CZ85898A3 - Způsob výroby humanizované protilátky, protilátka, DNA, vektor a hostitelská buňka - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu výroby humanizované protilátky proti lidskému Fas, která rozeznává antigen Fas. Vynález se rovněž týká kódové DNA pro tyto protilátky, protilátek jako takových a farmaceutického prostředku, který tyto protilátky obsahuje a je určen k léčení autoimunitních onemocnění a revmatických onemocnění nebo k inhibici růstu buněk. Vynález se rovněž týká příslušného vektoru a hostitelských buněk.

Dosavadní stav techniky

Imunoglobulin G, IgG, je tvořen dvěma lehkými polypeptidovými řetězci, řetězci L, z nichž každý má molekulovou hmotnost přibližně 23 000 a dvěma těžkými polypeptidovými ře tězci, řetězci H, z nichž každý má molekulovou hmotnost při

bližně 50 000. Řetězce H i L jsou tvořeny opakujícími se oblastmi konzervovaných aminokyselin, které jsou tvořeny přibližně 110 zbytky aminokyselin. Tato oblast se obvykle uvádí jako doména a tvoří základní trojrozměrnou strukturní jednotku IgG. Řetězce H a L jsou tvořeny čtyřmi nebo dvěma po sobě následujícími doménami.

..... V případě, že se srovnávají sekvence aminokyselin různých protilátek, je možno pozorovat, že amino-terminální doména řetězce H a L je variabilnější než ostatní domény. Uvádí se proto jako variabilní doména, doména V. Doména V řetězců H a L je komplementární povahy, takže mohou vzniknout variabilní aminoterminální oblasti molekul IgG. Ostatní domény se spojují k vytvoření konstantních oblastí. Sekvence konstantních oblastí jsou pro jednotlivé čeledi charakteris-. tické. Například konstantní oblast myšího IgG se liší od

- 2 odpovídající oblasti lidského IgG a IgG myší je proto lidským imunitním systémem rozpoznáván jako cizorodá bílkovina. Po podání IgG myši člověku dochází k produkci lidských protilátek proti myšímu IgG, které budou dále označovány jako HAMA (Schroff a další, 1985, Cancer Res., 45, 879 až 885). To znamená, že není možno myší protilátku opakovaně podávat člověku. Pro účinné podání je nutno takovou protilátku modifikovat tak, aby nedošlo k indukci HAMA, avšak stále ještě byla zachována specifičnost protilátky.

Údaje, získané při krystalografické analýze pomocí rtg-záření prokazují, že imunoglobulin obvykle tvoří dlouhou válcovou strukturu, která je tvořena dvěma vrstvami antiparalelních beta-vrstev, z nichž každá obsahuje tři nebo čtyři beta-řetězce. Ve variabilní oblasti se spojují tři smyčky z každé oblasti V řetězce H a L za vzniku místa pro vazbu antigenu. Každá z těchto smyček je zakončena oblastí, určující komplementárnost, CDR. Oblasti CDR jsou v sekvenci aminokyselin nejvariabilnější. Ty části variabilní oblasti, které netvoří součást CDR se označují rámcové oblasti, oblasti FR, a obvykle hrají svou úlohu při udržování struktury CDR.

V publikaci E. A. Kabat a další, Sequences of proteins of immunological interest, 5. vydání, HIH publikace, č. 91, str. 3242 se srovnávají primární sekvence řady variabilních oblastí řetězců H a L a současně jsou identifikovány putativní CDR nebo rámcové oblasti na základě konzanyace—sek-v-encí-.---Dále jsou rámcové oblasti klasifikovány do několika podskupin, jimž je společná část sekvence aminokyselin. Jsou také identifikovány odpovídající rámcové oblasti v příslušné sekvenci myši a člověka.

Studie strukturních vlastností molekul IgG vedly k vývoji metod pro přípravu humanizovaných protilátek, nevyvolávajících odpověď typu HAMA, jak bude dále uvedeno.

Počáteční návrhy byly zaměřeny na přípravu chimérní protilátky vazbou variabilní oblasti myší protilátky na konstantní oblast lidského původu podle publikace Morrison S. L. a další, 1984, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 81, str. 6851 až 6855. Taková chimární protilátka však stále ještě obsahuje řadu zbytků aminokyselin se sekvencí, odlišnou od lidské sekvence a může tedy vyvolat reakci typu HAMA, zvláště při dlouhodobém podávání, jak bylo popsáno v Begent a další, 1990, Br. J. Cancer, 62, str. 487 a následující.

Bylo také navrhováno naroubovat na lidskou protilátku pouze segmenty CDR, tak, aby bylo možno dále snížit poměr sekvencí aminokyselin, které by mohly vyvolat reakci HAMA podle Jones P. T. a další, 1986, Nátuře, 321, 522 až 525. Obecně však bylo zjištěno, že naroubování segmentů CDR obvykle není dostatečné pro účinnost imunoglobulinu proti danému antigenu.

Na základě krystalografických zjištění s použitím rtg-záření bylo podle publikace Chothia a další, 1987, J. M01. Biol. 196, 901 až 917 prokázáno, že

1)

CDR obsahuje oblast, která se účastní vazby antigenu a oblast, která slouží k udržování vlastní struktury CDR. Trojrozměrné struktury CDR mohou být klasifikovány do několika skupin s charakteristickou strukturou (kanonické struktury) a

2) skupiny kanonických struktur jsou určovány nejen sekvencemi CDR, nýbrž také povahou aminokyselin ve specifických polohách rámcových oblastí.

V důsledku těchto zjištění bylo navrhováno, aby technika s roubováním oblasti CDR zahrnovala také naroubování některých zbytků aminokyselin z rámcových oblastí do kostry n ···· ·· ····

- 4 lidské protilátky, jak je navrhováno ve zveřejněné japonské patentové přihlášce č. 4-502408 (Queen a další).

V souvislosti se svrchu uvedenými postupy se protilátka savce, odlišného od člověka, z níž se získává oblast CDR pro naroubování, označuje jako donorová molekula, kdežto lidská protilátka, na niž se oblast CDR roubuje, je označována jako akceptor.

Při roubování CDR-oblastí by měla být tato oblast co nejvíce konzervována a současně by měla být zachována účinnost molekuly imunoglobulinu. V této souvislosti mohou být určující následující faktory:

1) podskupina akceptoru a

2) povaha zbytků aminokyselin, které jsou přeneseny z rámcových oblastí donoru.

V publikaci Queen a další, zveřejněná japonská paten- tová přihláška č. 4-502408 se navrhuje postup pro humanizaci protilátek, který spočívá v tom, že se naroubuje zbytek aminokyseliny z rámcové oblasti donoru společně se sekvencí CDR do molekuly akceptoru za předpokladu, že uvedený zbytek se nachází v bezprostřední blízkosti CDR nebo se aminokyselina v rámcové oblasti akceptoru zřídka nachází v této poloze, kdežto odpovídající aminokyselina donoru se v uvedené poloze akceptoru běžně nachází .___

Imunoglobulin M, IgM, je obvykle tvořen deseti řetězci H a deseti řetězci L,. přičemž ve středu molekuly je uložen spojovací řetězec J. Myší IgM má konstantní oblasti stejně jako IgG a nemůže tedy být opakovaně podáván člověku. Z tohoto důvodu je rovněž nutno použít roubování CDR v případě, že je zapotřebí použít molekuly IgM k léčebným účelům u člověka.

• · • ·

- 5 Přestože je molekula IgM obvykle přítomna jako pentamer s řetězcem J, může být přítomna také jako hexamer bez řetězce J podle publikace Troy a další, J. Biol. Chem., 1992, 267, (25), 18002 až 18007. V hexameru IgM bez řetězce J je zvýšena schopnost vazby komplementu podle publikace Davis a další, Eur. J. Immunol., 1988, 18, 1001 až 1008. Dříve se však předpokládalo, že přítomnost řetězce J je podstatná pro zachování struktury IgM a pro udržení účinnosti molekuly jako imunoglobulinu. Až dosud není prokázáno, že si molekula IgM bez řetězce J udržuje svoji původní účinnost.

Fyziologické uhynutí buněk v živém organismu při normálním životním cyklu se označuje jako apoptosa a odlišuje se od pathologického uhynutí buněk, nekrosy podle Kerr a další, 1972, Br. J. Cancer, 26, 239 a následující. Apoptosa je příkladem programovaného uhynutí buněk, takže některé buňky jsou předurčeny předem k uhynutí v průběhu běžných pochodů v organismu, například po splnění předem určené funkce. Při apoptose dochází k morfoligickým změnám, například k zvlnění povrchu buněk, k zahuštění chromatinu v jádrech buněk a k fragmentaci DNA chromosomů.

Apoptosa má důležitou úlohu u buněk, rozpoznávajících autoantigeny v průběhu diferenciace lymfocytů T a B. Vznik tak zvaných autoimunitních onemocnění obvykle začíná tím, že se objeví autoreaktivní lymfocyty, které jsou důsledkem selhání apoptosy v průběhu diferenciace lymfocytů, jak bylo po“psáno v p ub lTkáčú“Kěuuc hTTí akay amOT^a^datšúy 1995-^—Meb-i-o—1-2-,--10, 79 až 86.

Fas je molekula buněčné membrány, která se účastní při apoptose imunokompetentních buněk podle svrchu uvedené publikace Itoh N. a další. Proti lidskému antigenů Fas byly vytvořeny myší monoklonální protilátky, jak je popsáno v • · • · · ·

- 6 Yonehara S. a další, 1989, J. Exp. Med., 169, 1747. Tyto protilátky proti lidskému antigenu Fas mají cytotoxický účinek ve smyslu vyvolání apoptosy u lidských buněk a byly navrhovány k léčení autoimunitních onemocnění, AIDS a nádorů podle zveřejněných japonských patentových přihlášek č. 2-237935 a 5-503281.

Revmatismus, zvláště rheumatoidní arthritis vzniká s největší pravděpodobností proliferací synoviocytů spolu s různými imunologickými nepravidelnostmi. Proliferace synoviocytů je v typických případech doprovázena infiltrací zánětlivými buňkami a rozrušením kostní tkáně. Rozrušení tkána v blízkosti nemocného kloubu v případech chronické rheumatoidní arthritidy je zřejmě způsobeno abnormální produkcí cytokinů zánětlivými synoviocyty. Při vyšetření kloubů u nemocných je možno zjistit abnormální proliferací synoviocytů, hyperplasii synoviálních klků, zmnožení vrstev synviocytů a podobně, jak bylo popsáno v publikaci Daniel J. McCarty, 1985, Arthritis and allied conditions, A textbook of rheumatology, 10. vyd., Lea and Febiger. Při léčení revmatismu se v současné době převážně užívají protizánětlivé účinné látky, jako steroidy a imunomodulátory. V případě, že by bylo možno dosáhnout inhibice abnormální proliferace synoviocytů, byla by jakákoliv látka s takovým účinkem výhodná při použití k léčení uvedené choroby.

Synoviocyty neproliferují v průběhu revmatismu neomezeným způsobem“ jak bylo popsáno ve svrchu uvedené publikaci—_:— Daniel J. McCartyho a bylo prokázáno, že i u nemocných s tímto onemocněním dochází k apoptose synoviocytů. Na membráně těchto buněk dochází k expresi antigenu Fas. V publikacích Nakajima T. a další, 1995, Arthritis Rheum., 38, 485 až 491 a Aono a další, Abstracts of the 38th Meeting of Japan Rheumatism Society (1994), str. 487, a také v materiálech ze sjezdu

- 7 Japan Cancer Society, 1994, str. 388 se popisují výsledky pokusů, jimiž bylo zjišťováno, zda by cytotoxické protilátky proti lidskému antigenu Fas mohly vyvolat apoptosu u abnormálně proliferujících synoviocytů u nemocných s revmatismem. Při aplikaci těchto protilátek bylo dosaženo vysokého stupně apoptosy u nemocných s revmatismem, kdežto u normálních synoviocytů nemocných s jiným onemocněním k tomuto vysokému stupni apoptosy nedošlo.

Tyto výsledky prokazují, že protilátka proti lidskému antigenu Fas může selektivně vyvolávat apoptosu nejen u lymfocytů, nýbrž také u abnormálně proliferujících synoviocytů, takže by tato protilátka proti lidskému Fas mohla být potenciálně použita k léčení revmatismu.

Bylo získáno několik myších monoklonálních protilátek proti lidskému antigenu Fas, které byly popsány například v Yonehara S. a další, 1989, J. Exp. Med., 169, 1747 až 1756 a Science, 1989, 245, 301 až 305. Mimoto, jak bylo svrchu popsáno, mohou tyto protilátky vyvolat in vitro apoptosu synoviálních buněk nemocných, trpících revmatismem (strana 487, Abstracts of the 38th Meeting of the Japan Rheumatology Society 1994 a str. 338, Articles of 1994 Annual Meeting of the Japan Oncology Society 1994). Nebyla však popsána příprava humanizované protilátky proti lidskému Fas, typu IgG ani typu IgM. Mimoto nebyla ještě nikdy popsána úspěšná příprava humanizované protilátky proti lidskému antigenu Fas bez řetězce avšak se zachovanou se-hopnos-t£—vyvol at__ap_opj=___ tosu.

K humanizaci myší monoklonální protilátky proti lidskému antigenu Fas je například zapotřebí zvolit sekvence aminokyselin variabilních oblastí, které mají být naroubovány na lidskou protilátku, která je akceptorem. Sekvence aminokyselin by ideálně měla zahrnovat sekvenci CDR a vybrané zbytky aminokyselin sekvence FR.

Při konstrukci humanizované protilátky je možno podskupiny akceptoru vyhledávat a volit jedním ze dvou způsobů:

1) užijí se těžký a lehký řetězec z téže známé protilátky lidského původu, nebo se

2) užije těžký a lehký řetězec, odvozený od odlišných protilátek lidského původu, které mají vysokou homologii sekvence nebo mají společné části sekvence se sekvencí donoru a současně se udržuje kombinace podskupin v řetězci akceptoru.

Dříve se postupovalo podle druhé možnosti vzhledem k tomu, že existuje jen omezený počet přírodně se vyskytujících kombinací podskupin. Bylo proto považováno za důležité udržovat tyto přírodně se vyskytující kombinace.

Vynález si klade za úkol navrhnout protilátku proti lidskému antigenu Fas pro léčebné použití v lékařství. Vynález si rovněž klade za úkol navrhnout způsob humanizace protilátek, jímž by mohlo být na nejvyšší míru sníženo nebezpečí vzniku odpovědi typu HAMA.

Podstata vynálezu

Nyní bylo neočekávaně zjištěno, že není nezbytné udr^· žovat přírodní kombinace podskupin ani užít řetězce H a L z téže protilátky. Výběr řetězců H a L je možno uskutečnit-z banky primárních sekvencí lidských protilátek pouze na základě homologie rámcových oblastí donoru a akceptoru bez ohledu na kombinaci podskupin. Takový postup byl také s úspěchem použit pro přípravu protilátky proti lidskému antigenu Fas.

Podstatu vynálezu tvoří způsob výroby humanizované protilátky obsahující nejméně jeden lehký řetězec a nejméně : jeden těžký řetězec, postup spočívá v tom, že se

a) volí protilátka odlišného než lidského původu s obsahem alespoň jedné oblasti CDR,

b) zvolí se těžký řetězec lidské protilátky,

c) zvolí se lehký řetězec lidské protilátky,

d) alespoň jedna oblast CDR z těžkého řetězce protilátky odlišné od lidského původu se uloží do těžkého řetězce lidské protilátky za vzniku rekombinantního těžkého řetězce a

e) alespoň jedna oblast CDR z lehkého řetězce protilátky jiného než lidského původu se uloží do lehkého řetězce protilátky lidského původu za vzniku rekombinantního lehkého řetězce, přičemž lehký a těžký řetězec lidské protilátky se volí pouze na základě homologie sekvence s lehkým a těžkým řetězcem protilátky jiného než lidského původu.

Vynález bude dále osvětlen v souvislosti s přiloženými výkresy.

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 je znázorněna konstrukce banky cDNA· pro klonování kódové DNA pro podjednotky CH11 s plnou délkou.

Na obr. 2 je znázorněno klonování kódové DNA s plnou délkou pro podjednotky TH11.

Na obr. 3 je znázorněn postup, užívaný pro analýzu sekvence těžkého řetězce.

N,a obr. 4 je znázorněn postup, užívaný pro analýzu) sekvence lehkého řetězce.

• · · · · ·

- 10 Na obr. 5 je znázorněn první stupeň PCR pro přípravu fragmentů DNA, VL-KY a VL-KF.

Na obr. 6 je znázorněn druhý .stupeň PCR pro přípravu fragmentů DNA, VL-KY a VL-KF.

Na obr. 7 je znázorněn třetí stupeň PCR pro přípravu fragmentů DNA, VL-KY a VL-KF.

Na obr. 8 je znázorněna konstrukce plasmidů pHkKY2-58 a pHkKF2-19.

Na obr. 9 je znázorněn první stupeň PCR pro přípravu fragmentu DNA, VL-RY a VL-RF.

Na obr. 10 je znázorněn druhý stupeň PCR pro přípravu fragmentů DNA, VL-RY a VL-RF.

Na obr. 11 je znázorněna konstrukce plasmidů pHkRY2-10 a pHkRF2-52.

Na obr. 12 je znázorněna příprava fragmentů DNA MEC.

Na obr. 13 je znázorněna konstrukce plasmidů pMEC22.

Na obr. 14 je znázorněn první stupeň PCR pro přípravu fragmentu DNA VH1234. ·

Na obr. 15 je znázorněn druhý stupeň PCR pro přípravu fragmentu DNA VH1234.

Na obr. 16 je znázorněn třetí stupeň PCR pro přípravu fragmentu DNA VH1234.

Na obr. 17 je znázorněna konstrukce plasmidů pMEHC20.

• · ··· · • ·

Na	obr.	18 je	znázorněn	první	stupeň PCR pro přípravu
fragmentů	DNA	HUMFR5	', HUMFR3'	, M0UFR5'a M0UFR3'.
Na	obr.	19 je	znázorněn	druhý	stupeň PCR pro	přípravu
fragmentů	DNA	HUMFR2	a M0UFR2.
Na	obr.	20 je	znázorněna konstrukce plasmidů	pHFR3 a
pHFR4.
Na	obr.	21 je	znázorněn	první	stupeň PCR pro	přípravu
fragmentu	DNA	HHC123	•
Na	obr.	22 je	znázorněn	druhý	stupeň PCR pro	přípravu
fragmentu	DNA	HHC123	•
Na	obr.	23 je	znázorněn	třetí	stupeň PCR pro	přípravu
fragmentu	DNA	HHC123	•
Na	obr.	24 je	znázorněna konstrukce plasmidů	pMECW5.
Na	obr.	25 je	znázorněna konstrukce plasmidů	pHC/UH
a pHC/UM.
Na	obr.	26 je	znázorněn	první	stupeň PCR pro	přípravu
fragmentu	. DNA	FASAIC	1
Na	obr.	27 je	znázorněn	druhý	stupeň PCR pro	přípravu

fragmentu DNA FASAIC.

Na obr. 28	je	znázorněna	konstrukce	plasmidů	phFas-AIC2
Na obr. 29	je	znázorněno	stanovení	účinnosti	vazby
Fas zkouškou ELISA.

Na obr. 30 je znázorněno stanovení účinnosti vazby Fas zkouškou ELISA.

·· ···» ·· ···· ·· ·· . a a ·· · · · · · • · · · · · a · aa . a a a · · * · ···· · a · · · · · · «·« a· ·· ·· · ·· ··

- 12 Na obr. 31 je znázorněno stanovení cytotoxické účinnosti na buňkách HPB-ALL.

Podle vynálezu je tedy možno zkonstruovat humanizované protilátky s minimálním rizikem vzniku odpovědi typu HAMA při zachování efektorové funkce protilátky.

Pod pojmem homologie sekvence se rozumí homologie sekvence DNA nebo homologie sekvence aminokyselin. Homologie je podobnost mezi dvěma sekvencemi, pojem je v oboru běžně užíván. Výhodné je zachovat homologii sekvence aminokyselin. Homologii sekvence aminokyselin je možno prokázat řadou postupů, které běžně zahrnují vyhledávání sekvencí v počítačových databázích. Tyto postupy jsou v oboru známé a běžně užívané. Výhodné je také stanovit homologii včetně rámcových oblastí.

Pojem lidského původu znamená v případě protilátek jakoukoliv protilátku, u níž lze předpokládat, že vyvolá jen malou nebo žádnou odpověď u jednotlivého člověka nebo u skupiny lidí.

Obvykle je výhodné naroubovat všechny oblasti CDR z dané protilátky do akceptorové protilátky tak, aby byly zachovány oblasti pro vazbu epitopu. Může však dojít k tomu, že je žádoucí nebo vhodné naroubovat jen některé oblasti CDR do molekuly donoru. Také tyto postupy spadají do rozsahu vynálezu.

Zvláště výhodné je provedení, při němž jsou všechny oblasti CDR z protilátky, odlišné od lidské protilátky naroubovány do lidské protilátky. Dále je výhodné začlenit některé oblasti rámcových oblastí rovněž do akceptorové protilátky tak, aby bylo možno zachovat trojrozměrnou strukturu rozpoznávacího místa protilátky, odlišné od lidské • · · · · · • A · ·

- 13 protilátky. Taková místa rámcových oblastí obvykle zahrnují jednotlivé zbytky aminokyselin, vybrané pro jejich důležitost podle kriterií, která budou dále uvedena. Výhodné jsou zvláště takové zbytky, které se v lidské protilátce vyskytují vzácně, avšak v příslušné donorové protilátce jsou obvyklé a také takové zbytky, u nichž je vysoká pravděpodobnost přímé interakce s epitopem nebo s rozpoznávacím místem.

Při roubování oblastí CDR do lidských protilátek se obvykle těmito oblastmi nahradí celá oblast CDR v lidské protilátce, zvláště v případě, že obě oblasti mají stejnou délku. Je však také možno v lidské protilátce nahradit jen část oblasti CDR nebo naroubovat pouze část CDR donorové protilátky nebo obě tyto možnosti kombinovat. Je také možné, že jedna oblast CDR bude větší, za této situace je vždy výhodné zachovat neporušené rámcové oblasti lidské protilátky.

Je také zřejmé, že CDR z protilátky jiného než lidského původu by měla nahradit odpovídající oblast CDR v lidské protilátce. Je však také možno, že akceptorem může být kostra lidského lehkého nebo těžkého řetězce, z níž již byla oblast CDR odstraněna. V tomto případě je možno CDR z donorové protilátky uložit do lidského řetězce v poloze, odkud byla odstraněna původní oblast CDR.

Lehké a těžké řetězce lidského původu nemusí být ne-zbytně_řetězce z téže lidské protilátky a dokonce ani z téže skupiny protilátek. Důležité je, aby sekvence zvolené akceptorové molekuly byla co nejbližší sekvenci donorové protilátky. Toto opatření je důležité proto, aby výsledná protilátka měla rozpoznávací místo, blízké původnímu místu donorové protilátky tak, aby docházelo k co nejlepší vazbě. Vynález tedy zahrnuje možnost použití řetězců, které si nebudou zcela blízké, avšak u nichž je'možno očekávat, že výsledná rekombinantní protilátka bude mít požadované vlastnosti.

··		····	····	99	··
9	•	•	9 9 9	9 ·	•	9
•	•	•	9 9 9	• ·	··
•	•	• ·	9 9 9	• ···	•	9
•	•	• ·	9 9 9	•	•	9
··		• ·	99 9	··

V případě, že je v průběhu přihlášky uvedena protilátka, je samozřejmé, že obdobné úvahy platí také pro příslušné kódové sekvence nukleových kyselin.

Při selekci pouze na bázi homologie sekvence bez dalších omezení je možno, aby donor a akceptor měly alespoň 70 % aminokyselin v části FR společných. Při zachování tohoto přístupu je možné snížit počet aminokyselin donoru, které je nutno naroubovat a tím snížit nebezpečí vzniku odpovědi typu HAMA.

Úloha zbytků aminokyselin, které se v molekule donoru vyskytují vzácně, nemůže být prozatím zcela definována vzhledem k tomu, že předpověď trojrozměrné struktury molekuly protilátky na základě její primární sekvence má omezenou přesnost. Tento postup se v současné době označuje jako modelování molekuly. Známé postupy, například uvedené ve svrchu zmíněné publikaci Queen a další, neuvádějí, zda má být v této poloze zvolen zbytek aminokyseliny donoru nebo akceptoru. Selekce molekuly akceptoru na bázi homologie sekvence může podstatně snížit potřebu takové selekce.

Pod pojmem rekombinantní se rozumí jakákoliv sloučenina, která byla získána genetickým inženýrstvím, to znamená

- -- -modifikací-jiné-látky nebo expresí odlišným způsobem nebo v odlišném systému.

Povaha protilátky není v průběhu způsobu podle vynálezu kritická. Může být použita jakákoliv protilátka, může napří) klad jít o IgG, IgM, IgA nebo IgE, protilátka se může volit z určité skupiny, například v závislosti na předpokládaném způsobu podání. Jak již bylo uvedeno, může se variabilní oblast těžkého řetězce odvodit z jednoho podtypu lidské protilátky a variabilní .oblast lehkého řetězce může být odvozena

9

z jiného podtypu protilátky. Mimoto je možno kombinovat těžký a lehký řetězec z podskupin, které se přirozeně nevyskytují.

Podle vynálezu se připravuje protilátka s účinností proti antigenu Fas, je však zřejmé, že takovou protilátku je možno zásadně připravit proti jakémukoliv antigenu. Zvláště výhodná je molekula IgM s účinností proti Fas. Bylo také prokázáno, že v případě, že se užije konstrukce typu IgM bez řetězce J, který vytváří pentamerní strukturu protilátky s pěti páry těžkého a lehkého řetězce, pak je možno zvýšit apoptotickou účinnost molekuly ve srovnání s molekulou, která řetězec J obsahuje.

Pojmy lehký řetězec a těžký řetězec jsou v oboru známé. V průběhu přihlášky se tyto pojmy nemusí týkat vždy řetězce s celou délkou, jediným požadavkem je, aby si rekombinantní protilátka podle vynálezu zachovala účinnost proti antigenu, s výhodou proti antigenu Fas.

Je výhodné, aby sekvence aminokyselin, odvozená od donorové protilátky, odlišné od lidské protilátky dovolovala zkříženou reakci protilátky s antigenem, z tohoto důvodu je obsažena oblast CDR nebo oblast, která této oblasti odpovídá. Je zřejmé,- že se sekvencí lidské, protilátky může být spojena jedna oblast nebo větší počet oblastí CDR. Ve* výhodném provedení obsahuje každý těžký a lehký řetězec tři oblasti CDR, odvozené od téže donorové protilátky.

Donorová oblast nebo oblasti mohou být odvozeny z jakéhokoliv zdroje, z nějž je možno protilátky získat. Nejběžnější je myš, je však možno také užít krysy a králíky. Ve výhodném provedení běží o oblasti CDR, odvozené z myší protilátky CH11, která reaguje s lidským antigenem Fas.

- 16 • ·

V dalším výhodném provedení tvoří části řetězce aminokyselin, odvozené od lidské protilátky v podstatě rámcové oblasti FR protilátky. Mimoto může být přítomna konstantní oblast protilátky nebo její část.

Rámcová oblast FR je přítomna ve variabilní oblasti podjednotky řetězce H nebo L v molekule imunoglobulinu. Například FRH^ označuje rámcovou oblast, uloženou nejdále N-terminálně ve variabilní oblasti podjednotky řetězce H a FRL₄ označuje čtvrtou rámcovou oblast od N-terminálního konce variabilní oblasti podjednotky řetězce L. Obdobně CDRH^ označuje oblast CDR, uloženou nejdále N-terminálně ve variabilní oblasti podjednotky řetězce H a CDRL^ znamená oblast CDR, uloženou jako třetí od N-terminálního konce variabilní oblasti podjednotky řetězce L. V jakémkoliv lehkém nebo těžkém řetězci jsou oblasti CDR obklopeny oblastmi FR.

Protilátky proti vynálezu nemají u člověka v podstatě vyšší imunogenitu než lidské protilátky. Tohoto výsledku je dosaženo tím, že není přítomna ta část cizorodé protilátky, která odpovídá heterologní konstantní oblasti. To znamená, že protilátka podle vynálezu může obsahovat část variabilní oblasti myší monoklonální protilátky, například CH11, avšak konstantní oblast byla odstraněna. Ve výhodném provedení je aminokyseliny z cizorodé protilátky ještě dále snížit tak, aby bylo možno zcela vyloučit imunogenitu a sou časně z-aehova-t—požadovanou—úČTi-nnosť-rproTt-i-l-á-ťk-y^—Toho je mož no dosáhnout výběrem lidských protilátek na bázi homologie sekvence, jak bylo popsáno svrchu.

Mimoto bylo prokázáno, že je možno uskutečnit ještě další selekci tak, aby byly identifikovány aminokyseliny rámcové oblasti donoru, které jsou důležité pro udržení struktury a funkce oblastí CDR donorové molekuly.

« · « · · · · · ·· • « · · · 9 · · ♦♦· · · ···· · · · ··· · e · ·· · ·· ··

- 17 Jakmile byla vybrána pro daný řetězec lidská akceptorová molekula, je nutno vybrat zbytky aminokyselin z rámcové oblasti donoru, které mají být naroubovány, selekce se provádí následujícím způsobem:

Srovnávají se sekvence aminokyselin donoru a akceptoru. V případě, že se zbytky aminokyselin v některé poloze rámcových oblastí liší, je nutno rozhodnout, který zbytek bude zvolen. Takový zbytek by neměl porušit trojrozměrnou strukturu oblasti CDN donoru nebo by měl mít pouze malý vliv.

Ve zveřejněné japonské patentové přihlášce č. 4-502408 (Queen a další) se navrhuje postup pro rozhodování, zda má být naroubován určitý zbytek aminokyseliny z rámcové oblasti FR donoru spolu s oblastí CDR. Podle tohoto postupu se zbytek aminokyseliny z oblasti FR naroubuje do akceptoru spolu s oblastí CDR v případě, že tento zbytek splní nejméně jedno z následujících kriterií:

1) aminokyselina lidské rámcové oblasti akceptoru je v této poloze vzácná, kdežto odpovídající aminokyselina donoru je v této poloze akceptoru běžně uložena,

2) aminokyselina je uložena v bezprostřední blízkosti ně-

....... které z oblas.tí. CDR.nebo........ ........... - —-----------------------------

3) aminokyselina obsahuje v postranním řetězci atom, kte- _______rý se nachází přibližně 3 x 10^_1° m od oblasti CDR---=----— podle trojrozměrného modelu imunoglobulinu a je potenciálně schopen interakce s antigenem nebo CDR humanizované protilátky.

Zbytek, který vyhovuje podmínce 2), často vyhovuje také podmínce 3). Z tohoto důvodu je možno podmínku 2) vynechat a vzít v úvahu pouze ostatní dvě podmínky. Podle vynálezu je tedy možno zařadit zbytek aminokyseliny z oblasti FR donoru

- 18 spolu s oblastí CDR v případě, že zbytek splňuje alespoň jedno z následujících kriterií:

a) aminokyselina se v rámcové oblasti lidského akceptoru v uvedené poloze vyskytuje vzácně, kdežto odpovídající aminokyselina donoru se v této poloze akceptoru běžně vyskytuje,

b) aminokyselina obsahuje v podstranním řetězci atom, který se nachází přibližně 3 x 10^-10 m od oblasti CDR podle trojrozměrného modelu imunoglobulinu a je potenciálně schopen interakce s antigenem nebo s oblastí CDR humanizované protilátky,

c) aminokyselina se nachází v poloze, která je jednou z určujících poloh pro strukturu kanonické oblasti CDR,

d) aminokyselina je v poloze, která je ve styku s lehkým a těžkým řetězcem tam, kde mezi těmito řetězci dochází ke vzájemnému styku.

Pokud jde o podmínku a), je aminokyselina běžná v případě, že se v uvedené poloze nachází nejméně v 90 % protilátek téže podskupiny, jak je popsáno ve svrchu uvedené publikaci Kabat a další. Aminokyselina se vzácně vyskytuje v případě, že je možno ji v uvedené poloze nalézt u méně než 10 % protilátek téže podskupiny.

Pokud jde o podmínku c), je uvedenou polohu zbytku možno jednoznačně stanovit na základě informací, uvedených ve svrchu zmíněné publikaci Chothia a další.

Pokud jde o podmínky b) ad), je zapotřebí předem provést modelování molekuly variabilních oblastí protilátky. K .< tomu účelu je možno použít jakýkoliv běžně dodávaný software pro modelování molekul, výhodné je použití softwaru AbM (Oxford Molecular Limited, lne.).

• · · · • · • ·

- 19 Předpovědi, provedené pomocí modelování molekul mají omezenou přesnost. Z tohoto důvodu byla struktura, získaná tímto způsobem ještě srovnávána s krystalografickými hodnotami, získanými pomocí rtg-záření z variabilních oblastí různých protilátek.

Při použití strukturního modelu, získaného modelováním pomocí softwaru AbM se předpokládá, že dva atomy jsou spolu ve styku prostřednictvím van der Waalsových sil v případě, že vzdálenost mezi těmito dvěma atomy je menší než součet jejich van der Waalsových poloměrů + 0,5 x 10 m. Je možno předpokládat přítomnost vazby vodíku v případě, že vzdálenost mezi polárními atomy, například mezi dusíkem amidové skupiny a kyslíkem karbonylové skupiny v hlavním a vedlejším řetězci je kratší než 2,9 x 10~ m, to znamená průměrnou délku vazby vodíku + 0,5 x 10 m. Mimoto v případě, že vzdálenost mezi dvěma atomy s opačným nábojem je kratší než 2,85 + 0,5 x 10~ m, je možno předpokládat tvorbu iontového páru.

Polohy aminokyselin rámcové oblasti, které jsou často ve styku s oblastí CDR, byly identifikovány na základě krystalografických údajů variabilních oblastí různých protilátek na bázi rtg-záření. Tyto polohy byly stanoveny bez ohledu na podskupiny protilátek. V případě lehkých řetězců jde o polohy 1, 2, 3, 4, 5, 23, 35, 36, 46, 48, 49, 58, 69, 71 a 88 a v případě těžkých řetězců běží o polohy 2, 4, 27, 28, 29, 30, 36, 38, 46, 47, 48, 49, 66, 67, 69, 71, 73, 78, 92, 93, 94 a---103. Číslování aminokyselin bylo provedeno podle svrchu uvedené publikace Kabat a další. Toto číslování bude i dále používáno. V případě využití modelování molekul bylo prokázáno, že aminokyseliny ve svrchu uvedených polohách jsou ve styku se zbytky v oblasti CDR ve dvou třetinách variabilních oblastí zkoumaných protilátek.

Svrchu uvedené informace byly použity k formulaci podmínky b). V případě, že poloha aminokyseliny v oblasti FR odpovídá podle modelu molekuly styku s oblastí CDR a současně se pokusně prokáže krystalograficky, že je podle analýzy rtg-zářením skutečně ve styku s oblastí CDR, pak její naroubování do donoru je výhodné. V případě ostatních možností se podmínka b) nebere do úvahy.

Obdobně, pokud jde o podmínku d), je možno na základě krystalografie pomocí rtg-záření z variabilních oblastí řady protilátek prokázat, že zbytky aminokyselin v polohách 36, 38, 43, 44, 46, 49, 87 a 98 v lehkých řetězcích a v polohách 37, 39, 45, 47, 91, 103 a 104 těžkých řetězců jsou často uloženy v místě styku lehkého a těžkého řetězce. V případě, že poloha těchto aminokyselin v lehkém a těžkém řetězci rovněž odpovídá molekulovému modelu, pak sedává naroubování tohoto zbytku aminokyseliny přednost. Jinak se podmínka d) nebere do úvahy.

Součást podstaty vynálezu tvoří také DNA a RNA pro svrchu uvedené protilátky, zejména DNA. Součást podstaty vynálezu tvoří i kódová DNA a RNA pro těžké a lehké řetězce protilátek.

«Λ řýja m Ή ínl/AiilzAlnv A <4κι Λ\ι i 1 uiuazjC ni-l υ J ah.Uu.x\v±x v viivúiiUu x L/xiiiU. s výhodou do vektoru pro expresi.

Je zřejme, ze DNA pro uložení do vektoru, Může být také spojena s jakoukoliv jinou vhodnou se-kv-enc-í-, například s vedoucí sekvencí nebo se sekvencí pro expresi kódované bílkoviny ve formě složené bílkoviny.

Součást podstaty vynálezu tvoří také hostitelská buňka, transformovaná takovým vektorem a systém pro expresi bílkoviny podle vynálezu, tvořený hostitelskou buňkou, transformovanou nejméně jedním vektorem pro. expresi, v němž je • · • ·

uložena svrchu uvedená DNA. Bílkoviny podle vynálezu je pak možno získat pěstováním transformovaných buněk při použití obvyklých postupů.

Dále budou popsána některá výhodná provedení způsobu podle vynálezu.

V jednom z těchto provedení je možno připravit geneticky pozměněný imunoglobulin M, IgM s vysokou účinností při vyvolávání apoptosy, bez řetězce J, imunoglobulin je tvořen lehkým řetězcem se sekvencí aminokyselin SEQ ID No. 78, lehkým řetězcem aminokyselin SEQ ID No. 80, lehkým řetězcem aminokyselin SEQ ID No 82 nebo lehkým řetězcem aminokyselin SEQ ID No. 84 a jedním těžkým řetězcem aminokyselin SEQ ID No. 86 nebo těžkým řetězcem aminokyselin SEQ ID No. 88.

Je zřejmé, že imunoglobulin obsahuje nebo může obsahovat čtyři výhodné lehké řetězce a dva výhodné těžké řetězce. Přitom může být každý z lehkých řetězců kombinován s kterýmkoliv těžkým řetězcem. Jsou tedy možné následující výhodné kombinace:

Lehký

řetězec

SEQ

ID

No.

78

a

těžký

řetězec

SEQ

ID

No.

86.

Lehký

řetězec

SEQ

ID

No.

78

a

těžký

řetězec

SEQ

ID

No.

-88-.

Lehký

řetězec

SEQ

ID

No.

80

a

těžký

řetězec

SEQ

ID

No.

86.

Lehký

řetězec

SEQ

ID

No.

80

a

těžký

řetězec

SEQ

ID

No.

88.

Lehký

řetězec

SEQ

ID

No.

82

a

těžký

řetězec

SEQ

ID

No.

86.

Lehký

řetězec

SEQ

ID

No.

82

a

těžký

řetězec

SEQ

ID

No.

88.

Lehký

řetězec

SEQ

ID

No.

84

a

těžký

řetězec

SEQ

ID

No.

86.

Lehký

řetězec

SEQ

ID

NO.

84

a

těžký

řetězec

SEQ

ID

No.

88.

·· 4 4

Součást podstaty vynálezu tvoří také kódová DNA pro svrchu uvedených osm bílkovin. Tyto sekvence budou dále uvedeny jako kódové sekvence SEQ ID Nos. 77, 79, 81, 83, 85 a 87 pro sekvence bílkovin SEQ ID Nos. 78, 80, 82, 84, 86 a 88. Výhodná je také DNA, která hybridizuje s takovou DNA, s výhodou při teplotě 60 až 70 °C v 6 x SSC.

Dále je výhodný také rekombinantní vektor, který obsahuje kteroukoliv ze svrchu uvedených DNA. Zvláště jde o rekombinantní vektory pHkKY2-58, pHkKF2-19, pHkRY2-10, pHkRF2-52,

buňky, transformované těmito vektory, zvláště jde o E. coli kmen pHkKY2-58, FERM BP-5861, E. coli kmen pHkKF2-19, FERM BP-5860, E. coli kmen pHkRY2-10, FERM BP-5859, E. coli kmen pHkRF2-52, FERM BP-5862, E. coli kmen pH/UH5-l, FERM BP-5863 a E. coli kmen pH/uMl-1, FERM BP-5864.

Výhodný postup pro výrobu imunoglobulinu podle vynále zu tedy spočívá v tom, že se:

pěstuje buňka, transformovaná svrchu uvedeným vektorem DNA za podmínek, při nichž může dojít k expresi kódové DNA pro řetězec H nebo řetězec L imunoglobulinu, obsažené ve vektoru a imunoglobulin se z kultury izoluje.

Uvedeným způsobem byly úspěšně klonovány kódové geny pro řetězce H a L myší monoklonální protilátky IgM proti lidskému Fas z banky cDNA, připravené z buněk hybridomu, produkujícího protilátky. Byly analyzovány nukleotidové sekvence v plné délce. Pak byly v každém řetězci identifikovány polohy v oblastech CDR. Byly vybrány sekvence aminokyselin, obsahující tyto oblasti CDR a mimoto několik zbytků aminokyselin z rámcových oblastí. Tyto sekvence byly naroubovány do řetězců H a L lidského imunoglobulinu IgM k získání úplných

řetězců H a L pro humanizovanou protilátku proti lidskému antigenu Fas.

Kódová DNA pro humanizované řetězce H a L byla klonována při použití vektorů pro expresi. Při současné transfekci živočišných buněk vektorem pro expresi řetězce H a vektorem pro expresi řetězce L bylo možno získat bílkovinu, vyvolávající apoptosu s funkcí protilátky proti lidskému Fas.

DNA podle vynálezu je možno získat tak, že se nejprve připraví poly(A)⁺RNA z buněk myšího hybridomu, produkujících monoklonální protilátku proti lidskému Fas, například CH11. Tato poly(A)⁺RNA se pak převede na cDNA při použití reverzní transkriptázy a kódová cDNA. pro řetězce H a L protilátky se pak čistí. V publikaci Yonehara a další, 1989, J. Exp. Med., 169, 1747 a následující se popisuje příprava monoklonální protilátky proti lidskému Fas, označené CH11, fúzí buněk myšího myelomu s myšími lymfocyty po imunizaci myší buněčnou linií lidských diploidních fibroblastů FS-7, u nichž dochází k expresi Fas. Protilátky CH11 z uvedeného hybridomu se běžně dodávají (Igaku-seibutsugaku Kenkyujo K. K.).

Poly(A)⁺RNA je možno získat tak, že se nejprve připraví celá RNA a pak se z ní čistí poly(A)⁺RNA například při použití sloupce pro afinitní chromatografií s náplní oligo(dT) celulosy, oligo(dT) latexových kuliček a podobně, nebo je možno poly(A)⁺RNA čistit přímo z materiálu s obsahem rozrušených buněk při použití týchž postupů. Celkovou RNA je možno připravit například v ultraodstředivce při použití hustotního gradientu sacharosy v alkalickém prostředí podle publikace Dougherty W. G. a Hiebert E., 1980, Virology, 101, 466 až 474, postupem s použitím guanidinthiokyanátu a fenolu nebo guanidinthiokyanátu a trifluorcesia nebo při použití fenolu a SDS. Při výhodném postupu se užívá guanidinthiokyanátu a chloridu česného podle ChirgwinJ. M. a další, 1979, Biochemistry 18, 5294 až 5299.

• ·· · • ·

• ·

Pak Je možno cDNA s jednoduchým řetězcem (ss), získanou použitím reverzní transkriptázy, jak je svrchu uvedeno, převést na cDNA s dvojitým řetězcem (ds). Vhodnými postupy pro přípravu ds cDNA jsou například postupy s použitím Sl-nukleázy podle Efstratiadis A. a další, 1976, Cell, 7, 279 až 288 a Gubler-Hoffmanův postup podle Gubler U. a Hoffman B. J., 1983, Gene, 25, 263 až 269. Velmi výhodný je také způsob podle publikace Okayama H. a Berg P., 1982, Mol. Cell. Biol., 2, 161 až 170.

Svrchu získanou ds cDNA je pak možno uložit do vektoru pro klonování a výsledný rekombinantní vektor je možno použít k transformaci vhodného mikroorganismu, například E. coli. Transformanty je možno podrobit selekci pomocí standardních postupů, například na základě uložení odolnosti proti tetracyklinu nebo ampicilinu do rekombinantního vektoru. V případě použití E. coli.je možno transformaci uskutečnit podle publikace..Hanahan. D.., 1983, J. Mol. Biol., 166, 557 až 580. Rekombinantní vektor je také možno uložit do kompetentních buněk, připravených současným vystavením buněk působení chloridu vápenatého a chloridu hořečnatého nebo chloridu rubidia. V případě, že je jako vektor použit plasmid, je vysoce žádoucí, aby tento plasmid obsahoval gen pro odolnost proti určité látce, stejně jako svrchu, k usnadnění selekce. Přestože jsou prozatím uváděny pouze plasmidy, je zřejmé, že je možno použít i jiné prostředky pro klonování, například fágy lambda.

Dále budou uvedeny některé postupy pro selekci transformantů, obsahujících požadovanou DNA.

1) Použití syntetického oligonukleotidu jako sondy

V případě, že je známa celá sekvence aminokyselin požadované bílkoviny nebo její část, je možno zkonstruovat krátkou sekvenci, která je rovněž representativní pro požaφφφφ • · φ · · φ · · φ · • · · φφφ φφφφ φ φ φ · φ φφ β ·· φ φ · · φφφφ φφφ ·Φ· • · φφ φφ ·' φ · φφ

- 25 dovánou bílkovinu a při použití této sekvence je pak možno zkonstruovat oligonukleotidovou sondu. Tato sonda obsahuje kódovou sekvenci pro řetězec aminokyselin, avšak vzhledem k degeneraci genetického kódu je možno připravit velké množství takových sond. Za obvyklých podmínek se tedy volí sekvence aminokyselin, pro niž může být kódovou sekvencí omezený počet oligonukleotidů. Počet oligonukleotidů, které je zapotřebí zkonstruovat, je možno dále snížit náhradou inosinu v těch případech, kdy je možno použít některou ze čtyř obvyklých baží. Sonda se pak značí vhodným způsobem, napří32 35 klad při použití P, S nebo biotinu a pak se hybridizuje s denaturovanou, transformovanou DNA z transformantu, imobilizovaného na nitrocelulosovém filtru. Pozitivní kmeny je možno identifikovat na základě značení v sondě.

2) Použití PCR

V případě, že byl analyzován celý řetězec aminokyselin požadované bílkoviny nebo jeho část, je možno syntetizovat oligonukleotidové primery ve směru a proti směru exprese, odpovídající určitým částem sekvence aminokyselin. Tyto primery je pak možno použít k uskutečnění PCR podle publikace Saiki R. K. a další, 1988, Science, 239, 487 až 491 k amplifikaci požadovaného kódového fragmentu DNA pro podjednotku myší monoklonální protilátky proti lidskému antigenu Fas. DNA, použitá jako matrice může být cDNA, připravená pomocí reverzní transkriptázv při použití mRNA, získané z hybridomu, produkujícího protilátku proti lidskému Fas, například hybridomu, u nějž dochází k expresi CH11. Takto syntetizované fragmenty DNA je možno přímo integrovat do plasmidu jako vektoru, například při užití běžně dodávané soupravy, nebo je možno ji označit například P, S nebo biotinem a pak použít jako sondu pro hybridizaci kolonií nebo plaků k získání požadovaného klonu.

···♦ ···· ♦ · · ·· · ·· · · • · · · · ·' ·· · · • φ · · ® · φ · · © φ φ · ···· · · ···· • Φ 9 9 9 9 9, 9 9 9 9

- 26 Monoklonální protilátka CH11 je imunoglobulin M, jde o komplex, který obsahuje pět podjednotek, z nichž každá je tvořena řetězcem H a řetězcem L·, mimoto obsahuje protilátka jeden řetězec J. Aby bylo možno analyzovat sekvenci aminokyselin v podjednotkách, je zapotřebí podjednotky oddělit jakýmkoliv vhodným způsobem, například elektroforézou, chromatografií na sloupci nebo jiným běžným postupem. Po oddělení podjednotek je pak možno analyzovat jejich sekvenci, například při použití zařízení pro automatickou analýzu sekvence bílkovin (např. PPSQ-10, Shimadzu) tak, aby bylo možno určit sekvenci aminokyselin alespoň na N-konci každé podjednotky. Na základě získaných poznatků je pak možno zkonstruovat oligonukleotidové primery.

Izolaci kódové DNA pro každou podjednotku monoklonální protilátky proti lidskému Fas z příslušných transformantů, získaných svrchu uvedeným způsobem, je možno uskutečnit známými postupy, například podle publikace Maniatis T. a další, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1982. Je například možno vyjmout z DNA plasmidů kódovou oblast v DNA pro požadovanou podjednotku po oddělení frakce, odpovídající vektorové DNA z transformantu, obsahující požadovaný plasmid.

Kmen E. coli DH5alfa byl transformován při použití plasmidů, obsahujících kódovou DNA pro těžký a lehký řetězec CH11, připravenou svrchu uvedeným způsobem a výsledné--__ dva transformanty byly označeny E. coli pCR3-H123 a E. coli PCR3-L103 a uloženy za podmínek Budapeštské úmluvy do sbírky mikroorganismů Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo (HIBH) 28. února 1996 pod přírůstkovými čísly FERM BP-5427 a FERM BP-5428. Kmen E. coli DH5alfa s obsahem uvedených plasmidů je možno pěstovat stejným způsobem jako kmen, který.tyto plasmidy neobsahuje. Všechny kmeny je možno.podro·· «·«· ·· 9999 ··99 • · 9 9 · · · · ·9 · · 9 · · · ·· · • · · · « 9 9 9 99 9 99

9 9 9 9 i 9 · ·· ·· 99 ·· 9 9999

- 27 bit selekci na základě jejich odolnosti k ampícilinu. DNA podle vynálezu může být získána při použití uvedených kmenů. To je možno uskutečnit pěstováním těchto kmenů a izolací příslušných plasmidů nebo při použití PCR s využitím plasmidů jako matric.

Analýzu sekvence DNA je možno uskutečnit různými známými postupy, například při použití chemické modifikace podle publikace Maxam A. M a Gilbert W., 1980, Methods in Enzymology, 65, 499 až 276 nebo při využití fágu M13 podle publikace Messing J. a Vieira J., 1982, Gene, 19, 269 až 276. V posledních letech je pro analýzu sekvence DNA často používán ještě další postup, pří němž se místo obvyklého radioizotopu používá fluorogenní barvivo. Celý postup je upraven tak, aby při něm bylo možno využít počítač včetně odečtení nukleotidové sekvence po elektroforéze. Vhodným komplexním zařízením k provádění tohoto postupu je například robot Perkin-Elmer Sequence robot CATALYST 800 a model 373A pro analýzu sekvence DNA (Perkin-Elmer). Při použití této techniky je možno analyzovat nukleotidovou sekvenci DNA bezpečně a současně velmi účinně.

Na základě údajů, získaných tímto způsobem pro nukleotidové sekvence a tím i pro N-terminální sekvence aminokyselin v řetězci H a L protilátky CH11 je pak možno stanovit úplnou sekvenci aminokyselin této protilátky.

Oblasti CDR, FR a konstantní oblast řetězce H a L pro-_____ tilátky CH11 byly identifikovány srovnáním sekvence aminokyselin v řetězci H a L a známé sekvence aminokyselin imunoglobulinu podle svrchu uvedené publikace Kabat a další.

Kódová DNA pro variabilní oblasti řetězce H a L humanizované protilátky proti lidskému Fas podle vynálezu může být připravena celou řadou postupů.

·· 9999 ♦ · ·* • · · ·· · · ♦ · ·

9 9 9 9 9 9 9 99

9 ··· «♦ · 9999 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

99 99 9 99 99

- 28 Při jednom z těchto postupů je možno syntetizovat polynukleotidové fragmenty o délce 60 až 70 nukleotidů, které představují část nukleotidové sekvence požadované DNA. Při syntéze se postupuje tak, aby zakončení fragmentů pozitivních řetězců se střídalo se zakončením fragmentů negativních řetězců. Výsledné polynukleotidové fragmenty je možno vzájemně spojovat a vázat pomocí DNA-ligázy. Tímto způsobem je možno připravit kódové fragmenty DNA pro variabilní oblasti řetězce H a L humanizované protilátky proti antigenu Fas.

Je také možno postupovat tak, že se kódová DNA pro celou variabilní oblast akceptoru izoluje z lidských lymfocytů. K uložení restrikčních míst do kódových oblastí CDR donoru je možno použít cílenou tvorbu mutace. Oblasti CDR je pak možno z akceptoru vyjmout působením příslušného restrikčního enzymu. Kódová DNA pro CDR donoru pak může být syntetizována a uloženy do molekuly akceptoru při použití DNA-ligázy.

Je výhodné připravit kódovou DNA pro variabilní oblast řetězce H a L požadované humanizované protilátky proti lidskému Fas pomocí PCR a překrývajících se prodloužených konců podle publikace Horton a další, 1989, Gene, 77, 61 až 68.

Uvedený postup při využití PCR dovoluje spojit dva fragmenty DNA, z nichž každý je kódovou sekvencí pro požadovanou sekvenci aminokyselin. Jako příklad je možno uvést dva fragmenty, označené A a B. Syntetizuje se negativní primer C o 20 až 40 nukleotidech, který se připojí na 5 -oblast---fragmentu A a pozitivní primer D o 20 až 40 nukleotidech, který se naváže na 3'-oblast fragmentu B. Pak je zapotřebí použít ještě dva primery. První z nich je chimérní negativní primer E, obsahující 20 až 30 nukleotidů z 3'-oblasti fragmentu A, spojených s 20 až 30 nukleotidy z 5*-oblasti fragmentu B. Druhým z těchto primerů je pozitivní primer F, který je komplementární k negativnímu primerů. λ •·· 4444 • · · 4 4 · 4 4 44 • « · · · · 9 999 *9 · e 4 · · 4 ····4 • « 9 9 9 9 9 9 99

99 99 9 9999

- 29 Reakci PCR je možno provést při použití primerů C a F v kombinaci s matricí DNA, obsahující fragment A. Tímto způsobem je možno připravit DNA, tvořenou 20 až 30 nukleotidy 5'-oblasti fragmentu B, navázanými na 3'-oblast fragmentu A. Vytvořený fragment byl označen G.

Obdobným způsobem je možno uskutečnit PCR při použití primerů D a E v kombinaci s matricí DNA, obsahující fragment B. Tímto způsobem je možno připravit DNA, tvořenou 20 až 30 nukleotidy 3'-oblasti fragmentu A, spojenými s 5'-oblastí fragmentu B. Tento fragment byl označen H.

Fragmenty G a H obsahují komplementární sekvence 40 až 60 nukleotidů ve 3'-oblasti fragmentu G a 40 až 60 nukleotidů v 5'-oblasti fragmentu H. Je možno uskutečnit PCR reakci při použití směsi fragmentů G a H jako matrice. V prvním denaturačním stupni vzniká DNA s jednoduchým řetězcem. V následujícím spojovacím stupni dochází k návratu většiny DNA do originální formy. Část DNA však vytvoří heterologní DNA duplex vzhledem k navázání fragmentů G a H do oblasti, v níž se řetězce překrývají. Při následující extenzi se přečnívající jednoduché části řetězce upravují za vzniku chimérní DNA, která představuje vazbu fragmentů A a B. Tento fragment DNA byl pak označen jako fragment I, který může být amplifikován při použití primerů C a primerů D.

:---——V jednom z provedení způsobu podle vynálezu mohou_____ fragmenty A a B představovat kódovou DNA oblasti CDR řetězce H ,a L myší humanizované monoklonální protilátky proti lidskému Fas, kódovou DNA pro oblasti FR lidského imunoglobulinu IgM nebo kódovou DNA pro sekreční signál pro lidský imunoglobulin IgM.

Kodon nebo kodony., odpovídající jednotlivým požadovaným aminokyselinám jsou známé. Při konstrukci sekvence DNA,

- 30 při jejímž použití má být připravena bílkovina, je možno zvolit jakýkoliv vhodný kodon. Kodon je možno zvolit například na základě kodonů, vyskytujících se v hostiteli. Částečné modifikace nukleotidové sekvence je možno provést běžnými postupy pro cílenou tvorbu mutací při použití syntetických oligonukleotidových primerů s kódovými řetězci pro požadované modifikace podle publikace Mark D. F. a další, 1984, Proč. Nati. Acad. Sci., USA 81, 5662 až 5666. Při použití vybraných primerů pro zavedení specifické bodové mutace nebo mutací je možno připravit kódovou DNA pro variabilní oblasti řetězců H a L jakékoliv požadované humanizované protilátky proti lidskému Fas.

Integrace takto získané DNA podle vynálezu do vektoru pro expresi dovoluje transformaci prokaryotických nebo eukaryotických hostitelských buněk. Tyto vektory pro expresi typicky obsahují vhodné, promotory, replikační místa a sekvence, účastnící se exprese genů a umožňují tak expresi DNA v hostitelské buňce.

Čtyři kmeny transformantů, obsahující plasmidy s kódovými oblastmi pro variabilní oblasti řetězců L humanizované protilátky proti lidskému Fas byly uloženy do sbírky mikroorganismů Kogyo Gijutsuin Feimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkvujo, 11. března 1997 podle Budapešťské úmluvy. Jde o kmeny E. coli pHkKY2-58, E. coli pHkKF2-19,,E. coli pHkRY2-10 a E- coli pHkRF2-52, uložené pod přírůstkovými čísly FERM BP-5861, BP-5860, BP-5859 a BP-5862. ~

Dva transformované kmeny, obsahující plasmidy s kódovou! sekvencí pro variabilní oblasti řetězců H humanizované protilátky proti lidskému Fas byly uloženy do svrchu uvedené sbírky rovněž 11. března 1997, šlo o kmeny E. coli pH/UH5-l, a E. coli pH/uMl-1, tyto -kmeny byly označeny přírůstkovými čísly FERM BP-5863 a BP 5864.

• to '···· '·· ···· toto ·· to · toto to to · · · ·· · · · · · · · to ·· · · · · · · .·· · · · ···· ··· ··· ·· to· to· · ·· · ·

- 31 DNA podle vynálezu je možno připravit při použití uvedených uložených kmenů. Je možno postupovat například tak, že se kmeny pěstují a pak se z nich izolují plasmidy, nebo se provádí PCR při použití těchto plasmidů jako matric.

Vhodným prokaryotickým hostitelem je například Escherichia coli a Bacillus subtilis. K dosažení exprese požadovaného genu v tomto buněčném materiálu je možno hostitelské buňky transformovat plasmidem jako vektorem, obsahujícím replíkon, odvozený od čeledi, kompatibilní s hostitelem a typicky obsahujícím počátek replikace a sekvenci promotoru, například lac UV5. Tyto vektory s výhodou obsahují také sekvenci, která přenáší na transformované buňky fenotyp pro příští selekci těchto buněk.

Vhodným kmenem E. coli je kmen JM1O9, odvozený od E. coli K12. Vhodné vektory jsou například plasmidy ze skupiny pBR322 a pUC. Vhodnými promotory jsou promotor pro laktozu, lac a promotor pro kryptofan laktozu trc. Je zřejmé, že vynález nemůže být omezen na použití jen některých hostitelských buněk, vektorů, promotorů a podobně a že je možno použít při provádění tohoto obecného postupu jakýkoliv vhodný systém podle potřeby.

Výhodným kmenem Bacillus subtilis je kmen 207-25 a> výhodným vektorem je pTUB228 podle publikace Ohrnuta K. a další, 1984, J. Biochem., 85, 87 až 93. Vhodným promotorem je řídící sekvence genů Bacillus subtilis pro‘alfa-amylázu. V případě potřeby je možno kódovou sekvenci DNA pro signální peptid sekvence pro alfa-amylázu navázat na DNA podle vynálezu k usnadnění extracelulární sekrece.

Vhodným eukaryotickým hostitelem mohou být buňky obratlovců, kvasinky a podobně. Z buněk obratlovců je možno uvést například opičí buněčnou linii COS podle publikace>

- 32 • · · '· '· ·

Gluzman Y. , 1981, Cell, 23, 175 až 182. Vhodnými kvasinkami jsou například Saccharomyces cerevisiae a Schizosaccharomyces pombe.

Obecným požadavkem na vhodný vektor pro expresi pro buněčný materiál obratlovců je přítomnost promotoru, obvykle proti směru exprese genu, k jehož expresi má dojít, přítomnost místa pro štěpení RNA, přítomnost polyadenylačního místa a sekvence pro ukončení transkripce a podobně. Mimoto může vektor ještě obsahovat podle potřeby počátek replikace. Vhodným plasmidem je například pSV2dhfr, obsahující časný promotor SV40 podle publikace Subramani S. a další, 1981, Mol. Cell. Biol., 1, 854 až 884.

Vhodným eukaryotickým mikroorganismem jsou kvasinky, například S. cerevisiae, vhodným vektorem pro kvasinky je například pAH301, pAH82 a YEp51. Vhodné vektory mohou obsahovat promotor genu pro alkoholdehydrogenázu podle publikace Bennetzen J. L. a Halí B. D., 1982, J. Biol. Chem., 257, 3018 až 3025, nebo promotor pro karboxypeptidázu Y,GAL10 podle publikace Ichikawa K. a další, 1993, Biosci, Biotech. Biochem., 57, 1686 až 1690. V případě potřeby může být na DNA, k jejíž expresi má dojít, navázána kódová sekvence DNA pro signální peptid karboxypeptidázy Y k usnadnění extracelulární exprese.

_____V případě buněk COS je vhodným vektorem vektor, obsahující počátek replikace, například SV40, umožňující autonomní růst, dále vektor obsahuje promotor transkripce, signál pro_;ukončení transkripce a místo sestřihu RNA. Vektor pro expresi může být použit k.transformaci buněk jakýmkoliv vhodným způsobem, například při použití DEAE-dextranu podle publikace Luthman H. a Magnusson G., 1983, Nucleic Acids Res., ···· •· •· •· ·· ·« ·· • «> · · • · · · · • · ··· · • · · postup se společným podle publikace Graham

- 33 11, 1295 až 1308, dále je možno použít srážením fosforečnanu vápenatého a DNA

F. L.a van der Eb A. J., 1973, Virology, 52, 456 až 457 a postup s otevřením pórů pomocí elektrického pulsu podle publikace Neumann E. a další, 1982, EMBO J., 1, 841 až 845. Ve výhodném provedení je možno uskutečnit současnou transakci buněk COS dvěma vektory pro expresi, z nichž jeden obsahuje kódovou DNA pro bílkovinu variabilní oblasti řetězce H protilátky CH11 a druhý kódovou DNA bílkoviny variabilní oblasti řetězce L protilátky CH11, k expresi těchto vektorů dochází současně za vzniku humanizované rekombinantní protilátky proti lidskému antigenů Fas.

Transformanty podle vynálezu je možno pěstovat běžnými metodami. Požadované bílkoviny zůstávají uvnitř buňky nebo jsou vylučovány mimo vnitřní prostor buněk. K pěstování je možno užít běžná živná'prostředí, která se volí podle typu hostitele. Výhodným prostředím pro buňky COS je například živné prostředí RPMI-1640 a Eaglovo minimální základní prostředí v Dulbeccově modifikaci, které může být ještě doplněno fetálním telecím sérem FBS. Pěstování může probíhat při jakékoliv teplotě, při níž nedochází k významnému snížení schopnosti buněk syntetizovat bílkoviny, jde obvykle o teplotní rozmezí 32 až 42 °C, nejvýhodnější je teplota 37 °C, zvláště pro buňky savců. V případě potřeby je možno pěstování uskutečnit v atmosféře, která obsahuje 1 až 10 % objemových oxidu uhličitého.______;_________________________.____,___________

Bílkovinu, k jejíž expresi došlo v transformantech podle vynálezu je možno izolovat a čistit různými známými postupy v závislosti na tom,zda k expresi došlo pouze intracelulárně nebo zda je bílkovina vylučována do živného prostředí, současně je nutno vzít do úvahy fyzikální a chemické vlastnosti bílkoviny. Vhodnými specifickými postupy pro oddělení bílkovin -jsou běžně užívaná srážecí činidla pro bílkoviny, ···· • 9 99 9 9

- 34 různé chromatografické postupy, jako ultrafiltrace, chromatografie při použití molekulového síta, jako filtrace na gelu, adsorpční chromatografie, chromatografie na iontoměniči, afinitní chromatografie a vysokotlaká kapalinová chromatografie HPLC, dále dialýza a různé kombinace těchto postupů.

Při použití svrchu uvedených způsobů je možno snadno připravit požadovanou bílkovinu ve vysokém výtěžku a s vysokou čistotou. I když humanizovaným protilátkám proti lidskému Fas chybí řetězec J, mají tyto protilátky cytotoxickou účinnost, srovnatelnou s účinností protilátky CH11 nebo účinnost ještě vyšší.

Specifická účinnost vazby bílkovin podle vynálezu na antigen Fas může být stanovena například metodou ELISA. Tento postup spočívá v tom, že se zkoumaný antigen imobilizuje na povrch vyhloubení..·plotny s 96 vyhloubeními a pak se do vyhloubení přidá/zkoumaný vzorek. Po promytí se povrch vyhloubení vystaví působení protilátky, značené enzymem, která specificky rozpoznává řetězec H (^u řetězec) lidského IgM. Pak se vyhloubení opět omyjí a prokazuje se jakékoliv značení, které ve vyhloubeních zbývá. Kódová cDNA pro lidský antigen Fas je známá látka a její uložení do živočišných buněk za účelem exprese je rovněž známé z publikace Itoh N. a další, 1991, Ceel. , 66, 233 až 243. Antigen pro použití při svrchu uvedeném postupu ELISA může být získán ze supernatantu kultury buněk, transformovaných vektorem pro expresi s obsahem kódového genu pro složenou bílkovinu, obsahující extracelulární oblast lidského antigenu Fas a extracelulární oblast myšího receptorů pro interleukin 3, jak je ve zmíněné publikaci uvedeno.

Schopnost bílkovin podle vynálezu vyvolat apoptosu je možno stanovit například tak, že se pě.stuje například buněčná linie lidských lymfocytů HPB-ALL (Morikawa S. a další, ·· ···· »· ···· • · • ·· • · · ·· ·· •· •· •· •· ·· ·· ·· •· · · •· ·· ♦ ·· ·· • ·· ·· ··

- 35 1978, Int. J. Cancer, 21, 166 až 170) nebo Jurkat (Američan Type Culture č. TIB-152) v prostředí, které zkoumaný vzorek již obsahuje nebo se k němu přidává. Pak se stanoví doba přežití zkouškou MTT podle publikace Green L. M. a další, 1984, J. Immunological Methods, 70, 257 až 268.

Při použití DNA podle vynálezu je možno připravit fragment Fv, který je tvořen pouze variabilními oblastmi řetězců H a L, nebo také fragment Fv s jednoduchým řetězcem, v němž jsou řetězce H a L spolu spojeny při použití ohebného peptidu scFv, podle publikace Huston J. S. a další, 1988, Proč. Nati. Acad. Sci. , USA, 85, 5879.

Vynález se týká také farmaceutických prostředků, které je možno použít k léčení svrchu uvedených stavů a onemocnění. Farmaceutický prostředek bude typicky obsahovat účinné množství bílkoviny podle vynálezu spolu s farmaceutickým nosičem. Tyto prostředky mohou být podávány jakýmkoliv vhodným způsobem, například parenterálně, nitrožilně, podkožně nebo místně. Zvláště v případech, kde onemocnění je omezeno na určitou část organismu, je výhodné bílkovinu podávat co nejblíže k takovému místu. Například ve velkých kloubech může být při revmatismu pociťována značná bolestivost a je tedy vhodné prostředek podávat přímo na takové místo. Při systemickém podávání bílkovin podle vynálezu je zvláště vhodné podávání ve formě bezpyrogenního vodného roztoku, vhodného pro parenterální podávání. Takový roztok musí vyhovovat pokud jde o pH, osmotický tlak, stálost a podobně. Mimoto mohou uvedené prostředky obsahovat ještě další složky, například látky, zpomalující růst buněk a podobně.

Dávky bílkovin podle vynálezu pro použití při jednotlivých specifických onemocněních mohou být určeny v závislosti na. různých faktorech, například na celkovém stavu nemocného, jehohmotnosti, pohlaví a způsobu stravování, na závažnosti • · · · • 9 · · · 9 9 9 9 9

9 9 ·· · 9 99 9

4 9 · · ,♦· · ···· ♦

9 9 ♦ · £ 9 99

Q6 9 9 99 Β ····

- 36 příznaků, době a způsobu podávání a na dalších faktorech. Konkrétní dávku musí vždy určit ošetřující lékař. Obecně je možno uvést, že se dávka bude pohybovat v rozmezí 1 až 1000 mikrogramů bílkoviny na kg hmotnosti.

Humanizované protilátky proti lidskému Fas podle vynálezu jsou schopné se vázat na lidský antigen Fas a současně vyvolávají ve vysokém stupni opoptozu. Jsou proto vhodné pro použití jako antirevmatické látky. Do těchto látek jsou zahrnuty také geneticky modifikované humanizované imunoglobuliny pro snížení potenciální toxicity prostředků.

Praktické provedení vynálezu bude nyní podrobněji osvětleno následujícími příklady, které jsou uvedeny pro ilustraci a uvádějí specifická provedení vynálezu, nejsou však určeny k omezení rozsahu vynálezu.

Jakékoliv postupy, prostředky, roztoky a podobně, které nejsou v příkladové části specificky uvedeny, je možno najít ve svrchu uvedené publikaci Molecular cloning - A laboratory Handbook. Pokud není výslovně uvedeno jinak, jsou všechny roztoky připraveny při použití sterilní deionizované vody.

• ·

- 37 Příklady provedení vynálezu

Referenční příklad 1

Klonování kódové DNA pro variabilní oblast myší monoklonální protilátky CH11 proti lidskému antigenu Fas (1-1) Příprava poly(A)⁺RNA

Celková RNA byla připravena z hybrídomu, produkujícího CH11, získaného podle publikace Yonehara a další, 1989, J. Exp. Med., 169, 1747 a následující způsobem podle publikace Chirgwin J. M. a další, 1979, Biochemistry, 18, 5294 a následující. Postup byl prováděn tak, že hybridom, produkující CH11 (Yonehara S. a další, 1994, International Immunology 6, 1849 až 1856) byl pěstován v prostředí ASF104 (Ajinomoto) s obsahem 10 % objemových fetálního telecího séra (Gibco). Přibližně 6,7 x 10 buněk bylo odděleno odstředěním a supernatant byl odložen. Výsledná usazenina buněk pak byla přímo smísena se 60 ml 4M roztoku guanidinthiokyanátu (Fluka). Buňky výsledné suspenze pak byly rozrušeny tak, že suspenze byla třikrát nasáta do stříkačky, opatřené jehlou č. 21. Takto získaný rozrušený materiál pak byl navrstven na 3 ml 5,7 M chloridu česného v 0,1 M roztoku EDTA o pH 7,5 ve zkumavce pro ultraodstředivku (13PA:Hitachi Koki) a pak byl ma- teriál odstředěn v rotoru Hitachi RPS-40T ve zkumavce 13PA při 150 000 g a teplotě 20 °C celkem 18 hodin k vysrážení RNA. Vysrážená RNA byla rozpuštěna ve vodě, roztok byl extrahován směsí chloroformu a 1-butanolu v objemovém poměru 4:1a pak byla RNA znovu vysrážená 100% ethanolem.

Pak byla z výsledné RNA, připravené svrchu uvedeným způsobem čištěna poly(A)⁺RNA běžným postupem podle publikace Sambrook J. a další, 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Lab., 7.26 až 7.28.

·· ···· ·· ······ ·· ·· · ·· · · · ·· e · · 9*9 9 999 · 9 9 9 9 · 9 999 99

9 9 9 ··.’ · ·· ee ·· 99 >·* ··

- 38 Postup byl prováděn tak, že polystyrénový sloupec pro jedno použití s průměrem 0,7 cm byl naplněn 100 mg oligo dT celulosy (Pharmacia, typ 7). Sloupec byl uveden do rovnovážného stavu s pufrem, obsahujícím 20 mM tris-HCl o pH 7,6, 0,5 M chloridu sodného, 1 mM EDTA a 0,1 % dodecylsulfátu sodného SDS. Celková RNA v množství přibližně 1,2 mg pak byla rozpuštěna v celkovém objemu 400 mikrolitrů vody zahřátím na 65 °C na 5 minut a pak bylo k roztoku přidáno 400 mikrolitrů svrchu uvedeného pufru, avšak s dvojnásobnou koncentrací. Výsledná směs byla zchlazena na teplotu místnosti a pak nanesena do sloupce. Frakce byly odebírány, zahřátý na dalších 5 minut na 65 °C a pak byly naneseny zpět do sloupce.

Pak byl sloupec promyt 10 ml svrchu uvedeného pufru a pak 5 ml téhož pufru s obsahem 0,1 M chloridu sodného k odstranění neadsorbovaného materiálu a také nespecificky adsorbovaného materiálu. Pak bylo do sloupce naneseno 5 ml elučního pufru, obsahujícího 10 mM tris-HCl o pH 7,5, 1 mM EDTA a 0,05 % SDS k eluci specificky adsorbovaného materiálu. Výsledný eluát byl zachycen ve frakcích po 200 mikrolitrech. Třetí a čtvrtá frakce s celkovým objemem 400 mikrolitrů byly spojeny a smíseny s 40 mikrolitry 3M octanu sodného o pH 4,0 a 1 ml 100% ethanolu. Výsledná směs byla uložena přes noc při teplotě -20 °C. Následujícího dne byla směs odstředěna v odstředivce při 10 000 g a teplotě 4 °Ccelkem 10 minut. Usazenina pak byla použita jako vzorek poly(A)⁺RNA a byla uložena při teplotě -80 °C až do použití.

(1-2) Klonování kódové DNA z variabilních oblastí

Fragmenty cDNA s kódovou sekvencí pro variabilní oblasti řetězce H a L myší protilátky CH11 proti antigenu Fas byly klonovány metodou RT-PCR, která zahrnuje použití reversní transkriptázy RT pro reversní transkripci při PCR-reakci.

• ·

Kombinace těchto postupů umožnila specifickou amplifikaci požadované sekvence ze vzorku poly(A)⁺RNA, získané z hybridomu, produkujícího .protilátku CH11, jak bylo popsáno svrchu v odstavci 1-1.

Ze sestavy Ig-Prime Set (Novagen) byly pro provedení reakce RT-PCR užity dvě skupiny primerů. MuIgV_H5^z-B a MuIgMV_u3'-l byly užity pro amplifikaci oblasti řetězce H, kdežto MuIgkV_L5* a MuIgMV_L3*-l byly použity pro aplifikaci oblasti řetězce L. Reakce RT-PCR byla provedena při použití skupiny primerů pro řetězec H i skupiny primerů pro řetězec L.

a) Reakce s reversní transkriptázou mikrolitrů reakčního roztoku s reverzní transkriptázou bylo připraveno smísením 10 mM tris-HCl o pH 8,3, 50 mM chloridu draselného, 0,1 mM dATP, 0,1 mM dGTP, 0,1 mM dCTP, 0,1 mM dTTP, 1,5 mM chloridu hořečnatého, 2,5 pmol primerů 3'-konce pro řetězec H nebo L, 50 ng poly(A)⁺RNA, připravené podle odstavce 1-1 a 20 jednotek reverzní transkriptázy (Biochemical Kogyo Co., Ltd.) z viru myší leukemie Moloney, MMLV a výsledná směs byla inkubována 1 hodinu při 42 °C.

b) Amplifikace pomocí PCR

Roztok s obsahem reversní transkriptázy, připravený ve stupni a), byl smí sen s 25 pmol 5* -primerů řetězce H nebo L a s pěti jednotkami Taq DNA-polymerázy (byl použit enzym ampliTaq, Perkin Elmer, Japonsko), do celkového objemu 100 mikrolitrů byl vzorek doplněn reakčním pufrem z dodané soupravy (pufry a^rroztoky enzymů jsou vždy použity z dodávané soupravy podle návodu výrobce, není-li uvedeno jinak). Výsledná reakční směs se zahřívá 2 minuty na teplotu 94 °C a pak se opakují cykly vždy 1 minuta při 94 °C,‘ 1 minuta • · ·· · · · · · · ··

- 40 při 50 °C a 2 minuty při 72 °C. Tyto cykly se opakují celkem 30x. Pak se roztok udržuje ještě 10 minut na 72 °C. K řízení reakční teploty při všech reakcích PLR se užije automatický systém pro amplifikaci genu pomocí PCR, č. 9600 (Perkin Elmer, Japonsko).

c) Zkouška na přítomnost produktu PCR

Podíl reakční směsi po ukončení PCR ve stupni b) se analyzuje elektroforézou na 1,5% agarosovém gelu (FMC Bioproducts). Produkt každé z reakcí PCR pro řetězec H a L se získá jako pás o přibližně 430 bp. Velikost pásu se stanoví srovnáním s označením pro molekulovou hmotnost, které se nechá probíhat v tomtéž gelu.

d) Klonování produktu PCR

Každý z produktů PCR, získaných ve stupni b) se uloží do odděleného vektoru typu plasmidu při použití soupravy TA pro klonování (Invitrogen). Postupuje se tak, že se 50 ng vektoru pCRII a čtyři jednotky T4 DNA ligázy (obě složky ze soupravy) přidají k reakčnímu pufru pro ligázu, který obsahuje 6 mM tris-HCl o pH 7,5, 6 mM chloridu horečnatého, 5 mM chloridu sodného, 7 mM beta-merkaptoethanolu, .0,1. mM ATP,.

mM dithiothreitolu ĎTŤ, 1 mM spermidinu a 0,1 mg/ml. sérového albuminu skotu. Reakční pufr pro ligázu obsahuje také podíl reakční směsi po provedení PCR, volený tak, aby obsahoval přibližně 10 ng požadovaného produktu PCR po stanovení elektroforézou na gelu ve stupni c). Výsledná směs se pak inkubuje 15 hodin při teplotě 14 °C.

Pak se 2 mikrolitry takto připravené směsi smísí s 50 mikrolitry E. coli, kmene T0P10F, který je přiložen k soupravě a který byl předem zpracován tak, aby byl kompetentní • · • · · · • ·

přidáním 2 mikrolitrů 0,5 M beta-merkaptoethanolu. Výsledná transformační směs se uloží na 30 minut do ledu, pak se zahřeje na 30 sekund na 42 °C, načež se opět uloží do ledu na další 2 minuty. Po této době se směs přidá k 500 mikrolitrům prostředí SOC, které obsahuje 2 g tryptonu, 0,5 % extraktu z kvasnic a 0,05 g chloridu sodného na 100 ml a mimo to 2,5 mM chloridu draselného, 1 mM chloridu horečnatého a 20 mM glukosy a výsledný materiál se pěstuje 1 hodinu při teplotě 37 °C na rotační třepačce při 110 ot/min. Výsledná kultura se pak nanese na plotny, obsahující agar s L-bujonem (1 g tryptonu, 0,5 g extraktu z kvasnic, 0,5 g chloridu sodného, 0,1 g glukosy a 0,6 g agaru Bacto (Difco) na 100 ml a mimoto 100 mikrogramů/ml ampicilinu a plotny se pak pěstují přes noc při teplotě 37 °C bez třepání.

Kolonie, odolné proti ampicilinu, získané tímto způsobem se podrobí selekci a pak se oddělí od živného prostředí pomocí platinové kličky. Buňky z vybraných kolonií se odděleně pěstují v 5 ml L-bujonu s obsahem 100 mikrogramů/ml ampicilinu přes noc při 37 °C. Pak se kultury odstředí k usazení buněk a z buněk se připraví plasmidová DNA rozrušením buněk v alkalickém prostředí podle svrchu uvedené publikace Sambrook a další. Byl získán plasmid pro každou sestavu primeru H a L, příslušné plasmidy byly označeny pVH4 (plasmid, obsahující fragment, amplifikovaný při použití příměrů pro řetězec H) a pVL8 (plasmid, obsahující fragment, amplifikovaný -P-ř.i_p_o_už i ti primeru pro řetězec L) .__

Referenční příklad 2

Analýza sekvence aminokyselin a sekvence nukleotidů pro variabilní oblasti CH11

« · · · · · · · · · • · · · · · · • · 4 β · · · • «β » β«e c e • · · · · · ·· 4 ·· ♦·

- 42 (2-1) Analýza N-terminální sekvence aminokyselin variabilních oblastí řetězce H a řetězce L CH11

a) Příprava CH11

Hybridom, produkující CH11, popsaný v příkladu 1, byl pěstován až do hustoty buněk 2 x 10 v prostředí ASF 104 (Ajinomoto) s obsahem 10 % objemových séra skotu (Gibco) a materiál se pak pěstuje v 50 ml prostředí ASF 104, prostého séra 5 dnů při teplotě 37 °C. Po této době se kultura odstředí 15 minut při 4 °C a při 15 000 g při použití rotoru č. 4 (Tommy Seiko) a supernatant se oddělí. Ze supernatantu se získá CH11 při použití dodané sestavy pro čištění protilátky, E-Z-Sep (Pharmacia Biotech).

b) Část čištěné, CH11, odpovídající 100 mikrolitrům supernatantu ze stupně a) se přidá k 10 mikrolitrům 100 mM tris-HC1 pufru o pH 6,8 s obsahem 10 % objemových beta-merkaptoethanolu a 4 g SDS na 100 ml. Výsledná směs se denaturuje tak, že se zahřeje na 5 minut na teplotu 95 °C. Denaturovaný vzorek se pak podrobí elektroforéze na 12% polyakrylamidovém gelu.

Po elektroforéze se gel uloží do pufru pro přenos s obsahem mM kyseliny borité a tris o pH 9,5 s 10 % objemovými methanolu a pak.se protřepává 15 minut při teplotě místnosti.. Pásy pro bílkovinu se z gelu přenesou na membránu z polyvinylidendifluoridu, PVDF (Nippon Millipore Ltd.) při použití příslušného přístroje k provedení biotu (Iwaki Glass Co. Ltd.) při konstantním proudu 0,2 A při 4 °C v průběhu 1 hodiny. Po této době se membrána PVDF barví při použití roztoku modři Coomassie Brilliant š koncentrací 0,1 % hmotnostní a pak se odbarví 100% methanolem. Je možno pozorovat pouze dvě hlavní skvrny pro bílkovinu, odpovídající řetězci H a řetězci L.

Tyto skvrny se vyříznou a gel s jejich obsahem se usuší při teplotě místnosti. - .

• · ♦ ·

c) Sekvence aminokyselin bílkovin, přenesených na membránu PVDF ve stupni b) se analyzuje v plynné fázi při použití automatického -analyzátoru PPSQ-10 (Shimadzu Corporation) při použití Edmanovy metody podle publikace Edman P. a další, 1967, Eur. J. Biochem., 1, str. 80 a následující. Takto byla analyzována N-terminální sekvence aminokyselin variabilní oblasti řetězce H v CH11 a také N-terminální sekvence aminokyselin řetězce L. Tyto sekvence jsou znázorněny jako sekvence SEQ OD NOs 13 a 14 v seznamu sekvencí.

(2-2) Analýza nukleotidové sekvence DNA

Úplná sekvence nukleotidů kódové cDNA pro variabilní oblasti řetězců H a L CH11 byla analyzována uložením do plasmidů pVH4 a pVL8 a analýzou uložených částí.

Vektor pCRII má. promotorovou sekvenci SP6 a promotoroveou sekvenci T7, každou na jedné straně uložené cDNA, takže je možno analyzovat sekvenci uložených částí pVH4 a pVL8 při použití zkonstruovaných oligonukleotidových primerů, které těmto sekvencím odpovídají (Perkin Elmer, Japonsko). Vzorky pro analýzu byly připraveny při použití těchto primerů a příslušné sestavy pro analýzu (Perkin Elmer, Japonsko). Jako matrice byla použita plasmidová DNA z plasmidů pVH4 nebo pVL8. Sekvence každé uložené cDNA byla analyzována při’použití- analyzátoru DNA model 373 (Perkin Elmer, Japonsko). Nikleotidová sekvence cDNA variabilní oblasti řetězce H je znázorněna jako SEQ ID č. 15, nukleotidová sekvence cDNA variabilní oblasti řetězec L je znázorněna jako SEQ IĎ č. 16.

Sekvence N-terminálních aminokyselin řetězce H CH11, představovaná aminokyselinami 1 až 15 sekvence SEQ ID č. 13 zcela odpovídá sekvenci aminokyselin, pro niž jsou kódovým řetězcem nukleotidy 32 až 76 sekvence SEQ ID Č. 15. Je tedy možno uzavřít, že plasmid pVH4 obsahuje kódovou sekvenci pro vyriabilní oblast řetězce H CH11.

Sekvence N-terminálních aminokyselin řetězce L protilátky CH11, představovaná aminokyselinami 1 až 21 sekvence SEQ ID č. 14 zcela odpovídá sekvenci aminokyselin, pro niž jsou kódovým řetězcem nukleotidy 29 až 91 sekvence SEQ ID č. 16. Je tedy možno odvodit, že plasmid pVL8 obsahuje kódovou DNA pro variabilní oblast řetězce L protilátky CH11.

Referenční příklad 3

Klonování kódové DNA pro úplné řetězce H, L a J protilátky CH11 (3-1) Příprava banky cDNA

Banka cDNA byla připravena způsobem podle publikace Okayama H. a další, 1987, Methods in Enzymology, 154, 3-28. Postupuje se tak, že se 5 mikrogramů poly(A)⁺RNA, připravená podle příkladu 1-1(a) z hybridomu, produkujícího CH11 přidá ke 30 mikrolitrům reakční směsi, tvořené 50 mM tris-HC1 o pH 8,3, 6 mM chloridu hořečnatého, 40 mM chloridu draselného, 2 mM dATP, 2 mM dGTP, 2 mM dCTP, 2 mM dTTP, 2 mikrogramy primerů vektoru, 3^,-oligo(dT)-prodloužení, pcDV-1 (Pharmacia) s obsahem 25 jednotek reverzní transkriptázy (Seikagaku Koqyo, Co., Ltd.) odvozené od viru ptačí myeloblastosy, AMV. Výsledná směs se inkubuje 30 minut při teplotě. 37 °C. “ ~ .·/ . . · _ .. . ý Ϊ .ý.....

---:----Po této době se přidá k reakční směsi ekvivalentní-------objem směsi fenolu a chloroformu v objemovém poměru 1 : 1 a reakční směs se důkladně promíchá. Výsledná směs se odstředí 5 minut při 10 000 g a vodná vrstva se oddělí (ten- to postup jé označován jako extrakce fenol-chloroformem). K výsledné vodné vrstvě se přidá 35 mikrolitrů 4M octanu amonného a 140 mikrolitrů 100% ethanolu, výsledná směs se na 15 minut zchladí na -70 ?G, načež.se odstředí 15 minut

při 4 °C a při 10 000 g. Usazenina se pak promyje 75% roztokem ethanolu (% objemová) a pak se vysuší za sníženého tlaku.

Vysušená sraženina se pak rozpustí ve 13 mikrolitrech destilované vody, pak se přidá 5,6 míkrolitrů směsi pro reakci s terminální transferázou, která obsahuje 140 mMkakodylátu sodného, 30 mM tris-HCl o pH 6,8, 1 mM chloridu kobaltnatého, 0,5 mM DTT, 0,3 mikrogramů polyadenylové kyseliny polyA (Pharmacia) a 0,2 mM dCTP a výsledná reakční směs se inkubuje 5 minut při teplotě 37 °C. Pak se přidá 21 jednotek terminální deoxynukleotidyltransferázy (Pharmacia) podle návodu výrobce a reakce se nechá probíhat 5 minut. Pak se reakční směs podrobí extrakci fenol-chloroformem. K oddělené vodné vrstvě se pak přidá 20 míkrolitrů 4M octanu amonného a 80 míkrolitrů 100% ethanolu, směs se chladí 15 minut na teplotu -70 °C a pak se 15 minut odstředí při teplotě 4 °C a při 10 000 g. Usazenina se promyje roztokem ethanolu s koncentrací 75 % objemových a pak se suší za sníženého tlaku.

Sraženina DNA, získaná tímto způsobem rozpustí ve 30 mikrolitrech reakční směsi, která obsahuje 10 mM tris-HCl o pH 7,5, 60 mM chloridu sodného, 7 mM chloridu horečnatého, přidá se 30 jednotek restrikčního enzymu HindlII. Obecně je možno uvést, že při použití- restrikčního enzymu nemusí jít o žádný specifický pufr, je možno užít ten pufr,“který je dodáván spolu s enzymem. V případě, že se DNA štěpí dvěma enzymy, provádí se toto štěpení postupně. Po prvním štěpení se DNA vysráží, znovu uvede do suspenze a pak se Štěpí druhým enzymem. Srážení a znovuuvedení do suspenze je známý postup, popsaný ve svrchu uvedené publikaci Sambrook a další. Všechny restrikční enzymy a pufry, použité v příkladové části, byly dodány Takara Schuzo.

- 46 DNA se štěpí přes noc při 37 °C v roztoku pro štěpení. Pak se reakční směs podrobí extrakci fenol-chloroformem. K oddělené vodné vrstvě se pak přidá 35 mikrolitrů 4M octanu amonného a 140 mikrolitrů 100% ethanolu a směs se 15 minut chladí na -70 °C. Pak se směs odstředí 15 minut při 4 °C a při 10 000 g k usazení DNA, výsledná usazenina se promyje ethanolem s koncentrací 75 % objemových a pak se suší za sníženého tlaku. Takto připravená vysrážená DNA se užije při následujícím postupu jako vzorek cDNA.

Paralelně se rozštěpí plasmidová DNA z vektoru pcDL-SRalfa296 (Takebe Y. a další, 1989, Jikken Igaku, Experimental Medicine, 7, str. 95 až 99) působením restrikčního enzymu Pstl. Produkt tohoto štěpení se zpracovává působením dGTP a terminální deoxynukleotidyltransferázy (Pharmacía) k navázání oligo dG na 3'-konec následujícím způsobem.

DNA plasmidu pCDL-SRakfa296 (100 mikrogramů v 50 mikrolitrech ) se přidá k 10 mikrolitrům lOx pufru pro působení terminální deoxynukleotidyltransferázy, lx pufr obsahuje 1,4 M kakodylátu sodného, 0,3 M tris-HCl o pH 7,6, 10 mikrolitrů 1 mM DTT, 20 mikrolitrů 0,1 mM ^Η-dGTP (Dupont) a 10 mikrolitrů terminální tranferázy (210 mezinárodních jednotek, Pharmacía). Směs se inkubuje 40 minut při teplotě 37 °C a pak se smísí sestejným objemempufru TE, nasyceného fenolem. Po určité době stání se vodnájvrstva oddělí a podrobí extrakci fenol-chloroformem. Po ukončení extrakce fenolem i fenolchloroformem se DNA vysráží při použití ÍÓÓ% ethanolu a pak se znovu uvede do suspenze v 50 mikrolitrech pufru TE.

' Celé.množství vysrážené DNA se štěpí restrikčním enzymem HindlII a produkty štěpení se děli elektroforézou na 1,8% agarosovém gelu. Z gelu se vyřízne pás o 800 bp a materiál se z gelu extrahuje při použití sestavy GENECLEAN , (Fukanoshi) podle návodu výrobce. Výsledná DNA se rozpustí

ve 100 mikrolitřech pufru TE a přidá se 100 mikrolitrů 100% ethanolu. Výsledná koncentrace DNA je 0,09 mikrogramů/mikrolitr.

Výsledným produktem je spojovník-DNA, v němž je oligo (dG) navázán na promotor SRalfa, jak je znázorněno na obr. 1, který je schematickým znázorněním konstrukce banky cDNA pro klonování kódové DNA pro celou délku každé podjednotky protilátky CH11. Na obr. 2 je pak znázorněn diagram, z nějž je zřejmý postup pro klonování a amplifikaci kódové DNA pro celou délku každé podjednotky protilátky CH11.

Vysrážený a usušený vzorek cDNA, připravený svrchu uvedeným způsobem se rozpustí v 10 mikrolitrech pufru TE, který obsahuje 10 mM tris-HCl o pH 7,5 a 1 mM EDTA. Pak se 1 mikrolitr výsledného roztoku přidá k reakčnímu pufru, obsahujícímu 10 mM tris-HCl o pH 7,5, 1 mM EDTA, 100 mM chloridu sodného a mimoto 0,08 pmol svrchu připraveného spojovníku-DNA. Výsledná směs se 5 minut zahřívá na 65 °C a pak se inkubuje 30 minut při teplotě 42 °C. Po této době se přidá 10 mikrolitrů lOx pufru pro ligázu, který obsahuje 10 mM ATP, 660 mM tris-HCl o pH 7,5, 66 mM chloridu horečnatého, 10 mM DTT, mimoto se přidá ještě 76 mikrolitrů destilované vody a 1 mikrolitr 10 mM beta-nikotinamidadenindinukleotidu, NAD (Boehringer Mannheim) a výsledná směs se chladí v ledu 10 minut. Pak se přidá 8,4 mg DNA ligázý z Έ. coli (Pharmacia) a výsledná směs se inkubuje přes noc při teplotě 12 C.

Po této inkubaci se k reakční směsi přidají 2 mikrolitry roztoku nukleotidů (2 mM dATP, 2 mM dCTP, 2 mM dGTP, 2· mM dTTP), 0,5 mikrolitrů 10 mM NAD, 42 mikrogramů DNA ligázy E. coli (Pharmacia), 4,1 jednotek DNA polymerázy I (Pharmacia) a 5,5 jednotek ribonukleázy H (Pharmacia). Výsledná směs se 1 hodinu inkubuje při teplotě 12 °C a pak

další 1 hodinu při teplotě 22 °C. Banka cDNA, připravená tímto způsobem se pak uloží až do použití při -20 °C.

(3-2) Klonování s použitím PCR

a) Příprava primerů

V případě řetězce H se sekvence aminokyselin variabilní oblasti řetězce H protilátky CH11, popsaná v příkladu 2, srovnává s databazí sekvence aminokyselin protilátky, připravenou podle publikace Kabat E. a další, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Vol. II, US Department of Health and Human Services. Bylo prokázáno, že řetězec H (/U řetězec) protilátky CH11 patří do podskupiny 2A. Z tohoto důvodu byl oligonukleotidový primer zkonstruován tak, aby byl schopen hybridizace s částí 5'-nepřenášené oblasti kódové DNA pro: myší řetězec H podskupiny 2a. Zvolený oligonukleotidový primer měl následující sekvenci SEQ ID č. 17, 5'-CTAAGGGAATTCCGCCTCTC CTCAGACACT GAA-3' (H5-1).

Byl také zkonstruován oligonukleotidový primer, schopný hybridizace s částí 3'-nepřenášené oblasti řetězce H protilátky CH11. Konstrukce tohoto oligonukleotidu byla založena na nukleotidové sekvenci kódové DNA pro konstantní oblast kódové DNA myšího imunoglobulinu M, popsané v publikaci Goldberg I. G. a dalším 1981, Gene, 15, 33 až 42, byla zvolena následující sekvence, SEQ ID č. 18 5'-TTTTACTCTA GAGACCCAAG GCCTGCCTGGTTGA-3' (H3-1).

V případě řetězce L se sekvence aminokyselin variabilní oblasti řetězce L protilátky CH11, popsaná v příkladu 2, srovnává s databazí pro sekvenci aminokyselin protilátky podle svrchu uvedené publikace Kabat a další. Bylo prokázáno, že řetězec L protilátky CH11 náleží do podskupiny k2. Z tohoto důvodu byl zkonstruován oligonukleotidový primer, schopný • ♦ 9 <

hybridizace s částí 5'-terminální nepřenášené oblasti kódové DNA pro myší řetězec L podskupiny k2. Byl vybrán oligonukleotidový primer s následující sekvencí SEQ ID č. 19: 5'-AAATAGAAT TCCAGTCTCC TCAGGCTGTC TCC-3' (L5-1).

Byl také připraven oligonukleotidový primer, schopný hybridizace s částí 3'-nepřenášené oblasti. Tento nukleotid byl svou konstrukcí založen na nukleotidové sekvenci kódové DNA pro konstantní oblast řetězce myšího imunoglobulinu k, registrovaného pod názvem MUSIGB1L1 (přírůstkové číslo D14630). Byla zvolena sekvence oligonukleotídu SEQ ID č. 20: 5'-ATGATCTCTA GAGTGGTGGC ATCTCAGGAC CT-3' (L3-1).

V případě řetězce J není přítomna variabilní oblast a kódová DNA pro řetězec J i sekvence aminokyselin řetězce J jsou známé z publikace Cann G. M. a další, 1982, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 79,. 6656 až. 6660. Na základě známých údajů . byly syntetizovány oligonukleotidové primery, schopné hybridizace s částí nepřenášených oblastí 5* a 3 kodové DNA pro řetězec J. Byly zvoleny oligonukleotidy s řetězcem SEQ ID č. 21: 5'-TTGCGGAATT CCTCACCTGT CCTGGGGTTA TT-3' (J5-1) a

SEQ ID č. 22: 5'-ATTGCCTCTA GAGCCTCTAA GGACAACGAC CT-3' (J3-1) ze seznamu sekvencí.

Uvedené oligonukleotidové primery byly syntetizovány při použití syntetizátoru 380 B (Perkin Elmer, Japonsko) pro· ____automatickou syntézu DNA fosfoamiditovou metodou podle publikace Mattrucci M. D. a Caruthers Μ. H., 1981, J. Am. Chem. Soc., 103, 3185 až 3191. Po ukončení syntézy byl každý primer odštěpen od nosiče a zbaven ochranných skupin a pak byl lyofilizován. Výsledný produkt byl rozpuštěn v destilované vodě . a pak byl až do použití uložen při -20 °C.

b) Amplifikace cílového genu pomocí PCR

Byl připraven reakční roztok k provedení PCR, obsahující 10 mM tris-HCl o pH 8,3, 50 mM chloridu draselného, 1,5 mM chloridu hořečnatého, 2,5 mM dATP, 2,5 mM dGTP, 2,5 mM dCTP, 2,4 mM dTTP a mimoto 0,1 mikrolitru banky cDNA, popsané v příkladu 3-1, jedna jednotka Taq DNA polymerázy (Perkin Elmer, Japonsko) a 15 pmol oligonukleotidového primerů, připraveného v příkladu 3-2a, užije se celkem 100 mikrolitrů reakčního roztoku pro PCR, směs se zahřívá 2 minuty na 94 °C a pak se směs podrobí cyklu vždy 1 minuta při 94 °C, pak 1 minuta při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Tento cyklus se opakuje 30x. Po posledním cyklu se roztok udržuje ještě 10 minut na teplotě 72 °C.

Dále jsou uvedeny kombinace primerů, které byly užity při. uvedených reakcích:

H5-1	a	H3-1	pro	řetězec	H,
L5-1	a	L3-1	pro	řetězec	L a
J5-1	a	J3-1	pro	řetězec	J.

c) Analýza produktu PCR

Po uskutečnění PCR ve stupni b) byl podíl reakční směsi analyzován elektroforézou na 0,8% agarosovém gelu v případě řetězce H. Pro řetězce L a J byl užit 1,5% agarosový gel (agarosa byla získána od FMC Bioproducts). Produkt reakce PCR byl uložen v pásu o přibližně 1900 bp v případě řetězce H, 800 bp v případě řetězce L a 650 bp v případě řetězce J. Rozměry jednotlivých pásů byly určeny-při použití značení pro molekulovou hmotnost na tomtéž gelu.

• · · ,· : i • ι :

- 51 d) Klonování produktu PCR

Každý z produktů PCR, získaný v odstavci b) byl uložen do vektoru typu plasmidu při použití sestavy TA pro klonování eukaryotů (Invitrogen). Postup byl prováděn tak, že bylo přidáno 60 ng vektoru pCR3 ze sestavy spolu se 4 jednotkami T4 DNA ligázy do pufru pro ligázu, obsahujícího 6 mM tris-HC1 o pH 7,5, 6 mM chloridu horečnatého, 5 mM chloridu sodného, 7 mM beta-merkaptoethanolu, 0,1 mM ATP, 2 mM DTT, 1 mM spermidinu a 0,1 mg/ml sérového albuminu skotu, mimoto směs obsahovala podíl reakční směsi po provedení PCR. Objem podílu reakční směsi po PCR byl zvolen tak, aby obsahoval přibližně 10 ng požadovaného produktu PCR po stanovení elektroforézou na gelu. Výsledná směs byla inkubována 15 hodin při teplotě 14 °C.

Podíl 2 mikrolitry směsi po reakci s ligázou byl smíšen s 50 mikrolitry buněk E. coli, kmen T0P10F ze sestavy, materiál byl předem zpracován tak, aby byl kompetentní přidáním 2 mikrolitrů 0,5 M beta-merkaptoethanolu. Výsledná směs byla uložena do ledu na 30 minut, pak byla zahřáta na 30 sekund na 42 °C, znovu uložena na 2 minuty do ledu a pak bylo ke směsi přidáno 500 mikrolitrů svrchu popsaného prostředí SOC a výsledná směs byla pěstována při teplotě 37 °C podobu 1 hodiny na rotační třepačce se 110 ot/min. Živné prostředí pak bylo naneseno na agarové plotny s L-bujonem, obsahující 100 mikrogramů/ml ampicilinu a kultury byly pěstovány přes noc při teplotě 37 °C. kolonie, které byly odolné proti ampicilinu, byly přenensy platinovou kličkou do 5 ml L-bujonu s obsahem 100 mikrogramů/ml ampicilinu a byly '.pěstovány přes, noc .při 37 °C. Pak .byly, kultury odstředěny k usazení buněk, které pak byly použity pro přípravu DNA plasmidu rozrušením v alkalickém prostředí podle svrchu uvedené publikace Sambrook a další.

·· ··♦· • φ ···· φφ ··

Tři z výsledných plasmidů byly označeny pCR3-H123 (plasmid s obsahem kódové cDNA pro řetězec H), pCR3-L103 (plasmid, obsahující kódovou cDNA pro řetězec L) a pCR3-J1123 (plasmid, obsahující kódovou cDNA pro řetězec j). Kompetentní buňky E. coli, kmen DH5alfa (Gibco), byly transformovány vždy jedním ze svrchu uvedených plasmidů a výsledné transformanty byly uloženy podle budapešťské úmluvy do veřejné sbírky kultur Research Institute of Life Science and Technology of the Agency of Industrial Science and Technology dne 28. února 1996 pod čísly FERM BP-5427, FERM BP-5428 a FERM BP-5429. Z těchto kmenů je možno snadno připravit kódovu DNA pro řetězce H, L a J protilátky CH11.

Referenční příklad 4

Určení úplné nukleotidové sekvence kódové cDNA pro řetězce

L, H a J protilátky CH11 (4-1) Stanovení nukleotidové sekvence DNA

Řetězec myšího imunoglobulinu M je tvořen N-terminální variabilní oblastí, obsahující přibližně 110 zbytků a konstantní oblastí, obsahující přibližně 470 zbytků, navazující na variabilní oblast. Řetězec k myšího imunoglobulinu je tvořen' N-terminální variabilní oblastí, obsahující;přibližně 110 zbytků a konstantní oblastí, obsahující 107 zbytků a na-v-a-zu-j-í-cú—na—uaniabilní—.Qblast. Bylo předpokládáno, že úplná nukleotidová sekvence kódové cDNA pro řetězec H a L protilátky CH11 bude tvořena kódovými nukleotidovými sekvencemi pro známé konstantní oblasti, vázanými na kódové nukleotidové sekvence pro variabilní oblasti těchto řetězců, jak bylo uvedeno v příkladu 2 a ve svrchu uvedené publikaci Kabat E.A. a další.

Bylo předpokládáno, že kódová nukleotidová sekvence pro řetězec J protilátky CH11 je totožná se známou sekvencí pro tento řetězec.

Na základě předpokládaných nukleotidových sekvenci byly syntetizovány oligonukleotidové primery v délce 20 nukleotidů, odpovídající sekvencím řetězců H, L a J, oddělené kódovými intervaly s délkou 60 až 200 bp. Tyto primery pak byly použity pro analýzu sekvence.

Syntetizované oligonukleotidové primery měly následující sekvence:

Pro řetězec H:

5’-TGGGGCCTCA GTGAAGATAT -3' (SHF-2; SEQ ID Š <. 23 5’-CAATGGTGGT ACTGGCTACA -3' (SHF-3; SEQ ID č. 24 5’-TGACATCTGA GGACTCTGCA -3' (SHF-4; SEQ ID č. 25 5’-TCCTCAGAGA GTCAGTCCTT -3* (SHF-6; SEQ ID ζ, 26 5’-TCCTTCACCT GGAACTACCA -3' (SHF-7; SEQ ID č2.7 5’-TCCCAAGAGC ATCCTTGAAG -3' (SHF-8; SEQ ID č.. 28 5’-AGATCTGCAT GTGCCCATTC -3’ (SHF-9; SEQ ID ζ29 5’-TCTAAACTCA TCTGCGAGGC-3'(SHF-10; SEQ ID č. 30 . ... .

5’-GGTGACCATC GAGAACAAAG -3' (SHF-11; SEQ ID č. 31 5ŮAGGGGTCTCACCTTCTTGAA -3' (SHF-12; SEQ ID č. 32 ------------:—:-----5’-TCCTTTGCCG ACATCTTCCT-3' (SHF-13; SEQ ID? c.33 5’-GTGTGTACTG TGACTCACAG -3' (SHF-15; SEQ ID č· 34 5’-AACTGAACCT GAGGGAGTCA-3'(SHF-16; SEQ ID č. 35 ‘ 5’-AACTCTTGCC CCAAGAGAAG-3' (SHF-17; SEQ ID ^δ·. 36.

5’-ATCCTGACTG TGACAGAGGA-3'(SHF-18; SEQ ID č. 37 5’-ACAAGTCQAC TGGTAAACCC-3'(SHF-19; SEQ ID č.. 38 54

• ·	• · · · · ·	····	99 1	9· ’
• ·	' · · l·	•	• ·	• ·
• <·	• L'· ·	9<	♦ :'9	9 9
		9	9 99'9	9 9
	« *· '· >·	9	'9	9 9
♦ ·	9 9 ® ♦	i	9 9	9 9

5’-AGGATATCTT CACTGAGGCC -3' (SHR-1; SEQ ID č.. 39 5’-ATCCACTCAA GGCTCTTTCC -3' (SHR-2; SEQ ID g. 40 5’-ACTGCAGAGT CCTCAGATGT -3' (SHR-3; SEQ ID č. 41 5’-AGACGGTGAC TGAGGTTCTT -3' (SHR-4; SEQ ID' č. 42 5’-CAGGTGAAGG AAATGGTGCT -3' (SHR-5; SEQ ID ζ. 43 5’-ATGCTCTTGG GAGACAGCAA -3' (SHR-6; SEQ ID č. 44 5’-CTCTGTTTTT GCCTCCGTAG -3' (SHR-7; SEQ ID č. 45 5’-TGGCCTCGCA GATGAGTTTA -3' (SHR-8; SEQ ID c. 46 5’_CCTTTGTTCT CGATGGTCAC -3’ (SHR-9; SEQ ID c. 47 5’-TGTGGAGGAC ACGTTCTTCA -3' (SHR-10; SEQ ID θ· 48 5’-ACTTTGAGAA GCCCAGGAGA -3' (SHR-12; SEQ ID č.. 49 5’-AGATCCCTGT GAGTCACAGT -3' (SHR-13; SEQ ID č. 50 5’-AGCAGGTGGA TGTTTGTGCA -3' (SHR-14; SEQ ID č. 51 5’-TGAAGCCACT GCACACTGAT -3' (SHR-15; SEQ ID c. 52 . 5’-AGTTCCATTC CTCCTCTGTC -3' (SHR-16; SEQ ID č. 53 5’-TGTGTCAGAC. ATGATCAGGG -3’ (SHR-18; SEQ ID č. 54

Pro řetězec L:

5’-TGAAGTTGCC TGTTAGGCTG-3' (SLF-1; SEQ ID č. 55 < 5’-CTTGGAGATC AAGCCTCCAT-3'(SLF-2; SEQ ID č. 56. 5’-GCTGAGGATC TGGGAGTTTA -3’ (SLF-3; SEQ ID g, 57 . 5’-GATGCTGCAC CAACTGTATC -3' (SLF-4; SEQ ID č. 58 5’-CGACAAAATG GČGŤCCTGAA -3' (SLF-5; SEQ ID 5. 59 ~ JAACGTTGACCA AGGACGAGTA -3’ (SLF-6; SEQ ID č. 60 5’-ATCTGCAAGAGATGGAGGCT -3' (SLR-2; SEQ ID č. 61 5’-ACCCCAGAAA ATCGGTTGGA -3' (SLR-3; SEQ ID c. 62 5’-CCGGAGGAAC ATGTGTACTT -3' (SLR-4; SEQ ID č. 63 5’-TCGTTCATAC TCGTCCTTGG-3'(SLR-6; SEQ ID č. 64 5’-CATCTCAGGA CCTTTGTCTC -3' (SLR-7; SEQ ID c· 65 .'Λ

Pro řetězec J:

·« ····

- 55 5’-CACCTGTCCT GGGGTTATTT -3' (SJF-1; SEQ ID č. 66 5’-AGACAAGATG AAGACCCACC -3' (SJF-2; SEQ ID) č. 67 5’-AAGCGACCAT TCTTGCTGAC -3* (SJE-3; SEQ ID č. 68 5’-ATATCTCTGA TCCCACCTCC -3' (SJF-8; SEQ ID ^č· 69 5’-GAAATGCGAT CCTGTGGAAG -3' (SJF-5; SEQ ID č. 70 5’-CTATACCACT ATGGTCCCAC -3' (SJE-6; SEQ ID č.. 71 5’-AGAAGCAGGT GGGTCTTCAT -3' (SJR-2; SEQ ID č. γ₂ 5’-TAGAGGTAAC TCGGGTACAC -3' (SJR-3; SEQ ID c. 73 5’-AAGTTCCTTC TCAGTGGGGA -3' (SJR-8; SEQ ID č. 74 5’-GGTGGCAGTA ACAACCTGAT -3' (SJR-5; SEQ ID č. 75 5’-CATGATACCT AAGTGGGACC -3' (SJR-6; SEQ ID č. 76

Každý z oligonukleotidových primerů byl syntetizován fosfoamiditovou metodou., při použití automatického syntetizátoru. DNA model 38OB (Parkin Elmer, Japonsko). Vzorky pro analýzu sekvence řetězce H byly připraveny při použití DNA z plasmidů pCR3-H123. Vzorky pro analýzu sekvence řetězce L byly připraveny při použití DNA z plasmidů pCR3-L103. Vzorky pro analýzu sekvence pro řetězec J byly připraveny při použití DNA z plasmidů pCR3-J1123. PCR-reakce byla prováděna při použití dodávané sestavy Prism Ready Reaction Terminátor Cycle Sequencing Kit (Perkin Elmer, Japonsko) násle-

- dujícím způsobem: - . . . . ......

- - - ~1,5 mikrogramů plasmidů pCR3-H123 a 4,8 pmol primerů——

SHF-2 se smísí na výsledný objem 16 mikrolitrů v destilované vodě. Podíl 9,5 mikrolitrů směsi plasmidů a primerů se smísí.s 10,5 mikrolitrů předběžné směsi s obsahem Taq DNA polymerázy podle návodu výrobce sestavy. Výsledná směs se vloží do automatického reaktoru Catalyst (Perkin Elmer, Japonsko) . Byl použit reakční cyklus 30 sekund 9^fJ °C, 15_r sekund °C a 4 minuty 60 °C, celkem 25x.

9'9 9999 99 9999 99 99

9 9 9 -9 9 9'999

9 9 9 9 9 · · · · • '·« · · · · 9 9 -99 · 9 9

9 9 9 9 9 '9 9 9 9

99 99 9 99 99

Po ukončení reakčních cyklů se přidá 8 mikrolitrů sterilizované vody a DNA ve výsledné směsi se dvakrát extrahuje -- fenol-chloroformem. Oddělená vodná vrstva se smísí s 15 mikrolitry 2M octanu sodného a 300 mikrolitry 100% ethanolu a pak se směs odstředí k usazení sraženiny. Sraženina se promyje ethanolem o koncentraci 70 % objemových a pak se suší za sníženého tlaku, načež se rozpustí ve 3 mikrolitřech roztoku pro vzorek s obsahem 4 mikrolitrů 0,25 M EDTA, 100 mikrolitrů formamidu a 15 mikrolitrů sterilizované vody.

Analýza sekvence byla provedena na sutomatickém zařízení Model 373A (Perkin Elmer, Japonsko) pro 32 primerů pro řetězec H, 11 primerů pro řetězec L a 11 primerů pro řetězec J .

Údaje o sekvenci pro každý primer byly spojeny a integrovány tak, aby bylo možno určit úplnou nukleotidovou sekvenci řetězců H, L a J protilátky CH11. Uložená sekvence cDNA v plasmidů je znázorněna sekvencemi SEQ ID č. 7, 9 a 11. Sekvence aminokyselin, odpovídající těmto nukleotidovým sekvencím jsou uvedeny jako SEQ ID č. 8, 10 a 12.

I (4-2) Primární struktura řetězce H protilátky CH11

Bylo prokázáno, že nukleotidová sekvence variabilní oblasti řetězce H, znázorněná jako nukleotidy 32 až 379 v “ SEQ ID č. 15 je totožná s nukleotidovou sekvencí 58 až 405________ v SEQ ID č. 7.

Sekvence aminokyselin 117 až 571 ze SEQ ID č. 8 je totožná se sekvencí aminokyselin konstantní oblasti řetězce H, odvozenou od myšího IgM při srovnání s databazí sekvencí aminokyselin protilátek podle svrchu uvedené publikace Kabat E. A. a další.

- 57 Bylo uzavřeno, že sekvence aminokyselin -19 až -1 v SEQ ID č. 8 je signální sekvencí řetězce H z CH11.

Sekvence nukleotidů 406 až 1770 v SEQ ID č. 7 je totožná s konstantní oblastí řetězce H myšího IgM.

Na základě těchto výsledků bylo možno zkonstruovat celkovou sekvenci nukleotidů a také úplnou sekvenci aminokyselin.

(4-3) Primární struktura řetězce L protilátky CH11

Bylo prokázáno, že nukleotizová sekvence pro variabilní oblast řetězce L, nukleotidy 29 až 364 v SEQ ID č. 16 je totožná se sekvencí nukleotidů 58 až 393 v SEQ ID č. 9.

Bylo rovněž prokázáno, že sekvence aminokyselin 113 až 219 v SEQ ID č, 10 je totožná se sekvencí aminokyselin konstantní oblasti řetězce kL myši při srovnávání s Rabatovou databazí sekvencí aminokyselin v protilátkách.

Bylo uzavřeno, že sekvence aminokyselin -19 až -1 v SEQ ID č. 10 je signální sekvencí řetězce L.

Bylo rovněž prokázáno , že sekvence nukleotidů 394 až 714 v SEQ ID č. 9 je zcela totožná se sekvencí nukleotidů pro kohsTantní^bbrast^ř^tězcO^klr^-myši.----—----------------Na základě těchto výsledků bylo možno zkonstruovat úplnou sekvenci nukleotidů a také úplnou sekvenci aminokyselin pro řetězec L.

• · · · • .· · ·

·· ·· ·· • · ·· • · · · • · (4-4) Primární struktura řetězce J protilátky CH11

Sekvence aminokyselin 1 až 137 v SEQ ID č. 12 byla srovnávána s databazí sekvence aminokyselin v protilátkách a bylo prokázáno, že je totožná se známým řetězcem J myši.

Nukleotidová sekvence 67 až 477 v SEQ ID č. 11 je totožná s nukleotidovou sekvencí známého řetězce J myši.

Sekvence aminokyselin -22 až -1 v SEQ ID č. 12 je signální sekvencí řetězce J protilátky CH11.

Na základě těchto výsledků bylo možno zkonstruovat úplnou sekvenci nukleotidů a také úplnou sekvenci aminokyselin pro řetězec J.

(4-5) Stanovení oblastí pro určení komplementarity, CDR

Poloha a sekvence aminokyselin každé CDR ve variabilních oblastech řetězců H a L protilátky CH11, stanovené svrchu uvedeným způsobem byly identifikovány srovnáním se svrchu uvedenou Rabatovou databazí pro sekvence aminokyselin v protilátkách. Tato databaze prokazuje, že délka sekvence aminokyselin v rámcové oblasti variabilní oblasti je u různých protilátek v podstatě stála’za předpokladů, že běží o protilátky téhož podtypu a za předpokladu, že sekvence aminokyselin mají některé společné vlastnosti. Avšak oblasti CDR, uložené mezi rámcovými oblastmi mají sekvence, které jsou pro každou protilátku specifické.

Pro srovnání je možno uvést, že sekvence aminokyselin variabilní oblasti řetězce H protilátky CH11 a sekvence CDR řetězce H protilátky CH11 myšího podtypu /U2a jsou representovány aminokyselinami č. 31 až 35 v SEQ .ID č. 8 (CDRH^, ·· ···· ·· ····

- 59 odpovídá SEQ ID č. 1), 50 až 66 v SEQ ID č. 8 (CDRH_2> odpovídá SEQ ID č. 2) a 99 až 105 v SEQ ID č. 8 (CDRH_3> odpovídá SEQ ID č. -3) .

V případě srovnávání sekvence aminokyselin variabilní oblasti řetězce L protilátky CH11 se sekvencí myšího podtypu k2 bylo prokázáno, že CDR řetězce L je representována aminokyselinami 24 až 39 v SEQ ID č. 10 (CDRL^j^, odpovídá SEQ ID č. 4), 55 až 61 v SEQ ID č. 10 (CDRL^, odpovídá SEQ ID č. 5) a 94 až 102 v SEQ ID č. 10 (CDRL^, odpovídá SEQ ID č. 6).

Příklad 1

Modelování molekul variabilní oblasti protilátky CH11

Modelování, molekul v různých variabilních oblastech protilátky CH11 bylo prováděno postupem na základě homologie podle publikace Andrew a další, 1991, Methods in Anzymology, 203, str. 121 až 153.

Primární sekvence variabilních oblastí lidských imunoglobulinů, pro něž bylo pomocí rtg-paprsků stanovena krystalická struktura jsou registrovány ve sbírce Protein Data Bank (dále uváděna jako PDB, Chemistry Department, Building ' j 555, Brookheaven National Laboratory, P. 0. Box 5000, Upton, NY 11973-5000, USA). Sekvence, obsažené v této sbírce byly----srovnávány se sekvencemi rámcových oblastí protilátky CH11. Bylo prokázáno, že dva lidské imunoglobuliny, 1NBV a 1IGI mají nejvyšší stupeň homologie s řetězcem L a H protilátky CH11.

Model trojrozměrné struktury rámcových oblastí protilátky CH11 byl zkonstruován na bázi známé struktury těchto lidských rámcových oblastí. Model je označován jako model rámcových oblastí.

·· ···· ·· ···· ·· ·· • · · · · • · · ·Α • · ··· · · e e e e • ·· ··

- 60 Oblasti CDR protilátky CH11 byly klasifikovány při použití metody podle publikace Chothia a další, J. Mol. Biol., 1987, 196, 901 až 917. Při použití tohoto postupu byla CDRL^ klasifikována do kanonické skupiny 4, CDRL₂ do kanonické skupiny 1, CDRL^ do kanonické skupiny 1 a CDRH^ do kanonické skupiny 1. CDRHg a CDRH^ neodpovídaly žádné definované kanonické skupině. Smyčky v CDRL-^, CDRL₂, CDRL^ a CDRH^^ odpovídaly uvedeným kanonickým skupinám a byly integrovány do modelu rámcových oblastí.

Identifikace CDRH₂ a CDRH^ byla provedena tak, že nejprve byly v PDB identifikovány sekvence s nejvyšší homologií s těmito skupinami CDR. Pak bylo stanoveno, do jaké míry odpovídají oblasti CDRH₂ a CDRH^ těmto sekvencím s nejvyšší homologií. Pak byla vypočítána energetická náročnost a byly zkonstruovány nejpravděpodobnější smyčky CDR, které pak byly integrovány do modelu rámcových oblastí. Pak byly znovu provedeny energetické výpočty tak, aby bylo možno vyřadit jakýkoliv energeticky nepříznivý vliv mezi atomy a bylo možno získat molekulový model protilátky CH11. Svrchu uvedený postup byl prováděn při použití softwaru AbM pro modelování molekul (Oxford Molecular Limited, lne.).

Přesnost struktury molekulárního modelu, získaného tímto způsobem byla vyhodnocena při použití softwaru ..... ’

PROCHECK podle publikace Laskowski R. A. J., 1993, Appl.

Cryst., 26, 283 až 291. Stupeň expozice povrchu byl pro---------každý zbytek vypočítán způsobem podle publikace Lee B. a Richards F. M., J. Mol. Biol., 1971, 55, 379 až 400, takže bylo možno stanovit stupeň kontaktu mezi atomy.

Příklad 2

Selekce akceptorů

Sekvence řetězců H a L protilátky CH11 byla srovnávána s analogickou sekvencí odpovídajících podskupin lidských protilátek. Bylo prokázáno, že řetězec L protilátky CH11 je z 83 % totožný s řetězcem lidské podskupiny kappa II a řetězec H protilátky CH11 je ze 74 % totožný s řetězcem lidské podskupiny I. Lidské protilátky RPMI6410^>CL (podskupina kil) a 21.28'CL (podskupina I) byly vybrány jako akceptorové molekuly pro řetězce L a H na bázi homologie sekvence.

Příklad 3

Selekce zbytků protilátky CH11 jako donoru pro naroubování do akceptorů

Jednotlivé polohy sekvence aminokyselin v řetězcích H a L protilátky CH11 byly srovnávány s polohami molekuly akceptoru při použití softwaru Cameleon (Oxford Molecular Limited, lne.). Humanizované sekvence byly zkonstruovány podle svrchu uvedených kriterií a) ad). Byly zkonstruovány čtyři sekvence pro lehký řetězec a dvě sekvence těžkého řetězce, které vytvořily základ pro přípravu· humanizovaných protilátek proti · lidskému Fas. Tyto sekvence aminokyselin a odpovídající kódové nukleotidové sekvence pro tyto bílkoviny budou nyní dále uvedeny.

Řetězce L (k řetězce) polypeptid VL-KY, SEQ ID č. 78 a odpovídající kódová sekvence DNA, SEQ ID č. 77, polypeptid VL-KF, SEQ ID č. 80 a odpovídající kódová sekvence DNA, SEQ ID č. 79, • · • ·

A polypeptid VL-RA,

DNA, SEQ ID č. 81

SEQ ID

č. 82 a odpovídající kódová sekvence polypeptid VL-RF, DNA, SEQ ID č. 83.

SEQ ID

č. 74 a odpovídající kódová sekvence

Řetězce H (^u řetězce) polypeptid H/UH, SEQ ID č. 86 a odpovídající DNA, SEQ ID č. 85 a polypeptid H/UM, SEQ ID č. 88 a odpovídající DNA, SEQ ID č. 87.

Příklad 4

Klonování a analýza úplného kódového řetězce lidské řetězce H a L (s podskupinami I a II oblastech) kódová sekvence kódová sekvence

DNA pro úplné ve.variabilních

1) Příprava primerů

a) Řetězec H

Sekvence aminokyselin variabilní oblasti řetěžcé*H * myší monoklonální protilátky CH11, SEQ ID č. 89 byla srovnávána—s databazí sekvencí aminokyselin proprotilátky podle svrchu uvedené publikace Kabat E. A. a další, tak, aby bylo možno identifikovat jakékoliv homologní sekvence. Bylo prokázáno, že sekvence aminokyselin rámcových oblastí variabilní oblasti řetězec H protilátky CH11 je homologní s řetězcem H lidské protilátky podskupiny I. Byl tedy syntetizován oligonukleotidový primer • · • · · • · · · · · f · · · • t> · · · · · ···.«

- 63 HVHI5-1, SEQ ID č. 90, tento primer hybridizuje s částí 5'-nepřenášené oblasti kódové DNA pro řetězec H lidského imunoglobulinu podskupiny I v databázi.

Kódová nukleotidová sekvence DNA pro konstantní oblasti řetězce H lidského imunoglobulinu byla popsána v publikaci Dorai a Gillies, 1989, Nucleic Acids Res., 17, 6412. Na základě těchto poznatků byl syntetizován oligonukleotidový primer

HC/U3-1, SEQ ID č. 91, tento primer hybridizuje s částí nukleotidové sekvence 3'-nepřenášené oblasti.

b) Řetězec L

Sekvence aminokyselin variabilní oblasti řetězce L myší monoklonální protilátky CH11, SEQ ID č. 92 byla srovnávána se sekvencí aminokyselin pro protilátky v databazi podle svrchu uvedené publikace Kabat a další, aby bylo možno identifikovat jakékoliv homologní sekvence. Bylo prokázáno, že sekvence aminokyselin rámcové oblasti variabilní oblasti .řetězce L protilátky ČH11 je homologní s řetězcem L lidské protilátky podskupiny II. Byl tedy zkonstruován oligonukleotidový primer

HVK II5-4, SEQ ID č. 93 tento primer hybridizuje s částí 5'-nepřenášené oblasti kódové DNA pro řetězec lidského imunoglobulinu L podskupiny II v databazi.

Kódový nukleotidový řetězec DNA pro konstantní oblast řetězce L lidského imunoglobulinu byl popsán v publikaci

• ·

- 64 Hieter P. A. a další, 1980, Cell, 22, str. 197 a následující. Na základě těchto znalostí byl zkonstruován oligonukleotidový primer

HKCL3-3, SEQ ID č. 94, tento primer hybridizuje s částí 3'-nepřenášené oblasti DNA.

Všechny svrchu uvedené oligonukleotidové primery byly syntetizovány fosfoamidotovou metodou podle publikace Mattrucci M. D. a Caruthers Μ. H., 1981, J. Am. Chem. Soc., 103, str. 3185 a následující při použití zařízení pro automatickou syntézu DNA Model 380B (Perkin Elmer, Japonsko). Po ukončení přípravy byl každý primer oddělen od nosiče, zbaven ochranných skupin · a pak lyofilizován. Primery byly rozpuštěny ve 100 mikrolitrech destilované vody a pak uloženy při teplotě -20 °C až do použití.

2) Amplifikace cílového genu při použití PCR

Řetězec H

Kódový fragment DNA pro řetězec H lidského IgM byl amplif ikován a izolován při použití PCR. Jako výchozí zdroj DNA byla-použita-banka -cDNA—lidských-lymfocytů.--——· ——~—— ____Dále uvedený reakční roztok byl nejprve zahříván 2 minuty na 94 °C. Pak byl vzorek zahříván při použití cyklu 1 minuta při 94 °C, 1 minuta při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Tento cyklus byl 30x opakován. Pak byl reakční roztok inkubován 10 minut při teplotě 72 °C.

Složení reakčního roztoku:

Banka cDNA lidských lymfocytů (Life Technologies), 25 ng, • · • · · •

• ·· •« • ·· ··99

pmol,

pmol,

- 65oligonukleotidový primer HVHI5-1, oligonukleotidový primer CH/U3-1, směs 25 mM dNTP, 10 mikrolitrů,

100 mM tris-HCl pufru o pH 8,5, 10 mikrolitrů,

M chlorid draselný, 5 mikrolitrů, mM chloridu horečnatého, 10 mikrolitrů,

Taq DNA polymeráza (Perkin Elmer, Japonsko), 1 jednotka.

Celkový objem byl upraven na konečný objem 100 mikrolitrů přidáním redestilované vody. Směs 25 mM dNTP je směs deoxynukleotidtrifosfátu, která obsahuje deoxyadenosintrifosfát dATP, deoxycytosintrifosfát dCTP, deoxyguanosintrifosfát dGTP a deoxythymidintrifosfát dPTP, každá z těchto látek je přítomna v koncentraci 25 mM.

Řetězec L

Kódový fragment DNA pro řetězec L lidksého IgM byl amplifikován a izolován při použiti PCR. Jako výchozí zdroj cDNA byla použita banka lidských lymfocytů.

Reakční roztok byl nejprve zahřát na 2 minuty na 94 °C. Pak _byl vzorek zahříván..pri.-použití_cyklu. .1. minuta_při_.94...°C, — . 1 minuta při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Tento cyklus byl 30x opakován. Pak byl reakční roztok inkubován 10 minut při teplotě 72 °C.

Složení reakčního roztoku:

banka cDNA lidských lymfocytů (Life Technologies), 25 ng, oligonukleotidový primer HVKII5-4, 50 pmol, oligonukleotidový primer HKCL3-3, 50 pmol, směs 25 mM dNTP, 10 mikrolitrů,

• · · · · ·	99 9999	9 9	• ·
9 9 ♦	9 9 9	9	•	• ·
* 1 · *	9 9 9 O	e 9	c	•	9
« 9 9 ♦	9 9 9		•		9
·· ··	99 9			• ·

100 mM tris-HCl pufr o pH 8,5, 10 mikrolitrů,

M chlorid draselný, 5 mikrolitrů, mM chlorid horečnatý, 10 mikrolitrů,

Taq DNA polymeráza (Perkin Elmer, Japonsko), 1 jednotka.

Celkový objem reakčního roztoku byl upraven na konečný objem 100 mikrolitrů přidáním redestilované vody.

3) Zkouška na přítomnost produktů PCR

Po PCR amplifikaci se produkty každé reakce analyzují elektroforézou na agarozovém gelu. Podíly každého reakčního roztoku, popsaného v odstavci 2) svrchu, odpovídající 200 ng DNA se podrobí elektroforéze na 0,8% agarozovém gelu. Rozměr produktu PCR se stanoví podle pohyblivosti pásů molekulového značení, toto značení probíhá současně s postupem vzorku. Bylo prokázáno, že fragment řetězce H lidského imunoglobulinu má velikost přibližně 2000 párů baží, bp, řetězec L lidského imunoglobulinu má velikost přibližně 800 bp.

4) Klonování produktů PCR

Každý z produktů PCR, získaných v odstavci 3) se naváže na vektor typu plasmidu při použití klonovací sestavy TA pro eukaryotické organismy (Invitrogen).

Postupuje se tak, že se 60 ng plasmidu pCR3 ze sestavy a 4 jednotky T4 DNA ligázy přidají k pufru pro reakci s ligázou, který obsahuje 6 mM tris-HCl o pH 7,5,. .6 mM chloridu hořečnatého, 5 mM chloridu sodného, 7 mM beta-merkaptoethanolu, 0,1 mM ATP, 2 mM DTT, 1 mM spermidinu a 0,1 mg/ml sérového albuminu skotu, mimoto se k reakčnímu pufru přidá ještě podíl • ·

- 67 reakční směsi po provedení PCR. Objem tohoto podílu se volí tak, aby obsahoval 10 ng požadovaného produktu PCR. Výsledná směs se inkubuje 15 hodin při teplotě 14 °C.

Podíl 2 mikrolitry reakční směsi s ligázou se smísí s 50 mikrolitry buněk E. coli,. kmen TOP 10F ze sestavy, tento kmen byl předem učiněn kompetentním přidáním 2 mikrolitrů 0,5 M beta-merkaptoethanolu. Výsledná směs se udržuje 30 minut v ledu. Pak se přidá 500 mikrolitrů prostředí SOC ze sestavy a výsledná směs se inkubuje za protřepávání 1 hodinu při teplotě 37 °C. Pak se živné prostředí nanese spolu s buněčným materiálem na agarové plotny s L-bujonem, obsahující 1 g bactotryptonu (Difco), 0,5 g extraktu z kvasnic (Difco), 0,1 g glukosy, 0,5 g chloridu sodného, 1,2 g bacto-agaru (Difco) na 100 ml a mimoto 100 mikrogramů/ml ampicilinu a pak se kultury inkubují přes noc při teplotě 37 °C.

Kolonie, odolné proti působení ampicilinu, které na živném prostředí vyrostou, se oddělí pomocí platinové kličky a jednotlivě se pak pěstují v 5 ml kapalného L-bujonu, obsahujícího 1 g bactotryptonu (Difco), 0,5 g extraktu z kvasnic (Difco) a 0,5 g NaCl na 100 ml a mimoto 100 mikrogramů/ml ampicilinu za protřepávání přes noc při teplotě 37 °C. Kultury se pak odstředí k oddělení buněk, z nichž se připraví plasmidová DNA rozrušením buněk v alkalickém prostředí podle- svrchu uvedené - publikace Sambrook~J'.’ýa~další = . _Pak, _se i mikrogram DNA plasmidu . připravené tímto způsobem rozštěpí působením restrikčního enzymu EcoRl při použití pufru dodávaného spolu s enzymem. Všechny štěpné reakce jsou prováděny v pufru, který se dodává spolu s příslušným enzymem (Takara Shuzo). V případě dvojího štěpení se užije pufr, kompatibilní s oběma restrikčními enzymy. Produk ty štěpení se oddělí elektroforézbu na 0,8% agarosovém gelu.

···· • · *

- 68 Byly identifikovány plasmidy, obsahující uloženou DNA o velikosti přibližně 2000 bp a 800 bp, což odpovídá lidským řetězcům H a L imunoglobulinu, velikost fragmentů byla zjištěna srovnáváním se značením pro molekulovou hmotnost na tomtéž gelu. Plasmidy s obsahem těchto fragmentů byly odděleny.

Šlo zvláště o následující dva plasmidy:

plasmid pHHl-5, obsahující kódový fragment DNA pro řetězec H lidského imunoglobulinu. Tento plasmid obsahuje uloženou kódovou cDNA pro řetězec H lidského imunoglobulinu s variabilní oblastí podskupiny I, plasmid pHL15-27, obsahující kódový fragment DNA pro řetězec L lidského imunoglobulinu. Tento plasmid obsahuje uloženou kódovou cDNA pro řetězec L lidského imunoglobulinu s variabilní oblastí podskupiny II.

5) Ověření klonované úplné nukleotidové sekvence kódové cDNA pro řetězce H a L lidského imunoglobulinu

Řetězec H lidského imunoglobulinu je tvořen N-terminální variabilní oblastí s obsahem přibližně 110 zbytků a sousední konstantní oblastí, obsahující přibližně 510 zbytků. Řetězec L·-lidského- imunoglobulinu—je--tvořen--N-terminální-va— riabilní oblastí s obsahem přibližně 110 zbytků a navazující konstantní oblastí, obsahující přibližně 107 zbytků._________

Z těchto důvodů bylo předpokládáno, že nukleotidová sekvence kódové cDNA pro řetězec H lidského imunoglobulinu, , klonovaná podle odstavce 4) svrchu, bude tvořena variabilní oblastí a konstantní oblastí. Bylo předpokládáno, že variabilní oblast bude vysoce homologní s variabilní oblastí řetězce H lidského imunoglobulinu, podskupiny I, šlo například :.o.klon 21/28'CL podle svrchu uvedené publikace Kabat E. A. a další. Kódová nukleotidová sekvence pro konstantní oblast řetězce H lidského imunoglobulinu je známa z téhož zdroje.

Bylo předpokládáno, že sekvence nukleotidů kódové cDNA pro řetězec L lidského imunoglobulinu, klonovaná svrchu v odstavci 4) bude tvořena variabilní oblastí a konstantní oblastí. Variabilní oblast by přitom měla být vysoce homologní s variabilní oblastí řetězce L lidského imunoglobulinu, podskupiny II, například klonu RPMI1640*CL podle svrchu uvedené publikace Kabat E. A. a další. Kódová nukleotidová sekvence pro konstantní oblast řetězce L lidského imunoglobulinu je známa z téhož zdroje.

Byly syntetizovány oligonukleotidové primery s délkou 20 nukleotidů pro analýzu sekvence. Tyto primery byly zkonstruovány na základě známých, dobře konzervovaných sekvencí v rámcových oblastech variabilních oblastí a na bázi známých nukleotidových sekvencí v konstantních oblastech. Primery odpovídaly sekvencím, odděleným úseky s obsahem 100 až 200 bp a byly použity spolu s primery HVHI5-1, HC/U3-1, HVKII5-4 a HKCL3-1, již použitými při provádění PCR, jak je uvedeno svrchu v odstavci 2).

Sekvence oligonukleotidových primerů, syntetizovaných pro analýzu sekvence řetězce H jsou následující:

SHHF-l;(SEQ ID No. 95); ŠHlff 4;TSEQ'IĎ No. 96);~ ~ SHHF-3; (SEQ ID No. 97);

SHHF-4; (SEQ ID No. 98);

SHHF-5; (SEQ ID No. 99);

SHHF-6; (SEQ ID No. 100);

SHHF-7; (SEQ ID No. 101);

SHHF-8; (SEQ ID No. 102);

SHHF-9; (SEQ ID No. 103); SHHF-10; (SEQ ID No. 104);

í

- 70 ·* ···· ·· • · p ·· • f ♦ 1· » · f · ·· • v · » *·

SHHF-11; (SEQ ID No. 105);

SHHF-13; (SEQ ID No. 106);

SHHF-14; (SEQ ID No. 107);

_x SHHF-15; (SEQ ID No. 108);

SHHR-1; (SEQ ID No. 109);

SHHR-2; (SEQ ID No. 110);

SHHR-3; (SEQ ID No. 111);

SHHR-4; (SEQ ID No. 112);

SHHR-5; (SEQ ID No. 113);

SHHR-6; (SEQ ID No. 114);

SHHR-7; (SEQ ID No. 115);

SHHR-8; (SEQ ID No. 116);

SHHR-9; (SEQ ID No. 117);

SHHR-10; (SEQ ID No. 118);

SHHR-11; (SEQ ID No. 119);

SHHR-12; (SEQ ID No. 120);

SHHR-13, (SEQ ID No. 121);

SHHR-14; (SEQ ID No. 122); a

SHHR-15; (SEQ ID No. 123).

Na obr. 3 je znázorněna poloha, na kterou jsou vázány odpovídající primery.

Sekvence oligonukleotidových primerů, syntetizovaných pro analýzu řetězce L jsou následující:

SHKF-1; (SEQ ID No. 124);

SHKF-2; (SEQ ID No. 125);

SHKF-4; (SEQ ID No. 126);

SHKF-5; (SEQ ID No. 127);

SHKF-6; (SEQ ID No. 128);

SHKF-11; (SEQ ID No. 129);

SHKF-12; (SEQ ID No. 130);

SHKR-1; (SEQ ID No. 131);

_ SHKR-2; (SEQ ID No. 132);

SHKR-3; (SEQ ID No. 133);

SHKR-4; (SEQ ID No. 134);

SHKR-6; (SEQ ID No. 135); ai

SHKR-13; (SEQ ID No. 136).

Na obr. 4 je znázorněna poloha, v níž jsou vázány odpovídající primery.

Vzorky pro analýzu sekvence se připraví při použití svrchu uvedených primerů a sestavy Prism Ready Reaction Terminátor Cycle Sequencing kit (Perkin Elmer, Japonsko). Jako matrice se užije DNA z plasmidů pHHl-5 nebo pHL15-27, jak je popsáno svrchu v odstavci 4).

Postupuje se tak, že se 1,5 mikrogramů čištěné DNA plasmidu smísí se 4,8 pmol příslušného primerů, objem se doplní na 16 mikrolitrů destilovanou vodou, tento roztok se dále označuje jako směs plasmidové DNA a primer. Podíl 9,5 mikrolitrů této směsi pro každý z primerů se přidá k 10,5 mikrolitrům předběžného., r o z toku, dodáván ého spolu se sestavou a obsahu- _ jícího Taq DNA polyměrázu. Výsledný reakční roztok “se uloží do automatického reaktoru Catalyst (perkin Elmer, Japonsko). Pak se použije reakční cyklus 30 sekund při 95 °C, 15 sekund při 50 °C a 4 minuty při 60 °C, tento cyklus se 25x opakuje.

.Po ukončení reakčních cyklů se k výslednému roztoku přidá 80 mikrolitrů destilované vody a z výsledné směsi se dvakrát extrahuje DNA fenol-chloroformovou metodou podle svrchu uvedené publikace Sambrook a další. Oddělená vodná — vrstva se; smísí s 15 mikrolitry 2M octanu sodného a 300 mikro- í litrů 100% ethanolu, načež se směs odstředí k oddělení sraženiny

DNA. Tato sraženina se pak promyje ethanolem s koncentrací 70 % objemových a suší za sníženého tlaku, načež se rozpustí ve 3 mikrolitrech roztoku pro vzorek, který obsahuje 4 mikrolitry 0,25 M EDTA, 100 mikrolitrů formamidu a 16 mikrolitrů destilované vody.

Analýza sekvence DNA byla provedena na automatickém analyzátoru Model 373A (Perkin Elmer, Japonsko). Analýza byla uskutečněna na 30 vzorcích řetězce H lidského imunoglobulinu a na 17 vzorcích řetězce L lidského imunoglobulinu.

Analýza zísakných údajů ověřila,,že plasmid pHHl-5 obsahuje uloženou kódovou DNA pro řetězec H lidského imunoglobulinu s variabilní oblastí podskupiny I. Na druhé straně bylo prokázáno, že plasmid pHL15-27 obsahuje uloženou kódovou DNA pro řetězec L lidského imunoglobulinu s variabilní oblastí podskupiny II.

Nukleotidová sekvence DNA, uložená do plasmidů pHHl-5 a do plasmidů pHL15-27 je uvedena jako SEQ ID č. 137 a 138.

Příklad 5

Konstrukce vektorů pro expresi humanizovaných verzí řetězce L protilátky CH11

1) Příprava primerů

Při použití PCR byly syntetizovány následující fragmenty DNA:

DNA (SEQ ID č. 77) je kódová sekvence pro polypeptidový řetězec VL-KY (SEQ ID č. 78),

···· < · . · φ • Φ ·· i ·

DNA (SEQ ID č. 79) je kódová sekvence pro polypeptidový řetězec VL-KF (SEQ ID č. 80),

DNA (SEQ ID č. 81) je kódová sekvence pro polypeptidový řetězec VL-RY (SEQ ID č. 82),

DNA (SEQ ID č. 83) je kódová sekvence pro polypeptidový řetězec VL-RF (SEQ ID č. 84).

Při použití PCR bylo syntetizováno následujících 14 primeru:

VL1P; (SEQ ID No. 139);

VL1N; (SEQ ID No. 140);

VL2P; (SEQ ID No. 141);

VL2N; (SEQ ID No. 142);

VL3TYRP; (SEQ ID No. 143);

VL3TYRN; (SEQ ED No. 144);

VL3PHEP; (SEQIDNo. 145);

VL3PHEN; (SEQ ID No. 146);

VL4P; (SEQ ID No. 147);

VL4N; (SEQ ID No. 148);

_______VL5P; (SEQ ID No. 149);_____ _______ ____________ _

VL50RP; (SEQ IDNo. 150); ' ....... '

VL50RN; (SEQ IDNo. 151); nebo

VLTERM; (SEQ ID No. 152).

2) - Konstrukce plasmidu pHkKY2-58 a plasmidu pHkKF2-19

a) První stupeň PCR

První stupeň PCR je znázorněn na obr. 5.

VL1

Byl připraven fragment DNA s kódovou sekvencí pro sekreci signální sekvence, oblasti FRL^ a aminoterminální části (dále uváděné jako N-konec) obasti CDRL^. Tento fragment bude dále uváděn jako fragment VL1 DNA. PCR byla prováděna za následujících podmínek:

Složení reakčního roztoku:

plasmid pHL15-27 DNA, 1 mikrogram, oligonukleotidový primer VL5P, 80 pmol, oligonukleotidový primer VL1N, 80 pmol, mM směs dNTP, 20 mikrolitrů, lOx pufr Pfu, 20 mikrolitrů,

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek.

Byla přidána redestilovaná voda do konečného objemu

200 mikrolitrů. lOx Pfu pufr byl dodáván spolu s Pfu polymer ázou.

Nejprve byl reakční roztok zahřát na 2 minuty na 94 °C. Pak byl vzorek zahříván v cyklech 1 minuta při 94 °C, 1 minuta při 55 °C a 2 minuty při. 72 °C- .Tento cyklus byl 30x “* opakován. Pak byl reakční roztok inkubován 10 minut při teplotě 72 °C. —

VL2

Byl připraven fragment DNA s kódovou sekvencí pro karboxyterminální část (dále bude uváděna jako C-konec) oblasti FRL₁, oblasti CDRL^ a N-konec oblasti FRL₂. Tento fragment bude dále uváděn jako fragment VL2 DNA. PCR'byla prováděna za následujících podmínek:

Složení reakčního roztoku:

plasmid pCR3-L103 DNA, 1 mikrogram, oligonukleotidový primer CL1P, 80 pmol, oligonukleotidový přimet VL2N, 80 pmol, mM směs dNTP, 20 mikrolitrů, lOx Pfu pufr, 20 mikrolitrů,

Pfu DNA polymeráza (Stratagene) , 10 jednotek.

Nejprve byl reakční roztok zahřát na 2 minuty na 94 °C. Pak byl vzorek zahříván v cyklech 1 minuta při 94 °C, 1 minuta při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Tento cyklus byl 30x opakován. Pak byl reakční roztok inkubován 10 minut při teplotě 72 °C.

VL3Y

Byl připraven kódový fragment DNA pro oblast CDRL₂, oblast FRLg (v níž byl zbytek aminokyseliny v poloze 87 nahrazen zbytkem tyrosinu) a oblast CDRL^. V tomto i v dalších příkladech jsou aminokyseliny číslovány podle svrchu uvedené publikace Kabat a další. Fragment bude dále uváděn jako fragment VL3Y DNA. -Reakce PCR byla prováděna’za následujících podmínek:

Složení reakčního roztoku:

plasmid pHL15-27 DNA, 1 mikrogram, oligonukleotidový primer VL2P, 80 pmol, oligonukleotidový primer VL3TYRN, 80 pmol, _;25 mM směs dNTP, 20 mikrolitrů, lOx Pfu pufr, 20 mikrolitrů,

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek.

Nejprve byl reakční roztok zahrát na 2 minuty na 94 °C. Pak byl vzorek zahříván v cyklech 1 minuta při 94 °C, 1 minuta při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Tento cyklus byl 30x opakován. Pak byl reakční roztok inkubován 10 minut při teplotě 72 °C.

VL3F

Byl připraven kódový fragment DNA pro oblast CDRL^, oblast FRL₃ (v níž byl zbytek aminokyseliny v poloze 87 nahrazen zbytkem fenylalaninu) a oblast CDRL^. Tento fragment bude dále uváděn jako fragment VL3F DNA. PCR byla prováděna za následujících podmínek:

Složení reakčního roztoku:

plasmid pHLl.5-27 DNA, 1 mikrogram, oligonukleotidový primer VL2P, 80 pmol, oligonukleotidový primer VL3PHEN, 80 pmol, mM směs dNTP, 20 mikrolitrů, lOx Pfu pufr, 20 mikrolitrů,

Pfu DNA polymeráza (Stratagene) , 10 jednotek.

Nejprve byl reakční* roztok’zahřát na 2 minutý na 94 °C. Pak byl vzorek zahříván v cyklech 1 minuta při 94 °C, 1 minuta při ’ 55’ °C a’2 minuty při 72 °C. Tento cyklus byl 30x opakován. Pak byl reakční roztok inkubován 10 minut při teplotě 72 °C.

VL4

Byl připraven kódový fragment DNA pro oblast CDRLg, oblast FRL₄ a oblast Ck (část konstantní oblasti). Tento

··		··
• ·	•	• ·
• ·	•	9.	•
i «	o	9 »	9
• ·	• *	9> ·
	··	3·

fragment bude dále uváděn jako fragment VL4 DNA. Reakce PCR byla prováděna za následujících podmínek:

Složení reakčního roztoku:

plasmid pHL15-27 DNA, 1 mikrogram, oligonukleotidový primer VL4P, 80 pmol, oligonukleotidový primer VLTERM, 80 pmol, mM směs dNTP, 20 mikrolitrů, lOx Pfu pufr, 20 mikrolitrů,

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek.

Nejprve byl reakční roztok zahřát na 2 minuty na 94 C. Pak byl vzorek zahříván v cyklech 1 minuta při 94 C, 1 minuta při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Tento cyklus byl 30x . opakován. Pak byl reakční roztok inkubován 10 minut při teplotě 72 °C.

Fragmenty VL1, VL2, VL3Y, VL3F a VL4 DNA, amplifikované svrchu uvedeným způsobem pomocí PCR byly extrahovány fenolem. Pak se DNA vysráží při použití 100% ethanolu. Vzorek DNA s hmotností přibližně 20 až 30 mikrogramů se pak podrobí elektroforéze na 5% polyakrylamidovém· gelu. Gel se barví roztokem ethidiumbromidu 1 mikrogram/l ml tak, že fragmenty DNA jsou viditelné v UV světle. Fragmenty DNA, prokázané---tímto způsobem se z gelu vyříznou žiletkou, pak se provádí elektroeluce akrylamidového gelu v přístroji Centriruter (Amicon), opatřeném zařízením Centricon 10 (Amicon). Po eluci’ sě DNA zahustí odstředěním 1 hodinu při přibližně 7500-g, načež se vysráží ethanolem. Výsledná DNA se vždy rozpustí v 50 mikrolitrech destilované vody.

- 78 b) Druhý stupeň PCR

Druhý stupeň PCR je znázorněn na obr. 6.

VL1-2

Pomocí PCR byla připravena složená bílkovina, obsahující svrchu uvedené fragmenty VL1 DNA a VL2 DNA. Výsledný fragment byl označen jako fragment VL1-2 DNA. PCR byla prováděna za následujících podmínek:

Složení reakčního roztoku:

Roztok VL1 DNA z prvního stupně PCR, 10 mikrolitrů, roztok VL2 DNA z prvního stupně PCR, 10 mikrolitrů, oligonukleotidový primer VL5P, 80 pmol, oligonukleotidový primer VL2N, 80 pmol, mM směs dNTP, 20 mikrolitrů, lOx Pfu pufr, 20 mikrolitrů,

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek.

Nejprve byl reakční roztok zahřát na 2 minuty na 94 °C.

—— ---— Pak-byl-vzorek-zahříván-v-cyklech-l-minuta-při-'94“°C~l*~mi‘^r“ nuta při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Tento cyklus byl 30x _________opakován. Pak byl reakční roztok inkubován 10 minut při teplotě 72 °C.

.... - -

VL3Y-4

Pomocí PCR byla připravena složená bílkovina, obsahující svrchu uvedené fragmenty VL3Y DNA a VL4 DNA. Vzniklý fragment byl označen' jako fragment VL3Y-4 DNA. PCR.byla prováděna za následujících podmínek:

• e -	····	·· toto··	··	to·
•	•	•	• · ·	• ·	•		•
•	•	•	♦ · ·	• ·		··
to	«	to 'to	to to to	to e 9 to	9		•
•	•	to ·	· ·	•	•		•
• ·		• to	• to ·	• ·		• to

Složení reakčního roztoku:

Roztok VL3Y DNA z prvního stupně PCR, 10 mikrolitrů, roztok VL4 DNA z prvního stupně PCR, 10 mikrolitrů, oligonukleotidový primer VL2P, 80 pmol, oligonukleotidový primer VLTERM, 80 pmol, mM směs dNTP, 20 mikrolitrů, lOx pfu pufr, 20 mikrolitrů,

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek.

Nejprve byl reakční roztok zahrát na 2 minuty na 94 °C. Pak byl vzorek zahříván v cyklech 1 minuta při 94 °C, 1 minuta při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Tento cyklus byl 30x opakován. Pak byl reakční roztok inkubován 10 minut při teplotě 72 °C.

VL3F-4

Pomocí PCR byla připravena složená bílkovina, obsahující svrchu uvedené fragmenty VL3F DNA a VL4 DNA. Výsledný fragment byl označen jako fragment VL3F-4 DNA. PCR byla prováděna za následujících podmínek:

Složení reakční směsi:

roztok VL3F DNA z prvního stupně PCR, 10 mikrolitrů, roztok VL4 DNA z prvního stupně PCR, 10 'mikrolitrů, oligonukleotidový primer VL2P, 80 pmol, oligonukleotidový primer VLTERM, 80 pmol, mM směs dNTP, 20 mikrolitrů, lOx Pfu pufr, 20 mikrolitrů,

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek.

- 80 Nejprve byl reakční roztok zahřát na 2 minuty na 94 C. Pak byl vzorek zahříván v cyklech 1 minuta při 94 C, 1 minuta při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Tento cyklus byl 30x opakován. Pak byl reakční roztok inkubován 10 minut při teplotě 72 °C.

Fragmenty VL1-2, VL3Y-4, a VL3F-4 DNA, amplifikované svrchu uvedeným způsobem pomocí PCR byly extrahovány fenolem. Pak byla DNA vysrážena 100% ethanolem. Přibližně 20 až 30 mikrogramů této DNA pak bylo podrobeno elektroforéze na 5% polyakrylamidovém gelu. Gel byl zbarven ethidiumbromidem 1 mikrogram/1 ml, takže fragmenty DNA byly viditelné v UV-světle. Tímto způsobem zjištěné fragmenty DNA pak byly z gelu vyříznuty žiletkou a podrobeny elektroeluci z akrylamidového gelu při použití přístroje Centriruter (Amicon), opatřeného zařízením Centricon 10 (Amicon). DNA pak byla zahuštěna odstředěním 1 hodinu při přibližně 7500 g, načež byla vysrá— žena ethanolem. Výsledná DNA byla vždy rozpuštěna v 50 mikrolitrech destilované vody.

c) Třetí stupeň PCR

Třetí stupeň PCR _ j e_ z n áz o rn ě n _ na _ ob r..-7-.----—--—--VL-KY

Pomocí PCR byla připravena složená bílkovina, obsahující fragmenty VLÍ-2 DNA a VL3Y-4 DNA. Získaný fragment byl označen .jako fragment VL-KY. PCR byla prováděna za následujících podmínek:

Složení reakčního roztoku:

- 81 roztok VL1-2 DNA z druhého stupně PCR, 10 mikrolitrů, roztok VL3Y-4 DNA z druhého stupně PCR, 10 mikrolitrů, oligonukleotidový primer VL5P, 80 pmol, oligonukleotidový primer VLTERM, 80 pmol, mM směs dNTP, 20 mikrolitrů, lOx Pfu pufr., 20 mikrolitrů,

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek.

Nejprve byl reakční roztok zahřát na 2 minuty na 94 °C. Pak byl vzorek zahříván v cyklech 1 minuta při 94 °C, 1 minuta při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Tento cyklus byl 30x opakován. Pak byl reakční roztok inkubován 10 minut při teplotě 72 °C.

Vl-KF

Pomocí PCR byla připravena složená bílkovina, obsahující fragment VL1-2 DNA a VL3F-4 DNA. Výsledný fragment byl označen jako fragment VL-KF DNA. PCR byla prováděna za následujících podmínek:

------ s 1o ž e n í~ - r e ak č n ího - r o z t o ku:--------------------“— roztok VL1-2 DNA z druhého'stupně PCR, 10 mikrolitrů,_______:_______ roztok VL3F-4 DNA z druhého stupně PCR, 10 mikrolitrů, oligonukleotidový primer VL5P, 80 pmol, oligonukleotidový primer VLTERM, 80 pmol, mM směs dNTP, 20 mikrolitrů, lOx Pfu pufr, 20 mikrolitrů,

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek.

»· '··<·« ·· ···· ··

.••Nejprve byl reakční roztok, zahřát .na 2 minuty na. 94. °C.. .· Pak byl vzorek zahříván v cyklech 1 minuta při 94 °C, 1 minuta při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Tento cyklus byl 30x opakován. Pak byl reakční roztok inkubován 10 minut při teplotě 72 °C.

Fragmenty VL-KY a VL-KF DNA, předem amplifikované svrchu uvedeným způsobem pomocí PCR byly extrahovány fenolem. Pak byla DNA vysrážena 100% ethanolem. Přibližně 20 až 30 mikrogramů této DNA pak bylo podrobeno elektroforéze na 5% polyakrylamidovém gelu. Gel byl zbarven ethidiumbromidem mikrogram/1 ml, takže fragmenty DNA byly viditelné v (JV-světle. Tímto způsobem zjištěné fragmenty DNA pak byly z gelu vyříznuty žiletkou a podrobeny elektroeluci z akrylamidového gelu při použití přístroje Centriruter (Amicon).

Konstrukce plasmidů s uloženými fragmenty VL-KY nebo VL-KF DNA je znázorněno na obr. 8.

DNA VL-KY a VL-KF, získaná tímto způsobem, byla dále čištěna extrakcí fenolem a pak byla vysrážena ethanolem. Podíl přibližně 1 mikrogram této DNA byl pak rozštěpen při použití 10 jednotek restrikČních enzymů Xhol a XBal při teplotě 37 °C při použití kompatibilního pufru, dodávaného ---------,— _Sp _o iu-s- enzymy-;----—------—“———¹— --—^J—¹------—· ' ~~~ ______________Podíl 1 mikrogram plasmidů pME185 DNA (Hara T. a______ Miyajima A., 1992, EMBO J., 11, 1875) byl rovněž rozštěpen restrikčními enzymy Xhol a Xbal. Výsledná DNA byla zpracovávána působením alkalické fosfatázy z telecího stře. . va, ,CIP (Takara Shuzo) k odstranění všech 5'-fosfátových skupin. Podíl 100 ng defosforylované DNA plasmidů pME18S byla navázán na 0,5 mikrogramů každého fragmentu VL-KY a VL-KF, rozštěpeného Xbal a Xhol. Vazba pak byla zskutečněna při použití se stavy pro vazbu (Takara Shuzo) a produkt

4« £ ·	•	44 ···· • · ·	99 9 9	• 4 4 9
	•	• 9 ·	• 4	9 9
© A « ·	•	• · · ·	* ··>	9 ·
• ·	© 4 ·	•	9 9
' · 4	.· ·	99 9	4 4	9 9-

vazby pak byl použit k transformaci E. coli kmene DH5alfa (Gibco-BRL) pomocí otevření pórů elektrickými pulzy.

Postupuje se tak, že se 50 mikrolitrů kompetentních buněk nechá roztát a smísí se s 5 mikrolitry směsi pro vazbu. Směs se přenese do kyvety pro otevření pórů elektrickými pulzy (BioRad). Byl užit jeden pulz o 25 /UF, 1,8 kV a 200 ohm. Po uskutečnění pulzu byl buněčný materiál znovu uveden do suspenze v 1 ml prostředí SOC. Buněčná suspenze byla přenesena do sterilní zkumavky a inkubována 1 hodinu při teplotě 37 °C. Výsledný buněčný materiál byl nanesen na plotny LB s obsahem 50 mikrogramů ampicilinu.

Byla provedena analýza plasmidové DNA v koloniích transformantů pomocí restrikčních enzymů tak, aby byly identifikovány ty plasmidy, které obsahovaly požadovanou DNA. Po pěstování transformovaných buněk přes noc byla plasmidová DNA připravena způsobem podle příkladu 4, stupeň 4. DNA byla rozštěpena restrikčními enzymy Xhol a Xbal, tak, aby bylo možno potvrdit klonování fragmentu se správnou velikostí.

Všechny vazné reakce, transformace a analýzy transformantů budou dále prováděny svrchu uvedeným způsobem, neni-li výslovně uvedeno jinak.

Byl identifikován plasmid pHkKY2-58 s obsahem fragmentuVL-KY DNA a plasmid pHkKF2-19, obsahující fragment VL-KF DNA. V obou- případech byly uvedené fragmenty uloženy po směru exprese za promotorem SRalfa v plasmidu mME18S ve správné orientaci pro expresi imunoglobulinu jako výsledného bílkovinného produktu.

3) Konstrukce plasmidu pHkRA2-10 a pHkRF2-52

Ppj použití DNA z plasmidů pHkKY2-58 a pHkKF2-19 jal^o matric, byly zkonstruovány dva další vektory pro expresi.

·· ···· ·· ···· • · · · · · · · ·· «· 9 9··· · ··· · · ···· · · · · · ®

99 99 9 ·· ··

- 84 a) První stupeň PCR

První stupeň PCR je znázorněn na obr. 9.

VLR5'

Byl připraven kódový fragment DNA pro sekreci signální sekvence, oblast FRL^, oblast CDRL^ a oblast FRLg (v níž byl užit v poloze 45 zbytek lysinu místo zbytku argininu). Tento fragment bude dále uváděn jako fragment VLR5* DNA. PCR byla prováděna za následujících podmínek:

Složení reakčního roztoku:

plasmid pHkKY2-58 DNA, 1 mikrogram, oligonukleotidový příměr VLP5, 80 pmol, oligonukleotidový příměr VLRN, 80 pmol, mM směs dNTP, 20 mikrolitrů, lOx Pfu pufr, 20 mikrolitrů,

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek.

Nejprve byl reakční roztok zahřát na 2 minuty na 94 °C. Pak byl vzorek zahříván v cyklech 1 minuta při 94 °C, 1 minuta při 55 °C a 2 minuty- při 72 °C. Tento cyklus byl 30x opakován. Pak byl reakční roztok inkubován 10 minut při teplotě72°C . — - -......----------------VLR3'Y

Byl připraven kódový fragment DNA pro oblast FRLg (v níž byl užit v poloze 45 zbytek lysinu místo zbytku argininu) , oblast CDRL₂, oblast FRL^ (se zbytkem tyrosinu v poloze 87), oblast FRL^ a oblast Ck. Tento fragment bude dále uváděn jako fragment VLR3*Y DNA. PCR byla prováděna za následujících podmínek:

·· ·· • · « · • · ·· ·· ····

··· · · ··

Složení reakčního roztoku:

plasmid pHkKY2-58 DNA, 1 mikrogram, oligonukleotidový přiměř VLRP, 80 pmol, oligonukleotidový primer VLTERM, 80 pmol, mM směs dNTP, 20 míkrolitrů, lOx Pfu pufr, 20 míkrolitrů,

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek.

Nejprve byl reakční roztok zahrát na 2 minuty na 94 °C. Pak byl vzorek zahříván v cyklech 1 minuta při 94 °C, 1 minuta při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Tento cyklus byl 30x opakován. Pak byl reakční roztok inkubován 10 minut při teplotě 72 °C.

VLR3 F

Byl připraven kódový fragment pro oblast FRL^ (se zbytkem lysinu v poloze 45 místo zbytku argininu), oblast CDRL₂, oblast FRLg (obsahující v poloze 87 zbytek fenylalaninu), oblast CDRL^, oblast FRL^ a oblast Ck. Tento fragment bude označován jako fragment VLR3 F DNA. PCR byla prováděna za~následu j ících~podmínek:—------*——~- ——— -Složení reakčního roztoku:___________________________________ plasmid pHkKF2-19 DNA, 1 mikrogram, oligonukleotidový primer VLRP, 80 pmol, oligonukleotidový primer VLTERM, 80 pmol, mM směs dNTP, 20 míkrolitrů, lOx Pfu pufr, 20 míkrolitrů,: λ

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek.

Nejprve byl reakční roztok zahřát na 2 minuty na 94 °C. Pak byl vzorek zahříván v cyklech 1 minuta při 94 °C, 1 minuta pří 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Tento cyklus byl 30x opakován. Pak byl reakční roztok inkubován 10 minut při teplotě 72 °C.

Fragmenty VLR5', VLR3'Y a VLR3'F DNA, amplifikované svrchu uvedeným způsobem pomocí PCR byly extrahovány fenolem. Pak byla DNA vysrážena 100% ethanolem. Přibližně 20 až 30 mikrogramů této DNA pak bylo podrobeno elektroforéze na 5% polyakrylamidovém gelu. Gel byl zbarven ethidiumbromidem 1 mikrogram/1 ml, takže fragmenty DNA byly viditelné v UV-světle. Tímto způsobem zjištěné fragmenty DNA pak byly z gelu vyříznuty žiletkou a podrobeny elektroeluci z akrylamidového gelu při použití přístroje Centriruter (Amicon), opatřeného zařízením Centr.icon 10 (Amicon) . DNA pak byla zahuštěna odstředěním 1 hodinu při přibližně 7500 g, načež byla vysrážena ethanolem. Výsledná DNA byla vždy rozpuštěna v 50 mikrolitrech destilované vody.

b) Druhý stupeň PCR

Druhý stupeň PCR je znázorněn na obr. 10.

VL-RY

Spojení fragmentů DNA VLR5 a VLR3 Y (dále bude výsledný fragment označován jako fragment DNA VLR-Y) bylo uskutečněno pomocí PCR za následujících podmínek:

Složení reakčního roztoku:

Roztok VLR5'DNA, připravený v prvním stupni PCR, 10 mikrolitrů roztok VLR3'Y DNA, připravený v prvním stupni PCR, 10/Ul, oligonukleotidový primer VL5P, 80 pmol, • · · · • ·

oligonukleotidový přiměř VL TERM, 80 pmol, mM směs dNTP, 20 mikrolitrů, lOx Pfu pufr, 20 mikrolitrů,

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek.

Nejprve byl reakční roztok zahřát na 2 minuty na 94 °C. Pak byl vzorek zahříván v cyklech 1 minuta při 94 °C, 1 minuta při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Tento cyklus byl 30x opakován. Pak byl reakční roztok inkubován 10 minut při teplotě 72 °C.

VL-RF

Složený fragment z fragmentů DNA VLR5 a VLR3 F (dále bude tento fragment označován jako fragment DNA VL-RF) byl připraven: pomocí. PCR za .následujících podmínek:

Složení reakčního roztoku:

roztok VLR5* DNA z prvního stupně PCR, 10 mikrolitrů, roztok VLR3*F DNA z prvního stupně PCR, 10 mikrolitrů, oligonukleotidový primer VL5P, 80 pmol, oTigonukleotidový'priměr “VL— TERMr~80^_pmol;--------—-------— mM směs dNTP, 20 mikrolitrů,

10x Pfu pufr, 20 mikrolitrů,

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek.

Nejprve byl reakční roztok zahřát na 2 minuty na 94 °C. Pak byl vzorek zahříván v cyklech 1 minuta při 94 C, 1 minuta při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Tento cyklus byl 30x opakován. Pak byl reakční roztok inkubován 10-minut při teplotě 72 °C.

- 88 Fragmenty VL-RY a VL-RF DNA, které byly amplifikovány svrchu uvedeným způsobem pomocí PCR byly extrahovány fenolem. Pak byla DNA vysrážena 100% ethanolem. Přibližně 20 až 30 mikrogramu této DNA pak bylo podrobeno elektroforéze na 5% pólyakrylamidovém gelu. Gel byl zbarven ethidiumbromidem 1 mikrogram/1 ml, takže fragmenty DNA byly viditelné v UV—světle. Tímto způsobem zjištěné fragmenty DNA pak byly z gelu vyříznuty žiletkou a podrobeny elektroeluci z akrylamidového gelu při použití přístroje Centriruter (Amicon), opatřeného zařízením Centricon 10 (Amicon). DNA pak byla zahuštěna odstředěním 1 hodinu při přibližně 7500 g, načež byla vysrážena ethanolem. Výsledná DNA byla vždy rozpuštěna v 50 mikrolitrech destilované vody.

Konstrukce plasmidu s obsahem fragmentu VL-RY nebo VL-RF DNA je znázorněna na obr. 11.

DNA s obsahem VL-RY nebo VL-RF, připravená tímto způsobem byla dále čištěna extrakcí fenolem a pak srážením ethanolu. Pak byl 1 mikrogram DNA rozštěpen pomocí restrikčních enzymů Xhol a Xbal.

Podíl 1 mikrogram DNA plasmidu pME18S (Hara T. a Miyajima A., svrchu) byl rovněž rozštěpen restrikčními enzymy Xhol a Xbal. Výsledná DNA byla zpracována působením CIP-. Podíl 200 ng defosforylované DNA plasmidu pME18S byl navázán na 0,5 mikrogramů fragmentů VL-RY a VL-RF po rozštěpení enzymy Xbal a Xhol. Vazba byla uskutečněna při použití běžně dodávané sestavy (Takara Syuzo), produkt vazby byl použit k transformaci E. coli, kmene DHSalfa.

• · · • ·

- 89 Byla uskutečněna analýza sekvence DNA plasmidu, obsaženého v koloniích transformantů při použití restrikčních enzymů tak, aby bylo možno identifikovat plasmidy, obsahující hledanou uloženou část DNA. Byl identifikován plasmid pHkRY2-10, obsahující fragment VL-RY a plasmid pHkRF2-52, obsahující fragment VL-RF. Fragmenty byly v obou případech uloženy po směru exprese od promotoru SRalfa v pME18S ve správné orientaci pro expresi výsledného imunoglobulinu.

4) Ověření nukleotidových sekvencí

Byla provedena analýza sekvence úseku DNA, uložených v plasmidech pHkKY2-58, pHkKF2-19, pHkRY2-10 a pHkRF2-52. Při tomto postupu byly použity svrchu popsané primery SHKF-4, SHKF-5, SHKF-6, SHKF-12, SHKR-13, SHKF-11, SHKF-2 a SHKR-3. Mimoto byly syntetizovány tři nové primery.

PMEF2, (SEQ ID' No. 153).,.

SHKF-14, (SEQ ID No. 154) a

PMER2, (SEQ ID No. 155).

Analýza sekvence DNA byla prováděna tvorbou dideoxynukleotidů na konci řetězce podle publikace Sanger F. S. a další, 1977, Proč. Nati. Acad. Sci., USA 74:5463. Před analý zou byla izolována z hostitelských buněk matrice DNA plasmidu rozrušením v alkalickém prostředí s obsahem SDS podle svrchu uvedené publikace Sambrook J. a další, a pak^-byla^DNA^-čršTěna odstředěním při použití chloridu česného podle téže publikace.

Postup byl prováděn tak, že 1 mikrogram čištěné DNA plasmidu byl rozpuštěn v 16 mikrolitrech redestilované vody. Roztok byl smísen se 2 mikrolitry 2 mM EDTA a 2 mikrolitry 2N hydroxidu sodného a pak byl inkubován 5 minut při teplotě • · · · • ·

místnosti. Pak byly k roztoku přidány 4 mikrolitry 10 M roztoku octanu amonného a 100 mikrolitrů 100% ethanolu, směs byla promíchána a uložena na 10 minut do suchého ledu. Pak byla DNA z roztoku oddělena odstředěním 5 minut při 15 000 ot/min. Vzniklá usazenina byla promyta ethanolem s koncentrací 80 % objemových a usušena za sníženého tlaku. Usušená DNA byla rozpuštěna v 7 mikrolitrech redestilované vody a užita jako matrice při analýze sekvence.

Analýza nukleotidové sekvence byla uskutečněna při použití sestavy 7-DEaza-Sequenase, verze 2,0 pro dCTP (Amersham). Postup byl prováděn tak, že 7 mikrolitrů roztoku plasmidu bylo přidáno k 1 pmol primerů a 1 mikrolitrů reakčního pufru (dodaného v sestavě). Směs byla inkubována 2 minuty při teplotě 65 °C. DNA plasmidů byla navázána na primer v průběhu postupného chlazení směsi na teplotu místnosti. DNA byla značena při použití /alfa P/dCTP (Amersham) podle návodu, přiloženého k sestavě. Produkt této reakce byl pak analyzován pomocí elektroforézy na 5% polyakrylamidovém gelu, obsahujícím 8 M močoviny v pufru TBE (100 mM Tris, 100 mM kyseliny borité a 1 mM EDTA při pH 8,3). Gel byl vysušen a sekvence DNA byla identifikována autoradiograficky.

Sekvence DNA, uložená v plasmidů pHkKY2-58 je znázorněna -j ako -SEQ -ID. No. ..7.7.,. ...Tato..nukleotidová..sekvence., .obsahuj.e_ otevřený čtecí rámec, který je kódovou sekvencí pro polypeptid, jehož sekvence je definována jako SEQ ID No. 78.

Sekvence DNA, uložená v plasmidů pHkKF2-19 je znázorněna jako SEQ ID No. 79. Tato nukleotidová sekvence obsahuje otevřený čtecí rámec, který je kódovou sekvencí pro pólypeptid, jehož sekvence je definována jako SEQ ID No. 80.

Sekvence DNA, uložená v plasmidu pHkRY2-10 je znázorněna jako SEQ ID No. 81. Tato nukleotidová sekvence obsahuje otevřený čtecí rámec, který je kódovou sekvenci pro polypeptid, jehož sekvence je definována jako SEQ ID No. 82.

Sekvence DNA uložená v plasmidu pHkRF2-52 je znázorněna jako SEQ ID No. 83. Tato nukleotidová sekvence obsahuje otevřený čtecí rámec, který je kódovou sekvenci pro polypeptid, jehož sekvence je definována jako SEQ ID No. 84.

Příklad 6

Konstrukce vektoru pro expresi humanizovaných variant řetězce H protilátky CH11

1) Příprava primerů

Pomocí PCR byly syntetizovány následující fragmenty DNA:

DNA (SEQ ID No, 85) je kódová sekvence pro polypeptidový řetězec (SEQ ID No. 86) řetězce H/UH, jde o řetězec H humanizované protilátky CH11 proti lidskému Fas.

DNA (SEQ ID No. 87) je kódová sekvence pro polypeptidový ře. tězec (SEQ ID No. 88) řetězce. H^uM řetězce H humanizované protilátky CH11 proti lidskému Fas.

K provádění metody PCR které jsou dále uvedeny:

(VH1P; (SEQ ID No. 156);

(VHSP, (SEQ ID No. 157);

VHSN; (SEQ ID No. 158);

bylo syntetizováno 24 primerů, • · · · • · · ·

- S2 VH2P; (SEQEDNo. 159); VH2N; (SEQ ID No. 160);

VH3P; (SEQ ID No. 161);

VH3N; (SEQ ID No. 162);

VH4P; (SEQ ID No. 163);

VH4N; (SEQ ID No. 164); VHAPAPX; (SEQ ID No. 165);

VHAPAN; (SEQ ID No. 166);

VHTERM; (SEQ ID No. 167);

HUMFR2P; (SEQ ID No. 168); HUMFR2N; (SEQ ID No. 169); MOUFR2P; (SEQ ID No. 170); MOUFR2; (SEQEDNo. 171);

GTOSP; (SEQ ID No. 172); GTOSN; (SEQ ED No. 173);

TCVVAP; (SEQ ID No. 174); TCVVN1; (SEQEDNo. 175); ME18P; (SEQ ID No. 176); a VH06; (SEQ ED No. 178).

-----2 -) ---Konstrukce -p 1 asmi du -pMRC 2 2— .........—----—__

Pro humanizovaný řetězec CH11 byl ve vícestupňovém postupu zkonstruován vektor pro expresi. Nejprve byl vytvořen vektor, obsahující C-konec konstantní oblasti řetězce H lidského IgM.

MEC

Byl připraven kódový fragment DNA pro.Crkonec sekvence aminokyselin řetězce H lidského IgM. Tento_; fragment bude dále označován jako fragment MEC DNA. Jeho konstrukce je znázor • · ·· · ·· · · · · ’ • · ··· ·· ♦ ···· ···· · · · · · ·· ·· ' ·· · ·· ·’

- 93 něna na obr. 12. PCR byla prováděna za následujících podmínek

Složení reakčního roztoku:

DNA plasmidu pHHl-5, 1 mikrogram, oligonukleotidový primer VHAPAPX, 80 pmol, oligonukleotidový primer VHTERM, 80 pmol, směs dNTP, 20 mikrolitrů, lOx Pfu pufr, 20 mikrolitrů,

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek.

Nejprve byl reakční roztok zahřát na 2 minuty na 94 °C. Pak byl vzorek zahříván v cyklech 1 minuta při 94 °C, 1 minuta při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Tento cyklus byl 30x opakován. Pak byl *reakční roztok inkubován 10 minut při teplotě 72 °C.

Fragment MEC DNA, který byl takto amplifikován svrchu uvedeným způsobem pomocí PCR byly extrahovány fenolem. Pak byla DNA vysrážena 100% ethanolem. Přibližně 20 až 30 mikrogramů této DNA pak bylo podrobeno elektroforéze na 5% pólyakrylamidovém gelu. Gel byl zbarven ethidiumbromidem_~~~ mikrogram/1 ml, takže fragmenty DNA byly viditelné v UV-světle. Tímto způsobem zjištěné fragmenty DNA pak byly z ge’ lu vyříznuty žiletkou a podrobeny elektroeluci z akrylamidového gelu při použití přístroje Centriruter (Amicon), opatřeného zařízením Centricon 10 (Amicon). DNA pak byla zahuštěna odstředěním 1 hodinu při přibližně 7500 g, načež byla vysrážena ethanolem. Výsledná DNA byla vždy rozpuštěna v 50 mikrolitrech destilované vody.

^f Konstrukce plasmidu s uloženým fragmentem MEC DNA je znázorněna na obr. 13.

• · · · · · ·· ···· ·· · ·· · · · · · • · · · · ·· · ···· ♦ ···· ··· ··· ·· · · e β ο · · ··

- 94 MEC DNA byla dále čištěna extrakcí fenolem s následným srážením ethanolem. Pak byl 1 mikrogram DNA rozštěpen restrikčními enzymy Xhol a Xbal.

Podíl 1 mikrogram DNA plasmidu pME18S (Hara T. a Miyajima A., svrchu), byl rovněž rozštěpen restrikčními enzymy Xhol a Xbal. Výsledná DNA byla zpracována působením CIP. Podíl 100 ng defosforylované DNA plasmidu pME18S byl navázán na 0,5 mikrogramů fragmentu MEC po jeho rozštěpení enzymy Xbal a Xhol. Vazba byla provedena pomocí dodávané sestavy (Takara Shuzo) a získaný produkt byl použit k transformaci E. coli kmene JM109 (Takara Shuzo).

DNA plasmidu, obsaženého v koloniích transformantů byla analyzována pomocí restrikčních enzymů tak, aby bylo možno identifikovat plasmidy, obsahující požadovanou DNA. Byl získán plasmid pMEC22., v němž je fragment MEC DNA uložen po směru exprese od promotoru SRalfa v plasmidu pMR18S ve správné orientaci pro expresi požadovaného imunoglobulinu.

3) Konstrukce plasmidu pMEHC20

a) První stupeň PCR

Provedení prvního stupně PCŘ je znázorněno na obr. 14.

HSEC------=--—-----------------------------------Byl připraven fragment DNA s kódovou sekvencí pro signální řetězec pro sekreci a pro N-konec oblasti FRH^. Tento fragment bude dále uváděn jako HSEC DNA. K provedení PCR byly užity následující reakční podmínky:

- 95 ·· ··♦·

Složení reakčního roztoku:

DNA plasmidu pCR3-H123, 1 mikrogram, oligonukleotidový primer VHSN, 80 pmol, oligonukleotidový primer VH1P, 80 pmol, mM směsi dNTP, 20 mikrolitrů, lOx Pfu pufr, 20 mikrolitrů,

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek.

Nejprve byl reakční roztok zahřát na 2 minuty na 94 °C. Pak byl vzorek zahříván v cyklech 1 minuta při 94 °C, 1 minuta při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Tento cyklus byl 30x opakován. Pak byl reakční roztok inkubován 10 minut při teplotě 72 °C.

VH1

Byl připraven fragment DNA s kódovou sekvencí pro oblast FRH₁ a N-konec oblasti CDRH₁. Tento fragment bude dále uváděn jako fragment CH1 DNA. Při PCR byly použity následující reakční podmínky.

-------Složení reakčního roztoku: — --------------------------;-------------------—— DNA plasmidu pHHl-5, 1 mikrogram,___________________________ oligonukleotidový primer VHSP, 80 pmol, oligonukleotidový primer VH2N, 80 pmol, mM směsi dNTP, 20 mikrolitrů, lOx Pfu pufr, 20 mikrolitrů,

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek.

·· ···· ·· ·♦♦·

- 96 Nejprve byl reakční roztok zahřát na 2 minuty na 94 °C. Pak byl vzorek zahříván v cyklech 1 minuta při 94 °C, 1 minuta při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Tento cyklus byl 30x opakován. Pak byl reakční roztok inkubován 10 minut při teplotě 72 °C.

VH2

Byl připraven fragment DNA s kódovou sekvencí pro oblast CDRHp C-konec oblasti FRH₂ a N-konec oblasti CDRHg. Tento fragment bude dále uváděn jako fragment VH2 DNA. PCR byla prováděna za následujících podmínek:

Složení reakčního roztoku:

DNA plasmidů pCR3-H123., 1 mikrogram, oligonukleotidový primer VH2P, 80 pmol, oligonukleotidový primer VH3N, 80 pmol, mM směs dNTP, 20 mikrolitrů, lOx Pfu pufr, 20 mikrolitrů,

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek.

Nejprve byl reakční roztok zahřát na 2 minutý na 94 °C'. Pak byl vzorek zahříván v cyklech 1 minuta při 94 °C, 1 minuta při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Tento cyklus byl 30x opakován. Pak byl reakční roztok inkubován 10 minut při teplotě 72 °C.

VH3

Byl připraven fragment DNA s kódovou sekvencí pro N-konec oblasti CDRH₂, oblast FRH^ a oblast CDRH^. Tento • · '· · · ·

- 97 fragment bude dále uváděn jako fragment VH3 DNA. PCR byla prováděna za následujících podmínek:

Složení reakčního roztoku:

DNA plasmidů pHHl-5, 1 mikrogram, oligonukleotidový primer VH3P, 80 pmol, oligonukleotidový primer VH4N, 80 pmol, mM směs dNTP, 20 mikrolitrů, lOx Pfu pufr, 20 mikrolitrů,

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek.

Nejprve byl reakční roztok zahřát na 2 minuty na 94 °C.

Pak byl vzorek zahříván v cyklech 1 minuta při 94 °C, 1 minuta při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Tento cyklus byl 30x opakován. Pak byl reakční roztok inkubován 10 minut při teplotě 72 °C.

VH4

Byl připraven fragment DNA s kódovou sekvencí pro oblast

CDR-3, oblast FR-4 a N-konec konstantní oblasti řetězce H.

Tento fragment bude _ dále uváděn j ako fragment - VH4 DNA-.- PCR--------......— byla prováděna za následujících podmínek:

Složení reakčního roztoku:

DNA plasmidů pHHl-5, 1 mikrogram, oligonukleotidový primer VH4P, 80 pmol, oligonukleotidový primer VHAPAN, 80 pmol, mM směs dNTP, 20 mikrolitrů, lOx Pfu pufr, 20 mikrolitrů,

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek.

• · · · « · • · · ·

Nejprve byl reakční roztok zahřát na 2 minuty na 94 °C. Pak byl vzorek zahříván v cyklech 1 minuta při 94 °C, 1 minuta při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Tento cyklus byl 30x opakován. Pak byl reakční roztok inkubován 10 minut při teplotě 72 °C.

Fragmenty HSEC, VH1, VH2, VH3 a VH4 DNA, amplifikované svrchu uvedeným způsobem pomocí PCR byly extrahovány fenolem. Pak se DNA vysráží při použití 100% ethanolu. Vzorek DNA s hmotností přibližně 20 až 30 mikrogramů se pak podrobí elektroforéze na 5% polyakrylamidovém gelu. Gel se barví roztokem ethidiumbromidu 1 mikrogram/1 ml tak, že fragmenty DNA jsou viditelné v UV světle. Fragmenty DNA, prokázané tímto způsobem se z gelu vyříznou žiletkou, pak se provádí elektroeluce akrylamidového gelu v přístroji Centriruter (Amicon), opatřeném zařízením Centricon 10 (Amicon). Po eluci se DNA zahustí odstředěním 1 hodinu při přibližně 7500 g, načež se vysráží ethanolem. Výsledná DNA se vždy rozpustí v 50 mikrolitrech destilované vody.

i

b) Druhý stupeň PCR

Provádění druhého stupně PCR je znázorněno na obr. 15.

VHS12

-----Produkt s obsahem fragmentů HSEC, VH1 a VH2 DNA byl---připraven s použitím PCR. Výsledný fragment bude dále označován jako fragment VHS12 DNA. PCR byla prováděna za následujících podmínek:

Složení reakčního roztoku:

roztok .HSEC DNA z prvního stupně PCR, 10 mikrolitrů, ·· ·· · · '9 · • · · • · · • · · • · • · ·· ··

roztok VH1 DNA z prvního stupně PCR, 10 mikrolitrů, roztok VH2 DNA z prvního stupně PCR, 10 mikrolitrů, oligonukleotidový primer VH1P, 80 pmol, oligonukleotidový primer VH3N, 80 pmol, mM směs dNTP, 20 mikrolitrů, lOx Pfu pufr, 20 mikrolitrů,

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek.

Nejprve byl reakční roztok zahřát na 2 minuty na 94 C. Pak byl vzorek zahříván v cyklech 1 minuta při 94 C, 1 minuta při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Tento cyklus byl 30x opakován. Pak byl reakční roztok inkubován 10 minut při teplotě 72 °C.

VH34

Produkt s obsahem fragmentu VH3 DNA a fragmentu VH4 DNA byl připraven s použitím PCR. Tento fragment bude dále uváděn jako VH34 DNA. PCR byla prováděna za následujících podmínek:

Složení reakčního roztoku:

ro_z.t_o.k VH3...DNAz prvního, stupně PCR., .10. mikrolitru,_______________________ roztok VH4 DNA z prvního stupně PCR, 10 mikrolitrů, oligonukleotidový primer VH3P, 80 pmol, ..

oligonukleotidový primer VHAPAN, 80 pmol, mM směs dNTP, 20 mikrolitrů, lOx Pfu pufr, 20 mikrolitrů,

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek.

·· ···· *· ·♦··

9·

9· •· «

• ·

9 •· •· •· •· ·· ·· •· · · •· ·· ··· ·· • ·· ·· ·*

100 °c.

minuty na 94 při 94 °C, 1 micyklus byl 30x 10 minut při teproztok zahřát na cyklech 1 minuta při 72 °C. Tento roztok inkubován

Nejprve byl reakční Pak byl vzorek zahříván v nuta při 55 °C a 2 minuty opakován. Pak byl reakční lote 72 °C.

Výsledné fragmenty VHS12 DNA a VH34 DNA, amplifikované svrchu uvedeným způsobem pomocí PCR byly extrahovány fenolem. Pak se DNA vysráží při použití 100% ethanolu. Vzorek DNA s hmotností přibližně 20 až 30 mikrogramů se pak podrobí elektroforéze na 5% polyakrylamidovém gelu. Gel se barví roztokem ethidiumbromidu 1 mikrogram/l ml tak, že fragmenty DNA jsou viditelné v UV světle. Fragmenty DNA, prokázané tímto způsobem se z gelu vyříznou žiletkou, pak se provádí elektroeluce akrylamidového gelu v přístroji Centriruter (Amicon), opatřeném zařízením Centricon 10 (Amicon). Po eluci se DNA zahustí odstředěním 1 hodinu při přibližně 7500 g, načež se vysráží· ethanolem. Výsledná DNA se vždy rozpustí v 50 mikrolitrech destilované vody.

c) Třetí stupeň PCR

Provedení třetího stupně PCR je znázorněno na obr. 16.

....... ....... VHS1234............................. .........................

__P rodukt s obsahem fragmentu VHS12 DNA a VH34 DNA bvl— připraven s použitím PCR. Tento fragment bude dále uváděn jako VHS1234 DNA. PCR byla prováděna za následujících podmínek:

Složení reakčního roztoku:

roztok VHS12 DNA z druhého stupně PCR, 10 mikrolitrů, roztok VH34 DNA z druhého stupně PCR, 10 mikrolitrů, ·· · · oligonukleotidový primer VH1P, 80 pmol, oligonukleotidový primer VHAPAN, 80 pmol, 25 mM směs dNTP, 20 mikrolitrů, lOx Pfu pufr, 20 mikrolitrů,

Pfu DNA polymeráza, (Stratagene) , 10 jednotek.

Nejprve byl reakčni roztok zahrát na 2 minuty na 94 C. Pak byl vzorek zahříván v cyklech 1 minuta při 94 C, 1 minuta při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Tento cyklus byl 30x opakován. Pak byl reakčni roztok inkubován 10 minut při teplotě 72 °C.

Výsledný fragment VHS1234 DNA, který byl amplifikován svrchu uvedeným způsobem při použití PCR, byl extrahován fenolem. Pak se DNA vysráží při použití 100% ethanolu. Vzorek DNA s hmotností přibližně. 20 až 30 mikrogramů se pak podrobí elektroforéze na 5% polyakrylamidovém gelu. Gel se barví roztokem ethidiumbromidu 1 mikrogram/1 ml tak, že fragmenty DNA jsou viditelné v UV světle. Fragmenty DNA, prokázané tímto způsobem se z gelu vyříznou žiletkou, pak se provádí elektroeluce akrylamidového gelu v přístroji Centriruter (Amicon), opatřeném zařízením Centricon 10 (Amicon). Po eluci se DNA zahustí odstředěním 1 hodinu při přibližně 7500 g, načež se vysráží ethanolem. Výsledná DNA se vždy rozpustí v 50 mikrolitrech destilované vody.

Konstrukce plasmidu s uloženým fragmentem VHS1234 DNA je znázorněna na obr. 17.

Fragment VHS1234 DNA, získaný uvedeným způsobem byl dále čištěn extrakcí fenolem a pak vysrážením ethanolem. Pak byla DNA rozštěpena restrikčními enzymy Xhol a Apal.

• · · · · · ··· ··· · · · ···· • · · · · · · · · · · · ···· ··· · · • β · · ·· · ·· · ·

- 102 Podíl 1 mikrogram DNA plasmidu pMEC22 byl rovněž rozštěpen restrikčními enzymy Xhol a Apal defosforylován pomocí CIP. Podíl 100 ng defosforylované DNA plasmidu pMEC22 byl navázán na 0,5 mikrogramů fragmentu VHS1234 DNA po jeho rozštěpení enzymy Xhol a Apal. Vazba byla provedena při použití běžně dodávané sestavy (Takara Shuzo) a produkt vazby byl použit k transformaci E. coli kmene JM109 (Takara Shuzo).

Analýza DNA plasmidu z transformovaných kolonií pomocí restrikčnich enzymů byla provedena k identifikaci plasmidu s obsahem požadovaného fragmentu DNA. Byl získán plasmid pMEHC20 s obsahem fragmentu DNA VHS1234. Tento fragment byl uložen po směru exprese od promotoru SRalfa v plasmidu pMHC22 ve správné orientaci pro expresi výsledného imunoglobulinu.

4) Kontrukce plasmidu pHFR3 a plasmidu pHFR4

a) První stupeň PCR

Provedení prvního stupně PCR je znázorněno na obr. 18.

HUMFR5'

Byl připraven fragment DNA s kódovou sekvencí pro signální sekvenci pro sekreci, oblast FRH^, oblast CDRH^ a oblast FRH₂ (v níž byly zbytky aminokyselin v polohách 38 až 44 nahrazeny— zbytky arg±n±nug—g-lutaminug—al-anřnug—prol“řnug—gi-ycd-nuT glutaminu a glycinu). Tento fragment bude dále uváděn jako fragment HUMFR5* DNA. PCR byla prováděna za následujících podmínek:

Složení reakčního roztoku:

DNA plasmidu pMRHC20, 1 mikrogram, • · · · • · • · » · · 9 9 9 99999

9999 999999

99 99 9 ····

- 103 oligonukleotidový primer VH1P, 80 pmol, oligonukleotidový primer HUMFR2N, 80 pmol, mM dNTP směsi, 20 mikrolitrů, lOx Pfu pufr, 20 mikrolitrů,

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek.

Nejprve byl reakční roztok zahrát na 2 minuty na 94 °C. Pak byl vzorek zahříván v cyklech 1 minuta při 94 °C, 1 minuta při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Tento cyklus byl 30x opakován. Pak byl reakční roztok inkubován 10 minut při teplotě 72 °C.

HUMFR3'

Byl připraven fragment DNA s kódovou sekvencí pro oblast FRH'₂ (v níž byly zbytky aminokyselin v polohách 38 až 44 nahrazeny argininem, glutaminem, alaninem, prolinem, glycinem, glutaminem a glycinem), oblast CDRH₂, oblast FRHg, oblast CDRH3, oblast FRH^ a N-konec konstantní oblasti řetězce H. Tento fragment bude dále uváděn jako fragment HUMFR3* DNA. PCR byla prováděna za následujících podmínek:

Složení reakčního roztoku:

DNA plasmidů pMEHC20, 1 mikrogram, oligonukleotidový primer VHÓ6, 80 pmol, oligonukleotidový primer HUMFR2P, 80 pmol, mM směs dNTP, 20 mikrolitrů, lOx Pfu pufr, 20 mikrolitrů,

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek.

·· ···· ·· ···· ·· ·· ·· · · · ····· »· 9 · · · · · · · • · 9··99 9 999 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 99 9 9 9 99

- 104 Nejprve byl reakční roztok zahřát na 2 minuty na 94 °C. Pak byl vzorek zahříván v cyklech 1 minuta při 94 °C, 1 minuta při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Tento cyklus byl 30x opakován. Pak byl reakční roztok inkubován 10 minut při teplotě 72 °C.

M0UFR5'

Byl připraven fragment DNA s kódovou sekvencí pro signální sekvenci pro sekreci, oblast FRH^, oblast CDRH^ a oblast FRH₂ (v níž byly zbytky aminokyselin v polohách 38 až 44 nahrazeny lysinem, glutaminem, alaninem, histidinem, glycinem, lysinem a serinem). Tento fragment bude dále uváděn jako fragment M0UFR5'DNA. PCR byla prováděna za následujících podmínek:

Složení reakčního roztoku:

DNA plasmidu pMEHC20, 1 mikrogram, oligonukleotidový primer VH1P, 80 pmol, oligonukleotidový primer M0UFR2N, 80 pmol, mM směs dNTP, 20 mikrolitrů, lOx Pfu pufr, 20 mikrolitrů,

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek.

Nejprve byl reakční roztok zahřát na 2 minuty na 94 C. Pak byl vzorek zahříván v cyklech i minuta při 94 C, 1 mi-______ nuta při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Tento cyklus byl 30x opakován. Pak byl reakční roztok inkubován 10 minut při teplotě 72 °C.

• · • · ·· · ·· · · · · · • 9 · · · · · · ♦ · • · · · · · · · · · · · ···· ··· ··· ·· · · ·· » ·· · ·

- 105 M0UFR3'

Byl připraven fragment DNA s kódovou sekvencí pro oblast FRH₂ (v níž byly zbytky aminokyseliny v polohách 38 až 44 nahrazeny lysinem, glutaminem, alaninem, histidinem, glycinem, lysinem a serinem), oblast CDRHg, oblast FRH_3> oblast CDRH^, oblast FRH^ a N-konec konstantní oblasti řetězce H. Tento fragment bude dále uváděn jako fragment M0UFR3' DNA. PCR byla prováděna za následujících podmínek:

Složení reakčního roztoku:

DNA plasmidu pMEHC20, 1 mikrogram, oligonukleotidový primer VH06, 80 pmol, oligonukleotidový primer M0UFR2P, 80 pmol, mM směs-dNTP, 20 mikrolitrů, lOx Pfu pufr, 20 mikrolitrů,

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek.

Nejprve byl reakční roztok zahřát na 2 minuty na 94 °C. Pak byl vzorek zahříván v cyklech 1 minuta při 94 °C , 1 minuta při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Tento cyklus byl 30x opakován-.. Pak-byl reakční roztok inkubován 10 minut při teplotě 72 °C.

HUMFR5 , HUMFR3 , M0UFR5 a M0UFR3 DNA, amplifikované svrchu uvedeným způsobem pomocí PCR byly extrahovány fenolem. Pak se DNA vysráží při použití 100% ethanolu. Vzorek DNA s hmotností přibližně 20 až 30„mikrogramů se pak podrobí elektroforéze na 5% polyakrylamidovém gelu. Gel se barví roztokem ethidiumbromidu 1 mikrogram/1 ml tak, že fragmenty DNA jsou viditelné v UV světle. Fragmenty DNA, prokázané tímto způsobem se z gelu vyříznou žiletkou, pak se provádí elektroeluce akrylamidového gelu v přístroji Centriruter • · · · • · • · · · *

106 (Amicon) , opatřeném zařízením Centricon 10 (Amicon). Po eluci se DNA zahustí odstředěním 1 hodinu při přibližně 7500 g, načež se vysráží ethanolem. Výsledná DNA se 50 mikrolitrech destilované vody.

vždy rozpustí v

b) Druhý stupeň PCR

Druhý stupeň PCR je znázorněn na obr.

19.

HUMFR2

HUMFR3' DNA byl

Produkt s obsahem fragmentů HUMFR5 a připraven při použití PCR. Tento fragment bude dále uváděn jako HUMFR2 DNA. PCR Byla prováděna za následujících podmínek:

Složení reakčního roztoku:

roztok HUMFR5* DNA z prvního stupně PCR, 10 mikrolitrů, roztok HUMFR3* DNA z prvního stupně PCR, 10 mikrolitrů, oligonukleotidový primer VH1P, 80 pmol, oligonukleotidový primer VH06, 80 pmol, mM směs dNTP, 20 mikrolitrů, lOx Pfu pufr, 20 mikrolitrů,

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek

Nejprve byl reakční Pak byl vzorek zahříván v nuta při 55 °C a 2 minuty opakován. Pak byl reakční lote 72 °C.

roztok zahřát na cyklech 1 minuta při 72 °C. Tento roztok inkubován minuty na 94 °C. při 94 °C, 1 micyklus byl 30x minut při tep• · ·

- 107 M0UFR2

Produkt s obsahem fragmentů M0UFR5* a M0UFR3* DNA byl připraven pomocí PCR. Tento produkt bude dále označován jako fragment M0UFR2 DNA. PCR byla prováděna za následujících podmínek:

Složení reakčního roztoku:

roztok M0UFR5'DNA z prvního stupně PCR, 10 mikrolitrů, roztok M0UFR3* DNA z prvního stupně PCR, 10 mikrolitrů, oligonukleotidový primer VH1P, 80 pmol, oligonukleotidový primer VH06, 80 pmol, mM směs dNTP, 20 mikrolitrů,

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek.

Nejprve byl reakční roztok zahřát na 2 minuty na 94 °C. Pak byl vzorek zahříván v cyklech 1 minuta při 94 °C, 1 minuta při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Tento cyklus byl 30x opakován. Pak byl reakční roztok inkubován 10 minut při teplotě 72 °C.

Fragmenty HUMFR2 DNA a M0UFR2 DNA, amplifikované svrchu uvedeným způsobem pomocí PCR byly extrahovány fenolem. Pak se DNA vysráží při použití 100% ethanolu. Vzorek ĎNÁ s hmotností přibližně 20 až 30 mikrogramů sé pak podrobí elektrofořeze na 5% polyakrylamidovém gelu. Gel se barví roztokem ethidiumbromidu 1 mikrogram/1 ml tak, že fragmenty DNA jsou viditelné v UV světle. Fragmenty DNA, prokázané tímto způsobem se z gelu vyříznou žiletkou, pak se provádí elektroeluce akrylamidového gelu v přístroji Centriruter (Amicon), opatřeném zařízením Centricon 10 (Amicon). Po eluci se DNA zahustí odstředěním 1 hodinu při přibližně 7500 g, načež se vysráží ethanolem. Výsledná DNA se vždy rozpustí v 50 mikrolitrech destilované vody.

• · · · • · · · • · · · · • · · ·· ··

- 108 Konstrukce plasmidu s uloženým fragmentem HUMFR2 DNA a M0UFR2 DNA je znázorněna na obr. 20.

Fragmenty HUMFR2 a M0UFR2 DNA, získané tímto způsobem, byly dále čištěny extrakcí fenolem a pak vysrážením ethanolem. Pak byla DNA rozštěpena při použití restrikčních enzymů Xhol a BglII.

Podíl 1mikrogram DNA plasmidu pMEHC20 byl rovněž rozštěpen restrikčními enzymy Xhol a BglII a pak byl defosforylován pomocí CIP. Podíl 100 ng defosforylované DNA plasmidu pMEHC20 byl navázán vždy na 0,5 mikrogramů fragmentu HUMFR2 nebo M0UFR2 po jejich rozštěpení Xho I a BglII. Vazba byla uskutečněna při použití běžně dodávané sestavy (Takara Shuzo) a produkt vazby byl použit k transformaci E. coli kmene JM109 (Takara Shuzo).

Byla provedena analýza sekvence DNA plasmidu z transformovaných kolonií pomocí restrikčních enzymů k identifikaci plasmidů s obsahem požadovaného fragmentu. Byl získán plasmid pHFR3, obsahující fragment HUMFR2 DNA a plasmid pHFR4, obsahující fragment M0UFR2 DNA.

5) Konstrukce plasmidu pMECW5

Plasmid pMECW5 byl zkonstruován pomocí PCR při použití DNA—z plasmidu pMEC22 jako matrice pro PCR. ———-----------Provádění PCR je znázorněno na obr. 21.

a) První stupeň PCR

HHC1

Byl připraven fragment DNA, odpovídající 5'-terminální oblasti uloženého fragmentu DNA v plasmidu pMEC22. Tento

I ··········

I ··· ·······

I ······· ······

I ···· ··♦···

I ···········

- 109 fragment bude dále označován jako HHC1 DNA. PCR byla prováděna za následujících podmínek:

Složení reakčního roztoku:

DNA plasmidu pMEC22, 1 mikrogram, oligonukleotidový primer ME18P, 80 pmol, _______________________oligonukleotidový primer GTOSN, 80 pmol,__________ mM směs dNTP, 20 mikrolitrů, lOx Pfu pufr, 20 mikrolitrů,

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek.

| Nejprve byl reakční roztok zahrát na 2 minuty na 94 °C.

\ Pak byl vzorek zahříván v cyklech 1 minuta při 94 °C, 1 minuta při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Tento cyklus byl 30x opakován. Pak byl reakční roztok inkubován 10 minut při teplotě 72 °C.

HHC2

Byl připraven fragment DNA, odpovídající vnitřní oblasti DNA, uložené do plasmidu pMEC22. Tento fragment bude dále uváděn jako fragment HHC2 DNA. PCR byla prováděna za následujících podmínek:

' Složení reakčního roztoku:

DNA plasmidu pMEC22, 1 mikrogram, oligonukleotidový primer GTOSP, 80 pmol, oligonukleotidový přiměř TCWN1, 80 pmol, mM směs dNTP, 20 mikrolitrů, lOx Pfu pufr, 20 mikrolitrů,

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek.

- 110 ·· ····

Nejprve byl reakční roztok zahřát na 2 minuty na 94 °C. Pak byl vzorek zahříván v cyklech 1 minuta při 94 °C, 1 minuta při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Tento cyklus byl 30x opakován. Pak byl reakční roztok inkubován 10 minut při teplotě 72 °C.

HHC3

Byl připraven fragment DNA, odpovídající 3'-terminální oblasti DNA, uložené do plasmidů pMEC22. Tento fragment bude dále označován jako fragment HHC3 DNA. PCR byla prováděna za následujících podmínek:

Složení reakčního roztoku:

DNA plasmidů pMEC22, 1 mikrogram, oligonukleotidový primer TCWAP, 80 pmol, oligonukleotidový primer VHTERM, 80 pmol, mM směs dNTP, 20 mikrolitrů, lOx Pfu pufr, 20 mikrolitrů,

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek.

Nejprve byl reakční roztok zahrát na 2 minuty na 94 °C. Pak byl vzorek zahříván v cyklech 1 minuta při 94 °C, 1 minuta při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Tento cyklus byl 30x opakován. Pak byl reakční roztokinkubován 10 minut při teplotě 72 °C.

Fragmenty HHC1, HHC2 a HHC3 DNA, amplifikované svrchu uvedeným způsobem pomocí PCR byly extrahovány fenolem. Pak se DNA vysráží při použití 100% ethanolu. Vzorek DNA s hmotností přibližně 20 až 30 mikrpgramů se pak podrobí elektroforéze na 5% polyakrylamidovém gelu. Gel se barví roztokem ethidiumbromidu 1 mikrogram/l’ml tak, že fragmenty DNA jsou viditelné v UV světle. Fragmenty DNA, prokázané φφ φφφφ • · φφφφ ·· · ·· φ φ · · φ ··· · · · ···· • · φ·· φφ φ φφφφ φ φφφφ φφφ φφφ φφ φφ Φ· φ ·· ·φ

- 111 tímto způsobem se z gelu vyříznou žiletkou, pak se provádí elektroeluce akrylamidového gelu v přístroji Centriruter (Amicon), opatřeném zařízením Centricon 10 (Amicon). Po eluci se DNA zahustí odstředěním 1 hodinu při přibližně 7500 g, načež se vysráží ethanolem. Výsledná DNA se vždy rozpustí v 50 mikrolitrech destilované vody.

b) Druhý stupeň PCR

Provedení druhého stupně PCR je znázorněno na obr. 22.

HHC1-2

Byl připraven produkt, obsahující fragment HHC1 DNA a fragment HHC2 DNA. Tento fragment, připravený pomocí PCR bude dále uváděn jako fragment HHC1-2 DNA. PCR byla prováděna za následujících podmínek:

Složení reakčního roztoku:

roztok HHC1 DNA z prvního stupně PCR, 10 mikrolitrů, roztok HHC2 DNA z prvního stupně PCR, 10 mikrolitrů, oligonukleotidový primer ME18P, 80 pmol, oligonukleotidový primer TCWN, 80 pmol, mM směs dNTP, 20 mikrolitrů, lOx Pfu pufr, 20 mikrolitrů,

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek.

Nejprve byl reakční roztok zahřát na 2 minuty na 94 °C. Pak byl vzorek zahříván v cyklech 1 minuta při 94 °C, 1 minuta při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Tento cyklus byl 30x opakován. Pak byl reakční roztok inkubován 10 minut při teplotě 72 °C.

- 112 • · · · · · ·· ····

Získaný fragment HHC1-2 se extrahuje fenolem. Pak se DNA vysráží při použití ethanolu. Získá se 20 až 30 mikrogramů DNA, které se podrobí elektroforéze na 5% polyakrylamidovém gelu. Po ukončení elektroforézy se pak gel barví roztokem ethidiumbromidu 1 mikrogram/1 ml tak, že fragmenty DNA jsou viditelné v UV světle. Fragmenty DNA, prokázané tímto způsobem se z gelu vyříznou žiletkou, pak se provádí elektroeluce akrylamidového gelu v přístroji Centriruter (Ámicon), opatřeném zařízením Čentricoň 10 (Ámicon). Po ěluci se DNA zahustí odstředěním 1 hodinu při přibližně 7500 g, načež se vysráží ethanolem. Výsledná DNA se vždy rozpustí v 50 mikrolitřech destilované vody.

c) Třetí stupeň PCR

Provedení třetího stupně PCR je znázorněno na obr. 23.

HHC123

Produkt s obsahem fragmentů DNA HHC1-2 a HHC3 se připraví při použití PCR. Výsledný fragment bude dále uváděn jako fragment DNA HHC123. PCR byla prováděna za následujících podmínek:

Složení reakčního roztoku:

-roz-tok-4dHC-3—DNA—z—p-rvn-í-ho—s-tupně—PCR-j—1-0—mí-krol-i-t-rů^---------roztok HHC1-2 DNA z druhého stupně PCR, 10 mikrolitrů, oligonukleotidový primer MR18P, 80 pmol, oligonukleotidový primer VHTERM, 80 pmol, mM směs dNTP, 20 mikrolitrů, lOx Pfu pufr, 20 mikrolitrů,

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek.

4 44·· ···· ··4 4 ·· · ·· 4···· • · 4 · · 4 4 · · 4 • 4 44444 4 444 44

444 4 4 4444

44 4* 4 4«44

- 113 Nejprve byl reakční roztok zahřát na 2 minuty na 94 °C. Pak byl vzorek zahříván v cyklech 1 minuta při 94 °C, 1 minuta při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Tento cyklus byl 30x opakován. Pak byl reakční roztok inkubován 10 minut při teplotě 72 °C.

Získaný fragment HHC123 se extrahuje fenolem. Pak se DNA vysráží při použití ethanolu. Získá se 20 až 30 mikrogřámu ^ĎNÁ7“kté~i^é“se^podrčiyí ^eTektTOforeze^n-a-S^-polyakryl— amidovém gelu. Po ukončení elektroforézy se pak gel barví roztokem ethidiumbromidu 1 mikrogram/1 ml tak, že fragmenty DNA jsou viditelné v UV světle. Fragmenty DNA, prokázané tímto způsobem se z gelu vyříznou žiletkou, pak se provádí elektroeluce akrylamidového gelu v přístroji Centriruter (Amicon), opatřeném zařízením Centricon 10 (Amicon). Po eluci se DNA zahustí odstředěním 1 hodinu při přibližně 7500 g, načež se vysráží ethanolem. Výsledná DNA se vždy rozpustí v 50 mikrolitrech destilované vody.

Konstrukce plasmidu s uloženým fragmentem DNA HHC123 je znázorněna na obr. 24.

Fragment DNA HHC123, získaný tímto způsobem, byl dále čištěn extrakcí fenolem s následným srážením ethanolem. Pak byla DNA rozštěpena restrikčními enzymy Xhol a Xbal.

Podíl 1 mikrogram DNA plasmidu pME18S (Hárá T. a Miyajima A., svrchu) byl rovněž rozštěpen restrikčními enzymy Xhol a Xbal a pak byl defosforylován s použitím CIP. Podíl 100 ng defosforylované DNA plasmidu pME18S byl pak navázán na 0,5 mikrogramů DNA HHC123 po rozštěpení enzymy Xhol a Xbal. Vazba byla uskutečněna při použití běžně dodávané sestavy (Takara Shuzo) a výsledná DNA byla použita k transformaci E. coli kmene JM109 (Takara Shuzo).

·· ···· •6 ···· ·· ·· • · · · • · ··

114

Byla provedena analýza DNA plasmidů, obsaženého v koloniích transformantů působením restrikčních enzymů tak, aby bylo možno identifikovat plasmidy, obsahující požadovaný uložený úsek DNA. Byl identifikován plasmid pMRCW5, obsahující fragment DNA HHC123.

6) Konstrukce plasmidů pro expresi pH/UH5-l a pH/UMl-1 s kódovými sekvencemi pro humanizovaný řetězec H protilátky CH11

byly zkonstruovány spojením DNA z plasmidů pHFR3, z plasmidů pHFR4 a z plasmidů pMRCW5. Konstrukce výsledných plasmidů je znázorněna na obr. 25.

Fragment DNA HFR3 byl připraven následujícím způsobem. Podíl 30 mikrogramů DNA plasmidů pHFR3 byl rozštěpen současně restrikčními enzymy a Apal a Xhol. Produkty štěpení byly děleny elektroforézou na 5% polyakrylamidovém gelu. Gel byl barven ethidiumbromidem s obsahem 1 mikrogram/ml, takže fragmenty DNA bylo možno pozorovat v UV světle. Fragmenty DNA, zjištěné tímto způsobem měly rozměr přibližně 950 bp. Tyto fragmenty byly z gelu vyříznuty žiletkou a izolovány elektroelucí při použití přístroje Centriruter (Amicon), opatřeného zařízením Centricon 10 (Amicon).

---—---Fragment DNA—HFR'4byl— při-praven—násl-eduj-í-c-í-m—způsobem:;— Podíl 30 mikrogramů DNA plasmidů pHFR4 byl rozštěpen současně restrikčními enzymy a Apal a Xhol. Produkty štěpení byly děleny elektroforézou na 5% polyakrylamidovém gelu. Gel byl barven ethidiumbromidem s obsahem 1 mikrogram/ml, takže fragmenty DNA bylo možno pozorovat v UV světle. Fragmenty DNA, zjištěné tímto způsobem měly rozměr přibližně 950 bp. Tyto fragmenty byly’z gelu vyříznuty žiletkou a izolovány elektroelúcí při použití přístroje Centriruter (Amicon), opatřeného zařízením Centricon 10 (Amicon).

• · · ·

- 115 Podíl 1 mikrogram DNA plasmidů pMECW5 se rozštěpí restrikčními enzymy Xhol a Apal a pak se deformoryluje při použití CIP. Podíl 100 ng defosforylované DNA plasmidů pMECWS se naváže na 0,5 mikrogramů každého ze svrchu připravených fragmentů DNA HFR3 a HFR4. Vazba se provádí při použití běžně dodávané sestavy (Takara Shuzo) a produkt reakce se použije k transformaci E. coli kmene DH5alfa.

p___~se~ analýzá~šekvěhcě^-DNA pTášmidu,“obsaženého v koloniích transformantů pomocí restrikčních enzymů k identifikaci plasmidů, obsahujících uložené fragmenty DNA. Byl identifikován plasmid pH/uH5-l, obsahující fragment DNA HFR3 a plasmid pH/UMl-1, obsahující fragment DNA HFR4.

7) Ověření nukleotidových sekvencí

Byly analyzovány sekvence úseků DNA, uložených v plasmidech pH/uH5-l a pH/UMl-1. K analýze sekvencí byly použity příměry ME18P (SEQ ID No. 176) a VH06 (SEQ ID No.178), popsané svrchu a mimoto osm dalších primerů:

ME18RV; (SEQ ID No. 177);

VH05; (SEQ ID No. 179);

VH07; (SEQ ID No. 180);

VH08; (SEQ ID No. 181);

VH01; (SEQ ID No. 182);

VH02; (SEQ ID No. 183);

VH03; (SEQ ED No. 184); aj

VH04; (SEQ ID No. 185).

Analýza sekvence DNA byla provedena při použití didioxynukleotidových koncových skupin (Sanger F. S. a další, svrchu). Před analýzou sekvence byla DNA plasmidů jako matrice • · • · · ·

z hostitelských buněk jejich rozrušením v alkalickém prostředí s obsahem SDS (Sambrook J. a další, svrchu) a DNA pak byla čištěna při použití chloridu česného podle téže publikace.

Analýza sekvence potvrdila, že sekvence DNA, uložená v plasmidu pH/UH5-l je kódovou sekvencí pro polypeptid, definovaný jako SEQ ID No. 86. Sekvence DNA, uložené do plasmidu je kódovou sekvencí pro polypeptid, definovaný jako

SEQ ID No. 88------------------------------------------ .. . .. __________________________________________________

Příklad 7

Exprese genů s kódovými sekvencemi pro podjednotky humanizované protilátky CH11 v buňkách COS-7

Humanizovaná DNA pro řetězec H a humanizovaná DNA pro řetězec L, zkonstruované svrchu uvedeným způsobem, byly uloženy do buněčné linie COS-7, odvozené od opičích ledvin, k dosažení exprese. Plasmidy pro expresi humanizovaného řetězce H a humanizovaného řetězce L byly použity k transfekci buněk COS-7 otevřením pórů působením elektrického proudu při použití zařízení pro transfekci ECM600M (BTX).

Buňky COS-7 (ATCC č. CRL-1651) byly pěstovány v běžné lahvi s plochou 225 cm (Sumitomo Bakelite). Buňky byly pěstovány téměř až do vytvoření souvislé vrstvy v Eaglově zá-kladním-pr_o-s_tř_e-dí_v Dulbeccově modifikaci, toto prostředí je uváděno jako DMEM (Nissui Seiyaku) s obsahem 10 % fetálního séra skotu (CSL). Prostředí se pak odstraní a buněčný materiál se zpracovává přidáním 3 ml roztoku trypsinu s EDTA (Sigma Chemicals Co.) na 3 minuty při 37 °C. Pak byl buněčný materiál oddělen odstředěním 2 minuty při 800 ot/min a dvakrát promyt fosfátovým pufrem s obsahem 0,02 % hmotnostní chloridu draselného, 0,02 % hmotností dihydrogenfosforečnanu

117

draselného, 0,8 % hmotnostních chloridu sodného a 1,15 % hmotnostních hydrogenfosforečnanu sodného, tento pufr bude dále označován jako pufr PBS(-), (Nissui Seiyaku). Promyté buOky COS-7 byly upraveny pufrem PBS(-) za vzniku buněčné β suspenze, obsahující 4 x 10 buněk/ml.

Paralelně byla připravena DNA plasmidu z plasmidu pro expresi řetězce H a řetězce L při použití běžně dodávané se-----------stavy pro přípravu a čištění DNA Maxiprep (Promega) . Podíl_____ 40 mikrogramů DNA z plasmidu pro expresi těžkého řetězce i plasmidu pro expresi lehkého řetězce byl promíchán v téže zkumavce a pak byl materiál vysrážen 100% ethanolem. Kombinace DNA pro lehký a těžký řetězec jsou dále uvedeny. Pak byla DNA znovu uvedena do suspenze ve 40 mikrolitrech pufru PBS(-). Výsledných 40 mikrolitrů směsi plasmidu bylo pak uvedeno do styku s 500 mikrolitry suspenze buněk C0S-7 s hustotou 2 x 10 buněk/ml, tak jak byla svrchu připravena.

Směs byla přenesena do kyvety pro otevření pórů působením elektrického proudu s elektrodami v odstupu 4 mm (BioRad) a kyveta pak byla uložena do příslušného zařízení. Při otevření pórů bylo použito pulzů o 150 V, 900/uF. Po otevření pórů byla směs buněk a DNA znovu uvedena do suspenze ve 20 ml prostředí DMEM s obsahem 10 % fetálního séra skotu a pak přenesena do lahve s plochou 75 cm pro pěstování kultur (Sumitomo Bakelit). Buněčný materiál byl inkubován 24 hodiny při teplotě 37 °C v přítomnosti 7,5 % oxidu uhličitého. Supernatant kultury byl odstřaněn a buněčný materiál byl promyt prostředím DMEM, prostým séra. Podíl 20 ml čerstvého prostředí DMEM, prostého séra byl pak přidán k buněčnému materiálu a buňky byly pěstovány 24 hodin při 37 °C v prostředí s obsahem 7,5 % oxidu uhličitého. Pak byl oddělen supernatant.

- 118 -

Buňky COS-7 byly podrobeny transfekci následujícími plasmidy nebo kombinacemi plasmidů při použití svrchu uvedeného postupu. V každém z těchto případů byl pak izolován supernatant.

(A) : pMEl8S (B) : ρΗμΜΙ-l ai (C) : ρΗμΜΙ-l a (D) : ρΗμ.Μ1-1 a (E) : ρΗμΜΙ-Ι a (F) : pHu.H5-l a:

(G) : ρΗμΗ5-1 a (Η): ρΗμΗ5-1 a:

(I): ρΗμΗ5-1 a ρΗκΚΥ2-58 .pHKKF2-19 _PHkRY2-10

ΓρΗκΚΕ2^5Ϊ pH<KY2-58 _PHkKF2-19 _PHkRY2-10 pHKRF2-52

Zkušební příklad 1

Detekce humanizovaných protilátek proti lidskému Fas

Humanizované protilátky proti lidskému Fas, získané způsobem podle vynálezu byly identifikovány metodou Western blot. Tento postup zahrnuje oddělení bílkovin na SDS-polyakrylamidovém gelu elektroforézou, dále uváděnou jako SDS-PAGE s následným přenosem na nitrocelulosovou membránu. Přenesenou bílkovinu je pak možno identifikovat zkříženou reakcí s protilátkami.__________

1) Dělení pomocí SDS-PAGE

Podíl 1 ml supernatantu kultury, získaného v příkladu 7, byl dialyzován proti 5 litrům čištěné vody při použití dialyzační trubice, oddělující látky od molekulové hmotnosti ·

• 4

12000 až 14000. Dialýza se provádí 15 hodin při teplotě 4 °C.

Výsledný roztok se zahustí ve vakuu při použití koncentračního zařízení CC-101 (Tomy Seiko). Pak se přidá podíl 10 mikrolitrů pufru pro vzorek, který obsahuje 2 % hmotnostní SDS pro elektroforézu (BioRad), 5 % objemových beta-merkaptoethanolu (Sigma Chemicals Co.), 10 % objemových glycerolu a 0,1 % hmotnostní bromfenolové modři, načež se směs na 5 minut zahřeje na 100 °C. Takto připravený vzorek pro elektroforézu se nanese na gel pro SDS-PAGE, gradient 4 až 20 % (Iwaki Glass) a__ elektroforéza se provádí 1 hodinu při teplotě místnosti a při stálé intensitě proudu 20 mA.

2) Přenos a imobilizace bílkovin

Po ukončení elektroforézy se bílkoviny přenesou z gelu na nitrocelulosovou membránu Transblot Transfer Membrane (BioRad) při použití, polosuchého postupu podle Towbin H. a další, 1979, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 76, 4350. Bylo užito následující zařízení a podmínky:

pufr pro přenos:

přístroj pro blot:

T-il-rT.r vs /·> o Fi i ί ♦ VkAlU-LXXXt.J' mM tris, 150 mM glycinu, % objemových metnaolu,

Iwaki Glass, TF03-050,

A θΖ* q+· on Ί nnnnH O O A Ί H —r nGixO uCux uxxa o j c. Λ y -i- x 1 · ——— SDS-PAGE a Western blot byly provedeny vždy ve dvojím----opakování za týchž podmínek, takže byly získány dvě totožné nitrocelulosové membrány. Jedna z membrán byla analyzována k detekci řetězce H a druhá k detekci řetězce L.

· • ·

120

3) Detekce protilátek

Po provedení přenosu byly nitrocelulosové membrány ponořeny do vodného roztoku, obsahujícího 20 mM tris-HCl pufru o pH 7,5 s 500 mM chloridu sodného (pufr TBS) a s 3 % hmotnostními želatiny (Nippon BioRad). Roztok s membránami byl opatrně protřepáván 1 hodinu při teplotě místnosti, tento postup se obvykle uvádí jako blokování.

Detekce řetězců H humanizovaných protilátek byla prováděna při použití protilátky proti lidskému řetězci IgM H, značené peroxidázou, šlo o kozí protilátku proti lidskému IgM, konjugovanou s peroxidázou, specifický fragment Fc5/U (AffiniPure, Jackson Immuno-research Laboratory). Po blokování byly nitrocelulosové membrány vyjmuty z bkkovacího roztoku a 4 hodiny protřepávány v 10 ml pufru TBS s obsahem 1 % hmotnostní želatiny, pufr rovněž obsahoval 5 mikrolitrů značené protilátky proti lidskému IgM H. Pak byly nitrocelulosové membrány vyjmuty a ponořeny do 20 ml roztoku TBS s obsahem 2 % objemových Tween 20 (BioRad) a v tomto roztoku promyty opatrným protřepáváním 20 minut při teplotě místnosti. Toto promytí bylo ještě jednou opakováno a pak byly nitrocelulosové membrány osušeny pomocí savého papíru.

Zkřížená reaktivita mezi protilátkou a bílkovinou na membráně byla prokazována pomocí účinnosti peroxidázy, konjugované s protilátkou.

Zbývající účinnost peroxidázy na membráně byla prokazována pomocí systému ECL Western blot (Amersham). Substrát v tomto systému vysílá světlo v průběhu chemické reakce v důsledku katalytického působení peroxidázy. Toto světlo je možno prokázat při použití kamery ECL Mini Camera (Amersham) s filmem typ 667 (Polaroid). Bílkoviny, zbývající v gelu byly • ·

barveny stříbrem podle Oakley a další, 1980, Anal. Biochem., 105, str. 361 a následující. Získané fotografie byly srovnávány s gelem, barveným stříbrem k identifikaci pásů bílkoviny, specificky vázaných na protilátku.

Detekce řetězce L humanizovaných protilátek byla prováděna při použití protilátky proti lidskému řetězci IgM L, značené peroxidázou, Peroxidase-Labeled Monoclonal Antibody —-----1o—Human.-Kappa Light—Chain HP6156J1 .(Kilk.e.guar_d_and_Ee.r.ry_La^__ boratory). Po blokování byly nitrocelulosové membrány vyjmuty z blokovacího roztoku a protřepávány v 10 ml pufru, tvořeného TBS roztokem s obsahem 1 % hmotnostní želatiny a s obsahem 10 mikrolitrů značené protilátky proti lidskému řetězci IgM ‘L, při teplotě místnosti celkem 4 hodiny. Pak byly nitrocelulosové membrány vyjmuty, ponořeny do 20 ml roztoku TBS s obsahem 0,05 % objemových Tween 20 a promyty opatrným protřepáváním 20 minut při teplotě místnosti. Toto promytí bylo ještě jednu opakováno. Pak byly nitrocelulosové membrány vysušeny savým papírem.

Stejně jako v případě humanizovaného řetězce H byly jakékoliv bílkoviny, reagující s protilátkou prokazovány pomocí systému ECL Western blot (Amersham). Zkřížená reakce byla provázena vývojem světla, zachyceným na fotografickém filmu. Získané obrázky, byly srovnávány s gelem, barveným stříbrem tak, aby bylo možno identifikovat pásy pro bílkovinu, specificky vázanou na protilátku.

Při použití protilátky, specifické pro lidský řetězec H bylo možno prokázat pás s molekulovou hmotností přibližně 78 000 ve vzorcích B, C, D, E, F, G, Hal z příkladu 7. Tyto vzorky všechny pocházely z buněk COS-7 po jejich transfekci plasmidem pH/UMl-1 nebo pH/uH5-l.

122

Použití protilátky, specifické pro lidský řetězec L vedlo k detekci pásu s molekulovou hmotností přibližně 25 000 ve vzorcích B, C, D, E, F, G, Hal z příkladu 7. Všechny tyto vzorky pocházely z buněk COS-7 po jejich transfekci plasmidem pHkKY2-58, plasmidem pHkKF2-19, plasmidem pHkRY2-10 nebo plasmidem pHkŘF2-52.

Zkušební příklad 2

Stanovení účinnosti vazby protilátek proti Fas na antigen Fas

Schopnost humanizovaných protilátek proti Fas podle vynálezu vázat se na antigen Fas byla stanovena metodou ELISA. Tento postup zahrnuje přípravu rozpustné složené bílkoviny, obsahující lidský Fas s následnou detekcí vazby protilátky na tuto rozpustnou bílkovinu.

1) Exprese složené bílkoviny s rozpustným lidským antigenem Fas

Aby bylo možno získat rozpustný lidský antigen Fas, byl zkonstruován vektor pro expresi složené bílkoviny, tvořený extracelulární doménou lidského antigenu Fas a extracelulární doménou myšího receptorů pro interleukin-3. Tato bílkovina bude dále uváděna jako složená bílkovina s obsahem lidského Fas.

DNA s kódovou sekvencí pro složenou bílkovinu s obsahem lidského Fas byla připravena pomocí PCR tímto způsobem:

a) Matrice DNA

DNA ze dvou plasmidů byla užita při PCR k získání bílkoviny s obsahem lidského Fas. Prvním plasmidem byl plasmid • · • · · ·

- 123 pME18S-mFas-AIC (Nishimura Y. , a další, 1995, J. Immunol., 154, 4395) s kódovou sekvencí pro složenou bílkovinu, obsahující extracelulární doménu myšího antigenu Fas (Watanabe-Fukunaga

R. a další, 1992, J. Immunol., 148, 1274 a následující) a extracelulární doménu myšího receptorů pro interleukin-3 (Gorman D. a další, 1990, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 87, 5459 a následující, Hara T. a Miyajima A., 1992, EMBO J.

11, 1875). Druhý plasmid, pCEV4 obsahuje kódovou cDNA pro ------1 i d ský an t i gen F as _ ..(-11 oh .N_... a další,__1991, Cell, 66,.....2 3B) ._____

b) Příprava primerů

K provádění PCR byly připraveny čtyři nukleotidové primery s následujícími sekvencemi:

NI, (SEQ. ID No. 186),

C3N, (SEQ. ID No. 187),

N3N, (SEQ. ID No. 188) a

CTN2, (SEQ. ID No. 189).

c) První stupeň PCR

Provedení prvního stupně PCR je znázorněno na obr. 26.

HFAS

Byl připraven fragmentDNA s kódovou sekvencí pro extracelulární doménu lidského antigenu Fas. Tento fragment bude dále označován jako fragment DNA HFAS. PCR byla prováděna při použití sestavy LA PCR (Takara Shuzo) za následujících podmínek:

složení reakčního roztoku:

DNA plasmidu pCEV4, 20 ng, ·· ····

- 124 -

oligonukleotidový primer NI, 0,5 mikrogramů, oligonukleotidový primer C3N, 0,5 mikrogramů, směs dNTP. 25 mikrolitrů, lOx La PCR pufr, 25 mikrolitrů,

LA Taq polymeráza /Takara shuzo), 12,5 jednotek.

Konečný objem roztoku byl doplněn redestilovanou vodou na 250 mikrolitrů. Směs dNTP, 10 x LA PCR pufr a LA Taq polymeráza se dodávají jako součást sestavy.

Nejprve byl reakční roztok zahřát na 2 minuty na 94 °C. Pak byl vzorek zahříván v cyklech 1 minuta při 94 °C, 1 minuta při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Tento cyklus byl 30x opakován. Pak byl reakční roztok inkubován 10 minut při teplotě 72 °C.

MAIC

Byl připraven fragment DNA s kódovou sekvencí pro extracelulární doménu myšího receptorů pro interleukin-3. Tento fragment bude dále uváděn jako fragment DNA MAIC. PCR byla prováděna při použití sestavy LA PCR (Takara Shuzo) za následujících podmínek:. ....... ........

Složení reakčního roztoku:

DNA plasmidu pMR18S-mFas-AIC, 20 ng, oligonukleotidový primer N3N, 0,5 mikrogramů, oligonukleotidový primer CTN2, 0,5 mikrogramů, směs dNTP, 25 mikrolitrů, x LA PCR pufr, 25 mikrolitrů,

LA Taq polymeráza (Takara Shuzo), 12,5 jednotek.

9999 99 9999 99 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9 · · · · ·· · 99 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

- 125 Konečný objem roztoku byl doplněn na 250 mikrolitrů redestilovanou vodou. Směs dNTP, 10 x La PCR pufr a LA Taq polymeráza jsou dodávány jako součást sestavy.

Nejprve byl reakční roztok zahřát na 2 minuty na 94 °C. Pak byl vzorek zahříván v cyklech 1 minuta při 94 °C, 1 minuta při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Tento cyklus byl 30x opakován. Pak byl reakční roztok inkubován 10 minut při teplotě 72 °C.

Fragmenty HFAS DNA a MAIC DNA, takto amplifikované svrchu uvedeným způsobem pomocí PCR byly extrahovány fenolem. Pak se DNA vysráží při použití 100% ethanolu. Vzorek DNA s hmotností přibližně 20 až 30 mikrogramů se pak podrobí elektroforéze na 5% polyakrylamidovém gelu. Gel se barví roztokem ethidiumbromidu 1 mikrogram/1 ml tak, že fragmenty DNA jsou viditelné v UV světle. Fragmenty DNA, prokázané tímto způsobem.· se z gelu vyříznou žiletkou, pak se provádí elektroeluce akrylamidového gelu v přístroji Centriruter (Amicon), opatřeném zařízením Centricon 10 (Amicon). Po eluci se DNA zahustí odstředěním 1 hodinu při přibližně 7500 g, načež se vysráží ethanolem. Výsledná DNA se vždy rozpustí v 50 mikrolitřech destilované vody.

d) Druhý stupeň PCR .......

Provedení druhého stupně PCR je znázorněno na obr. 27.

FASAIC

Byl připraven fragment DNA s kódovou sekvencí pro složenou bílkovinu s obsahem lidského Fas. Tento fragment bude dále uváděn jako fragment FASAIC. PCR byla prováděna při použití sestavy LA PCR (Takara Shuzo.))za těchto podmínek:

·· ···· toto ·· · ·· · ···· ·· · ·· · ···· • to >·· ·· · ···· · ···« ··· · o · ·· ·· ·· · ·· ··

- 126 Složení reakčního roztoku:

roztok HFAS DNA z prvního stupně PCR, 20 mikrolitrů, roztok MAIC DNA z prvního stupně PCR, 20 mikrolitrů, oligonukleotidový primer NI, 0,5 mikrogramů, oligonukleotidový primer CTN2, 0,5 mikrogramů, směs dNTP, 25 mikrolitrů, lOx LA PCR pufr, 25 mikrolitrů,

LA Taq polymeráza (Takara Shuzo), 12,5 jednotek.

Konečný objem roztoku byl doplněn na 250 mikrolitrů redestilovanou vodou. Směs dNTP, 10 x LA PCR pufr a LA Taq polymeráza tvoří součást sestavy.

Nejprve byl reakční roztok zahřát na 2 minuty na 94 °C. Pak byl vzorek zahříván, v cyklech 1 minuta při 94 °C, 1 minuta při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Tento cyklus byl 30x opakován. Pak byl reakční roztok inkubován 10 minut při teplotě 72 °C.

Takto získaný fragment FASAIC DNA, amplifikovaný svrchu uvedeným způsobem pomocí PCR byl^- extrahován· fenolem. Pak byla DNA vysrážena 100% ethanolem. Přibližně 20 až 30 mikrogramů této DNA pak bylo podrobeno elektroforéze na 5% polyakrylamidovém gelu. Gel byl zbarven ethidiumbromidem T mikrogram7T“ml talčža^-f ragmenty-DNAfbyly viditěTne”v“ UV-světle. Tímto způsobem zjištěné fragmenty DNA pak byly z gelu vyříznuty žiletkou a podrobeny elektroeluci z akrylamidového gelu při použití přístroje Centriruter (Amicon), opatřeného zařízením Centricon 10 (Amicon). DNA pak byla^-zahuštěna odstředěním 1 hodinu při přibližně 7500 g, načež byla vysrážena ethanolem. Výsledná DNA byla vždy rozpuštěna v 50 mikrolitrech destilované vody. >

·· '··«·' · · ·'··©'· ·· ··.....··........

• 4 ··· 4 4 4 44

4 ··««444 • 4 ·#«·· · 444 44

4 4 4 ·4· 4 44 • 4 4 · 44 · *44·

- 127 Konstrukce plasmidů s uloženým fragmentem DNA FASAIC je znázorněna na obr. 28.

Fragment DNA FASAIC, získaný tímto způsobem, byl dále čištěn extrakcí fenolem a pak vysrážením ethanolem. Pak byla DNA rozštěpena restrikčními enzymy EcoRI a Xbal.

Podíl 2 mikrogramy DNA plasmidů pME18S-mFas-AIC byl rozštěpen restrikčními enzymy EcoRI a Xbal. Produkty štěpení byly děleny elektroforézou na 0,8% agarosovém gelu. Gel byl barven ethidiumbromidem 1 mikrogram/ml tak, že fragmenty DNA bylo možno pozorovat v UV světle. Pás DNA s velikostí přibližně 3000 bp byl vyříznut žiletkou k izolaci DNA.

Část svrchu získané rozštěpené DNA plasmidů pME18S-mFas-AIC byl navázán na část fragmentu DNA FASAIC po jeho rozštěpení enzymy EcoRI a. Xbal. Vazba byla uskutečněna při použití sestavy pro vazbu a produkt vazby byl užit k transformaci E. coli kmene DH5alfa.

Analýza sekvence DNA plasmidů, obsaženého v koloniích transformantů byla prováděna pomocí restrikčních enzymů k identifikaci plasmidů, obsahujících uložený požadovaný fragment. Byl identifikován plasmid phFas-AIC2, obsahující fragment DNA FASAIC s kódovou sekvencí pro složenou bílkovinu s obsahem lidského Fas, uložený po směru exprese od promotořu SRalfa ve správné orientaci pro expresi výsledného imunoglobulinu.

e) Exprese v buňkách COS-7

Svrchu získaný plasmid pro expresi složené bílkoviny s obsahem lidského Fas byl použit k transfekci buněk COS-7 při otevření pórů elektrickým proudem za použití přístroje k provádění transfekce ECM600 Μ (BTX).

• · · ·

Buňky COS-7, ATCC č. CRL-1651, byly pěstovány v lahvi s plochou 225 cm (Sumitomo Bakelite). Buněčný materiál byl pěstován téměř do vytvoření spojité vrstvy v prostředí DMEM s obsahem 10 % fetálního séra skotu (CSL). Prostředí bylo odstraněno a buňky COS-7 byly zpracovány 3 minuty přidáním 3 ml roztoku trypsinu s EDTA (Sigma Chemical Co.) při teplotě 37 °C. Oddělené buňky byly odstředěny 2 minuty při 800 otáčkách za minutu a pak 2x promyty pufrem PBS(-), (Nissui Seiyaku).

g Promytý buněčný materiál byl upraven na hustotu 4 x 10 buněk/ml pufrem PBS(-) za vzniku suspenze buněk COS-7.

Paralelně bylo připraveno 100 mikrogramů DNA plasmidu phFas-AIC2 při použití sestavy pro přípravu plasmidu Maxiprep (Promega). DNA byla vysrážena 100% ethanolem a pak uvedena do suspenze ve 100 mikrolitrech pufru PBS(-). Roztok 100 míkrolitrů plasmidu byl smísen s 500 mikrolitry suspenze g buněk COS-7, připravené svrchu uvedeným způsobem (2 x 10 buněk) . Směs byla přenesena do kyvety pro otevření pórů působením elektrického proudu s elektrodami, vzdálenými od sebe 4 mm (BioRad) a pak byla kyveta uložena do příslušného přístroje. Otevřením pórů byla pak uložena DNA plasmidu do buněk COS-7 při použití pulsu o 150 V, 900 ^uF.

Po ukončení tohoto postupu se směs buněk a DNA uvede znovu do suspenze ve 20 ml prostředí DMEM s obsahem 10 % fetálního séra skotu a pak se přenese do lahve s plochou 75 cm (Sumitomo Bakelite) pro pěstování kultur. Buněčný materiál se inkubuje 24 hodin při teplotě’ 37 °C v přitomnosti7,5 % oxidu uhličitého. Pak se supernatant odstraní a buňky se promyjí prostředím DMEM, prostým séra. Přidá se 20 ml čerstvého prostředí DMEM, prostého séra a buňky se pěstují 24 hodin při 37 °C v přítomnosti 7,5 % oxidu uhličitého. Pak se supernatant oddělí.

- 129 2) Zkouška na schopnost vazby antigenu Fas metodou ELISA

Schopnost humanizovaných protilátek vázat antigen Fas byla zkoumána metodou ELISA následujícím způsobem:

Supernatant buněk COS-7, připravený ve stupni 1 byl smísen s 50 mM pufrem s uhličitanem a hydrogenuhličitanem o pH 9,5 v poměru 1:5. Podíl 50 mikrolitrů směsi byl přidán do každého vyhloubení ploten EIA s 96 vyhloubeními (3690, plocha dna 0,16 cm , Coster) a plotny byly inkubovány přes noc při 4 °C k adsorpci složené bílkoviny s obsahem lidského Fas na povrch vyhloubení. Po adsorpci bylo každé vyhloubení promyto pufrem PBS(-) s obsahem 0,05 % Tween 20 (čistota EIA, BioRad, dále bude uváděn jako PBS-T).

Pufr pro blokování (Pierce, lne.) byl připraven v PBS a do každého vyhloubení bylo přidáno 50 mikrolitrů tohoto pufru. Pak byly plotny inkubovány při teplotě místnosti 2 hodiny k dokončení blokování. Pak byla vyhloubení opět promyta při použití PBS-T.

Vzorek 50 mikrolitrů zředěného supernatantu každé kultury z příkladu 7 byl pak přidán do každého vyhloubení a plotny byly inkubovány 2 hodiny při teplotě 37 °C. Pak byla vyhloubení promyta PBS-T. Pak byl do každého vyhloubení přidán podíl 50 mikrolitrů monoklonální kozí protilátky proti lidskému IgM, značené peroxidázou (Jackson Immuno.research Laboratory) po zředění v poměru 1 : 10 000 v PBS. Pak byly plotny inkubovány 2 hodiny při teplotě 37 °C. Po promytí PBS-T bylo do každého vyhloubení přidáno 50 mikrolitrů roztoku substrátu (Peroxidase Substráte Set - ABTS, BioRad) k zahájení kolorimetrického stanovení.

444 ·

- 130 Schopnost humanizovaných protilátek, obsažených v supernatantech kultur vázat se na složenou bílkovinu s obsahem lidského antigenu Fas byla vyhodnocena tak, že byla odečtena absorbance pro každé vyhloubení při 405 nm a při 492 nm pomocí odečítacího zařízení pro plotny Model 3550 UV (BioRad). Poměr absorbance při 405 nm a při 492 nm dovoluje vypočítat vazbu na IgM.

Výsledek této zkoušky. prokážuje, . že_ Jium^izované; protilátky, přítomné ve vzorcích B, C, D, E, F, G, H a I z příkladu 7 jsou schopny se vázat na složenou bílkovinu s obsahem lidského antigenu Fas, jak je také znázorněno na obr. 29 a 30.

Zkušební příklad 3

Zkouška na vyvolání apoptosy

Supernatanty kultur, připravených podle příkladu 7 svrchu, byly inkubovány s buněčnou linií HPB-ALL lidských lymfocytů ke stanovení cytotoxické účinnosti humanizovaných protilátek, obsažených v těchto supernatantech.

Buňky HPB-ALL byly pěstovány v prostředí RPMI 1640 (Nissui Seiyaku) s obsahem 20 mM HEPES, 50 mikromol beta-merkaptoethanolu, 0,33 % hydrogenuhličitanu sodného (Sigma) a 10¾ fetálního séra skotu (CSL), prostředí bude dále uváděno jako prostředí RPMI při teplotě 37 °C v atmosféře s 5 % oxidu uhličitého. Buněčný materiál byl v logaritmické fázi růstu oddělen odstředěním 3 minuty při 800 ot/min. Usazenina buněk byla znovu uvedeny do suspenze v prostředí RPMI do hustoty 6 x 10 buněk/ml za vzniku suspenze buněk HBP-ALL.

- 131 -

Každý ze supernatantů kultur, připravených podle příkladu 7 a také myší protilátka CH11 proti lidskému Fas byly zředěny na následující koncentrace: 250, 100, 25, 10, 2,5, 1, 0,25 a 0,1 ng/ml. Podíl 50 mikrolitrů každého ředění byl smísen s 50 mikrolitry suspenze buněk HBP-ALL (odpovídá 3 x 10⁴ buněk/50 mikrolitrů) v každém vyhloubení plotny s 96 vyhloubeními. Plotna pak byla inkubována 2 hodiny při teplotě 37 °C v atmosféře s obsahem 5 % oxidu uhličitého. Pak byla měřena absorbance při 450 nm a 750 nm při použití odečítacího přístroje pro plotny Model 3550-UV (BioRad). Koncentrace pro každý vzorek byla měřena densitometrickou analýzou vzorků, připravených metodou Western blot podle zkušebního příkladu 1.

při

Přežívání buněk HPB-ALL v procentech je možno vypočítat použití následujícího, vzorce:

přežívání v % = (A-C)/(B-C) x 100, kde znamená počet buněk, zbývajících po inkubaci CH11 nebo humanizované protilátky s buňkami HBP-ALL, znamená

UDO .... Λ T T

111J1 počet buněk, zbývajících po pěstování buněk bez CH11 nebo humanizovaných protilátek, ,C znamena živné prostředí RPMI bez buněk HBP-ALL (inkubace 20 hodin, stejně jako v případě A a B).

Výsledky těchto pokusů jsou graficky znázorněny na obr. 31. Hodnota EDj-θ, která je indexem pro cytotoxickou účinnost, byla vypočítána ve všech případech. ED_5Q znamená koncentraci IgM, při níž přežívá 50 % buněk.

- 132 • ·

Výsledky svrchu uvedených zkoušek jsou shrnuty v následující tabulce:

vzorek	ED50 (ng/ml)
B	1,1
C	1,0
D	1,7
E	1,5
G	2,4
I	3,4
CH11	10,7

Z výsledků, uvedených v tabulce je zřejmé, že rekombinantní molekuly IgM proti Fas, které neobsahují řetězec J, mají 3x až lOx vyšší cytotoxickou účinnost než protilátka CH11, která řetězec J obsahuje.

133 • · • · · · ···· • · · 4 ···· • · · · · · ···· «

VÝPIS SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:

(i) ŽADATEL:

(A) JMÉNO: Sankyo Company, Limited (B) ULICE: 5-1, Nihonbashi Honcho 3-chome, Chuo-ku (C) MĚSTO: Tokyo (E) ZEMĚ: Japonsko (F) PSČ (ZIP): 103-8426 (G) TELEFON: 81-3-5255-7111 (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Humanizované protilátky proti lidskému Fas (iii) POČET SEKVENCÍ: 189

.....(iv) POČÍTAČOVÁ FORMA:------------------------------ -------------- ----- “ .......

(A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release 41.0, Version #1.30 (EPO) (vi) ÚDAJE O PŘEDCHOZÍCH PŘIHLÁŠKÁCH:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: JP Hei 9-67938 (B) DATUM PODÁNÍ: 21. března 1997 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:.

(A) DÉLKA: 5 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1:

Asp Tyr Asn Met His '

5 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární '(ii) TYP MOLEKULY: protein (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní • ·

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 2:

Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 15 10 15

Ser (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 7 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:

Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5

INFORMACE PRO SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: Arg Ser Ser Lys Ser 1 5

SEQ ID NO: 4:

Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His .10 15 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 7 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein

- 135 • ·

(v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 5:

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

5 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 6:

Ser Gin Ser Thr His Val Pro Pro Ala

5 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1773 párů baží (B) TYP: nukleová. kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA až mRNA

............(iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Mus musculus ____;______(G) TYP BUŇKY: hybridom__ (H) BUNĚČNÁ LINIE: CH11 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍ STÉNÍ:1..1770 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: mat_peptid (B) UMÍSTĚNÍ:58..1770 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: sig_peptid ' (B) UMÍSTĚNÍ:!..57 • · ·

- 136 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 7:

ATG Met -19

GGA TGG

AGC TGG ATC TTT

CTC TTC Leu Phe

CTC CTG

TCA GGA ACT

GCA GGC Ala Gly -5

48

Gly

Trp

Ser

Trp -15

Ile

Phe

Leu -10

Leu

Ser

Gly

Thr

GTC

CAC

TCT

GAG

GTC

CAG

CTT

CAG

CAG

TCA

GGA

CCT

GAG

CTG

GTG

AAA

96

Val

His

Ser

Glu

Val

Gin

Leu

Gin

Gin

Ser

Gly

Pro

Glu

Leu

Val

Lys

1

5

10

CCT

GGG

GCC

TCA

GTG

AAG

ATA

TCC

TGC

AAG

GCT

TCT

GGA

TAC

ACA

TTC

144

Pro

Gly

Ala

Ser

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

15

20

25

ACT

GAC

TAC

AAC

ATG

CAC

TGG

GTG

AAG

CAG

AGC

CAT

GGA

AAG

AGC

CTT

192

Thr

Asp

Tyr

Asn

Met

His

Trp

Val

Lys

Gin

Ser

His

Gly

Lys

Ser

Leu

30

35

40

45

GAG

TGG

ATT

GGA

TAT

ATT

TAT

CCT

TAC

AAT

GGT

GGT

ACT

GGC

TAC

AAC

240

Glu

Trp

Ile

Gly

Tyr

Ile

Tyr

Pro

Tyr

Asn

Gly

Gly

Thr

Gly

Tyr

Asn

50

55

60

CAG

AAG

TTC

AAG

AGC

AAG

GCC

ACA

TTG

ACT

GTT

GAC

AAT

TCC

TCC

AGC

288

Gin.

Lys

Phe

Lys

Ser

Lys

Ala

Thr

Leu

Thr

Val

Asp

Asn

Ser

Ser

Ser

65

70

75

ACA

GCC

TAC

ATG

GAG

CTC

CGC

AGC

CTG

ACA

TCT

GAG

GAC

TCT

GCA

GTC

336

Thr

Ala

Tyr

Met

Glu

Leu

Arg

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Ser

Ala

Val

80

85

90

TAT

TAC

TGT

GCA

AGA

AGT

TAC

TAT

GCT

ATG

GAC

TAC

TGG

GGT

CAA

GGA

384

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Ser

Tyr

Tyr

Ala

Met

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

95

100

105

ACC

TCA

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

GAG

AGT

CAG

TCC

TTC

CCA

AAT

GTC

TTC

432

Thr

Ser

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Glu

Ser

Gin

Ser

Phe

Pro

Asn

Val

Phe

110

115

120

125

CCC

CTC

GTC

TCC

TGC

GAG

AGC

CCC

CTG

TCT

GAT

AAG

AAT

CTG

GTG

GCC

480

Pro

Leu

Val

Ser

Cys

Glu

Ser

Pro

Leu

Ser

Asp

Lys

Asn

Leu

Val

Ala

130-

135

140

ATG

GGC

TGC

CTA

GCC

CGG

GAC

TTC

CTG

CCC

AGC

ACC

ATT

TCC

TTC

ACC

528

Met

Gly

Cys

Leu

Ala

Arg

Asp

Phe

Leu

Pro

Ser

Thr

Ile

Ser

Phe

Thr

-

•

14 5

.150

·

..... .

.155...

. -------

TGG

ÁAC

TAC

CAG

AAC

AAC

ACT

GAA

GTC

ATC

CAG

GGT

ATC

AGA

ACC

TTC

576

Trp

Asn

Tyr

Gin

Asn

Asn

Thr

Glu

Val

Ile

Gin

Gly

Ile

Arg

Thr

Phe

160

165

170

CCA

ACA

CTG

AGG

ACA

GGG

GGC

AAG

TAC

CTA

GCC

ACC

TCG

CAG

GTG

TTG

624

Pro

Thr

Leu

Arg

Thr

Gly

Gly

Lys

Tyr

Leu

Ala

Thr

Ser

Gin

Val

Leu

175

180

185

CTG

TCT

CCC

AAG

AGC

ATC

CTT

GAA

GGT

TCA

GAT

GAA

TAC

CTG

GTA

TGC

672

Leu

Ser

Pro

Lys

Ser

Ile

Leu

Glu

Gly

Ser

Asp

Glu

Tyr

Leu

Val

Cys

190

195

200

205

AAA

ATC

CAC

TAC

GGA

GGC

AAA

AAC

AGA

GAT

CTG

CAT

GTG

CCC

ATT

CCA

720

• · · · · ·

- 137 -

• • • • •

• • • ' · · » ·

• • • · • •

• · · • · · • · · • · 9 • · ♦

• · « • · • · · · « • « • ·

Lys

Ile

His

Tyr

Gly

Gly

Lys

Asn

Arg

Asp

Leu

His

Val

Pro

Ile

Pro

210

215

220

GCT

GTC

GCA

GAG

ATG

AAC

CCC

AAT

GTA

AAT

GTG

TTC

GTC

CCA

CCA

CGG

768

Ala

Val

Ala

Glu

Met

Asn

Pro

Asn

Val

Asn

Val

Phe

Val

Pro

Pro

Arg

225

230

235

GAT

GGC

TTC

TCT

GGC

CCT

GCA

CCA

CGC

AAG

TCT

AAA

CTC

ATC

TGC

GAG

816

Asp

Gly

Phe

Ser

Gly

Pro

Ala

Pro

Arg

Lys

Ser

Lys

Leu

Ile

Cys

Glu

240

245

250

GCC

ACG

AAC

TTC

ACT

CCA

AAA

CCG

ATC

ACA

GTA

TCC

TGG

CTA

AAG

GAT

864

Ala

Thr

Asn

Phe

Thr

Pro

Lys

Pro

Ile

Thr

Val

Ser

Trp

Leu

Lys

Asp

255

260

265

GGG

AAG

CTC

GTG

GAA

TCT

GGC

TTC

ACC

ACA

GAT

CCG

GTG

ACC

ATC

GAG

912

Gly

Lys

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Phe

Thr

Thr

Asp

Pro

Val

Thr

Ile

Glu

270

275

280

285

AAC

AAA

GGA

TCC

ACA

CCC

CAA

ACC

TAC

AAG

GTC

ATA

AGC

ACA

CTT

ACC

960

Asn

Lys

Gly

Ser

Thr

Pro

Gin

Thr

Tyr

Lys

Val

Ile

Ser

Thr

Leu

Thr

290

295

300

ATC

TCT

GAA

ATC

GAC

TGG

CTG

AAC

CTG

AAT

GTG

TAC

ACC

TGC

CGT

GTG

1008

Ile

Ser

Glu

Ile

Asp

Trp

Leu

Asn

Leu

Asn

Val

Tyr

Thr

Cys

Arg

Val

305

310

315

GAT

CAC

AGG

GGT

CTC

ACC

TTC

TTG

AAG

AAC

GTG

TCC

TCC

ACA

TGT

GCT

1056

Asp

His

Arg

Gly

Leu

Thr

phe.

Leu.

.Lys.

Asn

Val

Ser

Ser

Thr

Cys

Ala

320

325

330

GCC

AGT

CCC

TCC

ACA

GAC

ATC

CTA

ACC

TTC

ACC

ATC

CCC

CCC

TCC

TTT

1104

Ala

Ser

Pro

Ser

Thr

Asp

Ile.

Leu

Thr

Phe

Thr

Ile

Pro

Pro

Ser

Phe

335

340

345

GCC

GAC

ATC

TTC

CTC

AGC

AAG

TCC

GCT

AAC

CTG

ACC

TGT

CTG

GTC

TCA

1152

Ala

Asp

Ile

Phe

Leu

Ser

Lys

Ser

Ala

Asn

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Ser

350

355

360

365

AAC

CTG

GCA

ACC

TAT

GAA

ACC

CTG

AAT

ATC

TCC

TGG

GCT

TCT

CAA

AGT

1200

Asn

Leu

Ala

Thr

Tyr

Glu

Thr

Leu

Asn

Ile

Ser

Trp

Ala

Ser

Gin

Ser

370

375

380

GGT

GAA

CCA

CTG

GAA

ACC

AAA

ATT

AAA

ATC

ATG

GAA

AGC

CAT

CCC

AAT

1248

£iy

Glu

Pro

Leu

Glu.

Thr.

Lys

Ue

Lys

Ile

Met

Glu

Ser

His.

_Pro

Asn

_ ..

385

390

395

GGC

ACC

TTC

AGT

GCT

AAG

GGT

GTG

GCT

AGT

GTT

TGT

GTG

GAA

GAC

TGG

1296

Gly

Thr

Phe

Ser

Ala

Lys

Gly

Val

Ala

Ser

Val

Cys

Val

Glu

Asp

Trp

400

405

410

AAT

AAC

AGG

AAG

GAA

TTT

GTG

TGT

ACT

GTG

ACT

CAC

AGG

GAT

CTG

CCT

1344

Asn

Asn

Arg

Lys

Glu

Phe

Val

Cys

Thr

Val

Thr

His

Arg

Asp

Leu

Pro

415

420

425

TCA

CCA

CAG

AAG

AAA

TTC

ATC

TCA

AAA

CCC

AAT

GAG

GTG

CAC

AAA

CAT

1392

Ser

Pro

Gin

Lys

Lys

Phe

Ile

Ser

Lys

Pro

Asn

Glu

Val

His

Lys

His

430

435

440

445

• · ···· • ·

- 138 -

• • • •

• • • · • ·

• • · • •

• · · • · · • * · ·· ·

• · • · ♦ · · • · • ·

CCA

CCT

GCT

GTG

TAC

CTG

CTG

CCA

CCA

GCT

CGT

GAG

CAA

CTG

AAC

CTG

1440

Pro

Pro

Ala

Val

Tyr

Leu

Leu

Pro

Pro

Ala

Arg

Glu

Gin

Leu

Asn

Leu

450

455

460

AGG

GAG

TCA

GCC

ACA

GTC

ACC

TGC

TTG

GTG

AAG

GGC

TTC

TCT

CCT

GCA

1488

Arg

Glu

Ser

Ala

Thr

Val

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Ser

Pro

Ala

465

470

475

GAC

ATC

AGT

GTG

CAG

TGG

CTT

CAG

AGA

GGG

CAA

CTC

TTG

CCC

CAA

GAG

1536

Asp

Ile

Ser

Val

Gin

Trp

Leu

Gin

Arg

Gly

Gin

Leu

Leu

Pro

Gin

Glu

480

485

490

AAG

TAT

GTG

ACC

AGT

GCC

CCG

ATG

CCA

GAG

CCT

GGG

GCC

CCA

GGC

TTC

1584

Lys

Tyr

Val

Thr

Ser

Ala

Pro

Met

Pro

Glu

Pro

Gly

Ala

Pro

Gly

Phe

495

500

505

TAC

TTT

ACC

CAC

AGC

ATC

CTG

ACT

GTG

ACA

GAG

GAG

GAA

TGG

AAC

TCC

1632

Tyr

Phe

Thr

His

Ser

Ile

Leu

Thr

Val

Thr

Glu

Glu

Glu

Trp

Asn

Ser

510

515

520

525

GGA GAG

ACC Thr

TAT Tyr

ACC Thr 530

TGT Cys

GTT Val

GTA GGC

CAC His 535

GAG Glu

GCC Ala

CTG CCA CAC

CTG Leu

1680

Gly

Glu

Val

Gly

Leu

Pro

His 540

GTG

ACC

GAG

AGG

ACC

GTG

GAC

AAG

TCC

ACT

GGT

ΑΆΑ

CCC

ACA

CTG

TAC

1728

Val

Thr

Glu

Arg

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Thr

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Tyr

545

550

555

AAT

GTC

TCC

CTG

ATC

ATG

TCT

GAC.

ACA

GGC

GGC

ACC

TGC

TAT

1770

Asn

Val

Ser

Leu

Ile

Met

Ser

Asp

Thr

Gly

Gly

Thr

Cys

Tyr

560

565

570

TGA 1773 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 590 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein

.(xi).

POPIS .

SEKVENCE:

. SEQ ID

„NO..:.

8:

Met -19

Gly

Trp

Ser

Trp -15

Ile

Phe

Leu

Phe

Leu -10

Leu

Ser

Gly

Thr

Ala -5

Gly

Val

His

Ser

Glu 1

Val

Gin

Leu

Gin 5

Gin

Ser

Gly

Pro

Glu 10

Leu

Val

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Ile 20

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser 25

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Asp

Tyr

Asn

Met

His

Trp

Val

Lys

Gin

Ser

His

Gly

Lys

Ser

Leu

35 40 45

Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn

	Gin Lys	Phe	Lys 65	Ser Lys	Ala Thr Leu 70
	Thr	Ala	Tyr 80	Met	Glu	Leu	Arg	Ser 85	Leu
	Tyr	Tyr 95	Cys	Ala	Arg	Ser	Tyr 100	Tyr	Ala
	Thr 110	Ser	Val	Thr	Val	Ser 115	Ser	Glu	Ser
	Pro	Leu	Val	Ser	Cys 130	Glu	Ser	Pro	Leu
	Met	Gly	Cys	Leu 145	Ala	Arg	Asp	Phe	Leu 150
	Trp	Asn	Tyr 160	Gin	Asn	Asn	Thr	Glu 165	Val
	Pro	Thr 175	Leu	Arg	Thr	Gly	Gly 180	Lys	Tyr
	Leu 190	Ser	Pro	Lys	Ser	Ile 195	Leu	Glu	Gly
	Lys	Ile	His	Tyr	Gly. Gly 210	Lys	Asn	Arg
	Ala	Val	Ala	Glu 225	Met	Asn	Pro	Asn	Val 230
	Asp	Gly	Phe 240	Ser	Gly	Pro	Ala	Pro 245	Arg
	Ala	Thr 255	Asn	Phe	Thr	Pro	Lys 260	Pro	Ile
	Gly 270	Lys	Leu	Val	Glu	Ser 275	Gly	Phe	Thr
	Asn	Lys	Gly	Ser	Thr	Pro	Gin	Thr	Tyr
			-	··: =: · r	290
	Ue	Ser	Glu	Ile 305	Asp	Trp	Leu	Asn	Leu 310
	Asp	His	Arg 320	Gly	Leu	Thr	Phe	Leu 325	Lys
	Ala	Ser 335	Pro	Ser	Thr	Asp	Ile 340	Leu	Thr
1	Ala 350	Asp	Ile	Phe	Leu	Ser 355	Lys	Ser	Ala
Asn	Leu	Ala	Thr	Tyr	Glu	Thr	Leu	Asn

139 -	• 4 • • • • • 4	··· • • · • • · ··	1 · • · • • · · • ·	·· ···· ·· ·· • · · · · · • · · · ·· • · ·'···· 9 • · · · · ·· · ·· ··
55					60
Thr	Val	Asp	Asn	Ser 75	Ser	Ser
Thr	Ser	Glu	Asp 90	Ser	Ala	Val
Met	Asp	Tyr 105	Trp	Gly	Gin	Gly
Gin	Ser 120	Phe	Pro	Asn	Val	Phe 125
Ser 135	Asp	Lys	Asn	Leu	Val 140	Ala
Pro	Ser	Thr	Ile	Ser 155	Phe	Thr
Ile	Gin	Gly	Ue 170	Arg	Thr	Phe
Leu	Ala	Thr 185	Ser	Gin	Val	Leu
Ser	Asp 200	Glu	Tyr	Leu	Val	Cys 205
Asp 215	Leu	His	Val	Pro	Ue 220	Pro
Asn	Val	Phe	Val	Pro 235	Pro	Arg
Lys	Ser	Lys	Leu 250	Ile	Cys	Glu
Thr	Val	Ser 265	Trp	Leu	Lys	Asp
Thr	Asp 280	Pro	Val	Thr	Ue	Glu 285
Lys 295	Val	Ile	Ser	Thr	Leu 300	Thr
Asn	Val	Tyr	Thr	Cys 315	Arg	Val
Asn	Val	Ser	Ser 330	Thr	Cys	Ala
Phe	Thr	Ue 345	Pro	Pro	Ser	Phe
Asn	Leu 360	Thr	Cys	Leu	Val	Ser 365
Ile	Ser	Trp	Ala	Ser	Gin	Ser

• 4 ···· 4444 4444 • * · ·· · 4 · · · • 4 · 44 ·4··· • 4 « · 4 4 4 4 444 4 4

4*4* * *·44*

- 140 - .........

370

375

380

Gly

Glu

Pro'

Leu

Glu

Thr

Lys

Ile

Lys

Ile

Met

Glu

Ser

His

Pro

Asn

385

390

395

Gly

Thr

Phe

Ser

Ala

Lys

Gly

Val

Ala

Ser

Val

Cys

Val

Glu

Asp

Trp

400

405

410

Asn

Asn

Arg

Lys

Glu

Phe

Val

Cys

Thr

Val

Thr

His

Arg

Asp

Leu

Pro

415

420

425

Ser

Pro

Gin

Lys

Lys

Phe

Ile

Ser

Lys

Pro

Asn

Glu

Val

His

Lys

His

430

435

440

445

Pro

Pro

Ala

Val

Tyr

Leu

Leu

Pro

Pro

Ala

Arg

Glu

Gin

Leu

Asn

Leu

450

455

460

Arg

Glu

Ser

Ala

Thr

Val

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Ser

Pro

Ala

465

470

475

Asp

Ile

Ser

Val

Gin

Trp

Leu

Gin

Arg

Gly

Gin

Leu

Leu

Pro

Gin

Glu

480

485

490

Lys·

Tyr

Val

Thr

Ser

Ala

Pro

Met

Pro

Glu

Pro

Gly

Ala

Pro

Gly

Phe

495

500

505

Tyr

Phe

Thr

His

Ser

Ile

Leu

Thr

Val

Thr

Glu

Glu

Glu

Trp

Asn

Ser

510

515

520

525

Gly

Glu

Thr

..Tyr

Thr.

Cys.

Val

val.

Gly

His

Glu

Ala

Leu

Pro

His

Leu

530

535

540

Val

Thr

Glu

Arg

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Thr

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Tyr

545

550

555

Asn

Val

Ser

Leu

Ile

Met

Ser

Asp

Thr

Gly

Gly

Thr

Cys

Tyr

560

565

570

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 717 párů bázi (B) TYP: nukleové kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA až mRNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Mus musculus (G) TYP BUŇKY: hybridom (H) BUNĚČNÁ LINIE: CH11 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ:1..714 (ix) ZNAK:

·· ···!

·· ····

141 (A) JMÉNO/KLÍČ: mat_peptid (B) UMÍSTĚNÍ:58..714 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: sig_peptid (B) UMÍSTĚNÍ:!..57 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 9:

ATG AAG

TTG CCT

GTT Val -15

AGG Arg

CTG TTG

GTG Val

CTG Leu -10

ATG TTC

TGG ATT

CCT Pro -5

GCT Ala

48

Met -19

Lys

Leu

Pro

Leu

Leu

Met

Phe

Trp

Ile

TCC

AGC

AGT

GAT

GTT

GTG

ATG

ACC

CAA

AGT

CCA

CTC

TCC

CTG

CCT

GTC

96

Ser

Ser

Ser

Asp 1

Val

Val

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Leu

Ser 10

Leu

Pro

Val

AGT

CTT

GGA

GAT

CAA

GCC

TCC

ATC

TCT

TGC

AGA

TCT

AGT

AAG

AGC

CTT

144

Ser

Leu 15

Gly

Asp

Gin

Ala

Ser 20

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser 25

Ser

Lys

Ser

Leu

GTA

CAC

AGT

AAT

GGA

AAC

ACC

TAT

TTA

CAT

TGG

TAC

CTG

CAG

AAG

CCA

192

Val 30

His

Ser

Asn

Gly

Asn 35

Thr

Tyr

Leu

His

Trp 40

Tyr

Leu

Gin

Lys

Pro 45

GGC

CAG

TCT

CCA

AAG

CTC

CTG

ATC

TAC

AAA

GTT

TCC

AAC

CGA

TTT

TCT

240

Gly

Gin

Ser

Pro

Lys 50

Leu

Leu

Ile

Tyr

Lys 55

Val

Ser

Asn

Arg

Phe 60

Ser

GGG

GTC

CCA

GAC

AGG

TTC

AGT

GGC

AGT

GGA

TCA

GGG

ACA

GAT

TTC

ACA

288

Gly

Val

Pro

Asp 65

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser 70

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp 75

Phe

Thr

CTC

AAG

ATC

AGC

AGA

GTG

GAG

GCT

GAG

GAT

CTG

GGA

GTT

TAT

TTC

TGC

336

Leu

Lys

Ile 80

Ser

Arg

Val

Glu

Ala 85

Glu

Asp

Leu

Gly

Val 90

Tyr

Phe

Cys

TCT

CAA

AGT

ACA

CAT

GTT

CCT

CCG

GCG

TTC

GGT

GGA

GGC

ACC

AAG

CTG

384

Ser

Gin 95

Ser

Thr

His

Val

Pro 100

Pro

Ala

Phe

Gly

Gly 105

Gly

Thr

Lys

Leu

GAA

ATC

AAA

CGG

GCT

GAT

GCT

GCA

CCA

ACT

GTA

TCC

ATC

TTC

CCA

CCA

432

Glu 110

Ile

Lys

Arg

Ala

Asp 115

Ala

Ala

Pro

Thr

Val 120

Ser

Ile

Phe

Pro

Pro 125

TCC

AGT

GAG

CAG

TTA

ACA

TCT

GGA

GGT

GCC

TCA

GTC

GTG

TGC

TTC

TTG

480

Ser

Ser

Glu

Gin

Leu 130

Thr

Ser

Gly

Gly

Ala 135

Ser

Val

Val

Cys

Phe 140

Leu

AAC

AAC

TTC

TAC

CCC

AAA

GAC

ATC

AAT

GTC

AAG

TGG

AAG

ATT

GAT

GGC

528

Asn

Asn

Phe

Tyr 145

Pro

Lys

Asp

Ile

Asn 150

Val

Lys

Trp

Lys

Ile 155

Asp

Gly

AGT

GAA

CGA

CAA

AAT

GGC

GTC

CTG

AAC

AGT

TGG

ACT

GAT

CAG

GAC

AGC'

576

Ser

Glu

Arg

Gin

Asn

Gly

Val

Leu

Asn

Ser

Trp

Thr

Asp

Gin

Asp

Ser

160

165

170

·· ···· ·· ···· ·· toto • · · ·· · · to · to ·· · to · · · to to · • to · · to · · · · · · · « « · · · · to · to · to

-

142 -

··

• ·

• · ·

·· «

ΆΆΆ

GAC

AGC

ACC

TAC

AGC

ATG

AGC

AGC

ACC

CTC

ACG

TTG

ACC

AAG

GAC

624

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Met

Ser

Ser

Thr·

Leu

Thr

Leu

Thr

Lys

Asp

175

180

185

GAG

TAT

GAA

CGA

CAT

AAC

AGC

TAT

ACC

TGT

GAG

GCC

ACT

CAC

AAG

ACA

672

Glu

Tyr

Glu

Arg

His

Asn

Ser

Tyr

Thr

Cys

Glu

Ala

Thr

His

Lys

Thr

190

195

200

205

TCA

ACT

TCA

CCC

ATT

GTC

AAG

AGC

TTC

AAC

AGG

ΆΑΤ

GAG

TGT

714

Ser

Thr

Ser

Pro

Ile

Val

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Asn

Glu

Cys

210

215

TAG

717 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 238 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 10:

Met -19

Lys

Leu

Pro

Val Arg -15

Leu

Leu Val

Leu Met -10

Phe

Trp

Ile

Pro -5

Ala

Ser

Ser

Ser

Asp 1

Val

Val

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Leu

Ser 10

Leu

Pro

Val

Ser

Leu 15

Gly

Asp

Gin

Ala

Ser 20

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser 25

Ser

Lys

Ser

Leu

Val 30

His

Ser

Asn

Gly

Asn 35

Thr

Tyr

Leu

His

Trp 40

Tyr

Leu

Gin

Lys

Pro 45

Gly

Gin

Ser

Pro

Lys 50

Leu

Leu

Ile

Tyr

Lys 55

Val

Ser

Asn

Arg

Phe 60

Ser

Gly

Val

Pro

Asp 65

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser 70

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp 75

Phe

Thr

Leu

Lys

Ile 80

Ser

Arg

Val

Glu

Ala 85

Glu

Asp

Leu

Gly

Val 90

Tyr

Phe

Cys

Ser

Gin 95

Ser

Thr

His

Val

Pro 100

Pro

Ala

Phe

Gly

Gly 105

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu 110

Ile

Lys

Arg

Ala

Asp 115

Ala

Ala

Pro

Thr

Val 120

Ser

Ile

Phe

Pro

Pro 125

Ser

Ser

Glu

Gin

Leu 130

Thr

Ser

Gly

Gly

Ala 135

Ser

Val

Val

Cys

Phe 140

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr 145

Pro

Lys

Asp

Ile

Asn 150

Val

Lys

Trp

Lys

Ile 155

Asp

Gly

Ser

Glu

Arg

Gin

Asn

Gly

Val

Leu

Asn

Ser

Trp

Thr

Asp

Gin

Asp

Ser

4444

4 44 44 «

4 4

4 4

4 ·

4 4 4

-

143 -

4 4

4 4

4

• ·

160

165

170

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Met

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Lys

Asp

175

180

185

Glu

Tyr

Glu

Arg

His

Asn

Ser

Tyr

Thr

Cys

Glu

Ala

Thr

His

Lys

Thr

190

195

200

205

Ser

Thr

Ser

Pro

Ile

Val

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Asn

Glu

Cys

210

215

INFORMACE PRO SEQ ID NO: 11:

4444

4 44

4· II

4 4 4·

44

9999 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 480 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA až mRNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Mus musculus (G) TYP BUŇKY: hybridom (H) BUNĚČNÁ LINIE: CH11 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNÓ/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ:1..477 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: mat_peptid (B) UMÍSTĚNÍ:67..477 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: sig_peptid (B) UMÍSTĚNÍ:!..66

(xi) POPIS SEKVENCE:

: SEQ ID NO:

.11:

ATG

AAG

ACC

CAC

CTG

CTT

CTC

TGG

GGA

GTC

CTC

GCC

ATT

TTT

GTT

AAG

48

Met

Lys

Thr

His

Leu

Leu

Leu

Trp

Gly

Val

Leu

Ala

Ile

Phe

Val

Lys

-22

-20

...

- .. .

-15

-10^

.....

.·' ... -’ί

GCT

GTC

CTT

GTA

ACA

GGT

GAC

GAC

GAA

GCG

ACC

ATT

CTT

GCT

GAC

AAC

96

Ala

Val

Leu

Val

Thr

Gly

Asp

Asp

Glu

Ala

Thr

Ile

Leu

Ala

Asp

Asn

-5

1

5

10

AAA

TGC

ATG

TGT

ACC

CGA

GTT

ACC

TCT

AGG

ATC

ATC

CCT

TCC

ACC

GAG

144

Lys

Cys

Met

Cys

Thr

Arg

Val

Thr

Ser

Arg

Ile

Ile

Pro

Ser

Thr

Glu

15

20

25

GAT

CCT

AAT

GAG

GAC

ATT

GTG

GAG

AGA

AAT

ATC

CGA

ATT

GTT

GTC

CCT

192

Asp

Pro

Asn

Glu

Asp

Ile

Val

Glu

Arg

Asn

Ile

Arg

Ile

Val

Val

Pro

30

35

40

TTG

AAC

AAC

AGG

GAG

AAT

ATC

TCT

GAT

CCC

ACC

TCC

CCA

CTG

AGA

AGG

240

·· ···· ···· ··

- 144 -

Leu Asn Asn

Arg Glu

Asn

Ile

Ser Asp 50

Pro

Thr

Ser

Pro 55

Leu Arg

Arg

45

AAC

TTT

GTA

TAC

CAT

TTG

TCA

GAC

GTC

TGT

AAG

AAA

TGC

GAT

CCT

GTG

288

Asn

Phe

Val

Tyr

His

Leu

Ser

Asp

Val

Cys

Lys

Lys

Cys

Asp

Pro

Val

60

65

70

GAA

GTG

GAG

CTG

GAA

GAT

CAG

GTT

GTT

ACT

GCC

ACC

CAG

AGC

AAC

ATC

336

Glu

Val

Glu

Leu

Glu

Asp

Gin

Val

Val

Thr

Ala

Thr

Gin

Ser

Asn

Ile

75

80

85

90

TGC

AAT

GAG

GAC

GAT

GGT

GTT

CCT

GAG

ACC

TGC

TAC

ATG

TAT

GAC

AGA

384

Cys

Asn

Glu

Asp

Asp

Gly

Val

Pro

Glu

Thr

Cys

Tyr

Met

Tyr

Asp

Arg

95

100

105

AAC

AAG

TGC

TAT

ACC

ACT

ATG

GTC

CCA

CTT

AGG

TAT

CAT

GGT

GAG

ACC

432

Asn

Lys

Cys

Tyr

Thr

Thr

Met

Val

Pro

Leu

Arg

Tyr

His

Gly

Glu

Thr

110

115

120

ΑΆΑ

ATG

GTG

CAA

GCA

GCC

TTG

ACC

CCC

GAT

TCT

TGC

TAC

CCT

GAC

477

Lys

Met

Val

Gin

Ala

Ala

Leu

Thr

Pro

Asp

Ser

Cys

Tyt

Pro

Asp

125

130

135

TAG

480 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 159 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein

	(xi)	POPIS SEKVENCE	: SEQ ID
Met -22	Lys	Thr -20	His	Leu	Leu	Leu	Trp -15
Ala	Val -5	Leu	Val	Thr	Gly	Asp 1	Asp
Lys	Cys	Met	Cys	Thr 15	Arg	Val	Thr
Asp	Pro	Asn	Glu. 30	Asp	Ile	Val	Glu
Leu	Asn	Asn 45	Arg	Glu	Asn	Ile	Ser 50
Asn	Phe 60	Val	Tyr	His	Leu	Ser 65	Asp
Glu 75	Val	Glu	Leu	Glu	Asp 80	Gin	Val
Cys	Asn	Glu	Asp	Asp 95	Gly	Val	Pro

NO: 12:

Gly	Val	Leu	Ala	Ile -10	Phe	Val	Lys
Glu	Ala	Thr 5	Ile	Leu	Ala	Asp	Asn 10
Ser	Arg 20	Ile	Ile	Pro	Ser	Thr 25	Glu
Arg Asn 35	Ile	Arg	Ile	Val 40	.Val	Pro..,
Asp	Pro	Thr	Ser	Pro 55	Leu	Arg	Arg
Val	Cys	Lys	Lys 70	Cys	Asp	Pro	Val
Val	Thr	Ala 85	Thr	Gin	Ser	Asn	Ile 90
Glu	Thr 100	Cys	Tyr	Met	Tyr	Asp 105	Arg

44 4

4 4

4

145

Asn Lys

Lys Met

Cys Tyr

110

Val Gin

125

Thr Thr

Ala Ala

Met Val

Leu Thr

130

Pro Leu

115

Pro Asp

Arg Tyr

Ser Cys

His Gly

120

Tyr Pro

135

Glu Thr

Asp (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 15 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (v) TYP FRAGMENTU: N-koncový

(XÍ)	POPIS SEKVENCE:	SEQ	ID NO: 13:
Glu	Val Gin Leu Gin	Gin	Ser Gly Pro	Glu Leu Val Lys	Pro Gly
1	5			10	15
(2) INFORMACE PRO SEQ ID	NO:	14:
(i)	CHARAKTERISTIKA	SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (v) TYP FRAGMENTU: N-koncový

(xi)	POPIS SEKVENCE:	SEQ ID NO: 14:
Asp	Val Val Met Thr	Gin	Ser Pro Leu	Ser Leu Pro Val	Ser Leu Gly
1	5			10	15
Asp	Gin Ala Ser Ile		' -ir - --
	20
INFORMACE PRO SEQ ID	NO:	15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 391 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA až mRNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne

	- 146 -	·· ··«· ·· ···· ss c e · · ··· .......... e · · . · ·· · ···· • · · · »·· ·· .· ·· ·· · ·· ··
(iv)	KÓDUJÍCÍ: ne
(vi)	PŮVODNÍ ZDROJ:
	(A)	ORGANISMUS: Mus musculus
	(G)	TYP BUŇKY: hybridom
	(H)	BUNĚČNÁ LINIE: CH11
(ix)	ZNAK
	(A)	JMÉNO/KLÍČ: CDS
	(B)	UMÍSTĚNÍ:2..391
(ix)	ZNAK
	(A)	JMÉNO/KLÍČ: mat peptid
	(B)	UMÍSTĚNÍ:32..391
(ix)	ZNAK
	(A)	JMÉNO/KLÍČ: sig peptid
	(B)	UMÍSTĚNÍ:2..31

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 15:

C CTC

CTG

TCA

GGA

ACT

GCA GGC

GTC

CAC

TCT

GAG

GTC

CAG

CTT

CAG

46

Leu

Leu

Ser

Gly

Thr

Ala Gly

Val

His

Ser

Glu

Val

Gin

Leu

Gin

-10

-5

1

5

CAG Gin

TCA Ser

GGA Gly

CCT Pro

GAG Glu 10

CTG GTG Leu Val

AAA CCT

GGG GCC TCA GTG AAG ATA TCC

94

Lys

Pro

Gly 15

Ala Ser

Val

Lys

Ile 20

Ser

TGC

AAG

GCT

TCT

GGA

TAC

ACA

TTC

ACT

GAC

TAC

AAC

ATG

CAC

TGG

GTG

142

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Asp

Tyr

Asn

Met

His

Trp

Val

25

30

35

AAG

CAG

AGC

CAT

GGA

AAG

AGC

CTT

GAG

TGG

ATT

GGA

TAT

ATT

TAT

CCT

190

Lys

Gin

Ser

His

Gly

Lys

Ser

Leu

Glu

Trp

Ile

Gly

Tyr

Ile

Tyr

Pro

40

45

50

TAC

AAT

GGT

GGT

ACT

GGC

TAC

AAC

CAG

AAG

TTC

AAG

AGC

AAG

GCC

ACA

238

Tyr

Asn

Gly

Gly

Thr

Gly

Tyr

Asn

Gin

Lys

Phe

Lys

Ser

Lys

Ala

Thr

55

60

65

TTG

ACT

GTT

GAC

AAT

TCC

TCC

AGC

ACA

GCC

TAC

ATG

GAG

CTC

CGC

AGC

286

Leu

Thr

Val

Asp

Asn

Ser

Ser

Ser

Thr

Ala

Tyr

Met

Glu

Leu

Arg

Ser

70

75

80

85

CTG

ACA

TCT“’

GAG

GAC“

TCT’

GCA

GTC

TAT

TAC

TGT

GCA

AGA

'AGT

TAC

TAT

334

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Ser

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Ser

Tyr

Tyr

90

95

100

GCT

ATG

GAC

TAC

TGG

GGT

CAA

GGA

ACC

TCA

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

GAG

382

Ala

Met

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Ser

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Glu

105

110

115

AGT CAG TCC 391

Ser Gin Ser

120 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 16:

• · · ·

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 388 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA až mRNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Mus musculus (G) TYP BUŇKY: hybridom (H) BUNĚČNÁ LINIE: CH11 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ:2..388 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: mat_peptid (B) UMÍSTĚNÍ:29..388 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: sig_peptid (B) UMÍSTĚNÍ:2..28 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 16:

G ATG TTC TGG ATT CCT GCT TCC AGC AGT GAT GTT GTG ATG ACC CAA 4 6

Met Phe Trp Ile Pro Ala Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gin

-9-5 15

AGT Ser

CCA Pro

CTC Leu

TCC Ser 10

CTG Leu

CCT Pro

GTC Val

AGT Ser

CTT Leu 15

GGA GAT

CAA Gin

GCC Ala

TCC ATC

TCT Ser

94

Gly

Asp

Ser 20

Ile

TGC

AGA

TCT

AGT

AAG

AGC

CTT

GTA

CAC

AGT

ΆΑΤ

GGA

AAC

ACC

TAT

TTA

142

Cys

Arg

Ser

Ser

Lys

Ser

Leu

Val

His

Ser

Asn

Gly

Asn

Thr

Tyr

Leu

25

30

35

CAT

TGG

TAC

CTG

CAG

AAG

CCA

GGC

CAG

TCT

CCA

AAG

CTC

CTG

ATC

TAC

190

His

Trp

Tyr

Leu

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ser

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

40

45

50

AAA

GTT

TCC.

ÁAG

CGA TTT

TCT-

GGG =

GTC

CCA

*GAC

AGG

TTC

AGT

GGC

AGT

·. 238

Lys

Val

Ser

Asn

Arg

Phe

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

55

60

65

70

GGA

TCA

GGG

ACA

GAT

TTC

ACA

CTC

AAG

ATC

AGC

AGA

GTG

GAG

GCT

GAG

286

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Lys

Ile

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

75

80

85

GAT

CTG

GGA

GTT

TAT

TTC

TGC

TCT

CAA

AGT

ACA

CAT

GTT

CCT

CCG

GCG

334

Asp

Leu

Gly

Val

Tyr

Phe

Cys

Ser

Gin

Ser

Thr

His

Val

Pro

Pro

Ala

90

95

100

TTC

GGT

GGA

GGC

ACC

AAG

CTG

GAA

ATC

AAA

CGG

GCT

GAT

GCT

GCA

CCA

382

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

Ála

Asp

Ala

Ala

Pro

• ·

148

105

110

ACT GŤA Thr Val

115

388

120 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 17:

CTAAGGGAAT TCCGCCTCTC CTCAGACACT GAA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 34 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 18:

TTTTACTCTA GAGACCCAAG GCCTGCCTGG TTGA ' .. . ......... 34 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA

149 • ·

(iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 19:

AAATAGGAAT TCCAGTCTCC TCAGGCTGTC TCC 33 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 32 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 20:

ATGATCTCTA GAGTGGTGGC ATCTCAGGAC CT 32 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 32 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 21:

TTGCGGAATT CCTCACCTGT CCTGGGGTTA TT (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 32 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární • · · · (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne • · · · ····· • · ·· · · · · ·

---- ·

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 22:

ATTGCCTCTA GAGCCTCTAA GGACAACGAG CT 32 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 23:

TGGGGCCTCA GTGAAGATAT (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 páru baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne

.....(iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 24:

CAATGGTGGT ACTGGCTACA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) · DÉLKA: 20 párů baží ' (B) TYP: nukleová kyselina

151

(C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 25:

TGACATCTGA GGACTCTGCA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 26:

TCCTCAGAGA GTCAGTCCTT (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIŠ: ...../desc = synthetic DNA' (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 27:

TCCTTCACCT GGAACTACCA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 28:

·· ···· ♦

152

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii) (iv)	HYPOTETICKÁ: ne KÓDUJÍCÍ: ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 28:

TCCCAAGAGC ATCCTTGAAG (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 29:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 29:

AGATCTGCAT GTGCCCATTC (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 30:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne

TCTAAACTCA TCTGCGAGGC (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 30:

153 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 31:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 31:

GGTGACCATC GAGAACAAAG (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 32:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 páru baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární

(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii) (iv)	HYPOTETICKÁ: ne KÓDUJÍCÍ: ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 32:

AGGGGTCTCA CCTTCTTGAA20 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 33:

. - (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: ......

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 33:

- 154 -

TCCTTTGCCG ACATCTTCCT (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 34:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 34:

GTGTGTACTG TGACTCACAG 20 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 35:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne ' (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 35:

AACTGAACCT GAGGGAGTCA (2) INFORMACE' PRO SEQ ID NO: 36:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii) (iv)	HYPOTETICKÁ: ne KÓDUJÍCÍ: ne

·· ···· •4 4444

- 155 20 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 36:

AACTCTTGCC CCAAGAGAAG (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 37:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii) (iv)	HYPOTETICKÁ: ne KÓDUJÍCÍ: ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 37:

ATCCTGACTG TGACAGAGGA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 38:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA1
(iii) (iv)	HYPOTETICKÁ: ne KÓDUJÍCÍ: ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 38:

ACAAGTCCAC TGGTAAACCC (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 39:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA • · • ·

- 156 -

(iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 39:

AGGATATCTT CACTGAGGCC (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 40:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 40:

ATCCACTCAA GGCTCTTTCC 20 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 41:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 41:

ACTGCAGAGT CCTCAGATGT (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 42:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární • · · ·

157 ··· · (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: '/desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 42:

AGACGGTGAC TGAGGTTCTT (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 43:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii) (iv)	HYPOTETICKÁ: ne KÓDUJÍCÍ: ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 43:

CAGGTGAAGG AAATGGTGCT (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 44:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne —‘ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 44:

ATGCTCTTGG GAGACAGCAA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 45:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina

- 158 - (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 45:

CTCTGTTTTT GCCTCCGTAG (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 46:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (Xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 46:

TGGCCTCGCA GATGAGTTTA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 47:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární

(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina
(A) POPIS:	7děse =: synthetic DNA
(iii)	HYPOTETICKÁ:	ne
(iv)	KÓDUJÍCÍ: ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 47:

CCTTTGTTCT CGATGGTCAC (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 48:

159

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii) (iv)	HYPOTETICKÁ: ne KÓDUJÍCÍ: ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 48:

TGTGGAGGAC ACGTTCTTCA 20 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 49:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 49:

ACTTTGAGAA GCCCAGGAGA

2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 50:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii) (iv)	HYPOTETICKÁ: ne KÓDUJÍCÍ: ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 50:

AGATCCCTGT GAGTCACAGT • · e e • · 9 ·

- 160 (2) .INFORMACE PRO SEQ ID NO: 51:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární

(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii) (iv)	HYPOTETICKÁ: ne KÓDUJÍCÍ: ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 51:

AGCAGGTGGA TGTTTGTGCA 20 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 52:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 52:

TGAAGCCACT GCACACTGAT (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 53:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 53:

• · • · · · · • · · · · ·

161

AGTTCCATTC CTCCTCTGTC (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 54:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 54:

TGTGTCAGAC ATGATCAGGG (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 55:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii) (iv)	HYPOTETICKÁ: ne KÓDUJÍCÍ: ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 55:

TGAAGTTGCC TGTTAGGCTG (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 56:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii) (iv)	HYPOTETICKÁ: ne KÓDUJÍCÍ: ne

e ·· · ·

162 ·· 9999 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 56:

CTTGGAGATC AAGCCTCCAT 20 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 57:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 57:

GCTGAGGATC TGGGAGTTTA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 58:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE; (A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii) (iv)	HYPOTETICKÁ: ne KÓDUJÍCÍ: ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 58:

GATGCTGCAC CAACTGTATC (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 59:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA ·· ····

Β ·· ·

163

(iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne

POPIS SEKVENCE:

SEQ ID NO: 59:

t,

CGACAAAATG GCGTCCTGAA (2) INFORMACE PRO SEQ ID

NO: 60:

(i)

SEKVENCE:

DÉLKA: 20 párů baží TYP: nukleová kyselina

CHARAKTERISTIKA (A) (B) (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D)

TOPOLOGIE: lineární

TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA

HYPOTETICKÁ: ne

KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 60:

ACGTTGACCA AGGACGAGTA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 61:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 61:

ATCTGCAAGA GATGGAGGCT (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 62:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární • · · · · ·

- 164 (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 62:

ACCCCAGAAA ATCGGTTGGA 20 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 63:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 63:

CCGGAGGAAC ATGTGTACTT (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 64:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne.......

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 64:

TCGTTCATAC TCGTCCTTGG (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 65:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina ·· ···· • ·

165 ·· (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 65:

CATCTCAGGA CCTTTGTCTC '(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 66:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 66:

CACCTGTCCT GGGGTTATTT (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 67:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 páru baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IĎ NO: 67:

AGACAAGATG AAGACCCACC (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 68:

• · · · · ·

- 166 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 68:

AAGCGACCAT TCTTGCTGAC (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 69:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 69:

ATATCTCTGA TCCCACCTCC

_ ------.... . ...	----- (2) INFORMACE- PRO- SEQ ID NO: -70: ------------------------ - --------	- - -------— --'	-........—
	(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina - (C) TYP ŘETĚZCE-: jednoduchý - - - (D) TOPOLOGIE: lineární
í 5-	' (ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
k	(iii) (iv)	HYPOTETICKÁ: ne KÓDUJÍCÍ: ne
t L	(Xi)	POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 70:
	GAAATGCGAT CCTGTGGAAG		20

- 167 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 71:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární

(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii) (iv)	HYPOTETICKÁ: ne KÓDUJÍCÍ: ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 71:

CTATACCACT ATGGTCCCAC 20 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 72:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE:.lineární (ii) TYP MOLEKULY:, jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 72:

AGAAGCAGGT GGGTCTTCAT

20(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 73:

, (i)-CHARAKTERISTIKA-SEKVENCE: - (A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární

(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii) (iv)	HYPOTETICKÁ: ne KÓDUJÍCÍ: ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 73:

·· ···· <t ····

- 168 TAGAGGTAAC TCGGGTACAC (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 74:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 74:

AAGTTCCTTC TCAGTGGGGA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 75:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 20 párů bázi. (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii) (iv)	HYPOTETICKÁ: ne KÓDUJÍCÍ: ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 75:

GGTGGCAGTA ACAACCTGAT (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 76:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne • · · · • 9

- 169 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 76:

CATGATACCT AAGTGGGACC (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 77:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 720 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA až mRNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ:1..717 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: mat_peptid (B) UMÍSTĚNÍ:61..717 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: sig_peptid (B) UMÍSTĚNÍ :1.,.60 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 77:

ATG AGG CTC Met Arg Leu -20

CCT Pro

GCT Ala

CAG Gin -15

CTC CTG GGG CTG

CTA ATG Leu Met -10

CTC Leu

TGG GTC Trp Val

CCA Pro -5

48

Leu

Leu Gly

Leu

GGA

TCC

AGT

GGG

GAT

GTT

GTG

ATG

ACT

CAG

TCT

CCA

CTC

TCC

CTG

CCC

96

Gly

Ser

Ser

Gly

Asp

Val

Val

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Leu

Ser

Leu

Pro

-- -

1

- - -

... . .

- 5

- 10

. ......

...... -- - · -

----------------—

GTC

ACC

CTT

GGA

CAG

CCG

GCC

TCC

ATC

TCC

TGC

AGA

TCT

AGT

AAG

AGC

144

Val

Thr

Leu

Gly

Gin

Pro

Ala

Ser

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser

Ser

Lys

Ser

15

20

25

CTT

GTA

CAC

AGT

AAT

GGA

AAC

ACC

TAT

TTA

CAT

TGG

TAC

CTG

CAG

AAG

192

Leu

Val

His

Ser

Asn

Gly

Asn

Thr

Tyr

Leu

His

Trp

Tyr

Leu

Gin

Lys

30

35

40

CCA

GGC

CAG

TCT

CCA

AAG

CTC

CTG

ATC

TAC

AAA

GTT

TCC

AAC

CGA

TTT

240

Pro

Gly

Gin

Ser

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Lys

Val

Ser

Asn

Arg

Phe

45

50

55

60

TCT

GGG

GTC

CCA

GAC

AGA

TTC

AGC

GGC

AGT

GGG

TCA

GGC

ACT

GAT

TTC

288

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

65

70

75

ACA

CTG

AAA

ATC

AGC

AGG

GTG

GAG

GCT

GAG

GAT

GTT

GGG

GTT

TAT

TAC

336

Thr

Leu

Lys

Ile

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

Tyr

• 44

4

4 4 4

-

170 -

• · 4

4 4 4

4 * 4

• · · 44 44

4 4

4 4

80

• 85

90

TGC

TCT

CAA

AGT

ACA

CAT

GTT

CCT

CCG

GCG

TTC

GGC

CAA

GGG

ACC

AAG

384

Cys

Ser

Gin

Ser

Thr

His

Val

Pro

Pro

Ala

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

95

100

105

GTG

GAA

ATC

AAA

CGT

ACT

GTG

GCT

GCA

CCA

TCT

GTC

TTC

ATC

TTC

CCG

432

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

110

115

120

CCA

TCT

GAT

GAG

CAG

TTG

AAA

TCT

GGA

ACT

GCC

TCT

GTT

GTG

TGC

CTG

480

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

125

130

135

140

CTG

TKÁT

AAC

TTC

TAT

CCC

AGA

GAG

GCC

AAA

GTA

CAG

TGG

AAA

GTG

GAT

528

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

145

150

155

AAC

GCC

CTC

CAA

TCG

GGT

AAC

TCC

CAG

GAG

AGT

GTC

ACA

GAG

CAG

GAC

576

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

160

165

170

.AGC Ser

AAG GAC

AGC ACC

TAC AGC

CTC AGC AGC ACC

CTG ACG Leu Thr 185

CTG AGC AAA

624

Lys

Asp 175

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu 180

Ser

Ser

Thr

Leu

Ser

Lys

GCA

GAC

TAC

GAG

AAA.

CAC

AAA

GTC.

TAC

GCC

TGC

GAA

GTC

ACC

CAT

CAG

672

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val.

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

190

195

200

GGC

CTG

AGC

TCG

CCC

GTC

ACA

AAG

AGC

TTC

AAC

AGG

GGA

GAG

TGT

717

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

205

210

215

TAG

720

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 78:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 239 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID

Met -20	Arg	Leu	Pro	Ala	Gin -15	Leu	Leu
Gly	Ser	Ser	Gly	Asp 1	Val	Val	Met
Val	Thr	Leu 15	Gly	Gin	Pro	Ala	Ser 20
Leu	Val ' 30	His	Ser	Asn	Gly	Asn 35	Thr

NO: 77:

Gly	Leu	Leu -10	Met	Leu	Trp	Val	Pro -5
Thr 5	Gin	Ser	Pro	Leu	Ser 10	Leu	Pro
Ile	Ser	Cys	Arg	Ser .. 25	Ser	Lys	Ser
Tyr	Leu	His	Trp 40	Tyr	Leu	Gin	Lys

• · · · • ·

Pro 45

Gly

Gin

Ser Pro

Lys 50

Leu

Leu

Ile Tyr Lys 55

Val

Ser

Asn

Arg Phe 60

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

65

70

75

Thr

Leu

Lys

Ile

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

Tyr

80

85

90

Cys

Ser

Gin

Ser

Thr

His

Val

Pro

Pro

Ala

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

95

100

105

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

110

115

120

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

125

130

135

140

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

145

150

155

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

160

165

170

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

175

180

185

Ala

Asp

Tyr

Glu.

Lys

His

. Lys.

Val

. Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

190

195

200

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

205

210

215

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 79:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 720 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina . _________________(C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární

(ii)	TYP MOLEKULY: cDNA až mRNA
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne.
(iv)	KÓDUJÍCÍ: ne
(ix) ZNAK:
	(A)	JMÉNO/KLÍČ:	CDS
	(B)	UMÍSTĚNÍ:!.	.717
(ix)	ZNAK
	(A)	JMÉNO/KLÍČ:	mat peptid
	(B)	UMÍSTĚNÍ:61	. .717
(ix)	ZNAK
	(A)	JMÉNO/KLÍČ:	sig peptid
	(B)	UMÍSTĚNÍ:!.	. 60

• · · ·

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 79:

ATG AGG CTC

CCT Pro

GCT Ala

CAG CTC

CTG Leu

GGG Gly

CTG CTA ATG CTC

TGG GTC Trp Val

CCA Pro -5

48

Met -20

Arg Leu

Gin -15

Leu

Leu

Leu Met -10

Leu

GGA

TCC

AGT

GGG

GAT

GTT

GTG

ATG

ACT

CAG

TCT

CCA

CTC

TCC

CTG

CCC

96

Gly

Ser

Ser

Gly

Asp

Val

Val

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Leu

Ser

Leu

Pro

1

5

10

GTC

ACC

CTT

GGA

CAG

CCG

GCC

TCC

ATC

TCC

TGC

AGA

TCT

AGT

AAG

AGC

144

Val

Thr

Leu

Gly

Gin

Pro

Ala

Ser

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser

Ser

Lys

Ser

15

20

25

CTT

GTA

CAC

AGT

AAT

GGA

AAC

ACC

TAT

TTA

CAT

TGG

TAC

CTG

CAG

AAG

192

Leu

Val

His

Ser

Asn

Gly

Asn

Thr

Tyr

Leu

His

Trp

Tyr

Leu

Gin

Lys

30

35

40

CCA

GGC

CAG

TCT

CCA

AAG

CTC

CTG

ATC

TAC

ΑΆΑ

GTT

TCC

AAC

CGA

TTT

240

Pro

Gly

Gin

Ser

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Lys

Val

Ser

Asn

Arg

Phe

45

50

55

60

TCT

GGG

GTC

CCA

GAC

AGA

TTC

AGC

GGC

AGT

GGG

TCA

GGC

ACT

GAT

TTC

288

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

65

70

75

ACA

CTG

AAA

ATC

AGC

AGG

GTG

GAG

GCT

GAG

GAT

GTT

GGG

GTT

TAT

TTC

336

Thr

Leu

Lys

Ile

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

Phe

80

85

90

TGC

TCT

CAA

AGT

ACA

CAT

GTT

CCT

CCG

GCG

TTC

GGC

CAA

GGG

ACC

AAG

384

Cys

Ser

Gin

Ser

Thr

His

Val

Pro

Pro

Ala

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

95

100

105

GTG

GAA

ATC

AAA

CGT

ACT

GTG

GCT

GCA

CCA

TCT

GTC

TTC

ATC

TTC

CCG

432

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

110

115

120

CCA

TCT

GAT

GAG

CAG

TTG

AAA

TCT

GGA

ACT

GCC

TCT

GTT

GTG

TGC

CTG

480

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

125

•130

-- -

135

— -

140.....-

—

CTG

AAT

AAC

TTC

TAT

CCC

AGA

GAG

GCC

AAA

GTA

CAG

TGG

AAA

GTG

GAT

528

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

145

150

155

AAC

GCC

CTC

CAA

TCG

GGT

AAC

TCC

CAG

GAG

AGT

GTC

ACA

GAG

CAG

GAC

576

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

160

165

170

AGC

AAG

GAC

AGC

ACC

TAC

AGC

CTC

AGC

AGC

ACC

CTG

ACG

CTG

AGC

AAA

624

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

175

180

185

GCA

GAC

TAC

GAG

AAA

CAC

AAA

GTC

TAC

GCC

TGC

GAA

GTC

ACC

CAT

CAG

672

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

190

195

200

GGC

CTG

AGC

TCG

CCC

GTC

ACA

AAG

AGC

TTC

AAC

AGG

GGA

GAG

TGT

717

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

	- 173 -	·· ···· ·· ···· ·· ·· • · · ·· · · · · · ··· ··· ♦ · ·· • · · · · ·· · ·♦· ♦ * ···· · · · ··· ·· · · ·· · · ♦ ··
205	210	215
TAG			720
(2) INFORMACE PRO	SEQ ID NO: 80:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 239 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 80:

Met Arg Leu Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Met

Leu

Trp

Val

Pro -5

-20

-15

-10

Gly

Ser

Ser

Gly

Asp

Val

Val

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Leu

Ser

Leu

Pro

1

5

10

Val

Thr

Leu

Gly

Gin

Pro

Ala

Ser

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser

Ser

Lys

Ser

15

20

25

Leu

Val

His

Ser

Asn

Gly

Asn

Thr

Tyr

Leu

His

Trp

Tyr

Leu

Gin

Lys

30

35

40

Pro

Gly

Gin

Ser

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Lys

Val

Ser

Asn

Arg

Phe

45

50

55

60

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

65

70

75

Thr

Leu

Lys

Ile

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

Phe

80

85

90

Cys

Ser

Gin

Ser

Thr

His

Val

Pro

Pro

Ala

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

95

100

105

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

....

.110

- -

. 115

—

-

- -

.120

- - -

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

125

130

135

140

Leu

. Asn

,Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

.Ala

Lys.

.Val

Gin

Trp

...Lys.

Val

Asp

145

150

155

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

160

165

170

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

175

180

185

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyt

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

190

195

200

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

205 210 215 • · · · • ·

174 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 81:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 720 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE:'lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA až mRNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne

(iv)	KÓDUJÍCÍ: ne
(ix) ZNAK:
	(A)	JMÉNO/KLÍČ:	CDS
	(B)	UMÍSTĚNÍ:1.	.717
(ix)	ZNAK
	(A)	JMÉNO/KLÍČ:	mat peptid
	(B)	UMÍSTĚNÍ:61	. .717
(ix)	ZNAK
	(A)	JMÉNO/KLÍČ:	sig peptid
	(B)	UMÍSTĚNÍ:1.	. 60

(xi) POPIS SEKVENCE:

SEQ ID NO:

81:

ATG

AGG

CTC

CCT

GCT

CAG

CTC.

CTG

GGG

CTG

CTA

ATG

CTC

TGG

GTC

CCA

48

Met

Arg

Leu.

Pro

Ala

Gin.

Leu

Leu

Gly

Leu

Leu

Met

Leu

Trp

Val

Pro

-20

-15

-10

-5

GGA

TCC

AGT

GGG

GAT

GTT

GTG

ATG

ACT

CAG

TCT

CCA

CTC

TCC

CTG

CCC

96

Gly

Ser

Ser

Gly

Asp

Val

Val

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Leu

Ser

Leu

Pro

1

5

10

GTC

ACC

CTT

GGA

CAG

CCG

GCC

TCC

ATC

TCC

TGC

AGA

TCT

AGT

AAG

AGC

144

Val

Thr

Leu

Gly

Gin

Pro

Ala

Ser

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser

Ser

Lys

Ser

15

20

25

CTT

GTA

CAC

AGT

AAT

GGA

AAC

ACC

TAT

TTA

CAT

TGG

TAC

CTG

CAG

AAG

192

Leu

Val

His

Ser

Asn

Gly Asn

Thr

Tyr

Leu

His

Trp

Tyr

Leu

Gin

Lys

30

35

40

CCA

GGC.

CAG

TCT=

_CCA

.AGG

rCTC

JOTG

ATC

..TAC.

SAAA

GTT

TCC

AAC

CGA

TTT

240

Pro

Gly

Gin

Ser

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Lys

Val

Ser

Asn

Arg

Phe

45

50

55

60

TCT

GGG

GTC

CCA

GAC

AGA

TTC

AGC

GGC

AGT ,GGG

TCA

GGC

ACT

GAT

TTC

288

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

65

70

75

ACA

CTG

AAA

ATC

AGC

AGG

GTG

GAG

GCT

GAG GAT

GTT

GGG

GTT

TAT

TAC

336

Thr

Leu

Lys

Ile

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu Asp

Val

Gly

Val

Tyr

Tyr

80

85

90

TGC

TCT

CAA

AGT

ACA

CAT

GTT

CCT

CCG

GCG TTC

GGC

CAA

GGG

ACC

AAG

384

Cys

Ser

Gin

Ser

Thr

His

Val

Pro

Pro

Ala Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

• · • · · ·

- 175 -

95

100

105

GTG

GAA

ATC

AAA

CGT

ACT

GTG

GCT

GCA

CCA

TCT

GTC

TTC

ATC

TTC

CCG

432

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

110

115

120

CCA

TCT

GAT

GAG

CAG

TTG

AAA

TCT

GGA

ACT

GCC

TCT

GTT

GTG

TGC

CTG

480

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

125

130

135

140

CTG

ΑΆΤ

AAC

TTC

TAT

CCC

AGA

GAG

GCC

AAA

GTA

CAG

TGG

AAA

GTG

GAT

528

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

145

150

155

AAC

GCC

CTC

CAA

TCG

GGT

AAC

TCC

CAG

GAG

AGT

GTC

ACA

GAG

CAG

GAC

576

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

160

165

170

AGC

AAG

GAC

AGC

ACC

TAC

AGC

CTC

AGC

AGC

ACC

CTG

ACG

CTG

AGC

AAA

624

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

175

180

185

GCA

GAC

TAC

GAG

ΆΆΆ

CAC

AAA

GTC

TAC

GCC

TGC

GAA

GTC

ACC

CAT

CAG

672

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

190

.195

200

GGC

CTG

AGC

TCG

CCC

GTC

ACA

AAG

AGC

TTC

AAC

AGG

GGA

GAG

TGT

717

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

205

210

215

TAG

720

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 82:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 239 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii).TYP MOLEKULY: .protein__________________ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 82:

Met -2.0

Arg

Leu

Pro

Ala

Gin -15

Leu

Leu

Gly

Leu

Leu .-.10,.

Met

Leu

Trp

Val

Pro -5

Gly

Ser

Ser

Gly

Asp 1

Val

Val

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Leu

Ser 10

Leu

Pro

Val

Thr

Leu 15

Gly

Gin

Pro

Ala

Ser 20

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser 25

Ser

Lys

Ser

Leu

Val 30

His

Ser

Asn

Gly

Asn 35

Thr

Tyr

Leu

His

Trp 40

Tyr

Leu

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ser

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Lys

Val

Ser

'Asn

Arg

Phe

50 55 60

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe • · · · ···· • β 4 ·

176

65

70

75

Thr

Leu

Lys

Ile 80

Ser

Arg

Val

Glu

Ala 85

Glu

Asp

Val

Gly

Val 90

Tyr

Tyr

Cys

Ser

Gin 95

Ser

Thr

His

Val

Pro 100

Pro

Ala

Phe

Gly

Gin 105

Gly

Thr

Lys

Val

Glu 110

Ile

Lys

Arg

Thr

Val 115

Ala

Ala

Pro

Ser

Val 120

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro 125

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu 130

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala 135

Ser

Val

Val

Cys

Leu 140

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr 145

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys 150

Val

Gin

Trp

Lys

Val 155

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin 160

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin 165

Glu

Ser

Val

Thr

Glu 170

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp 175

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu 180

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr 185

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp 190

Tyr

Glu

Lys

His

Lys 195

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu 200

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

205 210 215 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 83:’ (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 720 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA až mRNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne -- (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ:1..717 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: mat_peptid (B) UMÍSTĚNÍ:61..717 (ix.) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: sig_peptid (B) UMÍSTĚNÍ:!..60

(xi)

POPIS

SEKVENCE:

SEQ

ID

NO:

83:

ATG

AGG

CTC

CCT

GCT

CAG

CTC

CTG

GGG

CTG

CTA

ATG

CTC

TGG.

GTC

CCA

Met

Arg

Leu

Pro

Ala

Gin

Leu

Leu

Gly

Leu

Leu

Met

Leu

Trp

Val

Pro

-20

-15

-10

-5

• · · ·

TAG

720 • ·

- 177 -

4 · v · • ·

• • · • ·

• 4 •

• 4 • · • ·

• 4 4 · • · · • 4 ··

GGA

TCC

AGT

GGG

GAT

GTT

GTG

ATG

ACT

CAG

TCT

CCA

CTC

TCC

CTG

CCC

96

Gly

Ser

Ser

Gly

Asp

Val

Val

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Leu

Ser

Leu

Pro

1

5

10

GTC

ACC

CTT

GGA

CAG

CCG

GCC

TCC

ATC

TCC

TGC

AGA

TCT

AGT

AAG

AGC

144

Val

Thr

Leu

Gly

Gin

Pro

Ala

Ser

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser

Ser

Lys

Ser

15

20

25

CTT

GTA

CAC

AGT

AAT

GGA

AAC

ACC

TAT

TTA

CAT

TGG

TAC

CTG

CAG

AAG

192

Leu

Val

His

Ser

Asn

Gly

Asn

Thr

Tyr

Leu

His

Trp

Tyr

Leu

Gin

Lys

30

35

40

CCA

GGC

CAG

TCT

CCA

AGG

CTC

CTG

ATC

TAC

AAA

GTT

TCC

AAC

CGA

TTT

240

Pro

Gly

Gin

Ser

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Lys

Val

Ser

Asn

Arg

Phe

45

50

55

60

TCT

GGG

GTC

CCA

GAC

AGA

TTC

AGC

GGC

AGT

GGG

TCA

GGC

ACT

GAT

TTC

288

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

65

70

75

ACA

CTG

AAA

ATC

AGC

AGG

GTG

GAG

GCT

GAG

GAT

GTT

GGG

GTT

TAT

TTC

336

Thr

Leu

Lys

Ile

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

Phe

80

85

90

TGC

TCT

CAA

AGT

ACA

CAT

GTT

CCT

CCG

GCG

TTC

GGC

CAA

GGG

ACC

AAG

384

Cys

Ser

Gin

Ser

Thr

His

Val

Pro

Pro

Ala

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

95

100

105

GTG

GAA

ATC

AAA

CGT

ACT

GTG

GCT

GCA

CCA

TCT

GTC

TTC

ATC

TTC

CCG

432

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

110

115

120

CCA

TCT

GAT

GAG

CAG

TTG

AAA

TCT

GGA

ACT

GCC

TCT

GTT

GTG

TGC

CTG

480

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

125

130

135

140

CTG

AAT

AAC

TTC

TAT

CCC

AGA

GAG

GCC

AAA

GTA

CAG

TGG

AAG

GTG

GAT

528

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

- -

1-45

-

•

150

-155

- -

AAC

GCC

CTC

CAA

TCG

GGT

AAC

TCC

CAG

GAG

AGT

GTC

ACA

GAG

CAG

GAC

576

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

160

165

170

AGC

AAG

GAC

AGC

ACC

TAC

AGC

CTC

AGC

AGC

ACC

CTG

ACG

CTG

AGC

AAA

624

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

175

180

185

GCA

GAC

TAC

GAG

AAA

CAC

AAA

GTC

TAC

GCC

TGC

GAA

GTC

ACC

CAT

CAG

672

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

190

195

200

GGC

CTG

AGC

TCG

CCC

GTC

ACA

AAG

AGC

TTC

AAC

AGG

GGA

GAG

TGT

717

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

·· · ·

- 178 -

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 84:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 239 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 84:

Met Arg Leu Pro Ala -20

Gin Leu Leu Gly Leu Leu Met

Leu

Trp

Val

Pro -5

-15

-10

Gly

Ser

Ser

Gly

Asp

Val

Val

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Leu

Ser

Leu

Pro

1

5

10

Val

Thr

Leu

Gly

Gin

Pro

Ala

Ser

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser

Ser

Lys

Ser

15

20

25

Leu

Val

His

Ser

Asn

Gly

Asn

Thr

Tyr

Leu

His

Trp

Tyr

Leu

Gin

Lys

30

35

40

Pro

Gly

Gin

Ser

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Lys

Val

Ser

Asn

Arg

Phe

45

50

55

60

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

65

70

75

Thr

Leu

Lys

Ile

Ser

Arg

Val

Glu.

Ala

Glu

Asp

Val

Gly

Val

Tyr

Phe

80

85

90

Cys

Ser

Gin

Ser

Thr

His

Val

Pro

Pro

Ala

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

95

100

105

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

110

115

120

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

125

—

1.30

—

.135

----

—

14.0.

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

145

150

155

Asn

Ala

Leu

Gin.

„Ser

.Gly. Asn

Ser

Gin

Glu.

.Ser

.Val

Thr

Glu

Gin

Asp

160

165

170

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

175

180

185

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

190

195

200

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

205 210 215 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 85:

9999

-. 179 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A) (B) (C) (D)	DÉLKA: 1768 párů baží TYP: nukleová kyselina TYP ŘETĚZCE: dvojitý
TOPOLOGIE:	lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: cDNA až mRNA
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne
(iv)	KÓDUJÍCÍ: ne
) ZNAK:
	(A)	JMÉNO/KLÍČ:	CDS
	(B)	UMÍSTĚNÍ:1.	.1764
(ix)	ZNAK
	(A)	JMÉNO/KLÍČ:	mat peptid
	(B)	UMÍSTĚNÍ:58	. . 1764
(ix)	ZNAK
	(A)	JMÉNO/KLÍČ:	sig peptid
	(B)	UMÍSTĚNÍ:!.	.57

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 85:

ATG GGA

TGG Trp

AGC TGG

ATC Ile

TTT Phe

CTC Leu

TTC Phe

CTC Leu -10

CTG TCA GGA

ACT Thr

GCA Ala -5

GGC Gly

48

Met -19

Gly

Ser

Trp -15

Leu Ser

Gly

GTC

CAC

TCT.

GAG

GTG

CAG'

CTT

GTG :

CAG

TCT

GGG

GCT

GAG

GTG

AAG

AAG

96

Val

His

Ser

Glu 1

Val

Gin'

Leu

Val 5

Gin

Ser

Gly

Ala

Glu 10

Val

Lys

Lys .

CCT

GGG

GCC

TCA

GTG

AAG

GTT

TCC

TGC

AAG

GCT

TCT

GGA

TAC

ACC

TTC

144

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Val 20

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser 25

Gly

Tyr

Thr

Phe

ACT

GAC

TAT

AAT

ATG

CAT

TGG

GTG

CGC

CAG

GCC

CCC

GGA

CAA

GGA

CTC

192

Thr 30

Asp

Tyr

Asn

Met

His 35

Trp

Val

Arg

Gin

Ala 40

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu 45

GAA

TGG

ATG

GGA

TAT

ATT

TAT

CCT

TAC

AAT

GGT

GGT

ACT

GGC

TAC

AAC ......

~ 240

Glu

Trp

Met

Gly

Tyr 50

Ile

Tyr

Pro

Tyr

Asn 55

Gly

Gly

Thr

Gly

Tyr 60

Asn

CAG

AAG

TTC

AAG

AGC

AAG

GCC

ACA

TTG

ACT

GTT

GAC

AAT

TCC

GCG

AGC

288

Gin

Lys

Phe

Lys' 65

Ser

“Lys

Ala

Thr

Leu 70

Thr

Val

Asp

Asn

Ser 75

Ala

Ser

ACA

GCC

TAC

ATG

GAG

CTG

AGC

AGC

CTG

AGA

TCT

GAA

GAC

ACG

GCT

GTG

336

Thr

Ala

Tyr 80

Met

Glu

Leu

Ser

Ser 85

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp 90

Thr

Ala

Val

TAT

TAC

TGT

GCG

AGA

AGT

TAC

TAT

GCT

ATG

GAC

TAC

TGG

GGC

CAG

GGA

384

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Arg

Ser

Tyr 100

Tyr

Ala

Met

Asp

Tyr 105

Trp

Gly

Gin

Gly

ACC

CTG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA'

GGG

AGT

GCA

TCC

GCC

CCA

ACC

CTT

TTC

432

Thr. 110

Leu

Val

Thr

Val

Ser 115

Ser

Gly

Ser

Ala

Ser 120

Ala

Pro

Thr

Leu

Phe 125

·· · · • · ··· · • ·

180

ccc

CTC

GTC

TCC

TGT

GAG

AAT

TCC

CCG

TCG

GAT

ACG AGC

AGC

GTG

GCC

480

Pro

Leu

Val

Ser

Cys

Glu

Asn

Ser

Pro

Ser

Asp

ThrSer

Ser

Val

Ala

130

135

140

GTT

GGC

TGC

CTC

GCA

CAG

GAC

TTC

CTT

CCC

GAC

TCC ATC

ACT

TTC

TCC

528

Val

Gly

Cys

Leu

Ala

Gin

Asp

Phe

Leu

Pro

Asp

Ser Ile

Thr

Phe

Ser

145

150

155

TGG AAA TAC

AAG AAC AAC TCT GAC

ATC AGC AGT ACC

CGG GGC TTC

CCA Pro

576

Trp

Lys

Tyr 160

Lys Asn Asn

Ser

Asp 165

Ile

Ser

Ser

Thr

Arg 170

Gly

Phe

TCA

GTC

CTG

AGA GGG GGC

AAG

TAC

GCA

GCC

ACC

TCA

CAG

GTG

CTG

CTG

624

Ser

Val

Leu

Arg Gly Gly

Lys

Tyr

Ala

Ala

Thr

Ser

Gin

Val

Leu

Leu

175

180

185

CCT

TCC

AAG

GAC GTC ATG

CAG

GGC

ACA

GAC

GAA

CAC

GTG

GTG

TGC

AAA

672

Pro

Ser

Lys

Asp Val Met

Gin

Gly

Thr

Asp

Glu

His

Val

Val

Cys

Lys

190

195

200

205

•

GTC

CAG

CAC

CCC AAC GGC

AAC

AAA

GAA

AAG

AAC

GTG

CCT

CTT

CCA

GTG

720

Val

Gin

His

Pro Asn Gly

Asn

Lys

Glu

Lys

Asn

Val

Pro

Leu

Pro

Val

210

215

220

ATT

GCC

GAG

CTG CCT CCC

AAA

GTG

AGC

GTC

TTC

GTC

CCA

CCC

CGC

GAC

768

Ile

Ala

Glu

Leu Pro Pro

Lys

Val

Ser

Val

Phe

Val

Pro

Pro

Arg

Asp

225

230

235

GGC

TTC

TTC

GGC AAC CCC

CGC

AAG

TCC

AAG

CTC

ATC

TGC

CAG

GCC

ACG

816

Gly

Phe

Phe

Gly Asn Pro.

Arg

Lys

Ser

Lys

Leu

Ile

Cys

Gin

Ala

Thr

240

245

250

GGT

TTC

AGT

CCC CGG CAG

ATT

CAG

GTG

TCC

TGG

CTG

CGC

GAG

GGG

AAG

864

Gly

Phe

Ser

Pro Arg Gin

Ile

Gin

Val

Ser

Trp

Leu

Arg

Glu

Gly

Lys

255

260

265

CAG

GTG

GGG

TCT GGC GTC

ACC

ACG

GAC

CAG

GTG

CAG

GCT

GAG

GCC

AAA

912

Gin

Val

Gly

Ser Gly Val

Thr

Thr

Asp

Gin

Val

Gin

Ala

Glu

Ala

Lys

270

275

280

285

GAG

TCT

GGG

CCC ACG ACC

TAC

AAG

GTG

ACC

AGC

ACA

CTG

ACC

ATC

AAA

960

Glu

Ser

Gly

Pro Thr Thr

Tyr

Lys

Val

Thr

Ser

Thr

Leu

Thr

Ile

Lys

2 90

295

300

GAG

AGC

GAC

TGG”CTC AGC

CAG

AGC

ATG

TTC

ACC

TGC

CGC

GTG

GAT

CAC

1008

Glu

Ser

Asp

Trp Leu Ser

Gin

Ser

Met

Phe

Thr

Cys

Arg

Val

Asp

His

305

310

315

AGG

GGC

CTG

ACC TTC CAG

CAG

AAT

GCG

TCC

TCC

ATG

TGT

GTC

CCC

GAT

1056

Arg

Gly

Leu

Thr Phe Gin

Gin

Asn

Ala

Ser

Ser

Met

Cys

Val

Pro

Asp

320

325

330

CAA

GAC

ACA

GCC ATC CGG

GTC

TTC

GCC

ATC

CCC

CCA

TCC

TTT

GCC

AGC

1104

Gin

Asp

Thr

Ala Ile Arg

Val

Phe

Ala

Ile

Pro

Pro

Ser

Phe

Ala

Ser

335

340

345

ATC

TTC

CTC

ACC AAG TCC

ACC

AAG

TTG

ACC

TGC

CTG

GTC

ACA

GAC

CTG

1152

Ile

Phe

Leu

Thr Lys Ser

Thr

Lys

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Thr

Asp

Leu

·· 4444

- 181 350

355

360

365

ACC ACC TAT GAC

AGC GTG Ser Val 370

ACC ATC TCC TGG ACC CGC

CAG AAT

GGC Gly 380

GAA Glu

1200

Thr

Thr

Tyr

Asp

Thr

Ile

Ser

Trp 375

Thr

Arg

Gin

Asn

GCT

GTG

AAA ACC

CAC

ACC

AAC

ATC

TCC

GAG

AGC

CAC

CCC

AAT

GCC

ACT

1248

Ala

Val

Lys

Thr

His

Thr

Asn

Ile

Ser

Glu

Ser

His

Pro

Asn

Ala

Thr

385

390

395

TTC

AGC

GCC

GTG

GGT

GAG

GCC

AGC

ATC

TGC

GAG

GAT

GAC

TGG

AAT

TCC

1296

Phe

Ser

Ala

Val

Gly

Glu

Ala

Ser

Ile

Cys

Glu

Asp

Asp

Trp

Asn

Ser

400

405

410

GGG

GAG

AGG

TTC

ACG

TGC

ACC

GTG

ACC

CAC

ACA

GAC

CTG

CCC

TCG

CCA

1344

Gly

Glu

Arg

Phe

Thr

Cys

Thr

Val

Thr

His

Thr

Asp

Leu

Pro

Ser

Pro

415

420

425

CTG

AAG

CAG

ACC

ATC

TCC

CGG

CCC

AAG

GGG

GTG

GCC

CTG

CAC

AGG

CCC

1392

Leu

Lys

Gin

Thr

Ile

Ser

Arg

Pro

Lys

Gly

Val

Ala

Leu

His

Arg

Pro

430

435

440

445

GAT

GTC

TAC

TTG

CTG

CCA

CCA

GCC

CGG

GAG

CAG

CTG

AAC

CTG

CGG

GAG

1440

Asp

Val

Tyr

Leu

Leu

Pro

Pro

Ala

Arg

Glu

Gin

Leu

Asn

Leu

Arg

Glu

450

455

460

TCG

GCC

ACC

ATC

ACG

TGC

CTG

GTG

ACG

GGC

TTC

TCT

CCC

GCG

GAC

GTC

1488

Ser

Ala

Thr

Ile

Thr

Cys

Leu

Val.

Thr

Gly

Phe

Ser

Pro

Ala

Asp

Val

465

470

475

TTC

GTG

CAG

TGG

ATG

CAG

AGG

GGG

CAG

CCC

TTG

TCC

CCG

GAG

AAG

TAT

1536

Phe

Val

Gin

Trp

Met

Gin

Arg

Gly

Gin

Pro

Leu

Ser

Pro

Glu

Lys

Tyr

480

485

490

GTG

ACC

AGC

GCC

CCA

ATG

CCT

GAG

CCC

CAG

GCC

CCA

GGC

CGG

TAC

TTC

1584

Val

Thr

Ser

Ala

Pro

Met

Pro

Glu

Pro

Gin

Ala

Pro

Gly

Arg

Tyr

Phe

495

500

505

GCC

CAC

AGC

ATC

CTG

ACC

GTG

TCC

GAA

GAG

GAA

TGG

AAC

ACG

GGG

GAG

1632

Ala

His

Ser

Ile

Leu

Thr

Val

Ser

Glu

Glu

Glu

Trp

Asn

Thr

Gly

Glu

510

515

520

525

ACC

TAC

ATC

TGC

GTG

GTG

GCC

CAT

GAG

GCC

CTG

CCC

AAC

AGG

GTC

ACC

1680

Thr

Tyr

Ile

Cys

Val

Val

Ala

His

Glu

Ala

Leu

Pro

Asn

Arg

Val

Thr

530

535

‘540

GAG

AGG

ACC

GTG

GAC

AAG

TCC

ACC

GGT

AAA

CCC

ACC

CTG

TAC

AAC

GTG

1728

Glu

Arg

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Thr

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Tyr

Asn

Val

545

550

555

TCC

CTG

GTC

ATG

TCC

GAC

ACA

GCT

GGC

ACC

TGC

TAC

TGA

17 67

Ser

Leu

Val

Met

Ser

Asp

Thr

Ala

Gly

Thr

Cys

Tyr

560

565

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 86:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

• · · • β

182 (A) DÉLKA: 588 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 86:

Met -19

Gly Trp

Ser

Trp -15

Ile

Phe

Leu

Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala

Gly

-10

-5

Val

His

Ser

Glu

Val

Gin

Leu

Val

Gin

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

Lys

1

5

10

Pro

Gly

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

15

20

25

Thr

Asp

Tyr

Asn

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

30

35

40

45

Glu

Trp

Met

Gly

Tyr

Ile

Tyr

Pro

Tyr

Asn

Gly

Gly

Thr

Gly

Tyr

Asn

50

55

60

Gin

Lys

Phe

Lys

Ser

Lys

Ala

Thr

Leu

Thr

Val

Asp

Asn

Ser

Ala

Ser

65

70

75

Thr

Ala

Tyr

Met

Glu

Leu

Ser

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

80

85

90

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Ser

Tyr

Tyr

Ala

Met

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

95

100.

105

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Gly

Ser.

Ala

Ser

Ala

Pro

Thr

Leu

Phe

110

115

120

125

Pro

Leu

Val

Ser

Cys

Glu

Asn

Ser

Pro

Ser

Asp

Thr

Ser

Ser

Val

Ala

130

135

140

Val

Gly

Cys

Leu

Ala

Gin

Asp

Phe

Leu

Pro

Asp

Ser

Ile

Thr

Phe

Ser

145

150

155

Trp

Lys

Tyr

Lys

Asn

Asn

Ser

Asp

Ile

Ser

Ser

Thr

Arg

Gly

Phe

Pro

160

165

'170

Ser

Val

Leu

Arg

Gly

Gly

Lys

Tyr

Ala

Ala

Thr

Ser

Gin

Val

Leu

Leu

175

180

185

Pro

Ser

Lys

Asp

Val

Meť

= Gln

Gly

Thr

Asp

Glu

Hi’š ‘

Val'

' Vál“

“ Cys

Lys

190

195

200

205

Val

Gin

His

Pro

Asn

Gly

Ašn

Lys

Glu

Lys

Asn

Val

Pro

Leu

Pro

Val

210

215

220

Ile

Ala

Glu

Leu

Pro

Pro

Lys

Val

Ser

Val

Phe

Val

Pro

Pro

Arg

Asp

225

230

235

Gly

Phe

Phe

Gly

Asn

Pro

Arg

Lys

Ser

Lys

Leu

Ile

Cys

Gin

Ala

Thr

240

245

250

Gly

Phe

Ser

Pro

Arg

Gin

Ile

Gin

Val

Ser

Trp

Leu

Arg

Glu

Gly

Lys

255

260

265

- 183 -

. Gin Val Gly ' 270

Ser Gly Val 275

Thr Thr Asp Gin

Val Gin Ala Glu Ala Lys

280

285

Glu

Ser

Gly

Pro

Thr

Thr

Tyr

Lys

Val

Thr

Ser

Thr

Leu

Thr

Ue

Lys

290

295

300

Glu

Ser

Asp

Trp

Leu

Ser

Gin

Ser

Met

Phe

Thr

Cys

Arg

Val

Asp

His

305

310

315

Arg

Gly

Leu

Thr

Phe

Gin

Gin

Asn

Ala

Ser

Ser

Met

Cys

Val

Pro

Asp

320

325

330

Gin

Asp

Thr

Ala

Ue

Arg

Val

Phe

Ala

Ue

Pro

Pro

Ser

Phe

Ala

Ser

335

340

345

Ue

Phe

Leu

Thr

Lys

Ser

Thr

Lys

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Thr

Asp

Leu

350

355

360

365

Thr

Thr

Tyr

Asp

Ser

Val

Thr

Ue

Ser

Trp

Thr

Arg

Gin

Asn

Gly

Glu

370

375

380

Ala

Val

Lys

Thr

His

Thr

Asn

Ue

Ser

Glu

Ser

His

Pro

Asn

Ala

Thr

385

390

395

Phe

Ser

Ala

Val

Gly

Glu

Ala

Ser

Ue

Cys

Glu

Asp

Asp

Trp

Asn

Ser

400

405

410

Gly

Glu

Arg

Phe

Thr

Cys

Thr

Val

Thr

His

Thr Asp

Leu

Pro

Ser

Pro

415

420

425

Leu

Lys

Gin

Thr

Ile

Ser

Arg

Pro

Lys

Gly

Val

Ala

Leu

His

Arg

Pro

430

435

440

445

Asp

Val

Tyr

Leu

Leu

Pro

Pro

Ala

Arg

Glu

Gin

Leu

Asn

Leu

Arg

Glu

450

455

460

Ser

Ala

Thr

Ue

Thr

Cys

Leu

Val

Thr

Gly

Phe

Ser

Pro

Ala

Asp

Val

465

470

475

Phe

Val

Gin

Trp

Met

Gin

Arg

Gly

Gin

Pro

Leu

Ser

Pro

Glu

Lys

Tyr

480

. *

—

-485

-------- .

—

- -

4-90

-* - -

......- -

Val

Thr

Ser

Ala

Pro

Met

Pro

Glu

Pro

Gin

Ala

Pro

Gly

Arg

Tyr

Phe

495

500

505

Ala

•His-

Ser

-Ile.

• Leu

Thr

Val

Ser-

Glu

Glu

-Glu

Trp

Asn

Thr·..

-Gly

Glu -

510

515

520

525

Thr

Tyr

Ue

Cys

Val

Val

Ala

His

Glu

Ala

Leu

Pro

Asn

Arg

Val

Thr

530

535

540

Glu

Arg

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Thr

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Tyr

Asn

Val

545

550

555

Ser

Leu

Val

Met

Ser

Asp

Thr

Ala

Gly

Thr

Cys

Tyr

5:60

565

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 87:

·· ··<·· ·· ···· ··

- 184 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1768 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA až mRNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ:1..1764 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: mat_peptid (B) UMÍSTĚNÍ:58..1764 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: sig_peptid (B) UMÍSTĚNÍ:!..57

(xi)

POPIS SEKVENCE:

SEQ ID NO: 87:

ATG

GGA

TGG

AGC

TGG

ATC

TTT

CTC

TTC

CTC

CTG

TCA

GGA

ACT

GCA

GGC

48

Met -19

Gly

Trp

Ser

Trp -15

Ile

Phe

Leu

Phe

Leu -10

Leu

Ser

Gly

Thr

Ala -5

Gly

GTC

CAC

TCT

GAG

GTG..

CAG- CTT.

GTG.

CAG

TCT

GGG

GCT

GAG

GTG

AAG

AAG

96

Val

His

Ser

Glu 1

Val

Gin.

Leu

Val. 5

Gin

Ser

Gly

Ala

Glu 10

Val

Lys

Lys

CCT

GGG

GCC

TCA

GTG

AAG

GTT

TCC

TGC

AAG

GCT

TCT

GGA

TAC

ACC

TTC

144

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Val 20

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser 25

Gly

Tyr

Thr

Phe

ACT

GAC

TAT

AAT

ATG

CAT

TGG

GTG

AAG

CAG

GCC

CAT

GGA

AAG

AGC

CTC .

192

Thr

Asp

Tyr

Asn

Met

His

Trp

Val

Lys

Gin

Ala

His

Gly

Lys

Ser

Leu

30

35

40

45

GAA

TGG

ATG

GGA

TAT

ATT

TAT

CCT

TAC

AAT

GGT

GGT

ACT

GGC

TAC

AAC

240

Glu

Trp

Met

Gly

Tyr 50

Ile

Tyr

Pro

Tyr

Asn 55

Gly

Gly

Thr

Gly

Tyr 60

Asn

CAG

AAG

TTC'

AAG“

“AGC

AAG

GCC

ACA

TTG’

ACT

GTT

GAC

AAT

TCC

GCG

AGC - -

288

Gin

Lys

Phe

Lys 65

Ser

Lys

Ala

Thr

Leu 70

Thr

Val

Asp

Asn

Ser 75

Ala

Ser

ACA

GCC

TAC

ATG

GAG

CTG

AGC

AGC

CTG

AGA

TCT

GAA

GAC

ACG

GCT

GTG

’ 336

Thr

Ala

Tyr 80

Met

Glu

Leu

Ser

Ser 85

Leu

Ařg

Ser

Glu

Asp 90

Thr

Ala

Val

TAT

TAC

TGT

GCG

AGA

AGT

TAC

TAT

GCT

ATG

GAC

TAC

TGG

GGC

CAG

GGA

384

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Arg

Ser

Tyr 100

Tyr

Ala

Met

Asp

Tyr 105

Trp

Gly

Gin

Gly

ACC

CTG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

GGG

AGT

GCA

TCC

GCC

CCA

ACC

CTT

TTC

432

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Gly

Ser

Ala

Ser

Ala

Pro

Thr

Leu

Phe

• · · · • ·

9

9 9

9

185

110

115

120

125

ccc Pro

CTC GTC Leu Val

TCC TGT

GAG AAT

TCC Ser

CCG Pro

TCG GAT ACG AGC AGC

GTG Val 140

GCC Ala

480

Ser

Cys 130

Glu

Asn

Ser Asp 135

Thr

Ser

Ser

GTT

GGC

TGC

CTC

GCA

CAG

GAC

TTC

CTT

CCC

GAC

TCC

ATC

ACT

TTC

TCC

528

Val

Gly

Cys

Leu

Ala

Gin

Asp

Phe

Leu

Pro

Asp

Ser

Ile

Thr

Phe

Ser

145

150

155

TGG

AAA

TAC

AAG

AAC

AAC

TCT

GAC

ATC

AGC

AGT

ACC

CGG

GGC

TTC

CCA

576

Trp

Lys

Tyr

Lys

Asn

Asn

Ser

Asp

Ile

Ser

Ser

Thr

Arg

Gly

Phe

Pro

160

165

170

TCA

GTC

CTG

AGA

GGG

GGC

AAG

TAC

GCA

GCC

ACC

TCA

CAG

GTG

CTG

CTG

624

Ser

Val

Leu

Arg

Gly

Gly

Lys

Tyr

Ala

Ala

Thr

Ser

Gin

Val

Leu

Leu

175

180

185

CCT

TCC

AAG

GAC

GTC

ATG

CAG

GGC

ACA

GAC

GAA

CAC

GTG

GTG

TGC

AAA

672

Pro

Ser

Lys

Asp

Val

Met

Gin

Gly

Thr

Asp

Glu

His

Val

Val

Cys

Lys

190

195

200

205

GTC

CAG

CAC

CCC

AAC

GGC

AAC

AAA

GAA

/ AAG

AAC

GTG

CCT

CTT

CCA

GTG

720

Val

Gin

His

Pro

Asn

Gly

Asn

Lys

Glu

Lys

Asn

Val

Pro

Leu

Pro

Val

210

215

220

ATT

GCC

GAG

CTG

CCT

CCC

AAA

GTG

AGC

GTC

TTC

GTC

CCA

CCC

CGC

GAC

768

Ile

Ala

Glu

Leu

Pro

Pro

Lys

Val

Ser

Val

Phe

Val

Pro

Pro

Arg

Asp

225

230

235

GGC Gly

TTC Phe

TTC Phe 240

GGC AAC Gly Asn

CCC Pro

CGC AAG Arg Lys 245

TCC AAG

CTC Leu

ATC TGC

CAG Gin

GCC Ala

ACG Thr

816

Ser

Lys

Ile

Cys 250

GGT

TTC

AGT

CCC

CGG

CAG

ATT

CAG

GTG

TCC

TGG

CTG

CGC

GAG

GGG

AAG

864

Gly

Phe

Ser

Pro

Arg

Gin

Ile

Gin

Val

Ser

Trp

Leu

Arg

Glu

Gly

Lys

255

260

265

CAG

GTG

GGG

TCT

GGC

GTC

ACC

ACG

GAC

CAG

GTG

CAG

GCT

GAG

GCC

AAA

912

Gin

Val

Gly

Ser

Gly

Val

Thr

Thr

Asp

Gin

Val

Gin

Ala

Glu

Ala

Lys

270

275

280

285

GAG

TCT

GGG

CCC

ACG

ACC

TAC

AAG

GTG

ACC

AGC

ACA

CTG

ACC

ATC

AAA

960

Glu

Ser

Gly

Pro

Thr

Thr

Tyr

Lys

Val

Thr

Ser

Thr

Leu

Thr

Ile

Lys

290

295

300’

GAG

AGC

GAC

TGG

CTC

AGC

CAG

AGC

ATG

TTC

ACC

TGC

CGC

GTG

GAT

CAC

1008

Glu

Ser

Asp

Trp

Leu

Ser

Gin

Ser

Met

Phe

Thr

Cys

Arg

Val

Asp

His

305

310

315

AGG

GGC

CTG

ACC

TTC

CAG

CAG

AAT

GCG

TCC

TCC

ATG

TGT

GTC

CCC

GAT

1056

Arg

Gly

Leu

Thr

Phe

Gin

Gin

Asn

Ala

Ser

Ser

Met

cys

Val

Pro

Asp

320

325

330

CAA

GAC

ACA

GCC

ATC

CGG

GTC

TTC

GCC

ATC

CCC

CCA

TCC

TTT

GCC

AGC

1104

Gin

Asp

Thr

Ala

Ile

Arg

Val

Phe

Ala

Ile

Pro

Pro

Ser

Phe

Ala

Ser

335

340

345

·· ···· ·· ···· ·· ·· • · · ·· · ···· e e · · · · ···· • · · φ · ·· β e · · · · ···· · · · · · ·

- 186 -

• ·

• ·

•

• · · ·

ATC

TTC

CTC

ACC

AAG

TCC

ACC

AAG

TTG

ACC

TGC

CTG

GTC

ACA

GAC

CTG

1152

Ile

Phe

Leu

Thr

Lys

Ser

Thr

Lys

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Thr

Asp

Leu

350

355

360

365

ACC

ACC

TAT

GAC

AGC

GTG

ACC

ATC

TCC

TGG

ACC

CGC

CAG

AAT

GGC

GAA

1200

Thr

Thr

Tyr

Asp

Ser

Val

Thr

Ile

Ser

Trp

Thr

Arg

Gin

Asn

Gly

Glu

370

375

380

GCT

GTG

AAA

ACC

CAC

ACC

AAC

ATC

TCC

GAG

AGC

CAC

CCC

AAT

GCC

ACT

1248

Ala

Val

Lys

Thr

His

Thr

Asn

Ile

Ser

Glu

Ser

His

Pro

Asn

Ala

Thr

385

390

395

TTC

AGC

GCC

GTG

GGT

GAG

GCC

AGC

ATC

TGC

GAG

GAT

GAC

TGG

AAT

TCC

1296

Phe

Ser

Ala

Val

Gly

Glu

Ala

Ser

Ile

Cys

Glu

Asp

Asp

Trp

Asn

Ser

400

405

410

GGG

GAG

AGG

TTC

ACG

TGC

ACC

GTG

ACC

CAC

ACA

GAC

CTG

CCC

TCG

CCA

1344

Gly

Glu

Arg

Phe

Thr

Cys

Thr

Val

Thr

His

Thr

Asp

Leu

Pro

Ser

Pro

415

420

425

CTG

AAG

CAG

ACC

ATC

TCC

CGG

CCC

AAG

GGG

GTG

GCC

CTG

CAC

AGG

CCC

1392

Leu

Lys

Gin

Thr

Ile

Ser

Arg

Pro

Lys

Gly

Val

Ala

Leu

His

Arg

Pro

430

435

440

445

GAT Asp

GTC Val

TAC Tyr

TTG Leu

CTG Leu 450

CCA Pro

CCA Pro

GCC Ala

CGG GAG CAG CTG AAC

CTG Leu

CGG Arg 460

GAG Glu

1440

Arg Glu 455

Gin

Leu

Asn

TCG

GCC

ACC

ATC

ACG TGC

CTG 'GTG

:acg

GGC

TTC

TCT

CCC

GCG

GAC

GTC

1488

Ser

Ala

Thr

Ile

Thr

Cys

Leu

Val

Thr

Gly

Phe

Ser

Pro

Ala

Asp

Val

465

470

475

TTC

GTG

CAG

TGG

ATG

CAG

AGG

GGG

CAG

CCC

TTG

TCC

CCG

GAG

AAG

TAT

1536

Phe

Val

Gin

Trp

Met

Gin

Arg

Gly

Gin

Pro

Leu

Ser

Pro

Glu

Lys

Tyr

480

485

490

GTG

ACC

AGC

GCC

CCA

ATG

CCT

GAG

CCC

CAG

GCC

CCA

GGC

CGG

TAC

TTC

1584

Val

Thr

Ser

Ala

Pro

Met

Pro

Glu

Pro

Gin

Ala

Pro

Gly

Arg

Tyr

Phe

495

500

505

GCC

CAC

AGC

ATC

CTG

ACC

GTG

TCC

GAA

GAG

GAA

TGG

AAC

ACG

GGG

GAG

1632

Ala

His

Ser

Ile

Leu

Thr

Val

Ser

Glu

Glu

Glu

Trp

Asn

Thr

Gly

Glu

510

515

520

525

ACC

TAC

ATC

TGC

GTG

GTG

GCC

CAT

GAG

GČČ

CTG

CCC

AAC

AGG

GTC

ACC

1680

Thr

Tyr

Ile

Cys

Val

Val

Ala

His

Glu

Ala

Leu

Pro

Asn

Arg

Val

Thr

530

535

540

GAG

AGG

ACC

GTG

GAC

AAG

TCC

ACC

GGT

AAA

CCC

ACC

CTG

TAC

AAC

GTG

1728

Glu

Arg

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Thr

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Tyr

Asn

Val

545

550

555

TCC

CTG

GTC

ATG

TCC

GAC

ACA

GCT

GGC

ACC

TGC

TAC

TGAT

1768

Ser

Leu

Val

Met

Ser

Asp

Thr

Ala

Gly

Thr

Cys

Tyr

560

565

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 88:

• · · ·

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 588 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 88:

Met -19

Gly

Trp

Ser Trp -15

Ile

Phe

Leu

Phe Leu -10

Leu Ser Gly

Thr

Ala -5

Gly

Val

His

Ser

Glu

Val

Gin

Leu

Val

Gin

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

Lys

1

5

10

Pro

Gly Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

15

20

25

Thr

Asp

Tyr

Asn

Met

His

Trp

Val

Lys

Gin

Ala

His

Gly

Lys

Ser

Leu

30

35

40

45

Glu

Trp

Met

Gly

Tyr

Ile

Tyr

Pro

Tyr

Asn

Gly

Gly

Thr

Gly

Tyr

Asn

50

55

60

Gin

Lys

Phe

Lys

Ser

Lys

Ala

Thr

Leu

Thr

Val

Asp

Asn

Ser

Ala

Ser

65

70

75

Thr

Ala

Tyr

Met

Glu

Leu

Ser

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

80

85

90

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Ser

Tyr.

Tyr

Ala

Met

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

95

100

105

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Gly

Ser

Ala

Ser

Ala

Pro

Thr

Leu

Phe

110

115

120

125

Pro

Leu

Val

Ser

Cys

Glu

Asn

Ser

Pro

Ser

Asp

Thr

Ser

Ser

Val

Ala

130

135

140

Val

Gly

Cys

Leu

Ala

Gin

Asp

Phe

Leu

Pro

Asp

Ser

Ile

Thr

Phe

Ser

- .

145

150

——

.15 5.

- - - -

Trp

Lys

Tyr

Lys

Asn

Asn

Ser

Asp

Ile

Ser

Ser

Thr

Arg

Gly

Phe

Pro

160

165

170

Ser

Val

Leu

Arg

Gly Gly

Lys

Tyr

Ala

„Ala

Thr

Ser

Gin.

Val

Leu

Leu

175

180

185

Pro

Ser

Lys

Asp

Val

Met

Gin

Gly

Thr

Asp

Glu

His

Val

Val

Cys

Lys

190

195

200

205

Val

Gin

His

Pro

Asn

Gly

Asn

Lys

Glu

Lys

Asn

Val

Pro

Leu

Pro

Val

210

215

220

Ile

Ala

Glu

Leu

Pro

Pro

Lys

Val

Ser

Val

Phe

Val

Pro

Pro

Arg

Asp

225

230

235

Gly

Phe

Phe

Gly

Asn

Pro

Arg

Lys

Ser

Lys

Leu

•Ile

Cys

Gin

Ala

Thr

240

245

250

- 188 -

• • • •

• • • 9 • ·

• 9 • · • • ·

• · 9 9 • · • 9 • ·

9 • 9 •

Gly

Phe

Ser

Pro

Arg

Gin

Ile

Gin

Val

Ser

Trp

Leu

Arg

Glu

Gly

Lys

255

260

265

Gin

Val

Gly

Ser

Gly

Val

Thr

Thr

Asp

Gin

Val

Gin

Ala

Glu

Ala

Lys

270

275

280

285

Glu

Ser

Gly

Pro

Thr

Thr

Tyr

Lys

Val

Thr

Ser

Thr

Leu

Thr

Ile

Lys

290

295

300

Glu

Ser

Asp

Trp

Leu

Ser

Gin

Ser

Met

Phe

Thr

Cys

Arg

Val

Asp

His

305

310

315

Arg

Gly

Leu

Thr

Phe

Gin

Gin

Asn

Ala

Ser

Ser

Met

Cys

Val

Pro

Asp

320

325

330

Gin

Asp

Thr

Ala

Ile

Arg

Val

Phe

Ala

Ile

Pro

Pro

Ser

Phe

Ala

Ser

335

340

345

Ile

Phe

Leu

Thr

Lys

Ser

Thr

Lys

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Thr

Asp

Leu

350

355

360

365

Thr

Thr

Tyr

Asp

Ser

Val

Thr

Ile

Ser

Trp

Thr

Arg

Gin

Asn

Gly

Glu

370

375

380

Ala

Val

Lys

Thr

His

Thr

Asn

Ile

Ser

Glu

Ser

His

Pro

Asn

Ala

Thr

385

390

395

.Phe

Ser

Ala

Val

Gly

Glu

Ala

Ser

Ile

Cys

Glu

Asp

Asp

Trp

Asn

Ser

400

405

410

Gly

Glu

Arg

Phe

Thr

Cys

Thr

Val

Thr.

His

Thr

Asp

Leu

Pro

Ser

Pro

415

420

425

Leu

Lys

Gin

Thr

Ile

Ser

Arg

Pro

Lys

Gly

Val

Ala

Leu

His

Arg

Pro

430

435

440

445

Asp

Val

Tyr

Leu

Leu

Pro

Pro

Ala

Arg

Glu

Gin

Leu

Asn

Leu

Arg

Glu

450

455

460

Ser

Ala

Thr

Ile

Thr

Cys

Leu

Val

Thr

Gly

Phe

Ser

Pro

Ala

Asp

Val

. - .

.4 65

470.

----- -

475-

—

Phe

Val

Gin

Trp

Met

Gin

Arg

Gly

Gin

Pro

Leu

Ser

Pro

Glu

Lys

Tyr

480

485

490

Val.

Thr

Ser

..Ala

Pro

Met

..Pro.

Glu

.Pro

Gin

Ala.,

...Pro,,

=Gly

Arg

Tyr

Phe

495

500

505

Ala

His

Ser

Ile

Leu

Thr

Val

Ser

Glu

Glu

Glu

Trp

Asn

Thr

Gly

Glu

510

515

520

525

Thr

Tyr

Ile

Cys

Val

Val

Ala

His

Glu

Ala

Leu

Pro

Asn

Arg

Val

Thr

530

535

540

Glu

Arg

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Thr

Gly

Lys

Pro

Thr

Leu

Tyr

Asn

Val

545

550

555

Ser

Leu'Val

Met

Ser

Asp

Thr

Ala

Gly Thr

Cys

Tyr

560 565 fy • · · · • ·

189 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 89:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 116 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 89:

Glu

Val

Gin

Leu

Gin

Gin

Ser

Gly

Pro

Glu

Leu

Val

Lys

Pro

Gly

Ala

1

5

10

15

Ser

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Asp

Tyr

20

25

30

Asn

Met

His

Trp

Val

Lys

Gin

Ser

His

Gly

Lys

Ser

Leu

Glu

Trp

Ile

35

40

45

Gly

Tyr

Ile

Tyr

Pro

Tyr

Asn

Gly

Gly

Thr

Gly

Tyr

Asn

Gin

Lys

Phe

50

55

60

Lys

Ser

Lys

Ala

Thr

Leu

Thr

Val

Asp

Asn

Ser

Ser

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Arg

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Ser

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Ser

Tyr

Tyr Ala.

Met

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Ser

Val

100

105

110

Thr Val Ser Ser

115 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 90:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 34 páru baží (B) TYP: nukleová kyselina

- (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý- -----(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 90:

GGGAATTCAT GGACTGGACC TGGAGGWTCC TYTT 34 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 91:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 32 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 91:

CCTCTAGAGG TTAGTTTGCA TGCACACACA GA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 92:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 112 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 92:

Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser. Leu Pro

Val

Ser

Leu 15

Gly

1

5

10

Asp

Gin

Ala

Ser 20

Ile

Ser.

Cys

Arg

Ser 25

Ser

Lys

Ser

Leu

Val 30

His

Ser

Asn

Gly

Asn 35

Thr

Tyr

Leu

His

Trp 40

Tyr

Leu

Gin

Lys

Pro 45

Gly

Gin

Ser

Pro

Lys 50

Leu

Leu

Ile

Tyr

Lys 55

Val

Ser

Asn

Arg

Phe 60

Ser

Gly

Val

Pro

Asp 65

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser 70

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp 75

Phe

Thr

Leu

Lys

Ile 80

Ser

Arg

Val

Glu

Ala 85

Glu

Asp

Leu

Gly

Val 90

Tyr

Phe

Cys

Ser

Gin 95

Ser

Thr

His

Val

Pro 100

Pro

Ala

Phe

Gly

Gly Gly 105'

Thr

Lys

Leu

Glu 110

Ile

Lys

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 93:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 34 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA • · ♦ · *

- 191 (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 93:

GCGAATTCTG CCTTGACTGA TCAGAGTTTC CTCA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 94:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 32 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii) (iv)	HYPOTETICKÁ: ne KÓDUJÍCÍ: ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 94:

GCTCTAGATG. AGGTGAAAGA·TGAGCTGGAG GA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 95:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 95:

CCTCGTCTCC TGTGAGAATT (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 96:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární • · • · • · · ·

192 • · (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 96:

ACTCTGACAT CAGCAGTACC (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 97:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 97:

ACGAACACGT GGTGTGCAAA 20 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 98:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne......

(iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 98:

AAGTCCAAGC TCATCTGCCA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 99:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží

193 (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 99:

TACAAGGTGA CCAGCACACT (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 100:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne - (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 100:

AATGCGTCCT CCATGTGTGT 20 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 101:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná”nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 101:

AGACCTGACC ACCTATGACA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 102:

• ·

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: - /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 102:

TCTGCGAGGA TGACTGGAAT 20 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 103:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná.nukleová kyselina (A). POPIS.:. /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 103:

ATGTCTACTT GCTGCCACCA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 104:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina ’ (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 104:

TTGTCCCCGG AGAAGTATGT • · 4 4·· •4 *· •4

4

444 4

195 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 105:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 105:

GTGTCCGAAG AGGAATGGAA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 106:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární .

(ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 106:

CTCAGTGAAG GTTTCCTGCA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 107:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 páru baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne ·· · ··· to· ··· ·

- 196 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 107:

AAAGGCTTGA GTGGATGGGA 20 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 108:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 108:

TGAGCAGCCT GAGATCTGAA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 109:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bázi.

(B) TYP: nukleová.kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 109:

GGTACTGCTG ATGTCAGAGT (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 110:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne ·« ···· ·· ····

- 197 - (xi) POPIS'SEKVENCE: SEQ ID NO: 110:

AATCACTGGA AGAGGCACGT (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 111:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 111:

TGGCAGATGA GCTTGGACTT (2) INFORMACE. PRO SEQ ID NO: 112:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:.

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 112:

AGCCAGTCGC TCTCTTTGAT (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 113:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA

198

(iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 113:

AGGAAGATGC TGGCAAAGGA 20 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 114:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 114:

TGGTGTGGGT TTTCACAGCT 20 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 115:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 115:

TTCCAGTCAT CCTCGCAGAT (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 116:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární • · · · • ·

9 9 9

9 99

9 9 9

199 • ·

(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii) (iv)	HYPOTETICKÁ: ne KÓDUJÍCÍ: ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 116:

TGGTGGCAGC AAGTAGACAT

2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 117:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii) (iv)	HYPOTETICKÁ: ne KÓDUJÍCÍ: ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 117:

ACATACTTCT CCGGGGACAA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 118:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ií) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne * - (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 118:

GTGTTCCATT CCTCTTCGGA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 119:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží

	(B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii) (iv)	HYPOTETICKÁ: ne KÓDUJÍCÍ: ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 119:

TTTACCGGTG GACTTGTCCA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 120:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY:.jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 120:

TATCCAGAAG CCTTGCAGGA 20 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 121:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 121:

TGTGTCCCTG GTAATGGTGA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 122:

• · · ·

- 201 -

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii) (iv)	HYPOTETICKÁ: ne KÓDUJÍCÍ: ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 122:

CTCGCACAGT AATACCACGC 20 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 123:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 123:

TATCCGACGG GGAATTCTCA 20 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 124:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 124:

TGTCTTCATC TTCCCGCCAT • · · · • 4

202 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 125:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý

------ (D) TOPOLOGIE: lineární .....

(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii) (iv)	HYPOTETICKÁ: ne KÓDUJÍCÍ: ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 125:

ACGCTGAGCA AAGCAGACTA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 126:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 126:

TCCAGTGGGG ATGTTGTGAT (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 127:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE’:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne • ·

- 203 -

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 127:

AGTGGGTCAG GCACTGATTT (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 128:

(i).CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: ..... (A) DÉLKA: 20 párů bázi ...... ’ (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 128:

TCTCCTGCAG GTCTAGTCAA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 129:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 129:

GGGTAACTCC CAGGAGAGTG 20 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 130:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne

- 204 -

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 130:

AGGGACCAAG GTGGAAATCA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 131:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární

(ii)	TYP MOLEKULY: (A) POPIS:	: jiná nukleová kyselina /desc = synthetic DNA
(iii) (iv)	HYPOTETICKÁ: KÓDUJÍCÍ: ne	ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 131:

TACTTTGGCC TCTCTGTGAT 20 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 132:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 132:

ACTTCGCAGG CGTAGACTTT (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 133:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:’ (A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA ·· ···· • ·

205

(iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 133:

TCTCCCCTGT TGAAGCTCTT (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 134:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii) (iv)	HYPOTETICKÁ: ne KÓDUJÍCÍ: ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 134:

TTAAAGCCAA GGAGGAGGAG (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 135:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA1
(iii) (iv)	HYPOTETICKÁ: ne KÓDUJÍCÍ: ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 135:

CTCCACCCTG CTGATTTTCA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 136:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární ···· ·· ··· · • · e

·· e

e

206 • · (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 136:

TGCAGCCACA GTACGTTTGA 20 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 137:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1869 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA až mRNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Homo sapiens (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 137:

ATGGACTGGA	CCTGGAGGAT	CCTCTTTTTG	GTGGCAGCAG	CCACAGGTGC	CCACTCCCAG	60
GTCCAACTTG	TGCAGTCTGG	GGCTGAGGTG	AAGAAGCCTG	GGGCCTCAGT	GAAGGTTTCC	120
TGCAAGGCTT	CTGGATACAC	CTTCACTACC	TATGCTATGC	ATTGGGTGCG	CCAGGCCCCC	180
GGACAAAGGC	TTGAGTGGAT	GGGATGGATC	AACGCTGGCA	ATGGTAACAC	AAAATATTCA	240
CAGAAGTTCC	AGGGCAGAGT	CACCATTACC	AGGGACACAT	CCGCGAGCAC	AGCCTACATG	300
GAGCTGAGCA	GCCTGAGATC	TGAAGACACG	GCTGTGTATT	ACTGTGCGAG	AGGCGAGGAG	360
ATGGGAGCTA	CTTCAGGTCC	CGGGCGGTAC	TACTTTGACT	ACTGGGGCCA	GGGAACCCTG	420
GTCACCGTCT	CCTCAGGGAG	TGCATCCGCC	CCAACCCTTT	TCCCCCTCGT	CTCCTGTGAG	480
AATTCCCCGT	CGGATACGAG	CAGCGTGGCC	GTTGGCTGCC	TCGCACAGGA	CTTCCTTCCC	540
GACTCCATCA	CTTTCTCCTG	GAAATACAAG	AACAACTCTG	ACATCAGCAG	CACCCGGGGC	600
TTCCCATCAG	TCCTGAGAGG	GGGCAAGTAC	GCAGCCACCT	CACAGGTGCT	GCTGCCTTCC	660
AAGGACGTCA	TGCAGGGCAC	AGACGAACAC	GTGGTGTGCA	AAGTCCAGCA	CCCCAACGGC	720
AACAAAGAAA	AGAACGTGCC	TCTTCCAGTG	ATTGCTGAGC	TGCCTCCCAA	AGTGAGCGTC	780
TTCGTCCCAC	CCCGCGACGG	CTTCTTCGGC	AACCCCCGCA	AGTCCAAGCT	CATCTGCCAG	840

	- 207 -	·· · • · • · • · • · · • ·	··· · · ···· • · · · • · · · • « · · · 9 9 9 9 99 99 9	• 9 9 9 9 9 9 9 99 9 9 9 9 9 9
GCCACGGGTT	TCAGTCCCCG	GCAGATTCAG	GTGTCCTGGC	TGCGCGAGGG	GAAGCAGGTG	900
GGGTCTGGCG	TCACCACGGA	CCAGGTGCAG	GCTGAGGCCA	AAGAGTCTGG	GCCCACGACC	960
TACAAGGTGA	CCAGCACACT	GACCATCAAA	GAGAGCGACT	GGCTCAGCCA	GAGCATGTTC	1020
ACCTGCCGCG	TGGATCACAG	GGGCCTGACC	TTCCAGCAGA	ATGCGTCCTC	CATGTGTGTC	1080
CCCGATCAAG	ACACAGCCAT	CCGGGTCTTC	GCCATCCCCC	CATCCTTTGC	CAGCATCTTC	1140
CTCACCAAGT	CCACCAAGTT	GACCTGCCTG	GTCACAGACC	TGACCACCTA	TGACAGCGTG	1200
ACCATCTCCT	GGACCCGCCA	GAATGGCGAA	GCTGTGAAAA	CCCACACCAA	CATCTCCGAG	1260
AGCCACCCCA	ATGCCACTTT	CAGCGCCGTG	GGTGAGGCCA	GCATCTGCGA	GGATGACTGG	1320
AATTCCGGGG	AGAGGTTCAC	GTGCACCGTG	ACCCACACAG	ACCTGCCCTC	GCCACTGAAG	1380
CAGACCATCT	CCCGGCCCAA	GGGGGTGGCC	CTGCACAGGC	CCGATGTCTA	CTTGCTGCCA	1440
CCAGCCCGGG	AGCAGCTGAA	CCTGCGGGAG	TCGGCCACCA	TCACGTGCCT	GGTGACGGGC	1500
TTCTCTCCCG	CGGACGTCTT	CGTGCAGTGG	ATGCAGAGGG	GGCAGCCCTT	GTCCCCGGAG	1560
AAGTATGTGA	CCAGCGCCCC	AATGCCTGAG	CCCCAGGCCC	CAGGCCGGTA	CTTCGCCCAC	1620
AGCATCCTGA	CCGTGTCCGA	AGAGGAATGG	AACACGGGGG	AGACCTACAT	CTGCGTGGTG	1680
GCCCATGAGG	CCCTGCCCAA	CAGGGTCACC	GAGAGGACCG	TGGACAAGTC	CACCGGTAAA	1740
CCCACCCTGT	ACAACGTGTC	CCTGGTCATG	TCCGACACAG	CTGGCACCTG	CTACTGACCC	1800
TGCTGGCCTG	CCCACAGGCT	CGGGGCGGCT	GGCCGCTCTG	TGTGTGCATG	CAAACTAACC	18 60

CGTGTCAAC 1869 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 138:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 891 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA až mRNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Homo sapiens (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 138:

TGCCTTGACT	GATCAGGACT	CCTCAGTTCA	CCTTCTCACA	ATGAGGCTCC	CTGCTCAGCT	60
CCTGGGGCTG	CTAATGCTCT	GGGTCCCAGG	ATCCAGTGGG	GATGTTGTGA	TGACTCAGTC	120
TCCACTCTCC	CTGCCCGTCA	TCCCTGGACA	GCCGGCCTCC	ATCTCCTGCA	GCTCTAGTCA	180

i • ·

	- 208 -	• · 9 9 9 · • · • · 99	···· ·· ···· • · · · • · · · • « · · · • · · · · ·· ·· ·	99 9 · • · • ··· • • 9
AGGCCTCGTA	TTCAGTGATG	GAAACACCTA	CGTGAATTGG	TTTCATCAGA	GGCCAGGCCA	240
ACCTCCAAGG	CGCCTAATTT	ATGAGGTTTC	TCACCGGGAC	TCTGGGGTCC	CAGACAGATT	300
CAGCGGCAGT	GGGTCAGGCA	CTGATTTCAC	ACTGAAAATC	AGCAGGGTGG	AGGCTGAGGA	360
TGTTGGGGTT	TATTACTGCA	TGCAAGGTAC	ACAGTGGCCG	TGGACGTTCG	GCCAAGGGAC	420
GAAGGTGGAA	ACCAAACGAA	CTGTGGCTGC	ACCATCTGTC	TTCATCTTCC	CGCCATCTGA	480
TGAGCAGTTG	AAATCTGGAA	CTGCCTCTGT	TGTGTGCCTG	CTGAATAACT	TCTATCCCAG	540
AGAGGCCAAA	GTACAGTGGA	AAGTGGATAA	CGCCCTCCAA	TCGGGTAACT	CCCAGGAGAG	600
TGTCACAGAG	CAGGACAGCA	AGGACAGCAC	CTACAGCCTC	AGCAGCACCC	TGACGCTGAG	660
CAAAGCAGAC	TACGAGAAAC	ACAAACTCTA	CGCCTGCGAA	GTCACCCATC	AGGGCCTGAG	720
CTCGCCCGTC	ACAAAGAGCT	TCAACAGGGG	AGAGTGTTAG	AGGGAGAAGT	GCCCCCACCT	780
GCTCCTCAGT	TCCAGCCTGA	CCCCCTCCCA	TCCTTTGGCC	TCTGACCCTT	TTTCCACAGG	840
GGACCTACCC	CTATTGCGGT	CCTCCAGCTC	ATCTTTCACC	TCATCTAGAG	C	891

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 139:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 40 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA” (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 139:

AGCCGGCCTC CATCTCCTGC AGATCTAGTA AGAGCCTTGT (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 140:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 40 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii) (iv)	HYPOTETICKÁ: ne KÓDUJÍCÍ: ne

· • · • ·

209 ··to··· • · · · • © ·· • ·· to ·· to· (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 140:

ACAAGGCTCT TACTAGATCT GCAGGAGATG GAGGCCGGCT40 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 141:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 40 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 141:

AAGTTTCCAA CCGATTTTCT GGGGTCCCAG ACAGATTCAG 40 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 142:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 40 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi)’ POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 142:

CTGAATCTGT CTGGGACCCC AGAAAATCGG TTGGAAACTT (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 143:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 50 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA'

4444 ··

210

444444

44 · 4 44

4· 4 ··

4 4 44

4

4'4

HYPOTETICKÁ: ne

KÓDUJÍCÍ: ne (xi)

POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 143

GGCTGAGGAT GTTGGGGTTT ATTACTGCTC TCAAAGTACA CATGTTCCTC 50 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 144:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 50 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 144:

GAGGAACATG TGTACTTTGA GAGCAGTAAT AAACCCCAAC ATCCTCAGCC 50 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 145:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 50 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 145:

GGCTGAGGAT GTTGGGGTTT ATTTCTGCTC TCAAAGTACA CATGTTCCTC 50 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 146:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 50 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) . TOPOLOGIE: lineární

211 ·· •· •4 •· •·

4·

4··· 44 ···· ····

4 4 · · · 4· • · 4 · · ··· • ··

44 (ii)

TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA

HYPOTETICKÁ: ne

KÓDUJÍCÍ: ne (xi)

POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 146:

GAGGAACATG TGTACTTTGA GAGCAGAAAT AAACCCCAAC ATCCTCAGCC (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 147:

CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 52 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární

TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) (iv)

HYPOTETICKÁ: ne

KÓDUJÍCÍ: ne

POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 147:

CTCAAAGTAC ACATGTTCCT CCGGCGTTCG GCCAAGGGAC CAAGGTGGAA

AT (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 148:

(i)

CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 52 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii)

TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA

HYPOTETICKÁ: ne

KÓDUJÍCÍ: ne

POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 148:

ATTTCCACCT TGGTCCCTTG GCCGAACGCC GGAGGAACAT GTGTACTTTG

AG (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 149:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 40 párů baží ·· ···· ·· ···· ··

- 212 - (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 149:

GGGCTCGAGT GCCTTGACTG ATCAGGACTC CTCAGTTCAC 40 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 150:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 150:
GGCCAGTCTC CAAGGCTCCT GATCTACAAA G	31
(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 151:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 31 páru baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii) (iv)	HYPOTETICKÁ: ne KÓDUJÍCÍ: ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 151:

CTTTGTAGAT CAGGAGCCTT GGAGACTGGC C (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 152:

213

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 152:

CCCTCTAGAC TAACACTCTC CCCTGTTGAA G 31 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 153:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 153:
CTGCTCTAAA AGCTGCGGAA	20
(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 154:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 20 párů baží
	(B) TYP: nukleová kyselina a ..... . _ ... (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne
(iv)	KÓDUJÍCÍ: ne
(xi)	POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 154:

TAGATCTGCA GGAGARGGAG ·· ···· ·· ····

- 214 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 155:

• (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý

- -------------(D) TOPOLOGIE: lineární-------**>

(ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 155:

TATGTTTCAG GTTCAGGGGG (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 156:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 40 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE.: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii) (iv)	HYPOTETICKÁ: ne KÓDUJÍCÍ: ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 156:

GGGCTCGAGC TAAGGGAATT CCGCCTCTCC TCAGACACTG (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 157:

: (i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 40 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii) (iv)	HYPOTETICKÁ: ne KÓDUJÍCÍ: ne

• · · · · · ·· ····

- 215 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 157:

GAACTGCAGG CGTCCACTCT GAGGTGCAGC TTGTGCAGTC 40 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 158:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

-------------- (A) DÉLKA: 40 párů bázi --- - (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární

(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina
	(A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne
(iv)	KÓDUJÍCÍ: ne
(xi)	POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 158:

GACTGCACAA GCTGCACCTC AGAGTGGACG CCTGCAGTTC 40 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 159:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 50 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 159:

AATATGCATA AATTCGAATG GATGGGATAT ATTTATCCTT ACAATGGTGG (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 160:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 50 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární

(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii) (iv)	HYPOTETICKÁ: ne KÓDUJÍCÍ: ne

- 216 -

4 ·		····	99 9999	99		99
•	•	•	9 9 4	9 9	9	9
e	•	9	• · β	9 9		ee
•	•	9 ·	• · 4	9 999	9	9
•	•	• ·	9 · 9	9	9	•
··		99	99 9	9 9		• 9

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 160:

CATCCATTCG AATTTATGCA TATTATAGTC AGTGAAGGTG TATCCAGAAG 50 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 161: ........ ' (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 40 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 161:

CCACATTGAC TGTTGACAAT TCCGCGAGCA CAGCCTACAT 40 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 162:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 40 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 162:

ATGTAGGCTG TGCTCGCGGA ATTGTCAACA GTCAATGTGG (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 163:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 40 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA ·· ···· ·· ···· ··

- 217 - (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 163:

GAAGTTACTA TGCTATGGAC TACTGGGGCC AGGGAACCCT

-------- 40------- 2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 164:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 40 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii) (iv)	HYPOTETICKÁ: ne KÓDUJÍCÍ: ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 164:

TAGTCCATAG CATAGTAACT. TCTCGCACAG TAATACACAG 40 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 165:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 39 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 165:

GGGCTCGAGG CCAAAGAGTC TGGGCCCACG ACCTACAAG (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 166:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární φφφφ

218 • · (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne

Φ Φ · ® • Φ ·· φ 5 · ·· ί · · ·φ • φ · · (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 166:

CTTGTAGGTC GTGGGCCCAG ACTCTTTGGC 30 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 167:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID.NO: 167:

GGGTCTAGAT CAGTAGCAGG TGCCAGCTGT G 31 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 168:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 60 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne ⁴ ” ~ (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 168:

TATGCATTGG GTGCGCCAGG CCCCCGGACA AGGACTCGAA TGGATGGGAT ATATTTATCC 60 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 169:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 60 párů baží • ·

219 - (B) TYP: nukleová kyselina (C) .TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ií) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne .....

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 169:
CGAGTCCTTG TCCGGGGGCC TGGCGCACCC AATGCATATT ATAGTCAGTG AAGGTGTATC	60
(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 170:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 60 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne
(iv)	KÓDUJÍCÍ: ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 170:

TATGCATTGG GTGAAGCAGG CCCATGGAAA GAGCCTCGAA TGGATGGGAT ATATTTATCC 60 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 171:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 60 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 171:

CGAGGCTCTT TCCATGGGCC TGCTTCACCC AATGCATATT ATAGTCAGTG AAGGTGTATC 60 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 172:

• · · · • ·

- 220 -

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 30 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA”
(iii) (iv)	HYPOTETICKÁ: ne KÓDUJÍCÍ: ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 172:

GAGCGACTGG CTCAGCCAGA GCATGTTCAC 30 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 173:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 173:

GTGAACATGC TCTGGCTGAG CCAGTCGCTC (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 174:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 36 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc - synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 174:

ACCTACATCT GCGTGGTGGC CCATGAGGCC CTGCCC • · • ·· · • ·

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 175:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 50 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA'
(iii) (iv)	HYPOTETICKÁ: ne KÓDUJÍCÍ: ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 175:

GGCCTCATGG GCCACCACGC AGATGTAGGT CTCCCCCGTG TTCCATTCCT 50 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 176:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 26 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární..

(ii) TYP MOLEKULY.: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 176:

GCTTTATTTG TAACCATTAT AAGCTG 26 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 177:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne • · · · • · · ·

- 222 -

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 177:

CTAGATCAGT AGCAGGTGCC AGCTGTGTCG (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 178:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

- (A) DÉLKA: 2 4 párů baží - (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární

(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii) (iv)	HYPOTETICKÁ: ne KÓDUJÍCÍ: ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 178:

CATAGTAACT TCTCGCACAG TAAT 24 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 179:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23: párů, baží (B) TYP: nukleová kyselina.

(C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý .

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 179:

GATACACCTT CACTGACTAT AAT (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 180:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 páru baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne

- 223 -

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 180:

□@ z—ή

CGTCGGATAC GAGCAGCGTG (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 181:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: ./desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 181:

CACCCCGCGA CGGCTTCTT (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 182:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA'
(iii) (iv)	HYPOTETICKÁ: ne KÓDUJÍCÍ: ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 182:

GGATCACAGG GGCCTGACCT (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 183:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina

- 224 (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii)' HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 183:

CTGTGAAAAC CCACACCAAC (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 184:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID.NO: 184:

GCTGAACCTG CGGGAGTCGG.

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 185:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 185:

GTGGCCCATG AGGCCCTGCC (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 186:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 37 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý • · ·· · · • *

I

225 (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 186:

GGGGAATTCC AGTACGGAGT TGGGGAAGAA GCTCTTT 37 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 187:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 35 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 187:

GTTTCTTCTG CCTCTGTCAC CAAGTTAGAT CTGGA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 188:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 35 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii) (iv)	HYPOTETICKÁ: ne KÓDUJÍCÍ: ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 188:

TCCAGATCTA ACTTGGTGAC AGAGGCAGAA GAAAC (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 189:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

• ·

- '226 -

(A) DÉLKA: 28 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne ' ' (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 189:

CCCTCTAGAC GGGTCACGTG GGCATCAC

Zastupuje:

Claims (43)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob výroby humanizované protilátky a jejích derivátů, obsahujících nejméně jedeýJn lehký řetězec a jeden těžký řetězec, vyznačující se tím, že se

   a) volí protilátka odlišného než lidského původu s obsahem alespoň jedné oblasti CDR,

   b) zvolí se těžký řetězec lidské protilátky,

   c) zvolí se lehký řetězec lidské protilátky,

   d) alespoň jedna oblast CDR z těžkého řetězce protilátky odlišné od lidského původu se uloží do těžkého řetězce lidské protilátky za vzniku rekombinantního těžkého řetězce a

   e) alespoň jedna oblast CDR z lehkého řetězce protilátky jiného než lidského původu se uloží do lehkého řetězce protilátky lidského původu za vzniku rekombinantního lehkého řetězce, přičemž lehký a těžký řetězec lidské protilátky se volí pouze na základě homologie sekvence s lehkým a těžkým řetězcem protilátky jiného než lidského původu.
2. 2. Způsob podle nároku .1, v y z nač ují c i s e t í m , že se z řetězce lidské protilátky odstraní oblasti CDR před uložením alespoň jedné oblasti CDR nebo jejího fragmentu z řetězce protilátky jiného než lidského původů.
3. 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačuj í cí se tím, že se lehký a těžký řetězec lidské protilátky vybírají na základě homologie sekvence aminokyselin.

   - 228 -

   4444 • ·

   * * * w • · · y e * * 4 e ♦ • 4 4 • 4 ♦ * 1 · * 4 · · · 9 99 · 4 · • · · • « • • 4 4 • • 9 4 • 4 4 ·
4. 4. Způsob podle některého z nároků 1 až 3, vyzná- • čujícísetím,žese homologie sekvencí stanoví v

   ._____________ pouze s. ohledem na rámcové oblastí ·. _____________ __
5. 5. Způsob podle některého z nároků 1 až 4, vyznačujíc í se tím, že se řetězce lidské protilátky vybírají na základě totožnosti alespoň 70 % amino- j kyselin v rámcových oblastech ve srovnání s řetězcem protilátky jiného než lidského původu.

   í'
6. 6. Způsob podle některého z nároků 1 až 5, vyznáĚ čující se tím, že se do příslušného řetězce lidské protilátky uloží celá oblast CDR z každého řetězce protilátky jiného nezlidského původu.
7. 7. Způsob podle některého z nároků 1 až 6, vyznačující se t í m, že se jako protilátka jiného než lidského původu užije myší protilátka CH11.
8. 8. Způsob podle některého z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že se jako lehký řetězec lidského původu užije lehký řetězec lidské protilátky RPMI641o'CL.
9. 9. Způsob podle některého z nároků 1 až 8, v y znač u jící se tím, že se jako těžký řetězec užije těžký řetězec lidské protilátky 21.28 CL.
10. 10. Způsob podle některého z nároků 1 až 9, vyznačující se t í m , že oblasti aminokyselin, odvozené od lidské protilátky jsou tvořeny alespoň většinou rámcových oblastí této protilátky.
11. 11. Způsob podle nároku 11, vyznačuj ící setím, že oblasti aminokyselin, odvozené od lidské protilátky dále obsahují konstantní oblast nebo její část.

    229
12. 12. Způsob podle některého nároku 1 až 11, v y značující se tím, že se do lidské protilátky uloží CDR jiného než 1idského původu spolu s ne jméně jedním významným zbytkem aminokyseliny nejméně jedné rámcové oblasti CDR jiného než lidského původu.
13. 13. Způsob podle nároku 12,vyznačující se tím, že se nejméně jeden významný zbytek aminokyselin zařazuje do rámcové oblasti jiného než lidského původu spolu s CDR v případě, že zbytek splňuje nejméně jedno z následujících kriterií:

    a) aminokyselina se v rámcové oblasti lidského akceptoru v uvedené poloze vyskytuje vzácně, kdežto odpovídající aminokyselina donoru se v této poloze akceptoru běžně vyskytuje,

    b) ve trojrozměrném modelu imunoglobulinu obsahuje aminokyselina v postranním řetězci atom, schopný vytvořit vazbu s antigenem nebo s oblastí CDR hzmanizované protilátky podle jednoho z kriterií i) a ii)

    i) podstranní řetězec je polární a je v menší vzdálenosti než 2,9 x 10^-^^ m od druhého polárního atomu nebo ii) atom postranního řetězce nese náboj a je ve vzdálenosti méně než 3.35 x 10 m od atomu s opačným nábojem, - ,

    c) aminokyselina je v poloze, která je jednou z určujících poloh pro strukturu kanonické oblasti CDR a

    d) aminokyselina je v poloze, která je ve styku s povrchem těžkého a lehkého řetězce.

    230
14. 14. Způsob podle nároku 13, vyznačuj í c í se t í m , že se polohy aminokyselin podle kriterií b) a d) stanoví pomocí modelování molekul.
15. 15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se t í m , že se polohy aminokyselin dále stanoví srovnáním s krystalografickými údaji pro další protilátky.

    iO

    Způsob podle nároku 15, vyznačuj i o i se t í m , že se aminokyselina z rámcové oblasti použije v případě, že její použitelnost je potvrzena modelováním molekul i krystalografickými údaji v rtg-záření.
16. 17. Protilátka, získaná způsobem podle některého z nároků 1 až 16.
17. 18. Protilátka podle nároku 17 s účinností proti Fas.
18. 19. Protilátka podle nároku 18, typu molekuly IgM s účinností proti Fas.
19. 20. Protilátka podle některého z nároků 17 až 19, typu IgM bez řetězce J.
20. 21. Protilátka podle některého z nároků 17 až 20, v níž lehký řetězec má sekvenci aminokyselin, definovanou SEQ ID No. 78 a těžký řetězec má sekvenci aminokyselin, definovanou SEQ ID No. 86.
21. 22. Protilátka podle některého z nároků 17 až 20, v níž lehký řetězec má sekvenci aminokyselin, definovanou SEQ ID No. 78 a těžký řetězec má sekvenci aminokyselin, definovanou SEQ ID No. 88.
22. 23. Protilátka podle některého z nároků 17 až 20, v níž lehký řetězec má sekvenci aminokyselin, definovanou

    - 231 -

    SEQ ID No. 80 a těžký řetězec má sekvenci aminokyselin definovanou SEQ ID No. 86.
23. 24. Protilátka podle některého z nároků 17 až 20, v níž lehký řetězec má sekvenci aminokyselin, definovanou SEQ ID No. 80, a těžký řetězec má sekvenci aminokyselin definovanou SEQ ID No. 88.
24. 25. Protilátka podle některého z nároků 17 až 20, v níž lehký řetězec má sekvenci aminokyselin, definovanou SEQ ID No. 82 a těžký řetězec má sekvenci aminokyselin, definovanou SEQ ID No. 86.
25. 26. Protilátka podle některého z nároků 17 až 20, v níž lehký řetězec má sekvenci aminokyselin, definovanou SEQ ID No. 82 a těžký řetězec má sekvenci aminokyselin, definovanou SEQ.ID No. 88.
26. 27. Protilátka podle některého z nároků 17 až 20, v níž lehký řetězec má sekvenci aminokyselin, definovanou SEQ ID No. 84 a těžký řetězec má sekvenci aminokyselin, definovanou SEQ ID No. 86.
27. 28. Protilátka podle některého z nároků 17 až 20, v níž lehký řetězec má sekvenci aminokyselin, definovanou SEQ ID No. 84 a těžký řetězec má sekvenci aminokyselin, definovanou SEQ ID No. 88.
28. 29. Kódová RNA pro protilátku podle některého z nároků 17 až 28.
29. 30. Kódová DNA pro protilátku podle některého z nároků 17 až 28.

    : ι .* : i. :

    ·« ·♦

    232
30. 31. DNA, hybridizující s DNA z nároku 30, s výhodou při 60 až 70 °C a v 6 x SSC.
31. 32. Vektor, obsahující DNA podle nároku 30 nebo 31.
32. 33. Vektor podle nároku 32, který je vektorem pro expresi.
33. 34. Vektor, zvolený z rekombinantních vektorů DNA ze Skupiny pHkKY2-58, pHkKF2-19, pHkRY2-10, pHkRF2-52, pH^uHB-l a pH/uMl-1.
34. 35. Hostitelská buňka, vyznačující se tím, že je transformována vektorem pro expresi podle některého z nároků 32 až 34.
35. 36 . E. coli ρΗκΚΥ2-58 (FERM BP-5861).
36. 37. E. co/í pHxKF2-19 (FERM BP-5860).
37. 38 . E. coli pHKRY2-10 (FERM BP-5859).
38. 39 . E. coli _PHkRF2-52 (FERM BP-5862).
39. 40 _: E. coli ρΗμΗ5-1 (FERM BP-5863).
40. 41. E. coli ρΗμΜΙ-1 (FERM BP-5864).
41. 42. Způsob výroby imunoglobulinového produktu, vyznačující se tím, že se pěstuje buňka podle některého z nároků 32 až 34 za podmínek, při nichž

    - 233 - může dojít k expresi kódové DNA pro řetězec H nebo řetězec L imunoglobulinu, uložené ve vektoru, načež se imunoglobulin z kultury izoluj'e.
42. 43. Použití protilátky podle některého z nároků 17 až 28 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení autoimunitních onemocnění.
43. 44. Použití podle nároku 43, při němž je autoimunitním onemocněním revmatismus.

    Zastupuje: