CN105463094B - 直肠腺癌的诊治标记物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种直肠腺癌的诊治标记物SLC26A9。本发明通过实验证明SLC26A9在转移直肠腺癌组织中呈高表达，通过检测SLC26A9的表达水平可以预判直肠腺癌转移的风险、诊断直肠腺癌是否发生转移、判断直肠腺癌是否复发，本发明同时公开了SLC26A9基因在制备抑制/预防直肠腺癌转移的药物中的应用。

Description

直肠腺癌的诊治标记物
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及SLC26A9基因在直肠腺癌诊断、治疗中的用途。
背景技术
直肠腺癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一。近年来，随着我国人民生活水平的提高，饮食结构的改变，人口老龄化以及直肠腺癌普查的开展，直肠腺癌在我国的发病率呈逐年上升的趋势，严重威胁着人们的健康。而且由于直肠腺癌早期大多数没有特殊症状或根本没有症状，因此直肠腺癌的诊断常被延误。当贫血、消瘦、便血、腹痛等肿瘤症状出现时，癌症常常已经到了中晚期。直肠腺癌的发病率和死亡率均较高。据统计，世界范围内直肠腺癌患者每年新增约123万人，其中约有60万患者死亡。直肠腺癌生物学行为复杂，其发生发展是一个多阶段、多因素的过程。
目前临床上直肠腺癌早期诊断主要依赖于直肠指检、血CEA检测、粪便隐血检查、直肠镜或结肠镜检查、盆腔磁共振检查、腹盆腔CT、直肠镜内B超、胸部CT或胸部X线检查。而临床上的治疗外科手术为主，辅以化疗、放疗或靶向治疗等的综合治疗。手术治疗主要是根据癌肿所在部位、大小、活动度、细胞分化程度、术前的排便控制能力及术前临床分期等因素进行局部切除，腹会阴联合直肠癌根治术，永久性乙状结肠造口、经腹直肠癌切除术，经腹直肠癌切除、近端造口、远端封闭手术。
直肠腺癌早期临床症状隐匿，不易发现，大多患者就诊时已到中晚期，失去了最佳手术时机。有报道表明，早期直肠腺癌患者术后5年生存率约为90％，而晚期患者仅为15％。因此，早发现、早治疗是降低直肠腺癌患者高死亡率、改善预后的关键。随着分子生物学技术的发展，国内外研究者不断探索直肠腺癌新的生物标志物，以对传统肿瘤标志物进行有效补充，从而对直肠腺癌患者的病情监测、预后判断以及实施个体化综合治疗，而且对新型抗肿瘤药物的研发和应用，均具有重要的理论意义和临床价值。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种直肠腺癌的诊治标记物，为直肠腺癌的诊断和治疗提供一种分子手段。
为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了SLC26A9在制备抑制或预防直肠腺癌转移、侵袭的药物中的应用。
进一步，所述的药物包含SLC26A9基因和/或其表达产物的抑制剂。
进一步，本发明所述抑制剂包括：通过干扰RNA抑制SLC26A9基因表达的双链核糖核酸，或基于SLC26A9抗原蛋白的肿瘤疫苗，或用于抑制SLC26A9蛋白活性的蛋白质。
优选的，所述抑制剂是针对SLC26A9基因的siRNA。
本发明还提供了一种用于治疗直肠腺癌转移、侵袭的药物，所述药物包含SLC26A9基因和/或其表达产物抑制剂。所述抑制剂包括抑制SLC26A9基因表达的物质、抑制SLC26A9基因表达产物稳定性的物质、和/或抑制SLC26A9基因表达产物活性的物质。
进一步，本发明所述抑制剂包括：通过干扰RNA抑制SLC26A9基因表达的双链核糖核酸，或基于SLC26A9抗原蛋白的肿瘤疫苗、或用于抑制SLC26A9蛋白活性的蛋白质。
本发明的药物还可与其他治疗直肠腺癌的药物联用，多种药物联合使用可以大大提高治疗的成功率。
一方面，本发明所述的“抑制或预防直肠腺癌转移、侵袭的药物”包含SLC26A9基因和/或其表达产物的抑制剂。所述抑制剂包括抑制SLC26A9基因表达的物质、抑制SLC26A9基因表达产物稳定性的物质、和/或抑制SLC26A9基因表达产物活性的物质。
另一方面，本发明所述的“抑制或预防直肠腺癌转移、侵袭的药物”包括能够括抑制细胞生长、促进细胞凋亡的物质。
本发明提供了SLC26A9在制备预判直肠腺癌转移风险、诊断直肠腺癌是否发生转移、判断直肠腺癌转移是否复发的产品中的应用。
进一步，上面所提到的产品能够通过检测直肠腺癌组织中SLC26A9基因的表达水平来预判直肠腺癌转移风险、诊断直肠腺癌是否发生转移、判断直肠腺癌转移是否复发。
进一步，所述通过检测直肠腺癌组织中SLC26A9基因的表达水平：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测SLC26A9基因及其表达产物的表达水平进行检测。
其中，所述用RT-PCR来预判直肠腺癌转移风险、诊断直肠腺癌是否发生转移、判断直肠腺癌转移是否复发的产品至少包括一对特异扩增SLC26A9基因的引物；所述用实时定量PCR预判直肠腺癌转移风险、诊断直肠腺癌是否发生转移、判断直肠腺癌转移是否复发的产品至少包括一对特异扩增SLC26A9基因的引物；所述用免疫检测预判直肠腺癌转移风险、诊断直肠腺癌是否发生转移、判断直肠腺癌转移是否复发的产品包括：与SLC26A9蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交预判直肠腺癌转移风险、诊断直肠腺癌是否发生转移、判断直肠腺癌转移是否复发的产品包括：与SLC26A9基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片预判直肠腺癌转移风险、诊断直肠腺癌是否发生转移、判断直肠腺癌转移是否复发的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与SLC26A9蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与SLC26A9基因的核酸序列杂交的探针。
优选地，所述产品包括芯片、试剂盒。
本发明提供了一种预判直肠腺癌转移风险、诊断直肠腺癌是否发生转移、判断直肠腺癌转移是否复发的产品，所述产品能够通过检测直肠腺癌组织中SLC26A9基因的表达水平来预判直肠腺癌转移风险、诊断直肠腺癌是否发生转移。
进一步，所述产品包括芯片、试剂盒。其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测SLC26A9基因转录水平的针对SLC26A9基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的SLC26A9蛋白的特异性抗体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测SLC26A9基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括SLC26A9蛋白的特异性抗体。
进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测SLC26A9基因表达水平过程中所需的试剂。优选地，所述试剂包括针对SLC26A9基因的引物和/或探针。根据SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列信息设计出可以用于检测SLC26A9基因表达水平的引物和探针。
与SLC26A9基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
进一步，所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。
进一步，所述SLC26A9蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述SLC26A9蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰，例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与SLC26A9蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。
本发明的药物还可包括药学上可接受的载体，这类载体包括(但并不限于)：稀释剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等；粘合剂如淀粉、预胶化淀粉、糊精、麦芽糖糊精、蔗糖、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮、海藻酸及海藻酸盐、黄原胶、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如硬脂酸锌、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末、氢化植物油、硬脂富马酸钠、聚氧乙烯单硬脂酸酯、单月桂蔗糖酸酯、月桂醇硫酸钠、月桂醇硫酸镁、十二烷基硫酸镁等；填充剂如甘露醇(粒状或粉状)、木糖醇、山梨醇、麦芽糖、赤藓糖、微晶纤维素、聚合糖、偶合糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、糊精、淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠等；崩解剂如交联乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基甲基、交联羧甲基纤维素钠、大豆多糖等。
本发明的药物可以使用不同的添加剂进行制备，例如矫味剂、泡腾剂、稳定剂、杀菌剂、等渗剂、螯合剂、生物利用度剂等中的一种或几种。所述矫味剂包括但不限于甘露醇、木糖醇、甜菊甙、乳糖、果糖、蔗糖、蛋白糖、麦芽糖醇、甘草甜素、环己氨基磺酸钠、明胶、阿斯巴甜、香蕉香精、菠萝香精、香兰素、香橙香精、桔子香精、薄荷香精、人参香精、草莓香精、枸橼酸、柠檬酸；所述泡腾剂包括但不限于苹果酸、柠檬酸或枸橼酸与碳酸氢钠或碳酸钠；所述稳定剂包括但不限于人类血清蛋白、L-氨基酸、糖及纤维素衍生物；糖类如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等单糖，甘露醇、纤维醇、木糖醇等糖醇，蔗糖、麦芽糖、乳糖等二糖；葡聚糖、羟丙基淀粉、硫化软骨素、透明质酸等多聚糖。纤维素衍生物如甲基纤维素、乙基纤维素、素羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素及羟甲基纤维钠。
添加剂缓冲剂可以包括硼酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、谷氨酸及相应的盐(它们的碱金属或碱性稀土金属盐，例如钠盐、钾盐、钙盐及镁盐)。等渗剂包括氯化钾、氯化钠、糖及甘油。螯合剂包括乙二胺四乙酸钠及柠檬酸。稳定剂包括人类血清蛋白、L-氨基酸、糖及纤维素衍生物。L-氨基酸还可以包括甘氨酸、半胱氨酸及谷氨酸中的任意一个。糖类包括单糖，例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等；糖醇，例如甘露醇、纤维醇、木糖醇等；二糖，例如蔗糖、麦芽糖、乳糖等；多聚糖，例如葡聚糖、羟丙基淀粉、硫化软骨素、透明质酸等及它们的衍生物。纤维素衍生物包括羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙甲基纤维素及羟甲基纤维素钠。表面活性剂包括离子表面活性剂或非离子表面活性剂，例如聚氧化乙烯烷基酯、山梨聚糖单酰基酯、脂肪酸甘油酯。
本发明的药物还可包括药学上可接受的包衣材料。所述包衣材料包括但不限于明胶、阿拉伯胶、海藻酸盐、壳聚糖、羧甲基纤维素盐、醋酸纤维素酞酸酯、乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、丙烯酸树脂类、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇。
本发明的药物还可包括药学上可接受的涂层材料包括(但不限于)，快速分解涂层材料、染色剂、肠溶性聚合物、增塑剂、水溶性聚合物、水不溶性聚合物、染料、色素、其他崩散剂。常见快速分解涂层材料包括OPADRY；肠溶性聚合物包括甲基内烯酸聚合物、磷羟丙甲基纤维素苯二甲酸酯、羟丙甲基纤维素乙酸酯、羟丙甲基纤维素琥珀酸酯、羟甲乙基纤维素、乙酰磷苯二甲酸纤维素；增塑剂包括聚乙二醇(PEG)、丙二醇等。
本发明药物的单位剂型可以使多种形式，代表性的剂型包括固体剂型如丸剂、粉剂、片剂、干粉剂、颗粒、胶囊等；液态剂型如悬浮液、溶液、乳状液、酏剂、糖浆等。
本发明所述药物可以通过任何途径给予受体，只要能达到目标组织，其可通过口服或非口服的多种途径，如口服给药、肺内给药、直肠内给药、鼻内给药、皮下给药、皮内给药、腹腔内给药、肌内给药、静脉内给药。
在本发明中，所述RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。以细胞为基础的RNAi筛选在功能基因学研究方面具有许多优势，主要表现在大多数细胞类型都能使用RNAi方法，并且相对较容易下调或沉默任何目的基因的表达。
为了确保SLC26A9基因能够被高效剔除或沉默，根据SLC26A9基因的mRNA序列设计了siRNA特异性片段。为了进一步提高siRNA片断的有效性，设计多个siRNA，通过同源性比对(NCBI BLAST)来过滤siRNA序列，以提高siRNA片断的特异性并减少RNAi干扰的脱靶效应。
在本发明的上下文中，“SLC26A9基因”包括SLC26A9基因以及SLC26A9基因的任何功能等同物的多核苷酸。SLC26A9基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中SLC26A9基因(NC_000001.11)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
优选地，SLC26A9基因的编码序列包括以下任意一种DNA分子：
(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列；
(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
在本发明的具体实施方案中，所述SLC26A9基因的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列。
在本发明的上下文中，SLC26A9基因表达产物包括SLC26A9蛋白以及SLC26A9蛋白的部分肽。所述SLC26A9蛋白的部分肽含有与直肠腺癌相关的功能域。
“SLC26A9蛋白”包括SLC26A9蛋白以及SLC26A9蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括SLC26A9蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物或其突变体。突变体包括等位变异体、天然突变体、诱导突变体、其氨基酸序列通过缺失、替代、增加和/或插入发生变异的突变体、与修饰的氨基酸序列功能相同的突变体及在高或低的严格条件下能与SLC26A9的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。
优选地，SLC26A9蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：
(1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。
(3)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，更优选地，与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。
在本发明的具体实施方案中，所述SLC26A9蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。
通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员可使用公知的方法对多聚核苷酸进行突变、缺失、插入、替换、和与其她多聚核苷酸连接等。如果需要可在本发明的编码融合蛋白基因的两侧引入多聚核苷酸，引入的多聚核苷酸可有限制性内切酶识别位点。
通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是SLC26A9蛋白的融合蛋白。对于与SLC26A9蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留SLC26A9蛋白的生物学活性即可。本发明中的融合蛋白可以有各种衍生物，这些衍生物可以是但不局限于不同形式的盐、修饰产物等，如在多肽的氨基、羧基、羟基、巯基上再进行修饰，所用修饰剂包括但不限于聚乙二醇、葡聚糖等。可用本领域公知的方法将含编码融合蛋白序列的核酸克隆到各种表达载体中去。
氨基酸序列的修饰可以源自自发突变或遗传后修饰，也可以人工诱导天然基因产生。
本发明的SLC26A9蛋白也包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留SLC26A9蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。
本发明的优点和有益效果：
本发明发现了一种与直肠腺癌转移相关的诊治标记物，通过检测直肠腺癌组织中SLC26A9基因的表达水平，可以预判直肠腺癌的转移风险、诊断直肠腺癌是否发生转移、判断直肠腺癌是否复发。
本发明提供了一种直肠腺癌的分子治疗手段，通过降低SLC26A9基因的表达水平或SLC26A9蛋白的表达量，从而改善或治疗直肠腺癌患者的症状。
附图说明
图1显示利用QPCR检测SLC26A9基因在直肠腺癌组织中的表达情况；
图2显示利用QPCR检测siRNA对SLC26A9基因表达的影响；
图3显示利用MTT检测SLC26A9基因表达对直肠腺癌细胞生长的影响。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选与直肠腺癌相关的基因标志物
1、样品的收集
各收集8例直肠腺癌非转移组织和直肠腺癌转移组织样本，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。所有手术切除标本用已消毒的眼科剪剪取小块分装，放入已用0.1％DEPC水浸泡过夜并消毒的1.5ml无菌EP管中，剩余组织用冻存管保存，并快速放入-80℃的液氮罐内保存。
2、RNA样品的制备
1)样品的前处理：从-80℃液氮罐中取出样本放入用用0.1％DEPC水浸泡过夜并消毒过的匀浆器中，用力研成粉末状；研磨过程中必须始终使样品在液氮环境里，研磨杯必须预冷，边研磨边加液氮。
2)裂解：向匀浆器内加入1ml Trizol RNA提取液，室温下匀浆10min，再静置10min，让核蛋白充分裂解。
3)纯化：让匀浆后的上层液体移至用0.1％DEPC水处理过的1.5ml无菌EP管中，颠倒混匀10s，室温静置5min，并分别做好标记。
4)分层：按0.2:1(氯仿：Trizol)的比例，分别向各EP管中加入0.2ml氯仿，剧烈颠倒混匀15s，再室温静置5min。
5)将各EP管中放入4℃低温离心机中离心，12000rpm离心10min。样品分成三层：黄色的有机相，中间层，上层无色的水相，RNA主要在水相，把水相转移到新EP管中，做好标记。注意一定不要吸到中间层和最下层，避免污染。
6)加入等体积的异丙醇，室温下混匀，并孵育10min；
7)沉淀：再放入4℃低温离心机中离心，12000rpm离心15min。
8)洗涤：离心后弃上清液，再加入1ml 75％乙醇轻轻洗涤沉淀。
9)弃上清液，吸干管内乙醇，室温下空气中干燥RNA沉淀5-10min。
10)溶解：加入20μl RNase free去离子水溶解RNA。
11)用紫外光分度计检测RNA纯度和浓度，剩余RNA样品置于-80℃冰箱保存。
3、高通量转录组测序
1)RNA-seq读段定位
首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHat v1.3.1将清洁片段与UCSC H.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配，H.sapiens UCSC hg19版的预先构建的索引从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用TopHat方法的系统默认参数。
2)转录丰度评估
匹配上的读段文件通过Cufflinks v1.0.3处理，Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。
3)差异表达基因的检测
将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。在Cuffidff输出中只有q值＜0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。
4、结果
RNA-seq结果显示，SLC26A9基因在直肠腺癌转移组织中的表达量显著高于非转移组织。
实施例2QPCR测序验证SLC26A9基因的差异表达
1、根据高通量测序的检测结果选择SLC26A9基因进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择直肠腺癌非转移组织和直肠腺癌转移组织各70例。
2、RNA提取步骤同实施例1。
3、逆转录：
1)反应体系：
试剂 体积
MgCl2 2μl
10×RT Buffer 1μl
无Rnase水 3.75μl
dNTP混合液 1μl
Rnase抑制剂 0.25μl
AMV反转录酶 0.5μl
Random 9mers 0.5μl
实验样品RNA 1μl
2)逆转录反应条件
按照RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0中逆转录反应条件进行。
30℃ 10min，50℃ 25min，99℃ 5min，5℃ 5min。
3)聚合酶链反应
(1)引物设计
根据Genebank中SLC26A9基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由博迈德生物公司合成。具体引物序列如下：
SLC26A9基因：
正向引物为5’-CAATGCCTTCAGATGTTC-3’(SEQ ID NO.3)；
反向引物为5’-TCAGGAATGATGTAGTCTT-3’(SEQ ID NO.4)。
β-actin基因：
正向引物为5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’(SEQ ID NO.5)；
反向引物为5’-CTCCTTAAGTCACGCACGATTCC-3’(SEQ ID NO.6)。
(2)按照表1配制PCR反应体系：
表1 PCR反应体系
试剂 体积
正向引物 0.5μl
反向引物 0.5μl
Takara Ex Taq HS 0.25μl
模板 10μl
去离子水 28.75μl
(3)PCR反应条件：95℃ 2min，(95℃ 30s，60℃ 30s)×30个循环。
4)琼脂糖凝胶电泳
配制1.2％琼脂糖凝胶，并在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭，电压90V，电泳30min，在波长为254nm的紫外灯下，对凝胶进行分析、拍照。
以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
5、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
6、结果
结果如图1所示，与非转移直肠腺癌组织相比，SLC26A9基因在转移直肠腺癌组织中的表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。
实施例3抑制SLC26A9基因表达
1、细胞培养(人直肠腺癌细胞株SW480)：
1)细胞复苏
a.从液氮罐中取出细胞冻存管，立即将细胞冻存管放入37℃温水中，并轻轻摇动令其尽快融化。
b.从37℃温水中取出冻存管，用吸管将细胞悬液吸出，加入离心管并加入5ml含10％太牛血清的L-15培养液，混合后800rpm离心5min，除去上清液，再用培养液洗一次。
c.加入5ml含10％胎牛血清的L-15培养液，接种于75ml培养瓶，置于37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。
2)细胞换液
a.当培养液开始变黄时，从恒温箱中取出培养瓶，倒出旧培养液。
b.加入PBS轻摇冲洗培养瓶2次，每次3min。
c.加入5ml新鲜配制的含10％胎牛血清的L-15培养液。
d.继续放回培养箱中培养。
3)细胞传代
a.倒置显微镜下观察，当细胞长到90％时进行传代。
b.去除培养瓶中的旧培养液，加入PBS轻摇洗培养瓶2次，每次3min。
c.加入0.25％胰蛋白酶2ml，消化1min。倒置显微镜下观察，当细胞收缩成接近圆形时，弃掉消化液，加入含10％胎牛血清的L-15培养液，反复吹打混匀细胞悬浮液，计数，调整细胞密度，接种到新培养瓶中。
d.将培养瓶做好标记，放入37℃、5％CO2恒温培养箱中继续培养。
2、siRNA设计
针对SLC26A9的siRNA序列：
siRNA1-SLC26A9：
正义链为5’-AAUGUCAAUGAAGGUAAAGAC-3’(SEQ ID NO.7)；
反义链为5’-CUUUACCUUCAUUGACAUUUG-3’(SEQ ID NO.8)，
siRNA2-SLC26A9：
正义链为5’-UGUCAAUGAAGGUAAAGACGA-3’(SEQ ID NO.9)；
反义链为5’-GUCUUUACCUUCAUUGACAUU-3’(SEQ ID NO.10)，
siRNA3-SLC26A9：
正义链为5’-UUGGUUUUCAUGAAUAGAGAC-3’(SEQ ID NO.11)；
反义链为5’-CUCUAUUCAUGAAAACCAAGA-3’(SEQ ID NO.12)
阴性对照siRNA序列(siRNA-NC)：
正义链为5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQ ID NO.13)；
反义链为5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQ ID NO.14)。
将细胞按1×104/孔接种到24孔细胞培养板中，在37℃、5％CO2培养箱中细胞培养24h，在无双抗、含10％FBS的DMEM培养基中，转染按照脂质体转染试剂2000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染，实验分为阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(20nM)(siRNA1-SLC26A9、siRNA2-SLC26A9、siRNA3-SLC26A9)，其中阴性对照组siRNA与SLC26A9基因的序列无同源性，浓度为20nM/孔，同时分别转染。
3、QPCR检测SLC26A9基因的转录水平
3.1细胞总RNA的提取
采用TRIzol Reagent(Invitrogen Cat.No.15596-018)总RNA提取试剂，按说明书提供方法提取SW480细胞的总RNA。
1)取细胞，用浓度为0.01M的PBS冲洗3次。
2)加入适量TRIzol试剂，室温放置5min裂解细胞，吹打均匀。
3)以1ml/管分装至1.5ml EP管中。每管加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15s，室温放置2-3min。
4)4℃、12000rpm离心15min。
5)将上层水相移至干净EP管中，加入0.5ml异丙醇，轻轻混匀，室温放置10min。
6)4℃、7500rpm离心10min。
7)弃上清，75％乙醇洗涤RNA沉淀，7500rpm离心5min。
8)室温干燥RNA沉淀，5-10min后溶于适量DEPC水。
9)质量分数为1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA样本的完整性，应用Bio-Photometer对提取的RNA进行定量测定。
3.2逆转录步骤同实施例2。
3.3QPCR扩增步骤同实施例2。
4、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，干扰SLC26A9基因表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
5、结果
结果如图2显示，相比siRNA2-SLC26A9、siRNA3-SLC26A9，siRNA1-SLC26A9能够更有效抑制SLC26A9基因的表达，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例4划痕实验检测转染siRNA后直肠腺癌细胞增殖、迁移能力
1、将SW480细胞平铺于六孔板中，每孔密度为5×105个，加入含10％胎牛血清的DMEM培养，37℃，5％CO2条件下培养24h。
2、转染按照脂质体转染试剂2000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染，实验分为阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(20nM)(siRNA1-SLC26A9)以及空白对照组。
3、用10μl移液枪头在单层细胞上画“一”字痕，用PBS溶液缓慢冲洗3次。分别选取培养24、48、72h的细胞置于倒置显微镜下观察拍照。计算划痕愈合率＝(0h划痕宽度-24h(或48h或72h)划痕宽度)/0h划痕宽度×100％。
4、结果
结果如表2所示，随着培养时间的增长，siRNA1-SLC26A9组的划痕愈合率明显低于siRNA-NC组和空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。此结果表明，抑制SLC26A9的表达可以抑制直肠腺癌细胞的迁移增殖，SLC26A9促进直肠腺癌细胞的迁移和增殖。
表2 siRNA1-SLC26A9对SW480迁移增殖的影响
实施例5SLC26A9基因对直肠腺癌细胞增殖的影响
采用MTT实验检测SLC26A9基因对直肠腺癌细胞增殖能力影响。
1、细胞培养与转染步骤同实施例3。
2、步骤：各组细胞转染12h后胰酶消化，制成单细胞悬液，以每孔6000个细胞接种于96孔培养板中，每组分7个时间点，每个时间点设6个复孔。细胞贴壁后，进行第1次检测：每孔加入5g/L的MTT液20μl，继续培养4h后，吸去培养基，加入DMSO 150μl，细心吹打，使紫蓝色沉淀充分溶解，用酶标仪在490nm波长测吸光度值(A值)。然后每12h检测1次，连续检测72h，共7次。本实验重复3次。
3、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
4、结果
图3所示的结果显示：siRNA1-SLC26A9组的细胞生长速度明显低于转染siRNA-NC组的细胞生长速度，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述结果表明SLC26A9表达有利于直肠腺癌细胞的生长，通过抑制SLC26A9基因的表达可以抑制直肠腺癌细胞的生长。
实施例6SLC26A9基因对直肠腺癌细胞凋亡的影响
使用流式细胞仪检测SLC26A9基因对细胞凋亡的影响。
1、细胞培养步骤同实施例3。
2、细胞转染步骤同实施例3。
3、步骤
1)细胞转染72h后，使用预冷PBS洗涤细胞两次，胰酶消化，再用预冷PBS洗细胞两次，于细胞沉淀中加入预冷70％乙醇，于4℃固定过夜。
2)细胞染色：离心收集细胞，以1ml的PBS洗细胞一次，加入500μl含50μg/ml碘化丙啶(PI)的PBS，4℃避光孵育30min。
3)取200μl细胞悬液加入到EP管中，加入10μl Annexin-V-FITC混匀。
4)流式分析：以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2～3万个细胞，结果用软件Mod Fit分析，观察凋亡细胞百分比。
3、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用的t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
4、结果：
转染siRNA1-SLC26A9组的细胞凋亡率为(28.45±0.027)％，转染siRNA-NC组的细胞凋亡率为(8.36±0.17)％，上述差异具有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明，SLC26A9表达有利于直肠腺癌细胞存活，通过抑制SLC26A9基因的表达可以促进直肠腺癌细胞的凋亡。
实施例7Transwell侵袭小室实验
1、用无血清L-15稀释matrigel胶(稀释比例6：1)，按50μl/孔均匀地铺在Millicell小室膜上，在小室另一面涂上10g/L纤维连接蛋白30μl。
2、实验设为三组：阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(siRNA1-SLC26A9)以及空白对照组，每组设3个复孔。各组细胞经培养8h，除对照加2ml L-15培养基外，其余各组加1ml培养基及1ml指示的培养上清。收集各组细胞2×105个，用400μl无血清L-15稀释，接种到上室中，将小室置于加有趋化因子(NIH-3T3)600μl的24孔板内，37℃、5％CO2孵育16h。
3、取出小室，小心擦掉上室细胞，PBS洗3次，95％乙醇固定，HE染色，显微镜下随机计数5个视野的细胞数，求出每个视野的平均穿膜细胞数。
4、结果
实验组(siRNA1-SLC26A9)细胞穿膜数为(40±3)个，阴性对照组(siRNA-NC)细胞穿膜数为(98±4)个，空白对照组细胞穿膜数为(110±5)个，实验组与对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。这表明SLC26A9表达促进直肠腺癌细胞的侵袭和转移。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (7)

1.SLC26A9基因和/或其表达产物的抑制剂在制备抑制或预防直肠腺癌转移、侵袭的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制剂是针对SLC26A9的siRNA。
3.SLC26A9在制备预判直肠腺癌转移风险、诊断直肠腺癌是否发生转移、判断直肠腺癌转移是否复发的产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品能够通过检测直肠腺癌组织中SLC26A9基因的表达水平来预判直肠腺癌转移风险、诊断直肠腺癌是否发生转移、判断直肠腺癌转移是否复发。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测直肠腺癌组织中SLC26A9基因的表达水平包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片进行检测。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片、试剂盒；其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测SLC26A9基因转录水平的针对SLC26A9基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的SLC26A9蛋白的特异性抗体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测SLC26A9基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括SLC26A9蛋白的特异性抗体。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂包括针对SLC26A9基因的引物和/或探针。
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