JP2020526191A - アミロイド沈着疾患を治療するためのキメラ抗体 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
本願は、EFS−Webを介して電子的に提出された配列表を含み、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。「8441−0004−1_ST25」と題するこの配列表のASCIIファイルは、2018年6月4日に作成され、その大きさは15.6kbである。
本出願は、2017年6月29日に出願された米国特許仮出願第62/526,835号の優先権を主張するものであり、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、サイエンス・アプリケーションズ・インターナショナル−フレデリックによって授与されたContact 20XS094Aの下、米国連邦政府の支援を受けてなされた。したがって、米国連邦政府は、本明細書および特許請求の範囲に開示される本発明において、一定の権利を有する。
ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、ウシ胎児血清(FBS)、リボ核酸(RNA)、メッセンジャーRNA(mRNA)、デオキシリボ核酸(DNA)、コピーDNA(cDNA)、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、分(min)、秒(sec)、トリス−ホウ酸緩衝液(TBE)。
マウス11−1F4モノクローナル抗体重鎖および軽鎖可変領域遺伝子をPCRクローニングし、単離された全ての可変領域遺伝子(疑および機能性)の詳細な配列分析を実施した。マウス11−1F4重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の詳細なDNAおよびアミノ酸配列を得た。
培地成分および他の全ての組織培養材料は、ライフテクノロジーズ社(英国)から入手した。RNA溶液キットはストラタジーン社(米国)から入手し、第1鎖cDNA合成キットはファルマシア社(英国)から購入した。AmpliTaq(登録商標)DNAポリメラーゼを含むRCR反応のための全ての構成成分および機器は、パーキンエルマー社(米国)から購入した。TOPO TA Cloning(登録商標)キットは、インビトロジェン社(米国)から入手した。アガロース(UltraPure(商標))は、ライフテクノロジーズ社(英国)から入手した。ABI PRISM(登録商標)Big Dye(商標)ターミネーターサイクルシーケンシング準備反応キットのプレミックスサイクルシーケンシングキットおよびABI PRISM(登録商標)310シーケンシングマシンは、共にPEアプライド・バイオシステムズ社(米国)から購入した。他の全ての分子生物学的製品は、ニュー・イングランド・バイオラボ社(米国)およびプロメガ社(米国)から入手した。
マウスモノクローナル抗体11−1F4を産生するハイブリドーマ細胞株からマウスVHおよびVK遺伝子をPCRクローニングするために使用される戦略を図1に概説する。
キメラマウス−ヒト抗体の一部として哺乳動物細胞で上記の11−1F4のVHおよびVK可変領域遺伝子の一過的発現を可能にするためには、特異的に設計されたPCRプライマーを使用して5’末端および3’末端を改変することが必要であった(表5)。オリゴヌクレオチドプライマーF39836およびF39837を使用して11−1F4のVK遺伝子をPCR改変し、プライマーF39835およびF58933を使用して11−1F4のVH遺伝子をPCR改変した。逆方向(BAK)プライマーF39836およびF39835は、VKおよびVH遺伝子のそれぞれの5’末端に、HindIII制限部位、コザック翻訳開始部位および免疫グロブリンリーダー配列を導入した。順方向(FOR)オリゴヌクレオチドプライマーF39837は、VK遺伝子の3’末端に、スプライスドナー部位およびBamHI制限部位を導入した。順方向(FOR)オリゴヌクレオチドプライマーF58933は、VH遺伝子の3’末端に、ApaI制限部位を含むγ−1CH1遺伝子の最初の22塩基対を付加した。
キメラ11−1F4抗体の両方の免疫グロブリン鎖を発現する単一スーパーベクターを次の通り構築した。11−1F4κ軽鎖発現カセット(HCMViプロモーター、11−1F4κ軽鎖可変領域遺伝子およびκ軽鎖定常領域遺伝子を含んでいた)を、11−1F4VK.pKN100構築物(図4)から制限酵素消化(1位および2490位のEcoRI)し、次いで、ユニークなEcoRI(4297位、図5)を介して11−1F4VHpG1D200構築物にライゲートした。このライゲーションによって、11−1F4キメラ抗体の重鎖とκ軽鎖の両方を含むスーパーベクター構築物pG1KD200−11−1F4が構築された。
キメラ11−1F4抗体を、次の2つの方法で欧州細胞培養コレクション(ECACC)のCOS細胞で一過的に発現させた:
(i)それぞれ10μgのベクター構築物11−1F4VK.pKN100および11−1F4VH.pG1D200のコトランスフェクションによる。コトランスフェクションは2連で行った。
(ii)13μgの単一スーパーベクター構築物pG1KD200−11−1F4のトランスフェクションによる。スーパーベクターのトランスフェクションは5回行った。
発現後に、COS細胞上清中に存在するIgG分子全体を、捕捉ELISAアッセイを使用して定量化した。IgG分子を、固定化ヤギ抗ヒトIgG、Fcγ断片特異的抗体を介してNunc−Immuno MaxiSorb(商標)プレート上に捕捉し、抗ヒトκ軽鎖ペルオキシダーゼコンジュゲート抗体を介して検出した。以下と同じ方法で、同じプレート上の既知の濃度の標準IgG抗体を捕捉および検出して、標準曲線を作成した。96ウェル(穴)イムノプレートの各ウェルを、PBSで希釈した0.4μg/mlヤギ抗ヒトIgG抗体の100μlのアリコートでコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。過剰なコーティング溶液を除去し、プレートを200μl/ウェルの洗浄緩衝液(1xPBS、0.1%TWEEN)で3回洗浄した。第2列のB行〜G行のウェルを除く全てのウェルに、100μlのSEC緩衝液を分注した。ヒトIgG1/κ抗体のSEC緩衝液中1μg/ml溶液を標準として調製し、200μl/ウェルを第2列のB行およびC行のウェルにピペットで入れた。トランスフェクトしたcos細胞の培地を遠心分離し(250g、5分)、上清を保存した。(COS細胞をDNAの非存在下でトランスフェクトした)「DNAなし」対照からの上清200μlのアリコートを、第2列のD行のウェルにピペットで入れ、実験上清の200μl/ウェルのアリコートを第2列、E行、F行およびG行のウェルにピペットで入れた。第2列のB行〜G行のウェルの200μlのアリコートを混合し、次いで、100μlを各ウェルから第3列の隣接ウェルに移した。このプロセスを、標準試料、対照試料および実験試料の一連の2倍希釈液で第11列まで続け、次いで、全てを37℃で1時間インキュベートし、全てのウェルを洗浄緩衝液の200μlのアリコートで6回すすいだ。ヤギ抗ヒトκ軽鎖ペルオキシダーゼコンジュゲートをSEC緩衝液で5000倍希釈し、100μlの希釈コンジュゲートを各ウェルに添加し、インキュベーションとすすぎステップを繰り返した。各ウェルに150μlのK−BLUE基質を添加し、暗所中25℃で10分間インキュベートした。50μlのRED STOP溶液を各ウェルに添加して反応を停止し、655nmで光学濃度を読み取った。
キメラ11−1F4抗体を、直接結合ELISAアッセイを使用して、アミロイド原線維への結合について試験した。合成原線維を免疫グロブリン軽鎖タンパク質から形成し、「低結合」ポリスチレンプレート(Costar、番号3474)を使用した固相ELISAベースアッセイで抗体の反応性を監視するために使用した。プレートをコーティングする直前に、250μgの原線維の塊をコーティング緩衝液(pH7.5のリン酸緩衝生理食塩水中0.1%ウシ血清アルブミン)で1mlに希釈した。次いで、最大値の40%に設定した出力でTekmar Sonic Disruptor超音波プローブを使用して、試料を20秒間超音波処理して、それぞれ最大2〜5個のプロトフィラメントで構成される短い原線維の溶液を得た。次いで、この溶液を5mlに希釈し、ボルテックスで十分に混合し、プレートのウェルに等分した。このプロセスにより、各ウェルで50μg/mlの濃度の原線維溶液50μlが得られた。次いで、プレートを37℃のインキュベーターに蓋をせずに入れて、一晩乾燥させた。
改変に成功したVHおよびVK遺伝子の配列分析によって、正しい配列が存在することが明らかになった。改変された11−1F4のVKおよびVH遺伝子の詳細なDNAおよびアミノ酸配列を図3および図4に示す。改変されたVKおよびVH遺伝子の、哺乳動物発現ベクターpG1D200およびpKN100へのクローニングにそれぞれ成功し、得られた11−1F4VK.pKN100および11−1F4VHpG1D200構築物を、哺乳動物細胞のコトランスフェクションに使用した。
Claims (22)
- 配列番号47のVK領域および配列番号48のVH領域を含む、キメラマウス−ヒト抗体。
- 配列番号36のVK領域および配列番号35のVH領域を含むマウス抗体よりも高い親和性でアミロイド原線維のβプリーツシート構造によって発現されるエピトープに結合する、請求項1に記載のキメラマウス−ヒト抗体。
- 請求項1に記載の抗体と、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
- アミロイド沈着疾患の治療を必要とするヒト患者の前記アミロイド沈着疾患を治療する方法であって、前記アミロイド沈着疾患を治療するのに有効な量の請求項1に記載の抗体と薬学的に許容される担体とを、前記患者に投与するステップを含む、方法。
- 前記アミロイド沈着疾患が原発性アミロイドーシスである、請求項4に記載の方法。
- ベクター構築物11−1F4VK.pKN100および11−F4VH.pG1D200の哺乳動物細胞へのコトランスフェクション、またはスーパーベクター構築物pG1KD200−11−1F4の哺乳動物細胞へのトランスフェクションを含む、キメラ抗体を産生する方法。
- 前記ベクター構築物11−1F4VK.pKN100および11−F4VH.pG1D200のコトランスフェクションまたはスーパーベクター構築物pG1KD200−11−1F4のトランスフェクションが、COS細胞で起こる、請求項6に記載の方法。
- 前記ベクター構築物11−1F4VK.pKN100および11−F4VH.pG1D200のコトランスフェクションを含む、請求項6に記載の方法。
- 前記スーパーベクター構築物pG1KD200−11−1F4のトランスフェクションを含む、請求項6に記載の方法。
- 前記ベクター構築物11−1F4VK.pKN100および11−F4VH.pG1D200のコトランスフェクションを含む、請求項7に記載の方法。
- 前記スーパーベクター構築物pG1KD200−11−1F4のトランスフェクションを含む、請求項7に記載の方法。
- 11−1F4VK.pKN100、11−1F4VHpG1D200およびpG1KD200−11−1F4からなる群から選択される、ベクター構築物。
- 11−1F4VK.pKN100である、請求項12に記載のベクター構築物。
- 11−1F4VHpG1D200である、請求項12に記載のベクター構築物。
- pG1KD200−11−1F4である、請求項12に記載のベクター構築物。
- アミロイド沈着物を有する疑いがある患者の前記アミロイド沈着物の存在を検出する方法であって、検出可能な標識が付着した請求項1に記載の抗体を前記患者に投与するステップを含み、投与される前記抗体の量は、前記アミロイド沈着物が存在する場合に前記アミロイド沈着物の検出に十分である、方法。
- 検出可能な標識が124Iである、
請求項16に記載の方法。 - 請求項6に記載の方法によって産生された、キメラマウス−ヒト抗体。
- 請求項8に記載の方法によって産生された、キメラマウス−ヒト抗体。
- 請求項9に記載の方法によって産生された、キメラマウス−ヒト抗体。
- 配列番号47および配列番号48から選択される、ポリペプチド。
- 配列番号42および配列番号45から選択される、ポリヌクレオチド。
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