CN101146822A

CN101146822A - EphB受体结合肽

Info

Publication number: CN101146822A
Application number: CNA200680009759XA
Authority: CN
Inventors: 埃琳娜·B·帕斯夸里; 米切尔·库尔普
Original assignee: Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute
Current assignee: Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute
Priority date: 2005-01-27
Filing date: 2006-01-26
Publication date: 2008-03-19
Also published as: US20060177452A1; US20100183510A1; CA2595892A1; EP1841790B1; JP2008528614A; ATE486890T1; AU2006208068B2; WO2006081418A2; DE602006017964D1; US7999069B2; WO2006081418A3; HK1108702A1; EP1841790A2; AU2006208068A1; US7582438B2; KR20070118230A

Abstract

本申请涉及选择性结合B类Eph受体的肽的识别。还公开了这些肽在治疗多种疾病中的应用。另外，还描述了通过给患者施用标记的肽，然后获得标记的肽的图像，从而使患者中的肿瘤成像。

Description

EphB受体结合肽

相关申请

根据35U.S.C.§119，本申请要求2005年1月27日提交的美国临时专利申请号60/647,852的优先权，该临时专利申请的全部内容被纳入本文作为参考。

政府利益

本发明是在政府的资助下进行的，国立卫生研究院(National Institutes ofHealth)资助号为CA82713和HD25938，国防部资助号为DAMD17-01-1-0168。美国政府在本发明中享有一定的权利。

技术领域

本申请涉及选择性结合包括EphB1、EphB2和EphB4在内的B类Eph受体的拮抗肽。也包括识别这种肽的方法。

背景技术

Eph受体是受体酪氨酸激酶的一个大家族，它们通过与被称为Ephrin(Ephrin)的一类配体结合而调节发育的以及成年的组织中的许多生物过程(Murai，K.K.和Pasquale，E.B.2003J Cell Sci116：2823-2832)。Eph受体在多种健康组织中差异性表达(Hafher，C.等人.2004ClinicalChem50：490-499)，并且涉及到正常功能的许多方面，如疼痛处理(Battaglia，A.A.等人.2003NatNeurosci6：339-340)、血小板凝集、神经元发育、细胞迁移和粘附(Prevost，N.等人.2005PNAS USA 102：9820-9825)。Eph受体也与多种病理过程有关，包括肿瘤进展(Dodelet，V.C.和Pasquale，E.B.2000 Oncogene19：5614-5619；Nakamoto，M.和Bergemann，A.D.2002 Microsc Res Tech59：58-67；Walker-Daniels，J.等人.2003 Am J Pathol 162：1037-1042；Hu，N.等人.2005Cancer Res65：2542-2546；Hafner，C.等人.2004 Clin Chem 50：490-499)、血管生成的病理形式(Adams，R.H.和Klein，R.2000 Trends Cardiov Medicine10：183-188；Brantley-Sieders，D.M.和Chen，J.2004 Angiogenesis 7：17-28；Noren，N.K.等人.2004 PNAS USA 101：5583-5588)、组织损伤后的慢性疼痛(Battaglia，A.A.等人.2003Nat Neurosci 6：339-340)、脊髓损伤后神经再生的抑制(Goldshmit，Y.等人.2004 J Neurosci 24：10064-10073)和人类先天性畸形(Twigg，S.R.等人.2004 PNAS USA 101：8652-8657；Wieland，I.等人.2004 Am JHum Genet 74：1209-1215)。此外，据报道这些受体在干细胞自我更新与细胞命运确定和分化之间的平衡中起作用(Conover，J.C.等人.2000Nat Neurosci3：1091-1097；Aoki，M.等人.2004J Biol Chem 279：32643-32650；Moore，K.B.等人.2004 Dev Cell6：55-67)。

Ephrin配体可以区分EphA类和EphB类受体。Ephrin-A配体与EphA受体结合，一个例外是Ephrin-A5，它在高浓度下可以与EphB2结合(Himanen，J.P.等人.2004Nat Neurosci 7：501-509)。Ephrin-B配体与EphB受体以及EphA4结合(Gale，N.W.等人，1996 Neuron 17：9-19；Kullander，K.和Klein，R.2002 Nat Rev Mol Cell Biol 3：475-486)。但是，Eph受体与属于相同类别的Ephrin之间的相互作用是高度不加区分的(Murai，K.K.和Pasquale，E.B.2003J Cell Sci 116：2823-2832；Kullander，K.和Klein，R.2002Nat Rev MolCell Biol3：475-486；Flanagan，J.G.和Vanderhaeghen，P.1998AnnuRevNeurosci21：309-345)。然而，通过噬菌体展示识别的几种12个氨基酸长的肽与一种或几种A类Eph受体选择性结合(Koolpe，M.等人.2002JBiolChem277：46974-46979；Murai，K.K.等人.2003Mol Cell Neurosci24：1000-1011)。这些肽与Ephrin的15个氨基酸长的G-H环具有一定的序列相似性，该G-H环是介导Ephrin与Eph受体高亲和力结合的主要区域(Himanen，J.P等人.2001Nature414：933-938)。特别是，几种EphA受体结合肽含有基序xx(其中“x”是非保守氨基酸，是芳族氨基酸(Aasland，R.等人，2002FEBSLett513：141-144))，在A类Ephrin的G-H环中也发现该基序。这些肽具有额外的独特的序列特征，据推测这些序列特征使它们具有对具体的EphA受体的选择性结合。微摩尔浓度的可与EphA2和EphA4结合的肽抑制Ephrin与这些受体的结合(Koolpe，M.等人.2002 J Biol Chem 277：46974-46979；Murai，K.K.等人.2003 Mol Cell Neurosci 24：1000-1011)。另外，EphA4结合肽是抑制受体被Ephrin活化的拮抗剂(Murai，K.K.等人.2003 Mol Cell Neurosci24：1000-1011)，而EphA2结合肽作为Ephrin模拟物，促进EphA2活化和下游信号传导(Koolpe，M.等人.2002 J Biol Chem 277：46914-46919)。拮抗性肽可能是通过阻止依赖于Ephrin的Eph受体聚簇和转磷酸作用而发挥功能，这些是激活下游信号通路的必要步骤(Murai，K.K.和Pasquale，E.B.2003 JCell Sci 116：2823-2832)。实际上，锚定在细胞表面的Ephrin促进Eph受体形成二聚体以及较大聚簇，二聚体和较大聚簇中的受体变活化(Himanen，J.P等人.2001 Nature 414：933-938)，但是Ephrin的可溶性单体形式作为拮抗剂起作用(Davis，S.等人.1994 Science 266：816-819)。现在还不清楚EphA2结合肽如何活化EphA2。

发明概述

本发明的一个实施方案是一种选择性结合EphB受体家族成员并且抑制Ephrin-B与EphB受体家族成员结合的肽。

本发明的另一实施方案是一种分离的肽，其模拟Ephrin的G-H环并且选择性结合EphB受体家族成员，抑制Ephrin-B与EphB受体家族成员的结合。

本发明的另一实施方案是一种分离的肽，其选自SEQ ID NO：1-39的肽。在本发明的一个实施方案中，该分离的肽具有SEQ ID NO：1的序列。在本发明的另一实施方案中，该分离的肽具有SEQ ID NO：2的序列。在本发明的另一实施方案中，该分离的肽具有SEQ ID NO：3的序列。在本发明的另一实施方案中，该分离的肽具有SEQ ID NO：4的序列。在本发明的另一实施方案中，该分离的肽具有SEQ ID NO：5的序列。在本发明的另一实施方案中，该分离的肽具有SEQ IDNO：39的序列。

本发明的另一实施方案是与药学上可接受的载体组合的肽，该肽选择性结合EphB受体家族成员并且抑制Ephrin-B与EphB受体家族成员的结合。

本发明的另一实施方案是一种治疗患者中与EphB受体相关的疾病的方法，包括：确定需要这种治疗的患者，给该患者施用与药学上可接受的载体相组合的治疗有效量的分离的肽，该肽选择性结合EphB受体家族成员并且抑制Ephrin-B与EphB受体家族成员的结合。这种与EphB受体相关的疾病可以是肿瘤性疾病、神经疾病或血管疾病。在另一实施方案中，该肽与化疗药或毒素连接。

本发明的另一实施方案是一种使患者中的肿瘤成像的方法，包括：确定怀疑患有表达Eph B受体的肿瘤的患者；给所述患者施用选择性结合EphB受体家族成员并且抑制Ephrin-B与EphB受体家族成员结合的分离的肽，该肽与显像剂连接；获得患者中所述显像剂的图像。在一个实施方案中，该显像剂是荧光性的。在另一实施方案中，该显像剂是放射性的。

附图说明

图1A-D是显示与EphB受体结合的噬菌体克隆的富集的条图。(A)使用EphB1免疫筛选(panning)的富集。(B)使用EphB2免疫筛选的富集。(C和D)使用EphB4免疫筛选的富集；

图2A-H显示肽之间结合EphB受体的竞争。(A)EWLS肽以浓度依赖性的方式抑制EWLS噬菌体与固定化的EphB1胞外域的结合。(B)SNEW肽以浓度依赖性的方式抑制SNEW噬菌体与固定化的EphB2胞外域的结合。(C)TNYL肽以浓度依赖性的方式抑制TNYL噬菌体与固定化的EphB4胞外域的结合。(D)EWLS肽抑制EphB1与通过对EphB1免疫筛选而分离的噬菌体克隆的结合。(E)和(G)SNEW肽抑制EphB2与通过对EphB2免疫筛选而分离的大多数噬菌体克隆的结合。(F)TNYL肽抑制EphB4与通过对EphB4免疫筛选而分离的噬菌体克隆的结合。(H)DALN肽以浓度依赖性的方式抑制DALN噬菌体与固定化的EphB4胞外域的结合。误差条表示重复测定值的标准差，是考虑误差传播而计算的；

图3A-G显示选择性拮抗Ephrin-B2与EphB受体结合的肽。(A、C、E和G)通过测定碱性磷酸酶活性检测Ephrin-B2AP与所示固定化EphB受体胞外域的结合。(B、D和F)不同的EphB胞外域与Ephrin-B2AP和所示肽一起温育。误差条表示重复测定值的标准差，是考虑误差传播而计算的；

图4A和4B显示SNEW肽拮抗COS细胞中由Ephrin诱导的内源EphB2活化。(A)SNEW肽以浓度依赖性的方式拮抗Ephrin-B1Fc诱导的EphB2的酪氨酸磷酸化(活化)。(B)SNEW肽拮抗Ephrin-B1Fc诱导的COS细胞的收缩。在使用及不使用Ephrin-B1Fc(B1)、存在或不存在400μM SNEW肽的条件下，具有刺突的细胞百分比的定量。(C)细胞形态的代表性实例；

图5A-H显示作为EphB受体靶向剂的肽。(A、C、D和E)EWLS(A)、SNEW(C)、TNYL(D)和DHNH(E)肽的Eph受体结合选择性。(B、F、G和H)固定在链霉抗生物素珠上的EWLS、SNEW和TNYL肽与来自组织和细胞系的EphB受体稳定地结合；

图6A-D显示TNYL-RAW肽是比TNYL更强的EphB4拮抗剂，同时保持选择性。(A)TNYL-RAW肽抑制Ephrin-B2AP与固定的EphB4胞外域的结合。误差条表示来自TNYL-RAW的三次重复测定和TNYL的两次重复测定的标准差，是考虑误差传播而计算的。(B)Ephrin-B2Fc抑制Ephrin-B2AP与固定的EphB4胞外域的结合。(C)TNYL-RAW肽抑制Ephrin-B2AP与固定的EphB4胞外域的结合，但不抑制其与其它EphB胞外域的结合。误差条表示三次重复测定值的标准差，是考虑误差传播而计算的。(D)TNYL-RAW肽以浓度依赖性的方式拮抗Ephrin-B2诱导的EphB4的酪氨酸磷酸化。

优选实施方案详述

Eph受体酪氨酸激酶在许多病理组织中过量表达，因此是有前景的药物靶标候选物。但是，极少能够获得可与一种Eph受体选择性结合而不与这个大受体家族中的其它成员结合的分子。本发明的一个实施方案涉及与EphB类别的不同受体(包括EphB1、EphB2、Eph B3和EphB4)选择性结合的肽。发现具有相同EphB受体特异性的肽对结合彼此竞争，提示它们具有部分重叠的结合部位。另外，几种肽含有在Ephrin-B配体的G-H环中发现的氨基酸基序，该G-H环是介导与EphB受体高亲和力相互作用的区域。与靶向Ephrin结合部位一致，较高亲和力的肽拮抗Ephrin与EphB受体的结合。

EphB2和EphB4都在多种癌中过量表达，可与这些受体结合的肽因此可用于成像和药物靶向应用。如下文所述，某些肽，如TNYL，有效地向表达EphB4的细胞递送荧光量子点。EphB受体拮抗剂也具有许多可能的应用，特别是在癌症治疗中。例如，报道了在乳腺癌细胞中表达的EphB4与在肿瘤脉管中表达的Ephrin-B2之间的相互作用，其中跨膜Ephrin-B2配体的胞质域通过刺激血管生成而促进肿瘤生长(Noren，N.K.等人.2004PNASUSA101：5583-5588)。因此，可以开发TNYL-RAW肽来抑制肿瘤进展，以及抑制类似地可能依赖于EphB4和Ephrin-B2的其它形式的病理血管生成。也可以设想与参与特定病理过程的EphA和EphB类受体(如癌中的EphB4和EphA2)结合的肽的组合。最后，柔性连接体介导的二聚化可以大大提高EphB受体结合肽的亲和力。然而，二聚化的肽可能成为激动剂。

如下文所述，本发明的实施方案涉及Eph受体结合配体在治疗与Eph受体相关的疾病中的应用。这些疾病的例子包括肿瘤性疾病、神经疾病和血管疾病。在一些实施方案中，与Eph受体相关的疾病包括与Eph B1受体相关的疾病。与Eph B1相关的疾病包括与高于正常的Eph B1受体表达有关的疾病。因此，针对Eph B1受体的结合配体对这些与Eph B1受体相关的疾病具有治疗效果。与Eph B1受体相关的疾病的例子包括肿瘤性疾病、神经疾病和血管疾病。

定义

以下定义用来说明和限定用于描述本发明的各个术语的含意和范围。

本文使用的“激动剂”是指生物活性配体，它与其互补的生物活性受体结合，并且激活后者，引起受体的生物应答或增强受体原有的生物活性。

本文使用的“拮抗剂”是指与其互补的生物活性受体结合并且抑制该受体的生理应答的生物活性配体。

本文使用的“药学上可接受的盐”是指在制药工业中常用的无毒碱金属盐、碱土金属盐和铵盐，包括钠、钾、锂、钙、镁、钡、铵和精蛋白锌盐，它们用本领域公知的方法制备。该术语还包括无毒酸加成盐，通常是通过将本发明的化合物与适当的有机酸或无机酸反应而制备的。代表性的盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、乙酸盐、草酸盐、戊酸盐、油酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘磺酸盐等。

本文使用的“药学上可接受的酸加成盐”是指保留游离碱的生物学效果和性质并且在生物学或其它方面合乎要求的盐，它们是与诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，和诸如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、延胡索酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等有机酸形成的。关于作为前药的药学上可接受的酸加成盐的说明，参见Bundgaard，H.编.1985 Design of Prodrugs，Elsevier Science Publishers，Amsterdam。

本文使用的“药学上可接受的酯”是指在酯键水解后保留羧酸或醇的生物学效果和性质并且在生物学或其它方面合乎要求的酯。关于作为前药的药学上可接受的酯的说明，参见，Bundgaard，H.编.1985Design ofProdrugs，Elsevier Science Publishers，Amsterdam。这些酯一般由相应的羧酸和醇形成。通常，酯的形成可以通过常规合成技术来完成。参见，例如，March，1992Advanced Organic Chemistry，第4版，John Wiley&Sons，New York，第393-396页和其中引用的参考文献，和Mark，等人.1980EncyclopediaofChemicalTechnology，John Wiley&Sons，New York。酯的醇组分通常含有：(i)C₂-C₁₂脂肪醇，其可能含有或者可能不含一个或多个双键，可能含有或者可能不含分支碳，或(ii)C₇-C₁₂芳香醇或杂环芳香醇。本发明还涉及既是本文所述的酯同时又是其药学上可接受的酸加成盐的那些组合物的应用。

本文使用的“药学上可接受的酰胺”是指在酰胺键水解后保留羧酸或胺的生物学效果和性质并且在生物学或其它方面合乎要求的酰胺。关于作为前药的药学上可接受的酰胺的说明，参见，Bundgaard，H.编.1985Design ofProdrugs Elsevier Science Publishers，Amsterdam。这些酰胺一般由相应的羧酸和胺形成。通常，酰胺的形成可以通过常规合成技术来完成。参见，例如，March，1992Advanced Organic Chemistry，第4版.，John Wiley&Sons，NewYork，p.393，和Mark等人.1980EncyclopediaofChemicalTechnology，JohnWiley&Sons，New York。本发明还涉及既是本文所述的酰胺同时又是其药学上可接受的酸加成盐的那些组合物的应用。

本文使用的“药学上或治疗可接受的载体”是指不干扰活性成分的生物活性有效性并且对于宿主或患者无毒的载体介质。

本文使用的“立体异构体”是指具有与另一种化合物相同的分子量、化学组成和键合顺序，但是其原子在围绕一个或多个手性中心的空间中分布不同的化学化合物。即，相同化学式的立体异构体含有绕至少一个手性中心以不同空间方向定位的相同的化学部分。当为纯品时，立体异构体具有旋转平面偏振光的能力。然而某些纯的立体异构体的旋光性可能太微弱而无法用现有仪器检测到。本发明的化合物可能具有一个或多个对称碳原子，因此包括各种立体异构体。所有立体异构体都包括在本发明的范围内。

本文使用的“治疗或药物有效量”在用于本发明的组合物时是指足以诱导所需生物学结果的组合物的量。该结果可以是指征、症状或病因的缓和，或任何其它期望的生物系统的改变。在本发明中，该结果例如包括抑制和/或逆转癌细胞生长。

本文使用的术语“肽化合物”和“肽结构”包括由天然存在的L-氨基酸组成的肽，以及天然存在的L-氨基酸结构的肽衍生物、肽类似物和拟肽。本文使用的术语“肽类似物”、“肽衍生物”和“拟肽”包括模拟肽的化学结构并且保留该肽功能性质的分子。设计肽类似物、衍生物和模拟物的方法是本领域公知的。例如，参见，Farmer，P.S.in：DrugDesign E.J.Aliens编，AcademicPress，New York，1980，vol.10，第119-143页；Ball J.B.和Alewood，P.F.1990JMol Recognition 3：55；Morgan，B.A.和Gainor，J.A.1989Ann Rep Med Chem24：243；和Freidinger，R.M.1989 Trends Pharmacol Sci10：270；Luthman，等人.1996 A Textbook of Drug Design and Development，14：386-406，第2版，Harwood Academic Publishers；Joachim Grante，Angew.1994 Chem Int Ed Engl33：1699-1720；Fauchere，J.1986 Adv Drug Res 15：29；Veber和Freidinger 1985TINS第392页；Evans等人.1987 J Med Chem 30：229，全部引入本文作为参考。在结构上类似于治疗上有用的肽的拟肽可以用来产生等同的或增强的治疗或预防效果。通常，拟肽在结构上类似于范例性多肽(即，具有生物或药理活性的多肽)，如天然存在的受体结合多肽，但是其中一个或多个肽键任选地通过本领域公知的方法替换为选自下组的键：-CH₂NH-、-CH₂S-、-CH₂-CH₂-、-CH＝CH-(顺式和反式)、-COCH₂-、-CH(OH)CH₂-和-CH₂SO-，这些方法在下面的参考文献中进一步描述：Spatola，A.F.1983in：Chemistryand Biochemistiy of amino acids，Peptides，and Proteins，B.Weinstein编，MarcelDekker，New York，第267页；Spatola，A.F.1983 Vega Data，Vol.1，Issue 3，Peptide Backbone Modifications(综述)；Morley，1980 Trends Pharm Sci第463-468页，(综述)；Hudson，等人.1979Int J Pept Prot Res 14：177-185(-CH₂NH-，CH₂CH₂-)；Spatola，等人.1986 Life Sci 38：1243-1249(-CH₂-S)；Hann，1982 J Chem Soc Perkin Trans I 307-314(-CH-CH-，顺式和反式)；Almquist，等人.1980 J Med Chem 23：1392-1398，(-COCH₂-)；Jennings-White等人.1982Tetrahedron Lett 23：2533(-COCH₂-)；Szelke，等人.1982European Appln.EP45665(-CH(OH)CH₂-)；Holladay，等人.1983 Tetrahedron Lett 24：4401-4404(-C(OH)CH₂-)；和Hruby，1982 Life Sci 31：189-199(-CH₂-S-)；均引入本文作为参考。这些拟肽相对于多肽实施方案可能具有显著的优点，包括，例如：更经济的制备，更高的化学稳定性，增强的药理学性质(半衰期、吸光度、功效、效能等)、改变的特异性(例如，广谱生物活性)、降低的抗原性等。拟肽的标记通常涉及一个或多个标记与拟肽上的非干扰位置的共价连接，这种共价连接是直接的，或者通过间隔区(例如酰胺基团)间接连接，该非干扰位置可以通过定量的结构活性数据和/或分子模建预测。这些非干扰位置通常是不与大分子(如受体分子)直接接触的位置，拟肽结合于其上产生治疗效果。拟肽的衍化(例如，标记)应当基本不干扰所需的拟肽生物或药理活性。通常，受体结合肽的拟肽与受体高亲和性结合，并且具有可检测的生物活性(即，对于一种或多种受体介导的表型改变具有激动作用或拮抗作用)。

可以通过将共有序列的一个或多个氨基酸系统地置换为相同类型的D-氨基酸(例如，D-赖氨酸代替L-赖氨酸)产生更稳定的肽。另外，也可以通过本领域公知的方法产生含有共有序列或含有基本相同的共有序列变体的约束肽(Rizo，等人.1992Ann Rev Biochem 61：387，引入本文作为参考)；例如，通过添加能够形成分子内二硫键的内部半胱氨酸残基，该分子内二硫键能使该肽环化。

合成的或非天然存在的氨基酸是指不在体内自然存在但可以引入本文所述肽结构内的氨基酸。优选的合成氨基酸是由通式H₂NCHR⁵COOH代表的天然存在的L-α-氨基酸的D-α-氨基酸以及非天然存在的D-α-氨基酸和L-α-氨基酸，其中R5是1)低级烷基，2)3-7个碳原子的环烷基，3)具有3-7个碳原子和1-2个选自氧、硫、氮的杂原子的杂环，4)6-10个碳原子的芳族残基，任选地在芳香环上具有1-3个选自羟基、低级烷氧基、氨基和羧基的取代基，5)-亚烷基-Y，其中亚烷基是1-7个碳原子的亚烷基，Y选自：(a)羟基，(b)氨基，(c)3-7个碳原子的环烷基和环烯基，(d)6-10个碳原子的芳基，任选地在芳香环上具有1-3个选自羟基、低级烷氧基、氨基和羧基的取代基，(e)具有3-7个碳原子和1-2个选自氧、硫、氮的杂原子的杂环，(f)-C(O)R²，其中R²选自氢、羟基、低级烷基、低级烷氧基和-NR³R⁴，其中R³和R⁴独立地选自氢和低级烷基，(g)-S(O)_nR⁶，其中n是1-2的整数，R⁶是低级烷基，前提是R⁵不限定天然存在的氨基酸的侧链。

其它优选的合成氨基酸包括其中氨基与羧基相隔一个以上碳原子的氨基酸，如β-丙氨酸、γ-氨基丁酸等。

特别优选的合成氨基酸包括，例如，天然存在的L-氨基酸的D-氨基酸、L-(1-萘基)-丙氨酸、L-(2-萘基)-丙氨酸、L-环己基丙氨酸、L-2-氨基异丁酸、甲硫氨酸的亚砜和砜衍生物(即，HOOC-(H₂NCH)CH₂CH₂-S(O)_nR⁶)，其中n和R⁶如上所述定义，以及甲硫氨酸的低级烷氧基衍生物(即，HOOC-(H₂NCH)CH₂CH₂-OR⁶，其中R⁶如上所述定义)。

本文使用的化合物X(例如，肽或氨基酸)的“衍生物”是指该化合物中的一个或多个反应基团已经被取代基衍生化的X形式。肽衍生物的例子包括其中氨基酸侧链、肽骨架或氨基或羧基末端已经被取代的肽。本文使用的化合物X的“类似物”是指这样的化合物，其保留了对于X的功能活性来说必需的X的化学结构，但也含有不同于X的某些化学结构。天然存在的肽的类似物的一个例子是包含一个或多个非天然存在的氨基酸的肽。本文使用的化合物X的“模拟物”是指这样的化合物，其中对于X的功能活性来说必需的X的化学结构已经被置换为模拟X的构象的其它化学结构。拟肽的例子包括其中肽骨架被一个或多个苯并二氮卓分子置换的肽化合物(参见，例如，James，G.L.等人.1993 Science 260：1937-1942)、其中所有L-氨基酸都被置换为相应的D-氨基酸的肽、和“反-转型(retro-inverso)”肽(参见Sisto的美国专利号4,522,752)，其在下文中进一步描述。

术语模拟物，特别是拟肽，包括电子等排体(isosteres)。本文使用的术语“电子等排体”包括可以取代另一化学结构的化学结构，因为该结构的空间排列构象适合对该另一结构特异的结合部位。该术语具体包括本领域技术人员公知的肽骨架修饰(即酰胺键模拟物)。这些修饰包括酰胺氮、α-碳、酰胺羰基的修饰，酰胺键的完全置换，延伸，缺失或骨架交联。已知几种肽骨架修饰，包括ψ[CH₂S]、ψ[CH₂NH]、ψ[CSNH₂]、ψ[NHCO]、ψ[COCH₂]和ψ[(E)或(Z)CH＝CH]。在以上使用的命名中，ψ表示不存在酰胺键。替换酰胺基团的结构在括号内注出。电子等排体的其它例子包括用一个或多个苯并二氮卓分子取代的肽(参见，例如，James，G.L.等人.1993Science260：1937-1942)。

其它可能的修饰包括N-烷基(或芳基)取代(ψ[CONR])、骨架交联以构建内酰胺和其它环状结构、化合物内的所有L-氨基酸被置换为D-氨基酸(“转型”化合物)或反-转型氨基酸引入(ψ[NHCO])。“转型”的意思是将序列的L-氨基酸置换为D-氨基酸，“反-转型”或“对映-反”的意思是颠倒氨基酸序列(“反”)并且将L-氨基酸置换为D-氨基酸。例如，如果亲本肽是Thr-Ala-Tyr，则反修饰形式为Tyr-Ala-Thr，转型形式为thr-ala-tyr(小写字母代表D-氨基酸)，反-转型形式是tyr-ala-thr。与亲本肽相比，反-转型肽具有颠倒的骨架，而基本上保留侧链的原空间构象，产生在拓扑学上非常类似于亲本肽的反-转型异构体。参见，Goodman等人.1981Perspectives in Peptide Chemistry，第283-294页。关于“反-转型”肽的进一步描述参见Sisto的美国专利号4,522,752。其它衍生物包括C-末端羟甲基衍生物、O-修饰的衍生物(例如，C-末端羟甲基苄醚)和N-末端修饰的衍生物，包括取代的酰胺如烷基酰胺和酰肼。

本文使用的术语“氨基酸结构”(如“亮氨酸结构”、“苯丙氨酸结构”或“谷氨酰胺结构”)包括保持化合物活性的氨基酸以及该氨基酸类似物、衍生物和模拟物。例如，术语“苯丙氨酸结构”包括苯丙氨酸以及吡啶基丙氨酸和高苯丙氨酸。术语“亮氨酸结构”包括亮氨酸以及缬氨酸或其它具有脂族侧链的天然或非天然氨基酸的取代，如正亮氨酸。

本文公开的肽化合物的氨基和/或羧基末端可以不被修饰(即，Y1和/或Y2可以独立地是氢)。或者，肽化合物的氨基和/或羧基末端可以用衍生物基团修饰。可以存在于肽化合物N-末端(即可以是Y1)的氨基-衍生物基团包括乙酰基、芳基、芳烷基、酰基、环氧琥珀酰基和胆甾醇基。可以存在于肽化合物C-末端(即可以是Y2)的羧基-衍生物基团包括醇、醛、环氧琥珀酸、酰基卤、羰基、卤代甲烷和重氮甲烷基团。

本文使用的“可检测标记”或“显像剂”是指当共价连接到一种化合物时使该化合物能够被检测的材料，包括但不限于在已经施用Eph受体结合剂的患者体内检测。合适的可检测标记是本领域中公知的，包括，例如，放射性同位素、荧光标记(例如，荧光素)等。具体使用的可检测标记并不重要，根据将要使用的标记的量以及在该用量时标记的毒性来选择。根据这些因素选择标记为本领域技术人员熟知。

可检测标记与肽或拟肽的共价连接通过本领域公知的常规方法来实现。例如，当使用¹²⁵I放射性同位素作为可检测标记时，¹²⁵I与肽或拟肽的共价连接可以通过使该肽或拟肽内含有酪氨酸然后将该肽碘化来实现(参见，例如，Weaner，等人.1994Synthesis and Applications of Isotopically Labelledcompounds，第137-140页)。如果肽或拟肽中不存在酪氨酸，则可以利用众所周知的化学方法向肽或拟肽的N末端或C末端引入酪氨酸。同样，使用常规化学方法，通过(例如)肽或拟肽上的羟基，可以将32P作为磷酸部分引入到肽或拟肽上。

“选择性地”是指对一个或几个Eph受体家庭成员的结合亲和力大大高于对其它已知Eph受体家庭成员的所述结合亲和力。当与选择性结合亲和力一起使用时，“大大高于”的意思是与受体结合的配体的量提高至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、或至少100倍。

本文使用的“Eph受体结合剂”或“Eph受体结合配体”是与Eph受体结合的化合物。该化合物可以包括任何能够与一种或多种Eph受体结合的分子。在一些情况下，能够与一种或多种Eph受体结合的分子是肽或拟肽。这些肽或拟肽的长度可以小于10、小于11、小于12、小于13、小于14、小于15、小于20、小于25、小于30、小于35、小于40、小于45、小于50、小于75、小于100、小于200、小于300、小于400或小于500个残基。术语“Eph受体结合剂”和“Eph受体结合配体”可以互换使用。

本文使用的“Ephrin-B”包括是Ephrin-B配体亚类的成员的任何Ephrin。

本文使用的术语“治疗剂”是指抗癌剂、神经保护剂或对具体疾病适应证能够具有所需治疗效果的其它药物。

本文所述的抗癌剂可以是细胞毒性剂或癌症化疗剂。作为非限定性的例子，针对DNA相关过程的细胞毒性剂包括：环磷酰胺、美法仑、丝裂霉素C、比折来新、顺铂、多柔比星、依托泊苷、米托蒽醌、SN38、Et 743、放线菌素D、博来霉素和TLK286。癌症化疗剂可以是但不限于：紫杉烷，如多西紫杉醇；蒽环类抗生素，如多柔比星；烷化剂；长春花生物碱；抗代谢药；铂类药物，如顺铂或卡铂；类固醇，如氨甲喋呤；抗生素，如阿霉素；异磷酰胺(isofamide)；或选择性雌激素受体调节剂；抗体，如曲妥单抗。

紫杉烷类是在本发明的联合治疗中有用的化疗剂。有用的紫杉烷类包括但不限于多西紫杉醇(泰索帝；Aventis Pharmaceuticals，Inc.；Parsippany，NJ)和紫杉醇(泰素；Bristol Myers Squibb；Princeton，NJ)。参见，例如，Chan等人.1999 J Clin Oncol 11：2341 2354，和Paridaens等人.2000J Clin Oncol18：724。

在本发明的联合治疗中有用的另外一种癌症化疗剂是蒽环类，如多柔比星、伊达比星或柔红霉素。多柔比星是一种常用的癌症化疗剂，可以用于，例如，治疗乳腺癌(Stewart和Ratain，In：″Cancer：Principles and Practice ofOncology″，第5版，第19章，DeVita，Jr.等人编；J.P.Lippincott1997；Harris等人.，In：″Cancer：Principles andpractice of oncology，″同上，1997)。另外，多柔比星还具有抗血管生成活性(Folkman，1997 Nature Biotechnology 15：510；Steiner，hi：″Angiogenesis：Key principles Science，technology and medicine，″第449-454页，Steiner等人编，Birkhauser Verlag，1992)，这对其在治疗癌症中的效果可能具有贡献。

烷化剂如美法仑或苯丁酸氮芥是在本发明的联合治疗中有用的癌症化疗剂。同样，长春花属生物碱如长春地辛、长春花碱或长春瑞滨；或抗代谢药如5-氟尿嘧啶、5-氟尿苷或其衍生物是在本发明的联合治疗中有用的癌症化疗剂。

铂类药物是在本发明的联合治疗中有用的化疗剂。这种铂类药物可以是，例如，如Crown，2001 Seminars in Oncol 28：28-37所述的顺铂或卡铂。在本发明的联合治疗中有用的其它癌症化疗剂包括但不限于氨甲喋呤、丝裂霉素C、阿霉素、异环磷酰胺和安沙霉素类。

用于治疗乳腺癌和其它激素依赖性癌症的癌症化疗剂也可以用作拮抗雌激素效果的药物，如选择性雌激素受体调节剂或抗雌激素。选择性雌激素受体调节剂他莫西芬是在用于治疗乳腺癌的本发明联合治疗中可以使用的癌症化疗剂(Fisher等人.1998 J Natl Cancer Instit 90：1371 1388)。

在本发明的联合治疗中有用的治疗剂可以是抗体，如人源化单克隆抗体。作为一个例子，抗表皮生物因子受体2(HER2)抗体、曲妥单抗(Herceptin；Genentech，South San Francisco，CA)是在用于治疗过量表达HER2/neu的乳腺癌的本发明偶联物中有用的治疗剂(White等人.2001Ann Rev Med52：125-141)。

在本发明中有用的其它治疗剂也可以是细胞毒性剂，本文使用的是任何直接或间接促进细胞死亡的分子。在本发明中有用的细胞毒性剂包括但不限于小分子、多肽、肽、拟肽、核酸分子、细胞和病毒。作为非限定性的例子，在本发明中有用的细胞毒性剂包括细胞毒性小分子，如多柔比星、多西紫杉醇或曲妥单抗；抗微生物肽，如下文进一步所述的那些；促细胞调亡多肽，如胱天蛋白酶和毒素，例如，胱天蛋白酶8；白喉毒素A链、假单胞菌外毒素A、霍乱毒素、配体融合毒素，如DAB389EGF、蓖麻毒素(蓖麻毒蛋白)；细胞毒性细胞，如细胞毒性T细胞。参见，例如，Martin等人.2000Cancer Res 60：3218-3224；Kreitman和Pastan 1997 Blood 90：252-259；Allam等人.1997 Cancer Res 57：2615-2618；Osborne和Coronado Heinsohn1996 Cancer JSci Am 2：175。本领域技术人员应当理解，本文所述的或本领域公知的这些和其它的细胞毒性剂可以作为本发明的治疗剂使用。

神经保护剂在本领域中公知，可以是阻止或延迟神经元细胞死亡的化合物。作为非限定性的例子，神经保护剂可以是抗细胞凋亡化合物，如小分子药物、肽、蛋白质、抗体或其组合。神经保护剂可以通过干扰一个或多个细胞凋亡或坏死途径、激活神经生长激素受体或调节离子通道来起作用。本领域技术人员应当理解，本文所述的或本领域公知的这些和其它的神经保护剂可以作为本发明的治疗剂使用。

Eph受体结合剂

本发明的实施方案提供与Eph受体结合的药物。本文所述的许多化合物只与Eph受体家族的16个已知受体中的一个或有限数量的受体选择性结合。Eph受体结合剂可以是小分子药物、肽或拟肽。Eph受体结合剂可以是天然化合物或合成化合物。本文所述的许多化合物也与Eph受体高亲和力结合，并且可以作为Eph受体激动剂或拮抗剂起作用。本文所述的化合物包括“先导”化合物和“衍生”化合物，该“衍生”化合物构建为具有与先导化合物相同或相似的分子结构或形状，但是在对水解或蛋白水解的敏感性方面和/或在其它生物学性质方面不同于先导化合物，如对受体的亲和力提高，或者具有与目标Eph受体无关的其它生物学性质。

肽和拟肽的制备

1.固相合成

本文所述的肽可以通过本领域公知的经典方法制备，例如，使用标准固相技术制备。标准方法包括完全固相合成法、部分固相合成法、片段缩合、经典溶液合成、甚至通过重组DNA技术合成。参见，例如，Merrilleld，1963JAm Chem Soc 85：2149，引入本文作为参考。在固相上，一般使用α-氨基保护的树脂从肽的C-末端开始合成。一种合适的起始材料可以如下制备：将所需的α-氨基酸附着到氯甲基化树脂、羟甲基树脂或二苯甲胺树脂上。一种这样的氯甲基化树脂是BioRad Laboratories，Richmond，CA以商品名BIO-BEADS SX-I出售的树脂，Bodonszky，等人.1966ChemInd(London)38：1597记载了羟甲基树脂的制备。二苯甲胺(BHA)树脂由Pietta和Marshall，1970Chem Commn650描述，可以从Beckman Instruments，Inc.，Palo Alto，CA以盐酸盐形式获得。

因此，按照Gisin，1973 Helv Chim Acta 56：1467所述的方法，使用(例如)碳酸氢铯催化剂，通过将α-氨基保护的氨基酸偶联到氯甲基化树脂上，可以制备化合物。在最初的偶联后，选用包括三氟乙酸(TFA)或盐酸(HCl)溶液在内的试剂，在有机溶剂中在室温下除去α-氨基保护基。

α-氨基保护基是已知可以在分步肽合成技术中使用的那些基团。包括酰基类型的保护基(例如，甲酰基、三氟乙酰基、乙酰基)、芳族尿烷类型的保护基(例如苄氧羰基(Cbz)和取代的Cbz)、脂族尿烷保护基(例如，叔丁氧羰基(Boc)、异丙氧羰基、环己氧羰基)和烷基类型的保护基(例如，苄基、三苯甲基)。Boc和Fmoc是优选的保护基。侧链保护基在偶联过程中保持完整，在氨基端保护基的脱保护过程中或者在偶联过程中也不裂解下来。侧链保护基必须可以在最终肽合成结束时在不改变目标肽的反应条件下除去。

Tyr的侧链保护基包括四氢吡喃基、叔丁基、三苯甲基、苄基、Cbz、Z--Br--Cbz和2，5-二氯苄基。Asp的侧链保护基包括苄基、2，6-二氯苄基、甲基、乙基和环己基。Thr和Ser的侧链保护基包括乙酰基、苯甲酰基、三苯甲基、四氢吡喃基、苄基、2，6-二氯苄基和Cbz。Thr和Ser的侧链保护基是苄基。Arg的侧链保护基包括硝基、甲苯磺酰基(Tos)、Cbz、金刚烷氧基羰基、草米酰磺酰基(Mts)或Boc。Lys的侧链保护基包括Cbz、2-氯苄氧羰基(2C1-Cbz)、2-溴苄氧羰基(2-BrCbz)、Tos或Boc。

在除去α-氨基保护基后，剩余的被保护的氨基酸按照所需的顺序分步偶联。过量的各种被保护的氨基酸通常与适当的羧基激活剂如二环己基碳二亚胺(DCC)在溶液诸如二氯甲烷(CH₂Cl₂)、二甲基甲酰胺(DMF)混合物中一起使用。

在所需的氨基酸序列完成后，通过用诸如三氟乙酸或氟化氢(HF)等试剂处理从树脂载体上将所需的肽解偶联，该试剂不仅从树脂上切下肽，而且切下所有剩余的侧链保护基。当使用氯甲基化树脂时，氟化氢处理导致生成游离肽酸。当使用二苯甲基胺树脂时，氟化氢处理直接生成游离的肽酰胺。可选择地，当使用氯甲基化树脂时，可以通过用氨处理肽树脂将侧链被保护的肽解偶联，产生所需的侧链被保护的酰胺，或者用烷基胺处理肽树脂，产生侧链被保护的烷基酰胺或二烷基酰胺。然后以常用的方式通过氟化氢处理除去侧链保护，产生游离的酰胺、烷基酰胺或二烷基酰胺。

这些固相肽合成方法在本领域中众所周知，并且由J.M.Stewart和J.D.Young，1984 Solid Phase Peptide Syntheses，第2版.，Pierce Chemical Company描述。

使用在1990年3月7日提交的美国专利申请07/492,462、1990年12月6日提交的07/624,120和1991年12月6日提交的07/805,727中所述的“编码合成文库(encoded synthetic library)”或“极大规模固定化聚合物合成(verylarge scale immobilized polymer synthesis)”系统，人们不仅能够确定具有这种活性的肽的最小大小，也可以制备形成与优选基序(或该基序的最小大小)有1个、2个或更多残基不同的一组肽的所有肽。然后可以针对与Eph受体家族成员(包括但不限于EphB1、EphB2和EphB4)结合的能力筛查这种肽的集合。应当理解，也可以使用这种固定化聚合物合成系统或其它肽合成方法来合成本发明的所有肽化合物的截短类似物和缺失类似物以及截短类似物和缺失类似物的组合。

2.合成氨基酸

也可以使用这些方法合成其中在本发明任何化合物的一个、两个或多个位置处置换为除20种天然存在的、遗传编码的氨基酸以外的氨基酸的肽。例如，萘基丙氨酸可以置换色氨酸，以促进合成。可以置换本发明的肽的其它合成氨基酸包括L-羟丙基、L-3，4-二羟基-苯丙氨酰基、d氨基酸如L-d-羟赖氨酰基和D-d-甲基丙氨酰基、L-a-甲基丙氨酰基、β氨基酸和异喹啉基。D氨基酸和非天然存在的合成氨基酸也可以结合到本发明的肽内(参见，例如，Roberts，等人.1983 Unusual Amino/Acids in Peptide Synthesis5：341-449)。

人们可以将20种遗传编码的氨基酸(或D氨基酸)的天然存在的侧链置换为其它侧链，例如烷基、低级烷基、4-环烷基、5-环烷基、6-环烷基至7-元环烷基、酰胺、酰胺低级烷基、酰胺二(低级烷基)、低级烷氧基、羟基、羧基及其低级酯衍生物等基团，和4-元杂环、5-元杂环、6-元杂环至7-元杂环。特别是，可以使用脯氨酸类似物，其中脯氨酸残基环的大小从5元环变为4元环、6元环或7元环。环基可以是饱和或不饱和的，如果是不饱和的，则可以是芳香族或非芳香族的。杂环基团优选地含有一个或多个氮、氧和/或硫杂原子。这些基团的例子包括呋吖基(furazanyl)、呋喃基、咪唑烷基、咪唑基、咪唑啉基、异噻唑基、异噁唑基、吗啉基(例如，吗啉代)、噁唑基、哌嗪基(例如，1-哌嗪基)、哌啶基(例如，1-哌啶基、哌啶基)、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基(例如，1-吡咯烷基)、吡咯啉基、吡咯基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、硫代吗啉基(例如，硫代吗啉代)和三唑基。这些杂环基团可以被取代或不被取代。当基团被取代时，取代基可以是烷基、烷氧基、卤素、氧或取代的或未取代的苯基。

人们可以通过磷酸化容易地修饰本发明的肽(参见，例如，W.Bannwarth等人.1996 Biorganic and Medicinal Chemistry Letters 6：2141-2146)，制备本发明化合物的肽衍生物的其它方法在Hruby，等人.1990 Biochem J 268：249-262中记载。本发明的肽化合物也作为制备具有类似生物活性的拟肽的基础。

3.末端修饰

本领域技术人员应当认识到，有多种技术可用于构建与相应肽化合物具有相同或相似的所需生物活性但是在溶解度、稳定性和对水解和蛋白水解的敏感性方面比所述肽具有更有利的活性的拟肽。参见，例如，Morgan，等人.1989Ann Rep Med Chem24：243-252。下面描述的方法用于制备在N-末端氨基、C-末端羧基处修饰的拟肽和/或将肽中的一个或多个酰氨键改变为非酰氨键。应当理解，两个或多个这样的修饰可以结合在一个拟肽结构中(例如，在C-末端羧基处修饰，并且在肽的两个氨基酸之间包括-CH2-氨基甲酸酯键)。

1).N-末端修饰

肽一般合成为游离酸，但是如上所述，可以容易地制备为酰胺或脂。也可以修饰肽化合物的氨基和/或羧基末端，以产生其它有用的化合物。氨基末端修饰包括甲基化(即，-NHCH₃或-NH(CH₃)₂)、乙酰化、添加苄氧羰基、或者用含有RCOO-限定的羧酸官能团的任意保护基封闭氨基末端，其中R选自萘基、吖啶基、固醇基和类似的基团。羧基末端修饰包括将游离酸替换为羧酰胺基，或者在羧基末端形成环状内酰胺，以引入结构约束。

氨基末端修饰如上所述，包括烷基化、乙酰化、添加羧苯甲酰基、形成琥珀酰亚胺基等(参见，例如，Murray，等人.1995Burger′sMedicinalChemistry and Drug Discovery第5版，Vol.1，Manfred E.Wolf编，John Wileyand Sons，Inc.)。具体而言，N-末端氨基然后可以如下反应：

(a)通过与酸性卤化物[例如，RC(O)Cl]或对称酸酐反应，形成通式RC(O)NH-的酰胺基团，其中R如上所述定义。一般来说，该反应可以如下进行：使大约等摩尔量的或过量的(例如，约5当量)酸性卤化物在惰性稀释剂(例如，二氯甲烷)中接触肽，该惰性稀释剂优选含有过量(例如，约10当量)的叔胺，如二异丙基乙胺，以清除反应过程中生成的酸。反应条件在其它方面为常规(例如，在室温下30分钟)。末端氨基的烷基化导致低级烷基N-取代，然后如上所述与酸性卤化物反应，这将产生通式RC(O)NR-的N-烷基酰胺基；

(b)通过与琥珀酸酐反应生成琥珀酰亚胺基团。如前所述，可以使用大致等摩尔量的或过量的琥珀酸酐(例如，约5当量)，利用本领域公知的技术将氨基转化为琥珀酰亚胺，包括在适当的惰性溶剂(例如，二氯甲烷)中使用过量的(例如，10当量)叔胺，如二异丙基乙胺。参见，例如，Wollenberg等人，美国专利号4,612,132，其全部内容被纳入本文作为参考。应当理解，琥珀酸基团可以被例如以常规方式制备的C₂-C₆烷基或-SR取代基取代，以在肽的N-末端提供取代的琥珀酰亚胺。这些烷基取代基通过利用Wollenberg，等人(同上)所述的方法将低级烯烃(C₂-C₆)与马来酸酐反应而制备，-SR取代基通过RSH与马来酸酐反应而制备，其中R如上所述定义；

(c)生成苄氧羰基-NH-或取代的苄氧羰基-NH-基团，方法是与大致等摩尔量的或过量的CBZ-Cl(即，苄氧羰基氯)或取代的CBZ-Cl在适当的惰性稀释剂(例如，二氯甲烷)中反应，该惰性稀释剂优选含有叔胺，以清除反应过程中生成的酸；

(d)生成磺胺基团，方法是与等量或过量(例如，5当量)的R-S(O)₂Cl在适当的惰性稀释剂(二氯甲烷)中反应，以将末端胺转化为磺胺，其中R如上所述定义。优选地，该惰性稀释剂含有过量的叔胺(例如10当量)，如二异丙基乙胺，以清除反应过程中生成的酸。反应条件在其它方面为常规(例如，室温下30分钟)；

(e)生成氨基甲酸酯基团，方法是与等量或过量(例如，5当量)的R-OC(O)Cl或R-OC(O)OC₆H₄-p-NO₂在适当的惰性稀释剂(例如，二氯甲烷)中反应，以将末端胺转化为氨基甲酸酯，其中R如上所述定义。优选地，该惰性稀释剂含有过量(例如约10当量)的叔胺，如二异丙基乙胺，以清除反应过程中生成的酸。反应条件在其它方面为常规(例如，室温下30分钟)；和

(f)生成脲基，方法是与等量或过量(例如，5当量)的R-N＝C＝O在适当的惰性稀释剂(例如，二氯甲烷)中反应，以将末端胺转化为脲(即RNHC(O)NH-)基，其中R如上所述定义。优选地，该惰性稀释剂含有过量(例如10当量)的叔胺，如二异丙基乙胺。反应条件在其它方面为常规(例如，室温下30分钟)。

2).C-末端修饰

在制备C-末端羧基被置换为酯(即，-C(O)OR，其中R如上所述定义)的拟肽中，使用用来制备肽酸的树脂，并且用碱和适当的醇例如甲醇切割侧链被保护的肽。然后以常用方式用氟化氢处理，除去侧链保护基团，获得需要的酯。

在制备C-末端羧基被置换为酰胺-C(O)NR³R⁴的拟肽中，使用二苯甲胺树脂作为肽合成的固体载体。在合成结束时，进行氟化氢处理将肽从载体上释放下来，直接生成游离的肽酰胺(即，C末端为-C(O)NH₂)。可选择地，在肽合成过程中使用氯甲基化树脂，结合用氨从载体上切下侧链被保护的肽的反应，产生游离肽酰胺，与烷基胺或二烷基胺反应生成侧链被保护的烷基酰胺或二烷基酰胺(即，C末端为-C(O)NRR¹，其中R和R¹如上所述定义)。然后以常用的方式用氟化氢处理以除去侧链保护，得到游离酰胺、烷基酰胺或二烷基酰胺。

在另一可选择的实施方案中，通过将羧基或酯的-OH或酯(-OR)分别内部置换为N-末端氨基，可以诱导C-末端羧基或C-末端酯环化，从而生成环肽。例如，在合成并切割而产生肽酸后，用适当的羧基活化剂如二环己基碳二亚胺(DCC)在(例如)二氯甲烷(CH₂Cl₂)、二甲基甲酰胺(DMF)混合物中的溶液将游离酸转化为活化酯。然后通过将活化酯内部置换为N-末端胺形成环肽。使用极稀的溶液可以增强与聚合相对的内部环化。这些方法在本领域中公知。

也可以将本发明的肽环化，或者在肽的末端引入脱氨基或脱羧基的残基，使其没有末端氨基或羧基，从而降低了对蛋白酶的敏感性，或者限制肽的构象。本发明化合物的C-末端官能团包括酰胺、酰胺低级烷基、酰胺二(低级烷基)、低级烷氧基、羟基和羧基、及其低级酯衍生物、及其药学上可接受的盐。

除了上述N-末端和C-末端修饰以外，本文所述的肽化合物，包括拟肽，可以有利地用一种或多种亲水性聚合物修饰或者与其共价偶联。已经发现，当用亲水性聚合物将肽化合物衍生化时，它们的溶解度和循环半衰期提高，而免疫原性被掩盖。非常令人惊讶的是，以上所述几乎不伴随结合活性的降低(如果有的话)。适用的非蛋白质聚合物包括但不限于聚烷基醚，例如聚乙二醇和聚丙二醇、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氧化烯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素和纤维素衍生物、葡聚糖和葡聚糖衍生物等。通常，这些亲水性聚合物的平均分子量为约500至约100,000道尔顿，更优选约2,000至约40,000道尔顿，再更优选地约5,000至约20,000道尔顿。在优选实施方案中，这些亲水性聚合物的平均分子量为约5,000道尔顿、10,000道尔顿和20,000道尔顿。

使用以下文献所述的任何方法，肽化合物可以用这些聚合物衍生化或者与这些聚合物偶联：Zallipsky，S.1995Bioconjugate Chem6：150-165；Monfardini，C等人.1995Bioco njugate Chem6：62-69；美国专利4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192；4,179,337或WO95/34326，全部内容均被纳入本文作为参考。

在一个实施方案中，肽化合物用聚乙二醇(PEG)衍生化。PEG是线性的、水溶性的氧化乙烯重复单元的聚合物，具有两个末端羟基。PEG根据其分子量分类，一般为约500道尔顿至约40,000道尔顿。在一个优选实施方案中，使用的PEG的分子量为5,000道尔顿至约20,000道尔顿。与本发明的肽化合物偶联的PEG可以是分支或不分支的。(参见，例如，Monfardini，C.等人.1995Bioconjugate Chem6：62-69)。PEG可从Shearwater Polymers，Inc.(Huntsville，Ala.)、SigmaChemical Co.和其它公司获得。这些PEG包括但不限于：单甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)、单甲氧基聚乙二醇-琥珀酸酯(MePEG-S)、单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚氨基琥珀酸酯(MePEG-S-NHS)、单甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH2)、单甲氧基聚乙二醇-三氟乙基磺酸酯(tresylate)(MePEG-TRES)和单甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)。

简要地说，在一个示例性的实施方案中，使用的疏水性聚合物，例如PEG，优选地在一端用非反应性基团如甲氧基或乙氧基封端。之后，该聚合物通过与适当的活化剂如氰尿酰卤(例如，氰尿酰氯、溴或氟)、二咪唑(diimadozle)、酸酐试剂(例如，二卤琥珀酸酐，如二溴琥珀酸酐)、酰基叠氮、对-重氮基二苄醚、3-(对-重氮基苯氧基)-2-羟基丙醚)等反应而在另一端被活化。活化的聚合物然后与本文所述的肽化合物反应，生成聚合物衍生化的肽化合物。可选择地，本发明的肽化合物中的官能团可以被活化，以供与聚合物反应，或者可以使用已知的偶联方法在协调的偶联反应中将两个基团连接在一起。应当理解，可以通过本领域技术人员公知并且使用的各种其它反应方案，用PEG对本发明的肽化合物衍生化。

在一些实施方案中，衍生肽的活性为未修饰肽的活性的约0.1至约0.01倍。在另外一些实施方案中，衍生肽的活性为未修饰肽的活性的约0.1至约1倍。在另外一些实施方案中，衍生肽的活性大于未修饰的肽。

适合在该实施方案中使用的肽通常包括与Eph受体家族成员(包括但不限于EphBl、EphB2、EphB3或EphB4)结合的肽，即配体。这些肽一般包含约50个或更少的氨基酸残基，更优选约20个或更少的氨基酸残基。适用于本发明的亲水性聚合物包括但不限于：聚烷基醚，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氧化烯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素和纤维素衍生物、葡聚糖和葡聚糖衍生物等。通常，这些亲水性聚合物的平均分子量为约500至约100,000道尔顿，更优选约2,000至约40,000道尔顿，再更优选约5,000至约20,000道尔顿。在一些优选实施方案中，这些亲水性聚合物的平均分子量为约5,000道尔顿、10,000道尔顿和20,000道尔顿。肽化合物可以用以上所述的和在引用的参考文献中所述的方法衍生化。

4.骨架修饰

制备化合物的肽衍生物的其它方法在Hraby等人.1990Biochem J268(2)：249-262中记载，其引入本文作为参考。因此，肽化合物也作为具有类似生物活性的非肽化合物的结构模型。本领域技术人员应当认识到，可以使用多种技术构建与先导肽化合物具有相同或相似的所需生物活性但是在溶解度、稳定性和对水解和蛋白质水解的敏感性方面具有优于先导化合物的活性的化合物。参见Morgan，等人.1989Ann Rep Med Chem24：243-252，引入本文作为参考。这些技术包括将肽骨架替换为由膦酸酯、酰胺化物、氨基甲酸酯、磺胺、仲胺和N-甲基氨基酸组成的骨架。

在常规肽合成中，在合成过程中通过在适当点处仅将氨基酸试剂置换为被适当保护的氨基酸类似物，制备其中一个或多个肽基键合[-C(O)NH-]已经被替换为如-CH₂-氨基甲酸酯键合、膦酸酯键合、-CH₂-磺胺键合、脲键合、仲胺(-CH₂NH-)键合和烷基化肽基键合[-C(O)NR⁶-，其中R⁶是低级烷基]等键的拟肽。

合适的试剂包括，例如，氨基酸类似物，其中氨基酸的羧基已经被置换为适合形成一种上述键合的部分。例如，如果希望将肽中的-C(O)NR-键合替换为-CH₂-氨基甲酸酯键合(-CH₂0C(O)NR-)，则首先将适当保护的氨基酸的羧基(-COOH)还原为-CH₂OH基，然后通过常规方法将-CH₂OH基转化为-OC(O)Cl官能团或对硝基碳酸酯-OC(O)O-C₆H₄-p-NO₂官能团。在固体载体上的部分构建的肽的N末端上使这些官能团中的任一种与游离胺或烷基化胺反应，形成-CH₂0C(O)NR-键合。关于-CH₂-氨基甲酸酯键合的形成的更详细说明，见Cho等人.1993Science261：1303-1305。

类似地，用膦酸酯键置换肽中的酰氨键可以用美国专利申请序列号07/943,805、08/081,577和08/119,700中所述的方法实现，该申请披露的内容全部引入本文作为参考。

用-CH₂-磺胺键合置换肽中的酰氨键合可以如下实现：将适当保护的氨基酸的羧基(-COOH)还原为-CH₂OH基，然后通过常规方法将羟基转化为适当的离去基团，如甲苯磺酰基。甲苯磺酸化衍生物与(例如)硫代乙酸反应，然后水解及氧化氯化，将产生-CH₂-S(O)₂Cl官能团，其替换了在其它方面被适当保护的氨基酸的羧基。在肽合成中使用这种适当保护的氨基酸类似物导致包含-CH₂S(O)₂NR-键合，该键合置换了肽中的酰氨键合，从而产生拟肽。关于氨基酸的羧基向-CH₂S(O)₂Cl基转化的更全面的说明，参见，例如，Weinstein，B.，1983Chemistiy & Biochemistry of amino acids，Peptides andProteins Vol.7，第267-357页，Marcel Dekker，Inc.，New York，引入本文作为参考。

用脲键合置换肽中的酰氨基键合可以利用美国专利申请08/147,805所述的方法实现，该申请的全部内容被纳入本文作为参考。

其中-CH₂NH-键合替换了肽中的酰胺键合的仲胺键合可以用(例如)适当保护的二肽类似物来制备，该二肽类似物中已经采用常规方法将酰胺键合的羰基键还原为CH₂基。例如，在二甘氨酸的情况下，将酰胺还原为胺在脱保护后将产生H₂NCH₂CH₂NHCH₂COOH，然后以N-保护的形式用于下一个偶联反应。通过还原二肽中的酰胺键合的羰基来制备这种类似物的方法在本领域中公知(参见，例如，M.W.Remington 1994 Meth Mol Bio35：241-247)。

在常规肽合成中以与相应氨基酸相同的方式使用适当保护的氨基酸类似物。例如，在该反应中一般使用约3当量的被保护的氨基酸类似物。使用惰性有机稀释剂如二氯甲烷或DMF，并且当生成作为反应副产物的酸时，反应溶剂通常含有过量的叔胺来清除在反应过程中生成的酸。一种特别优选的叔胺是二异丙基乙胺，它一般以大约10倍过量使用。该反应导致在拟肽中掺入具有非肽键合的氨基酸类似物。这种置换可以根据需要重复，以使肽中的0个到全部酰胺键合被置换为非酰胺键合。

也可以将肽环化，或者在肽的末端引入脱氨基或脱羧基的残基，使其不存在末端氨基或羧基，以降低对蛋白酶的敏感性或限制肽的构象。化合物的C-末端官能团包括酰胺、酰胺低级烷基、酰胺二(低级烷基)、低级烷氧基、羟基和羧基及其低级酯衍生物，及其药学上可接受的盐。

5.二硫键的形成

化合物可以以在半胱氨酸巯基之间具有分子内二硫键的环化形式存在。或者，可以在半胱氨酸的巯基之间产生分子间二硫键，以产生二聚体(或更高寡聚体)化合物。一个或多个半胱氨酸残基也可以用高半胱氨酸置换。

本发明的其它实施方案包括这些二硫化物衍生物的类似物，其中一个硫已经被置换为CH2基团或硫的其它电子等排体。这些类似物可以用本领域公知的方法通过分子内或分子间置换来制备。

可选择地，肽的氨基末端可以用α-取代的乙酸封端，其中α取代基是离去基团，如α-卤代乙酸，例如，α-氯乙酸、α-溴乙酸或α-碘乙酸。本发明的化合物可以通过将离去基团置换为半胱氨酸或高半胱氨酸残基的硫而环化或二聚化。参见，例如，Andreu等人.1994MethMolBio35(7)：91-169；Barker等人.1992J Med Chem35：2040-2048；和Or等人.1991J Org Chem56：3146-3149，均引入本文作为参考。

也可以通过本领域公知的重组DNA技术制备这些肽。

用Eph受体结合化合物调节Eph受体

本文所述的Eph受体结合化合物能够调节细胞中的Eph活性。调节Eph活性的Eph受体结合化合物包括本文所述的与Eph受体家族一个或多个成员结合的肽或拟肽。在本发明的某些实施方案中，Eph受体结合化合物仅包括一个本文所述的肽或拟肽。在本发明的某些实施方案中，细胞与有效引起受体磷酸化的量的Eph受体结合化合物接触，由此激活下游信号事件。在某些实施方案中，细胞与其量可以有效阻止Ephrin配体引起的受体磷酸化的Eph受体结合化合物接触，由此抑制受体的活性。在另外一些实施方案中，细胞可以与有效引起下游信号事件激活或失活的量的Eph受体结合化合物接触。有效激活或灭活下游信号事件的Eph受体结合化合物的量包括至少0.05μM、至少0.1μM、至少0.2μM、至少0.3μM、至少0.4μM、至少0.5μM、至少0.6μM、至少0.7μM、至少0.8μM、至少0.9μM、至少1μM、至少5μM、至少10μM、至少20μM、至少30μM、至少40μM、至少50μM、至少60μM、至少70μM、至少80μM、至少90μM、至少100μM或至少200μM的浓度。本文中没有描述的其它有效浓度可以由本领域技术人员容易地确定。

在本发明的一些实施方案中，在体外和在体内调节细胞中的目标Eph受体。对于任一种应用，细胞可以是表达Eph受体家族的至少一个成员的任何细胞，包括但不限于人细胞。

在其它实施方案中，调节EphB亚家族的受体。这些受体包括EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、EphB5和EphB6。在某些实施方案中，表达EphB1受体的细胞与有效量的本文所述的肽、拟肽或小分子接触，以调节该受体的活性和下游信号事件。在另外的实施方案中，表达EphB2受体的细胞与有效量的本文所述的肽、拟肽或小分子接触，以调节该受体的活性和下游信号事件。在另外的实施方案中，表达EphB4受体的细胞与有效量的本文所述的肽、拟肽或小分子接触，以调节该受体的活性和下游信号事件。

Eph受体家族某些成员的刺激与细胞凋亡(程序性细胞死亡)的激活有关。因此，在某些表达Eph受体的细胞如某些类型的肿瘤细胞中程序性细胞死亡的激活将有利于选择性杀伤不希望的细胞群体。此外，作为在程序性细胞死亡所针对的细胞型中过量表达的具体Eph受体的选择性激动剂，Eph受体结合化合物将提供一种清除靶细胞而不杀伤非靶细胞的方法。

在本发明的某些实施方案中，涉及施用Eph受体结合化合物的方法，这些化合物作为Eph受体家族具体成员的选择性激动剂或拮抗剂。在某些实施方案中，通过给包括人类在内的哺乳动物施用有效量的选择性激动剂，如本文所述的肽、拟肽或小分子，可以利用这些肽、拟肽或小分子激活程序性细胞死亡。在某些实施方案中，激动剂与EphB1、EphB2或EphB4受体结合，由此竞争性抑制Ephrin-B1或Ephrin-B2与受体的结合。在另外一些实施方案中，激动剂的结合刺激受体的磷酸化。

给哺乳动物施用的激动剂的有效量可以是大约0.001mg/kg体重至大约50mg/kg体重每天。该有效量取决于许多因素，包括但不限于施用激动剂的途径、激动剂的结合亲和力、靶细胞中的Eph受体表达水平、非靶细胞中的Eph受体表达水平。然而应当理解，本领域技术人员能够容易地确定激动剂的有效量。

作为治疗剂和治疗递送剂的Eph受体结合化合物

本文所述的Eph受体结合化合物也可以施用给温血动物，包括人类，以在体内调节Eph受体。例如，本文公开的某些肽可以用来选择性激活或抑制EphB1、EphB2、EphB3或EphB4。因此，本发明包括治疗Eph相关疾病的方法，该方法包括施用足以在体内激活或抑制Eph受体的量的这种化合物。

靶向Eph受体也允许治疗性干预癌症和其它疾病。本文所述的Eph受体结合化合物可以用来向患病组织的血管递送细胞毒性制剂。实际上，与化疗药、毒素或促凋亡肽偶联的血管靶向肽可以减弱肿瘤生长、抑制临床关节炎、或者破坏前列腺组织(Arap，W.等人1998Science279：377-380；Olson，T.A.等人.1997 Int J Cancer 73：865-870；Ellerby，H.M.等人1999 Nat Med5：1032-1038；Arap，W.等人.2002 PNAS USA 99：1527-1531；Gerlag，D.M.等人.2001 Arthritis Research3：357-361)。例如，激动剂引起的EphA2的酪氨酸磷酸化介导受体和激动剂的内化(Zantek，N.D.等人.1999CellGrowthDiffer10：629-638；Carles-Kinch，K.等人2002 Cancer Res 62：2840-2847；Van derGeer，P.等人.1994 Annu Rev Cell Biol 10：251-337)，因此，可以在细胞内递送毒性或促凋亡物质，以选择性杀伤细胞(Ellerby，H.M.等人.1999 Nat Med5：1032-1038)。此外，本文所述Eph受体结合化合物诱导的EphA2活化可以削弱表达EphA2的癌细胞的增殖、侵袭和转移行为(Zantek，N.D.等人.1999Cell Growth Differ 10：629-638；Carles-Kinch，K.等人2002 Cancer Res 62：2840-2847；Miao，H.等人Nature 2000 Cell Bio l2：62-69)。本领域中公知EphA2活化与乳腺癌和前列腺癌细胞的恶性程度降低有关，并且逆转EphA2过量表达的转化效应(Zelinski，D.P.等人.2002J Cell Biochem 85：714-720；Zantek，N.D.等人1999 Cell Growth Differ 10：629-638；Carles-Kinch，K.等人2002Cancer Res 62：2840-2847)。当使用本文所述的Eph受体结合化合物递送细胞毒性制剂时，本文公开的组合物引起的EphA2活化可以使细胞对凋亡刺激敏感(Dohn，M.等人2001 Oncogene20：6503-6515)。

本文使用的术语“肿瘤”和“肿瘤性疾病”应当理解为可以导致侵占正常组织的任何异常或不受控制的细胞生长。该术语也包括已经转移的异常或不受控制的细胞生长，即从体内原发位置(即原发肿瘤)向在空间上远离原发肿瘤的继发位置扩散的异常细胞。

预期本文所述的Eph受体结合化合物可以用于治疗多种肿瘤，例如，乳腺癌、前列腺癌、肾癌、卡波西肉瘤、结肠直肠癌、子宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肺癌、脑瘤、皮肤T淋巴细胞瘤、头颈癌、呼吸消化道癌症、胰腺癌、黑素瘤、膀胱癌、肉瘤、粘膜白斑病、急性前髓细胞性白血病等，间充质细胞起源的肿瘤(肉瘤)，即纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜肉瘤、间皮瘤、间皮肉瘤、尤因氏瘤、髓细胞性白血病、单核细胞性白血病、恶性淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、浆细胞瘤、平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤。

另外，预期本文所述的Eph受体结合化合物可以用于治疗肿瘤上皮起源的肿瘤(癌)，即鳞状细胞或表皮癌、基底细胞癌、汗腺癌、皮脂腺癌、腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、未分化癌(单纯癌)、支气管肺癌(bronchogenic carcinomas)、支气管癌、黑素癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、乳头状癌、移行细胞癌、鳞状细胞癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、恶性畸胎瘤和畸胎癌。

本发明的某些实施方案涉及含有与Eph受体结合化合物(如本文所述的肽、拟肽和小分子)连接的治疗剂的偶联物。通过给需要治疗的动物施用适当的该偶联物，可以将这些偶联物递送至表达适当Eph受体的靶细胞。在一些实施方案中，该治疗剂负责治疗。在另外一些实施方案中，该治疗剂和Eph受体结合化合物一起对治疗作出贡献。在一些实施方案中，治疗剂是显像剂。

与目标Eph受体结合的Eph受体结合化合物通过接头与治疗剂连接。该接头可以是任何键、小分子或使Eph受体结合化合物和治疗剂靶向相同区域、组织或细胞的其它载体。优选地，该接头可以被切下。

在一个实施方案中，该接头是一个或多个Eph受体结合化合物与一个或多个治疗剂之间的化学键。该键可以是共价键或离子键。接头是化学键的偶联物的一个例子是融合蛋白。在一个实施方案中，化学键是pH敏感的键。此外，该键也可以不是pH敏感的，但是可以被后来添加的或者天然存在于靶部位微环境中的具体酶或化学物质切开。或者，该键可以是在还原条件下被切开的键，例如二硫键。或者，该键可以不被切开。

可以使用任意种类的pH可切割的或pH敏感的接头。可被酸切开的键的例子包括但不限于：被称为顺式聚羧酸烯的一类有机酸。这类分子至少含有连接到碳链上的三个羧酸基团(COOH)，该碳链含有至少一个双键。关于这些分子的制备和使用在Shen等人的美国专利号4,631,190(引入本文作为参考)中公开。可选择地，也可以使用在弱酸条件下可被切割的分子，如氨基-巯基交联剂。这些分子在Blattler等人的美国专利号4,569,789(引入本文作为参考)中公开。

可选择地，可切割的接头可以是时间释放键，如可生物降解的、可水解的键。典型的可生物降解的载体键包括酯、酰胺或尿烷键，因此典型的载体是分子量约为5,000至1,000,000的聚酯、聚酰胺、聚尿烷和其它缩合聚合物。这些载体/键的例子在Peterson等人的美国专利号4,356,166(引入本文作为参考)中给出。其它可被酸切割的连接体可见于美国专利号4,569,789和4,631,190(引入本文作为参考)或Blattler等人.1985Biochemistry24：1517-1525。这些接头被天然酸性条件切割，或者可选择地，可以在目标部位诱导酸性条件，如Abrams等人的美国专利号4,171,563(引入本文作为参考)所述。

含有可切割的二硫键(可还原键)的连接剂的例子包括但不限于“DPDPB”，“1，4-二-[3′-(2′-吡啶二硫代)丙酰胺基]丁烷；“SADP”，(N-琥珀酰亚氨基(4-叠氮苯基)1，3′-二硫丙酸酯)；“Sulfo-SADP”(磺基琥珀酰亚氨基(4-叠氮苯基二硫代)丙酸酯；“DSP”-二硫代双(琥珀酰亚氨基丙酸酯)；“DTSSP”-3，3′-二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基丙酸酯)；“DTBP”-二甲基3，3′-二硫代双丙酰亚胺酯(dithio bispropionimidate)-2HCl，均从皮尔斯化学公司(Pierce Chemicals)(Rockford，Illinois)获得。

可被氧化切割的连接剂的例子有“DST”-二琥珀酰亚氨基酒石酸酯；和“Sulfo-DST”-二琥珀酰亚氨基酒石酸酯。这些连接体可以从皮尔斯化学公司获得。

不可切割的接头的例子有“Sulfo-LC-SMPT”-(琥珀酰亚氨基6-[α-甲基-α-(2-吡啶基硫代)甲苯酰氨基]己酸酯；“SMPT”；“ABH”-叠氮基苯甲酰基酰肼；“NHS-ASA”-N-羟基琥珀酰亚氨基-4-叠氮基水杨酸；“SASD”-硫代琥珀酰亚氨基2-(对-叠氮基水杨酰胺基)乙基-1，3-二硫代丙酸酯；“APDP”-N-[4-(对-叠氮基水杨酰胺基)丁基]-3′(2′-吡啶基二硫代)丙酰胺；“BASED”-双-[β-(4-叠氮基水杨酰胺基)乙基]二硫化物；“HSAB”-N-羟基琥珀酰亚氨基-4-叠氮基苯甲酸脂；“APG”-对-叠氮基苯基乙二醛一水合物；“SANPAH”-N-琥珀酰亚氨基-6-(4′-叠氮基-2′-硝基苯基-氨基)己酸酯；“Sulfo-SANPAH”-硫代琥珀酰亚氨基6-(4′-叠氮基-2′-硝基苯氨基)己酸酯；“ANB-NOS”-N-5-叠氮基-2-硝基苯甲氧基(benzyoyloxy)琥珀酰亚胺；“SAND”-硫代琥珀酰亚氨基-2-(间-叠氮基-邻-硝基苯甲酰氨基)-乙基-1，3′-二硫代丙酸酯；“PNP-DTP”-对-硝基苯基-2-重氮基-3，3，3-三氟丙酸酯；“SMCC”-琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯；“Sulfo-SMCC”-硫代琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯；“MBS”-间-马来酰亚氨基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯；“sulfo-MBS”-间-马来酰亚氨基苯甲酰基-N-羟基硫代琥珀酰亚胺酯；“SIAB”-N-琥珀酰亚氨基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯；“Sulfo-SIAB”-N-硫代琥珀酰亚氨基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯；“SMPB”-琥珀酰亚氨基4-(对-马来酰亚氨基苯基)丁酸酯；“Sulfo-SMPB”-硫代琥珀酰亚氨基4-(对-马来酰亚氨基苯基)丁酸酯；“DSS”-二琥珀酰亚氨基辛二酸酯；“BSSS”-双(硫代琥珀酰亚氨基)辛二酸酯；“BMH”-双马来酰亚氨基己烷；“DFDNB”-1，5-二氟-2，4-二硝基苯；“DMA”-二甲基己二酰亚胺酯(adipimidate)-2HCl；“DMP”-二甲基庚酰亚胺酯(pimelimidate)-2HCl；“DMS”-二甲基辛二酰亚胺酯(suberimidate)-2HCl；“SPDP”-N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基硫代)丙酸酯；“Sulfo-HSAB”-硫代琥珀酰亚氨基4-(对-叠氮基苯基)丁酸酯；“Sulfo-SAPB”-硫代琥珀酰亚氨基4-(对-叠氮基苯基丁酸酯)；“ASIB”-1-9对-叠氮基水杨酰氨基)-4-(碘乙酰氨基)丁烷；“ASBA”-4-(对-叠氮基水杨酰氨基)丁胺。所有这些接头都可以从皮尔斯化学公司获得。

在另一实施方案中，接头是小分子，如肽连接体。在一个实施方案中，肽接头是不可切割的。在另一实施方案中，肽接头在还原条件下可被碱切割，或者可被具体的酶切割。在一个实施方案中，酶是固有的(indigenous)。或者，小肽可以被在治疗复合物之后或之外施用的非固有的酶切割。或者，小肽可以在还原条件下被切割，例如，当肽含有二硫键时。肽接头的例子包括：聚(L-Gly)，(聚L-甘氨酸接头)；聚(L-Glu)，(聚L-谷氨酰胺接头)；聚(L-Lys)，(聚L-赖氨酸接头)。在一个实施方案中，肽接头具有通式(氨基酸)n，其中n是2-100之间的整数，优选地该肽包含一个或多个氨基酸的聚合物。

在另一实施方案中，肽接头可被蛋白酶切割(Suzuki等人.1998JBiomedMater Res42：112-6)。在一些实施方案中，该接头是可被切割的连接体，包括聚(乙二醇)(PEG)和可被嗜热菌蛋白酶切割的二肽、L-内氨酰-L-缬氨酸(Ala-Val)(Goyal等人.2000Biochem J345：247-254)。

通过本领域公知的偶联物合成技术，即，使用基因工程或化学方法，化学和肽接头可以在Eph受体结合化合物与治疗剂之间键合。偶联物合成可以通过蛋白质与其它部分在适当官能团处的经典偶联反应，经适当的抗体通过化学方法完成。蛋白质中存在的通常用于化学偶联反应的官能团的例子概括如下。碳水化合物结构可以被氧化为醛基，醛基又与含有基团H2NNH-R(其中R是该化合物)的化合物反应，生成C＝NH-NH-R基团。硫醇基(蛋白质中的半胱氨酸)可以与含有硫醇反应基的化合物反应，生成硫醚基团或二硫基团。氨基酸残基中的自由氨基(蛋白质的氨基末端或在赖氨酸上)可以与含有亲电子基团如活化的羧基基团的化合物反应，生成酰胺基。氨基酸残基中的自由羧基可以被转化为反应性羧基，然后与含有氨基的化合物反应，形成酰胺基团。

与Eph受体结合化合物连接的治疗剂可以是获得所需结果的任何化学物质、分子或复合物。其实例包括但不限于常规药物，如抗生素、抗肿瘤药、免疫抑制剂、激素等，一种或多种基因、反义寡核苷酸、小干扰RNA、对比剂、蛋白质、毒素、放射性分子或原子、表面活性蛋白、纳米颗粒或凝固蛋白。治疗剂可以是亲脂性的，其性质将有助于其进入靶细胞。

对比剂可以是本领域技术人员公知的任何类型的对比剂。最常用的对比剂基本上落入以下四组中的一组：X-射线试剂、放射线照相试剂、磁共振显像剂、量子点、纳米颗粒和超声剂。X-射线试剂包括离子型含碘试剂，以及非离子型试剂，如碘海醇(Omnipaque，Nycomed)和优维显(Ultravist，Schering)。放射线照相试剂包括下面公开的放射性同位素。磁共振显像剂包括磁性剂，如钆和三氧化二铁螯合物。超声剂包括气体的微气泡和大量释放气泡的制剂。

放射性核素可以是诊断性的或治疗性的。通常在医学上有用的放射性核素的例子包括：Y、Ln、Cu、Lu、Tc、Re、Co、Fe等，如⁹⁰Y、¹¹¹Ln、⁶⁷Cu、⁷⁷Lu、⁹⁹Tc等，优选三价阳离子，如⁹⁰Y和¹¹¹Ln。

适合通过诊断性γ闪烁光度测定法对器官和组织进行体内成像的放射性核素包括：发射γ射线的放射性核素：¹¹¹Ln、¹¹³mLn、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、^99mTc、⁵¹Cr、¹⁹⁷Hg、²⁰³Hg、¹⁶⁹Yb、⁸⁵Sr和⁸⁷Sr。适合被Fab′片段结合的螯合放射性核素的制剂在美国专利号4,658,839(Nicoletti等人)中教导，该专利引入本文作为参考。

适合在MRI中作为显像剂使用的顺磁性金属离子包括原子序数为57-70的镧系元素，或原子序数为21-29、42或44的过渡金属。美国专利号4,647,447(Gries等人)教导了通过螯合的顺磁性金属离子的MRI成像，其引入本文作为参考。

治疗性放射性核素的例子有β-发射体。合适的β-发射体包括⁶⁷Cu、¹⁸⁶Rh、¹⁸⁸Rh、¹⁸⁹Rh、¹⁵³Sm、⁹⁰Y和¹¹¹Ln。

反义寡核苷酸在治疗正常基因过量表达或异常基因表达引起的任何疾病中具有潜在应用。反义寡核苷酸可以用来减少或终止该基因的表达。可以用反义技术治疗的癌基因的例子和教导了可以使用的具体反义分子的参考文献包括：c-Jun和cFos(美国专利号5,985,558，引入本文作为参考)；HER-2(美国专利号5,968,748，引入本文作为参考)；E2F-1(Popoff等人的美国专利号6,187,587；引入本文作为参考)；SMAD1-7(美国专利号6,159,697；6,013,788；6,013,787；6,013,522；和6,037,142，引入本文作为参考)；和Fas(Dean等人的美国专利号6,204,055，引入本文作为参考)。

还提供了在治疗正常基因过量表达或异常基因表达所引起疾病的RNA干扰方法中使用的双链RNA分子。RNA干扰(RNAi)是转录后RNA降解引起的序列特异性基因沉默的过程，它是由在序列上与沉默化基因同源的双链RNA(dsRNA)启动的。适用于RNAi的双链RNA(dsRNA)含有对应于所靶向基因的约21个连续核苷酸的有义链和反义链，形成19个RNA碱基对，在每个3′末端留下两个核苷酸的突出端(Elbashir等人.2001 Nature411：494-498；Bass，2001 Nature 411：428-429；Zamore，2001 Nat Struct Biol8：746-750)。大约25-30个核苷酸的dsRNA也曾经成功用于RNAi(Karabinos等人.2001 PNAS 98：7863-7868)。dsRNA可以在体外合成，然后利用本领域公知的方法导入细胞内。利用这样的方法，可以降低目标多肽的翻译。

可以用作治疗剂的蛋白质包括当存在于细胞中时诱导凋亡的凋亡诱导剂如pRB和p53(Xu等人.美国专利号5,912,236，引入本文作为参考)，以及在疾病中缺失或表达不足的蛋白质如促红细胞生成素(Sytkowski，等人.美国专利号6,048,971，引入本文作为参考)。

应当理解，治疗剂可以是任何用于肿瘤性疾病的化疗剂，如烷化剂(氮芥、乙烯亚胺，烷基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯)、抗代谢药(叶酸类似物，如氨甲喋呤、嘧啶类似物和嘌呤类似物)、天然产物及其衍生物(抗生素、生物碱类、酶)、激素和拮抗剂(肾上腺皮质类固醇类、孕酮类、雌激素类)，等等。此外，治疗剂也可以是作为抗肿瘤剂的反义寡核苷酸或在肿瘤细胞中激活凋亡的蛋白质。

治疗剂可以是任何类型的神经效应剂，例如，神经递质或神经递质拮抗剂可以靶向至需要的区域而没有在其使用中通常具有的多种副作用的。

治疗剂可以是麻醉剂，如阿片样物质，其可以被特定靶向至疼痛区。使用阿片样物质疼痛缓解剂的患者通常会有副作用，如恶心。本发明的方法将使药物能够非常特异性地定位至需要的区域，例如外科创伤或关节炎情况下的关节处，可以减少副作用。

治疗剂可以是抗炎剂，如组胺、H1-受体拮抗剂和缓激肽。可选择地，治疗剂也可以是非甾体抗炎剂，如水杨酸衍生物、吲哚和茚乙酸和烷酮。可选择地，抗炎剂也可以是用于治疗哮喘的药物，如皮质类固醇、色甘酸钠和萘多罗米。抗炎剂可以与支气管扩张剂如B2-选择性肾上腺素能药物和茶碱一起给药，或者不与其一起给药。

治疗剂可以是利尿剂、后叶加压素激动剂或拮抗剂、血管紧张肽或肾素，它们特异地作用于患者的血压。

治疗剂可以是用于治疗心脏病的任何药物。这些药物包括但不限于有机亚硝酸盐类(亚硝酸戊酯、硝酸甘油、二硝酸异山梨酯)、钙通道阻滞剂、抗血小板和抗血栓形成剂、血管扩张剂、血管抑制剂、抗洋地黄抗体和结节阻滞剂(nodal blocker)。

治疗剂可以是用于治疗原生动物感染的任何药物，如四环素、克林霉素、奎宁类、氯喹、甲氟喹、复方新诺明(甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异噁唑)、甲硝达唑和奥拉明(oramin)。将药物或其它治疗剂靶向至原生动物感染区的能力特别重要，因为这些抗生素药物引起非常常见和严重的副作用。

治疗剂可以是任何抗细菌剂，如磺胺类、喹诺酮类、青霉素类、头孢菌素类、氨基糖甙类、四环素类、氯霉素、红霉素、异烟肼类和利福平。

治疗剂可以是用于治疗真菌感染的任何药物，如两性霉素类、氟胞嘧啶、咪康唑和氟康唑。

治疗剂可以是用于治疗病毒感染的任何药物，如阿昔洛韦、阿糖腺苷、干扰素、病毒唑、齐多夫定、扎西他滨、逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂。也可以设想能够使用诸如毒素、放射性原子和凋亡诱导剂等其它治疗剂来靶向和杀伤病毒感染的细胞。

治疗剂可以选自多种抗凝剂、抗血栓形成剂和抗血小板药物。

应当理解，激素过量产生或产生不足导致的疾病可以用诸如激素(生长激素、雄激素、促性腺素释放激素、甲状腺激素、肾上腺皮质类固醇、胰岛素和胰高血糖素)等治疗剂来治疗。此外，如果激素过量产生，则可以使用该激素的拮抗剂或抗体作为治疗剂。

各种其它可能的治疗剂包括维生素、酶和其它产生不足的细胞成分和毒素如白喉毒素或肉素毒素。

可选择地，治疗剂可以是一般在体外诊断中使用的药物。于是，用常规方法标记配体和连接体，形成信号产生系统的全部或部分。可以通过本领域公知的技术将配体和连接体共价结合到放射性同位素如氚、碳14、磷32、碘125和碘131上。例如，可以通过如氯胺-T方法、通过乳过氧化物酶方法或者通过预先标记的Bolton-Hunter技术引入¹²⁵I。这些技术及其它技术在H.Van Vunakis和J.J.Langone编，Methods in Enzymology，Vol.70，PartA，1980中记载。关于放射性标记的其它例子，参见美国专利号3,646,346和4,062,733，均引入本文作为参考。

可选择地，治疗剂可以是被化学环境的变化或离散的分子剂如酶的作用被转化为相应药物的前药或前分子。优选地，治疗剂与转化前分子所需的特定分子一起给药。可选择地，前分子可以被在目标组织的微环境中发现的天然分子切割。或者，前药是pH敏感的，并且在环境从血液到细胞或细胞内囊泡变化时转化(Greco等人.2001 J Cell Physiol 187：22-36)。

给哺乳动物施用的偶联物的有效量可以是每天约0.001mg/kg体重至约50mg/kg体重。有效量取决于许多因素，包括但不限于偶联物施应用途径、偶联物结合亲和力、靶细胞中的Eph受体表达水平、和非靶细胞中的Eph受体表达水平。然而应当理解，激动剂的有效量可以由本领域技术人员容易地确定。

本发明的另一方面包括药物组合物，其含有本文所述的肽、拟肽或小分子中的至少一种作为活性成分，与药物载体或稀释剂相组合。这些化合物可以经口、肺、肠胃外(肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下注射)、吸入(通过细粉制剂或气雾剂)、经皮、经鼻、经阴道、经直肠或舌下途径给药，并且可以配制为适合各种给药途径的剂型。参见，例如，Bernstein等人的PCT专利公开WO 93/25221；Pitt等人的PCT专利公开WO 94/17784；和Pitt等人的欧洲专利申请613,683，均引入本文作为参考。

用于口服的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉末剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种药学上可接受的惰性载体如蔗糖、乳糖或淀粉混合。这些剂型在通常的实践中也可以包含除惰性稀释剂以外的其它物质，例如，润滑剂，如硬脂酸镁。对于胶囊、片剂和丸剂，剂型还可以包含缓冲剂。片剂和丸剂另外还可以制备有肠溶衣。

用于口服的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、溶液、悬浮剂、糖浆以及酏剂，其中含有在本领域中常用的惰性稀释剂，如水。除了这些惰性稀释剂以外，组合物还可以含有辅料，如湿润剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、调味剂和芳香剂。

用于肠胃外给药的本发明的制剂包括无菌的水性或非水性溶液、悬浮液或乳剂。非水性溶剂或载体的例子有丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和玉米油、明凝、和可注射的有机酯如油酸乙酯。这些剂型还可以含有辅料如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。它们可以除菌，例如，通过保留细菌的滤器过滤，向组合中加入灭菌剂，照射组合物，或者加热组合物。它们也可以在紧接使用前使用无菌水或某些其它的无菌可注射介质来制备。

用于直肠或阴道给药的组合物优选栓剂，其除了活性物质之外还可以含有赋形剂，如可可脂或栓剂蜡。用于经鼻或舌下给药的组合物也可以用本领域公知的标准赋形剂来制备。

含有化合物的组合物可以为预防和/或治疗目的而给药。在治疗性应用中，给已经患有如上所述疾病的患者施用其量足以治愈或者至少部分阻止疾病及其并发症的症状的组合物。足以实现这一点的量被定义为“治疗有效剂量”。用于该应用的有效量取决于疾病的严重程度和患者的体重和一般状况。

本文所述的组合物也可以利用(例如)Tice和Bibi(in：Treatise onControlled Drug Delivery，A.Kydonieus编，Marcel Dekker，N.Y.1992，pp.315-339)的方法装入微胶囊，该文献的全部内容被纳入本文作为参考。

在预防性应用中，给易患特定疾病或具有特定疾病危险的患者施用含有本文公开的化合物的组合物。这种量被定义为“预防有效剂量”。在此应用中，准确的量也取决于患者的健康状况和体重，可以由本领域技术人员容易地确定。

有效治疗所需的Eph受体激动剂的量将取决于许多不同的因素，包括给药方式、靶部位、患者的生理状态、和施用的其它药物。因此，为了优化安全性和有效性应当滴定测量治疗剂量。一般来说，在体外使用的剂量可以对用于原位施用这些试剂的量提供有用的指导。用于治疗特定疾病的有效剂量的动物测试可以为人类剂量提供进一步预测性的指示。例如，以下文献中记载了各种考虑因素：Gilman等人.(编)，1990 Goodman andGilman′s：The Pharmacological Basis of Therapeutics，第8版，Pergamon Press；和Remington′s Pharmaceutical Sciences，第7版，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.(1985)，均引入本文作为参考。

当给药剂量为每天约0.001mg/kg体重至约50mg/kg体重时，本文所述的肽和拟肽在治疗Eph受体介导的疾病中是有效的。根据所治疗的具体疾病、给药途径、以及主治医生根据诸如疾病严重程度、患者年龄和一般状况等因素的判断，来调整使用的具体剂量。该剂量可以由本领域技术人员容易地确定。

对于肠胃外给药，肽可以配制为与药学上可接受的载体相结合的例如溶液、悬浮液、乳剂或冻干粉末。这些载体的例子有水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。也可以使用脂质体和非水载体，如不挥发性油。载体或冻干粉末可以含有保持等渗性(例如氯化钠、甘露醇)和化学稳定性(例如缓冲液和防腐剂)的添加剂。制剂通过常用的技术灭菌。例如，通过将1.5％重量的活性成分溶解在0.9％氯化钠溶液中制备适合注射给药的肠胃外组合物。

本文所述的药物组合物可以作为单一剂量或多剂量给药；作为单独的治疗剂或与其它治疗剂联合给药；以及与常规治疗联合，它们可以相继或同时施用。

化合物可以在时间释放制剂中给药，例如在含有缓释聚合物的组合中给药。活性化合物可以用保护化合物不被快速释放的载体制备，如控释制剂，包括植入体和微胶囊化的递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，如乙烯基乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、聚乳酸和聚乳酸、聚乙醇酸共聚物(PLG)。用于制备这些制剂的许多方法是本领域技术人员公知的。

本文所述的Eph受体结合化合物可以配制为其中该化合物是唯一活性剂的药物组合物。或者，药物组合物可以含有其它活性剂。例如，两种或多种本文所述的Eph受体结合化合物可以联合使用。而且，该肽化合物可以与一种或多种对Eph受体活性具有调节作用的其它药剂组合。

噬菌体展示在识别选择性结合Eph家族成员的肽中的应用

可以利用噬菌体展示分离特异性结合16种已知Eph受体中的每一种的肽。如本文所述，已经分离了几种特异性结合EphB1、EphB2、EphB3或EphB4的噬菌体展示的肽，其中许多选择性地结合。因此，可以利用针对Eph受体家族成员免疫筛选随机肽库来获得选择性结合目标Eph受体的肽。这些克隆可以利用本领域公知的测序技术来识别。可以调整肽库中含有的肽的长度，以获得具有高结合选择性和高结合亲和力的肽。

其它应用

本文所述的化合物在体外可以用作了解Eph受体的生物学作用的独特工具，包括评价被认为影响Ephrin配体产生和受体结合过程以及受其影响的许多因素。本化合物也可用于开发结合并激活Eph受体的其它化合物，因为本化合物提供关于结构与活性之间的关系的重要信息，可以促进这种开发。

该化合物也可以在测定中作为竞争性结合剂，用来筛选新的Eph受体激动剂。在这样的测定实施方案中，本文所述的化合物可以不加修饰而直接使用，或者可以用多种方式修饰；例如，通过标记，例如共价或非共价连接一个直接或间接提供可检测信号的部分。在任何这样的测定中，其材料可以直接或间接标记。用于直接标记的可能性包括标记基团，如：放射性标记，如¹²⁵I，酶(美国专利号3,645,090)如过氧化物酶和碱性磷酸酶，和能够监测荧光强度、波长移动或荧光偏振的变化的荧光标记(美国专利号3,940,475)。用于间接标记的可能性包括一种组分的生物素化，随后与偶联到一种上述标记基团上的亲和素结合。在化合物连接到固体载体上的情况中，该化合物也可以包括间隔区或连接体。

已知核磁共振(NMR)波谱分析能够表征大分子的结构，是一种用于研究与靶分子结合的配体的静止和瞬时特征的技术(Pellecchia，等人.2002Nature Rev Drug Disc1：211)。NMR波谱分析是一种用于测定配体与靶分子结合的有用的工具，具有不需要事先知道蛋白质的功能就能够高灵敏度地检测和定量相互作用的优点。此外，NMR波谱分析可以提供关于靶标和配体的结构信息，以帮助随后优化适合高亲和力先导化合物的弱结合。

通过从已经均匀标记的靶生物分子产生第一和第二核磁共振相关谱来检测配体化合物与靶生物分子的结合的方法在美国专利号5,698,401和5,804,390中报告。第一波谱是在不存在配体时由对靶物质采集的数据产生的，第二波谱是在一种或多种配体的存在下产生的。两种波谱的比较能够确定在推测配体的混合物中哪些化合物与靶生物分子结合。

可以通过向一个或多个氨基酸残基的侧链中掺入¹H、¹³C、¹⁵N和/或¹⁹F来选择性标记Eph受体。被选择性标记的与Eph受体结合配体结合的Eph受体复合物与第二分子接触，通过NMR波谱分析检测任何分子的相互作用。例如，可以利用2D13C，1H-HMQC(异核多级量子相干)和13C-编辑的1H，1H-NOESY NMR实验来检测分子的相互作用，以及确定任意复合物的解离常数。另外，可以基于靶标的三维结构并且根据配体相对于标记侧链的相对位置产生预测模型。在单一的选择性标记的靶分子中使用几种不同的标记侧链将提高模型的分辨率以及预测性能。

因为非肽小分子可能比肽更适合于临床开发，因此可以使用高通量筛选来筛查化学文库，以筛选破坏Eph-Ephrin复合物的小分子。该测定使用与Ephrin-碱性磷酸酶融合蛋白络合的固定的Eph受体胞外域。降低结合的碱性磷酸酶活性的能力将识别出Eph-Ephrin相互作用的小分子抑制剂。

另外，基于它们选择性结合Eph受体的能力，本文所述的肽可以作为试剂用于选择性检测活细胞、固定的细胞、生物液体、组织匀浆、纯化的天然生物材料等之中的Eph受体。例如，通过标记本文所述的肽，可以选择性识别在其表面上具有诸如EphB1、EphB2、EphB3或EphB4等受体的细胞。另外，基于它们与Eph受体结合的能力，这些肽可以用于原位染色、FACS(荧光激活细胞分类)、Western印迹分析、ELISA等。另外，基于它们选择性结合Eph受体的能力，这些肽可以用于受体纯化，或者用于纯化在细胞表面上(或在被透化细胞的内部)只表达特定Eph受体的细胞。

本文所述的化合物也可以作为商品试剂用于各种医学研究和诊断应用。这些应用包括但不限于：(1)在多种功能测定中用作定量候选Eph激动剂的活性的校准标准；(2)用于保持Eph依赖性细胞系的增殖和生长；(3)用于通过共结晶对Eph受体配体结合界面进行结构分析；(4)用于研究Eph信号传导/受体激活的机制；(5)其它研究和诊断应用，其中Eph受体优选地被激活，或者这种激活方便地根据已知量的Eph激动剂校准，等等；(6)其它研究和诊断应用，其中Eph受体优选地被抑制，或者这种抑制方便地根据已知量的Eph拮抗剂校准，等等。

实施例1

与不同EphB受体结合的肽的识别

为了识别EphB受体结合肽，通过羧基末端六组氨酸标记，基于与人Fc融合并固定在镍包被的孔上的EphB1、EphB2或EphB4胞外域免疫筛选展示12个氨基酸长的随机肽的M13噬菌体文库(R&D Systems，Minneapolis，MN)(图1)。使用与辣根过氧化物酶偶联的抗噬菌体抗体(M13噬菌体检测试剂盒，Amersham Biosciences)，以2，2-连氮-双(3-乙基苯噻唑啉-6-磺酸)作为底物，对与1μg/ml Eph受体Fc融合蛋白包被的Ni-NTA孔结合的噬菌体进行定量。在不存在EphB4Fc的情况下确定从测定值中减去的背景。组氨酸标记的EphB胞外域Fc融合蛋白在4℃下在镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)-包被的ELISA孔中温育过夜，其在Tris-缓冲盐水(TBS)(150mM NaCl，50mMTris-HCl，pH7.5)中浓度为10μg/ml，例外是第3.2和第4轮的EphB2和EphB4，它们的浓度为1μg/ml。将孔用TBS中的0.5％牛血清白蛋白(BSA)封闭1小时，用结合缓冲液(TBS，1mM CaCl₂，0.1％Tween-20，或对于EphB2和EphB4第3.2和第4轮为0.5％Tween-20)洗涤。在第1轮免疫筛选中，2×1011噬斑形成单位(PFU)的噬菌体文库在100μl结合缓冲液中在EphB受体包被的孔中室温温育1小时。洗涤后，剩余的结合的噬菌体用100μl0.2M甘氨酸-HCl，pH2.2洗脱10分钟，用15μl1M Tris-HCl，pH9中和。使用整个洗脱液感染对数早期的ER2738宿主细菌，在37℃下扩增4.5小时。按照生产商的推荐将噬菌体浓缩并贮存。在后面的轮次，将来自上一轮的2×1011PFU的扩增噬菌体集合体加到EphB Fc包被的孔和BSA包被的孔中。除了为了评价富集而在扩增之前滴定洗脱的噬菌体以外，如第1轮所述免疫筛选噬菌体。在第一轮免疫筛选(1^*)后回收的噬菌体不进行定量，以确保能够回收含量极少的克隆。

对EphB4进行两次免疫筛选实验。第一次在图1A中显示，第二次在图1D中显示。进行两次实验是因为第一次免疫筛选实验(图1C)产生只展示三个不同序列的受体结合噬菌体克隆(表1)。示出了第2-4轮的噬菌体的PFU(噬斑形成单位)，误差条表示标准差。在EphB1免疫筛选中(A)，在第3、4轮只计数肽展示噬菌体产生的蓝色噬斑，因为存在许多白色噬斑(代表不展示任何肽的噬菌体)。在EphB2免疫筛选(B)和第二次EphB4免疫筛选中，第3轮从第2轮开始重复两次，其中使用两种不同浓度的受体胞外域包被孔：10μg/ml用于第3.1轮，1μg/ml用于第3.2轮。在EphB2和EphB4的第4轮(使用来自第3.2轮的噬菌体进行)，用1μg/ml受体包被孔。在其它所有轮次，用10μg/ml受体进行包被。

来自不同免疫筛选轮次的各噬菌体克隆证实与用于其分离的EphB受体结合，测序以识别其展示的肽，并且根据其序列中的前4个或前5个氨基酸命名(表1)。也确定了噬菌体克隆对于不同哺乳动物EphB受体的结合选择性(表1)。令人感兴趣的是，通过对EphB1或EphB2免疫筛选识别的许多克隆与这两种受体都结合，而通过对EphB4免疫筛选分离的克隆都与该受体高选择性结合。与此一致，肽序列的比对(表1)显示在EphB1-和EphB2-结合肽之间具有相似性，而EphB4-结合肽具有更多不同的序列。例如，通过对EphB1免疫筛选识别的THWK噬菌体克隆以及通过对EphB2免疫筛选分离的除一个克隆之外的所有克隆都展示含有基序HW的相关肽(表1)。该基序在所有EphB4-结合噬菌体克隆中都不存在。有趣的是，EWLS EphB1特异性克隆含有序列SPNL，该序列在Ephrin-B2和Ephrin-B3的G-H环中被发现，而EphB4-结合TNYL和FSPQ肽分别含有序列FSPN和FSP，该序列在Ephrin-B1和Ephrin-B2的G-H环中被发现。其它两个EphB4-结合克隆(DALN和DHNH)含有序列NxWxL(其中x是非保守氨基酸)，该序列在Ephrin-B2和Ephrin-B3的G-H环中存在。其它EphB4-结合克隆只相对于Ephrin G-H环的羧基末端一半进行比对。使用不同噬菌体浓度获得的结合曲线表明这些克隆对于EphB4具有较低的结合亲合力。

实施例2

不同的肽彼此竞争结合用于其分离的EphB受体

为了确定不同的噬菌体克隆是否针对重叠的Eph受体结合部位，化学合成EWLS EphB1结合肽和TNYL EphB4结合肽。选择这些肽，因为它们含有在Ephrin中发现的基序并且当它们在噬菌体上展示时分别与EphB1或EphB4特异性结合(表1)。使用Fmoc(N-(9-芴基)甲氧羰基)化学法合成肽，通过高压液相层析纯化。合成生物素化的肽，其具有羧基末端GSGSK连接体，其中生物素连接到赖氨酸的侧链上，或者具有连接到羧基末端N-生物素基-N′-Fmoc-乙二胺(Novabiochem)的羧基末端GSGS序列。使用基质辅助激光解吸附电离-飞行时间质谱法证实正确的肽合成和纯度。将肽的贮存溶液溶解在磷酸缓冲液(PBS，Irvine Scientific)中，证实pH约为6.5。WHWT肽在含水缓冲液中的溶解度较低，因此溶解在15％DMSO的PBS溶液中。肽浓度基于OD₂₈₀计算。

也合成并在多个噬菌体克隆上展示了SNEW EphB2结合肽，它是识别为与EphB2高选择性结合的几种肽之一(表1)。也合成了其它几种肽。它们的选择是基于标准的组合，包括：(i)肽与Ephrin-B G-H环的序列相似性；(ii)分离的展示该肽的噬菌体克隆数；和(iii)不同基序的显现(表1)。

为了测定肽对噬菌体与EphB受体结合的竞争，Eph胞外域Fc包被的Ni-NTA孔与各种浓度的肽在结合缓冲液(100μl/孔)中室温温育30分钟。然后将用结合缓冲液以1∶500至1∶10,000稀释的噬菌体克隆的浓缩贮存液加到孔中，室温下1小时。洗孔，使用抗M13抗体检测结合的噬菌体。在一些实验中，使用具有与Eph结合肽序列无关的序列(RTVAHHGGLYHTNAEVK，SEQ ID NO：40)的生物素化对照肽作为阴性对照，如图例所述。

为了测定肽与Eph受体结合的特异性，将生物素化的肽以10μM的浓度固定在链霉抗生物素包被的板上(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)，并与2.5μg/ml的不同Eph胞外域Fc融合蛋白在结合缓冲液中温育1小时。使用对硝基苯磷酸盐作为底物(Pierce)，用与碱性磷酸酶(Promega)偶联的抗-Fc抗体检测结合的受体。通过省略Eph胞外域确定从测定值中减去的背景。

EWLS、SNEW和TNYL肽以浓度依赖性的方式有效抑制相应噬菌体克隆与固定化的适当EphB受体的结合(图2A、B、C)，RTVA(见实施例1)用作对照肽。

每种肽也抑制用相同EphB受体分离的所有其它噬菌体克隆的结合(见图2D、E、F、G)。具体来说，5μM的EWLS肽抑制EphB1与通过对EphB1免疫筛选分离的噬菌体克隆的结合(图2D)。在两组中使用SNEW作为对照肽。25μM的SNEW肽抑制EphB2与通过对EphB2免疫筛选分离的大多数噬菌体克隆的结合(图2E和G)。仅有的例外是IHWP、DHRWV和WHWT克隆。然而，50μM的SNEW肽抑制了这些克隆的结合，特别是在噬菌体浓度减半时。在(E)中使用RTVA作为SNEW噬菌体的对照肽，在(G)中使用SNEW作为TNYL EphB4结合噬菌体的对照肽。25μM的TNYL肽抑制EphB4与通过对EphB4免疫筛选分离的噬菌体克隆的结合，例外是DALN克隆(图2F)。在(C)和(F)中使用SWL EphA2结合肽(Koolpe，M.等人.2002JBiolChem277：46974-46979)作为对照肽。DALN肽(而不是DHNH和NPVI肽)以浓度依赖性的方式抑制DALN噬菌体与固定的EphB4胞外域的结合(图2H)。用与HRP偶联的抗-M13抗体检测结合的噬菌体，并将在肽存在下的噬菌体结合相对于不存在该肽的情况下的噬菌体结合标准化。误差条表示两次重复测定的标准差，是考虑误差传播计算的。

这些结果表明除一种肽以外，所有通过对EphB受体免疫筛选识别的肽都与该受体的相同区域结合。基于一些肽与Ephrin G-H环的序列相似性，推测共同结合部位对应于Eph受体的Ephrin高亲和力结合界面。

实施例3

选择性拮抗Ephrin与EphB1、EphB2和EphB4受体结合的肽

如果它们以足够的亲和力相互作用，预期与Ephrin结合相同受体区的肽将抑制Eph受体-Ephrin结合。检测了大量合成肽抑制碱性磷酸酶标记的Ephrin-B2(Ephrin-B2-AP)与EphB受体结合的能力(图3)。大多数肽合成有生物素标记，并且固定在链霉抗生物素板上，以证实它们捕获用于其分离的EphB胞外域的能力。

在指定的肽存在下测定Ephrin-B2AP与指定的固定化EphB受体胞外域的结合，并且通过测定碱性磷酸酶活性来检测。在检测抑制Ephrin与EphB受体结合的能力的肽中，EWLS和AHTF抑制Ephrin与EphB1的结合；SNEW(而不是DHWRI、SHWP或SHWT)抑制Ephrin与EphB2的结合；TNYL和DHNH(而不是NPVI或DALN)抑制Ephrin与EphB4的结合(图3A、C、E、G)。至于将二聚体Ephrin-B2 AP的结合抑制50％的生物素化肽的浓度(IC50)，EWLS约为10μM，AHTF约为150μM，SNEW约为15μM，TNYL约为50μM，DHNH约为200μM(图3A、C、E、G和表1)。合成的没有羧基末端生物素化连接体的EWLS和SNEW肽的IC₅₀值相似，而未生物素化TNYL肽的IC₅₀大大高于生物素化的TNYL(150μM)。用不同EphB胞外域包被的孔与Ephrin-B2AP和50μM的指定肽一起温育。将肽存在下Ephrin-B2AP的结合相对于不存在该肽的情况下的结合标准化。除了FSPQ和EWYM以外，所有肽都被生物素化。只有IPWT肽不能与EphB受体(EphB4)结合，这可能是因为其亲和力太低。因此，IPWT不用于进一步的实验。EWYM、TYFD和FSPQ肽合成不具有生物素标记，因此直接检测Ephrin-B2结合的抑制。EWLS、SNEW和TNYL肽是选择性的，因为它们只拮抗Ephrin与一种EphB受体的结合(图3B、D、F)。相反，AHTF肽抑制Ephrin与几种EphB受体的结合。

实施例4

SNEW肽抑制EphB2信号传导和生物学效应

COS细胞与SNEW肽预温育以浓度依赖性方式阻断了Ephrin-B1Fc诱导内源EphB2的酪氨酸磷酸化，因而阻断了内源EphB2的诱导激活的能力(图4A)。在指定浓度的SNEW肽和对照RTVA肽的存在下，在用Ephrin-B1Fc或作为对照的Fc刺激后，从COS细胞中免疫沉淀EphB2。对于EphB2免疫沉淀，COS细胞在DME高葡萄糖中血清饥饿3小时，之后在存在或不存在EphB2结合肽或对照肽的情况下，用1μg/mlEphrin-B1Fc或Fc蛋白刺激。对于EphB4免疫沉淀，在存在或不存在TNYL-RAW肽的情况下，用0.5μg/ml Ephrin-B2Fc或Fc蛋白刺激MCF-7细胞。在Ephrin刺激后，细胞在含有蛋白酶抑制剂和1mM原钒酸钠的改良的RIPA缓冲液(150mM NaCl，1mM EDTA，1％TritonX-100，1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，20mM Tris pH8.0)中裂解。细胞裂解物用5μg EphB2抗体或10μgEphB4抗体免疫沉淀。通过在2×SDS样品缓冲液中煮沸洗脱免疫沉淀物，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并通过用过氧化物酶偶联的抗磷酸酪氨酸抗体(TransductionLaboratories，San Diego，CA)进行免疫印迹分析来探查。然后剥下免疫印迹，用EphB2抗体或单克隆EphB4抗体(Zymed)再次探查，然后用第二抗兔IgG或抗小鼠过氧化物酶偶联的抗体再次探查。

通过与抗磷酸酪氨酸抗体(PTyr)进行免疫印迹分析来探查滤膜，并且用EphB2抗体再次探查，以证实等量的免疫沉淀的受体。

此外，SNEW抑制在Ephrin-B1Fc刺激EphB2信号传导时发生的COS细胞收缩表型(图4B，C)。在用1.5μg/mlEphrin-B1Fc处理后，COS细胞的外周收缩，留下刺突样突起。在存在或不存在400μM SNEW的情况下，使用以及不使用Ephrin-B1Fc(B1)，对具有刺突的细胞百分比的定量在(B)中显示。细胞形态的代表性实例在(C)中显示。将COS细胞涂布到盖玻片上，16小时后在含0.5％胎牛血清的DME中饥饿3小时。然后将细胞与在PBS中的400μM SNEW或对照肽一起温育20分钟，或者使用等体积的PBS作为对照，然后不加处理或者用1.5μg/ml Ephrin B1-Fc(R&D Systems，Inc.)刺激10分钟。然后将细胞在4％甲醛中固定，在0.1％TritonX-100的PBS溶液中透明，用Alexa594-标记的鬼笔环肽(Molecular Probes)染色，封固在载玻片上。对照肽：RTVA。因此，SNEW可以用来阻断EphB2受体的生物学效应。相反，浓度高达200μM的EWLS不抑制Ephrin-B1Fc刺激人主动脉内皮细胞后内源性EphB1的酪氨酸磷酸化，浓度高达350μM的TNYL不抑制Ephrin-B2Fc刺激MCF7和MDA-MB-231乳腺癌细胞后内源性EphB4的酪氨酸磷酸化。

实施例5

作为靶向剂的EphB结合肽

除了抑制Eph受体与Ephrin结合并引发生物应答的能力外，EphB结合肽还能够将其它分子如药物或显像探针选择性靶向至表达EphB受体的细胞。一种测定肽之受体结合特异性的严格测定法使用固定在链霉抗生物素平板上的生物素化肽，该平板高亲合力地捕获二聚EphB Fc(表观解离常数在低nM范围内)。生物素化的肽固定在链霉抗生物素包被的平板上，用来捕获Eph受体Fc蛋白。使用与碱性磷酸酶偶联的抗Fc抗体检测结合的受体，并相对于具有最高受体结合的孔的值进行标准化。这些实验显示，检测的EWLS和所有EphB4结合肽分别与EphB1或EphB4选择性结合，而不与任何其它A类或B类Eph受体结合，而SNEW除与EphB2结合外还表现出与EphA3有一定的结合(图5A、C、D和E)。相反，AHTF、SHWPI、WHWT和DHRWI肽的特异性较低，表现出与几种EphA和EphB受体的实质性结合。

实施例6

肽的结合稳定性

通过pull-down实验检测肽以稳定方式结合的能力，这对于靶向和竞争性抑制都是重要的。对于肽pull-down实验，在60em平板中70％汇合的细胞或成年小鼠脑组织溶解在pull-down缓冲液(50mM HEPES pH7.5，150mM NaCl，10％甘油，1％Triton-X100，5mM KCl和1mM EDTA)中。3μg生物素化肽与5μl链霉抗生物素琼脂糖珠(Sigma)一起温育45-90分钟，洗去未结合的肽，将珠与细胞裂解液一起温育45-90分钟。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离与珠结合的蛋白质，通过与EphB1、EphB2或EphB4抗体进行免疫印迹分析来探查。EphB1抗体(Santa Cruz)用第二抗山羊IgG过氧化物酶偶联的抗体(BioRad Laboratories)检测。EphB2和EphB4抗体是亲和纯化的抗GST融合蛋白的多克隆抗体，该融合蛋白含有来自EphB2或EphB4受体的羧基末端尾的大约100个氨基酸(Noren，N.K.等人.2004PNASUSA101：5583-5588；Holash，J.A.和Pasquale，E.B.1995DevelBiol172：683-693)，并且用第二抗兔IgG过氧化物酶偶联的抗体(AmershamBiosciences)检测该抗体。

使用固定在链霉抗生物素珠上的EWLS、SNEW和TNYL肽，从小鼠脑或培养的细胞的裂解液中分离内源性EphB受体(图5B、F、G和H)。固定在链霉抗生物素珠上的EWLS、SNEW和TNYL肽与来自组织和细胞系的EphB受体稳定结合。NPVI肽与来自MCF7乳腺癌细胞系的内源性EphB4的结合检测不到，但是与被转染的293T人胚肾细胞高度表达的EphB4结合，用RTVA作为EphB4pull down的对照肽。NPVI肽能够从被转染的细胞中分离EphB4，但是不能从MCF7细胞中分离低水平存在的内源性EphB4(图5B、F、G和H)。这些结果表明，EWLS、SNEW和TNYL缓慢解离，因此介导在洗涤步骤中保持的稳定结合。与包被了其它肽的珠结合的EphB受体检测不到。当单独或一起使用时，DALN和DHNH肽无效，尽管噬菌体竞争实验提示这两种肽与EphB4的不同位点结合并由此预期它们可能协同作用。

实施例7

肽的靶向

为了证明EphB受体结合肽的靶向能力，利用TNYL肽来介导荧光链霉抗生物素包被的量子点纳米晶体与表达转染的以及内源性EphB4的细胞的结合。对于对表达转染的EphB4的细胞进行标记，使用SuperFect转染试剂，用3μg编码与增强的绿色荧光蛋白(EGFP)融合的EphB4胞外域和跨膜域的质粒(Ogawa，K.等人.2000Oncogene19：6043-6052)或3μg作为对照的编码法尼基化EGFP(pEGFP-F)的载体(BD Biosciences Clontech)转染6cm平板中的COS细胞。转染1天后将细胞涂布在盖玻片上，转染2天后标记。对于标记实验，20nM链霉抗生物素偶联的Qdot655量子点(Quantum Dot Corp.)与500nM生物素化TNYL肽在量子点结合缓冲液(1mM CaCl₂，2％BSA，在PBS中)中在冰上预孵育20分钟。细胞与含有结合的TNYL肽的量子点或者作为对照的不含肽的量子点在4℃下孵育20分钟，用冰冷的1mMCaCl₂的PBS溶液洗涤。为了对内源表达EphB4的细胞进行标记，将涂布在包被了纤连蛋白(10μg/ml)的盖玻片上的MCF-7细胞与用量子点结合缓冲液稀释的100μM生物素化TNYL肽在4℃下孵育20分钟。然后用冰冷的1mM CaCl₂的PBS溶液洗涤细胞，随后与20nM链霉抗生物素量子点在4℃下孵育20分钟。在标记后，细胞在4％甲醛/4％蔗糖中固定10分钟，用0.05％Triton-X100的PBS溶液透明5分钟。核用DAPI复染，盖玻片用ProLong Gold封固剂(Molecular Probes)封固在载玻片上，在荧光显微镜下成像和照相。绿色荧光蛋白标记出被转染的细胞。TNYL Qdots标记出EphB4ΔC-EGFP转染的细胞而不标记EGFP-转染的细胞或未转染的细胞。

表达内源性EphB4的MCF7细胞也被与TNYL结合的量子点标记，但是不被不含肽的对照量子点标记。内源性表达EphB4的MCF-7人乳腺癌细胞在含有10％胎牛血清、0.01mg/ml牛胰岛素和Pen/Strep的Eagle最低基础培养基(MEM)(ATCC)中生长。内源性表达EphB2的COS细胞和293人胚肾(HEK)细胞在含有高葡萄糖(Irvine Scientific)和10％胎牛血清、丙酮酸钠和Pen/Strep的Dulbecco改良的Eagles培养基(DME)中培养。使用SuperFect转染试剂(Qiagen)，用9μg在pcDNA3中的EphB4cDNA和1μg增强的绿色荧光蛋白质粒(BD Biosciences Clontech)转染10cm平板上的293HEK细胞，以证实转染效率。转染1天后将细胞传代，在转染2天后用于进行pull-down实验。用DAPI标记转染的和未转染的细胞的核。显示TNYL也能够与EphB4结合，甚至在细胞用4％甲醛固定后仍能结合，表明受体上的肽结合部位未被固定操作所破坏。

实施例8

TNYL EphB4结合肽的优化

对EphB4结合肽序列的检查揭示了这些肽中的共有基序GP(见下文)和RAW，它们对应于Ephrin G-H环的羧基末端部分对齐(表1)。GP基序与TNYL的GP基序对齐，RAW基序紧接TNYL的最后一个氨基酸精确地对齐。这提示在羧基末端含有RAW共有基序的TNYL肽可以更好地与EphB4结合。对于肽和Ephrin-B2碱性磷酸酶融合蛋白(Ephrin-B2AP)之间的竞争测定，调整所用的Ephrin-B2AP的浓度，使不同的EphB受体获得类似的信号(0.135-1.45OD min^-1ml^-1)。Ephrin-B2AP与不同浓度的肽在用1μg/mlEph受体Fc包被的Ni-NTA孔中共温育1小时。数次洗涤后，使用对硝基苯基磷酸酯作为底物对结合的Ephrin-B2-AP进行定量。不含EphB Fc的孔的碱性磷酸酶活性作为背景减去。制备该TNYL-RAW肽的非生物素化形式(TNYLFSPNGPIARAW，SEQ ID NO：39)，发现其抑制Ephrin-B2AP与EphB4的结合，IC50约为15nM(图6A)。明显地，该值比非生物素化TNYL的IC50(约150μM)低10,000倍(图6A)，与二聚Ephrin-B2Fc的IC50(约9nM)相当(图6B)，其中使用Ephrin-Al Fc作为对照。在这些实验中，两种肽不被生物素化。尽管结合EphB4的能力显著提高，但是TNYL-RAW肽保持高选择性，并且在比足以抑制Ephrin结合的浓度高得多的浓度下不抑制Ephrin与其它EphB受体的结合事件(图6C)，其中TNYL-RAW肽(10μM)抑制Ephrin-B2AP与固定的EphB4胞外域的结合，但是不抑制与其它EphB胞外域的结合。在肽存在下，将Ephrin-B2-AP的结合相对于在(A)和(B)中不含肽条件下的结合标准化。TNYL-RAW肽也以浓度依赖性的方式抑制由Ephrin-B2Fc刺激MCF7细胞诱导的EphB4酪氨酸磷酸化以及基础EphB4酪氨酸磷酸化，基础EphB4酪氨酸磷酸化可能是由于内源表达的低水平Ephrin-B2的刺激引起的(图6D)。在用Ephrin-B2Fc刺激(Fc刺激作为对照)后，从MCF7乳腺癌细胞中免疫沉淀内源性EphB4，通过与抗磷酸酪氨酸抗体(PTyr)进行免疫印迹分析来探查。10秒的暴露显示TNYL-RAW肽抑制Ephrin-B2Fc诱导的EphB4的磷酸化，而2分钟的暴露显示该肽也抑制低水平的EphB4磷酸化，这种低水平的EphB4磷酸化可能是由于内源表达的Ephrin-B2引起的。滤膜用EphB4抗体再次探查，以证实等量的免疫沉淀的受体。

尽管只有某些肽含有在B类Ephrin-B的G-H环中保守的氨基酸(表1中的斜体和黑体)，但是这些肽之间的相似性允许进行总体比对(表1)。在筛查中识别的最佳EphB1-和EphB4-结合肽EWLS和TNYL具有与Ephrin G-H环的氨基末端部分共有的四个连续氨基酸，G-H环的氨基末端对该环与Eph受体接触贡献最大的部分(Himanen，J.P等人.2001Nature414：933-938)。然而，每种肽也具有不同的序列特征，这与它只与一种EphB受体选择性结合相一致。

比对揭示了这些肽的其它令人感兴趣的特征。大多数肽具有与EphrinG-H环尖部的色氨酸相对应的脯氨酸(Himanen，J.P等人.2001Nature414：933-938)。尽管脯氨酸与色氨酸不相似，但是它在肽中引入了弯曲，这可以模拟G-H环尖部的弯曲(Himanen，J.P等人.2001Nature414：933-938)。进一步支持脯氨酸可能在结构上重要的观点的是，在许多EphB4结合肽中，甘氨酸位于脯氨酸之前，并且已知在适当的序列中甘氨酸-脯氨酸(GP)基序通过促进β-发夹结构(甚至在不存在二硫键的情况下)大大稳定了短肽的结构(Blanco，F.等人.1998Curr OpinStruct Biol8：107-111；Neidigh，J.W.等人.2002Nat Struct Biol9：425-430；Song，J.等人.2002Biochemistry41：10942-10949)。已知GP基序在与促红细胞生成素受体结合的高亲和力环肽中起关键作用(Wrighton，N.C.等人.1996Science273：458-464；Livnah，O.等人.1996Science273：464-471)。在这个促红细胞生成素模拟肽中，GP基序引入了一个连接两个短β-链的β-折叠结构，它也介导与促红细胞生成素受体的重要的接触。展示含有中心GP基序的环肽的几种噬菌体文库已经成功用于识别与细胞表面受体高亲和力结合的结构限制的肽(Fairbrother，WJ.等人.1998Biochemistry37：17754-17764；Cwirla，S.E.等人.1997Science276：1696-1699；Lowman，H.B.等人.1998 Biochemistry 37：8870-8878)。令人感兴趣的是，含有GP基序的EphB4结合肽从非偏好的(unbiased)线性肽库中分离。

在EphB1-和EphB2-结合肽中，脯氨酸的前面不是甘氨酸，表明GP基序诱导的特定类型的β-折叠(Blanco，F.等人.1998Curr Opin Struct Biol8：107-111)对于与这些其它EphB受体的结合部位的相互作用来说不是重要的。THWC EphB2-结合肽是不含保守脯氨酸的少数几种肽之一。然而，这种肽可能是二硫键合的环肽，形成具有尖部的环，对应于Ephrin G-H环的尖部(Himanen，J.P等人.2001 Nature 414：933-938)。这支持了尽管所识别的大多数肽具有不同的机制但都模拟Ephrin的G-H环的观点。最后，不同于在大多数其它肽中发现的脯氨酸，三种EphB4结合肽含有色氨酸，色氨酸在EphB4的优选配体Ephrin-B2的G-H环中保守(Bennett，B.D.等人.1995PNAS USA92：1866-1870)。

如以上所证明的，将不同基序连接在一起极其有效地提高了结合亲和力。TNYL-RAW肽抑制二聚体Ephrin-B2AP与EphB4的结合，IC50值约为15nM，这表明TNYL-RAW与EphB4结合的KD与单价Eph-Ephrin相互作用的KD(EphB2-Ephrin-B2为16nM，EphA3-Ephrin-A5为10-12nM)在相同范围内(Lackmann，M.等人.1997J BiolChem272：16521-16530；Himanen，J.P.等人.1998Nature396：486-491；Smith，F.M.等人.2004J BiolChem279：9522-9531)。实际上，二聚体Ephrin-B2Fc的IC50值只是略低(约9nM)。考虑到在该肽中不含二硫键，TNYL-RAW作为拮抗剂的能力是明显的。这表明TNYL-RAW肯定具有适当限制的构象，以避免在EphB4结合时大的熵损失，熵损失将会损害结合亲和力。

根据与EphB1或EphB2的结合而识别的许多肽能够与这两种受体结合(表1)，表明这些受体的Ephrin结合袋密切相关。实际上，对于与Ephrin-B2之间的高亲和力界面有贡献的EphB2的残基(Himanen，J.P等人.2001Nature414：933-938)在EphB1中高度保守(在小鼠序列之间有85％的氨基酸同一性)，但是在EphB4中不保守(42％的同一性)。总体上，小鼠EphB1和EphB2的Ephrin结合域彼此有77％相同，但是与小鼠EphB4的Ephrin结合域分别只有46％和43％相同。

实施例9

在癌症治疗中施用EphB受体结合肽

通过各种诊断方法确定一名患者需要进行结肠直肠癌治疗。给该患者施用治疗有效量的EphB受体结合肽。在这种治疗后，观察到患者的结肠直肠癌减少。

实施例10

在癌症治疗中施用EphB受体结合肽

通过各种诊断方法确定一名患者需要对与异常血管生成有关的肿瘤性疾病进行治疗。在手术和/或化学治疗前给患者施用治疗有效量的EphB受体结合肽，以减少肿瘤的新血管形成，从而诱导肿瘤的皱缩。在这种治疗后，观察到肿瘤的尺寸变小。

实施例10

在慢性疼痛治疗中施用EphB受体结合肽

给一名主诉神经性疼痛的患者施用治疗有效量的EphB受体结合肽。发现并检测到在该患者疼痛水平降低。

实施例11

在脊髓损伤治疗中施用EphB受体结合肽

给一名脊髓损伤患者施用治疗有效量的抑制EphB受体活性的EphB受体结合肽。刺激损伤部位的神经再生。在这种治疗后，在患者的刺激部位观察到神经再生。

表1.EphB受体结合肽

^a免疫筛选的轮次用上标标出，1st是对EphB4的第一次免疫筛选。

^b合成肽的名称以下划线标出；^c通过目视比对，人Ephrin的G-H环以下划线标出。

^d>25的值用黑体标出。

^e将Ephrin-B2AP结合抑制50％所需的肽的浓度；^f生物素化的肽和非生物素化的肽获得相同的结果；^g受溶解度限制；

^h该值用生物素化的肽获得，而非生物素化的肽的IC₅₀为150μM；nd，未测定。

为了清楚和理解的目的已经详细描述了本发明，但是本领域技术人员应当理解，在不背离本发明的真实范围的情况下，可以在形式和细节上进行各种变化。以上提到的所有附图、表、附录、专利、专利申请和出版物都引入本文作为参考。

序列表

<110>伯纳姆研究所

帕斯夸里，埃琳娜B.

库尔普，米切尔

<120>EphB 受体结合肽

<130>BURNHAM.012VPC

<150>US 60/647,852

<151>2005-01-27

<160>40

<170>PatentIN 3.2

<210>1

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>1

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1 5 10

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<213>人工序列

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<223>合成肽

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<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>3

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1 5 10

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<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>4

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1 5 10

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<211>12

<212>PRT

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<220>

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<400>5

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1 5 10

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<212>PRT

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<220>

<223>合成肽

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<220>

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<220>

<223>合成肽

<400>8

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<220>

<223>合成肽

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<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>18

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<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>19

Glu Trp Tyr Met Lys Phe Pro Pro Glu His Tyr Phe

1 5 10

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<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>20

Asp Ala Leu Asn Asp Trp Leu Leu Phe Arg Pro Trp

1 5 10

<210>21

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>21

Asp His Asn His Asn Leu Tyr Asn Pro Trp Arg Leu

1 5 10

<210>22

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>22

Thr Tyr Phe Asp Phe Gln Ala Trp Ser Ile Arg Ala

1 5 10

<210>23

<21l>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>23

Glu Phe Phe Thr Trp Arg Pro Thr Tyr Tyr Gly Ile

1 5 10

<210>24

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>24

Thr Asn Tyr Leu Phe Ser Pro Asn Gly Pro Ile Ala

1 5 10

<210>25

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>25

Phe Ser Pro Gln Gly Pro Ala Ala Arg Asn Phe Ala

1 5 10

<210>26

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>26

Leu Pro His Gly Pro Val Ala Ala Trp Asp Ala

1 5 10

<210>27

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>27

Asn Pro Val Ile Gly Pro Ile Gln Arg Ala Trp Thr

1 5 10

<210>28

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>28

Ser His Val Gly Pro Ile Met Arg Ala Trp Ala Pro

1 5 10

<210>29

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>29

Gly Pro Val His Arg Ala Trp Glu Pro Thr Ser His

1 5 10

<210>30

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>30

Gly Pro Val Glu Arg Ala Trp Arg Pro Asp Leu Ile

1 5 10

<210>31

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>31

Gly Pro Val Ser Lys Ala Trp Gln Glu Thr Glu Thr

1 5 10

<210>32

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>32

Gly Pro Val Ala Asp Ala Trp Leu Val Tyr Pro Arg

1 5 10

<210>33

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>33

Trp Gly Ile Pro Arg Ala Ala Gln Val Met Trp Thr

1 5 10

<210>34

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>34

Ile Pro Trp Thr Gln His Met Ala Met Ser Pro Met

1 5 10

<210>35

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>35

Ser Gly His Gln Leu Leu Asn Lys Met Pro Asn

1 5 10

<210>36

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>36

Lys Phe Gln Glu Phe Ser Pro Asn Tyr Met Gly Leu Glu Phe Lys Lys

1 5 10 15

His His Asp Tyr

20

<210>37

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>37

Lys Phe Gln Glu Phe Ser Pro Asn Leu Trp Gly Leu Glu Phe Gln Lys

1 5 10 15

Asn Lys Asp Tyr

20

<210>38

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>38

Lys Phe Gln Glu Tyr Ser Pro Asn Leu Trp Gly His Glu Phe Arg Ser

1 5 10 15

His His Asp Tyr

20

<210>39

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>39

Thr Asn Tyr Leu Phe Ser Pro Asn Gly Pro Ile Ala Arg Ala Trp

1 5 10 15

<210>40

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>40

Arg Thr Val Ala His His Gly Gly Leu Tyr His Thr Asn Ala Glu Val

1 5 10 15

Lys

Claims

1.分离的肽，其选择性结合EphB受体家族成员并且抑制EphrinB配体与所述EphB受体家族成员的结合。

2.权利要求1的分离的肽，其中所述肽模拟Ephrin G-H环。

3.权利要求1的分离的肽，其中所述肽具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

4.权利要求1的分离的肽，其中所述肽具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

5.权利要求1的分离的肽，其中所述肽具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

6.权利要求1的分离的肽，其中所述肽具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列。

7.权利要求1的分离的肽，其中所述肽具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列。

8.权利要求1的分离的肽，其中所述肽具有SEQ ID NO：39的氨基酸序列。

9.权利要求1的分离的肽，其与治疗上可接受的载体组合。

10.治疗患者中与EphB受体相关的疾病的方法，包括：

确定需要治疗与EphB受体相关的疾病的患者；和

给所述患者施用治疗有效量的权利要求1的分离的肽。

11.权利要求10的方法，其中所述与EphB受体相关的疾病是肿瘤性疾病、神经疾病或血管疾病。

12.权利要求10的方法，其中所述分离的肽与化疗药或毒素连接。

13.对患者中的肿瘤成像的方法，包括：

确定怀疑患有表达Eph B受体的肿瘤的患者；

给所述患者施用权利要求1的分离的肽，其中所述分离的肽与显像剂连接；和

获得该患者中所述显像剂的图像。

14.权利要求13的方法，其中所述显像剂是荧光性的。

15.权利要求13的方法，其中所述显像剂是放射性的。

16.权利要求1的肽在制备治疗EphB相关疾病的药物中的应用。

17.权利要求16的应用，其中所述EphB相关疾病是肿瘤性疾病、神经疾病或血管疾病。