaszának három CDR-jét (7., 8. és 9. számú szekvencia) tartalmazhatja. Az így nyert humanizált antitestnek ugyanolyan antigénkötési specifitással és nagy affinitással kell rendelkeznie, mint amilyennel a 2B6 monoklonális antitest rendelkezik.
Az ezen a területen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy egy konstruált antitestet a variábilis doménben lévő aminosavak változtatásával tovább módosíthatunk anélkül, hogy a donorantitestnek a specifitása és nagy affinitása szükségszerűen károsodna (ebben az esetben tehát egy analógot nyerünk). Valószínűsíthető, hogy a nehéz és könnyű lánc aminosavak a variábilis dómén frameworkökben és/vagy a CDR-ekben más aminosavakkal helyettesíthetők.
Ezenkívül a találmány szerinti molekulák szelektív jellemzőinek fokozása vagy csökkentése érdekében a konstans szakasz is megváltoztatható {például dimerizáció, az Fc receptorokhoz történő kötés vagy komplementer kötési és aktiválási képesség [lásd például: Angal et al., Mól. Immunoi., 30, 105-108 (1993); Xu et al., J. Bioi. Chem., 269, 3469-3474 (1994); valamint a 307,434-B számú európai szabadalmi leírás]}.
Egy módosított antitest, amely egy kiméra antitest, a fentiekben ismertetett humanizált antitestektől abban tér el, hogy tartalmazza a teljes nem humán donorantitest nehéz lánc és könnyű lánc variábilis szakaszokat, köztük a framework szakaszokat, mindkét lánc esetén a humán immunglobulin konstans szakaszokkal társítva. Feltételezhető, hogy azok a kiméra antitestek, amelyek a találmány szerinti humanizált antitestekhez képest további nem humán szekvenciát is tartalmaznak, emberekben szignifikáns immunválaszt válthatnak ki.
Az ilyen antitestek (az alábbiakban részletesen tárgyaltaknak megfelelően) jól alkalmazhatók az IL-5mediált rendellenességek megelőzésére és kezelésére.
VL A módosított antitestek és a konstruált antitestek előállítása
A 2B6 monoklonális antitestnek vagy más alkalmas donor monoklonális antitesteknek (például 2E3, 2F2, 4A6 stb.) a variábilis könnyű és/vagy nehéz lánc szekvenciáit és CDR-jeit, valamint az ezeket kódoló nukleinsavszekvenciákat előnyösen a találmány szerinti módosított antitesteknek, előnyösen humanizált antitesteknek a következő eljárás alkalmazásával végzett összeállítására használhatjuk fel. Más találmány szerinti megoldások kidolgozásához is alkalmazhatunk ugyanilyen vagy hasonló technikákat.
Egy kiválasztott donor monoklonális antitestet, például egy 2B6 rágcsálóantitestet termelő hibridóma hagyományos módon klónozott, és a hibridóma nehéz és könnyű lánc variábilis szakaszok DNS-ét az ezen a területen jártas szakember számára ismert, például a Sambrook által ismertetett [Sambrook et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)] technikák alkalmazásával állíthatjuk elő. A 2B6-nak a legalább a CDR-kódoló szakaszokat és az akceptor monoklonális antitest könnyű és/vagy nehéz variábilis dómén framework szakaszoknak a donor monoklonális antitest kötési specifitásának megtartásához szükséges részeit tartalmazó variábilis nehéz és könnyű szakaszait, valamint a humán immunglobulinból származó antitestlánc további immunglobulineredetű részeit polinukleotid primerek és reverz transzkriptáz alkalmazásával állítjuk elő. A CDR-kódoló szakaszokat egy ismert adatbázis alkalmazásával és más antitestekkel történő összehasonlítással azonosítjuk.
Ezt követően előállíthatunk egy egér/humán kiméra antitestet, amelyet a kötésképességre nézve vizsgálhatunk. Egy ilyen kiméra antitest a teljes nem humán donorantitest VH és VL szakaszokat tartalmazza, mindkét lánc esetén a humán lg konstans szakaszokkal társítva.
Egy humán antitestből származó nehéz lánc variábilis szakasz homológ framework szakaszait számítógépes adatbázisok, például a KÁBÁT® adatbázis alkalmazásával azonosítottuk, míg akceptorantitestként egy, a 2B6-tal homológ humán antitestet választottunk. A hu9
HU 222 992 Bl mán antitest framework szakaszokon belül a 2B6 CDRkódoló szakaszokat tartalmazó szintetikus nehéz lánc variábilis szakaszok szekvenciáit a restrikciós helyek beépítéséhez opcionális nukleotidhelyettesítéssel terveztük. A tervezett szekvenciát ezt követően hosszú szintetikus oligomerek alkalmazásával szintetizáltuk. Alternatív módon a tervezett szekvenciát polimeráz-láncreakcióval (PCR) kiteqesztett (amplifikált) és korrigált átlapoló oligonukleotidokkal is szintetizálhatjuk.
Hasonló módon terveztünk meg egy alkalmas könnyű lánc variábilis szakaszt is.
Egy humanizált antitestet származtathatunk a kiméra antitestből, illetve előnyösen szintetikus úton állíthatjuk elő, amelynek során a donor monoklonális antitestnek a nehéz és könnyű láncokból származó CDRkódoló szakaszait megfelelő módon a kiválasztott nehéz és könnyű lánc frameworkbe inszertáljuk. Egy másik megoldás értelmében egy találmány szerinti humanizált antitestet standard mutagenezistechnikák alkalmazásával állíthatunk elő. A kapott humanizált antitest humán framework szakaszokat és donor monoklonális antitest CDR-kódoló szakaszokat tartalmaz. Az így nyert humanizált antitest rekombináns gazdasejtekben, például COS-, CHO- vagy myelomasejtekben expresszálható. Ennek a technikának az alkalmazásával más humanizált antitesteket is előállíthatunk egyéb alkalmas IL-5-specifikus, neutralizáló, nagy affinitású, nem humán antitesteken.
Egy hagyományos expressziós vektort vagy rekombináns plazmidot úgy állítunk elő, hogy ezeket a módosított antitest számára szolgáló kódolószekvenciákat operatív kapcsolatba hozzuk a gazdasejtben történő replikáció és expresszió, illetve a gazdasejtből történő szekréció szabályozására alkalmas hagyományos regulátor kontrollszekvenciákkal. A regulátorszekvenciák promoterszekvenciákat, például CMV promotert, és szignálszekvenciákat tartalmaznak, amelyek más ismert antitestekből is származhatnak. Hasonló módon állíthatunk elő egy olyan második expressziós vektort is, amely egy komplementer antitest könnyű vagy nehéz láncot kódoló DNS-szekvenciával rendelkezik. Előnyösen ez a második expressziós vektor azonos az elsővel, kivéve azt, hogy a kódolószekvenciák és a választható markerek olyanok, amelyek a lehető legjobban biztosítják, hogy valamennyi polipeptidlánc funkcionálisan expresszálódjon. Egy másik megoldás értelmében a módosított antitest számára szolgáló nehéz és könnyű lánc kódoló szekvenciák egyetlen vektoron helyezkedhetnek el.
Egy kiválasztott gazdasejtet hagyományos technikák útján az első és a második vektorral kotranszfektáljuk (vagy egyszerűen egyetlen vektorral transzfektáljuk), és így kialakítjuk az olyan találmány szerinti transzfektált gazdasejtet, amely a rekombináns vagy szintetikus könnyű és nehéz láncok mindegyikét tartalmazza. A találmány szerinti konstruált antitest termeléséhez ezt követően a transzfektált sejtet szokásos technikák alkalmazásával tenyésztjük. A rekombináns nehéz lánc és/vagy könnyű lánc asszociátumát tartalmazó humanizált antitestet megfelelő vizsgálati módszerek, például ELISA vagy RIA alkalmazásával a tenyészetből szkríneljük. Hasonló szokásos technikákat alkalmazhatunk más találmány szerinti módosított antitestek és molekulák előállításához is.
A találmány szerinti eljárásokban és a találmány szerinti kompozíciók konstrukciójához alkalmazott klónozási és szubklónozási lépések szempontjából alkalmas vektorokat az ezen a területen jártas szakember egyszerűen ki tudja választani. Például a klónozóvektorok hagyományos pUC-sorozatait használhatjuk. Az egyik alkalmazott vektor a pUC19, amelyet többféle kereskedelmi forrásból [például Amersham (Buckinghamshire, NagyBritannia) vagy Pharmacia (Uppsala, Svédország)] is beszerezhetünk. Ezenkívül a klónozáshoz bármely olyan vektort felhasználhatunk, amely alkalmas a könnyű replikációra, nagyszámú klónozóhellyel és (például az antibiotikumrezisztencia szempontjából) számos szelektálható génnel rendelkezik, továbbá amely egyszerűen manipulálható. A klónozóvektor megválasztása nem korlátozza a találmány oltalmi körét, illetve teqedelmét
A találmány szerinti konstruált antitestek expressziójához alkalmazott vektorokat az ezen a területen jártas szakember hasonló módon ki tudja választani bármely hagyományos vektorból. A vektorok ugyancsak tartalmaznak olyan szelektált regulátorszekvenciákat (például CMV promotereket), amelyek a szelektált gazdasejtekben irányítják a heterológ DNS-szekvenciák replikációját és expresszióját. A vektorok tartalmazzák azokat a fentiekben ismertetett DNS-szekvenciákat is, amelyek a konstruált antitestet vagy a módosított immunglobulin kódoló szakaszt kódolják. Ezenkívül a vektorokba az egyszerű manipulációhoz szükséges restrikciós helyek inszerciójával módosított szelektált immunglobulin-szekvenciák is beépíthetők.
Az expressziós vektorok a heterológ DNS-szekvenciák expressziójának felerősítésére (amplifikálására) alkalmas génekkel is jellemezhetők, amilyen például az emlős dihidrofolát-reduktáz-gén (DHFR). A további előnyös vektorszekvenciák közé tartozik egy poli-A szignálszekvencia, például egy borjú növekedési hormonból (BGH) származó poli-A szignálszekvencia, valamint a béta-globin promoterszekvencia (betaglopro). A találmány szerinti megoldásban felhasználható expressziós vektorokat az ezen a területen jártas szakember számára jól ismert technikák alkalmazásával szintetizálhatjuk.
Az ilyen vektorok komponenseit, például replikonjait, szelekciós génjeit, hatásfokozóit, promotereit, szignálszekvenciáit stb. a kereskedelemből szerezhetjük be vagy természetes forrásokból nyerhetjük, illetve a rekombináns DNS-nek egy kiválasztott gazdaszervezetben történő termelése során az expresszió és/vagy a szekréció irányítására alkalmazott ismert eljárások útján szintetizálhatjuk. Erre a célra számos más, az emlős-, bakteriális, rovar-, élesztő- és fungalis expresszió számára alkalmas, a szakterületen jól ismert expressziós vektort is választhatunk.
Ugyancsak jelen találmány tárgyát képezi egy, a konstruált antitesteknek vagy ezek módosított immunglobulin-molekuláinak a kódolószekvenciáit tartalmazó rekombináns plazmiddal transzfektált sejtvonal. A klónozóvektorok klónozására és más manipulációira fel10
HU 222 992 Bl használható gazdasejtek szintén szokásos sejtek. Legelőnyösebben azonban különféle Escherichia coli törzsekből származó sejteket használunk a klónozóvektorok replikációjára és a találmány szerinti módosított antitestek összeállításának további lépéseiben.
A találmány szerinti konstruált antitest vagy módosított antitest expresszálására szolgáló alkalmas gazdasejtek vagy sejtvonalak előnyösen emlőssejtek, például CHO-, COS-, fibroblaszt sejtek (például 3T3 sejt) és myeloid sejtek, még előnyösebben egy CHO- vagy egy myeloid sejt. Humán sejteket is felhasználhatunk, és így a humán glikozilezési jellemzőkkel módosított molekulát állíthatjuk elő. Egy másik megoldás értelmében egyéb eukarióta sejtvonalakat is használhatunk. Az alkalmas emlősgazdasejtek kiválasztása, valamint a transzformációs, tenyésztési, amplifikálási, szkrínelési és termék-előállítási, illetve terméktisztítási eljárások a szakterületen jól ismertek [lásd például: Sambrook et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)].
A bakteriális sejtek jól használható, a találmány szerinti rekombináns Fab-ok expresszálására alkalmas gazdasejtek lehetnek [lásd például: Plückthun, A., Immunoi. Rév., 130, 151-180 (1992)]. Azonban tekintettel arra, hogy a bakteriális sejtekben expresszált proteinek igen hajlamosak arra, hogy redőzetlen vagy nem kellőképpen redőzött formában, illetve nem glikozilezett formában jelenjenek meg, valamennyi bakteriális sejtben termelt rekombináns Fab esetén meg kell vizsgálni, hogy a rekombináns Fab megtartotta-e az antigénkötő képességét. Amennyiben a bakteriális sejt által expresszált molekula megfelelően redőzött formában termelődött, a bakteriális sejt alkalmas a gazdasejtként történő felhasználásra. Például a biotechnológia területén különféle Escherichia coli törzsek jól ismert expressziós gazdasejtek. Az eljárásban különféle B. subtilis, Streptomyces, más bacillus stb. törzseket is felhasználhatunk.
Kívánt esetben gazdasejtekként az ezen a területen jártas szakember számára jól ismert élesztőtörzsek sejtjeit, valamint rovarsejteket, például Drosophila és Lepidoptera sejteket, illetve víruseredetű expressziós rendszereket is alkalmazhatunk [lásd például: Miller et al., Genetic Engineering, 8, 277-298 (1986) Plenum Press, valamint a közleményben szereplő hivatkozások].
A találmány szerinti vektorok összeállítására szolgáló általános eljárások, a találmány szerinti gazdasejtek előállításához szükséges transzfekciós eljárások, valamint a találmány szerinti módosított antitestnek az ilyen gazdasejtekből történő előállításához szükséges eljárások kivétel nélkül hagyományosan alkalmazott technikák. Az ily módon előállított találmány szerinti módosított antitesteket hasonló módon, a szakterületen alkalmazott standard módszereknek megfelelően tisztíthatjuk a sejttenyészet-tartalomból, amelyek során például ammónium-szulfátos kicsapást, affinitáskromatográfiás oszlopokat, oszlopkromatográfiát, gélelektroforézist és más ezekhez hasonló eszközöket használhatunk. Ezek a módszerek a szakember ismeretanyagának részét képezik, a találmány oltalmi körét, illetve teqedelmét nem korlátozzák.
A humanizált antitestek expresszálásának egy további eljárása során az expresszió egy transzgenikus állatban történik, például annak megfelelően, ahogyan az a 4 873 316 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetésre került. Az eljárás egy, az állat kazein promoterét felhasználó olyan expressziós rendszerre vonatkozik, amelyet ha transzgenikus úton beépítünk egy emlősbe, lehetővé teszi, hogy a nőstény az anyatejében termelje a kívánt rekombináns proteint.
Az előnyös eljárással expresszált konstruált antitestet egy megfelelő teszt alkalmazásával vizsgálhatjuk az in vitro aktivitásra nézve. A konstruált antitest IL-5höz történő kötődésének minőségi és mennyiségi értékeléséhez általában szokásos ELISA vizsgálatokat használunk. A neutralizáló hatékonyság igazolásához ezenkívül más in vitro teszteket is alkalmazhatunk, majd ezt követően humán klinikai vizsgálatokat végezhetünk annak értékelése érdekében, hogy a testben a szokásos clearance mechanizmusok mellett milyen mértékű a konstruált antitest perzisztenciája.
A 2B6-ból előállított humanizált antitestekkel kapcsolatban ismertetett eljárásokat követve az ezen a területen jártas szakember más donor IL-5 antitestekből, variábilis szakasz szekvenciákból és CDR peptidekből is elő tud állítani humanizált antitesteket. Konstruált antitestek olyan variábilis szakasz frameworkök alkalmazásával is termelhetők, amelyeket a konstruált antitest recipiensei ténylegesen mint „saját”-jukat ismerik fel. A variábilis szakasz frameworkök kisebb módosításaival anélkül növelhető jelentősen az antigénkötés, hogy közben észrevehetően növekedne a recipiensnél az immunogenicitás. Az ilyen konstruált antitestekkel hatékonyan kezelhetők ember esetén az IL-5-mediált állapotok. Ezeket az antitesteket emellett felhasználhatjuk az említett állapotok diagnosztizálására is.
VII. Terápiás/profilaktikus alkalmazások
A találmány tárgyát képezi egy eljárás eozinofíliával kapcsolatos tünetektől szenvedő, például asztmás emberek kezelésére, amelynek során a jelen leírásban ismertetett antitestek, köztük egy vagy több konstruált antitest vagy módosított antitest, illetve ezek fragmentumainak hatásos dózisát adjuk be.
A találmány szerinti molekulák alkalmazásával indukált terápiás válaszreakció úgy jön létre, hogy a molekulák hozzákötődnek a humán IL-5-höz, és ez a kötés ezt követően blokkolja az eozinofil stimulációt. A gyógyászati felhasználásra szolgáló megfelelő preparátumok és készítmények formájában lévő találmány szerinti molekulák igen előnyösen alkalmazhatók az allergiás és/vagy atópiás válaszreakcióktól vagy az eozinofíliával együtt járó válaszreakcióktól szenvedő személyek esetén. Az ilyen állapotok közé tartoznak - egyebek mellett - például a következők: allergiás rhinitis, asztma, krónikus eozinofil pneumónia, allergiás bronchopulmonalis aspergillosis, genuin coeliakia, eosinophil gastroenteritis, Churg-Strauss-szindróma (periarteritis nodosus és atópia), eosinophil myalgia szindróma, hypereosinophil szindróma, ödémás reakciók, köztük epizodikus angiodema, bélféregfertőzések, ahol az eozinofilek védő szere11
HU 222 992 Bl pet tölthetnek be, onchocercalis dermatitis és atopic dermatitis.
A találmány szerinti módosított antitesteket, antitesteket és ezek fragmentumait más olyan antitestekkel, különösen humán monoklonális antitestekkel együtt is felhasználhatjuk, amelyek a konstruált antitest által megcélzott állapotért felelős egyéb markerekkel (epitópokkal) szemben reaktívak.
Az allergiás állapotok kezelésére a találmány szerinti terápiás anyagokat körülbelül két naptól körülbelül három héten keresztül, illetve szükség szerint alkalmazhatjuk. Például hosszabb kezelésre lehet szükség, ha a kezelendő betegség szezonális rhinitis vagy más ehhez hasonló állapot. Ez lényegesen előnyösebb, mint az IL-5-mediált rendellenességek kezelésére a technika állása alapján ismert és jelenleg alkalmazott infúziós protokoll. A találmány szerinti molekuláknak a humán vérkeringésben tapasztalt relatív tartózkodási idejétől függő kezelési dózist és időtartamot az ezen a területen jártas szakember a kezelendő állapot és a beteg általános egészségi állapotának a figyelembevételével állíthatja be.
A találmány szerinti terápiás anyag beadási módjaként bármely olyan utat alkalmazhatunk, amely alkalmas arra, hogy a szert eljuttassa a gazdaszervezethez. A találmány szerinti módosított antitestek, antitestek, konstruált antitestek és ezek fragmentumai, valamint a találmány szerinti gyógyszerkészítmények különösen parenterális, például szubkután, intramuszkuláris, intravénás vagy intranazális beadásra alkalmasak.
A találmány szerinti terápiás anyagokat olyan gyógyszerkészítményekké formálhatjuk, amelyek egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozóban hatóanyagként a találmány szerinti konstruált (például humanizált) antitest hatásos mennyiségét tartalmazzák. A találmány szerinti profilaktikus szer előnyösen egy injekciós beadásra kész, a konstruált antitestet tartalmazó, előnyösen fiziológiás pH-η pufferelt vizes szuszpenzió vagy oldat. A parenterális beadásra szolgáló kompozíciók szokásosan a találmány szerinti konstruált antitestnek vagy koktéljának egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozóval, előnyösen egy vizes hordozóval készített oldatából állnak. Különféle vizes hordozókat, például 0,4%-os vizes nátrium-klorid-oldatot, 0,3%-os vizes glicinoldatot stb. alkalmazhatunk. Az oldatok sterilek és szemcsés anyagtól általában mentesek. Az oldatokat hagyományos, jól ismert sterilizálási módszerekkel (például szűréssel) sterilizálhatjuk. A kompozíciók gyógyszerészetileg elfogadható segédanyagokat, például a megfelelő fiziológiás körülményekhez szükséges anyagokat, így pH-beállító és pufferanyagokat is tartalmazhatnak. A gyógyszerkészítményekben a találmány szerinti antitest koncentrációja széles határok között változhat. A választott konkrét beadási módtól függően, figyelembe véve a folyadék térfogatát, viszkozitását stb., a hatóanyag koncentrációja például 0,5 tömeg%-nál kisebb értékű is lehet, de szokásosan legalább körülbelül 1 tömeg%-tól 15-20 tömeg%-ig terjed.
Például egy intramuszkuláris injekció céljára szolgáló találmány szerinti gyógyszerkészítményt 1 ml steril, puffereit vízből, valamint körülbelül 1 ng és körülbelül 1000 ng, például körülbelül 50 ng és körülbelül 30 mg vagy még előnyösebben körülbelül 5 mg és körülbelül 25 mg közötti mennyiségű találmány szerinti antitestből állíthatunk elő. Hasonló módon egy intravénás infúzióra szolgáló találmány szerinti gyógyszerkészítményt körülbelül 250 ml Ringer-oldatból, valamint körülbelül 1 mg és körülbelül 30 mg, előnyösen körülbelül 5 mg és körülbelül 25 mg közötti mennyiségű találmány szerinti antitestből állíthatunk elő. A parenterális úton beadható gyógyszerkészítmények jelenleg alkalmazott előállítási eljárásai jól ismertek, illetve az ezen a területen jártas szakember számára könnyen hozzáférhetők. Az ilyen eljárások részletes ismertetésre kerültek például a következő szakkönyvben: Remington’s Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, USA.
A találmány szerinti terápiás hatóanyag - ha gyógyszerkészítménnyé formált - előnyösen egységdózis formákban van. A megfelelő, terápiásán hatásos dózist az ezen a területen jártas szakember könnyen meg tudja határozni. Ember vagy állat gyulladásos rendellenességének hatásos kezeléséhez 70 kg-os testtömeg esetén dózisonként egy találmány szerinti protein vagy antitest körülbelül 0,1 mg és körülbelül 70 mg közötti mennyiségét kell parenterális, előnyösen intravénás vagy intramuszkuláris úton beadni. Az ilyen dózist szükség esetén meghatározott időintervallumokban ismételten be lehet adni; a megismételt beadások gyakoriságát és idejét a kezelőorvos a gyulladásos reakciók figyelembevételével határozza meg.
A találmány szerinti módosított antitestek és konstruált antitesteket diagnosztikai eljárásokban is felhasználhatjuk, például az IL-5-mediált rendellenességek meghatározásához vagy az ilyen rendellenességek kezelési folyamatának nyomon követésére. A diagnosztikai reagensekként alkalmazott módosított antitesteket hagyományos módon jelölhetjük például az olyan, például ELISA vagy más szokásos vizsgálati módszerek számára, amelyek segítségével a szérumban, plazmában vagy más megfelelő szövetben lévő, illetve a tenyészetben humán sejtek által szabaddá tett IL-5-mennyiségeket. A módosított antitesteket felhasználó vizsgálatok szokásos jellegűek, a jelen találmány oltalmi körét, illetve terjedelmét nem korlátozzák.
A jelen találmánynak egy további tárgya eljárás betegekben történő túlzott eozinofiltermeléssel kapcsolatos allergia és egyéb állapotok diagnosztizálásának elősegítésére, amelynek során a betegtől vett (plazma- vagy szövet-) mintában meghatározzuk a humán IL-5 mennyiségét, az így meghatározott mennyiséget összehasonlítjuk a normál népesség humán IL-5 átlagmennyiségével, ahol a beteg mintájában lévő szignifikánsan nagyobb mennyiségű IL-5 jelenléte jelzi a túlzott eozinofiltermeléssel kapcsolatos allergiát és egyéb állapotokat.
A jelen leírásban ismertetett antitesteket, módosított antitesteket vagy ezek fragmentumait tárolási céllal liofílizálhatjuk, majd közvetlenül a felhasználás előtt egy alkalmas hordozóban helyreállíthatjuk. Ez a technika a hagyományos immunglobulinok esetén a korábbiakban
HU 222 992 Bl már hatékonynak bizonyult. A liofilizáláshoz és a helyreállításhoz a szakterületen ismert eljárásokat alkalmazhatunk.
Az alábbi példák a találmány tárgyainak, köztük konstruált antitestek összeállításának, valamint ezek alkalmas vektorokban és gazdasejtekben történő expresszálásának illusztrálására szolgálnak. A példák a találmány oltalmi körét, illetve terjedelmét nem korlátozzák. Az aminosavakat hagyományos hárombetűs vagy egybetűs kódokkal azonosítjuk. Amennyiben másképpen nem jelöljük, valamennyi restrikciós enzimet, plazmidot, reagenst és egyéb anyagot kereskedelmi forrásból szereztük be. Az általános klónozókapcsolásokat és egyéb rekombináns DNS-eljárásokat a következő szakirodalmi helyeken ismertetetteknek megfelelően végeztük: T. Maniatis et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982); T. Maniatis et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989); valamint Sambrook et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989).
1. példa
Humán IL-5-höz kötött monoklonális antitestek előállítása
Humán IL-5-öt Drosophila Schneider 2 (S2) sejtekben expresszáltunk, majd az expresszált terméket a homogenitás eléréséig tisztítottuk. Rágcsáló-IL-5-öt Spodoptera frugiperda 21 (Sf21) alkalmazásával Baculovirusban expresszáltunk, majd az expresszált terméket a homogenitás eléréséig tisztítottuk. TRFK-5 monoklonális antitestet (egy neutralizáló patkány antiegér IL-5 antitestet) a következő helyről szereztünk be: Genzyme Corp. (Cambridge, Massachusetts, Amerikai Egyesült Államok).
A) Immunizálási eljárás
Hét CAF1 nőstény egér (Charles River, Wilmington, Massachusetts, Amerikai Egyesült Államok) paneljához immunogénként rekombináns humán IL-5-öt (IL—5) használtunk. Az állatok az IL-5 foszfátpufferelt fiziológiás sóoldattal (PBS) készített, 1:1 arányú TiterMAX®-szal (CytoRx Corp., Norcross, Georgia, Amerikai Egyesült Államok) emulgeált oldatának három szubkután injekcióját kapták négy hónapos időtartamban. Az indító (priming) antigén dózis 50 pg-os volt, az emlékeztető (boost) dózisok 25 és 10 pg-osak voltak. Az emlékeztető dózisok után szérummintákat vettünk, majd a mintákat a receptorkötés-gátlási vizsgálat és a B13 proliferációs vizsgálat [vagy az IL-5 neutralizációs vizsgálat (2C. példa)] útján az IL-5-höz történt kötődésre és a neutralizációs aktivitásra nézve teszteltük. Valamennyi egér olyan szérummintákat termelt, amely az IL-5-höz kötött volt. A lépdonorokként kiválasztott állatoknak három nappal az eutanázia előtt intravénás úton 10 pg rekombináns humán IL-5 emlékeztető dózist adtunk be.
B) Hibridómafejlesztés
Az első alkalommal Kohler által ismertetett [Kohler et al., Natúré, 256, 495 (1975)] fúziós eljárást használtuk, amelynek végrehajtását egy sejt monoréteg (Kennet et al., Eds., „Hybridomas: A new dimension in biological analysis”, 368-377, Plenum Press, New York) alkalmazásával módosítottuk. Két donor egérből lépsejteket nyertünk, a sejteket összeöntöttük, majd (50 millió lépsejt)/(10 millió SP2/0/Agl4 myelomasejt) arány mellett fúziót hajtottunk végre. A fúziópozitív vájatokbái nyert felülúszókat ELISA alkalmazásával vizsgáltuk az IL-5-höz kapcsolódásra nézve. Az IL-5-höz kötött antitestet termelő sejteket tartalmazó vájatokat expandáltuk, majd a felülúszókat egy IL-5 receptorkötés-gátlási vizsgálatban és egy B13 (neutralizációs) proliferációs vizsgálatban szkríneltük (a vizsgálatok részleteit az alábbiakban ismertetjük).
Tizenhat olyan hibridómát izoláltunk, amely IL-5-tel reaktív monoklonális antitesteket szekretált. A hibridóma felülúszókat jódozott IL—5-tel kevertük össze, majd hozzáadtuk egy olyan mernbránextraktumhoz, amelyet az IL-5 receptor (IL-5R) α-láncát expresszáló Drosophila sejtekből preparáltunk; ezt követően a receptorkötés gátlását teszteltük. A hibridóma felülúszók közül tizenegy gátolta 60%-nál nagymértékben a jódozott IL-5-nek az IL-5 receptor α-lánchoz kötődését. A monoklonális antitestek közül három, nevezetesen a 2B6, a 2E3 és a 2F2 monoklonális antitest szintén 70%-nál nagyobb mértékben gátolta a rágcsáló B13 sejtek proliferációját a humán (nem pedig a rágcsáló) IL-5-re adott válaszreakcióban. Stabil klónozott sejtvonalak előállításához a hibridómák közül ötöt ismételten lágy agarba szubklónoztunk; az öt hibridóma közül négy (1C6,2B6,2E3 és 2F2) blokkolta a kötést és/vagy a proliferúciót, egy pedig (24G9) nem neutralizáló jellegű volt. A klónozott vonalakból nyert felülúszókat ELISA alkalmazásával szkríneltük a keresztreaktivitásra nézve; a felülúszók nem kötődtek humán IL-la-hoz, IL-lp-hoz, IL-4-hez, IL-8-hoz, M-CSF-hez vagy TGFa-hoz. A monoklonális antitesteket tisztítottuk, majd optikai bioszenzor (BIAcore)-analízis alapján meghatároztuk a kötési affinitásokat, amelyek 10-100 pM közötti értékűnek bizonyultak. A vonalakból származó felülúszókat rágcsáló izotipizáló reagensek (PharMingen, San Diego, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok) alkalmazásával izotipizáltuk. A monoklonális antitestek affinitásait és IC^ neutralizáló aktivitásait az I. táblázatban (2. példa) összegezzük.
Hasonló eljárásokkal származtattunk patkányhibridómákat immunizált patkányokból; ennek során egy összehasonlítható immunizálási protokollt, valamint patkány-myelomasejteket alkalmaztunk a fúzióhoz, annak megfelelően, ahogyan azt az egérrel kapcsolatban ismertettük. Két olyan patkányhibridómát azonosítottunk (4A6 és 5D3), amely az IL-5-höz kötődő monoklonális antitesteket termel. Az alábbiakban ismertetett B13 vizsgálatban a 2B6, a 2E3 és a 2F2 monoklonális antitesthez hasonlóan neutralizáló jellegűnek bizonyult a 4A6 és az 5D3 monoklonális antitest is.
C) A hibridómák letétbe helyezése (deponálása)
A 2B6 monoklonális antitestet termelő SK119-2B6.206.75(1) hibridóma sejtvonalat HB 11 783 szám alatt helyeztük letétbe az ATCC-nél (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland,
HU 222 992 Bl
Amerikai Egyesült Államok); a mikroorganizmusok szabadalmi eljárás céljából történő letétbe helyezését szabályozó 1977-es Budapesti Szerződéssel összhangban a minta szabadalmi letétként elfogadásra került.
A 2E3 monoklonális antitestet termelő SK119-2E3.39.40.2 hibridóma sejtvonalat HB 11 782 szám alatt helyeztük letétbe az ATCC-nél (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok); a mikroorganizmusok szabadalmi eljárás céljából történő letétbe helyezését szabályozó 1977-es Budapesti Szerződéssel összhangban a minta szabadalmi letétként elfogadásra került.
A 2F2 monoklonális antitestet termelő SK119-2F2.37.80.12 hibridóma sejtvonalat HB 11 781 szám alatt helyeztük letétbe az ATCC-nél (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok); a mikroorganizmusok szabadalmi eljárás céljából történő letétbe helyezését szabályozó 1977-es Budapesti Szerződéssel összhangban a minta szabadalmi letétként elfogadásra került.
A 24G9 monoklonális antitestet termelő SK119-24G9.8.20.5 hibridóma sejtvonalat HB 11 780 szám alatt helyeztük letétbe az ATCC-nél (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok); a mikroorganizmusok szabadalmi eljárás céljából történő letétbe helyezését szabályozó 1977-es Budapesti Szerződéssel összhangban a minta szabadalmi letétként elfogadásra került.
A 4A6 monoklonális antitestet termelő 4A6(1)G1F7 hibridóma sejtvonalat HB 11 943 szám alatt helyeztük letétbe az ATCC-nél (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok); a mikroorganizmusok szabadalmi eljárás céljából történő letétbe helyezését szabályozó 1977-es Budapesti Szerződéssel összhangban a minta szabadalmi letétként elfogadásra került.
Az 5D3 monoklonális antitestet termelő 5D3(1)F5D6 hibridóma sejtvonalat HB 11 942 szám alatt helyeztük letétbe az ATCC-nél (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok); a mikroorganizmusok szabadalmi eljárás céljából történő letétbe helyezését szabályozó 1977-es Budapesti Szerződéssel összhangban a minta szabadalmi letétként elfogadásra került.
2. példa
Vizsgálatok
A) ELISA
MaxiSorb™ immunlemezek (Nunc, Naperville, Illinois, Amerikai Egyesült Államok) egyes vájatait 0,2 pg IL-5-tel (0,05 M karbonátpuffer, pH 9,6) vontuk be. A lemezeket egy éjszakán keresztül 4 °C hőmérsékleten inkubáltuk, majd 0,025% Tween® 20-at tartalmazó PBS-sel öblítettük, majd 0,025% Tween® 20-at tartalmazó PBS-sel készített 1%-os bovin-szérumalbuminnal (BSA) 2 órán keresztül szobahőmérsékleten blokkoltuk. Az IL-5-tel bevont vájatokhoz hígítatlan hibrid felülúszókat adtunk, majd két órán keresztül szoba-hőmérsékletű inkubálást végeztünk. A lemezeket öblítettük, majd 1% BSA-t és 0,025% Tween® 20-at tartalmazó PBS-sel 1:7500 arányban hígított peroxidáz jelzett kecske antiegér IgG & IgM (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana, Amerikai Egyesült Államok) reagenst adtunk a lemezekhez. Két óra elteltével a lemezeket mostuk, majd a lemezekhez 0,1% kapbamid-peroxidázt és 1 mg/ml orío-fenilén-diamint tartalmazó 0,1 M citrátpuffer (pH 4,75) 0,2 ml-ét adtuk. Tizenöt perc elteltével a lemezeket egy VMax™ Microplate Reader (Molecular Devices, Menlo Park, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok) alkalmazásával 450 nm hullámhossz mellett leolvastuk.
B) Receptorkötés-gátlási vizsgálat
Az antitest azon hatásának a mérésére, amelyet az antitest az IL-5 és a receptor között történő kötődésre gyakorol, a humán IL-5 receptor (IL-5R) α-láncát expresszáló Drosophila S2 sejtek membránextraktumait alkalmaztuk. A membránok előállításához 109 sejtet 1000 xg érték mellett 4 °C hőmérsékleten 10 percen keresztül ülepítettünk. A sejtüledéket szárazjég/aceton fürdőben 15 percen keresztül fagyasztottuk. Az üledéket felolvasztottuk, 10 ml 4 °C hőmérsékletű PBS-ben szuszpendáltuk, majd 1000xg érték mellett 10 percen keresztül ülepítettük. A sejtüledéket PBS-ben kétszer mostuk, majd 13,5 ml hipotóniás pufferben [10 mM Tris (pH 7,5), 3 mM magnézium-klorid, 1 mM ditio-treit, 1 mM benzilszulfonil-fluorid, 1 μΜ leupeptin, 1 μΜ pepstatin A] szuszpendáltuk, ezt követően pedig jégen 5 percen keresztül inkubáltuk. A sejtszuszpenziót egy 15 ml-es Dounce homogenizátorban homogenizáltuk, majd 2,5 M szacharózoldattal 0,25 M szacharózkoncentrációra állítottuk be. A sejttöredékeket 1000 χ g érték mellett 15 percen keresztül végzett centriíugálással eltávolítottuk. A sejtmembránokat 100 000 x g érték mellett 4 °C hőmérsékleten 90 percen keresztül végzett centriíugálással ülepítettük, majd 10 mM Tris (pH 7,4), 3 mM magnézium-klorid, 250 mM szacharóz összetételű oldat 50 ml-ében szuszpendáltuk, ezt követően pedig -70 °C hőmérsékleten tároltuk.
A receptort tartalmazó Drosophila membránokkal végzett vizsgálatokat MultiscreenGV™ lemezeken (Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, Amerikai Egyesült Államok), 25 mM HEPES puffért (pH 7,2) és 0,1% bovin-szérumalbumint (kötőpuffert) tartalmazó M3 Drosophila szövettenyésztő médium [Lindquist et al., Drosophila Inf. Sérv., 58, 163 (1982)] alkalmazásával hajtottuk végre. A vájatokat 0,1 ml kötőpufferrel előzetesen blokkoltuk. A vájatokhoz három párhuzamos kísérletben 50 μΐ tesztmintát, majd 25 μΐ jódozott (125I) IL-5-öt adtunk. Húszperces, szobahőmérsékleten végzett inkubálás után a humán IL-5R α-láncát expresszáló Drosophila S2 sejtek membránextraktumának 25 μΐ-ét adtuk a vájatokhoz. Egyórás további inkubálást követően a membránokat vákuumszűréssel kiszűrtük, majd a kötőpufferrel háromszor mostuk. A szűrőket szárítottuk és számláltuk.
C) IL-5 neutralizációs vizsgálat
Az LyH7.B13 (B13) rágcsáló IL-5/IL-3 függő sejtvonalat R. Palacios (Basel Institute of Immunology, Svájc) segítségének köszönhetően kaptuk. A sejteket Lglutaminnal, nem esszenciális aminosavakkal, nátriumpiruváttal, penicillin-streptomicinnel (valamennyi Gib14
HU 222 992 Bl coBRL, Renfrewshire, Nagy-Britannia), valamint 2merkapto-etanollal (5χ10-5 M, Sigma), 10% magzati borjúszérummal (Globepharm, Surrey, Nagy-Britannia) és 1-10 egység rágcsáló-IL-5-tel kiegészített RPMI 1640 médiumban (GibcoBRL, Renfrewshire, Nagy- 5 Britannia) hetente kétszer átoltottuk. A vizsgálatok céljára a sejteket három párhuzamos kísérletben 96 vájatú, kerek fenekű lemezeken 5000 sejt/vájat mennyiségben 48 órán keresztül a megfelelően hígított tesztminták jelenlétében tenyésztettük, amelynek során az utolsó 4 óra idejére 0,5 pCi 3H-timidint (Amersham, Bucks, Nagy-Britannia) adtunk a tenyészethez. A sejteket előkészítettük a szcintillációs számláláshoz, amelyet egy 1205 Betaplate (LKB Wallac, Beds, Nagy-Britannia) berendezés alkalmazásával hajtottunk végre.
D) Optikai bioszenzor
Az immobilizált hIL-5-tel és antitestekkel a kinetikus és egyensúlyi kötési jellemzőket egy BIAcore optikai bioszenzor (Pharmacia Biosensor, Uppsala, Svédország) alkalmazásával mértük. A kinetikai adatokat a korábbiakban ismertetett összefüggések [Karlsson et al., J. Immunoi. Meth., 145, 229-240 (1991)] alkalmazásával értékeltük.
A neutralizáló monoklonális antitestek közül három, nevezetesen a 2B6, a 2E3 és a 2F2 monoklonális antitest rendkívül hasonló hatékonysággal gátolja a 125I-IL-5-nek a membránreceptorhoz történő kötődé10 sét, illetve neutralizálja a B-sejtek proliferációját, ugyanakkor az említett három monoklonális antitest az IL-5-tel szemben is nagyon hasonló affinitást mutat (lásd az I. táblázatot). Meghatároztuk az ebből a három monoklonális antitestből származó VH és VL nukleotid15 szekvenciáját, ami az előbbi sorrendnek megfelelően 2 IgGj és 1 IgG2a volt. Az így nyert szekvenciák rendkívül hasonlóak, csak néhány csoport esetén tapasztalható eltérés.
1. táblázat
A humán IL-5-tel reaktív monoklonális antitestek affinitása és neutralizáló aktivitása
Neutralizáció
mAb Kd(pM? Kötés IC50 (nM)b Proliferáció IC5O C 100%-os gátlás0
2B6 22 1 70 200
2E3 20 1 90 600
2F2 13 1 150 340
1C6 86 43 12 000 NA
24G9 NA >133 >100 000 NA
4A6 18 >88 28 100
5D3 NA NA 100 10 000
a: optikai bioszenzor (BIAcore)-analízissel (25 °C) meghatározva
b. a i25j_il_5 Drosophila membránokból származó IL-5R α-lánchoz történő kötődésének a gátlása c: a B13 sejtek proliferációjának (pM) a gátlása a 8 pM humán IL-5-re adott válaszreakcióban NA: nincs adat
3. példa
Az IL-5 Fab-ok kombinációs könyvtárból történő izolálása és jellemzése
A) PCR és kombinációs könyvtár konstrukció
A három egér lépéből tisztított RNS-t egy cDNS készlettel (kittel) (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana, Amerikai Egyesült Államok) reverz transzkripciónak vetettünk alá, amelynek során a kitet kiegészítő (dT)15 prímért, illetve a 3’ Fd (IgGl, IgG2a és IgG3) és kappa könnyű lánc primereket alkalmaztuk, annak megfelelően, ahogyan az a következő szakirodalmi helyeken a korábbiakban ismertetésre került: Huse et al., Science, 246, 1275 (1989); valamint Kang, S. A., Methods: Companion Methods Enzymol., 2, 111 (1991). A primerek és a Huse által ismertetett [Huse et al., Science, 246,1275 (1989)] termikus ciklizálási körülmények alkalmazásával végzett PCR útján immunglobulin cDNS-eket amplifikáltunk. Valamennyi reakció esetén az AmpliWax™ PCR Gém 100 (Perkin Elmer Cetus,
Norwalk, Connecticut, Amerikai Egyesült Államok) gyöngyök alkalmazásával végzett Hot Start technikát használtuk, a gyártó használati utasításainak megfelelően. A PCR-termékeket gélen tisztítottuk, emésztettük, majd a pMKFabGene3 vektorba [Ames et al., J. Immunoi., 152, 4572 (1994)] kapcsoltuk. A könyvtártiter az Fd cDNS-ekkel végzett kapcsolás után 5,1 χ 107 CFUértékű, illetve a kappa-cDNS-ekkel végzett kapcsolás után 1,5xlO6 CFU-értékű volt. A fágmid könyvtárral transzformált XLl-Blue sejteket (Stratagene, La Jolla, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok) VCSM13 segítő fággal (Stratagene, La Jolla, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok) infektáltuk, majd Barbas és Lemer módszerének [Barbas and Lemer, Methods: Companion Methods Enzymol., 2, 119 (1991)] alkalmazásával fágokat preparáltunk.
B) Biopanning
Négy mikrotitervájatot (Immulon II Removawell Strips, Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, Virginia,
HU 222 992 Bl
Amerikai Egyesült Államok) 4 °C hőmérsékleten egy éjszakán keresztül vájatonként 1 pg IL-5-tel (0,1 M hidrogén-karbonát, pH 8,6) vontunk be. A vájatokat vízzel mostuk, majd egy órán keresztül 37 °C hőmérsékleten 3% bovin-szérumalbumint tartalmazó PBS-sel blokkoltuk. A blokkolóoldatot eltávolítottuk, a mikrotitervájátokhoz 50 μΐ/vájat mennyiségben hozzáadtuk a könyvtárat, majd 37 °C hőmérsékleten 2 órán keresztül inkubálást végeztünk. A vájatokat tíz alkalommal TBS/Tween® [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM nátrium-klorid, 0,5% Tween® 20] oldattal, majd egyszer vízzel mostuk, ezt követően pedig a letapadó fágot 1 mg/ml bovin-szérumalbumint tartalmazó, glicinnel 2,2-es pH-ra beállított 0,1 M sósavoldattal eluáltuk.
C) Telepkiemelés
A biopanning harmadik és negyedik fordulójából izolált klónokból végzett telepkiemeléseket a korábbiakban ismertetetteknek [Barbas and Lerner, Methods: Companion Methods Enzymol., 2, 119 (1991)] megfelelően hajtottuk végre. A szűrőket egy órán keresztül szobahőmérsékleten 0,5-1,0 pCi 125I-IL-5-tel [a reagenst előzetesen Bolton-Hunter-reagenssel (NEN, Billerica, Massachusetts, Amerikai Egyesült Államok), a gyártó használati utasításainak megfelelően jódoztuk] 1% bovin-szérumalbumint tartalmazó PBS-ben inkubáltuk, 0,25% Tweent tartalmazó PBS-sel mostuk, majd Kodak XAR filmre exponáltuk. Az IL-5-tel reaktív Fab-okat expresszáló telepeket autoradiográfiás úton detektáltuk.
D) Oldható Fab-ok előállítása
Fágmid DNS-eket Nhel és Spel alkalmazásával emésztettünk a gén III eltávolítása érdekében. XLl-Blue sejteket transzformáltunk, majd az izolált kiónokat egy éjszakán keresztül 37 °C hőmérsékleten 1% glükózt és 50 pg/ml karbenicillint tartalmazó 5,0 ml szuperleves (super broth, SB) médiumban [30 g tripton, 20 g élesztőextraktum, 10 g 3-morfolino-propánszulfonsav (MOPS), 7-es pH-ra beállítva] növesztettük. A tenyészet 1 ml-ében lévő sejteket egy Beckman GS-6R centrifugában 3500 fordulat/perc sebességgel 10 percen keresztül ülepítettük, majd ezt alkalmaztuk 50 pg/ml karbenicillint tartalmazó 5 ml SB inokulálásához. A tenyészeteket egy órán keresztül 37 °C hőmérsékleten rázattuk, 1 mM izopropil-P-D-tiogalaktopiranozidot adtunk a tenyészetekhez, amelyeket ezt követően egy éjszakán keresztül 28 °C hőmérsékleten tartottunk. Az oldható Fab-ot a periplazmaextraktumokból úgy állítottuk elő, hogy a sejtüledéket 30 mM Tris-ben (pH 8,0) szuszpendált 20%-os szacharózban 20 percen keresztül 4 °C hőmérsékleten lizáltuk, majd egy Microfúge berendezésben 10 percen át centrifugáltuk. A Fab-koncentrációkat Westem-blot útján, rágcsáló-Fab ismert mennyiségeit tartalmazó mintákkal történő összehasonlítással állapítottuk meg. A Westem-blot-analízis alapján megállapítottuk, hogy a különböző bakteriális periplazmaextraktumok hasonló koncentrációkban (1 pg/ml és 20 pg/ml közötti koncentrációtartományban) tartalmaztak Fab-ot.
E) A Fab-ok tisztítása
A proteintisztítás elősegítése érdekében egy kelátképző pepiidet kapcsoltunk a nehéz lánc karboxiterminális végére. Az M13 gén III kódoló szakaszt Nhel és Spel alkalmazásával végzett emésztéssel eltávolítottuk, majd a Fab expressziós vektorba egy hat hisztidincsoportot kódoló átlapoló oligonukleotidpárt szubklónoztunk:
43. számú szekvencia: 5’-CTAGCCACCACCACCACCACCACTAA-3’;
44. számú szekvencia: 3’-GGTGGTGGTGGTGGTGGTGATTGATC-5’.
A Fab-expressziót a fentiekben ismertetetteknek megfelelően indukáltuk. Egy éjszakán 28 °C hőmérsékleten végzett inkubálás után 20% szacharózban (30 mM Tris, pH 8,0) 30 percen keresztül 4 °C hőmérsékleten hajtottunk végre inkubálást, és így állítottuk elő a sejtüledék periplazmalizátumát. Karbamidot és Brij-35 detergenst adtunk a letisztult felülúszóhoz - az előbbi sorrendnek megfelelően - 2 M és 1% végkoncentrációnak megfelelő mennyiségben. Az így kezelt és letisztult felülúszót egy órán keresztül szobahőmérsékleten kevertettük, majd 0,5 ml/perc sebességgel közvetlenül felvittük egy 5 ml-es, A. pufferrel (100 mM nátrium-foszfát, 10 mM Tris, 0,3 M nátrium-klorid, 2 M karbamid, pH 8,0) ekvilibrált Nickel-NTA fémkomplexáló oszlopra. Négy oszloptérfogatnyi (20 ml) mennyiséggel mosást végeztünk, majd a kötött anyagokat a fenti pufferben kialakított fordított (reverz) (pH 8->pH 4) pH-gradiens 6 oszloptérfogatnyi (30 ml) mennyiségével eluáltuk. A tisztított Fab-ok 5,5 pH-nál egy éles, szimmetrikus csúcs formájában eluálódtak. Az így nyert tisztított Fab-ok 90%-nál nagyobb tisztasággal rendelkeztek és DNS-től mentesek voltak.
F) Fab ELISA
Immulon II lemezeket (Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, Virginia, Amerikai Egyesült Államok) 4 °C hőmérsékleten egy éjszakán keresztül 0,1 M hidrogénkarbonát-pufferben (pH 8,6) szuszpendált proteinnel (1 mg/ml; 50 ml/vájat) vontunk be. A hígításokat és mosásokat 0,05% Tween™ 20-at tartalmazó PBS-ben hajtottuk végre. A lemezeket mostuk, majd egy órán keresztül szobahőmérsékleten 1% bovin-szérumalbumint tartalmazó PBS-sel blokkoltuk. Az oldható Fab-okat vagy tisztított Fab-okat tartalmazó bakteriális felülúszók különféle hígításait adtuk a lemezekhez. Egyórás inkubálás után a lemezeket mostuk és a lemezekhez 50 μΐ/vájat mennyiségben 1:2000 arányban hígított biotinilezett kecske antiegér kappa (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, Alabama, Amerikai Egyesült Államok) reagenst adtunk. Egy óra elteltével a lemezeket mostuk, majd 50 μΐ/vájat mennyiségben 1:2000 arányban hígított streptavidinjelzett torma-peroxidázt adtunk a lemezekhez. Egy óra elteltével a lemezeket mostuk, majd a lemezekhez 100 μΐ/vájat mennyiségben ABTS peroxidázszubsztrátot (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, Maryland, Amerikai Egyesült Államok) adtunk, ezt követően pedig egy UVmax™ (Molecular Devices, Menlo Park, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok) mikrolemezleolvasó készüléken 405 nm hullámhossz mellett meghatároztuk az optikai sűrűséget.
G) A Fab-ok kombinációs könyvtárból történő izolálása és jellemzése
Az IL-5-höz kötött Fab-okat hordozó fágot az Il-5-tel bevont mikrotitervájátokkal szemben végzett
HU 222 992 Bl többfordulós biopanning útján választottuk ki a könyvtárból. Négy szelekciós fordulat után az IL-5-tel reaktív Fab-okat egy ,25I-IL-5 alkalmazásával végzett telepkiemelés útján azonosítottuk. A harmadik fordulóból 34 és a negyedik fordulóból 4 olyan telepet azonosítottunk, amely a jelzett IL-5-höz kötődött. Az IL-5-höz történt kapcsolódást a Fab-gén III fúziós proteint expresszáló felülúszók alkalmazásával végzett közvetlen kötéses ELISA útján is igazoltuk. Ezekből a telepekből DNS-t izoláltunk, majd az Ml 3 gén III kódoló szakasz eltávolítása után oldható Fab-expressziót indukáltunk. Periplazmaffakciókat állítottunk elő, amelyeket az IL-5-höz történt kapcsolódásra nézve ELISA útján vizsgáltunk. A Fab-ok specifikusan kötődtek az IL-5-höz, egy másik proteinnel (rC5a) nem létesítettek kimutatható kötést.
A hígítatlan (1-20 pg/ml Fab-ot tartalmazó) periplazmaextraktumokat az IL-5R-kötés-gátlási vizsgálatban (2. példa) is teszteltük. A Fab-ok egyike sem gátolta a jódozott IL-5-nek az IL-5Ra-hoz történő kapcsolódását 35%-nál nagyobb mértékben.
H) A neutralizáló monoklonális antitest Fab-bá történő átalakítása
A 2B6 monoklonális antitest Fd-jét és κ-cDNS-eit a fentiekben ismertetett körülmények alkalmazásával végzett PCR útján izoláltuk. A géltisztított fragmentumokat az olyan pMKFabGene3 vektorba szubklónoztuk, amelyet előzetesen úgy módosítottunk, hogy magában foglalja a gén III cDNS 3’ hexa-His szekvenciáját, és így a pMKFabGene3H plazmidot nyertük. A telepkiemelési vizsgálattal egy funkcionális, a 2B6 nehéz és könnyű láncokat tartalmazó, IL-5-kötő Fab-klónt azonosítottunk. A gén III Nhe I/Spe I emésztés útján történő eltávolítása és önkapcsolás (self-ligation) után a nehéz láncot a hexa-His kerethez kapcsoltuk, majd a fentiekben ismertetetteknek megfelelően tisztítottuk. Ez a Fab dózisfüggő módon, körülbelül 7,5 pg/ml IC50értékkel gátolta a receptorkötést, ami hasonló nagyságú, mint az eredeti rágcsáló 2B6 monoklonális antitest esetén nyert IC5<)-érték.
I) A lánckevert (chain-shuffled) könyvtár konstrukciója és szkrinelése
A neutralizáló 2B6 monoklonális antitest Fd-jét kódoló cDNS-t egy Xhol/Spel fragmentumként olyan pMKFabGene3H plazmidba szubklónoztuk, amely egy könnyű lánc cDNS helyén egy Sstl/Xbal fragmentumot tartalmazott. A fágmidet SstI és Xbal alkalmazásával emésztettük, majd az IL-5-immunizált egérből (lásd fentebb) származó, Sstl/Xbal emésztett könnyű lánc PCRtermékkel kapcsoltuk. A kapcsolás után a könyvtártíter 4 χ 105 CFU-értékű volt. A kombinációs könyvtárhoz a fentiekben ismertetetteknek megfelelően biopanning és telepkiemelési vizsgálatot végeztünk.
A könyvtár összeállítása során a neutralizáló 2B6 monoklonális antitest Fd-jét kódoló cDNS-t ugyanazzal az IL-5-immunizált egerekből nyert könnyű lánc választékkal párosítottuk össze, mint amelyet a kombinációs könyvtár kialakításához használtunk. A lánckevert könyvtárat az immobilizált IL-5-tel szemben négyfordulós biopanningnak vetettük alá, majd az így kapott telepeket telepkiemelési vizsgálat alkalmazásával az IL-5-reaktívitásra nézve teszteltük. A pozitív telepeket, azaz azokat a telepeket, amelyek megkötötték a jódozott IL-5-öt, ELISA és az IL-5Ra kötési vizsgálattal tovább teszteltük. A lánckevert könyvtárból kinyert Fabok közül kettő (2. és 15.) blokkolta az IL-5-nek az IL-5Ra-hoz történő kötődését, illetve gátolta az IL-5függő proliferációt a B13 vizsgálatban. Ennek a 2 Vknak a szekvenciája hasonlít a 2B6 Vk, a 2B6 VH eredeti könnyű lánc partnerszekvenciájához. A 2. és a 15. Fab könnyű lánc szekvenciája - az előbbi sorrendnek megfelelően - a 45. és a 46. számú szekvenciának felel meg. A 2. Fab esetén az 1-3. CDR - az előbbi sorrendnek megfelelően - a 10., a 11. és a 47. számú szekvenciának felel meg. A 15. Fab esetén az 1-3. CDR - az előbbi sorrendnek megfelelően - a 10., a 11. és a 48. számú szekvenciának felel meg.
Az alábbi 4. és 5. példában felsorolt valamennyi antitest-aminosavszekvenciát a KÁBÁT számozási rendszer szerint számoztuk; a KÁBÁT számozási rendszer lehetőséget biztosít a CDR és a framework hosszak variabilitására. Ennek megfelelően a kulcs aminosavakat mindig ugyanazzal a számmal jelöljük, tekintet nélkül arra, hogy milyen az ezeket megelőző aminosavak tényleges száma. Például az a cisztein, amelyik megelőzi valamennyi könnyű lánc CDRl-jét, mindig a 23-as KÁBÁT pozíciónak felel meg, míg a CDR-l-et követő triptofáncsoport mindig a 35-ös KÁBÁT helyzetben van, még akkor is, ha a CDR1 akár 17 aminosavat is tartalmazhat.
4. példa
Humanizált antitest
Egy olyan humanizált antitestet terveztünk, amely egy humanizált antitest frameworkben rágcsáló-CDReket tartalmaz. Az IL-5-specifikus 2B6 egérantitestnek ezt a humanizált változatát a következő műveletek végrehajtásával állítottuk elő.
A) Génklónozás
A 2B6, 2F2 és 2E3 hibridóma sejtvonalak (lásd az 1. példát) mindegyikéből mRNS-t izoláltunk egy, a Boehringer Mannheimtől (Indianapolis, Indiana, Amerikai Egyesült Államok) kapott kittel, majd a cDNS előállításához egy cDNS kittel (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana, Amerikai Egyesült Államok) kiegészített (dT)15 primer alkalmazásával reverz transzkripciót hajtottunk végre. Egér immunglobulinra specifikus PCR primereket alkalmaztunk a nehéz lánc variábilis szakasz 9. számú aminosavjától (KÁBÁT számozási rendszer) a sarok szakaszáig teijedő, valamint a könnyű lánc variábilis szakasz 9. számú aminosavjától (KÁBÁT számozási rendszer) a konstans szakasz végéig teijedő doméneket kódoló DNS amplifikálásához. Független PCR-reakciókkal valamennyi antitestlánc esetén számos kiónt nyertünk.
A felhasznált egér gamma 1 sarok szakasz primer a 22. számú szekvenciának felel meg:
’-GTACATATGCAAGGCTTACAACCACAATC-3’.
A felhasznált egér gamma 2a sarok szakasz primer a 23. számú szekvenciának felel meg:
HU 222 992 Bl
5’-GGACAGGGCTTACTAGTGGGCCCTCTGGGCTC-3’.
A felhasznált egér nehéz lánc variábilis szakasz primer a 24. számú szekvenciának felel meg:
5’-AGGT(C vagy G)(C vagy A)A(G vagy A)CT(G vagy T)TCTCGAGTC(T vagy A)GG-3’.
A felhasznált egér kappa-lánc konstans szakasz primer a 25. számú szekvenciának felel meg:
5’-CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAATGGG-3’.
Az egér könnyű lánc variábilis szakasz primer a 26. számú szekvenciának felel meg:
’-CCAGATGTGAGCTCGTGATGACCC AGACTCCA-3’.
A PCR fragmentumokat pGEM7f+ (Promega) plazmidokba klónoztuk, amelyeket ezt követően E. coli DH5a-ba (Bethesda Research Labs) transzformáltunk.
B) DNS-szekvencia-meghatározás
Meghatároztuk a fenti A) rész szerinti nehéz és könnyű lánc rágcsáló-cDNS kiónok szekvenciáit. A kiónok variábilis szakaszainak szekvenciameghatározási eredményeit az 1-6. számú szekvencia (1-6. ábra) mutatja be. Az aminosavakat tartalmazó kiónok mindegyikéről tudott, hogy az ilyen klón az egér nehéz lánc variábilis szakaszok vagy könnyű lánc variábilis szakaszok között konzerválódik. A CDR aminosavszekvenciákat az alábbiakban soroljuk fel.
A 2B6 nehéz lánc CDR szakaszainak a 7., 8. és 9. számú szekvenciák felelnek meg. Lásd a 7. ábrát. Ezeket a szekvenciákat az 1. számú szekvencia kódolja. A könnyű lánc CDR szakaszainak a 10., 11. és 12. számú szekvenciák felelnek meg. Lásd a 7. ábrát. Ezeket a szekvenciákat a 2. számú szekvencia kódolja.
A 2F2 nehéz lánc CDR szakaszainak a 7., 8. és 9. számú szekvenciák felelnek meg. Lásd a 7. ábrát. Ezeket a szekvenciákat a 3. számú szekvencia kódolja. A könnyű lánc CDR szakaszainak a 10., 11. és 13. számú szekvenciák felelnek meg. Lásd a 7. ábrát. Ezeket a szekvenciákat a 4. számú szekvencia kódolja.
A 2E3 nehéz lánc CDR szakaszainak a 7., 8. és 14. számú szekvenciák felelnek meg. Lásd a 7. ábrát. Ezeket a szekvenciákat az 5. számú szekvencia kódolja. A könnyű lánc CDR szakaszainak a 10., 11. és 13. számú szekvenciák felelnek meg. Lásd a 7. ábrát. Ezeket a szekvenciákat a 6. számú szekvencia kódolja.
C) A humán frameworkök kiválasztása
Az TV-terminális csoportokhoz tartozó aminosavak aszignálása érdekében a 2B6 klónozását követően a variábilis szakasz nehéz és könnyű láncok aminosavszekvenciáit (1. és 2. ábra) (az előbbi sorrendnek megfelelően a 15. és a 16. számú szekvencia) összehasonlítottuk a KÁBÁT és a SWISS-PROT [Nuc. Acids Rés., 20, 2019-2022 (1992)] proteinszekvencia-adatbázisban szereplő ismert rágcsáló-immunglobulinszekvenciákkal. Annak érdekében, hogy mind a nehéz, mind pedig a könnyű lánc esetén azonosítsunk egy olyan humán frameworköt, amely a legközelebb áll a rágcsálószekvenciához, a 2B6 nehéz és könnyű lánc variábilis szakaszból származó aminosavszekvenciákat ezt követően összehasonlítottuk a humán immunglobulin proteinszekvencia-adatbázisokkal. A nehéz és könnyű láncokat ezenkívül egy, a Fab dómén szerkezeti modelljeiből kialakított pozíciós adatbázissal is értékeltük annak érdekében, hogy felbecsüljük a CDR viselkedését esetlegesen befolyásoló, az aminosavakkal kapcsolatos potenciális konfliktusokat. Ezeket a konfliktusokat a humanizált variábilis szakasz frameworkök szintézise során oly módon oldottuk fel, hogy az adott helyen a megfelelő egéraminosavat szubsztituáltuk.
Egy humán myeloma-immunglobulinból (COR) nyert antitestnek a nehéz lánc framework szakaszait használtuk [Ε. M. Press and N. M. Hogg, Biochem. J. 117, 641-660 (1970)]. Azt találtuk, hogy a humán nehéz lánc framework aminosavszekvencia 66%-os homológiát mutatott a 2B6 framework aminosavszekvenciájával.
Egy alkalmas könnyű lánc variábilis szakasz ffarneworkhöz a Bence-Jones protein (LEN) könnyű lánc variábilis framework szekvenciát alkalmaztuk [Schneider et al., Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem., 356, 507-557 (1975)]. Az aminosavak vonatkozásában a humán könnyű lánc framework szakaszok hozzávetőleg 82%-os homológiát mutattak a rágcsáló 2B6 könnyű lánc framework szakaszokkal.
A kiválasztott humán frameworköket visszafordítottuk, és így egy DNS-szekvenciát nyertünk.
D) Humanizált monoklonális antitestgének összeállítása
A 2B6 nehéz lánc CDR-ek (7. ábra és 1 -2. számú szekvencia) és a humanizált antitestek framework szekvenciáinak a birtokában egy szintetikus nehéz lánc variábilis szakaszt állítottunk elő (18. számú szekvencia). Ennek során négy szintetikus oligonukleotidot (27. és 28. számú szekvencia) (29. és 30. számú szekvencia) alkalmaztunk, amelyek összekapcsolódva a 21-106. számú aminosavakat (KÁBÁT számozás) kódolják. Ezt követően az oligonukleotidokat egy olyan pUC18alapú plazmidnak a Hpal-KpnI restrikciós helyeihez kapcsoltuk, amely egy másik, a COR frameworkön (lásd feljebb) alapuló humanizált nehéz láncból származó szekvenciákat tartalmazott. Ez a plazmid biztosítja a szignálszekvenciát (17. számú szekvencia) és a további variábilis szakasz szekvenciát. A feltérképezett szekvenciában bármely hibát mutagén primerekkel végzett PCR útján, vagy szintetikus linkereknek a meglévő restrikciós helyekhez történő hozzáadásával korrigáltunk.
A szignálszekvenciát és a humanizált nehéz lánc variábilis szakaszt egy EcoRI-Apai fragmentumként kivágtuk a pUC-alapú plazmidból, majd hozzákapcsoltuk az olyan pCD expressziós vektorhoz, amely egy IgGj humán konstans szakaszt tartalmazott. A szintetikus nehéz lánc variábilis szakasz nukleotid- és aminosavszekvenciát a 8. ábra mutatja be (18. és 19. számú szekvencia). A humán framework csoportoknak a 19. számú szekvencia szerinti 1-30., 36-49., 66-97. és 109-119. aminosavak felelnek meg. A CDR-ek aminosavszekvenciái azonosak a rágcsáló 2B6 CDR-ek aminosavszekvenciáival. Az így nyert pCDIL5HZHC1.0 expressziós vektor a 10. ábrán látható.
HU 222 992 Bl
A 2B6 könnyű lánc CDR-ek (7. ábra, valamint 10., 11. és 12. számú szekvencia) és a humanizált antitest ffamework szekvenciájának a birtokában egy szintetikus könnyű lánc variábilis szakaszt állítottunk elő (20. számú szekvencia). A SacI-KpnI és Pstl-HindlII végekkel rendelkező humanizált VL 27-58. számú aminosavait (KÁBÁT számozás) és 80-109. számú aminosavait kódoló négy szintetikus oligonukleotidot [az előbbi sorrendnek megfelelően (31. és 32. számú szekvencia), illetve (33. és 34. számú szekvencia)] egy olyan, pUC18-alapú plazmidba inszertáltuk, amely egy másik humán könnyű lánc ffameworkből (B17) [Marsh et al., Nuc. Acids Rés., 13, 6531-6544 (1985)] származó szekvenciákat tartalmazott. A B17 ffamework nagymértékű homológiát mutat a LEN ffameworkkel. Ez a plazmid biztosítja a további variábilis szakasz szekvenciát. A feltérképezett szekvenciában fellelt hibákat, valamint a LEN és B17 ffamework közötti egyetlen aminosaveltérést mutagén primerekkel végzett PCR útján, vagy szintetikus linkereknek a meglévő restrikciós helyekhez történő hozzáadásával korrigáltuk.
A humanizált könnyű lánc variábilis szakaszt egy EcoRVNarI fragmentumként izoláltuk a pUC plazmidból, majd hozzákapcsoltuk az olyan pCN expressziós vektorhoz, amely egy kappa humán konstans szakasz mellett egy szignálszekvenciát (17. számú szekvencia) tartalmazott. A szintetikus könnyű lánc variábilis szakasz nukleotid- és aminosavszekvenciát a 9. ábra mutatja be (20. és 21. számú szekvencia). A humán framework csoportoknak a 21. számú szekvencia szerinti 1-23., 41-55., 63-94. és 104-113. aminosavak felelnek meg. A CDR-ek aminosavszekvenciái azonosak a rágcsáló 2B6 CDR-ek aminosavszekvenciáival. Viszont a restrikciós enzimhelyek kialakulásának lehetővé tétele érdekében a CDR-eket kódoló szekvenciák eltérnek a rágcsáló 2B6 kódoló szekvenciáktól. Az így nyert expressziós vektorok egyikét, nevezetesen a pCNIL5HZLC1.0 expressziós vektort all. ábra mutatja be. Ezeket a szintetikus variábilis könnyű és/vagy nehéz lánc szekvenciákat egy humanizált antitest előállításában használhatjuk fel.
E) Humanizált monoklonális antitest expresszálása
A humanizált nehéz lánc, amely egy IgGt izotípusból származik, egy, a 19. számú szekvenciában bemutatott szintetikus nehéz lánc variábilis szakaszt használ fel. Ezt a 2B6 nehéz lánc CDR-eket tartalmazó szintetikus VH-t a fentieknek megfelelően terveztük és szintetizáltuk.
A humanizált könnyű lánc, amely egy humán kappalánc, egy, a 21. számú szekvenciában bemutatott szintetikus könnyű lánc variábilis szakaszt használ fel. Ezt a 2B6 könnyű lánc CDR-eket tartalmazó szintetikus VL-t a fentieknek megfelelően terveztük és szintetizáltuk, A humanizált variábilis szakaszokat kódoló DNS-fragmentumokat szokásos módszerekkel [T. Maniatis et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982); T. Maniatis et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989)] olyan, pUC19-alapú emlőssejt expressziós plazmidokba inszertáltuk, amelyek egy szignálszekvencia és CMV promoterek mellett az alábbi 5. példa szerinti kimérának a humán nehéz lánc vagy humán könnyű lánc konstans szakaszait tartalmazzák. Ennek eredményeként a pCDIL5HZHC1.0 (nehéz lánc) (49. számú szekvencia; lásd még: 10. ábra) és a pCNIL5HZLC1.0 (könnyű lánc) (50. számú szekvencia; lásd még: 11. ábra) plazmidokat nyertük. A plazmidokat COS-sejtekbe kotranszfektáltuk, majd - az előbbi sorrendnek megfelelően - három és öt nap elteltével a felülúszókat az 5. példa szerinti ELISA alkalmazásával a humanizált antitest jelenlétére nézve vizsgáltuk.
A fenti példa egy konkrét konstruált antitest előállítását ismerteti. Hasonló eljárásokat alkalmazva más, szokásos módon kifejlesztett anti-IL-5 antitestek (például 2F2,2E3,4A6,5D3,24G9 stb. antitestek) alkalmazásával további konstruált antitesteket is előállíthatunk.
F) Tisztítás
A CHO-expresszált kiméra és humanizált 2B6 tisztítását hagyományos protein A (vagy G) affinitáskromatográfiával, majd ezt követő ioncserés és molekulaszitás kromatográfiával hajthatjuk végre. Hasonló eljárásokat a korábbiakban már eredményesen alkalmaztak egyéb [például respiratory syncytial vírus (RS-vírus), interleukin-4 és malaria circumsporozoite antigén] monoklonális antitestek 95%-os tisztaság feletti tisztítására.
G) További humanizált monoklonális antitestek és expressziós vektorok
A pCDIL5HZHC1.0 plazmid (49. számú szekvencia) birtokában előállítottuk a pCDIL5HZHCl.l plazmidot, amely a 73-as ffamework pozícióban a treonin helyett egy aszparagint tartalmaz. Az előállítást úgy végeztük, hogy egy EcoRV és Xhil végekkel (51. számú szekvencia és 52. számú szekvencia) rendelkező szintetikus linkért azonos módon emésztett pCDIL5HZHC1.0 plazmidhoz kapcsoltunk. Hasonló módon előállítottuk a pCDIL5HZHC1.2 expressziós plazmidot, amelyben a 37-es ffamework pozícióban lévő valint egy izoleucin helyettesíti. Ennek az előállítását úgy végeztük, hogy egy Hpal és Xbal végekkel (53. számú szekvencia és 54. számú szekvencia) rendelkező szintetikus linkért azonos módon emésztett pCDIL5HZHC1.0 plazmidhoz kapcsoltunk. A pCDIL5HZHC1.3 expressziós plazmidot szintén úgy állítottuk elő, hogy egy Hpal és Xbal végekkel (53. számú szekvencia és 54. számú szekvencia) rendelkező szintetikus linkért azonos módon emésztett pCDIL5HZHCl.l plazmidhoz kapcsoltunk.
A korábbiakban ismertetett, négy szintetikus oligonukleotid DNS-szekvenciáit (31., 32., 33. és 34. számú szekvencia) tartalmazó pUC18-alapú plazmid birtokában előállítottunk egy olyan humanizált könnyű lánc variábilis szakaszt, amelyben a 15-ös ffamework pozícióban lévő leucint alaninra cseréltük. Ezt a plazmidot Nhel és SacI restrikciós endonukleázzal emésztettük, majd az emésztés után egy szintetikus linkért (55. és 56. számú szekvencia) inszertáltunk a plazmidba. Ezt követően egy EcoRV-NarI fragmentumot izoláltunk, amelyet a pCNIL5HZLCl.l kialakításához az azonosan emésztett pCNIL5HZLC1.0 expressziós vektorhoz kapcsoltunk.
Immunglobulinból (NEW) [Saul et al., J. Bioi. Chem., 253, 585-597 (1978)] és a 2B6 nehéz lánc
HU 222 992 Bl
CDR-ekből (7. ábra; 1-2. számú szekvencia) nyert nehéz lánc framework szakaszok alkalmazásával egy szintetikus variábilis szakaszt állítottunk elő. Azonosítottuk a CDR viselkedését esetlegesen befolyásoló framework aminosavakat, amelyeket ezt követően a korábbiakban ismertetett eljárások alkalmazásával lecseréltünk. Négy olyan átlapoló szintetikus oligonukleotidot (57., 58., 59. és 60. számú szekvencia) állítottunk elő, amelyek egy szignálszekvenciát (17. számú szekvencia) reprezentáló aminosavakat, valamint egy nehéz lánc variábilis szakaszt kódolnak. A szintetikus gént ezt követően PCR primerek (63. és 64. számú szekvencia) alkalmazásával amplifíkáltuk, majd egy BstXI-HindlII restrikciós fragmentumként egy pCU18-alapú olyan plazmidhoz kapcsoltuk, amely egy másik, a COR frameworkön alapuló humanizált láncból származó szekvenciákat tartalmaz. A KÁBÁT számozási rendszer szerinti 91-es helyzetű aminosavnál egy fenil-alaninról tirozinra történő framework szubsztitúciót hajtottunk végre, amelynek során egy szintetikus oligonukleotid linkért (75. és 76. számú szekvencia) a SacII és KpnI restrikciós helyekbe inszertáltunk. Az így nyert nehéz lánc variábilis szakaszt (12. ábra; valamint 61. és 62. számú szekvencia) NEWM humanizált nehéz lánc néven említjük a továbbiakban.
A feltérképezett szekvenciában bármely hibát mutagén primerekkel végzett PCR útján, vagy szintetikus linkereknek a meglévő restrikciós helyekhez történő hozzáadásával korrigáltunk. A szignálszekvenciát és a humanizált nehéz lánc variábilis szakaszt egy EcoRIApal fragmentumként kivágtuk a pUC-alapú plazmidból, majd hozzákapcsoltuk az olyan pCD expressziós vektorhoz, amely egy IgGj humán konstans szakaszt tartalmazott, és így a pCDIL5NEWM plazmidot nyertük. A CDR-ek aminosavszekvenciái azonosak a rágcsáló 2B6 nehéz lánc CDR-ek aminosavszekvenciáival.
Immunglobulinból (REI) [Palm et al., Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem., 356, 167-191 (1975)] és a 2B6 könnyű lánc CDR-ekből (7. ábra; valamint 10., 11. és 12. számú szekvencia) nyert könnyű lánc framework szakaszok alkalmazásával egy szintetikus variábilis szakaszt állítottunk elő. Azonosítottuk a CDR viselkedését esetlegesen befolyásoló framework aminosavakat, amelyeket ezt követően a korábbiakban ismertetett eljárások alkalmazásával lecseréltünk. Négy olyan átlapoló szintetikus oligonukleotidot (65., 66., 67. és 68. számú szekvencia) állítottunk elő, amelyek a REI humanizált könnyű láncnak elnevezett könnyű lánc variábilis szakaszt (13. ábra; valamint 69. és 70. számú szekvencia) reprezentáló aminosavakat kódolják. A szintetikus gént ezt követően PCR primerek (71. és 72. számú szekvencia) alkalmazásával amplifíkáltuk, majd egy EcoRI-HindlII restrikciós fragmentumként pGEM7Zf(+) plazmidhoz (Promega Corporation, Madison, Wisconsin, Amerikai Egyesült Államok) kapcsoltuk.
A feltérképezett szekvenciában bármely hibát mutagén primerekkel végzett PCR útján, vagy szintetikus linkereknek a meglévő restrikciós helyekhez történő hozzáadásával korrigáltunk. A humanizált könnyű lánc variábilis szakaszt egy EcoRV-NarI fragmentumként kivágtuk a pGEM-7Zf(+)-alapú plazmidból, majd hozzákapcsoltuk az olyan pCN expressziós vektorhoz, amely egy humán kappa konstans szakasz mellett egy szignálszekvenciát (17. számú szekvencia) tartalmazott, és így a pCNIL5REI plazmidot nyertük. A CDR-ek aminosavszekvenciái azonosak a rágcsáló 2B6 könnyű lánc CDR-ek aminosavszekvenciáival. Viszont a restrikciós enzimhelyek kialakulásának lehetővé tétele érdekében a CDR-eket kódoló szekvenciák eltérnek a rágcsáló 2B6 kódoló szekvenciáktól. Ezeket a szintetikus variábilis könnyű és/vagy nehéz lánc szekvenciákat használjuk fel egy humanizált antitest előállítására.
A fentiekben ismertetett pGEM-7Zf(3)-alapú plazmid birtokában egy olyan humanizált könnyű lánc variábilis szakaszt állíthatunk elő, amelyben a 15. számú framework pozícióban a valin helyett alanin áll. A plazmidot Nhel és SacI restrikciós endonukleázokkal emészthetjük, majd az emésztett plazmidba egy szintetikus linkért (73. és 74. számú szekvencia) inszertálunk. Ezt követően egy EcoRV-NarI fragmentumot izolálhatunk, amelyet a pCNIL5REIvl5A plazmid kialakításához az azonosan emésztett pCNIL5HZREI expressziós vektorhoz kapcsolhatunk.
5. példa
Egy kiméra antitest előállítása
A 2B6 hibridóma sejtvonalból (lásd a 4. példát) előállított cDNS-nek egy pGEM7Zf+-alapú PCR klónjából egy AvalI-StyI restrikciós fragmentum formájában izoláltuk a rágcsáló monoklonális antitest 2B6 nehéz lánc variábilis szakasz 9-104. számú aminosavait (KÁBÁT számozás) kódoló DNS-t. A nehéz lánc variábilis szakasz melletti szekvenciákat és egy szignálszekvenciát (17. számú szekvencia) úgy állítottuk elő, hogy négy kisméretű szintetikus oligomer linkerrel (35. és 36. számú szekvencia) (37. és 38. számú szekvencia) együtt a fragmentumot egy BstXl-HindlII-mal emésztett pUC18alapú plazmidba inszertáltuk. A szoros kapcsolatban álló rágcsáló nehéz láncokból származó N-terminális aminosavak azonosságát tapasztaltuk az első nyolc VH csoport esetén, amelyeket a 35. és a 36. számú szekvencia kódol. A nehéz lánc levezetett aminosavszekvenciáját megerősítette a 2B6 nehéz lánc első 15 N-terminális aminosavjának szekvenciameghatározása is.
Egy, a szignál és VH szakaszok számára szolgáló szekvenciát tartalmazó EcoRI-Apal fragmentumot izoláltunk, amelyet olyan pCD plazmidhoz kapcsoltunk, amely már kódolja a humán IgG, konstans szakaszt.
A 2B6 hibridóma sejtvonalból (lásd a 4. példát) előállított cDNS-nek egy pGEM7Zf+-alapú PCR klónjából egy Ddel-Aval restrikciós fragmentum formájában izoláltuk a rágcsáló monoklonális antitest 2B6 könnyű lánc variábilis szakasz 12-99. számú aminosavait (KÁBÁT számozás) kódoló DNS-t. A könnyű lánc variábilis szakasz melletti szekvenciákat úgy állítottuk elő, hogy négy kisméretű szintetikus oligomer linkerrel (39. és 40. számú szekvencia) (41. és 42. számú szekvencia) együtt a fragmentumot egy EcoRV-HindlII-mal emésztett pUC18-alapú plazmidba inszertáltuk. A szoros kap20
HU 222 992 Bl csolatban álló rágcsáló nehéz láncokból származó Nterminális aminosavak azonosságát tapasztaltuk az első nyolc VL csoport esetén, amelyeket a 39. és a 40. számú szekvencia kódol. A könnyű lánc levezetett aminosavszekvenciáját megerősítette a 2B6 könnyű lánc első 15 V-terminális aminosavjának szekvenciameghatározása is. Ezt a variábilis szakaszt ezt követően egy EcoRVNarl fragmentum formájában izoláltuk, majd az olyan pCN expressziós vektorhoz kapcsoltuk, amely már tartalmazza a humán kappa-szakaszt és már tartalmaz egy szignálszekvenciát.
Egy kiméra antitest expresszálását úgy hajtottuk végre, hogy a pCD- és a pCN-alapú plazmidokat COSsejtekbe kotranszfektáltuk. A tenyészet felülúszókat három és öt nap elteltével kinyertük, majd a következők szerinti ELISA útján az immunglobulin-expresszióra nézve vizsgáltuk. Az utolsó lépés kivételével valamennyi lépés után PBS-mosást végeztünk. Mikrotiterlemezeket egy éjszakán keresztül a humanizált antitestek Fc szakaszára specifikus kecskeantitesttel vontunk be (100 ng/50 μΐ/vájat). A mikrotiterlemezekhez hozzáadtuk a tenyészet felülúszókat, majd egyórás inkubálást hajtottunk végre. Ezt követően torma-peroxidázzal konjugált kecske antihumán IgG antitestet adtunk a lemezekhez, majd újabb egyórás inkubálást végeztünk. A követ5 kezd lépésben ABTS peroxidázszubsztrátot (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, Maryland, Amerikai Egyesült Államok) adtunk a lemezekhez, majd egy mikrolemezleolvasó készüléken 405 nm hullámhossz mellett meghatároztuk az abszorbanciát. A kiméra an10 titest expresszióját detektáltuk. Egy hasonló ELISA esetén a kiméra antitestet tartalmazó COS-sejt felülúszók specifikusan kötődtek az olyan mikrotiterváj átokhoz, amelyeket előzetesen humán IL-5 proteinnel vontunk be. Ez az eredmény megerősíti, hogy olyan géneket szin15 tetizáltunk és expresszáltunk, amelyek IL-5-höz kötődő antitestet kódolnak.
A fenti példa egy konkrét konstruált antitest előállítását ismerteti. Hasonló eljárásokat alkalmazva más, szokásos módon kifejlesztett anti-IL-5 antitestek (például
2F2, 2E3, 4A6, 5D3, 24G9 stb. antitestek) alkalmazásával további konstruált antitesteket is előállíthatunk.
Szekvenciákjegyzéke
AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 334bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (ix) JELLEGZETESSÉGEK:
(A) NÉV/KULCS: miscjeature (B) HELYZET: 1...334 (D) EGYÉB ADATOK: /megjegyzés=„Az első bázis a 24-es Kabat-pozíciónak felel meg.” (xi) AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ACCTGGCCTG GTGGCGCCCT CACAGAGCCT GTCCATCACT TGCACTGTCT CTGGGTTTTC 60 ATTAACCAGC TATAGTGTAC ACTGGGTTCG CCAGCCTCCA GGAAAGGGTC TGGAGTGGCT 120 GGGAGTAATA TGGGCTAGTG GAGGCACAGA TTATAATTCG GCTCTCATGT CCAGACTGAG 180 CATCAGCAAA GACAACTCCA AGAGCCAAGT TTTCTTAAAA CTGAACAGTC TGCAAACTGA 240 TGACACAGCC ATGTACTACT GTGCCAGAGA TCCCCCTTCT TCCTTACTAC GGCTTGACTA 300 CTGGGGCCAA GGCACCACTC TCACAGTCTC CTCA 334
A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 315 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (ix) JELLEGZETESSÉGEK:
(A) NÉV/KULCS: mise feature (B) HELYZET: 1...315 (D) EGYÉB ADATOK: /megjegyzés=„Az első bázis a 25-ös Kabat-pozíciónak felel meg.” (xi) A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TCCTCCCTGA GTGTGTCAGC AGGAGAGAAG GTCACTATGA GCTGCAAGTC CAGTCAGAGT 60 CTGTTAAACA GTGGAAATCA AAAGAACTAC TTGGCCTGGT ACCAGCAGAA ACCAGGGCAG 120 CCTCCTAAAC TTTTGATCTA CGGGGCATCC ACTAGGGAAT CTGGGGTCCC TGATCGCTTC 180 ACAGGCAGTG GATCTGGAAC CGATTTCACT CTTTCCATCA GCAGTGTGCA GGCTGAAGAC 240 CTGGCAGTTT ATTACTGTCA GAATGTTCAT AGTTTTCCAT TCACGTTCGG CTCGGGGACA 300 GAGTTGGAAA TAAAA 315
HU 222 992 ΒΙ
A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 334bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (ix) JELLEGZETESSÉGEK:
(A) NÉV/KULCS: miscjeature (B) HELYZET: 1...334 (D) EGYÉB ADATOK: /megjegyzés=,TAz első bázis a 24-es Kabat-pozíciónak felel meg.” (xi) A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ACCTGGCCTG GTGGCGCCCT CACAGAGCCT GTCCATCACT TGCACTGTCT CTGGGTTTTC 60 ATTAACCAGT TATAGTGTAC ACTGGGTTCG CCAGCCTCCA GGAAAGGGTC TGGAGTGGCT 120 GGGAGTAATA TGGGCTAGTG GAGGCACAGA TTATAATTCG GCTCTCATGT CCAGACTGAG 180 CATCAGCAAA GACAACTCCA AGAGCCAAGT TTTCTTAAAA CTGAACAGTC TGCGAACTGA 240 TGACACAGCC ATGTACTACT GTGCCAGAGA TCCCCCTTCT TCCTTACTAC GGCTTGACTA 300 CTGGGGCCAA GGCACCACTC TCACAGTCTC CTCA 334
A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 315 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (ix) JELLEGZETESSÉGEK:
(A) NÉV/KULCS: miscjeature (B) HELYZET: 1...315 (D) EGYÉB ADATOK: /megjegyzés=„Az első bázis a 25-ös Kabat-pozíciónak felel meg.” (xi) A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TCCTCCCTGA GTGTGTCAGC AGGAGAGAAG GTCACTATGA GCTGCAAGTC CAGTCAGAGT 60 CTATTAAACA GTGGAAATCA AAAGAACTAC TTGGCCTGGT ACCAACAGAA ACCAGGGCAG 120 CCTCCTAAAC TTTTGATCTA CGGGGCATCC ACTAGGGAAT CTGGGGTCCC TGATCGCTTC 180 ACAGGCAGTG GATCTGGAAC CGATTTCACT CTTACCATCA GCAGTGTGCA GGCTGAAGAC 240 CTGGCAGTTT ATTACTGTCA GAATGATCAT AGTTTTCCAT TCACGTTCGG CTCGGGGACA 300 GAGTTGGAAA TAAAA 315
AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 334bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (ix) JELLEGZETESSÉGEK:
(A) NÉV/KULCS: mise feature (B) HELYZET: 1...334 (D) EGYÉB ADATOK: /megjegyzés=„Az első bázis a 24-es Kabat-pozíciónak felel meg.” (xi) AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ACCTGGCCTG GTGGCGCCCT CACAGAGCCT GTCCATCACT TGCACTGTCT CTGGGTTTTC 315
ATTAACCAGC TATAGTGTAC ACTGGGTTCG CCAGCCTCCA GGAAAGGGTC TGGAGTGGCT 120 GGGAGTAATC TGGGCTAGTG GAGGCACAGA TTATAATTCG GCTCTCATGT CCAGACTGAG 180 CATCAGCAAA GACAACTCCA AGAGCCAAGT TTTCTTAAAA CTGAACAGTC TGCAAACTGA 240 TGACGCAGCC ATGTACTACT GTGCCAGAGA TCCCCCTTTT TCCTTACTAC GGCTTGACTT 300 CTGGGGCCAA GGCACCACTC TCACAGTCTC CTCA 334
A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 315 bázispár
HU 222 992 Bl (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (ix) JELLEGZETESSÉGEK:
(A) NÉV/KULCS: miscfeature (B) HELYZET: 1...315 (D) EGYÉB ADATOK: /megjegyzés=„Az első bázis a 25-ös Kabat-pozíciónak felel meg.” (xi) A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TCCTCTCTGA GTGTGTCAGC AGGAGAGAAG GTCACTATGA GCTGCAAGTC CAGTCAGAGT CTGTTAAACA GTGGAAATCA AAAAAACTAC TTGGCCTGGT ACCAGCAGAA ACCAGGGCAG CCTCCTAAAC TTTTGATCTA CGGGGCATCC ACTAGGGAAT CTGGGGTCCC TGATCGCTTC ACAGGCAGTG GATCTGGAAC CGATTTCACT CTTACCATCA GCAGTGTGCA GGCTGAAGAC CTGGCAGTTT ATTACTGTCA GAATGATCAT AGTTTTCCAT TCACGTTCGG CTCGGGGACA GAGTTGGAAA TAAAA
A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 5 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Ser Tyr Ser Val Hi s 1 5
A 8. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 16 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 8. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Val Ile Trp Alá Ser Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Ser Alá Leu Met Ser
10 15
A 9. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 11 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 9. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Asp Pro Pro Ser Ser Leu Leu Arg Leu Asp Tyr
5 10
A 10. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 17 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein
120
180
240
300
315
HU 222 992 Bl (xi) A 10. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn
5
Ser Gly Asn Gin 10
Lys Asn Tyr 15
Leu
Al a
A 11. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 7 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) All. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Gly Alá Ser Thr Arg Glu Ser 1 5
A 12. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI :
(A) HOSSZ: 9 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 12. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Gin Asn Val His Ser Phe Pro Phe Thr 1 5
A 13. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 9 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 13. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Gin Asn Asp His Ser Phe Pro Phe Thr 1 5
A 14. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 11 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 14. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Asp Pro Pro Phe Ser Leu Leu Arg Leu Asp Phe
1 5 10
A 15. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Gin Val Gin Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Al a Pro Ser Gin
1 5 10 15
Ser Leu Ser lle Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Ser Val Hi s Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Ly s Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
HU 222 992 Bl
Gly Val Ile Trp Al a Ser Gly G1 y Thr Asp Tyr Asn Ser Al a Leu Me t
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Leu Asn Ser Leu Gin Thr As p Asp Thr Al a Me t Tyr Tyr Cys Al a
85 90 95
Arg As p Pro Pro Ser Ser Leu Leu Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
A 16. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 113 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 16. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: Ser Ser 10 Leu Ser Val Ser Al a 15 Gly
Asp 1 Ile Val Met Thr 5 Gin Ser Pro
Glu Lys Val Thr 20 Me t Ser Cys Lys Ser 25 Ser Gin Ser Leu Leu 30 Asn Ser
Gly Asn Gin Lys 35 Asn Tyr Leu Al a 40 Trp Tyr Gin Gin Lys 45 Pro Gly Gin
Pro Pro Lys Leu 50 Leu Ile Tyr 55 Gly Alá Ser Thr Arg 60 Glu Ser Gly Val
Pro 65 Asp Arg Phe Thr Gly 70 Ser Gly Ser Gly Thr 75 Asp Phe Thr Leu Ser 80
Ile Ser Ser Val Gin 85 Al a Glu Asp Leu Al a 90 Val Tyr Tyr Cys Gin 95 Asn
Val His Ser Phe 100 Pro Phe Thr Phe Gly 105 Ser Gly Thr Glu Leu 110 Glu Ile
Lys
A 17. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 60bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 17. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ATGGTGTTGC AGACCCAGGT CTTCATTTCT CTGTTGCTCT GGATCTCTGG TGCCTACGGG
A 18. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 357 bázispár (B) TÍPUS : nukleinsav
HU 222 992 Bl (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 18. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CAGGTTACCC TGCGTGAATC CGGTCCGGCA ACCTGCACCG TCTCCGGTTT CTCCCTGACG CCGGGTAAAG GTCTAGAATG GCTGGGTGTA TCGGCTCTCA TGTCCCGTCT GTCGATATCC ACCATGACTA ACATGGACCC GGTTGACACC TCTTCCTTAC TACGGCTTGA CTACTGGGGT
CTAGTTAAAC CGACCCAGAC CCTGACGTTA AGCTATAGTG TACACTGGGT CCGTCAGCCG ATATGGGCTA GTGGAGGCAC AGATTATAAT AAAGACACCT CCCGTAACCA GGTTGTTCTG GCTACCTACT ACTGCGCTCG AGATCCCCCT CGTGGTACCC CAGTTACCGT GAGCTCA
120
180
240
300
357
A 19. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 119 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 19. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Gin Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Al a Leu Val Lys Pro Thr Gin
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cy s Thr Va 1 Ser Gly Phe Ser Leu Th r Ser Tyr
20 25 30
Ser Val His Trp Val Arg Gin Pro Pro G1 y Ly s Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Al a Ser Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Ser Al a Leu Me t
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gin Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Me t Thr Asn Me t Asp Pro Va 1 Asp Thr Al a Thr Tyr Tyr Cy s Al a
85 90 95
Arg Asp Pro Pr o Ser Ser Leu Leu Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Arg Gly
100 105 110
Thr Pro Val Thr Va 1 Ser Ser
115
A 20. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 339 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 20. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GATATCGTGA TGACCCAGTC TCCAGACTCG CTAGCTGTGT ATCAACTGCA AGAGCTCTCA GAGTCTGTTA AACAGTGGAA TGGTATCAGC AGAAACCCGG GCAGCCTCCT AAGTTGCTCA GAATCTGGGG TACCTGACCG ATTCAGTGGC AGCGGGTCTG ATCAGCAGCC TGCAGGCTGA AGATGTGGCA GTATACTACT CCATTCACGT TCGGCGGAGG GACCAAGTTG GAGATCAAA
CTCTGGGCGA GAGGGCCACC ATCAAAAGAA CTACTTGGCC TTTACGGGGC GTCGACTAGG GGACAGATTT CACTCTCACC GTCAGAATGT TCATAGTTTT
120
180
240
300
339
HU 222 992 Bl
A 21. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 113 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein
(xi) A 21. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: Ser 10 Leu Alá Val Ser Leu 15 Gly
Asp 1 Ile Val Me t Thr 5 Gin Ser Pro As p
Glu Arg Al a Thr 20 Ile Asn Cys Ly s Ser 25 Ser Gin Ser Leu Leu 30 Asn Ser
Gly Asn Gin 35 Lys Asn Tyr Leu Al a 40 Trp Tyr Gin Gin Lys 45 Pro G1 y Gin
Pro Pro 50 Lys Leu Leu Ile Tyr 55 Gly Al a Ser Thr Arg 60 Glu Ser Gly Val
Pro 65 Asp Arg Phe Ser Gly 70 Ser Gly Ser Gly Thr 75 Asp Phe Thr Leu Thr 80
Ile Ser Ser Leu Gin 85 Al a Glu Asp Val Al a 90 Val Tyr Tyr Cy s Gin 95 Asn
Val His Ser Phe 100 Pro Phe Thr Phe Gly 105 Gly Gly Thr Lys Leu 110 Glu Ile
Lys
A 22. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 29 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 22. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GTACATATGC AAGGCTTACA ACCACAATC 29
A 23. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 32 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 23. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GGACAGGGCT TACTAGTGGG CCCTCTGGGC TC 32
A 24. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 23 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 24. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AGGTSMARCT KTCTCGAGTC WGG 2 3
HU 222 992 Bl
A 25. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 36 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 25. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CTAACACTCA TTCCTGTTGA AGCTCTTGAC AATGGG 36
A 26. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 32 bázispár (B) TÍPUS : nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 26. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CCAGATGTGA GCTCGTGATG ACCCAGACTC CA 32
A 27. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 140 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 27. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AACCTGCAAC GTCTCCGGTT TCTCCCTGAC GAGCTATAGT GTACACTGGG TCCGTCAGCC 60
GCCGGGTAAA GGTCTAGAAT GGCTGGGTGT AATATGGGCT AGTGGAGGCA CAGATTATAA 120 TTCGGCTCTC ATGTCCCGTC 140
A 28. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 149 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 28. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ATATCGACAG ACGGGACATG AGAGCCGAAT TATAATCTGT GCCTCCACTA GCCCATATTA 60 CACCCAGCCA TTCTAGACCT TTACCCGGCG GCTGACGGAC CCAGTGTACA CTATAGCTCG 120 TCAGGGAGAA ACCGGAGACG GTGCAGGTT 149
A 29. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 139 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 29. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TGTCGATATC CAAAGACACC TCCCGTAACC AGGTTGTTCT GACCATGACT AACATGGACC 60 CGGTTGACAC CGCTACCTAC TACTGCGCTC GAGATCCCCC TTCTTCCTTA CTACGGCTTG 120 ACTACTGGGG TCGTGGTAC 139
A 30. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 126 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav
HU 222 992 Bl (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 30. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CACGACCCCA GTAGTCAAGC CGTAGTAAGG AAGAAGGGGG ATCTCGAGCG CAGTAGTAGG TAGCGGTGTC AACCGGGTCC ATGTTAGTCA TGGTCAGAAC AACCTGGTTA CGGGAGGTGT CTTTGG
A 31. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 117 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 31. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CTCAGAGTCT GTTAAACAGT GGAAATCAAA AGAACTACTT GGCCTGGTAT CAGCAGAAAC CCGGGCAGCC TCCTAAGTTG CTCATTTACG GGGCGTCGAC TAGGGAATCT GGGGTAC
A 32. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 117 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 32. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CCCAGATTCC CTAGTCGACG CCCCGTAAAT GAGCAACTTA GGAGGCTGCC CGGGTTTCTG CTGATACCAG GCCAAGTAGT TCTTTTGATT TCCACTGTTT AACAGACTCT GAGAGCT
A 33. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 102 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 33. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GCTGAAGATG TGGCAGTATA CTACTGTCAG AATGTTCATA GTTTTCCATT CACGTTCGGC GGAGGGACCA AGTTGGAGAT CAAACGTACT GTGGCGGCGC CA
A 34. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 111 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 34. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AGCTTGGCGC CGCCACAGTA CGTTTGATCT CCAACTTGGT CCCTCCGCCG AACGTGAATG GAAAACTATG AACATTCTGA CAGTAGTATA CTGCCACATC TTCAGCCTGC A
A 35. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 82 bázispár (B) TÍPUS : nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális)
120
126
117
117
102
111
HU 222 992 Bl (xi) A 35. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ATGGTGTTGC AGACCCAGGT CTTCATTTCT CTGTTGCTCT GGATCTCTGG TGCCTACGGG 60 CAGGTTCAAC TGAAAGAGTC AG 82
A 36. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 89 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 36. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GTCCTGACTC TTTCAGTTGA ACCTGCCCGT AGGCACCAGA GATCCAGAGC AACAGAGAAA 60 TGAAGACCTG GGTCTGCAAC ACCATGTTG 89
A 37. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 45 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 37. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CAAGGCACCA CTCTCACAGT CTCCTCAGCT AGTACGAAGG GCCCA 45
A 38. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 43 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 38. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AGCTTGGGCC CTTCGTACTA GCTGAGGAGA CTGTGAGTGG TGC 43
A 39. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 28 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 39. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ATCGTGATGA CCCAGTCTCC ATCCTCCC 28
A 40. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 31 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 40. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TCAGGGAGGA TGGAGACTGG GTCATCACGA T 31
A 41. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 43 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú
HU 222 992 Bl (D)TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 41. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TCGGGGGACA GAGTTGGAAA TAAAACGTAC TGTGGCGGCG CCA
A 42. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 42 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 42. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AGCTTGGCGC CGCCACAGTA CGTTTTATTT CCAACTCTGT CC
A 43. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 26 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 43. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CTAGCCACCA CCACCACCAC CACTAA
A 44. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 26 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 44. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CTAGTTAGTG GTGGTGGTGG TGGTGG
A 45. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 113 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 45. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Glu 1 Leu Val Me t Thr 5 Gin Ser Pro
Glu Lys Val Thr 20 Me t Ser Cy s Lys
Gly Asn Gin 35 Lys Asn Tyr Leu Al a 40
Pro Pr o 50 Lys Leu Leu Ile Tyr 55 Gly
Pro 65 Asp Arg Phe Thr Gly 70 Ser Gly
Ile Ser Ser Val Gin 85 Al a Glu As p
Ser Ser 10 Leu Ser Val Ser Al a 15 Gly
Ser 25 Ser Gin Ser Leu Leu 30 Asn Ser
Trp Tyr Gin Gin Lys 45 Pro Gly Gin
Al a Ser Thr Arg 60 Glu Ser Gly Val
Ser Gly Thr 75 Asp Phe Thr Leu Thr 80
Leu Al a 90 Val Tyr Tyr Cy s Gin 95 Asn
HU 222 992 Bl
Asp His Ser Tyr Pro Phe Thr 100
Phe Gly Ser 105
Gly Thr
Lys Leu Glu 110
Ile
A 46. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 113 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 46. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Glu 1 Leu Val Me t Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Val Ser Al a 15 Gly
Glu Lys Val Thr 20 Me t Ser Cys Lys Ser 25 Ser Gin Ser Leu Leu 30 Asn Ser
Gly Asn Gin 35 Lys Asn Tyr Leu Al a 40 Trp Tyr Gin Gin Lys 45 Pro Gly Gin
Pro Pro 50 Lys Leu Leu Ile Tyr 55 Gly Al a Ser Thr Arg 60 Glu Ser Gly Val
Pro 65 Asp Arg Phe Thr Gly 70 Ser Gly Ser Gly Thr 75 Asp Phe Thr Leu Thr 80
Ile Ser Ser Val Gin 85 Al a Glu Asp Leu Al a 90 Val Tyr Tyr Cy s Gin 95 Asn
Asp Tyr Ser Tyr 100 Pro Phe Thr Phe Gly 105 Ser Gly Thr Lys Leu 110 Glu Ile
A 47. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 9 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 47. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Gin Asn Asp His Ser Tyr Pro Phe Thr 1 5
A 48. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 9 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 48. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Gin Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr 1 5
HU 222 992 ΒΙ
A 49. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 6285 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: kétszálú (D) TOPOLÓGIA: cirkuláris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 49. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GACGTCGCGG CCGCTCTAGG CCTCCAAAAA AGGCCGAGGC GGCCTCGGCC TCTGCATAAA GGAGAATGGG CGGAACTGGG CGGAGTTAGG ATGGTTGCTG ACTAATTGAGATGCATGCTT GACTTTCCAC ACCTGGTTGC TGACTAATTG GGGGAGCCTG GGGACTTTCC ACACCCTAAC GGATCGATCC GTCGACGTAC GACTAGTTAT CATAGCCCAT ATATGGAGTT CCGCGTTACA CCGCCCAACG ACCCCCGCCC ATTGACGTCA ATAGGGACTT TCCATTGACG TCAATGGGTG GTACATCAAG TGTATCATAT GCCAAGTACG CCCGCCTGGC ATTATGCCCA GTACATGACC TACGTATTAG TCATCGCTAT TACCATGGTG GGATAGCGGT TTGACTCACG GGGATTTCCA TTGTTTTGGC ACCAAAATCA ACGGGACTTT ACGCAAATGG GCGGTAGGCG TGTACGGTGG AACCGTCAGA TCGCCTGGAG ACGCCATCGA GACCCAGGTC TTCATTTCTC TGTTGCTCTG GCGTGAATCC GGTCCGGCAC TAGTTAAACC CTCCGGTTTC TCCCTGACGA GCTATAGTGT TCTAGAATGG CTGGGTGTAA TATGGGCTAG GTCCCGTCTG TCGATATCCA AAGACACCTC CATGGACCCG GTTGACACCG CTACCTACTA ACGGCTTGAC TACTGGGGTC GTGGTACCCC CCCATCGGTC TTCCCCCTGG CACCCTCCTC GGGCTGCCTG GTCAAGGACT ACTTCCCCGA CCTGACCAGC GGCGTGCACA CCTTCCCGGC CAGCAGCGTG GTGACCGTGC CCTCCAGCAG GAATCACAAG CCCAGCAACA CCAAGGTGGA AACTCACACA TGCCCACCGT GCCCAGCACC CTTCCCCCCA AAACCCAAGG ACACCCTCAT GGTGGTGGAC GTGAGCCACG AAGACCCTGA GGAGGTGCAT AATGCCAAGA CAAAGCCGCG GGTCAGCGTC CTCACCGTCC TGCACCAGGA GGTCTCCAAC AAAGCCCTCC CAGCCCCCAT GCCCCGAGAA CCACAGGTGT ACACCCTGCC GGTCAGCCTG ACCTGCCTGG TCAAAGGCTT GAGCAATGGG CAGCCGGAGA ACAACTACAA CTCCTTCTTC CTCTATAGCA AGCTCACCGT CTTCTCATGC TCCGTGATGC ATGAGGCTCT CCTGTCTCCG GGTAAGTGAG TGTAGTCTAG TCTAGTTGCC AGCCATCTGT TGTTTGCCCC GCCACTCCCA CTGTCCTTTC CTAATAAAAT TGTCATTCTA TTCTGGGGGG TGGGGTGGGG AATAGCAGGC ATGCTGGGGA TGCGGTGGGC TGGATCTCCC GATCCCCAGC TTTGCTTCTC GAAAATTAAT TTTAACACCA ATTCAGTAGT GCTTTAGAGA CAGTGTTCTC TGCACAGATA GAGCTGAGAC TCCTAAGCCA GTGAGTGGCA CACCGAAGCC TGATTCCGTA GAGCCACACC AGAGAGGGCA GGAGCCAGGG CAGAGCATAT TTTGCTTCTG ACATAGTTGT GTTGGGAGCT
AGCCTCCTCA CTACTTCTGG AATAGCTCAG 60 TAAAAAAAAT TAGTCAGCCA TGCATGGGGC 120 GGCGGGATGG GCGGAGTTAG GGGCGGGACT 180 TGCATACTTC TGCCTGCTGG GGAGCCTGGG 240 AGATGCATGC TTTGCATACT TCTGCCTGCT 300 TGACACACAT TCCACAGAAT TAATTCCCGG 360 TAATAGTAAT CAATTACGGG GTCATTAGTT 420 TAACTTACGG TAAATGGCCC GCCTGGCTGA 480 ATAATGACGT ATGTTCCCAT AGTAACGCCA 540 GACTATTTAC GGTAAACTGC CCACTZGGCA 600 CCCCCTATTG ACGTCAATGA CGGTAAATGG 660 TTATGGGACT TTCCTACTTG GCAGTACATC 720 ATGCGGTTTT GGCAGTACAT CAATGGGCGT 780 AGTCTCCACC CCATTGACGT CAATGGGAGT 840 CCAAAATGTC GTAACAACTC CGCCCCATTG 900 GAGGTCTATA TAAGCAGAGC TGGGTACGTG 960 ATTCGAGGAC GCCAGCAACA TGGTGTTGCA 1020 GATCTCTGGT GCCTACGGGC AGGTTACCCT 1080 GACCCAGACC CTGACGTTAA CCTGCACCGT 1140 ACACTGGGTC CGTCAGCCGC CGGGTAAAGG 1200 TGGAGGCACA GATTATAATT CGGCTCTCAT 1260 CCGTAACCAG GTTGTTCTGA CCATGACTAA 1320 CTGCGCTCGA GATCCCCCTT CTTCCTTACT 1380 AGTTACCGTG AGCTCAGCTA GTACCAAGGG 1440 CAAGAGCACC TCTGGGGGCA CAGCGGCCCT 1500 ACCGGTGACG GTGTCGTGGA ACTCAGGCGC 1560 TGTCCTACAG TCCTCAGGAC TCTACTCCCT 1620 CTTGGGCACC CAGACCTACA TCTGCAACGT 1680 CAAGAGAGTT GAGCCCAAAT CTTGTGACAA 1740 TGAACTCCTG GGGGGACCGT CAGTCTTCCT 1800 GATCTCCCGG ACCCCTGAGG TCACATGCGT 1860 GGTCAAGTTC AACTGGTACG TGGACGGCGT 1920 GGAGGAGCAG TACAACAGCA CGTACCGTGT 1980 CTGGCTGAAT GGCAAGGAGT ACAAGTGCAA 2040 CGAGAAAACC ATCTCCAAAG CCAAAGGGCA 2100 CCCATCCCGG GAGGAGATGA CCAAGAACCA 2160 CTATCCCAGC GACATCGCCG TGGAGTGGGA 2220 GACCACGCCT CCCGTGCTGG ACTCCGACGG 2280 GGACAAGAGC AGGTGGCAGC AGGGGAACGT 2340 GCACAACCAC TACACGCAGA AGAGCCTCTC 2400 ATCTACGTAT GATCAGCCTC GACTGTGCCT 2460 TCCCCCGTGC CTTCCTTGAC CCTGGAAGGT 2520 GAGGAAATTG CATCGCATTG TCTGAGTAGG 2580 CAGGACAGCA AGGGGGAGGA TTGGGAAGAC 2640 TCTATGGAAC CAGCTGGGGC TCGACAGCGC 2700 AATTTCTTAT TTGCATAATG AGAAAAAAAG 2760 TGATTGAGCA AATGCGTTGC CAAAAAGGAT 2820 AGGACAAACA TTATTCAGAG GGAGTACCCA 2880 CAGCATTCTA GGGAGAAATA TGCTTGTCAT 2940 TTGGTAAGGG CCAATCTGCT CACACAGGAT 3000 AAGGTGAGGT AGGATCAGTT GCTCCTCACA 3060 TGGATAGCTT GGACAGCTCA GGGCTGCGAT 3120
HU 222 992 Bl
TTCGCGCCAA
CATCATGGTT
GAACGGAGAC
CACAACCTCT
CTCCATTCCT
ACTCAAAGAA
ACTTATTGAA
TTCTGTTTAC
CATGCAGGAA
TCTCCCAGAA
GTTTGAAGTC
CCTAAAGCTA
CTGTGCCTTC
TGGAAGGTGC
TGAGTAGGTG
GGGAAGACAA
GATCGAGTGT
CTGTTTCCTG
ATAAAGTGTA
TCACTGCCCG
CGCGCGGGGA
CTGCGCTCGG
TTATCCACAG
GCCAGGAACC
GAGCATCACA
TACCAGGCGT
ACCGGATACC
TGTAGGTATC
CCCGTTCAGC
AGACACGACT
GTAGGCGGTG
GTATTTGGTA
TGATCCGGCA
ACGCGCAGAA
CAGTGGAACG
ACCTAGATCC
ACTTGGTCTG
TTTCGTTCAT
TTACCATCTG
TTATCAGCAA
TCCGCCTCCA
AATAGTTTGC
GGTATGGCTT
TTGTGCAAAA
GCAGTGTTAT
GTAAGATGCT
CGGCGACCGA
ACTTTAAAAG
CCGCTGTTGA
TTTACTTTCA
GGAATAAGGG
AGCATTTATC
AAACAAATAG
ACTTGACGGC
CGACCATTGA
CTACCCTGGC
TCAGTGGAAG
GAGAAGAATC
CCACCACGAG
CAACCGGAAT
CAGGAAGCCA
TTTGAAAGTG
TACCCAGGCG
TACGAGAAGA
TGCATTTTTA
TAGTTGCCAG
CACTCCCACT
TCATTCTATT
TAGCAGGCAT
ATGACTGCGG
TGTGAAATTG
AAGCCTGGGG
CTTTCCAGTC
GAGGCGGTTT
TCGTTCGGCT
AATCAGGGGA
GTAAAAAGGC
AAAATCGACG
TTCCCCCTGG
TGTCCGCCTT
TCAGTTCGGT
CCGACCGCTG
TATCGCCACT
CTACAGAGTT
TCTGCGCTCT
AACAAACCAC
AAAAAGGATC
AAAACTCACG
TTTTAAATTA
ACAGTTACCA
CCATAGTTGC
GCCCCAGTGC
TAAACCAGCC
TCCAGTCTAT
GCAACGTTGT
CATTCAGCTC
AAGCGGTTAG
CACTCATGGT
TTTCTGTGAC
GTTGCTCTTG
TGCTCATCAT
GATCCAGTTC
CCAGCGTTTC
CGACACGGAA
AGGGTTATTG
GGGTTCCGCG
AATCCTAGCG
ACTGCATCGT
CTCCGCTCAG
GTAAACAGAA
GACCTTTAAA
GAGCTCATTT
TGGCAAGTAA
TGAATCAACC
ACACGTTTTT
TCCTCTCTGA
AAGACTAACA
TAAGACCATG
CCATCTGTTG
GTCCTTTCCT
CTGGGGGGTG
GCTGGGGATG
CCGCGATCCC
TTATCCGCTC
TGCCTAATGA
GGGAAACCTG
GCGTATTGGG
GCGGCGAGCG
TAACGCAGGA
CGCGTTGCTG
CTCAAGTCAG
AAGCTCCCTC
TCTCCCTTCG
GTAGGTCGTT
CGCCTTATCC
GGCAGCAGCC
CTTGAAGTGG
GCTGAAGCCA
CGCTGGTAGC
TCAAGAAGAT
TTAAGGGATT
AAAATGAAGT
ATGCTTAATC
CTGACTCCCC
TGCAATGATA
AGCCGGAAGG
TAATTGTTGC
TGCCATTGCT
CGGTTCCCAA
CTCCTTCGGT
TATGGCAGCA
TGGTGAGTAC
CCCGGCGTCA
TGGAAAACGT
GATGTAACCC
TGGGTGAGCA
ATGTTGAATA
TCTCATGAGC
CACATTTCCC
TGAAGGCTGG
CGCCGTGTCC
GAACGAGTTC
TCTGGTGATT
GGACAGAATT
TCTTGCCAAA
AGTAGACATG
AGGCCACCTT
CCCAGAAATT
GGTCCAGGAG
GGAAGATGCT
GGACTTTTGC
TTTGCCCCTC
AATAAAATGA
GGGTGGGGCA
CGGTGGGCTC
GTCGAGAGCT
ACAATTCCAC
GTGAGCTAAC
TCGTGCCAGC
CGCTCTTCCG
GTATCAGCTC
AAGAACATGT
GCGTTTTTCC
AGGTGGCGAA
GTGCGCTCTC
GGAAGCGTGG
CGCTCCAAGC
GGTAACTATC
ACTGGTAACA
TGGCCTAACT
GTTACCTTCG
GGTGGTTTTT
CCTTTGATCT
TTGGTCATGA
TTTAAATCAA
AGTGAGGCAC
GTCGTGTAGA
CCGCGAGACC
GCCGAGCGCA
CGGGAAGCTA
ACAGGCATCG
CGATCAAGGC
CCTCCGATCG
CTGCATAATT
TCAACCAAGT
ATACGGGATA
TCTTCGGGGC
ACTCGTGCAC
AAAACAGGAA
CTCATACTCT
GGATACATAT
CGAAAAGTGC
TAGGATTTTA
CAAAATATGG
AAGTACTTCC
ATGGGTAGGA
AATATAGTTC
AGTTTGGATG
GTTTGGATAG
AGACTCTTTG
GATTTGGGGA
GAAAAAGGCA
TTCAAGTTCT
TGGCTTTAGA
CCCCGTGCCT
GGAAATTGCA
GGACAGCAAG
TATGGAACCA
TGGCGTAATC
ACAACATACG
TCACATTAAT
TGCATTAATG
CTTCCTCGCT
ACTCAAAGGC
GAGCAAAAGG
ATAGGCTCCG
ACCCGACAGG
CTGTTCCGAC
CGCTTTCTCA
TGGGCTGTGT
GTCTTGAGTC
GGATTAGCAG
ACGGCTACAC
GAAAAAGAGT
TTGTTTGCAA
TTTCTACGGG
GATTATCAAA
TCTAAAGTAT
CTATCTCAGC
TAACTACGAT
CACGCTCACC
GAAGTGGTCC
GAGTAAGTAG
TGGTGTCACG
GAGTTACATG
TTGTCAGAAG
CTCTTACTGT
CATTCTGAGA
ATACCGCGCC
GAAAACTCTC
CCAACTGATC
GGCAAAATGC
TCCTTTTTCA
TTGAATGTAT
CACCT
TCCCCGCTGC
GGATTGGCAA
AAAGAATGAC
AAACCTGGTT
TCAGTAGAGA
ATGCCTTAAG
TCGGAGGCAG
TGACAAGGAT
AATATAAACT
TCAAGTATAA
CTGCTCCCCT
TCAGCCTCGA
TCCTTGACCC
TCGCATTGTC
GGGGAGGATT
GCTGGGGCTC
ATGGTCATAG
AGCCGGAAGC
TGCGTTGCGC
AATCGGCCAA
CACTGACTCG
GGTAATACGG
CCAGCAAAAG
CCCCCCTGAC
ACTATAAAGA
CCTGCCGCTT
ATGCTCACGC
GCACGAACCC
CAACCCGGTA
AGCGAGGTAT
TAGAAGGACA
TGGTAGCTCT
GCAGCAGATT
GTCTGACGCT
AAGGATCTTC
ATATGAGTAA
GATCTGTCTA
ACGGGAGGGC
GGCTCCAGAT
TGCAACTTTA
TTCGCCAGTT
CTCGTCGTTT
ATCCCCCATG
TAAGTTGGCC
CATGCCATCC
ATAGTGTATG
ACATAGCAGA
AAGGATCTTA
TTCAGCATCT
CGCAAAAAAG
ATATTATTGA
TTAGAAAAAT
3180
3240
3300
3360
3420
3480
3540
3600
3660
3720
3780
3840
3900
3960
4020
4080
4140
4200
4260
4320
4380
4440
4500
4560
4620
4680
4740
4800
4860
4920
4980
5040
5100
5160
5220
5280
5340
5400
5460
5520
5580
5640
5700
5760
5820
5880
5940
6000
6060
6120
6180
6240
6285
AZ 50. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 5703 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: kétszálú (D) TOPOLÓGIA: cirkuláris
HU 222 992 Bl (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) Az 50. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GACGTCGCGG CCGCTCTAGG CCTCCAAAAA AGGCCGAGGC GGCCTCGGCC TCTGCATAAA GGAGAATGGG CGGAACTGGG CGGAGTTAGG ATGGTTGCTG ACTAATTGAG ATGCATGCTT GACTTTCCAC ACCTGGTTGC TGACTAATTG GGGGAGCCTG GGGACTTTCC ACACCCTAAC GGATCGATCC GTCGACGTAC GACTAGTTAT CATAGCCCAT ATATGGAGTT CCGCGTTACA CCGCCCAACG ACCCCCGCCC ATTGACGTCA ATAGGGACTT TCCATTGACG TCAATGGGTG GTACATCAAG TGTATCATAT GCCAAGTACG CCCGCCTGGC ATTATGCCCA GTACATGACC TACGTATTAG TCATCGCTAT TACCATGGTG GGATAGCGGT TTGACTCACG GGGATTTCCA TTGTTTTGGC ACCAAAATCA ACGGGACTTT ACGCAAATGG GCGGTAGGCG TGTACGGTGG AACCGTCAGA TCGCCTGGAG ACGCCATCGA TGCAGACCCA GGTCTTCATT TCTCTGTTGC TGATGACCCA GTCTCCAGAC TCGCTAGCTG GCAAGAGCTC TCAGAGTCTG TTAAACAGTG AGCAGAAACC CGGGCAGCCT CCTAAGTTGC GGGTACCTGA CCGATTCAGT GGCAGCGGGT GCCTGCAGGC TGAAGATGTG GCAGTATACT CGTTCGGCGG AGGGACCAAG TTGGAGATCA TCTTCCCGCC ATCTGATGAG CAGTTGAAAT ATAACTTCTA TCCCAGAGAG GCCAAAGTAC GTAACTCCCA GGAGAGTGTC ACAGAGCAGG GCACCCTGAC GCTGAGCAAA GCAGACTACG CCCATCAGGG CCTGAGCTCG CCCGTCACAA AGATCCGTTA TCTACGTATG ATCAGCCTCG GTTTGCCCCT CCCCCGTGCC TTCCTTGACC TAATAAAATG AGGAAATTGC ATCGCATTGT GGGGTGGGGC AGGACAGCAA GGGGGAGGAT GCGGTGGGCT CTATGGAACC AGCTGGGGCT TTCTTATTTG CATAATGAGA AAAAAAGGAA TTGAGCAAAT GCGTTGCCAA AAAGGATGCT ACAAACATTA TTCAGAGGGA GTACCCAGAG CATTCTAGGG AGAAATATGC TTGTCATCAC GTAAGGGCCA ATCTGCTCAC ACAGGATAGA GTGAGGTAGG ATCAGTTGCT CCTCACATTT ATCGATCCAC CATGGTTGAA CAAGATGGAT AGAGGCTATT CGGCTATGAC TGGGCACAAC TCCGGCTGTC AGCGCAGGGG CGCCCGGTTC TGAATGAACT GCAGGACGAG GCAGCGCGGC GCGCAGCTGT GCTCGACGTT GTCACTGAAG TGCCGGGGCA GGATCTCCTG TCATCTCACC CTGATGCAAT GCGGCGGCTG CATACGCTTG CGAAACATCG CATCGAGCGA GCACGTACTC ATCTGGACGA AGAGCATCAG GGGCTCGCGC GCATGCCCGA CGGCGAGGAT CTCGTCGTGA TGGTGGAAAA TGGCCGCTTT TCTGGATTCA GCTATCAGGA CATAGCGTTG GCTACCCGTG CTGACCGCTT CCTCGTGCTT TACGGTATCG ATCGCCTTCT TGACGAGTTC TTCTGAGCGG GACGCCCAAC CTGCCATCAC GAGATTTCGA CTTCGGAATC GTTTTCCGGG ACGCCGGCTG GGAGTTCTTC GCCCACCCCA ACTTGTTTAT TAGCATCACA AATTTCACAA ATAAAGCATT
AGCCTCCTCA CTACTTCTGG AATAGCTCAG 60 TAAAAAAAAT TAGTCAGCCA TGCATGGGGC 120 GGCGGGATGG GCGGAGTTAG GGGCGGGACT 180 TGCATACTTC TGCCTGCTGG GGAGCCTGGG 240 AGATGCATGC TTTGCATACT TCTGCCTGCT 300 TGACACACAT TCCACAGAAT TAATTCCCGG 360 TAATAGTAAT CAATTACGGG GTCATTAGTT 420 TAACTTACGG TAAATGGCCC GCCTGGCTGA 480 ATAATGACGT ATGTTCCCAT AGTAACGCCA 540 GACTATTTAC GGTAAACTGC CCACTTGGCA 600 CCCCCTATTG ACGTCAATGA CGGTAAATGG 660 TTATGGGACT TTCCTACTTG GCAGTACATC 720 ATGCGGTTTT GGCAGTACAT CAATGGGCGT 780 AGTCTCCACC CCATTGACGT CAATGGGAGT 840 CCAAAATGTC GTAACAACTC CGCCCCATTG 900 GAGGTCTATA TAAGCAGAGC TGGGTACGTG 960 ATTCATTGAT AGGATCCAGC AAGATGGTGT 1020 fCTGGATCTC TGGTGCCTAC GGGGATATCG 1080 TGTCTCTGGG CGAGAGGGCC ACCATCAACT 1140 GAAATCAAAA GAACTACTTG GCCTGGTATC 1200 TCATTTACGG GGCGTCGACT AGGGAATCTG 1260 CTGGGACAGA TTTCACTCTC ACCATCAGCA 1320 ACTGTCAGAA TGTTCATAGT TTTCCATTCA 1380 AACGTACTGT GGCGGCGCCA TCTGTCTTCA 1440 CTGGAACTGC CTCTGTTGTG TGCCTGCTGA 1500 AGTGGAAGGT GGATAACGCC CTCCAATCGG 1560 ACAGCAAGGA CAGCACCTAC AGCCTCAGCA 1620 AGAAACACAA AGTCTACGCC TGCGAAGTCA 1680 AGAGCTTCAA CAGGGGAGAG TGTTAATTCT 1740 ACTGTGCCTT CTAGTTGCCA GCCATCTGTT 1800 CTGGAAGGTG CCACTCCCAC TGTCCTTTCC 1860 CTGAGTAGGT GTCATTCTAT TCTGGGGGGT 1920 TGGGAAGACA ATAGCAGGCA TGCTGGGGAT 1980 CGACAGCTCG AGCTAGCTTT GCTTCTCAAT 2040 AATTAATTTT AACACCAATT CAGTAGTTGA 2100 TTAGAGACAG TGTTCTCTGC ACAGATAAGG 2160 CTGAGACTCC TAAGCCAGTG AGTGGCACAG 2220 CGAAGCCTGA TTCCGTAGAG CCACACCTTG 2280 GAGGGCAGGA GCCAGGGCAG AGCATATAAG 2340 GCTTCTGACA TAGTTGTGTT GGGAGCTTGG 2400 TGCACGCAGG TTCTCCGGCC GCTTGGGTGG 2460 AGACAATCGG CTGCTCTGAT GCCGCCGTGT 2520 TTTTTGTCAA GACCGACCTG TCCGGTGCCC 2580 TATCGTGGCT GGCCACGACG GGCGTTCCTT 2640 CGGGAAGGGA CTGGCTGCTA TTGGGCGAAG 2700 TTGCTCCTGC CGAGAAAGTA TCCATCATGG 2760 ATCCGGCTAC CTGCCCATTC GACCACCAAG 2820 GGATGGAAGC CGGTCTTGTC GATCAGGATG 2880 CAGCCGAACT GTTCGCCAGG CTCAAGGCGC 2940 CCCATGGCGA TGCCTGCTTG CCGAATATCA 3000 TCGACTGTGG CCGGCTGGGT GTGGCGGACC 3060 ATATTGCTGA AGAGCTTGGC GGCGAATGGG 3120 CCGCTCCCGA TTCGCAGCGC ATCGCCTTCT 3180 GACTCTGGGG TTCGAAATGA CCGACCAAGC 3240 TTCCACCGCC GCCTTCTATG AAAGGTTGGG 3300 GATGATCCTC CAGCGCGGGG ATCTCATGCT 3360 TGCAGCTTAT AATGGTTACA AATAAAGCAA 3420 TTTTTCACTG CATTCTAGTT GTGGTTTGTC 3480
HU 222 992 Bl
CAAACTCATC AATGTATCTT ATCATGTCTG GCGTAATCAT GGTCATAGCT GTTTCCTGTG AACATACGAG CCGGAAGCAT AAAGTGTAAA ACATTAATTG CGTTGCGCTC ACTGCCCGCT CATTAATGAA TCGGCCAACG CGCGGGGAGA TCCTCGCTCA CTGACTCGCT GCGCTCGGTC TCAAAGGCGG TAATACGGTT ATCCACAGAA GCAAAAGGCC AGCAAAAGGC CAGGAACCGT AGGCTCCGCC CCCCTGACGA GCATCACAAA CCGACAGGAC TATAAAGATA CCAGGCGTTT GTTCCGACCC TGCCGCTTAC CGGATACCTG CTTTCTCAAT GCTCACGCTG TAGGTATCTC GGCTGTGTGC ACGAACCCCC CGTTCAGCCC CTTGAGTCCA ACCCGGTAAG ACACGACTTA ATTAGCAGAG CGAGGTATGT AGGCGGTGCT GGCTACACTA GAAGGACAGT ATTTGGTATC AAAAGAGTTG GTAGCTCTTG ATCCGGCAAA GTTTGCAAGC AGCAGATTAC GCGCAGAAAA TCTACGGGGT CTGACGCTCA GTGGAACGAA TTATCAAAAA GGATCTTCAC CTAGATCCTT TAAAGTATAT ATGAGTAAAC TTGGTCTGAC ATCTCAGCGA TCTGTCTATT TCGTTCATCC ACTACGATAC GGGAGGGCTT ACCATCTGGC CGCTCACCGG CTCCAGATTT ATCAGCAATA AGTGGTCCTG CAACTTTATC CGCCTCCATC GTAAGTAGTT CGCCAGTTAA TAGTTTGCGC GTGTCACGCT CGTCGTTTGG TATGGCTTCA GTTACATGAT CCCCCATGTT GTGCAAAAAA GTCAGAAGTA AGTTGGCCGC AGTGTTATCA CTTACTGTCA TGCCATCCGT AAGATGCTTT TTCTGAGAAT AGTGTATGCG GCGACCGAGT ACCGCGCCAC ATAGCAGAAC TTTAAAAGTG AAACTCTGAA GGATCTTACC GGTGTTGAGA AACTGATCTT CAGCATCTTT TACTTTCACC CAAAATGCCG CAAAAAAGGG AATAAGGGCG CTTTTTCAAT ATTATTGAAG CATTTATCAG GAATGTATTT AGAAAAATAA ACAAATAGGG CCT
AZ 51. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI :
(A) HOSSZ: 81 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) AZ 51. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ATCCAAAGAC AACTCCCGTA ACCAGGTTGT CACCGCTACC TACTACTGCG C
AZ 52. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 85 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) AZ 52. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TCGAGCGCAG TAGTAGGTAG CGGTGTCAAC CTGGTTACGG GAGTTGTCTT TGGAT
GATCGCGGCC GCGATCCCGT CGAGAGCTTG TGAAATTGTT ATCCGCTCAC AATTCCACAC GCCTGGGGTG CCTAATGAGT GAGCTAACTC TTCCAGTCGG GAAACCTGTC GTGCCAGCTG GGCGGTTTGC GTATTGGGCG CTCTTCCGCT GTTCGGCTGC GGCGAGCGGT ATCAGCTCAC TCAGGGGATA ACGCAGGAAA GAACATGTGA AAAAAGGCCG CGTTGCTGGC GTTTTTCCAT AATCGACGCT CAAGTCAGAG GTGGCGAAAC CCCCCTGGAA GCTCCCTCGT GCGCTCTCCT TCCGCCTTTC TCCCTTCGGG AAGCGTGGCG AGTTCGGTGT AGGTCGTTCG CTCCAAGCTG GACCGCTGCG CCTTATCCGG TAACTATCGT TCGCCACTGG CAGCAGCCAC TGGTAACAGG ACAGAGTTCT TGAAGTGGTG GCCTAACTAC TGCGCTCTGC TGAAGCCAGT TACCTTCGGA CAAACCACCG CTGGTAGCGG TGGTTTTTTT AAAGGATCTC AAGAAGATCC TTTGATCTTT AACTCACGTT AAGGGATTTT GGTCATGAGA TTAAATTAAA AATGAAGTTT TAAATCAATC AGTTACCAAT GCTTAATCAG TGAGGCACCT ATAGTTGCCT GACTCCCCGT CGTGTAGATA CCCAGTGCTG CAATGATACC GCGAGACCCA AACCAGCCAG CCGGAAGGGC CGAGCGCAGA CAGTCTATTA ATTGTTGCCG GGAAGCTAGA AACGTTGTTG CCATTGCTAC AGGCATCGTG TTCAGCTCCG GTTCCCAACG ATCAAGGCGA GCGGTTAGCT CCTTCGGTCC TCCGATCGTT CTCATGGTTA TGGCAGCACT GCATAATTCT TCTGTGACTG GTGAGTACTC AACCAAGTCA TGCTCTTGCC CGGCGTCAAT ACGGGATAAT CTCATCATTG GAAAACGTTC TTCGGGGCGA TCCAGTTCGA TGTAACCCAC TCGTGCACCC AGCGTTTCTG GGTGAGCAAA AACAGGAAGG ACACGGAAAT GTTGAATACT CATACTCTTC GGTTATTGTC TCATGAGCGG ATACATATTT GTTCCGCGCA CATTTCCCCG AAAAGTGCCA
3540
3600
3660
3720
3780
3840
3900
3960
4020
4080
4140
4200
4260
4320
4380
4440
4500
4560
4620
4680
4740
4800
4860
4920
4980
5040
5100
5160
5220
5280
5340
5400
5460
5520
5580
5640
5700
5703
TCTGACCATG ACTAACATGG ACCCGGTTGA
CGGGTCCATG TTAGTCATGG TCAGAACAAC
HU 222 992 Bl
AZ 53. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 73 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) AZ 53. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AACCTGCACC GTCTCCGGTT TCTCCCTGAC GAGCTATAGT GTACACTGGA TCCGTCAGCC 60 OCCGGGTAAA GGT 73
AZ 54. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 77 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) AZ 54. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CTAGACCTTT ACCCGGCGGC TGACGGATCC AGTGTACACT ATAGCTCGTC AGGGAGAAAC 60 CGGAGACGGT GCAGGTT 77
AZ 55. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(ii) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 46 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) AZ 55. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CTAGCTGTGT CAGCTGGCGA GAGGGCCACC ATCAACTGCA AGAGCT 46
AZ 56. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 38 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) AZ 56. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CTTGCAGTTG ATGGTGGCCC TCTCGCCAGC TGACACAG 38
AZ 57. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 140 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) AZ 57. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TTCGAGGACG CCAGCAACAT GGTGTTGCAG ACCCAGGTCT TCATTTCTCT GTTGCTCTGG 60 ATCTCTGGTG CCTACGGGCA GGTCCAACTG CAGGAGAGCG GTCCAGGTCT TGTGAGACCT 120 AGCCAGACCC TGAGCCTGAC 140
AZ 58. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 138 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris
HU 222 992 Bl (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) AZ 58. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GTGCCTCCAC TAGCCCATAT TACTCCAAGC CACTCTAGAC CTCGTCCAGG TGGCTGTCTC ACCCAGTGTA CACTATAGCT GGTGAGGGAG AAGCCCGAGA CGGTGCAGGT CAGGCTCAGG GTCTGGCTAG GTCTCACA
AZ 59. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 143 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) AZ 59. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GGCTTGGAGT AATATGGGCT AGTGGAGGCA CAGATTATAA TTCGGCTCTC ATGTCCAGAC TGAGTATACT GAAAGACAAC AGCAAGAACC AGGTCAGCCT GAGACTCAGC AGCGTGACAG CCGCCGACAC CGCGGTCTAT TTC
A 60. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 136 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA : DNS (genomiális) (xi) A 60. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CCAGTGCCAA GCTTGGGCCC TTGGTGGAGG CGCTCGAGAC GGTGACCGTG GTACCTTGTC CCCAGTAGTC AAGCCGTAGT AAGGAAGAAG GGGGATCTCG AGCACAGAAA TAGACCGCGG TGTCGGCGGC TGTCAC
A 61. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 357bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: kétszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 61. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CAGGTCCAAC TGCAGGAGAG CGGTCCAGGT CTTGTGAGAC CTAGCCAGAC CCTGAGCCTG ACCTGCACCG TCTCGGGCTT CTCCCTCACC AGCTATAGTG TACACTGGGT GAGACAGCCA CCTGGACGAG GTCTAGAGTG GCTTGGAGTA ATATGGGCTA GTGGAGGCAC AGATTATAAT TCGGCTCTCA TGTCCAGACT GAGTATACTG AAAGACAACA GCAAGAACCA GGTCAGCCTG AGACTCAGCA GCGTGACAGC CGCCGACACC GCGGTCTATT ACTGTGCTCG GGATCCCCCT TCTTCCTTAC TACGGCTTGA CTACTGGGGA CAAGGTACCA CGGTCACCGT CTCGAGC
A 62. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 119 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 62. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gin 15 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 20 25 30
120
138
120
143
120
136
120
180
240
300
357
HU 222 992 Bl
Ser Val Hi s 35 Trp Val Arg Gin Pro 40 Pro Gly Arg Gly Leu 45 Glu Trp Leu
Gly Val 50 Ile Trp Alá Ser Gly 55 Gly Thr Asp Tyr Asn 60 Ser Al a Leu Me t
Ser 65 Arg Leu Ser Ile Leu 70 Ly s Asp Asn Ser Lys 75 Asn Gin Val Ser Leu 80
Arg Leu Ser Ser Val 85 Thr Al a Al a Asp Thr 90 Al a Val Tyr Tyr Cys 95 Al a
Arg Asp Pro Pr o 100 Ser Ser Leu Leu Arg 105 Leu Asp Tyr Trp Gly 110 Gin Gly
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
A 63. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 28 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 63. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AGGACGCCAG CAACATGGTG TTGCAGAC 28
A 64. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 36 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 64. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TGCCAAGCTT GGGCCCTTGG TGGAGGCGCT CGAGAC 36
A 65. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 121 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 65. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GACCATGATT ACGAATTCGT AGTCGGATAT CGTGATGACC CAGAGCCCAA GCAGCCTGAG 36
CGCTAGCGTG GGTGACAGAG TGACCATCAC CTGTAAGAGC TCTCAGAGTC TGTTAAACAG 120
T 121
A 66. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 116 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 66. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AGATTCCCTA GTCGATGCCC CGTAGATCAG CAGCTTTGGA GCCTTACCGG GTTTCTGCTG 60 ATACCAGGCC AAGTAGTTCT TTTGATTTCC ACTGTTTAAC AGACTCTGAG AGCTCT 116
HU 222 992 Bl
A 67. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 116 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 67. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TCTACGGGGC ATCGACTAGG GAATCTGGGG TACCAGATAG ATTCAGCGGT AGCGGTAGCG GAACCGACTT CACCTTCACC ATCAGCAGCC TGCAGCCAGA GGACATCGCC ACCTAC
A 68. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 117 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 68. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TCGATGCCAA GCTTGGCGCC GCCACAGTAC GTTTGATCTC CACCTTGGTC CCTTGTCCGA ACGTGAATGG AAAACTATGA ACATTCTGGC AGTAGTAGGT GGCGATGTCC TCTGGCT
A 69. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 339bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: kétszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 69. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GATATCGTGA TGACCCAGAG CCCAAGCAGC CTGAGCGCTA GCGTGGGTGA CAGAGTGACC ATCACCTGTA AGAGCTCTCA GAGTCTGTTA AACAGTGGAA ATCAAAAGAA CTACTTGGCC TGGTATCAGC AGAAACCCGG TAAGGCTCCA AAGCTGCTGA TCTACGGGGC ATCGACTAGG GAATCTGGGG TACCAGATAG ATTCAGCGGT AGCGGTAGCG GAACCGACTT CACCTTCACC ATCAGCAGCC TGCAGCCAGA GGACATCGCC ACCTACTACT GCCAGAATGT TCATAGTTTT CCATTCACGT TCGGACAAGG GACCAAGGTG GAGATCAAA
A 70. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 113 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 70. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
116
117
120
180
240
300
339
Asp 1 Ile Val Me t Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Al a Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Ly s Ser 25 Ser Gin Ser Leu Leu 30 Asn Ser
Gly Asn Gin 35 Ly s Aen Tyr Leu Al a 40 Trp Tyr Gin Gin Lys 45 Pro Gly Lys
Al a Pro 50 Lys Leu Leu Ile Tyr 55 Gly Al a Ser Thr Arg 60 Glu Ser Gly Val
Pro 65 As p Arg Phe Se r Gly 70 Ser Gly Ser Gly Thr 75 Asp Phe Thr Phe Thr 80
HU 222 992 Bl
Ile Ser SerLeu Gin Pro Glu Asp Ile Ala Thr TyrTyr Cys Gin Asn 85 90 95
Val His Ser Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110
Lys
A 71. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 24bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 71. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GATTACGAAT TCGTAGTCGG ATAT 24
A 72. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 24 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 72. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TGCCAAGCTT GGCGCCGCCA CAGT 24
A 73. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 39 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 73. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CTAGTGCGGG TGACCGAGTG ACCATCACCT GTAAGAGCT 39
A 74. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 31 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 74. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CTTACAGGTG ATGGTCACTC GGTCACCCGC A 31
A 75. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 66 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 75. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GGTCTATTAC TGTGCTCGGG ATCCCCCTTC TTCCTTACTA CGGCTTGACT ACTGGGGACA 60 AGGTAC 66
HU 222 992 Bl
A 76. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 64bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 76. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CTTGTCCCCA GTAGTCAAGC CGTAGTAAGG AAGAAGGGGG ATCCCGAGCA CAGTAATAGA 60 CCGC 64

Claims (36)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Egy humán interleukin-5-re specifikus rágcsáló neutralizáló monoklonális antitest, amelynek kötési affinitása 3,5 χ IO-11 M értékű vagy ennél kisebb disszociációs állandójú, és amely az ATCC HB 11 783 számon letétbe helyezett hibridóma sejtvonal által termelt 2B6 monoklonális ellenanyag, ATCC HB 11 782 számon letétbe helyezett hibridóma sejtvonal által termelt 2E3 monoklonális ellenanyag, ATCC HB 11 781 számon letétbe helyezett hibridóma sejtvonal által termelt 2F2 monoklonális ellenanyag vagy ATCC HB 11 943 számon letétbe helyezett hibridóma sejtvonal által termelt 4A6 monoklonális ellenanyag azonosítási jellemzőkkel rendelkezik.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti monoklonális antitest, amely egy patkány- és/vagy egérantitest.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti monoklonális antitest, amely egy patkányantitest.
  4. 4. A 2. igénypont szerinti monoklonális antitest, amely a 16. számú szekvenciának megfelelő könnyű lánc aminosavszekvenciát és a 15. számú szekvenciának megfelelő nehéz lánc aminosavszekvenciát tartalmazza.
  5. 5. Egy hibridóma, amely az ATCC HB 11 783 szám alatt letétbe helyezett 2B6 monoklonális antitestet termelő hibridóma sejtvonal, ATCC HB 11 782 szám alatt letétbe helyezett 2E3 monoklonális antitestet termelő hibridóma sejtvonal, ATCC HB 11 781 szám alatt letétbe helyezett 2F2 monoklonális antitestet termelő hibridóma sejtvonal vagy ATCC HB 11 943 szám alatt letétbe helyezett 4A6 monoklonális antitestet termelő hibridóma sejtvonal azonosítási jellemzőkkel rendelkezik.
  6. 6. Egy, az 1. igénypont szerinti monoklonális antitest Fc szakaszának a deléciójával előállított neutralizáló Fab-fragmentum vagy ennek F(ab’)2-fragmentuma.
  7. 7. Egy neutralizáló Fab-fragmentum vagy ennek F(ab’)2-ffagmentuma, amely lánckeveréssel lett előállítva, miáltal az 1. igénypont szerinti monoklonális antitestnek az Fd nehéz lánca egy patkány és/vagy egér könnyű lánc szálas fág Fab demonstrációs könyvtárban expresszálódik.
  8. 8. Egy neutralizáló Fab-fragmentum vagy ennek F(ab’)2-fragmentuma, amely lánckeveréssel lett előállítva, miáltal az 1. igénypont szerinti monoklonális antitestnek a könnyű lánca egy patkány és/vagy egér nehéz lánc szálas fág Fab demonstrációs könyvtárban expresszálódik.
  9. 9. Egy módosított antitest, amely egy nehéz láncot és egy könnyű láncot tartalmaz, ahol a nehéz és könnyű láncok framework szakaszai legalább egy első szelektált antitestből származnak, és mindegyik lánc komplementaritás meghatározó szakaszainak az aminosavszekvenciái az 1. igénypont szerinti monoklonális antitestből származnak.
  10. 10. A 9. igénypont szerinti módosított antitest, amelyben a nehéz lánc komplementaritás meghatározó szakaszainak az aminosavszekvenciái a következők:
    (a) 7., 8., 9. számú szekvencia; vagy (b) 7., 8., 14. számú szekvencia.
  11. 11. A 9. igénypont szerinti módosított antitest, amelyben a könnyű lánc komplementaritás meghatározó szakaszainak az aminosavszekvenciái a következők:
    (a) 10., 11., 12. számú szekvencia; vagy (b) 10., 11., 13. számú szekvencia.
  12. 12. A 9. igénypont szerinti módosított antitest, amelyben a nehéz lánc framework szakaszai a 19. számú szekvencia 1-30., 36-49., 66-97. és 109-119. aminosavaiból állnak.
  13. 13. A 9. igénypont szerinti módosított antitest, amelyben a könnyű lánc framework szakaszai a 21. számú szekvencia 1-23., 41-55., 63-94. és 104-113. aminosavaiból állnak.
  14. 14. Egy immunglobulin nehéz lánc komplementaritás meghatározó szakasz - CDR -, amelynek aminosavszekvenciája a következő csoportból kerül kiválasztásra:
    (a) 7. számú szekvencia;
    (b) 8. számú szekvencia;
    (c) 9. számú szekvencia; és (d) 14. számú szekvencia.
  15. 15. Egy immunglobulin könnyű lánc komplementaritás meghatározó szakasz - CDR -, amelynek aminosavszekvenciája a következő csoportból kerül kiválasztásra:
    (a) 10. számú szekvencia;
    (b) 11. számú szekvencia;
    (c) 12. számú szekvencia;
    (d) 13. számú szekvencia;
    (e) 47. számú szekvencia; és (f) 48. számú szekvencia.
  16. 16. Egy, a 14. igénypont szerinti immunglobulin komplementaritás meghatározó szakaszt - CDR-t - kódoló nukleinsavmolekula.
  17. 17. Egy, a 15. igénypont szerinti immunglobulin komplementaritás meghatározó szakaszt - CDR-t - kódoló nukleinsavmolekula.
    HU 222 992 Bl
  18. 18. Egy kiméra antitest, amely egy nehéz láncot és egy könnyű láncot tartalmaz, és az antitest humán interleukin-5-re nézve legfeljebb körülbelül 3,5 χ 10“u M értékű disszociációs állandóval rendelkezik, ahol a nehéz és könnyű láncok konstans szakaszai legalább egy első szelektált antitestből származnak, és mindegyik lánc variábilis szakaszainak az aminosavszekvenciái az 1. igénypont szerinti monoklonális antitestből származnak.
  19. 19. A 18. igénypont szerinti antitest, amelyben a konstans szakaszok humán immunglobulinok közül kerülnek kiválasztásra.
  20. 20. Gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy a 9. igénypont szerinti módosított antitestet és egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozót tartalmaz.
  21. 21. A 9. igénypont szerinti módosított antitest alkalmazása, emberekben túlzott eozinofiltermeléssel kapcsolatos állapotok kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására.
  22. 22. A 21. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a túlzott eozinofiltermeléssel kapcsolatos állapot asztma.
  23. 23. A 21. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a túlzott eozinofiltermeléssel kapcsolatos állapot allergiás rhinitis.
  24. 24. A 21. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a túlzott eozinofiltermeléssel kapcsolatos állapot atopiás dermatitis.
  25. 25. Egy izolált nukleinsavszekvencia, amely a következő csoportból kerül kiválasztásra:
    (a) egy, a 9. igénypont szerinti módosított antitestet kódoló nukleinsavszekvencia;
    (b) az (a) nukleinsavszekvencia komplementer nukleinsavszekvenciája; és (c) az (a) vagy (b) nukleinsavszekvenciának egy olyan fragmentuma, amely egy humán interleukin-5-tel szembeni specifitással rendelkező proteint kódol;
    ahol a szekvencia adott esetben egy restrikciós helyet tartalmaz.
  26. 26. A 25. igénypont szerinti izolált nukleinsavszekvencia, amelyben a humanizált nehéz lánc variábilis szakaszt kódoló szekvencia a 18. számú szekvenciának megfelelő nukleinsavszekvenciát tartalmazza.
  27. 27. A 25. igénypont szerinti izolált nukleinsavszekvencia, amelyben a humanizált nehéz lánc variábilis szakaszt kódoló szekvencia a 61. számú szekvenciának megfelelő nukleinsavszekvenciát tartalmazza.
  28. 28. A 25. igénypont szerinti izolált nukleinsavszekvencia, amelyben a humanizált könnyű lánc variábilis szakaszt kódoló szekvencia a 20. számú szekvenciának megfelelő nukleinsavszekvenciát tartalmazza.
  29. 29. A 25. igénypont szerinti izolált nukleinsavszekvencia, amelyben a humanizált könnyű lánc variábilis szakaszt kódoló szekvencia a 69. számú szekvenciának megfelelő nukleinsavszekvenciát tartalmazza.
  30. 30. Egy, a 25. igénypont szerinti nukleinsavszekvenciát tartalmazó rekombináns plazmid.
  31. 31. Egy, a 30. igénypont szerinti rekombináns plazmáddal transzfektált gazdasejt.
  32. 32. Eljárás egy humán interleukin-5-re specifikus módosított antitest előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a 30. igénypont szerinti rekombináns plazmiddal transzfektált sejtvonalat olyan szelektált regulátorszekvenciák kontrollja alatt tenyésztünk, amely szelektált regulátorszekvenciák alkalmasak a módosított antitest expressziójának az irányítására az említett sejtekben.
  33. 33. Eljárás a humán IL-5 jelenlétének vagy hiányának a megállapítására emberekben, azzal jellemezve, hogy egy beteg valamely biológiai folyadékából mintát veszünk, ezt követően az 1. igénypont szerinti monoklonális antitestet olyan körülmények között érintkeztetjük a mintával, amelyek lehetővé teszik, hogy egy IL-5/monoklonális antitest komplex alakuljon ki, majd detektáljuk az IL-5/monoklonális antitest komplex jelenlétét vagy hiányát.
  34. 34. Eljárás túlzott eozinofiltermeléssel kapcsolatos allergia és egyéb állapotok diagnosztizálásának elősegítésére, azzal jellemezve, hogy a 33. igénypont szerinti eljárásnak megfelelően a betegtől vett mintában meghatározzuk a humán IL-5 mennyiségét, majd az így meghatározott mennyiséget összehasonlítjuk a normál népesség esetén tapasztalt humán IL-5 átlagmennyiséggel, ahol a beteg mintájában lévő szignifikánsan nagyobb mennyiségű IL-5 jelenléte jelzi a túlzott eozinofiltermeléssel kapcsolatos allergiát és egyéb állapotokat.
  35. 35. Egy, ATCC HB 11 780 szám alatt letétbe helyezett 24G9 monoklonális antitestet termelő hibridóma sejtvonal vagy az ATCC HB 11 942 szám alatt letétbe helyezett F5D6 monoklonális antitestet termelő hibridóma sejtvonal azonosítási jellemzőivel rendelkező hibridóma.
  36. 36. Egy, a 35. igénypont szerinti hibridóma által termelt monoklonális antitest.
HU9901120A 1994-12-23 1995-12-22 IL-5 Mediált rendellenességek kezelésére használható rekombináns IL-5 antagonisták HU222992B1 (hu)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HUS1500070C HUS1500070I1 (hu) 1994-12-23 2015-12-17 IL-5-Mediált rendellenességek kezelésére használható rekombináns IL-5 antagonisták

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US36313194A 1994-12-23 1994-12-23
US08/467,420 US5683892A (en) 1994-12-23 1995-06-06 DNA encoding recombinant IL-5 antagonists useful in treatment of IL-5 mediated disorders
US08/470,110 US5693323A (en) 1994-12-23 1995-06-06 Recombinant IL-5 antagonists useful in treatment of IL-5 mediated disorders
PCT/US1995/017082 WO1996021000A2 (en) 1994-12-23 1995-12-22 Recombinant il-5 antagonists useful in treatment of il-5 mediated disorders

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT78055A HUT78055A (hu) 1999-07-28
HU222992B1 true HU222992B1 (hu) 2004-01-28

Family

ID=27408594

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9901120A HU222992B1 (hu) 1994-12-23 1995-12-22 IL-5 Mediált rendellenességek kezelésére használható rekombináns IL-5 antagonisták

Country Status (22)

Country Link
US (1) US6129913A (hu)
EP (1) EP0800536B1 (hu)
JP (2) JP2001523083A (hu)
CN (1) CN100391977C (hu)
AT (1) ATE346867T1 (hu)
AU (1) AU708951B2 (hu)
BR (1) BR9510499B1 (hu)
CA (1) CA2208503C (hu)
CZ (1) CZ297045B6 (hu)
DE (1) DE69535319T2 (hu)
DK (1) DK0800536T3 (hu)
ES (1) ES2277336T3 (hu)
FI (1) FI119374B (hu)
HK (1) HK1003651A1 (hu)
HU (1) HU222992B1 (hu)
LU (1) LU92912I2 (hu)
MX (1) MX9704779A (hu)
NL (1) NL300787I2 (hu)
NO (2) NO324181B1 (hu)
NZ (1) NZ301916A (hu)
PL (1) PL194312B1 (hu)
WO (1) WO1996021000A2 (hu)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5693323A (en) * 1994-12-23 1997-12-02 Smithkline Beecham Corporation Recombinant IL-5 antagonists useful in treatment of IL-5 mediated disorders
US5783184A (en) * 1994-12-23 1998-07-21 Smithkline Beecham Corporation Method for treatment and diagnosis of IL-5 mediated disorders
ES2601882T5 (es) * 1999-04-09 2021-06-07 Kyowa Kirin Co Ltd Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
AU2003220525A1 (en) * 2002-03-29 2003-10-20 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to interleukin-5 and methods and compositions comprising same
WO2003084569A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Medicament contenant une composition anticorps
EP1682571A4 (en) * 2003-10-27 2006-12-06 Medvet Science Pty Ltd BICOORDIN PATTERN AND METHODS OF USE
KR101206318B1 (ko) * 2004-10-28 2012-11-29 교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤 자궁 내막증 치료제
EP2152310A4 (en) 2007-04-30 2010-05-26 Glaxosmithkline Llc METHODS OF ADMINISTERING ANTI-IL-5 ANTIBODIES
JP4335286B2 (ja) 2008-02-08 2009-09-30 ファナック株式会社 部品保護機能を備えたロボット制御装置及びロボット制御方法
EP2274009B1 (en) 2008-03-28 2013-11-13 GlaxoSmithKline LLC Methods of treatment
NZ601271A (en) * 2010-01-28 2014-09-26 Glaxo Group Ltd Cd127 binding proteins
JP6147670B2 (ja) 2010-12-22 2017-06-14 テバ・ファーマシューティカルズ・オーストラリア・ピーティワイ・リミテッド 改善された半減期を有する修飾された抗体
EP4056590A1 (en) 2015-08-24 2022-09-14 GlaxoSmithKline Intellectual Property (No.2) Limited Biopharmaceutical compositions
EP3436480A4 (en) * 2016-03-30 2019-11-27 Musc Foundation for Research Development METHOD FOR THE TREATMENT AND DIAGNOSIS OF CANCER BY TARGETING GLYCOPROTEIN A REPETITION PREDOMINANT (GARP) AND FOR EFFECTIVE IMMUNOTHERAPY ALONE OR IN COMBINATION
PE20191662A1 (es) 2016-12-23 2019-11-11 Cephalon Inc Anticuerpos anti-il-5
UY37747A (es) 2017-05-26 2019-01-02 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Composiciones para tratar enfermedades mediadas por interleucina 5 (il-5) y métodos relacionados
TWI801425B (zh) * 2017-09-29 2023-05-11 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 Il-5 抗體、其抗原結合片段及醫藥用途
CN109942706A (zh) * 2017-12-21 2019-06-28 三生国健药业（上海）股份有限公司 结合人il-5的单克隆抗体、其制备方法和用途
WO2020119728A1 (zh) * 2018-12-12 2020-06-18 尚华科创投资管理（江苏）有限公司 抗人白细胞介素5(il-5)单克隆抗体及其应用
WO2020200099A1 (zh) * 2019-03-29 2020-10-08 江苏恒瑞医药股份有限公司 包含抗il-5抗体的药物组合物及其用途

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8800397D0 (en) * 1988-01-08 1988-02-10 Sandoz Ltd Improvements in/relating to organic compounds
US5096704A (en) * 1988-11-03 1992-03-17 Schering Corporation Method of treating eosinophilia
AU633034B2 (en) * 1988-11-03 1993-01-21 Schering Corporation Method of preventing or reducing eosinophilia
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
ZA929328B (en) * 1991-12-02 1993-07-20 Fluor Corp Apparatus and method for economic use of excess compressed air when firing low caloric-value gas in a combustion gas turbine.
WO1993016184A1 (en) * 1992-02-06 1993-08-19 Schering Corporation Design, cloning and expression of humanized monoclonal antibodies against human interleukin-5
JPH06141885A (ja) * 1992-11-05 1994-05-24 Chemo Sero Therapeut Res Inst モノクローナル抗体
WO1995014040A1 (en) * 1993-11-19 1995-05-26 Baylor College Of Medicine Monoclonal antibodies specific for human interleukin-5
GB9412230D0 (en) * 1994-06-17 1994-08-10 Celltech Ltd Interleukin-5 specific recombiant antibodies
US5693323A (en) * 1994-12-23 1997-12-02 Smithkline Beecham Corporation Recombinant IL-5 antagonists useful in treatment of IL-5 mediated disorders
US5783184A (en) * 1994-12-23 1998-07-21 Smithkline Beecham Corporation Method for treatment and diagnosis of IL-5 mediated disorders
WO2001012646A1 (en) * 1999-08-19 2001-02-22 Smithkline Beecham Corporation Sialoadhesin factor-1 agonist and antagonist antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
US6129913A (en) 2000-10-10
EP0800536A4 (en) 2004-12-01
FI119374B (fi) 2008-10-31
NO972913L (no) 1997-08-19
NZ301916A (en) 1999-05-28
WO1996021000A2 (en) 1996-07-11
ATE346867T1 (de) 2006-12-15
DE69535319D1 (de) 2007-01-11
AU4745096A (en) 1996-07-24
HUT78055A (hu) 1999-07-28
CA2208503C (en) 2009-12-01
CN100391977C (zh) 2008-06-04
BR9510499A (pt) 1999-03-30
NO2015027I1 (no) 2015-12-18
FI972703A (fi) 1997-08-22
AU708951B2 (en) 1999-08-19
CA2208503A1 (en) 1996-07-11
BR9510499B1 (pt) 2009-05-05
MX9704779A (es) 1997-09-30
PL194312B1 (pl) 2007-05-31
DK0800536T3 (da) 2007-04-02
WO1996021000A3 (en) 1996-09-06
LU92912I2 (fr) 2016-02-16
JP2008029355A (ja) 2008-02-14
PL321088A1 (en) 1997-11-24
CZ297045B6 (cs) 2006-08-16
NL300787I1 (hu) 2016-04-05
CN1175263A (zh) 1998-03-04
HK1003651A1 (en) 1998-11-06
NO972913D0 (no) 1997-06-20
NO2015027I2 (no) 2016-01-04
ES2277336T3 (es) 2007-07-01
DE69535319T2 (de) 2007-07-19
EP0800536B1 (en) 2006-11-29
JP2001523083A (ja) 2001-11-20
EP0800536A2 (en) 1997-10-15
CZ196397A3 (en) 1997-10-15
FI972703A0 (fi) 1997-06-23
NO324181B1 (no) 2007-09-03
NL300787I2 (hu) 2016-04-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100511544B1 (ko) Ｉｌ－5 매개된 질환의 치료에 유용한 재조합 ｉｌ－5길항제
CN100391977C (zh) 用于治疗il-5介导的疾病的重组il-5拮抗剂
WO1996021000A9 (en) Recombinant il-5 antagonists useful in treatment of il-5 mediated disorders
EP0967994A1 (en) Improved method for treatment and diagnosis of il-5 mediated disorders
JP7538721B2 (ja) 抗インターロイキン１７ａ抗体、医薬組成物、およびその使用
EP2426143B1 (en) Method of providing disease-specific binding molecules and targets
EP2440578B1 (en) Use of an anti-tau ps422 antibody for the treatment of brain diseases
WO1998005787A1 (en) A method for inhibiting immunoglobulin-induced toxicity resulting from the use of immunoglobulins in therapy and in vivo diagnosis
WO1998005787A9 (en) A method for inhibiting immunoglobulin-induced toxicity resulting from the use of immunoglobulins in therapy and in vivo diagnosis
KR101989551B1 (ko) IL-1β 억제제 조성물 및 이의 용도
IL191587A (en) A monoclonal antibody that binds more specifically to an amyloid beta beta globulomer protein than to an amyloid beta beta monomer protein, and a kit containing it
US11155600B2 (en) Human IL1-R1 derived inhibitor of IL-1β
US20210403534A1 (en) IL1-R1 DERIVED INHIBITOR OF IL-1b AND USE THEREOF
AU2015310671B2 (en) Anti-Hepatitis C antibodies and antigen binding fragments thereof
AU775429B2 (en) A method for inhibiting immunoglobulin-induced toxicity resulting from the use of immunoglobulins in therapy and in vivo diagnosis
CN115768787A (zh) IL1-R1衍生的IL-1β抑制剂及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
HFG4 Patent granted, date of granting

Effective date: 20031127

GB9A Succession in title

Owner name: GLAXOSMITHKLINE LLC, US

Free format text: FORMER OWNER(S): SMITHKLINE BEECHAM CORPORATION, US; SMITHKLINE BEECHAM PLC., GB

AA1S Information on application for a supplementary protection certificate

Free format text: PRODUCT NAME: MEPOLIZUMAB; REGISTRATION NO/DATE: EU/1/15/1043 20151207

Spc suppl protection certif: S1500070

Filing date: 20151217

Expiry date: 20151222

FG4S Grant of supplementary protection certificate

Spc suppl protection certif: S1500070

Filing date: 20151217

Expiry date: 20151222