JP2002223758A

JP2002223758A - ＣＤｗ１０８をコードする遺伝子

Info

Publication number: JP2002223758A
Application number: JP23968798A
Authority: JP
Inventors: Akira Yamada; 亮山田; Yoshihiro Kubo; 慶裕久保; Kyogo Ito; 恭悟伊東
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1998-08-26
Filing date: 1998-08-26
Publication date: 2002-08-13
Also published as: WO2000012700A1; AU5443099A

Abstract

(57)【要約】【課題】GPIアンカー型細胞膜表面糖タンパク質であるC
Dw108の生物学的機能およびCDw108をコードする遺伝子
の分子特性を明らかにする。【解決手段】Ｔ細胞白血病細胞株HPB-ALLの細胞溶解液
より、抗CDw108抗体を用いた免疫沈降法と二次元電気泳
動により精製単離し、ペプチドシークエンサーにてN末
端ペプチド20残基のアミノ酸配列を決定した。このアミ
ノ酸配列に基づきプライマーを設定し、PCR法等によりC
Dw108遺伝子の断片の塩基配列を決定した。この配列を
元にGene Trapper法等によりCDw108cDNAのクローンを
得、その塩基配列を決定した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規に同定された
CDw108タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび
ポリヌクレオチドの変異体；該ポリヌクレオチドを含む
ベクター；該ベクターを含む宿主細胞；CDw108組換えタ
ンパク質の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】CDw108は、John-Milton-Hagen(以下、JM
Hと略す)ヒト血液型抗原とも呼ばれ、グリコシルホスフ
ァチジルイノシトール(以下、GPIと略す)アンカー型細
胞膜表面糖タンパク質であり、活性化リンパ球、いくつ
かの白血病細胞株および赤血球で発現している（1−
5）。既に、CDw108がリンパ球の発達および活性化に作
用していることを示唆する報告がいくつかなされている
（3−7）。更に、最近、HIV-1感染にCDw108がなんらか
の形で関与している可能性があることが報告された
（8）。しかし、CDw108の分子特性および生物学的機能
が十分に解明されたわけではない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、CDw108遺伝
子のクローニングを通じて、その分子特性を明らかにす
るものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者は、鋭意研究の
結果、CDw108をコードするヌクレオチドを見出した。す
なわち、本発明は、（ａ）配列番号：１に記載の２位か
ら６６６位のアミノ酸を含むポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド；（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに
相補的なポリヌクレオチド；および（ｃ）（ａ）または
（ｂ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下
でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなる群から
選択されるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；
ポリヌクレオチドがＤＮＡである、本発明のポリヌクレ
オチド；配列番号：１に記載の２１位から２０１５位の
ヌクレオチドを含む本発明のポリヌクレオチド；本発明
のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター；
本発明のベクターを含む宿主細胞；本発明のベクターに
より宿主細胞を形質転換またはトランスフェクション
し、該宿主細胞から組換えタンパク質を精製する、CDw1
08組換えタンパク質の製造方法；本発明の製造方法によ
り得られる、CDw108組換えタンパク質、に関する。

【０００５】「ストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズするポリヌクレオチド」は、Molecular Cloning :
A Laboratory Manual 第２版第1-3巻 Sambrook,J.ら
著、Clod Spring Harber Laboratory Press出版 New Yo
rk（1989年）などに記載の方法によって製造することが
できる。「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
する」とは、例えば、6×SSC、0.5%SDSおよび50%ホルム
アミドの溶液中で42℃にて加温した後、0.1×SSC、0.5%
SDSの溶液中で68℃にて洗浄する条件でも依然として陽
性のハイブリダイズのシグナルが観察されることを表
す。「ベクター」は、大腸菌ベクターであれば、pUC11
8、pUC119、pBR322、pCR3、pCMVSPORTなどのプラスミド
ベクター、λZAPII、λgt10などのファージベクターが
挙げられる。酵母の場合には、pYES2、pYEUra3などが使
用できる。「宿主細胞」として、大腸菌を使用する場合
には、Escherichia coli K-12系統のHB101株、C600株、
JM109株、DH5α株、DH10B株、XL-1BlueMRF'株、TOP10F
株などが使用可能である。「CDw108組換えタンパク質の
製造方法」としては、まず、CDw108遺伝子を効率よく発
現させるためのプラスミドを作成する。このプラスミド
を作成するためには、宿主内で機能する適切なプロモー
ター（Lac、Tac、Trc、Trp、CMVなど）を有するGST（グ
ルタチオンS−トランスフェラーゼ）融合タンパクベク
ター（pGEX4Tなど）やTag（Myc、HisAなど）配列を有す
る発現ベクター（pCDNA3.1／Myc−Hisなど）にCDw108遺
伝子を含むDNA断片を挿入すればよい。この発現プラス
ミドを適切な宿主（例えば、E.coli BL21株、DH5α株あ
るいはCOS-7細胞など）に導入することにより、効率の
よい発現が可能となる。発現されたCDw108組換えタンパ
ク質は、従来の精製方法に従い、遠心分離、ゲルろ過、
イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティー
クロマトグラフィーなどを適当に組み合わせて精製すれ
ばよい。

【０００６】

【発明の実施の形態】クローン化したCDw108cDNAの1998
bpのオープンリーディングフレームは、46個のシグナル
ペプチドと19個のGPIアンカーモチーフを含む666個のア
ミノ酸からなるタンパク質をコードしていた。CDw108の
膜アンカーフォームは、601個のアミノ酸でグリコシル
化されていないフォームの分子量概算は68-kDaであっ
た。RGD(Arg-Gly-Asp)細胞接着配列及び５カ所のN−グリ
コシレーションサイトが、膜アンカーフォームに存在し
ていた。CDw108cDNAのトランスフェクタントをフローサ
イトメトリーおよび免疫沈降で解析することで、クロー
ン化したcDNAがCDw108の天然型フォームをコードするも
のであることが確認された。CDw108のmRNAは、活性化PB
MC、脾臓、胸腺、精巣、胎盤および脳内で発現していた
が、調べたその他組織では発現していなかった。放射線
ハイブリッドマッピングによると、CDw108遺伝子は、第
15染色体長腕の中間、15q23-24に位置することが示唆さ
れた。

【０００７】

【実施例】実施例１抗CDw108抗体の作成フィトヘマグルチニン（以下、PHAを略す）で活性化し
たヒト末梢血単核細胞（Human peripheral blood monon
uclear cells：以下、PBMCと略す）を用いてBALB/cマウ
スを免疫し、該マウス脾臓細胞をマウスのミエローマ細
胞株NS-1と融合させた。T細胞活性化抗原に特異的なモ
ノクローナル抗体として、KS-2 (IgG2a)および H105 (I
gM)（7）をスクリーニングにより得た。これら２つのモ
ノクローナル抗体は、後にCDw108と命名された同一の分
子を認識する（5、7）。免疫沈降法分析により、還元ま
たは非還元状態で、KS-2/H105の分子量はおよそ80kDaで
あることが示された。

【０００８】実施例２細胞 PBMCは、Ficollconray密度勾配遠心分離法により調製し
た。PBMCは、0.1 % PHA-P (Difco, Detroit, MI)、10 %
FCSを含んだRPMI1640培地で37℃48時間培養した。PHA
はPBMCを活性化するために使用した。白血病細胞株であ
るHPB-ALL（T細胞）、NALM-6（B細胞）および食道癌細
胞TE9（9）は（以上各細胞は、久留米大学先端癌治療研
究センター内において保持）は、10 ％ FCSを含むRPMI1
640培地にて培養した。

【０００９】実施例３免疫沈降解析細胞(1×10⁷)は、文献（10）記載の方法に従い、PBSに
て二度洗浄し、ラクトペルオキシダーゼ触媒によるヨウ
素化により37 MBqのNa¹²⁵I (IMS-30; Amersham, Arling
ton Heights, IL)でラベルした。ヨウ素化の後、細胞を
３度PBSで洗浄し、室温１０分間１ｍｌの溶解緩衝液(50
mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl,1 % triton X-10
0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 10μg/ml aprotinin, 0.02
% NaN₃)で溶解した。その後20分間氷上に置いた。細胞
溶解物は、4℃20分間遠心分離し、さらにホルマリンで
固定したStaphylococcus aureus Cowan I (Melcian, To
kyo, Japan)と一緒に4℃で一晩処置した。溶解物は、5
μlのKS-2モノクローナル抗体腹水液またはコントロー
ルマウス血清と一緒に一晩保温し、その後Protein A-Af
fiGelビーズ(Bio-Rad, Richmond, CA)に結合したウサギ
抗マウスIgGで沈降させた。沈降物は、溶解緩衝液で二
度、0.5 M NaClを含んだ溶解緩衝液で一度、0.5 % deox
ycholateで一度、溶解緩衝液のみで一度洗浄した。免疫
沈降は、SDS-PAGEサンプル緩衝液で可溶化し、還元状態
で7.5 % SDS-PAGEで分析した。ゲルは、固定し、乾燥さ
せ、オートラジオグラフ法で処理した。

【００１０】実施例４ CDw108の単離およびN末端アミノ
酸配列決定 CDw108分子は、先の文献（10）記載の方法に従い、Trit
on-X100可溶化HPB-ALL細胞（10⁹細胞と等価物）よりモ
ノクローナル抗体KS-2で免疫沈降させた後、二次元ゲル
電気泳動法（等電点分画法およびSDS-PAGE）により分離
した。分離後、適当なタンパク質スポットを電気泳動的
にPVDF膜(Bio-Rad, Hercules, CA)に移植し、自動タン
パク質シークエンサー(477A, PE Applied Biosystems,
Foster City, CA)で処理した。

【００１１】実施例５ cDNAのクローニングおよびCDw10
8の配列決定 N末端タンパク質をコードするCDw108遺伝子の部分cDNA
フラグメント（60bp）を、RT-PCR法によりHPB-ALL細胞
で増幅させた。更に、PCR生成物をTAクローニングシス
テム(Invitrogen, Carsbad, CA)を用いてプラスミドベ
クター pCRIIでクローン化した。クローン化したcDNAフ
ラグメントの核酸配列は、自動DNAシークエンサー (AL
Fexpress DNA sequencer, Pharmacia, Uppsala, Swede
n)で決定した。一対のプライマー（K1およびK8）は、60
bpのCDw108cDNAフラグメントを増幅し、cDNAフラグメン
トから推定されるアミノ酸配列は、20個のN末端アミノ
酸配列うち19アミノ酸と一致した。 K 1: 5'-CAYCTGAGRAGCGGAC-3' （配列番号：2） K 8: 5'-ACGRTCYTGCCCSACATG-3' （配列番号：3）増幅した配列と一致する25-merの合成オリゴヌクレオチ
ド（KS-2gt）は、cDNAライブラリーから以下の配列決定
のためにプローブおよびプライマーとして用いた。 KS-2gt: 5'-ATCTTCGCCGTCTGGAAAGGCCATG-3' （配列番号：4） HPB-ALL細胞のcDNAライブラリーにつき、KS-2gtをプロ
ーブまたはプライマーとして用いてGene Trapper^TM cDN
A陽性選択システム (GIBCO-BRL)によりスクリーニング
した。cDNAライブラリーは、cDNA合成およびプラスミド
クローニングのためのSuperScript^TM plasmid sysytem
(GIBCO-BRL)を用いて作成した。cDNAライブラリーは、
オリゴ（dT）Not Iプライマーを用いて準備し、Sal Iア
ダプターにライゲートした。Not Iで切断した後、cDNA
ライブラリーは過剰なアダプターを除くため、サイズを
選択し、一方向にプラスミド発現ベクターpCMVSPORT2.0
(GIBCO-BRL)のNot I/Sal I切断部位にライゲートし
た。

【００１２】実施例６一過性トランスフェクションお
よびフローサイトメトリー TE9細胞 (4×10⁵ 細胞)は、10 % FCSを含むRPMI1640培
地を用いた６ウェルプレートにて18時間前培養した。細
胞は、PBSで二度リンスし、2μgのpCR3-ZH5.11、pCR3-Z
H5.23またはpCR3-ICAM-1および10μlのLipofectoamin
(GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD)で形質転換した。CDw10
8またはCD54 (ICAM-1)の細胞表面発現は、前記の形質転
換後、2日後に確認した。細胞 (2×10⁵)を、FITCが結合
した抗-CDw108 抗体 (KS-2)又は抗CD54抗体 (YH370)と
氷上で30分間染色した。PBSで洗浄の後、細胞をFACScan
(Becton-Dickinson, Mountainview, CA)で分析した。P
I-PLC処理は、細胞を二度PBSで洗浄し、PBS中1 unit/ml
のPI-PLC (EC3.1.4.10, Boehringer Mannheim, Tokyo,
Japan)37℃で1時間保温した。

【００１３】実施例７ CDw108遺伝子の染色体マッピン
グ 1つのイントロンを伴う2つのエクソン上に広がるCDw108
遺伝子のフラグメントは、放射線ハイブリッドクローン
パネルの全ヒトゲノム (Gene Bridge 4 Radiation Hybr
id Panel, Research Genetics, Huntsville, Alabama)
からPCRにより増幅した（11）。PCR増幅は、センスプラ
イマーKS205S (cDNAの344から362位)とアンチセンスプ
ライマーKS357A (494から475位)を用い、変性を94℃で1
時間、アニーリングを56℃で1分間、伸張を72℃で1分
間、35サイクルで行なった。 KS205S; 5'-CACGGTGAATATCGGCTCC-3' （配列番号：5） KS357A; 5'-AGTGCCATTCACCAGGTTCC-3' （配列番号：6） PCR生成物は、ニトロセルロースフィルター上でドット
ブロットし、５４℃、２時間、ハイブリダイゼーション
緩衝液［3 M tetra-methyl ammonium choride(TMAC), 5
0 mM Tris-HCl (8.0pH), 2 mM EDTA, 0.1 % SDS 及び 5
× Denhardt's溶液］中でオリゴヌクレオチドプローブK
S254S (393-409)に特異的な³²P末端ラベル配列とハイブ
リダイズさせた。保温後、フィルターを、58℃でTMAC溶
液（ハイブリダイゼーション緩衝液から、5× Denhard
t's溶液を除いたもの）にて洗浄し、オートラジオグラ
フで処理した。得られた結果は、Whitehead Institute/
MIT Center for Genome Research (http://www-genome.
wi.mit.edu/cigbin/contig/rhmapper.pl)製の放射線ハ
イブリッドマップソフトウェアで分析した。

【００１４】結果および考察１）核酸配列およびCDw108cDNAから推定されるアミノ酸
配列ヒトCDw108cDNAクローンは、白血病性のT細胞株HPB-ALL
から作られたプラスミドライブラリーをN末端ペプチド
をコードするオリゴヌクレオチドプローブ／プライマー
を用いてスクリーニングし同定された。得られた1-kbp
のcDNAフラグメントは、より長いcDNAクローンを得るた
め他のHPB-ALLファージライブラリーおよびヒト胎盤ラ
イブラリーのスクリーニングのためプローブとして使用
した。HPB-ALLライブラリーから得た最長クローンZH5の
cDNA配列は、1998bpのオープンリーディングフレームを
示し、Kozakモチーフ以下に666個のアミノ酸からなるタ
ンパク質をコードしている（図1及び図2）。オープンリ
ーディングフレームは、N末端シグナルペプチドである4
6アミノ酸、601アミノ酸からなる細胞外ドメインおよび
その後のC末端のGPIアンカーモチーフ（13）を含む。こ
のC末端は、3残基(A₆₄₈-S₆₅₀)のクラスターに続く疎水
性の16残基（L₆₅₁-H₆₆₆）から成る。従って、A₆₄₈はオ
メガサイトと呼ばれ、アンカー付加されうる。GPIアン
カーリング酵素を用いた切断後の分子量は68-kDaであっ
た。更に、フィブロネクチンの細胞接着配列として同定
されたRGD（Arg-Gly-Asp）配列（14、15）が、オープン
リーディングフレームの267位から269位に見られた（図
3）。BLASTサーチを用いた相同性解析によると、CDw108
の核酸配列は、他のGPIアンカー型タンパク質をコード
する遺伝子を含む既知のどの遺伝子とも異なっているこ
とが示唆された。JMH同種免疫抗体を用いた先の研究で
は、CDw108にはJMH同種抗体に対して異なった反応性を
有する変異型が存在することが、指摘されていた（1
6）。変異CDw108の分子量は、通常型と同じであり、CDw
108遺伝子の多型の存在が示唆されている（17）。CDw10
8をコードするいくつかのcDNAクローンは、HPB-ALLライ
ブラリーと同様に胎盤cNDAライブラリーから得られた。
これら配列には、変異や多型は見られなかった。変異JM
Hを発現している個々からの変異型CDw108対立遺伝子の
同定は、不可欠である。

【００１５】２）CDw108トランスフェクタントの解析ヒト食道癌細胞株TE9細胞を、CDw108遺伝子の全オープ
ンリーディングフレームを含むcDNAクローンpCR3-ZH5.1
1で一過性に形質転換させた。トランスフェクタント上
のCDw108細胞表面発現は、抗CDw108モノクローナル抗体
KS2を用いたFACScanにより解析した（図4）。トランス
フェクタント上でのCDw108の発現は、他の抗CDw108モノ
クローナル抗体（抗CDw108モノクローナル抗体の標準で
あるH105およびMEM-150）（3、4）によっても検出し
た。一方、アンチセンスCDw108のクローンpCR3-ZH5.23
トランスフェクタントでは、細胞表面にCDw108は発現し
ていなかった（図4）。PI-PLCで処理すると、HPB-ALLお
よびCDw108トランスフェクタント上でのCDw108の発現
は、著しく減少した（図4）。一方、対照試験におい
て、ICAM-1トランスフェクタント上でのI型膜タンパク
質であるCD54（ICAM-1）の発現は、PI-PLC処理により影
響を受けなかった。更に、トランスフェクタントの免疫
沈降分析によりトランスフェクタントでのCDw108の発現
を確認した。８０−ｋＤａのバンドは、ＨＰＢ−ＡＬＬ
の溶解物およびCDw108トランスフェクタントの両方で沈
降したが、親のTE9細胞溶解物からは沈降しなかった。7
0-kDaのバンドは、トランスフェクタントでも認められ
た。この70-kDaバンドは、トランスフェクタント内での
CDw108の過剰発現に起因するCDw108の非クリコシル化フ
ォームである可能性がある。これら全ての結果は、クロ
ーンしたcDNAがCDw108の天然型フォームをコードしたも
のであることを示唆していた。

【００１６】３）CDw108mRNA発現の組織分布 HPB-ALLにおけるCDw108mRNAのノーザンブロット解析に
より、CDw108のmRNAサイズはおよそ3.5-kDaであり、同
じサイズのものは、PHAで活性化されたPBMCで確認され
たが、不活性なPBMCおよびNALM-6では確認されなかっ
た。mRNAのサイズとクローン化されたcDNAのサイズの不
一致は、5'および/または3'末端の非翻訳領域内におけ
るおよそ800-bpの未特定配列の存在によることが示唆さ
れた。正常組織パネル内のCDw108mRNA発現も、ノーザン
ブロティングにより解析した。胎盤、精巣および脾臓内
では、CDw108mRNAの高い発現が確認され、脳および胸腺
では弱い発現が検出された。しかし、前立腺、子宮、小
腸、結腸、心臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および膵臓で
は、発現していなかった。これら組織におけるCDw108の
概算のサイズは、HPB-ALLおよびPHA活性化PBMCのものと
同じであった。これら結果より、CDw108は胸腺のみなら
ず、その他の臓器でも重要な役割を果たしていることが
推定された。

【００１７】４）CDw108遺伝子の染色体マッピング KS205S及びKS357Aを用いたPCR法により、PBMCより単離
されたゲノムDNAの内の449-bpのフラグメントを増幅し
た（図5）。PCR生成物は、GT-AGルール（18）と一致す
る298-bpのイントロンを含んでいた。かすかなバンドで
はあるが同じサイズのPCR生成物は、同一の条件下にて
ハムスターA23細胞由来のゲノムDNAから増幅した。放射
線ハイブリッドパネルからのPCR生成物を、ドットブロ
ットし、その後、オリゴヌクレオチドプローブKS254Sに
特異的な配列とハイブリダイズした。このプローブは、
ヒトHFL細胞由来のゲノムDNAからの生成物とハイブリダ
イズした（図6、最後段の右から3番目のカラム）が、し
かしハムスターA23細胞由来のゲノムDNAからの生成物と
はハイブリダイズしなかった（図6、最後段の右から2番
目のカラム）。放射線ハイブリドマッピングのためのデ
ータベース解析によれば、CDw108遺伝子は、第15染色体
の中間に位置し、WI-6247マーカー遺伝子から5.23 cent
i ray離れている。この部位は、従来の15q23-24に相当
する（図7）。この部位は、高アンドロゲン血症を伴う
多嚢胞性卵巣症候群、Tay-Sachs病、GM-2ガングリオシ
ドーシス、HexA擬欠損症、IIA型グルタル酸尿症及びI型
チロシン血症などのいくつかの代謝疾患関連遺伝子の近
くに存在する（19）。それゆえ、これら疾患の発症ある
いは病因に対するCDw108遺伝子の関与を研究することは
重要になると思われる。

【００１８】以下に、本明細書中に引用した文献名を列
記する。参考文献 1. Mudad,R.,Rao,N.,Angelisova,P.,Horejsi,V.,and Te
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ase of the National Center for Biotechnology Infor
mation. The URL is http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/om
im/

【００２２】

【発明の効果】本発明は、CDw108の生物学的機能並びに
CDw108遺伝子が関与する疾患の解明に有用である。

【００２３】

【配列表】 <110> SHIONOGI & CO.,LTD. <120> A gene encoding CDw108 <130> A005911 <160> 6 <210> 1 <211> 2661 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gctcccgggg ccacggg atg acg cct cct ccg ccc gga cgt gcc gcc ccc agc gca c cg 59 Met Thr Pro Pro Pro Pro Gly Arg Ala Ala Pro Ser Ala P ro 5 10 cgc gcc cgc gtc cct ggc ccg ccg gct cgg ttg ggg ctt ccg ctg cgg 107 Arg Ala Arg Val Pro Gly Pro Pro Ala Arg Leu Gly Leu Pro Leu Arg 15 20 25 30 ctg cgg ctg ctg ctg ctg ctc tgg gcg gcc gcc gcc tcc gcc cag ggc 155 Leu Arg Leu Leu Leu Leu Leu Trp Ala Ala Ala Ala Ser Ala Gln Gly 35 40 45 cac cta agg agc gga ccc cgc atc ttc gcc gtc tgg aaa ggc cat gta 203 His Leu Arg Ser Gly Pro Arg Ile Phe Ala Val Trp Lsy Gly His Val 50 55 60 ggg cag gac cgg gtg gac ttt ggc cag act gag ccg cac acg gtg ctt 251 Gly Gln Asp Arg Val Asp Phe Gly Gln Thr Glu Pro His Thr Val Leu 65 70 75 ttc cac gag cca ggc agc tcc tct gtg tgg gtg gga gga cgt ggc aag 299 Phe His Glu Pro Gly Ser Ser Ser Val Trp Val Gly Gly Arg Gly Lys 80 85 90 gtc tac ctc ttt gac ttc ccc gag ggc aag aac gca tct gtg cgc acg 347 Val Tyr Leu Phe Asp Phe Pro Glu Gly Lys Asn Ala Ser Val Arg Thr 95 100 105 110 gtg aat atc ggc tcc aca aag ggg tcc tgt ctg gat aag cgg gac tgc 395 Val Asn Ile Gly Ser Thr Lys Gly Ser Cys Leu Asp Lys Arg Asp Cys 115 120 125 gag aac tac atc act ctc ctg gag agg cgg agt gag ggg ctg ctg gcc 443 Glu Asn Tyr Ile Thr Leu Leu Glu Arg Arg Ser Glu Gly Leu Leu Ala 130 135 140 tgt ggc acc aac gcc cgg cac ccc agc tgc tgg aac ctg gtg aat ggc 491 Cys Gly Thr Asn Ala Arg His Pro Ser Cys Trp Asn Leu Val Asn Gly 145 150 155 act gtg gtg cca ctt ggc gag atg aga ggc tac gcc ccc ttc agc ccg 538 Thr Val Val Pro Leu Gly Glu Met Arg Gly Tyr Ala Pro Phe Ser Pro 160 165 170 gac gag aac tcc ctg gtt ctg ttt gaa ggg gac gag gtg tat tcc acc 587 Asp Glu Asn Ser Leu Val Leu Phe Glu Gly Asp Glu Val Tyr Ser Thr 175 180 185 190 atc cgg aag cag gaa tac aat ggg aag atc cct cgg ttc cgc cgc atc 635 Ile Arg Lys Gln Glu Tyr Asn Gly Lys Ile Pro Arg Phe Arg Arg Ile 195 200 205 cgg ggc gag agt gag ctg tac acc agt gat act gtc atg cag aac cca 683 Arg Gly Glu Ser Glu Leu Tyr Thr Ser Asp Thr Val Met Gln Asn Pro 210 215 220 cag ttc atc aaa gcc acc atc gtg cac caa gac cag gct tac gat gac 731 Gln Phe Ile Lys Ala Thr Ile Val His Gln Asp Gln Ala Tyr Asp Asp 225 230 235 aag atc tac tac ttc ttc cga gag gac aat cct gac aag aat cct gag 779 Lys Ile Tyr Tyr Phe Phe Arg Glu Asp Asn Pro Asp Lys Asn Pro Glu 240 245 250 gct cct ctc aat gtg tcc cgt gtg gcc cag ttg tgc agg ggg gac cag 827 Ala Pro Leu Asn Val Ser Arg Val Ala Gln Leu Cys Arg Gly Asp Gln 255 260 265 270 ggt ggg gaa agt tca ctg tca gtc tcc aag tgg aac act ttt ctg aaa 875 Gly Gly Glu Ser Ser Leu Ser Val Ser Lys Trp Asn Thr Phe Leu Lys 275 280 285 gcc atg ctg gta tgc agt gat gct gcc acc aac aag aac ttc aac agg 923 Ala Met Leu Val Cys Ser Asp Ala Ala Thr Asn Lys Asn Phe Asn Arg 290 295 300 ctg caa gac gtc ttc ctg ctc cct gac ccc agc ggc cag tgg agg gac 971 Leu Gln Asp Val Phe Leu Leu Pro Asp Pro Ser Gly Gln Trp Arg Asp 305 310 315 acc agg gtc tat ggt gtt ttc tcc aac ccc tgg aac tac tca gcc gtc 1019 Thr Arg Val Tyr Gly Val Phe Ser Asn Pro Trp Asn Tyr Ser Ala Val 320 325 330 tgt gtg tat tcc ctc ggt gac att gac aag gtc ttc cgt acc tcc tca 1067 Cys Val Tyr Ser Leu Gly Asp Ile Asp Lys Val Phe Arg Thr Ser Ser 335 340 345 350 ctc aag ggc tac cac tca agc ctt ccc aac ccg cgg cct ggc aag tgc 1115 Leu Lys Gly Tyr His Ser Ser Leu Pro Asn Pro Arg Pro Gly Lys Cys 355 360 365 ctc cca gac cag cag ccg ata ccc aca gag acc ttc cag gtg gct gac 1163 Leu Pro Asp Gln Gln Pro Ile Pro Thr Glu Thr Phe Gln Val Ala Asp 370 375 380 cgt cac cca gag gtg gcg cag agg gtg gag ccc atg ggg cct ctg aag 1211 Arg His Pro Glu Val Ala Gln Arg Val Glu Pro Met Gly Pro Leu Lys 385 390 395 acg cca ttg ttc cac tct aaa tac cac tac cag aaa gtg gcc gtc cac 1259 Thr Pro Leu Phe His Ser Lys Tyr His Tyr Gln Lys Val Ala Val His 400 405 410 cgc atg caa gcc agc cac ggg gag acc ttt cat gtg ctt tac cta act 1307 Arg Met Gln Ala Ser His Gly Glu Thr Phe His Val Leu Tyr Leu Thr 415 420 425 430 aca gac agg ggc act atc cac aag gtg gtg gaa ccg ggg gag cag gag 1355 Thr Asp Arg Gly Thr Ile His Lys Val Val Glu Pro Gly Glu Gln Glu 435 440 445 cac agc ttc gcc ttc aac atc atg gag atc cag ccc ttc cgc cgc gcg 1403 His Ser Phe Ala Phe Asn Ile Met Glu Ile Gln Pro Phe Arg Arg Ala 450 455 460 gct gcc atc cag acc atg tcg ctg gat gct gag cgg agg aag ctg tat 1451 Ala Ala Ile Gln Thr Met Ser Leu Asp Ala Glu Arg Arg Lys Leu Tyr 465 470 475 gtg agc tcc cag tgg gag gtg agc cag gtg ccc ctg gac ctg tgt gag 1499 Val Ser Ser Gln Trp Glu Val Ser Gln Val Pro Leu Asp Leu Cys Glu 480 485 490 gtc tat ggc ggg ggc tgc cac ggt tgc ctc atg tcc cga gac ccc tac 1547 Val Tyr Gly Gly Gly Cys His Gly Cys Leu Met Ser Arg Asp Pro Tyr 495 500 505 510 tgc ggc tgg gac caa ggc cgc tgc atc tcc atc tac agc tcc gaa cgg 1595 Cys Gly Trp Asp Gln Gly Arg Cys Ile Ser Ile Tyr Ser Ser Glu Arg 515 520 525 tca gtg ctg caa tcc att aat cca gcc gag cca cac aag gag tgt ccc 1643 Ser Val Leu Gln Ser Ile Asn Pro Ala Glu Pro His Lys Glu Cys Pro 530 535 540 aac ccc aaa cca gac aag gcc cca ctg cag aag gtt tcc ctg gcc cca 1691 Asn Pro Lys Pro Asp Lys Ala Pro Leu Gln Lys Val Ser Leu Ala Pro 545 550 555 aac tct cgc tac tac ctg agc tgc ccc atg gaa tcc cgc cac gcc acc 1739 Asn Ser Arg Tyr Tyr Leu Ser Cys Pro Met Glu Ser Arg His Ala Thr 560 565 570 tac tca tgg cgc cac aag gag aac gtg gag cag agc tgc gaa cct ggt 1787 Tyr Ser Trp Arg His Lys Glu Asn Val Glu Gln Ser Cys Glu Pro Gly 575 580 585 590 cac cag agc ccc aac tgc atc ctg ttc atc gag aac ctc acg gcg cag 1835 His Gln Ser Pro Asn Cys Ile Leu Phe Ile Glu Asn Leu Thr Ala Gln 595 600 605 cag tac ggc cac tac ttc tgc gag gcc cag gag ggc tcc tac ttc cgc 1883 Gln Tyr Gly His Tyr Phe Cys Glu Ala Gln Glu Gly Ser Tyr Phe Arg 610 615 620 gag gct cag cac tgg cag ctg ctg ccc gag gac ggc atc atg gcc gag 1931 Glu Ala Gln His Trp Gln Leu Leu Pro Glu Asp Gly Ile Met Ala Glu 625 630 635 cac ctg ctg ggt cat gcc tgt gcc ctg gcc gcc tcc ctc tgg ctg ggg 1979 His Leu Leu Gly His Ala Cys Ala Leu Ala Ala Ser Leu Trp Leu Gly 640 645 650 gtg ctg ccc aca ctc act ctt ggc ttg ctg gtc cac 2015 Val Leu Pro Thr Leu Thr Leu Gly Leu Leu Val His 655 660 665 taggg cctcccgagg ctgggcatgc ctcaggcttc 2050 tgcagcccag ggcactagaa cgtctcacac tcagagccgg ctggcccggg 2100 agctccttgc ctgccacttc ttccagggga cagaataacc cagtggagga 2150 tgccaggcct ggagacgtcc agccgcaggc ggctgctggg ccccaggtgc 2200 gcacggatgg tgaggggctg agaatgaggg caccgactgt gaagctgggg 2250 catcgatgac ccaagacttt atcttctgga aaatattttt cagactccct 2300 caaacttgac taaatgcagc gatgctccca gcccaagagc ccatgggtcg 2350 gggagtgggt ttggatagga gagctgggac tccatctcga ccctggggct 2400 gaggcctgag tccttctgga ctcttggtac ccacattgcc tccttcccct 2450 ccctctctca tggctgggtg gctggtgttc ctgaagaccc agggctaccc 2500 tctgtccagc cctgtcctct gcagctccct ctctggtcct gggtcccaca 2550 ggacagccgc cttgcatgtt tattgaagga tgtttgcttt ccggacggaa 2600 ggacggaaaa agctctattt ttatgttagg cttatttcat gtatagctac 2650 ttccgactgc c 2661 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 cayctgagra cggac 15 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 acgrtcytgc csacatg 17 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 atcttcgccg tctggaaagg ccatg 25 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 cacggtgaat atcggctcc 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 agtgccattc accaggttcc 20

【図面の簡単な説明】

【図１】CDw108cDNAの核酸配列および推定されるアミノ
酸配列を示す図である。H₄₇位からR₆₆位のN末端20-mer
ペプチドおよびA₆₄₈位からH₆₆₆位のPGIアンカーモチー
フに、下線を付した。また、推定上のN結合グリコシル
化部位およびRGD細胞接着配列にも下線を付した。

【図２】図１に続く、CDw108cDNAの核酸配列および推定
されるアミノ酸配列を示す図である。

【図３】CDw108の分子構造を示す図である。番号はアミ
ノ酸残基を示す。黒丸印は、推定上のN結合グリコシル
化部位を表す。

【図４】CDw108トランスフェクタントのFACScan解析の
結果を示す図である。TE-9細胞は、一時的にCDw108cDNA
（TE-9/ZH5.11）またはコントロールアンチセンス配列
（TE-9/ZH5.23）でトランスフェクトした。PI-PLCで処
理または未処理のHPB-ALL細胞およびトランスフェクタ
ントは、FITCを結合した抗CDw108モノクローナル抗体で
染色し、FACScanで解析した。

【図５】CDw108遺伝子の染色体マッピングを示す図であ
る。PBMCからのゲノムDNAを、KS205SプライマーおよびK
S357Aプライマーを用いてPCRにより増幅した結果であ
る。増幅された459-bpのフラグメントは、298-bpのイン
トロンを含んでいた。

【図６】同一のフラグメントを、Gene Bridge-4 Radiat
ion hybridパネルから増幅し、SSOP KS254Sでハイブリ
ダイズした後、ニトロセルロースフィルター上でドット
ブロットした。

【図７】CDw108遺伝子の染色体上での所在部位を示した
ものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）Ｃ１２Ｒ 1:91）Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:91）Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｒ 1:91）Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA20 BA80 CA04 CA09 CA20 DA03 EA04 GA13 GA18 HA13 HA14 4B064 AG01 CA10 CA19 CC01 CC24 DA01 DA13 4B065 AA93X AA93Y AA94Y AB01 AC14 AC16 BA05 BB01 BC01 BD50 CA24 CA44 CA46 4H045 AA10 AA20 BA10 BA53 BA55 CA41 CA42 DA50 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）配列番号：１に記載の４７位から６
４７位のアミノ酸を含むポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド；（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレ
オチド；および（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドとストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオ
チドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む
ポリヌクレオチド。
【請求項２】ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項
１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】配列番号：１に記載の１５６位から１９５
８位のヌクレオチドを含む請求項２記載のポリヌクレオ
チド。
【請求項４】請求項１から３のいずれかに記載のポリヌ
クレオチドを含むベクター。
【請求項５】請求項４記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項６】請求項４記載のベクターにより宿主細胞を
形質転換し、該宿主細胞から組換えタンパク質を精製す
る、CDw108組換えタンパク質の製造方法。
【請求項７】請求項６記載の製造方法により得られる、
CDw108組換えタンパク質。