CZ421898A3

CZ421898A3 - Ligandy TIE-2 receptoru (TIE ligand-3, TIE ligand-4) a jejich použití

Info

Publication number: CZ421898A3
Application number: CZ984218A
Authority: CZ
Inventors: David M. Valenzuela; Pamela F. Jones; George D. Yancopoulos
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 1996-06-19
Filing date: 1997-06-19
Publication date: 1999-05-12
Also published as: ES2194203T3; DE69720241D1; US6432667B1; NO985904D0; DE69720241T2; AU3406197A; AU724467B2; KR20000022028A; IL127623A0; EP0939809B1; ATE235551T1; US20030064470A1; PT939809E; WO1997048804A3; FI982745A; DK0939809T3; US6881395B2; PL330705A1; HUP0004320A2; FI982745A0

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká obecně oboru genetického inženýrství a zvláště pak genů pro kinasy receptoru tyrosinu a jejich spřízněné ligandy, jejich vsunutí do rekombinantních DMA vektorů a produkce zakódovaných proteinů v recipientních kmenech mikroorgamizmů a recipientních eukaryotických buněk· Předněji řečeno je tento vynález řízen na nové ligandy, známé jako TIE ligand-3 a TIE-ligand-4,které vážou TIE-2 receptor, jakož i způsoby přípravy a použití nových ligandů. Vynález dále zahrnuje sekvence nukleových kyselin se zakódovaným TIE ligandem-3 nebo TIE-ligandem-4, způsoby generování nukleových kyselin a genových produktů. Nové TIE ligandy, jakož i nukleové kyseliny, zakodující je, se mohou použít při diagnostice i léčbě hěkterých onemocnění se zahrnutím endo,theliálních buněk a spřízněných TIE receptorů, jako jsou neoplastická onemocnění, zahrnující tumorovou angiogenesi, -zahojování ran, thromboembolioká onemocnění, atherosklerosu a zánětlivá onemocnění? Dále pak se mohou tyto ligandy použít k podporování proláferace a/nebo diferenciace hematopoietických základních buněkBiologicky aktivní ligandy dle tohoto vynálezu se mohou použít k podporování růstu, přežití,.migrace a/nebo diferenciace a/nebo stabilizace či destabilizace buněk s expresí TIE receptoru. Biologicky aktivní TIE ligandy se mohou použít k udržování in vitro TIE receptoru s expresí buněk do kultury. Buňky a tkáně s expresí TIE receptoru zahrnují Například srdeční a vaskulární endotheliální buňky, epithelium očních čoček, srdeční epikard a ranné hematopoietické buňky. Jinak se mohou takové ligandy využít k podpoře buněk, které jsou řízeny na expresi TIE receptoru. Dále pak ligandy a jejich spřízněné receptory se mohou použít v testovacích soustavách k identi;fi.l£ování agonistů i antagonistů receptoru.

-2• · ·

•9 99 · • ♦ · · · '· • · · · · ♦ · ·· · · • · · · ···· · · «·

Dosavadní stav techniky

Chování se buněk, odpovědných za vývoj, udržování i opravu diferencovaných buněk a tkání je ovládáno z velké míry intercelulárními signály, dopravovanými cestou růstových faktorů a podobnými ligandy a jejich receptory. Receptory jsou umístěny na buněčném povrchu odpovídajících buněk a vážou peptidy nebo polypeptidy, známé jako růstové faktory, jakož i další ligandy, jako jsou hormony. Výsledky takové interakce se projeví jako rychlé biochemické změny v odpovídajících buňkách, jakož i rychlá a dlouho trvající zpětná úprava celulární genové exprese. Některé receptory spolu s různými buněčnými povrchy mohou vázat specifické růstové faktory.

Fosforylování tyrosinových zbytků v proteinech působením tyrosin-kinas jest jednám z klíčových možností, jimiž jsou signály přenášeny přes plasmovou membránu. Některé z běžně známých proteinových tyrosin-kinasových genů zakodovávají transmembránové receptory pro polypeptidové růstové faktory a hormony, jako jsou epidermální růstový faktor (EGF, epiderraal growth factor), insulin, insulinu podobný růstový faktor (IGF-l), růstové faktory založené na destičkách ( PDGF-A a PDGF-B)(platelet derived growth factors) a fibroblastový růstový faktory(FGFs)(fibroblast growth factor), viz Heldin a spol., Cell Regulation 1, 555-566 (1890); Ulrich a spol., Cell 6l, 243-254 (1890). Ve všech jbřípadech se všechny tyto faktory Vyznačují vázat se na extracelulární část jejich spřízněných receptorů, což vede k aktivování vnitřní tyrosin-kinasy, přítomné v cytoplasmové části receptoru. Zvláště zajímavými jsou receptory růstového faktoru endotheliálních buněk, to v důsledku možného zahrnutí růstových faktorů do četných důležitých fyziologických i pathologických postupů, jako je vaskulogenese, angiogenese, atherosklerosa a zánětlivá onemocnění, viz Folkman a spol., Science 235. 442-447;(1987). Také receptory některých hematopoietických růstových faktorů jsou tyrosin-kinasami; to jsou e

• * · · • · * • · · * · · 4 · • 4 ♦

O · 4

-3c-fms, což je receptor kolonově stimulujících faktoru 1, viz Sherr a spol., Cell , 665-676 (1985), a c-kit, receptor primitivního hematopoietického růstového faktoru, viz Huang a spol., Cell 6^, 225-233 (1990).

Kinasy receptorů tyrosinu se dělí do evolučních podskupin na základě charakteristické struktury jejich ekto-oblasti, viz Ullrich a spol., Cell 6l. 243-54 (1990). To těchto podskupin patří kinasa EGP-receptorové obdoby (podtřída I) a a ineulinová, receptorů podobná kinasa (podtřída II), z nichž každá obsahuje opakující se homologní sekvence, bohaté cysteinem v jejich extracelulárních oblastech. Jednoduchá, cysteinem bohatá oblast byla též zjištěn v extracelulárních oblastech eph-obdob kinas, viz Hirai a spol·, Science 238. 1717-1720 (1987); Lindberg a spol., Cell.Biol. 10, 6316-24 (1990); Lhotak a spol.^ol.Cell.Biolo 11, 2496-2502 (1991). PDGF receptory, jakož i c-fms a s-kit receptory tyrosinových kinas lze seskupit do pod třídy III, zatím co PGP receptory tvoří podtřídu IV. Typické je pro všechny členy těchto podtříd: extracelulární vazebné jednotky stabilizují se mezivazebnými disulfidickými vazbami. Tyto tak zvané imunoglobulinové (Ig)-podobné záhyby byly nalezeny v proteinech imunoglobulinové vyšší rodiny, obsahující velké množství dalších jiných povrchověbuněčných receptorů, majících bul ligandy vázané na buňky nebo rozpustné, viz Williams a spol·, Ann.Rev.Immunol., 6, 381-405 (1988).

Receptorové tyrosinové kinasy se líšou svou specifičností a afinitou. Obecně jsou receptorové tyrosinové kinasy glykoproteiny, sestávající z

1) extracelulární oblasti schopné vázat specifický růstový faktor nebo takové faktory,

2) transmembránové oblasti, jež je obvykle J^-spirální částí oblasti proteinu,

3) bezprostředně vedlejší membránové oblasti, kde lze regulovat receptor, například proteinovým fosforylováním,

4) tyrosin-kinasové oblasti, jež je enzymovou složkou receptoru, a

5) karboxylovou funkcí zakončeného konce, který u četných • » ·♦ a a a • · a ·· aa a· » a a o » · aa receptorů je zahrnut do rozpoznávání a vázání substrátu pro tyrosin-kinasu.

Bylo již uvedeno, že postupy, jako je jiná spletení výčnělku nebo jiná volba genového promotoru ®i míst polyadenylování, jsou schopny produkovat několik odlišných polypeptidů z téhož génu. Tyto polypeptidy mohou nebo nemusí obsahoů vat různé oblasti, jak jsou uvedeny zde výše. V důsledku toho může dojít k expresi některých extracelulárních oblastí jako oddělené, vylučované proteiny a některé formy receptorů mohou postrádat oblast tyrosin-kinasy a obsahují pouze extracelulární oblast, vsunutou do plasmové membrány transmembránovou oblastí, navíc pak krátké zakončení s karboxylovou funkcí.

Gén, zakodovévající endotheliální buněčnou transmembránovou tyrosin-kinasu, původně identifikovaný použitím RT-PCR jako neznámý tyrosin-kinasový cDNA homologní fragment z lidských leukemických buněk, byl popsán, viz Partanen a spol. Proč.Natl.Acad.Sci.USA 87. 8913-8917 (1990). Tento gén a jeho zakódovaný protein je označován zkratkou ”TIE” (tyrosine kinase with Ig and EGP homology domains), vifc Partanen a spol., Mol.Cell.Biol. 12, 1698-1707 (1992).

Bylo již zjištěno a popsáno, že tie mRNA je ve všech fetálních a myších erabryonických buňkách, dle zjištění projev tie je lokalizován do kardiálních a vaskulárních endotheliálních buněk. Specificky pak tie mRNA byla lokalizována do endo thelií krevního oběhu a endokardu embryí myší staří 9,5 až

18,5 dnů. Zvýšená exprese tie byla zjištěna během neovaskularizování ve spojitosti s vývojem vaječných folikulů a granulováním tkáně po poraněních kůže, viz Korhonen a spol., Bloood 80, 2548-2555 (1992). Takže bylo .navrhováno předpokládat, že látky typu TIE hrají úlohu v angiogenesi, což je důležité vyvíjení léčení pevných tumorů i dalších onemocnění v závislosti na angiogenesi, jako je diabetická retinopathie, psoriasis, atherosklerosa a arthritida.

• 99

99 9· 99

9 9 9 9 9 · • · 0 ♦ · * « · 0000 0 0 0 0 0 0 999 9999 99 9 9

-5Bylo zjištěno, že dva strukturně příbuzné krysí TIB receptory jsou zakodovávány určitými gény s podobnými profily exprese, Jeden gén, označený tiB-1, je krysí hoinolog lidského tie . Druhý gén, tie-2. může být krysím homologem tek genu, který - podobně jako tie. je u myší předmětem exprese výlučně v endotheliálních buňkách a jejich předpokládaných progenitorech, viz Dumont a spol·, Oncogene 8, 1293-1301 (1993)o Lidský homolog vůči tie-2 byl popsán, viz Žiegler a spolo, U.S.patentový spis 5 447 (860 (05. 09.1995), tamže je označován jako ”ork’’, a na to se zde pro úplnost upozorňuje.

Bylo zjištěno, že oba gény jsou spojeny se značnou expresí do endotheliálních buněk embrýonických a postnatálních tkání. Významné hladiny transkriptu tie-2 jsou rovněž přítomny v dalších populacích embrýonických buněk, čítaje v to epithelium o čenich čoček, srdeční epikgrd a oblasti mesenchymu, viz Maisonpierre a spol., Oncogene 8, 1631-1637 (1993).

Převažující exprese receptorů TIE do vaskulárního ífcndothelia je spojena s názorem, že TIE hraje svou roli při vývoji a údržbě vaskulárního systému. To může zahrnovat roli při determinaci endotheliálních buněk, proliferaci, diferenciaci a buněčné migraci, jakož i vzorkování vaskulárních elementů. Analyzypyších embrií, deficitních z hlediska TIE-2 . dokládají takovou důležitost při angiogenesi, zvláště pak při tvorbě vaskulárního pletiva v endotheliálních buňkách, viz Sáto T.N. a spol., Nátuře 376. 70-74 (1995)«.

Ve vyzrálém vyskulárním systému může hrát TIE a podobné látky svou funkci při přežití endotheliálních buněk, údržbě a odezve na pathogenní vlivy_o

Exprese receptorů TIE je patrná v primitivních, hematopoietických základních buňkách, B-buňkách a podřízených megakariotickýcfc buňkách, z čehož lze odvozovat úlohu ligandů,

I φφ) • φ ' φ · ·

-6které vážou tyto receptory v době časné hematopoiesy, při duferenciaci a/nebo proliferaci B buněk a při megakaryocytickém diferencování celé cest_v, viz Iwama a spol·, Biochem.Biophys.Research Communications 195. 301-309 (1993); dále Hashiyama a spol., Blood 87. 93-101); Batard a spol., Blood 82, 2212-2220 fil996)f.

Původci předkládaného znění předtím již identifikovali angiogenový faktor, ktwrý byl původně označen jako TIB-2 ligand~l (TLI), ale také je uváděn jako angiopoietin-1 (Angl), který vysílá signály prostřednictvím TIE-2 receptoru a má zásadní význam pro normální vaskulární vývoj ^u myší. Homologickým tříděním původci rovněž identifikovali Ang-1 příbuznou složku, označenou jako TIE-2 ligand-2 (TL2) nebo angiopoietin-2 (Ang2), což je přírodně se vyskytující antagonistická forma pro Angl a TIE2 receptor. Pro popis klo nování a sekvencování TLI (Angl) a TL2 (Ang2), jakož i se zřetelem na způsoby jejich přípravy a použití, viz PCT Inter Publ. WO 96/11 269 (18.04.1996) a PCT Inter». Publ. WO 96/31 598 (10.10. 1996), v obou případech Regeneron Pharmaceuticals, lne a Davis S. a spol., Cell 87, Il6l-ll69 (1996) na ty se zde pro úplnost odkazuje. Nepřítomnosti Angl je spo jena s těžkými vaskulárními abnormalitami při vývoji myšího embrya, viz Sun C. a spol., Cell 87. 1171-1180 (1996). Angl a Ang2 dostačují pro přorozeně probíhající kladnou i zápornou regulaci angiogenese. Kladná nebo záporná regulace TIE2 je pravděpodobně spojena s vyústěním do různých vývodů v závislosti na kombinování současně se projevujících angiogenových sugnálů.

• ·· · · * · ·* • t » « · ♦«·«·· • · * · · · · ··· ·« ·····«· ·· ··

7Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je kompozice, obsahující TIB ligand-3 nebo TIE ligand-4 v podstatě bež dalších jiných proteinů. Vynález rovněž popisuje isolování molekuly nukleová kyseliny se zakódovaným TIE-ligandem-3 s isolování nukleová kyseliny se zakódovaným TIE ligandem-4. Isolovanou nukleovou kyselinou může být DNA, cDNA nebo RNA. Vynález rovněž popisuje vektor, obsahující isolovanou nukleovou kyselinu , totiž její molekulu se zakódovaným TIE ligandem~3 nebo TIE ligandem-4. Dále popisuje vynález hostitelský vektorový systém pro produkci ve vhodném hostitelském buněčném prostředí polypeptidů s biologickou aktivitou TIE ligandu-3 nebo TXE ligandu-4. Vhodnou hostitelskou buňkou může být buňka bakteriální, kvasinková nebo savčí či hmyzu. Vynález rovněž popisuje způsob přípravy polypeptidů s biologickou aktivitou TIE ligandu-3 nebo TIE ligandu-4, který se vyznačuje tím,že v

se ponechají růst buňky hostitelského vektorového systému za podmínek, dovolujících produkci polypeptidů a získaní takto vzniklého polypeptidů»

Zde popisovaný vynález isolování nukleová kyseliny se zakódovaným TIE ligandem-3 nebo TIE ligandem-4 popisuje dále vývoj ligandú, jeho fragmentu či derivátu nebo jiné další molekuly, jež je receptorem agonistu nebo antagonistu, a to jako léčebný prostředek pro léčení pacientů, postižených nesnázemi v souvislosti s buňkami, tkáněmi nebo orgány, kde dochází k expresi TIE receptoru. Tento vynález popisuje rovněž protilátku, jež specificky váže takovou therapeuticky účinnou molekulu. Protilátka může být monoklonální nebo polyklonální. Vynález rovněž popisuje způsob použití takové monoklonální nebo polyklonální antilátky k měření množství therapeuticky účinné molekuly ve vzorku, odebraného pacientovi pro účely

• · · · · · · sledování průběhu léčení·

Tento vynález rovněž popisuje protilátku, jež specificky váže TIB ligand-3 nebo TIE ligand-4. Protilátka může být mohoklonální nebi polyklonální. Takže vynález dále popisuje therapeutické kompozice obsahující protilátku, jež specificky váže TIE ligand-3 nebo TIE ligand-4 a farmaceuticky přijatelný nosič. Vynález dále popisuje způsob blokování vzrůstu krevní.ch cév i u savců podáváním účinného množství therapeutické kompozice, obsahující protilátku, jež specificky váže TIE ligand-3 nebo TIE ligand-4, a to ve farmaceuticky přijatelném nosiči.

Dále popisuje tento vynález theraúeutické kompozice, obsahující TIE ligand-3 nebo TIE ligand-4 ve farmaceuticky vhodném nosiči. Dále popisuje tento vynález způsob podporování neovaskularizace pacienta podáváním účinného množství therapeutické kompozice obsahující TIE ligand-3 nebo TIE-ligand-4 ve farmaceuticky vhodném nosiči. Podle jednoho provedení se může postup použít k podporování hojení se poranění, podle dalšího provedebí je postup použitelný při léčení ischemie, a podle ještě dalšího provedení se použije TIE ligand-3 nebo TIE ligand-4, jako takový či v kombinaci s dalšími hernatopoietickými faktory k podporování proliferace nebo diferenciace hematopoietických základních buněk, B buněk nebo megakaryotických buněk.

Dále pak popisuje vynález, že lze konjugov_et TIE ligand-3 nebo THE ligand-4 s cytotoxickým činidlem a therapeutickou kompozicí, z něj připravenou. Takže dále popisuje vynález receptorovou látku, jež specificky váže TIE ligand-3 nebo TIE-ligand-4. Dále popisuje vynález therapeutické kompozice, obsahující receptorovou látku, jež spjecificky váže TIE ligand-3 nebo TIE ligand-4 v farmaceuticky vhodném nosiči. Dále popisuje vybález způsob blokování vzrůstu krevníbh

4

44

4 4 · · 44

4*4 4 ·

4 4

4 4 4

9— cev u savců podáváním účinného množství therapeutické kompozice, obsahující receptorovou látku, jež specificky váže TIE ligand-3 nebo TIE ligand-4, to ve farmaceuticky vhodném nosiči·

Dáihe popisuje vynález antagonisty TIE receptoru, jakož i způsob inhibování TIE ligandu-3 nebo TIE ligandu-4, lépe jeho biologické účinnosti u savců, což záleží v podávání savcům účinného množství antagonisty TIE. Podle tohoto vynálefcu antagoniste# může být TIE ligand-3 nebo TIE ligand-4, jak je zde popisován, protilátka či jiná molekula schopná specificky vázat TIE ligand-3, TIE ligand-4 nebo receptor TIE, nebo li^andovou látku, obsahující fibrinogenu podobnou oblast TIB ligandu-3 nebo TIE ligandu-4.

Krátký popis vyobrazení

Vyobrazení IA a IB TIE-2 receptorová látka (TIE-2 RB) inhibuje rozvoj krevních cév γ embryonové kuřecí chorioallantoinové membráně (CAM). Jediný kousek resorbovatelné žeíatinové pěny (Gelfoam), nasáknutý použitím 6 pg RB se vsune bezprostředně pod CAM den starých embryí kuřat. Po 3 dnech inkubování se vyjmou a testují 4 dny stará embrya a obklopující je CAM.

Vyobrazení 1: embrya, na která se působilo použitím EHK-1 RB (rEHK-1 akto/higGl Pc) byla viditelná a měla normálně vyvinut,© krevní cévy v obklopující CAM.

Vyobrazení IB:všechna embrya po působení TIE-2 RB (r TIE-2 ekto/higGl Pc) byla mrtva, zmenšená co do velikosti a byla téměř zbavena obklopujícími je krevními icévami.

Vyobrazení 2 :

Schematické zbázornění předpokládané úlo• φ

-10φφ ·· • φ φφφ' · φφφ • Φ φφφφ 1 φ φ φ <

φφφφφ Φ· φφ hy ΤΙΒ-2/ΤΙΕ ligandů v angiogenesi, TLI je označován jako (*), TL2 jako (⁺), TIE-2 označením (T), VEGP označením (II) a fik-1 (VEGP receptor je označován jako (V).

Vyobrazení 3: Diagramové znázornění TIE-2 ligandů, ukazující svinutý závitek” a fibrinogenu-podobnou oblast, a sestavování multimerů fibrinogenu-podobné oblasti za použití protilátek proti raye-tagům jakož i Pc špiček.

Vyobrazení 4: Typická křivka TIE-2-lgG po vazbě na imobilizovaný TLI v kvantitativním pokusu vazby prosté buněk.

Vyobrazení 5: Typická křivka, znázorňující vázání TIE-2ligandu 1 ligandové látky, obsahující fibrinogénuTpodobnou oblast ligandu ve vazbě na Pc oblast IgG (TLl-fPc) na imobilizovanou TIE-2 ektooblast v kvantitativním pokusu vazby prosté buněk.

Vyobrazení 6A-6B Nukleotidové a dedukované sekvence aminokyselin (jednoduchý kod) TIE ligandu-3. Kódovací sekvence začíná v poloze 47 · Pibrinogenu podobná oblast začíná v poloze 929,

Vyobrazení li Porovnání sekvencí aminokyselin členů skupiny TIE ligahdů.

mAng3 = mTL3 = myší TIE ligand-3 hAng4 = hT14 = lidský TIE ligand-4 hAngl = hTLl = lidský TIE-2 ligand, mAngl « mTLl = myší TIE-2 ligand 1, mAng2 = mTL2 % myší TIE ligand 2 hAng2 % h TL2 = lidský TIE-2 ligand 2, Podškrtnuté oblasti značí zachované oblasti homologie mezi členy skupiny.

Vyobrazení 8A-BC Nukleotidy a dedukované aminokyseliny se sekvencemi (jednoduchý kod). Šipky'značí polohu 569 nukleotidu.

Podrobný popis vynálezu

Jak je to popisováno zde ještě dále detailněji, isolovali a identifikovali původci nové ligandy příbuzné TIE-2 ligandům, které se vázají na TIE-2 reeeptor. Nové ligandy, které

44 44

-114 · • 4

4 4

4

lze získat vyčistěním přírodních látek nebo připravit rekombinantne, jsou zde označovány jako TIE ligand-3 (TL3) a TIE ligand-4 (TL4). Další členové rodiny TIE ligandů jsou zde označovány jako TIE_2 ligand- 1 (TLI), rovněž známý pod označením angiopoletin-1 (Angl) a TIE-2 ligand 2 (TL2), rovněž známý jako angiopoietin-2 (Ang2).

Původci zde popisují rodinu TIE ligandů a identifikovaní zachované oblasti homologie mezi členy rodiny.. Očekává se tedy, že nové ligandy TL3 a TL4 budou mít funkce a použitelnost podobné vlastnostem ligandů známých íTLl (Angl) a TL2 (Ang2) v oblasti angiogenese a hematopoiesis.

Tento vynález zahrnuje nové ligandy a sekvence jejich aminokyselin, jakož i funkčně rovnocenné varianty těchto se zahrnutím přírodních allelických variací, jakož i proteiny nebo peptidy, obsahující substituce, opomenutí nebo mutanty po vsunutí výše uvedených sekvencí, které vázají TIE receptor a působí jako agonisti nebo antagonisti téhož.

Takové varianty zahrnují . ty, kde zbytkem aminokyseliny je substituován zbytek v sekvenci v důsledku tiché záměny. Tak například jeden či více aminokyselinových zbytků v sekvenci se může substituovant jinou aminokyselinou či jinými aminokyselinami podobné polarity, které se použijí jako funkční ekvivalent v důsledku tiché záměny.

Substituenty aminokyseliny uvnitř sekvence lze zvolit z dalších členů skupiny, kam aminokyselina patří. Tak například skupinu nepolárních (hydrofobních) aminokyselin tvoří alanin, leucin, isoleucin, valin, prolin, fenylalanin, tryptofan _s methionin. Skupina polárních neutrálních aminokyselin zahrnuje glycin, serin, threonin, cystein, tyrosin, asparagin a glutamin. Kladně nabité (bázické) aminokyseliny jsou arginin, lysin a histidin. Mezi negativně nabité (kyselé) aminokyseliny nutno zařadit kyseliny asparagovou a glutamovou

-12·· ΦΦ • Φ Φ · • ♦ ΦΦ «ΦΦΦ · • Φ Φ • Φ ΦΦ

Zahrnuty do rozsahu tohoto vynálezu jsou proteiny nebo jejich fragmenty či deriváty, vyznačující se stejnou nebo podobnou biologickou aktivitou jako TIS ligand-3 nebo TIE ligand-4, popisované zde, a deriváty, které jsou různě modifikované během nebo po přenosu, například glykosylováním, proteolytickým štěpením, vázáním na molekulu protilátky nebo jiný buněčný ligand atd. Funkčně rovnocenné molekuly zahrnují rovněž molekuly, které obsahují modifikace, čítaje v to. modifikace N—koncovky, což je důsledkem exprese v částečně rekombinantním hostiteli, jako je tomu například u N-koncové methylace, k čemuž dochází v některých bakteriálních expresních systémech (například E.coli). Funkční obdoby zahrnují rovněž mutanty, kde aminokyselinové substituce jsou určeny pro cysteinové molekuly k zvýšení stability eelé molekuly se zřetelem na prevenci nežádoucího zesítění.

Tento vynález zahrnuje rovněž nukleotidové sekvence, jež zakodovávají protein, popisovaný zde jako TIE ligand-3, dále nukleotidové sekvence, které zakodovávají protein, popisovaný zde jako TIE ligand-4, jakož i hostitelské buňky, počítaje v to v

kvasinky, bakterie, viry a savčí buňky, které jsou geneticky směrovány, aby produkovaly protein, například transfekcí, transdukcí, infekcí, elektroporací nebo nikroinjekcemi nukleové kyseliny se zakódováním TIE ligandu-3 nebo TIE ligandu-4, jak jsou zde popisovány vždy ve vhodném expresním vektoru.

Tento vynález rovněž zahrnuje zavádění nukleové kyseliny se zakódovaným TIE ligandem-3 nebo TIE ligandem-4 postupem genové therapie, jak je to popisováno, viz například Finkel a Epstein, FASEB Jo 843-851 (1995); dále C-uzman a spol.,

PNAS (USA) 91, 10 732-10 736 (1994).Obeznámený na tomto úseku rovněž zjistí, že tento vynález zahrnuje DNA a RNA sekvence s hybridizací na odvozené sekvence, zakodovávající TIE ligand-3 a TIE ligand-4, to za podmínek střední přísnosti, viz například Sambrook a spol., Molecular Cloning, A Laboratory Aamual, 2.vyd., sv.l, str.

101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Takže molekula nukleové kyseliny, zahrnutá do rozsahu tohoto vynálezů, zahrnuje i molekulu, jež má sekvenci odvozenou od sekvence aminokyseliny TIS ligandu-3 a TIE ligandu-4, příprava viz zde výše, jakož i mulekulu, mající sekvenci nukleových kyselin s hybridizaci na takovou sekvenci nukleové kyseliny, a také takovou sekvenci nukleové kyseliny, jež degeneruje s přihlédnutím k výše uvedeným sekvencím v důsledku genetického kódu, ale zakodovává ligand, který váže TIE receptor a má sekvenci aminokyselin a dalších primárních, sekundárních i terciárních charakteristik, jež dostatečným způsobem duplikují zde popisovaný ligand, takže udílejí molekule stejnou biologickou aktivitu, jako zde popisované TIB ligand-3 a TIE ligand-4.

Podle toho zahrnuje tento vynález isolovanou i čištěnou molekulu nukleové kyseliny, obsahující sekvenci zakodovávající savčí TIE ligand-3, kde se nukleotidová sekvence volí ze skupiny, sestávající z:

(a) nukleotidové sekvence, obsahující kódovací oblast TIE ligandu-3, jak je to patrné z vyobr. 6A-6B;

(b) nukleotidové sekvence, obsahující kódovací oblast fibrinogenu podobné oblasti TIE ligandu-3, jak je to patrné z vyobr. 6A_T6B, (c) nukleotidové sekvence s hybridizaci za mírně přísných podmínek na nukleotidové sekvence (a) a (b) a zakodovávající ligand, který váže TIE receptor, a (d) nukleotidové sekvence, které - ale v důsledku degenerace genetického kódu - by se hybridizovaly na nukleotidové sekvence (a), Cb) nebo (c) a které zakodovávají ligand, vázající TIE receptor.

Tento vynález dále popisuje isolovaný a čištěný TIE ligand-3 zakódovaný isolovanou molekulou nukleové kyseliny • · • BBBB

·· ΒΒ • Β Β Β Β Β ΒΒ • ΒΒΒ· Β • Β Β • Β «Β dle tohoto vynálezu. Vynález se dále týká vektoru, který zahrnuje isolovanou molekulu nukleové kyseliny, obsahující sekvence nukleové kyseliny zakodovávající savčí TIE ligand-3.

Podle toho zahrnuje tento vynález isolovanou a čištěnou molekulu nukleové kyseliny, obsahující sekvenci zakodovávající savčí, tedy lidský TIE ligand-4, kde se nukleotidová sekvence volí ze skupiny, sestávající z (a) sekvence nukleové kyseliny, zahrnující kódovací oblast lidského TIE ligandu-4, obsaženého ve vektoru, označeném jako hTL-a, který byl uložen 02.07.1996 (ATCC Accession Mo

095), (b) sekvence nukleotidu, zahrnující kódovací oblast fibrinogenu podobné oblasri TIE ligandu-4, obsaženém ve vektoru s označením hTL-4 s uložením 02.07.1996 (ATCC Accession Mo 98 095), (c) sekvenci nukleotidu , hybridizující za středně přísných podmínek na nukleotidové sekvence (a) nebo (b), a zakodovávající ligand, který váže TIE receptor, a (d) sekvence nukleotidu, který - ale pro degeneraci genetického kódu - by se hybridizoval na nukleotidové sekvencq (a), (b) nebo (c) a který zakodováva ligand, který váže TIE receptor.

Tento vynález zahrnuje dále isolovanou a čištěnou molekulu nukleové kyseliny, obsahující nukleotidové sekvence zakodovávající lidský TIE ligand-4, kde sekvence nukleotidu je zvolena ze skupiny, sestávající z (a) nukleotidové sekvence, zakodovávající kódovací oblast lidského TIE ligandu-4, jak je to patrné z vyobr.

8A-8C, (b) nukleotidové sekvence, zakodovávající kódovací oblast fibrinogenu podobné oblasti lidského TIE ligandu-4, jak je to patrné z vyobr. 8A-8C, • · • · · · · ·· « · 4 • · 4 ·· ··

-15(c) nukleotidové sekvence, hybridizující za mírně přísných podmínek na nukleotidové sekvence (a) a (b) a zakodovávající ligand, který váže TIE receptor, a (d) nukleotidové sekvence, které - ale pro degeneraci genetického kódu by se hybridizovaly na nukleotidové sekvence (a), (b) nebo (c) a zakodovávající ligand, který váže TIE receptor.

Tento vynález dále zahrnuje isolovanou a čištěnou molekulu nukleové kyseliny, obsahující nukleotidovou sek-r věnci zakodovávající lidský TIE ligand-4, kde nukleotidové sekvence je zvolena ze skupiny, kterou tvoří (a) nuklefetidová sekvence, zahrnující kódovací oblast lidského TIB ligandu-4, jak patrno z vyobr. 8A-8C, (b nukleotidové sekvence, obsahující kódovací oblast fibri nogenu podobné oblasti lidského TIE ligandu-4, jak je to patrné z vyobr, 8A-8C, (c) nukleotidová sekvence, hybridizující se za středně přísných podmínek na nukleotidovou sekvenci (a) nebo (b) a jež zakodovává ligand, který váže TIE receptor, a (d) nukleotidová sekvence, jež v důsledku degenerace genetického kódu, se liší od nukleotidové sekvence (a), (b) nebo (c) a jež zakodovává TIE-2 ligand, který váže TIE-2 receptor.

Tento vynález zahrnuje dále isolovaný a čištěný TIE ligand-4, zakódovaný isolovanou molekulou nukleové kyseliny dle tohoto vynálezu. Vynález se dále týká vektoru, obsahujícího isolovanou molekulu nukleové kyseliny se sekvencí nukleové kyseliny, zakodovávající lidský TIE ligand-4.

Jakýkoli ze způsobů, jak jsou obeznámeným na tomto úseku známé pro vsunutí fragmentu DNA do vektoru se může použít pro konstruování expresních vektorů, zakodovávajících TIE ligand-3 nebo TIE ligand-4 za použití vhodných transkripčně/translačních kontrolních signálů a kódováním proteinových sekvencí.

-16« ·· · fefe ·· ·· • · · · ··· · · · · fe •fefe · fefe··· • fefefe · fefe fefefe · · fefefe fefe fefefe •fefe fefe fefefe ···· fefe fefe

Tyto postupy mohou zahrnovat in vitro rekombinaci DNA a syntetické postupy, a in vivo rekombinace (genetické rekombinace). Expresi sekvence nukleové kyseliny se zakódovaným ΤΙΞ ligandem-3 nebo TIE ligandem-4 nebo jejich peptidové fragmenty mohou být regulovány druhou sekvencí nukleové kyseliny, jež je operativně vázána na TIE ligand-3 nebo TIE ligand-4 se zakódovanou sekvencí tak, že dojde k expresi proteinu Či peptidu s TIE ligandem-3 nebo TIE ligandem-4 v hostiteli za transformace rekombinantní DNA molekulou. Tak například lze kontrolovat zde popisovanou expresi TIE ligandu-3 nebo TIE ligandu-4 kterýmkoli promotorským či podporujícím elementem, jak jsou na tomto úseku známé. Promotory, jichž lze využít při kontrole exprese ligsndu zahrnují, ale bez jakéhokoli omezování: dlouhou opakující se koncovku, viz Squinto a spol., Cell 65., 1-20 (1991); SV40 včasnou píomotorskou oblast, viz Bernoist a Chambon, Nátuře 290, 304-310;

CMV promotor, M-MulV 5opakující se koncovku, promotor, obsažený v 3 'dlouhé opakující se koncové jednotce viru Rous sarkoma, viz Yamamoto a spol., Cell 22, 787-797 (1980), promotor herpes-thymidin-kinasy, viz Wagner a spol., Proc.Natl.Acad.Sci.USA,

78, 144-1445 (1981), promotor adenoviru, regulační sekvence metallothioneinového genu, viz Brinster a spo., Nátuře 296,

39-42 (1982), prokaryotické expresní vektory, jako je B-laktamasový promotor, viz Villa-Kamaroff a spol., Proc.Natl.Acad. Sci.USA 75, 3727-3731 (1978),, nebo promotor tac, viz DeBoer a spol., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80, 21-25 (1983), viz též Useful proteáns from recombinant bacteria” v Scientific American 242, 74-94 (1980)£ promotorové elementy z kvasinek či jiných hub, jako je Gal 4 promotor, ADH (alcohol dehydrogenase) promotor, PGK (phosphoglycerol kinase) promotor, promtor alkalické fosfatasy a další živočišné transkripční kontrolní oblasti, které se vyznačují tkáňovou specifičností a byly použity u transgenických živočichů; kontrolní oblasti ·· • · ·· ·

• · · ·· *·

-17elastase 1 genu s aktivitou v pankreatických acinárních buňkách, viz Swift a spol., Cell 38. 639-648 (1984), Ornitz a spol., Cold Spring Harbor Symp. Quant.Biol. 50. 399-409 (1986), MacDonald, Hepatology 425-515 (1967), oblast insulinové genové kontroly, jež je aktivní v pankreatických py. -buňkách, viz Hanahan, Nátuře 315, 115-122 (1985), imunoglobulinovou genovou kontrolní oblast, která je aktivní v lymfoidních buňkách, viz Grosschedl a spol., Cell 38, 647658 (1984), Adames a spol., Nátuře 318. 533-538 (1985), Alexander a spol., Mol.Cell.Biol. 2., 1426-1444 (1987), kontrolní

spol., Cell 45, 485-495 (1986), albumihovou genovou kontrolní oblast, jež je aktivní v játrech, viz Pinkert a spol.,

Genes and Devel 1, 268-278 (1987) , X-fetoproteinovou genovou kontrolní oblast, jež je aktivní v játrech, viz Krumlauf a spol., Mol.Cell.Biol. 1639-1848 (1985), dále Hammer a spol.,

Science 235. 53-55 (1987), JL-l-antitrypsinovou genovou kontrol ní oblast, jež je aktivní v játrech, viz Keisey a spol., Genes and Devel 1, 161-171 (1987), -globinovou genovou kontrolní oblast, jež je aktivní v myeloidních buňkách, viz Mogram a spol., Nátuře 315. 338-340 (1985), Kollias a spol., Cell 48, 89-94 (1986), myelinovou bazickou proteinovou genovou kontrolní oblast, jež je aktivní v oligódendrocytěch mozku, viz Readhead a spol., Cell 48, 703-712 (1987)^yosinovou 2 genovou kontrolní oblast s lehkými řetězci, jež je aktivní ve skeletálním svalstvu, viz Shani, Nátuře 314. 283-286 (1985) a gonadotropní genovou kontrolní oblast uvolňování hormonu, jež je aktivní v hypothalamu, viz Mason a spol., Science 234. 1372-1378 (1986). Vynález dále zahrnuje produkci protichůdných sloučenin, které jsou schopny se specificky hybridizovat na sekvence RNA zakodovávající TIB ligand-3 nebo TIB ligand-4 s modulováním jejich exprese, viz Ecker, US patentový spis 5 166 195 (24.11*1992).

• 0

0 0 0 • · • ·

-18Takže podle tohoto vynálezu se expresní vektory, schopné replikace v bakteriálních nebo eukaryotických hostitelích, obsahující nukleovou kyselinu zakodovávající TIB ligand-3 nebo TIE ligand 4, jak to bylo zde popsáno, používají k transfikaci na hostitele a tím k přímé expresi takových nukleových kyselin k produkování TIB ligandu-3 nebo TIB ligandu-4, které pak lze získat zpět v biologicky aktivní formě. Výraz biologicky aktivní forma, jak se zde používá, zahrnuje formu schopnou vázat receptor TIB a způsobit tak biologickou odezvu, jako je odlišující v

se funkce nebo ovlivnění phenobypu buňky s expresí receptoru. Takové biologicky aktivní formy zahrnují například ty, které indukují fosforylování oblasti tyrosin-kinasy receptoru TIE. Jinak biologickou aktivitou může být účinek formou antagonistu na receptor TIB₀ Při jiném provedení je aktivní formou TIB ligandu-3 nebo TIB ligandu-4 taková, jež může rozpoznat receptor TIB a může tedy působit jako cílové činidlo pro akceptor při použití jak při diagnostikování, tak při léčení.

Ve shodě s takovými provedeními aktivní forma nemusí nijak působit na buňky s expresí TIB, aniž způsobí jakoukoli změnu phe no typu.

Expresní vektory, obsahující takové génové vsuvky, lze identifikovat čtyřmi obecnými postupy:

(a) hybridizaci DBA-DNA ( b) přítomností či nepřítomností značené části v g=nové funkci, (c) expresí vsunutých sekvencí, a ( d) důkazem PCR.

Při prvém z postupů se přítomnost:', cizího genu, vsunutého do expresního vektoru může zjistit hybridizaci DNA-DNA za použití vzorků, obsahující^v'sekvence, které jsou homologní k vsunutým TIB-ligandům-3 nebo TIE ligandům-4 zakodovávajícího génu. Při druhém postupu lze zjistit rekombinantní systém vektor/hostitel se selekcí založenou na přítomnosti či nepřítomnosti určiitých značených částí genových funkcí (například thymidin-kinasové aktivity, vzdorování antibiotikům, transformačního phenotypu, tvorbou akluzních částí baculoviru atd), _což j_e způsobeno vsunutím cizích génů do vektoru.

-19»♦ * · * ·· • » · • · · « c · · · ) · · « » · · · • · · · · • · · ·· ··

Tak například je-li nukleová kyselina se zakódovaným TIE ligandem-3 nebo TIE ligandem-4 vsunuta do značené genové sekvence vektoru, lze rekombinanty obsahující vsunutou část identifikovat dle nepřítomnosti značené genové funkce.

Při třetím postupu lze identifikovat rekombinantní expresní vektory testováním cizího genového produktu, který byl získán expresí působením rekombinantu. Takové testy mohou být založeny například na fyzikálních nebo funkčních vlastnostech TIE ligand-3 nebo TIE ligand-4-ového génového produktu, například vazbou ligandu na TIE receptor nebo jeho část, jež může být značena například zjistitelnou protilátkou nebo její částí nebo vazbou protilátek produkovaných proti TIE ligand-3 nebo TIE ligand-4 proteinu či odpovídající části. Buňky dle tohoto vynálezu mohou přechodně, nebo a to s výhodou nepřetržitě a stále exprimovat TIE ligand-3 nebo TIE ligand-4, jak to zde bylo popsáno.

Při čtvrtém postupu se mohou připravit priméry DNA nukleotidů, odpovídající tie-specifické DNA sekvence. Tyto priméry se pak mohou použít jako PCR fragmentu .lie-genu. viz PCR Protoools: A Guide To Methods and Applications,vyd,Michael

A.Innis a spol., Acad.Press (1990),

Rekombinantní ligand se může čistit jakýmkoli způsobem, který se hodí pro následnou tvorbu stabilního, biologicky aktivního proteinu, S výhodou se ligand se může čistit jakýmkoli způsobem, který dovoluje následnou tvorbu stabilního, biologicky aktivního proteinu. S výhodou se ligand vyloučí do prostředí kultury, ze které byl izolován. Jinak se ligand může získat z buněk at již jako rozpustný protein, nebo inkluzní útvar, ze kterého se může extrahovat kvanťitativnš 8 M roztokem hydrochloridu guanidinu a dialysou ve shodě s jinak známými postupy. Pro případné další čistění ligandu se může použít afinitní chromátografie, běžná iontoměničová chromatografie,

O Β Β • · • β • ΒΒΒ Β ΒΒΒΒ Β Β ΒΒΒ

Β ΒΒΒΒ ΒΒ Β ·

-20hydrofobní interakční chromatografie, chromatografie v reverzní fázáviá gelová filtrace.

Podle dalšího provedení tohoto vynálezu, jak je to ještě podrobněji popsáno v příkladech,se rekombinantní gen se zakódovaným TIB ligandem-3 nebo TIE ligandem-4 může použít k desaktivování vyřazeného endogenního génu homologní rekombinaci, takže tím vznikne buňka, tkáň či živočich postrádající TIB ligand-3 nebo TIE ligand-4. Tak například - ale bez jakéhokoli omezování - se může rekombinantní TIE ligand-3 nebo ligand-4 v zakódovaném génu ovládat takm že obsahuje vsunutou mutaci, nepříklad neo-Gén, který deaaktivuje přírodní gen, zakodovávající TIE ligand-3 nebo TIE ligand-4. Takový útvar lze pod kontrolou vhodného promotoru zavést do buňky, jako je embryonická stvolová buňka postupem, jako je transfekce, transdukce nebo injekce. Buňky s obsahem tahového útvaru se mohou vyznačovat G418 resi^tencí. Buňky postrádající nedotčený gen, zakodovávající TIE ligand-3 nebo TIE ligand-4 lze potom identifikovat, například použitím Southern blotting, detekcí PCR, Northern blotting” nebo testováním exprese,, Buňky, postrádající nedotčený gén zakodovávající TIE ligand-3 nebo TIB ligand-4 se mohou potom napojit na buňky mladého embrya za generování transgenových živočichů, postrádajících takový ligand. Takový živočich se dá použít k definování specifických postupů in vivo, normálně závislých na ligandu.

Tento vynález se také týká protilátek vůči zcle popisovaným TIE ligandu-3 a TIE ligandu-4, což je použitelné při detegování ligabdu třeba při diagnostických aplikacích. Při přípravě monoklonálních protilátek, směrovaných proti TIE ligandu-3 a TIE ligandu-4, se může použít jakýkoli technický postup, vyhovující pro,produkci molekul protilátky v nepřetržité linii buněk v kultuře. Tak například hybridomní postup, který původně popsal Kohler a Milstein, Nátuře 256, • ·

495-497 (1975), jakož i triomový postup, tedy hybridomní v

postup s lidskými B-bunkami, viz Kozbor a spol., Immunology Today £, 72 (1983) a EBV-hybridomní postup za vzniku lidských monoklonálních protilátek, viz Góle a spol. v Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy”, Alan R.Lis, lne. str.77-96 (1985) a podobné postupy spadají do rozsahu tohoto vynálezu.

Monoklonálními protilátkami mohou být lidské monoklonální protilátky nebo chimerní lidsko-myší (či jiného druhu) monoklonální protilátky. Lidské monoklonální protilátky se mohou připravit některým z četných postupů, jak jsou na tomto úseku známé, viz například Teng a spol., Proč. Nati.Acad.Sci.USA 80.7308-7312 (1983), dále Kozbor a spol., Immunology Today 4, 72-79 (1983), Olsson a spol., Meth. Enzymol. 92, 3-l6 (1982). Molekuly chimerních protilátek lze připravit s oblastí, obsahující myší antigenovou vazbu s lidskou konstantní oblastí, viz Morrison a spol., Proc.Natl-»Acad₀Sci.USA 81, 6851 (1984), Takeda a spol.,

Nátuře 314. 452 (1985)»

Různé postupy známé na tomto úseku se mohou použít pro produkci polyklonálních protilátek na epitopy TIE ligandu-3 a TIE ligandu-4, zde popisovaných. Při produkci protilátky lze četná hostitelská zvířata, počítaje v to - ale bez jakéhokoli omezování - králíky, myši a krysy, imunizovat injekcí TIE ligandu-3 nebo TIE ligandu-4, nebo odpovídajícího fragmentu Či derivátu» Mohou se použít četná adjuv.ancia pro zvýšení imunologické odezvy, to v závislosti na druhu hostitele, se zahrnutím - ale bez jakéhokoli omezování - Preundova (kompletního či nekompletního), minerálních gélů, jako je hydroxid hlinitý, povrchově aktivních látek, jako je lysolecithin, pluronických polyolů, polyaniontů, peptidů, olejových emulzí, klíčových hemocyaninů, dinitrofenol a potenciálně použitelná lidská adjuvancia, jako • 9 • 4 4

44 ·· • 4 · · · • · 4 4 4 * 4 · 4 4 4 • ft · 4

444 44 44

-22 — jest BCG (Bacille Calmette-Guerin) a Corynebacterium pervum«

Molekulární klon protilátky na zvolený epitop TIE ligandu-3 nebo TIE ligandu-4 se připraví znýnými postupy. Rekombinantní DNA metodologie, viz napříklaf Maniatis a spol., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratosy, Cold Spring Harbor. New York, se může použít pro konstrukci sekvencí nukleová kyseliny nebo antigenovou vaznou oblast tamže.

Vynález se týká také molekul protilátek, jakož i fragmentů takových molekul protilátek. Fragmenty protilátek, obsahujících idiotyp molekuly, lze generovat známými postupy,, Tak například zahrnují takové fragmenty - ale bez jakéhokoli omezování- fragment FCab*)^, který se dá připravit z molekuly protilátky digescí s pepsinem, dále fragmenty Fab^z, které se mohou generovat redukováním disulfidických můstků fragmentu Fíab*^, a fragmenty Fab, které lze generovat z molekuly protilátky reakcí s papainem _θ redukujícím činidlem. Molekuly protilátky lze čistit známými postipy, například imunoabsorpcí nebo imunoafinitní chromatografií, chromatografickými postupy, jako je vysokotlaková kapalinová chromatografie) či jejich kombinace.

Tento vynález dále zahrnuje imunotesty pro zjištění množství TIE ligandu-3 nebo TIE ligandu-4 v biologickém vzorku tak, že se (a) biologický vzorek uvede do styku s nejméně jednou protilátkou, jež specificky váže TIE ligand-3 nebo TIE ligand-4 tak, že protilátka vytvoří komplex s jakýmkoli TIE ligandem-3 nebo TIE ligandem-4, přítomným ve vzorku, a (b) zjistí se měřením množství komplexu a tím se i zjistí množství TIE ligandu-3 nebo TIE ligandu-4 v biologickém vzorku.

*« « ·· ·· ··· · · · · · · • · · « · · · ··· · · ··· · « ··· ··# ·· ··· ···· ·· ··

-23Vynález dále zahrnuje test měření množství TIB receptoru v biologickém vzorku tak, že se (a) biologický vzorek uvede do styku s nejméně jedním ligandem dle tohoto vynálezu tak, že ligand vytvoří s TIE receptorem komplex, a (b) zjistí se měřením množství komplexu a tím se i zjistí množství TIE receptoru v biologickém vzorku.

Dále se tento vynález týká použitelnosti TIE ligandu-3 a TIB ligandu-4 k podpoře přežití a/nebo růstu a/nebo migrace a/nebo diferenciace buněk s expresí TIE receptoru. Takže ligand se může použít jako dodatek k podkladu, na příklad do endotheliálních buněk v kultuře.

Dále pak zjištění původců vynálezu ve smyslu dalších ligandň pro TIE receptor umožňuje použitelnost testovacího systému pro identifikování agonistů nebo antagonistů TIE receptoru. Takový systém testů by byl použitelný při identifikování molekul, schopných promovat nebo inhibovat angiogenesi. Například podle jednoho provedení mohou být antagonisti TIE receptoru identifikováni jako testované molekuly, které jsou schopny rušit interakci TIB receptoru s biologicky aktivním TIE ligandem-3 nebo TIE ligandem-4. Takoví antagonisfck se dají identifikovat jejich schopností

1) blokovat vázání biologicky aktivního TIE ligandu-3 nebo TIE ligandu-4 na receptor za měření - například - použitím technologie BIAcore biosensor (BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ), nebo

2) blokovat schopnost biolggicky aktivního TIE ligandu-3 nebo TIE ligandu-4 způsobit biologickou odezvu. Takové biologické odezvy zahrnují - ale bez jakéhokoli omezování - fosforylování TIE receptoru nebo složek směrem dolů od cesty převodu TIE signálu, nebo přežití, růst nebo diferencování buněk s TIE receptorem.

• · • · • · • · • ·· • · • ··· · • · • 9

-24Podle jednoho z provedení mohou být buňky, řízené na expresi TIE receptorů, závislé z hlediska růstu na přidání TIE ligandu-3 nebo TIE ligandu-4. Takové buňky představují použitelný testovací systém pro identifikování dalších agonistů TIE receptorů, nebo antagonistů schopných rušit aktivitu TIB ligandu-3 nebo TIE ligandu-4 na takových buňkách.

Dále pak autokrinní buňky, řazené tak, aby byly schopny současné exprese jak obou TIB ligandu-3 a receptorů, nebo TIE ligandu-4 a receptorů, mohou poskytnout použitelný systém pro testování potenciálních agonistů nebo antagonistů.

Takže tento vynález popisuje zavádění TIE receptorů do buněk, kde normálně nedochází k expresi tohoto receptorů, takže umožňují těmto buňkým, aby se vyznačovaly hlubokými a snadno rozlišitelnými odezvami na ligand, který váže tento receptor.Typ vyvolané odezvy záleží na použité buňce, nikoli v

na specifickém receptorů, zavedeném do buňky. ¥hofiné buněčné linie se mohou zvolit, aby vyvolaly odezvu s největší použitelností pro testování, jakož aby odkryly molekuly, které mohou působit jako receptory tyrosin-kinasu. Mohou to být molekuly jakéhokoli typu se zahrnutím - ale bez omezení molekul peptidů a ne-pieptidů, které budou působit v systémech, které budou popsány formou specifického receptorů.

Jeden z použitelnějších systémů, který se má sledovat, se týká zavádění TIE receptorů (nebo chimérního receptorů, obsahujícího extracelulární oblast jiného receptorů tyrosinkinasy, jako je například trkC a intracelulární oblast TIB receptorů) do fibroblastové buněčné linie (například buněk MIH3T3), takže takový receptor, který normálně se neprojevuje jako proliferativní nebo s jinými dalšími odezvami, může být po zavedení do fibroblastů klidně testován četnými z dobře známých postupů ke kvantitativnímu vyhodnocení fibroblastového růstového faktoru, například vsunutím thymidinu či dalšími proliferativních testů, viz Zoelen The Use of Biological • · • 9 • · • ·

-25Assays For Betection Of Polypeptide Growth Factors” v Progress Factor Research, sv.2, str.131-152, dále Zhan a M. Goldfarb, IvIoloCell.Biol. sv.6, str. 3541-3544 (1986). Tyto testy jsou spojeny s výhodou, že jakýkoli přípravek může být testován jak na buněčné linii se zavedeným receptorem, tak i na paralelní buněčné linii postrádající receptor. Posuzují se pouze specifické efekty na buněčné linii s receptor em, jako kdyby byly zprostředkovány zavedeným receptorem.

Takové buňky mohou být dále řízeny k expresi TIE ligandu-3 nebo TIE ligandu-4, takže vznikne autokrinní systém, použitelný pro testování molekul, které působí jako antagonisti/agonisti dle tohoto vynálezu. Takže tento vynález se týká hostitelských buněk, obsahujících TIE ligand-3 nebo TIE ligand-4, zakódované v nukleové kyselině a TIE receptor, zakódovaný v nukleové kyselině.

Interakce TIE receptor/TIE ligand-3 nebo TIE ligand-4 skýtá systém, použitelný pro identifikování malých agonistických či antagonistických molekul TIE receptoru. Například fragmenty, mutanty nebo deriváty TIE ligandu-3 nebo TIE ligandu-4 lze identifikovat, pokud poutají TIE receptor, ale nappivádějí jakoukoli další biologickou aktivitu. Jinak řečeno charakterizování TIE ligandu-3 nebo TIE ligandu-4 umožňuje určit aktivní díl molekuly. Dále pak identifikování ligandu umožňuje stanovení krystalové struktury komplexu receptor/ligand použitím paprsků X, což umožňuje identifikování místa vazby na receptoru. Znalost místa vazbv je spojena s užitečným náhledem do racionálního znaku novýhh agonistů a antagonistů. Specifická vazba testované molekuly na TIE receptor se může vyhodnotit početnými-způsoby. Tak napříkla aktuální vazbu testované molekuly na buňky s expresí TIE je možno zjistit a změřit detekcí nebo měřením (i) testované molekuly vázané na povrch intaktních buněk, • · · · • · · · ·

-26(ii) testované molekuly zesítěné vázané na TIE protein v buněčných lysatech, nebo (iii) testované molekuly vázané na TIE in vitro. Specifickou interakci mezi testovanou molekulou a TIE lze vyhodnotit použitím reagujících složek, vyznačujících se jednoznačnými vlastnostmi při takové interakci.

Jako specifický, ale nijak neomezující příklad postupu dle tohoto vynálezu lze uvést tento: uvažujeme případ, kdy TIE ligand-3 nebo TIE ligahd-4 ve vzorku se má změřit. Různá zředění vzorku (testované molekuly) paralelně s negativní kontrolou (NC) bez obsahu TIE ligandu-3 nebo TIE ligandu-4 a jejich aktivity, a pozitivní kontrolou (PC), obsahující známé množství TIE ligandu-3 nebo TIE ligandu-4 se mohou exponovat do buněk s expresí TIE za přítomnosti zjistitelně značeného TIE ligandu-3 nebo TIE ligandu-4 (v tomto případě jde o rádiojodovaný ligand). Množství TIE ligandu-3 nebo TIE ligandu-4 v testovaném vzorku lze vyhodnotit stanovením množství ^^I-značeného Tie ligandu-3 nebo ^5i„_zn8čeného TIE ligandu-4, které se váže na kontrolní vzorky a v každém ze zředění s následným porovnáním hodnot vzorku se standartní křivkou. Čím více je ve vzorku TIE ligandu-3 nebo TIE ligandu-4, tím méhě _ge váže na TIB.

Množství vázaného ^5-j· xj__ganau se může stanovit měřením podílu radioaktivity na buňku, nebo zesítěnou vazbou TIE ligandu-3 nebo TIE liganáu-4 na proteiny buněčného povrchu za použití DSS, jak to popsali Meakin a Shooter, Neuron 6, 153163 (1991) a stanovením množství značeného proteinu v buněčných extraktech za použití například SDS polyakrylalidové gélové elektroforesy, jež může odkrýt značený protein velikosti odpovídající TIE receptor/TIE lidandu-3 nebo TIE receptor /TIE ligandu-4.

Specifický test interakce mulekula/ΤΙΞ lze dále upřesnit přidáním do vzorků různých zředění neznačeného kontrolního ligandu, který neváže TIE receptor a nemá tudíž mít postatnější

• ·· 4 4 ·· • · · · · · · 4 • 4 4 4 4 4 • 4 4 4444 4

-27vliv na vztah mezi značeným ligandem-3 nebo ligandem-4 a testovanou molekulou s přihlédnutím na vazbu TIE. Jinak se dá očekávat, te molekula, o které je známo, že rozruší vazbu TIE receptor/TIE ligand-3 nebo TIE-ligand-4, jako je - ale bez jakéhokoli omezování - proti-TIE protilátka nebo TIS receptorová hmota, jak je to zde popisováno, bude rušit vztah mezi ¹²^I-TIE ligandem-3 nebo ¹²^I-TIE ligandem-4 a molekulou, testovanou na vázání TIE receptoru.

Zjistitelně značení TIE ligand-3 nebo TIE ligand-4 zahrnují - ale bez jakéhékoli omezování - TIE ligand-3 nebo TIE ligand-4,vázaný kovalentne nebo nekovalentně na radioaktivní složku, fluoreskující složku, látku s enzymovou aktivitou, látku, jež může sloužit jako substrát pro enzym (výhodné v tomto směru jsou enzymy a substráty s kolorimetricky zjistitelnými reakcemi) nebo na látku, kterou lze rozpoznat molekulou protilátky a tou jest s výhodou zjistitelná značená molekula protilátky o

Jinak se může změřit specifická vazba testované molekuly na TIE vyhodnocením sekundárního biologického účinku TIE ligand-3 nebo TIE ligand 4/TiE receptor, totiž tuto vazbu, ale není to omezováno na buněčný růst a/nebg diferenciaci nebo bezprostřední časnou genovou expresi či fosforylování TIEo Tak například schopnost testované molekuly indukovat diferencování lze sledovat na buňkách postrádajících tie v porovnatelných buňkách s expresí tie:i diferenciace buněk s expresí tie, nikoli však v buňkách srovnatelných bez exprese tie je náznakem interakce specifické testov_ané molekuly/TIE. Podobná analýza se dá provést zjištěním bezprostředně časné genové indukce (například fos nebo jun) v buňkách ťie-minus a tieplus, nebo detekcí fosforylování TIE za užití stabdartních fosforylačních testů, jak jsou v tomzo směru známé. Taková analýza může být užitečná při identifikování agonistů nebo antagonistů, které se kompetitivně nevázají na TIE.

Podobně tento vynález zajišťuje způsob identifikování molekuly s biologickou aktivitou TIE ligandu-3 nebo TIE ligandu-4, který zahrnuje:

-289 9· 0 99 ·· 99 • 9 · · ··· · 9 9 9 9

99 9 9 9 9 99

99 9 · 9 9999 9

999 99 999

999 99 999 9999 99 99 (i) reakci buňky s expresí TIE s testovanou molekulou, a (ii) zjištění specifické vazby testované molekuly na TIE receptor, kdy specifická vazba na TIE souhlasí v kladném slova smyslu s TIE-obdobnou aktivitou. Specifické vázání lze zjistit bud sledováním přímé vazby, nebo sekundárních biologických účinků vazby, jak to bylo diskutováno již zde výšs_o Takový způsob může být zvláště vhodný při identifikování nových členů rodiny TIE ligandů, nebo ve farmaceutickém průmyslu při stínění velkých svazků peptidavých a nepeptidových molekul (například peptidomimetik) z hlediska biologické aktivity v souvislosti s TIE. Podle výhodného, specifického, nikoli však omezujícího provedení tohoto vynálezu se připraví velká sít kultivačních vlnek, obsahující ve střídajících se řadách PC12 (nebo fibroblasty, viz infra) bu^.nky, které jsou buď tie-minus nebo řízeny tak, aby byly tie-plus. Četné a různé z testovaných molekul lze pak přidávat, takže každá kolona sítě, nebo její část obsahuje jinou testovanou molekulu. Každý žlábek je potom možno vyhodnotit z hlediska přítomnosti či nepřítomnosti růstu a/nebo diferenciace. Neobyčejně velké množství testovaných molekul lze takto vyhodnotit z hlediska takové aktivity tímto způsobem.

Podle dalšího provedení popisuje tento vynález způsoby zjištění nebo změření aktivity podobné TIE ligandů, nebo identifikování molekuly, mající talovou aktivitu a to tak, že se (i) vystaví testovaná molekula účinkům proteinu s TIE receptorem in vitro za podmínek, jež dovolují, aby došlo k vazbě, a (ii) zjistí se vazba testované molekuly na protein s TIE receptorem, kdy vazby testované molekuly na TIE receptor souhlasí s aktivitou, podobnou TIE ligandů. Podle těchto postupů může být, ale nemusí být receptor TIE v podstatě vyčištěný, může být vázán na pevném podkladu (například ^finitní koloně, jako je to při testu ELISA), nebo můžs být obsažen v umělé membráně. Vazbu testované molekuly na • * ♦ *

• · ·· ·· • · · · · • · · ·* • · ·♦ · · · • · · · ··· ·· ··

-2 9TIE receptor lze vyhodnotit jakýmkoli na tomto úseku známým způsobem₀ Podle výhodných provedení lze dokázat nebo změřit vazbu testované molekuly vyhodnocením její schopnosti souměžit se se zjistitelným značeným známým TIE ligandem pro vazbu TIE receptoru.

Tento vynález popisuje také způsob zjištění schopnosti testované molekuly ve funkci jako antagonista aktivity podobné TIE ligandu, což obsahuje zjištění schopnosti molekuly inhibov^účinek TIE ligandu vázaného na TIE receptor ha buňku s expresí receptoru. Takový antagonista může nebo nemusí rušit při vázání TIE receptoru/TIE ligand_3 nebo TIE ligand-4. Účinky vázání TIB ligandu-3 nebo TIE ligandu-4 na TIE receptor jsou převážně biologickými nebo biochemickými účinky, čítaje v to - ale bez jakéhokoli omezování přežití nebo proliferaci buněk, transformaci buněk, bezprostřední časnou genovou indukci nebo TIE fosforylování.

Předmětem vynálezu jsou dále jak způsob identifikování gnotilátek či jiných molekul, schopných neutralizovat ligand nebo blokovat vázání na receptor, jakož i molekuly, identifikované tímto způsobem. Formou nijak neomezujícího příkladu: postup se dá provést použitím testu, který je koncepčně podobný testu ELISA. Například receptorová látka se může vázat na pevný podklad, jako je plastová destička s větším počtem žlábků. Pro kontrolu se známé množství TIE ligandu-3 nebo TIE ligandu-4 s Myc-značením ~ může zavést do žlábku a jakýkoli značený TIE ligand-3 nebo TIB ligand-4, který váže na hmotu receptoru, lze pak identifikovat pomocí vhodné protilátky, směrované proti My^-značení. Tento testovací systém se může použít ke stínění testovaných vzorků v případě molekul, které jsou schopné

i) vázat značený ligand, nebo ii) vázat se na receptorovou látku a tím blokovat vlastní vázání značeného ligandu na receptorovou látku.

•· ·· ·· • · 9 9 9 9 · · · ♦ • · 999 9 9

9 9 9

9999 99 99

-30Tak například vzorek, obsahující předmětnou látku, tedy molekulu, jež se teší zájmu a spolu známé množství značeného ligandu se může vnést do každého žlábku a dále se pak může zjistit množství značeného ligandu, jež se váže na receptorovou látku® Porovnáním množství vázaného značeného ligandu v testovaném vzorku a množství v kontrolních vzorcích, obsahujících tyto molekuly, lze identifikovat vzorky, obsahující molekuly, které jsou schopny blůkovat vazbu ligandu na receptoro Molekuly, těšící se zájmu, takto identifikované, lze potom izolovat použitím postupů, jak jsou odborníkům na tomto úseku dobře známé®

Jakmile již jednou bylo zjištěno blokující činidlo ligandu, obeznámený odborník provede sekundární testy, aby tak stanovil, zda blokující činidlo je vázáno na receptor nebo na ligand, jakož i testy stanovení, může-li blokující molekula neutralizovat biologickou aktivitu ligandu. Tak například použitím testu vazby s využitím technologie biosensoru BlAcore (nebo jiného rovnocenného), kdy bud TIB receptorová látka nebo TIB ligand-3 nebo TIE ligand-4 nebo ligandová hmota je kovalentně vázána na pevný podklad (například karboxymethyIdextran na zlatém povrchu), může odborník na tomto úseku určit, zda blokující molekula se váže specificky na ligand, ligandovou hmotu nebo na receptoro vou hmotu. Při stanovení, zda blokující molekula může neutralizovat biologickou aktivitu ligandu, může odborník provést fosforylační test (viz příklad 5 Intern.Publ. WO 96/31 598 z 10.10.1996), nebo jinak funkční biotest, jako je test přežití za použití primárních kultůr například endotheliálních buněk. Jinak blokující molekula, jež se váže na receptorovou látku, může být agonistou a obeznámený to zjistí stanovením této skutečnosti vhodným testem pro identifikování dalších agonistů TIE receptoru.

-31• ·· · ·· · · · · ··· · · · · · · · · · • · · · · ···· • · · · · ······· ··· ·· ··· ··· ·· ··· ···· ·· ··

Dále pak vynález zahrnuje kompozice, kde TIS ligand je receptorovou vaznou oblastí TIE ligandu-3 nebo TIE ligandu-4, zde popisovaných. Tak například TIE-2 ligand 1 obsahuje ”svinutou oblast a oblast podobnou fibrinogenu. Fibrinogenu podobná oblast TIE-2 ligandu 2 zřejmě začíná na nebo kolem téže sekvence aminokyselin, jako ligand 1 (FRDCA). Fibrinogenu-podobná oblast TIE ligandu-3 zřejmě začíná na nebo kolem sekvence aminokyselin, jež je zakódována nukleotidy s počátkem kolem polohy 929, jak je to patrné z vyobr.6A-6B. Multimerování ”svinuté” oblasti během produkce ligandu vadí při čistění. Jak je to popsáno v příkladu 7, zjistili jsme, že však fibrinogenu podobná oblast zahrnuje vaznou oblast TIE-2 receptoru.

Monomerní formy fibrinogenu podobné oblasti však se zdají vázat receptor. Studia za použití myc-značené' fibrinogenu obdob né oblasti, jež se nahromadila za použití proti-myc protilátek, uvádějí vázání TIE-2 receptoru, viz”Methods of production of clustered ligands and ligandbodies”, Davis a spol., Science 266. 816-819 (1994). Na podkladě těchto zjištění původe připravili ligandové látky”, obsahující fibrinogenu podobnou oblast TIE-2 Tigandu spojenou s Fc oblastí IgG (iFc^zs^zz).

'Tyto ligandové látky, tvořící dimery, vážou účinně TIE-2 receptor. Dle toho tento vynález zahrnuje přípravu

TIE ligand-3 a TIE ligand-4 ligandových látek, které se mohou použít jako cílová činidla v diagnostice' nebo therapeutických aplikacích, to jako cílová činidla pro tumory a/nebo ve spojitosti s vaskulaturou, kde je indikován TIE antagonista.

Vynález se dále týká vývoje ligandu, jeho fragmentu nebo derivátu nebo jiné molekuly, jež je agonistou či antagonistou receptoru, to pro therautické účely pro léčení pacientů, postižených nesnázemi v souvislosti s buňkami, tkáněmi nebo orgány s expresí TIE receptoru. Takové molekuly se mohou použít při postupech léčení lidí nebo zvířat, nebo jako diagnostické.

• fc » « ·· ·· ·· ·· • · · · · · • · · · · • · fcfc· ♦ · • fcfcfc • fcfcfc ·· fcfc

-32Protože TIB receptor byl identifikován ve spojitosti s andotheliálními buňkami a - jak je to zde dokazováno blokování TIE-2 ligandu 1 se zdá předcházet vaskularizování, očekáváme, že TIE ligand-3 a TIE ligand-4 babou použitelné při indukci vaskularizování při onemocněních nebo nesnázích, kde dochází k indikaci vaskularizování. Taková onemocnění či nesnáze b?/ pak zahrnovaly hojení ran, ischemii a cukrovku.

Ligandy mohou být testovány ns zvířatech a therapeuticky využity, jak se to zde popisuje místo dalších činidel, jako je vaskulární endotheliální růstový faktor (VEGP), jiný endotheliální, buněčně-specifický faktor, který je angiogenní, viz Perrara a spol., US pat.spis 5 332 671, 26,07.1994. Odkaz na Perrarovu práci, jakož i další studie se týkají postupů in vitro a in vivo, kterých lze využít při průkazu účinnosti angiogenního faktoru při podporování krevního toku při ischemii myokardu, při podporování hojení poranění a dalších therapeutických postupech, kde je žádoucí neoangiogenese, viz Sudo a spol., Evr.pat.přihl. 0 550 29β A2, 07.07.1993, dále Banai a spol.,

Circulation 89, 2183-2189 (1994), Unger a spol., Am.J.Physiol.

266, H1588-H1595 (1994), Lazarous a spol., Circulation .91, 145-153 (1995). Podle tohoto vynálezu se může použít TIE ligand-3 nebo TIE ligand-4 samotný nebo v kombinaci s jednou či více farmaceuticky aktivních látek, jako je například VEGP hebo bázický fibroblastový růstový faktor (bPGP), jakož i cytokiny, neurotrofiny atd.

Naopak, antagonisti TIB receptoru, jako jsou receptorové látky, popsané v příkladech 2 a 3 a TIE-2 ligand-2, popisovaný v příkladu 9 Intern.Publ. WO 96/31 598 z 10.10.1996, by byly vhodné k prevenci nebo zmírnění vaskularizování, takže jsou spojeny s prevencí nebo zmírněním například tumorového růstu. Tato činidla se mohou použít jako taková nebo v kombinaci s dalšími složkami, jako jsou proti-VEGP protilátky, u kterých se ukázalo, že jsou vhodné k použití za podmínek, kdy je therapeutickým záměrem blikování angiogenese. Očekáváme,

-33• ·· ·· * · · • fe· • · · « • fefe ··· fefe · • fe fefe ·· • · · · · · • · · ·· • fe ·· · · · • fefefe • ·«♦· ·· fefe že TIE ligand-3 a TIE ligand-4, jak jsou zde popisovány, se mohou také použít v kombinaci s činidly, jako jsou cytokinové antagonisti, třeba IL-6 antagonista, o kterém je známo, že blokuje záněty.

Například jsme zjistili, že dochází k expresi TIE ligandů v tumorových buňkách nebo v úzké souvislosti s nimi. Tak například se zdá, že TIE-2 ligand-2 je velmi úzce spjat s tumorovými endotheliálními buňkami. Podle toho tato látka a další TIE antagonisti se mohou také použít při prevenci nebo zmírňování například tumorového růstu. Dále pak TIE ligandy nebo ligandové látky mohou být vhodné k přepravě toxinů do buněk, unášejících receptory.

Jinak pak další molekuly, jako jsou růstové faktory, cytokiny nebo živné složky mohou být přepraveny do buněk s TIE receptory cestou TIE ligandů nebo ligandových látek. Ligandy nebo ligandové látky, jako je TIE ligand-3 nebo TIE ligand-4 se mohou rovněž použít jako diagnostická činidla pro TIE receptor, to ke zjištění receptoru in vivo nebo in vitro. Je-li TIE receptor ve spojitosti s chorobným stavem, mohou být TIE ligandy nebo ligandové látky, jako je TIE ligand-3 nebo TIB ligand-4 použitelné jako diagnostická činidla pro detekci onemocnění, například zbarvování tkáně nebo vyšetření celkovéjo tělesného stavu. Taková činidla zahrnují radioisotopy, fluorochromy, barviva, enzymy a biotin. Taková diagnostická činidla, nebo činidla, směřovaná na původ, se mohou připravit, jak to popisuje Alitalo a spol., WO 95/26 364 z 05.10.1995 a Burrows G. a Thorpe P., PNAS (USA)

90, 8996-9000 (1993), na což se zde pro úplnost odkazuje.

Podle dalšího provedeníⁿse mohou TIE ligandy, jako je TIE ligand-3 a TIS ligand-4, popisované zde, použít jako hematopoietické faktory. Velmi značný počet hematopoietických faktorů a jejich receptorů je zahrnut do proliferace a/nebo diferenciace a/nebo migrace různých buněčných typů, obsažených v krvi. Protože k expresi TIE receptorů dochází v mla• « • ·

-34dých hematopoietických buňkách, má se za to, že TIE liganay hrají porovnatelnou úlohu v proliferaci nebo diferenciaci či migraci těchto buněk. Tak například kompozice s obsahem TIE se může připravit, testovat a prověřovat in vitro a in vivo v biologickýchxisoustavách a využít therapeuticky, jak se to popisuje v kterémkoli z dále uvedených zdrojů:

Sousa, US pat.spis 4 810 643, Lee a spol., Proč.Nati.Acad,

Sci.USA 82. 4360-4364 (1985), Wong a spol., Science 228, 810-814 (1985), Yokota a spol., Proč.Nati.Acad.Sci.(USA)

81. 1070 (1984), Bosselman a spol., WO 9 105 795 z 02.05.

1991 pod názvem Stem Cell Pactor” a Kirkness a spol., WO 95/19 985 z 27.07.1995 pod názvem Haematopoetic Maturation Pactor”. Dle toho se může použít TIE ligand-3 nebo TIE ligand-4 při diagnóze, nebo podmínkách ošetřování, kdy dochází k potlačování normální hematopoiesis, čítaje v to- ale bez jakéhokoli omezování -anemii, thrombocytopenii, leukopenii a granulocytopenii. Podle výhodného provedení se mohou použít TIE ligand-3 a TIE ligand-4 k stimulování diferenciace prekursorů krevních buněk v situacích, kdy pacient ochoří nemocí, jako je AIDS, což způsobuje redukci hladin normálních krevních buněk, nebo při klinických zásazích, kdy je žádoucí zvýšení hematopoietické populace, jako je tomu ve spojitosti s transplantací kostní dřeně, nebo při léčení aplasie nebo myelosuprese v důsledku ozáření, působení chemikálií nebo po chemotherapii.

TIE ligand-3 nebo TIE ligand-4 dle tohoto vynálezu se mohou použít jako takové nebo v kombinaci s jinýrai farmaceuticky aktivními látkami, jako jsou například cytokiny, neurotrofiny, interleukiny atd. Podle výhodného provedení se může ligand použít spolu s některým., z výše uváděného výčtu faktorů, o nichž je známo, že indukují růst buněk nebo dalšími herna topoietickými proliferačními prekursory, jako jsou faktory, působící ve zralejších buňkách hematopoietického postupu, čítaje v to- ale bez jakéhokoli omezování- hernatopoetický faktor φ φ « • 9 9 β *z · · • · · • ·

-35zrání, thrombopoietin, faktor růstu buněk, erythropoietin,

G-GSF, GM-CSF atd.

Podle jiného dalšího provedení se antagonisti TIE receptoru použijí při diagnóze či léčení pacientů, kdy žádoucím výsledkem je inhibování hematopoietického průběhu, jako je tomu při léčení myeloproliferativních nebo dalších jiných proliferativních nesnází orgánů, kde se tvoří krev, jako je thrombocythemias, pólycythemias a leukemie. Při takových stavech může léčení zahrnovat použití therapeuticky účinného množství TIE ligandu-3, TIB ligandu-4, TIE protilátky, TIE receptorové látky, konjugátu TIE ligandu-3 nebo TIE ligandu-4 nebo ligandové látky nebo IFC, jak to zde bylo popisováno.

Tento vynález zahrnuje rovněž farmaceutické kompozice, obsahující TIE ligand-3 nebo TIE ligand-4 nebo ligandové látky, popisované zde, jejich peptidové fragmenty či deriváty ve farmaceuticky vhodných nosičích. Proteiny s TIE ligandem-3 nebo TIE ligandem-4, fraementy peptidů nebo odpovídající deriváty se mohou podávat systematicky nebo lokálně. Může se použít jakýkoli postup podávání, známý v tomto oboru, čítaje v to - ale bez jakéhokoli omezování - injekce intravenozní, intrathekální, intraarteriální,intranasální, orální podávání, sub_ kutánní, intraperitoneální nebo lokální injekce nebo chirurgický implant. Formulované přípravky s pozvolným uvolňováním účinné složky sem spadají také.

Vynález se rovněž vztahuje na protilátku, jež se specificky váže na takové therapeutické molekuly. Protilátka může být monoklonální nebo polyklonální. Vynález rovněž zahrnuje postup použití takových monoklonálních nebo polyklonálních antilátek ke zjištění množství therapeutické molekuly ve vzorku, odebraném pacientovi pro sledování průběhu therapie.

Vynález se dále týká therapeutických kompozic, obsahujících TIE ligand-3 nebo TIE ligand-4 nebo ligandovou látku a spolu s nimi konjugované cytotoxickí činidlo. Dle jednoho z provedení může být cytotoxické činidlo radioisotop nebo toxin.

-36b)

c)

d)

Vynález rovněž popisuje antilátku, jež specificky váže TIE ligand-3 nebo TIE ligand-4. Protilátka může být monoklonální nebo polyklonální.

Vynález dále popisuje způsob čistěbí TIE ligandu-3 nebo TIE ligandu-4, zahrnující stupně:

a) napojení nejméně jednoho TIE vázajícího substrátu na pevnou matrici, inkubování substrátu ze stupně a) s buněčným lysátem, tak, že substrát vytvoří komplex s jakýmkoli TIE ligandem-3 nebo TIE ligandem-4 v buněčném lysátu, promytí pevné matrice, a eluování TIE ligandu-3 nebo TIE ligandu-4 ze spojeného substrátu.

Substrátem může být jakákoli látka, jež specificky váže TIB ligand-3 nebo TIE ligand-4. Podle jednoho z provedení se substrát volí ze skupiny, obsahující proti-TIE ligand-3 nebo proti-TIE ligand-4 jako antilátku, dále TIE receptor a TIE receptorovou látku. Vynález dále zahrnuje receptorovou látku, jež specificky váže TIE ligand-3 nebo TIE ligand-4, jakož i therapeutickou kompozici, obsahující receptorovou lát ku ve farmaceuticky vhodném nosiči a způsob blokování růstu krevního oběhu u lidí, zahrnující podávání účinného množství therapeutické kompotice.

Vynález se rovněž týká therapeutické kompozice, obsahujíc.! TIE ligand-3 nebo TIE ligand-4 mebo ligandovou látku ve farmaceuticky vhodném nosiči, jakož i způsob podporování neovaskularizace u pacienta, což se vyznačuje podáváním účinného množství therapeutické kompozice pacientovi.

Dále pak tento vynález zajištuje způsob identifikování buňky s expresí TIE receptorů, který se vyznačuje tím, že se buňka uvede do st^ku se zjistitelným značeným TIE ligandem-3 nebo TIE ligandem-4 nebo ligandovou látkou za podmínek dovolujících navázání zjistitelného značen^o ligandu na TIE re• 99

ΦΦ ·· Φφ φ «ΦΦΦ ·Φ·« φ Φ ΦΦΦΦ «φ Φ · Φ ΦΦΦΦ Φ

Φ Φ Φ φφφ

ΦΦΦΦΦΦΦ ΦΦ «Φ

-37ceptor se stanovením, zda zjistitelný značený ligand gse váže na TIE receptor, čímž se identifikuje buňka jako taková, jež je spojena s expresí TIE receptoru. Vynález rovněž zahrnuje therapeutické kompožise, obsahující TIE ligand-3, nebo TIS ligand-4 nebo ligandovou látku a na ně konjugované cytotoxické činidlo. Cytotoxickým činidlem může být radioisotop nebo toxin.

Dále vynález zahrnuje způsob detekce exprese TIS ligandu-3 nebo TIE ligandu-4 buňkou, a způsob se vyznačuje tím, že se získá z buňky mRNA, ta se uvede do styku s molekulou značené nukleové kyseliny zakodovávající TIE ligand-3mnebo TIS ligand-4, to za hybridizačních podmínek, stanoví se přitonost mRNA hybridizované na značenou molekulu a tím se dokáže exprese TIE ligandu-3 nebo TIE ligandu-4 v buňce.

Dále ještě vybález zahrnuje způsob důkaru exprese TIE liggndu-3 nebo TIE ligandu-4 v tkáňových sekcích, což záleží v tom, že se tkáňová sekce dostane do styku s molekulou značené nukleové kyseliny zakodovávající TIE ligand-3 nebo TIE ligand-4, to za hybridizačních podmínek, stanoví se přítomnost mRNA hybridizované na značené molekule a tím se zjistí i exprese TIE ligandu-3 nebo TIE ligandu-4 v tkáňových sekcícho

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 Identifikování buněčné linie ABAE jako nosič buněk pro TIE-2 receptor.

Dospělé buňky BAE jsou registrovány u European Cell Culture Repository”pod označením ECA 00-^/92 010601 (viz PNAS 75. 2621 (1978). Analýzami typu “Northern (RNA) se zjistily mírné hladiny tie-2 transpriptu v ABAE (Adult Eovine Arteria.l Endothellal) buněčné linii, v souladu s hybridizací in šitu to vede k výsledku, že je zde důkaz takřka výlučného umístění tie-2 RNA do vsskulárních endothelialních buněk. Testovali ·* φ · « · • · · • ♦ • *· • · · • 0 • 0 0 0· jsme proto ΑΒΑΞ buněčné lysáty na přítomnosti TIE-2 proteinu, jakož i se zřetelem na rozsah, do jaké míry je tento TIE-2 protein tyrosin-fosforylovatelný za normálních podmínek proti podmínkám růstu bez sera. Lysaty ΑΒΑΞ buněk byly soustředěny a zpracovány imunoprecipitací s následnými analysami ”Western blot imunovysrážených proteinů pomocí antisera, TIE-2 specifického a fosfotyrosin-specifického. Opomenutí nebo inkluse

TIE-2 paptidů jako specifických blokujících molekul během

TIE-2 imunoprecipitace dovoluje nepochybné identifikování

TIE-2 jako středně zjistitelného proteinu asi o 150 kD, jehož hladina stálého stavu fosfotyrosinu se snižuje až do blízkosti nezjistitelné hladiny předtím, než se buňka zbaví séra.

Kultivování buněk ΑΒΑΞ a soustředěné buněčné lysáty:

Buňky ABAE s nízkým poetem průchodů byly umístěny jako jednoduchá vrstva hustoty 2 ₀ 10^ buněk na 150 mm plastové Petri-ho destičce (Palcon) s následným kultivováním v prostředí Eagle s modifikací Dulbecco (DIKEM) s obsahem 10% sera telat (10:% BOS, bovine calf sérum), 2 mM L-glutaminu (Q) a 1% vždy pecinilinu a streptomycinu (P-S) v atmosféře 5% oxidu uhličitého. Před soustředěním buněčných lysátů byly buňky 24 hodin zbavovány sera v DMEM/Q/P-Ss následnou aspirací prostředí a spláchnutím destiček ledem vychlazenou solankou, pufrovanou fosfáty (PBS) za přidání orthovanadičnanu sodného, fluoridu sodného a natriumbenzamidinu. Buňky byly lysovány malým objem proplachovacího pufru, ke kterému bylo přidání 1% detergentu NP40, proteasové inhibitory PMSP a aprotinin. Nerozpustné zbytky byly odstraněny z lysátů buněk odstředěním (14.000 xG, 10 minut, 4°C a čirá kapalina nad sedlinou byla imunoprecipitována protiserem, specifickým na TIE-2 receptor, za přítomnosti nebo bez blokujících peptidů, přidaných do asi 20 pg/ml lysátů. Imunoprecipitované proteiny byly rozpuštěny v PAGE (7,5% Laemmli gel), pak elektricky přeneseny na membránu PVDP a inkubovány buď s různými TIE-2 nebo antiserem, specifickým na fosfotyrosin. TIE-2 protein byl zvi4 · • Β

-39ditelněn inkubováním membrány se sekundárním antiserem s navázaným HRP s následujícím působením činidla ECL (Amersham).

Příklad 2 Klonování a exprese TIE-2 receptorové látky pro studie interakcí TIE-2 ligandu, založené na afinitě.

Byl vytvořen expresní stavební prvek, který by poskytnul vyloučený protein, obsahující veškerou extracelulární část krysího TIE-2 receptoru, navázaný na lidskou imunoglobulinovou konstantní oblast (IgGl Pc). takto vevázaný protein je označován jako TIE-2 receptorová látka (RB, receptor body) a dalo by se nor,álně očekávat, že bude existovat jako dimér v roztoku, založeném na tvorbě disulfidických vazeb mezi individuálními LgGl Pc chvosty. Část Pc TIE-2 RB byla připravena takto: Fragment DNA, zakodovávající Pc část lidského IgGlež se rozprostírá od závěsné oblasti až po karboxylové zakončení proteinu, byla amplifikována z lidské plačentální cDNA pomocí PCR s oligonukleotidy, odpovídajícími publikované sekvenci lidské oblasti IGG1. Získaný fragment DNA byl klonován v plasmidovém vektoru. Odpovídající vhodné restrikční fragmenty z plasmidu, zakodovávajícího plnou délky TIE-2 recwptoru a plasmid lidské oblasti IgGl Pc byly uloženy na každé straně krátkého, od PCR odvozeného fragmentu, který bvl určen ke spojení, v rámu ,TIE-2 a sekvencí, zakodovávajících lidský IgGl Pc protein. Takže výsledný TIE-2 v ekto-oblasti-Pc naváz_oný protein přesně nahradil IgGl Pc v místě regionu spojení TIE-2 transmembrány a cytoplasmové oblasti. Jiný způsob přípravy RBs popsal Goodwin a spol., Cell 7,3, 447-458 (1993).

Miligramová množství TIE-2 RB byla získána klonováním fragmentu TIE-2 RB DNA do pVL1393 baculovirového vektoru s následným infikováním linii buněk hmyzu ze Spodoptera frugiperda SF-21AE. Jinak se může použít buněčná linie SF-9 (ATCC Accession No. CRL-1711), nebo buněčná linie BTI-TN-5bl-4.

Β Β

ΒΒΒ ·« • · ΒΒΒ

-40DNA, zakodovávající ΤΙΕ-2 RB byla klonována jako fragment Eco RI-Notl do baculovirového fransferního plasmidu pVL1393. Plasmid DNA, čištěný odstřeďováním s roztokem chloridu česného o gradientu hustoty, byl rekombinován do virové DNA smícháním 3 ug plasmidu DNA s 0,5 jig Baculo-Gold DNA (Pharminigen) s následným vnesením do liposomů za užití 30 j^g Lipofectinu (GIBCO-BRL). Ds DNA-liposomové směs'byla přidána do SP-21AE buněk (2 _o 10^ buněk/60 mm destičku) v prostředí TMN-PH (modifikované prostředí Grace s hmyzími buňkami (GIBCO-BRL) na 5 hodin při 27°G s následným inkubováním při 27° C po 5 dnů v prostředí TMN-PH s dodatkem 5% fetálního telecího séra. Prostředí tkáňové kultury bylo potom sebráno pro Čistění na destičce od rekombinantních virů, což bylo provedeno použitím postupu, který byl již dříve popsán, viz O^Reilly a Miiler L.K., Luckow V .A., Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, 1992, New Yoek, W.H.Preeman, ale s tou změnou, že agarosový přeliv obsahoval 125 jig/ml X-gal (5-brom-4chlor-3~indolyl~^*)-D-galaktopyranosid, GIBCO-BRL). Po 5ti dnech ibkubování při 27°C byly sečteny ne-rekombinantní destičky s vyhodnocením pozitivní chromogenní reakce na X-gal substrát, a jejich poloha byla zaznamenána. Rekombinantní destičky byly pak zviditelněny přidáním druhého přelivu s obsahem 100 pg/ml MTT, tj. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yI)~2,5-difenyltetrazoliumbromid, Sigma. Předpokládané rekombinantní virové destičky byly sebrány odsáiiím zátkou a čištěny několikanásobným opakováním izolace destiček pro zajištění homogenity. Virové zásoby byly generovány sériovým, málo se opakujícím průchodem viru čištěného na destičkách. Došlo tak k produkci nízkoprůchodní sestavy virového klonu (vTIE-2 receptorové látky)_o

Buňky SP-21AE byly kultivovány v prostředí, prostém séra (SP-900 II, Gibco BRD) s obsahem IX antibioticko/antimykotického roztoku (Gibco BRL) a 25 mg/L gentamycinu (Gibci BRL), • 44

-41• 4

Jako povrchově aktivní látka byl přidán Pluronic F-68 do konečné koncentrace lg/L„ Kultura o objemu 4 litrů se ponechala zrát nejméně 3 dny před infikováním v bioreaktoru (Artisan Cell Station System).Buňky byly pěstovány za teploty 27° C za zavádění až do 50% rozpuštěného kyslíku za rychlosti průtoku plynu 80 ml/min (provzdušňování rozptylováním pomocí rozptylového kruhového zařízení). Míchání pomocí vrtule rychlostí 100 otáček za minutu. Buňky byly sklizeny ve středně logaritmické fázi růstu (asi 2 . 10° buněk na. ml)„ zahuštěbí provedeno odstředěním, infikování provedeno 5ti destičkami, tvořícími celek dTIB-2 receptorové látky na buňku. Buňky a inokulum byly přeneseny do 400 ml čerstvého prostředí a virus byl adsorbován po 2 hodiny při 27°C do jímací lahvičky. Kultura byla potom opět suspendována v konečném objemu 8 litrů čerstvého, sera prostého prostředí a buňky byly inkubovány v bioreaktoru za podmínek, jak již byly dříve popsány.

Prostředí kultury buněk z vTIB-2 receptorové látky, infikovacé buňkami SB2lAB,byly soustředěny odstředěním (500x g, linut) a to 72 hodin po infikování. Čirá kapalina nad buňkami byla upravena z hlediska hodnoty pH na 8 přidáním hydroxidu sodného, byla přidána kyseliny ethylendiamintetraoctová na konečnou koncentraci 10 mM a pH kapaliny nad sedlinou bylo znovu upraveno na 8_O Kapalina nad sedlinou byla potom filtrována ( 0,45 pm, Millipore) a nanesena na protein-A-kolonu (protein-A-sefarosa 4, rychlý průtok, nebo HiTrap protein A, v obou případech Pharmacia). Kolona byla promyta použitím PBS s obsahem 0,5 M chloridu sodného, až absorbance při 280 nm klesla na základní čáru. Dále byla kolona promývána pomocí PBS s eluováním 0,5 M roztokem kyseliny octové. Frakce z kolony byly bezprostředně neutralizovány eluováním do trubiček s obsahem 1 M Tris, pH 9. Píkové frakce s obsahem TIE-2 receptorové látky byly shromážděny a dialyfcovány proti PBS.

• · ·

-42Důkaz, že TIE-2 má rozhodující úlohu při vývinu vaskulatury

Příklad 3

Náhled do funkce TIE-2 byl získán zavedením nadbytku” rozpustné TIE-2 receptorové látky (TIE-2 RB) do vývojového systému. Potenciální schopnost TIE-2 RB vázat, a tím i neutralizovat dostupný TIE-2 ligand by se mohla projevit pozorovatelným rozrušením normálního vaskularního vývoje a charakterizováním ligandů. Pro zjištění, zda TIE-RB se může použít k rozrušení vaskularního vývoje časných embryí kuřat byly malé kousky biologicky resorbovatehné pěny nasáknuty použitím TIE-RB a vnořeny bezprostředně pod chorioalantoinovou membránu v postavení právě laterálním k primitivnímu embryu.

Vývin časných embryí kuřat byl spojen s vývojem malé plošky na vrcholu žloutku u buněk, které byly kryty chorioalantoionovou membránou (GAM). Endotheliální buňky, které mají poskytovat linii vaskulatury v embryu, pocházejí jak z extra, tak i infra-embryonických zdrojů buněk. Extra-embryonicky odvozované endotheliální buňky, které jsou hlavním zdrojem endotheliálních buněk v embryu,,pocházejí z přírůstků mesenchymu , které jsou umístěny laterálně kolem vlastního embrya, právě pod zmíněnou membránou CAM. Jak tyto mesenchymové buňky dozrávají, jsou zdrojem společného progenitoru jak endothev liálních, tak i hematopoietických buňkových lazeb, označení hemangioblast. Naopak hemangioblast je původcem vzniku smíšené populace angioblastů (progenitor endotheliálních buněk) a hematoblastu /prekuassor pluripotenciálně hematopoietický) .Tvorba základů cirkulačního systému začíná, když se progeny endotheliálních buněk segregují za vzniku váčku ťlouštky jedné buňky, který obklopuje primitivní krevní buňky. Proliferováním a migrací těchto buněčných složek případně je spojeno se vznikem mohutného pletiva mikroútvarň, plněných krví, pod membránou CAM s konečnou invází do embrya za spojení s limitovanými, intraembryonicky odvozenými vaskulárními zárodky.

ΦΦ φ · · φ «φ »φ φ φ φ

-43Nově snesenákuřecí vajíčka byla získána od Spatas, lne. Boston, MA), byla inkubována za teploty 37° C, relativní vlhkost 55%. Po asi 24 hodinách vývinu byla vaječná blána odebrána použitím 70%ního ethanolu a vrtačka zubaře byla použita pro vytvoření dirky 1,5 C51 tupé špičky každého vejce. Odstraněním vlastní membrány se projevil vzdušný prostor přímo nad embryem. Malé pravoúhle kousky sterilní gélové pěny (Lipjohn) byly vyříznuty skalpelem a nasáknuty stejnými koncentracemi každé z TIE-2 nebo EHK-1 receptorové látky.

EHK-1 receptorová látka byla připravena, jak je to popisováno v příkladu 2 za použití EHK-1 extracelulární oblasti místo TIE-2 x extracelulární oblasti, viz Maisonpierre a spol., Oncogene 8, 3277-3288 (1993). Každý z kousků gélové pěny absorboval asi 6 ug proteinu v 30 ul. Sterilní hodinářské kleštičky ) - k byly použity k vytvořeni malé trhlinky v membráně CAM v postavení několika mm laterálně k primitivnímu embryu.

Většina kousků RB-nasáknuté gélové pěny byla potom vsunuta pod membránu CAM a vaječný obal byl vně uzavřen kouskem lepící pásky®; další, podobně upravená vejce byla zpracována paralelně s RB nepříbuznou,neuronově expresní receptorovou tyrosin-kinasou, EHK-1, viz Maisonpierre a spol., Oncogene 8, 3277-3288 (1993). Vývoj byl ponechán postupovat 4 dny a embrya byla potom podrobena vizuální inspekci. Embrya byla vyjmuta opatrným rizbitím skořápek v mističkách s teplou BBS a embryo bylo opatrně odříznuto od okolní CAM. Z 12 vajec, zpracovaných vždy použitím RB, 6 TIE-2 RB a 5 EHK®1 RB se embrya vyvíjela mimo stupen, pozorovaný na počá' tku pokusu.

Byly pozorovány dramatické rozdíly mezi takto se vyvíjejícími embryi, jak je to patrné z vyobr. IA a IB. Ty zárodky, které byly testovány za použití EHK-1 RB se zdály vyvíjet se poměrně normálně. Čtyři z pěti EHK-I embryí byla živá, souzeno dle projevů bijícího srdce. Dále pak extra-embryonická vaskulatura, jež je zcela jasně poplatná přítomnosti červených krevních • · • ··

-44krvinek, byla velmi hojná a zasahovala několik centimetrů laterálně pod CAM. Naopak ta embrya, jež byla vystavena účinkům TIE-2 RB, byla těžce vyhladověhá, v průměru velikosti 2 až 5 mm ve srovnání s velikostí nad 10 mm průměru embryí po EHK-1. Všechna embrya po podání TIE-2 RB byla mrtvá a jejich CAM byly prosté krevního oběhu. Schopnost TIE-2 RB blokovat vaskulární vyviň u kuřat dokazuje, že TIE-2 ligand je skutečně nutný pro vývoj vaskulatury.

Příklad 4 Konstruování TIE-2 ligandových látek

Byla pořízena expresní konstrukce, jež by poskytovala vylučovaný protein, obsahující celé kódovací sekvence lidského TIE-2 ligandu 1 (TL 1) nebo TIE-2 ligandu 2 (TL2) navázané na lidskou imunoglobulinovou $-1 konstantní oblast (IgGl Pc). Takové navázané proteiny jsou označovány jako TIE-2 ligandové látky (TL-l-Pc nebo TL2-Pc). Část Pc, odpovídající TLl-Pc a TL2-PG byla připravena takto:

Použit byl DNA fragment Pc části lidského IgGl, jenž sahá od závěsné oblasti ke karboxylovému konci proteinu, a to z lidské placentální cDNA působením PCR s oligonukleotidy, odpovídajícími publikované sekvenci lidského IgGl; získaný fragment DNA byl klonován v plasmidovém vektoru. Vhodné DNA restrikční fragmenty z plasmidu, zakodovávající plnou délku TLI a TL2 a z lidského IgGl Pc plasmidu byl?/ uloženy na každé straně krátkého, od PCR odvozeného fragmentu, který byl určen jako rám pro splynutí TLI nebo TL2 se sekvencemi kódujícími lidský IgGl Pc protein.

Miligramová množství TL2-Pc byla získápa klonováním fragmentu TL2-Pc DNA do baculovirového vektorů pVL1393 s následným infikováním buněčnou linií hmyzu Spodoptera frugiperda. Jinak se může použít buněčná linie SP-9 ( ATCC Accession No.CRL-1711) nebo buněčná linie BTI-TN-Sbl-4. DNA se zakódovaným TL2-Pc byla klonována jako fragment Eco-RI-Notl do baculovirového transferního plasmidu pVL1393. Plasmid DNA byl rekombinován do virální DNA smícháním 3 ^ug plasmidu DNA s 0,5 yig Baculo-Gold DNA (Phaminigen) s následným zavedením do liposomů za použití 30 ug Lipofectinu (GIBCO-BRL),

• · · · · • · · · • · · · • · ·· ··· · · • · ·

-45DNA-liposomní směsi byly přidány do buněk SF-21AB (2 x 106 buněk/60mm misku) v prostředí TMN-FH (Modified Grace*s Insect Cell Medium, BIGCO-BRL) na 5 hodin při 27° C s následným inkubováním při 27° C po 5 dnů v prostředí TMN-FH s dodatkem 5% fetálního telecího sera. Prostředí tkáňové kultury bylo potom sklizeno pro čistění na destičkách rekombinantních virů, což bylo provedeno za použití postupu dříve již popsaného, viz O^Reilly D.R., Miller L.K.a Luckow V.A., Baculovirus Bxpression Vectors, A Laboratory Manual, 1992,

New York, N.Y., Freeman W.H.) s tou změnou, že agarosový přeliv obsahoval 125 mg/ml X-gal’ (5-brom-4-chlor-3-indolylD-galaktopyranosid, GIBCO-BRL).Oi 5 dnech inkubování při 27° C byly nerekombinantní destičky vyčleněny kladnou chromogenní reakcí na X-gal substrátu, jejich polohy byly zaznamenány, rekombinantni destiičky byly potom zviditelněny přidáním druhého přelivu s obsahem 100 mg/ml MTT, tj. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromidu, (Sigma).

Předpokládané rekombinantni virové destičky byly odebrány odsátím zátkou a čištěny několikrát izolováním destiček, aby se tak zajistila jejich homogenita. Virové zásoby byly pak generovány sériovým, nízko-násobným průchodem viru, čištěného na destičkácj. Byly tak pořízeny nízkoprůchodní zásoby jednoho virového klonu (vTL2-Fc, klon //7).

Buňky SF-21AE byly kultivovány na prostředí, prostém sera (SF-900 II, Gibco BRL), obsahujícím IX roztok antibiotika/ antimykotika (Gibco BRL) a 25 mg/litr gentamycinu (Giboo BRL).

Jako povrchově aktivní látka bjl přidán Pluronic F-68 ke konečné koncentraci lg/litr_o Kultury (4 litry) byly potom udržovány v bioreaktoru (Artisan Cell Station System) po nejméně 3 dny před infikováním. Růst buněk při 27°G, zavádění plynu až do 50% rozpuštěného kyslíku, průtoková rychlost plynu 80 ml/min, provětrávání kruhovým rozptylovačem. Míchání vrtulkou, 100 otáček za minutu. Buňky byly sklizeny v mid-logaritmické růstové fázi (asi 2 X10 6 buněk/ml), koncentrovány • ·· ·· • · · · · • · · · · • · ···· · • · · ·· ·· ·· • ·

odstředěním a infikovány 5 destičkami, tvořícími jednotku vTL2-Pc na buňku. Buňky a inokulum byly přeneseny do 400 ml Čerstvého prostředí, vir byl adsorbován 2 hodiny při 27°C ve vhodné nádobce. Kultura byla dále resuspendována na konečný objem 8 litrů v čerstvém prostředí, prostém sera a buňky byly inkubovány v bioreaktovu za použití podmínek, jak zde již byly popsány.

Prostředí kultuřy z vTL2-Pc, infikované buňkami SP21AE bylo sebráno odstředěním (55x g, 10 minut) a to 72 v

hodin po infekci. Kapalina nad buňkami byla přidáním hydroxidu sodného upravena na hodnotu pH 8, byla přidána kyselina ethylendiamintetraoctová na konečnou koncentraci 10 mM a pH kapaliny bylo opět upraveno na hodnotu 8. Kapalina nad sedlinou byla filtrována (0,45 pm, Millipore) a nanesena na protein A-kolonu( protein A sefarosa 4 s rychlým prů tokem nebo HITrap protein A, v obou případech Pharmacia). Kolona byla promyta použitím PBS s obsahem 0,5 M chloridu sodného, až adsorbance při 280 nm klesla na základní linii. Kolona byla promyta použitím PBS, eluována 0,5 M roztokem kyseliny octové a frakce z kolony byly ihned neutralizovány eluováním do zkumavek, obsahujících 1 M Tris, pH 9. Píkové frakce, obsahující TL2-Pc byly spojeny a dialyzovány proti PBS

Příklad 5 Systém receptor/ligand při angiogenesi.

Ačkoliv se zdá, že ΤΙΕ-2/ΤΙΞ ligandový systém hraje důležitou úlohu v endotheliální buněčné biologii, nebylo poukázáno na to, že by mohl hrát významnou a aktivní úlohu v časných až prostředních stadiích vaskularizování (například proliferaci a migraci angioblajstových nebo endotheliálních buněk, tvorbě tubulů a. dalších časných stadií vyskulárního modelování). Na rozdíl od receptorů a faktorů, známých mediováním těchto aspektů vaskulárního vývoje, časově pozdější projev exprese TIE-2 a TLI v průběhu vaskularizování • 4

44 44 44

4 4 4 4 44 4 • 4 4 4 44 • 4 4 444 · ·

4 4 4 4

444 4444 44 44 vede k názoru, že tento systém hraje zřetelnou úlohu v pozdějších stadiích vaskulárního vývoje, čítaje v to strukturální & funkční diferencováním stabilizování nových krevních cév. Vzor exprese TIE-2/TLI je rovněž v souladu s pokračující úlohou.při udržování strukturální integrity a/nebo fyziologických charakteristik ustavené vaskulatury.

Zdá se, že TIE ligand-2 je kompetitivním inhibitorem TLlo Prostorově-časové charakteristiky exprese TL2 vedou k úvaze, že tato jediná inhibiční molekula hraje úlohy vícenásobné a závislé na obsahu, které jsou závažné pro vlastní vhodný vaskulárné vývoj nebo remodelování (například destabilizačně dediferencování zrání endotgeliálních buněk, což dovoluje tvoření se nových cév ze stávající vaskulatury, inhibuje se tím tvorba nežádoucích krevních cév a regrese či zamotání vyzrálých krevních cév. Vyobr_o2 je schematickým znázorněním předpokládané úlohy TIE-2/TIE ligandů při angiogenesi. Na tomto vyobrazení TLI je vyznačena jako C^e), TL2 jako (⁺), TIE-2 pomocí (T), VEGP pomocí (II) a flk-l (receptor VEGP) je vyznačen jako (Y).

Příklad 6 Konstruování a charakterizování CYS-TL1 mutantu

TIE-2 ligandy mají dvě hlavní strukturní oblasti, jedna je popisována jako oblast svinutého závitu, obsahujícího přibližně C-koncovou třetinu proteinu a další jako oblast fibrinogenu podobná, obsahující asi dvě třetiny N-koncovky proteinu. Ačkoliv TIE-2 ligandy, označované jako TL-1 a TL2 sdílejí podobnou strukturní homologii, vyznačují se odlišnými fazikálními a biologickýcmi vlastnostmi,, Za použití neredukujících elektroforetických podmínek se vyznačují oba proteiny kovalentními, multimerními strukturami s tím, že TLI existuje primárně jako trimer, a TL2 existuje primárně jako dimer. Vyobr.3 je schematickým znázorněním, jak mů&eu TIE-2 ligandy vzájemně reagovat za vzniku multimerů. V pojmech • ·· · ·< ·· ··

9 9 · ·9 9 9 9 99 9

99 9 9 9 9 99

9 9 9 9 9 9 999 9 9

9 9 9 9 9 9 9

999 99 999 9999 99 99

-48biologické účinnosti se ukázalo, že TLI je agonistou pro TL£2 receptor, jak to bylo prokázáno indukcí fosforylování v buňkách s expresí TIE-2. TL2 na druhé straně se zdá být kompetitivním inhibitorem pro TLI. Sledování, kteréže faktory by mohly přispívat k různým fyzikálním a biologickým vlastnostem oněch dvou molekul vedla k zjištění přítomnosti cysteinových zbytků (CAS265), předcházejících fibrinogen-podobné oblasti v TLI, ale nepřítomné v TL2o Tento zbytek CAS265 v TLI je zakódován pomocí TGC a je lokalizován přibližně na nukleotidech 1102-1104 v bezprostředním spojení mezi oblastmi svinutého závěsu a fibrinogenu podobné . Protože cysteinové zbytky jsou obvykle zahrnuty do tvorby disulfidických vazeb, jejichž přítomnost může přispět jak k terciární struktuře, tak i biologickým vlastnostem molekuly, mělo se za to, že snad přítomnost CAS265 v TLI by mohla alespoň částečně být odpovědná za lišící se vlastnosti obou dvou molekul. Pro potvrzení této domněnky byl konstruován expresní plasmid, který obsahoval mutaci TLI, kde zbytek CAS byl nahrazen aminokyselinou, jež nevytváří disulfidické vazby. Navíc k tomuto TL1/CAS mutantu byl kontruován druhý expresní plasmid, který mutoval odpovídající polohu v TL2, takže tímto zbytkem byl nyní cystein.

Oba expresbí plasmidy, nemutovaný a mutovaná, odvozené od TLI a TL2¹ byly přecbhodně transfikovány do COS buněk. Kapaliny nad buňkami, obsahující rekombinantní proteiny, byly sklizeny a vzorky byly zpracovány jak redukční, tak i neredukční SDS/PAGB elektroforesou s následným westerb blotting· Western blots obou proteinů, nemutovaného i mutovaného TLI a TL2 pak vedly ke zjištění, že TL1/CAS mutant se chová více podobně TL2 potud, že se pohybuje jako dimer, a že TL2/Č|^ZS mutant se chová více jako TLI potud, že je schopný vytvořit trimer jakož i multimery vyššího řádu.

• · • 4 · · · · ♦ · 44 • · 4 4 4 4 4 • 4 · 4

4444 44 44 • ·

-49Je zajímavé, že byly-li tyto dva mutanty testovány na jejich schopnost indukovat fosforylování buněk s expresí

TIE-2, byl TL1/GAS mutant schopný aktivovat TIE-2 receptor, zatím co TL2/CAS⁺ mutant se nevyznacoval žádnou aktivující účinností.

Příklad 7 Konstruování a charakterizování mutantů pouze s fibrinogen-podobné oblastí.

Se zřetelem na testování, zda fibrinogenu-podobná oblast (P-obl_ast) TIE-2 ligandu obsahuje aktivační účinnost TIE-2 byly konstruovány expresní plasmidy, postrádající svinuté závity, resp.jejich oblast za ponechání pouze té části sekvence DNA, zakodovávající F-oblast (počínající asi u nukleotidu 1159, aminokyselinový zbytek ARG284). Tato mutantová konstrukce byla přechodně přenesena do buněk COS. Kapalina nad sedlinou, obsahující rekombinantní protein, byla odebrána a mutant TL1/F oblasti byl testován na schopnost vázat TIE-2 receptor. Výsledky ukázaly, že - jako monomer mutamt TLl/P-oblasti není schopný vázet TIE-2 na dokazatelné úrovni. Avšak byl-li monomer TLl/P-oblasti mye-značen a pak smíchán s antilátkou řízenou proti myc-znac&í, vyznačoval se zjistitelným vázáním TIE-2. Avšak mutantová oblast antilátka/příměs TL1-P nebyla schopná indukovat fosforylování buněčné linie s expresí TIE-2. Na vyobr.3 je schematické znázornění konstrukce P-oblasti a její poutající schopnost v případě plus či minus přimíšení protilátky.

Příklad 8 Test vázání receptorové látky a vázání ligandu, a kompetitivní test

Kvantitativní test buněčně-prosté vazby se dvěma alternativními formáty byl použit pro detekci vazby buď TIE-2 receptorové látky nebo vázání ligandu a jejich konkurování, Při verzi testu Vázání receptorové látky byly TIE-2 ligandy (čištěné nebo částečně čištěné, buď TLI nebo TL2) nanese-50ny na destičku ELISA. Potom byla přidána za měnících se koncentrací receptorové látka, jež se váže na imobilizovaný ligand způsobem, úměrným dávkování. Po dvou hodinách byl nadbytek receptorové látky vymyt pryč, a potom bylo zjištěno množství, vázané na destičce za použití specifické proti-lidské Fc protilátky, jež je značena alkalickou fosfatasou. Nadbytek nosné protilátky se vymyje, načež se vyvolá AP reakce užitím zbarveného substrátu. Test se vyhodnotí kvantitativně spektrometricky. Na vyobr.4 je typická křivka vazby TIE-2~IgG. Tento test byl využit při vyhodnocování integrity TIE-2-IgG po injikování krysám a myším. Test lze také využít v tomto formátu jako test kompetitivního ligandu, kdy čištěné nebo částečně vyčištěné TIE ligandy soutěží v účinnosti s imobilizováným ligandem z hlediska receptorové látky. Při verzi ligandové vazby a kompetitivního chování se při tomto vazném testu se nanese akto-oblast TIE-2 na destičku ELISA. Fragmenty Pc-značené, fibrinogenu podobné oblasti TIE ligandů (TLl-IPc a TL2-IPc) se potom vážou na ekto-oblast a lze je dokázat použitím stejné proti-lidské Pc protilátky, jak to bylo popsáno výše. Na vyobr. 5 je zachycen příklad vázání TLl-fPc na TIE-2 ektooblast.

Tato verze testu se také může použít k vyhodnocení kvantitativní hladiny: TLl-fPc v seru či jiných vzorcích. Přidá-li se neznačený ligand (opět buď čištěný nebo nečištěný) do téže linie, jako TLl-fPc, pak dojde k soutěžení mezi fragmentem značeného ligandu a ligandem plné délky. Ligand plné délky může nahradit Pc-značený fragment a generuje se tím kompetitivní křivka.

Příklad 9 Buněčná linie EA,hy926 se může použít jako nosič buněčné linie pro aktivitu ligandu

EA.hy926 je buněčná hybridní linie, k jejímuž sestavení došlo spojením HUVEO a lidskou plicní linií, karcinomně závislou, A549, viz Edgell a spol., Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)

- 51 ··· ·

80, 3734-3737 (1983). Bylo zjištěno, že buňky EA.hy926 jsou spojeny s expresí závažných hladin TIE-2 receptorového proteinu s nízkými bazálními hladinami fosfotyrosinu. Hustota, se kterou se buňky EA.hy926 nasadí před použitím pro receptorové testy, jakož i stupen jejich splynutí v tobě testů může ovlivnit nadbytek TIE-2 receptoru a relativní indukovatelnost v odezvě na působení ligandů. Adaptací dále uvedeného způsobu pro růst těchto buněk se může buněčná linie EA.hy926 použit jako závislý systém pro testování TIE-2 ligandových aktivit.

Buňky EA,hy926 byly nasazeny v množství 1,5 . 10 buněk do nádobek T-75 (Ealconware) a přikrmovány každý další den

MEM (Dulbecco, vysoký obsah glukosy), 10% fetálního telecího sera,Lt>glutaminem, kombinací penicilinu a streptomycinu a jednou směsí hypoxanthin-aminopterin-thymidin (HAT,

Gibco/BRL). Po 3 až 4 dnech růstu buňky prošly ještě jednou průchodem v množství 1,5 . 10θ buněk na lahvičku T-75 s následným kultivováním po další 3 až 4 dny. Pro fosforylační testy byly buňky, připravené, jak to bylo popsáno výše,, sérově vyhladověny náhradou prostředí kultury použitím prostředí DMEM (vysoký obsah glukosy) a inkubováním 2 až 3 hodiny při 37° C. Toto prostředí bylo provětráváno ze zásobní láhve a vzorky upraveného prostředí nebo čištěného ligandů byly přidány do lahvičky v celkovém objemu 1,5 ml s následným inkubováním 5 minut při 37° C. Lahvičky byly vyjmuty z inkubátoru a umístěny v ledové lázni, prostředí bylo odebráno a nahrazeno použitím 1,25 ml pufru Lysis s obsahem 1% nonidet P-40, 0,5% sodné soli kyseliny desoxycholové,

0,1% SDS v 20 mm pufru Tris, pH 7,6, 150 mM chloridu sodného, mM fluoridu sodného, ImM orthovanadičnanpt sodného, 5 mM benzamidinu a 1 mM kyseliny ethylendiamintetraoctové s dalším obsahem proteasových inhibitorů PMSP, aprotininu a leupeptinu.

Po 10 minutách stání v ledu, aby došlo k solubilizování membrány, ^b?iy destičky seškrábnuty a buněčné lysáty byly vyčeřeny • ·

-52mikrocentrifugováním za nejvyšší možné rychlosti po 10 minut a zs teploty 4° 0. TIE-2 receptor byl imunoprecipitován z vyčištěné kapaliny nad sedlinou inkubovánim za studená s anti-TIE-2 polyklonálním antiserem a kuličkami proteinu s G-konjugovanou sefarosou. Kuličky byly omyty třikrát studeným oufrem pro lyžování buněk, povařeny 5 minut v pufru Laemli, který byl potom nanesen na 7,5%ní SDS-polyakrylamidový gel. Resolvované proteiny byly elektricky přeneseny na PVDP membránu (Lamblia-P) a potom vystaveny analyse Western blot za užití antifosfotyrosinové antilátky a reagens EC1. Následné porovnání velkových hladin TIE-2 proteinu na těchže výčiaějcích bylo provedeno ponořením anti-fosfotyrosinové antilátky a reinkubováním s polyklonálním antiserem, specifickým pro ekto-oblast TIE-2,

Příklad 10 Izolování a sekvencování klonu plné délky cDNA se zakódováním savčího TIE ligandu-3

TIE ligand-3 (TL3) byl klonován z myší BAC genomické sbírky (Research Genetics) hybridizováním sbírkových duplikátů se vzorky myšího TLI nebo myšího TL2, jak to odpovídalo celé kódovací sekvenci těchto genů. Každá kopie sbírky byla hybridizována za použití fosfátového pufru za teploty 55° C po dobu noci. Po hybridizování byly filtry promyty použitím 2 x SSG, 0,1% SDS při 60°C s následným vystavením filtrů X-paprskům přes film. Silné hybridizační signály byly zjištěny, odpovídající myšímu TLI a myšímu j TL2.Dále bjly zjištěny signály pro slabě hybridizované myší^ jak TLI, tak TL2. DNA, odpovídající těmto klonům, byla čistěna_p potom digerována s restrikčními enzymy a dva fragmenty, které se hybridizovaly na původní vzorky, byly subklonovány do bakteriálního plasmidu a sekvencovány. Sekvence fragmentů obsahovala dva exony s homologii jak pro myší TLI, tak pro myší TL2.

• · • · · · · · ·

Primery, specifické pro tyto sekvence, byly použity jako PCR primery k identifikování tkání, obsahujících transkripty, odpovídající TL3. PCR pás, odpovídající TL3, byl identifikován vesestave cDNA myššího uteru v lambda gt-11 (Clontech Laboratories, inc., Tálo Alto, CA).

Destičky byly umístěny v hustotě 1,25 x 10 ne desku 20 na 20 cm a replikované filtry byly odebrány za dalších stabdardizov_oných podmínek, viz Sambrook a spol., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2.vyd_e, str.8.46, Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York,* Duplikované filtry byly sebrány s normální” přesností (2 x SSC, 65° c) a vznikla tak 200 bp PCR radioaktivní proba, připravená pro myší/ TL3 sekvence. Hybridizování při 65° C v roztoku s obsahem 0,5 mg/ml DNA l.sosího sperma,

Filtry byly promyty dvakrát SSC při 65° C a exponovány 6 godin na filmu X-paprsky. Byly zachyceny dva pozitivní klony s dvojnásobnou hybridizací· Digesce EcoRI fágů DNA z těchto klonů indikovala dva nezávislé klony s vsunutými velikostmi asi 1,2 kb a asi 2 kb. Vsunutá část 2.2 kb EcoR byla subklonována na EcoRI stranu pBluesoript-u KS (Stratagene). Sekvenční analýza ukázala, še delší klon postrádal počáteční methionin a peptidový signál, ale jinak fcakodoval vzorek homologní pro oba myšší TLI a TL2.

Dva TL3-specifické PCR primery byly potom takto synthetizovány: US2: cctctgggctcgcca gttt^ttagg

USl: ccagctggeagatatcagg

Další PCR reakce byly provedeny za použití expresních svazků, odvozených od_irayši_ch, buněčných linií C2C12ras a MG87. Při primární PCR reakci byl použit specifický primer US2 spolu s vektorově-specifickými oligos, aby se tak umožnila araplifikace v každé z orientací, PCR byl v celkovém objemu 100 ml za použití 35 cyklů 94° C, 1 minuta 42° C, nebo 48° C po dobu 1 minuty;; 72° C 1 min. Sekundární PCR reakce zahrnovala druhý specifický primer, USl, který je obsažen v primárním PCR produktu spolu s týmž vektorovými oligos. Sekundární

-54reakce: 30 cyklů tytéž teploty a doby, jako uvedeno výše.

PCR produkty byly izolovány na gelu a pak použity pro sekvenční analýzu. Na podkladě sekvencí, získaných celkově ze 4 nezávislých PCR reakcí za užití dvou různých svazků cDNA byly odvozeny sekvence 5koncovky TK3. Northern analysis zjistila střední až nízkou hladinu transkriptu myššího TL3 v myšší placentě. Exprese myššího TL3 záležela v transkriptu asi 3 kb. Celá délka TL3 kódující sekvence je uvedena ve vyobr_o 6A-6B.

Myšší TL3 sekvence se mohou potom použít k získání lidského klonu, obsahujícího kódované sekvence její lidské protičásti hybridizováním buď lidského genomického nebo cDNA svazku s probou, odpovídající myššímu TL3, jak to již bylo popsáno dříve,například v příklad 8 Intern.Publ. WO 96/31 598, 10.10.1996.

Příklad 11 Izolování genomického klonu a plné délce se zakódováním lidského TIE ligandu-4

TIE ligand-4 (TL4) byl klonován z myššího BAC gebomického svazku (BAC HUMAN(II), Genome Systems lne) hybridizováním duplikátů svazku buď s lidskou TLI radioaktivní probou, odpovídající celkové fibrinogenové kódovací sekvenci TLI (nukleotidy 1153 až 1806) nebo s myšší TL3 radioaktivní probou, odpovídající segmentu cll86 nukleotidů z fibrinogénové oblasti myši TL2 (nukleotidy 1307 až 1492, viz vyobr.6A-6B. Každá proba byla značena pomocí PCR za použití přesných oligonukleoti dů a stgndartních PCR podmínek, pouze dCTP byl nahrazen použitím P^dCTP. PCR směs byla potom puštěna gélovou filtrační kolonou k oddělení prob od volného P^dCTPl Každá kopie svazku byla hybridizována za použití fosfátového pufru a radio_sktivní proby přes noc při 55° C za užití standardizovaných hybridizačních podmínek. Po hybridizování byly filtry promyty použitím 2 x SSC, 0,1% SDS při 55° C s následným vyvoláním filmu X paprsky. Byly pozorovány silné hybridizační signály, odpovídající lidskému TLI.

• ·· ♦ ·· ··· · ··· · • ·· · · • · · · · · • · · · · ··· ·· ·······

-55Dále pak byly identifikovány signály se slabou hybridizací jak na lidský TLI, tak i myšší TL3. DNA, odpovídající těmto klonům, byla čištěna za použití standardizovaných postupů, potom digerována s restrikčními enzymy a jeden fragment, který hybridizoval na původní proby, byl subklonován do bakteriálního plasmidu a sekvencován. Sekvence fragmentů obsahovala jeden exon s homologii jak lidského TLI, tak i myššiho TL3 a další členy TIE ligandové rodiny. Priméry, specifické pro tyto sekvence se mohou použít jako PCR priméry k identifikování tkání, obsahujících transkripty, odpovídající TL4.

Kompletní sekvence lidského TL4 se dá získat sekvencováním celého BAC klonu, obsaženého v uložených bakteriálních buňkách. Exony mohou být identifikovány homologii versus známé členy TIE-ligaodové rodiny, jako jsou TLI, TL2 a TL3. Celá kódovací sekvence TL4 se může potom stanovit spojením dohromady exonů z TL4 genomického klonu, který se naopak může použít k produkci TL4 proteinu. Jinak se mohou exony použít jako proby pro získání cDNA ^lonu plné délky, a ten se může potom použít pro produkci TL4 proteinu. Exony lze rovněž identifikovat z BAC klonové sekvence homologii k proteinovým oblastem, jako je fibrinogenová oblast,oblast svinutého závitu, nebo k proteinovým signálům, jako jsou sekvence signálního peptidu. Chybějící exony z BAC klonu lze získat identifikováním nepřetržitých BAC klonů, například použitím koncovek uUložených BAC klonů jako proby ke stínění lidského genomického svazku, jako je jeden ze zde použitých, použitím exonové sekvence obsažené v BAC klobech ke stínění cDNA svazku, nebo provedením buď 5 'nebo 3'postupu RACE za použití oligonukleotidových primerů založených na TL4 exonových sekvencích.

Identifikování dalších členů TIE ligandové rodiny

Nové TIE ligand-4—évé sekvence se mohou použít při racionálním hledání dalších členů TIE ligandové rodiny • · ι I • · • 4 ·· > 4 4 4 za využití přístupu, který využívá výhod existence zachovaných segmentů silné homologie mezi známými členy rodiny. Tak například napojení sekvencí aminokyselin TIE ligandu poukazuje na několik oblastí zachované sekvence (viz podškrtnuté oblasti na vyobr.7). Mohou se použít degenerované oligonukleotidy, založené v podstatě na těchto uzavřených sestavách v kombinaci buď s dříve již známku nebo novou TIE ligandovou homologií ve formě segmentů k identifikování nových TIE ligandů.

Vysoce zachované oblasti mezi TLI, TL2 a 'TL3 se mohou použít při vyznačování degenerovaných oligonukleotidových primerů pomocí kterých se vyznačují PCR reakce za použití kyselin cDNA. Templáty cDNA lze generovat reversní transkripcí tkáňových RNA kyselin za užití d(T) či dalších vhodných primerů. Alikvotní podíly PCR reakcí se mohou pak vystavit účinkům elektroforesy na agarosovém gelu. Získané amplifikované DMA fragmenty se mohou klonovat vsunutím do plasmidů, sekvencovat s porovnáním sekvencá DNA s těmi všech známých TIE ligandů.

Amplifikované fragmenty DNA se zvolenou velikostí z těchto PCR reakcí mohou být klonovány do plasmidů, zavedených do E.coli elektroporováním a transformáty umístit na selektiv ním agaru. Bakteriální kolonie z PCR transformování lze analyzovat sekvencováním plasmidových DNA kyselin, které se čistí standartními plasmidovými postupy*.

Klonované fragmenty obsahující segment nového TIE ligandu se mohou použít jako hybridizační pro by pro získání cDNA klonů plné délky ze svazku cDNA. Například se může využít genomická sekvence lidského TL4 k získání lidského cDNA klonu, obsahujícího kompletní kodov_Qcí sekvenci lidského TL4 hybridizováním lidského cDNA svazku s probou, odpovídající lidskému TL4, jak to již bylo dříve popsáno.

·· · ·· ·· ·· ·· · · ·· · · ·»·· • ·· · · · · ·· • · · · · · · ···· · ··· ·· · · · ··· ·· ··· ···· ·· ··

-51Příklad 12 Klonování kódovací sekvence hTL4 plné délky

Jak 5' > tak 3'kódovací sekvence genomického lidského TL-4 klonu se zakódovaným lidským TIS ligandem-4 (hTL-4 ATCC Acces.No.98 095) se získá restrikční enzymovou digescí, použitím Southern blotting e hybridizováním hTL-4 klonu na kódovací sekvence z myšího TL3 s následným subklonováním a sekvencováním hybridovacích fragmentů.

Kódovací sekvence, odpovídající N-koncovce a C-koncevce aminokyselin z hTL4 se použijí k označení PCR primerů (viz dole), které se pak dále použijí pro PCR amplifikování TL4 z lidských ovariálních cDNA. PCR pás byl identifikován jako odpovídající sekvencování lidského TL4 použitím DNA za dalšího použití ΑΒΪ 373A DNA sekvenceru a TAG Dedeoxy Terminátor Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Ino.,

Poster City, CA). PCR pás byl potom subklonován do vektorového pCR -skriptu a několik plasmidových klonů bylo analyzováno sekvencováním. Byla tak sestavena kompletní lidská TL4 kódovací sekvence, jak je to patrné z vyobr.8A-8C. Podle jiného provedení tohoto vynálezu se nukleotid v poloze 569 vymění z A na G, výsledkem čehož je změna aminokyselin z Q na R.

PCR primery, jak jsou popisovány zde výše, byly označeny takto:

hTL4atg 5 '-gcatgctatctcgagccaccATGCTCTCCCAGCTAGCCATGCTGCAG-3 ' hTL4 be z 5 ' gtgtcgacGcggccgetxtagatcagacTTAGATGTCCAAAGGCCGTATCATCAT-3'

Menší písmena značí koncové sekvence přidané k PCR primerům k usnadnění klonování amplifikova-ných PCR fragmentů.

Dále uvedené složky byly deponovány u American Type Culture Collection, 12301 Parklavm Drive, Rociville, Maryland 20 852 ve sgodě s budapešťskou dohodou;

-58• 99 · · • ·· • · · · 9 ··· 9«

99 ·· 99 • 9 9 · 9 9 9 9 • 9 9 9 99 • · 9 9999 9

9 9 9 «

999 9999 99 99

Deposita:

Rekombinantní bacilovirus Autographa californioa, zakodovávající TI2-2 receptorové látky byl uložen u ATCC 0^.10.1994 s označením ”vTIE-2 receptorová látky” pod ATCC Acces.No. VR2.484.

Kmen E.coli DH10B obsahující plasmid pBaLoEacll s vsunutým genem lidským TL-4, zakodovávající lidský ligand-4 byl uložen v ATCC 02,07.1996, označen jako ”hTL-4 pod ATCC Access Ro. 98o95.

Vynález není jakkoli omezován zde popisovanými specifickými provedeními. A skutečně obeznámeným na tomto úseku budou zcela jasná četná obměnění a četné variace ve smyslu předcházejícího popisu a přiložených vyobrazení. Takové modifikace spadají do rozsahu připojených nároků.

ADVOKÁTNÍ KANCELÁŘ VŠETEČKA ZcLíuTí’ ŠVORCÍK KALENSKÝ

A PARTNEŘI i 20 00 Praha 2, Háikova 2 Česká republika .No 4221 .í,

P<řI/US97:iO7Í8 i *

74/87

4 • « 4 4 4

-59WO 97/48804

J fr KtMF & CO

944 4444 44 9 4

Vyobrazení Ja

.W°-<.&221 .J. JJ5/97 • PCT/US97Í10718 • · »

··

WO 97/48804

J H KtMF & IV

-60CM

M

Cl ω

N

OJ

J4

O

ANGIOGENESE

η κι

Ji/37 » » • · ·· • · ·· t · • ·

4.Dec. jyys 14:39

WO 97/48804

J A KEMP & CO >&221 .p.

PCX/U$97JlO7Í8 ί « 9 + 999

9 · ······· · ·

1	o·
		O	1			Q)	J4
			03	co		•Γ3	O
		p	>				+3
			O	Í4	03	>	•rí
			X	Φ	>54	•H	X
'«i				β	X	X	•H
c			O	ft	O	X	42
Φ	l		Jsd	X	X	CO	G
tq	03	Ά. s—_x ><n	Ctí			Φ	•rl
Ή	X		•ra	Ή	Φ	G
>H	-P	V \ G		cí	V3		Ή
	'oj		'>»	X		Φ	>03
?»>	r-4		c	G	Φ	r-4	ft
X		—\;3	co	Φ	>N	co	CO
o	'ctí		>	iH	'CO		X

>

I •rl >

	X	O
	Φ	X
	G	G
	Φ	O
	O	W)
A		•rl i—l

Vyobrazení 3

Řízení TIE2 ligahdových látek

O
X X	'>3 G
'Ctí	CO	F-t
ft	X	Φ
ft	o	s
X	M	o
O	S	G
F4	O	O
ft	ft	s

•rl

	X	P
Ctí	tQ	Í4
ta	ca	Φ
φ	ft	s
X	X	o
X	o	G
G	1	O
	ft	S
ta

£2 ω

&fl'Ctí o cí X αχ ta •rl o co Η tj (—I x o x ft ft O

ft
1 o X P G
ft	P
>	X
ca	ft >
X	'ctí
ta co	N
ft	O
X o	X

♦

Z--v, ♦

•rl ft

1	'rl
φ :			G
•Γ-3	m	23	Φ >O
	G	O	a
φ	'Ctí	X	G
Ώ	X o	X 'Ctí	N
Φ	'rl	ft	ft
>N	s	•rl	X
'03	o	X	O
í>	Í4	o	R
	ft	ft	P.

Φ
ta	>φ		ř4
	G		Φ
Φ	N		β
>N	ca	O	O
'Ctí	; X	X	G
>	»P	<0	O
Φ	Fh	•Γ3	e
c	ft

'M

G i—l

Φ

X •rl

X •i V3

>0i	P·,.	ft
X cC ^:	Pl Φ	>o
X	β	*
o 1 i	ft X	'Φ G
Ή i	ft	ft
ft !	P	Φ	'Φ
O	β	X	a
		CO	ft
X	'Φ	>	ω
	G	o	X
.. P;	CD	X	ft
X	>	P	>N
G	O	X	P
CC	a	o	o
bi-	ft	ÍH	ft
ft I	ft	Pl
ft	φ X	O O >SS3 >φ X	Ctí

J A KtfrtP & CO • 0« «· » · « «· « « · • · · ó· · ··

ΗΟ.6Λ21 £.' KM pcakís97fl.07Ss z · · «♦· · ·

TLI f-Fc (ng/ml)

.ΜΟ-Λ221 J>. ?«/87

PCWS97Í107Í8 ’ ’ ²'

J A KEMP & CO « · • * *

-63• · · · · τ- l/ b ύ I J 3 0 I 4 · 4 U

WM y//4&Stl4 • ·· »'»··· » • » · ít ·*

O *

O\

Λ (ň * y u

.8

A »-l d

F ‘ g^Q

É$ J ϋ

O * {4 „ r- & J §« * rt o .. o o o * ř r>

^H Č5 ^σ♦ O

F o a: u š·^ o * tn o » \ÍJ

Ěí w «<

* 13 rt O L>

O tó o*0 >£it h y _gK

U ♦ t3 M

O + O ΙΛ U Ifí rt F

CJ * 8° o *

M· n

8“ g

Ďrt ^Wh &

o * r3 O 8« o * 8* f o * rí tn o * rt rt (Λ

O * rt rt o * u tn gx rt

O * 8 Ci m O ΓΊ ϋ

g° * o .

8*

0*0 rt rt o * «Η n

£x!

CJ * 8« 8 &

- g<n o * t—t *3* o

* %* o *

O rt

É* w * rt §^Ř§ ^αy *

5j trt

Vyobrazebí 6A 1/3 o * rt o + rt o

o <

w c

O *

Ol

O

O rt * o

O h r4 rt

6°

8« ^K ^Λ

Š* o *

Oi rt o

S ^wo * rt co rt

	O * (	5 C5
CJ	ÍN <
§	r4	3 κ	o
y			o
	9 {		rt

O * rH

O * F rt g* g r—} u

*

X o

*4 rt rt

X *

rt g* * g ω

8c, o

o ♦ 01 >

>

t.

tS u o * U σι o * co rt ►3 c£ c/>

o * rrt

3= σ

o ♦ u? O * £j O

0+0 oi Sr 0· *<

|* «4 * o *5 ⁵⁵o

S* 8« So ♦4 rt |J

S

Fi

F

Q

O « rrt o * w>

rt

Brt * 15 o * n

rt

	o O * Q CO rt rt	F
<	gí	F
	F		O
			u>
			04

¹⁴

So . Sl·

Ο» Sj5 v> χς m

Sj ^ω* Ču rt

F H O * rt m

U

S· 3* Sca o * rt rt o * rt rt

F a

σ o

rt

J A KtMF ťt CO

Vyobrazení 6A

I J 0 I “4 · 41 < »ι ίΜΟυι

O * σ\ lA

O * cú (A ϋ * r» in £ O

B^w |5 w § ^σ*c ♦ ¢5

8« o * rf vo in u

X e<

-64·

No - 5221 P ...79/87 • FCJ7uS$'#/lO'«8 · ··*· i « 4 4 '4*1 «

• 4

4 • 4 · *

4>

»44 *4

8ώ o

* $} tt 8n rt;

s· a«

MJ O y * «ί χζ 2

O w 0*0 m

MJ o go * 82, m a

O ř

KO

M3

O * KO

0 *	<5
Lh	*ú	O
ΚΠ	0
	0
	rt	2	0
*			n
			\o
	β!

δ o * 8 > # 0 ¹⁰ í?

3° *

o * o

in * u o

3« ^w * u

Q ^ο §s a * <

CS * 8« ^a

S * 8 a

MJ o

3«

O 4 Pí ΙΛ	§	21	g
	0		*5
	rt	X	0 * Λ
*	x?		O <
			MS
	0		O

ě>

* o

O > f-i

S 3* o * in ro *

CO <x

O o

o

SAi

CM

o.g

0*0

M tn O o * m

O8 « di íj « ^W á a o + 8 21 <s u r* s ^w* % 2

O * rH

Γ* í-i tl·

O * 8* SU o *

Ch vo

O ♦

MJ

8*3 u

§ * Sb

O eC. O o * O r>

co O s ^σ * 8^, o o

8^W«

2* czj ^w8 » 21 o*

S y — gx * g ti _ o « r-j o *

CO

0*0 £ 3* o + co f-2 *<

o.

^ř 80 * 8 ti <

O * r4

OK s*

Cu u š* su * fc*⁴o

B^K o * o

cn

8a o ♦ £-< 3«

So <3\ « y 3°

2)

CU «

fri

Γ g* o ri!

* £-* *c g ⁶¹ti * 8 H rtí 8 o * <

⁴⁰ M oj E-<

o * <r>

o ♦ & IH

8^U8 tn * *c $*

H O * £* > * < uj O o * rf

CO Ě* >

CQ O

O * r· (0 tí >

¹ 82. o o * vo

Φ a

ř* <5

C4

Ch

O * <n σκ * g ^H rii o * <Λ

CÚ «!

O * tn co

J A KtMP & CO

-65ς v · i J 0 ύ ) Η · Η I

WO »7/48804 * te ° * y r tn ft tu O t* t-* ♦ 3*

É$ >

V a *

DO o

r-i

O *

Γ' o

r-4

U)

O

O w

IX y ~ » ií K § c* o * o \O OH O rt * O š* o *

CĎ rH rH

Ka u

O * &J Ctí P> U Ή rH O g te δ*:

H O H gW t} * 5P

O »

ΙΛ rl a

di s

K w

K o « in <*i H o *

KO

CO eH a

Ο»

Cm % ^zo * <

Iři m ta H ‘gte * £5 !* g * y *< c*

0Ί te o * <n <N

Νς·.6221 .. Ρ·.«80/87 .·’· Pť*r/trs»7/wtKj’··*' • *· · í .* * **í · · • · .... ·· ·· e

..

O « O

1*5' H

H Ote a

	o * rn xř	o 8 H	rt
o	rH	$	O
Ol	*		te

te

U) w

0*0^ « pa

Vyobrazení βΑ 3/3 o + tn o

o * o Gh tH £

O

O g« íb

ΓΊ grf f h >

O * r?

vs s' S*

O <

H

O *

P) o

Ij

O * πΊ rH &4

H gte frH , go a 8

ÍM r-i rH

O 4 rH u, o

w te ><

§“ § ^M

O w

W ř· o

te

C3 te

5S

O

S^B i?*

O * rH x* rH a *

T-l <N o * o

P$ dl w

o t 1 te o * b <n * § t* te o + te oj u f*>

y o * 5« o cn o * F H _t í*> €h rH fa Cfl <

s® o * σ>

N

6“ * 8 n rt a * H ³ 8“ * § ^ašte te o ♦ tN .8®

É ts M

J te

S O o * a

O xř Ε-»

-< yte o * σ» o

te o

gte * te

O ♦ <o í*5

O te

Q O # U δ §» rt * o > $ κ

0*0 m> O H m te rH w

te v v I sl -J U I *t · t í.

wy yv/4tf8u4

J a KtMH & CU

-66«0-6221 ..P· .81/87 . · ·. PcaywStyioqps: ·.. · $ ώ u ín

8’ 8 o * rH

Ifl o * o ko ·

0*0 o * S σ + 8 w o < tn # £-, s*

H O * <

S o ι—I *4 o * ιώ en Q in 0 r-< £-<

a * 8

O ♦ fť co O

5

O « O o * a> < « io <3 rr-l A rH

O * U O * r- p íko ** ^4 o * <_) ® < a •sfi CJ rď

So o *

Γ in rH ga, v>

0*0 O * k0 rtj kO kd CJ ΓΗ A M

A kX)

M

CJ

0)

G5

J3

O ř>>

í>

§£ o * £-ΐ > f O

H *C

O M * H g$ X & > o * Ε-» v>

Hh

O ♦ in ·«♦

H u

s j

tz

O

V)

O * xř «#

o * Q K	0*0	O
u> &	un Q	un
m	ko O	r*
H o .	ri A	t-í

u o g*

O * d in in

H 0 Pí

O xr m

•g

Sj * o g M y

O « < JH V) ÉH in

O e> w * υ B* o * fN tn

© * E-,	o * p	O
xf W	rh O	n<
w> Č5	t- K	co
Ή Q	W p	H

o * a	O * G	O
m f*	ro ř	σ’»
u? u	Γ-· ří	CO
pH <t£	«-4	H

o * o	O * Em	O
w o	f\J H	w
kfl <	r- <	00
r4 ÍC	pH Λ	r4

O * W	o * p	O
l“4 w	r-f fl	K
kO <	Γ- H	00
rM Μ	»-f O	iH

8°

No-6.221 J· 32/SI

P<^/eS9t/l0tZ8 *··* , : . · ··:: :

• · k « ·· « « »

. -67Vyobrazení 7 j A KtMF & CO o

o

T-4

Ο <Λ

Ο <0

S4 ·&·&

' <g ’ϋ* ’ϋ¹ Ή rH (' A? A? > >

I 1 Η Η

I I · »

Ρ U 0» > >

I I I

S :fíH

I^aááá

3 «! « * *

tň m P P

>» >t ní B« o«»o «0 « k · » J rt i-4 r-4 Ή «rl β J4 A< Ji Ať

O OL ů X . .

<a i 4 ( i <N I 4 ( I ..

L I t > i

Vi p Q O « P P 4 I :2J^'

Sp > σι cn w 01 cn w <u <u <n cn P c ¥

O t>

: :£·4

Η Η Η H i-šmš ťd ‘Fe*

¥ u

c

I i t

I tet «] p P i Cn Ol «

Λ L p f-i rP ·—4 r-4 i—t H -4 ·Ρ K r-4 . rt «J > · ! ΐ · 4

I Ίίι *53· 'ď S<

! Cr Cr CT O* CT itw & — 'HSd

£ físT ύ ΰ δ’ i? ,σι οι « <a ·! jís • σ «ί p p ·Μ M t-< <4-4 - Μ M <W U4

S «! B E r £

V Cl «Ρ rs a 5> © a et to

P P >

sh *ú »0 nj nj ko £? H

U Μ Μ M •H · » ♦ ? « » » » / » O 4) » fij

P iti « Λ 9

O <			o
ift S	5 · <ú	01 · ·	in
H 5	3 H rS	rM <M rH	«

!§diHťť a e s e e • t » k <J) » T} «tí

ΙΛ I I I Ϊ ;5ΛΛ& Λ l · < > ·' I ttJ Λζ Ať Ať Ať ;·»·* « » · > ιΗ }> -Η Η £» . 4 « » * ’ a « « a ίΟΟ

W « Μ M ·

P P P P P * k 4 .

» »rt ·Η *H «*4 φ <u « v e • . · »H *H §· « b s5 &

H Š. f> p -H -ri -i-4 • * * U tt) o «I

Aí g §$$ s

» · « · « x tfáe g

r*l rt rM r-< rq Ct Bi te “ «ρ

Μ»

Οί

J &&«§ S » -Η ·Κ ‘rt »γ| 3 ·ρί ;Η £» -Η s κ a w ·_ · η α ' Ρ Ať Αί

Sgg & & έ έ syni η · · « »

I3 Ať Μ 45 Αί *Ρ ’ · β ·γ4 » ρ ρ “ » « «β «αι w σ § 8 α! .η •AŽ Ať « Ή ^!·5 ’ §04 • r-Ι <Η (Ρ γΜ

σ.

• 4 * · » < r-Í Η 44 Μ4 tft V) <& W

r-L/OL·· 1000 I 4 · 44

J A KtMP & CO • ·· • · · ·

Na.£221 „P. .83/87

Pť§T/USS{7/10J28i ‘, ♦ · ·· · · « • · <

♦ · ·♦

CM

Vyobrazení 7

Λ A Λ A Λ O Ϊ3 · · · «

O Q< < . · rl H ’Í«J s ,»§ §1 § λ c g c a

-68*· ****«♦ sms • · « t '

I » A 1

Μ Μ Μ Ή ·Κ • · < · *j W u ΰ sa 2»bíí

O ιΛ o

o

ΓΩ θ' β β Aí Aí

Et i» ř> V tř’$ «f g< tř

M >W VI tft *H -rl « ‘ <« m <w <w ím >1 š ím

Oi <ň e> ti oi o « h « ft Oi ft Pi tr !3 g ε · « I » • » «

Ať Ať Ať Ať » fl tn oa · & n?

Ať Ať

o b 04 F	5 . ® «1 φ <u « ! & D\| ' -	o <N
m J	J «) · w a	M·
	í έ-s-séé

fl) Ať Aí ,

Oí · . *4 4-»

KS Ή <W r-t A3 • fl) fl) · o-ggčč d ΐ τί d <X 2» & Ch bi · Οι Oi · « a

Ať áí Ad M • ' Ss » « » .

Aí Áí At Ať *tí · · · « S c-l «Η <M <H hm srn ♦ 1 f <

* » * · * » · fl á ά ά a

J ň > J « I · «

Η H * ’ ' ‘ w w ♦Η -ri » 4

A! Ať a fl «) « 0>

•o ό flá *g Λ fl 5 R •H ri fl ♦ * *r| «řf

W3Š • · » fí »

4U -U U U Čti Ol O)jý jé

Qí (Η C tí S pí β Aí AČ

K · β R bi >

U * · e a

• · • ·

J A KfcMF & CO . Ng₄S22! .. P...84/87

PpTřUSmfl72S ·.♦·’ : .· · ··:: * _Z- ..»» ♦ · ** o* !> O fct u> U ca

H u o u tn u β

g

A h

O O rf υ

rf >

>

u>

►3 o

rt o

o ca rf <5

Ό

S° rf

CO

Ή

Cl

Φ «

CO ?4

JJ

P-í >

o o q 53 d rf o

a §

<5 rf o o o «Η u

o ta &

grf.

CJ o

& * rf υ

q tn £ 4

ΓΠ g° gw

8° o o d rf X rf O o

ga o .

rf ,

O A > rf 0 o

§ * o og^K o

rf <J a υ e* a

8⁰⁵ cj rf o q _ cngo rf ra 8 ^wo o rf σ 00 o tu rf rf , rf * o o a §° o

cn rf u

o ta E* ^Qo cí

O «

rf ta >

ra o

Γ' rf a

to rf &

U Λ V o o o 0 0

8* S Λ

CJ o E<

O

CJ th O 0 rf ra o EH u ta £*

O

3* o o tn a cu rf o

CJ

O rf »4 lu y* !4 v> O d □

rf *>

O

UJ d

rf σ a

o

3^a y

o c* a o ra o

ď d

ců ra

O (H u n o ⁰⁴ rf O ra a y

	rf a	o	rf ts	&
	rf	Ol	rf	o
		d
	o		U	0
	q **		rf ra	rf
O	0		rf	O
d
d	0 .			0

o>

d w rf dj Jů 8 ^w o rf rf 0 « d rf §

o rf o

a o

rf o O d O rf d rf gra w

rf

CJ

O O rf d 0 rf 8 ra rf ra 0 $ »4

S” tn 0

3*

3* q ·.

rf »4 O &

Of

O u rf rf o8^J<x> .

rf Ol o

gOf rf rf Cí a

O U <M o Ct n u rf 0 0 q rf rf 0 o rf Of co tj ra o

3° o8«

Of

O rf c* CJ a o to rf Of d O

SŠ <*Ί »4 U 0

3*

Q ca o P tn cíj o « rf rf rf o

rf H <^í

6« _cr i?» d^M !«

CJ CJ w ae t* rf

3“ o 8 ra tJ« o rf rf ga rf O 0 d $*· ga ° y « 33^s u

u

S* o

o 0 tň r-f rf

Et rf o o grf

O o O ď 0 rf « 0

O q ť o rf d tn y o ta fí

OD

33* řu g g » 0 gd §o 0° oi rf 0 § ® rf

Si ra rf ra s s &<

rf rf ga o fi C r* CJ rf u

gOf

CJ

W³ o a rf

Ol 0 tn w

oŽ° oo tn u 8^Wo go.

O

O 0

Kd⁰¹ go

O δ⁵ ° 3 ra to rf tn s

8ra rf od° tn rf

O 0 rf rf o tn CJ

O

3* ra o Η U d U tn •70v · ι j j u t . 40

WO 97/48804

J Λ KtMF 6 CO .··. .: ^·δ221.··.Ρ..··Ο5/87 ,♦·.. pqtw7/io7m:

·· ·· o

vo vo tn u vo

3* □

w rf a

8« α

o α ř?p υ _ g« fa A O fa • ^8>

o

8a <j o „ fa A U

O 0 _Λ« rf O o

m s

rf

0» a

o a

vo o

ΡΊ

VO £9 co

M

C!

CD

N

C3 fa £2

O

N

VO

0 rf

U

O rf 0

8a u

<2 g«

U u>

e° y« o

8a υ

o

8* α

Š⁵³ š* «α o U o > O „ O rf 0 u

8^rt

Cfí

O 0 oiSa vo O

O es o

CJ ta rf o 8 A <o <J vo

O o

Γ' ro vo c8 tó v

8a

VJ o

o w rf rf « o

o δ^σ s°

O

Tp g° s« & « fa H rf fa y<

o

O fa CJ o

m oo o

o vo o

_g« *3 g^w

O fa A o O rvo rj fa A O 0 á^w p

8«

O g

fa

U o

m řo **

Γo m

ro

CO o

ga o

OHH Ol rf OV

8* g* og>

tn fa

P ta *4

0,	a
y	0 0
*s	0
0	0
a ss	í$ cx

_o8«

So H 0 tí rf

Pí o

m o

v-<

080 oa 0 <řs

U fa A

CJ

M rf

O o w

L

S^K o

o fa rf

8>

o fa

0 C5

O

CJ W fa

8« e« ,

CJ < 0 0

PS rf o

A co

OC g>

o o

te

0« ř· fa y ***

S «ι rf

U *4}

8°

S ta fa α g« 0

3° fa H o rf 03 <0 0

O

O>

CO w

rf

CJ <&

<2

Et fa

O fa VO 0 ca fa

W rf o

w O rf ř**·

Ch U

S° tp

U o fa Vo 0 u <n fa

O

IP o

o rf M vn rf ov

8« oj o, u 0 o5«

0 y *· rf rtí < 0 ll· o u m y « cn fa

8>

o o

*í o «I

CJ i»· fa gw

CJ

M o cj i*»

O 0 ά Ct u

|,fa ll· o

o ▼H o

tH co

ÍU

C>

fa u u , 0 fa o 0 < o u o

fa w < a fa A O fa «i

8e*

SSÍU,

A O 0 ga g« g®

1« o

O fa ca

A 0 A < CX

O fa > o 0 *8>

σ

1« o o

58*

A g« o

Oi o

A fa

S^B § ° g.

o u sd« r-i

V

S §^E o O < r- 0 o

A rit U fa 0

0 o 0

S8fa e· s§°

A «Μ «£ g« o

u *C Q o 0 “Ί

A rtl A rf Of

O O

3§>

A o

Í»1 fa

A vn

A O rf JH fa CJ

8* φ φ

-72Ή Η Μ-5$

Claims

PATENTOVÍ NÁROKY φ φφφ φφφφ φ φ φ φ φφ φφ

1. Kompozice, obsahující TIE ligand v podstatě prostý jiných proteinů.
2. Izolovaná molekula nukleové kyseliny, zakodováva jící TIE ligando
3. Izolovaná molekula nukleové kyseliny, zakodovávající TIE ligand-3 nebo TIE ligand-4.
4. Izolovaná a vyčištěná molekula nukleové kyseliny, obsahující nukleotidovou sekvenci zakodovávající lidský TIE ligand-4, kde nukleotidová sekvence je zvolena ze skupiny, kterou tvoří (a) nukleotidová sekvence, zahrnující kódovací oblast lidského TIE ligandu-4, jak je to patrné z vyobr. 8A-8C, (b) nukleotidová sekvence, zahrnující kódovací oblast fibrinogenu podobné oblasti lidského TIE ligandu-4, jak je to patrné z vyobr. 8A-8C, (c) nukleotidová sekvence, jep se hybridizuje za mírně přísných podmínek na nukleotidovou sekvenci (a) nebo (b) a jež zakodovává ligand, vázající TIE receptor, a (d) nukleotidová sekvence, jež - jako důsledek degenerace generického kódu, se liší od nukleotidové sekvence (a), (b) nebo (c) a zakodovává TIE-2 ligand, který váže TIE-2-receptor .
5o Vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny podle nároku 9·.
6. Vektor podle nároku 5, kde molekula nukleové kyseliny je operativně vázána na expresní kontrolní sekvenci, v

schopnou řídit její espresi v hostitelské buňce.
7. Vektor podle nároku 6, který je plasraidem.

• ·

I « ·· • · · · ·

-73• · 9 ·

9 99

999 9 9

9 9

99
8. Izolovaný TIE ligand-4 v podstatě prostý jiných proteinů.
9. Izolovaný TIE ligand-4, zakódovaný molekulou nukleové kyseliny podle nároku 4.
10. Hostitelský vektorový systém pro produkci lidského TIE ligandu-4, zahrnující vektor podle nároku 6, v hostitelské buňce.
11. Hostitelský vektorový systém podle nároku 10, kde hostitelskou buňkou je bakteriální, kvasinková, hmyzí nebo savčí buňka.
12. Hostitelský vektorový systém, zahrnující hostitelský vektorový systém podle nároku 10 a TIE receptor, zakodovávající nukleovou kyselinu.
13. Způsob přípravy TIE ligandu-4, vyznačující se tím, že se pěstují buňky hostitelského vektorového systému podle nároku 11 na podmínek, dovolujících produkci

TIE ligandu-4, a izoluje se takto produkovaný TIE ligand-4.
14. Protilátka, jež specificky váže ligand podle nároku 9.
15. Protilátka podle nároku 14, jež je monoklonální protilátkou.

l6_o Receptorová látka, jež specificky váže ligand podle nároku 9.
17. Konjugát, obsahující ligand podle nároku 8, konjugovaný na cytotoxické činidlo.
18. Konjugát podle nároku 17, kde cytotoxickým činidlem je radioisotop nebo toxin.
19. Farmaceutická kompozice, obsahující ligand podle nároku 9 a farmaceuticky přijatelný nosič.

» · · · · • · · ·· • · ··· · · • · ·

-7420. Farmaceutická kompozice, obsahující protilátku podle nároku 14 a farmaceuticky přijatelný nosič.
21. Farmaceutická kompozice, obsahující receptorovou látku podle nároku 16 a farmaceuticky přijatelný nosič.
22. Farmaceutická kompozice, obsahující konjugát ⁴ podle nároku 17 a farmaceuticky přijatelný nosič.

,
23_o Izolovaná a vyčištěná molekula nukleové kyseliny, obsahující nukleotidovou sekvenci zakodovávající savčí TIE' ligand-3, kde nukleotidová sekvence je zvolena ze skupiny, kterou tvoří (a) nukleotidová sekvence, zahrnující kódovací oblast TIS ligandu-3, jak je to zachyceno na vyobr. 6A-6B, (b7 nukleotidová sekvence, zahrnující kódovací oblast fibrinogenu podobné oblasti TIS ligandu-3, jak je to zachyceno na vyobr. 6A-6B, (c) nukleotidová sekvence, jež se hybridizuje za středně přísných podmínek na nukleotidovou sekvenci (a) nebo (b) a jež zakodováva ligand, který váže TIS receptor, a (d) nukleotidová sekvence, která pro degeneraci genetického kódu by se hybridizovala na nukleotidovou sekvenci (a), (b) měno (c) a jež zakodováva ligand, který váže TIE receptor.
24. Vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny podle nároku 23« •
25. Vektor podle nároku 24, kde molekula nukleové kyseliny je operativně vázáns na expresní kontrolní sekvenci, schopnou řídit její expresi v hostitelské buňce.
26o Vektor podle nároku 25, který je plasmidem.
27. Izolovaný TIS ligand-3 v podstatě prostý jiných proteinů.
28. Izolovaný TIS ligand-3, zakódovaný molekulou nukleové kyseliny□ podle nároku 23.
29. Hostitelský vektorový systém pro produkci savčího »· > 4 ·· ·· ·· ·· • · · · · · • · · ·· • · ·· · · · • · · · • ·· · · · ··

-75TIE ligandu-3, obsahující vektor podle nároku 25 v hostitelské buňce.
30_o Hostitelský vektorový systém podle nároku v v _{z z}

29, kde hostitelskou buňkou je buňka bakteralm, kvasinková, hmxzí nebo savčí
31. Hostitelský vektorový systém, obsahující hostitelský vektorový systém podle nároku 28 a nukleovou kyselinu zakódovanou v TIE receptoru.
32. Způsob produkování TIE-ligandu-3, vyznačující se tím, že se pěstují buňky hostitelského vektorového systému podle nároku 30 za podmínek, dovolujících produkci TIE ligandu-3 a izoluje se takto produkovaný TIE ligand-3.
33. Protilátka, jež specificky váže ligand podle nároku 28.
34. Protilátka podle nároku 33, kterou je monoklonální protilátka.
35· Receptorová látka, jež specificky váže ligand podle nároku 28.
36. Konjugát, obsahující ligand podle nároku 28, konjugovaný na cytotoxické činidlo.
37. Konjugát podle nároku 36, kde cytotoxickým činidlem je radioisotop nebo toxin.
38. Farmaceutická kompozice, obsahující ligand podle nároku 28 a farmaceuticky přijatelný nosič.
39. Farmaceutická kompozice, obsahující protilátku podle nároku 33 a farmaceuticky přijatelný nosiě.
40.

látku podle

Farmaceutická kompozice, nároku 35 a farmaceuticky obsahující přijatelný receptorovou nosič.
41.

nároku 36 a

Farmaceutická kompozice, obsahující konjugát podl

KANCELÁŘ ₅,, /Ses-vKa Švorčík kalensKÝ

A RARTNEŘS

OO 00 Praha 2, Hálkova 2

Česká republika