CZ371296A3 - Interleukin-5 specifické rekombinantní protilátky - Google Patents

Interleukin-5 specifické rekombinantní protilátky Download PDF

Info

Publication number
CZ371296A3
CZ371296A3 CZ963712A CZ371296A CZ371296A3 CZ 371296 A3 CZ371296 A3 CZ 371296A3 CZ 963712 A CZ963712 A CZ 963712A CZ 371296 A CZ371296 A CZ 371296A CZ 371296 A3 CZ371296 A3 CZ 371296A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
antibody
residues
ser
light chain
human
Prior art date
Application number
CZ963712A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ292295B6 (cs
Inventor
John Spencer Emtage
Mark William Bodmer
Diljeet Singh Athwal
Original Assignee
Celltech Therapeutics Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Celltech Therapeutics Limited filed Critical Celltech Therapeutics Limited
Publication of CZ371296A3 publication Critical patent/CZ371296A3/cs
Publication of CZ292295B6 publication Critical patent/CZ292295B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Description

Oblast techniky ***“*^--f
Předložený vynález se týká rekombinantní protilátkové molekuly (RAM) a zejména humanizované protilátkové molekuly (HAM), mající specifitu pro lidský interleukin-5 (hIL-5), nukleových kyselin, které kódují variabilní domény těžkého a lehkého řetězce uvedené rekombinantní protilátky, způsobu produkce uvedené protilátky za použití rekombinantní DNA technologie a terapeutického použití rekombinatní protilátky.
V předložené přihlášce výraz rekombinantní protilátková molekula (RAM) je použit pro popis protilátky produkované způsobem, zahrnujícím použití rekombinantní DNA technologie. Výraz humanizovaná protilátková molekula (HAM) je použit pro popis molekuly získané z lidského imunoglobulinu. Antigen vázající místo může obsahovat buď kompletní variabilní domény fúzované ke konstantním doménám nebo jeden nebo více komplementárnch determinujících regionů (CDR) naroubovaných ke vhodným rámečkům regionům ve variabilní doméně. Zkratka MAb je použita k označení monoklonální protilátky.
Výraz rekombinantní protilátková molekula zahrnuje nejen kompletní imunoglobulinové molekuly, ale také jakékoliv antigen vázající imunoglobulinové fragmenty jako Fv, Fab a F(ab’)2 fragmenty a jakékoliv jejich deriváty jako jsou jednořetězcové Fv fragmenty.
Přírodní imunoglobuliny byly užívány v esejích, diagnóze a v omezeném rozsahu v terapii. Použití imunoglobulinů v terapii bylo bráněno tím, že většina protilátek potenciálního použití jako terapeutická činidla jsou MAb produkované fúzí náhradní list buněk sleziny hlodavců s buňkami myelomu hlodavců. Tyto Mab jsou tak v podstatě hlodavci proteiny. Použití těchto MAb jako terapeutických činidel u lidí může zvýšit nežádoucí imunitní odpověď nazvanou HAMA (z anglického Human Anti-mouše
Antibody). Použití hlodavcích MAb jako terapeutických činidel u lidí je inherentně omezeno skutečností, že lidský subjekt bude poskytovat imunologickou odezvu k MAb, která buď odstraní úplně nebo alespoň redukuje její účinnost.
Bylo vyvinuto mnoho technik pro snížení antigenických charakteristik takových lidských MAb. Tyto techniky obecně zahrnují použití rekombinantní DNA technologie k sestavení DNA sekvencí, kódujících polypeptidové řetězce protilátkové molekuly. Tyto metody jsou obecně nazývány jako humanizační techniky.
Nejnovější metody pro humanizaci MAb zahrnují produkci chimérních protilátek, ve kterých antigen vázající místa, obsahující kompletní variabilní domény jedné protilátky, jsou fúzována ke konstantním doménám získaným z jiné protilátky. Metody pro provedení takových chimerizačních postupů jsou popsány v EP 0120694 (Celltech Limited) a EP 0125023 (Genentech lne. a City of Hope). Humanizované chimerní protilátky však ještě obsahují významný podíl ne-humánních aminokyselinových sekvencí a mohou ještě stále vyvolávat určitou HAMA odezvu, zejména jsou-li podávány po delší dobu (Begent a spol., Br.J.Cancer, 62, 487 (1990)).
Alternativní řešení, popsané v EP-A-0239400 (Vinter), zahrnuje naroubování komplementaritu determinujícího regionu (CDR) myší MAb na rámečky regionů variabilních domén lidského imunoglobulinu za použití rekombinantních DNA technik Existují tři CDR (CDR1, CDR2 a CDR3) v každých variabilních náhradní list doménách těžkého a lehkého řetězce. Takové CDR-roubované humanizované protilátky pravděpodobně mnohem méně zvyšují HAMA odpověď než humanizované chimerní protilátky vzhledem ke mnohem nižšímu podílu ne-humánních aminokyselinových sekvencí, které obsahují. V Riechmann a spol. (Nátuře, 332, 323-324 (1988)) bylo nalezeno, že transfer CDR samotných, jak definuje Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US DEpartment of Health and Human Services, NIH, USA (1987)) nebyl dostačující pro poskytnutí vyhovující antigen vázající aktivity v CDR-roubovaném produktu. Riechmann a spol. zjistili, že bylo nezbytné konvertovat mnoho zbytků mimo CDR, zejména ve smyčce připojené k CDR1. Avšak vazebná afinita nejlepších CDR-roubovaných získaných protilátek byla ještě významnější než původní MAb.
Ve VO 91/09967, Adair a spol., popisují CDR-roubovanou protilátku těžkého a lehkého řetězce a determinují hierarchii donorových zbytků.
Ve VO 93/16184 Chou a spol. popisují dezén, klonování a expresi humanizovaných monoklonálních protilátek proti lidskému interleukinu-5. Je navržen způsob selekce lidských protilátkových sekvencí, které mají být použity jako humánní rámečky pro humanizaci zvířecích protilátek, zahrnující stupně porovnání humánních variabilních doménových sekvencí s variabilními doménovými sekvencemi ze zvířecí MAb, která se humanizuje, na procentickou identitu, sekvenční dvojznačnosti a podobné PIN-regionové vzdálenosti. PIN-regionová vzdálenost je definována jako počet zbytků mezi cysteinovými zbytky, tvořícími intra doménové disulfidové můstky. Vybere se lidská protilátka, mající nej lepší kombinaci těchto rysů. Je také navržena metoda stanovení, které variabilní doménové zbytky zvířecí NAb by měly být vybrány pro humanizaci, náhradní list zahrnující stanovení potenciálního minima zbytků (zbytky, které obsahují CDR strukturní smyčky a zbytky vyžadované pro podporu a/nebo orientaci CDR strukturních smyček) a maximum zbytků (zbytky, které obsahují Kabatovy CDR, CDR strukturní smyčky, zbytky vyžadované pro podporu a/nebo orientaci CDR strukturních smyček a zbytky, které spadají do asi 10 A CDR strukturní smyčky a vykazují povrch přístupný pro vodné rozpouštědlo asi 5 A nebo větší) zvířecí monoklonální protilátky. Dále se provádí počítačové modelování na všech možných rekombinantních protilátkách, zahrnujících lidskou protilátkovou rámečkovou sekvenci do které bylo inzertováno minimum a maximum zbytků. Minimum a maximum zbytků se vybere na základě kombinace, která produkuje rekombinantní protilátku, mající struturu počítačového modelu nej bližší struktuře zvířecí monoklonální protilátky. Humanizovaná získaná anti-IL-5 protilátka se jeví jako postrádající podstatné množství své afinity pro hIL-5 molekulu.
Cílem vynálezu je poskytnout humanizovanou protilátkovou molekulu, mající zlepšenou afinitu pro hIL-5 molekulu.
Podstata vynálezu
Podle předloženého vynálezu je poskytnuta RAM, mající afinitu pro lidský IL-5 a obsahující antigen vazebné regiony získané z těžkého a/nebo lehkého řetězce variabilních domén donor protilátky, mající afinitu pro lidský IL-5, RAM mající vazebnou afinitu podobnou afinitě donor protilátky.
RAM podle vynálezu může obsahovat antigen vázající regiony z jakékoliv vhodné donor anti-IL-5 protilátky.
Typicky je donor anti-IL-5 protilátka hlodavci MAb. Výhodně je donor protilátka MAb 39D10.
náhradní list
Variabilní domény těžkých a lehkých řetězců MAb 39D10 jsou zde dále popsány u obrázků 1 a 2.
Podle preferovaného aspektu vynálezu je RAM podle předloženého vynálezu anti-IL-5 protilátková molekula, mající afinitu pro lidský IL-5 antigen, obsahující kompozitní těžký řetězec a komplementární lehký řetězec, kde uvedený kompozitní těžký řetězec má variabilní doménu, obsahující převážně zbytky rámečku těžkého řetězce protilátkového akceptoru a vazebné zbytky pro těžký řetězec antigenu donor protilátky, kde uvedená donor protilátka má afinitu pro lidský IL-5, přičemž uvedený kompozitní těžký řetězec obsahuje donor zbytky alespoň v polohách 31 až 35, 50 až 65 a 95 až 102 (podle Kabatova systému číslování) [Kabat a spol., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Vol.I, páté vydání, 1991, US Department of Health and Huraan Services, National Institute of Health].
Výhodně rámeček kompozitního těžkého řetězce dále obsahuje donor zbytky v polohách 23, 24, 27-30, 37, 49, 73 a 76-78 nebo 24, 27-30, 37, 49, 72, 76 a 78.
Podle druhého preferovaného aspektu předloženého vynálezu je poskytnuta anti-IL-5 protilátková molekula, mající afinitu pro lidský IL-5 antigen, obsahující kompozitní lehký řetězec a komplementární těžký řetězec,kde uvedený kompozitní lehký řetězec má variabilní doménu, obsahující převážně zbytky rámečku lehkého řetězce protilátkového akceptoru a vazebné zbytky pro lehký řetězec antigenu donor protilátky, kde uvedená donor protilátka má afinitu pro lidský IL-5, přičemž uvedený kompozitní lehký řetězec obsahuje donor zbytky alespoň v polohách 24 až 34, 50 až 56 a 69 až 97 (podle Kabatova systému číslování).
náhradní list
Výhodně rámeček kompozitního lehkého řetězce dále obsahuje donor zbytky v polohách 22, 68 a 71 nebo v polohách a 71.
Podle třetího preferovaného aspektu předloženého vynálazu je poskytnuta anti-IL-5 protilátková molekula, mající afinitu pro lidský IL-5 antigen, obsahující kompozitní těžký řetězec podle prvního aspektu vynálezu a kompozitní lehký řetězec podle druhého aspektu vynálezu.
Výhodně každá RAM podle vynálezu má afinitní konstantu pro lidský IL-5 větší než 10”^ M.
Bude zřejmé, že vynález je v širokém rozsahu použitelný pro produkci anti-IL-5 RAM obecně. Donorová protilátka tak může být jakákoliv anti-IL-5 protilátka získaná z jakéhokoliv zvířete. Akceptorová protilátka může být získána ze zvířete stejných druhů a může to být i stejná třída nebo podtřída protilátky. Obvykleji však jsou donorové a akceptorové protilátky získány ze zvířat odlišných druhů. Typicky donorová anti-IL-5 protilátka je ne-lidská protilátka, jako je hlodavčí MAb a akceptorovou protilátkou je lidská protilátka.
Jakákoliv vhodná rámečková sekvence může být použita pokud jde o třídu nebo typ donorové protilátky, ze které jsou antigen vázající regiony získány. Výhodně typ použitého akceptorového rámečku je stejné nebo podobné třídy nebo typu jako donorová protilátka. Výhodně má zvolený rámeček nejvyšší homologii k donorové protilátce. Výhodně se použijí rámečky lidské skupiny III gama zárodečné linie pro kompozit těžkého řetězce a rámečky lidské skupiny I kappa zárodečné linie se použijí pro kompozitní lehké řetězce.
náhradní list
Konstantní regionové domény RAM podle vynálezu mohou být zvoleny s ohledem na navržené funkce protilátky, zejména efektorové funkce, které mohou být vyžadovány. Například konstantní regionové domény mohou být lidské IdA, IgE, IgG nebo IgM domény. Zejména může být použity IgG lidské konstantní regionové domény, zejména isotypu IgGl a IgG3, je-li humanizovaná protilátková molekula zamýšlena pro terapeutická použití a jsou vyžadovány protilátkové efektorové funkce. Alternativně mohou být použity IgG2 a IgG4 isotypy, je-li humanizovaná protilátková molekula zamýšlena pro terapeutické účely a nejsou vyžadovány protilátkové efektorové funkce, např. specifická vazba k a neutralizace biologické aktivity lidského IL-5. Mohou být také použity modifikované lidské konstantní regionové domény, ve kterých jeden nebo více aminokyselinových zbytků byl zaměněn nebo deletován pro změnu určité efektorové funkce. Výhodně jsou konstantní regionové domény RAM lidské IgG4.
Označení zbytků uvedené výše a jinde v předložené přihlášce jsou provedena podle číslování Kabata (Kabat a spol., Sequences of Proteins of Immunological Interest, díl.I, páté vydání, 1991, US Department of Health and Human Services, National Institute of Health). Označení zbytků tak vždy neodpovídají přímo lineárnímu číslování aminokyselinových zbytků. Aktuální lineární aminokyselinové sekvence mohou obsahovat méně nebo další aminokyseliny než v Rabatově číslování, odpovídající zkrácení, nebo inzerci do základní variabilní doménové struktury.
Také anti-IL-5 protilátkové molekuly podle předloženého vynálezu mohou být připojeny k efektorovým nebo reportérovým molekulám. Alternativně mohou být použity postupy technologie rekombinantní DNA pro produkci imunoglobulinových molekul, ve náhradní list kterých Fc fragment nebo CH3 doména kompletního imunoglobulinu byly nahrazeny, nebo byly k němu připojeny peptidovou vazbou, funkční ne-imunoglobulinový protein jako je enzym, cytokin, růstový faktor nebo toxinová molekula.
Proto zbytek protilátkových molekul nezbytně nemusí obsahovat pouze sekvence z imunoglobulinů. Například může být konstruován gen, ve kterém DNA sekvence, kódující část lidského imunoglobulinového řetězce je fúzována k DNA sekvenci, kódující aminokyselinovou sekvenci molekuly polypeptidového efektoru nebo reportéru.
Další aspekty vynálezu zahrnují DNA sekvence, kódující kompozitní těžký řetězec a kompozitní lehký řetězec. Klonovací a expresní vektory, obsahující DNA sekvence, hostitelské buňky transformované s DNA sekvencemi a způsoby produkce molekul protilátek, obsahujících DNA sekvence ve transformovaných hostitelských buňkách, jsou také dalšími aspekty vynálezu.
Obecné metody, kterými mohou být vektory konstruovány, transfekční metody a kultivační metody jsou dobře v oboru známé a netvoří část vynálezu.
DNA sekvence, které kódují anti-IL-5 donor aminokyselinové sekvence mohou být získány metodami dobře známými v oboru (viz například mezinárodní patentová přihláška č. VO 93/16184). Například anti-IL-5 kódující sekvence mohou být získány genomickým klonováním nebo cDNA klonováním ze vhodných hybridomových linií, např. buněčné linie 39D10. Pozitivní klony mohou být screenovány za použití vhodných sond pro požadované těžké a lehké řetězce. Také může být použito PCR klonování.
náhradní list
DNA, kódující akceptorové aminokyselinové sekvence, může být získána jakýmkoliv vhodným způsobem. Například DNA sekvence, kódující preferované lidské akceptorové rámečky jako je lidská skupina I lehkých řetězců a lidská skupina III těžkých řetězců, jsou v širokém rozsahu dostupné pracovníkům v oboru.
Pro přípravu požadovaných DNA sekvencí mohou být použity standardní techniky molekulární biologie. Sekvence mohou být syntetizovány kompletně nebo částečně za použití technik oligonukleotidové syntézy. Techniky místně řízené mutagenese a polymerasové řetězové reakce (PCR) mohou být použity jako vhodné. Například může být použita oligonukleotidová řízená syntéza jak popsal Jones a spol. (Nátuře 321, 522 (1986)).
Také může být použita oligonukleotidová řízená mutagenese již existujícího variabilního regionu jak je například popsána Verhoeynem a spol. (Science, 239, 1534-1536 (1988)). Také může být použito enzymatické plnění prolomených (gapped) oligonukleotidů za použití T4 DNA polymerasy, jak je například popsáno Queenem a spol. (Proč.Nati.Acad.Sci. USA, 86, 10029-10033 (1989) a ve VO 90/07861).
Pro expresi DNA sekvencí, kódujících RAM mohou být použity jakékoliv vhodné hostitelské buněčné a vektorové systémy. Výhodně se používají eukaryotické, např. savčí, hostitelské buněčné expresní systémy. Zejména vhodné savčí buňky zahrnují CHO buňky a myelomové nebo hybridomové buněčné linie.
Podle dalšího aspektu předloženého vynálezu je poskytnut způsob produkce anti-IL-5 RAM, zahrnující:
(a) produkci prvního expresního vektoru prvního operonu, náhradní list majícího DNA sekvenci, která kóduje kompozitní těžký řetězec, jak je definován podle prvního preferovaného aspektu vynálezu;
(b) popřípadě v prvním nebo druhém expresním vektoru produkci druhého operonu, majícího DNA sekvenci, která kóduje komplementární lehký řetězec, kterým může být kompozitní lehký řetězec jak je definován podle druhého preferovaného aspektu vynálezu;
(c) transfekci hostitelské buňky vektorem nebo každým vektorem;
(d) kultivaci transfektované buněčné linie pro produkci RAM.
Alternativně může způsob zahrnovat použití sekvencí, kódujících kompozitní lehký řetězec a komplementární těžký řetězec.
Pro produkci RAM, obsahujících jak těžký tak lehký řetězec, mohou být buněčné linie transfektovány dvěma vektory. První vektor může obsahovat operon, kódující kompozitní nebo komplementární těžký řetězec a druhý vektor může obsahovat operon, kódující komplementární nebo kompozitní lehký řetězec. Výhodně jsou vektory identické pokud jsou kódující sekvence a selektující markéry obsaženy tak, že umožňují, jak jen to je možné, že je stejně exprimován každý polypeptidový řetězec. V preferované alternativě může být použit jediný vektor, vektor, obsahující sekvence, kódující jak těžký řetězec tak lehký řetězec.
DNA v kóduj ících sekvencích pro těžký a lehký řetězec náhradní list může zahrnovat cDNA nebo genomickou DNA nebo obě.
Předložený vynález také zahrnuje terapeutické a diagnostické kompozice, obsahující RAM a použití takových kompozic v terapii a diagnóze.
V souladu s tím v dalším aspektu vynález poskytuje terapeutickou nebo diagnostickou kompozici, obsahující RAM podle předchozích aspektů vynálezu v kombinaci s farmaceuticky přijatelnou přísadou, ředidlem nebo nosičem.
Tyto kompozice mohou být připraveny použitím RAM podle předloženého vynálezu, například jako celých protilátek, jedno řetězcových Fv fragmentů nebo protilátkových fragmentů, jako jsou Fab nebo Fv fragmenty. Takové kompozice mají IL-5 blokující nebo antagonistické účinky a mohou být použity pro potlačení IL-5 aktivity.
Kompozice podle vynálezu mohou být formulovány v souladu s běžnou praxí pro podání jakýmkoliv vhodným způsobem a mohou obecně být v kapalné formě (např. roztok RAM ve sterilním fyziologicky přijatelném pufru) pro podání například intravenozním, intraperitoneálním nebo intramuskulárním způsobem; ve sprejové formě, například pro podání nasálním nebo bukálním způsobem; nebo ve formě vhodné pro implantaci.
Vynález také poskytuje způsob terapie nebo diagnózy, zahrnující podání účinného množství, výhodně 0,1 až 10 mg/kg tělesné hmotnosti, RAM podle předchozích aspektů vynálezu lidskému nebo zvířecímu subjektu. Přesná dávka a celková dávka se budou měnit podle zamýšleného použití RAM a věku a stavu léčeného pacienta. RAM může být podána jako jediná dávka nebo kontinuálním způsobem po časový úsek. Dávky mohou být podle náhradní list potřeby opakovány.
RAM podle předchozích aspektů vynálezu může být použita pro jakákoliv terapeutická použití, pro která byly použity nebo v budoucnosti budou použity anti-IL-5 protilátky, např. 39D10.
IL-5 je primární aktivátor eosinofilů a blokování funkce těchto cytokinů s protilátkami bylo zjištěno jako bránící nebo redukující eosinofilii, která je spojena s určitými alergickými chorobami. RAM podle vynálezu tak může být použita pro tento účel a zejména může být použita pro léčeni astma, kdy je možno očekávat, že bude bránit akumulaci a aktivaci eosinofilů v astmatických plicích a tím redukovat bronchiální zánět a zúžení dýchacích cest. Pro použití při léčení astma může RAM podle vynálezu být výhodně jednořetězcový Fv fragment formulovaný jako sprej, pro podání například nasáiní cestou.
Preferovaný protokol pro získání anti-IL-5 protilátkové molekuly v souladu s předloženým vynálezem je uveden dále. Tento protokol je uveden pro zobecnění vynálezu jak je zde popsán a definován.
39D10 krysí monoklonální protilátka působící proti lidskému IL-5 je použita jako donor protilátka. Variabilní domény těžkého a lehkého řetězce 39D10 byly již dříve klonovány (VO 93/16184) a nukleotidové a předpovězené aminokyselinové sekvence těchto domén jsou uvedeny na obr. 1 a
2. Vhodné variabilní domény akceptorú těžkého a lehkého řetězce musí být stanoveny a musí být známy aminokyselinové sekvence. RAM je pak číslována tak, že vychází ze základu akceptorové sekvence.
náhradní list . CDR
V prvním stupni jsou donorové zbytky nahrazeny za akceptorové zbytky v CDR. Pro tento účel jsou CDR definovány následovně:
těžký řetězec; CDR1 : CDR2; CDR3: zbytky 31 - 35 zbytky 50-65
zbytky 95-102
lehký řetězec: CDR1 : zbytky 24-34
CDR2: zbytky 50 až 56
CDR 3: zbytky 89 až 97
Polohy, ve kterých jsou donorové zbytky substituovány za akceptorové zbytky v rámečku jsou pak zvoleny následovně, nejprve s ohledem na těžký řetězec a následně s ohledem na lehký řetězec.
2. Těžký řetězec
2.1 Donorové zbytky jsou použity buď ve všech polohách 24, 27 až 30, 37, 49, 73, 76 a 78 nebo ve všech polohách 23,
24, 27 až 30, 37, 49, 73 a 76 až 78 těžkého řetězce.
3. Lehký řetězec
3.1 Donorové zbytky jsou použity buď ve všech polohách 22, 68 až 71 nebo ve všech polohách 68 a 71.
Předložený vynález se týká rekombinantní anti-IL-5 protilátkové molekuly, mající vazebnou afinitu v podstatě stejnou jako je afinita donorové protilátky. Předložený vynález bude nyní popsán pomocí příkladů s odkazy na připojené náhradní list obrázky .
Popis obrázků na připojených výkresech
Obrázek 1 představuje nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci 39D10 těžkého řetězce;
obrázek 2 představuje nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci 39D10 lehkého řetězce;
obrázek 3 představuje srovnání regionů rámečku variabilní domény těžkého řetězce s regiony rámečku těžkého řetězce souhlasné sekvence lidské skupiny III těžkých řetězců;
obrázek 4 představuje srovnání regionů rámečku variabilní domény lehkého řetězce s regiony rámečku těžkého řetězce souhlasné sekvence lidské skupiny III lehkých řetězců;
obrázek 5 představuje nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci CDR naroubovaného anti-IL-5 lehkého řetězce CTIL-5-gL6;
obrázek 6 představuje nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenc CDR naroubovaného anti-IL-5 těžkého řetězce CTIL-5-10gH;
obrázek 7 představuje mapu plasmidu pMR14;
obrázek 8 představuje mapu plasmidu pMR15.1;
obrázek 9 představuje afinitní konstanty a asociační a náhradní list disasociační rychlosti chimerní 39D10 protilátky a CTIL-5-10gH\-gL6 protilátky;
obrázek 10 představuje graf neutralizace IL-5 v TF1 eseji panelem protilátek;
obrázek 11 představuje výsledky kompetiční eseje pro krysí
39D10, chimerní 39D10 protilátku a CTIL-5-10gH/gL6 protilátku a obrázek 12 představuje účinek CTIL-5-10gH/gL6 na opičí eosinofilii.
Příklady provedení vynálezu
1. Materiál a metody
39D10 je krysí monoklonální protilátka působící proti lidskému IL-5. Geny pro variabilní domény těžkého a lehkého řetězce 39D10 byly již dříve klonovány (VO 93/16184) a nukleotidové a předpovězené aminokyselinové sekvence jsou uvedeny na obr. 1 a 2. Díky strategii použité při klonování variabilní domény 39D10 těžkého řetězce není prvních pět aminokyselin rámečkových regionů známých. Nicméně byl dostupný těžký řetězec, který obsahuje leader sekvenci a prvních pět aminokyselin rámečku 1 z protilátky YTH 34.5HL, Riechmann a spol.,(Nátuře, 332, 323-327 (1988)).
2. Molekulární biologické postupy
Byly použity postupy molekulární biologie jak popsal Maniatis a spol. (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, druhé vydání, sv. 1 až 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press náhradní list (1989)).
3. Konstrukce genů rekombinantního těžkého a lehkého řetězce
Těžký řetězec
Vh region těžkého řetězce byl generován PCR za použití oligonukleotidů R3601 a R2155. Jejich sekvence jsou;
83601 5 ' GCGCGCAAGCTTGCCGCCACCATGAAG( A, T) TGTGGTTAAACTGGGTTTT3 '
82155 5 ’ GCAGATGGGCCCTTCGTTG AGGCTG (A, C) (A,G)GAGAC(G,T, A)GTCA3 ’
Reakční směs (100 μΐ), obsahující 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl, 50 mM KC1, 0,01 hmotn./objem želatiny, 0,25 mM každého deoxyribonukleosid trifosfátu, 0,1 gg 39D10 DNA těžkého řetězce, 6 pmol R3601 a R2155 a 0,25 jednotek Taq polymerasy. Reakční směs byla zahřívána na 94 °C 5 minut a pak cyklována při 94 °C 1 minutu, 1 min při 55 °C a 1 min při 72 °C. Po 30 cyklech byla reakční směs extrahována se stejným objemem fenol/chloroformu (1:1 obj./obj.), potom s chloroformem před tím, než byla srážena přídavkem 2,5 objemu ethanolu. PCR produkt byl rozpuštěn ve vhodném pufru, štěpen s HindlII a Apal, čištěn na agarosovém gelu a ligován do vektoru pMR14 (obr. 7), který pak byl také štěpen s HindlII a Apal. Po transformaci do E.coli LM1035, rostly kolonie přes noc a plasmidová DNA byla analyzována na Vh inzerty. Nukleotidová sekvence vH regionu v plasmidu, pARH1217 je uvedena na obr. 1.
Lehký řetězec
Gen VI lehkého řetězce byl generován z původního VI jak je popsáno ve VO 93/16184, klonu PCR s oligonukleotidy R3585 a náhradní list
R3597. Jejich sekvence jsou:
R3 5 8 5 5 ’ GGACTGTTCGAAGCCGCCACCATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCT3 '
R3 5 9 7 5'GGATACAGTTGGTGCAGCATCCGTACGTTT3'
PCR byla provedena jak je popsáno výše. PCR produkt byl štěpen enzymy BstBI a SplI a po čištění ligován do pMR15.1 (obr. 8), který již byl dříve štěpen stejnými enzymy.
Byly identifikovány kolonie, po transformaci E.coli LM1035, které obsahují plasmid (pARH1215) s VI inzertem. Nukleotidová sekvence VI inzertu je uvedena na obr. 2.
CDR roubování 39D10
Za účelem zvolení nejvhodnějšleh lidských akceptorových rámečků pro CDR smyčky 39D10 byly aminokyselinové sekvence rámečků 1-3 39D10 porovnány se sekvencemi známých lidských kappa lehkých řetězců. 39D10 byl shledán jako nejvíce homologní k lidské skupině I lehkých řetězců. Na tomto základě bylo rozhodnuto použít rámečky lidské skupiny I zárodečné linie pro CDR roubování. Homologie mezi sekvencemi jsou uvedeny na obr. 3. Uvedena je také homologie mezi rámečkem 4 regionů 39D10 a souhlasná sekvence známých lehkých řetězců lidské skupiny I. Zbytky ve 39D10, které se liší od lidské souhlasné sekvence jsou podtrženy. Příspěvek, jak by se tyto zbytky mohly podílet na antigenové vazbě byl analyzován a dva geny byly konstruovány pro CDR roubovaný lehký řetězec. Byly to CTIL-5-gL5 a CTIL-5-gL6, ve kterých jako i v CDR zbytcích, buď zbytky 22, 68 a 71 nebo zbytky 68 a 71 byly také ze 39D10. Nukleotidové a aminokyselinové sekvence CTIL-5-gL6 jsou uvedeny na obr. 5.
náhradní list
Těžký řetězec
CDR roubování 39D10 těžkého řetězce bylo provedeno jak je popsáno pro lehký řetězec. Rámečkové regiony 39D10 byly nalezeny jako nejvíce homologní k regionům lidské skupiny III protilátek a, následně souhlasná sekvence rámečků genů lidské skupiny III zárodečné linie byla použita k akceptování CDR 39D10 těžkého řetězce. Jako dříve byla také zvolena souhlasná sekvence pro lidskou skupinu III rámečku 4 regionů. Porovnání těchto sekvencí je uvedeno na obr. 4 s podtrženými zbytky ve 39D10, které se liší od lidské souhlasné sekvence.
Byla provedena analýza rámečkových zbytků ve 39D10, které by mohly ovlivnit antigenovou vazbu a byly konstruovány dva geny, CTIL-5-9gH a CTIL-5-10gH, ve kterých buď zbytky 23, 24, 27 až 30, 37, 49, 73 a 76 až 78 nebo zbytky 24, 27-30, 37, 49, 73, 76 a 78 byly ze 39D10. Nukleotidová a aminokyselinová sekvence CTIL-5-10gH je uvedena na obr. 6.
Exprese a bioaktivita anti-IL-5 protilátek
Chimerní (krysí/lidský) a CDR roubovaný 39D10 byly vyrobeny pro biologické hodnocení přechodné exprese párů těžkého a lehkého řetězce po ko-transfekci do buněk vaječníků čínského křečka (CHO) za použití srážení fosforečnanem vápenatým.
Den před ko-transfekcí byly polo-konfluentní lahve CHO-L761h buněk (Cockett a spol., Nucl.Acids.Res., 19,
319-325, 1991) trypsinizovány, buňky byly spočteny a T75 lahve byly každá naplněny 10 buněk. Další den bylo kulivační medium vyměněno 3 hodiny před transfekci. Pro transfekci byla připravena sraženina fosforečnanu vápenatého smísením 1,25 ml náhradní list
Ο , 25M CaCl2, obsahující 50 gg každého z expresních vektorů těžkého a lehkého řetězce s 1,25 ml 2xHBS (16,36 g NaCl, 11,9 g HEPES a 0,4 g Na2HPO4 v 1 litru vody a pH upraveným na 7,1 pomocí NaOH) a ihned přidány do media buněk. Po 3 h při 37 °C v C02 inkubátoru byly medium a sraženina odstraněny a buňky šokovány přídavkem 15 ml 15% glycerinu ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (PBS) po 1 minutu. Glycerin byl odstraněn, buňky byly jednou promyty PBS a inkubovány 48-96 hodin ve 25 ml media, obsahujícího 10 mM butyrátu sodného. Protilátka byla čištěna z kultivačního media navázáním k a elucí z protein A Sepharosy. Koncentrace protilátky byla stanovena za použití lidský Ig ELISa (viz dále).
ELISA
Exprese protilátky byla hodnocena transfekcí párů genů těžkého a lehkého řetězce a, po třech dnech inkubace, měřením množství protilátky nahromaděné v kultivačním mediu pomocí ELISA.
Pro ELISA, byly Nunc ELISA plotny potaženy přes noc při 4 °C F(ab’)2 fragmentem polyklonální kozí anti-lidský Fc fragment specifické protilátky (Jackson Immunoresearch, kod 109-006-098) při 5 gg/ml v potahovacím pufru (15 mM uhličitan sodný, 35 inM hydrogenuhličitan sodný, pH 6,9). Nepotažená protilátka byla odstraněna promytím 5krát destilovanou vodou. Vzorky a čištěné standardy pro kvantifikaci byly zředěny na přibližně 1 pg/ml v konjugátovém pufru (0,1 Tris-HCl pH 7,0, 0,lM NaCl, 0,2% obj./obj. Tween 20, 0,2 % hmotn./obj.
Hammersten kaseinu). Vzorky byly titrovány v mikrotitračních jamkách ve 2-násobných zředěním pro poskytnutí konečného objemu 0,1 ml v každé jamce a plotny byly inkubovány při teplotě místnosti 1 hodinu za třepání. Po prvním inkubačním stupni náhradní list byly plotny promyty lOkrát destilovanou vodou a pak inkubovány 1 hodinu jako dříve s 0,1 ml myší monoklonální anti-lidské kappa(klon GD12) peroxidasa konjugované protilátky (The Binding Site, kod MP135) při ředění 1 v 700 v konjugátovém pufru. Plotny byly opět promyty a do každé jamky byl přidán substrátový roztok (0,1 ml). Substrátový roztok obsahuje 150 μΐ N,N,N,N-tetramethylbenzidinu (10 mg/ml v DMSO), 150 μΐ peroxidu vodíku (30% roztok) v 10 ml 0,lM octanu sodného/citrátu sodného, pH 6,0. Plotna byla vyvíjena 5 až 10 minut až absorbance při 630 nm byla přibližně 1,0 pro špičkový standard. Absorbance 630 nm byla měřena použitím plotnové čtečky a koncentrace vzorku stanovena porovnáním titračních křivek s křivkou standardu.
Stanovení afinitních konstant pro anti-IL-5 protilátky
Afinity chimerních a CDR roubovaných anti-IL-5 protilátek byly stanoveny za použití Biospecific Interaction Analysis (BIA) . Protilátky byly produkovány v CHO buňkách transfekci kombinací genů těžkého a lehkého řetězce a čištěny ze supernatantů kultury na Protein A Sepharose. Pro afinitní měření byla polyklonální anti-lidská Fc protilátka navázána k Pharmacia Biosensor chip (12150 relativní odezvové jednotky, RU) a použity k zachycení anti-IL-5, který prošel nad chipem při 5 μg/ml v 10 mM HEPES, 0,15M NaCl, 3,4 mM EDTA, pH 7,4. Množství ant.i-IL-5 zachycené pro každý běh bylo přibližně 1600 RU. Rekombinantní lidský IL-5 pak prošel přes Sensorchíp v různých koncentracích (0,6 až 5 pg/ml) ve výše uvedeném pufru. Sensorchíp byl čištěn po každém běhu pomocí 100 mM HCl a 100 mM kyseliny orthofosforečné pro odstranění navázaného IL-5 a protilátky. Generované sensogramy byly analyzovány za použití kinetického softwaru dostupného s přístrojem BIAcore.
náhradní list
Byly stanoveny hodnoty pro afinitní konstanty a asociační a disociační rychlosti dvou protilátek, chimerní 39D10 a CTIL-5-10gH/-gL6. Výsledky jsou uvedeny na obr. 9. Je možno vidět, že chimerní 39D10 má extrémně vysokou afinitu pro lidský IL-5 a že tato hodnota byla reprodukována v CTIL-5-10gH/-gL6.
Aktivita anti-IL-5 protilátek v in vitro bioeseji
Aktivity různých CDR roubovaných protilátek byly porovnány s aktivitami chimerní 39D10 v in vitro bioeseji za použití TF1 buněk. TF1 je erythroleukemieká buněčná linie, která vyžaduje pro růst GM-CSF. GM-CSF může být nahrazen IL-5, ale v tomto případě buňky pouze přežívají a nemnozí se.
Nicméně závislost na IL-5 pro přežití znamená, že TF1 buňky mohou být použity v bioeseji pro porovnání aktivit různých anti-IL-5 protilátek.
Neutralizace anti-IL-5 protilátkami byla měřena za použití konstantního množství IL-5 (2 ng/ml) a proměnných množství protilátky inkubované s 5x10^ buňkami na jamku v 96 jámových plotnách s plochým dnem po 3 dny. Po poslední 4 hodiny jsou buňky kultivovány za přítomnosti Thiazolyl blue (MIT). Toto barvivo se konvertuje na nerozpustnou purpurovou formu mitochondriálními enzymy v životaschopných buňkách. Nerozpustný materiál byl rozpuštěn inkubací přes noc po přídavku 100 μΐ 50% dimethylformamidu, 20% SDS pH 4,7 a množství přijatého barviva stanoveného spektrofotometricky. Hodnoty bioaktivního IL-5 zůstávajícího za přítomnosti protilátek se extrapoluje ze standardní křivky, vyjadřující příjem barviva ke koncentraci IL-5 koncentraci.
Aktivity různé kombinace těžkého a lehkého řetězce byly náhradní list hodnoceny za použití TF1 bioeseje. Výsledky jsou uvedeny na obr. 10. Je možno vidět, že všechny kombinace CDR roubovaného těžkého a lehkého řetězce produkují protilátky, které jsou ekvipotentní s chimerním 39D10. Tyto výsledky indikují, že ani zbytek 22 v lehkém řetězci ani zbytky 23 nebo 78 v těžkém řetězci nejsou vyžadovány aby 39D10 byl specifický pro optimální vázání. Kombinace s méně 39D10 specifickými zbytky je proto CTIL-5-10gH/-gL6.
Aktivita anti-IL-5 protilátek v kompetičních esejích
Rekombinantní lidský IL-5 byl ředěn na 1 pg/ml ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (PBS) a 100 μΐ podíly byly přidány na mikrotitrační plotny (Costar Amine Binding plates) a inkubovány přes noc při 4 °C. Plotny byly promyty třikrát s PBS, obsahujícím 0,5 % Tweenu 20 a jakákoliv zbývající aktivní místa blokována se 2 % hovězího sérového albuminu (BSA) v PBS po 30 minut. Plotny pak byly odsáty a vyklepány dosucha. Pro porovnání relativní vazebné aktivity rodičovské krysí protilátky (39D10) s chimerní a roubovanou protilátkou byla připravena postupná ředění každé anti-IL-5 protilátky v PBS/1 % BSA a 50 μΐ bylo přidáno k duplicitním jamkám a ihned následováno 50 μΐ 39D10-biotin konjugátu při 0,125 pg/ml. Esej byla inkubována 2 hodiny při teplotě místnosti za míchání a pak dvakrát promyta PBS. Do všech jamek byla přidána křenová peroxidasa konjugované ke streptavidinu (1 pg/ml) a inkubována dalších 30 minut. Plotny byly čtyřikrát promyty a bylo přidáno 100 μΐ tetramethylbenzidinového (TMB) substrátu. Vývin barvy byl odečten při 630 nm (referenčních 490 nm) a OD (630-490) byla vynesena proti log (10) koncentrace protilátky.
Při porovnání aktivit krysího 39D10, chimerního 39D10 a náhradní list
CTIL-5-10gH/gL6 ve výše uvedené kompetiční eseji, byly získány výsledky uvedené na obr. 11. Všechny tři protilátky soutěží stejně dobře s biotinylatovaným-39D1 pro navázání k IL-5, což indikuje, že CDR smyčky 39D10 byly úspěšně transferovány do lidských rámečků.
Vliv anti-IL-5 protilátky na opičí eosinofilii
Anti-IL-5 protilátka (CTIL-5-10gH/gL6) byla testována v opičím systému, který modeluje astmatické podmínky (viz Mauser P.J. a spol., Ann. Rev. Respir.Dis., v tisku). Při podání, jednu hodinu před podnětem s Ascaris, responzivním opicím, inhibuje CTIL-5-10gH/gL6 plicní výplach eosinofilie ze 75 % v dávce 0,3 mg/kg i.v. Tato sada opic není hyperresponzivní k histaminu takže účinky CTIL-5-10gH/gL6 na hyperresponzivní nemohly být stanoveny. Tři měsíce po této jediné dávce je akumulace eosinofilů v odpovědi na podnět s Ascaris ještě inhibována ze 75 %.
U alergické myši CTIL-5-10gH/gL6 inhibuje plicní eosinofilii při 1 mg/kg i.p.
náhradní list náhradní list
Seznam sekvencí (1) Obecná informace:
(i) Přihlašovatel:
(A) Jméno: CEI.LTECH LIMITED (B) Ulice: 216 ΒΑΤΗ EOAD (C) Město: SLOUGH (D) Stát: BERKSHIRE (E) Země: Velká Británie (F) Poštovní kod (ZIP):SLI 4EN (G) Telefon: 0753 534655 (H) Telefax: 0753 536632 (I) Telex: 848473 (ii) Název vynálezu: Interleukin-5 specifické rekombinantní protilátky (iii) Počet sekvencí: 28 (iv) Počítačově čtecí forma:
(A) Typ media: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Pracovní systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (EPO) (2) Informace o SEQ ID NO: 1:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 48 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (i i) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:
gcgcgcaagc ttgccgccac catgaagatx gtggttaaac tgggtttt (2) Informace o SEQ ID NO: 2:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 41 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:
GCAGATGGGC CCTTCGTTGA GGCTGACAGG AGACGTAGTG A náhradní list (2) Informace o SEQ ID NO: 3:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 44 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:
GGACTG7TCC AAGCCGCCAC CATGAGTGTG CTCACTCAGG TCCT (2) Informace o SEQ ID NO: 4:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 30 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ-ID NO: 4:
GGATACAGTT GGTGCAGCAT CCGTACGTTT (2) Informace o SEQ ID NO: 5:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 333 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Rysy:
(A) Jméno/klíč: CDS (B) Lokace: 1..333 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:
náhradní list
GAA TCT GGA GGA GGC TTG GTA CAG Gin CCA TCA CAG ACC CTG TCT CTC ACC 48
Glu 1 Ser Gly Gly Gly Leu 5 Val Pro Ser Gin 10 Thr Leu Ser Leu 15 Thr
TGC ACT' GTC TCT GGG TTA TCA TTA ÁCC AGC AAT AGT GTG AAC TGG ATT 96
Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu Thr Ser Asn Ser Val Asn Trp Ile
20 25 30
CGG CAG CCT CCA GGA AAG GGT CTG GAG TGG ATG GCA CTA ATA TGG AGT 144
Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Leu Ile Trp Ser
35 40 45
AAT GGA GAC ACA GAT TAT AAT TCA GCT ATC AAA TCC CGA CTG AGC ATC l9?
Asn Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Ile Lys Ser Arg Leu Ser Ile
5C 55 60
AGT AGC GAC ACC TCG AAG AGC CAG GTT TTC TTA AAG ATG AAC AGT CTG 240
Ser Are Asp Thr Ser Lys Ser Gin Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu
65 70 75 80
CAA AG”' GAA GAC ACA GCC ATG TAC TTC TGT GCC AGA GAG TAC TAC GGC 288
Gin Ser Glu Aap Thr Ala Met Tyr Phe Cys Ala Arg Glu Tyr Tyr Gly
85 90 95
TAC TTT GAT TAC TGG GGC CAA GGA GTC ATG GTC ACA GTC TCC TCA 333
Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
(2) Inf ormace o ; SEQ ID NO: 6:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 111 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:
náhradní list
Glu 1 Ser Gly Gly Gly c Leu Val Gin Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr
3 10 15
Cys Thr Val Ser 20 Gly Leu Ser Leu Thr 25 Ser Asn Ser Val Asn 30 Trp lle
Arg Glr. Pra 35 Pro Gly Lys Gly Leu 40 Glu Trp Met Gly Leu 45 lle Trp Ser
Asn Gly Asp 5Č Thr Asp Tyr Asn 55 Ser Ala lle Lys Ser 60 Arg Leu Ser lle
Ser 6 5 Are Asp Thr Ser Lys 70 Ser Gin Val Phe Leu 75 Lys Met Asn Ser Leu 80
Gin Ser Glu Asp Thr 85 Ala Met Tyr Phe Cys 90 Ala Arg Glu Tyr Tyr 95 Gly
Tyr Phe Asp Tyr 100 Trp Gly Gin Gly Val 105 Met Val Thr Val Ser 110 Ser
(2) Informace o SEQ ID NO: 7:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 384 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (i i) Typ molekuly: cDNA (ix) Rysy:
(A) Jméno/klíč: CDS (B) Lokace: 1..384 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:
ATG Met 1 GCT Ais GTG Val CCC Pro ACT Thr 5 CAG Gin CTC Leu CTG Leu GGG Gly TTG Leu 10 TTG TTG CTG Leu TGG Trp ATT Xle 15 ACA Thr 48
Leu Leu
GAT GCC ATA TGT GAC ATC CAG ATG ACA CAG TCT CCA GCT TCC CTG TCT 96
Asp Ala I le Cys Asp lle Gin Het Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser
20 25 30
GCA TCT CTG GGA GAA ACT ATC TCC ATC GAA TGT CTA GCA AGT GAG GGC 144
Ala Ser Leu Gly Glu Thr lle Ser lle Glu Cys Leu Ala Ser Glu Gly
35 40 45
ATT TCC AGT TAT TTA GCG TGG TAT CAG CAG AAG CCA GGG AAA TCT CCT 192
lle Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Ly3 Pro Gly Lys Ser Pro
5C 55 60
CAG CTC CTG ATC TAT GGT GCA AAT AGC TTG CAA ACT GGG GTC CCA TCA 240
Gin Leu Leu lle Tyr Gly Ala Asn Ser Leu Gin Thr Gly Val Pro Ser '
65 70 • 75 80
náhradní list
CCC Arg ITC AGT GGC AGT GGA TCT GCC ACA CAA TAT TCT CTC AAG ATC AGC Ser 288
F he Ser Gly Ser 85 Gly Ser Ala Thr Gin 90 Tyr Ser Leu Lys Ile 95
AGC tg CAA CCT CAA GAT GAA CGC GAT TAT TTC TCT CAA CAG AGT TAC 336
Ser Met Gin Pro Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Phe Cys Gin Gin Ser Tyr
100 10S 110
AAG 7 TT CCG AAC ACG TTT GGA GCT GGG ACC AAG CTG GAA CTG AAA CGG 384
Lys F he Pro Asn Thr Phe .cly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
115 120 125
(2) Informace o SEQ ID NO: 8:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 128 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:
Met 1 A. 1 a Val Pro Thr 5 Gin Leu Leu Gly Leu 10 Leu Leu Leu Trp Ile 15 Thr
Asp ? Fa Ile Cys Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser
20 25 30
Ala c· o £ Leu Gly Glu Thr Ile Ser Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Gly
35 40 45
Ile S ·** ΙΓ Ser Tyr Leu Ala Trn Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ser Pro
50 55 60
Gin Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Asn Ser Leu Gin Thr Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Ϊ he Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gin Tyr Ser Leu Lys Ile Ser
85 90 95
Ser Met Gin Pro Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Phe Cys Gin Gin Ser Tyr
100 105 110
Lys The Pro Asn Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
115 120 125
náhradní list (2) Informace o SEQ ID NO: 9:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 23 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:
Asp lle Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Glv 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lle Thr Cys 20 (2) Informace o SEQ ID NO: 10:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 23 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:
Z-.sp lle Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 clu Thr lle Ser lle Glu Cys 20 (2) Informace o SEQ ID NO: 11:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 15 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11:
Trp Tyr Gin Gin Ly3 Pro Gly Lya Ala Pro Lys Leu Leu lle Tyr ; s 10 15 náhradní list (2) Informace o SEQ ID NO: 12:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 15 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:
Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 (2) Informace o SEQ ID NO: 13:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 32 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 13:
Cly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 S 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 (2) Informace o SEQ ID NO: 14:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 32 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 14:
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gin Tyr Ser
5 10 15
Leu Ly3 Ile Ser Ser-Me“ Gin Pro Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Phe Cys
25 * 30 náhradní list (2) Informace o SEQ ID NO: 15:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 15:
řhe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 1 5 io (2) Informace o SEQ ID NO: 16:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 16:
ihe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 1 s 10 (2) Informace o SEQ ID NO: 17:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 30 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární
(ii) Typ molekuly: protein
(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: : 17:
'lu Val Gin Leu Val Glu 5 Ser Gly Gly Cly Leu Val Gin
10
- 5Γ Leu Arg Leu Ser Cys 20 Ala Ala Ser 25 Cly Phe Thr Phe
Pro Gly Gly 15
Ser náhradní list (2) Informace o SEQ ID NO: 18:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 25 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 18:
Gl.u Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr 1 S 10 15
c.-s Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu Thr 20 25 (2) Informace o SEQ ID NO: 19:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 14 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 19:
T-p Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser l' 5 10 (2) Informace o SEQ ID NO: 20:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 14 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 20:
Tra
Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly 5 10 náhradní list (2) Informace o SEQ ID NO: 21:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 32 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 21:
Arg 1 Phe Thr lle Ser 5 Arg Asp Asn Ser Lys 10 Asn Thr Leu Tyr Leu 15 Gin
Asn Ser Leu 20 Arg Ala Glu Asp Thr 25 Ala Val Tyr Tyr Cys 30 Ala Arg
(2) Informace o SEQ ID NO: 22:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 32 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 22:
Arg Leu Ser lle Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gin Val Phe Leu Lys
5 10 15
Het Asn Ser Leu Gin Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Ala Arg
25 30 (2) Informace o SEQ ID NO: 23:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 23:
-n Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 ío .
náhradní list (2) Informace o SEQ ID NO: 24:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 24:
Trp Gly Gin Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser 5 10 (2) Informace o SEQ ID NO: 25:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 399 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Rysy:
(A) Jméno/klíč: CDS (B) Lokace: 1. .399
( xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 25:
TTC GAA GCC GCC ACC ATG TCT GTC CCC ACC CAA GTC CTC GGT CTC CTG 48
Phe Clu Ala Ala Thr Met Ser Val Pro Thr Gin Val Leu Cly Lau Leu
1 5 10 15
CTG CTG TGG CTT ACA GAT GCC AGA TGT GAC ATT CAA ATG ACC CAG AGC 96
Leu Leu Trp Leu Thr Asp Ala Arg Cys Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser
20 25 30
CCA T CC AGC CTG AGC GCA TCT GTA GGA GAC CGG GTC ACC ATC ACA TGT 144
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
35 40 45
CTA GCA AGT GAG GGC ATC TCC AGT TAC TTA GCG TGG TAC CAG CAG AAG 192
Leu A -w 31 Ser Glu Gly Ile Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lya
30 55 60
CCC CCG AAA GCT CCT AAG CTC CTG ATC TAT GGT GCG AAT AGC TTG CAG 240
Pro Gly Ly3 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Asn Ser Leu Gin
65 70 75 80
náhradní list
ACT Thr c.;a Gly GTA CCA TCA AGA TTC AGT GGC TCA GGA TCC GCT ACA GAC TAC 288
Val Pro Ser 85 Arg Phe Ser Gly Ser 90 Gly Ser Ala Thr Asp 95 Tyr
ACG c;c ACG ATC TCC AGC CTA CAG CCT GAA GAT TTC GCA ACG TAT TAC 336
Thr L ru Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
100 105 110
TGT C Ά CAG TCG TAT AAG TTC CCG AAC ACA TTC CGT CAA GGC ACC AAG 384
Cys Gin Gin Ser Tyr Lys Phe Pro Asn Thr Phe Gly Gin GLy Thr Lys
11S 120 125
GTC G ,A GTC AAA CGT 399
Val Glu Val Lys Arg i :o (2) Informace o SEQ ID NO: 26:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 133 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 26:
Phe Gu Ala Ala Thr Met Ser Val Pro Thr Gin Val Leu Gly Leu Leu 1 .5 · . 10 15
Leu Leu Trp Leu Thr Asp Ala Arg Cys Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser náhradní list
25 30
Pro Ser Ser 35 Leu Ser Ala Ser Val 40 Gly Asp Arg Val Thr 45· Ile Thr Cy3
Leu Aia SO Ser Glu Gly Ile Ser 55 Ser Tyr Leu Ala Trp 60 Tyr Gin Gin Lys
Pro 65 Gly Lys Ala Pro Lya 70 Leu Leu Ile Tyr Gly 75 Ala Asn Ser Leu Gin 80
Thr G y Val Pro Ser 85 Arg Phe Ser Gly Ser 90 Cly Ser Ala Thr Asp 95 Tyr
Thr Leu Thr Xle 100 Ser Ser Leu Gin Pro 105 Glu Asp Phe Ala Thr 110 Tyr Tyr
Cys Gin Gin 115 Ser Tyr Lys Phe Pro 120 Asn Thr Phe Gly Gin 125 Gly Thr Ly3
Val G3u Val Lys Arg 13 0 (2) Informace o SEQ ID NO: 27:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 420 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Rysy:
(A) Jméno/klíč: CDS (B) Lokace: 1..420 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 27:
AAG Lys 1 ct : Le : GCC Ala GCC Ala ACC Thr 5 ATG Met GGC Gly TGG Trp AGC Ser TGT ATC ATC Ile CTC Leu TTC Phe TTA Leu 15 GTA Val 48
Cys 10 Ile
GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCC GAG GTC CAA CTG GTA GAA TCT GGA 95
Ala Thr Ala Thr 20 Gly Val His Ser Glu 25 Val Gin Leu Val Clu 30 Ser Gly
GGT GGT CTC GTA CAG CCA GGA GGA TCT CTG CGA CTG AGT TGC GCC GTC 144
Gly Gly Leu. 35 Val Gin Pro Gly Gly 40 Ser Leu Arg Leu Ser 45 Cys Ala Val
TCT GGG TTA TCA TTA ACT AGT AAT AGT GTC AAC TGG ATA CGG CAA GCA 192
Ser Gl/ 50 Leu Ser Leu Thr Ser 55 Asn Ser Val Asn Trp 60 Ile Arg Gin Ala
náhradní list
CCT CGC AAG GGT CTC GAG TGG GTT GGA CTA ATA TCG AGT AAT GGA GAC
Pro .Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Leu Ile Trp Ser Α3Π Gly Asp
65 70 75 80
ACA GAT TAT AAT TCA GCT ATC AAA TCT CGA TTC ACA ATC TCT AGA GAC
Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Ile Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
85 90 95
ACT TCP AAG AGC ACC GTA TAC CTG CAG ATG AAC AGT CTG AGA GCT GAA
Thr Se?; Lys Ser Thr Val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
100 105 110
GAT ACT GCA GTC TAC TAC TGT CCT CGT GAG TAC TAT GGA TAT TTC GAC
Asp T r Ala Val Tyr Tyr Cya Ala Arg Glu Tyr Tyr CLy Tyr Phe Asp
115 120 12S
TAT T'-’G GGT CAA GGT ACC CTA GTC ACA GTC TCC TCA
Tyr Tro Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr, Val Ser Ser
i:o 13S 140
240
288
336
334
420
ID NO: 28:
(2) Informace o SEQ (i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 140 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) (xi)
Typ molekuly: Popis sekvence protein : SEQ ID NO
28:
náhradní list
Lys 1 L*':U Ala Ala Thr Met Gly Trp 5 Ser Cys 10 Ile Ile Leu Phe Leu 15 Val
Ala Tir Ala Thr Gly Val His Ser Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly
20 25 30
Gly Gy Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val
35 40 45
Ser Gy Leu Ser Leu Thr Ser Asn Ser Val Asn Trp Ile Arg Gin Ala
50 55 60
Pro c: y Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Leu Ile Trp Ser Asn Gly Asp
65 70 75 80
Thr A?· o Tyr Asn Ser Ala Ile Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
85 90 95
Thr Sí-.r Lys Ser Thr Val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
100 105 110
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Tyr Tyr Gly Tyr Phe Asp
115 120 125
Tyr Ti o Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
13 0 135 140
li
Μ'ίίοά νΖΟΈώΚΑ advokát m λ.! PRAHA 2. Málkova 2

Claims (18)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. RAM, mající afinitu pro lidský IL-5 antigen a obsahující antigen vazebné regiony získané z variabilních domén těžkého a/nebo lehkého řetězce donor protilátky, mající afinitu pro fe, lidský IL-5, RAM, mající vazebnou afinitu podanou afinitě donor protilátky.
  2. 2. Anti-IL-5 protilátková molekula podle nároku 1, obsahující kompozitní těžký řetězec a komplementární lehký řetězec, kde uvedený kompozitní těžký řetězec, mající variabilní doménu, obsahující převážně zbytky rámečku akceptoru protilátky těžkého řetězce a antigen-vázající zbytky protilátky donor těžkého řetězce, kde uvedená donor protilátka má afinitu pro lidský IL-5, přičemž uvedený kompozitní těžký řetězec obsahuje donor zbytky alespoň v polohách 31 až 35, 50 až 65 a 95 až 102 (podle Kabatova číslovacího systému).
  3. 3. Protilátková molekula podle nároku 2, kde aminokyselinové zbytky 24, 27 až 30, 37, 49, 73, 76 a 78 v uvedeném kompozitním těžkém řetězci jsou navíc donor zbytky.
  4. 4. Protilátková molekula podle nároku 2, kde aminokyselinové zbytky 23, 24, 27 až 30, 37, 49, 73 a 76 až 78 v uvedeném kompozitním těžkém řetězci jsou navíc donor zbytky.
  5. 5. Anti-IL-5 protilátková molekula podle nároku 1, obsahující kompozitní lehký řetězec a koplementární těžký řetězec, kde uvedený kompozitní lehký řetězec má variabilní doménu, obsahující převážně zbytky rámečku lehkého řetězce protilátky a antigen-vázající zbytky lehkého řetězce donor protilátky, náhradní list kde uvedená donor protilátka má afinitu pro lidský IL-5, přičemž uvedený kompozitní lehký řetězec obsahuje donor zbytky alespoň v polohách 24 až 34, 50 až 56 a 89 až 97 (podle Kabatova číslovacího systému) a kde uvedená anti-IL-5 protilátková molekula má vazebnou afinitu podobnou afinitě donor protilátky.
  6. 6. Protilátková molekula podle nároku 5, kde aminokyselinové zbytky 68 a 71 v uvedeném kompozitním lehkém řetězci jsou navíc donor zbytky.
  7. 7. Protilátková molekula podle nároku 5, kde aminokyselinové zbytky 22, 68 a 71 v uvedeném kompozitním lehkém řetězci jsou navíc donor zbytky.
  8. 8. Anti-IL-5 protilátková molekula, mající afinitu pro lidský IL-5, obsahující kompozitní těžký řetězec podle kteréhokoliv z nároků 5 až 7.
  9. 9. Protilátková molekula podle kteréhokoliv z nároků 2 až 8, obsahující převážně lidské akceptorové zbytky a ne-lidské donor zbytky.
  10. 10. Protilátková molekula podle kteréhokoliv z nároků 2 až 9, kde akceptorové zbytky pro kompozitní těžké a lehké řetězce jsou zbytky těžkého řetězce lidské skupiny III a lehkého řetězce lidské skupiny I a donor zbytky pro kompozitní těžké a lehké řetězce jsou zbytky krysího 39D10 těžkého a lehkého řetězce.
  11. 11. DNA sekvence, která kóduje kompozitní těžký řetězec nebo kompozitní lehký řetězec protilátky podle kteréhokoliv z nároků 2 až 10.
    náhradní list
  12. 12. Klonovací nebo expresní vektor, obsahující DNA sekvenci podle nároku 11.
  13. 13. Hostitelská buňka transformovaná DNA sekvencí podle nároku 11 .
  14. 14. Způsob produkce anti-IL-5 protilátky, zahrnující expresi alespoň jedné DNA sekvence podle nároku 11 ve transformované hostitelské buňce.
  15. 15. Způsob produkce anti-IL-5 protilátkové molekuly, zahrnuj ící:
    (a) produkci operonu v expresním vektoru, majícího DNA sekvenci, která kóduje kompozitní těžký řetězec podle kteréhokoliv z nároků 2 až 4;
    (b) popřípadě produkci operonu v expresním vektoru, majícího DNA sekvenci, která kóduje komplementární lehký řetězec, kterým může být kompozitní lehký řetězec podle kteréhokoliv z nároků
    5 až 7;
    (c) transfekci. hostitelské buňky s vektorem nebo každým vektorem a (d) kultivaci transfektované buněčné linie pro produkci protilátkového produktu.
  16. 16. Způsob produkce anti-IL-5 protilátkové molekuly podle nároku 15, kde DNA sekvence kóduje kompozitní lehký řetězec a komplementární těžký řetězec.
  17. 17. Terapeutická nebo diagnostická kompozice, obsahující protilátkovou molekulu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10 v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem, ředidlem nebo přísadou.
    náhradní list
  18. 18. Způsob terapie nebo diagnózy, zahrnující podání účinného množství protilátkové molekuly podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10 lidskému nebo zvířecímu subjektu.
CZ19963712A 1994-06-17 1995-06-16 Rekombinantní protilátková molekula, DNA sekvence, terapeutická nebo diagnostická kompozice a použití protilátkové molekuly CZ292295B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB9412230A GB9412230D0 (en) 1994-06-17 1994-06-17 Interleukin-5 specific recombiant antibodies

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ371296A3 true CZ371296A3 (cs) 1998-05-13
CZ292295B6 CZ292295B6 (cs) 2003-08-13

Family

ID=10756925

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19963712A CZ292295B6 (cs) 1994-06-17 1995-06-16 Rekombinantní protilátková molekula, DNA sekvence, terapeutická nebo diagnostická kompozice a použití protilátkové molekuly

Country Status (18)

Country Link
US (3) US5998586A (cs)
EP (1) EP0765392B1 (cs)
JP (1) JP3973682B2 (cs)
AT (1) ATE264389T1 (cs)
AU (1) AU694783B2 (cs)
CA (1) CA2192543C (cs)
CZ (1) CZ292295B6 (cs)
DE (1) DE69532889T2 (cs)
ES (1) ES2218546T3 (cs)
FI (1) FI965032A0 (cs)
GB (1) GB9412230D0 (cs)
HU (1) HU221641B1 (cs)
IL (1) IL114179A (cs)
NO (1) NO964808L (cs)
NZ (1) NZ287927A (cs)
SK (1) SK282625B6 (cs)
WO (1) WO1995035375A1 (cs)
ZA (1) ZA954990B (cs)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USRE39548E1 (en) 1994-06-17 2007-04-03 Celltech R&D Limited Interleukin-5 specific recombinant antibodies
GB9412230D0 (en) * 1994-06-17 1994-08-10 Celltech Ltd Interleukin-5 specific recombiant antibodies
US5693323A (en) * 1994-12-23 1997-12-02 Smithkline Beecham Corporation Recombinant IL-5 antagonists useful in treatment of IL-5 mediated disorders
CZ297045B6 (cs) * 1994-12-23 2006-08-16 Smithkline Beecham Corporation Hlodavcí neutralizacní monoklonální protilátka, zpusob pro její produkci, kompozice s jejím obsahema pouzití, hybridom a jím produkovaná protilátka,fab fragment, komplementaritu urcující region, molekula nukleové kyseliny a její sekvence, plasmid a
US7399837B2 (en) 1995-12-22 2008-07-15 Smithkline Beecham Corporation Recombinant IL-5 antagonists useful in treatment of IL-5 mediated disorders
CA2370391A1 (en) 1999-04-23 2000-11-02 Pharmexa A/S Method for down-regulating il5 activity
NZ572565A (en) 2006-05-25 2011-04-29 Glaxo Group Ltd Modified humanised anti-interleukin-18 antibodies
BRPI0910854A2 (pt) 2008-03-28 2015-10-06 Glaxosmithkline Llc métodos de tratamento
EP2337801A4 (en) 2008-10-06 2012-07-25 Minerva Biotechnologies Corp MUC1 ANTIBODIES *
EP2600901B1 (en) 2010-08-06 2019-03-27 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
ES2737960T3 (es) 2010-10-01 2020-01-17 Modernatx Inc Nucleósidos, nucleótidos y ácidos nucleicos modificados y sus usos
WO2012083370A1 (en) * 2010-12-22 2012-06-28 Cephalon Australia Pty Ltd Modified antibody with improved half-life
AU2012236099A1 (en) 2011-03-31 2013-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP3682905B1 (en) 2011-10-03 2021-12-01 ModernaTX, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
EP2791160B1 (en) 2011-12-16 2022-03-02 ModernaTX, Inc. Modified mrna compositions
AU2013243948A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins associated with human disease
US9303079B2 (en) 2012-04-02 2016-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
EP4074834A1 (en) 2012-11-26 2022-10-19 ModernaTX, Inc. Terminally modified rna
JP6502856B2 (ja) * 2012-12-26 2019-04-17 オンコシナジー インコーポレイテッド 抗インテグリンβ１抗体組成物及びその使用方法
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
CA2926218A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
EP3160479A4 (en) 2014-06-30 2018-07-04 Academia Sinica Antagonists for interleukin-17 receptor b (il-17rb) and its ligand il-17b for cancer therapy
CN107660213B (zh) 2015-02-10 2023-01-13 米纳瓦生物技术公司 人源化抗MUCl＊抗体
BR112018003741A2 (pt) 2015-08-24 2018-09-25 Glaxosmithkline Ip No 2 Ltd composições biofarmacêuticas
WO2018226339A1 (en) 2017-06-06 2018-12-13 Glaxosmithkline Llc Biopharmaceutical compositions and methods for pediatric patients
JP7307720B2 (ja) 2017-09-29 2023-07-12 江蘇恒瑞医薬股▲ふん▼有限公司 Ｉｌ－５抗体、その抗原結合フラグメント、およびそれらの医薬適用
CN109942706A (zh) * 2017-12-21 2019-06-28 三生国健药业（上海）股份有限公司 结合人il-5的单克隆抗体、其制备方法和用途
WO2020119728A1 (zh) * 2018-12-12 2020-06-18 尚华科创投资管理（江苏）有限公司 抗人白细胞介素5(il-5)单克隆抗体及其应用
CN113507938B (zh) 2019-03-29 2024-04-16 广东恒瑞医药有限公司 包含抗il-5抗体的药物组合物及其用途

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308235D0 (en) * 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
GB8607679D0 (en) * 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
IL92180A (en) * 1988-11-03 1997-04-15 Schering Corp Pharmaceutical composition for preventing or reducing eosinophilia
IL162181A (en) * 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
GB8928874D0 (en) * 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
AU8910891A (en) * 1990-11-20 1992-06-11 National Heart & Lung Institute, The Treatment of lung diseases
CZ291039B6 (cs) * 1992-02-06 2002-12-11 Schering Corporation Monoklonální protilátka, hybridom, polypeptid a způsob jeho přípravy, izolovaná DNA, rekombinantní vektor, hostitelská buňka, humanizovaná protilátka a farmaceutický prostředek
SG52215A1 (en) * 1992-02-19 1998-09-28 Schering Corp Cloning and expresssion of humanized monoclonal antibodies against human interleukin-4
GB9412230D0 (en) * 1994-06-17 1994-08-10 Celltech Ltd Interleukin-5 specific recombiant antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
US6316227B1 (en) 2001-11-13
US6734286B2 (en) 2004-05-11
NZ287927A (en) 1998-07-28
WO1995035375A1 (en) 1995-12-28
CZ292295B6 (cs) 2003-08-13
AU2680395A (en) 1996-01-15
ZA954990B (en) 1996-12-17
GB9412230D0 (en) 1994-08-10
ATE264389T1 (de) 2004-04-15
IL114179A (en) 2001-08-26
US5998586A (en) 1999-12-07
JP3973682B2 (ja) 2007-09-12
NO964808L (no) 1997-02-17
SK160096A3 (en) 1997-06-04
DE69532889D1 (de) 2004-05-19
CA2192543C (en) 2008-07-29
EP0765392A1 (en) 1997-04-02
SK282625B6 (sk) 2002-10-08
AU694783B2 (en) 1998-07-30
CA2192543A1 (en) 1995-12-28
IL114179A0 (en) 1995-10-31
FI965032A (fi) 1996-12-16
HU9603183D0 (en) 1997-01-28
ES2218546T3 (es) 2004-11-16
HU221641B1 (hu) 2002-12-28
HUT76672A (en) 1997-10-28
FI965032A0 (fi) 1996-12-16
NO964808D0 (no) 1996-11-13
EP0765392B1 (en) 2004-04-14
DE69532889T2 (de) 2005-03-10
US20020042089A1 (en) 2002-04-11
JPH10501697A (ja) 1998-02-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ371296A3 (cs) Interleukin-5 specifické rekombinantní protilátky
CN101484471B (zh) 抗-nkg2a抗体及其用途
JP5059119B2 (ja) 操作された抗ｔｓｌｐ抗体
US20170210820A1 (en) Human antibodies and proteins
JP4252061B2 (ja) 選択的ＩＦＮ−γ経路インヒビターとしてのヒト抗ＩＦＮ−γ中和抗体
US7378091B2 (en) Antibodies against carbonic anhydrase IX (CA IX) tumor antigen
ES2388435T3 (es) Anticuerpos de IP-10 y sus usos
WO2020020281A1 (zh) 抗tigit抗体及其用途
JP2013223516A (ja) 抗ｔｓｌｐｒ抗体の設計製作
CN102656190A (zh) 用于在视网膜神经纤维层变性治疗中使用的针对rgm a蛋白质的单克隆抗体
WO2022117040A1 (zh) 抗人b7-h3抗体及其应用
JP2023513400A (ja) Ｃｌｄｎ１８．２抗体及びその使用
JP2022520632A (ja) 共通軽鎖を含む抗体及びその使用
USRE39548E1 (en) Interleukin-5 specific recombinant antibodies
TWI814094B (zh) 貓抗體變異體
NASOFF et al. Cloning and expression of the human tumor-specific antibody gm4

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 19950616