DE69730841T2 - C-typ lektine - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue Typ-C-Lectine. Insbesondere betrifft die Erfindung neue Mitglieder der endocytischen Typ-C-Lectin-Familie und funktionelle Derivate dieser neuen Polypeptide.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Es wurde ermittelt, dass die Erkennung von Kohlenwasserstoffen durch Lectine eine wichtige Rolle in verschiedenen Aspekten der eukaryotischen Physiologie spielt. Eine Zahl unterschiedlicher Tier- und Pflanzen-Lectin-Familien existiert, doch sind es die calciumabhängigen oder Typ-C-Lectine, die in jüngster Zeit die meiste Aufmerksamkeit sammelten. Beispielsweise wurde ermittelt, dass die Erkennung von Kohlenwasserstoffresten an entweder Endothelzellen oder Leukocyten durch die Selectin-Familie calciumabhängiger Lectine von hoher Bedeutung zum Dirigieren von Leukocyten an Entzündungsstellen ist. L. Lasky, Ann. Rev. Biochem., 64, 113–139 (1995). Die biophysikalische Analyse dieser adhäsiven Wechselwirkungen legte nahe, dass die in diesem Fall entwickelte Lectin-Kohlehydrat-Bindung die Adhäsion zwischen Leukocyten und dem Endothel unter den Bedingungen hoher Scherkraft des Gefäßsystems ermöglicht. Alon et al., Nature (1995), im Druck. Daher ermöglichen die hohen Raten der Kohlehydraterkennung durch derartige Lectine die eilige Akquisition eines Liganden, eine Notwendigkeit unter der hohen Scherkraft des vaskulären Flusses. Die physiologische Verwendung von Typ-C-Lectinen in diesem Fall wird auch durch die relativ niedrigen Affinitäten dieser Wechselwirkungen gestützt, eine Anforderung für das Leukocytenroll phänomen, von dem beobachtet wurde, dass es an Stellen einer akuten Entzündung auftritt. Die Kristallstrukturen des Mannose bindenden Proteins (Weis et al., Science 254, 1608–1615 [1991]; Weis et al., Nature 360, 127–134 [1992]) und E-Selectin (Graves et al., Nature 367(6463), 532–538 [1994]) zusammen mit verschiedenen Mutageneseanalysen (Erbe et al., J. Cell. Biol. 199(1), 215–227 [1992]; Drickamer, Nature 360, 183–186 [1992]; Iobst et al., J. Biol. Chem. 169(22), 15505–15511 [1994]; Kogan et al., J. Biol. Chem. 270(23), 14047–14055 [1995]) sind mit der Annahme konsistent, dass die Typ-C-Lectine allgemein an der raschen Erkennung von clusterförmigen Kohlehydraten beteiligt sind. Zusammen legen diese Daten nahe, dass Typ-C-Lectine eine Zahl kritischer physiologischer Phänomene über die rasche, mit relativ niedriger Affinität erfolgende Erkennung von Kohlehydraten durchführen.
  • Obwohl eine Zahl unterschiedlicher Typ-C-Lectin-Familien bekannt ist, ist eine besonders ungewöhnliche Gruppe die durch die Makrophagenmannose-(Taylor et al., J. Biol. Chem. 265(21), 12156–62 [1990]; Harris et al., Blood 80(9), 2363–73 [1992]), Phospholipase-A2-(Ishizaki et al., J. Biol. Chem. 269(8), 5897–904 [1994]; Lambeau et al., J. Biol. Chem. 269(3), 1575–8 [1994]; Higashino et al., Eur. J. Biochem. 225(1), 375–82 [1994]) und DEC-205-(Jiang et al., Nature 375(6527), 151–5 [1995])Rezeptoren repräsentierte. Während die meisten Mitglieder der Typ-C-Lectin-Gruppe nur eine einzige kohlehydratbindende Domäne enthalten, enthalten diese drei Rezeptoren entweder 8 (Makrophagenmannose- und Phospholipase-A2-Rezeptoren) oder 10 (DEC-205-Rezeptor) Lectin-Domänen, und es ist wahrscheinlich, dass diese Domänen miteinander unter Verstärkung der Ligandavidität kooperieren (Taylor et al., J. Biol. Chem. 267(3), 1719–20 [1992]; Taylor et al., J. Biol. Chem. 268(1), 399–404 [1993]). Alle drei dieser Moleküle scheinen Typ-1-Transmembranproteine zu sein, und sie scheinen alle verschiedene endocytische Phänomene zu vermitteln. Daher wird diese Familie im folgenden als endocytische Typ-C-Lectin-Familie bezeichnet (Harris et al., aaO; Jiang et al., aaO, Zvaritch et al, J. Biol. Chem. 271(1), 250–7 [1996]). Der endocytische Mechanismus ist besonders wichtig im Falle des Makrophagenmannoserezeptors, der dominant an Makrophagen und Leberendothel exprimiert wird (Harris et al., aaO), und des DEC-205-Rezeptors (Jiang et al., aaO), der speziell an dendritischen und Thymusepithelzellen exprimiert wird. Daher scheinen diese beiden Rezeptoren die Endocytose von großen teilchenförmigen (d. h. Pathogenen wie Hefe) (der Makrophagenmannoserezeptor) oder stark glykosylierten molekularen (der DEC-205-Rezeptor) Komplexen zu vermitteln. In beiden Fällen ist die Endocytose glykosylierter Komplexe durch diese Rezeptoren an dem Transport von entweder Teilchen oder Glykoproteinen zum endosomalen Weg beteiligt, wo sie abgebaut werden und im Falle des DEC-205-Rezeptors Zellen des Immunsystems durch die dendritischen oder Thymusepithelzellen wirksam präsentiert werden (Jiang et al., aaO). Es scheint daher wahrscheinlich, dass diese beiden Rezeptoren an der Präsentation von stark glykosylierten Strukturen gegenüber Immunzellen, um wirksame Reaktionen gegen pathogene Organismen zu ermöglichen, beteiligt sind. Interessanterweise ist der Phospholipase-A2-Rezeptor wahrscheinlich auch an der endocytischen Aufnahme extrazellulärer Proteine beteiligt, obwohl dies in diesem Fall ein endogenes Protein, d. h. eine oder mehrere Phospholipasen, zu sein scheint (Ishizaki et al., aaO; Lambeau et al., aaO; Higashino et al., aaO; Zvaritch et al., aaO). Die exakte biologische Funktion dieses Rezeptors außer der als Mediator hoher Affinität für die Phospholipase-Bindung ist nicht bekannt, und dessen Gewebeexpressionsmuster scheint weitaus breiter als das der anderen zwei Rezeptoren in dieser Familie zu sein (Higishino et al., aaO). Außerdem ist nicht klar, dass die Bindung von Phospholipase an diesen Rezeptor durch Protein-Kohlehydrat-Wechselwirkungen vermittelt wird, obwohl dieser Rezeptor klar zur Bindung glykosylierter Proteine fähig ist (Lambeau et al., aaO). Zusammengefasst scheinen alle drei bekannten Mitglieder dieser Familie der Typ-C-Lectine an der Bindung und Aufnahme von entweder großen teilchenförmigen oder molekularen Komplexen in den endocytischen Zellweg beteiligt zu sein, und im Falle von sowohl des Makrophagenmannose- als auch des DEC-205-Rezeptors scheinen diese Wechselwirkungen über die Protein-Kohlehydrat-Erkennung zu erfolgen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung basiert auf den Identifizierung, rekombinanten Herstellung und Charakterisierung eines neuen Mitglieds der Familie der endocytischen Typ-C-Lectine. Insbesondere betrifft die Erfindung ein neues Polypeptid, das eine Region umfasst, die eine entfernte (~23%) Homologie zu einer Region der E-Selectin-Lectin-Domäne zeigt. Bei der Analyse des homologen Sequenzmotivs ermittelten wir überraschenderweise, dass trotz des niedrigen Homologiegrads die Reste, die mit Resten in der E-Selectin-Lectin-Domäne identisch waren, im Teilsatz der Aminosäuren, die in der breiten Mehrzahl von Typ-C-Lectinen konserviert sind, enthalten waren. Auf der Basis dieser Beobachtung und von weiteren Erkenntnissen, die im folgenden beschrieben werden, wurde das neue Protein als ein neues Mitglied der Familie der endocytischen Typ-C-Lectine identifiziert. Das neue Protein enthält Domänen, die zu den in anderen Mitgliedern dieser Lectin-Familie gefundenen entfernt verwandt, jedoch hinsichtlich der Gesamtstruktur ähnlich sind. Außerdem scheint es in einigen hoch endothelialisierten Regionen des Embryo und Erwachsenen sowie durch aktives Züchten und Differenzieren von Chondrocyten im Embryo spezifisch exprimiert zu werden. Diese Daten legen nahe, dass dieses Lectin ein neues Mitglied der endocytischen Lectin-Familie präsentiert, das an der Endocytose von glykosylierten Komplexen durch das Endothel sowie durch Chondrocyten während der Knorpelbindung beteiligt sein kann.
  • In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung neue isolierte Säuger-Typ-C-Lectine, die mit dem Makrophagenmannoserezeptor, dem Phospholipase-A2-Rezeptor und dem DEC-205-Rezeptor, die alle Mitglieder der Familie der Typ-C-Lectine, die mehrfache Lectin-Domänen, die Endocytose vermitteln, enthalten, sind, eng verwandt sind, und funktionale Derivate der neuen Typ-C-Lectine. Die nativen Polypeptide innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung sind dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Signalsequenz, eine cysteinreiche Domäne, eine Fibronectin-Typ-II-Domäne, 8 Typ-C-Lectin-Domänen, eine Transmembrandomäne und eine kurze cytoplasmatische Domäne enthalten. Die vorliegende Erfindung umfasst speziell die löslichen Formen der neuen Rezeptormoleküle, denen eine aktive Transmembrandomäne und optional die gesamte oder ein Teil der cytoplasmatischen Domäne fehlt.
  • Die Erfindung betrifft ein isoliertes Typ-C-Lectin, das ausgewählt ist aus der Gruppe von:
    • (a) einem Polypeptid, das die Reste 37 bis 1393 der Aminosäuresequenz von 2 (SEQ ID NO: 2) oder 9 (SEQ ID NO: 4) umfasst;
    • (b) einem Polypeptid mit mindestens 60% Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz von 1 (SEQ ID NO: 2) oder 9 (SEQ ID NO: 4); und
    • (c) einem Polypeptid mit mindestens 80% Sequenzidentität mit den ersten drei Lectin-Domänen oder der Fibronec tin-Typ-II-Domäne der Aminosäuresequenz von 1 (SEQ ID NO: 2) oder 9 (SEQ ID NO: 4);
    • (d) einem Polypeptid mit mindestens 80% Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz von 1 (SEQ ID NO: 2) oder 9 (SEQ ID NO: 4);
    • (e) dem Polypeptid von (a)–(d), das keine aktive Transmembrandomäne und/oder cytoplasmatische Domäne aufweist, das nicht von nativer Glykosylierung begleitet ist, oder das eine andere Glykosylierung aufweist.
  • Die Erfindung betrifft ferner ein Nucleinsäuremolekül mit Codierung für ein neues Typ-C-Lectin der vorliegenden Erfindung, Vektoren, die eine derartige Nucleinsäure enthalten, und mit den Vektoren transformierte Wirtszellen. Die Nucleinsäure codiert vorzugsweise für mindestens die Fibronectin-Typ-II-Domäne und die ersten drei Lectin-Domänen eines nativen oder varianten Typ-C-Lectins der vorliegenden Erfindung. Die Erfindung umfasst ferner eine Nucleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit dem Komplement einer Nucleinsäure mit Codierung für ein natives Typ-C-Lectin der vorliegenden Erfindung hybridisiert und ein Protein codiert, das die qualitativen Kohlehydrat-Bindungseigenschaften eines nativen Typ-C-Lectins hierbei beibehält.
  • In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Typ-C-Lectins, das im vorhergehenden definiert ist, wobei das Verfahren das Transformieren einer Wirtszelle mit Nucleinsäure mit Codierung für das gewünschte Typ-C-Lectin, das Kultivieren der transformierten Zelle und das Gewinnen des produzierten Typ-C-Lectins aus der Wirtszellkultur umfasst.
  • In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Immunadhäsin, das eine wie im vorhergehenden beschriebene neue Typ-C-Lectin-Sequenz an eine Immunglobulinsequenz fusio niert umfasst. Die Typ-C-Lectin-Sequenz ist vorzugsweise die Form eines nativen oder varianten Polypeptids mit deletierter Transmembrandomäne, das an eine Sequenz der konstanten Domäne eines Immunglobulins fusioniert ist, und sie umfasst mindestens die Fibronectin-Typ-II-Domäne und eine Kohlehydraterkennungs(lectin)domäne eines nativen Typ-C-Lectins der vorliegenden Erfindung. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform zeigt die in dem Immunadhäsin vorhandene Typ-C-Lectin-Sequenz mindestens etwa 80% Sequenzhomologie mit der Fibronectin-Typ-II-Domäne und/oder mit mindestens einer der ersten drei Kohlehydraterkennungsdomänen eines nativen Typ-C-Lectins der vorliegenden Erfindung. Die Sequenz der konstanten Domäne eines Immunglobulins ist vorzugsweise die eines IgG-1-, IgG-2- oder IgG-3-Moleküls.
  • Die Erfindung betrifft ferner pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein wie oben definiertes Typ-C-Lectin im Gemisch mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1. Sequenzhomologie zwischen der E-Selectin-Lectin-Domäne und einem EST. Gezeigt wird die Homologiesequenz (T11885) (SEQ ID NO: 9), die aus einer Recherche der Expressed Sequence Tag (EST)-Datenbank mit der E-Selectin-Lectin-Domäne (SEQ ID NO: 8) stammt. Die Homologieregion wurde in dem Aminosäuren 10–67 der E-Selectin-Lectin-Domäne ermittelt.
  • 2. Die DNA und von der cDNA abgeleitete Proteinsequenz mit Codierung für die E-Selectin-homologe Maussequenz. Angegeben ist die gesamte DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 1) und die abgeleitete Proteinsequenz (SEQ ID NO: 2) der Maus-cDNA-Klone und RACE-Produkte, die unter Verwendung der T11885-DNA-Sequenz als Sonde abgeleitet wurden. Die zum ursprünglichen EST homologe Region erstreckt sich von den Aminosäuren 995 bis 1061.
  • 3. Proteinhomologien zwischen dem neuen Typ-C-Lectin (SEQ ID NO: 2), dem Makrophagenmannoserezeptor (SEQ ID NO: 5), dem Phospholipase-A2-Rezeptor (SEQ ID NO: 7) und dem DEC-205-Rezeptor (SEQ ID NO: 6). Angegeben sind die konservierten Reste in den drei Mitgliedern der endocytischen Typ-C-Lectin-Familie (eingerahmt). Als Überschrift angegeben sind die Signalsequenz, die cysteinreiche, Fibronectin-Typ-II-, Typ-C-Lectin-, Transmembran- und cytoplasmatische Domäne. Die neunte und zehnte Typ-C-Lectin-Domänen des DEC-205-Rezeptors wurden deletiert, um eine klarere Zuordnung zu ermöglichen.
  • 4. Domänenhomologien und relative prozentuale Konservierung zwischen dem neuen Lectin, dem Makrophagenmannoserezeptor, dem Phospholipase-A2-Rezeptor und dem DEC-205-Rezeptor. Angegeben sind die verschiedenen Domänen und die prozentuale Konservierung zwischen diesen Domänen in dem neuen Typ-C-Lectin und den drei anderen Mitgliedern der endocytischen Typ-C-Lectin-Familie. Die Domänen sind folgende: Cys-reich: cysteinreich, Fn II: Fibronectin Typ 2, CRD: Kohlehydraterkennungsdomäne (Typ-C-Lectin), TM: Transmembran, CYTO: cytoplasmatisch.
  • 5. Genomblot, das mit der cDNA des neuen Rezeptors untersucht wurde, und Genomstruktur des Gens mit Codierung für den neuen Rezeptor.
    A. Ein "Zooblot", das aus verschiedenen Organismen isolierte und mit EcoR1 verdaute Genom-DNA enthielt, wurde mit dem ursprünglichen EST-Fragment, das mittels PCR aus der Herzbibliothek isoliert wurde, als Sonde behandelt.
    B. Der obere Teil der Figur erläutert die Domänenstruktur des neuen Typ-C-Lectins und die näherungsweisen Orte, die durch Dot-Blotting und PCR-Analyse für jedes Intron bestimmt wurden (Pfeilspitzen). Unten ist der Genort angegeben, wobei jedes Exon als kleiner Kasten definiert ist.
  • 6. Northern-Blot-Analyse von humanen und murinen Geweben und Zelllinien auf die Expression des Transkripts mit Codierung für das neue Typ-C-Lectin.
    A. Ein handelsübliches Northern-Blot, das entweder vollständige Mausfetus-RNA (linkes Panel) oder von Geweben ausgewachsener Mäuse stammende RNA enthielt, wurde mit dem von ursprünglichem EST stammenden Fragment, das aus der Mausherz-cDNA-Bibliothek isoliert wurde, als Sonde untersucht.
    B. Ein handelsübliches Northern-Blot, das aus verschiedenen humanen Geweben von Erwachsenen oder Feten isolierte RNA enthielt, wurde mit dem aus der humanen Herz-cDNA-Bibliothek stammenden ursprünglichen EST als Sonde untersucht.
    C. Ein handelsübliches Blot, das RNA enthielt, die aus den humanen Tumorzelllinien a. promyelotische Leukämie-HL-60, b. Hela-Zellen-S3, c. chronische myelogene Leukämie-K-562, d. Lymphoblastenleukämie-MOLT-4, e. Burkitt-Lymphom-Raji, f. kolorektales Adenokarzinom-SW480, g. Lungenkarzinom-A549 und h. Melanom-G361 isoliert wurde, wurde mit dem aus der humanen Herz-cDNA-Bibliothek stammenden ursprünglichen EST als Sonde untersucht.
  • 7. Charakterisierung der 5'-Region des alternativ gespleißten humanen fetalen Lebertranskripts. Die Sequenz erläutert, dass das humane Transkript voller Länge (MRX) und das alternativ gespleißte Transkript (FL) von der 3'-Region bis zum Nucleotid 61 des alternativ gespleißten fetalen Leberklons identisch waren. Der obere Teil der Figur erläutert eine PCR-Analyse unter Verwendung von zwei 5'-Primern, die entweder für das Transkript voller Länge (Primer 1) (SEQ ID NO: 12) oder das alternativ gespleißte Transkript (Primer 2) (SEQ ID NO: 13) spezifisch sind. Der 3'-PCR-Primer ist am Ende der Sequenz angegeben und er ist in beiden Fällen identisch (SEQ ID NO: 14). Eine interne Oligonucleotidsonde, die zur Hybridisierung verwendet wird, ist als der Mittelprimer angegeben und ebenfalls für beide Sequenzen identisch (SEQ ID NO: 15). 1 oder 2 in den oberen Panels bezeichnet die 5'-Primer, die für die PCR-Reaktion für jedes Gewebe verwendet werden. Die Panels zeigen, dass das kleinere PCR-Fragment (2) dem alternativ gespleißten Transkript entspricht, und es findet sich nur in der fetalen Leber und nicht in der Lunge oder dem Herzen.
  • 8. In-situ-Hybridisierungsanalyse von Neugeborenen- und Embryogeweben mit dem neuen Typ-C-Lectin.
    A. Mit Antisense-Sonde hybridisierte Lunge, B. mit Sense-Sonde hybridisierte Lunge, C. mit Antisense-Sonde hybridisiertes Nierenglomerulum, D. mit Antisense-Sonde hybridisierter Plexus choroideus, E. mit Antisense-Sonde hybridisiertes sich entwickelndes Sternum, F. mit Sense-Sonde hybridisiertes sich entwickelndes Sternum, G. mit Antisense-Sonde hybridisierter sich entwickelnder Zahn, H. mit Antisense-Sonde hybridisierter sich entwickelnder Larynxkorpel.
  • 9. Proteinsequenz des neuen humanen Typ-C-Lectins (SEQ ID NO: 4).
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • A. Definitionen
  • Die Ausdrücke "neues Typ-C-Lectin" und "neues endocytisches Typ-C-Lectin" werden austauschbar verwendet und bezeichnen neue native Mitglieder der Familie der endocytischen Typ-C-Lectine, die speziell in einigen stark endothelialisierten Regionen des Embryos und von Erwachsenen und in aktiv wachsenden und sich differenzierenden Chondrocyten im Embryo exprimiert werden, und funktionale Derivate derartiger nativer Polypeptide.
  • Die Ausdrücke "natives (neues) endocytisches Typ-C-Lectin" und "natives (neues) Typ-C-Lectin" bezeichnen in diesem Zusammenhang neue natürlich vorkommende endocytische Typ-C-Lectin-Rezeptoren, die eine cysteinreiche Domäne, eine Fibronectin-Typ-II-Domäne, mehrere Typ-C-Lectin-Domänen, eine Transmembrandomäne und eine cytoplasmatische Domäne mit einer oder ohne eine native(n) Signalsequenz umfassen, und natürlich vorkommende lösliche Formen derartiger Typ-C-Lectin-Rezeptoren mit dem oder ohne das initiierende Methionin, ungeachtet dessen, ob sie aus einer nativen Quelle gereinigt, synthetisiert, durch Gentechnik oder durch eine beliebige Kombination dieser und/oder anderer Verfahren hergestellt wurden. Die nativen Typ-C-Lectine der vorliegenden Erfindung umfassen speziell das Maus-Typ-C-Lectin, dessen Aminosäuresequenz in 2 angegeben ist (SEQ ID NO: 2), und das humane Typ-C-Lectin mit der in 9 angegeben Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 4) und ferner Säugetierhomologa dieser nativen Rezeptoren. Die neuen nativen murinen und humanen Typ-C-Lectine der vorliegenden Erfindung weisen eine Länge von etwa 1480 Aminosäuren auf und sie umfassen eine Signalsequenz (Aminosäuren 1–36), eine cysteinreiche Domäne (von etwa Aminosäureposition 37 bis etwa Aminosäureposition 174), eine Fibronectin-Typ-II-Domäne (von etwa Aminosäureposition 175 bis etwa Aminosäureposition 229), acht Kohlehydraterkennungs(lectin)domänen (CRDs) (CRD1: etwa aa 234–360; CRD2: etwa aa 381–507; CDR3: etwa aa 520–645; CRD4: etwa aa 667–809; CRD5: etwa aa 824–951; CRD6: etwa aa 970–1108; CRD7: etwa aa 1110–1243; CRD8: etwa aa 1259–1393); eine Transmembrandomäne (von etwa Aminosäureposition 1410 bis etwa Aminosäureposition 1434); und eine cytoplasmatische Domäne, die sich bis zum C-Terminus des Moleküls erstreckt. Die Grenzen dieser Domänen sind in 3 für die neue Maus-Typ-C-Lectin-Sequenz angegeben.
  • Die Ausdrücke "lösliche Form", "löslicher Rezeptor", "lösliches Typ-C-Lectin", "lösliches endocytisches Typ-C-Lectin" und grammatikalische Varianten derselben bezeichnen Varianten der nativen oder varianten Typ-C-Lectine der vorliegenden Erfindung, die keine funktionale Transmembrandomäne aufweisen. Bei den löslichen Rezeptoren kann die Transmembrandomäne deletiert, gestutzt bzw. verkürzt oder in anderer Weise derart inaktiviert sein, dass sie zur Zellmembranverankerung nicht fähig sind. Falls gewünscht, können derartige lösliche Formen der Typ-C-Lectine der vorliegenden Erfindung zusätzlich ihre cytoplasmatischen Domänen vollständig oder partiell deletiert oder in anderer Weise inaktiviert aufweisen.
  • Ein "funktionales Derivat" eines Polypeptids ist eine Verbindung mit einer mit dem nativen Polypeptid gemeinsamen qualitativen biologischen Aktivität. Daher ist ein funktionales Derivat eines nativen neuen Typ-C-Lectins der vorliegenden Erfindung eine Verbindung, die eine mit einem derartigen nativen Lectin gemeinsame qualitative biologische Aktivität aufweist. "Funktionale Derivate" umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, Fragmente nativer Polypeptide einer beliebigen Tierart (einschließlich von Menschen), Derivate nativer (humaner und nicht-humaner) Polypeptide und deren Fragmente und Peptid- und Nichtpeptidanaloga nativer Polypeptide, vorausgesetzt, sie besitzen eine mit einem jeweiligen nativen Polypeptid gemeinsame biologische Aktivität. "Fragmente" umfassen Regionen in der Sequenz eines reifen nativen Polypeptids. Der Ausdruck "Derivat" wird zur Definition von Aminosäuresequenz- und Glykosylierungsvarianten und kovalenten Modifikationen eines nativen Polypeptids verwendet. "Nichtpeptidanaloga" sind organische Verbindungen, die im wesentlichen die gleiche Oberfläche wie Peptidanaloga der nativen Polypeptide aufweisen. Daher sind die Nichtpeptidanaloga der nativen neuen Typ-C-Lectine der vorliegenden Erfindung organische Verbindungen, die im wesentlichen die gleiche Oberfläche wie Peptidanaloga der nativen Typ-C-Lectine aufweisen. Derartige Verbindungen Wechselwirken mit anderen Molekülen in einer ähnlichen Weise wie die Peptidanaloga und sie ahmen die biologische Aktivität eines nativen Typ-C-Lectins der vorliegenden Erfindung nach. Üblicherweise behalten Aminosäuresequenzvarianten der vorliegenden Erfindung mindestens eine Domäne eines nativen Typ-C-Lectins bei oder sie weisen mindestens etwa 60% Aminosäuresequenzidentität, zweckmäßigerweise mindestens etwa 70% Aminosäuresequenzidentität, noch zweckmäßiger mindestens etwa 80% Aminosäuresequenzidentität, vorzugsweise mindestens etwa 90% Aminosäuresequenzidentität mit einer Domäne eines nativen Typ-C-Lectins der vorliegenden Erfindung auf. Die Aminosäuresequenzvarianten zeigen vorzugsweise einen sehr hohen Grad der Aminosäuresequenzhomologie mit der Fibronectin-Typ-II-Domäne oder den lectinähnlichen Domänen, vorzugsweise den ersten drei lectinähnlichen (Kohlehydrat bindenden) Domänen nativer Typ-C-Lectine der vorliegenden Erfindung. Diese sind die Domänen, die den höchsten Prozentsatz der Aminosäurekonservierung zwischen den neuen Typ-C-Lectinen der vorliegenden Erfindung und anderen Mitgliedern der endocytischen Typ-C-Lectin-Familie zeigen (4).
  • Die Ausdrücke "kovalente Modifikation" und "kovalente Derivate" werden austauschbar verwendet und umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, Modifikationen eines nativen Polypeptids oder eines Fragments desselben mit einem organischen proteinartigen oder nicht-proteinartigen Derivatisierungsmittel, Fusionen an heterologe Polypeptidsequenzen und posttranslationale Modifikationen. Kovalente Modifikationen werden herkömmlicherweise durch Umsetzen von gezielten Aminosäureresten mit einem organischen Derivatisierungsmittel, das mit gewählten Seiten oder terminalen Resten reagieren kann, oder durch die Nutzung von Mechanismen posttranslationaler Modifikationen, die in selektierten rekombinanten Wirtszellen funktionieren, eingeführt. Bestimmte posttranslationale Modifikationen sind das Ergebnis der Wirkung rekombinanter Wirtszellen auf das exprimierte Polypeptid. Glutaminyl- und Asparaginylreste werden häufig posttranslational zu den entsprechenden Glutamyl- und Aspartylresten desamidiert. Alternativ werden diese Reste unter leicht sauren Bedingungen desamidiert. Andere posttranslationale Modifikationen umfassen die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, die Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl-, Tyrosin- oder Threonylresten, die Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidinseitenketten [T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, S. 79–86 (1983)]. Kovalente Derivate/Modifikationen umfassen speziell Fusionsproteine, die native Typ-C-Lectin-Sequenzen der vorliegenden Erfindung und deren Aminosäuresequenzvarianten umfassen, wie Immunadhäsine, und N-terminale Fusionen an heterologe Signalsequenzen.
  • Der Ausdruck "biologische Aktivität" ist im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung als der Besitz von mindestens einer adhäsiven, regulatorischen oder Effektorfunktion, der qualitativ mit einem nativen Polypeptid gemeinsam ist, definiert. Bevorzugte funktionale Derivate innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung werden dadurch zusammengefasst, dass sie die qualitativen Kohlehydraterkennungseigenschaften eines nativen endocytischen Typ-C-Lectins der vorliegenden Erfindung beibehalten.
  • "Identität" oder "Homologie" in Bezug auf ein natives Polypeptid und dessen funktionales Derivat ist hier als der Prozentsatz der Aminosäurereste in der fraglichen Sequenz, die mit den Resten eines entsprechenden nativen Polypeptids nach der Ausrichtung der Sequenzen und, falls notwendig, der Einführung von Zwischenräumen, um die maximale prozentuale Homologie zu erreichen, und ohne die Berücksichtigung konservativer Substitutionen als Teil der Sequenzidentität identisch sind, definiert. Weder N- noch C-terminale Verlängerungen noch Insertionen sollen als die Identität oder Homologie verringernd betrachtet werden. Verfahren und Computerprogramme zur Ausrichtung sind einschlägig bekannt.
  • Der Ausdruck "Agonist" wird zur Bezeichnung von Peptid- und Nichtpeptidanaloga der nativen Typ-C-Lectine der vorliegenden Erfindung und Antikörpern, die derartige native Typ-C-Lectine spezifisch binden, vorausgesetzt, sie behalten mindestens eine biologische Aktivität eines nativen Typ-C-Lectins bei, verwendet. Vorzugsweise behalten die Agonisten der vorliegenden Erfindung die qualitativen Kohlehydraterkennungseigenschaften der nativen Typ-C-Lectin-Polypeptide bei.
  • Der Ausdruck "Antagonist" wird zur Bezeichnung eines Moleküls verwendet, das eine biologische Aktivität eines nativen Typ-C-Lectins der vorliegenden Erfindung hemmt. Vorzugsweise hemmen die Antagonisten hier die Kohlehydratbindung eines nativen Typ-C-Lectins der vorliegenden Erfindung. Bevorzugte Antagonisten blockieren die Bindung eines nativen Typ-C-Lectins an eine Kohlehydratstruktur, an die es ansonsten bindet, im wesentlichen vollständig.
  • Üblicherweise bezeichnen die Ausdrücke "Aminosäure" und "Aminosäuren" alle natürlich vorkommenden L-α-Aminosäuren. In einigen Ausführungsformen können jedoch D-Aminosäuren in den Polypeptiden oder Peptiden der vorliegenden Erfindung vorhanden sein, um eine Konformationsbeschränkung zu ermöglichen. Beispielsweise kann zur Erleichterung der Bildung und Stabilität einer Disulfidbindung die Aminosäure D-Cystein an einem oder beiden Enden eines funktionalen Peptidderivats oder Peptidantagonisten der nativen Typ-C-Lectine der vorliegenden Erfindung angebracht werden. Die Aminosäuren werden durch entweder die Ein-Buchstaben- oder Drei-Buchstaben-Bezeichnungen identifiziert:
    Asp D Asparaginsäure
    Thr T Threonin
    Ser S Serin
    Glu E Glutaminsäure
    Pro P Prolin
    Gly G Glycin
    Ala A Alanin
    Cys C Cystein
    Val V Valin
    Met M Methionin
    Ile I Isoleucin
    Leu L Leucin
    Tyr Y Tyrosin
    Phe F Phenylalanin
    His H Histidin
    Lys K Lysin
    Arg R Arginin
    Trp W Tryptophan
    Gln Q Glutamin
    Asn N Asparagin
  • Der Ausdruck "Aminosäuresequenzvariante" bezeichnet Moleküle mit einigen Unterschieden in deren Aminosäuresequenzen im Vergleich zu einer nativen Aminosäuresequenz.
  • Substitutionsvarianten sind diejenigen, bei denen mindes tens ein Aminosäurerest in einer nativen Sequenz entfernt und eine unterschiedliche Aminosäure an deren Stelle an der gleichen Position eingefügt wurde.
  • Insertionsvarianten sind diejenigen, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren unmittelbar angrenzend an eine Aminosäure an einer speziellen Position in einer nativen Sequenz eingefügt wurde. Unmittelbar angrenzend an eine Aminosäure bedeutet entweder an die funktionelle α-Carboxy- oder α-Aminogruppe der Aminosäure gebunden.
  • Deletionsvarianten sind diejenigen, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren in der nativen Aminosäuresequenz entfernt sind.
  • "Antikörper (Abs)" und "Immunglobuline (Igs)" sind Glykoproteine mit den gleichen Struktureigenschaften. Während Antikörper Bindungsspezifität gegenüber einem spezifischen Antigen zeigen, umfassen Immunglobuline sowohl Antikörper als auch antikörperähnliche Moleküle, denen Antigenspezifität fehlt. Polypeptide der letzteren Art werden beispielsweise in niedrigen Konzentrationen durch das Lymphsystem und in höheren Konzentrationen durch Myelome produziert.
  • Native Antikörper und Immunglobuline sind üblicherweise heterotetramere Glykoproteine von etwa 150000 Dalton, die aus zwei identischen leichten (L) Ketten und zwei identischen schweren (H) Ketten bestehen. Jede leichte Kette ist durch eine kovalente Disulfidbindung an eine schwere Kette gebunden, während die Zahl der Disulfidverknüpfungen zwischen den schweren Ketten unterschiedlicher Immunglobulinisotypen variiert. Jede schwere und leichte Kette besitzt auch regelmäßig beabstandete Disulfidbrücken in der Kette. Jede schwere Kette besitzt an einem Ende eine variable Domäne (VH) gefolgt von einer Zahl konstanter Domänen. Jede leichte Kette besitzt eine variable Domäne an einem Ende (VL) und eine konstante Domäne am anderen Ende; die konstante Domäne der leichten Kette ist an der ersten konstanten Domäne der schweren Kette ausgerichtet, und die variable Domäne der leichten Kette ist an der variablen Domäne der schweren Kette ausgerichtet. Es wird angenommen, dass spezielle Aminosäurereste eine Grenzfläche zwischen den variablen Domänen der leichten und schweren Kette bilden (Clothia et al., J. Mol. Biol. 186, 651–663 [1985]; Novotny und Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4592–4596 [1985]).
  • Die leichten Ketten von Antikörpern (Immunglobulinen) jeder Wirbeltierart können auf der Basis der Aminosäuresequenzen ihrer konstanten Domänen einem von zwei klar unterschiedlichen Typen der Bezeichnung kappa und lambda (λ) zugeordnet werden.
  • In Abhängigkeit von der Aminosäuresequenz der konstanten Domäne von deren schweren Ketten können Immunglobuline unterschiedlichen Klassen zugeordnet werden. Es gibt fünf Hauptklassen von Immunglobulinen: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, und mehrere von diesen können weiter in Unterklassen (Isotypen), beispielsweise IgG-1, IgG-2, IgG-3 und IgG-4; IgA-1 und IgA-2, unterteilt werden. Die konstanten Domänen der schweren Kette, die den unterschiedlichen Immunglobulinklassen entsprechen, werden mit α, δ, ϵ, γ bzw. μ bezeichnet. Die Untereinheitstrukturen und dreidimensionalen Konfigurationen unterschiedlicher Immunglobulinklassen sind bekannt.
  • Der Ausdruck "Antikörper" wird im breitesten Sinne verwendet und umfasst insbesondere einzelne monoklonale Antikörper (die Agonisten- und Antagonistenantikörper umfassen), Antikörperzusammesetzungen mit Polyepitopspezifität, sowie Antikörperfragmente (beispielsweise Fab, F(ab')2 und Fv), sofern sie die gewünschte biologische Aktivität zeigen.
  • Der hier verwendete Ausdruck "monoklonaler Antikörper" bezeichnet einen Antikörper, der aus einer Population von im wesentlichen homogenen Antikörpern erhalten wurde, d. h. die die Population umfassenden individuellen Antikörper sind mit Ausnahme von möglichen, natürlich auftretenden Mutationen, die in geringeren Mengen vorhanden sein können, identisch. Die Modifizierung "monoklonal" bezeichnet den Charakter des Antikörpers, dass dieser aus einer im wesentlichen homogenen Population von Antikörpern erhalten wurde, und soll nicht bedeuten, dass die Herstellung des Antikörpers durch ein spezielles Verfahren erforderlich ist. Beispielsweise können die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten monoklonalen Antikörper durch das Hybridomverfahren, das als erstes von Kohler & Milstein, Nature 256: 495 (1975) beschrieben wurde, oder durch gentechnische Verfahren [siehe beispielsweise US-Patent Nr. 4 816 567 (Cabilly et al.)] hergestellt werden.
  • Die hier angegebenen monoklonalen Antikörper umfassen speziell "chimäre" Antikörper (Immunglobuline), in denen ein Teil der schweren und/oder leichten Kette mit entsprechenden Sequenzen in Antikörpern, die von einer speziellen Art stammen oder zu einer speziellen Antikörperklasse oder -unterklasse gehören, identisch ist oder zu diesen homolog ist, während der Rest der Kette(n) mit entsprechenden Sequenzen in Antikörpern, die von einer anderen Art stammen oder zu einer anderen Antikörperklasse oder -unterklasse gehören, identisch ist oder zu diesen homolog ist, sowie Fragmente derartiger Antikörper, sofern sie die gewünschte biologische Aktivität zeigen (US-Patent Nr. 4 816 567, Cabilly et al.; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851–6855 [1984]).
  • "Humanisierte" Formen nicht-humaner (beispielsweise muriner) Antikörper sind chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente derselben (beispielsweise Fv, Fab, Fab', F(ab)2 oder andere antigenbindenden Teilsequenzen von Antikörpern), die eine von nicht-humanem Immunglobulin abgeleitete Minimalsequenz enthalten. Größtenteils sind humanisierte Antikörper humane Immunglobuline (Empfängerantikörper), in denen Reste einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) des Empfängers durch Reste einer CDR einer nicht-humanen Spezies (Donorantikörper), wie Maus, Ratte oder Kaninchen, mit der gewünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt sind. In einigen Fällen sind Reste des Fv-Gerüsts des humanen Immunglobulins durch die entsprechenden nicht-humanen Reste ersetzt. Ferner kann ein humanisierter Antikörper Reste umfassen, die sich weder im Empfängerantikörper noch in der importierten CDR oder Gerüstsequenzen finden. Diese Modifikationen erfolgen zur weiteren Verfeinerung und Optimierung der Antikörpereigenschaften. Allgemein umfasst der humanisierte Antikörper im wesentlichen alle von mindestens einer und typischerweise zwei variablen Domänen, in denen alle oder im wesentlichen alle CDR-Regionen denen eines nicht-humanen Immunglobulins entsprechen und alle oder im wesentlichen alle FR-Regionen diejenigen einer humanen Immunglobulinkonsensussequenz sind. Der humanisierte Antikörper umfasst ferner optimalerweise mindestens einen Teil einer konstanten Region eines Immunglobulins (Fc), typischerweise der eines humanen Immunglobulins. Für weitere Details siehe: Jones et al., Nature 321, 522–525 [1986]; Reichmann et al., Nature 332, 323–329 [1988]; EP-B-239 400, veröffentlicht am 30. September 1987; Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593–596 [1992]; und EP-B-451 216, veröffentlicht am 24. Januar 1996.
  • Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung werden die Ausdrücke "Zelle", "Zelllinie" und "Zellkultur" austauschbar verwendet, und alle derartigen Bezeichnungen umfassen Nachkommen. Es ist auch klar, dass nicht alle Nachkommen aufgrund geplanter oder unabsichtlicher Mutationen hinsichtlich des DNA-Gehalts genau identisch sind. Mutierte Nachkommen, die die gleiche Funktion oder biologische Eigenschaft, nach der die ursprünglich transformierte Zelle durchmustert wurde, aufweisen, werden umfasst.
  • Die Ausdrücke "replizierbarer Expressionsvektor", "Expressionsvektor" und "Vektor" bezeichnen ein üblicherweise doppelsträngiges DNA-Stück, in das ein Stück Fremd-DNA insertiert worden sein kann. Fremd-DNA ist als heterologe DNA definiert, die DNA ist, die natürlichweise in der Wirtszelle nicht gefunden wird. Der Vektor wird zum Transport der Fremd-DNA oder heterologen DNA in eine geeignete Wirtszelle verwendet. Sobald der Vektor in der Wirtszelle ist, kann er sich unabhängig von der chromosomalen DNA des Wirts replizieren und es können mehrere Kopien des Vektors und von dessen insertierter (fremder) DNA erzeugt werden. Außerdem enthält der Vektor die notwendigen Elemente, die die Translation der Fremd-DNA in ein Polypeptid gestatten. Viele Moleküle des durch die Fremd-DNA codierten Polypeptids können auf diese Weise rasch synthetisiert werden.
  • Der Ausdruck "Kontrollsequenzen" bezeichnet DNA-Sequenzen, die zur Expression einer operativ verknüpften Codierungssequenz in einem speziellen Wirtsorganismus notwendig sind. Die Kontrollsequenzen, die beispielsweise für Prokaryoten geeignet sind, umfassen einen Promotor, optional eine Operatorsequenz, eine Ribosomenbindungsstelle und möglicherweise andere, bisher kaum verstandene Sequenzen. Von eukaryotischen Zellen ist bekannt, dass sie Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer verwenden.
  • Eine Nucleinsäure ist "operativ verknüpft", wenn sie in eine funktionsmäßige Beziehung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz gesetzt wurde. Beispielsweise ist DNA für eine Vorsequenz oder eine sekretorisches Leadersequenz operativ mit DNA für ein Polypeptid verknüpft, wenn sie als ein Präprotein, das an der Sekretion des Polypeptids teilnimmt, exprimiert wird; ein Promotor oder Enhancer operativ mit einer Codierungssequenz verknüpft, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosomenbindungsstelle operativ mit einer Codierungssequenz verknüpft, wenn sie so positioniert ist, dass die Translation ermöglicht wird. Allgemein bedeutet "operativ verknüpft", dass die DNA-Sequenzen, die verknüpft werden, fortlaufend sind und im Falle einer sekretorischen Leadersequenz fortlaufend und in der Lesephase sind. Enhancer müssen jedoch nicht fortlaufend sein. Die Verknüpfung wird durch Ligation an passenden Restriktionsstellen erreicht. Wenn derartige Stellen nicht exisitieren, werden synthetische Oligonucleotidadapter oder -linker gemäß der herkömmlichen Praxis verwendet.
  • "Oligonucleotide" sind einzel- oder doppelsträngige Polydesoxynucleotide kurzer Länge, die chemisch durch bekannte Verfahren synthetisiert werden [wie Phosphotriester-, Phosphit- oder Phosphoramididchemie, unter Verwendung von Festphasenverfahren, beispielsweise gemäß der Beschreibung in EP 266 032 , veröffentlicht am 4. Mai 1988, oder über Desoxynucleosid-H-phosphanat-Zwischenprodukte gemäß der Beschreibung bei Froehler et al., Nucl. Acids Res. 14, 5399 (1986)]. Sie werden dann auf Polyacrylamidgelen gereinigt.
  • Eine Hybridisierung wird vorzugsweise unter "stringenten Bedingungen" durchgeführt, was (1) die Verwendung niedriger Ionenstärke und einer hohen Temperatur zum Waschen, beispielsweise 0,015 Natriumchlorid/0,0015 Natriumcitrat/0,1% Natriumdodecylsulfat bei 50°C, oder (2) die Verwendung eines Denaturierungsmittels, wie Formamid, beispielsweise 50% (Vol/Vol) Formamid mit 0,1% Rinderserumalbumin 0,1% Ficoll/0,1% Polyvinylpyrrolidon/50 nM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM Natriumchlorid, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C während der Hybridisierung bedeutet. Ein weiteres Beispiel ist die Verwendung von 50% Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6/8), 0,1% Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardt-Lösung, ultraschallbehandelter Lachsspermien-DNA (50 μg/ml), 0,1% SDS und 10% Dextransulfat bei 42°C mit Waschen bei 42°C in 0,2 × SSC und 0,1% SDS. Ein weiteres Beispiel ist die Hybridisierung unter Verwendung eines Puffers aus 10% Dextransulfat, 2 × SSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat) und 50% Formamid bei 55°C, gefolgt von einem hochstringenten Waschen, das aus EDTA enthaltendem 0,1 × SSC bei 55°C besteht.
  • "Immunadhäsine" oder "Typ-C-Lectin-Immunglobulinchimäre" sind chimäre antikörperähnliche Moleküle, die die funktionale Domäne(n) eines bindenden Proteins (üblicherweise ein Rezeptor, ein Zelladhäsionsmolekül oder ein Ligand) mit der Immunglobulinsequenz kombinieren. Das häufigste Beispiel dieses Typs eines Fusionsproteins kombiniert die Gelenk- und Fc-Regionen eines Immunglobulins (Ig) mit Domänen eines Zelloberflächenrezeptors, der einen speziellen Liganden erkennt. Dieser Typ eines Moleküls wird als "Immunadhäsin" bezeichnet, da er "Immun"- und "Adhäsions"funktionen kombiniert; andere häufig verwendete Namen sind "Ig-Chimäre", "Ig-" oder "Fc-Fusionsprotein" oder "Rezeptorglobulin".
  • B. Herstellung der neuen Typ-C-Lectine durch Gentechnologie
  • 1. Identifizierung und Isolierung von Nucleinsäure mit Codierung für die neuen Typ-C-Lectine
  • Die nativen endocytischen Typ-C-Lectine der vorliegenden Erfindung können aus cDNA- oder Genombibliotheken isoliert werden. Beispielsweise kann eine geeignete cDNA-Bibliothek konstruiert werden, indem polyadenylierte mRNA aus Zellen, die bekanntermaßen das gewünschte Typ-C-Lectin exprimieren, gewonnen und die mRNA als Templat zur Synthese von doppelsträngiger cDNA verwendet wird. Geeignete Quellen der mRNA sind stark endothelialisierte Bereiche von embryonalen und ausgewachsenen Säugergeweben und differenzierende Chondrocyten im Embryo. mRNA mit Codierung für native Typ-C-Lectine der vorliegenden Erfindung wird beispielsweise in Lungen-, Nieren- und Lebergewebe von humanen Feten; Herz-, Lungen-, Nieren-, Hirn- und Muskelgewebe von ausgewachsenen Mäusen; Herz-, Prostata-, Hoden-, Eierstock-, Darm-, Hirn-, Plazenta-, Lungen-, Nieren-, Pankreas-, Milz-, Thymus- und Kolongewebe von erwachsenen Menschen exprimiert. Das Gen mit Codierung für die neuen Typ-C-Lectine der vorliegenden Erfindung kann auch aus einer Genombibliothek, beispielsweise einer Humangenom-Cosmidbibliothek oder einer von Mäusen stammenden Genombibliothek von embryonalen Zellen (ES) erhalten werden.
  • Die entweder cDNA- oder Genombibliotheken werden dann mit Sonden, die zur Identifizierung des interessierenden Gens oder des dadurch codierten Proteins gestaltet sind, durchmustert. Für cDNA-Expression-Bibliotheken umfassen geeignete Sonden monoklonale und polyklonale Antikörper, die einen Typ-C-Lectin-Rezeptor erkennen und spezifisch an diesen binden. Für cDNA-Bibliotheken umfassen geeignete Sonden sorgfältig ausgewählte Oligonucleotidsonden (üblicherweise einer Länge von etwa 20–80 Basen), die bekannte oder vermutete Teile eines Typ-C-Lectin-Polypeptids der gleichen oder einer unterschiedlichen Art codieren, und/oder komplementäre oder homologe cDNAs oder Fragmente derselben, die das gleiche oder ein ähnliches Gen codieren. Geeignete Sonden zur Durchmusterung von Genom-DNA-Bibliotheken umfassen ohne Beschränkung Oligonucleotide, cDNAs oder Fragmente derselben, die das gleiche oder ein ähnliches Gen codieren, und/oder homologe Genom-DNAs oder Fragmente derselben. Die Durchmusterung der cDNA- oder Genombibliothek mit der gewählten Sonde kann unter Verwendung von Standardverfahren gemäß der Beschreibung in Kapitel 10–12 von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, durchgeführt werden.
  • Wenn DNA mit Codierung für ein Enzym der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von sorgfältig ausgewählten Oligonucleotidsequenzen zur Durchmusterung von cDNA-Bibliotheken von verschiedenen Geweben isoliert wird, sollten die als Sonden gewählten Oligonucleotidsequenzen eine ausreichende Länge aufweisen und so ausreichend unzweideutig sein, dass falsche positive Ergebnisse minimiert sind. Die aktuelle Nucleotidsequenz bzw. die aktuellen Nucleotidsequenzen werden üblicherweise auf der Basis von Bereichen, die geringste Codonredundanz aufweisen, gestaltet. Die Oligonucleotide können an einer oder mehreren Positionen entartet sein. Die Verwendung entarteter Oligonucleotide ist von besonderer Bedeutung, wenn eine Bibliothek einer Spezies, in der eine bevorzugte Codonverwendung nicht bekannt ist, durchmustert wird.
  • Das Oligonucleotid muss derart markiert werden, dass es bei Hybridisierung mit einer DNA in der Bibliothek, die durchmustert wird, detektiert werden kann. Das bevorzugte Markierungsverfahren ist die Verwendung von ATP (beispielsweise γ32P) und Polynucleotidkinase zur radioaktiven Markierung des 5'-Endes des Oligonucleotids. Jedoch können andere Verfahren zur Markierung des Oligonucleotids verwendet werden, wobei diese, ohne hierauf beschränkt zu sein, eine Biotinylierung oder Enzymmarkierung umfassen.
  • cDNAs mit Codierung für die neuen Typ-C-Lectine können auch durch andere bekannte Verfahren der Gentechnik, beispielsweise durch direkte Expressionsklonierung oder durch die Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) gemäß der Beschreibung in US-Patent Nr. 4 683 195, erteilt am 28. Juli 1987, in Abschnitt 14 von Sambrook et al., aaO, oder in Kapitel 15 von Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Hrsg., Greene Publishing Associates und Wiley-Interscience 1991, identifiziert und isoliert werden. Die Verwendung der PCR-Technik zur Amplifizierung einer cDNA-Bibliothek von humanem Herz und Mausherz wird in den Beispielen beschrieben.
  • Wenn cDNA mit Codierung für ein neues natives endocytisches Typ-C-Lectin von einer Art isoliert wurde, können cDNAs von anderen Arten auch durch Kreuzhybridisierung erhalten werden. Gemäß diesem Ansatz werden humane oder andere Säuger-cDNA- oder -Genombibliotheken durch markierte Oligonucleotidsequenzen, die aus bekannten Typ-C-Lectin-Sequenzen (wie murinen oder humanen Sequenzen) entsprechend bekannten Kriterien – u. a., dass die Sequenz eine ausreichende Länge besitzen und so ausreichend unzweifelhaft sein sollte, dass falsche positive Ergebnisse minimiert sind – ausgewählt sind, sondiert. Typischerweise ist ein 32P-markiertes Oligonucleotid mit etwa 30 bis 50 Basen ausreichend, insbesondere, wenn das Oligonucleotid ein oder mehrere Codons für Methionin oder Typtophan enthält. Isolierte Nucleinsäure ist DNA, die identifiziert und von begleitender Nucleinsäure mit Codierung für andere Polypeptide von der Nucleinsäurequelle abgetrennt ist. Die Hybridisierung wird vorzugsweise unter "stringenten Bedingungen", die im vorhergehenden definiert wurden, durchgeführt.
  • Wenn die Sequenz bekannt ist, kann das Gen mit Codierung für ein spezielles Typ-C-Lectin auch durch eine chemische Synthese gemäß einem der Verfahren, die in Engels und Uhlmann, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 28, 716 (1989) beschrieben sind, erhalten werden. Diese Verfahren umfassen Triester-, Phosphit-, Phosphoramidit- und H-Phosphonatverfahren, PCR und andere Autoprimerverfahren und Oligonucleotidsynthesen auf festen Trägern.
  • 2. Klonierung und Expression von Nucleinsäure mit Codierung für die neuen Typ-C-Lectine
  • Wenn die Nucleinsäure mit Codierung für ein neues Typ-C-Lectin verfügbar ist, wird sie allgemein in einen zur Replikation fähigen Expressionsvektor zur weiteren Klonierung (Amplifikation der DNA) oder zur Expression ligiert.
  • Expressions- und Klonierungsvektoren sind einschlägig bekannt und enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die den Vektor zur Replikation in einer oder mehreren ausgewählten Wirtszellen befähigt. Die Selektion des geeigneten Vektors hängt von 1) der Frage, ob er zur DNA-Amplifikation oder zur DNA-Expression verwendet werden soll, 2) der Größe der in den Vektor zu insertierenden DNA und 3) der mit dem Vektor zu transformierenden Wirtszelle ab. Jeder Vektor enthält in Abhängigkeit von dessen Funktion (Amplifikation von DNA oder Expression von DNA) und der Wirtszelle, für die er kompatibel ist, verschiedene Komponenten. Die Vektorkomponenten umfassen allgemein, ohne hierauf beschränkt zu sein, eine oder mehrere der folgenden: eine Signalsequenz, einen Replikationsstartpunkt, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancerelement, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz. Die Konstrukion geeigneter Vektoren, die eine oder mehrere der oben angeführten Komponenten, die gewünschten Codierungs- und Kontrollsequenzen enthalten, verwendet Standardligationstechniken. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, maßgeschneidert und in der gewünschten Form religiert, wobei die erforderlichen Plasmide erzeugt werden. Zur Analyse, um die korrekten Sequenzen in konstruierten Plasmiden festzustellen, werden die Ligationsgemische üblicherweise zur Transformation von E. coli-Zellen, beispielsweise dem E. coli K12-Stamm 294 (ATCC 31 446), verwendet und erfolgreiche Transformanten durch ggf. Ampicillin- oder Tetracyclin-Resistenz selektiert. Plasmide werden ausgehend von den Transformanten hergestellt, durch Restriktionsendonucleaseverdau analysiert und/oder durch das Verfahren von Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981), oder durch das Verfahren von Maxam et al., Methods in Enzymology 65, 499 (1980), sequenziert.
  • Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können in einer Vielzahl von prokaryotischen und eukaryotischen Wirtszellen exprimiert werden. Geeignete Prokaryoten umfassen gramnegative oder grampositive Organismen, beispielsweise E. coli oder Bazillen. Ein bevorzugter Klonierungwirt ist E. coli 294 (ATCC 31 446), obwohl andere gramnegative oder grampositive Prokaryoten, wie E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31 537), E. coli W3110 (ATCC 27 325), Pseudomonas-Arten oder Serratia Marcesans geeignet sind.
  • Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mikroben, wie Fadenpilze oder Hefe hierbei geeignete Wirte für Vektoren. Saccharomyces cerevisiae oder Bäckerhefe ist der am häufigsten verwendete von niederen eukaryotischen Wirtsmikroorganismen. Jedoch sind eine Zahl anderer Gattungen, Arten und Stämme hierbei üblicherweise verfügbar und verwendbar, beispielsweise S. pombe [Beach und Nurse, Nature 290, 140 (1981)], Klyveromyces lactis [Louvencourt et al., J. Bacteriol. 737 (1983)]; Yarrowia ( EP 402 226 ); Pichia pastoris ( EP 183 070 ), Trichoderma reesia ( EP 244 234 ), Neurospora crassa [Case et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA 76, 5259–5263 (1979)]; und Aspergillus-Wirte, wie A. nidulans [Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 284–289 (1983)]; Tilburn et al., Gene 26, 205–221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA 81, 1470–1474 (1984)] und A. niger [Keller und Hynes, EMBO J. 4, 475–479 (1985)].
  • Geeignete Wirtszellen können auch von mehrzelligen Organismen stammen. Derartige Wirtszellen sind zu komplexen Prozessierungs- und Glykosylierungsaktivitäten fähig. Im Prinzip ist jede höhere eukaryotische Zellkultur, ungeachtet dessen, ob von einer Wirbeltier- oder Wirbellosenkultur, verwendbar, obwohl Zellen von Säugern, wie Menschen, bevorzugt sind. Beispiele für Wirbellosenzellen umfassen Pflanzen- und Insektenzellen. Zahlreiche Baculovirenstämme und Varianten und entsprechende zulässige Insektenwirtszellen von Wirten wie Spodoptera frugiperda (Käfer), Aedes aegypti (Stechmücke), Aedes albopictus (Stechmücke), Drosophila melangaster (Obstfliege), und Bombyx mori-Wirtszellen wurden identifiziert. Siehe beispielsweise Luckow et al., Bio/Technology 6, 47–55 (1988); Miller et al., in Genetic Engineering, J. K. Setlow et al., Hrsg., Band 8 (Plenum Publishing, 1986), S. 277–279; und Maeda et al., Nature 315, 592–594 (1985). Eine Vielzahl derartiger Virusstämme ist öffentlich zugänglich, beispielsweise die L-1-Variante von Autographa californica NPV, und derartige Viren können hier als das Virus gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere zur Transfektion von Spodoptera frugiperda-Zellen verwendet werden.
  • Pflanzenzellkulturen von Baumwolle, Mais, Kartoffel, Sojabohne, Petunie, Tomate und Tabak können als Wirte verwendet werden. Typischerweise werden Pflanzenzellen durch Inkubation mit bestimmten Stämmen des Bakteriums Agrobacterium tumefaciens, das zuvor so manipuliert wurde, dass es die DNA des Typ-C-Lectins enthält, transfiziert. Während der Inkubation der Pflanzenzellkultur mit A. tumefaciens wird die DNA mit Codierung für ein Typ-C-Lectin auf den Pflanzenzellwirt derart übertragen, dass er transfiziert wird und unter geeigneten Bedingungen die DNA des Typ-C-Lectins exprimiert. Außerdem sind mit Pflanzenzellen kompatible regulatorische und Signalsequenzen, beispielsweise der Nopalinsynthasepromotor und Polyadenylierungssignalsequenzen, verfügbar. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen. 1, 561 (1982). Außerdem können DNA-Segmente, die von der strangaufwärtigen Region des T-DNA-780-Gens isoliert wurden, die Transkriptionsgrade von in Pflanzen exprimierbaren Genen in rekombinante DNA enthaltendem Pflanzengewebe aktivieren oder erhöhen. Siehe EP 321 196 , veröffentlicht am 21. Juni 1989.
  • Jedoch war das Interesse an Wirbeltierzellen am größten, und die Vermehrung von Wirbeltierzellen in Kultur (Gewebekultur) ist als solche bekannt. Siehe Tissue Culture, Academic Press, Kruse und Patterson, Herausgeber (1973). Beispiele für verwendbare Säugerwirtszelllinien sind die mit SV40 transformierte Affenleber-CV1-Linie (COS-7, ATCC CRL 1651); eine humane Embryonierenzelllinie [293 oder 293-Zellen, die zur Zucht in Suspensionskultur subkloniert wurden, Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59 (1977)]; Babyhamsternierenzellen (BHK, ATCC CCL 10); Chinese Hamster Ovary-Zellen/-DHFR [CHO, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acac. Sci. USA 77, 4216 (1980)]; Maus-Sertoli-Zellen [TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243–251 (1980)]; Affennierenzellen (CV1 ATCC CCL 70); African Green Monkey-Nierenzellen (VERO-76, ATCC CRL-1587); humane Zervixkarzinomzellen (HELA, ATCC CCL 2); Hundenierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Buffalo-Rattenleberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); humane Lungenzellen (W138, ATCC CCL75); humane Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Mausbrusttumor (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI-Zellen [Mather et al., Annals N.Y. Acac. Sci. 383, 44068 (1982)]; MRC 5-Zellen; FS4-Zellen; und eine humane Hepatomzelllinie (Hep G2). Bevorzugte Wirtszellen sind humane Embryonieren-293- und Chinese Hamster Ovary-Zellen.
  • Besonders verwendbar bei der Durchführung dieser Erfindung sind Expressionsvektoren, die die transiente Expression von DNA mit Codierung für ein neues Typ-C-Lectin in Säugetierzellen hier ergeben. Allgemein umfasst eine transiente Expression die Verwendung eines Expressionsvektors, der in einer Wirtszelle effizient zur Replikation derart fähig ist, dass die Wirtszelle viele Kopien des Expressionsvektors ansammelt und wiederum hohe Mengen eines gewünschten Polypeptids, das durch den Expressionsvektor codiert wird, synthetisiert. Transiente Systeme, die einen geeigneten Expressionsvektor und eine Wirtszelle umfassen, ermöglichen die bequeme positive Identifizierung von Polypeptiden, die durch klonierte DNAs codiert werden, sowie das rasche Durchmustern derartiger Polypeptide auf gewünschte biologische oder physiologische Eigenschaften. Daher sind transiente Expressionssysteme zum Zwecke der Identifizierung von Analoga und Varianten eines nativen Typ-C-Lectins hier in der Erfindung besonders verwendbar.
  • Andere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die zur Anpassung für die Synthese der Typ-C-Lectine in einer rekombinanten Wirbeltierzellkultur geeignet sind, sind in Getting et al., Nature 293, 620–625 (1981); Mantel et al., Nature 281, 40–46 (1979); Levinson et al., EP 117 060 und EP 117 058 beschrieben. Zur Säugetierzellkulturexpression der Typ-C-Lectin-Polypeptide besonders verwendbare Plasmide sind pRK5 ( EP 307 247 ) oder pSVI6B (PCT-Veröffentlichung Nr. WO 91/08291).
  • Andere Klonierungs- und Expressionsvektoren, die zur Expression der Typ-C-Lectine der vorliegenden Erfindung in einer Vielzahl von Wirtszellen geeignet sind, sind beispielsweise in EP 457 758 , veröffentlicht am 27. November 1991, beschrieben. Eine große Vielzahl von Expressionsvektoren ist nun im Handel erhältlich. Ein Beispiel für einen im Handel erhältlichen Hefeexpressionsvektor ist pPIC.9 (Invitrogen), während ein zur Transformation von E. coli-Zellen geeigneter, im Handel erhältlicher Expressionsvektor PET15b (Novagen) ist.
  • C. Kultivieren der Wirtszellen
  • Prokaryotenzellen, die zur Herstellung der Typ-C-Lectine dieser Erfindung verwendet werden, werden in geeigneten Medien gemäß der allgemeinen Beschreibung in Sambrook et al., aaO, kultiviert.
  • Säugetierzellen können in einer Vielzahl von Medien kultiviert werden. Im Handel erhältliche Medien, wie Ham F10 (Sigma), Minimal Essential Medium (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma) und Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Sigma), sind zur Kultivierung der Wirtszellen geeignet. Ferner kann jedes der bei Ham und Wallace, Meth. Enzymol. 58, 44 (1979); Barnes und Sato, Anal. Biochem. 102, 255 (1980), US 4 767 704 , 4 657 866 , 4 927 762 oder 4 560 655 ; WO 90/03430, WO 87/00195 oder US Pat. Re. 30 985 beschriebene Medium als Kulturmedium für die Wirtszellen verwendet werden. Jedes dieser Medien kann nach Bedarf mit Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (wie Insulin, Transferin oder epidermaler Wachstumsfaktor), Salzen (wie Natriumchlorid, Calcium, Magnesium und Phosphat), Puffern (wie HEPES), Nucleosiden (wie Adenosin und Thymidin), Antibiotika (wie GentamycinTM-Wirkstoff), Spurenelementen (definiert als anorganische Verbindungen, die üblicherweise in Endkonzentra tionen im Mikromolbereich vorhanden sind) und Glucose oder einer äquivalenten Energiequelle ergänzt werden. Jeder andere notwendige Ergänzungsstoff kann auch in geeigneten Konzentrationen, die dem Fachmann geläufig sind, eingearbeitet werden. Die Kulturbedingungen, wie Temperatur, pH-Wert und dgl., sind günstigerweise die zuvor bei der Wirtszelle verwendeten, die zur Klonierung oder ggf. Expression verwendet wurden und dem üblichen Bearbeiter offenkundig sind.
  • Die Wirtszellen, die in dieser Offenbarung angegeben werden, umfassen Zellen in einer In-vitro-Zellkultur sowie Zellen, die sich in einem Wirtstier oder einer Wirtspflanze befinden.
  • Es wird ferner angenommen, dass die Typ-C-Lectine dieser Erfindung durch homologe Rekombination oder mit rekombinanten Herstellungsverfahren unter Verwendung von Kontrollelementen, die in Zellen eingeführt wurden, die bereits DNA mit Codierung für das spezielle Typ-C-Lectin enthielten, hergestellt werden können.
  • D. Detektion von Genamplifikation/expression
  • Eine Genamplifikation und/oder -expression kann in einer Probe direkt, beispielsweise durch herkömmliches Southern Blotting, Northern Blotting zur quantitativen Bestimmung der Transkription von mRNA [Thomas, Proc. Natl. Acac. Sci. USA 77, 5201–5205 (1980)], Dot Blotting (DNA-Analyse) oder In-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer geeignet markierten Sonde auf der Basis der hier bereitgestellten Sequenzen ermittelt werden. Verschiedene Markierungen können verwendet werden, am häufigsten Radioisotope, insbesondere 32P. Jedoch können auch andere Techniken verwendet werden, beispielsweise die Verwendung von Biotin-modifizierten Nucleotiden zur Einführung in ein Polynucleotid. Das Biotin dient dann als eine Stelle zur Bindung von Avidin oder Antikörpern, die mit einer breiten Vielzahl von Markierungen, wie Radionucliden, fluoreszierenden Stoffen, Enzymen oder dgl., markiert sein können. Alternativ können Antikörper verwendet werden, die spezifische Doppelhelices, die DNA-Doppelhelices, RNA-Doppelhelices und DNA-RNA-Hybriddoppelhelices oder DNA-Protein-Doppelhelices umfassen, erkennen können. Die Antikörper können wiederum markiert werden und der Test kann durchgeführt werden, wenn die Doppelhelix an die Oberfläche gebunden ist, so dass bei der Bildung der Doppelhelix an der Oberfläche das Vorhandensein von an die Doppelhelix gebundenem Antikörper detektiert werden kann.
  • Die Genexpression kann alternativ durch immunologische Verfahren, beispielsweise immunhistochemische Anfärbung von Gewebeschnitten und Test einer Zellkultur oder von Körperflüssigkeiten zur direkten quantitativen Bestimmung der Expression eines Genprodukts, ermittelt werden. Eine besonders empfindliche Anfärbetechnik, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet ist, ist bei Hse et al., Am. J. Clin. Parm. 75, 734–738 (1980) beschrieben.
  • Antikörper, die zur immunhistochemischen Anfärbung und/oder zum Test von Probenflüssigkeiten verwendbar sind, können entweder monoklonal oder polyklonal sein und in jedem Tier gebildet werden. Günstigerweise können die Antikörper gegen ein natives Typ-C-Lectin-Polypeptid oder gegen ein synthetisches Peptid auf der Basis der hier bereitgestellten DNA-Sequenz, wie im folgenden später beschrieben wird, gebildet werden.
  • E. Aminosäuresequenzvarianten von nativen Typ-C-Lectinen
  • Aminosäuresequenzvarianten von nativen Typ-C-Lectinen werden durch einschlägig bekannte Verfahren durch Einführen von geeigneten Nucleotidänderungen in DNA eines nativen Typ-C-Lectins oder durch In-vitro-Synthese des gewünschten Polypeptids hergestellt. Es bestehen zwei Hauptvariablen bei der Konstruktion von Aminosäuresequenzvarianten: die Lokalisierung der Mutationsstelle und die Natur der Mutation. Mit Ausnahme von natürlich vorkommenden Allelen, die keine Manipulation der DNA-Sequenz mit Codierung für das native Typ-C-Lectin erfordern, werden die Aminosäuresequenzvarianten von Typ-C-Lectinen vorzugsweise durch Mutation der DNA, um entweder ein Allel oder eine Aminosäuresequenzvariante, die in der Natur nicht auftritt, zu erhalten, konstruiert.
  • Eine Gruppe von Mutationen wird in der Fibronectin-Typ-II-Domäne oder in einer oder mehreren der Typ-C-Lectin-Domänen (vorzugsweise in den lectinähnlichen Domänen 1–3) eines neuen nativen Typ-C-Lectins der vorliegenden Erfindung erzeugt. Von diesen Domänen wird vermutet, dass sie funktional wichtig sind, weshalb angenommen wird, dass Änderungen, wie nichtkonservative Substitutionen, Insertionen und/oder Deletionen, in diesen Regionen zu ernsthaften Änderungen der Eigenschaften der nativen Rezeptormoleküle führen. Von dem Tyrosinrest an Position 1451 der neuen murinen und humanen Typ-C-Lectine und der umgebenden Aminosäuren wird ebenfalls angenommen, dass sie funktionale Bedeutung besitzen, da dieses Tyrosin in Typ-C-Lectinen konserviert ist und bereits als für die Endocytose des Phospholipase-A2-Rezeptors wichtig ermittelt wurde. Daher wird von den Aminosäureänderungen in dieser Region auch angenommen, dass sie zu Varianten mit gegenüber den entsprechenden nativen Polypeptiden signifikant unterschiedlichen Eigenschaften führen. Nichtkonservative Substitutionen innerhalb dieser funktionsmäßig wichtigen Domänen können zu Varianten führen, die die Kohlehydraterkennungs- und -bindungsfähigkeit ihrer nativen Gegen stücke verlieren oder im Vergleich zu den entsprechenden nativen Proteinen verstärkte Kohlehydraterkennungseigenschaften und verstärkte Selektivität aufweisen.
  • Alternativ oder zusätzlich können in Abhängigkeit vom Ziel, das erreicht werden soll, Aminosäureänderungen an Stellen, die sich in neuen Typ-C-Lectinen von verschiedenen Arten unterscheiden oder in hochkonservierten Regionen durchgeführt werden. Stellen an derartigen Orten werden typischerweise in Reihe modifiziert, beispielsweise durch (1) Substituieren mit zunächst konservativen Wahlmöglichkeiten und anschließend mit radikaleren Auswahlmöglichkeiten in Abhängigkeit von den erreichten Ergebnissen, (2) Deletion des Zielrests oder der Zielreste oder (3) Insertion von Resten der gleichen oder einer unterschiedlichen Klasse angrenzend an die lokalisierte Stelle oder Kombinationen der Optionen 1–3. Eine hilfreiche Technik wird als "Alanine Scanning" (Cunningham and Wells, Science 244, 1081–1085 [1989]) bezeichnet.
  • In einer noch weiteren Gruppe der Varianten von Typ-C-Lectinen der vorliegenden Erfindung können eine oder mehrere der funktionsmäßig weniger signifikanten Domänen deletiert oder inaktiviert sein. Beispielsweise ergibt die Deletion oder Inaktivierung der Transmembrandomäne lösliche Varianten der nativen Proteine. Alternativ oder zusätzlich kann die cytoplasmatische Domäne deletiert, verkürzt oder in anderer Weise geändert sein.
  • Natürlich vorkommende Aminosäuren werden auf der Basis der Eigenschaften einer gemeinsamen Seitenkette in Gruppen eingeteilt:
    • (1) hydrophobe: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
    • (2) neutrale hydrophobe: Cys, Ser, Thr;
    • (3) saure: Asp, Glu;
    • (4) basische: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
    • (5) Reste, die die Kettenorientierung beeinflussen: Gly, Pro; und
    • (6) aromatische: Trp, Tyr, Phe.
  • Konservative Substitutionen umfassen den Austausch eines Mitglieds in einer Gruppe durch ein anderes Mitglied in der gleichen Gruppe, während nicht-konservative Substitutionen den Austausch eines Mitglieds von einer dieser Klassen durch ein anderes ergeben. Wesentliche Änderungen der Funktion oder immunologischen Identität erfolgen durch die Wahl von Substitutionen, die weniger konservativ sind, d. h. sich signifikanter hinsichtlich deren Wirkung auf das Beibehalten von (a) der Struktur des Polypeptidgerüsts im Substitutionsbereich, beispielsweise als Faltblatt- oder Helixkonformation, (b) der Ladung oder Hydrophobizität des Moleküls an der Zielstelle oder (c) der sterischen Masse der Seitenkette unterscheiden. Die Substitutionen, von denen allgemein erwartet wird, dass sie die größten Änderungen der Eigenschaften der neuen nativen Typ-C-Lectine der vorliegenden Erfindung ergeben, sind diejenigen, in denen (a) ein hydrophiler Rest, beispielsweise Seryl oder Threonyl, für (oder durch) einen hydrophoben Rest, beispielsweise Leucyl, Isoleucyl, Phenylalanyl, Valyl oder Alanyl, substituiert ist; (b) ein Cystein oder Prolin für (oder durch) einen anderen Rest substituiert ist; (c) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette, beispielsweise Lysyl, Arginyl oder Histidyl, für (oder durch) einen elektronegativen Rest, beispielsweise Glutamyl oder Aspartyl, substituiert ist; oder (d) ein Rest mit einer sterisch sperrigen Seitenkette, beispielsweise Phenylalanin, für (oder durch) einen ohne eine Seitenkette, beispielsweise Glycin, substituiert ist.
  • Substitutionsvarianten der neuen Typ-C-Lectine der vorlie genden Erfindung umfassen auch Varianten, in denen funktional homologe (mit mindestens etwa 40–50% Homologie) Domänen anderer Proteine durch Routineverfahren für eine oder mehrere der im vorhergehenden identifizierten Domänen in der neuen Typ-C-Lectin-Struktur substituiert sind. Beispielsweise können die cysteinreiche Domäne, die Fibronectin-Typ-II-Domäne oder eine oder mehrere der erstem drei Kohlehydraterkennungs(CDR)domänen eines neuen Typ-C-Lectins der vorliegenden Erfindung durch eine entsprechende Domäne eines Makrophagenmannoserezeptors, eines Phospholipase-A2-Rezeptors oder eines DEC-205-Rezeptors ersetzt werden.
  • Aminosäuresequenzdeletionen liegen allgemein im Bereich von etwa 1 bis 30 Resten, vorzugsweise etwa 1 bis 10 Resten, und sie sind typischerweise fortlaufend. Typischerweise sind die Transmembran- und cytoplasmatischen Domänen oder nur die cytoplasmatischen Domänen deletiert. Jedoch ist eine Deletion von der C-terminalen bis zu jeder anderen geeigneten N-terminalen bis zur Transmembranregion, die die biologische Aktivität oder immunologische Kreuzreaktivität eines nativen Typ-C-Lectins konserviert, geeignet.
  • Eine bevorzugte Klasse von Substitutions- und/oder Deletionsvarianten der vorliegenden Erfindung sind diejenigen, die eine Transmembranregion eines neuen Typ-C-Lectin-Moleküls umfassen. Transmembranregionen sind hoch hydrophobe oder lipophile Domänen, die die passende Größe zum Durchspannen der Lipiddoppelschicht der Zellmembran aufweisen. Es wird angenommen, dass sie das Lectin in der Zellmembran verankern und eine Homo- oder Heteropolymerkomlexbildung ermöglichen. Die Inaktivierung der Transmembrandomäne, typischerweise durch Deletion oder Substitution von Transmembrandomänenhydroxylierungsresten, ermöglicht die Gewinnung und Formulierung durch Verringerung von deren zellulärer oder Membranlipidaffinität und Verbesserung von deren Was serlöslichkeit. Wenn die Transmembran- und cytoplasmatischen Domänen deletiert sind, wird die Einführung von potentiell immunogenen Epitopen entweder durch Freilegen von sonst intrazellulären Polypeptiden, die durch den Körper als fremd erkannt werden könnten, oder durch Insertion von heterologen Polypeptiden, die potentiell immunogen sind, vermieden. Die Inaktivierung der Membranbindungsfunktion wird durch Deletion von derart ausreichenden Resten, dass ein im wesentlichen hydrophiles Hydropathieprofil an dieser Stelle erzeugt wird, oder durch eine Substitution mit heterologen Resten, die das gleiche Ergebnis erreichen, erreicht.
  • Ein Hauptvorteil der transmembraninaktivierten Varianten der Typ-C-Lectine der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass sie in das Kulturmedium rekombinanter Wirte sezerniert werden können. Diese Varianten sind im Körperflüssigkeiten, wie Blut, löslich und besitzen keine erkennbare Affinität für Zellmembranlipide, wodurch ihre Gewinnung aus einer rekombinanten Zellkultur beträchtlich vereinfacht wird. Als allgemeiner Vorschlag sollen derartige lösliche Varianten keine funktionale Transmembrandomäne aufweisen und vorzugsweise keine funktionale cytoplasmatische Domäne aufweisen. Beispielsweise kann die Transmembrandomäne durch eine Aminosäuresequenz, beispielsweise eine zufällige oder vorgegebene Sequenzen von etwa 5 bis 50 Serin-, Threonin-, Lysin-, Arginin-, Glutamin-, Asparaginsäure- und dgl. hydrophilen Resten, die zusammen ein hydrophiles Hydropathieprofil zeigen, substituiert sein. Wie die löslichen (gestutzten) Deletionsvarianten werden diese Varianten in das Kulturmedium rekombinanter Wirte sezerniert.
  • Aminosäureinsertionen umfassen Amino- und/oder Carboxylterminale Fusionen einer Länge im Bereich von einem Rest bis zu hundert oder mehr Reste enthaltenden Polypeptiden sowie Intrasequenzinsertionen von einzelnen oder mehreren Aminosäureresten. Intrasequenzinsertionen (d. h. Insertionen in der neuen Typ-C-Lectin-Aminosäuresequenz) können allgemein im Bereich von etwa 1 bis 10 Resten, vorzugsweise 1 bis 5 Resten, vorzugsweise 1 bis 3 Resten, liegen. Beispiele für terminale Insertionen umfassen die Typ-C-Lectine mit einem N-terminalen Methionylrest, einem Artefakt von dessen direkter Expression in einer rekombinanten Bakterienzellkultur, und die Fusion einer heterologen N-terminalen Signalsequenz an den N-Terminus des Typ-C-Lectin-Moleküls zur Erleichterung der Sekretion des reifen Typ-C-Lectins aus rekombinanten Wirtszellen. Derartige Signalsequenzen werden allgemein von der geplanten Wirtszellart und damit homolog zu dieser erhalten. Geeignete Sequenzen umfassen STII oder Ipp für E. coli, alpha-Faktor für Hefe und virale Signale, wie Herpes-gD, für Säugetierzellen.
  • Andere Insertionsvarianten der nativen Typ-C-Lectin-Moleküle umfassen die Fusion des N- oder C-Terminus des Typ-C-Lectin-Moleküls an immunogene Polypeptide, beispielsweise Bakterienpolypeptide, wie beta-Lactamase oder ein durch den E. coli-trp-Locus codiertes Enzym oder Hefeprotein, und C-terminale Fusionen mit Proteinen mit einer langen Halbwertszeit, wie Immunglobulinregionen (vorzugsweise konstante Regionen von Immunglobulin), Albumin oder Ferritin gemäß der Beschreibung in WO 89/02922, veröffentlicht am 6. April 1989.
  • Weitere Insertionsvarianten sind immunologisch aktive Derivate der neuen Typ-C-Lectine, die das Lectin und ein Polypeptid, das ein Epitop eines immunologisch kompetenten fremden Polypeptids enthält, d. h. ein Polypeptid, das in dem Tier, dem die Fusion verabreicht wird, eine Immunreaktion auslösen kann, oder das von einem gegen ein fremdes Polypeptid gebildeten Antikörper gebunden werden kann, um fassen. Typische Beispiele für derartige immunologisch kompetente Polypeptide sind Allergene, Autoimmunepitope oder andere starke Immunogene oder Antigene, die durch bereits existierende Antikörper in dem Fusionsempfänger erkannt werden, die bakterielle Polypeptide, wie trpLE, β-Galactosidase, virale Polypeptide, wie Herpes-Gd-Protein und dgl., umfassen.
  • Immunogene Fusionen werden durch Verknüpfung in vitro oder durch eine mit DNA mit Codierung für ein immunogenes Polypeptid transformierte rekombinante Zellkultur hergestellt. Vorzugsweise ist die immunogene Fusion eine, in der die immunogene Sequenz mit einem neuen Typ-C-Lectin-Molekül oder Fragment desselben durch (eine) Peptidbindung(en) verbunden oder in dieses insertiert wird. Diese Produkte bestehen daher aus einer linearen Polypeptidkette, die das Typ-C-Lectin-Epitop und mindestens ein für das Typ-C-Lectin fremdes Epitop enthält. Es ist klar, dass es innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegt, die Epitope an einer beliebigen Stelle in einem Typ-C-Lectin-Molekül der vorliegenden Erfindung oder einem Fragment desselben einzuführen. Diese immunogenen Insertionen sind besonders günstig, wenn sie in einen pharmakologisch akzeptablen Träger formuliert und einem Subjekt zur Bildung von Antikörpern gegen das Typ-C-Lectin-Molekül verabreicht werden, wobei diese Antikörper wiederum als Diagnostika, zur Gewebetypisierung oder zur Reinigung der neuen Typ-C-Lectine durch als solche bekannte Immunaffinitätsverfahren verwendbar sind. Alternativ werden bei der Reinigung der Typ-C-Lectine der vorliegenden Erfindung Bindungspartner für das fusionierte fremde Polypeptid, beispielsweise Antikörper, Rezeptoren oder Liganden, zur Adsorption der Fusion aus unreinen Gemischen verwendet, wonach die Fusion eluiert und, falls gewünscht, das neue Typ-C-Lectin aus der Fusion, beispielsweise durch enzymatische Spaltung, gewonnen wird.
  • Da es häufig schwierig ist, im voraus die Eigenschaften eines varianten Typ-C-Lectins vorherzusagen, ist klar, dass zur Wahl der optimalen Variante eine gewisse Durchmusterung notwendig ist.
  • Nach der Identifizierung der gewünschten Mutation(en) kann das Gen mit Codierung für eine Typ-C-Lectin-Variante beispielsweise durch chemische Synthese, wie im vorhergehenden beschrieben, erhalten werden. Vorzugsweise wird DNA mit Codierung für eine Typ-C-Lectin-Aminosäuresequenzvariante durch positionsorientierte Mutagenese von DNA, die für eine früher hergestellte Variante oder eine nicht-variante Version des Typ-C-Lectins codiert, hergestellt. Positionsorientierte (positionsspezifische) Mutagenese ermöglicht die Herstellung von Varianten von Typ-C-Lectin durch die Verwendung von spezifischen Oligonucleotidsequenzen, die die DNA-Sequenz der gewünschten Mutation codieren, sowie einer ausreichenden Zahl von angrenzenden Nucleotiden zur Bereitstellung einer Primersequenz einer so ausreichenden Größe und Sequenzkomplexität, dass eine stabile Doppelhelix auf beiden Seiten der Deletionsverbindungsstelle, die durchquert wird, bereitgestellt wird. Typischerweise ist ein Primer einer Länge von etwa 20 bis 25 Nucleotiden bevorzugt, wobei etwa 5 bis 10 Reste auf beiden Seiten der Verbindungsstelle der Sequenz geändert sind. Allgemein sind die Techniken der positionsspezifischen Mutagenese einschlägig bekannt, beispielsweise durch Veröffentlichungen wie Edelman et al., DNA 2, 183 (1983). Es ist klar, dass die positionsspezifische Mutagenesetechnik typischerweise einen Phagenvektor verwendet, der in sowohl Einzelstrang- als auch Doppelstrangform existiert. Typische, bei positionsspezifischer Mutagenese verwendbare Vektoren umfassen Vektoren, wie den M13-Phagen, beispielsweise gemäß der Offenbarung bei Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, A. Walton, Hrsg., Elsevier, Amsterdam (1981). Dieser und andere Phagenvektoren sind im Handel erhältlich und deren Verwendung ist dem Fachmann bekannt. Ein durchführbares und effizientes Verfahren zur Konstruktion von auf Oligodesoxyribonucleotide gerichteten positionsspezifischen Mutationen in DNA-Fragmenten unter Verwendung von von M13 abgeleiteten Vektoren wurde bei M. J. Zoller und M. Smith, Nucleic Acids Res. 10, 6487–6500 [1982] veröffentlicht. Auch können Plasmidvektoren, die einen Einzelstrangphagen-Replikationsursprung enthalten (Veira et al., Meth. Enzymol. 153, 3 [1987]) zur Gewinnung von einzelsträngiger DNA verwendet werden. Alternativ werden Nucleotidsubstitutionen durch Synthetisieren des geeigneten DNA-Fragments in vitro und Amplifikation desselben durch einschlägig bekannte PCR-Verfahren eingeführt.
  • Die PCR-Technik kann auch zur Erzeugung von Aminosäuresequenzvarianten eines neuen Typ-C-Lectins verwendet werden. In einem spezifischen Beispiel für PCR-Mutagenese wird Templatplasmid-DNA (1 μg) durch Verdau mit einer Restriktionsendonuclease, die eine singuläre Erkennungsstelle in der Plasmid-DNA außerhalb der zu amplifizierenden Region hat, linearisiert. Von diesem Material werden 100 ng zu einem PCR-Gemisch, das PCR-Puffer, der die vier Desoxynucleotidtriphosphate enthält und in den GeneAmp®-Kits (erhalten von Perkin-Elmer Cetus, Norvalk, CT und Emeryville, CA) enthalten ist, und 25 pmol jedes Oligonucleotidprimers enthält, zu einem Endvolumen von 50 μl gegeben. Das Reaktionsgemisch wird mit 35 μl Mineralöl überschichtet. Das Reaktionsgemisch wird 5 min bei 100°C denaturiert, kurz auf Eis gegeben, und dann wird 1 μl Thermus aquaticus(Taq)-DNA-Polymerase (5 Einheiten/l) (gekauft von Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT und Emeryville, CA) unter der Mineralölschicht zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird dann in einen DNA Thermal Cycler (gekauft von Perkin-Elmer Cetus) gegeben, der wie folgt programmiert ist:
    2 min 55°C,
    30 s 72°C, dann 19 Zyklen des folgenden:
    30 s 94°C,
    30 s 55°C und
    30 s 72°C.
  • Am Ende des Programms wird die Reaktionsampulle aus dem Thermal Cycler entnommen und die wässrige Phase in eine neue Ampulle übertragen, mit Phenol/Chloroform (50 : 50 Vol) extrahiert und mit Ethanol gefällt, und die DNA wird durch Standardverfahren gewonnen. Dieses Material wird anschließend geeigneten Behandlungen zur Insertion in einem Vektor unterzogen.
  • Ein anderes Verfahren zur Herstellung von Varianten, Kassettenmutagenese, beruht auf der von Wells et al. [Gene 34, 315 (1985)] beschriebenen Technik.
  • Außerdem kann das sogenannte Phagemid-Display-Verfahren zur Herstellung von Aminosäuresequenzvarianten von nativen oder Varianten von Typ-C-Lectinen oder deren Fragmenten verwendbar sein. Dieses Verfahren umfasst (a) die Konstruktion eines zur Replikation fähigen Expressionsvektors, der ein erstes Gen mit Codierung für einen zu mutierenden Rezeptor, ein zweites Gen mit Codierung für mindestens einen Teil eines natürlich vorkommenden Phagenhüllproteins oder Phagenhüllproteins des Wildtyps, wobei das erste und zweite Gen heterolog sind, und ein operativ mit dem ersten und zweiten Gen verknüpftes transkriptionsregulatorisches Element umfasst, wodurch eine Genfusion mit Codierung für ein Fusionsprotein gebildet wird; (b) eine Mutation des Vektors an einer oder mehreren ausgewählten Positionen in dem ersten Gen, wodurch eine Familie verwandter Plasmide gebildet wird; (c) die Transformation geeigneter Wirtszellen mit den Plasmiden; (d) die Infektion der transformierten Wirtszellen mit einem Helferphagen mit einem Gen mit Codierung für das Phagenhüllprotein; (e) das Kultivieren der transformierten infizierten Wirtszellen unter Bedingungen, die zur Bildung von rekombinanten Phagemidpartikeln, die mindestens einen Teil des Plasmids enthalten und zur Transformation des Wirts fähig sind, geeignet sind, wobei die Bedingungen so eingestellt werden, dass nicht mehr als eine geringe Menge von Phagemidpartikeln mehr als eine Kopie des Fusionsproteins auf der Oberfläche des Partikels zeigen; (f) das Kontaktieren der Phagemidpartikel mit einem geeigneten Antigen derart, dass mindestens ein Teil der Phagemidpartikel an das Antigen bindet; und (g) das Abtrennen der Phagemidpartikel, die binden, von denen, die nicht binden. Die Stufen (d) bis (g) können ein oder mehrere Male wiederholt werden. Vorzugsweise steht bei diesem Verfahren das Plasmid unter der festen Kontrolle der transkriptionsregulatorischen Elemente und die Kulturbedingungen sind so eingestellt, dass die Menge oder Zahl der Phagemidpartikel, die mehr als eine Kopie des Fusionsproteins auf der Oberfläche des Partikels zeigen, weniger als etwa 1% beträgt. Auch beträgt die Menge von Phagemidpartikeln, die mehr als eine Kopie des Fusionsproteins zeigen, vorzugsweise weniger als 10% der Menge von Phagemidpartikeln, die eine einzige Kopie des Fusionsproteins zeigen. Vorzugsweise beträgt die Menge weniger als 20%. Typischerweise enthält bei diesem Verfahren der Expressionsvektor ferner eine sekretorische Signalsequenz an die DNA mit Codierung für die einzelnen Teileinheiten des Polypeptids fusioniert und das transkriptionsregulatorische Element ist ein Promotorsystem. Bevorzugte Promotorsysteme sind aus lac Z-, λPL-, tac-, T7-Polymerase-, Tryptophan- und alkalische Phosphatase-Promotoren und Kombinationen derselben ausgewählt. Auch verwendet das Verfahren normalerweise einen Helferphagen, der aus M13K07, M13R408, M13-VCS und Phi X 174 ausgewählt ist. Der bevorzugte Helferphage ist M13K07, und das bevorzugte Hüllprotein ist das M13-Phage-Gen-III-Hüllprotein. Der bevorzugte Wirt ist E. coli und proteasedefiziente Stämme von E. coli.
  • Weitere Details der genannten und ähnlicher Mutagenesetechniken finden sich in allgemeinen Handbüchern, beispielsweise Sambrook et al., aaO, und Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Hrsg., aaO.
  • F. Glykosylierungsvarianten
  • Glykosylierungsvarianten werden vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfasst. Sie umfassen Varianten, denen Glykosylierung vollständig fehlt (nicht-glykosylierte), Varianten mit mindestens einer glykosylierten Stelle weniger als die native Form (deglykosylierte) sowie Varianten, in denen die Glykosylierung geändert wurde. Umfasst werden deglykosylierte und nicht-glykosylierte Aminosäuresequenzvarianten, deglykosylierte und nicht-glykosylierte native Typ-C-Lectine und andere Glykosylierungsvarianten. Beispielsweise kann eine Substitutions- oder Deletionsmutagenese zur Eliminierung der N- oder O-gebundenen Glykosylierungsstellen in dem nativen oder einem varianten Typ-C-Lectin der vorliegenden Erfindung verwendet werden, beispielsweise kann der Asparaginrest deletiert oder durch einen anderen basischen Rest, wie Lysin oder Histidin, substituiert sein. Alternativ können die Glykosylierungsstelle bildende flankierende Reste substituiert oder deletiert sein, auch wenn die Asparaginreste unverändert bleiben, um eine Glykosylierung durch Eliminieren der Glykosylierungserkennungsstelle zu verhindern.
  • Außerdem können nicht-glykosylierte Typ-C-Lectine, die die Glykosylierungsstellen eines nativen Moleküls besitzen, in einer rekombinanten prokaryotischen Zellkultur hergestellt werden, da Prokaryoten zur Einführung einer Glykosylierung in Polypeptide unfähig sind.
  • Glykosylierungsvarianten können durch die Wahl geeigneter Wirtszellen oder durch In-vitro-Verfahren hergestellt werden. Hefe und Insektenzellen führen beispielsweise eine Glykosylierung ein, die gegenüber der von Säugetiersystemen signifikant variiert. In ähnlicher Weise werden Säugetierzellen, die von einer anderen Art (beispielsweise Hamster, Maus, Schwein, Rind oder Schaf) oder einem anderen Gewebe (beispielsweise Lunge, Leber, Lymphe, Mesenchym oder Epidermis) als der Quelle des Typ-C-Lectins stammen, routinemäßig auf die Fähigkeit zur Einführung einer varianten Glykosylierung, die beispielsweise durch erhöhte Mannosespiegel oder variante Anteile von Mannose, Fucose, Sialinsäure und anderen Zuckern, die typischerweise in Säugetierglykoproteinen gefunden werden, gekennzeichnet ist, durchmustert. Die In-vitro-Prozessierung des Typ-C-Lectins wird typischerweise durch enzymatische Hydrolyse, beispielsweise Neuraminidase-Verdau, durchgeführt.
  • G. Kovalente Modifikationen
  • Kovalente Modifikationen der neuen Typ-C-Lectine der vorliegenden Erfindung werden hier vom Umfang umfasst. Derartige Modifikationen werden herkömmlicherweise durch Umsetzen von Ziel-Aminosäureresten der Typ-C-Lectine mit einem organischen Derivatisierungsmittel, das mit ausgewählten Seiten oder terminalen Resten reagieren kann, oder durch die Nutzung von Mechanismen posttranslationaler Modifikationen, die in ausgewählten rekombinanten Wirtszellen wirken, eingeführt. Die gebildeten kovalenten Derivate sind in Programmen, die auf die Identifizierung von für biologische Aktivität wichtigen Resten gerichtet sind, für Immunoassays des Typ-C-Lectins oder zur Herstellung von Anti-Typ-C-Lectin-Antikörpern zur Immunaffinitätsreinigung der Rekombinante verwendbar. Beispielsweise würde eine vollständige Inaktivierung der biologischen Aktivität des Proteins nach der Umsetzung mit Ninhydrin nahelegen, dass mindestens ein Arginyl- oder Lysylrest für dessen Aktivität entscheidend ist, wonach die individuellen Reste, die unter den gewählten Bedingungen modifiziert wurden, durch Isolierung eines Peptidfragments, das den modifizierten Aminosäurerest enthält, identifiziert werden. Derartige Modifikationen sind dem Fachmann üblicher Erfahrung geläufig und werden ohne unzumutbaren Aufwand durchgeführt.
  • Eine Derivatisierung mit bifunktionalen Mitteln ist zur Herstellung intramolekularer Aggregate der Typ-C-Lectine mit Polypeptiden sowie zur Vernetzung des Typ-C-Lectins-Polypeptids mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder Oberfläche zur Verwendung bei Tests oder Affinitätsreinigung verwendbar. Außerdem ergibt eine Untersuchung von Vernetzungen zwischen Ketten eine direkte Information über die strukturelle Konformation. Üblicherweise verwendete Vernetzungsmittel umfassen 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, homobifunktionale Imidoester und bifunktionale Maleimide. Derivatisierungsmittel, wie Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat, ergeben photoaktivierbare Zwischenprodukte, die Vernetzungen in Gegenwart von Licht bilden können. Alternativ werden reaktive wasserunlösliche Matrizes, wie durch Bromcyan aktivierte Kohlehydrate und die Systeme reaktiver Substrate gemäß der Beschreibung in US-Patent Nr. 3 959 642, 3 969 287, 3 691 016, 4 195 128, 4 247 642, 4 229 537, 4 055 635 und 4 330 440 zur Proteinimmobilisierung und -vernetzung verwendet.
  • Bestimmte posttranslationale Modifikationen sind das Ergebnis der Wirkung rekombinanter Wirtszellen auf das exprimierte Polypeptid. Glutaminyl- und Asparaginylreste werden häufig posttranslational zu den entsprechenden Glutamyl- und Aspartylresten desamidiert. Alternativ werden diese Reste unter leicht sauren Bedingungen desamidiert. Beide Formen dieser Reste fallen unter den Umfang dieser Erfindung.
  • Andere posttranslationale Modifikationen umfassen die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, die Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl-, Threonyl- oder Tyrosylresten, die Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidinseitenketten [T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, S. 79–86 (1983)].
  • Weitere Derivate der Typ-C-Lectine sind hier die sogenannten "Immunadhäsine", die chimäre antikörperähnliche Moleküle sind, die die funktionale(n) Domäne(n) eines bindenden Proteins (üblicherweise ein Rezeptor, ein Zelladhäsionsmolekül oder ein Ligand) mit einer Immunglobulinsequenz kombinieren. Das häufigste Beispiel dieser Art eines Fusionsproteins kombiniert die Gelenk- und Fc-Regionen eines Immunglobulins (Ig) mit Domänen eines Zelloberflächenrezeptors, der einen spezifischen Liganden erkennt. Dieser Molekültyp wird als "Immunadhäsin" bezeichnet, da er "Immun"- und "Adhäsions"funktionen kombiniert; andere häufig verwendete Namen sind "Ig-Chimäre", "Ig-" oder "Fc-Fusionsprotein" oder "Rezeptorglobulin".
  • Bisher wurde über mehr als fünfzig Immunadhäsine einschlägig berichtet. Immunadhäsine, über die in der Literatur berichtet wurde, umfassen beispielsweise Fusionen des T-Zellrezeptors (Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2936–2940 [1987]); von CD4 (Capon et al., Nature 337, 525–531 [1989]); Traunecker et al., Nature 339, 68–70 [1989]; Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA 9, 347–353 [1990]; Byrn et al., Nature 344, 667–670 [1990]); L-Selectin (Homing Receptor) (Watson et al., J. Cell. Biol. 110, 2221–2229 [1990]; Watson et al., Nature 349, 164–167 [1991]); E-Selectin (Mulligan et al., J. Immunol. 151, 6410–17 [1993]; Jacob et al., Biochemistry 34, 1210–1217 [1995]); P-Selectin (Mulligan et al., aaO; Hollenbaugh et al., Biochemistry 34, 5678–84 [1995]); ICAM-1 (Stauton et al., J. Exp. Med. 176, 1471–1476 [1992]; Martin et al., J. Virol. 67, 3561–68 [1993]; Roep et al., Lancet 343, 1590–93 [1994]); ICAM-2 (Damle et al., J. Immunol. 148, 665–71 [1992]); ICAM-3 (Holness et al., J. Biol. Chem. 270, 877–84 [1995]); LFA-3 (Kanner et al., J. Immunol. 148, 2-23-29 [1992]); L1-Glykoprotein (Doherty et al., Neuron 14, 57–66 [1995]); TNF-R1 (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10535–539 [1991]; Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 21, 2883–86 [1991]; Peppel et al., J. Exp. Med. 174, 1483–1489 [1991]); TNF-R2 (Zack et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2335–39 [1993]; Wooley et al., J. Immunol. 151, 6602–07 [1993]); CD44 [Aruffo et al., Cell 61, 1303–1313 (1990)]; CD28 und B7 [Linsley et al., J. Exp. Med. 173, 721–730 (1991)]; CTLA-4 [Lisley et al., J. Exp. Med. 174, 561–569 (1991)]; CD22 [Stamenkovic et al., Cell 66, 1133–1144 (1991)]; NP-Rezeptoren [Bennett et al., J. Biol. Chem. 266, 23060–23067 (1991)]; IgE-Rezeptor α [Ridgway und Gorman, J. Cell. Biol. 115, Abstr. 1448 (1991)]; HGF-Rezeptor [M. R. Mark et al., 1992, J. Biol. Chem. eingereicht]; IFN-γR-α- und -β-Kette [Marsters et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 5401–05 [1995]); trk-A, -B und -C (Shelton et al., J. Neurosci. 15, 477–91 [1995]); IL-2 (Landolfi, J. Immunol. 146, 915–19 [1991]); IL-10 (Zheng et al., J. Immunol. 154, 5590–5600 [1995]).
  • Das einfachste und direkteste Immunadhäsinmodell kombiniert die Bindungsregion(en) des "Adhäsin"proteins mit den Gelenk- und Fc-Regionen der schweren Kette eines Immunglobulins. Üblicherweise wird bei der Herstellung der Lectin-Immunglobulin-Chimären der vorliegenden Erfindung eine Nucleinsäure mit Codierung für das gewünschte Typ-C-Lectin-Polypeptid C-terminal mit einer Nucleinsäure mit Codierung für den N-Terminus der Sequenz der konstanten Domäne eines Immunglobulins fusioniert, doch sind N-terminale Fusionen ebenfalls möglich. Typischerweise behält das codierte chimäre Polypeptid bei derartigen Fusionen mindestens funktional aktive Gelenk-, CH2- und CH3-Domänen der konstanten Region der schweren Kette eines Immunglobulins bei. Fusionen erfolgen auch mit dem C-Terminus des Fc-Teils einer konstanten Domäne oder unmittelbar N-terminal zu CH1 der schweren Kette oder der entsprechenden Region der leichten Kette. Die genaue Stelle, an der die Fusion erfolgt, ist nicht kritisch; spezielle Stellen sind bekannt und können zur Optimierung der biologischen Aktivität, der Sekretions- oder Bindungseigenschaften der Lectin-Immunglobulin-Chimären gewählt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Sequenz eines nativen reifen Lectin-Polypeptids oder einer löslichen Form derselben (mit inaktivierter Transmembrandomäne) an den N-Terminus des C-terminalen Teils eines Antikörpers (insbesondere der Fc-Domäne), der die Effektorfunktionen eines Immunglobulins, beispielsweise IgG-1, enthält, fusioniert. Es ist möglich, die gesamte konstante Region der schweren Kette an die Lectinsequenz zu fusionieren. Jedoch wird vorzugsweise eine Sequenz, die in der Gelenkregion unmittelbar strangaufwärts der Papainspaltungsstelle beginnt (die IgG-Fc chemisch festlegt; Rest 216, wenn der erste Rest der konstanten Region der schweren Kette als 114 genommen wird [Kobert et al., aaO], oder analoge Stellen anderer Immun globuline), in der Fusion verwendet. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird die Typ-C-Lectin-Sequenz (voller Länge oder löslich) an die Gelenkregion und CH2- und CH3- oder CH1-, Gelenk-, CH2- und CH3-Domänen einer schweren Kette von IgG-1, IgG-2 oder IgG-3 fusioniert. Die genaue Stelle, an der die Fusion erfolgt, ist unkritisch, und die optimale Stelle kann durch Routineversuche bestimmt werden.
  • In einigen Ausführungsformen werden die Lectin-Immunglobulin-Chimären als Multimere und insbesondere als Homodimere oder -tetramere zusammengebaut (WO 91/08298). Allgemein besitzen diese zusammengebauten Immunglobuline bekannte Einheitsstrukturen. Eine Basisstruktureinheit aus vier Ketten ist die Form, in der IgG, IgD und IgE existieren. Eine Vierereinheit wird in den Immunglobulinen mit höherem Molekulargewicht wiederholt; IgM existiert allgemein als Pentamer von Basis-Vierereinheiten, die durch Disulfidbindungen zusammengehalten werden. IgA-Globulin und gelegentlich IgG-Globulin können auch in Multimerform in Serum existieren. Im Falle eines Multimers kann jede Vierereinheit gleich oder unterschiedlich sein.
  • Verschiedene Beispiele für zusammengebaute Lectin-Immunglobulin-Chimären in dem hier vorliegenden Umfang sind im folgenden schematisch dargestellt:
    • (a) ACL-ACL;
    • (b) ACH-[ACH, ACL-ACH, ACL-VHCH oder VLCL-ACH];
    • (c) ACL-ACH-[ACL-ACH, ACL-VHCH, ACL-VHCH, VLCL-ACH oder VLCL-VHCH];
    • (d) ACL-VHCH-[ACH oder ACL-VHCH oder VLCL-ACH];
    • (e) VLCL-ACH-[ACL-VHCH oder VLCL-ACH]; und
    • (f) [A-Y]n-[VLCL-VHCH]2,
    worin
    jedes A identische oder unterschiedliche neue Typ-C-Lectin- Polypeptidaminosäuresequenzen bedeutet;
    VL eine variable Domäne der leichten Kette eines Immunglobulins ist;
    VH eine variable Domäne der schweren Kette eines Immunglobulins ist;
    CL eine konstante Domäne der leichten Kette eines Immunglobulins ist;
    CH eine konstante Domäne der schweren Kette eines Immunglobulins ist;
    n eine ganze Zahl größer als 1 ist;
    Y den Rest eines kovalenten Vernetzungsmittels bezeichnet.
  • Im Interesse der Kürze zeigen die genannten Strukturen nur Schlüsselmerkmale; sie geben nicht die bindenden (J) oder andere Domänen der Immunglobuline an, noch sind Disulfidbindungen angegeben. Wenn jedoch derartige Domänen für eine Bindungsaktivität erforderlich sind, sollen sie so konstruiert sein, dass sie an den üblichen Orten, die sie in den Immunglobulinmolekülen einnehmen, vorhanden sind.
  • Alternativ können die Typ-C-Lectin-Aminosäuresequenzen zwischen Sequenzen der schweren Kette und der leichten Kette eines Immunglobulins derart insertiert werden, dass ein Immunglobulin, das eine chimäre schwere Kette umfasst, erhalten wird. In dieser Ausführungsform werden die Typ-C-Lectin-Polypeptidsequenzen an das 3'-Ende der schweren Kette eines Immunglobulins an jedem Arm eines Immunglobulins entweder zwischen der Gelenk- und der CH2-Domäne oder zwischen der CH2- und der CH3-Domäne fusioniert. Ähnliche Konstrukte wurden bei H. R. Hoogenboom et al., Mol. Immunol. 28, 1027–1037 (1991) berichtet.
  • Obwohl das Vorhandensein der leichten Kette eines Immunglobulins in den Immunadhäsinen der vorliegenden Erfindung nicht erforderlich ist, kann eine leichte Kette eines Im munglobulins entweder kovalent mit einem Typ-C-Lectinschwere Kette eines Immunglobulins-Fusionspolypeptid verbunden oder direkt mit dem Typ-C-Lectin-Polypeptid fusioniert vorhanden sein. Im ersteren Fall wird DNA mit Codierung für die leichte Kette eines Immunglobulins typischerweise mit der DNA mit Codierung für das Typ-C-Lectinschwere Kette eines Immunglobulins-Fusionsprotein koexprimiert. Bei der Sekretion werden das schwere-Kette-Hybrid und die leichte Kette kovalent verbunden, wobei eine immunglobulinähnliche Struktur, die zwei disulfidverknüpfte schwere Kette-leichte Kette-Paare von Immunglobulinen umfasst, bereitgestellt wird. Geeignete Verfahren zur Herstellung derartiger Strukturen sind beispielsweise im US-Patent Nr. 4 816 567, erteilt am 28. März 1989, offenbart.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform stammen die bei der Konstruktion der Immunadhäsine der vorliegenden Erfindung verwendeten Immunglobulinsequenzen von einer konstanten Domäne der schweren Kette eines IgG-Immunglobulins. Für humane Immunadhäsine ist die Verwendung von humanen IgG-1- und IgG-3-Immunglobulinsequenzen bevorzugt. Ein Hauptvorteil der Verwendung von IgG-1 ist, dass IgG-1-Immunadhäsine an immobilisiertem Protein A effizient gereinigt werden können. Im Gegensatz dazu erfordert die Reinigung von IgG-3 Protein G, ein signifikant weniger vielseitiges Medium. Jedoch sollten andere strukturelle und funktionale Eigenschaften von Immunglobulinen berücksichtigt werden, wenn der Ig-Fusionspartner für eine spezielle Immunadhäsinkonstruktion gewählt wird. Beispielsweise ist das IgG-3-Gelenk länger und flexibler, weshalb es längere "Adhäsin"-Domänen unterbringen kann, die nicht passend gefaltet werden oder funktionieren können, wenn sie mit IgG-1 fusioniert werden. Während IgG-Immunadhäsine typischerweise ein- oder zweiwertig sind, können andere Ig-Subtypen, wie IgA und IgM, di mere oder pentamere Strukturen der Basis-Ig-Homodimereinheit ergeben. Multimere Immunadhäsine sind insofern vorteilhaft, als sie ihre jeweiligen Zielstrukturen mit größerer Avidität als ihre Gegenstücke auf IgG-Basis binden können. Berichtete Beispiele für derartige Strukturen sind CD4-IgM (Traunecker et al., aaO), ICAM-IgM (Martin et al., J. Virol. 67, 3561–68 [1993]) und CD2-IgM (Arulanandam et al., J. Exp. Med. 177, 1439–50 [1993]).
  • Für Typ-C-Lectin-Ig-Immunadhäsine, die zur In-vivo-Applikation gestaltet werden, sind auch die pharmakokinetischen Eigenschaften und die Effektorfunktionen, die durch die Fc-Region spezifiziert werden, wichtig. Obwohl IgG-1, IgG-2 und IgG-4 alle In-vivo-Halbwertszeiten von 21 Tagen besitzen, sind ihre relativen Wirksamkeiten bei der Aktivierung des Komplementsystems unterschiedlich. IgG-4 aktiviert das Komplement nicht und IgG-2 ist bei der Komplementaktivierung wesentlich schwächer als IgG-1. Außerdem bindet IgG-2 im Gegensatz zu IgG-1 nicht an Fc-Rezeptoren an mononukleären Zellen oder Neutrophilen. Während IgG-3 zur Komplementaktivierung optimal ist, beträgt dessen In-vivo-Halbwertszeit etwa ein Drittel der der anderen IgG-Isotypen. Eine andere wichtige Überlegung für zur Verwendung als humane Therapeutika gestaltete Immunadhäsine ist die Zahl der Allotypvarianten des speziellen Isotyps. Im allgemeinen sind IgG-Isotypen mit weniger serologisch definierten Allotypen bevorzugt. Beispielsweise besitzt IgG-1 nur vier serologisch definierte Allotypstellen, von denen zwei (G1m und 2) in der Fc-Region lokalisiert sind; und eine dieser Stellen, G1m1, ist nicht-immunogen. Im Gegensatz dazu bestehen in IgG-3 12 serologisch definierte Allotypen, die alle in der Fc-Region sind; nur drei dieser Stellen (G3m5, 11 und 21) weisen einen Allotyp auf, der nicht-immunogen ist. Daher ist die potentielle Immunogenität eines γ3-Immunadhäsins größer als die eines γ1-Immunadhäsins.
  • Typ-C-Lectin-Ig-Immunadhäsine werden am bequemsten durch Fusion der cDNA-Sequenz mit Codierung für den Typ-C-Lectin-Teil im Raster mit einer Ig-cDNA-Sequenz konstruiert. Jedoch kann eine Fusion mit Genom-Ig-Fragmenten ebenfalls verwendet werden (siehe beispielsweise Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2936–2940 [1987]; Aruffo et al., Cell 61, 1303–1313 [1990]; Stamenkovic et al., Cell 66, 1133–1144 [1991]). Der letztere Fusionstyp erfordert das Vorhandensein von regulatorischen Sequenzen von Ig zur Expression. cDNAs mit Codierung für konstante Regionen der schweren Kette von IgG können auf der Basis einer veröffentlichten Sequenz von cDNA-Bibliotheken, die von Lymphocyten aus der Milz oder peripherem Blut abgeleitet sind, durch Hybridisierungs- oder Polymerasekettenreaktions(PCR)techniken isoliert werden.
  • Andere Derivate der neuen Typ-C-Lectine der vorliegenden Erfindung, die eine längere Halbwertszeit als die nativen Moleküle besitzen, umfassen das Lectin oder eine Lectin-Immunglobulin-Chimäre, die kovalent an ein nicht-proteinartiges Polymer gebunden sind. Das nicht-proteinartige Polymer ist üblicherweise ein hydrophiles synthetisches Polymer, d. h. ein Polymer, das ansonsten nicht in der Natur gefunden wird. Jedoch sind Polymere, die in der Natur existieren und durch rekombinante oder In-vitro-Verfahren hergestellt werden, ebenso wie Polymere, die aus nativen Quellen isoliert werden, verwendbar. Hydrophile Polyvinylpolymere fallen in den Umfang dieser Erfindung, beispielsweise Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon. Besonders verwendbar sind Polyalkylenether, wie Polyethylenglykol (PEG); Polyalkylene, wie Polyoxyethylen, Polyoxypropylen, und Blockcopolymere von Polyoxyethylen und Polyoxypropylen (Pluronics); Polymethylacrylate; Carbomere; verzweigte oder unverzweigte Polysaccharide, die die Saccharidmonomere D- Mannose, D- und L-Galactose, Fucose, Fructose, D-Xylose, L-Arabinose, D-Glucuronsäure, Sialinsäure, D-Galacturonsäure, D-Mannuronsäure (beispielsweise Polymannuronsäure oder Alginsäure), D-Glucosamin, D-Galactosamin, D-Glucose und Neuraminsäure, die Homopolysaccharide und Heteropolysaccharide, wie Lactose, Amylopectin, Stärke, Hydroxyethylstärke, Amylose, Dextransulfat, Dextran, Dextrine, Glykogen oder die Polysaccharidteileinheit von sauren Mucopolysacchariden, beispielsweise Hyaluronsäure, umfassen, umfassen; Polymere von Zuckeralkoholen, wie Polysorbit und Polymannit; Heparin oder Heparon. Das Polymer vor der Vernetzung muss nicht wasserlöslich sein, ist jedoch vorzugsweise wasserlöslich, doch das fertige Konjugat muss wasserlöslich sein. Außerdem sollte das Polymer in der Konjugatform nicht hochimmunogen sein, noch sollte es eine Viskosität besitzen, die mit intravenöser Infusion oder Injektion inkompatibel ist, wenn eine Verabreichung auf derartigen Wegen geplant ist.
  • Vorzugsweise enthält das Polymer nur eine einzige Gruppe, die reaktiv ist. Dies dient der Vermeidung einer Vernetzung von Proteinmolekülen. Jedoch liegt es im Umfang dieser Erfindung, die Reaktionsbedingungen zur Verringerung einer Vernetzung zu optimieren oder die Reaktionsprodukte durch Gelfiltration oder chromatographische Siebe zu reinigen, um im wesentlichen homogene Derivate zu gewinnen.
  • Das Molekulargewicht des Polymers kann günstigerweise im Bereich von etwa 100 bis 500000 und vorzugsweise von etwa 1000 bis 20000 liegen. Das gewählte Molekulargewicht hängt von der Natur des Polymers und dem Substitutionsgrad ab. Im allgemeinen kann ein um so niedrigeres Molekulargewicht verwendet werden, je größer die Hydrophilie des Polymers und je größer der Substitutionsgrad ist. Optimale Molekulargewichte werden durch Routineversuche bestimmt.
  • Das Polymer wird allgemein durch ein multifunktionales Vernetzungsmittel, das mit dem Polymer und einem oder mehreren Aminosäure- oder Zuckerresten des Typ-C-Lectins oder der Lectin-Immunglobulin-Chimäre, die verknüpft werden sollen, reagiert, mit dem neuen Typ-C-Lectin oder den Lectin-Immunglobulin-Chimären kovalent verknüpft. Es liegt jedoch im Umfang der Erfindung, das Polymer durch Umsetzung eines derivatisierten Polymers mit dem Hybrid oder umgekehrt direkt zu vernetzen.
  • Die Stelle der kovalenten Vernetzung an dem Typ-C-Lectin oder Lectin-Ig umfasst die N-terminale Aminogruppe und epsilon-Aminogruppen, die sich an Lysinresten befinden, sowie andere Amino-, Imino-, Carboxyl-, Sulfhydryl-, Hydroxyl- oder andere hydrophile Gruppen. Das Polymer kann kovalent direkt an das Hybrid ohne die Verwendung eines multifunktionalen (üblicherweise bifunktionalen) Vernetzungsmittels gebunden werden. Eine kovalente Bindung an Aminogruppen wird durch bekannte Chemie auf der Basis von Chlorcyan, Carbonyldiimidazol, reaktiven Gruppen mit einem Aldehyd (PEG-Alkoxid plus Diethylacetal von Bromacetaldehyd; PEG plus DMSO und Essigsäureanhydrid oder PEG-Chlorid plus das Phenoxid von 4-Hydroxybenzaldehyd, aktive Succinimidylester, aktiviertes Dithiocarbonat-PEG, 2,4,5-Trichlorphenylchlorformiat oder aktiviertes P-Nitrophenylchlorformiat-PEG) erreicht. Carboxylgruppen werden durch Kopplung von PEG-Amin unter Verwendung von Carbodiimid derivatisiert.
  • Polymere werden mit Oligosaccharidgruppen durch Oxidation unter Verwendung von Chemikalien, beispielsweise Metaperiodat, oder Enzymen, beispielsweise Glucose- oder Galactoseoxidase, (die beide das Aldehydderivat des Kohlehydrats ergeben) und anschließende Reaktion mit hydrazid- oder aminoderivatisierten Polymeren gemäß der Beschreibung bei Heitzmann et al., P. N. A. S. 71, 3537–41 (1974) oder Bayer et al., Methods in Enzymology 62, 310 (1979) zur Markierung von Oligosacchariden mit Biotin oder Avidin konjugiert. Ferner sind andere chemische oder enzymatische Verfahren, die bisher zur Verknüpfung von Oligosacchariden verwendet wurden, besonders vorteilhaft, da allgemein weniger Substitutionen als Aminosäurestellen zur Derivatisierung vorhanden sind und die Oligosaccharidprodukte daher homogener sind. Die Oligosaccharidsubstituenten werden auch optional durch Enzymverdau unter Entfernung von Zuckern, beispielsweise durch Neuraminidaseverdau, vor der Polymerderivatisierung modifiziert.
  • Das Polymer trägt eine Gruppe, die gegenüber einer Aminosäureseitenkette oder dem N- oder C-Terminus des verknüpften Polypeptids direkt reaktiv ist, oder die gegenüber dem multifunktionalen Vernetzungsmittel reaktiv ist. Allgemein sind derartige reaktive Gruppen tragende Polymere zur Herstellung von immobilisierten Proteinen bekannt. Um diese Chemie hier zu verwenden, sollte ein wasserlösliches Polymer verwendet werden, das ansonsten auf die gleiche Weise wie bisher zur Proteinimmobilisierung verwendete unlösliche Polymere derivatisiert ist. Eine Bromcyanaktivierung ist ein zur Verwendung bei der Verknüpfung von Polysacchariden besonders günstiges Verfahren.
  • "Wasserlöslich" in Bezug auf das Ausgangspolymer bedeutet, dass das Polymer oder dessen zur Konjugation verwendetes reaktives Zwischenprodukt ausreichend wasserlöslich ist, um an einer Derivatisierungsreaktion teilzunehmen.
  • "Wasserlöslich" in Bezug auf das Polymerkonjugat bedeutet, dass das Konjugat in physiologischen Flüssigkeiten, wie Blut, löslich ist.
  • Der Substitutionsgrad bei einem derartigen Polymer variiert in Abhängigkeit von der Zahl der reaktiven Stellen am Protein, ungeachtet dessen, ob das gesamte oder ein Fragment des Proteins verwendet wird, ob das Protein eine Fusion mit einem heterologen Protein (beispielsweise eine Typ-C-Lectin-Immunglobulin-Chimäre) ist, dem Molekulargewicht, der Hydrophilie und anderen Eigenschaften des Polymers und den speziellen gewählten Proteinderivatisierungsstellen. Allgemein enthält das Konjugat etwa 1 bis 10 Polymermoleküle, während eine heterologe Sequenz mit einer im wesentlichen unbeschränkten Zahl von Polymermolekülen substituiert sein kann, sofern die gewünschte Aktivität nicht signifikant nachteilig beeinflusst wird. Der optimale Vernetzungsgrad wird leicht durch eine Versuchsmatrix bestimmt, in der die Zeit, Temperatur und andere Reaktionsbedingungen zur Änderung des Substitutionsgrades variiert werden, nach der die Fähigkeit der Konjugate, in der gewünschten Weise zu funktionieren, bestimmt wird.
  • Das Polymer, beispielsweise PEG, wird durch eine breite Vielzahl von als solchen bekannten Verfahren zur kovalenten Modifikation von Proteinen mit nicht-proteinartigen Polymeren, wie PEG, vernetzt. Bestimmte dieser Verfahren sind jedoch für die Zwecke dieser Erfindung nicht bevorzugt. Cyanuronchloridchemie führt zu vielen Nebenreaktionen, die Proteinvernetzung umfassen. Außerdem ist es besonders wahrscheinlich, dass dies zur Inaktivierung von Sulfhydrylgruppen enthaltenden Proteinen führt. Carbonyldiimidazolchemie (Beauchamp et al., Anal. Biochem. 131, 25–33 [1983]) erfordert einen hohen pH-Wert (> 8,5), der Proteine inaktivieren kann. Außerdem ist, da das "aktivierte PEG"-Zwischenprodukt mit Wasser reagieren kann, ein sehr großer Molüberschuss von "aktiviertem PEG" gegenüber Protein erforderlich. Die für die Carbonyldiimidazolchemie erfor derlichen hohen PEG-Konzentrationen führten auch zu Problemen bei der Reinigung, da sowohl Gelfiltrationschromatographie als auch Chromatographie mit hydrophiler Wechselwirkung nachteilig beeinflusst werden. Außerdem können die hohen Konzentrationen von "aktiviertem PEG" Protein ausfällen, ein Problem, das als solches bereits festgestellt wurde (Davis, US-Patent Nr. 4 179 337). Andererseits ist Aldehydchemie (Royer, US-Patent Nr. 4 002 531) effizienter, da sie nur einen 40-fachen Molüberschuss von PEG und eine Inkubation von 1–2 h erfordert. Jedoch ist das durch Royer zur Herstellung des PEG-Aldehyds vorgeschlagene Mangandioxid "wegen der starken Tendenz von PEG zur Bildung von Komplexen mit Oxidationsmitteln auf Metallbasis" (Harris et al., J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed. 22, 341–52 [1984]) problematisch. Die Verwendung einer Moffatt-Oxidation unter Verwendung von DMSO und Essigsäureanhydrid umgeht dieses Problem. Außerdem muss das von Royer vorgeschlagene Natriumborhydrid bei hohem pH-Wert verwendet werden und es besitzt eine signifikante Tendenz zur Reduzierung von Disulfidbindungen. Im Gegensatz dazu ist Natriumcyanoborhydrid, das bei neutralem pH-Wert wirksam ist und eine sehr geringe Tendenz zur Reduktion von Disulfidbindungen besitzt, bevorzugt.
  • Die Konjugate mit langer Halbwertszeit dieser Erfindung werden von den nicht-umgesetzten Ausgangsmaterialien durch Gelfiltration abgetrennt. Heterologe Spezies der Konjugate werden auf die gleiche Weise voneinander gereinigt. Das Polymer kann auch als hydrophiles Gel wasserunlöslich sein.
  • Die neuen Typ-C-Lectine können in Mikrokapseln, die beispielsweise durch Koazervationstechniken oder durch Grenzflächenpolymerisation hergestellt wurden, in kolloiden Arzneimittelabgabesystemen (beispielsweise Liposomen, Albuminmikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanopartikeln und Nanokap seln) oder in Makroemulsionen gefangen sein. Derartige Techniken sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, A. Osol, Hrsg. (1980), offenbart.
  • H. Antikörperherstellung
  • (i) Polyklonale Antikörper
  • Polyklonale Antikörper gegen ein Typ-C-Lectin der vorliegenden Erfindung werden allgemein in Tieren durch mehrfache subkutane (sc) oder intraperitoneale (ip) Injektionen des Typ-C-Lectins und eines Adjuvans gebildet. Es kann günstig sein, das Lectin oder ein die Zielaminosäuresequenz enthaltendes Fragment mit einem Protein, das in der zu immunisierenden Art immunogen ist, beispielsweise Schlüssellochnapfschnecken-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinderthyroglobulin oder Sojabohnentrypsininhibitor, unter Verwendung eines bifunktionalen oder Derivatisierungsmittels, beispielsweise Maleimidobenzoylsulfosuccinimidester (Konjugation über Cysteinreste), N-Hydroxysuccinimid (über Lysinreste), Glutaraldehyd, Bernsteinsäureanhydrid, SOCl2 oder R1N=C=NR, wobei R und R1 unterschiedliche Alkylgruppen sind, zu konjugieren.
  • Die Tiere werden gegen die immunogenen Konjugate oder Derivate durch Kombination von 1 mg oder 1 μg Konjugat (für Kaninchen bzw. Mäuse) mit 3 Volumina von Freud'schem vollständigem Adjuvans und Injektion der Lösung intradermal an mehreren Stellen immunisiert. Einen Monat später werden die Tiere mit 1/5 bis 1/10 der ursprünglichen Menge Konjugat in Freud'schem vollständigem Adjuvans durch subkutane Injektion an mehreren Stellen zur Wiederholung geimpft. 7 bis 14 Tage später wird den Tieren Blut entnommen und das Serum auf den Anti-Typ-C-Lectin-Antikörpertiter getestet. Die Tiere werden wiederholt geimpft, bis der Titer ein Plateau bildet. Vorzugsweise werden die Tiere mit dem Konjugat des gleichen Typ-C-Lectins, jedoch an ein unterschiedliches Protein und/oder durch ein unterschiedliches Vernetzungsreagens konjugiert zur Wiederholung geimpft. Konjugate können auch in rekombinanter Zellkultur als Proteinfusionen hergestellt werden. Auch werden Aggregationsmittel, wie Alaun, zur Verstärkung der Immunreaktion verwendet.
  • (ii) Monoklonale Antikörper
  • Monoklonale Antikörper werden aus einer Population von im wesentlichen homogenen Antikörpern erhalten, d. h. die die Population umfassenden individuellen Antikörper sind mit Ausnahme von möglichen natürlich vorkommenden Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können, identisch. Daher gibt die Modifizierung "monoklonal" den Charakter des Antikörpers derart an, dass dieser kein Gemisch diskreter Antikörper ist. Beispielsweise können die Anti-Typ-C-Lectin-monoklonalen-Antikörper der Erfindung unter Verwendung des Hybridomverfahrens, das als erstes von Kohler & Milstein, Nature 256: 495 (1975) beschrieben wurde, oder durch gentechnische Verfahren [Cabilly et al., US-Patent Nr. 4 816 567] hergestellt werden.
  • DNA mit Codierung für die monoklonalen Antikörper wird unter Verwendung herkömmlicher Verfahren (beispielsweise die Verwendung von Oligonucleotidsonden, die spezifisch zur Bindung an Gene mit Codierung für die schweren und leichten Ketten von Maus-Antikörpern fähig sind) ohne weiteres isoliert und sequenziert. Die Hybridomzellen dienen als bevorzugte Quelle derartiger DNA. Wenn die DNA isoliert ist, kann sie in Expressionsvektoren platziert werden, die dann in Wirtszellen, wie Affen-COS-Zellen, Chinese Hamster Ovary(CHO)-Zellen oder Myelomzellen, die ansonsten kein Immunglobulinprotein produzieren, transfiziert werden, wobei die Synthese monoklonaler Antikörper in den rekombi nanten Wirtszellen erhalten wird. Die DNA kann auch beispielsweise durch Substitution der Codierungssequenz für humane konstante Domänen der schweren und leichten Kette anstelle der homologen Maussequenzen (Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81, 6851 (1984)) oder durch kovalente Verbindung der Immunglobulincodierungssequenz mit der gesamten oder einem Teil der Codierungssequenz für ein Nicht-Immunglobulinpeptid modifiziert werden. Auf diese Weise werden "chimäre" oder "hybride" Antikörper hergestellt, die die Bindungsspezifität eines monoklonalen Antikörpers gegen Typ-C-Lectin hier aufweisen.
  • Typischerweise werden die konstanten Domänen eines Antikörpers oder die variablen Domänen einer mit Antigen kombinierenden Stelle eines Antikörpers der Erfindung durch derartige Nicht-Immunglobulinpeptide ersetzt, wobei ein chimärer zweiwertiger Antikörper erzeugt wird, der eine mit Antigen kombinierende Stelle mit Spezifität für ein Typ-C-Lectin und eine andere mit Antigen kombinierende Stelle mit Spezifität für ein unterschiedliches Antigen umfasst.
  • Chimäre oder hybride Antikörper können auch in vitro unter Verwendung von in der Chemie synthetischer Proteine bekannten Verfahren, die auch die unter Beteiligung von Vernetzungsmitteln umfasst, hergestellt werden. Beispielsweise können Immuntoxine unter Verwendung einer Disulfidaustauschreaktion oder durch Bildung einer Thioetherbindung konstruiert werden. Beispiele für für diesen Zweck geeignete Reagenzien umfassen Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimidat.
  • Für diagnostische Anwendungen werden die Antikörper typischerweise mit einer detektierbaren Einheit markiert. Die detektierbare Einheit kann eine beliebige Einheit sein, die entweder direkt oder indirekt ein detektierbares Signal erzeugen kann. Beispielsweise kann die detektierbare Einheit ein Radioisotop, wie 3H, 14C, 32P, 35S oder 125I, eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Verbindung, wie Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin oder Luciferin; Biotin; radioaktive Isotopenmarkierungen, wie beispielsweise 125I, 32P, 14C oder 3H, oder ein Enzym, wie alkalische Phosphatase, beta-Galactosidase oder Meerrettichperoxidase, sein.
  • Jedes einschlägig bekannte Verfahren zur getrennten Konjugation des Antikörpers mit der detektierbaren Einheit kann verwendet werden, wobei diese die bei Hunter et al., Nature 144: 945 (1962), David et al., Biochemistry 13: 1014 (1974), Pain et al., J. Immunol. Meth. 40: 219 (1981) und Nygren, J. Histochem. und Cytochem. 30: 407 (1982) beschriebenen Verfahren umfassen.
  • Die Antikörper können in einem beliebigen bekannten Testverfahren, beispielsweise Tests der kompetitiven Bindung, direkte und indirekte Sandwichassays und Immunpräzipitationsassays, Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, S. 147–158 (CRC Press, Inc., 1987), verwendet werden.
  • (iii) Humanisierte Antikörper
  • Verfahren zur Humanisierung nicht-humaner Antikörper sind einschlägig bekannt. Allgemein besitzt ein humanisierter Antikörper einen oder mehrere Aminosäurereste, die in diesen aus einer nicht-humanen Quelle eingeführt wurden. Diese nicht-humanen Aminosäurereste werden häufig als "Import"-Reste bezeichnet, die typischerweise einer "Import"-variablen-Domäne entnommen sind. Eine Humanisierung kann im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Winter und Mitarbeitern [Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986), Riechmann et al., Nature 332, 323–327 (1988), Verhoeyen et al., Science 239, 1534–1536 (1988)] durch Substitution von Nagetier-CDRs oder CDR-Sequenzen für die entsprechenden Sequenzen eines humanen Antikörpers durchgeführt werden. Daher sind derartige "humanisierte" Antikörper chimäre Antikörper (Cabilly, aaO), in denen im wesentlichen weniger als eine intakte humane variable Domäne durch die entsprechende Sequenz von einer nicht-humanen Art substituiert wurde. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise humane Antikörper, in denen einige CDR-Reste und möglicherweise einige FR-Reste durch Reste von analogen Stellen in Nagetierantikörpern substituiert wurden.
  • Es ist wichtig, dass Antikörper unter Beibehaltung von hoher Affinität für das Antigen und anderen günstigen biologischen Eigenschaften humanisiert werden. Um dieses Ziel zu erreichen, werden nach einem bevorzugten Verfahren humanisierte Antikörper durch ein Verfahren der Analyse der Muttersequenzen und verschiedener geplanter humanisierter Produkte unter Verwendung dreidimensionaler Modelle der Mutter- und humanisierten Sequenzen hergestellt. Dreidimensionale Immunglobulinmodelle sind üblicherweise verfügbar und dem Fachmann vertraut. Computerprogramme sind verfügbar, die wahrscheinliche dreidimensionale Strukturkonformationen von ausgewählten als Kandidaten betrachteten Immunglobulinsequenzen erläutern und zeigen. Die Inspektion dieser Darstellungen ermöglicht die Analyse der wahrscheinlichen Rolle der Reste bei der Funktionsweise der als Kandidat betrachteten Immunglobulinsequenz, d. h. die Analyse von Resten, die die Fähigkeit des als Kandidat betrachteten Immunglobulins zur Bindung von dessen Antigen beeinflussen. Auf diese Weise können FR-Reste ausgewählt und ausgehend von der Konsensus- und der Importsequenz so kombiniert werden, dass die gewünschte Antikörpereigenschaft, beispielsweise eine erhöhte Affinität für das Zielantigen bzw. die Zielantigene, erreicht wird. Allgemein sind die CDR-Reste di rekt und am stärksten an der Beeinflussung der Antigenbindung beteiligt. Für weitere Details siehe die PCT-Veröffentlichung WO 94/04679, veröffentlicht am 3. März 1994, die eine Continuation-in-part der PCT-Veröffentlichung WO 92/22653, veröffentlicht am 23. Dezember 1992, ist.
  • Alternativ ist nun die Herstellung transgener Tiere (beispielsweise Mäuse) möglich, die bei Immunisierung ein vollständiges Repertoire humaner Antikörper in Abwesenheit einer endogenen Immunglobulinproduktion produzieren können. Beispielsweise wurde beschrieben, dass die homozygote Deletion des Gens der Bindungsregion (JH) der schweren Kette eines Antikörpers in chimären und keimlinienmutierten Mäusen zur vollständigen Hemmung der endogenen Antikörperproduktion führt. Die Übertragung der humanen Keimlinienimmunglobulinanordnung in derartigen keimlinienmutierten Mäusen führt zur Produktion von humanen Antikörpern bei Antigenexposition. Siehe beispielsweise Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551–255 (1993), Jakobovits et al., Nature 362, 255–258 (1993).
  • (iv) Bispezifische Antikörper
  • Bispezifische Antikörper sind monoklonale, vorzugsweise humane oder humanisierte Antikörper, die Bindungsspezifitäten für mindestens zwei unterschiedliche Antigene besitzen. Im vorliegenden Fall besteht eine der Bindungsspezifitäten für ein Typ-C-Lectin der vorliegenden Erfindung und die andere für ein anderes Antigen, beispielsweise ein anderes Mitglied der endocytischen Typ-C-Lectin-Familie oder ein Selectin, wie E-, L- oder P-Selectin. Derartige Konstrukte können auch als bispezifische Immunadhäsine bezeichnet werden. Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper (und bispezifischer Immunadhäsine) sind einschlägig bekannt.
  • Herkömmlicherweise beruht die rekombinante Produktion bispezifischer Antikörper auf der Koexpression von zwei schwere Kette-leichte Kette-Paaren eines Immunglobulins, wobei die zwei schweren Ketten unterschiedliche Spezifitäten besitzen (Milstein und Cuello, Nature 305, 537–539 (1983)). Wegen der zufälligen Auswahl der schweren und leichten Ketten eines Immunglobulins produzieren diese Hybridome (Quadrome) ein potentielles Gemisch von 10 unterschiedlichen Antikörpermolekülen, von denen nur eines die korrekte bispezifische Struktur aufweist. Die Reinigung des korrekten Moleküls, die üblicherweise durch Affinitätschromatographiestufen erfolgt, ist ziemlich mühsam, und die Produktausbeuten sind niedrig. Ähnliche Verfahren sind in der Veröffentlichung der PCT-Anmeldung Nr. WO 93/08829 (veröffentlicht am 13. Mai 1993) und in Traunecker et al., EMBO 10, 3655–3659 (1991) offenbart.
  • Gemäß einem unterschiedlichen und stärker bevorzugten Ansatz werden variable Domänen eines Antikörpers mit den gewünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-Kombinationsstellen) mit Sequenzen der konstanten Domäne eines Immunglobulins fusioniert. Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit der konstanten Domäne der schweren Kette eines Immunglobulins, die mindestens einen Teil des Gelenks und zweite und dritte konstante Regionen der schweren Kette eines Immunglobulins (CH2 und CH3) umfasst. Vorzugsweise ist die erste konstante Region der schweren Kette (CH1), die die zur Bindung der leichten Kette notwendige Stelle enthält, in mindestens einer der Fusionen vorhanden. DNAs mit Codierung für die Fusionen der schweren Kette eines Immunglobulins und, falls gewünscht, die leichte Kette eines Immunglobulins werden in getrennte Expressionsvektoren insertiert und in einen geeigneten Wirtsorganismus kotransfektiert. Dies ergibt eine große Flexibilität bei der Einstellung der gegenseitigen Anteile der drei Polypeptidfragmente in Ausführungsformen, wenn ungleiche Anteile der bei der Konstruktion verwendeten drei Polypeptidketten die optimalen Ausbeuten ergeben. Es ist jedoch möglich, die Codierungssequenzen für zwei oder alle drei Polypeptidketten in einem Expressionsvektor zu insertieren, wenn die Expression von mindestens zwei Polypeptidketten in gleichen Anteilen zu hohen Ausbeuten führt oder wenn die Anteile von keiner besonderen Bedeutung sind. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Ansatzes bestehen die bispezifischen Antikörper aus einer hybriden schweren Kette eines Immunglobulins mit einer ersten Bindungsspezifität in einem Arm und einem hybriden schwere Kette-leichte Kette-Paar eines Immunglobulins (das eine zweite Bindungsspezifität ergibt) in dem anderen Arm. Es wurde ermittelt, dass diese asymmetrische Struktur die Abtrennung der gewünschten bispezifischen Verbindung von unerwünschten Immunglobulinkettenkombinationen erleichtert, da das Vorhandensein einer leichten Kette eines Immunglobulins in nur einer Hälfte des bispezifischen Moleküls einen leichten Abtrennungsweg ergibt. Dieser Ansatz ist in der PCT-Anmeldung WO 94/04690, veröffentlicht am 3. März 1994, offenbart.
  • Für weitere Details der Erzeugung bispezifischer Antikörper siehe beispielsweise Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986).
  • (v) Heterokonjugatantikörper
  • Heterokonjugatantikörper bestehen aus zwei kovalent verbundenen Antikörpern. Derartige Antikörper wurden beispielsweise zur Zielrichtung von Immunsystemzellen auf unerwünschte Zellen (US-Patent Nr. 4 676 980) und zur Behandlung einer HIV-Infektion (Veröffentlichung der PCT-Anmeldung Nr. 91/00360 und WO 92/200373; EP 03089 ) offenbart.
  • Heterokonjugatantikörper können unter Verwendung beliebiger passender Verknüpfungsverfahren hergestellt werden. Geeignete Verknüpfungsmittel sind einschlägig bekannt und in US-Patent Nr. 4 676 980 zusammen mit einer Zahl von Verknüpfungstechniken offenbart.
  • 2. Peptid- und Nichtpeptidanaloga
  • Peptidanaloga der Typ-C-Lectine der vorliegenden Erfindung werden auf der Basis der dreidimensionalen Struktur der nativen Polypeptide modelliert. Peptide können durch bekannte Techniken, wie die Festphasensynthesetechniken, die ursprünglich bei Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 15, 2149–2154 (1963) beschrieben wurden, synthetisiert werden. Andere Peptidsynthesetechniken sind beispielsweise bei Bodanszky et al., Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 2. Auflage, 1976, sowie in anderen Referenzbüchern, die dem Fachmann ohne weiteres verfügbar sind, beschrieben. Eine Zusammenfassung von Peptidsynthesetechniken findet sich bei Stuart und Young, Solid Phase Peptide Synthesia, Pierce Chemical Company, Rockford, IL (1984). Peptide können auch durch Gentechnik unter Verwendung einer DNA-Sequenz mit Codierung für das gewünschten Peptid hergestellt werden.
  • Zusätzlich zu Peptidanaloga betrachtet die vorliegende Erfindung auch Nichtpeptid(beispielsweise organische)verbindungen, die im wesentlichen die gleiche Oberfläche wie die Peptidanaloga der vorliegenden Erfindung zeigen und daher mit anderen Molekülen in ähnlicher Weise Wechselwirken.
  • J. Verwendung der Typ-C-Lectine
  • Aminosäuresequenzvarianten der nativen Typ-C-Lectine der vorliegenden Erfindung können therapeutisch zum Konkurrieren mit der normalen Bindung der nativen Proteine an deren Liganden verwendet werden. Die Typ-C-Lectin-Aminosäuresequenzvarianten sind daher als kompetitive Inhibitoren der biologischen Aktivität nativer Typ-C-Lectine verwendbar.
  • Native Typ-C-Lectine und deren Aminosäuresequenzvarianten sind zur Identifizierung und Reinigung von deren nativen Liganden verwendbar. Die Reinigung wird vorzugsweise durch Immunadhäsine, die eine Typ-C-Lectin-Aminosäuresequenz umfassen, die die qualitative Fähigkeit eines nativen Typ-C-Lectins der vorliegenden Erfindung zur Erkennung von dessen nativem Kohlehydratliganden beibehält, durchgeführt.
  • Die nativen Typ-C-Lectine der vorliegenden Erfindung sind ferner als molekulare Marker der Gewebe, in denen sie exprimiert werden, verwendbar.
  • Ferner ergeben die Typ-C-Lectine der vorliegenden Erfindung nutzbare Sequenzmotive, die in andere native Mitglieder der endocytischen Typ-C-Lectine, wie den nativen Mannoserezeptor, den DEC-205-Rezeptor oder den Phospholipase-A2-Rezeptor, insertiert oder in diesen substituiert werden können. Die Änderung dieser nativen Proteine durch die Substitution oder Insertion von Sequenzen von den neuen Typ-C-Lectinen der vorliegenden Erfindung kann Molekülvarianten mit geänderten biologischen Eigenschaften, wie die Ligandenbindungsaffinität oder Ligandspezifität, ergeben. Beispielsweise können eine oder mehrere Lectindomänen eines anderen Mitglieds der endocytischen Typ-C-Lectin-Familie vollständig oder partiell durch Lectindomänesequenzen, die von den Typ-C-Lectinen der vorliegenden Erfindung abgeleitet sind, ersetzt werden. In ähnlicher Weise können Fibronectin-Typ-II-Domäne-Sequenzen von den hier vorliegenden Typ-C-Lectinen in die Aminosäuresequenzen anderer Typ-C-Lectine insertiert oder in diesen substituiert werden.
  • Nucleinsäure mit Codierung für die Typ-C-Lectine der vorliegenden Erfindung ist auch zur Bereitstellung von Hybridisierungssonden zum Durchsuchen von cDNA- und Genombibliotheken auf die Codierungssequenz von anderen Typ-C-Lectinen verwendbar.
  • Weitere Details der Erfindung werden aus dem folgenden nicht-beschränkenden Beispiel offensichtlich.
  • Beispiel
  • Neue murine und humane Typ-C-Lectine
  • A. Materialien und Verfahren
  • 1. Isolierung von cDNAs mit Codierung für die murinen und humanen Lectine
  • Entsprechend der EST-Sequenz wurden zwei 33-Mere (5' CCG GAA TTC CGG TTT GTT GCC ACT GGG AGC AGG 3' (SEQ ID NO: 10) und 5' CCC AAG CTT GAA GTG GTC AGA GGC ACA GTT CTC 3' (SEQ ID NO: 11)) zur PCR (94°C, 1 min, 60°C, 1 min und 72°C, 1 min während 35 Zyklen) unter Verwendung von 5 μl einer humanen Herz-cDNA-Bibliothek (Clontech) als Templat synthetisiert. Das PCR-Produkt von 260 Basen wurde kloniert (TA Cloning Kit, Invitrogen) und als Sonde zum Durchmustern einer humanen Herz-cDNA-Bibliothek sowie zur Sondierung von Northern und Southern Blots (Clontech) verwendet. Das gleiche Primerpaar wurde auch zur Amplifikation einer Maus-Herz-cDNA-Bibliothek mit einer niedrigeren Renaturierungstemperatur (55°C) verwendet, und es wurde ein Mausprodukt mit der gleichen Größe (260 bp) erhalten. Das Durchmustern von etwa 500000 Plaques von cDNA-Bibliotheken erfolgte unter Verwendung von Standardverfahren mit einer zufallsmarkierten DNA-Sonde. Einzelne positive Phagenklone wurden nach zwei weiteren Runden eines erneuten Durchmusterns isoliert. Die Größe der Inserts wurde durch PCR unter Verwendung von zwei Primes von dem lambda-gt10-Vektor identifiziert, und die Inserts wurden subkloniert. Eine DNA-Sequenzierung wurde auf einem automatisierten DNA-Sequenzer von Applied Biosystems durchgeführt. Zur Klonierung der 5'-Region der Transkripte wurde 5'-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) unter Verwendung des letzten Teils des 5'-Endes der bekannten Sequenz durchgeführt und dem vom Hersteller gelieferten Protokoll für 5'-RACE (Marathon-Ready cDNAs, Clontech) gefolgt. Die RACE-Produkte wurden wie beschrieben subkloniert und sequenziert.
  • 2. Northern- und Southern-Blot-Analysen
  • Die DNA-Sonden wurden durch Agarosegelreinigung (Gel Extraction Kit, Qiagen) und statistische Zufallsmarkierung (Pharmacia) hergestellt. Blot-Hybridisierung wurde gemäß der Beschreibung in den Vorschriften des Herstellers unter Verwendung von im Handel erhältlichen Blots (Clontech) durchgeführt.
  • 3. Charakterisierung des fetalen Lebertranskripts
  • Die Sequenzierung der RACE-Produkte unter Verwendung von humaner fetaler Leber-Marathon-Ready-cDNA (Clontech) als Templat ergab eine neue 5'-Region, die in den ursprünglichen, von Herz abgeleiteten Klonen nicht gefunden wurde. Zur weiteren Charakterisierung dieses Transkripts wurde PCR an Herz, Lunge und fetaler Leber unter Verwendung eines üblichen strangabwärtigen Primers mit zwei unterschiedlichen strangaufwärtigen Primern durchgeführt. Ein strangaufwärtiger Primer stammt von der Lectinsequenz, die im fetalen Leberklon nicht vorhanden ist, und der andere stammt von einer singulären Sequenz von fetaler Leber. Die PCR-Produkte wurden auf Agarosegel analysiert und mit einem beiden Transkripten gemeinsamen Oligonucleotid hybridi siert.
  • 4. Isolierung von Genomklonen mit Codierung für das murine Lectin
  • Eine 129 Mouse-Derived Embryonic Cell(ES)-Genombibliothek wurde zur Durchmusterung durch zwei Lectin-cDNA-Sequenzen verwendet. Eine stammt von dem 5'-Ende der Lectincodierungssequenz und die andere stammt von dem 3'-Ende der cDNA. Das Durchmustern von 500000 Plaques ergab drei Arten von Lectingenomklonen, die positiv gegenüber der 5'-Ende-Sonde, der 3'-Ende-Sonde und beiden waren. Rekombinante Phagen-DNA wurde von Plattenlysaten (Wizard Lambda Preps, Promega) isoliert und durch NotI verdaut. Genom-DNA-Inserts wurden in einen NotI-verdauten pBlueScript SK-Vektor unter Verwendung des Rapid DNA Ligation Kit (Boehringer Mannheim) nach Hitzeinaktivierung des Restriktionsenzyms subkloniert. Die näherungsweisen Orte von Introns und Exons wurden unter Verwendung von Dot-Blot-Hybridisierung mit spezifischen Oligonucleotidsonden und PCR-Analyse von lambda-Klonen unter Verwendung von Exon-spezifischen Sonden identifiziert. Die physikalische Kartierung des Lectingens wurde unter Verwendung von Restriktionsenzymverdau von Genomklonen und anschließender Southern-Blot-Hybridisierung mit Exon-spezifischen Oligonucleotidsonden durchgeführt.
  • 5. In-situ-Hybridisierung
  • Die In-situ-Hybridisierung wurde im wesentlichen wie bereits beschrieben durchgeführt (Lasky et al., Cell 69(6), 927–38 [1992]). Kurz gesagt, wurden Antisense- und Sense-Ribosonden für diesen Klon durch Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) erzeugt, um Template für eine anschließende In-vitro-Transkription abzuleiten. Bei der Vorbereitung zur Hybridisierung wurden Abschnitte aufeinander folgend mit 4% Paraformaldehyd (10 min) und Proteinase K (0,5 mg/ml, 15 min) behandelt und dann mit 50 ml Hybridisierungspuffer bei 42°C 2 h vorhybridisiert. Hybridisierungspuffer bestand aus 10% Dextransulfat, 2 × SSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat) und 50% Formamid. Die Sonden wurden mit einer Endkonzentration von 106 cpm/Objektträger zugegeben und die Abschnitte wurden über Nacht bei 55°C inkubiert. Die Posthybridisierungswaschbehandlungen bestanden aus 2 × SSC, das 1 mM EDTA enthielt, vor und nach einer 30-minütigen Behandlung mit Ribonuclease (20 mg/ml). Eine hochstringente Waschbehandlung, die aus EDTA enthaltendem 0,1 × SSC bestand, wurde in einem großen Volumen während 2 h bei 55°C durchgeführt. Abschnitte wurden dann in 0,5 × SSC gewaschen, in zunehmenden Konzentrationen von Ethanol dehydratisiert und dann unter Vakuum getrocknet. Die Objektträger wurden mit NTB2-Nuclear Emulsion (Eastman Kodak, Rochester, NY) bedeckt und bis zu 5 Wochen diesem ausgesetzt. Nachdem die Objektträger entwickelt waren, wurden sie mit Hämatoxylin und Eosin gegengefärbt und durch Epilumineszenzmikroskopie auf positive Hybridisierung bewertet. Reihenschnitte der mit den Sense-Sonden hybridisierten Gewebe dienten als negative Kontrollen.
  • B. Ergebnisse
  • Die Expressed Sequenz Tag(EST)-Datenbank ist eine große Sammlung von zufälligen cDNA-Sequenzen von einer Vielzahl von Bibliotheken. Wir sondierten die EST-Datenbank in silico mit der Lectindomäne von E-Selectin. Wie aus 1 ersichtlich ist, wurde eine Sequenz (T11885) identifiziert, die niedrige Homologie (~23%) zu einer Region der Lectindomäne von E-Selectin zeigte. Während diese Homologie ganz entfernt zu sein schien, ermittelten wir, dass die Reste, die identisch waren, in dem Teilsatz von Aminosäuren, von denen bereits gezeigt wurde, dass sie in der großen Mehr heit von Typ-C-Lectinen konserviert sind (Drickhamer, J. Biol. Chem. 263, 9557–9560 [1988]), enthalten waren. Außerdem ergab das Durchsuchen der GenBank-EMBL-Datenbank mit der neuen, EST-abgeleiteten, mit E-Selectin verwandten Sequenz nur Typ-C-Lectin-Homologien (Daten nicht angegeben), was wiederum mit der neuen Sequenz als einem Mitglied dieser großen Familie von Proteinen konsistent ist.
  • Da die neue EST-Sequenz ursprünglich von einer humanen Herz-cDNA-Bibliothek stammte, wurde eine ähnliche Bibliothek zur PCR-Analyse unter Verwendung von von der EST-Sequenz abgeleiteten Primern verwendet. Dies ergab ein DNA-Fragment, das die gleiche Sequenz wie die für den Datenbankeintrag gefundene enthielt, und dieses Fragment wurde zur Sondierung einer humanen Herzbibliothek verwendet. Außerdem wurde ein Mausfragment unter Verwendung ähnlicher Techniken ebenfalls isoliert, und dieses Fragment wurde zur Isolierung von cDNA von einer murinen Herzbibliothek verwendet. 2 erläutert die von dem Maus-cDNA-Klon erhaltene Sequenz voller Länge. Aus dieser Figur ist ersichtlich, dass dieses große Transkript ein Protein von 1479 Resten mit einem Molekulargewicht von etwa 167 kD codierte. Die humane Sequenz zeigte etwa 90% Aminosäuresequenzhomologie mit dem Mausprotein. Der in der Maussequenz gezeigte ATG-Translationsinitiationscodon steht im Zusammenhang einer Kozak-Translationsstartstelle, und es gibt zwei Stoppcodons 5' zu diesem ATG. Eine Durchsuchung der GenBank mit der abgeleiteten Mausproteinsequenz ergab, dass diese neue Sequenz sehr eng mit dem Makrophagenmannoserezeptor (32,5% Identität) (Taylor et al., aaO; Harris et al, aaO), dem Phospholipase-A2-Rezeptor (34% Identität) (Higishino et al., aaO; Ishizaki et al., aal; Lambeau et al., aaO) und dem DEC-205-Rezeptor (33% Identität) (Jiang et al., aaO), drei Mitgliedern der Familie der Typ-C-Lectine, die mehrere Lectindomänen enthalten, die alle Endocytose vermitteln, verwandt ist (3). Diese Grade der Sequenzhomologie sind ähnlich denen, die ermittelt wurden, als diese drei lectinähnlichen Rezeptoren miteinander verglichen wurden, was mit der Annahme konsistent ist, dass die hier beschriebene neue cDNA ein neues Mitglied dieser Familie ist. Eine weitere Homologieanalyse durch Domänen ergab, dass die höchsten Sequenzhomologien zwischen diesen vier verwandten Proteinen in den Fibronectin-Typ-II- und lectinähnlichen Domänen 1–3 gefunden wurden, was mit der Möglichkeit konsistent ist, dass diese Domänen funktional wichtig sind (4). Außerdem ergab die Analyse der cytoplasmatischen Domäne des neuen Typ-C-Lectins auch, dass sie einen konservierten Tyrosinrest (Restnummer 1451) in einem Zusammenhang ähnlich dem NSYY-Motiv, von dem früher ermittelt wurde, dass es für die Endocytose des Phospholipase-A2-Rezeptors wichtig ist (Zvaritch et al., aaO), enthielt. Zusammenfassend gesagt, ist der hier beschriebene neue Rezeptor mit drei früher beschriebenen Lectinen mit einer Gesamtstruktur, die aus einer Signalsequenz, einer cysteinreichen Domäne, einer Fibronectin-Typ-II-Domäne, 8 Typ-C-Lectin-Domänen (10 derartige Domänen in dem DEC-205-Rezeptor), einer Transmembrandomäne und einer kurzen cytoplasmatischen Domäne besteht, (4) verwandt.
  • C. Analyse der Genomstruktur des neuen Typ-C-Lectins
  • Southern-Blot-Analysen mit einer kleinen Region des neuen Typ-C-Lectins ergaben, dass es in Übereinstimmung mit dem hohen Grad an Sequenzhomologie zwischen den murinen und humanen cDNAs durch ein hoch konserviertes Gen mit Einzelkopie codiert wurde (5). Das Gen mit Codierung für die murine bzw. Mausform des neuen Typ-C-Lectins mit Ausnahme der Exons der Signalsequenz und der cysteinreichen Domäne, die aus unserer Bibliothek nicht isoliert werden konnten, wurde unter Verwendung einer Kombination von Southern Blotting und PCR-Analyse von lambda-Klonen unter Verwendung von Exon-spezifischen Sonden, die aufgrund der humanen und murinen Makrophagenmannoserezeptorgenstrukturen vorhergesagt wurden (Kim et al., Genomic 14(3), 721–727 [1992]; Harris et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 198(2), 682–92 [1994]), charakterisiert. Wie aus 5 ersichtlich, wurde das Gen durch minimal 28 Introns unterbrochen und es breitete sich über mindestens 39 kB DNA aus. Diese Genomstruktur erinnert daher stark an die, die für die humanen und murinen Makrophagenmannoserezeptoren gefunden wurde, die beide durch eine ähnliche Zahl von Introns an ähnlichen Stellen unterbrochen wurden. Diese Daten sind daher mit der Annahme konsistent, dass die Mitglieder dieser Familie von Typ-C-Lectinen alle von einem ursprünglichen Stammgen stammten, das dann dupliziert und mutiert wurde, wobei diese vier unterschiedlichen Proteine mit unterschiedlichen Funktionen gebildet wurden.
  • D. Northern-Blot-Analyse von Transkripten mit Codierung für das neue Typ-C-Lectin
  • Eine vielfältige Sammlung von murinen und humanen Geweben wurde auf die Expression des Transkripts mit Codierung für das neue Typ-C-Lectin analysiert. Wie aus 6 ersichtlich, wurde ermittelt, dass das Transkript im frühesten geprüften Mausembryostadium (Tag 7) exprimiert wurde und dessen Expression während der Embryoentwicklung andauerte. Die Analyse von humanen fetalen Geweben ergab, dass das Transkript in Lunge und Niere stark exprimiert wurde. Interessanterweise wurde ermittelt, dass ein verkürztes Transkript vorwiegend in der fetalen Leber exprimiert wurde, und dieses Transkript wird im folgenden detaillierter beschrieben. Die Analyse von Geweben von ausgewachsenen Mäusen ergab, dass hohe Expressionsgrade in Herz, Lunge und Niere und niedrigere Grade in Hirn und Muskulatur detek tiert wurden. Interessanterweise scheint das Transkript in der ausgewachsenen Leber bei sowohl Menschen als auch Mäusen nicht vorhanden zu sein, was des weiteren die Spezifität des alternativ gespleißten Transkripts für die fetale Leber stützt. Die Analyse der Expression in humanen Geweben ergab, dass auch hohe Transkriptmengen im Herzen sowie in Prostata, Hoden, Eierstock und Darm mit niedrigeren Mengen in Hirn, Plazenta, Lunge, Niere, Pankreas, Milz, Thymus und Kolon vorhanden waren. Die Analyse der Expression in verschiedenen transformierten Zellen (6) ergab, dass das neue Lectin in mindestens zwei unterschiedlichen hämatopoetischen Zelllinien im Gegensatz zur offensichtlichen fehlenden Expression in humanen Leukocyten in peripherem Blut (PBL) transkribiert wurde. Ferner waren mehrere andere transformierte Zelllinien, die von verschiedenen Tumoren abgeleitet waren, ebenfalls positiv hinsichtlich der Expression dieses Lectins. Zusammenfassend gesagt, legt die Analyse der Expression des neuen Typ-C-Lectins nahe, dass es in einer Vielzahl von Geweben und durchgängig während der Entwicklung exprimiert wird, obwohl es in erwachsener Leber nicht vorhanden zu sein scheint und als kleineres Transkript in fetaler Leber gefunden wird. Die Expression eines kleineren Transkripts in humaner fetaler Leber legte zusammen mit der oben beschriebenen komplexen Genomstruktur nahe, dass diese RNA durch alternatives Spleißen produziert worden sein könnte. Die Analyse von von der fetalen Leber stammenden RACE-Klonen ergab, dass das kleinere Transkript eine divergierende 5'-Sequenz zu haben schien. Um dieses Transkript weiter zu charakterisieren, wurden eine humane Bibliothek von fetaler Leber durchmustert und die gebildeten positiven Phagen sequenziert. Ein positiver Phage wurde ermittelt, der eine partielle cDNA zu codieren schien, die dem kleineren Transkript entsprach. Daher ist, wie aus 7 ersichtlich ist, die gebildete Sequenz mit dem ursprünglichen Lectin voller Länge bis zu Nucleotid 61 identisch, wo eine divergierende Sequenz gefunden wird, die zum 5'-Ende des Transkripts, das in diesem Phagen enthalten ist, führt. Dies ist die identische Spleißstelle, die für das Intron Nummer 18 in dem Mannoserezeptor gefunden wird (Kim et al., aaO, Harris et al., aaO), die eine Region in dem Carboxyterminus der fünften Lectindomäne unterbricht, was mit alternativem Spleißen konsistent ist. Um zu belegen, dass dieses Transkript existiert, sowie um dessen Gewebespezifität zu untersuchen, wurden spezifische Primer ausgehend von dem ursprünglichen Transkript sowie von dem kleineren, alternativ gespleißten Transkript gestaltet (7). Wie aus 7 ersichtlich ist, ergab die Analyse von RNA von Lunge, Herz und fetaler Leber, dass das alternativ gespleißte kleine Transkript für die fetale Leber spezifisch war, obwohl dieses Gewebe auch das Transkript voller Länge herzustellen schien. Außerdem ergab die Analyse eines Northern-Blot von Gewebe mit einem 30-Mer-Oligonucleotid, das für die neue Region in diesem Transkript spezifisch war, ein dieser kleinen RNA entsprechendes Signal nur in der fetalen Leber (Daten nicht gezeigt). Die Größe des Transkripts bei Northern-Blots legt nahe, dass dieses alternativ gespleißte Transkript sich nur über einen relativ kurzen Abstand 5' zu dem hier isolierten lambda-Klon erstrecken sollte.
  • E. In-situ-Hybridisierungsanalyse des neuen Typ-C-Lectins
  • Um die Zellarten zu überprüfen, die das Transkript mit Codierung für das neue Typ-C-Lectin exprimierten, wurden In-situ-Hybridisierungsanalysen unter Verwendung von Geweben von neugeborenen und ausgewachsenen Mäusen durchgeführt. Aus 8 ist ersichtlich, dass dieses Transkript in zwei sehr divergierenden Gewebearten gefunden wurde. Beispielsweise legte die Northern-Blot-Analyse von Geweben ausgewachsener Mäuse sowie von humanen fetalen Geweben (7) einen hohen Expressionsgrad des Transkripts in Lunge nahe, und 8 erläutert, dass diese RNA in der Lunge klar exprimiert gefunden wurde. Obwohl es schwierig ist, bei der Auflösung der In-situ-Experimente wegen der hoch vaskularisierten Natur der Lunge den genauen Zellort des Transkripts festzustellen, ist es möglich, dass es durch das Lungenendothel exprimiert wird. Das Transkript wurde auch an einer Zahl anderer hoch endothelialisierter Stellen gefunden, die beispielsweise den Plexus choroideus und die Nierenglomerula umfassen (8), jedoch wurde es nicht universell in detektierbaren Mengen im gesamten Endothel exprimiert. Außerdem zeigte eine Prüfung von Endothelzelllinien, die von Mauseidotter stammten, mittels PCR ebenfalls die Expression des Lectins (Daten nicht gezeigt). Die Figur erläutert auch, dass ermittelt wurde, dass das Transkript durch Chondrocyten an Stellen einer aktiven Knorpelablagerung hoch exprimiert wurde. Wie aus dieser Figur ersichtlich ist, produzierte die Kollagenregion des Larynx eine hohe Menge dieses Transkripts, wie auch andere Knochenbildungsregionen bei dem Neugeborenen einschließlich der sich entwickelnden Brustbeinknochen sowie der sich entwickelnden Zähne dies tun. Diese Daten legen nahe, dass im Gegensatz zu der beschränkten Expression der früher berichteten Mitglieder dieser Familie das hier beschriebene neue Typ-C-Lectin in einer Vielzahl von hoch endothelialisierten Regionen und Knochenbildungsstellen im Embryo sowie im Erwachsenen exprimiert zu werden scheint.
  • G. Diskussion
  • Die Erkennung von Kohlehydraten durch verschiedene calciumabhängige oder Typ-C-Lectine wurde vor kurzem als Hauptaspekt einer Zahl von physiologischen Phänomenen erkannt. Diese umfassen beispielsweise die Adhäsion von verschiedenen Leukocytenzellen am Endothel unter den Bedingun gen des vaskulären Flusses (Lasky, Ann. Rev. Biochem. 64, 113–139 [1995]), die Bindung und das Auffressen pathogener Organismen durch Makrophagen (Harris et al., aaO), die Erkennung transformierter Zellen durch natürliche Killer(NK)zellen (Bezouska et al., Nature 372(6502), 150–7 [1994]) und die Entfernung desialinisierter Glykoproteine aus dem Kreislauf. Die Bedeutung dieser Arten von Wechselwirkungen wurde durch sowohl natürlich vorkommende als auch induzierte Mutationen signifikant hervorgehoben. Beispielsweise führen natürlich vorkommende humane Mutationen in dem zirkulierenden Mannosebindungsprotein zu Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen Pathogeninfektionen bei betroffenen Individuen (Lipscombe et al., Immunology 85(4), 660–7 [1995]), und die Produktion von Tieren mit Mutationen in verschiedenen Selectingenen führt zu schwerwiegenden Defekten des Leukocytentransports (Mayadas et al., Cell 74(3), 541–555 [1993]; Arbones et al., Immunity 1, 247–260 [1994]). Während weder natürlich vorkommende noch induzierte Mutationen bisher für die Familie von endocytischen Typ-C-Lectinen berichtet wurden, legen verschiedene In-vitro-Daten die Vermutung nahe, dass diese Lectine auch für einen Bereich von potentiell kritischen Funktionen wichtig sind. Wir beschreiben hier ein neues Mitglied der endocytischen Lectinfamilie, das viele der Strukturmerkmale der bereits beschriebenen Mitglieder enthält, das jedoch mehrere Unterschiede hinsichtlich der Expressionsstellen mit potentiell wichtigen funktionalen Folgen zeigt. Ein Vergleich der Gesamtstruktur des hier berichteten neuen Rezeptors legt nahe, dass er klar ein Mitglied der endocytischen Typ-C-Lectin-Familie ist. Dies beruht auf der klaren Konservierung von jedem der Proteinmotive, die in dieser Familie gefunden werden, im Vergleich mit denjenigen, die in dem neuen Lectin gefunden werden. Daher enthält der neue Rezeptor Regionen, die homolog zu den cysteinreichen, Fibronectin-Typ-II- und mehreren Lectin-Domänemotiven, die in den anderen drei Mitgliedern dieser Lectin-Familie gefunden werden, sind, zusätzlich zu einer Signalsequenz und einer Transmembrandomäne, die den Rezeptor als Typ-1-Transmembranprotein ausrichten. Interessanterweise ist die cytoplasmatische Domäne ebenfalls homolog zu den anderen Mitgliedern dieser Familie, und diese Homologie umfasst ein konserviertes Thyrosin in einem Zusammenhang ähnlich dem NSYY-Motiv, das für Endocytose entscheidend ist (Zvaritch et al., aaO). Daher legen, obwohl die Konservierungsgrade zwischen diesen Familienmitgliedern ganz niedrig (~30–35%) zu sein scheinen, ihre gesamten vorhergesagten Proteindomänestrukturen sowie die Exonstrukturen von mindestens den Genen für die humanen und murinen Mannosemakrophagenrezeptoren (Kim et al., aaO, Harris et al., aaO) sowie den hier berichteten neuen Rezeptor nahe, dass sie klar eine verwandte Familie von Rezeptoren sind. Daher ist sehr wahrscheinlich, dass dieser neue Rezeptor an der Aufnahme von Liganden zum Zwecke einer endocytischen Reaktion, was für die anderen Proteine dieser Familie ermittelt wurde, beteiligt ist.
  • Im Hinblick auf die Liganderkennung durch den neuen Rezeptor implizierten frühere Arbeiten, dass die Typ-C-Lectin-Domänen für die Bindungsaktivität der anderen Mitglieder dieser Familie entscheidend sind. Beispielsweise ergaben Deletionsanalysen von sowohl dem Makrophagenmannoserezeptor (siehe die zwei Artikel von Taylor et al., aaO) als auch dem Phospholipase-A2-Rezeptor (Ishizaki et al., aaO), dass die Typ-C-Lectin-Motive an der Bindung von entweder einen hohen Mannosegehalt aufweisenden Glykoproteinen (der Makrophagenmannoserezeptor) oder Phospholipase A2 (der Phospholipase-A2-Rezeptor) beteiligt sind. Interessanterweise ist im Falle des letzteren Rezeptors die Bindung von Phospholipase nicht kohlehydratabhängig, obwohl dieser Rezeptor auch mit signifikanter Affinität an hoch glykosylierte Neoglyko proteine, wie Mannose-BSA, bindet (Lambeau et al., aaO). Die Notwendigkeit von mehreren Kohlehydraterkennunsgmotiven wird durch die Erkenntnis unterstrichen, dass die Affinität des Makrophagenmannoserezeptors für glykosylierte Proteine verstärkt ist, wenn mehr als ein Motiv im Zusammenhang eines gekürzten Rezeptors exprimiert wird (siehe die zwei Artikel von Taylor et al., aaO). Da der DEC-205-Rezeptor auch glykosylierte Antigene zu binden scheint, um die Antigenpräsentation durch dendritische Zellen und Thymusepithel zu verstärken (Jiang et al., aaO), scheint es sehr wahrscheinlich, dass er auch eine Mehrzahl von Lectinmotiven für eine hochaffine Ligandbindung nutzt. Schließlich belegt eine vergleichende Analyse der Sequenzen der Typ-C-Lectin-Motive in dem neuen Rezeptor mit denjenigen, die in der gemeinsamen Kristallstruktur des Mannosebindungsproteins und von Mannose gefunden wurden (die zwei Arbeiten von Weis et al., aaO; Drickhamer et al., aaO) (K. Drickamer-persönliche Mitteilung), dass viele der an der Ligation von Calcium und der Erkennung von entweder Mannose oder Galactose beteiligten Aminosäuren in den ersten zwei Lectinmotiven des neuen Proteins gefunden werden, was mit einer Rolle für diese Motive bei der Kohlehydraterkennung konsistent ist. Interessanterweise steht dies im Gegensatz zu dem Makrophagenmannoserezeptor, wo die vierte Domäne des Lectintyps diejenige zu sein scheint, die für die Kohlehydraterkennung am stärksten entscheidend ist (die zwei Arbeiten von Taylor et al., aaO). Zusammenfassend gesagt, stützen diese Daten daher die Annahme, dass das hier berichtete verwandte Lectin auch an der Erkennung eines hoch glykosylierten Liganden oder hoch glykosylierter Liganden unter Vermittlung einer endocytischen Aufnahme beteiligt ist.
  • Während die hier berichteten Daten nahelegen, dass die Mechanismen einer Liganderkennung durch das neue endocytische Typ-C-Lectin mit den früher für die anderen Familienmit glieder beschriebenen verwandt sein können, legt die Analyse der Expressionsmuster dieses neuen Proteins nahe, dass es potentiell eine neue Aufgabe(n) erfüllt. Die Expressionsmuster von zwei Mitgliedern der endocytischen Lectinfamilie, dem Makrophagenmannoserezeptor und dem DEC-205-Rezeptor, zeigen eine stark beschränkte Transkription dieser Proteine in Makrophagen und Leberendothelzellen (der Makrophagenmannoserezeptor) oder in dendritischen Zellen und Thymusepithel (der DEC-205-Rezeptor), und diese Muster korrelieren mit den bekannten Funktionen dieser Rezeptoren in der Immunsystemfunktion. Ein breiteres Expressionsmuster wird für den Phospholipase-A2-Rezeptor beobachtet. Dieser endocytische Rezeptor wird in verschiedenen Geweben des Embryos und des Erwachsenen, die Herz, Lunge, Niere, Skelettmuskulatur und Leber in der ausgewachsenen Maus und die Niere im menschlichen Embryo umfassen, exprimiert. Dieses Muster erinnert in gewisser Weise an den hier beschriebenen neuen Rezeptor, insbesondere die Expression in Herz, Lunge und Niere von Erwachsenen. Es bestehen jedoch mehrere Unterschiede zwischen diesen Rezeptoren, die die Expression des neuen Rezeptors in der embryonalen Lunge als großes Transkript und in der fetalen Leber als kleines, alternativ gespleißtes Transkript umfassen. Außerdem wird der neue Rezeptor im Gegensatz zum Phospholipase-A2-Rezeptor in der Leber von Erwachsenen überhaupt nicht exprimiert. Diese Unterschiede des Expressionsmusters sind mit Unterschieden der Funktion zwischen diesen zwei breiter exprimierten lectinähnlichen Rezeptoren konsistent.
  • Die Zellarten, die das neue endocytische Lectin exprimieren, liefern auch einen gewissen Schlüssel für dessen mögliche Funktion. Die relativ weit verbreitete Transkription in ausgewachsenen Geweben ist mit endothelialer Expression konsistent, und die In-situ-Hybridisierungsanalyse stützt diese Annahme ebenfalls. Daher wurde, auch wenn die Auflö sung dieser Experimente zur exakten Identifizierung der das neue Lectin exprimierenden Zellarten unzureichend war, dieses häufig in stark vaskularisierten Bereichen, die Lunge, Nierenglomerulum, Plexus choroideus und Knochenmark umfassen, um einige wenige zu nennen, gefunden. Diese Daten legen daher nahe, dass das neue Lectin als vaskuläres Kohlehydratbindungsprotein fungieren kann. Im Gegensatz dazu scheinen andere Mitglieder dieser Familie, die den Makrophagenmannoserezeptor und den DEC-205-Rezeptor umfassen, als Mediatoren des Immunsystems zu fungieren, und sie werden in einem kleinen Teilsatz von Immunsystemzellen von Erwachsenen exprimiert. Da jedoch der Embryo in einer sterilen Umgebung ist, ist es unwahrscheinlich, dass das derzeit beschriebene Lectin an diesem Funktionstyp beteiligt ist, vorwiegend deshalb, weil es durchgängig während der Embryoentwicklung bereits ab dem 7. Tag der Mausentwicklung exprimiert wird. Eine mögliche Funktion, die dieses Lectin im Gefäßsystem erfüllt, kann der Transport von stark glykosylierten Proteinen durch das Blutgefäß sein. Dies kann entweder von der Lumenseite des Gefäßes zum extravaskulären Raum oder in der anderen Richtung in Abhängigkeit von der Disposition des Lectins erfolgen. Wenn das Lectin auf die Lumenseite blickt, könnte es daher zum Transportieren von stark glykosylierten Proteinen aus dem vaskulären Fluss in den extravaskulären Raum fungieren. Konsistent mit dessen Expression am Endothel ist die Identifizierung in verschiedenen, vom Embryo abgeleiteten Endothelzelllinien. Dieser Typ einer möglichen Funktion ist daher ähnlich dem als Hypothese für den Makrophagenmannoserezeptor, der an Endothelzellen der Leber exprimiert wird, angenommenen. In diesem Fall scheint dieser Rezeptor die Clearance von desialinisierten Proteinen aus dem Blutstrom zu vermitteln. Die Untersuchung dieser Hypothese erwartet die Produktion von gegen dieses neue Lectin gerichteten Antikörpern, was eine Analyse mit höherer Auflösung der tatsächlichen zellulären Lokalisation dieses Proteins im Embryo und Erwachsenen ermöglicht. Der hohe Expressionsgrad des neuen Lectins in Chondrocyten legt ebenfalls interessante Möglichkeiten nahe. Im Gegensatz zu Endothelzellen sind diese Zellen dem Blutstrom nicht direkt ausgesetzt, weshalb es unwahrscheinlich ist, dass das Lectin im Falle dieser matrixabscheidenden Zellen an identische Liganden bindet. Die Expression des Lectins wurde in Mineralisierungsregionen, wie den Brustbein- und Zahnregionen, sowie an Stellen einer Knorpelabscheidung, wie dem Larynx, nachgewiesen. Diese Daten legen nahe, dass das Lectin an der Synthese von Knorpel oder anderen Arten einer extrazellulären Matrix, die durch die Chondrocyten produziert wird, beteiligt sein kann. Wenn das hier beschriebene neue Lectin tatsächlich als an der Endocytose beteiligt ermittelt wird, kann dann eine mögliche Funktion in Chondrocyten die Aufnahme von stark glykosylierten Vorläuferproteinen, die abgebaut und zur Produktion extrazellulärer Matrix verwendet werden, sein. Eine kontrastierende Möglichkeit kann darin bestehen, dass die Chondrocyten dieses Lectin zum Neuaufbau der extrazellulären Matrix durch die Endocytose von stark glykosylierten Proteinen nutzen.
  • Schließlich ist die Identifizierung des alternativ gespleißten Transkripts, das für die humane fetale Leber spezifisch ist, ein sehr interessantes Ergebnis mit potentiellen Auswirkungen auf die Hämatopoese, obwohl das Fehlen eines Startcodons in dem derzeitigen Klon uns nicht die Vorhersage gestattete, dass dieses Transkript für ein Protein codiert. Die PCR-Analyse dieses Transkripts zeigte klar, dass es in Herz und Lunge vollständig fehlte, und eine Northern-Blot-Analyse ergab das Fehlen eines Signals für dieses oder das Transkript voller Länge in der Leber von Erwachsenen. Da fetale Leber eine hervorragend wichtige Stelle der Hämatopoese im Embryo ist, legt dieses Ergebnis nahe, dass dieses Transkript in gewisser Weise an der fetalen Hämatopoese beteiligt ist. Die mögliche endotheliale Lokalisierung des Transkripts legt auch eine mögliche Beteiligung an der Produktion von Blutzellen nahe, da frühere Arbeiten nahelegten, dass Endothelzellen an der Ausbreitung von Vorläuferzellen im Embryo beteiligt zu sein scheinen. Interessanterweise fehlen dem gespleißten Transkript die ersten zwei Lectindomänen, die aufgrund der Sequenzhomologie mit dem mannosebindenden Protein an der Kohlehydraterkennung beteiligt sein können. Daher ist es wahrscheinlich, dass, wenn dieses Transkript für ein Protein codiert, diese Form des Lectins andere Regionen des extrazellulären Teils des Proteins für neue Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen nutzen kann.
  • Zusammenfassend gesagt, geben die hier berichteten Daten den Beweis für ein neues Mitglied der endocytischen Typ-C-Lectin-Familie. Dieses Glykoprotein scheint in einer breiten Vielzahl von Geweben im Embryo und Erwachsenen exprimiert zu werden und es wird durch Chondrocyten und möglicherweise Endothelzellen transkribiert.
  • Alle in der Beschreibung sowie den darin aufgeführten Literaturstellen angeführten Dokumente werden hierdurch ausdrücklich als Bezug aufgenommen. Obwohl die vorliegende Erfindung unter Bezug auf spezielle Ausführungsformen erläutert wurde, ist die Erfindung nicht darauf beschränkt. Es ist klar, dass weitere Modifikationen und Variationen ohne Abweichen von der Gesamtidee der Erfindung möglich sind. Alle derartigen Modifikationen sollen im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung liegen.
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Claims (18)

  1. Isoliertes Typ-C-Lectin, das ausgewählt ist aus der Gruppe von: (a) einem Polypeptid, das die Reste 37 bis 1393 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 umfasst, (b) einem Polypeptid mit mindestens 60% Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 und (c) einem Polypeptid mit mindestens 80% Sequenzidentität mit den ersten drei Lectin-Domänen oder der Fibronectin-Typ-II-Domäne der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4.
  2. Typ-C-Lectin nach Anspruch 1 mit mindestens 80 Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4.
  3. Typ-C-Lectin nach Anspruch 1, das keine aktive Transmembrandomäne und/oder cytoplasmatische Domäne aufweist.
  4. Typ-C-Lectin nach Anspruch 1, das nicht von nativer Glykosylierung begleitet ist.
  5. Typ-C-Lectin nach Anspruch 1, das eine andere Glykolisierung aufweist.
  6. Nukleinsäuremolekül mit Codierung für das Typ-C-Lectin nach Anspruch 1.
  7. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 6 mit Codierung für mindestens die Fibronectin-Typ-II-Domäne und die ersten drei Lectin-Domänen eines Typ-C-Lectins mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4.
  8. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 6 mit Codierung für ein Typ-C-Lectin, das keine aktive Transmembrandomäne und/oder cytoplasmatische Domäne aufweist.
  9. Vektor, der das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 6 in funktioneller Verknüpfung mit Kontrollsequenzen, die von einer mit dem Vektor transformierten Wirtszelle erkannt werden, umfasst.
  10. Wirtszelle, die mit dem Vektor nach Anspruch 9 transformiert ist.
  11. Wirtszelle nach Anspruch 10, die eine Säugetierzelle ist.
  12. Wirtszelle nach Anspruch 11, die eine Chinese Hamster Ovary-Zelle ist.
  13. Verfahren zur Herstellung des Typ-C-Lectins nach Anspruch 1, das das Transformieren einer Wirtszelle mit Nukleinsäure mit Codierung für das Typ-C-Lectin, das Kultivieren der transformierten Zelle und das Gewinnen des Typ-C-Lectins aus der Zellkultur umfasst.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Typ-C-Lectin in das Kulturmedium sezerniert und aus dem Kulturmedium gewonnen wird.
  15. Immunadhäsin, das eine Aminosäuresequenz eines Typ-C-Lectins gemäß Anspruch 1 an eine Immunglobulinsequenz fusioniert umfasst.
  16. Immunadhäsin nach Anspruch 15, das mindestens die Fibronectin-Typ-II-Domäne und eine Kohlehydraterkennungsdomäne eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 umfasst.
  17. Immunadhäsin nach Anspruch 15, wobei die Immunglobulinsequenz eine Sequenz der konstanten Domäne der schweren Kette eines Immunglobulins, vorzugsweise eines IgG-1, IgG-2 oder IgG-3 ist.
  18. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Typ-C-Lectin gemäß Anspruch 1 umfasst.
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