MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA MEJORAR LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES Referencia Cruzada a Solicitudes Relacionadas Esta solicitud reivindica prioridad para la Solicitud de Patente de E.U. Serie No. 60/616,474, presentada en Octubre 5 de 2004, cuyo contenido completo se incorpora en la presente mediante la referencia. Antecedentes de la Invención Los vectores de expresión para la producción de proteínas recombinantes han existido desde al menos mediados de los 80s. Típicamente, se han empleado por mucho tiempo estrategias basadas en vectores para la expresión de proteínas recombinantes en la investigación básica y para experimentación a pequeña escala cuando no es crítica la absoluta pureza de la preparación de proteína. En contraste, cuando se utilizan proteínas recombinantes para aplicaciones terapéuticas, incluso contaminantes menores, por ejemplo, la presencia de sub-productos mal empalmados o de intrones de lectura traspasada, puede disminuir la actividad y rendimiento de las proteínas terapéuticas resultantes. La administración a pacientes de proteínas terapéuticas que tienen secuencias de proteínas mal empalmadas o de lectura traspasada, puede incrementar la posibilidad de efectos secundarios indeseables. Tales sub-productos son también problemáticos para
la elaboración. La presencia de sub-productos puede comprometer el proceso de purificación debido a que tales sub-productos son típicamente similares a las proteínas deseadas en términos de tamaño, afinidad o bioactividad. Aún adicionalmente, se ha observado que el aumento de la expresión de proteínas utilizando células huésped recombinantes, típicamente da como resultado el incremento en la cantidad de los sub-productos en comparación con el producto deseado, particularmente si las células se cultivan bajo condiciones de cultivo celular menos que óptimas. Tales condiciones sub-óptimas del cultivo celular se presentan frecuentemente en la producción de proteínas a gran escala, por ejemplo, al final de un ciclo del biofermentador o cuando, por otras razones, se deteriora la salud del cultivo a gran escala. En consecuencia, existe la necesidad de métodos para mejorar la producción de proteínas recombinantes, particularmente para la producción a gran escala de proteínas terapéuticas . Sumario de la Invención La presente invención proporciona métodos y composiciones para mejorar la expresión y/o producción de proteínas o péptidos recombinantes. En una modalidad, se proporcionan moléculas de ácido nucleico modificadas para reducir o eliminar los sub-productos mal empalmados y/o de
lectura traspasada de intrón, y/o para mejorar la expresión de la proteína recombinante. En ciertas modalidades, los ácidos nucleicos codifican para anticuerpos recombinantes
(también referidos en la presente como inmunoglobulinas) , o sus fragmentos . La invención incluye además vectores (e.g., vectores de expresión) modificados para reducir o eliminar sub-productos mal empalmados y/o de lectura traspasada de intrón y/o para mejorar la expresión de proteínas recombinantes; células huésped, e.g., células huésped de mamífero, incluyendo tales moléculas de ácido nucleico y vectores; y métodos para el cultivo de tales células para producir las proteínas o péptidos recombinantes, e.g., a gran escala. También se describen composiciones, e.g., composiciones farmacéuticas, de proteínas o péptidos recombinantes, e.g., anticuerpos, sustancialmente libres de sub-productos mal empalmados y/o de lectura traspasada de intrón. Estas composiciones son adecuadas para uso terapéutico, incluyendo, por ejemplo, el tratamiento de trastornos neurodegenerativos y malignos. En particular, la invención proporciona composiciones y métodos para la expresión de un anticuerpo terapéutico para su uso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa. La integridad de tales anticuerpos es especialmente importante de manera que, por ejemplo, la
actividad terapéutica de la molécula por dosis unitaria se mantiene y mejora la purificación. Existe un gran deseo por mejorar la pureza de tales proteínas propuestas para funciones especializadas, para el suministro y uso en ciertas indicaciones biológicas, por ejemplo, para el tratamiento de condiciones neurodegenerativas, cuando los polipéptidos terapéuticos atraviesan la barrera sanguínea cerebral (BBB) y se unen a un antígeno objetivo en el cerebro. Un anticuerpo ejemplar producido de acuerdo con la invención es un anticuerpo producido a alta pureza para unirse a un objetivo de enfermedad neurodegenerativa, por ejemplo, la proteína amiloide de la enfermedad de Alzheimer, i.e., el péptido beta-amiloide (Aß) . En consecuencia, en un aspecto, la invención incorpora una molécula de ácido nucleico (e.g., una molécula de ácido nucleico modificada o recombinante) que incluye una secuencia de nucleótidos que tiene una o más secuencias de intrones y exones, en donde al menos una secuencia de intrones se ha modificado en comparación con la secuencia de origen natural para mejorar la expresión de las proteínas y/o reducir o eliminar el (los) sub-producto (s) mal empalmado (s) o de lectura traspasada de intrón (IRT) . En una modalidad, la molécula de ácido nucleico dirige la expresión aumentada y/o reduce o elimina el (los) sub-producto (s) mal empalmado (s) o de lectura traspasada de intrón (IRT) de una
proteína o péptido deseado, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento del mismo (e.g., una cadena pesada de inmunoglobulina) en relación con una secuencia de origen natural (e.g., una secuencia genómica). La proteína o péptido puede ser de origen de mamífero, e.g., humano o murino, típicamente, de origen humano. Se entiende que la molécula de ácido nucleico descrita en la presente se refiere a una forma modificada de la secuencia de origen natural . En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico se aisla o se purifica. En otras modalidades, es una molécula recombinante . En una modalidad, la molécula de ácido nucleico tiene al menos uno, dos, tres intrones o hasta casi un intrón suprimido, en comparación con la secuencia de origen natural (e.g., la secuencia genómica) . Por ejemplo, un intrón que facilita la lectura traspasada de intrón (IRT) puede suprimirse de la secuencia de origen natural . En otras modalidades, la molécula de ácido nucleico se modifica mediante uno o más de: el re-ordenamiento de la configuración de intrón/exón (e.g., el orden 5' a 3' de intrón/exón) ,- la supresión de una porción de uno o más intrones; o el reemplazo de un intrón o una porción del mismo con una secuencia heteróloga de intrones, de manera que se presente el aumento en la expresión de proteínas y/o la reducción o eliminación de (los) sub-producto (s) mal empalmado (s) o de
lectura traspasada de intrón (IRT) . En una modalidad relacionada, la molécula de ácido nucleico incluye una secuencia de nucleótidos (e.g., una secuencia genómica humana) que codifica una cadena pesada de anticuerpo o un fragmento de la misma. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos puede incluir una o más secuencias de nucleótidos (e.g., exones) que codifican para una región variable de cadena pesada, una región de articulación, y una primera, segunda y tercera regiones constantes (e.g., CH1, C2, CH3) de un subtipo de inmunoglobulina, e.g., un subtipo G de inmunoglobulina (e.g. un subtipo de anticuerpo IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4) . Típicamente, el subtipo de inmunoglobulina es de origen mamífero, e.g., murino o humano. En una modalidad se selecciona una IgGl o IgG4 humana o una versión mutada de la misma. Por ejemplo, la región constante de una inmunoglobulina puede mutarse para dar como resultado uno o más de: aumento en la estabilidad, reducción de la función efectora o reducción en la fijación del complemento. En una modalidad la IgG4 humana se muta para aumentar la estabilidad, e.g., teniendo un reemplazo en el residuo 241 de serina a prolina para aumentar la estabilidad de la región de articulación. En otras modalidades, la región constante se muta para reducir la glicosilación. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico se modifica para suprimir al menos un intrón que facilita la
lectura traspasada de intrón de la secuencia. Por ejemplo, puede suprimirse un intrón entre CH2 y CH3 de la región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina. Ejemplos de otros intrones de inmunoglobulina de cadena pesada que pueden suprimirse individualmente o en combinación, incluyen un intrón entre la región variable de cadena pesada y CH1, un intrón entre CH1 y la región de articulación, y un intrón entre la región de articulación y CH2 , de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina. Puede suprimirse cualquier combinación de los intrones precedentes, incluyendo una combinación de dos, tres intrones o hasta solo un intrón de los intrones antes mencionados. En algunas modalidades,, se suprimen tres intrones de la región constante de cadena pesada, por ejemplo el intrón entre CH1 y la región de articulación, el intrón entre la región de articulación y CH2 , y el intrón entre CH2 y CH3. También se encuentran dentro del alcance de la presente invención las siguientes combinaciones ejemplares de supresiones de intrón de una inmunoglobulina de cadena pesada: un intrón entre C1 y la región de articulación, y un intrón entre CH2 y CH3 ; un intrón entre CH1 y la región de articulación y un intrón entre la región de articulación y CH2 ; un intrón entre la región de articulación y CH2 y un intrón entre CH2 y CH3 de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina. En algunas modalidades, la molécula de ácido
nucleico incluye una secuencia de nucleótidos representada por la fórmula: VH- Int1-CH1- Int2 -Articulación-Int3 -CH2 - Int4 -CH3 , en donde VH es una secuencia de nucleótidos que codifica para una región variable de cadena pesada; CH1, CH2 y CH3 son secuencias de nucleótidos que codifican para la región constante de cadena pesada correspondiente, e.g., una forma de origen natural o mutada de IgGl humana o de gen de cadena pesada IgG4 ; Articulación es una secuencia de nucleótidos que codifica para una región de articulación de una región constante de cadena pesada, e.g., una forma de origen natural o mutada de IgGl humana o de gen de cadena pesada IgG4 ; y Intl, Int2, Int3 e Int4, son intrones de la secuencia genómica de cadena pesada. En una modalidad, se suprime el intrón entre CH2 y CH3 , representado en la presente como Int4. En otras modalidades, se suprimen uno, dos o típicamente tres de los intrones entre CH1 y la región de articulación, entre la región de articulación y CH2 , y/o entre CH2 y CH3 , representados en la presente como Int2, Int3 e Int4. Se muestran representaciones esquemáticas adicionales de las disposiciones de intrón/exón de la secuencia genómica de cadena pesada en las Figuras 1, 5 y 7. Típicamente, al menos un intrón se encuentra presente en la molécula de ácido nucleico, por ejemplo, el
intrón entre la región variable de cadena pesada y CH1, representado en la presente como Intl. Ejemplos de otros intrones de inmunoglobulina de cadena pesada que pueden encontrarse presentes individualmente o en combinación incluyen un intrón entre CH1 y la región de articulación; un intrón entre la región de articulación y CH2; y un intrón entre CH2 y CH3 de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina. Frecuentemente, es deseable incluir al menos un intrón en la molécula de ácido nucleico modificada. Sin vincularse a alguna teoría, se cree que los intrones influyen en un número de eventos en el proceso de producción de proteínas, incluyendo proporción de transcripción, poliadenilación, exportación de ARNm, eficiencia translacional, y decaimiento del ARNm . En una modalidad, la molécula de ácido nucleico incluye una secuencia de nucleótidos representada por la fórmula : VH-Intl-CH1-Int2-Articulación-Int3-CH2-CH3, en donde VH es una secuencia de nucleótidos que codifica para una región variable de cadena pesada; CH1, CH2 y CH3 son secuencias de nucleótidos que codifican para la región constante de cadena pesada correspondiente, e.g., una forma de origen natural o mutada de IgGl humana o de gen de cadena pesada IgG4 ; Articulación es una secuencia de nucleótidos que
codifica para una región de articulación de una región constante de cadena pesada, e.g., una forma de origen natural o mutada de IgGl humana o de gen de cadena pesada IgG ; y Intl, Int2, e Int3, son intrones de la secuencia genómica de cadena pesada. En una modalidad, la secuencia de nucleótidos consiste esencialmente de los constituyentes ilustrados anteriormente, e.g., sin una secuencia de intervención que altere la estructura o función. En otras modalidades la molécula de ácido nucleico incluye una secuencia de nucleótidos representada por la fórmula: v?-Intl-CHl-Articulación-CH2-CH3, en donde VH es una secuencia de nucleótidos que codifica para una región variable de cadena pesada; CH1, CH2 y CH3 son secuencias de nucleótidos que codifican para la región constante de cadena pesada correspondiente, e.g., una forma de origen natural o mutada de IgGl humana o de gen de cadena pesada IgG4 ; Articulación es una secuencia de nucleótidos que codifica para una región de articulación de una región constante de cadena pesada, e.g., una forma de origen natural o mutada de IgGl humana o de gen de cadena pesada IgG4 ; y Intl, es un intrón de la secuencia genómica de cadena pesada. En una modalidad, la secuencia de nucleótidos consiste esencialmente de los constituyentes ilustrados
anteriormente, e.g., sin una secuencia de intervención que altere la estructura o función. El nucleótido genómico y las secuencias de aminoácidos correspondientes para IgGl humana se muestran en la Figura 8 (SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente) . Los exones que codifican para CH1 , la región de articulación, CH2 y CH3 se encuentran ubicados aproximadamente en los nucleótidos 231 a 524, 916 a 960, 1079 a 1408, y 1506 a 1829 de la Figura 8 (SEQ ID NO: 1), respectivamente. Intl, Int2 , Int3 e Int4 corresponden a intrones de la secuencia genómica de cadena pesada de IgGl humana ubicada aproximadamente en los nucleótidos 1 a 230, aproximadamente en los nucleótidos 525 a 915, aproximadamente en los nucleótidos 961 a 1078 y aproximadamente en los nucleótidos 1409 a 1505, de la Figura 8 (SEQ ID NO 1), respectivamente. El nucleótido genómico y las secuencias de aminoácidos correspondientes para IgG4 humana mutada se muestran en la Figura 9 (SEQ ID NO: 3 y 4, respectivamente) . Los exones que codifican para CH1, la región de articulación, CH2 y CH3 se encuentran ubicados aproximadamente en los nucleótidos 231 a 524, 916 a 952, 1071 a 1400, y 1498 a 1820 de la Figura 9 (SEQ ID NO: 3), respectivamente. Intl, Int2 , Int3 e Int4 corresponden a intrones de la secuencia genómica de cadena pesada de IgG4 humana ubicada aproximadamente en los nucleótidos 1 a 230, aproximadamente en los nucleótidos
525 a 916, aproximadamente en los nucleótidos 953 a 1070 y aproximadamente en los nucleótidos 1401 a 1497, de la Figura 9 (SEQ ID NO 4) , respectivamente. Ejemplos de las moléculas de ácido nucleico modificadas de la presente invención incluyen una secuencia de región constante de cadena pesada genómica humana que tiene una supresión en el intrón entre CH2 y CH3 de IgGl humana, correspondiente a aproximadamente los nucleótidos 1409 a 1505 de la Figura 8 (SEQ ID NO: 1) , o de IgG4 humana mutada correspondiente a aproximadamente los nucleótidos 1401 a 1497 de la Figura 9 (SEQ ID NO: 3) . Ejemplos de otros intrones de inmunoglobulina de cadena pesada que pueden suprimirse individualmente o en combinación incluyen un intrón entre la región variable de cadena pesada y CH1 , de IgGl humana, correspondiente a aproximadamente los nucleótidos 1 a 230 de la Figura 8 (SEQ ID NO: 1) , o de IgG4 humana mutada correspondiente a aproximadamente los nucleótidos 1 a 230 de la Figura 9 (SEQ ID NO: 3) ; un intrón entre CH1 y la región de articulación de la IgGl humana correspondiente a aproximadamente los nucleótidos 525 a 915 de la Figura 8 (SEQ ID NO: 1) , o de IgG4 humana mutada correspondiente a aproximadamente los nucleótidos 525 a 916 de la Figura 9 (SEQ ID NO: 3) ; y un intrón entre la región de articulación y CH2 de la IgGl humana correspondiente a aproximadamente los nucleótidos 961 a 1078 de la Figura 8
(SEQ ID NO: 1) , o de IgG4 humana mutada correspondiente a aproximadamente los nucleótidos 953 a 1070 de la Figura 9 (SEQ ID NO: 3) . Puede suprimirse cualquier combinación de los intrones precedentes puede suprimirse, incluyendo una combinación de dos, tres, cuatro intrones o hasta un solo intrón, de los intrones antes mencionados. En algunas modalidades, se suprimen tres intrones de la región constante de cadena pesada, por ejemplo, el intrón entre CH1 y la región de articulación, entre la región de articulación y CH2 , y entre CH2 y CH3. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico incluye una o más de las secuencias de nucleótidos exónicas, y una o más (pero no todas) secuencias de nucleótidos intrónicas, para la IgGl o IgG4 humana descrita en la presente, o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma. En una modalidad relacionada, la molécula de ácido nucleico tiene una supresión en una o más
(pero no todas) secuencias de nucleótido intrónicas, de la
IgGl o IgG4 humana descrita en la presente, o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico modificada incluye la secuencia de nucleótidos que codifica para la IgGl humana mostrada como Figura 10 (SEQ ID NO: 5) o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma (e.g., una secuencia al menos 85%, 90%, 95% o 99% idéntica a la SEQ ID NO: 5, o que tiene, uno, cinco, diez, cincuenta o más cambios
de nucleótidos en comparación con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5) . En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico modificada incluye la secuencia de nucleótidos de la IgG4 humana modificada mostrada como Figura 11 (SEQ ID NO: 6) o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma (e.g., una secuencia al menos 85%, 90%, 95% o 99% idéntica a la SEQ ID NO: 6, o que tiene, uno, cinco, diez, cincuenta o más cambios de nucleótidos en comparación con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 6) . La molécula de ácido nucleico modificada puede incluir una secuencia de nucleótidos que codifica para un anticuerpo de cadena ligera y pesada o secuencia de inmunoglobulina. Tales secuencias pueden encontrarse presentes en la misma molécula de ácido nucleico (e.g., el mismo vector de expresión) o alternativamente, pueden expresarse de moléculas de ácido nucleico separadas (e.g., vectores de expresión separados). Típicamente, el anticuerpo o inmunoglobulinas codificados o sus fragmentos pueden incluir al menos una y preferentemente dos cadenas pesadas de longitud total y al menos una y preferentemente dos cadenas ligeras. Alternativamente, las inmunoglobulinas codificadas o sus fragmentos pueden incluir solo un fragmento de unión de antígeno (e.g., un fragmento Fab, F(ab')2, Fv o Fv monocatenario) . El anticuerpo o su fragmento puede ser un
anticuerpo monoclonal o de especificidad única. El anticuerpo o su fragmento también puede ser un anticuerpo humano, humanizado, quimérico, injertado de CDR, o generado in vi tro . Aún en otras modalidades, el anticuerpo tiene una región constante de cadena pesada seleccionada de e.g., IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2 , IgD e IgE; más particularmente, seleccionada de e.g., IgGl , IgG2, IgG3 e IgG4. En otra modalidad, el anticuerpo tiene una cadena ligera seleccionada de e.g., kappa o lambda. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico incluye una región variable, por ejemplo, una región variable humanizada, quimérica, injertada de CDR o generada in vi tro . Típicamente, la región variable se une específicamente a un antígeno predeterminado, e.g., un antígeno asociado con un trastorno, e.g., un trastorno neurodegenerativo o maligno. En una modalidad, el trastorno es un trastorno neurodegenerativo y el anticuerpo se une a una proteína amiloide, por ejemplo, un péptido Aß (e.g., un péptido Aß humano) . Por ejemplo, el anticuerpo puede ser un anticuerpo humanizado contra un péptido Ajß que tiene regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera conteniendo una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de un anticuerpo murino, e.g., el anticuerpo 3D6 de ratón anti-A3, o el anticuerpo 12A11 de ratón anti-A/3, o el anticuerpo 10D5 de ratón anti-A/3, o el anticuerpo 12B4 de ratón anti-A/3. la
región variable del anticuerpo humanizado típicamente incluye una región de estructura humana o sustancialmente humana. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico incluye las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo de péptido anti -A3 humanizado. En otro aspecto, la invención presenta un vector
(e.g., un vector de expresión) que incluye una o más de las moléculas de ácido nucleico modificadas anteriores. El vector puede incluir adicionalmente una secuencia de nucleótidos que mejora una o más de: replicación, selección, transcripción de ARNm, estabilidad de ARNm, expresión de proteínas o secreción de proteínas en una célula huésped. Por ejemplo, el vector puede incluir las secuencias de nucleótidos responsables de la replicación o la expresión del mejorador, elementos promotores del mejorador, secuencias de nucleótidos que codifican para una secuencia de guía, un gen que codifica para un marcador seleccionable (e.g., DHFR), una secuencia del sitio de entrada interno ribosomal (IRES) , y secuencias de poliadenilación) . En otro aspecto, la invención proporciona una célula, por ejemplo, una célula huésped eucariótica, e.g., una célula huésped de mamífero (e.g., una célula de ovario de hámster Chino (CHO) ) , incluyendo una de las moléculas de ácido nucleico y/o vectores anteriores, e.g., vectores de expresión. La célula puede transfectarse de manera
transitoria o estable con las secuencias de ácido nucleico de la invención. En otro aspecto, la invención proporciona un método para mejorar la expresión de proteínas o péptidos recombinantes, e.g., anticuerpos, o para expresar proteínas o péptidos recombinantes, e.g., anticuerpos que tienen niveles reducidos de (e.g., sustancialmente libres de) productos mal empalmados y/o de lectura traspasada de intrón, en comparación con una referencia, e.g., una secuencia genómica de origen natural. El método incluye la introducción de una molécula de ácido nucleico como se describe en la presente, en una célula huésped, e.g., una célula huésped de mamífero
(e.g., una célula CHO); el cultivo de dicha célula huésped bajo condiciones que permitan la expresión de la proteína o péptido recombinante para producir un cultivo de células huésped; y opcionalmente, la obtención, e.g., purificación, de la proteína o péptido recombinante, del cultivo de células huésped (e.g., sobrenadantes de célula huésped). El método puede incluir además las etapas de identificar (e.g., detectar y/o determinar el nivel de ) IRT o un producto de IRT, en una muestra de ácido nucleico, e.g., una muestra de ARNm de la célula huésped, poniendo en contacto dicha muestra con sondas de ácido nucleico complementarias a una secuencia de intrón y una de exón adyacente, o alternativamente, complementarias a secuencias
de exón adyacentes, bajo condiciones que permitan la hibridación de la muestra de ácido nucleico y las sondas; detectar el complejo resultante, e.g., mediante amplificación PCR de las secuencias de sonda. La detección de un complejo, e.g., un producto amplificado con PCR, en la muestra que contiene la sonda de ácido nucleico complementaria a la secuencia de intrón, es indicativa de la ocurrencia de IRT o del producto de IRT. El nivel de un producto de IRT puede cuantificarse como se describe, e.g., en el Ejemplo 1. En otro aspecto, se proporciona un método para la producción de un anticuerpo o fragmento del mismo que tiene un sub-producto de cadena pesada de lectura traspasada de intrón (IRT) reducido (e.g., sustancialmente desprovisto de), en comparación con una referencia estándar, e.g., una secuencia genómica de origen natural. El método incluye cultivar una célula, e.g., una célula de mamífero (e.g., una célula CHO) conteniendo una molécula de ácido nucleico como se describe en la presente, y, opcionalmente, un ácido nucleico que codifica para una cadena ligera de anticuerpo, bajo condiciones tales que las cadenas pesadas y ligeras se expresen y opcionalmente, se asocien operativamente. El anticuerpo o fragmento del mismo, se purifica, opcionalmente, del cultivo celular. Típicamente, el anticuerpo o su fragmento, tiene sub-productos mal empalmados o de lectura traspasada de intrón (IRT) reducidos.
El método puede incluir además las etapas de detección y/o determinación del nivel de IRT o producto de IRT, en una muestra, e.g., una muestra de ARNm de la célula huésped; poniendo en contacto dicha muestra con sondas de ácido nucleico complementarias a una secuencia de intrón y una de exón adyacente, o alternativamente, complementarias a secuencias de exón adyacentes, bajo condiciones que permitan la hibridación de la muestra de ácido nucleico y las sondas; detección del complejo resultante, e.g., mediante amplificación PCR de las secuencias de sonda. La detección de un complejo, e.g., un producto amplificado con PCR, en la muestra que contiene la sonda de ácido nucleico complementaria a la secuencia de intrón, es indicativa de la ocurrencia de IRT o del producto de IRT. El nivel de un producto de IRT puede cuantificarse como se describe, e.g., en el Ejemplo 1. En otro aspecto, la invención proporciona un método para la reducción de un sub-producto de cadena pesada de anticuerpo de lectura traspasada de intrón reducida expresado de una secuencia de cadena pesada genómica, suprimiendo al menos un intrón de dicha secuencia, en donde dicho intrón facilita la IRT. En otro aspecto, la invención presenta un método para la identificación (e.g., detección y/o determinación del nivel de) IRT o un producto de IRT, en una muestra, e.g., una
muestra de ácido nucleico. El método incluye: la obtención de una muestra de ácido nucleico, e.g., una muestra de ARNm de una célula, e.g., una célula recombinante (e.g., una célula huésped como se describe en la presente) ; poner en contacto dicha muestra de ácido nucleico con sondas de ácido nucleico complementarias a una secuencia de intrón y una de exón adyacente, o alternativamente, complementarias a secuencias de exón adyacentes, bajo condiciones que permitan la hibridación de la muestra de ácido nucleico y las sondas; detectar el complejo resultante, e.g., mediante amplificación PCR de las secuencias de sonda. La detección de un complejo, e.g., un producto amplificado con PCR, en la muestra que contiene la sonda de ácido nucleico complementaria a la secuencia de intrón, es indicativa de la ocurrencia de IRT o del producto de IRT. El nivel de un producto de IRT puede cuantificarse como se describe, e.g., en el Ejemplo 1. En otro aspecto, la invención presenta un anticuerpo (e.g., un anticuerpo recombinante) o fragmento del mismo, que tiene productos mal empalmados y/o de lectura traspasada de intrón reducidos (e.g., sustancialmente libres de), en comparación con una referencia, e.g., una secuencia genómica de origen natural, producida de acuerdo con los métodos descritos en la presente. En una modalidad, el anticuerpo o su fragmento es un anticuerpo quimérico, humanizado, de injerto de CDR o generado in vi tro .
Típicamente el anticuerpo o su fragmento, tiene una región variable que se une específicamente a un antígeno predeterminado, e.g., un antígeno asociado con un trastorno, e.g., un trastorno neurodegenerativo. En otro aspecto, la invención proporciona una composición, e.g., una composición farmacéutica, que contiene proteínas o péptidos recombinantes, e.g., anticuerpos, que tienen productos mal empalmados y/o de lectura traspasada de intrón reducidos (e.g., sustancialmente libres de), en comparación con una referencia, e.g., una secuencia genómica de origen natural y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones son adecuadas para uso terapéutico, incluyendo, por ejemplo, el tratamiento de trastornos neurodegenerativos . Otras características y ventajas de la invención serán aparentes a partir de la siguiente descripción detallada y reivindicación. Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 ilustra el pre-ARNm esperado transcrito del vector de expresión que contiene el gen 3D6 IgG (parte superior) así como el ARNm correctamente empalmado (parte media) y el ARNm de lectura traspasada de intrón (parte inferior) . La Figura 2 muestra la secuencia de ácido nucleico que extiende el intrón entre las regiones constantes CH2 y
CH3 (referido como el cuarto intrón) del vector de expresión de cadena pesada 3D6 indicando las uniones de empalme 5' y 3'
(SEQ ID NO: 7. También se muestra la secuencia de aminoácidos parcial predicha de los polipéptidos derivados del ARNm correctamente (SEQ ID NO: 8) e incorrectamente (SEQ
ID NO: 9) empalmado. Las uniones de empalme de ARN se indican mediante una línea sólida doble. La Figura 3 es una representación esquemática de las sondas de reacción cuantitativa de cadena de polimerasa (Q-PCR) utilizadas para evaluar los niveles total de la transcripción del gen de cadena pesada 3D6 (niveles de CH2 conteniendo la transcripción ARNm) y los niveles de la transcripción de lectura del cuarto intrón. La Figura 4 es una barra de gráfica que demuestra la acumulación incrementada de transcripciones que contienen el intrón cuatro en respuesta al tiempo en cultivo y a la inducción de la expresión de proteína. La Figura 5 proporciona dibujos de la disposición genómica de intrones y exones 3D6 y la disposición modificada utilizada en un vector de expresión desarrollado para resolver la transcripción de lectura traspasada de intrón. La Figura 6 muestra cromatogramas de la cromatografía líquida en fase de reversa de alto rendimiento
(HPLC) que demuestran la carencia de sub-productos de cadena pesada de lectura traspasada de intrón en una línea celular
transformada con vectores de expresión modificados. La Figura 7 ilustra la disposición de intrones y exones en una estructura genómica de cadena pesada, una estructura, la estructura con las últimas tres secuencias intrónicas suprimidas y la estructura de ADNc que no contiene intrones . La Figura 8 muestra los nucleótidos genómicos y las secuencias de aminoácidos correspondientes para la IgGl se muestran en la SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente. Los exones que codifican para CH1 , la región de articulación, CH2 y CH 3 se ubican en aproximadamente los nucleótidos 231 a 524, 916 a 960, 1079 a 1408, y 1506 a 1829, respectivamente (SEQ ID NO: 1) . Los Intl, Int2, Int3 e Int4 corresponden a intrones de la secuencia genómica de cadena pesada de IgGl humana ubicada aproximadamente en los nucleótidos 1 a 230, aproximadamente en los nucleótidos 525 a 915, aproximadamente en los nucleótidos 961 a 1078 y aproximadamente en los nucleótidos 1409 a 1505, respectivamente (SEQ ID NO 1). La Figura 9 muestra el nucleótido genómico y las secuencias de aminoácidos correspondientes a IgG4 humana se muestran en la SEQ ID NO: 3 y 4, respectivamente. Los exones que codifican para CH1, la región de articulación, CH2 y CH3 se encuentran ubicados aproximadamente en los nucleótidos 231 a 524, 916 a 952, 1071 a 1400, y 1498 a 1820, respectivamente (SEQ ID NO: 3) . Intl, Int2, Int3 e Int4 corresponden a
intrones de la secuencia genómica de cadena pesada de IgG4 humana ubicada aproximadamente en los nucleótidos 1 a 230, aproximadamente en los nucleótidos 525 a 916, aproximadamente en los nucleótidos 953 a 1070 y aproximadamente en los nucleótidos 1401 a 1497, respectivamente (SEQ ID NO 4) . La Figura 10 muestra la secuencia de nucleótidos genómicos de IgGl humana (SEQ ID NO: 5) que tiene suprimido el intrón entre CH2 y CH3 de la región constante. La Figura 11 muestra la secuencia de nucleótidos genómicos de IgG4 humana modificada (SEQ ID NO: 6) que tiene las siguientes supresiones de intrón: el intrón entre CH1 y la articulación, el intrón entre la articulación y CH2 y el intrón entre CH2 y CH3. Las Figuras 12 a detallan las secuencias de aminoácidos de cadena pesada para varios anticuerpos 3D6, 10D5, 12B4 y 266 adicionales. Las Figuras a detallan las secuencias de aminoácidos de cadena pesada para varios anticuerpos 3D6, 10D5, 12B4 y 266 adicionales. Descripción Detallada de la Invención Puede realizarse una cantidad de procedimientos en el diseño y construcción de vectores de expresión, y el proceso requiere típicamente experimentación sustancial de prueba y error antes de producir niveles razonables de una proteína. Una consideración significativa en el proceso del
diseño concierne al uso de secuencias de intrón en la construcción del vector. En un procedimiento, puede utilizarse una secuencia de gen completa como se origina naturalmente, conteniendo el complemento completo de las secuencias tanto intrónicas como exónicas. En tal caso, se espera que la maquinaria post-transcripcional de empalme dentro de la célula separe las secuencias intrónicas para producir el ARNm maduro conteniendo solo las secuencias exónicas del gen. Un segundo procedimiento es el uso solo de la secuencia correspondiente al AD?c del gen. en este caso, se predice que no se presentarán eventos de empalme y que la secuencia de pre-AR?m será sustancialmente la misma que la secuencia de AR?m en el contenido de codificación de proteína. Aún en un tercer caso, la estructura del vector implica la selección y colocación de intrones no normalmente asociados con la secuencia de gen original . El efecto de las secuencias intrónicas en la expresión de genes dentro del contexto de un vector se comprende de manera incompleta. Se ha reportado que los intrones pueden efectuar una cantidad de eventos en el proceso de la producción de proteínas incluyendo la proporción de transcripción, la poliadenilación, la exportación del AR?m, la eficiencia translacional, y el decaimiento del AR?m (?ott et al., (2003) R?A 9:607-617). Dentro del contexto de la expresión del AR?m, no ha existido
una línea brillante de predicción con referencia al resultado de un intrón en la producción de proteína a partir de un vector. Por ejemplo, se ha reportado que la inclusión de varias secuencias intrónicas puede ocasionar grandes incrementos en la expresión, no tener ningún efecto, o reducir la expresión del ARNm (Berg et al., (1988) Mol. Cell Biol., 8:4395-4405; Bourdon et al., (2001) EMBO Rep., 2:394-398) . Dado que la mayoría de los genes eucarióticos mayores contienen intrones, el desarrollo de un sistema que pueda utilizarse para expresar de manera predecible los genes que contienen intrones a altos niveles y con cercana fidelidad a las secuencias exónicas del gen en ausencia de sub-productos de lectura no deseados, es obviamente una ayuda para el desarrollo predecible de sistemas de expresión de proteína. Aunque la falta de predicción asociada con las secuencias intrónicas posee un diseño de vector de expresión de obstaculizado a confiable, puede observarse un significativo beneficio en el diseño cuando la proteína de interés tiene una forma modular dócil a las técnicas de ingeniería genética. Los anticuerpos proporcionan un ejemplo tal en donde la inclusión de secuencias intrónicas facilita el diseño del vector de expresión. Se definen a continuación ciertos términos utilizados en la especificación y reivindicaciones. Como se utiliza en la presente, el término "intrón"
incluye un segmento de ADN transcrito, pero removido de la transcripción de ARN empalmando entre sí las secuencias
(exones) en cada lado de la misma. Los intrones se consideran secuencias de intervención dentro de la región de codificación de proteínas de un gen y generalmente no contienen información representada en la proteína producida del gen. El término "exón" incluye cualquier segmento de un gen que contiene secuencias de intervención, representado en el producto de ARN maduro. Los exones comprenden la información dentro de un gen que se traduce en proteínas. El término "pre-ARNm" incluye el producto inicial de ARN que resulta de la transcripción de un gen mediante polimerasa ARN. El ARN designado como pre-AR?m contiene secuencias tanto intrónicas como exónicas y, en consecuencia, no se ha procesado mediante la maquinaria de empalme de la célula. El término "AR?m" incluye una transcripción de AR? que se ha procesado para remover los intrones y que es capaz de traducirse en un polipéptido. El término "empalme" incluye un evento celular que se presenta en los núcleos de células eucarióticas en donde los intrones se remueven de la especie pre-AR?m.
Generalmente, el proceso requiere la formación de un complejo un tanto empalmado en el cual un sitio donante de empalme 5'
se aproxima con un sitio receptor de empalme 3' y la secuencia intrónica de intervención se remueve de la transcripción . El término "vector" incluye una estructura de ácido nucleico que comprende frecuentemente un gen o genes de interés y que comprende además un mínimo de elementos requeridos para que el ácido nucleico se replique y/o se transcriba en una célula huésped. Tales estructuras pueden existir como elementos extracromosomales o pueden integrarse en el genoma de una célula huésped. La frase "lectura traspasada de intrón" ("IRT") denota el proceso mediante el cual el empalme aberrante de una transcripción de pre-ARNm produce una proteína o péptido de tamaño alternativo o de constitución de aminoácido. Pueden presentarse resultados variables referentes a la proteína final producida de esta transcripción mal empalmada. Por ejemplo, puede presentarse una proteína más grande que la predicha o una proteína con un codón de detención incorrecto, en cuyo caso la proteína puede ser más larga o más corta que la predicha, respectivamente. Además, la proteína también puede tener residuos incorrectos o adicionales facilitando la modificación de la proteína para glicosilación, miristolización, fosforilación, ubicuitinación u otras modificaciones post-translacionales . El término "sub-producto de lectura traspasada de
intrón" se refiere a proteínas o péptidos que se traducen del ARNm empalmado de manera aberrante dando como resultado una lectura traspasada de intrón, e.g., proteínas de tamaño no predicho o de constitución de aminoácido. Los sub-productos de lectura traspasada de intrón pueden ser más cortos o más largos que los polipéptidos predichos por la secuencia de aminoácidos conocida por los genes y/o predichos por el ADNc del gen. Los sub-productos de lectura traspasada de intrón también pueden tener pesos moleculares aparentes que difieren del peso molecular aceptado de proteínas que surgen del ARNm correctamente empalmado del gen. Además, el término "subproductos de lectura traspasada de intrón" incluye proteínas que se originan de eventos de procesamiento proteolítico no normalmente asociados con la proteína de interés, surgiendo dicho procesamiento proteolítico potencialmente de productos de proteína empalmados en la estructura debido a la lectura de una unión de intron-exón. El término "sub-producto de cadena pesada" se refiere a polipéptidos que se traducen del AR?m de cadena pesada de inmunoglobulina empalmado de manera aberrante dando como resultado la lectura traspasada de intrón, e.g., proteína de cadena pesada de un tamaño no predicho o constitución de aminoácido. Los sub-productos de cadena pesada pueden ser más cortos o más largos que el polipéptido predicho por la secuencia de aminoácido conocida del gen de
inmunoglobulina y/o predicho por el ADNc del gen. los subproductos de cadena pesada también pueden tener pesos moleculares aparentes que difieren del peso molecular aceptado de las proteínas que surgen del ARNm correctamente empalmado del gen de cadena pesada. Además el término "subproductos de cadena pesada" incluye polipéptidos que se originan de eventos proteolíticos de procesamiento no normalmente asociados con la proteína. La frase "secuencia de origen natural" o "secuencia genómica de origen natural" se refiere a la organización intrónica y exónica de un gen encontrado en su estado natural o nativo. La secuencia de origen natural puede encontrarse, e.g., en su ubicación cromosomal natural o clonada en un vector, siempre que se retenga la organización intrónica y exónica de la secuencia. El término "inmunoglobulina" o "anticuerpo" (utilizados de manera intercambiable en la presente) se refiere a una proteína que tiene una estructura de cadena de cuatro polipéptidos que consiste de dos cadenas pesadas y dos ligeras, encontrándose estabilizadas dichas cadenas, por ejemplo, mediante uniones disulfuro intercatenarias, en donde la inmunoglobulina o anticuerpo tiene la capacidad de unirse selectivamente o específicamente a un antígeno. El término inmunoglobulina Aß o anticuerpo A/3 se refiere a un anticuerpo que se une selectivamente o
específicamente a un péptido A/3. El término "inmunoglobulina monocatenaria" o "anticuerpo monocatenario" (utilizado intercambiablemente en la presente) se refiere a una proteína que tiene una estructura de cadena de dos polipéptidos que consiste de una cadena pesada y una ligera, encontrándose dichas cadenas estabilizadas, por ejemplo, mediante uniones de péptido intercatenarias, en donde la inmunoglobulina o anticuerpo tiene la capacidad para unirse específicamente al antígeno. El término "dominio de inmunoglobulina o de anticuerpo" se refiere a una región globular dentro de un polipéptido de cadena pesada o ligera incluyendo circuitos de péptido (e.g., incluyendo de 3 a 4 circuitos de péptido) estabilizados, por ejemplo, mediante una unión disulfuro intracatenaria de hoja plateada ß . Los dominios se refieren además en la presente como "constantes" o "variables" en donde el término "constante" se refiere a la relativa carencia de variación de secuencia dentro de los dominios de miembros de varias clases en el caso de un dominio "constante" y en donde el término "variable" se refiere a la significativa variación dentro de los dominios de miembros de varias clases en el caso de un dominio "variable" . Los "dominios" de anticuerpo o polipéptido se refieren frecuentemente de manera intercambiable en la técnica, como "regiones" de anticuerpo o polipéptido. Los dominios
"constantes" de una cadena ligera de anticuerpo se refieren de manera intercambiable como "regiones constantes de cadena ligera", "dominios constantes de cadena ligera", regiones "CL" o dominios "CL" . Los dominios "constantes" de una cadena pesada de anticuerpo se refieren de manera intercambiable como "regiones constantes de cadena pesada" , "dominios constantes de cadena pesada" , regiones "CH" o dominios "CH" . Los dominios "variables" de una cadena ligera de anticuerpo se refieren de manera intercambiable como "regiones variables de cadena ligera", "dominios variables de cadena ligera", regiones "VL" o dominios "VL" . Los dominios "variables" de una cadena pesada de anticuerpo se refieren de manera intercambiable como "regiones variables de cadena pesada" , "dominios variables de cadena pesada" , regiones "VH" o dominios "VH" . El término "región" también puede referirse a una parte o porción de una cadena de anticuerpos o dominio de cadena de anticuerpos (e.g., parte o porción de una cadena pesada o ligera o parte o porción de un dominio constante o variable, como se define en la presente) , así como partes o porciones más discretas de dichas cadenas o dominios. Por ejemplo, las cadenas ligera y pesada o dominios variables de cadena ligera y pesada incluyen "regiones determinantes de complementariedad" o "CDRs" ínter dispersadas entre las "regiones de estructura" o "FRs", como se define en la
presente . Las inmunoglobulinas o anticuerpos pueden existir en forma monomérica o polimérica, por ejemplo, anticuerpos IgM, que existen en forma pentamérica, y/o anticuerpos IgA, que existen en forma monomérica, dimérica o multimérica. El término "fragmento" se refiere a una parte o porción de un anticuerpo o cadena de anticuerpos que incluye menos residuos de aminoácido que un anticuerpo intacto o completo o una cadena de anticuerpo. Los fragmentos pueden obtenerse mediante un tratamiento químico o enzimático de un anticuerpo intacto o completo o de una cadena de anticuerpo. Los fragmentos también pueden obtenerse mediante medios recombinantes. Los fragmentos ejemplares incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fabc y/o Fv. El término "fragmento de unión de antígeno" se refiere a un fragmento de polipéptido de una inmunoglobulina o anticuerpo que se une al antígeno o compite con un anticuerpo intacto (i.e., con el anticuerpo intacto del cual se derivaron) por la unión al antígeno (i.e., unión específica). El término "conformación" se refiere a la estructura terciaria de una proteína o polipéptido (e.g., un anticuerpo, cadena de anticuerpo, dominio o región de los mismos) . Por ejemplo, la frase "conformación de cadena ligera (o pesada)" se refiere a la estructura terciaria de una región variable de cadena ligera (o pesada) , y la frase
"conformación de anticuerpo" o "conformación del fragmento de anticuerpo" se refiere a la estructura terciaria de un anticuerpo o un fragmento del mismo. El término "conformación" también puede referirse a estructuras cuaternarias que resultan de la relación tridimensional de una o varias proteínas o cadenas de péptido. Con relación a las determinantes antigénicas, la frase "epítope de conformación" se refiere a una determinante de antígeno que incluye una disposición espacial específica de aminoácidos dentro de una o varias proteínas existentes en cercana aposición. Considerando la naturaleza multifuncional de los anticuerpos (i.e., la capacidad de las moléculas de IgG para unir varios epítopes de manera concomitante en más de una molécula de proteínas) , puede considerarse que los anticuerpos tienen la capacidad innata para unir epítopes de conformación comprendidos por varias cadenas de aminoácido. Por ejemplo, la deposición de A o para formar placas, proporciona un epítope de conformación en el cual un anticuerpo puede unir varios péptidos A p cercanamente colocados. Se producen fragmentos de unión mediante técnicas de ADN recombinante, o mediante división enzimática o química de inmunoglobulinas intactas. Los fragmentos de unión incluyen anticuerpos Fab, Fab' , F(ab')2, Fabc, Fv, cadenas únicas y monocatenarios . Además de inmunoglobulinas o
anticuerpos "biespecíficos" o "bifuncionales" , se entiende que una inmunoglobulina o anticuerpo tiene cada uno de sus sitios de unión idéntico. Un "anticuerpo biespecífico" o "bifuncional" es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos diferentes pares de cadena pesada/ligera y dos diferentes sitios de unión. Los anticuerpos biespecíficos pueden producirse mediante una variedad de métodos incluyendo fusión de hibridomas o unión de fragmentos Fab'. Ver, e.g., Songsivilai 6 Lachmann, Clin. Exp. Immunol . , 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol . , 148, 1547-1553 (1992). "Unión específica" o "unión selectiva" de un anticuerpo significa que el anticuerpo exhibe una apreciable afinidad para un antígeno o epítope particular y, generalmente, no exhibe una reactividad cruzada significativa. Unión "apreciable" o preferida incluye la unión con afinidad de al menos 106, 107, 108, 109 M"1 o 1010 M" 1. Son más preferidas las afinidades mayores que 107 M"1, preferentemente mayores que 108 M"1. Los valores intermedios a aquellos detallados en la presente también pretenden encontrarse dentro del alcance de la presente invención y una afinidad de unión preferida puede indicarse como un rango de afinidades, por ejemplo, de 106 a 1010 M"1, preferentemente de 107 a 1010 M"1, más preferentemente de 108 a 1010 M"1. Un anticuerpo que "no exhibe una reactividad cruzada significativa" es uno que no se une apreciablemente a una
entidad indeseable (e.g., una entidad proteinácea indeseable) . Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a Aß se unirá apreciablemente a Aß pero no reaccionará significativamente con proteínas o péptidos no Aß (e.g., proteínas o péptidos no Aß incluidos en placas). Un anticuerpo específico para un epítope particular, por ejemplo, no reaccionará de manera cruzada significativamente con epítopes remotos en la misma proteína o péptido. En modalidades ejemplares, el anticuerpo no exhibe reactividad cruzada (e.g., no reacciona de manera cruzada con péptidos Aß o con epítopes remotos en A/3) . La unión específica puede determinarse de acuerdo con cualquier otro medio reconocido en la técnica para la determinación de tal unión. Preferentemente, la unión específica se determina de acuerdo con el análisis Scatchard y/o análisis de unión competitivos. El término "identidad significativa" significa que dos secuencias, e.g., dos secuencias de polipéptido, cuando se alinean de manera óptima, tal como mediante los programas
GAP o BESTFIT utilizando pesos de brecha de falla, comparten al menos una identidad de secuencia de 50-60%, preferentemente al menos una identidad de secuencia de 60-70%, más preferentemente al menos una identidad de secuencia de 70-80%, más preferentemente al menos una identidad de 80-90%, incluso más preferentemente al menos una identidad de 90-95%, e incluso más preferentemente al menos una identidad
de secuencia de 95% o más (e.g., 99% de identidad de secuencia o más) . El término "identidad sustancial" o "sustancialmente idéntica" significa que dos secuencias, e.g., dos secuencias de polipéptido, al alinearse de manera óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT que utilizan pesos de brecha de falla, comparten al menos una identidad de secuencia de 80-90%, preferentemente al menos una identidad de secuencia de 90-95%, y más preferentemente al menos una identidad de secuencia de 95% o más (e.g., 99% de identidad de secuencia o más) . Para la comparación de secuencia, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia con la cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencia, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en una computadora, se diseñan coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se diseñan parámetros de programa de algoritmo de secuencia. El algoritmo de comparación de secuencia calcula entonces la identidad porcentual de secuencia para la(s) secuencia (s) de prueba en relación con la secuencia de referencia en base a los parámetros de programa diseñados. La óptima alineación de secuencias para comparación, puede conducirse, e.g., mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 (1981) , mediante el algoritmo de alineación de homología de
Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970) (, mediante la búsqueda del método de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci., EUA 85:2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science, Dr. Madison, WI) , o mediante inspección visual (ver generalmente Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology). Un ejemplo de algoritmo adecuado para la determinación de la identidad de secuencia porcentual y la similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403 (1990). El software para efectuar análisis BLAST se encuentra públicamente disponible a través del National Center for Biotechnology Information (accesible públicamente a través del servidor de internet National Institutes of Health NCBI) . Típicamente pueden utilizarse parámetros de programa de falla para realizar la comparación de secuencia, aunque pueden utilizarse también parámetros diseñados. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como falla una longitud de palabra (W) de 3 , y una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM (ver Heinkoff & Heinkoff, Proc. Nati. Acad. Sci., EUA 89:1'915 (1989) ) . Preferentemente, las posiciones del residuo que no son idénticas difieren por las sustituciones de aminoácido
conservadoras. Para propósitos de clasificación de las sustituciones de aminoácidos como conservadoras o no conservadoras, los aminoácidos se agrupan como sigue: Grupo I (cadenas laterales hidrófobas): leu, met, ala, val, leu, ile; Grupo II (cadenas laterales hidrófilas neutrales) : cys, ser, thr; Grupo III (cadenas laterales acídicas) : asp, glu; Grupo IV (cadenas laterales básicas) : asn, gln, his, lys, arg; Grupo V (residuos que influyen en la orientación de cadena) : gly, pro; y Grupo VI (cadenas laterales aromáticas) : trp, tyr, phe. Las sustituciones conservadoras implican sustituciones entre los aminoácidos en la misma clase. Las sustituciones no conservadoras constituyen el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra. Anticuerpos La metodología de la presente invención es aplicable en una variedad de procesos de producción de anticuerpos en donde se detectan sub-productos no queridos o indeseables. En particular, la metodología es aplicable en la producción de anticuerpos recombinantes, tales como los anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, en donde se conoce la secuencia del anticuerpo que se produce. El término "inmunoglobulina humanizada" o "anticuerpo humanizado" se refiere a una inmunoglobulina o anticuerpo que incluye al menos una cadena humanizada de inmunoglobulina o anticuerpo (i.e., al menos una cadena
humanizada ligera o pesada) . El término "cadena humanizada de inmunoglobulina" o "cadena humanizada de anticuerpo" (i.e., una "cadena ligera humanizada de inmunoglobulina" o "cadena pesada humanizada de inmunoglobulina") se refiere a una cadena de inmunoglobulina o de anticuerpo (i.e., una cadena ligera o pesada, respectivamente) que tiene una región variable que incluye una región de estructura variable sustancialmente de una inmunoglobulina o anticuerpo humano y regiones determinantes de complementariedad (CDRs) (e.g., al menos una CDR, preferentemente dos CDR, más preferentemente tres CDRs) sustancialmente de una inmunoglobulina o anticuerpo no humano, e incluye además regiones constantes
(e.g., al menos una región constante o una porción de la misma, en el caso de una cadena ligera, y preferentemente tres regiones constantes en el caso de una cadena pesada) . El término "región variable humanizada" (e.g., "región variable humanizada de cadena ligera o "región variable humanizada de cadena pesada) se refiere a una región variable que incluye una región de estructura variable sustancialmente de una inmunoglobulina o anticuerpo humano y regiones determinantes de complementariedad (CDRs) sustancialmente de una inmunoglobulina o anticuerpo no humano. La frase "sustancialmente de una inmunoglobulina o anticuerpo humano" o "sustancialmente humano" significa que, al alinearse a una secuencia de inmunoglobulinas o
anticuerpos humanos para propósitos de comparación, comparte al menos 80-90%, 90-95% o 95-99% de identidad (i.e., identidad de secuencia local) con la estructura humana o secuencia de región constante permitiendo, por ejemplo, para sustituciones conservadoras, sustituciones de secuencia de consenso, sustituciones de línea germinal, retro-mutaciones, y lo similar. La introducción de las sustituciones conservadoras, sustituciones de secuencia de consenso, sustituciones de línea germinal, retro-mutaciones, y lo similar, se refiere frecuentemente como "optimización" de un anticuerpo o cadena humanizada. La frase "sustancialmente de una inmunoglobulina o anticuerpo no humano" o "sustancialmente no humano" significa que tiene una secuencia de inmunoglobulinas o de anticuerpos al menos 80-95%, preferentemente al menos 90-95%, más preferentemente, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la de un organismo no humano, e.g., un mamífero no humano. En consecuencia, todas las regiones o residuos de una inmunoglobulina o anticuerpo humanizado, o de una cadena de inmunoglobulina o de anticuerpo humanizado, excepto posiblemente las CDRs, son sustancialmente idénticas a las regiones o residuos correspondientes de una o más secuencias naturales de inmunoglobulina humana. El término "región correspondiente" o "residuo correspondiente" se refiere a una región o residuo en una segunda secuencia de aminoácidos o de
nucleótidos que ocupa la misma (i.e., equivalente) posición que una región o residuo en una primera secuencia de aminoácidos o nucleótidos, cuando las primera y segunda secuencias se encuentran alineadas de manera óptima para propósitos de comparación. Preferentemente, las inmunoglobulinas o anticuerpos humanizados se unen al antígeno con una afinidad dentro de un factor de tres, cuatro o cinco de el del anticuerpo no humanizado correspondiente. Por ejemplo, si el anticuerpo no humanizado tiene una afinidad de unión de 109 M"1, los anticuerpos humanizados tendrán una afinidad de unión de al menos 3 x 109 M"1, 4 x 109 M"1, o 5 x 109 M"1. Al describir las propiedades de unión de una cadena de inmunoglobulina o de anticuerpo, la cadena puede describirse en base a su capacidad para "dirigir la unión a antígeno (e.g., A/3 o 5T4)". Se dice que una cadena "dirige la unión a antígeno" cuando confiere, mediante una inmunoglobulina o anticuerpo intacto (o fragmento de unión a antígeno del mismo) una propiedad de unión específica o afinidad de unión. Se dice que una mutación (e.g., una retro-mutación) afecta sustancialmente la capacidad de una cadena pesada o ligera para dirigir la unión a antígeno si afecta (e.g., disminuye) la afinidad de unión de una inmunoglobulina o anticuerpo intacto (o fragmento de unión a antígeno del mismo) que comprende dicha cadena por al menos un orden de magnitud en
comparación con el del anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno del mismo) que comprende una cadena equivalente que carece de dicha mutación. Una mutación "no afecta (e.g., disminuye) sustancialmente la capacidad de una cadena para dirigir la unión a antígeno" si afecta (e.g., disminuye) la afinidad de unión de una inmunoglobulina o anticuerpo intacto (o fragmento de unión a antígeno del mismo) que comprende dicha cadena, por solo un factor de dos, tres o cuatro de el del anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno del mismo) que comprende una cadena equivalente que carece de dicha mutación. El término "inmunoglobulina quimérica" o anticuerpo, se refiere a una inmunoglobulina o anticuerpo cuyas regiones variables se derivan de una primera especie y cuyas regiones constantes se derivan de una segunda especie. Las inmunoglobulinas o anticuerpos quiméricos pueden construirse, por ejemplo, mediante ingeniería genética, a partir de segmentos de gen de inmunoglobulina pertenecientes a diferentes especies. Los términos "inmunoglobulina humanizada" o "anticuerpo humanizado" no pretenden abarcar inmunoglobulinas o anticuerpos quiméricos, como se define en la presente. Aunque las inmunoglobulinas o anticuerpos humanizados con quiméricos en su construcción (i.e., comprenden regiones de más de una especie de proteína) , incluyen características adicionales (i.e., regiones
variables que comprenden residuos de CDR donantes y residuos de estructura receptores) no encontradas en inmunoglobulinas o anticuerpos quiméricos, como se define en la presente. Tales anticuerpos monoclonales humanizados pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica, por ejemplo, utilizando los métodos descritos en Robinson et al., Solicitud Internacional No. PCT/US86/02269; Akira, et al., Solicitud de Patente Europea 184,187; Taniguchi M., Solicitud de Patente Europea 171,496; Morrison et al., Solicitud de Patente Europea 173,494; Neuberger et al., Publicación Internacional PCT No. WO 86/01533; Cabilly et al., Patente de E.U. No. 4,816,567; Cabilly et al., Solicitud de Patente Europea 125,023; Better et al., (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al., (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 84:3439-3442; Liu et al., (1987) J. Immunol . , 139:3521-3526; Sun et al., (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 84:214-218; Nishimura et al., (1987) Canc . Res. 47:999-1005; Wood et al., (1985) Nature 314:446-449; y Shaw et al., (1988) J. Nati. Cáncer Inst . , 80:1553-1559; Morrison S. L. , (1985) Science 229:1202-1207; Oí et al., (1986) BioTechniques 4:214; Winter Patente de E.U. 5,225,539; Jones et al., (1986) Nature 321:552-525; Verhoyen et al., (1988) Science 239:1534; y Beidler et al., (1988) J. Immunol . , 141:4053-4060. Los anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que se han modificado, e.g., suprimiendo,
agregando o sustituyendo otras porciones del anticuerpo, e.g., la región constante, se encuentran también dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, un anticuerpo puede modificarse como sigue: (i) reemplazando la región constante con otra región constante, e.g., una región constante propuesta para incrementar la vida media, estabilidad o afinidad del anticuerpo, o una región constante de otra especie o clase de anticuerpo; o (ii) modificando uno o más aminoácidos en la región constante para alterar, por ejemplo, el número de sitios de glicosilación, la función de célula efector, la unión del receptor Fe (FcR) , la fijación de complemento, entre otros. Los métodos para alterar una región constante de anticuerpo se conocen en la técnica. Los anticuerpos con función alterada, e.g., afinidad alterada para un ligante efector, tal como FcR en una célula, o el componente Cl del complemento, pueden producirse reemplazando al menos un residuo de aminoácido en la porción constante del anticuerpo con un residuo diferente (ver, e.g., EP 388,151 Al, Pat. No. 5,624,821 y Pat. de E.U. No. 5,648,260, cuyo contenido se incorpora en la presente mediante la referencia) . Podrían describirse tipos de alteraciones similares que si se aplican a especies murinas u otras de inmunoglobulina reducirían o eliminarían estas funciones. Por ejemplo, es posible alterar la afinidad de una región Fe de un anticuerpo (e.g., una IgG, tal como la IgG
humana) para una unión de FcR (e.g., Rl Fe gamma), o Clq, reemplazando el (los) residuo (s) especificado (s) con residuo (s) que tiene (n) una funcionalidad apropiada en su cadena lateral, o introduciendo un grupo funcional cargado, tal como glutamato o aspartato, o tal vez un residuo aromático no polar tal como fenilalanina, tirosina, triptofán o alanina (ver e.g., Pat. de E.U. No. 5,624,821). Anticuerpos Humanos de Animales Transgénicos y Visualización de Fago Alternativamente, actualmente es posible producir animales transgénicos (e.g., ratones) que son capaces, a la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la supresión homózigua del gen de la región de unión de cadena pesada del anticuerpo (JH) en ratones mutantes quiméricos y de línea germinal da como resultado la inhibición total de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la disposición del gen de inmunoglobulina humano de línea germinal en tales ratones mutantes de línea germinal da como resultado la producción de anticuerpos humanos al reto con antígenos. Ver, e.g., Patentes de E.U. Nos. 6,150,584; 6,114,598 y 5,770,429. Los anticuerpos completamente humanos también pueden derivarse de bibliotecas de visualización de fago
(Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)). Anticuerpos Biespecíf icos , Polipéptidos de Fusión de Anticuerpos y Anticuerpos Monocatenarios Los anticuerpos biespecíficos (BsAbs) son anticuerpos que tienen especificidades de unión para al menos dos epítopes diferentes. Tales anticuerpos pueden derivarse de anticuerpos de longitud total o fragmentos de anticuerpo (e.g., anticuerpos biespecíficos F(ab')2). Se conocen en la técnica métodos para la preparación de anticuerpos biespecíficos . La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud total se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Debido a que la selección aleatoria de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diferentes moléculas de anticuerpo (ver WO 93/08829 y en Traunecker et al., EMBO J. , 10:3655-3659 (1991) ) . Los anticuerpos biespecíficos incluyen también anticuerpos reticulados o "heteroconjugados" . Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse a avidina, el otro a biotina u otra carga de compensación. Los anticuerpos de heteroconjugado pueden producirse
utilizando cualquier método de reticulación. Los agentes de reticulación adecuados son muy conocidos en la técnica y se describen en la Pat. de E.U. No. 4,676,980, conjuntamente con un número de técnicas de reticulación. Aún en otra modalidad, el anticuerpo puede fusionarse, química o genéticamente, a un dominio de carga de compensación, por ejemplo, una inmunotoxina para producir un polipéptido de fusión de anticuerpo. Tales cargas de compensación incluyen, por ejemplo, inmunotoxinas , quimioterapéuticos, y radioisótopos, todos los cuales son muy conocidos en la técnica. Los anticuerpos monocatenarios también son adecuados para la estabilización de acuerdo con la invención. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera
(VL) con una unión, que permite que cada región variable produzca una interfaz con la otra y recree la bolsa de unión a antígeno del anticuerpo de origen del cual se derivan las regiones VL y VH. Ver Gruber et al., J. Immunol . , 152:5368 (1994) . Anticuerpos Anti -Aß Generalmente, los anticuerpos de la presente invención incluyen anticuerpos para el tratamiento de enfermedades amiloidogénicas, en particular, Enfermedad de Alzheimer, dirigiendo el péptido A/3.
El término "enfermedad amiloidogénica" incluye cualquier enfermedad asociada con (u ocasionada por) la formación o deposición de fibrilos amiloide insolubles. Las enfermedades amiloidogénicas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, amiloidosis sistémica, enfermedad de Alzheimer, diabetes de establecimiento maduro, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, demencia fronto-temporal , y las encefalopatías espongiformes transmisibles relacionadas a prión (enfermedad kuru y Creutzfield-Jacob en humanos y scrapie y BSE en ovejas y ganado, respectivamente) . Las diferentes enfermedades amiloidogénicas se definen o se caracterizan por la naturaleza del componente de polipéptido de los fibrilos depositados. Por ejemplo, en sujetos o pacientes que tienen enfermedad de Alzheimer, la proteína ß-amiloide (e.g., proteína /3-amiloide de tipo silvestre, variante o truncada) es el componente de polipéptido caracterizado del depósito amiloide. En consecuencia, la enfermedad de Alzheimer es un ejemplo de una "enfermedad caracterizada por depósitos de A/3" o una "enfermedad asociada con depósitos de A/3" , e.g., en el cerebro de un sujeto o paciente. Los términos "proteína /3-amiloide" , "péptido ß-amiloide" , "/3-amiloide" , "A/3", y "péptido Aß" se utilizan de manera intercambiable en la presente. Un "agente inmunogénico" o "inmunógeno" es capaz de inducir una respuesta inmunológica contra sí mismo al administrarse a un
mamífero, opcionalmente en conjunción con un adyuvante. Los términos "anticuerpo AO" , anticuerpo anti Aü" , y anti AO" se utilizan de manera intercambiable en la presente para referirse a un anticuerpo que se une a uno o más epítopes o determinantes antigénicos de APP, proteína A a, o ambos. Los epítopes o determinantes antigénicos ejemplares pueden encontrarse dentro de la proteína precursora amiloide humana (APP) , pero se encuentran preferentemente dentro del péptido Ajß de APP. Existen múltiples isoformas de APP, por ejemplo APP695, APP751 y APP770. Se asignan números a los aminoácidos dentro de APP de acuerdo con la secuencia de la isoforma de APP770 (ver e.g., GenBank Accesión No. P05067) . El péptido Aß (también referido en la presente como péptido beta amiloide y beta A) es un fragmento interno de -4 kDa de los aminoácidos 39-43 de APP (A/339, A/340, A/341, A/342 y A/343) . A/340, por ejemplo, consiste de los residuos 672-711 de APP y A/342 consiste de los residuos 672-713 de APP. Como resultado del procesamiento proteolítico de APP mediante diferentes enzimas secretasa in vivo o in situ. A/3 se encuentra tanto en "forma corta", 40 aminoácidos de longitud y en una "forma larga", que varía de 42-43 aminoácidos de longitud. Los epítopes o determinantes antigénicos pueden localizarse dentro de la terminación N del péptido A/3 e incluyen los residuos dentro de los aminoácidos 1-10 de Aß , preferentemente de los residuos 1-3, 1-4, 1-5, 1-
6, 1-7, 2-7, 3-6, o 3-7 de A/342 o dentro de los residuos 2-4, 5, 6, 7, u 8 de A/3, los residuos 3-5, 6, 7, 8 o 9 de Aß o los residuos 4-7, 8, 9, o 10 de A/342. Los epítopes "centrales" o determinantes antigénicos se localizan dentro de la porción media o central del péptido A/3 e incluyen los residuos dentro de los aminoácidos 16-24, 16-23, 16-22, 16-21, 19-21, 19-23 o 19-24 de A/3. los epítopes de "terminación C" o determinantes antigénicos se localizan dentro de la terminación C del péptido A/ß e incluyen los residuos dentro de los aminoácidos 33-40, 33-41, o 33-42 de Ajß. En diversas modalidades, un anticuerpo A/3 es específico del extremo. Como se utiliza en la presente "específico del extremo" se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a los residuos de terminación N o de terminación C de un péptido Aß pero que no reconocen los mismos residuos cuando se encuentra presentes en una especie Aß más larga que comprende los residuos o en APP. En varias modalidades, un anticuerpo Ajß es "específico de la terminación C" . Como se utiliza en la presente, el término "específico de la terminación C" significa que el anticuerpo reconoce específicamente una terminación C libre de un péptido A/3. ejemplos de anticuerpos Ajß específicos de la terminación C incluyen aquellos que: reconocen un péptido A/3 que termina en el residuo 40, pero no reconocen un péptido Ajß que termina en el
residuo 41, 42 y/o 43; reconocen un péptido Aß que termina en el residuo 42, pero no reconocen un péptido A/3 que termina en el residuo 40, 41 y/o 43; etc. En una modalidad, el anticuerpo puede ser un anticuerpo 3D6 o una variante del mismo, o un anticuerpo 10D5 o una variante del mismo, ambos descritos en la Publicación de Patente de E.U. No. 2003/0165496 Al, Publicación de Patente de E.U. No. 2004/0087777 Al, Publicación de Patente Internacional No. WO 02/46237 A3. La descripción de 3D6 y 10D5 también puede encontrarse, por ejemplo, en la Publicación Internacional de Patente No. WO 02/088306 A2 y en la Publicación Internacional de Patente No. WO 02/088307 A2. 3D6 es un anticuerpo monoclonal (mAb) que se une específicamente a un epítope de terminación N ubicado en el péptido humano /3-amiloide, específicamente en los residuos 1-5. En comparación, 10D5 es un mAb que se une específicamente a un epítope de terminación N ubicado en el péptido humano ß-amiloide, específicamente en los residuos 3-6. En otra modalidad, el anticuerpo puede ser un anticuerpo 12B4 o su variante, como se describe en la Publicación de Patente de E.U. No. 2004/0082762 Al y la Publicación Internacional de Patente No. WO 03/077858 A2. 12B4 es un mAb que se une específicamente a un epítope de terminación N ubicado en el péptido jß-amiloide, específicamente los residuos 3-7. Aún en otra modalidad, el anticuerpo puede ser un anticuerpo 12A11 o
variante del mismo, como se describe en la Solicitud de Patente de E.U. No. 10/858,855 y la Solicitud Internacional de Patente No. PCT/US04/17514. 12A11 es un mAb que se une específicamente a un epítope de terminación N localizado en el péptido humano /3-amiloide, específicamente en los residuos 3-7. Aún en otra modalidad, el anticuerpo puede ser un anticuerpo 266 como se describe en la Solicitud de Patente de E.U. No. 10/789,273, y la Solicitud Internacional de Patente No. WO 01/62801 A2. Los anticuerpos diseñados para unirse específicamente a epítopes de terminación C ubicados en el péptido humano /3-amiloide, para uso en la presente invención, incluyen, pero no se limitan a, 369.2B, como se describe en la Patente de E.U. No. 5,786,160. En modalidades ejemplares, el anticuerpo se selecciona de un anticuerpo 3D6 del péptido humanizado anti-Ajß, un anticuerpo 12A11 del péptido humanizado anti-A/3, un anticuerpo 10D5 del péptido humanizado anti-A/3, un anticuerpo 12B4 del péptido humanizado anti-A/3 y un anticuerpo 266 del péptido humanizado anti-A/3, que se une selectivamente al péptido A/3. Más específicamente, el anticuerpo 3D6 del péptido humanizado anti-A/3 se diseña para unirse específicamente a un epítope de terminación NH2 ubicado en el péptido jß-amiloide humano 1-40 o 1-42 encontrado en depósitos de placa en el cerebro (e.g., en pacientes que sufren de enfermedad de Alzheimer) .
Fusiones Fe En algunas modalidades, las moléculas de ácido nucleico de la invención codifican para una proteína de fusión o quimérica. La proteína de fusión puede incluir un residuo objetivo, e.g., un fragmento de receptor soluble o un ligante, y una cadena de inmunoglobulina, un fragmento Fe, regiones constantes de cadena pesada de los diversos isotipos, incluyendo: IgGl, IgG2 , IgG3 , IgG4 , IgM, IgAl, IgA2, IgD e IgE) . Por ejemplo, la proteína de fusión puede incluir el dominio extracelular de un receptor, y, e.g., fusionarse a, una cadena Fe de inmunoglobulina humana (e.g., IgG humana, e.g., IgGl humana o IgG4 humana o una forma mutada de la misma) . En una modalidad, la secuencia Fe humana se ha mutado en uno o más aminoácidos, e.g., mutada en los residuos 254 y 257 de la secuencia de tipo silvestre para reducir la unión del receptor Fe. Las proteínas de fusión pueden incluir adicionalmente una secuencia de unión que une el primer residuo al segundo residuo, e.g., el fragmento de inmunoglobulina. Por ejemplo, la proteína de fusión puede incluir una unión a péptido, e.g., una unión a péptido de aproximadamente 4 a 20, más preferentemente de 5 a 10 aminoácidos de longitud; la unión a péptido es de 8 aminoácidos de longitud. Por ejemplo, la proteína de fusión puede incluir una unión a péptido que tiene la fórmula (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)y en donde y es l, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8. En
otras modalidades, pueden agregarse secuencias de aminoácidos adicionales a la terminación N o C de la proteína de fusión para facilitar la expresión, la flexibilidad estérica, la detección y/o aislamiento o la purificación. Una proteína quimérica o de fusión de la invención puede producirse mediante técnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican para las diferentes secuencias de polipéptidos se encuentran ligados entre sí en marco, de acuerdo con las técnicas convencionales, e.g., empleando terminaciones de extremo romo o de extremo vacilante para ligación, digestión de enzima de restricción, para proporcionar las terminaciones apropiadas, llenas de extremos cohesivos según sea apropiado, tratamiento de fosfatasa alcalina para evitar la unión no deseada, y la ligación enzimática. En otra modalidad, el gen de fusión puede sintetizarse mediante técnicas convencionales incluyendo sintetizadores de ADN automatizados. Alternativamente, puede efectuarse la amplificación PCR de fragmentos de gen utilizando iniciadores de anclaje para dar lugar a proyecciones complementarias entre dos fragmentos consecutivos de gen que pueden subsecuentemente recocerse y re-amplificarse para generar una secuencia de gen quimérica (ver, por ejemplo, Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1992) . Además, se encuentran comercialmente disponibles muchos vectores de
expresión que codifican para un residuo de fusión (e.g., una región Fe de una cadena pesada de inmunoglobulina) . Los polipéptidos de fusión de inmunoglobulina se conocen en la técnica y se describen e.g., en las Pat. de E.U. Nos. 5,516,964; 5,225,538; 5,428,130; 5,514,582; 5,714,147; y 5,455,165. Moléculas, Estructuras y Vectores de Ácido Nucleico Las modalidades ejemplares de la presente invención caracterizas estructuras fabricadas diseñadas para eliminar sub-productos no queridos o indeseables, en particular, subproductos de anticuerpo (o inmunoglobulina) no queridos o indeseables. En ciertos aspectos, las estructuras incluyen componentes de secuencias de gen de anticuerpo de origen natural, en donde los componentes se han alterado, modificado o fabricado genéticamente (e.g., fabricados genéticamente) de manera que la estructura exprese los productos deseados
(e.g., anticuerpos) de interés en ausencia del sub-producto no querido o indeseable. Las estructuras pueden generarse utilizando técnicas reconocidas en la técnica para la producción de moléculas de ácido nucleico recombinante (e.g., que comprenden componentes de genes de cadena de inmunoglobulina) como se describe en detalle abajo. Las secuencias de genes de anticuerpo codifican para anticuerpos de los diversos isotipos, incluyendo: IgG (e.g., IgGl, IgG2 , IgG3, IgG4) , IgM, IgAl , IgA2 , IgD e IgE.
Preferentemente, las secuencias de genes de anticuerpo codifican para un anticuerpo del anticuerpo como en el isotipo IgG. Las moléculas de inmunoglobulinas o anticuerpos codificadas pueden incluir inmunoglobulina de longitud total (e.g., IgGl o IgG4) o alternativamente pueden incluir solo un fragmento (e.g., un fragmento Fe). Se apreciará por el técnico experto que las secuencias de nucleótidos que codifican para los anticuerpos de la presente invención, pueden derivarse de las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos en la presente solicitud o de fuentes adicionales de secuencias de genes de inmunoglobulina conocidos en la técnica utilizando el código genético y técnicas estándar de biología molecular. Las composiciones de ácido nucleico de la presente invención pueden derivarse de ADN de inmunoglobulina conocido (e.g., secuencias de ADNc) . En particular, las secuencias de nucleótidos pueden ser sustancialmente idénticas a o derivadas de secuencias naturales V, D, J o ADNc constantes. Las secuencias de genes de región constante de cadena pesada o ligera se conocen en la técnica. Preferentemente, la región constante es humana, pero también pueden utilizarse regiones constantes de otras especies, e.g., de roedor (e.g., ratón o rata), primate
(macaco) , camello o conejo. Las regiones constantes de estas especies se conocen en la técnica (ver e.g., Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,
Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones pueden obtenerse mediante amplificación PCR estándar. La región constante de cadena pesada puede ser una región constante de IgGl , IgG2 , IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD. Las secuencias para regiones constantes de cadena pesada se conocen en la técnica y pueden encontrarse, e.g., en NCBI NG_001019. En algunas modalidades, la región constante es una región constante IgGl o IgG4. Para un gen de cadena pesada del fragmento Fe, el ADN que codifica para Fe puede unirse operativamente a una secuencia guía de cadena pesada (e.g., una secuencia guía de cadena variable de cadena pesada) para la expresión directa. Aspectos adicionales de la invención incluyen secuencias de cásete de ADN de inmunoglobulina ensambladas. Las secuencias de cásete de inmunoglobulina ensambladas incluyen secuencias de nucleótidos así como secuencias de aminoácidos codificadas por la secuencia de nucleótidos de cásete de ADN de inmunoglobulina. Se proporciona en la presente la secuencia genómica de región constante de IgGl humana ejemplar: GTGAGTCCTGTCGACTCTAGAGCTTTCTGGGGCAGGCCAGGCCTGACTTTGGCTGG GGGCAGGGAGGGGGCTAAGGTGACGCAGGTGGCGCCAGCCAGGCGCACACCCAATG CCCATGAGCCCAGACACTGGACGCTGAACCTCGCGGACAGTTAAGAACCCAGGGGC CTCTGCGCCCTGGGCCCAGCTCTGTCCCACACCGCGGTCACATGGCACCACCTCTC
TTGCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGC ACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACC GGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGG CTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCC AGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACAC CAAGGTGGACAAGAAAGTTGGTGAGAGGCCAGCACAGGGAGGGAGGGTGTCTGCTG GAAGCCAGGCTCAGCGCTCCTGCCTGGACGCATCCCGGCTATGCAGTCCCAGTCCA GGGCAGCAAGGCAGGCCCCGTCTGCCTCTTCACCCGGAGGCCTCTGCCCGCCCCAC TCATGCTCAGGGAGAGGGTCTTCTGGCTTTTTCCCCAGGCTCTGGGCAGGCACAGG CTAGGTGCCCCTAACCCAGGCCCTGCACACAAAGGGGCAGGTGCTGGGCTCAGACC TGCCAAGAGCCATATCCGGGAGGACCCTGCCCCTGACCTAAGCCCACCCCAAAGGC CAAACTCTCCACTCCCTCAGCTCGGACACCTTCTCTCCTCCCAGATTCCAGTAACT CCCAATCTTCTCTCTGCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACC GTGCCCAGGTAAGCCAGCCCAGGCCTCGCCCTCCAGCTCAAGGCGGGACAGGTGCC CTAGAGTAGCCTGCATCCAGGGACAGGCCCCAGCCGGGTGCTGACACGTCCACCTC CATCTCTTCCTCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCC CAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTG GTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGT GGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACC GTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTAC AAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAA AGCCAAAGGTGGGACCCGTGGGGTGCGAGGGCCACATGGACAGAGGCCGGCTCGGC CCACCCTCTGCCCTGAGAGTGACCGCTGTACCAACCTCTGTCCCTACAGGGCAGCC CCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACC AGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAG
TGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGA CTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGC AGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTAC ACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAATGA (SEQ ID N0:1)
Se proporciona en la presente la secuencia genómica de región constante de IgG4 ejemplar: GTGAGTCCTGTCGACTCTAGAGCTTTCTGGGGCAGGCCAGGCCTGACTTTGGCTGG GGGCAGGGAGGGGGCTAAGGTGACGCAGGTGGCGCCAGCCAGGCGCACACCCAATG CCCATGAGCCCAGACACTGGACGCTGAACCTCGCGGACAGTTAAGAACCCAGGGGC CTCTGCGCCCTGGGCCCAGCTCTGTCCCACACCGCGGTCACATGGCACCACCTCTC TTGCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGC ACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACC GGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGG CTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCC AGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAATGTAGATCACAAGCCCAGCAACAC CAAGGTGGACAAGAGAGTTGGTGAGAGGCCAGCACAGGGAGGGAGGGTGTCTGCTG GAAGCCAGGCTCAGCCCTCCTGCCTGGACGCACCCCGGCTGTGCAGCCCCAGCCCA GGGCAGCAAGGCAGGCCCCATCTGTCTCCTCACCTGGAGGCCTCTGACCACCCCAC TCATGCTCAGGGAGAGGGTCTTCTGGATTTTTCCACCAGGCTCCGGGCAGCCACAG GCTGGATGCCCCTACCCCAGGCCCTGCGCATACAGGGGCAGGTGCTGCGCTCAGAC CTGCCAAGAGCCATATCCGGGAGGACCCTGCCCCTGACCTAAGCCCACCCCAAAGG CCAAACTCTCCACTCCCTCAGCTCAGACACCTTCTCTCCTCCCAGATCTGAGTAAC TCCCAATCTTCTCTCTGCAGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAG GTAAGCCAACCCAGGCCTCGCCCTCCAGCTCAAGGCGGGACAGGTGCCCTAGAGTA GCCTGCATCCAGGGACAGGCCCCAGCCGGGTGCTGACGCATCCACCTCCATCTCTT
CCTCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCC AAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGT GAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGC ATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTC AGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAA GGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAG GTGGGACCCACGGGGTGCGAGGGCCACATGGACAGAGGTCAGCTCGGCCCACCCTC TGCCCTGGGAGTGACCGCTGTGCCAACCTCTGTCCCTACAGGGCAGCCCCGAGAGC CACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGC CTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAG CAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACG GCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGG AATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAA GAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA (SEQ ID NO : 3 )
Producción de Anticuerpos Los anticuerpos de la presente invención se producen típicamente mediante expresión recombinante. Los ácidos nucleicos que codifican para las cadenas ligera y pesada pueden insertarse en vectores de expresión. Las cadenas ligera y pesada pueden clonarse en el mismo o en diferentes vectores de expresión. Los segmentos de ADN que codifican para cadenas de inmunoglobulina se encuentran operablemente unidos a secuencias de control en el (los) vector (es) de expresión que aseguran la expresión de los polipéptidos de inmunoglobulina. Las secuencias de control
de expresión incluyen, pero no se limitan a, promotores (e.g., promotores asociados naturalmente o heterólogos), secuencias de señal, elementos mejoradores, y secuencias de terminación de transcripción. Preferentemente, las secuencias de control de expresión son sistemas eucarióticas promotoras en vectores capaces de transformar o transfectar células huésped eucarióticas (e.g., células COS o CHO). Después de la manipulación del material genético aislado para proporcionar los polipéptidos de la invención como se detalló anteriormente, los genes se insertan típicamente en un vector de expresión para la introducción en células huésped que pueden utilizarse para producir la cantidad deseada de anticuerpo modificado que, a su vez, proporcionar los polipéptidos reivindicados. El término "vector" incluye una estructura de ácido nucleico que incluye frecuentemente un ácido nucleico, e.g., un gen, e incluye además los mínimos elementos necesarios para la replicación, transcripción, estabilidad y/o expresión o secreción de proteína de aminoácidos de una célula huésped. Tales estructuras pueden existir como elementos extracromosomales o pueden integrarse en el genoma de una célula huésped. El término "vector de expresión" incluye un tipo específico de vector en donde la estructura de ácido nucleico se optimiza para la expresión a alto nivel de un producto de proteína deseado. Los vectores de expresión tienen
frecuentemente agentes reguladores transcripcionales, tales como elementos promotores y mejoradores, optimizados para altos niveles de transcripción en tipos celulares y/o optimizados de manera que la expresión sea constitutiva en base al uso de un agente de inducción específico. Los vectores de expresión tienen además secuencias que proporcionan una translación apropiada y/o mejorada de la proteína. Como es conocido por los expertos en la técnica, tales vectores pueden seleccionarse fácilmente del grupo que consiste de plásmidos, fagos, virus y retrovirus. El término "cásete de expresión" incluye una estructura de ácido nucleico que contiene un gen que tiene elementos además del gen que permiten la apropiada y/o mejorada expresión de ese gen en una célula huésped. El término "operablemente unido" incluye una yuxtaposición en donde los componentes se encuentran en una relación que les permite funcionar de la manera pretendida
(e.g., funcionalmente unidos). Como ejemplo, un promotor/operador operablemente unido a un polinucleótido de interés se encuentra ligado a dicho polinucleótido de manera que la expresión del polinucleótido de interés se logre bajo condiciones que activan la expresión dirigida por el promotor/mej orador . Con respecto a la invención descrita en la presente, operablemente unido abarca también la relación de los sitios del donante de empalme y del receptor de
empalme encontrados en la transcripción primaria (pre-ARNm) de un gen de interés. Normalmente, los sitios de empalme receptor y donante se encuentran operablemente unidos en que las dos secuencias se requieren y funcionan conjuntamente para que se presenten los eventos de empalme dando como resultado un ARN mensajero maduro. La frase "asociación operativa natural" se refiere a la organización intrónica y exónica de un gen encontrado en su estado natural o nativo. Un procedimiento para la clonación de un gen de interés implica el aislamiento del ácido nucleico del gen, tanto exones como intrones, y la inserción de la secuencia de ácido nucleico en un vector para la amplificación de la secuencia de ácido nucleico. Esta secuencia de gen completo también puede insertarse en un vector de expresión útil para la expresión de la proteína en la misma o diferentes especies. Cuando un gen se clona conteniendo los intrones y exones como se encuentran existentes en su estado natural, se dice que los intrones y exones retienen su asociación operativa natural. Los vectores de expresión son típicamente replicables en los organismos huésped ya sea como episomas o como parte integral del ADN cromosomal huésped. Comúnmente, los vectores de expresión contienen marcadores de selección (e.g., resistencia a ampicilina, resistencia a higromicina, resistencia a tetraciclina, resistencia a canamicina o
resistencia a neomicina) para permitir la detección de aquellas células transformadas con las secuencias de ADN deseadas (ver, e.g., Itakura et al., Patente de E.U. No. 4,704,362). Además, de las secuencias de cásete de ADN de inmunoglobulina, las secuencias de inserción y las secuencias de regulación, los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden contener secuencias adicionales, tales como las secuencias que regulan la replicación del vector en células huésped (e.g., orígenes de replicación) y genes de marcador elegibles. El gen marcador seleccionable facilita la selección de células huésped en las cuales el vector se ha introducido (ver, e.g., Pat. de E.U. Nos. 4,399,216, 4,634,665 y 5,179,017, todas por Axel et al.), por ejemplo, típicamente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a drogas tales como G418, higromicina, o metotrexato, en una célula huésped en la cual se ha introducido el vector. Los genes marcador elegibles preferidos incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR)
(para uso en células huésped dhfr- con selección/amplificación de metotrexato) y el gen neo (para selección G418) . Una vez que el vector se ha incorporado en el huésped apropiado, el huésped se mantiene bajo condiciones adecuadas para la expresión a alto nivel de las secuencias de nucleótidos, y la recolección y purificación de los
anticuerpos deseados. Se prefieren las células de mamífero para la expresión y producción de los anticuerpos de la presente invención. Ver e.g., Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y. , N.Y. , (1987). Se prefieren las células eucarióticas debido a que se han desarrollado en la técnica una cantidad de líneas de célula huésped adecuadas capaces de visualizar proteínas heterólogas (e.g., inmunoglobulinas intactas) , e incluyen líneas de célula CHO, varias líneas de célula COS, células HeLa, preferentemente, líneas celulares de mieloma, o células B transformadas o hibridomas. Preferentemente, las células son no humanas. Las células huésped de mamífero preferidas para la expresión de los anticuerpos de la invención incluyen células de ovario de hámster Chino (células CHO) (incluyendo las células CHO dhfr-, descritas en Urlaub y Chasin (1980) Proc. Nati. Acad. Sci., EUA 77:4216-4220, utilizadas con un marcador seleccionable DHFR, e.g., como se describe en Kaufman y Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), líneas de célula linfocítica, e.g., células NSO de mieloma y células SP2, células COS y células derivadas de un animal transgénico, e.g., célula epitelial de mamífero. Se conocen en la técnica otras células huésped adecuadas. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias de control de expresión, tales como un origen de replicación, un promotor y un mejorador (Queen et
al., Immunol . Rev., 89:49 (1986)), y sitios de información de procesamiento necesarios, tales como sitios de unión de ribosoma y secuencias de terminación transcripcionales. Las secuencias de control de expresión preferidas son promotores derivados de genes de inmunoglobulina, SV40, adenovirus, virus de papiloma bovino, citomegalovirus y lo similar. Ver, e.g., Co. et al., (1992) J. Immunol . , 148:1149. Las secuencias reguladoras preferidas para la expresión de células huésped de mamífero incluyen elementos virales que dirigen los altos niveles de expresión de proteínas en células de mamífero, tales promotores y/o mejoradores derivados del promotor FF-la y BGH poli A, citomegalovirus (CMV) (tales como el promotor/mejorador CMV) , virus de simio 40 (SV40) (tal como el promotor/mejorados SV40) , adenovirus (e.g., el promotor final principal de adenovirus (AdMLP)), y polioma. Para una descripción adicional de los elementos reguladores virales, y sus secuencias, ver, e.g., Pat. de E.U. No. 5,168,062 por Stinski, Pat. de E.U. No. 4,510,245 por Bell et al., y Patente de E.U. No. 4,968,615 por Schaffner et al. en modalidades ejemplares, los genes de cadena pesada y ligera de anticuerpo se encuentran operativamente unidos a los elementos reguladores mej oradores/promotores (e.g., derivados de SV40, CMV, adenovirus y lo similar, tales como el elemento regulador mejorador de CMV/promotor de AdMLP o un elemento regulador
mejorador de SV40/promotor de AdMLP) para conducir los altos niveles de transcripción de los genes. En modalidades ejemplares de la invención, la estructura incluye un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) para proporcionar relativamente altos niveles de los polipéptidos de la invención en células huésped eucarióticas. Las secuencias IRES compatibles se describen en la Pat. de E.U. No. 6,193,980 que también se incorpora en la presente. Alternativamente, las secuencias decodificación de anticuerpos pueden incorporarse en un transgen para la introducción en el genoma de un animal transgénico y la subsecuente expresión en la leche del animal transgénico (ver e.g., Deboer et al., US 5,741,957, Rosen, US 5,304,489 y Meade et al., US 5,849,992). Los transgenes adecuados incluyen secuencias de codificación para las cadenas ligera y/o pesada en la unión operable con un promotor y mejorados de un gen específico de glándula mamaria, tal como caseína o beta lactoglobulina . Las células eucarióticas también pueden ser adecuadas para la producción de los anticuerpos de la invención. E. coli es un huésped procariótico particularmente útil para la clonación de los polinucleótidos
(e.g., secuencias de ADN) de la presente invención. Otros huéspedes microbiales adecuados para su uso incluyen bacilos, tales como Bacilus subtilis, enterobacteriáceas, tales como
Escherichia, Salmonella y Serratia y varias especies de Pseudomonas. En estos huéspedes procarióticos, también pueden producirse vectores de expresión, que típicamente contienen secuencias de control de expresión compatibles con la célula huésped (e.g., un origen de replicación) . Adicionalmente, se encontrarán presentes cualquier cantidad de una variedad de promotores muy conocidos, tales como el sistema promotor de lactosa, un sistema promotor de triptofán (trp) , un sistema promotor de beta-lactamasa o un sistema promotor del fago lambda. Los promotores típicamente controlarán la expresión, opcionalmente con una secuencia operadora, y tendrán secuencias del sitio de unión de ribosoma y lo similar, para iniciar y completar la transcripción y la translación. La expresión de proteínas en eucariotos se lleva a cabo más frecuentemente en E. coli con los vectores conteniendo promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas ya sea de fusión o de no fusión. Los vectores de fusión agregan un número de aminoácidos a un anticuerpo codificado en los mismos, frecuentemente a la región constante del anticuerpo recombinante, sin afectar la especificidad o el reconocimiento de antígeno del anticuerpo. La adición de los aminoácidos del péptido de fusión puede agregar una función adicional al anticuerpo, por ejemplo como un marcador (e.g., marca de epítope tal como myc o flag) .
También son útiles para la expresión otros microbios tales como levadura. Saccharomyces es un huésped de levadura preferido, con vectores adecuados que tienen secuencias de control de expresión (e.g., promotores), un origen de replicación, secuencias de terminación y lo similar según se desee. Los promotores típicos incluyen 3-fosfoglicerato cinasa y otras enzimas glicolíticas . Los promotores de levadura inducibles incluyen, entre otros, promotores de alcohol dehidrogenasa, isocitocromo C, y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa . Alternativamente, los anticuerpos de la invención pueden producirse en plantas transgénicas (e.g., tabaco, maíz, soja y alfalfa) . Los vectores mejorados de "cuerpo vegetal" (Hendy et al., (1999) J. Immunol . Methods 231:137-146) las estrategias de purificación acopladas con un incremento en las especies de cultivo transformable, hacen a tales métodos un medio práctico y eficiente para la producción de inmunoglobulinas recombinantes no solo para terapia humana y animal, sino también para aplicaciones industriales (e.g., anticuerpos catalíticos). Además, los anticuerpos producidos de plantas han mostrado ser seguros y efectivos y evitan el uso de materiales derivados de animales y en consecuencia el riesgo de contaminación con un agente transmisible de encefalopatía espongiforme (TSE) . Además,
las diferencias en los patrones de glicosilación de anticuerpos producidos de células vegetales y de mamífero tienen poco o ningún efecto en la unión o especificidad al antígeno. Además, no se ha observado evidencia de toxicidad o HAMA en pacientes que reciben la aplicación tópica oral de un anticuerpo IgA dimérico secretorio derivado de plantas (ver, e.g., Larrick et al., (1998) Res. Immunol . , 149:603-608) . Pueden utilizarse varios métodos para expresar anticuerpos recombinantes en plantas transgénicas. Por ejemplo, pueden clonarse independientemente las cadenas pesada y ligera de anticuerpo en vectores de expresión (e.g., vectores de Agrobacterium tumefaciens) , seguido por la transformación del tejido vegetal in vitro con bacterias recombinantes o transformación directa utilizando, e.g., las partículas recubiertas con el vector que después se introducen físicamente en el tejido vegetal utilizando, e.g., balística. Subsecuentemente, se reconstituyen plantas completas que expresan cadenas individuales seguido por su cruza sexual, dando como resultado finalmente la producción de un anticuerpo completamente ensamble y funcional. Se han utilizado protocolos similares para expresar los anticuerpos funcionales en plantas de tabaco (ver, e.g., Hiatt et al.,
(1989) Nature 342:76-87). En varias modalidades, pueden utilizarse secuencias de señal para promover la expresión,
unión y duplicación de cadenas de anticuerpo no ensambladas dirigiendo las cadenas a un ambiente vegetal apropiado (e.g., el ambiente acuoso del apoplasma u otros tejidos vegetales específicos incluyendo tubérculos, frutos o semillas) (ver Fiedler et al., (1995) BioTechnology 13:1090-1093). Los biorreactores vegetales también pueden utilizarse para incrementar la producción de anticuerpo y para reducir significativamente los costos. Las células huésped adecuadas se tratan adicionalmente en Goeddel (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. Alternativamente, el vector de expresión recombinante puede transcribirse y traducirse in vitro, por ejemplo utilizando secuencias reguladoras de promotor T7 y T7 polimerasa. Los vectores que contienen las secuencias de polinucleótidos de interés (e.g., las secuencias que codifican para la cadena pesada y ligera y las secuencias de control de expresión) pueden transferirse en la célula huésped mediante métodos muy conocidos, que varían dependiendo del tipo de huésped celular. Por ejemplo, se utiliza comúnmente la transfección de cloruro de calcio para células procarióticas, aunque puede utilizarse el tratamiento de fosfato de calcio, electroporación, lipofección, biolística o transfección de base viral para otros huéspedes celulares. (Ver en general, Sambrook et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2a edición, 1989) , incorporada por la referencia en la presente en su totalidad para todo propósito) . Otros métodos utilizados para transformar células de mamífero incluyen el uso de polibreno, fusión de protoplasto, liposomas, electroporación, y microinyección (ver en general, Sambrook et al., supra) . Para la producción de animales transgénicos, pueden microinyectarse los transgenes en oocitos fertilizados, o pueden incorporarse en el genoma de células embriónicas progenitoras, y los núcleos de tales células transferirse en oocitos enucleados. Cuando se clonan las cadenas pesada y ligera en vectores de expresión separados, los vectores se co-transfectan para obtener la expresión y ensamble de inmunoglobulinas intactas. Una vez expresados, los anticuerpos completos, sus dímeros, cadenas ligera y pesada individuales u otras formas de inmunoglobulina de la presente invención, pueden purificarse de acuerdo con procedimientos estándar de la técnica, incluyendo precipitación de sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía de columna, purificación HPLC, electroforesis de gel y lo similar (ver en general, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag N.Y.,
(1982)). Se prefieren las inmunoglobulinas sustancialmente puras de al menos aproximadamente 90 a 95% de homogeneidad y son más preferidas con 98 a 99% o más homogeneidad para usos
farmacéuticos . Una inmunoglobulina o anticuerpo producido de acuerdo con la molécula de la presente invención, puede derivatizarse o unirse a otra molécula funcional (e.g., otro péptido o proteína) . En consecuencia, los anticuerpos y porciones de anticuerpo o de otra manera las formas modificadas de los anticuerpos de la invención descritos en la presente, pueden derivatizarse además para su uso en contextos de investigación, diagnósticos y/o terapéuticos. Por ejemplo, un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención puede encontrarse funcionalmente unido (mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra manera) a una o más entidades moleculares diferentes, tales como otro anticuerpo (e.g., un anticuerpo biespecífico o diabody) , un agente detectable, un agente citotóxico, un agente farmacéutico, y/o una proteína o péptido que pueda mediar asociado al anticuerpo o porción de anticuerpo con otra molécula (tal como la región de núcleo de estreptavidina o una marca de polihistidina) . Un tipo de anticuerpo derivatizado se produce mediante reticulación de dos o más anticuerpos (del mismo tipo o de tipos diferentes e.g., para crear anticuerpos biespecíficos) . Los reticuladores adecuados incluyen aquellos que son heterobifuncionales, que tienen dos distintos grupos reactivos separados por un separador
apropiado (e.g., m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida éster) u homobifuncional (e.g., disuccinimidil suberato) . Tales uniones se encuentran disponibles de Pierce Chemical Company, Rockford, IL. Los agentes fluorescentes detectables incluyen fluorescencia, isotiocianato de fluorescencia, rodamina, 5-dimetilamina-1-naftalenosulfon-il cloruro, ficoeritrina y lo similar. Un anticuerpo también puede derivatizarse con enzimas detectables, tales como alcalina fosfatasa, peroxidasa horseradish, P-galactosidasa, acetilcolinaesterasa, glucosa oxidasa y lo similar. Cuando un anticuerpo se derivatiza con una enzima detectable, se detecta agregando reactivos adicionales que utilizan la enzima para producir un producto de reacción detectable. Por ejemplo, cuando se encuentra presente el agente detectable de peroxidasa horseradish, la adición de peróxido de hidrógeno y diaminobencidina conduce a un producto de reacción coloreado, que es detectable. un anticuerpo también puede derivatizarse con un grupo prostético (e.g., estreptavidina/biotina y avidina/biotina) . Por ejemplo, un anticuerpo puede derivatizarse con biotina, y detectarse a través de la medición indirecta de la unión de avidina o estreptavidina. Ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluorescencia, isotiocianato de fluorescencia, rodamina, fluorescencia de diclorotriazinilamina, dansil
cloruro o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol ; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina, una aecuorina y ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen 125I, 131I, 35S o 3H. Un anticuerpo (o su fragmento) también puede conjugarse a un residuo terapéutico tal como una citotoxina u otra proteína terapéutica. Alternativamente, un anticuerpo puede conjugarse a un segundo anticuerpo para formar un heteroconjugado de anticuerpo como se describe por Segal en la Patente de E.U. No. 4,676,980. Vectores de Expresión para Disminuir o Eliminar Sub-productos de Polipéptido No deseados Durante el desarrollo de un sistema de expresión de proteínas para proteínas terapéuticas, el análisis de HPLC del producto objetivo purificado identificó inesperadas especies de péptido de bajo peso molecular (LMW) . Más específicamente, se observaron sub-productos de polipéptido no deseados en una línea de célula CHO (ovario de hámster Chino) desarrollada para expresar el anticuerpo 3D6. Este anticuerpo se ha descrito en otras partes y es el resultado de esfuerzos por desarrollar un agente inmunoterapéutico útil para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. Ésta tiene especificidad para el péptido A-beta y ha demostrado ser eficaz para purificar placas A-beta. La línea de célula CHO se desarrolló utilizando métodos aceptados en la técnica
y contuvo copias de la cadena pesada y ligera del anticuerpo 3D6 además de genes para el cultivo selectivo de células que contienen el cásete de expresión. El examen de un número de aislados clónales de la línea celular demostró que la producción de las especies de LMW no fue un fenómeno específico al clone que se utiliza, i.e., una fracción menor del total de proteína producido en todas las líneas celulares probadas fue de las inesperadas especies LMW. Se observó además que la fracción de las especies de LMW relativa al total de proteína aumentó cuando se indujo la expresión de proteína. Además, la evaluación de los polipéptidos utilizando espectrometría de masa indicó que las especies de LMW contuvo aminoácidos no predichos por las secuencias exónicas del gen. El panel superior de la Figura 1 presenta esquemáticamente el cásete de expresión de cadena pesada 3D6 mostrando la relación de intrones y exones así como la posición del sitio de entrada ribosomal interno (IRES) y el gen marcador seleccionable de dihidrofolato reductasa (DHFR) . Los exones mostrados son pesados variables (VH1) , de articulación y pesados constantes 1, 2 y 3 (CH1, CH2 , CH3). Los intrones del cásete de expresión se denotan Intl, Int2, Int3 e Int4. La Figura 1 ilustra además los eventos de empalme correctos predichos para el ARNm derivado del cásete de expresión. El panel medio muestra el ARNm correctamente
empalmado conteniendo solo secuencias intrónicas de la transcripción bicistrónica. El escrutinio de las secuencias intrónicas y exónicas en el vector de expresión y los datos de espectrometría de masa apuntaron a la lectura traspasada de intrón (IRT) de ARN polimerasa de una unión específica del sitio de empalme. Dado que la organización de los intrones y exones y del donante del sitio de empalme y los sitios receptores contenidos en el vector de expresión fueron sustancialmente idénticos a los existentes en la forma genómica original del gen, el evento de mal empalmado no fue predecible . El panel inferior de la Figura 1 ilustra el producto predicho generado mediante la lectura traspasada de intrón del cuarto intrón. La Figura 2 proporciona información de secuencia que muestra las cadenas de sentido y antisentido de la secuencia de ADN en la región del cuarto intrón de la secuencia genómica del vector de expresión del anticuerpo 3D6. Las uniones de empalme (sitios de empalme donantes y receptores) se denotan mediante líneas verticales perpendiculares a la secuencia de ácido nucleico. El ADN que corresponde a la secuencia intrónica se muestra subrayado y en itálicas. Los aminoácidos predichos para polipéptidos deseados de sub-productos de lectura se muestran bajo la cadena de antisentido del ADN genómico. La secuencia de
aminoácidos del polipéptido derivado del ARN correctamente empalmado se muestra en letras altas negritas; los subproductos de polipéptido derivados del ARN incorrectamente empalmado se muestran en fuente baja. La presente invención describe materiales y métodos para diseñar casetes y vectores de expresión de proteínas de manera tal que los sub-productos de polipéptido de lectura traspasada de intrón (IRT) y no deseados se reducen sustancialmente o se eliminan completamente. En parte, la invención proporciona el nuevo diseño de vectores en donde la asociación operativa natural de intrones y exones en un ácido nucleico aislado que codifica para una proteína de interés se alteram de manera que se reduce o se elimina la IRT reduciendo o eliminando así las especies de polipéptido de IRT no deseadas. Las alteraciones únicas son particularmente adecuadas para anticuerpos IgGl o IgG4, pero pueden utilizarse para cualquier gen de interés. Además, los vectores de la presente invención que tienen intrones y exones con asociaciones operativas naturales alteradas demuestran no solo reducción o eliminación de sub-productos de IRT sino también aumento en los niveles de expresión de proteína para los vectores designados utilizando técnicas estándar reconocidas en la técnica. Ej mplos Materiales y Métodos
A lo largo de los ejemplos, se utilizaron materiales y métodos ejemplificados en el siguiente texto a menos que se indique de otra manera: En general, la práctica de la presente invención emplea técnicas reconocidas en la técnica en biología molecular, tecnología de ADN recombinante, e inmunología, especialmente, e.g., tecnología de anticuerpos. Ver e.g., Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ; Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul S., Human Press (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed. IRL Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., Cold Spring Harbor Press, (1999); y Current Protocols in Molecular Biology eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992). Ejemplo 1. Cuantificación de Transcripción de Lectura traspasada de intrón A fin de cuantificar la cantidad relativa de transcripción aberrante formada debido a la lectura traspasada de intrón, se diseñó un análisis de PCR cuantitativa. El procedimiento para evaluar la transcripción de IRT se señala gráficamente en la Figura 3. Específicamente se diseñó un análisis de PCR cuantitativo utilizando un sistema TaqMan3, en el cual se empleó la amplificación PCR para cuantificar las especies de ácido
nucleico de interés. Se diseñaron tres grupos de sonda-iniciador para determinar la fracción de ARNm de lectura traspasada de intrón que se produce . El primer grupo de sonda-iniciador se diseñó para cuantificar el nivel de transcripción de secuencias de un exón en una asociación operativa natural con un intrón de interés. En el caso del cásete de expresión de cadena pesada 3D6, se dirigió a especies de ARNm conteniendo el exón de la segunda cadena pesada constante 3D6 (CH2) . Esto proporcionó una medición de la producción total de ARNm 3D6. El segundo grupo de sonda iniciador formó un puente entre el intrón y el exón en asociación operativa, aquí la interfaz de exón CH2 -cuarto intrón del cásete de expresión 3D6. La amplificación derivada de este grupo de sonda iniciador indicó la presencia de transcripción de lectura traspasada de intrón conteniendo la secuencia donante de empalme 5' así como el puente entre el exón CH2 y el intrón 4. El tercer grupo de sonda-iniciador se dirigió a la secuencia del cuarto intrón. Este grupo de sonda proporcionó la cuantificación de la fracción del ARN correctamente empalmado comprendiendo la secuencia interna del intrón 4. La Figura 4 muestra los resultados del análisis Q-PCR utilizando los grupos de sonda iniciador como se describe. Brevemente, las células CHO conteniendo el vector de expresión establemente integrado se sembraron y se
mantuvieron en cultivo durante dos semanas. Al séptimo día se indujeron los cultivos para incrementar la expresión de proteínas. Durante el curso del experimento, las muestras del cultivo celular se lisaron y se evaluó el contenido de ARN en análisis utilizando grupos de sonda e iniciados específicos para el exón CH2 o específicos para el intrón como se describió en el párrafo precedente. El esquema demostró un bajo nivel de producto de ARN incorrectamente empalmado previo a la inducción y un aumento en el porcentaje de intrón 4 conteniendo ARN durante el tiempo post-inducción. Este método de Q-PCR descrito en la presente predice la probabilidad de que un cásete de expresión particular conteniendo intrones y exones en asociación operativa natural producirá sub-productos de lectura traspasada de intrón. Aunque se proporcionan de manera explícita los detalles para cuantificación de IRT del sistema de expresión de anticuerpo 3D6, la técnica puede implementarse en cualquier sistema de expresión de proteína en donde existe el potencial de IRT. Este nuevo procedimiento, en consecuencia, es especialmente útil para evaluar si los vectores de esta invención (descritos en detalle abajo) deben adoptarse para una proteína particular de interés de manera que se evite la producción de sub-productos de polipéptido de IRT no deseados. Cuando la transcripción de IRT se encuentra en abundancia mayor que aproximadamente 0.1%-1%, pueden
emplearse vectores que emplean asociación operativa natural para expresar la proteína deseada. Será fácilmente aparente para el experto en la técnica que los métodos para detectar el ARNm de lectura traspasada de intrón, y por tanto, para predecir polipéptidos de lectura traspasada de intrón son aplicables a cualquier sistema de expresión de proteínas en donde se presentan eventos de empalme. Por ejemplo, el sistema puede utilizarse con cualquier sistema celular eucariótico, e.g., sistemas a base de células Saccharomyces, Drosophila, de ratón, mono, conejo, rata o humanas. Ejemplo 2. Vectores con Intrones y Exones que Tienen
Asociación Operativa Natural Se diseñaron vectores de expresión en donde la asociación operativa natural de los intrones y exones se modificó. Se muestran en la Figura 5 dos secuencias de vectores ejemplares. Esta figura ilustra estructuras de expresión desarrolladas para resolver el problema de los subproductos de lectura traspasada de intrón. El panel superior ilustra gráficamente la organización genómica, intrónica-exónica de una cadena pesada de anticuerpo genérica conteniendo los exones para una región variable (VH) , tres regiones constantes (CH1, CH2, CH3) y una región de articulación. Los dibujos medio e inferior describen modificaciones a la secuencia genómica incorporadas en vectores de expresión que eliminaron los sub-productos de
cadena pesada de lectura traspasada de intrón. Las células CHO que expresan la cadena ligera 3D6 se transformaron ya sea con la secuencia de cadena pesada genómica completa del anticuerpo 3D6 o se transformaron con vectores de expresión de cadena pesada 3D6 modificados en donde la asociación operativa natural de intrones y exones se modificó. Las células se cultivaron utilizando técnicas estándar para el propósito de expansión de proteínas como se describe en Materiales y Métodos. Los anticuerpos se purificaron a partir del sobrenadante acondicionado y subsecuentemente se fraccionaron utilizando HPLC en fase inversa de desnaturalización (RP) (Figura 6) . Las columnas funcionaron de manera que los constituyentes de cadena pesada y ligera del anticuerpo se disolvieran. En el trazo superior, representando el fraccionamiento de una preparación de proteína de clon genómico 3D6, son fácilmente aparentes los picos de cadenas pesada y ligera. Además, puede discernirse un pequeño pico que se fracciona entre la cadena pesada y ligera correspondiente al producto de lectura traspasada de intrón de cadena pesada. El trazo inferior es un ejemplo de un sistema de expresión en el cual se ha reducido el problema de lectura traspasada de intrón. Como en el trazo superior, los picos de cadena ligera y cadena pesada se encuentran claramente
presentes, sin embargo, el nivel de IRT se ha reducido por debajo del límite de detección. El descubrimiento se ha extendido a otros vectores en los cuales la asociación operativa natural de exones e intrones se ha alterado. Por ejemplo, la secuencia de HC?Intron 4 descrita en la Figura 5 reduce de manera similar la IRT a niveles no detectables. La Tabla 1 muestra el detalle de la secuencia de HC?Intron 4 descrita en la Figura 5. Table 1: hu3D6 v2 HC - ?4 ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAGG TGCAGCTGCTGGAGTCCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCTCCCTGCGCCTGTCCTG CGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAACTACGGCATGTCCTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGC AAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCTCCATCCGCTCCGGCGGCGGCCGCACCTACTACTCCGACA ACGTGAAGGGCCGCTTCACCATCTCCCGCGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGAT GAACTCCCTGCGCGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGTGCGCTACGACCACTACTCC GGCTCCTCCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCCGGTGAGTCCTGTC GACTCTAGAGCTTTCTGGGGCAGGCCAGGCCTGACTTTGGCTGGGGGCAGGGAGGGGGCTA AGGTGACGCAGGTGGCGCCAGCCAGGCGCACACCCAATGCCCATGAGCCCAGACCTGGACG CTGAACCTCGCGGACAGTTAAGAACCCAGGGGCCTCTGCGCCCTGGGCCCAGCTCTGTCCC ACACCGCGGTCACATGGCACCACCTCTCTTGCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCC CCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAG GACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGC ACACTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTG CCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACA CCAAGGTGACAAGAAAGTTGGTGAGAGGCCAGCACAGGGAGGGAGGGTGTCTGCTGGAAGC
CAGGCTCAGCGCTCCTGCCTGGACGCATCCCGGCTATGCAGTCCCAGTCCAGGGCAGCAAG GCAGGCCCCGTCTCCTCTTCACCCGGAGGCCTCTGCCCGCCCCACTCATGCTCAGGGAGAG GGTCTTCTGGCTTTTTCCCCAGGCTCTGGGCAGGCACAGGCTAGGTGCCCCTAACCCAGGC CCTGCACACAAAGGGGCAGTGCTGGGCTCAGACCTGCCAAGAGCCATATCCGGGAGGACCC TGCCCCTGACCTAAGCCCACCCCAAAGGCCAAACTCTCCACTCCCTCAGCTCGGACACCTT CTCTCCTCCCAGATTCCAGTAACCCCAATCTTCTCTCTGCAGAGCCCAAATCTTGTGACAA AACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGGTAAGCCAGCCCAGGCCTCGCCCTCCAGCTCAAGG CGGGACAGGTGCCCTAGAGTAGCCTGCACCAGGGACAGGCCCCAGCCGGGTGCTGACACGT CCACCTCCATCTCTTCCTCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCC CCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGG ACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCA TAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACACACGTACCGTGTGGTCAGCGTCC TCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAA AGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCA CAGGTGTACACCCGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTG CCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCG GAGAACAACTACAAGACCCGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAG CAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATG CATGAGGCTCTGCACAACCACTAACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAATGA Ejemplo 3. El Retiro de Intrón Aumenta la Expresión de
Proteína Para determinar el efecto del retiro de intrón en la expresión del anticuerpo, se crearon estructuras de expresión de un anticuerpo con números diferentes de intrones. Las regiones variables de 12Allv3.1 se expresaron
de manera estable en células CHO con tres estructuras de expresión de región constante conteniendo la secuencia genómica, la secuencia de ADNc, y la secuencia genómica con tres intrones suprimidos (i.e., el intrón entre CH1 y la región de articulación, el intrón entre la región de articulación y CH2 , y el intrón entre CH" y CH3) . Para el 12Allv3.1, el retiro de los intrones produjo un aumento significativo en la expresión del anticuerpo. Más específicamente, se detectó un aumento de aproximadamente cinco veces en la expresión en la estructura de tres intrones suprimidos para 12Allv3.1 en comparación con la secuencia genómica. La estructura 12Allv3.1 que tiene la secuencia de ADNc mostró un aumento de hasta seis veces en la expresión en relación con la secuencia genómica. En consecuencia, los anticuerpos bien expresados típicamente no mostraron un cambio significativo en la expresión de células CHO entre las secuencias con intrón suprimido y las secuencias genómicas. Aunque la invención anterior se ha descrito en detalle para propósitos de claridad y comprensión, será obvio que pueden practicarse ciertas modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones y documentos de patente citados en la presente, así como el texto que aparece en las figuras y la lista de secuencias, se incorporan en la presente por la referencia en su totalidad para todo propósito en la misma medida en que se
denotaran individualmente. La especificación se comprende más completamente a la luz de las enseñanzas de las referencias citadas dentro de la especificación que se incorporan en la presente por la referencia. Las modalidades en la especificación proporcionan una ilustración de modalidades en esta descripción y no deben tomarse como limitantes de su alcance. El técnico experto reconoce fácilmente que muchas otras modalidades se encuentran abarcadas por esta descripción. Todas las publicaciones y patentes citadas y las secuencias identificadas por los números de referencia de acceso o de la base de datos en esta descripción se incorporan por la referencia en su totalidad. En la medida en que el material incorporado por la referencia contradiga o sea inconsistente con la presente especificación, la presente especificación sustituye tal material. La cita de toda referencia en la presente no es una admisión de que tales referencias sean la técnica anterior a la presente descripción. A menos que se indique de otra manera, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, cultivos celulares, condiciones de tratamiento, etcétera, utilizados en la especificación, incluyendo las reivindicaciones, deben entenderse modificados en todos los ejemplos por el término "aproximadamente" . En consecuencia, a menos que se indique lo contrario, todos los parámetros numéricos son
aproximaciones y pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se busca obtener por la presente invención. A menos que se indique de otra manera, el término "al menos" precediendo una serie de elementos, debe entenderse referente a todo elemento en la serie. Los expertos en la técnica reconocerán o serán capaces de lograr utilizando no más que experimentación de rutina, muchos equivalentes a las modalidades específicas de la invención descritos en la presente. Tales equivalentes pretenden encontrarse abarcados por las siguientes reivindicaciones.