CZ98598A3 - Molekula protilátky proti FAS a způsob výroby - Google Patents

Description

Molekula protilátky proti Fas a způsob výroby

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká protilátek a jejich fragmentů, zvláště humanizovaných protilátek, rozpoznávajících antigen Fas, DNA kódující všechny části takové protilátky a prostředků s obsahem těchto protilátek pro léčení a/nebo prevenci stavů vznikajících v důsledku abnormalit v systému Fas/ligand Fas.

Dosavadní stav techniky

Fyziologická smrt buněk v živém organismu v přirozeném průběhu života je známa jako apoptóza a rozlišuje se od patologické smrti buněk, tj. nekrózy (Kerr a další, (1972), Br. J. Cancer, 26, 239 a dále).

Apoptóza je příklad naprogramované smrti buněk, tj. když jsou určité buňky předem naprogramovány zahynout v průběhu přirozeného života organismu, jako například když dotyčná buňka již splnila předem stanovenou úlohu. Apoptóza je charakterizována mj. morfologickými změnami, jako je zakřivený povrch buněk, kondenzovaný chromatin jádra a fragmentovaná chromozomální DNA.

Apoptóza má úlohu při diferenciaci lymfocytů (T buněk a B buněk) odstraňováním buněk, které rozpoznávají autoantigen. V této souvislosti bylo ukázáno, že 95 % nebo ještě více buněk, jako jsou buňky reagující s autoantigeny, je v thymu odstraněno v průběhu zrání T lymfocytů (Shigekazu Nagata, Tanpakushitsu Kakusan Koso (1993), 38, 2208 - 2218). Jestliže se tyto buňky neodstraní apoptózou, předpokládá se, že jsou příčinou autoimunního onemocnění v důsledku přítomnosti zralých autoreaktivních lymfocytů v systému (Nakayama a další (1995), Mebio, 12 (10), 79 - 86).

• · • · • · · · · · • · · • · · ·

-2 Byly identifikovány různé molekuly, které hrají úlohu v apoptóze, včetně: Fas (Yonehara, S., a další, (1989), J. Exp. Med., 169, 1747 1756); receptor tumorového nekrózního faktoru (Loetscher, H., a další, (1990), Cell, 61, 351 - 359); CD40 (Tsubata, T., a další, (1993), Nátuře, 364, 645 - 648); a perforin - granzym A (Jenne, D. E., a další, (1988), Immunol. Rev. 103, 53 - 71).

Fas je transmembránový protein přítomný na povrchu buněk a vázaje se svou extracelulární doménou na protein obecně známý jako „ligand Fas“, exprimovaný na povrchu dalších buněk, způsobuje apoptózu buněk exprimujících Fas. Abnormality v systému Fas/ligand Fas mají za následek různé poruchy tím, že nedochází k odstraňování buněk, které by mohly být škodlivé pro homeostázu a které by měly být odstraňovány apoptózou, nebo alternativně tím, že je apoptóza indukována u buněk, které jinak nejsou určeny pro odstranění a které by mohly být nezbytné pro udržování homeostázy. Takové poruchy jsou zde označovány jako poruchy v důsledku abnormalit systému Fas/ligand Fas.

Při rozvinutí nebo postupu onemocnění vznikajících v důsledku abnormalit systému Fas/ligand Fas dochází často k tomu stavu, že abnormální buňky exprimující Fas, které však nicméně nejsou odstraněny (abnormální buňky), buď napadají normální tkáně nebo buňky nebo jinak abnormálně proliferují a tím způsobují poruchy ve tkáních nebo buňkách, které naopak vedou k případným projevům onemocnění. V některých případech mohou tyto poruchy pocházet z nebo mohou znovu vzplanout v důsledku exprese Fas na abnormálních buňkách, čímž dojde ke stimulaci apoptózy u normálních tkání nebo buněk. Specifickými příklady onemocnění, která jsou přičítána abnormalitám systému Fas/ligand Fas jsou následující choroby.

......... .··, ,·*.

«··· · · · ···· . · ····· ···· • ···· ♦····♦· • · ·· · ··· • ·· · ··· ·· ··· ·· ··

- 3 Autoimunní onemocnění

Mnohokrát byly popisovány vazby mezi různými lidskými autoimunními onemocněními (choroba Hashimoto, systémová lupus erythematosus, Sjógrenův syndrom, zhoubná anémie, Addisonova choroba, na inzulínu závislá cukrovka, scleroderma, Goodpastureův syndrom, Crohnova choroba, autoimunní hemolytická anémie, sterilita, myastenia gravis, roztroušená skleróza, Basedowova choroba, purpura při trombopenii, revmatoidní artritida) a abnormalitami v systému Fas/ligand Fas.

U myší jsou známy různé genetické abnormality systému Fas/ligand Fas včetně Ipr (lymfoproliferace), gld (generalizované lymfoproliferativní onemocnění) a mutace lpr^C9 (kde gen Ipr je komplementem genu gld). Myši s těmito genetickými abnormalitami mají všechny různé autoimunní příznaky doprovázeny charakteristickým systémovým zduřením lymfatických uzlin.

Myš MRL-Ipr/lpr, myší model spontánní lidské systémové lupus erythematosus vykazuje znatelný přírůstek hmotnosti lymfatických uzlin a produkuje vlastní protilátky způsobující nefritidu v důsledku vytváření imunokomplexů. Uvažuje se, že k těmto patologickým příznakům dochází u myši v důsledku mutace genu Fas, čímž dojde k chybějící imunologické toleranci k antoantigenu v důsledku chybějící Fas - indukované apoptózy v periferním systému a v důsledku dlouhodobého hromadění aktivovaných autoreaktivních T buněk (Strasser, A., Nátuře, 373, 385 (1995).

U lidí bylo hlášeno několik případů včetně dvou pediatrických případů se zduřením lymfatických uzlin, hyper γ-globulinemií a vyznačeným vzrůstem počtu CD4CD8' T buněk (Sneller, MC., a další, (1992), J. Clin. Invest, 90, 334). U těchto příkladů se uvádělo, že jejich příčinou jsou abnormality v genu Fas (Fisher, G. H., a další, (1995), Cell, 81, 935; a Rieux-Laucat, F., a další (1995), Science, 268, 1347) a byly označeny jako autoimunní lymfoproliferativní syndrom • ·

-4 (ALPS). Na základě těchto objevů se předpokládá, že systém indukující apoptózu ovlivňovaný Fas je ve velké míře zapojen ve vytváření a udržování vlastní tolerance, a to nejen u myši, ale i u člověka, a poruchy tohoto systému indukují různé autoimunní choroby.

Je také známo, že autoimunní prvek má také revmatoidní artritida na základě skutečnosti, že velká většina T buněk pronikajících do postižených oblastí u pacientů s revmatoidní artritidou a způsobujících destrukci tkání exprimuje Fas (Hoa, T. T. M., a další, (1996), J. Rheumatol, 23, 1332 - 1337).

Mnoho případů na inzulínu závislé cukrovky vzniká v důsledku kritického zmenšení sekrece inzulínu v důsledku destrukce pankreatických β buněk autoreaktivními T buňkami. Eliminace autoreaktivních T buněk je tedy důležité při radikálním léčení určitých forem na inzulínu závislé cukrovky.

U onemocnění v důsledku ovlivnění hostitele štěpem, které se vyskytuje po transplantaci kostní dřeně, vzrůstá v postiženém orgánu exprese Fas a je zde přímá korelace mezi stupněm přírůstku exprese Fas a poškozením cílového orgánu (Chu, J. L., a další, (1995), J. Exp. Med., 181, 393). Při prevenci nebo léčení tohoto onemocnění je proto cílem blokovat apoptózu u buněk cílového orgánu a snižovat počet buněk napadajících cílový orgán.

Alergická onemocnění

Zánětlivé buňky účastnící se alergických onemocnění jsou normálně aktivovány a pronikají do místa poškození. Zánětlivé buňky se v poškození místně hromadí a mohou dlouhodobě fungovat, protože jejich doba života je prodloužena potlačením apoptózy. V experimentálním modelu s acidofilním zánětem dýchacích cest indukovaným u myši bylo ukázáno, že podávání protilátky anti-Fas, která má účinek indukující apoptózu dýchacími cestami, vede • ·

- 5 k přerušení invaze acidofilů pod sliznici, která je normálně vidět po inhalaci alergenu (Tsuyuki, S., a další, (1995), J. Clin. Invest., 96, 2924). Proto je možné zmírnit příznaky alergického zánětu indukcí apoptózy u zánětlivých buněk.

Revmatoidní artritida

Mimo autoimunní aspekt revmatoidní artritidy popisovaný výše je známo, že abnormálně proliferující synoviální buňky v poškozeních exprimují Fas (Hoa, T. T. M., a další, (1996), J. Rheumatol., 23, 1332). Apoptózu je možno indukovat stimulací synoviálních buněk z těchto poškození protilátkou anti-Fas s apoptózu indukujícím účinkem (Nakajima, T., a další, (1995), Arthr. Rheum., 38, 485). Jinými slovy, systém Fas/ligand Fas u pacientů s revmatoidní artritidou v ohniscích nemoci nefunguje správně a nejsou odstraňovány ani autoreaktivní T buňky ani abnormálně proliferující synoviální buňky, i když oba druhy exprimují Fas.

Arterioskleróza

Ačkoliv konečná diagnóza smrti buněk v centru arteriosklerotických poškození je nekróza, byla hlášena účast apoptózy při postupu degenerace (Kenji Harada (1997), Gendai Iryou, 29, 109). Elektronové mikroskopie poškození arteriosklerózou ukazují apoptózu buněk hladkých svalů, charakterizovanou kondenzací jader (Isner, J. M., a další, (1995), Circulation, 91, 2703). Dále bylo hlášeno, že pěnové buňky, kterými jsou makrofágy hromadící se ve vnitřní vrstvě artérie a obsahující lipidy v časných arteriosklerotických poškozeních, exprimují Fas a mají podléhat apoptóze přirozeně se vyskytujícími anti-Fas protilátkami indukujícími apoptózu (Richardson,

B. C., a další, (1994), Eur. J. Immunol., 24, 2640). Arteriosklerotická poškození jsou často spojena s pronikáním lymfocytů, což naznačuje možnost, že ligand Fas T buněk spolu s Fas makrofágů je odpovědný za řízení arteriosklerózy (Kenji Harada (1997), Gendai Iryou, 29, 109).

• ·

-6 Myokarditida a kardiomyopatie

Systém Fas/ligand Fas je pravděpodobně účasten na patogenezi autoimunního onemocnění srdce, jako je ischemická choroba srdeční, virové onemocnění srdce, kardiomyopatie s rozšířením srdce a chronická kardiomyopatie. Myokarditida je zánět srdečního svalu, o kterém se předpokládá, že je způsoben hlavně viry, jako je virus coxsackie a je pro něj typická bolest na prsou, arytmie, srdeční selhání nebo šok po příznacích podobných nachlazení. Kardiomyopatie je definována jako „onemocnění srdečního svalu neznámého původu“, ačkoliv se rovněž předpokládá, že je důsledkem virové infekce. Při studiích na modelech myší myokarditidy se srdečním selháním jsou pozorovány v srdci myši po inokulaci virem apoptotické buňky (jejichž důkazem je kondenzace a/nebo fragmentace jádra). V srdci myši se pozoruje také přírůstek exprese Fas, což vedlo ke spekulacím, že tento stav je důsledkem apoptózy indukované ligandem Fas odvozeným z infiltrujících zánětlivých buněk, převážně lymfocytů (Takehiko Yamada, a další, Gendai Iryou, (1977), 29, 119). Je známo, že apoptóza se indukuje u kultivovaných buněk srdečního svalu krysy ischemií současně se vzrůstem koncentrace mRNA kódující v buňkách Fas (Tanaka M., a další, (1994), Circ. Res. 75, 426).

Ledvinové choroby

U mnoha chronických onemocnění ledvin je důsledkem rekonstituce tkáně uvnitř glomerulů akumulace extracelulárních substrátů uvnitř glomerulů a tím podpora sklerózy glomerulů, která vede k patologické ztrátě filtračního účinku a nakonec ke chronickému selhání ledvin. Na modelu progresivní glomerulosklerózy vykazovaly sklerotické oblasti typický apoptotický vzhled, při pozorování elektronickým mikroskopem a pozoruje se přírůstek apoptózy v glomerulech souběžně s poklesem počtu glomerulárních buněk spojených s postupem sklerózy (Sugiyama H., a další, (1996), Kidney • · · ·

- 7 Int., 49, 103). Při akutní glomerulonefritidě je známo, že dojde ke zmírnění onemocnění apoptotickým snížením počtu abnormálně proliferovaných mesangiálních buněk (Shimizu A., a další, (1995), Kidney Int., 47, 114 a Baker A. J., a další, (1994), J. Clin. Invest., 94, 2105). Při onemocněních jako je purpura nephritis a lupus nephritis byl hlášen výrazný vzrůst počtu buněk exprimujících Fas (Takemura T., a další, (1995), Kidney Int., 48, 1886).

Hypoplastická anémie

Na povrchu hematopoetických prekurzorových buněk pacientů s hypoplastickou anémií je výrazně zvýšena exprese Fas ve srovnání s expresí u normálních jednotlivců, což ukazuje na vliv Fas na pokles počtu hematopoetických kmenových buněk u těchto pacientů (Maciejewski, J. P., a další, (1995), Br. J. Haematol., 91, 245).

Hepatitida

U fulminantní hepatitidy je známo, že v mnoha hepatocytech je indukována apoptóza. Silné odumírání hepatocytú podobné tomu, které se pozoruje u fulminantní hepatitidy, se pozoruje po intraperitoneálním podání protilátky anti-Fas Jo2 myši. Je proto pokládáno za pravděpodobné, že při patogenezi fulminantní hepatitidy má úlohu Fas-indukovaná apoptóza hepatocytú (Kamogawa, Y., a další, (1996), Molecular Medicine, 33, 1284; a Ogasawara, J., a další, (1993), Nátuře, 364, 806). Při imunohistochemických studiích byla pozorována zvýšená exprese Fas v cytoplazmě hepatocytú v oblastech vykazujících vysokou míru nekrózy hepatocytú, jako je tomu v poškozeních způsobených chronickou hepatitidou a na buněčné membráně hepatocytú poškození jaterními chorobami, jako je steatóza jater (Hiramatsu, N., a další, (1994), Hepatology, 19, 1354 a Takatani, M., a další, (1996), International Hepatology Commun., 4, 334).

• ; · ; ........

• ···· ······ · . · ·· · ··· ···· ··· ·· ··· ·· ··

- 8 Navíc je Fas exprimován v poškozeních chronické přetrvávající hepatitidy C a chronické aktivní hepatitidy, které obě vykazují disperzní zbarvení hepatocytů obklopených infiltrujícími lymfocyty, které jsou zřejmě cytotoxické T buňky (Mita, E., a další, (1994), Biochem. Biophys. Res. Commun., 204, 468). Cytotoxické T buňky mají indukovat apoptózu u infikovaných buněk přes ligand Fas exprimovaný na jejich povrchu. Podobně indukují apoptózu v normálních buňkách umístěných v blízkosti. Tento vliv na místní normální buňky, nazývaný bystander disorder, je důsledkem skutečnosti, že mnoho buněk v těle exprimuje Fas buď po jejich vlastní infekci nebo po infekci sousedících buněk. U případů chronické hepatitidy, kdy je hladina RNA odvozené od viru hepatitidy C po podání interferonu podstatně snížena, v takovéto tkáni výrazně poklesne exprese Fas.

Hepatocyty pacientů s akutní jaterní poruchou mají na svém povrchu zvýšené množství Fas a při styku s anti-Fas protilátkami indukující apoptózu podléhají apoptóze. Navíc u alkoholové hepatitidy je ligand Fas exprimován na samotných hepatocytech uvnitř pseudoacinu (Galle, P. R., a další, (1995), J. Exp. Med., 182, 1223). Při studiích zabývajících se hybridizací in šitu při genové expresi ligandů Fas byla nalezena exprese jak u lymfocytů infiltrujících játra v případech akutní jaterní poruchy, tak i u samotných hepatocytů v pseudoacinu v případech alkoholické cirrhózy Qako výše). Existuje tedy domněnka, že apoptóza je indukována rozdílným mechanismem v případě virové cirrhózy a v případě alkoholické cirrhózy, ale v obou případech je systém Fas/ligand Fas abnormální. Je známo, že v myším modelu hepatitidy je jaterní porucha inhibována podáním látky schopné inhibovat vazbu ligandů Fas na Fas (Kondo, T., a další, (1997), Nátuře Medicine, 3, 409).

• · · · • ·

Syndrom získané imunitní nedostatečnosti

Nedostatek imunity u pacientů infikovaných virem lidské imunodeficience (HIV) je alespoň částečně důsledkem odumírání apoptotických buněk početných imunitních buněk, které nejsou infikovány HIV. Pomocné T buňky při kontaktu s HIV zahynou. Protože růstový faktor z pomocných T buněk je nezbytný pro potlačování apoptózy u cytotoxických T buněk, odstranění pomocných T buněk vede k apoptóze cytotoxických T buněk. Pokládá se také za pravděpodobné, že apoptóza imunitních buněk u pacientů infikovaných HIV je důsledkem abnormalit v systému Fas/ligand Fas, což je založeno na pozorováních, že exprese Fas u periferních krevních lymfocytů pacientů infikovaných HIV dobře koreluje s patologickým postupem onemocnění (Dhein, J., a další, (1995), Behring Inst. Mitt., 96, 13 a McCIoskey, T. W., a další, (1995), Cytometry, 22, 111). Fas-pozitivní periferní krevní lymfocyty z neinfikovaných jedinců nepodléhají snadno apoptóze stimulací Fas, zatímco periferní krevní lymfocyty infikovaných pacientů podléhají v krátkém čase Fas-indukované apoptóze (Owen-Schaub, L. B., a další, (1992), Cell Immunol., 140, 197).

Odmítání po transplantaci orgánů

Odmítání po transplantaci orgánů má určitou podobnost s autoimunními onemocněními kromě toho, že transplantovaný orgán je napadán cytotoxickými T buňkami dárce. Je tedy možno očekávat zmírnění příznaků v případě, že může být potlačena funkce cytotoxických T buněk.

Pro výše vyjmenovaná onemocnění znamenají účinné prostředky pro jejich léčení odstranění abnormálních buněk (například autoreaktivních T buněk u autoimunitních onemocnění, pěnových buněk u arteriosklerózy, mesangiálních buněk u akutní glomerulonefritidy, infikovaných buněk u virových infekcí • · · · '·

- 10 a synoviálních buněk u revmatoidní artritidy) a/nebo ochrana normálních tkání nebo buněk.

Problém spočívá v tom, že prostředky, které jsou schopny pouze indukovat Fas-zprostředkovanou apoptózu budou s vysokou 5 pravděpodobností způsobovat poruchy normálních tkání i v případě odstranění normálních buněk. Na druhé straně buňky, které jsou schopny pouze inhibovat Fas-zprostředkovanou apoptózu nemohou eliminovat abnormální buňky, ačkoliv by mohly být schopny chránit normální buňky. Monoklonální protilátka Jo2 proti myší Fas má 10 například účinky indukující apoptózu, ale způsobuje u myši fulminantní hepatitidu (Ogasawara, J., a další, (1993), Nátuře, 364, 806 - 809).

Dosud není známa protilátka proti Fas, která by mohla být použita při léčení a/nebo prevenci některých z výše uvedených chorob, ale která by nebyla spojena s nežádoucími vedlejšími účinky.

Imunoglobulin G (IgG) je složen ze dvou lehkých polypeptidových řetězců (L řetězce), které mají oba molekulovou hmotnost přibližně 23 000 kD a dvou těžkých polypeptidových řetězců (H řetězce), které mají oba molekulovou hmotnost přibližně 50 000 kD. Řetězce H i L se skládají z opakující se oblasti konzervovaných

2o aminokyselin sestávající z přibližně 110 zbytků. Tato oblast se označuje v této specifikaci jako „doména“ a představuje základní trojrozměrnou strukturní jednotku IgG. Řetězce H a L se skládají ze čtyř, popřípadě dvou za sebou následujících domén.

Když se porovnávají aminokyselinové sekvence protilátky, 25 ukazuje se aminokoncová doména řetězců H i L variabilnější než jiné domény. Proto se označuje také jako „variabilní“ doména (V doména). V domény řetězců H a L se vzájemně spojují v důsledku jejich komplementární povahy, čímž v aminových koncích molekul IgG vytvářejí variabilní oblasti. Jiné domény se spojují za vytváření 3o konstantních oblastí. Konstantní oblasti sekvencí jsou pro dané druhy charakteristické. Například konstantní oblasti myšího IgG se odlišují

- 11 od konstantních oblastí lidského IgG a molekula myšího IgG je rozpoznávána lidským imunitním systémem jako cizí protein. Podávání molekuly myšího IgG člověku vede ke tvorbě lidské antimyší protilátky (dále označované jako „HAMA“ (Schroff a další, (1985), Cancer Res., 45, 879 - 885). Myší protilátka tedy nemůže být opakovaně podávána člověku. Pro účinné podávání musí být protilátka modifikována pro zabránění indukce odpovědi na HAMA při zachování specificity protilátky.

Údaje z rentgenové krystalografie ukazují, že složený imunoglobulin obecně tvoří dlouhou válcovou strukturu obsahující dvě vrstvy antiparalelních β-vrstev, která každá sestává ze tří nebo čtyř βřetězců. Ve variabilní oblasti se shlukují tři smyčky z každé V domény řetězců H a L za vytvoření vazebného místa pro antigen. Každá z těchto smyček je zakončena oblastí určující komplementaritu (CDR). CDR mají nejvyšší variabilitu v sekvenci aminokyselin. Části variabilní oblasti, které nejsou částmi CDR se nazývají rámcové oblasti „framework regions“ (oblasti „FR“) a obecně mají úlohu při udržování struktury CDR.

Kabat a spolupracovníci porovnávali primární sekvence řady variabilních oblastí řetězců H a L a identifikovali domnělé rámcové oblasti jednotlivých CDR, založené na konzervaci sekvence (E. A. Kabat a další, Sequences of immunological interest, 5. vydání, NIH Publication, No. 91 - 3242). Dále roztřídili rámcové oblasti do několika podskupin, které mají společné sekvence aminokyselin. Identifikovali také rámcové oblasti, které si odpovídají u sekvencí myši a člověka.

Studie strukturních vlastností molekul IgG vedly k rozvinutí metod pro přípravu humanizovaných protilátek, které nevyvolávají odpověď HAMA, jak bude popsáno dále.

První návrhy se zaměřovaly na přípravu chimérické protilátky spojením variabilní oblasti myší protilátky s konstantními oblastmi lidského původu (Morrison, S. L., a další, (1984), Proč. Nati. Acad.

•· · <«······ ···· · · ·· · • · ······· • · · · · ······· • · ·· ···· ·«·· ··· ·· ··♦·· ··

- 12Sci. USA, 81, str. 6851 - 6855). Taková chimérická protilátka však stále obsahuje mnoho zbytku aminokyselin, které nejsou lidského původu a tak mohou vyvolat odpověď HAMA, zvláště jestliže jsou podávány delší dobu (Begent a další, (1990), Br. J. Cancer, 62, str. 487 a dále).

Potom bylo navrženo vnesení samotných úseků CDR do lidské protilátky s cílem dále snížit počet aminokyselinových sekvencí, které nejsou lidského původu, způsobujících odpověď HAMA (Jones, P. T., a další, (1986), Nátuře, 321, 522 - 525). Vnesení štěpů částí CDR samotných se však ukázalo jako nedostatečné pro zachování účinnosti imunoglobulinu proti antigenu.

Na základě údajů z rentgenové krystalografie stanovili Chothia a spolupracovníci (Chothia a další, (1987), J. Mol. Biol., 196, 901 917), že:

1) CDR má oblast odpovědnou za vazbu antigenu a oblast, která se účastní zachování struktury samotné CDR. Možné trojrozměrné struktury CDR mohou být roztříděny do několika tříd s charakteristickými obrazy (kanonické struktury); a

2) třídy kanonických struktur jsou určeny nejen sekvencemi CDR, ale také povahou aminokyselin v určitých polohách rámcových oblastí.

Na základě těchto předpokladů bylo navrženo, že technika vnášení štěpů CDR by měla také zahrnovat vnášení štěpů určitých zbytků aminokyselin z rámcových oblastí do kostry lidské protilátky (Queen a další, International Patent Publication No. WO 90/07861).

V této souvislosti je protilátka ze savce jiného než člověk, ze kterého se CDR pro vnášení štěpů získávají, dále označována jako „donorová“ molekula. Lidská protilátka, do které se štěp CDR vnáší, se dále označuje jako „akceptorová“ molekula.

Při provádění vnášení štěpů CDR by měly být v ideálním případě struktury oblasti CDR konzervovány a měla by tak být ·« 99 λ 9 9 9 ·· ···· ·

• ···

999 9

9 · ·· ··· • · ··

999 9 9 • · 9

9 99 zachována účinnost molekuly imunoglobulinu. Mohou se tak uplatnit ještě následující faktory:

1) podskupina akceptoru; a

2) povaha zbytku aminokyselin, které byly převedeny z rámcových oblastí donoru.

Queen a další (mezinárodní publikovaná přihláška No. WO 90/07861) navrhují způsob rozhodování, zda má být zbytek aminokyseliny z donorové FR přenesen jako štěp spolu se sekvencí CDR. Podle tohoto způsobu se vnese do akceptoru štěp aminokyselinového zbytku z oblasti FR spolu se sekvencí CDR, jestliže zbytek splňuje alespoň jedno z následujících kritérií:

1) aminokyselina v lidské rámcové oblasti akceptoru se v této poloze u akceptoru nachází zřídka, zatímco odpovídající aminokyselina u donoru se ve stejné poloze akceptoru nachází obvykle

2) aminokyselina je umístěna těsně u jedné z CDR; a

3) aminokyselina má atom postranního řetězce umístěný ve vzdálenosti přibližně do 0,3 nm od CDR při posuzování na trojrozměrném modelu imunoglobulinu, a je potenciálně schopna interagovat s antigenem nebo CDR humanizované protilátky.

Dosud se však nikomu nepodařilo úspěšně získat humanizovanou Fas protilátku typu IgG, která by měla aktivitu indukující apoptózu.

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je tedy poskytnout protilátku proti Fas nebo podobnou molekulu, kterou je možno hodnotit na zvířecím modelu lidského onemocnění spojeného s Fas. Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout humanizovanou protilátku anti-Fas nebo podobnou molekulu, • φ ·· · · · ····· • · · · · φ ·· φφφφ ··· φφ φφφ ····

- 14 použitelnou při léčení a/nebo prevenci stavů vznikajících v důsledku abnormalit v systému Fas/ligand Fas.

V prvním hledisku tedy předkládaný vynález poskytuje molekulu s vazebnou oblastí specifickou pro epitop Fas, kde epitop je mezi primátem a zvířetem, kterým není primát, konzervován.

Ve druhém hledisku poskytuje předkládaný vynález molekulu s vazebnou oblastí specifickou pro společný savčí epitop Fas.

Předkládaný vynález dále poskytuje protilátku, tak jak je produkována hybridomem HFE7A s depozitním číslem FERM BP5828, stejně jako molekulu s alespoň šesti CDR protilátky, protilátku specifickou proti lidskému Fas, kde CDR jsou identické s CDR protilátky produkované hybridomem HFE7A s depozitním číslem FERM BP-5828.

Další předměty, cíle, hlediska a provedení předkládaného vynálezu budou zřejmé z následujícího textu.

Překvapující výhodou protilátky HFE7A podle předkládaného vynálezu je to, že je nejen schopna indukovat apoptózu u abnormálních buněk exprimujících Fas, ale že je také schopna inhibovat apoptózu u normálních buněk. Tato výhoda se obecně přenáší na humanizované protilátky anti-Fas podle předkládaného vynálezu.

Žádná ze známých monoklonálních protilátek, která se váže na lidský Fas a která má aktivitu indukující apoptózu, není schopna vázat se na myší Fas. Monoklonální protilátky, které se vážou na myší Fas jsou známy, ale žádná z nich se neváže na lidský Fas. Žádná ze známých protilátek anti-Fas nemůže být tedy hodnocena na myším modelu nemoci. Naopak protilátky HFE7A jsou schopny vyhodnocování na myším modelu nemoci a tím poskytují jak prostředky pro zajištění farmaceutické účinnosti, tak i zajišťují model pro výzkum úlohy Fas obecně.

• · · ·· ······ ·· ···· ······· • · · ····· ··· • · · · · · · ···· · • · ·· ···· • · · · ··· ·· ····· ··

- 15 Předpokládá se, že výhody protilátek podle předkládaného vynálezu vznikají v důsledku jejich schopnosti rozpoznávat konzervovaný epitop na antigenu Fas. Fas je společná molekula, ale druh od druhu se liší. Aniž by bylo třeba omezovat se teorií, předpokládá se, že existuje alespoň jedna konzervovaná oblast Fas, která je společná všem savcům, a která je nezbytná pro funkci Fas indukující apoptózu. Molekuly podle předkládaného vynálezu rozpoznávají konzervovaný epitop Fas. Z tohoto hlediska jestliže porovnáváme například myší a lidský Fas, dotyčný epitop nemusí být nezbytně absolutně shodný u těchto dvou molekul za předpokladu, že oblast, která váže epitop v molekule je schopna rozpoznávat oba tyto epitopy. Obecně však bude epitop přesně stejný.

Je známo mnoho protilátek proti Fas včetně protilátek schopných indukovat apoptózu, ale dosud nebyl získán žádný, který by se vázal na všechny druhy konvenční (consensus) sekvence. Protilátky podle předkládaného vynálezu se naopak na konvenční sekvenci vážou. Proti dosud známým teoretickým znalostem tedy působí protilátky podle předkládaného vynálezu namísto pouhého vyřazení z činnosti nebo interference generalizovanou vazbou na Fas, která může mít nebezpečné a nepředvídatelné účinky, jako je tomu u Jo2 a fulminantní hepatitidy u myší (výše) jako aktivní místo Fas, a tím napodobují přirozený ligand spíše než pouhou nespecifickou vazbu na antigen Fas.

Jestliže je lidským Fas imunizována normální laboratorní myš, jako například myš BALB/c, buňky produkující protilátky, které se vážou jak na lidský Fas, tak i na myší Fas, budou v thymu odstraněny normálním průběhem odstraňování autoreaktivních protilátek. Pro získání myší monoklonální protilátky, která působí proti epitopu konzervovanému mezi člověkem a myší, a která se tedy váže jak na lidský Fas, tak i myší Fas, je tedy nezbytné použít myši, u které bylo toto odstranění částečně nebo úplně vyřazeno z činnosti.

·· · · · · · · ··· ·· • · · · ··· · · · · • · · · ···· ··· • · ·· · ·· ···· · • · · · ·· · · ···· ··· ·· ··· ·· ··

- 16 Předpokládalo se, že při tomto procesu eliminace autoreaktivních T buněk v thymu, se účastní systém Fas/ligand Fas (Shin Yonehara (1994), Nikkei Science Bessatsu, 110, 66 - 77). Proto mohou být získány imunizací myší s mutací systému Fas/ligand Fas (taková myš se bude dále označovat jako „Fas knock-out mouše“ nebo „Fas/ligand Fas deficientní myš“) například takových myší, které nejsou schopny exprimovat gen kódující Fas, protilátky, které se vážou na myší Fas stejně jako na Fas člověka.

Dále se tedy poskytuje způsob získávání protilátky nebo molekuly podle vynálezu, který zahrnuje podávání imunogenně účinného množství látky obsahující imunogenní epitop heterologního Fas zvířeti, které není člověkem, které má alespoň částečnou deficienci apoptotické eliminace autoreaktivních T buněk a poté oddělení protilátek z takového zvířete.

Látkou nesoucí epitop Fas může být Fas samotný nebo může jít o jinou vhodnou látku, jako je například fuzní protein.

Volba vhodných protilátek spadá do rámce znalostí odborníka v oboru a její příklady jsou uvedeny níže. Zvláště je výhodné použít imunizovaného zvířete ze způsobu podle vynálezu pro získání alespoň jedné monoklonální protilátky, která se snadno získává s použitím v oboru známých metod.

Z důvodů snadné manipulace je také vhodné, jestliže je zvířetem odlišným od člověka myš, ačkoliv je možno použít i dalších hlodavců jako jsou králíci a jiná zvířata, obecně kozy a makakové, i když tyto systémy nejsou tak dobře charakterizovány jako myši. Bude také pravděpodobně výhodné, jestliže Fas použitý pro podávání bude lidský, ačkoliv v případě potřeby mohou být protilátky podle vynálezu získány i pro jiné savce. Je však obecně zřejmé, že v důsledku sdílení společného epitopu mají protilátky podle předkládaného vynálezu univerzální použití.

- 17 • · · · · · · ·· * · • · ··· ···· • · · · · · · ··· • · · · · · ···· · • · · · · · · • · · ·· · · · ·· ··

Z použití výše popsaného způsobu byl připraven hybridom, který produkuje novou monoklonální protilátku anti-Fas, která se váže jak na lidský, tak i myší Fas. Fas/ligand Fas deficientní myš byla imunizována lidským Fas a potom byly buňky sleziny fúzovány s myšími myelomovými buňkami a ze supernatantu kultury byly izolovány monoklonální protilátky.

Takto získaná nová monoklonální protilátka anti-Fas se ukázala jako účinná při zmírňování příznaků autoimunního onemocnění modelové myši. Navíc bylo ukázáno, že tato monoklonální protilátka anti-Fas neindukuje poruchy jater, které způsobovaly problémy dříve. Byly také klonovány a sekvenovány geny pro oba řetězce nové protilátky s cílem získat sekvence aminokyselin CDR. Pro uskutečnění produkce rekombinantní protilátky anti-Fas byly zkonstruovány expresní vektory, obsahující geny pro těžký a lehký řetězec. Bylo zjištěno, že rekombinantní protilátka získaná ze supernatantu kultury živočišných buněk kotransfekovaných těmito vektory, reaguje s Fas.

Takto získaná protilátka anti-Fas a její klony rekombinantní protilátky jsou schopny chránit játra před fulminantní Fas-indukovanou hepatitidou a je také účinná při prevenci a léčení revmatoidní artritidy.

Bylo tedy nyní ukázáno, že je možno snadno získat protilátky schopné jak indukovat apoptózu přes Fas v abnormálních buňkách, tak i inhibovat Fas-indukovanou apoptózu u normálních buněk a tyto protilátky jsou tedy účinné při prevenci a/nebo léčení onemocnění připisovaných abnormalitám systému Fas/ligand Fas.

Sekvence aminokyselin CDR od myši odvozené monoklonální protilátky anti-Fas byly vloženy do lidské protilátky a úspěšně byla získána rekombinantní protilátka, která nebyla imunogenní u člověka, ale stále měla vazebnou účinnost vůči Fas.

Předkládaný vynález dovoluje vytváření humanizovaných protilátek s minimálním rizikem indukce odpovědi HAMA při zachování požadované funkce protilátky.

• ·

- 18 Jak se zde používá, termíny „lidský“ a „humanizovaný“ v souvislosti s protilátkami se týkají jakýchkoli protilátek, u kterých se předpokládá, že vyvolají nízkou nebo žádnou imunogenní odezvu u lidského pacienta, ať už jde o jednotlivce nebo skupinu.

Je obecně výhodné, jestliže se do akceptorové protilátky vnese veškerá CDR z dané protilátky pro zachování vazebné oblasti epitopu Fas nebo epitopové vazebné oblasti, jak se bude dále obecně označovat. Mohou však být případy, kdy je vhodné nebo žádoucí vnést do donoru méně než celkové množství CDR; tyto případy jsou rovněž v rámci předkládaného vynálezu. Rozumí se také, že vnášení štěpu zahrnuje obecně náhradu jedné aminokyselinové oblasti za jinou, zbytek za zbytek. Je však také možno při převodu oblasti přidat nebo vynechat jeden nebo více zbytků podle potřeby, přičemž tyto delece a inzerce stejně jako vhodné náhrady a záměny spadají do rámce zkušeností odborníka v oboru.

Epitopová vazebná oblast podle předkládaného vynálezu je oblast molekuly, která odpovídá epitopové vazebné oblasti protilátky. Epitopová vazebná oblast nemusí být odvozena přímo z konkrétní protilátky nebo páru protilátek a nemusí zachovávat jakoukoliv konkrétní epitopovou vazebnou oblast. Jediný požadavek je, aby epitopová vazebná oblast zachovala rozpoznávací místo protilátky co se týče její schopnosti vázat se na antigen, v tomto případě epitop Fas. I když je epitopová vazebná oblast navržena s použitím CDR ze známé protilátky, jestliže se potom přenese do lidské protilátky, získaná epitopová vazebná oblast nemusí nezbytně odpovídat oblasti ze známé protilátky, ačkoliv je žádoucí velký stupeň podobnosti z hlediska zachování vazebné specificity.

Autoři vynálezu dávají zvláště přednost tomu, aby všechny CDR z nehumánní protilátky byly přeneseny do humánní protilátky. Dále je výhodné, aby do akceptorové protilátky (zde také označované jako lidská protilátka) byly vloženy určité oblasti rámcových oblastí

- 19 z důvodů zachování trojrozměrné struktury nehumánního vazebného místa. Takové úseky rámcových oblastí typicky zahrnují jednotlivé zbytky aminokyselin vybrané z hlediska jejich důležitosti (významné zbytky) podle dále uvedených doporučení. Pro přenos spolu s CDR jsou výhodné zvláště takové zbytky, které se zřídka vyskytují u člověka, ale které jsou běžné u odpovídající nehumánní protilátky a takové zbytky, které mají vysokou pravděpodobnost přímé interakce s epitopem nebo rozpoznávacím místem.

Při přenášení CDR do lidské protilátky se obvykle postupuje tak, že nehumánní CDR nahradí odpovídající humánní CDR ve svém celku, zvláště pokud mají obě oblasti stejnou délku. Může však také nastat případ, že se nahradí pouze část lidské CDR nebo se přenese pouze část nehumánní CDR, přičemž tyto dva způsoby obvykle probíhají současně.

Je také výhodné, jestliže se CDR z nehumánní protilátky obecně použijí pro náhradu odpovídajících CDR lidské protilátky. V takové situaci, kde se použije kostra lidského lehkého nebo těžkého řetězce, která má pouze místa pro vložení CDR, aniž by ve skutečnosti nesla CDR, platí podobné předpoklady.

Rozumí se také, že lidský těžký a lehký řetězec nemusí nezbytně pocházet ze stejné lidské protilátky a nemusí být ani stejných tříd. Důležité je to, aby sekvence zvoleného donoru souhlasila pokud možno co nejtěsněji se sekvencí nehumánní protilátky. Důležitost souhlasu dvou řetězců (lehký/lehký nebo těžký/těžký spočívá v tom, že výsledná protilátka by měla mít epitopovou vazebnou oblast co nejpodobnější epitopové vazební oblasti původní nehumánní protilátky pro zajištění co nejlepší vazby. Předkládaný vynález však rovněž zahrnuje možnost použití oblastí, které nejsou vzájemně nejpodobnější pokud je důvod očekávat, že výsledná rekombinantní protilátka bude sloužit požadovanému účelu.

• ·

- 20 Molekuly podle předkládaného vynálezu jsou s výhodou protilátky, ačkoliv to není nutné v tom případě, že epitopová vazebná oblast se váže na epitop Fas. Tak mohou být například připojena izolovaná a stabilizovaná vazebná místa na afinitní chromatografickou kolonu nebo může být součástí způsobu podávání adjuvantní nosná molekula, ke které se epitopové vazebné oblasti podle vynálezu připojují. Pro jednoduchost budou molekuly podle předkládaného vynálezu obecně označovány jako protilátky, ale toto označení bude zahrnovat všechny molekuly podle vynálezu, pokud nebude uvedeno jinak.

Kde je molekulou podle vynálezu protilátka, je zřejmé, je možno napodobit nebo použít jakýkoliv vhodný typ protilátky jako IgG, IgA, IgE a IgM, přičemž výhodný je obecně typ IgG.

Pokud se hovoří o molekulách a protilátkách, rozumí se také, že podobné úvahy platí i naopak o sekvencích nukleových kyselin, které je kódují tam, kde je to vhodné.

Nyní budou následovat některá výhodná provedení předkládaného vynálezu.

Je výhodné, jestliže se protilátka podle vynálezu váže na peptid obsahující sekvenci aminokyselin označenou jako SEQ ID No. 1 ve výpisu sekvencí.

Protilátkou je s výhodou IgG a výhodněji obsahuje polypeptid lehkého řetězce zvolený individuálně ze sekvence aminokyselin 1 až 218 SEQ ID No. 50, sekvence aminokyselin 1 až 218 SEQ ID No. 52, sekvence aminokyselin 1 až 218 SEQ ID No. 54, sekvence aminokyselin 1 až 218 SEQ ID No. 107 a sekvence aminokyselin 1 až 218 SEQ ID No. 109 výpisu sekvencí a protein polypeptidu těžkého řetězce s výhodou obsahuje sekvenci aminokyselin 1 až 451 SEQ ID No. 89 nebo sekvenci aminokyselin 1 až 451 SEQ ID No. 117 výpisu sekvencí.

• · • · · ·

- 21 Protilátka podle vynálezu má ve výhodném provedení lehký řetězec a těžký řetězec, přičemž těžký řetězec má následující obecný vzorec (I).

-FRHi-CDRHrFRHa-CDRHz-FRHa-CDRHa-FRHv (I) kde FRHi je jakákoliv sekvence aminokyselin složená z 18 až 30 aminokyselin, CDRHi znamená sekvenci definovanou v SEQ ID No. 2 ve výpisu sekvencí, FRH₂ znamená jakoukoliv sekvenci aminokyselin složenou ze 14 aminokyselin, CDRH₂ znamená sekvenci definovanou v SEQ ID No. 3 ve výpisu sekvencí, FRH₃ znamená jakoukoliv sekvenci aminokyselin složenou z 32 aminokyselin, CDRH₃ znamená sekvenci definovanou v SEQ ID No. 4 ve výpisu sekvencí, FRH₄ znamená jakoukoliv sekvenci aminokyselin složenou z 11 aminokyselin a každá aminokyselina se váže s jinou aminokyselinou, peptidovou vazbou, a lehký řetězec má následující obecný vzorec (II):

-FRL^CDRL^FRLz-CDRLz-FRL^CDRLa-FRL^ (II) kde FRLi je jakákoliv sekvence aminokyselin složená z 23 aminokyselin, CDRLi znamená sekvenci definovanou v SEQ ID No. 5 ve výpisu sekvencí, FRL₂ znamená jakoukoliv sekvenci aminokyselin složenou ze 15 aminokyselin, CDRL₂ znamená sekvenci definovanou v SEQ ID No. 6 ve výpisu sekvencí, FRL₃ znamená jakoukoliv sekvenci aminokyselin složenou z 32 aminokyselin, CDRL₃ znamená sekvenci definovanou v SEQ ID No. 7 ve výpisu sekvencí, FRL₄ znamená jakoukoliv sekvenci aminokyselin složenou z 10 aminokyselin a každá aminokyselina se váže s jinou aminokyselinou, peptidovou vazbou.

Vynález také poskytuje DNA a RNA kódující jakýkoliv z výše popsaných lehkých nebo těžkých řetězců polypeptidových proteinů. Výhodnější je DNA obsahující nukleotidovou sekvenci 100 až 753 SEQ ID No. 49, DNA obsahující nukleotidovou sekvenci 100 až 753 SEQ ID No. 51, DNA obsahující nukleotidovou sekvenci 100 až 753 SEQ ID

- 22 No. 53 a/nebo DNA obsahující nukleotidovou sekvenci 84 až 2042 SEQ ID No. 88 výpisu sekvencí.

Vynález dále poskytuje vektor rekombinantní DNA obsahující výše uvedenou DNA stejně jako hostitelskou buňku transformovanou 5 tímto vektorem. Hostitel je s výhodou transformován odděleným vektorem pro těžký a pro lehký řetězec, takže bude obvykle obsahovat dva vektory, ačkoliv předkládaný vynález také zahrnuje hostitele transformovaného jediným expresním vektorem kódujícím všechny exprimované sekvence. Tato hostitelská buňka je s výhodou buňka io savčí.

Výhodná provedení vynálezu představují bakterie E. coli pHSGMM6 SANK73697 (FERM BP-6071), E. coli pHSGHM17 SANK73597 (FERM BP-6072), E. coli pHSGHH7 SANK73497 (FERM BP-6073), E. coli pHSHM2 SANK70198 a E. coli pHSHH5 SANK70398 15 (FERM BP-6272), E. coli pgHSL7A62 (FERM BP-6274) SANK73397 (FERM BP-6074) a E. coli pgHPDHV3 SANK70298 (FERM BP-6273).

Předkládaný vynález také poskytuje způsob výroby humanizované protilátky anti-Fas, který zahrnuje kultivaci uvedených hostitelských buněk a izolaci humanizované protilátky anti-Fas 2o z kultury.

Dále se poskytuje prostředek pro prevenci nebo léčení onemocnění připisovatelných abnormalitám systému Fas/ligand Fas obsahující jako aktivní složku protilátku podle předkládaného vynálezu, zvláště pokud jsou tato onemocnění výše uvedených typů.

Prostředky jsou zaměřeny na autoimunní onemocnění (systémová lupus erythematosus, choroba Hashimoto, revmatoidní artritida, onemocnění způsobené reakcí hostitele na štěp, Sjógrenův syndrom, zhoubná anémie, Addisonova choroba, scleroderma, Goodpastureův syndrom, Crohnova choroba, autoimunní hemolytická anémie, sterilita,

3o myastenia gravis, roztroušená skleróza, Basedowova choroba, purpura při trombopenii, na inzulínu závislá cukrovka). Oddělené • · • · · ·

- 23 prostředky je možno také předpokládat pro následující onemocnění: alergie; revmatoidní artritida; arterioskleróza; myokarditida nebo kardiomyopatie; glomerulonefritis; hypoplastická anémie; hepatitida (fulminantní hepatitida, chronická hepatitida, virová hepatitida (hepatitida C, hepatitida B, hepatitida D) nebo alkoholická hepatitida); a odmítání po transplantaci orgánů.

Rámcové oblasti jsou přítomny ve variabilní oblasti podjednotky řetězce H nebo L molekuly imunoglobulinu. Například FRHi označuje rámcovou oblast umístěnou v nejvíce N-koncové poloze ve variabilní oblasti podjednotky H řetězce a FRL₄ označuje čtvrtou rámcovou oblast od N-konce variabilní oblasti podjednotky L řetězce. Podobně CDRHi označuje například CDR přítomnou v nejvíce N-koncové poloze ve variabilní oblasti podjednotky H řetězce a CDRL₃ označuje třetí CDR od N-konce variabilní oblasti podjednotky L řetězce. Oblasti FR obklopují oblasti CDR u každého lehkého nebo těžkého řetězce.

V jednom provedení může být získána monoklonální protilátka anti-Fas, vhodná pro přípravu humanizované protilátky anti-Fas podle předkládaného vynálezu, kultivací vhodného hybridomu, který může být naopak získán imunizací Fas/ligand Fas deficientní myši lidským Fas a následným fúzováním buněk sleziny myši s buňkami myšího myelomu.

Příprava monoklonální protilátky zahrnuje typicky následující kroky:

a) purifikace biomakromolekuly pro použití jako antigenu pro imunizaci;

b) příprava buněk produkujících protilátku po první imunizaci vhodného zvířete injekcemi antigenu, odběru krve zvířeti a stanovení titru protilátky pro určení doby, kdy má být odebrána slezina;

c) příprava myelomových buněk;

d) fúzování buněk produkujících protilátky a myelomových buněk;

e) selekce hybridomu produkujícího protilátky, o které se zajímáme;

• · ·

f) příprava jednobuněčného klonu (klonování);

g) popřípadě kultivace hybridomových buněk nebo růst zvířat, do kterých byly hybridomové buňky transplantovány pro výrobu monoklonální protilátky ve velkém měřítku; a

h) testování biologických účinků a specificity nebo stanovení vlastností týkajících se markérů takto připravené monoklonální protilátky.

V následujícím textu se podrobněji popisuje obecný postup pro přípravu monoklonální protilátky anti-Fas v souladu s výše uvedenými kroky. Je však zřejmé, že tento způsob představuje pouze jednu cestu pro přípravu vhodné protilátky a je možno postupovat dalšími postupy, jako například použitím jiných buněk produkujících protilátku než jsou buňky sleziny a jiných buněčných linií než je linie myelomová.

a) Příprava antigenu

Rekombinantní protein (dále označovaný jako „rekombinantní lidský Fas“) účinný jako antigen Fas je možno získat transfekováním opičí buněčné linie COS-1 expresním vektorem pME18S-mFas-AIC, který kóduje fuzní protein obsahující extracelulární doménu lidského Fas a extracelulární doménu myšího receptoru interleukinu-3 (IL3RNishimura, Y., a další, (1995), J. Immunol., 154, 4395 - 4403) a izolací a částečným čištěním expresního produktu. Plazmid phFas-AIC2 byl zkonstruován vložením DNA kódující lidský Fas a myší fuzní protein IL3R do plazmidu pME18S, který je expresním vektorem pro živočišné buňky. Jak je uvedeno výše, použité materiály jako například DNA kódující Fas, vektor a hostitel nejsou omezeny na uvedené příklady.

Výsledný fuzní protein lidského Fas a IL3R, dále označovaný jako rekombinantní lidský Fas, který byl izolován z kultivačního supernatantu transformovaných buněk COS-1, je možno částečně purifikovat vhodným způsobem, jako například iontoměničovou chromatografií s použitím kolony Resource Q™ firmy Pharmacia.

• * · · · · • · · · ··· · ··· • · · · · ·· ···· · • · · · · ··· ···· ··· ·· ··· ·· ··

-25 Jako vhodná alternativa může být purifikovaný Fas získaný z buněčných membrán lidských buněčných linií použit jako antigen. Dále, protože je známa primární struktura Fas (Itoh, N., a další, (1991), Cell, 66, 233 - 243), může být chemicky syntetizován vhodnou metodou a použit jako antigen peptid obsahující vhodnou část aminokyselinové sekvence lidského Fas, jako například SEQ ID No. 1 výpisu sekvencí.

b) Příprava buněk produkujících protilátku

Experimentální zvíře se imunizuje imunogenem vyprodukovaným v kroku a) ve vhodné směsi s adjuvans, jako je Freundovo kompletní nebo nekompletní adjuvans a kamenec. V daném případě je vhodným experimentálním zvířetem Fas/ligand Fas deficientní myš, kterou je možno vytvořit způsobem podle Senju a dalších (Senju, S., a další, (1996), Intemational Immunology, 8, 423).

Vhodné cesty podávání pro imunizaci myši zahrnují subkutánní, intraperitoneální, intravenózní, intradermální a intramuskulární injekce, přičemž výhodné jsou subkutánní a intraperitoneální injekce.

Imunizace může probíhat použitím jedné dávky nebo výhodněji několika opakovanými dávkami ve vhodných intervalech (s výhodou 1 až 5 týdnů). Imunizované myši jsou monitorovány na aktivitu protilátky anti-Fas v jejich séru a zvířata s dostatečně vysokým titrem protilátky se vyberou jako zdroj buněk produkujících protilátku. Volba zvířete s vysokým titrem činí následující postup efektivnější. Buňky pro následnou fúzi se obecně sklízí ze zvířete 3 až 5 dnů po poslední imunizaci.

Mezi způsoby pro testování titru protilátek patří různé v oboru známé metody jako je radioimunologický test (RIA), enzymatický imunologický test na pevné fázi (ELISA), test fluorescenční protilátkou a pasivní test hemaglutinace, přičemž stanovení RIA a ELISA jsou z důvodu citlivosti, rychlosti, a možnosti automatizace výhodné.

	-26 -	• · · ·· ···· ·· • · · · ··· · · • · ····· · · « · · · · · · · · · • · · · · · ···· ··· ·· ··· ·♦
Stanovení	titru protilátky	může být	například	provedeno
metodou ELISA	následujícím	způsobem.	Nejprve	se čištěný

a částečně purifikovaný Fas adsorbuje na povrch pevné fáze, jako je 96-jamková destička ELISA a zbývající povrch, na který se Fas nenavázal, se blokuje proteinem, který není příbuzný s antigenem, jako je bovinní sérový albumin (BSA). Po promytí se povrchy jamek přivedou do styku se sériově naředěnými vzorky testovaných preparátů protilátky (například myšího séra) pro umožnění navázání protilátky anti-Fas ve vzorcích na antigen. Přidá se enzymaticky značená antimyší protilátka jako sekundární protilátka pro vazbu na myší protilátku. Po promytí se přidá substrát pro enzym a anti-Fas vazebnou aktivitu je potom možno testovat určením velikosti vhodné změny, jako je například změna absorbance v důsledku vyvinutí barvy.

c) Příprava myelomových buněk

Jako zdroj myelomových buněk slouží obecně buňky ze zavedených myších buněčných linií. Mezi vhodné buněčné linie patří: myší myelomové kmeny rezistentní na 8-azaguanin (odvozené zBALB/c) P3X63Ag8U.1 (P3-U1) (Yelton, D. E., a další, Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1 - 7, (1978), P3/NSI/1Ag4-1 (NS-1) (Kohler, G., a další, European J. Immunology, 6, 511 519 (1976), Sp2PO-Ag14 (SP-2) (Shulman, M., a další, Nátuře, 276, 269 - 270 (1978), P3X63Ag8-653 (653) (Kearney, J. F., a další, J. Immunology, 123, 1548 - 1550 (1979) a P3X64Ag8 (X63) (Horibata, K. a Harris, A. W., Nátuře, 256, 495 - 497 (1975). Vybraná buněčná linie se sériově převede do vhodného média, jako je 8-azaguaninové médium (médium RPMI-1640 doplněné glutaminem, 2merkaptoethanolem, gentamycinem, fetálním telecím sérem (FCS) a 8azaguaninem), lscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) nebo Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM). Buňky se pak převedou do normálního média jako je médium ASF104 (Ajinomoto, K. K.) • · • · · ·

-27 s obsahem 10 % hmotnost/objem FCS 3 až 4 dny před fúzí pro zajištění počtu alespoň 2 x 10⁷ životaschopných buněk v den fuze.

d) Buněčná fuze

Buňky produkující protilátku použité při fúzi jsou buňky plazmy a jejich prekurzorové buňky lymfocyty, které mohou být získány z jakékoliv vhodné části zvířete. Typické oblasti jsou slezina, lymfatické uzliny, periferní krev nebo jejich vhodná kombinace, přičemž běžně se nejvíce používají buňky sleziny.

Po poslední injekci zesilující účinek se z myši s předem stanovenou velikostí titru protilátky odstraní tkáň, ve které jsou přítomny buňky produkující protilátku, jako je slezina, pro přípravu protilátku produkujících buněk. V dnešní době se dává přednost způsobu fuze buněk sleziny s myelomovými buňkami připravenými v kroku c), který používá polyethylenglykolu, který má relativně nízkou cytotoxicitu a postup fuze je jednoduchý. Dále se uvádí příklad tohoto způsobu.

Buňky sleziny a myelomové buňky se dobře promyjí bezsérovým médiem (jako je RPMI 1640) nebo fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (PBS) a potom smísí, takže poměr počtu buněk sleziny k myelomovým buňkám je přibližně mezi 5 : 1 a 10 : 1 a zcentrifugují. Po slití supernatantu a dostatečném uvolnění usazených buněk se přidá po kapkách za míchání vhodné množství, obvykle 1 ml, bezsérového média obsahujícího 50 % (hmotnost/objem) polyethylenglykolu (molekulová hmotnost 1000 až 4000). Potom se pomalu přidá 10 ml bezsérového média a směs se centrifuguje. Supernatant se opět slije a usazené buňky se suspendují ve vhodném množství média HAT (roztok hypoxantinu, aminopterinu a thymidinu (tyto tři sloučeniny jsou společně také známy jako „HAT“) a myšího interleukinu 2 (IL-2). Suspenze se potom rozplní do jamek na kultivačních destičkách (dále označované také jednoduše jako • · • · · ·

-28„destičky“) a inkubuje se v přítomnosti 5 % objemových CO₂ při 37 °C po dobu přibližně dvou týdnů, přičemž se v případě potřeby provádí přídavek doplňkového média HAT.

e) Selekce hybridomů

Jestliže je použitý myelomový kmen rezistentní na 8-azaguanin, tzn. je deficientní na hypoxantinguaninfosforibosyltransferázu (HGPRT), všechny nefuzované myelomové buňky a případy fúzí myelom - myelom jsou neschopny v médiu HAT přežít. Na druhé straně fuze buněk produkujících protilátku navzájem stejně jako hybridomy buněk produkujících protilátku s myelomovými buňkami mohou přežít, přičemž první z nich mají pouze omezenou dobu života. Pokračující inkubace v médiu HAT tedy vede k selekci pouze požadovaných hybridomů.

Vzniklé hybridomy se potom pěstují do vytvoření kolonií v médiu HAT bez aminopterinu (médium HT). Potom se odeberou alikvoty kultivačního supernatantu pro stanovení titru anti-Fas protilátky například metodou ELISA. Když se použije jako antigenu ELISA výše uvedeného rekombinantního fuzního proteinu lidského FAS, je také nezbytné odstranit klony produkující protilátku, která se specificky váže na extracelulární doménu myšího receptorů IL3. Přítomnost nebo nepřítomnost takového klonu je možno například prokázat použitím ELISA využívající myšího receptorů IL3 nebo jeho extracelulární domény jako antigenu.

I když je výše uvedený postup selekce ukázán na příkladu buněk rezistentních na 8-azaguanin, je zřejmé, že je možno použít jiných buněčných linií s vhodnými selekčními markéry a s vhodnou modifikací použitého média.

f) Klonování • ·

Hybridomy, které se ukázaly jako produkující protilátky specifické proti Fas použitím podobné metody jako byla popsána v kroku b) pro stanovení titru protilátky, se potom převedou na další destičku pro klonování. Vhodné způsoby klonování zahrnují: metodu limitního zředění, při které se hybridomy naředí až na obsah jedné buňky na jamku nebo destičku a potom kultivují; metoda měkkého agaru, při které se získají kolonie po kultivaci v měkkém agarovém médiu; použití mikromanipulátoru pro oddělení jednotlivé buňky pro kultivaci; a metoda „sort-a-clone“, při které se jednotlivé buňky oddělí zařízením pro třídění buněk. Obecně nejjednodušší a běžně používanou metodou je metoda limitního zředění.

Ať už se zvolí jakákoliv metoda klonování, opakuje se pro každou jamku 2 až 4 x spolu se stanovením titru protilátky a klony se stabilními titry protilátky se vyberou jako hybridomy produkující monoklonální protilátku anti-Fas. Hybridomy produkující antimyší protilátku Fas se selektují podobným způsobem za získání buněčné linie produkující monoklonální protilátku anti-Fas. Vhodný myší Fas použitelný k tomuto účelu je například fuzní protein exprimovaný kulturními živočišnými buňkami transfekovanými expresním vektorem pME18S-mFas-AIC. Tento plazmid obsahuje DNA kódující fuzní protein obsahující extracelulární doménu myšího Fas a extracelulární doménu myšího receptorů IL3 (Nishimura, A., a další, (1995),

J. Immunol., 154, 4359 - 4403). Jinými zdroji myšího Fas jsou purifikovaný myší Fas a buňky exprimující myší Fas na svém povrchu.

Výše popsaným způsobem byl selektován hybridom myš - myš HFE7A. Specifický způsob jeho přípravy se popisuje v příkladové části. HFE7Aje buněčná linie produkující monoklonální protilátku antiFas vhodnou jako základ při přípravě humanizované protilátky antiFas podle předkládaného vynálezu, která byla uložena ve sbírce Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo, 19. 2. 1997, v souladu s Budapešťskou smlouvou o ukládání mikroorganismů pod ·· · ·· ···· ·· »· «··· ··· ·«·· » · ····· ···· • · ·· · · · ·»· · · • · · · · · · · ···· ··· ·· *·· ·· ·*

- 30 depozitním číslem FERM BP-5828. Při přípravě protilátky s použitím hybridomu myš - myš HFE7A může být tedy příprava provedena podle postupu počínaje krokem g) níže s vynecháním kroku a) až f) výše.

g) Kultivace hybridomu pro přípravu monoklonální protilátky

Hybridom získaný v předcházejících krocích se potom kultivuje v normálním médiu a nikoliv v médiu HT. Kultivace ve velkém měřítku je možno provádět kultivací v otáčivé láhvi, s použitím velkých kultivačních láhví nebo rotační kulturou. Supernatant z kultivace ve velkém měřítku se potom sklidí a purifikuje vhodným způsobem, např. gelovou filtrací, která je odborníkům v oboru dobře známa za získání monoklonální protilátky anti-Fas. Hybridom může také růst intraperitoneálně u syngenní myši, jako je například myš BALB/c nebo myš Nu/Nu za získání ascitické kapaliny obsahující anti-Fas monoklonální protilátku ve velkém množství. Pro purifikaci sklizených protilátek je možno pohodlně využít komerčně dostupných kitů pro purifikaci monoklonální protilátky, například kitu MAbTrap Gll Kit; Pharmacia.

Výše připravené monoklonální protilátky, které byly vybrány na specificitu proti lidskému a myšímu Fas mají vysokou specificitu proti oběma těmto antigenům.

h) Stanovení monoklonální protilátky

Stanovení izotypu a podtřídy takto získané monoklonální protilátky může být provedeno následujícím způsobem. Vhodné způsoby identifikace zahrnují Ouchterlonyho metodu, ELISA a RIA. Ouchterlonyho metoda je jednoduchá, ale vyžaduje zakoncentrování používaných roztoků v případě nízké koncentrace monoklonální protilátky. Naopak při použití metody ELISA nebo RIA může reagovat kultivační supernatant přímo s antigenem adsorbovaným na pevné fázi a se sekundárními protilátkami specifickými pro různé izotypy «· « ·· *··*·« ·· ···· · * · · · ·♦ • · · · ··· ·· ·· • · · · · · · ··· ·· • · ·· · · ·· ···· »«e ·» ·»·'· ··

- 31 imunoglobulinů a podtřídy imunoglobulinů pro identifikaci izotypů a podtřídy monoklonální protilátky. Obecně je však výhodné použít komerčního identifikačního kitu, jako je například Mouše Typer Kit™, BioRad.

Kvantifikaci proteinů je možno provádět metodou Folin-Lowryho, například použitím výpočtu založeného na absorbanci při 280 nm (při OD₂₈₀ = 1,4 je koncentrace imunoglobulinů 1 mg/ml).

Identifikace epitopu Fas, který monoklonální protilátka rozpoznává, může být provedena následujícím způsobem. Nejprve se připraví různé částečné struktury Fas. Částečné struktury je možno připravit synteticky například syntézou oligopeptidů, nebo in vivo použitím vhodného hostitele, jako je E. coli, který byl transformován vhodným vektorem obsahujícím DNA kódující požadované fragmenty. Oba způsoby se často užívají v kombinaci pro identifikaci epitopu rozpoznávaného vazebnou oblastí epitopu. Je například možné připravit technikami genetického inženýrství dobře známými odborníkům v oboru řadu polypeptidů s vhodně redukovanými délkami, přičemž se postupuje od C- nebo N-konce proteinu antigenu. Zjištěním, které fragmenty reagují s protilátkou je možno získat přibližnou představu o epitopovém místě.

Epitop je možno blíže identifikovat syntézou řady malých oligopeptidů odpovídajících částem nebo mutantům peptidu nebo peptidů rozpoznávaných protilátkou. Syntéza oligopeptidů se obecně používá pro přípravu menších fragmentů. Identifikaci epitopu je potom možno provést studiem vazby nebo studiem kompetitivní inhibice s rekombinantním lidským fuzním proteinem Fas, například v testu ELISA. Pro získání velkého množství různých polypeptidů je možno pohodlně použít komerčně dostupné kity, jako například SPOTs Kit (Genosys Biotechnologies, lne.) a řady kitú pro syntézu peptidů založených na metodě „multipin synthesis method“ (Chiron Corp.).

• ·

• ···· · · · · • · · · ···· · • · · · · · • · · · · ·· · ·

DNA kódující těžké a lehké řetězce monoklonální protilátky antiFas připravené výše může být získána přípravou mRNA z hybridomových buněk produkujících monoklonální protilátku anti-Fas přeměnou mRNA na cDNA reverzní transkripcí a potom izolací DNA kódující těžké a/nebo lehké řetězce protilátky. Tato DNA může být potom použita pro vytváření humanizované protilátky anti-Fas podle předkládaného vynálezu.

Extrakci mRNA je možno například provádět způsobem využívajícím guanidium thiokyanátu a horkého fenolu nebo guanidium thiokyanátu a guanidium hydrochloridu, ale výhodná je metoda využívající guanidinium thiokyanátu a chloridu česného. Příprava mRNA z buněk se obecně provádí tak, že se nejprve připraví celková RNA a potom se mRNA z celkové DNA oddělí s použitím purifikační matrix poly(A)⁺ RNA, jako je oligo(dT) celulóza a oligo(dT) latexové kuličky. Alternativně je možno připravit mRNA přímo z buněčného lyzátu použitím takového matrix. Metody pro přípravu celkové RNA zahrnují: centrifugaci v alkalickém gradientu hustoty sacharózy (Dougherty, W. G. a Hiebert, E., (1980), Virology, 101, 466 - 474); metodu guanidinium thiokyanát - fenol; metodu guanidinium thiokyanát - trifluorcesium; a metodu fenol - SDS. Výhodná v současnosti používaná metoda využívá guanidinium thiokyanátu a chloridu česného (Chirgwin, J. M., a další, (1979), Biochemistry, 18, 5294 - 5299).

Takto získaná poly(A)⁺ RNA může být použita jako templát při reverzní transkripci pro přípravu jednořetězcová cDNA ((ss) cDNA). (ss) cDNA získaná použitím reverzní transkriptázy jak se popisuje výše pak může být převedena na dvouřetězcovou (ds) cDNA. Vhodné metody pro získání ds cDNA zahrnují S1 nukleázovou metodu (Efstratiadis, A., a další, (1976), Cell, 7, 279 - 288), GublerHoffmanovu metodu (Gubler, U. a Hoffman, B. J., (1983), Gene, 25, 263 - 269) a Okayama-Bergovu metodu (Okayama, H. a Berg, P.,

- 33 (1982), Mol. Cell. Biol., 2, 161 - 170). V současnosti výhodně používané metody však využívají polymerázové řetězové reakce (PCR - Saiki, R. K., a další, (1988), Science, 239, 487 - 491) s použitím jednořetězcové cDNA jako templátu. Výhodný postup se označuje „RT-PCR“ a obsahuje reverzní transkripci a PCR.

Získaná ds cDNA může být potom integrována do klonovacího vektoru a výsledný rekombinantní vektor může potom být použit pro transformaci vhodného mikroorganismu, jako je E. coli. Selekci transformanta je možno provádět s použitím standardní metody, jako je selekce rezistencí na tetracyklin nebo ampicilin kódovaná rekombinantním vektorem. Jestliže se použije E. coli, je možno transformaci provádě Hanahanovou metodou (Hanahan, D., (1983), J. Mol. Biol., 166, 557 - 580). Alternativně je možno zavádět rekombinantní vektor do kompetentních buněk připravených současnou expozicí chloridu vápenatému a buď chloridu hořečnatému nebo chloridu rubidnéhu. Jestliže se jako vektor použije plazmid, je velmi žádoucí, aby nesl gen rezistence na léčivo jak je například uvedeno výše pro umožnění selekce. Použití hrubého selekčního tlaku je možné, ale ne výhodné. Ačkoliv bylo diskutováno použití plazmidů, je zřejmé, že je možno použít jiných klonovacích prostředků, jako jsou fágy lambda.

Pro selekci transformantů pro získání těch, které nesou cDNA kódující podjednotku protilátky proti lidskému Fas je možno použít různé metody, které se například uvádějí dále. Jestliže se cDNA specificky amplifikuje metodou RT-PCR, tyto kroky je možno vynechat.

(1) Screening polymerázovou řetězovou reakcí

Jestliže byla zjištěna celá aminokyselinová sekvence požadovaného proteinu nebo její část, je možno syntetizovat kódující a nekódující oligonukleotidové primery odpovídající odděleným nesousedním částem aminokyselinové sekvence. Těchto primerů je · ··· ··· · · · · • · · ···· · ··· • · ·· · · · ···· ·

QA · · ·· · ···

- □*+ “ 999· ··· ·· ··· ·· ·· potom možno použít při polymerázové řetězové reakci (Saiki, R. K., a další, (1988), Science, 239, 487 - 491) pro amplifikací požadovaného fragmentu DNA kódující podjednotku myší monoklonální protilátky proti lidskému Fas. Templátová DNA použitá při PCR může být například cDNA syntetizovaná reverzní transkripcí z mRNA hybridomu produkujícího monoklonální protilátku proti lidskému Fas HFE7A (FERM BP-5828).

Takto syntetizovaný fragment DNA může být buď přímo integrován do plazmidového vektoru například použitím komerčního kitu nebo může být označen například ³²P, ³⁵S nebo biotinem a potom použit jako sonda pro hybridizaci kolonií nebo plaků pro získání požadovaného klonu.

DNA kódující každou podjednotku monoklonální protilátky proti lidskému Fas může být sklizena z příslušných transformantů získaných výše popsaným způsobem dobře známými způsoby, například jak se popisuje v Maniatis, T., a další v „Molecular Cloning A Laboratory Manual“ Cold Spring Harbor Laboratory, NY, (1982). Oblast DNA kódující požadovanou podjednotku může být vyříznuta z plazmidové DNA po oddělení frakce odpovídající DNA vektoru z transformanta, o kterém bylo zjištěno, že nese požadovaný plazmid.

(2) Screening s použitím sondy syntetického oligonukleotidu

Jestliže byla zjištěna celá aminokyselinová sekvence požadovaného proteinu nebo její část, může být použita při konstrukci oligonukleotidové sondy krátká sousedící sekvence, která také představuje požadovaný protein. Sonda kóduje sekvenci aminokyselin, ale v důsledku degenerace genetického kódu je možno připravit větší počet sond. Normálně se tedy zvolí sekvence aminokyselin, která může být kódována pouze omezeným počtem oligonukleotidů. Počet oligonukleotidů, který je nezbytné vytvořit, může být dále snížen substitucí inosinu v místech, kde může být

• · · · · · · • ···« · ··· • · · ·· ···· · • · · · · · • «···· · · ·· použita jakákoliv ze čtyř normálních bází. Sonda se potom vhodně označí např. ³²P, ³⁵S nebo biotinem a potom se hybridizuje s denaturovanou transformovanou DNA z transformanta, který byl imobilizován na nitrocelulózovém filtru. Pozitivní kmeny se zviditelní detekcí markéru na sondě.

Kde je to vhodné, mohou být sekvence DNA sekvenovány různými v oboru známými způsoby včetně například Maxam-Gilbertova způsobu chemické modifikace (Maxam, A. M. a Gilbert, W. (1980) v „Methods in Enzymology“ 65, 499 - 276) a dideoxy metodou zakončení řetězce s použitím fága M13 (Messing, J. a Vieira, J. (1982), Gene, 19, 269 - 276). V posledních letech nalezla široké použití další metoda sekvenování DNA, která využívá namísto běžného radioizotopu při dideoxy metodě fluorogenního barviva. Celý postup je automatizován pomocí počítače včetně čtení nukleotidové sekvence po elektroforéze. Vhodným přístrojem pro provádění tohoto způsobu je například Perkin-Elmer Sequence robot „CATALYST 800“ a Perkin-Elmer model 373A DNA Sequencer. Použitím tohoto způsobu se tak stane určení sekvence nukleotidů DNA jak účinné, tak i bezpečné.

Použitím způsobů, které byly popsány výše, může být účinně a bezpečně prováděno stanovení sekvence DNA. Na základě dat takto určených nukleotidových sekvencí DNA podle předkládaného vynálezu a N-koncových aminokyselinových sekvencí těžkých a lehkých řetězců je možno stanovit celkovou sekvenci aminokyselin těžkého a lehkého řetězce monoklonáiní protilátky podle předkládaného vynálezu. Například monoklonáiní protilátka HFE7A podle předkládaného vynálezu, která je vhodná pro poskytnutí CDR pro vnesení do humanizované protilátky podle předkládaného vynálezu je molekula imunoglobulinu G1 (lgG1) a je tedy komplexem složeným z podjednotek γ1 těžkého řetězce a κ lehkého řetězce.

- 36 Výhodné způsoby pro stanovení částečné aminokyselinové sekvence těchto podjednotek zahrnují například izolaci podjednotek vhodným způsobem jako je elektroforéza nebo chromatografie na koloně a potom analýzu N-koncových aminokyselinových sekvencí podjednotek s použitím například automatického sekvenátoru proteinů (např. přístroje PPSQ-10, Shimadzu Seisakusyo, K. K.).

Každý těžký a lehký řetězec imunoglobulinu se skládá z variabilní oblasti a konstantní oblasti, kde variabilní oblast každého řetězce se dále skládá ze tří CDR a čtyř rámcových oblastí obklopujících CDR.

Sekvence aminokyselin konstantní oblasti je v rámci dané podtřídy konstantní bez ohledu na rozpoznávaný antigen. Naopak sekvence aminokyselin variabilní oblasti je alespoň v případě CDR pro každou protilátku specifická. Porovnávacími studiemi bylo však zjištěno s použitím dat aminokyselinových sekvencí četných protilátek, že jak umístění CDR, tak i délky rámcových sekvencí jsou mezi podjednotkami protilátky patřících do stejné podskupiny přibližně podobné (Kabat, E. A., a další, (1991), v „Sequences of Proteins of Immunological Interest, díl II.,“ US Department of Health and Human Services). Srovnáním aminokyselinových sekvencí lehkého a těžkého řetězce monoklonální protilátky HFE7A anti-Fas s těmito známými daty aminokyselinových sekvencí je tedy možno získat například CDR a rámcové oblasti stejně jako umístění konstantní oblasti v každé z výše stanovených sekvencí aminokyselin.

Délka FRHj, tj. nejvíce na N-konci umístěné rámcové oblasti těžkých řetězců, byla náhodně nalezena kratší než normální délka 30 aminokyselin. Například nejkratší známá FRHi myšího lgG1 stejného subtypu jako HFE7A má délku pouze 18 aminokyselin (Kabat a další, tamtéž). U protilátky podle předkládaného vynálezu lze tedy předpokládat, že délka té části celé molekuly, která odpovídá FRHj může mít vhodnou délku, typicky mezi 18 a 30 aminokyselinami, ale

-37 • · · · s výhodou přibližně 30 aminokyselin za předpokladu, že se neztratí nezbytná vazebná aktivita Fas.

Trojrozměrná struktura vazebné oblasti Fas se určuje hlavně podle sekvencí ve variabilních oblastech, přičemž tyto oblasti jsou podporovány konstantními oblastmi. Rámcové oblasti poskytují CDR strukturu, která je chemicky a strukturně konfigurována pro interakci s antigenem. Je tedy možno vybrat a modifikovat některou existující protilátku nebo její část, která rozpoznává antigen jiný než Fas tak, aby rozpoznávala Fas vhodnou změnou CDR podle výše uvedených postupů (viz například U. S. publikovaná patentová přihláška No. 5,331,573). Aby bylo zachováno co nejvíce vazebné aktivity, je obecně výhodné zvolit akceptorové řetězce, které mají nejvyšší podobnost donorovým řetězcům. Takto modifikované peptidy jsou využitelné v předkládaném vynálezu například při prevenci nebo léčení onemocnění spojených s abnormalitami systému Fas/ligand Fas.

Konstrukce mutantu, u kterého je odstraněna v sekvenci aminokyselin jedna nebo více aminokyselin, může být například provedena kazetovou mutagenezí (Toshimitsu Kishimoto, „ShinSeikagaku Jikken Kouza 2: Kakusan III Kumikae DNA Gijutsu“, 242 251).

Sekvence DNA je možno připravit řadou z mnoha známých vhodných metod. Vhodnou metodou zvláště pro kratší sekvence je chemická syntéza s použitím konvenční metody, jako je fosfit triesterová metoda (Hunkapiller, M., a další, (1984), Nátuře, 310, 105 111). Kodony pro jakoukoliv aminokyselinu je možno zvolit z jakýchkoliv rozpoznávaných kodonů odpovídajících požadované aminokyselině a tato volba může být arbitrární nebo je možno vzít v úvahu frekvenci daného kodonů u hostitele nebo možnost vytvoření restrikčního místa při zvolení vhodného kodonů, aniž by došlo ke změně sekvence aminokyselin. Částečná modifikace nukleotidové

- 38 sekvence může být provedena místně specifickou mutagenezí s použitím syntetických oligonukleotidových primerů kódujících požadované modifikace (Mark, D. F., a další, (1984), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 81, 5662 - 5666) známými způsoby.

Hybridizace DNA s DNA kódující těžký nebo lehký řetězec monoklonální protilátky anti-Fas podle předkládaného vynálezu může být například stanovena použitím vhodného fragmentu DNA podle vynálezu značeného (cc-³²P)dCTP, například ve formě sondy nebo způsobem jako je metoda náhodných primerů (Feinberg, A. P. a Vogelstein, B. (1983), Anal. Biochem., 132, 6 - 13) nebo metoda posunu jednořetězcových zlomů (Maniatis, T., a další, (1982) v „Molecular Cloning A Laboratory Manual“ Cold Spring Harbor Laboratory, NY). Vhodný způsob je následující:

Nejprve se potenciálně hybridizující DNA adsorbuje na nitrocelulózovou nebo nylonovou membránu, v případě potřeby se vystaví působení alkálií a potom se fixuje zahřátím nebo ozářením UV. Při výhodném postupu se potom membráta ponoří do předhybridizačního roztoku obsahujícího 6 x SSC (1 x SSC je vodný roztok 0,15 M NaCI a 0,015 M trojsodné soli kyseliny citrónové), 5 % obj. Denhardtův roztok a 0,1 % obj. dodecylsulfát sodný (SDS) a inkubuje se při 55 °C 4 hod nebo déle. Potom se předem připravená hybridizační sonda rozpustí v podobném předhybridizačním roztoku na konečnou specifickou aktivitu 1 x 10⁶ cpm/ml a inkubuje se při 60 °C přes noc. Potom se membrána při pokojové teplotě promyje opakovaným promýváním 6 x SSC po dobu 5 min a dále 2 x SSC po dobu 20 min a potom se provede autoradiografie.

Použitím této metody je možno izolovat z knihovny cDNA nebo genomové knihovny (Maniatis, T., a další, (1982), v „Molecular Cloning A Laboratory Manual“ Cold Spring Harbor Laboratory, NY) DNA hybridizovatelnou s DNA kódující těžký nebo lehký řetězec monoklonální protilátky anti-Fas, která slouží jako základ pro

- 39 • · · · · humanizovanou protilátku anti-Fas podle předkládaného vynálezu. Tato DNA je také v rámci předkládaného vynálezu, přičemž nezbytné podmínky hybridizace jsou 6 x SSC a 55 °C, s výhodou 60 °C a výhodněji 70 °C.

Integrace takto získané DNA podle předkládaného vynálezu do expresního vektoru umožní transformaci prokaryotických nebo eukaryotických hostitelských buněk. Tyto expresní vektory budou typicky obsahovat vhodné promotory, replikační místa a sekvence účastnící se genové exprese a tím bude umožněna exprese DNA v hostitelské buňce.

Vhodnými prokaryotickými hostitelskými buňkami jsou například E. coli (Escherichia coli) a Bacillus subtilis. Aby byla umožněna exprese uvažovaného genu v takové hostitelské buňce, hostitelské buňky mohou být transformovány plazmidovým vektorem obsahujícím replikon odvozený z druhu kompatibilního s hostitelem, který má typicky počátek replikace a sekvenci promotoru, jako je lac UV5. Tyto vektory mají s výhodou sekvence umožňující provádění selekce fenotypu u transformované buňky.

Vhodným kmenem E. coli je kmen JM109 odvozený z E. coli K12. Vhodnými vektory jsou plazmidy pBR322 a řady pUC. Vhodné promotory zahrnují laktózový promotor (lac), tryptofan laktózový promotor (trc), tryptofanový promotor (trp), lipoproteinový promotor (Ipp), promotor lambda (λ)ΡΙ_ odvozený z bakteriofága λ a promotor prodlužovacího faktoru polypeptidového řetězce Tu(tufB). Obecně se předpokládá, že předkládaný vynález není omezen na použití těchto hostitelů, vektorů, promotorů apod., jejichž příklady byly uvedeny výše a podle potřeby je možno použít jakýchkoliv vhodných systémů. Vhodný výhodný kmen Bacillus subtilis je kmen 207-25 a výhodný vektor je pTUB228 (Ohmura, K., a další, (1984), J. Biochem, 95, 87 93). Vhodný promotor je regulační sekvence α-amylázového genu Bacillus subtilis. V případě potřeby je možno do DNA podle ·· ····

- 40 - ................

předkládaného vynálezu zařadit signální sekvenci pro α-amylázu pro umožnění extracelulární sekrece.

Mezi eukaryotické hostitele patří hostitelské buňky obratlovců a kvasinek. Příkladem buněk obratlovců, které se používají, je opičí 5 buněčná linie COS-1 (Gluzman, Y., (1981), Cell, 23, 175 - 182). Vhodné kvasinkové hostitelské buňky jsou například pekařské kvasinky (Saccharomyces cerevisiae), methylotrofní kvasinky (Pichia pastoris) a kvasinky rozmnožující se dělením (Schizosaccharomyces pombe). Je zřejmé, že v případě potřeby je možno použít také jiných io hostitelů.

Požadavky na vhodné expresní vektory pro savčí buňky jsou následující: promotor, obvykle proti směru translace vzhledem k exprimovanému genu; místo sestřihu RNA; polyadenylační místo; a sekvence ukončení transkripce stejně jako jiné požadované funkce, 15 jako je počátek replikace. Vhodný plazmid je pSV2dhfr obsahující časný promotor SV40 (Subramani, S., a další, (1981), Mol. Cell. Biol., 1, 854 - 884), ale odborníkům v oboru je známo velké množství dalších plazmidů.

Vhodné eukaryotické mikroorganismy jsou kvasinky, jako je S. 2o cerevisiae a vhodnými kvasinkovými expresními vektory jsou pAH301, pAH82 a YEp51. Vhodné vektory obsahují například promotor alkoholdehydrogenázového genu (Bennetzen, J. L. a Halí, B. D., (1982), J. Biol. Chem., 257, 3018 - 3025) nebo karboxypeptidázový Y GAL10 promotor (Ichikawa, K., a další, (1993), Biosci. Biotech.

Biochem., 57, 1686 - 1690). V případě potřeby můžebýt připojena sekvence DNA kódující signální peptidovou sekvenci karboxypeptidázy Y, například k DNA, která má být exprimována pro umožnění extracelulární sekrece.

Jestliže se jako hostitelé použijí buňky COS, vektory vhodně 30 obsahují počátek replikace SV40 umožňující autonomní replikaci a promotor transkripce, signál ukončení transkripce a místo sestřihu ·· ···· • ·

ΛΑ · * * * . 4 - ······· · ♦

RNA. Expresní vektory mohou být použity pro transformaci buněk jakoukoliv vhodnou metodou, jako je DEAE-dextranová metoda (Luthman, H., a Magnusson, G. (1983), Nucleic Acids Res., 11, 1295 1308), koprecipitační metoda fosforečnan vápenatý - DNA (Graham, F. L. a Van der Eb, A. J., (1973), Virology, 52, 456 - 457) a metoda elektroporace elektrickými pulzy (Neumann, E., a další, (1982), EMBO J„ 1, 841 - 845).

Ve výhodném provedení jsou buňky COS kotransfekovány dvěma rozdílnými expresními vektory - jedním obsahujícím DNA kódující protein s obsahem alespoň variabilní oblasti těžkého řetězce protilátky HFE7A, s výhodou část nebo celý humanizovaný těžký řetězec, a jedním obsahujícím DNA kódující protein obsahující alespoň variabilní oblast lehkého řetězce protilátky HFE7A, s výhodou část nebo celý humanizovaný lehký řetězec, přičemž tyto vektory se exprimují současně za vytvoření humanizované rekombinantní protilátky proti lidskému Fas.

Transformanty podle předkládaného vynálezu mohou být kultivovány s použitím běžných metod, přičemž požadované proteiny se exprimují buď intra- nebo extracelulárně. Mezi vhodná kultivační média patří četná běžně používaná média, která se obecně zvolí podle zvoleného hostitele. Například vhodné médium pro buňky COS je RPMI-1640 a médium Dulbecco’s Modified Eagle Minimum Essential medium (DMEM), které může být v případě potřeby doplněno fetálním bovinním sérem (FBS).

Teplota kultivace může být jakákoliv vhodná teplota, která výrazně nesnižuje schopnost syntetizovat proteiny a s výhodou je v rozmezí 32 až 42 °C, nejvýhodněji 37 °C, zvláště v případě savčích buněk. V případě potřeby může být kultivace prováděna v atmosféře obsahující 1 až 10 % obj. oxidu uhličitého.

Transformované buňky E. coli pME-H a E. coli pMR-L, vždy transformované vektorem rekombinantní DNA pro expresi DNA ·· ·· · · • · ·· ·· · • · ·· ··· • · · · ·· · • · · ··

- 42 - “·· “......

kódující lehké a těžké řetězce monoklonální protilátky anti-Fas použitelné pro přípravu humanizovaných protilátek anti-Fas podle předkládaného vynálezu v živočišných buňkách byly uloženy podle Budapešťské úmluvy v Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo 12. března 1997 pod depozitními čísly FERM BP-5868 a BP5867. Transformací kulturních zvířecích buněk, jako jsou COS-1 rekombinantními vektory izolovanými z uložených kmenů a kultivací transformovaných buněk je tedy možno produkovat v kultuře rekombinantní protilátku anti-Fas.

Protein exprimovaný transformanty podle předkládaného vynálezu může být izolován a purifikován různými známými způsoby separace podle toho, jestli se protein exprimuje intra- nebo extracelulárně a v závislosti na fyzikálních a chemických vlastnostech proteinu. Vhodné konkrétní metody separace zahrnují: působení běžně používaných srážecích činidel na protein; různé způsoby chromatografie jako je ultrafiltrace, chromatografie molekulárními síty (gelová filtrace), adsorpční chromatografie, iontoměničová chromatografie, afinitní chromatografie a vysoce výkonná kapalinová chromatografie (HPLC); dialýza; a jejich kombinace.

Použitím výše popsaných způsobů může být požadovaný protein snadno získán s vysokými výtěžky a vysokou čistotou.

Pro optimální humanizace v tomto případě myší monoklonální protilátky anti-Fas je výhodné včlenit variabilní oblasti do lidské protilátky alespoň tak, že každá CDR se jako celek vloží do lidské protilátky a s výhodou také tak, že významné zbytky sekvencí FR se vloží do lidské protilátky s cílem zachovat co největší možný rozsah struktury vazebného místa. To je možno provést některou z následujících tří metod:

1) použitím těžkých a lehkých řetězců ze stejné známé lidské protilátky; nebo ··

2) použitím těžkých a lehkých řetězců odvozených od jiných lidských protilátek, které mají vysokou sekvenční homologii nebo sdílejí souhlasné sekvence s řetězci dárce při současném zachování kombinace podskupin akceptorového řetězce; nebo

3) volbou oblastí FR těžkých a lehkých řetězců tak, aby měly co nejvyšší homologii s oblastmi FR donoru z knihovny primárních sekvencí lidských protilátek bez ohledu na kombinaci podskupin.

Tyto způsoby selekce založené na samotné sekvenční homologii bez dalších omezení, umožňují sdílení alespoň 70 % shody aminokyselin mezi donorem a akceptorem v částech FR. Použitím tohoto přístupu je možno snížit počet aminokyselin vyštěpených z donoru s ohledem na známé metody a tím minimalizovat indukci odpovědi HAMA.

Termín „homologie aminokyselinové sekvence“ jak se zde používá, označuje podobnost aminokyselinové sekvence mezi dvěma různými polypeptidy nebo protein. Homologii aminokyselinové sekvence je možno stanovit řadou způsobů, které běžně využívají počítačového průzkumu databází sekvencí. Tyto způsoby jsou odborníkům v oboru dobře známy. Autoři vynálezu dávají přednost testování homologie v průběhu celé délky rámcových oblastí.

Je zřejmé, že úloha zbytků aminokyselin, které se vyskytují v donorové podskupině pouze zřídka, nemůže být zcela definována, protože postupy pro předpovídání trojrozměrné struktury molekuly protilátky z její primární sekvence (dále označované jako „molekulární modelování“) mají omezenou přesnost. Známé metody, jako je metoda Queena a spolupracovníků (Queen a další, výše) neudávají, zda by měl být v dané poloze zvolen zbytek aminokyseliny od donoru nebo od akceptoru. Volba akceptorové molekuly založená na homologii sekvence samotné může podstatně snížit potřebu tohoto typu volby.

Autoři vynálezu dále objevili další zdokonalení této metody podmínkou dodatečného selekčního postupu, navrženého pro

-44identifikaci aminokyselin z donorových FR, které jsou důležité pro zachování struktury a funkce donorových oblastí CDR.

Jakmile byla pro daný řetězec zvolena lidská akceptorová molekula, volba zbytku aminokyselin, které mají být vyštěpeny z FR donoru se provádí následujícím způsobem.

Porovná se sekvence aminokyselin donoru a akceptoru. Jestliže se v některé poloze seřazené zbytky aminokyselin oblastí FR liší, je nutné rozhodnout se, který zbytek má být zvolen. Zbytek, který je zvolen, by neměl interferovat nebo by měl mít pouze minimální vliv na trojrozměrnou strukturu oblastí CDR odvozených z donoru.

Queen a další (mezinárodní publikovaná přihláška WO 90/07861) navrhli způsob rozhodování, zda má být zbytek aminokyseliny z donorové FR přenesen spolu se sekvencí CDR. Podle této metody se zbytek aminokyseliny z oblasti FR přenese do akceptoru spolu se sekvencí CDR, jestliže zbytek splňuje alespoň jedno z následujících kritérií:

1) aminokyselina v lidské rámcové oblasti akceptoru se v této poloze akceptoru nalézá pouze zřídka, zatímco odpovídající aminokyselina v donoru se v této poloze akceptoru nalézá běžně;

2) aminokyselina je umístěna těsně u jedné z oblastí CDR; a

3) aminokyselina má atom postranního řetězce do vzdálenosti přibližně 0,3 nm od CDR při posuzování na trojrozměrném modelu imunoglobulinu a je potenciálně schopna interagovat s antigenem nebo CDR humanizované protilátky.

Zbytek identifikovaný pomocí kritéria (2) výše má často vlastnosti podle kritéria (3). V předkládaném vynálezu se tedy kritérium (2) vynechává a zavádějí se dvě nová kritéria. Podle předkládaného vynálezu se zbytek aminokyseliny přenáší z donorové FR spolu s CDR, jestliže zbytek splňuje alespoň jedno z následujících kritérií:

- 45 • · · · · • · · · · · · • ···· · ··· • · · · ···· · • · · · · · •· ··· ·· ··

a) aminokyselina v lidské rámcové oblasti akceptoru se zřídka nalézá v této poloze u akceptoru, zatímco odpovídající aminokyselina v donoru se v této poloze akceptoru nachází běžně;

b) aminokyselina má atom postranního řetězce do vzdálenosti přibližně 0,3 nm od CDR při posuzování na trojrozměrném modelu imunoglobulinu a je potenciálně schopna interagovat s antigenem nebo CDR humanizované protilátky;

c) aminokyselina se nachází v poloze, která má úlohu při určování struktury kanonické třídy CDR;

d) je nalezeno umístění aminokyseliny v místě styku povrchu těžkého a lehkého řetězce.

Vzhledem ke kritériu (a) je aminokyselina definována jako „společná“, pokud se v dané poloze nalézá v 90 % nebo více protilátkách stejné podtřídy (Kabat a další, výše). Aminokyselina je definována jako „zřídka se vyskytující“, jestliže se nachází u méně než % protilátek stejné podtřídy.

Vzhledem ke kritériu (c), poloha zbytků určujících kanonickou třídu může být jednoznačně určena podle informací poskytnutých pracovníky Chothia a další, výše.

Vzhledem ke kritériím (b) a (d) je nutno provádět molekulární modelování proměnných oblastí protilátky předem. I když je možno použít jakohokoliv komerčně dostupného software pro molekulární modelování, autoři vynálezu dávají přednost software AbM (Oxford Molecular Limited, lne.).

Předpovědi získané molekulárním modelováním mají omezenou přednost. Proto byla předpovězená struktura v předkládaném vynálezu získaná pomocí molekulárního modelování ověřována porovnáváním s daty rentgenové krystalografie z proměnných oblastí různých protilátek.

Při použití strukturního modelu vytvořeného molekulárním modelováním (jako je software AbM) se o dvou atomech předpokládá, • · · · · · · • · · ···· · ··· • · ·· · ·· · · · · · • · · · · ··· . 46 - ................

že jsou vzájemně v kontaktu pomocí Van der Waalsových sil, jestliže vzdálenost mezi dvěma atomy je menší než je součet jejich Van der Waalsových poloměrů plus 0,05 nm. Výskyt vodíkové vazby se předpokládá v případě, jestliže je vzdálenost mezi polárními atomy jako je amidový atom dusíku a karbonylový atom kyslíku hlavního a postranního řetězce kratší než 0,29 nm (průměrná délka vodíkové vazby) plus 0,05 nm. Navíc, pokud je vzdálenost mezi dvěma opačně nabitými atomy kratší než 0,285 nm plus 0,05 nm, předpokládá se, že tvoří iontový pár.

Polohy aminokyselin v oblastech FR, které jsou v častém styku s CDR byly identifikovány na základě rentgenových krystalografických dat variabilních oblastí různých protilátek. Tyto polohy byly stanoveny bez ohledu na podskupiny. Pro lehké řetězce jde o polohy 1, 2, 3, 4, 5, 23, 35, 36,46, 48, 49, 58, 69, 71 a 88 a pro těžké řetězce o polohy 2, 4, 27, 28, 29, 30, 36, 38, 46, 47, 48, 49, 66, 67, 69, 71, 73, 78, 92, 93, 94 a 103. Výše uvedené číslování aminokyselin je definováno v souladu s publikací Kabat a další, výše. Tento systém číslování se používá i dále. Jestliže jsou stejná data analyzována molekulárním modelováním, zbytky aminokyselin v těchto polohách se ukázaly být v kontaktu se zbytky aminokyselin CDR ve dvou třetinách proměnných oblastí protilátek, které byly zkoumány.

Tyto objevy byly použity pro definování kritéria (b) výše. Konkrétně, jestliže je pro polohu aminokyseliny v oblasti FR předpovězeno, že je ve styku s CDR pomocí molekulárního modelování a zároveň se analýzou rentgenových krystalografických dat často zjišťuje, že je ve styku s CDR, dá se přednost přenosu zbytku aminokyseliny z donoru. V jakémkoliv jiném případě se kritérium (b) nebere v úvahu.

Podobně co se týče kritéria (d), data zjištěná rentgenovou krystalografií z různých oblastí velkého počtu protilátek ukazují, že aminokyselinové zbytky v polohách 36, 38, 43, 44, 46, 49, 87 a 98

- 47 v lehkých řetězcích a zbytky v polohách 37, 39, 45, 47, 91, 103 a 104 v těžkých řetězcích se často podílejí na kontaktu mezi lehkými a těžkými řetězci. Jestliže je pro některou z těchto aminokyselin molekulárním modelováním předpovězeno, že se bude účastnit kontaktu mezi lehkým a těžkým řetězcem, dá se přednost přenosu zbytku aminokyseliny z donoru. V kterémkoliv jiném případě se kritérium (d) nebere v úvahu.

DNA kódující variabilní oblasti řetězců H a L humanizované protilátky proti lidskému Fas podle předkládanému vynálezu, může být připravena řadou způsobů.

V jednom z těchto způsobů mohou být syntetizovány polynukleotidové fragmenty o délce mezi 60 a 70 nukleotidy, které představují částečné nukleotidové sekvence požadované DNA. Postup syntézy je uspořádán tak, že se konce fragmentů nekódujícího řetězce střídají s konci fragmentů řetězce kódujícího. Výsledné polynukleotidové fragmenty je možno spolu vzájemně teplotně hybridizovat a ligovat DNA ligázou. Tímto způsobem je možno získat požadovaný fragment DNA kódující variabilní oblasti řetězců H a L humanizované protilátky proti lidskému Fas.

Alternativně může být z lidských lymfocytů izolována DNA kódující celou proměnnou oblast akceptorů. Pro zavedení restrikčních míst do oblastí kódujících CDR donoru může být použita například místně specifická mutageneze. CDR potom mohou být vyříznuty z akceptorů pomocí příslušného restrikčního enzymu. DNA kódující CDR donoru pak může být syntetizována a ligována do akceptorové molekuly s použitím DNA ligázy.

Autoři vynálezu dávají přednost řešení, při kterém se DNA kódující proměnné oblasti těžkého a lehkého řetězce požadované humanizované protilátky proti lidskému Fas získají způsoby překrývajícího se prodlužování pomocí PCR (overlap extension PCR) (Horton, a další, (1989), Gene, 77, 61 - 68).

- 48 Překrývající se prodlužování pomocí PCR dovoluje spojování dvou fragmentů DNA, které oba kódují požadovanou sekvenci aminokyselin. Například dva fragmenty zde označíme jako (A) a (B). Je syntetizován nekódující primer (C) o délce 20 až 40 nukleotidů, který teplotně hybridizuje s 5’-oblastí (A) spolu s kódujícím primerem o délce 20 až 40 nukleotidů (D), který teplotně hybridizuje s 3’-oblastí (B). Jsou nutné dva další primery. Za prvé: chimérický nekódující primer (E), který obsahuje 20 až 30 nukleotidů z 3’-oblasti (A) spojený s 20 až 30 nukleotidy z 5’-oblasti (B). Za druhé je to kódující primer (F) komplementární k nekódujícímu primerů.

Reakce PCR může být prováděna použitím primerů (C) a (F) v kombinaci s templátovou DNA obsahující fragment A. To umožní vytvoření produktu DNA obsahujícího 20 až 30 nukleotidů 5’-oblasti (B) spojených s 3’-koncem (A). Tento fragment se nazývá fragment (G) .

Podobně je možno provádět PCR použitím primerů (D) a (E) v kombinaci s templátovou DNA obsahující fragment B. To umožní vytvořit produkt DNA obsahující 20 až 30 nukleotidů 3’-oblasti (A) spojených s 5’-koncem (B). Tento fragment se nazývá fragment (H).

Fragmenty (G) a (H) nesou komplementární sekvence 40 až 60 nukleotidů v 3’-oblasti (G) a 40 až 60 nukleotidů v 5’-oblasti (H). Reakce PCR může být provedena s použitím směsi fragmentů (G) a (H) jako templátu. Při prvním kroku denaturace se DNA přemění na jednořetězcovou formu. Většina DNA se vrátí zpět do původní formy v následujícím kroku teplotní hybridizace. Část DNA však vytvoří heterologní duplex DNA v důsledku teplotní hybridizace fragmentů (G) a (H) v oblasti překrývajících se sekvencí. V následujícím kroku prodlužování se přesahující jednořetězové části opraví za vzniku chimérické DNA, která představuje spojení (A) a (B). Tento fragment DNA se dále označuje jako (I). Fragment (I) může být amplifikován s použitím primerů (C) a primerů (D).

Při provedeních předkládaného vynálezu mohou představovat fragmenty (A) a (B) DNA kódující oblasti CDR řetězců H a L myší humanizované monoklonální protilátky proti lidskému Fas, DNA kódující oblasti FR lidského IgG nebo DNA kódující sekreční signál lidského IgG.

Kodon nebo kodony, které odpovídají požadované aminokyselině, jsou známy. Při navrhování sekvence DNA, ze které má být vytvářen protein, je možno zvolit jakýkoliv vhodný kodon. Například může být kodon zvolen podle použití tohoto kodonu u hostitele. Je možno provést částečnou modifikaci nukleotidové sekvence, například standardním způsobem místně zaměřené mutageneze, využívající syntetické oligonukleotidové primery kódující požadované modifikace (Mark, D. F., a další, (1984), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 81, 5662 - 5666). Použitím vybraných primerů pro zavedení specifické bodové mutace nebo mutací je možno získat DNA kódující různé oblasti řetězců H a L jakékoliv požadované humanizované protilátky proti lidskému Fas.

Integrace takto získané DNA podle předkládaného vynálezu do expresního vektoru umožní transformaci prokaryotických nebo eukaryotických hostitelských buněk. Tyto expresní vektory budou typicky obsahovat vhodné promotory, replikační místa a sekvence, které se účastní genové exprese, což dovolí expresi DNA v hostitelské buňce.

Pět transformantních kmenů nesoucích DNA kódující variabilní oblasti lehkých řetězců humanizované protilátky anti-Fas podle předkládaného vynálezu, totiž E. coli pHSGMM6 SANK 73697, E. coli pHSGHM17 SANK 73597, E. coli pHSGHH7 SANK 73497, E. coli pHSGHM2 SANK 70198 a E. coli pHSHHS SANK 70398 stejně jako dva transformantní kmeny nesoucí DNA kódující variabilní oblast těžkého řetězce humanizované protilátky anti-Fas podle předkládaného vynálezu, totiž E. coli pgHSL7A62 SANK 73397 a E.

coli pgHPDHV3 SANK 70298, bylo uloženo ve sbírce Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo, 22. 8. 1997, v souladu s Budapešťskou smlouvou o ukládání mikroorganismů pod depozitním číslem FERM BP-6071, FERM BP-6072, FERM BP-6073, FERM-6272 a FERM-6274 (lehké řetězce) a FERM BP-6074 a FERM BP-6273 (těžké řetězce). Izolací plazmidů z těchto uložených kmenů nebo provedením PCR s použitím extraktu z uložených kmenů jako templátu může být tedy získána DNA kódující každou z podjednotek proteinu humanizované protilátky anti-Fas.

Rekombinantní anti-Fas protilátka s vysokou čistotou může být snadno vyráběna s vysokými výtěžky výše popsanými postupy.

Pro zjištění zda se rekombinantní protilátka anti-Fas připravená podle výše uvedeného způsobu specificky váže na Fas může být provedena ELISA podobným způsobem, jak bylo prováděno výše pro vyhodnocení titrů protilátek u imunizovaných myší.

Protilátka HFE7A a humanizované protilátky anti-Fas podle předkládaného vynálezu mají různé funkční vlastnosti a) až f) níže, z nichž každou je možno ověřit například popsanými způsoby.

Indukce apoptózy u T buněk exprimujících Fas.

Aktivita indukující apoptózu u T buněk exprimujících Fas může být testována odstraněním thymu z myši, které byla podána humanizovaná anti-Fas protilátka podle předkládaného vynálezu (dále také označovaná jako „protilátka“), rozdrcením thymu a uvedením získaných buněk do styku s T buňkami a protilátkou specifickou pro myší Fas a měření podílu buněk, na které se obě protilátky váží průtokovou cytometrií.

Odstranění autoimunních příznaků myši MRL gld/gld.

Protilátka se podá intraperitoneálně myši MRL gld/gld. Tyto myši nesou mutaci genu kódujícího ligand Fas a mají příznaky

napodobující autoimunní onemocnění (Shin Yonehara (1994), Nikkei Science Bessatsu, 110, 66 - 77). Protilátka je v mnoha případech schopna zabránit nebo alespoň zmírnit otok končetin, který je jedním z příznaků podobných autoimunnímu onemocnění.

Neschopnost indukovat poruchy jater.

Myši BALB/c, které byla podána protilátka, se odebere periferní krev a měří se krevní hladiny enzymů glutamát - oxalacetát transaminázy (GOT) a glutamát - pyruvát transaminázy (GTP) pomocí automatického analyzátoru (například Model 7250; Hitachi Seisakusyo, K. K.) spolu s nezbytnými reagenciemi pro analyzátor (například transamináza-HRII; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Neschopnost způsobit zvýšené hladiny krevní GOT a GPT ukazuje, že protilátka neindukuje po podání in vivo jaterní poruchy.

Terapeutický nebo profylaktický účinek na fulminantní hepatitidu.

V experimentálním systému, ve kterém se u myši indukuje fulminantní hepatitida podáním monoklonální protilátky antimyší Fas Jo2, je možno zkoumat účinky podání výše uvedené protilátky současně s Jo2 nebo po podání Jo2. Protilátky podle vynálezu mohou ve velké míře zabránit všem účinkům Jo2 u myši a tím je ukázán jejich ochranný účinek na játra.

Preventivní účinek na nástup kolagenem indukované artritidy.

Vyšetřují se účinky podávání protilátky na model revmatoidní artritidy vyvolané podáváním emulze obsahující kolagen a Freundovo kompletní adjuvans myši. Protilátka má profylaktické vlastnosti.

Indukce apoptózy u synoviálních buněk pacienta s revmatoidné artritidou.

·· · ·· »·»· • · · · ♦ ·· • · ····· • · · · ·* « . . .· ···· ··· ·· ···

- 52 Synoviální buňky získané z postižené oblasti pacienta s revmatoidní artritidou se kultivují a vyšetřuje se životaschopnost buněk, jestliže je v kultivačním médiu obsažena výše uvedená protilátka. Překvapivě je inhibována proliferace synoviálních buněk.

Protilátky podle předkládaného vynálezu tedy narozdíl od dosud známých monoklonálních protilátek anti-Fas nejen chrání normální buňky, ale také usmrcují buňky abnormální. Jsou tedy použitelné jako terapeutické prostředky pro onemocnění v důsledku abnormalit systému Fas/ligand Fas.

Schopnost proteinů podle předkládaného vynálezu indukovat apoptózu může být zjištěna například kultivací buněk jako je buněčná linie lidských lymfocytů HPB-ALL (Morikawa, S., a další, (1978), Int. J. Cancer, 21, 166 - 170) nebo Jurkat (Američan Type Culture No. TIB1520) v médiu, do kterého byl nebo bude přidán vzorek. Míra přežívání může pak být stanovena například testem MTT (Green, L. M., a další, (1984), J. Immunological Methods, 70, 257 - 268).

Protilátky podle předkládaného vynálezu mohou být použity v řadě farmaceutických prostředků vzhledem k různým stavům onemocnění spojeným s abnormalitami systému Fas/ligand Fas, jako jsou například výše uvedená onemocnění.

Takový profylaktický nebo terapeutický prostředek může být podáván v jakékoliv z mnoha možných forem. Vhodné způsoby podávání zahrnují orální podávání formou tablet, kapslí, granulí, prášků a sirupů nebo parenterální podávání jako je vhodnou formou injekce včetně intravenózní, intramuskulární a intradermální, stejně jako infuzemi a čípky. Předkládaný vynález poskytuje tedy také způsoby a terapeutické prostředky pro léčení stavů uvedených výše. Tyto prostředky typicky obsahují terapeuticky účinné množství proteinu podle předkládaného vynálezu ve směsi s farmaceuticky přijatelným nosičem a mohou být podávány jakýmkoli vhodným

• · · to * to ·· • ·· ···· • ·· · · • · · ·· • ·· ·· · ·· způsobem, jako je parenterální, intravenózní, subkutánní nebo místní podávání.

Jestliže je léčený stav místního charakteru, je výhodné podávat protein co nejblíže k postiženému místu. Například vážná revmatická bolest se může vyskytovat u velkých kloubů a protein je možno podávat do těchto míst.

Systémově podávané proteiny podle předkládaného vynálezu se zvláště výhodně podávají ve formě apyrogenního, terapeuticky, zvláště parenterálně přijatelného vodného roztoku. Výroba takových farmaceuticky přijatelných roztoků proteinu s ohledem na taková hlediska jako je pH, izotonicita, stabilita apod., je v oboru známa a spadá do rámce znalostí odborníka v oboru. Prostředky podle předkládaného vynálezu mohou navíc obsahovat další složky, které mohou být vhodné, jako jsou látky brzdící růst buněk a jiná léčiva.

Je zřejmé, že dávky se budou lišit v závislosti na faktorech, jako je stav, věk a tělesná hmotnost pacienta, ale obvykle je dávka pro orální podávání dospělému v rozmezí přibližně 0,1 mg až 1000 mg za den, která může být podána v jediné dávce nebo několika dělených dávkách. Dávka pro parentarální podávání je typicky v rozmezí mezi 0,1 mg a 1000 mg, přičemž tato dávka může být podána subkutánní, intramuskulární nebo intravenózní injekcí (nebo injekcemi.)

Vhodná forma pro orální podávání humanizované protilátky antiFas podle předkládaného vynálezu je ampule obsahující sterilní roztok nebo suspenzi ve vodě nebo farmaceuticky přijatelném roztoku. Alternativně může být do ampule naplněn sterilní prášek (s výhodou připravený lyofilizací humanizované protilátky anti-Fas), který se pak ředí pro použití farmaceuticky přijatelným roztokem.

Jelikož protilátky podle předkládaného vynálezu používané pro léčení člověka byly humanizovány, toxicita je velmi nízká.

• · · ·· ···· · · ·· • · · · ··· ··· • · · ···· · ··· • · · · · ·· ···· • · · · · · · ···· ··· ·· ··· ·« *· -54Vynález bude nyní ilustrován podrobněji následujícími neomezujícími příklady, které představují konkrétní provedení předkládaného vynálezu.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 je schéma znázorňující konstrukci phFas-AIC2.

Obr. 2 je schéma znázorňující konstrukci pME-H a pME-L.

Obr. 3 znázorňuje výsledky testu ELISA pro stanovení epitopu rozpoznávaného protilátkou HFE7A.

iq Obr. 4 znázorňuje výsledky kompetitivního testu pro stanovení epitopu rozpoznávaného protilátkou HFE7A.

Obr. 5 znázorňuje výsledky testování toxicity protilátky HFE7A.

Obr. 6 znázorňuje výsledky testování modelem fulminantní hepatitidy.

Obr. 7 znázorňuje výsledky testování prevence kolagenem indukované 15 artritidy.

Obr. 8 je souhrnné znázornění prvního kroku PCR při výrobě VHHDNA.

Obr. 9 je souhrnné znázornění druhého kroku PCR při výrobě VHHDNA.

Obr. 10 je souhrnné znázornění třetího kroku PCR při výrobě VHHDNA.

Obr. 11 je souhrnné zobrazení konstrukce expresního plazmidu nesoucího fragment VHH-DNA.

Obr. 12 je souhrnné znázornění prvního kroku PCR při výrobě VHM25 DNA.

Obr. 13 je souhrnné znázornění druhého kroku PCR při výrobě VHMDNA.

• » ···· · · ····· • · · ····« ··· • φ · · · · · ··· ·· φ · φφ φφφφ

ΦΦΦΦ ΦΦΦ ΦΦ Μ4 ····

- 55 Obr. 14 je souhrnné zobrazení konstrukce expresního plazmidu nesoucího fragment VHM-DNA.

Obr. 15 je souhrnné znázornění prvního kroku PCR při výrobě VMMDNA.

Obr. 16 je souhrnné znázornění druhého kroku PCR při výrobě VMMDNA.

Obr. 17 je souhrnné znázornění třetího kroku PCR při výrobě VMMDNA.

Obr. 18 je souhrnné zobrazení konstrukce expresního plazmidu nesoucího fragment VMM-DNA.

Obr. 19 znázorňuje polohy, ve kterých se vážou sekvenační primery lehkého řetězce.

Obr. 20 je souhrnné znázornění prvního kroku PCR při výrobě VDDNA.

Obr. 21 je souhrnné znázornění druhého kroku PCR při výrobě VDDNA.

Obr. 22 je souhrnné znázornění třetího kroku PCR při výrobě VD-DNA.

Obr. 23 je souhrnné zobrazení konstrukce expresního plazmidu nesoucího fragment VD-DNA.

Obr. 24 je souhrnné zobrazení konstrukce fragmentu DNA (IG5’-DNA) obsahujícího oblast CH1 lidského lgG1 a intron.

Obr. 25 je souhrnné zobrazení konstrukce fragmentu genomické DNA (IG3’-DNA) obsahujícího pantovou oblast (hinge region), oblast

DH2, CH3 a introny lidského lgG1.

Obr. 26 je souhrnné zobrazení konstrukce expresního plazmidu pEg7AH-H.

Obr. 27 znázorňuje polohy, na které se vážou sekvenační primery těžkého řetězce.

-56·· · · · ··· ··· ·· • · · ······» • · · · ···· ··· • · * · · ·· ···· · • · ·· ···· ··· ··· ·· ··· ·· tt

Obr. 28 je graf znázorňující vazebnou aktivitu humanizovaných protilátek anti-Fas na lidský fuzní protein Fas.

Obr. 29 ukazuje kompetitivní inhibici HFE7A a humanizovaných antiFas protilátek pro lidský fuzní protein Fas.

Obr. 30 ukazuje cytotoxicitu humanizovaného HFE7A vůči WR19L12a.

Obr. 31 je znázornění prvního stupně PCR při výrobě LPDHH-DNA.

Obr. 32 je znázornění druhého stupně PCR při výrobě LPDHH-DNA.

Obr. 33 je znázornění třetího stupně PCR při výrobě LPDHH-DNA.

Obr. 34 je souhrnné znázornění konstrukce expresního plazmidu nesoucího fragment LPDHH-DNA.

Obr. 35 je znázornění prvního stupně PCR při výrobě LPDHM-DNA.

Obr. 36 je znázornění druhého stupně PCR při výrobě LPDHM-DNA.

Obr. 37 je znázornění třetího stupně PCR při výrobě LPDHM-DNA.

Obr. 38 je souhrnné znázornění konstrukce plazmidu nesoucího fragment LPDHM-DNA.

Obr. 39 je znázornění prvního stupně PCR při výrobě HPD1.2-DNA.

Obr. 40 je znázornění druhého stupně při výrobě HPD1.2-DNA

Obr. 41 je souhrnné znázornění plazmidu nesoucího fragment

HPD1.2-DNA.

Obr. 42 ukazuje, ve kterém místě se vážou primery pro sekvenování pEgPDHV3-21.

Obr. 43 ukazuje konstrukci expresních vektorů pro dosažení vysoké úrovně exprese humanizovaných lehkých řetězců.

Obr. 44 ukazuje konstrukci expresních vektorů pro dosažení vysoké úrovně exprese humanizovaných těžkých řetězců.

Obr. 45 ukazuje vazebnou aktivitu lidského fuzního proteinu Fas pro supernatanty z příkladu 12.

- 57 Obr. 46 ukazuje výsledky kompetitivní inhibice protilátky HFE7A supernatanty z příkladu 12.

Obr. 47 ukazuje výsledky indukce apoptózy u T buněk supernatantem kultivačních kapalin z příkladu 12.

Příklady provedení vynálezu

Všechny metody, přípravy, roztoky apod., které nejsou zvlášť definovány, mohou být nalezeny v publikaci „Molecular Cloning - A laboratory Handbook“ výše. Všechny roztoky jsou vodné a připravují se ze sterilní deionizované vody, pokud není uvedeno jinak.

Referenční příklad 1

Příprava antigenu Fas

Byl zkonstruován expresní vektor s cílem získat rozpustnou verzi lidského Fas, který nemá transmembránovou doménu. Tento vektor byl navržen tak, aby kódoval fuzní protein („fuzní protein Fas“) obsahující extracelulární doménu lidského Fas fúzovanou k extracelulární doméně myšího receptorů interleukinu 3 (IL3) (Gorman, D. M. a další, (1990), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 87, 5459 5463). DNA kódující lidský fuzní protein Fas byla připravena z tohoto vektoru pomocí PCR. Konstrukce vektoru a příprava DNA probíhala následujícím způsobem.

a) Templát

Templáty použitými pro PCR pro konstrukci inzertu kódujícího fuzní protein byly dva plazmidy. První plazmid, pME18S-mFas-AIC (Nishimura, Y. a další, (1995), J. Immunol., 154, 4395 - 4403) byl DNA expresní plazmidový vektor kódující fuzní protein obsahující extracelulární doménu myšího Fas a extracelulární doménu myšího ·· · ·· ······ ·· • · · · ······· • · · ····· ··· • · · · 9 9 9 9 9 9 99

9 9 9 9 9 99

9999 999 99 99999 99

- 58 receptorů IL3. Druhý plazmid, pCEV4 (Itoh, N., a další, (1991), Cell, 66, 233 - 243), nesl cDNA kódující lidský Fas.

b) Primery PCR

Byly syntetizovány následující oligonukleotidové primery: 5’-GGGGAATTCC AGTACGGAGT TGGGGAAGCT CTT T-3’ (N1: SEQ ID No. 12 výpisu sekvencí);

5’-GTTTCTTCTG CCTCTGTCAC CAAGTTAGAT CTGGA-3’ (C3N: SEQ ID No. 13 výpisu sekvencí);

5’-TCCAGATCTA ACTTGGTGAC AGAGGCAGAA GAAAC-3’ (N3N: SEQ ID No. 14 výpisu sekvencí); a 5’-CCCTCTAGAC GCGTCACGTG GGCATCAC-3’ (CTN2: SEQ ID No. 15 výpisu sekvencí).

Pokud není uvedeno jinak, všechny oligonukleotidy v těchto příkladech byly syntetizoványs použitím automatického syntezátoru DNA (Model 380B; Perkin Elmer Japan, Applied Biosystems Division) podle instrukcí výrobce (Matteucci, M. D. a Caruthers, Μ. H., (1981),

J. Am. Chem. Soc., 103, 3185 - 3191). Po syntéze byl každý oligonukleotid (primer) odstraněn z nosiče, byly odstraněny ochranné skupiny a získaný roztok byl lyofilizován na získání prášku. Tento prášek byl potom rozpuštěn v destilované vodě a skladován podle potřeby při teplotě - 20 °C.

c) První stupeň PCR

i) Fragment DNA označený HFAS a kódující extracelulární doménu lidského Fas byl připraven následujícím způsobem. PCR byla prováděna s použitím LA (Long and Accurate) PCR Kitu (Takara Shuzo Co., Ltd., Japonsko).

Složení reakčního roztoku PCR:

templátová DNA pCEV4, 20 ng;

- 59 primer N1, 0,5 pg;

primer C3N, 0,5 pg;

x koncentrovaný pufr LA PCR (součást kitu), 25 pl;

směs dNTP (součást kitu) 25 pl; a

Taq polymeráza LA (součást kitu) 12,5 jednotek.

K roztoku byla přidána destilovaná voda na celkový objem 250 pl. Pokud není uvedeno jinak, směs dNTP je poskytována jako ekvimolární směs dATP, dCTP, dGTP a dTTP.

Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejprve zahříván 2 min při 94 °C a potom byl 30 x opakován cyklus zahřívání 1 min 94 °C, 1 min 55 °C a 2 min 72 °C. Po skončení tohoto postupu byl reakční roztok zahříván 10 min při 72 °C (ve všech reakcích PCR popisovaných v příkladech byla teplota řízena systémem GeneAmp PCR systém 9600; Perkin Elmer, Japonsko).

ii) Fragment DNA označený MAIC a kódující extracelulární doménu myšího receptorů IL3 byl připraven následujícím způsobem.

Složení reakčního roztoku PCR:

Templátová DNA pME18S-mFas-AIC, 20 ng;

primer N3N, 0,5 pg;

primer CTN2, 0,5 pg;

x koncentrovaný PCR pufr LA, 25 pl;

směs dNTP, 25 pl;

Taq polymeráza, 12,5 jednotek; a sterilní destilovaná voda do celkového objemu 250 pl.

Reakce PCR byla prováděna jak bylo uvedeno výše.

Amplifikované fragmenty DNA HFAS a MAIC získané tímto způsobem byly nejprve odděleně extrahovány fenolem, potom sráženy • · • ·· • · · • ·· • ·· • ·

-60 ethanolem (tyto dva postupy probíhaly podle definice v příkladu 2 (2)

3) a) níže) a nakonec byla provedena elektroforéza purifikovaných fragmentů na polyakrylamidovém gelu 5 % hmotnost/objem. Gel byl obarven ethidiumbromidem v koncentraci 1 pg/ml pro zviditelnění pruhů DNA pod UV lampou. Pruhy, u kterých bylo zjištěno, že obsahují požadované fragmenty DNA, byly vyříznuty žiletkou a byla provedena elektroeluce DNA z těchto vyříznutých pruhů s použitím přístroje Amicon Centriruter opatřeným ultrafiltračním zařízením Centricon-10 typu centrifugační zkumavky firmy Amicon. Po elektroluci byla jednotka Centricon-10 obsahující eluát slita a centrifugována přibližně 7500 x g 1 hodinu pro zakoncentrování DNA. DNA byla vysrážena ethanolem a potom rozpuštěna ve 20 pl destilované vody.

d) Druhý stupeň PCR

Fragment DNA FASAIC kódující lidský fuzní protein Fas (lidský Fas/myší receptor IL3) byl připraven následujícím způsobem.

Složení reakčního roztoku PCR:

roztok templátové DNA HFAS, 20 pl;

roztok templátové DNA MAIC, 20 μΙ;

primer N1, 0,5 pg;

primer CTN2, 0,5 pg;

x koncentrovaný pufr PCR LA, 25 pl;

směs dNTP, 25 pl;

Taq polymeráza LA, 12,5 jednotek; a sterilní destilovaná voda do celkového objemu 250 pl.

Reakce PCR byla prováděna jako v odstavci c) výše.

Amplifikovaný fragment DNA FASAIC získaný tímto způsobem byl nejprve extrahován fenolem, potom vysrážen ethanolem a byla provedena jeho elektroforéza na polyakrylamidovém gelu 1 % • · · ·· ······ ·· ···· · · · · · ·· • · · · · · · ···· • · ·· · · · ····· • · · · · · ·· ···· ··· ·· ····· ··

-61 hmotnost/objem. Gel abyl obarven ethidiumbromidu 1 pg/ml pro zviditelnění pruhů DNA pod UV lampou. Pruh, u kterého bylo určeno, že obsahuje požadovaný fragment DNA, byl vyříznut žiletkou a byla provedena elektroeluce DNA z tohoto vyříznutého pruhu s použitím přístroje Amicon Centriruter opatřeným zařízením Centricon-10 typu popsaného výše. Po elektroluci byla jednotka Centricon-10 obsahující eluát vyjmuta a centrifugována přibližně 7500 x g 1 hodinu pro zakoncentrování DNA. DNA byla vysrážena ethanolem a potom rozpuštěna ve 50 pl destilované vody.

e) Konstrukce vektorů

Celá FASAIC DNA získaná v kroku d) výše byla štěpena restrikčními enzymy EcoRI a Xbal a potom extrahována směsí fenol/chloroform (50 % obj. fenolu saturovaného vodou, 48 % obj. chloroformu, 2 % obj. izoamylalkoholu) a potom srážena ethanolem. Výsledná sraženina byla suspendována ve 2 μΙ sterilní deionizované vody.

μg plazmidů pME18S-mFas-AIC bylo štěpeno restrikčními enzymy EcoRI a Xbal a defosforylovány (způsob defosforylace je definován v příkladu 2 (2) 3) a) níže). Výsledný fragment DNA byl potom ligován s restrikčně štěpenou DNA FASAIC získanou výše s použitím ligačního kitu (Takara Shuzo Co., Ltd.). Produkt ligace byl potom použit při transformaci E. coli kmene DH5a (Gibco BRL) podle popisu u Hanahana (Hanahan, D., (1983), J. Mol. Biol., 166, 557 580). Plazmid byl potom z transformované E. coli získán metodou alkalického SDS (Maniatis, T., a další, (1989), v Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. vydání), Cold Spring Harbor Laboratory, NY). Takto získaný plazmid byl označen phFas-AIC2.

Tento plazmid byl potom dále čištěn s použitím kitu pro přípravu plazmidů ve velkém měřítku (MaxiPrep DNA purification systém, Promega) 20 pg čištěné plazmidové DNA bylo sráženo ethanolem

- 62 a precipitát byl rozpuštěn ve 20 μΙ sterilního média Dulbecco’s PBS(-) (dále označovaného jako PBS; Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.).

f) Exprese

Buňky COS-1 (Američan Type Culture Collection No. CRL-1650) rostly do semikonfluence v kultivační láhvi (kultivační plocha 225 cm²; Sumitomo Bakelite, K. K.) obsahující médium Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM; Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., Japonsko) doplněné 10 % obj. fetálního telecího séra (FCS; Gibco) při 37 °C v atmosféře 5 % obj. plynného CO₂. Růstové médium bylo potom slito a do láhve bylo přidáno 3 ml vodného roztoku 5 g/l trypsinu a 2 g/l kyseliny ethylendiamintetraoctové (roztok trypsin - EDTA; Sigma Chemicals, Co.). Láhev byla potom pro uvolnění buněk inkubována při 37 °C 3 minuty.

Sklizené buňky byly suspendovány v PBS, dvakrát promyty PBS a jejich koncentrace byla upravena PBS na 6 x 10⁷ buněk/ml. Dvacet mikrolitrů výsledné buněčné suspenze (1,2 x 10⁶ buněk) bylo smíseno s 20 μΙ výše připraveného roztoku plazmidu a směs byla zavedena do komory s elektrodami ve vzdálenosti 2 mm (Shimadzu Seisakusyo, K.

K.). Komora byla potom vložena do zařízení pro transfekci genů (GTE1; Shimadzu Seisakusyo, K. K.) a dvakrát byly aplikovány pulzy 600 V v trvání 30 ps v časovém odstupu 1 s. Směs buňky - DNA v komoře byla potom vložena do 10 ml DMEM doplněného 10 % obj. FCS a inkubována v kultivační láhvi (kultivační plocha 75 cm²) při koncentraci CO₂ 7,5 % obj. po dobu 24 hodin. Potom byl supernatant z kultury slit a buňky byly promyty DMEM bez séra. Potom bylo k pro mytým buňkám přidáno 10 ml bezsérového DMEM a směs byla dále inkubována při koncentraci 7,5 % obj. CO² při 37 °C po dobu 24 hodin a potom byl oddělen supernatant.

Oddělený supernatant byl dialyzován proti 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) v dialyzační trubici (oddělení při molekulové hmotnosti 12 000 • · • · · ·

9 · ···· · · · · • · ·· · ·· ···· · • · · · · ··· ···· ··· ·· ··· ·· ·*

-6314 000; Gibco BRL) a lidský fuzní protein Fas byl potom dále částečně purifikován s použitím přístroje FPLC firmy Pharmacia za následujících podmínek:

Kolona: Resource Q™; průměr 6,4 x 30 mm; Pharmacia;

Eluent: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0);

Průtok: 5 ml/min;

Eluce: NaCI 0,1 M - 0,3 M, lineární gradient v průběhu 30 min.

Eluát byl jímán do frakcí po 5 ml a ty byly testovány na expresní produkt genu Fas metodou ELISA, jak je popsáno níže. Nejprve bylo 100 μΙ každé frakce odděleně umístěno do jamek v 96 jamkové mikrodestičce (Costar) a inkubováno při 37 °C 1 hodinu. Potom byl roztok z jamek odsát a destička byla třikrát promyta PBS s obsahem 0,1 % obj. Tween 20 (PBS-Tween), vždy 100 μΙ na jamku. Potom byl přidán PBS obsahující 2 % hmotnost/objem bovinního sérového albuminu („BSA“) v množství 100 μΙ/jamku a destička byla potom inkubována 1 hodinu při 37 °C.

Jamky byly potom dále promyty třikrát 100 μΙ na jamku roztokem PBS-Tween a potom bylo přidáno 100 μΙ/jamku roztoku antimyší monoklonální protilátky HC β podjednotky receptorů IL-3 (1 mg/ml; Igaku Seibutsugaku Kenkyujo, K. K.) zředěné 100 x roztokem PBSTween a destička byla opět inkubována 1 hod při 37 °C. Jamky byly potom promyty třikrát 100 μΙ/jamku roztoku PBS-Tween a potom bylo do každé jamky přidáno 100 μΙ/jamku protilátky proti myšímu imunoglobulinu značené křenovou peroxidázou (Amersham) zředěné 2000 x roztokem PBS-Tween, destička byla inkubována při 37 °C další 1 hodinu a každá jamka byla opět promyta třikrát 100 μΙ roztoku PBSTween. Potom byl do každé jamky přidán substrát křenové peroxidázy (BioRad) v množství 100 μΙ/jamku a ponechán 5 minut. Potom byla měřena absorbance při 415 nm čtečkou mikrodestiček (model 450; BioRad). Frakce 19 až 23 včetně, které měly při těchto vlnových

-64 ·· ···· · · ·· • · · · · · · • · · · · · · · · • · ♦ · ···· · • · · · · · 9 9 99 9 9 9 9 9 délkách vysokou absorbanci, byly spojeny pro přípravu vzorku surového fuzního proteinu lidského Fas.

Referenční příklad 2

Imunizace myši a příprava hybridomu (2-1) Imunizace

Vzorek 1 ml surového fuzního proteinu lidského Fas získaného v referenčním příkladu 1 výše (obsah celkového proteinu 100 pg) byl odebrán a bylo k němu přidáno 25 μΙ 2N HCI, 250 μΙ roztoku síranu hlinitodraselného 9 % hmotnost/objem (konečná koncentrace 1,1 % hmotnost/objem) a 25 μΙ 2N NaOH. Výsledná směs byla přídavkem přibližně 120 μΙ vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného 10 % hmotnost/objem upravena na pH mezi přibližně 6,5 a 7,0 a ponechána stát přibližně 30 min při pokojové teplotě. Potom bylo do směsi přidáno 200 μΙ usmrcené bakterie Bordetella pertussis (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.; 1,2 x 10¹¹ buněk/ml) pro aktivaci T buněk a směs byla podána intraperitoneálně Fas/ligand Fas deficientní myši. Použitá myš byla připravena způsobem popsaným v Senju, S. a další, (1996), International Immunology, 8, 423). Myši byla po dvou týdnech podána intraperitoneální zesilující injekce samotného surového fuzního proteinu lidského Fas (20 pg proteinu/myš).

(2-2) Fuze buněk

Třetí den po zesilující injekci byla z myši vyjmuta slezina a vložena do 10 ml bezsérového média RPMI 1640 (10,4 g/l RPMI 1640 „Nussui“ 1; Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) obsahujícího 20 mM pufr HEPES (pH 7,3), 350 mg/ml hydrogenuhličitanu sodného, 0,05 mM β-merkaptoethanol, 50 jednotek/ml penicilinu, 50 pg/ml streptomycinu a 300 pg/ml kyseliny L-glutamové a rozdrcena protlačením přes síto (Cell Strainer; Falcon) za použití špachtle.

-65 Výsledná buněčná suspenze byla centrifugována pro usazení buněk sleziny, které byly dvakrát promyty bezsérovým médiem RPMI. Promyté buňky byly potom suspendovány v bezsérovém médiu RPMI a počítány.

Mezitím byly myelomové buňky NS1 (Američan Type Culture Collection TIB-18) ponechány růst do buněčné hustoty nepřesahující 1 x 10⁸ buněk/ml v médiu ASF104 (Ajinomoto, K. K.) obsahujícím 10 % obj. FCS (Gibco BRL) („médium ASF se sérem“) při 37 °C a koncentraci 5 % obj. CO₂ a získané buňky byly stejným způsobem rozrušeny, promyty, suspendovány a počítány.

Množství suspenze buněk NS1 vypočtené tak, aby obsahovalo 3x 10⁷ buněk bylo smíseno s množstvím suspenze buněk sleziny obsahující 3 x 10⁸ buněk. Výsledná směs byla centrifugována a supernatant byl odlit. Byly provedeny následující kroky fuze buněk, zatímco byla plastová zkumavka obsahující usazené buňky udržována při 37 °C v kádince s teplou vodou.

Do zkumavky byl pomalu přidán 1 ml polyethylenglykolu 1500 50 % hmotnost/objem (Boehringer Manheim) za míchání usazeniny hrotem pipety. Potom byl ve dvou částech přidán 1 ml bezsérového média RPMI předem ohřátého na 37 °C a potom bylo přidáno dalších 7 ml bezsérového média RPMI. Výsledná směs byla potom centrifugována, supernatant byl slit a bylo přidáno 10 ml média hypoxantinaminopterinthymidin („médium HAT“; Boehringer Manheim) obsahujícího 10 % obj. FCS za stálého mírného míchání hrotem pipety. Bylo přidáno dalších 20 ml média HAT obsahujícího 10 % obj. FCS a suspenze byla po alikvotech 100 μΙ/jamka rozplněna do 96jamkové mikrodestičky pro kultivaci buněk a inkubována při 37 °C a koncentraci 5 % obj. CO₂. Po 7 nebo 8 dnech bylo použito 100 μΙ/jamku čerstvého média HAT pro náhradu média ve všech jamkách, ve kterých se vyskytlo nažloutlé zbarvení. Byl proveden ···· · φφ ···· ···· φ φ φφ φ φ φ φφφφ φ ·· · φ φ · · > φ · » φ · ·· · φ· · · · · ···

-66 screening fúzovaných buněk z těchto jamek metodou limitního zředění, jak se popisuje dále.

(2-3) Limitní zředění

Sleziny ze samic myší BALB/c stáří 4 až 10 týdnů (Japan SLC, lne.) byly vyjmuty, rozdrceny na sítu (Cell Strainer; Falcon) jak bylo popsáno výše a buňky byly dvakrát promyty médiem hypoxantin thymidin („médium HT“; Boehringer, Manheim) obsahujícím 10 % obj. FCS. Množství buněk thymu odpovídající buňkám z jedné myši bylo suspendováno v 30 ml média HT obsahujícího 10 % obj. FCS za vytvoření zásobní buněčné suspenze. Preparát fuzních buněk získaný výše (2-2) byl zředěn zásobní suspenzí buněk 10 až 100 x a dále sériově ředěn zásobní buněčnou suspenzí za vytvoření suspenzí s hustotami fuzních buněk 5, 1 a 0,5 buněk/ml. Takto připravené vzorky byly rozplněny do jamek na 96-jamkových kultivačních mikrodestičkách po 100 μΙ/jamku a inkubovány 5 dnů při 37 °C a koncentraci 5 % obj. CO₂.

(2-4) Screening

Buňky WR19L12a (Itoh, N. a další, (1991), Cell, 66, 233 - 243) byly pomnoženy inkubací v médiu RPMI1640 obsahujícím 10 % obj. FCS při 37 °C a 5 % obj. CO₂. Buňky WR19L12a jsou odvozeny z myších T lymfomových buněk WR19L (Američan Type Culture Collections TIB-52) a byly modifikovány pro expresi genu kódujícího lidský Fas. Suspenze pomnožených buněk WR19L12a byla naředěna na hustotu buněk 1 x 10⁷ buněk/ml a alikvoty 50 μΙ/jamku byly dispendovány do jamek na 96-jamkové mikrodestičce se dnem ve tvaru U (Nunc) a destička byla centrifugována (90 x g, 4 °C, 10 min). Supernatant byl slit a do jamek bylo za míchání přidáno 50 μΙ/jamku kultivačního supernatantu získaného z fuzních buněk kultivovaných podle článku 2-3 výše.

Výsledné směsi byly ponechány stát na ledu 1 hod a potom byly centrifugovány (90 x g, 4 °C, 10 min) a supernatant byl odstraněn. Usazeniny byly vždy dvakrát promyty 100 μΙ/jamku pufru pro průtokovou cytometrii (PBS obsahující 5 % obj. FCS a 0,04 % hmotnost/objem azidu sodného). Do promytých buněk byla přidána sekundární protilátka (kozí antimyší IgG frakce IgG protilátky značená fluorescein-5-izothiokyanátem (FITC) (Organon Technika) v množství 50 μΙ a 500 násobném zředění a směs byla udržována na ledu 1 hod. Po další centrifugaci (90 x g, 4 °C, 10 min) a odstranění supernatantu byla usazenina dvakrát promyta 100 μΙ/jamku pufru pro průtokovou cytometrii a buňky byly fixovány přídavkem 50 μΙ roztoku formaldehydu 3,7 % obj. a ponechány stát na ledu 10 min. Po centrifugaci (90 x g, 4 °C, 10 min) a odstranění supernatantu byly usazeniny opět promyty 100 μΙ/jamku pufru pro průtokovou cytometrii a resuspendovány v dalších 100 μΙ/jamku pufru pro průtokovou cytometrii za vytvoření vzorků pro průtokovou cytometrii.

Intenzita fluorescence FITC u buněk v každém vzorku byla měřena průtokovým cytometrem (Epics Elitě; Coulter; vlnová délka excitace 488 nm; vlnová délka detekce 530 nm) a fúzované buňky byly vybrány ze vzorků, které měly jasně vyšší fluorescenci FITC (intenzity fluorescence FITC přibližné 100 až 1000) než kontrolní vzorky buněk WR19L12a, ke kterým nebyl přidán supernatant fuzních buněk (intenzita fluorescence FITC přibližně 0,3).

(2-5) Klonování

Kroky popsané v částech (2-3) a (2-4) výše, byly pětkrát opakovány pro buňky vybrané v části (2-4), a tím byla umožněna selekce několika klonů hybridomů, z nichž každý produkoval jedinou protilátku vázající WR19L12a, ale nevázající WR19L. Vazba těchto protilátek na myší Fas byla vyšetřována použitím testu podobného testu popisovanému v části (2-4), ale s použitím buněk L5178YA1. Buněčná linie L5178YA1 exprimuje myší Fas. L5178YA1 je buněčná • · · · · ·

-68 linie vytvořená transfekci buněk L5178Y expresním vektorem myšího Fas. Buňky L5178Y (Američan Type Culture Collection No. CRL-1722) neexprimují téměř žádný Fas.

Výsledkem tohoto selekčního postupu je získání hybridomu myš - myš označeného HFE7A a produkujícího protilátku vázající se na buňky L5178YA1, ale ne na buňky L5178Y. Tento hybridom označená HFE7A byl uložen v souladu s Budapešťskou smlouvou pro ukládání mikroorganismů ve sbírce Kogyo Gijutsuin Seimei Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo 20. února 1997 pod depozitním číslem FERM BP5828.

Podtřída protilátky vytvořená hybridomem myš - myš HFE7A (dále označovaného pro jednoduchost jako „HFE7A“) byla stanovena po testování kitem pro zjištění izotypů monoklonálních protilátek (Pierce) jako lgG1, k.

Referenční příklad 3

Purifikace monoklonální protilátky HFE7A

Hybridom myš - myš HFE7A získaný v referenčním příkladu 2 (FERM BP-5828) byl ponechán růst do hustoty buněk 1 x 10⁶ buněk/ml inkubací v 1 I média ASF obsahujícího 10 % obj. FCS při 37 °C a koncentraci CO₂ 5 % obj. Kultura byla potom centrifugována (1000 ot/min, 2 min) a supernatant byl slit. Usazené buňky byly jednou promyty bezsérovým médiem ASF, suspendovány v 1 I bezsérového média ASF a inkubovány 48 hod při 37 °C a koncentraci CO₂ 5 % obj. Potom byla kultura centrifugována (1000 ot/min 2 min) pro získání supernatantu. Supernatant byl potom vložen do dialyzační trubice (oddělení při molekulové hmotnosti 12 000 - 14 000; Gibco BRL) a dialyzován proti deseti objemům 10 mM pufru fosforečnanu sodného (pH 8,0). Částečné purifikace IgG z vnitřního roztoku bylo dosaženo

-69 «· « ·« ······ ·· • · · · ««· ·· · · • · · · ·«« ·· ·· • * · · » .··«··· • · ·· ···· »»·» ··· ·· ····· ·· použitím přístroje pro vysoce výkonnou kapalinovou chromatografií (systém FPLC; Pharmacia) za následujících podmínek:

Kolona: kolona DEAE-Sepharose CL-6B (objem 10 ml; Pharmacia);

Eluent: 10 mM pufr fosforečnanu sodného (pH 8,0);

Průtok: 1 ml/min;

Eluce: lineární gradient 1M NaCI (0 až 50 %, 180 min).

Eluát byl jímán do frakcí po 5 ml a v každé frakci byl testován titr protilátky anti-Fas testem ELISA s použitím výše připraveného fuzního proteinu lidského Fas.

Nejprve bylo do jamek 96-jamkové mikrodestičky ELISA vloženo 100 μΙ/jamku surového fuzního proteinu lidského Fas připraveného v referenčním příkladu 1. Po inkubaci při 37 °C 1 hodinu byl roztok odlit a jamky byly vždy třikrát promyty 100 μΙ/jamku roztoku PBSTween. Potom bylo přidáno 100 μΙ/jamku PBS obsahujícího 2 % BSA a inkubováno 37 °C 1 hodinu. Potom byly buňky promyty třikrát roztokem PBS-Tween 100 μΙ/jamku a potom byly do jamek přidány 100 μΙ vzorky testovaných frakcí a destička byla inkubována 1 hod při 37 °C. Potom po promytí každé z jamek třikrát 100 μΙ/jamku roztoku PBS-Tween, byla přidána protilátka proti myšímu imunoglobulinu značená křenovou peroxidázou (Amersham), v množství 100 μΙ/jamku zředěná 2000 x pufrem PBS-Tween a směs byla ponechána reagovat 1 hodinu při 37 °C. Potom byla každá jamka třikrát promyta 100 μΙ/jamku roztoku PBS-Tween. V množství 100 μΙ/jamku byl přidán substrát pro křenovou peroxidázu (BioRad) a ponechán 5 min před odečtením absorbance v každé jamce při 415 nm na čtečce mikrodestiček.

Frakce 21 - 30 včetně, které měly vysoké hodnoty absorbance, byly spojeny a naneseny na dvě afinitní kolony pro čištění protilátek (HighTrap Protein G column, objem kolony 5 ml, Pharmacia). Po

• to	• ··	····	• to	toto
• ·	• ·	• ·	•	• to	•		•
•	•	• ·	···	• ·		··
to	•	• · to	•	• ·*·	•		•
•	•	• ·	•	•	•		•
toto··	• toto	··	···	··		··

promytí kolon ekvilibračním pufrem (20 mM pufrovací roztok fosforečnanu sodného pH 7,0, 25 ml/kolonu) byla protilátka eluována ml na kolonu elučního pufru (0,1 M glycin - HCI (pH 2,7). Eluát byl jímán do zkumavek, které obsahovaly vždy 1,125 ml pufru 1 M TrisHCI (pH 9,0) a centrifugován při 3000 x g a 4 °C 2 hodiny ve vrchní části ultrafiltračního zařízení typu centrifugační kyvety (CentriPrep 10;

Grace Japan, K. K.) ihned po ukončení eluce. Filtrát shromážděný na dně zařízení byl odlit a do vrchní části bylo přidáno 15 ml PBS a systém byl opět centrifugován při 3000 x g a 4 °C 2 hodiny. Stejné kroky byly opakovány 5 x u všech zkumavek. Pátá centrifugace byla zastavena, když objem roztoku zbylého ve vrchní části zařízení, dosáhl objemu 0,5 ml a tento objem byl zachován jako vzorek HFE7A.

Referenční příklad 4 Klonování cDNA (4-1) Příprava polyfA)* RNA

Buňky hybridomu myš - myš HFE7A (FERM BP-5828) získané v referenčním příkladu 2 byly ponechány růst na buněčnou hustotu 1 x 10⁶ buněk/ml v 1 I média ASF doplněného 10 % obj. FCS při 37 °C a koncentraci CO₂ 5 % objemových. Tyto buňky byly sklizeny centrifugací a lyžovány v přítomnosti roztoku guanidinium thiokyanátu (4 M guanidinium thiokyanát, 1 % obj. sarkosyl, 20 mM EDTA, 25 mM citran sodný (pH 7,0), 100 mM 2-merkaptoethanol, 0,1 % obj. odpěňovadla Antifoam A) a lyzát byl oddělen. Izolace poly(A)⁺ RNA byla provedena přesně podle popisu v „Molecular Cloning: A Laboratory Manual“ (Maniatis, T., a další (1982), str. 196 - 198). Podrobnější popis tohoto postupu uvádí následující odstavec.

Získaný buněčný lyzát byl několikrát nasát a vytlačen z 10 ml stříkačky opatřené jehlou kalibr 21. Buněčný lyzát byl navrstven na povrch 3 ml vodného roztoku 5,7 M chloridu česného a roztoku 0,1 M

·· · · · · · · · · • · · · · · ·· ··· · · ··

EDTA (pH 7,5) v polyallomerové centrifugační kyvetě do rotoru RPS40T (Hitachi Seisakusyo, K. K.). Lyzát byl potom centrifugován při 30 000 ot/min při 20 °C 18 hodin a výsledný sediment byl rozpuštěn ve 400 μΙ destilované vody a srážen ethanolem. Získaný sediment byl opět rozpuštěn ve 400 μΙ destilované vody, smísen se stejným objemem směsi chloroformu a 1-butanolu (4:1, objem/objem) a vodná vrstva byla odebrána po centrifugaci 10 min při 5000 ot/min. Vodná vrstva byla opět srážena ethanolem a sraženina byla rozpuštěna v 600 μΙ destilované vody. Výsledný roztok byl uchován jako vzorek celkové RNA.

Poly(A)⁺ RNA byla čištěna z 600 μg (suchá hmotnost) vzorku celkové RNA získaného výše chromatografií na oligo(dT) celulóze.

Konkrétně, celková RNA byla rozpuštěna ve 200 μΙ adsorpčního pufru (0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,1 % obj. dodecylsulfát sodný (SDS) a potom zahřívána na 65 °C po dobu 5 min a nanesena na kolonu oligo(dT) celulózy (Type 7; Pharmacia), na kterou byl nanesen adsorpční pufr. Poly(A)⁺ RNA byla eluována a izolována z kolony s použitím elučního pufru (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,05 % obj. SDS). Tímto postupem bylo získáno celkové množství 100 pg frakce poly(A)⁺ RNA.

(4-2) Určení N-koncových sekvencí aminokyselin lehkých a těžkých řetězců HFE7A μΙ roztoku obsahujícího protilátku HFE7A proti lidskému Fas získanou v referenčním příkladu 3 bylo podrobeno elektroforéze na gelu SDS - polyakrylamid („SDS-PAGE“) s použitím koncentrace gelu 12 % hmotnost/objem a konstantního napětí 100 V po dobu 120 min. Po elektroforéze byl gel ponořen do přenosového pufru (25 mM TrisHCl (pH 9,5), 20 % methanol, 0,02 % obj. SDS) na 5 minut. Potom byl protein obsažený v gelu přenesen na polyvinylidendifluoridovou membránu („membrána PVDF“; velikost pórů 0,45 pm; Millipore, ···· · · ····· • · · ····· ··· • · · · · · · ···· · • · ·· ···· ···· ··· ·· ··· ·· ··

-72 Japonsko) předem namočenou v přenosovém pufru, s použitím přístroje pro blotování (KS-8451; Marysol) při konstantním napětí 10 V při teplotě 4 °C po dobu 14 hodin.

Potom byla PVDF membrána promyta promývacím pufrem (25 mM NaCl, 10 mM sodný borátový pufr (pH 8,0) a potom barvena v barvicím roztoku (50 % obj. methanolu, 20 % obj. kyseliny octové a 0,05 % hmotnost/objem modři Coomassie Brilliant Blue) 5 minut pro zjištění proteinových pruhů. Membrána PVDF byla potom odbarvena v 90 % obj. vodném methanolu a pruhy odpovídající těžkému řetězci (pruh s nižší pohyblivostí) a lehkému řetězci (pruh s vyšší pohyblivostí) nacházející se na PVDF membráně byly vyříznuty a promyty deionizovanou vodou.

N-koncová aminokyselinová sekvence těžkého a lehkého řetězce může být potom stanovena Edmanovou automatizovanou metodou (Edman, P., a další, (1967), Eur. J. Biochem., 1, 80) s použitím sekvenátoru proteinů v plynné fázi (PPSQ-10; Shimadzu Seisakusyo, K. K.).

N-koncová aminokyselinová sekvence pruhu odpovídajícího těžkému řetězci byla stanovena takto:

Gln-Xaa-Gln-Leu-Gln-Gln-Pro-Gly-Ala-Glu-Leu (SEQ ID No. 16 výpisu sekvencí); a N-koncová aminokyselinová sekvence pruhu odpovídajícího lehkému řetězci byla stanovena takto: Asp-lle-Val-Leu-Thr-GIn-Ser-Pro-Ala-Ser-Leu-Ala-Val-Ser-Leu-GlyGln-Arg-Ala-Thr-lle-Ser (SEQ ID No. 17 ve výpisu sekvencí).

Porovnání těchto sekvencí aminokyselin s databází aminokyselinových sekvencí protilátek vytvořenou Kabatem a dalšími (Kabat E. A., a další, (1991) v „Sequences of Proteins of Immunological Interest, díl ΙΓ, U. S. Department of Health and Human Services) ukázalo, že těžký řetězec (řetězec γ1) a lehký řetězec (řetězec k) HFE7A náležel k subtypům 2b, popřípadě 3. Na základě těchto objevů byly syntetizovány oligonukleotidové primery, u kterých • ·

-73 se očekávalo, že budou hybridizovat s částmi 5’-nepřekládaných oblastí a úplné konce 3’-překládaných oblastí genů náleží do těchto myších subtypů (Kabat a další, tamtéž; Matti Kartinen a další, (1988), 25, 859 - 865; a Heinrich, G., a další, (1984), J. Exp. Med., 159, 417 435):

5’-GACCTCACCA TGGGATGGA-3’ (H1: SEQ ID No. 18 ve výpisu sekvencí);

5’-TTTACCAGGA GAGTGGGAGA-3’ (H2: SEQ ID No. 19 ve výpisu sekvencí);

5’-AAGAAGCATC CTCTCATCTA-3’ (L1: SEQ ID No. 20 ve výpisu sekvencí); a

5’-ACACTCATTC CTGTTGAAGC-3’ (L2: SEQ ID No. 21 ve výpisu sekvencí).

(4-3) Klonování cDNA cDNA kódující těžký a lehký řetězec myší monoklonální protilátky HFE7A proti lidskému Fas byla klonována kombinací reverzní transkripce a PCR („RT-PCR“). Amplifikace byla prováděna na frakci poly(A)⁺ RNA získané z hybridomových buněk produkujících HFE7A podle popisu v odstavci (4-1) výše. Reakce RT-PCR byla prováděna s použitím kitu RNA PCR Kit (AMV) Version 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.).

a) Reakce s reverzní transkriptázou

Jako páry primerů pro reakci RT-PCR pro lehký a těžký řetězec byly použity sady oligonukleotidových primerů (5’-koncové a 3’koncové primery) syntetizovaných v odstavci (4-2) výše.

Složení reakčních roztoků“ poly(A)⁺ RNA (těžký nebo lehký řetězec podle potřeby), 1 pg;

3’-primer (H2 nebo L2), 0,3 pg;

• · · · · ·· ···· · • · ·· · ··· ••♦to ··· ·· ··· ·· ··

-74 Tris-HCl (pH 8,3), 10 mM;

chlorid draselný, 50 mM;

směs dNTP, 1 mM;

chlorid hořečnatý, 5 mM;

inhibitor RNázy (součást kitu), 0,5 jednotky;

reverzní transkriptáza (součást kitu), 0,25 jednotky; a redestilovaná voda do celkového objemu 20 μΙ.

Reakční roztok byl inkubován při teplotě 55 °C 30 min, 99 °C 5 minut a potom 5 °C 5 minut. Takto zpracovaný roztok RT byl potom použit v následujícím kroku PCR.

b) PCR

Složení reakčního roztoku PCR:

reakční roztok s reverzní transkriptázou, 20 μΙ;

x koncentrovaný RNA PCR pufr (součást kitu), 10 μΙ;

roztok chloridu hořečnatého (součást kitu), 10 μΙ;

Taq polymeráza (součást kitu), 2,5 jednotky;

5’-primer (H1 nebo L1), konečná koncentrace 0,2 μΜ; a sterilní deionizovaná voda do celkového objemu 100 μΙ.

Reakční roztok PCR byl zahříván 2 min při 94 °C a potom následoval cyklus 94 °C 30 s, 60 °C 30 s a 72 °C 1,5 min opakovaný 28 x.

Po reakci PCR byla provedena elektroforéza alikvotů reakčních roztoků na agarózových gelech 1,5 % hmotnost/objem. Bylo zjištěno, že v reakčních roztocích byly ampiifikovány pruhy o velikosti přibližně

1,4 kbp a přibližně 0,7 kbp s použitím primerů pro těžký, popřípadě lehký řetězec. To potvrdilo, že cDNA kódující těžký a lehký řetězec byly ampiifikovány, jak bylo zamýšleno. PCR amplifikované reakční • · • · • · · · ·

roztoky by mohly být použity v dalším kroku klonování amplifikovaných cDNA s použitím kitu TA Cloning kit (Invitrogen). Bylo použito následujícího postupu.

Příslušný reakční roztok PCR spolu s 50 ng vektoru pCRII (součást TA klonovacího kitu) byl smísen v 1 μΙ 10 x lizázového reakčního pufru (6 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM chlorid hořečnatý, 5 mM chlorid sodný, 7 mM β-merkaptoethanol, 0,1 mM ATP, 2 mM DTT, 1 mM spermidin a 0,1 mg/ml bovinní sérový albumin), ke kterému byly přidány 4 jednotky T4 DNA ligázy (1 μΙ). Celkový objem směsi byl sterilní deionizovanou vodou nastaven na 10 μΙ a vzniklý ligázový roztok byl inkubován při 14 °C 15 hodin.

Potom byly 2 μΙ tohoto ligázového reakčního roztoku přidány do 50 μΙ kompetentního kmene E. coli TOP10F’ (poskytnutého s klonovacím kitem TA a přivedeného do kompetentního stavu podle doporučení výrobce), do kterého byly přidány 2 μΙ 0,5 Μ βmerkaptoethanolu a výsledná směs byla uchována na ledu 30 min, potom 30 s při 42 °C a opět na ledu po dobu 5 min. Potom bylo ke kultuře přidáno 500 μΙ média SOC (2 % obj. tryptonu, 0,5 % hmotnost/objem kvasničného extraktu, 0,05 % hmotnost/objem chloridu sodného, 2,5 mM chlorid draselný, 1 mM chlorid hořečnatý a 20 mM glukóza) a směs byla inkubována 1 hodinu při 37 °C za třepání.

Potom byla kultura rozetřena na plotnu agaru L-broth (1 % obj. tryptonu, 0,5 % hmotnost/objem kvasničného extraktu, 0,5 % hmotnost/objem chloridu sodného, 0,1 % hmotnost/objem glukózy a 0,6 % hmotnost/objem baktoagaru (Difco), obsahující 100 pg/ml ampicilinu a plotna byla inkubována při 37 °C přes noc. Jednotlivé kolonie rezistentní na ampicilin, které se na plotně objevily, byly seškrábnuty platinovou kličkou a kultivovány v médiu L-broth obsahujícím 100 pg/ml ampicilinu při 37 °C přes noc při třepání rychlostí 200 ot/min. Po inkubaci byly buňky sklizeny centrifugací • ·

- 76 a plazmidová DNA z nich byla připravena alkalickou metodou. Takto získané plazmidy byly označeny jako plazmid pCR-H (plazmid nesoucí cDNA kódující těžký řetězec HFE7A) nebo pCR-L (plazmid nesoucí cDNA kódující lehký řetězec HFE7A).

(4-4) Analýza nukleotidové sekvence

Nukleotidové sekvence cDNA kódujících těžký řetězec HFE7A (1,4 kbp) a lehký řetězec HFE7A (0,7 kbp) nesené plazmidy pCR-H a pCR-L získané v odstavci (4-3) výše, byly stanoveny dideoxymetodou (Sanger, F. S., a další, (1977), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74: 5463 - 5467) s použitím sekvenátoru genů (Model 310 Genetic Analyzer; Perkin Elmer, Japonsko).

Takto stanovené nukleotidové sekvence cDNA těžkého a lehkého řetězce jsou uvedeny jako SEQ ID No. 8, popřípadě SEQ ID No. 10 ve výpisu sekvencí. Souběžné úplné aminokyselinové sekvence těžkého a lehkého řetězce HFE7A kódovaných cDNA jsou uvedeny ve výpisu sekvencí jako SEQ ID No. 9, popřípadě 11. Nkoncová aminokyselinová sekvence HFE7A těžkého řetězce uvedená v odstavci (4-1) výše (SEQ ID No. 16 výpisu sekvencí) výborně souhlasila se sekvencí aminokyselin No. 1 až 11 SEQ ID No. 9 kromě jednoho nejistého zbytku. N-koncová aminokyselinová sekvence lehkého řetězce HFE7A (SEQ ID No. 17 ve výpisu sekvencí) přesně souhlasila se sekvencí aminokyselin No. 1 až 22 ze SEQ ID No. 11. Bylo tedy ukázáno, že N-konce maturních proteinů těžkého a lehkého řetězce HFE7A jsou aminokyselinami No. 1 až 11 a No. 1 až 22 v SEQ ID No. 9, popřípadě 11.

Navíc, když byly aminokyselinové sekvence těžkého a lehkého řetězce porovnány s databází aminokyselinových sekvencí protilátek (Kabat E. A., a další, (1991), v „Sequences of Proteins of Immunological Interest díl ΙΓ, U. S. Department of Health and Human Services) bylo zjištěno, že v případě těžkého řetězce tvořily

-77·· · ·» ······ ·· • · ·· · · ····· • · · ····· ··· • · ·· · ·· · · · · · • · · · ···· ·*·· ··· ·· ····· ·· aminokyseliny No. 1 až 121 SEQ ID No. 9 variabilní oblast, zatímco aminokyseliny No. 122 až 445 tvořily konstantní oblast. V případě lehkého řetězce aminokyseliny No. 1 až 111 SEQ ID No. 11 tvořily variabilní oblast a aminokyseliny No. 112 až 218 tvořily oblast konstantní.

Umístění a sekvence CDR v aminokyselinových sekvencích variabilních oblastí těžkého a lehkého řetězce HFE7A jak bylo určeno výše byly rovněž objasněny porovnáním homologií se stejnou databází sekvencí aminokyselin protilátek (Kabat E. A., a další, (1991), tamtéž). Z této publikace je možno zjistit, že délky rámcových oblastí ve variabilních oblastech jsou v podstatě stejné, a že aminokyselinové sekvence scílejí společné charakteristiky mezi rozdílnými protilátkami stejného subtypu. CDR jsou jedinečné sekvence umístěné mezi rámcovými oblastmi. Porovnáním aminokyselinových sekvencí těžkého a lehkého řetězce HFE7A s řetězci stejných subtypu v Kabátově práci je tedy možné identifikovat oblasti CDR HFE7A.

Bylo tedy zjištěno, že v těžkém řetězci HFE7A (SEQ ID No. 9 ve výpisu sekvencí) tvoří oblast CDRHí aminokyseliny No. 31 až 35, oblast CDRH₂ aminokyseliny No. 50 až 66 a oblast CDRH₃ aminokyseliny No. 99 až 110. Oblasti CDR v lehkém řetězci HFE7A (SEQ ID No. 11 ve výpisu sekvencí) byly identifikovány jako aminokyseliny No. 24 až 38 (CDRL.!), aminokyseliny No. 54 až 60 (CDRL₂) a aminokyseliny No. 93 až 101 (CDRL₃).

Referenční příklad 5

Příprava rekombinantní protilátky (5-1) Konstrukce expresního plazmidu

Rekombinantní expresní vektory pro zvířecí buňky byly konstruovány vložením cDNA kódujících těžký a lehký řetězec HFE7A (klonovaný v referenčním příkladu 4) do expresního vektoru pMS18S ·· ···· • · ···· • · • · · · • · · • · ·· · ··

• · · ··· · · • · · ♦ · ·· (Hara, T., a další, (1992), EMBO J., 11, 1875). Toho bylo dosaženo následujícím způsobem.

Nejprve byly syntetizovány oligonukleotidové primery:

5’-GGGGAATTCG ACCTCACCAT GGGATGGA-3’ (H3: SEQ ID No. 22 výpisu sekvencí) a

5’-GGGTCTAGAC TATTTACCAG GAGAGTGGGA GA-3’ (H4: SEQ ID No. 23 výpisu sekvencí). Tyto primery slouží pro zavedení rozpoznávacího místa pro restrikční enzym EcoRI, Xbal a terminačního kodonu na 5’-konec, popřípadě 3’-konec cDNA těžkého řetězce neseného plazmidem pCR-H.

Oligonukleotidové primery:

5’-GGGGAATTCA AGAAGCATCC TCTCATCTA-3’ (L3: SEQ ID No. 24 výpisu sekvencí) a

5’-GGGGCGGCCG CTTACTAACA CTCATTCCTG TTGAAGC-3’ (L4: SEQ ID No. 25 výpisu sekvencí) byly syntetizovány také. Tyto primery slouží pro zavedení rozpoznávacího místa pro restrikční enzym EcoRI a Notl stejně jako terminačního kodonu na 5’-konec, popřípadě 3’konec cDNA lehkého řetězce nesené plazmidem pCR-L.

Použitím těchto primerů lehkého a těžkého řetězce byla prováděna PCR následujícím způsobem.

Složení reakčního roztoku:

templát (pCR-H nebo pCR-L), 1 pg;

5’-primer (H3 nebo L3), 40 pmol;

3’-primer (H4 nebo L4), 40 pmol;

Tris-HCl (pH 8,0), 20 mM;

chlorid draselný, 10 mM;

síran amonný, 6 mM;

chlorid hořečnatý, 2 mM;

9

Triton X-100, 0,1 %;

bovinní sérový albumin, beznukleázový, 10 pg/ml;

směs dNTP, 0,25 mM;

Nativní Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 5 jednotek; a sterilní destilovaná voda do celkového objemu 100 μΙ.

Teplotní podmínky při PCR:

Počáteční zahřívání reakčního roztoku probíhalo při 94 °C 2 minuty a potom byly 28 x opakovány teplotní cykly 94 °C 30 s, 60 °C 30 s a 75 °C 1,5 minut.

Výsledná amplifikovaná DNA byla štěpena restrikčními enzymy EcoRI a Xbal v případě těžkého řetězce nebo EcoRI a Notl v případě lehkého řetězce a potom smísena s expresním plazmidem živočišných buněk pME18S (Hara, T., a další, (1992), EMBO J., 11, 1875), který byl buď štěpen restrikčními enzymy EcoRI a Xbal v případě těžkého řetězce nebo EcoRI a Notl v případě lehkého řetězce a defosforylován použitím CIP (jak bylo popsáno v příkladu 2 (2) 3) c) níže. 1 μΙ obsahující 4 jednotky T4 DNA ligázy byl přidán do 8 μΙ výsledné směsi a k této směsi byl také přidán 1 μΙ 10 x ligázového reakčního pufru (6 mM Tris-HCI (pH 7,5), 6 mM chlorid hořečnatý, 5 mM chlorid sodný, 7 mM β-merkaptoethanol, 0,1 mM ATP, 2 mM DTT, 1 mM spermidin a 0,1 mg/ml bovinní sérový albumin) a vzniklý ligázový roztok byl inkubován při 14 °C 15 hodin.

Potom byly 2 μΙ tohoto ligázového reakčního roztoku přidány do 50 μΙ kompetentního kmene E. coli JM109 s hustotou buněk 1-2 x 10⁹ buněk/ml (Takara Shuzo Co., Ltd.) a výsledná směs byla uchována na ledu 30 min, potom 30 s při 42 °C a opět na ledu po dobu 5 min. Potom bylo ke kultuře přidáno 500 μΙ média SOC (2 % obj. tryptonu, 0,5 % hmotnost/objem kvasničného extraktu, 0,05 % hmotnost/objem chloridu sodného, 2,5 mM chlorid draselný, 1 mM chlorid hořečnatý a 20 mM glukóza) a směs byla inkubována další 1 hodinu za třepání.

• · • · · ···· · ··· • · · · · · · ···· · • · ·· · · · · ···· ··· ·· ··· ·· ··

- 80 Transformované kmeny byly potom izolovány a plazmidová DNA byla z těchto kmenů připravena způsobem popsaným v referenčním příkladu 4 (4-3).

Výsledné plazmidy byly označeny pME-H (expresní plazmidový vektor nesoucí dDNA kódující těžký řetězec HFE7A) a pME-L (expresní plazmidový vektor nesoucí dDNA kódující lehký řetězec HFE7A). Transformované kmeny E. coli nesoucí tyto plazmidy označené E. coli pME-H a E. coli pME-L byly uloženy do sbírky Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo, 12. 3. 1997, v souladu s Budapešťskou smlouvou o ukládání mikroorganismů pod depozitním číslem FERM BP-5868, popřípadě FERM BP-5867.

(5-2) Exprese v buňkách COS-7

Trensfekce buněk COS-7 expresními plazmidy pME-H a pME-L získanými v části (5-1) výše byla provedena elektroporací s použitím přístroje pro transfekci genů (ECM600; BTX).

Buňky COS-7 (Američan Type Culture Collection No. CRL-1651) byly ponechány narůst až do semikonfluence v kultivační láhvi (kultivační plocha: 225 cm²; Sumitomo Bakelite, K. K.) obsahující médium DMEM doplněné 10 % obj. FCS. Poté bylo médium slito a bylo přidáno 3 ml roztoku trypsin-EDTA (Sigma Chemicals Co.) a směs ponechána inkubovat 3 minuty při 37 °C. Buňky uvolněné tímto postupem byly sklizeny, promyty dvakrát PBS a hustota buněk byla nastavena PBS na 5 x 10⁶ buněk/ml.

Mezitím bylo 20 pg každého z plazmidů pME-H a pME-L připravených s použitím kitu pro přípravu plazmidů ve velkém měřítku (MaxiPrep DNA Purification Systém; Promega), odděleně sráženo ethanolem a rozpuštěno vždy ve 20 μΙ sterilního PBS. Tam kde byly buňky COS-7 kotransfekovány oběma plazmidy, bylo použito 20 pg každého plazmidu a rozpuštěno společně ve 20 μΙ sterilního PBS.

···· ·· · · • · · ··

99· 99 99

9 9 9 9 99

9 99

99 9 9 ·9 μΙ buněčné suspenze připravené výše (1,2 x 10⁶ buněk) a 20 μΙ odpovídajícího roztoku plazmidu bylo smíseno a převedeno do komory s elektrodami ve vzdálenosti 2 mm (BTX). Komora byla potom vložena do přístroje pro transfekci genů a bylo použito jediného pulzu v trvání 10 ms a napětí 150 V pro dosažení celkového náboje 900 pF. Směs buněk a DNA v komoře byla přidána ke 40 ml DMEM doplněnému 10 % obj. FCS a celek byl inkubován v plastických miskách pro kultivaci buněčných kultur při koncentraci 5 % objemových CO₂ a teplotě 37 °C a 24 hodin. Potom byl supernatant z kultivace slit a buňky byly promyty bezsérovým médiem DMEM. Potom bylo do každé plastikové misky přidáno 40 ml bezsérového média DMEM a supernatant odebrán po kultivaci buněk při koncentraci 5 % obj.CO₂ a teplotě 37 °C dalších 72 hodin.

S použitím výše popsané metody byly získány buňky COS-7, které byly transfekovány buď jedním nebo oběma plazmidy (jak je ukázáno níže) a supernatant z každého transformantu byl odebrán a označen:

(A) : pouze pME-H;

(B) : pouze pME-L; a (C) : kotransfekce pME-H a pME-L.

(5-3) Detekce protilátky anti-Fas v supernatantu z transformované kultury

Exprese protilátky anti-Fas v kultivačních supernatantech získaných v části (5-2) výše byla stanovena metodou ELISA způsobem podobným jako byl popsán v referenčním příkladu 3 a s použitím fuzního proteinu lidského Fas jako antigenu. Bylo zjištěno, že produkce protilátky reagující s antigenem fuzním proteinem lidským Fas v kultivačním supernatantu nastala pouze v tom případě, jestliže pro kotransfekování buněk COS-7 byly použity oba plazmidy pME-H a pME-L (5-2 (C).

• · · ·

-82Referenční příklad 6

Určování epitopů

99 9

(6-1) ELISA

Syntézou na pevné fázi pomocí Fmoc byly syntetizovány následující peptidy (Carpino, L. A. a Han, G. Y., (1970), J. Am. Chem. Soc., 92, 5748 - 5749) s použitím automatického syntezátoru peptidů (Model 430A; Perkin Elmer, Japonsko, Applied Biosystems Division): Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gin Val Thr Asp Ile Asn Ser Lys Gly Leu (P1: SEQ ID NO: 26 ve výpisu sekvencí)

Val Thr Asp Ile Asn Ser Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu (P2: SEQ ID NO: 27 ve výpisu sekvencí)

Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr Gin Asn Leu Glu Gly Leu His His Asp (P3: SEQ ID NO: 28 ve výpisu sekvencí)

Thr Gin Asn Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gin Phe Cys His Lys Pro Cys Pro Pro (P4: SEQ ID NO: 29 ve výpisu sekvencí)

Gly Gin Phe Cys His Lys Pro Cys Pro Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys Thr Val (P5: SEQ ID NO: 30 ve výpisu sekvencí)

Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys Thr Val Asn Gly Asp Glu Pro Asp

Cys Val Pro Cys Gin (P6: SEQ ID NO: 31 ve výpisu sekvencí)

Asn Gly Asp Glu Pro Asp Cys Val Pro Cys Gin Glu Gly Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Ala (P7: SEQ ID NO: 32 ve výpisu sekvencí)

Glu Gly Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His Phe Ser Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg (P8: SEQ ID NO: 33 ve výpisu sekvencí)

His Phe Ser Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg Leu Cys Asp Glu Gly His Gly Leu Glu Val (P9: SEQ ID NO: 34 ve výpisu sekvencí) Leu Cys Asp Glu Gly His Gly Leu Glu Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Thr Gin Asn Thr (P10: SEQ ID NO: 35 ve výpisu sekvencí)

Glu Ile Asn Cys Thr Arg Thr Gin Asn Thr Lys Cys Arg Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys (P11: SEQ ID NO: 36 ve výpisu sekvencí) • · · · · ···· ·· ·· «··· · · · ··· • · · ···· 9 9 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 99 9

9999 999 9· ·99 9999

- 83 Lys Cys Arg Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His Cys Asp Pro (P12: SEQ ID NO: 37 ve výpisu sekvencí) Asn Ser Thr Val Cys Glu His Cys Asp Pro Cys Thr Lys Cys Glu His Gly Ile Ile Lys (P13: SEQ ID NO: 38 ve výpisu sekvencí)

Cys Thr Lys Cys Glu His Gly Ile Ile Lys Glu Cys Thr Leu Thr Ser Asn Thr Lys Cys (P14: SEQ ID NO: 39 ve výpisu sekvencí) Glu Cys Thr Leu Thr Ser Asn Thr Lys Cys Lys Glu Glu Gly Ser Arg Ser Asn (P15: SEQ ID NO:40 ve výpisu sekvencí)

Ser Ser Gly Lys Tyr Glu Gly Gly Asn Ile Tyr Thr Lys Lys Glu Ala

Phe Asn Val Glu (P16: SEQ ID NO: 41 ve výpisu sekvencí)

P1 až P15 jsou částečné sekvence aminokyselinové sekvence No. 1 až 157 extracelulární domény lidského Fas s vzájemně se překrývajícími mezi 9 a 11 zbytky aminokyselin. P16 je negativní kontrola, která nemá žádnou homologii s lidským Fas.

P1 až P16 byly rozpuštěny úplně vždy ve 48 μΙ dimethylsulfoxidu (DMSO) a každý vzorek byl potom nastaven na konečný objem 0,8 ml přídavkem 752 μΙ PBS obsahujícího 1 mM βmerkaptoethanol.

Výše uvedené peptidy odpovídají každý části extracelulární domény molekuly lidského Fas, ale s karboxylovou skupinou přidanou na C-konec. Každý peptid byl zředěn 0,05 M pufrem uhličitan hydrogenuhličitan (pH 9,6) obsahujícím 10 mM 2-merkaptoethanol na koncentraci 50 pg/ml a vždy 50 μΙ roztoku bylo vloženo do jamky 96jamkové mikrodestičky ELISA (Ninc). Destička byla v klidu inkubována při 4 °C přes noc pro umožnění adsorpce peptidu na stěnu jamky. Potom byl roztok v jamkách slit a každá jamka byla promyta čtyřikrát roztokem PBS - Tween. Potom bylo do každé jamky přidáno 100 μΙ PBS obsahujícího 1 % (hmotnost/objem) bovinního sérového albuminu (A3803; Sigma Chemicals Co.) a destička byla inkubována 1 hodinu při 37 °C. Jamky byly potom promyty čtyřikrát roztokem PBS-Tween a potom bylo do každé jamky přidáno 50 μΙ HFE7A nebo CH11 • · · ·

- 84 nastaveného na koncentraci 500 pg/ml v PBS. Destička byla potom inkubována 1 hodinu při 37 °C a jamky byly opět čtyřikrát promyty roztokem PBS-Tween. Po promytí bylo přidáno 50 μΙ roztoku kozí protilátky proti myšímu imunoglobulinu značené křenovou peroxidázou (Amersham) zředěného 1000 x PBS do každé jamky a destička byla znovu inkubována 1 hodinu při 37 °C a jamky byly opět promyty 4 x roztokem PBS-Tween. Potom byl přidán substrát křenové peroxidázy (BioRad) v množství 100 ml/jamku a destička byla ponechána stát 15 minut při pokojové teplotě před odečtením absorbance v každé jamce při 415 nm s použitím čtečky mikrodestiček (Corona). Jako pozitivní kontrola byl namísto syntetických peptidů použit fuzní protein lidského Fas připravený v referenčním příkladu 1.

Použitím výše uvedeného postupu bylo zjištěno, že vysoké hodnoty absorbance vykazovaly pouze jamky s adsorbovaným P11, což ukazuje, že se HFE7A specificky váže na sekvenci aminokyselin obsaženou v P11 (obr. 3).

(6-2) Identifikace epitopu rozpoznávaného HFE7A u P11 kompetitivním testem His-Gly-Leu-Glu-Val-Glu-lle-Asn-Cys-Thr-(P95: SEQ ID No. 42 výpisu sekvencí);

Glu-lle-Asn-Cys-Thr-Arg-Thr-Gln-Asn-Thr-(P100: SEQ ID No. 43 výpisu sekvencí);

Arg-Thr-GIn-Asn-Thr-Lys-Cys-Arg-Cys-Lys (P105: SEQ ID No. 1 výpisu sekvencí);

Lys-Cys-Arg-Cys-Lys-Pro-Asn-Phe-Phe-Cys-(P110: SEQ ID No. 44 výpisu sekvencí);

Pro-Asn-Phe-Phe-Cys-Asn-Ser-Thr-Val-Cys-Glu-His-Cys-Asp-(P115L:SEQ-ID-No.-45-výpisu-sekvencí;-a

Gly-Lys-lle-Ala-Ser-Cys-Leu-Asn-Asp-Asn-(D355-364:-SEQ-ID-No.-46výpisu-sekvencí).

-85P95, P100, P105 a P110 jsou vždy částečné sekvence s deseti zbytky (odpovídající aminokyselinám 95 až 128 extracelulární domény lidského Fas) aminokyselinové sekvence odpovídající P11 v extracelulární doméně lidského Fas, přičemž každá má vždy pět překrývajících se aminokyselinových zbytků se sekvencí následující.

Zamýšlený peptid P115, Pro-Asn-Phe-Phe-Cys-Asn-Ser-Thr-Val-Cys (P115: aminokyseliny No. 1 až 10 SEQ ID No. 45 výpisu sekvencí) se pěti zbytky překrývá s peptidem P110 obsahujícím deset zbytků, ale očekávalo se, že má špatnou rozpustnost, takže byly na Ckonec P115 pro vytvoření P115L přidány čtyři další zbytky.

D355 - 364 byl použit jako negativní kontrola; tento peptid nemá žádnou homologii s lidským Fas.

Každý peptid s výjimkou P115L byl úplně rozpuštěn vždy v 16 pl DMSO a celkový objem byl potom nastaven na hodnotu 0,8 ml přídavkem 784 μΙ PBS obsahujícího 1 mM 2-merkaptoethanol. P115L byl úplně rozpuštěn ve 48 μΙ DMSO a celkový objem byl nastaven na 0,8 ml přídavkem PBS s obsahem 1 mM 2-merkaptoethanolu.

Každý z výše uvedených peptidových roztoků (odpovídající 200 pg peptidu) byl smísen s 0,25 pg HFE7A v mikrozkumavce a celkový objem byl doplněn na 100 μΙ PBS obsahujícím 1 mM 2merkaptoethanol. Směs byla 2 hodiny inkubována při 37 °C za míchání při 10 až 20 ot/min a potom bylo přidáno FCS na konečnou koncentraci 5 %; tím byla získána směs peptid - protilátka.

Buňky WR19L12a byly pomnoženy podobným způsobem, jaký byl popsán v referenčním příkladu 2. Buňky potom byly odděleny centrifugací a hustota suspenze nastavená na 1 x 10⁷ buněk na ml bezsérovým médiem RPMI. Buněčná suspenze byla rozplněna po 100 μΙ na jamku do 96-jamkové destičky s dny jamek ve tvaru U a centrifugována při 4 °C, 1000 ot/min po dobu 3 minut s použitím

- 86 výkyvného rotoru pro mikrodestičky a supernatant byl odlit. Potom bylo ke každé usazenině přidáno 100 μΙ směsi peptid - protilátka a směs byla zamíchána několikanásobným pipetováním, jak bylo popsáno výše. Destička byla potom ponechána stát 30 min při 4 °C, potom abyla centrifugována a supernatant slit. Usazenina byla třikrát promyta pufrem pro průtokovou cytometrii a potom bylo do každé jamky přidáno 50 μΙ kozí antimyší protilátky IgG značené FITC (Kappel) zředěné 250 x pufrem pro průtokovou cytometrii a směs byla mírným nasáváním pipetou dobře promísena.

Destička byla udržována v temnu 30 min při 4 °C, potom byla centrifugována a supernatant odlit. Usazenina byla třikrát promyta pufrem pro průtokovou cytometrii, který obsahoval 10 % obj. neutrálního pufrovaného roztoku formaldehydu (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) pro fixaci tkání při zředění tohoto roztoku desetkrát roztokem PBS a bylo přidáno 50 μΙ/jamku tohoto roztoku a smíseno mírným nasáváním pipetou. Potom byla destička alespoň 12 hodin udržována v temnu při 4 °C pro fixaci buněk.

Potom byly buňky suspendovány po 100 μΙ/jamku v pufru pro průtokovou cytometrii a centrifugovány pro odstranění supernatantu. Usazenina byla třikrát promyta pufrem pro průtokovou cytometrii a suspendována v 500 μΙ/jamku pufru pro průtokovou cytometrii a výsledná suspenze byla analyzována na průtokovém cytometru (Cytoace-150; Nippon Buňko, K. K. - excitační vlnová délka: 488 nm; vlnová délka detekce: 530 nm) pro výpočet průměrných intenzit fluorescence FITC na buňku. Průměrné intenzity fluorescence FITC pro každý vzorek byly vypočteny tak, že hodnota vzorku, který neobsahoval směs peptid - protilátka byla položena rovna nule a hodnota vzorku obsahujícího D355 - 364 100 %.

Výše uvedeným postupem bylo zjištěno, že P105 je schopen silně inhibovat vazbu mezi buňkami v HFE7A a WR19L12a a že P100 a P110, jejichž aminokyselinové sekvence se překrývají vždy z 50 % • ·

• · · · · · · • ···· · ··· • · » · · ···· · • · · · · · * · ·♦· · · · · s P105, inhibují každý vazbu mezi HFE7A a WR19L12a přibližně o 50 %, popřípadě 60 %. Použitím P95 a P115L, které rovněž nemají překrývající se úseky společné s P105 (obr. 4), nedošlo k žádné inhibici. Z těchto výsledků bylo zjištěno, že P105 představuje sekvenci aminokyselin schopnou inhibovat vazbu mezi HFE7A a lidským Fas a že tedy epitop pro HFE7A musí být umístěn uvnitř aminokyselinové sekvence reprodukované v P105. Tato epitopová sekvence aminokyselin je oblastí, která je konzervována mezi lidským Fas a myším Fas.

Referenční příklad 7

Vazba HFE7A na opičí Fas

Pro zjištění, zda byla schopna HFE7A vazby na antigen Fas z různých druhů primátů, byl proveden následující test.

Nejprve byly odebrány ze šimpanze (Sanwa Kagaku Kenkyujo Kumamoto Primates Park) vzorky periferní krve (40 ml), z japonské opice (Macaca fuscata) nebo z opice „crab-eating monkey“ (Macaca irus) 20 ml a 3 ml z kosmana (rod Hapalidae). Ke vzorkům krve byl přidán 1 ml heparinu (Novoheparin; Novo) a vzorky byly potom pomalu převrstveny přes stejný objem roztoku Ficol Paque (Pharmacía), hustota 1,077 g/cm³ ve všech případech kromě Macaca irus, u kterého bylo použito hustoty 1,072 g/cm³ a centrifugovány při 1700 ot/min 30 minut pro získání frakce mononukleárních buněk periferní krve. Tato frakce mononukleárních buněk byla dvakrát promyta Hanksovým vyváženým fyziologickým roztokem a potom suspendována v médiu RPMI 1640 obsahujícím 10 % obj. FCS na hustotu buněk 1 x 10⁶ buněk/ml. K získané suspenzi byl přidán Phytohemagglutinin-P (Sigma Chemicals, Co.) na konečnou koncentraci 5 pg/ml a vzorek byl inkubován při 37 °C a koncentraci CO₂ 5 % objemových 24 hodin. Potom byly buňky odděleny centrifugací, promyty a resuspendovány v médiu RPMI 1640 s obsahem 10 % obj. FCS. Potom byl přidán

k suspenzi interleukin-2 (Amersham) na konečnou koncentraci 10 jednotek/ml pro aktivaci získaných buněk a suspenze byla inkubována při 37 °C s koncentrací 5 % objemových CO₂ po dobu 72 hodin. Množství aktivovaného preparátu vypočtené pro získání 1 x 10⁶ aktivovaných lymfocytůbylo vloženo do zkumavky a buď suspendováno v 50 pl HFE7A 20 pg/ml v PBS nebo 50 μΙ samotného PBS. Výsledná suspenze byla ponechána stát na ledu 1 hod a potom byly buňky třikrát promyty alikvoty 500 ml PBS a potom suspendovány v 50 μΙ protilátky proti myšímu IgG (Bioresource), 20 pg/ml v PBS. Tato suspenze byla umístěna do ledu na 30 minut a třikrát promyta alikvotem 500 μΙ PBS. S použitím buněk suspendovaných v 500 μΙ PBS jako kontrolách byly měřeny intenzity fluorescence s použitím průtokového cytometru (Cytoace; Nippon Buňko, K. K.).

Distribuce počtu buněk byla získána pomocí intenzity fluorescence a byly vypočteny podíly počtu obarvených buněk k počtu celkových buněk. Bylo zjištěno, že ve vzorcích bez HFE7A tvořily zbarvené buňky u všech druhů méně než 3 %. Ve vzorcích s HFE7A bylo však obarveno alespoň 17 % buněk, přičemž bylo dosaženo maxima 82 % HFE7A je tedy schopen vázat široký rozsah Fas primátů včetně lidí, proti jejichž Fas byl HFE7A původně připraven.

Referenční příklad 8

Aktivita HFE7A indukující apoptózu u myších T buněk in vivo

Myším ve třech skupinách 6 týdnů starých samic C3H/HeJ (z Japan Clea) bylo intraperitoneálně podáno buď 500 μΙ samotného PBS nebo 0,05 nebo 0,1 mg monoklonální protilátky HFE7A (v 500μΙ PBS). Myši byly 42 hodin po podání anestetizovány etherem a byl vyjmut thymus. Tyto thymy byly promyty médiem RPMI s obsahem 10 % obj. FCS a potom rozdrceny s použitím špachtle nebo síta (Cell Strainer; Falcon). Rozdrcené buňky (které prošly sítem) byly dvakrát promyty médiem RPMI 1640 s obsahem 10 % obj. FCS.

• · · · · · · · «· + · ··· ♦· ·99 ·· ··

- 89 Jestliže se v některém z uvedených příkladů hovoří o vícenásobném praní, rozumí se, že pro každé promytí je médium nahrazeno čerstvým médiem, pokud není uvedeno jinak.

Získané promyté buňky byly spočítány a jejich počet nastaven na 1 x 10⁶ buněk v 50 μΙ média RPMI 1640 obsahujícího 10 % objemových FCS. Každá ze získaných suspenzí byla rozplněna do jamky 96-jamkové mikrodestičky se dnem ve tvaru U (Nunc) a destička byla potom centrifugována (90 x g, 4 °C, 10 minut).

Supernatanty byly slity a potom byl do každé jamky přidán roztok následujících dvou fluorescenčně značených protilátek (a) nebo (b) v PBS:

(a) 10 μΙ protilátky proti myšímu CD95 (Fas) značené FITC (Jo2; PharMingen), 0,5 mg/ml a 10 μΙ protilátky proti myšímu CD90 značené phycoerythrinem (PE) (Thy-1.2; Cedarlane; CD90 je buněčný povrchový antigen exprimovaný pouze T buňkami), 0,5 mg/ml;

(b) 10 μΙ protilátky proti myšímu CD4 značené FITC (L3T4; PharMingen), 0,5 mg/ml a 10 μΙ protilátky proti myšímu CD8 (Ly-2; PharMingen), 0,2 mg/ml.

Po přidání směsí protilátek byla destička třepána pro smísení obsahů jamek a potom před centrifugováním udržována 1 hodinu na ledu (centrifugace 90 x g, 4 °C, 10 minut). Po slití supernatantu a promytí jamek dvakrát 100 μΙ/jamku pufru pro průtokovou cytometrii byly buňky fixovány přídavkem 3,7 % objemových roztoku formaldehydu 50 μΙ/jamku a potom ponechány stát v ledu 10 minut. Po další centrifugaci (90 x g, 4 °C, 10 min) pro odstranění supernatantu byly usazené buňky opět promyty 100 μΙ/jamku pufru pro průtokovou cytometrii a suspendovány ve 100 μΙ/jamku pufru pro průtokovou cytometrii. S použitím takto získaných buněčných suspenzí z jamek jako vzorků byla měřena fluorescence 1 x 10⁴ buněk průtokovým cytometrem (Epics Elitě; Coulter) za následujících podmínek: excitační vlnová délka: 488 nm;

-90vlnová délka detekce: 530 nm (FITC) nebo 600 nm (PE).

Tak mohly být připraveny distribuční křivky fluorescence FITC a PE pro populace buněk. Pro vzorky, ke kterým byla přidána směs protilátek (a), byl vypočten podíl počtu buněk, které byly pozitivní pro Fas a CD90 (dále označované jako „Fas* CD90*“) vzhledem k celkovému počtu buněk. Podobně pro vzorky, ke kterým byla přidána směs protilátek (b), byl vypočten podíl počtu buněk pozitivních na CD4 a CD8 (dále označované jako „CD4*CD8⁺“) nebo buněk, které byly pozitivní na CD4 ale negativní na CD8 (zde označované jako „CD4*CD8 “) vzhledem k celkovému počtu buněk.

Výsledky jsou uvedeny jako procenta v tabulce 1 níže.

Tabulka 1

Buňka	Fas*CD90*	CD4*CD8*	CD4*CD8'
Samotný PBS	76,2	62,6	11,7
0,05 mg HFE7A	2,3	1,9	1,2
0,1 mg HFE7A	1,7	2,8	0,7

Ve srovnání se skupinou, které byl podáván samotný PBS, byly u obou dávek značně sníženy podíly T buněk exprimujících Fas (Fas*CD90*) v buňkách Thymu myši ve skupinách, kterým byl podáván HFE7A. Navíc byl ve srovnání se skupinou, které byl podáván samotný PBS, rovněž výrazně snížen po podání HFE7A počet buněčných populací CD4*CD8* a CD4*CD8‘.

Bylo tedy odvozeno, že monoklonální protilátka anti-Fas HFE7A má na T buňkách exprimujících Fas in vivo apoptózu indukující účinek.

• · · · • · · · · · · ···· · • · · · · · · · ···· ··· ·· ··· ·· ··

- 91 Referenční příklad 9

Účinky HFE7A na model autoimunitního onemocnění

Účinky podávání monoklonální protilátky anti-Fas HFE7A na příznaky autoimunitního onemocnění byly vyšetřovány s použitím myši MRL gld/gld. Tyto myši nesou mutantu genu ligand Fasu a slouží jako zvířecí model autoimunitních systémových onemocnění typu lupus erythematosus týdnů starým myším MRL gld/gld (z Japan SLC, K. K.) byla intraperitoneálně podána jediná dávka buď 0,2 nebo 0,5 mg monoklonální protilátky HFE7A připravené v referenčním příkladu 3 (v 500 μΙ PBS) nebo 500 μΙ samotného PBS.

Každá testovací myš byla monitorována na otékání kotníků jako příznak autoimunitního onemocnění. Stupeň otoku byl vyhodnocen a v každé skupině zaznamenáván v průběhu času (Shin Yonehara, (1994), Nikkei Science Bessatsu, 110, 66 - 77). Stupeň otoku končetin se podáním HFE7A výrazně snížil.

Z testovacích myší byly odstraněny thymy a způsobem popsaným v referenčním příkladu 8 výše byly stanoveny podíly T buněk, které exprimovaly Fas v thymech. Výsledky ukázaly, že počet T buněk exprimujících Fas v thymech byl výrazně snížen po podání HFE7A, což je ve shodě s výsledky získanými v referenčním příkladu

8.

Referenční příklad 10

Testování hepatotoxicity

Myším BALB/c byla intraperitoneálně podána jediná dávka následujích látek:

i) 0,2 mg HFE7A v 500 μΙ PBS;

• · · · · · • · ·· · · · · ···· ··· ·· ··· ·· ·· ii) 0,5 mg HFE7A v 500 μΙ PBS;

iii) 0,1 mg Jo2 (PharMingen) v 500 μΙ PBS; a iv) 500 μΙ samotného PBS.

Z výše uvedených látek je Jo2 známá protilátka proti myšímu Fas, která má apoptózu indukující účinek. V časech 8 hodin, 24 hodin nebo 72 hodin po podání byly myším odebírány vzorky krve z aorta posterior. Myším ošetřeným Jo2 byla krev odebírána 3 hod po podání, když byly ještě naživu. Všechny vzorky krve byly odebírány za lehké anestetizace etherem. V každém vzorku krve byly měřeny hladiny glutamát-oxalacetát transaminázy (GOT) a glutamát-pyruvát transaminázy (GPT) s použitím automatického analyzátoru (Model 7250; Hitachi Seisakusyo, K. K.) spolu s vhodnými reagenciemi pro analyzátor (Transaminase-HRII; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Myši ošetřené Jo2 vykázaly rychlé zvýšení hladiny GOT a GPT po 3 hodinách, zatímco odpovídající hodnoty pro skupiny ošetřené HFE7A ukázaly malou změnu, stejně jako skupina ošetřená samotným PBS (obr. 5). Z těchto výsledků bylo možno zjistit, že HFE7A neindukovala akutní poruchy jater.

Referenční příklad 11

Účinky na model fulminantní hepatitidv

Je známo, že po intraperitoneálním podání antimyší Fas protilátky Jo2 se u myší rozvíjí fulminantní hepatitida a myši zahynou během několika hodin (Ogasawara, J., a další, (1993), Nátuře, 364, 806). Aby bylo možno vyhodnotit účinky HFE7A na poruchy jater indukované Jo2, byla testována životaschopnost myší podáním HFE7A současně s nebo po podání Jo2.

Samicím 6 týdnů starých myší BALB/c (3 myši na skupinu; z Japan SLC) byl intraperitoneálně podán preparát protilátky podle následujícího schématu:

···· · · ·· • · · · · · · • · · · · · · · ···· ··· ·· ··· ·· ·· (A) 0,1 mg Jo2 v 0,5 ml PBS;

(B) 0,01 mg Jo2 v 0,5 ml PBS;

(C) 0,1 mg Jo2 a 0,1 mg HFE7A spolu v 0,5 ml PBS (současné podávání);

(D) 0,2 mg Jo2 a 0,05 mg HFE7A v 0,5 ml PBS (současné podávání); a (E) 0,01 mg Jo2 v 0,2 ml PBS, následované 0,1 mg HFE7A v 0,2 ml PBS po 20 minutách;

a myši byly průběžně pozorovány. Výsledky jsou uvedeny v obrázku 6.

V případě podávání samotné Jo2 zahynuly všechny myši během 9 hodin bez ohledu na to, jestli bylo podáno 0,1 mg nebo 0,01 mg Jo2/myš, tj. myši ze skupin (A) a (B) všechny zahynuly do 9 hodin od podání. Naopak při současném podání HFE7A a Jo2 Qak 0,5 mg/myš, tak i 0,05 mg/myš), tj. u skupin (C) a (D) výše, neukázaly myši žádné změny dokonce i několik týdnů po podání, což ukazuje, že podání HFE7A může blokovat vývoj fulminantní hepatitidy. Navíc zůstaly myši v normálním stavu bez zřejméno vývoje příznaků dokonce i v tom případě, když byla HFE7A podána 20 min po podání Jo2.

HFE7A má tedy preventivní a terapeutické účinky na různá onemocnění včetně poruch normálních tkání zprostředkovaných systémem Fas/ligand Fas, a to jak u jater, tak i u jiných orgánů.

Referenční příklad 12

Účinky na revmatoidní artritidu

1) Preventivní vliv na rozvoj kolagenem indukované artritidy

Myši F1 získané pářením samice myši BALB/c a samce myši DBA/1J (myši CD1F1, 6 týdnů staré, samice, z Japan Charles River, • · · · · · ···· · · · ·· ♦ · • · · ···· ·· · · • · · · · ♦ · ···· · • · · · ···· ···· ··· ·· ··· ·· ··

-94 Κ. Κ.) byly udržovány v klidu 1 týden. Potom byl myším podán kolagen pro indukci artritidy.

Podrobněji, metoda je založena na způsobu popisovaném v literatuře (Phadke, K., (1985), Immunopharmacol., 10, 51 - 60). Při této metodě se zředí roztok hovězího kolagenu typu II (Collagen Gijutsu Kensyukai, dodávaný v roztoku s 50 mM kyselinou octovou) koncentrace 0,3 % hmotnost/objem zředí na 0,2 % (2 mg/ml) další 50 mM kyselinou octovou a potom se emulguje stejným objemem Freundova kompletního adjuvans (Difco). Tato emulze byla potom podána v množství 100 μΙ (odpovídající 100 pg bovinního kolagenu typu 2) intradermálně do proximální části ocasu, který byl pro intravenózní injekci fixován s použitím 1 ml plastické stříkačky opatřené tuberkulinovou jehlou. Jeden týden po počátečním podání byla podána stejná zesilující dávka.

Ve stejné době jako zesilující injekce byla myším (6 myší na skupinu) podána intraperitoneálně injekce 100 pg buď HFE7A nebo kontrolního myšího IgG v 0,5 ml PBS. Počínaje pátým týdnem po počátečním podání bylo vizuálně monitorováno otékání končetin. Stupeň otékání kloubů končetin byl hodnocen metodou podle Wood, F. D., a další (Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., (1969), 35, 456 - 467). Pro výpočty výsledků hodnocení pro každou končetinu bylo tedy použito následujících stupňů:

Hodnocení

0: bez příznaků;

1: otok a zčervenání pouze jednoho z malých kloubů, například prstů u nohy;

2: otok a zčervenání dvou nebo více malých kloubů nebo jednoho realtivně velkého kloubu jako je kotník; a

3: otok a zčervenání celé končetiny.

·· · ·· ·· ·· · · · · • · · · ··· ·· · · • · · · · ·« ·· · · • · · · · ♦ · ···· · • · ·· ···· ···· ··· ·· ···9· ··

-95 Maximální hodnocení pro jedno zvíře je dosaženo v případě, jestliže otečou všechny čtyři končetiny a má hodnotu 12. Hodnocení zvířat alespoň 1 pro všechny čtyři končetiny bylo označeno jako „postižená myš“. Výsledky jsou uvedeny v obr. 7.

V kontrolní skupině, které byl podán nespecifický myší IgG byly všechny myši do 7 týdnů po počátečním podávání postiženy, zatímco u skupiny, které byl podáván HFE7A, nevykázala polovina myší žádné zčervenání na žádném z kloubů po celou dobu až do osmého týdne (obr. 7A). Navíc měla skupina ošetřená HFE7A nižší průměrné celkové hodnocení ve srovnání s kontrolní skupinou (obr. 7B).

2) Indukce apoptózv u svnoviálních buněk revmatických pacientů

Byly vyhodnocovány účinky HFE7A na životaschopnost synoviálních buněk u pacientů s revmatoidní artritidou. Bylo použito metody popsané níže s použitím redukující schopnosti mitochondrie jako indexu.

Synoviální tkáň získaná z postižené oblasti pacienta s revmatoidní artritidou byla nůžkami nastříhána na malé kousky v médiu Dulbecco’s modified Eagle medium (Gibco) doplněném 10 % obj. FCS (Summit). Byl odstraněn tuk, ke směsi byla přidána kolagenáza (Sigma Chemical Co.) do konečné koncentrace 5 pg/ml a směs byla inkubována 90 min při 37 °C v atmosféře 5 % obj. CO₂. Vzniklé inkubované buňky potom sloužily po zbytek experimentu jako synoviální buňky.

Takto získané synoviální buňky byly rozděleny na jednotlivé buňky působením 0,05 % hmotnost/objem vodního roztoku trypsinu 2 min při teplotě 37 °C a potom suspendovány v médiu Dulbecco’s modified Eagle medium obsahujícím 10 % obj. FCS na hustotu buněk 1 x 10⁵/ml. Tato buněčná suspenze byla potom rozplněna do jamek na 96-jamkové destičce při koncentraci 2 x 10⁴ buněk/200 μΙ na jamku a inkubována 37 °C v atmosféře 5 % objemových CO₂ po dobu 6 dnů.

- 96 ·· · ·«···· ·· ·· ···· ··· · · · · • · ····· ···· • · «· · ·· * · · · · • · · · · · · · • to·· ··· ·> ··· ·· ··

Supernatant z kultury byl odlit a buňky byly třikrát promyty Hankovým pufrem (Gibco). Po promytí bylo přidáno 200 pl média Dulbecco’s modified Eagle medium obsahujícího 10 % objemových FCS a mezi 10 a 1000 ng/ml HFE7A (sériová ředění 10 x) do každé jamky a deska byla dále inkubována 20 hodin při 37 °C v atmosféře 5 % objemových C0₂. Potom bylo do každé jamky přidáno 50 μΙ vodného roztoku s koncentrací 1 mg/ml XTT (vnitřní sůl 2,3-bis[2-methoxy-4-nitro-5sulfofenyl]-2H-tetrazolium-5-karboxanilidu; Sigma Chemical Co.) a 25 μΜ PMS (fenazinmethosulfát; Sigma Chemical Co.) za dosažení konečných koncentrací 250 μg/ml XTT a 5 μΜ PMS. Po dalších čtyřech hodinách inkubace při 37 °C v atmosféře 5 % obj. CO₂ byla odečítána sbsorbance v každé jamce při 450 nm.

Životaschopnost (viabilita) buněk v každé jamce byla vypočtena podle následujícího vzorce:

Viabilita (%) = 100 x (a - b)/(c - b), kde „a“ je absorbance v testovací jamce, „b“ je absorbance jamky bez přidaných buněk a „c“ je absorbance jamky bez přidaných protilátek.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2. HFE7A inhibovala přežívání synoviálních buněk z pacientů s revmatismem v závislosti na dávce.

Tabulka 2

Koncentrace HFE7A	Průměrná viabilita
(ng/ml)	(%)
0	100
10	91
100	77
1000	42

• φ φφφφ φφ φφ • φφφ · · φ · · « · φ · · · φφφ φ · ·· • φφφφ φ φ *·Φφ φ φ φ φφ φ φ » φ φφφφ φφφ φφ φφφ φ* φφ

-97 Příklad 1

Návrh humanizované verze protilátky HFE7A (1) Molekulární modelování variabilních oblastí HFE7A

Molekulární modelování variabilních oblastí HFE7A bylo prováděno metodou obecně známou jako homologní modelování (Methods in Enzymology, 203, 121 - 153, (1991).

Primární sekvence variabilních oblastí lidského imunoglobulinu registrované v proteinové databance (Protein Data Bank, dále označovaná jako „PDB“; Chemistry Department, Building 555, Brookhaven National Laboratory, P. O. Box 5000, Upton, NY 11973 5000, USA), pro kterou byla provedena rentgenová krystalografie, byla porovnána s rámcovými oblastmi HFE7A určenými výše. Jako výsledek byly vybrány jako oblasti s nejvyššími homologiemi trojrozměrných struktur 1GGI a 2HFL pro lehký, popřípadě těžký řetězec. Trojrozměrné struktury rámcových oblastí byly vytvořeny kombinací vlastností 1GGI a 2HFL a výpočtem vlastností oblastí HFE7A jak bude popsáno níže, za získání „rámcového modelu“ (framework model).

Použitím klasifikace popsané u Chothia a dalších, mohly být CDR HFE7A klasifikovány následujícím způsobem: CDRL₂, CDRL₃ a CDRHi patří všechny do kanonické třídy 1, zatímco CDRL!, CDRH₂ a CDRH₃ podle současných znalostí patrně nepatří do některé konkrétní kanonické třídy. Smyčkám CDR oblastí CDRL₂, CDRL₃ a CDRHi byly připisovány konformace nezávisle na jejich kanonických třídách a potom integrovány do rámcového modelu. CDRLi byla označena konformací clusteru 15B podle třídění Thorntona a dalších (J. Mol. Biol., 263, 800 - 815 (1996). Pro CDRH₂ a CDRH₃ byly z PDB zvoleny konformace sekvencí s vysokou homologií a ty byly potom kombinovány s výsledky energetických výpočtů. Konformace smyček • ·

- 98 CDR s nejvyššími pravděpodobnostmi byly potom integrovány do rámcového modelu.

Nakonec byly provedeny energetické výpočty pro odstranění nežádoucího kontaktu mezi nepříslušnými atomy z hlediska energie pro získání celkového molekulárního modelu HFE7A. Výše uvedený postup byl proveden s použitím komerčně dostupného běžného systému pro molekulární modelování AbM (Oxford Molecular Limited, lne.), ačkoliv by mohlo být použito i jiného vhodného systému.

Pro získaný molekulární model byla struktura dále hodnocena s použitím softwaru PROCHECK (J. Appl. Cryst., (1993), 26, 283 291) a byl vypočten stupeň expozice povrchu každého zbytku pro určení, které povrchové atomy a skupiny vstoupily do reakce.

(2) Volba akceptorů

Podskupiny lehkého a těžkého řetězce HFE7A měly identity ze 79 % s podskupinou kIV a rovněž 79 % s podskupinou I porovnáním s konvenčními sekvencemi odpovídajících podskupin lidských protilátek.

Nevyskytla se však žádná lidská protilátka, která by obsahovala kombinaci lehkého řetězce kIV a těžkého řetězce podskupiny I. Jako jediná lidská protilátka, která měla lehký a těžký řetězec v obou případech s identitou větší než 70 % s lehkým a těžkým řetězcem HFE7A, byla zvolena 8E10’CL, která obsahovala lehký řetězec podskupiny kIII a těžký řetězec podskupiny I, které měly 72 % a 77 % sekvenční identitu s lehkým a těžkým řetězcem HFE7A.

(3) Volba donorovych zbytků pro přenos na akceptorv

Použitím softwaru Cameleon (Oxford Molecular Limited, lne.) byly vedle sebe postaveny aminokyselinové sekvence z lehkých a těžkých řetězců HFE7A a odpovídajících řetězců 8E10OL a podle popisu v následujících příkladech podle obecného schématu • · · · ···· ··· ···· • · · · · · · · ··· • ···· ······· • · · · · ··· ···· ··· ·· ··· ·· ··

- 99 uvedeného v odstavcích a) až e) výše byly získány humanizované sekvence variabilních oblastí. Byly zkonstruovány plazmidy, které mohly sloužit jako rekombinantní vektory obsahující nukleotidové sekvence DNA kódující humanizované protilátky proti lidskému Fas.

Příklad 2

Příprava DNA kódující humanizovaný lehký řetězec (1) Klonování cDNA kódující lidsky lehký řetězec (řetězec k) s plnou délkou

Před humanizací aminokyselinové sekvence lehkého řetězce myší protilátky HFE7A proti lidskému Fas bylo nejprve provedeno klonování cDNA lehkého řetězce lidského imunoglobulinu obsahujícího konstantní oblast.

1) Syntéza primerů

Separace cDNA kódující lidský lehký řetězec byla provedena pomocí PCR. Pro PCR byly syntetizovány následující primery: 5’-GCGAATTCTG CCTTGACTGA TCAGAGTTTC CTCA-3’ (HVKII5-4: SEQ ID No. 47 ve výpisu sekvencí); a 5’-GCTCTAGATG AGGTGAAAGA TGAGCTGGAG GA-3’ (HKCL3-3: SEQ ID No. 48 ve výpisu sekvencí).

2) Konstrukce plazmidu obsahující cDNA lehkého řetězce lidského imunoglobulinu cDNA kódující lehký řetězec lidského imunoglobulinu s úplnou délkou byla připravena pomocí PCR, vložena do plazmidu a klonována do E. coli.

Fragment HL-DNA kódující lehký řetězec lidského imunoglobulinu s úplnou délkou byl připraven za následujících podmínek:

• · · ♦ 9 · · ···· · • ' · ·· · ··· ···· ··· ·· ··· ·· «·

- 100 Složení reakčního roztoku PCR:

knihovna lidské lymfocytární cDNA (Life Technologies), 25 ng;

oligonukleotidový primer HVKII5-4, 50 pmol;

oligonukleotidový primer HKCL3-3, 50 pmol;

mM směs dNTP, 10 μΙ;

100 mM pufr Tris-HCI (pH 8,5), 10 μΙ;

M chlorid draselný (KCI), 5 μΙ;

mM chlorid hořečnatý (MgCI₂), 10 μΙ;

Taq DNA polymeráza (Perkin Elmer Japonsko), 1 jednotka;

redestilovaná voda do celkového objemu 100 μΙ.

Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem: roztok byl nejprve zahřát na 94 °C 2 minuty, a potom byl třicetkrát opakován cyklus zahřívání na 94 °C 1 minutu, 55 °C 1 minutu a 72 °C 2 minuty. Po ukončení tohoto postupu byl reakční roztok 10 min zahříván na 72 °C.

Takto připravený fragment HL-DNA (DNA lidského lehkého řetězce) byl vložen pomocí kitu eukaryote TA Cloning Kit (Invitrogen) podle doporučení výrobce do plazmidu pCR3DNA, který byl zaveden do kompetentní buňky E. coli TOP10F’ obsažené v kitu podle doporučení výrobce. Tím byl získán plazmid pHL15-27 nesoucí fragment HL-DNA, tj. cDNA lehkého řetězce lidského imunoglobulinu.

(2) Konstrukce expresních vektorů pro lehké řetězce humanizovaných verzí protilátky HFE7A

1) Konstrukce expresních plazmidových vektorů lehkého řetězce humanizované HFE7A

Humanizace aminokyselinové sekvence lehkého řetězce myší protilátky proti lidskému Fas HFE7A vyžadovala náhradu • ·

- 101 • · · · ·· ··· • · · · · · · · • ·· · · • ♦ φ···· ·· aminokyseliny v poloze 47 (prolin) a aminokyseliny v poloze 49 (lyzin) z N-konce aminokyselinové sekvence lehkého řetězce (dále označované jako „oblast Γ) alaninem, popřípadě argininem. Alanin (47) a arginin (49) jsou v lidském lehkém řetězci (řetězec k). Byla také provedena další humanizace, která zahrnovala náhradu aminokyseliny v poloze 80 (histidin), v poloze 81 (prolin), v poloze 82 (valin), v poloze 84 (kyselina glutamová), v poloze 85 (kyselina glutamová), v poloze 87 (alanin) a v poloze 89 (threonin) (v oblasti dále označované jako „oblast II“) serinem, argininem, leucinem, prolinem, alaninem, fenylalaninem a valinem, protože tyto aminokyseliny jsou v lidském lehkém řetězci (řetězec k).

Když byly humanizovány obě oblasti I a II, sekvence byla označena jako „typ HH“.

Když byla humanizována pouze oblast I, sekvence byla označena jako „typ HM“.

Když nebyla humanizována žádná oblast, sekvence byla označena jako „typ MM“.

Následujícím způsobem byly zkonstruovány expresní plazmidy, nesoucí vždy jeden ze tří typů sekvencí aminokyselin humanizovaných lehkých řetězců z protilátky HFE7A proti lidskému Fas.

2) Syntéza primerů pro přípravu variabilních a konstantních oblastí lehkého řetězce humanizované HFE7A

Pro konstrukci následujících sekvencí DNA bylo použito PCR, přičemž sekvence obsahovaly jednu ze sekvencí HH, HM nebo MM popsaných výše, spolu s konstantních oblastí lehkého řetězce lidského imunoglobulinu (řetězec k):

DNA (SEQ ID No. 49 ve výpisu sekvencí) kódující polypeptidový řetězec typu HH (SEQ ID No. 50 ve výpisu sekvencí);

• · · · ··· ···· • · · · · · · · ··· • · · · · · « ···· · • · · · · ··· ···· ··· ·· ··· ·· ··

- 102 DNA (SEQ ID No. 51 ve výpisu sekvencí) kódující polypeptidový řetězec typu HM (SEQ ID No. 52 ve výpisu sekvencí); a

DNA (SEQ ID No. 53 ve výpisu sekvencí) kódující polypeptidový řetězec typu MM (SEQ ID No. 54 ve výpisu sekvencí).

5’-CCCAAGCTTA AGAAGCATCC TCTCATCTAG TTCT-3’ (7AL1P; SEQ ID No. 55);

5’-GAGAGGGTGG CCCTCTCCCC TGGAGACAGA GACAAAGTAC CTGG-3’ (7AL1N; SEQ ID No. 56);

5’-CCAGGTACTT TGTCTCTGTC TCCAGGGGAG AGGGCCACCC

TCTC-3’ (7AL2P; SEQ ID No. 57);

5’-GATTCGAGAT TGGATGCAGC ATAGATGAGG AGTCTGGGTG

CCTG-3’ (7AL2N; SEQ ID No. 58);

5’-GCTGCATCCA ATCTCGAATC TGGGATCCCA GACAGGTTTA

GTGGC-3’ (7AL3PA; SEQ ID No. 59);

5’-AAAATCCGCC GGCTCCAGAC GAGAGATGGT GAGGGTGAAG

TCTGTCCCAG AC-3’ (7AL3N; SEQ ID No. 60);

5’-CTCGTCTGGA GCCGGCGGAT TTTGCAGTCT ATTACTGTCA

GCAAAGTAAT GAGGATCC-3’ (7AL4P; SEQ ID No. 61);

5’-TGAAGACAGA TGGTGCAGCC ACAGTCCGTT TGATTTCCAG

CCTGGTGCCT TGACC-3’ (7AL4N; SEQ ID No. 62);

5’-GGTCAAGGCA CCAGGCTGGA AATCAAACGG ACTGTGGCTG

CACCATCTGT CTTCA-3’ (7ALCP; SEQ ID No. 63);

- 103 • ·

5’-CCCGAATTCT TACTAACACT CTCCCCTGTT GAAGCTCTTT

GTGAC-3’ (7ALCN; SEQ ID No. 64);

5’-TCTGTCCCAG ACCCACTGCC ACTAAACCTG TCTGGGATCC

CAGATTCGAG ATTGG-3’ (M7AL2N; SEQ ID No. 65);

5’-GTTTAGTGGC AGTGGGTCTG GGACAGACTT CACCTCTACC

ATCCATCCTG TGGAG-3’ (M7AL3PA; SEQ ID No. 66); a

5’-ATGGTGCAGC CACAGTCCGT TTGATTTCCA GCCTGGTGCC

TTGACCGAAC GTCCG-3’ (7AL4NA; SEQ ID No. 67).

3) Konstrukce plazmidu P7AL-HH (expresní plazmid humanizovaného lehkého řetězce HFE7A typu HH

Fragment VHH-DNA (SEQ ID No. 49 ve výpisu sekvencí) kódující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID No. 50 ve výpisu sekvencí byl připraven třístupňovou PCR a potom vložen do plazmidového vektoru a klonován do E. coli.

a) První stupeň PCR

Znázornění prvního stupně PCR pro přípravu VHH-DNA je uvedeno v obr. 8.

Fragment L7A1-DNA kódující sekreční signálovou sekvenci a část oblasti FRL: změněný tak, aby obsahoval štěpící místo restrikčního enzymu Hindlll na 5’-konci byl připraven následujícím způsobem.

Složení reakčního roztoku PCR:

plazmid pME-L DNA, 200 ng;

oligonukleotidový primer 7AL1P, 80 pmol;

- 104 -

oligonukleotidový primer 7AL1N, 80 pmol;

směs dNTP, 20μΙ;

pufr 10 x Pfu, 20 μΙ;

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek; a redestilovaná voda do celkového objemu 200 μΙ.

Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejprve zahřát na 2 minuty na teplotu 94 °C a potom byl třicetkrát opakován cyklus zahřívání 1 min 94 °C, 1 min 55 °C a 2 min při teplotě 72 °C. Po ukončení tohoto postupu byl reakční roztok zahříván 10 min při teplotě 72 °C.

Fragment L7A2-DNA kódující část FRLi, CDRLi, FRL₂ a část oblasti CDRL₂ byl připraven následujícím způsobem.

Složení reakčního roztoku PCR:

plazmid pME-L DNA, 200 ng;

oligonukleotidový primer 7AL2P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer M7AL2N, 80 pmol;

směs dNTP, 20μΙ;

pufr 10 x Pfu, 20 μΙ;

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek; a redestilovaná voda do celkového objemu 200 μΙ.

Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejprve zahřát na 2 minuty na teplotu 94 °C a potom byl třicetkrát opakován cyklus zahřívání 1 min 94 °C, 1 min 55 °C a 2 min při teplotě 72 °C. Po ukončení tohoto postupu byl reakční roztok zahříván 10 min při teplotě 72 °C.

Fragment L7A3-DNA kódující CDRL₂ a část FRL₃ byl připraven následujícím způsobem.

• · • φ

Složení reakčního roztoku PCR:

plazmid pME-L DNA, 200 ng;

oligonukleotidový primer 7AL3PA, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7AL3N, 80 pmol;

směs dNTP, 20μΙ;

pufr 10 x Pfu, 20 μΙ;

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek; a redestilovaná voda do celkového objemu 200 μΙ.

Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejprve zahřát na 2 minuty na teplotu 94 °C a potom byl třicetkrát opakován cyklus zahřívání 1 min 94 °C, 1 min 55 °C a 2 min při teplotě 72 °C. Po ukončení tohoto postupu byl reakční roztok zahříván 10 min při teplotě 72 °C.

Fragment L7A4-DNA kódující část FRL₃, CDRL₃, FRL₄ a část konstantní oblasti byl připraven následujícím způsobem.

Složení reakčního roztoku PCR:

plazmid pME-L DNA, 200 ng;

oligonukleotidový primer 7AL4P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7AL4N, 80 pmol;

směs dNTP, 20μΙ;

pufr 10 x Pfu, 20 μΙ;

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek; a redestilovaná voda do celkového objemu 200 μΙ.

Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejprve zahřát na 2 minuty na teplotu 94 °C a potom byl třicetkrát opakován cyklus zahřívání 1 min 94 °C, 1 min 55 °C a 2 min při

- 106 teplotě 72 °C. Po ukončení tohoto postupu byl reakční roztok zahříván 10 min při teplotě 72 °C.

Fragment L7A5 DNA kódující část FRL₄ a konstantní oblast změněnou tak, aby obsahovala štěpící místo restrikčního enzymu EcoRI na 3’-konci byl připraven následujícím způsobem.

Složení reakčního roztoku PCR:

plazmid pHL15-27 DNA, 200 ng;

oligonukleotidový primer 7ALCP, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7ALCN, 80 pmol;

směs dNTP, 20μΙ;

pufr 10 x Pfu, 20 pl;

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek; a redestilovaná voda do celkového objemu 200 μΙ.

Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejprve zahřát na 2 minuty na teplotu 94 °C a potom byl třicetkrát opakován cyklus zahřívání 1 min 94 °C, 1 min 55 °C a 2 min při teplotě 72 °C. Po ukončení tohoto postupu byl reakční roztok zahříván 10 min při teplotě 72 °C.

K 200 μΙ každého z PCR produktů byl přidán stejný objem fenolchloroformu (50 % obj. fenolu nasyceného vodou, 48 % obj. chloroformu, 2 % obj. izoamylalkoholu) a směs byla důkladně míchána 1 minutu. Potom byla směs centrifugována při 10 000 x g a vodná vrstva byla oddělena a smísena se stejným objemem chloroformizoamylalkoholu (96 % obj. chloroformu a 4 % objemová izoamylalkoholu), a opět důkladně míchána 1 minutu. Výsledná směs byla centrifugována při 10 000 x g a vodná vrstva byla oddělena (řada kroků uvedených v tomto odstavci se zde označuje jako „extrakce fenolem“).

• · · · · · • · · ···· · ··· • · · · · ·· ···· · • · ·· · ··· ···· ··· ·· ··· ·· ··

- 107 U oddělené vodné vrstvy bylo potom provedeno srážení ethanolem. Jak bude označováno dále, „srážení ethanolem“ sestává z přídavku 1/10 objemu 3 M octanu sodného (pH 5,2) a 2,5 objemu 100 % ethanolu za míchání ke sráženému roztoku a zmrazení směsi použitím suchého ledu. Získaná směs se potom centrifuguje při 10 000 x g pro získání DNA jako sraženiny.

Po extrakci fenolem a srážení ethanolem byla získaná sraženina DNA sušena ve vakuu, rozpuštěna v minimálním množství redestilované vody a oddělena elektroforézou na polyakrylamidovém gelu 5 % hmotnost/objem. Po elektroforéze byl gel barven vodným roztokem ethidiumbromidu s koncentrací 1 pg/ml pro umožnění detekce DNA pod UV světlem. Pruhy DNA odpovídající L7A1-DNA, L7A2-DNA, L7A3-DNA, L7A4-DNA a L7A5-DNA byly vyříznuty žiletkou a eluovány z gelu systémem Centriruter a Centricon-10 jak bylo popsáno výše. Eluovaná DNA byla potom zakoncentrována centrifugací při 7500 x g a srážením ethanolem a nakonec rozpuštěna v 50 μΙ destilované vody.

b) Druhy stupeň PCR

Schéma druhého stupně PCR pro přípravu VHH-DNA je ukázáno na obr. 9.

L7A1.2-DNA, ve které byly fúzovány fragmenty L7A1-DNA a L7A2-DNA, popsané výše, byla připravena následujícím způsobem.

Složení reakčního roztoku PCR:

roztok L7A1-DNA připravený v prvním stupni PCR, 10 μΙ;

roztok L7A2-DNA připravený v prvním stupni PCR, 10 μΙ;

oligonukleotidový primer 7AL1P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7AL2N, 80 pmol;

směs dNTP, 20μΙ;

• ·

pufr 10 x Pfu, 20 μ|;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do celkového objemu 200 μΙ.

Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejprve zahřát na 2 minuty na teplotu 94 °C a potom byl třicetkrát opakován cyklus zahřívání 1 min 94 °C, 1 min 55 °C a 2 min při teplotě 72 °C. Po ukončení tohoto postupu byl reakční roztok zahříván 10 min při teplotě 72 °C.

L7A4.5-DNA, ve které byly fúzovány fragmenty L7A4-DNA a L7A5-DNA, popsané výše, byla připravena následujícím způsobem.

Složení reakčního roztoku PCR:

roztok L7A4-DNA připravený v prvním stupni PCR, 10 μΙ;

roztok L7A5-DNA připravený v prvním stupni PCR, 10 μΙ;

oligonukleotidový primer 7AL4P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7ALCN, 80 pmol;

směs dNTP, 20μΙ;

pufr 10 x Pfu, 20 μΙ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do celkového objemu 200 μΙ.

Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejprve zahřát na 2 minuty na teplotu 94 °C a potom byl třicetkrát opakován cyklus zahřívání 1 min 94 °C, 1 min 55 °C a 2 min při teplotě 72 °C. Po ukončení tohoto postupu byl reakční roztok zahříván 10 min při teplotě 72 °C.

Nejprve byla provedena extrakce fenolem a potom srážení ethanolem fragmentů DNA L7A1.2-DNA a L7A4.5-DNA amplifikovaných pomocí PCR a tyto fragmenty potom byly separovány elektroforézou na polyakrylamidovém gelu s koncentrací 5 % «· · ·· ♦··· ·· ·· .·« ··· ···· • · · · ··· · · ·· • · ·· · ·· ···· · • · ·· · ··· ···· ··· ·· ··· ·· ··

- 109 hmotnost/objem. Po elektroforéze byl gel obarven roztokem ethidiumbromidu 1 pg/ml a pruhy detekované pod UV lampou byly vyříznuty žiletkou a eluovány z gelu použitím systémů Centriruter a Centricon-10, jak bylo popsáno výše. Eluovaná DNA byla nejprve zakoncentrována centrifugací při 7500 x g, potom srážením ethanolem a nakonec byla rozpuštěna v 50 pl destilované vody.

c) Třetí stupeň PCR

Schéma třetího stupně PCR pro přípravu VHH-DNA je uvedeno na obr. 10.

Fragment VHH-DNA, ve které byly fúzovány fragmenty L7A1.2DNA a L7A4.5-DNA a L7A3-DNA, popsané výše, byla připravena následujícím způsobem.

Složení reakčního roztoku PCR:

roztok L7A1.2-DNA připravený v druhém stupni PCR, 10 μΙ;

roztok L7A4.5-DNA připravený v druhém stupni PCR, 10 μΙ;

roztok L7A3-DNA připravený v prvním stupni PCR, 10 μΙ;

oligonukleotidový primer 7AL1P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7ALCN, 80 pmol;

směs dNTP, 20μΙ;

pufr 10 x Pfu, 20 μΙ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do celkového objemu 200 μΙ.

Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejprve zahřát na 2 minuty na teplotu 94 °C a potom byl třicetkrát opakován cyklus zahřívání 1 min 94 °C, 1 min 55 °C a 2 min při teplotě 72 °C. Po ukončení tohoto postupu byl reakční roztok zahříván 10 min při teplotě 72 °C.

····

• · · · · · · • ···· · ··· ·· · ·· toto·· · • · · · · · • ····· · · ··

Amplifikovaný fragment CHH-DNA byl nejprve podroben extrakci fenolem a potom srážení ethanolem a nakonec byl oddělen elektroforézou na polyakrylamidovém gelu 5 % hmotnost/objem. Po elektroforéze byl gel obarven roztokem ethidiumbromidu 1 pg/ml a pruh VHH-DNA detekovaný pod UV lampou byl vyříznut žiletkou a eluován z gelu s použitím systému Centriruter a Centricon-10, jak bylo popsáno výše. Eluovaná DNA byla potom koncentrována centrifugací při 7500 x g, která byla následována srážením ethanolem, a potom rozpuštěna v 50 pl destilované vody.

Konstrukce expresního plazmidů nesoudího fragment VHH-DNA je popsána v obr. 11.

Fragment VHH-DNA získaný výše byl dále čištěn extrakcí fenolem následovanou srážením ethanolem a potom byl štěpen restrikčními enzymy Hindlll a EcoRI.

pg DNA klonovacího plazmidů pHSG399 (Tekara Shuzo Co., Ltd.) byl štěpen restrikčními enzymy Hindlll a EcoRI a potom defosforylován alkalickou fosfatázou (z telecího žaludku, dále zkracována jako CIP). Výsledná defosforylovaná DNA plazmidů pHSG399 a štěpený fragment VHH-DNA byly ligovány soupravou DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.) podle doporučení výrobce.

Ligovaná DNA byla oddělena srážením ethanolem, rozpuštěna v 5 pl redestilované vody a potom smísena s bakteriemi E. coli JM109 Electro-Cell (Takara Shuzo Co., Ltd.). Směs byla převedena do kyvety Gene Pulser/E. coli Pulser Cuvette, 0,1 cm (BioRad) a ligovaná směs byla použita pro transformaci buněk E. coli JM109 přístrojem Gene Pulser II (BioRad) podle doporučení výrobce (řada kroků uvedená v tomto odstavci bude dále označována jako „transformace“).

Po transformaci byly buňky vysety na plotny s LB agarem (Bacto-tryptone (Difco) 10 g, Bacto-yeast extract (Difco) 5 g, NaCI 10 g, Bacto-agar (Difco) 15 g; rozpuštěno v destilované vodě a

- 111 doplněno na 1 I) obsahující konečnou koncentraci 1 mM IPTG (izopropylthio-3-D-galaktosid; Takara Shuzo Co., Ltd.), 0,1 % hmotnost/objem X-Gal (5-brom-4-chlor-3-indolyl-p-D-galaktosid; Takara Shuzo Co., Ltd.) a 50 pg/ml chloramfenikolu a plotny byly inkubovány při 37 °C přes noc pro získání transformantů E. coli.

Všechny získané bílé transformanty byly kultivovány ve 2 ml kapalného média LB při 37 °C přes noc a z výsledné kultury byla extrahována plazmidová DNA metodou alkalického SDS (Sambrook, J., a další, (1989), v „Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. vydání)“, Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Výsledná extrahovaná plazmidová DNA byla štěpena restrikčními enzymy Hindlll a EcoRI a klon nesoucí fragment VHHDNA byl potom vybrán elektroforézou na 1 % agarózovém gelu (hmotnost/objem).

Stejným způsobem byl získán plazmid pHSGHH7 nesoucí fuzní fragment proměnné oblasti humanizovaného lehkého řetězce typu HH HFE7A a DNA kódující konstantní oblast κ řetězce lidského imunoglobulinu. Transformovaná E. coli pHSGHH7 SANK 73497 nesoucí plazmid pHSGHH7 byla uložena v souladu s Budapešťskou úmluvou ve sbírce Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo 22. srpna 1997 a byla označena depozitním číslem FERM BP-6073.

S použitím popsaného plazmidu pHSGHH7 bylo potom možné zkonstruovat plazmid p7AL-HH expresního vektoru nesoucí DNA podle SEQ ID No. 49 výpisu sekvencí a kódující humanizovaný polypeptid lehkého řetězce HFE7A typu HH ze SEQ ID No. 50 výpisu sekvencí.

pg DNA pEE.12.1 (Lonza), expresního vektoru savčích buněk, byl štěpen restrikčními enzymy Hindlll a EcoRI a potom defosforylován použitím CIP. Vzniklá štěpená defosforylovaná plazmidová DNA (100 ng) byla ligována s 10 pg fragmentu DNA • ·

- 112 -

pHSGHH7, který byl také štěpen enzymy HindlII a EcoRI, s použitím soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Ligační směs byla potom použita pro transformaci E. coli JM109 (jak bylo popsáno výše), která byla potom vyseta na plotny s LB agarem obsahující 50 pg/ml ampicilinu.

Transformované buňky získané touto metodou byly kultivovány ve 2 ml kapalného média LB obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu při 37 °C přes noc a ze získané kultury byla metodou alkalického SDS extrahována plazmidová DNA.

Extrahovaná plazmidová DNA byla štěpena enzymy HindlII a EcoRI a potom podrobena elektroforéze na agarózovém gelu 1 % hmotnost/objem pro potvrzení přítomnosti nebo nepřítomnosti požadovaného inzertu. To umožnilo izolaci plazmidu p7AL-HH, který obsahuje fuzní fragment nesoucí variabilní oblast humanizovaného lehkého řetězce typu HH HFE7A s DNA kódující konstantní oblast řetězce κ lidského imunoglobulinu. Fuzní fragment se nacházel po směru translace vzhledem k promotoru cytomegaloviru (CMV) ve správné orientaci.

4) Konstrukce plazmidu p7AL-HM (expresní plazmid humanizovaného lehkého řetězce typu HM HFE7A

Fragment VHM-DNA podle SEQ ID No. 51 ve výpisu sekvencí kódující sekvenci aminokyselin SEQ ID No. 52 ve výpisu sekvencí byl vytvořen provedením třístupňové PCR, vložen do plazmidového vektoru a potom klonován do E. coli.

a) První stupeň PCR

Znázornění prvního stupně PCR pro přípravu fragmentu VHMDNA je ukázáno na obr. 12.

Fragment L7A1-DNA kódující sekreční signálovou sekvenci a část FRLj s místem štěpení restrikčním enzymem HindlII přidaným • · · · na 5’-konec, fragment L7A2-DNA kódující část FRLi, CDRLi, FRL₂ a část CDRL.2 a fragment L7A5-DNA kódující část FRL₄ a konstantní oblast, která měla na 3’-konci přidané štěpící místo EcoRI, které byly získány při přípravě fragmentu VHH-DNA v části 2) výše byly použity při tomto postupu.

Fragment ML7A3-DNA kódující CDRL₂, FRL₃, CDRL₃, FRL₄ a část konstantní oblasti byl připraven následujícím způsobem.

Složení reakčního roztoku PCR:

DNA plazmidu pME-L, 200 ng;

oligonukleotidový primer 7AL3PA, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7AL4NA, 80 pmol;

směs dNTP, 20μΙ;

pufr 10 x Pfu, 20 μΙ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do celkového objemu 200 μΙ.

Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejprve zahřát na 2 minuty na teplotu 94 °C a potom byl třicetkrát opakován cyklus zahřívání 1 min 94 °C, 1 min 55 °C a 2 min při teplotě 72 °C. Po ukončení tohoto postupu byl reakční roztok zahříván 10 min při teplotě 72 °C.

Produkty PCR byly nejprve extrahovány fenolem a potom sráženy ethanolem a potom odděleny elektroforézou na 5 % hmotnost/objem polyakrylamidovém gelu. Po elektroforéze byl gel obarven ethiniumbromidem 1 pg/ml a pruh DNA byl detekován pod UV lampou. Pruh odpovídající ML7A3-DNA byl vyříznut žiletkou a eluován z gelu použitím systémů Centriruter a Centricon-10, jak bylo popsáno výše. Eluovaná DNA byla potom koncentrována centrifugací při 7500 x g a potom srážena ethanolem a nakonec rozpuštěna v 50 μΙ destilované vody.

• · · · · · · · · · · • · · · ♦ · · · ··· • · · · · · · ···· · • · · · · ···

-114- ................

b) Druhý stupeň PCR

Znázornění druhého stupně PCR pro přípravu VHM-DNA je uvedeno na obr. 13.

Fuzní fragment VHM-DNA obsahující L7A1.2-DNA, ML7A3-DNA a L7A5-DNA popisované výše byl připraven následujícím způsobem.

Složení reakčního roztoku PCR:

roztok L7A1.2-DNA, připravený ve druhém stupni PCR, 10 μΙ;

roztok ML7A3-DNA, připravený v prvním stupni PCR, 10 μΙ;

roztok L7A5-DNA, připravený v prvním stupni PCR, 10 μΙ;

oligonukleotidový primer 7AL1P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7ALCN, 80 pmol;

směs dNTP, 20μΙ;

pufr 10 x Pfu, 20 μΙ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do celkového objemu 200 μΙ.

Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejprve zahřát na 2 minuty na teplotu 94 °C a potom byl třicetkrát opakován cyklus zahřívání 1 min 94 °C, 1 min 55 °C a 2 min při teplotě 72 °C. Po ukončení tohoto postupu byl reakční roztok zahříván 10 min při teplotě 72 °C.

Produkty PCR byly nejprve extrahovány fenolem a potom sráženy ethanolem a potom odděleny elektroforézou na 5 % hmotnost/objem polyakrylamidovém gelu. Po elektroforéze byl gel obarven ethiniumbromidem 1 pg/ml a pruh DNA byl detekován pod UV lampou. Pruh odpovídající VHM-DNA byl vyříznut žiletkou a eluován z gelu použitím systémů Centriruter a Centricon-10, jak bylo popsáno výše. Eluovaná DNA byla potom koncentrována centrifugací při • ·

- 115 7500 x g a potom srážena ethanolem a nakonec rozpuštěna v 50 pl destilované vody.

Konstrukce expresního plazmidu nesoudího fragment VHM-DNA je uvedena v obr. 14.

VHM-DNA získaná výše byla dále čištěna extrakcí fenolem následovanou srážením ethanolem a potom štěpena restrikčními enzymy Hindlll a EcoRI.

pg DNA klonovacího plazmidu pHSG399 (Takara Shuzo Co., Ltd.) byl štěpen restrikčními enzymy Hindlll a EcoRI a potom defosforylován s použitím CIP. Výsledný defosforylovaný pHSG399 byl potom ligován s VHM-DNA, která byla také štěpena Hindlll a EcoRI, s použitím soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Ligovanou DNA byla potom transformována bakterie E. coli JM109, která byla potom rozetřena na LB agarové médium obsahující konečnou koncentraci 1 mM IPTG, 0,1 % hmotnost/objem X-Gal a 50 pg(ml chloramfenikolu. Získané bílé transformanty byly kultivovány ve 2 ml kapalného média LB obsahujícího 50 pg/ml chloramfenikolu při 37 °C přes noc a plazmidová DNA byla extrahována z výsledné kultury metodou alkalického SDS. Extrahovaná plazmidová DNA byla potom štěpena Hindlll a EcoRI a elektroforézou na agarózovém gelu koncentrace 1 % hmotnost/objem byl zvolen klon nesoucí fragment VHM-DNA.

Stejným způsobem byl získán plazmid pHSGHM17 nesoucí fuzní fragment variabilní oblasti lehkého řetězce humanizovaného HFE7A typu HM a DNA kódující konstantní oblast lidského řetězce Igx. Transformant E. coli pHSGHM17 SANK 73597 nesoucí plazmid pHSGHM17 byl uložen podle Budapešťské smlouvy ve sbírce Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo 22. srpna 1997 a byl označen depozitním číslem FERM BP-6072.

Použitím výše popsaného plazmidu pHSGHM17 byl zkonstruován plazmid expresního vektoru p7AL-HM, který nesl DNA • · · ·

SEQ ID No. 51 ve výpisu sekvencí kódující humanizovaný polypeptid lehkého řetězce typu HM HFE7A podle SEQ ID No. 52 ve výpisu sekvencí.

pg DNA pEE.12.1 (Lonza), expresního vektoru pro savčí buňky, byl štěpen restrikčními enzymy HindlII a EcoRI a potom defosforylován použitím CIP. Vzniklá rozštěpená defosforylovaná plazmidová DNA (100 ng) byla ligována s 10 pg fragmentu pHSGHM17-DNA, který byl rovněž štěpen enzymy HindlII a EcoRI s použitím soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Ligační směs byla potom použita pro transformaci E. coli JM109 (jak bylo popsáno výše), která byla potom vyseta na plotny s LB agarem obsahujícím 50 pg/ml ampicilinu.

Transformanty získané tímto způsobem byly kultivovány ve 2 ml kapalného média LB obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu při 37 °C přes noc a plazmidová DNA byla potom extrahována ze vzniklé kultury metodou alkalického SDS.

Extrahovaná plazmidová DNA byla štěpena HindlII a EcoRI a potom byla prováděna její elektroforéza na agarózovém gelu 1 % hmotnost/objem pro potvrzení přítomnosti nebo nepřítomnosti požadovaného inzertu. To umožnilo izolaci plazmidů p7AL-HM, který obsahuje fuzní fragment s variabilní oblastí humanizovaného lehkého řetězce HFE7A typu HM, spolu s DNA kódující konstantní oblast řetězce lidského imunoglobulinu k. Zjistilo se, že fuzní fragment je umístěn ve směru translace vzhledem k promotoru cytomegaloviru (CMV) ve správné orientaci.

5) Konstrukce plazmidů p7AL-MM (expresní plazmid pro humanizovaný lehký řetězec HFE7A typu MM)

Fragment VMM-DNA ze SEQ ID No. 53 ve výpisu sekvencí kódující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID No. 54 ve výpisu • ·

-117 sekvencí byl vytvořen provedením třístupňové PCR, vložen do plazmidového vektoru a potom klonován do E. coli.

a) První stupeň PCR

Znázornění prvního stupně PCR pro přípravu fragmentu VMMDNAje ukázáno na obr. 15.

Fragment L7A1-DNA kódující sekreční signálovou sekvenci a část FRL_b který má štěpící místo restrikčního enzymu HindlII přidané na 5’-konci a fragment L7A5-DNA kódující část FRL₄ a konstantní oblast s restrikčním místem EcoRI přidaným na 3’-konec, byly získány jak bylo popsáno při přípravě fragmentu VHH-DNA v části (2) výše. Tyto fragmenty byly použity v prvním stupni PCR při konstrukci VMM-DNA.

Fragment ML7A2M-DNA kódující část FRL.!, CDRL,, FRL₂, CDRL.2 a část FRL₃ byl připraven následujícím způsobem.

Složení reakčního roztoku PCR:

DNA plazmidu pME-L, 200 ng;

oligonukleotidový primer 7AL2P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer M7AL2N, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΙ;

pufr 10 x Pfu, 20 μΙ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do celkového objemu 200 μΙ.

Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejprve zahřát na 2 minuty na teplotu 94 °C a potom byl 30 x opakován cyklus zahřívání na 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut. Po ukončení tohoto postupu byl reakční roztok 10 min zahříván při teplotě 72 °C.

• · · ·

Fragment ML7A3M-DNA kódující část FRL₃, CDRL₃, FRL₃, a část konstantní oblasti byl připraven následujícím způsobem.

Složení reakčního roztoku PCR:

DNA plazmidu pME-L, 200 ng;

oligonukleotidový primer M7AL3PA, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7AL4NA, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΙ;

pufr 10 x Pfu, 20 μΙ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do celkového objemu 200 μΙ.

Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejprve zahřát na 2 minuty na teplotu 94 °C a potom byl 30 x opakován cyklus zahřívání na 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut. Po ukončení tohoto postupu byl reakční roztok 10 min zahříván při teplotě 72 °C.

Produkty PCR byly nejprve extrahovány fenolem, potom sráženy ethanolem a odděleny elektroforézou na polyakrylamidovém gelu 5 % hmotnost/objem. Po elektroforéze byl gel obarven roztokem ethidiumbromidu 1 pg/ml a pruhy DNA odpovídající ML7A2M-DNA a ML7A3M-DNA detekované pod UV lampou byly vyříznuty žiletkou a eluovány z gelu použitím systémů Centriruter a Centricon-10, jak bylo popsáno výše. Eluované DNA byly koncentrovány centrifugací při 7500 x g následovanou srážením ethanolem a rozpuštěním v 50 μΙ destilované vody.

b) Druhý stupeň PCR

Znázornění druhého stupně PCR pro přípravu VMM-DNA je ukázáno na obr. 16.

-119 -

Fragment ML7A1.2-DNA obsahující fúzované fragmenty ML7A1DNA a ML7A2M-DNA připravené výše byl připraven následujícím způsobem.

Složení reakčního roztoku PCR:

roztok L7A1-DNA připravený v prvním stupni PCR, 10 μΙ;

roztok ML7A2M-DNA připravený v prvním stupni PCR, 10 μΙ oligonukleotidový primer 7AL1P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7AL2N, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΙ;

pufr 10 x Pfu, 20 μΙ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do celkového objemu 200 μΙ.

Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejprve zahřát na 2 minuty na teplotu 94 °C a potom byl 30 x opakován cyklus zahřívání na 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut. Po ukončení tohoto postupu byl reakční roztok 10 min zahříván při teplotě 72 °C.

Vzniklý amplifikovaný fragment ML7A1.2-DNA byl nejprve extrahován fenolem, potom srážen ethanolem a oddělen elektroforézou na polyakrylamidovém gelu 5 % hmotnost/objem. Po elektroforéze byl gel obarven roztokem ethidiumbromidu 1 pg/ml a pruh fuzní DNA detekovaný pod UV lampou byl vyříznut žiletkou a eluován z gelu použitím systémů Centriruter a Centricon-10, jak bylo popsáno výše. Eluované DNA byly koncentrovány centrifugací při 7500 x g následovanou srážením ethanolem a rozpuštěním v 50 μΙ destilované vody.

• · ·

-120- ·:·· .·*·

c) Třetí stupeň PCR

Znázornění třetího stupně PCR pro přípravu VMM-DNA je ukázáno na obr. 17.

Fragment VMM-DNA obsahující fúzované fragmenty ML7A1.2DNA a ML7A3M-DNA a fragment L7A5-DNA připravené výše byl připraven následujícím způsobem.

Složení reakčního roztoku PCR:

roztok ML7A1.2-DNA připravený v druhém stupni PCR, 10 μΙ;

roztok ML7A3M-DNA připravený v prvním stupni PCR, 10 μΙ;

roztok L7A5-DNA připravený v prvním stupni PCR, 10 μΙ;

oligonukleotidový primer 7AL1P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7ALCN, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΙ;

pufr 10 x Pfu, 20 μΙ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do celkového objemu 200 μΙ.

Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejprve zahřát na 2 minuty na teplotu 94 °C a potom byl 30 x opakován cyklus zahřívání na 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut. Po ukončení tohoto postupu byl reakční roztok 10 min zahříván při teplotě 72 °C.

Vzniklý amplifikovaný fragment VMM-DNA byl nejprve extrahován fenolem, potom srážen ethanolem a oddělen elektroforézou na polyakrylamidovém gelu 5 % hmotnost/objem. Po elektroforéze byl gel obarven roztokem ethidiumbromidu 1 pg/ml a pruh VMM-DNA detekovaný pod UV lampou byl vyříznut žiletkou a eluován z gelu použitím systémů Centriruter a Centricon-10, jak bylo popsáno výše. Eluovaná DNA byla koncentrována centrifugací při

- 121 ·· · · · • · · · · · · · · • · · ·· ···· · • · · · · · • ····· ·· ··

7500 x g následovanou srážením ethanolem a rozpuštěním v 50 μΙ destilované vody.

Konstrukce plazmidu nesoucího fragment VMM-DNA je znázorněna na obr. 18.

VMM-DNA získaná výše byla dále čištěna extrakcí fenolem následovanou srážením ethanolem a potom štěpena restrikčními enzymy HindlII a EcoRI.

pg klonovací plazmidové DNA pHSG399 (Takara Shuzo Co., Ltd.) byl štěpen restrikčními enzymy HindlII a EcoRI a potom defosforylován CIP. Výsledná defosforylovaná DNA pHSG399 byla potom ligována s VMM-DNA, která byla také štěpena enzymy HindlII a EcoRI použitím soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.). E. coli JM109 byla potom transformována ligovanou DNA a rozetřena na LB agarové médium obsahující konečné koncentrace 1 mM IPTG, 0,1 % hmotnost/objem X-Gal a 50 pg/ml chloramfenikolu. Získané bílé transformanty byly kultivovány ve 2 ml kapalného LB média obsahujícího 50 pg/ml chloramfenikolu při 37 °C přes noc a z výsledné kultury byla extrahována plazmidová DNA metodou alkalického SDS. Extrahovaná plazmidová DNA byla potom štěpena HindlII a EcoRI a klon nesoucí fragment VMM-DNA byl vybrán s použitím elektroforézy na agarózovém gelu 1 % hmotnost/objem.

Byl tedy získán plazmid pHSGMM6 nesoucí fuzní fragment variabilní oblasti lehkého řetězce typu MM HFE7A a DNA kódující konstantní oblast řetězce κ lidského imunoglobulinu. Transformant E. coli pHSGMM6 SANK 73697 nesoucí plazmid pHSGMM6 byl uložen v souladu s Budapešťskou úmluvou ve sbírce Kogyo Gijutsuin SeimeiKogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo 22. srpna 1997 a byl označen depozitním číslem FERM BP-6071.

Expresní plazmidový vektor p7AL-MM byl zkonstruován použitím výše popsaného plazmidu pHSGMM6 a nese DNA SEQ ID No. 53 podle výpisu sekvencí kódující polypeptid lehkého řetězce typu MM • · · ·

HFE7A, který má sekvenci uvedenou jako SEQ ID No. 54 ve výpisu sekvencí.

pg pEE.12.1 DNA (Lonza), expresního vektoru pro savčí buňky, byl štěpen restrikčními enzymy Hindlll a EcoRI a potom defosforylován použitím CIP. Výsledná štěpená defosforylovaná plazmidová DNA (100 ng) byla ligována s 10 pg fragmentu DNA pHSGMM6, který byl rovněž štěpen Hindlll a EcoRI s použitím soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Ligační směs byla potom použita pro transformaci E. coli JM109, jak bylo popsáno výše, která potom byla vyseta na plotny s LB agarem obsahujícím 50 pg/ml ampicilinu.

Transformanty získané touto metodou byly pěstovány ve 2 ml kapalného média LB, obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu při 37 °C přes noc a plazmidová DNA byla potom extrahována ze získané kultury metodou alkalického SDS.

Extrahovaná plazmidová DNA byla štěpena enzymy Hindlll a EcoRI a potom byla přítomnost nebo nepřítomnost hledaného inzertu potvrzena elektroforézou na agarózovém gelu koncentrace 1 % hmotnost/objem. To umožnilo izolaci plazmidu p7AL-MM, který obsahuje fuzní fragment s variabilní oblastí lehkého řetězce typu MM HFE7A spolu s DNA kódující konstantní oblast řetězce κ lidského imunoglobulinu. Bylo zjištěno, že fuzní fragment je umístěn ve směru translace vzhledem k promotoru cytomegaloviru (CMV) ve správné orientaci.

6) Ověření nukleotidových sekvencí

Pro ověření, zda inzerty DNA plazmidů p7AL-HH, p7AL-HM a p7AL-MM mají požadované nukleotidové sekvence byly jejich inzerty DNA analyzovány pro stanovení sekvence nukleotidů. Oligonukleotidové primery připravené pro sekvenování nukleotidů byly následující.

• · · · to · • · · ···· · ··· • · ·· · ·· ♦ ·· · ·

OO * · · · · · · ·

- - ·♦·· ··· ·· ··· ·· ··

5’-CCCAAGCTTA AGAAGCATCC-3’ (SP1; SEQ ID No. 68);

5’-ATCTATGCTG CATCCAATCT-3’ (SP2; SEQ ID No. 69);

5’-GTTGTGTGCC TGCTGAATAA-3’ (SP3; SEQ ID No. 70);

5’-CCCGAATTCT TACTAACACT-3’ (SP4; SEQ ID No. 71);

5’-TTATTCAGCA GGCACACAAC-3’ (SP5; SEQ ID No. 72); a

5’-AGATTGGATG CAGCATAGAT-3’ (SP6; SEQ ID No. 73).

Polohy, na které se všechny primery vážou, jsou uvedeny v obr. 19. Stanovení nukleotidových sekvencí bylo provedeno metodou terminace dideoxynukleotidového řetězce (Sanger, F. S. a další, (1977), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74, 5463). Použitými templáty byly odpovídající plazmidové DNA čištěné metodou alkalického SDS a centrifugací v chloridu česném (Sambrook, J. a další (1989), v „Molecular Cloning: A laboratory Manual, druhé vydání“, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pramen pro obě metody).

Konkrétně, 3 pg purifikované plazmidové DNA byly rozpuštěny ve 13 μΙ redestilované vody a potom byly přidány vždy 2 μΙ 2 mM EDTA a 2 N NaOH a směs byla ponechána stát při pokojové teplotě 5 minut. Potom byly přidány 4 μΙ roztoku 10 M octanu amonného a100pl 100 % ethanolu a směs byla zamíchána a uložena do suchého ledu na 10 minut. Potom byla směs centrifugována při 15 000 x g a získaná usazenina byla promyta 80 % obj. vodným ethanolem a potom sušena ve vakuu. Výsledná usušená DNA byla rozpuštěna v 7 μΙ redestilované vody a použita pro sekvenování nukleotidů.

Reakce sekvenování nukleotidů byla provedena s použitím soupravy 7-Deaza-Sequenase, Version 2.0 Kit (pro dCTP; Amersham). Směs 7 μΙ výše připraveného plazmidového roztoku, 1 pmol primerů, který byl předem syntetizován a 1 μΙ reakčního pufru (součást kitu) byla inkubována 2 min při teplotě 65 °C. Potom byla DNA teplotně hybridizována s primerem postupným ochlazováním na pokojovou

- 124 teplotu a potom probíhalo značení [a-³²P]dCTP (Amersham). Potom byla provedena elektroforéza reakčního produktu na polyakrylamidovém gelu 5 % hmotnost/objem obsahujícím 8 M močovinu v pufru 1 x TBE (100 mM Tris, 100 mM kyselina boritá, 1 mM EDTA, pH 8,3). Po usušení byly sekvence na gelu čteny pomocí autoradiografie. Veškeré sekvenování nukleotidů bylo prováděno jak se popisuje výše, pokud není uvedeno jinak.

Bylo zjištěno, že inzerty DNA plazmidů p7AL-HH, p7AL-HM a p7AL-MM měly očekávané nukleotidové sekvence, tj.:

SEQ ID No. 49 kódující polypeptidovou sekvenci podle SEQ ID No. 50;

SEQ ID No. 51 kódující polypeptidovou sekvenci podle SEQ ID No. 52; a

SEQ ID No. 53 kódující polypeptidovou sekvenci podle SEQ ID No. 54 ve výpisu sekvencí.

Příklad 3

Konstrukce expresního vektoru pro těžký řetězec humanizované verze protilátky HFE7A (1) Konstrukce plazmidů nesoucího DNA proměnné oblasti těžkého řetězce humanizované HFE7A

1) Syntéza primerů pro přípravu variabilní oblasti humanizovaného těžkého řetězce

Pomocí kombinace postupů PCR byla provedena syntéza DNA (SEQ ID No. 74 ve výpisu sekvencí) kódující polypeptidový řetězec obsahující proměnnou oblast těžkého řetězce humanizované protilátky anti-Fas HFE7A a 5 aminokyselinových zbytků na N-konci oblasti IgGCH1 (SEQ ID No. 75 ve výpisu sekvencí)• · • ·

- 125 Popisem uvedeným výše bylo syntetizováno následujících osm primerů PCR:

5’- GGGAAGCTTG GCTTGACCTC ACCATGGGAT GGAGCTGTAT-3’ (7AH1P; SEQ ID No. 76);

5’- TGAAGCCCCA GGCTTCTTGA CCTCAGCCCC AGACTGCACC AGTTGGAC-3’ (7AH1NNEW; SEQ ID No. 77);

5’- TCCACTCAAG CCTCTGTCCA GGGGCCTGTT TTACCC-3’ (7AH2N; SEQ ID No. 78);

5’- GTCTGGGGCT GAGGTCAAGA AGCCTGGGGC TTCAGTGAAG GTGTCCTGCA AG-3’ (7AH2PNEW; SEQ ID No. 79);

5’-CAGGCCCCTG GACAGAGGCT TGAGTGGATG GGAGAGATT-3’ (7AH3P; SEQ ID No. 80);

5’- TCAGATCTCA GGCTGCTGAG CTCCATGTAG GCTGTGCTAG CGGATGTGTC-3’ (7AH3N; SEQ ID No. 81);

5’- TGGAGCTCAG CAGCCTGAGA TCTGAGGACA CGGCGGTCTA TTAC-3’ (7AH4P; SEQ ID No. 82); a

5’- GATGGGCCCT TGGTGGAGGC TGAGGAGACG GTGACCAGGG TCCCTTCGCC CCAGT-3’ (7AH4N; SEQ ID No. 83).

2) Konstrukce plazmidu pBL7A27

Fragment VD-DNA (SEQ ID No. 74 ve výpisu sekvencí) kódující sekvenci aminokyselin SEQ ID No. 75 ve výpisu sekvencí byl připraven provedením třístupňové PCR a potom vložen do plazmidu a klonován do E. coli.

• · · ·· ···· ·· · · • · · · ··· ··· • · · ···· · · · · • · ·· · ·· · · · · • · · · · · ·

- 126 - .............* “

a) První stupeň PCR

Znázornění prvního stupně PCR přípravy VD-DNA je ukázáno na obr. 20.

Fragment H7A1-DNA kódující sekreční signálovou sekvenci a Nkoncová část FRHj s štěpícím místem restrikčního enzymu HindlII přidaným na 5’-konec byl připraven následujícím způsobem.

Složení reakčního roztoku PCR:

DNA plazmidu pME-H, 200 ng;

oligonukleotidový primer 7AH1P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7AH1NNEW, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΙ;

pufr 10 x Pfu, 20 μΙ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do celkového objemu 200 μΙ.

Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejprve zahřát na 2 minuty na teplotu 94 °C a potom byl 30 x opakován cyklus zahřívání na 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut. Po ukončení tohoto postupu byl reakční roztok 10 min zahříván při teplotě 72 °C.

Fragment H7A2-DNA, kódující část FRHj, CDRHi a část FRH₂ byl připraven následujícím způsobem.

Složení reakčního roztoku PCR:

DNA plazmidu pME-H, 200 ng;

oligonukleotidový primer 7AH2N, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7AH2PNEW, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΙ;

pufr 10 x Pfu, 20 μΙ;

- 127 Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do celkového objemu 200 μΙ.

Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejprve zahřát na 2 minuty na teplotu 94 °C a potom byl 30 x opakován cyklus zahřívání na 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut. Po ukončení tohoto postupu byl reakční roztok 10 min zahříván při teplotě 72 °C.

Fragment H7A3-DNA kódující část FRH₂, CDRH₂ a část FRH₃ byl připraven následujícím způsobem.

Složení reakčního roztoku PCR:

DNA plazmidu pME-H, 200 ng;

oligonukleotidový primer 7AH3P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7AH3N, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΙ;

pufr 10 x Pfu, 20 μΙ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do celkového objemu 200 μΙ.

Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejprve zahřát na 2 minuty na teplotu 94 °C a potom byl 30 x opakován cyklus zahřívání na 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut. Po ukončení tohoto postupu byl reakční roztok 10 min zahříván při teplotě 72 °C.

Fragment H7A4-DNA kódující část FRH₃, CDRH₃, FRH₄ a 5 N-koncových aminokyselinových zbytků oblasti CH1 byl připraven následujícím způsobem.

Složení reakčního roztoku PCR:

DNA plazmidu pME-H, 200 ng;

• · · ·

- 128 oligonukleotidový primer 7AH4P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7AH4N, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΙ;

pufr 10 x Pfu, 20 μΙ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do celkového objemu 200 μΙ.

Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejprve zahřát na 2 minuty na teplotu 94 °C a potom byl 30 x opakován cyklus zahřívání na 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut. Po ukončení tohoto postupu byl reakčni roztok 10 min zahříván při teplotě 72 °C.

Produkty PCR byly nejprve extrahovány fenolem a potom sráženy ethanolem a potom děleny elektroforézou na polyakrylamidovém gelu 5 % hmotnost/objem. Po elektroforéze byl gel barven roztokem ethidiumbromidu 1 pg/ml a pruhy DNA odpovídající H7A1-DNA, H7A2-DNA, H7A3-DNA a H7A4-DNA byly po detekci UV lampou vyříznuty žiletkou a eluovány z gelu s použitím systému Centriruter a Centricon-10, jak bylo popsáno výše. Eluovaná DNA byla koncentrována centrifugací při 7500 x g, srážena ethanolem a rozpuštěna v 50 μΙ destilované vody.

b) Druhý stupeň PCR

Znázornění druhého stupně PCR pro přípravu VD-DNA je ukázáno na obr. 21.

Fragment H7A1.2-DNA, ve kterém byly fúzovány výše popsané fragmenty H7A1-DNA a H7A2-DNA, byl připraven následujícím způsobem.

Složení reakčního roztoku PCR:

roztok H7A1-DNA připravený v prvním stupni PCR, 10 μΙ;

• · · · · · · · to toto · · • · · to · · · · · · to • to ····· to · toto • · ·« · · * · · · · « • · ·· · ··· • to·· ··· ♦ · «· · · · · ·

- 129 roztok H7A2-DNA připravený v prvním stupni PCR, 10 μΙ;

oligonukleotidový primer 7AH1P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7AH2N, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΙ;

pufr 10 x Pfu, 20 μΙ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do celkového objemu 200 μΙ.

Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejprve zahřát na 2 minuty na teplotu 94 °C a potom byl 30 x opakován cyklus zahřívání na 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut. Po ukončení tohoto postupu byl reakční roztok 10 min zahříván při teplotě 72 °C.

Fragment H7A3.4-DNA, ve kterém byly fúzovány výše popsané fragmenty H7A3-DNA a H7A4-DNA, byl připraven následujícím způsobem.

Složení reakčního roztoku PCR:

roztok H7A3-DNA připravený v prvním stupni PCR, 10 μΙ;

roztok H7A4-DNA připravený v prvním stupni PCR, 10 μΙ;

oligonukleotidový primer 7AH3P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7AH4N, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΙ;

pufr 10 x Pfu, 20 μΙ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do celkového objemu 200 μΙ.

Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejprve zahřát na 2 minuty na teplotu 94 °C a potom byl 30 x opakován cyklus zahřívání na 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu

- 130 -

minuty a 72 °C po dobu 2 minut. Po ukončení tohoto postupu byl reakční roztok 10 min zahříván při teplotě 72 °C.

Výsledné fragmenty amplifikované H7A1.2-DNA a H7A3.4 DNA byly nejprve extrahovány fenolem a potom sráženy ethanolem a byly rozděleny elektroforézou na polyakrylamidovém gelu 5 % hmotnost/objem. Po elektroforéze byly gely obarveny roztokem ethidiumbromidu 1 pg/ml a odpovídající pruhy byly vyříznuty žiletkou a eluovány z gelu použitím systémů Centriruter a Centricon-10, jak bylo popsáno výše. Eluovaná DNA byla koncentrována centrifugací při 7500 x g, srážena ethanolem a rozpuštěna v 50 μΙ destilované vody.

c) Třetí stupeň PCR

Znázornění třetího stupně PCR pro přípravu VD-DNA je ukázáno na obr. 22.

Fragment VD-DNA, ve kterém byly fúzovány výše popsané fragmenty H7A1.2-DNA a H7A3.4-DNA, byl připraven následujícím způsobem.

Složení reakčního roztoku PCR:

roztok H7A1.2-DNA připravený ve druhém stupni PCR, 10 μΙ;

roztok H7A3.4-DNA připravený ve druhém stupni PCR, 10 μΙ;

oligonukleotidový primer 7AH1P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7AH4N, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΙ;

pufr 10 x Pfu, 20 μΙ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do celkového objemu 200 μΙ.

Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejprve zahřát na 2 minuty na teplotu 94 °C a potom byl 30 x • ·

- 131 opakován cyklus zahřívání na 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut. Po ukončení tohoto postupu byl reakční roztok 10 min zahříván při teplotě 72 °C.

Výsledný fragment amplifikované VD-DNA byl nejprve extrahován fenolem a potom srážen ethanolem a byl oddělen elektroforézou na polyakrylamidovém gelu 5 % hmotnost/objem. Po elektroforéze byl gel obarven roztokem ethidiumbromidu 1 pg/ml a pruh odpovídající VD-DNA byl vyříznut žiletkou a eluován z gelu použitím systémů Centriruter a Centricon-10, jak bylo popsáno výše. Eluovaná DNA byla koncentrována centrifugací při 7500 x g, srážena ethanolem a rozpuštěna v 50 pl destilované vody.

Konstrukce plazmidů nesoucího VD-DNA fragment je ukázána na obr. 23.

Fragment VD-DNA získaný výše byl dále čištěn extrakcí fenolem následovanou srážením ethanolem a potom štěpen restrikčními enzymy HindlII a Apal.

pg DNA plazmidového vektoru pBLUESCRIPT-ll SK+ (Stratagene), byl štěpen enzymy HindlII a Apal a potom defosforylován použitím CIP. Výsledná defosforylovaná plazmidová DNA a 100 ng fragmentu VD-DNA, který byl také štěpen HindlII a Apal, byly ligovány použitím soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Výsledná ligační směs byla potom použita pro transformaci E. coli JM109, která potom byla vyseta na plotny s LB agarem obsahující konečné koncentrace 1 mM IPTG, 0,1 % hmotnost/objem X-Gal a 50 pg/ml ampicilinu. Všechny vzniklé bílé transformanty byly kultivovány ve 2 ml kapalného média LB obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu při teplotě 37 °C přes noc a plazmidová DNA byla potom z kultury extrahována metodou alkalického SDS. Výsledný plazmid byl štěpen enzymy HindlII a Apal a byla provedena jeho elektroforéza na agarozovém gelu pro • · • · · · · · · ··· · · • · · · · ··· ···· ·«· ·· ··· ·· ··

- 132 potvrzení přítomnosti nebo nepřítomnosti požadovaného inzertu. Tak byl získán plazmid pBL7A27 s inzertem VD-DNA.

(2) Konstrukce plazmidů nesoucího konstantní oblast qenomové DNA lidského lqG1

1) Syntéza primerů pro přípravu 5’-koncového fragmentu qenomové DNA lidského lqG1

5’-koncový fragment genomové DNA lidského lgG1 byl syntetizován PCR. Za tím účelem byly připraveny následující dva oligonukleotidové primery: 5’-GGGAAGCTTC CGCGGTCACA TGGCACCACC TCTCTTGCA-3’ (5’ Hind: SEQ ID No. 84 ve výpisu sekvencí); a 5’-GCTCTGCAGA GAGAAGATTG GGAGTTACTG GAATC-3’ (IGGCPSTN: SEQ ID No. 85 ve výpisu sekvencí).

2) Konstrukce plazmidů plG5’03

Genomová DNA obsahující oblast CH1 lidského lgG1 spolu s intronem následujícím po štěpícím místu HindlII byla oddělena a amplifikována PCR s použitím lidské genomové DNA jako templátu a potom vložena do plazmidů pHSG399 (Takara Shuzo Co., Ltd.) a klonována do E. coli. Příprava této DNA (dále označované jako „IG5’-DNA“) je ukázána na obr. 24.

Fragment IG5’-DNA byl připraven následujícím způsobem.

Složení reakčního roztoku PCR:

lidská genomová DNA (Clonetech), 2 pg;

oligonukleotidový primer 5’Hind, 80 pmol;

oligonukleotidový primer IGGCPSTN, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΙ;

pufr 10 x Pfu, 20 μΙ;

• · ···· · ♦ · · · · • · · ···· · ··· • · ·· ♦ · · ···· • · · · · · · ···· ··· ·· ··· ··

- 133 Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do celkového objemu 200 μΙ.

Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejprve zahřát na 2 minuty na teplotu 94 °C a potom byl 30 x opakován cyklus zahřívání na 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut. Po ukončení tohoto postupu byl reakční roztok 10 min zahříván při teplotě 72 °C.

Výsledný fragment amplifikované IG5’-DNA byl nejprve extrahován fenolem a potom srážen ethanolem a byl oddělen elektroforézou na polyakrylamidovém gelu 5 % hmotnost/objem. Po elektroforéze byl gel obarven roztokem ethidiumbromidu 1 pg/ml a pruh odpovídající IG5’-DNA byl vyříznut žiletkou a eluován z gelu použitím systémů Centriruter a Centricon-10, jak bylo popsáno výše. Eluovaná DNA byla koncentrována centrifugací při 7500 x g, srážena ethanolem a rozpuštěna v 50 μΙ destilované vody.

Fragment IG5’-DNA získaný výše byl dále čištěn extrakcí fenolem následovanou srážením ethanolem a potom štěpen restrikčními enzymy HindlII a Pstl.

pg DNA plazmidu pHSG399 (Takara Shuzo Co., Ltd.), byl štěpen restrikčními enzymy HindlII a Pstl a potom defosforylován použitím CIP. Výsledná defosforylovaná plazmidová DNA a 100 ng fragmentu IG5’-DNA, který byl také štěpen HindlII a Pstl, byly ligovány použitím soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Výsledná ligační směs byla potom použita pro transformaci E. coli JM109, která potom byla vyseta na plotny s LB agarem obsahující konečné koncentrace 1 mM IPTG, 0,1 % hmotnost/objem X-Gal a 50 pg/ml ampicilinu. Všechny vzniklé bílé transformanty byly kultivovány ve 2 ml kapalného média LB obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu při teplotě 37 °C přes noc a plazmidová DNA byla potom z kultury extrahována metodou alkalického SDS. Extrahovaná plazmidová DNA byla štěpena enzymy HindlII a Pstl a byla provedena její elektroforéza • · • ·

- 134 na agarózovém gelu pro potvrzení přítomnosti nebo nepřítomnosti požadovaného inzertu. Tak byl získán plazmid plG5’03 s inzertem IG5’-DNA.

(3) Konstrukce plazmidu nesoucí konstantní oblast genomové DNA lidského lgG1

1) Syntéza primerů pro přípravu 3’-koncového fragmentu genomové DNA lidského lgG1

3’-koncový fragment genomové DNA lidského lgG1 byl syntetizován pomocí PCR. K tomu účelu byly připraveny následující dva primery: 5’-TCTCTGCAGA GCCCAAATCT TGTGACAAAA CTCAC-3’ (IGGCPSTP: SEQ ID No. 86 ve výpisu sekvencí); a 5’-GGGGAATTCG GGAGCGGGGC TTGCCGGCCG TCGCACTCA-3’ (Eco3’: SEQ ID No. 87 ve výpisu sekvencí).

2) Konstrukce plazmidu plG3’08

DNA obsahující sekvenci: intron z lidského lgG1; pantovou oblast; intron z lidského lgG1; oblast CH2; intron z lidského lgG1; oblast CH3; a štěpící sekvenci EcoRI byla oddělena a amplifikována pomocí PCR s použitím lidské genomové DNA jako templátu a potom vložena do plazmidu pHSG399 (Takara Shuzo Co., Ltd.) a klonována do E. coli. Příprava výše uvedené DNA (dále označovaná jako JG3’DNA“) je znázorněna na obr. 25.

IG3’-DNA byla připraven následujícím způsobem.

Složení reakčního roztoku PCR:

lidská genomová DNA (Clonetech), 2 pg;

oligonukleotidový primer IGGCPSTP, 80 pmol;

oligonukleotidový primer Eco3’, 80 pmol;

• ·

- 135 směs dNTP, 20 μΙ;

pufr 10 x Pfu, 20 μΙ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do celkového objemu 200 μΙ.

Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejprve zahřát na 2 minuty na teplotu 94 °C a potom byl 30 x opakován cyklus zahřívání na 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut. Po ukončení tohoto postupu byl reakční roztok 10 min zahříván při teplotě 72 °C.

Výsledný fragment amplifikované IG3’-DNA byl nejprve extrahován fenolem a potom srážen ethanolem a byl oddělen elektroforézou na polyakrylamidovém gelu 5 % hmotnost/objem. Po elektroforéze byl gel obarven roztokem ethidiumbromidu 1 pg/ml a pruh odpovídající IG3’-DNA byl vyříznut žiletkou a eluován z gelu použitím systémů Centriruter a Centricon-10, jak bylo popsáno výše. Eluovaná DNA byla koncentrována centrifugací při 7500 x g, srážena ethanolem a rozpuštěna v 50 μΙ destilované vody.

Fragment IG3’-DNA získaný výše byl dále čištěn extrakcí fenolem následovanou srážením ethanolem a potom štěpen restrikčními enzymy EcoRI a Pstl.

pg DNA plazmidů pHSG399 (Takara Shuzo Co., Ltd.), byl štěpen restrikčními enzymy EcoRI a Pstl a potom defosforylován použitím CIP. Výsledná defosforylovaná plazmidová DNA a 100 ng fragmentu IG3’-DNA, který byl také štěpen EcoRI a Pstl, byly ligovány použitím soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Výsledná ligační směs byla potom použita pro transformaci E. coli JM109, která potom byla vyseta na plotny s LB agarem obsahující konečné koncentrace 1 mM IPTG, 0,1 % hmotnost/objem X-Gal a 50 pg/ml ampicilinu. Všechny vzniklé bílé kolonie byly odebrány a byl získán plazmid plG3’08 s inzertem IG3’-DNA.

• · • · · ·

-136 ·· · · · ···· • · · · · • · · · · · · · (4) Konstrukce plazmidověho expresního vektoru pro humanizovaný těžký řetězec HFE7A

Expresní plazmidový vektor pEg7AH-H nesoucí DNA SEQ ID No. 88 ve výpisu sekvencí a kódující humanizovaný polypeptid těžkého řetězce HFE7A SEQ ID No. 89 ve výpisu sekvencí byl zkonstruován použitím výše popsaných plazmidů pBL7A27, plG5’03 a plG3’08. Postup je znázorněn na obr. 26.

pg DNA plazmidů plG5’03 obsahujícího oblast CH1 těžkého řetězce lidského lgG1 a intron bylo štěpeno restrikčními enzymy Apal a Kpnl. Navíc byl štěpen rovněž restrikčními enzymy Apal a Kpnl 1 pg DNA pBL7A27 a potom defosforylován použitím CIP. Výsledná defosforylovaná DNA pBL7A27 (100 ng) byla ligována s 10 pg štěpené a defosforylované DNA plG5’03 použitím soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Ligační směs byla potom použita pro transformaci E. coli JM109, která byla vyseta na médium LB obsahující 50 pg/ml ampicilinu. Výsledné transformanty byly kultivovány ve 2 ml kapalného média LB obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu přes noc při 37 °C a plazmidová DNA byla z kultury extrahována metodou alkalického SDS. Plazmid byl štěpen Apal a Kpnl nebo HindlII a Pstl a byl testován pro potvrzení přítomnosti nebo nepřítomnosti inzertu použitím elektroforézy na agarózovém gelu 1 % hmotnost/objem. Tak byl získán plazmid pBL7AF184 obsahující fragment VD-DNA humanizované HFE7A spojený s fragmentem IG5’DNA.

Potom bylo 10 pg takto získaného plazmidů pBL7AF184 štěpeno restrikčními enzymy HindlII a Pstl a 1 pg plazmidové DNA plG3’08 připravené výše byl podobně štěpen HindlII a Pstl a defosforylován s použitím CIP. Výsledná defosforylovaná DNA plG3’08 (100 ng) byla ligována s 10 pg štěpené DNA pBL7AF184 s použitím soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Ligační směs byla potom použita pro transformaci E. coli JM109, která byla vyseta na • · ··

- 137 médium LB obsahující 50 pg/ml ampicilinu. Výsledné transformanty byly kultivovány ve 2 ml kapalného média LB obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu přes noc při 37 °C a plazmidová DNA byla z kultury extrahována metodou alkalického SDS. Plazmid byl štěpen Hindlll a Pstl nebo Hindlll a EcoRI a byl testován pro potvrzení přítomnosti nebo nepřítomnosti inzertu použitím elektroforézy na agarózovém gelu 1 % hmotnost/objem.

Byl získán plazmid pgHSL7A62 obsahující fragment VD-DNA humanizované HFE7A připojený na fragment genomové DNA kódující konstantní oblast lidského lgG1. Transformované bakterie E. coli pgHSL7A62 SANK 73397 nesoucí plazmid pgHSL7A62 byly uloženy ve sbírce Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo

22. srpna 1997 podle Budapešťské úmluvy a bylo jim přiděleno depozitní číslo FERM BP-6074.

pg takto získané DNA plazmidu pgHSL7A62 bylo štěpeno restrikčními enzymy Hindlll a EcoRI a podobně byl štěpen 1 pg DNA expresního plazmidu pEE.6.1 enzymy Hindlll a EcoRI a defosforylován použitím CIP. Výsledná defosforylovaná DNA pEE.6.1 (100 ng) byla ligována s 10 pg štěpené DNA pgHSL7A62 s použitím soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Ligační směs byla potom použita pro transformaci E. coli JM109, která byla vyseta na médium LB obsahující 50 pg/ml ampicilinu. Výsledné transformanty byly kultivovány ve 2 ml kapalného média LB obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu přes noc při 37 °C a plazmidová DNA byla z kultury extrahována metodou alkalického SDS. Plazmid byl štěpen Hindlll a EcoRI a byl testován pro potvrzení přítomnosti nebo nepřítomnosti inzertu použitím elektroforézy na agarózovém gelu 1 % hmotnost/objem.

Výsledný plazmid, pEg7AH-H, obsahoval fuzní fragment obsahující fragment VD-DNA humanizované HFE7A a fragment genomové DNA kódující konstantní oblast lidského lgG1 spolu ve ···· ··· ··· • · · · · · · · · · · • ♦ · · · ······ • · · · · · · ··#· ··· ·· ··· ·· - ·· - 138 spojení a vloženou ve směru translace vzhledem k promotoru CMV ve správné orientaci.

(5) Ověření nukleotidové sekvence

Pro ověření, zda měl inzert DNA plazmidu pEg7AH-H očekávanou nukleotidovou sekvenci, byl analyzován inzert DNA pro stanovení nukleotidové sekvence. K tomu účelu byly syntetizovány následující primery:

5’-ACAGCCGGGA AGGTGTGCAC-3’ (IG01: SEQ ID No. 90); 5’-AGACACCCTC CCTCCCTGTG-3’ (IG02: SEQ ID No. 91); 5’-GTGCAGGGCC TGGGTTAGGG-3’ (IG03: SEQ ID No. 92); 5’-GCACGGTGGG CATGTGTGAG-3’ (IG04: SEQ ID No. 93); 5’-GTTTTGGGGG GAAGAGGAAG-3’ (IG05: SEQ ID No. 94); 5’-CCAGTCCTGG TGCAGGACGG-3’ (IG06: SEQ ID No. 95); 5’-CCTGTGGTTC TCGGGGCTGC-3’ (IG07: SEQ ID No. 96); 5’-CGTGGTCTTG TAGTTGTTCT-3’ (IG08: SEQ ID No. 97); 5’-CTTCCTCTTC CCCCCAAAAC-3’ (IGP5: SEQ ID No. 98); 5’-CCGTCCTGCA CCAGGACTGG-3’ (IGP6: SEQ ID No. 99); 5’-GCAGCCCCGA GAACCACAGG-3’ (IGP7: SEQ ID No. 100); 5’-AGAACAACTA CAAGACCACG-3’ (IGP8: SEQ ID No. 101); 5’-GCCTGACATC TGAGGACTC-3’ (H5+: SEQ ID No. 102); 5’-GAGTCCTCAG ATGTCAGGC-3’ (H5-: SEQ ID No. 103); 5’-GAGCAGTACT CGTTGCTGCC GCGCGCGCCA CCAG-3’ (PEEF: SEQ ID No. 104); a

5’-GGTATGGCTG ATTAATGATC AATG-3’ (PEEB: SEQ ID No. 105).

Polohy, ve kterých se vážou primery, jsou uvedeny v obr. 27. Stanovení nukleotidové sekvence bylo provedeno metodou terminace dideoxynukleotidového řetězce (výše) s použitím plazmidů čištěných metodou alkalického SDS a centrifugací v gradientu chloridu česného (výše). Bylo potvrzeno, že pEg7AH-H měl nukleotidovou sekvenci SEQ ID No. 88 ve výpisu sekvencí, kódující polypeptid SEQ ID No. 89 ve výpisu sekvencí.

• · • · · ···· · · ·· • · ·· · ·· · · · · · • · · · · ···

-139- ................

Příklad 4

Exprese v buňkách COS-1

Buňky COS-1 (odvozené z opičí ledviny) byly transfekovány expresními plazmidy těžkého řetězce humanizované HFE7A a expresními plazmidy každého z výše získaných lehkých řetězců humanizované HFE7A. Transfekce byla prováděna elektroporací s použitím přístroje pro transfekci genu GTE-1 (Shimadzu Seisakusyo,

K. K.) opatřeného komorou FCT-13 se vzdáleností elektrod 2 mm (Shimadzu Seisakusyo, K. K.).

Buňky COS-1 (Američan Type Culture Collection No. CRL-1650) byly ponechány růst v kultivační láhvi (kultivační plocha 225 cm²; Sumitomo Bakelite) obsahující médium Minimal Essential a (_na(+)MEM“; Gibco BRL) doplněné 10 % objemovými FCS (Moregate) do semikonfluentního nárůstu. Potom bylo médium slito a buňky COS1 byly z láhve uvolněny působěním 3 ml roztoku trypsin-EDTA (Sigma Chemicals Co.) 3 minuty při 37 °C. Uvolněné buňky byly potom sklizeny centrifugací 2 min při 800 ot/min, slitím supernatantu a dvojnásobným promytím fosfátovým pufrem (0,02 % hmotnost/objem chlorid draselný (KCI), 0,02 % hmotnost/objem dihydrogenfosforečnan draselný (KH2PO4), 0,8 % hmotnost/objem chlorid sodný (NaCl), 1,5 % hmotnost/objem hydrogenfosforečnan sodný (Na₂HPO₄); dále označované jako „ pufr PBS(-)“; Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.). Promyté buňky COS-1 byly potom suspendovány na hustotu buněk 1 x 10⁸ buněk/ml v pufru PBS(-).

Paralelně byly smíseny 4 pg DNA expresního plazmidů humanizovaného těžkého řetězce HFE7A se 4 pg DNA expresního plazmidů humanizovaného lezkého řetězce HFE7A; obě DNA byly čištěny metodou alkalického SDS a centrifugace v hustotním gradientu chloridu česného. Vzniklá směs byla srážena ethanolem a potom suspendována ve 20 pl pufru PBS(-). Tyto kroky míšení, srážení • ·

a resuspendování byly všechny provedeny ve stejné zkumavce. Celý objem vzniklé suspenze plazmidu (20 μΙ) byl smísen s 20 μΙ předem připravené suspenze buněk COS-1 (2 x 10⁶ buněk) a směs byla převedena do elektroporační komory FCT-13 (Shimadzu Seisakusyo, Κ. K.) se vzdáleností elektrod 2 mm, která byla potom vložena do přístroje pro genovou transfekci GTE-1 (Shimadzu Seisakusyo, Κ. K.). Bylo použito pulzů s napětím 600 V, každý po 50 pF dvakrát v intervalu 1 s pro dosažení transformace buněk COS-1 plazmidovou DNA. Po elektroporaci byla směs buňky - DNA v komoře suspendována ve 20 μΙ média a(+)MEM doplněného 10 % obj. FCS a převedena do kultivační láhve (plocha kultivace 75 cm²; Sumitomo Bakelite). Po inkubaci při 37 °C v atmosféře 5 % obj. C0₂ po dobu 72 hodin byl kultivační supernatant oddělen a byla provedena analýza supernatantů s cílem zjistit, jsou-li přítomné expresní produkty.

Použitím výše popsané metody, která byla vhodně modifikována, byly buňky COS-1 různým způsobem transfekovány každým z následujících plazmidů nebo kombinací plazmidů:

(A) : bez přítomnosti plazmidové DNA (B) : kotransfekce pEg7AH-H a p7AL-MM (C) : kotransfekce pEg7AH-H a p7AL-HM (D) : kotransfekce pEg7AH-H a p7AL-HH

Příklad 5

Kvantifikace expresních produktů metodou ELISA

Ověření a kvantitativní stanovení exprese humanizovaných protilátek jako expresních produktů v supernatantech z kultur připravených v příkladu 4 byly provedeny metodou ELISA s použitím protilátky proti lidskému IgG.

• · · · · ···· ··· ·· ··· .

- 141 Kozí polyklonální protilátka specifická proti lidskému IgG Fc (Kappel) byla rozpuštěna na konečnou koncentraci 1 pg/ml v adsorpčním pufru (0,05 M hydrogenuhličitan sodný, 0,02 % hmotnost/objem azid sodný, pH 9,6) a alikvoty 100 μΙ byly přidány do každé jamky 96-jamkové destičky (MaxiSorb, Nunc) a destička byla inkubována 2 hodiny při teplotě 37 °C pro umožnění adsorpce protilátky. Potom byla každá jamka čtyřikrát promyta vždy 350 μΙ pufru PBS-T (PBS(-) s obsahem 0,05 % hmotnost/objem Tween-20 (BioRad). Po promytí byl do jamek přidán kultivační supernatant zředěný médiem a(+)MEM obsahujícím 10 % objemových FCS a destička byla dále inkubována 2 hodiny při 37 °C.

Potom byly jamky opět promyty čtyřikrát pufrem PBS-T a potom bylo do každé jamky přidáno 100 μΙ kozí polyklonální protilátky specifické proti lidskému IgG Fc značené alkalickou fosfatázou (Caltag Lab.) zředěné 5000 x PBS-T a destička byla inkubována 2 hodiny při teplotě 37 °C. Každá jamka byla potom znovu čtyřikrát promyta PBS-T a potom bylo do každé jamky přidáno 100 μΙ substrátu (roztok p-nitrofenylfosfátu s koncentrací 1 mg/ml připravený v 10 % obj. diethanolaminu (pH 9,8). Po následné inkubaci 0,5 až 1 hodina při teplotě 37 °C byla měřena absorbance při 405 nm.

Při prováděných experimentech byl použit lidský plazmatický IgG podtřídy 1 (lgG1; Biopure AG) zředěný médiem a(+)MEM obsahujícím 10 % obj. FCS na určité požadované koncentrace tak, aby byly získány koncentrace referenčních vzorků humanizovaných protilátek HFE7A obsažených v supernatantech z kultur.

Podle očekávání bylo zjištěno, že všechny supernatanty transformantů (B), (C) a (D) exprimují lidskou protilátku jak abylo detekováno protilátkou proti lidskému IgG. U negativní kontroly (A) se nevyskytla žádná exprese lidské protilátky.

ΦΦΦΦ ·

- 142 φ φ ···· φ φ φφ φφφ · · · · • φφφφ · · ·· • φ · · ···· φ φ · · φφφ φφ φφφ φφ φφ

Příklad 6

Test vazebné aktivity vůči Fas

Test vazebné aktivity vůči Fas v supernatantech buněčných kultur připravených v příkladu 4 byl proveden metodou ELISA podle následujícího popisu.

Supernatant z kultury buněk COS-1 exprimujících lidský fuzní protein Fas získaný v referenčním příkladu 1 výše zředěný pětkrát adsorpčním pufrem byl rozplněn do jamek 96-jamkové destičky (MaxiSorb; Nunc) v množství 50 μΙ na jamku a destička byla inkubována při 4 °C přes noc pro umožnění adsorpce fuzního proteinu lidského Fas na povrch jamek. Potom byla každá jamka čtyřikrát promyta 350 μΙ PBS-T. Po promytí bylo do jamek přidáno 50 μΙ na jamku média PBS-T obsahujícího 5 % obj. BSA (bovinní sérový albumin; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) a destička byla inkubována 1 hod při 37 °C s cílem blokovat zbytek povrchu každé jamky. Jamky byly potom opět čtyřikrát promyty roztokem PBS-T.

Supernatanty kultur získaných v příkladu 4 byly nastaveny tak, aby konečná koncentrace zjišťovaného produktu byla 100 ng/ml v médiu a(+)MEM s obsahem 10 % objemových FCS. Koncentrace byly odhadnuty metodou popsanou v příkladu 5. Každý z těchto vzniklých roztoků s koncentrací 100 ng/ml byl potom použit pro vytvoření sériových ředění sériovým dvojnásobným ředěním médiem cc(+)MEM obsahujícím 10 % obj. FCS. Potom bylo do jamek připravených jak bylo uvedeno výše přidáno 50 μΙ každého z výsledných sériových ředění každého expresního produktu a destička byla inkubována 2 hodiny při 37 °C pro umožnění reakce.

Potom byly jamky opět čtyřikrát promyty roztokem PBS-T a potom bylo do každé jamky přidáno 50 μΙ kozí polyklonální protilátky specifické proti lidskému IgG Fc značené alkalickou fosfatázou • to ···· · · · ···· • · ·· ··· · · ·· • · · · · ······· • · ·· · ··· ···· ··· ·· ··· ·· ·*

- 143 (Caltag Lab.) zředěné 10 000 x roztokem PBS-T a reakce byla ponechána probíhat 2 hodiny při 37 °C.

HFE7A purifikovaná z myší hybridomové HFE7A byla použita jako kontrola (lgG1) a byla detekována s použitím kozí protilátky proti myšímu IgG + IgA + IgM značené alkalickou fosfatázou (Gibco BRL), zředěné 5000 x roztokem PBS-T namísto kozí polyklonální protilátky proti lidskému IgG Fc značené alkalickou fosfatázou.

Jamky byly opět čtyřikrát promyty roztokem PBS-T a potom bylo do každé jamky napipetováno 50 pl roztoku substrátu (1 mg/ml pnitrofenylfosfátu v 10 % obj. diethanolaminu (pH 9,8) a destička byla inkubována při 37 °C 0,5 až 1 hodinu. Vazebná aktivita expresního produktu obsaženého v každém kultivačním supernatantu s lidským fuzním proteinem Fas byla vyhodnocena odečítáním absorbance v každé jamce při 405 nm.

Podle očekávání byla vazebná aktivita vůči lidskému fuznímu proteinu Fas prokázána u supernatantů (B), (C) a (D) výše (obr. 28).

Příklad 7

Kompetitivní inhibice vazby HFE7A na Fas

Humanizované protilátky proti Fas z příkladů by měly inhibovat vazbu HFE7A na Fas, protože protilátky podle příkladů byly z HFE7A odvozeny. Proto byla měřena schopnost expresních produktů získaných v příkladu 4 kompetitivně inhibovat vazbu HFE7A na lidský fuzní protein Fas.

mg purifikované monoklonální protilátky HFE7A získaný v referenčním příkladu 3 byl označen s použitím komerčně dostupného kitu pro značení alkalickou fosfatázou (Immuno-Link AP a APL Labeling Kit; Genosis) podle protokolu dodávaného s výrobkem. Výsledná označená protilátka se také dále označuje jako „AP-HFE7A“.

• · <· · · · • · · · ··· · · ·· • φ · · · · · ·«·· · • · « · · ··· ···· ··· ·· ··· ·* ··

- 144 Kultivační supernatant z buněk COS-1 obsahující fuzní protein lidského Fas jak byl získán v referenčním příkladu 1 byl pětkrát zředěn adsorpčním pufrem a rozplněn do jamek 96-jamkové destičky pro detekci luminiscence (Luminescent Solid Assay Plate, vysoká schopnost vazby; Costar) v množství 50 μΙ na jamku. Destička byla potom inkubována přes noc při 4 °C pro umožnění adsorpce lidského fuzního proteinu Fas na povrch buněk.

Potom byla každá jamka čtyřikrát promyta 350 μΙ roztoku PBS-T a potom bylo do každé jamky přidáno 100 μΙ roztoku PBS-T obsahujícího 5 % objemových BSA a destička byla inkubována 1 hodinu při 37 °C pro blokování zbylého povrchu v každé jamce. Jamky byly potom opět čtyřikrát promyty roztokem PBS-T. Kultivační supernatanty získané v příkladu 4 byly nastaveny na konečnou koncentraci protilátky 1 pg/ml v a(+)MEM obsahujícím 10 % objemových FCS metodou z příkladu 5. Všechny výsledné roztoky expresních produktů byly použity pro získání sériových ředění dvojnásobným sériovým ředěním médiem a(+)MEM s obsahem 10 % obj. FCS. Protilátka AP-HFE7A byla zředěna na koncentraci 50 ng/ml médiem a(+)MEM s obsahem 10 % objemových FCS a 25 μΙ výsledného roztoku bylo smíseno se stejným objemem každého z připravených sériových ředění.

Všechny jamky byly opět čtyřikrát promyty roztokem PBS-T a potom bylo k jednotlivým jamkám přidáno 50 μΙ každé z vzniklých směsí protilátek a destička byla ponechána stát při pokojové teplotě přes noc. Potom bylo do každé jamky přidáno po promytí každé jamky opět čtyřikrát roztokem PBS-T 100 μΙ pufru CDP-star (9,58 ml diethanolaminu, 0,2 g chloridu hořečnatého, 0,25 g azidu sodného, pH 8,5) a destička byla ponechána stát 10 min při pokojové teplotě. Potom byl pufr CDP-star slit a substrát CDP-star (1,2 ml sapphire II (Tropix), 200 μΙ CDP-star (Tropix), doplněno do 12 ml pufrem CDP ·· ···· • · • ··· » «

- 145 stár) přidán v množství 50 μΙ na jamku a destička byla ponechána stát při pokojové teplotě dalších 40 minut.

Kompetitivní inhibice expresních produktů z příkladu 4 vazby HFE7A na lidský fuzní protein Fas byla vyhodnocena měřením intenzity luminiscence přístrojem Luminoscan (Titertech).

Bylo tedy ověřeno, že expresní produkty připravené v příkladu 4 specificky inhibovaly vazbu HFE7A na lidský fuzní protein Fas (obr. 29).

Příklad 8

Aktivita indukující apoptózu

Pro zjištění apoptózu indukující aktivity supernatantu buněčné kultury z buněk COS-1 z příkladu 4 byly použity buňky WR19L12a (Itoh, N. a další, výše).

Buňky WR19L12a byly kultivovány v médiu RPM11640 s 10 % obj. FCS (Gibco BRL) 3 dny při 37 °C v koncentraci 5 % objemových CO₂ a potom bylo 50 μΙ (1 x 10⁵ buněk) rozplněno do každé jamky 96jamkové mikrodestičky (Sumitomo Bakelite). Kultivační supernatanty získané v příkladu 4 byly nastaveny na konečnou koncentraci protilátky 100 ng/ml v médiu RPMI1640 obsahujícím 10 % objemových FCS. Koncentrace byly stanoveny metodou podle příkladu 5. Každý z nastavených roztoků expresních produktů byl použit pro přípravu sériových ředění dvojnásobným sériovým ředěním médiem RPM11640 obsahujícím 10 % objemových FCS. Všechna výsledná ředění každého expresního produktu byla přidána do jednotlivých jamek v množství 50 μΙ na jamku a destička byla inkubována 1 hodinu při 37 °C. Potom byly buňky v každé jamce čtyřikrát promyty médiem RPM11640 obsahujícím 10 % objemových FCS a promyté buňky byly suspendovány v 75 μΙ média RPMI1640 s obsahem 10 % objemových FCS na jamku.

• · · ······ · 4 44

4 4 4 4 4 4 · · 4· • · · 4 4 4 4 · 44 4 • · ·· · * · 4 4 4 44 • · ·· 4 4 44 ···· ··· · · ··· 4 4 4 4

- 146 Potom bylo do každé jamky přidáno 75 μΙ kozí polyklonální protilátky specifické proti lidskému IgG Fc (Kappel) v koncentraci 1,25pg/ml v médiu RPMI1640 obsahujícího 10 % obj. FCS jako sekundární protilátky. Destička byla ponechána stát 12 hodin při teplotě 37 °C a potom bylo do každé jamky přidáno 50 μΙ 25 μΜ PMS (fenazinmethosulfát; Sigma chemical Co.) obsahujícího 1 mg/ml XTT (vnitřní soli 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfofenyl)-2H-tetrazolium-5karboxanilidu; Sigma Chemical Co.) na konečné koncentrace 250 μg/ml v případě XTT a 5 μΜ v případě PMS. Destička byla potom inkubována 3 hodiny při 37 °C a byla měřena absorbance při 450 nm u každé jamky pro výpočet buněčné viability s použitím redukční schopnosti mitochondrie jako indexu.

Viabilita buněk v každé jamce byla vypočtena podle následujícího vzorce:

Viabilita (%) = 100 x (a-b)/(c-b) kde „a“ je absorbance testované jamky, „b“ je absorbance jamky neobsahující buňky a „c“ je absorbance jamky bez přidané protilátky.

Podle očekávání se ukázalo, že všechny expresní produkty (B), (C) a (D) z příkladu 4 indukovaly u T buněk exprimujících lidský antigen Fas apoptózu (obr. 30).

Příklad 9

Příprava DNA kódující humanizovaný lehký řetězec (1) Konstrukce vektorů pro lehké řetězce humanizovaných verzí protilátky HFE7A

Pro humanizaci aminokyselinové sekvence lehkého řetězce myší protilátky HFE7A proti lidskému Fas byly nahrazeny aminokyselina v poloze 85 (alanin) a aminokyselina v poloze 107 (arginin) z N-konce aminokyselinové sekvence lehkého řetězce typu • · · · · · · · · ·· ·· ···· ··· · · · · • · · ···· · ··· • · ·· · ·· · · · · · • · ·· · · · · ···· ··· ·· *·· *· ··

- 147 HH kyselinou glutamovou, kyselinou glutamovou a lyzinem. Tyto nahrazené zbytky jsou u lidského lehkého řetězce (řetězec k) konzervovány. Výsledná sekvence byla označena jako „typ PDHH“. U sekvence lehkého řetězce HM byla aminokyselina v poloze 1 (kyselina aspargová) a aminokyselina v poloze 7 (arginin) od N-konce aminokyselinové sekvence nahrazena konzervovanou kyselinou glutamovou, popřípadě lyzinem. Vzniklá sekvence byla označena jako „typ PDHM“.

Následujícím způsobem byly zkonstruovány expresní plazmidy, které odděleně nesou tyto dva typy aminokyselinových sekvencí humanizovaného lehkého řetězce (PDHH a PFHM).

1) Syntéza primerů pro přípravu variabilních a konstantních oblastí lehkého řetězce humanizovaného HFE7A

DNA (SEQ ID No. 106 ve výpisu sekvencí) kódující polypeptidový řetězec typu PDHH (SEQ ID No. 107 ve výpisu sekvencí) a DNA (SEQ ID No. 108 ve výpisu sekvencí) kódující polypeptidový řetězec typu PDHM (SEQ ID No. 109 ve výpisu sekvencí) byly připraveny PCR. Každá z těchto sekvencí je fúzí jedné humanizované verze proměnné oblasti lehkého řetězce HFE7A s konstantní oblastí lehkého řetězce lidského Ig (řetězec κ).

Sekvence 7AL1P (SEQ ID No. 55) a 7ALCN (SEQ ID No. 64) byly již syntetizovány (příklad 2 (2) 2) výše) a pomocí PCR byly navíc syntetizovány následující oligonukleotidové primery: 5’-GGTGAGATTG TGCTCACCCA ATCTCCAGG-3’ (LPD1P; SEQ ID No. 110);

5’-CCTGGAGATT GGGTGAGCAC AATCTCACC-3’ (LPD1N; SEQ ID

No. 111);

5’-CCATCTCTCG TCTGGAGCCG GAGGATTTTG C-3’ (LPD2P; SEQ ID No. 112);

- 148 5’-GCAAAATCCT CCGGCTCCAG ACGAGAGATG G-3’ (LPD2N; SEQ ID No. 113);

5’-CAAGGCACCA AGCTGGAAAT CAAACGGACT G-3’ (LPD3P; SEQ ID No. 114); a

5’-CAGTCCGTTT GATTTCCAGC TTGGTGCCTT G-3’ (LPD3N; SEQ ID No. 115).

2) Konstrukce plazmidu pLPDHH75 (expresní plazmid humanizovaného lehkého řetězce HFE7A typu PDHH

LPDHH-DNA (lehký řetězec konstantní oblasti fúzovaný s PDHH DNA) jak je definován v SEQ ID No. 106 ve výpisu sekvencí kódující aminokyselinovou sekvenci podle SEQ ID No. 107 ve výpisu sekvencí byl připraven třístupňovou PCR, vložen do plazmidového vektoru a klonován do E. coli.

a) První stupeň PCR

První stupeň PCR při přípravě LPDHH-DNA je znázorněn na obr. 31.

Fragment LPD1-DNA, kódující sekreční signálovou sekvenci a část FRLi, který má však přidané štěpící místo restrikčního enzymu Hindlll na 5’-konci, byl připraven následujícím způsobem.

Složení reakčního roztoku PCR:

DNA plazmidu pHSGHH7, 200 ng;

oligonukleotidový primer 7AL1P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer LPD1N, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΙ;

pufr 10 x Pfu, 20 μΙ;

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek; a redestilovaná voda do celkového objemu 200 μΙ.

• · · · · ···· · · ·· • · · · ······· • · · ····· ··· • · · · · ······· • · · · ···· ···· ··· ·· ····· ··

- 149 Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejprve zahříván 2 minuty při teplotě 94 °C a potom byl 30 x opakován cyklus zahřívání 1 minutu při 94 °C, 1 minutu při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Po ukončení tohoto postupu byl reakční roztok zahříván 10 min při 72 °C.

Fragment LPDHH1-DNA, kódující část FRL_n CDRLn FRL₂, CDRL₂ a část oblasti FRL₃ byl připraven následujícím způsobem.

Složení reakčního roztoku PCR:

DNA plazmidu pHSGHH7, 200 ng;

oligonukleotidový primer LPD1P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer LPD2N, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΙ;

pufr 10 x Pfu, 20 μΙ;

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek; a redestilovaná voda do celkového objemu 200 μΙ.

Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejprve zahříván 2 minuty při teplotě 94 °C a potom byl 30 x opakován cyklus zahřívání 1 minutu při 94 °C, 1 minutu při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Po ukončení tohoto postupu byl reakční roztok zahříván 10 min při 72 °C.

Fragment LPDHH2-DNA, kódující část FRL₃, CDRL₃, a oblast FRL₄ byl připraven následujícím způsobem.

Složení reakčního roztoku PCR:

DNA plazmidu pHSGHH7, 200 ng; oligonukleotidový primer LPD2P, 80 pmol; oligonukleotidový primer LPD3N, 80 pmol; směs dNTP, 20 μΙ;

- 150 pufr 10 x Pfu, 20 μΙ;

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek; a redestilovaná voda do celkového objemu 200 μΙ.

Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejprve zahříván 2 minuty při teplotě 94 °C a potom byl 30 x opakován cyklus zahřívání 1 minutu při 94 °C, 1 minutu při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Po ukončení tohoto postupu byl reakční roztok zahříván 10 min při 72 °C.

Fragment LPDC-DNA, kódující část FRL₄, a konstantní oblast lehkého řetězce HFE7A, který však obsahuje štěpící místo restrikčního enzymu EcoRI přidané na 3’-konec byl připraven následujícím způsobem.

Složení reakčního roztoku PCR:

DNA plazmidů pHSGHH7, 200 ng;

oligonukleotidový primer LPD3P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7ALCN, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΙ;

pufr 10 x Pfu, 20 μΙ;

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek; a redestilovaná voda do celkového objemu 200 μΙ.

Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejprve zahříván 2 minuty při teplotě 94 °C a potom byl 30 x opakován cyklus zahřívání 1 minutu při 94 °C, 1 minutu při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Po ukončení tohoto postupu byl reakční roztok zahříván 10 min při 72 °C.

Po PCR byly nejprve amplifikované fragmenty DNA extrahovány fenolem a potom sráženy ethanolem a potom rozděleny na elektroforéze polyakrylamidového gelu s koncentrací 5 % • · • · · · • · · · • · · · · · ····· • · · ··«·· ··· • · ·· · · · ···· · • · · · ···· ···· ··· ·· ··· ·· ··

- 151 hmotnost/objem. Po elektroforéze byl gel obarven roztokem ethidiumbromidu s koncentrací 1 pg/ml a takto detekované pruhy DNA byly po detekci UV lampou vyříznuty žiletkou a eluovány z gelu použitím systémů Centriruter a Centricon-10 jak bylo popsáno výše. Eluovaná DNA byla koncentrována centrifugací při 7500 x g následovanou srážením ethanolem a nakonec byla rozpuštěna v 50 pl destilované vody.

b) Druhy stupeň PCR

Druhý stupeň PCR při přípravě LPDHH-DNA je znázorněn na obr. 32.

LPDHH1.2-DNA, ve které jsou fúzovány výše popsané fragmenty LPD1-DNA, LPDHH1-DNA a LPDHH2-DNA, byla připravena následujícím způsobem.

Složení reakčního roztoku PCR:

roztok LPD1-DNA (z prvního stupně PCR), 10 pl;

roztok LPDHH1-DNA (z prvního stupně PCR), 10 pl;

roztok LPDHH2-DNA (z prvního stupně PCR), 10 pl;

oligonukleotidový primer 7AL1P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer LPD3N, 80 pmol;

směs dNTP, 20 pl;

pufr 10 x Pfu, 20 pl;

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek; a redestilovaná voda do celkového objemu 200 pl.

Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejprve zahříván 2 minuty při teplotě 94 °C a potom byl 30 x opakován cyklus zahřívání 1 minutu při 94 °C, 1 minutu při 55 °C a • · · · · · · · ··· ·· • · · · · · * ·· · · • · · · ··· ···· • · ·· · · · ···· · • · · · ···· ···· ·· ·· ····· ··

- 152 - minuty při 72 °C. Po ukončení tohoto postupu byl reakční roztok zahříván 10 min při 72 °C.

Po PCR byl nejprve amplifikovaný fragment LPDHH1.2-DNA extrahován fenolem a potom srážen ethanolem a potom oddělen na elektroforéze polyakrylamidového gelu s koncentrací 5 % hmotnost/objem. Po elektroforéze byl gel obarven roztokem ethidiumbromidu s koncentrací 1 pg/ml a pru fuzní DNA byl po detekci UV lampou vyříznut žiletkou a eluován z gelu použitím systémů Centriruter a Centricon-10 jak bylo popsáno výše. Eluovaná DNA byla koncentrována centrifugací při 7500 x g následovanou srážením ethanolem a nakonec byla rozpuštěna v 50 μΙ destilované vody.

c) Třetí stupeň PCR

Třetí stupeň PCR při přípravě LPDHH-DNA je znázorněn na obr.

33.

Fragment LPDHH-DNA, ve kterém jsou fúzovány výše popsané fragmenty LPDHH1.2-DNA a LPDC-DNA, byl připraven následujícím způsobem.

Složení reakčního roztoku PCR:

roztok LPDHH1.2-DNA (z druhého stupně PCR), 10 μΙ;

roztok LPDC-DNA (z prvního stupně PCR), 10 μΙ;

oligonukleotidový primer 7AL1P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7ALCN, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΙ;

pufr 10 x Pfu, 20 μΙ;

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek; a redestilovaná voda do celkového objemu 200 μΙ.

• » · ·· · · · · · · ·· ♦ · · · ······· • · · ···· · · · · • · · · · · · · · · · · • · · · ·· · · ···· ··· φφ ··*·· ·4

- 153 Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejprve zahříván 2 minuty při teplotě 94 °C a potom byl 30 x opakován cyklus zahřívání 1 minutu při 94 °C, 1 minutu při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Po ukončení tohoto postupu byl reakční roztok zahříván 10 min při 72 °C.

Po PCR byl nejprve amplifikovaný fragment LPDHH-DNA extrahován fenolem a potom srážen ethanolem a potom oddělen na elektroforéze polyakrylamidového gelu s koncentrací 5 % hmotnost/objem. Po elektroforéze byl gel obarven roztokem ethidiumbromidu s koncentrací 1 pg/ml a pru fuzní DNA byl po detekci UV lampou vyříznut žiletkou a eluován z gelu použitím systémů Centriruter a Centricon-10 jak bylo popsáno výše. Eluovaná DNA byla koncentrována centrifugací při 7500 x g následovanou srážením ethanolem a nakonec byla rozpuštěna v 50 μΙ destilované vody.

Konstrukce expresního plazmidů nesoucího fragment LPDHHDNA je znázorněna na obr. 34.

Fragment LPDHH-DNA získaný výše byl dále čištěn extrakcí fenolem následovanou srážením ethanolem a potom štěpen restrikčními enzymy HindlII a EcoRI.

pg DNA klonovacího plazmidů pHSG399 byl štěpen restrikčními enzymy HindlII a EcoRI a potom defosforylován CIP. Výsledná defosforylovaná DNA pHSG399 byla potom ligována s fragmentem LPDHH-DNA, který byl předem rovněž štěpen enzymy HindlII a EcoRI, s použitím soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo, Co. Ltd.). Potom byla bakterie E. coli JM109 transformována ligační směsí a vyseta na LB agar obsahující konečné koncentrace 1 mM IPTG, 0,1 % hmotnost/objem X-Gal a 50 pg/ml chloramfenikolu. Všechny získané bílé transformanty byly kultivovány ve 2 ml kapalného média LB obsahujícího 50 pg/ml chloramfenikolu přes noc při 37 °C a plazmidová DNA byla z výsledné kultury extrahována metodou alkalického SDS. Extrahovaná plazmidová DNA • · · ···· · ··· • · ·· · ·· ···· · • · · · · · to · ···* ··· ·· ··· ·· to·

- 154 byla štěpena HindlII a EcoRI a klon nesoucí fragment LPDHH-DNA byl potom vybrán elektroforézou na agarózovém gelu s koncentrací 1 % hmotnost/objem.

Byl tedy izolován plazmid pHSHH5 nesoucí fuzní inzert obsahující proměnnou oblast humanizované LPDHH DNA a DNA kódující konstantní oblast lidského imunoglobulinového řetězce k. Transformant E. coli pHSHH5 SANK 70398 nesoucí plazmid pHSHH5 byla uložena v souladu s Budapešťskou úmluvou ve sbírce Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo 26. února 1998 pod depozitním číslem FERM BP-6274.

Plazmid expresního vektoru pLPDHH75 nesoucí fragment DNA SEQ ID No. 106 ve výpisu sekvencí kódující humanizovaný polypeptid lehkého řetězce typu PDHH HFE7A SEQ ID No. 107 ve výpisu sekvencí byl potom připraven s použitím plazmidu pHSHH5.

pg DNA pEE.12.1 (Lonza), expresního vektoru pro savčí buňky, byl štěpen restrikčními enzymy HindlII a EcoRI a potom defosforylován použitím CIP. Výsledná rozštěpená plazmidová DNA (100 ng) byla ligována s 10 pg fragmentu DNA pHSHH5, který byl rovněž štěpen enzymy HindlII a EcoRI, s použitím soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Ligační směs byla potom použita pro transformaci E. coli JM109 flak bylo popsáno výše), která byla potom vyseta na plotny LB agaru obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu.

Transformanty získané touto metodou byly kultivovány ve 2 ml kapalného média LB obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu přes noc při 37 °C a plazmidová DNA byla potom extrahována z výsledné kultury metodou alkalického SDS.

Extrahovaná plazmidová DNA byla štěpena enzymy HindlII a EcoRI a byla provedena její elektroforéza na agarózovém gelu s koncentrací 1 % hmotnost/objem pro potvrzení přítomnosti nebo nepřítomnosti požadovaného inzertu. To umožnilo izolaci plazmidu • · · · · ·

- 155 -

pLPDHH75, který obsahuje fuzní fragment s variabilní oblastí humanizovaného lehkého řetězce typu PDHH HFE7A spolu s DNA kódující konstantní oblast řetězce κ lidského imunoglobulinu. Bylo zjištěno, že fuzní fragment je umístěn po směru translace vzhledem k promotoru cytomegaloviru (CMV) ve správné orientaci.

3) Konstrukce plazmidu PLPDHM32 (expresní plazmid pro lehký řetězec humanizované HFE7A typu PDHM)

Fragment LPDHM-DNA (SEQ ID No. 108 ve výpisu sekvencí, kódující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID No. 109 ve výpisu sekvencí) byl vytvořen třístupňovou PCR, a potom byl vložen do plazmidového vektoru a klonován do E. coli.

a) První stupeň PCR

První stupeň PCR při přípravě LPDHM-DNA je znázorněn na obr. 35.

Fragment LPD1-DNA, kódující sekreční signálovou sekvenci a část FRLi, obsahující štěpící místo restrikčního enzymu Hindlll přidané na 5’-konec, a fragment LPDC-DNA, kódující část FRL₄ a konstantní oblast s štěpícím místem restrikčního enzymu EcoRI přidaným na 3’-konec, byly získány při přípravě fragmentu LPDHHDNA (viz odst. „2) Konstrukce plazmidu PLPDHH75 (expresní plazmid pro humanizovaný lehký řetězec HFE7A typu PDHH)“ a „a) První stupeň PCR“).

Fragment LPDHM1-DNA kódující část CDRLi, FRL₂, CDRL₂, FRL₃ a CDRL₃ a FRL₄ byl připraven následujícím způsobem.

Složení reakčního roztoku PCR:

DNA plazmidu pHSGHM17, 200 ng;

oligonukleotidový primer LPD1P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer LPD3N, 80 pmol;

• · • · ·· · ·· · · · · · • · ·· · ··· ···· ··· ·· ··· ·· ··

- 156 směs dNTP, 20 μΙ;

pufr 10 x Pfu, 20 μΙ;

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek; a redestilovaná voda do celkového objemu 200 μΙ.

Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejprve zahříván 2 minuty při teplotě 94 °C a potom byl 30 x opakován cyklus zahřívání 1 minutu při 94 °C, 1 minutu při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Po ukončení tohoto postupu byl reakční roztok zahříván 10 min při 72 °C.

Po PCR byly nejprve amplifikované fragmenty LPD1, LPDHM1 a LPDC-DNA extrahovány fenolem a potom sráženy ethanolem a potom odděleny na elektroforéze polyakrylamidového gelu s koncentrací 5 % hmotnost/objem. Po elektroforéze byl gel obarven roztokem ethidiumbromidu s koncentrací 1 pg/ml a fuzní pruhy DNA byly po detekci UV lampou vyříznuty žiletkou a eluovány z gelu použitím systémů Centriruter a Centricon-10 jak bylo popsáno výše. Eluovaná DNA byla koncentrována centrifugací při 7500 x g následovanou srážením ethanolem a nakonec byla rozpuštěna v 50 μΙ destilované vody.

b) Druhý stupeň PCR

Druhý stupeň PCR při přípravě PDHM-DNA je znázorněn na obr. 36.

LPDHM1.2-DNA, ve které jsou fúzovány výše popsané fragmenty LPD1-DNA a LPDHM1-DNA, byla připravena následujícím způsobem.

Složení reakčního roztoku PCR:

roztok LPD1-DNA (z prvního stupně PCR), 10 μΙ;

roztok LPDHM1-DNA (z prvního stupně PCR), 10 μΙ;

• · • · • · · · · · · ···· • · · · · · · · ··· • · · · · ······ · • · · · · ··· ···· ··· ·· ··· ·· ··

-157oligonukleotidový primer 7AL1P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer LPD3N, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΙ;

pufr 10 x Pfu, 20 μΙ;

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek; a redestilovaná voda do celkového objemu 200 μΙ.

Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejprve zahříván 2 minuty při teplotě 94 °C a potom byl 30 x opakován cyklus zahřívání 1 minutu při 94 °C, 1 minutu při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Po ukončení tohoto postupu byl reakční roztok zahříván 10 min při 72 °C.

Po PCR byl nejprve amplifikovaný fragment LPDHM1.2-DNA extrahován fenolem a potom srážen ethanolem a potom oddělen na elektroforéze polyakrylamidového gelu s koncentrací 5 % hmotnost/objem. Po elektroforéze byl gel obarven roztokem ethidiumbromidu s koncentrací 1 pg/ml a pruh fuzní DNA byl po detekci UV lampou vyříznut žiletkou a eluován z gelu použitím systémů Centriruter a Centricon-10 jak bylo popsáno výše. Eluovaná DNA byla koncentrována centrifugací při 7500 x g následovanou srážením ethanolem a nakonec byla rozpuštěna v 50 μΙ destilované vody.

c) Třetí stupeň PCR

Třetí stupeň PCR při přípravě LPDHM-DNA je znázorněn na obr. 37.

Fragment LPDHM-DNA, ve kterém jsou fúzovány výše popsané fragmenty LPDHM1.2-DNA a LPDC-DNA, byl připraven následujícím způsobem.

Složení reakčního roztoku PCR:

• · · · · ·· ···· · • · · · · ···

- 158 - ................

roztok LPDHM1.2-DNA (z druhého stupně PCR), 10 pl;

roztok LPDC-DNA (z prvního stupně PCR), 10 μΙ; oligonukleotidový primer 7AL1P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7ALCN, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΙ;

pufr 10 x Pfu, 20 μΙ;

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek; a redestilovaná voda do celkového objemu 200 μΙ.

Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejprve zahříván 2 minuty při teplotě 94 °C a potom byl 30 x opakován cyklus zahřívání 1 minutu při 94 °C, 1 minutu při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Po ukončení tohoto postupu byl reakční roztok zahříván 10 min při 72 °C.

Po PCR byl nejprve amplifikovaný fragment LPDHM-DNA extrahován fenolem a potom srážen ethanolem a potom oddělen na elektroforéze polyakrylamidového gelu s koncentrací 5 % hmotnost/objem. Po elektroforéze byl gel obarven roztokem ethidiumbromidu s koncentrací 1 pg/ml a pruh fuzní DNA byl po detekci UV lampou vyříznut žiletkou a eluován z gelu použitím systémů Centriruter a Centricon-10 jak bylo popsáno výše. Eluovaná DNA byla koncentrována centrifugací při 7500 x g následovanou srážením ethanolem a nakonec byla rozpuštěna v 50 μΙ destilované vody.

Konstrukce plazmidů nesoucího fragment LPDHM-DNA je znázorněna na obr. 38.

LPDHM-DNA získaná výše byla dále čištěna extrakcí fenolem a potom srážením ethanolem a potom štěpena restrikčními enzymy HindlII a EcoRI.

• · • ·

pg DNA klonovacího plazmidu pHSG399 byl štěpen restrikčními enzymy Hindlll a EcoRI a potom defosforylován CIP. Výsledná defosforylovaná DNA pHSG399 byla potom ligována s fragmentem LPDHM-DNA, který byl předtím také štěpen Hindlll a EcoRI s použitím soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Ligační směsí byla potom transformována E.coli JM109, která byla vyseta na LB agar obsahující konečné koncentrace mM IPTG, 0,1 % hmotnost/objem X-Gal a 50 pg/ml chloramfenikolu. Všechny bílé transformanty, které byly získány, byly kultivovány ve ml kapalného média LB obsahujícího 50 pg/ml chloramfenikolu při 37 °C přes noc a plazmidová DNA byla z výsledné kultury extrahována metodou alkalického SDS. Extrahovaná plazmidová DNA byla štěpena Hindlll a EcoRI a klon nesoucí fragment LPDHM-DNA byl potom vybrán elektroforézou na agarózovém gelu 1 % hmotnost/objem.

Výsledkem výše popsaného postupu je plazmid pHSHM2 nesoucí fuzní inzert obsahující variabilní oblast humanizovaného lehkého řetězce typu PDMM HFE7A a DNA kódující konstantní oblast řetězce κ lidského Ig. Transformant E. coli pHSHM2 SANK 70198 nesoucí plazmid pHSHM2 byl uložen v souladu s Budapešťskou úmluvou ve sbírce Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo 26. února 1998 pod depozitním číslem FERM BP-6272.

S použitím plazmidu pHSHM2 získaného výše byl zkonstruován plazmid pLPDHM32 expresního vektoru nesoucí DNA SEQ ID No. 108 ve výpisu sekvencí kódující polypeptid humanizovaného lehkého řetězce typu PDHM HFE7A SEQ ID No. 109.

pg DNA pEE.12.1 (Lonza), expresního vektoru pro savčí buňky, byl štěpen restrikčními enzymy Hindlll a EcoRI a potom defosforylován s použitím CIP. Výsledná rozštěpená defosforylovaná plazmidová DNA (100 ng) byla ligována s 10 pg fragmentu DNA pHSHM2, který byl rovněž štěpen enzymy Hindlll a EcoRI, s použitím soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.).

• · • ·

Ligační směs byla potom použita pro transformaci E. coli JM109 (jak bylo popsáno výše), která byla potom vyseta na plotny s LB agarem obsahující 50 pg/ml ampicilinu.

Transformanty získané tímto způsobem byly kultivovány ve 2 ml kapalného média LB obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu při 37 °C přes noc a plazmidová DNA byla potom extrahována z výsledné kultury metodou alkalického SDS.

Extrahovaná plazmidová DNA byla štěpena enzymy Hindlll a EcoRI a byla provedena její elektroforéza na agarózovém gelu koncentrace 1 % hmotnost/objem pro potvrzení přítomnosti nebo nepřítomnosti požadovaného inzertu. To umožnilo izolaci plazmidů pLPDHM32, který obsahuje fuzní fragment s proměnnou oblastí humanizovaného lehkého řetězce typu PDHM HFE7A spolu s DNA kódující konstantní oblast řetězce κ lidského imunoglobulinu. Bylo zjištěno, že fuzní fragment je umístěn ve směru translace vzhledem k promotoru cytomegaloviru (CMV) ve správné orientaci.

(4) Ověření nukleotidových sekvencí

Pro ověření, zda mají inzerty DNA plazmidů pLPDHH75 a pLPDHM32 požadované nukleotidové sekvence, byly inzerty DNA analyzovány pro stanovení jejich nukleotidových sekvencí. Pro sekvenování nukleotidů byly použity oligonukleotidové primery SP1 (SEQ ID No. 68), SP2 (SEQ ID No. 69), SP3 (SEQ ID No. 70), SP4 (SEQ ID No. 71), SP5 (SEQ ID No. 72) a SP6 (SEQ ID No. 73).

Polohy, ve kterých se vážou uvedené primery, jsou ukázány v obr. 19. Stanovení nukleotidové sekvence bylo prováděno metodou ukončení dideoxynukleotidového řetězce s použitím plazmidů obsahujícího sekvenci, která má být potvrzena, jako templátu, přičemž plazmid byl čištěn metodou alkalického SDS a centrifugací v chloridu česném. Podle očekávání bylo potvrzeno, že plazmid pLPDHH75 má nukleotidovou sekvenci SEQ ID No. 106 ve výpisu sekvencí kódující • β ··· ·

- 161 polypeptid SEQ ID No. 107, a že plazmid pLPDHM32 má nukleotidovou sekvenci SEQ ID No. 108 ve výpisu sekvencí kódující polypeptid SEQ ID No. 109.

Příklad 10

Příprava DNA kódující humanizovaný těžký řetězec (1) Konstrukce vektoru těžkého řetězce humanizované verze protilátky HFE7A

Při další humanizaci aminokyselinové sekvence SEQ ID No. 75 ve výpisu sekvencí (humanizovaný těžký řetězec myší protilátky HFE7A proti lidskému Fas) byla nahrazena aminokyselina v SEQ ID No. 75 v poloze 44 (arginin) gylcinem a aminokyselina v poloze 76 (alanin) threoninem, protože tyto zbytky jsou v lidském těžkém řetězci konzervovány. Výsledná sekvence byla označena jako „typ HV“.

Expresní plazmidy nesoucí aminokyselinové sekvence humanizovaného těžkého řetězce typu HV protilátky HFE7A proti lidskému Fas byly zkonstruovány následujícím způsobem.

(1) Syntéza primerů pro přípravu variabilní oblasti humanizovaného těžkého řetězce

Syntéza DNA (SEQ ID No. 116 ve výpisu sekvencí) kódující humanizovaný těžký řetězec protilátky HFE7A proti Fas (SEQ ID No. 117 ve výpisu sekvencí) byla provedena s použitím kombinace kroků PCR.

Navíc k 7AH1P (SEQ ID No. 76 výše) byly pro PCR syntetizovány následující tři primery:

5’-CAGGCCCCTG GACAGGGCCT TGAGTGGATG-3’ (HPD1P; SEQ ID No. 118);

• 4 ··· · • · • ··· ···· • · · ♦ • · ·· • ·» · · · · · • · · » · · Φ· «·· ·· ··

- 162 5’-CATCCACTCA AGGCCCTGTC CAGGGGCCTG-3’ (HPD1N; SEQ ID No. 119); a

5’-GCTGAGCTCC ATGTAGGCTG TGCTAGTGGA TGTGTCTAC-3’ (HPD2N; SEQ ID No. 120).

2) Konstrukce plazmidu pqHPDHV3

Fragment HPD1.2-DNA kódující aminokyseliny -19 až +84 SEQ ID No. 117 ve výpisu sekvencí byl připraven provedením dvou stupňů PCR, vložen do plazmidu a potom klonován do E. coli.

a) První stupeň PCR

První stupeň PCR při přípravě HPD1.2-DNA je znázorněn na obr. 39.

Fragment HPD1-DNA kódující sekreční signálovou sekvenci a FRHi, CDRHi a část FRH₂ s přidaným místem restrikčního štěpení Hindlll na 5’-konci byl připraven následujícím způsobem:

Složení reakčního roztoku PCR:

DNA plazmidu pgHSL7A62, 200 ng;

oligonukleotidový primer 7AH1P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer HPD1N, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΙ;

pufr 10 x Pfu, 20 μΙ;

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek; a redestilovaná voda do celkového objemu 200 μΙ.

Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejprve zahříván 2 minuty při teplotě 94 °C a potom byl 30 x opakován cyklus zahřívání 1 minutu při 94 °C, 1 minutu při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Po ukončení tohoto postupu byl reakční roztok zahříván 10 min při 72 °C.

• · • ·

- 163 -

Fragment HPD2-DNA kódující část FRH₂, CDRH₃ a část FRH₃ byl připraven následujícím způsobem:

Složení reakčního roztoku PCR:

DNA plazmidů pgHSL7A62, 200 ng;

oligonukleotidový primer HPD1P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer HPD2N, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΙ;

pufr 10 x Pfu, 20 μΙ;

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek; a redestilovaná voda do celkového objemu 200 μΙ.

Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejprve zahříván 2 minuty při teplotě 94 °C a potom byl 30 x opakován cyklus zahřívání 1 minutu při 94 °C, 1 minutu při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Po ukončení tohoto postupu byl reakční roztok zahříván 10 min při 72 °C.

Po PCR byly nejprve amplifikované fragmenty HPD1 a HPD2DNA extrahovány fenolem a potom sráženy ethanolem a potom odděleny na elektroforéze polyakrylamidového gelu s koncentrací 5 % hmotnost/objem. Po elektroforéze byl gel obarven roztokem ethidiumbromidu s koncentrací 1 pg/ml a pruhy DNA byly po detekci UV lampou vyříznuty žiletkou a eluovány z gelu použitím systémů Centriruter a Centricon-10 jak bylo popsáno výše. Eluovaná DNA byla koncentrována centrifugací při 7500 x g následovanou srážením ethanolem a nakonec byla rozpuštěna v 50 μΙ destilované vody.

b) Druhy stupeň PCR

Druhý stupeň PCR při přípravě HPD1.2-DNA je znázorněn na obr. 40.

• ·

- 164 Fragment HPD1.2-DNA, ve kterém jsou fúzovány výše popsané fragmenty HPD1-DNA a HPD2-DNA, byl připraven následujícím způsobem.

Složení reakčního roztoku PCR:

roztok HPD1-DNA (z prvního stupně PCR), 10 μΙ;

roztok HPD2-DNA (z prvního stupně PCR), 10 μΙ;

oligonukleotidový primer 7AH1P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer HPD2N, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΙ;

pufr 10 x Pfu, 20 μΙ;

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek; a redestilovaná voda do celkového objemu 200 μΙ.

Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejprve zahříván 2 minuty při teplotě 94 °C a potom byl 30 x opakován cyklus zahřívání 1 minutu při 94 °C, 1 minutu při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Po ukončení tohoto postupu byl reakční roztok zahříván 10 min při 72 °C.

Po PCR byl nejprve amplifikovaný fragment HPD1.2-DNA extrahován fenolem a potom srážen ethanolem a potom oddělen na elektroforéze polyakrylamidového gelu s koncentrací 5 % hmotnost/objem. Po elektroforéze byl gel obarven roztokem ethidiumbromidu s koncentrací 1 pg/ml a pruh DNA byl po detekci UV lampou vyříznut žiletkou a eluován z gelu použitím systémů Centriruter a Centricon-10 jak bylo popsáno výše. Eluovaná DNA byla koncentrována centrifugací při 7500 x g následovanou srážením ethanolem a nakonec byla rozpuštěna v 50 μΙ destilované vody.

Konstrukce plazmidu nesoucího fragment HPD1.2-DNA je znázorněna na obr. 41.

• · • ·

Fragment HPD1.2-DNA získaný výše byl dále čištěn extrakcí fenolem a potom srážením ethanolem a potom štěpen restrikčními enzymy HindlII a Sací.

pg DNA plazmidu pgHSL7A62 byl štěpen restrikčními enzymy HindlII a Sací a potom defosforylován CIP. Výsledná defosforylovaná DNA pgHSL7A62 (100 ng) byla potom ligována s 10 pg HPD1.2-DNA, která byla předtím také štěpena HindlII a Sací s použitím soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Všechny transformanty, které byly získány, byly kultivovány ve 2 ml kapalného média LB obsahujícího 50 pg/ml chloramfenikolu při 37 °C přes noc a plazmidová DNA byla z výsledné kultury extrahována metodou alkalického SDS.

Extrahovaná plazmidová DNA byla štěpena HindlII a Sací pro potvrzení přítomnosti nebo nepřítomnosti požadovaného inzertu elektroforézou na agarózovém gelu s koncentrací 1 % hmotnost/objem. Tak byl získán plazmid pgHPDHV3 nesoucí fuzní inzert obsahující fragment DNA kódující variabilní oblast humanizovaného těžkého řetězce typu HV HFE7A a fragment genomové DNA kódující konstantní oblast těžkého řetězce lidského lgG1. Transformant E. coli pgHPDHV3 SANK 70298 nesoucí plazmid pgHPDHV3 byl uložen v souladu s Budapešťskou úmluvou ve sbírce Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo 26. února 1998 pod depozitním číslem FERM BP-6273.

pg takto získané DNA plazmidu pgHPDHV3 bylo štěpeno restrikčními enzymy HindlII a EcoRI. Paralelně byl 1 pg DNA pEE.6.1 expresního vektoru pro savčí buňky, štěpen restrikčními enzymy HindlII a EcoRI a potom defosforylován s použitím CIP. Výsledná rozštěpená defosforylovaná plazmidová DNA pEE.6.1 (100 ng) byla ligována s 10 pg fragmentu DNA pgHPDHV3, s použitím soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.) a klonována do E. coli JM109.

• · « ·

Transformanty získané tímto způsobem byly kultivovány ve 2 ml kapalného média LB obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu při 37 °C přes noc a plazmidová DNA byla potom extrahována z výsledné kultury metodou alkalického SDS. Plazmid byl štěpen enzymy HindlII a EcoRI pro potvrzení přítomnosti nebo nepřítomnosti požadovaného inzertu elektroforézou na agarózovém gelu s koncentraci 1 % hmotnost/objem. Byl získán plazmid pEgPDHV3-21 obsahující fuzní inzert obsahující fragment DNA kódující proměnnou oblast humanizovaného těžkého řetězce typu HV HFE7A a fragment genomové DNA kódující konstantní oblast lidského těžkého řetězce lgG1 ve směru translace vzhledem k promotoru cytomegaloviru (CMV) ve správné orientaci.

(3) Ověření nukleotidové sekvence

Pro ověření, zda má inzert DNA plazmidu pEgPDHV3-21 požadovanou nukleotidovou sekvenci, byl inzert DNA analyzován pro stanovení jeho nukleotidové sekvence. Pro sekvenování nukleotidů byly použity oligonukleotidové primery PEEF (SEQ ID No. 104), HPD1P (SEQ ID No. 118), HPD1N (SEQ ID No. 119) a HPD2N (SEQ ID No. 120).

Polohy, ve kterých se vážou uvedené primery, jsou ukázány v obr. 42. Stanovení nukleotidové sekvence bylo prováděno metodou ukončení dideoxynukleotidového řetězce s použitím plazmidu obsahujícího sekvenci, která má být potvrzena, jako templátu, přičemž plazmid byl čištěn metodou alkalického SDS a centrifugací v chloridu česném.

Podle očekávání bylo potvrzeno, že plazmid pEgPDHV3-21 má nukleotidovou sekvenci SEQ ID No. 116 ve výpisu sekvencí kódující polypeptid SEQ ID No. 117.

• · · · · ···· · · ·· ···· · · · ···· • · · · · · · · ··· • · ·· · ·· ···· · • · ·· · ··· . 167 - ................

Příklad 11

Konstrukce vektorů optimalizovaných pro buňky COS-1 s vysokou mírou exprese

Vektory s vysokou mírou exprese optimalizované pro buňky COS-1 byly zkonstruovány s použitím výše popsaných vektorů p7ALHH, p7AL-HM, p7AL-MM, pLPDHH75, pLPDHM32, pEg7AH-H a pEgPDHV3-21.

(1) Vektory s vysokou mírou exprese pro humanizované lehké řetězce

Konstrukce expresních vektorů s vysokou mírou exprese pro humanizované lehké řetězce je znázorněna na obr. 43.

1) Syntéza primerů pro přípravu fragmentu DNA promotoru SR a

Fragment DNA promotoru SR a pro vložení do expresních vektorů pro humanizované lehké řetězce byl syntetizován použitím PCR.

Pro PCR byly syntetizovány následující dva oligonukleotidové primery:

5’-TGCACGCGTG GCTGTGGAAT GTGTGTCAGT TAG-3’ (MLUA: SEQ ID No. 121); a

5’-TCCGAAGCTT TTAGAGCAGA AGTAACACTT C-3’ (HINDB: SEQ ID No. 122).

2) Konstrukce plazmidů

Po syntéze byl fragment DNA promotoru SR a vložen do vektorů P7AL-HH, p7AL-HM, p7AL-MM, pLPDHH75 nebo pLPDHM32 a potom klonován do E. coli.

Fragment LSR α-DNA obsahující promotor SR a s místem restrikčního štěpení Mull přidaným na 5’-konec a místem restrikčního

- 168 -

štěpení HindlII přidaným na 3’-konec byl připraven následujícím způsobem.

Složení reakčního roztoku PCR:

DNA plazmidů pME18S, 200 ng;

oligonukleotidový primer MLUA, 80 pmol;

oligonukleotidový primer HINDB, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΙ;

pufr 10 x Pfu, 20 μΙ;

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek; a redestilovaná voda do celkového objemu 200 μΙ.

Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejprve zahříván 2 minuty při teplotě 94 °C a potom byl 30 x opakován cyklus zahřívání 1 minutu při 94 °C, 1 minutu při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Po ukončení tohoto postupu byl reakční roztok zahříván 10 min při 72 °C.

Po PCR byl nejprve amplifikovaný fragment LSR a-DNA extrahován fenolem a potom srážen ethanolem a potom oddělen na elektroforéze polyakrylamidového gelu s koncentrací 5 % hmotnost/objem. Po elektroforéze byl gel obarven roztokem ethidiumbromidu s koncentrací 1 pg/ml a pruh DNA byl po detekci UV lampou vyříznut žiletkou a eluován z gelu použitím systémů Centriruter a Centricon-10 jak bylo popsáno výše. Eluovaná DNA byla koncentrována centrifugací při 7500 x g následovanou srážením ethanolem a nakonec byla rozpuštěna v 50 μΙ destilované vody.

pg DNA plazmidů p7AL-HH, p7AL-HM, p7AL-MM, pLPDHH75 nebo pLPDHM32 byl štěpen restrikčními enzymy Mull a HindlII a potom defosforylován CIP. Vzniklá defosforylovaná plazmidová DNA (100 ng) byla ligována s 10 μΙ roztoku obsahujícího fragment LSR aDNA, který byl předem štěpen enzymy Mull a HindlII s použitím • ·

soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Ligační směsí byla transformována E. coli JM109 a potom byla vyseta na LB agar obsahující 50 pg/ml ampicilinu. Získané transformanty byly kultivovány ve 2 ml kapalného média LB obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu při 37 °C přes noc a plazmidová DNA byla extrahována z výsledné kultury metodou alkalického SDS. Extrahovaná plazmidová DNA byla štěpena Mull a Hindlll a klon nesoucí fragment LSR a-DNA byl vybrán elektroforézou na agarózovém gelu 1 % hmotnost/objem.

Podle výše popsaného postupu byly získány plazmidové vektory s vysokou mírou exprese pSRHH (typ HH), pSRHM (typ HM), pSRMM (typ MM), pSRPDHH (typ PDHH) a pSRPDHM (typ PDHM).

(2) Vektory pro humanizované těžké řetězce s vysokou mírou exprese

Konstrukce expresních vektorů pro humanizované těžké řetězce s vysokou mírou exprese je znázorněna na obr. 44.

1) Syntéza primerů pro přípravu fragmentu DNA promotoru SR a

Fragment DNA promotoru SR a pro vložení do expresních vektorů pro humanizované těžké řetězce byl syntetizován použitím PCR.

Navíc k primerů HINDB (SEQ ID No. 122) byl pro PCR syntetizován následující oligonukleotidový primer: 5’-AAAGCGGCCG CTGCTAGCTT GGCTGTGGAA TGTGTG-3’ (NOTA: SEQ ID No. 123).

2) Konstrukce plazmidů

Fragment DNA promotoru SR a byl syntetizován použitím PCR, vložen do výše popsaného vektoru pEg7AH-H nebo pEgPDHV3-21 a potom klonován do E. coli.

• ·

- 170 Fragment HSR α-DNA obsahující promotor SR a s restrikčním štěpícím místem Notl přidaným na 5’-konci a restrikčním štěpícím místem HindlII přidaným na 3’-konci byl připraven následujícím způsobem.

Složení reakčního roztoku PCR:

DNA plazmidu pME18S, 200 ng;

oligonukleotidový primer NOTA, 80 pmol;

oligonukleotidový primer HINDB, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΙ;

pufr 10 x Pfu, 20 μΙ;

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek; a redestilovaná voda do celkového objemu 200 μΙ.

Reakce PCR byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejprve zahříván 2 minuty při teplotě 94 °C a potom byl 30 x opakován cyklus zahřívání 1 minutu při 94 °C, 1 minutu při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Po ukončení tohoto postupu byl reakční roztok zahříván 10 min při 72 °C.

Po PCR byl nejprve amplifikovaný fragment HSR a-DNA extrahován fenolem a potom srážen ethanolem a potom oddělen na elektroforéze polyakrylamidového gelu s koncentrací 5 % hmotnost/objem. Po elektroforéze byl gel obarven roztokem ethidiumbromidu s koncentrací 1 pg/ml a pruh DNA byl po detekci UV lampou vyříznut žiletkou a eluován z gelu použitím systémů Centriruter a Centricon-10 jak bylo popsáno výše. Eluovaná DNA byla koncentrována centrifugací při 7500 x g následovanou srážením ethanolem a nakonec byla rozpuštěna v 50 μΙ destilované vody.

μg DNA plazmidu pEg7AH-H nebo pEgPDHV3-21 byl potom štěpen restrikčními enzymy Notl a HindlII a potom defosforylován CIP. Výsledná defosforylovaná plazmidová DNA (100 ng) byla ligována • · s 10 μΙ roztoku obsahujícího fragment HSR α-DNA, který byl předem také štěpen enzymy Notl a HindlII s použitím soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Ligační směsí byla transformována E. coli JM109, která byla rozetřena na LB agar obsahující konečné koncentrace 1 mM IPTG, 0,1 % hmotnost/objem XGal a 50 pg/ml ampicilinu. Získané bílé transformanty byly kultivovány ve 2 ml kapalného média LB obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu při 37 °C přes noc a z výsledné kultury byla extrahována plazmidová DNA metodou alkalického SDS. Extrahovaná plazmidová DNA byla štěpena enzymy Notl a HindlII a klon nesoucí fragment HSR α-DNA byl vybrán na elektroforéze v agarózovém gelu 1 % hmotnost/objem.

Podle výše popsaného postupu byly získány plazmidové vektory s vysokou mírou exprese pSRg7AH a pSRgPDH (typu HV).

Příklad 12

Exprese v buňkách COS-1

Transfekce buněk COS-1 expresními plazmidy s vysokou mírou exprese pro humanizované těžké řetězce HFE7A a pro humanizované lehké řetězce HFE7A získané výše byla prováděna elektroporaci podobným způsobem jako se popisuje v příkladu 4.

Buňky COS-1 byly pěstovány do semikonfluentního nárůstu v kultivační láhvi (kultivační plocha 225 cm²) obsahující médium a(+)MEM doplněné 10 % objemovými FCS. Potom bylo médium slito a buňky COS-1 byly z láhve uvolněny působením 3 ml roztoku trypsinEDTA (Sigma Chemicals Co.) 3 min při 37 °C. Uvolněné buňky byly sklizeny centrifugací 2 min při 800 ot/min a dvakrát promyty pufrem PBS(-). Promyté buňky COS-1 byly potom použity k vytvoření suspenze COS-1 buněk s koncentrací nastavenou pufrem PBS(-) 1 x 10⁸ buněk/ml.

·· · · · ··· · · · · · • · · · · · · ··· • · · · · · · · · · · • v ·· · ·· · · · · • · · · · · · .-172- ............ .....

Paralelně byly smíseny 4 pg expresní plazmidové DNA humanizovaného těžkého řetězce HFE7A a 4 pg expresní plazmidové DNA humanizovaného lehkého řetězce HFE7A připravené metodou alkalického SDS a centrifugací v gradientu chloridu česného a směs byla srážena ethanolem před resuspendováním ve 20 pl pufru PBS(-), přičemž celá operace byla prováděna ve stejné zkumavce. Celá získaná suspenze plazmidu (20 pl) byla smísena s 20 pl předem připravené suspenze COS-1 (2 x 10⁶ buněk) a směs byla převedena do komory FCT-13 (Shimadzu Seisakusyo, K. K.) se vzdáleností elektrod 2 mm. Tato komora byla potom vložena do přístroje pro transfekci genů GTE-1 (Shimadzu Seisakusyo, K. K.) a pro transformaci buněk COS-1 DNA určeného plazmidu bylo použito dvou pulzů s napětím 600 V, 50 pF v intervalu 1 s.

Po elektroporaci byla směs buněk s DNA v komoře suspendována v 5 ml a(+)MEM, doplněným 10 % obj. FCS v kultivační láhvi (kultivační plocha 25 cm²; Sumitomo Bakelite) a inkubována v atmosféře 5 % obj. CO₂ a teplotě 37 °C 72 hodin. Potom byl supernatant z kultury odebrán a analyzován na přítomnost produktů exprese.

Výše uvedenou metodou byly získány buňky COS-1 transfekované vždy některou z následujících kombinací plazmidů:

(A) bez přítomnosti plazmidové DNA;

(B) kotransfekce plazmidy pSTgPDH a pSRPDHH;

(C) kotransfekce plazmidy pSRgPDH a pSRPDHM;

(D) kotransfekce plazmidy pSRg7AH a pSRHH;

(E) kotransfekce plazmidy pSRg7AH a pSRHM; a (F) kotransfekce plazmidy pSRg7AH a pSRMM.

- 173 Příklad 13

Test vazebné aktivity Fas

Test na vazebnou aktivitu Fas v supernatantech z buněčných kultur připravených v příkladu 12 byl proveden metodou ELISA následujícím způsobem.

Kultivační supernatant z buněk COS-1 exprimujících lidský fuzní protein Fas získaný v referenčním příkladu 1 výše zředěný 5 x adsorpčním pufrem byl rozplněn do jamek 96-jamkové destičky (MaxiSorb; Nunc) v množství 50 μΙ na jamku a destička byla inkubována přes noc při 4 °C pro umožnění adsorpce lidského fuzního proteinu Fas na povrch jamek. Potom byly všechny jamky čtyřikrát promyty 350 μΙ pufru PBS-T. Po promytí byl do jamek přidán v množství 50 μΙ na jamku pufr PBS-T obsahující 5 % obj. BSA (bovinní sérový albumin; Wako Pure chemical Industries, Ltd.) a destička byla inkubována 1 hodinu při 37 °C pro blokování zbylého povrchu v jamkách. Jamky byly potom znovu promyty čtyřikrát pufrem PBS-T.

Kultivační supernatanty získané v příkladu 4 byly nastaveny na konečnou koncentraci sledovaného produktu 100 ng/ml v médiu a(+)MEM obsahujícím 10 % obj. FCS. Koncentrace byly odhadnuty metodou popsanou v příkladu 5. Každý z vytvořených roztoků 100 ng/ml byl potom použit pro vytvoření sériových ředění dvojnásobným sériovým ředěním médiem a(+)MEM obsahujícím 10 % obj. FCS. Potom bylo do jamek připravených podle popisu výše přidáno vždy 50 μΙ výsledných sériových ředění každého expresního produktu a destička byla inkubována 2 hod při 37 °C pro umožnění průběhu reakce. Potom byly jamky opět čtyřikrát promyty pufrem PBS-T a potom bylo do každé jamky přidáno 50 μΙ kozí polyklonální protilátky specifické proti lidskému IgG Fc značené alkalickou fosfatázou (Caltag Lab.) zředěné 10 000 x PBS-T a reakce byla ponechána probíhat 2 hod při 37 °C.

174 • · · ·

Jako kontrola (lgG1) byla použita HFE7A vyčištěná z myší hybridomové HFE7A, která byla detekována s použitím kozí antimyší protilátky IgG + IgG + IgM značené alkalickou fosfatázou (Gibco BRL) zředěné 5000 x PBS-T namísto kozí polyklonální protilátky specifické proti lidskému IgG Fc značené alkalickou fosfatázou.

Jamky byly opět čtyřikrát promyty pufrem PBS-T a potom bylo do každé jamky přidáno 50 μΙ roztoku substrátu (1 mg/ml pnitrofenylfosfátu v 10 % obj. diethanolaminu (pH 9,8) a destička byla inkubována 0,5 až 1 hod při 37 °C. Vazebná aktivita expresního produktu obsaženého v každém kultivačním supernatantu vůči fuznímu proteinu lidského Fas byla vyhodnocena odečtením absorbance v každé jamce při 405 nm.

Jak bylo očekáváno, u supernatantů kategorií (B), (C), (D), (E) a (F) z příkladu 12 se objevila vazebná aktivita vůči fuznímu proteinu lidského Fas, která je ukázána na obr. 45.

Příklad 14

Kompetitivní inhibice vazebné aktivity HFE7A na Fas

Humanizované protilátky anti-Fas získané v příkladu 12 by měly inhibovat vazbu HFE7A na Fas, protože protilátky z tohoto příkladu byly odvozeny z HFE7A. Proto byla měřena schopnost expresních produktů získaných v příkladu 12 kompetitivně inhibovat vazbu HFE7A na fuzní protein lidského Fas.

Kultivační supernatant z buněk COS-1 obsahující fuzní protein lidského Fas jak byl získán v referenčním příkladu 1, byl pětkrát zředěn adsorpčním pufrem a rozplněn do jamek 96-jamkové destičky pro detekci luminiscence (Luminescent Solid Assay Plate, vysoká vazebná schopnost; Costar) v množství 50 μΙ na jamku. Destička potom byla inkubována při 4 °C přes noc pro umožnění adsorpce fuzního proteinu lidského Fas na povrch jamek.

• ·

Potom byla každá jamka promyta čtyřikrát 350 μΙ PBS-T a potom bylo do každé jamky přidáno 100 μΙ PBS-T s obsahem 5 % obj. BSA a destička byla inkubována 1 hod při 37 °C pro blokování zbytku povrchu každé jamky. Jamky byly potom znovu čtyřikrát promyty pufrem PBS-T.

Kultivační supernatanty získané v příkladu 12 byly nastaveny na konečné koncentrace protilátky 1 pg/ml v médiu a(+)MEM obsahujícím 10 % obj. FCS metodou podle příkladu 5. Každý z výsledných roztoků expresních produktů byl použit pro vytvoření sériových ředění dvojnásobným sériovým ředěním médiem a(+)MEM obsahuajícím 10 % obj. FCS. AP-HFE7A byla zředěna na koncentraci 50 ng/ml médiem a(+)MEM s obsahem 10 % obj. FCS a 25 μΙ získaného roztoku bylo smíseno se stejným objemem každého z připravených sériových ředění.

Každá z jamek byla opět čtyřikrát promyta pufrem PBS-T a potom bylo do všech jamek přidáno po 50 μΙ každé ze získaných směsí protilátky. Destička byla ponechána stát při pokojové teplotě přes noc. Potom bylo do každé jamky přidáno po promytí čtyřikrát roztokem PBS-T 100 μΙ pufru CDP-star (9,58 ml diethanolaminu, 0,2 g chloridu hořečnatého, 0,25 g azidu sodného, pH 8,5) a destička byla ponechána stát 10 min při pokojové teplotě. Potom byl pufr CDP-star slit a substrát CDP-star (1,2 ml sapphire II (Tropix), 200 μΙ CDP-star (Tropix), doplněno do 12 ml pufrem CDP-star) přidán v množství 50 μΙ na jamku a destička byla ponechána stát při pokojové teplotě dalších 40 minut.

Kompetitivní inhibice expresních produktů z příkladu 12 vazby HFE7A na lidský fuzní protein Fas byla vyhodnocena měřením intenzity luminiscence přístrojem Luminoscan (Titertech).

Bylo tedy ověřeno, že expresní produkty supernatantů (B), (C), (D), (E) a (F), připravené v příkladu 12 specificky inhibovaly vazbu protilátky HFE7A na lidský fuzní protein Fas (obr. 46).

···· ··· ···· • · · · · · · · ··· • · ·· · ·· ···· · • · 9 9 · · · ·

-176- ................

Příklad 15

Aktivita indukující apoptózu

Pro zjištění apoptózu indukující aktivity supernatantů buněčných kultur z příkladu 12 bylo použito podobného způsobu jako se popisuje v příkladu 8.

Buňky WR19L12a byly kultivovány v médiu RPMI1640 s 10 % obj. FCS (Gibco BRL) 3 dny při 37 °C v koncentraci 5 % objemových CO₂ a potom bylo 50 μΙ (1 x 10⁵ buněk) rozplněno do každé jamky 96jamkové mikrodestičky (Sumitomo Bakelite). Kultivační supernatanty získané v příkladu 12 byly nastaveny na konečnou koncentraci protilátky 100 ng/ml v médiu RPMI1640 obsahujícím 10 % objemových FCS. Koncentrace byly stanoveny metodou podle příkladu 5. Každý z nastavených roztoků expresních produktů byl použit pro přípravu sériových ředění dvojnásobným sériovým ředěním médiem RPMI1640 obsahujícím 10 % objemových FCS. Všechna výsledná ředění každého expresního produktu byla přidána do jednotlivých jamek v množství 50 μΙ na jamku a destička byla inkubována 1 hodinu při 37 °C. Potom byly buňky v každé jamce čtyřikrát promyty médiem RPMI1640 obsahujícím 10 % objemových FCS a promyté buňky byly suspendovány v 100 μΙ média RPMI1640 s obsahem 0,5 μg/ml kozí polyklonální protilátky specifické proti lidskému IgG Fc (Kappel) a 10 % objemových FCS na jamku.

Destička byla ponechána stát 12 hodin při teplotě 37 °C a potom bylo do každé jamky přidáno 50 μΙ 25 μΜ PMS (fenazinmethosulfát; Sigma chemical Co.) obsahujícího 1 mg/ml XTT (vnitřní soli 2,3-bis(2methoxy-4-nitro-5-sulfofenyl)-2H-tetrazolium-5-karboxanilidu; Sigma Chemical Co.) na konečné koncentrace 333 μg/ml v případě XTT a 8,3 μΜ v případě PMS. Destička byla potom inkubována 3 hodiny při 37 °C a byla měřena absorbance při 450 nm u každé jamky pro výpočet buněčné viability s použitím redukční schopnosti mitochondrie jako indexu.

Viabilita buněk v každé jamce byla vypočtena podle následujícího vzorce:

Viabilita (%) = 100 x (a-b)/(c-b) kde „a“ je absorbance testované jamky, „b“ je absorbance jamky neobsahující buňky a „c“ je absorbance jamky bez přidané protilátky.

Podle očekávání se ukázalo, že všechny expresní produkty z kultivačních supernatantů (B), (C), (D), (E) a (F) z příkladu 12 výše io indukovaly u T buněk exprimujících lidský antigen Fas apoptózu (obr.

47).

• ·

- 178 VÝPIS SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:

(i) ŽADATEL:

(A) JMÉNO: Sankyo Company, Limited (B) ULICE: 5-1, Nihoribashi Honcho 3-choirie, Chuo-ku (C) MĚSTO: Tokyo (E) ZEMĚ: Japonsko (F) PSČ (ZIP): 103-8426 (G) TELEFON: 81-3-5255-7111 (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: protilátky proti Fas (iii) POČET SEKVENCÍ: 123 (iv) POČÍTAČOVÁ FORMA:

(A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (EPO) (vi) ÚDAJE O PŘEDCHOZÍCH PŘIHLÁŠKÁCH:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: JP Hei 9-82953 (B) DATUM PODÁNÍ: 1. dubna 1997 (vi) ÚDAJE O PŘEDCHOZÍCH PŘIHLÁŠKÁCH:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: JP Hei 9-169088 (B) DATUM PODÁNÍ: 25. června 1997 (vi) ÚDAJE O PŘEDCHOZÍCH PŘIHLÁŠKÁCH:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: JP Hei 9-276064 (B) DATUM PODÁNÍ: 8. října 1997 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 10 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1:

Arg Thr Gin Asn Thr Lys Cys Arg Cys Lys

10 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 5 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina • Φ φφ φ · φ · •Φ φφφφ φφ

φ φ φ φ φφφ·

- 179 φφφφ φ φφφ • φ φ · φ φ φ φ φ φ φ φ (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 2:

Ser Tyr Trp Met Gin (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 3:

Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Phe Lys

Gly (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 4 :

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 12 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 4:

Asn Arg Asp Tyr Ser Asn Asn Trp Tyr Phe Asp Val (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 15 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina • ·· · ····

180 ···· • to ···· • · to • · ··· ··· ·· (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 5:

Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn 15 10 15 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 7 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 6:

Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: amino kys e1ina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 7:

Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Arg Thr

5 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1392 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý

- 181 (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA až mRNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Mus musculus (G) TYP BUŇKY: hybridom (H) BUNĚČNÁ LINIE: HFE7A

(ix) ZNAK:
	(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS
(B)	UMÍSTĚNÍ:1..1392
(ix)	ZNAK
	(A)	JMÉNO/KLÍČ: mat peptid
	(B)	UMÍSTĚNÍ:58..1392
(ix)	ZNAK
	(A)	JMÉNO/KLÍČ: sig peptid
	(B)	UMÍSTĚNÍ:!..57

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 8:

ATG GGA TGG

AGC TGT

ATC ATC

CTC Leu

TTC TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT

48

Met -19

Gly

Trp

Ser

Cys -15

Ile

Ile

Phe Leu -10

Val

Ala

Thr

Ala Thr -5

Gly

GTC

CAT

TCT

CAG

GTC

CAA

CTG

CAG

CAG

CCT

GGG

GCT

GAG

CTT

GTG

AAG

96

Val

His

Ser

Gin

Val

Gin

Leu

Gin

Gin

Pro

Gly

Ala

Glu

Leu

Val

Lys

1

5

10

CCT

GGG

GCT

TCA

GTG

AAG

CTG

TCC

TGC

AAG

GCT

TCT

GGC

TAC

ACC

TTC

144

Pro

Gly

Ala

Ser

Val

Lys

Leu

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

15

20

25

ACC

AGC

TAC

TGG

ATG

CAG

TGG

GTA

AAA

CAG

AGG

CCT

GGA

CAG

GGC

CTT

192

Thr

Ser

Tyr

Trp

Met

Gin

Trp

Val

Lys

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

30

35

40

45

GAG

TGG

ATC

GGA

GAG

ATT

GAT

CCT

TCT

GAT

AGC

TAT

ACT

AAC

TAC

AAT

240

Glu

Trp

Ile

Gly

Glu

Ile

Asp

Pro

Ser

Asp

Ser

Tyr

Thr

Asn

Tyr

Asn

50

55

60

CAA

AAG

TTC

AAG

GGC

AAG

GCC

ACA

TTG

ACT

GTA

GAC

ACA

TCC

TCC

AGC

288

Gin

Lys

Phe

Lys

Gly

Lys

Ala

Thr

Leu

Thr

Val

Asp

Thr

Ser

Ser

Ser

65

70

75

ACA

GCC

TAC

ATG

CAG

CTC

AGC

AGC

CTG

ACA

TCT

GAG

GAC

TCT

GCG

GTC

336

Thr

Ala

Tyr

Met

Gin

Leu

Ser

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Ser

Ala

Val

80

85

90

TAT

TAC

TGT

GCA

AGA

AAT

AGG

GAC

TAT

AGT

AAC

AAC

TGG

TAC

TTC

GAT

384

♦ · ···· ·· ·· • · · · · · · • ···· · ··· • · · · · ···· ·

- 182 -

• · · · · · ·

• · · · ·

• · · ·

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Asn

Arg

Asp

Tyr

Ser

Asn

Asn

Trp

Tyr

Phe

Asp

95

100

105

GTC

TGG

GGC

ACA

GGG

ACC

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

GCC

AAA

ACG

ACA

432

Val

Trp

Gly

Thr

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Lys

Thr

Thr

110

115

120

125

CCC

CCA

TCT

GTC

ΤΆΤ

CCA

CTG

GCC

CCT

GGA

TCT

GCT

GCC

CAA

ACT

AAC

480

Pro

Pro

Ser

Val

Tyr

Pro

Leu

Ala

Pro

Gly

Ser

Ala

Ala

Gin

Thr

Asn

130

135

140

TCC

ATG

GTG

ACC

CTG

GGA

TGC

CTG

GTC

AAG

GGC

TAT

TTC

CCT

GAG

CCA

528

Ser

Met

Val

Thr

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

145

150

155

GTG

ACA

GTG

ACC

TGG

AAC

TCT

GGA

TCC

CTG

TCC

AGC

GGT

GTG

CAC

ACC

576

Val

Thr

Val

Thr

Trp

Asn

Ser

Gly

Ser

Leu

Ser

Ser

Gly

Val

His

Thr

160

165

170

TTC

CCA

GCT

GTC

CTG

CAG

TCT

GAC

CTC

TAC

ACT

CTG

AGC

AGC

TCA

GTG

624

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Asp

Leu

Tyr

Thr

Leu

Ser

Ser

Ser

Val

175

180

185

ACT

GTC

CCC

TCC

AGC

ACC

TGG

CCC

AGC

CAG

ACC

GTC

ACC

TGC

AAC

GTT

672

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Thr

Trp

Pro

Ser

Gin

Thr

Val

Thr

Cys

Asn

Val

190

195

200

205

GCC

CAC

CCG

GCC

AGC

AGC

ACC

AAG

GTG

GAC

AAG

AAA

ATT

GTG

CCC

AGG

720

Ala

His

Pro

Ala

Ser

Ser

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Ile

Val

Pro

Arg

210

215

220

GAT

TGT

GGT

TGT

AAG

CCT

TGC

ATA

TGT

ACA

GTC

CCA

GAA

GTA

TCA

TCT

768

Asp

Cys

Gly

Cys

Lys

Pro

Cys

Ile

Cys

Thr

Val

Pro

Glu

Val

Ser

Ser

225

230

235

GTC

TTC

ATC

TTC

CCC

CCA

AAG

CCC

AAG

GAT

GTG

CTC

ACC

ATT

ACT

CTG

816

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

Leu

Thr

Ile

Thr

Leu

240

245

250

ACT

CCT

AAG

GTC

ACG

TGT

GTT

GTG

GTA

GAC

ATC

AGC

AAG

GAT

GAT

CCC

864

Thr

Pro

Lys

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Ile

Ser

Lys

Asp

Asp

Pro

255

260

265

GAG

GTC

CAG

TTC

AGC

TGG

TTT

GTA

GAT

GAT

GTG

GAG

GTG

CAC

ACA

GCT

912

Glu

Val

Gin

Phe

Ser

Trp

Phe

Val

Asp

Asp

Val

Glu

Val

His

Thr

Ala

270

275

280

285

CAG

ACG

CAA

CCC

CGG

GAG

GAG

CAG

TTC

AAC

AGC

ACT

TTC

CGC

TCA

GTC

960

Gin

Thr

Gin

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Phe

Asn

Ser

Thr

Phe

Arg

Ser

Val

290

295

300

AGT

GAA

CTT

CCC

ATC

ATG

CAC

CAG

AAC

TGG

CTC

AAT

GGC

AAG

GAG

TTC

1008

Ser

Glu

Leu

Pro

Ile

Met

His

Gin

Asn

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Phe

305

310

315

AAA

TGC

AGG

GTC

AAC

AGT

GCA

GCT

TTC

CCT

GCC

CCC

ATC

GAG

AAA

ACC

1056

Lys

Cys

Arg

Val

Asn

Ser

Ala

Ala

Phe

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

320

325

330

• · ·

- 183 -

• • • · · · ·

• · • • ·

• · • · • ·

• · • • · ·

• · · · · • · · • · · ·

ATC

TCC

AAA

ACC

AAA

GGC

AGA

CCG

AAG

GCT

CCA

CAG

GTG

TAC

ACC

ATT

1104

Ile

Ser

Lys

Thr

Lys

Gly

Arg

Pro

Lys

Ala

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Ile

335

340

345

CCA

CCT

CCC

AAG

GAG

CAG

ATG

GCC

AAG

GAT

AAA

GTC

AGT

CTG

ACC

TGC

1152

Pro

Pro

Pro

Lys

Glu

Gin

Met

Ala

Lys

Asp

Lys

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

350

355

360

365

ATG

ATA

ACA

GAC

TTC

TTC

CCT

GAA

GAC

ATT

ACT

GTG

GAG

TGG

CAG

TGG

1200

Met

Ile

Thr

Asp

Phe

Phe

Pro

Glu

Asp

Ile

Thr

Val

Glu

Trp

Gin

Trp

370

375

380

AAT

GGG

CAG

CCA

GCG

GAG

AAC

TAC

AAG

AAC

ACT

CAG

CCC

ATC

ATG

AAC

1248

Asn

Gly

Gin

Pro

Ala

Glu

Asn

Tyr

Lys

Asn

Thr

Gin

Pro

Ile

Met

Asn

385

390

395

ACG

AAT

GGC

TCT

TAC

TTC

GTC

TAC

AGC

AAG

CTC

AAT

GTG

CAG

AAG

AGC

1296

Thr

Asn

Gly

Ser

Tyr

Phe

Val

Tyr

Ser

Lys

Leu

Asn

Val

Gin

Lys

Ser

400

405

410

AAC

TGG

GAG

GCA

GGA

AAT

ACT

TTC

ACC

TGC

TCT

GTG

TTA

CAT

GAG

GGC

1344

Asn

Trp

Glu

Ala

Gly

Asn

Thr

Phe

Thr

Cys

Ser

Val

Leu

His

Glu

Gly

415

420

425

CTG

CAC

AAC

CAC

CAT

ACT

GAG

AAG

AGC

CTC

TCC

CAC

TCT

CCT

GGT

AAA

1392

Leu

His

Asn

His

His

Thr

Glu

Lys

Ser

Leu

Ser

His

Ser

Pro

Gly

Lys

430

435

440

445

(2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 464 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein

	(xi)	POPIS SEKVENCE: SEQ ID
Met -19	Gly	Trp	Ser	Cys -15	Ile	Ile	Leu
Val	His	Ser	Gin 1	Val	Gin	Leu	Gin 5
Pro	Gly 15	Ala	Ser	Val	Lys	Leu 20	Ser
Thr 30	Ser	Tyr	Trp	Met	Gin 35	Trp	Val
Glu	Trp	Ile	Gly	Glu 50	Ile	Asp	Pro

NO: 9:

Phe	Leu -10	Val	Ala	Thr	Ala	Thr -5	Gly
Gin	Pro	Gly	Ala	Glu 10	Leu	Val	Lys
Cys	Lys	Ala	Ser 25	Gly	Tyr	Thr	Phe
Lys	Gin	Arg 40	Pro	Gly	Gin	Gly	Leu 45
Ser	Asp 55	Ser	Tyr	Thr	Asn	Tyr 60	Asn

Gin Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser • · • · · · • · · · · · · • · · ·· · ··· • · · · · · · · ·

- 184 -

• · · · ·

• · 75

• ·

• · ·

65

70

Thr

Ala

Tyr

Met

Gin

Leu

Ser

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Ser

Ala

Val

80

85

90

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Asn

Arg

Asp

Tyr

Ser

Asn

Asn

Trp

Tyr

Phe

Asp

95

100

105

Val

Trp

Gly

Thr

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Lys

Thr

Thr

110

115

120

125

Pro

Pro

Ser

Val

Tyr

Pro

Leu

Ala

Pro

Gly

Ser

Ala

Ala

Gin

Thr

Asn

130

135

140

Ser

Met

Val

Thr

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

145

150

155

Val

Thr

Val

Thr

Trp

Asn

Ser

Gly

Ser

Leu

Ser

Ser

Gly

Val

His

Thr

160

165

170

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Asp

Leu

Tyr

Thr

Leu

Ser

Ser

Ser

Val

175

180

185

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Thr

Trp

Pro

Ser

Gin

Thr

Val

Thr

Cys

Asn

Val

190

195

200

205

Ala

His

Pro

Ala

Ser

Ser

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Ile

Val

Pro

Arg

210

215

220

Asp

Cys

Gly

Cys

Lys

Pro

Cys

Ile

Cys

Thr

Val

Pro

Glu

Val

Ser

Ser

225

230

235

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

Leu

Thr

Ile

Thr

Leu

240

245

250

Thr

Pro

Lys

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Ile

Ser

Lys

Asp

Asp

Pro

255

260

265

Glu

Val

Gin

Phe

Ser

Trp

Phe

Val

Asp

Asp

Val

Glu

Val

His

Thr

Ala

270

275

280

285

Gin

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Phe

Asn

Ser

Thr

Phe

Arg

Ser

Val

290

295

300

Ser

Glu

Leu

Pro

Ile

Met

His

Gin

Asn

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Phe

305

310

315

Lys

Cys

Arg

Val

Asn

Ser

Ala

Ala

Phe

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

320

325

330

Ile

Ser

Lys

Thr

Lys

Gly

Arg

Pro

Lys

Ala

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Ile

335

340

345

Pro

Pro

Pro

Lys

Glu

Gin

Met

Ala

Lys

Asp

Lys

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

350

355

360

365

Met

Ile

Thr

Asp

Phe

Phe

Pro

Glu

Asp

Ile

Thr

Val

Glu

Trp

Gin

Trp

370

375

380

• ·

- 185 -

Asn

Gly

Gin

Pro 385

Ala

Glu

Asn

Tyr

Lys 390

Asn

Thr

Gin

Pro

Ile 395

Met

Asn

Thr

Asn

Gly 400

Ser

Tyr

Phe

Val

Tyr 405

Ser

Lys

Leu

Asn

Val 410

Gin

Lys

Ser

Asn

Trp 415

Glu

Ala

Gly

Asn

Thr 420

Phe

Thr

Cys

Ser

Val 425

Leu

His

Glu

Gly

Leu

His

Asn

His

His

Thr

Glu

Lys

Ser

Leu

Ser

His

Ser

Pro

Gly

Lys

430 435 440 445 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 714 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA až mRNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Mus musculus (G) TYP BUŇKY: hybridom (H) BUNĚČNÁ LINIE: HFE7A (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ:1..714 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: mat_peptid (B) UMÍSTĚNÍ:61..714 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: sig_peptid (B) UMÍSTĚNÍ:!..60 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 10:

ATG GAG ACA

GAC Asp

ACA ATC

CTG CTA TGG GTG

ATG ATG CTC

TGG ATT

CCA Pro -5

48

Met -20

Glu

Thr

Thr

Ile -15

Leu

Leu Trp

Val

Met -10

Met

Leu

Trp

Ile

GGC

TCC

ACT

GGT

GAC

ATT

GTG

CTG

ACC

CAA

TCT

CCA

GCT

TCT

TTG

GCT

96

Gly

Ser

Thr

Gly

Asp

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ala

Ser

Leu

Ala

1

5

10

GTG TCT CTA GGG CAG AGG GCC ACC ATC TCC TGC AAG GCC AGC CAA AGT

144 • · * ·· ···· ·· ·· ···· ··· ···· • · · ···· · · · · • · ·· · ·· ···· ·

-

186

-

• · ·

• ··

•

·· ·

9 9 9 9

• ·

Val

Ser

Leu

Gly

Gin

Arg

Ala

Thr

Ile

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Ser

15

20

25

GTT

GAT

TAT

GAT

GGT

GAT

AGT

TAT

ATG

AAC

TGG

TAC

CAA

CAG

AAA

CCA

192

Val

Asp

Tyr

Asp

Gly

Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

30

35

40

GGA

CAG

CCA

CCC

AAA

CTC

CTC

ATC

TAT

GCT

GCA

TCC

AAT

CTA

GAA

TCT

240

Gly

Gin

Pro

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

45

50

55

60

GGG

ATC

CCA

GCC

AGG

TTT

AGT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACA

GAC

TTC

ACC

288

Gly

Ile

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

65

70

75

CTC

AAC

ATC

CAT

CCT

GTG

GAG

GAG

GAG

GAT

GCT

GCA

ACC

TAT

TAC

TGT

336

Leu

Asn

Ile

His

Pro

Val

Glu

Glu

Glu

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

80

85

90

CAG

CAA

AGT

AAT

GAG

GAT

CCT

CGG

ACG

TTC

GGT

GGA

GGC

ACC

AAG

CTG

384

Gin

Gin

Ser

Asn

Glu

Asp

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

95

100

105

GAA

ATC

AAA

CGG

GCT

GAT

GCT

GCA

CCA

ACT

GTA

TCC

ATC

TTC

CCA

CCA

432

Glu

Ile

Lys

Arg

Ala

Asp

Ala

Ala

Pro

Thr

Val

Ser

Ile

Phe

Pro

Pro

110

115

120

TCC

AGT

GAG

CAG

TTA

ACA

TCT

GGA

GGT

GCC

TCA

GTC

GTG

TGC

TTC

TTG

480

Ser

Ser

Glu

Gin

Leu

Thr

Ser

Gly

Gly

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Phe

Leu

125

130

135

140

AAC

AAC

TTC

TAC

CCC

AAA

GAC

ATC

AAT

GTC

AAG

TGG

AAG

ATT

GAT

GGC

528

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Lys

Asp

Ile

Asn

Val

Lys

Trp

Lys

Ile

Asp

Gly

145

150

155

AGT

GAA

CGA

CAA

AAT

GGC

GTC

CTG

AAC

AGT

TGG

ACT

GAT

CAG

GAC

AGC

576

Ser

Glu

Arg

Gin

Asn

Gly

Val

Leu

Asn

Ser

Trp

Thr

Asp

Gin

Asp

Ser

160

165

170

AAA

GAC

AGC

ACC

TAC

AGC

ATG

AGC

AGC

ACC

CTC

ACG

TTG

ACC

AAG

GAC

624

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Met

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Lys

Asp

175

180

185

GAG

TAT

GAA

CGA

CAT

AAC

AGC

TAT

ACC

TGT

GAG

GCC

ACT

CAC

AAG

ACA

672

Glu

Tyr

Glu

Arg

His

Asn

Ser

Tyr

Thr

Cys

Glu

Ala

Thr

His

Lys

Thr

190

195

200

TCA

ACT

TCA

CCC

ATT

GTC

AAG

AGC

TTC

AAC

AGG

AAT

GAG

TGT

714

Ser

Thr

Ser

Pro

Ile

Val

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Asn

Glu

Cys

205

210

215

(2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 238 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární

- 187 - (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 11:

Met -20

Glu Thr

Asp

Thr

Ile -15

Leu

Leu Trp

Val

Met Met -10

Leu

Trp

Ile

Pro -5

Gly

Ser

Thr

Gly

Asp

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ala

Ser

Leu

Ala

1

5

10

Val

Ser

Leu

Gly

Gin

Arg

Ala

Thr

Ile

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Ser

15

20

25

Val

Asp

Tyr

Asp

Gly

Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

30

35

40

Gly

Gin

Pro

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

45

50

55

60

Gly

Ile

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

65

70

75

Leu

Asn

Ile

His

Pro

Val

Glu

Glu

Glu

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

80

85

90

Gin

Gin

Ser

Asn

Glu

Asp

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

95

100

105

Glu

Ile

Lys

Arg

Ala

Asp

Ala

Ala

Pro

Thr

Val

Ser

Ile

Phe

Pro

Pro

110

115

120

Ser

Ser

Glu

Gin

Leu

Thr

Ser

Gly

Gly

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Phe

Leu

125

130

135

140

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Lys

Asp

Ile

Asn

Val

Lys

Trp

Lys

Ile

Asp

Gly

145

150

155

Ser

Glu

Arg

Gin

Asn

Gly

Val

Leu

Asn

Ser

Trp

Thr

Asp

Gin

Asp

Ser

160

165

170

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Met

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Lys

Asp

175

180

185

Glu

Tyr

Glu

Arg

His

Asn

Ser

Tyr

Thr

Cys

Glu

Ala

Thr

His

Lys

Thr

190

195

200

Ser

Thr

Ser

Pro

Ile

Val

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Asn

Glu

Cys

205

210

215

(2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 34 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý

188 (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 12:

GGGGAATTCC AGTACGGAGT TGGGGAAGCT CTTT 34 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 13:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 35 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 13:

GTTTCTTCTG CCTCTGTCAC CAAGTTAGAT CTGGA 35 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 35 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 14:

TCCAGATCTA ACTTGGTGAC AGAGGCAGAA GAAAC 35 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 15:

• · · · · ·

- 189 • •toto to ·· ·· • · to · • to to to • · to to to • to · ·· ··

CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) (B) (C) (D)

DÉLKA: 28 párů baží TYP: nukleová kyselina TYP ŘETĚZCE: jednoduchý TOPOLOGIE: lineární (ii)

TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii)

HYPOTETICKÁ: ne

KÓDUJÍCÍ: ne

POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 15:

CCCTCTAGAC GCGTCACGTG GGCATCAC (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 16:

(i)

CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) (B) (C) (D)

DÉLKA: 11 aminokyselin

TYP: amino kys e1ina

TYP ŘETĚZCE: jednoduchý TOPOLOGIE: lineární

TYP MOLEKULY: protein

TYP FRAGMENTU: N-koncový

POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:

16:

Gin Xaa

Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ala

Glu Leu (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 17:

CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) (B) (C) (D)

DÉLKA: 22 aminokyselin TYP: aminokyselina TYP ŘETĚZCE: jednoduchý TOPOLOGIE: lineární (ii)

TYP MOLEKULY: protein (v)

TYP FRAGMENTU: N-koncový

POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:

17:

Asp

Gin

Ile Val Leu

Arg Ala Thr

Thr Gin Ser Pro Ala

Ile Ser

Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

15

- 190 • ·

(2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 18:

GACCTCACCA TGGGATGGA 19 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 19:

TTTACCAGGA GAGTGGGAGA 20 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 20:

AAGAAGCATC CTCTCATCTA 20 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 21:

ACACTCATTC CTGTTGAAGC 20 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 28 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 22:

GGGGAATTCG ACCTCACCAT GGGATGGA 28 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 32 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina

- 192 - (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii)

HYPOTETICKÁ: ne

KÓDUJÍCÍ: ne (xi)

POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 23:

GGGTCTAGAC TATTTACCAG GAGAGTGGGA GA (2(INFORMACE PRO SEQ ID NO: 24:

TOPOLOGIE: lineární (ii)

TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA

HYPOTETICKÁ: ne (iv)

KÓDUJÍCÍ: ne (xi)

POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 24:

GGGGAATTCA AGAAGCATCC TCTCATCTA (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 25:

CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) (B) (C) (D)

DÉLKA: 37 párů baží TYP: nukleová kyselina TYP ŘETĚZCE: jednoduchý TOPOLOGIE: lineární

TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii)

HYPOTETICKÁ: ne (iv)

KÓDUJÍCÍ: ne (xi)

POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 25:

GGGGCGGCCG CTTACTAACA CTCATTCCTG TTGAAGC (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 aminokyselin

- 193 - (B) TYP: aminokyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 26:

Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gin Val Thr Asp Ile Asn Ser 15 10 15

Lys Gly Leu (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 27:

Val Thr Asp Ile Asn Ser Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr

Thr Val Glu (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 28:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 28:

Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr Gin Asn Leu Glu Gly

Leu His His Asp (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 29:

- 194 (i) CHARAKTERISTIKA. SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 29:

Thr Gin Asn Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gin Phe Cys His Lys 15 10 15

Pro Cys Pro Pro (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 30:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid

	(xi)	POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:	30:
Gly 1	Gin	Phe Cys His Lys Pro Cys 5	Pro	Pro 10	Gly Glu Arg Lys Ala Arg 15
Asp	Cys	Thr Val

(2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 31:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 31:

Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys Thr Val Asn Gly Asp Glu Pro Asp 15 10 15

Cys Val Pro Cys Gin ·· 1···

- 195 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 32:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 32:

Asn Gly Asp Glu Pro Asp Cys Val Pro Cys Gin Glu Gly Lys Glu Tyr 15 10 15

Thr Asp Lys Ala (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 33:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 33:

Glu Gly Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His Phe Ser Ser Lys Cys Arg 15 10 15

Arg Cys Arg (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 34:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 34:

His Phe Ser Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg Leu Cys Asp Glu Gly His 15 10 15

Gly Leu Glu Val ·« «··*

- 196 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 35:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 35:

Leu Cys Asp Glu Gly His Gly Leu Glu Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg 15 10 15

Thr Gin Asn Thr (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 36:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid

	(xi)	POPIS	SEKVENCE:	SEQ ID	NO:	36:
Glu	Ile	Asn	Cys	Thr Arg	Thr Gin	Asn	Thr Lys	Cys Arg Cys Lys Pro
1				5			10	15
Asn	Phe	Phe	Cys

(2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 37:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 37:

Lys Cys Arg Cys Lys Pro Asn Phe Phe

5

Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu

15

- 197 His Cys Asp Pro (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 38:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid

	(xi)	POPIS	SEKVENCE:	; SEQ	ID	NO:	38:
Asn	Ser	Thr	Val	Cys Glu	His	Cys	Asp	Pro Cys	Thr Lys Cys Glu His
1				5				10	15
Gly	Ile	Ile	Lys

(2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 39:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid

	(xi)	POPIS	SEKVENCE:	: SEQ	ID	NO:	39:
Cys	Thr	Lys Cys	Glu His	Gly	Ile	Ile	Lys Glu Cys	Thr Leu Thr Ser
1			5				10	15

Asn Thr Lys Cys (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 40:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 40:

Glu Cys Thr Leu Thr Ser Asn Thr Lys Cys Lys Glu Glu Gly Ser Arg

- 198 15

Ser Asn (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 41:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 41:

Ser Ser Gly Lys Tyr Glu Gly Gly Asn Ile Tyr Thr Lys Lys Glu Ala 15 10 15

Phe Asn Val Glu (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 42:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 10 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 42:

His Gly Leu Glu Val Glu Ile Asn Cys Thr 15 10 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 43:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 10 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 43:

Glu Ile Asn Cys Thr Arg Thr Gin Asn 1 5

Thr

- 199 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 44:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 10 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 44:

Lys Cys Arg Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys

10 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 45:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 14 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 45:

Pro Asn Phe Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His Cys Asp

10 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 46:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 10 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 46:

Gly Lys Ile Ala Ser Cys Leu Asn Asp Asn 15 10 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 47:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 34 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina • · · · • v

-200 - (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 47:

GCGAATTCTG CCTTGACTGA TCAGAGTTTC CTCA 34 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 48:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 32 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 48:

GCTCTAGATG AGGTGAAAGA TGAGCTGGAG GA 32 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 49:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 768 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA až mRNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ:40..753 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: mat_peptid (B) UMÍSTĚNÍ:100..753

- 201 - (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: sig_peptid (B) UMÍSTĚNÍ:40..99 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 49:

CCCAAGCTTA AGAAGCATCC TCTCATCTAG TTCTCAGAG ATG GAG ACA GAC ACA 54

Met Glu Thr Asp Thr

ATC Ile -15

CTG Leu

CTA TGG

GTG CTG CTG

CTC TGG GTT

CCA GGC

TCC ACT

GGT Gly

GAC Asp 1

102

Leu

Trp

Val

Leu Leu -10

Leu

Trp Val

Pro -5

Gly

Ser

Thr

ATT

GTG

CTC

ACC

CAA

TCT

CCA

GGT

ACT

TTG

TCT

CTG

TCT

CCA

GGG

GAG

150

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

5

10

15

AGG

GCC

ACC

CTC

TCC

TGC

AAG

GCC

AGC

CAA

AGT

GTT

GAT

TAT

GAT

GGT

198

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Asp

Tyr

Asp

Gly

20

25

30

GAT

AGT

TAT

ATG

AAC

TGG

TAC

CAA

CAG

AAA

CCA

GGA

CAG

GCA

CCC

AGA

246

Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

35

40

45

CTC

CTC

ATC

TAT

GCT

GCA

TCC

AAT

CTC

GAA

TCT

GGG

ATC

CCA

GAC

AGG

294

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

Ile

Pro

Asp

Arg

50

55

60

65

TTT

AGT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACA

GAC

TTC

ACC

CTC

ACC

ATC

TCT

CGT

342

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

70

75

80

CTG

GAG

CCG

GCG

GAT

TTT

GCA

GTC

TAT

TAC

TGT

CAG

CAA

AGT

AAT

GAG

390

Leu

Glu

Pro

Ala

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Asn

Glu

85

90

95

GAT

CCT

CGG

ACG

TTC

GGT

CAA

GGC

ACC

AGG

CTG

GAA

ATC

AAA

CGG

ACT

438

Asp

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Arg

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

100

105

110

GTG

GCT

GCA

CCA

TCT

GTC

TTC

ATC

TTC

CCG

CCA

TCT

GAT

GAG

CAG

TTG

486

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

115

120

125

AAA

TCT

GGA

ACT

GCC

TCT

GTT

GTG

TGC

CTG

CTG

AAT

AAC

TTC

TAT

CCC

534

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

130

135

140

145

AGA

GAG

GCC

AAA

GTA

CAG

TGG

AAA

GTG

GAT

AAC

GCC

CTC

CAA

TCG

GGT

582

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

150

155

160

AAC

TCC

CAG

GAG

AGT

GTC

ACA

GAG

CAG

GAC

AGC

AAG

GAC

AGC

ACC

TAC

630

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

-202 165 170 175

AGC Ser

CTC AGC AGC ACC

CTG ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC

678

Leu

Ser 180

Ser

Thr

Leu

Thr Leu Ser 185

Lys

Ala

Asp Tyr Glu Lys 190

His

AAA

GTC

TAC

GCC

TGC

GAA

GTC

ACC

CAT

CAG

GGC

CTG

AGC

TCG

CCC

GTC

726

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

195

200

205

ACA

AAG

AGC

TTC

AAC

AGG

GGA

GAG

TGT

TAGTAAGAAT '

rCGGG

768

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210

215

(2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 50:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 238 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 50:

Met -20

Glu

Thr Asp Thr

Ile -15

Leu Leu Trp Val

Leu Leu Leu Trp -10

Val

Pro -5

Gly

Ser

Thr

Gly

Asp

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

1

5

10

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Ser

15

20

25

Val

Asp

Tyr

Asp

Gly

Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

30

35

40

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

45

50

55

60

Gly

Ile

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

65

70

75

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Ala

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

80

85

90

Gin

Gin

Ser

Asn

Glu

Asp

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Arg

Leu

95

100

105

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

110

115

120

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

125

130

135

140

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn

-203 -

				145
Ala	Leu	Gin	Ser 160	Gly	Asn	Ser	Gin
Lys	Asp	Ser 175	Thr	Tyr	Ser	Leu	Ser 180
Asp	Tyr 190	Glu	Lys	His	Lys	Val 195	Tyr
Leu 205	Ser	Ser	Pro	Val	Thr 210	Lys	Ser

	150					155
Glu 165	Ser	Val	Thr	Glu	Gin 170	Asp	Ser
Ser	Thr	Leu	Thr	Leu 185	Ser	Lys	Ala
Ala	Cys	Glu	Val 200	Thr	His	Gin	Gly
Phe	Asn	Arg 215	Gly	Glu	Cys

(2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 51:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 768 páru bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA až mRNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ:40..753 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: mat_peptid (B) UMÍSTĚNÍ:100..753 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: sig_peptid (B) UMÍSTĚNÍ:40..99 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 51:

CCCAAGCTTA AGAAGCATCC TCTCATCTAG TTCTCAGAG ATG GAG ACA GAC ACA 54

Met Glu Thr Asp Thr

ATC Ile -15

CTG CTA TGG GTG CTG

CTG CTC TGG GTT

CCA Pro -5

GGC Gly

TCC Ser

ACT Thr

GGT Gly

GAC Asp 1

102

Leu

Leu

Trp Val

Leu -10

Leu

Leu

Trp

Val

ATT

GTG

CTC

ACC

CAA

TCT

CCA

GGT

ACT

TTG

TCT

CTG

TCT

CCA

GGG

GAG

150

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

5

10

15

AGG

GCC

ACC

CTC

TCC

TGC

AAG

GCC

AGC

CAA

AGT

GTT

GAT

TAT

GAT

GGT

198

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Asp

Tyr

Asp

Gly

·· · ·· ···· ·· ·· ♦ · · · ··· · · · • · · · · · · · · · ·

-204 -

• • • · · · ·

• · • ·

• · • · • ·

• · • • · ·

• · · · · • · · • · · ·

20

25

30

GAT

AGT

TAT

ATG

AAC

TGG

TAC

CAA

CAG

AAA

CCA

GGA

CAG

GCA

CCC

AGA

246

Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

35

40

45

CTC

CTC

ATC

TAT

GCT

GCA

TCC

AAT

CTC

GAA

TCT

GGG

ATC

CCA

GAC

AGG

294

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

Ile

Pro

Asp

Arg

50

55

60

65

TTT

AGT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACA

GAC

TTC

ACC

CTC

ACC

ATC

CAT

CCT

342

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

His

Pro

70

75

80

GTG

GAG

GAG

GAG

GAT

GCT

GCA

ACC

TAT

TAC

TGT

CAG

CAA

AGT

AAT

GAG

390

Val

Glu

Glu

Glu

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Asn

Glu

85

90

95

GAT

CCT

CGG

ACG

TTC

GGT

CAA

GGC

ACC

AGG

CTG

GAA

ATC

AAA

CGG

ACT

438

Asp

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Arg

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

100

105

110

GTG

GCT

GCA

CCA

TCT

GTC

TTC

ATC

TTC

CCG

CCA

TCT

GAT

GAG

CAG

TTG

486

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

115

120

125

AAA

TCT

GGA

ACT

GCC

TCT

GTT

GTG

TGC

CTG

CTG

AAT

AAC

TTC

TAT

CCC

534

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

130

135

140

145

AGA

GAG

GCC

AAA

GTA

CAG

TGG

AAA

GTG

GAT

AAC

GCC

CTC

CAA

TCG

GGT

582

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

150

155

160

AAC

TCC

CAG

GAG

AGT

GTC

ACA

GAG

CAG

GAC

AGC

AAG

GAC

AGC

ACC

TAC

630

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

165

170

175

AGC

CTC

AGC

AGC

ACC

CTG

ACG

CTG

AGC

AAA

GCA

GAC

TAC

GAG

AAA

CAC

678

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

180

185

190

AAA

GTC

TAC

GCC

TGC

GAA

GTC

ACC

CAT

CAG

GGC

CTG

AGC

TCG

CCC

GTC

726

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

195

200

205

ACA

AAG

AGC

TTC

AAC

AGG

GGA

GAG

TGT

TAGTAAGAAT TCGGG

768

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210

215

(2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 52:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 238 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární · · r • · · · · · ····· • · · · · · ·· ··· • · · · · ·· · · · · · • · · 9 9 9 99 «··· 999 99 99· ····

-205 - (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 52:

Met -20

Glu Thr

Asp

Thr

Ile Leu -15

Leu Trp Val

Leu Leu -10

Leu

Trp

Val

Pro -5

Gly

Ser

Thr

Gly

Asp

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

1

5

10

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Ser

15

20

25

Val

Asp

Tyr

Asp

Gly

Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

30

35

40

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

45

50

55

60

Gly

Ile

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

65

70

75

Leu

Thr

Ile

His

Pro

Val

Glu

Glu

Glu

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

80

85

90

Gin

Gin

Ser

Asn

Glu

Asp

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Arg

Leu

95

100

105

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

110

115

120

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

125

130

135

140

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

145

150

155

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

160

165

170

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

175

180

185

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

190

195

200

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

205

210

215

(2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 53:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 768 páru bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární to ····

-206 ···· • to (ii) TYP MOLEKULY: cDNA až mRNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ:40..753 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: mat_peptid (B) UMÍSTĚNÍ:100..753 (ix) ZNAK:

(A) JMENO/KLÍČ: sig_peptid (B) UMÍSTĚNÍ:40..99 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 53:

CCCAAGCTTA AGAAGCATCC TCTCATCTAG TTCTCAGAG ATG Met -20

GAG ACA GAC ACA

ATC Ile -15

CTG Leu

CTA TGG GTG

CTG CTG CTC

TGG GTT Trp Val

CCA GGC TCC

ACT Thr

GGT Gly

GAC Asp 1

102

Leu

Trp Val

Leu -10

Leu

Leu

Pro -5

Gly

Ser

ATT

GTG

CTC

ACC

CAA

TCT

CCA

GGT

ACT

TTG

TCT

CTG

TCT

CCA

GGG

GAG

150

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

5

10

15

AGG

GCC

ACC

CTC

TCC

TGC

AAG

GCC

AGC

CAA

AGT

GTT

GAT

TAT

GAT

GGT

198

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Asp

Tyr

Asp

Gly

20

25

30

GAT

AGT

TAT

ATG

AAC

TGG

TAC

CAA

CAG

AAA

CCA

GGA

CAG

CCA

CCC

AAA

246

Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Pro

Pro

Lys

35

40

45

CTC

CTC

ATC

TAT

GCT

GCA

TCC

AAT

CTC

GAA

TCT

GGG

ATC

CCA

GAC

AGG

294

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

Ile

Pro

Asp

Arg

50

55

60

65

TTT

AGT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACA

GAC

TTC

ACC

CTC

ACC

ATC

CAT

CCT

342

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

His

Pro

70

75

80

GTG

GAG

GAG

GAG

GAT

GCT

GCA

ACC

TAT

TAC

TGT

CAG

CAA

AGT

AAT

GAG

390

Val

Glu

Glu

Glu

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Asn

Glu

85

90

95

GAT

CCT

CGG

ACG

TTC

GGT

CAA

GGC

ACC

AGG

CTG

GAA

ATC

AAA

CGG

ACT

438

Asp

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Arg

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

100

105

110

• · · · · *··· • · ···· · ··· • · · · · « ···· · • · · · · · · •« · · · · · · · · · · • · · ·

-207 -

GTG

GCT

GCA

CCA

TCT

GTC

TTC

ATC

TTC

CCG

CCA

TCT

GAT

GAG

CAG

TTG

486

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

115

120

125

AAA

TCT

GGA

ACT

GCC

TCT

GTT

GTG

TGC

CTG

CTG

ΆΑΤ

AAC

TTC

TAT

CCC

534

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

130

135

140

145

AGA

GAG

GCC

AAA

GTA

CAG

TGG

AAA

GTG

GAT

AAC

GCC

CTC

CAA

TCG

GGT

582

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

150

155

160

AAC

TCC

CAG

GAG

AGT

GTC

ACA

GAG

CAG

GAC

AGC

AAG

GAC

AGC

ACC

TAC

630

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

165

170

175

AGC

CTC

AGC

AGC

ACC

CTG

ACG

CTG

AGC

AAA

GCA

GAC

TAC

GAG

AAA

CAC

678

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

180

185

190

AAA

GTC

TAC

GCC

TGC

GAA

GTC

ACC

CAT

CAG

GGC

CTG

AGC

TCG

CCC

GTC

726

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

195

200

205

ACA

AAG

AGC

TTC

AAC

AGG

GGA

GAG

TGT

TAGTAAGAAT TCGGG

768

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210 215 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 54:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 238 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 54:

Met -20

Glu

Thr

Asp Thr

Ile -15

Leu

Leu

Trp Val

Leu Leu -10

Leu Trp

Val

Pro -5

Gly

Ser

Thr

Gly

Asp

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

1

5

10

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Ser

15

20

25

Val

Asp

Tyr

Asp

Gly

Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

30

35

40

Gly

Gin

Pro

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

45

50

55

60

Gly

Ile

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

65

70

75

« · · ·

-208 -

Leu Thr

Ile

His 80

Pro Val Glu

Glu

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr

Cys

85

90

Gin

Gin

Ser

Asn

Glu

Asp

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Arg

Leu

95

100

105

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

110

115

120

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

125

130

135

140

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

145

150

155

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

160

165

170

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

175

180

185

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

190

195

200

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

205

210

215

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 55:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 34 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 55:

CCCAAGCTTA AGAAGCATCC TCTCATCTAG TTCT (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 56:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 44 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární • · · ·

- 209 -

(ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 56:

GAGAGGGTGG CCCTCTCCCC TGGAGACAGA GACAAAGTAC CTGG (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 57:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 44 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 57:

CCAGGTACTT TGTCTCTGTC TCCAGGGGAG AGGGCCACCC TCTC 44 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 58:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 44 páru baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 58:

GATTCGAGAT TGGATGCAGC ATAGATGAGG AGTCTGGGTG CCTG 44 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 59:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

- 210 -

(A) DÉLKA: 45 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 59:

GCTGCATCCA ATCTCGAATC TGGGATCCCA GACAGGTTTA GTGGC 45 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 60:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 52 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 60:

AAAATCCGCC GGCTCCAGAC GAGAGATGGT GAGGGTGAAG TCTGTCCCAG AC 52 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 61:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 58 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 61:

CTCGTCTGGA GCCGGCGGAT TTTGCAGTCT ATTACTGTCA GCAAAGTAAT GAGGATCC • ·

-211 -

(2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 62:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 55 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne
(iv)	KÓDUJÍCÍ: ne
(xi)	POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 62:
TGAAGACAGA TGGTGCAGCC ACAGTCCGTT TGATTTCCAG CCTGGTGCCT TGACC	55

(2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 63:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 55 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne
(iv)	KÓDUJÍCÍ: ne
(xi)	POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 63:
GGTCAAGGCA CCAGGCTGGA AATCAAACGG ACTGTGGCTG CACCATCTGT CTTCA	55

(2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 64:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 45 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne

- 212 - (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 64:

CCCGAATTCT TACTAACACT CTCCCCTGTT GAAGCTCTTT GTGAC 45 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 65:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 55 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 65:

TCTGTCCCAG ACCCACTGCC ACTAAACCTG TCTGGGATCC CAGATTCGAG ATTGG 55 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 66:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 55 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 66:

GTTTAGTGGC AGTGGGTCTG GGACAGACTT CACCTCTACC ATCCATCCTG TGGAG 55 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 67:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 55 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina

		• · · • · · ·	·· ···· • · to	·· ·· • · · ·
		• ·	• · · ·	• to · · to ·
		-213- *’**	• · to toto	·· ··
	(A) POPIS:	/desc = synthetic DNA
(iii)	HYPOTETICKÁ:	ne
(iv)	KÓDUJÍCÍ: ne
(xi)	POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 67:
ATGGTGCAGC CACAGTCCGT	TTGATTTCCA GCCTGGTGCC TTGACCGAAC	GTCCG	55

(2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 68:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 68:

CCCAAGCTTA AGAAGCATCC 20 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 69:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA'
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne
(iv)	KÓDUJÍCÍ: ne
(xi)	POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 69:
ATCTATGCTG CATCCAATCT

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 70:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží

-214- (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 70:

GTTGTGTGCC TGCTGAATAA 20 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 71:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 71:
CCCGAATTCT TACTAACACT	20
(2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 72:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne
(iv)	KÓDUJÍCÍ: ne
(xi)	POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 72:
TTATTCAGCA GGCACACAAC	20

-215- (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 73:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 73:

AGATTGGATG CAGCATAGAT (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 74:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 457 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA až mRNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ:21..455 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: mat_peptid (B) UMÍSTĚNÍ:78..455 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: sig_peptid (B) UMÍSTĚNÍ:21..77 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 74:

AAGCTTGGCT TGACCTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG50

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu PheLeu

-19 -15-10

GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCT CAG GTC CAA CTG GTG CAG TCT98

Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gin Val Gin Leu Val Gin Ser

-515

-216 -

• to ·
to ·	··
•	•
•	• ·
•	•
····	···

·· totototo • toto • toto·* ·

• · · ·· toto* ·· totototo toto to* • to·to •· ·· • ····· ·· ·· toto

GGG GCT Gly Ala

GAG Glu 10

GTC AAG

AAG CCT

GGG GCT TCA GTG AAG GTG TCC

TGC Cys

AAG Lys

146

Val

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser Val

Lys

Val 20

Ser

GCT

TCT

GGC

TAC

ACC

TTC

ACC

AGC

TAC

TGG

ATG

CAG

TGG

GTA

AAA

CAG

194

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Ser

Tyr

Trp

Met

Gin

Trp

Val

Lys

Gin

25

30

35

GCC

CCT

GGA

CAG

AGG

CTT

GAG

TGG

ATG

GGA

GAG

ATT

GAT

CCT

TCT

GAT

242

Ala

Pro

Gly

Gin

Arg

Leu

Glu

Trp

Met

Gly

Glu

Ile

Asp

Pro

Ser

Asp

40

45

50

55

AGC

TAT

ACT

AAC

TAC

AAT

CAA

AAG

TTC

AAG

GGC

AAG

GCC

ACA

TTG

ACT

290

Ser

Tyr

Thr

Asn

Tyr

Asn

Gin

Lys

Phe

Lys

Gly

Lys

Ala

Thr

Leu

Thr

60

65

70

GTA

GAC

ACA

TCC

GCT

AGC

ACA

GCC

TAC

ATG

GAG

CTC

AGC

AGC

CTG

AGA

338

Val

Asp

Thr

Ser

Ala

Ser

Thr

Ala

Tyr

Met

Glu

Leu

Ser

Ser

Leu

Arg

75

80

85

TCT

GAG

GAC

ACG

GCG

GTC

TAT

TAC

TGT

GCA

AGA

AAT

AGG

GAC

TAT

AGT

386

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Asn

Arg

Asp

Tyr

Ser

90

95

100

AAC

AAC

TGG

TAC

TTC

GAT

GTC

TGG

GGC

GAA

GGG

ACC

CTG

GTC

ACC

GTC

434

Asn

Asn

Trp

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Glu

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

105

110

115

TCC

TCA

GCC

TCC

ACC

AAG

GGC

CC

457

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

120

125

(2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 75:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 145 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 75:

Met -19

Gly

Trp

Ser

Cys -15

Ile

Ile Leu

Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

-10

-5

Val

His

Ser

Gin

Val

Gin

Leu

Val

Gin

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

Lys

1

5

10

Pro

Gly

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

15

20

25

Thr

Ser

Tyr

Trp

Met

Gin

Trp

Val

Lys

Gin

Ala

Pro

Gly

Gin

Arg

Leu

30

35

40

45

-

217

Φ · · · ·

• ·

• ·

• · ·

Glu

Trp

Met

Gly

Glu 50

Ile

Asp

Pro

Ser

Asp 55

Ser

Tyr

Thr

Asn

Tyr 60

Asn

Gin

Lys

Phe

Lys 65

Gly

Lys

Ala

Thr

Leu 70

Thr

Val

Asp

Thr

Ser 75

Ala

Ser

Thr

Ala

Tyr 80

Met

Glu

Leu

Ser

Ser 85

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp 90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Arg

Asn

Arg 100

Asp

Tyr

Ser

Asn

Asn 105

Trp

Tyr

Phe

Asp

Val 110

Trp

Gly

Glu

Gly

Thr 115

Leu

Val

Thr

Val

Ser 120

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys 125

Gly (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 76:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 40 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 76:

GGGAAGCTTG GCTTGACCTC ACCATGGGAT GGAGCTGTAT (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 77:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 48 páru baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne
(iv)	KÓDUJÍCÍ: ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 77:

- 218 -

TGAAGCCCCA GGCTTCTTGA CCTCAGCCCC AGACTGCACC AGTTGGAC	48
(2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 78:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 36 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne
(iv)	KÓDUJÍCÍ: ne
(xi)	POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 78:
TCCACTCAAG CCTCTGTCCA GGGGCCTGTT TTACCC	36

(2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 79:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 52 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 79:

GTCTGGGGCT GAGGTCAAGA AGCCTGGGGC TTCAGTGAAG GTGTCCTGCA AG 52 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 80:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 39 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne

-219 - (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 80:

CAGGCCCCTG GACAGAGGCT TGAGTGGATG GGAGAGATT (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 81:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 50 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 81:

TCAGATCTCA GGCTGCTGAG CTCCATGTAG GCTGTGCTAG CGGATGTGTC 50 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 82:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 44 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 82:

TGGAGCTCAG CAGCCTGAGA TCTGAGGACA CGGCGGTCTA TTAC 44 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 83:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 55 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární • · · · • · · · ·

220 • * · · · «

(ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 83:

GATGGGCCCT TGGTGGAGGC TGAGGAGACG GTGACCAGGG TCCCTTCGCC CCAGT 55 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 84:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 39 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 84:

GGGAAGCTTC CGCGGTCACA TGGCACCACC TCTCTTGCA 39 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 85:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 35 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 85:

GCTCTGCAGA GAGAAGATTG GGAGTTACTG GAATC 35 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 86:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

-221 - (A) DÉLKA: 35 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 86:

TCTCTGCAGA GCCCAAATCT TGTGACAAAA CTCAC 35 (2(INFORMACE PRO SEQ ID NO: 87:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 39 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 87:

GGGGAATTCG GGAGCGGGGC TTGCCGGCCG TCGCACTCA 39 (2(INFORMACE PRO SEQ ID NO: 88:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 2077 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: sig_peptid (B) UMÍSTĚNÍ:27..83 • · · ·

- 222 - (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: intron (B) UMÍSTĚNÍ:741..1131 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: intron (B) UMÍSTĚNÍ:1177..1294 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: intron (B) UMÍSTĚNÍ :1625..1721 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: exon (B) UMÍSTĚNÍ:27..740 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: exon (B) UMÍSTĚNÍ :1132..117 6 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: exon (B) UMÍSTĚNÍ :1295..1624 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: exon (B) UMÍSTĚNÍ :1722..2077 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: mat_peptid

(B)	UMÍSTĚNÍ:spoj (84..740,	1132.	.1176,	1295.	. 1624,	1722. .2042)
(ix) ZNAK
(A)	JMÉNO/KLÍČ: ODS
(B)	UMÍSTĚNÍ:spoj (27..740,	1132.	.1176,	1295.	.1624,	1722..2042)

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 88:
GGGCGAAAGC TTGGCTTGAC CTCACC	ATG GGA TGG	AGC	TGT	ATC	ATC	CTC	TTC	53
	Met Gly Trp	Ser	Cys	Ile	Ile	Leu	Phe
	-19		-15

TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT

GTC Val

CAC His

TCT Ser

CAG GTC

CAA Gin

CTG GTG

CAG Gin

101

Leu Val -10

Ala

Thr

Ala Thr -5

Gly

Gin 1

Val

Leu

Val 5

TCT

GGG

GCT

GAG

GTC

AAG

AAG

CCT

GGG

GCT

TCA

GTG

AAG

GTG

TCC

TGC

149

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

10

15

20

AAG

GCT

TCT

GGC

TAC

ACC

TTC

ACC

AGC

TAC

TGG

ATG

CAG

TGG

GTA

AAA

197

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Ser

Tyr

Trp

Met

Gin

Trp

Val

Lys

25

30

35

CAG

GCC

CCT

GGA

CAG

AGG

CTT

GAG

TGG

ATG

GGA

GAG

ATT

GAT

CCT

TCT

245

Gin

Ala

Pro

Gly

Gin

Arg

Leu

Glu

Trp

Met

Gly

Glu

Ile

Asp

Pro

Ser

40

45

50

• * • · · ·

-223 -

GAT AGC

TAT Tyr

ACT Thr

AAC TAC AAT

CAA Gin

AAG TTC AAG GGC AAG

GCC ACA

TTG Leu 70

293

Asp 55

Ser

Asn Tyr 60

Asn

Lys

Phe

Lys 65

Gly Lys

Ala

Thr

ACT

GTA

GAC

ACA

TCC

GCT

AGC

ACA

GCC

TAC

ATG

GAG

CTC

AGC

AGC

CTG

341

Thr

Val

Asp

Thr

Ser

Ala

Ser

Thr

Ala

Tyr

Met

Glu

Leu

Ser

Ser

Leu

75

80

85

AGA

TCT

GAG

GAC

ACG

GCG

GTC

TAT

TAC

TGT

GCA

AGA

AAT

AGG

GAC

TAT

389

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Asn

Arg

Asp

Tyr

90

95

100

AGT

AAC

AAC

TGG

TAC

TTC

GAT

GTC

TGG

GGC

GAA

GGG

ACC

CTG

GTC

ACC

437

Ser

Asn

Asn

Trp

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Glu

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

105

110

115

GTC

TCC

TCA

GCC

TCC

ACC

AAG

GGC

CCA

TCG

GTC

TTC

CCC

CTG

GCA

CCC

485

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

120

125

130

TCC

TCC

AAG

AGC

ACC

TCT

GGG

GGC

ACA

GCG

GCC

CTG

GGC

TGC

CTG

GTC

533

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

135

140

145

150

AAG

GAC

TAC

TTC

CCC

GAA

CCG

GTG

ACG

GTG

TCG

TGG

AAC

TCA

GGC

GCC

581

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

155

160

165

CTG

ACC

AGC

GGC

GTG

CAC

ACC

TTC

CCG

GCT

GTC

CTA

CAG

TCC

TCA

GGA

629

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

170

175

180

CTC

TAC

TCC

CTC

AGC

AGC

GTG

GTG

ACC

GTG

CCC

TCC

AGC

AGC

TTG

GGC

677

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

185

190

195

ACC

CAG

ACC

TAC

ATC

TGC

AAC

GTG

AAT

CAC

AAG

CCC

AGC

AAC

ACC

AAG

725

Thr

Gin

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

200

205

210

GTG GAC AAG AGA GTT GGTGAGAGGC CAGCACAGGG AGGGAGGGTG TCTGCTGGAA 780

Val Asp Lys Arg Val

215

GCCAGGCTCA

GCGCTCCTGC

CTGGACGCAT

CCCGGCTATG

CAGTCCCAGT

CCAGGGCAGC

840

AAGGCAGGCC

CCGTCTGCCT

CTTCACCCGG

AGGCCTCTGC

CCGCCCCACT

CATGCTCAGG

900

GAGAGGGTCT

TCTGGCTTTT

TCCCCAGGCT

CTGGGCAGGC

ACAGGCTAGG

TGCCCCTAAC

960

CCAGGCCCTG

CACACAAAGG

GGCAGGTGCT

GGGCTCAGAC

CTGCCAAGAG

CCATATCCGG

1020

GAGGACCCTG

CCCCTGACCT

AAGCCCACCC

CAAAGGCCAA

ACTCTCCACT

CCCTCAGCTC

1080

GGACACCTTC

TCTCCTCCCA

GATTCCAGTA

ACTCCCAATC

TTCTCTCTGC

A GAG CCC

Glu Pro

220

1137

-224ΑΑΆ TCT TGT GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG TGC CCA GGTAAGCCAG118 6

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

225230

CCCAGGCCTC GCCCTCCAGC TCAAGGCGGG ACAGGTGCCC TAGAGTAGCC TGCATCCAGG1246

GACAGGCCCC AGCCGGGTGC TGACACGTCC ACCTCCATCT CTTCCTCA GCA CCT GAA1303

Ala Pro Glu

235

CTC Leu

CTG GGG GGA CCG TCA GTC TTC CTC

TTC CCC CCA AAA CCC AAG GAC

1351

Leu

Gly Gly 240

Pro

Ser Val

Phe 245

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys 250

Pro

Lys

Asp

ACC

CTC

ATG

ATC

TCC

CGG

ACC

CCT

GAG

GTC

ACA

TGC

GTG

GTG

GTG

GAC

1399

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

255

260

265

GTG

AGC

CAC

GAA

GAC

CCT

GAG

GTC

AAG

TTC

AAC

TGG

TAC

GTG

GAC

GGC

1447

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

270

275

280

285

GTG

GAG

GTG

CAT

AAT

GCC

AAG

ACA

AAG

CCG

CGG

GAG

GAG

CAG

TAC

AAC

1495

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

290

295

300

AGC

ACG

TAC

CGT

GTG

GTC

AGC

GTC

CTC

ACC

GTC

CTG

CAC

CAG

GAC

TGG

1543

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

305

310

315

CTG

AAT

GGC

AAG

GAG

TAC

AAG

TGC

AAG

GTC

TCC

AAC

AAA

GCC

CTC

CCA

1591

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

320

325

330

GCC

CCC

ATC

GAG

AAA

ACC

ATC

TCC

AAA

GCC

AAA

GGTGGGACCC GTGGGGTGCG

1644

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

335

340

AGGGCCACAT GGACAGAGGC CGGCTCGGCC CACCCTCTGC

CCTGAGAGTG ACCGCTGTAC

1704

CAACCTCTGT CCCTACA GGG CAG CCC CGA GAA (

3CA CAG GTG TAC ACC CTG

1754

Gly Gin Pro Arg Glu :

Pro Gin Val Tyr Thr Leu

345

350

355

CCC

CCA

TCC

CGG

GAG

GAG

ATG

ACC

AAG

AAC

CAG

GTC

AGC

CTG

ACC

TGC

1802

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

360

365

370

CTG

GTC

AAA

GGC

TTC

TAT

CCC

AGC

GAC

ATC

GCC

GTG

GAG

TGG

GAG

AGC

1850

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

375

380

385

AAT

GGG

CAG

CCG

GAG

AAC

AAC

TAC

AAG

ACC

ACG

CCT

CCC

GTG

CTG

GAC

1898

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

Asp

390

395

400

TCC

GAC

GGC

TCC

TTC

TTC

CTC

TAT

AGC

AAG

CTC

ACC

GTG

GAC

AAG

AGC

1946

• · · to • · ·

- 225 -

• · · · ·

• ·

to·

• to to

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

405

410

415

AGG

TGG

CAG

CAG

GGG

AAC

GTC

TTC

TCA

TGC

TCC

GTG

ATG

CAT

GAG

GCT

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

420

425

430

435

CTG

CAC

AAC

CAC

TAC

ACG

CAG

AAG

AGC

CTC

TCC

CTG

TCC

CCG

GGT

AAA

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

440

445

450

TGAGTGCGAC GGCCGGCAAG CCCCGCTCCC GAATT ···· • · • to

1994

2042

2077 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 89:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 470 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein

	(xi)	POPIS SEKVENCE	: SEQ ID
Met -19	Gly	Trp	Ser	Cys -15	Ile	Ile	Leu
Val	His	Ser	Gin 1	Val	Gin	Leu	Val 5
Pro	Gly 15	Ala	Ser	Val	Lys	Val 20	Ser
Thr 30	Ser	Tyr	Trp	Met	Gin 35	Trp	Val
Glu	Trp	Met	Gly	Glu 50	Ile	Asp	Pro
Gin	Lys	Phe	Lys 65	Gly	Lys	Ala	Thr
Thr	Ala	Tyr 80	Met	Glu	Leu	Ser	Ser 85
Tyr	Tyr 95	Cys	Ala	Arg	Asn	Arg 100	Asp
Val 110	Trp	Gly	Glu	Gly	Thr 115	Leu	Val
Gly	Pro	Ser	Val	Phe 130	Pro	Leu	Ala

NO: 89:

Phe	Leu -10	Val	Ala	Thr	Ala	Thr -5	Gly
Gin	Ser	Gly	Ala	Glu 10	Val	Lys	Lys
Cys	Lys	Ala	Ser 25	Gly	Tyr	Thr	Phe
Lys	Gin	Ala 40	Pro	Gly	Gin	Arg	Leu 45
Ser	Asp 55	Ser	Tyr	Thr	Asn	Tyr 60	Asn
Leu 70	Thr	Val	Asp	Thr	Ser 75	Ala	Ser
Leu	Arg	Ser	Glu	Asp 90	Thr	Ala	Val
Tyr	Ser	Asn	Asn 105	Trp	Tyr	Phe	Asp
Thr	Val	Ser 120	Ser	Ala	Ser	Thr	Lys 125
Pro	Ser 135	Ser	Lys	Ser	Thr	Ser 140	Gly

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

145

- 226 - 150

• · 4 4 4

• * 155

4·

• · ·

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

160

165

170

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

175

180

185

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

190

195

200

205

Val

Asn

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

Pro

210

215

220

Lys

Ser

Cys

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

225

230

235

Leu

Leu

Gly

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

240

245

250

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

255

260

265

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

270

275

280

285

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

290

295

300

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

305

310

315

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

320

325

330

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

335

340

345

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

350

355

360

365

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

370

375

380

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

385

390

395

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

400

405

410

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

415

420

425

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

430

435

440

445

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450

-227 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 90:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 90:

ACAGCCGGGA AGGTGTGCAC 20 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 91:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 91:

AGACACCCTC CCTCCCTGTG 20 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 92:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne

- 228 - • ·

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 92:

GTGCAGGGCC TGGGTTAGGG 20 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 93:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární

(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina
(A) POPIS:	/desc = synthetic DNA
(iii)	HYPOTETICKÁ:	ne
(iv)	KÓDUJÍCÍ: ne
(xi)	POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 93:
GCACGGTGGG CATGTGTGAG

(2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 94:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 94:

GTTTTGGGGG GAAGAGGAAG 20 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 95:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina

-229 A a • ·

(A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 95:

CCAGTCCTGG TGCAGGACGG 20 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 96:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 96:

CCTGTGGTTC TCGGGGCTGC 20 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 97:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 97:

CGTGGTCTTG TAGTTGTTCT 20 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 98:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží

- 230 - (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 98:

CTTCCTCTTC CCCCCAAAAC (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 99:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 99:

CCGTCCTGCA CCAGGACTGG (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 100:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 100:

GCAGCCCCGA GAACCACAGG

-231 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 101:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 101:

AGAACAACTA CAAGACCACG 20 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 102:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 102:

GCCTGACATC TGAGGACTC 19 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 103:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 páru baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne

-232- (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 103:

GAGTCCTCAG ATGTCAGGC 19 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 104:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 34 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 104:

GAGCAGTACT CGTTGCTGCC GCGCGCGCCA CCAG 34 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 105:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární

(ii)	TYP MOLEKULY: (A) POPIS:	: jiná nukleová kyselina /desc = synthetic DNA
(iii)	HYPOTETICKÁ:	ne
(iv)	KÓDUJÍCÍ: ne
(xi)	POPIS SEKVENCE: SEQ	ID NO: 105:
GGTATGGCTG ATTAATGATC	AATG

(2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 106:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 768 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA až mRNA • ·

	- 233 -	• · · • · ··	• · · · · · • · · • · · · ·	• · · · • · ·· • · · · · · • · · 9· ··
9 9 • 99 9-	• · • • · ·	• · • · ··	• • • · ·
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne
(iv)	KÓDUJÍCÍ: ne
(ix)	ZNAK: (A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ:40..753
(ix)	ZNAK: (A) JMÉNO/KLÍČ: mat peptid (B) UMÍSTĚNÍ.-100..753
(ix)	ZNAK: (A) JMÉNO/KLÍČ: sig peptid (B) UMÍSTĚNÍ:40..99
(Xi)	POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 106:
CCCAAGCTTA AGAAGCATCC TCTCATCTAG TTCTCAGAG	ATG Met -20	GAG Glu	ACA Thr	GAC Asp	ACA Thr	54

ATC Ile -15

CTG CTA TGG GTG CTG

CTG Leu

CTC Leu

TGG Trp

GTT Val

CCA Pro -5

GGC TCC ACT GGT

GAG Glu 1

102

Leu

Leu

Trp Val

Leu -10

Gly

Ser

Thr

Gly

ATT

GTG

CTC

ACC

CAA

TCT

CCA

GGT

ACT

TTG

TCT

CTG

TCT

CCA

GGG

GAG

150

Ile

Val

Leu

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr 10

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro 15

Gly

Glu

AGG

GCC

ACC

CTC

TCC

TGC

AAG

GCC

AGC

CAA

AGT

GTT

GAT

TAT

GAT

GGT

198

Arg

Ala

Thr 20

Leu

Ser

Cys

Lys

Ala 25

Ser

Gin

Ser

Val

Asp 30

Tyr

Asp

Gly

GAT

AGT

TAT

ATG

AAC

TGG

TAC

CAA

CAG

AAA

CCA

GGA

CAG

GCA

CCC

AGA

246

Asp

Ser 35

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr 40

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly 45

Gin

Ala

Pro

Arg

CTC

CTC

ATC

TAT

GCT

GCA

TCC

ΆΑΤ

CTC

GAA

TCT

GGG

ATC

CCA

GAC

AGG

294

Leu 50

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala 55

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser 60

Gly

Ile

Pro

Asp

Arg 65

TTT

AGT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACA

GAC

TTC

ACC

CTC

ACC

ATC

TCT

CGT

342

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly 70

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe 75

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser 80

Arg

CTG

GAG

CCG

GAG

GAT

TTT

GCA

GTC

TAT

TAC

TGT

CAG

CAA

AGT

AAT

GAG

390

Leu

Glu

Pro

Glu 85

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr 90

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser 95

Asn

Glu

GAT

CCT

CGG

ACG

TTC

GGT

CAA

GGC

ACC

AAG

CTG

GAA

ATC

AAA

CGG

ACT

438

Asp

Pro

Arg 100

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly 105

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile 110

Lys

Arg

Thr

GTG

GCT

GCA

CCA

TCT

GTC

TTC

ATC

TTC

CCG

CCA

TCT

GAT

GAG

CAG

TTG

486

Val

Ala 115

Ala

Pro

Ser

Val

Phe 120

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser 125

Asp

Glu

Gin

Leu

• ·· · • · · · · · · • ···· · · ·· _Λ • · ·.···:::

-234 -

• • • • · · · *

• •

v · • · • · ♦ ·

• · • • · ·

• · · · · • 9 · ·· ··

AAA

TCT

GGA

ACT

GCC

TCT

GTT

GTG

TGC

CTG

CTG

AAT

AAC

TTC

TAT

CCC

534

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

130

135

140

145

AGA

GAG

GCC

AAA

GTA

CAG

TGG

AAA

GTG

GAT

AAC

GCC

CTC

CAA

TCG

GGT

582

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

150

155

160

AAC

TCC

CAG

GAG

AGT

GTC

ACA

GAG

CAG

GAC

AGC

AAG

GAC

AGC

ACC

TAC

630

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

165

170

175

AGC

CTC

AGC

AGC

ACC

CTG

ACG

CTG

AGC

AAA

GCA

GAC

TAC

GAG

7AA

CAC

678

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

180

185

190

AAA

GTC

TAC

GCC

TGC

GAA

GTC

ACC

CAT

CAG

GGC

CTG

AGC

TCG

CCC

GTC

726

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

195

200

205

ACA

AAG

AGC

TTC

AAC

AGG

GGA

GAG

TGT

TAGTAAGAAT TCGGG

768

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210

215

(2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 107:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 238 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 107:

Met -20

Glu Thr Asp

Thr

Ile Leu Leu -15

Trp

Val

Leu Leu -10

Leu

Trp

Val

Pro -5

Gly

Ser

Thr

Gly

Glu

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

1

5

10

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Ser

15

20

25

Val

Asp

Tyr

Asp

Gly

Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

30

35

40

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

45

50

55

60

Gly

Ile

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

65

70

75

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

80

85

90

-235 -

• ··*·

·· ·

• ·

• · ·

Gin

Gin

Ser

Asn

Glu

Asp

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Leu

95

100

105

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

110

115

120

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

125

130

135

140

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

145

150

155

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

160

165

170

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

175

180

185

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

190

195

200

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

205 210 215 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 108:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 768 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA až mRNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ:40..753 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: mat_peptid (B) UMÍSTĚNÍ:100..753 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: sig_peptid (B) UMÍSTĚNÍ:40..99 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 108:

CCCAAGCTTA AGAAGCATCC TCTCATCTAG TTCTCAGAG ATG GAG ACA GAC ACA Met Glu Thr Asp Thr -20

-236 -

ATC Ile -15

CTG Leu

CTA Leu

TGG Trp

GTG CTG CTG CTC TGG GTT

CCA GGC

TCC ACT

GGT Gly

GAG Glu 1

102

Val

Leu -10

Leu

Leu

Trp

Val

Pro -5

Gly

Ser

Thr

ATT

GTG

CTC

ACC

CAA

TCT

CCA

GGT

ACT

TTG

TCT

CTG

TCT

CCA

GGG

GAG

150

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

5

10

15

AGG

GCC

ACC

CTC

TCC

TGC

AAG

GCC

AGC

CAA

AGT

GTT

GAT

TAT

GAT

GGT

198

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Asp

Tyr

Asp

Gly

20

25

30

GAT

AGT

TAT

ATG

AAC

TGG

TAC

CAA

CAG

AAA

CCA

GGA

CAG

GCA

CCC

AGA

246

Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

35

40

45

CTC

CTC

ATC

TAT

GCT

GCA

TCC

AAT

CTC

GAA

TCT

GGG

ATC

CCA

GAC

AGG

294

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

Ile

Pro

Asp

Arg

50

55

60

65

TTT

AGT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACA

GAC

TTC

ACC

CTC

ACC

ATC

CAT

CCT

342

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

His

Pro

70

75

80

GTG

GAG

GAG

GAG

GAT

GCT

GCA

ACC

TAT

TAC

TGT

CAG

CAA

AGT

AAT

GAG

390

Val

Glu

Glu

Glu

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Asn

Glu

85

90

95

GAT

CCT

CGG

ACG

TTC

GGT

CAA

GGC

ACC

AAG

CTG

GAA

ATC

AAA

CGG

ACT

438

Asp

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

100

105

110

GTG

GCT

GCA

CCA

TCT

GTC

TTC

ATC

TTC

CCG

CCA

TCT

GAT

GAG

CAG

TTG

486

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

115

120

125

AAA

TCT

GGA

ACT

GCC

TCT

GTT

GTG

TGC

CTG

CTG

AAT

AAC

TTC

TAT

CCC

534

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

130

135

140

145

AGA

GAG

GCC

AAA

GTA

CAG

TGG

AAA

GTG

GAT

AAC

GCC

CTC

CAA

TCG

GGT

582

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

150

155

160

AAC

TCC

CAG

GAG

AGT

GTC

ACA

GAG

CAG

GAC

AGC

AAG

GAC

AGC

ACC

TAC

630

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

165

170

175

AGC

CTC

AGC

AGC

ACC

CTG

ACG

CTG

AGC

AAA

GCA

GAC

TAC

GAG

AAA

CAC

678

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

180

185

190

AAA

GTC

TAC

GCC

TGC

GAA

GTC

ACC

CAT

CAG

GGC

CTG

AGC

TCG

CCC

GTC

726

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

195 200 205

ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT TAGTAAGAAT TCGGG

768 ·· ··«·

-237• »·· ···

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 109:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 238 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 109:

Met Glu Thr -20

Asp Thr

Ile -15

Leu

Leu Trp

Val

Leu -10

Leu

Leu

Trp Val

Pro -5

Gly

Ser

Thr

Gly

Glu

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

1

5

10

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Ser

15

20

25

Val

Asp

Tyr

Asp

Gly

Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

30

35

40

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

45

50

55

60

Gly

Ile

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

65

70

75

Leu

Thr

Ile

His

Pro

Val

Glu

Glu

Glu

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

80

85

90

Gin

Gin

Ser

Asn

Glu

Asp

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Leu

95

100

105

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

110

115

120

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

125

130

135

140

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

145

150

155

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

160

165

170

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

175

180

185

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

190

195

200

• · · · • ·

-238 -

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

205 210 215 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 110:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 29 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 110:

GGTGAGATTG TGCTCACCCA ATCTCCAGG (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: lil:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 29 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 111:

CCTGGAGATT GGGTGAGCAC AATCTCACC (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 112:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne

-239 31

(iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 112:

CCATCTCTCG TCTGGAGCCG GAGGATTTTG C (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 113:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 113:

GCAAAATCCT CCGGCTCCAG ACGAGAGATG G (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 114:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 114:

CAAGGCACCA AGCTGGAAAT CAAACGGACT G (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 115:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární • · · · • · • o

-240 -

(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne
(iv)	KÓDUJÍCÍ: ne
(xi)	POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 115:

CAGTCCGTTT GATTTCCAGC TTGGTGCCTT G 31 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 116:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 2071 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ; sig_peptid (B) UMÍSTĚNÍ:21..77 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: intron (B) UMÍSTĚNÍ:741..1131 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: intron (B) UMÍSTĚNÍ :1177..1294 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: intron (B) UMÍSTĚNÍ :1619..1715 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: exon (B) UMÍSTĚNÍ:21..734 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: exon (B) UMÍSTĚNÍ :1126..1170 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: exon (B) UMÍSTĚNÍ :1289..1618 (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: exon (B) UMÍSTĚNÍ :1716..2071

-241 -

(ix)	ZNAK:	1126..1170,	1289.	.1618,	1716. .2036)
(A) (B)	JMÉNO/KLÍČ: mat peptid UMÍSTĚNÍ:spoj (78 ..734,
(ix)	ZNAK
	(A)	JMÉNO/KLÍČ: CDS
	(B)	UMÍSTĚNÍ:spoj(21..734,	1126.	.1170,	1289.	.1618,	1716. .2036)

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 116:

AAGCTTGGCT TGACCTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG 50

Met Glv Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu

-19 -15 -10

GTA GCA ACA

GCT Ala

ACA Thr -5

GGT Gly

GTC CAC TCT CAG GTC

CAA CTG GTG

CAG TCT

98

Val Ala

Thr

Val

His

Ser Gin 1

Val

Gin

Leu Val 5

Gin

Ser

GGG

GCT

GAG

GTC

AAG

AAG

CCT

GGG

GCT

TCA

GTG

AAG

GTG

TCC

TGC

AAG

146

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

10

15

20

GCT

TCT

GGC

TAC

ACC

TTC

ACC

AGC

TAC

TGG

ATG

CAG

TGG

GTA

AAA

CAG

194

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Ser

Tyr

Trp

Met

Gin

Trp

Val

Lys

Gin

25

30

35

GCC

CCT

GGA

CAG

GGC

CTT

GAG

TGG

ATG

GGA

GAG

ATT

GAT

CCT

TCT

GAT

242

Ala

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

Gly

Glu

Ile

Asp

Pro

Ser

Asp

40

45

50

55

AGC

TAT

ACT

AAC

TAC

AAT

CAA

AAG

TTC

AAG

GGC

AAG

GCC

ACA

TTG

ACT

290

Ser

Tyr

Thr

Asn

Tyr

Asn

Gin

Lys

Phe

Lys

Gly

Lys

Ala

Thr

Leu

Thr

60

65

70

GTA

GAC

ACA

TCC

ACT

AGC

ACA

GCC

TAC

ATG

GAG

CTC

AGC

AGC

CTG

AGA

338

Val

Asp

Thr

Ser

Thr

Ser

Thr

Ala

Tyr

Met

Glu

Leu

Ser

Ser

Leu

Arg

75

80

85

TCT

GAG

GAC

ACG

GCG

GTC

TAT

TAC

TGT

GCA

AGA

AAT

AGG

GAC

TAT

AGT

386

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Asn

Arg

Asp

Tyr

Ser

90

95

100

AAC

AAC

TGG

TAC

TTC

GAT

GTC

TGG

GGC

GAA

GGG

ACC

CTG

GTC

ACC

GTC

434

Asn

Asn

Trp

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Glu

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

105

110

115

TCC

TCA

GCC

TCC

ACC

AAG

GGC

CCA

TCG

GTC

TTC

CCC

CTG

GCA

CCC

TCC

482

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

120

125

130

135

TCC

AAG

AGC

ACC

TCT

GGG

GGC

ACA

GCG

GCC

CTG

GGC

TGC

CTG

GTC

AAG

530

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

140

145

150

GAC

TAC

TTC

CCC

GAA

CCG

GTG

ACG

GTG

TCG

TGG

AAC

TCA

GGC

GCC

CTG

578

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

- 242 -

• · · » · · · * ·

• • • • · • •

• · · • · 9 9 9 • • • · «

• · · · • · • · · • · · · · n · • · ♦

• · • · • · • · • · • ·

• • 9 · ·

• • · 9

155

160

165

ACC

AGC

GGC

GTG

CAC

ACC

TTC

CCG

GCT

GTC

CTA

CAG

TCC

TCA

GGA

CTC

62 6

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

170

175

180

TAC

TCC

CTC

AGC

AGC

GTG

GTG

ACC

GTG

CCC

TCC

AGC

AGC

TTG

GGC

ACC

674

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

185

190

195

CAG

ACC

TAC

ATC

TGC

AAC

GTG

AAT

CAC

AAG

CCC

AGC

AAC

ACC

AAG

GTG

722

Gin

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

200

205

210

215

GAC AAG AGA GTT GGTGAGAGGC CAGCACAGGG AGGGAGGGTG TCTGCTGGAA 77 4

Asp Lys Arg Val

GCCAGGCTCA	GCGCTCCTGC	CTGGACGCAT	CCCGGCTATG	CAGTCCCAGT	CCAGGGCAGC	834
AAGGCAGGCC	CCGTCTGCCT	CTTCACCCGG	AGGCCTCTGC	CCGCCCCACT	CATGCTCAGG	894
GAGAGGGTCT	TCTGGCTTTT	TCCCCAGGCT	CTGGGCAGGC	ACAGGCTAGG	TGCCCCTAAC	954
CCAGGCCCTG	CACACAAAGG	GGCAGGTGCT	GGGCTCAGAC	CTGCCAAGAG	CCATATCCGG	1014
GAGGACCCTG	CCCCTGACCT	AAGCCCACCC	CAAAGGCCAA	ACTCTCCACT	CCCTCAGCTC	1074
GGACACCTTC	TCTCCTCCCA	GATTCCAGTA	ACTCCCAATC	TTCTCTCTGC	A GAG CCC	1131

Glu Pro

220

AAA TCT TGT GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG TGC CCA GGTAAGCCAG

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

225 230

CCCAGGCCTC GCCCTCCAGC TCAAGGCGGG ACAGGTGCCC TAGAGTAGCC TGCATCCAGG

GACAGGCCCC AGCCGGGTGC TGACACGTCC ACCTCCATCT CTTCCTCA GCA CCT GAA

1180

1240

1297

Ala Pro Glu

235

CTC Leu

CTG Leu

GGG Gly 240

GGA CCG TCA GTC

TTC Phe 245

CTC TTC

CCC Pro

CCA AAA CCC AAG GAC

1345

Gly Pro

Ser Val

Leu

Phe

Pro

Lys 250

Pro

Lys

Asp

ACC

CTC

ATG

ATC

TCC

CGG

ACC

CCT

GAG

GTC

ACA

TGC

GTG

GTG

GTG

GAC

1393

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

255

260

265

GTG

AGC

CAC

GAA

GAC

CCT

GAG

GTC

AAG

TTC

AAC

TGG

TAC

GTG

GAC

GGC

1441

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

270

275

280

285

GTG

GAG

GTG

CAT

AAT

GCC

AAG

ACA

AAG

CCG

CGG

GAG

GAG

CAG

TAC

AAC

1489

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

290

295

300

c · • · · · · · · ·« · · ··· · · · ··· • · · · · · · 9 ···

-

243

-

9 • 991

• • • 9 ·

• 9 •

Φ 9 U 9 9

• « 9 9 9 9 9 • · ·

• · 9 9 • ·

AGC

ACG

TAC

CGT

GTG

GTC

AGC

GTC

CTC

ACC

GTC

CTG

CAC

CAG

GAC

TGG

1537

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

305

310

315

CTG

AAT

GGC

AAG

GAG

TAC

AAG

TGC

AAG

GTC

TCC

AAC

AAA

GCC

CTC

CCA

1585

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

320

325

330

GCC

CCC

ATC

GAG

AAA

ACC

ATC

TCC

AAA

GCC

AAA

GGTGGGACCC

GTGGGGTGCG

1638

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

335

340

AGGGCCACAT GGACAGAGGC CGGCTCGGCC CACCCTCTGC CCTGAGAGTG ACCGCTGTAC 1698

CAACCTCTGT CCCTACA GGG CAG CCC CGA GAA CCA CAG GTG TAC ACC CTG1748

Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu

345 350355

CCC Pro

CCA Pro

TCC Ser

CGG Arg

GAG GAG ATG

ACC AAG AAC CAG GTC AGC

CTG ACC

TGC Cys

1796

Glu 360

Glu

Met

Thr

Lys Asn 365

Gin

Val

Ser

Leu

Thr 370

CTG

GTC

AAA

GGC

TTC

TAT

CCC

AGC

GAC

ATC

GCC

GTG

GAG

TGG

GAG

AGC

1844

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

375

380

385

AAT

GGG

CAG

CCG

GAG

AAC

AAC

TAC

AAG

ACC

ACG

CCT

CCC

GTG

CTG

GAC

1892

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

Asp

390

395

400

TCC

GAC

GGC

TCC

TTC

TTC

CTC

TAT

AGC

AAG

CTC

ACC

GTG

GAC

AAG

AGC

1940

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

405

410

415

AGG

TGG

CAG

CAG

GGG

AAC

GTC

TTC

TCA

TGC

TCC

GTG

ATG

CAT

GAG

GCT

1988

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

420

425

430

435

CTG

CAC

AAC

CAC

TAC

ACG

CAG

AAG

AGC

CTC

TCC

CTG

TCC

CCG

GGT

AAA

2036

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

440 445 450

TGAGTGCGAC GGCCGGCAAG CCCCGCTCCC GAATT2071 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 117:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 470 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineami (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 117:

Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly -15 -10 -5

Met

-244-

Val His

Ser Gin Val 1

Gin Leu

Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys

Lys

5

10

Pro

Gly

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

15

20

25

Thr

Ser

Tyr

Trp

Met

Gin

Trp

Val

Lys

Gin

Ala

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

30

35

40

45

Glu

Trp

Met

Gly

Glu

Ile

Asp

Pro

Ser

Asp

Ser

Tyr

Thr

Asn

Tyr

Asn

50

55

60

Gin

Lys

Phe

Lys

Gly

Lys

Ala

Thr

Leu

Thr

Val

Asp

Thr

Ser

Thr

Ser

65

70

75

Thr

Ala

Tyr

Met

Glu

Leu

Ser

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

80

85

90

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Asn

Arg

Asp

Tyr

Ser

Asn

Asn

Trp

Tyr

Phe

Asp

95

100

105

Val

Trp

Gly

Glu

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

110

115

120

125

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

130

135

140

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

145

150

155

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

160

165

170

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

175

180

185

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

190

195

200

205

Val

Asn

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

Pro

210

215

220

Lys

Ser

Cys

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

225

230

235

Leu

Leu

Gly

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

240

245

250

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

255

260

265

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

270

275

280

285

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

290

295

300

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp

-245 305

Leu	Asn	Gly 320	Lys	Glu	Tyr	Lys	Cys 325
Ala	Pro 335	Ile	Glu	Lys	Thr	Ile 340	Ser
Pro 350	Gin	Val	Tyr	Thr	Leu 355	Pro	Pro
Gin	Val	Ser	Leu	Thr 370	Cys	Leu	Val
Ala	Val	Glu	Trp 385	Glu	Ser	Asn	Gly
Thr	Pro	Pro 400	Val	Leu	Asp	Ser	Asp 405
Leu	Thr 415	Val	Asp	Lys	Ser	Arg 420	Trp
Ser 430	Val	Met	His	Glu	Ala 435	Leu	His
Ser	Leu	Ser	Pro	Gly 450	Lys

310					315
Lys	Val	Ser	Asn	Lys 330	Ala	Leu	Pro
Lys	Ala	Lys	Gly 345	Gin	Pro	Arg	Glu
Ser	Arg	Glu 360	Glu	Met	Thr	Lys	Asn 365
Lys	Gly 375	Phe	Tyr	Pro	Ser	Asp 380	Ile
Gin 390	Pro	Glu	Asn	Asn	Tyr 395	Lys	Thr
Gly	Ser	Phe	Phe	Leu 410	Tyr	Ser	Lys
Gin	Gin	Gly	Asn 425	Val	Phe	Ser	Cys
Asn	His	Tyr 440	Thr	Gin	Lys	Ser	Leu 445

(2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 118:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 30 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne
(iv)	KÓDUJÍCÍ: ne

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 118:

CAGGCCCCTG GACAGGGCCT TGAGTGGATG (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 119:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární

-246 - (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 119:

CATCCACTCA AGGCCCTGTC CAGGGGCCTG (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 120:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 39 páru baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 120:

GCTGAGCTCC ATGTAGGCTG TGCTAGTGGA TGTGTCTAC (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 121:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 121:

TGCACGCGTG GCTGTGGAAT GTGTGTCAGT TAG 33 (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 122:

-247 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 122:

TCCGAAGCTT TTAGAGCAGA AGTAACACTT C (2)INFORMACE PRO SEQ ID NO: 123:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 36 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = synthetic DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 123:

AAAGCGGCCG CTGCTAGCTT GGCTGTGGAA. TGTGTG

Zastupuje:

-248 • · · ·

Claims (55)

1. PATENTOVÉ NÁROKY • · · · · · ··4 · • · · · · ·» • ···· 4··· • · ♦ · 4 4 4 4 4·

   1. Molekula, nesoucí vazebnou oblast pro antigen, specifickou pro epitop antigenu Fas, přičemž epitop je konzervován mezi primátem a živočichem, kterým není primát.
2. 2. Molekula podle nároku 1, kde primátem je člověk.
3. 3. Molekula podle nároku 1 nebo 2, kde živočichem, kterým není primát, je hlodavec.
4. 4. Molekula podle nároku 3, kde hlodavcem je myš.
5. 5. Molekula nesoucí vazebnou oblast pro antigen, specifickou pro konzervovaný savčí epitop antigenu Fas.
6. 6. Protilátka, vyznačující se tím, že je produkována hybridomem HFE7A uloženým pod depozitním číslem FERM BP-5828.
7. 7. Molekula nesoucí oblasti určující komplementaritu alespoň šesti protilátek, kde protilátka je specifická vůči lidskému Fas, přičemž oblasti určující komplementaritu mají identitu s oblastmi určujícími komplementaritu protilátky produkované hybridomem HFE7A uloženým pod depozitním číslem FERM BP-5828.

   -249-
8. 8. Molekula nesoucí vazebnou oblast pro antigen, přičemž vazebná oblast je specifická pro antigenní determinantu rozpoznávanou protilátkou, produkovanou hybridomem HFE7A, uloženým pod depozitním číslem FERM BP-5828.
9. 9. Molekula obsahující lehký polypeptidový řetězec a těžký polypeptidový řetězec, kde těžký řetězec má následující obecný vzorec (I):

   -FRHj-CDRHj-FRHs-CDRFk-FRHa-CDRHa-FRH^ (I) kde FRHi představuje jakoukoliv sekvenci aminokyselin tvořenou 18 až 30 aminokyselinami, CDRHi představuje sekvenci definovanou v SEQ ID No. 2 ve výpisu sekvencí, FRH₂ představuje jakoukoliv sekvenci aminokyselin tvořenou 14 aminokyselinami, CDRH₂ představuje sekvenci definovanou v SEQ ID No. 3 ve výpisu sekvencí, FRH₃ představuje jakoukoliv sekvenci aminokyselin tvořenou 32 aminokyselinami, CDRH₃ představuje sekvenci definovanou v SEQ ID No. 4 ve výpisu sekvencí, FRH₄ představuje jakoukoliv aminokyselinovou sekvenci tvořenou 11 aminokyselinami, přičemž aminokyseliny jsou vzájemně navázány za sebou prostřednictvím peptidické vazby, a lehký řetězec má následující obecný vzorec (II): -FRLJ-CDRLJ-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4- (II) kde FRLi představuje jakoukoliv sekvenci aminokyselin tvořenou 23 aminokyselinami, CDRLi představuje sekvenci definovanou v SEQ ID No. 5 ve výpisu sekvencí, FRL₂ představuje jakoukoliv sekvenci aminokyselin tvořenou 15 aminokyselinami, CDRL₂ představuje sekvenci definovanou v SEQ ID No. 6 ve výpisu sekvencí, FRL₃ představuje jakoukoliv sekvenci aminokyselin tvořenou 32 aminokyselinami, CDRL₃ • · • · představuje sekvenci definovanou v SEQ ID No. 7 ve výpisu sekvencí, FRL₄ představuje jakoukoliv aminokyselinovou sekvenci tvořenou 10 aminokyselinami, přičemž aminokyseliny jsou vzájemně navázány za sebou prostřednictvím peptidické vazby.
10. 10. Molekula podle některého z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že má vlastnost zvolenou z následující skupiny:

    indukuje apoptózu u T buněk exprimujících Fas;

    odstraňuje autoimunní příznaky u myší MRL gld/gld;

    neindukuje poruchy jater;

    má terapeutický nebo preventivní účinek na fulminantní hepatitdu;

    má preventivní účinek na nástup kolagenem indukované artritidy;

    indukuje apoptózu u synoviálních buněk pacienta s revmatoidní artritidou.
11. 11. Molekula podle nároku 10, která má všechny z uvedených vlastností.
12. 12. Molekula podle některého z nároků 1 až 11, která je humanizovaná.
13. 13. Molekula podle některého z nároků 1 až 12, kterou je protilátka.

    - 251 -
14. 14. Protilátka podle nároku 13, která je typu imunoglobulinů G.
15. 15. Molekula podle některého z nároků 1 až 14, která je schopna indukovat apoptózu u abnormálních buněk exprimujících Fas a která je schopna inhibovat apoptózu u buněk normálních.
16. 16. Použití molekuly podle některého z nároků 1 až 15 pro vyhodnocování způsobů léčení stavů člověka ovlivněných interakcí Fas/ligand Fas, přičemž vyhodnocování probíhá na zvířatech, která jsou modely pro tyto stavy.
17. 17. Humanizovaná molekula, která má vazebnou oblast pro antigen specifickou pro epitop antigenu Fas, která je konzervována mezi primátem a živočichem, kterým není primát, přičemž tato molekula je získatelná přenesením příslušných oblastí určujících komplementaritu z protilátky specifické pro epitop antigenu Fas do každého z alespoň jednoho lidského lehkého řetězce nebo jeho části nebo do alespoň jednoho lidského těžkého řetězce nebo jeho části.
18. 18. Molekula podle nároku 17, kde lidský lehký a těžký řetězec jsou zvoleny na základě nejbližší podobnosti mezi variabilními oblastmi obsaženými v uvedených řetězcích a variabilními oblastmi protilátky.
19. 19. Molekula podle nároku 17 nebo 18, u které se do těžkého a lehkého řetězce přenesou také významné aminokyseliny z rámcových oblastí protilátky, ze které jsou oblasti určující « * • ·

    -252komplementaritu získatelné, aby zůstala zachována struktura v místě rozpoznávajícím epitop.
20. 20. Molekula podle některého z předcházejících nároků, která se váže na peptid obsahující aminokyselinovou sekvenci ze SEQ ID No. 1 z výpisu sekvencí.

    Molekula podle některého z nároků 1 až 20, která obsahuje protein polypeptidu lehkého řetězce, který má sekvenci aminokyselin 1 až 218 ze SEQ ID No. 50, sekvenci aminokyselin 1 až 218 ze SEQ ID No. 52, sekvenci aminokyselin 1 až 218 ze SEQ ID No. 54, sekvenci aminokyselin 1 až 218 ze SEQ ID No. 107 nebo sekvenci

    aminokyselin 1 až 218 ze SEQ ID No. 109 výpisu sekvencí.
21. 22. Molekula podle některého z nároků 1 až 21, která obsahuje protein polypeptidu těžkého řetězce, který má sekvenci aminokyselin 1 až 451 ze SEQ ID No. 89 nebo sekvenci aminokyselin 1 až 451 ze SEQ ID No. 117 výpisu sekvencí.
22. 23. Molekula podle některého z nároků 1 až 22, obsahující protein polypeptidu lehkého řetězce, který má sekvenci aminokyselin 1 až 218 ze SEQ ID No. 50 ve výpisu sekvencí a protein polypeptidu těžkého řetězce, který má sekvenci aminokyselin 1 až 451 ze SEQ ID No. 89 ve výpisu sekvencí.
23. 24. Molekula podle některého z nároků 1 až 23, která obsahuje protein polypeptidu lehkého řetězce, který má sekvenci aminokyselin 1 až 218 ze SEQ ID No. 107 ve výpisu sekvencí

    - 253 - a protein polypeptidu těžkého řetězce, který má sekvenci aminokyselin 1 až 451 ze SEQ ID No. 117 ve výpisu sekvencí.
24. 25. Molekula DNA kódující jakoukoliv jednotlivou část polypeptidu molekuly podle některého z nároků 1 až 24.
25. 26. Molekula DNA obsahující sekvenci nukleotidů 100 až 753 ze SEQ ID No. 49, nukleotidovou sekvenci 100 až 753 ze SEQ ID No. 51, nukleotidovou sekvenci 100 až 753 ze SEQ ID No. 53, nukleotidovou sekvenci 100 až 753 ze SEQ ID No. 106 nebo nukleotidovou sekvenci 100 až 753 ze SEQ ID No. 108.
26. 27. Molekula DNA obsahující sekvenci nukleotidů 84 až 2042 ze SEQ ID No. 88 nebo nukleotidovou sekvenci 84 až 2042 ze SEQ ID No. 116 ve výpisu sekvencí.
27. 28. Rekombinantní vektor DNA obsahující DNA podle některého z nároků 25 až 27.
28. 29. Hostitelská buňka transformovaná rekombinantním vektorem DNA podle nároku 28.
29. 30. Hostitelská buňka transformovaná alespoň jedním rekombinantním vektorem DNA podle nároku 28, obsahujícím DNA kódující protein polypeptidu lehkého řetězce a DNA kódující polypeptid těžkého řetězce.

    • · • · · · ··· · · · · • · · ···· · · · · • · · · · ······ · • · ·· · ···

    - 254 - ................
30. 31. Hostitelská buňka podle některého z nároků 29 nebo 30, kterou je savčí buňka.
31. 32. E. coli pHSGMM6 SANK73697 (FERM BP-6071).
32. 33. E. coli pHSGHM17 SANK73597 (FERM BP-6072).
33. 34. E. coli pHSGHH7 SANK73497 (FERM BP-6073).
34. 35. E. coli pHSHM2 SANK70198 (FERM BP-6272).
35. 36. E. coli pHSHH5 SANK70398 (FERM BP-6274).
36. 37. E. coli SANK73397 (FERM BP-6074).
37. 38. E. coli pgHPDHV3 SANK70298 (FERM BP-6273).
38. 39. Způsob výroby protilátky anti-Fas, vyznačující se tím, že se kultivují hostitelské buňky podle některého z nároků 29 až 31 a potom se z kultury izolují protilátky anti-Fas.
39. 40. Prostředek pro léčení nebo prevenci stavů připisovatelných abnormalitám systému Fas/ligand Fas, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku molekulu podle některého z nároků 1 až 24.

    • ·
40. 41. Prostředek pro léčení nebo prevenci stavů připisovatelných abnormalitám systému Fas/ligand Fas, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku molekulu podle některého z nároků 1 až 24, kde stav je zvolen ze skupiny autoimunních onemocnění, alergie, atopie, arterioskleróza, myokarditida, kardiomyopatie, glomerulonefritida, hypoplastická anémie, hepatitida, získaný syndrom imunologické nedostatečnosti a odmítání po transplantaci orgánů.
41. 42. Prostředek pro léčení nebo prevenci stavů připisovatelných abnormalitám systému Fas/ligand Fas, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku molekulu podle některého z nároků 1 až 24, kde stavem je autoimunní onemocnění zvolené ze skupiny systémová lupus erythematosus, Hashimotova choroba, revmatoidní artritida, onemocnění způsobené reakcí hostitele na Štěp, Sjógrenův syndrom, perniciózní anémie, Addisonova choroba, skleroderma, Goodpastureův syndrom, Crohnova choroba, autoimunní hemolytická anémie, sterilita, myasthenia gravis, roztroušená skleróza, Basedowova choroba, trombopenia purpura a na inzulínu závislá cukrovka.
42. 43. Prostředek pro léčení nebo prevenci stavů připisovatelných abnormalitám systému Fas/ligand Fas, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku molekulu podle některého z nároků 1 až 24, kde stavem je alergie.
43. 44. Prostředek pro léčení nebo prevenci stavů připisovatelných abnormalitám systému Fas/ligand Fas, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku molekulu podle

    -256 - ·· · ·· · ·· · · ♦ · · ··· · · · «··· • · · · ··· ···· • · · · · · · ···· · • · · · · ··· • · · · · · ··-··· ·· · · některého z nároků 1 až 24, kde stavem je revmatoidní artritida.
44. 45. Prostředek pro léčení nebo prevenci stavů připisovatelných abnormalitám systému Fas/ligand Fas, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku molekulu podle některého z nároků 1 až 24, kde stavem je arterioskleróza.
45. 46. Prostředek pro léčení nebo prevenci stavů připisovatelných abnormalitám systému Fas/ligand Fas, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku molekulu podle některého z nároků 1 až 24, kde stav je zvolen ze skupiny myokarditidy a kardiomyopatie.
46. 47. Prostředek pro léčení nebo prevenci stavů připisovatelných abnormalitám systému Fas/ligand Fas, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku molekulu podle některého z nároků 1 až 24, kde stavem je glomerulonefritida.
47. 48. Prostředek pro léčení nebo prevenci stavů připisovatelných abnormalitám systému Fas/ligand Fas, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku molekulu podle některého z nároků 1 až 24, kde stavem je hypoplastická anémie.
48. 49. Prostředek pro léčení nebo prevenci stavů připisovatelných abnormalitám systému Fas/ligand Fas, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku molekulu podle některého z nároků 1 až 24, kde stavem je hepatitida.

    -257 -
49. 50. Prostředek pro léčení nebo prevenci stavů připisovatelných abnormalitám systému Fas/ligand Fas, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku molekulu podle některého z nároků 1 až 24, kde stav je zvolen ze skupiny fulminantní hepatitida, chronická hepatitida, virová hepatitida, hepatitida C, hepatitida B, hepatitida D a alkoholická hepatitida.
50. 51. Prostředek pro léčení nebo prevenci stavů připisovatelných abnormalitám systému Fas/ligand Fas, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku molekulu podle některého z nároků 1 až 24, kde stavem je odmítání po transplantaci orgánů.
51. 52. Prostředek pro léčení nebo prevenci stavů připisovatelných abnormalitám systému Fas/ligand Fas, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku molekulu podle některého z nároků 1 až 24, kde stavem je získaný syndrom imunologické nedostatečnosti.
52. 53. Použití molekuly podle některého z nároků 1 až 24 při výrobě farmaceutického prostředku pro léčení nebo prevenci stavu definovaného v některém z nároků 40 až 52.
53. 54. Hybridom HFE7A uložený pod depozitním číslem FERM BP5828.

    • · • · ···« · · ·· • · · * · · · • · · · · « ··· • · · · · · · · · * • · · · · · • 4 ··· · · ··

    -258 -
54. 55. Způsob výroby protilátky s vazebnou oblastí pro antigen specifickou pro epitop antigenu Fas, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci hybridomu HFE7A uloženého pod depozitním číslem FERM BP-5828 a získání 5 exprimované protilátky.
55. 56. Způsob výroby protilátky, vyznačující se tím, ž e zahrnuje kultivaci hybridomu HFE7A uloženého pod depozitním číslem FERM BP-5828 a oddělení exprimované io protilátky.

    Zastupuje:

    'pí/etfi-IS ν· · ·· ···· ·· ·· ···· · · · ·»·· • · · ···· · ··· • · · · · «···«· • · ·· · ··· ·*· ··· ·· ·<· »· ··

    Extracelulámí doména lidského Fas

    Fragment HFAS DNA

    Plazmid pME18S-mFas-AIC

    Extracelulární doména Extracelulární doména IL3R