PL219018B1 - Kompozycja farmaceutyczna, czynnik do zastosowania w sposobie diagnozowania choroby nowotworowej, czynnik do zastosowania w sposobie oznaczania regresji, przebiegu lub początku choroby nowotworowej, cytolityczne lub wydzielające cytokinę komórki T, kwas nukleinowy, komórka gospodarza, białko lub polipeptyd, przeciwciało, produkt sprzęgania przeciwciała i zestaw do wykrywania ekspresji antygenu - Google Patents
Kompozycja farmaceutyczna, czynnik do zastosowania w sposobie diagnozowania choroby nowotworowej, czynnik do zastosowania w sposobie oznaczania regresji, przebiegu lub początku choroby nowotworowej, cytolityczne lub wydzielające cytokinę komórki T, kwas nukleinowy, komórka gospodarza, białko lub polipeptyd, przeciwciało, produkt sprzęgania przeciwciała i zestaw do wykrywania ekspresji antygenuInfo
- Publication number
- PL219018B1 PL219018B1 PL377240A PL37724003A PL219018B1 PL 219018 B1 PL219018 B1 PL 219018B1 PL 377240 A PL377240 A PL 377240A PL 37724003 A PL37724003 A PL 37724003A PL 219018 B1 PL219018 B1 PL 219018B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- nucleic acid
- tumor
- associated antigen
- antibody
- cells
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3023—Lung
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3046—Stomach, Intestines
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
- G01N33/5017—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity for testing neoplastic activity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
- C12N2503/02—Drug screening
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna, czynnik do zastosowania w sposobie diagnozowania choroby nowotworowej, czynnik do zastosowania w sposobie oznaczania regresji, przebiegu lub początku choroby nowotworowej, cytolityczne lub wydzielające cytokinę komórki T, kwas nukleinowy, komórka gospodarza, białko lub polipeptyd, przeciwciało, produkt sprzęgania przeciwciała i zestaw do wykrywania ekspresji antygenu.
Mimo interdyscyplinarnego podejścia i obszernego stosowania klasycznych procedur leczniczych, nowotwory nadal należą do głównych przyczyn śmierci. Ostatnio koncepcje terapeutyczne zmierzają w kierunku włączania układu immunologicznego pacjenta do ogólnej koncepcji terapeutycznej, przez zastosowanie rekombinowanych szczepionek nowotworu oraz innych szczególnych środków, takich jak terapia przeciwciałami. Warunkiem wstępnym do osiągnięcia sukcesu przy stosowaniu takiej strategii jest rozpoznanie przez układ immunologiczny pacjenta, którego funkcje efektorowe mają być interwencyjnie polepszane, specyficznych dla nowotworu lub związanych z nowotworem antygenów lub epitopów. Biologicznie, komórki nowotworowe różnią się zasadniczo od niezłośliwych komórek, od których pochodzą. Te różnice są spowodowane zmianami genetycznymi nabywanymi w czasie rozwoju guza i skutkują, między innymi, tworzeniem się w komórkach nowotworowych także jakościowo i ilościowo zmienionych struktur molekularnych. Tego rodzaju związane z nowotworem struktury, które rozpoznawane są przez specyficzny układ immunologiczny gospodarza posiadającego nowotwór, są określane, jako związane z nowotworem antygeny. Specyficzne rozpoznawanie związanych z nowotworem antygenów obejmuje mechanizmy komórkowe i humoralne, które są dwiema funkcjonalnie połączonymi jednostkami: limfocyty T CD4 i CD8 rozpoznają przetworzone antygeny prezentowane na cząsteczkach MHC (główny kompleks zgodności tkankowej) odpowiednio klasy II i I, podczas gdy limfocyty B wytwarzają krążące cząsteczki przeciwciała, które bezpośrednio wiążą się do nieprzetworzonych antygenów. Potencjalnie kliniczne znaczenie lecznicze antygenów związanych z nowotworem wynika z faktu, że rozpoznawanie antygenów na komórkach nowotworowych przez układ immunologiczny prowadzi do zainicjowania cytotoksycznych mechanizmów efektorowych i w obecności komórek pomocniczych T może powodować eliminację komórek rakowych (Pardoll, Nat. Med. 4: 525-31, 1998). Zgodnie z tym, głównym celem immunologii nowotworowej jest molekularne zdefiniowanie tych struktur. Molekularna natura tych antygenów pozostawała zagadkowa od długiego czasu. Dopiero po odkryciu odpowiednich technik klonowania stało się możliwe systematyczne przeglądanie bibliotek ekspresji cDNA nowotworów, ze względu na związane z nowotworem antygeny, poprzez analizowanie struktur docelowych cytotoksycznych limfocytów (CTL) (van der Bruggen i wsp., Science 254: 1643-7, 1991) lub przy użyciu, jako sond, krążących przeciwciał (Sahin i wsp., Curr Opin. Immunol. 9: 709-16, 1997). Dotychczas, biblioteki ekspresji cDNA otrzymywano ze świeżej tkanki nowotworu i w odpowiednich układach zachodziła rekombinacyjna ekspresja białek. W celu klonowania odpowiednich antygenów, używano izolowanych od pacjentów immunoefektorów, mianowicie klonów CTL ze specyficznymi dla nowotworu wzorcami lizy lub krążących autoprzeciwciał.
W ostatnich latach, przy użyciu tych metod, określono wielorakie antygeny w różnych nowotworach. Jednakże sondy używane do identyfikacji antygenów w klasycznych metodach zilustrowanych powyżej, są immunoefektorami (krążące autoprzeciwciała lub klony CTL) od pacjentów mających zazwyczaj zaawansowanego raka. Wiele danych wskazuje, że nowotwory mogą prowadzić do rozwoju tolerancji i nie reagowania (stan anergiczny) komórek T oraz że w przebiegu choroby szczególnie tamte specyficzności, które mogą powodować efektywne immunologiczne rozpoznawanie są tracone z immunoefektorowego repertuaru. Aktualne badania pacjentów nie dostarczyły jeszcze mocnych dowodów rzeczywistego działania poprzednio znalezionych i używanych, związanych z nowotworem antygenów. W związku z tym, nie można wykluczyć, że białka wywołujące spontaniczną odpowiedź immunologiczną są źle wybranymi strukturami docelowymi.
Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie docelowych struktur do diagnozy i terapii raka.
Zgodnie z wynalazkiem, poszukiwano strategii identyfikacji i dostarczania antygenów, których ekspresja zachodzi w powiązaniu z nowotworem oraz kodujących je kwasów nukleinowych. Strategia ta oparta jest na fakcie, że poszczególne geny, których ekspresja zachodzi w sposób specyficzny dla narządu, np. wyłącznie w tkance okrężnicy, płuc lub nerek, są reaktywowane w komórkach nowotworowych innych tkanek w ektopowy i zabroniony sposób. Najpierw, zastosowanie metod eksploracji danych (ang. data mining) daje tak kompletną jak to możliwe listę wszystkich znanych, narządospecyficznych genów. Są one następnie oceniane ze względu na odchylenia od normy w ich aktywacji
PL 219 018 B1 w różnych nowotworach, poprzez analizę ekspresji przy użyciu specyficznego RT-PCR. Eksploracja danych jest znaną metodą identyfikowania związanych z nowotworem genów. Jednak w konwencjonalnych strategiach transkryptomy bibliotek normalnych tkanek są zwykle elektronicznie wybierane z bibliotek tkanek nowotworowych przy założeniu, że pozostające geny są specyficzne dla nowotworów (Schmitt i wsp., Nucleic Acids Res. 28: 4251-60, 1999; Vasmatzis i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95: 300-4, 1998; Scheurle i wsp., Cancer Res. 60: 4037-43, 2000).
Koncepcja wynalazku, która okazała się znacznie bardziej satysfakcjonująca, jest oparta jednakże na wykorzystaniu eksploracji danych do elektronicznej ekstrakcji wszystkich narządowo specyficznych genów i późniejszej ocenie tych genów ze względu na ekspresję w nowotworach.
Tak więc, niniejszy wynalazek opiera się na strategii identyfikowania genów specyficznych tkankowo, ulegających ekspresji w zróżnicowany sposób w nowotworach. Ta strategia łączy eksplorację danych publicznych bibliotek sekwencji („in siico”) z następującymi po tym oceniającymi badaniami laboratoryjno-doświadczalnymi („wet bench”).
Tak jak ujawnia to opis wynalazku, łączoną strategię oparto na dwóch różnych bioinformatycznych skryptach pozwalających identyfikować nowe geny nowotworowe. Były one poprzednio sklasyfikowane, jako narządowo słabo specyficzne. Odkrycie, że te geny są nieprawidłowo aktywowane w komórkach nowotworowych pozwala, żeby wyznaczyć im istotnie nową jakość z funkcjonalnymi następstwami. Zgodnie z wynalazkiem, te związane z nowotworem geny i kodowane genetyczne produkty były identyfikowane i dostarczane niezależnie od immunogenicznego działania.
Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna, która zawiera jeden lub więcej składników wybranych z grupy składającej się z:
(i) związanego z nowotworem antygenu lub jego części, (ii) kwasu nukleinowego, który koduje związany z nowotworem antygen lub jego część, (iii) przeciwciała, które wiąże się do związanego z nowotworem antygenu, (iv) komórki gospodarza, z ekspresją związanego z nowotworem antygenu lub jego części i (v) izolowanych kompleksów pomiędzy związanym z nowotworem antygenem lub jego częścią i cząsteczką HLA, przy czym wspomniana część zawiera co najmniej 6 przylegających do siebie aminokwasów antygenu związanego z nowotworem, przy czym wspominany związany z nowotworem antygen posiada sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z:
(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybrana z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 41-44, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w rygorystycznych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b) i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c).
Korzystnie, w kompozycji według wynalazku kwas nukleinowy kodujący związany z nowotworem antygen lub jego część jest obecny w wektorze ekspresyjnym, a bardziej korzystnie może być funkcjonalnie połączony z promotorem.
Według wynalazku kompozycja farmaceutyczna zwierająca komórkę gospodarza, korzystnie wydziela związany z nowotworem antygen lub jego część.
Ponadto, również korzystnie, w komórce gospodarza zachodzi ekspresja cząsteczki HLA, która wiąże się do związanego z nowotworem antygenu lub jego części. Ekspresja cząsteczki HLA i/lub związanego z nowotworem antygenu lub jego części korzystnie zachodzi metodą rekombinacji oraz również korzystnie ekspresja cząsteczki HLA może zachodzić endogennie w komórce gospodarza.
W kolejnym korzystnym aspekcie wynalazku komórka gospodarza jest komórką prezentującą antygen, bardziej korzystnie jest komórką dendrytyczną lub makrofagiem.
W kolejnym korzystnym rozwiązaniu kompozycji według wynalazku komórka gospodarza jest komórką nie proliferacyjną.
Zgodnie z wynalazkiem kompozycja farmaceutyczna charakteryzuje się tym, że przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym, ewentualnie przeciwciałem chimerycznym lub humanizowanym, lub też przeciwciało jest fragmentem przeciwciała naturalnego. Przeciwciało korzystnie jest sprzężone z czynnikiem terapeutycznym lub diagnostycznym.
W kolejnym korzystnym rozwiązaniu kompozycja farmaceutyczna według wynalazku charakteryzuje się tym, że związany z nowotworem antygen lub jego część dostarczana przez wspomnianą kompozycję farmaceutyczną wiąże się do cząsteczek MHC na powierzchni komórek, w których za4
PL 219 018 B1 chodzi ekspresja nieprawidłowej ilości tego związanego z nowotworem antygenu lub jego części, przy czym wiązanie powoduje cytolityczną reakcję i/lub indukuje uwalnianie cytokin.
W korzystnej postaci wykonania kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera ponadto farmaceutycznie akceptowalny nośnik i/lub adiuwant.
W bardziej korzystnym wykonaniu adiuwantem tym jest saponina, GM-CSF, CpG, cytokina lub chemokina.
Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku jest do stosowania w leczeniu choroby nowotworowej charakteryzującej się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją związanego z nowotworem antygenu, przy czym chorobą ta jest nowotwór płuc, nowotwór piersi, nowotwór prostaty, czerniak, nowotwór okrężnicy, przerzuty nowotworu okrężnicy, rak komórek nerki, lub rak szyjki macicy, rak okrężnicy lub rak gruczołu piersiowego.
W korzystnej postaci wykonania kompozycja farmaceutyczna według wynalazku charakteryzuje się tym, że związany z nowotworem antygen zawiera sekwencję aminokwasów składającą się z grupy złożonej z SEQ ID Nr: 45-48, 123 i 124.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest czynnik do zastosowania w sposobie diagnozowania choroby nowotworowej charakteryzującej się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją związanego z nowotworem antygenu, który to sposób obejmuje takie etapy, że:
(i) wykrywa się kwas nukleinowy, który koduje związany z nowotworem antygen i/lub (ii) wykrywa się związany z nowotworem antygen, i/lub (iii) wykrywa się przeciwciało dla tego związanego z nowotworem antygenu, i/lub (iv) wykrywa się cytotoksyczne lub pomocnicze limfocyty T specyficzne dla związanego z nowotworem antygenu lub jego części zawierającej 6 przylegających aminokwasów związanego z nowotworem antygenu, w próbce biologicznej izolowanej od pacjenta ze wspomnianym związanym z nowotworem antygenem mającym sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z:
(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybrana z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 41-44, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w rygorystycznych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b) i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c), w którym wykrywanie obejmuje:
(I) kontaktowanie biologicznej próbki z czynnikiem, który wiąże się specyficznie z kwasem nukleinowym kodującym związany z nowotworem antygen, z związanym z nowotworem antygenem, z przeciwciałem lub z cytotoksycznymi lub pomocniczymi limfocytami T i (II) wykrywanie tworzenia się kompleksu między tym czynnikiem i kwasem nukleinowym, związanym z nowotworem antygenem, przeciwciałem lub cytotoksycznymi lub pomocniczymi limfocytami T, i w którym wykrywanie jest przyrównywane do wykrywania w porównywalnej prawidłowej biologicznej próbce, przy czym czynnik do wykrywania kwasu nukleinowego jest sondą polinukleotydową, która hybrydyzuje specyficznie z wspomnianym kwasem nukleinowym lub jest primerem do selektywnego powielania wspomnianego kwasu nukleinowego, przy czym czynnik do wykrywania związanego z nowotworem antygenu jest przeciwciałem wiążącym się specyficznie do tego związanego z nowotworem antygenu, przy czym czynnik do wykrywania przeciwciała jest białkiem lub peptydem wiążącym się specyficznie do wspomnianego przeciwciała, i przy czym czynnik do wykrywania cytotoksycznych lub pomocniczych limfocytów T jest komórką prezentującą kompleks pomiędzy związanym z przeciwciałem antygenem lub jego częścią i cząsteczka MHC.
W korzystnym aspekcie wynalazku sonda polinukleotydowa, przeciwciało, białko lub peptyd, lub komórka są znakowane w sposób pozwalający na wykrycie. W bardziej korzystnym wykonaniu wynalazku ten pozwalający na wykrycie wskaźnik jest wskaźnikiem radioaktywnym lub enzymatycznym.
Zgodnie z wynalazkiem próbka w której dokonuje się pomiaru zawiera płyn ustrojowy lub tkankę.
W następnym korzystnym aspekcie wynalazku białko, polipeptyd lub związany z nowotworem antygen zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 45-48, 123 i 124.
W kolejnym korzystnym aspekcie wynalazku przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym, chimerycznym lub humanizowanym lub fragmentem przeciwciała.
PL 219 018 B1
Przedmiotem wynalazku jest również czynnik do zastosowania w sposobie oznaczania regresji, przebiegu lub początku choroby nowotworowej charakteryzującej się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją związanego z nowotworem antygenu, który to sposób obejmuje monitorowanie próbki od pacjenta, który ma tę chorobę lub jest podejrzenie zachorowania na tę chorobę, ze względu na jeden lub więcej parametrów wybranych z grupy składającej się z:
(i) ilości kwasu nukleinowego, który koduje związany z nowotworem antygen, (ii) ilości związanego z nowotworem antygenu, (iii) ilości przeciwciał, które wiążą się do związanego z nowotworem antygenu i (iv) ilości cytolitycznych lub uwalniających cytokiny komórek T, które są specyficzne dla kompleksu pomiędzy związanym z nowotworem antygenem lub jego częścią zawierającą co najmniej 6 przylegających aminokwasów związanego z nowotworem antygenu i cząsteczki MHC, przy czym ten związany z nowotworem antygen ma sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy, który jest wybrany z grupy składającej się z:
(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 41-44, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w rygorystycznych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b) i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c), który obejmuje oznaczanie parametru(ów) w pierwszej próbce, w pierwszym punkcie czasowym i w kolejnej próbce w drugim punkcie czasowym, i w którym przebieg choroby jest oznaczany przez porównanie dwóch próbek, przy czym czynnik do oznaczania ilości kwasu nukleinowego jest sondą polinukleotydową, która hybrydyzuje specyficznie z tym kwasem nukleinowym lub jest primerem do selektywnej amplifikacji tego kwasu nukleinowego, przy czym czynnik do oznaczania ilości związanego z nowotworem antygenu jest przeciwciałem wiążącym się specyficznie do tego związanego z nowotworem antygenu, przy czym czynnik do oznaczania ilości przeciwciał jest białkiem lub peptydem wiążącym się specyficznie do przeciwciała i przy czym czynnik do oznaczania ilości cytolitycznych lub uwalniających cytokiny komórek T jest komórką prezentującą kompleks pomiędzy związanym z nowotworem antygenem i cząsteczką MHC.
W czynniku według wynalazku sonda polinukleotydowa, przeciwciało, białko lub peptyd, lub komórka są znakowane w sposób pozwalający na wykrycie, przy czym korzystnie wskaźnik pozwalający na wykrycie jest wskaźnikiem radioaktywnym lub enzymatycznym.
Próbka w której dokonuje się pomiaru zawiera płyn ustrojowy i/lub tkankę.
Zgodnie z wynalazkiem białko, polipeptyd lub związany z nowotworem antygen korzystnie zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 45-48, 123 i 124. Również korzystnie, przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym, chimerycznym lub humanizowanym, lub fragmentem przeciwciała.
Wynalazek dotyczy również cytolitycznych lub wydzielających cytokinę komórek T do zastosowania w sposobie leczenia pacjenta mającego chorobę nowotworową charakteryzującą się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją związanego z nowotworem antygenu, przy czym te cytolityczne lub wydzielające cytokinę komórki T otrzymuje się sposobem obejmującym etapy takie że:
(i) pobiera się próbkę zawierającą immunoreaktywne komórki od pacjenta i (ii) kontaktuje się tę próbkę z komórką gospodarza z ekspresją tego związanego z nowotworem antygenu lub jego częścią w warunkach które sprzyjają wytwarzaniu cytolitycznych lub uwalniających cytokiny komórek T, skierowanych przeciw temu związanemu z nowotworem antygenowi lub jego części i przy czym wspomniany sposób leczenia obejmuje takie etapy, że: wprowadza się cytolityczne lub wydzielające cytokiny komórki T pacjentowi w ilości odpowiedniej do przeprowadzenia lizy komórek, w których zachodzi ekspresja związanego z nowotworem antygenu lub jego częścią przy czym wspomniana część zawiera co najmniej 6 przylegających aminokwasów tego związanego z nowotworem antygenu, mającego sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z:
(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 41-44, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w rygorystycznych warunkach,
PL 219 018 B1 (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b) i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c).
W korzystnym wykonaniu wynalazku w komórce gospodarza wytwarzana jest rekombinacyjnie cząsteczka HLA wiążąca się do związanego z nowotworem antygenu.
Ponadto, zgodnie z wynalazkiem dotyczącym cytolitycznych lub wydzielających cytokinę komórek T, w komórce gospodarza endogennie zachodzi ekspresja cząsteczki HLA wiążącej się do związanego z nowotworem antygenu lub do jego części zawierającej co najmniej 6 przylegających aminokwasów związanego z nowotworem antygenu. W bardziej korzystnym rozwiązaniu te komórki gospodarza są nie proliferacyjne.
Przedmiotem wynalazku jest również kwas nukleinowy, wybrany z grupy składającej się z:
(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 41-44 lub jego część, lub pochodną, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w rygorystycznych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b) i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c).
Korzystnie, kwas nukleinowy według wynalazku koduje białko lub polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 45-48, 123 i 124.
Przedmiotem wynalazku jest również komórka gospodarza, która zwiera kwas nukleinowy, jak zdefiniowano powyżej.
Komórka gospodarza korzystnie zawiera ponadto kwas nukleinowy kodujący cząsteczkę HLA.
Przedmiotem wynalazku jest również białko lub polipeptyd kodowane przez kwas nukleinowy, jak zdefiniowano powyżej.
Przedmiotem wynalazku jest również białko lub polipeptyd, który zawiera sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z SEQ 45-48, 123 i 124.
Przedmiotem wynalazku jest również przeciwciało, które wiąże się specyficznie do białka lub polipeptydu, przy czym białko to lub polipeptyd są kodowane przez kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z:
(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 41-44, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w rygorystycznych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b) i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c).
Przeciwciało według wynalazku, korzystnie wiąże się do białka, polipeptydu związanego z nowotworem antygenu zawierających sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 45-48, 123 i 124.
Korzystnie, przeciwciało według wynalazku jest przeciwciałem monoklonalnym, chimerycznym lub humanizowanym lub fragmentem przeciwciała.
Korzystnie, wspomniane przeciwciało sprzężone jest z czynnikiem terapeutycznym lub diagnostycznym do zastosowanie w sposobie leczenia, diagnozowania lub monitorowania choroby nowotworowej charakteryzującej się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją związanego z nowotworem antygenu, który to sposób obejmuje podawanie tego przeciwciała pacjentowi, przy czym ten wspomniany związany z nowotworem antygen ma sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy wybraną z grupy składającej się z:
(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego składającą się z sekwencji SEQ ID Nr: 41-44, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w rygorystycznych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b) i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c).
Przedmiotem wynalazku jest także produkt sprzęgania przeciwciała jak zdefiniowano powyżej z czynnikiem terapeutycznym lub diagnostycznym. Korzystnie, wspomniany czynnik terapeutyczny lub diagnostyczny jest toksyną.
Przedmiotem wynalazku jest także zestaw do wykrywania ekspresji lub nieprawidłowej ekspresji związanego z nowotworem antygenu, charakteryzujący się tym, że zestaw zawiera czynniki do detekcji:
PL 219 018 B1 (i) kwasu nukleinowego kodującego ten związany z nowotworem antygen, (ii) związanego z nowotworem antygenu, (iii) przeciwciał, które wiążą się do związanego z nowotworem antygenu i/lub (iv) komórek T, które są specyficzne dla kompleksu związanego z nowotworem antygenu lub części i cząsteczki MHC, przy czym wspomniana część zawiera co najmniej 6 przylegających aminokwasów związanego z nowotworem antygenu, przy czym wspomniany związany z nowotworem antygen posiada sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z:
(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 41-44, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w rygorystycznych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b) i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c), przy czym czynnik do wykrywania kwasu nukleinowego jest sondą polinukleotydową, która hybrydyzuje specyficznie ze wspomnianym kwasem nukleotydowym lub jest primerem do selektywnej amplifikacji kwasu nukleinowego, przy czym czynnik do wykrywania związanego z nowotworem antygenu jest przeciwciałem specyficznie wiążącym się do związanego z nowotworem antygenu, przy czym czynnik do wykrywania przeciwciała wiążącego się związanym nowotworem antygenem jest białkiem lub peptydem wiążącym się specyficznie do wspomnianego przeciwciała, przy czym czynnik do wykrywania komórek T jest komórka prezentującą kompleks pomiędzy związanym z nowotworem antygenem lub jego częścią i cząsteczka MHC.
W korzystnym wykonaniu wynalazku zestaw według wynalazku, cząsteczki kwasu nukleinowego do selektywnej amplifikacji kwasu nukleinowego zawierają sekwencję 6-50 przylegających nukleotydów kwasu nukleinowego, który koduje związany z nowotworem antygen.
Związane z nowotworem antygeny zidentyfikowane w niniejszym wynalazku mają sekwencję aminokwasów zakodowaną przez kwas nukleinowy, który jest wybrany z grupy składającej się z (a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 1-8, 41-44, 51-59, 84 117 i 119, jego część lub pochodną, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w ściśle kontrolowanych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b) oraz (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c). Związany z nowotworem antygen zidentyfikowany zgodnie z wynalazkiem, ma sekwencję aminokwasów kodowaną przez kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 1-8, 41-44, 51-59, 84, 117 i 119. Związany z nowotworem antygen, zidentyfikowany zgodnie z wynalazkiem, ma sekwencję aminokwasów kodowaną przez kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 9-19, 45-48, 60-66, 85, 90-97, 100-102, 105, 106, 111-116, 118, 120,123,124 i 135-137, jego część lub pochodną.
Ogólnie, niniejszy wynalazek dotyczy użycia do terapii i diagnozy związanych z nowotworem antygenów, zidentyfikowanych zgodnie z wynalazkiem lub ich części lub pochodnych, kodujących je kwasów nukleinowych lub kwasów nukleinowych skierowanych przeciwko tym kodującym kwasom nukleinowym lub przeciwciał skierowanych przeciwko związanym z nowotworem antygenom, zidentyfikowanym zgodnie z wynalazkiem lub ich częściom lub pochodnym.
Te zastosowania do diagnozy, terapii i kontroli postępu, mogą odnosić się do poszczególnych, ale także mogą odnosić się do kombinacji dwóch lub więcej tych antygenów, funkcjonalnych fragmentów, kwasów nukleinowych, przeciwciał etc., w pewnej postaci także w kombinacji z innymi związanymi z nowotworem genami i antygenami.
Chorobami preferowanymi do terapii i/lub diagnozy są te, w których jeden lub więcej związanych z nowotworem antygenów zidentyfikowanych zgodnie z wynalazkiem ulega selektywnej ekspresji lub nieprawidłowej ekspresji.
Wynalazek dotyczy także kwasów nukleinowych i produktów genetycznych, których ekspresja zachodzi w powiązaniu z komórką nowotworu.
W dalszej kolejności wynalazek odnosi się do produktów genetycznych, tj. kwasów nukleinowych i białek lub peptydów wytwarzanych przez alternatywne składanie RNA znanych genów (warianty składania) lub zmienioną translację przy użyciu alternatywnych otwartych ramek odczytu. W tym aspekcie wynalazek opisuje kwasy nukleinowe, które zawierają sekwencję kwasów nukleinowych wybraną z grupy składającej się z sekwencji zgodnej z SEQ ID Nr: 3-5 listy sekwencji. Ponadto, wynalazek ujawnia też białka lub peptydy, które zawierają sekwencję aminokwasów wybraną z grupy skła8
PL 219 018 B1 dającej się z sekwencji o numerze SEQ ID Nr: 10 i 12-14. Warianty składania mogą być użyte zgodnie z wynalazkiem jako cele diagnozy i terapii chorób nowotworowych.
W szczególności wynalazek odnosi się także do sekwencji aminokwasów ujawnionej na liście sekwencji jako SEQ ID Nr: 10, która jest kodowana przez alternatywną otwartą ramkę odczytu zidentyfikowaną zgodnie z wynalazkiem i różniącą się od poprzednio opisanej sekwencji białka (SEQ ID Nr: 9) dodatkowymi 85 aminokwasami na N końcu białka.
Bardzo odmienne mechanizmy mogą powodować, że wytwarzane są warianty składania, na przykład:
- używanie zmiennych miejsc inicjacji transkrypcji,
- używanie dodatkowych eksonów,
- całkowite lub niecałkowite składanie poza jednym lub dwoma lub więcej eksonami,
- zmienione regulatorowe sekwencje składania poprzez mutację (delecja lub wytwarzanie nowych sekwencji donor/akceptor),
- niecałkowita eliminacja sekwencji intronu.
Alternatywne składanie genu powoduje zmienioną sekwencję transkryptu (wariant składania). Translacja wariantu składania w regionie jego zmienionej sekwencji daje w wyniku zmienione białko, którego struktura i działanie może różnić się wyraźnie od oryginalnego białka. Związane z nowotworem warianty składania mogą wytwarzać związane z nowotworem transkrypty i związane z nowotworem białka/antygeny. Mogą być one używane jako molekularne wskaźniki, zarówno do wykrywania komórek nowotworu, jak i do terapeutycznego atakowania nowotworu. Wykrywanie komórek nowotworowych, np. we krwi, surowicy, szpiku kostnym, płynie z płukania oskrzeli, wydzielinach ciała i próbkach pobranych w wyniku biopsji, może być przeprowadzane zgodnie z wynalazkiem, na przykład po ekstrakcji kwasów nukleinowych, przy użyciu powielania PCR ze specyficznymi dla wariantu składania oligonukleotydami. W szczególności, pary starterów są właściwe, kiedy oligonukleotydy, przynajmniej jeden z nich, wiążą się w ściśle kontrolowanych warunkach do regionu wariantu składania, który jest związany z nowotworem. Zgodnie z wynalazkiem, do takiego celu odpowiednie są oligonukleotydy opisane w przykładach, w szczególności oligonukleotydy, które mają lub zawierają sekwencję wybraną z listy sekwencji SEQ ID Nr: 34-36, 39, 40 oraz 107-110.
Zgodnie z wynalazkiem, wszystkie zależne od sekwencji systemy wykrywania są właściwe do wykrywania. Na przykład, są nimi oprócz PCR, chip genowy/systemy mikromacierzy, Northern blot, test ochrony przed RNazą (ang. RNAse protection assays) (RDA) i inne. We wszystkich systemach detekcji, wspólną cechą jest, że są one oparte na specyficznej hybrydyzacji z przynajmniej jedną sekwencją kwasu nukleinowego specyficzną dla wariantu składania. Jednakże, zgodnie z wynalazkiem komórki nowotworowe mogą także być wykrywane przez przeciwciała, które rozpoznają specyficzny epitop kodowany przez wariant składania. Te przeciwciała mogą być otrzymane przy użyciu peptydów immunizujących, które są specyficzne dla tego wariantu składania.
W tym aspekcie wynalazek w szczególności dotyczy peptydów, które mają lub zawierają sekwencję wybraną z grupy SEQ ID Nr: 17-19, 111-115, 120 i 137 i specyficznych przeciwciał, które są skierowane do tego. Szczególnie odpowiednie do immunizacji są aminokwasy, których epitopy są wyraźnie różne od wariantu(ów) produktu genetycznego, który jest(są) chętniej wytwarzany(e) w zdrowych komórkach. Detekcja komórek nowotworowych przy użyciu przeciwciał może być tutaj przeprowadzona w próbce wyizolowanej od pacjenta albo jako odwzorowanie z dożylnym podaniem przeciwciał. Oprócz użyteczności diagnostycznej, warianty składania mające nowe lub zmienione epitopy są atrakcyjnym celem immunoterapii.
Będące przedmiotem wynalazku epitopy mogą być używane dla docelowych aktywnych terapeutycznie monoklonalnych przeciwciał lub limfocytów T. W pasywnej immunoterapii, przeciwciała lub limfocyty T, które rozpoznają specyficzne epitopy wariantów składania są przenoszone tutaj adopcyjnie. Tak jak w przypadku innych antygenów, przeciwciała mogą być wytwarzane także przy użyciu standardowych technologii (immunizacja zwierząt, strategie panoramowania do izolacji zrekombinowanych przeciwciał) przy użyciu polipeptydów, które zawierają te epitopy.
Alternatywnie, możliwe jest użycie do immunizacji kodujących kwasów nukleinowych dla oligolub polipeptydów zawierających te epitopy. Różne techniki wytwarzania in vivo i in vitro, specyficznych dla epitopu limfocytów T są znane i zostały opisane w szczegółach (na przykład Kessler J. H. i wsp., 2001, Sahin i wsp., 1997). Są one także oparte na stosowaniu oligo- i polipeptydów, które zawierają specyficzne warianty składania epitopów lub kwasów nukleinowych kodujących te oligo- lub polipeptydy. Oligo- lub polipeptydy, które zawierają warianty składania specyficznych epitopów mogą także być
PL 219 018 B1 użyte jako substancje aktywne farmaceutycznie w aktywnej immunoterapii (szczepienie, terapia szczepionką).
Niniejszy wynalazek opisuje także białka, które różnią się między normalną i nowotworową tkanką naturą i stopniem ich drugorzędowych modyfikacji (na przykład Durand & Seta, 2000; Clin. Chem. 46: 795-805; Hakomori, 1996; Cancer Res. 56: 5309-18).
Analiza modyfikacji białek może być wykonana przy użyciu Western blot. W szczególności, glikozylacje, które z reguły mają rozmiar kilku kDa powodują zwiększenie całkowitej masy docelowego białka, które może być wyizolowane przy użyciu SDS-PAGE. Do wykrywania specyficznych O- lub N-glikozydowych wiązań białek, przed denaturacją z użyciem SDS, lizaty są inkubowane z O- lub N-glikozylazami (zgodnie z instrukcją odpowiedniego producenta, na przykład Pngase, endoglikozydaza F, endoglikozydaza H, Roche Diagnostic). Po tym przeprowadzany jest Western blot. Jeżeli rozmiar docelowego białka jest zmniejszony, specyficzna glikozylacja może być wykryta po ikubacji z glikozydazą i w ten sposób także może być analizowana specyficzność modyfikacji względem nowotworu.
Szczególnie interesujące są regiony białek, które są glikozylowane odmiennie w nowotworowych i w zdrowych komórkach. Jednak takie różnice w glikozylacji zostały dotychczas opisane tylko dla kilku powierzchniowych białek komórkowych (na przykład Muc1).
Zgodnie z wynalazkiem, możliwe było wykrycie w nowotworach zróżnicowanej glikozylacji dla Claudin-18. Nowotwory żołądkowo-jelitowe, nowotwory trzustki, nowotwory przełyku, nowotwory prostaty oraz nowotwory płuc maja formę Claudin-18, która jest glikozylowana na niskim poziomie. Glikozylacja w zdrowych tkankach maskuje białkowe epitopy Claudin-18, które w komórkach nowotworowych nie są pokryte, w związku z brakiem glikozylacji. Odpowiednio, możliwe jest, zgodnie z wynalazkiem, wybranie ligandów i przeciwciał, które wiążą się do tych domen. Takie ligandy i przeciwciała, zgodnie z wynalazkiem, nie wiążą się do Claudin-18 w zdrowych komórkach, ponieważ tutaj z powodu glikozylacji epitopy są pokryte.
Jak to opisano powyżej, dla epitopów białkowych, które są pochodnymi związanych z nowotworem wariantów składania, dla celów diagnostycznych i terapeutycznych do rozróżniania komórek normalnych i nowotworowych możliwe jest użycie różnicującej glikozylacji.
Jak zaznaczono powyżej, wynalazek dotyczy farmaceutycznej kompozycji zawierającej czynnik, który rozpoznaje, zidentyfikowany zgodnie z wynalazkiem, związany z nowotworem antygen i który dobrze jeżeli jest selektywny w stosunku do komórek, w których zachodzi ekspresja lub nieprawidłowa ekspresja związanego z nowotworem antygenu, zidentyfikowanego zgodnie z wynalazkiem. W szczególnych postaciach czynnik ten może powodować śmierć komórek, zmniejszenie wzrostu komórek, uszkodzenie błony komórkowej lub sekrecję cytokin i wskazane, żeby miał aktywność hamującą nowotwór. W pewnej postaci, czynnik jest nonsensownym kwasem nukleinowym, który selektywnie hybrydyzuje z kwasem nukleinowym kodującym związany z nowotworem antygen. W kolejnej postaci, czynnik jest przeciwciałem, które wiąże się selektywnie ze związanym z nowotworem antygenem, w szczególności aktywowanym dopełniaczem lub przeciwciałem sprzężonym z toksyną, które wiąże się selektywnie do antygenu związanego z nowotworem. W kolejnej postaci, czynnik zawiera dwa lub więcej czynniki, z których każdy selektywnie rozpoznaje różne związane z nowotworem antygeny, z których przynajmniej jeden jest związanym z nowotworem antygenem identyfikowanym zgodnie z wynalazkiem. Rozpoznawaniu nie musi bezpośrednio towarzyszyć hamowanie aktywności lub ekspresji antygenu. W tym aspekcie wynalazku, antygen selektywnie ograniczony do nowotworów, korzystnie służy jako oznakowanie dla mechanizmów pozyskiwania efektora dla tej specyficznej lokalizacji. W preferowanej postaci, czynnik jest cytotoksycznym limfocytem T, który rozpoznaje antygen na cząsteczce HLA i lizuje znakowane w ten sposób komórki. W dalszej postaci, czynnik jest przeciwciałem, które selektywnie wiąże się do związanego z nowotworem antygenu i w ten sposób pozyskuje naturalne lub sztuczne mechanizmy efektorowe dla tej komórki. W dalszej postaci, czynnik jest pomocniczym limfocytem T specyficznie rozpoznającym ten antygen, który poprawia efektorowe funkcje innych komórek.
W pewnej postaci, wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej zawierającej czynnik, który hamuje ekspresję lub aktywność związanego z nowotworem identyfikowanego zgodnie z wynalazkiem antygenu. W preferowanej postaci, czynnik jest nonsensownym kwasem nukleinowym, który hybrydyzuje selektywnie z kwasem nukleinowym kodującym związany z nowotworem antygen. W dalszej postaci, czynnik jest przeciwciałem, które wiąże się selektywnie ze związanym z nowotworem antygenem. W kolejnej postaci, czynnik zawiera dwa lub więcej czynniki, z których każdy selektywnie hamuje
PL 219 018 B1 ekspresję lub aktywność różnych związanych z nowotworem antygenów, z których przynajmniej jeden jest związanym z nowotworem antygenem zidentyfikowanym zgodnie z wynalazkiem.
W dalszej kolejności wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej, która zawiera czynnik, który kiedy jest podany, selektywnie zwiększa ilość kompleksów cząsteczki HLA i peptydowego epitopu ze związanego z nowotworem, zidentyfikowanego zgodnie z wynalazkiem antygenu. W pewnej postaci, czynnik zawiera jeden lub więcej składników wybranych z grupy składającej się z (i) związanego z nowotworem antygenu lub jego części, (ii) kwasu nukleinowego, który koduje ten związany z nowotworem antygen lub jego część, (iii) komórki gospodarza, w której zachodzi ekspresja tego związanego z nowotworem antygenu lub jego części i (iv) izolowanych kompleksów peptydowych epitopów tego związanego z nowotworem antygenu i cząsteczki MHC. W pewnej postaci, czynnik zawiera dwa lub więcej czynników, z których każdy selektywnie zwiększa ilość kompleksów cząsteczek MHC i peptydowych epitopów różnych związanych z nowotworem antygenów, z których przynajmniej jeden jest antygenem związanym z nowotworem zidentyfikowanym zgodnie z wynalazkiem.
W dalszej kolejności wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej, która zawiera jeden lub więcej składników wybranych z grupy składającej się z (i) zidentyfikowanego zgodnie z wynalazkiem związanego z nowotworem antygenu lub jego części, (ii) kwasu nukleinowego, który koduje zidentyfikowany zgodnie z wynalazkiem związany z nowotworem antygen lub jego część, (iii) przeciwciała, które wiąże się do zidentyfikowanego zgodnie z wynalazkiem związanego z nowotworem antygenu lub jego części, (iv) nonsensownego kwasu nukleinowego, który specyficznie hybrydyzuje z kwasem nukleinowym kodującym zidentyfikowany z zgodnie z wynalazkiem związany z nowotworem antygen, (v) komórki gospodarza, w której zachodzi ekspresja zidentyfikowanego zgodnie z wynalazkiem związanego z nowotworem antygenu lub jego części i (vi) izolowanego kompleksu zidentyfikowanego zgodnie z wynalazkiem związanego z nowotworem antygenu lub jego części i cząsteczki HLA.
Kwas nukleinowy kodujący zidentyfikowany zgodnie z wynalazkiem związany z nowotworem antygen lub jego część może być obecny w kompozycji farmaceutycznej w wektorze ekspresyjnym i może być funkcjonalnie połączony z promotorem.
Komórka gospodarza, obecna w będącej przedmiotem wynalazku kompozycji farmaceutycznej, może wydzielać związany z nowotworem antygen lub jego część, ekspresja antygenu może zachodzić na powierzchni lub może dodatkowo zachodzić ekspresja cząsteczki HLA, która wiąże się do tego związanego z nowotworem antygenu lub do tej jego części. W pewnej postaci, w komórce gospodarza ekspresja HLA zachodzi endogennie. W kolejnej postaci, w komórce gospodarza ekspresja cząsteczki HLA i/lub związanego z nowotworem antygenu lub jego części zachodzi metodą rekombinacji.
Korzystnie, jeżeli komórka gospodarza jest nieproliferacyjna. W preferowanej postaci, komórka gospodarza jest komórką prezentującą antygen, w szczególności komórką dendrytyczną, monocytem lub makrofagiem.
Przeciwciało obecne w będącej przedmiotem wynalazku kompozycji farmaceutycznej może być przeciwciałem monoklonalnym. W dalszych postaciach, przeciwciało jest przeciwciałem chimerycznym lub humanizowanym fragmentem naturalnego przeciwciała lub syntetycznym przeciwciałem, z których każde może być otrzymane technikami kombinatoryjnymi. Przeciwciało może być przyłączone do czynnika użytecznego terapeutycznie lub diagnostycznie.
Nonsensowny kwas nukleinowy znajdujący się w będącej przedmiotem wynalazku kompozycji farmaceutycznej może zawierać sekwencję 6-50, w szczególności 10-30, 15-30 i 20-30 przylegających nukleotydów kwasu nukleinowego kodującego zidentyfikowany zgodnie z wynalazkiem związany z nowotworem antygen.
W kolejnych postaciach, związany z nowotworem antygen, dostarczany poprzez będącą przedmiotem wynalazku kompozycję farmaceutyczną albo bezpośrednio, albo przez ekspresję kwasu nukleinowego lub jego część, wiąże się do cząsteczek MHC na powierzchni komórek, korzystnie, żeby to było wiązanie powodujące cytolityczną reakcję i/lub indukujące uwalnianie cytokiny.
Będąca przedmiotem wynalazku kompozycja farmaceutyczna może zawierać farmaceutycznie kompatybilny nośnik i/lub adiuwant. Adiuwant może być wybrany z: saponiny, GM-CSF, nukleotydów CpG, RNA, cytokiny lub chemokiny. Będąca przedmiotem wynalazku kompozycja farmaceutyczna jest chętnie używana do leczenia choroby charakteryzującej się selektywną ekspresją lub nieprawidłową ekspresją związanego z nowotworem antygenu. W preferowanej postaci, chorobą jest rak.
Na podstawie wynalazku tu opisanego można wdrożyć leczenie lub diagnozowanie choroby charakteryzującej się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją jednego lub więcej związanych z nowoPL 219 018 B1 tworem antygenów. Leczenie to obejmuje podawanie będącej przedmiotem wynalazku kompozycji farmaceutycznej.
W wynalazku opisuje się także sposób diagnozowania choroby charakteryzującej się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją związanego z nowotworem antygenu zidentyfikowanego zgodnie z wynalazkiem. Sposób obejmuje wykrywanie (i) kwasu nukleinowego, który koduje antygen związany z nowotworem lub jego część i/lub (ii) wykrywanie antygenu związanego z nowotworem lub jego części, i/lub (iii) wykrywanie przeciwciała dla związanego z nowotworem antygenu lub jego części i/lub (iv) wykrywanie w izolowanej od pacjenta próbce biologicznej cytotoksycznych lub pomocniczych limfocytów T, które są specyficzne dla związanego z nowotworem antygenu lub dla jego części. W szczególnych postaciach wykrywanie obejmuje (i) kontaktowanie biologicznej próbki z czynnikiem, który wiąże się specyficznie z kwasem nukleinowym kodującym związany z nowotworem antygen lub jego część, z tym związanym z nowotworem antygenem lub tą jego częścią, z przeciwciałem lub cytotoksycznymi lub pomocniczymi limfocytami T specyficznymi dla związanego z nowotworem antygenu lub jego części i (ii) wykrywanie tworzenia kompleksu czynnika z kwasem nukleinowym lub jego częścią, związanym z nowotworem antygenem lub jego częścią, przeciwciałem lub cytotoksycznymi lub pomocniczymi limfocytami T. W pewnej postaci choroba charakteryzuje się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją dwóch lub więcej różnych związanych z nowotworem antygenów i wykrywanie obejmuje wykrywanie dwóch lub więcej kwasów nukleinowych kodujących te dwa lub więcej związane z nowotworem antygeny lub ich części, wykrywanie dwóch lub więcej związanych z nowotworem antygenów lub ich części, wykrywanie dwóch lub więcej przeciwciał wiążących te dwa lub więcej różne związane z nowotworem antygeny lub ich części, lub wykrywanie dwóch lub więcej cytotoksycznych lub pomocniczych limfocytów T specyficznych w stosunku do tych dwóch lub więcej różnych związanych z nowotworem antygenów. W dalszej postaci, wyizolowana od pacjenta próbka biologiczna jest porównywana z normalną porównawczą próbką biologiczną.
Wynalazek pozwala także na zrealizowanie sposobu oznaczania regresji, przebiegu lub rozpoczęcia choroby charakteryzującej się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją zidentyfikowanego zgodnie z wynalazkiem, związanego z nowotworem antygenu, który polega na tym, że monitoruje się próbki od pacjenta, który ma tę chorobę lub jest podejrzany, że podlega tej chorobie, z uwzględnieniem jednego lub więcej parametrów wybranych z grupy składającej się z (i) ilość kwasu nukleinowego, który koduje związany z nowotworem antygen lub jego część, (ii) ilość antygenu związanego z nowotworem lub jego część, (iii) ilość przeciwciał, które wiążą się do związanego z nowotworem antygenu lub jego część i (iv) ilość cytolitycznych komórek T lub pomocniczych komórek T, które są specyficzne dla kompleksu związanego z nowotworem antygenu lub jego części i cząsteczki MHC.
Korzystnie, jeżeli sposób zawiera oznaczanie parametru(ów) w pierwszej próbce w pierwszym punkcie czasowym i w kolejnej próbce w drugim z kolei punkcie czasowym i w którym przebieg choroby jest oznaczony przez porównanie dwóch próbek. W szczególnych postaciach, choroba charakteryzuje się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją dwóch lub więcej różnych związanych z nowotworem antygenów i monitorowanie obejmuje monitorowanie (i) ilości dwóch lub więcej kwasów nukleinowych, które kodują te dwa lub więcej różne, związane z nowotworem antygeny lub ich części i/lub (ii) ilości tych dwóch lub więcej różnych związanych z nowotworem antygenów lub ich części i/lub (iii) ilości dwóch lub więcej przeciwciał, które wiążą się do tych dwóch lub więcej różnych związanych z nowotworem antygenów lub ich części i/lub (iv) ilości dwóch lub więcej cytolitycznych komórek T lub pomocniczych komórek T, które są specyficzne dla kompleksów tych dwóch lub więcej różnych związanych z nowotworem antygenów lub ich części i cząsteczek MHC.
Zgodnie z wynalazkiem, wykrywanie kwasu nukleinowego lub jego części, lub monitorowanie kwasu nukleinowego, lub jego części może być przeprowadzone przy użyciu sondy polinukleotydowej, która specyficznie hybrydyzuje z tym kwasem nukleinowym lub tą jego częścią, lub może być przeprowadzone przez selektywne powielanie tego kwasu nukleinowego, lub jego części. Sonda polinukleotydowa może zawierać 6-50, w szczególności 10-30, 15-30 i 20-30 przylegających nukleotydów tego kwasu nukleinowego.
W szczególnych postaciach, związany z nowotworem antygen lub jego część, żeby był wykryty jest prezentowany wewnątrz lub na powierzchni komórki. Zgodnie z wynalazkiem wykrywanie związanego z nowotworem antygenu lub jego części, lub monitorowanie ilości związanego z nowotworem antygenu, lub jego części może być przeprowadzone przy użyciu przeciwciała specyficznie wiążącego się do tego związanego z nowotworem antygenu, lub tej jego części.
PL 219 018 B1
W dalszych postaciach, związany z nowotworem antygen lub jego część, żeby był wykryty jest prezentowany w kompleksie z cząsteczką MHC, w szczególności z cząsteczką HLA.
Zgodnie z wynalazkiem, wykrywanie przeciwciała lub monitorowanie ilości przeciwciał może być przeprowadzone przy użyciu białka lub peptydu specyficznie wiążącego się do tego przeciwciała.
Zgodnie z wynalazkiem, wykrywanie cytolitycznych komórek T lub pomocniczych komórek T lub monitorowanie cytolitycznych komórek T lub pomocniczych komórek T, które są specyficzne dla kompleksów antygenu lub jego części i cząsteczek MHC, może być przeprowadzone przez użycie komórki prezentującej kompleks tego antygenu lub tej jego części i cząsteczki MHC.
Wskazane jest, aby sonda polinukleotydowa, przeciwciało, białko lub peptyd, lub komórka, które są użyte do wykrywania lub monitorowania, były znakowane w sposób pozwalający na wykrycie. W szczególnych postaciach, dający się wykrywać wskaźnik jest wskaźnikiem radioaktywnym lub enzymatycznym. Limfocyty T mogą być dodatkowo wykrywane poprzez wykrywanie ich proliferacji, wytwarzania przez nie cytokin i wyzwalania ich specyficznej cytotoksycznej aktywności wywoływanej przez specyficzną stymulację kompleksem MHC i związanego z nowotworem antygenu lub jego części. Limfocyty T mogą także być wykrywane przez zrekombinowaną cząsteczkę MHC lub jeszcze przez kompleks dwóch lub więcej cząsteczek MHC, które są obciążone szczególnym immunogenicznym fragmentem jednego lub więcej związanych z nowotworem antygenów i które mogą identyfikować specyficzne limfocyty T przez kontakt ze specyficznym receptorem komórek T.
Wynalazek pozwala także na wdrożenie sposobów leczenia, diagnozowania lub monitorowania choroby, która charakteryzuje się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją zidentyfikowanego zgodnie z wynalazkiem, związanego z nowotworem antygenu, który to sposób obejmuje podawanie przeciwciała, które wiąże się do tego związanego z nowotworem antygenu lub jego części i które jest połączone z czynnikiem terapeutycznym lub diagnostycznym. Przeciwciało może być przeciwciałem monoklonalnym. W dalszych postaciach przeciwciało jest przeciwciałem chimerycznym lub humanizowanym, lub fragmentem przeciwciała naturalnego.
Wynalazek pozwala na określenie sposobów leczenia pacjenta mającego chorobę charakteryzującą się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją zidentyfikowanego zgodnie z wynalazkiem, związanego z nowotworem antygenu, który to sposób zawiera (i) pobranie próbki zawierającej immunoreaktywne komórki od tego pacjenta, (ii) kontaktowanie tej próbki z komórką gospodarza, w której zachodzi ekspresja tego związanego z nowotworem antygenu lub jego części w warunkach, które sprzyjają wytwarzaniu cytolitycznych komórek T przeciw temu związanemu z nowotworem antygenowi lub jego części, (iii) wprowadzenie cytolitycznych komórek T pacjentowi w ilości odpowiedniej do wywołania lizy komórek, w których zachodzi ekspresja związanego z nowotworem antygenu lub jego części. Wynalazek opisuje również klonowanie receptora komórkowego T komórek cytolitycznych T przeciwko związanemu z nowotworem antygenowi. Ten receptor może być transferowany do innych komórek T, które w ten sposób otrzymają pożądaną specyficzność i mogą być wprowadzone pacjentowi.
W pewnej postaci, w komórce gospodarza ekspresja cząsteczki HLA zachodzi endogennie. W kolejnej postaci, w komórce gospodarza zachodzi rekombinacyjna ekspresja cząsteczki HLA i/lub związanego z nowotworem antygenu lub jego części. Wskazane jest aby komórka gospodarza była komórką nie proliferacyjną.
W preferowanej postaci, komórka gospodarza jest komórką prezentującą antygen, w szczególności komórką dendrytyczną, monocytem lub makrofagiem.
W następnym aspekcie wynalazek pozwala na leczenie pacjenta mającego chorobę charakteryzującą się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją związanego z nowotworem antygenu, która to metoda leczenia obejmuje (i) identyfikowanie kwasu nukleinowego, który koduje zidentyfikowany zgodnie z wynalazkiem, związany z nowotworem antygen i którego ekspresja zachodzi w komórkach związanych z tą chorobą, (ii) transfekowanie komórki gospodarza tym kwasem nukleinowym lub jego częścią, (iii) hodowanie transfekowanej komórki gospodarza w celu ekspresji tego kwasu nukleinowego (nie jest to konieczne, jeżeli otrzymuje się wysoki stopień transfekcji) i (iv) wprowadzenie komórek gospodarza lub ich ekstraktu pacjentowi w ilości odpowiedniej do zwiększenia odpowiedzi immunologicznej komórek pacjenta związanych z chorobą. Metoda leczenia może następnie zawierać identyfikowanie prezentującej związany z nowotworem antygen lub jego część cząsteczki MHC z komórki gospodarza, w której zachodzi ekspresja zidentyfikowanej i prezentującej ten związany z nowotworem antygen lub jego część cząsteczki MHC. Odpowiedź immunologiczna może zawierać odpowiedź komórki B lub odpowiedź komórki T. Co więcej, odpowiedź komórki T może zawierać wytwarzanie cytolitycznych komórek T i/lub pomocniczych komórek T, które są specyficzne dla komórek gospodarza
PL 219 018 B1 prezentujących związany z nowotworem antygen lub jego część, lub specyficzne dla komórek pacjenta, w których zachodzi ekspresja tego związanego z nowotworem antygenu lub jego części.
Wynalazek opisuje także metodę leczenia choroby charakteryzującej się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją zidentyfikowanego zgodnie z wynalazkiem, związanego z nowotworem antygenu, która to metoda obejmuje (i) identyfikowanie komórek pacjenta, w których zachodzi ekspresja nieprawidłowych ilości związanego z nowotworem antygenu, (ii) izolowanie próbki tych komórek, (iii) hodowanie tych komórek i (iv) wprowadzenie tych komórek pacjentowi w ilości wystarczającej do wywołania odpowiedzi immunologicznej na te komórki.
Właściwym jest jeżeli komórki gospodarza użyte zgodnie z wynalazkiem są nie proliferacyjne lub są uczynione nie proliferacyjnymi. W szczególności, choroba charakteryzującą się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją związanego z nowotworem antygenu jest rakiem.
Niniejszy wynalazek opisuje także kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z (a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 3-5, jego części lub pochodnej, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w ściśle kontrolowanych warunkach, (c) kwas nukleinowy, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b) i (d) kwas nukleinowy, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c). W dalszej kolejności, wynalazek dotyczy kwasu nukleinowego, który koduje białko lub polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 10 i 12-14, jego części lub pochodnej.
Wynalazek opisuje także sekwencje promotora będących przedmiotem wynalazku kwasów nukleinowych. Te sekwencje mogą być funkcjonalnie przyłączone do innego genu, lepiej w wektorze ekspresyjnym i w ten sposób zapewniają selektywną ekspresję tego genu w odpowiednich komórkach.
W dalszym aspekcie, wynalazek dotyczy cząsteczki zrekombinowanego kwasu nukleinowego, w szczególności cząsteczki DNA lub RNA, która zawiera będący przedmiotem wynalazku kwas nukleinowy.
Wynalazek dotyczy także komórek gospodarza, które zawierają będący przedmiotem wynalazku kwas nukleinowy lub cząsteczkę zrekombinowanego kwasu nukleinowego zawierającą będący przedmiotem wynalazku kwas nukleinowy.
Komórka gospodarza może także zawierać kwas nukleinowy kodujący cząsteczkę HLA. W pewnej postaci, ekspresja cząsteczki HLA w komórce gospodarza zachodzi endogennie. W dalszej postaci, w komórce gospodarza zachodzi ekspresja rekombinacyjna cząsteczki HLA i/lub będącego przedmiotem wynalazku kwasu nukleinowego lub jego części.
Korzystnie, jeżeli komórka gospodarza jest nie proliferacyjna. W preferowanej postaci, komórka gospodarza jest komórką prezentującą antygen, w szczególności komórką dendrytyczną, monocytem lub makrofagiem.
W wynalazku ujawnia się również oligonukleotydy, które hybrydyzują z kwasem nukleinowym zidentyfikowanym zgodnie z wynalazkiem i które mogą być użyte jako genetyczne sondy lub jako cząsteczki „nonsensowne”. Cząsteczki kwasów nukleinowych w formie oligonukleotydowych starterów lub kompetentnych próbek, które hybrydyzują ze zidentyfikowanym zgodnie z wynalazkiem kwasem nukleinowym lub z jego częściami, mogą być użyte do znajdowania kwasów nukleinowych, które są homologiczne do tego kwasu nukleinowego zidentyfikowanego zgodnie z wynalazkiem. Do znajdowania homologicznych kwasów nukleinowych może być użyte powielanie PCR, hybrydyzacja Southern i Northern. Hybrydyzacja może być przeprowadzona w łagodnie kontrolowanych warunkach, lepiej umiarkowanie kontrolowanych a najlepiej w ściśle kontrolowanych warunkach. Zgodnie z wynalazkiem termin „ściśle kontrolowane warunki” dotyczy warunków, które pozwalają na specyficzną hybrydyzację między polinukleotydami.
Wynalazek ujawnia także białka, polipeptyd lub peptyd, który jest kodowany przez kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z (a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 3-5, jego części lub pochodnej, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w ściśle kontrolowanych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b) i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c). W pewnej postaci, wynalazek opisuje białka lub polipeptyd lub peptyd, który zawiera sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 10 i 12-14, jego części lub pochodnej.
Wynalazek ujawnia również immunogeniczny fragment zidentyfikowanego zgodnie z wynalazkiem związanego z nowotworem antygenu. Wskazane, żeby ten fragment wiązał się do ludzkiego
PL 219 018 B1 receptora HLA lub do ludzkiego przeciwciała. Wskazane, żeby będący przedmiotem wynalazku fragment zawierał sekwencję przynajmniej 6, w szczególności przynajmniej 8, przynajmniej 10, przynajmniej 12, przynajmniej 15, przynajmniej 20, przynajmniej 30 lub przynajmniej 50 aminokwasów.
Wynalazek ujawnia również peptyd, który ma lub zawiera sekwencję wybraną z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 17-19, 90-97, 100-102, 105, 106, 111-116, 120, 123, 124 i 135-137, jego części lub pochodnej.
W dalszym aspekcie wynalazek dotyczy czynnika, który wiąże się do zidentyfikowanego zgodnie z wynalazkiem związanego z nowotworem antygenu lub do jego części. W preferowanej postaci czynnikiem jest przeciwciało. W dalszych postaciach przeciwciało jest chimerycznym humanizowanym przeciwciałem lub przeciwciałem wytwarzanym technikami kombinatoryjnymi lub jest fragmentem przeciwciała. Ponadto wynalazek dotyczy przeciwciała, które wiąże się selektywnie do kompleksu (i) zidentyfikowanego zgodnie z wynalazkiem, związanego z nowotworem antygenu lub jego części i (ii) cząsteczki MHC, do której ten zidentyfikowany zgodnie z wynalazkiem, związany z nowotworem antygen lub ta jego część wiąże się, z tym przeciwciałem niewiążącym się do samego (i) lub do samego (ii). Będące przedmiotem wynalazku przeciwciało może być przeciwciałem monoklonalnym. W dalszych postaciach przeciwciało jest chimerycznym lub humanizowanym przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała naturalnego.
W szczególności, wynalazek ujawnia takie czynniki, w szczególności przeciwciała, które specyficznie wiąże się do peptydu, który ma lub zawiera sekwencję wybraną z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 17-19, 90-97, 100-102, 105, 106, 111-116, 120, 123, 124 i 135-137, jego części lub pochodnej.
Ponadto, wynalazek dotyczy koniugatu, który wiąże się do zidentyfikowanego zgodnie z wynalazkiem związanego z nowotworem antygenu lub do jego części lub będącego przedmiotem wynalazku przeciwciała i terapeutycznego lub diagnostycznego czynnika. W pewnej postaci terapeutycznym lub diagnostycznym czynnikiem jest toksyna.
W dalszym aspekcie wynalazek dotyczy zestawu do wykrywania ekspresji lub nieprawidłowej ekspresji związanego z nowotworem antygenu, który to zestaw zawiera czynniki do wykrywania (i) kwasu nukleinowego, który koduje związany z nowotworem antygen lub jego część, (ii) związanego z nowotworem antygenu lub jego części, (iii) przeciwciał, które wiążą się do związanego z nowotworem antygenu lub jego części i/lub (iv) komórek T, które są specyficzne dla kompleksu związanego z nowotworem antygenu lub jego części i cząsteczki MHC. W pewnej postaci, czynniki do wykrywania kwasu nukleinowego lub jego części, są cząsteczkami kwasu nukleinowego do selektywnego powielania tego kwasu nukleinowego, który w szczególności zawiera sekwencję 6-50, w szczególności 10-30, 15-30 i 20- 30 przylegających nukleotydów tego kwasu nukleinowego.
Szczegółowy opis wynalazku
Zgodnie z wynalazkiem opisane są geny, które selektywnie lub w sposób odbiegający od normy podlegają ekspresji w komórkach nowotworu i które są związanymi z nowotworem antygenami.
Zgodnie z wynalazkiem, te geny i/lub ich genetyczne produkty, i/lub ich pochodne, i/lub części są preferowanymi docelowymi strukturami do zastosowań terapeutycznych. Jeśli chodzi o koncepcję, te terapeutyczne zastosowania mogą mieć na celu hamowanie aktywności selektywnie zachodzącej ekspresji związanego z nowotworem produktu genetycznego. Jest użyteczne, jeżeli ta odbiegająca od normy lub selektywna ekspresja jest funkcjonalnie ważna w patogenezie nowotworu i jeżeli ligacji produktu genu towarzyszy selektywne uszkodzenie odpowiadających komórek. Inne terapeutyczne koncepcje rozważają związane z nowotworem antygeny, jako znaczniki, które włączają mechanizmy efektora mające możliwość selektywnego uszkadzania komórek nowotworu. Tu działanie samych w sobie docelowych cząsteczek i ich rola w rozwoju nowotworu są całkowicie oderwane.
Zgodnie z wynalazkiem „pochodna” kwasu nukleinowego oznacza, że pojedyncze lub wielokrotne nukleotydowe podstawienia, delecje i/lub addycje są obecne w tym kwasie nukleinowym. Poza tym termin „pochodna” zawiera także chemiczną derywatyzację kwasu nukleinowego lub zasady nukleotydowej na cukrze lub na fosforanie. Termin „pochodna” obejmuje także kwasy nukleinowe, które zawierają nukleotydy lub analogi nukleotydów nie występujące naturalnie.
Zgodnie z wynalazkiem korzystnie jest, jeżeli kwasem nukleinowym jest kwas dezoksyrybonukleinowy (DNA) lub rybonukleinowy (RNA). Zgodnie z wynalazkiem kwasy nukleinowe zawierają wytworzone rekombinacyjnie i zsyntetyzowane chemicznie cząsteczki genomowego DNA, cDNA, mRNA. Zgodnie z wynalazkiem kwas nukleinowy może być obecny, jako jedno niciowy i dwuniciowy oraz liniowa i kowalentna koliście zamknięta cząsteczka.
PL 219 018 B1
Wskazane, żeby opisane zgodnie z wynalazkiem kwasy nukleinowe zostały izolowane. Zgodnie z wynalazkiem termin „izolowany kwas nukleinowy” oznacza, że kwas nukleinowy był (i) powielany in vitro, na przykład przez reakcję łańcuchową z polimerazą (PCR), (ii) rekombinacyjnie otrzymany przez klonowanie, (iii) oczyszczony, na przykład przez cięcie i elektroforetyczne frakcjonowanie na żelu lub (iv) syntetyzowany, na przykład w drodze syntezy chemicznej. Izolowany kwas nukleinowy jest kwasem nukleinowym, który jest dostępny do manipulowania technikami rekombinacji DNA.
Kwas nukleinowy jest „komplementarny” do innego kwasu nukleinowego, jeżeli dwie cząsteczki są zdolne do hybrydyzacji i do tworzenia jedna z drugą stabilnego dupleksu, korzystnie, jeżeli hybrydyzacja jest przeprowadzana w warunkach, które pozwalają na specyficzną hybrydyzację między polinukleotydami (ściśle kontrolowane warunki). Ściśle kontrolowane warunki są na przykład opisane w Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook i wsp., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, New York, 1989 or Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel i wsp., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York i odwołują się na przykład do hybrydyzacji w 65°C w buforze hybrydyzacyjnym (3,5 x SSC, 0,02% Ficoll, 0,02% poliwinylopirolidon, 0,02 albumina surowicy wołowej, 2,5 mM NaH2PO4) (pH 7), 0,5 SDS, 2 mM EDTA). SSC jest to 0,15 M chlorek sodu/0,15 M cytrynian sodu, pH 7. Po hybrydyzacji, błona, na którą DNA został transferowany, jest przemywana, na przykład 2 x SSC w temperaturze pokojowej i później w 0,1-0,5 x SSC/0,1 x SDS w temperaturze do 68°C.
Zgodnie z wynalazkiem, komplementarne kwasy nukleinowe mają przynajmniej 40%, w szczególności przynajmniej 50%, przynajmniej 60%, przynajmniej 70%, przynajmniej 80%, przynajmniej 90%, korzystnie przynajmniej 95%, przynajmniej 98%, przynajmniej 99% identycznych nukleotydów.
Kwasy nukleinowe kodujące związane z nowotworem antygeny, zgodnie z wynalazkiem mogą być obecne same lub w połączeniu z innymi kwasami nukleinowymi, w szczególności z heterologicznymi kwasami nukleinowymi. W preferowanych postaciach, kwas nukleinowy jest funkcjonalnie połączony z sekwencjami kontrolnymi lub sekwencjami regulatorowymi ekspresji, które mogą być homologiczne lub heterologiczne w stosunku do tego kwasu nukleinowego. Sekwencja kodująca i sekwencja regulatorowa są wzajemnie „funkcjonalnie” połączone. Jeżeli są połączone kowalencyjnie to w taki sposób, że ekspresja lub transkrypcja sekwencji kodującej jest pod kontrolą lub pod wpływem tej regulatorowej sekwencji. Jeżeli sekwencja kodująca ma ulegać translacji w białko funkcjonalne, wtedy indukcja tej sekwencji regulatorowej sekwencją regulatorową funkcjonalnie związaną z sekwencją kodującą daje w wyniku transkrypcję tej sekwencji kodującej, nie tworząc ramki odczytu w sekwencji kodującej lub ta sekwencja kodująca nie jest w stanie ulegać translacji w pożądane białko.
Termin „sekwencja kontrolna ekspresji” lub „sekwencja regulatorowa”, zgodnie z wynalazkiem, obejmuje promotory, enhancery i inne elementy kontrolne, które regulują ekspresję genu. W szczególnych postaciach wynalazku, sekwencje kontroli ekspresji mogą być regulowane. Dokładna struktura sekwencji regulatorowych może różnić się w zależności od gatunku lub typu komórek ale zazwyczaj posiada nie podlegające transkrypcji sekwencje 5' i nie podlegające translacji sekwencje 5' które są włączone odpowiednio w inicjację transkrypcji i translacji, takie jak TATA box, sekwencja czapeczki, sekwencja CAAT i temu podobne. Bardziej specyficznie, nie podlegająca transkrypcji regulatorowa sekwencja 5' zawiera region promotora, który obejmuje sekwencję promotora do kontroli transkrypcji funkcjonalnie połączonego genu. Sekwencje regulatorowe mogą także zawierać sekwencje wzmacniacza (ang. enhancera) lub sekwencje aktywatora w pozycji powyżej.
Tak więc, zilustrowane tutaj, związane z nowotworem antygeny mogą być łączone ze wszystkimi sekwencjami kontroli ekspresji i promotorami. Z drugiej strony, zgodnie z wynalazkiem, zilustrowane tutaj promotory związanych z nowotworem produktów genetycznych mogą być łączone ze wszystkimi genami. To pozwala na wykorzystywanie selektywnej aktywności tych promotorów.
Zgodnie z wynalazkiem, kwas nukleinowy może poza tym występować w połączeniu z innym kwasem nukleinowym, który koduje polipeptyd kontrolujący sekrecję z komórki gospodarza białka lub polipeptydu kodowanego przez ten kwas nukleinowy. Zgodnie z wynalazkiem, kwas nukleinowy może występować także w połączeniu z innym kwasem nukleinowym, który koduje polipeptyd powodując, że kodowane białko lub polipeptyd jest umocowane na błonie komórkowej komórki gospodarza lub rozdzielane do poszczególnych organelli tej komórki. Podobnie możliwe jest połączenie z kwasem nukleinowym, który reprezentuje gen reporterowy lub każdy „tag”.
W preferowanej postaci, zgodnie z wynalazkiem, cząsteczka zrekombinowanego DNA jest wektorem, jeśli potrzeba z promotorem, który kontroluje ekspresję kwasu nukleinowego, na przykład kwasu nukleinowego kodującego będący przedmiotem wynalazku, związany z nowotworem antygen. Termin „wektor” jest użyty tutaj w jego najbardziej ogólnym znaczeniu i zawiera pośredni nośnik dla
PL 219 018 B1 kwasu nukleinowego, który umożliwia na przykład temu kwasowi nukleinowemu, żeby był wprowadzony do prokariotycznych i/lub eukariotycznych komórek i tam, jeżeli potrzeba był zintegrowany z genomem. Wektory tego rodzaju są chętnie replikowane i ulegają ekspresji w komórkach. Pośredni nośnik może być adaptowany, na przykład, do użycia w elektroporacji, w bombardowaniu mikropociskami, w podawaniu liposomów, przy transferze przy pomocy agrobakterii lub przy wstawianiu poprzez DNA lub RNA wirusów. Wektory obejmują plazmidy, fagemidy lub genomy wirusowe.
Kwasy nukleinowe kodujące antygen, zidentyfikowane zgodnie z wynalazkiem, mogą być użyte do transfekcji komórek gospodarza. Tutaj kwasy nukleinowe oznaczają zarówno zrekombinowany DNA jak i RNA. Zrekombinowany RNA może być otrzymany przez transkrypcję in vitro matrycy DNA. Co więcej, może być on modyfikowany przed zastosowaniem przez sekwencje stabilizujące, dodawanie czapeczki i poliadenylację.
Zgodnie z wynalazkiem, termin „komórka gospodarza” dotyczy każdej komórki, która może być transformowana lub transfekowana egzogennym kwasem nukleinowym. Zgodnie z wynalazkiem, termin „komórka gospodarza” obejmuje komórki priokariotyczne (np. E. coli) lub eukariotyczne (np. komórki dendrytyczne, komórki B, komórki CHO, komórki COS, komórki K562, komórki drożdży i komórki insektów). Szczególnie pierwszeństwo daje się komórkom ssaków, takich jak komórki ludzkie, mysie, chomików, świń, kóz, naczelnych. Komórki mogą pochodzić z różnych typów tkanek i zawierać komórki pierwotne i linie komórkowe.
Specyficzne przykłady obejmują kreatynocyty, leukocyty krwi obwodowej, komórki rdzeniowe szpiku kostnego i embrionalne komórki rdzeniowe. W dalszych postaciach, komórka gospodarza jest komórką prezentującą antygen, w szczególności komórką dendrytyczną, monocytem lub makrofagiem. Kwas nukleinowy może być obecny w komórce gospodarza w formie pojedynczej kopii lub dwóch lub więcej kopii i w pewnej postaci, jego ekspresja zachodzi w komórce gospodarza.
Zgodnie z wynalazkiem, termin „ekspresja” jest używany w jego najbardziej ogólnym znaczeniu i obejmuje wytwarzanie RNA lub RNA i białka. Obejmuje on także częściową ekspresję kwasów nukleinowych. Ponadto, ekspresja może być przeprowadzona przejściowo lub trwale. Preferowane układy ekspresji w komórkach ssaka obejmują pcDNA3.1 i pRc/CMV (Invitrogen, Carlsbad, CA), które zawierają dający się selekcjonować wskaźnik, taki jak gen przekazujący oporność na G418 (i w ten sposób znakują trwale linie transfekowanych komórek by mogły być selekcjonowane) i sekwencje enhancerpromotor cytomegalowirusa (CMV).
W tych przypadkach wynalazku, w których cząsteczka HLA prezentuje związany z nowotworem antygen lub jego część, wektor ekspresyjny może także zawierać sekwencję kwasu nukleinowego kodującego tę cząsteczkę HLA. Sekwencja kwasu nukleinowego, kodująca cząsteczkę HLA może być obecna w tym samym wektorze ekspresyjnym, co kwas nukleinowy kodujący związany z nowotworem antygen lub jego część lub oba kwasy nukleinowe mogą być obecne na różnych wektorach ekspresyjnych. W tym drugim przypadku, dwa ekspresyjne wektory mogą być kotransfekowane do komórki. Jeżeli w komórce gospodarza nie zachodzi ekspresja ani związanego z nowotworem antygenu lub jego części, ani cząsteczki HLA, oba kodujące kwasy nukleinowe są zatem transfekowane do komórki albo na tym samym wektorze ekspresyjnym albo na różnych wektorach ekspresyjnych. Jeżeli w komórce zachodzi już ekspresja cząsteczki HLA, tylko sekwencja kwasu nukleinowego kodująca związany z nowotworem antygen lub jego część może być transfekowana do komórki.
Wynalazek obejmuje także zestaw do powielania kwasu nukleinowego kodującego związany z nowotworem antygen. Takie zestawy zawierają na przykład, parę starterów do powielania, które hybrydyzują z kwasem nukleinowym kodującym związany z nowotworem antygen. Wskazane, żeby startery zawierały sekwencję 6-50, w szczególności 10-30, 15-30 i 20-30 przylegających nukleotydów kwasu nukleinowego i żeby nie zachodziły one na siebie, żeby zapobiec tworzeniu się dimerów starterów. Jeden ze starterów będzie hybrydyzował do jednej nici kwasu nukleinowego kodującego związany z nowotworem antygen a drugi starter będzie hybrydyzował do komplementarnej nici w układzie, który pozwala na powielanie kwasu nukleinowego kodującego związany z nowotworem antygen.
Cząsteczki „nonsensowne” lub „nonsensowne” kwasy nukleinowe mogą być użyte do regulowania, w szczególności redukowania ekspresji kwasu nukleinowego. Zgodnie z wynalazkiem, termin „nonsensowna cząsteczka” lub „nonsensowny kwas nukleinowy” dotyczy oligonukleotydu, który jest oligorybonukleotydem, oligodezoksyrybonukleotydem, zmodyfikowanym oligorybonukleotydem lub zmodyfikowanym oligodezoksyrybonukleotydem i który w fizjologicznych warunkach hybrydyzuje z DNA zawierającym określony gen lub z mRNA tego genu, w ten sposób hamuje transkrypcję tego genu i/lub translację tego mRNA. Zgodnie z wynalazkiem, „nonsensowna cząsteczka” obejmuje także
PL 219 018 B1 konstrukt, który zawiera kwas nukleinowy lub jego część w odwrotnej orientacji w stosunku do jego naturalnego promotora. Nonsensowny transkrypt kwasu nukleinowego lub jego części może tworzyć dupleks z naturalnie występującym mRNA określającym enzym i tak zapobiega gromadzeniu lub translacji mRNA do aktywnego enzymu. Inną możliwością jest użycie rybosomów do inaktywacji kwasu nukleinowego. Preferowane, zgodnie z wynalazkiem, nonsensowne oligonukleotydy mają sekwencję 6-50, w szczególności 10- 30, 15-30 i 20-30 przylegających nukleotydów docelowego kwasu nukleinowego i dobrze, jeżeli są całkowicie komplementarne do docelowego kwasu nukleinowego lub jego części.
W preferowanych postaciach, nonsensowny nukleotyd hybrydyzuje z N-końcem lub miejscem 5' powyżej, takim jak miejsce inicjacji translacji, miejsce inicjacji transkrypcji lub miejsce promotora. W dalszych postaciach, nonsensowny nukleotyd hybrydyzuje z niepodlegającym translacji regionem 3' lub miejscem składania mRNA.
W pewnej postaci, będący przedmiotem wynalazku oligonukleotyd składa się z rybonukleotydów, dezoksyrybonukleotydów lub ich kombinacji ze wzajemnym połączeniem końca 5' jednego nukleotydu z końcem 3' drugiego nukleotydu wiązaniem fosfodiestrowym. Te oligonukleotydy mogą być syntetyzowane sposobem konwencjonalnym lub wytwarzane techniką rekombinacji.
W preferowanych postaciach, będący przedmiotem wynalazku oligonukleotyd jest „modyfikowanym” oligonukleotydem. Tutaj oligonukleotyd może być modyfikowany bardzo różnymi sposobami, bez uszkadzania jego zdolności do wiązania jego celu, żeby na przykład zwiększyć jego stabilność lub efektywność terapeutyczną. Zgodnie z wynalazkiem, termin „zmodyfikowany oligonukleotyd” oznacza oligonukleotyd, w którym: (i) przynajmniej dwa z jego nukleotydów są wzajemnie połączone przez syntetyczne między nukleotydowe wiązanie (np. między nukleotydowe wiązanie, które nie jest fosfodiestrowym wiązaniem) i/lub (ii) grupa chemiczna, która zwykle nie znajduje się w kwasie nukleinowym, jest kowalencyjnie przyłączona do oligonukleotydu. Preferowanymi syntetycznymi wiązaniami między nukleotydowymi są wiązania tiofosforanów, alkilofosfonianów, ditiofosfornów, estrów fosforanowych, alkilotiofosfotionianów, fosfoamidów, karbaminianów, węglanów, trójestrów fosforanowych, acetoamidów, estrów karboksymetylowych i peptydów.
Termin „zmodyfikowany oligonukleotyd” obejmuje także oligonukleotydy mające kowalencyjnie zmodyfikowaną zasadę i/lub cukier. „Zmodyfikowane oligonukleotydy” obejmują na przykład oligonukleotydy z resztami cukrowymi, które są kowalencyjnie połączone z grupami organicznymi o małym ciężarze cząsteczkowym, innymi niż grupa hydroksylowa w pozycji 3' i grupa fosforanowa w pozycji 5'. Zmodyfikowane oligonukleotydy mogą zawierać na przykład 2'-O-alkilowaną resztę rybozy lub inny cukier zamiast rybozy, taki jak arabinoza.
Dobrze, jeżeli białka opisane zgodnie z wynalazkiem zostały wyizolowane. Terminy „izolowane białko” lub „izolowany polipeptyd” oznaczają, że białko lub polipeptyd zostało oddzielone od swojego naturalnego środowiska. Izolowane białko lub polipeptyd może być w stanie istotnie oczyszczonym. Termin „istotnie oczyszczony” oznacza, że białko lub polipeptyd jest istotnie wolny od innych substancji, z którymi jest powiązany w naturze lub in vivo.
Takie białka i polipeptydy mogą być użyte na przykład, do wytwarzania przeciwciał i w testach immunologicznych lub diagnostycznych lub w lecznictwie. Opisane zgodnie z wynalazkiem białka i polipeptydy mogą być izolowane z próbek biologicznych takich jak homogenaty tkankowe lub komórkowe i mogą także być otrzymane technikami ekspresji rekombinacyjnej w różnorodnych pro- lub eukariotycznych systemach ekspresji.
Dla celów niniejszego wynalazku „pochodne” białek lub polipeptydów albo sekwencji aminokwasów zawierają warianty wstawień aminokwasów, warianty delecji aminokwasów i/lub warianty podstawień aminokwasów.
Warianty wstawienia aminokwasów obejmują połączenia amino i/lub karboksy końca, a także wstawienie jednego lub dwóch lub więcej aminokwasów w określonej sekwencji aminokwasów. W przypadku mających wstawienie wariantów sekwencji aminokwasów, jedna lub więcej reszt aminokwasowych jest wstawiona w określone miejsce sekwencji aminokwasów, chociaż możliwe jest także losowe wstawienie z odpowiednim skriningiem otrzymanego produktu. Warianty delecji aminokwasu charakteryzują się usunięciem jednego lub więcej aminokwasów z sekwencji. Warianty substytucji aminokwasów charakteryzują się tym, że przynajmniej jedna reszta w sekwencji zostaje usunięta i inna reszta zostaje wstawiona na jej miejsce. Daje się pierwszeństwo modyfikacjom w pozycjach sekwencji aminokwasów, które między homologicznymi białkami i polipeptydami nie są konserwatywne. Daje się pierwszeństwo do zastępowania aminokwasów innymi, mającymi podobne właściwości
PL 219 018 B1 takie jak hydrofobowość, hydrofilowość, elektroujemność, objętość bocznego łańcucha i podobne (podstawienia konserwatywne). Podstawienia konserwatywne, na przykład, dotyczą zamiany jednego aminokwasu przez inny aminokwas wymieniony poniżej w tej samej grupie aminokwasów, które mają być podstawiane:
1. reszty małe alifatyczne, niepolarne lub o niewielkiej polarności: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly),
2. reszty ujemnie naładowane i ich amidy: Asn, Asp, Glu, Gln,
3. reszty dodatnio naładowane: His, Arg, Lys,
4. duże alifatyczne, niepolarne reszty: Met, Leu, Ile, Val, (Cys),
5. reszty duże aromatyczne: Phe, Tyr, Trp.
Z powodu ich udziału w architekturze białek trzy reszty są pokazane w nawiasach. Gly jest jedyną resztą bez łańcucha bocznego i dlatego przekazuje do łańcucha giętkość. Pro ma niezwykłą geometrię, która znacznie ogranicza łańcuch. Cys może tworzyć mostki dwusiarczkowe.
Opisane powyżej warianty aminokwasów mogą być łatwo otrzymane przy pomocy znanych technik syntezy peptydów, takich jak na przykład, synteza w fazie stałej (Merrifield, 1964) i podobnymi sposobami lub przez manipulację rekombinacją DNA. Techniki wprowadzania mutacji polegającej na substytucji we wcześniej określonym miejscu w DNA, które ma znaną lub częściowo znaną sekwencję, są dobrze znane i obejmują na przykład mutagenezę M13. Ta manipulacja sekwencją DNA w celu otrzymania białek mających substytucje, wstawienia lub delecje, jest opisana w szczegółach na przykład w Sambrook i wsp. (1989).
Zgodnie z wynalazkiem, „pochodne” białek, polipeptydów lub peptydów także zawierają pojedyncze lub wielokrotne substytucje, delecje i/lub addycje wszystkich związanych z enzymem cząsteczek takich jak węglowodany, lipidy i/lub białka, polipeptydy lub peptydy. Termin „pochodna” także rozciąga się na wszystkie funkcjonalne chemiczne równoważniki tych białek, polipeptydów lub peptydów.
Zgodnie z wynalazkiem, część lub fragment związanego z nowotworem antygenu ma funkcjonalne właściwości polipeptydu z którego pochodzi. Takie funkcjonalne właściwości obejmują interakcję z przeciwciałami, interakcje z innymi polipeptydami lub białkami, selektywne wiązanie kwasów nukleinowych i aktywność enzymatyczną. Szczególną własnością jest zdolność do formowania kompleksu z HLA i kiedy to stosowne, wytwarzanie odpowiedzi immunologicznej. Ta odpowiedź immunologiczna może być oparta na stymulowaniu cytotoksycznych lub pomocniczych komórek T. Będące przedmiotem wynalazku część lub fragment związanego z nowotworem antygenu, dobrze jeżeli zawiera sekwencję przynajmniej 6, w szczególności przynajmniej 8, przynajmniej 10, przynajmniej 12, przynajmniej 15, przynajmniej 20, przynajmniej 30 lub przynajmniej 50 kolejnych aminokwasów związanego z nowotworem antygenu.
Część lub fragment kwasu nukleinowego kodującego związany z nowotworem antygen, zgodnie z wynalazkiem, dotyczy części kwasu nukleinowego, która koduje przynajmniej związany z nowotworem antygen i/lub część lub fragment tego związanego z nowotworem antygenu, jak to zdefiniowano powyżej.
Izolacja i zidentyfikowanie genów kodujących związane z nowotworem antygeny stwarza także możliwość diagnozy chorób charakteryzujących się ekspresją jednego lub więcej związanych z nowotworem antygenów. Te sposoby zawierają oznaczanie jednego lub więcej kwasów nukleinowych, które kodują związany z nowotworem antygen i/lub oznaczanie tych kodowanych związanych z nowotworem antygenów i/lub pochodnych od nich peptydów. Kwasy nukleinowe mogą być oznaczane konwencjonalnie, włączając reakcję łańcuchową z polimerazą lub hybrydyzację ze znakowaną sondą. Związane z nowotworem antygeny lub pochodne od nich peptydy, mogą być oznaczane przez skrining surowicy odpornościowej pacjenta pod względem rozpoznawania antygenu i/lub peptydów. Mogą być one także oznaczane przez skrining komórek T pacjenta na specyficzną odpowiedź na odpowiedni związany z nowotworem antygen.
Niniejszy wynalazek umożliwia także, żeby białka wiążące się do opisanego tutaj, związanego z nowotworem antygenu były izolowane, włączając przeciwciała i wiążących komórkowych partnerów tych związanych z nowotworem antygenów.
Zgodnie z wynalazkiem, poszczególne postaci powinny obejmować dostarczanie „dominujących negatywnych” polipeptydów pochodnych od związanych z nowotworem antygenów. Dominujący negatywny polipeptyd jest wariantem nieaktywnego białka, które w drodze interakcji z komórkowym mechanizmem wypiera aktywne białko z jego interakcji z komórkowymi mechanizmami albo które konkuruje z aktywnym białkiem, przez co redukuje efekt tego aktywnego białka. Na przykład, dominująco negatywny receptor, który wiąże się z ligandem ale nie daje żadnego sygnału jako odpowiedzi na
PL 219 018 B1 wiązanie z ligandem, może redukować biologiczny efekt tego liganda. Podobnie, dominująco negatywna katalitycznie nieaktywna kinaza, która zazwyczaj wchodzi w interakcje z docelowymi białkami, ale nie fosforyluje tych docelowych białek, może zmniejszać fosforylację tych docelowych białek w odpowiedzi na sygnał komórkowy. Podobnie dominujący negatywny czynnik transkrypcyjny, który wiąże się do miejsca promotorowego w kontrolnym regionie genu ale nie zwiększa transkrypcji tego genu, może redukować efekt normalnego czynnika transkrypcyjnego przez okupowanie miejsca wiążącego promotor, bez zwiększania transkrypcji.
Wynikiem ekspresji dominującego negatywnego polipeptydu w komórce jest zmniejszenie funkcji aktywnych białek. Biegli pracownicy mogą otrzymać dominujące negatywne warianty białka, na przykład metodami konwencjonalnej mutagenezy i przez ocenianie dominujących negatywnych efektów wariantu polipeptydu.
Wynalazek także obejmuje substancje takie jak polipeptydy, które wiążą się do związanych z nowotworem antygenów. Takie substancje wiążące mogą być użyte na przykład w badaniach skriningowych do wykrywania związanych z nowotworem antygenów i kompleksów związanych z nowotworem antygenów z ich wiążącymi partnerami i w oczyszczaniu tych związanych z nowotworem antygenów i ich kompleksów z ich wiążącymi partnerami. Takie substancje mogą także być użyte do hamowania aktywności związanych z nowotworem antygenów, na przykład przez wiązanie do takich antygenów.
Tak więc, wynalazek zawiera substancje wiążące takie jak na przykład przeciwciała lub fragmenty przeciwciał, które są zdolne selektywnie wiązać się do związanych z nowotworem antygenów. Przeciwciała obejmują poliklonalne i monoklonalne przeciwciała otrzymywane konwencjonalnymi sposobami.
Takie przeciwciała mogą rozpoznawać białka w natywnym i/lub zdenaturowanym stanie (Anderson i wsp., J. Immunol. 143: 1899-1904, 1989; Gardsvoll, J. Immunol. Methods 234: 107-116, 2000; Kayyem i wsp., Eur. J. Biochem. 208: 1-8, 1992; Spiller i wsp., J. Immunol. Methods 224: 51-60, 1999).
Surowica odpornościowa, która zawiera specyficzne przeciwciała, wiążące się specyficznie do docelowego białka, może być otrzymana różnymi standardowymi sposobami; patrz na przykład „Monoclonal Antibodies: A Practical Approach” by Philip Shepherd, Christopher Dean ISBN 0-19-963722-9; „Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO” by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN 0879695447. Wskutek tego, możliwe jest wytworzenie powinowactwa i specyficznych przeciwciał, które rozpoznają kompleks błonowych białek w ich natywnej formie (Azorsa i wsp., J. Immunol. Methods 229: 35-48, 1999; Anderson i wsp., J. Immunol. 143: 1899-1904, 1989; Gardsvoll, J. Immunol. Methods 234: 107-116, 2000). Jest to w szczególności odpowiednie do wytwarzania przeciwciał, które są do użytku terapeutycznego ale także do wielu diagnostycznych zastosowań. Z tego względu możliwe jest immunizowanie całym białkiem, częściowymi sekwencjami zewnątrzkomórkowymi jak i komórkami, w których zachodzi ekspresja docelowej molekuły w fizjologicznie pozwijanej formie.
Monoklonalne przeciwciała są przygotowywane tradycyjnie przy użyciu technologii hybrydoma. (W celu znalezienia technicznych szczegółów patrz: „Monoclonal Antibodies: A practical Approach” by Philip Shepherd, Christopher Dean ISBN 0-19-963722-9; „Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO” by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN 0879695447; „Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO” by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN: 0879695447).
Wiadomo, że tylko mała część cząsteczki przeciwciała, paratop, jest włączona w wiązanie przeciwciała do jego epitopu (porównaj Clark, W. R. (1986), The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991), Essential Immunology, 7th Edition, Blackwell Scientific Publications, Oxford). Na przykład regiony pFc' i Fc są efektorami kaskady dopełniacza ale nie są włączone w wiązanie antygenu. Przeciwciało, z którego region pFc' został enzymatycznie usunięty albo takie, które zostało otrzymane bez regionu pFc', określane jako fragment F(ab')2, przenosi oba wiążące antygen miejsca kompletnego przeciwciała. Podobnie, przeciwciało z którego region Fc został enzymatycznie usunięty albo takie, które zostało otrzymane bez tego regionu Fc, określane jako fragment Fab, przenosi jedno miejsce wiążące antygen nietkniętej cząsteczki przeciwciała. Ponadto, fragmenty Fab składają się z kowalencyjnie związanego lekkiego łańcucha przeciwciała i części ciężkiego łańcucha tego przeciwciała, określanego jako Fd. Fragmenty Fd są głównymi determinantami specyficzności przeciwciała (pojedynczy fragment Fd może być związany z wieloma, do dziesięciu, różnymi lekkimi łańcuchami bez zmiany specyficzności przeciwciała) i wyizolowane fragmenty Fd kiedy są wyizolowane, zachowują zdolność do wiązania epitopu.
PL 219 018 B1
Wewnątrz części przeciwciała wiążącej antygen umiejscowione są regiony determinujące dopasowanie (CDRy), które oddziaływują bezpośrednio z epitopem antygenu i regionami zrębowymi (FRy), które utrzymują trzeciorzędową strukturę paratopu. I fragment Fd ciężkiego łańcucha, i lekki łańcuch immunoglobulin IgG zawierają cztery regiony zrębowe (FR1 do FR4), które w każdym przypadku są oddzielone przez trzy regiony determinujące dopasowanie (CDR1 do CDR3). Regiony CDRów, a w szczególności CDR3 a jeszcze dokładniej region CDR3 ciężkiego łańcucha w dużym zakresie są odpowiedzialne za specyficzność przeciwciała.
Wiadomo, że inne niż CDR regiony przeciwciał ssaków mogą być zastąpione przez podobne regiony przeciwciał o takiej samej lub różnej specyficzności, z zachowaniem specyficzności oryginalnego przeciwciała do epitopu. To daje możliwość rozwoju „humanizowanych” przeciwciał, w których inne niż ludzkie CDRy są kowalencyjnie połączone z regionami ludzkich FR i/lub Fc/pFc' w celu wytwarzania funkcjonalnych przeciwciał.
Jest to użyteczne w tak zwanej technologii „SLAM”, w której izolowane są komórki B z całkowitej krwi i komórki są monoklonowane. Następnie, supernatant pojedynczych komórek B jest analizowany pod względem ich specyficzności jako przeciwciał. W przeciwieństwie do technologii hybrydoma, różne regiony genu przeciwciała są powielane przy użyciu PCR pojedynczej komórki i klonowane do odpowiedniego wektora. W ten sposób dostarczanie monoklonalnych przeciwciał jest przyspieszane (de Wildt i wsp., J. Immunol. Methods 207: 61-67, 1997).
Jako inny przykład, WO nr 92/04381 opisuje wytwarzanie i stosowanie mysich humanizowanych przeciwciał RSV, w których przynajmniej część mysich regionów FR została zastąpiona regionami FR pochodzącymi od ludzi. Przeciwciała tego rodzaju, włączając w to fragmenty nietkniętych przeciwciał ze zdolnością wiązania antygenu, są często określane jako przeciwciała „chimerowe”
Wynalazek dostarcza także fragmentów F(ab')2, Fab, Fv i Fd przeciwciał, przeciwciał chimerowych, w których regiony Fc i/lub FR, i/lub CDR1, i/lub CDR2, i/lub lekkiego łańcucha CDR3 mogą być zastąpione homologicznymi ludzkimi lub innymi niż ludzkie sekwencjami, fragmentu F(ab')2 chimerowych przeciwciał, w którym regiony FR i/lub CDR1, i/lub CDR2, i/lub lekkiego łańcucha CDR3 mogą być zastąpione homologicznymi ludzkimi lub innymi niż ludzkie sekwencjami fragmentu Fab chimerowych przeciwciał, w którym regiony FR i/lub CDR1, i/lub CDR2, i/lub lekkiego łańcucha CDR3 mogą być zastąpione homologicznymi ludzkimi lub innymi niż ludzkie sekwencjami, fragmentu Fd chimerowych przeciwciał, w którym regiony FR i/lub CDR1, i/lub CDR2 mogą być zastąpione homologicznymi ludzkimi lub innymi niż ludzkie sekwencjami. Wynalazek zawiera także „jednołańcuchowe” przeciwciała.
Wynalazek obejmuje także polipeptydy, które wiążą się specyficznie do związanych z nowotworem przeciwciał. Polipeptydy wiążące substancje tego rodzaju mogą być dostarczone na przykład przez zdegenerowanie bibliotek peptydów, które mogą być otrzymane w prosty sposób w roztworze w unieruchomionej formie lub jako biblioteki obrazowania faga. Możliwe jest również sporządzenie kombinatoryjnych bibliotek peptydów z jednym lub więcej aminokwasami. Mogą także być otrzymane biblioteki peptoidów i niepeptydowych syntetycznych reszt.
Obrazowanie faga może być szczególnie efektywne w identyfikowaniu będących przedmiotem wynalazku peptydów wiążących. W tym połączeniu, na przykład, otrzymywana jest biblioteka faga (używając na przykład, fagów M13, fd lub lambda), która prezentuje wstawki długości od 4 do około 80 reszt aminokwasów. Selekcjonowane są następnie fagi, które noszą wstawki, które wiążą się do związanego z nowotworem antygenu. Ten proces może być powtarzany przez dwa lub więcej cykli ponownej selekcji wiązania fagów do związanego z nowotworem antygenu. Powtarzanie cykli powoduje zatężenie fagów noszących określone sekwencje. Analiza sekwencji DNA może być przeprowadzona żeby identyfikować sekwencję polipeptydów, których ekspresja zachodzi. Może być oznaczona najmniejsza liniowa część sekwencji wiążącej związanego z nowotworem antygenu. „Dwuhybrydowy system” drożdży także może być użyteczny do identyfikowania polipeptydów, które wiążą się do związanego z nowotworem antygenu. Opisane zgodnie z wynalazkiem związane z nowotworem antygeny lub ich fragmenty mogą być użyte do skriningu bibliotek peptydów, włączając w to biblioteki obrazowania fagów, żeby zidentyfikować i wybrać partnerów peptydów wiążących związane z nowotworem antygeny. Takie cząsteczki mogą być, na przykład, użyte do testów skriningowych, protokołów oczyszczania, do interferencji z działaniem związanego z nowotworem antygenu i do innych celów znanych biegłym pracownikom.
Opisane powyżej przeciwciała i inne wiążące cząsteczki mogą być użyte, na przykład, do identyfikacji tkanek, w których zachodzi ekspresja związanego z nowotworem antygenu. Przeciwciała mogą także być sprzężone ze specyficznymi diagnostycznymi substancjami, w celu uwidocznienia komóPL 219 018 B1 rek i tkanek, w których zachodzi ekspresja związanych z nowotworem antygenów. Mogą być one także sprzęgane z substancjami użytecznymi terapeutycznie. W nieograniczający sposób, substancje diagnostyczne zawierają: siarczan baru, kwas iocetamic, kwas iopanoic, ipodate wapnia, diatrizoate sodu (sól kwasu kwasu 3,5-diacetamido-2,4,6-trijodobenzoesowego), meglumine diatrizoate, metrizamide, tyropanoate sodu i radiodiagnostyczne włączając w to emitery pozytronowe, takie jak fluor-18 i węgiel-11, emitery gamma, takie jak jod-123, technet 99m, jod-131 i ind 111, nuklidy do jądrowego rezonansu magnetycznego, takie jak fluor i gadolin.
Zgodnie z wynalazkiem, termin „substancja użyteczna terapeutycznie” oznacza każdą cząsteczkę terapeutyczną, która jeśli jest pożądana, jest wybiórczo wprowadzana do komórki, w której zachodzi ekspresja jednego lub więcej związanych z nowotworem antygenów, włączając w to środki przeciwnowotworowe, radioaktywne znakowane jodem związki, toksyny, leki cytostatyczne lub cytolityczne etc. Na przykład, przeciwrakowe czynniki zawierają aminoglutetimid, azatioprynę, siarczan bleomycyny, bisulfan, karmustynę, chlorambucyl, cysplatynę, cyklofosfamid, cyklosporynę, cytarabidynę, dakarbazynę, etopozyd, fluorouracyl, interferon-α, lomustynę, merkaptopurynę, metotreksat, mitotan, prokarbazynę HCl, tioguaninę, siarczan winblastyny, i siarczan winkrystyny. Inne przeciwrakowe środki są opisane na przykład w Goodman i Gilman, „The Pharmacological Basis of Therapeutics”, 8 Edition, 1990, McGraw-Hill, Inc., w szczególności rozdział 52 (Antineoplastic Agents (Paul Calabresi and Bruce A. Chabner). Toksyny mogą być białkami takimi jak antywirusowe białko z rośliny Phytolacca, toksyna cholery, toksyna krztuśca, rycyna, gelonina, abryna, egzotoksyna dyfterytu lub egzotoksyna Pseudomonas. Reszty toksyn mogą także być radionuklidami emitującymi promieniowanie o wysokiej energii, takimi jak kobalt-60.
Zgodnie z wynalazkiem, termin „pacjent” oznacza człowieka, naczelne inne niż człowiek lub inne zwierzęta, w szczególności ssaki, takie jak krowa, koń, świnia, owca, koza, pies, kot i gryzonie, takie jak mysz i szczur. W szczególnie preferowanej postaci, pacjentem jest istota ludzka.
Zgodnie z wynalazkiem, termin „choroba” dotyczy każdego stanu patologicznego, w którym związane z nowotworem antygeny podlegają ekspresji lub podlegają nieprawidłowej ekspresji. Zgodnie z wynalazkiem, „nieprawidłowa ekspresja” oznacza, że ekspresja jest zmieniona, lepiej podniesiona w stosunku do stanu u zdrowego osobnika. Wzrost ekspresji dotyczy wzrostu o przynajmniej 10%, w szczególności o przynajmniej 20%, o przynajmniej 50% lub o przynajmniej 100%. W pewnej postaci, ekspresja związanego z nowotworem antygenu zachodzi tylko w tkankach chorego osobnika, podczas gdy ekspresja w tkankach zdrowego osobnika jest tłumiona. Przykładem takiej choroby jest rak, gdzie zgodnie z wynalazkiem termin „rak” obejmuje białaczkę, nasieniak, melanoma, potworniak, glejak, raka nerek, raka nadnerczy, raka tarczycy, raka jelit, raka wątroby, raka okrężnicy, raka żołądka, raka żołądkowo jelitowego, raka węzłów chłonnych, raka przełyku, raka odbytnicy, raka trzustki, raka ucha, raka nosa i gardzieli (ENT), raka piersi, raka prostaty, raka macicy, raka jajników i raka płuc oraz ich przerzuty.
Zgodnie z wynalazkiem, próbka biologiczna do użycia przy stosowaniu różnych opisanych tutaj sposobów, może być próbką tkanki i/lub próbką zawierającą komórki i może być otrzymana w konwencjonalny sposób taki jak biopsja tkanki, biopsja trepanem, przez pobranie krwi, zasysanie z oskrzeli, plwocina, mocz, fekalia lub inne płyny biologiczne.
Zgodnie z wynalazkiem, termin „komórka immunoreaktywna” oznacza komórkę, która przy odpowiedniej stymulacji, może dojrzewać do komórki odpornościowej (takiej jak komórka B, pomocnicza komórka T lub cytolityczna komórka T). Komórki immunoreaktywne zawierają komórki macierzyste układu krwiotwórczego CD34\niedojrzałe i dojrzałe komórki T oraz niedojrzałe i dojrzałe komórki B. Jeżeli pożądane jest wytwarzanie cytolitycznych lub pomocniczych komórek T rozpoznających związany z nowotworem antygen, immunoreaktywne komórki są kontaktowane z komórką, w której zachodzi ekspresja związanego z nowotworem antygenu w warunkach, które sprzyjają wytwarzaniu, różnicowaniu i/lub selekcji cytolitycznych komórek T i pomocniczych komórek T. Różnicowanie prekursorów komórki T w cytolityczną komórkę T, wtedy gdy są wystawione na działanie antygenu jest podobne do klonalnej selekcji układu immunologicznego.
Pewne sposoby terapii są oparte na reakcji układu immunologicznego pacjenta, która powoduje lizę komórek prezentujących antygen, takich jak komórki rakowe, które prezentują jeden lub więcej antygenów związanych z nowotworem. Na przykład, w tym połączeniu, autologiczne, cytotoksyczne limfocyty T, specyficzne dla kompleksu związanego z nowotworem antygenu i cząsteczki MHC są podawane pacjentowi, u którego występują komórkowe nieprawidłowości. Znane jest wytwarzanie takich cytotoksycznych limfocytów T in vitro. Przykład sposobu różnicowania komórek T może być
PL 219 018 B1 znaleziony w WO-A-9633265. Ogólnie, próbka zawierająca komórki takie jak komórki krwi jest pobierana od pacjenta i komórki są kontaktowane z komórką, która prezentuje kompleks i która może powodować namnażanie cytotoksycznych limfocytów T (np. komórki dendrytyczne). Docelowe komórki mogą być komórkami transfekowanymi, takimi jak komórka COS. Te transfekowane komórki prezentują pożądany kompleks na swojej powierzchni i kiedy są kontaktowane z cytotoksycznymi limfocytami T, stymulują namnażanie tych ostatnich. Klonalnie powiększone autologiczne, cytotoksyczne limfocyty T są następnie podawane pacjentowi.
W innym sposobie selekcji specyficznych w stosunku do antygenu cytotoksycznych limfocytów T, fluorogeniczne tetramery kompleksów cząsteczki MHC klasy 1/peptyd są używane do wykrywania klonów cytotoksycznych limfocytów T (Altman i wsp., Science 274: 94-96, 1996; Dunbar i wsp., Curr. Biol. 8: 413-416, 1998). Rozpuszczalne cząsteczki MHC klasy I są zwijane in vitro w obecności mikroglobulin β2 i peptydowego antygenu wiążącego się do tej cząsteczki klasy I. Kompleksy MHC/peptyd są oczyszczane a następnie znakowane biotyną. Tetramery są tworzone przez mieszanie kompleksów biotynylowany peptyd-MHC ze znakowaną awidyną (np. fikoerytryną) w stosunku molowym 4:1. Tetramery są następnie kontaktowane z cytotoksycznymi limfocytami T, takimi jak krew obwodowa lub węzły limfatyczne. Tetramery wiążą się do cytotoksycznych limfocytów T, które rozpoznają kompleks peptydowy antygen/MHC klasy I. Komórki, które są wiązane do tetramerów mogą być sortowane przy użyciu sortowania komórek kontrolowanego fluorescencyjnie, w celu wyizolowania reaktywnych cytotoksycznych limfocytów T. Izolowane cytotoksyczne limfocyty T mogą być namnażane in vitro.
W metodzie terapeutycznej określanej jako transfer adopcyjny (Greenberg, J. Immunol. 136 (5): 1917, 1986; Riddel i wsp., Science 257:238, 1992; Lynch i wsp., Eur. J. Immunol. 21: 1403-1410, 1991; Kast i wsp., Cell 59: 603- 614, 1989), komórki prezentujące pożądany kompleks (np. komórki dendrytyczne) są łączone z cytotoksycznymi limfocytami T pacjenta, który ma być leczony, co powoduje namnażanie specyficznych cytotoksycznych limfocytów T. Namnażane cytotoksyczne limfocyty T są następnie podawane pacjentowi, u którego występuje anomalia komórkowa charakteryzująca się określonymi nieprawidłowymi komórkami prezentującymi specyficzny kompleks. Następnie, cytotoksyczne limfocyty T powodują lizę nieprawidłowych komórek, osiągając w wyniku tego pożądany efekt terapeutyczny.
Często z repertuaru komórek T pacjenta mogą być namnażane tylko komórki T z niskim powinowactwem do specyficznego kompleksu tego rodzaju, ponieważ te z wysokim powinowactwem zostały wygaszone w związku z rozwojem tolerancji. Alternatywą może być tutaj transfer samego receptora komórki I. Dlatego też, komórki prezentujące pożądany kompleks (np. komórki dendrytyczne) są łączone z cytotoksycznymi limfocytami zdrowych osobników lub innych gatunków (np. myszy). To powoduje namnażanie specyficznych cytotoksycznych limfocytów T z wysokim powinowactwem, jeżeli limfocyty T pochodzą z organizmu donora, który nie miał poprzednio kontaktu ze specyficznym kompleksem. Receptor komórki T o wysokim powinowactwie, tych namnażanych specyficznych limfocytów jest klonowany. Jeżeli receptory komórek T o wysokim powinowactwie zostały sklonowane z innych gatunków, mogą być one humanizowane w różnym zakresie. Takie receptory komórki T, jeśli są pożądane, są następnie transdukowane poprzez transfer genowy, na przykład stosując wektory retrowirusowe, do komórek T pacjentów. Następnie, przeprowadzany jest adopcyjny transfer przy użyciu tych genetycznie zmienionych limfocytów T (Stanisławski i wsp., Nat. Immunol. 2: 962-70, 2001; Kessels i wsp., Nat. Immunol. 2: 957-61, 2001).
Powyższe terapeutyczne aspekty, opierają się na fakcie, że przynajmniej niektóre nieprawidłowe komórki pacjenta prezentują kompleks związanego z nowotworem antygenu i cząsteczki HLA. Takie komórki mogą być identyfikowane znanym samym przez się sposobem. Tak szybko jak komórki prezentujące kompleks zostały zidentyfikowane, mogą być one połączone z próbką od pacjenta, która zawiera cytotoksyczne limfocyty T. Jeżeli cytotoksyczne limfocyty T lizują komórki prezentujące kompleks, można przypuszczać, że związany z nowotworem antygen jest prezentowany.
Transfer adopcyjny nie jest jedyną formą terapii, jaka może być zastosowana zgodnie z wynalazkiem. Cytotoksyczne limfocyty T mogą także być wytwarzane in vivo znanym samym przez się sposobem. Pewien sposób używa komórek nieproliferacyjnych, w których zachodzi ekspresja kompleksu. Używane tutaj komórki będą tymi, w których zwykle zachodzi ekspresja kompleksu, takimi jak naświetlane komórki nowotworowe lub komórki transfekowane jednym lub oboma genami niezbędnymi do prezentacji kompleksu (np. antygenowy peptyd i cząsteczka prezentująca cząsteczkę HLA). Mogą być używane różne typy komórek. Poza tym, możliwe jest użycie wektorów, które przenoszą jeden lub oba będące przedmiotem zainteresowania geny. Szczególnie pierwszeństwo daje się wektoPL 219 018 B1 rom wirusowym lub bakteryjnym. Na przykład, kwasy nukleinowe kodujące związany z nowotworem antygen lub jego część mogą być funkcjonalnie połączone z sekwencjami promotora lub enhancera, które kontrolują ekspresję tego związanego z nowotworem antygenu lub jego fragmentu w określonych tkankach lub typach komórek. Kwas nukleinowy może być inkorporowany do wektora ekspresyjnego. Wektory ekspresyjne mogą być niezmodyfikowanymi, poza chromosomalnymi kwasami nukleinowymi, plazmidami lub genomami wirusowymi do których mogą być wstawione egzogenne kwasy nukleinowe. Kwasy nukleinowe, kodujące związany z nowotworem antygen, mogą także być wstawione do genomu retrowirusowego, pozwalając w ten sposób, żeby kwas nukleinowy był zintegrowany z genomem docelowej tkanki lub komórki. W tych układach, mikroorganizm, taki jak wirus krowianki, wirus pox, wirus opryszczki, retrowirus lub adenowirus przenosi będący przedmiotem zainteresowania gen i de facto „infekuje” komórki gospodarza. Inną korzystną formą jest wprowadzenie związanego z nowotworem antygenu w formie zrekombinowanego RNA, który może być wprowadzony do komórek na przykład przez transfer liposomalny lub przez elektroporację. W wyniku, komórki prezentują będący przedmiotem zainteresowania kompleks i są rozpoznawane przez autologiczne cytotoksyczne limfocyty T, które są potem namnażane.
Podobny efekt może być osiągnięty przez łączenie związanego z nowotworem antygenu lub jego fragmentu z adiuwantem, w celu umożliwienia inkorporacji do komórek prezentujących antygen in vivo. Związany z nowotworem antygen lub jego część może być przedstawiony jako białko, jako DNA (np. w wektorze) lub jako RNA. Związany z nowotworem antygen jest przetwarzany w celu otrzymania peptydowego partnera dla cząsteczki HLA, podczas gdy jego fragment może być prezentowany bez potrzeby dalszego przetwarzania. To drugie w szczególności w przypadku, jeżeli mogą się one wiązać do cząsteczek HLA. Pierwszeństwo daje się formom podawania, w których kompletny antygen jest przetwarzany in vivo przez komórkę dendrytyczną, ponieważ może to wytwarzać także odpowiedzi pomocniczej komórki T, które są potrzebne dla efektywnej odpowiedzi immunologicznej (Ossendrop i wsp., Immunol. Lett. 74: 75-9, 2000; Ossendrop i wsp., J. Exp. Med. 187: 693-702, 1998). Na ogół możliwe jest podanie pacjentowi efektywnej ilości związanego z nowotworem antygenu na przykład przez śródskórną iniekcję. Jednakże iniekcja może być także przeprowadzona do węzłów limfatycznych (Maloy i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 3299-303, 2001). Może być także przeprowadzona w połączeniu z odczynnikami, które ułatwiają wychwyt do komórek dendrytycznych. Preferowane antygeny związane z nowotworem zawierają te, które reagują z allogeniczną surowicą przeciwrakową lub z komórkami T wielu pacjentów z nowotworami. Jednakże szczególnie interesujące są te, przeciw którym poprzednio nie istniała spontaniczna odpowiedź immunologiczna. Możliwa oczywiście jest indukcja przeciwko tym odpowiedziom immunologicznym, które mogą lizować nowotwory (Keogh i wsp., J Immunol. 167: 787-96, 2001; Appella i wsp., Biomed Pept Proteins Nucleic Asids 1: 177-84, 1995; Wentworth i wsp., Mol. Immunol. 32: 603-12, 1995).
Opisane zgodnie z wynalazkiem kompozycje farmaceutyczne, mogą także być użyte do immunizacji jako szczepionki. Zgodnie z wynalazkiem, termin „immunizacja” lub „szczepienie” oznacza wzrost lub aktywację odpowiedzi immunologicznej na antygen. Możliwe jest użycie modeli zwierzęcych do testowania immunizującego wpływu na nowotwór, użycia związanego z nowotworem antygenu lub kodującego go kwasu nukleinowego. Na przykład, ludzkie komórki nowotworowe mogą być wprowadzone myszy w celu wytworzenia nowotworu i może być podany jeden lub więcej kwasów nukleinowych kodujących związany z nowotworem antygen. Jako pomiar efektywności immunizacji przez kwas nukleinowy, może być mierzony wpływ na komórki nowotworowe (na przykład zmniejszenie rozmiaru nowotworu).
Jako część kompozycji do immunizacji, jeden lub więcej związanych z nowotworem antygenów lub ich stymulujących fragmentów może być podana razem z jednym lub więcej adiuwantami w celu indukcji odpowiedzi immunologicznej lub w celu zwiększenia odpowiedzi immunologicznej. Adiuwant jest substancją, która jest inkorporowana do antygenu lub podawana razem z tym ostatnim i która zwiększa odpowiedź immunologiczną. Adiuwanty mogą zwiększać odpowiedź immunologiczną przez dostarczanie zbiornika antygenów (zewnątrz komórkowo lub w makrofagach), aktywującego makrofagi i/lub stymulującego określone limfocyty. Adiuwanty są znane i, w sposób nieograniczający, zawierają monofosforylowany lipid A (MPL, SmithKline Beecham), saponiny takie jak QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33739) QS7, QS17, QS18 i QS-L1 (So i wsp., Mol. Cells 7:178-186, 1997), niekompletny adiuwant Freunda, kompletny adiuwant Freunda, witaminę E, montanid, ałun, oligonukleotydy CpG (porównaj Kreig i wsp., Nature 374: 546-9, 1995) i różne emulsje wody i oleju przygotowywane z ulegających biologicznej degradacji olei, takich jak skwalen i/lub tokoferol.
PL 219 018 B1
Dobrze jeżeli peptydy są podawane w mieszaninie z DQS21/MPL. Typowo stosunek DQS21 dp MPL jest około 1:10 do 10:1, lepiej 1:5 do 5:1 a w szczególności około 1:1. Typowy preparat szczepionki do podawania ludziom, zawiera DQS21 i MPL w zakresie od około 1 μg do około 100 μg.
Mogą być także podane inne substancje, które stymulują immunologiczną odpowiedź pacjenta. Możliwe jest na przykład użycie do szczepienia cytokin ze względu na ich regulatorowe właściwości w stosunku do limfocytów. Takie cytokiny na przykład zawierają interleukinę-12 (IL- 12), która, co zostało wykazane, zwiększa ochronne działanie szczepionek (porównaj Science 268: 1432-1434, 1995), GM--CSF i IL-18.
Istnieje kilka związków, o których wiadomo, że zwiększają odpowiedź immunologiczną i dlatego mogą być używane do szczepienia. Te związki zawierają ko stymulujące cząsteczki dostarczane w formie białek lub kwasów nukleinowych. Przykładami takich ko stymulujących cząsteczek są B7-1 i B7-2 (odpowiednio CD80 i CD86), których ekspresja zachodzi w komórkach dendrytycznych (DC) i które oddziaływują z cząsteczką CD28, której ekspresja zachodzi w komórkach T. Te interakcje dostarczają kostymulacji (sygnał 2) do stymulowanej antygenem/MHC/TCR (sygnał 1) komórki T, zwiększając w ten sposób namnażanie tej komórki T i zwiększając działanie efektorowe. B7 oddziaływuje także z CTLA4 (CD152) w komórkach T i badania obejmujące ligandy CTLA4 i B7 wykazują, że interakcja CTLA4-B7 może zwiększać antynowotworową odporność i namnażanie CTL (Zheng, P. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (11): 6284-6289 (1998).
Zazwyczaj ekspresja B7 nie zachodzi w komórkach nowotworowych, tak więc nie są one komórkami aktywnie prezentującymi antygen dla komórek T (APC). Indukcja ekspresji B7 mogłaby umożliwić komórkom nowotworowym stymulowanie efektywniejszego namnażania cytotoksycznych limfocytów T i działanie efektorowe. Kostymulacja przez łączenie B7/IL-6/IL-12 ujawnia indukcję profilu IFN-gamma i cytokiny Th1 w populacji komórek T powodując zwiększenie aktywności komórek T (Gajewski i wsp., J. Immunol. 154: 5648 (1995)).
Całkowita aktywacja cytotoksycznych limfocytów T i całkowite działanie efektora wymaga włączenia komórek pomocniczych T poprzez oddziaływanie liganda CD40 na te pomocnicze komórki T i cząsteczkę CD40, których ekspresja zachodzi w komórkach dendrytycznych (Ridge i wsp., Nature 393: 474 (1998), Bennett i wsp., Nature 393: 478 (1998), Schonberger i wsp., Nature 393: 480 (1998). Mechanizm tego kostymulującego sygnału prawdopodobnie dotyczy zwiększenia produkcji B7 i towarzyszącej produkcji IL-6/IL-12 przez te dendrytyczne komórki (komórki prezentujące antygen). W ten sposób oddziaływanie CD40-CD40L uzupełnia oddziaływanie sygnału 1 (antygen/MHC-TCR) i sygnału 2 (B7-CD28).
Można by się spodziewać, że użycie przeciwciał przeciw CD-40 do stymulowania komórek dendrytycznych, bezpośrednio zwiększy reakcję na antygeny nowotworu, które są zwykle poza zakresem odpowiedzi zapalnej albo, które są prezentowane przez nieprofesjonalne komórki prezentujące antygen (komórki nowotworowe). W tych sytuacjach, sygnały kostymulujące pomocnicze T i B7 nie są dostarczane. Ten mechanizm może być użyty w połączeniu z terapiami opartymi o komórki dendrytyczne uderzane antygenem.
Wynalazek dostarcza także kwasów nukleinowych, polipeptydów lub peptydów do podawania. Polipeptydy i peptydy mogą być podawane w znany sposób. Kwasy nukleinowe mogą być podawane sposobami ex vivo, to jest przez usunięcie komórek pacjentowi, następnie genetyczną modyfikację tych komórek w celu wprowadzenia związanego z nowotworem antygenu i ponowne wprowadzenie zmienionych komórek pacjentowi. Ogólnie, obejmuje to wprowadzenie funkcjonalnej kopii genu do komórek pacjenta in vitro i ponowne wprowadzenie genetycznie zmienionych komórek pacjentowi. Funkcjonalna kopia genu jest pod funkcjonalną kontrolą elementów regulatorowych, które pozwalają na ekspresję genu w genetycznie zmienionych komórkach. Metody transfekcji i transdukcji są znane biegłym fachowcom. Wynalazek dotyczy także podawania kwasów nukleinowych in vivo przy użyciu wektorów, takich jak wirusy i liposomy z kontrolą celowania.
W preferowanej postaci, wirusowy wektor do podawania kwasu nukleinowego kodującego antygen związany z nowotworem jest wybierany z grupy składającej się z adenowirusów, wirusów pox, włączając wirus krowianki i osłabione wirusy pox, wirus Semliki Forest, retrowirusów, wirusa Sindbis i podobnych do wirusów cząstek Ty. Szczególnie daje się pierwszeństwo adeno- i retrowirusom. Retrowirusy mają zazwyczaj deficyt replikacji (to jest są niezdolne do wytwarzania cząstek zakaźnych).
W celu wprowadzenia, zgodnie z wynalazkiem, kwasów nukleinowych do komórek in vitro i in vivo mogą być używane różne sposoby. Sposoby tego rodzaju obejmują transfekcję strontów CaPO4 kwasów nukleinowych, transfekcję kwasów nukleinowych związanych z DEAE, transfekcję lub infekcję
PL 219 018 B1 powyższymi wirusami przenoszącymi będące przedmiotem zainteresowania kwasy nukleinowe, transfekcję przy udziale liposomów i temu podobne. W szczególnych postaciach, pierwszeństwo ma kierowanie kwasu nukleinowego do określonych komórek. W takich postaciach, nośnik używany do podawania kwasu nukleinowego do komórki (np. retrowirus lub liposom) może mieć związaną cząsteczkę kontroli celu. Na przykład, cząsteczka taka jak przeciwciało specyficzne dla białka powierzchniowego docelowej komórki lub ligand receptora docelowej komórki może być włączona lub przyłączona do nośnika kwasu nukleinowego. Preferowane przeciwciała zawierają przeciwciała, które wiążą się selektywnie do związanego z nowotworem antygenu. Jeżeli pożądane jest podawanie kwasu nukleinowego poprzez liposomy, do formuły liposomu mogą być włączone białka wiążące do powierzchniowego białka błonowego związanego z endocytozą, żeby umożliwić kontrolowanie celu i/lub wychwytu. Takie białka obejmują białka kapsydowe lub ich fragmenty, które są specyficzne dla określonego typu komórki, przeciwciała dla białek, które są internalizowane, białek umiejscowionych wewnątrz komórki i temu podobne.
Będące przedmiotem wynalazku kompozycje terapeutyczne mogą być podawane w farmaceutycznie kompatybilnych preparatach. Takie preparaty zwykle zawierają farmaceutycznie kompatybilne stężenia soli, substancje buforujące, środki konserwujące, nośniki, substancje uzupełniające, które zwiększają odporność, takie jak adiuwanty, CpG i cytokiny oraz gdzie jest to właściwe inne terapeutycznie aktywne związki.
Będące przedmiotem wynalazku terapeutycznie aktywne związki mogą być podawane jakąkolwiek konwencjonalną drogą, włączając iniekcje lub infuzje. Podawanie może być przeprowadzane na przykład doustnie, dożylnie, dootrzewnowo, domięśniowo, podskórnie lub śródskórnie. Dobrze, jeżeli przeciwciała są podawane terapeutycznie przez aerozol do płuc. Nonsensowne kwasy nukleinowe chętnie są podawane przez powolne dożylne podawanie.
Będące przedmiotem wynalazku kompozycje podawane są w efektywnych ilościach. „Efektywna ilość” odnosi się do ilości, która osiąga pożądaną reakcję lub pożądany efekt sama lub razem z kolejnymi dawkami. W przypadku leczenia określonej choroby lub określonego stanu charakteryzującego się ekspresją jednego lub więcej związanych z nowotworem antygenów, pożądana reakcja dotyczy hamowania przebiegu choroby. Obejmuje to zwolnienie rozwoju choroby, a w szczególności przerwanie rozwoju choroby. Pożądaną reakcją w leczeniu choroby lub stanu może także być opóźnienie rozpoczęcia lub zapobieżenie rozpoczęciu tej choroby lub tego stanu.
Efektywna ilość będącej przedmiotem wynalazku kompozycji będzie zależała od stanu, który ma być leczony, nasilenia choroby, indywidualnych parametrów pacjenta włączając w to wiek, fizjologiczną kondycję, rozmiar i wagę, czas trwania leczenia, typ towarzyszącej terapii (jeżeli jest obecny), specyficzną drogę podawania i temu podobne czynniki.
Korzystne jest, jeżeli będące przedmiotem wynalazku farmaceutyczne kompozycje są sterylne i zawierają terapeutycznie aktywną substancję, w efektywnej do wytworzenia pożądanej reakcji lub pożądanego efektu ilości. Podawane dawki będących przedmiotem wynalazku kompozycji, mogą zależeć od różnych parametrów, takich jak typ podawania, stan pacjenta, pożądany okres podawania etc. W przypadku, kiedy reakcja u pacjenta jest niewystarczająca po początkowej dawce, mogą być użyte wyższe dawki (lub efektywnie wyższe dawki osiągane przez inną, bardziej zlokalizowaną drogę podania).
Na ogół, w celu leczenia lub wytwarzania, lub zwiększania odpowiedzi immunologicznej, dawki związanego z nowotworem antygenu formułowane są i podawane w ilości 1 ng do 1 mg, lepiej 10 ng do 100 μg. Jeżeli pożądane jest podawanie kwasów nukleinowych (DNA i RNA) kodujących związane z nowotworem antygeny, formułowane i podawane są dawki 1 ng do 0,1 mg.
Będące przedmiotem wynalazku kompozycje farmaceutyczne na ogół są podawane w farmaceutycznie m zgodnych ilościach i w farmaceutycznie zgodnych kompozycjach. Termin „farmaceutycznie zgodne” dotyczy nietoksycznego materiału, który nie oddziaływuje z aktywnymi składnikami kompozycji farmaceutycznej. Zwykle preparaty tego rodzaju mogą zawierać sole, substancje buforujące, środki konserwujące, nośniki i jeżeli to właściwe, inne terapeutycznie aktywne związki. Jeżeli są stosowane w medycynie, sole powinny być farmaceutycznie zgodne. Jednakże sole, które nie są farmaceutycznie zgodne mogą być użyte do przygotowywania soli farmaceutycznie zgodnych i są włączone w wynalazek.
Farmakologicznie i farmaceutycznie zgodne sole tego rodzaju, zawierają w nieograniczający sposób, te przygotowywane z następujących kwasów: chlorowodorowego, bromowodorowego, siarkowego, azotowego, fosforowego, maleinowego, octowego, salicylowego, cytrynowego, mrówkowego,
PL 219 018 B1 malonowego, bursztynowego i temu podobnych. Farmaceutycznie zgodne sole mogą także być otrzymane jako sole metali alkalicznych lub sole metali ziem alkalicznych, takie jak sole sodowe, sole potasowe lub sole wapnia.
Będąca przedmiotem wynalazku kompozycja farmaceutyczna może zawierać farmaceutycznie zgodny nośnik. Zgodnie z wynalazkiem, „farmaceutycznie zgodny nośnik” odnosi się do jednego lub więcej zgodnych, stałych lub ciekłych wypełniaczy, rozcieńczalników lub substancji tworzących pojemnik, które są odpowiednie do podawania ludziom. Termin „nośnik” dotyczy organicznego lub nieorganicznego składnika, naturalnego lub syntetycznego, z którym aktywny składnik jest połączony w celu ułatwienia zastosowania. Składniki będącej przedmiotem wynalazku kompozycji farmaceutycznej są zazwyczaj takie, że nie występują oddziaływania, które w istotnym stopniu uszkadzają pożądaną farmaceutyczną skuteczność.
Będące przedmiotem wynalazku farmaceutyczne kompozycje mogą zawierać odpowiednie substancje buforujące, takie jak sole kwasu octowego, sole kwasu cytrynowego, sole kwasu bornego i sole kwasu fosforowego.
Kompozycje farmaceutyczne mogą, gdy jest to potrzebne, zawierać także odpowiednie środki konserwujące takie jak chlorek benzalkonium, chlorobutanol, paraben i timerosal.
Kompozycje farmaceutyczne są zwykle dostarczane w postaci jednostkowych dawek i mogą być otrzymywane w powszechnie znany sposób. Będące przedmiotem wynalazku kompozycje farmaceutyczne mogą być, na przykład, w formie kapsułek, tabletek, pastylek do ssania, zawiesin, syropów, eliksirów lub w formie emulsji.
Kompozycje odpowiednie do podawania pozajelitowego, zwykle zawierają sterylne wodne lub nie wodne preparaty aktywnego związku, które dobrze jeżeli są izotoniczne w stosunku do krwi biorcy. Przykładami zgodnych nośników i rozpuszczalników są roztwór Ringera i izotoniczny roztwór chlorku sodu. Dodatkowo, jako roztwór lub środowisko dla zawiesiny, używane są, zazwyczaj sterylne, zestalone oleje.
Niniejszy wynalazek jest szczegółowo opisany na figurach i w poniższych przykładach, które użyto tylko w celu zilustrowania wynalazku, które jednakże nie są ograniczające. Dzięki opisowi i przykładom, dalsze postaci, które są również włączone w wynalazek są dostępne dla biegłych pracowników.
Figury
Figura 1. Ekspresja mRNA GPR35 w biopsjach raka okrężnicy
Badania RT-PCR przy użyciu DNA wolnego od RNA wykazują ekspresję GPR35 w większości biopsji raka okrężnicy. W przeciwieństwie do tego, ekspresja jest niewykrywalna w normalnych tkankach. (1 - piersi, 2 - płuca, 3 - węzły chłonne, 4 - grasica, 5 - okrężnica, 6-15 - rak okrężnicy, 16 - ujemna próba kontrolna).
Figura 2. Ilościowa analiza PCR ekspresji GUCY2C mRNA w normalnych i nowotworowych tkankach
Badania PCR w czasie rzeczywistym ze starterami specyficznymi dla GUCY2C (SEQ ID Nr: 22-23) pokazują selektywną ekspresję mRNA w normalnym jelicie krętym, okrężnicy i we wszystkich próbkach raka okrężnicy otrzymanych metodą biopsji. Także różne ilości transkryptów GUCY2C wykrywano w przerzutach raka okrężnicy w wątrobie.
Figura 3. Identyfikacja specyficznych dla nowotworu wariantów składania GUCY2C
Produkty PCR z normalnych tkanek okrężnicy i raka okrężnicy klonowano i klony z obu grup sprawdzano przy użyciu analizy restrykcyjnej (EcoRI) i sekwencjonowano.
Figura 4. Selektywna ekspresja SCGB3A w prawidłowych płucach i w raku płuc
Analiza RT-PCR ze specyficznymi dla genu SCGB3A2 starterami (SEQ ID Nr: 37, 38) wykazuje powielanie DNA wyłącznie w normalnych płucach (pasmo 8, 14-15) i w biopsjach raka płuc (pasmo 16-24). (1 - wątroba-N, 2 - PBMC-N, 3 - węzły chłonne-N, 4 - żołądek-N, 5 - jądro-N, 6 - pierś-N, 7 nerki-N, 8 - płuco-N, 9 - grasica-N, 10 - jajnik-N, 12 - śledziona-N, 14-15 - płuco-N, 16-24 - rak płuc, 25 - kontrola negatywna).
Figura 5. Ekspresja claudin-18A2.1 w żołądku, przełyku, raku żołądka i raku trzustki
Analiza RT-PCR ze specyficznymi dla claudin-18A2.1 starterami (SEQ ID Nr: 39, 40), zgodnie z wynalazkiem, wykazuje wyraźnie zaznaczoną ekspresję claudin-18A2.1 w 8/10 pochodzących z biopsji próbkach raka żołądka i 3/6 pochodzących z biopsji próbkach raka trzustki. Odmienną ekspresję wykryto także w żołądku i normalnej tkance przełyku. W przeciwieństwie do tego, ekspresja nie została wykryta w jajniku i raku jajnika.
PL 219 018 B1
Figura 6. Ekspresja SLC13A1 w nerkach i rakowych komórkach nerki
Analiza RT-PCR ze specyficznymi w stosunku do SLC13A1 starterami (SEQ ID Nr: 49, 50) wykazuje ekspresję w 7/8 próbek komórek rakowych nerki. Poza tym, w prawidłowych tkankach transkrypty były wykrywane wyłącznie w nerkach. (1-2 - nerki, 3-10 - komórki rakowe nerek, 11 - pierś, 12 - płuco, 13 - wątroba, 14 - okrężnica, 15 - węzły chłonne, 16 - śledziona, 17 - przełyk, 18 - grasica, 19 tarczyca, 20 - PBMC, 21 - jajnik, 22 - jądra).
Figura 7. Ekspresja CLCA1 w okrężnicy, raku okrężnicy i raku żołądka
Badania RT-PCR ze starterami specyficznymi dla CLCA1 (SEQ ID Nr: 67, 68) potwierdzają selektywną ekspresję w okrężnicy i wykazują wysoką ekspresję w (3/7) badanych próbkach raka okrężnicy i (1/3) badanych próbek raka żołądka. Inne prawidłowe tkanki (NT) nie wykazują lub wykazują tylko bardzo słabą ekspresję.
Figura 8. Ekspresja FLJ21477 w okrężnicy i raku okrężnicy
Badania RT-PCR ze specyficznymi dla FLJ21477 starterami (SEQ ID Nr: 69, 70) wykazują selektywną ekspresję w okrężnicy i dodatkowo różne poziomy ekspresji w (7/12) badanych próbek raka okrężnicy. Inne prawidłowe tkanki (NT) nie wykazują ekspresji.
Figura 9. Ekspresja FLJ20694 w okrężnicy i raku okrężnicy
Badania RT-PCR ze specyficznymi dla FLJ20694 starterami (SEQ ID Nr: 71, 72) wykazują selektywną ekspresję w okrężnicy i dodatkowo różne poziomy ekspresji w (5/9) badanych próbek raka okrężnicy. Inne prawidłowe tkanki (NT) nie wykazują ekspresji.
Figura 10. Ekspresja von Ebner w żołądku, płucu i raku płuc
Badania RT-PCR ze specyficznymi dla von Ebner starterami (SEQ ID Nr: 73, 74) wykazują selektywną ekspresję w żołądku i w płucu i w (5/10) badanych próbek raka płuc. Inne prawidłowe tkanki (NT) nie wykazują ekspresji.
Figura 11. Ekspresja Plunc w grasicy, płucu i raku płuc
Badania RT-PCR ze specyficznymi dla Plunc starterami (SEQ ID Nr: 75, 76) wykazują selektywną ekspresję w grasicy i w płucu i w (6/10) badanych próbek raka płuc. Inne prawidłowe tkanki (NT) nie wykazują ekspresji.
Figura 12. Ekspresja SLC26A9 w płucu i raku płuc i tarczycy
Badania RT-PCR ze specyficznymi dla SLC26A9 starterami (SEQ ID Nr: 77, 78) wykazują selektywną ekspresję w płucu i we wszystkich (13/13) badanych próbkach raka płuc. Inne prawidłowe tkanki (NT) nie wykazują ekspresji za wyjątkiem tarczycy.
Figura 13. Ekspresja THC1005163 w żołądku, jajniku, płucu i raku płuc
Badania RT-PCR ze specyficznymi dla THC1005163 starterami (SEQ ID Nr: 79) i niespecyficznym oligo dT tag starterem wykazują ekspresję w żołądku, jajniku, płucu i (5/9) pochodzących z biopsji próbek raka płuc. Inne prawidłowe tkanki (NT) nie wykazują ekspresji.
Figura 14. Ekspresja LOC134288 w nerkach i komórkach rakowych nerki
Badania RT-PCR ze specyficznymi dla LOC134288 starterami (SEQ ID Nr: 80, 81) wykazują selektywną ekspresję w nerkach i w (5/8) pochodzących z biopsji badanych próbek komórek rakowych nerek.
Figura 15. Ekspresja THC943866 w nerkach i komórkach rakowych nerki
Badania RT-PCR ze specyficznymi dla THC943866 starterami (SEQ ID Nr: 82, 83) wykazują selektywną ekspresję w nerkach i w (4/8) pochodzących z biopsji badanych próbek komórek rakowych nerek.
Figura 16. Ekspresja FLJ21458 w okrężnicy i raku okrężnicy
Badania RT-PCR ze specyficznymi dla FLJ21458 starterami (SEQ ID Nr: 86, 87) wykazują selektywną ekspresję w okrężnicy i w (7/10) pochodzących z biopsji, badanych próbek raka okrężnicy. (1-2 - okrężnica, 3 - wątroba, 4 - PBMC, 5 - śledziona, 6 - prostata, 7 - nerki, 8 - jajniki, 9 - skóra, 10 - jelito cienkie, 11 - płuco, 12 - jądra, 13-22 - rak okrężnicy, 23 - kontrola ujemna).
Figura 17. Komórkowa lokalizacja GPR35
Immunofluorescencja do wykrywania komórkowej lokalizacji GPR35 po transfekcji plazmidu, którego ekspresja daje białko fuzyjne GPR35-GFP. Strzałki identyfikują związaną z błoną fluorescencję fluoryzującego GFP.
PL 219 018 B1
Figura 18. Ilościowa ekspresja GPR35
A. Ilościowy PCR-RT ze specyficznymi dla GPR35 starterami (SEQ ID Nr: 88, 89) wykazuje selektywną ekspresję w próbkach jelita, nowotworu okrężnicy i w przerzutach nowotworu jelita. Analizowano następujące prawidłowe tkanki: wątrobę, płuco, węzły chłonne, żołądek, śledzionę, nadnercza, nerki, przełyk, jajniki, jądra, grasicę, skórę, pierś, trzustkę, limfocyty, aktywowane limfocyty, prostatę, tarczycę, jajowód, endometrium, móżdżek, mózg.
B. Rozpowszechnienie GPR35 w nowotworach okrężnicy i ich przerzutach. Ekspresja GPR35 zachodzi w ponad 90% przypadków zarówno w nowotworze jak i w przerzutach.
Figura 19. Ilościowa ekspresja GUCY2C
Ilościowy RT-PCR ze specyficznymi dla GUCY2C starterami (SEQ ID Nr: 98, 99) wykazuje wysoką i selektywną ekspresję w prawidłowych tkankach żołądka i okrężnicy (A) i specyficzną ekspresję GUCY2C w próbkach nowotworu okrężnicy i żołądka (B). GUCY2C jest wykrywalny w 11/12 przypadkach raka okrężnicy i w 7/10 przypadkach raka żołądka.
Figura 20. Ilościowa ekspresja SCGB3A2
Ilościowy RT-PCR ze specyficznymi dla SCGB3A2 starterami (SEQ ID Nr: 103, 104) wykazuje selektywną ekspresję w próbkach płuc i próbkach raka płuc. 19/20 próbek raka płuc jest SCGB3A2 pozytywna, współczynnik nadekspresji SCGB3A2 wynosi przynajmniej 10 w więcej niż 50% próbek. Analizowano następujące prawidłowe tkanki: wątrobę, płuco, węzły chłonne, żołądek, śledzionę, nadnercza, nerki, przełyk, jajniki, jądra, grasicę, skórę, pierś, trzustkę, limfocyty, aktywowane limfocyty, prostatę, tarczycę, jajowód, endometrium, móżdżek, mózg.
Figura 21. Immunofluorescencja z przeciwciałami specyficznymi dla SCGB3A2
Komórki COS7 transfekowano plazmidem, który koduje białko fuzyjne SCGB3A2-GFP.
A. Wykrywanie transferowanego białka fuzyjnego przy użyciu specyficznej króliczej surowicy odpornościowej przeciwko SCGB3A2 (immunizacja przy użyciu SEQ ID Nr: 105).
B. Wykrywanie transfekowanego białka fuzyjnego przy użyciu fluorescencji GFP.
C. Nałożenie dwóch fluorescencji: z A i z B. Żółty kolor jest wytwarzany w punktach, w których nakładają się dwie fluorescencje i w ten sposób wykazuje specyficzność surowicy odpornościowej SCGB3A2.
Figura 22. Schematyczne opisanie wariantów składania claudin-18
Dwa warianty składania claudin-18, A1 i A2, różnią się N-końcem i różną zdolnością miejsc do glikozylacji.
Figura 23. Ilościowa ekspresja wariantu A1 claudin-18
Claudin-A1 jest silnie aktywowana w znacznej liczbie nowotworowych tkanek. Szczególnie silną ekspresję stwierdza się w nowotworach żołądka, nowotworach płuc, nowotworach trzustki i nowotworach przełyku.
Figura 24. Ilościowa ekspresja wariantu A2 claudin-18
Wariant A2, podobnie jak wariant A1 jest aktywowany w wielu nowotworach.
Figura 25. Zastosowanie przeciwciał specyficznych dla claudin-18A2 (domena pozakomórkowa) (Góra) Znakowanie komórek nowotworu żołądka claudin-18A2 pozytywnych (SNU-16) przy użyciu przeciwciał, które zostały wyprodukowane przez immunizację peptydem (SEQ ID Nr: 17). Znakowanie błony pojawia się szczególnie silnie w regionach interakcji komórka/komórka. A - przed surowicą odpornościową, MeOH; B - surowica odpornościowa MeOH, 5 μg/ml;
(Poniżej) Wykazanie specyficzności przeciwciał przez analizę kolokalizacji w komórkach 293T transfekowanych claudin-18A2-GFP. A - Claudin-18A2 GFP, B - anty-claudin-A2; C - nałożenie.
Figura 26. Zastosowanie przeciwciał specyficznych dla claudin-18A2 (domena pozakomórkowa)
Znakowanie błony komórek nowotworowych żołądka cłaudin-18A2 pozytywnych (SNU-16) przeciwciałami, które otrzymano przez immunizację peptydem (SEQ ID Nr: 113, domena pozakomórkowa umiejscowiona N-końcem). Do barwienia kontrastowego użyto przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciwko E-kadherynie. A - przeciwciało; B - barwienie kontrastowe; C - nałożenie.
Figura 27. Zastosowanie przeciwciał przeciw pozakomórkowej domenie C-końca claudin-18 (Lewy, góra i poniżej) Znakowanie błony komórek nowotworowych żołądka claudin-18A2 pozytywnych (SNU-16) przeciwciałami, które otrzymano przez immunizację peptydem (SEQ ID Nr: 116, domena pozakomórkowa umiejscowiona C-końcem). Do barwienia kontrastowego użyto przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciwko E-kadherynie (prawo góra, poniżej).
PL 219 018 B1
Figura 28. Zastosowanie specyficznych przeciwciał przeciw claudin-18A1 (Góra) Słabe lub brak znakowania komórek nowotworowych żołądka (SNU-16; claudinl8A2 pozytywne) przez przeciwciało, które zostało wytworzone przez immunizację specyficznym peptydem claudin-18A1 (SEQ ID Nr: 115). A - anty-E-kadheryna; B - anty-claudin-18A1; C - nałożenie.
(Poniżej) Wykazanie specyficzności przeciwciał przez analizę kolokalizacji w komórkach 293T transfekowanych claudin-18A1-GFP. A - GFP-claudin-18A1; B - anty-claudin-18A1; C - nałożenie.
Figura 29. Wykrywanie claudin-18A2 w Western blot
Western blot z lizatami z różnych zdrowych tkanek z przeciwciałem specyficznym dla claudin18A2 skierowanym przeciw epitopowi z SEQ ID Nr:17. 1 - żołądek; 2 - jądra; 3 - skóra; 4 - pierś; 5 wątroba; 6 - okrężnica; 7 - płuco; 8 - nerki; 9 - węzły chłonne.
Figura 30. Western blotting Claudin-18A2 z próbkami żołądka i nowotworów żołądka
Lizaty z próbek żołądka i próbek nowotworów żołądka przenoszono i testowano przy użyciu specyficznych dla claudin-18A2 przeciwciał przeciwko epitopowi mającemu SEQ ID Nr: 17. Nowotwory żołądka wykazują mniej glikozylowanych form claudin-18A2. Potraktowanie lizatów żołądka PNGazą F prowadzi do powstawania nisko glikozylowanych form. Lewa: 1 - żołądek Nr # A; 2 - żołądek Tu # A; 3 - żołądek Nr # B; 4 - żołądek Tu # B. Prawa: 1 - żołądek Nr # A; 2 - żołądek Nr # B 3 - żołądek Nr # B + PNGaza F; 4 - żołądek Tu # C; 5 - żołądek Tu # D; 6 - żołądek Tu # D + PNGaza F.
Figura 31. Ekspresja claudin-18 w nowotworach płuc
Nisko glikozylowane warianty claudin-18A2 wykrywano w raku płuc, zgodnie z fig. 30. 1 -żołądek Nr; 2 - żołądek Tu; 3-9 - płuco Tu.
Figura 32. Immunohistochemiczna analiza claudin-18 w tkance nowotworu żołądka przy użyciu przeciwciał specyficznych dla claudin-18A2
Figura 33. Pośrednia immunofluorescencja specyficznych dla żołądka komórek Snul6 z poliklonalną surowicą odpornościową specyficzną dla claudin-18
A. Znakowanie surowicą sprzed immunizacji, wytworzoną przed immunizacją; B. Znakowanie surowicą specyficzną dla claudin-18.
Figura 34. Ilościowa ekspresja SLC13A1
Ilościowy RT-PCR ze specyficznymi dla SLC13A1 starterami (SEQ ID Nr: 121, 122) wykazuje wysoką i selektywną ekspresję w prawidłowej tkance nerek (A) i specyficzną dla SLC13A1 w nowotworowych komórkach nerek (B). Transkrypcja SLC13Aljest wykrywalna w 5/8 przypadków nowotworowych komórek nerek.
Figura 35 Komórkowa lokalizacja SLC13A1
Immunofluorescencja w celu wykazania komórkowej lokalizacji SLC13A1 po transfekcji plazmidu, który dostarcza białka fuzyjnego SLC13A1-GFP. Związana z błoną fluorescencja białka fuzyjnego SLC13A1 jest w celu klarownego uwidocznienia (jako pierścień dookoła transfekowanej komórki).
Figura 36. Ilościowa ekspresja CLCA1
Ilościowy RT-PCR ze starterami specyficznymi dla CLCA1 (SEQ ID Nr: 125, 126) wykazuje wysoką i selektywną ekspresję w prawidłowej tkance okrężnicy i żołądka (A) i ekspresję specyficzną dla CLCA1 próbkach nowotworowej tkanki okrężnicy i żołądka (B). CLCA1 jest wykrywalne w 6/12 przypadkach raka okrężnicy i 7/10 raka żołądka.
Figura 37. Ilościowa ekspresja FLJ21477
Ilościowy RT-PCR ze starterami specyficznymi dla FLJ21477 (SEQ ID Nr: 127, 128) wykazuje wysoką i selektywną ekspresję w prawidłowej tkance okrężnicy i żołądka i słabą ekspresję w grasicy, przełyku i mózgu (A) i ekspresję specyficzną dla FLJ21477 w próbkach nowotworowej tkanki okrężnicy (B). FLJ21477 jest wykrywalne w 11/12 przypadkach raka okrężnicy.
Figura 38. Ilościowa ekspresja FLJ20694
Ilościowy RT-PCR ze starterami specyficznymi dla FLJ20694 (SEQ ID Nr: 129, 130) wykazuje wysoką i selektywną ekspresję w prawidłowej tkance okrężnicy i żołądka (A) i specyficzną dla FLJ20694 nadekspresję w próbkach nowotworowej tkanki okrężnicy i żołądka(B). FLJ20694 jest wykrywalne w 11/12 przypadkach raka okrężnicy i 7/ raka żołądka.
Figura 39. Ilościowa ekspresja FLJ21458
Ilościowy RT-PCR ze starterami specyficznymi dla FLJ21458 (SEQ ID Nr: 133, 134) wykazuje selektywną ekspresję w tkance jąder, żołądka i jelit. Dodatkowo specyficzne dla FLJ21458 transkrypty były wykrywalne w 20/20 przypadków raka okrężnicy i w 7/11 przerzutów raka okrężnicy. Analizowano
PL 219 018 B1 następujące prawidłowe tkanki: wątrobę, płuca, węzły chłonne, śledzionę, nadnercza, nerki, przełyk, jajniki, jądra, grasicę, skórę, pierś, trzustkę, limfocyty, aktywowane limfocyty, prostatę, tarczycę, jajowód, endometrium, móżdżek, mózg.
Figura 40. Immunofluorescencja ze specyficznymi dla FLJ21458 przeciwciałami (Góra) Komórki 293 transfekowano plazmidem, który koduje białko fuzyjne FLJ21458-GFP.
A: wykrywanie transfekowanego białka fuzyjnego przy użyciu specyficznej dla FLJ21458 króliczej surowicy odpornościowej (immunizacja SEQ ID Nr: 136).
B: wykrywanie transfekowanego białka fuzyjnego przez fluorescencję GFP.
C: nałożenie dwóch fluorescencji: z A i z B. Żółty kolor jest wytwarzany w punktach w których fluorescencje nałożyły się i to demonstruje specyficzność antysurowicy FLJ21458.
(Poniżej) Analiza komórek Snul6, które endogennie syntetyzują FLJ21458.
A: wykrywanie białka przy użyciu specyficznej dla FLJ21458 antysurowicy (immunizacja SEQ ID Nr: 136).
B: wykrywanie białka błonowego kadheryny-E.
C: nałożenie dwóch fluorescencji z A i z B. Żółty kolor jest wytwarzany w punktach, w których fluorescencje nałożyły się i demonstruje błonową lokalizację FLJ21458.
Figura 41. Sekwencje
Pokazane są sekwencje, do których robione są odnośniki.
Przykłady
Materiał i metody
Terminy „in silico”, „elektroniczny” i „wirtualne klonowanie” dotyczą wyłącznie stosowania opartych na bazach danych metod, które mogą być także zastosowane do symulacji doświadczalnych procesów laboratoryjnych.
Jeżeli nie jest to wyraźnie zdefiniowane inaczej, wszystkie inne terminy i oznaczenia używane są tak, jak jest to rozumiane przez biegłego pracownika. Wspomniane techniki i sposoby są przeprowadzane sposobem zrozumiałym samym przez się i są opisane na przykład w Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Mannual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Wszystkie sposoby, w których używa się zestawów i odczynników są wykonywane zgodnie z instrukcją producenta.
Strategie oznaczania nowych związanych z nowotworami genów oparte na eksploracji danych.
Łączone są dwie strategie in silico, mianowicie szukanie przy użyciu słowa kluczowego w GenBank i cDNAxProfiler. Stosując NCBI ENTREZ Search i Retrieval System (Http://www.ncbi.n)m.nih.gov/entrez) szukanie w GenBank jest przeprowadzane dla genów kandydujących, dla których zanotowano, że ich ekspresja zachodzi specyficznie w ściśle określonych tkankach (Wheeler i wsp., Nucleic Acids Resarch 28: 10-14, 2000).
Przeprowadzając poszukiwania przy użyciu słów kluczowych, takich jak „gen specyficzny dla okrężnicy”, „gen specyficzny dla żołądka”, „gen specyficzny dla nerek”, wybierano z baz danych geny kandydujące (GOI, geny będące przedmiotem zainteresowania). Poszukiwania ograniczono do części całkowitej informacji zawartej w tych bazach danych przez użycie ograniczeń „homo sapiens” dla organizmu i „mRNA” dla typu cząsteczki.
Listę znalezionych GOI sprawdzano przez określanie różnych nazw dla tej samej sekwencji i eliminowanie podobnych nadmiarów.
Wszystkie geny kandydujące otrzymane przez poszukiwanie przy użyciu słów kluczowych badano z kolei ze względu na ich tkankową dystrybucję przy użyciu metody „elektronicznego Northen'a” (eNorthen). eNorthen jest oparty na szeregowaniu sekwencji GOI przy użyciu bazy danych dla EST (sekwencja tag ulegająca ekspresji) (Adams i wsp., Science 252: 1651, 1991) (http://www.ncbi.ntm.nih.gov/BLAST). Pochodzenie tkankowe każdego EST, dla którego znaleziono, że jest homologiczny do wstawionego GOI może być oznaczone i w ten sposób suma wszystkich EST daje wstępną ocenę tkankowej dystrybucji GOI. Dalsze badania przeprowadzono tylko z tymi GOI, które nie miały homologii z EST z narządowo niespecyficznych prawidłowych tkanek. Ta ocena bierze także pod uwagę, że ta własność publiczna zawiera źle opisane biblioteki cDNA (Scheurle i wsp., Cancer Res. 60: 4037-4043, 2000) (www.fau.edu/cmbb/pubtications/cancergenes6.htm).
Drugą stosowaną metodą eksploracji danych był cDNAxProfiler NCBI Cancer Genome Anatomy Project (http://cgap.nci.nih.gov/Tissues/xProfiter) (Hillier i wsp., Genome Research 6: 807-828, 1996; Pennisi, Science 276: 1023-1024, 1997). Pozwala to, żeby przy użyciu operatorów logicznych, pule
PL 219 018 B1 transkryptomów zdeponowane w bazach danych były odnoszone jedna do drugiej. Zdefiniowaliśmy pulę A, do której zostały przypisane wszystkie biblioteki ekspresyjne otrzymane, na przykład z okrężnicy, z wyłączeniem bibliotek mieszanych. Wszystkie biblioteki cDNA z prawidłowych tkanek innych niż okrężnica, zostały przypisane do puli B. Ogólnie, używane były wszystkie biblioteki cDNA niezależnie od zasadniczych metod otrzymywania, ale przyjęto tylko te o rozmiarze > 1000. Pula B była cyfrowo odjęta od puli A za pomocą operatora BUT NOT. Znaleziony w ten sposób zbiór GOI poddano także badaniom eNorthen'a i potwierdzono danymi z piśmiennictwa.
Ta łączona eksploracja danych, będących własnością publiczną, obejmuje wszystkie z około 13000 pełnej długości genów i prognozuje poza tymi genami mającymi potencjalnie narządowo specyficzną ekspresję.
Wszystkie inne geny, przy zastosowaniu RT-PCR, były oceniane najpierw w tkankach prawidłowych. Wszystkie GOI, dla których udowodniono, że ulegają ekspresji w narządowo niespecyficznych, prawidłowych tkankach, musiały być uznane za fałszywie dodatnie i były wykluczane z dalszych badań. Pozostałe badano w dużym panelu szerokiego wachlarza tkanek nowotworowych. Udowodniono tutaj, że antygeny przedstawione poniżej są aktywowane w komórkach nowotworowych.
Ekstrakcja RNA, otrzymywanie cDNA wyposażonego w poli-d(T) i konwencjonalna analiza RT-PCR
Całkowity RNA ekstrahowano z natywnego materiału tkanki przy użyciu guanidynoizocjanianu jako czynnika chalotropowego (Chomczyński & Sacchi, Anal. Biochem. 162: 156-9, 1987). Po ekstrakcji z kwasowym fenolem i strąceniu izopropanolem, ten RNA rozpuszczano w DEPC traktowanym wodą. Syntezę pierwszej nici cDNA z 2-4 μg całkowitego RNA przeprowadzano w 20 μl mieszaniny reakcyjnej przy użyciu Superscript II (Invitrogen), zgodnie z instrukcją producenta. Użytym starterem był oligonukleotyd d(T). Integralność i jakość cDNA sprawdzano przez powielanie p53 w 30 cyklach PCR (sensowny CGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCG, nonsensowny CCTAACCAGCTGCCCAACTGTAG, temperatura hybrydyzacji 67°C).
Archiwum pierwszej nici cDNA otrzymano z kilku prawidłowych tkanek i z jednostek nowotworu. Do badań ekspresji, powielano 0,5 μl tych cDNA w 30 μl mieszaniny reakcyjnej używając specyficznych dla GOI starterów (patrz poniżej) i 1 U polimerazy DNA HotStarTaq (Qiagen). Każda mieszanina reakcyjna zawierała 0,3 mM dNTP, 0,3 μl każdego startera i 0,3 μl 10 x buforu reakcyjnego. Startery wybierano tak, żeby były umiejscowione w dwóch różnych eksonach, a eliminację interferencji zanieczyszczeniami genomowego DNA, powód fałszywie dodatnich wyników, potwierdzano przez testowanie użytego jako matrycy DNA, które nie zostało otrzymane drogą odwrotnej transkrypcji. Po 15 minutach w 95°C w celu zaktywowania polimerazy DNA HotStarTaq, przeprowadzano 35 cykli PCR (1 min w 94°C, 1 min w konkretnej temperaturze hybrydyzacji, 2 min w 72°C i końcowe wydłużanie w 72°C przez 6 min).
μl z tej reakcji frakcjonowano i analizowano na żelu agarozowym znakowanym bromkiem etydyny. Do analizy ekspresji odpowiednich antygenów używano następujących starterów we wskazanej temperaturze hybrydyzacji.
GPR35 (65°C)
Sensowny: 5'-AGGTACATGAGCATCAGCCTG-3'
Nonsensowny: 5'-GCAGCAGTTGGCATCTGAGAG-3'
GUCY2C (62°C)
Sensowny: 5'-GCAATAGACATTGCCAAGATG-3'
Nonsensowny: 5'-AACGCTGTTGATTCTCCACAG-3'
SCGB3A2 (66°C)
Sensowny: 5'-CAGCCTTTGTAGTTACTCTGC-3'
Nonsensowny: 5'-TGTCACACCAAGTGTGATAGC-3'
Claudin18A2 (68°C)
Sensownyl: 5'-GGTTCGTGGTTTCACTGATTGGGATTGC-3'
Nonsensowny: 5'-CGGCTTTGTAGTTGGTTTCTTCTGGTG-3'
Sensowny2: 5'- TGTTTTCAACTACCAGGGGC-3'
Nonsensowny: 5'- TGTTGGCTTTGGCAGAGTCC-3'
Claudin18A1 (64°C)
Sensowny: 5'-GAGGCAGAGTTCAGGCTTCACCGA-3'
Nonsensowny: 5'- TGTTGGCTTTGGCAGAGTCC-3'
SLC13A1 (64°C)
PL 219 018 B1
Sensowny: 5'-CAGATGGTTGTGAGGAGTCTG-3'
Nonsensowny: 5'-CCAGCTTTAACCATGTCAATG-3'
CLCA1 (62°C)
Sensowny: 5'-ACACGAATGGTAGATACAGTG-3'
Nonsensowny: 5'-ATACTTGTGAGCTGTTCCATG-3'
FLJ21477 (68°C)
Sensowny: 5'- ACTGTTACCTTGCATGGACTG-3'
Nonsensowny: 5'- CAATGAGAACACATGGACATG-3'
FLJ20694 (64°C)
Sensowny: 5'- CCATGAAAGCTCCATGTCTA-3'
Nonsensowny: 5'- AGAGATGGCACATATTCTGTC
Ebner (70°C)
Sensowny: 5'-ATCGGCTGAAGTCAAGCATCG-3'
Nonsensowny: 5'-TGGTCAGTGAGGACTCAGCTG-3'
Plunc (55°C)
Sensowny: 5'-TTTCTCTGCTTGATGCACTTG-3'
Nonsensowny: 5'-GTGAGCACTGGGAAGCAGCTC-3'
SLC26A9 f67°C)
Sensowny: 5'-GGCAAATGCTAGAGACGTGA-3'
Nonsensowny: 5'-AGGTGTCCTTCAGCTGCCAAG-3'
THC1005163 .(60°C)
Sensowny: 5'- GTTAAGTGCTCTCTGGATTTG-3'
L0C134288 (64°C)
Sensowny: 5'-ATCCTGATTGCTGTGTGCAAG-3'
Nonsensowny: 5'-CTCTTCTAGCTGGTCAACATC-3'
THC943866 (59°C)
Sensowny: 5'-CCAGCAACAACTTACGTGGTC-3'
Nonsensowny: 5'-CCTTTATTCACCCAATCACTC-3'
FLJ21458 (62°C)
Sensowny: 5'-ATTCATGGTTCCAGCAGGGAC-3'
Nonsensowny: 5'-GGGAGACAAAGTCACGTACTC-3'
Przygotowanie dowolnego startera cDNA będącego heksamerem i ilościowy PCR w czasie rzeczywistym
Ekspresja poszczególnych genów była oznaczana ilościowo przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym. Produkty PCR wykrywano używając SYBR Green jako wtrąconego barwnika reporterowego. Fluorescencja reportera SYBR Green jest tłumiona w roztworze i barwnik jest aktywny tylko po związaniu do fragmentów dwuniciowego DNA. Do ilościowego oznaczenia używany jest wzrost fluorescencji SYBR Green powstałej w wyniku specyficznego powielania przy użyciu starterów specyficznych dla GOI, po każdym cyklu PCR. Ekspresja docelowego genu jest oznaczana bezwzględnie lub względem ekspresji kontrolnego genu, który wykazuje stałą ekspresję w tkance, która ma być badana. Ekspresję mierzono po standaryzacji próbek przeciw RNA 18s tzw. Genu housekeeping (gen kodujący białko konstytutywne) używając metody ΔΔ-C (PE Biosystems, USA). Reakcję przeprowadzano w duplikatach a oznaczenia w triplikatach. Zestawu QuantiTec SYBR Green PCR (Qiagen, Hilden) używano zgodnie z instrukcją producenta. cDNA syntetyzowano stosując zestaw cDNA Archive Kit (PE Biosystems, USA) o wysokiej wydajności i używając starterów heksamerowych zgodnie z instrukcją producenta. Do PCR każda 5 μl porcja rozcieńczonego cDNA była stosowana w całkowitej objętości 25 μΙ: sensowny starter 300 nM, nonsensowny starter 300 nM; początkowa denaturacja 15 min w 95°C; 30 sek. w 95°C; przyłączanie przez 30 sek.; 30 sek. w 72°C; 40 cykli. Sekwencje używanych starterów pokazano w odpowiednich przykładach.
Klonowanie i analiza sekwencji
Klonowanie genów pełnej długości i fragmentów genów miało miejsce przy użyciu konwencj onalnych metod. Żeby ustalić sekwencję, odpowiednie antygeny powielano używając polimerazy proofreading pfu (Stratagene). Po zakończeniu PCR adenozyna była ligowana przy użyciu polimerazy DNA HotStarTaq do końców amplikonu, żeby zgodnie z instrukcjami producenta, sklonować fragmenty wektora TOPOTA. Sekwencjonowanie przeprowadzano przy użyciu komercyjnego serwisu. Sekwencje analizowano używając konwencjonalnych programów predykcyjnych i algorytmów.
PL 219 018 B1
Western blotting
Komórki z hodowli komórkowej (endogenna ekspresja docelowego genu lub synteza docelowego białka po transfekcji wektora ekspresyjnego, który koduje docelowe białko) lub próbki tkanek, które mogą zawierać docelowe białko są lizowane w 1% roztworze SDS. SDS denaturuje białka obecne w lizacie. Lizaty doświadczalnej mieszaniny są frakcjonowane wg wielkości przy użyciu elektroforezy na 8-15% denaturującym żelu poliakrylamidowym (zawierającym 1% SDS), zależnie od oczekiwanego rozmiaru białka (elektroforeza na żelu poliakrylamidowym w obecności SDS, SDS-PAGE). Białka są następnie przenoszone metodą półsuchego elektroblottingu (Biorad) na membranę nitrocelulozową (Schleicher & Schull), na której pożądane białko może być wykryte. W tym celu membrana jest wstępnie blokowana (np. mlekiem w proszku) a następnie inkubowana ze ściśle określonym przeciwciałem w rozcieńczeniu 1:20-1:200 (zależnie od specyficzności przeciwciała) przez 60 minut. Po przemyciu membrana jest inkubowana ze sprzężonym ze wskaźnikiem (np. enzymem, takim jak peroksydaza lub fosfataza alkaliczna) przeciwciałem drugorzędowym, które rozpoznaje przeciwciało pierwszorzędowe. Następnie, po kolejnym przemywaniu, docelowe białko jest wizualizowane na membranie w wyniku barwnej li chemiluminescencyjnej reakcji za pomocą reakcji enzymatycznej (np. ECL, Amersham Bioscience). Wynik jest dokumentowany poprzez zrobienie zdjęć odpowiednią kamerą.
Analiza modyfikacji białek zazwyczaj jest wykonywana metodą Western blotting. Glikozylacje, które zwykle mają rozmiar kilku kDa, dają w wyniku większą całkowitą masę docelowego białka, które może być frakcjonowane przy użyciu SDS-PAGE. Do wykrycia specyficznych O- i N-glikozydowych wiązań, lizaty białkowe z komórek lub tkanek są przed denaturacją SDS inkubowane z O- lub N-glikozydazami (zgodnie z odpowiednimi instrukcjami producenta, np. PNgasa, endoglikozydaza F, endoglikozydaza H, Roche Diagnostics). Po tym stosowany jest Western blotting, tak jak opisano powyżej. Tak więc, jeżeli zmniejsza się rozmiar docelowego białka po inkubacji z glikozydazą, możliwe jest wykrycie specyficznej glikozylacji i w ten sposób nowotworowe specyficznej modyfikacji. Dokładna pozycja glikozylowanego aminokwasu może być przewidywana przy użyciu algorytmów i programów predykcyjnych.
Immunofluorescencja
Używane są komórki ustalonych linii komórkowych, które albo syntetyzują endogennie docelowe białko (detekcja RNA metodą RT-PCR lub białka metodą Western blotting) lub też zostały transfekowane DNA plazmidu przed IF. Opracowanych jest wiele różnorodnych sposobów (np. elektroporacja, transfekcja za pomocą liposomów, strącanie fosforanem wapnia) transfekowania linii komórkowych (np. Lemoine i wsp. Methods Mol. Biol. 1997; 75: 441-7). Transfekowany plazmid może w metodach immunofluorescencyjnych kodować niezmodyfikowane białko lub też sprzęgać różne aminokwasowe wskaźniki z docelowym białkiem. Najważniejszymi markerami są na przykład fluoryzujące „zielone białko fluorescencyjne (GFP) w jego różnych w różny sposób fluoryzujących formach i krótkie sekwencje peptydowe 6-12 aminokwasów dla których dostępne są specyficzne przeciwciała o wysokim powinowactwie. Komórki, które syntetyzują docelowe białko są utrwalane w paraformaldehydzie, saponinie lub metanolu. Jeżeli jest to wymagane, komórki mogą być permeabilizowane przez inkubację z detergentami (np. 0,2% Triton X-100). Po utrwalaniu/permeabilizacji komórki są inkubowane z przeciwciałami pierwszorzędowymi, które są skierowane przeciwko białku docelowemu jako jednemu ze sprzężonych markerów. Po przemyciu, mieszanina jest inkubowana z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym ze wskaźnikiem fluorescencyjnym (np. fluoresceiną, Texas Red, Dako), które wiąże się do przeciwciała pierwszorzędowego. Znakowane w ten sposób komórki są następnie pokrywane warstwą glicerolu i analizowane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego zgodnie z instrukcjami producenta. Emisja specyficznej fluorescencji jest w tym przypadku osiągana przez specyficzne pobudzenie zależne od użytych substancji. Analiza zazwyczaj zezwala na rzetelną lokalizację białka docelowego, właściwości przeciwciała i białka docelowego są potwierdzane w podwójnym znakowaniu, żeby wyznakować w uzupełnieniu do białka docelowego także sprzężone aminokwasowe wskaźniki lub inne wskaźniki białkowe, których lokalizacja została opisana w piśmiennictwie. GFP i jego pochodne reprezentują specjalny przypadek, może być on bezpośrednio pobudzany i może sam fluoryzować tak, że przeciwciała nie są konieczne do detekcji.
Immunohistochemia
IHC służy szczególnie do (1) dawania możliwości oznaczenia ilości docelowego białka w tkankach nowotworowych i prawidłowych, (2) analizowania, jak wiele komórek w tkance nowotworowej i zdrowej syntetyzuje docelowy gen i/lub określenia typu komórki w tkance (komórki nowotworowe, zdrowe), w których białko jest wykrywalne.
PL 219 018 B1
Różne procedury muszą być używane dla poszczególnych przeciwciał (np. „Diagnostic
Inmmnochemistry by David J., MD Dabbs ISBN: 0443065667 lub Microscopy, Immunochemistry and Antigen Retrieval Methods: For Light and Electron Microscopy ISBN: 0306467704).
Immunhistochemia (IHC) ściśle określonych próbek tkanek służy do wykrywania białka w odpowiedniej tkance. Celem tego sposobu jest zidentyfikować lokalizację białka w funkcjonalnie nietkniętej całej tkance.
IHC jest szczególnie przydatny, ze względu (1) na zdolność oznaczania ilości docelowego białka w tkankach nowotworowych i prawidłowych, (2) analizowanie jak wiele komórek w tkance nowotworowej i w tkance zdrowej syntetyzuje gen docelowy i (3) określania w tkance typu komórek (nowotwór, zdrowe komórki), w których białko docelowe jest wykrywalne. Alternatywnie, ilość białka docelowego genu może być zmierzona ilościowo przy zastosowaniu immunofluorescencji tkankowej przy użyciu kamery cyfrowej z odpowiednim oprogramowaniem (np. Tillvision, Tillphotonics, Germany). Opis tej techniki jest często publikowany i szczegóły dotyczące znakowania oraz mikroskopii mogą być znalezione na przykład w „Diagnostic Immunochemistry” David J., MD Dabbs ISBN: 0443065667 lub „Microscopy, Immunochemistry and Antigen Retrieval Methods: For Light and Electron Microscopy” ISBN: 0306467704. Należy zwrócić uwagę, że ze względu na różne właściwości przeciwciał, w celu otrzymania rzetelnego wyniku, muszą być używane różne procedury (przykład jest opisany poniżej).
Zazwyczaj, w IHC stosowane są histologicznie określone tkanki nowotworowe i jako referencyjne stosowane są porównywalne zdrowe tkanki. Poza tym, możliwe jest użycie jako kontroli pozytywnych i negatywnych linii komórkowych, w których obecność genu docelowego jest znana dzięki analizie RT-PCR. Zawsze musi być uwzględnione kontrolne tło.
Stosowana jest utrwalona tkanka (np. utrwalanie substancjami zawierającymi aldehyd, formaldehyd, paraformaldehyd lub w roztworach alkoholu) lub gwałtownie zamrożone skrawki o grubości 1-10 μm, na szklanym podłożu. Próbki zatopione w parafinie są odparafinowywane przy użyciu na przykład ksylenu. Próbki są przemywane TBS-T i blokowane surowicą. Potem następuje inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym (rozcieńczenie 1:2 do 1:2000) przez 1-18 godzin, zazwyczaj stosowane są przeciwciała oczyszczone na kolumnie powinowactwa. Po przemyciu następuje około 30-60 minut inkubacji z przeciwciałem drugorzędowym, które jest sprzężone z fosfatazą alkaliczną (alternatywnie na przykład z peroksydazą) i jest skierowane przeciwko przeciwciału pierwszorzęd owemu. Następnie przeprowadza się reakcję barwną przy użyciu barwnych substratów, które są przekształcane przez przyłączone enzymy (porównaj na przykład Shin i wsp., J. Hostochem. Cytochem. 39: 741-748, 1991; Shin i wsp., Lab. Invest. 64: 693-702, 1991). W celu wykazania specyficzności przeciwciała, reakcja może być blokowana przez uprzednie dodanie immunogenu.
Immunizacja (Patrz także Monoclonal Antibodies: A Practical Approach Philip Shepherd, Christopher Dean, isbn 0-19-963722-9; Antibodies: A Laboratory Manual Ed Harlow, David Lane ISBN: 0879693142; Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO. Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN: 0879695447).
Proces otrzymywania przeciwciał jest krótko opisany poniżej, a szczegóły mogą być znalezione w cytowanych publikacjach. Najpierw zwierzęta (np. króliki) są immunizowane przez pierwszą iniekcję pożądanego białka docelowego. Odpowiedź immunologiczna zwierząt na immunogen może być podwyższona przez drugą i trzecią immunizację w określonym okresie czasu (około 2-4 tygodni po poprzedniej immunizacji). Raz za razem, po określonych, różnych okresach czasu (pierwsze skrwawianie po 4 tygodniach, później co około dwa tygodnie, razem do 5 razy), krew jest pobierana od zwierząt i otrzymywana jest z niej surowica odpornościowa.
Zwierzęta są zazwyczaj immunizowane jednym z czterech dobrze opracowanych sposobów, dostępne są także inne sposoby. Co więcej, możliwe jest immunizowanie peptydami specyficznymi dla białka docelowego, całkowitym białkiem lub niepełnymi, pozakomórkowymi sekwencjami białka, które może być identyfikowane eksperymentalnie lub poprzez programy prognozujące.
(1) W pierwszym przypadku, peptydy (długość: 8-12 aminokwasów) sprzężone z KLH (hemocjanina pijawki w kształcie dziurki od klucza) syntetyzowane są przy użyciu znormalizowanych metod i te peptydy używane są do immunizacji. Zazwyczaj przeprowadzane są 3 immunizację ze stężeniem 5-1000 μg/immunizację. Immunizacja może także być przeprowadzana jako usługa dostawcy.
(2) Alternatywnie, immunizacja może być przeprowadzana z białkami zrekombinowanymi. W tym celu sklonowane DNA genu docelowego jest klonowane do wektora ekspresyjnego i docelowe białko jest syntetyzowane w analogii do warunków poszczególnych wytwórców (np. Roche DiagnostiPL 219 018 B1 cs, Invitrogen, Clontech, Qiagen) na przykład in vitro bez komórek, w bakteriach (np. E. coli), w drożdżach (np. S. pombe), w komórkach insektów lub w komórkach ssaków. Po syntezie w jednym z tych systemów, białko docelowe jest oczyszczane, w tym przypadku zazwyczaj przy użyciu znormalizowanych metod chromatograficznych. W związku z tym, możliwe jest także użycie do immunizacji białek, które mają molekularne zamocowanie jako ułatwienie oczyszczania (np. His tag, Qiagen; FLAG tag, Roche Diagnostics; białka fuzyjne Gst). Ogromna liczba procedur może być znaleziona na przykład w „Current Protocols in Molecular Biology” John Wiley & Sons Ltd., Wiley Interscience.
(3) Jeżeli dostępna jest linia komórkowa, która syntetyzuje endogennie pożądane białko, ta linia komórkowa także może być użyta do wytwarzania specyficznej surowicy odpornościowej. W tym przypadku, immunizacja ma miejsce podczas 1-3 iniekcji, w każdym przypadku z około 1-5 x 107 komórek.
(4) Immunizacja może także mieć miejsce po iniekcji DNA (immunizacja DNA). W tym celu gen docelowy początkowo jest klonowany do wektora ekspresyjnego tak, że sekwencja docelowa jest pod kontrolą silnego eukariotycznego promotora (np. promotora CMV). Następnie, 5-10 μg DNA jest transferowanych jako immunogen przy użyciu „strzelby genowej” do regionów organizmu (np. mysz, królik), gdzie są naczynia włosowate z silnym przepływem krwi. Transferowane DNA jest pobierane przez komórki zwierzęce, zachodzi ekspresja genu docelowego i w końcu u zwierzęcia rozwija się odpowiedź immunologiczna na gen docelowy (Jung i wsp., Mol. Cells 12: 41-49, 2001; Kasinrerk i wsp.,
Hybrid Hybridomics 21: 287-293, 2002).
Kontrola jakości surowicy poliklonalnej lub przeciwciała
Najodpowiedniejsze do wykazania specyficzności są badania oparte na hodowli komórkowej z późniejszym Western blotting (różne warianty są opisane na przykład w „Current Protocols in Protein Chemistry”, John Wiley & Sons Ltd., Wiley InterScience). W celu wykazania, komórki są transfekowane, będącym pod kontrolą silnego eukariotycznego promotora (na przykład promotora cytomegalowirusa) cDNA dla białka docelowego. Opracowana jest duża różnorodność metod transfekowania linii komórkowych DNA (np. elektroporacja, transfekcja w oparciu o liposomy, strącanie fosforanem wapnia) (np. Lemoine i wsp., Methods Mol. Biol. 75: 441-7, 1997). Możliwe jest także alternatywne użycie linii komórkowych, w których endogennie zachodzi ekspresja docelowego genu (wykazanie przez specyficzne dla docelowego genu RT-PCR). W idealnym przypadku, jako kontrola, homologiczne geny także są transfekowane w doświadczeniu, żeby móc wykazać w późniejszym Western blot specyficzność analizowanego przeciwciała.
W późniejszym Western blot, komórki z hodowli komórkowej lub próbek tkanki, które mogą zawierać białko docelowe, są lizowane w 1% roztworze SDS i w wyniku tego białka są denaturowane. Lizaty są frakcjonowane według wielkości przy użyciu elektroforezy na 8-15% denaturującym żelu poliakrylamidowym (zawierającym 1% SDS) (elektroforeza na żelu poliakrylamidowym z dodatkiem SDS, SDS-PAGE). Białka są następnie przenoszone przy użyciu jednej z wielu metod blottingu (np. pół-suchy elektroblot; Biorad) na specyficzne membrany (np. nitroceluloza, Schleicher & Schul). Na tej membranie pożądane białko może być uwidocznione. W tym celu membrana jest najpierw przez 60 minut inkubowana z przeciwciałem, które rozpoznaje docelowe białko (rozcieńczenie 1:20-1:200, zależnie od specyficzności przeciwciała). Po przemyciu membrana jest inkubowana ze sprzężonym ze wskaźnikiem (np. enzymami takimi jak peroksydaza lub fosfataza alkaliczna) przeciwciałem drugorzędowym, które rozpoznaje przeciwciało pierwszorzędowe. Później możliwa jest, dzięki reakcji barwnej lub chemiluminescencyjnej, wizualizacja białka docelowego na membranie (np. ECL, Amersham Bioscience). W idealnym przypadku, przeciwciało o wysokiej specyficzności do białka docelowego rozpoznaje tylko pożądane białko.
Stosowane są różne sposoby potwierdzania lokalizacji, zidentyfikowanego w podejściu silico, białka docelowego na membranie. Ważną i dobrze rozwiniętą metodą używającą przeciwciał, jest opisana powyżej immunofluorescencja (IF). Używane są komórki ustalonych linii komórkowych, które albo syntetyzują docelowe białko (wykrywanie RNA w RT-PCR lub białka w Western blot) lub też zostały transfekowane DNA plazmidu. Duża różnorodność sposobów (np. elektroporacja, oparta na liposomach transfekcja, strącanie fosforanem wapnia) jest dobrze ustalona dla transfekcji DNA linii komórkowych (np. Lemoine i wsp., Methods Mol. Biol. 75: 441-7, 1997).
Plazmid transfekowany do komórek może immunofluorescencyjnie kodować niezmodyfikowane białko lub też sprzęgać różne aminokwasowe wskaźniki z docelowym białkiem. Głównymi wskaźnikami są na przykład fluorescent „zielone białko fluorescencyjne” (GFP) w jego odmiennych różnych formach fluorescencyjnych, krótka sekwencja peptydów, składająca się z 6-12 aminokwasów dla których
PL 219 018 B1 dostępne są przeciwciała o wysokim powinowactwie i specyficzności lub krótka sekwencja aminokwasów, Cys-Cys-X-X-Cys-Cys, która może wiązać poprzez swoją cysteinę specyficzne substancje fluorescencyjne (Invitrogen). Komórki, które syntetyzują docelowe białko są np. utrwalane paraformaldehydem lub metanolem. Później komórki można, jeżeli jest to wymagane, permeabilizować przez inkubację z detergentami (np. 0,2% Triton X-100). Komórki są następnie inkubowane z przeciwciałem pierwszorzędowym, skierowanym przeciw białku docelowemu lub przeciw jednemu ze sprzężonych wskaźników. Po przemyciu, mieszanina jest inkubowana z wiążącym się z pierwszorzędowym przeciwciałem, przeciwciałem drugorzędowym, które jest sprzężone ze wskaźnikiem fluoroscencyjnym (np. fluoresceina, Texas Red, Dako). Wyznakowane w ten sposób komórki są następnie pokrywane warstwą glicerolu i analizowane przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego zgodnie z instrukcją producenta. Emisja specyficznej fluorescencji jest w tym przypadku osiągana przez specyficzne pobudzenie zależne od rodzaju użytych substancji.
Analiza zezwala zazwyczaj na rzetelną lokalizację białka docelowego, właściwości przeciwciała i białka docelowego są potwierdzane w podwójnym znakowaniu żeby wyznakować oprócz białka docelowego także sprzężone aminokwasowe wskaźniki lub inne wskaźniki białkowe, których lokalizacja została opisana w piśmiennictwie. GFP i jego pochodne reprezentują specjalny przypadek, możliwe jest ich bezpośrednie pobudzanie i mogą fluoryzować same z siebie. Przepuszczalność błonowa, która może być kontrolowana przez użycie detergentów, zezwala na wykazanie przy użyciu immunofluorescencji, czy immunogenny epitop jest umiejscowiony wewnątrz czy na zewnątrz komórki. Przewidywanie wybranych białek może być więc poparte doświadczalnie. Inną możliwością jest wykrycie pozakomórkowych domen przy użyciu cytometrii przepływowej. W tym celu komórki są utrwalane w warunkach nie permeabilizujących (np. w PBS/azydek Na/2% FCS/5 mM EDTA) i analizowane w cytometrze przepływowym zgodnie instrukcjami producenta. Żeby być analizowane tą metodą, tylko pozakomórkowe epitopy mogą być rozpoznawane przez przeciwciało. Różnica w porównaniu z immunofluorescencją jest taka, że możliwe jest rozróżnienie martwych i żywych komórek, na przykład przez użycie jodku propidyny, błękitu trypanowego, co zapobiega otrzymywaniu wyników fałszywie dodatnich.
Oczyszczanie przy wykorzystaniu powinowactwa
Oczyszczanie poliklonalnego przeciwciała dotyczy wyłącznie przeciwciał peptydowych lub częściowo, w przypadku przeciwciał przeciw zrekombinowanym białkom jako usługa dostawcy. W tym celu, w obu przypadkach, odpowiedni peptyd lub zrekombinowane białko było kowalencyjnie wiązane do podłoża i później po sprzężeniu było równoważone natywnym buforem (PBS: bufor fosforanowy) i następnie inkubowane z surową surowicą.
Po dalszym przemyciu PBS, przeciwciało eluowano 100 mM glicyną, pH 2,7 i eluat bezzwłocznie zobojętniano 2M Trisem, pH 8. Przeciwciała oczyszczane w ten sposób, mogły potem być stosowane do specyficznej detekcji białek docelowych zarówno przy użyciu Western blotting, jak i immunofluorescencji.
Przygotowywanie komórek transfekowanych EGFP
Dla celów mikroskopii fluorescencyjnej związanych z nowotworem antygenów, których ekspresja zachodzi heterogennie, klonowano całkowity ORF antygenów do wektorów pEGFP-C1 i pEGFP-N3 (Clontech). Komórki CHO i NIH3T3 hodowane na szkiełkach podstawowych były transfekowane zgodnie z instrukcjami producenta odpowiednimi konstruktami plazmidu przy użyciu odczynnika do transfekcji Fugene (Roche) i po 12-24 h analizowane przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego.
P r z y k ł a d 1. Identyfikacja GPR35 jako celu diagnostyki i terapii nowotworu
GPR35 (SEQ ID Nr: 1) i produkt jego translacji (SEQ ID Nr: 9) zostały opisane jako przypuszczalny receptor związany z białkiem G. Sekwencja jest opublikowana w Genbank pod nr akcesyjnym AF089087. Ten transkrypt koduje białko o 309 aminokwasach, o ciężarze cząsteczkowym 34 kDa. Przewidywano, że GPR35 należy do nadrodziny receptorów związanych z białkiem G z 7 domenami transbłonowymi (O'Dowd i wsp., Genomics 47: 310-13, 1998). W celu potwierdzenia przewidywanej lokalizacji GPR35 w komórce, wykonano fuzję białka do eGFP jako cząsteczki reporterowej i po transfekcji odpowiedniego plazmidu zaszła heterogenna ekspresja w komórkach 293. Lokalizacja była następnie analizowana w mikroskopie fluorescencyjnym. Zgodnie z wynalazkiem zostało potwierdzone, że GPR35 jest integralną transbłonową cząsteczką (fig. 17). Dotychczasowe badania ludzkiego GPR35 (patrz między innymi Horikawa Y, Oda N., Cox N. J., Li X., Orho-Melander M., Hara M., Hinokio Y., Lindner T. H., Mashima H., Schwarz P. E., del Bosque-Plata L., Horikawa Y., Oda Y., Yoshiuchi I., Colilla S., Polonsky K. S., Wei S., Concannon P., Iwasaki N., Schulze J., Baier L. J., Bogardus C., Groop L., Boerwinkle E., Hanis C. L., Bell G. I., Nat. Genet. 2000 Oct; 26 (2):163-75) wskazują, że
PL 219 018 B1
GPR35 jest aktywowane w wielu zdrowych tkankach. Ramka odczytu dla genu zawiera pojedynczy ekson. Zgodnie z wynalazkiem, para starterów (SEQ ID Nr: 20, 21) specyficznych dla genu GPR35 była używana w analizie RT-PCR do powielania cDNA w okrężnicy i raku okrężnicy (13/26). W przeciwieństwie do tego, nie wykryto znaczącej ekspresji w innych prawidłowych tkankach. Z tego szczególnego powodu, że GPR35 posiada pojedynczy ekson, zanieczyszczenia genomowego DNA nie mogą być wykryte poprzez startery obejmujące intron. Żeby nie dopuścić do genomowych zanieczyszczeń próbek RNA, wszystkie RNA traktowano DNAazą. Zgodnie z wynalazkiem transkrypty GPR35 wykrywano w okrężnicy, odbytnicy, w jądrach i rakach okrężnicy przy użyciu DNA wolnego od RNA.
T a b e l a 1
Ekspresja GPR35 w prawidłowych tkankach
Prawidłowa tkanka | Ekspresja |
Mózg | - |
Móżdżek | - |
Mięsień sercowy | - |
Mięsień szkieletowy | - |
Odbytnica | ++ |
Żołądek | - |
Okrężnica | + + |
Trzustka | - |
Nerki | - |
Jądra | - |
Grasica | - |
Gruczoł piersiowy | - |
Jajniki | - |
Macica | Nie oznaczono |
Skóra | - |
Płuca | - |
Tarczyca | - |
Węzły chłonne | - |
Śledziona | - |
PBMC | - |
Nadnercza | - |
Przełyk | - |
Jelito cienkie | + |
Prostata | - |
Selektywna i wysoka ekspresja transkryptów GPR35 prawidłowej tkanki okrężnicy i otrzymanej drogą biopsji nowotworowej tkanki okrężnicy (fig. 1) nie była poprzednio znana, a zgodnie z wynalazkiem może być używana w metodach diagnostyki molekularnej, takich jak RT-PCR do wykrywania rozprzestrzeniających się komórek nowotworowych w surowicy i szpiku kostnym oraz do wykrywania przerzutów w innych tkankach. Ilościowy RT-PCR ze specyficznymi starterami (SEQ ID Nr: 88 i 89) także potwierdza, że GPR35 jest wysoce selektywnym dla jelit, specyficznie różnicującym antygenem, który także występuje w nowotworach jelit i w przerzutach nowotworów jelitowych. W niektórych nowotworach jelit rzeczywiście występuje nadekspresja o jeden rząd wielkości w porównaniu z prawidło38
PL 219 018 B1 wym jelitem (fig. 18). Przeciwciała do wykrywania białka GPR35 wytwarzano przez immunizację królika. Następujące peptydy były używane do namnażania tych przeciwciał:
SEQ ID Nr: 90: GSSDLTTWPPAIKLGC (AA 9-23)
SEQ ID Nr: 91: DRYVAVRHPLRARGLR (AA 112-127)
SEQ ID Nr: 92: VAPRAKAHKSQDSLC (koniec C)
SEQ ID Nr: 93: CFRSTRHNFNSMR (pozakomórkowa domena 2)
Znakowania tymi przeciwciałami, np. w Western Blot potwierdzają ekspresję w nowotworach. Zgodnie z wynalazkiem, wszystkie 4 pozakomórkowe domeny GPR35 (pozycja przewidywanych pozakomórkowych domen w sekwencji SEQ ID Nr: 9 AA 1-22 (SEQ ID Nr: 94); AA 81-94 (SEQ ID Nr: 95); AA 156-176 (SEQ ID Nr: 96); AA 280-309 (SEQ ID Nr: 97)) mogą być użyte, jako docelowe struktury dla monoklonalnych przeciwciał. Te przeciwciała wiążą się specyficznie do powierzchni komórkowej komórek nowotworowych i mogą być użyte zarówno w metodach diagnostycznych jak i terapeutycznych. Nadekspresja GPR35 w nowotworach dodatkowo potwierdza takie zastosowanie. Poza tym, zgodnie z wynalazkiem, sekwencja kodująca białka, może być użyta jako szczepionka (RNA, DNA, peptyd, białko) w celu indukcji specyficznej dla nowotworu odpowiedzi immunologicznej (odpowiedzi przenoszonej przez komórki T i komórki B). Poza tym, co zaskakujące, stwierdzono, że istnieje dalszy kodon startowy 5' przed ogólnie znanym kodonem startowym i zachodzi ekspresja białka z rozszerzeniem N-końca.
Zgodnie z wynalazkiem stwierdzono, że GPR35, białko, które poprzednio opisano jako ulegające ekspresji w bardzo wielu miejscach, ulega nadekspresji w powiązaniu z nowotworem, selektywnie w nowotworach jelitowo- żołądkowych, szczególnie w nowotworach okrężnicy. GPR35 jest więc odpowiednie, szczególnie jako molekularna docelowa struktura do diagnozy i leczenia tych nowotworów. Dotychczasowe badania ludzkiego GPR35 (patrz między innymi Horikawa Y., Oda N., Cox N. J., Li X,, Orho-Melander M., Hara M., Hinokio Y., Lindner T. H., Mashima H., Schwarz P. E., del Bosque-Plata L., Horikawa Y., Oda Y., Yoshiuchi I., Colilla S., Polonsky K. S., Wei S., Concannon P., Iwasaki N., Schulze J., Baier L. J., Bogardus C., Groop L., Boerwinkle E., Hanis C. L., Bell G. I., Nat Genet 2000 Oct; 26 (2): 163-75) wskazują, że GPR35 jest aktywowane w wielu zdrowych tkankach. Przeciwnie, według wynalazku badania wykazują, że wykrywalność GPR35 jest zaskakująco nie znacząca większości prawidłowych tkanek i w przeciwieństwie do tego jest mocno aktywowana w pierwotnych nowotworach okrężnicy i w przerzutach. Zgodnie z wynalazkiem, dodatkowo, oprócz opisanej sekwencji GPR35, został znaleziony nowy wariant translacyjny, który wykorzystuje alternatywny kodon startu (SEQ ID Nr: 10).
GPR jest członkiem grupy receptorów związanych z białkiem G (GPCR), bardzo dużej rodziny białek, których struktura i funkcja została bardzo dobrze zbadana. GPCR są wybitnie odpowiednie jako docelowe struktury do rozwoju farmaceutycznie aktywnych substancji, ponieważ niezbędne do tego sposoby (np. ekspresja receptorów, oczyszczanie, skrining ligandów, mutageneza, funkcjonalne hamowanie, selekcja ligandów o działaniu agonistycznym i antagonistycznym , radioznakowanie ligandów) są bardzo dobrze rozwinięte i szczegółowo opisane, porównaj na przykład „G Protein-Coupled Receptors” Tatsuya Haga, Gabriel Berstein i Gabriel Berstein ISBN: 0849333849 i w „Identification and Expression of G-Protein Coupled Receptors Receptor Biochemistry and Methodology” Kevin R. Lynch ASIN: 0471183105. Zgodnie z wynalazkiem, to że GPR35 jest niewykrywalne w większości prawidłowych tkanek ale w powiązaniu z nowotworem ulega ekspresji na powierzchni komórek pozwala, żeby było używane jako związana z nowotworem struktura docelowa, na przykład dla farmaceutycznie aktywnych ligandów, szczególnie na przykład, sprzężonych z radioaktywnymi cząsteczkami jako substancjami farmaceutycznymi. W szczególnej postaci możliwe jest użycie radioznakowanych ligandów, które wiążą się do GPR35 w celu wykrywania komórek nowotworowych albo do leczenia nowotworów okrężnicy in vivo.
P r z y k ł a d 2. Identyfikacja GUCY2C w nowotworach wątroby i jajników i nowe warianty składania GUCY2C jako cele diagnostyki i terapii nowotworów
Cyklaza guanylinowa 2C (SEQ ID Nr: 2; produkt translacji SEQ ID Nr: 11) - typ I białka transbłonowego należy do rodziny sodopędnych receptorów peptydowych. Sekwencja jest opublikowana w Genbank pod numerem akcesyjnym NM 004963. Wiązanie peptydów guanylinowych i uroguanylinowych lub) też enterotoksyn ciepłostałych (ST) zwiększa stężenie wewnątrzkomórkowego cGMP indukując w ten sposób sygnał procesów transdukcji wewnątrz komórki.
Ostatnie badania wskazują, że ekspresja GUCY2C rozciąga się także na pozajelitowe regiony, takie jak na przykład rak pierwotny i przerzuty gruczolaka żołądka i przełyku (Park i wsp., Cancer EpiPL 219 018 B1 demiol. Biomarkers Prev. 11: 739-44, 2002). Wariant składania GUCYC, który znaleziono zarówno w prawidłowej, jak i zmienionej tkance jelita, zawiera delecję 142 bp w eksonie 1, zapobiegając tym sposobem translacji podobnego do GUCY2C produktu (Pearlman i wsp., Dig. Dis. Sci. 45: 298-05, 2000). Jedyny opisany dotychczas wariant składania nie prowadzi do powstania produktu translacji. Zgodnym z wynalazkiem celem była identyfikacja związanych z nowotworem wariantów składania GUCY2C, które mogą być używane zarówno w diagnostyce, jak i w terapii.
Badania RT-PCR z parą starterów specyficznych dla GUCY2C (SEQ ID Nr: 22, 23, 98, 99) wykazują nasiloną ekspresję transkryptów GUCY2C w prawidłowej okrężnicy i żołądku, a słabą ekspresję w wątrobie, jądrach, jajnikach, grasicy, śledzionie, mózgu i płucach (tabela 2, fig. 19). Ekspresja w okrężnicy i żołądku była przynajmniej 50 razy większa niż we wszystkich innych prawidłowych tkankach. Poziomy znakowanych transkryptów GUCY2C były wykrywane w raku okrężnicy i raku żołądka (tab. 2). Te wyniki były sprecyzowane na podstawie ilościowej analizy PCR i wykazały nasiloną ekspresję GUCY2C w prawidłowej okrężnicy, jelicie krętym i prawie wszystkich badanych próbkach raka okrężnicy (fig. 2, 19B). Masywna nadekspresja była wykrywalna w niektórych próbkach raka okrężnicy. Poza tym ekspresję stwierdzono w 7/10 nowotworów żołądka. Co zaskakujące, stwierdziliśmy, że gen jest aktywowany w wielu innych uprzednio nie opisanych nowotworach, między innymi, nowotworach jajników, piersi, wątroby i prostaty (ryciny 19B, tab. 2).
T a b e l a 2
Ekspresja GUCY2C w tkankach prawidłowych i nowotworowych
Prawidłowa tkanka | Ekspresja |
1 | 2 |
Mózg | + |
Móżdżek | |
Mięsień sercowy | |
Mięsień szkieletowy | - |
Mięsień sercowy | |
Odbytnica | |
Żołądek | +++ |
Okrężnica | +++ |
Trzustka | - |
Nerki | - |
Wątroba | + |
Jądra | ++ |
Grasica | + |
Gruczoł piersiowy | - |
Jajniki | + |
Macica | + |
Skóra | |
Płuca | + |
Tarczyca | |
Węzły chłonne | - |
Śledziona | + |
PBMC | - |
Prostata | - |
PL 219 018 B1 cd. tabeli 2
Typ nowotworu | Ekspresja |
Rak okrężnicy | +++ |
Rak trzustki | - |
Rak przełyku | - |
Rak żołądka | +++ |
Rak oskrzeli | - |
Rak piersi | — + |
Rak jajników | + |
Rak endometrium | |
Nowotwory ENT | |
Rak komórek nerek | |
Rak prostaty | + |
Rak wątroby | + |
GUCYC2C-118s/GUCYC2C-498as
GUCYC2C 621s/GUCYC2C-1140as
GUCYC2C-1450s/GUCYC2C-1790as
GUCYC2C-1993s/GUCYC2C-2366as
GUCYC2C-2717s/GUCYC2C-3200as
GUCYC2C-118s/GUCYC2C-1140as
GUCYC2C-621s/GUCYC2C-1790as
GUCYC2C-1450s/GUCYC2C-2366as
GUCYC2C-1993/GUCYC2C-3200as
Do wykrywania wariantów składania w tkance okrężnicy i tkance raka okrężnicy używano następujących par starterów:
(SEQ ID Nr: 24, 29);
(SEQ ID Nr: 25, 30);
(SEQ ID Nr: 26, 31);
(SEQ ID Nr: 27, 32);
(SEQ ID Nr: 28, 33);
(SEQ ID Nr: 24, 30);
(SEQ ID Nr: 25, 31);
(SEQ ID Nr: 26, 32);
(SEQ ID Nr: 27, 33).
Zgodnie z wynalazkiem, w badaniach wariantów składania w raku okrężnicy zidentyfikowano trzy poprzednio nieznane formy.
a) Delecja eksonu 3 (SEQ ID Nr: 3), która prowadzi do wariantu, który ma długość tylko 111 aminokwasów i w którym asparagina w pozycji 111 jest zastąpiona przez prolinę.
b) Delecja eksonu 6 (SEQ ID Nr: 4), który w wyniku daje produkt ekspresji, który ma długość 258 aminokwasów. To mogłoby wytwarzać neoepitop C-końca zawierający 13 aminokwasów.
c) Wariant, w którym nukleotydy w pozycjach 1606-1614 i odpowiadające aminokwasy L(536), L(537) i Q(538) są usunięte (SEQ ID Nr: 5).
Zgodnie z wynalazkiem, warianty składania z delecjami odpowiednio w eksonie 3 i 6 (SEQ ID Nr: 3 i 4) są rozróżniane w szczególności na podstawie produktów translacji (SEQ ID Nr: 12 i 13) nie mających domen transbłonowych. W przypadku delecji eksonu 6, wynikiem jest neoepitop C-końca o 13 aminokwasach, który nie wykazuje żadnej homologii z dotychczas znanymi białkami. Ten epitop jest więc predestynowany, by być docelową strukturą dla immunoterapii. Będący przedmiotem wynalazku wariant składania z delecją zasad w pozycjach 1606-1614 (SEQ ID Nr: 5) i produkt jego translacji (SEQ ID Nr: 14) podobnie zawiera neoepitop. Przeciwciała do wykrywania białka GUCY2C były otrzymywane przez immunizację królików. Do namnażania przeciwciał używano następujących peptydów:
SEQ ID Nr: 100: HNGSYEISVLMMGNS (AA 31-45);
SEQ ID Nr: 101: NLPTPPTVENQQRLA (AA 1009-1023).
Takie przeciwciała mogą być w zasadzie używane do celów diagnostycznych i terapeutycznych.
Zgodnie z wynalazkiem, w szczególności pozakomórkowa domena GUCY2C (pozycja przewidywanej pozakomórkowej domeny z sekwencji SEQ ID Nr: 11: AA 454-1073 (SEQ ID Nr: 102)) może być użyta jako docelowa struktura przeciwciał monoklonalnych. Jednak przewidywanie struktury może być niejednoznaczne i jeszcze nie zostało zweryfikowane eksperymentalnie tak, że alternatywna orientacja membrany jest także dopuszczalna. W tym przypadku aminokwasy 1-431 mogłyby być na zewnątrz komórki i być odpowiednie jako punkt startowy dla przeciwciał monoklonalnych. Te przeciwciaPL 219 018 B1 ła wiążą się specyficznie do powierzchni komórkowej komórek nowotworowych i mogą być użyte zarówno w diagnostyce jak i w terapii. Nadekspresja GUCY2C, szczególnie w nowotworach okrężnicy dostarcza dodatkowego wsparcia dla takiego zastosowania. Co więcej, zgodnie z wynalazkiem, sekwencje kodujące dla białek mogą być użyte jako szczepionki (RNA, DNA, peptydy, białko) w celu indukcji specyficznej dla nowotworu odpowiedzi immunologicznej (odpowiedź immunologiczna przenoszona przez komórki T i komórki B). Co więcej, zgodnie z komórkową funkcją cząsteczki GUCY2C, zgodnie z wynalazkiem, możliwy jest rozwój substancji, szczególnie małych cząsteczek, które modulują działanie enzymu na komórki nowotworowe. Produkt reakcji enzymatycznej cGMP, jest znaną komórkową cząsteczką sygnałową o szerokim zakresie działania (Tremblay i wsp., Mol. Cell Biochem. 230, 31).
P r z y k ł a d 3. Identyfikacja SCGB3A2 jako celu diagnostyki i terapii nowotworów
SCGB3A2 (SEQ ID Nr: 6) (produkt translacji: SEQ ID Nr: 15) należy do rodziny genów sekretoglobin. Sekwencja jest opublikowana w Genbank pod numerem akcesyjnym NM054023. SCGB3A2 (UGRP1) jest homodimerycznym białkiem sekrecyjnym o wielkości 17 kDa, którego ekspresja zachodzi wyłącznie w płucach i nozdrzach (Niimi i wsp., Am. J. Hum. Genet. 70: 718-25, 2002). Badania RTPCR z użyciem pary starterów (SEQ ID Nr: 37, 38) potwierdziły selektywną ekspresję w prawidłowej tkance płuc. Geny specyficzne dla płuc i tchawicy, np. dla powierzchniowo czynnych białek, są silnie regulowane w dół w nowotworach złośliwych podczas odróżnicowywania i normalnie są niewykrywalne w nowotworach płuc. Z zaskoczeniem stwierdzono, że SCGB3A2 jest aktywny w pierwotnym nowotworze płuc i w przerzutach. Badania zgodnie z wynalazkiem wykazały, że SCGB3A2 ulega silnej i częstej ekspresji w raku oskrzeli (fig. 4). Wszystkie pozostałe, 23 badane prawidłowe tkanki oprócz płuc i tchawicy, nie wykazywały ekspresji (porównaj fig. 20). Było to dodatkowo potwierdzone w specyficznym ilościowym RT-PCR (SEQ ID Nr: 103, 104) (fig. 20), co dodatkowo pokazuje nadekspresję przynajmniej o jeden rząd wielkości większą w więcej niż 50% przypadków raka oskrzeli.
Selektywna i wysoka ekspresja SCGB3A2 w prawidłowej tkance płuc i biopsjach raka płuc, może być zgodnie z wynalazkiem zastosowana do wykrywania rozprzestrzeniających się komórek nowotworowych sposobami diagnostyki molekularnej takimi jak RT-PCR we krwi, szpiku kostnym, plwocinie, płynie odessanym z oskrzeli lub płynie z płukania oskrzeli oraz do wykrywania przerzutów w innych tkankach, np. w lokalnych węzłach chłonnych. W zdrowych płucach, SCGB3A2 jest wydzielane przez wyspecjalizowane komórki wyłącznie do oskrzeli. Zgodnie z tym, nie należy się spodziewać, że białko SCGB3A2 będzie wykrywalne w płynach ustrojowych na zewnątrz dróg oddechowych zdrowych osobników. W przeciwieństwie do tego, w szczególności komórki nowotworowe w przerzutach, wydzielają swoje produkty białkowe wprost do krwioobiegu. Dlatego pewien aspekt wynalazku, jako diagnostyka nowotworów płuc, dotyczy wykrywania produktów SCGB3A2 w surowicy lub osoczu pacjentów poprzez badanie przy użyciu specyficznych przeciwciał.
Przeciwciała do wykrywania białka SCGB3A2 były wytwarzane przez immunizowanie królików. Do namnażania przeciwciał stosowano następujące peptydy:
SEQ ID Nr: 105: LINKVPLPVDKLAPL,
SEQ ID Nr: 106: SEAVKKLLEALSHLV.
Specyficzna dla SCGB3A2 reakcja był wykrywana fluorescencyjnie (fig. 21). Tak, jak spodziewano się, dla wydzielonego białka, rozkład SCGB3A2 był przypisany do retikulum endoplazmatycznego i ziaren sekrecyjnych (fig. 21A). W celu sprawdzenia specyficzności, komórki równolegle transfekowano plazmidem, który syntetyzuje białko fuzyjne SCGB3A2-GFP. W tym przypadku detekcja białka odbywała się dzięki autofluorescencji GFP (zielone białko fluorescencyjne) (fig. 21B). Nałożenie na siebie dwóch fluorescencyjnych diagramów pokazuje, nie pozostawiając wątpliwości, że surowica odpornościowa rozpoznaje białko SCGB3A2 (fig. 21C). Zgodnie z wynalazkiem takie przeciwciała mogą być np. używane w formie testów immunologicznych do celów diagnostycznych i terapeutycznych.
P r z y k ł a d 4. Identyfikacja wariantów składania claudin-18A1 i claudin-18A2 jako celów diagnostyki i terapii nowotworów
Gen claudin-18 koduje cząsteczkę powierzchniową błony mającą 4 transbłonowe domeny i wewnątrzkomórkowy N koniec i C koniec. Niimi i współpracownicy (Moll. Cell. Biol. 21: 7380-90, 2001) opisali dwa warianty składania mysiego i ludzkiego claudin-18, które zostały opisane jako ulegające selektywnej ekspresji odpowiednio w tkance płuc (claudin-18A) i w tkance żołądka (claudin-18A2). Te warianty różnią się na N końcu (fig. 22).
Zgodnie z wynalazkiem badano, do jakiego stopnia warianty składania claudin-18A2 (SEQ ID Nr: 7) i claudin-18A1 (SEQ ID Nr: 117) i odpowiednie produkty translacji (SEQ ID Nr: 16 i 118) mogą być użyte dla nowotworu jako wskaźniki lub docelowe struktury terapeutyczne. Zdolny do rozróżnienia
PL 219 018 B1 między tymi dwoma wariantami ilościowy PCR został ustalony przez wybór par starterów specyficznych dla A1 (SEQ ID Nr: 109 i 110) i dla A2 (SEQ ID Nr: 107 i 108). Wariant składania A2 był dodatkowo testowany przy użyciu innej pary starterów w PCR konwencjonalnym (SEQ ID Nr: 39 i 40). Opisano, że wariant A1 jest aktywny tylko w prawidłowych płucach. Jednakże ku zaskoczeniu, zgodnie z wynalazkiem, stwierdzono, że wariant A1 jest aktywny także w śluzówce żołądka. Żołądek i płuca były jedynymi prawidłowymi tkankami wykazującymi znaczącą aktywację. We wszystkie pozostałych prawidłowych tkankach otrzymano dla claudin A1 wynik negatywny. W badanych nowotworach z zaskoczeniem stwierdzono, że claudin-A1 jest aktywowana w ogromnej liczbie tkanek nowotworowych. Szczególnie silną ekspresję stwierdzono w nowotworach żołądka, nowotworach płuc, nowotworach trzustki, nowotworach przełyku (fig. 23), nowotworach ENT i nowotworach prostaty. Poziomy ekspresji claudin-A1 w nowotworach ENT, prostaty, trzustki i przełyku są 100-10000 wyższe niż w odpowiadających prawidłowych tkankach. Oligonukleotydy użyte do badania wariantu składania claudin-2A specyficznie znakują ten transkrypt, który ma być powielany (SEQ ID Nr: 39 i 40, i 107, i 108). Badania ujawniły, że wariant składania A2 nie ulega ekspresji w żadnej z badanych ponad 20 prawidłowych tkanek, za wyjątkiem śluzówki żołądka i w małym zakresie także tkanki jąder. Stwierdziliśmy także, że wariant A2, podobnie jak wariant A1 jest aktywowany w wielu nowotworach (wyliczone przy okazji przykładów na fig. 24). Obejmują one nowotwory żołądka (8/10), nowotwory trzustki (6/6), nowotwory przełyku (5/10) i nowotwory wątroby. Chociaż aktywacja claudin-18A2 nie jest wykrywalna w zdrowych płucach, z zaskoczeniem stwierdzono, że w pewnych nowotworach płuc zachodzi ekspresja wariantu składania A2.1.
T a b e l a 3A
Ekspresja claudin-18A2 w tkance prawidłowej i nowotworowej
Prawidłowa tkanka | Ekspresja |
Mózg | - |
Móżdżek | - |
Mięsień sercowy | - |
Mięsień szkieletowy | - |
Endometrium | - |
Żołądek | +++ |
Okrężnica | - |
Trzustka | - |
Nerki | - |
Wątroba | - |
Jądra | + |
Grasica | - |
Gruczoł piersiowy | - |
Jajniki | - |
Macica | - |
Skóra | - |
Płuca | - |
Tarczyca | - |
Węzły chłonne | - |
Śledziona | - |
PBMC | - |
Przełyk | - |
PL 219 018 B1 cd. tabeli 3A
Typ nowotworu | Ekspresja |
Rak okrężnicy | - |
Rak trzustki | ++ |
Rak przełyku | ++ |
Rak żołądka | +++ |
Rak oskrzeli | ++ |
Rak piersi | - |
Rak jajników | - |
Rak endometrium | nie badano |
Nowotwory ENT | ++ |
Rak komórek nerek | - |
Rak prostaty | - |
T a b e l a 3B
Ekspresja claudin-18A1 w tkankach prawidłowych i nowotworowych
Prawidłowa tkanka | Ekspresja |
Mózg | - |
Móżdżek | - |
Mięsień sercowy | - |
Mięsień szkieletowy | - |
Endometrium | - |
Żołądek | +++ |
Okrężnica | - |
Trzustka | - |
Nerki | - |
Wątroba | - |
Jądra | + |
Grasica | - |
Gruczoł piersiowy | - |
Jajniki | - |
Macica | - |
Skóra | - |
Płuca | +++ |
Tarczyca | - |
Węzły chłonne | - |
Śledziona | - |
PBMC | - |
Przełyk | - |
PL 219 018 B1 cd. tabeli 3B
Typ nowotworu | Ekspresja |
Rak okrężnicy | - |
Rak trzustki | ++ |
Rak przełyku | ++ |
Rak żołądka | +++ |
Rak oskrzeli | + + |
Rak piersi | + |
Rak jajników | nie badano |
Rak endometrium | nie badano |
Nowotwory ENT | ++ |
Rak komórek nerek | - |
Rak prostaty | + + |
Konwencjonalny PCR, jako niezależne badanie kontrolne, także potwierdził wyniki otrzymane w ilościowym PCR. Użyte do tego oligonukleotydy (SEQ ID Nr: 39, 40) pozwalają na specyficzne powielanie wariantu składania A2. Zgodnie z wynalazkiem wykazano, że 8/10 nowotworów żołądka i połowa badanych nowotworów trzustki wykazuje silną ekspresję tego wariantu składania (fig. 5). W przeciwieństwie do tego, w innych tkankach, ekspresja jest niewykrywalna przy użyciu konwencjonalnego PCR. W szczególności nie stwierdzono ekspresji w płucach, wątrobie, krwi, węzłach chłonnych, tkance piersi i tkance nerek (tab. 3).
Tak więc, zgodnie z wynalazkiem, warianty składania reprezentują wysoce specyficzne molekularne wskaźniki nowotworów górnej części przewodu żołądkowo-jelitowego oraz nowotworów płuc, nowotworów ENT, nowotworów prostaty i ich przerzutów. Zgodnie z wynalazkiem, te molekularne wskaźniki mogą być użyte do wykrywania komórek nowotworowych. Zgodnie z wynalazkiem, wykrywanie nowotworów jest możliwe przy użyciu opisanych oligonukleotydów (SEQ ID Nr: 39, 40, 107-110). Szczególnie odpowiednimi oligonukleotydami są pary starterów, z których przynajmniej jeden wiąże się w ściśle kontrolowanych warunkach do odcinka transkryptu, który ma długość 180 par zasad i jest specyficzny dla jednego (SEQ ID Nr: 8) lub drugiego (SEQ ID Nr: 119) wariantu składania.
Żeby potwierdzić te dane na poziomie białka, przeciwciała specyficzne w stosunku do claudin i surowicę odpornościową wytwarzano przez immunizację zwierząt. Lokalizację claudin-18 na błonie plazmowej i topologię białka potwierdzano przez analizę transbłonowych domen narzędziami bioinformatycznymi (TMHMM, TMPRED) i immunofluorescencyjnymi badaniami komórek, w których zachodzi ekspresja białek fuzyjnych claudin-18 znakowanych ulepszonym GFP. Claudin-18 ma dwie pozakomórkowe domeny. Pozakomórkowa domena N-końca różni się sekwencją w dwóch wariantach składania (SEQ ID Nr 11 dla A1 i SEQ ID Nr: 112 dla A2). Domena C końca jest identyczna dla obu wariantów (SEQ ID Nr: 137). Dotychczas nie opisano jeszcze przeciwciał, które wiążą się do pozakomórkowych domen claudin-18. Zgodnie z wynalazkiem, do immunizacji są wybrane epitopy peptydu, które są umiejscowione zewnątrzkomórkowo i są specyficzne dla wariantu A1 lub A2 lub pojawiają się w obu wariantach. Oba warianty claudin-18 nie mają konwencjonalnych motywów glikozylacji i dlatego glikozylacja białka nie jest oczekiwana. Niemniej jednak, przy wyborze epitopów, bierze się pod uwagę, że epitopy, które zawierają asparaginę, serynę, treoninę, są w rzadkich przypadkach potencjalnie glikozylowane, nawet bez konwencjonalnych miejsc glikozylacji. Glikozylacja epitopu może zapobiegać wiązaniu przeciwciała specyficznego dla tego epitopu. Między innymi, zgodnie z wynalazkiem, epitopy są wybierane tak, że przeciwciała wytwarzane w ten sposób dopuszczają stan glikozylacji antygenu, żeby był rozróżniany. Między innymi, do wytwarzania przeciwciał przez immunizację, wybrane były następujące peptydy:
SEQ ID Nr: 17: DQWSTQDLYN (pozakomórkowa domena N końca, specyficzna do A2, wiążąca niezależnie od glikozylacji);
SEQ ID Nr: 18: NNPVTAVFNYQ (pozakomórkowa domena N końca, specyficzna do A2, wiążąca głównie do nieglikozylowanej formy, N37);
PL 219 018 B1
SEQ ID Nr: 113: STQDLYNNPVTAVF (pozakomórkowa domena N końca, specyficzna do A2, wiążąca tylko do nieglikozylowanej formy, N37);
SEQ ID Nr: 114: DMWSTQDLYDNP (pozakomórkowa domena N końca, specyficzna do A1);
SEQ ID Nr: 115: CRPYFTILGLPA (pozakomórkowa domena N końca, specyficzna głównie do A1);
SEQ ID Nr: 116: TNFWMSTANMYTG (pozakomórkowa domena N końca, rozpoznaje A1 i A2).
Dane dla przeciwciała specyficznego dla A2, wytwarzanego przez immunizację SEQ ID Nr: 17 pokazane są przy okazji przykładu. Specyficzne przeciwciało, utrwalone różnymi sposobami, może być używane do badań immunofluorescencyjnych. Przy znakowaniach porównawczych linii komórkowych RT-PCR dodatnich i ujemnych, w ilości, która jest łatwo wykrywalna, odpowiadające białka mogą być specyficznie wykrywane w liniach komórkowych nowotworów żołądkowych określanych jako pozytywne (fig. 25).
Endogenne białko jest umiejscowione na błonie i tworzy na niej duże centralne skupiska. To przeciwciało było dodatkowo wykorzystane do wykrywania białka w Western Blottingu. Tak jak spodziewano się, białko jest wykrywalne tylko w żołądku i niewykrywalne w innych prawidłowych tkankach ani nawet w płucach (fig. 29). Ku zaskoczeniu, porównawcze znakowanie nowotworów żołądka i sąsiadujących prawidłowych tkanek żołądka pacjenta ujawnia, że claudin-18 A2 ma mniejszą masę we wszystkich nowotworach żołądka, w których to białko jest wykrywane (fig. 30, lewy).
Zgodnie z wynalazkiem, w serii doświadczeń stwierdzono, że prążek także pojawia się na tym poziomie, kiedy lizat prawidłowej tkanki żołądka jest traktowany środkiem deglikozylującym, PNGazą F (fig. 30, prawy). Podczas gdy we wszystkich prawidłowych tkankach żołądka wykrywalna jest wyłącznie glikozylowana forma wariantu A2. A2 jest wykrywane także w więcej niż 60% badanych żołądkowych nowotworów, w szczególności wyłącznie w deglikozylowanej formie. Chociaż wariant A2 nie jest wykrywany w prawidłowych płucach nawet na poziomie białka, został znaleziony w nowotworach oskrzeli, jak też poprzednio w ilościowym RT-PCR. Od nowa, tylko glikozylowany wariant jest obecny (fig. 31) Przeciwciała, które rozpoznają pozakomórkową domenę wariantu składania claudin-18-A2 zostały wytworzone zgodnie z wynalazkiem. Poza tym, zostały wytworzone przeciwciała, które selektywnie rozpoznają domenę N-końca wariantu składania claudin-18-A1 (fig. 28) i przeciwciała, które wiążą się do obu wariantów w regionie C-końca pozakomórkowej domeny (fig. 27).
Zgodnie z wynalazkiem możliwe jest użycie tych przeciwciał do celów diagnostycznych, np. do immunohistologii (fig. 32) ale także do celów terapeutycznych, jak wyjaśniono powyżej. Dalsze ważne aspekty dotyczą różnicowania glikozylowanych domen claudin-18. Przeciwciała, które wiążą się wyłącznie do nie glikozylowanych epitopów zostały wytworzone zgodnie z wynalazkiem. Claudin-18 sama w sobie jest wysoce selektywnym różnicującym antygenem dla tkanki żołądka (A2) i dla płuc i żołądka (A1). Ponieważ jest ewidentnie zmieniana przez zmiany jakie zachodzą w mechanizmie glikozylacji w nowotworach, w szczególności w nowotworach jest wytwarzany deglikozylowany wariant A2. To może być użyteczne diagnostycznie i terapeutycznie. Surowica odpornościowa, taka jak ta opisana tutaj (przeciwko peptydowi SEQ ID Nr: 17) może być używana diagnostycznie na przykład w Western blotting. Przeciwciała, które wstępnie są niezdolne do wiązania do glikozylowanego epitopu, jak na przykład otrzymane przez immunizację peptydem SEQ ID Nr: 113 (fig. 26), mogą rozróżniać tkankę nowotworową i tkankę prawidłową na podstawie wiązania. W szczególności możliwe jest wykorzystanie takich przeciwciał terapeutycznie, ponieważ są wysoce selektywne. Wytworzone przeciwci ała mogą być także użyte bezpośrednio do wytwarzania zrekombinowanych chimerycznych lub humanizowanych przeciwciał. To także może mieć miejsce bezpośrednio z przeciwciałami otrzymanymi od królików (odnośnie tego, patrz J. Biol. Chem. 2000 May 5; 275 (18): 13668-76 Rader C., Ritter G., Nathan S., Elia M., Gout I., Jungbluth A. A., Cohen L. S., Welt S., Old L. J., Barbas C. F. 3rd. „The rabbit antibody repertoire as a novel source for the generation of therapeutic human antibodies”). W tym celu zachowano limfocyty od immunizowanych zwierząt. Aminokwasy 1-47 (SEQ ID Nr: 19 i 120) także reprezentują szczególnie dobre epitopy do immunoterapeutycznych sposobów, takich jak szczepionki i adopcyjny transfer limfocytów T specyficznych w stosunku do antygenu.
P r z y k ł a d 5. Identyfikacja SLC13A1 jako celu diagnostyki i terapii nowotworu
SLC13A1 należy do rodziny kotransporterów siarczanu sodu. Ludzki gen, w przeciwieństwie do mysiego homologu tego genu, ulega selektywnej ekspresji w nerkach (Lee i wsp., Genomics 70: 354-63). SLC13A1 koduje 595 aminokwasowe białko, które zawiera 13 domniemanych transmembranowych domen. Alternatywne składanie daje w wyniku 4 różne transkrypty (SEQ ID Nr: 45-48). Badano, czy SLC13A1 może być użyteczne jako wskaźnik nowotworów nerek. Użyto oligonukleotydów (SEQ ID Nr: 49, 50), które są w zdolne specyficznie powielać SLC13A1.
PL 219 018 B1
T a b e l a 4
Ekspresja SLC13A1 w tkankach prawidłowych i nowotworowych
Prawidłowa tkanka | Ekspresja |
Mózg | - |
Móżdżek | nie oznaczano |
Mięsień sercowy | nie oznaczano |
Mięsień szkieletowy | nie oznaczano |
Mięsień sercowy | - |
Żołądek | - |
Okrężnica | - |
Trzustka | nie oznaczano |
Nerki | +++ |
Wątroba | - |
Jądra | + |
Grasica | - |
Gruczoł piersiowy | - |
Jajniki | - |
Macica | nie oznaczano |
Skóra | nie oznaczano |
Płuca | - |
Tarczyca | - |
Węzły chłonne | - |
Śledziona | - |
PBMC | - |
Esica | - |
Przełyk | - |
Typ nowotworu | Ekspresja |
Rak okrężnicy | nie oznaczano |
Rak trzustki | nie oznaczano |
Rak przełyku | nie oznaczano |
Rak żołądka | nie oznaczano |
Rak oskrzeli | nie oznaczano |
Rak piersi | nie oznaczano |
Rak jajników | nie oznaczano |
Rak endometrium | nie oznaczano |
Nowotwory ENT | nie oznaczano |
Rak komórek nerek | +++ |
Rak prostaty | nie oznaczano |
PL 219 018 B1
Badania RT-PCR ze specyficzną dla SLC13A1 parą starterów (SEQ ID Nr: 49, 50) potwierdziły rzeczywiście selektywną ekspresję w nerkach i wykazały zgodną z wynalazkiem wysoką ekspresję w rzeczywiście wszystkich (7/8) badanych, otrzymanych drogą biopsji próbkach raka nerek (tab. 4, fig. 6). Ilościowy RT-PCR ze specyficznymi starterami (SEQ ID Nr: 121, 122) także potwierdził te wyniki (fig. 34). Słaby sygnał wykrywano w następujących prawidłowych tkankach: okrężnicy, żołądka, jąder, piersi, wątroby i mózgu. Jednakże ekspresja w nowotworach nerek była przynajmniej 100 razy wyższa niż we wszystkich innych prawidłowych tkankach.
W celu zanalizowania subkomórkowej lokalizacji SLC13A1 w komórce, białko przyłączano do eGFP jako cząsteczki reporterowej i po transfekcji odpowiedniego plazmidu heterogenna ekspresja zachodziła w komórkach 293. Lokalizację analizowano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. Nasze dane w imponujący sposób potwierdziły, że SLC13A1 jest integralną transbłonową cząsteczką (fig. 35). Przeciwciała do wykrywania SLC13A1 otrzymywano przez immunizowanie królików. Do namnażania tych przeciwciał używano peptydów SEQ ID Nr: 123 i 124. Takie przeciwciała w zasadzie mogą być używane w celach diagnostycznych i terapeutycznych.
Białko SLC13A1 ma 13 transbłonowych domen i 7 regionów pozakomórkowych. Zgodnie z wynalazkiem, w szczególności te pozakomórkowe domeny mogą być używane jako struktury docelowe dla przeciwciał monoklonalnych. SLC13A1 jako białko wchodzące w skład kanału, jest włączone w transport jonów. Pozakomórkowe domeny w zdrowych nerkach są skierowane polarnie w kierunku przewodu moczowego (do światła przewodu). Jednak stosowane terapeutycznie przeciwciała monoklonalne o dużym ciężarze cząsteczkowym, nie są wydalane do przewodu moczowego tak, że w zdrowych nerkach nie występuje wiązanie do SLC13A1. W przeciwieństwie do tego, w komórkach nowotworowych, polarność jest zniesiona i białko jest dostępne dla przeciwciała dostarczanego do celu bezpośrednio przez krwioobieg. Wyraźnie zaznaczona ekspresja i duży zakres SLC13A1 w nowotworach nerek sprawiają, że zgodnie z wynalazkiem, białko to jest bardzo interesującym diagnostycznym i terapeutycznym wskaźnikiem. Zgodnie z wynalazkiem, obejmuje to wykrywanie rozprzestrzeniania się komórek nowotworowych we krwi, szpiku kostnym, moczu oraz wykrywanie, przy użyciu RT-PCR, przerzutów w innych narządach. Poza tym, zgodnie z wynalazkiem, możliwe jest użycie pozakomórkowych domen SLC13A1 jako struktur docelowych do immunodiagnostyki i terapii przeciwciałami monoklonalnymi. Co więcej, zgodnie z wynalazkiem, SLC13A1 może być stosowane jako szczepionka (RNA, DNA, białko, peptydy) w celu indukcji specyficznej dla nowotworu odpowiedzi immunologicznych (przenoszona przez komórki T i B odpowiedź immunologiczna). Zgodnie z wynalazkiem, obejmuje to także rozwój tak zwanych małych związków, które modulują biologiczną aktywność SLC13A1 i mogą być stosowane do terapii nowotworów nerek.
P r z y k ł a d 6. Identyfikacja CLCA1 jako celu diagnostyki i terapii nowotworów
CLCA1 (SEQ ID Nr: 51; produkt translacji SEQ ID Nr: 60) należy do rodziny kanałów Cl- aktywowanych Ca2+. Sekwencja jest opublikowana w Genbank pod numerem akcesyjnym NM 001285. Ekspresja CLCA1 zachodzi wyłącznie w nabłonku zagłębienia jelit i w komórkach kubkowych (Gruber i wsp., Genomics 54: 200-14, 1998). Badano, czy CLCA1 może być użyte jako wskaźnik dla nowotworów okrężnicy i żołądka. Do tego celu użyto oligonukleotydów (SEQ ID Nr: 67, 68), które są zdolne do specyficznego powielania CLCA1. Badania RT-PCR z tym zestawem starterów potwierdziły selektywną ekspresję w okrężnicy i zgodnie z wynalazkiem wykazały wysoką ekspresję w badanych próbkach nowotworu okrężnicy (3/7), żołądka (1/3) (fig. 7). Inne prawidłowe tkanki nie wykazywały lub wykazywały tylko bardzo słabą ekspresję. Dodatkowo potwierdzono to specyficznym ilościowym RT-PCR (SEQ ID Nr: 125, 126), w którym to badaniu ekspresja nie była wykrywana w analizowanych prawidłowych tkankach (fig. 36). W badanych w tym doświadczeniu próbkach nowotworów, 6/12 próbek nowotworu okrężnicy i 5/10 próbek nowotworu żołądka było CLCA1 pozytywnych. Ogólnie, w nowotworach pojawia się dysregulacja ekspresji genu. Oprócz próbek z bardzo silną ekspresja, w innych próbkach obserwuje się znaczną regulację w dół CLCA1.
Przewiduje się, że białko ma 4 transbłonowe domeny z ogólną liczbą 2 pozakomórkowych regionów. Zgodnie z wynalazkiem, te pozakomórkowe domeny CLCA1 mogą być użyte jako docelowe struktury dla przeciwciał monoklonalnych.
Wyraźnie zaznaczona ekspresja i duży zakres CLCA1 w nowotworach żołądka i okrężnicy sprawiają, że zgodnie z wynalazkiem, białko to jest bardzo interesującym diagnostycznym i terapeutycznym wskaźnikiem. Zgodnie z wynalazkiem, obejmuje to wykrywanie rozprzestrzeniania się komórek nowotworowych w surowicy, szpiku kostnym, moczu oraz wykrywanie przerzutów w innych narządach przy użyciu RT-PCR. Poza tym, zgodnie z wynalazkiem, możliwe jest użycie pozakomórkowych
PL 219 018 B1 domen CLCA1 jako struktur docelowych do immunodiagnostyki i terapii przeciwciałami monoklonalnymi. Co więcej, zgodnie z wynalazkiem, CLCA1 może być stosowane jako szczepionka (RNA, DNA, białko, peptydy) w celu indukcji specyficznej dla nowotworu odpowiedzi immunologicznej (przenoszona przez komórki T i B odpowiedź immunologiczna). Zgodnie z wynalazkiem, obejmuje to także rozwój tak zwanych małych związków, które modulują biologiczną aktywność jak transport białek CLCA1 i mogą być stosowane do terapii nowotworów żołądkowo-jelitowych.
P r z y k ł a d 7. Identyfikacja FLJ21477 jako celu diagnostyki i terapii nowotworów
FLJ21477 (SEQ ID Nr: 52) i jego przewidywany produkt translacji (SEQ ID Nr: 61) został opublikowany jako hipotetyczne białko w Genbank, pod numerem akcesyjnym NM 025153. Jest to integralne białko błonowe mające aktywność ATP-azy i 4 transbłonowe domeny, które jest stosownie odpowiednie do terapii przy użyciu specyficznych przeciwciał. Badania RT-PCR ze specyficznymi starterami (SEQ ID Nr: 69, 70) wykazały selektywną ekspresję w okrężnicy i dodatkowo różne poziomy ekspresji (7/12) w badanych próbkach raka okrężnicy (fig. 8). Inne prawidłowe tkanki nie wykazywały ekspresji. Zostało to dodatkowo potwierdzone przy użyciu specyficznego ilościowego RT-PCR (SEQ ID Nr: 127, 128).
Specyficzna dla FLJ21477 ekspresja była wykrywalna zarówno w okrężnicy (fig. 37A) jak i 11/12 nowotworów okrężnicy. Dodatkowo, oprócz ekspresji w tkance okrężnicy, ekspresja była wykrywalna w tkance żołądka. Dodatkowo, w warunkach ilościowego RT-PCR wykrywalna w mózgu, grasicy i przełyku ekspresja była wyraźnie słabsza w porównaniu do okrężnicy i żołądka (fig. 37A). Co więcej, możliwe jest dodatkowo wykrycie ekspresji specyficznej dla FLJ21477 w następujących próbkach nowotworu: żołądka, trzustki, przełyku i wątroby. Przewiduje się, że białko ma 4 transbłonowe domeny z ogólną liczbą 2 pozakomórkowych regionów. Zgodnie z wynalazkiem, te pozakomórkowe domeny FLJ21477 mogą być użyte jako docelowe struktury dla przeciwciał monoklonalnych.
Wyraźnie zaznaczona ekspresja i duży zakres FLJ21477 w nowotworach żołądka i okrężnicy sprawiają, że zgodnie z wynalazkiem, białko to jest bardzo wartościowym diagnostycznym i terapeutycznym wskaźnikiem. Zgodnie z wynalazkiem, obejmuje to wykrywanie rozprzestrzeniania się komórek nowotworowych w surowicy, szpiku kostnym, moczu oraz wykrywanie przerzutów w innych narządach przy użyciu RT-PCR. Poza tym, zgodnie z wynalazkiem, pozakomórkowe domeny FLJ21477 mogą być użyte jako struktury docelowe do immunodiagnostyki i terapii przeciwciałami monoklonalnymi. Co więcej, zgodnie z wynalazkiem, FLJ21477 może być stosowane jako szczepionka (RNA, DNA, białko, peptydy) w celu indukcji specyficznej dla nowotworu odpowiedzi immunologicznej (przenoszona przez komórki T i B odpowiedź immunologiczna).
P r z y k ł a d 8. Identyfikacja FLJ20694 jako celów diagnostyki i terapii nowotworów
FLJ20694 (SEQ ID Nr: 53) i jego produkt translacji (SEQ ID Nr: 62) zostały opublikowane jako hipotetyczne białko w Genbank, pod numerem akcesyjnym NM 017928. To białko jest integralną transbłonową cząsteczką (transbłonowa domena AA 33-54), co bardzo prawdopodobne z funkcją tioredoksyny. Badania RT-PCR FLJ20694 ze specyficznymi starterami (SEQ ID Nr: 71, 72) wykazały selektywną ekspresję w okrężnicy i dodatkowo różne poziomy ekspresji (7/12) w badanych próbkach raka okrężnicy (Fig. 9). Inne prawidłowe tkanki nie wykazywały ekspresji. Zostało to dodatkowo potwierdzone przy użyciu specyficznego ilościowego RT-PCR (SEQ ID Nr: 129, 130) (fig. 38). Ekspresja FLJ20694 była niewykrywalna w jakichkolwiek innych prawidłowych tkankach oprócz okrężnicy i żołądka (nie analizowanych w pierwszym doświadczeniu).
Przewiduje się, że białko ma jedną transbłonową domenę z pozakomórkowym regionem. Zgodnie z wynalazkiem, te pozakomórkowe domeny FLJ20694 w szczególności mogą być użyte jako docelowe struktury dla przeciwciał monoklonalnych.
Dodatkowo, zgodnie z wynalazkiem, FLJ20694 może być stosowane jako szczepionka (RNA, DNA, białko, peptydy) w celu indukcji specyficznej dla nowotworu odpowiedzi immunologicznej (przenoszona przez komórki T i B odpowiedź immunologiczna). Zgodnie z wynalazkiem, obejmuje to także rozwój tak zwanych małych związków, które modulują aktywność biologiczną FLJ20694 i mogą być stosowane do terapii nowotworów żołądkowo-jelitowych.
P r z y k ł a d 9. Identyfikacja białka von Ebner'a (c20orf114) jako celów diagnostyki i terapii nowotworów
Białko von Ebner'a (SEQ ID Nr: 54) i jego produkt translacji (SEQ ID Nr: 63) były opublikowane jako odpowiadające Plunc białko górnych dróg oddechowych i nabłonka noso-gardzieli w Genbank pod numerem akcesyjnym AF364078. Zgodnie z wynalazkiem badano, czy białko von Ebner'a może być użyte jako wskaźnik nowotworu płuc. Do tego celu użyto oligonukleotydów (SEQ ID NO: 73, 74),
PL 219 018 B1 które są zdolne do specyficznego powielania białka von Ebner'a. Badania RT-PCR z tym zestawem starterów wykazały selektywną ekspresję w płucach i w badanych próbkach (5/10) nowotworu płuc (fig. 10). W grupie prawidłowych tkanek, ekspresję stwierdzono także w żołądku. Inne prawidłowe tkanki nie wykazywały ekspresji.
P r z y k ł a d 10. Identyfikacja Plunc jako celu diagnostyki i terapii nowotworów
Plunc SEQ ID Nr: 55) i produkt jego translacji (SEQ ID Nr: 64) były opublikowane w Genbank pod numerem akcesyjnym NM 016583. Ludzki Plunc koduje 256 aminokwasowe białko i wykazuje
72% homologii z mysim Plunc (Bingle i Bingle, Biochem, Biophys Acta 1493: 363-7, 2000). Ekspresja
Plunc jest ograniczona do tchawicy, górnych dróg oddechowych, nabłonka noso-gardzieli i gruczołu ślinowego. Zgodnie z wynalazkiem badano, czy Plunc może być użyty jako wskaźnik raka płuc. W tym celu użyto oligonukleotydów (SEQ ID Nr: 75, 76), które są zdolne do specyficznego powielania Plunc.
Badania RT-PCR z tym zestawem starterów wykazały selektywną ekspresję w grasicy, w płucach i w (6/10) badanych próbek raka płuc (fig. 11). Inne prawidłowe tkanki nie wykazywały ekspresji.
P r z y k ł a d 11. Identyfikacja SLC26A9 jako celu diagnostyki i terapii nowotworów
SLC26A9 (SEQ ID Nr: 56) i jego produkt translacji (SEQ ID Nr: 65) zostały opublikowane w Genbank pod numerem akcesyjnym NM 134325. SLC26A9 należy do rodziny wymieniaczy anionowych. Ekspresja CLCA1 zachodzi wyłącznie w nabłonku oskrzelikowym i pęcherzykowym płuc (Lohi i wsp., J. Bilo. Chem. 277: 14246-54, 2002).
Badano, czy SLC26A9 może być użyte jako wskaźnik nowotworu płuc. Do tego celu użyto oligonukleotydów (SEQ ID Nr: 77, 78), które są zdolne do specyficznego powielania SLC26A9. Badania RT-PCR z SLC26A9-specyficznymi starterami (SEQ ID Nr: 77, 78) wykazały selektywną ekspresję w płucach i we wszystkich (13/13) badanych próbkach nowotworu płuc (fig. 12). Inne prawidłowe tkanki, z wyjątkiem tarczycy, nie wykazywały ekspresji. Możliwe jest najpierw w doświadczeniu w ilościowym RT-PCR ze starterami SEQ ID Nr: 131 i 132 potwierdzenie tych wyników i otrzymanie dodatkowych informacji. Możliwe jest w połączonych próbkach 4-5 nowotworowych tkanek wykrycie wysokiego poziomu ekspresji dla SLC26A9-specyficznego RNA w nowotworach płuc, okrężnicy i żołądka. SLC26A9 jest członkiem rodziny transbłonowych transporterów anionowych. W zdrowych płucach białko jest skierowane względem światła przewodu w kierunku dróg oddechowych i dlatego nie jest bezpośrednio dostępne dla przeciwciał IgG z krwi. Zgodnie z wynalazkiem jest więc możliwe użycie SLC26A9 jako celu terapeutycznego przy użyciu przeciwciał monoklonalnych w określonych nowotworach, między innymi nowotworach płuc, nowotworach żołądka, nowotworach trzustki. Wyraźnie zaznaczona ekspresja i duży zakres SLC26A9 w nowotworach płuc, żołądka i trzustki sprawiają, że zgodnie z wynalazkiem, białko to jest znakomitym diagnostycznym i terapeutycznym wskaźnikiem.
Zgodnie z wynalazkiem, obejmuje to wykrywanie rozprzestrzeniania się komórek nowotworowych w surowicy, szpiku kostnym, moczu oraz wykrywanie przerzutów w innych narządach przy użyciu RT-PCR. Poza tym, zgodnie z wynalazkiem, możliwe jest użycie pozakomórkowych domen SLC26A9 jako struktur docelowych do immunodiagnostyki i terapii przeciwciałami monoklonalnymi. Co więcej, zgodnie z wynalazkiem, możliwe jest zastosowanie SLC26A9 jako szczepionki (RNA, DNA, białko, peptydy) w celu indukcji specyficznej dla nowotworu odpowiedzi immunologicznej (przenoszona przez komórki T i B odpowiedź immunologiczna). Zgodnie z wynalazkiem, obejmuje to także rozwój tak zwanych małych związków, które modulują biologiczną aktywność SLC26A9 i mogą być stosowane do terapii nowotworów płuc i nowotworów żołądkowo-jelitowych.
P r z y k ł a d 12. Identyfikacja THC1005163 jako celu diagnostyki i terapii nowotworów
THC1005163 (SEQ ID Nr: 57) jest fragmentem genu z indeksu genów TIGR. Gen jest zdefiniowany tylko w regionie 3' podczas gdy brakuje ORF. Badania RT-PCR przeprowadzano ze specyficznym dla THC1005163 starterem i starterem oligo dTis który ma specyficzny tag 21 specyficznych zasad na końcu 5'. Ten tag był badany przy użyciu programów do przeszukiwania baz danych ze względu na homologię ze znana sekwencją. Ten specyficzny starter początkowo był stosowany w syntezie cDNA w celu wykluczenia zanieczyszczeń genomowym DNA. Badania RT-PCR z tym zestawem starterów wykazały ekspresję w żołądku, jajnikach, płucach i (5/9) biopsjach nowotworu płuc (fig. 13). Inne prawidłowe tkanki nie wykazywały ekspresji.
P r z y k ł a d 13. Identyfikacja L0C134288 jako celów diagnostyki i terapii nowotworów
LOC134288 (SEQ ID Nr: 58) i jego przewidywany produkt translacji (SEQ ID Nr: 66) został opublikowany w Genbank, pod numerem akcesyjnym XM059703.
Badano zgodnie z wynalazkiem, czy L0C134288 może być użyty jako wskaźnik nowotworu komórek nerek. Do tego celu użyto oligonukleotydów (SEQ ID Nr: 80, 81), które są zdolne do specyficz50
PL 219 018 B1 nego powielania LOC134288. Badania RT-PCR wykazały selektywną ekspresję w nerkach i w (5/8) badanych biopsji nowotworów komórek nerek (fig. 14).
P r z y k ł a d 14. Identyfikacja THC943866 jako celu diagnostyki i terapii nowotworów
THC 943866 (SEQ ID Nr: 59) jest fragmentem genu z indeksu genów TIGR. Zgodnie z wynalazkiem badano, czy THC943866 może być użyty jako wskaźnik nowotworu komórek nerek. Do tego celu użyto oligonukleotydów (SEQ ID Nr: 82, 83), które są zdolne do specyficznego powielania THC943866.
Badania RT-PCR z THC943866-specyficznymi starterami (SEQ ID Nr: 82, 83) wykazały selektywną ekspresję w nerkach i w (4/8) badanych biopsji nowotworów komórek nerek (fig. 15).
P r z y k ł a d 15. Identyfikacja FLJ21458 jako celu diagnostyki i terapii nowotworów
FLJ21458 (SEQ ID Nr: 84) i jego przewidywany produkt translacji (SEQ ID Nr: 85) został opublikowany w Genbank, pod numerem akcesyjnym NM034850. Analiza sekwencji ujawniła, że białko reprezentuje nowego członka rodziny butyrofilin. Analiza strukturalna ujawniła, że reprezentuje typ 1 białka transbłonowego z pozakomórkową domeną immunoglobulinową. Do badania ekspresji użyto oligonukleotydów (SEQ ID Nr: 86, 87), które są zdolne specyficznie powielać FLJ21458. Badania RT-PCR z FLJ21458-specyficznymi starterami (SEQ ID Nr: 86, 87) wykazały selektywną ekspresję w biopsjach nowotworu okrężnicy (fig. 16, tab. 5).
Ilościowy RT-PCR ze specyficznymi starterami SEQ ID Nr: 86, 87) potwierdził ten specyficzny profil (fig. 39). W doświadczeniu dodatkowo było możliwe wykrycie specyficznie żołądkowo-jelitowego FLJ21458 w okrężnicy i w żołądku, odbytnicy, jelicie ślepym i w jądrach. 7/11 próbek przerzutów okrężnicy także było pozytywnych w ilościowym PCR. FLJ21458-specyficzna ekspresja rozciągała się na inne nowotwory i specyficzna dla białka ekspresja była wykrywalna w nowotworach żołądka, trzustki i wątroby (tab. 5).
Przeciwciała do wykrywania białka FLJ21458 były otrzymywane przez immunizację królików. Do namnażania przeciwciał używano następujących peptydów:
SEQ ID Nr: 135:QWQVFGPDKPVQAL;
SEQ ID Nr: 136: AKWKGPQGQDLSTDS.
FLJ21458-specyficzna reakcja była wykrywalna metodą immunofluorescencji (fig. 40). Żeby sprawdzić specyficzność przeciwciał, komórki 293 transfekowano plazmidem, który koduje białko fuzyjne FLJ21458-GFP. Specyficzność wykazano na jednym prążku przez badanie kolokalizacji używając specyficznego dla FLJ21458 przeciwciała i z drugiej strony poprzez autofluorescencją GFP. Nałożenie dwóch fluorescencyjnych diagramów pokazuje jednoznacznie, że surowica odpornościowa rozpoznaje białko FLJ21458 (fig. 40a). Z powodu nadekspresji białka, wynik znakowania komórek był rozmyty i nie pozwalał na jednoznaczną lokalizację białka. Z tego powodu przeprowadzono dalsze doświadczenie z zastosowaniem immunofluorescencji z linią komórkową Snu16 specyficzną dla nowotworu żołądka, w której ekspresja FLJ21458 zachodzi endogennie (fig. 41B).
Komórki znakowano surowicą odpornościową specyficzną dla FLJ21458 i innym przeciwciałem, które rozpoznaje białko błonowe E-kadherynę. Przeciwciało specyficzne dla FLJ21458 znakuje przynajmniej słabo błonę komórkową i to jest dowodem, że FLJ21458 jest zlokalizowane w błonie komórkowej.
Badania bioinformatyczne wykazały, że białko kodowane przez FLJ21458 reprezentuje cząsteczkę powierzchniową komórki i ma domenę imunoglobulinowej supercząsteczki. Selektywna ekspresja tej powierzchniowej cząsteczki sprawia, że jest ona dobrym celem do rozwoju diagnostycznych metod wykrywania komórek nowotworowych i do terapeutycznych sposobów eliminacji komórek nowotworowych.
Wyraźnie zaznaczona ekspresja i duży zakres FLJ21458 w nowotworach żołądka i okrężnicy sprawiają, że zgodnie z wynalazkiem, białko to jest bardzo interesującym diagnostycznym i terapeutycznym wskaźnikiem. Zgodnie z wynalazkiem, obejmuje to wykrywanie rozprzestrzeniania się komórek nowotworowych w surowicy, szpiku kostnym, moczu oraz wykrywanie przerzutów w innych narządach przy użyciu RT-PCR. Poza tym, zgodnie z wynalazkiem, możliwe jest użycie pozakomórkowych domen FLJ21458 jako struktur docelowych do immunodiagnostyki i terapii przeciwciałami monoklonalnymi. Co więcej, zgodnie z wynalazkiem, możliwe jest zastosowanie FLJ21458 jako szczepionki (RNA, DNA, białko, peptydy) w celu indukcji specyficznych dla nowotworu odpowiedzi immunologicznej (przenoszona przez komórki T i B odpowiedź immunologiczna). Zgodnie z wynalazkiem, obejmuje to także rozwój tak zwanych małych związków, które modulują biologiczną aktywność FLJ21458 i mogą być stosowane do terapii nowotworów płuc i nowotworów żołądkowo-jelitowych.
PL 219 018 B1
T a b e l a 5
Ekspresja FLJ21458 w tkankach prawidłowych i nowotworowych
Prawidłowa tkanka | Ekspresja |
Mózg | - |
Móżdżek | - |
Mięsień sercowy | nie oznaczano |
Mięsień szkieletowy | - |
Mięsień sercowy | - |
Żołądek | ++ |
Okrężnica | +++ |
Trzustka | - |
Nerki | - |
Wątroba | - |
Jądra | ++ |
Grasica | nie oznaczano |
Gruczoł piersiowy | nie oznaczano |
Jajniki | - |
Macica | - |
Skóra | - |
Płuca | - |
Tarczyca | nie oznaczano |
Węzły chłonne | - |
Śledziona | - |
PBMC | - |
Nadnercza | nie oznaczano |
Przełyk | - |
Jelito cienkie | - |
Prostata | - |
Typ nowotworu | Ekspresja |
1 | 2 |
Rak okrężnicy | 7/10 |
Rak trzustki | 5/6 |
Rak przełyku | nie oznaczano |
Rak żołądka | 8/10 |
Rak oskrzeli | nie oznaczano |
Rak piersi | nie oznaczano |
Rak jajników | nie oznaczano |
Rak endometrium | nie oznaczano |
Nowotwory ENT | nie oznaczano |
PL 219 018 B1 cd. tabeli 5
1 | 2 |
Rak komórek nerek | nie oznaczano |
Rak prostaty | nie oznaczano |
Przerzuty okrężnicy | 7/11 |
Rak wątroby | 5/8 |
PL 219 018 B1
LISTA SEKWENCJI <110> Ganymed Pharmaceuticals AG Sahin Dr., ugur Tureci Dr., ózlem Koslowski Dr., Michael <120> Produkty genetyczne, których ekspresja w nowotworach jest zróżnicowana i ich zastosowanie <130> 342-4PCT <150> DE 102 54 601.0 <151> 2002-11-22 <160> 137 <170> Patent In wersja 3.1 <210> 1 <211> 1875 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 1 caggccagag | tcccagctgt | cctggactct | gctgtgggga | agggctgatg | caggtgtgga | 60 |
gtcaaatgtg | ggtgcctcct | gcagccgggt | gccaggaggg | gtggaggggc | caccctgggc | 120 |
tttgtccggg | agcctggtct | tcccgtcctt | gggctgacag | gtgctgctgc | ctctgagccc | 180 |
tccctgctaa | gagctgtgtg | ctgggtaagg | ctggtggccc | tttgggctcc | ctgtccagga | 240 |
tttgtgctct | ggagggtagg | gcttgctggg | ctggggactg | gaggggaacg | tggagctcct | 300 |
tctgcctcct | ttcctgcccc | atgacagcag | gcagatccca | ggagagaaga | gctcaggaga | 360 |
tgggaagagg | atctgtccag | gggttagacc | tcaagggtga | cttggagttc | tttacggcac | 420 |
ccatgctttc | tttgaggagt | tttgtgtttg | tgggtgtggg | gtcggggctc | acctcctccc | 480 |
acatccctgc | ccagaggtgg | gcagagtggg | ggcagtgcct | tgctccccct | gctcgctctc | 540 |
tgctgacctc | cggctccctg | tgctgcccca | ggaccatgaa | tggcacctac | aacacctgtg | 600 |
PL 219 018 B1
gctccagcga | cctcacctgg | cccccagcga | tcaagctggg | cttctacgcc | tacttgggcg | 660 |
tcctgctggt | gctaggcctg | ctgctcaaca | gcctggcgct | ctgggtgttc | tgctgccgca | 720 |
tgcagcagtg | gacggagacc | cgcatctaca | tgaccaacct | ggcggtggcc | gacctctgcc | 780 |
tgctgtgcac | cttgcccttc | gtgctgcact | ccctgcgaga | cacctcagac | acgccgctgt | 840 |
gccagctctc | ccagggcatc | tacctgacca | acaggtacat | gagcatcagc | ctggtcacgg | 900 |
ccatcgccgt | ggaccgctat | gtggccgtgc | ggcacccgct | gcgtgcccgc | gggctgcggt | 960 |
cccccaggca | ggctgcggcc | gtgtgcgcgg | tcctctgggt | gctggtcatc | ggctccctgg | 1020 |
tggctcgctg | gctcctgggg | attcaggagg | gcggcttctg | cttcaggagc | acccggcaca | 1080 |
atttcaactc | catggcgttc | ccgctgctgg | gattctacct | gcccctggcc | gtggtggtct | 1140 |
tctgctccct | gaaggtggtg | actgccctgg | cccagaggcc | acccaccgac | gtggggcagg | 1200 |
cagaggccac | ccgcaaggct | gcccgcatgg | tctgggccaa | cctcctggtg | ttcgtggtct | 1260 |
gcttcctgcc | cctgcacgtg | gggctgacag | tgcgcctcgc | agtgggctgg | aacgcctgtg | 1320 |
ccctcctgga | gacgatccgt | cgcgccctgt | acataaccag | caagctctca | gatgccaact | 1380 |
gctgcctgga | cgccatctgc | tactactaca | tggccaagga | gttccaggag | gcgtctgcac | 1440 |
tggccgtggc | tcccagtgct | aaggcccaca | aaagccagga | ctctctgtgc | gtgaccctcg | 1500 |
cctaagaggc | gtgctgtggg | cgctgtgggc | caggtctcgg | gggctccggg | aggtgctgcc | 1560 |
tgccagggga | agctggaacc | agtagcaagg | agcccgggat | cagccctgaa | ctcactgtgt | 1620 |
attctcttgg | agccttgggt | gggcagggac | ggcccaggta | cctgctctct | tgggaagaga | 1680 |
gagggacagg | gacaagggca | agaggactga | ggccagagca | aggccaatgt | cagagacccc | 1740 |
cgggatgggg | cctcacactt | gccaccccca | gaaccagctc | acctggccag | agtgggttcc | 1800 |
tgctggccag | ggtgcagcct | tgatgacacc | tgccgctgcc | cctcggggct | ggaataaaac | 1860 |
tccccaccca | gagtc | 1875 |
<210> 2 <211> 3222
<212> DNA | i sapiens | |||||
<213> Home | ||||||
<400> 2 atgaagacgt | tgctgttgga | cttggctttg | tggtcactgc | tcttecagcc | cgggtggctg | 60 |
tcctttagtt | cccaggtgag | tcagaactgc | cacaatggca | gctatgaaat | cagcgtcctg | 120 |
atgatgggca | actcagcctt | tgcagagccc | ctgaaaaact | tggaagatgc | ggtgaatgag | 180 |
PL 219 018 B1
gggctggaaa | tagtgagagg | acgtctgcaa | aatgctggcc | taaatgtgac | tgtgaacgct | 240 |
actttcatgt | attcggatgg | tctgattcat | aactcaggcg | actgccggag | tagcacctgt | 300 |
gaaggcctcg | acctactcag | gaaaatttca | aatgcacaac | ggatgggctg | tgtcctcata | 360 |
gggccctcat | gtacatactc | caccttccag | atgtaccttg | acacagaatt | gagctacccc | 420 |
atgatctcag | ctggaagttt | tggattgtca | tgtgactata | aagaaacctt | aaccaggctg | 480 |
atgtctccag | ctagaaagtt | gatgtacttc | ttggttaact | tttggaaaac | caacgatctg | 540 |
cccttcaaaa | cttattcctg | gagcacttcg | tatgtttaca | agaatggtac | agaaactgag | 600 |
gactgtttct | ggtaccttaa | tgctctggag | gctagcgttt | cctatttctc | ccacgaactc | 660 |
ggctttaagg | tggtgttaag | acaagataag | gagtttcagg | atatcttaat | ggaccacaac | 720 |
aggaaaagca | atgtgattat | tatgtgtggt | ggtccagagt | tcctctacaa | gctgaagggt | 780 |
gaccgagcag | tggctgaaga | cattgtcatt | attctagtgg | atcttttcaa | tgaccagtac | 840 |
ttggaggaca | atgtcacagc | ccctgactat | atgaaaaatg | tccttgttct | gacgctgtct | 900 |
cctgggaatt | cccttctaaa | tagctctttc | tccaggaatc | tatcaccaac | aaaacgagac | 960 |
tttgctcttg | cctatttgaa | tggaatcctg | ctctttggac | atatgctgaa | gatatttctt | 1020 |
gaaaatggag | aaaatattac | cacccccaaa | tttgctcatg | ctttcaggaa | tctcactttt | 1080 |
gaagggtatg | acggtccagt | gaccttggat | gactgggggg | atgttgacag | taccatggtg | 1140 |
cttctgtata | cctctgtgga | caccaagaaa | tacaaggttc | ttttgaccta | tgatacccac | 1200 |
gtaaataaga | cctatcctgt | ggatatgagc | cccacattca | cttggaagaa | ctctaaactt | 1260 |
cctaatgata | ttacaggccg | gggccctcag | atcctgatga | ttgcagtctt | caccctcact | 1320 |
ggagctgtgg | tgctgctcct | gctcgtcgct | ctcctgatgc | tcagaaaata | tagaaaagat | 1380 |
tatgaacttc | gtcagaaaaa | atggtcccac | attcctcctg | aaaatatctt | tcctctggag | 1440 |
accaatgaga | ccaatcatgt | tagcctcaag | atcgatgatg | acaaaagacg | agatacaatc | 1500 |
cagagactac | gacagtgcaa | atacgacaaa | aagcgagtga | ttctcaaaga | tctcaagcac | 1560 |
aatgatggta | atttcactga | aaaacagaag | atagaattga | acaagttgct | tcagattgac | 1620 |
tattacaacc | tgaccaagtt | ctacggcaca | gtgaaacttg | ataccatgat | cttcggggtg | 1680 |
atagaatact | gtgagagagg | atccctccgg | gaagttttaa | atgacacaat | ttcctaccct | 1740 |
gatggcacat | tcatggattg | ggagtttaag | atctctgtet | tgtatgacat | tgctaaggga | 1800 |
atgtcatatc | tgcactccag | taagacagaa | gtccatggtc | gtctgaaatc | taccaactgc | 1860 |
gtagtggaca | gtagaatggt | ggtgaagatc | actgattttg | gctgcaattc | cattttacct | 1920 |
ccaaaaaagg | acctgtggac | agctccagag | cacctccgcc | aagccaacat | ctctcagaaa | 1980 |
ggagatgtgt | acagctatgg | gatcatcgca | caggagatca | ttctgcggaa | agaaaccttc | 2040 |
tacactttga | gctgtcggga | ccggaatgag | aagattttca | gagtggaaaa | ttccaatgga | 2100 |
PL 219 018 B1 atgaaaccct tccgcccaga tttattcttg gaaacagcag aggaaaaaga gctagaagtg 2160 tacctacttg taaaaaactg ttgggaggaa gatccagaaa agagaccaga tttcaaaaaa 2220 attgagacta cacttgccaa gatatttgga ctttttcatg accaaaaaaa tgaaagctat 2280 atggatacct tgatccgacg tctacagcta tattctcgaa acctggaaca tctggtagag 2340 gaaaggacac agctgtacaa ggcagagagg gacagggctg acagacttaa ctttatgttg 2400 cttccaaggc tagtggtaaa gtctctgaag gagaaaggct ttgtggagcc ggaactatat 2460 gaggaagtta caatctactt cagtgacatt gtaggtttca ctactatctg caaatacagc 2520 acccccatgg aagtggtgga catgcttaat gacatctata agagttttga ccacattgtt 2580 gatcatcatg atgtctacaa ggtggaaacc atcggtgatg cgtacatggt ggctagtggt 2640 ttgcctaaga gaaatggcaa tcggcatgca atagacattg ccaagatggc cttggaaatc 2700 ctcagcttca tggggacctt tgagctggag catcttcctg gcctcccaar atggattcgc 2760 attggagttc actctggtcc ctgtgctgct ggagttgtgg gaatcaagat gcctcgttat 2820 tgtctatttg gagatacggt caacacagcc tctaggatgg aatccactgg cctccctttg 2880 agaattcacg tgagtggctc caccatagcc atcctgaaga gaactgagtg ccagttcctt 2940 tatgaagtga gaggagaaac atacttaaag ggaagaggaa atgagactac ctactggctg 3000 actgggatga aggaccagaa attcaacctg ccaacccctc ctactgtgga gaatcaacag 3060 cgtttgcaag cagaattttc agacatgatt gccaactctt tacagaaaag acaggcagca 3120 gggataagaa gccaaaaacc cagacgggta gccagctata aaaaaggcac tcrggaatac 3180 ttgcagctga ataccacaga caaggagagc acctattttt aa 3222 <210> 3 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens
<4OO> 3 atgaagacgt | tgctgttgga | cttggctttg | tggtcactgc | tcttccagcc | cgggtggctg | 60 |
tcctttagtt | cccaggtgag | tcagaactgc | cacaatggca | gctatgaaat | cagcgtcctg | 120 |
atgatgggca | actcagcctt | tgcagagccc | ctgaaaaact | tggaagatgc | ggtgaatgag | 180 |
gggctggaaa | tagtgagagg | acgtctgcaa | aatgctggcc | taaatgtgac | tgtgaacgct | 240 |
actttcatgt | attcggatgg | tctgattcat | aactcaggcg | actgccggag | tagcacctgt | 300 |
gaaggcctcg | acctactcag | gaaaatttca | ccttga | 336 |
PL 219 018 B1
<21O> | 4 |
<211> | 777 |
<212> | DNA |
<213> | Homo sapiens |
<400> | 4 |
atgaagacgt tgctgttgga cttggctttg tggtcactgc tcttccagcc cgggtggctg 60 tcctttagtt cccaggtgag tcagaactgc cacaatggca gctatgaaat cagcgtcctg 120 atgatgggca actcagcctt tgcagagccc ctgaaaaact tggaagatgc ggtgaatgag 180 gggctggaaa tagtgagagg acgtctgcaa aatgctggcc taaatgtgac tgtgaacgct 240 actttcatgt attcggatgg tctgattcat aactcaggcg actgccggag tagcacctgt 300 gaaggcctcg acctactcag gaaaatttca aatgcacaac ggatgggctg tgtcctcata 360 gggccctcat gtacatactc caccttccag atgtaccttg acacagaatt gagctacccc 420 atgatctcag ctggaagttt tggattgtca tgtgactata aagaaacctt aaccaggctg 480 atgtctccag ctagaaagtt gatgtacttc ttggttaact tttggaaaac caacgatctg 540 cccttcaaaa cttattcctg gagcacttcg tatgtttaca agaatggtac agaaactgag 600 gactgtttct ggtaccttaa tgctctggag gctagcgttt cctatttctc ccacgaactc 660 ggctttaagg tggtgttaag acaagataag gagtttcagg atatcttaat ggaccacaac 720 aggaaaagca atgtgaccag tacttggagg acaatgtcac agcccctgac tatatga 777 <210> 5 <211> 3213 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 atgaagacgt tgctgttgga cttggctttg tggtcactgc tcttccagcc cgggtggctg 60 tcctttagtt cccaggtgag tcagaactgc cacaatggca gctatgaaat cagcgtcctg 120 atgatgggca actcagcctt tgcagagccc ctgaaaaact tggaagatgc ggtgaatgag 180 gggctggaaa tagtgagagg acgtctgcaa aatgctggcc taaatgtgac tgtgaacgct 240 actttcatgt attcggatgg tctgattcat aactcaggcg actgccggag tagcacctgt 300 gaaggcctcg acctactcag gaaaatttca aatgcacaac ggatgggctg tgtcctcata 360 gggccctcat gtacatactc caccttccag atgtaccttg acacagaatt gagctacccc 420
PL 219 018 B1
atgatctcag | ctggaagttt | tggattgtca | tgtgactata | aagaaacctt | aaccaggctg | 480 |
atgtctccag | ctagaaagtt | gatgtacttc | ttggttaact | tttggaaaac | caacgatctg | 540 |
cccttcaaaa | cttattcctg | gagcacttcg | tatgtttaca | agaatggtac | agaaactgag | 600 |
gactgtttct | ggtaccttaa | tgctctggag | gctagcgttt | cctatttctc | ccacgaactc | 660 |
ggctttaagg | tggtgttaag | acaagataag | gagtttcagg | atatcttaat | ggaccacaac | 720 |
aggaaaagca | atgtgattat | tatgtgtggt | ggtccagagt | tcctctacaa | gctgaagggt | 780 |
gaccgagcag | tggctgaaga | cattgtcatt | attctagtgg | atcttttcaa | tgaccagtac | 840 |
ttggaggaca | atgtcacagc | ccctgactat | atgaaaaatg | tccttgttct | gacgctgtct | 900 |
cetgggaatt | cccttctaaa | tagctctttc | tccaggaatc | tatcaccaac | aaaacgagac | 960 |
tttgctcttg | cctatttgaa | tggaatcctg | ctctttggac | atatgctgaa | gatatttctt | 1020 |
gaaaatggag | aaaatattac | cacccccaaa | tttgctcatg | ctttcaggaa | tctcactttt | 1080 |
gaagggtatg | acggtccagt | gaccttggat | gactgggggg | atgttgacag | taccatggtg | 1140 |
cttctgtata | cctctgtgga | caccaagaaa | tacaaggttc | ttttgaccta | tgatacccac | 1200 |
gtaaataaga | cctatcctgt | ggatatgagc | cccacattca | cttggaagaa | ctctaaactt | 1260 |
cctaatgata | ttacaggccg | gggccctcag | atcctgatga | ttgcagtctt | caccctcact | 1320 |
ggagctgtgg | tgctgctcct | gctcgtcgct | ctcctgatgc | tcagaaaata | tagaaaagat | 1380 |
tatgaacttc | gtcagaaaaa | atggtcccac | attcctcctg | aaaatatctt | tcctctggag | 1440 |
accaatgaga | ccaatcatgt | tagcctcaag | atcgatgatg | acaaaagacg | agatacaatc | 1500 |
cagagactac | gacagtgcaa | atacgacaaa | aagcgagtga | ttctcaaaga | tctcaagcac | 1560 |
aatgatggta | atttcactga | aaaacagaag | atagaattga | acaagattga | ctattacaac | 1620 |
ctgaccaagt | tctacggcac | agtgaaactt | gataccatga | tcttcggggt | gatagaatac | 1680 |
tgtgagagag | gatccctccg | ggaagtttta | aatgacacaa | tttcctaccc | tgatggcaca | 1740 |
ttcatggatt | gggagtttaa | gatctctgtc | ttgtatgaca | ttgctaaggg | aatgtcatat | 1800 |
ctgcactcca | gtaagacaga | agtccatggt | cgtctgaaat | ctaccaactg | cgtagtggac | 1860 |
agtagaatgg | tggtgaagat | cactgatttt | ggctgcaatt | ccattttacc | tccaaaaaag | 1920 |
gacctgtgga | cagctccaga | ΠΓ łlfrtrrnr y vd uu* l l i» | caagccaaca | tctctcagaa | aggagatgtg | 1980 |
tacagctatg | ggatcatcgc | acaggagatc | attctgcgga | aagaaacctt | ctacactttg | 2040 |
agctgtcggg | accggaatga | gaagattttc | agagtggaaa | attccaatgg | aatgaaaccc | 2100 |
ttccgcccag | atttattctt | ggaaacagca | gaggaaaaag | agctagaagt | gtacctactt | 2160 |
gtaaaaaact | gttgggagga | agatccagaa | aagagaccag | atttcaaaaa | aattgagact | 2220 |
acacttgcca | agatatttgg | actttttcat | gaccaaaaaa | atgaaagcta | tatggatacc | 2280 |
PL 219 018 B1 ttgatccgac gtctacagct atattctcga aacctggaac atctggtaga ggaaaggaca 2340 cagctgtaca aggcagagag ggacagggct gacagactta actttatgtt gcttccaagg 2400 ctagtggtaa agtctctgaa ggagaaaggc tttgtggagc cggaactata tgaggaagtt 2460 acaatctact tcagtgacat tgtaggtttc actactatct gcaaatacag cacccccatg 2520 gaagtggtgg acatgcttaa tgacatctat aagagttttg accacattgt tgatcatcat 2580 gatgtctaca aggtggaaac catcggtgat gcgtacatgg tggctagtgg tttgcctaag 2640 agaaatggca atcggcatgc aatagacatt gccaagatgg ccttggaaat cctcagcttc 2700 atggggacct ttgagctgga gcatcttcct ggcctcccaa tatggattcg cattggagtt 2760 cactctggtc cctgtgctgc tggagtcgtg ggaatcaaga tgcctcgtta ttgtctattt 2820 ggagatacgg tcaacacagc ctctaggatg gaatccactg gcctcccttt gagaattcac 2880 gtgagtggct ccaccatagc catcctgaag agaactgagt gccagttcct ttatgaagtg 2940 agaggagaaa catacttaaa gggaagagga aatgagacta cctactggct gactgggatg 3000 aaggaccaga aattcaacct gccaacccct cctactgtgg agaatcaaca gcgtttgcaa 3060 gcagaatttt cagacatgat tgccaactct ttacagaaaa gacaggcagc agggataaga 3120 agccaaaaac ccagacgggt agccagctat aaaaaaggca ctctggaata cttgcagctg 3180 aataccacag acaaggagag cacctatttt taa 3213 <210> 6 <211> 550 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 ggggacactt tgtatggcaa gtggaaccac tggcttggtg gattttgcta gatttttctg 60 atttttaaac tectgaaaaa tatcccagat aactgtcatg aagctggtaa ctatcttcct 120 gctggtgacc atcagccttt gtagttactc tgctactgcc ttectcatca acaaagtgcc 180 ccttcctgtt gacaagttgg cacctttacc tctggacaac attcttccct ttatggatcc 240 attaaagctt cttctgaaaa ctctgggcat ttctgttgag caccttgtgg aggggctaag 300 gaagtgtgta aatgagctgg gaccagaggc ttctgaagct gtgaagaaac tgctggaggc 360 gctatcacac ttggtgtgac atcaagataa agagcggagg tggatgggga tggaagatga 420 tgctcctatc ctccctgcct gaaacttgtt ctaccaatta tagatcaaat gccctaaaat 480 gtagtgaccc gtgaaaagga caaataaagc aatgaatact aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 540 aaaaaaaaaa 550 <210> 7
PL 219 018 B1 <211> 786 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 atggccgtga ctgcctgtca gggcttgggg ttcgtggttt cactgattgg gattgcgggc 60 atcattgctg ccacctgcat ggaccagtgg agcacccaag acttgtacaa caaccccgta 120 acagctgttt tcaactacca ggggctgtgg cgctcctgtg tccgagagag ctctggcttc 180 accgagtgcc ggggctactt caccctgctg gggctgccag ccatgctgca ggcagtgcga 240 gccctgatga tcgtaggcat cgtcctgggt gccattggcc tcctggtatc catctttgcc 300 ctgaaatgca tccgcattgg cagcatggag gactctgcca aagccaacat gacactgacc 360 tccgggatca tgttcattgt ctcaggtctt tgtgcaattg ctggagtgtc tgtgtttgcc 420 aacatgctgg tgactaactt ctggatgtcc acagctaaca tgtacaccgg catgggtggg 480 atggtgcaga ctgttcagac caggtacaca tttggtgcgg ctctgttcgt gggctgggtc 540 gctggaggcc tcacactaat tgggggtgtg atgatgtgca tcgcctgccg gggcctggea 600 ccagaagaaa ccaactacaa agccgtttct tatcatgcct caggccacag tgttgcctac 660 aagcctggag gcttcaaggc cagcactggc tttgggtcca acaccaaaaa caagaagata 720 tacgatggag gtgcccgcac agaggacgag gtacaatctt atccttccaa gcacgactat 780 gtgtaa 786 <210> 8 <211> 180 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 8 | ||||||
tgcgccacca | tggCCgtgaC | tgcctgtcag | ggcttggggt | tcgtggtttc | actgattggg | 60 |
attgcgggca | tcattgctgc | cacctgcatg | gaccagtgga | gcacccaaga | cttgtacaac | 120 |
aaccccgtaa | cagctgtttt | caactaccag | gggctgtggc | gctcctgtgt | CCy3QHQ3.C|ę | 180 |
<210> 9 <211> 309 <212> PRT
PL 219 018 B1
<213> Homo | sapi ens | ||||||||||||||
<400> 9 | |||||||||||||||
Met | Asn | Gly | Thr | Tyr | Asn | Thr | cys | Gly | Ser | Ser | Asp | Leu | Thr | Trp | Pro |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Pro | Ala | Ile | Lys | Leu | Gly | Phe | Tyr | Ala | Tyr | Leu | Gly | val | Leu | Leu | val |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Leu | Gly | Leu | Leu | Leu | Asn | Ser | Leu | Ala | Leu | Trp | val | Phe | cys | cys | Arg |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Met | Gin | Gin | Trp | Thr | Glu | Thr | Arg | Ile | Tyr | Met | Thr | Asn | Leu | Ala | val |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Al a | ASp | Leu | cys | Leu | Leu | cys | Thr | Leu | Pro | phe | val | Leu | His | ser | Leu |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Arg | Asp | Thr | Ser | Asp | Thr | Pro | Leu | cys | Gin | Leu | ser | Gin | Gly | ile | Tyr |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Leu | Thr | Asn | Arg | Tyr | Met | Ser | ile | Ser | Leu | Val | *|**j*j i** | Ala | Ile | Ala | val |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Asp | Arg | Tyr | val | Ala | val | Arg | His | Pro | Leu | Arg | Ala | Arg | Gly | Leu | Arg |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
ser | Pro | Arg | Gin | Ala | Ala | Ala | Val | cys | Ala | val | Leu | Trp | val | Leu | Val |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
He | Gly | Ser | Leu | val | Ala | Arg | Trp | Leu | Leu | Gly | Ile | Gin | Glu | Gly Gly | |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Phe | cys | Phe | Arg | Ser | Thr | Arg | His | Asn | Phe | Asn | Ser | Met | Arg | Phe | Pro |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Leu | Leu | Gly | Phe | Tyr | Leu | Pro | Leu | Ala | val | Val | val | Phe | cys | ser | Leu |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Lys | val | val | Thr | Ala | Leu | Ala | Gin | Arg | Pro | Pro | Thr | Asp | Val | Gly | Gin |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Ala | Glu | Ala | Thr | Arg | Lys | Ala | Ala | Arg | Met | val | Trp | Ala | Asn | Leu | Leu |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Val | Phe | val | val | Cys | Phe | Leu | Pro | Leu | His | val | Gly | Leu | Thr | va1 | Arg |
PL 219 018 B1
225 230 235 240
Leu | Ala | Val | Gly Trp 245 | Asn | Ala Cys Ala Leu 250 | Leu | Glu | Thr | Ile | Arg 255 | Arg | ||||
Ala | Leu | Tyr | Ile | Thr | ser | Lys | Leu | Ser | Asp | Ala | Asn | Cys | Cys | Leu | Asp |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Ala | Ile | cys | Tyr | Tyr | Tyr | Met | Ala | Lys | Glu | Phe | Gin | Glu | Ala | Ser | Ala |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Leu | Ala | val | Ala | Pro | Arg | Ala | Lys | Ala | Hi s | Lys | Ser | Gin | Asp | Ser | Leu |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Cys | Val | 1*1 j** | Leu | Ala |
305 <210> 10 <211> 394 <212> PRT
<213 | > H | lomo | sapi | ens | |||||||||||
<400 | l> 10 | ||||||||||||||
Met | Thr | Ala | Gly | Arg | Ser | Gin | Glu | Arg | Arg | Ala | Gin | Glu | Met | Gly | Arg |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Gly | Ser | Val | Gin | Gly | Leu | Asp | Leu | Lys | Gly | Asp | Leu | Gl u | Phe | Phe | Thr |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Ala | Pro | Met | 1» 6U | Ser | Leu | Arg | Ser | Phe | val | phe | val | Gly | val | Gly | Ser |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Gly | Leu | Thr | Ser | Ser | His | Π e | Pro | Ala | Gin | Arg | Trp | Ala | Glu | Trp | Gly |
50 | 5 5 | 60 | |||||||||||||
Gin | Cys | Leu | Ala | Pro | Pro | Al a | Arg | Ser | Leu | Leu | Thr | Ser | Gly | Ser | Leu |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Cys | cys | Pro | Arg | Thr | Met | Asn | Gly | Thr | Tyr | Asn | Thr | cys | Gly | Ser | Ser |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Asp | Leu | Thr | Trp | pro | Pro | Ala | ile | Lys | Leu | Gly | Phe | Tyr | Ala | Tyr | Leu |
100 105 110
PL 219 018 B1
Gly val | Leu Leu 115 | val | Leu Gly | Leu Leu Leu Asn Ser Leu Ala Leu | Trp | ||||||||||
120 | 125 | ||||||||||||||
val | Phe | Cys | Cys | Arg | Met | Gin | Gin | Trp | Thr | Glu | Thr | Arg | Ile | Yy p | Met |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Thr | Asn | Leu | Ala | val | Ala | ASp | Leu | Cys | Leu | Leu | cys | Thr | Leu | Pro | Phe |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Val | Leu | Hi s | ser | Leu | Arg | Asp | Thr | Ser | Asp | Thr | Pro | Leu | cys | Gin | Leu |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Ser | Gin | Gly | Ile | Tyr | Leu | Thr | Asn | Arg | Tyr | Met | Ser | ile | Ser | Leu | val |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Thr | Ala | Ile | Ala | Val | ASp | Arg | Tyr | val | Ala | Val | Arg | His | Pro | Leu | Arg |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Ala | Arg | dy | Leu | Arg | Ser | Pro | Arg | Gl n | Ala | Ala | Ala | va1 | cys | Ala | val |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Leu | Trp | val | Leu | Va1 | ile | Gly | Ser | Leu | val | Ala | Arg | Trp | Leu | Leu | Gly |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Ile | Gin | Glu | Gly Gly | Phe | cys | Phe | Arg | Ser | Thr | Arg | His | Asn | Phe | Asn | |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Ser | Met | Ala | Phe | Pro | Leu | Leu | Gly | Phe | Tyr | Leu | Pro | Leu | Ala | val | val |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Val | Phe | Cys | Ser | Leu | Lys | val | val | Thr | Ala | Leu | Ala | Gin | Arg | Pro | Pro |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Thr | Asp | Val | Gly | Gin | Ala | Glu | Ala | Thr | Arg | Lys | Ala | Ala | Arg | Met | Val |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Trp | Ala | Asn | Leu | Leu | val | Phe | val | Val | Cys | Phe | Leu | Pro | Leu | His | Val |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Gly | Leu | Thr | val | Arg | Leu | Ala | val | dy | Asn | Ala | Cys | Ala | Leu | Leu | |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Glu | Thr | ile | Arg | Arg | Ala | Leu | Yyp | „ *1 I 1 € | Thr | Ser | Lys | Leu | Ser | Asp | Ala |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Asn | cys | cys | Leu | ASp | Ala | ile | cys | Yy r | Tyr | Tyr | Met | Ala | Lys | Glu | Phe |
355 360 365
PL 219 018 B1
Gin Glu 370 | Ala Ser | Ala Leu | Ala Val 375 | Ala Pro Ser | Ala 380 | Lys | Ala | His | Lys | ||||||
Ser | Gin | Asp | ser | Leu | cys | Val | Thr | Leu | Ala | ||||||
385 | 390 | ||||||||||||||
<210> 11 | |||||||||||||||
<211> 1073 | |||||||||||||||
<212> PRT | |||||||||||||||
<213> Homo | sapi ens | ||||||||||||||
<400> 11 | |||||||||||||||
Met | Lys | Thr | Leu | Leu | Leu | Asp | Leu | Ala | Leu | Trp | Ser | Leu | Leu | Phe | Gin |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Pro | Gly | Trp | Leu | Ser | Phe | Ser | ser | Gin | val | Ser | Gin | Asn | Cys | His | Asn |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Gly | Ser | Tyr | Glu | ile | ser | val | Leu | Met | Met | Gly | Asn | Ser | Al a | Phe | Ala |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Glu | Pro | Leu | Lys | Asn | Leu | Glu | Asp | Ala | Val | Asn | Glu | Gly | Leu | Glu | ile |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
val | Arg | Gly | Arg | Leu | Gin | Asn | Ala | Gly | Leu | Asn | val | Thr | Val | Asn | Ala |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Thr | Phe | Met | Tyr | Ser | Asp | Gly | Leu | Ile | His | Asn | Ser | Gly | Asp | Cys | Arg |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Ser | Ser | Thr | cys | Gl u | Gly | Leu | Asp | Leu | Leu | Arg | Lys | ile | Ser | Asn | Al a |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Gin | Arg | Met | Gly | cys | val | Leu | ile | Gly | Pro | Ser | cys | Thr | Tyr | Ser | Thr |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Phe | Gin | Met | Tyr | Leu | Asp | Thr | Glu | Leu | Ser | Tyr | Pro | Met | Ile | Ser | Ala |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Gly | Ser | Phe | Gly | Leu | Ser | Cys | Asp | Tyr | Lys | Glu | Thr | Leu | Thr | Arg | Leu |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Met | Ser | Pro | Ala | Arg | Lys | Leu | Met | Tyr | Phe | Leu | val | Asn | Phe | T rp | Lys |
165 | 170 | 175 |
PL 219 018 B1
Thr | Asn | Asp | Leu | Pro | Phe | Lys | Thr | Tyr | Ser | Trp | Ser | Thr | Ser | Tyr | val |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Tyr | Lys | Asn | Gly | Thr | Glu | Thr | Glu | Asp | Cys | Phe | Trp | Tyr | Leu | Asn | Ala |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Leu | Glu | Ala | Ser | Val | Ser | Tyr | Phe | Ser | His | Glu | Leu | Gly | Phe | Lys | val |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Val | Leu | Arg | Gin | Asp | Lys | Glu | Phe | Gin | Asp | Ile | Leu | Met | Asp | His | Asn |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Arg | Lys | Asn | Val | Ile | Ile | Met | Cys | Gly | Gly | Pro | Glu | Phe | Leu | Tyr | |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Lys | Leu | Lys | Gly | Asp | Arg | Ala | val | Ala | Glu | Asp | Ile | val | Ile | Ile | Leu |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Val | Asp | Leu | Phe | Asn | Asp | Gin | Tyr | Leu | Glu | Asp | Asn | val | Thr | Ala | pro |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Asp | Tyr | Met | Lys | Asn | val | Leu | val | Leu | Thr | Leu | ser | Pro | Gly | Asn | Ser |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Leu | Leu | Asn | Ser | Ser | Phe | Ser | Arg | Asn | Leu | Ser | Pro | Thr | Lys | Arg | Asp |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Phe | Ala | Leu | Ala | Tyr | Leu | Asn | Gly | ile | Leu | Leu | Phe | Gly | His | Met | Leu |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Lys | ile | Phe | Leu | Glu | Asn | Gly | Glu | Asn | Ile | Thr | Thr | Pro | Lys | Phe | Ala |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
His | Ala | Phe | Arg | Asn | Leu | Thr | Phe | Glu | Gly | Tyr | Asp | Gly | Pro | val | Thr |
355 360 365
Leu Asp Asp Trp Gly Asp val Asp Ser Thr Met val Leu Leu Tyr Thr 370 375 380
Γ* 385 | val | Asp Thr Lys | Lys 390 | Lys | val | Leu | Leu 395 | Thr | Tyr | Asp | Thr | His 400 | |||
Val | Asn | Lys | Thr | Tyr | Pro | val | Asp | Met | Ser | pro | Thr | Phe | Thr | Trp | Lys |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Asn | Ser | Lys | Leu | Pro | Asn | ASP | Ile | Thr | Gly | Arg | Gly | Pro | Gin | Ile | Leu |
PL 219 018 B1
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Met | ile | Al a | val | Phe | Thr | Leu | Thr | Gly | Al a | val | Val | Leu | Leu | Leu | Leu |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
val | Ala 450 | Leu | Leu | Met | Leu | Arg 455 | Lys | Tyr | Arg | Lys | Asp 460 | Tyr | Glu | Leu | Arg |
Gin | Lys | Lys | Trp | Ser | His | Ile | Pro | Pro | Glu | Asn | Ile | Phe | Pro | Leu | Glu |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Thr | Asn | Glu | Thr | Asn | His | val | ser | Leu | Lys | ile | Asp | ASp | Asp | Lys | Arg |
485 | 490 | 495 | |||||||||||||
Arg | Asp | Thr | Ile 500 | Gin | Arg | Leu | Arg | Gin 505 | cys | Lys | Tyr | Asp | Lys 510 | Lys | Arg |
Val | Ile | Leu | Lys | Asp | Leu | Lys | His | Asn | Asp | Gly | Asn | Phe | Thr | Glu | Lys |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
Gin | Lys | Ile | Glu | Leu | Asn | Lys | Leu | Leu | Gin | ile | Asp | Tyr | Tyr | Asn | Leu |
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
Thr | Lys | Phe | Tyr | Gly | Thr | val | Lys | Leu | Asp | Thr | Met | Ile | Phe | Gly | val |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
Ile | Glu | Tyr | Cys | Glu | Arg | Gly | Ser | Leu | Arg | Glu | val | Leu | Asn | Asp | Thr |
565 | 570 | 575 | |||||||||||||
Ile | Ser | Tyr | Pro | Asp | Gly | Thr | Phe | Met | Asp | Trp | Glu | Phe | Lys | Ile | Ser |
580 | 585 | 590 | |||||||||||||
val | Leu | Tyr | ASP | Ile | Ala | Lys | Gly | Met | Ser | Tyr | Leu | His | Ser | Ser | Lys |
595 | 600 | 605 | |||||||||||||
Thr | Glu | Val | His | Gly | Arg | Leu | Lys | Ser | Thr | Asn | cys | val | val | Asp | ser |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
Arg | Met | val | val | Lys | ile | Thr | Asp | Phe | Gly | Cys | Asn | Ser | ile | Leu | Pro |
625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
Pro | Lys | Lys | Asp | Leu | Trp | Thr | Ala | Pro | Glu | His | Leu | Arg | Gin | Ala | Asn |
645 | 650 | 655 | |||||||||||||
Ile | Ser | Gin | Lys | Gly | Asp | Val | Tyr | Ser | Tyr | Gly | Ile | Ile | Ala | Gin | Glu |
660 | 665 | 670 |
PL 219 018 B1
ile | Ile | Leu | Arg | Lys | Glu | Thr | Phe | Tyr | Thr | Leu | Ser | Cys | Arg | Asp | Arg |
675 | 680 | 685 | |||||||||||||
Asn | Glu | Lys | ile | Phe | Arg | Va1 | Glu | Asn | Ser | Asn | Gly | Met | Lys | Pro | Phe |
690 | 695 | 700 | |||||||||||||
Arg | Pro | ASp | Leu | Phe | Leu | Glu | Thr | Ala | Glu | Glu | Lys | Gl u | Leu | Glu | val |
705 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||||
Tyr | Leu | Leu | Val | Lys | Asn | cys | Trp | Glu | Glu | Asp | Pro | Glu | Lys | Arg | Pro |
725 | 730 | 735 | |||||||||||||
Asp | Phe | Lys | Lys | Ile | Glu | Thr | Thr | Leu | Al a | Lys | Ile | Phe | Gly | Leu | Phe |
740 | 745 | 750 | |||||||||||||
His | Asp | Gin | Lys | Α5Π | Glu | Ser | Tyr | Met | Asp | Thr | Leu | Ile | Arg | Arg | Leu |
755 | 760 | 765 | |||||||||||||
Gin | Leu | Tyr | Ser | Arg | Asn | Leu | Glu | His | Leu | val | Glu | Glu | Arg | Thr | Gin |
770 | 775 | 780 | |||||||||||||
Leu | Tyr | Lys | Ala | Glu | Arg | Asp | Arg | Ala | Asp | Arg | Leu | Asn | Phe | Met | Leu |
785 | 790 | 795 | 800 | ||||||||||||
Leu | Pro | Arg | Leu | val | Val | Lys | Ser | Leu | Lys | Glu | Lys | Gly | Phe | val | Glu |
805 | 810 | 815 | |||||||||||||
Pro | Glu | Leu | Tyr | Glu | Glu | val | Thr | Ile | Tyr | Phe | Ser | Asp | Ile | va1 | Gly |
820 | 825 | 830 | |||||||||||||
Phe | Thr | Thr | Ile | Cys | Lys | Tyr | Ser | Thr | Pro | Met | Glu | val | val | ASp | Met |
835 | 840 | 845 | |||||||||||||
Leu | Asn | ASp | Ile | Tyr | Lys | ser | Phe | Asp | Hi s | Ile | Val | Asp | His | His | Asp |
850 | 855 | 860 | |||||||||||||
val | Tyr | Lys | val | Glu | Thr | Ile | Gly | Asp | Al a | Tyr | Met | Val | Al a | Ser | Gly |
865 | 870 | 875 | 880 | ||||||||||||
Leu | Pro | Lys | Arg | Asn | Gly | Asn | Arg | His | Al a | Ile | Asp | Ile | Al a | Lys | Met |
885 | 890 | 895 | |||||||||||||
Ala | Leu | Glu | Ile | Leu | Ser | Phe | Met | Gly | Thr | Phe | Glu | Leu | Gl u | His | Leu |
900 | 905 | 910 | |||||||||||||
Pro | Gly | Leu | Pro | Ile | Trp | Ile | Arg | Ile | Gly | Val | Hi s | Ser | Gly | Pro | Cys |
915 920 925
PL 219 018 B1
Ala | Ala 930 | Gly | val | Val | Gly | Ile 935 | Lys | Met | Pro | Arg | Tyr 940 | cys | Leu | Phe | Gly |
Asp 945 | Thr | Val | Asn | Thr | Ala 950 | Ser | Arg | Met | Glu | Ser 955 | Thr | Gly | Leu | Pro | Leu 960 |
Arg | ile | Hi s | val | Ser 965 | Gly | Ser | Thr | Ile | Ala 970 | Ile | Leu | Lys | Arg | Thr 975 | Glu |
Cys | Gin | Phe | Leu 980 | Tyr | Glu | Val | Arg | Gly 985 | Glu | Thr | Tyr | Leu | Lys 990 | Gly | Arg |
Gly | Asn | Glu | Thr | Thr | Tyr | Trp | Leu | Thr Gly Met Lys | i Asp Gin Lys Pl |
1005
1000
Asn | Leu | pro | Thr | Pro | Pro | Thr | val | Glu | Asn | Gin | Gin |
1010 | 1015 | 1020 | |||||||||
Ala | Glu | Phe | Ser | Asp | Met | Ile | Al a | Asn | Ser | Leu | Gin |
1025 | 1030 | 1035 | |||||||||
Ala | Ala | Gly | Ile | Arg | Ser | Gin | Lys | Pro | Arg | Arg | Val |
1040 | 1045 | 1050 | |||||||||
Lys | Lys | Gly | Thr | Leu | Glu | Tyr | Leu | Gin | Leu | Asn | Thr |
1055 | 1060 | 1065 | |||||||||
Glu | Ser | Thr | Tyr | Phe | |||||||
1070 |
<210> | 12 |
<211> | 111 |
<212> | PRT |
<213> | Homo |
<400> 12
Met 1 | Lys | Thr | Leu | Leu 5 | Leu | Asp | Leu | Ala | Leu 10 | Trp | Ser | Leu | Leu | Phe 15 | Gin |
pro | Gly | Trp | Leu | Ser | Phe | Ser | Ser | Gin | val | Ser | Gin | Asn | Cys | His | Asn |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Gl y | Ser | Tyr | Glu | Ile | Ser | val | Leu | Met | Met | Gly | Asn | Ser | Ala | Phe | Ala |
PL 219 018 B1
Glu | Pro | Leu | Lys | Asn | Leu | Glu | Asp | Al a | Val | Asn | Glu | Gly | Leu | Glu | ile |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
val | Arg | Gly | Arg | Leu | Gin | Asn | Ala | Gly | Leu | Asn | Val | Thr | val | Asn | Ala |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Thr | Phe | Met | Tyr | ser | Asp | Gly | Leu | Ile | HIS | Asn | Ser | Gly | Asp | Cys | Arg |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
ser | Ser | Thr | cys | Glu | Gly | Leu | Asp | Leu | Leu | Arg | Lys | ile | Ser | Pro |
100 105 110 <210> 13 <211> 258 <212> PRT
<213 | :> i | lomo | sapi | ens | |||||||||||
<400> 13 | |||||||||||||||
Met | Lys | Thr | Leu | Leu | Leu | Asp | Leu | Ala | Leu | Trp | ser | Leu | Leu | Phe | Gin |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Pro | Gly | Trp | Leu | Ser | Phe | Ser | Ser | Gin | val | Ser | Gin | Asn | cys | Hi s | Asn |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Gly | Ser | Tyr | Glu | ile | Ser | val | Leu | Met | Met | Gly | Asn | Ser | Ala | Phe | Ala |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Glu | Pro | Leu | Lys | Asn | Leu | Glu | Asp | Ala | val | Asn | Glu | Gly | Leu | Glu | ile |
50 | 60 | ||||||||||||||
val | Arg | Gly | Arg | Leu | Gin | Asn | Ala | Gly | Leu | Asn | Val | val | Asn | Ala | |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Thr | Phe | Met | Tyr | Ser | ASP | Gly | Leu | Ile | His | Asn | Ser | Gly | Asp | cys | Arg |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Ser | Ser | Thr | Cys | Glu | Gly | Leu | Asp | Leu | Leu | Arg | Lys | ile | Ser | Asn | Ala |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Gin | Arg | Met | Gly | Cys | Val | Leu | ile | Gly | Pro | Ser | cys | Thr | Tyr | Ser | Thr |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Phe | Gin | Met | Tyr | Leu | Asp | Thr | Glu | Leu | ser | Tyr | Pro | Met | Ile | Ser | Ala |
PL 219 018 B1
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Gly | ser | Phe | Gly | Leu | ser | Cys | Asp | Tyr | Lys | Gl u | Thr | Leu | Thr | Arg | Leu |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Met | ser | Pro | Ala | Arg | Lys | Leu | Met | Tyr | Phe | Leu | val | Asn | Phe | Trp | Lys |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Thr | Asn | Asp | Leu | Pro | Phe | Lys | Thr | Tyr | Ser | Trp | Ser | Thr | Ser | Tyr | val |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Tyr | Lys | Asn | Gly | Thr | Glu | Thr | Glu | ASp | Cys | Phe | Trp | Tyr | Leu | Asn | Ala |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Leu | Glu | Ala | Ser | val | Ser | Tyr | Phe | Ser | His | Glu | Leu | Gly | phe | Lys | val |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
val | Leu | Arg | Gin | Asp | Lys | Glu | Phe | Gin | Asp | ile | Leu | Met | Asp | His | Asn |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Arg | Lys | ser | Asn | val | Thr | Ser | Thr | Trp | Arg | Thr | Met | ser | Gin | pro | Leu |
245 250 255
Thr Ile
<210> | 14 |
<211> | 1070 |
<212> | PRT |
<213> | Homo |
<400> | 14 |
Met 1 | Lys Thr | Leu Leu 5 | Leu | Asp Leu Ala | Leu Trp Ser Leu Leu Phe Gin | ||||||||||
10 | 15 | ||||||||||||||
Pro | Gly | Trp | Leu | ser | Phe | Ser | Ser | Gin | val | Ser | Gin | Asn | cys | His | Asn |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Gly | Ser | Tyr | Glu | Ile | Ser | val | Leu | Met | Met | Gly | Asn | Ser | Ala | Phe | Ala |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Glu | Pro | Leu | Lys | Asn | Leu | Glu | ASP | Ala | val | Asn | Glu | Gly | Leu | Glu | ile |
50 | 55 | 60 |
PL 219 018 B1
val | Arg | Gly | Arg | Leu | Gin | Asn | Al a | Gly | Leu | Α5Π | Val | Thr | val | Asn | Al a |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Thr | Phe | Met | Tyr | Ser | Asp | Gly | Leu | Ile | His | Asn | ser | Gly | Asp | cys | Arg |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Ser | Ser | Thr | Cys | Glu | Gly | Leu | Asp | Leu | Leu | Arg | Lys | Ile | Ser | Asn | Al a |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Gin | Arg | Met | Gly | Cys | val | Leu | Ile | Gly | Pro | Ser | Cys | Thr | Tyr | Ser | Thr |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Phe | Gin | Met | Tyr | Leu | ASp | Thr | Glu | Leu | Ser | Tyr | Pro | Met | ile | Ser | Al a |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Gly | ser | Phe | Gly | Leu | Ser | cys | Asp | Tyr | Lys | Glu | Thr | Leu | Thr | Arg | Leu |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Met | ser | Pro | Ala | Arg | Lys | Leu | Met | Tyr | Phe | Leu | val | Asn | Phe | Trp | Lys |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Thr | Asn | Asp | Leu | Pro | Phe | Lys | Thr | Tyr | ser | Trp | Ser | Thr | Ser | Tyr | val |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Tyr | Lys | Asn | Gly | Thr | Glu | Thr | Glu | Asp | cys | Phe | Trp | Tyr | Leu | Asn | Ala |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Leu | Glu | Ala | Ser | Val | Ser | Tyr | Phe | Ser | Hi s | Glu | Leu | Gly | Phe | Lys | val |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
val | Leu | Arg | Gin | ASp | Lys | Glu | Phe | Gin | Asp | Ile | Leu | Met | Asp | His | Asn |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Arg | Lys | Ser | Asn | val | Ile | ile | Met | cys | Gly | Gly | Pro | Glu | Phe | Leu | Tyr |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Lys | Leu | Lys | Gly | Asp | Arg | Ala | val | Ala | Glu | Asp | Ile | val | Ile | ile | Leu |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
val | Asp | Leu | Phe | Asn | Asp | Gin | Tyr | Leu | Glu | Asp | Asn | val | Thr | Ala | Pro |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Asp | Tyr | Met | Lys | Asn | val | Leu | Val | Leu | Thr | Leu | Ser | Pro | Gly | Asn | Ser |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Leu | Leu | Asn | i Ser | Ser | Phe | Ser | Arg | Asn | Leu | Ser | Pro | Thr | Lys | Arg | Asp |
305 310 315 320
PL 219 018 B1
Phe Ala Leu Ala Tyr 325 | Leu | Asn | Gly | Ile Leu Leu 330 | Phe | Gly | His | Met 335 | Leu | ||||||
Lys | Ile | Phe | Leu | Glu | Asn | Gly | Glu | Asn | ile | Thr | Thr | pro | Lys | Phe | Ala |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
His | Ala | Phe | Arg | Asn | Leu | Thr | Phe | Glu | Gly | Tyr | Asp | Gly | Pro | Val | Thr |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Leu | Asp | Asp | Trp | Gly | Asp | val | Asp | Ser | Thr | Met | Val | Leu | Leu | Tyr | Thr |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Ser | Val | Asp | Thr | Lys | Lys | Tyr | Lys | val | Leu | Leu | Thr | Tyr | Asp | Thr | Hi s |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Val | Asn | Lys | Thr | Tyr | Pro | val | Asp | Met | Ser | Pro | Thr | phe | Thr | Trp | Lys |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Asn | Ser | Lys | Leu | Pro | Asn | Asp | ile | Thr | Gly | Arg | Gly | Pro | Gin | Ile | Leu |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Met | ile | Ala | val | Phe | Thr | Leu | Thr | dy | Ala | val | val | Leu | Leu | Leu | Leu |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
val | Ala | Leu | Leu | Met | Leu | Arg | Lys | Tyr | Arg | Lys | ASp | Tyr | Glu | Leu | Arg |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
Gin | Lys | Lys | Trp | Ser | Hi s | ile | Pro | Pro | Glu | Asn | Ile | Phe | Pro | Leu | Glu |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Thr | Asn | Glu | Thr | Asn | His | val | ser | Leu | Lys | ile | ASp | Asp | Asp | Lys | Arg |
485 | 490 | 495 | |||||||||||||
Arg | Asp | Thr | Ile | Gin | Arg | Leu | Arg | Gin | cys | Lys | Tyr | Asp | Lys | Lys | Arg |
500 | 505 | 510 | |||||||||||||
va1 | Ile | Leu | Lys | Asp | Leu | Lys | His | Asn | Asp | Gly | Asn | Phe | Thr | Glu | Lys |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
Gin | Lys | Ile | Glu | Leu | Asn | Lys | Ile | ASp | Tyr | Tyr | Asn | Leu | Thr | Lys | Phe |
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
Tyr | Gly | Thr | val | Lys | Leu | Asp | Thr | Met | ii β | phe | Gly | val | Ile | Glu | Tyr |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
Cys | Glu | Arg | Gly | Ser | Leu | Arg | Gl u | val | Leu | Asn | AS p | Thr | ile | Ser | Tyr |
565 570 575
PL 219 018 B1
Pro Asp Gly Thr | Phe Met Asp Trp Glu Phe Lys ile ser 585 | val 590 | Leu | Tyr | |||||||||||
580 | |||||||||||||||
Asp | ile | Ala | Lys | Gly | Met | Ser | Tyr | Leu | Hi s | Ser | Ser | Lys | Thr | Glu | val |
595 | 600 | 605 | |||||||||||||
Hi s | Gly | Arg | Leu | Lys | Ser | Thr | Asn | cys | val | val | ASp | Ser | Arg | Met | val |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
Val | Lys | Ile | Thr | Asp | Phe | Gly | Cys | Asn | Ile | Leu | Pro | Pro | Lys | Lys | |
625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
Asp | Leu | Trp | Thr | Ala | Pro | Glu | Hi s | Leu | Arg | Gin | Ala | Asn | ile | Ser | Gin |
645 | 650 | 655 | |||||||||||||
Lys | Gly | Asp | Val | Tyr | Ser | Tyr | Gly | Ile | Ile | Ala | Gin | Glu | Ile | Ile | Leu |
660 | 665 | 670 | |||||||||||||
Arg | Lys | Glu | Thr | Phe | Tyr | Thr | Leu | Ser | cys | Arg | Asp | Arg | Asn | Glu | Lys |
675 | 680 | 685 | |||||||||||||
ile | Phe | Arg | Val | Glu | Asn | Ser | Asn | Gly | Met | Lys | Pro | Phe | Arg | Pro | ASp |
690 | 695 | 700 | |||||||||||||
Leu | Phe | Leu | Glu | Thr | Ala | Glu | Glu | Lys | Glu | Leu | Glu | val | Tyr | Leu | Leu |
705 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||||
val | Lys | Asn | cys | Trp | Glu | Glu | ASp | pro | Glu | Lys | Arg | Pro | Asp | Phe | Lys |
725 | 730 | 735 | |||||||||||||
Lys | ile | Glu | Thr | Thr | Leu | Ala | Lys | ile | Phe | Gly | Leu | Phe | Hi s | ASP | Gin |
740 | 745 | 750 | |||||||||||||
Lys | Asn | Glu | Ser | Tyr | Met | Asp | Thr | Leu | ile | Arg | Arg | Leu | Gin | Leu | Tyr |
755 | 760 | 765 | |||||||||||||
Ser | Arg | Asn | Leu | Glu | His | Leu | val | Glu | Glu | Arg | Thr | Gin | Leu | Tyr | Lys |
770 | 775 | 780 | |||||||||||||
Ala | Glu | Arg | Asp | Arg | Ala | Asp | Arg | Leu | Asn | Phe | Met | Leu | Leu | pro | Arg |
785 | 790 | 795 | 800 | ||||||||||||
Leu | val | val | Lys | Ser | Leu | Lys | Glu | Lys | Gly | Phe | Val | Glu | Pro | Glu | Leu |
805 | 810 | 815 | |||||||||||||
Tyr | Glu | i Glu | Val | Thr | Ile | Tyr | Phe | Ser | Asp | Ile | val | Gly | Phe | Thr | Thr |
PL 219 018 B1
820 | 825 | 830 | |||||||||||||
ile | Cys | Lys | Tyr | ser | Thr | Pro | Met | Glu | val | val | Asp | Met | Leu | Asn | Asp |
835 | 840 | 845 | |||||||||||||
ile | Tyr | Lys | ser | Phe | Asp | His | Ile | Val | Asp | Hi s | His | Asp | Val | Tyr | Lys |
850 | 855 | 860 | |||||||||||||
val | Glu | Thr | Ile | Gly | Asp | Ala | Tyr | Met | val | Ala | Ser | Gly | Leu | Pro | Lys |
865 | 870 | 875 | 880 | ||||||||||||
Arg | Asn | Gly | Asn | Arg | His | Al a | ile | Asp | Ile | Ala | Lys | Met | Al a | Leu | Glu |
885 | 890 | 895 | |||||||||||||
Ile | Leu | Ser | Phe | Met | Gly | Thr | Phe | Glu | Leu | Glu | His | Leu | Pro | Gly | Leu |
900 | 905 | 910 | |||||||||||||
Pro | Ile | Trp | Ile | Arg | Ile | Gly | val | His | Ser | Gly | Pro | Cys | Ala | Ala | Gly |
915 | 920 | 925 | |||||||||||||
Val | val | Gly | Ile | Lys | Met | pro | Arg | Tyr | Cys | Leu | Phe | Gly | Asp | Thr | val |
930 | 935 | 940 | |||||||||||||
Asn | Thr | Al a | Ser | Arg | Met | Glu | Ser | Thr | Gly | Leu | Pro | Leu | Arg | ile | His |
945 | 950 | 955 | 960 | ||||||||||||
val | Ser | Gly | Ser | Thr | Ile | Ala | Ile | Leu | Lys | Arg | Thr | Glu | cys | Gin | Phe |
965 | 970 | 975 | |||||||||||||
Leu | Tyr | Glu | Val | Arg | Gly | Glu | Thr | Tyr | Leu | Lys | Gly | Arg | Gly | Asn | Glu |
980 | 985 | 990 |
Thr Thr Tyr Trp Leu Thr Gly Met Lys Asp Gin Lys Phe Asn Leu Pro 995 1000 1005
Thr | Pro 1010 | Pro | Thr | val | Glu | Asn 1015 | Gin | Gin | Arg | Leu | Gin 1020 | Ala | Glu | Phe |
Ser | ASp 102 5 | Met | ile | Ala | Asn | Ser 1030 | Leu | Gin | Lys | Arg | Gin 1035 | Ala | Ala | Gly |
Ile | Arg 1040 | Ser | Gl n | Lys | Pro | Arg 1045 | Arg | val | Ala | Ser | Tyr 1050 | Lys | Lys | Gly |
Thr | Leu 105 5 | Glu | Tyr | Leu | Gin | Leu 1060 | Asn | Thr | Thr | Asp | Lys 1065 | Glu | Ser | Thr |
PL 219 018 B1
Tyr Phe 1070 <210> 15 <211> 93 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15
Met 1 | Lys | Leu Val | Thr ile Phe Leu Leu val Thr Ile Ser Leu Cys ser | ||||||||||||
5 | 10 | 15 | |||||||||||||
Tyr | Ser | Ala | Thr | Ala | Lys | Leu | ile | Asn | Lys | cys | Pro | Leu | pro | Val | Asp |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
uys | Leu | Ala | pro | Leu | pro | Leu | ASp | Asn | Ile | Leu | Pro | Phe | Met | Asp | Pro |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Leu | Lys | Leu | Leu | Leu | Lys | Thr | leu | Gly | Ile | Ser | Val | Glu | His | Leu | val |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Glu | Gly | Leu | Arg | Lys | cys | val | Asn | Glu | Leu | Gly | pro | Glu | Ala | Ser | Glu |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Ala | Val | Lys | Lys | Leu | Leu | Glu | Ala | Leu | Ser | His | Leu | val |
90 <210> 16 <211> 261 <212> PRT <213> Homo sapiens <4OO> 16
Met | Ala | val | Thr | Ala | Cys | Gin | Gly | Leu | Gly | Phe | val | Val | Ser | Leu | Ile |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Gly | Ile | Al a | Gly | Ile | Ile | Ala | Ala | Thr | Cys | Met | ASP | Gin | Trp | Ser | Thr |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Gin | Asp | Leu | Tyr | Asn | Asn | pro | val | Thr | Al a | val | Phe | Asn | Tyr | Gin | Gly |
40 45
PL 219 018 B1
Leu | Trp | Arg | Ser | Cys | val | Arg | Gl u | Ser | Ser | Gly | Phe | Thr | Glu | cys | Arg |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Gly | Tyr | Phe | Thr | Leu | Leu | Gly | Leu | Pro | Ala | Met | Leu | Gin | Ala | val | Arg |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Ala | Leu | Met | Ile | val | Gly | ile | val | Leu | Gly | Ala | Ile | Gly | Leu | Leu | val |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
ser | Ile | Phe | Ala | Leu | Lys | Cys | Ile | Arg | Ile | Gly | Ser | Met | Glu | Asp | Ser |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Ala | Lys | Ala | Asn | Met | Thr | Leu | Thr | Ser | Gly | Ile | Met | Phe | Ile | Val | Ser |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Gly | Leu | cys | Ala | Ile | Ala | Gly | val | Ser | val | Phe | Ala | Asn | Met | Leu | Val |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Thr | Asn | Phe | Trp | Met | ser | Thr | Ala | Asn | Met | Tyr | Thr | Gly | Met | Gly | Gly |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Met | Val | Gin | Thr | val | Gin | Thr | Arg | Tyr | Thr | Phe | Gly | Ala | Ala | Leu | Phe |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
val | Gly | T rp | val | Ala | Gly | Gly | Leu | Thr | Leu | Ile | Gly | Gly | val | Met | Met |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
cys | ile | Ala | Cys | Arg | Gly | Leu | Ala | Pro | Glu | Glu | Thr | Asn | Tyr | Lys | Ala |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
val | Ser 210 | Tyr | His | Ala | Ser | Gly 215 | His | ser | val | Ala | Tyr 220 | Lys | Pro | Gly | Gly |
Phe | Lys | Ala | ser | Thr | Gly | Phe | Gly | ser | Asn | Thr | Lys | Asn | Lys | Lys | Ile |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Tyr | Asp | Gly | Gly | Ala | Arg | Thr | Glu | Asp | Glu | Val | Gin | Ser | Tyr | Pro | Ser |
245 250 255
Lys His Asp Tyr val 260
<210> | 17 |
<211> | 10 |
<212> | PRT |
PL 219 018 B1
<400> 19
Met | Ala | Val | Thr | Ala | cys | Glrt | Gly | Leu | Gly | Phe | val | val | Ser | Leu | Ile |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Gly | Ile | Ala | Gly | Ile | Ile | Al a | Ala | Thr | Cys | Met | Asp | Gin | Trp | Ser | Thr |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Gin | Asp | Leu | Tyr | Asn | Asn | Pro | val | Thr | Ala | Val | Phe | Asn | Tyr | Gin |
40 45 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd
PL 219 018 B1
<400> 20 aggtacatga gcatcagcct g | 21 | ||
<210> | 21 | ||
<211> | 21 | ||
<212> | DNA | ||
<213 > | Sztuczna sekwencja | ||
<22O> <22 3 > | Opisanie sztucznej sekwencji: | Oligonukleotyd | |
<400> 21 gcagcagttg gcatctgaga g | 21 | ||
<210> | 22 | ||
<211> | 21 | ||
<212> | DNA | ||
<213> | Sztuczna sekwencja | ||
<220> <22 3 > | Opisanie sztucznej sekwencji: | Oligonukleotyd | |
<400> 22 gcaatagaca ttgccaagat g | 21 | ||
<210> | 23 | ||
<211> | 21 | ||
<212> | DNA |
<213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 23 aacgctgttg attctccaca g 21 <210> 24 <211> 33
PL 219 018 B1
PL 219 018 B1
<400> | 27 | |
agctatggga tcatcgcaca g | 21 | |
<21O> | 28 | |
<211> | 21 | |
<212> | DNA | |
<213> | Sztuczna sekwencja | |
<22O> <223> | Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd | |
<400> 28 cctttgagct ggagcatctt c | 21 | |
<21O> | 29 | |
<211> | 21 | |
<212> | DNA | |
<213> | Sztuczna sekwencja | |
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd
<400> | 29 | |
ctttctagct ggagacatca g | 21 | |
<210> | 30 | |
<211> | 21 | |
<212> | DNA | |
<213> | Sztuczna sekwencja | |
<220> < 2 2 3 > | Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd | |
<400> | 30 | |
caccatggta ctgtcaacat c | 21 | |
<210> | 31 | |
<211> | 21 |
PL 219 018 B1
<212> | DNA | ||||
<213> | Sztuczna | sekwencja | |||
<220* <223* | Opisanie | sztucznej | sekwencj i: | Oligonukleotyd | |
<400> 31 atgtcataca agacagagat c | 21 | ||||
<210* | 32 | ||||
<211> | 21 | ||||
<212* | DNA | ||||
<213> | Sztuczna | sekwencj a | |||
<220* <223> | Opisanie | sztucznej | sekwencj i: | Oligonukleotyd |
<400> 32 tctgccttgt acagctgtgt c | |
<210> | 33 |
<211> | 21 |
<212> | DNA |
<213> | Sztuczna sekwencja |
<220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 33 tctgtggtat tcagctgcaa g 21 <210* 34 <211> 22 <212> DNA <213* Sztuczna sekwencja <22O>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd
PL 219 018 B1 <400> 34 tactcaggaa aatttcacct tg <21Q> 35 <211> 27 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji;
Oligonukleotyd <400> 35 gaccacaaca ggaaaagcaa tgtgacc <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 36 gatagaattg aacaagattg ac
<210> | 37 |
<211> | 21 |
<212> | DNA |
<213> | Sztuczna sekwencja |
<22O> | |
<223> | Opasanie sztucznej |
<400> | 37 |
sekwencj i
Oligonukleotyd cagcctttgt agttactctg c <210> 38 <211> 21
PL 219 018 B1 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22O>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 38 tgtcacacca agtgtgatag c 21 <210> 39 <211> 28 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 39 ggttcgtggt ttcactgatt gggattgc 28 <210> 40 <211> 27 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22Q>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 40 cggctttgta gttggtttct tctggtg 27
<210> | 41 |
<211> | 3814 |
<212> | DNA |
<213> | Homo sapiens |
<400> | 41 |
ctattgaagc cacctgctca ggacaatgaa attcttcagt tacattctgg tttatcgccg 60
PL 219 018 B1
atttctcttc | gtggttttca | ctgtgttggt | tttactacct | ctgcccatcg | tcctccacac | 120 |
caaggaagca | gaatgtgcct | acacactctt | tgtggtcgcc | acattttggc | tcacagaagc | 180 |
attgcctctg | tcggtaacag | ctttgctacc | tagtttaatg | ttacccatgt | ttgggatcat | 240 |
gccttctaag | aaggtggcat | ctgcttattt | caaggatttt | cacttactgc | taattggagt | 300 |
tatctgttta | gcaacatcca | tagaaaaatg | gaatttgcac | aagagaattg | ctctgaaaat | 360 |
ggtgatgatg | gttggtgtaa | atcctgcatg | gctgacgctg | gggttcatga | gcagcactgc | 420 |
ctttttgtct | atgtggctca | gcaacacctc | gacggctgcc | atggtgatgc | ccattgcgga | 480 |
ggctgtagtg | cagcagatca | tcaatgcaga | agcagaggtc | gaggccactc | agatgactta | 540 |
cttcaacgga | tcaaccaacc | acggactaga | aattgatgaa | agtgttaatg | gacatgaaat | 600 |
aaatgagagg | aaagagaaaa | caaaaccagt | tccaggatac | aataatgata | cagggaaaat | 660 |
ttcaagcaag | gtggagttgg | aaaagaactc | aggcatgaga | accaaatatc | gaacaaagaa | 720 |
gggccacgtg | acacgtaaac | ttacgtgttt | gtgcattgcc | tactcttcta | ccattggtgg | 780 |
actgacaaca | atcactggta | cctccaccaa | cttgatcttt | gcagagtatt | tcaatacacg | 840 |
ctatcctgac | tgtcgttgcc | tcaactttgg | atcatggttt | acgttttcct | tcccagctgc | 900 |
ccttatcatt | ctactcttat | cctggatctg | gcttcagtgg | cttttcctag | gattcaattt | 960 |
taaggagatg | ttcaaatgtg | gcaaaaccaa | aacagtccaa | caaaaagctt | gtgctgaggt | 1020 |
gattaagcaa | gaataccaaa | agcttgggcc | aataaggtat | caagaaattg | tgaccttggt | 1080 |
cctcttcatt | ataatggctc | tgctatggtt | tagtcgagac | cccggatttg | ttcctggttg | 1140 |
gtctgcactt | ttttcagagt | accctggttt | tgctacagat | tcaactgttg | ctttacttat | 1200 |
agggctgcta | ttctttctta | tcccagctaa | gacactgact | aaaactacac | ctacaggaga | 1260 |
aattgttgct | tttgattact | ctccactgat | tacttggaaa | gaattccagt | cattcatgcc | 1320 |
ctgggatata | gccattcttg | ttggtggagg | gtttgccctg | gcagatggtt | gtgaggagtc | 1380 |
tggattatct | aagtggatag | gaaataaatt | atctcctctg | ggttcattac | cageatggct | 1440 |
aataattctg | atatcttctt | tgatggtgac | Ί t t 'C | gaggtagcca | gc aa t c cagc | 1500 |
taccattaca | ctctttctcc | caatattatc | tccattggcc | gaagccattc | atgtgaaccc | 1560 |
tctttatatt | ctgatacctt | ctactctgtg | tacttcattt | gcattcctcc | taccagtagc | 1620 |
aaatccaccc | aatgctattg | tcttttcata | tggtcatctg | aaagtcattg | acatggttaa | 1680 |
agctggactt | ggtgtcaaca | ttgttggtgt | tgctgtggtt | atgcttggca | tatgtacttg | 1740 |
gattgtaccc | atgtttgacc | tctacactta | cccttcgtgg | gctcctgcta | tgagtaatga | 1800 |
gaccatgcca | taataagcac | aaaatttctg | actatcttgc | ggtaatttct | ggaagacatt | 1860 |
aatgattgac | : tgtaaaatgt | ggctctaaat | aactaatgac | : acacatttaa | atcagttatg | 1920 |
gtgtagctgc | : tgcaattccc | : gtgaataccc | : gaaacctgct | : ggtataactc | agagtccata | 1980 |
PL 219 018 B1
tttgttattg | cagtgcaact | aaagagcatc | tatgtgcctt | catcaagaag | cccatgtttt | 2040 |
gagattttgc | tcatgaacca | tctgcaactt | gcttcatcat | aagaataatt | tataacttga | 2100 |
ccttcaaaga | gattagagca | tttgtttcat | cttacagttg | gagttcaatg | taacatttta | 2160 |
aatgcaattt | attatttcag | aaatttccca | tgaaactaaa | aatagaaaat | aagatataca | 2220 |
agttaattcg | gtacttggat | aaatcatttc | tgcattgttg | ttccagagaa | tttgctgaga | 2280 |
aatcaaagcc | atggtcatct | ggtgatgaag | agaaaaggtt | aatctaaatg | atatgtgcat | 2340 |
ttcctcattt | aaaaaatcca | attggattat | tcttaatata | tacatgtaat | atgaaaattg | 2400 |
agattgaagc | actaattcca | aaattatggc | tgaatatact | aaataacaga | aaagttacag | 2460 |
ataagaattt | atttctaetg | aactctatag | ttagtgtaat | ataattcata | tttttatgat | 2520 |
attggcacac | tgagaaattc | attttgtaga | gctatggata | aggcttgcta | tgatttgcac | 2580 |
tattagtaca | gtatagttag | aaaggaaagc | tgaacactat | aaaactatta | acatattttc | 2640 |
gtatatgagt | aacaactttg | cttaagtgtt | tatcttagtt | cagaaataca | taatgtcata | 2700 |
tgttaaaaat | aaagagatgt | agaaatctaa | atgaattatc | actgtgtata | cagacagaaa | 2760 |
aatcacataa | ctctggtgtg | ttaacattgc | aatgaaaaaa | tgaaaaaaag | aaggaaaaaa | 2820 |
gaataagaat | gaaaactgct | gacgtattac | aaaacagaaa | aataaatgat | ttaaaatcaa | 2880 |
atcaaaaaga | aaaaaactaa | acatttaaac | aaaaatggga | taagaatagt | cttctagaag | 2940 |
tgaggatgcg | taaaagaatg | agtttccaat | taccctgatg | tgacaattac | acattgtaga | 3000 |
caggtagcaa | aatatcacat | acacccccaa | aatatgtaca | aatattatat | atcaataaat | 3060 |
aaatttttaa | agagtaagtg | ctattggcat | tccaaaattc | agctaaagga | aaaatgatca | 3120 |
aaaacaaagt | aaggtgcaca | gttagcaaaa | gatgcagatg | ttatatcaca | gcaattctca | 3180 |
tgctaaaaat | acaacaaaag | acaaagcaaa | d n *3 a ύ r 41* ¢1 GŁ GL w tA Cł L. *- Lu | ttgctttttt | tttttttttt | 3240 |
tttttttttt | gagacggagt | ctcgctctgt | cgcccaggct | ggagtgcagt | ggcgggatct | 3300 |
cggctcactg | caagctccgc | ctcccaggtt | cacgccattc | tcctgcctca | gccaaacctt | 3360 |
tgctattttt | aatcttcgtt | ggcactttcc | agctgttact | gaccttgtca | ttttttgttc | 3420 |
aaataagatt | atttacaaac | ttattcttga | aactaaatat | agtaaagagg | gtttttaaaa | 3480 |
taatatttaa | catacgaatt | attaattggc | catgttcatt | atttatctat | gtttattaat | 3540 |
gggccaatgc | aaaaaatcat | tttttcaaag | aaaaatttgt | ccatgtaaag | cttaaattat | 3600 |
aatattgctg | ctttgtataa | ctcttctatg | tttattctat | tcatttgttc | ctttccctac | 3660 |
catattttac | acatgtattt | ataatctgta | gtatttatta | catttctgct | tttttctagt | 3720 |
cattcaattt | atcactgctg | aattgcatca | gatcatggat | gcatttttat | tatgaaaaaa | 3780 |
taaaatgact | tttcaaatta | aaaaaaaaaa | aaaa | 3814 |
PL 219 018 B1
<210> | 42 |
<211> | 734 |
<212* | DNA |
<213> | Homo sapiens |
<400> 42 caggacaatg aaattcttca gttacattct ggtttatcgc cgatttctct tcgtggtttt 60 cactgtgttg gttttactac ctctgcccat cgtcctccac accaaggaag cagaatgtgc 120 ctacacactc tttgtggtcg ccacattttg gctcacagaa gcattgcctc tgtcggtaac 180 agctttgcta cctagtttaa tgttacccat gtttgggatc atgccttcta agaaggtggc 240 atctgcttat ttcaaggatt ttcacttact gctaattgga gttatctgtt tagcaacatc 300 catagaaaaa tggaatttgc acaagagaat tgctctgaaa atggtgatga tggttggtgt 360 aaatcctgca tggctgacgc tggggttcat gagcagcact gcctttttgt ctatgtggct 420 cagcaacacc tcgacggctg ccatggtgat gcccattgcg gaggctgtag tgcagcagat 480 catcaatgca gaagcagagg tcgaggccac tcagatgact tacttcaacg gatcaaccaa 540 ccacggacta gaaattgatg aaagtgttaa tggacatgaa ataaatgaga ggaaagagaa 600 aacaaaacca gttccaggat acaataatga tacagggaaa atttcaagca aggtggagtt 660 ggaaaagact gtttaactac tgaaatgaag gactaaacat aactgaaaaa 720 ccattcatta aatg 734 <210> 43 <211> 539 <212* DNA <213> Homo sapiens
<400* 43 gccactcaga | tgacttactt | caacggatca | accaaccacg | gactagaaat | tgatgaaagt | 60 |
gttaatggac | atgaaataaa | tgagaggaaa | gagaaaacaa | aaccagttcc | aggatacaat | 120 |
aatgatacag | ggaaaatttc | aagcaaggtg | gagttggaaa | agcactggaa | acttgcagtt | 180 |
caagatggct | ccccatctcc | ctctgtccat | tctgtatcgc | agctagctgc | tcaaggaaag | 240 |
gagaaagtgg | aaggcatatg | tacttagaaa | ttattctatt | actttcctgg | atttaagagt | 300 |
attcagattt | tctatttcaa | catcaaacaa | ttgcattttt | aaaaagaaat | ttatgtgttc | 360 |
catgtcaaat | ttagtagtgt | gtggttgttt | ataatatttt | cttatatcta | cttaatttct | 420 |
PL 219 018 B1
atagtattta | tagttatatg | tctttatttc | taacattttt | cttgtgcttt | taaagattat | 480 |
ttaaagatta | tttttaaata | atctttattt | catttaaata | aaatatttta | tttaagtct | 539 |
<210> 44 | ||||||
<211> 556 | ||||||
<212> DNA | ||||||
<213> Homo sapiens | ||||||
<400> 44 cacggactag | aaattgatga | aagtgttaat | ggacatgaaa | taaatgagag | gaaagagaaa | 60 |
acaaaaccag | ttccaggata | caataatgat | acagggaaaa | tttcaagcaa | ggtggagttg | 120 |
gaaaagaact | caggcatgag | aaccaaatat | cgaacaaaga | agggccacgt | gacacgtaaa | 180 |
cttacgtgtt | tgtgcattgc | ctactcttct | accattggtg | gactgacaac | aatcactggt | 240 |
acctccacca | acttgatctt | tgcagagtat | ttcaatacat | tccatccaca | cagaagagga | 300 |
gatcgtacaa | ggcatgtaca | ccaggaggca | gaaatttgag | gcatatcttg | gaactctgtc | 360 |
taccacatcc | tgaacatcac | acagtttcca | ctcttgttgc | cttcaatcct | gagaatgcat | 420 |
ccaggagcca | ttctgtttta | tgtcaattac | taattagatc | atgtcacgtt | actaacttac | 480 |
tacgttccaa | ttagtcctta | ttgcatttgt | aataaaatcc | gcatactttc | ggactggcta | 540 |
caaggttata | catgat | 556 |
<210> | 45 | |||||||||||||
<211> | 595 | |||||||||||||
<212> | PRT | |||||||||||||
<213> | Homo | sapi | ens | |||||||||||
<400> | 45 | |||||||||||||
Met Lys | Phe | Phe | Ser | Tyr | ile | Leu | val | Tyr | Arg | Arg | Phe | Leu | Phe | val |
1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
val Phe | ! Thr | Val | Leu | val | Leu | Leu | Pro | Leu | Pro | ile | val | Leu | His | Thr |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||
Lys Glu | i Al a | Glu | Cys | Ala | Tyr | Thr | Leu | Phe | Val | Val | Ala | Thr | Phe | Trp |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||
Leu Thr Glu | Ala | Leu | Pro | Leu | Ser | val | Thr | Al a | Leu | Leu | Pro | Ser | Leu |
PL 219 018 B1
55
Met | Leu | Pro | Met | phe | Gly | Ile | Met | Pro | Ser | Lys | Lys | val | Ala | Ser | Ala |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Tyr | Phe | Lys | Asp | Phe | His | Leu | Leu | Leu | ile | Gly | va1 | Ile | cys | Leu | Ala |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Thr | Ser | ile | Gl u | Lys | Trp | Asn | Leu | Hi s | Lys | Arg | Ile | Ala | Leu | Lys | Met |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
val | Met | Met | val | Gly | val | Asn | Pro | Ala | Trp | Leu | Thr | Leu | Gly | Phe | Met |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
ser | Ser | Thr | Al a | Phe | Leu | Ser | Met | Trp | Leu | Ser | Asn | Thr | Ser | Thr | Ala |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Ala | Met | val | Met | Pro | Ile | Al a | Glu | Ala | val | Val | Gin | Gin | ile | Ile | Asn |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Ala | Glu | Ala | Glu | val | Glu | Ala | Thr | Gin | Met | Thr | Tyr | Phe | Asn | Gly | Ser |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Thr | Asn | His | Gly | Leu | Glu | Ile | Asp | Glu | Ser | Va1 | Asn | Gly | Hi s | Glu | Ile |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Asn | Glu | Arg | Lys | Glu | Lys | Thr | Lys | Pro | val | Pro | Gly | Tyr | Asn | Asn | Asp |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Thr | Gly | Lys | Ile | Ser | Ser | Lys | Va1 | Glu | Leu | Glu | Lys | Asn | Ser | Gly | Met |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Arg | Thr | Lys | Tyr | Arg | Thr | Lys | Lys | Gly | Hi s | val | Thr | Arg | Lys | Leu | Thr |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
cys | Leu | cys | ile | Ala | Tyr | Ser | Ser | Thr | Ile | Gly | Gly | Leu | Thr | Thr | Ile |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Thr | Gly | Thr | Ser | Thr | Asn | Leu | Ile | Phe | Ala | Glu | Tyr | Phe | Asn | Thr | Arg |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Tyr | Pro | Asp | cys | Arg | Cys | Leu | Asn | Phe | Gly | Ser | Trp | Phe | Thr | Phe | Ser |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Phe | Pro | Ala | Ala | Leu | ile | ile | Leu | Leu | Leu | Ser | Trp | Ile | Trp | Leu | Gl n |
290 295 300
PL 219 018 B1
Trp 305 | Leu | Phe | Leu | Gly | Phe 310 | Asn | Phe |
Thr | Lys | Thr | va1 | Gin 325 | Gin | Lys | Ala |
Tyr | Gin | Lys | Leu 340 | Gly | Pro | ile | Arg |
Leu | Phe | Ile 355 | Ile | Met | Ala | Leu | Leu 360 |
val | Pro 370 | Gly | Trp | Ser | Ala | Leu 375 | Phe |
Asp 385 | Ser | Thr | Val | Ala | Leu 390 | Leu | Ile |
Ala | Lys | Thr | Leu | Thr 405 | Lys | Thr | Thr |
Asp | Tyr | Ser | Pro 420 | Leu | Ile | Thr | Trp |
τ rp | Asp | Ile 435 | Ala | ile | Leu | val | Gly 440 |
cys | Glu 450 | Glu | Ser | Gly | Leu | Ser 455 | Lys |
Leu 465 | Gly | Ser | Leu | Pro | Al a 470 | Trp | Leu |
val | Thr | Ser | Leu | Thr 485 | Glu | val | Ala |
Phe | Leu | Pro | Ile 500 | Leu | ser | Pro | Leu |
Leu | Tyr | ile 515 | Leu | ile | Pro | Ser | Thr 520 |
Leu | Pro 530 | val | Al a | Asn | Pro | Pro 535 | Asn |
Leu | Lys | val | Ile | Asp | Met | Val | Lys |
545 550
Lys | Glu | Met 315 | Phe | Lys | Cys | Gl y | Lys 320 |
Cys | Ala 330 | Glu | Val | ile | Lys | Gin 335 | Glu |
Tyr 345 | Gin | Glu | Ile | val | Thr 350 | Leu | Val |
Trp | Phe | Ser | Arg | Asp 365 | Pro | Gly | Phe |
Ser | Glu | Tyr | Pro 380 | Gly | Phe | Al a | Thr |
Gly | Leu | Leu 395 | Phe | Phe | Leu | Ile | Pro 400 |
Pro | Thr 410 | Gly | Glu | Ile | val | Al a 415 | Phe |
Lys 425 | Glu | Phe | Gin | Ser | Phe 430 | Met | Pro |
Gly | Gly | Phe | Ala | Leu 445 | Ala | Asp | Gly |
Trp | Ile | Gly | Asn 460 | Lys | Leu | Ser | Pro |
Ile | Ile | Leu 475 | Ile | Ser | Ser | Leu | Met 480 |
Ser | Asn 490 | Pro | Ala | Thr | Ile | Thr 495 | Leu |
Al a 505 | Glu | Al a | Ile | Hi s | Val 510 | Asn | Pro |
Leu | Cys | Thr | Ser | Phe 525 | Ala | Phe | Leu |
Al a | Ile | Val | Phe 540 | Ser | Tyr | Gly | His |
Ala | Gly | Leu | Gly | Val | Asn | Ile | val |
555 560
PL 219 018 B1
Gly | val | Ala | val | Val | Met | Leu | Gly | Ile | Cys | Thr | Trp | Ile | val | Pro | Met |
565 | 570 | 575 | |||||||||||||
Phe | ASp | Leu | Tyr | Thr | Tyr | Pro | Ser | Trp | Ala | Pro | Ala | Met | Ser | Asn | Glu |
580 | 585 | 590 | |||||||||||||
Thr | Met | Pro |
595 <210> 46 <213> 224 <212> PRT
<213 | >> Homo | sapi | ens | ||||||||||||
<400> 46 | |||||||||||||||
Arg | Thr | Met | Lys | Phe | Phe | Ser | Tyr | Ile | Leu | val | Tyr | Arg | Arg | Phe | Leu |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Phe | val | val | Phe | Thr | Val | Leu | val | Leu | Leu | Pro | Leu | Pro | Ile | Val | Leu |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
His | Thr | Lys | Glu | Ala | Glu | Cys | Ala | Tyr | Thr | Leu | Phe | val | val | Al a | Thr |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Phe | Trp | Leu | Thr | Glu | Ala | Leu | Pro | Leu | ser | val | Thr | Ala | Leu | Leu | Pro |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
ser | Leu | Met | Leu | Pro | Met | Phe | Gly | Ile | Met | Pro | Ser | Lys | Lys | val | Ala |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
ser | Ala | Tyr | Phe | Lys | Asp | Phe | Hi s | Leu | Leu | Leu | Ile | Gly | val | ile | Cys |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Leu | Ala | Thr | Ser | ile | Glu | Lys | Trp | Asn | Leu | Hi 5 | Lys | Arg | ile | Ala | Leu |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Lys | Met | val | Met | Met | Val | Gly | Va1 | Α5Π | Pro | Ala | Trp | Leu | Thr | Leu | Gl y |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Phe | Met | Ser | ser | Thr | Ala | Phe | Leu | ser | Met | Trp | Leu | Ser | Asn | Thr | Ser |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Thr | Ala | Ala | Met | val | Met | Pro | Ile | Ala | Glu | Ala | val | val | Gin | Gin | ile |
145 | 150 | 155 | 160 |
PL 219 018 B1
Ile Asn Ala | Glu | Ala Glu Val 165 | Glu | Ala Thr Gin Met Thr Tyr Phe | Α5Π | ||||||||
170 | 175 | ||||||||||||
Gly ser Thr | Asn 180 | His | Gly | Leu | Glu | Ile 185 | Asp | Glu | ser | val | Asn 190 | Gly | His |
Glu ile Asn 195 | Glu | Arg | Lys | Glu | Lys 200 | Thr | Lys | Pro | val | Pro 205 | Gly | Tyr | Asn |
Asn Asp Thr 210 | Gly | Lys | Ile | Ser 215 | Ser | Lys | val | Glu | Leu 220 | Glu | Lys | Thr | Val |
<210> 47 | |||||||||||||
<211> 88 | |||||||||||||
<212> prt | |||||||||||||
<213> Homo | sapiens | ||||||||||||
<400* 47 | |||||||||||||
Ala Thr Gin 1 | Met | Thr 5 | Tyr | Phe | Asn | Gly | Ser 10 | Thr | Asn | His | Gly | Leu 15 | Glu |
Ile Asp Glu | Ser 20 | Val | Asn | Gly | His | Glu 25 | ile | Asn | Glu | Arg | Lys 30 | Glu | Lys |
Thr Lys Pro 35 | Val | Pro | Gly | Tyr | Asn 40 | Asn | Asp | Thr | Gly | Lys 45 | ile | Ser | Ser |
Lys val Glu 50 | Leu | Glu | Lys | His 55 | Trp | Lys | Leu | Ala | val 60 | Gin | Asp | Gly | ser |
Pro Ser pro 65 | ser | val | Hi s 70 | Ser | val | Ser | Gin | Leu 75 | Al a | Ala | Gin | Gly | Lys 80 |
Glu Lys val | Glu | Gly 85 | ile | Cys | Thr | ||||||||
<210* 48 | |||||||||||||
<211> 112 | |||||||||||||
<212> PRT | |||||||||||||
<213> Homo | sapiens |
PL 219 018 B1
<400> 48 | |||||||||||||||
His | Gly | Leu | Glu | Ile | Asp | Glu | Ser | Val | Asn | Gly | Hi s | Glu | rl e | Asn | Glu |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Arg | Lys | Glu | Lys | Thr | Lys | Pro | val | Pro | Gly | Tyr | Asn | Asn | Asp | Thr | Gly |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Lys | Ile | Ser | Ser | Lys | val | Glu | Leu | Glu | Lys | Asn | ser | Gly | Met | Arg | Thr |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Lys | Tyr | Arg | Thr | Lys | Lys | Gly | Hi s | Va1 | Thr | Arg | Lys | Leu | Thr | Cys | Leu |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Cys | Ile | Ala | Tyr | Ser | Ser | Thr | Ile | Gly | Gl y | Leu | Thr | Thr | Ile | Thr | Gly |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Thr | Ser | p | Asn | Leu | Ile | Phe | Ala | Glu | Tyr | Phe | Asn | Thr | Phe | His | Pro |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
HI s | Arg | Arg | Gly | Asp | Arg | Thr | Arg | Hi s | val | His | Gin | Glu | Ala | GlU | Ile |
100 | 105 | 110 |
<210> 49 <211> 21 <212> DNA <213 > Sztuczna sekwencja <22O>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 49 ccagctttaa ccatgtcaat g 21 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd
PL 219 018 B1 <400> 50 cagatggttg tgaggagtct g 21 <210> 51 <211> 3311 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 51 | ||||||
tgctaatgct | tttggtacaa | atggatgtgg | aatataattg | aatattttct | tgtttaaggg | 60 |
gagcatgaag | aggtgttgag | gttatgtcaa | gcatctggca | cagctgaagg | cagatggaaa | 120 |
tatttacaag | tacgcaattt | gagactaaga | tattgttatc | attctcctat | tgaagacaag | 180 |
agcaatagta | aaacacatca | ggtcaggggg | ttaaagacct | gtgataaacc | acttccgata | 240 |
agttggaaac | gtgtgtctat | attttcatat | ctgtatatat | ataatggtaa | agaaagacac | 300 |
cttcgtaacc | cgcattttcc | aaagagagga | atcacaggga | gatgtacagc | aatggggcca | 360 |
tttaagagtt | ctgtgttcat | cttgattctt | caccttctag | aaggggccct | gagtaattca | 420 |
ctcattcagc | tgaacaacaa | tggctatgaa | ggcattgtcg | ttgcaatcga | ccccaatgtg | 480 |
ccagaagatg | aaacactcat | tcaacaaata | aaggacatgg | tgacccaggc | atctctgtat | 540 |
ctgtttgaag | ctacaggaaa | gcgattttat | ttcaaaaatg | ttgccatttt | gattcctgaa | 600 |
acatggaaga | caaaggctga | ctatgtgaga | ccaaaacttg | agacctacaa | aaatgctgat | 660 |
gttctggttg | ctgagtctac | tcctccaggt | aatgatgaac | cctacactga | gcagatgggc | 720 |
aactgtggag | agaagggtga | aaggatccac | ctcactcctg | atttcattgc | aggaaaaaag | 780 |
ttagctgaat | atggaccaca | aggtaaggca | tttgtccatg | agtgggctca | tctacgatgg | 840 |
ggagtatttg | acgagtacaa | taatgatgag | aaattctact | tatccaatgg | aagaatacaa | 900 |
gcagtaagat | gttcagcagg | tattactggt | acaaatgtag | taaagaagtg | tcagggaggc | 960 |
agctgttaca | ccaaaagatg | cacattcaat | aaagttacag | gactctatga | aaaaggatgt | 1020 |
gagtttgttc | tccaatcccg | ccagacggag | aaggcttcta | taatgtttgc | acaacatgtt | 1080 |
gattctatag | ttgaattctg | tacagaacaa | aaccacaaca | aagaagctcc | aaacaagcaa | 1140 |
aatcaaaaat | gcaatctccg | aagcacatgg | gaagtgatcc | gtgattctga | ggactttaag | 1200 |
aaaaccactc | ctatgacaac | acagccacca | aatcccacct | tctcattgct | gcagattgga | 1260 |
caaagaattg | tgtgtttagt | ccttgacaaa | tctggaagca | tggcgactgg | taaccgcctc | 1320 |
aatcgactga | atcaagcagg | ccagcttttc | ctgctgcaga | cagttgagct | ggggtcctgg | 1380 |
gttgggatgg | tgacatttga | cagtgctgcc | catgtacaaa | gtgaactcat | acagataaac | 1440 |
PL 219 018 B1
agtggcagtg | acagggacac | actcgccaaa | agattacctg | cagcagcttc | aggagggacg | 1500 |
tccatctgca | gcgggcttcg | atcggcattt | actgtgatta | ggaagaaata | tccaactgat | 1560 |
ggatctgaaa | ttgtgctgct | gacggatggg | gaagacaaca | ctataagtgg | gtgctttaac | 1620 |
gaggtcaaac | aaagtggtgc | catcatccac | acagtcgctt | tggggccctc | tgcagctcaa | 1680 |
gaactagagg | agctgtccaa | aatgacagga | ggtttacaga | catatgcttc | agatcaagtt | 1740 |
cagaacaatg | gcctcattga | tgcttttggg | gccctttcat | caggaaatgg | agctgtctct | 1800 |
cagcgctcca | tccagcttga | gagraaggga | ttaaccctcc | agaacagcca | gtggatgaat | 1860 |
ggcacagtga | tcgtggacag | caccgtggga | aaggacactt | tgtttcttat | cacctggaca | 1920 |
acgcagcctc | cccaaatcct | tctctgggat | cccagtggac | agaagcaagg | tggctttgta | 1980 |
gtggacaaaa | acaccaaaat | ggcctacctc | caaatcccag | gcattgctaa | ggttggcact | 2040 |
tggaaataca | gtctgcaagc | aagctcacaa | accttgaccc | tgactgtcac | gtcccgtgcg | 2100 |
tccaatgcta | ccctgcctcc | aattacagtg | acttccaaaa | cgaacaagga | caccagcaaa | 2160 |
ttccccagcc | ctctggtagt | ttatgcaaat | attcgccaag | gagcctcccc | aattctcagg | 2220 |
gccagtgrca | cagccctgat | tgaatcagtg | aatggaaaaa | cagttacctt | ggaactactg | 2280 |
gataatggag | caggtgctga | tgctactaag | gatgacggtg | tctactcaag | gtatttcaca | 2340 |
acttatgaca | cgaatggtag | atacagtgta | aaagtgcggg | ctctgggagg | agttaacgca | 2400 |
gccagacgga | gagtgatacc | ccagcagagt | ggagcactgt | acatacctgg | ctggattgag | 2460 |
aatgatgaaa | tacaatggaa | tccaccaaga | cctgaaatta | ataaggatga | tgttcaacac | 2520 |
aagcaagtgr | gtttcagcag | aacatcctcg | ggaggctcat | ttgtggcttc | tgatgtccca | 2580 |
aatgctccca | tacctgatct | cttcccacct | ggccaaatca | ccgacctgaa | ggcggaaatt | 2S40 |
cacgggggca | gtctcattaa | tctgacttgg | acagctcctg | gggatgatta | tgaccatgga | 2700 |
acagctcaca | agtatatcat | tcgaataagt | acaagtattc | ttgatctcag | agacaagttc | 2760 |
aatgaatctc | ttcaagtgaa | tacractgct | crcatcccaa | aggaagccaa | ctctgaggaa | 2820 |
gtctttttgt | ttaaaccaga | aaacattact | tttgaaaatg | gcacagatct | tttcattgct | 2880 |
attcaggctg | rtgataaggt | cgatctgaaa | tcagaaatat | ccaacattgc | acgagtatct | 2940 |
ttgtttattc | ctccacagac | tccgccagag | atacctagrc | ctgatgaaac | gtctgctcct | 3000 |
tgtcctaata | tteatatcaa | cagcaccatt | cctggcattc | acattttaaa | aattatgtgg | 3060 |
aagtggatag | gagaactgca | gctgtcaata | gcctagggct | gaatttttgt | cagataaata | 3120 |
aaataaatca | ttcatccttt | ttttgattat | aaaattttcr | aaaatgtatt | ttagacttcc | 3180 |
tgtagggggc | gatatactaa | atgtatatag | tacatttata | ctaaatgtat | tcctgtaggg | 3240 |
ggcgatatac | taaatgtatt | ttagacttcc | tgtagggggc | gataaaataa | aatgctaaac | 3300 |
aactgggtaa | a | 3311 |
PL 219 018 B1
<210> | 52 |
<211> | 3067 |
<212> | DNA |
<213> | Homo sapiens |
<400> | 52 |
aattaaatta | tgagaattaa | aaagacaaca | ttgagcagag | atgaaaaagg | aagggaggaa | 60 |
aaggtggaaa | agaaaagaag | acaagaagcg | agtagtggtc | tctaacttgc | tctttgaagg | 120 |
atggtctcac | aaagagaacc | ccaacagaca | tcatcgtggg | aatcaaatca | agaccagcaa | 180 |
gtacaccgtg | ttgtccttcg | tccccaaaaa | catttttgag | cagctacacc | ggtttgccaa | 240 |
tctctatttt | gtgggcattg | cggttctgaa | ttttatccct | gtggtcaatg | ctttccagcc | 300 |
tgaggtgagc | atgataccaa | tctgtgttat | cctggcagtc | actgccatca | aggacgcttg | 360 |
ggaagacctc | cggaggtaca | aatcggataa | agtcatcaat | aaccgagagt | gcctcatcta | 420 |
cagcagaaaa | gagcagacct | atgtgcagaa | gtgctggaag | gatgtgcgtg | tgggagactt | 480 |
catccaaatg | aaatgcaatg | agattgtccc | agcagacata | ctcctccttt | tttcctctga | 540 |
ccccaatggg | atatgccatc | tggaaactgc | cagcttggat | ggagagacaa | acctcaagca | 600 |
aagacgtgtc | gtgaagggct | tctcacagca | ggaggtacag | ttcgaaccag | agcttttcca | 660 |
caataccatc | gtgtgtgaga | aacccaacaa | ccacctcaac | aaatttaagg | gttatatgga | 720 |
gcatcctgac | cagaccagga | ctggctttgg | ctgtgagagt | cttctgcttc | gaggctgcac | 780 |
catcagaaac | accgagatgg | ctgttggcat | tgtcatctat | gcaggccatg | agacgaaagc | 840 |
catgctgaac | aacagtggcc | cccggtacaa | acgcagcaag | attgagcggc | gcatgaatat | 900 |
agacatcttc | ttctgcattg | ggatcctcat | cctcatgtgc | cttattggag | ctgtaggtca | 960 |
cagcatctgg | aatgggacct | ttgaagaaca | ccctcccttc | gatgtgccag | atgccaatgg | 1020 |
cagcttcctt | cccagtgccc | ttgggggctt | ctacatgttc | ctcacaatga | tcatcctgct | 1080 |
ccaggtgctg | atccccatct | ctttgtatgt | ctccattgag | ctggtgaagc | tcgggcaagt | 1140 |
gttcttcttg | ^ici c ci a t g a c. | ttgacctgta | tgatgaagag | accgatttat | ccattcaatg | 1200 |
tcgagccctc | aacatcgcag | aggacttggg | ccagatccag | tacatcttct | ccgataagac | 1260 |
ggggaccctg | acagagaaca | agatggtgtt | ccgacgttgc | accatcatgg | gcagcgagta | 1320 |
ttctcaccaa | gaaaatggta | tagaagctcc | caagggctcc | atccctcttt | ctaaaaggaa | 1380 |
ataccctgct | ctcctaagaa | acgaggagat | aaaagacatt | ctcctggctc | tcttagaggc | 1440 |
tgtgtggcat | ttccacaagt | tgcttcctgt | atccętgtgg | tcttccttgt | cacagatcag | 1500 |
PL 219 018 B1
ggctgttcca | attacttgta | aactttcatt | tgtttacaaa | ggttagaagt | tatcccatat | 1560 |
gtggttcccc | ttcagctgat | ctttgtctgg | tgccagacaa | agcactttat | gagacgagtt | 1620 |
ttttatctgt | cagcaatgga | ttggagacat | ttcccaattg | tgtgccagtc | acacaaccaa | 1680 |
ggcttaggaa | tttctcaggc | caccttacct | gacatgtcag | ggcaggtctg | tgtctaggtg | 1740 |
catggtcaga | tttaatacat | ccagaagatg | tcttctattc | taacagatct | cttagcttgt | 1800 |
cactgaggca | aagttttgat | ttaggagata | gggctataaa | atgcctggac | tgttaccttg | 1860 |
catggactga | atatgactca | taaaactgat | ctgattcctt | cagccatcat | ctgcccaact | 1920 |
tggttcccct | ccccaccccc | ccacaacaca | cacacacact | ttctaagaaa | agaaaagaaa | 1980 |
ttcttttttt | tcaatacttt | aagttctggg | atacatgtgc | agaatgtgca | ggtttgttac | 2040 |
ataggtatac | atgtgtcatg | gtggtttgca | gcacccacca | acccatcatc | taccttaggt | 2100 |
atttctccta | atgctatccc | tcccctagcc | cccaaccccc | cgatgggctc | cagtgtgtga | 2160 |
tgttcccctc | catgtccatg | tgttctcatt | gttcaattcc | cacttatgag | tgagaacatg | 2220 |
cagtatttgg | ttttctgttc | ttgtgttagt | ttgctgatgg | tttcctgttc | atccgtgtcc | 2280 |
ctgcaaagga | catgaactca | tcctttttta | tggctgcata | atattccatg | gtgtatatgt | 2340 |
gccacatttt | ctttatccag | tctatcgctg | atgggcactg | gggttggttc | caagtctttg | 2400 |
ctattgtgaa | cagtgctgca | ataaacttac | atgtgcatgt | gtctttagta | gaatgattta | 2460 |
taatcctttg | ggtatatacc | cagtaatggg | attgctggtc | aaatggtatt | tctggttcta | 2520 |
gatccttgag | gaatctttgt | cttccacaat | ggttgaacta | atttgtactc | ccaccaacag | 2580 |
tgtaaaagta | ttcctgtttc | tctacatcct | cttcagcatc | tgttgtgtcc | tgacatttta | 2640 |
atgatcacta | ttctcactgg | cgtgagatgt | tatctcattg | tggttttgat | ttgcatttct | 2700 |
ctaatgacca | gtaatgatga | gctttttttc | atatgtttgt | tggctgcata | aatgtcttct | 2760 |
tttgagaagt | gtctgttcat | atccttcacc | cattttttga | agaaaacaaa | ctcttaagag | 2820 |
agcagtattc | attcttttga | gtgtgaggga | tggagaaaga | gaaagatgga | gagagtatta | 2880 |
taagcagctg | tatccccttt | gccatggtga | tagcagacca | ttcacatggg | agcttctggt | 2940 |
ctctttgtaa | taataataag | agccacatta | ccagtactta | gagtatgcta | gttattttaa | 3000 |
cacattgtat | cattaaatct | tcaaaacatc | cctatgagtt | agaaacctaa | aaaaaaaaaa | 3060 |
aaaaaaa 3067 <210> 53 <211> 2778 <212> DNA <213> Homo sapiens .
PL 219 018 B1
<400> 53 ctcattttga | tgtctagaat | caggggatcc | aggatcatca | ccaaggtcat | tttcccaggt | 60 |
atggaggggt | ctttctgctr | ctttcttgtc | atgcacagct | gctgaggaag | gggctgggag | 120 |
taaagacagt | gaaatgggga | ggaggagtcc | attcaaaccg | agaaacaaag | tgtttggttt | 180 |
ttcttacccc | tggtgtagaa | gctaccaacc | ttttccaaga | aagagggcct | ggcccccttc | 240 |
tcgggtctgg | ctgggtgcct | gctgtgcctc | tctggcctcc | cctccgaagg | gcaccattcc | 300 |
ctcgggtgag | tactaccggc | ctgcaccgtc | ttccagtggg | gacagcctga | gaagagagtc | 360 |
tggggcctta | cttcagtacc | ttccttcact | ggcctcaccc | tgtgcaaatc | atgccacacg | 420 |
ctgcagcctc | cttttcccta | tctataaaat | aaaaatgacc | ctgctctatc | tcactgggct | 480 |
ggcaagaaca | cactgttgtt | gccttgcaga | cagatgtgct | gaggctgtag | aaagtgcttt | 540 |
ttatttggtt | gggagcttgt | gcataaatgc | gagaggggct | gcacatctga | cggactagag | 600 |
gtgactcatg | gctgaaccgg | aacaggacat | cggggagaag | ccagcagcca | tgctgaactc | 660 |
tccacagggc | cctgtgaaaa | gctcttcacc | tcctctgccc | tctggatcta | gtgaagccta | 720 |
ttcatccttc | agatgtcagc | tcaaataatc | aaccttcatg | gaggcctccc | ttgaccccta | 780 |
acatgctttc | aaagtactgt | gtatttcaca | ttcatcatgc | cccgacaact | gtgatttccc | 840 |
atttattaat | atctgtctct | tctgctggcc | tgcaaactcc | aggagcacag | agacatcttt | 900 |
gggatttttg | aacatgattt | ccccagggct | tagcccagtg | cctggtgcaa | agcaggcttt | 960 |
caacatgttc | agtggatatt | gtaagaaaga | aagaaataca | caaaaggcct | ggcatatgca | 1020 |
aagcactcta | aatattcact | cctttccctt | ccctctgggt | gagaaaattt | ctccttataa | 1080 |
agacaccctc | ctaactgtat | ctctgctaga | gaactgaaga | cataaagcac | tctgtgccaa | 1140 |
aaatatttaa | gtaaaaactt | gagctaagca | cagagattat | aaatatttct | tccccagatt | 1200 |
acgcaccatt | taaaaatact | gtctcagctc | cttttcatga | tttgggtggt | gattaaagaa | 1260 |
aattactctt | caagactgaa | agtcattact | gcccttttcc | tgacttgcct | tttcccttga | 1320 |
gaaggggagg | ataagctgca | gggcaggaag | tggaagtggg | gcatccttgt | cctttgtctg | 1380 |
gcagacagcc | aactggtcag | gtactgctcc | ttctcaactc | tttcctgatt | cccaggtgaa | 1440 |
tataaacaag | aaggcacaaa | tccacacttg | ccaacaacgg | acccaagtga | taacaagaaa | 1500 |
cccagtgaca | cctgtctagg | tgaagactca | gcccctatgt | gaccaggttg | caaagccaaa | 1560 |
ctgaccatct | gctttccatt | tggactttta | gttcatactg | tatcttctca | ggacagttaa | 1620 |
gttggaatac | aatgccactg | tcctgaaaga | tggtagaatt | atcctatttc | tggaggagtg | 1680 |
ggggtggtgg | gtaggaatct | caagagcgat | ttgctcctct | gcacaatagc | ttctttaagg | 1740 |
acaccagggc | ccccagggct | atacatttcc | ctgaagcttt | ccagataagc | aacaaggtat | 1800 |
PL 219 018 B1 gagcacctgc tatgtattgc ccaagggtga tgtgtttaaa tatccattgc atattttaaa 1860 tccttggctg gcttaaagct gcaagctttc tgtcttcagt ggatataatg ggggcataca 1920 tcccagagct tgcccaacac tccaagaaaa gaaccctcag ctaatgcaaa gtgtgtatgt 1980 gcccatgaaa gctccatgtc tacttaacat tcagttttta ggattattta tgctgtaata 2040 atagatatga aaatctctga caggtatttt gtttccttta caaactgtat ttgaatttat 2100 gggtgattta gagcttgtgt ttaaagtcag aattcagaac cccaaagaaa atgacttcat 2160 tgaaattgaa ctgaagagac aagaactgag ttaccaaaac ctactaaacg tgagttgctg 2220 tgaactgggg attaaaccag aacgagtgga gaagatcaga aagctaccaa acacactgct 2280 cagaaaggac aaagacattc gaagactgcg ggactttcag gaagtggaac tcattttaat 2340 gaaaaatgga agctccagat tgacagaata tgtgccatct ctgacagaaa ggccctgcta 2400 tgatagcaaa gctgcaaaaa tgacttatta aatactccca ggaatggccg cgcatggtgg 2460 ctcaccccct gtaatcceag cactttggga agccaaggtg ggcggatcac ctgaggtcag 2520 gagttctaga ccagcctggc caacatatag tgaaacccag tctctactaa aaaaaataca 2580 aaaattagct aggtgtggtg gcgcacacct gtagtagtcc cagctacatg ggaagctgag 2640 gcaggagaat cacctgaacc caggaggcag aggttgcagt gagctgagat tgcgccactg 2700 cactccagcc tggcgacaga gcaagactct gtctctcaaa ataaataaat aaataaataa 2760 ataaataaat aaataatc 2778 <210* 54 <211> 1646 <212* DNA <213* Homo sapiens
<400* 54 gcccgggaga | ggagaggagc | gggccgagga | ctccagcgtg | cccaggtctg | gcatcctgca | 60 |
cttgctgccc | tctgacacct | gggaagatgg | ccggcccgtg | gaccttcacc | cttctctgtg | 120 |
gtttgctggc | agccaccttg | atccaagcca | ccctcagtcc | cactgcagtt | ctcatcctcg | 180 |
gcccaaaagt | catcaaagaa | aagctgacac | aggagctgaa | ggaccacaac | gccaccagca | 240 |
tcctgcagca | gctgccgctg | ctcagtgcca | tgcgggaaaa | gccagccgga | ggcatccctg | 300 |
tgctgggcag | cctggtgaac | accgtcctga | agcacatcat | ctggctgaag | gtcatcacag | 360 |
ctaacatcct | ccagctgcag | gtgaagccct | cggccaatga | ccaggagctg | ctagtcaaga | 420 |
tccccctgga | catggtggct | ggattcaaca | cgcccctggt | caagaccatc | gtggagttcc | 480 |
acatgacgac | tgaggcccaa | gccaccatcc | gcatggacac | cagtgcaagt | ggccccaccc | 540 |
PL 219 018 B1
gcctggtcct | cagtgactgt | gccaccagcc | atgggagcct | c ej c a 1.C C | ctgctgcata | 600 |
agctctcctt | cctggtgaac | gccttagcta | agcaggtcat | gaacctccta | gtgccatccc | 660 |
tgcccaatct | agtgaaaaac | cagctgtgtc | ccgtgatcga | ggcttccttc | 3. ii cj y c ct t] ΐ | 720 |
atgcagacct | cctgcagctg | gtgaaggtgc | ccatttccct | cagcattgac | cgtctggagt | 780 |
ttgaccttct | gtatcctgcc | atcaagggtg | acaccattca | gctctacctg | ggggccaagt | 840 |
tgttggactc | acagggaaag | gtgaccaagt | ggttcaataa | ctctgcagct | tccctgacaa | 900 |
tgcccaccct | ggacaacatc | ccgttcagcc | tcatcgtgag | tcaggacgtg | gtgaaagctg | 960 |
cagtggctgc | tgtgctctct | ccagaagaat | tcatggtcct | gttggactct | gtgcttcctg | 1020 |
agagtgccca | tcggctgaag | tcaagcatcg | ggctgatcaa | tgaaaaggct | gcagataagc | 1080 |
tgggatctac | ccagatcgtg | aagatcctaa | ctcaggacac | tcccgagttt | tttatagacc | 1140 |
aaggccatgc | caaggtggcc | caactgatcg | tgctggaagt | gtttccctcc | agtgaagccc | 1200 |
tccgcccttt | gttcaccctg | ggcatcgaag | ccagctcgga | ag ctcagttt | tacaccaaag | 1260 |
gtgaccaact | tatactcaac | ttgaataaca | tcagctctga | tcggatccag | ctgatgaact | 1320 |
ctgggattgg | ctggttccaa | cctgatgttc | t ci ci ct a ćs ta t | catcactgag | atcatccact | 1380 |
ccatcctgct | gccgaaccag | aatggcaaat | taagatctgg | ggtcccagtg | tcattggtga | 1440 |
aggccttggg | attcgaggca | gctgagtcct | cactgaccaa | ggatgccctt | gtgcttactc | 1500 |
cagcctcctt | gtggaaaccc | agctctcctg | tctcccagtg | aagacttgga | tggcagccat | 1560 |
cagggaaggc | tgggtcccag | ctgggagtat | gggtgtgagc | tctatagacc | atccctctct | 1620 |
gcaatcaata | aacacttgcc | tgtgat | 1646 |
<210> 55 <211> 1049
<212> DNA <213> Home | i sapiens | |||||
<400> 55 | ||||||
ggagtggggg | agagagagga | gatcaggaca | gctgctgaga | cctctaagaa | gtccagatac | 60 |
taagagcaaa | gatgtttcaa | actgggggcc | tcattgtctt | ctacgggctg | ttagcccaga | 120 |
ccatggccca | gtttggaggc | ctgcccgtgc | ccctggacca | gaccctgccc | ttgaatgtga | 180 |
atccagccct | gcccttgagt | cccacaggtc | ttgcaggaag | cttgacaaat | gccctcagca | 240 |
atggcctgct | gtctgggggc | ctgttgggca | ttctggaaaa | ccttccgctc | ctggacatcc | 300 |
tgaagcctgg | aggaggtact | tctggtggtc | tccttggggg | actgcttgga | aaagtgacgt | 360 |
100
PL 219 018 B1 cagtgattcc tggcctgaac aacatcattg acataaaggt cactgacccc cagctgctgg 420 aacttggcct tgtgcagagc cctgatggcc accgtctcta tgtcaccatc cctctcggca 480 taaagctcca agtgaatacg cccctggtcg gtgcaagtct gttgaggctg gctgtgaagc 540 tggacatcac tgcagaaatc ttagctgtga gagataagca ggagaggatc cacctggtcc 600 ttggtgactg cacccattcc cctggaagcc tgcaaatttc tctgcttgat ggacttggcc 660 ccctccccat tcaaggtctt ctggacagcc tcacagggat cttgaataaa gtcctgcctg 720 agttggttca gggcaacgtg tgccctctgg tcaatgaggt tctcagaggc ttggacatca 780 ccctggtgca tgacattgtt aacatgctga tccacggact acagtttgtc atcaaggtct 840 aagccttcca ggaaggggct ggcctctgct gagctgcttc ccagtgctca cagatggctg 900 gcccatgtgc tggaagatga cacagttgcc ttctctccga ggaacctgcc ccctctcctt 960 tcccaccagg egtgtgtaac atcccatgtg cctcacctaa taaaatggct cttcttctgc 1020 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1049 <210> 56 <211> 4815 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 56
gagcagagcc ctttcacaca cctcaggaac acctttcggc tgcccgctcc ccagacacac | 60 |
ctgcagccct gcccagccgg ctttgctcac ccactgcttg taaatgcccc agatatgagc | 120 |
cagcccaggc cccgctacgt ggtagacaga gccgcatact cccttaccct cttcgacgat | 180 |
gagtttgaga agaaggaccg gacataccca gtgggagaga aacttcgcaa tgccttcaga | 240 |
tgttcctcag ccaagatcaa agctgtggtg tttgggctgc tgcctgtgct ctcctggctc | 300 |
cccaagtaca agattaaaga ctacatcatt cctgacctgc tcggtggact cagcggggga | 360 |
tccatccagg tcccacaagg catggcattt gctctgctgg ccaaccttcc tgcagtcaat | 420 |
ggcctctact cctccttctt ccccctcctg acctacttct tcctgggggg tgttcaccag | 480 |
atggtgccag gtacctttgc cgttatcagc atcctggtgg gtaacatctg tctgcagctg | 540 |
gccccagagt cgaaattcca ggtcttcaac aatgccacca atgagagcta tgtggacaca | 600 |
gcagccatgg aggctgagag gctgcacgtg tcagctacgc tagcctgcct caccgccatc | 660 |
atccagatgg gtctgggctt catgcagttt ggctttgtgg ccatctacct ctccgagtcc | 720 |
ttcatccggg gcttcatgac ggccgccggc ctgcagatcc tgatttcggt gctcaagtac | 780 |
atcttcggac tgaccatccc ctcctacaca ggcccagggt ccatcgtctt taccttcatt | 840 |
PL 219 018 B1
101
gacatttgca | aaaacctccc | ccacaccaac | atcgcctcgc | tcatcttcgc | tctcatcagc | 900 |
ggtgccttcc | tggtgctggt | gaaggagctc | aatgctcgct | acatgcacaa | gattcgcttc | 960 |
cccatcccta | cagagatgat | tgtggtggtg | gtggcaacag | ctatctccgg | gggctgtaag | 1020 |
atgcccaaaa | agtatcacat | gcagatcgtg | ggagaaatcc | aacgcgggtt | ccccaccccg | 1080 |
gtgtcgcctg | tggtctcaca | gtggaaggac | atgataggca | cagccttctc | cctagccatc | 1140 |
gtgagctacg | tcatcaacct | ggctatgggc | cggaccctgg | ccaacaagca | cggctacgac | 1200 |
gtggattcga | accaggagat | gatcgctctc | ggctgcagca | acttctttgg | ctccttcttt | 1260 |
aaaattcatg | tcatttgctg | tgcgctttct | gtcactctgg | ctgtggatgg | agctggagga | 1320 |
aaatcccagg | tggccagcct | gtgtgtgtct | ctggtggtga | tgatcaccat | gctggtcctg | 1380 |
gggatctatc | tgtatcctct | ccctaagtct | gtgctaggag | ccctgatcgc | tgtcaatctc | 1440 |
aagaactccc | tcaagcaact | caccgacccc | tactacctgt | ggaggaagag | caagctggac | 1500 |
tgttgcatct | gggtagtgag | cttcctctcc | tccttcttcc | tcagcctgcc | ctatggtgtg | 1560 |
gcagtgggtg | tcgccttctc | cgtcctggtc | gtggtcttcc | agactcagtt | tcgaaatggc | 1620 |
tatgcactgg | cccaggtcat | ggacactgac | atttatgtga | atcccaagac | ctataatagg | 1680 |
gcccaggata | tccaggggat | taaaatcatc | acgtactgct | cccctctcta | ctttgccaac | 1740 |
tcagagatct | tcaggcaaaa | ggtcatcgcc | aagacaggca | tggaccccca | gaaagtatta | 1800 |
ctagccaagc | aaaaatacct | caagaagcag | gagaagcgga | gaatgaggcc | cacacaacag | 1860 |
aggaggtctc | tattcatgaa | aaccaagact | gtctccctgc | aggagctgca | gcaggacttt | 1920 |
gagaatgcgc | cccccaccga | ccccaacaac | aaccagaccc | cggctaacgg | caccagcgtg | 1980 |
tcctatatca | ccttcagccc | tgacagctcc | tcacctgccc | agagtgagcc | accagcctcc | 2040 |
gctgaggccc | ccggcgagcc | cagtgacatg | ctggccagcg | tcccaccctt | cgtcaccttc | 2100 |
cacaccctca | tcctggacat | gagtggagtc | agcttcgtgg | acttgatggg | catcaaggcc | 2160 |
ctggccaagc | tgagctccac | ctatgggaag | atcggcgtga | aggtcttctt | ggtgaacatc | 2220 |
catgcccagg | tgtacaatga | cattagccat | ggaggcgtct | ttgaggatgg | gagtctagaa | 2280 |
tgcaagcacg | tctttcccag | catacatgac | gcagtcctct | ttgcccaggc | aaatgctaga | 2340 |
gacgtgaccc | caggacacaa | cttccaaggg | gctccagggg | atgctgagct | ctccttgtac | 2400 |
gactcagagg | aggacattcg | cagctactgg | gacttagagc | aggagatgtt | cgggagcatg | 2460 |
tttcacgcag | agaccctgac | cgccctgtga | gggctcagcc | agtcctcatg | ctgcctacag | 2520 |
agtgcctggc | acttgggact | tccataaagg | atgagcctgg | ggtcacaggg | ggtgtcgggc | 2580 |
ggaggaaagt | gcatccccca | gagcttgggt | tcctctctcc | tctccccctc | tctcctccct | 2640 |
tccttccctc | cccgcatctc | cagagagagc | ctctcagcag | caggggggtg | ctacccttac | 2700 |
102
PL 219 018 B1 gggagtgaga gtctggtgag cccactcttc acccgtcagg ccctggccgc aatggacaag 2760 cctcctgctc actccacccc acccacatct gccctgtcct tggcagctga aggacacctt 2820 gacttccagc ttttacgagt gagccaaaaa cagaaggaca agtacaactg tgctggcctg 2880 ctgtacaagc ttcaaaaagt gtcccagagc ccgcacggct cggtgtcaga tggtgtcagg 2940 ctgtcacgga catagggata aacttggtta ggactctggc ttgccttccc cagctgcctc 3000 aactctgtct ctggcagctc tgcacccagg gaceatgtgc tctccacacc caggagtcta 3060 ggccttggta actatgcgcc ccccctccat catccccaag gctgcccaaa ccaccactgc 3120 tgtcagcaag cacatcagac tctagcctgg acagtggcca ggaccgtcga gaccaccaga 3180 gctacctccc cggggacagc ccactaaggt tctgcctcag cctcctgaaa catcactgcc 3240 ctcagaggct gctcccttcc cctggaggct ggctagaaac cccaaagagg gggatgggta 3300 gctggcagaa tcatctggca tcctagtaat agataccagt tattctgcac aaaacttttg 3360 ggaattcctc tttgcaccca gagactcaga ggggaagagg gtgctagtac caacacaggg 3420 aaaacggatg ggacctgggc ccagacagtc ccccttgacc ccagggccca tcagggaaat 3480 gcctcccttt ggtaaatctg ccttatcctt ctttacctgg caaagagcca atcatgttaa 3540 ctcttcctta tcagcctgtg gcccagagac acaatggggt ccttctgtag gcaaaggtgg 3600 aagtcctcca gggatccgct acatccccta actgcatgca gatgtggaaa ggggctgatc 3660 cagattgggt c.ttcctgcac aggaagactc tttaacaccc ttaggacctc aggccatctt 3720 ctcctatgaa gatgaaaata ggggttaagt tttccatatg tacaaggagg tattgagagg 3780 aaccctactg ttgacttgaa aataaatagg ttccatgtgt aagtgttttg taaaatttca 3840 gtggaaatgc acagaaaatc ttctggcctc tcatcactgc ttttctcaag cttcttcagc 3900 ttaacaaccc cttccctaac aggttgggct ggcccagcct aggaaaacat ccccatttct 3960 aacttcagcc agacctgcgt tgtgtgtctg tgtgttgagt gagctggtca gctaacaagt 4020 cttettagag ttaaaggagg gggtgctggc caagagccaa cacattcttg gcccaggagc 4080 attgcttttc tgtgaattca ttatgccatc tggctgccaa tggaactcaa aacttggaag 4140 gcgaaggaca atgttatctg ggattcaccg tgcccagcac ccgaagtgcc aaattccagg 4200 aggacaagag ccttagccaa tgacaactca ctctccccta ctccacctcc ttccaagtcc 4260 agctcaggcc caggaggtgg gagaaggtca cagagcctca ggaatttcca agtcagagtc 4320 ccctttgaac caagtatcta gatcccctga ggacttgatg aagtgatcct taacccccaa 4380 gtaatcatta acccccagac cagcctcaga actgaaggag attgttgacc cagtgacctg 4440 gagttgaggc tcagggagag atctgccaca tgtctgaggg ttgcagagcc cgctgtggag 4500 gtaagattgg aaacacatga ggcagaggga agacattgaa gaaaacatct ctgctggaat 4560 atttggaaaa gaacactctt ctggacctgg ttgaagcagg aaagatggag gcaaagtagt 4620
PL 219 018 B1
103
gaaataatcc agaatttcaa tgcttttgaa tgttcttagt gatactgacc | tgtgataata | 4680 |
taattcccag ggaggactgg gaaccttatc tcttgagata tttgcataat | ttatttaatt | 4740 |
taagcctcat tctccttttg ttcattttgg taataaactg gatttgaatt | gtgaacaaaa | 4800 |
aaaaaaaaaa aaaaa | 4815 |
<210> 57 <211> 2572
<212> DNA | ||||||
<213> Homo | i sapiens | |||||
<400> 57 aatgctctaa | gacctctcag | cacgggcgga | agaaactccc | ggagagctca | cccaaaaaac | 60 |
aaggagatcc | catctagatt | tcttcttgct | tttgactcac | agctggaagt | tagaaaagcc | 120 |
tcgatttcat | ctttggagag | gccaaatggt | cttagcctca | gtctctgtct | ctaaatattc | 180 |
caccataaaa | cagctgagtt | atttatgaat | tagaggctat | agctcacatt | ttcaatcctc | 240 |
tatttctttt | tttaaatata | actttctact | ctgatgagag | aatgtggttt | taatctctct | 300 |
ctcacatttt | gatgatttag | acagactccc | cctcttcctc | ctagtcaata | aacccattga | 360 |
tgatctattt | cccagcttat | ccccaagaaa | acttttgaaa | ggaaagagta | gacccaaaga | 420 |
tgttattttc | tgctgtttga | attttgtctc | cccaccccca | acttggctag | taataaacac | 480 |
ttactgaaga | agaagcaata | agagaaagat | atttgtaatc | tctccagccc | atgatctcgg | 540 |
ttttcttaca | ctgtgatctt | aaaagttacc | aaaccaaagt | cartttcagt | ttgaggcaac | 600 |
caaacctttc | tactgctgtt | gacatcttct | tattacagca | acaccattct | aggagtttcc | 660 |
tgagctctcc | actggagtcc | tctttctgtc | gcgggtcaga | aattgtccct | agatgaatga | 720 |
gaaaattatt | ttttttaatt | taagtcctaa | atatagttaa | aataaataat | gttttagtaa | 780 |
aatgatacac | tatctctgtg | aaatagcctc | acccctacat | gtggatagaa | ggaaatgaaa | 840 |
aaataattgc | tttgacattg | tctatatggt | actttgtaaa | gtcatgctta | agtacaaatt | 900 |
ccatgaaaag | ctcactgatc | ctaattcttt | ccctttgagg | tctctatggc | tctgattgta | 960 |
catgatagta | agtgtaagcc | atgtaaaaag | taaataatgt | ctgggcacag | tggctcacgc | 1020 |
ctgtaatcct | agcactttgg | gaggctgagg | aggaaggatc | acttgagccc | agaagttcga | 1080 |
gactagcctg | ggcaacatgg | agaagccctg | tctctacaaa | atacagagag | aaaaaatcag | 1140 |
ccagtcatgg | tggcatacac | ctgtagtccc | agcattccgg | gaggctgagg | tgggaggatc | 1200 |
acttgagccc | agggaggttg | gggctgcagt | gagccatgat | cacaccactg | cactccagcc | 1260 |
104
PL 219 018 B1
aggtgacata | gcgagatcct | gtctaaaaaa | ataaaaaata | aataatggaa | cacagcaagt | 1320 |
cctaggaagt | aggttaaaac | taattcttta | aaaaaaaaaa | aaagttgagc | ttgaattaaa | 1380 |
tgtaatgttt | ccaagtgaca | ggtatccaca | tttgcatggt | tacaagccac | tgccagttgg | 1440 |
cagtagcact | ttcctggcac | tgtggtcggt | tttgttttgt | tttgctttgt | ttagagacgg | 1500 |
ggtctcactt | tccaggctgg | cctcaaactc | ctgcactcaa | gcaattcttc | taccctggcc | 1560 |
tcccaagtag | ctggaattac | aggtgtgcge | catcacaact | agctggtggt | cagttttgtt | 1620 |
actctgagag | ctgttcactt | ctctgaattc | acctagagtg | gttggaccat | cagatgtttg | 1680 |
ggcaaaactg | aaagctcttt | gcaaccacac | accttccctg | agcttacatc | actgcccttt | 1740 |
tgagcagaaa | gtctaaattc | cttccaagac | agtagaattc | catcccagta | ccaaagccag | 1800 |
ataggccccc | taggaaactg | aggtaagagc | agtctctaaa | aactacccac | agcagcattg | 1860 |
gtgcagggga | acttggccat | taggttatta | tttgagagga | aagtcctcac | atcaatagta | 1920 |
catatgaaag | tgacctccaa | ggggattggt | gaatactcat | aaggatcttc | aggctgaaca | 1980 |
gactatgtct | ggggaaagaa | cggattatgc | cccattaaat | aacaagttgt | gttcaagagt | 2040 |
cagagcagtg | agctcagagg | cccttctcac | tgagacagca | acatttaaac | caaaccagag | 2100 |
gaagtatttg | tggaactcac | tgcctcagtt | tgggtaaagg | atgagcagac | aagtcaacta | 2160 |
aagaaaaaag | aaaagcaagg | aggagggttg | agcaatcrag | agcatggagt | ttgttaagtg | 2220 |
ctctctggat | ttgagttgaa | gagcatccat | ttgagttgaa | ggccacaggg | cacaatgagc | 2280 |
tctcccttct | accaccagaa | agtccctggt | caggtctcag | gtagtgcggt | gtggctcagc | 2340 |
tgggttttta | attagcgcat | tctctatcca | acatttaatt | gtttgaaagc | ctccatatag | 2400 |
ttagattgtg | ctttgtaatt | ttgttgttgt | tgctctatct | tattgtatat | gcattgagta | 2460 |
ttaacctgaa | tgttttgtta | cttaaatatt | aaaaacactg | ttatcctaca | aaaaaaccct | 2520 |
caaaggctga | aaataaagaa | ggaagatgga | gacaccctct | gggggtcctc | tc | 2572 |
<210> 58 <211> 1324
<212> DNA <213> Homo sapiens | ||||||
<400> 58 | ||||||
ctttgcagtg | gatgeccttg | gcagggtgag | cccacaagga | gcaatggagc | agggcagcgg | 60 |
ccgcttggag | gacttccctg | tcaatgtgtt | ctccgtcact | ccttacacac | ccagcaccgc | 120 |
tgacatccag | gtgtccgatg | atgacaaggc | gggggccacc | ttgctcttct | caggcatctt | 180 |
tctgggactg | gtggggatca | cattcactgt | catgggctgg | atcaaatacc | aaggtgtctc | 240 |
PL 219 018 B1
105
ccactttgaa | tggacccagc | tccttgggcc | cgtcctgctg | tcagttgggg | tgacattcat | 300 |
cctgattgct | gtgtgcaagt | tcaaaatgct | ctcctgccag | ttgtgcaaag | aaagtgagga | 360 |
aagggtcccg | gactcggaac | agacaccagg | aggaccatca | tttgttttca | ctggcatcaa | 420 |
ccaacccatc | accttccatg | gggccactgt | ggtgcagtac | atccctcctc | cttatggttc | 480 |
tccagagcct | atggggataa | ataccagcta | cctgcagtct | gtggtgagcc | cctgcggcct | 540 |
cataacctct | ggaggggcag | cagccgccat | gtcaagtcct | cctcaatact | acaccatcta | 600 |
ccctcaagat | aactctgcat | ttgtggttga | tgagggctgc | ctttctttca | cggacggtgg | 660 |
aaatcacagg | cccaatcctg | atgttgacca | gctagaagag | acacagctgg | aagaggaggc | 720 |
ctgtgcctgc | ttctctcctc | ccccttatga | agaaatatac | tctctccctc | gctagaggct | 780 |
attctgatat | aataacacaa | tgctcagctc | agggagcaag | tgtttccgtc | attgttacct | 840 |
gacaaccgtg | gtgttctatg | ttgtaacctt | cagaagttac | agcagcgccc | aggcagcctg | 900 |
acagagatca | ttcaaggggg | gaaaggggaa | gtgggaggtg | caatttctca | gattggtaaa | 960 |
aattaggctg | ggctggggaa | attctcctcc | ggaacagttt | caaattccct | cgggtaagaa | 1020 |
atctcctgta | taaggttcag | gagcaggaat | ttcacttttt | catccaccac | cctccccctt | 1080 |
ctctgtagga | aggcattggt | ggctcaattt | taaccccagc | agccaatgga | aaaatcacga | 1140 |
cttctgagac | tttgggagtt | tccacagagg | tgagagtcgg | gtgggaagga | agcagggaag | 1200 |
agaaagcagg | cccagctgga | gatttcctgg | tggctgtcct | tggccccaaa | gcagactcac | 1260 |
taatcccaaa | caactcagct | gccatctggc | ctctctgagg | actctgggta | ccttaaagac | 1320 |
tata 1324 <210> 59 <211> 683 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 59 caggaaagtt cgtgctgcta ggcagaggaa ctgcagcttg ttggcaggtg aagggagcct | 60 |
gtttagctgt gtccagcaac aacttacgtg gtcctgcttg tgttccaggt gaagcgtctg | 120 |
gccgccgagc agaggaatca agacctgctc attctttcct cgggggatcc atccagcaat | 180 |
gacatcatct catgctgcca caaggacccc aagtctgggc tgctggggac cagccacgct | 240 |
ccccactgct cattccttca tcctagagac attctgactc tcctccgact gcgctgtgca | 300 |
caggcgtgac aagctctttt acatctcagt ctgcacaact tcaggcactt agcagattga | 360 |
106
PL 219 018 B1 tatgcatcca acaaatatrg attgaatatc tgctaaatac ccagtaatgt ttcatgagtg 420 attgggtgaa taaaggaatg ctggttcctt ctggccatat taactcctgc acaatactaa 480 gaaaaataaa ttgcactagc tgtggaataa tgtgaatccc aatgtcatct attgaaatat 540 tacctgacta ttaagaggta tttatttttg tatcttttct agcaaagtaa ataaaattct 600 taatacagca tatcccctta ttcacggggg gtatgttcca agacccccgg tggatgcctg 660 aaactatgga taataccaga tcc 683 <210> 60 <211> 914 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60
Met 1 | Gly Pro | Phe | Lys Ser ser Val 5 | Phe | ile Leu ile Leu 10 | Hi s | Leu 15 | Leu | |||||||
Glu | Gly | Ala | Leu | Ser | Asn | Ser | Leu | ile | Gin | Leu | Asn | Asn | Asn | Gly | Tyr |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Glu | Gly | Ile | Val | Val | Ala | Ile | Asp | Pro | Asn | Val | Pro | Glu | Asp | Gl u | Thr |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Leu | Ile | Gin | Gin | Ile | Lys | Asp | Met | Val | Thr | Gin | Ala | Ser | Leu | Tyr | Leu |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Phe | Glu | Ala | Thr | Gly | Lys | Arg | Phe | Tyr | Phe | tys | Asn | Va1 | Al a | Ile | Leu |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Ile | Pro | Glu | Thr | Trp | Lys | Thr | Lys | Ala | Asp | Tyr | val | Arg | Pro | Lys | Leu |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Glu | Thr | Tyr | Lys | Asn | Ala | Asp | Val | Leu | val | Al a | Glu | Ser | Thr | Pro | Pro |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Gly | Asn | Asp | Glu | Pro | Tyr | Thr | Glu | Gin | Met | Gly | Asn | cys | Gly | Glu | Lys |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Gly | Glu | Arg | ile | His | Leu | Thr | Pro | Asp | Phe | Ile | Ala | Gly | Lys | Lys | Leu |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Al a | Gl u | Tyr | Gly | Pro | Gin | Gly | Lys | Ala | Phe | val | Hi s | Glu | Trp | Ala | Hi s |
145 | 150 | 155 | 160 |
PL 219 018 B1
107
Leu Arg | Trp Gly val 165 | Phe | Asp | Glu | Tyr Asn 170 | Asn | Asp Glu | Lys | Phe 175 | Tyr | |||||
Leu | Ser | Asn | Gly | Arg | Ile | Gin | Ala | Val | Arg | cys | Ser | Ala | Gly | Ile | Thr |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Gly | Thr | Asn | val | val | Lys | Lys | Cys | Gin | Gly | Gly | Ser | Cys | Tyr | Thr | Lys |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Arg | cys | Thr | Phe | Asn | Lys | Val | Thr | Gly | Leu | Tyr | Glu | Lys | Gly | Cys | Glu |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Phe | val | Leu | Gin | Ser | Arg | Gin | Thr | Glu | Lys | Ala | Ser | Ile | Met | Phe | Ala |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Gin | Hi 5 | val | Asp | ser | Ile | val | Glu | Phe | cys | Thr | Glu | Gin | Asn | His | Asn |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Lys | Glu | Ala | Pro | Asn | Lys | Gin | Asn | Gin | Lys | cys | Asn | Leu | Arg | Ser | Thr |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
T rp | Glu | val | ile | Arg | Asp | Ser | Glu | Asp | Phe | Lys | tys | Thr | Thr | Pro | Met |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Thr | Thr | Gin | Pro | Pro | Asn | Pro | Thr | Phe | Ser | Leu | Leu | Gin | Ile | Gly | Gin |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Ile | Val | cys | Leu | val | Leu | Asp | Lys | ser | Gly | Ser | Met | Ala | Thr | Gly | |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Asn | Arg | Leu | Asn | Arg | Leu | Asn | Gin | Ala | Gly | Gin | Leu | Phe | Leu | Leu | Gin |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Thr | val | Glu | Leu | Gly | Ser | Trp | val | Gly | Met | val | Thr | Phe | Asp | Ser | Ala |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Ala | His | val | Gin | Ser | Glu | Leu | Ile | Gin | Ile | Asn | Ser | Gly | Ser | Asp | Arg |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Asp | Thr | Leu | Ala | Lys | Arg | Leu | pro | Ala | Ala | Ala | Ser | Gly | Gly | Thr | ser |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Ile | cys | ser | Gly | Leu | Arg | Ser | Al a | Phe | Thr | val | Ile | Arg | Lys | Lys | Tyr |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Pro | Thr | Asp | Gly | Ser | Glu | Ile | val | Leu | Leu | Thr | Asp | Gly | Glu | Asp | Asn |
108
PL 219 018 B1
405 | |||||||
Thr | Ile | Ser | Gly 420 | Cys | Phe | Asn | Glu |
Hi s | Thr | val 435 | Ala | Leu | Gly | Pro | Ser 440 |
Ser | Lys 450 | Met | Thr | Gly | Gly | Leu 455 | Gin |
Asn 465 | Asn | Gly | Leu | ile | Asp 470 | Ala | Phe |
Ala | val | Ser | Gin | Arg 485 | ser | ile | Gin |
Gin | Asn | Ser | Gin 500 | Trp | Met | Asn | Gly |
Gly | Lys | ASp 515 | Thr | Leu | phe | Leu | li e 520 |
Ile | Leu 530 | Leu | Trp | Asp | Pro | Ser 535 | Gly |
Asp 545 | Lys | Asn | Thr | Lys | Met 550 | Ala | Tyr |
val | Gly | Thr | Trp | Lys 565 | Tyr | Ser | Leu |
Leu | Thr | Val | Thr 580 | Ser | Arg | Al a | Ser |
val | Thr | ser 595 | Lys | Thr | Asn | Lys | ASp 600 |
val | val 610 | Tyr | Al a | Asn | Ile | Arg 615 | Gin |
Ser 625 | val | Thr | Ala | Leu | Ile 630 | Glu | ser |
Glu | Leu | Leu | Asp | Asn | Gly | Al a | Gly |
645
410 | 415 | ||||||
val 425 | Lys | Gin | ser | Gly | Al a 430 | ile | Ile |
Ala | Al a | Gin | Glu | Leu 445 | Glu | Glu | Leu |
Thr | Tyr | Ala | Ser 460 | Asp | Gin | val | Gin |
Gly | Ala | Leu 475 | Ser | Ser | Gly | Asn | Gly 480 |
Leu | Glu 490 | Ser | Lys | Gly | Leu | Thr 495 | Leu |
Thr 505 | val | Ile | val | Asp | Ser 510 | Thr | val |
Thr | Trp | Thr | Thr | Gin 525 | Pro | Pro | Gin |
Gin | Lys | Gin | Gly 540 | Gly | Phe | Val | Val |
Leu | Gin | ile 555 | Pro | Gly | Ile | Ala | Lys 560 |
Gin | Ala 570 | ser | Ser | Gin | Thr | Leu 575 | Thr |
Asn 585 | Ala | Thr | Leu | Pro | Pro 590 | ile | Thr |
Thr | Ser | Lys | Phe | Pro 605 | Ser | pro | Leu |
Gly | Ala | Ser | Pro 620 | ile | Leu | Arg | Ala |
Val | Asn | Gly 635 | Lys | Thr | val | Thr | Leu 640 |
Ala | Asp 650 | Al a | Thr | Lys | Asp | Asp 655 | Gly |
PL 219 018 B1
109
Val | Tyr | Ser | Arg 660 | Tyr | Phe Thr Thr Tyr Asp Thr Asn Gly Arg Tyr Ser | ||||||||
665 | 670 | ||||||||||||
Val | Lys | Val 675 | Arg | Ala | Leu | Gly | Gly 680 | val | Asn | Ala Ala Arg 685 | Arg | Arg | Val |
Ile | pro | Gin | Gin | Ser | Gly | Ala | Leu | Tyr | ile | Pro Gly Trp | ile | Glu | Asn |
690 | 695 | 700 | |||||||||||
Asp | Glu | Ile | Gin | Trp | Asn | Pro | Pro | Arg | Pro | Glu ile Asn | Lys | Asp | Asp |
705 | 710 | 715 | 720 | ||||||||||
val | Gin | Hi s | Lys | Gin | val | Cys | Phe | Ser | Arg | Thr ser Ser | Gly | Gly | Ser |
725 | 730 | 735 | |||||||||||
Phe | val | Al a | Ser | Asp | Val | Pro | Asn | Ala | Pro | ile Pro Asp | Leu | Phe | Pro |
740 | 745 | 750 | |||||||||||
Pro | Gly | Gin | ile | Thr | Asp | Leu | Lys | Ala | Glu | Ile His Gly | Gly | ser | Leu |
755 | 760 | 765 | |||||||||||
Ile | Asn | Leu | Thr | Trp | Thr | Ala | Pro | Gly | Asp | Asp Tyr Asp | His | Gly | Thr |
770 | 775 | 780 | |||||||||||
Al a | Hi s | Lys | Tyr | ile | Ile | Arg | ile | Ser | Thr | Ser ile Leu | Asp | Leu | Arg |
785 | 790 | 795 | 800 | ||||||||||
ASp | Lys | Phe | Asn | Glu | Ser | Leu | Gin | Val | Asn | Thr Thr Ala | Leu | Ile | Pro |
805 | 810 | 815 | |||||||||||
Lys | Glu | Ala | Asn | Ser | Glu | Glu | val | Phe | Leu | Phe Lys Pro | Glu | Asn | Ile |
820 | 825 | 830 | |||||||||||
Thr | Phe | Glu | Asn | Gly | Thr | Asp | Leu | Phe | Ile | Ala Ile Gin | Al a | Val | Asp |
835 | 840 | 845 | |||||||||||
Lys | val | Asp | Leu | Lys | Ser | Glu | Ile | Ser | Asn | Ile Ala Arg | Val | Ser | Leu |
850 | 855 | 860 | |||||||||||
Phe | Ile | Pro | Pro | Gin | Thr | Pro | Pro | Glu | Thr | Pro ser Pro | Asp | Glu | Thr |
865 | 870 | 875 | 880 | ||||||||||
Ser | Ala | Pro | Cys | pro | Asn | Ile | His | Ile | Asn | Ser Thr Ile | Pro | Gly | Ile |
885 | 890 | 895 | |||||||||||
Hi S | Ile | Leu | Lys | Ile | Met | Trp | Lys | Trp | ile | Gly Glu Leu | Gin | Leu | Ser |
900 905 910
110
PL 219 018 B1
Ile Ala
<210> | 61 |
<211> | 501 |
<212> | PRT |
<213> | Homo |
<400> | 61 |
Met 1 | Lys | Lys | Glu | Gly 5 | Arg Lys | Arg Trp Lys Arg Lys Glu Asp Lys | Lys | ||||||||
10 | 15 | ||||||||||||||
Arg | val | val | val | Ser | Asn | Leu | Leu | Phe | Glu | Gly | T rp | ser | His | Lys | Glu |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Asn | Pro | Asn | Arg | His | Hi s | Arg | Gly | Asn | Gin | ile | Lys | Thr | Ser | Lys | Tyr |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Thr | val | Leu | Ser | Phe | val | Pro | Lys | Asn | Ile | Phe | Glu | Gin | Leu | Hi s | Arg |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Phe | Al a | Asn | Leu | Tyr | phe | val | Gly | Ile | Ala | val | leu | Asn | Phe | Ile | Pro |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
val | val | Asn | Ala | Phe | Gin | Pro | Glu | val | Ser | Met | ile | Pro | ile | cys | val |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Ile | Leu | Ala | val | Thr | Ala | Ile | Lys | Asp | Ala | Trp | Glu | Asp | Leu | Arg | Arg |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Tyr | Lys | ser | Asp | Lys | val | ile | Asn | Asn | Arg | Glu | Cys | Leu | ile | Tyr | Ser |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Arg | Lys 130 | Gl u | Gl n | Thr | Tyr | Val 135 | Gin | Ly s | Cys | Trp | Lys 140 | Asp | val | Arg | Val |
Gly | ASp | Phe | Ile | Gin | Met | Lys | Cys | Asn | Glu | Ile | Val | pro | Ala | Asp | ile |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Leu | Leu | Leu | Phe | Ser | Ser | Asp | Pro | Asn | Gly | Ile | Cys | His | Leu | Glu | Thr |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Ala | Ser | Leu | Asp | Gly | Glu | Thr | Asn | Leu | Lys | Gin | Arg | Arg | Val | Val | Lys |
180 | 185 | 190 |
PL 219 018 B1
111
Gly Phe | Ser Gin 195 | Gin | Glu val | Gin phe Glu Pro Glu Leu Phe | Hi s | Asn | |||||||||
200 | 205 | ||||||||||||||
Thr | Ile | Val | Cys | Glu | Lys | Pro | Asn | Asn | Hi s | Leu | Asn | Lys | phe | Lys | Gly |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Tyr | Met | Glu | Hi s | Pro | Asp | Gin | Thr | Arg | Thr | Gly | Phe | Gly | cys | Glu | ser |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Leu | Leu | Leu | Arg | Gly | Cys | Thr | Ile | Arg | Asn | Thr | Glu | Met | Ala | val | Gly |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Ile | Val | ile | Tyr | Ala | Gly | His | Glu | Thr | Lys | Al a | Met | Leu | Asn | Asn | Ser |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Gly | Pro | Arg | Tyr | Lys | Arg | Ser | Lys | ile | Gl u | Arg | Arg | Met | Asn | ile | Asp |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Ile | Phe | Phe | cys | Ile | Gly | ile | Leu | ile | Leu | Met | cys | Leu | Ile | Gly | Ala |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
val | Gly | Hi s | Ser | Ile | Trp | Asn | Gly | Thr | Phe | Glu | Glu | Hi s | Pro | Pro | Phe |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Asp | val | Pro | Asp | Ala | Asn | Gly | Ser | phe | Leu | Pro | Ser | Ala | Leu | Gly Gly | |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Phe | Tyr | Met | Phe | Leu | Thr | Met | ile | ile | Leu | Leu | Gin | val | Leu | Ile | Pro |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
ile | Ser | Leu | Tyr | Val | ser | ile | Glu | Leu | val | Lys | Leu | Gly | Gin | val | Phe |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Phe | Leu | Ser | Asn | Asp | Leu | Asp | Leu | Tyr | ASp | Glu | Glu | Thr | Asp | Leu | Ser |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
ile | Gin | cys | Arg | Ala | Leu | Α5Π | ile | Ala | Glu | Asp | Leu | Gly | Gl n | ile | Gin |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Tyr | Ile | Phe | Ser | Asp | Lys | Thr | Gly | Thr | Leu | Thr | Glu | Asn | Lys | Met | Val |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Phe | Arg | Arg | Cys | Thr | ile | Met | Gly | Ser | Glu | Tyr | ser | His | Gin | Gl u | Asn |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Gly | Ile | Gl u | Ala | Pro | Lys | Gly | Ser | ile | Pro | Leu | Ser | Lys | Arg | Lys | Tyr |
112
PL 219 018 B1
435 | 440 | 445 | ||||||||||||
Pro Ala 450 | Leu | Leu | Arg | Asn | Glu 455 | Glu | ile | Lys | Asp | ile 460 | Leu | Leu | Ala | Leu |
Leu Glu 465 | Ala | Val | Trp | Hi s 470 | Phe | HI s | Lys | Leu | Leu 475 | Pro | val | Ser | Leu | Trp 480 |
Ser ser | Leu | Ser | Gin 485 | ile | Arg | Ala | val | Pro 490 | Ile | Thr | cys | Lys | Leu 495 | Ser |
Phe Val | Tyr | Lys 500 | Gly | |||||||||||
<210> i | 52 | |||||||||||||
<211> . | 154 | |||||||||||||
<212> l | PRT | |||||||||||||
<213> 1 | Homo | sapi ens | ||||||||||||
<400> 1 | 52 | |||||||||||||
Met Gly 1 | Arg | Arg | Ser 5 | Pro | Phe | Lys | Pro | Arg 10 | Asn | Lys | val | Phe | Gly 15 | Phe |
ser Tyr | Pro | Trp 20 | Cys | Arg | Ser | Tyr | Gin 25 | Pro | Phe | Pro | Arg | Lys 30 | Arg | Ala |
Trp Pro | Pro 35 | Ser | Arg | Val | Trp | Leu 40 | Gly | Ala | Cys | cys | Ala 45 | Ser | Leu | Ala |
Ser Pro 50 | Pro | Lys | Gly | Thr | Ile 55 | Pro | Ser | Gly | Glu | Tyr 60 | Tyr | Arg | Pro | Ala |
Pro ser 65 | Ser | Ser | Gly | Asp 70 | Ser | Leu | Arg | Arg | Glu 75 | Ser | Gly | Ala | Leu | Leu 80 |
Gin Tyr | Leu | Pro | ser 85 | Leu | Ala | Ser | Pro | Cys 90 | Ala | Asn | His | Ala | Thr 95 | Arg |
cys Ser | Leu | Leu 100 | Phe | Pro | Ile | Tyr | Lys 105 | ile | Lys | Met | Thr | Leu 110 | Leu | Tyr |
Leu Thr | Gly 115 | Leu | Ala | Arg | Thr | His 120 | Cys | Cys | Cys | Leu | Ala 125 | ASp | Arg | cys |
PL 219 018 B1
113
Ala Glu Ala val Glu ser Ala | Phe Tyr Leu val | Gly Ser Leu 140 | Cys | Ile | |||||||||||
130 | 135 | ||||||||||||||
Asn | Ala Arg | Gly Ala | Ala | His | Leu | Thr | ASp | ||||||||
145 | 150 | ||||||||||||||
<210> 63 | |||||||||||||||
<211> 484 | |||||||||||||||
<212> PRT | |||||||||||||||
<213> Homo | sapiens | ||||||||||||||
<400> 63 | |||||||||||||||
Met | Ala | Gly | Pro | Trp | Thr | Phe | Thr | Leu | Leu | cys | Gly | Leu | Leu | Ala | Ala |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Thr | Leu | Ile | Gin | Ala | Thr | Leu | ser | Pro | Thr | Ala | Val | Leu | Ile | Leu | Gly |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Pro | Lys | Val | Ile | Lys | Glu | Lys | Leu | Thr | Gin | Glu | Leu | Lys | Asp | His | Asn |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Ala | Thr | ser | Ile | Leu | Gin | Gin | Leu | Pro | Leu | Leu | Ser | Ala | Met | Arg | Glu |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Lys | Pro | Ala | Gly | Gly | ile | Pro | val | Leu | Gly | Ser | Leu | val | Asn | Thr | val |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Leu | Lys | His | Ile | Ile | Trp | Leu | Lys | val | Ile | Thr | Ala | Asn | Ile | Leu | Gin |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Leu | Gin | val | Lys | pro | ser | Ala | Asn | Asp | Gin | Glu | Leu | Leu | val | Lys | Ile |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Pro | Leu | Asp | Met | val | Ala | Gly | Phe | Asn | Thr | Pro | Leu | val | Lys | Thr | ile |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Val | Glu | Phe | His | Met | Thr | Thr | Glu | Ala | Gin | Ala | Thr | Ile | Arg | Met | Asp |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Thr | Ser | Ala | Ser | Gly | Pro | Thr | Arg | Leu | val | Leu | ser | Asp | Cys | Ala | Thr |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Ser | His | Gly | ser | Leu | Arg | ile | Gin | Leu | Leu | Hi s | Lys | Leu | ser | Phe | Leu |
165 170 175
114
PL 219 018 B1
val | ASO | Ala Leu 180 | Ala | Lys Gin val | Met Asn 185 | Leu | Leu | Val | Pro 190 | Ser | Leu | ||||
pro | Asn | Leu | val | Lys | Asn | Gin | Leu | Cys | Pro | Val | ile | Glu | Ala | Ser | Phe |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Asn | Gly | Met | Tyr | Ala | Asp | Leu | teu | Gin | Leu | Val | Lys | val | Pro | ile | Ser |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Leu | Ser | Ile | Asp | Arg | Leu | Glu | Phe | Asp | Leu | Leu | Tyr | pro | Al a | ile | Lys |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Gly | Asp | Thr | Ile | Gin | Leu | Tyr | Leu | Gly | Ala | Lys | Leu | Leu | Asp | Ser | Gin |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Gly | Lys | Val | Thr | Lys | Trp | Phe | Asn | Asn | Ser | Ala | Al a | Ser | Leu | Thr | Met |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Pro | Thr | Leu | ASp | Asn | Ile | Pro | Phe | Ser | Leu | ll e | Val | Ser | Gin | Asp | val |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
val | Lys | Ala | Ala | val | Ala | Ala | val | Leu | Ser | Pro | Glu | Glu | Phe | Met | Val |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Leu | Leu | Asp | ser | Val | Leu | pro | Glu | Ser | Ala | Hi s | Arg | Leu | Lys | Ser | Ser |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Ile | Gl y | Leu | Ile | Asn | Glu | Lys | Ala | Ala | Asp | Lys | Leu | Gly | ser | Thr | Gin |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Ile | Val | Lys | Ile | Leu | Thr | Gin | ASP | Thr | Pro | Glu | Phe | Phe | Ile | Asp | Gin |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Gly | Hi s | Ala | Lys | Val | Ala | Gin | Leu | Ile | val | Leu | Glu | val | Phe | Pro | Ser |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Ser | Glu | Ala | Leu | Arg | Pro | Leu | Phe | Leu | Gly | Ile | Glu | Ala | Ser | Ser | |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Glu | Ala | Gin | Phe | Tyr | Thr | Lys | Gly | ASp | Gin | Leu | ile | Leu | Asn | Leu | Asn |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Asn | ile | ser | ser | ASp | Arg | ile | Gin | Leu | Met | Asn | Ser | Gly | Ile | Gly | Trp |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Phe | Gin | Pro | Asp | Val | Leu | Lys | Asn | Ile | Ile | Thr | Glu | Ile | ile | Hi s | Ser |
420 | 425 | 430 |
PL 219 018 B1
115
ile | Leu Leu 435 | Pro Asn | Gin Asn Gly 440 | Lys | Leu Arg | Ser | Gly 445 | val | Pro | Val | |||||
Ser | Leu | Val | Lys | Ala | Leu | Gly | Phe | Glu | Ala | Ala | Glu | ser | ser | Leu | Thr |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
Lys | Asp | Ala | Leu | Val | Leu | Thr | Pro | Ala | Ser | Leu | Trp | Lys | Pro | Ser | Ser |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Pro | val | Ser | Gin |
<210> | 64 |
<213> | 256 |
<212> | PRT |
<213> | Homo |
<400> 64
Met 1 | Phe | Gin | Thr | Gly 5 | Gly Leu ile | val | Phe Tyr Gly 10 | Leu | Leu | Ala 15 | Gin | ||||
Thr | Met | Ala | Gin | Phe | Gly | Gly | Leu | Pro | val | Pro | Leu | ASP | Gin | Thr | Leu |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Pro | Leu | Asn | val | Asn | Pro | Ala | Leu | Pro | Leu | Ser | Pro | Thr | Gly | Leu | Ala |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Gly | Ser | Leu | Thr | Asn | Ala | Leu | Ser | Asn | Gly | Leu | Leu | ser | Gly Gly | Leu | |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Leu | Gly | ile | Leu | Glu | Asn | Leu | pro | Leu | Leu | ASp | ile | Leu | Lys | Pro | Gly |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Gly | Gly | Thr | ser | Gly Gly | Leu | Leu | Gly | Gly | Leu | Leu | Gly | Lys | val | Thr | |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Ser | Val | ile | Pro | Gly | Leu | Asn | Asn | Ile | Ile | ASp | li 6 | Lys | val | Thr | Asp |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Pro | Gin | Leu | Leu | Glu | Leu | Gly | Leu | val | Gin | Ser | Pro | Asp | Gly | His | Arg |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Leu | Tyr | val | Thr | ile | Pro | Leu | Gly | ile | Lys | Leu | Gin | val | Asn | Thr | Pro |
116
PL 219 018 B1
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Leu | val | Gly | Ala | Ser | Leu | Leu | Arg | Leu | Ala | Val | Lys | Leu | Asp | ile | Thr |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Ala | Glu | Ile | Leu | Ala | val | Arg | ASp | Lys | Gin | Glu | Arg | ile | His | Leu | val |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Leu | Gly | Asp | Cys | Thr | His | Ser | Pro | Gly | ser | Leu | Gin | Ile | Ser | Leu | Leu |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Asp | Gly | Leu | Gly | Pro | Leu | Pro | ile | Gin | Gly | Leu | Leu | Asp | Ser | Leu | Thr |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Gly | ile | Leu | Asn | Lys | val | Leu | Pro | Glu | Leu | val | Gin | Gly | Asn | val | cys |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Pro | Leu | val | Asn | Glu | val | Leu | Arg | Gly | Leu | Asp | U e | Thr | Leu | val | His |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
ASp | ile | val | Asn | Met | Leu | Ile | Hi s | Gly | Leu | Gin | Phe | Val | Ile | Lys | val |
245 250 255
<210> | 65 |
<211> | 791 |
<212> | PRT |
<213> | Homo |
<400> | 65 |
Met | ser | Gin | Pro | Arg | ΡΓΟ | Arg | Tyr | Val | val | ASp | Arg | Ala | Ala | Tyr | Ser |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Leu | Thr | Leu | Phe | Asp | Asp | Glu | Phe | Glu | Lys | Lys | Asp | Arg | Thr | Tyr | Pro |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
val | Gly | Glu | Lys | Leu | Arg | Asn | Ala | phe | Arg | cys | Ser | Ser | Ala | Lys | Ile |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Lys | Ala | val | Val | Phe | Gly | Leu | Leu | Pro | val | Leu | Ser | Trp | Leu | pro | Lys |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Tyr | Lys | Ile | Lys | Asp | Tyr | ile | Ile | Pro | Asp | Leu | Leu | Gly | Gly | Leu | Ser |
65 | 70 | 75 | 80 |
PL 219 018 B1
117
Gly | Gly | Ser | ile | Gin 85 | Val | pro | Gl n |
Asn | Leu | Pro | Ala 100 | val | Asn | Gly | Leu |
Thr | Tyr | Phe 115 | Phe | Leu | Gly Gly | val 120 | |
Ala | val 130 | ile | Ser | ile | Leu | Val 13 5 | Gly |
Glu 145 | Ser | Lys | Phe | Gin | Val 150 | Phe | Asn |
Asp | Thr | Ala | Ala | Met 165 | Glu | Ala | Gl u |
Ala | cys | Leu | Thr 180 | Ala | Ile | Ile | Gin |
Gly | Phe | val 195 | Ala | ile | Tyr | Leu | Ser 200 |
Thr | Ala 210 | Ala | Gly | Leu | Gin | Ile 215 | Leu |
Gly 225 | Leu | Thr | Ile | Pro | Ser 230 | Tyr | Thr |
Phe | ile | Asp | ile | cys 245 | Lys | Asn | Leu |
Ile | phe | Ala | Leu 260 | Ile | Ser | Gly | Ala |
Asn | Ala | Arg 275 | Tyr | Met | Hi s | L,y s | Il e 280 |
ile | val 290 | Val | Val | Val | Ala | Thr 295 | Ala |
Lys 305 | Lys | Tyr | His | Met | Gin 310 | il e | val |
Thr | Pro | val | Ser | pro | val | val | Ser |
325
Met Ala Phe Ala Leu Leu Ala | ||||||
90 | 95 | |||||
Ser | Ser | Phe | Phe | Pro 110 | Leu | Leu |
Gin | Met | Val | Pro 125 | Gly | Thr | Phe |
Ile | Cys | Leu 140 | Gin | Leu | Ala | Pro |
Ala | Thr 155 | Asn | Glu | Ser | Tyr | Val 160 |
Leu 170 | Hi s | Val | ser | Al a | Thr 175 | Leu |
Gly | Leu | Gly | Phe | Met 190 | Gin | Phe |
Ser | Phe | ile | Arg 205 | Gly | Phe | Met |
Ser | val | Leu 220 | Lys | Tyr | ile | Phe |
Pro | Gly 235 | Ser | ile | Val | Phe | Thr 240 |
His 250 | Thr | Asn | ile | Ala | Ser 255 | Leu |
Leu | val | Leu | val | Lys 270 | Glu | Leu |
Phe | Pro | Ile | Pro 285 | Thr | Glu | Met |
Ser | Gly Gly 300 | Cys | Lys | Met | Pro | |
Glu | Ile 315 | Gin | Arg | Gly | Phe | ΡΓΟ 320 |
Trp 330 | Lys | Asp | Met | Ile | Gly 335 | Thr |
118
PL 219 018 B1
Ala Phe Ser Leu 340 | Ala ile Val | Ser Tyr val 345 | ile | Asn | Leu | Ala 3 50 | Met | Gly | |||||||
Arg | Thr | Leu | Ala | Asn | Lys | His | Gly | Tyr | Asp | va1 | Asp | Ser | Asn | Gin | Glu |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Met | Ile | Ala | Leu | Gly | Cys | Γ | Asn | Phe | Phe | Gly | Ser | Phe | Phe | Lys | ile |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Hi s | val | Ile | Cys | Cys | Ala | Leu | Ser | val | Thr | Leu | Ala | val | Asp | Gly | Ala |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Gly Gly | Lys | Ser | Gin | val | Ala | Ser | Leu | cys | val | Ser | Leu | val | val | Met | |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
ile | Thr | Met | Leu | val | Leu | Gly | ile | Tyr | Leu | Tyr | Pro | Leu | Pro | Lys | Ser |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
val | Leu | Gly | Ala | Leu | Ile | Ala | Val | Asn | Leu | Lys | Asn | Ser | Leu | Lys | Gin |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Leu | Thr | ASp | Pro | Tyr | Tyr | Leu | Trp | Arg | Lys | Ser | Lys | Leu | Asp | Cys | Cys |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
ile | Trp | val | val | Ser | Phe | Leu | Ser | Ser | Phe | Phe | Leu | Ser | Leu | Pro | Tyr |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Gly | Val | Ala | val | Gly | val | Ala | Phe | Ser | val | Leu | val | val | val | Phe | Gin |
485 | 490 | 495 | |||||||||||||
Thr | Gin | Phe | Arg | Asn | Gly | Tyr | Al a | Leu | Ala | g! π | val | Met | Asp | Thr | ASp |
500 | 505 | 510 | |||||||||||||
ile | Tyr | Val | Asn | Pro | Lys | Thr | Tyr | Asn | Arg | Ala | Gin | Asp | Ile | Gin | Gly |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
ile | Lys | ile | ile | Thr | Tyr | cys | Ser | Pro | Leu | Tyr | Phe | Ala | Asn | Ser | Glu |
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
Ile | Phe | Arg | Gin | Lys | val | ile | Ala | Lys | Thr | Gly | Met | Asp | Pro | Gin | Lys |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
val | Leu | Leu | Ala | Lys | Gin | Lys | Tyr | Leu | Lys | Lys | Gin | Gl u | Lys | Arg | Arg |
565 | 570 | 575 | |||||||||||||
Met | Arg | Pro | Thr | Gin | Gin | Arg | Arg | Ser | Leu | Phe | Met | Lys | Thr | Lys | Thr |
580 585 590
PL 219 018 B1
119
val | Ser | Leu 595 | Gin | Glu | Leu | Gin | Gin 600 |
Asp | Pro 610 | Asn | Asn | Asn | Gin | Thr 615 | Pro |
Ile 625 | Thr | Phe | Ser | Pro | Asp 630 | Ser | Ser |
Ala | Ser | Al a | Glu | Ala 645 | Pro | Gly | Glu |
Pro | Pro | Phe | val 660 | Thr | Phe | Hi s | Thr |
Ser | Phe | val 675 | Asp | Leu | Met | Gly | ile 680 |
Thr | Tyr 690 | Gly | Lys | Ile | Gly | Val 695 | Lys |
Gin 705 | val | Tyr | Asn | Asp | ile 710 | Ser | Hi s |
Leu | Glu | Cys | Lys | His 725 | val | Phe | Pro |
Ala | Gin | Al a | Asn 740 | Ala | Arg | Asp | val |
Ala | Pro | Gly 755 | Asp | Ala | Glu | Leu | Ser 760 |
Arg | Ser 770 | Tyr | Trp | Asp | Leu | Glu 775 | Gin |
Ala 785 | Glu | Thr | Leu | Thr | Ala 790 | Leu |
Asp Phe Glu Asn Ala Pro Pro Thr 605
Ala Asn Gly Thr ser val ser Tyr 620 ser Pro Ala Gin Ser Glu Pro Pro 635 640
Pro Ser Asp Met Leu Ala ser val 650 655
Leu Ile Leu Asp Met Ser Gly val 665 670
Lys Ala Leu Ala Lys Leu Ser Ser 685
Val Phe Leu Val Asn ile His Ala 700
Gly Gly Val Phe Glu Asp Gly Ser 715 720
Ser Ile His Asp Ala val Leu Phe 730 735
Thr Pro Gly His Asn Phe Gin Gly 745 750
Leu Tyr Asp ser Glu Glu Asp Ile 765
Glu Met Phe Gly Ser Met Phe His 780 <210> 66 <211> 243 <212> PRT <213> Homo sapiens
120
PL 219 018 B1 <400> 66
Met | Glu | Gl n | Gly | Ser | Gly | Arg | Leu | Glu | Asp | Phe Pro | val | Asn | val | Phe |
1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
Ser | Val | Thr | Pro | Tyr | Thr | Pro | Ser | Thr | Al a | Asp Ile | Gin | val | ser | Asp |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||
Asp | Asp | Lys | Ala | Gly | Ala | Thr | Leu | Leu | Phe | Ser Gly | Ile | Phe | Leu | Gly |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||
Leu | val | Gly | Ile | Thr | Phe | Thr | val | Met | Gly | Trp Ile | Lys | Tyr | Gin | Gly |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||
val | Ser | His | Phe | Glu | Trp | Thr | Gin | Leu | Leu | Gly Pro | val | Leu | Leu | Ser |
65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||
val | Gly | val | Thr | Phe | II e | Leu | ile | Al a | val | Cys Lys | Phe | Lys | Met | Leu |
85 | 90 | 95 | ||||||||||||
ser | Cys | Gin | Leu | cys | Lys | Glu | Ser | Glu | Glu | Arg val | Pro | ASp | Ser | Glu |
100 | 105 | 110 | ||||||||||||
Gin | Thr | Pro | Gly | Gly | pro | Ser | Phe | Val | Phe | Thr Gly | Ile | Asn | Gin | Pro |
115 | 120 | 125 | ||||||||||||
Ile | Thr | Phe | Hi s | Gly | Ala | Thr | Val | val | Gin | Tyr Ile | Pro | Pro | Pro | Tyr |
130 | 135 | 140 | ||||||||||||
Gly | Ser | Pro | Glu | Pro | Met | Gly | Ile | Asn | Thr | Ser Tyr | Leu | Gin | Ser | val |
145 150 155 160
Val | ser | Pro cys | Gl y | Leu | Ile | Thr | Ser | Gly | Gly | Al a | Ala | Ala | Al a | Met |
165 | 170 | 175 | ||||||||||||
Ser | Ser | Pro Pro | Gin | Tyr | Tyr | Thr | Ile | Tyr | Pro | Gin | ASp | Asn | Ser | Al a |
180 185 190
Phe Val | Val 195 | Asp | Glu | Gly | Cys Leu Ser phe Thr Asp Gly Gly Asn | His | |||||||||
200 | 205 | ||||||||||||||
Arg | Pro | Asn | pro | Asp | val | ASp | Gin | Leu | Glu | Glu | Thr | Gin | Leu | Glu | Glu |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Glu | Ala | cys | Ala | Cys | Phe | Ser | Pro | Pro | Pro | Tyr | Glu | Glu | ile | Tyr | Ser |
225 | 230 | 235 | 240 |
PL 219 018 B1
121
Leu Pro Arg <210> 67 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 67 acacgaatgg tagatacagt g 21
<210> | 68 |
<211> | 21 |
<212> | DNA |
<2T3 > | Sztuczna sekwencja |
<220> | |
<223> | Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd |
<400> 68 atacttgtga gctgttccat g 21
<210> | 69 |
<211> | 21 |
<212> | DNA |
<213> | Sztuczna sekwencja |
<22O> <223'> | Opisanie sztucznej sekwencji; Oligonukleotyd |
<400> | 69 |
actgttacct tgcatggact g 21 <210> 70 <211> 21 <212> DNA
122
PL 219 018 B1 <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 70 caatgagaac acatggacat g <210> 71 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22O>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 71 ccatgaaagc tccatgtcta c
<210> | 72 |
<211> | 21 |
<212> | DNA |
<213> | Sztuczna sekwencja |
<22O> |
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 72 agagatggca catattctgt c <210> 73 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd
PL 219 018 B1
123 <400> 73 atcggctgaa gtcaagcatc g <210> 74 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22O>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 74 tggtcagtga ggactcagct g <210> 75 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22O>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 75 tttctctgct tgatgcactt g <210> 76 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztuczneg sekwencji: Oligonukleotyd <400> 76 gtgagcactg ggaagcagct c <210> 77 <211> 21 <212> DNA
124
PL 219 018 B1 <213* Sztuczna sekwencja
7fK <223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400* 77 ggcaaatgct agagacgtga c <210* 78 <211* 21 <212* DNA <213> Sztuczna sekwencja <220* <223* Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400* 78 aggtgtcctt cagctgccaa g <210* 79 <211* 21 <212* DNA <213* Sztuczna sekwencja <220* <223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400* 79 gttaagtgct ctctggattt g <210* 80 <211* 21 <212* DNA <213* Sztuczna sekwencja <220* <223* Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd
PL 219 018 B1
125
<400> | 80 | |
atccrgattg ctgtgtgcaa g | 21 | |
<210> | 81 | |
<211> | 21 | |
<212> | DNA | |
<213> | Sztuczna sekwencja | |
<220> <223> | Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd | |
<400> | 81 |
ctcttctagc tggtcaacat c 21
<210> | 82 | ||
<211> | 21 | ||
<212> | DNA | ||
<213> | Sztuczna sekwencja | ||
<223> | Opisanie sztucznej | sekwencji: Oligonukleotyd | |
<400> 82 ccagcaacaa cttacgtggt c | 21 | ||
<210> | 83 | ||
<211> | 21 | ||
<212> | DNA | ||
<213> | Sztuczna sekwencja | ||
<22O> <223> | Opisanie sztucznej | sekwencji: Oligonukleotyd | |
<400> 83 cctttattca cccaatcact c | 21 | ||
<210> | 84 | ||
<211> | 2165 | ||
<212> | DNA |
126
PL 219 018 B1 <213> Homo sapiens
<400> 84 agaacagcgc | agtttgccct | ccgctcacgc | agagcctctc | cgtggcctcc | gcaccttgag | 60 |
cattaggcea | gttctcctct | tctctctaat | ccatccgtca | cctctcctgt | catccgtttc | 120 |
catgccgtga | ggtccattca | cagaacacat | ccatggctct | catgctcagt | ttggttctga | 180 |
gtctcctcaa | gctgggatca | gggcagtggc | aggtgtttgg | gccagacaag | cctgtccagg | 240 |
ccttggtggg | ggaggacgca | gcattctcct | gtttcctgtc | tcctaagacc | aatgcagagg | 300 |
ccatggaagt | gcggttcttc | aggggccagt | tctctagcgt | ggtccacctc | tacagggacg | 360 |
ggaaggacca | gccatttatg | cagatgccac | agtatcaagg | caggacaaaa | ctggtgaagg | 420 |
attctattgc | ggaggggcgc | atctctctga | ggctggaaaa | cattactgtg | ttggatgctg | 480 |
gcctctatgg | gtgcaggatt | agttcccagt | cttactacca | gaaggccatc | tgggagctac | 540 |
aggtgtcagc | actgggctca | gttcctctca | tttccatcac | gggatatgtt | gatagagaca | 600 |
tccagctact | ctgtcagtcc | tcgggctggt | tcccccggcc | cacagcgaag | tggaaaggtc | 660 |
cacaaggaca | ggatttgtcc | acagactcca | ggacaaacag | agacatgcat | ggcctgtttg | 720 |
atgtggagat | ctctctgacc | gtccaagaga | acgccgggag | catatcctgt | tccatgcggc | 780 |
atgctcatct | gagccgagag | gtggaatcca | gggtacagat | aggagatacc | tttttcgagc | 840 |
ctatatcgtg | gcacctggct | accaaagtac | tgggaatact | ctgctgtggc | ctattttttg | 900 |
gcattgttgg | actgaagatt | ttcttctcca | aattccagtg | taagcgagag | agagaagcat | 960 |
gggccggtgc | cttattcatg | gttccagcag | ggacaggatc | agagatgctc | ccacatccag | 1020 |
ctgcttctct | tcttctagtc | ctagcctcca | ggggcccagg | cccaaaaaag | gaaaatccag | 1080 |
gcggaactgg | actggagaag | aaagcacgga | caggcagaat | tgagagacgc | ccggaaacac | 1140 |
gcagtggagg | tgactctgga | tccagagacg | gctcacccga | agctctgcgt | ttctgatctg | 1200 |
aaaactgtaa | cccatagaaa | agctccccag | gaggtgcctc | actctgagaa | gagatttaca | 1260 |
aggaagagtg | tggtggcttc | tcagagtttc | caagcaggga | aacattactg | ggaggtggac | 1320 |
ggaggacaca | ataaaaggtg | gcgcgtggga | gtgtgccggg | atgatgtgga | caggaggaag | 1380 |
gagtacgtga | ctttgtctcc | cgatcatggg | tactgggtcc | tcagactgaa | tggagaacat | 1440 |
ttgtatttca | cattaaatcc | ccgttttatc | agcgtcttcc | ccaggacccc | acctacaaaa | 1500 |
ataggggtct | tcctggacta | tgagtgtggg | accatctcct | tcttcaacat | aaatgaccag | 1560 |
tcccttattt | ataccctgac | atgtcggttt | gaaggcttat | tgaggcccta | cattgagtat | 1620 |
ccgtcctata | atgagcaaaa | tggaactccc | atagtcatct | gcccagtcac | ccaggaatca | 1680 |
gagaaagagg | cctcttggca | aagggcctct | gcaatcccag | agacaagcaa | cagtgagtcc | 1740 |
PL 219 018 B1
127 tcctcacagg caaccacgcc cttcctcccc aggggtgaaa tgtaggatga atcacatccc 1800 acattcttct ttagggatat taaggtctct ctcccagatc caaagtcccg cagcagccgg 1860 ccaaggtggc ttccagatga agggggactg gcctgtccac atgggagtca ggtgtcatgg 1920 ctgccctgag ctgggaggga agaaggctga cattacattt agtttgctct cactccatct 1980 ggctaagtga tcttgaaata ccacctctca ggtgaagaac cgtcaggaat tcccatctca 2040 caggctgtgg tgtagattaa gtagacaagg aatgtgaata atgcttagat cttattgatg 2100 acagagtgta tcctaatggt ttgttcatta tattacactt tcagtaaaaa aaaaaaaaaa 2160 aaaaa 2165 <210> 85 <211> 347 <212> PRT
<213> Hojno | sapi | ens | |||||||||||||
<400> 85 | |||||||||||||||
Met | Ala | Leu | Met | Leu | Ser | Leu | val | Leu | Ser | Leu | Leu | Lys | Leu | Gly | Ser |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Gly | Gin | Trp | Gin | Val | ,Phe | Gly | Pro | ASp | Lys | Pro | val | Gin | Ala | Leu | Val |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Gly | Glu | Asp | Ala | Ala | Phe | Ser | Cys | Phe | Leu | Ser | Pro | Lys | Thr | Asn | Ala |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Glu | Ala | Met | Glu | val | Arg | Phe | Phe | Arg | Gly | Gin | Phe | Ser | Ser | Val | val |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
His | Leu | Tyr | Arg | Asp | Gly | Lys | Asp | Gin | Pro | Phe | Met | Gin | Met | pro | Gin |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Tyr | Gin | Gly | Arg | Thr | Lys | Leu | Val | Lys | Asp | Ser | Ile | Ala | Glu | Gly | Arg |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Ile | ser | teu | Arg | Leu | Glu | Asn | ile | Thr | val | Leu | Asp | Al a | Gly | Leu | Tyr |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Gly | Cys | Arg | ile | Ser | ser | Gin | Ser | Tyr | Tyr | Gin | Lys | Ala | Ile | Trp | Glu |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Leu | Gin | Val | Ser | Ala | Leu | Gly | Ser | val | Pro | Leu | Ile | Ser | Ile | Thr | Gly |
128
PL 219 018 B1
130 135
Tyr 145 | Val | Asp | Arg Asp ile Gin Leu Leu 150 | Cys Gin Ser Ser Gly Trp Phe | |||||||||||
155 | 160 | ||||||||||||||
Pro | Arg | Pro | Thr | Al a | Lys | Trp | Lys | Gly | Pro | Gin | Gly | Gin | Asp | Leu | Ser |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Thr | Asp | ser | Arg | Thr | Asn | Arg | Asp | Met | His | Gly | Leu | Phe | Asp | val | Glu |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Ile | Ser | Leu | Thr | val | Gin | Glu | Asn | Ala | Gly | Ser | II e | Ser | cys | ser | Met |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Arg | Hi s | Ala | His | Leu | Ser | Arg | Glu | Val | Glu | Ser | Arg | val | Gin | Ile | Gly |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Asp | Thr | Phe | Phe | Glu | Pro | Ile | Ser | Trp | His | Leu | Al a | Thr | Lys | Val | Leu |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Gly | ile | Leu | Cys | Cys | Gly | Leu | Phe | Phe | Gly | Ile | val | Gly | Leu | Lys | Ile |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Phe | Phe | Ser | Lys 260 | Phe | Gin | cys | Lys | Arg 265 | Glu | Arg | Glu | Ala | Trp 270 | Ala | Gly |
Al a | Leu | Phe | Met | val | Pro | Ala | Gly | Thr | Gly | Ser | Glu | Met | Leu | Pro | His |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Pro | Ala | Ala | Ser | Leu | Leu | Leu | val | Leu | Ala | Ser | Arg | Gly | Pro | Gly | Pro |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Lys | Lys | Glu | Asn | Pro | Gly Gly | Thr | Gly | Leu | Glu | Lys | Lys | Ala | Arg | Thr | |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Gly | Arg | ile | Glu | Arg | Arg | Pro | Glu | Thr | Arg | Ser | Gly | Gly | Asp | Ser | Gly |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Ser | Arg | Asp | Gly | Ser | Pro | Glu | Ala | Leu | Arg | Phe |
340 345
<210> | 86 |
<211> | 21 |
<212> | DNA |
<213> | Sztuczna sekwencja |
PL 219 018 B1
129
<220> <223> | Opisanie sztucznej | sekwencji: | Oligonukleotyd |
<400> 86 attcatggtt ccagcaggga c | |||
<210> | 87 | ||
<211> | 21 | ||
<212> | DNA | ||
<213> | Sztuczna sekwencja | ||
<223> | Opisanie sztucznej | sekwencj i: | Oligonukleotyd |
<400> 87 gggagacaaa gtcacgtact c
<210> | 88 | |
<211> | 22 | |
<212> | DNA | |
<213> | Sztuczna sekwencja | |
<223> | Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd | |
<400> | 88 | |
tcctggtgtt cgtggtctgc tt | 22 | |
<210> | 89 | |
<211> | 22 | |
«-71 ?·> | DNA | |
<213> | Sztuczna sekwencja | |
<220> | ||
<223> | Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd > | |
<400> | 89 | |
gagagtcctg gcttttgtgg gc | 22 | |
<210> | 90 | |
<211> | 15 | |
<212> | PRT | |
<213> | Homo sapiens | |
<400> | 90 |
130
PL 219 018 B1
Gly ser ser Asp Leu Thr Trp Pro Pro Ala ile Lys Leu Gly cys 1 5 10 15 <210> 91 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91
Asp Arg Tyr Val Ala val Arg His Pro Leu Arg Ala Arg Gly Leu Ara 1 5 10 15 <210> 92 <2ll> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92
Val Ala Pro Arg Ala Lys Ala His Lys Ser Gin Asp Ser Leu cvs 1 5 10 15 <210> 93 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93
Cys Phe Arg ser Thę Arg His Asn Phe Asn ser Met Arg 1 5 10 <210> 94 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94
Met Asn Gly Thr Tyr Asn Thr Cys Gly ser Ser Asp Leu Thr Trp Pro 1 5 10 15
Pro Ala ile Lys Leu Gly <210> 95 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95
Arg Asp Thr Ser Asp Thr Pro Leu Cys Gin Leu ser Gin Glv
3-5 10
PL 219 018 B1
131
<210> | 96 |
<211> | 22 |
<212> | PRT |
<213> | Homo sapiens |
<400> 96
Gly ile Gin Glu Gly Gly Phe Cys Phe Arg ser Thr Arg His Asn Phe 15 10 15
Asn ser Met Arg Phe Pro 20 <210> 97 <211> 30 <212> prt <213> Homo sapiens <400> 97
Ala Lys Glu Phe Gin Glu Ala Ser Ala Leu Ala val Ala Pro Ara Ala 1 5 10 15
Lys Ala His Lys ser Gin Asp Ser Leu Cys val Thr Leu Ala 20 25 30 <210> 98 <211> 22 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd a <400> 98 tcctgctcgt cgctctcctg at 22 <210> 99 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<22 3> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd e <400> 99 tcgctttttg tcgtatttgc 20 <210> 100 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100
132
PL 219 018 B1
His Asn Gly Ser Tyr Glu Ile Ser val Leu Met Met Gly Asn ser 10 15 <210> 101 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 101
Asn Leu Pro Thr Pro Pro Thr val 1 5
Glu Asn Gin Gin Arg Leu Ala 10 15 <210> 102 <211> 619 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102
Arg 1 | Lys | Tyr | Arg | Lys 5 | Asp | Tyr | Glu |
Ile | Pro | Pro | Glu 20 | Asn | Ile | Phe | Pro |
val | Ser | Leu 35 | Lys | Ile | Asp | Asp | Asp 40 |
Leu | Arg 50 | Gin | cys | Lys | Tyr | Asp 55 | Lys |
Lys 65 | Hi s | Asn | Asp | Gly | Asn 70 | Phe | Thr |
Lys | Leu | Leu | Gin | Ile 85 | ASp | Tyr | Tyr |
val | Lys | Leu | Asp 100 | Thr | Met | ile | Phe |
Gly | Ser | Leu 115 | Arg | Glu | Val | Leu | Asn 120 |
Thr | Phe 130 | Met | Asp | Trp | Glu | Phe 135 | Lys |
Lys 145 | Gly | Met | Ser | Tyr | Leu 150 | Hi S | Ser |
Leu Arg Gin Lys Lys Trp Ser His 10 15
Leu Glu Thr Asn Glu Thr Asn His 25 30
Lys Arg Arg Asp Thr Ile Gin Arg 45
Lys Arg val ile Leu Lys Asp Leu 60
Glu Lys Gin Lys ile Glu Leu Asn 75 80
Asn Leu Thr Lys Phe Tyr Gly Thr 90 95
Gly val Ile Glu Tyr Cys Glu Arg 105 110
Asp Thr Ile Ser Tyr Pro Asp Gly 125
Ile Ser Val Leu Tyr Asp Ile Ala 140 ser Lys Thr Glu Va1 His Gly Arq 155 160
PL 219 018 B1
133
Leu Lys Ser | Thr Asn 165 | Cys | val val Asp Ser 170 | Arg | Met | val | val | Lys 175 | ile | ||||||
Thr | Asp | Phe | Gly 180 | cys | Asn | Ser | Ile | Leu 185 | Pro | Pro | Lys | Lys | Asp 190 | Leu | Trp |
Thr | Ala | Pro | Glu | HIS | Leu | Arg | Gin | Ala | Asn | ile | Ser | Gin | Lys | Gly | Asp |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Val | Tyr | Ser | Tyr | Gly | Ile | ile | Ala | Gin | Glu | ile | Ile | Leu | Arg | Lys | Glu |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Thr | Phe | Tyr | Thr | Leu | Ser | cys | Arg | ASp | Arg | Asn | Gl u | Lys | Ile | Phe | Arg |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Val | Glu | Asn | Ser | Asn | Gly | Met | Lys | Pro | Phe | Arg | Pro | Asp | Leu | Phe | Leu |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Gl u | Thr | Ala | Glu | Glu | Lys | Glu | Leu | Glu | Val | Tyr | Leu | Leu | Val | Lys | Asn |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
cys | Trp | Glu | Glu | Asp | Pro | Glu | Lys | Arg | Pro | Asp | Phe | Lys | Lys | ile | Gl u |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Thr | Thr | Leu | Ala | Lys | ile | Phe | Gly | Leu | Phe | HIS | Asp | Gin | Lys | Asn | Glu |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Ser | Tyr | Met | ASp | Thr | Leu | Ile | Arg | Arg | Leu | Gl n | Leu | Tyr | Ser | Arg | Asn |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Leu | Glu | Hi s | Leu | Val | Glu | Glu | Arg | Thr | Gin | Leu | Tyr | Lys | Ala | Glu | Arg |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Asp | Arg | Ala | Asp | Arg | Leu | Asn | Phe | Met | Leu | Leu | pro | Arg | Leu | Val | Val |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Lys | ser | Leu | Lys | Glu | Lys | Gly | Phe | val | Glu | Pro | Glu | Leu | Tyr | Glu | Glu |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
val | Thr | Ile | Tyr | Phe | Ser | ASP | Ile | Val | Gly | phe | Thr | Thr | Ile | Cys | Lys |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Tyr | 5er | Thr | Pro | Met | Glu | Val | Val | Asp | Met | Leu | Asn | Asp | ile | Tyr | Lys |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Ser | Phe | Asp | His | Ile | Val | Asp | Hi s | His | Asp | val | Tyr | Lys | val | Glu | Thr |
405 | 410 | 415 |
134
PL 219 018 B1
ile | Gly Asp | Ala 420 | Tyr Met | Val Ala Ser Gly Leu Pro Lys Arg Asn | Gly | ||||||||||
425 | 430 | ||||||||||||||
Asn | Arg | His | Ala | Ile | Asp | Ile | Al a | Lys | Met | Ala | Leu | Glu | Ile | Leu | Ser |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Phe | Met | Gly | Thr | Phe | Glu | Leu | Glu | His | Leu | Pro | Gly | Leu | Pro | Ile | Trp |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
Ile | Arg | ile | Gly | Val | His | Ser | Gly | Pro | cys | Ala | Ala | Gly | Val | val | Gly |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Ile | Lys | Met | Pro | Arg | Tyr | Cys | Leu | Phe | Gly | Asp | Thr | val | Asn | Thr | Ala |
485 | 490 | 495 | |||||||||||||
Ser | Arg | Met | Glu | Ser | Thr | Gly | Leu | Pro | Leu | Arg | Ile | His | Val | Ser | Gly |
500 | 505 | 510 | |||||||||||||
Ser | Thr | Ile | Ala | Ile | Leu | Lys | Arg | Thr | Glu | cys | Gin | Phe | Leu | Tyr | Glu |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
Val | Arg 530 | Gly | Glu | Thr | Tyr | Leu 535 | Lys | Gly | Arg | Gly | Asn 540 | Glu | Thr | Thr | Tyr |
Trp | Leu | Thr | Gly | Met | Lys | ASp | Gin | Lys | Phe | Asn | Leu | Pro | Thr | Pro | Pro |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
Thr | Val | Glu | Asn | Gin | Gin | Arg | Leu | Gin | Ala | Glu | Phe | Ser | Asp | Met | Ile |
565 | 570 | 575 | |||||||||||||
Ala | Asn | Ser | Leu | Gin | Lys | Arg | Gin | Ala | Ala | Gly | Ile | Arg | Ser | Gin | Lys |
580 | 585 | 590 | |||||||||||||
Pro | Arg | Arg | Val | Ala | Ser | Tyr | Lys | Lys | Gly | Thr | Leu | Glu | Tyr | Leu | Gin |
595 | 600 | 605 | |||||||||||||
Leu | Asn | Thr | Thr | Asp | Lys | Glu | Ser | Thr | Tyr | Phe |
610 615 <210> 103 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22O>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 103
PL 219 018 B1
135 gctggtaact atcttcctgc 20 <210> 104 <211> 20 <-?1 ?* nwa <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 104 gaagaatgtt gtccagaggt 20 <210> 105 <211> 15 <212> prt <213> Homo sapiens <400> 105
Leu Ile Asn Lys Val Pro Leu Pro Val Asp Lys Leu Ala Pro Leu 15 10 15 <210> 106 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 106
Ser Glu Ala val Lys Lys Leu Leu Glu Ala Leu Ser His Leu val 15 10 15 <210> 107 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22O>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 107 tgttttcaac taccaggggc 20 <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 108 tgttggcttt ggcagagtcc 20
136
PL 219 018 B1 <210> 109 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22O>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 109 gaggcagagt tcaggcttca ccga 24 <210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 110 tgttggcttt ggcagagtcc 20 <210> 111 <211> 56 <212> prt <213> Homo sapiens
<400> 111 | |||||||||||||||
Thr | Gly | Met | Asp | Met | Trp | Ser | Thr | Gin | Asp | Leu | Tyr | Asp | Asn | Pro | val |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Thr | Ser | Val | Phe 20 | Gin | Tyr | Glu | Gly | Leu 25 | Trp | Arg | Ser | Cys | val 30 | Arg | Gin |
Ser | Ser | Gly 35 | Phe | Thr | Glu | cys | Arg 40 | Pro | Tyr | Phe | Thr | Ile 45 | Leu | Gly | Leu |
Pro | Ala | Met | Leu | Gin | Ala | Val | Arg | ||||||||
50 | 55 |
<210> 112 <211> 53 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 112
Asp Gin Trp Ser Thr Gin Asp Leu Tyr Asn Asn Pro val Thr Ala Val 1 5 10 15
Phe Asn Tyr Gin Gly Leu Trp Arg Ser Cys Va1 Arg Glu Ser Ser Gly 20 25 30
PL 219 018 B1
137
Phe Thr Glu Cys Arg Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met 35 40 45
Leu Gin Ala val Arg 50 <210> 113 <211> 14 <212> prt <213> Homo sapiens <400> 113
Ser Thr Gin Asp Leu Tyr Asn Asn Pro val Thr Ala val Phe 15 10 <2l0> 114 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 114
Asp Met Trp Ser Thr Gin Asp Leu Tyr Asp Asn Pro 15 10 <210> 115 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 115
Cys Arg Pro Tyr phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala 15 10 <210> 116 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 116
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly 15 10 <210> 117 <211> 816 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 117 gccaggatca tgtccaccac cacatgccaa gtggtggcgt tcctcctgtc catcctgggg 60 ctggccggct gcatcgcggc caccgggatg gacatgtgga gcacccagga cctgtacgac 120
138
PL 219 018 B1 aaccccgtca cctccgtgtt ccagtacgaa gggctctgga ggagctgcgt gaggcagagt 180 tcaggcttca ccgaatgcag gccctatttc accatcctgg gacttccagc catgctgcag 240 gcagtgcgag ccctgatgat cgtaggcatc gtcctgggtg ccattggcct cctggtatcc 300 atctttgccc tgaaatgcat ccgcattggc agcatggagg actctgccaa agccaacatg 360 acactgacct ccgggatcat gttcattgtc tcaggtcttt gtgcaattgc tggagtgtct 420 gtgtttgcca acatgctggt gactaacttc tggatgtcca cagctaacat gtacaccggc 480 at99gtggga tggtgcagac tgttcagacc aggtacacat ttggtgcggc tctgttcgtg 540 ggctgggtcg ctggaggcct cacactaatt gggggtgtga tgatgtgcat cgcctgccgg 600 ggcctggcac cagaagaaac caactacaaa gccgtttctt atcatgcctc aggccacagt 660 gttgcctaca agcctggagg cttcaaggcc agcactggct ttgggtccaa caccaaaaac 720 aagaagatat acgatggagg tgcccgcaca gaggacgagg tacaatctta tccttccaag 780 cacgactatg tgtaatgctc taagacctct cagcac 816 <210> 118 <211> 261 <212> PRT
<213> Homo | sap- | iens | |||||||||||||
<400> 118 | |||||||||||||||
Met | Ser | Thr | Thr | Thr | Cys | Gin | Val | val | Ala | Phe | Leu | Leu | Ser | ile | Leu |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Gly | Leu | Ala | Gly | Cys | Ile | Ala | Ala | Thr | Gly | Met | ASp | Met | Trp | Ser | Thr |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Gin | Asp | Leu | Tyr | ASp | Asn | Pro | Val | Thr | Ser | val | Phe | Gin | Tyr | Glu | Gly |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Leu | Trp 50 | Arg | Ser | Cys | val | Arg 55 | Gin | Ser | ser | Gly | Phe 60 | Thr | Glu | Cys | Arg |
Pro 65 | Tyr | Phe | Thr | Ile | Leu 70 | Gly | Leu | Pro | Ala | Met 75 | Leu | Gin | Ala | val | Arq 80 |
Ala | Leu | Met | ile | val | Gly | ile | val | Leu | Gly | Ala | ile | Gly | Leu | Leu | val |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Ser | Ile | Phe | Ala 100 | Leu | Lys | cys | ile | Arg 105 | ile | Gly | Ser | Met | Glu 110 | Asp | Ser |
Ala | Lys | Ala | Asn | Met | Thr | Leu | Thr | Ser | Gly | ile | Met | Phe | Ile | val | Ser |
115 | 120 | 125 |
PL 219 018 B1
139
Gly Leu | Cys Ala ile Ala Gly val 135 | ser Va1 | Phe | Al a 140 | Asn | Met | Leu | val | |||||||
130 | |||||||||||||||
Thr | Asn | Phe | Trp | Met | Ser | Thr | Al a | Asn | Met | Tyr | Thr | Gly | Met | Gly | Gly |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Met | val | Gin | Thr | val | Gin | Thr | Arg | Tyr | Thr | Phe | Gly | Al a | Ala | Leu | Phe |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
val | Gly | Trp | val | Ala | Gly | Gly | Leu | Thr | Leu | Ile | Gly | Gly | Val | Met | Met |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Cys | Ile | Ala | cys | Arg | Gly | Leu | Ala | Pro | Glu | Glu | Thr | Asn | Tyr | Lys | Al a |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Val | Ser | Tyr | His | Ala | Ser | Gly | His | ser | val | Ala | Tyr | Lys | Pro | Gly | Gly |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Phe | Lys | Ala | Ser | Thr | Gly | Phe | Gly | ser | Asn | Thr | Lys | Asn | Lys | Lys | Ile |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Tyr | Asp | Gly | Gly | Ala | Arg | Thr | Glu | Asp | Glu | Val | Gin | Ser | Tyr | Pro | Ser |
245 | 250 | 255 |
Lys His Asp Tyr Val, 260 <210> 119 <211> 227 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 119 gccaggatca tgtccaccac cacatgccaa gtggtggcgt tcctcctgtc catcctgggg 60 ctggccggct gcatcgcggc caccgggatg gacatgtgga gcacccagga cctgtacgac 120 aaccccgtca cctccgtgtt ccagtacgaa gggctctgga ggagctgcgt gaggcagagt 180 tcaggcttca ccgaatgcag gccctatttc accatcctgg gacttcc 227 <210> 120 <211> 69 <212> PRT <213* Homo sapiens <400> 120
Met Ser Thr Thr Thr Cys Gin Val Val Ala Phe Leu Leu ser ile Leu 15 10 15
140
PL 219 018 B1
Gly Leu Ala Gly Cys Ile Ala Ala Thr Gly Met Asp Met Trp Ser Thr 20 25 30
Gin Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Val Thr Ser val Phe Gin Tyr Glu Gly 35 40 45
Leu Trp Arg ser Cys Val Arg Gin Ser ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60
Pro Tyr Phe Thr ile 65 <210> 121 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 121 aatgagagga aagagaaaac <210> 122 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd
<400> 122 atggtagaag agtaggcaat | |
<210> <211> <212> <213> | 123 15 PRT Homo sapiens |
<400> 123
Glu Lys Trp Asn Leu His Lys Arg Ile Ala Leu Lys Met val Cys 1 5 10 β <210> 124 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 124
Cys Leu Gly phe Asn Phe Lys Glu Met Phe Lvs 1 5 10
PL 219 018 B1
141 <210> 125 <21Ł> 23 <212> DNA <213 > Sztuczna sekwencja <22O>
<223 > Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 125 taatgatgaa ccctacactg agc <210> 126 <211> 20 <21?> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 126 atggacaaat gccctacctt <2l0> 127 <2ll> 22 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 127 agtgctggaa ggatgtgcgt gt <210> 128 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 128 ttgaggtggt tgttgggttt <210> 129 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd
142
PL 219 018 B1 <400> 129 agatgtgctg aggctgtaga <210> 130 <211> 20 <212> DNA <2l3> Sztuczna sekwencja <22O>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 130 atgaaggttg attatttgag <210> 131 <211> 23 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 131 agccgcatac tcccttaccc tct <210> 132 <2ll> 20 <?12> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22Q>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 132 gcagcagccc aaacaccaca <210> 133 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 133 ctgagccgag aggtggaatc <210> 134 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd
PL 219 018 B1
143
<400> | 134 |
ctctctcgct tacactggaa | |
<210> | 135 |
<211> | 14 |
<212> | PRT |
<213> | Homo sapiens |
<400> 135
Gin Trp Gin Val Phe Gly Pro Asp Lys Pro val Gin Ala Leu 15 10 <210> 136 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 136
Ala Lys Trp Lys Gly Pro Gin Gly Gin Asp Leu Ser Thr Asp Ser 15 10 15 <210> 137 <211> 32 <212> prt
<213> | Homo | sapiens | ||||||||||
<400> | 137 | |||||||||||
Asn Met | Leu | val Thr | Asn | Phe | Trp | Met | Ser | Thr | Ala | Asn | Met | Tyr Thr |
1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||
Gly Met | Gly | Gly Met | val | Gin | Thr | val | Gin | Thr | Arg | Tyr | Thr | Phe Gly |
20 | 25 | 30 |
Zastrzeżenia patentowe
Claims (51)
1. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera jeden lub więcej składników wybranych z grupy składającej się z:
(i) związanego z nowotworem antygenu lub jego części, (ii) kwasu nukleinowego, który koduje związany z nowotworem antygen lub jego część, (iii) przeciwciała, które wiąże się do związanego z nowotworem antygenu, (iv) komórki gospodarza, z ekspresją związanego z nowotworem antygenu lub jego części i (v) izolowanych kompleksów pomiędzy związanym z nowotworem antygenem lub jego częścią i cząsteczką HLA, przy czym wspomniana część zawiera co najmniej 6 przylegających do siebie aminokwasów antygenu związanego z nowotworem, przy czym wspominany związany z nowotworem antygen posiada sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z:
(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybrana z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 41-44, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w rygorystycznych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b) i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c).
144
PL 219 018 B1
2. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że kwas nukleinowy (ii) jest obecny w wektorze ekspresyjnym.
3. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że kwas nukleinowy (ii) jest funkcjonalnie połączony z promotorem.
4. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że komórka gospodarza wydziela związany z nowotworem antygen lub jego część.
5. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że dodatkowo w komórce gospodarza zachodzi ekspresja cząsteczki HLA, która wiąże się do związanego z nowotworem antygenu lub jego części.
6. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 5, znamienna tym, że w komórce gospodarza ekspresja cząsteczki HLA i/lub związanego z nowotworem antygenu lub jego części zachodzi metodą rekombinacji.
7. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 5, znamienna tym, że w komórce gospodarza ekspresja cząsteczki HLA zachodzi endogennie.
8. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, 5 lub 7, znamienna tym, że komórka gospodarza jest komórką prezentującą antygen.
9. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 8, znamienna tym, że komórka prezentująca antygen jest komórką dendrytyczną lub makrofagiem.
10. Kompozycja farmaceutyczna według któregokolwiek z zastrz. 4-9, znamienna tym, że komórka gospodarza jest komórką nieproliferacyjną.
11. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym.
12. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że przeciwciało jest przeciwciałem chimerycznym lub humanizowanym.
13. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że przeciwciało jest fragmentem przeciwciała naturalnego.
14. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że przeciwciało jest sprzężone z czynnikiem terapeutycznym lub diagnostycznym.
15. Kompozycja farmaceutyczna według któregokolwiek z zastrz. 1-4, znamienna tym, że związany z nowotworem antygen lub jego część dostarczana przez wspomnianą kompozycję farmaceutyczną wiąże się do cząsteczek MHC na powierzchni komórek, w których zachodzi ekspresja nieprawidłowej ilości tego związanego z nowotworem antygenu lub jego części.
16. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 15, znamienna tym, że wiązanie powoduje cytolityczną reakcję i/lub indukuje uwalnianie cytokin.
17. Kompozycja farmaceutyczna według któregokolwiek z zastrz. 1-16, znamienna tym, że zawiera ponadto farmaceutycznie akceptowalny nośnik i/lub adiuwant.
18. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 17, znamienna tym, że adiuwantem jest saponina, GM-CSF, CpG, cytokina lub chemokina.
19. Kompozycja farmaceutyczna według któregokolwiek z zastrz. 1-18, do stosowania do leczenia choroby nowotworowej charakteryzującej się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją związanego z nowotworem antygenu.
20. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 19, znamienna tym, że chorobą jest nowotwór płuc, nowotwór piersi, nowotwór prostaty, czerniak, nowotwór okrężnicy, przerzuty nowotworu okrężnicy, rak komórek nerki, lub rak szyjki macicy, rak okrężnicy lub rak gruczołu piersiowego.
21. Kompozycja farmaceutyczna według któregokolwiek z zastrz. 1-20, znamienna tym, że związany z nowotworem antygen zawiera sekwencję aminokwasów składającą się z grupy złożonej z SEQ ID Nr: 45-48, 123 i 124.
22. Czynnik do zastosowania w sposobie diagnozowania choroby nowotworowej charakteryzującej się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją związanego z nowotworem antygenu, który to sposób obejmuje takie etapy, że:
(i) wykrywa się kwas nukleinowy, który koduje związany z nowotworem antygen i/lub (ii) wykrywa się związany z nowotworem antygen, i/lub (iii) wykrywa się przeciwciało dla tego związanego z nowotworem antygenu, i/lub (iv) wykrywa się cytotoksyczne lub pomocnicze limfocyty T specyficzne dla związanego z nowotworem antygenu lub jego części zawierającej 6 przylegających aminokwasów związanego z nowotworem antygenu, w próbce biologicznej izolowanej od pacjenta ze wspomnianym związanym z nowoPL 219 018 B1
145 tworem antygenem mającym sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z:
(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybrana z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 41-44, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w rygorystycznych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b) i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c), w którym wykrywanie obejmuje:
(I) kontaktowanie biologicznej próbki z czynnikiem, który wiąże się specyficznie z kwasem nukleinowym kodującym związany z nowotworem antygen, z związanym z nowotworem antygenem, z przeciwciałem lub z cytotoksycznymi lub pomocniczymi limfocytami T i (II) wykrywanie tworzenia się kompleksu między tym czynnikiem i kwasem nukleinowym, związanym z nowotworem antygenem, przeciwciałem lub cytotoksycznymi lub pomocniczymi limfocytami T i w którym wykrywanie jest przyrównywane do wykrywania w porównywalnej prawidłowej biologicznej próbce, przy czym czynnik do wykrywania kwasu nukleinowego jest sondą polinukleotydową, która hybrydyzuje specyficznie z wspomnianym kwasem nukleinowym lub jest primerem do selektywnego powielania wspomnianego kwasu nukleinowego, przy czym czynnik do wykrywania związanego z nowotworem antygenu jest przeciwciałem wiążącym się specyficznie do tego związanego z nowotworem antygenu, przy czym czynnik do wykrywania przeciwciała jest białkiem lub peptydem wiążącym się specyficznie do wspomnianego przeciwciała, i przy czym czynnik do wykrywania cytotoksycznych lub pomocniczych limfocytów T jest komórką prezentującą kompleks pomiędzy związanym z przeciwciałem antygenem lub jego częścią i cząsteczka MHC.
23. Czynnik według zastrz. 22, znamienny tym, że sonda polinukleotydowa, przeciwciało, białko lub peptyd, lub komórka są znakowane w sposób pozwalający na wykrycie.
24. Czynnik według zastrz. 23, znamienny tym, że wskaźnik pozwalający na wykrycie jest wskaźnikiem radioaktywnym lub enzymatycznym.
25. Czynnik według któregokolwiek z zastrz. 22-24, znamienny tym, że próbka zawiera płyn ustrojowy lub tkankę.
26. Czynnik według któregokolwiek z zastrz. 22-25, znamienny tym, że białko, polipeptyd lub związany z nowotworem antygen zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 45-48, 123 i 124.
27. Czynnik według któregokolwiek z zastrz 22 do 26, znamienny tym, że przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym, chimerycznym lub humanizowanym, lub fragmentem przeciwciała.
28. Czynnik do zastosowania w sposobie oznaczania regresji, przebiegu lub początku choroby nowotworowej charakteryzującej się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją związanego z nowotworem antygenu, który to sposób obejmuje monitorowanie próbki od pacjenta, który ma tę chorobę lub jest podejrzenie zachorowania na tę chorobę, ze względu na jeden lub więcej parametrów wybranych z grupy składającej się z:
(i) ilość kwasu nukleinowego, który koduje związany z nowotworem antygen, (ii) ilość związanego z nowotworem antygenu, (iii) ilość przeciwciał, które wiążą się do związanego z nowotworem antygenu i (iv) ilość cytolitycznych lub uwalniających cytokiny komórek T, które są specyficzne dla kompleksu pomiędzy związanym z nowotworem antygenem lub jego częścią zawierającą co najmniej 6 przylegających aminokwasów związanego z nowotworem antygenu i cząsteczki MHC, przy czym ten związany z nowotworem antygen ma sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy, który jest wybrany z grupy składającej się z:
(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 41-44, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w rygorystycznych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b) i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c), który obejmuje oznaczanie parametru(ów) w pierwszej próbce, w pierwszym punkcie czasowym i w kolejnej próbce w drugim punkcie czasowym, i w którym przebieg choroby jest oznaczany przez porównanie dwóch próbek, przy czym czynnik do oznaczania ilości kwasu nukleinowego jest sondą polinu146
PL 219 018 B1 kleotydową, która hybrydyzuje specyficznie z tym kwasem nukleinowym lub jest primerem do selektywnej amplifikacji tego kwasu nukleinowego, przy czym czynnik do oznaczania ilości związanego z nowotworem antygenu jest przeciwciałem wiążącym się specyficznie do tego związanego z nowotworem antygenu, przy czym czynnik do oznaczania ilości przeciwciał jest białkiem lub peptydem wiążącym się specyficznie do przeciwciała i przy czym czynnik do oznaczania ilości cytolitycznych lub uwalniających cytokiny komórek T jest komórką prezentującą kompleks pomiędzy związanym z nowotworem antygenem i cząsteczką MHC.
29. Czynnik według zastrz. 28, znamienny tym, że sonda polinukleotydowa, przeciwciało, białko lub peptyd, lub komórka są znakowane w sposób pozwalający na wykrycie.
30. Czynnik według zastrz. 29, znamienny tym, że wskaźnik pozwalający na wykrycie jest wskaźnikiem radioaktywnym lub enzymatycznym.
31. Czynnik według któregokolwiek z zastrz. 28-30, znamienny tym, że próbka zawiera płyn ustrojowy i/lub tkankę.
32. Czynnik według któregokolwiek z zastrz. 28-31, znamienny tym, że białko, polipeptyd lub związany z nowotworem antygen zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 45-48, 123 i 124.
33. Czynnik według któregokolwiek z zastrz 28 do 32, znamienny tym, że przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym, chimerycznym lub humanizowanym, lub fragmentem przeciwciała.
34. Cytolityczne lub wydzielające cytokinę komórki T do zastosowania w sposobie leczenia pacjenta mającego chorobę nowotworową charakteryzującą się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją związanego z nowotworem antygenu, przy czym te cytolityczne lub wydzielające cytokinę komórki T otrzymuje się sposobem obejmującym etapy takie że:
(i) pobiera się próbkę zawierającą immunoreaktywne komórki od pacjenta i (ii) kontaktuje się tę próbkę z komórką gospodarza z ekspresją tego związanego z nowotworem antygenu lub jego częścią w warunkach które sprzyjają wytwarzaniu cytolitycznych lub uwalniających cytokiny komórek T, skierowanych przeciw temu związanemu z nowotworem antygenowi lub jego części i przy czym wspomniany sposób leczenia obejmuje takie etapy, że:
wprowadza się cytolityczne lub wydzielające cytokiny komórki T pacjentowi w ilości odpowiedniej do przeprowadzenia lizy komórek, w których zachodzi ekspresja związanego z nowotworem antygenu lub jego częścią przy czym wspomniana część zawiera co najmniej 6 przylegających aminokwasów tego związanego z nowotworem antygenu, mającego sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z:
(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 41- 44, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w rygorystycznych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b) i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c).
35. Cytolityczne lub wydzielające cytokinę komórki T według zastrz. 34, znamienne tym, że komórki gospodarza wytwarzają rekombinacyjnie cząsteczkę HLA wiążąca się do związanego z nowotworem antygenu.
36. Cytolityczne lub wydzielające cytokinę komórki T według zastrz. 35, znamienne tym, że w komórce gospodarza endogennie zachodzi ekspresja cząsteczki HLA wiążącej się do związanego z nowotworem antygenu lub do jego części zawierającej co najmniej 6 przylegających aminokwasów związanego z nowotworem antygenu.
37. Cytolityczna lub uwalniająca cytokinę komórka T według któregokolwiek z zastrz. 34 do 36, znamienna tym, że komórki gospodarza są nieproliferacyjne.
38. Kwas nukleinowy, wybrany z grupy składającej się z:
(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 41-44 lub jego część, lub pochodną, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w rygorystycznych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b) i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c).
39. Kwas nukleinowy, znamienny tym, że koduje białko lub polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 45-48, 123 i 124.
PL 219 018 B1
147
40. Komórka gospodarza, znamienna tym, że zwiera kwas nukleinowy jak zdefiniowano w zastrz. 38 lub 39.
41. Komórka gospodarza według zastrz. 40, która zawiera ponadto kwas nukleinowy kodujący cząsteczkę HLA.
42. Białko lub polipeptyd kodowane przez kwas nukleinowy, jak zdefiniowano w zastrz. 38.
43. Białko lub polipeptyd, znamienne tym, że zawiera sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z SEQ 45-48, 123 i 124.
44. Przeciwciało, znamienne tym, że wiąże się specyficznie do białka lub polipeptydu, przy czym białko to lub polipeptyd są kodowane przez kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z:
(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 41-44, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w rygorystycznych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b) i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c).
45. Przeciwciało według zastrz. 44, znamienne tym, że białko, polipeptyd związany z nowotworem antygen zawierają sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 45-48, 123 i 124.
46. Przeciwciało według zastrz. 44 lub 45, znamienne tym, że przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym, chimerycznym lub humanizowanym, lub fragmentem przeciwciała.
47. Przeciwciało według któregokolwiek z zastrz. 44-46, gdzie przeciwciało sprzężone jest z czynnikiem terapeutycznym lub diagnostycznym do zastosowanie w sposobie leczenia, diagnozowania lub monitorowania choroby nowotworowej charakteryzującej się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją związanego z nowotworem antygenu, który to sposób obejmuje podawanie tego przeciwciała pacjentowi, przy czym ten wspomniany związany z nowotworem antygen ma sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy wybraną z grupy składającej się z:
(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego składającą się z sekwencji SEQ ID Nr: 41-44, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w rygorystycznych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b) i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c).
48. Produkt sprzęgania przeciwciała, jak zdefiniowano w którymkolwiek z zastrz. 44-46, z czynnikiem terapeutycznym lub diagnostycznym.
49. Produkt sprzęgania według zastrz. 48, znamienny tym, że czynnik terapeutyczny lub diagnostyczny jest toksyną.
50. Zestaw do wykrywania ekspresji lub nieprawidłowej ekspresji związanego z nowotworem antygenu, znamienny tym, że zestaw zawiera czynniki do detekcji:
(i) kwasu nukleinowego kodującego ten związany z nowotworem antygen, (ii) związanego z nowotworem antygenu, (iii) przeciwciał, które wiążą się do związanego z nowotworem antygenu i/lub (iv) komórek T, które są specyficzne dla kompleksu związanego z nowotworem antygenu lub części i cząsteczki MHC, przy czym wspomniana część zawiera co najmniej 6 przylegających aminokwasów związanego z nowotworem antygenu, przy czym wspomniany związany z nowotworem antygen posiada sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z:
(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 41-44, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w rygorystycznych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b) i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c), przy czym czynnik do wykrywania kwasu nukleinowego jest sondą polinukleotydową, która hybrydyzuje specyficznie ze wspomnianym kwasem nukleotydowym lub jest primerem do selektywnej amplifikacji kwasu nukleinowego, przy czym czynnik do wykrywania związanego z nowotworem antygenu jest przeciwciałem specyficznie wiążącym się do związanego z nowotworem antygenu, przy czym czynnik do wykrywania przeciwciała wiążącego się związanym nowotworem antygenem jest białkiem lub pep148
PL 219 018 B1 tydem wiążącym się specyficznie do wspomnianego przeciwciała, przy czym czynnik do wykrywania komórek T jest komórka prezentującą kompleks pomiędzy związanym z nowotworem antygenem lub jego częścią i cząsteczka MHC.
51. Zestaw według zastrz. 50, znamienny tym, że cząsteczki kwasu nukleinowego do selektywnej amplifikacji kwasu nukleinowego zawiera sekwencję 6-50 przylegających nukleotydów kwasu nukleinowego, który koduje związany z nowotworem antygen.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE10254601A DE10254601A1 (de) | 2002-11-22 | 2002-11-22 | Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL377240A1 PL377240A1 (pl) | 2006-01-23 |
PL219018B1 true PL219018B1 (pl) | 2015-02-27 |
Family
ID=32240310
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL377240A PL219018B1 (pl) | 2002-11-22 | 2003-11-21 | Kompozycja farmaceutyczna, czynnik do zastosowania w sposobie diagnozowania choroby nowotworowej, czynnik do zastosowania w sposobie oznaczania regresji, przebiegu lub początku choroby nowotworowej, cytolityczne lub wydzielające cytokinę komórki T, kwas nukleinowy, komórka gospodarza, białko lub polipeptyd, przeciwciało, produkt sprzęgania przeciwciała i zestaw do wykrywania ekspresji antygenu |
PL392311A PL219093B1 (pl) | 2002-11-22 | 2003-11-21 | Kompozycja farmaceutyczna, kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu, czynnik do zastosowania w sposobie diagnozowania choroby, czynnik do zastosowania w sposobie oznaczania regresji, przebiegu lub rozpoczęcia choroby, cytolityczne lub wydzielające cytokinę komórki T, komórka gospodarza lub jej wyciąg, komórki z ekspresją związanego z nowotworem antygenu, kwas nukleinowy, cząsteczka zrekombinowanego DNA lub RNA, komórka gospodarza, białko lub polipeptyd, przeciwciało, produkt sprzęgania i zestaw do wykrywania ekspresji |
PL392310A PL219043B1 (pl) | 2002-11-22 | 2003-11-21 | Kompozycja farmaceutyczna, kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu choroby, czynnik do zastosowania w sposobie diagnozowania, czynnik do zastosowania w sposobie oznaczania regresji, cytolityczne lub wydzielające cytokinę komórki T do zastosowania w sposobie leczenia, kwas nukleinowy, komórka gospodarza, polipeptyd, przeciwciało, produkt sprzęgania przeciwciała i zestaw do wykrywania ekspresji |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL392311A PL219093B1 (pl) | 2002-11-22 | 2003-11-21 | Kompozycja farmaceutyczna, kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu, czynnik do zastosowania w sposobie diagnozowania choroby, czynnik do zastosowania w sposobie oznaczania regresji, przebiegu lub rozpoczęcia choroby, cytolityczne lub wydzielające cytokinę komórki T, komórka gospodarza lub jej wyciąg, komórki z ekspresją związanego z nowotworem antygenu, kwas nukleinowy, cząsteczka zrekombinowanego DNA lub RNA, komórka gospodarza, białko lub polipeptyd, przeciwciało, produkt sprzęgania i zestaw do wykrywania ekspresji |
PL392310A PL219043B1 (pl) | 2002-11-22 | 2003-11-21 | Kompozycja farmaceutyczna, kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu choroby, czynnik do zastosowania w sposobie diagnozowania, czynnik do zastosowania w sposobie oznaczania regresji, cytolityczne lub wydzielające cytokinę komórki T do zastosowania w sposobie leczenia, kwas nukleinowy, komórka gospodarza, polipeptyd, przeciwciało, produkt sprzęgania przeciwciała i zestaw do wykrywania ekspresji |
Country Status (21)
Country | Link |
---|---|
US (7) | US7527933B2 (pl) |
EP (27) | EP1563068B1 (pl) |
JP (7) | JP2006516190A (pl) |
KR (7) | KR20170031804A (pl) |
CN (4) | CN106581694A (pl) |
AU (2) | AU2003282101B2 (pl) |
BR (1) | BR0316435A (pl) |
CA (2) | CA2505757A1 (pl) |
CY (1) | CY1117786T1 (pl) |
DE (1) | DE10254601A1 (pl) |
ES (2) | ES2675785T3 (pl) |
HK (1) | HK1165480A1 (pl) |
HU (1) | HUE027825T2 (pl) |
IL (7) | IL168168A (pl) |
MX (2) | MXPA05005423A (pl) |
NZ (4) | NZ590225A (pl) |
PL (3) | PL219018B1 (pl) |
PT (1) | PT2400018T (pl) |
SG (3) | SG10201705641SA (pl) |
SI (1) | SI2400018T1 (pl) |
WO (1) | WO2004047863A2 (pl) |
Families Citing this family (78)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE10254601A1 (de) | 2002-11-22 | 2004-06-03 | Ganymed Pharmaceuticals Ag | Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung |
GB0307428D0 (en) | 2003-03-31 | 2003-05-07 | Medical Res Council | Compartmentalised combinatorial chemistry |
US20060078893A1 (en) | 2004-10-12 | 2006-04-13 | Medical Research Council | Compartmentalised combinatorial chemistry by microfluidic control |
GB0307403D0 (en) | 2003-03-31 | 2003-05-07 | Medical Res Council | Selection by compartmentalised screening |
DE10344799A1 (de) * | 2003-09-26 | 2005-04-14 | Ganymed Pharmaceuticals Ag | Identifizierung von Oberflächen-assoziierten Antigenen für die Tumordiagnose und -therapie |
US20050221339A1 (en) | 2004-03-31 | 2005-10-06 | Medical Research Council Harvard University | Compartmentalised screening by microfluidic control |
DE102004023187A1 (de) | 2004-05-11 | 2005-12-01 | Ganymed Pharmaceuticals Ag | Identifizierung von Oberflächen-assoziierten Antigenen für die Tumordiagnose und -therapie |
AU2011256897B2 (en) * | 2004-05-18 | 2013-09-19 | Astellas Pharma Inc. | Genetic products differentially expressed in tumors and the use thereof |
DE102004024617A1 (de) | 2004-05-18 | 2005-12-29 | Ganymed Pharmaceuticals Ag | Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung |
US7892755B2 (en) | 2004-08-30 | 2011-02-22 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Screening method |
US7968287B2 (en) | 2004-10-08 | 2011-06-28 | Medical Research Council Harvard University | In vitro evolution in microfluidic systems |
DE102005013846A1 (de) | 2005-03-24 | 2006-10-05 | Ganymed Pharmaceuticals Ag | Identifizierung von Oberflächen-assoziierten Antigenen für die Tumordiagnose und -therapie |
EP1790664A1 (en) * | 2005-11-24 | 2007-05-30 | Ganymed Pharmaceuticals AG | Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer |
AU2014208256B2 (en) * | 2005-11-24 | 2016-01-14 | Astellas Pharma Inc. | Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer |
AU2016202322B2 (en) * | 2005-11-24 | 2018-03-08 | Astellas Pharma Inc. | Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer |
CA2636855C (en) | 2006-01-11 | 2016-09-27 | Raindance Technologies, Inc. | Microfluidic devices and methods of use in the formation and control of nanoreactors |
EP3031918B1 (en) | 2006-05-11 | 2018-03-14 | Raindance Technologies Inc. | Microfluidic devices |
US9562837B2 (en) | 2006-05-11 | 2017-02-07 | Raindance Technologies, Inc. | Systems for handling microfludic droplets |
WO2008021123A1 (en) | 2006-08-07 | 2008-02-21 | President And Fellows Of Harvard College | Fluorocarbon emulsion stabilizing surfactants |
US8133859B2 (en) | 2006-09-27 | 2012-03-13 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | SCGB3A2 as a growth factor and anti-apoptotic agent |
CA2664567C (en) * | 2006-10-04 | 2016-04-26 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Tumor immunity |
US7951781B2 (en) * | 2006-11-02 | 2011-05-31 | University Of Iowa Research Foundation | Methods and compositions related to PLUNC surfactant polypeptides |
WO2008097559A2 (en) | 2007-02-06 | 2008-08-14 | Brandeis University | Manipulation of fluids and reactions in microfluidic systems |
WO2008130623A1 (en) | 2007-04-19 | 2008-10-30 | Brandeis University | Manipulation of fluids, fluid components and reactions in microfluidic systems |
EP1997832A1 (en) * | 2007-05-29 | 2008-12-03 | Ganymed Pharmaceuticals AG | Monoclonal antibodies against Claudin-18 for treatment of cancer |
EP2060583A1 (en) * | 2007-10-23 | 2009-05-20 | Ganymed Pharmaceuticals AG | Identification of tumor-associated markers for diagnosis and therapy |
EP2315629B1 (en) | 2008-07-18 | 2021-12-15 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Droplet libraries |
US20110206736A1 (en) * | 2008-09-23 | 2011-08-25 | Thomas Jefferson University | Cancer Vaccines Against Mucosal Antigens and Methods of Making and Using the Same |
WO2010111231A1 (en) | 2009-03-23 | 2010-09-30 | Raindance Technologies, Inc. | Manipulation of microfluidic droplets |
US10520500B2 (en) | 2009-10-09 | 2019-12-31 | Abdeslam El Harrak | Labelled silica-based nanomaterial with enhanced properties and uses thereof |
MX366890B (es) * | 2009-10-23 | 2019-07-30 | Millennium Pharm Inc | Moléculas de anticuerpo anti - gcc y composiciones y métodos relacionados. |
EP2517025B1 (en) | 2009-12-23 | 2019-11-27 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Methods for reducing the exchange of molecules between droplets |
US9366632B2 (en) | 2010-02-12 | 2016-06-14 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
US10351905B2 (en) | 2010-02-12 | 2019-07-16 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital analyte analysis |
US9399797B2 (en) | 2010-02-12 | 2016-07-26 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
CA2789425C (en) | 2010-02-12 | 2020-04-28 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis with polymerase error correction |
EP2547695B1 (en) * | 2010-03-16 | 2018-05-09 | Biontech Protein Therapeutics GmbH | Tumor vaccination involving a humoral immune response against self-protein cldn18.2 |
US9562897B2 (en) | 2010-09-30 | 2017-02-07 | Raindance Technologies, Inc. | Sandwich assays in droplets |
EP2673614B1 (en) | 2011-02-11 | 2018-08-01 | Raindance Technologies, Inc. | Method for forming mixed droplets |
US9150852B2 (en) | 2011-02-18 | 2015-10-06 | Raindance Technologies, Inc. | Compositions and methods for molecular labeling |
WO2012139137A2 (en) | 2011-04-08 | 2012-10-11 | Tufts Medical Center, Inc. | Pepducin design and use |
EP2714970B1 (en) | 2011-06-02 | 2017-04-19 | Raindance Technologies, Inc. | Enzyme quantification |
US8841071B2 (en) | 2011-06-02 | 2014-09-23 | Raindance Technologies, Inc. | Sample multiplexing |
US8658430B2 (en) | 2011-07-20 | 2014-02-25 | Raindance Technologies, Inc. | Manipulating droplet size |
CN102526703B (zh) * | 2012-01-18 | 2013-11-13 | 广东医学院司法鉴定中心 | 一种鼻咽癌相关易感基因yh1蛋白的制备方法及其应用 |
WO2013120089A1 (en) | 2012-02-10 | 2013-08-15 | Raindance Technologies, Inc. | Molecular diagnostic screening assay |
PE20142322A1 (es) | 2012-04-27 | 2015-01-25 | Millennium Pharm Inc | Moleculas de anticuerpo anti-gcc y uso de las mismas para probar la susceptibilidad a la terapia dirigida a gcc |
EP3524693A1 (en) | 2012-04-30 | 2019-08-14 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
WO2013167153A1 (en) * | 2012-05-09 | 2013-11-14 | Ganymed Pharmaceuticals Ag | Antibodies useful in cancer diagnosis |
WO2013174404A1 (en) | 2012-05-23 | 2013-11-28 | Ganymed Pharmaceuticals Ag | Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer |
AU2013347184B2 (en) | 2012-11-13 | 2018-06-14 | Astellas Pharma Inc. | Agents for treatment of claudin expressing cancer diseases |
WO2014127785A1 (en) | 2013-02-20 | 2014-08-28 | Ganymed Pharmaceuticals Ag | Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer |
WO2014146672A1 (en) | 2013-03-18 | 2014-09-25 | Ganymed Pharmaceuticals Ag | Therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer |
WO2014172288A2 (en) | 2013-04-19 | 2014-10-23 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
US11901041B2 (en) | 2013-10-04 | 2024-02-13 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital analysis of nucleic acid modification |
US9944977B2 (en) | 2013-12-12 | 2018-04-17 | Raindance Technologies, Inc. | Distinguishing rare variations in a nucleic acid sequence from a sample |
US11193176B2 (en) | 2013-12-31 | 2021-12-07 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Method for detecting and quantifying latent retroviral RNA species |
PL3105309T3 (pl) | 2014-02-13 | 2019-11-29 | Basf Se | Proszek i granulka, sposób wytwarzania takiego proszku i granulki oraz ich zastosowanie |
WO2015124138A1 (de) * | 2014-02-20 | 2015-08-27 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | Tumor-assoziierte antigene und genprodukte in der diagnose und therapie |
CA2980078C (en) * | 2015-03-16 | 2024-03-12 | Personal Genome Diagnostics Inc. | Systems and methods for analyzing nucleic acid |
WO2016165762A1 (en) * | 2015-04-15 | 2016-10-20 | Ganymed Pharmaceuticals Ag | Drug conjugates comprising antibodies against claudin 18.2 |
US10647981B1 (en) | 2015-09-08 | 2020-05-12 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Nucleic acid library generation methods and compositions |
CA3005029A1 (en) | 2015-11-13 | 2017-05-18 | Oasis Pharmaceuticals, LLC | Protease-activated receptor-2 modulators |
CN105463094B (zh) * | 2015-12-29 | 2018-09-07 | 北京泱深生物信息技术有限公司 | 直肠腺癌的诊治标记物 |
EP3494231A4 (en) * | 2016-08-02 | 2020-04-15 | Georgetown University | METHODS FOR IDENTIFYING NEW PROTEINS AND NEW ANTIGENS IN CANCER CELLS |
US10998178B2 (en) | 2017-08-28 | 2021-05-04 | Purdue Research Foundation | Systems and methods for sample analysis using swabs |
TWI803637B (zh) * | 2018-05-23 | 2023-06-01 | 美商輝瑞大藥廠 | 特異性針對gucy2c之抗體及其用途 |
WO2020043044A1 (zh) | 2018-08-27 | 2020-03-05 | 南京圣和药业股份有限公司 | 一种抗Claudin18.2抗体及其应用 |
CA3128502A1 (en) | 2019-02-01 | 2020-08-06 | Novarock Biotherapeutics, Ltd. | Anti-claudin 18 antibodies and methods of use thereof |
US20230030674A1 (en) | 2019-12-06 | 2023-02-02 | Sotio Biotech A.S. | Humanized cldn18.2 antibodies |
IL294185A (en) | 2019-12-23 | 2022-08-01 | Sotio As | Tumor-specific claudin 18.2 antibodies |
WO2021238831A1 (en) * | 2020-05-25 | 2021-12-02 | Mabspace Biosciences (Suzhou) Co., Limited | Anti-cldn18.2 antibodies and diagnostic uses thereof |
US20230323431A1 (en) * | 2020-08-31 | 2023-10-12 | World Biotech Regenerative Medical Group Limited | Personalized Immunogenic Compositions and Methods for Producing and Using Same |
CN114181944B (zh) * | 2020-09-14 | 2023-10-03 | 中国科学院动物研究所 | 突变基因及构建短肢性侏儒症小型猪模型的方法和用途 |
WO2022122709A1 (en) | 2020-12-07 | 2022-06-16 | Sotio Biotech A.S. | Antibody-drug conjugates based on humanized cldn18.2 antibodies |
TW202237638A (zh) | 2020-12-09 | 2022-10-01 | 日商武田藥品工業股份有限公司 | 烏苷酸環化酶c(gcc)抗原結合劑之組成物及其使用方法 |
TW202237639A (zh) | 2020-12-09 | 2022-10-01 | 日商武田藥品工業股份有限公司 | 鳥苷酸環化酶c(gcc)抗原結合劑之組成物及其使用方法 |
US20240100180A1 (en) | 2020-12-23 | 2024-03-28 | Sotio Biotech A.S. | Tumor-specific claudin 18.2 antibody-drug conjugates |
Family Cites Families (245)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4475196A (en) | 1981-03-06 | 1984-10-02 | Zor Clair G | Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system |
US4447233A (en) | 1981-04-10 | 1984-05-08 | Parker-Hannifin Corporation | Medication infusion pump |
US4439196A (en) | 1982-03-18 | 1984-03-27 | Merck & Co., Inc. | Osmotic drug delivery system |
US4522811A (en) | 1982-07-08 | 1985-06-11 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides |
US4447224A (en) | 1982-09-20 | 1984-05-08 | Infusaid Corporation | Variable flow implantable infusion apparatus |
US4487603A (en) | 1982-11-26 | 1984-12-11 | Cordis Corporation | Implantable microinfusion pump system |
US4486194A (en) | 1983-06-08 | 1984-12-04 | James Ferrara | Therapeutic device for administering medicaments through the skin |
US5374548A (en) | 1986-05-02 | 1994-12-20 | Genentech, Inc. | Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor |
MX9203291A (es) | 1985-06-26 | 1992-08-01 | Liposome Co Inc | Metodo para acoplamiento de liposomas. |
GB8601597D0 (en) | 1986-01-23 | 1986-02-26 | Wilson R H | Nucleotide sequences |
US4954617A (en) | 1986-07-07 | 1990-09-04 | Trustees Of Dartmouth College | Monoclonal antibodies to FC receptors for immunoglobulin G on human mononuclear phagocytes |
US5260203A (en) | 1986-09-02 | 1993-11-09 | Enzon, Inc. | Single polypeptide chain binding molecules |
US4881175A (en) | 1986-09-02 | 1989-11-14 | Genex Corporation | Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides |
US4946778A (en) | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
WO1988007089A1 (en) | 1987-03-18 | 1988-09-22 | Medical Research Council | Altered antibodies |
US5013653A (en) | 1987-03-20 | 1991-05-07 | Creative Biomolecules, Inc. | Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage |
US5258498A (en) | 1987-05-21 | 1993-11-02 | Creative Biomolecules, Inc. | Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins |
US5132405A (en) | 1987-05-21 | 1992-07-21 | Creative Biomolecules, Inc. | Biosynthetic antibody binding sites |
EP0623679B1 (en) | 1987-05-21 | 2003-06-25 | Micromet AG | Targeted multifunctional proteins |
US5091513A (en) | 1987-05-21 | 1992-02-25 | Creative Biomolecules, Inc. | Biosynthetic antibody binding sites |
US4941880A (en) | 1987-06-19 | 1990-07-17 | Bioject, Inc. | Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly |
US4790824A (en) | 1987-06-19 | 1988-12-13 | Bioject, Inc. | Non-invasive hypodermic injection device |
GB8717430D0 (en) | 1987-07-23 | 1987-08-26 | Celltech Ltd | Recombinant dna product |
GB8809129D0 (en) | 1988-04-18 | 1988-05-18 | Celltech Ltd | Recombinant dna methods vectors and host cells |
US4956556A (en) | 1988-11-14 | 1990-09-11 | Siemens Analytical X-Ray Instruments, Inc. | Radiation scintillation detector |
US5108921A (en) | 1989-04-03 | 1992-04-28 | Purdue Research Foundation | Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules |
US6020145A (en) | 1989-06-30 | 2000-02-01 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods for determining the presence of carcinoma using the antigen binding region of monoclonal antibody BR96 |
US5064413A (en) | 1989-11-09 | 1991-11-12 | Bioject, Inc. | Needleless hypodermic injection device |
US5312335A (en) | 1989-11-09 | 1994-05-17 | Bioject Inc. | Needleless hypodermic injection device |
CA2070995A1 (en) | 1989-12-27 | 1991-06-28 | Thomas E. Kmiecik | Diagnostic probe for detecting human stomach cancer |
US6255458B1 (en) | 1990-08-29 | 2001-07-03 | Genpharm International | High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin |
GB9019812D0 (en) | 1990-09-11 | 1990-10-24 | Scotgen Ltd | Novel antibodies for treatment and prevention of infection in animals and man |
US5383851A (en) | 1992-07-24 | 1995-01-24 | Bioject Inc. | Needleless hypodermic injection device |
GB9223377D0 (en) | 1992-11-04 | 1992-12-23 | Medarex Inc | Humanized antibodies to fc receptors for immunoglobulin on human mononuclear phagocytes |
FR2697752B1 (fr) | 1992-11-10 | 1995-04-14 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Compositions antitumorales contenant des dérivés du taxane. |
US5595756A (en) | 1993-12-22 | 1997-01-21 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents |
US5589579A (en) * | 1994-07-19 | 1996-12-31 | Cytoclonal Pharmaceutics, Inc. | Gene sequence and probe for a marker of non-small cell lung carinoma |
WO2000073454A1 (en) | 1999-06-02 | 2000-12-07 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
US6121022A (en) | 1995-04-14 | 2000-09-19 | Genentech, Inc. | Altered polypeptides with increased half-life |
US5677139A (en) | 1995-04-21 | 1997-10-14 | President And Fellows Of Harvard College | In vitro differentiation of CD34+ progenitor cells into T lymphocytes |
UA56132C2 (uk) | 1995-04-25 | 2003-05-15 | Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. | Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини |
AU728777B2 (en) * | 1996-01-11 | 2001-01-18 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the treatment and diagnosis of breast cancer |
US5939265A (en) * | 1996-11-05 | 1999-08-17 | Abbott Laboratories | Reagents and methods useful for detecting diseases of the lung |
WO2002000690A2 (en) * | 2000-06-23 | 2002-01-03 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of disorders involving angiogenesis |
US6277375B1 (en) | 1997-03-03 | 2001-08-21 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Immunoglobulin-like domains with increased half-lives |
GB9704444D0 (en) * | 1997-03-04 | 1997-04-23 | Isis Innovation | Non-invasive prenatal diagnosis |
US7368531B2 (en) | 1997-03-07 | 2008-05-06 | Human Genome Sciences, Inc. | Human secreted proteins |
US20070224663A1 (en) | 1997-03-07 | 2007-09-27 | Human Genome Sciences, Inc. | Human Secreted Proteins |
US7411051B2 (en) | 1997-03-07 | 2008-08-12 | Human Genome Sciences, Inc. | Antibodies to HDPPA04 polypeptide |
WO2000078961A1 (en) | 1999-06-23 | 2000-12-28 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
WO2000012708A2 (en) | 1998-09-01 | 2000-03-09 | Genentech, Inc. | Further pro polypeptides and sequences thereof |
US20030073129A1 (en) | 1998-09-01 | 2003-04-17 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
US20030022298A1 (en) | 1997-09-15 | 2003-01-30 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
US20020127584A1 (en) | 1997-09-18 | 2002-09-12 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
US20050196832A1 (en) | 1997-09-18 | 2005-09-08 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
US20030027272A1 (en) | 1997-09-18 | 2003-02-06 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
US20030008352A1 (en) | 1997-09-18 | 2003-01-09 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
US20030166104A1 (en) | 1997-09-18 | 2003-09-04 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
US20030027262A1 (en) | 1997-09-18 | 2003-02-06 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
US7160985B2 (en) * | 1997-10-29 | 2007-01-09 | Genentech, Inc. | Pro180 polypeptide |
US6194551B1 (en) | 1998-04-02 | 2001-02-27 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants |
US20030022835A1 (en) | 1998-04-29 | 2003-01-30 | Genesis Research And Development Corporation Limited | Compositions isolated from skin cells and methods for their use |
US20030040471A1 (en) | 1998-04-29 | 2003-02-27 | Watson James D. | Compositions isolated from skin cells and methods for their use |
US6852318B1 (en) * | 1998-05-08 | 2005-02-08 | The Regents Of The University Of California | Methods for detecting and inhibiting angiogenesis |
JP3428441B2 (ja) | 1998-05-15 | 2003-07-22 | エーザイ株式会社 | タイトジャンクション構成膜蛋白質クローディンファミリー |
WO1999060160A1 (en) * | 1998-05-21 | 1999-11-25 | Diadexus Llc | A novel method of diagnosing, monitoring, and staging lung cancer |
US7319008B2 (en) | 1998-06-02 | 2008-01-15 | Genentech, Inc. | Nucleic acid underexpressed in melanoma |
US7351543B2 (en) | 1998-06-02 | 2008-04-01 | Genentech, Inc. | Antibodies to a polypeptide encoded by a nucleic acid underexpressed in melanoma |
WO1999064452A1 (en) * | 1998-06-11 | 1999-12-16 | Smithkline Beecham Corporation | Gpr35a receptor |
JP2002519064A (ja) * | 1998-07-02 | 2002-07-02 | インサイト・ファーマスーティカルズ・インコーポレイテッド | 神経伝達関連タンパク質 |
JP3524061B2 (ja) | 1998-08-04 | 2004-04-26 | ダイアデクスアス・インコーポレーテッド | 肺がんを診断し、モニターし、病期決定し、画像化し、そして処置する新規な方法 |
US20030166132A1 (en) | 1998-08-26 | 2003-09-04 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
US20030109672A1 (en) | 1998-09-01 | 2003-06-12 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
US20030082626A1 (en) | 1998-09-01 | 2003-05-01 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
US20050181478A1 (en) | 1998-09-01 | 2005-08-18 | Baker Kevin P. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
US7538086B2 (en) | 1998-09-01 | 2009-05-26 | Genentech, Inc. | PRO1303 polypeptides |
EP1112364A2 (en) * | 1998-09-16 | 2001-07-04 | ZymoGenetics, Inc. | Stomach polypeptide zsig28 |
IL141535A0 (en) | 1998-09-16 | 2002-03-10 | Genentech Inc | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
US6355623B2 (en) * | 1998-09-24 | 2002-03-12 | Hopital-Sainte-Justine | Method of treating IBD/Crohn's disease and related conditions wherein drug metabolite levels in host blood cells determine subsequent dosage |
CA2345377A1 (en) | 1998-10-06 | 2000-04-13 | Curagen Corporation | Novel secreted proteins and polynucleotides encoding them |
US7399834B2 (en) | 1998-10-07 | 2008-07-15 | Genentech, Inc. | Anti-PRO1558 antibodies |
WO2000023603A2 (en) | 1998-10-21 | 2000-04-27 | Arch Development Corporation | Methods of treatment of type 2 diabetes |
EP1124850A4 (en) * | 1998-10-28 | 2005-10-19 | Human Genome Sciences Inc | 12 HUMAN SECRETATED PROTEINS |
US20030190669A1 (en) | 1998-12-30 | 2003-10-09 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
US7026449B2 (en) | 1999-01-05 | 2006-04-11 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
US7507404B2 (en) | 1999-03-08 | 2009-03-24 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
CA2361849A1 (en) | 1999-03-08 | 2000-09-14 | Genentech, Inc. | Promotion or inhibition of angiogenesis and cardiovascularization |
EP1263948A2 (en) | 1999-03-08 | 2002-12-11 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
JP4174183B2 (ja) | 1999-03-23 | 2008-10-29 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 分泌及び膜貫通ポリペプチドとそれをコードする核酸 |
WO2000058473A2 (en) | 1999-03-31 | 2000-10-05 | Curagen Corporation | Nucleic acids including open reading frames encoding polypeptides; 'orfx' |
US20080286821A1 (en) | 1999-05-14 | 2008-11-20 | Eaton Dan L | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
ES2287020T3 (es) | 1999-06-02 | 2007-12-16 | Genentech, Inc. | Procedimiento y composiciones para inhibir el crecimiento de celulas neoplasicas. |
AU2215300A (en) | 1999-06-02 | 2000-12-28 | Genentech Inc. | Methods and compositions for inhibiting neoplastic cell growth |
AU3246100A (en) | 1999-06-02 | 2000-12-28 | Genentech Inc. | Methods and compositions for inhibiting neoplastic cell growth |
CA2372511C (en) | 1999-06-15 | 2011-11-22 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
AU2883900A (en) | 1999-07-07 | 2001-01-30 | Genentech Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
AU6321400A (en) * | 1999-08-17 | 2001-03-13 | Protegene Inc. | Human proteins having hydrophobic domains and dnas encoding these proteins |
CA2380355A1 (en) * | 1999-09-01 | 2001-03-08 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
US7442776B2 (en) * | 1999-10-08 | 2008-10-28 | Young David S F | Cancerous disease modifying antibodies |
WO2001027257A1 (en) * | 1999-10-14 | 2001-04-19 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Tumor antigen derived gene-16 (tadg-16): a novel extracellular serine protease and uses thereof |
EP1690872A3 (en) | 1999-12-01 | 2006-08-23 | Genentech, Inc. | Composition and methods for the diagnosis of tumours |
US6380362B1 (en) | 1999-12-23 | 2002-04-30 | Genesis Research & Development Corporation Ltd. | Polynucleotides, polypeptides expressed by the polynucleotides and methods for their use |
EP1244784A2 (en) | 2000-01-06 | 2002-10-02 | Genentech, Inc. | Methods and compositions for inhibiting neoplastic cell growth |
WO2001055326A2 (en) | 2000-01-31 | 2001-08-02 | Human Genome Sciences, Inc. | Nucleic acids, proteins, and antibodies |
US20030050231A1 (en) | 2000-01-31 | 2003-03-13 | Rosen Craig A. | Nucleic acids, proteins, and antibodies |
WO2001055387A1 (en) | 2000-01-31 | 2001-08-02 | Human Genome Sciences, Inc. | Nucleic acids, proteins, and antibodies |
CA2396719A1 (en) * | 2000-01-31 | 2001-08-02 | Human Genome Sciences, Inc. | 22 human secreted proteins |
WO2001061055A2 (en) * | 2000-02-17 | 2001-08-23 | Diadexus, Inc. | Methods for diagnosing, monitoring, staging, imaging and treating lung cancer via lung cancer specific genes |
NZ521430A (en) * | 2000-02-22 | 2004-04-30 | Corixa Corp | Compositions comprising 1-4 antigenic peptide fragments of the Wilms' tumour gene product for treatment or prevention of malignant mesothelioma |
AU6802801A (en) * | 2000-03-01 | 2001-09-24 | Genentech Inc | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
US20030165831A1 (en) | 2000-03-21 | 2003-09-04 | John Lee | Novel genes, compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of ovarian cancer |
US6436703B1 (en) * | 2000-03-31 | 2002-08-20 | Hyseq, Inc. | Nucleic acids and polypeptides |
AU2001259063A1 (en) | 2000-04-12 | 2001-10-30 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
AU2001260847A1 (en) | 2000-05-24 | 2001-12-03 | Genesis Research And Development Corporation Limited | Compositions isolated from skin cells and methods for their use |
EP1301524A1 (en) * | 2000-06-30 | 2003-04-16 | Human Genome Sciences, Inc. | B7-like polynucleotides, polypeptides, and antibodies |
WO2002002621A2 (en) | 2000-06-30 | 2002-01-10 | Zymogenetics, Inc. | Mammalian secreted proteins |
EP1354040A2 (en) * | 2000-07-20 | 2003-10-22 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
EA013564B1 (ru) | 2000-08-03 | 2010-06-30 | Терапеутик Хьюман Поликлоналз Инк. | Гуманизированный иммуноглобулин и содержащая его фармацевтическая композиция |
DE60128701T2 (de) | 2000-08-15 | 2008-02-07 | Immunex Corp., Thousand Oaks | Claudin polypeptide |
EP1309679A2 (en) * | 2000-08-16 | 2003-05-14 | Chiron Corporation | Human genes and gene expression products |
EP1328635A2 (en) * | 2000-08-28 | 2003-07-23 | Diadexus, Inc. | Compositions and methods relating to lung specific genes |
CN1452633A (zh) | 2000-09-08 | 2003-10-29 | 先灵公司 | 哺乳动物基因、相关试剂及方法 |
JP2004537254A (ja) * | 2000-09-15 | 2004-12-16 | インサイト・ゲノミックス・インコーポレイテッド | 輸送体及びイオンチャネル |
WO2002022885A1 (en) | 2000-09-18 | 2002-03-21 | Thomas Jefferson University | Compositions and methods for identifying and targeting stomach and esophageal cancer cells |
WO2002046224A2 (en) * | 2000-10-26 | 2002-06-13 | Diadexus, Inc. | Compositions and methods relating to lung specific genes and proteins |
AU2002220265A1 (en) * | 2000-11-03 | 2002-05-15 | University Of Vermont And State Agricultural College | Compositions for inhibiting grb7 |
US7041870B2 (en) | 2000-11-30 | 2006-05-09 | Medarex, Inc. | Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies |
WO2002061087A2 (en) * | 2000-12-19 | 2002-08-08 | Lifespan Biosciences, Inc. | Antigenic peptides, such as for g protein-coupled receptors (gpcrs), antibodies thereto, and systems for identifying such antigenic peptides |
WO2002068579A2 (en) | 2001-01-10 | 2002-09-06 | Pe Corporation (Ny) | Kits, such as nucleic acid arrays, comprising a majority of human exons or transcripts, for detecting expression and other uses thereof |
US7754208B2 (en) | 2001-01-17 | 2010-07-13 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
US20030133939A1 (en) | 2001-01-17 | 2003-07-17 | Genecraft, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
EP1368499A2 (en) | 2001-01-29 | 2003-12-10 | Phase-1 Molecular Toxicology Inc. | Rat toxicologically relevant genes and uses thereof |
JP3948702B2 (ja) * | 2001-02-14 | 2007-07-25 | 社団法人畜産技術協会 | ウシのClaudin−16欠損症タイプ2の遺伝子診断法 |
CA2439383A1 (en) * | 2001-02-26 | 2002-09-06 | Arena Pharmaceuticals, Inc. | Endogenous and non-endogenous versions of human g protein-coupled receptors |
US20030109434A1 (en) * | 2001-03-19 | 2003-06-12 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of kidney cancer |
US20030152939A1 (en) | 2001-04-09 | 2003-08-14 | Glennda Smithson | Novel secreted proteins and polynucleotides encoding them |
US20060084794A1 (en) | 2001-04-12 | 2006-04-20 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
JP2003000249A (ja) | 2001-05-10 | 2003-01-07 | Daiichi Fine Chemical Co Ltd | クローディンによるMT−MMPsを介したproMMP−2活性化 |
AU2002330714A1 (en) | 2001-05-30 | 2003-01-02 | Biomedical Center | In silico screening for phenotype-associated expressed sequences |
WO2002098891A2 (en) * | 2001-06-05 | 2002-12-12 | Exelixis, Inc. | GADs AS MODIFIERS OF THE p53 PATHWAY AND METHODS OF USE |
EP1493028A4 (en) | 2001-07-06 | 2006-06-14 | Genentech Inc | PHAGEN DISPLAY PRESENTED LIGANDS OF THE PDZ DOMAIN |
AU2002321903A1 (en) | 2001-08-03 | 2003-02-24 | Arbor Vita Corporation | Molecular interactions in cells |
WO2004045535A2 (en) | 2002-11-14 | 2004-06-03 | Arbor Vita Corporation | Molecular interactions in neurons |
US7202335B2 (en) | 2001-12-06 | 2007-04-10 | Genentech, Inc. | PRO300 polypeptides |
US20040002587A1 (en) | 2002-02-20 | 2004-01-01 | Watkins Jeffry D. | Fc region variants |
CA2379661A1 (en) | 2002-03-28 | 2003-09-28 | Kursad Turksen | Paracellular drug delivery system |
WO2003101283A2 (en) | 2002-06-04 | 2003-12-11 | Incyte Corporation | Diagnostics markers for lung cancer |
WO2004029629A1 (en) | 2002-09-27 | 2004-04-08 | Janssen Pharmaceutica N.V. | N-11 truncated amyloid-beta nomoclonal antibodies, compositions, methods and uses |
DK2345671T3 (en) | 2002-09-27 | 2016-02-15 | Xencor Inc | Optimized Fc variants and methods for their formation |
HUE025086T2 (en) | 2002-10-10 | 2016-02-29 | Merck Patent Gmbh | Pharmaceutical preparations for ERB-B1 receptor |
EP3284753B1 (en) | 2002-10-17 | 2019-06-05 | Genmab A/S | Human monoclonal antibodies against cd20 for use in the treatment of multiple sclerosis |
DE10254601A1 (de) | 2002-11-22 | 2004-06-03 | Ganymed Pharmaceuticals Ag | Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung |
EP1430902A1 (en) | 2002-12-20 | 2004-06-23 | Mondobiotech Laboratories Anstalt | Pharmaceutical composition of interferon gamma with molecular diagnostics for the improved treatment of asthma bronchiale |
WO2004063351A2 (en) | 2003-01-09 | 2004-07-29 | Macrogenics, Inc. | IDENTIFICATION AND ENGINEERING OF ANTIBODIES WITH VARIANT Fc REGIONS AND METHODS OF USING SAME |
WO2004063355A2 (en) | 2003-01-10 | 2004-07-29 | Protein Design Labs, Inc. | Novel methods of diagnosis of metastatic cancer, compositions and methods of screening for modulators of matastatic cancer |
US7393531B2 (en) * | 2003-01-21 | 2008-07-01 | Arius Research Inc. | Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of MCSP |
RU2005137325A (ru) | 2003-05-31 | 2006-09-10 | Микромет Аг (De) | Фармацевтическая композиция, содержащая конструкт, специфичный к ерсам |
WO2004106381A1 (en) | 2003-05-31 | 2004-12-09 | Micromet Ag | Pharmaceutical compositions comprising bispecific anti-cd3, anti-cd19 antibody constructs for the treatment of b-cell related disorders |
EP2481814A3 (en) | 2003-06-09 | 2012-10-10 | The Regents of the University of Michigan | Compositions and methods for treating and diagnosing cancer |
US20060240441A1 (en) | 2003-10-03 | 2006-10-26 | Bayer Pharmaceuticals Corporation | Gene expression profiles and methods of use |
NZ546173A (en) | 2003-10-16 | 2009-04-30 | Micromet Ag | Multispecific deimmunized CD3-binders |
DE10354601B3 (de) | 2003-11-21 | 2005-06-23 | Chiropro Gmbh | Gelenkprothese für Fingerglieder |
WO2005052182A2 (en) | 2003-11-26 | 2005-06-09 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | A method of analyzing plasma membrane protein content of cells |
EP1709084A4 (en) | 2003-12-23 | 2008-05-28 | Nono Inc | POLYPEPTIDES FOR MODULATING BINDING OF TRP-CHANNEL PROTEINS AND TRP-ASSOCIATED PROTEINS |
WO2005076939A2 (en) | 2004-02-09 | 2005-08-25 | University Of Kentucky Research Foundation | Assay and method for diagnosing and treating alzheimer’s disease |
WO2005082398A2 (en) | 2004-02-26 | 2005-09-09 | Ohio University | Diagnosis of hyperinsulinemia and type ii diabetes and protection against same based on genes differentially expressed in muscle cells |
BRPI0509411A (pt) | 2004-04-16 | 2007-09-04 | Emisphere Tech Inc | método para tratar doença maligna, hipercalcemia de malignidade e metástases ósseas osteolìticas, sal de mesilato, composição e método de administração de agente ativo e bisfosfonato |
US20050255041A1 (en) | 2004-05-13 | 2005-11-17 | Arius Research, Inc. | Cancerous disease modifying antibodies |
DE102004024617A1 (de) | 2004-05-18 | 2005-12-29 | Ganymed Pharmaceuticals Ag | Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung |
WO2005114221A2 (en) | 2004-05-21 | 2005-12-01 | The Institute For Systems Biology | Compositions and methods for quantification of serum glycoproteins |
WO2006023121A1 (en) | 2004-07-27 | 2006-03-02 | Ohio University | Diagnosis of hyperinsulinemia and type ii diabetes and protection against same based on genes differentially expressed in white adipose tissue (13) |
DE102004042822A1 (de) | 2004-08-31 | 2006-03-16 | Technische Universität Dresden | Verbindungen und Methoden zur Behandlung, Diagnose und Prognose bei Pankreaserkrankungen |
FR2876705B1 (fr) | 2004-10-19 | 2008-12-12 | Biomerieux Sa | Procede pour le diagnostic d'une intolerance a l'aspirine |
US20070072175A1 (en) | 2005-05-13 | 2007-03-29 | Biogen Idec Ma Inc. | Nucleotide array containing polynucleotide probes complementary to, or fragments of, cynomolgus monkey genes and the use thereof |
WO2007005800A1 (en) | 2005-06-30 | 2007-01-11 | Abbott Laboratories | Endoprosthesis having foot extensions |
ATE549624T1 (de) | 2005-07-01 | 2012-03-15 | Arbor Vita Corp | Verfahren und zusammensetzungen zur diagnose und behandlung von grippe |
AU2006280321A1 (en) | 2005-08-15 | 2007-02-22 | Genentech, Inc. | Gene disruptions, compositions and methods relating thereto |
WO2007027867A2 (en) | 2005-08-31 | 2007-03-08 | Cell Signaling Technology, Inc. | Reagents for the detection of protein phosphorylation in carcinoma signaling pathways |
DK1930414T3 (da) | 2005-09-08 | 2012-10-22 | Medinet Co Ltd | Fremgangsmåde til aktiveringsbehandling af antigenpræsenterende celle |
JP2009508493A (ja) | 2005-09-19 | 2009-03-05 | ベリデックス・エルエルシー | すい臓がんを診断するための方法 |
DE102005046490A1 (de) | 2005-09-28 | 2007-03-29 | Johannes-Gutenberg-Universität Mainz | Modifikationen von RNA, die zu einer erhöhten Transkriptstabilität und Translationseffizienz führen |
AU2006304605A1 (en) | 2005-10-17 | 2007-04-26 | Institute For Systems Biology | Tissue-and serum-derived glycoproteins and methods of their use |
EP1790664A1 (en) | 2005-11-24 | 2007-05-30 | Ganymed Pharmaceuticals AG | Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer |
US8394926B2 (en) | 2005-12-21 | 2013-03-12 | Micromet Ag | Pharmaceutical compositions with resistance to soluble CEA |
EP1981539B1 (en) | 2006-02-09 | 2014-07-23 | Amgen Research (Munich) GmbH | Treatment of metastatic breast cancer |
TWI388568B (zh) | 2006-02-10 | 2013-03-11 | Genentech Inc | 抗fgf19抗體及其使用方法 |
MX2008012279A (es) | 2006-03-29 | 2008-10-08 | Genentech Inc | Diagnostico y tratamientos para tumores. |
WO2008013954A2 (en) | 2006-07-27 | 2008-01-31 | Cell Signaling Technology, Inc. | Tyrosine phosphorylation sites |
EP2520935A3 (en) | 2006-08-09 | 2013-02-13 | Homestead Clinical Corporation | Organ-specific proteins and methods of their use |
US8450057B2 (en) | 2006-08-14 | 2013-05-28 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Diagnostic tests using gene expression ratios |
EP2074226A2 (en) | 2006-09-19 | 2009-07-01 | Novartis AG | Biomarkers of target modulation, efficacy, diagnosis and/or prognosis for raf inhibitors |
WO2008043561A2 (en) | 2006-10-11 | 2008-04-17 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Influenza targets |
EP2097538A4 (en) | 2006-12-07 | 2011-11-30 | Switchgear Genomics | TRANSCRIPTION REAGULATION ELEMENTS OF BIOLOGICAL PATHS, TOOLS AND METHODS |
EP2104734A2 (en) | 2006-12-08 | 2009-09-30 | Asuragen, INC. | Mir-20 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention |
BRPI0807227A2 (pt) | 2007-02-01 | 2019-01-22 | Veridex Llc | métodos e materiais para identificação da origem de um carcinoma de origem primária desconhecida |
EP1970384A1 (en) | 2007-03-14 | 2008-09-17 | Ganymed Pharmaceuticals AG | Monoclonal antibodies for treatment of cancer |
US20090004213A1 (en) | 2007-03-26 | 2009-01-01 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Combination therapy using active immunotherapy |
EP1983002A3 (en) | 2007-04-19 | 2009-03-11 | Peter Hornbeck | Tyrosine phosphorylation sites and antibodies specific for them |
EP1997832A1 (en) | 2007-05-29 | 2008-12-03 | Ganymed Pharmaceuticals AG | Monoclonal antibodies against Claudin-18 for treatment of cancer |
CN101801419A (zh) | 2007-06-08 | 2010-08-11 | 米尔纳疗法公司 | 作为治疗干预的靶标的miR-34调控的基因和路径 |
WO2008152822A1 (ja) | 2007-06-15 | 2008-12-18 | Medinet Co., Ltd. | 医薬 |
US20090274698A1 (en) | 2007-07-06 | 2009-11-05 | Shripad Bhagwat | Combination anti-cancer therapy |
WO2009015050A2 (en) | 2007-07-20 | 2009-01-29 | The Gov. Of The U.S.A. As Represented By The Secretary Of The Department Of Health & Human Services | Gene expression profile for predicting ovarian cancer patient survival |
WO2009035497A2 (en) | 2007-08-08 | 2009-03-19 | Savidge Tor C | Disease related cysteine modifications and uses thereof |
EP2036987A1 (en) | 2007-09-17 | 2009-03-18 | Siemens Healthcare Diagnostics GmbH | Molecular markers for tumor cell content in tissue samples |
WO2009038090A1 (ja) | 2007-09-19 | 2009-03-26 | Suntory Holdings Limited | セサミン類とアラキドン酸類を含有する組成物 |
AU2008309520A1 (en) | 2007-10-12 | 2009-04-16 | The Provost, Fellows And Scholars Of The College Of The Holy And Undivided Trinity Of Queen Elizabeth, Near Dublin | Method for opening tight junctions |
WO2009102367A2 (en) | 2007-11-19 | 2009-08-20 | The Regents Of The University Of Colorado | Tight junction protein modulators and uses thereof |
JP5596559B2 (ja) | 2008-01-28 | 2014-09-24 | メディミューン リミテッド | 安定化アンジオポエチン2抗体とその用途 |
WO2009148593A1 (en) | 2008-06-02 | 2009-12-10 | Nsabp Foundation, Inc. | Identification and use of prognostic and predictive markers in cancer treatment |
US7989597B2 (en) | 2008-06-20 | 2011-08-02 | Oklahoma Medical Research Foundation | Immunogenic memapsin 2 β-secretase peptides and methods of use |
WO2010009794A1 (en) | 2008-07-25 | 2010-01-28 | Merck Patent Gmbh, | Method of determination of receptor binding saturation effected by monoclonal antibodies |
WO2010046889A1 (en) | 2008-10-23 | 2010-04-29 | Quark Pharmaceuticals, Inc. | Methods for delivery of sirna to bone marrow cells and uses thereof |
CN101381524A (zh) | 2008-10-24 | 2009-03-11 | 南开大学 | 单层氧化石墨与水溶性高分子增强复合材料 |
SI3330293T1 (sl) | 2008-11-07 | 2019-10-30 | Amgen Res Munich Gmbh | Zdravljenje pediatrične akutne limfoblastne levkemije z bispecifičnimi protitelesi proti CD3XCD19 |
US20110286916A1 (en) | 2008-11-20 | 2011-11-24 | Jose Miguel Aste-Amezaga | Generation and characterization of anti-notch antibodies for therapeutic and diagnostic use |
GB0904957D0 (en) | 2009-03-23 | 2009-05-06 | Univ Erasmus Medical Ct | Tumour gene profile |
US20120028816A1 (en) | 2009-03-31 | 2012-02-02 | Warren Stephen T | Methods and systems for screening for and diagnosing dna methylation associated with autism spectrum disorders |
CN101584860A (zh) | 2009-04-27 | 2009-11-25 | 西安杰诺瓦生物科技有限公司 | 重组人Claudin18.2肿瘤疫苗及其制备方法 |
WO2010141093A2 (en) | 2009-06-04 | 2010-12-09 | The University Of Maryland, Baltimore | Co-signaling methods for treating cancers |
JP2013505730A (ja) | 2009-10-01 | 2013-02-21 | チップディーエックス エルエルシー | 患者を分類するためのシステムおよび方法 |
BR112012011143B1 (pt) | 2009-11-11 | 2020-05-19 | Ganymed Pharmaceuticals Ag | "anticorpos específicos para claudina 6 (cldn6)". |
JP2013512000A (ja) | 2009-12-01 | 2013-04-11 | コンペンディア バイオサイエンス, インコーポレイテッド | 癌の分類 |
WO2011090005A1 (ja) | 2010-01-19 | 2011-07-28 | 協和発酵キリン株式会社 | 大腸癌の治療用医薬および治療方法 |
EP2547695B1 (en) | 2010-03-16 | 2018-05-09 | Biontech Protein Therapeutics GmbH | Tumor vaccination involving a humoral immune response against self-protein cldn18.2 |
EP2366709A1 (en) | 2010-03-16 | 2011-09-21 | BioNTech AG | Tumor vaccination involving a humoral immune response against self-proteins |
US8945847B2 (en) | 2010-05-24 | 2015-02-03 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. | Methods and kits for ascertaining biosafety of an agent |
EP2576824A2 (en) | 2010-06-07 | 2013-04-10 | Roche Diagnostics GmbH | Gene expression markers for predicting response to interleukin-6 receptor-inhibiting monoclonal antibody drug treatment |
WO2011163627A2 (en) | 2010-06-24 | 2011-12-29 | Integrated Diagnostics, Inc. | Organ specific diagnostic panels and methods for identification of organ specific panel proteins |
WO2012070014A2 (en) | 2010-11-26 | 2012-05-31 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. | Identification of novel cell surface markers for pancreatic progenitor cells and definite endodermal cells |
WO2012096272A1 (ja) | 2011-01-12 | 2012-07-19 | 森永乳業株式会社 | 免疫調節作用を有する乳を産生する食餌のスクリーニング法 |
DE102011005235B4 (de) | 2011-03-08 | 2017-05-24 | Sirs-Lab Gmbh | Verfahren zum Identifizieren einer Teilmenge von Polynucleotiden aus einer dem Humangenom entsprechenden Ausgangsmenge von Polynucleotiden zur in vitro Bestimmung eines Schweregrads der Wirtsantwort eines Patienten |
DE18200782T1 (de) | 2012-04-02 | 2021-10-21 | Modernatx, Inc. | Modifizierte polynukleotide zur herstellung von proteinen im zusammenhang mit erkrankungen beim menschen |
WO2013167153A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-14 | Ganymed Pharmaceuticals Ag | Antibodies useful in cancer diagnosis |
WO2013174403A1 (en) * | 2012-05-23 | 2013-11-28 | Ganymed Pharmaceuticals Ag | Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer |
WO2013174404A1 (en) | 2012-05-23 | 2013-11-28 | Ganymed Pharmaceuticals Ag | Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer |
WO2014025199A2 (ko) | 2012-08-09 | 2014-02-13 | 주식회사 한독 | 스테필로코칼 엔테로톡신 유래의 초항원 변이체 및 이에 표적 특이적 폴리펩타이드가 연결된 융합단백질 및 그 용도 |
WO2014025198A2 (ko) | 2012-08-09 | 2014-02-13 | 주식회사 한독 | Lfa3 변이체 및 상기 변이체 또는 lfa3 cd2 결합영역과 이에 표적 특이적 폴리펩타이드가 연결된 융합단백질 및 그 용도 |
EP2888391A4 (en) | 2012-08-24 | 2016-09-14 | Univ Utah Res Found | COMPOSITIONS AND METHODS RELATING TO BLOOD BIOMARKERS OF BREAST CANCER |
US9856532B2 (en) | 2012-09-07 | 2018-01-02 | Institute For Systems Biology | Markers and methods for detecting posttraumatic stress disorder (PTSD) |
US20140073524A1 (en) | 2012-09-07 | 2014-03-13 | Institute For Systems Biology | Markers and methods for detecting posttraumatic stress disorder (ptsd) |
AU2013347184B2 (en) | 2012-11-13 | 2018-06-14 | Astellas Pharma Inc. | Agents for treatment of claudin expressing cancer diseases |
WO2014127785A1 (en) * | 2013-02-20 | 2014-08-28 | Ganymed Pharmaceuticals Ag | Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer |
WO2014146672A1 (en) * | 2013-03-18 | 2014-09-25 | Ganymed Pharmaceuticals Ag | Therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer |
JP6241403B2 (ja) | 2014-10-24 | 2017-12-06 | 横浜ゴム株式会社 | リン酸変性ポリマー |
-
2002
- 2002-11-22 DE DE10254601A patent/DE10254601A1/de not_active Ceased
-
2003
- 2003-11-21 CN CN201610244960.1A patent/CN106581694A/zh active Pending
- 2003-11-21 EP EP03773719.4A patent/EP1563068B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-11-21 MX MXPA05005423A patent/MXPA05005423A/es active IP Right Grant
- 2003-11-21 EP EP20110007321 patent/EP2400010A3/de not_active Withdrawn
- 2003-11-21 JP JP2004554414A patent/JP2006516190A/ja active Pending
- 2003-11-21 EP EP11007307.9A patent/EP2399996B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-11-21 SG SG10201705641SA patent/SG10201705641SA/en unknown
- 2003-11-21 US US10/537,002 patent/US7527933B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-11-21 EP EP20110007317 patent/EP2400006A3/de not_active Ceased
- 2003-11-21 CA CA002505757A patent/CA2505757A1/en not_active Abandoned
- 2003-11-21 SG SG2008036014A patent/SG180019A1/en unknown
- 2003-11-21 SI SI200332486A patent/SI2400018T1/sl unknown
- 2003-11-21 PL PL377240A patent/PL219018B1/pl unknown
- 2003-11-21 EP EP20110007328 patent/EP2400017A3/de not_active Withdrawn
- 2003-11-21 PL PL392311A patent/PL219093B1/pl unknown
- 2003-11-21 EP EP11007308A patent/EP2399997A3/de not_active Withdrawn
- 2003-11-21 KR KR1020177006922A patent/KR20170031804A/ko active IP Right Grant
- 2003-11-21 CA CA3000243A patent/CA3000243C/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-11-21 KR KR1020137031249A patent/KR101604788B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2003-11-21 EP EP11007329.3A patent/EP2400018B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-11-21 ES ES03773719.4T patent/ES2675785T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-11-21 EP EP20110007319 patent/EP2400008A3/de not_active Withdrawn
- 2003-11-21 KR KR1020127025528A patent/KR101507976B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2003-11-21 EP EP11007323A patent/EP2400012A3/de not_active Withdrawn
- 2003-11-21 EP EP20110007322 patent/EP2400011A3/de not_active Withdrawn
- 2003-11-21 EP EP11007310A patent/EP2399999A3/de not_active Withdrawn
- 2003-11-21 KR KR1020117028601A patent/KR101483736B1/ko active IP Right Grant
- 2003-11-21 PL PL392310A patent/PL219043B1/pl unknown
- 2003-11-21 CN CN2003801037821A patent/CN1714150B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2003-11-21 EP EP11007306A patent/EP2399995A3/de not_active Withdrawn
- 2003-11-21 EP EP18157559.8A patent/EP3348570A1/de not_active Ceased
- 2003-11-21 EP EP11007312.9A patent/EP2400001B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-11-21 EP EP20110007326 patent/EP2400015A3/de not_active Withdrawn
- 2003-11-21 NZ NZ590225A patent/NZ590225A/en not_active IP Right Cessation
- 2003-11-21 ES ES11007329.3T patent/ES2583754T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-11-21 EP EP11007314A patent/EP2400003A3/de not_active Withdrawn
- 2003-11-21 NZ NZ539649A patent/NZ539649A/en not_active IP Right Cessation
- 2003-11-21 KR KR1020147025289A patent/KR101551621B1/ko active IP Right Grant
- 2003-11-21 WO PCT/EP2003/013091 patent/WO2004047863A2/de active Application Filing
- 2003-11-21 CN CN201310159717.6A patent/CN103381274B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2003-11-21 EP EP20110007320 patent/EP2400009A3/de not_active Withdrawn
- 2003-11-21 PT PT110073293T patent/PT2400018T/pt unknown
- 2003-11-21 NZ NZ595896A patent/NZ595896A/xx not_active IP Right Cessation
- 2003-11-21 EP EP11007325A patent/EP2400014A3/de not_active Withdrawn
- 2003-11-21 KR KR1020157004401A patent/KR101718117B1/ko active Application Filing
- 2003-11-21 EP EP11007315A patent/EP2400004A3/de not_active Withdrawn
- 2003-11-21 HU HUE11007329A patent/HUE027825T2/en unknown
- 2003-11-21 EP EP20110007327 patent/EP2400016A3/de not_active Withdrawn
- 2003-11-21 EP EP20110007318 patent/EP2400007A3/de not_active Withdrawn
- 2003-11-21 EP EP11007313A patent/EP2400002A3/de not_active Withdrawn
- 2003-11-21 EP EP11007316A patent/EP2400005A3/de not_active Withdrawn
- 2003-11-21 CN CN2010102791184A patent/CN101966337A/zh active Pending
- 2003-11-21 MX MX2012004983A patent/MX344216B/es unknown
- 2003-11-21 EP EP11007324A patent/EP2400013A3/de not_active Withdrawn
- 2003-11-21 EP EP11007309A patent/EP2399998A3/de not_active Withdrawn
- 2003-11-21 BR BR0316435-7A patent/BR0316435A/pt not_active Application Discontinuation
- 2003-11-21 SG SG2012077905A patent/SG2012077905A/en unknown
- 2003-11-21 NZ NZ578130A patent/NZ578130A/en not_active IP Right Cessation
- 2003-11-21 KR KR1020057009252A patent/KR20050083962A/ko active Search and Examination
- 2003-11-21 EP EP11007330A patent/EP2400019A3/de not_active Withdrawn
- 2003-11-21 EP EP11007311A patent/EP2400000A3/de not_active Withdrawn
- 2003-11-21 AU AU2003282101A patent/AU2003282101B2/en not_active Ceased
-
2005
- 2005-04-21 IL IL168168A patent/IL168168A/en active IP Right Grant
-
2008
- 2008-12-03 US US12/326,997 patent/US8088588B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-04-14 US US12/423,153 patent/US8586047B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2009-10-01 IL IL201278A patent/IL201278A/en active IP Right Grant
-
2010
- 2010-02-17 JP JP2010032059A patent/JP5726422B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2010-06-10 AU AU2010202440A patent/AU2010202440B2/en not_active Ceased
-
2011
- 2011-01-07 JP JP2011001695A patent/JP5904478B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2011-11-15 US US13/296,620 patent/US8637012B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2012
- 2012-06-19 HK HK12106007.4A patent/HK1165480A1/zh not_active IP Right Cessation
- 2012-10-16 JP JP2012228760A patent/JP2013046626A/ja active Pending
-
2013
- 2013-10-01 US US14/043,109 patent/US20140186338A1/en not_active Abandoned
-
2014
- 2014-03-04 IL IL231296A patent/IL231296A0/en unknown
- 2014-03-04 IL IL231295A patent/IL231295A0/en unknown
- 2014-03-04 IL IL231294A patent/IL231294A0/en unknown
- 2014-03-04 IL IL231298A patent/IL231298A0/en unknown
- 2014-03-04 IL IL231297A patent/IL231297A0/en unknown
- 2014-11-06 JP JP2014225894A patent/JP6182127B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2015
- 2015-08-07 US US14/821,411 patent/US20150337052A1/en not_active Abandoned
-
2016
- 2016-02-10 JP JP2016023703A patent/JP2016104800A/ja active Pending
- 2016-07-15 CY CY20161100686T patent/CY1117786T1/el unknown
-
2017
- 2017-07-14 US US15/650,092 patent/US10414824B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2017-08-04 JP JP2017151213A patent/JP2017206551A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR101718117B1 (ko) | 종양에서 특이적으로 발현되는 유전 산물 및 그의 용도 | |
CA2563666C (en) | Differentially expressed claudin-18 variants in tumors and use thereof | |
JP5639989B2 (ja) | 診断および治療のための腫瘍関連細胞表面抗原の同定 | |
AU2016203425C1 (en) | Genetic products differentially expressed in tumors and the use thereof | |
WO2000004142A1 (en) | Mucins |