JP2001517438A - Ｔｉｅレセプターチロシンキナーゼリガンドホモログ - Google Patents

Ｔｉｅレセプターチロシンキナーゼリガンドホモログ

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規ＴＩＥリガンドホモログＮＬ２、ＮＬ３、およびＮＬ６（ＦＬＳ１３９）をコードする単離された核酸分子、このような核酸分子によってコードされるタンパク質、ならびにこのような核酸およびタンパク質分子を製造および使用するための方法および手段に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、新規ＴＩＥリガンドホモログをコードする単離された核酸分子、こ
のような核酸分子によってコードされるＴＩＥリガンドホモログタンパク質、な
らびにこのような核酸およびタンパク質分子を製造および使用するための方法お
よび手段、ならびに開示されたＴＩＥリガンドホモログを結合する抗体に関する
。
【０００２】 （背景技術） 略号「ＴＩＥ」または「ｔｉｅ」は頭字語であり、これらは、「チロシンキナ
ーゼ含有ＩｇおよびＥＧＦ相同性ドメイン」を表し、そして血管内皮細胞および
初期造血細胞でほぼ排他的に発現され、そしてＥＧＦ様ドメイン、および「免疫
グロブリン（ＩＧ）様」折り畳みと一般にいわれる鎖内ジスルフィド結合によっ
て安定化される細胞外折り畳みユニットの存在によって特徴づけられる、レセプ
ターチロシンキナーゼの新しいファミリーを示すために新しく作り出された。ヒ
ト白血病細胞からのチロシンキナーゼホモログｃＤＮＡフラグメント（ｔｉｅ）
は、Ｐａｒｔａｎｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８
７，８９１３−８９１７（１９９０）に記載された。このヒト「ｔｉｅ」レセプ
ターのｍＲＮＡは、すべてのヒト胎児およびマウス胚組織で検出されており、そ
して心臓および血管内皮細胞に局在することが報告されている。Ｋｏｒｈｏｎｅ
ｎら，Ｂｌｏｏｄ ８０，２５４８−２５５５（１９９２）；ＰＣＴ出願公開公
報第ＷＯ ９３／１４１２４号（１９９３年７月２２日公開）。「ｔｉｅ−１」
といわれるヒトｔｉｅのラットホモログは、Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら，Ｏｎ
ｃｏｇｅｎｅ ８，１６３１−１６３７（１９９３）によって同定された。「ｔ
ｉｅ−２」と命名されたもう１つのｔｉｅレセプターは、もともとラットで同定
されたが（Ｄｕｍｏｎｔら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８，１２９３−１３０１（１９
９３））、「ｏｒｋ」といわれる、ｔｉｅ−２のヒトホモログは、米国特許第５
，４４７，８６０号（Ｚｉｅｇｌｅｒ）に記載された。ｔｉｅ−２のマウスホモ
ログは、もともと「ｔｅｋ」と称された。脳毛細管ｃＤＮＡライブラリーからの
マウスｔｉｅ−２レセプターのクローニングは、ＰＣＴ出願公開公報第ＷＯ ９
５／１３３８７号（１９９５年５月１８日公開）に開示される。ＴＩＥレセプタ
ーは、新脈管形成に積極的に関与すると考えられ、そしてその上造血においても
役割を果たし得る。
【０００３】 ヒトＴＩＥ−２リガンドの発現クローニングは、ＰＣＴ出願公開公報第ＷＯ
９６／１１２６９号（１９９６年４月１８日公開）および米国特許第５，５２１
，０７３号（１９９６年５月２８日公開）に記載されている。「ｈｔｉｅ−２リ
ガンド１」または「ｈＴＬ１」と命名されたＴＩＥ−２リガンドをコードするλ
ｇｔ１０と命名されたベクターは、ＡＴＣＣ受託番号７５９２８で寄託されてい
る。「ｈｔｉｅ−２ ２」または「ｈＴＬ２」と命名されたもう１つのＴＩＥ−
２リガンドをコードするプラスミドは、ＡＴＣＣ受託番号７５９２８で入手可能
である。この第２のリガンドは、ＴＡＩ−２レセプターのアンタゴニストとして
記載されている。ＴＩＥ−２レセプターについての分泌されたヒトおよびマウス
リガンドの同定は、Ｄａｖｉｓら，Ｃｅｌｌ ８７，１１６１−１１６９（１９
９６）によって報告されている。新脈管形成および造血中の可能性のある作用に
おけるその役割を反映するために、「アンジオポエチン−１」と命名したヒトリ
ガンドは、ＷＯ ９６／１１２６９において「ｈｔｉｅ−２ １」または「ｈＴ
Ｌ−１」と種々に命名されたリガンドと同じリガンドである。アンジオポエチン
−１は、後で脈管形成役割を果たし、そしてＶＥＧＦの役割とは異なることが記
載されている（Ｓｕｒｉら，Ｃｅｌｌ ８７，１１７１−１１８０（１９９６）
）。ＴＩＥ−２は、腫瘍増殖に必要な病理的な脈管形成中に明らかにアップレギ
ュレートされるので（Ｋａｉｐａｉｎｅｎら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４，６
５７１−６５７７（１９９４））、アンジオポエチン−１は、腫瘍脈管構造を特
異的に標的するためにさらに有用であることが示唆されている（Ｄａｖｉｓら，
前出）。
【０００４】 （発明の要旨） 本発明は、血管系に強力な効果を有する新規ヒトＴＩＥリガンドホモログに関
する。本発明はまた、このようなリガンドホモログまたはその機能的誘導体をコ
ードする単離された核酸分子、およびこのような核酸分子を含むベクターを提供
する。本発明はさらに、新規ＴＩＥリガンドホモログまたはその機能的誘導体を
産生するためにこのような核酸で形質転換された宿主細胞に関する。新規リガン
ドホモログは、公知または以後に発見された、ＴＩＥレセプターのアゴニストま
たはアンタゴニストであり得る。他の治療剤または診断剤のそれぞれのＴＩＥレ
セプターを発現する細胞への送達を含む、その治療または診断用途もまた、本発
明の範囲内である。
【０００５】 本発明はさらに、本明細書中のＴＩＥリガンドホモログを特異的に結合するア
ゴニストまたはアンタゴニスト抗体、およびこのような抗体の診断または治療用
途を提供する。
【０００６】 別の局面では、本発明は、この新規リガンドホモログまたは抗体を含む組成物
に関する。
【０００７】 さらなる局面では、本発明は、本発明の新規ＴＩＥリガンドホモログと他の治
療剤または細胞傷害性薬剤との結合体、およびこのような結合体を含む組成物に
関する。ＴＩＥ−２レセプターは、腫瘍増殖に必要である病理的な脈管形成中に
アップレギュレートされることが報告されており、そして他のＴＩＥレセプター
は同様の特徴を有し得る。従って、本発明のＴＩＥリガンドホモログの細胞傷害
性または他の抗腫瘍薬剤への結合体は、腫瘍血管系を特異的に標的することにお
いて有用であり得る。
【０００８】 なお別の局面では、本発明は、ＴＩＥレセプターを発現する細胞を同定するた
めの方法に関し、これは、このようなＴＩＥリガンドホモログのＴＩＥレセプタ
ーへの結合を可能にする条件下で、本発明の検出可能に標識したＴＩＥリガンド
ホモログと細胞とを接触させる工程、およびこのような結合が実際に生じたかど
うかを決定する工程を包含する。
【０００９】 異なる局面では、本発明は、ＴＩＥリガンドホモログを特異的に結合する少な
くとも１つの抗体と生物学的試料を接触させる工程、および形成したＴＩＥリガ
ンドホモログ−抗体複合体の量を測定する工程によって、生物学的試料中の本発
明のＴＩＥリガンドホモログの量を測定するための方法に関する。
【００１０】 本発明はさらに、対応するＴＩＥレセプターに結合するために本発明のネイテ
ィブなまたは改変体ＴＩＥリガンドホモログと競合する能力に基づいて、ＴＩＥ
レセプターのポリペプチドまたは低分子アゴニストまたはアンタゴニストを同定
するためのスクリーニング方法に関する。
【００１１】 本発明はまた、創傷治癒、炎症、またはヒト患者の腫瘍において新脈管形成の
存在を画像化するための方法に関し、これは、本発明の検出可能に標識されたＴ
ＩＥリガンドホモログまたはアゴニスト抗体を投与する工程、および新脈管形成
を検出する工程を包含する。
【００１２】 別の局面では、本発明は、薬学的に受容可能なビヒクル中の本発明のＴＩＥリ
ガンドホモログの有効量を投与する工程による、患者において新生血管形成を促
進または阻害する方法に関する。好ましい実施態様では、本発明は、創傷治癒の
促進のための方法に関する。別の実施態様では、本発明は、虚血性心臓または肢
において側副血管新生を誘導するためのような、脈管形成プロセスを促進するた
めの方法に関する。さらに好ましい実施態様では、本発明は、腫瘍増殖を阻害す
るための方法に関する。
【００１３】 なお別の局面では、本発明は、患者における骨発生および／または成熟および
／または増殖を促進する方法に関し、薬学的に受容可能なビヒクル中の本発明の
ＴＩＥリガンドホモログの有効量を患者に投与する工程を包含する。
【００１４】 さらなる局面では、本発明は、筋肉増殖および発達を促進する方法に関し、こ
れは、薬学的に受容可能なビヒクル中の本発明のＴＩＥリガンドホモログの有効
量を必要な患者に投与する工程を包含する。
【００１５】 なお別の局面において、本発明は、本発明のＴＩＥリガンドホモログの有効量
を投与する工程による、内非細胞増殖を阻害および／または内非細胞のアポトー
シスを誘導する方法に関する。さらに、本発明は、炎症を阻害する方法に関し、
この方法は、本発明のＴＩＥホモログのアゴニスト（例えば、本明細書中のＴＩ
Ｅリガンドホモログに対する抗体(例えば、アゴニスト抗ＮＬ−６抗体））の有 効量を患者に投与する工程を包含する。
【００１６】 本発明のＴＩＥリガンドホモログは、単独で、あるいは互いにおよび／または
ＶＥＧＦファミリーのメンバーを含む他の治療剤もしくは診断剤と組み合わせて
、投与され得る。組み合わせ治療は、新生血管形成、ならびに筋肉および／また
は骨の増殖、発達または分化を促進または阻害するための新しいアプローチ、あ
るいは不要な内非細胞増殖に関連する条件の処置（例えば、腫瘍処置）に導き得
る。
【００１７】 （発明の詳細な説明） （Ａ．リガンドホモログおよびそれをコードする核酸分子） 本発明のＴＩＥリガンドホモログは、ＮＬ２（配列番号２）、ＮＬ３（配列番
号４）、およびＦＬＳ１３９（続いて「ＮＬ６」と改名した；配列番号６）と命
名したネイティブなヒトリガンドホモログ、ならびに、サルのような高等哺乳動
物；マウス、ラットハムスターのような齧歯類；ブタ；ウマ；ウシを含む（しか
しこれらに限定されない）、他の非ヒト哺乳動物種におけるそのホモログ、天然
に存在する対立遺伝子およびスプライス改変体、ならびに、ネイティブなＴＬ−
１またはＴＬ−２リガンドとは異なる限り、このようなネイティブな分子のアミ
ノ酸配列改変体のような、生物学的に活性な（機能的）誘導体を含む。本明細書
中に開示されるネイティブＮＬ２は、ｈＴＬ−１（ＴＩＥ２Ｌ１）と２７％アミ
ノ酸配列同一性およびｈＴＬ２（ＴＩＥ２Ｌ２）と約２４％アミノ酸配列同一性
を有する。本明細書中に開示されるネイティブＮＬ３のアミノ酸配列は、ｈＴＬ
−１のアミノ酸配列と約３０％同一およびｈＴＬ−２のアミノ酸配と約２９％列
同一性である。本明細書中に開示される天然のＦＬＳ１３９（ＮＬ６）とｈＴＬ
−１およびｈＴＬ−２との間のアミノ酸配列同一性は、約２１％である。本発明
のネイティブなＴＩＥリガンドホモログは、そのネイティブな環境に関連する他
のタンパク質を実質的に含まない。この定義は、本発明のＴＩＥリガンドホモロ
グが得られる方法によっていかなるようにも限定されず、そしてその他の点で定
義内のすべてのリガンドホモログを含み、天然供給源から精製されるか、組換え
ＤＮＡ技法から得られるか、合成されるか、またはこれらおよび／もしくは他の
技術の任意の組み合わせによって調製されるいずれかである。本発明のネイティ
ブなＴＩＥリガンドホモログのアミノ酸配列改変体は、本発明の全長のネイティ
ブなヒトＴＩＥリガンドホモログと、または本発明のネイティブなヒトＴＩＥリ
ガンドホモログのフィブリノーゲン様ドメインと、少なくとも約９０％、好まし
くは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％、最も好ましくは
少なくとも約９９％配列同一性を有する。このようなアミノ酸配列改変体は、好
ましくは、ネイティブなＴＩＥリガンドホモログの定性的生物学的活性を提示ま
たは阻害する。
【００１８】 用語「フィブリノーゲンドメイン」または「フィブリノーゲン様ドメイン」は
、公知のｈＴＬ−１アミノ酸配列における約２７８位〜約４９８位のアミノ酸；
公知のｈＴＬ−２アミノ酸配列における約２７６位〜約４９６位のアミノ酸；Ｎ
Ｌ２のアミノ酸配列における約１８０位〜約４５３位のアミノ酸；ＮＬ３のアミ
ノ酸配列における約７７位〜約２８８位のアミノ酸；およびＦＬＳ１３９のアミ
ノ酸配列における約２３８位〜約４６０位のアミノ酸；ならびに他のＴＩＥリガ
ンドホモログにおけるホモログドメインをいうために使用される。ＮＬ２のフィ
ブリノーゲン様ドメインは、ｈＴＬ−１（ＴＩＥ２Ｌ１）およびｈＴＬ−２（Ｔ
ＩＥ２Ｌ２）のフィブリノーゲン様ドメインと約３７〜３８％同一である。ＮＬ
３フィブリノーゲン様ドメインは、ｈＴＬ−１およびｈＴＬ−２のフィブリノー
ゲン様ドメインと約３７％同一であり、一方、ＦＬＳ１３９フィブリノーゲン様
ドメインは、ｈＴＬ−１およびｈＴＬ−２のフィブリノーゲン様ドメインと約３
２〜３３％同一である。
【００１９】 用語「核酸分子」は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、およびｃＤＮＡ分子を含む。遺伝コー
ドの縮重の結果として、所定のＴＩＥホモログをコードする多数のヌクレオチド
配列が産生され得ることが理解される。本発明は、すべての可能なコドン選択に
基づいて、本発明のＴＩＥリガンドホモログをコードする、ヌクレオチド配列の
あらゆる可能な改変体を特に意図する。本明細書中におけるＴＩＥリガンドホモ
ログをコードする核酸分子は、好ましくは、ストリンジェント条件下で天然に存
在するＴＩＥリガンドホモログ遺伝子にハイブリダイズし得るが、実質的に異な
るコドン利用を有する、ＴＩＥリガンドホモログをコードするヌクレオチド配列
を産生するために有利であり得る。例えば、コドンは、特定のコドンが宿主によ
って利用される頻度に従って、ポリペプチドの発現が特定の原核生物または真核
生物宿主細胞で起こる割合を増加させるように選択され得る。さらに、改良され
た特性（例えば、半減期）を有するＲＮＡ転写物は、所定のＴＩＥリガンドホモ
ログをコードするヌクレオチド配列の適切な選択によって産生され得る。
【００２０】 「配列同一性」は、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇソフトウ
エア（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）のバ
ージョン１．６、またはこのソフトウエアの任意のアップデート版もしくは等価
物に組み込まれる、多配列アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ方法（Ｈｉｇｇｉｎ
ｓらＣｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．５，１５１−１５３（１９８９）
およびＨｉｇｇｉｎｓら，Ｇｅｎｅ ７３，２３７−２４４（１９８８））に従
って比較されるべき２つの配列を整列することによって決定される。
【００２１】 ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容
易に決定可能であり、そして一般に、プローブ長、洗浄温度、および塩濃度に依
存的な経験的計算である。一般に、より長いプローブは、適切なアニーリングの
ためにより高い温度を必要とするが、より短いプローブはより低い温度を必要と
する。ハイブリダイゼーションは、一般に、相補鎖が融解温度以下の環境に存在
する場合に変性したＤＮＡが再アニールする能力に依存する。プローブとハイブ
リダイズ可能な配列との間の所望の相同性の程度が高いほど、使用され得る相対
温度が高い。結果として、より高い相対温度が、反応条件をよりストリンジェン
トにする傾向があるが、より低い温度ではそうではないことになる。ハイブリダ
イゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明については、
Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉ
ｓｈｅｒｓ，（１９９５）を参照のこと。
【００２２】 本明細書で定義される「ストリンジェント条件」または「高ストリンジェンシ
ー条件」は、（１）洗浄のための低イオン強度および高温、例えば、５０℃で０
．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデ
シル硫酸ナトリウムを用いる；（２）ホルムアルドのような変性剤、例えば、４
２℃にて、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％ Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポ
リビニルピロリドン／７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム
を含むｐＨ ６．５での５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６．５）を含
む５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、をハイブリダイゼーション中に用いる；また
は（３）４２℃にて５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、
０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ ６．８
）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート溶液、超音波処理したサケ
精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ ＳＤＳ、および１０％硫酸デキスト
ランを用い、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５
５℃で５０％ホルムアミド中で４２℃にて洗浄し、次いで５５℃にてＥＤＴＡを
含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄する、条件によって同定
され得る。
【００２３】 「中程度のストリンジェント条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載
のように同定され得、そして上記よりもストリンジェントでない洗浄溶液および
ハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度、および％ＳＤＳ）の
使用を含む。中程度のストリンジェント条件の例は、２０％ホルムアミド、５×
ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリ
ン酸ナトリウム（ｐＨ ７．６）、５×デンハート溶液、１０％硫酸デキストラ
ン、および２０ｍｇ／ｍＬ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で３７℃にての
一晩インキュベート、次いで約３７〜５０℃にて１×ＳＳＣ中でフィルターを洗
浄することである。当業者は、プローブ長などのような適切な因子に必要なよう
に、温度、イオン強度などをどのように調節するかを認識する。
【００２４】 本明細書で使用する場合、用語「タグ化されたエピトープ」とは、「タグポリ
ペプチド」に融合したＴＩＥリガンドホモログポリペプチドを含むキメラポリペ
プチドをいう。タグポリペプチドは、抗体が作製され得るエピトープを提供する
ために十分な残基を有するが、融合されるポリペプチドの活性を妨害しないよう
に十分に短い。タグポリペプチドはまた、好ましくは、抗体が他のエピトープと
実質的に交差反応しないように、かなり独特である。適切なタグポリペプチドは
、一般に、少なくとも６アミノ酸残基、および通常は約８〜５０アミノ酸残基（
好ましくは、約１０〜２０アミノ酸残基）を有する。
【００２５】 本発明のＴＩＥリガンドホモログに関して、用語「生物学的活性」および「生
物学的に活性な」とは、分子が公知または本明細書中以降に発見されるＴＩＥリ
ガンドのネイティブなレセプター（以降「ＴＩＥレセプター」という）、例えば
、ネイティブなＴＩＥ−２レセプターに特異的に結合しそしてそれによってシグ
ナルを出す能力、あるいはシグナル伝達に関与するネイティブなＴＩＥレセプタ
ー（例えば、ＴＩＥ−２）の能力をブロックする能力をいう。従って、本発明の
（ネイティブなおよび改変体）ＴＩＥリガンドは、ネイティブなＴＩＥ（例えば
、ＴＩＥ−２）レセプターのアゴニストおよびアンタゴニストを含む。本発明の
ＴＩＥリガンドの好ましい生物学的活性は、新生血管形成を誘導または阻害する
能力を含む。新生血管形成を誘導する能力は、生物学的状態および疾患（例えば
、創傷治癒、虚血、および糖尿病）の処置に有用であり、ここでは、新生血管形
成が望ましい。他方で、新生血管形成を阻害またはブロックする能力は、例えば
、腫瘍増殖を予防または減弱することに有用であり得る。別の好ましい生物学的
活性は、筋肉増殖または発達に影響を及ぼす能力である。さらに好ましい生物学
的活性は、骨発生、成熟、または増殖に影響を与える能力である。なお別の好ま
しい生物学的活性は、内皮細胞増殖を阻害および／またはアポトーシスを誘導す
る能力である。
【００２６】 本明細書で使用される場合、用語「細胞傷害性薬剤」とは、細胞の機能を阻害
または抑制するおよび／または細胞の破壊を引き起こす物質をいう。この用語は
、放射性同位元素（例えば、Ｉ131、Ｉ125、Ｙ90、およびＲｅ186）、化学療法 剤、および細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素的に活性な毒素またはその
フラグメントのようなトキシンを含むことを意図する。
【００２７】 「化学療法剤」は、ガンの処置に有用な化学化合物である。化学療法剤の例に
は、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、５−フルオロウラシル
、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、
ブスルファン、シトキシン、タキソイド類、例えば、パクリタキセル（Ｔａｘｏ
ｌ，Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎ
ｃｅｔｏｎ，ＮＪ）、およびドキセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ，Ｒｈｏｎｅ−
Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｒｎａｃｅ）、トキソテレ、メト
トレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン
、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビン
クリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カ
ルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン類、エス
ペラミシン類（米国特許第４，６７５，１８７号を参照のこと）、メルファラン
、および他の関連のナイトロジェンマスタードが挙げられる。この定義には、タ
モキシフェンおよびオナプリストンのような腫瘍においてホルモン作用を調節ま
たは阻害するように作用するホルモン性薬剤もまた含まれる。
【００２８】 本明細書で使用される場合、「増殖阻害薬剤」とは、インビトロまたはインビ
ボのいずれかで、細胞、特に本明細書で同定された遺伝子のいずれかを過剰発現
するガン細胞の増殖を阻害する化合物または組成物をいう。したがって、増殖阻
害薬剤は、Ｓ期においてこのような遺伝子を過剰発現する細胞の割合を顕著に減
少させるものである。増殖阻害薬剤の例には、Ｇ１期阻止およびＭ期阻止を誘導
する薬剤のような、細胞周期進行（Ｓ期以外の期間で）をブロックする薬剤が挙
げられる。古典的Ｍ期ブロッカーには、ビンカス（ビンクリスチンおよびビンブ
ラスチン）、タキソール、ならびに、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノル
ビシン、エトポシド、およびブレオマイシンのようなトポＩＩインヒビターが挙
げられる。Ｇ１期を阻止する薬剤はまた、Ｓ期阻止にも及び、例えば、タモキシ
フェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクトレタミン、シスプラチン、メトト
レキセート、５−フルオロウラシル、およびａｒａ−ＣのようなＤＮＡアルキル
化剤である。さらなる情報が、Ｍｕｒａｋａｍｉら（ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ：
Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， １９９５）による「Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｒｅ
ｇｕｌａｔｉｏｎ， ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ， ａｎｄ ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓ
ｔｉｃ ｄｒｕｇｓ」という題の、Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ
ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ， ＭｅｎｄｅｌｓｏｈｎおよびＩｓｒａｅｌ編，Ｃｈａｐ
ｔｅｒ １、特に１３頁で見られ得る。
【００２９】 「ドキソルビシン」は、アントラサイクリン系抗生物質である。ドキソルビシ
ンの完全な化学物質名は、（８Ｓ−シス）−１０−［（３−アミノ−２，３，６
−トリデオキシ−α−Ｌ−リソキシ−ヘキサピラノシル）オキシ］−７，８，９
，１０−テトラヒドロ−６，８，１１−トリヒドロキシ−８−（ヒドロキシアセ
チル）−１−メトキシ−５，１２−ナフタセネジオンである。
【００３０】 用語「サイトカイン」は、細胞内メディエーターとしてもう１つの細胞で作用
する１つの細胞集団によって放出されるタンパク質についての一般的な用語であ
る。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および伝統的
ポリペプチドホルモンである。サイトカインの中には、ヒト成長ホルモン、Ｎ−
メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンのような成長ホルモン；
副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プ
ロレラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、
および黄体形成ホルモン（ＬＨ）のような糖タンパク質ホルモン；肝臓増殖因子
；繊維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子−αお
よび−β；ミュラー管阻害因子；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒ
ビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰ
Ｏ）；ＮＦＧ−βのような神経増殖因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ−αおよびＴ
ＧＦ−βのようなトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖
因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導性因子；インター
フェロン−α、−β、および−γのようなインターフェロン；マクロファージ−
ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）のようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒球−マクロフ
ァージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；ＩＬ
−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ
−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２のようなインターロイキン
（ＩＬ）；ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−βのような腫瘍壊死因子；およびＬＩＦお
よびキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子が挙げられる。本明細
書で使用される場合。用語サイトカインには、天然供給源からまたは組換え細胞
培養物からのタンパク質およびネイティブな配列のサイトカインの生物学的に活
性な等価物が挙げられる。
【００３１】 「血管内皮増殖因子」／「血管透過因子」（ＶＥＧＦ／ＶＰＦ）は、低酸素症
によって刺激されそして腫瘍脈管形成に必要とされることが最近示された、内皮
細胞特異的マイトジェンである（Ｓｅｎｇｅｒら，Ｃａｎｃｅｒ ４６：５６２
９−５６３２（１９８６）；Ｋｉｍら，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：８４１−８４４
（１９９３）；Ｓｃｈｗｅｉｋｉら，Ｎａｔｕｒｅ ３５９：８４３−８４５（
１９９２）；Ｐｌａｔｅら，Ｎａｔｕｒｅ ３５９：８４５−８４８（１９９２
））。これは、合成されそして種々の腫瘍および正常細胞によって分泌される３
４〜４３ｋＤａ（約４５ｋＤａにて優勢な種を有する）ダイマーのジスルフィド
結合した糖タンパク質である。さらに、色素上皮細胞および周皮細胞のような培
養したヒト網膜細胞は、低酸素症に応答してＶＥＧＦを分泌しそしてＶＥＧＦ遺
伝子発現を増加させることが証明された（Ａｄａｍｉｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９３：６３１−６３８（１９９３）；
Ｐｌｏｕｅｔら，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３４
：９００（１９９２）；Ａｄａｍｉｓら，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ
．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３４：１４４０（１９９３）；Ａｉｅｌｌｏら，Ｉｎｖｅｓ
ｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３５：１８６８（１９９４）；Ｓ
ｉｍｏｒｒｅ−ｐｉｎａｔｅｌら，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉ
ｓ．Ｓｃｉ．３５：３３９３−３４００（１９９４））。逆に、正常組織におけ
るＶＥＧＦは比較的低い。したがって、ＶＥＧＦは、新生血管形成に関連する多
くの病理学的状態およびプロセスにおいて主要な役割を果たすようである。した
がって、上記の種々の状態によって影響を受ける組織におけるＶＥＧＦ発現の調
節は、低酸素症に関連する処置または予防的治療に重要であり得る。
【００３２】 用語「アゴニスト」は、ネイティブなＴＩＥレセプター（例えば、ＴＩＥ−２
）によってシグナルを出す能力を有するならば、本発明のネイティブなＴＩＥリ
ガンドホモログのペプチドおよび非ペプチドアナログ、ならびにこのようなネイ
ティブなＴＩＥリガンドホモログを特異的に結合する抗体をいうために使用され
る。言い換えると、用語「アゴニスト」は、ＴＩＥレセプターの生物学的役割の
状況において定義され、およびネイティブなＴＩＥリガンドホモログの生物学的
役割に関して定義されず、これは、上述のように、ＴＩＥレセプター生物学的機
能のアゴニストまたはアンタゴニストであり得る。好ましいアゴニストは、上記
に列挙したＴＩＥホモログの好ましい生物学的活性を保有し、そして血管形成の
プロモーター、骨形成成熟または増殖に役割を果たす分子、ならびに筋肉増殖お
よび／または発達のプロモーターを含む。
【００３３】 用語「アンタゴニスト」は、ネイティブなＴＩＥレセプター（例えば、ＴＩＥ
−２）の生物学的機能を阻害する能力を有するならば、本発明のネイティブなＴ
ＩＥリガンドホモログのペプチドおよび非ペプチドアナログを、ならびにこのよ
うなネイティブなＴＩＥリガンドホモログを特異的に結合する抗体をいうために
使用される。また、用語「アンタゴニスト」は、ＴＩＥレセプターの生物学的役
割に関して定義され、およびネイティブなＴＩＥリガンドホモログの生物学的役
割に関して定義されず、これは、ＴＩＥレセプター生物学的機能のアゴニストま
たはアンタゴニストのいずれかであり得る。好ましいアンタゴニストは、血管形
成、あるいは病理学的骨格または筋肉の発達または成長のインヒビターである。
【００３４】 本明細書で使用される場合、「腫瘍」とは、悪性または良性の、ならびにすべ
ての前ガン性およびガン性の細胞および組織のいずれかの、全ての新形成細胞成
長および増殖をいう。
【００３５】 用語「ガン」および「ガン性」とは、代表的には調節されない細胞増殖によっ
て特徴づけられる、哺乳動物における生物学的症状をいうかまたは記載する。ガ
ンの例には、ガン腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられるが
、これらに限定されない。このようなガンのより特定な例には、乳ガン、前立腺
ガン、結腸ガン、扁平上皮ガン、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、胃腸ガン、膵
臓ガン、神経膠芽腫、子宮頚ガン、卵巣ガン、肝臓ガン、膀胱ガン、悪性肝ガン
（ｈｅｐａｔｏｍａ）、結直腸ガン、子宮内膜ガン、唾液腺ガン、腎臓ガン、肝
臓ガン、外陰部ガン、甲状腺ガン、肝ガン腫、ならびに種々のタイプの頭部およ
び頚部ガンが挙げられる。
【００３６】 「処置」は、発生を抑制することまたは障害の病理を変更することを意図して
行われる介入である。したがって、「処置」とは、治療処置および予防または防
止尺度の両方をいう。処置を必要とするものには、既に障害を有するものならび
に障害が予防されるべきものが挙げられる。腫瘍（例えば、ガン）処置では、治
療薬剤は、腫瘍細胞の病理を直接減少し得るか、または腫瘍細胞が他の治療薬剤
による処置、例えば、放射線照射および／または化学療法をより受けやすくし得
る。
【００３７】 ガンの「病理」は、患者の安寧に欠陥を生じさせるすべての現象を含む。これ
には、異常または制御不能な細胞増殖、転移、隣接細胞の正常機能の妨害、サイ
トカインまたは他の分泌産物の異常レベルでの放出、炎症または免疫学的応答の
抑制または悪化などが挙げられが、これらに限定されない。
【００３８】 処置の目的のための「哺乳動物」とは、ヒト、家畜および飼育動物、ならびに
イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどのような動物園、競技、またはペット動物を含む、
哺乳動物として分類される任意の動物をいう。好ましくは、哺乳動物はヒトであ
る。
【００３９】 １つ以上のさらなる治療薬剤「と組み合わせた」投与は、同時（共同して作用
する（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ））および任意の順での連続投与を含む。
【００４０】 用語「機能的誘導体」は、本発明のネイティブなＴＩＥリガンドホモログの生
物学的に活性なアミノ酸配列改変体、ならびに、有機誘導体化薬剤との反応によ
って得られた誘導体、翻訳後修飾、非タンパク質性ポリマーを有する誘導体、お
よびイムノアドヘシンを含む共有改変を定義するために使用される。
【００４１】 本明細書に記載される種々のポリペプチドを記載するために使用される場合、
用語「単離された」とは、その天然環境の成分から同定および分離および／また
は回収されているポリペプチドを意味する。その天然の環境の夾雑成分は、代表
的には、ポリペプチドについての診断または治療用途を妨害し、そして酵素、ホ
ルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る物質であ
る。好ましい実施態様では、ポリペプチドは、（１）スピニングカップシークエ
ネーターの使用によるＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得
るために十分な程度まで、または（２）クーマシーブルーまたは好ましくは銀染
色を使用して非還元または還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで、精
製される。単離されたポリペプチドは、インサイチュで、組換え細胞内にポリペ
プチドを含む。なぜなら、ＴＩＥリガンドの天然環境の少なくとも１つの成分が
存在しないからである。しかし、通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも
１つの精製工程によって調製される。
【００４２】 「単離された」核酸分子は、核酸の天然供給源中に普通に会合する少なくとも
１つの夾雑核酸分子から同定および分離される核酸分子である。単離された核酸
分子は、天然で見いだされる形態または配置以外である。単離された核酸分子は
、したがって、天然細胞に存在するので、核酸分子とは区別される。しかし、単
離された核酸分子には、例えば、核酸分子が天然細胞とは異なる染色体位置にあ
る場合、本発明のＴＩＥリガンドを普通に発現する細胞に含まれる核酸分子が含
まれる。
【００４３】 用語「アミノ酸配列改変体」とは、ネイティブなアミノ酸配列と比較してその
アミノ酸配列にいくつかの差を有する分子をいう。
【００４４】 置換改変体は、除去されるネイティブな配列で少なくとも１つのアミノ酸残基
および同じ位置で代わりに挿入される異なるアミノ酸を有するものである。置換
は、分子中の１つのみのアミノ酸が置換される場合、単一であり得、あるいは、
２つ以上のアミノ酸が同じ分子で置換される場合は、複数であり得る。
【００４５】 挿入改変体は、ネイティブな配列において特定の位置でアミノ酸に直接隣接し
て挿入される１つ以上のアミノ酸を有する改変体である。アミノ酸に直接隣接す
るとは、アミノ酸のα−カルボキシ官能基またはα−アミノ官能基のいずれかに
接続されることを意味する。
【００４６】 欠失改変体は、ネイティブなアミノ酸配列に除去される１つ以上のアミノ酸を
有する改変体である。通常、欠失改変体は、分子の特定の領域で欠失した１また
は２アミノ酸を有する。欠失改変体には、Ｃ−および／またはＮ−末端欠失（短
縮）を有するもの、ならびに１つ以上のアミノ酸の内部欠失を有する改変体が挙
げられる。本発明の好ましい欠失改変体は、本発明のネイティブなＴＩＥリガン
ドホモログのフィブリノーゲン様ドメインの外側の欠失を含む。
【００４７】 本発明のアミノ酸配列改変体は、最適の特徴を有する分子を産生するために、
アミノ酸置換、挿入、および／または欠失の種々の組み合わせを含み得る。
【００４８】 アミノ酸は、化学組成およびその側鎖の特性に従って分類され得る。これらは
、２つの群、荷電的および非荷電的に広く分類される。これらの群のそれぞれは
、アミノ酸をより正確に分類するために下位集団に分割される。 Ｉ．荷電アミノ酸 酸性残基：アスパラギン酸、グルタミン酸 塩基性残基：リジン、アルギニン、ヒスチジン ＩＩ．非荷電アミノ酸 親水性残基：セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン 脂肪族残基：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン 非極性残基：システイン、メチオニン、プロリン 芳香族残基：フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン 保存的置換は、１つの群内のメンバーを同じ群内のもう１つのメンバーと交換
することを含むが、非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーをもう１
つに交換することを伴う。非保存的置換によって得られる改変体は、得られた改
変体の生物学的特性／機能の顕著な変化を生じることが予測される。
【００４９】 アミノ酸配列欠失は、一般に、約１〜３０残基、より好ましくは約１〜１０残
基の範囲であり、そして代表的には隣接する。欠失は、ネイティブなＴＩＥレセ
プターとの相互作用に直接関連しない領域に導入され得る。欠失は、好ましくは
、本発明のＴＩＥリガンドホモログのＣ末端のフィブリノーゲン様領域の外側で
行われる。
【００５０】 アミノ酸挿入には、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまでの長
さの範囲のアミノおよび／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複
数アミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。配列内挿入（すなわち、ＴＩＥリガ
ンドホモログアミノ酸配列内の挿入）は、一般に、約１〜１０残基、より好まし
くは１〜５残基、より好ましくは１〜３残基の範囲であり得る。末端挿入の例に
は、Ｎ末端メチオニル残基を有するＴＩＥリガンドホモログ、細菌組換え細胞培
養物中のその直接発現の人工産物、および組換え宿主細胞からの成熟ＴＩＥリガ
ンドホモログの分泌を容易にするための異種Ｎ末端シグナル配列のＴＩＥリガン
ドホモログ分子のＮ末端への融合物が挙げられる。このようなシグナル配列は、
一般に、目的の宿主細胞種から得られ、したがってそれに相同である。適切な配
列には、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉについてはＳＴＩＩまたはＩｐｐ、酵母について
はα因子、および哺乳動物細胞についてはヘルペスｇＤのようなウイルスシグナ
ルが挙げられる。
【００５１】 ネイティブなＴＩＥリガンド分子の他の挿入改変体には、免疫原性ポリペプチ
ド、例えば、β−ラクタマーゼまたはＥ．ｃｏｌｉ ｔｒｐ遺伝子座によってコ
ードされる酵素のような細菌ポリペプチド、または酵母タンパク質への、ＴＩＥ
リガンドホモログ分子のＮ末端またはＣ末端の融合物、ならびに、１９８９年４
月６日に公開されたＷＯ ８９／０２９２２に記載のように、免疫グロブリン領
域（好ましくは、免疫グロブリン定常領域）、アルブミン、またはフェリチンの
ような長い半減期を有するタンパク質とのＣ末端融合物が挙げられる。
【００５２】 改変体ＴＩＥリガンドホモログの特徴を予め予測することがしばしば困難であ
るので、いくつかのスクリーニングが最適な改変体を選択するために必要とされ
ることが理解される。
【００５３】 本発明のネイティブなＴＩＥリガンドホモログのアミノ酸配列改変体は、ネイ
ティブなまたは改変体ＴＩＥリガンドホモログのＤＮＡに適切なヌクレオチド変
化を導入することによって、または所望のポリペプチドのインビトロ合成によっ
て、当該技術分野で公知の方法によって調製される。アミノ酸配列改変体の構築
における２つの主な変数がある：変異部位の位置および変異の性質。ＴＩＥリガ
ンドホモログをコードするＤＮＡ配列の操作を必要としない、天然に存在する対
立遺伝子を除いて、ＴＩＥリガンドホモログのアミノ酸配列改変体は、好ましく
は、天然に存在しない対立遺伝子またはアミノ酸配列改変体のいずれかを実現す
るために、ＤＮＡを変異することによって構築される。
【００５４】 変異の１つの群は、ＴＩＥレセプター、例えば、ＴＩＥ−１もしくはＴＩＥ−
２、またはまだ発見されていないレセプターとの相互作用に関連すると同定され
た、本発明のＴＩＥリガンドホモログのドメイン内で生成される。
【００５５】 あるいはまたはさらに、アミノ酸の変更は、実現されるべき目的に依存して、
種々の種からのＴＩＥリガンドホモログにおいて異なる部位、または高度に保存
された領域に作成され得る。
【００５６】 このような位置での部位は、代表的には、例えば、（１）最初に保存的選択で
、次いで実現した結果に依存してより根本的選択で置換すること、（２）標的残
基を欠失すること、または（３）位置した部位に隣接する同じまたは異なるクラ
スの残基を挿入すること、または選択肢１〜３の組み合わせによって連続して改
変される。
【００５７】 １つの有用な技術は、「アラニンスキャンニング」と呼ばれる（Ｃｕｎｎｉｎ
ｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４，１０８１−１０８５［１
９８９］）。ここで、残基または標的残基の群は、アラニンまたはポリアラニン
によって同定されそして置換される。次いで、アラニン置換に対する機能的感受
性を証明するドメインは、アラニン置換の部位でまたは部位に対してさらにまた
は他の置換基を導入することによって精錬される。
【００５８】 所望の変異を同定した後、ＴＩＥリガンドホモログのアミノ酸配列改変体をコ
ードする遺伝子は、例えば、上記のように化学合成によって得られ得る。
【００５９】 より好ましくは、ＴＩＥリガンドホモログのアミノ酸配列改変体をコードする
ＤＮＡは、より初期に調製されたリガンドの改変体または非改変型をコードする
ＤＮＡの部位特異的変異誘発によって調製される。部位特異的変異誘発は、所望
の変異のＤＮＡ配列をコードする特異的オリゴヌクレオチド配列、ならびに横切
った欠失連結部の両側で安定な二重鎖を形成するために十分なサイズおよび配列
複雑性のプライマー配列を提供するために、隣接ヌクレオチドの十分な数の使用
によってリガンド改変体の産生を可能にする。代表的には、約２０〜２５ヌクレ
オチド長のプライマーが好ましく、配列の連結部の両側での約５〜１０残基が変
更される。一般に、部位特異的変異誘発の技術は、当該分野で周知であり、Ｅｄ
ｅｌｍａｎら，ＤＮＡ ２，１８３（１９８３）のような刊行物に例示される。
理解されるように、部位特異的変異誘発技術は、代表的には、一本鎖形態および
二本鎖形態の両方で存在するファージベクターを用いる。部位特異的変異誘発に
有用な代表的なベクターには、例えば、Ｍｅｓｓｉｎｇら，Ｔｈｉｒｄ Ｃｌｅ
ｖｅｌａｎｄ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａ
ｎｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ａ．Ｗａｌｔｏｎ編，Ｅｌｓｅｖｉｅ
ｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８１）に開示されるように、Ｍ１３ファージのよ
うなベクターが挙げられる。これおよび他のファージベクターは市販されており
、そしてその使用は、当業者に周知である。Ｍ１３由来ベクターを使用するＤＮ
Ａフラグメントにおける部位特異的変異を指示するオリゴデオキシリボヌクレオ
チドの構築のための多才なおよび有効な手順は、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．および
Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０，６４８７−６
５００［１９８２］によって公開された。また、一本鎖ファージ複製起点を含む
プラスミドベクター（Ｖｅｉｒａら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３，３［
１９８７］）は、一本鎖ＤＮＡを得るために用いられ得る。あるいは、ヌクレオ
チド置換は、インビトロで適切なＤＮＡフラグメントを合成することによって、
および当該技術分野で公知のＰＣＲ手順によって増幅することによって導入され
る。
【００６０】 一般に、本願の部位特異的変異誘発は、関連タンパク質をコードするＤＮＡ配
列をその配列内に含む一本鎖ベクターを最初に得ることによって行われる。所望
に変異された配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーは、例えば、Ｃｒｅａ
ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ７５，５７６５（１９７
８）の方法によって、一般に合成的に調製される。次いで、このプライマーは、
一本鎖タンパク質配列含有ベクターとアニールし、そしてＥ．ｃｏｌｉポリメラ
ーゼＩクレノウフラグメントのようなＤＮＡ重合化酵素を受けさせて、変異含有
鎖の合成を完了させる。したがって、ヘテロ二重鎖は、１つの鎖が元の非変異配
列をコードし、そして第２鎖が所望の変異を有する場合に形成される。次いで、
このヘテロ二重鎖ベクターは、ＪＰ１０１細胞のような適切な宿主細胞を形質転
換するために使用され、そして変異した配列アライメントを有する組換えベクタ
ーを含むクローンが選択される。その後、変異した領域は除去され、そしてタン
パク質産生に適切な発現ベクター中に配置され得る。
【００６１】 ＰＣＲ技術はまた、ＴＩＥリガンドのアミノ酸配列改変体を生成することに使
用され得る。少量のテンプレートＤＮＡがＰＣＲにおける開始物質として使用さ
れる場合、テンプレートＤＮＡにおいて対応する領域とは配列がわずかに異なる
プライマーは、プライマーがテンプレートと異なる位置のみでテンプレート配列
とは異なる比較的大量の特異的ＤＮＡフラグメントを生成するために使用され得
る。プラスミドＤＮＡへの変異の導入のために、プライマーの１つは、変異の位
置を重複しそして変異を含むように設計され；他のプライマーの配列は、プラス
ミドの反対鎖の配列のストレッチと同一でなければならないが、この配列は、プ
ラスミドＤＮＡに沿ってどこにでも位置し得る。しかし、第２プライマーの配列
が、第１の配列から２００ヌクレオチド内に位置しそのため末端でプライマーに
結合したＤＮＡの全体の増幅した領域が容易に配列決定され得ることが好ましい
。まさに記載したもののようなプライマー対を使用するＰＣＲ増幅は、プライマ
ーによって特定される変異の位置で異なるＤＮＡフラグメントの集団を生じ、そ
しておそらく他の位置では、テンプレートとしてコピーすることは、幾分誤る傾
向がある。
【００６２】 物質を産生するためのテンプレートの比が非常に低いならば、大多数の産物Ｄ
ＮＡフラグメントは、所望の変異を組み込む。この産物物質は、標準的ＤＮＡ技
術を使用してＰＣＲテンプレートとして用いたプラスミド中の対応する領域を置
換するために使用される。別々の位置での変異は、変異体第２プライマーを使用
するかまたは異なる変異体プライマーでの第２ＰＣＲを行うことのいずれか、お
よび３つ（またはそれ以上）の部分的ライゲーションにおいてベクターフラグメ
ントに２つの得られるＰＣＲフラグメントを同時にライゲートすることによって
、同時に導入され得る。
【００６３】 ＰＣＲ変異誘発の特定の例では、テンプレートプラスミドＤＮＡ（１μｇ）は
、増幅されるべき領域の外側でプラスミドＤＮＡ中に独特の認識部位を有する制
限エンドヌクレアーゼによる切断によって直線化される。この物質のうち、１０
０ｎｇを、４つのデオキシヌクレオチド三リン酸を含みそしてＧｅｎｅＡｍｐ（
商標）キット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ
およびＥｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡより入手）、および２５ｐｍｏｌの各オリゴ
ヌクレオチドプライマーに含まれるＰＣＲ緩衝液を含むＰＣＲ混合物に、５０μ
ｌの最終容量まで添加する。反応混合物を、３５μｌ鉱油で重層する。反応物を
、１００℃にて５分間変性し、氷上に簡単に置き、次いでＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍ
ｅｒ Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴおよびＥｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡか
ら購入した１μｌ Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリ
メラーゼ（５単位／ｌ）を、鉱油層の下に添加する。次いで、反応混合物を、以
下のようにプログラムされたＤＮＡサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍ
ｅｒ Ｃｅｔｕｓから購入した）に差し込む： ２分、５５℃、 ３０秒、７２℃、次いで以下の１９サイクル： ３０秒、９４℃、 ３０秒、５５℃、および ３０秒、７２℃。
【００６４】 プログラムの最後に、反応バイアルを、サーマルサイクラーから取り出しそし
て水相を新しいバイアルに移し、フェノール／クロロホルム（５０：５０ｖｏｌ
）で抽出し、そしてエタノール沈殿し、そしてＤＮＡを標準的手順によって回収
する。この物質は、その後、ベクターへの挿入のために適切な処置にかける。
【００６５】 改変体を調製するためのもう１つの方法である、カセット変異誘発は、Ｗｅｌ
ｌｓら，［Ｇｅｎｅ ３４，３１５（１９８５）］に記載の技術に基づく。開始
物質は、変異されるべきＴＩＥリガンドホモログＤＮＡを含むプラスミド（また
はベクター）である。変異されるべきＴＩＥリガンドホモログ内のコドンが同定
される。同定された変異部位の各側における独特の制限エンドヌクレアーゼがな
ければならない。このような制限部位が存在しないならば、これらは、ＴＩＥリ
ガンドホモログをコードするＤＮＡにおいて適切な位置に導入するための上記の
オリゴヌクレオチド媒介変異誘発方法を使用して生成され得る。制限部位がプラ
スミドに導入された後、プラスミドを、直線にするためにこれらの部位で切断す
る。制限部位間のＤＮＡの配列をコードするが所望の変異を含む二本鎖オリゴヌ
クレオチドを、標準的手順を使用して合成する。２つの鎖を別々に合成し、次い
で標準的技術を使用してともにハイブリダイズする。この二本鎖オリゴヌクレオ
チドは、カセットという。このカセットを、プラスミドに直接連結され得るよう
に、直線にしたプラスミドの末端と適合可能である３’および５’末端を有する
ように設計する。このプラスミドは、今や、変異したＴＩＥリガンドホモログＤ
ＮＡ配列を含む。
【００６６】 さらに、いわゆるファージミド提示方法は、ネイティブか、または改変体ＴＩ
Ｅリガンドホモログのアミノ酸配列改変体を作成することに有用であり得る。こ
の方法は、（ａ）変異させるべきレセプターをコードする第１の遺伝子、第１お
よび第２の遺伝子が異種である天然または野生型ファージコートタンパク質の少
なくとも一部をコードする第２の遺伝子、および融合タンパク質をコードする遺
伝子融合物を形成する第１および第２の遺伝子に作動可能に連結される転写調節
エレメントを含む、複製可能な発現ベクターを構築する工程；（ｂ）関連のプラ
スミドのファミリーを形成する第１の遺伝子内の１つ以上の選択された位置でベ
クターを変異する工程；（ｃ）プラスミドで適切な宿主細胞を形質転換する工程
；（ｄ）ファージコートタンパク質をコードする遺伝子を有するヘルパーファー
ジで、形質転換された宿主細胞を感染させる工程；（ｅ）プラスミドの少なくと
も一部を含む組換えファージミド粒子を形成するために適切でありそして宿主を
形質転換し得る条件下で、形質転換し感染した宿主細胞を培養する工程であって
、この条件が、ほんの少量のファージミド粒子が粒子の表面上に融合タンパク質
の１つより多くのコピーを提示するように調節される、工程；（ｆ）ファージミ
ド粒子の少なくとも一部が抗原に結合するように、適切な抗原とファージミド粒
子とを接触させる工程；および（ｇ）結合するファージミド粒子を結合しないも
のと分離する工程、を包含する。工程（ｄ）〜（ｇ）は、１回以上繰り返され得
る。好ましくは、この方法において、プラスミドは、転写調節エレメントの堅い
制御下にあり、そして培養条件は、粒子の表面上に融合タンパク質の１つより多
くのコピーを提示するファージミド粒子の量または数が、約１％以下であるよう
に調節される。また、好ましくは、融合タンパク質の１つより多くのコピーを提
示するファージミド粒子の量は、融合タンパク質の単一コピーを提示するファー
ジミド粒子の量の１０％以下である。最も好ましくは、この量は２０％以下であ
る。代表的には、この方法では、発現ベクターは、ポリペプチドの各サブユニッ
トをコードするＤＮＡに融合した分泌シグナル配列をさらに含み、そして転写調
節エレメントは、プロモーター系である。好ましいプロモーター系は、ｌａｃ
Ｚ、λPL、ｔａｃ、Ｔ７ポリメラーゼ、トリプトファン、およびアルカリホスフ
ァターゼプロモーター、ならびにその組み合わせから選択される。また、通常は
、この方法は、Ｍ１３Ｋ０７、Ｍ１３Ｒ４０８、Ｍ１３−ＶＣＳ、およびＰｈｉ
Ｘ １７４から選択されるヘルパーファージを用いる。好ましいヘルパーファ
ージは、Ｍ１３Ｋ０７であり、そして好ましいコートタンパク質は、Ｍ１３ファ
ージ遺伝子ＩＩＩコートタンパク質である。好ましい宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ、お
よびＥ．ｃｏｌｉのプロテアーゼ欠失株である。
【００６７】 上記および類似の変異誘発技術のさらなる詳細は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ
らＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｗｉ
ｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１のような、一般的教科書で見いだ
される。
【００６８】 「イムノアドヘシン」は、適切な免疫グロブリン定常ドメイン配列に連結した
レセプター配列から伝統的に構築されるキメラである（イムノアドヘシン）。こ
のような構造は、当該技術分野で周知である。文献で報告されたイムノアドヘシ
ンには、Ｔ細胞レセプター*［Ｇａｓｃｏｉｇｎｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ ｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４、２９３６−２９４０（１９８７）］；ＣＤ４* ［Ｃａｐｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３３７，５２５−５３１（１９８９）；Ｔｒａ
ｕｎｅｃｋｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ ３３９，６８−７０（１９８９）；Ｚｅｔｔ
ｍｅｉｓｓｌら，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．ＵＳＡ ９，３４７−３５３（
１９９０）；Ｂｙｒｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３４４，６６７−６７０（１９９０）
］；Ｌ−セレクチン（ホーミングレセプター）［Ｗａｔｓｏｎら，Ｊ．Ｃｅｌｌ
．Ｂｉｏｌ．，１１０，２２２１−２２２９（１９９０）；Ｗａｔｓｏｎら，Ｎ
ａｔｕｒｅ ３４９，１６４−１６７（１９９１）］；ＣＤ４４*［Ａｒｕｆｆ ｏら，Ｃｅｌｌ ６１，１３０３−１３１３（１９９０）］；ＣＤ２８*および Ｂ７*［Ｌｉｎｓｌｅｙら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３，７２１−７３０（１ ９９１）］；ＣＴＬＡ−４*［Ｌｉｎｓｌｅｙら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４ ，５６１−５６９（１９９１）］；ＣＤ２２*「Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら，Ｃ ｅｌｌ ６６，１１３３−１１４４（１９９１）］；ＴＮＦレセプター［Ａｓｈ
ｋｅｎａｚｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８，１０
５３５−１０５３９（１９９１）；Ｌｅｓｓｌａｕｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．２７，２８８３−２８８６（１９９１）；Ｐｅｐｐｅｌら，Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．１７４，１４８３−１４８９（１９９１）］；ＮＰレセプター［Ｂ
ｅｎｎｅｔｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，２３０６０−２３０６７（
１９９１）］；ＩｇＥレセプターα鎖*［ＲｉｄｇｗａｙおよびＧｏｒｍａｎ， Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１５，ａｂｓｔｒ．１４４８（１９９１）］；ＨＧ
Ｆレセプター［Ｍａｒｋ，Ｍ．Ｒ．ら，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
投稿中］の融合物が挙げられ、ここでアステリスク（*）は、レセプターが免疫 グロブリンスーパーファミリーのメンバーであることを示す。
【００６９】 リガンド−免疫グロブリンキメラもまた公知であり、そして例えば、米国特許
第５，３０４，６４０号（Ｌ−セレクチンリガンドについて）；同第５，３１６
，９２１号および同第５，３２８，８３７号（ＨＧＦ改変体について）に開示さ
れる。これらのキメラは、レセプター−免疫グロブリンキメラの構築と類似の方
法で作成され得る。
【００７０】 本発明のＴＩＥリガンドホモログの共有改変は、本発明の範囲内に含まれる。
このような改変は、ＴＩＥリガンドの標的されたアミノ酸残基を、選択された側
面または末端残基と反応し得る有機誘導体化薬剤と反応させることによって、あ
るいは選択された宿主細胞で機能する翻訳後改変のメカニズムを利用することに
よって伝統的に導入される。得られる共有誘導体は、生物学的活性に、イムノア
ッセイに、または組換え体のイムノアフィニティー精製のための抗ＴＩＥリガン
ド抗体の調製に、重要な残基を同定することに関するプログラムで有用である。
例えば、ニンヒドリンとの反応後のタンパク質の生物学的活性の完全不活化は、
少なくとも１つのアルギニル残基またはリジル残基がその活性に重要であり、そ
の後選択された条件下で改変された個々の残基が、改変したアミノ酸残基を含む
ペプチドフラグメントの単離によって同定されることを示唆する。このような改
変は、当業者の範囲内であり、そして過度の実験を行うことなく行われる。
【００７１】 システニル残基は、最も普通には、クロロ酢酸またはクロロアセタミドのよう
なα−ハロ酢酸塩（および対応するアミン）と反応して、カルボキシメチルまた
はカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システニル残基はまた、ブロモトリフ
ルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロ
アセチルリン酸、Ｎ−アルキルマレイミド，３−ニトロ−２−ピリジルジスルフ
ィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ水銀安息香酸、２−クロロ
水銀−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−
１，３−ジアゾールとの反応によって誘導体化される。
【００７２】 ヒスチジル残基は、この薬剤がヒスチジル側鎖に比較的特異的であるので、ｐ
Ｈ ５．５〜７．０でのジエチルピロカーボネートとの反応によって誘導体化さ
れる。パラ−ブロモフェナシルブロミドも有用である；反応は、好ましくは、ｐ
Ｈ ６．０にて０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中で行われる。
【００７３】 リジニルおよびアミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボン酸無水物と反
応する。これらの薬剤の誘導体化は、リジニル残基の電荷を逆にする効果を有す
る。α−アミノ含有残基を誘導体化するための他の適切な試薬には、メチルピコ
リンイミデートのようなイミドエステル；ピリドキサルリン酸；ピリドキサール
；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；
２，４−ペンタンジオン；およびグリコキシレートとのトランスアミナーゼ触媒
した反応物が挙げられる。
【００７４】 アルギニル残基は、１つまたはいくつかの従来の試薬、その中でもフェニルグ
リオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、および
ニンヒドリンとの反応によって改変される。アルギニン残基の誘導体化は、グア
ニジン官能基の高いｐＫaのために、反応がアルカリ条件で行われることが必要 とされる。さらに、これらの試薬は、リジン基およびアルギニンイプシロン−ア
ミノ基と反応し得る。
【００７５】 チロシル残基の特定の改変は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロ
メタンとの反応によってチロシル残基にスペクトル標識を導入することにおいて
、特定の目的で行われ得る。最も普通には、Ｎ−アセチルイミジゾールおよびテ
トラニトロメタンは、それぞれＯ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体
を形成するために使用される。チロシル残基は、ラジオイムノアッセイでの使用
のために標識されたタンパク質を調製するために125Ｉまたは131Ｉを使用してヨ
ード化される。
【００７６】 カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）は、１−シクロヘキシル
−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３
−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドのようなカルボ
ジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応によって選択的に改変される。さ
らに、アスパルチル残基およびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応
によってアスパラギニル残基およびグルタミニル残基に変換される。
【００７７】 グルタミニル残基およびアスパラギニル残基は、頻繁に、対応するグルタミル
およびアスパルチル残基に脱アミド化される。あるいは、これらの残基は、穏や
かな酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれかの形態は、本発明
の範囲内にはいる。
【００７８】 他の改変には、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリル、トレオニル
、またはチロシル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およ
びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐ
ｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐ
ｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓ
ｃｏ，ｐｐ．７９−８６［１９８３］）、Ｎ−末端アミンのアセチル化、ならび
に任意のＣ−末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。分子は、さらに、米
国特許４，６４０，８３５；４，４９６，６８９；４，３０１，１４４；４，６
７０，４１７；４，７９１，１９２；または４，１７９，３３７に記載の方法で
、非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレン
グリコール、またはポリオキシアルキレンに共有結合され得る。
【００７９】 二官能性薬剤での誘導体化は、ＴＩＥリガンドのポリペプチドとの分子内凝集
を調製するために、ならびにアッセイまたはアフィニティー精製での使用のため
に水不溶性支持体マトリクスまたは表面にＴＩＥリガンドポリペプチドを架橋す
るために、有用である。さらに、鎖間架橋の研究は、コンホメーション構造にお
ける直接情報を提供する。普通に使用される架橋剤には、１，１−ビス（ジアゾ
アセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル、ホモ二官能性イミドエステル、および二官能性マレイミドが
挙げられる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデー
トのような誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成し得る光活性化可能中間体を
得る。あるいは、臭化シアン活性化した炭化水素のような反応性水不溶性マトリ
クスならびに米国特許第３，９５９，６４２号；第３，９６９，２８７号；第３
，６９１，０１６号；第４，１９５，１２８号；第４，２４７，６４２号；第４
，２２９，５３７号；第４，０５５，６３５号；および第４，３３０，４４０号
に記載の系反応性基質が、タンパク質固定化および架橋に用いられる。
【００８０】 ある翻訳後修飾は、発現したポリペプチドにおける組換え宿主細胞の作用の結
果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、頻繁に、対応するグルタ
ミルおよびアスパルチル残基に翻訳後脱アミド化される。あるいは、これらの残
基は、穏やかな酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれかの形態
は、本発明の範囲内にはいる。
【００８１】 他の翻訳後修飾には、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリン、トレ
オニン、またはチロシン残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン
、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化［Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏ
ｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐ
ｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎ
ｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３）］が挙げられる。
【００８２】 他の誘導体は、非タンパク質性ポリマーに共有結合した本発明の新規ペプチド
を含む。非タンパク質性ポリマーは、通常は、親水性合成ポリマー、すなわち、
天然で他には見いだされないポリマーである。しかし、天然に存在し、そして組
換えまたはインビトロ方法によって産生されるポリマーは、天然から単離される
ポリマーと同様に、有用である。親水性ポリビニルポリマー、例えば、ポリビニ
ルアルコールおよびポリビニルピロリドンは、本発明の範囲にはいる。ポリエチ
レングリコール、ポリプロピレングリコールのようなポリビニルアルキレンエー
テルは、特に有用である。
【００８３】 ＴＩＥリガンドホモログは、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６
，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１
，１９２号；または第４，１７９，３３７号に記載の様式で、ポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンの
ような種々の非タンパク質性ポリマーに連結され得る。まさに本発明のイムノア
ドヘシンのような、これらの改変体は、対応するネイティブなＴＩＥリガンドホ
モログよりも長い半減期を有することが予測される。
【００８４】 ＴＩＥリガンドホモログは、例えば、コアセルベーション技術によってまたは
界面重合化によって調製されるマイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系（例
えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノパ
ーティクル、およびナノカプセル）に、あるいはマクロエマルジョンに捕らえら
れ得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ
ｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）に開示され
る。
【００８５】 用語「ネイティブなＴＩＥレセプター」は、公知であるか、本明細書中以後に
開示されているヒト、他の高等霊長類（例えば、サル）、ならびに齧歯類（例え
ば、ラットおよびマウス）を含むが、これらに限定されない任意の動物種のＴＩ
Ｅレセプターをいうために本明細書で使用される。この定義は、詳細には、例え
ば、ＰＣＴ出願第ＷＯ ９５／１３３８７号（１９９５年５月１８日公開）に開
示されるＴＩＥ−２レセプター、およびＰＣＴ出願公開公報第ＷＯ ９３／１４
１２４号（１９９３年７月２２日公開）で「ＴＩＥ」という内皮細胞レセプター
チロシンキナーゼを含み、そして好ましくはＴＩＥ−２である。
【００８６】 （Ｂ．抗ＴＩＥリガンドホモログ抗体） 本発明は、ＴＩＥリガンドホモログを特異的に結合する、アゴニストおよびア
ンタゴニスト抗体をカバーする。この抗体は、モノクローナルまたはポリクロー
ナルであり得、そして限定することなく、成熟抗体、抗体フラグメント（例えば
、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、ＦVなど）、単鎖抗体、および種々の鎖の組み合わせ
を含む。
【００８７】 用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、そして具体的には本発明のＴＩＥ
リガンドを特異的に結合する単一モノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニ
スト、および中和抗体を含む）、ならびに多エピトープ特異性を有する抗体組成
物をカバーする。
【００８８】 本明細書で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質
の抗体の集団から得られる抗体をいい、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少
ない量で存在し得る潜在的な天然に存在する変異を除いては、同一である。モノ
クローナル抗体は、非常に特異的であり、単一抗原性部位に対して指向される。
さらに、代表的には種々の決定基（エピトープ）に対して指向される種々の抗体
を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは逆に、各モノクローナル抗体は
、抗原上の単一の決定基に対して指向される。
【００８９】 本明細書におけるモノクローナル抗体には、起源の種または免疫グロブリンク
ラスもしくはサブクラスの指定にかかわりなく、定常ドメインを伴う、抗ＴＩＥ
リガンドホモログ抗体の可変（超可変を含む）ドメインをスプライシングするこ
とによって産生されるハイブリッドおよび組換え抗体（例えば、「ヒト化」抗体
）、または重鎖を伴う軽鎖、またはもう１つの種からの鎖を伴う１つの種からの
鎖、または異種タンパク質を伴う融合物、ならびに所望の生物学的活性を示す限
り抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、およびＦｖ）が挙げら れる。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号およびＭａｇｅら，Ｍｏｎｏｃ
ｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．７９−９７（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅ
ｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）を参照のこと。
【００９０】 したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得
られるような抗体の特徴を示し、そして任意の特定の方法による抗体の産生を必
要とすると解釈されない。例えば、本発明に従って使用されるべきモノクローナ
ル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９
５（１９７５）に最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作製され得、ま
たは米国特許第４，８１６，５６７号に記載のような組換えＤＮＡ方法によって
作製され得る。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ
ら，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載の技術を使用し
て生成されるファージライブラリーから単離され得る。
【００９１】 非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、特異的キメラ免疫グロブ
リン、免疫グロブリン鎖、またはそれらのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ
、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、または抗体の他の抗原結合サブ配列）であり、こ れは非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含む。ほとんどの部分につい
て、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、ここで、
このレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基は、所望の特異性、親
和性、および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種（ドナ
ー抗体）のＣＤＲからの残基によって置換される。いくつかの場合、ヒト免疫グ
ロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によっ
て置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体においても、移入され
たＣＤＲもしくはフレームワーク配列においても見られない残基を含み得る。こ
れらの改変は、抗体性能をさらに精錬および最適化するために行われる。一般に
、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、そして代表的には２つの可変ドメインの実質
的にすべてを含み、このドメインにおいてＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にす
べては、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、そしてＦＲ領域のすべて
または実質的にすべては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域であ
る。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆ
ｃ）の少なくとも一部（代表的にはヒト免疫グロブリンのもの）の一部を含む。
【００９２】 本発明のＴＩＥリガンドホモログに対するポリクローナル抗体は、一般に、Ｔ
ＩＥリガンドおよびアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）
注射によって動物で惹起される。ＴＩＥリガンドまたは標的アミノ酸配列を含む
フラグメントを、免疫される種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キ
ーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、ま
たはダイズトリプシンインヒビターに対して、二官能性または誘導体化剤、例え
ば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介
した結合体化）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グル
タルアルデヒド、コハク酸無水物、ＳＯＣｌ2、またはＲ1Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（ここで
ＲおよびＲ1は異なるアルキル基である）を用いて、結合体化することが有用で あり得る。
【００９３】 動物は、１ｍｇまたは１μｇの結合体（それぞれ、ウサギまたはマウスに対し
て）を３容量のフロイント完全アジュバントと合わせること、および複数の部位
で皮内に溶液を注射することによって、免疫原性結合体または誘導体に対して免
疫される。１カ月後、その動物に、複数の部位での皮下注射によってフロイント
完全アジュバント中の元の量の１／５〜１／１０の結合体を用いてブーストする
。７〜１４日後、動物から採血し、そしてその血清を抗ＴＩＥリガンド抗体力価
についてアッセイする。動物に、その力価がプラトーになるまでブーストする。
好ましくは、動物を、同じＴＩＥリガンドの結合体であるが異なるタンパク質に
および／または異なる架橋試薬を介して結合体化された結合体でブーストする。
結合体はまた、タンパク質融合体として組換え細胞培養物中で作製され得る。ま
た、ミョウバンのような凝集剤が、免疫応答を増強するために使用される。
【００９４】 モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団から得られ、すなわち、こ
の集団を含む個々の抗体は、少ない量で存在し得る可能性のある天然に存在する
変異を除いては、同一である。したがって、修飾語「モノクローナル」は、異な
る抗体の混合物ではないような抗体の特徴を示す。
【００９５】 例えば、本発明の抗ＴＩＥリガンドホモログモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌ
ｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）に最
初に記載されたハイブリドーマ方法を使用して作製され得るか、または組換えＤ
ＮＡ方法［Ｃａｂｉｌｌｙら，米国特許第４，８１６，５６７号］によって作製
され得る。
【００９６】 ハイブリドーマ方法では、マウス、またはハムスターのような他の適切な宿主
動物が、本明細書中上記のように免疫されて、免疫のために使用されるタンパク
質に特異的に結合する抗体を産生または産生し得るリンパ球を誘起する。あるい
は、リンパ球は、インビトロで免疫され得る。次いで、リンパ球は、ポリエチレ
ングリコールのような適切な融合剤を使用してミエローマ細胞と融合されて、ハ
イブリドーマ細胞を形成する［Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９
−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）］。
【００９７】 このように調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親ミエローマ細
胞の増殖または生存を阻害する、好ましくは１つ以上の物質を含む、適切な培養
培地中に播種し、そして増殖する。例えば、親ミエローマ細胞が酵素ヒポキサン
チングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）
を欠くならば、ハイブリドーマについての培養培地は、代表的には、ヒポキサン
チン、アミノプテリン、およびチミジンを含み（ＨＡＴ培地）、これらの物質は
ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を妨げる。
【００９８】 好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による
抗体の安定な高いレベルの発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に感受
性である細胞である。これらのうち、好ましいミエローマ細胞株は、ｔｈｅ Ｓ
ａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔ
ｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡから入手可能なＭ
ＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来するようなマウスミエローマ
株、ならびにアメリカンタイプカルチャーコレクション，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，
Ｍａｒｙｌａｎｄ ＵＳＡから入手可能なＳＰ−２細胞である。ヒトミエローマ
およびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の
産生について記載されている［Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３
００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏ
ｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）］。
【００９９】 ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地は、ＴＩＥリガンドホモログに対
して指向されるモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。好ましくは
、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、
免疫沈降剤あるいはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着ア
ッセイ（ＥＬＩＳＡ）のようなインビトロ結合アッセイにより決定される。
【０１００】 このモノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌ
ｌａｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０（１９８０）のスキャッ
チャード分析によって決定され得る。
【０１０１】 所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ
細胞を同定した後、そのクローンは、限界希釈手順によってサブクローニングさ
れ、そして標準的方法によって増殖され得る。Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎ
ａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃ
ｅ，ｐｐ．５９−１０４（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）。この目
的に適切な培養培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地またはＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地が挙げられる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物における
腹水腫瘍のようにインビボで増殖され得る。
【０１０２】 このサブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、プロテ
インＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲ
ル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーのような従来の免
疫グロブリン精製手順によって、培養培地、腹水液、または血清から適切に分離
される。
【０１０３】 本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（
例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得る
オリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離され、そして
配列決定される。本発明のハイブリドーマ細胞を、このようなＤＮＡの好ましい
供給源として用いる。一旦単離すると、ＤＮＡは、発現ベクター中に配置され得
、このベクターは、次いでそうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しな
いサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはミエロ
ーマ細胞のような宿主細胞にトランスフェクトされて、組換え宿主細胞中でのモ
ノクローナル抗体の合成を得る。このＤＮＡはまた、例えば、同種マウス配列の
代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインでコード配列を置換することによって
（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１，６８５
１（１９８４））、または非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列
のすべてまたは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合することによって、
改変され得る。このように、本明細書における抗ＴＩＥリガンドモノクローナル
抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体が調製される
。
【０１０４】 代表的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定
常ドメインと置換されるか、または本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ド
メインと置換されて、本発明のＴＩＥリガンドに対する特異性を有する１つの抗
原結合部位および異なる抗原に対する特異性を有するもう１つの抗原結合部位を
含むキメラ二価抗体を生成する。
【０１０５】 キメラまたはハイブリッド抗体はまた、架橋剤を含む化学反応を含む、合成タ
ンパク質化学で公知の方法を使用してインビトロで調製され得る。例えば、イム
ノトキシンは、ジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエーテル結合を形
成することによって、構築され得る。この目的に適切な試薬の例には、イミノチ
オレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートが挙げられる。
【０１０６】 診断適用のために、本発明の抗体は、代表的には、検出可能部分を用いて標識
される。この検出可能部分は、直接的または間接的のいずれかで、検出可能シグ
ナルを産生し得る任意の部分であり得る。例えば、この検出可能部分は、3Ｈ、1 4 Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、または125Ｉのような放射性同位元素、フルオレセンイソチオ
シアネート、ローダミン、またはルシフェリンのような蛍光または化学発光化合
物；ビオチン；例えば、125Ｉ、32Ｐ、14Ｃ、または3Ｈのような放射性同位元素
標識、あるいは、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、または西洋
ワサビペルオキシダーゼのような酵素であり得る。
【０１０７】 抗体を検出可能部分に別々に結合するための当該技術分野で公知の任意の方法
が用いられ得、これには、Ｈｕｎｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ １４４：９４５（１
９６２）；Ｄａｖｉｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：１０１４（１９７
４）；Ｐａｉｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４０：２１９（１９８１）
；およびＮｙｇｒｅｎ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．
３０：４０７（１９８２）に記載の方法が挙げられる。
【０１０８】 本発明の抗体は、競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、
ならびに免疫沈降アッセイのような、任意の公知のアッセイ方法で用いられ得る
。Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ
ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，
Ｉｎｃ．，１９８７）。
【０１０９】 競合結合アッセイは、標識された標準（ＴＩＥリガンドホモログまたはその免
疫学的反応性部分であり得る）が、限定された量の抗体との結合についてテスト
試料分析物（ＴＩＥリガンド）と競合する能力に依存する。テスト試料中のＴＩ
Ｅリガンドホモログの量は、抗体に結合するようになる標準の量に反比例する。
結合するようになる標準の量を決定することを容易にするために、抗体は、一般
に、競合前または後に不溶化され、そのため抗体に結合される標準および分析物
は、結合しないままの標準および分析物から簡便に分離され得る。
【０１１０】 サンドイッチアッセイは、２つの抗体の使用を含み、それぞれは、検出される
タンパク質の異なる免疫原性部分、またはエピトープに結合し得る。サンドイッ
チアッセイでは、テスト試料分析物は、固体支持体上に固定されている第一の抗
体によって結合され、その後第二の抗体がその分析物に結合し、したがって不溶
性３部分複合体を形成する。ＤａｖｉｄおよびＧｒｅｅｎｅ，米国特許第４，３
７６，１１０号。この第二の抗体は、それ自体が検出可能部分で標識され得るか
（直接的サンドイッチアッセイ）、または検出可能部分で標識される抗免疫グロ
ブリン抗体を使用して測定され得る（間接的サンドイッチアッセイ）。例えば、
サンドイッチアッセイの１つのタイプは、ＥＬＩＳＡアッセイであり、この場合
、検出可能部分は酵素である。
【０１１１】 非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該技術分野で周知である。一般に、
ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入される１つ以上のアミノ酸残基を有
する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「移入（ｉｍｐｏｒｔ）」残
基といわれ、これは代表的には、「移入」可変ドメインから採用される。ヒト化
は、本質的に、ヒト抗体の対応する配列で齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列を置換
することによる、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者［Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ
３２１，５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ
３３２，３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｎｅｃ
ｅ ２３９，１５３４−１５３６（１９８８）］の方法に従って行われ得る。し
たがって、このような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体であり（Ｃａｂｉｌｌｙ，
前出）、ここで、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ないものが、非
ヒト種からの対応する配列によって置換されている。実際に、ヒト化抗体は、代
表的には、いくつかのＣＤＲ残基およびおそらくいくつかのＦＲ残基が、齧歯類
抗体における類似部位由来の残基によって置換されているヒト抗体である。
【０１１２】 抗体が、抗原についての高い親和性および他の好ましい生物学的特性を保持し
ながらヒト化されることは重要である。この目的を達成するために、好ましい方
法にしたがって、ヒト化抗体は、親およびヒト化配列の三次元モデルを使用して
、親配列および種々の概念上のヒト化産物の分析のプロセスによって調製される
。モデル中の三次元免疫グロブリンは、一般に利用可能であり、そして当業者は
熟知している。選択された候補免疫グロブリン配列の有望な三次元コンホメーシ
ョン構造を例示および提示するコンピュータプログラムは、利用可能である。こ
れらの提示の検査は、候補免疫グロブリン配列の機能性における残基の可能性の
ある役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原を結合する能力に影
響を及ぼす残基の分析を可能にする。この方法で、ＦＲ残基が、標的抗原に対す
る増加した親和性のような所望の抗体特性が達成されるように、コンセンサスお
よび移入配列から選択され、そして組み合わせられ得る。一般に、ＣＤＲ残基は
、抗原結合に影響を及ぼすことに、直接的およびほとんど実質的に関与する。
【０１１３】 あるいは、免疫の際に、内因性免疫グロブリン産生の不在下でヒト抗体の完全
レパートリーを産生し得る、トランスジェニック動物（例えば、マウス）を産生
することが、今や可能である。例えば、キメラおよび生殖細胞系変異マウスにお
ける抗体重鎖Ｊ領域（ＪH）遺伝子のホモ接合欠損が、内因性抗体産生の完全阻 害を生じることが記載されている。このような生殖細胞系変異マウスへのヒト生
殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原チャレンジの際のヒト抗体
の産生を生じる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０，２５５１−２５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖ
ｉｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３６２，２５５−２５８（１９９３）を参照のこと。
【０１１４】 二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する
、モノクローナル、好ましくはヒトまたはヒト化、抗体である。本発明の場合で
は、結合特異性の１つは、特定のＴＩＥリガンドに対してであり、他方は、任意
の他の抗原に対してであり、そして好ましくはもう１つのリガンドに対してであ
る。例えば、２つの異なるＴＩＥリガンドホモログを特異的に結合する二重特異
性抗体は、本発明の範囲内である。
【０１１５】 二重特異性抗体を作成する方法は、当該技術分野で公知である。
【０１１６】 伝統的には、二重特異性抗体の組換え産生は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽
鎖対の同時発現に基づき、ここでこの２つの重鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉ
ｌｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ ３０５，５３７−５３９（
１９８３））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダム類別のため、これらの
ハイブリドーマ（クアドローマ）は、１つのみが正しい二重特異性構造を有する
、１０の異なる抗体分子の潜在的混合物を産生する。アフィニティークロマトグ
ラフィー工程によって通常行われる、正しい分子の精製は、むしろ煩わしく、そ
して産物収量は低い。類似の手順が、ＰＣＴ出願公開公報第ＷＯ ９３／０８８
２９号（１９９３年５月１３日に公開）およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら，ＥＭＢ
Ｏ １０，３６５５−３６５９（１９９１）に開示される。
【０１１７】 異なるおよびより好ましいアプローチよれば、所望の結合特異性を有する抗体
可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）は、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融
合される。この融合物は、好ましくは、免疫グロブリン重鎖定常ドメインを有し
、ヒンジの少なくとも一部、および免疫グロブリン重鎮の第２および第３の定常
領域（ＣＨ２およびＣＨ３）を含む。この融合物の少なくとも１つに存在する軽
鎖結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好まし
い。免疫グロブリン重鎖融合物、および所望であれば、免疫グロブリン軽鎖をコ
ードするＤＮＡは、別々の発現ベクターに挿入され、そして適切な宿主生物に同
時トランスフェクトされる。これは、構築に使用される３つのポリペプチド鎖の
不同の比が最適収量を提供する場合の実施態様では、３つのポリペプチドフラグ
メントの相互の割合を調節することに、非常に柔軟性を提供する。しかし、少な
くとも２つのポリペプチド鎖の等しい比での発現が、高い収量を得る場合、また
は比が特に重要ではない場合、１つの発現ベクター中に、２つまたは３つすべて
のポリペプチド鎖についてのコード配列を挿入することが可能である。このアプ
ローチの好ましい実施態様では、二重特異性抗体は、１つのアームにおける第１
の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他のアームにお
ける（第２の結合特性を提供する）ハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対か
ら構成される。二重特異性分子の半分のみにおける免疫グロブリン軽鎖の存在が
分離の容易な方法を提供するので、この非対称構造が、望ましくない免疫グロブ
リン鎖の組み合わせから、所望の二重特異性化合物の分離を容易にすることを見
いだした。
【０１１８】 二重特異性抗体を生成することのさらに詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓ
ｈら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１，２１０（１９８
６）を参照のこと。
【０１１９】 用語「ダイアボディ」とは、２つの抗原結合部位を有する小抗体フラグメント
をいい、このフラグメントは同じポリペプチド鎖中に軽鎖可変ドメイン（ＶL） に連結された重鎖可変ドメイン（ＶH）を含む（ＶH−ＶL）。短すぎて同じ鎖に おける２つのドメイン間の対形成ができないリンカーを使用することによって、
このドメインは、もう１つの鎖の相補ドメインと対形成させ、そして２つの抗原
結合部位を生成する。ダイアボディは、例えば、ＥＰ ４０４，０９７；ＷＯ
９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）に、より十分に記
載される。
【０１２０】 「単離された」抗体は、単離されたポリペプチドについて本明細書中上記で提
供される定義と同様に定義される。詳細には、「単離された」抗体は、その天然
環境の成分から同定および分離および／または回収されたものである。その天然
環境の夾雑成分は、抗体についての診断または治療使用を妨害する物質であり、
そして酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が挙
げられ得る。好ましい実施態様では、抗体は、（１）Ｌｏｗｒｙ方法によって決
定される場合９５％重量を越える抗体、および最も好ましくは９９％重量を越え
るまで、（２）スピニングカップシークエネーターの使用によってＮ末端または
内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るために十分な程度まで、または（
３）クーマシーブルーまたは好ましくは銀染色を使用して還元または非還元条件
下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで、精製される。抗体の天然環境の少な
くとも１つの成分が存在しないので、単離された抗体は、組換え細胞内でのイン
サイチュでの抗体を含む。しかし、通常、単離された抗体は、少なくとも１つの
精製工程によって調製される。
【０１２１】 本明細書で使用される場合、用語「標識」とは、「標識された」抗体を生成す
るように抗体に直接的または間接的に結合体化される検出可能な化合物または組
成物をいう。この標識は、それ自体によって検出可能であり得るか（例えば、放
射性同位元素標識または蛍光標識）、または酵素的標識の場合には、検出可能で
ある基質化合物または組成物の化学変更を触媒し得る。
【０１２２】 「固相」とは、本発明の抗体が付着し得る非水性マトリクスを意味する。本明
細書において含まれる固相の例は、ガラス（例えば、制御された孔ガラス）、多
糖類（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニル
アルコール、およびシリコーンから部分的または全体が形成されるものを含む。
ある実施態様では、状況に依存して、その固相は、アッセイプレートのウェルを
含み得；他では、固相は精製カラム（例えば、アフィニティークロマトグラフィ
ーカラム）である。この用語はまた、米国特許第４，２７５，１４９号に記載の
ような別々の粒子の不連続固相を含む。
【０１２３】 「リポソーム」は、哺乳動物への薬物（例えば、本明細書で開示される抗Ｅｒ
ｂＢ２抗体、および必要に応じて、化学療法剤）の送達に有用である、種々のタ
イプの脂質、リン脂質、および／または界面活性剤から構成される小胞である。
リポソームの成分は、生物学的膜の脂質配置に類似の、二層形成で一般に配置さ
れる。
【０１２４】 抗体「アゴニスト」および「アンタゴニスト」は、上で定義されるとおりであ
る。
【０１２５】 ヘテロ結合体抗体はまた、本発明の範囲内である。ヘテロ結合体抗体は、２つ
の共有結合した抗体から構成される。このような抗体は、例えば、望ましくない
細胞に免疫系細胞を標的するため（米国特許第４，６７６，９８０号）、および
ＨＩＶ感染の処置のために（ＰＣＴ出願公開公報第ＷＯ ９１／００３６０号お
よび第ＷＯ ９２／２００３７３号；ＥＰ ０３０８９）提案されている。ヘテ
ロ結合体抗体は、任意の便利な架橋方法を使用して作製され得る。適切な架橋剤
は当該技術分野で周知であり、そして多くの架橋技術とともに米国特許第４，６
７６，９８０号に開示される。
【０１２６】 「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶHおよびＶLドメ
インを含み、ここでこれらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。
好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、ＶHおよびＶLドメイン間にポリペプチドリン
カーをさらに含み、このことはｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成する
ことを可能にする。ｓＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ Ｐ
ｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
，１１３巻，ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅ
ｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照のこと
。
【０１２７】 （Ｃ．ＴＩＥリガンドホモログのクローニングおよび発現） 本発明の文脈では、表現「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」は、交
換可能に使用され、そしてすべてのこのような名称は子孫を含む。すべての子孫
が、故意のまたは偶然の変異のため、ＤＮＡ含量が正確に同一であり得ないこと
も理解される。最初の形質転換された細胞についてスクリーニングした場合に、
同じ機能または生物学的特性を有する変異体子孫が、含まれる。
【０１２８】 用語「複製可能な発現ベクター」および「発現ベクター」とは、一片の外来Ｄ
ＮＡを挿入され得る、通常二本鎖の、一片のＤＮＡをいう。外来ＤＮＡは、異種
ＤＮＡと定義され、これは、宿主細胞中に天然に見いだされないＤＮＡである。
このベクターは、適切な宿主細胞に外来または異種ＤＮＡを輸送するために使用
される。一旦宿主細胞にはいると、ベクターは、宿主染色体ＤＮＡから独立して
複製し得、そしてベクターおよびその挿入された（外来）ＤＮＡのいくつかのコ
ピーが生成され得る。さらに、このベクターは、外来ＤＮＡをポリペプチドに翻
訳することを可能にするのに必要なエレメントを含む。したがって、外来ＤＮＡ
によってコードされるポリペプチドの多くの分子は、迅速に合成され得る。
【０１２９】 発現およびクローニングベクターは、当該技術分野で周知であり、そして１つ
以上の選択された宿主細胞中でベクターが複製することを可能にする核酸配列を
含む。適切なベクターの選択は、１）ＤＮＡ増幅またはＤＮＡ発現に使用される
べきかどうか、２）ベクターに挿入されるべきＤＮＡのサイズ、および３）ベク
ターで形質転換されるべき宿主細胞、に依存する。各ベクターは、その機能（Ｄ
ＮＡの発現、ＤＮＡの増幅）および適合可能である宿主細胞に依存して、種々の
成分を含む。ベクター成分は、一般に、１つ以上の以下のものを含むが、これら
に限定されない：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハ
ンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列。
【０１３０】 （（ｉ）シグナル配列成分） 一般に、シグナル配列は、ベクターの成分であり得るか、またはベクターに挿
入されるＴＩＥリガンド分子の一部であり得る。シグナル配列が異種であるなら
ば、宿主細胞によって認識およびプロセシング（すなわち、シグナルペプチダー
ゼによって切断）されるように選択されるべきである。
【０１３１】 原核生物宿主細胞に適切な異種シグナル配列は、好ましくは、α−アミラーゼ
、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＣ、ｏｍｐＥ、ｏｍｐＦ、アルカリホスファターゼ、ペニシ
リナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩのリーダーのような、
原核生物シグナル配列である。酵母分泌については、例えば、酵母インベルター
ゼ、アミラーゼ、α因子、または酸性ホスファターゼのリーダーが使用され得る
。哺乳動物細胞発現では、哺乳動物シグナル配列が最も適切である。列挙したシ
グナル配列は、例示のためのみであり、そしていかなるようにも本発明の範囲を
限定しない。
【０１３２】 （（ｉｉ）複製起点成分） 発現ベクターおよびクローニングベクターの両方とも、１つ以上の選択された
宿主細胞においてベクターが複製することを可能にした核酸配列を含む。一般に
、クローニングベクターでは、この配列は、ベクターが宿主染色体から独立して
複製することを可能にする配列であり、そして複製起点または自律複製する配列
を含む。このような配列は、種々の細菌、酵母、およびウイルスにとって周知で
ある。周知のプラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は、ほとんどのグラム陰性
菌に適切であり、酵母についての２μプラスミド起点および種々のウイルス起点
（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、またはＢＰＶ）は、哺乳動
物細胞におけるクローニングベクターにとって有用である。複製起点は、哺乳動
物発現ベクターに必要ではない（ＳＶ４０起点は、代表的には、単に初期プロモ
ーターを含むので、使用され得る）。ほとんどの発現ベクターは、「シャトル」
ベクターであり、すなわち、これらは、少なくとも１つのクラスの生物で複製し
得るが、発現のために他の生物にトランスフェクトされ得る。例えば、ベクター
はＥ．ｃｏｌｉにクローニングされ、次いで同じベクターが、たとえ宿主細胞染
色体から独立して複製し得ないとしても、発現のために酵母または哺乳動物細胞
にトランスフェクトされる。
【０１３３】 ＤＮＡはまた、宿主ゲノムへの挿入によってクローニングされる。これは、例
えば、ＢａｃｉｌｌｕｓゲノムＤＮＡで見いだされる配列に相補的であるＤＮＡ
配列をベクターに含むことによって、宿主としてＢａｃｉｌｌｕｓ種を使用して
、容易に達成される。このベクターでのＢａｃｉｌｌｕｓのトランスフェクショ
ンは、ゲノムとの相同組換えおよび所望の異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ
の挿入を生じる。しかし、制限酵素切断が、コードされたポリペプチド分子を切
り出すために必要とされるので、ゲノムＤＮＡの回収は、外因性の複製されたベ
クターの回収よりも複雑である。
【０１３４】 （（ｉｉｉ）選択遺伝子成分） 発現およびクローニングベクターは、選択可能マーカーとも称する、選択遺伝
子を含むべきである。これは、このベクターで形質転換した宿主細胞の生存また
は増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子である。この遺伝子の存在は、そ
のベクターを欠失する宿主細胞が、形質転換した宿主よりも増殖または再生で全
く有利点を得ないことを確実にする。代表的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質ま
たは他のトキシン、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、
またはテトラサイクリンに対する耐性を与えるか、（ｂ）栄養要求性の欠損を相
補するか、または（ｃ）複合培地から利用可能でない重要な栄養を供給する（例
えば、バチルス属についてのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）、タ
ンパク質をコードする。
【０１３５】 選択スキームの１つの例は、宿主細胞の増殖を停止するために薬物を利用する
。異種遺伝子でうまく形質転換される細胞は、薬物耐性を与えるタンパク質を発
現し、したがって選択レジメを生存する。このような優性選択の例は、薬物ネオ
マイシン［Ｓｏｕｔｈｅｒｎら，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，
３２７（１９８２）］、ミコフェノール酸［Ｍｕｌｌｉｇａｎら，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２０９，１４２２（１９８０）］、またはハイグロマイシン［Ｓｕｄｇｅｎ
ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．５，４１０−４１３（１９８５）］を使用する
。上記の３つの例は、それぞれ、適切な薬物Ｇ４１８またはネオマイシン（ゲネ
チシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）、あるいはハイグロマイシンに対する
耐性を与えるために真核生物制御下で細菌遺伝子を用いる。
【０１３６】 哺乳動物細胞に適切な選択可能マーカーの他の例は、ジヒドロ葉酸レダクター
ゼ（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナーゼである。このようなマーカーは、所望の
核酸を取り込むためにコンピテントであった細胞の同定を可能にする。哺乳動物
細胞の形質転換体は、形質転換体のみが、そのマーカーを取り込んでいることに
よって生存するために独特に適合される選択圧下に、配置される。選択圧は、培
地中の選択薬剤の濃度がうまく変化する条件下で形質転換体を培養することによ
って課され、それによって、選択遺伝子および所望のポリペプチドをコードする
ＤＮＡの両方の増幅を導く。増幅は、増殖に重要なタンパク質の産生について非
常に需要がある遺伝子が、染色体内で協調して組換え細胞のうまくいった生成を
繰り返すプロセスである。所望のポリペプチドの増加した量は、増幅したＤＮＡ
から合成される。
【０１３７】 例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換した細胞は、ヒポキサンチン、グリシ
ン、およびチミジンを含まない培養培地中で、すべての形質転換体を培養するこ
とによって、最初に同定される。この場合に適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性を
欠失するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株であり、Ｕｒｌａｕｂお
よびＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７、
４２１６（１９８０）に記載のように調製および増殖される。特に有用なＤＨＦ
Ｒは、ＭＴＸ（ＥＰ １１７，０６０）に非常に耐性である、変異ＤＨＦＲであ
る。この選択薬剤は、内因性ＤＨＦＲの存在にもかかわらず、他の適切な任意の
宿主、例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ６１ ＣＨＯ−Ｋ１を用いて使用され得
る。次いで、ＤＨＦＲおよび所望のポリペプチドをコードするＤＮＡは、それぞ
れ、ＤＨＦＲを不活化する薬剤（メトトレキサート、またはＭＴＸ）への曝露に
よって増幅される。細胞が、常により多量のＭＴＸ濃度の連続したラウンドにお
いて増殖し得る細胞についてのみ選択することによって、より多くのＤＨＦＲを
必要とする（そして結果としてすべての外因性ＤＮＡを増幅する）ことを確実に
する。あるいは、所望のポリペプチド、野生型ＤＨＦＲ、およびｎｅｏ遺伝子の
ようなもう１つの選択可能マーカーをコードする遺伝子で同時形質転換した宿主
は、Ｇ４１８のような選択可能マーカーについての選択薬剤を使用して同定され
得、次いで内因性ＤＨＦＲを含む野生型宿主中でメトトレキサートを使用して選
択および増幅され得る（米国特許第４，９６５，１９９号も参照のこと）。
【０１３８】 酵母における使用に適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在する
ｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら，１９７９，Ｎａｔｕｒｅ ２
８２：３９；Ｋｉｎｇｓｍａｎら，１９７９，Ｇｅｎｅ ７：１４１；またはＴ
ｓｃｈｅｍｐｅｒら，１９８０，Ｇｅｎｅ １０：１５７）。ｔｒｐ１遺伝子は
、トリプトファン中で増殖する能力のない酵母の変異体株、例えば、ＡＴＣＣ
Ｎｏ．４４０７６、またはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ，１９７７，Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ ８５：１２）についての選択マーカーを提供する。次いで、酵母宿主細胞
ゲノム中のｔｒｐ１障害の存在は、トリプトファンの不在下での増殖による、形
質転換体を検出するために効果的な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠失酵母
株（ＡＴＣＣ ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する
公知のプラスミドによって相補される。
【０１３９】 （（ｉｖ）プロモーター成分） 発現ベクターは、クローニングベクターとは異なって、宿主生物によって認識
されそして所望のポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されるプロモ
ーターを含むべきである。プロモーターは、その制御下で核酸の転写および翻訳
を制御する、構造遺伝子（一般に約１００〜１０００ｂｐ以内）の開始コドンか
ら上流に位置する非翻訳配列である。これらは、代表的には、２つのクラス、誘
導性および構成性に分かれる。誘導性プロモーターは、培養条件のいくつかの変
化、例えば、栄養の存在または不在あるいは温度変化に応じて、その制御下でＤ
ＮＡからの転写のレベルの増加を開始するプロモーターである。この時、種々の
可能性のある宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。こ
れらのプロモーターは、制限酵素切断によって起源の遺伝子から取り出され、次
いで発現されるべきポリペプチドについての開始コドンの５’への挿入によって
、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結される。これは、Ｔ
ＩＥリガンドについてのゲノムプロモーターが使用可能ではないことをいうので
はない。しかし、異種プロモーターは、一般に、天然のままのＴＩＥリガンドプ
ロモーターと比較した場合、発現したＴＩＥリガンドホモログのより大きい転写
および高い収量を生じる。
【０１４０】 原核生物宿主との使用に適切なプロモーターには、β−ラクタマーゼおよびラ
クトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ ２７５：６１５（１９
７８）；およびＧｏｅｄｄｅｌら，Ｎａｔｕｒｅ ２８１：５４４（１９７９）
）、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏ
ｅｄｄｅｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０５７（１９８０）
および欧州特許出願公開公報第３６，７７６号）、およびｔａｃプロモーターの
ようなハイブリッドプロモーター（Ｈ．ｄｅ Ｂｏｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８０：２１−２５（１９８３））が挙げられる
。しかし、他の公知の細菌プロモーターが適切である。それらのヌクレオチド配
列は公開されており、それによって、当業者は、任意の必要とされる制限部位を
供給するためにリンカーまたはアダプターを使用してＴＩＥリガンドをコードす
るＤＮＡに作動可能に連結することを可能にする（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔら，Ｃ
ｅｌｌ ２０：２６９（１９８０））。細菌系での使用のためのプロモーターは
また、ＴＩＥリガンドをコードするＤＮＡに作動可能に連結されるシャイン・ダ
ルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含む。
【０１４１】 酵母宿主との使用に適切なプロモーター配列には、３−ホスホグリセリン酸キ
ナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３（１
９８０））または他の解糖系酵素（例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−
３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ
、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホ
グリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、
ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼ）（Ｈｅｓｓら，Ｊ．Ａ
ｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．７：１４９（１９７８）；およびＨｏｌｌａｎｄ
，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７：４９００（１９７８））のプロモーターが
挙げられる。
【０１４２】 増殖条件によって制御される転写のさらなる有利点を有する誘導性プロモータ
ーである、他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシト
クロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネ
イン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトース
およびガラクトース利用に応答する酵素についてのプロモーター領域である。酵
母発現における使用に適切なベクターおよびプロモーターは、さらに、Ｒ．Ｈｉ
ｔｚｅｍａｎら，ＥＰ ７３，６５７Ａに記載される。酵母エンハンサーもまた
、酵母プロモーターとともに有利に使用される。
【０１４３】 プロモーター配列は、真核生物について公知である。実際には、すべての真核
生物遺伝子は、転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に位置するＡＴ
リッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写の開始から７０〜８０塩基上流に見い
だされるもう１つの配列は、ＣＸＣＡＡＴ領域であり、ここでＸは任意のヌクレ
オチドであり得る。ほとんどの真核生物遺伝子の３’末端にはコード配列の３’
末端へのポリＡテイルの付加のためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列が存
在する。これらの配列のすべては、哺乳動物発現ベクターに適切に挿入される。
【０１４４】 哺乳動物宿主細胞におけるベクターからのＴＩＥリガンド転写は、ポリオーマ
ウイルス、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日に公開された英国特許２，２１１
，５０４）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２型）、ウシパピローマ
ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝
炎ウイルスのようなウイルス、および最も好ましくはシミアンウイルス４０（Ｓ
Ｖ４０）のゲノムから、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモー
ターまたは免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから、な
らびにこのようなプロモーターが宿主細胞系と適合可能であるならば、ＴＩＥリ
ガンド配列に通常付随するプロモーターから、得られるプロモーターによって制
御され得る。
【０１４５】 ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターおよび後期プロモーターは、ＳＶ４０ウ
イルス複製起点もまた含むＳＶ４０制限フラグメントとして便利に得られる［Ｆ
ｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３（１９７８）、Ｍｕｌｌｉｇａｎお
よびＢｅｒｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９，１４２２−１４２７（１９８０）；Ｐ
ａｖｌａｋｉｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ７８，７
３９８−７４０２（１９８１）］。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモー
ターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限フラグメントとして便利に得られる［Ｇｒｅｅ
ｎａｗａｙら，Ｇｅｎｅ １８，３５５−３６０（１９８２）］。ベクターとし
てウシパピローマウイルスを使用する哺乳動物宿主中でＤＮＡを発現するための
系は、米国特許第４，４１９，４４６号に開示される。この系の改変は、米国特
許第４，６０１，９７８号に記載される。サル細胞中でヒト免疫インターフェロ
ンをコードするｃＤＮＡを発現することにおいては、Ｇｒａｙら，Ｎａｔｕｒｅ
２９５，５０３−５０８（１９８２）；単純ヘルペスウイルス由来のチミジン
キナーゼプロモーターの制御下で、マウス細胞におけるヒトβ−インターフェロ
ンｃＤＮＡを発現することにおいてはＲｅｙｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ ２９７，５
９８−６０１（１９８２）；培養したマウス細胞およびウサギ細胞におけるヒト
インターフェロンβ１遺伝子の発現においてはＣａｎａａｎｉおよびＢｅｒｇ、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ７９，５１６６−５１７０（
１９８２）；ならびにプロモーターとしてラウス肉腫ウイルス長末端反復を使用
するＣＶ−１サル腎臓細胞、ニワトリ胚線維芽細胞、チャイニーズハムスター卵
巣細胞、ＨｅＬａ細胞、およびマウスＮＩＨ−３Ｔ３細胞における細菌ＣＡＴ配
列の発現においてはＧｏｒｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
ＵＳＡ ７９，６７７７−６７８１（１９８２）も参照のこと。
【０１４６】 （ｖ）エンハンサーエレメント成分 高等真核生物による本発明のＴＩＥリガンドホモログをコードするＤＮＡの転
写は、しばしば、ベクターにエンハンサー配列を挿入することによって増加する
。エンハンサーは、その転写を増加させるためにプロモーターで作用する、通常
約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサーは、
転写ユニットに対して５’［Ｌａｉｍｉｎｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ ＵＳＡ ７８，９９３（１９８１）］および３’［Ｌａｓｋｙら，Ｍ
ｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．３，１１０８（１９８３）］、イントロン内［Ｂａｎ
ｅｒｊｉら，Ｃｅｌｌ ３３，７２９（１９８３）］ならびにコード配列自体内
［Ｏｓｂｏｒｎｅら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．４，１２９３（１９８４）］
に見いだされており、比較的配向性および位置非依存性である。多くのエンハン
サー配列は、現在は、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、
α−フェトプロテイン、およびインスリン）由来で公知である。しかし、代表的
には、真核生物細胞ウイルスからのエンハンサーを使用する。例としては、複製
起点の後ろ側におけるＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメ
ガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後ろ側におけるポリオ
ーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核生物
プロモーターの活性化のためのエレメントを増強することにおいてはＹａｎｉｖ
、Ｎａｔｕｒｅ ２９７，１７−１８（１９８２）も参照のこと。エンハンサー
は、ＴＩＥリガンドＤＮＡの５’または３’の位置でベクターにスプライスされ
得るが、好ましくは、プロモーターから５’の部位に位置する。
【０１４７】 （ｖｉ）転写終結成分 真核生物宿主細胞（酵母、真菌類、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細
胞生物由来の有核細胞）で使用される発現ベクターはまた、転写の終結およびｍ
ＲＮＡを安定化するために必要な配列を含む。このような配列は、真核生物また
はウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および時には３’非翻訳領域から一般に
利用可能である。これらの領域は、ＴＩＥリガンドをコードするｍＲＮＡの非翻
訳部分においてポリアデニル化フラグメントとして転写されたヌクレオチドセグ
メントを含む。３’非翻訳領域はまた、転写終結部位を含む。
【０１４８】 上記の成分、所望のコード配列および制御配列の１つ以上を含む適切なベクタ
ーの構築は、標準的ライゲーション技術を用いる。単離したプラスミドまたはＤ
ＮＡフラグメントは、切断され、適合させられ、そして必要とされるプラスミド
を生成することが所望される形態に再ライゲートされる。
【０１４９】 構築したプラスミドにおいて正確な配列を確認するための分析のために、ライ
ゲーション混合物は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ ３１，４４６
）を形質転換するために使用され、そして成功した形質転換体は、適切であるア
ンピシリン耐性またはテトラサイクリン耐性によって選択される。形質転換体か
らのプラスミドは、調製され、制限エンドヌクレアーゼ消化によって分析され、
および／またはＭｅｓｓｉｎｇら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９，
３０９（１９８１）の方法によってか、またはＭａｘａｍら，Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６５，４９９（１９８０）の方法によって配列決
定される。
【０１５０】 ＴＩＥリガンドをコードするＤＮＡの哺乳動物細胞における一過性発現を提供
する発現ベクターは、本発明の実施に特に有用である。一般に、一過性発現は、
宿主細胞に効率的に複製し得る発現ベクターの使用を含み、そのため、宿主細胞
は、発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、次に、発現ベクターによってコード
される高いレベルの所望のポリペプチドを合成する。適切な発現ベクターおよび
宿主細胞を含む一過性の系は、クローンＤＮＡによってコードされるポリペプチ
ドの便利な陽性同定、ならびに所望の生物学的または生理学的特性についてのこ
のようなポリペプチドの迅速なスクリーニングを可能にする。したがって、一過
性発現系は、ＴＩＥリガンドのアナログおよび改変体を同定する目的のために、
本発明で特に有用である。
【０１５１】 組換え脊椎動物細胞培養物におけるＴＩＥポリペプチドの合成への適合に適切
な他の方法、ベクター、および宿主細胞は、Ｇｅｔｔｉｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ
２９３，６２０−６２５（１９８１）；Ｍａｎｔｅｌら，Ｎａｔｕｒｅ ２８１
，４０−４６（１９７９）；Ｌｅｖｉｎｓｏｎら；ＥＰ １１７，０６０および
ＥＰ １１７，０５８に記載される。ＴＩＥリガンドポリペプチドの哺乳動物細
胞培養物発現に特に有用なプラスミドは、ｐＲＫ５（ＥＰ ３０７，２４７）、
その他に、ｓｐ６転写開始部位、次いでＸｈｏ／ＮｏｔＩＩ ｃＤＮＡクローニ
ング部位の前にＳｆｉＩ制限酵素部位を有するｐＲＫ５Ｄ、およびＳｆｉＩ部位
を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体のｐＲＫ５Ｂのような、ｐＲＫ５の誘導体である
；Ｈｏｌｍｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３，１２７８−１２８０（１９９１）
を参照のこと。
【０１５２】 （ｖｉｉ）ベクターの構築および分析 １つ以上の上記の成分を含む適切なベクターの構築は、標準的なライゲーショ
ン技術を用いる。単離されたプラスミドまたはＤＮＡフラグメントは、切断され
、適合させられ、そして必要とされるプラスミドを生成することが所望される形
態に再ライゲートされる。
【０１５３】 構築したプラスミドにおいて正確な配列を確認するための分析のために、ライ
ゲーション混合物は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ ３１，４４６
）を形質転換するために使用され、そして成功した形質転換体は、適切であるア
ンピシリンまたはテトラサイクリン耐性によって選択される。形質転換体からの
プラスミドは、調製され、制限エンドヌクレアーゼ消化によって分析され、およ
び／またはＭｅｓｓｉｎｇら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９，３０
９（１９８１）の方法によってか、またはＭａｘａｍら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６５，４９９（１９８０）の方法によって配列決定さ
れる。
【０１５４】 （ｖｉｉｉ）一過性発現ベクター ＴＩＥリガンドをコードするＤＮＡの哺乳動物細胞における一過性発現を提供
する発現ベクターは、本発明の実施に特に有用である。一般に、一過性発現は、
宿主細胞で効率的に複製し得る発現ベクターの使用を含み、そのため、宿主細胞
は、発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、次に、発現ベクターによってコード
される高いレベルの所望のポリペプチドを合成する。Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出
，１６．１７−１６．２２頁。適切な発現ベクターおよび宿主細胞を含む一過性
発現系は、所望の生物学的特性または生理学的特性についてのこのようなポリペ
プチドの便利なポジティブスクリーニングを可能にする。したがって、一過性発
現系は、必要な生物学的活性を有する天然のＴＩＥリガンドホモログのアナログ
および改変体を同定する目的のために、本発明で特に有用である。
【０１５５】 （ｉｘ）適切な例示的脊椎動物細胞ベクター 組換え脊椎動物細胞培養物におけるＴＩＥリガンド（天然のタンパク質の機能
的誘導体を含む）の合成への適合に適切な他の方法、ベクター、および宿主細胞
は、Ｇｅｔｈｉｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ ２９３，６２０−６２５（１９８１）；
Ｍａｎｔｅｉら，Ｎａｔｕｒｅ ２８１，４０−４６（１９７９）；Ｌｅｖｉｎ
ｓｏｎら；ＥＰ １１７，０６０およびＥＰ １１７，０５８に記載される。Ｔ
ＩＥリガンドの哺乳動物細胞培養物発現に特に有用なプラスミドは、ｐＲＫ５（
ＥＰ ３０７，２４７）またはｐＳＶ１６Ｂ（ＰＣＴ公開公報第ＷＯ ９１／０
８２９１号）である。
【０１５６】 本発明のベクターをクローニングまたは発現するために適切な宿主細胞は、上
記の原核生物、酵母、または高等真核生物細胞である。適切な原核生物には、グ
ラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはバチルス属が挙げ
られる。好ましいクローニング宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ ２９４（ＡＴＣＣ ３１
，４４６）であるが、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ
３１，５３７）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７，３２５）、Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種またはＳｅｒｒａｔｉａ Ｍａｒｃｅｓａｎｓのような
他のグラム陰性またはグラム陽性原核生物が適切である。
【０１５７】 原核生物の他に、糸状真菌または酵母のような真核生物微生物は、本発明のベ
クターに適切な宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅまたは一般のパン酵母は、下等真核生物宿主微生物のうちで最も一般に使用さ
れる。しかし、多くの他の属、種、および株は一般に利用可能であり、そして本
発明で有用であり、例えば、Ｓ．ｐｏｍｂｅ［ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ，Ｎ
ａｔｕｒｅ ２９０，１４０（１９８１）］、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌ
ａｃｔｉｓ［Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．７３７（１
９８３）］；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ ｐａ
ｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ １８３，０７０）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉ
ａ（ＥＰ ２４４，２３４）、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ［Ｃａｓｅ
ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ７６，５２５９−５２６
３（１９７９）］；およびＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ［Ｂａｌｌａｎｃｅら，Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１２，２８４−２８９（
１９８３）；Ｔｉｌｂｕｒｎら，Ｇｅｎｅ ２６，２０５−２２１（１９８３）
；Ｙｅｌｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８１，１
４７０−１４７４（１９８４）］およびＡ．ｎｉｇｅｒ［ＫｅｌｌｙおよびＨｙ
ｎｅｓ，ＥＭＢＯ Ｊ．４，４７５−４７９（１９８５）］のようなＡｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓ宿主である。
【０１５８】 適切な宿主細胞はまた、多細胞生物に由来し得る。このような宿主細胞は、複
雑なプロセシングおよびグリコシル化活性を行い得る。原則として、脊椎動物ま
たは無脊椎動物のいずれかからの、任意の高等真核生物培養物は作動可能である
が、ヒトのような哺乳動物からの細胞が好ましい。無脊椎動物の例には、植物お
よび昆虫細胞が挙げられる。多くのバキュロウイルス株および改変体およびＳｐ
ｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（イモムシ）、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙ
ｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌ
ａ ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）、およびＢｏｍｂｙｘ ｍｏ
ｒｉ宿主細胞のような宿主由来の対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。
例えば、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，４７−５５（１
９８８）；Ｍｉｌｌｅｒら，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｅｔ
ｌｏｗ，Ｊ．Ｋ．ら、（編） 第８巻（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，
１９８６），２７７−２７９頁；およびＭａｅｄａら，Ｎａｔｕｒｅ ３１５，
５９２−５９４（１９８５）を参照のこと。種々のこのようなウイルス株は、例
えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ＮＰＶのＬ−１改変体
は、公に利用可能であり、そしてこのようなウイルスは、本発明による本発明の
ウイルスとして、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトラ
ンスフェクションのために使用され得る。
【０１５９】 一般に、植物細胞は、細菌Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅ
ｎｓの特定の株（ＴＩＥリガンドＤＮＡを含むように既に操作されている）との
インキュベーションによってトランスフェクトされる。Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅ
ｎｓとの植物細胞培養物のインキュベーション中、ＴＩＥリガンドをコードする
ＤＮＡは、トランスフェクトされるように植物細胞宿主に移入され、そして適切
な条件下で、ＴＩＥリガンドＤＮＡを発現する。さらに、ノパリンシンターゼプ
ロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列のような植物細胞と適合可能な調
節およびシグナル配列は、利用可能である。Ｄｅｐｉｃｋｅｒら，Ｊ．Ｍｏｌ．
Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１，５６１（１９８２）。さらに、Ｔ−ＤＮＡ ７８０遺伝
子の上流領域から単離されたＤＮＡセグメントは、組換えＤＮＡ含有植物組織に
おいて植物発現可能遺伝子の転写レベルを活性化または増加し得る。１９８９年
６月２１日に公開されたＥＰ ３２１，１９６を参照のこと。
【０１６０】 しかし、脊椎動物細胞が最も興味深く、そして培養物（組織培養物）中での脊
椎動物細胞の増殖はそれ自体周知である。Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＫｒｕｓｅおよびＰａｔｔｅｒｓｏｎ編（１９７３
）を参照のこと。有用な哺乳宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換され
たサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎臓
細胞株［２９３細胞または、懸濁培養物中の増殖のためにサブクローニングした
２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６，５９（１９７７
）］；ベビーハムスター腎臓細胞９ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイ
ニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ［ＣＨＯ、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓ
ｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７，４２１６（１９
８０）］；マウスセルトリ細胞［ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏ
ｄ．２３，２４３−２５１（１９８０）］；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ
ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ Ｃ
ＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頚部ガン腫細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２
）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット
肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３
８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）
；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細
胞［Ｍａｔｈｅｒら，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３，４４
０６８（１９８２）］；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝ガン細胞株
（Ｈｅｐ Ｇ２）である。好ましい宿主細胞は、ヒト胚腎臓２９３およびチャイ
ニーズハムスター卵巣細胞である。
【０１６１】 本発明の目的に特に好ましい宿主細胞は、本発明のＴＩＥリガンドホモログを
産生する脊椎動物細胞である。
【０１６２】 宿主細胞は、トランスフェクトされ、そして好ましくは上記の発現またはクロ
ーニングベクターで形質転換され、そしてプロモーターを誘導するかまたは増幅
した遺伝子を含む形質転換体を選択するために適切であるように改変された従来
の栄養培地中で培養される。
【０１６３】 本発明のＴＩＥリガンドホモログを産生するために使用される原核生物細胞は
、一般にＳａｍｂｒｏｏｋら、（前出）に記載のように適切な培地中で培養され
る。
【０１６４】 哺乳動物細胞は、種々の培地中で培養され得る。Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇ
ｍａ）、最少必須培地（ＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ）ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ
）、およびダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ）のような市
販の培地は、宿主細胞を培養するために適切である。さらに、ＨａｍおよびＷａ
ｌｌａｃｅ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．５８，４４（１９７９）；Ｂａｒｎｅ
ｓおよびＳａｔｏ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２，２５５（１９８０）、
米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７
，７６２号；または同第４，５６０，６５５号；ＷＯ ９０／０３４３０；ＷＯ
８７／００１９５、または米国特許再発行３０，９８５に記載の培地のいずれ
かが、宿主細胞のための培養培地として使用され得る。これらの培地のいずれか
は、ホルモンおよび／または他の増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェ
リン、または上皮増殖因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグ
ネシウム、およびリン酸）、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例
えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えば、ゲンタマイシンTM薬物
）、微量元素（μモル範囲での最終濃度で通常存在する無機化合物として定義さ
れる）、およびグルコースまたは等価のエネルギー源が必要な場合に補充され得
る。任意の他の必要な補充物はまた、当業者に公知である適切な濃度で含まれ得
る。温度、ｐＨなどのような培養条件は、適切には、場合によっては、クローニ
ングまたは発現のために選択される宿主とともにこれまで使用された条件であり
、そして当業者には明らかである。
【０１６５】 本開示でいわれる宿主細胞は、インビトロ細胞培養物中の細胞ならびに宿主動
物または植物内にある細胞を含む。
【０１６６】 本発明のＴＩＥリガンドホモログが、相同組換えによって、または特定のＴＩ
ＥリガンドをコードするＤＮＡを既に含む細胞に導入された制御エレメントを利
用する組換え産生方法で、産生され得ることが、さらに想到される。
【０１６７】 遺伝子増幅および／または発現は、例えば、本発明で提供される配列に基づく
適切に標識されたプローブを使用して便利なサザンブロッティング、ｍＲＮＡの
転写を定量するためのノーザンブロッティング［Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７，５２０１−５２０５（１９８０）］、
ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、またはインサイチュハイブリダイゼーシ
ョンによって、試料中で直接的に測定され得る。種々の標識が用いられ得、最も
一般には、放射性同位体、特に32Ｐである。しかし、ポリヌクレオチドへの導入
のためにビオチン改変化ヌクレオチドを使用するような、他の技術も用いられ得
る。次いで、ビオチンは、アビジンまたは抗体に結合するための部位として作用
し、これは放射性同位元素、蛍光体、酵素などのような広範な標識で標識され得
る。あるいは、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッ
ド二重鎖またはＤＮＡ−タンパク質二重鎖を含む、特異的二重鎖を認識し得る抗
体が用いられ得る。抗体は、次に、標識され得、そしてアッセイは、二重鎖が表
面に結合される場合に行われ得、そのため表面上での二重鎖の形成の際に、その
二重鎖に結合した抗体の存在が検出され得る。
【０１６８】 あるいは、遺伝子発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量するための、組織
切片の免疫組織化学的染色および細胞培養物または体液のアッセイのような、免
疫学的方法によって測定され得る。免疫組織化学的染色技術では、細胞試料は、
代表的には、脱水および固定、次いで遺伝子産物に特異的な標識された抗体との
結合反応によって調製され、ここで、酵素標識、蛍光標識、化学発光標識などの
ような標識は、通常、可視で検出可能である。本発明での使用に適切な特に感度
の高い染色技術は、Ｈｓｅら，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍ．７５，７３４
−７３８（１９８０）に記載される。
【０１６９】 試料液体の免疫組織化学的染色および／またはアッセイに有用な抗体は、モノ
クローナルまたはポリクローナルのいずれかであり得、そして任意の動物で調製
され得る。都合よく、その抗体は、本発明の天然のＴＩＥリガンドポリペプチド
に対して、または以下にさらに記載されるような本発明で提供されるＤＮＡ配列
に基づく合成ペプチドに対して、調製され得る。
【０１７０】 ＴＩＥリガンドホモログは、封入体の形態で宿主細胞中で産生され得るか、あ
るいはペリプラズム空間または培養培地中に分泌され得、そして、代表的には、
宿主細胞溶解物から回収される。組換えリガンドホモログは、安定なタンパク質
のその後の形成を考慮して、任意の技術によって精製され得る。
【０１７１】 ＴＩＥリガンドホモログがヒト起源の細胞以外の組換え細胞で発現される場合
、ヒト起源のタンパク質またはポリペプチドを完全に含まない。しかし、リガン
ドについて実質的に均質である調製物を得るために組換え細胞タンパク質または
ポリペプチドからＴＩＥリガンドホモログを精製することが必要である。第１の
工程としては、培養培地または溶解物を遠心分離して、粒子状の細胞破砕片を除
去する。次いで、膜および可溶性タンパク質画分を分離する。次いで、ＴＩＥリ
ガンドホモログは、可溶性タンパク質画分から精製され得る。以下の手順は、適
切な精製手順の例である：イムノアフィニティーまたはイオン交換カラムでの分
画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカでまたはＤＥＡＥのような陽イオン
交換樹脂でのクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
；硫酸アンモニウム沈殿；例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５を使用するゲル
濾過；およびＩｇＧのような夾雑物を除去するためのプロテインＡ Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅカラム。
【０１７２】 残基が欠失、挿入、および／または置換されているＴＩＥリガンドホモログの
機能的誘導体は、変更によって生じた特性の任意の実質的変化を考慮して、天然
のリガンドと同じ様式で回収される。例えば、ＴＩＥリガンドホモログと、もう
１つのタンパク質またはポリペプチド、例えば、細菌またはウイルス抗原との融
合物は、精製を容易にし；抗原に対する抗体を含むイムノアフィニティーカラム
は、融合物を吸着するために使用され得る。ウサギポリクローナル抗ＴＩＥリガ
ンドホモログカラムのようなイムノアフィニティーカラムは、少なくとも１つの
残っている免疫エピトープに結合することによってＴＩＥリガンドホモログ改変
体を吸着するために用いられ得る。フェニルメチルスルホニルフルオライド（Ｐ
ＭＳＦ）のようなプロテアーゼインヒビターはまた、精製中のタンパク質分解を
阻害するために有用であり得、そして抗生物質は、偶然の夾雑物の増殖を防ぐた
めに含まれ得る。本発明のＴＩＥリガンドホモログは、ＴＩＥレセプター、例え
ば、ＴＩＥ−２に結合する能力に基づいて、アフィニティークロマトグラフィー
によって便利に精製される。
【０１７３】 当業者は、天然のＴＩＥリガンドホモログに適切な精製方法が、改変を必要と
し得ること、そしてこのことが組換え細胞培養物中での発現の際に天然のＴＩＥ
リガンドホモログまたはその改変体の特徴の変化を説明することを理解する。
【０１７４】 （Ｄ．ＴＩＥリガンドホモログ、核酸分子、および抗体の使用） 本発明のＴＩＥリガンドホモログは、細胞培養物においてＴＩＥレセプターを
発現する細胞の生存および／または増殖および／または分化を促進することに有
用であることが予測される。
【０１７５】 ＴＩＥリガンドホモログは、天然のＴＩＥレセプターを発現する細胞を同定す
るためにさらに使用され得る。この目的ために、検出可能に標識されたリガンド
を、そのレセプター（ＴＩＥレセプター）への結合を可能にする条件下で標的細
胞と接触させ、そして結合はモニターされる。
【０１７６】 本発明のＴＩＥリガンドホモログはまた、例えば、本発明のＴＩＥリガンドホ
モログを発現する細胞をテスト分子に曝露すること、そして直接的検出によって
または二次的生物学的効果に基づいてのいずれかで、テスト分子のＴＩＥレセプ
ターへの特異的結合を検出することによって、ＴＩＥリガンドホモログの生物学
的活性を提示する分子を同定するために使用され得る。このアプローチは、ＴＩ
Ｅリガンドファミリーの新しいメンバーを同定するために、あるいはペプチドま
たは非ペプチド小分子ライブラリーをスクリーニングするために特に適切である
。
【０１７７】 本明細書中で開示されたＴＩＥホモログリガンドはまた、骨発生、成熟、もし
くは成長に、または筋肉増殖または発育に重要な役割を果たし、および／あるい
は血管新生を促進または阻害する、天然のＴＩＥレセプターのアゴニストまたは
アンタゴニストを同定するように設計されたスクリーニングアッセイで有用であ
る。例えば、ＴＩＥレセプターのアンタゴニストは、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅバ
イオセンサー技術（ＢＩＡｃｏｒｅ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ
，Ｍｉｄｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を使用することによって；または本発明
の生物学的に活性なＴＩＥリガンドホモログによって引き起こされる生物学的応
答をブロックする能力をモニターすることによって、測定されるように、天然の
ＴＩＥレセプターへの本発明のＴＩＥリガンドホモログの結合をブロックする能
力に基づいて同定され得る。モニターされ得る生物学的応答には、例えば、ＴＩ
ＥレセプターまたはＴＩＥシグナル伝達経路の下流の成分のリン酸化、あるいは
、ＴＩＥレセプターを発現する細胞の生存、増殖、または分化が挙げられる。Ｔ
ＩＥレセプターを発現するようにか、またはＴＩＥレセプターおよび本発明のＴ
ＩＥリガンドホモログを同時発現するように操作された、ＴＩＥレセプターを正
常に発現しない細胞を利用する細胞ベースのアッセイは、使用に特に便利である
。
【０１７８】 特定の実施態様では、天然のＴＩＥレセプターの小分子アゴニストおよびアン
タゴニストは、ＴＩＥリガンド／ＴＩＥレセプター相互作用を妨害する能力に基
づいて、同定され得る。ＴＩＥレセプターへのテスト分子の特異的結合を測定す
るために多くの方法があり、これには、ＴＩＥレセプターを発現するインタクト
な細胞の表面に結合したか、細胞溶解物中のＴＩＥレセプターに架橋したか、ま
たはインビトロでＴＩＥレセプターに結合した、テスト分子の量を検出または測
定することが含まれるがこれに限定されない。
【０１７９】 検出可能に標識されたＴＩＥリガンドホモログには、例えば、放射活性物質、
例えば、125Ｉ、蛍光物質、酵素活性を有する物質（好ましくは、比色検出に適 切な）、酵素のための基質（好ましくは、比色検出に適切な）、または（検出可
能に標識された）抗体分子によって認識され得る物質に共有または非共有結合し
たＴＩＥリガンドホモログが挙げられる。
【０１８０】 本発明のアッセイは、１９９６年４月１８日に公開された、ＰＣＴ公開公報Ｗ
Ｏ ９６／１１２６９に記載されるものと類似の方法で行われ得る。
【０１８１】 本発明のＴＩＥリガンドホモログはまた、イムノアドヘシン（ｉｍｍｕｎｏａ
ｄｈｅｓｉｎ）の形態で必要に応じて使用されるＴＩＥレセプターを精製するた
めに有用であり、ＴＩＥリガンドまたはそのＴＩＥレセプター結合部分は、免疫
グロブリン重鎖または軽鎖定常領域に融合される。
【０１８２】 さらに、本発明の新規のＴＩＥリガンドホモログは、新血管形成を促進するた
めに使用され得、そして腫瘍増殖を阻害するために有用であり得る。
【０１８３】 更なる潜在的な治療用途としては、筋肉および骨発達、成熟、または増殖の調
整が挙げられる。
【０１８４】 本発明の核酸分子は、細胞または組織切片においてＴＩＥリガンドホモログの
発現を検出することに有用である。細胞または組織切片は、ハイブリダイズ条件
下で本発明のＴＩＥリガンドをコードする検出可能に標識された核酸分子と接触
され得、そして核酸分子にハイブリダイズしたｍＲＮＡの存在を決定し、それに
よってＴＩＥリガンドの発現を検出する。
【０１８５】 本発明の抗体は、例えば、生物学的試料においてＴＩＥリガンドの量を測定す
るためにイムノアッセイで使用され得る。生物学的試料は、本発明のＴＩＥリガ
ンドを特異的に結合する抗体または抗体混合物と接触され、そしてテスト試料に
存在するリガンドと形成された複合体の量が測定される。
【０１８６】 本発明のＴＩＥリガンドホモログに対する抗体は、さらに、対応するＴＩＥレ
セプターを発現する細胞に対する、細胞傷害性分子、例えば、放射性同位元素ま
たはトキシン、あるいは治療薬剤の送達に有用であり得る。治療薬剤は、例えば
、ＴＩＥ−２リガンドを含む他のＴＩＥリガンド、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ
）ファミリーのメンバー、公知の抗腫瘍薬剤、および筋肉増殖または発育、ある
いは骨発生、成熟、または増殖に関連することが公知の薬剤であり得る。
【０１８７】 抗ＴＩＥリガンドホモログ抗体はまた、ＴＩＥ（例えば、ＴＩＥ−２）レセプ
ターの発現に関連する疾患状態を検出するために、診断薬剤として適切である。
したがって、検出可能に標識されたＴＩＥリガンドホモログおよびＴＩＥレセプ
ターの抗体アゴニストは、血管新生の存在をイメージングするために使用され得
る。
【０１８８】 抗ＴＩＥリガンドホモログ抗体特異的抗ＮＬ６抗体もまた、抗炎症性薬剤とし
ての有用性を見出す。
【０１８９】 治療用途については、本発明のＴＩＥリガンドホモログまたは抗ＴＩＥリガン
ド抗体は、全身または局所適用に適切な、薬理学的に受容可能なビヒクルとの混
合物中に活性成分を含む治療組成物として処方される。本発明の薬学的組成物は
、凍結乾燥した処方物または水溶液の形態で、所望の程度の純度を有する活性成
分を、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または安定化剤と
混合することによって、貯蔵のために調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．編（
１９８０））。受容可能なキャリア、賦形剤、または安定化剤は、用いられる投
与量および濃度でレシピエントに非毒性であり、そしてリン酸、クエン酸、およ
び他の有機酸のような緩衝剤；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１
０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン
のようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン
、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジンのようなアミノ酸；グ
ルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖類、二糖類、および他の
炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート化剤；マンニトールまたはソルビトールの
ような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成カウンターイオン；および／ま
たはＴｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、またはＰＥＧのような非イオン性界面活
性剤を含む。
【０１９０】 活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面重合
化、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロ
カプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルによって調製
されるマイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アル
ブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノパーティクル、およびナ
ノカプセル）に、またはマクロエマルジョンに捕らえられ得る。このような技術
は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｅｉｎｃｅ
ｓ，前出に開示される。
【０１９１】 インビボ投与に使用されるべき処方物は、無菌でなければならない。これは、
凍結乾燥および再構成の前または後に、滅菌濾過メンブランを通す濾過によって
容易に行われる。
【０１９２】 本発明の治療組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、
皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイ
アル中に配置される。
【０１９３】 投与の経路は、例えば、静脈内、腹腔内、大脳内、筋肉内、眼内、動脈内、ま
たは病巣内経路による注射または注入、局所投与、または持続放出システムによ
る、公知の方法に従う。
【０１９４】 持続放出調製物の適切な例には、成形品の形態、例えば、フィルムまたはマイ
クロカプセルでの、半透性ポリマーマトリクスが挙げられる。持続放出マトリク
スには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許３，７７３，９１
９、ＥＰ ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタミン
酸とのコポリマー（Ｕ．Ｓｉｄｍａｎら，１９８３，「Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ
」２２（１）：５４７−５５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート
）（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら，１９８１，「Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ
．」１５：１６７−２７７およびＲ．Ｌａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅ
ｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレンビニル酢酸（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら，同上
）、またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ １３３，９８８Ａ）
が挙げられる。持続放出組成物はまた、リポソームを含む。本発明の範囲内の分
子を含むリポソームは、それ自体公知の方法によって調製される：ＤＥ ３，２
１８，１２１Ａ；Ｅｐｓｔｅｉｎら，１９８５，「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ」８２：３６８８−３６９２；Ｈｗａｎｇら，１９８０，「
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ」７７：４０３０−４０３４；
ＥＰ ５２３２２Ａ；ＥＰ ３６６７６Ａ；ＥＰ ８８０４６Ａ；ＥＰ １４３
９４９Ａ；ＥＰ １４２６４１Ａ；日本国特許出願８３−１１８００８；米国特
許４，４８５，０４５および４，５４４，５４５；およびＥＰ １０２，３２４
Ａ。もともと、リポソームは、脂質含量が約３０ｍｏｌ．％を越えるコレステロ
ールである小さい（約２００〜８００オングストローム）単層タイプであり、選
択された割合は、最適なＮＴ−４治療に対して調節される。
【０１９５】 治療的に用いられるべき本発明の分子の有効量は、例えば、治療対象、投与経
路、および患者の症状に依存する。したがって、投与量を滴定し、そして最適な
治療効果を得るために必要とされる投与経路を改変することが、治療医師には必
要である。代表的な１日の用量は、上記の要素に依存して、約１μｇ／ｋｇ〜１
００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。代表的には、臨床医は、必要とされる生
物学的効果を提供する投与量に達するまで、本発明の分子を投与する。この治療
の進捗は、従来のアッセイによって容易にモニターされる。
【０１９６】 この治療の到達点が腫瘍の予防または処置である場合、本発明における化合物
は、他の治療と組み合わせられ得る。例えば、このような抗腫瘍剤で処置される
患者は放射線療法もまた受け得る。あるいは、またはさらに、化学療法剤が患者
に投与され得る。このような化学療法剤についての調製および投薬のスケジュー
ルが、製造者の指導書に従って、または熟練した開業医により経験的に決定され
たように使用され得る。このような化学療法についての調製および投薬スケジュ
ールはまた、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ編、Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒ
ｙ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９９２
）において記載される。化学療法剤は、抗腫瘍剤の投与に先行し得るかまたは続
き得、またはそれらと共に同時に授与され得る。
【０１９７】 抗原に関連する他の腫瘍に対する抗体（例えば、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、Ｅｒ
ｂＢ３、ＥｒｂＢ４または血管内皮因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体）を投与す
ることもまた所望され得る。あるいは、またはさらに、本明細書に開示される同
じかまたは２つ以上の異なる抗原に結合する２つ以上の抗体が患者に同時投与さ
れ得る。時々、１つ以上のサイトカインを患者に投与することもまた有益であり
得る。好ましい実施態様では、本発明の抗腫瘍化合物が、さらなる増殖阻害剤と
ともに同時投与される。
【０１９８】 疾患の予防または処置のために、例えば、本発明の抗体のような抗腫瘍剤の適
切な用量は、上記で定義されるような処置されるべき疾患の型、疾患の重篤度お
よび経過、薬剤が予防的な目的または治療的な目的のために投与されるか否か、
先行治療、患者の臨床的経歴および薬剤への応答、ならびに主治医の裁量に依存
する。この薬剤は、１回または一連の処置にわたって患者に適切に投与される。
【０１９９】 本発明のさらなる詳細が、以下の制限されない実施例から明らかである。
【０２００】 （実施例１） （ＦＬＳ１３９リガンドの同定） ＦＬＳ１３９を、本明細書中に参考として援用される「説明書マニュアル：ｃ
ＤＮＡ合成およびλクローニングのためのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）
Ｌａｍｂｄａ Ｓｙｓｔｅｍ」、カタログ番号１９６４３−０１４、Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡに記載の
プロトコルに従って、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．
Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ ＵＳＡから得たヒト胎児肝臓ｍＲＮＡ、カタログ番
号６４０１８−１から調製したｃＤＮＡライブラリーにおいて同定した。他に言
及されない限り、全試薬もまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得た
。全手順は、以下の工程に要約され得る：（１）第１鎖合成；（２）第２鎖合成
；（３）アダプター添加；（４）酵素消化；（５）ｃＤＮＡのゲル単離；（６）
ベクターへの連結；および（７）形質転換。
【０２０１】 （第１鎖合成：） ＮｏｔＩプライマー−アダプター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ．，２μｌ、０．５μ
ｇ／μｌ）を滅菌１．５ｍｌ微量遠心管に添加し、これにポリＡ＋ｍＲＮＡ（７
μｌ、５μｇ）を添加した。反応管を、７０℃まで、５分間、またはｍＲＮＡの
２次構造を変性するのに十分な時間で加熱した。次いで、反応物を氷上で冷却し
、そして５×第１鎖緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ．，４μｌ）、０．１Ｍ ＤＴ
Ｔ（２μｌ）、および１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ．，１
μｌ）を添加し、次いで、３７℃まで２分間加熱して、温度を平衡化させた。次
いで、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（登録商標）逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃ
ｈ．，５μｌ）を添加し、反応管を十分に混合し、そして３７℃で１時間インキ
ュベートし、そして氷上に置くことにより終結させた。反応物の最終濃度は、以
下の通りであった：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）；７５ｍＭ Ｋ
Ｃｌ；３ｍＭ ＭｇＣｌ2；１０ｍＭ ＤＴＴ；５００μＭ 各ｄＡＴＰ、ｄＣ ＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ；５０μｇ／ｍｌ ＮｏｔＩプライマー−アダ
プター；５μｇ（２５０μｇ／ｍｌ）ｍＲＮＡ；５０，０００Ｕ／ｍｌ Ｓｕｐ
ｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（登録商標）逆転写酵素。
【０２０２】 （第２鎖合成：） 氷上の間に、以下の試薬を、第１鎖合成からの反応管に添加し、反応物を十分
に混合し、そして温度を１６℃より上にさせないように注意して、１６℃で２時
間反応させた：蒸留水（９３μｌ）；５×第２鎖緩衝液（３０μｌ）；ｄＮＴＰ
混合物（３μｌ）；１０Ｕ／μｌ Ｅ．Ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ（１μｌ）；
１０Ｕ／μｌ Ｅ．Ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ（４μｌ）；２Ｕ／μｌ
Ｅ．Ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ（１μｌ）。１０Ｕ Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（
２μｌ）を添加し、そして反応物を、もう５分間１６℃でインキュベートし続け
た。反応物の最終濃度は、以下の通りであった：２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（
ｐＨ７．５）；１００ｍＭ ＫＣｌ；５ｍＭ ＭｇＣｌ2；１０ｍＭ （ＮＨ4） 2 ＳＯ4；０．１５ｍＭ β−ＮＡＤ＋；２５０μＭ 各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＧＴＰ、およびｄＴＴＰ；１．２ｍＭ ＤＴＴ；６５Ｕ／ｍｌ ＤＮＡリガーゼ
；２５０Ｕ／ｍｌ ＤＮＡポリメラーゼＩ；１３Ｕ／ｍｌ ＲＮａｓｅＨ。反応
を、氷上に置くことおよび０．５Ｍ ＥＤＴＡ（１０μｌ）の添加により止め、
次いで、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１、
１５０μｌ）により抽出した。水相を取り出し、収集し、そして５Ｍ ＮａＣｌ
（１５μｌ）および無水エタノール（−２０℃、４００μｌ）に希釈し、そして
１４，０００×ｇで２分間遠心分離した。上清を、得られたＤＮＡペレットから
注意深く除去し、ペレットを、７０％エタノール（０．５ｍｌ）に再懸濁し、そ
して１４，０００×ｇで２分間、再度遠心分離した。上清を再度除去し、そして
ペレットをスピードバックで乾燥した。
【０２０３】 （アダプター添加） 以下の試薬を、上記の第２鎖合成からのｃＤＮＡペレットに添加し、そして反
応物を穏やかに混合し、そして１６℃で１６時間インキュベートした：蒸留水（
２５μｌ）；５×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（１０μｌ）；ＳａｌＩアダプタ
ー（１０μｌ）；Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（５μｌ）。反応物の最終組成は、以下
であった：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）；１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ；１ｍＭ ＡＴＰ；５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８０００；１ｍＭ ＤＴＴ；２００μ
ｇ／ｍｌ ＳａｌＩアダプター；１００Ｕ／ｍｌ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ。反応
物を、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１、５
０μｌ）により抽出し、水相を取り出し、収集し、そして５Ｍ ＮａＣｌ（８μ
ｌ）および無水エタノール（−２０℃、２５０μｌ）に希釈した。次いで、これ
を１４，０００×ｇで２０分間遠心分離し、上清を除去し、そしてペレットを０
．５ｍｌの７０％エタノールに再懸濁し、そして１４，０００×ｇで２分間、再
度遠心分離した。続いて、上清を除去し、そして得られたペレットをスピードバ
ックにおいて乾燥し、そして次の手順へ続けた。
【０２０４】 （酵素消化：） 以下の試薬を、前段落からのＳａｌＩアダプターを用いて調製したｃＤＮＡに
添加し、そして混合物を３７℃で２時間インキュベートした：ＤＥＰＣ処理水（
４１μｌ）；ＮｏｔＩ制限緩衝液（ＲＥＡＣＴ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ．，５μｌ
）、ＮｏｔＩ（４μｌ）。この反応物の最終組成は、以下であった：５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）；１０ｍＭ ＭｇＣｌ2；１００ｍＭ ＮａＣ ｌ；１，２００Ｕ／ｍｌ ＮｏｔＩ。
【０２０５】 （ｃＤＮＡのゲル単離：） ｃＤＮＡを、５％アクリルアミドゲルでのアクリルアミドゲル電気泳動により
サイズ分画し、そして分子量マーカーとの比較により決定される、１ｋｂより長
いいずれのフラグメントもゲルから切り出した。次いで、ｃＤＮＡを、ゲルから
０．１×ＴＢＥ緩衝液（２００μｌ）に電気溶出させ、そしてフェノール：クロ
ロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１、２００μｌ）により抽出し
た。水相を取り出し、収集し、そして１４，０００×ｇで２０分間遠心分離した
。上清をＤＮＡペレットから除去し、これを７０％エタノール（０．５ｍｌ）に
再懸濁し、そして１４，０００×ｇで２分間、再度遠心分離した。上清を再度捨
て、ペレットをスピードバックにおいて乾燥し、そして蒸留水（１５μｌ）に再
懸濁した。
【０２０６】 （ｃＤＮＡのｐＲＫ５ベクターへの連結：） 以下の試薬を共に添加し、そして１６℃で１６時間インキュベートした：５×
Ｔ４リガーゼ緩衝液（３μｌ）；ｐＲＫ５、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩで消化したベク
ター、０．５μｇ、１μｌ）；前段落から調製したｃＤＮＡ（５μｌ）、および
蒸留水（６μｌ）。続いて、さらなる蒸留水（７０μｌ）および１０ｍｇ／ｍｌ
ｔＲＮＡ（０．１μｌ）を添加し、そして全反応物を、フェノール：クロロホ
ルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）により抽出した。水相を取り出
し、収集し、そして５Ｍ ＮａＣｌ（１０μｌ）および無水エタノール（−２０
℃、２５０μｌ）に希釈した。次いで、これを、１４，０００×ｇで２０分間遠
心分離し、デカントし、そしてペレットを７０％エタノール（０．５ｍｌ）に再
懸濁し、そして１４，０００×ｇで２分間、再度遠心分離した。次いで、ＤＮＡ
ペレットをスピードバックにおいて乾燥し、そして後の手順における使用のため
に蒸留水（３μｌ）に溶出した。
【０２０７】 （ライブラリー連結物の細菌への形質転換：） 前で調製した連結ｃＤＮＡ／ｐＲＫ５ベクターＤＮＡを氷上で冷却し、これに
エレクトロコンピテント（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ＤＨ１０Ｂ細菌
（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ．，２０μｌ）を添加した。次いで、細菌ベクター混合物
を、製造者の推奨どおりにエレクトロポレーションした。続いて、ＳＯＣ培地（
１ｍｌ）を添加し、そして混合物を、３７℃で３０分間インキュベートした。次
いで、形質転換体を、２０個の標準的な、１５０ｍｍ アンピシリン含有ＬＢプ
レートに配置し、そして１６時間（３７℃）インキュベートして、コロニーを増
殖させた。次いで、陽性コロニーをそぎ落とし、そしてＤＮＡを、標準的なＣｓ
Ｃｌ勾配プロトコルを用いて細菌ペレットから単離した。例えば、Ａｕｓｕｂｅ
ｌら、２．３．１。
【０２０８】 （ＦＬＳ１３９の同定） ＦＬＳ１３９は、当該分野で既知の任意の標準的な方法（Ｋｌｅｉｎ Ｒ．Ｄ
．ら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３，７１０８−７
１１３、およびＪａｃｏｂｓ（１９９６年７月１６日に発行された米国特許第５
，５６３，６３７号）により報告された方法を含む）により、ヒト胎児肝臓ライ
ブラリーにおいて同定され得る。Ｋｌｅｉｎら、およびＪａｃｏｂｓによれば、
新規の分泌および膜結合哺乳動物タンパク質をコードするｃＤＮＡは、それらの
分泌リーダー配列を、リポーター系として酵母インベルターゼ遺伝子を用いて検
出することにより同定される。この酵素インベルターゼは、スクロースからグル
コースおよびフルクトースへの分解、ならびにラフィノースからスクロースおよ
びメリビオースへの分解を触媒する。分泌形態のインベルターゼは、酵母（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）によるスクロース資化に必要
とされ、その結果、分泌型インベルターゼを生成し得ない酵母細胞は、唯一の炭
素源およびエネルギー源としてスクロースを含む培地上で十分に増殖しない。Ｋ
ｌｅｉｎ Ｒ．Ｄ．、前出、およびＪａｃｏｂｓ、前出の両方は、哺乳動物シグ
ナル配列が、機能的に、酵母インベルターゼのネイティブシグナル配列の代わり
になるという既知の能力を利用する。哺乳動物ｃＤＮＡライブラリーを、非分泌
型酵母インベルターゼをコードするＤＮＡに連結し、連結されたＤＮＡを単離し
、そしてインベルターゼ遺伝子を含まない酵母細胞に形質転換する。哺乳動物シ
グナル配列に連結した非分泌型酵母インベルターゼ遺伝子を含む組換え体を、炭
素源としてスクロースのみまたはラフィノースのみを含む培地上で増殖するそれ
らの能力に基づいて同定する。次いで、同定された哺乳動物シグナル配列を使用
して、第２の完全長ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、対応する分泌型
タンパク質をコードする完全長クローンを単離する。例えば、クローニングは、
発現クローニングによって、または当該分野で既知の任意のほかの技術によって
行われ得る。
【０２０９】 ＦＬ１３９の同定のために使用されたプライマーは、以下の通りである： ＯＬＩ１１４：ＣＣＡＣＧＴＴＧＧＣＴＴＧＡＡＡＴＴＧＡ 配列番号１３ ＯＬＩ１１５：ＣＣＴＣＣＡＧＡＡＴＴＧＡＴＣＡＡＧＡＣＡＡＴＴＣＡＴＧ
ＡＴＴＴＧＡＴＴＣＴＣＴＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧ 配列番号１４ ＯＬＩ１１６：ＴＣＧＴＣＴＡＡＣＡＴＡＧＣＡＡＡＴＣ 配列番号１５。
【０２１０】 ＦＬＳ１３９のヌクレオチド配列を図６（配列番号５）に示すが、一方、その
アミノ酸配列を図７（配列番号６）に示す。図１に例示するように、ＦＬＳ１３
９は、２つの既知のヒトＴＩＥ−２レセプターリガンド（ｈ−ＴＩＥ２Ｌ１およ
びｈ−ＴＩＥ２Ｌ２）と高度の配列相同性を示す、フィブリノーゲン様ドメイン
を含む。従って、ＦＬＳ１３９は、ＴＩＥリガンドファミリーの新規メンバーと
して同定された。
【０２１１】 ＦＬＳ１３９クローンは、ブタペスト条約により、１９９７年９月１８日に、
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣ
Ｃ），１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａ
ｒｙｌａｎｄ ２０８５２に寄託し、そして寄託番号ＡＴＣＣ ２０９２８１を
与えられている。
【０２１２】 （実施例２） （ＮＬ２およびＮＬ３の同定） ＮＬ２およびＮＬ３は、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴを使用してＧｅ
ｎＢａｎｋデーターベースをスクリーニングすることによった（Ａｌｔｓｈｕｌ
ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６：４６０−４８０（
１９９６））。ＮＬ２配列は、既知のＥＳＴ配列、Ｔ０８２２３、ＡＡ１２２０
６１およびＭ６２２９０との相同性を示す。同様に、ＮＬ３は、既知のＥＳＴ配
列、Ｔ５７２８０およびＴ５０７１９との相同性を示す。完全長配列として同定
され、またはＴＩＥレセプターと結合したリガンドとして記載されている既知の
ＥＳＴ配列はない。
【０２１３】 これらの同定の後、ＮＬ２およびＮＬ３を製造者の指示に従って、Ｃｌｏｎｔ
ｅｃｈ、Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ、ＵＳＡ）、カタログ＃６５２８
−１から購入したｍＲＮＡから調製したヒト胎児肺ライブラリーからクローニン
グした。このライブラリーを以下の合成オリゴヌクレオチドプローブとのハイブ
リダイゼーションによりスクリーニングした： ＮＬ２に関して： ＮＬ２，５−１ ＡＴＧＡＧＧＴＧＧＣＣＡＡＧＣＣＴＧＣＣＣＧＡＡＧＡＡ
ＡＧＡＧＧＣ 配列番号７ ＮＬ２，３−１ ＣＡＡＣＴＧＧＣＴＧＧＧＣＣＡＴＣＴＣＧＧＧＣＡＧＣＣ
ＴＣＴＴＴＣＴＴＣＧＧＧ 配列番号８ ＮＬ２，３−４ ＣＣＣＡＧＣＣＡＧＡＡＣＴＣＧＣＣＧＴＧＧＧＧＡ 配列
番号９ ＮＬ３に関して： ＮＬ３，５−１ ＴＧＧＴＴＧＧＣＡＡＡＧＧＣＡＡＧＧＴＧＧＣＴＧＡＣＧ
ＡＴＣＣＧＧ 配列番号１０ ＮＬ３，３−１ ＧＴＧＧＣＣＣＴＴＡＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＴＴ
ＣＣＧＧＡＴＣＧＴＣＡＧＣＣＡＣ 配列番号１１ ＮＬ３，３−２ ＴＣＣＡＴＴＣＣＣＡＣＣＴＡＴＧＡＣＧＣＴＧＡＣＣＣＡ
配列番号１２。これらは、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて見出されたＥ
ＳＴに基づく。ｃＤＮＡ配列は、それらの全体での配列であった。
【０２１４】 ＮＬ２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図２（配列番号１）および図３（
配列番号２）にそれぞれ示す。ＮＬ３のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図４
（配列番号３）および図５（配列番号４）にそれぞれ示す。
【０２１５】 ＮＬ−２のクローン（ＮＬ−２−ＤＮＡ２２７８０−１０７８）をブダペスト
条約により、１９９７年９月１８日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕ
ｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄ
ｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２に寄託し、そし
て寄託番号ＡＴＣＣ ２０９２８４を与えられている。
【０２１６】 ＮＬ３のクローンを、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）
（１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａ
ｒｙｌａｎｄ２０８５２）に、１９９７年９月１８日に、ブタペスト条約の下に
寄託し、そして受託番号ＡＴＣＣ２０９２８３を割り当てられた。
【０２１７】 （実施例３） （ノーザンブロット分析およびインサイチュハイブリダイゼーション結果） ヒト組織におけるＦＬＳ１３９、ＮＬ２およびＮＬ３ ｍＲＮＡの発現をノー
ザンブロット分析によって試験した。ヒトｍＲＮＡブロットを全長ｃＤＮＡに基
づいた32Ｐ−標識ＤＮＡプローブとハイブリダイズした；このプローブをｃＤＮ
Ａインサートを消化し、精製することによって生成した。ヒト胎児ＲＮＡブロッ
トＭＴＮ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびヒト成体ＲＮＡブロットＭＴＮ−ＩＩ（Ｃ
ｌｏｎｔｅｃｈ）をＤＮＡプローブとインキュベートした。ブロットをハイブリ
ダイゼーション緩衝液（５×ＳＳＰＥ；２Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ 溶液；１００
ｍｇ／ｍＬ 変性剪断サケ精子ＤＮＡ；５０％ ホルムアミド；２％ ＳＤＳ）
中で４２℃、６０時間プローブとインキュベートした。このプローブは、数回、
２×ＳＳＣ；０．０５％ ＳＤＳで１時間、室温で洗浄し、次いで５０℃で０．
１×ＳＳＣ；０．１％ ＳＤＳにおいて３０分間洗浄した。このブロットは、ホ
スホルイメージャー分析（Ｆｕｊｉ）によって一晩の曝露後、発色させた。
【０２１８】 図８および９に示したように、ＮＬ２およびＮＬ３ ｍＲＮＡ転写物を検出し
た。
【０２１９】 ＮＬ３の組織発現パターンをまた、ＰＣＲ−生成した33Ｐ−標識化リボプロー
ブを使用する最適化されたプロトコールを使用して、インサイチューハイブリダ
イゼーション（細胞ＲＮＡに対するハイブリダイゼーションを観察して）によっ
て決定した。（ＬｕおよびＧｉｌｌｅｔｔ、Ｃｅｌｌ Ｖｉｓｉｏｎ １：１６
９−１７６（１９９４））。ホルマリン固定し、パラフィン包埋したヒト胎児お
よび成体組織を切り出し、脱パラフィンし、プロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ
）で１５分間、３７℃でタンパク質除去した。そして、さらにＬｕおよびＧｉｌ
ｌｅｔｔ（１９９４）によって記載されるようにインサイチューハイブリダイゼ
ーションについてさらに処理した。[33−Ｐ]ＵＴＰ−標識化アンチセンスリボプ
ローブをＰＣＲ産物から生成し、そして５５℃で一晩、ハイブリダイズした。こ
のスライドをＫｏｄａｋ ＮＴＢ２ 核トラックエマルジョンに浸漬し、４週間
曝露した。
【０２２０】 （33Ｐ−リボプローブ合成） ６．０μｌ（１２５ｍＣｉ）の33Ｐ−ＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＢＦ １０
０２，ＳＡ＜２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）をスピードバック乾燥した。乾燥33Ｐ−
ＵＴＰを含む各々のチューブに、以下の成分を添加した： ２．０μｌ ５×転写緩衝液 １．０μｌ ＤＴＴ（１００ｍＭ） ２．０μｌ ＮＴＰ混合物（２．５ｍＭ：１０μ：各１０ｍＭ ＧＴＰ、ＣＴ
Ｐ、およびＡＴＰ＋１０μｌ Ｈ2Ｏ） １．０μｌ ＵＴＰ（５０μＭ） １．０μｌ Ｒｎａｓｉｎ １．０μｌ ＤＮＡ鋳型（１μｇ） １．０μｌ Ｈ2Ｏ １．０μｌ ＲＮＡポリメラーゼ（ＰＣＲ産物については通常、Ｔ３＝ＡＳ、
Ｔ７＝Ｓ） チューブを３７℃で１時間インキュベートした。１．０μｌのＲＱ１ ＤＮａ
ｓｅを添加し、次いで、３７℃で１５分間インキュベートを行った。９０μｌの
ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）／１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））
を添加し、そして混合物をＤＥ８１紙の上にピペットで移した。残っている溶液
を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ−５０限外濾過ユニットにロードし、そしてプログラム１
０（６分）を用いてスピンをかけた。濾過ユニットを、２番目の管の上に逆さま
にし、そしてプログラム２（３分）を用いてスピンをかけた。最後の回収スピン
の後、１００μｌのＴＥを添加した。１μｌの最終産物をＤＥ８１紙の上にピペ
ットで移し、そして６ｍｌのＢｉｏｆｌｕｏｒ ＩＩでカウントした。
【０２２１】 プローブをＴＢＥ／尿素ゲルにおいて流した。１〜３μｌのプローブまたは５
μｌのＲＮＡ Ｍｒｋ ＩＩＩを、３μｌのローディング緩衝液に添加した。９
５℃ヒートブロック上で３分間の加熱後、ゲルを直ぐに氷上に置いた。ゲルのウ
ェルをフラッシュし、サンプルをロードし、そして１８０〜２５０ボルトで４５
分間流した。ゲルをサランラップでくるみ、そして−７０℃フリーザーで、１時
間〜一晩、増感スクリーンと共にＸＡＲフィルムに曝露した。
【０２２２】 （33Ｐハイブリダイゼーション） （凍結切片の前処理） スライドをフリーザーから取り出し、アルミニウム
トレー上に置き、そして室温で５分間解凍した。トレーを５５℃のインキュベー
ターに５分間入れて、曇りを減少させた。スライドを、換気装置（ｆｕｍｅ ｈ
ｏｏｄ）内で、氷上で、４％パラホルムアルデヒド中で１０分間固定し、そして
０．５×ＳＳＣで、室温で５分間洗浄した（２５ｍｌ ２０×ＳＳＣ＋９７５ｍ
ｌ ＳＱ Ｈ2Ｏ）。０．５μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ中で３７℃１０分のタ ンパク質除去（予め温めたＲＮａｓｅを含まないＲＮＡｓｅ緩衝液２５０ｍｌ中
、 １２．５μｌの１０ｍｇ／ｍｌストック）の後、切片を、０．５×ＳＳＣで、室
温で１０分間洗浄した。切片を、７０％、９５％、１００％エタノール中で各々
２分間脱水した。
【０２２３】 （パラフィン包埋切片の前処理） スライドを脱パラフィンし、ＳＱ Ｈ2 Ｏ中に置き、そして２×ＳＳＣで、室温で２回各時５分間リンスした。この切片
を、ヒト胚−２０μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（ＲＮａｓｅを含まないＲＮａｓ
ｅ緩衝液２５０ｍｌ中、１０ｍｇ／ｍｌの５００μｌ；３７℃、１５分）、また
はホルマリン組織−８×プロテイナーゼＫ（ＲＮａｓｅ緩衝液２５０ｍｌ中、１
００μｌ；３７℃、３０分）中でタンパク質除去した。その後の０．５×ＳＳＣ
でのリンスおよび脱水を、上記のように行った。
【０２２４】 （プレハイブリダイゼーション） スライドを、Ｂｏｘ緩衝液（４×ＳＳＣ
、５０％ホルムアミド）に浸した濾紙が並んだプラスチックの箱の中に置いた。
組 織を、５０μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（３．７５ｇ デキストラン硫
酸＋６ｍｌ ＳＱ Ｈ2Ｏ）で覆い、ボルテックスし、そして蓋を緩めてマイク ロ波で２分間加熱した。氷上で冷却した後、１８．７５ｍｌのホルムアミド、３
．７５ｍｌの２０×ＳＳＣ、および９ｍｌのＳＱ Ｈ2Ｏを添加し、組織を十分 にボルテックスし、そして４２℃で１〜４時間インキュベートした。
【０２２５】 （ハイブリダイゼーション） スライド１枚あたり１．０×１０6ｃｐｍの プローブおよび１．０μｌのｔＲＮＡ（５０ｍｇ／ｍｌストック）を、９５℃で
３分間加熱した。スライドを氷上で冷却し、そしてスライドあたり４８μｌのハ
イブリダイゼーション緩衝液を添加した。ボルテックスした後、５０μｌの33Ｐ
混合物を、スライド上の５０μｌのプレハイブリダイゼーションに添加した。ス
ライドを、５５℃で一晩インキュベートした。
【０２２６】 （洗浄） 洗浄を、２×ＳＳＣ、ＥＤＴＡを用いて室温で、２×１０分で行
い（４００ｍｌ ２０×ＳＳＣ＋１６ｍｌ ０．２５Ｍ ＥＤＴＡ、Ｖf＝４Ｌ ）、それに続いてＲＮａｓｅＡ処理を３７℃で３０分間行った（ＲＮａｓｅ緩衝
液２５０ｍｌ中、１０ｍｇ／ｍｌの５００μｌ＝２０μｇ／ｍｌ）。スライドを
、２×ＳＳＣ、ＥＤＴＡを用いて室温、２×１０分で洗浄した。ストリンジェン
シーな洗浄条件は以下の通りであった：５５℃で２時間、０．１×ＳＳＣ、ＥＤ
ＴＡ（２０ｍｌの２０×ＳＳＣ＋１６ｍｌのＥＤＴＡ、Ｖf＝４Ｌ）。
【０２２７】 （オリゴ：） Ｃ−１４１Ｆ−ＮＬ３ｐ１：４８マー ＧＧＡ ＴＴＣ ＴＡＡ ＴＡＣ ＧＡ
Ｃ ＴＣＡ ＣＴＡ ＴＡＧ ＧＧＣ ＡＡＧ ＴＴＧ ＴＣＣ ＴＣＣ （配
列番号１６） Ｃ−１４１Ｇ−ＮＬ３ｐ２：４７マー ＣＴＡ ＴＧＡ ＡＡＴ ＴＡＡ ＣＣ
Ｃ ＴＣＡ ＣＴＡ ＡＡＧ ＧＧＡ ＣＧＴ ＧＧＴ ＣＡＧ ＣＧＴ （配
列番号１７）。
【０２２８】 検査された成体組織は以下のものである：肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈
、脾臓、リンパ節、膵臓、肺、皮膚、大脳皮質、海馬、小脳、陰茎、目、膀胱、
胃、胃ガン、結腸、結腸ガンおよび軟骨肉腫、アセトアミノフェン誘導肝臓損傷
および肝硬変。検査された胎児組織は、以下のものである：胎盤、臍帯、肝臓、
腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大脈管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、
脳、目、脊髄、体壁、骨盤および下肢。発現は、正常組織または胎児組織のいず
れからも観察されなかった。発現は、急性（アセトアミノフェン誘導）および慢
性肝臓障害（肝硬変および直腸結腸ガン転移に隣接した）において肝臓洞様毛細
血管細胞（おそらく内皮の）で検出された。これらの結果は、ＮＬ３が肝臓の再
生の調節において役割を果たし得ることを示す。
【０２２９】 ＮＬ１の発現をまた成体および胎児組織の同様の配列で検査したが、発現は、
上に示した状態下では観察されなかった。
【０２３０】 （実施例４） （Ｅ．ｃｏｌｉ中でのＦＬＳ１３９、ＮＬ２およびＮＬ３の発現） 本実施例は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける本発明のＴＩＥリガンドホモログの非グリ
コシル化形態の調製を例示する。ＮＬ２、ＮＬ３、またはＦＬＳ１３９リガンド
をコードするＤＮＡ配列（それぞれ、配列番号１、３、および５）を、選択した
ＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅した。このプライマーは、選択した発現ベ
クター上の制限酵素部位に対応する制限酵素部位を含むべきである。種々の発現
ベクターが使用され得る。ベクターは、好ましくは、抗生物質耐性遺伝子、複製
起点、プロモーター、およびリボザイム結合部位をコードする。適切なベクター
の例は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含む、ｐＢ
Ｒ３２２（Ｅ．ｃｏｌｉ由来；Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ ２：９５（１９７
７）を参照のこと）である。ベクターを制限酵素で消化し、そして脱リン酸化す
る。次いで、ＰＣＲ増幅配列をベクターに連結する。
【０２３１】 次いで、連結混合物を使用して、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出に記載の方法を用
いて、選択したＥ．ｃｏｌｉ株を形質転換する。形質転換体を、ＬＢプレート上
で増殖するそれらの能力により同定し、次いで、抗生物質耐性コロニーを選択す
る。プラスミドＤＮＡを単離し、そして制限分析により確認し得る。
【０２３２】 選択したクローンを、液体培養培地（例えば、抗生物質を補充したｌＢブロス
）中で一晩増殖し得る。続いて、一晩培養物を使用して、大規模（ｌａｔｅｒ
ｓｃａｌｅ）培養物に接種し得る。次いで、細胞を、所望の光学密度まで増殖さ
せる。誘導物質（例えば、ＩＰＴＧ）を添加し得る。
【０２３３】 さらに数時間細胞を培養した後、細胞を遠心分離によって回収し得る。遠心分
離によって得られた細胞ペレットを当該分野で既知の種々の薬剤を使用して可溶
化し得、次いで可溶化タンパク質を金属キレートカラムを使用して、タンパク質
のタイトな結合を可能にする条件下で精製し得る。
【０２３４】 実際、ＮＬ２を、次の手順を使用して、ポリ−Ｈｉｓタグ化形態でＥ．ｃｏｌ
ｉ中で発現させた。ＮＬ２をコードするＤＮＡを選択したＰＣＲプライマーを使
用して最初に増幅した。このプライマーは、選択した発現ベクターで制限酵素部
位に対応する制限酵素部位、ならびに有効および信頼できる翻訳開始、金属キレ
ートカラムでの迅速な精製、ならびにエンテロキナーゼを用いたタンパク質分解
除去のために提供する他の有用な配列を含んだ。次いで、ＰＣＲ増幅したポリ−
Ｈｉｓタグ化配列を発現ベクターに連結した。これは、株５２（Ｗ３１１０ｆｕ
ｈＡ（ｔｏｎＡ）ｌｏｎ ｇａｌＥ ｒｐｏＨｔｓ（ｈｔｐＲｔｓ）ｃｌｐＰ（
ｌａｃＩｑ）に基づいたＥ．ｃｏｌｉ宿主を形質転換するために使用した。形質
転換体をまず、３〜５のＯ．Ｄ．６００に達するまで５０ｍｇ／ｍｌのカルベニ
シリンを含むＬＢ中で３０℃で振とうして増殖させた。次いで培養物をＣＲＡＰ
培地（３．５７ｇ（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．７１ｇクエン酸ナトリウム２水和物、 １．０７ｇ ＫＣｌ、５．３６ｇ Ｄｉｆｃｏ 酵母抽出物、５．３６ｇの５０
０ｍｌ水中におけるＳｈｅｆｆｉｅｌｄ ｈｙｃａｓｅ ＳＦ、ならびに１１０
ｍＭ ＭＰＯＳ、ｐＨ７．３、０．５５％（ｗ／ｖ）グルコースおよび７ｍＭ
ＭｇＳＯ4を混合することにより調製した）中で５０〜１００倍希釈し、そして 振とうして３０℃で約２０〜３０時間増殖させた。サンプルを取り出し、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ分析によって発現を確かめた。そして大量培養物を遠心分離して細胞
をペレットにした。細胞ペレットを精製およびリフォールディングまで凍結した
。 ０．５〜１Ｌの発酵からのＥ．ｃｏｌｉペースト（６〜１０ｇ ペレット）
を１０容量（ｗ／ｖ）で７Ｍ グアニジン、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８緩衝液
中に再懸濁した。固形亜硫酸ナトリウムおよびテトラチオン酸ナトリウムを加え
てそれぞれ０．１Ｍおよび０．０２Ｍの最終濃度とし、そしてこの溶液を４℃で
一晩攪拌した。この工程は、亜硫酸化（ｓｕｌｆｉｔｏｌｉｚａｔｉｏｎ）によ
ってブロックされた全システイン残基を有する変性されたタンパク質を生じる。
この溶液を３０分間、Ｂｅｃｋｍａｎ 超遠心機で４０，０００ｒｐｍで遠心分
離した。上清を３〜５容量の金属キレートカラムバッファー（６Ｍ グアニジン
、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４）で希釈し、そして０．２２ミクロンのフィ
ルターを通して濾過し、透明化した。未定の透明化した抽出物を、金属キレート
緩衝液で平衡化した５ｍｌのＱｉａｇｅｎ Ｎｉ−ＮＴＡ金属キレートカラムに
ロードした。このカラムを５０ｍＭイミダゾール（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｕｔ
ｒｏｌ ｇｒａｄｅ）を含むさらなる緩衝液、ｐＨ７．４で洗浄した。このタン
パク質を２５０ｍＭ イミダゾールを含む緩衝液で溶出した。所望のタンパク質
を含む画分をプールし、そして４℃で貯蔵した。タンパク質濃度を、このアミノ
酸配列に基づいた計算された吸光係数を使用して２８０ｎｍの吸光度によって推
定した。
【０２３５】 このタンパク質を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．６、０．３Ｍ ＮａＣｌ、２
．５Ｍ 尿素、５ｍＭ システイン、２０ｍＭ グリシンおよび１ｍＭ ＥＤＴ
Ａからなる新鮮に調製されたリフォールディング緩衝液中にサンプルをゆっくり
と希釈することによりリフォールドした。リフォールディング容量を最終タンパ
ク質濃度が５０〜１００μｇ／ｍｌであるように選択した。リフォールディング
溶液を４℃で１２〜３６時間穏やかに攪拌した。リフォールディング反応は、０
．４％の最終濃度にＴＦＡを添加することによって停止した。このタンパク質の
さらなる精製の前に、この溶液を０．２２ミクロンのフィルターを通してろ過し
、そしてアセトニトリルを２〜１０％の最終濃度まで添加した。リフォールドさ
れたタンパク質を０．１％ ＴＦＡの流動緩衝液を使用して、１０〜８０％のア
セトニトリルのグラジエントを用いた溶出でＰｏｒｏｓ Ｒ１／Ｈ逆相カラムに
おいてクロマトグラフした。Ａ２８０の吸光度を有するフラクションのアリコー
トをＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析し、そして均質なリフォールドタンパ
ク質を含むフラクションをプールした。一般に、ほとんどのタンパク質の適切に
リフォールドされた種は、最も低濃度のアセトニトリルで溶出される。なぜなら
これらの種は、最もコンパクトであり、これらの疎水性の内部は、逆相樹脂との
相互作用から遮蔽されるからである。凝集した種は、より高いアセトニトリル濃
度で通常、溶出される。所望の形態からタンパク質のミスフォールドされた形態
を分離することに加えて、逆相工程はまた、サンプルからエンドトキシンを取り
除く。
【０２３６】 所望のフォールドされたＮＬ２タンパク質を含む画分をプールし、この溶液に
対する窒素の緩やかな流れを使用してアセトニトリルを除いた。タンパク質を透
析によってまたは処方緩衝液で平衡化されたＧ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）樹脂を使用したゲルろ過によって０．１４Ｍ 塩化ナトリウム
および４％ マニトールを有する２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ６．８中に処方し
、そして滅菌濾過した。
【０２３７】 （実施例５） （哺乳動物細胞におけるＦＬＳ１３９、ＮＬ２およびＮＬ３の発現） 本実施例は、哺乳動物細胞における組換え発現による、ＦＬＳ１３９、ＮＬ２
およびＮＬ３リガンドホモログのグリコシル化形態の調製を例示する。
【０２３８】 ベクター、ｐＲＫ５（１９８９年３月１５日に公開されたＥＰ ３０７，２４
７を参照のこと）を、発現ベクターとして使用する。必要に応じて、ＦＬＳ１３
９、ＮＬ２およびＮＬ３ ＤＮＡを、連結方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、
前出に記載）を用いて、ＦＬＳ１３９、ＮＬ２およびＮＬ３ ＤＮＡの挿入を可
能にする選択した制限酵素で、ｐＲＫ５に連結する。得られたベクターを、それ
ぞれ、ｐＲＫ５−ＦＬＳ１３９、−ＮＬ２およびＮＬ３と呼ぶ。
【０２３９】 １つの実施態様において、選択した宿主細胞は２９３細胞であり得る。ヒト２
９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １５７３）を、培地（例えば、ウシ胎仔血清、必
要に応じて栄養成分および／または抗生物質を補充したＤＭＥＭ）中で組織培養
プレートにおいてコンフルエンスまで増殖させる。約１０μｇのｐＲＫ５−ＦＬ
Ｓ１３９、−ＮＬ２またはＮＬ３ ＤＮＡを、約１μｇのＶＡ ＲＮＡ遺伝子を
コードするＤＮＡ（Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａら、Ｃｅｌｌ，３１：５４３（１９
８２））と混合し、そして５００μｌの１ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．２２７Ｍ ＣａＣｌ2に溶解する。この混合物に、５００μｌ の５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ
ＮａＰＯ4を滴下し、そして沈殿物を、２５℃で１０分間形成させる。沈殿物 を懸濁し、そして２９３細胞に添加し、そして３７℃で約４時間放置する。培養
培地を吸引し、そしてＰＢＳ中２０％のグリセロール２ｍｌを３０秒間添加する
。次いで、２９３細胞を無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、そして細胞
を約５日間インキュベートする。
【０２４０】 トランスフェクションの約２４時間後、培養培地を除去し、そして培養培地（
単独）、または２００μＣｉ／ｍｌ、35Ｓ−システインおよび２００μＣｉ／ｍ
ｌ、35Ｓ−メチオニンを含む培養培地で置換する。１２時間のインキュベーショ
ン後、馴化培地を収集し、スピンフィルター上で濃縮し、そして１５％ＳＤＳゲ
ル上にロードする。処理したゲルを乾燥し、そして選択した期間、フィルムに暴
露して、ＦＬＳ１３９、ＮＬ２およびＮＬ３ポリペプチドの存在を明らかにし得
る。トランスフェクト細胞を含む培養物は、さらなるインキュベーション（無血
清培地中で）を受け得、そして培地を、選択されたバイオアッセイで試験する。
【０２４１】 代替の技術において、Ｓｏｍｐａｒｙｒａｃら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．，１２：７５７５（１９８１）により記載されたデキストラン硫酸
法を用いて、ＦＬＳ１３９、ＮＬ２およびＮＬ３を、２９３細胞に一過的に導入
し得る。２９３細胞を、スピナーフラスコ中で最大密度まで増殖し、そして７０
０μｇのｐＲＫ５−ＦＬＳ１３９、ＮＬ２およびＮＬ３ ＤＮＡを添加する。細
胞を、最初に、遠心分離によりスピナーフラスコから濃縮し、そしてＰＢＳで洗
浄する。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を、細胞ペレット上で４時間インキュベー
トする。細胞を、２０％グリセロールで９０秒間処理し、組織培養培地で洗浄し
、そして組織培養培地、５μｇ／ｍｌウシインシュリン、および０．１μｇ／ｍ
ｌウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再導入する。約４日後、馴化
培地を遠心分離し、そして濾過して細胞および破片を除去する。次いで、発現Ｆ
ＬＳ１３９、ＮＬ２およびＮＬ３を含むサンプルを濃縮し、そして任意の選択し
た方法（例えば、透析および／またはカラムクロマトグラフィー）により精製し
得る。
【０２４２】 別の実施態様においては、ＦＬＳ１３９、ＮＬ２およびＮＬ３は、ＣＨＯ細胞
において発現され得る。ｐＲＫ５−ＦＬＳ１３９、ＮＬ２およびＮＬ３を、既知
の試薬（例えば、ＣａＰＯ4またはＤＥＡＥ−デキストラン）を用いて、ＣＨＯ 細胞にトランスフェクトし得る。上記のように、細胞培養物をインキュベートし
、そして培地を、培養培地（単独）または放射性標識（例えば、35Ｓ−メチオニ
ン）を含む培養培地で置換し得る。ＦＬＳ１３９、ＮＬ２およびＮＬ３ポリペプ
チドの存在を決定した後、培養培地を無血清培地で置換し得る。好ましくは、培
養物を約６日間インキュベートし、次いで、馴化培地を回収する。次いで、発現
ＦＬＳ１３９、ＮＬ２またはＮＬ３を含む培地を濃縮し、そして任意の選択した
方法により精製し得る。
【０２４３】 エピトープタグ化ＦＬＳ１３９、ＮＬ２およびＮＬ３もまた、宿主ＣＨＯ細胞
において発現され得る。ＦＬＳ１３９、ＮＬ２およびＮＬ３を、ｐＲＫ５ベクタ
ーからサブクローニングし得る。サブクローン挿入物は、バキュロウイルス発現
ベクターに、選択したエピトープタグ（例えば、ポリ−ｈｉｓタグ）とインフレ
ームで融合するようにＰＣＲを受け得る。次いで、ポリ−ｈｉｓタグ化ＦＬＳ１
３９、ＮＬ２およびＮＬ３挿入物を、安定クローンの選択のための選択マーカー
（例えば、ＤＨＦＲ）を含むＳＶ４０駆動ベクターにサブクローニングし得る。
最後に、ＣＨＯ細胞を、ＳＶ４０駆動ベクターで（上記のように）トランスフェ
クトし得る。標識を上記のように行って、発現を確かめ得る。次いで、発現ポリ
−Ｈｉｓタグ化ＦＬＳ１３９、ＮＬ２およびＮＬ３を含む培養培地を濃縮し、そ
して任意の選択した方法（例えば、Ｎｉ2+キレートアフィニティークロマトグラ
フィー）により精製し得る。
【０２４４】 グルコシル化形態のＮＬ２、ＮＬ３およびＦＬＳ１３９（ＮＬ６）を実際、ポ
リＨｉｓタグ化された形態でＣＨＯ細胞中で発現させた。ＰＣＲ増幅の後、ＮＬ
２、ＮＬ３またはＮＬ６ＤＮＡをＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｔ ３．１６
、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９７）に記載されたような標
準の技術を使用してＣＨＯ発現ベクター中でサブクローニングした。ＣＨＯ発現
ベクターを目的のＤＮＡの５’および３’に適合性制限酵素部位を有し、ｃＤＮ
Ａの便利なシャトリングを可能にするように構築する。ＣＨＯ細胞におけるＮＬ
２、ＮＬ３またはＮＬ６の発現のために使用されるベクターは、Ｌｕｃａｓら、
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：９（１７７４−１７７９（１９９６））
に記載されている通りであり、そして目的のｃＤＮＡおよびジヒドロ葉酸レダク
ターゼ（ＤＨＦＲ）の発現を駆動するためにＳＶ４０初期プロモーター／エンハ
ンサーを使用する。ＤＨＦＲ発現はトランスフェクション後のプラスミドの安定
な維持のための選択を可能とする。
【０２４５】 １２μｇのＮＬ２、ＮＬ３またはＮＬ６をコードするプラスミドＤＮＡを市販
のトランスフェクション試薬、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（登録商標）（Ｑｕｉａｇｅ
ｎ）、Ｄｏｓｐｅｒ（登録商標）またはＦｕｇｅｎｅ（登録商標）（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して約１０００万のＣＨＯ細胞に導入し
た。この細胞は増殖され、そしてＬｕｃａｓら、前出で記載された。約３×１０ -7 の細胞を下記のようにさらなる増殖および生成のためにアンプル中に凍結した
。
【０２４６】 ＮＬ２、ＮＬ３またはＮＬ６プラスミドＤＮＡを含むアンプルを、水浴に入れ
ることにより解凍し、そしてボルテックスにより混合した。内容物を、１０ｍＬ
の培地を含む遠心管にピペットで移し、そして１０００ｒｐｍで５分間遠心分離
した。上清を吸引し、そして細胞を、１０ｍＬの選択培地（５％ ０．２μｍダ
イアフィルトレーションしたウシ胎仔血清を含む０．２μｍ濾過ＰＳ２０）に再
懸濁した。次いで、細胞を、９０ｍＬの選択培地を含む１００ｍＬスピナーにア
リコートした。１〜２日後、細胞を、１５０ｍＬの選択増殖培地で満たした２５
０ｍＬスピナーに移し、そして３７℃でインキュベートした。さらに２〜３日後
、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、および２０００ｍＬスピナーに３×１０5個細胞／ ｍＬを接種した。培地を、遠心分離および生成培地中への再懸濁により新鮮な培
地と交換した。任意の適切なＣＨＯ培地（例えば、１９９２年６月１６日に発行
された、米国特許第５，１２２，４６９号に記載の培地）を、使用し得る。３Ｌ
生成スピナーに、１．２×１０6個細胞／ｍＬで接種する。０日目に、細胞数お よびｐＨを測定した。１日目に、スピナーをサンプリングし、そして濾過空気の
散布を開始した。２日目に、スピナーをサンプリングし、温度を３３℃に変え、
そして３０ｍＬの５００ｇ／Ｌ−グルコースおよび０．６ｍＬの１０％消泡剤（
例えば、３５％ポリジメチルシロキサンエマルジョン、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ
３６５ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｒａｄｅ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ）を添加した。生成
の間、ｐＨを、約７．２で保持するために必要なように調節した。１０日後、ま
たは生存率が７０％未満に下がるまで、遠心分離により細胞培養物を採集し、そ
して０．２２μｍフィルターに通して濾過した。濾過物を、精製カラムへのロー
ディングまで４℃で貯蔵した。
【０２４７】 このポリＨｉｓタグ化構築物をＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて
精製した。精製前に、イミダゾールを、５ｍＭの濃度まで馴化培地に添加した。
馴化培地を、流速４〜５ｍｌ／分、４℃で、０．３Ｍ ＮａＣｌおよび５ｍＭ
イミダゾールを含む２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）緩衝液で平衡化した６
ｍｌ Ｎｉ−ＮＴＡカラムにポンプで注入した。ローディング後、カラムをさら
なる平衡化緩衝液で洗浄し、そしてタンパク質を、０．２５Ｍイミダゾールを含
む平衡化緩衝液で溶出した。続いて、精製タンパク質を、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ
、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、および４％ マンニトールを含む貯蔵緩衝液（ｐＨ６
．８）中に、２５ｍｌ Ｇ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カ
ラムを用いて脱塩し、そして−８０℃で貯蔵した。
【０２４８】 精製タンパク質の均質性をＳＤＳ ＰＥＧにより確かめ、そしてＮ末端アミノ
酸配列決定をエドマン分解により行った。
【０２４９】 （実施例６） （酵母におけるＦＬＳ１３９、ＮＬ２およびＮＬ３の発現） まず、ＦＬＳ１３９、ＮＬ２またはＮＬ３の細胞内産生または分泌のために、
酵母発現ベクターを、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターから構築する。ＦＬＳ
１３９、ＮＬ２またはＮＬ３をコードするＤＮＡ、選ばれたシグナルペプチドお
よびプロモーターを、ＦＬＳ１３９、ＮＬ２またはＮＬ３の細胞内発現を指示す
るために、選ばれたプラスミド中の適当な制限酵素部位に挿入する。分泌に関し
ては、ＦＬＳ１３９、ＮＬ２またはＮＬ３の発現のための、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤ
ＨプロモーターをコードするＤＮＡ、酵母α因子分泌シグナル／リーダー配列、
およびリンカー配列（もし必要なら）と共に、ＦＬＳ１３９、ＮＬ２またはＮＬ
３をコードするＤＮＡを、選ばれたプラスミドにクローニングし得る。
【０２５０】 次いで、酵母株ＡＢ１１０のような酵母細胞を、上記で述べられたような発現
プラスミドで形質転換し、選ばれた発酵培地中で培養し得る。形質転換した酵母
の上清を、１０％トリクロロ酢酸を用いた沈澱およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分
離によって、次にゲルをクマシーブルー染料で染色することによって分析し得る
。
【０２５１】 次に、組換えＦＬＳ１３９、ＮＬ２およびＮＬ３を、遠心分離によって酵母細
胞を発酵培地から除去すること、次に選ばれたカートリッジフィルターを用いて
その培地を濃縮することによって、単離および精製し得る。ＦＬＳ１３９、ＮＬ
２またはＮＬ３を含む濃縮液を、選ばれたカラムクロマトグラフィー樹脂を用い
て、さらに精製し得る。
【０２５２】 （実施例７） （バキュロウイルストランスフェクトされた昆虫細胞におけるＦＬＳ１３９
、ＮＬ２およびＮＬ３の発現） 次の方法は、バキュロウイルストランスフェクトされた昆虫細胞におけるＦＬ
Ｓ１３９、ＮＬ２またはＮＬ３の組換え発現について記載する。
【０２５３】 ＦＬＳ１３９、ＮＬ２またはＮＬ３を、バキュロウイルス発現ベクターと、含
まれるエピトープタグの上流に融合する。そのようなエピトープタグは、ポリヒ
スチジンタグおよび免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域のような）を含む。
ｐＶＬ１３９３（Ｎｏｖａｇｅｎ）のような、市販のプラスミド由来のプラスミ
ドを含む、種々のプラスミドを利用し得る。簡単には、ＦＬＳ１３９、ＮＬ２ま
たはＮＬ３、またはＦＬＳ１３９、ＮＬ２またはＮＬ３の所望の部分（膜貫通タ
ンパク質の細胞外ドメインをコードする配列のような）を、５’および３’領域
に相補的なプライマーを用いてＰＣＲで増幅する。５’プライマーを隣接する（
選ばれた）制限酵素部位に組み込むことができる。産生物を次にそれらの選ばれ
た制限酵素で消化して、発現ベクターにサブクローニングする。
【０２５４】 組換えバキュロウイルスを、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（
「Ｓｆ９」）細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に、リポフェクチン（ＧＩＢ
ＣＯ−ＢＲＬから市販）を用いて、上記のプラスミドおよびＢａｃｕｌｏＧｏｌ
ｄTMウイルスＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を同時にトランスフェクトするこ
とによって産生する。２８℃で４−５日間インキュベートした後、放出されたウ
イルスを回収してさらに増幅するために使用する。ウイルス感染およびタンパク
質の発現を、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｅｙら、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｏｘｆｏ
ｒｄ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）によって
述べられたように、実施する。
【０２５５】 次に、発現したポリヒスチジンタグのついたＦＬＳ１３９、ＮＬ２またはＮＬ
３を、例えばＮｉ2+キレートアフィニティークロマトグラフィーによって、次の
ように精製し得る。Ｒｕｐｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：１７５−１７９（
１９９３）によって記載されるように、組換えウイルスが感染したＳｆ９細胞か
ら抽出物を調製する。簡単には、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理緩衝液（２５
ｍＬ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．９；１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2；０．１ｍＭ ＥＤ ＴＡ；１０％グリセロール；０．１％ＮＰ−４０；０．４Ｍ ＫＣｌ）に再懸濁
し、氷上で２０秒間、２回超音波処理する。超音波処理したものを遠心分離によ
り透明にし、上清をローディング緩衝液（５０ｍＭリン酸、３００ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．８）で５０倍に希釈し、０．４５μｍのフィ
ルターで濾過する。Ｎｉ2+−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎから市販）
を床容積５ｍＬで調製し、２５ｍＬの水で洗浄して２５ｍＬのローディング緩衝
液で平衡化する。濾過した細胞抽出液を１分あたり０．５ｍＬカラムにロードす
る。カラムをＡ280のベースラインになるまでローディング緩衝液で洗浄し、そ の時点から画分の回収を開始する。次に、非特異的に結合したタンパク質を溶出
する２番目の洗浄緩衝液（５０ｍＭリン酸；３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリ
セロール、ｐＨ６．０）でカラムを洗浄する。再びＡ280のベースラインに達し た後、２番目の洗浄緩衝液中、０から５００ｍＭまでのイミダゾールの勾配でカ
ラムを展開する。１ｍＬの画分を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび、銀染色また
はアルカリホスファターゼに結合したＮｉ2+−ＮＴＡを用いたウエスタンブロッ
ト（Ｑｉａｇｅｎ）によって分析する。溶出されたヒスチジン10タグのついたＦ
ＬＳ１３９、ＮＬ２またはＮＬ３を含む画分をプールし、ローディング緩衝液に
対して透析する。
【０２５６】 あるいは、ＩｇＧタグ（またはＦｃタグ）のついたＦＬＳ１３９、ＮＬ２また
はＮＬ３の精製を、例えばプロテインＡまたはプロテインＧカラムクロマトグラ
フィーを含む既知のクロマトグラフィー技術を用いて行い得る。
【０２５７】 ＮＬ２またはＦＬＳ１３９（ＮＬ６）を、バキュロウイルスが感染したＨｉｇ
ｈ５細胞においてポリヒスチジンタグのついた形態で発現させた。発現は実際に
は０．５Ｌの規模で実施したが、より大きな（例えば、８Ｌ）調製法に簡単に規
模を拡大することができる。
【０２５８】 それぞれのコード配列をＰＣＲ増幅後、バキュロウイルス発現ベクター（ｐｂ
．ＰＨ．Ｈｉｓ．ｃ）にサブクローニングし、ベクターおよびＢａｃｕｌｏｇｏ
ｌｄ（登録商標）バキュロウイルスＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）をＨｉｇｈ
５細胞に、リポフェクチン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて、同時にトランスフェ
クトした。ｐｂ．ＰＨ．Ｈｉｓは、市販のバキュロウイルス発現ベクターｐＶＬ
１３９３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を修飾したものであり、ヒスチジン配列を含
む改変されたポリリンカー領域を伴う。その細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏ
ｎｅ）を補充したＨｉｎｋ’ｓ ＴＮＭ−ＦＨ培地中で増殖した。細胞を、２８
℃で５日間インキュベートした。この上清を採取し、次に１０％ＦＢＳを補充し
たＨｉｎｋ’ｓ ＴＮＭ−ＦＨ培地中のＳｆ９細胞に、感染多重度（ＭＯＩ）約
１０で感染させることにより、最初のウイルス増幅に使用した。細胞を２８℃で
３日間インキュベートした。この上清を回収し、バキュロウイルス発現ベクター
におけるＮＬ２およびＮＬ６構築物の発現を、１ｍｌの上清の、２５ｍＬのＮｉ
−ＮＴＡビーズ（ＱＩＡＧＥＮ）に対するバッチ結合によって決定し、次にＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ分析でクマシーブルー染色によって既知の濃度の標準タンパク質と
比較した。
【０２５９】 最初のウイルス増幅上清を、ＥＳＦ−９２１培地（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ ＬＬＣ）中で増殖された、Ｈｉｇｈ５細胞のスピナー培養物（５
００ｍｌ）への感染に、約０．１のＭＯＩで使用した。細胞を、２８℃で３日間
インキュベートした。この上清を採取し、そして濾過した。必要に応じて、この
スピナー培養物での発現が確認されるまで、バッチ結合とＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
を繰り返した。
【０２６０】 トランスフェクトされた細胞（０．５〜３Ｌ）からの馴化培地を、遠心分離に
よって採取して細胞を除いて、そして０．２２ミクロンフィルターを通して濾過
した。ポリヒスチジンタグのついた構築物については、タンパク質構築物をＮｉ
−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。精製の前に、イミダゾール
を馴化培地に５ｍＭの濃度まで加えた。この馴化培地を、０．３Ｍ ＮａＣｌお
よび５ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４で平衡
化した６ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラムに、４℃、流速４−５ｍｌ／分で注入した。
ロード後、このカラムをさらなる平衡化緩衝液で洗浄し、タンパク質を０．２５
Ｍのイミダゾールを含む平衡化緩衝液で溶出した。次いで、その高度に精製され
たタンパク質を、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、０．１４Ｍ ＮａＣｌおよび４％マン
ニトールを含む、ｐＨ６．８の保存緩衝液に、２５ｍｌのＧ２５ Ｓｕｐｅｒｆ
ｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを用いて脱塩し、そして−８０℃で保存し
た。
【０２６１】 ＮＬ２およびＮＬ６タンパク質の均質性を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（
ＰＡＧ）電気泳動およびエドマン分解によるＮ末端アミノ酸配列決定によって実
証した。
【０２６２】 （実施例８） （ＦＬＳ１３９、ＮＬ２またはＮＬ３に結合する抗体の調製） この実施例はＦＬＳ１３９、ＮＬ２またはＮＬ３に特異的に結合し得るモノク
ローナル抗体の調製を説明する。
【０２６３】 モノクローナル抗体の産生技術は当該分野において公知であり、そして例えば
、Ｇｏｄｉｎｇ、前出において記載される。使用され得る免疫原は、本発明の精
製されたリガンドホモログ、そのようなリガンドホモログを含む融合タンパク質
、および細胞表面に組換えリガンドホモログを発現した細胞を含む。当業者は過
度な実験をせずに免疫原を選択し得る。
【０２６４】 Ｂａｌｂ／ｃのようなマウスを完全フロイントアジュバントに乳化した免疫原
で免疫し、そして１〜１００μｇの量を皮下または腹腔内に注射する。あるいは
、この免疫原を、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）に乳化し、そして動
物の後足肉趾内に注射する。免疫されたマウスに、次に１０から１２日後に選ん
だアジュバントに乳化した追加の免疫原で追加免疫する。その後、数週間、マウ
スをさらなる免疫注射で追加免疫もまたし得る。抗体を検出するＥＬＩＳＡアッ
セイを試験するために、血清サンプルを定期的にマウスから眼窩後方の採血によ
って採取し得る。
【０２６５】 適切な抗体力価を検出した後、抗体「陽性」の動物に、所定のリガンドを最終
的に静脈内注射し得る。３日から４日後、そのマウスを屠殺し、そして脾臓細胞
を回収する。次にこの脾臓細胞を、ＡＴＣＣ、Ｎｏ．ＣＲＬ １５９７より入手
可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１のような選ばれたマウスミエローマ細胞株と融合す
る（３５％ポリエチレングリコールを用いて）。この融合物は、ハイブリドーマ
細胞を産生し、次にこれを、融合していない細胞、ミエローマハイブリッド、お
よび脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害するために、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、
アミノプテリン、およびチミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートにプ
レートし得る。
【０２６６】 ハイブリドーマ細胞を、抗原に対する反応性についてＥＬＩＳＡでスクリーニ
ングする。本明細書中のＴＩＥリガンドホモログに対する望ましいモノクローナ
ル抗体を分泌する「陽性」ハイブリドーマ細胞の決定は当業者の技術的範囲内で
ある。
【０２６７】 抗ＴＩＥリガンドホモログモノクローナル抗体を含む腹水を産生するために、
陽性ハイブリドーマ細胞を同系Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に注射し得る。ある
いは、ハイブリドーマ細胞を組織培養フラスコまたはローラーボトル中で増殖さ
せ得る。腹水中で産生されたモノクローナル抗体の精製を、硫酸アンモニウム沈
澱、次にゲル排除クロマトグラフィーを用いて達成し得る。あるいは、抗体のプ
ロテインＡまたはプロテインＧへの結合に基づくアフィニティークロマトグラフ
ィーを使用し得る。
【０２６８】 （実施例９） （ＶＥＧＦ刺激による内皮細胞増殖の阻害） ウシ副腎皮質毛細管内皮（ＡＣＥ）細胞（初代培養から最大１２〜１４継代）
を、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ）で、１００μＬあたり５００個の細胞／ウェルの密度で、３ｎｇ／
ｍＬのＶＥＧＦを追加した低グルコースＤＭＥＭ、１０％仔ウシ血清、２ｍＭグ
ルタミン、１×ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐｔおよびファンギゾン（ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ
）中にプレートした。コントロールを同じ方法でプレートしたが、いくつかはＶ
ＥＧＦを含まなかった。ＮＬ８ポリペプチドの試験サンプルを１００μｌ容量で
加えて、最終的な容積を２００μＬ容量とした。細胞を３７℃で６〜７日間イン
キュベートした。この培地を吸引し、細胞をＰＢＳで１回洗浄した。酸性ホスフ
ァターゼ反応混合物（１００μＬ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５、０．
１％Ｔｒｉｔｏｎ−１００、１０ｍＭ ｐ−ニトロフェニルリン酸）を加えた。
３７℃で２時間インキュベートした後、１０μＬの１Ｎ ＮａＯＨを加えて反応
を止めた。マイクロタイタープレートリーダーで４０５ｎｍの光学密度を測定し
た。コントロールは細胞なし、細胞単独、細胞＋ＦＧＦ（５ｎｇ／ｍＬ）、細胞
＋ＶＥＧＦ（３ｎｇ／ｍＬ）、細胞＋ＶＥＧＦ（３ｎｇ／ｍｌ）＋ＴＧＦ−β（
１ｎｇ／ｍｌ）、および細胞＋ＶＥＧＦ（３ｎｇ／ｍＬ）＋ＬＩＦ（５ｎｇ／ｍ
Ｌ）であった（１ｎｇ／ｍｌの濃度のＴＧＦ−βはＶＥＧＦ刺激による細胞増殖
を７０−９０％阻害することが知られている）。
【０２６９】 酸性ホスファターゼの活性をＯＤ４０５ｎｍで測定することによって決定する
、ＶＥＧＦ（３ｎｇ／ｍｌ）刺激による細胞増殖の阻害の割合を計算することに
よって、（１）刺激なしの細胞と比較して、および（２）ＶＥＧＦ刺激活性の参
照ＴＧＦ−β阻害と比較して、結果を評価した。阻害が３０％以上であれば、結
果を陽性と判断する。以下の表１に示す結果は、ＮＬ５、およびおそらく関連ポ
リペプチドの、ガン治療および特に腫瘍脈管形成を阻害することにおける有用性
の指標である。表１に示される数値（相対阻害）を、ＶＥＧＦ刺激増殖のパーセ
ント阻害を、刺激無しの細胞に対する試験したＴＩＥリガンドホモログを計算す
ること、次いでこのパーセンテージをＶＥＧＦ刺激細胞増殖の７０〜９０％をブ
ロックすることが公知である２ｎｇ／ｍｌでのＴＧＦ−βによって得られたパー
セント阻害へと除することによって決定した。
【０２７０】
【表１】 （実施例１０） （内皮細胞のアポトーシス誘導） ＮＬ２、ＮＬ３およびＮＬ６が内皮細胞にアポトーシスを誘導する能力を、９
６ウェル形式で、１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを補充した０％血清培地中で、ヒ
ト静脈性臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）において試
験した（ＨＵＶＥＣ細胞は容易にプレート表面から取り除かれるので、ウェル中
のすべてのピペット操作は実施可能な限り穏やかに行わなければならない）。
【０２７１】 培地を吸引し、細胞を１回ＰＢＳで洗浄した。５ｍｌの１×トリプシンをＴ−
１７５フラスコ中の細胞に加え、細胞がプレートから離れるまで（約５−１０分
）静置した。５ｍｌの増殖培地を加えることにより、トリプシン処理を止めた。
細胞を４℃、１０００ｒｐｍで５分間、遠心分離（ｓｐｉｎ）した。培地を吸引
し、細胞を１０ｍｌの１０％血清補充培地（Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１×
ｐｅｎｎ／ｓｔｒｅｐに再懸濁した。
【０２７２】 この細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉ
ｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、ｃｙｔｏｓｔａｒ−Ｔ ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｎｇ
ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ、ＲＰＮＱ１６０、滅菌、組織培養処理、個別包装）で、
１０％血清（ＣＳＧ培養液、Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）中で、総容積１００μ
ｌ、ウェルあたり２×１０4個の細胞密度でプレートした。ＮＬ５およびＮＬ８ ポリペプチドを１％、０．３３％、０．１１％の希釈で３組づつ加えた。細胞無
しのウェルをブランクとして、細胞のみのウェルをネガティブコントロールとし
て使用した。ポジティブコントロールとして、５０μｌのスタウロスポリン３倍
ストックを１：３に連続的に希釈したものを使用した。ＮＬ５ポリペプチドがア
ポトーシスを誘導する能力を、アポトーシスを検出するためにカルシウムおよび
リン脂質結合タンパク質の１つであるアネキシンＶを用いて決定した。
【０２７３】 ０．２ｍｌのアネキシンＶ−ビオチンストック溶液（１００μｇ／ｍｌ）を４
．６ｍｌの２×Ｃａ2+結合緩衝液および２．５％ＢＳＡに希釈した（１：２５希
釈）。５０μｌの希釈したアネキシンＶ−ビオチン溶液を各ウェルに加え（コン
トロールを除いて）、最終的な濃度を１．０μｇ／ｍｌとした。35Ｓ−ストレプ
トアビジンを直接加える前に、サンプルをアネキシン−ビオチンと共に１０−１
５分間インキュベートした。35Ｓ−ストレプトアビジンを２×Ｃａ2+結合緩衝液
、２．５％ＢＳＡで希釈し、全てのウェルに最終的な濃度が３×１０4ｃｐｍ／ ウェルになるように加えた。プレートに封をし、１０００ｒｐｍで１５分間遠心
分離して軌道振盪機（ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｅｒ）に２時間置いた。１４５
０Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘ（Ｗａｌｌａｃ）で分析を行った。
【０２７４】 ＮＬ２、ＮＬ３、およびＮＬ６はこのアッセイで陽性であった。これらの結果
は、この分子、および潜在的に関連する分子の、ガン治療における潜在的な有用
性をさらに確認する。
【０２７５】 （実施例１１） （内皮細胞におけるｃ−ｆｏｓの誘導） 増殖培地（５０％Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２、ＧＨＴ無し、低グルコース、および５
０％ＤＭＥＭ、グリシン無し、ＮａＨＣＯ3有、１％グルタミン、１０ｍＭ Ｈ ｅｐｅｓ、１０％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ）中のヒト静脈臍静脈内皮
細胞（ＨＵＶＥＣ、Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、９６ウェルのマイクロタイ
タープレートに、１×１０4細胞／ウェルの細胞密度でプレートした。プレーテ ィングの翌日、その細胞を、増殖培地を除去することおよびその細胞を１００μ
ｌ／ウェルの試験サンプルおよびコントロール（陽性コントロール：増殖培地；
陰性コントロール：１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、４％（ｗ／
ｖ）マンニトール、ｐＨ６．８）で処置することによって飢餓させた。その細胞
を３０分間３７℃で５％ＣＯ2中でインキュベートした。そのサンプルを取り出 し、そしてｂＤＮＡキットプロトコル（Ｃｈｉｒｏｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ
、ｃａｔ＃６００５−０３７）の第一部にしたがい、ここで、以下に列挙した各
大文字で始まる試薬／緩衝液はそのキットから利用可能であった。
【０２７６】 手短には、その試験に必要なＴＭ Ｌｙｓｉｓ ＢｕｆｆｅｒおよびＰｒｏｂ
ｅの量を、製造業者によって提供される情報に基づいて計算した。解凍したＰｒ
ｏｂｅの適切な量をＴＭ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒに添加した。Ｃａｐｔｕｒ
ｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを室温に暖めた。ｂＤＮＡスト
リップを金属ストリップホルダに設定し、そして１００μｌのＣａｐｔｕｒｅ
Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを、必要とされる各ｂＤＮＡウェル
に添加し、次いで少なくとも３０分間インキュベートした。その細胞を有する試
験プレートをインキュベーターから取り出し、そしてその培地を緩やかにそのバ
キュームマニホルドを用いて除去した。１００μｌのＰｒｏｂｅを伴うＬｙｓｉ
ｓ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを、マイクロタイタープレート
の各ウェルへ迅速にピペッティングした。次いで、このプレートを５５℃で１５
分間インキュベートした。インキュベーターからの取り出しの際、そのプレート
をマイクロタイターアダプターヘッドを伴うボルテックスミキサに置き、そして
＃２設定で１分間ボルテックスした。８０μｌの溶解物を取り出し、そしてＣａ
ｐｔｕｒｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを含むｂＤＮＡウェル
へ添加し、そして上下にピペッティングして混合した。このプレートを５３℃で
少なくとも１６時間インキュベートした。
【０２７７】 翌日、ｂＤＮＡキットプロトコルの第二部を行った。詳細には、Ｐｌａｔｅを
インキュベーターから取り出し、そしてベンチにおいて１０分間冷却した。必要
とされる追加の容量を、製造業者によって提供された情報に基づいて計算した。
Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを、Ａｍｐｌｉｆｉｅ
ｒ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（２０ｆｍ／μｌ）のＡＬ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔ
ｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒへの１：１００希釈を行うことによって調製した。ハイブ
リダイゼーション混合物を、プレートから取り出し、そしてＷａｓｈ Ａを用い
て２回洗浄した。５０μｌのＡｍｐｌｉｆｉｅｒ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔ
ｉｏｎを各ウェルに添加し、そしてそのウェルを５３℃で３０分間インキュベー
トした。次いで、そのプレートをそのインキュベーターから取り出し、そして１
０分間放冷した。Ｌａｂｅｌ Ｐｒｏｂｅ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ
を、Ｌａｂｅｌ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（４０ｐモル／μｌ）のＡＬ Ｈｙｒ
ｂｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ中で１：１００希釈を行うことによって調
製した。１０分間の放冷期間の後、Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔ
ｉｏｎ Ｍｉｘｔｕｒｅを除去し、そしてそのプレートをＷａｓｈ Ａで２回洗
浄した。５０μｌのＬａｂｅｌ Ｐｒｏｂｅ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏ
ｎ を各ウェルに添加し、そしてそのウェルを５３℃で１５分間インキュベート
した。１０分間冷却した後、そのＳｕｂｓｔｒａｔｅを室温まで暖めた。アッセ
イに必要とされるＳｕｂｓｔｒａｔｅ１ｍｌあたり３μｌのＳｕｂｓｔｒａｔｅ
Ｅｎｈａｎｃｅｒを添加する際に、そのプレートを１０分間放冷し、Ｌａｂｅ
ｌ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｍｉｘｔｕｒｅを除去し、そしてそのプレー
トを２回Ｗａｓｈ Ａで洗浄し、そしてＷａｓｈ Ｄで３回洗浄した。５０μｌ
のＥｎｈａｎｃｅｒを伴うＳｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを各ウェルに
添加した。そのプレートを３０分間３７℃でインキュベートし、そしてＲＬＵを
適切なルミノメーターで読み取った。
【０２７８】 複製を平均し、そして変動係数を決定した。陰性コントロール（上記のＨＥＰ
ＥＳ緩衝液）の値に対する増加倍数の活性の尺度を、化学発光単位（ＲＬＵ）に
より示した。陰性コントロールの値に対して少なくとも２倍の値を示したサンプ
ルを陽性とみなした。
【０２７９】
【表２】 （実施例１２） （内皮細胞Ｃａ流入アッセイ） Ｃａ流入は、特定のリガンドの、そのレセプターに対する結合の際の充分に記
載された応答である。このＣａ流入アッセイにおいて陽性応答をもたらす試験化
合物を、特定のレセプターに結合し、そしてヒト内皮細胞における生物学的シグ
ナル伝達経路を活性化するといい得る。これは、最終的には、例えば、細胞分裂
、細胞増殖の阻害、内皮細胞管形成、細胞移動、アポトーシスなどを導き得る。
【０２８０】 増殖培地（５０：５０グリシン無し、１％グルタミン、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ
、１０％ＦＢＳ，１０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ）中のヒト静脈臍静脈内皮細胞（Ｈ
ＵＶＥＣ、Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、９６ウェルのＶｉｅｗＰｌａｔｅｓ
−９６（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ＃６００５１ ８２）マイクロタイタープレートに、２×１０4細胞／ウェルでプレートした。 この細胞を緩衝液（ＨＢＳＳ＋１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ）で３回洗浄し、１ウェル
あたり１００μｌ放置した。ＮＬ６ポリペプチドの試験サンプルを、異なる９６
ウェルプレートに、緩衝液中に５×濃縮で調製した。陽性コントロール：５０μ
Ｍイオノマイシン（５×）；陰性コントロール：Ｐｒｏｔｅｉｎ ３２．細胞プ
レートおよびサンプルプレートを、ＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉ
ｃｅｓ）装置上にかけた。ＦＬＩＰＲ装置は２５μｌの試験サンプルを細胞に添
加し、および読み取りを、１分間にわたり１秒ごとに行い、次いで次の３分間に
わたり３秒ごとに行った。
【０２８１】 曲線（Δ変化）の最大の上昇に対する基底線の蛍光変化を計算し、そしてその
複製を平均した。蛍光が増加する速度を、モニターし、そして１０００を超える
Δ変化を有し、そして６０秒以内に上昇したそのサンプルのみを陽性とみなした
。以下の表３には、結果が、陽性コントロールと比較して表現される。
【０２８２】
【表３】 （実施例１３） （モルモット皮膚生検評価） ３５０グラム以上の体重の無毛モルモットにケタミン（７５〜８０ｍｇ／ｋｇ
）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）で筋肉内で麻酔をかけた。ＮＬ６または馴
化培地試験サンプルを、注射部位あたり１００μｌで背中に皮内注射した。動物
１匹あたりおよそ１６〜２４の注射部位が存在した。１ｍｌのＥｖａｎｓ青色色
素（１％生理学的緩衝化生理食塩水）を心臓内注射した。試験化合物に対する前
炎症または皮膚血管透過性応答を、肉眼で、試験材料（ＮＬ６）の投与後１〜６
時間で注射部位からもれる青色色素の直径を測定することによってスコア付けし
た。動物を投与後６時間で屠殺した。各皮膚部位を生検し、そしてホルマリンで
固定した。皮膚を組織学的評価のために調製した。各部位を皮膚内への炎症細胞
浸潤について評価した。可視の炎症細胞浸潤を有する部位を、陽性とスコア付け
した。炎症細胞浸潤物は、好中球、好酸球、単球、またはリンパ球性であり得る
。ＮＬ６を、このアッセイにおいて、潜在的な前炎症物質と同定した。
【０２８３】 （実施例１４） （内皮の管形成の刺激） このアッセイは、以下のようにＤａｖｉｓおよびＣａｍａｒｉｌｌｏ、Ｅｘｐ
ｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２４：３９−５１（１９
９６）で述べられたアッセイまたは、その変形の１つに従う。
【０２８４】 プロトコル：ＨＵＶＥ細胞（継代回数が初代培養から８回未満）を６×１０5 個の細胞／ｍｌの密度でＩ型ラットテイルコラーゲンと混合し、最終濃度は２．
６ｍｇ／ｍｌ、そして９６ウェルプレート上にウェルあたり５０μｌをプレート
した。ゲルを３７℃で１時間凝固させておいて、次いでウェルあたり５０μｌの
１％ＦＢＳを追加したＭ１９９培養培地およびＮＬ６ポリペプチドサンプル（各
１％、０．１％、０．０１％の希釈で）を、液胞が形成されている間それを染色
する１μＭの６−ＦＡＭ−ＦＩＴＣ色素と共に加える。細胞を３７℃／５％ＣＯ 2 で４８時間インキュベートし、３．７％ホルマリンを用いて室温で１０分間固 定し、ＰＢＳで５回洗浄した。次にＲｈ−ファロイジンを用いて４℃で１晩染色
し、次に４μＭのＤＡＰＩで核を染色した。
【０２８５】 （１．アポトーシスアッセイ） このアッセイは、３次元マトリクス中で、外来性の増殖因子（ＶＥＧＦ、ＰＭ
ＡなしのｂＦＧＦ）存在下で、細胞の生存を促進する因子を同定する。
【０２８６】 １以下の結果が陽性である。０＝アポトーシスなし、１＝２０％未満の細胞が
アポトーシスをおこしている、２＝５０％未満の細胞がアポトーシスをおこして
いる、３＝５０％を超える細胞がアポトーシスをおこしている。この系でアポト
ーシスを刺激する物質は、アポトーシス因子と予想され、インヒビターはアポト
ーシスを防止または抑制することが予想れる。
【０２８７】 （２．液胞アッセイ） このアッセイは、ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦ（４０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、内
皮の液胞形成および管腔形成を刺激する因子を同定する。
【０２８８】 ２以上の結果が陽性である。１＝２０％未満の細胞に液胞が存在する、２＝２
０−５０％の細胞に液胞が存在する、３＝５０％を超える細胞に液胞が存在する
。このアッセイをピノサイトーシス、イオン輸送、透過性、および結合形成の刺
激に関与する因子を同定するために設計する。
【０２８９】 （３．管形成アッセイ） このアッセイは、３次元マトリクス中で内皮の管形成を刺激する因子を同定す
る。このアッセイは、３次元マトリクス中で外来性の増殖因子（ＶＥＧＦ、ｂＦ
ＧＦ）存在下で、内皮細胞の管様構造への分化を刺激する因子を同定する。
【０２９０】 ２以上の結果が陽性である。１＝細胞は全て丸い、２＝細胞は細長くなってい
る、３＝細胞はいくらか結合した管を形成している、４＝細胞は複雑な管ネット
ワークを形成している。このアッセイはトラッキング、走化性、または内皮の形
状変化の刺激に関与し得る因子を同定する。
【０２９１】 図１０はＨＵＶＥＣの管形成に対する、ポリヒスチジンに結合した１％希釈の
ＮＬ６ポリペプチド、および１％希釈の緩衝液コントロール（１０ｍＭ ＨＥＰ
ＥＳ／０．１４Ｍ ＮａＣｌ／４％マンニトール、ｐＨ６．８）の効果を示して
いる。ＩｇＧ融合物として試験した、もう１つの新規のＴＩＥリガンドホモログ
（ＮＬ１）および２つの公知のＴＩＥリガンドであるＴＩＥ−１およびＴＩＥ−
２と比較した結果もまた図１０に示す。
【０２９２】 （材料の寄託） 前に言及したように、次の材料をアメリカンタイプカルチャーコレクション、
１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳ
Ａ（ＡＴＣＣ）に寄託した：
【０２９３】
【表４】 これらの寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト
条約（ブダペスト条約）およびその下での規制の規定の下になされた。これは寄
託の生存可能な培養物を寄託日から３０年間維持することを保証する。寄託物は
ブダペスト条約の条項の下で、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．およびＡＴＣＣ間
の合意を条件として、ＡＴＣＣによって入手可能となり、これは、適切な米国特
許が発行された時点、またはあらゆる米国または外国特許出願が公開された時点
のどちらが先にきても、寄託物の培養物の子孫を、公衆が永続的に無制限に入手
できることを保証する。そして、３５ＵＳＣ§１２２およびそれに準ずる米国特
許商標庁長官の規則（８８６ＯＧ６８３に特に言及している３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§
１．１４を含む）によって、米国特許商標庁長官によってその権利があると決定
されたものがその子孫を入手できることを保証する。
【０２９４】 本願の譲受人は、寄託した材料の培養物が、適切な条件下で培養されている時
に死滅または喪失または破壊された場合、通知に基づいて直ちにもう１つの同じ
ものと交換することに同意した。寄託した材料の入手可能性は、あらゆる政府の
権威のもとでその特許法に従って授与された権利に違反して本発明を実施する実
施許諾とは解釈されるべきではない。
【０２９５】 本明細書は、当業者が発明を実施するのを可能にするのに十分であると判断さ
れる。寄託された実施態様は本発明の特定の局面の１つの例示として意図されて
おり、機能的に等価なあらゆる構築物は本発明の範囲内であるので、本発明は寄
託された構築物によって範囲が制限されるべきではない。本明細書中の材料の寄
託は、明細書がその最良の形態を含む本発明のあらゆる局面の実施を可能にする
のに不適当であるという承認を構成しない。また請求の範囲をそれが表す特定の
例示に制限するように解釈されるべきではない。実際に、本明細書中に示され記
述されたものに加えて、本発明の様々な変形が、前述の記載から当業者に明らか
になり、添付される請求の範囲の範囲内に入る。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、リガンドホモログＮＬ２、ＮＬ３およびＦＬＳ１３９の、ＴＩＥ２レ
セプターの２つの公知のリガンドホモログ（ｈ−ＴＩＥ２Ｌ１およびｈ−ＴＩＥ
２Ｌ２）ならびに出願番号第０８／９３３，８２１号（１９９７年９月１９日出
願）に開示される他のＴＩＥリガンドホモログとの関係の図示である。
【図２】 図２は、ＴＩＥリガンドＮＬ２のヌクレオチド配列である（配列番号１）（Ｄ
ＮＡ ２２７８０）。
【図３】 図３は、ＴＩＥリガンドＮＬ２のアミノ酸配列である（配列番号２）。
【図４】 図４は、ＴＩＥリガンドＮＬ３のヌクレオチド配列である（配列番号３）（Ｄ
ＮＡ ３３４５７）。
【図５】 図５は、ＴＩＥリガンドＮＬ３のアミノ酸配列である（配列番号４）。
【図６】 図６は、ＴＩＥリガンドＦＬＳ１３９のヌクレオチド配列である（配列番号５
）（ＤＮＡ １６４５１）。
【図７】 図７は、ＴＩＥリガンドＦＬＳ１３９のアミノ酸配列である（配列番号６）。
【図８】 図８は、種々の組織においてＴＩＥリガンドホモログＮＬ２およびＮＬ３のｍ
ＲＮＡの発現を示すノーザンブロットである。
【図９】 図９は、種々の組織においてＴＩＥリガンドＮＬ２およびＮＬ３のｍＲＮＡの
発現を示すノーザンブロットである。
【図１０】 図１０は、１％希釈でポリ−ｈｉｓに結合したＮＬ６ポリペプチドの、および
１％希釈で緩衝液コントロール（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／０．１４Ｍ ＮａＣｌ
／４％マンニトール、ｐＨ ６．８）の、ＨＵＶＥＣチューブ形成における効果
を示す。ＩｇＧ融合体としてテストした、別の新規ＴＩＥリガンドホモログ（Ｎ
Ｌ１）および２つの公知のＴＩＥリガンドＴＩＥ−１およびＴＩＥ−２との比較
結果もまた、図中で示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/475 ４Ｈ０４５ 43/00 １０５ 16/22 Ｃ０７Ｋ 14/475 16/46 16/22 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/46 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/08 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/24 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ゴッダード， オードリー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94131, サン フランシスコ， コンゴ ストリ ート 110 (72)発明者 ゴドウスキー， ポール アメリカ合衆国 カリフォルニア 94010, バーリンガム， イーストン ドライブ 2627 (72)発明者 ガーニー， オースティン エル. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94002, ベルモント， デビー レーン １ (72)発明者 ヒラン， ケネス アメリカ合衆国 カリフォルニア 94114, サン フランシスコ， シワード 64 (72)発明者 ウイリアムズ， ピー． ミッキー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94019, ハーフ ムーン ベイ， アルト アベ ニュー 509 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA44 BA80 CA01 CA04 CA11 GA11 HA01 4B064 AG01 AG27 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA93Y AB01 BA01 BA30 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA01 AA02 ZA361 ZA362 ZA891 ZA892 ZA941 ZA942 ZA961 ZA962 ZB011 ZB012 ZB211 ZB212 ZB261 ZB262 ZC351 ZC352 4C085 AA14 4H045 AA10 AA11 BA10 CA40 DA76 EA28 FA74 【要約の続き】

Claims (29)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 哺乳動物ＴＩＥリガンドホモログポリペプチドをコードする
    単離された核酸分子であって、該ポリペプチドが、 （ａ）ヒトＮＬ２（配列番号２）、ヒトＮＬ３（配列番号４）、ヒトＮＬ６（
    ＦＬＳ１３９）（配列番号６）、および非ヒト哺乳動物種におけるそれらのホモ
    ログからなる群から選択される；または （ｂ）それらの生物学的に活性な機能的誘導体であり、 ただし、該機能的誘導体がアミノ酸配列改変体である場合、該機能的誘導体は
    、ヒトＮＬ２、ヒトＮＬ３、もしくはヒトＮＬ６リガンドのフィブリノーゲン様
    ドメインと少なくとも約９０％配列同一性を有する、 単離された核酸分子。
  2. 【請求項２】 配列番号１；配列番号３；または配列番号５のコード領域を
    含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
  3. 【請求項３】 配列番号１；配列番号３；または配列番号５のフィブリノー
    ゲン様ドメインを含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
  4. 【請求項４】 請求項１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
  5. 【請求項５】 請求項１に記載の核酸分子で形質転換した、組換え宿主細胞
    。
  6. 【請求項６】 原核生物細胞である、請求項５に記載の組換え宿主細胞。
  7. 【請求項７】 真核生物細胞である、請求項５に記載の組換え宿主細胞。
  8. 【請求項８】 単離された哺乳動物ＴＩＥリガンドホモログポリペプチドで
    あって、該ポリペプチドが、 （ａ）ヒトＮＬ２（配列番号２）、ヒトＮＬ３（配列番号４）、ヒトＮＬ６（
    配列番号６）、および非ヒト哺乳動物種におけるそれらのホモログからなる群か
    ら選択される；または （ｂ）それらの生物学的に活性な機能的誘導体であり、 ただし、該機能的誘導体がアミノ酸配列改変体である場合、該機能的誘導体は
    、ヒトＮＬ２、ヒトＮＬ３、もしくはＮＬ６リガンドのフィブリノーゲン様領域
    と少なくとも約９０％配列同一性を有する、 単離された哺乳動物ＴＩＥリガンドホモログポリペプチド。
  9. 【請求項９】 請求項８に記載のＴＩＥリガンドを特異的に結合する、抗体
    。
  10. 【請求項１０】 モノクローナル抗体である、請求項９に記載の抗体。
  11. 【請求項１１】 非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）残基およびヒトフレーム
    ワーク（ＦＲ）残基を有する、請求項１０に記載の抗体。
  12. 【請求項１２】 内皮細胞の増殖を阻害する、請求項９に記載の抗体。
  13. 【請求項１３】 前記細胞が腫瘍細胞である、請求項１２に記載の抗体。
  14. 【請求項１４】 細胞のアポトーシスを誘導する、請求項９に記載の抗体。
  15. 【請求項１５】 腫瘍細胞の血管新生を阻害する、請求項９に記載の抗体。
  16. 【請求項１６】 抗ＮＬ２、抗ＮＬ３、または抗ＮＬ６抗体である、請求項
    ９に記載の抗体。
  17. 【請求項１７】 標識されている、請求項９に記載の抗体。
  18. 【請求項１８】 請求項８に記載のポリペプチドをキャリアとともに含む、
    組成物。
  19. 【請求項１９】 請求項９に記載の抗体をキャリアとともに含む、組成物。
  20. 【請求項２０】 前記抗体の増殖阻害量を含む、請求項１９に記載の組成物
    。
  21. 【請求項２１】 抗ＮＬ２、抗ＮＬ３、または抗ＮＬ６抗体を含む、請求項
    ２０に記載の組成物。
  22. 【請求項２２】 細胞傷害性薬剤または化学療法剤の二次抗体をさらに含む
    、請求項２１に記載の組成物。
  23. 【請求項２３】 さらなる治療剤または細胞傷害性薬剤に融合された、請求
    項８に記載のポリペプチドまたは請求項９に記載の抗体を含む、結合体。
  24. 【請求項２４】 前記さらなる治療剤が、トキシン、異なるＴＩＥリガンド
    、または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ファミリーのメンバーである、請求項２
    ３に記載の結合体。
  25. 【請求項２５】 血管新生の存在を画像化するための方法であって、請求項
    ８に記載の検出可能に標識されたＴＩＥリガンドホモログ、または請求項９に記
    載のアゴニスト抗体を患者に投与する工程、および血管新生をモニタリングする
    工程、を包含する、方法。
  26. 【請求項２６】 血管形成を阻害するための方法であって、請求項８に記載
    のＴＩＥリガンドホモログまたは請求項９に記載のアゴニスト抗体の有効量を患
    者に投与する工程を包含する、方法。
  27. 【請求項２７】内皮細胞増殖の阻害のための方法であって、請求項８に記載
    のＴＩＥリガンドホモログポリペプチドの有効量で、該内皮細胞を処理する工程
    、を包含する、方法。
  28. 【請求項２８】 内皮細胞アポトーシスの誘導のための方法であって、請求
    項８に記載のＴＩＥリガンドホモログポリペプチドの有効量で該内皮細胞を処理
    する工程、を包含する、方法。
  29. 【請求項２９】 腫瘍増殖を阻害するための方法であって、請求項８に記載
    のアゴニストＴＩＥリガンドの有効量を患者に投与する工程、を包含する、方法
    。
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