CZ297045B6 - Hlodavcí neutralizacní monoklonální protilátka, zpusob pro její produkci, kompozice s jejím obsahema pouzití, hybridom a jím produkovaná protilátka,fab fragment, komplementaritu urcující region, molekula nukleové kyseliny a její sekvence, plasmid a - Google Patents

Hlodavcí neutralizacní monoklonální protilátka, zpusob pro její produkci, kompozice s jejím obsahema pouzití, hybridom a jím produkovaná protilátka,fab fragment, komplementaritu urcující region, molekula nukleové kyseliny a její sekvence, plasmid a Download PDF

Info

Publication number
CZ297045B6
CZ297045B6 CZ0196397A CZ196397A CZ297045B6 CZ 297045 B6 CZ297045 B6 CZ 297045B6 CZ 0196397 A CZ0196397 A CZ 0196397A CZ 196397 A CZ196397 A CZ 196397A CZ 297045 B6 CZ297045 B6 CZ 297045B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
ser
leu
thr
gly
ctg
Prior art date
Application number
CZ0196397A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ196397A3 (en
Inventor
S. Ames@Robert
Robert Appelbaum@Edward
M. Chaiken@Irwin
M. Cook@Richard
Stuart Gross@Mitchell
Dudley Holmes@Stephen
Jane McMillan@Lynette
Wayne Theisen@Timothy
Original Assignee
Smithkline Beecham Corporation
Smithkline Beecham Plc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27408594&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ297045(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from US08/467,420 external-priority patent/US5683892A/en
Application filed by Smithkline Beecham Corporation, Smithkline Beecham Plc filed Critical Smithkline Beecham Corporation
Publication of CZ196397A3 publication Critical patent/CZ196397A3/cs
Publication of CZ297045B6 publication Critical patent/CZ297045B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5409—IL-5
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6869—Interleukin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/026—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a baculovirus

Abstract

Je poskytnuta hlodavcí neutralizacní monoklonálníprotilátka specifická pro lidský interleukin 5, hybridom, neutralizacní fab fragment nebo jeho f(ab').sub.2.n. fragment, pozmenená protilátka obsahující tezký retezec a lehký retezec, komplementarituurcující region tezkého a lehkého retezce, molekula nukleové kyseliny kódující takový region, chimérická protilátka obsahující tezký retezec a lehký retezec, farmaceutická kompozice s obsahem pozmenené protilátky, a pouzití této protilátky pro výrobu léciva pro lécbu stavu asociovaných s excesivní produkcí eosinofilu, izolovaná sekvence nukleové kyseliny, rekombinantní plasmid obsahující sekvencinukleových kyselin, hostitelská bunka transfekovaná rekombinantním plasmidem, zpusob pro produkci pozmenených protilátek a monoklonální protilátka produkovaná hybridomem.

Description

Oblast techniky
Tento vynález se obecně týká protilátek a pozměněných protilátek, které jsou použitelné v léčbě a diagnostice stavů zprostředkovaných IL-5 a excesivní produkcí eosinofílů. Vynález se týká mAb, Fab, chimérických a humanizovaných protilátek. Tento vynález se konkrétně týká hlodavčí neutralizační monoklonální protilátky specifické pro lidský interleukin 5, hybridomu, neutralizačního fab fragmentu nebo jeho f(ab')2 fragmentu, pozměněné protilátky obsahující těžký řetězec a lehký řetězec, komplementaritu určujícího regionu těžkého a lehkého řetězce, molekuly nukleové kyseliny kódující takový region, chimérické protilátky obsahující těžký řetězec a lehký řetězec, farmaceutické kompozice s obsahem pozměněné protilátky, a použití této protilátky pro výrobu léčiva pro léčbu stavů asociovaných s excesivní produkcí eosinofílů, izolované sekvence nukleové kyseliny, rekombinantního plasmidu obsahujícího sekvenci nukleových kyselin, hostitelské buňky transfekované rekombinantním plasmidem, způsobu pro produkci pozměněných protilátek a monoklonální protilátky produkované hybridomem.
Dosavadní stav techniky
Eosinofily jsou předpokládány v patogenesi mnoha zánětlivých chorobných stavů včetně alergických poruch asociovaných s hypersensitivní reakcí v plicní tkání (Butterfíeld et al., Immunopharmacology of Eosinofils, H. Smith and R. Cook, Eds., str. 151 - 192, Academics Press, London (1993)). Vhodným příkladem je astma, choroba charakterizovaná reversibilní obstrukcí dýchacích cest vedoucí k nespecifické bronchiální přecitlivělosti. Tento následek je závislý na generování chronické zánětlivé reakce na úrovni bronchiální mukosy a charakteristickou infiltrací makrofágy, lymfocyty a eosinofily. Eosinofily pravděpodobně hrají centrální úlohu v iniciaci poškození mukosy typickém pro tuto chorobu (Corrigan et al., Immunol. Today, 13: 501 -507 (1992)). Zvýšený počet aktivovaných eosinofílů byl popsán v cirkulaci, bronchiální sekreci a v parenchymu plic pacientů s chronickým astmatem, a závažnost choroby, jak je měřena velkou škálou testů plicních funkcí, koreluje s počtem eosinofílů v krvi (Griffen et al., J. Aller. Clin. Immunol., 67: 548 - 558 (1991)). Zvýšený počet eosinofílů, často v procesu degranulace, byl také získán v tekutině broncheoalveolámí laváže (BAL) od pacientů, u kterých proběhla pozdní astmatická reakce, a redukce počtu eosinofílů, obvykle jako následek terapie steroidy, je asociována se zlepšením klinických symptomů (Bousquet et al., N. Eng. J. Med., 323: 1033 - 1039 (1990)).
Interleukin 5 (IL-5) je homodimemí glykoprotein produkovaný predominantně aktivovanými CD4+ T lymfocyty. U lidí je IL-5 široce odpovědný za kontrolu růstu a diferenciace eosinofílů. Zvýšené hladiny IL-5 jsou detekovány ve výplaších bronchoalveolámí laváže od astmatiků (Motojima et al., Allergy 48: 98 - (1994). Myši, které jsou transgenní pro IL-5 vykazují značnou eosinofílii v periferní krvi a tkáních za absence antigenní stimulace (Dent et al., J. Exp. Med., 172: 1425 (1990)) a u anti myších IL-5 monoklonálních protilátek byl ukázán účinek v redukci eosinofílie v krvi a tkáních myší (Hitoshi et al., Int. Immunol. 3: 135 (1995) stejně jako eosinofílie asociované s parasitámí infekcí a expozici alergenu u experimentálních zvířat (Coffman et al., Science 4: 308 - 310 (1998) Sher et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 83: 61 - 65 (1990), Chandetal., Eur. J. Pharmacol., 211: 121 - 123 (1992).
Ačkoliv kortikosteroidy jsou extrémně účinné v supresi počtu eosinofílů a jiných složek zánětu u astma, jsou zvažovány vzhledem ke svým vedlejším účinkům jak u těžkých astmatiků, tak v poslední době i u astmatiků středního a mírného stupně. Jediná další hlavní protizánětlivá léková
-1 CZ 297045 B6 terapie - kromoglykáty (kromolyn sodný a nedocromil) - je významně méně účinná než kortikosteroidy a její přesný mechanismus účinku zůstává neznámý.
Nedávné výzkumy se zaměřily na nové inhalační steroidy, bronchodilatancia s delším účinkem a agens účinkující na nových biochemických a farmakologických cílech (např. aktivátory draslíkových kanálů, antagonisté leukotrienů, inhibitory 5-lipooxygenasy atd.). Ideálním léčivem by bylo to, které by kombinovalo účinnost steroidů s bezpečností spojenou s použitím kromolynu sodného, a ještě by mělo zvýšenou selektivitu a rychlejší nástup účinku. IL-5 neutralizující protilátky mohou být potenciálně užitečné v léčbě s eosinofilií spojených příznaků u lidí.
Proto v oboru existuje potřeba pro vysoce afínitní antagonisty IL-5, jako jsou neutralizační monoklonální protilátky proti lidskému interleukinu 5, které budou redukovat diferenciaci a proliferaci eosinofilů (tj. akumulaci eosinofilů) a tak eosinofilní zánětlivou reakci.
Podstata vynálezu
Předmětem tohoto vynálezu je hlodavčí neutralizační monoklonální protilátka specifická pro lidský interleukin 5 a mající vazebnou afinitu charakterizovanou disociační konstantou rovnou nebo menší než 3,5 x 10 11 M, kde aminokyselinové sekvence CDR1, CDR2 a CDR3 těžkého řetězce jsou uvedeny v SEQ ID NO: 7, 8, 9 nebo 7, 8, 14 a aminokyselinové sekvence CDR1, CDR2 a CDR3 lehkého řetězce jsou uvedeny v SEQ ID NO: 10, 11, 12 nebo 10, 11, 13, stejně jako 47, 48.
Předmětem tohoto vynálezu je také hybridom mající identifikující charakteristiky buněčné linie SKI 19-2B6.206.75(1), uložený pod ATCC přístupovým číslem HB 11783, SKI 19-2E3.39.40.2, uložený pod ATCC přístupovým číslem HB 11782, SKI 19—2F2.37.80.12, uložený pod ATCC přístupovým číslem HB 11781 nebo 4A6(1)G1F7, uložený pod ATCC přístupovým číslem HB 11943, jakož i hybridom mající identifikující charakteristiky buněčné linie SKI 1924G9.8.20.5, uložené pod ATCC přístupovým číslem HB 11870, nebo 5D3(1)F5D6, uložené pod ATCC přístupovým číslem HB 11942.
Předmětem tohoto vynálezu je dále neutralizační Fab fragment nebo jeho Fb(ab')2 fragment produkovaný delecí Fc regionu u monoklonální protilátky popsané výše, jakož i produkovaný přeskupením řetězců, kde je Fd těžký řetězec monoklonální protilátky popsané výše exprimován s myším lehkým řetězcem ve filamentosní fágové Fab zobrazující knihovně nebo kde je lehký řetězec monoklonální protilátky popsané výše exprimován s myším těžkým řetězcem ve filamentosní fágové Fab zobrazující knihovně.
Předmětem tohoto vynálezu je též pozměněná protilátka obsahující těžký řetězec a lehký řetězec, kde jsou úseky základní struktury (frameshift region) uvedeného těžkého a lehkého řetězce z alespoň jedné vybrané protilátky a aminokyselinové sekvence komplementaritu určujících regionů každého uvedeného řetězce jsou z monoklonální protilátky popsané výše.
Předmětem vynálezu je dále komplementaritu určující region (CDR) těžkého nebo lehkého řetězce imunoglobulinu.
Předmětem tohoto vynálezu je taktéž molekula nukleové kyseliny kódující komplementaritu určující region (CDR) imunoglobulinu.
Předmětem tohoto vynálezu je také chimérická protilátka obsahující těžký řetězec a lehký řetězec, kde uvedená protilátka je charakterizována disociační konstantou rovnou nebo menší než 3,5 x 10 11 M pro lidský interleukin 5, kde jsou konstantní regiony uvedeného lehkého a těžkého řetězce z alespoň jedné vybrané protilátky a aminokyselinové sekvence variabilních regionů každého uvedeného řetězce jsou z monoklonální protilátky popsané výše.
-2CZ 297045 B6
Předmětem tohoto vynálezu je rovněž farmaceutická kompozice, jejíž podstata spočívá v tom, že obsahuje pozměněnou protilátku popsanou výše a farmaceuticky akceptovatelný.
Předmětem tohoto vynálezu je dále použití pozměněné protilátky popsané výše pro výrobu léčiva pro léčbu stavů asociovaných s excesivní produkcí eosinofílů.
Předmětem tohoto vynálezu je také izolovaná sekvence nukleové kyseliny.
Předmětem tohoto vynálezu je rovněž rekombinantní plasmid obsahující sekvenci nukleových kyselin vymezenou výše, jakož i hostitelská buňka transfekovaná takovým rekombinantním plasmidem.
Předmětem tohoto vynálezu je dále způsob pro produkci pozměněných protilátek podle nároku 1, specifických pro lidský interleukin 5, jehož podstata spočívá vtom, že zahrnuje kultivaci buněčné linie transfekované rekombinantním plasmidem uvedeným svrchu pod kontrolou vybraných regulačních sekvencí schopných řízení jeho exprese v uvedených buňkách.
Předmětem tohoto vynálezu je konečně monoklonální protilátka produkovaná hybridomem popsaným výše.
Dále se uvádějí různé aspekty tohoto vynálezu a jejich podrobnější objasnění.
V prvním aspektu předkládaný vynález poskytuje hlodavčí (např. krysí nebo myší) neutralizační monoklonální protilátky specifické pro lidský interleukin 5 a mající vazebnou afinitu charakterizovanou disociační konstantou rovnou nebo menší 3,5 x 10“11 M jak je popsána v podrobném popisu. Příkladem takových monoklonálních protilátek jsou myší monoklonální protilátky 2B6, 2E6 a 2F2 a krysí monoklonální protilátka jako je 4A6. Jiným aspektem vynálezu jsou hybridomyjakoje SKI 19-2B6.206.75 (1), SKI 19-2E3.39.40.2, SKI 19-2F2.37.80.12, 4A6(1)G1F7 a 5D3(1)F5D6.
V příbuzném aspektu předkládaný vynález poskytuje jejich neutralizační Fab fragmenty nebo F(ab)'2 fragmenty specifické pro lidský interleukin 5 produkované deletováním Fc regionu hlodavčích neutralizačních monoklonálních protilátek podle předkládaného vynálezu.
V ještě dalším příbuzném aspektu předkládaný vynález poskytuje jejich neutralizační Fab fragmenty nebo F(ab)'2 fragmenty specifické pro lidský interleukin 5 produkované technikou přesunů řetězců, kde je těžký (nebo lehký) imunoglobulinový řetězec, izolovaný z hlodavčích neutralizačních monoklonálních protilátek podle vynálezu exprivován s lehkým (nebo těžkým) řetězcem imunoglobulinové knihovny izolovaným z interleukinem 5 imunizovaných hlodavců, ve filamentosním fágu Fab zobrazené knihovně.
V ještě dalším příbuzném aspektu předkládaný vynález poskytuje změněnou protilátku specifickou pro lidský interleukin 5, která obsahuje komplementaritu určující regiony (CDR) odvozené od non-lidské neutralizační monoklonální protilátky (mAb) charakterizované disociační konstantou rovnou nebo menší 3,5 x 10 11 pro lidský interleukin 5 a molekulou nukleové kyseliny kódující stejné. Pokud je pozměněnou protilátkou humanizovaná protilátka, pak sekvence, která kóduje komplementaritu určující regiony (CDR) z non-lidského imunoglobulinu jsou insertovány do prvního imunoglobulinového partnera, ve kterém alespoň jeden, a preferovaně všechny komplementaritu určující regiony (CDR) prvního imunoglobulinového partnera jsou nahrazeny CDR z non-lidské monoklonální protilátky. Preferovaně je první imunoglobulinový partner operativně navázán na druhý imunoglobulinový partner, který obsahuje všechny nebo část konstantního řetězce imunoglobulinů.
-3 CZ 297045 B6
V příbuzném aspektu předkládaný vynález poskytuje CDR odvozené od non-lidských neutralizačních monoklonálních protilátek (mAb) charakterizovaných disociační konstantou rovnou nebo menší 3,5 x 10 11 pro lidský interleukin 5 a molekulou nukleové kyseliny kódující takové CDR.
V ještě dalším aspektu je zde poskytnuta chimérická protilátka obsahující konstantní regiony lidských těžkých a lehkých řetězců a variabilní regiony těžkých a lehkých řetězců odvozených od non-lidských neutralizačních monoklonálních protilátek charakterizovaných disociační konstantou rovnou nebo menší 3,5 x 10 11 pro lidský interleukin 5.
V ještě dalším aspektu předkládaný vynález poskytuje farmaceutickou kompozici, která obsahuje jeden (nebo více) výše popsaných pozměněných protilátek a farmaceuticky akceptovatelný nosič.
V dalším aspektu předkládaný vynález poskytuje způsob pro léčbu stavů u lidí asociovaných s excesivní produkcí eosinofilů podáním účinného množství farmaceutické kompozice podle vynálezu uvedeným lidem.
V ještě dalším aspektu předkládaný vynález poskytuje způsob pro, a složky užitečné v, rekombinantní produkci pozměněných protilátek (např. zpracovaných protilátek, CDR, Fab nebo F(ab)'2 fragmentů, nebo jejich analog), které jsou odvozené od non-lidských neutralizačních monoklonálních protilátek (mAb) charakterizovaných disociační konstantou rovnou nebo menší 3,5 x 10 11 pro lidský IL-5. Tyto složky zahrnují izolované sekvence nukleových kyselin kódujících tento, rekombinantní plasmidy obsahující sekvence nukleových kyselin pod kontrolou vybrané regulačních sekvencí, které jsou schopné řízení jejich exprese v hostitelských buňkách (preferovaně savčích) transfektovaných rekombinantními plasmidy. Metoda produkce vyžaduje kultivování transfektované hostitelské linie podle předkládaného vynálezu za takových podmínek, že alterovaná protilátka, preferovaně humanizovaná protilátka, je exprivována v uvedených buňkách a izolování exprivovaného produktu z těchto buněk.
Ještě dalším aspektem vynálezu je způsob pro diagnostiku stavů asociovaných s excesivní produkcí eosinofilů u lidí, který zahrnuje získání vzorku biologické tekutiny od pacienta a umožnění kontaktu protilátek a pozměněných protilátek podle vynálezu s takovým vzorkem za takových podmínek, že je tvořen komplex IL-5/(monoklonální nebo pozměněná) protilátka a detekování přítomnosti nebo absence uvedeného komplexu IL-5/protilátka.
Jiné aspekty a výhody předkládaného vynálezu jsou popsány dále v podrobném popisu a v jeho preferovaných provedeních.
Popis obrázků na připojených výkresech
Obr. 1 (SEQ ID NO: 1 až 15) ilustruje variabilní region těžkého řetězce pro myší protilátku 2B6, a myší/lidskou 2B6 chimérickou protilátku. Orámečkované oblasti značí CDR.
Obr. 2 (SEQ ID NO: 2 a 16) ilustruje variabilní region lehkého řetězce pro myší protilátku 2B6, a myší/lidskou 2B6 chimérickou protilátku. Orámečkované oblasti značí CDR.
Obr. 3 (SEQ ID NO: 3) ilustruje variabilní region těžkého řetězce pro myší protilátku 2F2. Orámečkované oblasti značí CDR.
Obr. 4 (SEQ ID NO: 4) ilustruje variabilní region lehkého řetězce pro myší protilátku 2F2. Orámečkované oblasti značí CDR.
Obr. 5 (SEQ ID NO: 5) ilustruje variabilní region těžkého řetězce pro myší protilátku 2E3. Orámečkované oblasti značí CDR.
Obr. 6 (SEQ ID NO: 6) ilustruje variabilní region lehkého řetězce pro myší protilátku 2E3. Orámečkované oblasti značí CDR.
-4CZ 297045 B6
Obr. 7 (SEQ ID NO: 7-14) ilustruje těžké a lehké řetězce CDR z myších protilátek 2B6, 2F2 a 2E3.
Obr. 8 (SEQ ID NO: 18, 19) ilustruje variabilní region těžkého řetězce pro humanizovanou protilátku 2B6. Orámečkované oblasti značí CDR.
Obr. 9 (SEQ ID NO: 20, 21) ilustruje variabilní region lehkého řetězce pro humanizovanou protilátku 2B6. Orámečkované oblasti značí CDR.
Obr. 10 je schematická kresba plasmidu pCDIL5HZHC1.0 využitého pro expresi genu humanizovaného těžkého řetězce v savčích buňkách. Plasmid obsahuje beta laktamasový gen (BETA LAC), SV-40 zdroj replikace (SV40), cytomegalovirovou promotorovou sekvenci (CMV), signální sekvenci, humanizovaný těžký řetězec, póly A signál z hovězího růstového hormonu (BGH), betaglobinový promotor (beta glopro), gen dihydrofolát reduktasy (DHFR) a jiný póly A signál BGH sekvence na pUC19 pozadí.
Obr. 11 je schematická kresba plasmidu pCNIL5HZLC1.0 využitého pro expresi genu humanizovaného lehkého řetězce v savčích buňkách.
Obr. 12 (SEQ ID NO: 61, 62) ilustruje variabilní region NewM těžkého řetězce pro humanizovanou protilátku 2B6. Orámečkované oblasti značí CDR.
Obr. 13 (SEQ ID NO: 69, 70) ilustruje variabilní region REI lehkého řetězce pro humanizovanou protilátku 2B6. Orámečkované oblasti značí CDR.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje škálu protilátek, pozměněných protilátek a jejich fragmentů, které jsou charakterizovány vazebnou specifitou pro lidský IL-5, neutralizační aktivitou a vysokou afinitou pro lidský IL-5 jak je doloženo na příkladu myší monoklonální protilátky 2B6. Protilátky podle předkládaného vynálezu byly připraveny konvenčními technikami hybridomů, fágovými kombinatoriálními knihovnami, přeskupování imunoglobulinových řetězců, a humanizačními technikami pro generování nových neutralizačních protilátek. Tyto produkty jsou použitelné v terapeutických a farmaceutických kompozicích pro léčbu IL-5 zprostředkovaných chorob, např. astmatu. Tyto produkty jsou také využitelné v diagnostice IL-5 zprostředkovaných stavů měřením (např. enzymem vázanou imunosorbentní zkouškou (ELISA)) endogenní hladiny IL-5 u lidí nebo IL-5 uvolňované ex vivo z aktivovaných buněk.
I. Definice „Pozměněná protilátka“ označuje protein kódovaný pozměněným imunoglobulin kódujícím regionem, který může být získán expresí ve vybraném hostiteli. Takové pozměněné protilátky jsou zpracované protilátky (např. chimérické nebo humanizované protilátky) nebo fragmenty protilátky postrádající celý nebo část konstantního regionu imunoglobulinu, např. Fv, Fab, nebo F(ab)2 a podobně.
„Pozměněný imunoglobulin kódující region“ označuje sekvenci nukleových kyselin kódující pozměněnou protilátku podle vynálezu. Pokud je pozměněnou protilátkou CDR-roubovaná nebo humanizovaná protilátka, pak jsou sekvence kódující komplementaritu určující regiony (CDR) z non-lidského imunoglobulinu insertovány do prvního imunoglobulinového partnera obsahujícího sekvence lidských variabilních úseků základní struktury. Volitelně je první imunoglobulinový partner operativně navázán na druhý imunoglobulinový partner.
„První imunoglobulinový partner“ označuje sekvenci nukleové kyseliny kódující lidský úsek základní struktury nebo variabilní region lidského imunoglobulinu, ve kterém jsou nativní (nebo přirozeně se vyskytující) CDR kódující regiony nahrazeny CDR kódující regiony donorové protilátky. Lidský variabilní region může být těžký řetězec imunoglobulinu, lehký řetězec, (nebo oba řetězce), nebo jejich analoga nebo funkční fragmenty. Takové CDR regiony umístěné uvnitř
-5CZ 297045 B6 variabilního regionu protilátek (imunoglobulinů) mohou být určeny metodami v oboru známými. Například Kabat et al., (Sequences of Proteins of Immunological Interes, 4. vydání, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)) popisuje pravidla pro zaměření CDR. Kromě toho jsou známé počítačové programy, které jsou užitečné pro identifikaci CDR regionů/struktur.
„Neutralizační“ označuje protilátku, která inhibuje aktivitu IL-5 zabráněním vazby lidského IL-5 na jeho specifický receptor nebo inhibicí signalizace IL-5 prostřednictvím tohoto receptoru, pokud vazba proběhla. mAb je neutralizační, jestliže je 90% účinná, lépe 95% účinná a nejlépe 100% účinná v inhibici IL-5 aktivity, jak je měřena vbiotestu B13 buněk (IL-5 neutralizační test, viz příklad 2C).
Termín „vysoce afinitní“ označuje protilátku mající vazebnou afinitu charakterizovanou Kd rovnou nebo menší než 3,5 x 10 11 M pro lidský IL-5, jak je určeno optickými biosenzorickými analýzami (viz příklad 2D).
„Vazebnou specifitou pro lidský IL-5“ je míněna vysoká afinita pro lidský, nikoliv pro myší, IL5.
„Druhý imunoglobulinový partner“ označuje jinou nukleotidovou sekvenci kódující protein nebo peptid, na který je první imunoglobulinový partner fúzován v rámečku nebo prostřednictvím volitelné konvenční linkerové sekvence (např. operativně navázán). Preferovaně to je imunoglobulinový gen. Druhý imunoglobulinový partner může obsahovat sekvenci nukleové kyseliny kódující celý konstantní region pro stejné (tj. homologní - první a druhá pozměněná protilátka jsou odvozeny od stejného zdroje) nebo adiční (tj. heterologní) požadované protilátky. Může to být těžký nebo lehký řetězec imunoglobulinu (nebo oba řetězce jako část jednoho polypeptidu). Druhý imunoglobulinový partner není omezen na určitou třídu nebo izotyp imunoglobulinů. Kromě toho, druhý imunoglobulinový partner může obsahovat část konstantního regionu imunoglobulinu, jak je nacházeno ve Fab nebo F(ab)2 (tj. diskrétní část vhodného lidského konstantního regionu nebo úseku základní struktury). Takový druhý imunoglobulinový partner může také obsahovat sekvenci kódující integrální membránový protein přítomný na zevním povrchu hostitelské buňky, např. jako část fágové knihovny, nebo sekvenci kódující protein pro analytickou nebo diagnostickou detekci, např. křenovou peroxidasu, β-galaktosidasu, atd.
Termíny Fv, Fc, Fd, Fab nebo F(ab)2 jsou použité v jejich standardním významu (viz např. Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)).
Jak je zde použito popisuje „zpracovaná protilátka“ typ pozměněné protilátky, tj. kompletně syntetickou protilátku (např. chimérickou nebo humanizovanou protilátku v protikladu k fragmentu protilátky), ve které je část variabilních domén lehkého a/nebo těžkého řetězce vybrané akceptorové protilátky nahrazena analogickými částmi z jedné nebo více donorových protilátek, které jsou specifické pro vybraný epitop. Například mohou takové molekuly zahrnovat protilátky charakterizované humanizovaným těžkým řetězcem asociovaným s nemodifikovaným lehkým řetězcem (nebo chimérickým lehkým řetězcem) nebo vice versa. Zpracované protilátky mohou také být charakterizovány alterací sekvence nukleové kyseliny kódujících úseky základní struktury variabilní domény lehkého a/nebo těžkého řetězce akceptorové protilátky tak, aby získala vazebnou specificitu donorové protilátky. Tyto protilátky mohou obsahovat nahrazení jedné nebo více CDR (preferovaně všech) z akceptorové protilátky s CDR z donorové protilátky, jak je zde popsáno.
„Chimérická protilátka“ označuje typ zpracované protilátky, která obsahuje přirozeně se vyskytující variabilní region (lehký a těžký řetězec) odvozený od donorové protilátky v asociaci s konstantními regiony lehkých a těžkých řetězců odvozených od akceptorové protilátky.
-6CZ 297045 B6 „Humanizovaná protilátka“ označuje typ zpracované protilátky, která má CDR odvozené od nonlidského donorového imunoglobulinu, a zbývající z imunoglobulinu odvozené části molekuly odvozené od jednoho (nebo více) lidských imunoglobulinů. Kromě toho mohou být zbytky úseků základní struktury pozměněny tak, aby se zachovala vazebná afinita (viz např. Queen et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 8: 10029 - 10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421 (1991)).
Termín „donorová protilátka“ označuje protilátku (monoklonální nebo rekombinantní), která přispívá sekvencí nukleové kyseliny svých variabilních regionů, CDR, nebo jiných funkčních fragmentů nebo jejich analog prvnímu imunoglobulinovému partneru, takže poskytuje pozměněný imunoglobulinový kódující region a výslednou exprimovanou pozměněnou protilátku s antigenní specifitou nebo neutralizační aktivitou charakteristickou pro donorovou protilátku. Jednou donorovou protilátkou vhodnou pro použití v tomto vynálezu je non-lidská neutralizační monoklonální protilátka (tj. myší) označená jako 2B6. Protilátka 2B6 je definována jako vysoce afínitní, lidský IL-5 specifická (tj. nerozpoznávající myší IL-5) neutralizační protilátka izotypu IgGi mající DNA variabilního lehkého řetězce s aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1 a 15, v příslušném pořadí, na vhodném myším IgG konstantním regionu.
Termín „akceptorová protilátka“ označuje protilátku (monoklonální nebo rekombinantní) heterologní k donorové protilátce, která přispívá všemi (nebo jakoukoliv částí, ale preferovaně všemi) sekvencemi nukleových kyselin kódujícími své úseky základní struktury těžkého a/nebo lehkého řetězce a/nebo své konstantní řetězce těžkého a/nebo lehkého řetězce k prvnímu imunoglobulinovému partneru. Preferovaně je lidská protilátka akceptorovou protilátkou.
„CDR“ je definována jako aminokyselinová sekvence komplementaritu určujícího regionu protilátky, kterými jsou hypervariabilní regiony lehkých a těžkých řetězců imunoglobulinů. Viz např. Kabat et al„ (Sequences of Proteins of Immunological Interes, 4. vydání, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987). Existují tři CDR těžkého řetězce a tři CDR lehkého řetězce (nebo CDR regiony) ve variabilní části imunoglobulinu. Tak „CDR“ jak je zde použito označuje všechny tři CDR těžkého řetězce nebo všechny tři CDR lehkého řetězce (nebo jak CDR těžkého, tak CDR lehkého řetězce, je-li to vhodné).
CDR poskytuje většinu kontaktních zbytků pro vazbu protilátky na antigen nebo epitop. Žádoucí CDR pro tento vynález jsou odvozeny od variabilních sekvencí těžkého a lehkého řetězce donorové protilátky, a zahrnující analoga přirozeně se vyskytujících CDR, kterážto analoga se také podílejí na nebo si uchovávají stejnou vazebnou specifitu pro antigen a/nebo neutralizační schopnost jako donorová protilátka, ze které byly odvozeny.
„Podílením se na vazebné specifitě pro antigen nebo na neutralizační schopnosti“ je míněno například to, že ačkoliv mAb 2B6 může být charakterizována jistým stupněm afinity pro antigen, může mít CDR kódovaný sekvencí nukleových kyselin 2B6 za vhodných strukturálních podmínek nižší nebo vyšší afinitu. Je očekáváno, že CDR 2B6 za takových podmínek nebudou nikdy rozpoznávat stejný epitop jako 2B6. Příkladné těžké řetězce CDR 2B6 zahrnují SEQ ID NO:7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; a příkladné lehké řetězce CDR 2B6 zahrnují SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; a SEQ ID NO: 12.
„Funkční fragment“ je částečná variabilní sekvence těžkého nebo lehkého řetězce (např. malé delece v amino nebo karboxy konci variabilního regionu imunoglobulinu), která si uchovává stejnou vazebnou specifícitu pro antigen a/nebo neutralizační schopnost jako má protilátka, ze které byl fragment odvozen.
„Analog“ je aminokyselinová sekvence modifikovaná alespoň jednou aminokyselinou, kde uvedená modifikace může být chemická nebo substituce nebo přeskupení několika aminokyselin (tj. ne více než 10), kde tato modifikace umožňuje, aby si aminokyselinová sekvence uchovala biologické charakteristiky, např. vazebnou specifitu pro antigen a vysokou afinitu, nemodifikované sekvence. Například, mohou být konstruovány (silentní) mutace, cestou substituce, kde jsou
-7CZ 297045 B6 vytvořena jistá restrikční místa pro endonukleasy uvnitř nebo v sousedství CDR-kódujících regionů.
Analoga mohou také vzniknout jako alelická variace. „Alelické variace nebo modifikace“ jsou alterace sekvence nukleových kyselin kódujících aminokyselinovou nebo peptidovou sekvenci podle vynálezu. Takové variace nebo modifikace mohou být provedeny prostřednictvím degenerace genetického kódu nebo mohou být záměrně vytvořeny pro poskytnutí žádoucích charakteristik. Tyto variace nebo modifikace mohou nebo nemusí vést k jakékoliv alteraci v kódované aminokyselinové sekvenci.
Termín „efektorové agens“ označuje neproteinovou molekulu nosiče, se kterou může být pozměněná protilátka a/nebo přirozený nebo syntetický lehký nebo těžký řetězec donorové protilátky nebo jiný fragment donorové protilátky asociován s konvenčními prostředky. Takové neproteinové nosiče zahrnují konvenční nosiče používané na poli diagnostiky, například polystyrénové nebo jiné plastikové korálky, polysacharidy, např. jak jsou použity v BIAcore (Pharmacia) systému, nebo jiné neproteinové substance použitelné v medicíně a bezpečné při podání člověku a zvířatům. Jiná efektorová agens mohou zahrnovat makrocyklus, pro chelaci atomu těžkého kovu, nebo radioizotopy. Taková efektorová agens mohou být také užitečná pro zvýšení poločasu pozměněné protilátky, např. polyethylen glykol.
II. Vysoce afmitní IL-5 monoklonální protilátky
Pro použití v konstrukci protilátek, pozměněných protilátek a fragmentů podle vynálezu mohou být použity ne-lidské druhy (např. hovězí dobytek, ovce, opice, kuřata, hlodavci (např. krysy nebo myši) atd.) pro generování požadovaného imunoglobulinu za prezentace nativního lidského IL-5 nebo jeho peptidového epitopu. Konvenční hybridomové techniky jsou využity pro poskytnutí hybridomových buněčných linií secemujících non-lidské mAb proti IL-5. Takové hybridomy jsou potom vyšetřovány na vazbu za použití IL-5 navázaného na 96-jamkové plotny, jak je popsáno v příkladech, nebo alternativně za použití biotinylovaného IL-5 navázaného na streptavidinem potaženou plotnu.
Jednou příkladnou vysoce afmitní, neutralizační mAb podle předkládaného vynálezu je mAb 2B6, myší protilátka, která může být použita pro vývoj chimérické nebo humanizované protilátky, popsané přesněji v příkladu 1 níže. 2B6 mAb je charakterizována antigenovou vazebnou specificitou pro lidský IL-5, s Kd menší než 3,5 x 10“11 M (okolo 2,2 x 10”11 M) pro IL-5. Kd pro IL-5 pro Fab fragment z 2B6 (viz příklad 3H) je okolo 9 x 10 11 M, jak bylo určeno optickým biosenzorem. MAb 2B6 se jeví jako blokující vazebnou interakci mezilidským IL-5 a a-řetězcem lidského IL-5 receptoru.
Jinou žádoucí donorovou protilátkou je myší mAb 2E3. Tato mAb je charakterizována izotypem IgG2a, a má disociační konstantu pro hIL-5 menší než 3,5 x 10 M (okolo 2,0 x 10’1 M).
Ještě jinou žádoucí donorovou protilátkou je krysí mAb 4A6. Tato mAb je charakterizována tím, že má disociační konstantu pro hIL-5 menší než 3,5 x 10 M (okolo 1,8 x 10 nM). Kromě toho se mAb 4A6 zdá být blokující vazebnou interakci mezi lidským IL-5 a β-řetězcem lidského IL-5 receptoru.
Tento vynález není omezen na použití 2B6 mAb, 2E3 mAb nebo jejich hypervariabilních (tj. CDR) sekvencí. Jakékoliv jiné vhodné vysoce afmitní IL-5 protilátky charakterizovány tím, že mají disociační konstantu menší než 3,5 x 10_11M pro lidský IL-5 a korespondující anti IL-5 CDR mohou být za ně zaměněny. Kdekoliv je v následujícím popisu donorová protilátka identifikována jako 2B3 nebo 2E3, je toto provedeno pouze pro ilustraci a zjednodušení popisu.
-8CZ 297045 B6
III. Fragmenty protilátky
Předkládaný vynález také zahrnuje použití Fab fragmentů nebo F(ab')2 fragmentů odvozených od mAb namířené proti lidskému IL-5. Tyto fragmenty jsou použitelné jako agens protektivní in vivo proti 1L-5 a eosinofily zprostředkovaným stavům nebo in vitro jako část IL-5 diagnostiky. Fab fragment obsahuje celý lehký řetězec a aminoterminální část těžkého řetězce; a F(ab')2 fragment je fragment tvořený dvěma Fab fragmenty navázanými disulfídovou vazbou. MAb 2B6, 2E3 a jiné podobné vysoce afinitní, IL-5 vážící protilátky poskytují zdroj Fab fragmentů a F(ab')2 fragmentů, které mohou být získány konvenčními prostředky, např. štěpením mAb vhodnými proteolytickými enzymy, papainem a/nebo pepsinem, nebo rekombinantními metodami. Tyto Fab a F(ab')2 fragmenty jsou použitelné sami o sobě jako terapeutická, profylaktická nebo diagnostická agens, a jako donory sekvencí obsahující variabilní regiony a CDR sekvence využitelné v tvorbě rekombinantních nebo humanizovaných protilátek, jak jsou zde popsány.
Fab a F(ab')2 fragmenty mohou být konstruovány cestou kombinatomí fágové knihovny (viz Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433 - 455 (1994)) nebo metodou míšení imunoglobulinových řetězců (viz např. Marks et al., Bio/Technology, 10: 779 - 783 (1992), oboje je zde uvedeno jako odkaz), kde Fd nebo vH imunoglobulinu z vybrané protilátky (např. 2B6) je umožněno asociovat s repertoárem lehkých řetězců imunoglobulinů, vL (nebo vK) za tvorby nových Fab. Naopak, lehkému řetězci z vybraného imunoglobulinu může být umožněna asociace s repertoárem těžkých řetězců imunoglobulinů, vH (nebo Fd), za tvorby nových Fab. Neutralizující IL-5 Fab byly získány tehdy, pokud Fd mAb 2B6 byla umožněna asociace s repertoárem lehkých řetězců imunoglobulinů, jak je podrobněji popsáno v příkladech. Proto je možné získat neutralizační Fab s jedinečnými sekvencemi (nukleotidovými a aminokyselinovými) technikou přeskupování řetězců.
IV. Požadované anti-IL-5 aminokyselinové a nukleotidové sekvence mAb 2B6 nebo jiné protilátky popsané výše mohou přispívat sekvencemi, jako jsou peptidové sekvence variabilního těžkého a/nebo lehkého řetězce, sekvence úseku základní struktury CDR sekvence, funkční fragmenty a jejich analoga, a jejich kódující sekvence nukleových kyselin, které jsou použitelné v projektování a získávání různých pozměněných protilátek, které jsou charakterizovány vazebnou specifítou pro antigen donor protilátky.
Jako jeden příklad poskytuje předkládaný vynález sekvence lehkého řetězce a variabilního těžkého řetězce z IL-5 myší protilátky 2B6 a sekvence od nich odvozené. Variabilní region těžkého řetězce 2B6 je ilustrován na obrázku 1. CDR kódující regiony jsou ukázány orámečkovanými políčky a jsou poskytnuty v SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; a SEQ ID NO: 9. Variabilní region lehkého řetězce klonu 2B6 je ilustrován na obrázku 2. CDR kódující regiony jsou poskytnuty SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; a SEQ ID NO: 12.
Variabilní region humanizovaného těžkého řetězce je ilustrován na obrázku 8 (SEQ ID NO: 18 a 19). Signální sekvence je také poskytnuta v SEQ ID NO: 17. Jiné vhodné signální sekvence, odborníkům známé, mohou být zaměněny za zde ukázané signální sekvence. CDR aminokyselinové sekvence tohoto konstruktu jsou identické s nativním myším a chimérickým těžkým řetězcem CDR a jsou poskytnuty SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; a SEQ ID NO: 9. Příkladná (syntetická) variabilní sekvence humanizovaného lehkého řetězce je ilustrována na obrázku 9 (SEQ ID NO: 20 a 21).
Sekvence nukleových kyselin podle vynálezu, nebo její fragmenty, kódující peptidové sekvence variabilního lehkého a těžkého řetězce jsou také použitelné pro mutagenní zavedení specifických změn do sekvence nukleových kyselin kódujících CDR nebo regiony úseků základní struktury, a pro inkorporaci vzniklých modifikovaných nebo fúzních sekvencí nukleových kyselin do plasmidů pro expresi. Například, substituce v nukleotidové sekvenci pracovních a CDR kódujících
-9CZ 297045 B6 regionů byly použity pro vytvoření míst pro restrikční enzymy, které usnadňují inzerci mutovaných CDR (a/nebo pracovních) regionů. Tyto CDR kódující regiony byly použity pro konstrukci humanizovaných protilátek podle vynálezu.
Pokud je brána do úvahy degenerace genetického kódu, pak mohou být konstruovány různé kódující sekvence, které kódují aminokyselinové sekvence variabilního lehkého a těžkého řetězce, a CDR sekvence podle vynálezu, stejně jako jejich funkční fragmenty a analoga, které si zachovávají vazebnou specifítou pro antigen donorové protilátky. Izolované sekvence nukleových kyselin podle vynálezu, nebo jejich fragmenty, kódující peptidové sekvence variabilního řetězce nebo CDR mohou být použity pro produkci pozměněných protilátek, např. chimérických nebo humanizovaných protilátek, nebo jiných upravených protilátek podle vynálezu, pokud jsou operativně kombinovány s druhým imunoglobulinovým partnerem.
Mělo by být zmíněno, že kromě izolovaných sekvencí nukleových kyselin kódujících části pozměněné protilátky a protilátek zde popsaných jsou v předkládaném vynálezu obsaženy také jiné sekvence nukleových kyselin, jako například ty, které jsou komplementární k nativním CDR kódujícím sekvencím nebo jsou komplementární k modifikovaným lidským úsekům základní struktury sousedícím s CDR kódující regiony. Použitelné DNA sekvence zahrnují ty sekvence, které hybridizují za podmínek přísné hybridizace (viz T. Maniatis et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (982), str. 387 až 389) na DNA sekvence. Příkladem takových podmínek přísné hybridizace je hybridizace při 4XSSC při 65 °C, po čemž následuje promytí v 0,lXSSC při 65 °C po 1 hodinu. Alternativním příkladem podmínek přísné hybridizace je 50% formamid, 4XSSC při 42 °C. Preferovaně jsou tyto hybridizující DNA sekvence délky alespoň 18 nukleotidů, tj. okolo velikosti CDR.
V. Pozměněné imunoglobulinové molekuly a pozměněné protilátky
Pozměněné imunoglobulinové molekuly mohou kódovat pozměněné protilátky, které zahrnují upravené protilátky jako jsou chimérické protilátky a humanizované protilátky. Požadovaný pozměněný imunoglobulin kódující region obsahuje CDR kódující region, který kóduje peptid mající antigenní specifitu IL-5 protilátky, preferovaně vysoce aflnitní protilátky jak je ta, která je poskytnuta předkládaným vynálezem, insertovaný do prvního imunoglobulinového partnera (lidského pracovního regionu nebo variabilního regionu lidského imunoglobulinu).
Preferovaně je první imunoglobulinový partner operativně navázán na druhý imunoglobulinový partner. Druhý imunoglobulinový partner je definován výše a může obsahovat sekvenci kódující druhý region požadované protilátky, například Fc region. Druhý imunoglobulinový partner může také obsahovat sekvence kódující jiný imunoglobulin, na kterýje fúzován konstantní region lehkého nebo těžkého řetězce v rámečku nebo prostřednictvím linker sekvence. Upravené protilátky namířené proti funkčním fragmentům nebo analogům IL-5 mohou být projektovány tak, aby vznikla zvýšená vazba se stejnou protilátkou.
Druhý imunoglobulinový partner může být také asociován s efektorovým agens jak je definováno výše, včetně neproteinové molekuly nosiče, na který může být druhý imunoglobulinový partner operativně navázán konvenčními prostředky.
Fúze nebo vazba mezi druhými imunoglobulinovými partnery, např. sekvencemi protilátky, a efektorovým agens může být provedena s jakýmikoliv vhodnými prostředky, např. běžnými kovalentními nebo iontovými vazbami, proteinovou fůzí, nebo hetero-bifunkčními cross-linkery, např. karbodiimidem, glutaraldehydem a podobně. Takové techniky jsou v oboru známé a jsou popsány v běžných chemických a biochemických textech.
Navíc, konvenční linkerové sekvence, které jednoduše poskytují požadované množství prostoru mezi druhým imunoglobulinovým partnerem a efektorovým agens, mohou být také konstruovány
-10CZ 297045 B6 v pozměněném imunoglobulin kódujícím regionu. Charakter takových linkerů je odborníkům dobře znám.
Kromě toho, signální sekvence pro molekuly podle vynálezu mohou být modifikovány pro zvýšenou expresi. Příkladem je 2B6 humanizovaná protilátka mající signální sekvenci a CDR odvozenou od sekvence myšího těžkého řetězce, má původní signální peptid nahrazen jinou signální sekvencí (SEQ ID NO: 17).
Příkladná pozměněná protilátka obsahuje peptidové nebo proteinové sekvence variabilního těžkého a/nebo lehkého řetězce mající antigenní specifitu mAb 2B6, např., VH a VL řetězce. Ještě jiná požadovaná pozměněná protilátka podle vynálezu je charakterizována aminokyselinovou sekvencí obsahující alespoň jeden, a preferovaně všechny, CDR variabilního regionu těžkého a/nebo lehkého řetězce molekuly myší protilátky 2B6 se zbývající sekvencí odvozenou z lidského zdroje, nebo jeho funkčního fragmentu nebo analoga. Viz např. humanizované VH a VL regiony (obrázek 8 a 9).
V ještě dalším provedení může být upravená protilátka podle vynálezu připojena na další agens. Například může být použito postupu rekombinantní DNA technologie pro produkci upravené protilátky podle vynálezu, jejíž Fc fragment nebo CH2 CH3 doména úplné molekuly protilátky byla nahrazena enzymem nebo jinou deteko vatě lnou molekulou (tj. polypeptidovým efektorem nebo reportérovou molekulou).
Druhý imunoglobulinový partner může také být operativně navázán na neimunoglobulinový peptid, protein nebo jeho fragment heterologní k CDR obsahující sekvenci mající antigenní specifitu myší 2B6. Výsledný protein může vykazovat jak antigenní specifitu pro IL-5, tak charakteristiky neimunoglobulinu při expresi. Takovou charakteristikou fúzního partnera může být např. funkční charakteristika jako je jiná vazebná nebo receptorová doména, nebo terapeutická charakteristika, pokud je fúzní partner sám o sobě terapeutický protein, nebo jiné antigenní charakteristiky.
Jiný požadovaný protein podle tohoto vynálezu může obsahovat úplnou molekulu protilátky mající kompletní lehký a těžký řetězec, nebo jakýkoliv její diskrétní fragment, jako je Fab nebo F(ab')2 fragment, dimer těžkých řetězců nebo jakékoliv jejich minimální rekombinantní fragmenty jako je Fv nebo jednořetězcová protilátka (SCA) nebo jakoukoliv jinou molekulu se stejnou specifitou jako vybraná donorová protilátka, např. mAb 2B6 nebo 2E3. Takový protein může být použit pro tvorbu pozměněné protilátky nebo může být použit ve své nefúzované formě.
Kdekoliv je druhý imunoglobulinový partner odvozen od protilátky jiné než je donorová protilátka, např. od úseku základní struktury nebo konstantního regionu jakéhokoliv izotypu nebo třídy imunoglobulinu, vzniká upravená protilátka. Upravené protilátky mohou obsahovat imunoglobulinové (Ig) konstantní regiony a variabilní úseky základní struktury z jednoho zdroje, např. akceptorové protilátky a jeden nebo více (preferovaně všechny) CDR z donorové protilátky, např. anti-IL-5 protilátky zde popsané. Kromě toho, alterace, např. delece, substituce nebo adice na úrovni nukleových kyselin nebo aminokyselin úseků základní struktury lehkých a/nebo těžkých variabilních domén, akceptorový mAb, nebo donorových CDR regionů, mohou být provedeny tak, aby se zachovala vazebná specificita donorové protilátky pro antigen.
Takové upravené protilátky jsou projektovány tak, aby využily jeden (nebo oba) variabilní těžké a/nebo lehké řetězce IL-5 mAb (volitelně modifikované jak je popsáno) nebo jeden nebo více dále identifikovaných těžkých nebo lehkých řetězců CDR (viz také obrázek 7). Upravené protilátky podle vynálezu jsou neutralizační, tj. požadovaným způsobem blokují vazbu IL-5 proteinu na receptor a také blokují nebo brání proliferaci IL-5 dependentních buněk.
Takové upravené protilátky mohou zahrnovat humanizované protilátky obsahující úseky základní struktury vybraného lidského imunoglobulinu nebo subtypu, nebo chimérické protilátky obsahující konstantní regiony lidského lehkého a těžkého řetězce fúzované s fragmenty IL-5 protilátky.
-11 CZ 297045 B6
Vhodná lidská (nebo jiná zvířecí) akceptorová protilátka může být vybrána z konvenční databáze, a např. KABAT® databáze, Los Alamos databáze a Swiss Protein databáze, podle homologie nukleotidové a aminokyselinové sekvence donorové protilátky. Lidská protilátka charakterizovaná homologií k úsekům základní struktury donorové protilátky (na aminokyselinovém základě) může být vhodná pro poskytnutí konstantního regionu těžkého řetězce a/nebo úseků základní struktury variabilního regionu těžkého řetězce pro inzerci donorových CDR. Vhodná akceptorová protilátka schopná poskytnout konstantní nebo variabilní úseky základní struktury lehkého řetězce může být vybrána stejným způsobem. Mělo by být uvedeno, že není požadováno, aby těžké a lehké řetězce akceptorové protilátky pocházely ze stejného akceptorová protilátky.
Výhodně jsou heterologní úseky základní struktury a konstantní regiony vybrány ze tříd a izotypů lidských protilátek, jako je IgG (subtypy 1 až 4), IgM, IgA a IgE. Nicméně akceptorová protilátka nemusí obsahovat pouze proteinové sekvence lidského imunoglobulinu. Například může být konstruován gen, ve kterém je DNA sekvence kódující část řetězce lidského imunoglobulinu fúzována na DNA sekvenci kódující neimunoglobulinovou aminokyselinovou sekvenci, jako je polypeptidová efektorová nebo reporterová molekula.
Jeden příklad určité požadované humanizované protilátky obsahuje CDR z 2B6 insertované do úseků základní struktury vybrané sekvence lidské protilátky. Pro neutralizační humanizované protilátky jsou jeden, dva nebo preferovaně tři CDR z variabilních regionů těžkého řetězce a/nebo lehkého řetězce IL-5 protilátky insertovány do úseků základní struktury vybrané sekvence lidské protilátky za náhrady nativních CDR této další protilátky.
Preferovaně, v humanizované protilátce byly variabilní domény lidských lehkých a těžkých řetězců upraveny jednou nebo více CDR záměnami. Je možné použít všech šest CDR, nebo různé kombinace méně než šesti CDR. Preferovaně je nahrazeno všech šest CDR. Je možné nahradit CDR pouze v lidském těžkém řetězci, za použití jako lehkého řetězce nemodifikovaného lehkého řetězce z lidské akceptorové protilátky. Ještě alternativně může být kompatibilní lehký řetězec vybrán z jiné lidské protilátky pomocí běžné databáze protilátek. Zbytek upravené protilátky může být odvozen od jakéhokoliv vhodného lidského akceptorového imunoglobulinu.
Upravená humanizovaná protilátka tak má strukturu přirozené lidské protilátky nebo jejího fragmentu, a má kombinaci vlastností požadovaných pro účinné terapeutické použití, např. léčbu IL5 zprostředkovaných zánětlivých onemocnění u lidí, nebo pro diagnostické použití.
Jako jiný příklad může upravená protilátka obsahovat tři CDR variabilního regionu lehkého řetězce 2E3 (SEQ ID NO: 0, a 13) a tři CDR variabilního regionu těžkého řetězce 2B6 (SEQ ID NO: 7, 8 a 9). Vzniklá humanizovaná protilátka by měla být charakterizována stejnou vazebnou specifitou pro antigen a vysokou afinitou jako 2B6.
Odborník pochopí, že upravené protilátky mohou být dále modifikovány změnami v aminokyselinách variabilní domény bez nutného ovlivnění specificity a vysoké afinity donorové protilátky (tj. analoga). Je předkládáno, že aminokyseliny lehkého a těžkého řetězce mohou být substituovány jinými aminokyselinami jak ve variabilní doméně úseků základní struktury, tak v CDR nebo v obojím.
Kromě toho může být konstantní region pozměněn pro zvýšení nebo snížení selektivních vlastností molekul podle předkládaného vynálezu. Například dimerizací, navázáním na Fc receptory nebo schopností vázat a aktivovat komplement (viz např. Angal et al., Mol. Immunol. 30: 105 108 (1993), Xu et al., J. Biol. Chem. 269: 3469 - 3474 (1994), Winter et al., EP 307,434-B).
Pozměněná protilátka, která je chimérickou protilátkou se odlišuje od humanizovaných protilátek, jak jsou popsány výše tím, že poskytuje kompletní variabilní regiony lehkého a těžkého řetězce non-lidské donorové protilátky, včetně úseků základní struktury, v asociaci s konstantními regiony lidského imunoglobulinu pro oba řetězce. Je předpokládáno, že chimérické proti
- 12CZ 297045 B6 látky, které si uchovávají další ne-lidské sekvence příbuzné humanizovaným protilátkám podle vynálezu, mohou vyvolat signifikantní imunitní odpověď u lidí.
Takové protilátky jsou užitečné v zabránění a léčbě IL-5 zprostředkovaných onemocnění, jak je uvedeno dále.
VI. Produkce pozměněných protilátek a upravených protilátek.
Preferovaně jsou v konstrukci protilátek, preferovaně humanizovaných protilátek podle vynálezu, použity variabilní sekvence lehkého a těžkého řetězce a CDR mAb 2B6 nebo jiných vhodných donorových mAb (např. 2E3, 2F2, 4A6 atd.) a jejich kódující sekvence nukleových kyselin, v následujícím procesu. Stejné nebo podobné techniky mohou být také použity pro generování jiných provedení vynálezu.
Hybridom produkující vybranou donorové mAb, např. myší protilátku 2B6, je konvenčně klonován a DNA jejich variabilních regionů lehkého a těžkého řetězce je získána technikami v oboru známými, např. technikou popsanou v Sambrook et al., (Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)). Tyto variabilní lehké a těžké regiony 2B6 obsahující alespoň CDR kódující regiony a ty části úseků základní struktury lehkých a těžkých variabilních regionů akceptorové mAb, které jsou požadovány pro zachování vazebné specifity donorové mAb, stejně jako zbývající od imunoglobulinu odvozené části protilátkového řetězce odvozeného od lidského imunoglobulinu jsou získány za použití polynukleotidových primerů a reversní transkriptázy. CDR kódující regiony jsou identifikovány za použití známé databáze a srovnáním s jiným protilátkami.
Myší/lidská chimérická protilátka může potom být připravena a testována na vazebnou schopnost. Taková chimérická protilátka obsahuje celé VH a VL regiony ne-lidské donorové protilátky v asociaci s konstantními regiony lidského Ig pro oba řetězce.
Homologní úseky základní struktury variabilního regionu těžkého řetězce byly identifikovány za použití počítačové databáze, např. KABAT®, a lidské protilátky mající homologii k 2B6 byly vybrány jako akceptorové protilátky. Sekvence syntetických variabilních regionů těžkého řetězce obsahující 2B6 CDR-kódující regiony uvnitř úseků základní struktury lidské protilátky byly projektovány s volitelnou nukleotidovou náhradou v úsecích základní struktury pro inkorporování restrikčních míst. Tato projektovaná sekvence byla potom syntetizována za použití dlouhých syntetických oligomerů. Alternativně může být projektovaná sekvence syntetizována přesahujícími oligonukleotidy, amplifikovanými polymerasovou řetězovou reakcí (PCR) a s opravou chyb.
Vhodné variabilní pracovní regiony lehkého řetězce byly projektovány podobným způsobem.
Humanizované protilátky mohou být odvozeny od chimérické protilátky, nebo preferovaně mohou být vyrobeny synteticky inzercí CDR kódujících regionů z lehkého a těžkého řetězce donorových mAb vhodným způsobem do vybraných úseků základní struktury lehkého a těžkého řetězce. Alternativně může být humanizovaná protilátka podle vynálezu připravena standardní technikou mutagenese. Tak obsahuje vzniklá humanizovaná protilátka lidské úseky základní struktury a donorové mAb CDR, kódující regiony. Následná manipulace residuí úseku základní struktury možná. Vzniklá humanizovaná protilátka může být exprimována v rekombinantních buňkách, např. COS, CHO nebo myelomových buňkách. Jiné humanizované protilátky mohou být připraveny za použití této techniky na jiné vhodné IL-5 specifické, neutralizační, vysoce afinitní ne-lidské protilátky.
Konvenční expresní vektor nebo rekombinantní plasmid je produkován umístěním těchto kódujících sekvencí pro pozměněnou protilátku v operativní asociaci s běžnými regulačními kontrolními sekvencemi schopnými kontroly replikace a exprese v, a/nebo sekrece z, hostitelské buňky. Regulační sekvence zahrnují promotorové sekvence, např. CMV promotor a signální sekvence,
-13 CZ 297045 B6 které mohou být odvozeny od jiných známých protilátek. Obdobně může být produkován druhý expresní vektor mající DNA sekvenci kódující komplementární lehký a těžký řetězec protilátky. Preferovaně je tento druhý expresní vektor identický s prvním kromě toho, že je uvažována kódující sekvence a selektovatelné markéry pro co možná nejlepší zajištění toho, aby každý polypeptidový řetězec byl funkčně exprimován. Alternativně, kódující sekvence lehkého a těžkého řetězce pro pozměněnou protilátku mohou být umístěny na jednom vektoru.
Vybraná hostitelská buňka je kotransfektována běžnými technikami jak prvním, tak druhým vektorem (nebo jednoduše transfektována jedním vektorem) pro vytvoření transfektované hostitelské buňky podle vynálezu obsahující rekombinantní nebo syntetické lehké a těžké řetězce. Transfektovaná buňka je potom kultivována běžnými technikami za produkce upravené protilátky podle vynálezu. Humanizované protilátka, která obsahuje asociaci obou rekombinantních těžkého a/nebo lehkého řetězce, je v kultuře vyšetřována vhodným testem, jako je ELISA nebo RIA. Podobné běžné techniky mohou být využity pro konstrukci jiných pozměněných protilátek a molekul podle vynálezu.
Vhodné vektory pro kroky klonování a subklonování použité v metodách a konstrukci kompozic podle tohoto vynálezu mohou být vybrány odborníkem v oboru. Například konvenční pUC série klonovaných vektorů mohou být použity. Jedním použitým vektorem je pUC19, který je komerčně dostupný od zásobovacích firem, jako je Amersham (Buckinghamshire, United Kingdom) nebo Pharmacia (Uppsala, Sweden). Kromě toho, jakýkoliv vektor, který je schopen snadné replikace, má hojnost klonovacích míst a selektovatelných genů (např. pro antibiotickou resistenci), a je snadno manipulovatelný může být použit pro klonování. Tak není selekce klonovacího vektoru limitujícím faktorem tohoto vynálezu.
Podobně mohou být vektory použité pro expresi upravených protilátek podle vynálezu vybrány odborníkem z jakýchkoliv běžných vektorů. Vektory také obsahují selektovatelné regulační sekvence (jako jsou CMV promotory), které řídí replikaci a expresi heterologních DNA sekvencí ve vybraných hostitelských buňkách. Tyto vektory obsahují výše popsané DNA sekvence, které kódují upravenou protilátku nebo pozměněný imunoglobulin kódující region. Kromě toho mohou vektory inkorporovat vybrané imunoglobulinové sekvence modifikované inzercí požadovaných restrikčních míst pro snadnou manipulaci.
Expresní vektory mohou také být charakterizovány geny vhodnými pro amplifikační expresi heterologních DNA sekvencí, např. savčího genu pro dihydrofolát reduktásu (DHRF). Jiné preferované vektorové sekvence obsahují póly A signální sekvence, jako jsou ty z hovězího růstového hormonu (BGH) a betaglobinové promotorové sekvence (betaglopro). Zde použitelné expresní vektory mohou být syntetizovány technikami, které jsou odborníkům dobře známé.
Složky takových vektorů, např. replikony, selekční geny, enhancery, promotory, signální sekvence a podobně, mohou být získány z komerčních nebo přirozených zdrojů nebo mohou být syntetizovány známými postupy pro použití v řízení exprese a/nebo sekrece produktu rekombinantní DNA ve vybraném hostiteli. Pro tento účel mohou být vybrány jiné vhodné expresní vektory, které jsou v oboru známé pro savčí, bakteriální, hmyzí, kvasinkovou a houbovou expresi.
Předkládaný vynález také obsahuje buněčné linie transfektované rekombinantním plasmidem obsahujícím kódující sekvence upravených protilátek nebo jejich pozměněných imunoglobulinových molekul. Hostitelské buňky použitelné pro klonování a jiné manipulace s těmito klonujícími vektory jsou také konvenční. Nicméně, nejvhodnější je, pokud jsou pro replikaci a jiné kroky v konstrukci pozměněných protilátek podle tohoto vynálezu použity buňky z různých kmenů E. coli.
Vhodnými hostitelskými buňkami nebo buněčnými liniemi pro expresi upravených protilátek podle vynálezu jsou preferovaně savčí buňky jako je CHO, COS, fibroblastové buňky (např. 3T3), a myeloidní buňky, a nejlépe CHO nebo myeloidní buňky. Lidské buňky mohou být pou
-14CZ 297045 B6 žity, což umožňuje modifikaci molekuly lidskými glykosylačními vzorky. Alternativně mohou být použity jiné eukaryotické buněčné linie. Selekce vhodných savčích hostitelských buněk a metod pro transformaci, kultivaci, amplifikaci, vyšetření a produkci produktu a purifíkaci jsou v oboru známé. Viz Sambrook et al., citován výše.
Bakteriální buňky se mohou ukázat jako užitečné pro expresi rekombinantních Fab podle předkládaného vynálezu (viz např. Pluckthun, A., Immunol. Rev. 130: 151 - 188 (1992)). Nicméně, vzhledem k tendenci proteinů exprimovaných v bakteriálních buňkách být v neskládané nebo nevhodně skládané formě nebo v neglykosylované formě měl by být jakýkoliv Fab produkovaný v bakteriální buňce vyšetřován na zachování vazebné schopnosti pro antigen. Pokud bude molekula exprimovaná bakteriální buňkou produkována ve správně složené formě, pak bude bakteriální buňka vhodným hostitelem. Například, různé kmeny E. coli použité pro expresi jsou v oblasti biotechnologie dobře známé jako hostitelské buňky. Různé kmeny B. subtilis, Streptomyces, jiné Bacilli a podobně mohou být také použity v této metodě.
Pokud je to žádoucí, jsou různé kmeny kvasinek odborníků známé také dostupné jako hostitelské buňky, stejně jako hmyzí buňky, např. Drosophila a Lepidoptera a virové expresní systémy. Viz např. Miller et al., Genetic Engineering, 8: 277 - 298, Plenům Press (1986) a odkazy zde citované.
Obecné metody, podle kterých mohou být vektory podle vynálezu konstruovány, metody transfekce vyžadované pro produkci hostitelských buněk podle vynálezu a kultivační metody nezbytné pro produkci pozměněných protilátek podle vynálezu z takových hostitelských buněk jsou vše běžné techniky. Obdobně, jednou produkovaná pozměněná protilátka podle vynálezu může být purifikována z obsahu kultury podle v oboru standardních postupů, včetně precipitace síranem amonným, afínitních kolon, kolonové chromatografie, gelové elektroforesy a podobně. Takové techniky jsou v oboru známé a neomezují tento vynález.
Ještě jiná metoda exprese humanizovaných protilátek může využívat expresi v transgenních zvířatech, jak je popsána v U.S. patentu 4873316. Ten se týká expresních systémů využívajících zvířecího kaseinového promotoru, který, pokud je transgenně inkorporován do savce, umožňuje samicím produkovat požadovaný rekombinantní protein v jejich mléce.
Po expresi požadovanou metodou je upravená protilátka vyšetřována na in vitro aktivitu použitím vhodného testu. Pro hodnocení kvalitativní a kvantitativní vazby upravené protilátky na IL-5 jsou použity běžné nynější ELISA test formáty. Navíc mohou být použity jiné in vitro testy pro verifikaci neutralizační účinnosti před následnými lidskými klinickými studiemi provedenými pro hodnocení persistence upravené protilátky v těle vzhledem k obvyklému mechanizmu clearens.
Podle postupů popsaných pro humanizované protilátky připravené z 2B6 může odborník také konstruovat humanizované protilátky z jiných donorových 1L-5 protilátek, sekvencí variabilního regionu a CDR peptidů zde popsaných. Upravené protilátky mohou být produkovány s úseky základní struktury variabilních regionů potenciálně rozpoznaných jako „vlastní“ příjemci upravené protilátky. Mírné modifikace variabilních úseků základní struktury mohou být nástrojem pro značné zvýšení vazby antigenu bez zjevné zvýšené imunogenicity pro příjemce. Takové upravené protilátky mohou účinně léčit IL-5 zprostředkované chorobné stavy u lidí.
VII. Terapeutické/profylaktické použití
Tento vynález se také týká metod pro léčbu lidí trpících s eosinofilií spojenými symptomy, jako je astma, kde tato metoda obsahuje podání účinné dávky protilátek obsahujících jednu nebo více upravených protilátek nebo pozměněných protilátek zde popsaných, nebo jejich fragmentů.
- 15 CZ 297045 B6
Terapeutická odpověď indukovaná za použití molekul podle tohoto vynálezu je produkována vazbou na lidský IL-5 a tak následným blokem eosinofilní stimulace. Tak molekuly podle předkládaného vynálezu, pokud jsou v přípravcích a formulacích vhodných pro terapeutické použití, jsou vysoce žádoucí pro tyto osoby trpící alergickou a/nebo atopickou odpovědí, nebo odpovědí asociovanou s eosinofilií, jako například je alergická rhinitis, astma, chronická eosinofilní pneumonie, alergická bronchopulmonámí aspergilosa, coeliakie, eosinofilní gastroenteritis, ChurgStraussův syndrom (periarteritis nodosa plus atopie), eosinofilní myalgický syndrom, hypereosinofilní syndrom, edematosní reakce včetně episodámího angioedemu, infekce helmity, kde eosinofilií mohou hrát protektivní roli, onchocercální dermatitis a atopická dermatitis.
Pozměněné protilátky, protilátky a jejich fragmenty podle tohoto vynálezu mohou být použity v konjunkci s jinými protilátkami, zejména s lidskými mAb reaktivními s jinými markéry (epitopy) odpovědnými za stavy, proti kterým je upravená protilátka podle vynálezu namířena.
Terapeutická agens podle vynálezu jsou považována za žádoucí pro léčbu alergických stavů od asi 2 dní do asi 3 týdnů, nebo podle potřeby. Další léčba může například být žádoucí pokud se jedná o léčbu sezónní rhinitidy a podobně. Toto reprezentuje znatelný pokrok oproti nyní užívanému infusnímu protokolu předchozí léčby IL-5 zprostředkovaných onemocnění. Dávka a trvání léčby je ve vztahu k relativním přetrvávání molekul podle předkládaného vynálezu v lidské cirkulaci, a může být odborníkem upraveno na léčeném stavu a celkovém stavu pacienta.
Způsob podání terapeutického agens podle vynálezu může být jakoukoliv vhodnou cestou, kterou se dostane agens do hostitele. Pozměněné protilátky, upravené protilátky a jejich fragmenty a farmaceutické kompozice podle vynálezu jsou zejména použitelné pro parenterální podání, tj. subkutánně, intramuskulámě, intravenosně nebo intranasálně.
Terapeutická agens podle vynálezu mohou být připravena jako farmaceutické kompozice obsahující účinné množství upravené (např. humanizované) protilátky podle vynálezu jako aktivní přísadu ve farmaceuticky akceptovatelném nosiči. V profylaktickém agens podle vynálezu je preferována vodná suspenze nebo roztok obsahující upravenou protilátku, preferovaně pufrovaný na fyziologickou hodnotu pH, s výhodou ve formě připravené pro injekci. Kompozice pro parenterální podávání bude obecně obsahovat roztok upravené protilátky podle tohoto vynálezu nebo směs těchto protilátek rozpuštěnou ve farmaceuticky akceptovatelném nosiči. Mohou se použít různé vodné nosiče, např. 0,4 % fyziologický roztok, 0,3 % roztok glycerinu a podobně. Tyto roztoky jsou sterilizovány a obecně zbaveny materiálu ve formě částic. Tyto roztoky mohou být sterilizovány běžnými, dobře známými technikami sterilizace (např. filtrací). Kompozice mohou obsahovat farmaceuticky akceptovatelné pomocné substance jak jsou požadovány pro přiblížení fyziologickým podmínkám jako je pH upravující a pufrovací agens, atd. Koncentrace protilátky podle vynálezu se může v takových farmaceutických formulacích velmi lišit, tj. od méně než asi 0,5%, obvykle alespoň okolo 1% do více než 15 nebo 20% hmotnosti a bude primárně vybrána na podkladě objemu kapaliny, viskozitě atd., podle vybraného způsobu podání.
Tak mohou být připraveny farmaceutické kompozice podle vynálezu pro intramuskulámí podání, které obsahují 1 ml sterilní pufrované vody a okolo 1 ng až do 100 mg, např. okolo 50 ng až asi 30 mg a lépe okolo 5 až 25 mg upravené protilátky podle vynálezu. Obdobně mohou být vyrobeny farmaceutické kompozice podle vynálezu, které obsahují asi 250 ml sterilního Ringerova roztoku a asi 1 až asi 30 a preferovaně 5 až 25 mg upravené protilátky podle vynálezu. Aktuální metody pro přípravu parenterálně podatelných kompozic jsou dobře známé a jasné odborníkům a jsou podrobněji popsány, například, v Remingtonů Pharmaceutical Science, 15. vydání, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.
Je preferováno, aby terapeutická agens podle vynálezu, pokud je ve farmaceutickém přípravku, bylo ve formě jednotkové dávky. Vhodná terapeuticky účinná dávka může být snadno určena odborníkům. Pro účinnou léčbu zánětlivých onemocnění u lidí nebo jiných zvířat by měla být jedna dávka od přibližně 0,1 až přibližně 20 mg na 70 kg tělesné hmotnosti proteinu nebo proti
-16CZ 297045 B6 látky podle vynálezu podána parenterálně, preferovaně i.v. nebo i.m. (intramuskulámě). Taková dávka může být, pokud to je nutné, opakovaně podána ve vhodných časových intervalech vybraných lékařem v průběhu zánětlivé odpovědi.
Pozměněné protilátky nebo upravené protilátky podle tohoto vynálezu mohou také být použity pro diagnostické účely, jako pro určení IL-5 zprostředkovaných onemocnění nebo sledování postupu léčby takových onemocnění. Jako diagnostická reagens mohou být tyto pozměněné protilátky konvenčně značeny pro použití v ELISA a jiných konvenčních testech pro měření IL-5 hladiny v séru, plasmě nebo jiné vhodné tkáni, nebo jeho uvolňování lidskými buňkami v kultuře. Vlastnosti testu, ve kterém jsou pozměněné protilátky použity jsou běžné a neomezují tento objev.
Tak se v jednom provedení předkládaný vynález týká metody pro diagnostiku alergií a jiných stavů asociovaných s excesivní produkcí eosinofilů u pacientů, kde tato metoda obsahuje kroky určení množství lidského IL-5 ve vzorku (plasmě nebo tkáni) získaného od uvedeného pacienta a srovnání uvedeného určeného množství s průměrným množstvím lidského IL-5 v normální populaci, kde přítomnost signifikantně zvýšeného množství IL-5 ve vzorku od pacienta je známkou alergií a jiných stavů asociovaných s excesem produkce eosinofilů.
Protilátky, pozměněné protilátky nebo jejich fragmenty zde popsané mohou být lyofilizovány pro skladování a rekonstituovány ve vhodném nosiči před použitím. Tato technika byla ukázána jako účinná pro běžné imunoglobuliny a mohou být využity v oboru známé lyofilizační a rekonstituční techniky.
Následující příklady ilustrují různé aspekty vynálezu včetně konstrukce příkladných upravených protilátek a jejich exprese ve vhodných vektorech a hostitelských buňkách, a nejsou konstruovány jako omezení rozsahu tohoto vynálezu. Všechny aminokyseliny jsou identifikovány běžným třípísmenným nebo jednopísmenným kódem. Všechny nezbytné restrikční enzymy, plasmidy a jiná reagens a materiály byly získány z komerčních zdrojů, pokud není jinak uvedeno. Všechny obecné klonovací ligace a jiné rekombinantní DNA metody byly provedeny podle T. Maniatis et al., citovaný výše, nebo jeho druhé edice (1989), vyd. Sambrook et al., stejným vydavatelem („Sambrook et al.“).
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1 - Produkce mAb k hIL-5
Lidský IL-5 byl exprimován v Drosophila Schneider 2 (S2) buňkách a purifíkován do homogenity. Myší IL-5 byl exprivován v Baculovirus za použití Spodoptera frugiperda 21 (Sf21) buněk a purifíkován do homogenity. Monoklonální protilátka TRFK-5 (neutralizační krysí anti-myší protilátka) byla získána od Genzyme Corp. (Cambridge, MA).
A. Imunizační postup
Rekombinantní lidský IL-5 (IL-5) byl použit jako imunogen pro panel sedmi CAFi samic myší (Charles River, Wilmington, MA). Zvířata obdržela tři subkutánní injekce IL-5 ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (PBS) emulsifikovaném v poměru jedna ku jedné s TiterMAX (CytoRx Corp., Norcross, GA) v průběhu čtyř měsíců, počáteční dávka antigenu byla 50 pg (mikrogramů) a dosycovací dávka byla 25 a 10 pg (mikrogramů). Po dosycení byly odebrány vzorky séra a byly testovány na vazbu na IL-5 a neutralizační aktivitu prostřednictvím receptorového vazebného inhibičního testu a B13 proliferačního testu (nebo IL-5 neutralizačního testu (příklad 2C)). Všechny myši produkovaly vzorky séra, které vázaly IL-5. Zvířata vybraná jako
- 17CZ 297045 B6 dárci sleziny byly dosycena intravenosně 10 pg (mikrogramy) rekombinantního lidského IL-5 před eutanasií.
B. Vývoj hybridomů
Postup fúze, prvně popsaný Kohlerem et al., (Nátuře, 256: 495 (1975)), byl použit s modifikacemi k provedení techniky za použití monovrstvy buněk (Kennet et al., Vyd., „Hybridomas: A new dimension in biological analysis“, str. 368 - 377, Plenům Press, New York). Buňky sleziny ze dvou dárcovských myší byly shromážděny a fúze byla provedena za použití poměru 50 milionů buněk sleziny ku 10 milionům SP2/0/Agl4 myelomových buněk. Jamky obsahující buňky produkující protilátku kIL-5 byly expandovány a supematant byl vyšetřován v IL-5 receptor vazebném inhibičním testu, a B13 (neutralizačním) proliferačním testu (popsaném níže).
Bylo izolováno šestnáct hybridomů, které secemovaly mAb reaktivní s IL-5. Supematanty hybridomů byly smíseny sjodinovaným IL-5, přidány k membránovému extraktu připravenému z Drosophila buněk exprimujících α-řetězec IL-5 receptoru (IL-5R) a byly testovány na inhibici vazby na receptor. Jedenáct supematantů hybridomů inhibovalo z více než 60% vazbu jodovaného IL-5 na α-řetězec IL-5 receptoru. Tři mAb, 2B6, 2E3 a 2F2 také inhibovali z více než 70% proliferaci myších B13 buněk v odpovědi na lidský, ale ne na myší IL-5. Pět z hybridomů, z nichž čtyři blokovaly vazbu a/nebo proliferaci (1C6, 2B6, 2e3 A 2f2) a 1, který nebyl neutralizující (24G9), bylo opakovaně subklonováno nájemném agaru pro generování stabilních klonálních buněčných linií. Supematanty z klonovaných linií byly vyšetřovány na zkříženou reaktivitu ELISA a nevázaly lidský IL-5a, ΙΙ-5β, IL-4, IL-8, M-CSF ani TGFa. mAb byly purifikovány a vazebná afinita byla hodnocena za použití analýzy optickým biosensorem (BIAcore) v rozsahu 10 až 100 pM. Supematanty z těchto linií byly izotypovány za použití myších izotypovacích reagens (PharMingen, San Diego, CA). Souhrn afinit a IC50 pro neutralizační aktivity mAb je prezentován v tabulce 1 (příklad 2).
Podobnou metodou byly odvozeny krysí hybridomy z imunizovaných krys, za použití srovnatelného protokolu imunizace a krysích myelomů jak bylo popsáno pro myši. Dva krysí hybridomy, které produkovaly mAb vážící IL-5, 4A6 a 5D3, byly identifikovány. Podobně jako u mAb 2B6, 2E3 a 2F2 bylo u mAb 4A6 a 5D3 shledáno, že jsou neutralizující v B13 testu popsaném níže.
C. Uložení hybridomů
Hybridomová buněčná linie SKI 19-2B6.206.75 (1) produkující monoklonální protilátku 2B6 byla uložena v Američan Type Culture Collection (ATCC) Rockville, MD, USA, pod přírůstkovým číslem HB 11783, a byla akceptována jako depositum pro účely patentování v souladu s Budapešťskou smlouvou 1977 upravující uskladnění mikroorganismů za účelem patentovacích postupů.
Hybridomová buněčná linie SKI 19-2E3.39.40.2 produkující monoklonální protilátku 2E3 byla uložena v Američan Type Culture Collection (ATCC) Rockville, MD, USA, pod přírůstkovým číslem HB 11782, a byla akceptována jako depositum pro účely patentování v souladu s Budapešťskou smlouvou 1977 upravující uskladnění mikroorganismů za účelem patentovacích postupů.
Hybridomová buněčná linie SK119-2F2.37.80.12 produkující monoklonální protilátku 2F2 byla uložena v Američan Type Culture Collection (ATCC) Rockville, MD, USA, pod přírůstkovým číslem HB 11781, a byla akceptována jako depositum pro účely patentování v souladu s Budapešťskou smlouvou 1977 upravující uskladnění mikroorganismů za účelem patentovacích postupů.
Hybridomová buněčná linie SKI 19-24G9.8.20.5 produkující monoklonální protilátku 24G9 byla uložena v Američan Type Culture Collection (ATCC) Rockville, MD, USA, pod přírůstkovým
-18CZ 297045 B6 číslem HB 11780, a byla akceptována jako depositum pro účely patentování v souladu s Budapešťskou smlouvou 1977 upravující uskladnění mikroorganismů za účelem patentovacích postupů.
Hybridomová buněčná linie 4A6(1)G1F7 produkující monoklonální protilátku 4A6 byla uložena v Američan Type Culture Collection (ATCC) Rockville, MD, USA, pod přírůstkovým číslem HB 11943, a byla akceptována jako depositum pro účely patentování v souladu s Budapešťskou smlouvou 1977 upravující uskladnění mikroorganizmů za účelem patentovacích postupů.
Hybridomová buněčná linie 5D3(1)F5D6 produkující monoklonální protilátku 5D3 byla uložena v Američan Type Culture Collection (ATCC) Rockville, MD, USA, pod přírůstkovým číslem HB 11942, a byla akceptována jako depositum pro účely patentování v souladu s Budapešťskou smlouvou 1977 upravující uskladnění mikroorganizmů za účelem patentovacích postupů.
Příklad 2 - Testy
A. EL1SA
Jednotlivé jamky MaxiSorb™ imunoploten (Nunc, Naperville, IL) byly potaženy 0,2 pg IL-5 v 0,05 uhličitanovém pufru pH 9,6. Po inkubaci přes noc při 4 °C byly plotny vypláchnuty PBS obsahujícím 0,025% Tween®20 a blokovány 1% BSA v PBS s 0,025% Tween®20 po dvě hodiny při pokojové teplotě. Naředěný supematant hybridomů byl přidán do IL-5 potažených jamek a byl inkubován po dvě hodiny při pokojové teplotě. Po vypláchnutí ploten byl přidán anti-myší IgG a IgM (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) v 1/7500 ředění v PBS obsahujícím 1% BSA a 0,025% Tween®20. O dvě hodiny později byly plotny znovu promyty a bylo přidáno 0,2 ml 0,1 M citrátového pufru pH 4,75 obsahujícího 0,1% peroxid močoviny a 1 mg/ml orthofenylenediamin. Po 15 minutách byly plotny čteny při 450 nm na VMax čtečce mikroploten (Molecular Devices, Menlo Park, CA).
B. Test inhibice vazby receptoru
Membránový extrakt Drosophila S2 buněk exprimujících α-řetězec lidského IL-5 receptoru (IL5R) byl použit k měření účinku protilátky na IL-5 vazbu na receptor. Pro přípravu membrán bylo 109 buněk peletováno při 1000 x g při 4 °C po 10 minut. Buněčné pelety byly zmraženy v lázni suchý led/ethanol po 15 minut. Pelety byly rozmraženy, resuspendovány v 10 ml PBS při 4 °C a peletovány při 1000 x g po 10 minut. Pelety buněk byly potom promyty 2X v PBS a resuspendovány v 13,5 ml hypotonického pufru (10 mM Tris pH 7,5, 3 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol, 1 mM fenylmethylsulfonylfluorid, 1 μΜ leupeptin, 1 μΜ pepstatin A) a inkubovány na ledu po 5 minut. Buněčná suspenze byla homogenizována v 15 ml Dounce homogenizéru a převedena do konečné koncentrace 0,25 M sukrosy roztokem 2,5 M sukrosy. Byla odstraněna buněčná drť 15 minutovou centrifugací při 1000 x g. Buněčné membrány byly peletovány při 100 000 x g při 4 °C po 90 minut a resuspendovány v 50 ml 10 mM Tris pH 7,5, 3 mM MgCl2, 250 mM sukrosy a uskladněny při -70 °C.
Testy s Drosophila membránami obsahujícími receptor byly provedeny na MultiscreenGV™ plotnách (Millipore Corp., Bedford, MA) za použití kultivačního média M3 Drosophila tkání (Lindquist et al., Drosophila Inf. Serv., 58: 163 (1982)) obsahujícím 25 mM HEPES pufru pH 7,2 a 0,1% BSA (vazebný pufr). Jamky byly předem blokovány 0,1 ml vazebného pufru. 50 μΐ testovaného vzorku, v trojím provedení, bylo přidáno do jamek po čemž následovalo 25 μΐ jodovaného (125I) IL-5. Po 20 minutové inkubaci při pokojové teplotě bylo do jamek přidáno 25 μΐ membránového extraktu Drosophila S2 buněk exprivujících α-řetězec lidského IL-5R. Po jedné hodině další inkubace byly membrány shromážděny vakuovou filtrací a promyty; 3X vazebným pufrem. Filtry byly sušeny a hodnoceny.
- 19CZ 297045 B6
C. IL-5 neutralizační test
Myší IL-5/IL-5 dependentní buněčná linie LyH7.B13 (B13) byla získána díky laskavosti R. Palacios, Basel Institute of Immunology, Switzerland. Buňky byly subkultivovány dvakrát týdně v RPMI 1640 médiu (GibcoBRL, Renfrewshire, UK) doplněném L-glutaminem, neesenciálními aminokyselinami, pyruvátem sodným, penicilin-streptomycinem (vše GibcoBRL), plus 2-merkaptoethanolem (5 x 10“5 M, Sigma), 10% fetálním hovězím sérem (Globefarm, Surrey, UK) a 1 - 10 jednotkami myšího IL-5. Pro testy byly buňky trojnásobně kultivovány po 48 hodin (5000 buněk/jamku) na 96 jamkových plotnách s kulatým dnem za přítomnosti vhodných ředění testovaných vzorků a pulsovány uCi 3H-thymidinem (Amersham, Bucks, UK) po konečné 4 hodiny. Byly upraveny pro scintilační hodnocení v 1205 Betaplate (LKB Wallac, Beds, UK).
D. Optický biosensor
Kinetická a ekvilibrační vazebné vlastnosti s imobilizovaným hIL-5 a protilátkami byly měřeny za použití BIAcore optického biosensoru (Pharmacia Biosensor, Uppsala, Sweden). Kinetická data byla hodnocena za použití vztahů popsaných dříve (Karlsson et al., J. Immunol. Meth., 145: 229 - 240 (1991)) ajsou zde uvedena ve své úplnosti jako odkaz.
Tři neutralizační protilátky, jmenovitě 2B6, 2E3 a 2F2, měly velmi podobný potenciál inhibice l25I—IL—5 vazby na membránový receptor a neutralizace proliferace B-buněk a také velmi podobné afinity pro IL-5 (viz tabulka 1). Byly určeny nukleotidové sekvence VH a VL z těchto tří mAb 2 IgGi a 1 IgG2a, v příslušném pořadí. Získané sekvence byly velmi podobné, s odlišnostmi pouze v několika reziduích.
Tabulka 1
Afinita a neutralizační aktivita mAb reaktivních s lidským IL-5
mAb Kd (pM)“ vazebná ICso(nM)to neutralizace proliferace 100% IC ° 50 inhibice
2B6 22 1 70 200
2E3 20 1 90 600
2F2 13 1 150 340
1C6 86 43 12200 ND
24G9 ND >133 >100000 ND
4A6 18 >88 28 100
5D 3 . . ND ND Ififi 10000
a určeno analýzou optickým biosensorem (BIAcore) (25 °C) b inhibice 125I—IL—5 vazby na IL-5R (α-řetězec) z Drosophila membrán c inhibice proliferace (v pM) B13 buněk v odpovědi na 8 pM lidského IL-5 ND - žádná data
-20CZ 297045 B6
Příklad 3 - Izolace a charakterizace IL-5 Fab z kombinatoriální knihovny
A. PCR a konstrukce kombinatomí knihovny
RNA purifikovaná ze slezin tří myší byla reversně transkribována cDNA kitem (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) za použití buď primeru (dT)15 dodaného s kitem nebo 3' Fd (IgG 1, IgG2a a IgG3) a primery kappa lehkého řetězce jak je popisuje Huse et al., (Science, 246: 1275 (1983)) a Kang, S. A. (Methods: Companion Methods Enzymol., 2: 111 (1991)), což je zde uvedeno jako odkaz. Imunoglobulinové cDNA byly amplifíkovány PCR za použití primerů a podmínek tepelných cyklů, jak je popisuje Huse et al., výše. Pro všechny reakce byla použita Hot Start technika za použití AmpliWax™ PCR Gem 100 (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) korálků a protokolu výrobce. PCR produkty byly purifikovány na gelu, tráveny a ligovány do pMKFabGene3 vektoru (Ames et al., J. Immunol. 152: 4572 (1994)). Titr knihovny po ligaci s Fd cDNA byl 5,1 x 107 CFU a po ligaci s kappa cDNA byl 1,5 x 106 CFU. XLl-Blue buňky (Stratagene, La Jolla, CA) transformované fagemidovou knihovnou byly infikovány pomocným fágem VCSM13 (Stratagene) a fág byl připraven jak popisuje Barbas a Lemer (Methods: Companion Methods Enzymol., 2: 119 (1991)).
B. Biopanning
Čtyři mikrotitrační jamky (Immulon II Removawell Strips, Dynatech Laboratories lne., Chantilly, VA) byly potaženy přes noc při 4 °C 11-5 (1 pg/jamku) v 0,1 M bikarbonátu, pH 8,6. Jamky byly promyty vodou a blokovány PBS obsahujícím 3% BSA při 37 °C po 1 hodinu. Blokující roztok byl odstraněn a knihovna byla přidána do mikrotitračních jamek (50 μΐ/jamku) a inkubována při 37 °C po 2 hodiny. Jamky byly promyty 10 krát TBP/Tween® (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5% Tween® 20) a jednou H2O před elucí adherentního fágu s 0,1 M HC1, upraveného na pH 2,2 glycinem, obsahujícím 1 mg/ml BSA.
C. Odběr kolonií
Odběr kolonií z klonů izolovaných ze třetího a čtvrtého kola biopanningu byly zpracovány jak je popsáno (Barbas a Lemer, výše). Filtry byly inkubovány po 1 hodinu při pokojové teplotě s 0,5 1,0 uCi 1251—IL—5, který byl jodinován za použití Bolton-Hunterova reagens (NEN, Billerica, MA) podle výrobcem doporučeného postupu, v PBS obsahujícím 1% BSA, byly promyty PBS 0,25% Tween a exponovány na Kodak XAR filmu. Kolonie exprimující IL-5-reaktivní Fab byly detekovány autoradiografií.
D. Příprava solubilních Fab
Fágemidové DNA byly tráveny Nhel a Spěl pro odstranění genu III a smoligovány. XLl-Blue buňky byly transformovány, a izolované klony byly kultivovány přes noc při 37 °C v 5,0 ml super bujónu (SB) média (30 g trypton, 20 g kvasinkový extrakt, 10 g 3-(N-morfolino)propansulfonová kyselina, MOPS s pH upraveným na 7) obsahujícím 1% glukosu a 50 pg/ml karbencilinu. Buňky z 1 ml této kultury byly peletovány při 3500 rpm po 10 minut na Beckman GS-6R centrifuse a byly použity pro inokulaci 5 ml SB obsahujícího 50 pg/ml karbencilinu. Kultury byly třepány po 1 hodinu při 37 °C, byl přidán izopropyl-b-D-thiogalaktopyranosi (IPTG; 1 mM) a kultury byly přeneseny do 28 °C přes noc. Solubilní Fab byl připraven z periplasmatických extraktů lýzou buněčných pelet po 20 minut při 4 °C ve 20% sukrose suspendované ve 30 mM Tris pH 8,0, po čemž následovala centrifugace na Mikrofuge po 10 minut. Fab koncentrace byla hodnocena western blotem za srovnání vzorků obsahujících známá množství myší Fab. Různé bakteriální periplasmatické extrakty obsahovaly podobné koncentrace Fab, v rozsahu 1 až 20 pg/ml, jak bylo zhodnoceno western blot analýzou.
-21 CZ 297045 B6
E. Purifikace Fab
Chelační peptid byl zapracován do karboxy-terminálního konce těžkého řetězce pomoc při proteinové purifikaci. Po odstranění Ml3 gen III kódujícího regionu, prostřednictvím trávení Nhel a Spěl, byl pár přesahujících oligonukleotidů.
(SEQ ID NO: 43) 5- CTAGCCACCACCACCACCACCACTAA-3;
(SEQ ID NO: 44) 5'- GGTGGIX3GTGGTGGTGGTGATTGATC-5' kódující šest histidinových residuí subklonován do Fab expresního vektoru. Indukce Fab exprese byla provedena jak je popsáno výše. Po indukci přes noc při 28 °C byl připraven periplasmatický lysát buněčné pelety 30 minutovou inkubací při 4 °C ve 20% sukrose, 30 mM TRIS pH 8,0. Močovina a Brij-35 detergenty byly přidány do čirého supematantu do konečné koncentrace 2M a 1%, respektive. Po promíchání při pokojové teplotě po 1 hodinu byl ošetřený a čirý supematant zaveden při 0,5 ml/ml přímo na 5 ml Nickel-NTA kovovou chelační kolonu (1,5 x 3 cm) ekvilibrovanou pufrem A (100 mM Na-fosfát. 10 mM Tris, 0,3 M NaCl, 2 M Urea, pH 8,0). Po promytí 4 objemy kolony (20 ml) byl navázaný materiál eluován 6 objemy kolony (30 ml) reversním pH gradientem pd pH 8 do pH 4 ve stejném pufru jako je uvedeno výše. Purifikované Fab eluovaly z kolony v ostrém symetrickém píku při pH 5,5. Byly více než z 90% čisté a prosté DNA.
F. Fab ELISA
Immulon II plotny (Dynatech) byly potaženy přes noc při 4 °C proteinem suspendovaným (1 mg/ml; 50 ml na jamku) v 0,1 M bikarbonátového pufru, pH 8,6. Ředění a promytí bylo provedeno v PBS obsahujícím 0,05% Tween™ 20. Plotny byly promyty a blokovány po 1 hodinu PBS obsahujícím 1% BSA při pokojové teplotě. Různá ředění bakteriálních supematantů obsahujících solubilní Fab, nebo purifikované Fab, byla přidána do ploten. Po jednohodinové inkubaci byly plotny promyty a byla přidána biotinilovaná kozí anti-myší kappa (Southem Biotechnology Associates, lne., Birmingham, AL) (1:2000 ředění; 50 pg/jamku) po jednu hodinu. Plotny byly promyty a byla přidána streptavidinem značená křenová peroxidasa (1:2000 ředění; 50 pg/jamku) po jednu hodinu. Plotny byly promyty, byl přidán ABTS peroxidasa substrát (100 pg/jamku; Kirjegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) a optická densita při 405 nm byla čtena na UVmax™ (Molecular Devices) čtečce mikroploten.
G. Izolace a charakterizace Fab z kombinatoriální knihovny
Fág nesoucí Fab k IL-5 byl vybrán z knihovny opakovanými koly biopanorámování proti mikrotitrovým jamkám potaženým IL-5. Po 4 kolech selekce byly IL-5 reaktivní Fab identifikovány testem sběru kolonií za použití 125I—IL—5. Bylo identifikováno třicet čtyři kolonií ze třetího kola a čtyři kolonie ze čtvrtého kola, které vázaly značený IL-5. Vazba IL-5 byla potvrzena přímou vazbou ELISA za použití supematantů kultury exprimující Fab-genlII fúzní protein. DNA byla izolována z těchto kolonií a po odstranění kódujícího regionu M13 genu III byla indukována exprese solubilního Fab. Byla připravena periplasmatická frakce a byla testována ELISA na vazbu IL-5. Fab se vázaly specificky na IL-5 s žádnou demonstrovatelnou vazbou na jiný protein, rC5a.
Neředěné periplasmatické extrakty (obsahující 1 až 20 pg/ml Fab) byly testovány v testu inhibice IL-5R vazby (Příklad 2). Žádný z Fab neinhiboval vazbu jodovaného IL-5 na IL-5Rcc z více než 35%.
H. Konverse neutralizační mAb na Fab
Fd a kappa cDNA mAb (2B6) byly izolovány PCR za použití podmínek popsaných výše. Fragmenty purifikované na gelu byly subklonovány do pMKFFabGene3 vektoru, který byl modifíko
-22CZ 297045 B6 ván tak, aby obsahoval hexa-His sekvenci 3' genu III cDNA, což vedlo ke vzniku plasmidu pMKFabGene3H. Funkční, IL-5 vážící Fab klon obsahující 2B6 těžký a lehký řetězec byl identifikován testem sběru kolonií. Za odstranění genu III cestou Nhel/Spel trávení a samoligace těžkého řetězce byl fúzován do rámečku s hexa-His, což umožnilo purifikaci jak je popsána výše. Tento Fab inhiboval vazbu na receptor na dávce závislým způsobem s IC5o přibližně 7,5 pg/ml, podobně jako rodičovská protilátka 2B6.
I. Konstrukce a vyšetřování knihovny s přeskupenými řetězci cDNA kódující Fd neutralizační mAb 2B6 byla subklonována jako Xhol/Spel fragment do pMKFabGene3H, který obsahoval Sstl/Xbal fragment místo cDNA lehkého řetězce. Tento fagemid byl tráven Sstl a Xbal a ligován do Sstl/Xbal tráveného lehkého řetězce PCR produktu odvozeného od IL-5 imunizované myši (popsáno výše). Titr knihovny byl po ligaci 4 x 105 CFU. Biopanorámování a test sběru kolonií byly provedeny stejně jako je popsáno výše pro kombinatomí knihovnu.
Knihovna byla konstruována párováním cDNA kódující Fd neutralizační mAb 2B6 se stejným repertoárem lehkých řetězců, odebraných z L-5 imunizované myši, použité ke generování kombinatomí knihovny. Tato knihovna s přeskupenými řetězci byla podrobena 4 kolům biopanorámování s imobilizovaným IL-5 a výsledné kolonie byly testovány na IL-5 reaktivitu za použití testu sběru kolonií. Pozitivní kolonie, které vázaly jodinovaný IL-5, byly déle testovány ELISA a testem IL-5Ra vazby. Dva z Fab, 2 a 15, získaných z knihovny s přeskupenými řetězci blokovaly vazbu IL-5 na IL-5Roc a inhibovaly IL-5 dependentní proliferaci vB13 testu. Sekvence těchto dvou Vks byly podobné sekvencím 2B6 Vk, původnímu partneru lehkého řetězce pro 2B6 VH. Sekvence lehkého řetězce pro Fab 2 a 15 jsou SEQ ID NO: 45 a 46, v příslušném pořadí. Pro Fab 2 jsou CDR 1-3 SEQ ID NO: 10, 11 a 47, v příslušném pořadí. Pro Fab 15 jsou CDR 1-3 SEQ ID NO: 10, 11 a 48, v příslušném pořadí.
Všechny aminokyselinové sekvence protilátky uvedené dále v příkladech 4 a 5 používají číslování podle KABAT, které umožňuje variabilitu v délce CDR a pracovních regionů. To znamená, že klíčové aminokyseliny jsou vždy označeny stejným číslem bez ohledu na množství aminokyselin, které jim předcházejí. Například, cystein předcházející CDR1 všech lehkých řetězců je vždy v pozici 23 podle KABAT a tryptofan po CDR1 je vždy v pozici 35 podle KABAT, ačkoliv může CDR1 obsahovat více než 17 aminokyselin.
Příklad 4 - Humanizovaná protilátka
Jedna humanizovaná protilátka byla projektována tak, aby obsahovala myší CDR v pracovním regionu lidské protilátky. Tato humanizovaná verze IL-5 specifické myší protilátky 2B6 byla připravena za použití následujících manipulací.
A. Klonování genu mRNA byla izolována z příslušných 2B6, 2F2 a 2E3 hybridomových buněčných linií (viz příklad 3) za použití kitu získaného od Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN) a byla reversně transkribována za použití primeru (dT)i5 dodaného s cDNA kitem (Boehringer Mannheim) za vytvoření cDNA. PCR primery specifické pro myší imunoglobulin byly použity pro amplifikaci cDNA kódující domény v rozsahu od aminokyseliny #9 (KABAT číslování) variabilního regionu těžkého řetězce po pantový region a od aminokyseliny #9 (KABAT číslování) variabilního regionu lehkého řetězce po konec konstantního regionu. Nezávislými PCR reakcemi bylo získáno několik klonů každého řetězce protilátky.
-23 CZ 297045 B6
Primer použitý pro myší gamma 1 pantový region je (SEQ ID NO: 22):
5’-GTACATATGCAAGGCTTACAACCACAATC-3'
Primer použitý pro myší gamma 2a pantový region je (SEQ ID NO: 23):
’ -GGA(^GGGCnTACTAGTCGGCCCTCTGGGCTC-3 ‘
Primer použitý pro myší variabilní region těžkého řetězce je (SEQ ID NO: 24):
5'-AGGT(C nebo G) (C nebo A)A(G nebo A)CT(G nebo T)TCTCGAGTC(T nebo A)GG-3'
Primer použitý pro myší kappa řetězec konstantního regionu je (SEQ ID NO: 25):
5' -CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAATGGG“ 3 1
Primer použitý pro myší variabilní region lehkého řetězce je (SEQ ID NO: 26):
' -CCAGATGTGAGCTCGTGATGACCCAGACTCCA- 3 '
PCR fragmenty byly klonovány do plasmidů pGEM7f+ (Promega), které byly potom transformovány do E. coli DHa (Bethesda Research Labs.).
B. DNA sekvencování
Těžké a lehké řetězce myších cDNA klonů z části A výše byly potom sekvencovány. Výsledky sekvencování variabilních regionů těchto klonů jsou ukázány v SEQ ID NO: 1 - 6 (Obr. 1 - 6). Každý klon obsahoval aminokyseliny, o kterých je známo, že jsou konzervovány ve variabilních regionech myších těžkých řetězců nebo ve variabilních regionech lehkých řetězců. Aminokyselinové sekvence CDR jsou uvedeny níže.
CDR regiony pro těžký řetězec 2B6 jsou SEQ ID NO: 7, 8 a 9. Viz obr. 7. Tyto sekvence jsou kódovány SEQ ID NO: 1. CDR regiony pro lehký řetězec jsou SEQ ID NO: 10, 11 a 12. Viz obr. 7. Tyto sekvence jsou kódovány SEQ ID NO: 2.
CDR regiony pro těžký řetězec 2F2 jsou SEQ ID NO: 7, 8 a 9. Viz obr. 7. Tyto sekvence jsou kódovány SEQ ID NO: 3. CDR regiony pro lehký řetězec jsou SEQ ID NO: 10, 11 a 13. Viz obr. 7. Tyto sekvence jsou kódovány SEQ ID NO: 4.
CDR regiony pro těžký řetězec 2E3 jsou SEQ ID NO: 7, 8 a 14. Viz obr. 7. Tyto sekvence jsou kódovány SEQ ID NO: 5. CDR regiony pro lehký řetězec jsou SEQ ID NO: 10, 11 a 13. Viz obr. 7. Tyto sekvence jsou kódovány SEQ ID NO: 6.
C. Výběr lidských úseků základní struktury
Po klonování 2B6 byly aminokyselinové sekvence variabilních regionů těžkých a lehkých řetězců (obr. 1 a 2) (SEQ ID NO: 15 a 16, v příslušném pořadí) srovnávány se známými sekvencemi myšího imunoglobulinu vKABAT a SWISS-PROT (Nuc. Acids Res., 20: 2019-2022 (1992)) databázích proteinových sekvencí kvůli označení aminokyselin k N-terminálním residuím. Dedukované aminokyselinové sekvence variabilního regionu těžkého a lehkého řetězce 2B6 byly potom srovnány s databází proteinové sekvence lidského imunoglobulinu tak, aby se identifikoval lidský pracovní region pro těžký a lehký řetězec, který by co nejtěsněji odpovídal myší sekvenci. Kromě toho, těžký a lehký řetězec byly hodnoceny za použití poziční databáze generované ze strukturálního modelu Fab domén pro zhodnocení potenciálních konfliktů způsobených aminokyselinami, které mohou mít vliv na CDR prezentaci. Konflikty byly vyřešeny během syntesy úseků základní struktury humanizovaného variabilního regionu substitucí korespondujících myších aminokyselin v této lokalizaci.
-24CZ 297045 B6
Úseky základní struktury těžkého řetězce protilátky získané z lidského myelomového imunoglobulinu (COR) byly použity (E. M. Press a N. M. Hogg, Biochem. J., 117: 641 - 660 (1970)). Aminokyselinová sekvence úseku základní struktury regionu lidského těžkého řetězce byla shledána z přibližně 66 % homologní k pracovnímu regionu 2B6.
Pro vhodné úseky základní struktury variabilního regionu lehkého řetězce byla použita sekvence úseku základní struktury regionu lehkého řetězce Bence-Jonesova proteinu, (LEN) (Schneider et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 356: 507 -557 (1975)). Lidské úseky základní struktury lehkého řetězce byly přibližně z 82 % homologní k úsekům základní struktury lehkého řetězce myší 2B6, na úrovni aminokyselin.
Vybrané lidské pracovní regiony byly zpětně translatovány za poskytnutí DNA sekvence.
D. Konstrukce genů humanizovaných mAb
Za použití daných CDR těžkého řetězce 2B6 (obr. 7 a SEQ ID NO: 1 - 2) a sekvence úseků základní struktury lidských protilátek byl vyroben syntetický variabilní region těžkého řetězce (SEQ ID NO. 18). Toto bylo provedeno za použití čtyř syntetických oligonukleotidů (SEQ ID NO: 27 a 28) (SEQ ID NO: 29 a 30) které, při spojení, kódovaly aminokyseliny #21 - #106 (KABAT číslování). Oligonukleotidy byly potom ligovány do Hpal-KpnI restrikčních míst plastidu založeném na pUC18 obsahujícího sekvence odvozené od jiného humanizovaného těžkého řetězce založeného na COR pracovním regionu (výše). Tento plasmid poskytoval signální sekvenci (SEQ ID NO: 17) a zbývající sekvenci variabilního regionu. Jakékoliv chyby v mapované sekvenci byly opraveny PCR s mutagenními primery nebo přidáním syntetických linkerů do existujících restrikčních míst.
Signální sekvence humanizovaných variabilních regionů těžkého řetězce byly excisovány z plastidu založeném na pUC jako EcoRI-Apal fragment a byly ligovány do expresního vektoru pCD, který obsahoval konstantní region lidského IgGi. Syntetické nukleotidy a aminokyselinové sekvence variabilního regionu těžkého řetězce jsou poskytnuty na obr. 8 (SEQ ID NO: 18 a 19). Residua úseku základní struktury jsou aminokyseliny 1 - 30, 36 - 49, 66 - 97 a 109- 119 SEQ ID NO: 19. Aminokyselinové sekvence CDR jsou shodné s CDR myší 2B6. Vzniklý expresní vektor, pCDIL5HZHC1.0, je ukázán na obr. 10.
Za použití daných CDR lehkého řetězce 2B6 (obr. 7 a SEQ ID NO: 10, 11 a 12) a sekvence úseků základní struktury lidské protilátky byl vyroben syntetický variabilní region lehkého řetězce (SEQ ID NO: 20). Čtyři syntetické oligonukleotidy kódující aminokyseliny #27 - #58 (KABAT číslování) (SEQ ID NO: 31 a 32) a aminokyseliny #80 -#109 (SEQ ID NO: 33 a 34) humanizovaného VL s SacI-KpnI a Pstl-HindlII konci v příslušném pořadí byly insertovány do na pUC18 založeném plasmidu obsahujícího sekvence odvozené od jiného úseku základní struktury lehkého řetězce (B17) (Marsh et al., Nuc. Acids Res., 13: 6531 - 6544 (1985)), který vykazuje vysoký stupeň homologie s LEN úsekem základní struktury. Tento plastid poskytoval zbývající sekvenci variabilního regionu. Jakékoliv chyby v mapované sekvenci a jednotlivé rozdíly v aminokyselinách mezi LEN a B17 pracovními regiony byly opraveny PCR s mutagenními primery nebo přidáním syntetických linkerů do existujících restrikčních míst.
Variabilní region humanizovaného lehkého řetězce byl izolován z pUC plasmidu jako EcoRVNarl fragment a byl ligován do expresního vektoru pCN, který obsahoval signální sekvenci (SEQ ID NO: 17) spolu s kappa lidským konstantním regionem. Syntetické nukleotidy a aminokyselinové sekvence variabilního regionu lehkého řetězce jsou poskytnuty na obr. 9 (SEQ ID NO: 20 a 21). Residua lidského úseku základní struktury jsou aminokyseliny 1 - 23, 41 - 55, 64 - 94 a 104 - 113 SEQ ID NO: 21. Aminokyselinové sekvence CDR jsou shodné s CDR myší 2B6. Nicméně, kódující sekvence pro tyto CDR se liší od kódujících sekvencí myší 2B6 tak, aby bylo možné vytvořit místa pro restrikční enzym. Jeden vzniklý expresní vektor,
-25CZ 297045 B6 pCNIL5HZLCl .0, je ukázán na obr. 11. Tyto syntetické variabilní sekvence lehkého a/nebo těžkého řetězce jsou využity pro konstrukci humanizované protilátky.
E. Exprese humanizované mAB
Humanizovaný těžký řetězec, odvozený od IgG] izotypu, využívá syntetický variabilní region těžkého řetězce, jak je poskytnut SEQ ID NO: 19. Tento syntetický VH obsahující CDR těžkého řetězce 2B6 byl projektován a syntetizován, jak je popsáno výše.
Humanizovaný lehký řetězec, lidský kappa řetězec, využívá syntetický variabilní region lehkého řetězce, jak je poskytnut SEQ ID NO: 21. Tento syntetický VL obsahující CDR těžkého řetězce 2B6 byl projektován a syntetizován, jak je popsáno výše. DNA fragmenty kódující humanizované variabilní regiony byly insertovány do na pUC19 založeného expresního plasmidu pro savčí buňky, který využívá signální sekvenci a obsahuje CMV promotory a konstantní regiony lidského těžkého řetězce a lidského lehkého řetězce chiméry produkované v příkladu 5 níže za použití běžných metod (Maniatis et al., citován výše), za vzniku plasmidu pCDIL5HZHC1.0 (těžký řetězec) (SEQ ID NO: 49, viz též obr. 10) a pCNIL5HZLC1.0 (lehký řetězec) (SEQ ID NO: 50, viz též obr. 11). Plasmidy byly kotransfektovány do COS buněk a supematanty byly testovány po třech a pěti dnech, v příslušném pořadí, na přítomnost lidské protilátky.
Výše uvedený příklad popisuje přípravu příkladné upravené protilátky. Obdobné postupy mohou být provedeny pro vývoj jiných upravených protilátek, za použití jiných anti-IL-5 protilátek (např. 2F2, 2E3, 4A6, 5D3, 24G9 atd.) vyvinutých běžnými prostředky.
F. Purifikace
Purifikace CHO exprimované chimérické a humanizované 2B6 může být provedena běžnou protein A (nebo G) afínitní chromatografií následovanou iontovou výměnou a molekulární sítovou chromatografií. Obdobný postup může být použit pro purifíkaci do více než 95% čistoty pro jiné mAb (např. k respiračně syncyciálnímu viru, interleukinu - 4, antigenům cirkumsporozoitu malarie).
G. Další humanizované protilátky a expresní plasmidy
Za použití plasmidu pCDIL5HZHC1.0 (SEQ ID NO: 49) byl vyroben expresní plasmid pCDIL5HZHCl.l, který substituuje asparagin za threonin v pozici 73 úseku základní struktury. Toto bylo provedeno ligací syntetického linkeru s EcoRV a Xhol konci (SEQ ID NO: 51 a SEQ ID NO: 52) do identicky tráveného pCDIL5HZHC1.0. Obdobně, expresní plasmid pCDIL5HZHC1.2 substituuje izoleucin za valin v pozici 37 pracovního regionu. Toto bylo provedeno ligací syntetického linkeru s Hpal a Xbal konci (SEQ ID NO: 53 a SEQ ID NO: 54) do identicky tráveného pCDIL5HZHC1.0. Expresní plasmid pCDIL5HZHC1.3 byl také vytvořen ligací syntetického linkeru s Hpal a Xbal konci (SEQ ID NO: 53 a SEQ ID NO: 54) do identicky tráveného pCDIL5HZHCl .0.
Za použití daného na pUC18 založeného plasmidu popsaného dříve, který obsahuje DNA sekvence čtyř syntetických oligonukleotidů (SEQ ID NO: 31, 32, 33 a 34) byl vyroben humanizovaný variabilní region lehkého řetězce, kde je změněna pozice #15 pracovního regionu z leucinu na alanin. Tento plasmid byl tráven Nhel a Sací restrikčními endonukleasami a byl insertován syntetický linker (SEQ ID NO: 55 a 56). EcoRV-Narl fragment byl potom izolován a ligován do identicky tráveného expresního vektoru pCNIL5HZLCl .0 za vytvoření pCNIL5HZLCl .1.
Syntetický variabilní region byl vyroben za použití úseků základní struktury těžkého řetězce získaných z imunoglobulinu (NEW) (Saul et al., J. Biol. Chem. 253: 585 - 597 (1978)) a CDR těžkého řetězce 2B6 (obr. 7 a SEQ ID NO: 1 - 2). Aminokyseliny úseku základní struktury, které mohou ovlivňovat CDR prezentaci byly identifikovány a byla provedena substituce, jak je
-26CZ 297045 B6 popsáno výše. Byly generovány čtyři přesahující syntetické oligonukleotidy (SEQ ID NO: 57, 58, 59 a 60) které, po tepelném zpracování a extensi, kódují aminokyseliny reprezentující signální sekvenci (SEQ ID NO: 17) a variabilní region těžkého řetězce. Tento syntetický gen byl potom amplifikován za použití PCR primerů (SEQ ID NO: 63 a 64) a ligován jako BstXI-HindlII restrikční fragment do na pUC18 založeného plasmidu obsahujícího sekvence odvozené od jiného humanizovaného těžkého řetězce založeného na COR pracovním regionu. Byla provedena substituce fenylalanin za tyrosin v pracovním regionu v aminokyselinové pozici 91 (Kabat číslování) (ekvivalentní pozici 94 na obrázku 12) inzercí syntetického oligonukleotidového linkeru (SEQ ID NO: 75 a 76) do SacII a KpnI restrikčních míst. Vzniklý variabilní region těžkého řetězce je označen jako NEWM humanizovaný těžký řetězec.
Jakékoliv chyby v mapované sekvenci byly opraveny PCR s mutagenními primery nebo přidáním syntetických linkerů do existujících restrikčních míst. Signální sekvence variabilního regionu humanizovaného těžkého řetězce byla excisována z plastidu založeném na pUC jako EcoRIApal fragment a byla ligována do expresního vektoru pCD, který obsahoval konstantní region lidského IgGj za vytvoření plasmidu pCDIL5NEWM. Aminokyselinové sekvence CDR jsou shodné s CDR těžkého řetězce myší 2B6.
Syntetický variabilní region byl vyroben za použití úseků základní struktury lehkého řetězce získaných z imunoglobulinu (RE1) (Palm et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 356: 167- 191 (1975)) a CDR lehkého řetězce 2B6 (obr. 7 a SEQ ID NO: 10, 11 a 12). Aminokyseliny úseku základní struktury, které mohou ovlivňovat CDR prezentaci, byly identifikovány a byla provedena substituce, jak je popsáno výše. Byly generovány čtyři přesahující syntetické oligonukleotidy (SEQ ID NO: 65, 66, 67 a 68) které, po tepelném zpracování a extensi, kódují aminokyseliny reprezentující variabilní region lehkého řetězce (Obr. 13 a SEQ ID NO: 69, 70) označenou jako REI humanizovaný lehký řetězec. Tento syntetický gen byl potom amplifikován za použití PCR primerů (SEQ ID NO: 71 a 72) a ligován jako EcoRI-HindlII restrikční fragment do pGEM7Zf(+) (Promega Corporation, Madison, WI).
Jakékoliv chyby v mapované sekvenci byly opraveny PCR s mutagenními primery nebo přidáním syntetických linkerů do existujících restrikčních míst. Variabilní region humanizovaného lehkého řetězce byl excisován z na pGEM-7Zf(+) založeném plasmidu jako EcoRV-Narl fragment a byl ligována do expresního vektoru pCN, který obsahoval signální sekvenci (SEQ ID NO: 17) spolu s kappa lidským konstantním regionem za vytvoření plasmidu pCNIL5HREI. Aminokyselinové sekvence CDR jsou shodné s CDR lehkého řetězce myší 2B6. Nicméně, kódující sekvence pro tyto CDR se liší od kódujících sekvencí myší 2B6 tak, aby bylo možné vytvořit místa pro restrikční enzym. Tyto syntetické variabilní sekvence lehkého a/nebo těžkého řetězce jsou využity pro konstrukci humanizované protilátky.
Za použití na pGEM—7Zf(+) založeném plasmidu popsaném výše může být vyroben variabilní region humanizovaného lehkého řetězce, kde je pozice #15 úseku základní struktury změněna z valinu na alanin. Tento plasmid může být tráven Nhel a Sací restrikčními endonukleasami a je insertován syntetický linker (SEQ ID NO: 73 a 74). Potom může být izolován EcoRV-Narl fragment a může být ligován do shodně tráveného expresního vektoru pCNIL5HZREI za vytvoření plasmidu pCNIL5REIVi5A·
Příklad 5 - Konstrukce chimérické protilátky
DNA kódující aminokyseliny #9—#104 (KABAT číslování) variabilního regionu těžkého řetězce myší mAb 2B6 byla izolována jako Avall-Styl restrikční fragment z pGEM-7Zf(+) založeného na PCR klonu cDNA generované z 2B6 hybridomní buněčné linie (viz příklad 4). Sousedící sekvence variabilního regionu těžkého řetězce a signální sekvence (SEQ ID NO: 17) byly poskytnuty kombinováním tohoto fragmentu se čtyřmi malými syntetickými oligomemími linkery (SEQ ID NO: 35 a 36) (SEQ ID NO: 37 a 38) do na pUC18 založeném plasmidu tráveného BstXl
-27CZ 297045 B6
HindlII. Konsensus N-terminálních aminokyselin, dedukovaných z těsně příbuzných myších těžkých řetězců, byl stanoven pro prvních osm VH reziduí, které jsou kódovány SEQ ID NO: 35 a
36. Dedukovaná aminokyselinová sekvence těžkého řetězce byla verifikována sekvencováním prvních 15 N-terminálních aminokyselin těžkého řetězce 2B6.
EcoRI-Apal fragment obsahující sekvence pro signální a VH regiony byl izolován a ligován do plasmidu pCD, který již kóduje konstantní region lidského IgG],
DNA kódující aminokyseliny #12—#99 (KABAT číslování) variabilního regionu lehkého řetězce myší mAB 2B6 byla izolována jako Ddel-Aval restrikční fragment zpGEM-7Zf(+) založením na PCR klonu cDNA generované z 2B6 hybridomové buněčné linie (viz příklad 4). Sousedící sekvence variabilního regionu lehkého řetězce byly poskytnuty kombinováním tohoto fragmentu se čtyřmi malými syntetickými oligomemími linkery (SEQ ID NO: 39 a 40) (SEQ ID NO: 41 a 42) do na pUC18 založeném plasmidu tráveného EcoRV-HindlII. Konsensus N-terminálních aminokyselin, dedukovaný z těsně příbuzných myších lehkých řetězců, byl stanoven pro prvních osm VH residuí, které jsou kódovány SEQ ID NO: 39 a 40. Dedukovaná aminokyselinová sekvence lehkého řetězce byla verifikována sekvencováním prvních 15 N-terminálních aminokyselin lehkého řetězce 2B6. Tento variabilní region byl potom izolován jako AcoRV-Narl fragment a ligován do expresního vektoru pCN, který již obsahuje lidský kappa region a signální sekvenci.
Exprese chimérické protilátky byla provedena kontransfekcí na pCD a pCN založených plasmidů do COS buněk. Supematanty kultur byly shromážděny o tři a pět dní později a testovány na imunoglobulinovou expresi ELISA následovně. Každý krok kromě posledního je následován promytím PBS. Mikrotitrační plotny byly potaženy přes noc 100 ng/50pl/jamku kozí protilátkou specifickou pro Fc region lidské protilátky. Byly přidány supematanty kultur a inkubovány po 1 hodinu. Potom byla přidána s křenovou peroxidasou konjugovaná kozí anti-lidská IgG protilátka a byla inkubována po 1 hodinu. Toto bylo následováno přidáním ABTS peroxidasového substrátu (Kirkegaard and Perry Laboratories lne., Gaithersburg, MD). Po 1 hodinové inkubaci byla čtena absorbance na čtečce mikroploten (Molecular Devices Corporation, Menlo Park, CA). Byla detekována exprese chimérické protilátky. V obdobné ELISA byl supematant COS buněk, obsahující chimérickou protilátku, specificky navázán na mikrotitrační jamky potažené lidským IL-5 proteinem. Tento výsledek potvrdil, že byly syntetizovány geny kódující protilátku k IL-5 a že tyto geny byly exprimovány.
Výše uvedený příklad popisuje přípravu příkladné upravené protilátky. Obdobné postupy mohou být provedeny pro vývoj jiných upravených protilátek, za použití jiných anti-IL-5 donorových protilátek (např. 2F2, 2E3, 4A6, 5D3, 24G9 atd.) vyvinutých běžnými prostředky.
Seznam sekvencí (1) Obecné informace:
(i) Přihlašovatel: Ames, Robert S.
Appelbaum, Edward R.
Chaiken, Irwin M.
Cook, Richard M. Gross, Mitchell S. Holmes, Stephen D. McMillan, Lynette J. Theisen, Timothy W.
(ii) Název vynálezu: Rekombinantní IL5 antagonisté pro léčbu IL5 zprostřed kovaných onemocnění
-28CZ 297045 B6 (iii) Počet sekvencí: 76 (iv) Adresa pro korespondenci (A) Adresa: SmithKline Beecham Corp./Corporate (B) Ulice: P.O. Box 1539-UW2220 (C) Město: King of Prussia (D) Stát: Pennsylvania (E) Země: USA (F) ZIP: 19406-0939 (v) Počítačová čtecí forma:
(A) Typ média: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, verse #1.30 (vi) Údaje o současné přihlášce:
(A) Číslo přihlášky:
(B) Datum podání:
(C) Klasifikace:
(vii) Předchozí data přihlášky:
(A) Číslo přihlášky: US 08/470110 (B) Datum podání: 6.6.1995 (viii) Předchozí data přihlášky:
(A) Číslo přihlášky: US 08/467420 (B) Datum podání: 6.6.1995 (viii) Předchozí data přihlášky:
(A) Číslo přihlášky: US 08/363131 (B) Datum podání: 6.6.1995 (viii) Zástupce/agent informace (A) Jméno: Sutton, Jeffrey A.
(B) Registrační číslo: 34028 (C) Reference/číslo rejstříku: P50282-2 (ix) Telekomunikační informace:
(A) Telefon: 610-270-5024 (B) Fax: 610-270-5090 (2) Informace pro SEQ ID NO: 1:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 334 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (ix) Vlastnosti:
(A) Jméno/klíč: misc_charakter (B) Umístění: 1...334
-29CZ 297045 B6 (D) Jiné informace: /upozomění= „první báze koresponduje pozici 24 podle Kabat“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:
ACCTGGCCTG GTGGCGCCCT CACAGAGCCT GTCCATCACT TGCACTGTCT CTGGGTTTTC 60
ATTAACCAGC TATAGTGTAC ACTGGGTTCG CCAGCCTCCA GGAAAGGGTC TGGAGTGGCT 120
GGGAGTAATA TGGGCTAGTG GAGGCACAGA TTATAATTCG GCTCTCATGT CCAGACTGAG 180
CATCAGCAAA GACAACTCCA AGAGCCAAGT TTTCTTAAAA CTGAACAGTC TGCAAACTGA 240
TGACACAGCC ATGTACTACT GTGCCAGAGA TCCCCCTTCT TCCTTACTAC GGCTTGACTA 300
CTGGGGCCAA GGCACCACTC TCACAGTCTC CTCA 334
(2) Informace pro SEQ ID NO: 2:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 315 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (ix) Vlastnosti:
(A) Jméno/klíč: misc_charakter (B) Umístění: 1...315 (D) Jiné informace: /upozomění= „první báze koresponduje pozici 25 podle
Kabat“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:
TCCTCCCTGA GTGTGTCAGC AGGAGAGAAG GTCACTATGA GCTGCAAGTC CAGTCAGAGT60
CTGTTAAACA GTGGAAATCA AAAGAACTAC TTGGCCTGGT ACCAGCAGAA ACCAGGGCAG120
CCTCCTAAAC TTTTGATCTA CGGGGCATCC ACTAGGGAAT CTGGGGTCCC TGATCGCTTC180
ACAGGCAGTG GATCTGGAAC CGATTTCACT CTTTCCATCA GCAGTGTGCA GGCTGAAGAC240
CTGGCAGTTT ATTACTGTCA GAATGTTCAT AGTTTTCCAT TCACGTTCGG CTCGGGGACA300
GAGTTGGAAA TAAAA315
-30CZ 297045 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 3:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 334 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (ix) Vlastnosti:
(A) Jméno/klíč: misccharakter (B) Umístění: 1...334 (D) Jiné informace: /upozomění= „první báze koresponduje pozici 24 podle Kabat“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:
ACCTGGCCTG GTGGCGCCCT CACAGAGCCT GTCCATCACT TGCACTGTCT CTGGGTTTTC 60
ATTAACCAGT TATAGTGTAC ACTGGGTTCG CCAGCCTCCA GGAAAGGGTC TGGAGTGGCT 120
GGGAGTAATA TGGGCTAGTG GAGGCACAGA TTATAATTCG GCTCTCATGT CCAGACTGAG 180
CATCAGCAAA GACAACTCCA AGAGCCAAGT TTTCTTAAAA CTGAACAGTC TGCGAACTGA 240
TGACACAGCC ATGTACTACT GTGCCAGAGA TCCCCCTTCT TCCTTACTAC GGCTTGACTA 300
CTGGGGCCAA GGCACCACTC TCACAGTCTC CTCA 334
(2) Informace pro SEQ ID NO: 4:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 315 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (ix) Vlastnosti:
(A) Jméno/klíč: misc charakter (B) Umístění: 1...315 (D) Jiné informace: /upozomění= „první báze koresponduje pozici 25 podle Kabat“
-31 CZ 297045 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:
TCCTCCCTGA GTGTGTCAGC AGGAGAGAAG GTCACTATGA GCTGCAAGTC CAGTCAGAGT 50
CTATTAAACA GTGGAAATCA AAAGAACTAC TTGGCCTGGT ACCAACAGAA ACCAGGGCAG 120
CCTCCTAAAC TTTTGATCTA CGGGGCATCC ACTAGGGAAT CTGGGGTCCC TGATCGCTTC 180
ACAGGCAGTG GATCTGGAAC CGATTTCACT CTTACCATCA GCAGTGTGCA GGCTGAAGAC 240
CTGGCAGTTT ATTACTGTCA GAATGATCAT AGTTTTCCAT TCACGTTCGG CTCGGGGACA 300
GAGTTGGAAA TAAAA 315
(2) Informace pro SEQ ID NO: 5:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 334 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (ix) Vlastnosti:
(A) Jméno/klíč: misc charakter (B) Umístění: 1...334 (D) Jiné informace: /upozomění= „první báze koresponduje pozici 24 podle Kabat“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:
ACCTGGCCTG GTGGCGCCCT CACAGAGCCT GTCCATCACT TGCACTGTCT CTGGGTTTTC 60
ATTAACCAGC TATAGTGTAC ACTGGGTTCG CCAGCCTCCA GGAAAGGGTC TGGAGTGGCT 120
GGGAGTAATC TGGGCTAGTG GAGGGACAGA TTATAATTCG GCTCTCATGT CCAGACTGAG 180
CATCAGCAAA GACAACTCCA AGAGCCAAGT TTTCTTAAAA CTGAACAGTC TGCAAACTGA 240
TGACGCAGCC ATGTACTACT GTGCCAGAGA TCCCCCTTTT TCCTTACTAC GGCTTGAC7T 300
CTGGGGCCAA GGCACCACTC TCACAGTCTC CTCA 334
-32CZ 297045 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 6:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 315 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (ix) Vlastnosti:
(A) Jméno/klíč: misc_charakter (B) Umístění: 1...315 (D) Jiné informace: /upozorněni- „první báze koresponduje pozici 25 podle Kabat“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:
TCCTCTCTGA GTGTGTCAGC AGGAGAGAAG GTCACTATGA GCTGCAAGTC CAGTCAGAGT 60
CTGTTAAACA GTGGAAATCA AAAAAACTAC TTGGCCTGGT ACCAGCAGAA ACCAGGGCAG 120
CCTCCTAAAC TTTTGATCTA CGGGGCATCC ACTAGGGAAT CTGGGGTCCC TGATCGCTTC 180
ACAGGCAGTG GATCTGGAAC CGATTTCACT CTTACCATCA GCAGTGTGCA GGCTGAAGAC 240
CTGGCAGTTT ATTACTGTCA GAATGA.TCAT AGTTTTCCAT TCACGTTCGG CTCGGGGACA 300
GAGTTGGAAA TAAAA
315 (2) Informace pro SEQ ID NO: 7:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 5 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:
Ser Tyr Ser Val His
5
-33 CZ 297045 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 8:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 16 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární io (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:
Val Ile Trp Ala Ser Gly Gly Trp Asp Tyr Asn Ser Ala Leu
10
Met Ser (2) Informace pro SEQ ID NO: 9:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:
Asp Pro Pro Ser Ser Leu Leu Arg Leu Asp Tyr
10 (2) Informace pro SEQ ID NO: 10:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 17 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:
Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gin Lys Asn
10
Tyr Leu Ala
-34CZ 297045 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 11:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 7 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11:
Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser
5 (2) Informace pro SEQ ID NO: 12:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 9 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:
Gin Asn Val His Ser Phe Pro Phe Thr
5 (2) Informace pro SEQ ID NO: 13:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 9 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 13:
Gin Asn Asp His Ser Phe Pro Phe Thr
5 (2) Informace pro SEQ ID NO: 14:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina
-35CZ 297045 B6 (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 14:
Asp Pro Pro Phe Ser Leu Leu Arg Leu Asp Phe
10 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 15:
Gin Val Gin Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro ser Gin
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Ser Val His Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tm Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ala Ser Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Leu Asn Ser Leu Gin Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Pro Pro Ser Ser Leu Leu Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 (2) Informace pro SEQ ID NO: 16:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 113 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina
-36CZ 297045 B6 (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 16:
Asp Ile Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gin Lys Asn Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glv Gin
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Asn
85 90 95
Val His Ser Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Glu Leu Glu Ile
100 105 110
Lys (2) Informace pro SEQ ID NO: 17:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 60 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 17:
ATGGTGTTGC AGACCCAGGT CTTCATTTCT CTGTTGCTCT GGATCTCTGG
TGCCTACGGG 60
-37CZ 297045 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 18:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 357 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 18:
CAGGTTACCC TGCGTGAATC CGGTCCGGCA CTAGTTAAAC CGACCCAGAC CCTGACGTTA 60
ACCTGCACCG TCTCCGGTTT CTCCCTGACG AGCTATAGTG TACACTGGGT CCGTCAGCCG 120
CCGGGTAAAG GTCTAGAATG GCTGGGTGTA ATATGGGCTA GTGGAGGCAC AGATTATAAT 180
TCGGCTCTCA TGTCCCGTCT GTCGATATCC AAAGACACCT CCCGTAACCA GGTTGTTCTG 240
accatgacta ACATGGACCC GGTTGACACC GCTACCTACT ACTGCGCTCG AGATCCCCCT 300
Tcrrccmc TACGGCTTGA CTACTGGGGT CGTGGTACCC CAGTTACCGT GAGCTCA 357
(2) Informace pro SEQ ID NO: 19:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 119 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 19:
-38CZ 297045 B6
Gin Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro
Thr Gin
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
25 30
Ser Val His Trp 35 Val Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
40 45
Gly Val Xle Trp Ala ser Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gin val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Pro Pro Ser Ser Leu Leu Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Arg Gly
100 105 110
Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115 (2) Informace pro SEQ ID NO: 20:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 339 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý ío (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 20:
-39CZ 297045 B6
GATATCGTGA TGACCCAGTC TCCAGACTCG CTAGCTGTGT ctctgggcga gagggccacc 60
ATCAACTGCA AGAGCTCTCA GAGTCTGTTA AACAGTGGAA ATCAAAAGAA CTACTTGGCC 120
TGGTATCAGC AGAAACCCGG GCAGCCTCCT AAGTTGCTCA TTTACGGGGC gtcgactagg 180
GAATCTGGGG TACCTGACCG ATTCAGTGGC AGCGGGTCTG GGACAGATTT CACTCTCACC 240
ATCAGCAGCC TGCAGGCTGA AGATGTGGCA · GTATACTACT GTCAGAATGT TCATAGTTTT 300
CCATTCACGT TCGGCGGAGG GACCAAGTTG GAGATCAAA 339
(2) Informace pro SEQ ID NO: 21:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 113 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 21:
-40CZ 297045 B6
Asp Ile Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gin Lys Asn Tvt Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
ile Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Asn
S5 90 95
Val His Ser Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
(2) Informace pro SEQ ID NO: 22:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 29 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 22:
GTACATATGC AAGGCTTACA ACCACAATC (2) Informace pro SEQ ID NO: 23:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 32 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová)
-41 CZ 297045 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 23:
GGACAGGGCT TACTAGTGGG CCCTCTGGGC TC 32 (2) Informace pro SEQ ID NO: 24:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 23 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 24:
AGGTSMARCT KTCTCGAGTC WGG 23 (2) Informace pro SEQ ID NO: 25:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 36 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 25:
CTAACACTCA TTCCTGTTGA AGCTCTTGAC AATGGG 36 (2) Informace pro SEQ ID NO: 26:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 32 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 26:
CCAGATGTGA GCTCGTGATG ACCCAGACTC CA 32
-42CZ 297045 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 27:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 140 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 27:
AACCTGCACC GTCTCCGGTT TCTCCCTGAC GAGCTATAGT GTACACTGGG TCCGTCAGCC 60
GCCGGGTAAA GGTCTAGAAT GGCTGGGTGT AATATGGGCT AGTGGAGGCA CAGATTATAA 120
TTCGGCTCTC ATGTCCCGTC
140 (2) Informace pro SEQ ID NO: 28:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 149 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 28:
ATATCGACAG ACGGGACATG AGAC-CCGAAT TATAATCTGT GCCTCCACTA GCCCATATTA 60
CACCCAGCCA TTCTAGACC7 TTACCCGGCG GCTGACGGAC CCAGTGTACA CTATAGCTCG 120
TCAGGGAGAA ACCGGAGACG GTGCAGGTT 149 (2) Informace pro SEQ ID NO: 29:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 139 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 29:
-43 CZ 297045 B6
TGTCGATATC CAAAGACACC TCCCGTAACC AGGTTGTTCT GACCATGACT AACATGGACC 60
CGGTTGACAC CGCTACCTAC TACTGCGCTC GAGATCCCCC TTCTTCCTTA CTACGGCTTG 120
ACTACTGGGG TCGTGGTAC 139 (2) Informace pro SEQ ID NO: 30:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 126 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 30:
CACGACCCCA GTAGTCAAGC CGTAGTAAGG AAGAAGGGGG
ATCTCGAGCG
CAGTAGTAGG
TAGCGGTGTC AACCGGGTCC ATGTTAGTCA TGGTCAGAAC
AACCTGGTTA
CGGGAGGTGT
120
CTTTGG
126 (2) Informace pro SEQ ID NO: 31:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 117 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 31:
CCGGGCAGCC TCCTAAGTTG CTCATTTACG GGGCGTCGAC ggcctggtat
CAGCAGAAAC
TAGGGAATCT
117 (2) Informace pro SEQ ID NO: 32:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 117 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina
-44CZ 297045 B6 (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 32:
CCCAGATTCC CTAGTCGACG CCCCGTAAAT GAGCAACTTA GGAGGCTGCC CGGGTTTCTG
CTGATACCAG GCCAAGTAGT TCTTTTGATT TCCACTGTTT AACAGACTCT GAGAGCT (2) Informace pro SEQ ID NO: 33:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 102 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 33:
GCTGAAGATG TGGCAGTATA CTACTGTCAG AATGTTCATA GTTTTCCATT CACGTTCGGC 60
GGAGGGACCA AGTTGGAGAT CAAACGTACT GTGGCGGCGC CA 1Q2 (2) Informace pro SEQ ID NO: 34:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 111 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 34:
agcttggcgc CGCCACACTA cgtttgatct CCAACTTGGT CCCTCCGCCG AACGTGAATG 60
GAAAACTATG AACATTCTGA CAGTAGTATA CTGCCACATC TTCAC-CCTGC A lil (2) Informace pro SEQ ID NO: 35:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 82 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina
-45CZ 297045 B6 (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 35:
ATGGTGTTGC AGACCCAGGT CTTCATTTCT CTGTTGCTCT GGATCTCTGG TGCCTACGGG 60
CAGGTTCAAC TGAAAGAGTC AG (2) Informace pro SEQ ID NO: 36:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 89 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 36:
GTCCTGACTC TTTCAGTTGA ACCTGCCCGT AGGCACCAGA GATCCAGAGC AACAGAGAAA 60
TGAAGACCTG GGTCTGCAAC ACCATGTTG 89 (2) Informace pro SEQ ID NO: 37:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 45 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 37:
CAAGGCACCA CTCTCACAGT CTCCTCAGCT AGTACGAAGG GCCCA 45 (2) Informace pro SEQ ID NO: 38:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 43 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární
-46CZ 297045 B6 (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 38:
AGCTTGGGCC CTTCGTACTA GCTGAGGAGA CTGTGAGTGG TGC 43 (2) Informace pro SEQ ID NO: 39:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 28 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 39:
ATCGTGATGA CCCAGTCTCC ATCCTCCC 28 (2) Informace pro SEQ ID NO: 40:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 31 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 40:
TCAGGGAGGA TGGAGACTGG GTCATCACGA T 31 (2) Informace pro SEQ ID NO: 41:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 43 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 41:
TCGGGGGACA GAGTTGGAAA TAAAACGTAC TGTGGCGGCG CCA 43
-47CZ 297045 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 42:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 42 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 42:
AGCTTGGCGC CGCCACAGTA CGTTTTATTT CCAACTCTGT CC 42 (2) Informace pro SEQ ID NO: 43:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 26 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 43:
CTAGCCACCA CCACCACCAC CACTAA 26 (2) Informace pro SEQ ID NO: 44:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 26 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 44:
CTAGTTAGTG GTGGTGGTGG TGGTGG 26 (2) Informace pro SEQ ID NO: 45:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 113 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein
-48CZ 297045 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 45:
Glu Leu Val Mec Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Asn
85 90 95
Asp His Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys (2) Informace pro SEQ ID NO: 46:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 113 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 46:
-49CZ 297045 B6
Glu Leu Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys (2) Informace pro SEQ ID NO: 47:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 9 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 47:
3al Asn Asp His Ser Tyr Pro Phe Thr (2) Informace pro SEQ ID NO: 48:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 9 aminokyselin
-50CZ 297045 B6 (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 48:
Gin Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr
5 (2) Informace pro SEQ ID NO: 49:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 6285 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: cirkulámí (iii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 49:
-51 CZ 297045 B6
GACGTCGCGG CCGCTCTAGG CCTCCAAAAA AGCCTCCTCA CTACTTCTGG AATAGCTCAG 60
AGGCGGAGGC GGCCTCGGCC TCTGCATAAA TAAAAAAAAT TAGTCAGCCA TGCATGGGGC 120
GGAGAATGGG CGGAACTGGG CGGAGTTAGG GGCGGGATGG GCGGAGTTAG gggcgggact 180
ATGGTTGCTG ACTAATTGAG ATGCATGCTT TGCATACTTC TGCCTGCTGG GGAGCCTGGG 240
GACTTTCCAC ACCTGCTTGC TGACTAATTG AGATGCATGC TTTGCATACT TCTGCCTGCT 300
GGGGAGCCTG GGGACTTTCC ACACCCTAAC TGACACACAT TCCACAGAAT TAATTCCCGG 360
GGATCGATCC GTCGACGTAC GACTAGTTAT TAATAGTAAT CAATTACGGG GTCATTAGTT 420
CATAGCCCAT ATATGGAGTT CCGCGTTACA TAACTTACGG WATGGCGC GCCTGGCTGA 480
CCGCCCAACG ACCCCCGCCC ATTGACGTCA ATAATGACGT ATOTTCCCAT AGTAACGCCA 540
ATAGGGACT7 TCCATTGACG TCAATGGGTG GACTATTTAC GGTAAACTGC CCACTTGGCA 600
GTACATCAAG TGTATCATAT GCCAAGTACG CCCCCTATTG ACGTCAATGA CGGTAAATGG 660
CCCGCCTGGC ATTATGCCCA GTACATGACC TTATGGGACT TTCCTACTTG GCAGTACATC 720
TACGTATTAG TCATCGCTAT 7ACCATGGTG ATGCGG-TTT ggcagtacat CAATGGGCGT 780
-52CZ 297045 B6
GGATAGCGGT TTGACTCACG GGGATTTCCA AGTCTCCACC CCATTGACGT CAATGGGAGT 840
TTGTTTTGGC ACCAAAATCA ACGGGACTTT CCAAAATGTC GTAACAACTC CGCCCCATTG 900
ACGCAAATGG z» z* z* zw«T» z·» r· r* r* TGTACGGTGG GAGGTCTATA TAAGCAGAGC TGGGTACGTG 960
AACCGTCAGA TCGCCTGGAG ACGCCATCGA ATTCGAGGAC GCCAGCAACA TGGTGTTGCA 1020
GACCCAGGTC TTCATTTCTC TGTTGCTCTG GATCTCTGGT GCCTACGGGC AGGTTACCCT 1080
GCGTGAATCC GGTCCGGCAC TAGTTAAACC GACCGAGACC CTGACGTTAA CCTGCACCGT 1140
CTCCGGTTTC TCCCTGACGA GCTATAGTGT ACACTGGGTC CGTCAGCCGC CGGGTAAAGG 1200
TCTAGAATGG CTGGGTGTAA TATGGGCTAG TGGAGGCACA GATTATAATT CGGCTCTCAT 1260
GTCCCGTCTG TCGATATCCA AAGACACCTC CCGTAACCAG GTTGTTCTGA CCATGACTAA ' ~ 2-
CATGGACCCG GTTGACACCG CTACCTACTA CTGCGCTCGA GATCCCCCTT 1380
ACGGCTTGAC TACTGGGGTC GTGGTACCCC AGTTACCGTG AGCTCAGCTA GTACCAAGGG 1440
CCCATCGGTC TTCCCCCTOG CACCCTCCTC CAAGAGCACC TCTGGGGGCA CAGCGGCCCT 1500
GGGCTGCCTG GTCAAGGACT ACTTCCCCGA ACCGGTGACG GTGTCGTGGA ACTCAGGCGC 1560
CCTGACCAGC GGCGTGCACA CCTTCCCGGC TGTCCTACAG TCCTCAGGAC TCTACTCCCT 1620
CAGCAGCGTG GTGACCGTGC CCTCCAGCAG CTTGGGCACC CAGACCTACA TCTGCAACGT 168C
GAATCACAAG CCCAGCAACA CCAAGGTGGA CAAGAGAGTT GAGCCCAAAT CTTGTGAOAA 1740
AACTCACACA TGCCCACCGT GCCCAGCACC TGAACTCCTG GGGGGACCGT CAGTCTTCCT 180C
CTTCCGCCCA AAACCCAAGG ACACCCTCAT GATCTCCCGG ACCCCTGAGG TCACATGCGT 1860
GGTGGTGGAC GTGAGCCACG AAGACCCTGA GGTCAAGTTC AAC7GGTACG TGGACGGCGT 1920
-53CZ 297045 B6
«JUAÍJU Λ w^a - AATGCCAAGA CAAAGCCGCG GGAGGAGCAG TACAACAGCA CGTACCGTGT 1980
GGTCAGCGTC CTCACCGTCC TGCACCAGGA CTGGCTGAAT GGCAAGGAGT ACAAGTGCAA 2040
GGTCTCCAAC AAAGCCCTCC CAGCZCCCAT CGAGAAAACC ATCTCCAAAG CCAAAGGGCA 2100
GCCCCGAGAA CCACAGGTGT ACACCCTGCC CCCATCCCGG GAGGAGATGA CCAAGAACCA 2160
GGTCAGCCTG ACCTGCCTGG TCAAAGGCTT CTATCCCAGC GACATCGCCG TGGAGTGGGA 2220
GAGCAATGGG CAGCCGGAGA ACAACTACAA GACCACGCCT CCCGTGCTGG ACTCCGACGG 2280
CTCC’’v^,C’r’mC CTCTATAGCA AGCTCACCGT GGACAAGAGC AGGTGGCAGC AGGGGAACGT 2340
CTTCTCATGC TCCGTGATGC ATGAGGCTCT GCACAACCAC TACACGCAGA AGAGCCTCTC 2400
CCTGTCTCCG GGTAAGTGAG TGTAGTCTAG ATCTACGTAT GATCAGCCTC GACTGTGCCT 2460
TCTAGTTGCC AGCCATCTGT TGTTTGCCCC TCCCCCGTGC crrcCTTGAc CCTGGAAGGT 2520
GCCACTCCCA CTGTCCTTTC CTAATAAAAT GAGGAAATTG CATCGCATTG TCTGAGTAGG 2530
TGTCATTCTA TTCTGGGGGG TGGGGTGGGG CAGGACAGCA AGGGGGAGGA TTGGGAAGAC 2640
AATAGCAGGC ATGCTGGGGA TGCGG7GGGC TCTATGGAAC CAGCTGGGGC TCGACAGCGC 2700
TGGATCTCCC GATCCCCAGC 'TtGCTTCTC AATTTCTTAT TTGCATAATG AGAAAAAAAG 27 60
GAAAATTAAT TTTAACACCA ATTCAGTAGT TGATTGAGCA AATGCGTTGC CAAAAAGGAT 2820
GCTTTAGAGA CAGTGTTCTC TGCACAGATA AGGACAAACA TTATTCAGAG GGAGTACCCA 2880
GAGCTGAGAC TCCTAAGCCA GTGAGTGGCA CAGCATTCTA GGGAGAAATA TGCTTGTCAT 2940
CACCGAAGCC TGATTCCGTA GAGCCACACC TTGGTAAGGG CCAATCTGCT CACACAGGAT 300C
-54CZ 297045 B6
AGAGAGGGCA GGAGCCAGGG CAGAGCATAT AAGGTGAGGT AGGATCAGTT GCTCCTCACA 3060
TTTGCTTCTG ACATAGTTGT GTTGGGAGCT TGGATAGCTT GGACAGCTCA GGGCTGCGAT 3-20
TTCGCGCCAA ACTTGACGGC AATCCTAGCG TGAAGGCTGG TAGGATTTTA TCCCCGCTGC 3180
CATCATGGTT CGACCATTGA ACTGCATCGT CGCCGTCTCC CAAAATATGG GGATTGGCAA 3240
GAACGGAGAC CTACCCTGGC CTCCGCTCAG GAACGAGTTC AAGTACTTCC AAAGAATGAC 3300
CACAACCTCT TCAGTGGAAG GTAAACAGAA TCTGGTGATT ATGGGTAGGA AAACCTGGTT 3360
CTCCATTCCT GAGAAGAATC GACCTTTAAA GGACAGAATT AATATAGTTC TCAGTAGAGA 3420
ACTCAAAGAA CCACCACGAG GAGCTCATTT TCTTGCCAAA AGTTTGGATG ATGCCTTAAG 3480
ACTTATTGAA CAACCGGAAT TGGCAAGTAA AGTAGACATG GTTTGGATAG TCGGAGGCAG 3540
TTCTGTTTAC CAGGAAGCCA TGAATCAACC AGGCCACCTT AGACTCTTTG TGACAAGGAT 3600
CATGCAGGAA TTTGAAAGTG ACACGTTTTT CCCAGAAATT GATTTGGGGA AATATAAACT 3660
TCTCCCAGAA TACCCAGGCG TCCTCTCTGA GGTCCAGGAG GAAAAAGGCA TCAAGTATAA 3720
GTTTGAAGTC TACGAGAAGA AAGACTAACA GGAAGATGCT TTCAAGTTCT CTGCTCCCCT 3780
CCTAAAGCTA TGCATTTTTA TAAGACCATG GGACTTTTGC TGGCTTTAGA TCAGCCTCGA 3840
CTGTGCCTTC TAGTTGCCAG CCATCTGTTG TTTGCCCCTC CCCCGTGCCT TCCTTGACCC 3900
TGGAAGGTGC CACTCCCACT GTCCTTTCCT AATAAAATGA GGAAATTGCA TCGCATTGTC 3960
TGAGTAGGTG TCATTCTATT CTGGGGGGTG GGGTGGGGCA GGACAGCAAG GGGGAGGATT 4020
GGGAAGACAA TAGCAGGCAT GCTGGGGATG CGGTGGGCTC TATGGAACCA GCTGGGGCTC 4080
GATCGAGTGT ATGACTGCGG CCGCGATCCC GTCGAGAGCT TGGCGTAATC ATGGTCATAG 4140
-55CZ 297045 B6
CTGTTTCCTG TGTGAAATTG TTATCCGCTC ACAATTCCAC ACAACATACG agccggaagc 420C
ATAAAGTGTA AAGCCTGGGG TGCCTAATGA GTGAGCTAAC TCACATTAAT TGCGTTGCGC 4250
TCACTGCCCG CTTTCCAGTC GGGAAACCTG TCGTGCCAGC TGCATTAATG wcggccaa 4320
CGCGCGGGGA GAGGCGGTTT GCGTATTGGG CGCTCTTCCG CTTCCTCGCT CACTGACTCG 4380
CTGCGCTCGG TCGTTCGGCT GCGGCGAGCG GTATCAGCTC ACTCAAAGGC GGTAATACGG 4440
TTATCCACAG AATCAGGGGA TAACGCAGGA AAGAACATGT GAGCAAAAGG CCAGCAAAAG 4500
GCCAGGAACC GTAAAAAGGC CGCGTTGCTG GCGTTTTTCC ATAGGCTCCG CCCCCCTGAC 45 60
GAGCATCACA AAAATCGACG CTCAAGTCAG AGGTGGCGAA ACCCGACAGG ACTATAAAGA 4620
TACCAGGCGT TTCCCCCTGG AAGCTCCCTC GTGCGCTCTC CTGTTCCGAC CCTGCCGCTT 4680
ACCGGATACC TGTCCGCCTT TCTCCCTTCG GGAAGCGTGG CGCTTTCTCA ATGCTCACGC 4740
TGTAGGTATC TCAGTTCGGT GTAGGTCGTT CGCTCCAAGC TGGGCTGTGT GCACGAACCC 4800
CCCGTTCAGC CCGACCGCTG CGCCTTATCC GGTAACTATC GTCTTGAGTC CAACCCGGTA 4860
AGACACGACT TATCGCCACT GGCAGCAGCC ACTGGTAACA GGATTAGCAG AGCGAGGTAT 4920
GTAGGCGGTG CTACAGAGTT CTTGAAGTGG TGGCCTAACT ACGGCTACAC TAGAAGGACA 4980
GTATTTGGTA TCTGCGCTCT GCTGAAGCCA GTTACCTTCG GAAAAAGAGT TGGTAGCTCT 5040
TGATCCGGCA AACAAACCAC CGCTGGTAGC GGTGGTTTTT TTGTTTGCAA GCAGCAGATT 5100
ACGCGCAGAA AAAAAGGATC TCAAGAAGAT CCTTTGATCT TTTCTACGGG GTCTGACGCT 5150
CAGTGGAACG AAAACTCACG TTAAGGGATT TTGGTCATGA GATTATCAAA AAGGATCTTC 5220
-56CZ 297045 B6
ACCTAGATCC TTTTAAATTA AAAATGAAGT TTTAAATCAA TCTAAAGTAT ATATGAGTAA 5280
acttgotctg ACAGTTACCA ASGCTTAATC agtgaggcac CTATCTCAGC GATCTGTCTA 5340
TTťCGTTCAT CCATAGITGC CTGACTCCCC GTCGTGTAGA TAACTACGAT ACGGGAGGGC 540C
TTACCATCTG GCCCCAGTGC TGCAATGATA CCGCGAGACC CACGCTCACC GGCTCCAGAT 5460
TTATCAGCAA TAAACCAGCC AGCCGGAAGG GCCGAGCGCA GAAGTGGTCC TGCAACTTTA 5520
TCCGCCTCCA TCCAGTCTAT TRATTGTTGC CGGGAAGCTA GAGTAAG7AG TTCGCCAGTT 558C
AATAGTTTGC GCAACGTTGT TGCCATTGCT ACAGGCATCG TGGTGTCACG CTCGTCGTTT 5640
GGTATGGCTT CATTCAGCTC CGGTTCCCAA CGATCAAGGC GAGTTACATG ATCCCGCATG 6700
TTGTGCAAAA AAGCGGTTAG CTCCTTCGCT CCTCCGATCG TTGTCAGAAG TAAGTTGGCC 5760
GCAGTGTTAT CACTCATGGT TATGGCAGCA CTGCATAATT CTCTTACTGT CATGCCATCC 5820
GTAAGATGCT TTTCTGTGAC TGGTGAGTAC TCAACCAAGT CATTCTGAGA ATAGTGTATG 5880
CGGCGACCGA GTTGCTCTTG CCCGGCGTCA ATACGGGATA ATACCGCGCC ACATAGCAGA 5940
ACTTTAAAAG TGCTCATCAT TGGAAAACGT TCTTCGGGGC GAAAACTCTC AAGGATCTTA 6000
CCGCTGTTGA GATCCAGTTC GATGTAACCC ACTCGTGCAC CCAACTGATC TTCAGCATCT 6060
TTTACTTTCA CCAGCGTTTC TGGGTGAGCA AAAACAGGAA GGCAAAATGC CGCAAAAAAG 6120
GGAATAAGGG CGACACGGAA ATGTTGAATA CTCATACTCT '’CCTTmTTCA ATATTATTGA 618C
AGCATTTATC AGGGTTATTG TCTCATGAGC GGATACATAT TTGAATGTAT TTAGAAAAAT 624C
AAACAAATAG GGGTTCCGCG CACATTTCCC CGAAAAGTGC CACCT 6285
(2) Informace pro SEQ ID NO: 50:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 5703 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý '0 (D) Topologie: cirkulámí
-57CZ 297045 B6 (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 50:
GACGTCGCGG CCGCTCTAGG CCTCCAAAAA AGCCTCCTCA CTACTTCTGG AATAGCTCAG 50
AGGCCGAGGC GGCCTCGGCC TCTGCATAAA TAAAAAAAAT TAGTCAGCCA TGCATGGGGC 120
GGAGAATGGG CGGAACTGGG CGGAGTTAGG GGCGGGATGG GCGGAGTTAG GGGCGGGACT 180
ATGGTTGCTG ACTAATTGAG ATGCATGCTT TGCATACTTC TGCCTGCTGG GGAGCCTGGG 240
GACTTTCCAC ACCTGGTTGC TGACTAATTG AGATGCATGC TTTGCATACT TCTGCCTGCT 300
GGGGAGCCTG GGGACTTTCC acaccctaac TGACACACAT TCCACAGAAT TAATTCCCGG 360
GGATCGATCC GTCGACGTAC GACTAGTTAT TAATAGTAAT CAATTACGGG GTCATTAGTT 420
CATAGCCCAT ATATGGAGTT CCGCGTTACA TAACTTACGG TAAATGGCCC GCCTGGCTGA 480
CCGCCCAACG ACCCCCGCCC ATTGACGTCA ATAATGACGT ATGTTCCCAT AGTAACGCCA 540
ATAGGGACTT TCCATTGACG TCAATGGGTG GACTATTTAC GGTAAACTGC CCACTTGGCA 600
GTACATCAAG TGTATCATAT GCCAAGTACG CCCCCTATTG ACGTCAATGA CGGTAAATGG
CCCGCCTGGC ATTATGCCCA GTACATGACC wrixW’-·--'’ GCAGTACATC 720
-58CZ 297045 B6
TACGTATTAG TCATCGCTAT TACCATGGTG ATGCGGTTT? GGCAGTACAT CAATGGGCGT 780
GGATAGCGGT TTGACTCACG GGGATTTCCA AGTCTCCACC ccattgacgt CAATGGGAGT 840
ACCAAAATCA ACGGGACTTT CCAAAATGTC GTAACAACTC CGCCCCATTG 900
ACGCAAATGG GCGGTAGGCG TGTACGGTGG GAGGTCTATA taagcagagc TGGGTACGTG 960
AACCGTCAGA TCGCCTGGAG ACGCCATCGA ATTCATTGAT aggatccagc AAGATGGTGT 1020
tgcagaccca GGTCTTCATT TCTCTGTTGC TCTGGATCTC TGGTGCCTAC GGGGATATCG 1080
TGATGACCCA GTCTCCAGAC TCGCTAGCTG TGTCTCTGGG CGAGAGGGCC ACCATCAACT 1140
GCAAGAGCTC TCAGAGTCTG TTAAACAGTG GAAATCAAAA GAACTACTTG GCCTGGTATC 1200
AGCAGAAACC CGGGCAGCCT CCTAAGTTGC TCATTTACGG GGCGTCGACT AGGGAATCTG 1260
GGGTACCTGA CCGATTCAGT GGCAGCGGGT CTCGGACAGA TTTCACTCTC ACCATCAGCA 1320
gcctgcaggc TGAAGATGTG GCAGTATACT ACTGTCAGAA TGTTCATAGT TTTCCATTCA 1380
cgttcggcgg AGGGACCAAG TTGGAGATCA AACGTACTGT GGCGGCGCCA TCTGTCTTCA 1440
TCTTCCCGCC atctgatgag CAGTTGAAAT CTGGAACTGC CTCTGTTGTG TGCCTGCTGA 1500
ATAACTTCTA TCCCAGAGAG GCCAAAGTAC AGTGGAAGGT GGATAACGCC CTCCAATCGG 1560
GTAACTCCCA GGAGAGTGTC acagagcagg ACAGCAAGGA CAGCACCTAC AGCCTCAGCA 1620
GCACCCTGAC GCTGAGCAAA GCAGACTACG AGAAACACAA AGTCTACGCC TGCGAAGTCA 1680
CCCATCAGGG CCTGAGCTCG CCCGTCACAA AGAGCTTCAA caggggagag TGTTAATTCT 1740
AGATCCGTTA TCTACGTATG ATCAGCCTCG ACTGTGCCTT CTAGTTGCCA GCCATCTGTT 1800
GTTTGCCCCT CCCCCGTGCC TTCCTTGACC CTGGAAGGTG CCACTCCCAC TGTCCTTTCC 1860
-59CZ 297045 B6
TAATAAAATG AGGAAATTGC ATCGCATTGT CTGAGTAGGT TCTGGGGGGT 1920
UXjKjfSJ 4» AGGACAGCAA GGGGGAGGAT TGGGAAGACA ATAGCAGGCA TGCTGGGGAT 1980
GCGGTGGGCT CTATGGAACC AGCTGGGGCT CGACAGCTCG AGCTAGCTTT GCTTCTCAAT 2040
^TCT^^T^TG CATAATGAGA AAAAAnGGAA aattaatttt AACACCAATT CAGTAGTTGA 210G
TTGAGCAAAT GCGTTGCCAA AAAGGATGCT ttagagacag TGTTCTCTGC ACAGATAAGG 2160
ACAAACATTA TTCAGAGGGA GTACCCAGAG CTGAGACTCC TAAGCCAGTG agtggcacag 2220
CATTCTAGGG AGAAATATGC TTGTCATCAC CGAAGCCTGA TTCCGTAGAG CCACACCTTG 2230
GTAAGGGCCA ATCTGCTCAC ACAGGATAGA GAGGGCAGGA GCCAGGGCAG AGCATATAAG 2340
GTGAGGTAGG ATCAGTTGCT CC7CACATTT GCTTCTGACA TAGTTGTGTT r-GGAGCTTGG 2400
ATCGATCCAC catggttgaa CAAGATGGAT TGCACGCAGG TTCTCCGGCC GCTTGGGTGG 2460
AGAGGCTATT CGGCTATGAC TGGGCACAAC AGACAATCGG CTGCTCTGAT GCCGCCGTGT 2520
TCCGGCTGTC AGCGCAGGGG CGCCCGGTTC TTTTTGTCAA GACCGACCTG TCCGGTGCCC 2580
TGAATGAACT GCAGGACGAG GCAGCGCGGC TATCGTGGCT GGCCACGACG GGCGTTCCTT 2640
GCGCAGCTGT GCTCGACGTT GTCACTGAAG CGGGAAGGGA CTGGCTGCTA TTGGGCGAAG 2700
TGCCGGGGCA GGATCTCCTG TCATCTCACC TTGCTCCTGC CGAGAAAGTA TCCATCATGG 2760
CTGATGCAAT GCGGCGGCTG CATACGCTTG ATCCGGCTAC CTGCCCATTC GACCACCAAG 2820
CGAAACATCG CATCGAGCGA GCACGTACTC GGATGGAAGC CGGTCTTGTC GATCAGGATG 2880
ATCTGGACGA AGAGCATCAG GGGCTCGCGC CAGCCGAACT GTTCGCCAGG CTCAAGGCGC 2940
-60CZ 297045 B6
GCATGCCCGA CGGCGAGGAT CTCGTCGTGA CCCATGGCGA TGCCTGCTTG CCGAATATCA 3000
TGGTGGAAAA TGGCCGCTTT TCTGGATTCA TCGACTGTGG CCGGCTGGGT gtgggggacc 3060
GCTATCAGGA CATAGCGTTG GCTACCCGTG ATATTGCTGA AGAGCTTGGC GGCGAATGGG 3120
CTGACCGCTT CCTCGTGCTT TACGGTATCG CCGCTCCCGA TTCGCAGCGC ATCGCCTTCT 3130
ATCGCCTTCT TGACGAGTTC TTCTGAGCGG GACTCTGGGG TTCGAAATGA CCGACCAAGC 324C
GACGCCCAAC CTGCCATCAC GAGATTTCGA TTCCACCGCC GCCTTCTATG AAAGGTTGGG 3300
CTTCGGAATC GTTTTCCGGG ACGCCGGCTG GATGATCCTC CAGCGCGGGG ATCTCATGCT 3360
GGAGTTCTTC GCCCACCCCA ACTTGTTTAT TGCAGCTTAT AATGGTTACA AATAAAGCAA 3420
TAGCATCACA AATTTCACAA ATAAAGCATT TTTTTCACTG CATTCTAGT? GTGGTTTGTC 3480
CAAACTCATC AATGTATCTT ATCATGTCTG GATCGCGGCC GCGATCCCGT CGAGAGCTTG 3540
GCGTAATCAT GGTCATAGCT GTTTCCTGTG TGAAATTGTT ATCCGCTCAC AATTCCACAC 3600
AACATACGAG CCGGAAGCAT AAAGTGTAAA GCCTGGGGTG CCTAATGAGT GAGCTAACTC 3660
ACATTAATTG CGTTGCGCTC ACTGCCCGCT TTCCAGTCGG GAAACCTGTC GTGCCAGCTG 3720
CATTAATGAA TCGGCCAACG CGCGGGGAGA GGCGGTTTGC GTATTGGGCG CTCTTCCGCT 3780
TCCTCGCTCA CTGACTCGCT GCGCTCGGTC GTTCGGCTGC GGCGAGCGGT ATCAGCTCAC 3340
TCAAAGGCGG TAATACGGTT ATCCACAGAA TCAGGGGATA ACGCAGGAAA GAACATGTGA 3900
GCAAAAGGCC AGCAAAAGGC CAGGAACCGT AAAAAGGCCG CGTTGCTGGC GTTTTTCCAT 3960
AGGCTCCGCC CCCCTGACGA GCATCACAAA AATCGACGCT CAAGTCAGAG GTGGCGAAAC 4020
CCGACAGGAC TATAAAGATA CCAGGGGTTT CCCCCTGGAA GCTCCCTCGT GCGCTCTCCT 4080
-61 CZ 297045 B6
GTTCCGACCC TGCCGCTTAC CGGAGACCTG TCCGCCTTTC TCCCTTCGGG AAGCGTGGCG 4140
CTTTCTCAAT GCTCACGCTG TAGGTATCTC AGTTCGGTGT aggtcgttcg CTCCAAGCTG 4200
GGCTGTGTGC ACGAACCCCC CGTTCAGCCC GACCGCTGCG CCTTATCCGG TAACTATCGT 4260
CTTGAGTCCA ACCCGGTAAG ACACGACTTA TCGCCACTGG CAGCAGCCAC TGGTAACAGG 4320
ATTAGCAGAG CGAGGTATGT AGGCGGTGCT ACAGAGGTCG TGAAGTGGTG GCCTAACTAC 4380
GGCTACACTA GAAGGACAGT ATTTGGTATC TGCGCTCTGC TGAAGCCAGT TACCTTCGGA 4440
AAAAGAGTTG GTAGCTCTTG ATCCGGCAAA CAAACCACCG CTGGTAGCGG 4500
GTTTGCAAGC AGCAGATTAC GCGCAGAAAA AAAGGATGTC AAGAAGATCC 4560
TCTACGGGGT CTGACGCTCA GTGGAACGAA AACTCACGTT AAGGGATTTT GGTCATGAGA 4620
TTATCAAAAA GGATCTTCAC CTAGATCCTT TTAAATTAAA AATGAAGTTT 7AAATCAATC 468C
TAAAGTATAT ATGAGTAAAC TTGGTCTGAC AGTTACCAAT GCTTAATCAG TGAGGCACCT 4740
ATCTCAGCGA TCTGTCTATT TCGTTCATCC ATAGTTGCCT GACTCCCCGT CGTGTAGATA 4800
ACTACGATAC GGGAGGGCTT ACCATCTGGC CCCAGTGCTG CAATGATACC GCGAGACCCA 4860
CGCTCACCGG CTCCAGATTT ATCAGCAATA AACCAGCCAG CCGGAAGGGC CGAGCGCAGA 4920
AGTGGTCGTG CAACTTTATC CGCCTCGATC CAGTCTATTA ATTGTTGCCG GGAAGCTAGA 4980
GTAAGTAGTT CGCCAGTTAA TAGTTGGCGC AACGTTGTTG CCATTGCTAC AGGCATCGTG 5040
GTGTCACGCT CGTCGTTTGG TATGGCTTCA TTCAGCTCCG GTTCCCAACG ATCAAGGCGA 5100
GTTACA7GAT CCCCCATGTT GTGCAAAAAA GCGGTTAGCT CCTTCGGTCC TCCGATCGTT 5160
-62CZ 297045 B6
GTCAGAAGTA AGTTGGCCGC AGTGTTATCA CTCATGGTTA TGGCAGCACT GCATAAÍTCT
CTTACTGTCA TGCCATCCGT AAGATGCTTT TCTGTGACTG GTGAGTACTC AACCAAGTCA
TTCTGAGAAT AGTGTATGCG GCGACCGAGT TGCTCTTGCC CGGCGTCAAT ACGGGATAAT
ACCGCGCCAC ATAGCAGAAC TTTAAAAGTG CTCATCATTG GAAAACGTTC TTCGGGGCGA
AAACTCTCAA GGATCTTACC GCTGTTGAGA TCCAGTTCGA TGTAACCCAC TCGTGCACCC
AACTGATCTT CAGCATCTTT TACTTTCACC AGCGTTTCTG GGTGAGCAAA AACAGGAAGG
CAAAATGCCG CAAAAAAGGG AATAAGGGCG ACACGGAAAT GTTGAATACT CATACTCTTC
CTTTTTCAAT ATTATTGAAG CATTTATCAG GGTTATTGTC TCATGAGCGG ATACATATTT
GAATGTATTT AGAAAAATAA ACAAATAGGG GTTCCGCGCA CATTTCCCCG AAAAGTGCCA CCT (2) Informace pro SEQ ID NO: 51:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 81 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 51:
ATCCAAAGAC AACTCCCGTA ACCAGGTTGT TCTGACCATG ACTAACATGG ACCCGGTTGA
CACCGCTACC TACTACTGCG C
5220
S23C
5340
5400
5460
5520
5530
5640
5700
5703 (2) Informace pro SEQ ID NO: 52:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 85 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární £7 (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 52:
TCGAGCGCAG TAGTAGGTAG CGGTGTCAAC CGGGTCCATG TTAGTCATGG TCAGAACAAC
CTGGTTACGG GAGTTGTCTT TGGAT (2) Informace pro SEQ ID NO: 53:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 73 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 53:
AACCTGCACC GTCTCCGGTT TCTCCCTGAC GAGCTATAGT GTACACTGGA TCCGTCAGCC 60
GCCGGGTAAA GGT 73 (2) Informace pro SEQ ID NO: 54:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 77 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 54:
CTAGACCTTT ACCCGGCGGC TGACGGATCC AGTGTACACT ATAGCTCGTC AGGGAGAAAC 60
CGGAGACGGT GCAGGTT (2) Informace pro SEQ ID NO: 55:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 46 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární i / (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 55:
CTAGCTGTGT CAGCTGGCGA GAGGGCCACC ATCAACTGCA AGAGCT (2) Informace pro SEQ ID NO: 56:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 38 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 56:
CTTGCAGTTG ATGGTGGCCC TCTCGCCAGC TGACACAG (2) Informace pro SEQ ID NO: 57:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 140 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 57:
TTCGAGGACG CCAGCAACAT GGTGTTGCAG ACCCAGGTCT TCATTTCTCT GTTGCTCTGG
ATCTCTGGTG CCTACGGGCA GCTCCAACTG CAGGAGAGCG GTCCAGGTCT TGTGAGACCÚ
AGCCAGACCC TGAGCCTGAC
120
140 (2) Informace pro SEQ ID NO: 58:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 138 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová)
-65CZ 297045 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 58:
GTGCCTCCAC TAGCCCATAT TACTCCAAGC CACTCTAGAC CTCGTCCAGG TGGCTGTCTC
6C
ACCCAGTGTA CACTATAGCT GGTGAGGGAG AAGCCCGAGA CGGTGCAGGT CAGGCTCAGG
120
GTCTGGCTAG GTCTCACA
138 (2) Informace pro SEQ ID NO: 59:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 143 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 59:
GGCTTGGAGT AATATGGGCT AGTGGAGGCA CAGATTATAA
TTCGGCTCTC ATGTCCAGAC
TGAGTATACT GAAAGACAAC AGCAAGAACC AGGTCAGCCT GAGACTCAGC AGCGTGACAG
CCGCCGACAC CGCGGTCTAT TTC (2) Informace pro SEQ ID NO: 60:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 136 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 60:
120
143
CCAGTGCCAA GCTTGGGCCC TTGGTGGAGG CGCTCGAGAC GGTGACCGTG GTACCTTGTC 60
CCCAGTAGTC AAGCCGTAGT AAGGAAGAAG GGGGATCTCG AGCACAGAAA TAGACCGCGG 120
136
TGTCGGCGGC TGTCAC
-66CZ 297045 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 61:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 357 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 61:
CAGGTCCAAC TGCAGGAGAG CGGTCCAGGT CTTGTGAGAC CTAGCCAGAC CCTGAGCCTG 60
ACCTGCACCG TCTCGGGCTT CTCCCTCACC AGCTATAGTG TACACTGGGT GAGACAGCCA 120
CCTGGACGAG GTCTAGAGTG GCTTGGAGTA ATATGGGCTA GTGGAGGCAC AGATTATAAT 180
TCGGCTCTCA TGTCCAGACT GAGTATACTG AAAGACAACA GCAAGAACCA GGTCAGCCTG 240
AGACTCAGCA GCGTGACAGC CGCCGACACC GCGGTCTATT ACTGTGCTCG GGATCCCCCT 300
TCTTCCTTAC TACGGCTTGA CTACTGGGGA CAAGGTACCA CGGTCACCGT CTCGAGC 357
(2) Informace pro SEQ ID NO: 62:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 119 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 62:
-67CZ 297045 B6
Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gin
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Ser Val His Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ala Ser Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Leu Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gin Val Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Pro Pro Ser Ser Leu Leu Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 (2) Informace pro SEQ ID NO: 63:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 28 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 63:
AGGACGCCAG CAACATGGTG TTGCAGAC 28 (2) Informace pro SEQ ID NO: 64:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 36 párů bází
-68CZ 297045 B6 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 64:
TGCCAAGCTT GGGCCCTTGG TGGAGCGCT CGAGAC 36 (2) Informace pro SEQ ID NO: 65:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 121 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 65:
GACCATGATT ACGAATTCGT AGTCGGATAT CGTGATGACC CAGAGCCCAA GCAGCCTGAG60
CGCTAGCGTG GGTGACAGAG TGACCATCAC CTGTAAGAGC TCTCAGAGTC TGTTAAACAG120
T121 (2) Informace pro SEQ ID NO: 66:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 116 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 66:
AGATTCCCTA GTCGATGCCC CGTAGATCAG CAGCTTTGGA GCCTTACCGG GTTTCTGCTG 60
ATACCAGGCC AAGTAGTTCT TTTGATTTCC ACTGTTTAAC AGACTCTGAG AGCTCT 116 (2) Informace pro SEQ ID NO: 67:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 116 párů bází
-69CZ 297045 B6 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 67:
TCTACGGGGC ATCGACTAGG GAATCTGGGG TACCAGATAG ATTCAGCGGT AGCGGTAGCG
GAACCGACTT CACCTTCACC ATCAGCAGCC TGCAGCCAGA GGACATCGCC ACCTAC (2) Informace pro SEQ ID NO: 68:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 117 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 68:
TCGATGCCAA GCTTGGCGCC GCCACAGTAC GTTTGATCTC CACCTTGGTC CCTTGTCCGA
ACGTGAATGG AAAACTATGA ACATTCTGGC AGTAGTAGGT GGCGATGTCC TCTGGCT
116
117 (2) Informace pro SEQ ID NO: 69:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 339 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 69:
-70CZ 297045 B6
GATATCGTGA TGACCCAGAG CCCAAGCAGC CTGAGCGCTA GCGTGGGTGA CAGAGTGACC 60
ATCACCTGTA AGAGCTCTCA GAGTCTGTTA AACAGTGGAA ATCAAAAGAA CTACTTGGCC 120
TGGTATCAGC AGAAACCCGG TAAGGCTCCA AAGCTGCTGA TCTACGGGGC ATCGACTAGG 180
GAATCTGGGG TACCAGATAG ATTCAGCGGT AGCGGTAGCG GAACCGAOT CACCTTCACC 240
ATCAGCAGCC TGCAGCCAGA GGACATCGCC ACCTACTACT GCCAGAATGT TCATAGTTTT 30C
CCATTCACGT TCGGACAAGG GACCAAGGTG GAGATCAAA 339
(2) Informace pro SEQ ID NO: 70:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 113 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jednoduchý ío (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 70:
-71 CZ 297045 B6
Asp Ile Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ssr Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Asn
85 90 95
Val His Ser Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys (2) Informace pro SEQ ID NO: 71:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 24 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý io (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 71:
GATTACGAAT TCGTAGTCGG ATAT (2) Informace pro SEQ ID NO: 72:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 24 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina
-72CZ 297045 B6 (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 72:
TGCCAAGCTT GGCGCCGCCA CAGT 24 (2) Informace pro SEQ ID NO: 73:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 39 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 73:
(2) Informace pro SEQ ID NO: 74:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 31 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 74:
CTTACAGGTG ATGGTCACTC GGTCACCCGC A 31 (2) Informace pro SEQ ID NO: 75:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 66 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 75:
GGTCTATTAC TGTGCTCGGG ATCCCCCTTC TTCCTTACTA CGGCTTGACT ACTGGGGACA 60
AGGTAC 66
-73 CZ 297045 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 76:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 64 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 76:
CTTGTCCCCA GTAGTCAAGC CGTAGTAAGG AAGAAGGGGG ATCCCGAGCA CAGTAATACA 60
CCGC 64
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (35)

  1. CCGC 64
    PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Hlodavci neutralizační monoklonální protilátka specifická pro lidský interleukin 5 a mající vazebnou afinitu charakterizovanou disociační konstantou rovnou nebo menší než 3,5 x 1011 M, kde aminokyselinové sekvence CDR1, CDR2 a CDR3 těžkého řetězce jsou uvedeny v SEQ ID NO: 7, 8, 9 nebo 7, 8, 14 a aminokyselinové sekvence CDR1, CDR2 a CDR3 lehkého řetězce jsou uvedeny v SEQ ID NO: 10, 11, 12 nebo 10, 11, 13, stejně jako 47 a 48.
  2. 2. Monoklonální protilátka podle nároku 1, která je myší monoklonální protilátkou.
  3. 3. Monoklonální protilátka podle nároku 1, která je krysí monoklonální protilátkou.
  4. 4. Monoklonální protilátka podle nároku 2, která obsahuje lehký řetězec aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 16 a těžký řetězec aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 15.
  5. 5. Monoklonální protilátka podle nároku 1 mající identifikující charakteristiky 2B6, vytvořená hybridomem ATCC přístupového čísla HB 11783, 2E3, vytvořená hybridomem ATCC přístupového čísla HB 11782, 2F2, vytvořená hybridomem ATCC přístupového čísla HB 11781 nebo 4A6, vytvořená hybridomem ATCC přístupového čísla HB 11943.
  6. 6. Hybridom mající identifikující charakteristiky buněčné linie SKI 19-2B6.206.75(l), uložený pod ATCC přístupovým číslem HB 11783, SKI 19-2E3.39.40.2, uložený pod ATCC přístupovým číslem HB 11782, SKI 19-2F2.37.80.12, uložený pod ATCC přístupovým číslem HB 11781 nebo 4A6(1)G1F7, uložený pod ATCC přístupovým číslem HB 11943.
  7. 7. Neutralizační Fab fragment nebo jeho F(ab')2 fragment produkovaný delecí Fc regionu u monoklonální protilátky podle nároku 1.
  8. 8. Neutralizační Fab fragment nebo jeho F(ab')2 fragment produkovaný přeskupením řetězců, kde je Fd těžký řetězec monoklonální protilátky podle nároku 1 exprimován s myším lehkým řetězcem ve filamentosní fágové Fab zobrazující knihovně. 9 * *
  9. 9. Neutralizační Fab fragment nebo jeho F(ab')2 fragment produkovaný přeskupením řetězců, kde je lehký řetězec monoklonální protilátky podle nároku 1 exprimován s myším těžkým řetězcem ve filamentosní fágové Fab zobrazující knihovně.
    -74CZ 297045 B6
  10. 10. Pozměněná protilátka obsahující těžký řetězec a lehký řetězec, kde jsou úseky základní struktury uvedeného těžkého a lehkého řetězce z alespoň jedné vybrané protilátky a aminokyselinové sekvence komplementaritu určujících regionů každého uvedeného řetězce jsou zmonoklonální protilátky podle nároku 1.
  11. 11. Pozměněná protilátka podle nároku 10, kde uvedené aminokyselinové sekvence komplementaritu určujících regionů těžkého řetězce jsou:
    (a) SEQ ID NO: 7, 8, 9; nebo (b) SEQ ID NO: 7, 8, 14.
  12. 12. Pozměněná protilátka podle nároku 10, kde uvedené aminokyselinové sekvence komplementaritu určujících regionů lehkého řetězce jsou:
    (a) SEQ ID NO: 10, 11, 12; nebo (b) SEQ ID NO: 10, 11, 13.
  13. 13. Pozměněná protilátka podle nároku 10, kde uvedené úseky základní struktury uvedeného těžkého řetězce obsahují: aminokyseliny 1 - 30, 36 - 49, 66 - 97 a 109 - 119 SEQ ID NO: 19.
  14. 14. Pozměněná protilátka podle nároku 10, kde uvedené úseky základní struktury uvedeného lehkého řetězce obsahují: aminokyseliny 1 - 23, 41 - 55, 63 - 94 a 104 - 113 SEQ ID NO: 21.
  15. 15. Komplementaritu určující region (CDR) těžkého řetězce imunoglobulinu, jehož aminokyselinová sekvence je vybrána ze skupiny skládající se z:
    (a) SEQ ID NO: 7, (b) SEQ ID NO: 8, (c) SEQ ID NO: 9, a (d) SEQ ID NO: 14.
  16. 16. Komplementaritu určující region (CDR) lehkého řetězce imunoglobulinu, jehož aminokyselinová sekvence je vybrána ze skupiny skládající se z:
    (a) SEQ ID NO: 10, (b) SEQ ID NO: 11, (c) SEQ ID NO: 12, (d) SEQ ID NO: 13, (e) SEQ ID NO: 47, a (f) SEQ ID NO: 48.
  17. 17. Molekula nukleové kyseliny kódující komplementaritu určující region (CDR) imunoglobulinu podle nároku 15.
  18. 18. Molekula nukleové kyseliny kódující komplementaritu určující region (CDR) imunoglobulinu podle nároku 16.
  19. 19. Chimérická protilátka obsahující těžký řetězec a lehký řetězec, kde uvedená protilátka je charakterizována disociační konstantou rovnou nebo menší než 3,5 x 10 11 M pro lidský interleukin 5, kde jsou konstantní regiony uvedeného lehkého a těžkého řetězce z alespoň jedné vybrané protilátky a aminokyselinové sekvence variabilních regionů každého uvedeného řetězce jsou z monoklonální protilátky podle nároku 1.
  20. 20. Protilátka podle nároku 19, kde jsou konstantní regiony vybrány z lidských imunoglobulinů.
    -75CZ 297045 B6
  21. 21. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje pozměněnou protilátku podle nároku 10 a farmaceuticky akceptovatelný nosič.
  22. 22. Použití pozměněné protilátky podle nároku 10, pro výrobu léčiva pro léčbu stavů asociovaných s excesivní produkcí eosinofilů.
  23. 23. Použití podle nároku 22, pro výrobu léčiva pro léčbu stavů asociovaných s excesivní produkcí eosinofilů, kde uvedeným stavem je astma.
  24. 24. Použití podle nároku 22, pro výrobu léčiva pro léčbu stavů asociovaných s excesivní produkcí eosinofilů, kde uvedeným stavem je alergická rhinitida.
  25. 25. Použití podle nároku 22, pro výrobu léčiva pro léčbu stavů asociovaných s excesivní produkcí eosinofilů, kde uvedeným stavem je atopická dermatitida.
  26. 26. Izolovaná sekvence nukleové kyseliny, která je vybrána ze skupiny skládající se z:
    (a) sekvence nukleové kyseliny kódující pozměněnou protilátku podle nároku 10;
    (b) sekvence nukleové kyseliny komplementární k (a);
    (c) fragmentu nebo analogu (a) nebo (b), který kóduje protein charakterizovaný specifitou pro lidský interleukin 5;
    kde uvedená sekvence popřípadě obsahuje restrikční místo.
  27. 27. Izolovaná sekvence nukleové kyseliny podle nároku 26, kde sekvence kóduje variabilní region humanizovaného těžkého řetězce, který obsahuje sekvenci nukleové kyseliny SEQ ID NO: 18.
  28. 28. Izolovaná sekvence nukleové kyseliny podle nároku 26, kde sekvence kóduje variabilní region humanizovaného těžkého řetězce, který obsahuje sekvenci nukleové kyseliny SEQ ID NO: 61.
  29. 29. Izolovaná sekvence nukleové kyseliny podle nároku 26, kde sekvence kóduje variabilní region humanizovaného lehkého řetězce, který obsahuje sekvenci nukleové kyseliny SEQ ID NO: 20.
  30. 30. Izolovaná sekvence nukleové kyseliny podle nároku 26, kde sekvence kóduje variabilní region humanizovaného lehkého řetězce, který obsahuje sekvenci nukleové kyseliny SEQ ID NO: 69.
  31. 31. Rekombinantní plasmid obsahující sekvenci nukleových kyselin podle nároku 26.
  32. 32. Hostitelská buňka transfekovaná rekombinantním plasmidem podle nároku 31.
  33. 33. Způsob pro produkci pozměněných protilátek podle nároku 1, specifických pro lidský interleukin 5, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci buněčné linie transfekované rekombinantním plasmidem podle nároku 31 pod kontrolou vybraných regulačních sekvencí schopných řízení jeho exprese v uvedených buňkách.
  34. 34. Hybridom mající identifikující charakteristiky buněčné linie SKI 19-24G9.8.20.5, uložené pod ATCC přístupovým číslem HB 11780, nebo 5D3(1)F5D6, uložené pod ATCC přístupovým číslem HB 11942.
  35. 35. Monoklonální protilátka produkovaná hybridomem podle nároku 34.
    13 výkresů
    -76CZ 297045 B6
    Obrázek 1
    2B6 DNA sekvence variabilního regionu těžkého řetězce
    1 CCT GGC 30 Gin Ual Gin Leu LyS Glu Ser Gly Pro G ly 31 CTG GTG GCG CCC TCR CRG RGC CTG TCC RTC 60 Leu Ual Rla Pro Ser Gin Ser Leu Ser Ile 51 RCT. TGC RCT GTC TCT GGG TTT TCR TTR RCC 90 Thr Cys Thr Ual Ser Gly Phe Ser Leu Thr 91 RGC TRT RGT GTR CRC TGG GTT CGC CRG CCT 120 Ser Tur Ser Ual His Trp Ual Rrg Gin Pro 121 CCR GGR RRG GGT CTG GRG TGG CTG GGR GTR 150 Pro Gly lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Ual 151 RTR TGG GCT RGT GGR GGC RCR GRT tRT RRT 180 Ile Trp Rla Ser Gly Gly Thr Rsp Tyr Rsn 181 TCG GCT CTC RTG TCC RGR CTG Aše RŤC RGC 210 Ser Rla Leu het Šer Rrg Leu Ser Ile Ser 211 RRR GRC RRC TCC RRG RGC CRR GTT TTC TTR 240 Lys Rsp Rsn Ser LyS Ser Gin Ual Phe Leu 241 RRR CTG RRC RGT CTG CRR RCT GRT GRC RCR 270 Lys Leu Rsn Ser Leu Gin Thr Rsp Rsp Thr 271 GCC RTG TRC TRC TGT GCC RGR GRT CCC CCT 30« Rla het Tyr Tyr Cys Rla Rrg Rsp Pro Pro 301 TCT TCC TTR CTR CGG CTT GRC TRC TGG GGC 33© Ser Šer Leu Leu Rrg Leu Rsp Tyr Trp Gly
    331 CRR GGC RCC RCT CTC RCR GTC.TCC TCR 357 Gin Gly Thr Thr Leu Thr Ual Ser Ser
    -77CZ 297045 B6
    Obrázek 2
    2B6 DNA sekvence variabilního regionu lehkého řetězce i TCC tcc ftsp Ile Val Het Thr Gin Ser Pro Ser Ser
    31 CTG RGT pTG TCR GCR GGR GRG RRG GTC RCT
    Leu Ser Ual Ser Rla Gly Glu Lys Ual Thr
    RTG RGC TGC het Ser Cys;
    RRG TCC RGT CRG RGT CTG TTR Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu
    RRC RGT GGR RRT CRR RRG RRC TRC TTG GCC Rsn Ser Gly Rsn Gin Lys Rsn Tyr Leu Rla
    121
    TGG TRC CRG CRG Rfffi CCR GGG CRG CCT CCT Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro
    151 RRR CTT TTG RTC TRC Lys Leu Leu Ile Tyr
    GGG GCR TCC RCT RGG Gly Rla Ser Thr Rrg
    181
    GRR TCTÍGGG GTC CCT Glu Ser Gly Ual Pro
    GRT CGC TTC RCR GGC Rsp Rrg Phe Thr Gly
    211 RGT GGR TCT GGR RCC GRT TTC RCT CTT TCC
    Ser Gly Ser Gly Thr Rsp Phe Thr Leu Ser
    241 RTC RGC RGT GTG CRG GCT GRfl GRC CTG GCR
    Ile Ser Ser Ual Gin Rla Glu Rsp Leu Rla
    271 GTT TRT TRC TGT Ual Tyr Tyr Cys
    CRGRRTGTT CŘT RGT TŤT Gin Rsn Ital His Ser Phe
    301
    CCR TTC RCGITTC GGC TCG GGG RCR GRG TTG Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Glu Leu
    120
    150
    180
    210
    240
    270
    300
    330
    331 GRR RTR RRR 339 Glu Ile Lys
    -78CZ 297045 B6
    Obrázek 3
    2F2 i
    DNA sekvence variabilního regionu těžkého řetězce
    l CCT GGC CTG GTG GCG ccc TCR CRG RGC CTG 30 Pro Gly Leu Val filo Pro Ser Gin Ser _eu 31 TCC RTC RCT TGC RCT GTC TCT GGG TTT TCR 60 Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser 61 TTR fícc RGT TRT RGT GTR CRC TGG GTT CGC 90 Leu Thr Ser Tyr Ser Val His Trp Val Rrg 91 CRG CCT CCR GGR RRG GGT CTG GRG TGG CTG 120 Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 121 GGR GTR RTfl TGG GCT RGT GGR GGC RCR GRT 150 Gly Val Ile Trp fila Ser Gly Gly Thr Rsp 151 TRT fiat TCG GCT CTC RTG TCC RGfi CTG RGC 188 Tyr fisn Ser Rla Leu het Ser firg Leu Ser 181 ATC RGC RRR GRC RRC TCC RRG fiGC CRR GTT 210 Ile Ser Lys Rsp fisn Ser Lys Ser Gin Val 211 TTC TTR RRR CTG RRC RGT CTG CGR RCT GRT 240 Phe Leu Lys Leu fisn Ser Leu Rrg Thr Rsp 241 GRC RCR GCC RTG TflC TRC TGT GCC RGfi GRT 27Θ Rsp Thr Rla ttet Tyr Tyr Cys Rla Rrg Rsp
    271 CCC CCT TCT TCC TTR CTR CGG CTT GRC TflC 300 Pro Pro Ser Ser Leu Leu Rrg Leu Rsp Tyr 301 TGG GGC CRR GGC RCC RCT CTC RCR GTC TCC 330 Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser 331 TCR 333 Ser
    -79CZ 297045 B6
    Obrázek 4 2F2 DNA sekvence variabilního regionu lehkého řetězce
    9l
    121
    151
    181
    211
    241
    271
    301
    < VL V ÍU rtu i UIU Ser Ser Leu Ser Uot GTC RCT RTG RGC TGC Val Thr net Ser Cys CTR TTR RRC AGT GGA Leu Leu fisn Ser Gly TTG GCC TGG TRC CRR Leu Ala Trp Tyr Gin CCT CCT AAA CTT TTG Pro Pro Lys Leu Leu RCT AGG GRR TCT GGG Thr Ary Glu Ser Gly RCR GGC RGT GGA TCT Thr Gly Ser Gly Ser CTT RCC RTC RGC RGT Leu Thr I le Ser Ser CTG GCR GTT TRT TRC Leu Rlo Ual Tyr Tyr
    120
    150
    180
    210
    240
    270
    300
    GRG TTG GRfi RTR RRR 315 Glu Leu Glu íle Lus
    -80CZ 297045 B6
    Obrázek 5
    2E3 DNA sekvence variabilního regionu těžkého řetězce
    1 CCT ggc CTG GTG GCG ccc TCR CRG RGC CTG 30 Pro Gly Leu Ual Rla Pro Ser Gin Ser Leu 31 TCC RTC RCT TGC RCT GTC TCT GGG TTT TCR 60 Ser I le Thr Cys Thr Ual Ser Gly Phe Ser 61 TTR RCC RGC TRT RGT GTR CRC TGG GTT CGC 90 Leu Thr Ser Tyr Ser Ual His Trp Ual Rrg 91 CRG CCT cca GGR RRG GGT CTG GRG TGG CTG 120 Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 121 GGR GTR RTC TGG GCT RGT GGR GGC RCR GRT 150 Gly Ual Ile Trp Rla Ser Gly Gly Thr Rsp 131 TRT RRT TCG GCT CTC RTG TCC RGR CTG RGC 180 Tur Rsn Ser Rla Leu fiet Ser Rrg Leu Ser 181 RTC RGC RRR GRC RRC TCC RRG RGC CfiR GTT 210 I le Ser Lys Rsp Rsn Ser Lys Ser Gin Uat 211 TTC TTR RRR CTG RRC RGT CTG CRR RCT GRT 24® Phe Leu Lys Leu Rsn Ser Leu Gin Thr Rsp 241 GAC GCR GCC RTG TRC TRC TGT GCC RGR GRT 270 Rsp Rla Rla tlel Tyr Tyr Cys Rla Rrg Rsp
    -81 CZ 297045 B6
    Obrázek 6
    2C3 DNA sekvence variabilního regionu lehkého řetězce i
    121
    151
    181
    211
    241
    271
    3ΘΙ
    TCC TCT CTG RGT GTG TCA GCR GGR GRG RRG 30 Ser Ser Leu Ser Uol Ser Rla Gly Glu Lys GTC RCT RTG RGC TGC RRG TCC RGT CRG RGT 50 Uol Thr Het Ser* Cys Lys Ser Ser Gin Ser CTG TTA RRC RGT GGR RRT CAR RRR RRC TRC 90 Leu Leu Rsn Ser Gly Rsn Gin Lys Rsn Tyr
    TRC GGG GCR TCC 150 Tyr GlV Rla Ser CCT GRT CGC TTC 180 Pro Rsp Rrg Phe RCC GRT TTC RCT 210 Thr fisp Phe Thr CRG GCT GRR GRC 24® Gin Rla Glu fisp CRG RRT GRT CRT 270 Gin Rsn flsp His
    GRG TTG GRR RTR RRR 315
    Glu Leu Glu Ile Lys
    -82CZ 297045 B6
    Obrázek 7
    2B6 CDRs
    Těžký řetězec p
    Těžký řetězec 2.
    Těžký řetězec
    Lehký řetězec j;
    Lehký řetězec 2.
    o.
    Lehký řetězec
    2F2 CDRs
    Těžký řetězec p
    Těžký řetězec 2:
    Těžký řetězec
    Lehký řetězec
    Lehký řetězec 2:
    Lehký řetězec 32E3 CDRs
    Těžký řetězec p
    Těžký řetězec 2;
    Těžký řetězec 3’
    Lehký řetězec p
    Lehký řetězec 2:
    Lehký řetězec 3
    SYSVH
    VrWASCCTDYNSALMS
    DPPSSLLRLDY
    KSSQJLLNSGNQKNYLA GASTRES QNVHSFPFT
    SYSVH
    VIWASGGTDYNSALMS
    DPPSSLLRLDY
    KSSQ.SLLNSGNQKNYLA GASTRES QNDHSFPFT
    SYSVH
    VIWASGGTDYNSALMS DPPFSLLRLDF
    KSSQSLLNSGNQJCNYLA GASTRES
    QNDHSFPFT
    -83 CZ 297045 B6
    Obrázek 8
    IL5 variabilní region humanizovaného těžkého řetězce
    1 CRG GTT RCC CTG CGT GRR TCC GGT CCG GCR 3® Gin Ual Thr Leu rtng Glu Ser Gly Pro Rla 31 CTR GTT RRR CCG RCC CRG RCC CTG RCG TTR 6® Leu Ual Lys Pro Thr Gin Thr Leu Thr Leu 61 RCC TGC RCC TTC TCC GGT TTC TCC CTG RCG 90 Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Thr 91 RGC TRT RGT GTR CRC TGG RTC CGT CRG CCG 120 Ser Tyr Ser Ual His Trp Ile Rrg Gin Pro
    121 CCG GGT «λα ΠΠΠ GGT CTG GAG TGG CTG GGT GTR Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Ual 151 RTR TGG GCT RGT GGR GGC ACR GRT TRT AAT Ile Trp Rla Ser Gly Gly Thr Rsp Tyr Rsn 181 TCG GCT CTC RTG TCC CGT CTG RCG RTR TCC Ser Rla Leu Met Ser Rrg Leu Thr Ile Ser
    150
    180
    21®
    211 RRR GRC RCC TO CGT RRC CRG GTT GTT CTG 240
    Lys Rsp Thr Ser Rrg Rsn Gin Ual Ual Leu
    241 RCC RTG RCT RFC RTG GRC CCG GTT GRC RCC 270
    Thr het Thr ftsn Met Rsp Pro Ual Rsp Thr
    271
    301
    GCT RCC
    Rla Thr
    TRC TRC TGC Tyr Tyr Cys
    GCT
    Rla
    CGR Rrg
    GRT CCC
    Rsp Pro
    CCT
    Pro
    TCT TCC TTR CTR CGG CTT GRC TRC TGG GGT
    300
    33®
    Ser Ser Leu Leu Rrg Leu Rsp Tyr
    Trp Gly
    331 CGT GGT RCCCCR GTT RCC GTG RGC TCR 357 Rrg Gly Thr Pro Ual Thr Ual Ser Ser
    -84CZ 297045 B6
    Obrázek. 9
    Variabilní region humanizovaného lehkého řetězce
    1 GRT RTC GTG RTG RCC CRG TCT CCR GRC TCG Rsp lle Ual tlet Thr Gin Ser Pro Rsp Ser 31 CTR GCT GTG TCT CTG GGC GRG RGG GCC RCC Lea Ala Ual Ser Leu Gly Glu Rla Thr 61 RTC RRC TGC ARG RGC TCT CRG RGT CTG CTR lle Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu 91 RRC RGT GGA ART CAR ARG RRC TRC CTG GCC Rsn Ser Gly Asn Gin Lys flsn Tyr Leu Rla
    121 TGG TRT CAG CAG RRR CCC GGG CRG CCT CCT Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro
    151 RRG TTG CTC RTT TRC Lys Leu Leu lle Tyr 181 GRA TCT GGG GTR CCT Glu Ser Gly Ual Pro 211 RGC GGG TCT GGG RCR Ser Gly Ser Gly Thr
    GGG GCG TCG RCT RGG Gly Rla Ser Thr Rrg
    GRC CGR TTC RGT GGC Asp Arg Phe Ser Gly
    GRT TTC RCT CTC RCC Asp Phe Thr Leu Thr
    12®
    150
    180
    210
    240
    241 RTC RGC RGC CTG CRG GCT GAR GRT CTG GCR Lle Ser Ser Leu Gin Rla Glu Asp Ual Ala
    27«
    271
    301
    GTR TRC TRC TGT CRG RRT GTT CRT RGT TCT Ual Tyr Tyr Cys Gin Rsn Ual His Ser Phe
    CCR TTC RCGlTTC GGC GGA GGG RCC RRG TTG Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
    300
    330
    331 GRG RTC RRR 339 Glu lle Lys
    -85CZ 297045 B6
    6285
    I Stul SspI /Sfil
    Eco4tIII
    Obrázek 10
    -86CZ 297045 B6
    570J
    I stul
    I / sfii < X ttJ cn
    Q. <λ tv5HZLl1-o
    O <
    LU
    O O
    ΓΗ
    O
    JZu
    Li)
    Γ**Ί s
    ω
    Rsrll I I I MscI
    JOOO |
    BssHIl I
    BspGI
    Ui
    Obrázek 11
    -87CZ 297045 B6
    Obrázek 12
    IL5 NEWM variabilní region humanizovaného těžkého řetězce
    1 CRG GTC CRR CTG CRG GAG RGC GGT CCA GGT 30 Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly *ro Gly 31 CTT GTG RGR CCT RGC CRG RCC CTG AGC CTG 60 Leu Val Arg Pro Ser G In Thr Leu Ser Leu 61 RCC TGC RCC GTC TCG GGC TTC TCC CTC RCC 90 Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr 91 RGC TRT RGT GTR CRC TGG GTG RGR CRG CCA 120 Ser Tyr Ser Val His Trp Val Arg jin Pro 121 CCT GGA CGA GGT CTR GAG TGG CTT GGA GTA 150 Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val 151 RTR TGG GCT AGT GGA GGC ACH GAT TRT AAT 180 Ile Trp Ala Ser Gly Gly Thr Asp Tyr fisn 181 TCG GCT CTC RTG TCC AGA CTG TCR RTR CTG 210 Ser Rla Leu Met Ser Arg Leu Ser Ile Leu 211 rtrtn GRC RRC RGC RRG RRC CRG GTC RGC CTG 24© Lys fisp fisn Ser Lys Asn Gin Val Ser Leu 241 RGR CTC RGC AGC GTG RCR GCC GCC GRC RCC 270 Leu Ser Ser Vol Thr Rla Rla Asp Thr 271 GCG GTC TRT TRC TGT GCT CGG GAT CCC CCT 30© Rla Ual Tyr Tyr Cys Rla firg Rsp Pro Pro 301 TCT TCC TTA CTR CGG CTT GRC TRC TGG GGA 33® Ser Ser Leu Leu Arg Leu Asp Tyr Trp Gly
    331 CRR GGT RCC ACG GTC RCC GTC TCG RGC 357 Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
    -88CZ 297045 B6
    Obrázek 13 variabilní region humanizovaného lehkého řetězce
    GRT RTC GTG RTG RCC CRG RGC CCA AGC RGC 3Q Asp Ile ual het Thr Gin Ser Pro Ser Ser CTG RGC GCT RGC GTG GGT GRC AGA GTG RCC 6© Leu Ser Rla Ser Ual Gly Rsp Rrg Ual Thr RTC RCC TGT RRG RGC TCT CRG RGT CTG TTR 9© I le Thr Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu RAC RGT GGR RRT CAR RRG RAC TRC TTG GCC 120 Rsn Ser Rsn Gin Lys Rsn Tyr Leu Rla TGG TRT CRG CRG RRR CCC GGT RRG GCT CCR 150 Trp Tyr Gin G In Lys Pro Gly Lys Rla Pro ARG CTG CTG RTC TRC GGG ócA TCG ACT AGG 180 Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Rla Ser Thr Rrg
    GRR TCT GGG GTR CCA GRT RGR TTC AGC GGT 210 Glu Ser Gly Ual Pro Rsp Rrg Phe Ser Gly RGC GGT RGC GGR RCC GRC TTC RCC TTC RCC 24Θ Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr RTC RGC RGC CTG CRG CCR GRG GRC RTC GCC 270 Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Ile Ala RCC TRC TRC TGC CAG ART GTT CRT RGT TTT 3ΘΘ Thr Tyr Tyr Cys Gin Rsn Ual His Ser Phe CCA TTC RCG TTC GGR CRR GGG RCC RRG GTG 330 Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Ual
    GRG RTC RRR 339
    Glu Ue Lys
    Konec dokumentu
CZ0196397A 1994-12-23 1995-12-22 Hlodavcí neutralizacní monoklonální protilátka, zpusob pro její produkci, kompozice s jejím obsahema pouzití, hybridom a jím produkovaná protilátka,fab fragment, komplementaritu urcující region, molekula nukleové kyseliny a její sekvence, plasmid a CZ297045B6 (cs)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US36313194A 1994-12-23 1994-12-23
US08/467,420 US5683892A (en) 1994-12-23 1995-06-06 DNA encoding recombinant IL-5 antagonists useful in treatment of IL-5 mediated disorders
US08/470,110 US5693323A (en) 1994-12-23 1995-06-06 Recombinant IL-5 antagonists useful in treatment of IL-5 mediated disorders
PCT/US1995/017082 WO1996021000A2 (en) 1994-12-23 1995-12-22 Recombinant il-5 antagonists useful in treatment of il-5 mediated disorders

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ196397A3 CZ196397A3 (en) 1997-10-15
CZ297045B6 true CZ297045B6 (cs) 2006-08-16

Family

ID=27408594

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ0196397A CZ297045B6 (cs) 1994-12-23 1995-12-22 Hlodavcí neutralizacní monoklonální protilátka, zpusob pro její produkci, kompozice s jejím obsahema pouzití, hybridom a jím produkovaná protilátka,fab fragment, komplementaritu urcující region, molekula nukleové kyseliny a její sekvence, plasmid a

Country Status (22)

Country Link
US (1) US6129913A (cs)
EP (1) EP0800536B1 (cs)
JP (2) JP2001523083A (cs)
CN (1) CN100391977C (cs)
AT (1) ATE346867T1 (cs)
AU (1) AU708951B2 (cs)
BR (1) BR9510499B1 (cs)
CA (1) CA2208503C (cs)
CZ (1) CZ297045B6 (cs)
DE (1) DE69535319T2 (cs)
DK (1) DK0800536T3 (cs)
ES (1) ES2277336T3 (cs)
FI (1) FI119374B (cs)
HK (1) HK1003651A1 (cs)
HU (1) HU222992B1 (cs)
LU (1) LU92912I2 (cs)
MX (1) MX9704779A (cs)
NL (1) NL300787I2 (cs)
NO (2) NO324181B1 (cs)
NZ (1) NZ301916A (cs)
PL (1) PL194312B1 (cs)
WO (1) WO1996021000A2 (cs)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5783184A (en) * 1994-12-23 1998-07-21 Smithkline Beecham Corporation Method for treatment and diagnosis of IL-5 mediated disorders
US5693323A (en) * 1994-12-23 1997-12-02 Smithkline Beecham Corporation Recombinant IL-5 antagonists useful in treatment of IL-5 mediated disorders
PT1914244E (pt) * 1999-04-09 2013-07-26 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Processo para regular a actividade de moléculas funcionais sob o ponto de vista imunológico
US6946292B2 (en) * 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
ATE435239T1 (de) * 2002-03-29 2009-07-15 Schering Corp Menschliche monoklonale antikörper gegen interleukin-5 sowie diese umfassende verfahren und zusammensetzungen
US7691568B2 (en) 2002-04-09 2010-04-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Antibody composition-containing medicament
EP1682571A4 (en) * 2003-10-27 2006-12-06 Medvet Science Pty Ltd BICOORDIN PATTERN AND METHODS OF USE
ATE541585T1 (de) 2004-10-28 2012-02-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Antikörper gegen il-5-rezeptor zur verwendung in der behandlung von endometriose.
ES2492943T3 (es) 2007-04-30 2014-09-10 Glaxosmithkline Llc Procedimientos de administración de anticuerpos anti-IL5
JP4335286B2 (ja) 2008-02-08 2009-09-30 ファナック株式会社 部品保護機能を備えたロボット制御装置及びロボット制御方法
BRPI0910854A2 (pt) * 2008-03-28 2015-10-06 Glaxosmithkline Llc métodos de tratamento
KR20130028055A (ko) * 2010-01-28 2013-03-18 글락소 그룹 리미티드 Ｃｄ １２７ 결합 단백질
WO2012083370A1 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Cephalon Australia Pty Ltd Modified antibody with improved half-life
BR112018003741A2 (pt) 2015-08-24 2018-09-25 Glaxosmithkline Ip No 2 Ltd composições biofarmacêuticas
WO2017173091A1 (en) * 2016-03-30 2017-10-05 Musc Foundation For Research Development Methods for treatment and diagnosis of cancer by targeting glycoprotein a repetitions predominant (garp) and for providing effective immunotherapy alone or in combination
CA3048186A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 Cephalon, Inc. Anti-il-5 antibodies
WO2018215964A1 (en) 2017-05-26 2018-11-29 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Biopharmaceutical compositions and related methods
JP7307720B2 (ja) 2017-09-29 2023-07-12 江蘇恒瑞医薬股▲ふん▼有限公司 Ｉｌ－５抗体、その抗原結合フラグメント、およびそれらの医薬適用
CN109942706A (zh) * 2017-12-21 2019-06-28 三生国健药业（上海）股份有限公司 结合人il-5的单克隆抗体、其制备方法和用途
WO2020119728A1 (zh) * 2018-12-12 2020-06-18 尚华科创投资管理（江苏）有限公司 抗人白细胞介素5(il-5)单克隆抗体及其应用
CN113507938B (zh) * 2019-03-29 2024-04-16 广东恒瑞医药有限公司 包含抗il-5抗体的药物组合物及其用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0367596A1 (en) * 1988-11-03 1990-05-09 Schering Corporation Antagonist to interleukin-5 for preventing or reducing eosinophilia
WO1993016184A1 (en) * 1992-02-06 1993-08-19 Schering Corporation Design, cloning and expression of humanized monoclonal antibodies against human interleukin-5

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8800397D0 (en) * 1988-01-08 1988-02-10 Sandoz Ltd Improvements in/relating to organic compounds
US5096704A (en) * 1988-11-03 1992-03-17 Schering Corporation Method of treating eosinophilia
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
ZA929328B (en) * 1991-12-02 1993-07-20 Fluor Corp Apparatus and method for economic use of excess compressed air when firing low caloric-value gas in a combustion gas turbine.
JPH06141885A (ja) * 1992-11-05 1994-05-24 Chemo Sero Therapeut Res Inst モノクローナル抗体
WO1995014040A1 (en) * 1993-11-19 1995-05-26 Baylor College Of Medicine Monoclonal antibodies specific for human interleukin-5
GB9412230D0 (en) * 1994-06-17 1994-08-10 Celltech Ltd Interleukin-5 specific recombiant antibodies
US5783184A (en) * 1994-12-23 1998-07-21 Smithkline Beecham Corporation Method for treatment and diagnosis of IL-5 mediated disorders
US5693323A (en) * 1994-12-23 1997-12-02 Smithkline Beecham Corporation Recombinant IL-5 antagonists useful in treatment of IL-5 mediated disorders
WO2001012646A1 (en) * 1999-08-19 2001-02-22 Smithkline Beecham Corporation Sialoadhesin factor-1 agonist and antagonist antibodies

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0367596A1 (en) * 1988-11-03 1990-05-09 Schering Corporation Antagonist to interleukin-5 for preventing or reducing eosinophilia
WO1993016184A1 (en) * 1992-02-06 1993-08-19 Schering Corporation Design, cloning and expression of humanized monoclonal antibodies against human interleukin-5

Also Published As

Publication number Publication date
DK0800536T3 (da) 2007-04-02
LU92912I2 (fr) 2016-02-16
NO2015027I1 (no) 2015-12-18
PL194312B1 (pl) 2007-05-31
EP0800536A4 (en) 2004-12-01
FI972703A0 (fi) 1997-06-23
CA2208503A1 (en) 1996-07-11
BR9510499A (pt) 1999-03-30
AU4745096A (en) 1996-07-24
CZ196397A3 (en) 1997-10-15
EP0800536B1 (en) 2006-11-29
HUT78055A (hu) 1999-07-28
CN100391977C (zh) 2008-06-04
ES2277336T3 (es) 2007-07-01
JP2001523083A (ja) 2001-11-20
ATE346867T1 (de) 2006-12-15
EP0800536A2 (en) 1997-10-15
DE69535319D1 (de) 2007-01-11
MX9704779A (es) 1997-09-30
NL300787I1 (cs) 2016-04-05
NO324181B1 (no) 2007-09-03
FI972703A (fi) 1997-08-22
WO1996021000A3 (en) 1996-09-06
DE69535319T2 (de) 2007-07-19
NO972913L (no) 1997-08-19
CA2208503C (en) 2009-12-01
NO2015027I2 (no) 2016-01-04
JP2008029355A (ja) 2008-02-14
US6129913A (en) 2000-10-10
NL300787I2 (cs) 2016-04-05
BR9510499B1 (pt) 2009-05-05
NZ301916A (en) 1999-05-28
AU708951B2 (en) 1999-08-19
FI119374B (fi) 2008-10-31
NO972913D0 (no) 1997-06-20
CN1175263A (zh) 1998-03-04
HU222992B1 (hu) 2004-01-28
PL321088A1 (en) 1997-11-24
WO1996021000A2 (en) 1996-07-11
HK1003651A1 (en) 1998-11-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100511544B1 (ko) Ｉｌ－5 매개된 질환의 치료에 유용한 재조합 ｉｌ－5길항제
FI119374B (fi) Rekombinantti IL-5-antagonisteja, jotka ovat käyttökelpoisia hoidettaessa IL-5:een liittyviä sairauksia
WO1996021000A9 (en) Recombinant il-5 antagonists useful in treatment of il-5 mediated disorders
EP0967994A1 (en) Improved method for treatment and diagnosis of il-5 mediated disorders
JP6513617B2 (ja) 脳疾患を治療するための抗タウｐＳ４２２抗体の使用
DK2426143T3 (en) Process for providing disease-specific binding molecules and targets
KR101551878B1 (ko) 항-ｍｎ 항체 및 그의 사용 방법
JP4432031B2 (ja) インターロイキン１３受容体α１（ＩＬ−１３Ｒα１）に対するモノクローナル抗体
WO1998005787A1 (en) A method for inhibiting immunoglobulin-induced toxicity resulting from the use of immunoglobulins in therapy and in vivo diagnosis
WO1998005787A9 (en) A method for inhibiting immunoglobulin-induced toxicity resulting from the use of immunoglobulins in therapy and in vivo diagnosis
MX2007003856A (es) Metodos y composiciones para mejorar la produccion de proteinas recombinantes.
KR101989551B1 (ko) IL-1β 억제제 조성물 및 이의 용도
JP2022518770A (ja) Ｉｌ－７ｒアルファサブユニットに対する抗体及びその使用
US20220259278A1 (en) Novel fusion protein and use of same
CN114364695A (zh) 特异性识别c5a的抗体及其应用
US20210403534A1 (en) IL1-R1 DERIVED INHIBITOR OF IL-1b AND USE THEREOF
AU775429B2 (en) A method for inhibiting immunoglobulin-induced toxicity resulting from the use of immunoglobulins in therapy and in vivo diagnosis
WO2024026351A2 (en) Cannabinoid type 1 receptor binding proteins and uses thereof
KR20230150319A (ko) iRhom2에 대한 인간화 항체
JP2023552846A (ja) メタニューモウイルスのｆ－タンパク質に結合する抗体およびその使用
WO2005007800A2 (ja) 抗血小板膜糖蛋白質ⅵモノクローナル抗体

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20151222