JP3948702B2 - ウシのClaudin−16欠損症タイプ2の遺伝子診断法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、ウシのClaudin−16欠損症タイプ2の遺伝子診断法(又は検出方法)、そのための装置またはキット、もしくはそれらの構成要素(例えば遺伝子診断試薬、プロ−ブ、プライマー、ヌクレオチド配列など)、に関する。
【0002】
【発明に関わる語句の定義】
本明細書において、「Claudin−16」はClaudin−16遺伝子が転写され翻訳されて生成したタンパク質を意味し、「Claudin−16遺伝子」はClaudin−16をコードしている翻訳領域のエクソン部分、隣接している非翻訳領域のエクソン部分、それらのイントロン部分、該遺伝子の発現の制御に関わる領域に加え、本疾患に関連する変異部分が含まれるDNAの領域を意味する。「Claudin−16欠損症タイプ1」とは、Claudin−16欠損症というべき遺伝病のうち、特開2000−270880(特願平11−084373)「ウシのClaudin−16欠損症の遺伝子診断法」なる日本の特許出願公開文献(公開日:平成12年10月3日)にて公知とされた遺伝子診断技術によりそのキャリアではないことの判定を直接可能にされたタイプのClaudin−16欠損症を指す。一方、「Claudin−16欠損症タイプ2」とは、Claudin−16欠損症というべき遺伝病でありながら、かかる「Claudin−16欠損症タイプ1」用の遺伝子診断技術(結果論的に言えば、配列表の配列番号:1に示される塩基配列の、例えば1〜629位までの領域しか調べないものや、例えば1〜650位までの領域しか調べないもの)では正常と判定されるのに、タイプ1キャリア牛と交配すると、劣性遺伝であるClaudin−16欠損症を発症してしまうものであり、従ってタイプ1とは異なる特定の変異をClaudin−16に有するはずのものである(但し誤解のないように言えば、ここで述べた「650」という数値は、特にこれが公知技術で特定されていたというわけではなく、本発明の結果から逆に特定されたというべきである)。そして、現実にこの「Claudin−16欠損症タイプ2」は、「Claudin−16欠損症タイプ1」と同様な先天性腎尿細管形成不全を主徴とする常染色体性劣性遺伝病であるばかりでなく、臨床的には発育不良、背湾姿勢、過長蹄などを呈し、生化学的特徴として血液中のBUN(尿素態窒素)値及びクレアチニン値の高い疾患である。
【0003】
【従来の技術】
1998年以降、和牛において、上記Claudin−16欠損症タイプ1の遺伝子診断法(特願平11−084373)によりキャリアではなく正常と判定されたウシとタイプ1キャリア牛との交配による発症が本発明者らによって初めて見出された。すなわち、Claudin−16欠損症タイプ1に認められた欠失の変異とは異なるClaudin−16遺伝子のここでいうタイプ2の変異の存在を本発明者らは予想した。
このClaudin−16欠損症タイプ2キャリアのウシは、すでに確立されているClaudin−16欠損症タイプ1の遺伝子診断では検出できないため、間違って正常と診断され、和牛集団中にタイプ2の変異が広がる可能性がある。したがってClaudin−16欠損症タイプ1の遺伝子診断だけでは本疾患の発生を未然に防ぐ上では問題を有している。しかしながら、これまで即ち本発明がなされるまで、上記Claudin−16欠損症タイプ2の診断を遺伝子レベルで合理的に行うための技術は知られていなかった。
【0004】
【発明が解決しようとしている課題】
したがって、本発明の主な目的は、上述した従来技術の問題点を解消するため、ウシのClaudin−16欠損症タイプ2の遺伝子診断法(遺伝子検出法)や、そのための新規且つ有効な各種手段またはその構成要素を提供することにある。
【0005】
【課題を解決するための手段】
ウシのClaudin−16欠損症タイプ2を予防する手段の1つとして、ヘテロ接合体同士の交配を避けるという方法が考えられる。そのためにはウシのClaudin−16欠損症タイプ2の診断を遺伝子レベルで行い、疾患遺伝子のキャリアーを早急に見つけだす必要がある。異常を持つウシの疾患遺伝子が正常なものに比べてどのように変異しているかを明らかにし、様々な遺伝子工学的手法により変異遺伝子を迅速に検出できる手段を得ることができれば、このような遺伝子診断法を確立することができる。その効果としては、Claudin−16欠損症タイプ2のキャリアーをスクリーニングすることによって今後の本疾患の発生を未然に防ぐことができる。
本発明者らの研究成果を本発明との関連で概して言えば、それは、Claudin−16遺伝子内の約56kbに及ぶ新規なタイプ2というDNA欠損を見出し、この欠損によりClaudin−16欠損症タイプ1と同様にClaudin−16遺伝子が発現していないことが本疾患即ち欠損症タイプ2の原因であることを見出し特定したことと、かかるタイプ2というDNA欠損を効率的にスクリーニングするための方法の確立、及び、そのための各種キットや、その構成要素としてのヌクレオチド配列といったツールの提案にあると言えよう。より具体的に言えば、まず、タイプ2のDNA欠損では、タイプ1におけるDNA欠損の領域と比べてさらにセントロメア側に18.5kb、テロメア側480bpまで欠損領域が計19kb拡大しており、この拡大した欠損領域内にタイプ1診断用に設定されたオリゴヌクレオチドプライマー配列が含まれていた。したがって、タイプ1の診断とは別に、タイプ2の変異を検出するための該遺伝子上に設定した特定のオリゴヌクレオチドプライマーを含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いるPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)法により、かかる変異が検出されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0006】
結果として、本発明として把握できる態様としては、例えば以下の(1)〜(18)のいずれかのように記載できる。
態様(1): 工程(a):ウシの核酸試料を得る工程と、
工程(b):工程(a)にて得られた核酸試料を遺伝子増幅反応に付して、ウシのClaudin−16遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域が増幅された核酸断片を得る工程と、
工程(c):工程(b)の核酸断片について変異の存在を調べる工程、
とを含むウシのClaudin−16欠損症タイプ2の遺伝子診断法であって、前記領域が、配列表の配列番号:1に示される塩基配列の1〜651位を含む領域である、ウシのClaudin−16欠損症タイプ2の遺伝子診断法。
態様(2): 遺伝子増幅反応が、PCR法によって行われるものである、前記態様(1)に記載の遺伝子診断法。
態様(3): 変異の存在をPCR増幅により調べることを特徴とする前記態様(1)〜(2)のいずれかに記載の遺伝子診断法。
態様(4): 核酸試料がゲノミックDNA、cDNA、又はmRNAを含む試料である前記態様(1)〜(3)のいずれかに記載の遺伝子診断法。
【0007】
態様(5): ウシのClaudin−16欠損症タイプ2を検出するためのキットであって、ウシのClaudin−16遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域を遺伝子増幅反応により増幅するのに利用されるオリゴヌクレオチドプライマーを含有しており、しかも、前記オリゴヌクレオチドプライマーが、(a)配列表の配列番号:1に示された塩基配列のうちの5’末端の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び(b)配列表の配列番号:1に示された塩基配列のうちの3’末端の領域に対する相補塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、からなる群から選ばれたものであることを特徴とする、ウシのClaudin−16欠損症タイプ2を検出するためのキット。
態様(6): ウシのClaudin−16欠損症タイプ2を検出するためのキットであって、ウシのClaudin−16遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域を遺伝子増幅反応により増幅するのに利用されるオリゴヌクレオチドプライマーを含有しており、しかも、前記オリゴヌクレオチドプライマーが、10〜50個のヌクレオチドからなるものであることを特徴とする、ウシのClaudin−16欠損症タイプ2を検出するためのキット。
態様(7): ウシのClaudin−16欠損症タイプ2を検出するためのキットであって、ウシのClaudin−16遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域を遺伝子増幅反応により増幅するのに利用されるオリゴヌクレオチドプライマーを含有しており、該オリゴヌクレオチドプライマーが、(一)配列表の配列番号:1に示された塩基配列のうちの5’末端の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び(二)配列表の配列番号:1に示された塩基配列のうちの3’末端の領域に対する相補塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、からなる群から選ばれたものであって、しかも該オリゴヌクレオチドプライマーは、10〜50個のヌクレオチドからなるものであることを特徴とする、ウシのClaudin−16欠損症タイプ2を検出するためのキット。
態様(8): ウシのClaudin−16欠損症タイプ2を検出するためのキットであって、ウシのClaudin−16遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域を遺伝子増幅反応により増幅するのに利用されるオリゴヌクレオチドプライマーを含有しており、しかも、前記オリゴヌクレオチドプライマーが、15〜35個のヌクレオチドからなるものであることを特徴とする、ウシのClaudin−16欠損症タイプ2を検出するためのキット。
態様(9): ウシのClaudin−16欠損症タイプ2を検出するためのキットであって、ウシのClaudin−16遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域を遺伝子増幅反応により増幅するのに利用されるオリゴヌクレオチドプライマーを含有しており、該オリゴヌクレオチドプライマーが、(一)配列表の配列番号:1に示された塩基配列のうちの5’末端の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び(二)配列表の配列番号:1に示された塩基配列のうちの3’末端の領域に対する相補塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、からなる群から選ばれたものであって、しかも該オリゴヌクレオチドプライマーは、15〜35個のヌクレオチドからなるものであることを特徴とする、ウシのClaudin−16欠損症タイプ2を検出するためのキット。
態様(10): ウシのClaudin−16欠損症タイプ2を検出するためのキットであって、ウシのClaudin−16遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域を遺伝子増幅反応により増幅するのに利用されるオリゴヌクレオチドプライマーを含有しており、しかも、前記オリゴヌクレオチドプライマーが、配列表の配列番号4〜6に示されたものからなる群から選ばれたものであることを特徴とする、ウシのClaudin−16欠損症タイプ2を検出するためのキット。
【0008】
態様(11): ウシClaudin−16遺伝子及びウシClaudin−16欠損症タイプ2の遺伝子に対応するヌクレオチド配列又はその相補鎖の全体又はその一部であって、
(a)配列表の配列番号:1で示されたヌクレオチド配列又はその相補鎖の全体又はその一部、
(b)前記配列(a)とハイブリッド形成し、PCRによりウシのClaudin−16遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域を遺伝子増幅するのに利用できる一切の配列、
(c)遺伝子コードの縮退のために前記配列(a)及び(b)から派生した配列からなる群から選ばれたものであることを特徴とする配列。
態様(12): 配列表の配列番号:1で示されたヌクレオチド配列又はその相補鎖の全体又はその一部を含むことを特徴とするヌクレオチド配列。
態様(13): ゲノミックDNA配列、cDNA配列、RNA配列、ハイブリッド配列、合成配列、及び半合成配列からなる群から選ばれたものであることを特徴とする上記態様(11)〜(12)のいずれかに記載のヌクレオチド配列。
【0009】
態様(14): 上記態様(11)〜(12)のいずれか一記載の配列又は対応するmRNAとハイブリッド形成できることを特徴とするヌクレオチドプローブ。
態様(15): ウシClaudin−16欠損症タイプ2を検出するため、ウシのClaudin−16遺伝子に存在しうる変異部位を含む配列を明らかにしたり、及び/又は、単離するための用途の、上記態様(14)記載のヌクレオチドプローブ。
態様(16): 上記態様(14)に記載のヌクレオチドプローブを用いてウシのClaudin−16遺伝子に存在しうる変異部位を含む配列を明らかにしたり、及び/又は、単離する工程を有することを特徴とする、ウシClaudin−16欠損症タイプ2の検出方法。
態様(17): 上記態様(5)〜(10)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
態様(18): 上記態様(17)記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含有することを特徴とするウシのClaudin−16欠損症タイプ2用遺伝子診断試薬。
【0010】
以下の「発明の実施の形態」の欄における記載及び、更に具体的な実施例・実験例の記載、並びに同時に提出される図面・配列表データ等は、本発明の好ましい態様の詳細部分や変更態様が示されているか、及び/または比較上の対照のために従来技術が示されているものであることが理解されるべきである。当業者であれば、上述した及び以下の記載を参酌すれば、本願特許請求の範囲の欄の記載に基づく技術範囲内で、その様々な構成技術につき、容易に個別の事情に即し、実施のための更なる具体化等及びその改良・変更等を行えるような、そのような理解に達することができるはずである。
【0011】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
ウシClaudin−16欠損症タイプ2の遺伝子診断法(検出方法)の確立:
後述のように、ウシClaudin−16欠損症タイプ2の原因となる遺伝子上の変異が解明され(図1)、この変異を利用して該疾患の検出を行うことができる。具体的なウシClaudin−16欠損症タイプ2の遺伝子診断法(検出方法)としては、次のような工程を含む様態が例示される。すなわち、
工程(a):ウシの核酸試料を得る工程、
工程(b):工程(a)にて得られた核酸試料を遺伝子増幅反応に付して、ウシのClaudin−16遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域が増幅された核酸断片を得る工程、及び
工程(c):行程(b)の核酸断片について変異の存在を調べる工程、
である。
【0012】
第1に、工程(a)について述べる。本発明に用いられるウシの核酸試料としては、Claudin−16をコードするヌクレオチド配列を有するものであれば特に限定されるものではなく、適当な細胞又は組織由来の核酸(全ゲノムDNA及び細胞の全RNAから転写されたcDNAを包含する)、例えば、ゲノミックDNA、cDNA、mRNA等があげられる。ウシの核酸試料の調整は、公知の方法、例えばMolecular cloning, a laboratory manual (2nd edition)(J. Sambrook,E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989))に記載の方法により行うことができる。
【0013】
第2に、工程(b)について述べる。工程(a)で得られた核酸試料及び適当なプライマーを用いて、ウシClaudin−16遺伝子に存在しうる変位部位を含む領域が増幅され、所望の核酸断片を得ることができる。本工程で用いられる遺伝子増幅反応の方法としては、該領域を増幅できる方法であれば特に限定されないが、PCR法、RNAポリメラーゼを利用した核酸増幅法や鎖置換増幅法のような核酸増幅法を利用することができる。なかでもPCR法が好ましく用いられる。増幅の対象となる、変異部位を含む領域としては、ウシClaudin−16遺伝子の塩基配列のうち、ウシClaudin−16欠損症タイプ2の原因となる変異を含んでいる領域であれば特に限定されず、例えば、配列表の配列番号:1に示される塩基配列の中の1〜651位を含む領域が挙げられる。
【0014】
本明細書中、「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「PCR」とは、一般的に、米国特許第4683195号明細書に記載されたような方法を指し、例えば、所望のヌクレオチド配列をインビトロで酵素的に増幅するための方法を指している。一般に、PCR法は、鋳型核酸と優先的にハイブリダイズすることのできる2個のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、プライマー伸長合成を行うところのサイクルを繰り返し行うことを含むものである。典型的には、PCR法で用いられるプライマーは、鋳型内部の増殖されるべきヌクレオチド配列に対して相補的なプライマーを使用することができ、例えば、該増幅されるべきヌクレオチド配列とその両端において相補的であるか、あるいは該増幅されるべきヌクレオチド配列に隣接しているものを好ましく使用され得る。
【0015】
PCR法は、M. A. Innis, D. M. Gelfaud, J. J. Snindky, & T. J. White (Ed.), PCR protocols: a guide to methods andapplications, Academic Press, Inc.,New York (1990); M. J. McPherson, P. Quirke & G. R. Taylor (Ed.), PCR: a practical approach, IRL Press, Oxford (1991); R. K. Saiki et al., Science, 239, 487−491 (1988); M. A. Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998−9002 (1988)などに記載の方法あるいはそれを修飾したり、改変した方法により行うことができる。また、PCR法は、それに適した市販のキットを用いて行うことができ、キット製造業者あるいはキット販売業者により明らかにされているプロトコールに従って実施することもできる。
【0016】
本明細書中、「オリゴヌクレオチド」とは、比較的短い一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチドで、好ましくはポリデオキシヌクレオチドが挙げられ、Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., Vol. 28, p.716−734 (1989)に記載されているような既知の方法、例えば、トリエステル法、ホスファイト法、ホスホアミダイト法、ホスホネート法などの方法により化学合成されることができる。通常合成は、修飾された固体支持体上で合成を便利に行うことができることが知られており、例えば、自動化された合成装置を用いて行うことができ、該装置は市販されている。該オリゴヌクレオチドは、一つ又はそれ以上の修飾された塩基を含有していてよく、例えば、イノシンなどの天然においては普通でない塩基あるいはトリチル化された塩基などを含有していてよい。
【0017】
PCR法で用いるプライマーとしては、上記の変異部位を含むDNA断片を増幅できるものであれば、特に限定されない。代表的には、プライマーは(a)配列表の配列番号:1に示された塩基配列のうちの任意の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び(b)配列表の配列番号:1に示された塩基配列のうちの任意の領域に対する相補塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用することができ、より好ましくは(一)配列表の配列番号:1に示された塩基配列のうちの5’端側の任意の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び(二)配列表の配列番号:1に示された塩基配列のうちの3’端側の任意の領域に対する相補塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用することができ、例えば、3〜100個、好ましくは10〜50個、さらに好ましくは15〜35個のヌクレオチドを含有するものが挙げられる。また、PCR条件も特に限定されず、通常行われる公知の条件でよく、例えば、上記した文献の記載を参考に選択することができる。PCRにおいては、DNA鎖の熱変性、プライマーのアニーリング及びポリメラーゼによる相補鎖の合成からなる一つのサイクルが、例えば、10〜50回、好ましくは20〜35回、より好ましくは25〜30回繰り返して行われる。
【0018】
第3に、工程(c)について述べる。本工程において、工程(b)で得られる核酸断片について変異の存在が調べられる。変異の存在の検出方法としては、特に限定されないが、PCR法により得られたDNA断片長を調べることにより検出される。DNA断片長を調べる方法は特に限定されないが、ポリアクリルアミド又はアガロースゲル上の電気泳動によりDNA断片を分離し、例えば、既知分子量のマーカーDNAフラグメントの移動度に対してのそれの移動度に基づいて、目的のDNA断片を同定する方法が好まれる。
【0019】
上記以外の検出法としては、前記に例示された態様の工程(c)をその他の変異検出方法に変更した方法がある。変異の検出には、例えば変異部位を含む適当なDNA断片をプローブに用いるハイブリダイゼーション法のような公知の変異検出方法が使用できる。さらに、増幅されたDNAを適当なベクターにクローニングして塩基配列を決定する方法や、あるいは増幅断片そのものを鋳型としてその塩基配列を決定する方法によっても変異の検出を行うことができる。
【0020】
オリゴヌクレオチドやプローブなどは、検出を容易にするためのラベル成分により標識されていることができる。該ラベル成分は、分光学的手段、光学的手段、生化学的手段、免疫学的手段、酵素化学的手段、放射化学的手段などにより検出できるものであることができる。ラベル成分の例としては、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼなどの酵素、32Pなどの放射性ラベル、アイソトープ、ビオチン、蛍光色素、発光物質、発色物質などが挙げられる。
【0021】
本発明のウシClaudin−16欠損症タイプ2の遺伝子診断法(検出方法)により、Claudin−16欠損症タイプ2を発病しているウシのみならず、Claudin−16欠損症タイプ2のキャリアーのウシについても検出し、診断することができる。従って、本発明でいうウシClaudin−16欠損症タイプ2とは、遺伝子的に異常であることを意味し、症状の有無を問わず、またキャリアーを含めて広義に解釈するものとする。
【0022】
正常ウシ及びClaudin−16欠損症タイプ2発症ウシのClaudin−16遺伝子の解析:
遺伝子上の変異と本疾患との関連を調べるために、まず正常なウシのClaudin−16をコードする遺伝子(cDNA)の配列を知る必要があるが、本発明者らはすでに、ポジショナルクローニング法と云われる手法を用いてウシClaudin−16遺伝子を単離し、その配列を明らかにしている(T. Hirano et al., Genome Research, 10, 659−663 (2000)。
【0023】
次に、得られた正常ウシのClaudin−16をコードするcDNAの全塩基配列を配列表の配列番号:1に示す。DNA断片の塩基配列の決定(シークエンシング)は、化学分解法(Maxam & Gilbert法)、チェーンターミネーター法(Sangerジデオキシ法)などにより行うことができる。
【0024】
Claudin−16欠損症タイプ2の原因となる遺伝子上の変異は、正常ウシ及び発症ウシのClaudin−16遺伝子の塩基配列を比較することによって明らかにすることができる。すなわち、前記の正常ウシの場合と同様に発症ウシのClaudin−16遺伝子の塩基配列を調べ、これを正常ウシ遺伝子と比較することにより、該疾患の原因である変異を確認することができる。
【0025】
本発明では、Claudin−16欠損症タイプ2ウシのClaudin−16遺伝子上では、配列表の配列番号:1に示される正常ウシのClaudin−16遺伝子上のClaudin−16をコードする翻訳領域の塩基配列のうち、1〜651位の部分が欠損する変異を見出した(図1)。
【0026】
【実施例】
以下、本発明を実施例、実験例をもってさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものでばない。以下の記載では、特に説明がない場合には、D. M. Glover & B. D. Hames (Ed.), DNA Cloning 1, Core Techniques (2nd edition), A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford (1995); J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (2nd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); M. A. Innis, D.M. Gelfaud, J. J. Snindky & T. J. White (Ed.), PCR protocols: a guide to methods and applications, AcademicPress, Inc., New York (1990); M. J.McPherson, P. Quirke & G. R. Taylor(Ed.), PCR: a practical approach, IRL Press, Oxford (1991)に記載の方法あるいはそれを修飾したり、改変した方法により行われている。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールの指示に従って行ってある。
【0027】
[実験例1]
1−(一)ウシClaudin−16欠損症タイプ2変異とタイプ1変異とのDNAマーカーの型判定による比較
ウシClaudin−16欠損症タイプ1における変異は、Claudin−16遺伝子のエクソン1から4までを含む約37kbの欠損である(実は、特願平11−084373及びその公開公報には約30kbと表現してある)(T.Hirano et al., Genome Research, 10,659−663 (2000))。図1に示すように、この欠損領域にDNAマーカーBMS4009、DIK130、DIK129は含まれるが、DIK131、BM9019、DIK132は外側に位置する。
タイプ2変異である欠損部位を推定するため、タイプ2変異をヘテロでもつウシのゲノミックDNAを用いて、377蛍光DNAシークエンサー(PEバイオシステムズ社製)によるマーカー型判定を行ったところ、タイプ2の変異ではこれらDNAマーカーBMS4009、DIK130、DIK129に加えてBM9019が欠損していた。しかしながら、DIK131およびDIK132はヘテロ接合体であったことから、これら2種のマーカーは欠損していないことがわかった。したがって、タイプ2における欠損領域は、タイプ1よりも広く、DIK131とDIK132間の約63kb以内の範囲に存在することが示唆された。
【0028】
1−(二) Claudin−16欠損症タイプ2の変異である欠損部位の決定発明者らはすでにClaudin−16遺伝子周辺のゲノミックDNA塩基配列約55kb(配列番号:2)及び約39kb(配列番号:3)を解読し、タイプ1の欠損領域を同定している。この配列の情報を用いて、DIK131からテロメア方向の18.5kbにPCR用センスプライマーを500bp間隔で40種類調製した。一方、DIK132からセントロメア方向の800bpにPCR用アンチセンスプライマーを3種類調製した。これらのPCRプライマーを組み合わせてPCRを行ったところ、DIK131から13番目と14番目のセンスプライマーとDIK132に最も近いアンチセンスプライマーの組み合わせでそれぞれ約1kbおよび約0.6kbのPCR生成物が得られた。これらのPCR生成物の塩基配列を決定した。決定された塩基配列を前記の正常ウシについて決定されたものと比較した結果、Claudin−16欠損症タイプ2ウシのClaudin−16遺伝子では、配列表の配列番号:1に示された塩基配列中、1〜651位を含む約56kbの欠損(タイプ1の変異では1〜629位を含む約37kbの欠損)が認められ、エクソン1から4およびエクソン5の一部が欠失していた。このため、該疾患牛ではClaudin−16遺伝子の発現が見られないと考えられる。
【0029】
[実験例2]
ウシのゲノミツクDNA上のClaudin−16遺伝子の変異が無いことの確認:
すでに発明者らは、Claudin−16欠損症タイプ1ウシに認められた欠損部位を含むDNA断片を増幅するためのプライマーDN−F1、DN−F2、DN−Rを合成しており(特願平11−084373)、これらのプライマーはタイプ2の変異の無いことの確認に適用できる。
【0030】
DN−F1: tatgctgttg atgtttatgt ag
DN−F2: tatgtagaac gttcttctct g
DN−R: cccccccccg cctttttc
【0031】
正常ウシ、Claudin−16欠損症タイプ1変異とタイプ2変異をヘテロにもつウシ、及びその母牛の血液(抗擬固剤としてEDTA、ヘパリンを含む)より、自動核酸分離装置NA−1000(クラボウ社製)を用いてゲノミックDNAを調製した。これらのゲノミックDNAを鋳型とし、プライマーDN−F1とDN−R、及び/又はDN−F2とDN−Rを用いたPCR(TAKARA Taqを使用、94℃で1分間、57℃で1分間、72℃で1分間からなる工程を1サイクルとした40サイクル反応)を行い、反応液を1.5%ゲル(0.5x TBE)を用いた電気泳動に供し、泳動後のゲルをエチジムブロマイド染色して増幅DNA断片を確認した。正常ウシとClaudin−16欠損症タイプ2ウシの母牛のゲノミックDNAを鋳型とした場合、図2aに示すように、375bp及び/又は360bpのDNA断片の増幅が見られた。しかし、Claudin−16欠損症タイプ1変異とタイプ2変異をヘテロにもつウシのゲノミックDNAを鋳型にした場合は増幅が認められなかった。
【0032】
[実験例3]
ウシのゲノミツクDNA上のClaudin−16遺伝子のタイプ2の変異が有ることの確認:
Claudin−16欠損症タイプ2の変異をもつウシのゲノミックDNAにおいてのみDNA断片を増幅するため、実験例1−(二)記載の約56kbの欠損部分を決定するために用いた13番目と14番目のセンスプライマーDA2−F1、DA2−F2、およびアンチセンスプライマーDA2−Rを合成した。配列表の配列番号:4、5、6にぞれぞれプライマーDA2−F1、DA2−F2、DA2−Rの塩基配列を示す。
【0033】
DA2−F1: aatgcactca tttctccagt tcagc
[配列番号:4]
DA2−F2: gtcattcttg gaaaggcttc agtag
[配列番号:5]
DA2−R: gtcgacagca tacattttgg cagtc
[配列番号:6]
【0034】
正常ウシ、Claudin−16欠損症タイプ2の変異をもつウシ、及びその母牛のゲノミックDNAを鋳型とし、プライマーDA2−F1とDA2−R、及び/又はDA2−F2とDA2−Rを用いたPCR(TAKARA Taqを使用、94℃で1分間、55℃で1分間、72℃で1分間からなる工程を1サイクルとした40サイクル反応)を行い、反応液を1.5%ゲル(0.5 x TBE)を用いた電気泳動に供し、泳動後のゲルをエチジムブロマイド染色して増幅DNA断片を確認した。Claudin−16欠損症タイプ2の変異をもつウシ、及びその母牛のゲノミックDNAを鋳型とした場合、図2bに示すように、1,027bp及び/又は566bpのDNA断片の増幅が見られたが、正常ウシでは認められなかった。
【0035】
これらの結果より、Claudin−16遺伝子の翻訳領域の1〜651位を含む約56kbの欠損について、発症ウシの母牛はこの変異に関してへテロ接合体であり、Claudin−16遺伝子のタイプ2の変異が染色体性劣性遺伝をする遺伝性疾患であるClaudin−16欠損症の原因となることが確認された。
【0036】
【発明の効果】
本発明によりウシのClaudin−16欠損症タイプ2およびそのキヤリアーを簡便かつ迅速に検出し、診断することが可能となる。
【0037】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】(a)Claudin−16欠損症タイプ2ウシ由来のウシClaudin−16遺伝子の欠損部分を示す図である。(b)欠損部分を検出するためのPCRプライマーの位置。
【図2】Claudin−16遺伝子のタイプ2の変異の有るゲノミックDNAを鋳型とすれば、PCRで増幅することを示す電気泳動パターン図である。
Claims (5)
- ウシの Claudin-16 欠損症タイプ2を診断するための遺伝子診断法であって、
前記ウシのゲノムDNAにおいて、配列番号 1 に示される第 651 位に相当する配列番号 3 の第 15811 位から 5 ’側に 56kb が欠失した、ウシの Claudin-16 欠損症タイプ2の欠失変異の有無を調べる工程を含むことを特徴とする遺伝子診断法。 - 工程(a):ウシの核酸試料を得る工程と、
工程(b):工程(a)にて得られた核酸試料を遺伝子増幅反応に付して、配列番号 1 に示される第 651 位に相当する配列番号 3 の第 15811 位から 5 ’側に 56kb が欠失した、ウシの Claudin-16 欠損症タイプ2の欠失変異を含む領域が増幅された核酸断片を得る工程と、
工程(c):工程(b)にて得られた核酸断片について前記領域の欠失変異の有無を調べる工程と、
を含むウシのClaudin-16欠損症タイプ2の遺伝子診断法。 - 前記遺伝子増幅反応がPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)法によって行なわれることを特徴とする請求項2に記載の遺伝子診断法。
- ウシのClaudin-16欠損症タイプ2の欠失変異を検出するためのキットであって、
配列番号 1 に示される第 651 位に相当する配列番号 3 の第 15811 位から 5 ’側に 56kb が欠失した、ウシの Claudin-16 欠損症タイプ2の欠失変異を含む領域を、遺伝子増幅反応により増幅させるためのプライマーを含むキット。 - 前記プライマーは、配列番号4又は配列番号5に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号6に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項4に記載のキット。
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