JP2008528614A - EphB受容体結合ペプチド - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
本出願は、合衆国法典第35巻第119条(35 U.S.C. §119)に基づき、2005年1月27日に出願された米国仮出願第60/647,852号への優先権の利益を主張し、該仮出願の全体は引用により明示的に本明細書に組み込まれる。
本発明は、国立衛生研究所から与えられた助成金番号CA82713及びHD25938、並びに国防総省から与えられた助成金番号DAMD17-01-1-0168に基づく政府支援で作出した。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
(発明の分野)
本出願は、EphB1、EphB2及びEphB4を含む、BクラスのEph受容体に選択的に結合する、アンタゴニスト的ペプチドに関する。また、そのようなペプチドの同定方法も含む。
Eph受容体は、受容体チロシンキナーゼの大きなファミリーであり、エフリンと呼ばれるリガンドのファミリーが結合することによって、成体組織のみならず、発育組織において、数多くの生物学的過程を制御する(Murai, K. K.及びPasquale, E.B. の論文2003 J Cell Sci 116:2823-2832)。Eph受容体は、様々な健常組織において異なる発現をし(Hafher, C.らの論文 2004 Clinical Chem 50:490-499)、痛みの進行(Battaglia, A.A.らの論文. 2003 Nat Neurosci 6:339-340)、血小板凝集、神経の発達、細胞遊走及び接着(Prevost, N.らの論文. 2005 PNAS USA 102:9820-9825)などの、正常機能の様々な側面に関与する。また、Eph受容体は、腫瘍の進行(Dodelet, V.C.及びPasquale, E. B.の論文 2000 Oncogene 19:5614-5619;Nakamoto, M.及びBergemann, A.D.の論文 2002 Microsc Res Tech 59:58-67;Walker-Daniels, J.らの論文 2003 Am J Pathol 162:1037-1042;Hu, N.らの論文. 2005 Cancer Res 65:2542-2546;Hafher, C.らの論文. 2004 Clin Chem 50:490-499)、血管新生の病理形態(Adams, R.H.,及びKlein, R.の論文 2000 Trends Cardiov Medicine 10:183-188;Brantley-Sieders, D.M.及びChen, J.の論文 2004 Angiogenesis 7:17-28;Noren, N.K.らの論文. 2004 PNAS USA 101:5583-5588)、組織損傷後の慢性的な痛み(Battaglia, A.A.らの論文. 2003 Nat Neurosci 6:339-340)、脊髄損傷後の神経再生(Goldshmit, Y.らの論文. 2004 JNeurosci 24:10064-10073)、及び先天性奇形(Twigg, S. R.らの論文. 2004 PNAS USA 101:8652-8657;Wieland, I.らの論文. 2004 Am J Hum Genet 74:1209-1215)を含む、様々な病理的過程に関与する。さらに、これらの受容体は、幹細胞の自己再生対細胞運命決定及び分化のバランスに役割を担うという報告がなされている(Conover, J. C.らの論文. 2000 Nat Neurosci 3:1091-1097;Aoki, M.らの論文. 2004 J Biol Chem 279:32643-32650;Moore, K.B.らの論文. 2004 Dev Cell 6:55-67)。
本発明の一実施態様は、EphB受容体ファミリーのメンバーに選択的に結合し、かつEphB受容体ファミリーメンバーへのエフリン−Bの結合を阻害する、ペプチドである。
本発明の別の実施態様は、エフリンG−Hループを模倣し、EphB受容体ファミリーのメンバーに選択的に結合し、かつEphB受容体ファミリーメンバーへのエフリン−Bの結合を阻害する、単離ペプチドである。
本発明の別の実施態様は、EphB受容体関連疾患の治療を必要とする患者を同定すること、及び該患者に、EphB受容体ファミリーのメンバーに選択的に結合し、かつ該EphB受容体ファミリーメンバーへのエフリン−Bの結合を阻害する単離ペプチドの治療的有効量を投与することによる、患者におけるEphB受容体関連疾患の治療方法である。該単離ペプチドは、医薬として許容し得る担体とともに組成物中に存在する。そのようなEphB受容体関連疾患は、腫瘍性疾患、神経疾患、又は血管疾患であってよい。別の実施態様において、該ペプチドは、化学療法薬剤、又は毒素に連結される。
Eph受容体チロシンキナーゼは、多くの病理組織中で発現し、それゆえ有望な薬剤標的候補として頭角を現してきた。しかしながら、単一のEph受容体に選択的に結合することができ、かつこの大きな受容体ファミリーの他のメンバーには結合することができないという、有用な分子はほとんどない。本発明の一実施態様は、EphB1、EphB2、EphB3及びEphB4を含む、EphBクラスの異なる受容体に選択的に結合するペプチドに関する。同一のEphB受容体特異性を有するペプチド群は、結合に際して互いに競合することが見出され、これは該ペプチド群が、部分的に重複した結合部位を有することを示唆する。さらに、該ペプチドのいくつかは、EphB受容体との高親和性相互作用を仲介する領域である、エフリン−BリガンドのG−Hループに見出されるアミノ酸モチーフを含む。該エフリン結合部位を標的化することに一致して、より高親和性のペプチドは、エフリンがEphB受容体に結合することに拮抗する。
本発明明細書の記載に使用される様々な用語の意味及び範囲を明らかにし、かつ明確化するために、下記の定義を説明する。
本明細書で使用するように、「アゴニスト」は、その生物学的に相補的な活性受容体に結合して該受容体を活性化させて該受容体の生物学的反応をもたらす、又は該受容体の既存の生物活性を増幅させる、生物学的に活性なリガンドをさす。
本明細書で使用するように、「医薬として許容し得る塩」は、医薬品工業で一般的に使用される、非毒性のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩及びアンモニウム塩をさし、これらは当業者に周知の方法で製造されるナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩、アンモニウム塩及びプロタミン亜鉛塩を含む。また、該用語は、本発明の化合物を適切な有機酸又は無機酸と反応させることによって一般的に製造される、非毒性の酸付加塩を含む。代表的な塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩, 酢酸塩、シュウ酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、ホウ酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、及びナプシル酸塩などを含む。
本明細書で使用するように、「立体異性体」は、別のものと同じ分子量、同じ化学組成及び同じ結合順序を有するが、1以上のキラル中心周辺の空間で、異なって分類される原子を有する化合物をさす。すなわち、同じ化学式の立体異性体は、少なくとも1つのキラル中心について、異なる空間配向で配置される、同一の化学的部分を含む。純粋である場合、立体異性体は、平面偏光光を回転させる能力を有する。しかしながら、いくつかの純粋な立体異性体は、現在の分析機器で検出不可能な、ごくわずかな旋光を有していてもよい。本発明の化合物は、1以上の非対称的炭素原子を有してよく、それゆえ、様々な立体異性体を含んでいてもよい。全ての立体異性体は、本発明の範囲内に含まれる。
特に好ましい合成アミノ酸は、例として、天然型L−アミノ酸、L−(1−ナフチル)−アラニン、L−(2−ナフチル)−アラニン、L−シクロヘキシルアラニン、L−2−アミノイソ酪酸、メチオニンのスルホキシド及びスルホン誘導体(すなわち、HOOC-(H2NCH)CH2CH2-S(O)nR6、ここでn及びR6は先に定義したようなものである。)、並びにメチオニンの低級アルコキシ誘導体(すなわち、R6が先に定義したようなものであるHOOC-(H2NCH) CH2CH2-OR6)のD−アミノ酸を含む。
本明細書で使用するように、用語「治療剤」は、抗ガン剤、神経保護剤、又は特定の疾患徴候に所望の治療効果を有し得る他の作用物質を意味する。
本明細書に記載する抗ガン剤は、細胞毒性剤又はガン化学療法剤であり得る。非限定的な例として、DNA関連プロセスを標的化する細胞毒性剤は、シクロホスファミド、メルファラン、マイトマイシンC、ビゼレシン、シスプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、ミトキサントロン、SN 38、Et 743、アクチノマイシンD、ブレオマイシン及びTLK286を含む。ガン化学療法剤は、限定でなく、ドセタキセルなどのタキサン;ドキソルビシンなどのアントラサイクリン;アルキル化剤;ビンカアルカロイド;抗代謝剤;シスプラチン又はカルボプラチンなどの白金剤;メトトレキサートなどのステロイド;アドリアマイシンなどの抗生物質;イソファミド(isofamide);又は選択的エストロゲン受容体調節物質;トラスツズマブなどの抗体;であり得る。
白金剤は、本発明の併用療法に有用な化学療法剤である。そのような白金剤は、例えば、Crownの文献, 2001 Seminars in Oncol 28:28-37に記載されるような、例えばシスプラチン又はカルボプラチンであり得る。本発明の併用療法に有用な他のガン化学療法剤は、限定でなく、メトトレキサート、マイトマイシンC、アドリアマイシン、イホスファミド及びアンサマイシンを含む。
本発明の実施態様は、Eph受容体に結合する作用物質を提供する。本明細書に記載する化合物の多くは、Eph受容体ファミリーの受容体として知られる16種の1種又は限定された数にのみ、選択的に結合する。Eph受容体結合剤は、小分子薬剤、ペプチド又はペプチド模倣体であり得る。Eph受容体結合剤は、天然化合物又は合成化合物であってよい。本明細書に記載の化合物の多くもまた、高い親和性でEph受容体に結合し、Eph受容体アゴニスト又はアンタゴニストのいずれかとして作用することができる。本明細書に記載の化合物は、リード化合物と同一又は類似した分子構造若しくは形状を有するように構築した「リード」化合物及び「誘導体」化合物を含むが、これらは加水分解又はタンパク質分解に対する感受性について、及び/又は該受容体への増加した親和性などの他の生物学的特性について、若しくは該標的Eph受容体に関連しないさらなる生物学的特性を有することのいずれかに関して、該リード化合物とは異なる。
(1.固相合成)
本明細書に記載のペプチドは、当業者に既知の古典的方法、例えば標準的な固相技術を使用することによって製造することができる。該標準的方法は、排他的(exclusive)固相合成法、部分固相合成法、フラグメント濃縮、古典的溶液合成、及び組換えDNA技術すらも含む。例えば、引用によって本明細書に組み込まれるMerrifieldの論文, 1963 J Am Chein Soc 85:2149を参照されたい。固相において、該合成は通常、アルファ−アミノ保護樹脂を使用して、該ペプチドのC末端から開始される。適切な出発物質を、例えば、所要のアルファ−アミノ酸を、クロロメチル化樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、又はベンズヒドリルアミン樹脂へと付着させることによって製造することができる。そのようなクロロメチル化樹脂の1つは、BioRad Laboratories社, Richmond, CAによって商品名BlO-BEADS SX-lで販売されており、ヒドロキシメチル樹脂の調製は、Bodonszkyらの論文,1966 Chem Ind (London) 38:1597に記載されている。ベンズヒドリルアミン(BHA)樹脂は、Pietta及びMarshallの論文, 1970 Chem Commn 650に記載されており、かつ塩酸形態で、Beckman Instruments社, Palo Alto, CAから市販されている。
1990年3月7日に出願された米国特許出願出願番号第07/492,462号;1990年12月6日に出願された出願番号第07/624,120号;及び1991年12月6日に出願された出願番号第07/805,727号;に記載される、「コード化合成ライブラリー(encoded thynthetic library)」又は「非常に大規模な固定化重合体合成(very large scale immobilized polymer synthesis)」系を使用する場合、あるものはそのような活性を有するペプチドの最小サイズを測定することができるのみならず、またあるものは1又は2以上の残基で好ましいモチーフ(又はそのモチーフの最小サイズ)とは異なるペプチド基を形成させる全てのペプチドを作ることができる。その後、このペプチド収集物を、これらにが限定されないが、EphB1、EphB2及びEphB4を含むEph受容体のメンバーに結合する能力に関して選別することができる。この固定化重合体合成系又は他のペプチド合成法を使用して、本発明の全てのペプチド化合物の切断類似体及び欠損類似体並びにそれらの組み合わせを合成することも可能であることは理解される。
これらの方法を使用して、天然型で遺伝的にコードされる20種のアミノ酸以外のアミノ酸が、本発明の任意の化合物の1又は2以上で置換されたペプチドを合成することも可能である。例えばナフチルアラニンをトリプトファンと置換し、合成を促進することができる。本発明のペプチド内に置換可能な他の合成アミノ酸は、L−ヒドロキシプロピル、L−3,4−ジヒドロキシ-フェニルアラニル、L−d−ヒドロキシリジル(hydrokylysyl)及びD−d−メチルアラニルなどのdアミノ酸、βアミノ酸、及びイソキノリルを含む。Dアミノ酸及び非天然型合成アミノ酸もまた、本発明のペプチドに組み込むことが可能である(例えば、Robertsらの文献,1983 『ペプチド合成における非一般的なアミノ/酸(Unusual Amino/Acids in Peptide Synthesis)』5:341-449を参照されたい)。
当業者は、対応するペプチド化合物と同一の又は類似した所望の生物活性を有するが、溶解度、安定性及び加水分解及びタンパク質分解への感受性に関して、該ペプチドよりもより好ましい活性を有するペプチド模倣体を構築するのに、様々な技術が利用可能であることを理解する。例えば、Morganらの論文,1989 Ann Rep Med Chem 24:243-252を参照されたい。以下に、N末端アミノ基、C末端カルボキシル基で修飾したペプチド模倣体の製造方法、及び/又はペプチド中の1以上のアミド結合を非アミド結合へと変更する方法を記載する。2以上のそのような修飾を、1つのペプチド模倣体構造中でカップリング可能であることは理解される(例えば、C末端カルボキシル基での修飾、及び該ペプチド中の2つのアミノ酸間の-CH2-カルバメート結合の含有)。
ペプチドは通常、遊離酸として合成されるが、先に記載したように、アミド又はエステルとして容易に製造可能である。またあるものは、ペプチド化合物のアミノ末端及び/又はカルボキシ末端を修飾して、他の有用な化合物を製造することができる。アミノ末端修飾は、メチル化(すなわち、-NHCH3又は-NH(CH3)2)、アセチル化、ベンジルオキシカルボニル基の付加、又はアミノ末端をRCOO-(式中、Rはナフチル、アクリジニル、ステロイジル及び類似基)によって定義されるカルボン酸官能性を含む任意の保護基で保護することを含む。カルボキシ末端修飾は、該遊離酸をカルボキサミド基で置換すること、又はカルボキシ末端で環状ラクタムを形成させて構造的に制限を導入すること、を含む。
(d)不活性希釈剤(ジクロロメタン)中で、等量又は過剰量(例えば、5当量)のR-S(O)2Clとの反応によってスルホンアミド基を形成させ、末端アミンをスルホンアミドへと変換させる(式中、Rは先に定義したようなものである)。好ましくは、該不活性希釈剤は、ジイソプロピルエチルアミンなどの第三級アミンの過剰量(例えば、10当量)を含み、反応中に生じる酸を除去する。反応条件は、その他の点では従来型である(例えば、室温で30分間);
C末端カルボキシル基をエステル(すなわち、-C(O)OR(式中、Rは先に記載したようなものである))に置換するペプチド模倣体の製造において、該ペプチド酸を調製するために使用した樹脂を使用し、側鎖を保護したペプチドを、塩基及び適切なアルコール、例えばメタノールを用いて切断する。それから側鎖保護基を、フッ化水素を用いる普通の方法で除去し、所望のエステルを得る。
本明細書の実施態様における使用に適切なペプチドは、一般的にはペプチド、すなわち、これらに限定されないが、EphB1、EphB2、EphB3又はEphB4を含むEph受容体のメンバーに結合するリガンドを含む。そのようなペプチドは、典型的には、約50アミノ酸残基以下、より好ましくは約20アミノ酸以下を含む。本発明の使用に適切な親水性重合体は、これらに限定されないが、ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールなどに例示されるようなポリアルキルエーテル、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリオキシアルケン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロース及びセルロース誘導体、デキストラン及びデキストラン誘導体、などを含む。一般的に、そのような親水性重合体は、約500〜約100,000ダルトン、より好ましくは約2,000〜約40,000ダルトン、さらにより好ましくは約5,000〜約20,000ダルトンの平均分子量を有する。いくつかの実施態様において、そのような親水性重合体は、約5,000ダルトン、約10,000ダルトン及び約20,000ダルトンの平均分子量を有する。該ペプチド化合物は、先に記載した方法、及び引用文献中に記載の方法を使用して誘導体化することができる。
該化合物のペプチド誘導体を作成する他の方法は、引用によって本明細書に組み込まれるHrubyらの論文,1990 Biochem J 268(2):249-262に記載される。それゆえ、該ペプチド化合物もまた、類似した生物活性を有する非ペプチド化合物の構造的モデルとして機能する。当業者は、様々な技術が、リード化合物と同一の又は類似の所望の生物活性を有するが、溶解度、安定性、並びに加水分解及びタンパク質分解への感受性に関しては、該リードペプチド化合物よりもより好ましい活性を有する化合物を構築するのに有用であることを理解する。引用によって本明細書に組み込まれるMorganらの論文,1989 Ann Rep Med Chem 24:243-252を参照されたい。これらの技術は、ペプチド骨格を、ホスホン酸、アミド、カルバメート、スルホンアミド、第二級アミン、及びN−メチルアミノ酸からなる骨格で置換することを含む。
該ペプチド中のアミド結合の、-CH2-スルホンアミド結合との置換は、適切に保護したアミノ酸のカルボキシル基(-COOH)を、-CH2OHへと還元することによって達成することができ、それから該ヒドロキシル基を従来法によってトシル基などの適切な離脱基に変換する。トシラート化誘導体と、例えばチオ酢酸との反応に続く、加水分解及び酸化的塩基化は-CH2-S(O)2Cl官能基を与え、これが他の部分は適切に保護されたアミノ酸のカルボキシル基を置換する。ペプチド合成における、適切に保護されたこのアミノ酸類似体の使用は、-CH2S(O)2NR-結合の含有を与え、これは該ペプチド中のアミド結合を置換することによってペプチド模倣体を与える。アミノ酸のカルボキシル基から-CH2S(O)2Cl基への変換のより完全な記載に関しては、例えば、引用によって本明細書に組み込まれるWeinstein, B.の文献, 1983 『アミノ酸、ペプチド及びタンパク質の化学並びに生化学(Chemistry & Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins)』7巻, 267-357頁, Marcel Dekker社, New Yorkを参照されたい。
該ペプチドにおいて、-CH2NH-結合がアミド結合を置換した第二級アミン結合は、例えば従来法で、アミド結合のカルボニル結合をCH2基へと還元した、適切に保護されたジペプチド類似体を使用して調製可能である。例えば、ジグリシンの場合、該アミドからアミンへの還元は、脱保護後にH2NCH2CH2NHCH2COOHを生じ、これをそれから次のカップリング反応のN−保護形態で使用する。ジペプチド中のアミド結合のカルボニル基の還元による、そのような類似体の製造は当業者に周知である(例えば、M.W. Remingtonの論文 1994 Meth Mol Bio 35:241-247を参照されたい)。
該化合物は、システインのチオール基間の分子間ジスルフィド結合を有する環状形態で存在してもよい。あるいは、システインのチオール基間の分子内ジスルフィド結合を生成して、二量体(又はそれより大きいオリゴマー)化合物を得ることができる。また、1以上のシステイン残基をホモシステインで置換してもよい。
本発明の他の実施態様は、その硫黄の1つを、CH2基又は硫黄の他のアイソスターで置換した、これらのジスルフィド誘導体の類似体を含む。これらの類似体は、当業者に既知の方法を使用して、分子内置換又は分子間置換を介して作成することができる。
また、該ペプチドを、当業者に周知の組換えDNA技術で製造してもよい。
本明細書に記載のEph受容体結合化合物は、細胞のEph活性を調節することができる。Eph活性を調節するEph受容体結合化合物は、本明細書に記載のペプチド又はペプチド模倣体を含み、これらはEph受容体ファミリーの1以上のメンバーに結合する。本発明のいくつかの実施態様において、Eph受容体結合化合物は、本明細書で記載の、単一ペプチド又はペプチド模倣体のみを含む。本発明のいくつかの実施態様において、細胞を、Eph受容体のリン酸化を引き起こすのに効果的な量で、Eph受容体結合化合物と接触させ、それによって下流のシグナル伝達事象を活性化させる。いくつかの実施態様において、細胞を、エフリンリガンドによる受容体のリン酸化を妨げるのに効果的な量で、Eph受容体結合化合物と接触させ、それによって受容体活性を阻害する。他の実施態様において、該細胞を、下流のシグナル伝達事象の活性化又は不活化をもたらすのに効果的な量で、Eph受容体結合化合物と接触させることが可能である。下流のシグナル伝達事象の活性化又は不活化をもたらすのに効果的なEph受容体結合化合物の量は、少なくとも0.05μM、少なくとも0.1μM、少なくとも0.2μM、少なくとも0.3μM、少なくとも0.4μM、少なくとも0.5μM、少なくとも0.6μM、少なくとも0.7μM、少なくとも0.8μM、少なくとも0.9μM、少なくとも1μM、少なくとも5μM、少なくとも10μM、少なくとも20μM、少なくとも30μM、少なくとも40μM、少なくとも50μM、少なくとも60μM、少なくとも70μM、少なくとも80μM、少なくとも90μM、少なくとも100μM又は少なくとも200μMの濃度を含む。本明細書に記載されない他の有効濃度の決定は、当業者によって容易に決められ得る。
他の実施態様において、EphBサブファミリーの受容体を調節する。そのような受容体は、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、EphB5及びEphB6を含む。特定の実施態様において、EphB1受容体発現細胞を、この受容体の活性を調節してその後の下流シグナル伝達事象を調節するために、本明細書に記載のペプチド、ペプチド模倣体又は小分子の有効量に接触させる。他の実施態様において、EphB2受容体発現細胞を、この受容体の活性を調節してその後の下流シグナル伝達事象を調節するために、本明細書に記載のペプチド、ペプチド模倣体又は小分子の有効量に接触させる。他の実施態様において、EphB4受容体発現細胞を、この受容体の活性を調節してその後の下流シグナル伝達事象を調節するために、本明細書に記載のペプチド、ペプチド模倣体又は小分子の有効量に接触させる。
また、本明細書に記載のEph受容体結合化合物を、ヒトを含む温血動物に投与し、インビボでEph受容体を調節することもできる。例えば、本明細書に記載の特定のペプチドを使用して、EphB1、EphB2、EphB3又はEphB4を選択的に活性化させる又は阻害することが可能である。それゆえ、本発明は、インビボでEph受容体を活性化させる又は阻害するのに十分な量で、そのような化合物を投与することを含む、Eph関連疾患の治療的処置方法を含む。
一実施態様において、該リンカーは、1以上のEph受容体結合化合物と1以上の治療剤との間の化学結合である。それゆえ、該結合は、共有結合又はイオン結合であり得る。該リンカーが化学結合である複合体の例は、融合タンパク質であり得る。一実施態様において、該化学結合は、pH感受的結合である。あるいは、該結合はpH感受的でなくてもよいが、後に添加する、又は標的部位の微小環境に自然に見出される、特定の酵素又は化学物質によって開裂可能であってよい。あるいは、該結合は、還元条件下、例えばジスルフィド結合で切断される結合であってよい。あるいは、該結合は開裂可能でなくてもよい。
非開裂型リンカーの例は、"スルホ-LC-SMPT"-(スルホスクシンイミジル 6-[アルファ-メチル-アルファ-(2-ピリジルチオ) トルアミド] ヘキサン酸;"SMPT";"ABH"-アジドベンゾイルヒドラジド;"NHS-ASA"-N-ヒドロキシスクシンイミジル-4-アジドサリチル酸;"SASD"-スルホスクシンイミジル 2-(p -アジドサリチルアミド)エチル-1,3-ジチオプロピオン酸;"APDP"-N-[4-(p-アジドサリチルアミド) ブチル]-3' (2'-ピリジルジチオ) プロピオンアミド;"BASED"-ビス-[ベータ-(4-アジドサリチルアミド)エチル] ジスルフィド;"HSAB"-N-ヒドロキシスクシンイミジル-4 アジド安息香酸;"APG"-p-アジドフェニルグリオキサール一水和物;"SANPAH"-N-Succiminidyl-6(4'-アジド-2'-mitroフェニル-amimo)ヘキサン酸;"スルホ-SANPAH"-スルホスクシンイミジル-6-(4'-アジド-2-ニトロフェニルアミノ)ヘキサン酸;"ANB-NOS"-N-5-アジド-2-ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド;"SAND"-スルホスクシンイミジル-2-(m-アジド-o-ニトロベンズアミド)-エチル-1,3'-ジチオプロピオン酸;"PNP-DTP"-p-ニトロフェニル-2-ジアゾ-3,3,3-トリフルオロプロピオン酸;"SMCC"-スクシンイミジル 4-(N-マレイミドメチル) シクロヘキサン-1-カルボン酸;"スルホ-SMCC"-スルホスクシンイミジル 4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸;"MBS"-m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル;"スルホ-MBS"-m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル;"SIAB"-N-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル) アミノ安息香酸;"スルホ-SIAB"-N-スルホスクシンイミジル(4-ヨードアセチル) アミノ安息香酸;"SMPB"-スクシンイミジル 4-(p-マレイミドフェニル)酪酸;"スルホ-SMPB"-スルホスクシンイミジル 4-(p-マレイミドフェニル)酪酸;"DSS"-ジスクシンイミジルスベリン酸;"BSSS"-ビス(スルホスクシンイミジル)スベリン酸;"BMH"-ビスマレイミドヘキサン;"DFDNB"-1, 5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン;"DMA"-ジメチルアジピミダート 2 HCl;"DMP" ジメチルピメリミダート-2HCl;"DMS"-ジメチルスベリミダート-2-HC1;"SPDP"-N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルチオ) プロピオン酸;" スルホ-HSAB"-スルホスクシンイミジル 4-(p-アジドフェニル)酪酸;"スルホ-SAPB"-スルホスクシンイミジル 4-(p-アジドフェニル酪酸);"ASIB"-1-9p-アジドサリチルアミド)-4-(ヨードアセトアミド)ブタン;"ASBA"-4-(p-アジドサリチルアミド)ブチルアミンである。これら全てのリンカーは、Pierce Chemicals社から入手可能である。
診断的ガンマシンチレーション測光法を介して、インビボで、器官及び組織を画像化するのに適した放射線核種は、下記のものを含む:γ線放射核種:111Ln、113mLn、67Ga、68Ga、99mTc、51Cr、197Hg、203Hg、169Yb、 85Sr及び87Sr。Fab'フラグメントによる結合に適したキレート化放射線核種の製造は、引用により本明細書に組み込まれる米国特許第4,658,839号(Nicolettiらの文献)に教示されている。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、正常遺伝子の過剰発現、又は異常遺伝子の発現によって引き起こされる全ての疾患の治療に、潜在的用途を有する。アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、該遺伝子の発現を減少又は停止させることができる。アンチセンス技術で治療可能なガン遺伝子の例、及び使用可能な特異的アンチセンス分子を教示する文献は、以下のものを含む:c-Jun 及び cFos (引用によって本明細書に組み込まれる米国特許第5,985,558号);HER-2 (引用によって本明細書に組み込まれる米国特許第5,968,748号) B2F-1 (Popoffらの論文、米国特許第6,187,587号;これらは引用によって本明細書に組み込まれる)、SMAD1〜7 (米国特許第6,159,697号;第6,013,788号;第6,013,787号;第6,013,522号;及び第6,037,142号、これらは引用によって本明細書に組み込まれる)、及び Fas (Deanらによる米国特許第6,204,055号、これは引用によって本明細書に組み込まれる)。
該治療剤は、オピオイドなどの麻酔剤であり得、これを痛みのある部分に特異的に標的化することができる。吐き気などの副作用は、オピオイド鎮痛剤を使用した患者に普通に経験される。本発明の方法は、外科的創傷又は関節炎の場合の関節などの、鎮痛剤が必要な部位へ該薬剤の非常に特異的な局在を可能にし、これは該副作用を減少し得る。
該治療剤は、心疾患の治療に使用する全ての医薬品であり得る。そのような医薬品は、これらに限定されないが、有機亜硝酸塩 (亜硝酸アミル、ニトログリセリン、硝酸イソソルビド), カルシウムチャネル遮断薬、抗血小板剤及び抗血栓剤、血管拡張剤、抗ジギタリス抗体、並びに節遮断薬を含む。
該治療剤は、アンホテリシン、フルシトシン、ミコナゾール及びフルコナゾールなどの真菌感染症の治療に使用する全ての医薬品であり得る。
ホルモンの過剰産生又は低産生に由来する疾患は、ホルモン(成長ホルモン、アンドロゲン、エストロゲン、ゴナドトロピン放出ホルモン、甲状腺ホルモン、副腎皮質ステロイド、インスリン及びグルカゴン)などの治療薬を使用して治療可能であることが理解される。あるいは、該ホルモンが過剰産生される場合、該ホルモンに対するアンタゴニスト又は抗体を治療剤として使用してもよい。
あるいは、該治療剤は、通常のインビトロ診断に使用するものであってよい。それゆえ、リガンド及びリンカーを従来法で標識し、シグナル産生システム全体又は一部を形成する。該リガンド及びリンカーは、当業者に周知の方法で、トリチウム、炭素14、リン32、ヨウ素125、及びヨウ素131などの放射性同位体に共有結合可能である。例えば125Iは、クロラミン−T法などの方法、ラクトペルオキシダーゼ法又は前標識ボルトン−ハンター法によって酵素的に導入可能である。これらの方法及び他の方法は、H. Van Vunakis及びJ.J. Langone編, 『酵素学における方法(Methods in Enzymology)』, 70巻, 部分A, 1980で議論されている。また、さらなる放射性標識の例として、両方が引用によって本明細書に組み込まれる米国特許第3,646,346号及び第4,062,733号を参照されたい。
非経口投与用の本発明に従った製剤は、滅菌水溶液又は非水溶液、懸濁液、若しくは乳剤を含む。非水溶性溶媒又は媒体の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイル及びコーンオイルなどの植物油、ゼラチン、及びオレイン酸エチルなどの注入可能な有機エステルである。そのような剤形も、保存料、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などのアジュバントを含んでよい。それらを、例えば、細菌滞留フィルターを通す濾過、該組成物中への滅菌剤の取り込み、該組成物の照射、又は該組成物の加熱によって滅菌してよい。また、それらの使用直前に、滅菌水又は他の滅菌注入可能媒体を使用して製造することができる。
該化合物を含む組成物は、予防的処置及び/又は治療的処置に投与可能である。治療用途において、該疾患の症状及びその合併症を治癒又は少なくとも部分的に抑止させるのに十分な量で、先に記載したような疾患を既に患っている患者に投与する。この達成に適した量を、「治療的有効量」として定義する。この使用に有効な量は、疾患の重篤度、及び患者の体重並びに一般状態によって決まる。
予防的用途において、本明細書に開示する化合物を含む組成物を、特定の疾患に感受性のある患者又は別の特定の疾患の危険性のある患者に投与する。そのような量を、「予防的有効量」と定義する。この使用においても、正確な量は、患者の健康状態及び体重によって決まり、かつ当業者によって容易に決定され得る。
非経口投与に関して、該ペプチドは、例えば医薬として許容し得る非経口媒体に関連して、溶液、懸濁液、乳剤又は凍結乾燥粉末として製剤可能である。そのような媒体の例は、水、生理食塩水、リンガー溶液、ブドウ糖溶液、及び5%血清アルブミンである。リポソーム、及び固定油などの非水性媒体も使用してよい。該媒体又は凍結乾燥粉末は、等張性(例えば、塩化ナトリウム、マンニトール)及び化学的安定性(例えば、緩衝液及び防腐剤)を維持する添加剤を含んでよい。該製剤を、一般的に使用される方法で滅菌する。例えば、注射による投与に適した非経口組成物を、0.9%塩化ナトリウム溶液中に、活性成分の重量の1.5%で溶解して製造する。
該化合物は、徐放性組成物、例えば遅延放出性重合体を含む組成物で投与可能である。該活性化合物は、移植片、及びマイクロカプセル型送達システムを含む制御放出製剤などの、急速放出に対して該化合物を保護する担体とともに製造可能である。生分解性で生体適合性の重合体は、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸及びポリ乳酸、ポリグリコール性共重合体(PLG)を使用可能である。そのような製剤の製造に関する多くの方法は、当業者に一般的に知られている。
ファージディスプレイを使用して、16種の既知のEph受容体の各々に特異的に結合するペプチドを単離することができる。本明細書に記載のように、EphB1、EphB2、EphB3又はEphB4に特異的に結合するペプチドを呈示するいくつかのファージを単離し、それらの多くは選択的に結合する。したがって、Eph受容体ファミリーのメンバーに対するパニング(panning)ランダムペプチドライブラリーを使用して、興味ある受容体に選択的に結合するペプチドを得ることができる。該クローンを、当業者に周知の配列決定法で同定することができる。該ペプチドライブラリー中に含まれるペプチドの長さを調節して、高結合選択性及び高結合親和性の両方を有するペプチドを得ることができる。
本明細書に記載の化合物は、エフリンリガンドの産生及び受容体結合過程に影響を与える、及び影響を受けると考えられる多くの因子の評価を含む、Eph受容体の生物学的役割を理解する類のない道具としてインビトロにおいて有用である。また、該化合物は、Eph受容体に結合して活性化させる他の化合物の開発にも有用である。なぜなら、該化合物は、構造と活性との関連性に重要な情報を提供し、そのような開発を促進するからである。
(異なるEphB受容体に結合するペプチドの同定)
EphB受容体結合ペプチドを同定するために、ランダムに12アミノ酸長のペプチドを提示するM13ファージライブラリー(R&D Systems社, Minneapolis, MN)を、ヒトFcに融合させてカルボキシ末端のヘキサヒスチジンタグを介してニッケル被覆したウエル上に固定したEphB1、EphB2又はEphB4の外部ドメイン上で選別した(図1)。1μg/mlのEph受容体Fc融合タンパク質で被覆したNi−NTAウエルに結合したファージを、ワサビペルオキシダーゼに連結した抗ファージ抗体(M13ファージ検出キット, Amersham Biosciences社)を使用し、基質として2,2−アジノ−ビス(3−エチルベンズチアゾリン−6−スルホン酸)を用いて定量した。該測定値から引いたバックグラウンドは、EphB4 Fcなしで測定した。ヒスチジンタグ化EphB外部ドメインFc融合タンパク質を、トリス緩衝食塩水(TBS)(150 mM NaCl, 50mM トリス-HCl, pH 7.5)中、10μg/mlの濃度で、ニッケル−ニトリロ三酢酸(Ni−NTA)被覆ELISAウエル内において4℃で一晩インキュベートした(1μg/mlでインキュベートしたEphB2及びEphB4のラウンド3.2及び4を除く。)。ウエルを、0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)含有TBSで1時間ブロッキングし、結合緩衝液(TBS、1mM CaCl2, 0.1% Tween-20、又はEphB2及びEphB4のラウンド3.2 及び4に関しては0.5% Tween-20)でリンスした。パニングのラウンド1において、100μlの結合緩衝液中のファージライブラリーの2×1011プラーク形成単位(PFU)を、EphB受容体被覆ウエル内において、室温で1時間インキュベートした。洗浄後、残っていた結合ファージを100μlの0.2M グリシン−HCl, pH 2.2で10分間溶出し、15μlの1M トリス−HCl, pH 9で中和した。該溶出物全部を使用して、初期対数期のER2738宿主細菌を感染させ、37℃で4.5時間増殖させた。該ファージを濃縮し、製造業者の推奨に従って保存した。次のラウンドにおいて、前のラウンド由来の増幅ファージプールの2×1011PFUを、EphB Fc被覆ウエル及びBSA被覆ウエルに添加した。該ファージをラウンド1に記載したように選別した(溶出ファージを増幅に先立って力価測定して濃縮を測定した場合を除く。)。パニングの最初のラウンド(1*)後に回収したファージは、稀なクローンを回収できることを保証するので定量しなかった。
(これらの単離に使用する、EphB受容体への結合に関して互いに競合する異なるペプチド)
異なるファージクローンが、重複するEph受容体結合部位を標的化するかを測定するために、EWLS EphB1結合ペプチドとTNYL EphB4結合ペプチドを化学的に合成した。これらのペプチドは、エフリン中に見出される配列モチーフを含み、ファージ上に提示された場合、それぞれEphB1又はEphB4に特異的に結合するので選択した(表1)。Fmoc(N-(9-フルオレニル)メトキシカルボニル)化学を使用してペプチドを合成し、高圧液体クロマトグラフィーで精製した。リジン側鎖に結合したビオチンを有するカルボキシ末端のGSGSKリンカーを有するビオチン化ペプチド、又はカルボキシ末端のN-ビオチニル-N'-Fmoc-エチレンジアミン(Novabiochem社)に連結したカルボキシ末端GSGS配列を有するビオチン化ペプチドを合成した。マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析法を、適切なペプチド合成及び純度であるかを検証するために使用する。ペプチドの保存溶液を、リン酸緩衝食塩水(PBS、Irvine Scientific社)に溶かし、該pHが〜6.5であることを検証した。WHWTペプチドは、水性緩衝液中で低い溶解度を有し、それゆえ15%のDMSOを含有するPBS中に可溶化した。ペプチド濃度を、OD280に基づいて計算した。
また、各々のペプチドは、同じEphB受容体を使用して単離された全ての他のファージクローンの結合を阻害した(図2D、E、F及びG)。具体的には、5μMのEWLSペプチドは、EphB1でのパニングによって単離されたファージクローンのEphB1結合を阻害した(図2D)。SNEWは、両方のパネルにおいて、コントロールペプチドとして使用した。25μMのSNEWペプチドは、EphB2でのパニングで単離されたほとんどのファージクローンのEphB2結合を阻害した(図2E及びG)。例外は、IHWPクローン、DHRWVクローン及びWHWTクローンのみであった。しかしながら、これらのクローンの結合は、特にファージ濃度を半分にした場合に、50μMのSNEWペプチドで阻害された。RTVAを(E)におけるSNEWファージを用いたコントロールペプチドとして使用し、かつSNEWを(G)におけるTNYL EphB4結合ファージクローンと共にコントロールペプチドとして使用した。25μMのTNYLペプチドは、EphB4でのパニングで単離されたファージクローンのEphB4への結合を阻害した(DALNクローンを除く。)(図2F)。SWL EphA2結合ペプチド(Koolpe, M.らの論文 2002 J Biol Chem 277:46974-46979)を、(C)及び(F)におけるコントロールペプチドとして使用した。DALNペプチドは、濃度依存的様式で、固定したEphB4外部ドメインへのDALNファージの結合を阻害した(しかし、DHNHペプチド及びNPVIペプチドは阻害しなかった。)(図2H)。結合したファージを、HRPに連結した抗M13ファージ抗体を使用して検出し、ペプチド存在下で結合するファージを、ペプチド不在下で結合するファージに対して標準化した。エラーバーは、2回反復測定からの標準偏差を示し、誤った増殖を考慮して計算した。
(EphB1受容体、EphB2受容体及びEphB4受容体へのエフリン結合に選択的に拮抗するペプチド)
エフリンと同じ受容体領域に結合するペプチドが、十分な親和性で相互作用する場合、Eph受容体−エフリン会合を阻害することが予期される。EphB受容体へのアルカリホスファターゼタグ化エフリン−B2(エフリン−B2−AP)の結合を阻害する能力に関して、多くの合成ペプチドを試験した(図3)。ほとんどのペプチドをビオチンタグと共に合成して、ストレプトアビジンプレート上に固定化し、それらの単離に使用したEphB外部ドメインを捕捉する能力を検証した。
(SNEWペプチドは、EphB2シグナル伝達及び生物学的効果を阻害する)
濃度依存的様式でSNEWペプチドを用いたCOS細胞のプレインキュベーションは、チロシンリン酸化を誘導するEphB1 Fcの能力を阻害し、それゆえ内因性EphB2の活性化を阻害した(図4A)。表示の濃度のSNEWペプチド及びコントロールRTVAペプチドの存在下で、エフリン−B1 Fc、又はコントロールとしてのFcを用いた刺激の後に、COS細胞からEphB2を免疫沈降した。EphB2の免疫沈降に関して、EphB2結合ペプチド又はコントロールペプチドの存在下若しくは不在下での1μg/mlのエフリン−B1Fc又はFcタンパク質を用いた刺激に先立ち、DME高グルコース中でCOS細胞を血清飢餓させた。EphB4免疫沈降に関して、MCF−7を、TNYL-RAWペプチドの存在下又は不在下で、0.5μg/mlのエフリン−B2Fc又はFcタンパク質を用いて刺激した。エフリン刺激後、該細胞を、プロテアーゼ阻害剤及び1mMオルトバナジン酸ナトリウムを含有する修飾RIPA緩衝液(150mM NaCl, 1mM EDTA, 1% TritonX-100, 1% デオキシコール酸Na, 0.1% SDS, 20mM トリス pH 8.0)中で溶解させた。細胞溶解物を、5μgのEphB2抗体、又は10μgのEphB4抗体のいずれかを用いる免疫沈降に使用した。該免疫沈降物を、2×SDSサンプル緩衝液中で煮沸して溶出し、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ペルオキシダーゼ複合体化抗リン酸化チロシン抗体(Transduction Laboratories, San Diego, CA)を用いた免疫ブロッティングで標識化した。該免疫ブロットをそれからはがし、EphB2抗体Fc又はモノクローナルEphB4抗体(Zymed社)のいずれかで再標識し、二次抗ウサギIgG、又は抗マウスペルオキシダーゼ複合体化抗体で標識した。
さらに、SNEWは、EphB2シグナル伝達をエフリン−B1 Fcで刺激した場合に起こるCOS細胞の退縮表現型を阻害した(図4B、C)。1.5μg/mlのエフリン−B1 Fcを用いた処理後すぐに、COS細胞は表面で退縮し、スパイク様突起部を残した。400μMのSNEWペプチド存在下又は不在下において、エフリン−B1 Fc(B1)を用いた、又は用いない場合の、スパイクを有する細胞の割合の定量を、(B)に示す。細胞形態の代表例を(C)に示す。COS細胞をガラス製カバーガラス上にまき、16時間後に、0.5%ウシ胎仔血清含有DME中で3時間飢餓させた。該細胞をそれから400μMのSNEW又はコントロールペプチド含有PBS、若しくはコントロールとして等量のPBSで20分間インキュベートし、それから未処理のまま、又は1.5μg/mlのエフリンB1−Fc(R&D Systems社)で10分間刺激した。該細胞をそれから4%ホルムアルデヒドで固定し、0.1% TritonX-100含有PBSで透過処理し、アレクサ(Alexa)594-標識ファロイジン(Molecular Probes社)で染色し、スライドガラス上に包埋した。コントロールペプチドはRTVAであった。それゆえ、SNEWを使用して、EphB2受容体の生物学的効果を阻害することができる。対照的に、200μMまでの濃度のEWLSは、ヒト大動脈内皮細胞のEph−B1 Fc刺激後の内因性EphB1チロシンリン酸化を阻害せず、かつ350μMまでの濃度のTNYLは、MCF7及びMDA-MB-231乳ガン細胞のエフリン−B2 Fc刺激後の内因性EphB4チロシンリン酸化を阻害しなかった。
(標的化剤としてのEphB結合ペプチド)
エフリンに結合し、生物学的反応を誘発するEph受容体の能力を阻害することに加え、EphB結合ペプチドは、薬剤又は造影プローブなどの他の分子を、EphB受容体発現細胞に選択的に標的化させることができる。該ペプチドの受容体結合特異性を測定する厳密な(stringent)アッセイで、高い親和性(見かけ上の解離定数は、低いnMの範囲である。)で二量体化EphB Fcを捕捉した、ストレプトアビジンプレート上に固定化したビオチン化ペプチドを使用した。ビオチン化ペプチドをストレプトアビジン被覆プレートに固定化し、Eph受容体Fcタンパク質を捕捉するために使用した。結合した受容体を、アルカリホスファターゼ連結抗Fc抗体を使用して検出し、最も高い受容体結合を有するウエルの値に対して標準化した。これらの実験は、試験したEWLS及び全てのEphB4結合ペプチドが、それぞれEphB1又はEphB4に選択的に結合したが、他の全てのAクラスEph受容体又はBクラスEph受容体には結合せず、一方でSNEWはEphB2に加えてEphA3にいくらか結合することを示した(図5A、C、D及びE)。対照的に、AHTFペプチド、SHWPIペプチド、WHWTペプチド及びDHRWIペプチドは特異性が低く、いくつかのEphA受容体及びEphB受容体への実質的結合を示した。
(ペプチドの結合安定性)
標的化及び競合阻害の両方に重要である、安定的様式で結合するペプチドの能力を、プルダウン実験で試験した。ペプチドプルダウン実験に関して、60cmプレート中70%密集度の細胞、又は成体マウス脳組織を、プルダウン緩衝液(50mM HEPES pH 7.5, 150mM NaCl, 10% グリセロール, 1% Triton-X100, 5mM KCl、及び1mM EDTA)中で可溶化した。3μgのビオチン化ペプチドを、5μlのストレプトアビジンアガロースビーズ(Sigma社)と共に45〜90分間インキュベートし、非結合ペプチドを洗い流し、該ビーズを該細胞溶解物と共に45〜90分間インキュベートした。該ビーズに結合したタンパク質をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、EphB1抗体、EphB2抗体又はEphB4抗体を用いた免疫ブロッティングで標識した。EphB1抗体(Santa Cruz社)を、二次抗ヤギIgGペルオキシダーゼ複合体化抗体(BioRad Laboratories社)を用いて検出した。EphB2抗体及びEphB4抗体は、EphB2受容体又はEphB4受容体のカルボキシ末端尾部から100アミノ酸程度を含むGST融合タンパク質に対して親和性精製したポリクローナル抗体であり(Noren, N.K.らの論文. 2004 PNAS USA 101:5583-5588;Holash, J.A.及びPasquale, E.B.の論文 1995 DeveiBiol 172:683-693)、これらを二次抗ウサギIgGペルオキシダーゼ複合体化抗体(Amersham Biosciences社)を用いて検出した。
(ペプチド標的化)
EphB受容体結合ペプチドの標的化能力を測定するために、TNYLペプチドを使用して、内因性EphB4に加えて、形質導入されて発現する細胞への、蛍光ストレプトアビジン被覆量子ドットナノクリスタルの結合を仲介させる。形質導入されたEphB4を発現する細胞の標識に関して、6cmプレート中のCOS細胞に、SuperFect形質導入試薬を使用して、強化型緑色蛍光タンパク質(EGFP)に連結したEphB4細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインをコードするプラスミド(Ogawa, K.らの論文. 2000 Oncogene 19:6043-6052)3μg、又はコントロールとしてファルネシル化EGFPをコードするベクター(pEGFP-F)(BD Biosciences Clontech社)3μgを形質移入させた。該細胞を、形質導入後1日目にガラス製カバーガラス上にまき、形質導入後2日目に標識した。標識実験に関して、20nMのストレプトアビジン複合体化Qドット(Qdot)655量子ドット(Quantum Dot社)を、氷冷の量子ドット結合緩衝液(1mM CaCl2, 2% BSA含有PBS)中で20分間、500nMのビオチン化TNYLペプチドと共にプレインキュベートした。該細胞を、結合したTNYLペプチドを含む量子ドット、又はコントロールとしてペプチドを伴わない量子ドットと共に4℃で20分間インキュベートし、氷冷の1mM CaCl2含有PBSで洗浄した。内因的にEphB4を発現する細胞の標識に関して、フィブロネクチン(10μg/ml)で被覆したガラス製カバーガラス上にまいたMCF-7細胞を、量子ドット結合緩衝液で希釈した100μMのビオチン化TNYLペプチドと共に4℃で20分間インキュベートした。それから該細胞を、氷冷の1mM CaCl2含有PBSで洗浄した後、20nMのストレプトアビジン量子ドットと共に4℃で20分間インキュベートした。標識後、該細胞を4%ホルムアルデヒド/4%スクロース中で10分間固定し、0.05% Triton-X100含有PBSを用いて5分間透過処理した。核をDAPIで対比染色し、該カバーガラスをスライドガラス上においてプロロングゴールド封入剤(ProLong Gold mounting media)(Molecular Probes社)を使用して封入し、蛍光顕微鏡下で画像化し撮影した。緑色蛍光タンパク質は、形質移入細胞を特徴付けた。TNYL Qドットは、EphB4ΔC−EGFPを形質移入した細胞を標識したが、EGFPで形質移入した細胞、又は非形質移入細胞は標識しなかった。
(TNYL EphB4結合ペプチドの最適化)
EphB4結合ペプチド配列の調査は、エフリンG−Hループのカルボキシ末端部分に一致して整列させた、該ペプチド中のコンセンサスモチーフGP(以下を参照されたい)及びRAWを示した(表1)。GPモチーフをTNYLのGPモチーフで整列させ、かつRAWモチーフをTNYLの最後のアミノ酸の次に正確に整列させる。これは、そのカルボキシ末端にRAWコンセンサスモチーフを含むTNYLペプチドが、EphB4によりよく結合するであろうことを示唆する。該ペプチド群とエフリン−B2アルカリホスファターゼ融合タンパク質(エフリン−B2 AP)との競合アッセイに関して、使用するエフリン−B2 AP濃度を調節し、異なるEphB受容体と同様なシグナルを得た(0.135〜1.45OD分−1ml−1)。異なるペプチド濃度のエフリン−B2 APを、1μg/mlのEph受容体Fcで被覆したNi−NTAウエル内で1時間、共にインキュベートした。何回かの洗浄後、エフリン−B2−AP結合量を、基質としてp−ニトロフェニルリン酸を使用して定量した。EphB Fcがないウエルからのアルカリホスファターゼ活性を、バックグラウンドとして差し引いた。TNYL-RAWペプチド (TNYLFSPNGPIARAW、配列番号:39)の非ビオチン化形態を作成し、〜15nMのIC50で、EphB4へのエフリン−B2 AP結合を阻害することを見出した(図6A)。注目すべきことに、この値は、非ビオチン化TNYLの〜150μMのIC50よりも10000倍低く(図6A)、かつ二量体化エフリン−B2 Fcの〜9nMのIC50に匹敵する(図6B)(ここで、エフリン−A1 Fcをコントロールとして使用した。)。これらの実験において、該2つのペプチドはビオチン化していない。EphB4を結合する能力は劇的に増加したにもかかわらず、TNYL-RAWペプチドは高い選択性を保持し、かつエフリン結合を阻害するのに十分なそれらの濃度よりも高い濃度でさえも、他のEphB受容体へのエフリン結合を阻害しなかった(図6C)。ここで該TNYL-RAWペプチド(10μM)は、固定化したEphB4の外部ドメインへのエフリン−B2 APの結合を阻害するが、他のEphBの結合ドメインへの結合は阻害しない。ペプチド存在下でのエフリン−B2−AP結合を、(A)及び(B)におけるペプチド不在下での結合に対して標準化した。またTNYL-RAWペプチドは、基底のEphB4チロシンリン酸化と同様、MCF7細胞のエフリン−B2 Fc刺激によって誘導される濃度依存的様式でのEphB4チロシンリン酸化を阻害したが、これはおそらく、内因的に発現した低レベルのエフリン−B2による刺激に起因する(図6D)。エフリン−B2 Fc、又はコントロールとしてのFcでの刺激後、内因性EphB4をMCF7乳ガン細胞から免疫沈降し、抗リン酸化チロシン抗体(PTyr)を用いた免疫ブロッティングで標識した。10秒の露光が、TNYL-RAWペプチドがエフリン−B2 Fcによって誘導されるEphB4のリン酸化を阻害するのを示すのに対し、2分の露光は、該ペプチドもEphB4の低レベルのリン酸化を阻害することを示し、これはおそらく内因的に発現したエフリン−B2に起因する。該フィルターを、EphB4抗体で再標識し、免疫沈降された受容体の等量を確認した。
(ガンの治療におけるEphB結合ペプチドの投与)
様々な診断方法で、結腸直腸ガンの治療の必要がある患者を同定する。治療的有効量のEphB受容体結合ペプチドを、患者に投与する。そのような治療の後、該患者における結腸直腸ガンの減少を検出する。
(実施例10)
(ガンの治療におけるEphB受容体結合ペプチドの投与)
様々な診断方法にで、異常な血管新生に関連する腫瘍性疾患の治療が必要である患者を同定する。治療的有効量のEphB受容体結合ペプチドを、外科的治療及び/又は化学療法的治療に先立って患者に投与し、該腫瘍の血管新生を減少させ、それによって該腫瘍の収縮を誘導する。そのような処理の後、該腫瘍のサイズの減縮を検出する。
(慢性痛の治療におけるEphB結合ペプチドの投与)
神経因性疼痛を訴える患者に、治療的有効量のEphB受容体結合ペプチドを投与する。その痛みのレベルの減少を観測し、該患者で測定する。
(実施例11)
(脊髄損傷の治療における、EphB受容体結合ペプチドの投与)
脊髄の負傷を有する患者に、EphB受容体の活性を阻害する治療的有効量のEphB受容体結合ペプチドを投与する。損傷部位での神経再生を刺激する。そのような治療後、刺激した部位での神経再生が患者で見られる。
Claims (17)
- EphB受容体ファミリーのメンバーに選択的に結合し、かつ該EphB受容体ファミリーの前記メンバーへのエフリンBリガンドの結合を阻害する、単離ペプチド。
- エフリンG−Hループを模倣する、請求項1記載の単離ペプチド。
- 配列番号:1のアミノ酸配列を有する、請求項1記載の単離ペプチド。
- 配列番号:2のアミノ酸配列を有する、請求項1記載の単離ペプチド。
- 配列番号:3のアミノ酸配列を有する、請求項1記載の単離ペプチド。
- 配列番号:4のアミノ酸配列を有する、請求項1記載の単離ペプチド。
- 配列番号:5のアミノ酸配列を有する、請求項1記載の単離ペプチド。
- 配列番号:39のアミノ酸配列を有する、請求項1記載の単離ペプチド。
- 治療的に許容し得る担体と組み合わせた、請求項1記載の単離ペプチド。
- 患者におけるEphB受容体関連疾患の治療方法であって:
EphB受容体関連疾患の治療を必要とする患者を同定すること;及び、
前記患者に、治療的有効量の請求項1の単離ペプチドを投与すること;
を含む、前記方法。 - 前記EphB受容体関連疾患が、腫瘍性疾患、神経疾患、又は血管疾患である、請求項10記載の方法。
- 前記単離ペプチドが、化学療法薬剤、又は毒素に連結される、請求項10記載の方法。
- 患者における腫瘍の画像化方法であって:
EphB受容体を発現する腫瘍を有すると疑われる患者を同定すること;
該患者に、造影剤に連結された請求項1記載の単離ペプチドを投与すること;及び、
該患者において、前記造影剤の画像を得ること;
を含む、前記方法。 - 前記造影剤が、蛍光性である、請求項13記載の方法。
- 前記造影剤が、放射性である、請求項13記載の方法。
- EphB関連疾患の治療用薬剤の製造における、請求項1記載のペプチドの使用。
- 前記EphB関連疾患が、腫瘍性疾患、神経疾患、又は血管疾患である、請求項16記載の使用。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013166751A (ja) * | 2012-01-20 | 2013-08-29 | Nippon Flour Mills Co Ltd | がんの治療又は予防剤 |
Families Citing this family (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006507256A (ja) | 2002-09-24 | 2006-03-02 | ザ バーナム インスティチュート | Eph受容体活性を調節する新規薬剤 |
CA2584130A1 (en) * | 2004-10-18 | 2006-04-27 | Medimmune, Inc. | High cell density process for growth of listeria |
KR20070118230A (ko) | 2005-01-27 | 2007-12-14 | 더 번햄 인스티튜트 | Ephb 수용체-결합 펩티드 |
US8343461B2 (en) | 2006-03-08 | 2013-01-01 | Wake Forest University Health Sciences | Molecular signature of cancer |
CA2644743C (en) | 2006-03-08 | 2015-05-19 | Waldemar Debinski | Soluble monomeric ephrin a1 |
JP2009221107A (ja) * | 2006-05-24 | 2009-10-01 | Aqumen Biopharmaceuticals Kk | エフリンb2の活性を高めるペプチド,その塩,医薬用組成物,治療用キット |
US20100150834A1 (en) * | 2006-09-15 | 2010-06-17 | The Burnham Institute | High affinity ephb receptor binding compounds and methods of use thereof |
WO2008060481A1 (en) * | 2006-11-10 | 2008-05-22 | Parker College Of Chiropractic | Method for treating chronic pain |
ES2447868T3 (es) | 2007-03-14 | 2014-03-13 | Bionsil S.R.L. In Liquidazione | Inhibidores de la BTK para uso en el tratamiento de tumores epiteliales resistentes a fármacos quimioterapéuticos |
WO2008156642A1 (en) * | 2007-06-15 | 2008-12-24 | Vasgene Therapeutics, Inc. | Non-immunoglobulin antigen binding scaffolds for inhibiting angiogenesis and tumor growth |
US20120121613A1 (en) * | 2009-01-19 | 2012-05-17 | Bayer Healthcare Llc | Protein conjugate having an endopeptidase- cleavable bioprotective moiety |
US20100240594A1 (en) * | 2009-03-20 | 2010-09-23 | Burnham Institute For Medical Research | Targeted delivery of chemotherapeutic agents |
US20120207734A1 (en) * | 2011-02-14 | 2012-08-16 | Allergan, Inc. | Methods of Inhibiting Aberrant Blood Vessel Formation Using Opioid Retargeted Endpeptidases |
WO2012112434A1 (en) * | 2011-02-14 | 2012-08-23 | Allergan, Inc. | Inhibiting aberrant blood vessel formation using retargeted endopeptidases |
WO2013106824A1 (en) * | 2012-01-13 | 2013-07-18 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Epherin receptor targeting agents |
CN105694891B (zh) * | 2015-12-30 | 2018-01-23 | 深圳先进技术研究院 | 一种用于荧光寿命编码的量子点及其荧光寿命编码方法 |
CN105906691B (zh) * | 2016-07-05 | 2019-09-13 | 珠海诺贝尔国际生物医药研究院有限公司 | 一种Eph激酶多肽抑制剂及其应用 |
CN106153920B (zh) * | 2016-07-25 | 2018-04-27 | 四川大学华西医院 | 一种肺癌筛查试剂盒 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002026827A1 (en) * | 2000-09-29 | 2002-04-04 | Novartis Ag | Extracellular polypeptides of eph b receptors and ephrin b ligands and the corresponding nucleic acid molecules |
WO2004028551A1 (en) * | 2002-09-24 | 2004-04-08 | The Burnham Institute | Novel agents that modulate eph receptor activity |
WO2004080425A2 (en) * | 2003-03-12 | 2004-09-23 | Vasgene Therapeutics, Inc. | Polypeptide compounds for inhibiting angiogenesis and tumor growth |
Family Cites Families (29)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1333777C (en) | 1988-07-01 | 1995-01-03 | Randy M. Berka | Aspartic proteinase deficient filamentous fungi |
IL107599A0 (en) * | 1992-11-13 | 1994-02-27 | Amgen Inc | Eck receptor ligands |
US5824303A (en) * | 1992-11-13 | 1998-10-20 | Amgen Inc. | Eck receptor ligands |
DE69334100T2 (de) * | 1992-11-13 | 2007-07-19 | Immunex Corp., Seattle | Elk ligand, ein cytokin |
US5516658A (en) | 1993-08-20 | 1996-05-14 | Immunex Corporation | DNA encoding cytokines that bind the cell surface receptor hek |
US6303769B1 (en) | 1994-07-08 | 2001-10-16 | Immunex Corporation | Lerk-5 dna |
US5864020A (en) | 1994-07-20 | 1999-01-26 | Genentech, Inc. | HTK ligand |
US5795734A (en) * | 1994-09-19 | 1998-08-18 | President And Fellows Of Harvard College | EPH receptor ligands, and uses related thereto |
NZ295022A (en) | 1994-10-05 | 1999-04-29 | Immunex Corp | Lerk-6 polypeptide derivatives, proteins, dna and host cells thereof |
US5919905A (en) | 1994-10-05 | 1999-07-06 | Immunex Corporation | Cytokine designated LERK-6 |
US5759775A (en) * | 1994-10-27 | 1998-06-02 | Genetech, Inc. | Methods for detecting nucleic acids encoding AL--1 neurotrophic factor |
ATE263781T1 (de) | 1994-10-27 | 2004-04-15 | Genentech Inc | Neurotrophischer al-1 faktor, einer ligand verwant mit dem eph tyrosine kinase receptor |
DK0871702T3 (da) | 1994-12-06 | 2005-09-19 | Immunex Corp | Cytokin betegnet Lerk-7 |
US6057124A (en) | 1995-01-27 | 2000-05-02 | Amgen Inc. | Nucleic acids encoding ligands for HEK4 receptors |
WO1996026958A2 (en) | 1995-02-27 | 1996-09-06 | President And Fellows Of Harvard College | Eph RECEPTOR LIGAND ELF-2 |
US6001964A (en) * | 1995-09-20 | 1999-12-14 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Peptides which bind to anti-double stranded DNA antibody |
JP2001521368A (ja) | 1996-03-21 | 2001-11-06 | イミュネックス・コーポレーション | Lerk―8と称すサイトカイン |
EP0864956A3 (en) * | 1997-03-12 | 1999-03-31 | Texas Instruments Incorporated | Low dropout regulators |
AU9024198A (en) | 1997-08-19 | 1999-03-08 | Vanderbilt University | Methods for determining cell responses through ephb receptors |
WO1999045121A1 (en) | 1998-03-02 | 1999-09-10 | The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary Of The Department Health And Human Services | EPITOPE PEPTIDES IMMUNOGENIC AGAINST $i(STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE) |
US6864227B1 (en) | 1998-04-13 | 2005-03-08 | California Institute Of Technology | Artery-and vein-specific proteins and uses therefor |
DK1090033T4 (da) | 1998-06-24 | 2008-03-31 | Innogenetics Nv | Partikler af HCV-kappeproteiner: Anvendelse til vaccination |
ATE293989T1 (de) | 1998-11-20 | 2005-05-15 | Genentech Inc | Verwendung von eph-rezeptor-antagonisten und agonisten zur behandlung von vaskulären krankheiten |
WO2000037500A1 (en) | 1998-12-18 | 2000-06-29 | Mount Sinai Hospital | Three dimensional structure of a sterile alpha motif domain |
US7060284B1 (en) | 1999-08-03 | 2006-06-13 | The Ohio State University | Polypeptides and polynucleotides for enhancing immune reactivity to HER-2 protein |
WO2003004057A1 (en) * | 2001-07-03 | 2003-01-16 | The Hospital For Sick Children | Ephrin and eph receptor mediated immune modulation |
EP1617864A4 (en) | 2003-04-11 | 2006-06-21 | Medimmune Inc | EPHA2 AND NON-NEOPLASTIC HYPERPROLIFERATIVE CELL TROUBLESHOOTING |
KR20070118230A (ko) | 2005-01-27 | 2007-12-14 | 더 번햄 인스티튜트 | Ephb 수용체-결합 펩티드 |
US20100150834A1 (en) | 2006-09-15 | 2010-06-17 | The Burnham Institute | High affinity ephb receptor binding compounds and methods of use thereof |
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002026827A1 (en) * | 2000-09-29 | 2002-04-04 | Novartis Ag | Extracellular polypeptides of eph b receptors and ephrin b ligands and the corresponding nucleic acid molecules |
WO2004028551A1 (en) * | 2002-09-24 | 2004-04-08 | The Burnham Institute | Novel agents that modulate eph receptor activity |
WO2004080425A2 (en) * | 2003-03-12 | 2004-09-23 | Vasgene Therapeutics, Inc. | Polypeptide compounds for inhibiting angiogenesis and tumor growth |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013166751A (ja) * | 2012-01-20 | 2013-08-29 | Nippon Flour Mills Co Ltd | がんの治療又は予防剤 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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