KR19980080514A - 항-인간 파스 인간화 항체 - Google Patents

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세리자와노부후사
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요네하라신
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가오무라요시부미
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Abstract

본 발명은 Fas 를 발현하는 세포에서 세포소멸을 유도할 수 있고, 자가면역 질병 및 만성 류마티스관절염의 치료에 유용한 인간화 항인간-Fas 항체를 제공한다. 이외에, 본 발명은 이러한 항체의 H 및 L 사슬의 가변부를 코딩하는 DNA 및 항체의 인간화 방법을 제공한다.

Description

항-인간 파스 인간화 항체
본 발명은 Fas 항원을 인식하는 인간화 항-인간 Fas 항체 및 이러한 항체를 코딩하는 DNA 에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 특히 자가면역질병 및 류마티스질병을 포함하는 질병의 치료를 위한 상기 항체를 함유하는 약제, 추가로 세포성장억제제를 임의적으로 함유하는 제제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 인간화 항체의 향상된 제조방법에 관한 것이다.
면역글로불린 G(IgG) 는 각각 약 23,000 kD 의 분자량을 갖는 두 개의 경 폴리펩티드사슬 (L사슬) 및 각각 약 50,000 kD 의 분자량을 갖는 두 개의 중 폴리펩티드사슬 (H사슬) 로 이루어졌다. H 및 L 사슬 양방은 약 110 잔기로 구성된 보존 아미노산의 반복영역으로 구성된다. 이 영역은 도메인으로 불리우고, IgG 의 기본적읜 삼차원 구조단위를 구성한다. H 및 L 사슬은 각각 4 개 및 2 개의 연속 도메인으로 구성된다.
항체 아미노산 서열을 비교하는 경우, H 및 L사슬 양방의 아미노-말단 도메인은 기타 도메인보다 더 가변적임이 발견된다. 그래서, 이는 가변적 도메인 (V 도메인) 으로 부른다. H 및 L 사슬의 V 도메인은 이들의 상보적 성질로해서 상호간에 결합하여 IgG 분자의 아미노-말단에서 가변부를 형성한다. 기타 도메인은 결합하여 불변부를 형성한다. 불변부 서열은 일정한 종에 특징적이다. 예로서, 마우스 IgG 의 불변부는 인간 IgG 와는 상이하고, 마우스 IgG 분자는 인간 면역 시스템에의해 외래 단백질로 인식된다. 마우스 IgG 분자를 인간을 대상으로하여 투여하면 인간 항-마우스 항체(이후 HAMA 로칭함) 반응이 발생된다 [Schroff etal.,(1985),Cancer Res.,45,879-885]. 따라서, 마우스 항체는 인간을 대상으로 반복적으로 투여할 수 없다. 효과적인 투여를 위해서는, 항체는 HAMA 반응의 유도를 피하도록 변성되어야 하나, 여전히 항체 특이성은 유지하여야 한다.
X-선 결정학 분석의 데이터는 면역글로불린 폴드(fold) 는 통상적으로 각각 3 개 또는 4 개의 β-사슬로 구성된 두층의 역평행 β-쉬트를 포함하는 장관형 구조를 형성함을 보여준다. 가변부에서, H 및 L 사슬의 V 도메인의 각각에서의 3 개의 루프는 함께 합쳐저 항원-결합부위를 형성한다. 이러한 각각의 루프는 상보성결정영역(CDR) 로 불리운다. CDR 은 아미노산 서열에서 가장 높은 가변성을 갖는다. CDR 의 일부가 아닌 가변부의 일부는 프레임워크 영역(FR영역) 으로 불리우고 통상적으로 CDR 의 구조를 유지하는 역할을 한다.
카바트 및 공역자는 H 및 L 사슬의 수많은 가변부의 일차구조를 비교하였고, 서열 보존성에 기초하여 추정되는 CDR 또는 프레임워크 영역을 동정하였다 [E.A. Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th edition,NIH Publication, No.91-3242]. 추가로, 이들은 프레임워크 영역을 공통 아미노산 서열을 공유하는 여러 소집단으로 분류하였다. 이들은 또한 마우스 및 인간 서열사이에서 대응하는 프레임워크 영역을 동정하였다.
IgG 분자의 구조특성을 연구하여 후술되는 바와 같이 HAMA 반응을 유발하지 않는 인간화 항체를 제조하는 방법을 개발하게 되었다.
초기의 제안은 마우스 항체의 가변부를 인간기원의 불변부에 결합시켜 키메라 항체를 제조하는 것이었다 [Morrison, S.L., et al.,(1984),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81, p6851-6855]. 그러나, 이러한 키메라 항체는 여전히 많은 비-인간 아미노산 잔기를 함유하여, 특히 장기간 투여하는 경우 HAMA 반응을 유발할 수 있다 [Begent et al., (1990),Br.J.Cancer,62,p487 이하참조].
이어서 CDR 단편만을 인간항체로 이식하여 추가로 HAMA 반응을 유발하는 비인간 아미노산 서열의 수를 감소시키는 것이 제안되었다[Jones, P.T. et al.,(1986),Nature,321,522-525]. 그러나, CDR 부분만의 이식은 통상적으로 항원에 대한 면역글로불린의 활성을 유지시키기에 불충분한 것으로 밝혀졌다.
X-선 결정학의 데이터에 기초하여, 초티아 및 공역자 [Chothia et al., (1987),J.Mol.Biol., 196,901-917]는 이하를 판명하였다:
1) CDR 은 항원결합에 관여하는 영역 및 CDR 자체의 구조를 유지하는데 관여하는 영역을 갖는다. CDR 에 대한 가능한 삼차원 구조는 특성패턴(기본 구조)를 갖는 여러 종류로 분류할 수 있다;
2) 기본 구조의 종류는 CDR 서열뿐만아니라 프레임워크내 특정위치내 아미노산의 성질에 의해 결정된다.
그 결과, CDR-이식 기술은 또한 프레임워크 영역으로부터 특정 아미노산 잔기를 인간 항체 뼈대로 이식하는 것이 동반됨이 시사되었다[Queen et al., Japanese Provisional Patent Publication No.4-502408].
상기에서, 이식을 위하여 CDR이 수득되는 비인간 포유류로부터의 항체는 이후 '공여체' 분자로 부른다. CDR이 이식되는 인간 항체는 이후 '수용체'분자로 부른다.
CDR-이식을 실행하는데 있어서, CDR 영역의 구조는 이상적으로 보존되어야하며 면역글로불린 분자의 활성은 유지되어야한다. 그러므로, 하기 인자가 관련될 수 있다:
1) 수용체의 소집단; 및
2) 공여체의 프레임워크 영역으로부터 전달된 아미노산 잔기의 성질.
퀸 및 공역자[Queen et al., Japanese Provisional Patent Publication No.4-502408] 는 공여체의 프레임워크 영역으로부터의 아미노산 잔기는 CDR 서열과 더불어 수용체 분자에 이식시키나, 단, 잔기는 CDR 에 가깝거나, 또는 수용체의 프레임워크 영역내 아미노산은 수용체의 그 위치에서는 거의 발견되지 않는 반면, 공여체내의 대응하는 아미노산은 수용체의 그 위치에서 공통적으로 발견되는, 항체를 인간화시키는 방법을 제안하였다.
면역글로불린 M(IgM) 은 보통 10 개의 H 사슬 및 10 개의 L 사슬과 더불어 분자의 중심에 위치한 연결사슬(J사슬) 로 구성된다. 마우스 IgM 는 IgG 와 같이 불변부를 갖기 때문에 인간을 대상으로 반복적으로 투여할 수 없다. 그래서, 만일 IgM 분자를 인간에서 약제로 사용하려면 CDR 이식이 필요하다.
비록 IgM 분자는 통상적으로 J 사슬과 오합체로서 존재하지만, 이것은 J 사슬이 결핍된 육합체로서 존재할 수 있다 [Troy, et al., J.Biol.Chem.,(1992),267, (25),18002-18007]. 상보-결합 활성이 이러한 J 사슬 결핍 IgM 육합체에서 향상된다고 한다.[Davis,et al., Eur.J.Immunol., (1988) 18, 1001-1008]. 그러나, J 사슬의 존재는 이미 IgM 구조의 유지 및 분자가 이의 면역글로불린 활성을 유지하기 위해서는 필수적임이 이미 고려되었다. 현재, J 사슬이 결핍된 IgM 분자가 이의 원래 활성을 보유하는지는 공지되어 있지않다.
자연과정에서의 살아있는 유기체내 세포의 생리학적 죽음은 세포소멸로 공지되어 있고, 이는 세포의 병리학적 죽음, 즉 괴사와는 구별된다.[참조 Kerr et al., (1972),Br.J.Cancer,26, 239 이하 참조]. 세포소멸은 당해의 세포가 소정의 기능을 실행한 경우에서와 같이, 자연과정에서 살아있는 유기체에서 특정 세포가 미리 죽도록 예정되어있는, 예정된 세포사의 예이다. 세포소멸은 기타의 것들중에서 곡선의 세포표면, 응축된 핵크로마틴 및 단편화된 염색체 DNA 와 같은 형태학적 변화를 특징으로한다.
세포소멸은 T 및 B 림프구 분화의 과정동안 자가항원을 인식하는 세포의 처분에 중요한 역할을 한다. 소위 자가면역 질병의 발병은 통상적으로 림프구 분화동안 세포소멸의 실패로부터 발생하는 자가반응 림프구의 출현으로 발생한다[참조, Keiichi Nakayama et al., (1995), Mebio 12(10),79-86].
Fas 는 면역적격성 세포의 세포소멸에 관여하는 세포막 분자이다 [Itoh, N., et al., 하기]. 뮤린 모노클론성 항체는 인간 Fas 항원에 대해 생성된다[Yonehara,S., et al.,(1989),J.Exp.Med., 169,1747]. 이 항-인간 Fas 항체는 인간 세포에서 세포소멸-유도 세포독성 활성을 갖으며 자가면역 질병, AIDS 및 종양의 치료에서 잠재적인 치료제로서 제안되었다 [Japanesc Provisional Patent Publications Nos.2-237935 및 5-503281].
류마티즘, 특히 류마티스 관절염은 활말세포의 증식으로 발생하는 것으로 여겨지며, 다양한 면역학적 비정상을 수반한다. 활막세포의 증식은 전형적으로 염증성 세포 침윤 및 뼈의 미란을 수반한다. 만성 류마티스 관절염에서 침범된 관절주위의 조직 미란은 명백히 염증성 활막세포로부터 시토킨의 비정상적 생성으로 유발된다. 류마티즘환자에서 관절의 조사로 활막세포의 비정상적 증식, 활액 융모의 과형성, 다층 활막세포 등이 밝혀졌다[참조, Daniel J.McCarty(1985), in Arthritis and allied conditions, A textbook of rheumatology 10th Edition,Lea Febiger]. 류마티즘용 약제는 현재 주로 스테로이드 및 면역조절제와 같은 항염증성 약을 함유한다. 만일 활막세포의 비정상적 증식을 억제할 수 있으면, 임의의 이러한 제제는 류마티즘의 치료에 유용할 것이다.
류마티즘에서의 활막세포는 비제한적 방식으로 증식하지 않으며 [참조, Daniel J.McCarty(1985), in Arthritis and allied conditions, A textbook of rheumatology 10th Edition,Lea Febiger], 세포소멸은 류마티즘환자의 활막세포에서 발생함이 실증되었다. Fas 항원은 활막세포의 막상에서 발현되며, 나까지마등 [Nakajima,T.,et al., (1995),Arthritis Rheum.38, 485-491] 및 아노등 [Abstracts of the 38th Meeting of Japan Rheumatism Society (1994),p.487, and articles of 1994 Meeting of Japan Cancer Society,(1994),p.388]은 세포독성 항-인간 Fas 항체가 류마티즘환자로부터 비정상적으로 증식된 활막세포에서 세포소멸을 유도할 수 있는지를 조사하였다. 이것은 류마티즘외의 질병을 갖은 환자의 활막세포를 함유하는 대조군과 비교하여, 류마티즘 환자로부터 비정상적으로 증식된 활막세포에서 고수준의 세포소멸을 유도할 수있다.
따라서, 항-인간 Fas 항체는 림프구에서 뿐만아니라 비정상적으로 증식된 활막세포에서 세포소멸을 선택적으로 유도할 수 있어, 항-인간 Fas 항체는 류마티즘제로서 유용하다.
여러 마우스 항-인간 Fas 모노클론성 항체가 수득되었다 [예, Yonehara,S., et al., (1989) J.Exp.Med.169,1747-1756;Science,(1989),245, 301-305]. 추가로, 전술한 바와 같이, 이러한 항체는 시험관에서 류마티즘환자의 활액세포에서 세포소멸을 유도한 것이 보고되어 있다[참조, p487,Abstracts of the 38th Meeting of the Japan Rheumatology Society (1994), and p338, Articles of 1994 Annual Meeting of the Japan Oncology Society(1994)]. 그러나, 인간화 항-인간 Fas 항체의 제조는, 이것이 IgG 또는 IgM 이던 간에, 보고 된바없다. 더욱이, J사슬이 결핍된 그러나 세포소멸을 유도하는 능력을 갖은 인간화 항-인간 Fas IgM 항체의 성공적인 제조는 보고된 바 없다.
마우스 항-인간 Fas 모노클론성 항체를 인간화시키기 위해서는, 예컨대, 인간 항체 수용체상으로 이식시킬 가변부의 아미노산 서열을 선택하는 것이 필요하다. 아미노산 서열은 이상적으로는 예견된 CDR 서열 뿐만아니라 FR 서열의 선택된 아미노산 잔기를 포함하여야 한다.
인간화 항체를 설계시, 수용체의 소집단은 통상적으로 두 방법중의 하나로 선택한다:
1) 동일한 공지의 인간 항체로부터 중사슬(heavy chain) 및 경사슬 (light chain) 의 이용; 또는
2) 공여체의 사슬에 높은 서열 상동성을 갖거나 컨센서스 서열을 공유하면서, 동시에 수용체 사슬의 소집단의 결합을 유지시키는, 상이한 인간 항체에서 유래한 중사슬 및 경사슬의 이용.
단지 소집단의 자연발생 결합의 제한된 수 만이 존재하기 때문에 상기 기준 (2) 가 이미 사용되어왔다. 이러한 자연발생 결합을 유지하는 것이 중요하다고 여겨진다.
인간에게서 치료적으로 사용할 수 있는 항-인간 Fas 항체를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 더욱이, 잠재적인 HAMA 반응을 최소화하는 항체를 인간화하는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 추가목적이다.
본 출원사는 놀랍게도 소집단의 이러한 자연적 결합을 유지하거나 동일한 항체로부터 H 및 L 사슬을 사용할 필요가 없음을 발견하였다. 수용체 H 및 L 사슬의 선택은, 소집단의 결합에 무관하게, 공여체 및 수용체의 프레임워크 영역의 상동성에만 근거하는 인간 항체의 일차서열의 라이브러리로부터 실행할 수 있다. 이러한 선택 공정을 성공적으로 사용하여 항-인간 Fas 항체를 제조하였다.
따라서, 첫 번째 양태로서, 본 발명은 하기의 단계로 이루어진, 하나이상의 경사슬 및 중사슬을 함유하는 인간화 항체의 제조방법을 제공한다:
a 하나이상의 CDR 을 갖는 비-인간 항체를 선택하는 단계;
b 인간 항체 중사슬을 선택하는 단계;
c 인간 항체 경사슬을 선택하는 단계;
d 비-인간 항체 중사슬로부터의 하나이상의 CDR 을 인간 항체 중사슬로 도입하여 재조합 중사슬을 형성시키는 단계; 및
e 비-인간 항체 경사슬로부터의 하나이상의 CDR 을 인간 항체 경사슬로 도입하여 재조합 경사슬을 형성시키는 단계;
여기에서 인간항체 중사슬 및 경사슬 각각의 선택은 각각 비-인간 항체 중사슬 및 경사슬과의 서열 상동성만으로 결정한다.
본 발명의 기타 목적, 의도, 양태 및 구현예는 이후 명백해질 것이다.
도 1 은 CH11 의 소단위체를 코딩하는 전장 DNA 의 클로닝을 위한 cDNA 라이브러리의 구축도이다.
도 2 는 CH11 의 소단위체를 코딩하는 전장 DNA 의 클로닝 공정을 보여주는 도이다.
도 3 은 H 사슬의 서열결정을 위한 전략도이다.
도 4 는 L 사슬의 서열결정을 위한 전략도이다.
도 5 는 VL-KY 및 VL-KF DNA 단편의 제조를 위한 제 1 단계 PCR 작성도이다.
도 6 는 VL-KY 및 VL-KF DNA 단편의 제조를 위한 제 2 단계 PCR 작성도이다.
도 7 은 VL-KY 및 VL-KF DNA 단편의 제조를 위한 제 3 단계 PCR 작성도이다.
도 8 은 플라스미드 pHkKY2-58 및 pHkKF2-19 의 구축도이다.
도 9 는 VL-RY 및 VL-RF DNA 단편의 제조를 위한 제 1 단계 PCR 작성도이다.
도 10 은 VL-RY 및 VL-RF DNA 단편의 제조를 위한 제 2 단계 PCR 작성도이다.
도 11 은 플라스미드 pHkRY2-10 및 pHkRF2-52 의 구축도이다.
도 12 는 MEC DNA 단편의 작성도이다.
도 13 은 플라스미드 pMEC22 의 구축도이다.
도 14 는 VH1234 DNA 단편의 제조를 위한 제 1 단계 PCR 의 작성도이다.
도 15 는 VH1234 DNA 단편의 제조를 위한 제 2 단계 PCR 의 작성도이다.
도 16 은 VH1234 DNA 단편의 제조를 위한 제 3 단계 PCR 의 작성도이다.
도 17 은 플라스미드 pMEHC20 의 구축도이다.
도 18 은 HUMFR5' DNA, HUMFR3' DNA, MOUFR5' DNA 및 MOUFR3' DNA 단편의 제조를 위한 제 1 단계 PCR 의 작성도이다.
도 19 는 HUMFR2 DNA 및 MOUFR2 DNA 단편의 제조를 위한 제 2 단계 PCR 의 작성도이다.
도 20 은 플라스미드 pHFR3 및 pHFR4 의 구축도이다.
도 21 은 HHC123 DNA 단편의 제조를 위한 제 1 단계 PCR 의 작성도이다.
도 22 은 HHC123 DNA 단편의 제조를 위한 제 2 단계 PCR 의 작성도이다.
도 23 은 HHC123 DNA 단편의 제조를 위한 제 3 단계 PCR 의 작성도이다.
도 24 는 플라스미드 pMECW5 의 구축도이다.
도 25 는 플라스미드 pHCμH 및 pHCμM 의 구축도이다.
도 26 은 FASAIC DNA 단편의 제조를 위한 제 1 단계 PCR 의 작성도이다.
도 27 은 FASAIC DNA 단편의 제조를 위한 제 2 단계 PCR 의 작성도이다.
도 28 은 플라스미드 phFas-AIC2 의 구축도이다.
도 29 은 ELISA 에의한 Fas-결합활성의 측정도이다.
도 30 은 ELISA 에의한 Fas-결합활성의 측정도이다.
도 31 은 HPB-ALL 세포에서 세포독성 활성의 측정도이다.
본 발명으로 HAMA 반응을 유도하는 최소의 위험성을 갖으며, 반면에 여전히 효과적인 항체 작동체 기능을 갖는 인간화 항체의 구축이 가능해진다.
여기에서 사용하는 용어'서열 상동성' 은 DNA 서열 상동성 또는 아미노산 서열 상동성을 의미한다. 용어 '상동성' 은 두서열 사이의 유사성을 의미하며, 이는 당기술에서는 기준이다. 서열상동성은 아미노산 서열 상동성이 바람직하다. 아미노산 서열 상동성은 공통적으로 서열 데이터베이스의 컴퓨터화된 탐색을 동반하는 수많은 방법중 임의의 하나로 평가할 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게는 공지되어 있다. 또한 상동성은 프레임워크 영역의 길이에 대해 평가하는 것이 바람직하다.
여기에서 사용하는 바와 같은, 항체와 관련한 인간 은 인간대상에서 면역원성 반응을 조금 유도해내거나 거의 유도해내지 못하리라 기대되는 임의의 항체에 관한 것이고, 당해 대상은 개인 또는 집단이다.
통상적으로, 일정한 항체 유래의 모든 CDR 은 수용체 항체로 이식하여 에피토프 결합 영역을 보존하는 것이 바람직함을 알 수 있을 것이다. 그러나, CDR 의 총수미만이 공여체로 이식되는 것이 바람직할 경우가 있을 수 있으며, 이것이 본 발명에 의해 구상되었다.
비-인간 항체유래의 CDR 을 인간 항체에 이식시키는 것이 특히 바람직하다. 또한, 프레임워크 영역의 특정 구역이 수용체 항체(또한 여기에서는 인간 항체로서도 불리움) 로 도입되어 비-인간 인식부위의 삼차원 구조를 유지시키는 것이 바람직하다. 이러한 프레임워크 영역의 구역은, 하기의 가이드라인에 따라, 각자의 중요성으로 인해 선택된 각각의 아미노산 잔기를 포함한다. 특히, 인간에서 드문, 그러나 관련 비-인간 항체에서 공통적인 아미노산 잔기, 및 에피토프 또는 인식부위와의 직접적 상호작용의 높은가능성을 갖는 아미노산 잔기가 CDR 과 함께 이식되는 것이 바람직하다.
CDR 을 인간 항체에 이식하는 경우, 비-인간 CDR 이 완전히 관련 인간 CDR 를 대체하는 경우, 특히 양방이 같은 길이를 갖는 경우가 통상적으로 존재할 것이다. 그러나, 또한 단지 일부의 인간 CDR 만이 대체되거나 또는 단지 일부의 비-인간 CDR 만이 이식되는 경우가 존재할 수 있으며, 이 둘은 통상적으로 병행된다. 하나의 CDR 이 다른것보다 더 큰 경우가 있을 수 있으나, 상황이 어떠하든, 전술한 대체외에는, 인간 프레임워크 영역은 본래대로 두는 것이 매우 바람직하다.
비-인간 항체유래의 CDR 을 통상적으로 사용하여 인간 항체내 대응하는 CDR 을 대체해야 하는 것을 알 수 있을 것이다. 그러나, 인간 항체 사슬의 CDR 영역이 이미 제거된 골격 인간 경 또는 중사슬을 수용체로서 사용할 수 있는 것이 가능하다. 이러한 경우에서, 비-인간 항체유래의 CDR 은 원래의 인간 CDR 에 의해 미리 점유된 위치에서 인간사슬로 도입할 수 있다.
또한 인간 중사슬 및 경사슬은 동일한 인간 항체로부터 유래할 필요가 없으며, 또한 동일한 종류로부터 유래할 필요가 없음을 이해하게 될 것이다. 중요한 것은 선택한 수용체의 서열이 가능한한 가깝게 비-인간 항체의 서열과 합치하여야 하는 것이다. 두 사슬(경/경 또는 중/중) 의 합치의 중요성은 생성된 항체는 가능한한 원래의 비-인간 항체의 것을 가깝게 닮은 인식부위를 갖어 최상의 결합을 확보하는 것이다. 따라서, 또한 본 발명은 가장 가까울 가능성이 없는 상대를 이용하는 가능성을 구상하였으며, 여기에는 생성된 재조합 항체는 요구되는 목적에 도움이될 것이 당연히 기대된다.
여기에서 항체를 논하는 경우, 적절히는, 항체를 코딩하는 임의의 핵산 서열에도, 준용하여, 동일한 고려가 적용됨을 이해하게 될 것이다.
기타 제한없이 서열상동성만에 근거한 선택방법은 공여체 및 수용체가 FR 부분에서 70% 이상의 아미노산 동일성을 공유하는 것을 가능케 해준다. 이러한 접근법을 채택하여, 공지된 방법과 관련하여, 공여체로부터 이식되는 아미노산의 수를 감소시킬 수 있어 HAMA 반응의 유발을 최소화시킬 수 있다.
공여체 소집단내 드물게 일어나는 아미노산 잔기의 역할은 완전히 정의할 수 없어, 항체분자의 일차구조로부터 삼차원구조를 예견하는 기술(이후 분자 모델링 로 부름) 은 정확성이 제한받음을 알 수 있을 것이다. 퀸 및 공역자 [Queen et al., 상기] 의 방법과 같은 공지된 방법은 공여체 또는 수용체로부터의 아미노산 잔기가 이러한 위치에서 선택되어야 하는지는 보여주지 않는다. 서열 상동성에만 근거한 수용체 분자의 선택은 선택이 이러한 유형의 선택의 필요를 현저히 감소시킬 수 있다.
여기에서 사용하는 바와 같은, 용어 '재조합' 는 유전학적으로 조작하여 수득되는 임의의 물질에 관한 것이나, 당해 물질이 원래의 물질로부터 변성되거나 또는 원래의 것으로부터 상이한 방법 또는 상이한 계로 발현된 것에 한한다.
여기에서 사용하는 바와 같은 용어 '항체' 는 당기술에 공지된 것이고, 항체의 성질은 본 발명에 중요하지 않다. 항체는 임의의 항체 종류에 대응할 수 있고, 여기에서 단백질은 실제적으로 항체 종류에 대응한다. 예컨대, 항체는 IgG, IgM, IgA 또는 IgE 일 수 있으며, 종류는 전적으로 투여경로에 의존할 수 있다. 중 사슬 가변부는 항체의 하나의 아형에서 유래한 인간 서열을 포함할 수 있는 반면, 경사슬 가변부는 항체의 다른 아형에서 유래한 서열을 포함할 수 있는 것을 알 수 있을 것이다. 또한, 본 발명은 자연적으로 발생하지 않는 중 및 경 사슬 소집단의 결합으로 항체를 제공할 수 있다.
본 발명의 항체는 항-Fas 활성을 갖는 것이 바람직하나, 항체는 잠재적으로 임의의 항원에 대해 제조할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 분자는 항-Fas 활성을 갖는 IgM 분자인 것이 특히 바람직하다. 사실, 또한 만일 5 개의 중 및 경 사슬쌍과 오합체 항체 구조를 형성하는 J 사슬없이 IgM 형 구조물을 사용하면, 세포소멸 활성은 J 사슬를 포함하는 분자에 대해 증가하는 것을 발견하였다.
용어 '경사슬' 및 '중사슬' 은 당기술에 공지되어 있다. 여기에서 사용하는 이러한 용어는 전장의 사슬을 반드시 의미하는 것은 아니고, 단지 요구조건은 본 발명의 재조합 항체 분자가 항원, 가장 바람직하게는 Fas 항원에 대해 활성을 유지할 수 있는 것임을 알 수 있을 것이다.
비-인간 항체에서 유래한 아미노산 서열은 항체가 항원과 교차반응 하도록하여, CDR 영역을 포함하거나, CDR 영역에 대응하는 것이 바람직하다. 하나 또는 그이상의 CDR 영역은 인간 항체 서열과 연결될 수 있다는 것을 알수 있을 것이다. 각 중사슬 및 경사슬이 3 개의 CDR 영역을 포함하고, CDR 영역은 동일한 비-인간 항체로부터 유래하는 것이 특히 바람직하다.
비-인간 영역 또는 영역들은 항체를 발생시키는 것이 가능한 임의의 원으로부터 유래할 수 있다. 비록 이것은 가장 편리한 것은 마우스이나, 기타의 원, 예컨대 래트 및 토끼도 또한 가능하다. 비-인간 영역은 주로 인간 Fas 항체와 반응하는 마우스 CH11 항체에서 유래한 CDR 영역인 것이 바람직하다.
인간 항체에서 유래한 아미노산 영역은 항체의 프레임워크 영역(FR) 을 주로 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 항체의 불변부 또는 불변부의 일부가 존재할 수 있다.
FR 은 면역글로불린 분자의 H 및 L 사슬 소단위체의 가변부에 존재한다. 예로서, FRH1은 H 사슬 소단위체의 가변부내 가장 N-말단에 위치한 프레임워크 영역을 의미하고, FRL4는 L 사슬 소단위체의 가변부의 N-말단에서 4 번째 프레임워크 영역을 의미한다. 마찬가지로, CDRH1은, 예컨대, H 사슬 소단위체의 가변부내 가장 N-말단 위치에 존재하는 CDR 을 의미하고, CDRL3은 L 사슬 소단위체의 가변부의 N-말단에서 3 번째 CDR을 의미한다. FR 은 임의의 경 또는 중사슬에서 CDR 영역곁에 위치한다.
본 발명의 항체는 실질적으로 인간 항체에서와 마찬가지로 인간환자에서 면역원성을 갖지 않는다. 이것을 주로 이질성 불변부에 대응하는 항체의 일부가 존재하지 않기 때문이다. 따라서, 본 발명의 항체는 CH11 과 같은 마우스 모노클론성 항체에서 발생하는 가변부의 일부를 갖을 수 있으나,마우스 불변부는 제거된다. 비-인간 항체에서 유래한 아미노산의 수는 추가로 감소시켜 면역원성을 제거하는 반면,목적하는 항체 활성을 보유하는 것이 바람직하다. 이것은 전술한 바와 같이, 서열 상동성에 기초하여 인간 항체의 선택으로 달성된다.
또한, 공여체 CDR 영역의 구조 및 기능의 유지에서 중요한 공여체 FR 로부터 아미노산을 동정하도록 고안된 추가의 선택절차의 제공으로 상기방법에 대한 추가의 정교함을 발견하였다.
일단 인간 수용체 분자를 일정한 사슬에 대하여 선택하면, 공여체의 FR 로부터 이식될 아미노산 잔기의 선택을 하기와 같이 실행한다:
공여체 및 수용체의 아미노산 서열을 나란히 배열한다. 만일 FR 의 배열된아미노산 잔기가 임의의 위치에서 상이하면, 어떤 잔기를 선택하여야 하는지를 결정할 필요가 있다. 선택된 잔기는 공여체에서 유래한 CDR 의 삼차원 구조를 방해하지 않거나 단지 최소한의 영향만을 미쳐야한다.
퀸 등 [Japanese Provisional Patent Publication No.4-502408] 은 공여체 FR유래의 아미노산 잔기를 CDR 서열과 더불어 이식시킬 것인 가를 결정하는 방법을 제안하였다. 이 방법에 따라, FR 에서 유래한 아미노산 잔기를, 만일 잔기가 하기의 기준중 적어도 하나를 만족시키면, CDR 서열과 더불어 수용체에 이식시킨다:
1) 수용체의 인간 프레임워크 영역내 아미노산은 수용체의 그 위치에서 드물게 발견되는 반면, 공여체내 대응하는 아미노산은 수용체의 그 위치에서 공통적으로 발견된다;
2) 아미노산은 CDR 중 하나에 가깝게 위치한다; 그리고
3) 아미노산은, 면역글로불린의 삼차원 모델로 판단시, CDR 의 약 3Å 내에서 측쇄원자를 갖고, 잠재적으로 항원 또는 인간화 항체의 CDR 과 상호작용할 수 있다.
상기 기준 (2) 에 의해 동정된 잔기는 종종 기준 (3) 의 특성을 보인다. 따라서, 본 발명에서, 기준 (2) 는 생략하고 두 개의 새로운 기준을 도입한다. 따라서, 본 발명에서는, 아미노산 잔기를, 만일 잔기가 하기 기준중 하나이상을 만족시키면, CDR 과 더불어 공여체 FR 로부터 이식시킨다:
a) 수용체의 인간 프레임워크 영역내 아미노산은 수용체의 그 위치에서 드물게 발견되는 반면, 공여체내 대응하는 아미노산은 수용체의 그 위치에서 공통적으로 발견된다;
b) 아미노산은, 면역글로불린의 삼차원 모델로 판단시, CDR 의 약 3Å 내에서 측쇄원자를 갖고, 잠재적으로 항원 또는 인간화 항체의 CDR 과 상호작용할 수 있다;
c) 아미노산은 CDR 의 기본종류의 구조를 결정하는데 관여하는 위치에서 발견된다;
d) 아미노산의 위치는 중사슬 및 경사슬의 접촉표면에서 발견된다.
기준 (a) 에 있어서, 아미노산은 동일한 아종의 항체의 90% 이상으로 그 위치에서 발견되는 경우 공통적인 것으로 정의한다 [Kabat et al,이상]. 아미노산은 동일한 아종의 항체의 10% 미만에서 발견되는 경우 드물다고 정의한다.
기준 (c) 에 있어서, 기본종류 결정 잔기의 위치는 초티아 및 공역자 [Chothia et al, 상기] 에 의해 제공된 정보에 따라 명확하게 결정할 수 있다.
기준 (b) 및 (d) 에 있어서, 미리 항체의 가변부의 분자 모델링을 실행하는 것이 필요하다. 분자 모델링을 위한 임의의 시판용 소프트웨어를 이용할 수 있는 반면, AbM 소프트웨어를 사용하는 것이 바람직하다 [Oxford Molecular Limited,Inc.].
분자 모델링에의한 예견은 정확성에 한계가 있다. 그러므로, 본 발명에서는, 분자 모델링으로 수득한 구조 예견은 다양한 항체의 가변부로부터 얻은 X-선 결정학 데이터와 비교하여 평가한다.
분자 모델링 (AbM 소프트웨어) 으로 생겨난 구조 모델을 이용하는 경우, 두 개의 원자는 두 원자사이의 거리가 이들의 반데르발스 반경 플러스 0.5Å 의 총합미만인 경우 반데르발스력에의해 상호간 접촉하리라 추정된다. 수소결합은 주사슬 및 측사슬의 아미드 질소 및 카로보닐 산소와 같은 극성원자 사이의 거리가 2.9Å, 즉 수소결합을 위한 평균길이 플러스 5Å 보다 작은 경우 존재하리라 추정된다. 더욱이, 두 개의 상반적인 전하의 원자사이의 거리가 2.85Å 플러스 0.5Å 보다 작은 경우, 이것은 이온쌍을 형성하는 것으로 추정된다.
CDR 과 빈번하게 접촉하는 FR 내 아미노산의 위치는 다양한 항체의 가변부로부터 얻은 X-선 결정학 데이터에 기초하여 동정한다. 이러한 위치는 소집단에 무관하게 결정된다. 사슬에 대해서는, 이것은 위치 1,2,3,4,5,23,35,36,46,48,49,58,69,71 및 88 이고, 중사슬 위치는 2,4,27,28,29,30,36,38,46,47,48,49,66,67,69,71,73,78,92,93,94 및103 이다. 상기 아미노산 넘버링은 카바트등 [Kabat et al., 상기] 의 정의에 따른다. 이 넘버링 시스템은 이후에 뒷따른다. 분자 모델링을 사용하는 경우, 상기에열거된 아미노산 위치는 조사된 항체 가변부의 2/3 에서 CDR 잔기와 접촉하는 것이 보여진다.
이러한 발견을 이용하여 상기 기준 (b) 를 정의하였다. 구체적으로는, 만일 FR 내 아미노산 위치가 분자 모델링에의해 CDR 과 접촉하리라 예견되고 X-선 결정학적 분석으로 CDR 과 접촉하는 것이 실험적으로 빈번하게 발견되면, 공여체의 아미노산 잔기의 이식이 우선된다. 임의의 기타 경우에서는, 기준 (b) 는 고려되지 않는다.
마찬가지로, 기준 (d) 에 있어서, 수많은 항체의 가변부에서 얻은 X-선 결정학 데이터는 경사슬내 위치 36,38,43,44,46,49,87 및 98 에서의 아미노산 잔기 및 중사슬내 위치 37,39,45,47,91,103 및 104 에서의 아미노산 잔기는 빈번하게 중사슬과 경사슬사이의 접촉에 관여하는 것을 보여준다. 만일 임의의 이러한 아미노산이 분자 모델링에의해 경 및 중사슬 접촉에 관여하는 것으로 예견되면, 공여체의 아미노산 잔기의 이식이 우선된다. 임의의 기타의 경우에서, 기준 (d) 는 고려되지 않는다.
본 발명은 추가로 임의의 상기 동정된 항체를 코딩하는 DNA 및 RNA, 특히 DNA 를 제공하는 것을 알 수 있을 것이다. 중사슬 및 경사슬 양방을 코딩하는 DNA 및 RNA 가 제공된다.
DNA 는 벡터, 적합하게는 발현벡터로 통합시킬 수 있는 임의의 적합한 형태일 수 있는 것을 알수 있을 것이다. 또한 이것은 리더(reader) 서열 또는 융합 단백질형태로 코딩된 단백질의 발현을 위한 서열과 같은 임의의 기타 적합한 서열과 결합될 수 있다.
본 발명은 추가로 상기에서 정의된 바와 같은 벡터로 형질전환된 숙주세포 및 상기 DNA 를 포함하는 하나이상의 발현 벡터로 형질전환된 상기 숙주세포를 포함하는 본 발명의 단백질의 발현을 위한 계를 구상한다.
본 발명의 단백질은 표준기술에 의해 계의 배양후 이러한 계부터 수득할 수 있다.
본 발명의 특정의 바람직한 양태 및 구현예는 이하와 같다:
유전학적으로 조작된 면역글로불린 M(IgM) 단백질, 이 IgM 단백질은 J 사슬 단백질없이 세포소멸 유도 활성을 갖으며, 여기에서 IgM 단백질은 서열목록의 SEQ ID No. 78 에서 정의된 아미노산 서열을 포함하는 경 폴리펩티드사슬 단백질, 서열목록의 SEQ ID No. 80 에서 정의된 아미노산 서열을 포함하는 경 폴리펩티드사슬 단백질, 서열목록의 SEQ ID No. 82 에서 정의된 아미노산 서열을 포함하는 경 폴리펩티드사슬 단백질 또는 서열목록의 SEQ ID No. 84 에서 정의된 아미노산 서열을 포함하는 경 폴리펩티드사슬 단백질중 하나 및 서열목록의 SEQ ID No. 86 에서 정의된 아미노산 서열을 포함하는 중 폴리펩티드사슬 단백질 또는 서열목록의 SEQ ID No. 88 에서 정의된 아미노산 서열을 포함하는 중 폴리펩티드사슬 단백질중 하나만으로 구성된다.
4 개의 바람직한 경사슬 서열 및 2 개의 바람직한 중 사슬 서열이 존재함을 알 수 있을 것이다. 임의의 경사슬 서열은 임의의 중사슬 서열과 결합할 수 있다. 따라서, 바람직한 결합은 이하와 같다:
SEQ ID No.78 로 정의된 바와 같은 경사슬 및 SEQ ID No.86 로 정의된 바와 같은 중사슬.
SEQ ID No.78 로 정의된 바와 같은 경사슬 및 SEQ ID No.88 로 정의된 바와 같은 중사슬.
SEQ ID No.80 로 정의된 바와 같은 경사슬 및 SEQ ID No.86 로 정의된 바와 같은 중사슬.
SEQ ID No.80 로 정의된 바와 같은 경사슬 및 SEQ ID No.88 로 정의된 바와 같은 중사슬.
SEQ ID No.82 로 정의된 바와 같은 경사슬 및 SEQ ID No.86 로 정의된 바와 같은 중사슬.
SEQ ID No.82 로 정의된 바와 같은 경사슬 및 SEQ ID No.88 로 정의된 바와 같은 중사슬.
SEQ ID No.84 로 정의된 바와 같은 경사슬 및 SEQ ID No.86 로 정의된 바와 같은 중사슬.
SEQ ID No.84 로 정의된 바와 같은 경사슬 및 SEQ ID No.88 로 정의된 바와 같은 중사슬.
본 발명은 상기에서 정의한 8 개의 단백질중의 임의의 것을 코딩하는 DNA 를 추가로 제공한다. 이런 서열은 각각 SEQ ID No. 78,80,82,84,86 및 88 로 정의된 단백질을 코딩하는 SEQ ID No. 77,79,81,83,85 및 87 로서 주어진다. 바람직하게는 60-70℃ 및 6 x SSC 의 조건하, 상기 DNA 와 혼성화하는 DNA 가 또한 바람직하다.
전술한 임의의 DNA 를 포함하는 재조합 DNA 벡터, 특히 재조합체 DNA 벡터 pHkKY2-58, pHkKF2-19, pHkRY2-10, pHkRF2-52, pHμH5-1 및 pHμM1-1벡터가 또한 바람직하다. 본 발명에는 또한 이러한 벡터로 형질전환된 세포, 특히 대장균 pHκKY2-58주 (FERM BP-5861), 대장균 pHκKF2-19 주 (FERM BP-5860), 대장균pHκRY2-10주(FERM BP-5859), 대장균 pHκRF2-52주(FERM BP-5862), 대장균pHμH5-1 주(FERM BP-5863) 및 대장균 pHμM1-1 주 (FERM BP-5864) 가 포함된다.
본 발명의 면역글로불린 단백질의 바람직한 제조방법은 이하로 구성된다:
벡터내 포함된 면역글로불린 H 사슬 또는 L 사슬 소단위체를 코딩하는 DNA 을 발현시킬 수 있는 조건하 전술한 DNA 벡터로 형질전환된 세포를 배양하고,그리고
배양물로부터 면역글로불린 단백질을 회수한다.
본질적으로, 본 출원사는 항체-생산 하이브리도마 세포로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 마우스 IgM 항-인간 Fas 모노클론성 항체의 H 및 L 사슬을 코딩하는 유전자를 성공적으로 클로닝하였다. 전장 뉴클레오티드 서열을 결정한다. 이어서 CDR 영역의 위치를 각각의 사슬에서 동정한다. 프레임워크 영역에서 유래한 여러 아미노산 잔기와 더불어, 상기 CDR 영역을 포함하는 아미노산 서열을 선택한다. 이러한 서열을 인간 IgM 면역글로불린의 H 및 L 사슬에 이식하여 인간화 항-인간 Fas 항체의 완전한 H 및 L 사슬을 수득한다.
인간화 H 및 L 사슬을 코딩하는 DNA 는 발현벡터로 클로닝시킨다. 배양된 동물 세포로의 H 사슬 발현 벡터와 L 사슬 발현 벡터의 공-트랜스펙션으로 세포소멸 유도 활성을 갖는 단백질이 생성되고 이것은 항-인간 Fas 항체로서 작용한다.
본 발명의 DNA 는 CH11 과 같은, 항-인간 Fas 모노클론성 항체를 생산하는 마우스 하이브리도마 세포로부터 처음에 폴리(A)+RNA 를 제조하여 수득할 수 있다. 이어서 폴리(A)+RNA 는 역전사효소를 이용하여 cDNA 로 전환시키고, 항체의 H 및 L 사슬을 코딩하는 cDNA 를 정제할 수 있다. 요네하라등 [(1989),J.Exp.Med.,169, 1747 이하참조] 는 마우스를 Fas-발현 인간 2배성 섬유아세포 세포계통 FS-7 로 면역화시킨후 마우스 골수종 세포와 마우스 림프구를 융합하여, CH11 로 나타낸, 항-인간 Fas 모노클론성 항체를 수득하였다. 하이브리도마로부터 유래한 CH11 는 이가꾸-세이부쓰가꾸 겐뀨조 가부시끼 가이샤의 시판품이다.
폴리(A)+RNA 는 처음에 총 RNA 를 제조한후, 예컨대 올리고(dT)셀룰로오스, 올리고(dT)라텍스 비드등으로 충진된 친화성 칼럼을 이용하여 총 RNA 로부터 폴리(A)+RNA 를 정제하여 수득하거나, 또는 전술한 바와같은 친화성 물질을 이용하여 세포 용해물로부터 폴리(A)+RNA 를 직접 정제하여 수득할 수 있다. 총 RNA 는 예컨대 이하와 같은 방법으로 제조할 수 있다: 알칼리 수크로오스 밀도구배 초원심분리 [참조, Dougherty,W.G. and Hiebert,E.,(1980),Virology, 101, 466-474]; 구아니딘 티오시아네이트-페놀법; 구아니딘 티오시아네이트-트리플루오로세슘법; 및 페놀-SDS법. 그러나 바람직한 방법은 구아니딘 티오시아네이트 및 염화세슘을 이용하는 것이다[참조, Chirgwin,J.M., et al.(1979), Biochemistry, 18, 5294-5299].
이어서 전술한 바와 같은 역전사효소의 사용으로 수득한 단일 가닥(ss) cDNA 는 이중가닥 (ds)cDNA 로 전환시킬 수 있다. ds cDNA 를 수득하기 위한 적당한 방법에는 S1 뉴클레아제법 [참조, Efstratiadis,A.,et al., (1976), Cell, 7,279-288] 및 구블러-호프만법 [참조, Gubler,U. and Hoffman,B.J., (1983),Gene, 25, 263-269] 이 포함된다. 그러나, 오까야마-버그법 [참조, Okayama,H. and Berg,P., (1982),Mol. Cell.Biol.2,161-170] 을 사용하는 것이 바람직하다.
이어서 상기에서 수득한 ds cDNA 는 클로닝 벡터에 통합시킬 수 있고 그 다음 생성된 재조합체 벡터를 사용하여 대장균과 같은 적당한 미생물을 형질전환시킬 수 있다. 형질전환체는 표준방법, 예컨대 재조합체 벡터에 의해 코딩되는 테트라사이클린 내성 또는 암피실린 내성에 대한 선택으로 선택할 수 있다. 만일 대장균을 사용하면, 형질전환은 하나한법으로 실행할 수 있다 [참조, Hanahan, D. (1983), J.Mol.Biol., 166,557-580]. 이와는 달리, 재조합체 DNA 는 염화칼슘 및 염화마그네슘 또는 염화루비듐에 함께 노출시켜 제조한 수용성(competent) 세포로 도입시킬 수 있다. 만일 플라스미드를 벡터로 사용하면, 플라스미드는 전술한 바와 같은 내약성 유전자를 함유하여 선별을 촉진하는 것이 매우 바람직하다. 브루트 퍼스(Brute force) 선별이 가능하나, 바람직하지 않다. 비록 플라스미드가 거론되었으나, lambda 파아지와 같은 기타 클로닝 벡터를 사용할 수 있는 것을 알 수 있을 것이다.
목적 DNA 를 갖는 형질전환체의 선별 방법은 하기와 같다 :
(1) 합성 올리고뉴클레오티드 탐침을 이용한 스크리닝
목적 단백질의 아미노산 서열 전부 또는 일부를 밝히고자 하는 경우, 목적 단백질의 대표적인 짧은 인접 서열을 사용하여 올리고뉴클레오티드 탐침을 구성할 수 있다. 탐침은 아미노산 서열을 코드하지만, 유전자 코드의 동의성으로 인해, 제조될 수 있는 다수의 탐침이 있을 수 있다. 그러므로, 제한된 수의 올리고뉴클레오티드에 의해만 코드될 수 있는 아미노산 서열이 통상 선별될 것이다. 생성에 필요한 올리고뉴클레오티드의 수는 또한 4 개의 일반적인 염기중 임의 것이 사용될 수 있는 위치에서 이노신의 치환으로 인해 감소될 수 있다. 탐침을 이어서32P,35S 또는 비오틴으로 적절하게 표지한 다음, 니트로셀룰로스 필터상에 고정된 형질전환체로 부터의 변성되고 형질전환된 DNA 와 혼성화시킨다. 양성 균주는 탐침상의 표지를 감식하므로써 나타난다.
(2) 폴리머라제 연쇄 반응에 의한 스크리닝
목적 단백질의 아미노산 서열 전부 또는 일부를 밝히고자 하는 경우, 아미노산 서열중 별개의 비-인접 부분에 상응하는 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오티드 프라이머가 합성될 수 있다. 상기 프라이머들을 이어서 폴리머라제 연쇄 반응 방법 [참고, Saiki, R. K.et al, (1988), Science,239, 487-491] 에 사용하여 마우스 항-인간 Fas 모노크로날 항체 소단위체를 코드하는 목적 DNA 단편을 증폭시킬 수 있다. 여기에서 사용된 주형 DNA 는, CH11 을 발현하는 것과 같은, 항-인간 Fas 항체를 생성하는 하이브리도마로 부터 수득된 mRNA 를 사용한 역전사효소 반응에 의해 합성된 cDNA 일 수 있다. 상기 합성된 DNA 단편은 시판되는 키트를 이용하여 플라스미드 벡터에 직접 삽입시키거나 또는 예를 들어,32P,35S 또는 비오틴으로 표지시킨 다음, 목적 클론을 수득하기 위한 콜로니 혼성화 또는 플라크 혼성화의 탐침으로서 사용될 수 있다.
모노크로날 항체 CH11 은 각각 H (μ 사슬) 및 L 사슬인 5 개의 소단위체 및 하나의 J 사슬로 이루어진 착물인, 면역글로블린 M (IgM) 이다. 그러므로, 소단위체의 아미노산 서열 일부를 밝히기 위해서, 소단위체를 분리하여야 하며, 이는 당 분야의 숙련자에게 이미 공지된 전기영동, 컬럼 크로마토그래피 등과 같은 임의의 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 소단위체가 분리되는 경우, 그들은, 하나 이상의 각 소단위체 N-말단의 아미노산 서열을 확인하기 위해서, 자동 단백질 시퀀서 (예를 들어, PPSQ-10; Shimadzu 사제) 를 이용하여 서열화될 수 있다. 올리고뉴클레오티드/프라이머는 이어서 상기 공지된 방법을 이용하여 생성될 수 있다.
상기 수득된 적절한 형질전환체로 부터 항-인간 Fas 모노크로날 항체의 각 소단위체를 코드하는 DNA 의 수합은 문헌 [Maniatis, T.,et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, NY, (1982)] 에 기재된 방법과 같은, 이미 공지된 방법에 의해서 수행될 수 있다. 예를 들어, 필수 플라스미드를 함유하는 것으로 확인된 형질전환체로 부터 벡터 DNA 에 상응하는 분획을 분리한 후 플라스미드 DNA 로 부터 목적 소단위체를 코드하는 DNA 영역을 삭제할 수 있다.
상기 기재된 바와 같이 제조된 CH11 의 중사슬 및 경사슬을 코드하는 DNA 를 함유하는 플라스미드로E. coliDH 5α 를 형질전환시키고, 생성된 2 개의 형질전환체 (E. colipCR3-H123 및E. colipCR3-L103 으로 각각 명명) 는 미생물 기탁에 관한 부다페스트 조약에 따라서 1996 년 2 월 28 일자로 기탁기관 [Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo (NIBH)] 에 기탁되었고, 각각의 기탁번호는 FERM BP-5427 및 FERM BP-5428 이다. 상기 플라스미드를 함유하는E. coliDH 5α 를 상기 플라스미드를 함유하지 않는E. coliDH 5α 와 직접적으로 비교가능한 방법으로 배양시킬 수 있다. 그러므로, 본 발명의 DNA 는 상기 기탁을 이용하여 수득될 수 있다. 이는, 예를 들어, 기탁물을 배양하여 플라스미드를 단리시키므로써, 또는 플라스미드를 주형으로 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응을 이용하므로써 수득될 수 있다.
적절하게는, DNA 서열은 예를 들어, 막삼-길버트 화학 변형법 (Maxam-Gilbert chemical modification techniqe; 참고, Maxam, A.M. 및 Gilbert, W. (1980), Methods in Enzymology65, 499-276) 및 M13 파아지를 이용한 디데옥시 사슬 종결 방법 (Dideoxy chain termination method; 참고, Messing, J. 및 Vieira, J. (1982), Gene,19, 269-276) 을 포함한, 당 분야에서 이미 공지된 각종 방법들에 따라서 서열화될 수 있다. 최근에, DNA 를 서열화하기 위한 또 다른 방법은 넒은 수용능을 가지며, 디데옥시 방법에 있어서 통상적인 방사성 동위원소 대신에 형광염료의 사용을 포함한다. 전체 방법은 전기영동후 뉴클레오티드 서열의 판독을 포함하여 컴퓨터화된다. 상기 방법을 위한 적절한 기계로는, 예를 들어, 퍼킨-엘머 시퀀스 로봇 CATALYST 800 및 퍼킨-엘머 모델 373A DNA 시퀀서가 있다. 상기 방법의 이용으로 DNA 뉴클레오티드 서열의 결정이 효율적이며 안전하게 된다.
상기 결정된 뉴클레오티드 서열 및 CH11 의 H 및 L 사슬의 각 N-말단 아미노산 서열의 데이타를 기초로 하여, CH11 의 H 및 L 사슬의 전체 아미노산 서열이 결정될 수 있다.
따라서, H 및 L 사슬의 N-말단에 대한 서열 데이타와 연관시켜, CH11 의 H 및 L 사슬을 코드하는 DNA 의 상기 결정된 뉴클레오티드 서열로 부터, CH11 의 H 및 L 사슬의 전체 아미노산 서열을 결정하는 것이 가능하다.
CH11 의 H 및 L 사슬의 CDR 영역, FR 영역 및 불변 영역은 H 및 L 사슬의 아미노산 서열을 카밧 [Kabatet al.,supra]에 의해 결정된 면역글로블린의 공지된 아미노산 서열과 비교하므로써 확인된다.
본 발명의 인간화된 항-인간 Fas 항체의 H 및 L 사슬의 가변 영역을 코드하는 DNA 는 다수의 방법으로 제조될 수 있다.
한 방법에 있어서, 목적 DNA 의 부분적인 뉴클레오티드 서열을 나타내는, 길이가 60 내지 70 뉴클레오티드인 폴리뉴클레오티드 단편이 합성될 수 있다. 합성 방법은 센스 가닥 단편의 말단과 안티센스 가닥 단편의 말단이 번갈아 배열되는 것과 같이 배열된다. 생성된 폴리뉴클레오티드 단편들은 서로 어닐링되어 DNA 리가제에 의해 결찰될 수 있다. 상기 방법에 있어서, 인간화된 항-인간 Fas 항체의 H 및 L 사슬의 가변 영역을 코드하는 목적 DNA 단편이 수득될 수 있다.
이와는 달리, 수용체의 전체 가변 영역을 코드하는 DNA 는 인간 임파구로 부터 단리될 수 있다. 공여체의 CDRs 를 코드하는 영역으로 제한효소 부위를 도입하기 위해 부위 지정 돌연변이가 이용될 수 있다. CDRs 은 이어서 적절한 제한효소를 이용하여 수용체로 부터 삭제될 수 있다. 공여체의 CDRs 를 코드하는 DNA 가 이어서 합성되어 수용체 분자내로 DNA 리가제를 이용하여 결찰될 수 있다.
목적 인간화된 항-인간 Fas 항체의 H 및 L 사슬의 가변 영역을 코드하는 DNA 가 오버랩 확장 PCR [overlap extension PCR; Hortonet al., (1989), Gene,77, 61-68] 방법에 의해서 수득될 수 있다.
오버랩 확장 PCR 은 목적 아미노산 서열을 각각 코드하는 2 개의 DNA 단편이 결합될 수 있도록 한다. 예로써, 2 개의 단편을 여기에서 (A) 및 (B) 로 명명한다. (A) 의 5' 영역과 어닐링된 20 ∼ 40 개의 뉴클레오티드의 센스 프라이머 (C) 가, (B) 의 3'-영역과 어닐링된 20 ∼ 40 개의 뉴클레오티드의 안티센스 프라이머 (D) 와 나란히 합성된다. 2 개의 또다른 프라이머가 필요하다. 첫번째로, (A) 의 3'-영역으로 부터의 20 ∼ 30 개의 뉴클레오티드로 이루어진 키메라 센스 프라이머 (E) 는 (B) 의 5'-영역으로 부터의 20 ∼ 30 개의 뉴클레오티드와 결합된다. 두번째로, 센스 프라이머와 상보적인, 안티센스 프라이머 (F) 가 필요하다.
PCR 반응은, 단편 A 를 함유하는 DNA 주형과 결합하여, 프라이머 (C) 및 (F) 를 이용하여 수행될 수 있다. 이로써 (A) 의 3'-말단과 결합된 (B) 의 5'-영역의 20 ∼ 30 개의 뉴클레오티드로 함유하는 DNA 생성물이 생성될 수 있다. 상기 단편을 단편 (G) 로 명명한다.
유사하게, PCR 은 단편 B 를 함유하는 DAN 주형과 결합하여, 프라이머 (D) 및 (E) 를 이용하여 수행될 수 있다. 이로써 (B) 의 5'-말단과 결합된 (A) 의 3'-영역의 20 ∼ 30 개의 뉴클레오티드로 함유하는 DNA 생성물이 생성될 수 있다. 상기 단편을 단편 (H) 로 명명한다.
(G) 및 (H) 단편은 (G) 의 3'-영역에 있어서 40 ∼ 60 개의 뉴클레오티드 및 (H) 의 5'-영역에 있어서 40 ∼ 60 개의 뉴클레오티드와 각각 상보적인 서열을 수반한다. PCR 반응은 주형으로써 (G) 및 (H) 단편의 혼합물을 이용하여 수행될 수 있다. 일차 변성 단계에 있어서, DNA 는 단일 가닥으로 된다. 대부분의 DNA 는 다음 어닐링 단계에서 본래 형태로 되돌아 간다. 그러나, DNA 의 일부가, 중복 서열 영역에서의 (G) 와 (H) 단편의 어닐링으로 인해, 이형의 DNA 이중나선을 형성한다. 다음 확장 단계에 있어서, 돌출된 단일 가닥 부분이 수복되어 (A) 및 (B) 의 결찰부를 나타내는 키메라 DNA 가 생성된다. 상기 DNA 단편을 이후 (I) 로 칭한다. 단편 (I) 는 프라이머 (C) 및 프라이머 (D) 를 이용하여 증폭될 수 있다.
본 발명의 구현에 있어서, 단편 (A) 및 (B) 는 마우스 인간화된 항-인간 Fas 모노크로날 항체의 H 및 L 사슬의 CDR 영역을 코드하는 DNA, 인간 면역글로블린 IgM 의 FR 영역을 코드하는 DNA 또는 인간 면역글로블린 IgM 의 분비 시그날을 코드하는 DNA 를 나타낼 수 있다.
목적 아미노산에 상응하는 코돈 또는 코돈들이 공지되어 있다. 단백질 생성으로 부터 DNA 서열을 도안하는 경우, 임의의 적절한 코돈이 선택될 수 있다. 예를 들어, 숙주의 코돈 이용을 근거로 하여 코돈이 선택될 수 있다. 뉴클레오티드 서열의 부분적인 변형은 목적 변형체를 코드하는 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한, 부위 지정 돌연변이의 표준 방법에 의해서 달성될 수 있다 [Mark, D.F.et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5662-5666]. 특정 지점 돌연변이(들)을 유발하는 선택된 프라이머들을 이용하므로써, 임의 목적 인간환 항-인간 Fas 항체의 H 및 L 사슬의 가변 영역을 코드하는 DNA 가 수득될 수 있다.
발현 벡터로의 상기 수득된 본 발명의 DNA 의 삽입은 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있다. 상기 발현 벡터는 전형적으로 적합한 프로모터, 복제 부위 및 유전자 발현에 포함되는 서열을 함유하여, DNA 를 숙주세포내에서 발현시킬 수 있다.
인간화된 항-인간 Fas 항체의 L 사슬의 가변 영역을 코드하는 플라스미드를 수반하는 4 개의 형질전환 균주를 부다페스트 조약에 따라서 1997 년 3 월 11 자로 기탁기관 [Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo] 에 기탁하였다. 상기 균주는E.colipHκKY2-58,E.colipHκKF2-19,E.colipHκRY2-10 및E.colipHκRF2-52 이고, 기탁번호는 각각 FERM BP-5861, BP-5860, BP-5859 및 BP-5862 이다.
인간화된 항-인간 Fas 항체의 H 사슬의 가변 영역을 코드하는 플라스미드를 수반하는 2 개의 형질전환 균주를 부다페스트 조약에 따라서 1997 년 3 월 11 자로 기탁기관 [Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo] 에 기탁하였다. 상기 균주는E.colipHμH5-1 및E.colipHμM1-1 이고, 기탁번호는 각각 FERM BP-5863 및 BP-5864 이다.
본 발명의 DNA 는 상기 기탁물을 이용하여 수득될 수 있다. 이는, 예를 들어, 기탁물을 배양하여 플라스미드를 단리시키거나, 또는 주형으로써 플라스미드를 사용하는 PCR 을 이용하므로써 수득될 수 있다.
적합한 원핵 숙주세포로는, 예를 들어,E.coli(에쉐리키아 콜리) 및 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 가 포함된다. 상기 숙주세포내에서 목적 유전자를 발현하기 위해서, 상기 숙주세포는 숙주와 혼용가능한 종으로 부터 유래된 레플리콘을 함유하며, 전형적으로 lac UV5 와 같은, 복제 오리진 및 프로모터 서열을 갖는 플라스미드 벡터로 형질전환될 수 있다. 상기 벡터는 바람직하게는 형질전환된 세포상에 선별 표현형을 부여할 수 있는 서열을 갖는다.
E.coli의 적합한 균주는E.coliK12 로 부터 유래된 균주 JM109 이다. 적합한 벡터로는 pBR322 및 pUC 시리즈 플라스미드가 포함된다. 적합한 프로모터로는 락토스 프로모터 (lac) 및 트립토판 락토스 프로모터 (trc) 가 포함된다. 일반적으로, 본 발명은 여기에서 예시화된 바와 같은 숙주, 벡터, 프로모터 등에 국한되지 않으며 임의 적합한 시스템이 필요에 따라 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 할 것이다.
바실러스 서브틸리스의 적합하고 바람직한 균주는 균주 207-25 이고, 바람직한 벡터는 pTUB228 이다 [참고, Ohmura, K.,et al., (1984), J. Biochem.,95, 87-93]. 적합한 프로모터는 바실러스 서브틸리스 α-아밀라제 유전자의 조절 서열이다. 필요하다면, α-아밀라제의 시그날 펩티드 서열을 코드하는 DNA 서열이 본 발명의 DNA 에 연결되어 세포외 분비될 수 있다.
적합한 진핵 숙주 세포로는 척추동물, 효모 등으로 부터 유래된 것이 포함될 수 있다. 적합한 척추동물 세포는, 예를 들어, 원숭이 세포주 COS 이다 [참고, Gluzman, Y. (1981),23, 175-182]. 적합한 효모는 사카로마이세스 세레비시아 (Saccharomyces cerevisiae) 및 쉬조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) 이다.
일반적으로, 척추동물 세포에 적합한 발현 벡터를 위해 필요한 것은, 발현되는 유전자의 상류에 통상적으로 위치하는 프로모터; RNA 접합 부위; 폴리아데닐화 부위; 및 전사 말단 서열 등을 함유하는 것이다. 바람직하게는, 필요에 따라, 복제 오리진을 부가적으로 함유할 수 있다. 적합한 플라스미드는 SV40 시발 프로모터를 함유하는 pSV2dhfr 이다 [참고, Subramani, S.,et al., (1981), Mol. Cell. Biol.,1, 854-884].
적합한 진핵 미생물은, S. 세레비시아와 같은, 효모이고, 효모에 대한 적합한 발현 벡터로는 pAH301, pAH82 및 YEp51 이 포함된다. 적합한 벡터는, 예를 들어, 알콜 탈수소효소 유전자의 프로모터 [참고, Bennetzen, J.L. 및 Hall, B.D. (1982), J. Biol. Chem.,257, 3018-3025] 또는 카르복시펩티다제 Y GAL 10 프로모터 [참고, Ichikawa, K.et al., (1993), Biosci. Biotech. Biochem.,57, 1686-1690] 를 함유한다. 필요하다면, 세포외 분비시킬 수 있기 위해서 카르복시펩티다제 Y 의 시그날 펩티드 서열을 코드하는 DNA 서열을 발현되는 DNA 에 연결시킬 수 있다.
숙주로써 사용되는 COS 세포의 경우에 있어서, 적합한 벡터는 자율 성장 가능한 SV40 복제 오리진, 전사 프로모터, 전사 종결 시그날 및 RNA 접합 부위를 함유한다. 발현 벡터는, DEAE-덱스트란 방법 [참고, Luthman, H, 및 Magnusson, G. (1983), Nucleic Acids Res.,11, 1295-1308], 포스페이트 칼슘-DNA 공-침강 방법 [참고, Graham, F.L. 및 van der Eb, A.J. (1973), Virology,52, 456-457] 및 전기 펄스 일렉트로포레이션 방법 [참고, Neumann, E.,et al., (1982), EMBO J.,1, 841-845] 과 같은, 임의 적합한 방법에 의해서 세포를 형질전환시키는데 사용될 수 있다. 바람직한 구현에 있어서, COS 세포는 2 개의 별개 발현 벡터 - CH11 의 H 사슬의 가변 영역을 함유하는 단백질을 코드하는 DNA 를 함유하는 것 및 CH11 의 L 사슬의 가변 영역을 함유하는 단백질을 코드하는 DNA 를 함유하는 것으로 공-형질감염되고, 상기 벡터는 동시에 발현되어 인간화 재조합 항-인간 Fas 항체를 생성한다.
본 발명의 형질전환체는 통상적인 방법을 이용하여 배양되어, 목적 단백질은 세포내 또는 세포외 발현될 수 있다. 적합한 배양 배지는 각종 통상적으로 사용되는 배지를 포함하고, 일반적으로 선택된 숙주에 따라서 선택될 것이다. 예를 들어, COS 세포에 적합한 배지로는 RPMI-1640 및 필요에 따라 소 태아 혈청 (FBS) 이 공급될 수 있는 둘베코 변형된 이글 최소 필수 배지 (Dulbecco's Modified Eagle Minimum Essential medium) 가 포함된다. 배양 온도는 세포의 단백질 생성능을 상당히 저해하지 않는 임의 적합한 온도일 수 있고, 특히 포유류 세포에 대해서 바람직하게는 32 ∼ 42 ℃ 의 범위이고, 가장 바람직하게는 37 ℃ 이다. 필요에 따라, 배양은 1 ∼ 10 % (v/v) 이산화탄소를 함유하는 대기하에서 효과적일 수 있다.
본 발명의 형질전환체에 의해 발현되는 단백질은, 단백질이 세포내 또는 세포외 발현되는지에 따라서 및 단백질의 물리적 및 화학적 성질과 같은 고려할 점에 따라서 이미 공지된 각종 분리 방법에 의해 단리 및 정제될 수 있다. 적합한 특정 분리 방법으로는, 단백질에 대해 통상 사용되는 침전제로의 처리법; 초여과법, 분자체 크로마토그래피 (겔 여과법), 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 및 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 와 같은 크로마토그래피의 각종 방법; 투석; 및 상기 방법들의 조합이 포함된다.
상기 기재된 바와 같은 방법들을 이용하므로써, 목적 단백질은 고수율 및 고순도로 용이하게 수득될 수 있다. 그들이 J 사슬이 부족하다해도, 본 발명의 인간화 항-인간 Fas 항체는 CH11 과 동등하거나 또는 더 우수한 세포 독성 활성을 갖는다.
Fas 항원에 대한 본 발명의 단백질의 고유 결합 활성은, 예를 들어, 효소-연관 면역흡착 분석 (ELISA) 에 의해 결정될 수 있다. 상기 방법은 96-웰 플레이트의 웰 바닥 표면상에 시험 항원을 고정시킨 다음, 시험 시료를 웰로 도입하는 것으로 구성된다. 세척 단계후, 이어서 웰을 인간 IgM 의 H 사슬 (μ 사슬) 을 특이적으로 인식하는 효소-표지된 항체에 노출시킨다. 세포를 이어서 다시 세척하고, 웰에 남아있는 임의 표지를 감식한다. 인간 Fas 항원을 코드하는 cDNA 는 이미 개시되었으며, 그의 발현을 위해 cDNA 를 동물 세포로 도입하는 방법 또한 공지되어 있다 [참고, Itoh, N.,et al., (1991), Cell,66, 233-243]. 상기 ELISA 방법에 사용되는 항원은, 상기 문헌 [Itoh, 상기] 에 개시된 바와 같이, 인간 Fas 항원의 세포외 영역 및 마우스 인터루킨 3 수용체의 세포외 영역으로 이루어진 융합 단백질을 코드하는 유전자를 함유하는 발현 벡터로 형질전환된 세포의 배양 상층액으로 부터 수득될 수 있다.
본 발명의 단백질의 세포소멸을 유도하는 능력은, 예를 들어, 인간 림프구 세포주 HPB-ALL (Morikawa, S., et al, (1978) Int. J. Cancer21, 166-170) 또는 주르카트 (Jurkat; American Type Culture No. TIB-152) 와 같은 세포를 시험 시료가 첨가되었거나 또는 첨가될 배지에서 배양하므로써 달성될 수 있다. 생존률은 MTT 검정법 (Green, L.M.,et al, (1984) J. Immunological Methods 70, 257-268) 에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 DNA 를 이용하여, H 및 L 사슬의 가변 영역, 또는 H 및 L 사슬이 가변 (flexible) 펩티드로 연결된 단일 가닥 Fv 만으로 주요 구성된 Fv 단편을 생성하는 것이 가능하다 ['scFv', Huston, J.S.et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA85, 5870].
본 발명은 또한 상기 언급된 상태를 치료하기 위한 방법 및 치료 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 전형적으로 약학적으로 허용 가능한 담체와 부가 혼합된 치료학적 유효량의 본 발명의 단백질로 이루어진다. 조성물은 임의 적합한 방법, 비경구, 정맥내, 피하내 또는 국부 투여와 같은 방법으로 투여될 수 있다. 특히, 치료되어야할 상태가 국부적이라면, 그 부위에 가능한 한 근접하게 단백질을 투여하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 심한 관절염 통증이 주요 관절에서 나타날 수 있고, 단백질은 상기 부위에 투여될 수 있다. 본 발명의 체계적으로 투여되는 단백질은 피로겐 유리, 약학적으로, 특히 비경구적으로 허용 가능한 수용액의 형태로 투여되는 것이 특히 바람직하다. pH, 등장성, 안정성 등과 같은 면에 대해서 약학적으로 허용 가능한 단백질 용액의 제조는 당 분야의 숙련자의 기술 범위내이다. 또한, 본 발명의 조성물은 세포 성장 저해제 및 기타 약제와 같은, 적절한 것으로 여겨질 수 있는 또 다른 성분들을 함유할 수 있다.
치료 가능한 각종 상태에 대한 본 발명의 단백질의 투여 양생법은 환자의 상태, 체중, 성별 및 식이법, 증상의 심각도, 시간, 반복 치료의 고려할 점과 같은 각종 요인, 뿐 아니라 다른 적절한 임상학적 요인을 고려하여, 당 분야의 숙련자에게 용이하게 명백할 것이다. 일반적인 기준으로써, 매일 투여량은 전형적으로 체중의 킬로그램당 1 ∼ 1000 μg 의 범위내이야 한다.
본 발명의 인간화 항-인간 Fas 항체는 인간 Fas 항원에 결합될 수 있을 뿐 아니라 월등한 세포소멸-유도 활성을 가질 수 있다. 그러므로, 본 발명에 제공된 항체는 항-관절염 제제로써 유용하다. 또한, 본 발명에 의해 제공된 항-관절염 제제 모두는 유전자 조작된 인간화 면역글로블린을 포함하고, 이는 제제의 잠재적인 독성을 감소시킨다.
본 발명은 이제 하기 실시예를 참고로 하여 보다 상세하게 설명될 것이고, 실시예는 본 발명을 설명하지만 이를 구속하지 않는다. 실시예는 본 발명의 구체적인 구현예를 나타낸다.
구체적으로 정의되지 않은 임의 방법, 제제, 용액 등은 문헌 [Molecular cloning - A Laboratory Handbook, 상기] 에서 알 수 있다. 모든 용액은 수용성이고 달리 특정된 바 없으면 멸균된 탈이온수로 구성된다.
참조예 1
인간 Fas 항원에 대한 마우스 모노클론항체 CH11 의 가변부를 코딩하는 DNA 의 클로닝
(1-1) 폴리(A) + RNA 의 제조
전 RNA 를 키르긴 및 공역자에 의해 기술된 방법 [Chirgwin,J.M.,et al (1979) Biochemistry,18,5294, 이하참조] 에 따라 CH11-생산 하이브리도마[요네하라로부터 수득, 참조,Yonehara et al., (1989), J.Exp.Med., 169, 1747 이하참조] 로부터 제조한다. 구체적으로는, CH11-생산 하이브리도마 [Yonehara, S., et al (1994),International Immunology 6, 1849-1856] 을 10% (v/v) 소태아혈청 [Gibco사제] 를 함유하는 ASF104 배지 [아지노모또사제] 에서 배양한다. 약 6.7×108세포를 원심분리하여 회수하고 상층액은 버린다. 이어서 생성된 세포의 펠릿은 4M 구아니딘 티오시안에이트 용액 60ml [플루카사제]와 즉시 혼합한다. 생성된 현탁액중의 세포는 이어서 21-게이지 바늘이 장착된 주사기를 통해 세포현탁액을 3회 흡출하여 용해시킨다. 이렇게 수득된 세포 용해물을 초원심분리 튜브 [13PA: 히다찌 고끼사제] 내 5.7M 염화세슘/0.1 M EDTA 용액 (pH 7.5) 3ml 에 적층시키고 히다찌 RPS-40T Rotor (13PA 튜브, 150,000 x g, 20℃, 18 시간) 으로 회전시켜 RNA 를 침전시킨다. 침전된 RNA 를 물에 용해시키고, 클로로포름/1-부탄올 (4:1,v/v) 로 추출하고 이어서 100% 에탄올로 재침전시킨다.
다음, 폴리(A)+RNA 를 상기에서 제조 생성된 전 RNA 으로부터 일상적 방법 [참조, Sambrook, J, et al., (1989),Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition),Cold Spring Harbor Lab., 7.26-7.28] 로 정제한다. 좀더 구체적으로는, 일회용 폴리스티렌 칼럼 (직경 0.7cm) 를 올리고 dT 셀룰로오스 100mg [파르마시아사제, Type 7] 로 충진한다. 칼럼은 20mM tris-염산(pH 7.6), 0.5 M 염화나트륨, 1mM 에틸렌디아민 테트라아세테이트 (EDTA) 및 0.1% (w/v) 소듐 도데실술페이트 (SDS) 를 함유하는 로딩(loading) 버퍼로 평형시킨다. 이어서 전 RNA (약 1.2mg) 을 65℃ 에서 5 분간 가열하여 총부피 400㎕ 의 물에 용해시키고, 이어서 이 용액에 로딩 버퍼 400㎕ (상기농도의 2배) 를 가한다. 생성된 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 이어서 칼럼에 붓는다. 칼럼을 곧바로 통과한 분획은 회수하여 추가로 65℃에서 5 분간 가열하고 칼럼에 다시 붓는다.
다음, 칼럼을 로딩 버퍼 10ml 로 세정한후, 추가로 0.1M 염화나트륨을 함유하는 로딩 버퍼 5ml 로 세정하여 비흡착물 및 또한 비특이 흡착물을 제거시킨다. 이어서, 용출버퍼 5ml[10mM tris-염산 (pH 7.5), 1mM EDTA 및 0.05% (w/v)SDS] 를 칼럼에 부어서 특이 흡착물을 용출시킨다. 생성된 용출물은 200㎕ 의 분획으로 회수한다. 세 번째 및 네 번째 200㎕ 용출 분획 (총 400㎕) 를 합하고, 3M 아세트산나트륨 40㎕ (pH 4.0) 및 100% 에탄올 1ml 과 혼합한다. 생성된 혼합물은 -20℃ 에서 밤새 저장한다. 다음날 혼합물을 원심분리기 (10,000 x g, 4℃, 10 분) 로 회전시켜 펠릿을 회수한다. 이 펠릿은 폴리 (A)+RNA 시료로 사용하고 사용할 때까지 -80℃ 에서 저장한다.
(1-2) 가변부를 코딩하는 DNA 의 클로닝
마우스 항-Fas 항원 (CH11) 의 H 사슬 및 L 사슬의 가변부를 코딩하는 cDNA 단편은 역전사 (역전사효소-RT 사용) 와 폴리머라아제 사슬 반응 (PCR) 을 결합시킨 'RT-PCR' 로 클로닝시킨다. 이러한 기술의 결합으로 (1-1) 에서 제조된 CH11-생산 하이브리도마로부터 유래한 폴리(A)+RNA 시료로부터 목적하는 서열의 특정 증폭이 가능해진다.
RT-PCR 반응을 위한 두 조의 프라이머는 Ig-Prime Set로부터 선택한다 [노바겐사제]. MuIgVH5'-B 및 MuIgMVH3'-1 를 사용하여 H 사슬의 영역을 증폭시키는 반면, MuIgkVL5' 및 MuIgMVL3'-1 를 사용하여 L 사슬의 영역을 증폭시킨다. RT-PCR 반응을 각각 H 사슬 프라이머 조 및 L 사슬 프라이머 조 양방을 사용하여 실행한다.
a) 역전사효소 반응
역전사효소 반응용액 (44㎕) 를 하기와 같이 제조한다. 10mM tris-염산 (pH 8.3), 50mM 염화칼륨, 0.1mM dATP, 0.1mM dGTP, 0.1mM dCTP, 0.1mM dTTP, 1.5 mM 염화마그네슘, 2.5 pmol 의 H 사슬 또는 L 사슬 3'-측 프라이머, (1.1) 에서 제조한 폴리(A)+RNA 50ng 및 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (MMLV) 로부터 유래한 역전사효소 20 단위 [BIOCHEMICAL KOGYO CO., LTD.] 를 합하고 생성된 혼합물을 42℃ 에서 1 시간동안 보온한다.
b) PCR 증폭
a) 에서 제조한 역전사효소 반응용액은 25 pmol 의 H 사슬 또는 L 사슬 5' 프라이머와, 적절하다면, 5 단위의 Taq DNA 폴리머라아제 [일본 퍼킨 엘머사제, ampliTaq DNA 폴리머라아제] 를 키트로 공급된 반응 용액의 100㎕ 의 최종부피로 (만일 특별한 언급이 없으면, 효소용 버퍼 및 용액은 공급자의 키트로 공급된 것과 같다) 혼합한다. 생성된 전 반응 혼합물을 94℃ 에서 2 분간 가열하고, 이어서 94℃에서 1 분, 50℃에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분의 가열주기로 가열한다. 이 주기는 30 회 반복한다. 이어서 용액을 추가로 72℃ 에서 10 분간 유지시킨다. 유전자 증푹기 PCR 시스템 9600 [퍼킨 엘머사제, 일본] 를 사용하여 RCR 반응의 전반에 걸쳐서의 반응 온도를 조절한다.
c) PCR 산물의 분석
b) 에서 제조한 PCR 반응 혼합물의 일부를 1.5% (w/v) 아가로오스 겔 [에프엠시 바이오프러덕트사제] 상에서 겔 전기영동시켜 분석한다. H 사슬 및 L 사슬 PCR 반응의 각각의 산물은 약 430bp 의 밴드로서 수득한다. 밴드 크기는 또한 동일한 겔상에서 시행했던 분자량 마커와 비교하여 측정한다.
d) PCR 생성물의 클로닝
b) 에서 수득한 PCR 생성물의 각각은 원 TA 클로닝 키트 [인비트로겐사제] 를 이용하여 별개의 플라스미드 벡터에 접합시킨다. 좀더 구체적으로는, 50ng 의 pCRII 벡터 및 4 단위의 T4 DNA 리가아제 (양방다 키트내포함) 를 리가아제 반응 버퍼[6mM tris-염산 (pH 7.5), 6mM 염화마그네슘, 5mM 염화나트륨, 7mM β-머캅토에탄올, 0.1 mM ATP, 2mM 디티오트레이톨 (DTT), 1mM 스퍼미딘 및 0.1 mg/ml 소혈청 알부민] 에 가한다. 리가아제 반응 버퍼는 또한 상기 c) 에서 겔 전기영동으로 평가시, 목적하는 PCR 산물은 약 10ng 을 함유하는 정도로 선택된 PCR 반응 혼합물의 일부를 함유한다. 생성된 혼합물을 14℃ 에서 15 시간동안 보온시킨다.
이어서, 리가아제 반응 혼합물 2㎕ 를, 0.5M β-머캅토에탄올 2㎕ 를 첨가하여 미리 수용성 (competent) 으로 만든 대장균 TOP10F' 주 50㎕ (키트내 포함) 와 혼합한다. 생성된 형질전환 혼합물을 30 분간 얼음에 놓고, 이어서 42℃ 에서 30 초간 가열한후, 다시 추가로 2 분간 얼음위에 놓는다. 이후, 혼합물을 SOC 배지 500㎕ [2% (w/v) 트립톤, 0.5% (w/v) 이스트추출물, 0.05% (w/v) 염화나트륨, 2.5mM 염화칼륨, 1mM 염화마그네슘, 20mM 글루코오스] 에 가하고 , 생성된 혼합물을 1 시간(37℃, 110 rpm) 동안 회전진탕하면서 배양한다. 이어서 생성된 배양물을 암피실린 100㎍/ml 를 함유하는 L-브로쓰 아가 배지 플레이트 [1% (w/v) 트립톤, 0.5% (w/v) 이스트추출물, 0.05% (w/v) 염화나트륨, 0.1 (w/v) 글루코오스, 0.6% (w/v) Bacto 아가 (디프코사제)] 상에 뿌리고 플레이트를 진탕없이 밤새 37℃ 에서 배양한다.
이러한 절차로 생성된 암피실린 내성 콜로니를 선별하고 백금 피크로 긁어낸다. 선별된 콜로니에서 유래한 세포는 암피실린 100 ㎍/ml 를 함유하는 L-브로쓰 배지 5 ml 에서 37℃ 로 밤새워 개별적으로 배양한다. 이어서 배양물을 원심분리하여 세포를 펠릿화시키고 플라스미드 DNA 를 알칼리 용해법 [참조, Sambrook,J., et al., 상기] 를 이용하여 세포로부터 제조한다. H 및 L 프라이머조의 각각에 대한 플라스미드를 수득하고, 이것들을 pVH4 (H 사슬 프라이머 조를 이용하여 증폭된 단편을 함유하는 플라스미드) 및 pVL8 (L 사슬 프라이머 조를 이용하여 증폭된 단편을 함유하는 플라스미드) 로 명명한다.
참조예 2
CH11 의 가변부의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열의 결정
(2-1) CH11 의 H 사슬 및 L 사슬의 가변부의 N-말단 아미노산 서열의 결정
a) CH11 의 제조
CH-11 생산 하이브리도마 (실시예 1 참조) 를 10% (v/v) 소혈청 [기브코사제] 를 함유하는 ASF 104 배지 [아지노모또사제] 에서 2 x 108세포수로 증식시키고, 이어서 이 시료를 무혈청 ASF 104 배지 50 ml 에서 37℃ 로 5 일간 배양한다. 이후, 배양물을 원심분리하고 (Tommy Seiko's No. 4 rotor, 15,000 x g, 4℃, 15 분) 상층액을 회수한다. E-Z-Sep 항체정제 키트 [파르마시아 바오테크사제] 를 이용하여 배양물 상층액으로부터 CH11 를 수득한다.
b) a) 에서 제조된 상층액 100㎕ 에 대응하는 정제된 CH-11 의 일부를 10% (v/v) 의 β-머캅토에탄올 및 4% (w/v) SDS 를 함유하는 100 mM tris-염산 버퍼 (pH 6.8) 10㎕에 가한다. 생성된 혼합물을 95℃ 에서 5 분간 가열하여 변성시킨다. 이어서 변성된 시료를 12% (w/v) 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동시킨다. 전기영동후 겔을 전사버퍼 [25mM tris-붕산 (pH9.5), 10% 메탄올 (v/v)] 에 침지시키고 실온에서 15 분간 진탕시킨다. 이어서 겔상의 단백질 밴드를 세미드라이브 블롯팅 장치[이와끼 글래스사제] 를 이용하여, 0.2A 정전류, 4℃, 1 시간동안 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (PVDF) 막으로 전사시킨다. 이후 PVDF 막을 0.1% (w/v) 코마시에 브릴리언트 블루 용액으로 염색시키고 100% 메탄올로 탈염시킨다. H 사슬 및 L 사슬에 해당되는 단지 두 개의 주 단백질 반점만이 보여진다. 이러한 단백질 반점을 절단하고, 이를 함유한 겔을 실온에서 건조시킨다.
c) b) 에서 PVDF 막상으로 전사된 단백질의 아미노산 서열은 자동 에드만법 [참조 Edman, P., et al., (1967), Eur.J.Biochem.1, 80 이하참조] 으로 기상 단백질 시퀀서 [PPSQ-10; 시마드즈 코포레이션사제] 를 이용하여 분석한다. CH11 의 H 사슬의 가변부의 N-말단 아미노산 서열 및 L 사슬의 N-말단 아미노산 서열을 결정하고, 각각 서열 목록의 SEQ ID No 13 및 14 로 나타내었다.
(2-2) DNA 뉴클레오티드 서열의 결정
CH11 의 H 사슬 및 L 사슬의 가변부를 코딩하는 cDNA 의 전 뉴클레오티드 서열은 각각 플라스미드 pVH4 및 pVL8 (실시예 1 에서 제조) 내 삽입체를 서열결정하여 결정한다.
pCRII 벡터는 SP6 프로모터 서열 및 T7 프로모터 서열을 갖으며, 이것은 임의의 삽입된 cDNA 의 측면에 접해서 pVH4 및 pVL8 의 삽입체의 서열을 이 서열에 대응하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 [퍼킨 엘머사제] 를 이용하여 결정하는 것을 가능케한다. 서열분석을 위한 시료는 이러한 프라이머 및 염료 프라이머 순환-서열결정 키트 [퍼킨 엘머사제, 일본] 를 이용하여 제조한다. 플라스미드pVH4 또는 pVL8 로부터 유래한 플라스미드 DNA 를 주형으로서 사용한다. 각각의 cDNA 삽입체의 서열은 DNA 시퀀서 [Model 373, 퍼킨 엘머사제, 일본] 를 이용하여 결정한다. H 사슬 가변부의 cDNA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID No. 15 및 L 사슬 가변부의 cDNA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID No. 16 으로 나타내었다.
서열목록내 SEQ ID No. 13 의 아미노산 서열 번호 1 내지 15 로 나타낸, CH11 의 H 사슬의 N-말단 아미노산 서열은 SEQ ID No. 15 의 뉴클레오티드 번호 32 내지 76 에 의해 코딩되는 아미노산서열에 완전히 일치한다. 그러므로, 플라스미드 pVH4 는 CH11 의 H 사슬의 가변부를 코딩하는 DNA 를 함유함이 유추된다.
서열목록내 SEQ ID No. 14 의 아미노산 서열 번호 1 내지 21 로 나타낸, CH11 의 L 사슬의 N-말단 아미노산 서열은 SEQ ID No. 16 의 뉴클레오티드 번호 29 내지 91 에 의해 코딩되는 아미노산서열과 완전히 일치한다. 그러므로, 플라스미드 pVL8 은 CH11 의 L 사슬의 가변부를 코딩하는 DNA 를 함유함이 유추된다.
참조예 3
CH11 의 완전한 H 사슬, L 사슬 및 J 사슬을 코딩하는 DNA 의 클로닝
(3-1) cDNA 라이브러리의 제조
cDNA 라이브러리를 오까야마-버그법 [Okayama, H. et al., (1987), Method in Enzymology 154,3-28] 로 제조한다. 좀더 구체적으로는, CH11-생산 하이브리도마로부터 실시예 1-1(a) 에서 제조한 바와 같은 폴리(A)+RNA 5㎍ 을 아비앙 마이엘로블라스토시스 (Avian myeloblastosis) 바이러스 (AMV) 로부터 유래한 역전사효소 75 단위 [세이가가꾸 고오교 가부시끼 가이샤] 를 함유하는 반응 혼합물 30 ㎕ [50mM tris-염산 (pH 8.3), 6mM 염화마그네슘, 40mM 염화칼륨, 2mM dATP, 2mM dGTP, 2mM dCTP, 2mM dTTP, 2㎍ 벡터 프라이머 (3'-올리고(dT)-tailed, pcDV-1): 파르마시아사제] 에 가한다. 생성된 혼합물은 37℃ 에서 30 분간 보온시킨다.
이후, 동량의 페놀-클로로포름 (1:1, v/v) 를 반응 혼합물에 가하고 철저히 혼합한다. 생성된 혼합물을 원심분리 (10,000 x g, 실온, 5 분) 하고, 수성층을 회수한다 ( 페놀:클로로포름으로 추출하고 수성 상층액을 회수하는 이러한 절차는 이후 페놀-클로로포름 추출 로 칭한다). 생성된 수성층에 4M 아세트산 암모늄 35㎕ 및 100% 에탄올 140㎕ 를 가하고, 생성된 혼합물은 -70℃ 에서 15 분간 냉각시킨후, 원심분리 (10,000 x g, 4℃, 15 분) 시킨다. 펠릿은 에탄올의 75% (v/v) 용액으로 세정하고 이어서 감압하 건조시킨다.
이어서 건조된 침전물은 증류수 13㎕ 에 용해시킨후, 말단 전사효소 반응 혼합물 5.6 ㎕ [140 mM 소듐 카코딜레이트, 30 mM tris-염산 (pH 6.8), 1 mM 염화코발트, 0.5mM DTT, 0.3㎍ 폴리아데닐산 (폴리A, 파르마시아사제), 0.2 mM dCTP] 를 가하고 생성된 반응 혼합물을 37℃, 5 분간 보온한다. 이어서 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제 [21 단위, 파르마시아사제] 를 공급자의 지시에 따라 첨가하고, 반응을 5 분간 진행시킨다. 이어서 반응 혼합물을 페놀-클로로포름 추출시킨다. 이어서, 4M 아세트산 암모늄 20㎕ 및 100% 에탄올 80㎕ 를 회수된 수성층에 가하고, 혼합물을 -70℃에서 15 분간 냉각시킨후, 원심분리시킨다 (10,000 x g, 4℃, 15 분). 펠릿을 에탄올의 75% (v/v) 용액으로 세정하고 감압하 건조시킨다.
이러한 방식으로 수득한 DNA 침전물은 반응 혼합물 30㎕ [10mM tris-염산 (pH 7.5), 60 mM 염화나트륨, 7mM 염화마그네슘] 에 용해시키고, 제한효소 HindIII 30 단위를 생성된 용액에 첨가한다. 통상적으로, 버퍼를 특정하지 않고, 제한효소를 사용하면, 사용하는 버퍼는 효소가 공급된 버퍼이다. DNA 를 두 개의 효소로 소화시키는 경우, 소화는 연속적으로 두 개의 효소로 실행한다. 첫 번째 소화후,DNA 는 침전, 재현탁시키고 이어서 두 번째 효소로 소화시킨다. 침전 및 재현탁 기술은 당분야에서 공지되어 있다 [참조, Sambrook et al., 상기]. 본 실시예에서 사용하는 모든 제한효소 및 버퍼는 다까라 슈조사제를 이용한다.
DNA 는 소화 용액에서 37℃ 로 밤새워 소화시킨다. 이어서, 반응 혼합물을 페놀-클로로포름 추출시킨다. 이어서, 회수한 수성층에 4M 아세트산암모늄 35㎕ 및 100% 에탄올 140㎕ 를 가하고, 혼합물을 -70℃ 에서 15 분간 냉각시킨다. 혼합물을 원심분리 (10,000 x g, 4℃, 15분) 하여 DNA 를 침전시키고, 생성된 펠릿을 에탄올의 75% (v/v) 로 세정하고 감압하 건조시킨다. 이렇게 제조한 침전DNA 는 후속 절차에서 cDNA 시료로서 사용한다.
마찬가지로, 벡터 pcDL-SRα296 [참조, Takebe, Y etal., (1989), JIKKEN IGAKU (Experimental Medicine), 7,pp. 95-99] 로부터 유래한 플라스미드 DNA 를 제한효소 PstI 로 소화시킨다. 소화산물을 dGTP 및 말단 데옥시뉴클레오티딜 전사효소 [파르마시아사제] 로 처리하여 올리고 dG 를 3'말단 끝에 하기와 같이 부가한다.
pcDL-SRα296 DNA (100㎍, 50㎕ 내 존재) 를 10㎕ 의 10x 말단 데옥시뉴클레오티딜 전사효소 버퍼[1 x 버퍼: 1.4M 소듐 카코딜레이트, 0.3M Tris-HCl(pH 7.6), 10㎕ 의 DTT (1mM), 20㎕ 의 0.1mM3H-dGTP (듀퐁사제) 및 10㎕ 의 말단 전사효소 (210 IU, 파르마시아사제)] 에 첨가한다. 혼합물을 37℃에서 40 분간 보온시키고, 이어서 동량의 TE 버퍼-포화 페놀과 혼합한다. 정치후, 수성층은 제거하고 페놀-클로로포름 추출한다. 페놀 및 페놀-클로로포름 양방의 추출을 실행한후, DNA 를 100% 에탄올을 이용하여 침전시키고 TE 버퍼 50㎕ 에 재현탁시킨다.
침전된 모든 DNA 를 제한효소 HindIII 로 소화시키고, 소화 산물을 1.8% (w/v) 아가로오스 겔상에서 겔 전기영동으로 분리시킨다. 800bp 의 밴드를 겔로부터 절단하고, GENECLEAN 키트 [후나꼬시사제] 를 이용하여 제조자의 지시에 따라 겔로부터 절단한다. 생성된 DNA 를 TE 버퍼 100㎕ 에 용해시키고, 100% 에탄올 100㎕ 를 첨가한다. DNA 의 최종농도는 0.09 ㎍/㎕ 이다.
생성된 산물은 올리고 (dG) 가 SRα프로모터에 부착된 링커-DNA 를 산출시킨다.(참조, 도 1, 이것은 CH11 의 각각의 소단위체의 전장을 코딩하는 DNA 의 클로닝을 가능케하는 cDNA 라이브러리의 구축도이고, 도 2 는 CH11 의 각각의 소단위체의 전장을 코딩하는 DNA 를 클로닝하고 증폭하는 공정을 보여주는 도이다).
상기에서 제조한 침전 건조된 cDNA 시료를 TE 버퍼 10㎕ [10mM tris-염산 (pH 7.5), 1mM EDTA] 에 용해시킨다. 생성된 용액의 일부 (1㎕) 를 상기에서 제조한 링커-DNA 0.08 pmol 을 함유하는 반응 버퍼 [10 mM, tris-염산 (pH 7.5), 1mM EDTA, 100mM 염화나트륨] 에 첨가한다. 생성된 혼합물을 65℃ 에서 5 분간 가열하고, 이어서 42℃ 에서 30 분간 보온시킨다. 이후, 10㎕ 의 10x 리가아제 버퍼 [10mM ATP, 660 mM tris-염산 (pH 7.5), 66mM 염화마그네슘, 100mM DTT], 76㎕ 의 증류수 및 1 ㎕ 의 10mM β-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 [NAD, 뵈링거 만하임사제] 를 반응 혼합물에 가하고, 생성된 혼합물을 빙상에서 10 분간 냉각시킨다. 이어서 대장균 DNA 리가아제 [8.4㎍ 당량, 파르마시아사제] 를 냉각된 반응 혼합물에 가하고, 전체를 12℃에서 밤새워 보온시킨다.
이 보온후, 2㎕ 의 뉴클레오티드 용액 [2mM dATP, 2mM dCTP, 2mM dGTP, 2mM dTTP], 0.5㎕ 의 10mM NAD, 42㎍ 당량의 대장균 DNA 리가아제 [파르마시아사제], 4.1 단위의 DNA 폴리머라아제I [파르마시아사제] 및 5.5 단위의 리보뉴클레아제H [파르마시아사제] 를 반응 혼합물에 가한다. 이어서 생성된 혼합물을 12℃에서 1 시간동안 보온시키고 이어서 추가로 22℃ 에서 1시간동안 보온시킨다. 이러한 방식으로 제조된 cDNA 라이브러리를 필요할 때까지 -20℃ 에서 저정한다.
(3-2) PCR 클로닝
a) 프라이머의 제조
H 사슬의 경우에서, 실시예 2 에서 결정한 바와 같은, CH11 의 H 사슬의 가변부의 아미노산 서열을 카바트 등에 의해 만들어진 항체 아미노산 서열 데이터 베이스와 비교한다 [Kabat E.A. et al., (1991), in Sequences of Proteins of Immunological Interest Vol.II, U.S.Department of Health and Human Services]. CH 11의 H 사슬 (μ사슬) 는 아종 2A 인 것이 판명되었다. 그러므로, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 아종 2a 인 마우스 H 사슬을 코딩하는 DNA 의 5'-비번역 영역의 일부와 혼성화되게 합성한다. 선택된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 이하의 서열을 갖는다 : 5'-CTAAGGGAAT TCCGCCTCTC CTCAGACACT GAA-3' (H5-1; 서열목록의 SEQ ID No.17).
또한 CH11 H 사슬의 3' 비번역 영역의 일부와 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계한다. 올리고뉴클레오티드의 설계는 골드버드등[참조, Goldberg, I.G., et al., (1981), Gene 15, 33-42] 에의해 보고된 마우스 면역글로불린 M 사슬 불변부를 코딩하는 DNA 의 뉴클레오티드 서열에 기초하고, 선택된 서열은 이하와 같다: 5'-TTTTACTCTA GAGACCCAAG GCCTGCCTGG TTGA-3' (H3-1; 서열목록의 SEQ ID No. 18).
L 사슬에 있어서, 실시예 2 에서 결정한 바와 같은, CH11 의 L 사슬의 가변부의 아미노산 서열을 카바트 및 공역자[상기] 에의해 만들어진 항체 아미노산 서열 데이터 베이스과 비교한다. CH11 의 L 사슬은 k2 임이 밝혀졌다. 그러므로, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 마우스 아종 k2인 L 사슬을 코딩하는 DNA 의 5'-말단 비번역 영역의 일부와 혼성화되게 설계한다. 선택된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 이하의 서열을 갖는다: 5'-AAATAGGAAT TCCAGTCTCC TCAGGCTGTC TCC-3' (L5-1; 서열목록의 SEQ ID No. 19).
또한 3' 비번역 영역의 일부와 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계한다. 올리고뉴클레오티드의 설계는 등록명 MUSIGBILI (수탁번호 D14630) 하 등록된 마우스 면역글로불린 k 사슬 불변영역을 코딩하는 DNA 의 뉴클레오티드 서열에 기초한다. 사용하는 서열은 이하와 같다: 5'-ATGATCTCTA GAGTGGTGGC ATCTCAGGAC CT-3' (L3-1; 서열목록의 SEQ ID No. 20).
J 사슬의 경우에 있어서, 가변부는 존재하지 않고, J 사슬을 코딩하는 DNA 의 서열 및 J 사슬의 아미노산 서열 양방은 공지되어 있다 [참조, Cann, G.M., et al., (1982), Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 79, 6656-6660]. 이러한 발견에 기초하여, J 사슬을 코딩하는 DNA 의 5' 및 3' 비번역 영역의 일부와 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성한다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 하기의 서열을 갖는다 : 5'-TTGCGGAATT CCTCACCTGT CCTGGGGTTA TT-3'(J5-1; 서열목록의 SEQ ID No. 21) 및 5'-ATTGCCTCTA GAGCCTCTAA GGACAACGAC CT-3' (J3-1; 서열목록의 SEQ ID No. 22).
이러한 올리고뉴클레오티드 프라이머는 모두 포스포아미다이트법 [참조 Mattrucci, M.D. Caruthers,M.H. (1981),J.Am.Chem.Soc., 103, 3185-3191] 으로 자동 DNA 합성기 380 B [퍼킨 엘머사제, 일본] 이용하여 합성한다. 합성완료후, 각각의 프라이머는 지지체로부터 절단 및 탈보호시킨후, 냉동건조시킨다. 생성된 산물을 증류수에 용해시키고 필요할때까지 -20℃ 에서 저장한다.
b) PCR 에의한 목표 유전자의 증폭
PCR 반응 용액 [10mM tris-염산 (pH 8.3), 50 mM 염화칼륨, 1.5 mM 염화마그네슘, 2.5 mM dATP, 2.5 mM dGTP, 2.5 mM dCTP, 2.5mM dTTP] 를 제조하고, 실시예 4-1 에 기재된 cDNA 라이브러리 0.1㎕, Taq DNA 폴리머라아제 1 단위 [퍼킨 엘머사제, 일본] 및 올리고뉴클레오티드 프라이머 15 pmol(3-2a 에서 제조) 를 PCR 반응용액 100㎕ 에 첨가하고 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 생성된 혼합물을 94℃ 에서 1 분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분의 가열주기로 30 회 반복하여 가열한다. 마지막 주기후, 용액을 72℃ 에서 추가로 10 분간 유지시킨다.
각각의 반응에서 사용한 프라이머의 조합은 하기와 같다:
H5-1 H3-1 (H 사슬에 대해);
L5-1 L3-1 (L 사슬에 대해); 및
J5-1 J3-1 (J 사슬에 대해).
c) PCR 산물의 분석
b) 에서 PCR 반응을 실행한후, 반응 혼합물의 일부를 H 사슬의 경우는 0.8% (w/v) 아가로오스 겔상에서 겔 전기 영동으로 분석하고, L 및 J 사슬에 대해서는, 1.5% (w/v) 아가로오스 겔 [FMC 바이오프로덕트사제 아가로오스] 를 이용한다. PCR 반응 산물은 H 사슬 경우 약 1900 bp, L 사슬 경우 800 bp 및 J 사슬의 경우 650 bp 의 밴드이다. 밴드 크기는 동일한 겔에서 시행한 분자량 마커와 비교하여 평가한다.
d) PCR 산물의 클로닝
b) 에서 수득한 PCR 산물의 각각을 진핵생물 TA 클로닝 키트[인비트로겐사제] 를 이용하여, 플라스미드 벡터에 접합시킨다. 좀더 구체적으로는, pCR3 벡터 60 ng (키트내 포함) 및 4 단위의 T4 DNA 리가아제를 PCR 반응 혼합물의 일부를 함유하는 리가아제 반응 버퍼 [6mM tris-염산 (pH 7.5), 6mM 염화마그네슘, 5mM 염화나트륨, 7mM β-머캅토에탄올, 0.1mM ATP, 2mM DTT, 1mM 스퍼미딘, 0.1 mg/ml 소혈청알부민] 에 첨가한다. PCR 반응 혼합물의 부피는 겔 전기영동으로 평가시 목적하는 PCR 산물을 약 10 ng 을 함유하는 정도로 선택한다. 생성된 혼합물은 14℃ 에서 15 시간동안 보온시킨다.
리가아제 반응 혼합물의 일부 (2㎕) 를 0.5M β-머캅토에탄올 2㎕ 을 가하여 수용성으로 만든 대장균 세포인 TOP 10F' 주(키트내 포함) 50㎕ 와 혼합한다. 생성된 혼합물은 빙상에 30 분간 놓고, 42℃ 에서 30 초간 데운후, 다시 빙상에 2 분간 놓는다. 이어서 SOC 배지 (500 ㎕, 전술한 바와 같음) 를 상기 혼합물에 첨가하고, 생성된 혼합물을 회전 진탕 (110 rpm) 하면서 37℃ 에서 1 시간동안 배양한다. 이어서 배양액을 암피실린 100㎍/ml 를 함유하는 L-브로쓰 아가 배지 플레이트상에 뿌리고 37℃ 에서 밤새워 배양한다. 이어서 암피실린내성을 보이는 콜로니를 백금 피크로 긁어내고 암피실린 100㎍/ml 를 함유하는 L-브로쓰 5ml 에서 37℃ 로 밤새 배양한다. 이 배양물을 원심분리하여 세포를 침전시키고 이것을 사용하여 알칼리용해법 [Sambrook et al., 상기] 으로 플라스미드 DNA 를 제조한다.
생성된 플라스미드 3 개를 pCR3-H123 (H 사슬-코딩 cDNA 를 포함하는 플라스미드), pCR3-L103 (L사슬-코딩 cDNA 를 포함하는 플라스미드) 및 pCR3-J1123 (J사슬-코딩 cDNA 를 포함하는 플라스미드) 로 명명한다. 대장균 DH5α 주[기브코사제] 의 수용성 세포를 플라스미드 pCR3-H123, pCR3-L103 또는 pCR3-J1123 중 하나로 형질전환시키고 생성된 형질전환체는 1996 년 2 월 28 일자로 공업기술원생명공학공업기술 연구소에 각각 수탁번호 FERM BP-5427, FERM BP-5428 및 FERM BP-5429 로 기탁되었다. CH11 의 H, L 및 J 사슬을 코딩하는 DNA 는 공지된 방법으로 상기 균주로부터 쉽게 제조할 수 있다.
참조예 4
CH11 H 사슬, L 사슬 및 J 사슬을 코딩하는 cDNA 의 전 뉴클레오티드 서열의 결정
(4-1) DNA 의 뉴클레오티드서열의 결정
마우스 면역글로불린 M 사슬은 약 110 잔기를 포함하는 N-말단 가변부 및 가변부에 인접한, 약 470 잔기를 포함하는 불변부로 이루어진다. 마우스 면역글로불린 k 사슬은 약 110 잔기를 포함하는 N-말단 가변부 및 가변부에 인접한 107 잔기를 포함하는 불변부로 이루어진다. CH11 H 사슬 및 L 사슬을 코딩하는 cDNA 의 완전한 뉴클레오티드 서열은 실시예 2 에서 확인된 바와 같이 [참조, Kabat E.A.et al., 상기] 공지된 불변부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 이루어지고 사슬의 가변부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 접합된 것으로 예견된다.
CH11 의 J 사슬을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 공지된 J 사슬 서열의 것과 동일한 것으로 추정된다.
이러한 추정된 뉴클레오티드 서열에 기초하여, 길이에 있어 20 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하며, 이는 H, L 및 J 사슬의 서열에 대응하고, 60 내지 200 bp 의 코딩간격으로 분리된다.
합성된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열은 하기와 같다:
H 사슬:
5'-TGGGGCCTCA GTGAAGATAT -3'(SHF-2; 서열목록의 SEQ ID NO. 23)
5'-CAATGGTGGT ACTGGCTACA -3'(SHF-3; 서열목록의 SEQ ID NO. 24)
5'-TGACATCTGA GGACTCTGCA -3'(SHF-4; 서열목록의 SEQ ID NO. 25)
5'-TCCTCAGAGA GTCAGTCCTT -3'(SHF-6; 서열목록의 SEQ ID NO. 26)
5'-TCCTTCACCT GGAACTACCA -3'(SHF-7; 서열목록의 SEQ ID NO. 27)
5'-TCCCAAGAGC ATCCTTGAAG -3'(SHF-8; 서열목록의 SEQ ID NO. 28)
5'-AGATCTGCAT GTGCCCATTC -3'(SHF-9; 서열목록의 SEQ ID NO. 29)
5'-TCTAAACTCA TCTGCGAGGC -3'(SHF-10; 서열목록의 SEQ ID NO. 30)
5'-GGTGACCATC GAGAACAAAG -3'(SHF-11; 서열목록의 SEQ ID NO. 31)
5'-AGGGGTCTCA CCTTCTTGAA -3'(SHF-12; 서열목록의 SEQ ID NO. 32)
5'-TCCTTTGCCG ACATCTTCCT -3'(SHF-13; 서열목록의 SEQ ID NO. 33)
5'-GTGTGTACTG TGACTCACAG -3'(SHF-15; 서열목록의 SEQ ID NO. 34)
5'-AACTGAACCT GAGGGAGTCA -3'(SHF-16; 서열목록의 SEQ ID NO. 35)
5'-AACTCTTGCC CCAAGAGAAG -3'(SHF-17; 서열목록의 SEQ ID NO. 36)
5'-ATCCTGACTG TGACAGAGGA -3'(SHF-18; 서열목록의 SEQ ID NO. 37)
5'-ACAAGTCCAC TGGTAAACCC -3'(SHF-19; 서열목록의 SEQ ID NO. 38)
5'-AGGATATCTT CACTGAGGCC -3'(SHR-1; 서열목록의 SEQ ID NO. 39)
5'-ATCCACTCAA GGCTCTTTCC -3'(SHR-2; 서열목록의 SEQ ID NO. 40)
5'-ACTGCAGAGT CCTCAGATGT -3'(SHR-3; 서열목록의 SEQ ID NO. 41)
5'-AGACGGTGAC TGAGGTTCTT -3'(SHR-4; 서열목록의 SEQ ID NO. 42)
5'-CAGGTGAAGG AAATGGTGCT -3'(SHR-5; 서열목록의 SEQ ID NO. 43)
5'-ATGCTCTTGG GAGACAGCAA -3'(SHR-6; 서열목록의 SEQ ID NO. 44)
5'-CTCTGTTTTT GCCTCCGTAG -3'(SHR-7; 서열목록의 SEQ ID NO. 45)
5'-TGGCCTCGCA GATGAGTTTA -3'(SHR-8; 서열목록의 SEQ ID NO. 46)
5'-CCTTTGTTCT CGATGGTCAC -3'(SHR-9; 서열목록의 SEQ ID NO. 47)
5'-TGTGGAGGAC ACGTTCTTCA -3'(SHR-10; 서열목록의 SEQ ID NO. 48)
5'-ACTTTGAGAA GCCCAGGAGA -3'(SHR-12; 서열목록의 SEQ ID NO. 49)
5'-AGATCCCTGT GAGTCACAGT -3'(SHR-13; 서열목록의 SEQ ID NO. 50)
5'-AGCAGGTGGA TGTTTGTGCA -3'(SHR-14; 서열목록의 SEQ ID NO. 51)
5'-TGAAGCCACT GCACACTGAT -3'(SHR-15; 서열목록의 SEQ ID NO. 52)
5'-AGTTCCATTC CTCCTCTGTC -3'(SHR-16; 서열목록의 SEQ ID NO. 53)
5'-TGTGTCAGAC ATGATCAGGG -3'(SHR-18; 서열목록의 SEQ ID NO. 54)
L 사슬:
5'-TGAAGTTGCC TGTTAGGCTG -3'(SLF-1; 서열목록의 SEQ ID NO. 55)
5'-CTTGGAGATC AAGCCTCCAT -3'(SLF-2; 서열목록의 SEQ ID NO. 56)
5'-GCTGAGGATC TGGGAGTTTA -3'(SLF-3; 서열목록의 SEQ ID NO. 57)
5'-GATGCTGCAC CAACTGTATC -3'(SLF-4; 서열목록의 SEQ ID NO. 58)
5'-CGACAAAATG GCGTCCTGAA -3'(SLF-5; 서열목록의 SEQ ID NO. 59)
5'-ACGTTGACCA AGGACGAGTA -3'(SLF-6; 서열목록의 SEQ ID NO. 60)
5'-ATCTGCAAGA GATGGAGGCT -3'(SLR-2- 서열목록의 SEQ ID NO. 61)
5'-ACCCCAGAAA ATCGGTTGGA -3'(SLR-3; 서열목록의 SEQ ID NO. 62)
5'-CCGGAGGAAC ATGTGTACTT -3'(SLR-4; 서열목록의 SEQ ID NO. 63)
5'-TCGTTCATAC TCGTCCTTGG -3'(SLR-6; 서열목록의 SEQ ID NO. 64)
5'-CATCTCAGGA CCTTTGTCTC -3'(SLR-7; 서열목록의 SEQ ID NO. 65)
J 사슬:
5'-CACCTGTCCT GGGGTTATTT -3'(SJF-1; 서열목록의 SEQ ID NO. 66)
5'-AGACAAGATG AAGACCCACC -3'(SJF-2; 서열목록의 SEQ ID NO. 67)
5'-AAGCGACCAT TCTTGCTGAC -3'(SJF-3; 서열목록의 SEQ ID NO. 68)
5'-ATATCTCTGA TCCCACCTCC -3'(SJF-8; 서열목록의 SEQ ID NO. 69)
5'-GAAATGCGAT CCTGTGGAAG -3'(SJF-5; 서열목록의 SEQ ID NO. 70)
5'-CTATACCACT ATGGTCCCAC -3'(SJF-6; 서열목록의 SEQ ID NO. 71)
5'-AGAAGCAGGT GGGTCTTCAT -3'(SJR-2; 서열목록의 SEQ ID NO. 72)
5'-TAGAGGTAAC TCGGGTACAC -3'(SJR-3; 서열목록의 EQ ID NO. 73)
5'-AAGTTCCTTC TCAGTGGGGA -3'(SJR-8; 서열목록의 SEQ ID NO. 74)
5'-GGTGGCAGTA ACAACCTGAT -3'(SJR-5; 서열목록의 SEQ ID NO. 75)
5'-CATGATACCT AAGTGGGACC -3'(SJR-6; 서열목록의 SEQ ID NO. 76)
각각의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 자동 DNA 합성기 [Model 380B: 퍼킨 엘머사제, 일본] 를 이용하여 포스포아미다이트법으로 합성한다. H 사슬의 서열분석용 시료는 플라스미드 pCR3-H123 유래 DNA 를 이용하여 제조한다. L 사슬의 서열분석용 시료는 플라스미드 pCR3-L103 유래 DNA 를 이용하여 제조한다. J 사슬의 서열분석용 시료는 플라스미드 pCR3-J1123 유래 DNA 를 이용하여 제조한다. PCR 반응은 Prism Ready Reaction Terminator Cycle Sequencing Kit [퍼킨 엘머사제, 일본] 를 이용하여 하기와 같이 실행한다:
pCR3-H123(1.5㎍) 및 프라이머 (SHF-2) 4.8 pmol 을 혼합하여 증류수에서 16㎕ 의 최종부피로 혼합한다. 이 pCR3-H123/프라이머 혼합물 (9.5㎕) 의 일부를 Taq DNA 폴리머라아제를 함유하는 예비배합물 10.5㎕ 와 혼합한다. 생성된 혼합물을 자동 반응기에 놓는다 [Catalyst:퍼킨 엘머사제, 일본]. 사용한 반응 주기는 하기와 같다: 95℃ 에서 30초, 50℃ 에서 15 초 및 60℃ 에서 4 분간 25 회 반복.
반응주기의 완료후, 살균수 80㎕ 를 생성된 용액에 첨가하고, 생성된 혼합물내 DNA 를 페놀/클로로포름법으로 2 회 추출한다. 회수한 수성층을 2M 아세트산나트륨 15㎕ 및 100% 에탄올 300㎕ 과 혼합한후, 원심분리하여 침전물을 회수한다. 침전물은 에탄올의 70%(v/v) 용액으로 세정하고, 감압하 건조시키고, 이어서 시료 용액 3㎕ [0.25 M EDTA 4㎕, 포름아미드 100㎕ 및 살균수 15㎕] 에 용해시킨다.
서열결정 반응을 시행하고 32H 사슬 프라이머, 11L 사슬 프라이머 및 11J 사슬 프라이머에 대하여, DNA 시퀀서 [Model 373A: 퍼킨 엘머사제, 일본]로 분석한다.
각각의 프라이머에 대하여 수득한 서열 데이터를 합하고 통합하여 CH11 의 H, L 및 J 사슬의 완전한 뉴클레오티드 서열을 결정한다. 각각의 플라스미드 삽입체의 cDNA 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 목록의 SEQ ID No. 7, 9 및 11 로 나타내었다. 이러한 뉴클레오티드 서열에 대응하는 아미노산 서열은 각각 서열 목록의 SEQ ID No. 8, 10 및 12 로 나타내었다.
(4-2) CH11 의 H 사슬의 일차구조
서열목록의 SEQ ID No. 15 의 뉴클레오티드 번호 32 내지 379 로 나타낸 , H 사슬 가변부의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID No. 7 의 뉴클레오티드 번호 58 내지 405 와 동일한 것으로 밝혀졌다.
SEQ ID No. 8 의 아마노산 번호 117 내지 571 로서 나타낸 아미노산 서열은, 항체 아미노산 서열의 데이터베이스와 비교시 [Kabat E.A. et al., 상기], 마우스 IgM 으로부터 유래한 H 사슬 불변부내 아미노산 서열과 일치하는 것으로 밝혀졌다.
SEQ ID No. 8 의 아미노산 번호 -19 내지 -1 로서 나타낸 아미노산 서열은 CH11 의 H 사슬의 시그널 서열로 결정되었다.
SEQ ID No. 7 의 뉴클레오티드 406 내지 1770 로 나타낸 뉴클레오티드 서열은 마우스 IgM 의 H 사슬 불변부과 동일한 것으로 밝혀졌다.
이러한 결과에 기초하여, 전 뉴클레오티드 서열은 전 아미노산 서열과 더불어 확립될 수 있었다.
(4-3) CH11 L 사슬의 일차구조
서열목록의 SEQ ID No. 16 의 뉴클레오티드 번호 29 내지 364 로 나타낸, L 사슬 가변부의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID No. 9 의 뉴클레오티드 번호 58 내지 393 과 동일한 것으로 밝혀졌다.
SEQ ID No. 10 의 아마노산 번호 113 내지 219 로서 나타낸 아미노산 서열은, 항체 아미노산 서열의 카바트의 데이터베이스와 비교시, 마우스 kL 사슬 불변부내 아미노산 서열과 일치하는 것으로 밝혀졌다.
SEQ ID No. 10 의 아미노산 번호 -19 내지 -1 로 나타낸 아미노산 서열은 L 사슬의 시그널 서열로 결정되었다.
SEQ ID No. 9 의 뉴클레오티드 394 내지 714 로 나타낸 뉴클레오티드 서열은 마우스 kL 사슬 불변부과 동일한 것으로 확립되었다.
이러한 결과에 기초하여, 전 뉴클레오티드 서열은 전 아미노산 서열과 더불어 확립될 수 있었다.
(4-4) CH11 의 J 사슬의 일차구조
SEQ ID No. 12 의 아미노산 번호 1 내지 137 로 나타낸 아미노산 서열은 항체 아미노산 서열 데이터베이스와 비교한 결과, 공지된 마우스 J 사슬과 동일한 것으로 밝혀졌다.
SEQ ID No. 11 의 뉴클레오티드 번호 67 내지 477 로서 나타낸 뉴클레오티드서열은 공지된 마우스 J 사슬과 일치하는 것으로 밝혀졌다.
SEQ ID No. 12 의 아미노산 번호 -22 내지 -1 로서 나타낸 아미노산 서열은 CH11 의 J 사슬의 시그널 서열로 결정되었다.
이러한 결과에 기초하여, 전 뉴클레오티드 서열은 전 아미노산 서열과 더불어 확립될 수 있었다.
(4-5) 상보성 결정 영역 (CDR) 의 결정
전술한 바와 같이 결정된, CH11 의 H 사슬 및 L 사슬 의 가변부내 각 CDR 의 위치 및 아미노산 서열 양방은 카바트의 항체 아미노산 서열 데이터베이스[상기] 와 비교로 동정하였다. 이러한 데이터베이스는 가변부내 프레임워크 구역의 아미노산사슬 길이는 상이한 항체 전반에 걸쳐 실질적으로 일정함을 보여주며, 단 아형은 동일하고, 아미노산 서열은 약간의 공통 특성을 갖는다. 그러나, 이러한 프레임워크 영역사이에 존재하는 CDR 은 각 항체에 특이적인 서열이다.
CH11 H 사슬의 가변부의 아미노산 서열과 마우스 μ2a 아형의 서열을 비교하는 경우, CH11 H사슬내 CDR 은 SEQ ID No. 8의 아미노산 번호 31 내지 35 (CDRH1, 서열목록의 SEQ ID No.1 에 대응), SEQ ID No. 8 의 50 내지 66 (CDRH2, 서열목록의 SEQ ID No. 2 에 대응) 및 SEQ ID No.8 의 99 내지 105 (CDRH3, 서열목록의 SEQ ID No.3 에 대응) 로 표시되는 것으로 보여진다.
CH11 L사슬의 가변부의 아미노산 서열을 마우스 k2 아형의 서열과 비교하는 경우, L사슬의 CDR 은 SEQ ID No. 10의 아미노산 번호 24 내지 39 (CDRL1, 서열목록의 SEQ ID No.4 에 대응), SEQ ID No. 10 의 55 내지 61 (CDRL2, 서열목록의 SEQ ID No. 5 에 대응) 및 SEQ ID No.10 의 94 내지 102 (CDRL3, 서열목록의 SEQ ID No.6 에 대응) 로 표시되는 것으로 보여진다.
CH11 L사슬의 가변부의 아미노산 서열을 마우스 k2 아형의 서열과 비교하는 경우, L사슬의 CDR 은 서열목록의 SEQ ID No. 10의 아미노산 번호 24 내지 39 (CDRL1, 서열목록의 SEQ ID No.4 에 대응),55 내지 61 (CDRL2, 서열목록의 SEQ ID No. 5 에 대응) 및 94 내지 102 (CDRL3, 서열목록의 SEQ ID No.6 에 대응) 로 나타나는 것으로 보여진다.
본 발명은 하기의 실시예로 추가로 설명하며, 이러한 실시예는 단지 설명을 위한 것이며 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
실시예 1
CH11 의 가변부의 분자 모델링
CH11 의 가변부의 분자 모델링을 '상동성 모델링' 의 방법으로 실행한다[Andrew et al., (1991) Methods in Enzymology, 203, p.121-153].
X-선 결정 구조가 결정된 인간 면역글로불린의 가변부의 일차서열을 단백질 데이터 뱅크에 등록하였다(이후 PDB 로 칭함, Chemistry Department,Building 555, Brookheaven National Laboratory,P.O.Box 5000, Upton, NY 11973-5000,USA). 데이터 뱅크내 있는 서열을 CH11 의 프레임워크 영역의 서열과 비교한다. 두 개의 인간 면역글로불린인 1NBV 및 1IGI 는 각각 CH11 L 및 H 사슬과 최고의 상동성을 갖는 것으로 동정되었다.
CH11 의 프레임워크 영역의 삼차원 구조의 모델은 상기 인간 FR 영역의 공지된 구조에 기초하여 구축한다. 이후 이러한 모델은 프레임워크 모델 로 칭한다.
CH11 의 CDR 은 초티아 등의 방법을 이용하여 분류한다 [Chothia et al,J.Mol.Biol., (1987),196,901-917]. 이러한 방법을 이용하여, CDRL1은 기준등급 4 로 분류하고, CDRL2는 기준등급 1 로 분류하고, CDRL3는 기준등급 1 로 분류하고, CDRH1은 기준등급 1 로 분류한다. CDRH2및 CDRH3은 정의된 기준등급에 대응되지 않는다. CDRL1, CDRL2, CDRL3및 CDRH1의 CDR 루프는 각각의 기준등급에 본래하는 구조에 의해 주어지며, 프레임워크에 통합된다.
CDRH2및 CDRH3의 구조는 하기와 같이 결정한다. 첫째로, 이러한 CDR 에대해 높은 상동성을 갖는 서열을 PDB 로부터 동정한다. CDRH2및 CDRH3의 구조는 상기 공지된 서열의 구조를 본뜬다. 이러한 구조는 에너지 계산의 결과와 합하고, 최고의 가능성을 갖는 CDR 루프의 구조를 구축하여 프레임워크 모델에 통합시킨다. 최종적으로, 에너지 계산을 행하여 임의의 에너지적으로 바람직하지않은 원자접촉을 제거하여 CH11 의 분자모델을 얻는다. 상기 절차는 AbM 분자 모델링 소프트웨어를 이용하여 실행한다 [Oxford Molecular Limited, Inc.].
수득한 분자 모델의 구조의 정확성은 PROCHECK 소프트웨어를 이용하여 평가한다 [Laskowiski,R,A,J., (1993),Appl.Cryst.26,283-291]. 각 잔기의 표면노출도는 원자간 접촉도의 측정이 가능한 리 앤 리차드방법을 이용하여 계산한다 [Lee,B., and Richards,F.M., J.Mol.Biol., (1971), 55,379-400].
실시예 2
수용체의 선택
CH11 의 H 및 L 사슬의 서열은 인간 항체의 각각의 소집단의 컨센서스 서열과 비교한다. CH11 의 L 사슬은 인간 소집단 kappa II 와 83% 의 동일성을 갖고, CH11 의 H 사슬은 인간 소집단 I 와 74% 동일성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 인간 항체 RPMI6410'CL (소집단 kII) 및 21·28'CL(소집단 I) 를 서열 상동성에 기초하여 각각 L 및 H 사슬에 대한 수용체 분자로서 선택한다.
실시예 3
수용체로 이식되는 CH11 유래의 공여체 잔기의 선택
CH11 의 H 및 L 사슬 각각의 아미노산 서열은 'Cameleon'소프트웨어 [Oxford Molecular Limited, Inc.]를 이용하여 각각의 수용체 분자의 것과 정렬시킨다. 인간화 서열은 전술한 기준 (a) 내지 (d) 에 따라 설계한다. 4 개의 경사슬 서열과 2 개의 중사슬 서열을 설계하여 인간화 항-인간 Fas 항체를 생산하기 위한 기초를 형성시킨다. 이러한 아미노산 서열 및 이러한 단백질을 코딩하는 대응하는 뉴클레오티드 서열은 하기에 열거하였다.
L 사슬(k 사슬):
폴리펩티드 VL-KY(SEQ ID No.78) 및 이를 코딩하는 DNA 서열 (SEQ ID No.77);
폴리펩티드 VL-KF(SEQ ID No.80) 및 이를 코딩하는 DNA 서열 (SEQ ID No.79);
폴리펩티드 VL-RY(SEQ ID No.82) 및 이를 코딩하는 DNA 서열 (SEQ ID No.81);
폴리펩티드 VL-RF(SEQ ID No.84) 및 이를 코딩하는 DNA 서열 (SEQ ID No.83).
H 사슬(μ사슬):
폴리펩티드 HμH사슬 (SEQ ID No.86) 및 이를 코딩하는 DNA 서열 (SEQ ID No.85); 및
폴리펩티드 HμM사슬(SEQ ID No.88) 및 이를 코딩하는 DNA 서열 (SEQ ID No.87).
실시예 4
(가변부에서 각각 소집단 I 및 II 를 갖는) 전장 인간 H 및 L 사슬을 코딩하는 DNA 의 클로닝 및 서열결정
1) 프라이머의제조
a) H사슬
마우스 모노클론성 항체 CH11 의 H사슬의 가변부의 아미노산 서열 (SEQ ID No.89) 는 카바트 등에의해 만들어진 항체의 아미노산 서열의 데이터베이스 [Kabat E.A., et al., 상기] 와 비교하여 임의의 상동 서열을 동정한다. CH11 의 H 사슬 (μ사슬) 의 가변부의 프레임워크 영역의 아미노산 서열은 인간 항체 소집단 I 의 H 사슬에 상동적인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 올리고뉴클레오티드 프라이머: HVHI5-1;(SEQ ID No.90) 를 합성하였고, 이는 데이터베이스내 인간 면역글로불린 H 사슬 소집단을 코딩하는 DNA 의 5'-비번역 영역의 일부와 혼성화한다.
인간 면역글로불린 H 사슬의 불변부를 코딩하는 DNA 의 뉴클레오티드 서열은 도라이 및 길리어스에 의해 보고되었다 [(1989), Nucleic Acids Res., 17, 6412]. 이것에 기초하여, 올리고뉴클레오티드 프라이머 : HCμ3-1;(SEQ ID No. 91) 를 합성하였고, 이는 3'-비번역 영역의 뉴클레오티드 서열의 일부와 혼성화한다.
b) L 사슬
마우스 모노클론성 항체 CH11 의 L사슬의 가변부의 아미노산 서열 (SEQ ID No.92) 는 카바트 등에의해 제조된 항체의 아미노산 서열의 데이터베이스 [상기] 와 비교하여 임의의 상동 서열을 동정한다. CH11 의 L 사슬 (k사슬) 의 가변부의 프레임워크 영역의 아미노산 서열은 인간 항체 소집단 II 의 L 사슬에 상동적인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 올리고뉴클레오티드 프라이머: HVK II5-4;(SEQ ID No.93) 를 합성하였고, 이는 데이터베이스내 인간 면역글로불린 L 사슬 소집단 II 를 코딩하는 DNA 의 5'-비번역 영역의 일부와 혼성화한다.
인간 면역글로불린 L 사슬의 불변부를 코딩하는 DNA 의 뉴클레오티드 서열은 히에터등에 의해 보고되었다 [Hieter, P.A., (1980), Cell, 22, 197 이하참조]. 이것에 기초하여, 올리고뉴클레오티드 프라이머 : HKCL3-3;(SEQ ID No. 94) 를 합성하였고, 이는 DNA 의 3'-비번역 영역의 일부와 혼성화한다.
상기의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 모두 포스포아미디드법[Mattrucci,M.D., and Caruthers,M.H., (1981)J.Am.Chem.Soc., 103,3185 이하 참조] 으로 자동 DNA 합성기 Model 380B [퍼킨 엘머사제, 일본]를 이용하여 합성한다. 합성후, 각 프라이머를 지지체로부터 분해, 탈보호 및 이어서 냉동건조시킨다. 프라이머는 증류수 100㎕ 에 용해시키고 사용때까지 -20℃ 에서 저장한다.
2)폴리머라아제 사슬 반응(PCR) 에 의한 목표 유전자의 증폭
H 사슬
인간 IgM 의 H 사슬을 코딩하는 DNA 단편을 PCR 를 이용하여 증폭 및 단리시킨다. 인간 림프구 cDNA 라이브러리를 DNA 의 출발원으로서 사용한다.
구체적으로는, 하기 정의된 반응용액을 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 이하 열주기를 이용하여 가열한다:94℃에서 1 분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기는 30 회 반복한다. 이어서, 반응 용액을 72℃ 에서 10 분간 보온한다.
반응 용액의 조성:
인간 림프구 cDNA 라이브러리 [라이프 테크롤로지사제], 25ng;
올리고뉴클레오티드 프라이머 HVHI5-1,50pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 HCμ3-1,50pmol;
25mM dNTPs 칵테일, 10㎕;
100mM Tris-HCl 버퍼 (pH8.5), 10㎕;
1M 염화칼륨 [KCl],5㎕;
25mM 염화마그네슘 [MgCl2], 10㎕;
Taq DNA 폴리머라아제 [퍼킨 엘머사제, 일본], 1단위.
재증류수를 첨가하여 총부피를 100㎕ 의 최종부피로 조정하다. 용어 '25mM dNTPs 칵테일'은 dATP(데옥시아데노신 트리포스페이트), dCTP (데옥시시토신 트리포스페이트), dGTP (데옥시구아노신 트리포스페이트) 및 dTTP (데옥시티미딘 트리포스페이트) 를 각각 25mM 의 농도로 함유하는 칵테일을 의미한다.
L 사슬
인간 IgM 의 L 사슬을 코딩하는 DNA 단편을 PCR 를 이용하여 증폭 및 단리시킨다. 인간 림프구 cDNA 라이브러리를 DNA 의 출발원으로서 사용한다.
구체적으로는, 하기 정의된 반응용액을 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 이하 열주기를 이용하여 가열한다:94℃에서 1 분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기는 30 회 반복한다. 이어서, 반응 용액을 72℃ 에서 10 분간 보온한다.
반응 용액의 조성:
인간 림프구 cDNA 라이브러리 [Life Technologies 사제], 25ng;
올리고뉴클레오티드 프라이머 HVKII5-4,50pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 HKCL3-3,50pmol;
25mM dNTPs 칵테일, 10㎕;
100mM Tris-HCl 버퍼 (pH8.5), 10㎕;
1M 염화칼륨 [KCl],5㎕;
25mM 염화마그네슘 [MgCl2], 10㎕;
Taq DNA 폴리머라아제 [퍼킨 엘머사제, 일본], 1단위.
재증류수를 첨가하여 총부피를 최종부피 100㎕ 로 조정한다.
3) PCR 산물 분석
PCR 증폭후, 각 반응의 산물을 아가로오스 겔 전기영동으로 분석한다. 상기 200ng 의 DNA 에 해당하는 2) 항에 기재된 각 반응용액의 분량 (aliquot) 를 0.8% (w/v) 아가로오스 겔상에서 전기영동시킨다. PCR 산물의 크기는 시료와 함께 시행한 분자량 마커의 밴드의 이동성에 대하여 평가한다. 인간 면역글로불린 H사슬 단편은 크기가 약 2,000 bp 로 밝혀졌고, 인간 면역글로불린 L 사슬은 크기가 약 800bp 인 것으로 밝혀졌다.
4) PCR 산물의 클로닝
상기 3) 항에서 얻은 각각의 PCR 산물을 진핵생물 TA 클로닝 키트를 이용하여 플라스미드 벡터에 접합시킨다[인트로겐사제]
좀더 구체적으로, 60ng 의 pCR3 벡터 DNA (키트내 포함) 및 4 단위의 T4DNA 리가아제를 PCR 반응 혼합물을 일정비율 함유하는 리가아제 반응 버퍼 [6mM Tris-HCl (pH7.5), 6mM 염화마그네슘 (MgCl2), 5mM 염화나트륨 (NaCl), 7mM β-머캅토에탄올, 0.1mM ATP, 2mM DTT, 1mM 스퍼미딘 및 0.1 mg/ml 소혈청 알부민] 에 첨가한다. PCR 반응 혼합물의 부피는 목적하는 PCR 산물을 약 10ng 함유하는 정도로 선택한다. 생성된 혼합물은 14℃ 에서 15 시간동안 보온시킨다.
리가아제 반응 혼합물 (2㎕) 의 일부를 0.5M β-머캅토에탄올 2㎕ 를 가하여 수용성으로 만든 대장균TOP10F' 주 50㎕ (키트내 포함) 과 혼합한다. 생성된 혼합물을 빙상에서 30 분간 유지시킨다. SOC 배지 500 ㎕(키트내 포함) 를 첨가하고, 생성된 혼합물을 진탕하면서 37℃ 에서 1 시간동안 보온시킨다. 이어서 배양액을 100㎍/ml 암피실린을 함유하는 L-브로쓰 아가 배지 플레이트 [1% (w/v) 박토트립톤 (디프코사제), 0.5%(w/v) 박토-이스트 추출물 (디프코사제). 0.1%(w/v) 글루코오스, 0.5%(w/v) NaCl, 1.2% (w/v) 박토-아가 (디프코사제)] 에 뿌리고 37℃ 에서 밤새워 보온시킨다.
이어서 암피실린에 내성인 것으로 보이는 콜로니를 백금 피크로 긁어내어 개별적으로 암피실린을 100㎍/ml 함유하는 L-브로쓰 배지 5 ml [1%(w/v) 박토트립톤 (디프코사제), 0.5% (w/v) 박토-이스트 추출물 (디프코사제), 0.5% (w/v) NaCl] 에서 37℃로 진탕하면서 배양한다. 이어서 이 배양물을 원심분리하여 세포를 회수하고, 이로부터 플라스미드 DNA 를 알칼리 용해법으로 제조한다 [Sambrook, J. et al. 이상].
이런 방식으로 제조한 플라스미드 DNA (1㎍) 를 효소가 공급된 버퍼를 이용하여, 제한효소 EcoR1 로 소화시킨다. 이후 모든 제한효소 소화는 효소가 공급된 버퍼 [다까라 슈조사제] 를 이용하여 실행한다 . 이중 소화의 경우에서, 양 효소와 상용적인 제한효소 버퍼를 사용한다. 소화산물은 0.8%(w/v) 아가로오스 겔상에서 전기영동으로 분리시킨다. 각각 인간 면역글로불린 H 및 L 사슬에 해당하는,약 2,000 bp 및 약 800 bp 의 DNA 삽입체 를 함유하는 플라스미드를 동일한 겔에서 시행한 분자량 마커와 비교하여 동정한다. 이러한 단편을 포함하는 플라스미드를 선택한다.
구체적으로는, 하기의 두 플라스미드를 선택한다:
인간 면역글로불린 H 사슬을 코딩하는 DNA 단편를 포함하는 플라스미드 pHH1-5. 구체적으로는, 플라스미드는 소집단 I 의 가변부를 갖는 인간 면역글로불린 H 사슬을 코딩하는 cDNA 삽입체를 포함한다.
인간 면역글로불린 L 사슬을 코딩하는 DNA 단편를 포함하는 플라스미드 pHL15-27. 구체적으로는, 플라스미드는 소집단 II 의 가변부를 갖는 인간 면역글로불린 L 사슬을 코딩하는 cDNA 삽입체를 포함한다.
5) 인간 면역글로불린 H 및 L 사슬을 코딩하는 클론된 전장 뉴클레오티드 서열의 확인
인간 면역글로불린 H 사슬은 약 110 잔기의 N-말단 가변부 및 약 510 잔기의 인접한 불변부로 구성된다. 한편, 인간 면역글로불린 L 사슬은 약 110 잔기의 N-말단 가변부 및 약 107 잔기의 인접한 불변부로 구성된다.
그러므로, 상기 (4) 항에서 클론된, 인간 면역글로불린의 H사슬을 코딩하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열은 가변부 및 불변부로 구성되리라 예견된다. 가변부는 소집단 I 의 인간 면역글로불린 H 사슬 서열의 가변부에 매우 상동적일 것으로 예견된다 [예, clone 21/28'CL; Kabat E.A., et al.(1991), 상기]. 인간 면역글로불린 H 사슬의 불변부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 공지되어 있다 [kabat E.A., et al., (1991), 상기].
상기 (4) 항에서 클론된, 인간 면역글로불린의 L 사슬을 코딩하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열은 가변부 및 불변부로 구성되리라 예견된다. 가변부는 소집단 II 의 인간 면역글로불린 L 사슬의 가변부에 매우 상동적이라 예견된다 (예, clone RPMI1640'CL;Kabat E.A., et al., 상기). 인간 면역글로불린 L 사슬의 불변부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 공지되어 있다 [Kabat E.A., et al., 상기].
길이 20 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하여 서열분석을 행한다. 프라이머는 가변부의 프레임워크 영역내 공지-보존 서열 및 불변부내 공지된 뉴클레오티드 서열에 기초하여 설계한다. 프라이머는 100 내지 200 bp 간격으로 분리된 서열에 대응하도록 설계하고, 이미 PCR (상기 2 항) 에서 사용한, 프라이머 HVHI5-1, HCμ3-1, HVKII5-4 및 HKCL3-1 과 함께 사용한다.
H 사슬의 서열분석을 위하여 합성한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열은 하기와 같다:
SHHF-1; (SEQ ID No. 95);
SHHF-2; (SEQ ID No. 96);
SHHF-3; (SEQ ID No. 97);
SHHF-4; (SEQ ID No. 98);
SHHF-5; (SEQ ID No. 99);
SHHF-6; (SEQ ID No. 100);
SHHF-7; (SEQ ID No. 101),
SHHF-8; (SEQ ID No. 102);
SHHF-9; (SEQ ID No. 103);
SHHF-10; (SEQ ID No. 104);
SHHF-11; (SEQ ID No. 105);
SHHF-13; (SEQ ID No. 106);
SHHF-14; (SEQ ID No. 107);
SHHF-15; (SEQ ID No. 108);
SHHR-1; (SEQ ID No. 109);
SHHR-2; (SEQ ID No. 110);
SHHR-3; (SEQ ID No. 111);
SHHR-4; (SEQ ID No. 112);
SHHR-5; (SEQ ID No. 113);
SHHR-6; (SEQ ID No. 114);
SHHR-7; (SEQ ID No. 115);
SHHR-8; (SEQ ID No. 116);
SHHR-9; (SEQ ID No. 117);
SHHR-1O; (SEQ ID No. 118);
SHHR-11; (SEQ ID No. 119);
SHHR-12; (SEQ ID No. 120);
SHHR-13; (SEQ ID No. 121);
SHHR-14; (SEQ ID No. 122); 및
SHBR-15; (SEQ ID No. 123).
도 3 은 각각의 프라이머가 결합하는 위치를 나타낸다.
L 사슬의 서열분석을 위해 합성한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열은 하기와 같다:
SHKF-1; (SEQ ID No. 124);
SHKF-2; (SEQ ID No. 125);
SHKF-4; (SEQ ID No. 126);
SHKF-5; (SEQ ID No. 127);
SHKF-6; (SEQ ID No. 128);
SHKF-11; (SEQ ID No. 129);
SHKF-12; (SEQ ID No. 130);
SHKR-1; (SEQ ID No. 131);
SHKR-2; (SEQ ID No. 132);
SHKR-3; (SEQ ID No. 133);
SHKR-4; (SEQ ID No. 134);
SHKR-6; (SEQ ID No. 135); 및
SHKR-13; (SEQ ID No. 136).
도 4 는 각각의 프라이머가 결합하는 위치를 나타낸다.
서열 분석용 시료를 상기 프라이머 및 Prism Ready Reac tion Terminator Cycle Sequencing kit [퍼킨 엘머사제] 를 이용하여 제조한다. 상기 4) 항에 기재된 바와 같이, 플라스미드 pHH1-5 DNA 또는 플라스미드 pHL15-27 DNA 로부터 유래한 플라스미드 DNA 를 주형으로서 사용한다.
구체적으로는, 정제한 플라스미드 DNA (1.5㎍) 을 증류수로 최종부피 16㎕ 로, 적당한 프라이머 4.8 pmol 과 혼합한다(이 용액은 이후 플라스미드 DNA/프라이머 혼합물 로 칭한다). 각 프라이머에 대응하는, 상기 플라스미드 DNA/프라이머 혼합물의 일부(9.5㎕)를 Taq DNA 폴리머라아제를 함유하는 키트내 제공된 예비배합물 용액 10.5㎕ 에 첨가한다. 반응용액을 자동화 반응기에 넣는다 [Catalyst; 퍼킨 엘머사제, 일본). 사용하는 반응 주기는 이하와 같다: 95℃에서 30 초, 50℃에서 15 초 및 60℃ 에서 4 분의 열주기를 25 회 반복.
반응주기의 완료후, 증류수 80㎕ 를 생성된 용액에 첨가하고 생성된 혼합물내 DNA 는 페놀-클로로포름법으로 2 회 추출한다 [Sambrook et al., 상기]. 회수한 수성층을 2M 아세트산나트륨 15㎕ 및 100% 에탄올 300㎕ 과 혼합하고, 이어서 원심분리하여 DNA 침전물을 회수한다. 침전물을 70% (v/v) 로 세정하고 감압하 건조시킨후, 시료용액 3㎕ 에 용해시킨다 [0.25M EDTA 4㎕, 포름아미드 100㎕ 및 증류수 16㎕]
서열 반응을 실행하고 DNA 시퀀서 [Model 373A; 퍼킨 엘머사제, 일본] 로 분석한다. 인간 면역글로불린 H 사슬용의 30 개의 시료 및 인간 면역글로불린 L 사슬용의 17 개의 시료에 대해 분석을 행한다.
플라스미드 pHH1-5 는 소집단 I 의 가변부를 갖는 인간 면역글로불린 H 사슬을 코딩하는 DNA 삽입체를 함유하는 것은 데이터의 분석으로 확인된다. 한편, 플라스미드 pHL15-27 는 소집단 II 의 가변부를 갖는 인간 면역 글로불린 L 사슬을 코딩하는 DNA 삽입체를 함유하는 것으로 보여진다.
플라스미드 pHH1-5 및 플라스미드 pHL15-27 에 의해 운반되는 DNA 삽입체의 뉴클레오티드 서열은 각각 SEQ ID No. 137 및 138 로 나타내었다.
실시예 5
CH11 L 사슬의 인간화를 위한 발현벡터의 구축
1) 프라이머의 제조
하기의 DNA 단편은 PCR 를 이용하여 합성한다:
VL-KY 사슬의 폴리펩티드사슬 (SEQ ID No.78) 를 코딩하는 DNA (SEQ ID No. 77),
VL-KF 사슬의 폴리펩티드사슬 (SEQ ID No.80) 를 코딩하는 DNA (SEQ ID No. 79),
VL-RY 사슬의 폴리펩티드사슬 (SEQ ID No.82) 를 코딩하는 DNA (SEQ ID No. 81),
VL-RF 사슬의 폴리펩티드사슬 (SEQ ID No.84) 를 코딩하는 DNA (SEQ ID No. 83).
하기의 14 프라이머를 PCR 공정에서 사용하기 위하여 합성한다:
VL1P; (SEQ ID No. 139);
VL1N; (SEQ ID No. 140);
VL2P; (SEQ ID No. 141);
VL2N; (SEQ ID No. 142);
L3TYRP; (SEQ ID No. 143);
VL3TYRN; (SEQ ID No. 144);
VL3PHEP; (SEQ ID No. 145);
VL3PHEN; (SEQ ID No. 146);
VL4P; (SEQ ID No. 147);
VL4N; (SEQ ID No. 148);
VL5P; (SEQ ID No. 149);
VL50RP; (SEQ ID No. 150);
VL50RN; (SEQ ID No. 151); 또는
VLTERM; (SEQ ID No. 152).
2) 플라스미드 pHkKY2-58 및 플라스미드 pHkKF2-19 의 구축
a) 제 1 단계 PCR
제 1 단계 PCR 의 개요를 도 5 에 나타내었다.
VL1
분비 시그널 서열, FRL1영역 및 CDRL1영역의 아미노-말단 부분 (이후 N-말단 으로 칭함) 를 코딩하는 DNA 단편을 제조한다. 여기에서 이 단편은 VL1 DNA 단편 으로 칭한다. PCR 반응 조건은 하기와 같다:
반응용액의 조성:
플라스미드 pHL 15-27 DNA, 1㎍;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VL5P, 80 pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VL1N, 80 pmol;
25 mM dNTPs 칵테일, 20㎕;
10 x Pfu 버퍼, 20㎕;
Pfu DNA 폴리머라아제 [스트라타겐사제], 10 단위.
재증류수를 최종부피 200㎕ 로 첨가한다. 10 x Pfu 버퍼에는 Pfu 폴리머라아제가 제공된다.
구체적으로는, 반응 용액은 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 이하의 열주기를 이용하여 가열한다: 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기를 30 회 반복한다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 10 분간 보온한다.
VL2
FRL1영역의 카르복실-말단부분 (이후C-말단으로 칭함), CDRL1영역 및 FRL2영역의 N-말단의 카르복실-말단을 코딩하는 DNA 단편을 제조한다. 이러한 단편은 여기에서는 VL2 DNA 단편 으로 칭한다. PCR 반응 조건은 하기와 같다:
플라스미드 pCR3-L103 DNA, 1㎍;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VL1P, 80 pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VL2N, 80 pmol;
25 mM dNTPs 칵테일, 20㎕;
10 x Pfu 버퍼, 20㎕;
Pfu DNA 폴리머라아제 [스트라타겐사제], 10 단위.
구체적으로는, 반응 용액은 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 하기의 열주기를 이용하여 가열한다: 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기를 30 회 반복한다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 10 분간 보온한다.
VL3Y
CDRL2영역, FRL3영역 (여기에서 87 위치의 아미노산 잔기는 티로신 잔기로 변경된다) 및 CDRL3영역을 코딩하는 DNA 단편을 제조한다. 본 실시예 및 기타 모든 실시예에서, 아미노산 넘버링은 카바트 [Kabat et al., 상기] 에서 주어진 것을 따른다. 여기에서 이 단편은 VL3Y DNA 단편 으로 칭한다. PCR 반응 조건은 하기와 같다:
반응 용액의 조성:
플라스미드 pHL15-27 DNA, 1㎍;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VL2P, 80 pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VL3TYRN, 80 pmol;
25 mM dNTPs 칵테일, 20㎕;
10 x Pfu 버퍼, 20㎕;
Pfu DNA 폴리머라아제 [스트라타겐사제], 10 단위.
구체적으로는, 반응 용액은 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 하기의 열주기를 이용하여 가열한다: 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기를 30 회 반복한다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 10 분간 보온한다.
VL3F
CDRL2영역, FRL3영역 (여기에서 87 위치의 아미노산 잔기는 페닐알라닌 잔기로 변경된다) 및 CDRL3영역을 코딩하는 DNA 단편을 제조한다. 여기에서 이 단편은 VL3F DNA 단편 으로 칭한다. PCR 반응 조건은 하기와 같다:
반응 용액의 조성:
플라스미드 pHL15-27 DNA, 1㎍;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VL2P, 80 pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VL3PHEN, 80 pmol;
25 mM dNTPs 칵테일, 20㎕;
10 x Pfu 버퍼, 20㎕;
Pfu DNA 폴리머라아제 [스트라타겐사제], 10 단위.
구체적으로는, 반응 용액은 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 하기의 열주기를 이용하여 가열한다: 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기를 30 회 반복한다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 10 분간 보온한다.
VL4
CDRL3영역, FRL4영역 및 Ck 영역 (불변부의 일부)을 코딩하는 DNA 단편을 제조한다. 여기에서 이 단편은 VL4 DNA 단편 으로 칭한다. PCR 반응 조건은 하기와 같다:
반응 용액의 조성:
플라스미드 pHL15-27 DNA, 1㎍;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VL4P, 80 pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VLTERM, 80 pmol;
25 mM dNTPs 칵테일, 20㎕;
10 x Pfu 버퍼, 20㎕;
Pfu DNA 폴리머라아제 [스트라타겐사제], 10 단위.
구체적으로는, 반응 용액은 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 하기의 열주기를 이용하여 가열한다: 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기를 30 회 반복한다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 10 분간 보온한다.
이러 방식으로 PCR 로 증폭된 VL1, VL2, VL35, VL3F 및 VL4 DNA 단편을 페놀로 추출한다. 이어서 100% 에탄올을 이용하여 DNA 를 침전시킨다. DNA (약 20-30㎍) 를 5% (w/v) 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동시킨다. 겔은 UV 광에서 볼 때 DNA 단편이 보일수 있을 정도로 에티듐 브로마이드 1 ㎍/ml 로 염색한다. 이런 방식으로 검출된 DNA 단편은 면도날로 겔로부터 절단하고 Centricon 10 [아미콘사제] 가 장착된 Centriruter [아미콘사제] 를 이용하여 아크릴아미드겔로부터 전기용출시킨다. 용출된 DNA 를 약 1 시간동안 7,500 x g 으로 원심분리하여 농축하고, 이어서 에탄올 침전시킨다. 각 경우에서의 최종 DNA 산물을 증류수 50㎕ 에 용해시킨다.
b) 제 2 단계 PCR
제 2 단계 PCR 의 개요를 도 6 에 나타내었다.
VL1-2
전술한 VL1 DNA 단편 및 VL2 DNA 단편의 융합물을 PCR 를 이용하여 제조한다. 이후 상기 단편은 VL1-2 DNA 로 칭한다. PCR 반응 조건은 하기와 같다:
반응용액의 조성:
제 1 단계 PCR 에서 제조한 VL1 DNA 용액, 10㎕;
제 1 단계 PCR 에서 제조한 VL2 DNA 용액, 10㎕;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VL5P, 80 pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VL2N, 80 pmol;
25 mM dNTPs 칵테일, 20㎕;
10 x Pfu 버퍼, 20㎕;
Pfu DNA 폴리머라아제 [스트라타겐사제], 10 단위.
구체적으로는, 반응 용액은 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 하기의 열주기를 이용하여 가열한다: 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기를 30 회 반복한다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 10 분간 보온한다.
VL3Y-4
전술한 VL3Y DNA 단편 및 VL4 DNA 단편의 융합물을 PCR 를 이용하여 제조한다. 이후 상기 단편은 VL3Y-4 DNA 단편 으로 칭한다. PCR 반응 조건은 하기와 같다:
반응용액의 조성:
제 1 단계 PCR 에서 제조한 VL3Y DNA 용액, 10㎕;
제 1 단계 PCR 에서 제조한 VL4 DNA 용액, 10㎕;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VL2P, 80 pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VLTERM, 80 pmol;
25 mM dNTPs 칵테일, 20㎕;
10 x Pfu 버퍼, 20㎕;
Pfu DNA 폴리머라아제 [스트라타겐사제], 10 단위.
구체적으로는, 반응 용액은 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 하기의 열주기를 이용하여 가열한다: 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기를 30 회 반복한다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 10 분간 보온한다.
VL3F-4
전술한 VL3F DNA 단편 및 VL4 DNA 단편의 융합물을 PCR 를 이용하여 제조한다. 이후 상기 단편은 VL3F-4 DNA 단편 으로 칭한다. PCR 반응 조건은 하기와 같다:
반응용액의 조성:
제 1 단계 PCR 에서 제조한 VL3F DNA 용액, 10㎕;
제 1 단계 PCR 에서 제조한 VL4 DNA 용액, 10㎕;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VL2P, 80 pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VLTERM, 80 pmol;
25 mM dNTPs 칵테일, 20㎕;
10 x Pfu 버퍼, 20㎕;
Pfu DNA 폴리머라아제 [스트라타겐사제], 10 단위.
구체적으로는, 반응 용액은 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 하기의 열주기를 이용하여 가열한다: 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기를 30 회 반복한다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 10 분간 보온한다.
이런 방식으로 PCR 로 증폭한 VL1-2, VL3Y-4 및 VL3F-4DNA 단편을 페놀로 추출한다. 이어서 DNA 를 100% 에탄올을 이용하여 침전시킨다. DNA (약 20-30㎍) 을 5% (w/v) 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동시킨다. 겔은 UV 광에서 볼 때 DNA 단편이 보일수 있을 정도로 에티듐 브로마이드 1 ㎍/ml 로 염색한다. 이런 방식으로 검출된 DNA 단편은 면도날로 겔로부터 절단하고 Centricon 10 [아미콘사제] 가 장착된 Centriruter [아미콘사제] 를 이용하여 아크릴아미드겔로부터 전기용출시킨다. 용출된 DNA 를 약 1 시간동안 7,500 x g 으로 원심분리하여 농축하고, 이어서 에탄올 침전시킨다. 각 경우에서의 최종 DNA 산물을 증류수 50㎕ 에 용해시킨다.
c) 제 3 단계 PCR
제 3 단계 PCR 의 개요를 도 7 에 나타내었다.
VL-KY
전술한 VL1-2 DNA 단편 및 VL3Y-4 DNA 단편의 융합물을 PCR 를 이용하여 제조한다. 이후 상기 단편은 VL-KY DNA 단편 으로 칭한다. 하기 PCR 반응 조건을 사용한다:
반응용액의 조성:
제 2 단계 PCR 에서 제조한 VL1-2 DNA 용액, 10㎕;
제 2 단계 PCR 에서 제조한 VL3Y-4 DNA 용액, 10㎕;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VL5P, 80 pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VLTERM, 80 pmol;
25 mM dNTPs 칵테일, 20㎕;
10 x Pfu 버퍼, 20㎕;
Pfu DNA 폴리머라아제 [스트라타겐사제], 10 단위.
구체적으로는, 반응 용액은 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 하기의 열주기를 이용하여 가열한다: 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기를 30 회 반복한다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 10 분간 보온한다.
VL-KF
전술한 VL1-2 DNA 단편 및 VL3F-4 DNA 단편의 융합물을 PCR 를 이용하여 제조한다. 이후 상기 단편은 VL-KF DNA 단편 으로 칭한다. PCR 반응 조건은 하기와 같다:
반응용액의 조성:
제 2 단계 PCR 에서 제조한 VL1-2 DNA 용액, 10㎕;
제 2 단계 PCR 에서 제조한 VL3F-4 DNA 용액, 10㎕;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VL5P, 80 pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VLTERM, 80 pmol;
25 mM dNTPs 칵테일, 20㎕;
10 x Pfu 버퍼, 20㎕;
Pfu DNA 폴리머라아제 [스트라타겐사제], 10 단위.
구체적으로는, 반응 용액은 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 하기의 열주기를 이용하여 가열한다: 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기를 30 회 반복한다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 10 분간 보온한다.
이런 방식으로 PCR 로 증폭한 VL-KY 및 VL-KF DNA 단편을 페놀로 추출한다. 이어서 DNA 를 100% 에탄올을 이용하여 침전시킨다. DNA (약 20-30㎍) 을 5% (w/v) 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동시킨다. 겔은 UV 광에서 볼 때 DNA 단편이 보일수 있을 정도로 에티듐 브로마이드 1 ㎍/ml 로 염색한다. 이런 방식으로 검출된 DNA 단편은 면도날로 겔로부터 절단하고 Centricon 10 [아미콘사제] 가 장착된 Centriruter [아미콘사제] 를 이용하여 아크릴아미드겔로부터 전기용출시킨다.
VL-KY 또는 VL-KF DNA 단편을 운반하는 플라스미드의 구축을 도 8 에 개략하였다.
추가로 이러한 방식으로 수득한 VL-KY 및 VL-KF DNA 를 페놀 추출로 정제하고 , 이어서 에탄올침전시킨다. 이어서 이 DNA 의 일부 (약 1㎍) 를 효소가 제공된 상용성 제한효소 버퍼를 이용하여, 37℃ 에서 제한효소 Xho1 및 Xba1 의 10 단위로 소화시킨다.
또한 플라스미드 pME18S DNA 의 일부 (1㎍) [Hara, T. and Miyajima,A.,(1992), EMBO J., 11, 1875] 를 제한효소 Xho1 및 Xba1 로 소화시킨다. 생성된 DNA 는 소의 소장 알칼리 포스파타아제 (이후 CIP 로 약칭함; 다까라 슈조사제) 로 처리하여 임의의 5' 포스페이트기를 제거한다. 탈인산화된 pME18S 플라스미드 DNA 의 일부 (100ng) 를 Xba1, Xho1 로 소화된 VL-KY 및 VL-KF DNA 단편의 각각의 0.5㎍ 에 접합시킨다. 접합은 접합 키트[다까라 슈조사제] 를 이용하여 실행하고, 리겐이션 산물은 전기천공으로 대장균 DH5α 주 [기브코-비알엘사제] 로 형질전환시킨다.
구체적으로는, 수용성 세포 50㎕ 를 해빙시키고 리겐이션 배합물 5㎕ 와 혼합한다. 혼합물을 전기천공 큐베트 [바이오래드사제] 로 옮긴다. 25μF, 1.8 kV 및 200Ω 의 펄스를 가한다. 펄스후, 세포를 SOC 배지 1 ml 에 재현탁시킨다. 세포 현탁액을 살균 튜브로 옮기고 37℃ 에서 1 시간동안 보온시킨다. 생성된 세포를 암피실린 50㎍ 을 함유하는 LB 플레이트상에 도포한다.
형질전환 콜로니에 함유된 플라스미드 DNA 의 제한효소 분석을 실행하여 목적 DNA 삽입체를 함유하는 플라스미드를 동정한다. 구체적으로는, 플라스미드 DNA 를 실시예 4 의 4) 항에 주어진 방법으로 형질전환 세포를 밤새워 배양하여 제조한다. 플라스미드 DNA 는 원래 제한효소 (현 실시예의 Xho1 및 Xba1) 로 소화시켜 정확한 크기의 단편이 클론되었는지를 확인한다.
이후 상술되는, 모든 접합 반응, 형질전환 및 형질전환체의 분석은 구체적인 지시를 제외하고는 상기 개략한 방법론을 이용하여 실행한다.
VL-KY DNA 단편을 함유하는 플라스미드 pHkKY2-58 를 동정하였고 VL-KF DNA 단편을 함유하는 플라스미드 pHkKF2-19 를 동정하였다. 이 양경우에서의 단편은 면역글로불린 단백질 산물의 발현을 위한 정배향으로, pME18S 내 SRα 프로모터의 하류에 삽입되어있다.
3) 플라스미드 pHkRY2-10 및 pHkRF2-52 의 구축
주형으로 플라스미드 pHkKY2-58 DNA 및 pKkKF2-19 DNA 로부터 유래한 DNA 를 이용하여, 두 개의 추가 발현벡터를 구축한다.
a) 제 1 단계 PCR
제 1 단계 PCR 의 개관을 도 9 에 나타내었다.
VLR5'
분비 시그널 서열, FRL1영역, CDRL1영역 및 FRL2영역 (위치 45 의 라이신잔기는 아르기닌 잔기대신 치환된다) 를 코딩하는 DNA 단편을 제조한다. 여기에서 이 단편은 VLR5' DNA 단편 으로 칭한다. PCR 반응 조건은 하기와 같다:
반응용액의 조성:
플라스미드 pHkKY2-15 DNA, 1㎍;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VL5P, 80 pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VLRN, 80 pmol;
25 mM dNTPs 칵테일, 20 ㎕;
10x Pfu 버퍼, 20㎕;
Pfu DNA 폴리머라아제 [스트라타겐], 10 단위.
구체적으로는, 반응 용액은 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 하기의 열주기를 이용하여 가열한다: 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기를 30 회 반복한다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 10 분간 보온한다.
VLR3'Y
FRL2영역(위치 45 의 라이신 잔기는 아르기닌 잔기대신 치환된다), CDRL2영역 ,FRL3영역 (위치 87 는 티로신 잔기이다), FRL4영역 및 Ck 영역을 코딩하는 DNA 단편을 제조한다. 여기에서 이 단편은 VLR3'Y DNA 단편 으로 칭한다. PCR 반응 조건은 하기와 같다:
반응용액의 조성:
플라스미드 pHkKY2-58 DNA, 1㎍;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VLRP, 80 pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VLTERM, 80 pmol;
25 mM dNTPs 칵테일, 20 ㎕;
10x Pfu 버퍼, 20㎕;
Pfu DNA 폴리머라아제 [스트라타겐], 10 단위.
구체적으로는, 반응 용액은 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 하기의 열주기를 이용하여 가열한다: 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기를 30 회 반복한다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 10 분간 보온한다.
VLR3'F
FRL2영역(위치 45 의 라이신 잔기는 아르기닌 잔기대신 치환된다), CDRL2영역 ,FRL3영역 (위치 87 는 페닐알라닌 잔기이다), CDRL3영역, FRL4영역 및 Ck 영역을 코딩하는 DNA 단편을 제조한다. 여기에서 이 단편은 VLR3'F DNA 단편 으로 칭한다. PCR 반응 조건은 하기와 같다:
반응용액의 조성:
플라스미드 pHkKF2-19 DNA, 1㎍;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VLRP, 80 pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VLTERM, 80 pmol;
25 mM dNTPs 칵테일, 20 ㎕;
10x Pfu 버퍼, 20㎕;
Pfu DNA 폴리머라아제 [스트라타겐], 10 단위.
구체적으로는, 반응 용액은 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 하기의 열주기를 이용하여 가열한다: 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기를 30 회 반복한다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 10 분간 보온한다.
이러한 방식으로 PCR 로 증폭한 VLR5', VLR3'Y 및 VLR3'F DNA 단편을 페놀로 추출한다. 이어서 DNA 를 100% 에탄올을 이용하여 침전시킨다. DNA (20-30㎍) 를 5%(w/v) 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동시킨다. 겔을 에티듐 브로마이드 1㎍/ml 으로 염색하여, DNA 단편이 UV 조사시 볼수 있도록한다. 이런 방식으로 검출된 DNA 단편을 면도날로 겔로부터 절단하고 Centricon 10 [아미콘사제] 가 장착된 Centriruter [아미콘사제] 를 이용하여 아크릴아미드 겔로부터 전기용출시킨다. 용출된 DNA 를 7,500 x g 에서 약 1시간동안 원심분리하여 농축시키고, 이어서 에탄올 침전시킨다. 각각의 경우의 최종 DNA 산물을 증류수 50㎕ 에서 용해시킨다.
b) 제 2 단계 PCR
제 2 단계 PCR 의 개요를 도 10 나타내었다.
VL-RY
전술한 VLR5' DNA 단편 및 VLR3'Y DNA 단편의 융합물 (이후 VL-RY DNA 단편 으로 칭한다) 을 PCR 를 이용하여 하기의 조건하 제조한다.
반응용액의 조성:
제 1 단계 PCR 에서 제조한 VLR5' DNA 용액, 10㎕;
제 1 단계 PCR 에서 제조한 VLR3'Y DNA 용액, 10㎕;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VL5P, 80 pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VLTERM, 80 pmol;
25 mM dNTPs 칵테일, 20㎕;
10 x Pfu 버퍼, 20㎕;
Pfu DNA 폴리머라아제 [스트라타겐사제], 10 단위.
구체적으로는, 반응 용액은 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 하기의 열주기를 이용하여 가열한다: 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분.
VL-RF
전술한 VLR5' DNA 단편 및 VLR3'F DNA 단편의 융합물 (이후 VL-RF DNA 단편 으로 칭한다) 을 PCR 를 이용하여 하기의 조건하 제조한다.
반응용액의 조성:
제 1 단계 PCR 에서 제조한 VLR5' DNA 용액, 10㎕;
제 1 단계 PCR 에서 제조한 VLR3'F DNA 용액, 10㎕;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VL5P, 80 pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VLTERM, 80 pmol;
25 mM dNTPs 칵테일, 20㎕;
10 x Pfu 버퍼, 20㎕;
Pfu DNA 폴리머라아제 [스트라타겐사제], 10 단위.
구체적으로는, 반응 용액은 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 하기의 열주기를 이용하여 가열한다: 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기를 30 회 반복한다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 10 분간 보온한다.
이러한 방식으로 PCR 로 증폭한 VL-RY, VL-RF DNA 단편을 페놀로 추출한다. 이어서 DNA 를 100% 에탄올을 이용하여 침전시킨다. DNA (20-30㎍) 를 5%(w/v) 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동시킨다. 겔을 에티듐 브로마이드 1㎍/ml 으로 염색하여, DNA 단편이 UV 조사시 볼수 있도록한다. 이런 방식으로 검출된 DNA 단편을 면도날로 겔로부터 절단하고 Centricon 10 [아미콘사제] 가 장착된 Centriruter [아미콘사제] 를 이용하여 아크릴아미드 겔로부터 전기용출시킨다. 용출된 DNA 를 7,500 x g 에서 약 1시간동안 원심분리하여 농축시키고, 이어서 에탄올 침전시킨다. 각각의 경우에서 최종 DNA 를 증류수 50㎕ 에서 용해시킨다.
VL-RY 또는 VL-RF DNA 단편을 운반하는 플라스미드의 구축을 도 11 에 개략하였다.
이러한 방식으로 수득한 VL-RY 및 VL-RF DNA 를 페놀 추출로 추가정제하고 , 이어서 에탄올침전시킨다. 이어서 이 DNA 의 일부 (약 1㎍) 를 제한효소 Xho1 및 Xba1 으로 소화시킨다.
또한 플라스미드 pME18S DNA 의 일부 (1㎍) [Hara, T. and Miyajima,A. 상기] 를 제한효소 Xho1 및 Xba1 로 소화시킨다. 생성된 DNA 는 CIP 로 처리한다. 탈인산화된 pME18S 플라스미드 DNA 의 일부 (200ng) 를 Xba1, Xho1 로 소화된 VL-RY 및 VL-RF DNA 단편의 각각의 0.5㎍ 에 접합시킨다. 접합은 접합 키트[다까라 슈조사제] 를 이용하여 실행하고, 리겐이션 산물은 대장균 DH5α 주로 형질전환시킨다.
형질전환 콜로니에 함유된 플라스미드 DNA 의 제한효소 분석은 실행하여 목적 DNA 삽입체를 함유하는 플라스미드를 동정한다. 플라스미드 pHkRY2-10 는 VL-RY DNA 단편을 함유함이 동정되었고, 플라스미드 pHkRF2-52 는 VL-RF DNA 단편을 함유함이 동정되었다. 이 양경우에서의 단편은 면역글로불린 단백질 산물의 발현을 위한 정배향으로, pME18S 내 SRα 프로모터의 하류에 삽입되어 있다.
4) 뉴클레오티드 서열의 확인
플라스미드 pKkKY2-58, pKkKF2-19, pHkRY2-10 및 pHkRF2-52 의 DNA 삽입체를 서열결정한다. 서열결정공정에서 사용된 프라이머는 전술한 SHKF-4, SHKF-5, SHKF-6, SHKF-12, SHKR-13, SHKF-11, SHKF-2 및 SHKR-3 이다. 이외에, 새로운 세 개의 프라이머를 합성한다;
PMEF2;(SEQ ID No.153);
SHKF-14;(SEQ ID No.154); 및
PMER2;(SEQ ID No.155).
디데옥시뉴클레오티드 사슬 종결법 [Sanger,F.S.et al.(1977)Proc.Natl. Acad.Sci.USA 74:5463] 을 이용하여 서열결정한다. 서열결정전, 플라스미드 DNA 주형을 알칼리-SDS 용해로 숙주세포로부터 분리시키고[Sambrook,J.et al., 상기] 및 염화세슘 원심분리를 이용하여 DNA 를 정제한다 [Sambrook,J.et al., 동일부분].
구체적으로는, 정제된 플라스미드 DNA 의 일부 (1㎍) 를 재증류수 16㎕ 에 용해시킨다. 이 용액을 2mM EDTA 2㎕ 및 2 N 수산화나트륨(NaOH) 2㎕ 와 혼합하고, 이어서 실온에서 5 분간 보온한다. 이어서 일정량 (4㎕) 의 10M 아세트산암모늄 용액 및 100% 에탄올 100㎕ 를 첨가하여 혼합하고, 혼합물을 10 분간 드라이 아이스에 놓는다. 이어서 용액내 DNA 를 15,000 rpm 으로 5 분간 원심분리하여 회수한다. 수득한 펠릿을 80% (v/v) 에탄올로 세정하고 감압하 건조시킨다. 건조된 DNA 를 재증류수 7 ㎕ 에 용해시키고 서열결정용 주형으로서 사용한다.
뉴클레오티드 서열결정 반응은 7-Deaza-Sequenase kit, Version 2.0, dCTP 용 Kit [아메르샴사제] 를 이용하여 실행한다. 플라스미드 용액 전부 ( 7㎕) 를 프라이머 1pmol 및 반응버퍼 1㎕(키트내 제공) 에 첨가한다. 혼합물을 65℃ 에서 2 분간 보온한다. 플라스미드 DNA 를 혼합물을 실온으로 서서히 냉각시켜 프라이머와 어닐링시킨다. DNA 라벨링 반응은 키트내 제공된 프로토콜에 따라, [α32P]dCTP[아메르샴사제] 를 이용하여 실행한다. 반응 산물은 TBE 버퍼[100mM Tris, 100mM 붕산, 1mM EDTA, pH8.3]내 8M 우레아를 함유하는 5%(w/v) 폴리아크릴아미드겔상에서 겔 전기영동으로 분석한다. 겔을 건조시키고, DNA 서열은 방사선사진으로 동정한다.
플라스미드 pHkKY2-58 의 DNA 삽입체의 서열은 SEQ ID No. 77 에 나타내었다. 이 뉴클레오티드는 SEQ ID No.78 에 정의된 서열을 갖는 폴리펩티드사슬을 코딩하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 포함한다.
플라스미드 pHkKF2-19 의 DNA 삽입체의 서열은 SEQ ID No. 79 에 나타내었다. 이 뉴클레오티드는 SEQ ID No.80 에 정의된 서열을 갖는 폴리펩티드사슬을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다.
플라스미드 pHkRY2-10 의 DNA 삽입체의 서열은 SEQ ID No. 81 에 나타내었다. 이 뉴클레오티드는 SEQ ID No.82 에 정의된 서열을 갖는 폴리펩티드사슬을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다.
플라스미드 pHkKF2-52 의 DNA 삽입체의 서열은 SEQ ID No. 83 에 나타내었다. 이 뉴클레오티드는 SEQ ID No.84 에 정의된 서열을 갖는 폴리펩티드사슬을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다.
실시예 6
CH11 H 사슬의 인간화를 위한 발현벡터의 구축
1) 프라이머의 제조
하기의 DNA 단편을 PCR 을 이용하여 합성한다:
인간화 항-인간 Fas 항체 CH11 의 H 사슬인, HμH 사슬의 폴리펩티드사슬 (SEQ ID No.86) 코딩용 DNA (SEQ ID No.85); 및
인간화 항-인간 Fas 항체 CH11 의 H 사슬인, HμM 사슬의 폴리펩티드사슬 (SEQ ID No.88) 코딩용 DNA (SEQ ID No.87).
24 개의 프라이머를 하기와 같이 PCR 을 위해 합성한다:
VH1P; (SEQ ID No. 156);
VHSP; (SEQ ID No. 157);
VHSN; (SEQ ID No. 158).
VH2P; (SEQ ID No. 159);
VH2N; (SEQ ED No. 160);
VH3P; (SEQ ID No. 161);
VH3N; (SEQ ID No. 162);
VH4P; (SEQ ID No. 163);
VH4N; (SEQ ID No. 164);
VHAPAPX; (SEQ ID No. 165);
VHAPAN; (SEQ ID No. 166);
VHTERM; (SEQ ID No. 167);
HUMFR2P; (SEQ ID No. 168);
HUMFR2N; (SEQ ID No. 169);
MOUFR2P; (SEQ ID No. 170);
MOUFR2; (SEQ ID No. 171);
GTOSP; (SEQ ID No. 172);
GTOSN; (SEQ ID No. 173);
TCVVAP; (SEQ ID No. 174);
TCVVN1; (SEQ ID No. 175);
ME18P; (SEQ ID No. 176); 및
VH06; (SEQ ID No. 178).
2) 플라스미드 pMEC22 의 구축
다단계공정으로 인간화 CH11 사슬을 위한 발현 벡터를 구축한다. 처음에, 인간 IgM 의 H 사슬의 불변부의 카르복실 말단를 (이후, C-말단으로 칭함)를 포함하는 벡터를 구축한다.
MEC
인간 IgM 의 H 사슬의 C-말단 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 단편을 제조한다. 이 단편을 이후로 MEC DNA단편 으로 칭한다. 구축은 도 12 에 개략하였다. PCR 반응 조건은 하기와 같다:
반응용액의 조성:
플라스미드 pHH1-5 DNA, 1㎍;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VHAPAPX, 80 pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VHTERM, 80 pmol;
dNTPs 칵테일, 20㎕;
10 x Pfu 버퍼, 20㎕;
Pfu DNA 폴리머라아제 [스트라타겐사제], 10 단위.
구체적으로는, 반응 용액은 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 하기의 열주기를 이용하여 가열한다: 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기를 30 회 반복한다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 10 분간 보온한다.
이러한 방식으로 PCR 로 증폭한 MEC DNA 단편을 페놀로 추출한다. 이어서 DNA 를 100% 에탄올을 이용하여 침전시킨다. DNA (20-30㎍) 를 5%(w/v) 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동시킨다. 겔을 에티듐 브로마이드 1㎍/ml 으로 염색하여, DNA 단편이 UV 조사시 볼수 있도록한다. 이런 방식으로 검출된 DNA 단편을 면도날로 겔로부터 절단하고 Centricon 10 [아미콘사제] 가 장착된 Centriruter [아미콘사제] 를 이용하여 아크릴아미드 겔로부터 전기용출시킨다. 용출된 DNA 를 7,500 x g 에서 약 1시간동안 원심분리하여 농축시키고, 이어서 에탄올 침전시킨다. 각각의 경우에서 최종 DNA 를 증류수 50㎕ 에서 용해시킨다.
MEC DNA 단편을 운반하는 플라스미드의 구축을 도 13 에 개략하였다.
추가로 이러한 방식으로 수득한 MEC DNA 를 페놀 추출로 정제하고 , 이어서 에탄올침전시킨다. 이어서 이 DNA 의 일부 (약 1㎍) 를 제한효소 Xho1 및 Xba1 으로 소화시킨다.
또한 플라스미드 pME18S DNA 의 일부 (1㎍) [Hara, T. and Miyajima,A. 상기] 를 제한효소 Xho1 및 Xba1 로 소화시킨다. 생성된 DNA 는 CIP 로 처리한다. 탈인산화된 pME18S 플라스미드 DNA 의 일부 (100ng) 를 Xba1, Xho1 로 소화된 MEC 단편의 0.5㎍ 에 접합시킨다. 접합은 접합 키트[다까라 슈조사제] 를 이용하여 실행하고, 리겐이션 산물은 전기천공으로 대장균 JM109주[다께라 슈조사제]로 형질전환시킨다.
형질전환 콜로니에 함유된 플라스미드 DNA 의 제한효소 분석을 실행하여 목적 DNA 삽입체를 함유하는 플라스미드를 동정한다. 플라스미드 pMEC22 가 수득되며, 여기에서 MEC DNA 는 면역글로불린 단백질 산물의 발현을 위한 정배향으로 pME18S 내 SRα 프로모터의 하류에 삽입되어 있다.
3) 플라스미드 pMEHC20 의 구축
a) 제 1 단계 PCR
제 1 단계 PCR 의 개관을 도 14 에 나타내었다.
HSEC
분비 시그널 서열 및 FRN1 영역의 N-말단을 코딩하는 DNA 단편을 제조한다. 이후 이 단편은 HSEC DNA 단편으로 칭한다. 하기 PCR 반응 조건을 사용한다:
반응 용액의 조성:
플라스미드 pCR3-H123 DNA, 1㎍;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VHSN, 80 pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VH1P, 80 pmol;
25mM dNTPs 칵테일, 20㎕;
10 x Pfu 버퍼, 20㎕;
Pfu DNA 폴리머라아제 [스트라타겐사제], 10 단위.
구체적으로는, 반응 용액은 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 하기의 열주기를 이용하여 가열한다: 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기를 30 회 반복한다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 10 분간 보온한다.
VH1
FRH1영역 및 CDRH1영역의 N-말단을 코딩하는 DNA 단편을 제조한다. 이후 이 단편은 VH1 DNA 단편으로 칭한다. 하기 PCR 반응 조건을 사용한다:
반응 용액의 조성:
플라스미드 pHH1-5 DNA, 1㎍;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VHSP, 80 pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VH2N, 80 pmol;
25mM dNTPs 칵테일, 20㎕;
10 x Pfu 버퍼, 20㎕;
Pfu DNA 폴리머라아제 [스트라타겐사제], 10 단위.
구체적으로는, 반응 용액은 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 하기의 열주기를 이용하여 가열한다: 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기를 30 회 반복한다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 10 분간 보온한다.
VH2
CDRH1영역, FRH2영역의 C-말단 및 CDRH2영역의 N-말단을 코딩하는 DNA 단편을 제조한다. 이후 이 단편은 VH2 DNA 단편 이라 칭한다. 하기의 PCR 반응 조건을 사용한다:
반응 용액의 조성:
플라스미드 pCR3-H23 DNA, 1㎍;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VH2P, 80 pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VH3N, 80 pmol;
25mM dNTPs 칵테일, 20㎕;
10 x Pfu 버퍼, 20㎕;
Pfu DNA 폴리머라아제 [스트라타겐사제], 10 단위.
구체적으로는, 반응 용액은 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 하기의 열주기를 이용하여 가열한다: 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기를 30 회 반복한다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 10 분간 보온한다.
VH3
CDRH2영역의 N-말단, FRH3영역 및 CDRH3영역을 코딩하는 DNA 단편을 제조한다. 이후 이 단편은 VH3 DNA 단편 이라 칭한다. 하기의 PCR 반응 조건을 사용한다:
반응 용액의 조성:
플라스미드 pHH1-5 DNA, 1㎍;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VH3P, 80 pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VH4N, 80 pmol;
25mM dNTPs 칵테일, 20㎕;
10 x Pfu 버퍼, 20㎕;
Pfu DNA 폴리머라아제 [스트라타겐사제], 10 단위.
구체적으로는, 반응 용액은 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 하기의 열주기를 이용하여 가열한다: 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기를 30 회 반복한다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 10 분간 보온한다.
VH4
CDR-3 영역, FR-4 영역 및 H 사슬의 불변부의 N-말단을 코딩하는 DNA 단편을 제조한다. 이후 이 단편은 VH4 DNA 단편 이라 칭한다. 하기의 PCR 반응 조건을 사용한다:
반응 용액의 조성:
플라스미드 pHH1-5 DNA, 1㎍;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VH4P, 80 pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VHAPAN, 80 pmol;
25mM dNTPs 칵테일, 20㎕;
10 x Pfu 버퍼, 20㎕;
Pfu DNA 폴리머라아제 [스트라타겐사제], 10 단위.
구체적으로는, 반응 용액은 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 하기의 열주기를 이용하여 가열한다: 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기를 30 회 반복한다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 10 분간 보온한다.
이러한 방식으로 PCR 로 증폭한 HSEC, VH1, VH2, VH3 및 VH4 DNA 단편을 페놀로 추출한다. 이어서 DNA 를 100% 에탄올을 이용하여 침전시킨다. DNA (20-30㎍) 를 5%(w/v) 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동시킨다. 겔을 에티듐 브로마이드 1㎍/ml 으로 염색하여, DNA 단편이 UV 조사시 볼수 있도록한다. 이런 방식으로 검출된 DNA 단편을 면도날로 겔로부터 절단하고 Centricon 10 [아미콘사제] 가 장착된 Centriruter [아미콘사제] 를 이용하여 아크릴아미드 겔로부터 전기용출시킨다. 용출된 DNA 를 7,500 x g 에서 약 1시간동안 원심분리하여 농축시키고, 이어서 에탄올 침전시킨다. 각각의 경우에서 최종 DNA 를 증류수 50㎕ 에서 용해시킨다.
b) 제 2 단계 PCR
제 2 단계 PCR 을 도 15 에 개략하였다.
VHS12
전술한 HSEC, VH1 및 VH2 DNA 단편의 융합물을 PCR 을 이용하여 제조한다. 이후 이 단편은 VHS12 DNA 단편 이라 칭한다. 하기의 PCR 반응 조건을 사용한다:
반응 용액의 조성:
제 1 단계 PCR 에서 제조한 HSEC DNA 용액, 10㎕;
제 1 단계 PCR 에서 제조한 VH1 DNA 용액, 10㎕;
제 1 단계 PCR 에서 제조한 VH2 DNA 용액, 10㎕;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VH1P, 80 pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VH3N, 80 pmol;
25mM dNTPs 칵테일, 20㎕;
10 x Pfu 버퍼, 20㎕;
Pfu DNA 폴리머라아제 [스트라타겐사제], 10 단위.
구체적으로는, 반응 용액은 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 하기의 열주기를 이용하여 가열한다: 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기를 30 회 반복한다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 10 분간 보온한다.
VH34
전술한 VH3 DNA 단편 및 VH4 DNA 단편의 융합물을 PCR 을 이용하여 제조한다. 이후 이 단편은 VH34 DNA 단편 이라 칭한다. 하기의 PCR 반응 조건을 사용한다:
반응 용액의 조성:
제 1 단계 PCR 에서 제조한 VH3 DNA 용액, 10㎕;
제 1 단계 PCR 에서 제조한 VH4 DNA 용액, 10㎕;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VH3P, 80 pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VHAPAN, 80 pmol;
25mM dNTPs 칵테일, 20㎕;
10 x Pfu 버퍼, 20㎕;
Pfu DNA 폴리머라아제 [스트라타겐사제], 10 단위.
구체적으로는, 반응 용액은 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 하기의 열주기를 이용하여 가열한다: 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기를 30 회 반복한다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 10 분간 보온한다.
생성된 VHS12 및 VH34 DNA 단편을 페놀로 추출한다. 이어서 DNA 를 100% 에탄올을 이용하여 침전시킨다. DNA (20-30㎍) 를 5%(w/v) 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동시킨다. 겔을 에티듐 브로마이드 1㎍/ml 으로 염색하여, DNA 단편이 UV 조사시 볼수 있도록한다. 이런 방식으로 검출된 DNA 단편을 면도날로 겔로부터 절단하고 Centricon 10 [아미콘사제] 가 장착된 Centriruter [아미콘사제] 를 이용하여 아크릴아미드 겔로부터 전기용출시킨다. 용출된 DNA 를 7,500 x g 에서 약 1시간동안 원심분리하여 농축시키고, 이어서 에탄올 침전시킨다. 각각의 경우에서 최종 DNA 를 증류수 50㎕ 에서 용해시킨다.
b) 제 3 단계 PCR
제 3 단계 PCR 을 도 16 에 개략하였다.
VHS 1234
전술한 VHS12 DNA 단편 및 VH34 DNA 단편의 융합물을 PCR 을 이용하여 제조한다. 이후 이 단편은 VHS1234 DNA 단편 이라 칭한다. 하기의 PCR 반응 조건을 사용한다:
반응 용액의 조성:
제 2 단계 PCR 에서 제조한 VHS12 DNA 용액, 10㎕;
제 2 단계 PCR 에서 제조한 VH34 DNA 용액, 10㎕;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VH1P, 80 pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VHAPAN, 80 pmol;
25mM dNTPs 칵테일, 20㎕;
10 x Pfu 버퍼, 20㎕;
Pfu DNA 폴리머라아제 [스트라타겐사제], 10 단위.
구체적으로는, 반응 용액은 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 하기의 열주기를 이용하여 가열한다: 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기를 30 회 반복한다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 10 분간 보온한다.
생성된 VHS1234 DNA 단편을 페놀로 추출한다. 이어서 DNA 를 100% 에탄올을 이용하여 침전시킨다. DNA (20-30㎍) 를 5%(w/v) 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동시킨다. 겔을 에티듐 브로마이드 1㎍/ml 으로 염색하여, DNA 단편이 UV 조사시 볼수 있도록한다. 이런 방식으로 검출된 DNA 단편을 면도날로 겔로부터 절단하고 Centricon 10 [아미콘사제] 가 장착된 Centriruter [아미콘사제] 를 이용하여 아크릴아미드 겔로부터 전기용출시킨다. 용출된 DNA 를 7,500 x g 에서 약 1시간동안 원심분리하여 농축시키고, 이어서 에탄올 침전시킨다. 각각의 경우에서 최종 DNA 를 증류수 50㎕ 에서 용해시킨다.
VHS1234 DNA 를 운반하는 플라스미드의 구축은 도 17 에 개략하였다.
이런 방식으로 수득한 VHS1234 DNA 를 추가로 페놀추출로 정제한후 에탄올 침전시킨다. 이어서 DNA 를 제한효소 Xho1 및 Apa1 로 소화시킨다.
또한 플라스미드 pMEC22 DNA 의 일부(1㎍) 을 제한효소 Xho1 및 Apa1 로 소화시키고, 이어서 CIP 로 탈인산화시킨다. 탈인산화 pMEC22 플라스미드DNA (100ng) 의 일부를 Xho1-Apa1 소화된 VHS1234 DNA 단편 0.5 ㎍ 에 접합시킨다. 접합은 접합 키트 [다까라 슈조사제] 를 이용하여 실행하고 접합 산물은 대장균 JM109주[다까라 슈조사제] 로 형질전환시킨다.
형질전환 콜로니에 함유된 플라스미드 DNA 의 제한효소 분석을 실행하여 목적 DNA 삽입체를 함유하는 플라스미드를 동정한다. 플라스미드 pMEHC20 이 수득되며, 이에는 VHS1234 DNA 단편이 함유되어있다. 이 단편은 면역글로불린 단백질 산물의 발현을 위한 정배향으로 pMHC22 내 SRα 프로모터의 하류에 삽입되어 있다.
4) 플라스미드 pHFR3 및 플라스미드 pHFR4 의 구축
a) 제 1 단계 PCR
제 1 단계 PCR 의 개요는 도 18 에 나타내었다.
HUMFR5'
분비 시그널 서열, FRH1영역, CDRH1영역 및 FRH2영역 (위치 38 내지 44 의 아미노산잔기는 아르기닌, 글루타민, 알라닌, 프롤린, 글리신, 글루타민 및 글리신 잔기로 치환된다) 을 코딩하는 DNA 단편을 제조한다. 이후 이 단편은 HUMFR5' DNA 단편 으로 칭한다. PCR 반응 조건은 하기와 같다:
반응용액의 조성:
플라스미드 pMEHC20 DNA, 1㎍;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VH1P, 80 pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 HUMFR2N, 80 pmol;
25 mM dNTPs 칵테일, 20㎕;
10 x Pfu 버퍼, 20㎕;
Pfu DNA 폴리머라아제 [스트라타겐사제], 10 단위.
구체적으로는, 반응 용액은 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 하기의 열주기를 이용하여 가열한다: 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기를 30 회 반복한다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 10 분간 보온한다.
HUMFR3'
FRH2영역 (위치 38 내지 44 의 아미노산잔기는 아르기닌, 글루타민, 알라닌, 프롤린, 글리신, 글루타민 및 글리신 잔기로 치환된다), CDRH2영역, FRH3영역, CDRH3영역, FRH4영역 및 H사슬의 불변부의 N-말단을 코딩하는 DNA 단편을 제조한다. 이후 이 단편은 HUMFR3' DNA 단편 으로 칭한다. PCR 반응 조건은 하기와 같다:
반응용액의 조성:
플라스미드 pMEHC20 DNA, 1㎍;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VH06, 80 pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 HUMFR2P, 80 pmol;
25 mM dNTPs 칵테일, 20㎕;
10 x Pfu 버퍼, 20㎕;
Pfu DNA 폴리머라아제 [스트라타겐사제], 10 단위.
구체적으로는, 반응 용액은 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 하기의 열주기를 이용하여 가열한다: 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기를 30 회 반복한다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 10 분간 보온한다.
MOUFR5'
분비 시그널 서열, FRH1영역, CDRH1영역 및 FRH2영역 (위치 38 내지 44 의 아미노산잔기는 라이신, 글루타민, 알라닌, 히스티딘, 글리신, 라이신 및 세린으로 치환된다) 을 코딩하는 DNA 단편을 제조한다. 이후 이 단편은 HOUFR5' DNA 단편 으로 칭한다. PCR 반응 조건은 하기와 같다:
반응용액의 조성:
플라스미드 pMEHC20 DNA, 1㎍;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VH1P, 80 pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 H0UFR2N, 80 pmol;
25 mM dNTPs 칵테일, 20㎕;
10 x Pfu 버퍼, 20㎕;
Pfu DNA 폴리머라아제 [스트라타겐사제], 10 단위.
구체적으로는, 반응 용액은 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 하기의 열주기를 이용하여 가열한다: 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기를 30 회 반복한다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 10 분간 보온한다.
MOUFR3'
FRH2영역 (위치 38 내지 44 의 아미노산잔기는 라이신, 글루타민, 알라닌, 히스티딘, 글리신, 라이신 및 세린 잔기로 치환된다), CDRH2영역, FRH3영역, CDRH3영역, FRH4영역 및 H사슬의 불변부의 N-말단을 코딩하는 DNA 단편을 제조한다. 이후 이 단편은 H0UFR3' DNA 단편 으로 칭한다. PCR 반응 조건은 하기와 같다:
반응용액의 조성:
플라스미드 pMEHC20 DNA, 1㎍;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VH06, 80 pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 M0UFR2P, 80 pmol;
25 mM dNTPs 칵테일, 20㎕;
10 x Pfu 버퍼, 20㎕;
Pfu DNA 폴리머라아제 [스트라타겐사제], 10 단위.
구체적으로는, 반응 용액은 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 하기의 열주기를 이용하여 가열한다: 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기를 30 회 반복한다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 10 분간 보온한다.
생성된 HUMFR5', HUMFR3', MOUFR5' 및 MOUFR3' DNA 단편을 페놀로 추출한다. 이어서 DNA 를 100% 에탄올을 이용하여 침전시킨다. DNA (20-30㎍) 를 5%(w/v) 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동시킨다. 겔을 에티듐 브로마이드 1㎍/ml 으로 염색하여, DNA 단편이 UV 조사시 볼수 있도록한다. 이런 방식으로 검출된 DNA 단편을 면도날로 겔로부터 절단하고 Centricon 10 [아미콘사제] 가 장착된 Centriruter [아미콘사제] 를 이용하여 아크릴아미드 겔로부터 전기용출시킨다. 용출된 DNA 를 7,500 x g 에서 약 1시간동안 원심분리하여 농축시키고, 이어서 에탄올 침전시킨다. 각각의 경우에서 최종 DNA 를 증류수 50㎕ 에서 용해시킨다.
b) 제 2 단계 PCR
제 2 단계 PCR 을 도 19 에 개략하였다.
HUMFR2
전술한 HUMFR5' 및 HUMFR3'DNA 단편의 융합물을 PCR 을 이용하여 제조한다. 이후 이 단편은 HUMFR2 DNA 단편 이라 칭한다. 하기의 PCR 반응 조건을 사용한다:
반응 용액의 조성:
제 1 단계 PCR 에서 제조한 HUMFR5' DNA, 10㎕;
제 1 단계 PCR 에서 제조한 HUMFR3' DNA, 10㎕;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VH1P, 80 pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VH06, 80 pmol;
25mM dNTPs 칵테일, 20㎕;
10 x Pfu 버퍼, 20㎕;
Pfu DNA 폴리머라아제 [스트라타겐사제], 10 단위.
구체적으로는, 반응 용액은 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 하기의 열주기를 이용하여 가열한다: 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기를 30 회 반복한다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 10 분간 보온한다.
MOUFR2
전술한 MOUFR5' 및 MOUFR3'DNA 단편의 융합물을 PCR 을 이용하여 제조한다. 이후 이 단편은 MOUFR2 DNA 단편 이라 칭한다. 하기의 PCR 반응 조건을 사용한다:
반응 용액의 조성:
제 1 단계 PCR 에서 제조한 MOUFR5' DNA 용액, 10㎕;
제 1 단계 PCR 에서 제조한 MOUFR3' DNA 용액, 10㎕;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VH1P, 80 pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VH06, 80 pmol;
25mM dNTPs 칵테일, 20㎕;
10 x Pfu 버퍼, 20㎕;
Pfu DNA 폴리머라아제 [스트라타겐사제], 10 단위.
구체적으로는, 반응 용액은 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 하기의 열주기를 이용하여 가열한다: 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기를 30 회 반복한다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 10 분간 보온한다.
HUMFR2 및 MOUFR2 DNA 단편을 페놀로 추출한다. 이어서 DNA 를 에탄올을 이용하여 침전시킨다. DNA (20-30㎍) 를 5%(w/v) 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동시킨다. 겔을 에티듐 브로마이드 1㎍/ml 으로 염색하여, DNA 단편이 UV 조사시 볼수 있도록한다. 이런 방식으로 검출된 DNA 단편을 면도날로 겔로부터 절단하고 Centricon 10 [아미콘사제] 가 장착된 Centriruter [아미콘사제] 를 이용하여 아크릴아미드 겔로부터 전기용출시킨다. 용출된 DNA 를 7,500 x g 에서 약 1시간동안 원심분리하여 농축시키고, 이어서 에탄올 침전시킨다. 각각의 경우에서 최종 DNA 를 증류수 50㎕ 에서 용해시킨다.
HUMFR2 DNA 단편 및 MOUFR2 DNA 단편을 운반하는 플라스미드의 구축은 도 20 에 개략하였다.
이런 방식으로 수득한 HUMFR2 및 MOUFR2 DNA 단편을 페놀추출로 추가정제한후 에탄올 침전시킨다. 이어서 DNA 를 제한효소 Xho1 및 Bg1II 로 소화시킨다.
또한 플라스미드 pMEHC20 DNA 의 일부(1㎍) 을 제한효소 Xho1 및 Bg1II 로 소화시키고, 이어서 CIP 로 탈인산화시킨다. 탈인산화 플라스미드 pMEHC20 의 일부 (100ng)를 Xho1 및 Bg1II 소화된 HUMFR2 또는 MOUFR2 DNA 단편의 각각의 0.5 ㎍ 에 접합시킨다. 접합은 접합 키트 [다까라 슈조사제] 를 이용하여 실행하고 접합 산물은 대장균 JM109주[다까라 슈조사제] 로 형질전환시킨다.
형질전환 콜로니에 함유된 플라스미드 DNA 의 제한효소 분석을 실행하여 목적 DNA 삽입체를 함유하는 플라스미드를 동정한다. HUMFR2 DNA 단편을 함유하는 플라스미드 pHFR3 및 MOUFR2 DNA 단편을 함유하는 플라스미드 pHFR4 를 수득하였다
5) 플라스미드 pMECW5 의 구축
PCR 반응용 주형으로서 플라스미드 pMEC22 유래의 DNA 를 이용하여 PCR 로 플라스미드 pMECW5 를 구축한다.
PCR 공정을 도 21 에 개략하였다.
a) 제 1 단계 PCR
HHC1
플라스미드 pMEC22의 DNA 삽입체의 5'-말단 영역을 나타내는 DNA 단편을 제조한다. 이후 이 단편은 HHC1 DNA 단편 으로 칭한다. PCR 반응 조건은 하기와 같다:
반응용액의 조성:
플라스미드 pMEC22 DNA, 1㎍;
올리고뉴클레오티드 프라이머 ME18P, 80 pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 GTOSN, 80 pmol;
25 mM dNTPs 칵테일, 20㎕;
10 x Pfu 버퍼, 20㎕;
Pfu DNA 폴리머라아제 [스트라타겐사제], 10 단위.
구체적으로는, 반응 용액은 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 하기의 열주기를 이용하여 가열한다: 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기를 30 회 반복한다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 10 분간 보온한다.
HHC2
플라스미드 pMEC22의 DNA 삽입체의 내부영역에 대응하는 DNA 단편을 제조한다. 이후 이 단편은 HHC2 DNA 단편 으로 칭한다. PCR 반응 조건은 하기와 같다:
반응용액의 조성:
플라스미드 pMEC22 DNA, 1㎍;
올리고뉴클레오티드 프라이머 GTOSP, 80 pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 TCVVN1, 80 pmol;
25 mM dNTPs 칵테일, 20㎕;
10 x Pfu 버퍼, 20㎕;
Pfu DNA 폴리머라아제 [스트라타겐사제], 10 단위.
구체적으로는, 반응 용액은 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 하기의 열주기를 이용하여 가열한다: 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기를 30 회 반복한다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 10 분간 보온한다.
HHC3
플라스미드 pMEC22의 DNA 삽입체의 3'-말단 영역을 나타내는 DNA 단편을 제조한다. 이후 이 단편은 HHC3 DNA 단편 으로 칭한다. PCR 반응 조건은 하기와 같다:
반응용액의 조성:
플라스미드 pMEC22 DNA, 1㎍;
올리고뉴클레오티드 프라이머 TCVVAP, 80 pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VHTERM, 80 pmol;
25 mM dNTPs 칵테일, 20㎕;
10 x Pfu 버퍼, 20㎕;
Pfu DNA 폴리머라아제 [스트라타겐사제], 10 단위.
구체적으로는, 반응 용액은 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 하기의 열주기를 이용하여 가열한다: 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기를 30 회 반복한다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 10 분간 보온한다.
이렇게 수득한 HHC1, HHC2 및 HHC3 DNA 단편을 페놀로 추출한다. 이어서 DNA 를 100% 에탄올을 이용하여 침전시킨다. DNA (20-30㎍) 를 5%(w/v) 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동시킨다. 겔을 에티듐 브로마이드 1㎍/ml 으로 염색하여, DNA 단편이 UV 조사시 볼수 있도록한다. 이런 방식으로 검출된 DNA 단편을 면도날로 겔로부터 절단하고 Centricon 10 [아미콘사제] 가 장착된 Centriruter [아미콘사제] 를 이용하여 아크릴아미드 겔로부터 전기용출시킨다. 용출된 DNA 를 7,500 x g 에서 약 1시간동안 원심분리하여 농축시키고, 이어서 에탄올 침전시킨다. 각각의 경우에서 최종 DNA 를 증류수 50㎕ 에서 용해시킨다.
b) 제 2 단계 PCR
제 2 단계 PCR 은 도 22 에 개략하였다.
HHC1-2
HHC1 DNA 단편 및 HHC2 DNA 단편의 융합물을 PCR 을 이용하여 제조한다. 이후 이 DNA 단편은 HHC1-2 DNA 단편으로 칭한다. PCR 반응 조건은 하기와 같다:
반응용액의 조성:
제 1 단계 PCR 에서 제조한 HHC1 DNA 용액, 10㎕;
제 1 단계 PCR 에서 제조한 HHC2 DNA 용액, 10㎕;
올리고뉴클레오티드 프라이머 ME18P, 80 pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 TCVVN, 80 pmol;
25 mM dNTPs 칵테일, 20㎕;
10 x Pfu 버퍼, 20㎕;
Pfu DNA 폴리머라아제 [스트라타겐사제], 10 단위.
구체적으로는, 반응 용액은 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 하기의 열주기를 이용하여 가열한다: 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기를 30 회 반복한다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 10 분간 보온한다.
이렇게 수득한 HHC1-2 단편을 페놀로 추출한다. 이어서 DNA 를 에탄올을 이용하여 침전시킨다. DNA (20-30㎍) 를 5%(w/v) 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동시킨다. 겔을 에티듐 브로마이드 1㎍/ml 으로 염색하여, DNA 단편이 UV 조사시 볼수 있도록한다. 이런 방식으로 검출된 DNA 단편을 면도날로 겔로부터 절단하고 Centricon 10 [아미콘사제] 가 장착된 Centriruter [아미콘사제] 를 이용하여 아크릴아미드 겔로부터 전기용출시킨다. 용출된 DNA 를 7,500 x g 에서 약 1시간동안 원심분리하여 농축시키고, 이어서 에탄올 침전시킨다. 각각의 경우에서 최종 DNA 를 증류수 50㎕ 에서 용해시킨다.
c) 제 3 단계 PCR
제 3 단계 PCR 은 도 23 에 개략하였다.
HHC123
전술한 HHC1-2 및 HHC3 DNA 단편의 융합물을 PCR 을 이용하여 제조한다. 이후 이 DNA 단편은 HHC123 DNA 단편 으로 칭한다. PCR 반응 조건은 하기와 같다:
반응용액의 조성:
제 1 단계 PCR 에서 제조한 HHC3 DNA 용액, 10㎕;
제 2 단계 PCR 에서 제조한 HHC1-2 DNA 용액, 10㎕;
올리고뉴클레오티드 프라이머 ME18P, 80 pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 VHTERM, 80 pmol;
25 mM dNTPs 칵테일, 20㎕;
10 x Pfu 버퍼, 20㎕;
Pfu DNA 폴리머라아제 [스트라타겐사제], 10 단위.
구체적으로는, 반응 용액은 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 하기의 열주기를 이용하여 가열한다: 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기를 30 회 반복한다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 10 분간 보온한다.
이렇게 수득한 HHC1-2 단편을 페놀로 추출한다. 이어서 DNA 를 100% 에탄올을 이용하여 침전시킨다. DNA (20-30㎍) 를 5%(w/v) 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동시킨다. 겔을 에티듐 브로마이드 1㎍/ml 으로 염색하여, DNA 단편이 UV 조사시 볼수 있도록한다. 이런 방식으로 검출된 DNA 단편을 면도날로 겔로부터 절단하고 Centricon 10 [아미콘사제] 가 장착된 Centriruter [아미콘사제] 를 이용하여 아크릴아미드 겔로부터 전기용출시킨다. 용출된 DNA 를 7,500 x g 에서 약 1시간동안 원심분리하여 농축시키고, 이어서 에탄올 침전시킨다. 각각의 경우에서 최종 DNA 를 증류수 50㎕ 에서 용해시킨다.
HHC123 DNA 를 운반하는 플라스미드의 구축은 도 24 에 개략하였다.
이런 방식으로 수득한 HHC123 DNA을 추가로 페놀추출로 정제한후 에탄올 침전시킨다. 이어서 DNA 를 제한효소 Xho1 및 Xba1 로 소화시킨다.
또한 플라스미드 pME18S DNA [Hara,T. and Miyajima,A., 상기] 의 일부(1㎍) 을 제한효소 Xho1 및 Xba1 로 소화시키고, 이어서 CIP 로 탈인산화시킨다. 탈인산화 플라스미드 pME18S DNA 의 일부 (100ng)를 Xho1 및 Xba1 소화된 HHC 123 DNA 단편의 0.5 ㎍ 에 접합시킨다. 접합은 접합 키트 [다까라 슈조사제] 를 이용하여 실행하고 생성된 DNA 는 대장균 JM109주[다까라 슈조사제] 로 형질전환시킨다.
형질전환 콜로니에 함유된 플라스미드 DNA 의 제한효소 분석을 실행하여 목적 DNA 삽입체를 함유하는 플라스미드를 동정한다. HHC123 DNA 단편을 함유하는 플라스미드 pMECW 5 가 동정된다.
6) CH11 H 사슬의 인간화를 코딩하는 발현 플라스미드 pHμH5-1 및 플라스미드 pHμM1-1 의 구축
최종 발현 플라스미드 pHμH5-1 및 pHμM1-1 를 플라스미드 pHFR3 DNA, 플라스미드 pHFR4 DNA 및 플라스미드 pMECW5 DNA 로부터 유래한 DNA 를 합쳐 구축한다. 구축은 도 25 에 개략하였다.
HFR3 DNA 단편을 이하와 같이 제조한다. 플라스미드 pHFR3 DNA 의 일부 (30㎍) 를 제한효소 Apa1 및 Xho1 로 동시에 소화시킨다. 소화의 산물을 5%(w/v) 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동하여 분리시킨다. 겔을 에티듐 브로마이드 1㎍/ml 으로 염색하여, DNA 단편이 UV 조사시 볼수 있도록한다. 이런 방식으로 검출된 약 950bp 크기의 DNA 단편을 면도날로 겔로부터 절단하고 Centricon 10 [아미콘사제] 가 장착된 Centriruter [아미콘사제] 를 이용하여 아크릴아미드 겔로부터 전기용출시킨다.
HFR4 DNA 단편을 이하와 같이 제조한다. 플라스미드 pHFR3 DNA 의 일부 (30㎍) 를 제한효소 Apa1 및 Xho1 로 동시에 소화시킨다. 소화의 산물을 5%(w/v) 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리시킨다. 겔을 에티듐 브로마이드 1㎍/ml 으로 염색하여, DNA 단편이 UV 조사시 볼수 있도록한다. 이런 방식으로 검출된 약 950bp 크기의 당해 DNA 단편을 면도날로 겔로부터 절단하고 Centricon 10 [아미콘사제] 가 장착된 Centriruter [아미콘사제] 를 이용하여 아크릴아미드 겔로부터 전기용출시킨다.
또한 플라스미드 pMECW5 의 DNA 1㎍ 을 제한효소 Xho1 및 Apa1 로 소화시키고, 이어서 CIP 로 탈인산화시킨다. 탈인산화 플라스미드 pMECW5 DNA 의 일부(100ng)를 상기에서 제조한 HFR3 DNA 또는 HFR4 DNA 단편의 각각의 0.5㎍에 접합시킨다. 접합은 접합 키트 [다까라 슈조사제] 를 이용하여 실행하고 접합 산물은 대장균 DH5α 주로 형질전환시킨다.
형질전환 콜로니에 함유된 플라스미드 DNA 의 제한효소 분석을 실행하여 목적 DNA 삽입체를 함유하는 플라스미드를 동정한다. 플라스미드 pHμH5-1 는 HFR3 DNA 단편을 함유함이 동정되었다. 플라스미드 pHμMI-1 는 HFR4 DNA 단편을 함유함이 동정되었다.
7) 뉴클레오티드 서열의 확인
플라스미드 pHμH5-1 및 pHμMI-1 의 DNA 삽입체를 서열결정한다. 서열결정 공정에서 사용한 프라이머는 8 개의 새롭게 합성한 프라이머외에, 전술한 ME18P(SEQ ID No.176) 및 VH06 (SEQ ID No. 178) 이다. 이러한 새로운 합성 프라이머는 하기와 같다:
ME18RV; (SEQ ID No. 177);
VH05; (SEQ ID No. 179);
VH07; (SEQ ID No. 180);
VH08; (SEQ ID No. 181);
VH01; (SEQ ID No. 182);
VH02; (SEQ ID No. 183);
VH03; (SEQ ID No. 184); 및
VH04; (SEQ ID No. 185).
DNA 서열결정을 디데옥시뉴클레오티드 사슬 종결법 [Sanger,F.S.et al., 상기] 를 이용하여 실행한다. 서열결정전, 플라스미드 DNA 주형을 알칼리 SDS 용해로 숙주세포로부터 분리시키고 [Sambrook, J.et al., 상기] 염화세슘을 이용하여 DNA 를 정제한다[Sambrook, J.et al., 동일한책].
서열 분석으로 pHμH5-1 의 DNA 삽입체의 서열은 SEQ ID No.86 에 정의된 폴리펩티드를 코딩함이 확인된다. pHμM1-1의 DNA 삽입체의 서열은 SEQ ID No.88 에 정의된 폴리펩티드를 코딩한다.
실시예 7
COS-7 세포내 CH11의 인간화의 소단위를 코딩하는 유전자의 발현
상기에서 구축된 인간화 H 사슬 DNA 및 인간화 L 사슬 DNA 를 원숭이 신장으로부터 유래한 세포계통인 COS-7 세포계통에서 발현시킨다. 인간화 H 사슬 및 인간화 L 사슬을위한 발현 플라스미드는 유전자 트랜스펙션 장치 ECM600M(BTX) 를 이용하여 전기천공으로 COS-7 세포로 트랜스펙션시킨다.
COS-7 세포[American Type Culture Collection No. CRL-1651] 를 225cm2배양 플라스크 [스미또모 베이크라이트사제] 에서 배양한다. 세포를 10% 소태아 혈청 [CSL] 를 함유하는 둘베코변성 이글 최소 필수배지 (이후DMEM 로 칭함; 니수이 세이야꾸) 에서 세미컨플루언트(semi-confluent) 상태까지 증식시킨다. 배지를 제거하고 COS-7 세포를 37℃ 에서 3 분간 트립신-EDTA 용액 [시그마 케미컬사제] 로 처리한다. 세로를 800 rpm 으로 2 분간 원심분리하여 회수하고 이어서 포스페이트 버퍼 [0.02% (w/v) 염화칼륨 (KCl), 0.02 %(w/v) 포타슘 디히드로겐포스페이트 (KH2PO4), 0.8%(w/v) 염화나트륨 (NaCl), 1.15 %(w/v) 디소듐 히드로겐포스페이트 (Na2HPO4); 이후 PBS(-)버퍼 로 칭함; 니수이 세이야꾸] 로 2 회 세정한다. 세정된 COS-7 세포는 PBS(-)버퍼로 4x106세포/ml 의 밀도로 조정하여 COS-7 세포 현탁액을 제조한다.
마찬가지로, 플라스미드 DNA 를 플라스미드 Maxiprep kit [MaxiPrep DNA Purification Kit; 프로메가사제] 를 이용하여 H 사슬 발현 플라스미드 및 L 사슬 발현 플라스미드로부터 제조한다. 중사슬 발현 플라스미드 및 경사슬 발현 플라스미드 각각에서 유래한 일부(40㎍) 을 단일 튜브에서 혼합하고, 이어서 100% 에탄올로 침전시킨다. 중사슬 및 경사슬 DNA 혼합물의 조합은 후술하였다. DNA 는 PBS(-)버퍼 40㎕ 에 재현탁시킨다. 생성된 플라스미드 혼합물 (40㎕) 를 상기에서 제조한 COS-7 세포 현탁액 (2 x 106세포) 500㎕ 와 혼합한다.
혼합물을 전극간격 4mm [바이오래드사제] 의 전기천공 큐베트로 옮기고, 이어서 전기천공 장치에 적하한다. 이어서 전기천공을 이용하여 목적 플라스미드 DNA 를 COS-7 세포로 도입한다 (150V, 900㎌ 의 펄스). 전기천공후, 세포-DNA 혼합물을 10% 소태아 혈청를 함유하는 DMEM 20ml 에 재현탁시키고, 75cm2배양 플라스크 [스미또모 베이트라이트] 로 옮긴다. 세포를 37℃ 에서 24 시간동안 7.5% CO2하 배양한다. 배양 상층액을 제거하고 세포를 무혈청 DMEM 배지로 세정한다. 새로운 무혈청 DMEM 배지의 일정량(20ml) 를 가하고 세포를 37℃ 에서 24 시간동안 7.5% CO2하 배양한다. 이어서 상층액을 제거한다.
COS-7 세포를 상기 절차를 이용하여 하기 플라스미드 또는 플라스미드 배합물로 트랜스펙션시킨다. 상층액은 각각의 경우에서 회수한다.
(A): pME18S
(B): pHμM1-1 및 pHkKY2-58
(C): pHμM1-1 및 pHkKF2-19
(D): pHμM1-1 및 pHkRY2-1 0
(E): pHμM1-1 및 pHkRF2-52
(F): pHμH5-1 및 pHkKY2-58
(G): pHμH5-1 및 pHkKF2-19
(H): pHμH5-1 및 pHKkRY2-10
(I): pHμH5-1 및 pHkRF2-52
시험예 1
인간화 항-인간 Fas 항체의 검출
본 발명에 의해 생산된 인간화 항-인간 Fas 항체는 웨스턴 블로팅법으로 동정한다. 이 방법은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(이후 SDS-PAGE로 칭함) 으로 단백질을 분리시키고, 이어서 니트로셀룰로오스막으로 옮기는 것이다. 이어서 옮겨진 단백질은 항체와의 교차반응으로 동정될 수 있다.
1) SDS-PAGE 에 의한 분리
실시예 7 에서 수득한 배양 상층액의 일부 (1ml) 를 12,000 내지 14,000 달톤의 배타한계를 갖는 투석 튜브를 이용하여, 순수 5 l 에 대해 투석한다. 생성된용액을 원심분리-농축기 [CC-101; 토미 세이꼬사제] 를 이용하여 진공하 건조시킨다. 시료 버퍼 [2% (w/v) SDS(전기영동 등급; 바이오래드사제), 5% (v/v) β-머캅토에탄올 (시그마 케미칼사제), 10% (v/v) 글리세롤, 0.1% (w/v) 브로모페놀 블루] 의 일부 (10 ㎕) 를 가하고, 이어서 혼합물을 100℃ 에서 5 분간 가열하여 전기영동 시료를 제조한다. 수득한 전기영동 시료는 SDS-PAGE (4 내지 20% 농도구배 겔; 이와끼 글라스사제) 에 적하하고, 20mA, 정류, 실온에서 1 시간동안 시행한다.
2) 단백질의 전사 및 고정화
전기영동을 실행한후, 단백질은 반건조 블로팅법 [Towbin,H., et al., (1979), Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 76, 4350]을 이용하여 겔로부터 니트로셀룰로오스막으로 옮긴다 [Transblot Transfer Membrane; 바이오래드사제]. 사용하는 특정 장치 및 조건은 하기와 같다:
전사 버퍼: 20mM Tris, 150mM 글리신, 10% (v/v) 메탄올;
블로팅 장치: 이와끼사제 장치(TF03-050);
시행 조건: 4℃, 0.2A (정류), 1시간.
SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅을 동일한 조건하 두 번 실시하며, 그 결과 두 개의 동일한 니트로셀룰로오스막이 생긴다. 하나의 막은 H 사슬의 검출을 위하여 분석하고, 나머지는 L 사슬을 검출하기위하여 분석한다.
3) 항체 검출
웨스턴 전사후, 니트로셀룰로오스막을 3% (w/v) 젤라틴 [니뽄 바이오래드사제]를 함유하는 500mM 염화나트륨 [NaCl]과 20mM Tris-HCl(pH 7.5) 의 수용액(이후 TBS 로 칭함)에 침지시킨다. 막을 실온에서 1 시간동안 부드럽게 진탕시킨다 (이 절차를 이후 블로킹 으로 칭한다).
인간화 항체의 H 사슬의 검출은 퍼옥시다아제-표식 항 인간 IgM H사슬 항체 [Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5μ Fragment Specific; Jackson Immuno-research Laboratory] 를 이용하여 실행한다. 블록킹후, 니트로셀룰로오스 막을 블록킹 용액으로부터 제거하고 실온에서 4 시간동안 표식된 항인간 IgM H 사슬 항체를 5㎕ 함유하는 버퍼 10 ml (1%(w/v) 젤라틴을 함유하는 TBS 용액) 에서 진탕시킨다. 이어서 니트로셀룰로오스막을 제거하고 2%(v/v) Tween 20 [바이오래드사제] 를 함유하는 TBS 20ml 에 침지시킨후, 실온에서 20 분간 부드럽게 진탕시킨다. 이 세정을 반복한다. 이어서 세정된 니트로셀룰로오스 막을 종이타월로 블로트-건조시킨다.
막상에서 항체와 단백질사이의 교차반응성을 항체에 결합한 퍼옥시다아제 활성을 통해 검출한다.
막상의 잔류 퍼옥시다아제 활성은 ECL 웨스턴 블로팅 시스템[아메르샴사제] 를 이용하여 검출한다. 좀더 구체적으로는, 이런 시스템내 기질은 퍼옥시다아제의 촉매작용하 화학 반응동안 빛을 방출한다. 빛방출은 ECL Mini Camera [아메르샴사제] 및 즉석 필름[Type 667; 폴라로이드사제] 를 이용하여 검출할 수 있다. 겔내 남아있는 단백질은 은염색한다 [Oakley et al., (1980), Anal.Biochem, 105, 36 이하참조]. 찍은 사진은 은염색된 겔과 비교하여 항체에 특이적으로 결합한 단백질을 동정한다.
인간화 항체의 L 사슬의 검출은 퍼옥시다아제-표식 항-인간 IgM L사슬 항체 [Peroxidase-Labeled Monoclonal Antibody to Human Kappa Light Chain HP6156;Kilkeguard and Perry Laboratory] 를 이용하여 실행한다. 블록킹후, 니트로셀룰로오스 막은 블록킹 용액으로부터 제거하고 실온에서 4 시간동안 표식된 항인간 IgM L사슬 항체 10㎕ 을 함유하는 버퍼 10ml (1% (w/v) 젤라틴을 함유하는 TBS) 에서 진탕시킨다. 이어서 니트로셀룰로오스막을 제거하고 0.05%(v/v) Tween 20 를 함유하는 TBS 용액 20ml 에 침지시킨후, 실온에서 20 분간 부드럽게 진탕시킨다. 이 세정을 반복한다. 이어서 세정된 니트로셀룰로오스 막을 종이타월로 블로트-건조시킨다.
인간화 H 사슬의 검출과 같이, 항체와 반응하는 임의의 단백질은 ECL 웨스턴 블로팅 시스템[아메르샴사제] 를 이용하여 검출한다. 교차반응에는 빛의 발생이 뒤따르며, 사진필름으로 검출한다. 찍은 사진은 은염색된 겔과 비교하여 항체에 특이적으로 결합하는 단백질 밴드를 동정한다.
인간 H 사슬에 대해 특이적인 항체의 사용으로 하기에서 약 78,000 달톤의 밴드가 검출된다; 실시예 7 의 시료 (B),(C),(D),(E),(F),(G),(H) 및 (I). 이 시료들은 모두 pHμM1-1 또는 pHμH5-1 로 형질전환된 COS-7 세포로부터 유래한다.
인간 L 사슬에 대해 특이적인 항체의 사용으로 하기에서 약 25,000 달톤의 밴드가 검출된다; 실시예 7 의 시료 (B),(C),(D),(E),(F),(G),(H) 및 (I). 이 시료들은 모두 플라스미드 pHkKY2-58, 플라스미드 pHkKF2-19, 플라스미드 pHkRY2-10 또는 플라스미드 pHkRF2-52 로 형질전환된 COS-7 세포로부터 유래한다.
시험예 2
Fas 항원에 대한 항-Fas 항체의 결합활성의 측정
Fas 항원에 결합하는 본 발명의 인간화 항-Fas 항체의 능력은 ELISA 기술로 분석한다. 이 방법은 가용성 인간 Fas 융합 단백질을 제조하고, 이어서 가용성 단백질에 대한 항체의 결합을 검출분석하는 것이다.
1) 가용성 인간 Fas 항원 융합 단백질의 발현
가용성 인간 Fas 항원을 제조하기 위하여, 융합 단백질용 발현 벡터를 구축하며, 이는 인간 Fas 항원의 세포외 도메인 및 마우스 인터루킨-3 수용체의 세포외 도메인으로 구성된다. 이후 이 단백질은 인간 Fas 융합 단백질 로 칭한다.
인간 Fas 융합 단백질을 코딩하는 DNA 는 하기와 같이 PCR 로 제조한다;
a) 주형 DNA
두 개의 플라스미드로부터 유래한 플라스미드 DNA 를 PCR 반응에서 이용하여 인간 Fas 융합 단백질을 제조한다. 첫 번째 플라스미드는 마우스 Fas 항원 [Watanabe-Fukunaga,R., et al.,(1992),J.Immunol., 148, 1274 이하 참조] 및 마우스 인터루킨-3 수용체의 세포외 도메인 [Gorman,D., et al.,(1990),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,5459 이하참조, Hara,T. and Miyajima,A.,(1992), EMBO J, 11, 1875]의 융합 단백질을 코딩하는 pME 18S-mFas-AIC[Nishimura, Y.et al., (1995), J.Immunol., 154,4395] 이다.
b) 프라이머의 제조
4 개의 뉴클레오티드 프라이머를 PCR 을 위해 제조한다. 제조한 서열은 하기와 같다:
N1;(SEQ ID No.186);
C3N;(SEQ ID No.187);
N3N;(SEQ ID No.188); 및
CTN2;(SEQ ID No.189).
c) 제 1 단계 PCR
제 1 단계 PCR 의 개략을 도 26 에 나타내었다.
HFAS
인간 Fas 항원의 세포외 도메인을 코딩하는 DNA 의 단편을 제조한다. 이후 이 단편은 HFAS DNA 단편 으로 칭한다. PCR 공정을 하기의 조건하 LA PCR Kit [다까라 슈조사제] 를 이용하여 실행한다:
반응용액의 조성:
플라스미드 pCEV4 DNA, 20ng;
올리고뉴클레오티드 프라이머 N1, 0.5㎍;
올리고뉴클레오티드 프라이머 C3N, 0.5㎍;
dNTPmix, 25㎕;
10 x LA PCR 버퍼, 25㎕;
LA Taq 폴리머라아제 [다까라슈조사제], 12.5 단위.
용액의 최종부피를 재증류수로 250㎕ 로 만든다. dNTPmix, 10 x LA PCR 버퍼 및 LA Taq 폴리머라아제는 키트내 제공되어 있다.
구체적으로는, 반응 용액은 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 하기의 열주기를 이용하여 가열한다: 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기를 30 회 반복한다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 10 분간 보온한다.
MAIC
마우스 인터루킨-3 수용체의 세포외 도메인을 코딩하는 DNA 의 단편을 제조한다. 이후 이 단편은 MAIC DNA 단편 으로 칭한다. PCR 공정을 하기의 조건하 LA PCR Kit [다까라 슈조사제] 를 이용하여 실행한다:
반응용액의 조성:
플라스미드 pME18S-mFas-AIC DNA, 20ng;
올리고뉴클레오티드 프라이머 N3N, 0.5㎍;
올리고뉴클레오티드 프라이머 CTN2, 0.5㎍;
dNTPmix, 25㎕;
10 x LA PCR 버퍼, 25㎕;
LA Taq 폴리머라아제 [다까라슈조사제], 12.5 단위.
용액의 최종부피를 재증류수로 250㎕ 로 만든다. dNTPmix, 10 x LA PCR 버퍼 및 LA Taq 폴리머라아제는 키트내 제공되어 있다.
구체적으로는, 반응 용액은 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 하기의 열주기를 이용하여 가열한다: 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기를 30 회 반복한다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 10 분간 보온한다.
PCR 후 증폭된 HFAS DNA 및 MAIC DNA 단편을 페놀로 추출한다. 이어서 DNA 를 100% 에탄올을 이용하여 침전시킨다. DNA 단편 (20-30㎍) 를 5%(w/v) 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동시킨다. 겔을 에티듐 브로마이드 1㎍/ml 으로 염색하여, DNA 단편이 UV 조사시 볼수 있도록한다. 이런 방식으로 검출된 DNA 단편을 면도날로 겔로부터 절단하고 Centricon 10 [아미콘사제] 가 장착된 Centriruter [아미콘사제] 를 이용하여 아크릴아미드 겔로부터 전기용출시킨다. 용출된 DNA 를 7,500 x g 에서 약 1시간동안 원심분리하여 농축시키고, 이어서 에탄올 침전시킨다. 각각의 경우에서 최종 DNA 를 증류수 20㎕ 에서 용해시킨다.
d) 제 2 단계 PCR
제 2 단계 PCR 은 도 27 에 개략하였다.
FASAIC
인간 Fas 융합 단백질을 코딩하는 DNA 단편을 제조한다. 이후 이 단편은 FASAIC DNA 단편 으로 칭한다. 하기의 조건하 PCR 공정을 LA PCR Kit [다까라 슈조사제] 를 이용하여 실행한다:
반응용액의 조성:
제 1 단계 PCR 에서 제조한 HFAS DNA 용액, 20㎕;
제 1 단계 PCR 에서 제조한 MAIC DNA 용액, 20㎕;
올리고뉴클레오티드 프라이머 N1, O.5㎍;
올리고뉴클레오티드 프라이머 CTN2, 0.5㎍;
dNTPmix, 25㎕;
10 x LA PCR 버퍼, 25㎕;
LA Taq 폴리머라아제 [다까라슈조사제], 12.5 단위.
용액의 최종부피를 재증류수로 250㎕ 로 만든다. dNTPmix, 10 x LA PCR 버퍼 및 LA Taq 폴리머라아제는 키트내 제공되어 있다.
구체적으로는, 반응 용액은 초기에 94℃ 에서 2 분간 가열한다. 이어서 시료를 하기의 열주기를 이용하여 가열한다: 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1 분 및 72℃ 에서 2 분. 이 주기를 30 회 반복한다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 10 분간 보온한다.
이런식으로 PCR 로 증폭된 FASAIC DNA 단편을 페놀로 추출한다. 이어서 DNA 를 100% 에탄올을 이용하여 침전시킨다. DNA (20-30㎍) 를 1%(w/v) 아가로오스 겔상에서 전기영동시킨다. 겔을 에티듐 브로마이드 1㎍/ml 으로 염색하여, DNA 단편이 UV 조사시 볼수 있도록한다. 이런 방식으로 검출된 DNA 단편을 면도날로 겔로부터 절단하고 Centricon 10 [아미콘사제] 가 장착된 Centriruter [아미콘사제] 를 이용하여 아크릴아미드 겔로부터 전기용출시킨다. 용출된 DNA 를 7,500 x g 에서 약 1시간동안 원심분리하여 농축시키고, 이어서 에탄올 침전시킨다. 각각의 경우에서 최종 DNA 를 증류수 50㎕ 에서 용해시킨다.
FASAIC DNA 단편을 운반하는 플라스미드의 구축은 도 28 에 개략하였다.
이런 방식으로 수득한 FASAIC DNA 를 추가로 페놀추출로 정제한후 에탄올 침전시킨다. 이어서 DNA 를 제한효소 Xho1 및 Xba1 로 소화시킨다.
플라스미드 pME18S-mFas-AIC DNA 의 일부 (2㎍) 를 제한효소 EcoR1 및 Xba1 로 소화시킨다. 소화의 산물을 0.8%(w/v) 아가로오스 겔상에서 전기영동으로 분리시킨다. 겔을 1㎍/ml 의 에티듐 브로마이드로 염색시켜 UV 조사하 볼 때 DNA 를 볼수 있도록한다. 약 3,000 bp 의 DNA 밴드를 면도날로 절단하여 DNA 를 회수한다.
상기에서 수득한 소화된 pME18S-mFas-AIC DNA 의 일부를 EcoR1 및 Xba1 소화된 FASAIC DNA 의 일부에 접합시킨다. 접합 키트를 이용하여 접합을 실행하고 접합 산물을 대장균 DH5α 주로 형질전환시킨다.
형질전환 콜로니내 함유된 플라스미드 DNA 의 제한효소 분석을 행하여 목적 DNA 삽입체를 함유하는 플라스미드를 동정한다. 플라스미드 phFas-AIC2 는 면역글로불린 폴리펩티드의 발현을 위해 정배향으로 SRα 프로모터의 하류에 삽입된 FASAIC DNA 단편 (인간 Fas 융합 단백질) 을 함유함이 동정된다.
e) COS-7 세포내 발현
인간 Fas 융합 단백질을 위해 상기에서 수득한 발현 플라스미드는 유전자 트랜스펙션 장치 ECM600M(BTX) 를 이용하여 전기천공으로 COS-7 세포로 트랜스펙션시킨다.
COS-7 세포[American Type Culture Collection No. CRL-1651] 를 225cm2배양 플라스크 [스미또모 베이크라이트사제] 에서 배양한다. 세포를 10% 소태아 혈청 [CSL] 를 함유하는 둘베코변성 이글 최소 필수배지 (이후DMEM 로 칭함; 니수이 세이야꾸) 에서 세미컨플루언트(semi-confluent) 상태까지 증식시킨다. 배지를 제거하고 COS-7 세포를 37℃ 에서 3 분간 트립신-EDTA 용액 [시그마 케미컬사제] 3 ml로 처리한다. 검출전 세포를 800 rpm 으로 2 분간 원심분리하여 회수하고 이어서 PBS(-)버퍼[니수이 세이야꾸] 로 2 회 세정한다. 세정된 세포는 PBS(-)버퍼로 4x106세포/ml 의 밀도로 조정하여 COS-7 세포 현탁액을 제조한다.
마찬가지로, phFas-AIC2 플라스미드 DNA 100㎍ 을 플라스미드 Maxiprep kit [MaxiPrep DNA Purification Kit; 프로메가사제] 를 이용하여 제조한다. DNA 를 100% 에탄올로 침전시키고, 이어서 PBS(-)버퍼 100㎕ 에 현탁시킨다. 플라스미드 용액 (100㎕) 을 상기에서 제조한 COS-7 세포 500㎕ (2 x 106세포에 상당)와 혼합한다. 혼합물을 전극간격 4mm [바이오래드사제] 의 전기천공 큐베트로 옮기고, 이어서 전기천공 장치에 적하한다. 이어서 전기천공을 이용하여 목적
플라스미드 DNA 를 COS-7 세포로 도입한다 (펄스 150V-900㎌).
전기천공후, 세포-DNA 혼합물을 10% 소태아 혈청를 함유하는 DMEM 20ml 에 재현탁시키고, 75cm2배양 플라스크 [스미또모 베이트라이트] 로 옮긴다. 세포를 7.5% CO2하 37℃에서 24 시간동안 배양한다. 배양 상층액을 제거하고 세포를 무혈청 DMEM 배지로 세정한다. 새로운 무혈청 DMEM 배지의 일정량(20ml) 를 가하고 세포를 7.5% CO2하 37℃에서 24 시간동안 배양한다. 이어서 상층액을 제거한다.
2) ELISA 로 Fas 항원에 대한 결합력의 분석
Fas 항원에 결합하는 인간화 항체의 능력을 하기와 같이 ELISA 법으로 분석한다.
COS-7 세포 배양물 (상기, 1 항에서 제조) 의 상층액을 (1:5) 의 비율로 50mM 탄산염-이탄산염 버퍼(pH9.5) 와 혼합한다. 혼합물의 일부 (50㎕) 를 96-웰 ELA 플레이트(3690, 바닥면적 0.16 cm2, 코스터사제) 의 각각의 웰에 가하고 4 ℃에서 밤새워 보온하여 인간 Fas 융합 단백질을 웰의 표면에 흡착시킨다. 흡착후, 각각의 웰을 0.05% Tween 20 를 함유하는 PBS(-)버퍼 (EIA 등급; 바이오래드사제, 이후PBS-T 로 칭함) 로 세정한다.
슈퍼블록(SuperBlock) 블록킹 버퍼[피어스사제] 를 PBS 에 보충하고, 이버퍼 50㎕ 를 각각의 버퍼에 가한다. 플레이트를 실온에서 2 시간동안 보온하여 브록킹시킨다. 웰을 다시 PBS-T 로 세정한다.
실시예 7 에서 제조한 희석된 배양물 상층액 각각의 50㎕ 시료를 각각의 웰에 가하고 37℃ 에서 2 시간동안 보온시킨다. 이어서 웰을 PBS-T 로 세정한다. 퍼옥시다아제-표식 염소 항-인간 IgM 모노클론성 항체의 일부 (50㎕) [Jackson Immuno-research Laboratory]를 PBS 에 1:10,000 으로 희석시키고, 각각의 웰에 분산시키고 플레이트를 37℃ 에서 2 시간동안 보온시킨다. PBS-T 로 세정한후, 기질 용액 50㎕ [Peroxidase Substrate Set-ABTS; 바이오래드사제] 를 각각의 웰에 분산시켜 색측정분석을 한다.
인간 Fas 항원 융합 단백질에 결합하는 배양 상층액내 함유된 인간화 항체의 능력은 마이크로플레이터 리더 [Model 3550UV;바이오래드사제] 로 405nm 및 492nm 에서의 각 웰의 흡광도를 읽어 평가한다. 405nm 및 492nm 에서의 흡광도의 비로 고정물에대한 IgM 의 결합을 평가할 수 있다.
분석의 결과는 실시예 7 의 시료 (B),(C),(D),(E),(F),(G),(H) 및 (I) 에서 생산된 인간화 항체는 인간 Fas 항원 융합 단백질 (도 29 및 30) 에 결합할 수 있음을 보여준다.
시험예 3
세포소멸유도 활성의 분석
상기 실시예 7 에서 제조한 배양 상층액을 인간 림프구 세포계통 'HPB-ALL' 과 함께 보온하여, 상층액내 함유된 인간화 항체의 세포독성 활성을 측정한다.
HPB-ALL 세포는 20mM HEPES, 50μMβ-머캅토에탄올, 0.33% 이탄산나트륨 [시그마사제] 및 10% 소태아혈청 [CSL]를 함유하는 RPMI 배지(니수이 세이야꾸사제), (이후 'RPMI 배지' 로 칭함)에서, 37℃, 5% CO2 하 증식시킨다. HBP-ALL 세포를 800 RPM 으로 3 분간 원심분리로 대수상에서 회수한다. 세포펠릿은 6 x 105세포/ml 의 밀도로 RPMI 배지에 재현탁하여, HBP-ALL 세포 현탁액을 제조한다.
실시예 7 에서 제조한 배양물 상층액의 각각과 더불어 마우스 항-인간 Fas 항체 CH11 를 하기의 농도로 희석한다: 250, 100, 25, 10, 2.5, 1, 0.25 및 0.1 ng/ml. 각 희석물의 일부 (50㎕) 를 96-웰 배양 플레이트의 각웰에서 HBP-ALL 세포 현탁액 (3 x 104세포/50㎕) 50㎕ 과 함께 혼합한다. 플레이트는 37℃, 5% CO2하 2 시간동안 보온한다. 마이크로플레이트 리더 Model 3550-UV [바이오래드사제] 를 이용하여, 450nm 및 750nm 에서의 흡광도를 측정한다.
각 시료의 농도를 시험예 1 에 기재된 바와 같이 제조된 웨스턴 블로트의 색측정분석으로 측정한다.
HBP-ALL 세포의 생존률% 는 하기식을 이용하여 계산한다:
생존률 (%) =(A-C)/(B-C)x100
식중:
A = CH11 또는 인간화 항체와 HBP-ALL 세포의 보온후 남는 세포수
B = HBP-ALL 세포만의 배양후 남는 세포수(CH11 또는 인간화 항체없음)
C = HBP-ALL 세포없이 RPMI(상기 A 및 B와 같이, 20 시간동안 보온).
결과는 도 31 에 그래프로 나타내었다. 세포독성 활성지수인 ED50은 각각의 경우에서 계산한다. ED50은 세포의 50% 가 생존하는 IgM 의 농도를 나타낸다.
결과는 하기와 같다:
시료 ED50(ng/ml)
B 1.1
C 1.0
D 1.7
E 1.5
G 2.4
I 3.4
CH11 10.7
결과는 J 사슬이 결핍된 재조합 항-Fas IgM 분자는 J 사슬을 갖는 CH11 보다 3 내지 10 배의 세포독성을 갖음을 보여준다.
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서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
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서열번호: 122
서열의 길이: 20
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
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서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
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서열의 유형: 핵산
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서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
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서열번호: 136
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서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
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서열번호: 137
서열의 길이: 1869
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 이중 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: cDNA 내지 mRNA
가설: 없음
안티센스: 없음
기원
생물명: 사람 (Homo sapiens)
세포의 종류:
서열번호: 138
서열의 길이: 891
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 이중 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: cDNA 내지 mRNA
가설: 없음
안티센스: 없음
기원
생물명: 사람 (Homo sapiens)
세포의 종류:
서열번호: 139
서열의 길이: 40
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
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서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
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서열번호: 140
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서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
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서열번호: 141
서열의 길이: 40
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
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서열번호: 142
서열의 길이: 40
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 143
서열의 길이: 50
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 144
서열의 길이: 50
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 145
서열의 길이: 50
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 146
서열의 길이: 50
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 147
서열의 길이: 52
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 148
서열의 길이: 52
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 149
서열의 길이: 40
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
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서열번호: 150
서열의 길이: 31
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 151
서열의 길이: 31
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
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서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
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서열번호: 152
서열의 길이: 31
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
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가설: 없음
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서열번호: 153
서열의 길이: 20
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 154
서열의 길이: 20
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 155
서열의 길이: 20
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 156
서열의 길이: 40
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 157
서열의 길이: 40
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 158
서열의 길이: 40
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
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서열번호: 159
서열의 길이: 50
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 160
서열의 길이: 50
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 161
서열의 길이: 40
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 162
서열의 길이: 40
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 163
서열의 길이: 40
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 164
서열의 길이: 40
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 165
서열의 길이: 39
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 166
서열의 길이: 30
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 167
서열의 길이: 31
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 168
서열의 길이: 60
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 169
서열의 길이: 60
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 170
서열의 길이: 60
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 171
서열의 길이: 60
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 172
서열의 길이: 30
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 173
서열의 길이: 30
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 174
서열의 길이: 36
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 175
서열의 길이: 50
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 176
서열의 길이: 26
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 177
서열의 길이: 30
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 178
서열의 길이: 24
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 179
서열의 길이: 23
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 180
서열의 길이: 20
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 181
서열의 길이: 19
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 182
서열의 길이: 20
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 183
서열의 길이: 20
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 184
서열의 길이: 20
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 185
서열의 길이: 20
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 186
서열의 길이: 37
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 187
서열의 길이: 35
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 188
서열의 길이: 35
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
서열번호: 189
서열의 길이: 28
서열의 유형: 핵산
가닥의 수: 단일 가닥
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 (합성 DNA)
가설: 없음
안티센스: 없음
본 발명은 Fas 를 발현하는 세포에서 세포소멸을 유도할 수 있고, 자가면역 질병 및 만성 류마티스관절염의 치료에 유용한 인간화 항인간-Fas 항체를 제공하며, 이외에, 본 발명은 이러한 항체의 H 및 L 사슬의 가변부를 코딩하는 DNA 및 항체의 인간화 방법을 제공한다

Claims (53)

  1. 하기의 단계들을 특징으로하는, 적어도 하나의 경사슬(light chain) 및 하나의 중사슬 (heavy chain) 로 이루어진 인간화 항체 및 이의 유도체의 제조방법:
    a 하나이상의 CDR 를 갖는 비-인간 항체를 선택하는 단계;
    b 인간 항체 중사슬을 선택하는 단계;
    c 인간 항체 경사슬을 선택하는 단계;
    d 비-인간 항체 중사슬유래의 하나이상의 CDR 또는 이의 단편을 인간 항체 중사슬로 도입하여 재조합 중사슬을 형성시키는 단계; 및
    e 비-인간 항체 경사슬유래의 하나이상의 CDR 또는 이의 단편을 인간 항체 경사슬로 도입하여 재조합 경사슬을 형성시키는 단계;
    상기에서, 인간 항체 중사슬 및 경사슬의 각각의 선택은 단지 비-인간 항체 중사슬 및 경사슬과의 서열 상동성만으로 각각 결정한다.
  2. 제 1 항에 있어서, CDR 영역은 비-인간 항체 사슬로부터 유래한 하나이상의 CDR 또는 이의 단편을 도입하기전에 인간 항체사슬로부터 제거하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 서열 상동성은 아미노산 서열 상동성인 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 서열 상동성은 단지 프레임워크 영역에 대해서만 실질적으로 평가하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 각각의 인간 항체 사슬의 선택은 비-인간 항체 사슬을 갖는 프레임워크 영역에서 70% 이상의 아미노산 동일성을 공유함으로써 결정되는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 각 비-인간 항체 사슬유래의 모든 CDR 이 관련 인간 항체 사슬로 도입되는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 선택된 비-인간 항체는 마우스 CH11 항체인 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 선택된 인간 경사슬은 인간 항체 RPMI6410'CL 에서 유래되는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 인간 중사슬은 인간 항체 21·28'CL 에서 유래되는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 인간 항체로부터 유래한 아미노산 영역은 항체의 프레임워크 영역의 각각의 대부분을 적어도 함유하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 인간 항체로부터 유래한 아미노산 영역은 불변부 또는 불변부의 일부를 추가로 함유하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 하나이상의 비-인간 CDR 을 비-인간 CDR 의 프레임워크 영역의 하나이상의 1 종이상의 중요한 아미노산 잔기와 더불어 인간 항체로 도입하는 방법.
  13. 하기의 단계를 특징으로하는, 적어도 하나의 경사슬 및 하나의 중사슬로 이루어진 인간화 항체 및 이의 유도체의 제조방법:
    a 하나이상의 CDR 를 갖는 비-인간 항체를 선택하는 단계;
    b 인간 항체 중사슬을 선택하는 단계;
    c 인간 항체 경사슬을 선택하는 단계;
    d 비-인간 항체 중사슬로부터 하나이상의 CDR 또는 이의 단편을 인간 항체 중사슬로 도입하여 재조합 중사슬을 형성시키는 단계; 및
    e 비-인간 항체 경사슬로부터 하나이상의 CDR 또는 이의 단편을 인간 항체 경사슬로 도입하여 재조합 경사슬을 형성시키는 단계;
    상기에서, 인간 항체 중사슬 및 경사슬의 각각의 선택은 단지 비-인간 항체 중사슬 및 경사슬과의 아미노산 서열 상동성만으로 각각 결정하고, 하나이상의 비-인간 CDR 은 비-인간 CDR 의 하나이상의 프레임워크 영역의 하나이상의 중요한 아미노산 잔기와 더불어 인간 항체로 도입하며, 하나이상의 중요한 아미노산 잔기는 비-인간 프레임워크 영역으로부터 CDR 과 더불어 도입된다. 단, 잔기는 하기의 기준중 하나이상을 충족시킨다:
    a) 수용체의 인간 프레임워크 영역내 아미노산은 수용체내 그 위치에서는 드물게 발견되는 반면, 공여체내 대응하는 아미노산은 수용체의 그 위치에서 공통적으로 발견된다;
    b) 면역글로불린의 삼차원 모델에 있어서, 아미노산은 하기의 기준 i), ii) 및 iii) 중 하나에 따라, 항원 또는 인간화 항체의 CDR 과 결합을 형성하는 것으로 판단되는 측쇄원자를 갖는다:
    i) 측쇄원자는 제 2 원자와 이들의 반데르 발스반경 플러스 0.5Å 의 총합미만의 거리내 있고,
    ii) 측쇄원자는 극성이고 제 2 극성원자로부터 2.9Å 미만이며,
    iii) 측쇄원자는 전하를 띠고 반대전하 원자로부터 3.35Å 미만이다;
    c) 아미노산은 CDR 의 기본종류의 구조를 결정하는데 관여하는 위치에서 발견된다; 그리고
    d) 아미노산의 위치는 중사슬 및 경사슬의 추정되는 접촉표면에서 발견되다.
  14. 제 13 항에 있어서, 기준 (b) 및 (d) 의 아미노산의 위치는 분자 모델링으로 결정하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 아미노산의 위치는 기타 항체에 대한 X-선 결정학적 데이터와 비교하여 추가로 결정하는 방법.
  16. 제 13 항에 있어서, 프레임워크 영역에서 유래한 아미노산은, 만일 분자 모델링에 의해 CDR 과 접촉하리라 예견되거나 X-선 결정학에의해 CDR 과 접촉하는 것이 실험적으로 빈번하게 발견되면, 도입하는 방법.
  17. 제 13 항에 있어서, 서열 상동성은 실질적으로 단지 프레임워크 영역에 대해서만 평가하는 방법.
  18. 제 13 항에 있어서, 각 인간 항체 사슬의 선택은 비-인간 항체 사슬과 프레임워크 영역에서 70% 이상의 아미노산 동일성을 공유함으로써 결정되는 방법.
  19. 제 13 항에 있어서, 각 비-인간 항체 사슬에서 유래한 모든 CDR 을 관련 인간 항체 사슬로 도입하는 방법.
  20. 제 13 항에 있어서, 선택된 비-인간 항체는 마우스 CH11 항체인 방법.
  21. 제 13 항에 있어서, 선택된 인간 경사슬은 인간 항체 RPMI6410'CL 에서 유래되는 방법.
  22. 제 13 항에 있어서, 인간 중사슬은 인간 항체 21·28'CL 에서 유래되는 방법.
  23. 제 13 항에 있어서, 인간 항체로부터 유래한 아미노산 영역은 항체의 프레임워크 영역의 각각의 대부분을 적어도 함유하는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 인간 항체로부터 유래한 아미노산 영역은 불변부 또는 불변부의 일부를 추가로 함유하는 방법.
  25. 하기의 단계를 특징으로하는 방법으로 제조되는, 적어도 하나의 경사슬 및 하나의 중사슬로 이루어진 인간화 항체 또는 이의 유도체:
    a 하나이상의 CDR 를 갖는 비-인간 항체를 선택하는 단계;
    b 인간 항체 중사슬을 선택하는 단계;
    c 인간 항체 경사슬을 선택하는 단계;
    d 비-인간 항체 중사슬로부터 하나이상의 CDR 또는 이의 단편을 인간 항체 중사슬로 도입하여 재조합 중사슬을 형성시키는 단계; 및
    e 비-인간 항체 경사슬로부터 하나이상의 CDR 또는 이의 단편을 인간 항체 경사슬로 도입하여 재조합 경사슬을 형성시키는 단계;
    상기에서, 인간 항체 중사슬 및 경사슬의 각각의 선택은 단지 비-인간 항체 중사슬 및 경사슬과의 아미노산 서열 상동성만으로 각각 결정하고, 하나이상의 비-인간 CDR 은 비-인간 CDR 의 하나이상의 프레임워크 영역의 하나이상의 중요한 아미노산 잔기와 더불어 인간 항체로 도입하며, 하나이상의 중요한 아미노산 잔기는 비-인간 프레임워크 영역으로부터 CDR 과 더불어 도입된다. 단, 잔기는 하기의 기준중 하나이상을 충족시킨다:
    a) 수용체의 인간 프레임워크 영역내 아미노산은 수용체내 그 위치에서는 드물게 발견되는 반면, 공여체내 대응하는 아미노산은 수용체의 그 위치에서 공통적으로 발견된다;
    b) 면역글로불린의 삼차원 모델에 있어서, 아미노산은 하기의 기준 i), ii) 및 iii) 중 하나에 따라, 항원 또는 인간화 항체의 CDR 과 결합을 형성하는 것으로 판단되는 측쇄원자를 갖는다:
    i) 측쇄원자는 제 2 원자와 이들의 반데르 발스반경 플러스 0.5Å 의 총합미만의 거리내 있고,
    ii) 측쇄원자는 극성이고 제 2 극성원자로부터 2.9Å 미만이며,
    iii) 측쇄원자는 전하를 띠고 반대전하 원자로부터 3.35Å 미만이다;
    c) 아미노산은 CDR 의 기본종류의 구조를 결정하는데 관여하는 위치에서 발견된다; 그리고
    d) 아미노산의 위치는 중사슬 및 경사슬의 추정되는 접촉표면에서 발견되다.
  26. 제 25 항에 있어서, 항체는 항-Fas 활성을 갖는 항체.
  27. 제 25 항에 있어서, 분자는 항-Fas 활성을 갖는 IgM 분자인 항체.
  28. 제 27 항에 있어서, J 사슬이 결핍된 항체.
  29. SEQ ID No. 78 로 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 함유하는 경사슬 및 SEQ ID No. 86 으로 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 함유하는 중사슬로 이루어진 인간화 항체.
  30. SEQ ID No. 78 로 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 함유하는 경사슬 및 SEQ ID No. 88 로 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 함유하는 중사슬로 이루어진 인간화 항체.
  31. SEQ ID No. 80 으로 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 함유하는 경사슬 및 SEQ ID No. 86 으로 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 함유하는 중사슬로 이루어진 인간화 항체.
  32. SEQ ID No. 80 로 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 함유하는 경사슬 및 SEQ ID No. 88 로 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 함유하는 중사슬로 이루어진 인간화 항체.
  33. SEQ ID No. 82 로 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 함유하는 경사슬 및 SEQ ID No. 86 으로 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 함유하는 중사슬로 이루어진 인간화 항체.
  34. SEQ ID No. 82 로 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 함유하는 경사슬 및 SEQ ID No. 88 로 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 함유하는 중사슬로 이루어진 인간화 항체.
  35. SEQ ID No. 84 로 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 함유하는 경사슬 및 SEQ ID No. 86 으로 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 함유하는 중사슬로 이루어진 인간화 항체.
  36. SEQ ID No. 84 로 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 함유하는 경사슬 및 SEQ ID No. 88 로 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 함유하는 중사슬로 이루어진 인간화 항체.
  37. 제 25 항의 항체를 코딩하는 RNA.
  38. 제 25 항 내지 제 36 항중 어느 한 항의 항체를 코딩하는 DNA.
  39. 60-70℃ 및 6 x SSC 의 조건하, 제 25 항의 항체를 코딩하는 DNA 와 혼성화하는 DNA.
  40. 제 39 항의 DNA 를 함유하는 복제성 벡터.
  41. 발현벡터인 제 40 항의 벡터.
  42. 재조합 DNA 벡터 pHκKY2-58, pHκKF2-19, pHκRY2-10, pHκRF2-52, pHμH5-1 및 pHμM1-1 로 이루어진 군에서 선택한 벡터.
  43. 제 41 항의 발현벡터로 형질전환된 숙주세포.
  44. 대장균 pHκKY2-58주 (FERM BP-5861).
  45. 대장균 pHκKF2-19 주 (FERM BP-5860).
  46. 대장균pHκRY2-10주(FERM BP-5859).
  47. 대장균 pHκRF2-52주(FERM BP-5862).
  48. 대장균pHμH5-1 주(FERM BP-5863).
  49. 대장균 pHμM1-1 주(FERM BP-5864).
  50. 벡터내 포함된 면역글로불린 H 사슬 또는 L 사슬 소단위체를 코딩하는 DNA 을 발현시킬 수 있는 조건하 제 43 항의 숙주세포를 배양하고 배양물로부터 면역글로불린 단백질을 회수하는 것을 특징으로하는 면역글로불린 단백질의 제조방법.
  51. 제 25 항의 항체의 비독성량을 이를 필요로하는 포유류에 투여하는 것을 특징으로하는 자가면역 질병의 치료방법.
  52. 제 51 항에 있어서, 자가면역 질병이 류마티즘인 방법.
  53. 제 51 항에 있어서, 포유류는 인간인 방법.
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