CN1227603A - Tie－2受体配体(tie配体－3;tie配体－4)及其应用 - Google Patents

Tie－2受体配体(tie配体－3;tie配体－4)及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种分离的编码TIE配体家族成员的核酸分子。本发明还提供了编码TIE配体－3或TIE配体－4的分离的核酸分子。另外，本发明提供了一种特异性地结合TIE配体－3或TIE配体－4的受体。本发明还提供了特异性地结合TIE配体－3或TIE配体－4的抗体。本发明进一步提供了TIE的拮抗剂。本发明还提供了治疗组合物以及阻止血管生长的方法，促进新血管形成的方法，促进表达TIE受体的细胞生长或分化的方法，阻止表达TIE受体的细胞生长或分化的方法及减弱或抑制人肿瘤生长的方法。

Description

TIE-2受体配体(TIE配体-3； TIE配体-4)及其应用
本国际申请要求申请日为1996年6月19日的美国申请U.S.流水号08/665,926,1996年7月2日申请的美国临时申请60/021,087和1996年8月2日申请的美国临时申请60/022,999的优先权。在本申请全文中引用了多种公开物，这些公开物的内容以其全文引用进本申请以供参考。
                           前言
本发明总的说来涉及遗传工程领域，更具体地说，涉及受体酪氨酸激酶及其相关配体的基因，其插入重组DNA载体和编码的蛋白质在微生物的接受体株和接受体真核细胞中的生产。更具体地说，本发明涉及结合TIE-2受体的称为TIE配体-3和TIE配体-4的新配体以及涉及制备和使用该新配体的方法。本发明进一步提供了编码TIE配体-3或TIE配体-4的核酸序列，产生该核酸及其基因产物的方法。该新TIE配体以及编码它们的核酸可能在涉及内皮细胞和有关TIE受体的某些疾病，如涉及肿瘤血管形成的赘生性疾病，伤口愈合，血栓栓塞疾病，动脉粥样硬化和发炎疾病的诊断和治疗中有用。另外，该配体可用于促进造血干细胞的增生和/或分化。
本发明的生物学活性配体可用于促进表达TIE受体的细胞生长，存活，迁移，和/或分化和/或稳定或去稳定。生物学活性TIE配体可用于在培养物中体外维持表达TIE受体的细胞。例如，表达TIE受体的细胞和组织包括心和血管内皮细胞，晶状体上皮和心外膜及早期造血细胞。另外，这种配体可用于支持改造成表达TIE受体的细胞。而且，该配体和其相关受体可用于鉴定该受体的激动剂或拮抗剂的试验系统。
                        发明背景
负责分化的细胞和组织的发育，维持和修复的细胞行为大部分受经生长因子和相似配体及其受体传递的细胞间信号调控。受体位于相应细胞的细胞表面且它们结合称为生长因子以及其它激素样配体的肽或多肽。这种相互作用的结果是在相应的细胞中的快速生化变化以及细胞基因表达的快速和长期重调，与不同细胞表面相关的一些受体可结合特定的生长因子。
酪氨酸激酶对蛋白质上酪氨酸残基的磷酸化是一个主要的模式，其中信号通过质膜转导。一些熟知的蛋白质酪氨酸激酶基因编码多肽生长因子和激素的跨膜受体，如上皮生长因子(EGF)，胰岛素，胰岛素样生长因子-1(IGF-1)，来源于血小板的生长因子(PDGF-A和-B)和成纤维细胞生长因子(FGFs)。(Heldin等，细胞调节，1:555-566(1990)；Ullrich等，细胞，61:243-54(1990))。在每种情况下，这些生长因子经过与其相关受体的细胞外部分结合发挥其作用，这导致存在于受体细胞质部分的固有的酪氨酸激酶的活化。对内皮细胞的生长因子受体特别感兴趣是由于在一些重要的生理和病理过程，如血管形成，血管发生，动脉粥样硬化和发炎性疾病中可能涉及生长因子(Folkman等，科学，235:442-447(1987))。另外，一些造血生长因子的受体是酪氨酸激酶；这些包括c-fms，它是集落刺激因子1受体，Sherr等，细胞，41:665-676(1985)和c-kit在Huang等，细胞，63:225-33(1990)中报道的原始造血生长因子受体。
受体酪氨酸激酶根据其胞外结构域的特征性结构被分成进化亚家族(Ullrich等，细胞，61:243-54(1990))。这些亚家族包括EGF受体样激酶(亚类Ⅰ)和胰岛素受体样激酶(亚类Ⅱ)，各自在其细胞外结构域含有重复的同源富含半胱氨酸的序列。在eph样激酶的细胞外结构域也发现单个富含半胱氨酸的区域。Hirai等，科学，238:1717-1720(1987)；Lindberg等，分子细胞生物学，10:6316-24(1990)；Lhotak等，分子细胞生物学，11:2496-2502(1991)。PDGF受体以及c-fms和c-kit受体酪氨酸激酶可分成亚类Ⅲ；而FGF受体形成亚类Ⅳ。这些亚类的成员典型地经链内二硫键稳定细胞外折叠单元。这些所谓的免疫球蛋白(Ig)样折叠在含具有细胞结合或可溶性配体的许多种其它细胞表面受体的免疫球蛋白超家族的蛋白中发现。Williams等，免疫学年鉴，6:381-405(1988)。
受体酪氨酸激酶在其特异性和亲和力方面有区别。一般来说，受体酪氨酸激酶是糖蛋白，它由下列结构组成：(1)能结合特异性生长因子的细胞外结构域；(2)通常是蛋白质α-螺旋部分的跨膜结构域；(3)近膜结构域，受体可能在此受诸如蛋白质磷酸化调节；(4)酪氨酸激酶区，它是受体的酶成份；(5)羧基末端尾巴，在许多受体中它涉及酪氨酸激酶底物的识别和结合。
诸如另外的外显子剪接和基因启动子或多聚腺苷酸化位点的其它选择的过程据报道能从相同基因产生一些明显不同的多肽。这些多肽可含有或不含上面列出的各个结构域。因此，一些细胞外结构域可作为单独的，分泌蛋白表达，该受体的一些形式可缺乏酪氨酸激酶结构域和仅含有经跨膜区插入质膜的细胞外结构域加上短羧基末端尾巴。
以前经RT-PCR作为未知酪氨酸激酶同源cDNA片段从人白血病细胞鉴定的编码内皮细胞跨膜酪氨酸激酶的基因由Partanen等，美国国家科学院院刊，87:8913-8917(1990)描述。该基因和其编码的蛋白质称为“TIE”，它是“具有Ig和EGF同源结构域的酪氨酸激酶”的缩写，Partanen等，分子细胞生物学，12:1698-1707(1992)。
已报道tie mRNA存在于所有人类胎儿和小鼠胚胎组织中。经检查，tie信使已定位于心血管内皮细胞。具体地说，tie mRNA定位于9.5至18.5日龄小鼠胚胎的血管和心内内皮中。与发育的卵泡和皮肤伤口肉芽组织相关的新血管形成期间显示出tie表达增强。Korhonen等，血液，80:2548-2555(1992)。因此认为TIEs在血管形成中发挥作用，它对形成治疗实体肿瘤和一些其它血管形成依赖性疾病如糖尿病性视网膜病，牛皮癣，动脉粥样硬化和关节炎较重要。
已报道2个结构上相关的大鼠TIE受体蛋白质由具有相关表达情况的不同基因编码。一个基因称为tie-1，它是人tie的大鼠同源物，Maisonpierre等，癌基因，8:1631-1637(1993)。另一基因tie-2可能是鼠tek基因的大鼠同源物，它与tie一样，已报道专一性地在小鼠内皮细胞和其假定的祖先细胞中表达。Dumont等，癌基因，8:1293-1301(1993)。tie-2的人类同源物在1995年9月5日批准的Ziegler的美国专利号5,447,860中描述(其中tie-2的人类同源物被称为“ork”)，本文引用其全文。
发现两个基因都在胚胎和出生后的细胞内皮细胞中广泛表达。tie-2转录物的明显水平也存在于其它胚胎细胞群体中，包括晶状体上皮，心外膜和间质区。Maisonpierre等，癌基因，8:1631-1637(1993)。
TIE受体在血管内皮中的优势表达表明TIE在血管系统的发育和维持中起作用。这可能包括在内皮细胞决定，增生，分化和细胞迁移及血管成分定型中的作用。对TIE-2缺陷型小鼠胚胎的分析显示它在血管形成，特别是在内皮细胞血管网形成中是重要的。Sato,T.N.等，自然，376:70-74(1995)。在成熟血管系统中，TIEs在内皮细胞存活，维持及对病原性感染的反应中发挥功能。
TIE受体也在原始造血干细胞，B细胞和巨核细胞亚组中表达，由此表明在早期造血，在B细胞分化和/或增生中及在巨核细胞分化途径中结合这些受体的配体作用。Iwama等，生物化学和生物物理研究通讯，195:301-309(1993)；Hashiyama等，血液，87:93-101(1996),Batard等，血液，87:2212-2220(1996)。
申请人以前鉴定了一种血管生成因子，它最初称为TIE-2配体-1(TL-1)，但也称为血管生成素-1(Ang1)，它通过TIE-2受体传递信号且对小鼠正常血管形成是必需的。经过同源性筛选，申请人还鉴定了一种Ang1相关物，称为TIE-2配体-2(TL2)或血管生成素-2(Ang2)，它是Ang1和TIE2受体的天然存在的拮抗物。为了描述TL1(Ang1)和TL2(Ang2)的克隆和测序及其制备和使用方法，本文参考1996年4月18日公开的PCT国际公开号WO 96/11269和1996年10月10日公开的PCT国际公开号WO 96/31598(两者均属于Regeneron Pharmaceuticals,Inc.)，和S.Davis等，细胞，87:1161-1169(1996)，各文献在本文引用以供参考。Ang 1缺乏在发育的小鼠胚胎中引起严重的血管异常，C.Suri等，细胞，87:1171-1180(1996)。Ang1和Ang2提供天然存在的血管形成的正、负调节剂。根据同时作用的血管形成，TIE2的正或负调节很可能产生不同的结果。
                      发明概述
本发明提供了包含基本上不含其它蛋白质的TIE配体-3或TIE配体-4的组合物。本发明还提供了分离的编码TIE配体-3的核酸分子和编码TIE配体-4的分离的核酸分子。该分离的核酸可以是DNA，cDNA或RNA。本发明还提供了包含分离的编码TIE配体-3或TIE配体-4的核酸分子的载体。本发明进一步提供了在合适的宿主细胞中生产具有TIE配体-3或TIE配体-4生物学活性的多肽的宿主载体系统。合适的宿主细胞可以是细菌、酵母、昆虫或哺乳动物。本发明还提供了生产具有TIE配体-3或TIE配体-4生物学活性的多肽的方法，包含在允许该多肽生产的条件下培养宿主-载体系统的细胞并回收所产生的多肽。
本文描述的本发明的编码TIE配体-3或TIE配体-4的分离的核酸分子进一步用于形成配体、其片段或衍生物，或称为受体激动剂或拮抗剂的另一分子作为用于治疗患有涉及表达TIE受体的细胞，组织或器官的紊乱的病人的治疗剂。本发明还提供了特异性地结合这种治疗分子的抗体。该抗体可以是单克隆或多克隆的。本发明还提供了使用该单克隆或多克隆抗体测量病人样品中治疗性分子含量的方法以便监测治疗过程。
本发明还提供了特异性地结合TIE配体-3或TIE配体-4的抗体。该抗体可以是单克隆或多克隆的。因此，本发明进一步提供了包含一种特异性地结合TIE配体-3或TIE配体-4的抗体和一种药用上可接受的载体的治疗组合物。本发明还提供了经过施用有效量的包含在药用上可接受的载体中的特异性地结合TIE配体-3或TIE配体-4的抗体的治疗组合物阻断哺乳动物血管生长的方法。
本发明进一步提供了包含在药用上可接受的载体中的TIE配体-3或TIE配体-4的治疗组合物。本发明还提供了经过施用有效量的包含在药用上可接受的载体中的TIE配体-3或TIE配体-4的治疗组合物促进病人新血管形成的方法。在一个实施方案中，该方法可用于促进伤口愈合。在另一实施方案中，该方法可用于治疗局部缺血。在另外一个实施方案中，单独或与其它造血因子结合使用TIE配体-3或TIE配体-4以促进造血干细胞，B细胞或巨核细胞的增生或分化。
另外，本发明提供了TIE配体-3或TIE配体-4可偶联到细胞毒剂上并由此制备治疗组合物。本发明进一步提供了特异性地结合TIE配体-3或TIE配体-4的受体。本发明进一步提供了包含在药用上可接受的载体中的特异性地结合TIE配体-3或TIE配体-4的受体的治疗组合物。本发明还提供了经过施用有效量的包含在药用上可接受的载体中的特异性结合TIE配体-3或TIE配体-4的受体融合体的治疗组合物阻断哺乳动物血管生长的方法。
本发明还提供了TIE受体拮抗剂以及在哺乳动物中抑制TIE配体-3或TIE配体-4生物学活性的方法，包含给哺乳动物施用有效量的TIE拮抗剂。根据本发明，该拮抗剂可以是本文描述的TIE配体-3或TIE配体-4，抗体或能特异性地结合TIE配体-3，TIE配体-4或TIE受体的其它分子，或含TIE配体-3或TIE配体-4的纤维蛋白原样结构域的配体融合体。
                      附图简述
图1A和1B.TIE-2受体融合体(TIE-2RB)抑制鸡胚胎绒毛膜尿囊膜(CAM)中的血管形成。用6μgRB浸泡的单片可消溶的明胶泡(Gelfoam)立即插入1日龄鸡胚CAM中。再培养3天后，取出4日龄胚及周围的CAM并检查。图1A：用EHK-1RB(rEHK-1 ecto/hIgG1 Fc)处理的胚存活并在其周围CAM中具有正常形成的血管。图1B：全部用TIE-2RB(rTIE-2 ecto/h IgG1 Fc)处理的胚死亡，大小减小并几乎完全缺乏周围血管。
图2.TIE-2/TIE配体在血管形成中假定的作用的示意图。TL1以(·)表示，TL2以(*)表示，TIE-2以(T)表示，VEGF以(□)表示，flk-1(VEGF受体)以(Y)表示。
图3.TIE-2配体的示意图，显示了“螺旋状圈”和纤维蛋白原样结构域以及使用抗myc-标记和Fc标记改造纤维蛋白原样结构域的多聚体。
图4.在定量无细胞结合试验中TIE-2-IgG结合固着的TL1的典型曲线。
图5.显示在定量无细胞结合试验中含有结合于IgG(TL1-fFc)的Fc结构域上的配体纤维蛋白原样结构域的TIE-2配体1配体融合体结合固着的TIE-2胞外结构域的典型曲线。
图6A-6B.TIE配体-3的核苷酸和推断的氨基酸(单字母密码)序列。该编码序列开始于47位。纤维蛋白原样结构域开始于929位。
图7.TIE配体家族成员的氨基酸序列比较。mAng3=mTL3=小鼠TIE配体-3；hAng 4=hTL 4=人TIE配体-4；hAng 1=hTL 1=人TIE-2配体1；mAng 1=mTL 1=小鼠TIE-2配体1；mAng 2=mTL 2=小鼠TIE-2配体2；hAng 2=hTL 2=人TIE-2配体2。下面划线的区域表示在家族成员中保守的同源区域。
图8A-8C.TIE配体-4的核苷酸和推断的氨基酸(单字母密码)序列。箭头表示核苷酸位置569。
                       发明详述
正如下文以更详细的方式所描述的，申请人分离了并鉴定了一种与结合TIE-2受体的TIE-2配体相关的新配体。该新配体可从天然纯化或经重组制备，在本文中称之为TIE配体-3(TL3)和TIE配体-4(IL4)。其它TIE配体家族成员在本文称为TIE-2配体1(TL1)(也称为血管生成素-1(Ang1))和TIE-2配体2(TL2)(也称为血管生成素-2(Ang2))。申请人在本文中描述了一个TIE配体家族并鉴定了家族成员中的保守同源区。因此预期该新的配体TL3和TL4在血管形成和造血过程中具有相似于已知配体TL1(Ang1)和TL2(Ang2)的功能和用途。
本发明包括该新的配体和其氨基酸序列，以及包含天然存在的等位变异体的其功能等同变异体，结合TIE受体并充当其激动剂或拮抗剂的蛋白质或包含对所述序列的取代，缺失或插入突变的多肽。该变异体包括序列内氨基酸残基被残基取代导致沉默变化的多肽。例如，序列内的一个或多个氨基酸残基被发挥相当功能的极性相似的另一氨基酸取代导致沉默变化。序列内的氨基酸取代物可选自该氨基酸所属类型的其它成员。例如，非极性(疏水)氨基酸类型包括丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸，赖氨酸和组氨酸。带负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
还包括在本发明范围内的有表现出与TIE配体-3或TIE配体-4相同或相似生物学活性的蛋白质或其片段或衍生物及在翻译期间或之后进行不同修饰的衍生物，例如，经糖基化，蛋白水解裂解，连接到抗体分子或其它细胞配体上，等等。功能等同分子还包括含有修饰的分子，包括在特定重组宿主细胞中表达产生的N端修饰，例如，在某些细菌(例如，大肠杆菌)表达系统中产生的N端甲基化。功能等同物还包括对半胱氨酸分子进行氨基酸取代以增强分子稳定性并防止不需要的交联的突变体。
本发明还包括编码本文描述为TIE配体-3的蛋白质的核苷酸序列，编码本文描述为TIE配体-4的蛋白质的核苷酸序列，以及经过诸如转染，转导，感染，电穿孔或显微注射存在于合适表达载体中的编码本文所述的TIE配体-3或TIE配体-4的核酸遗传改造为产生该蛋白质的宿主细胞，包括酵母，细菌，病毒和哺乳动物细胞。本发明还包含诸如在Finkel和Epstein,FASEB J.9:843-851(1995)；Guzman等，PNAS(USA)91:10732-10736(1994)中所述的通过基因治疗技术导入编码TIE配体-3或TIE配体-4的核酸。
本领域的技术人员还将认识到本发明包含在诸如Sambrook等，分子克隆：实验室手册，第二版，Vol.1.pp.101-104，冷泉港实验室出版(1989)限定的中等严格条件下与推断的TIE配体3或TIE配体-4编码序列杂交的DNA和RNA序列。因此，本发明包含的核酸分子包括具有从本文所述制备的TIE配体-3或TIE配体-4氨基酸序列推导的序列的分子以及具有与该核酸序列杂交的核酸序列的分子，还有上述序列由于遗传密码的简并编码能结合TIE受体的配体并具有作为本文所述的配体的足够相同点的氨基酸序列和其它第一，第二和第三级特征以赋予该分子与本文所述的TIE配体-3或TIE配体-4相似的生物学活性的核酸序列。
因此，本发明包含一种分离并纯化的核酸分子，它含有编码哺乳动物TIE配体-3的核苷酸序列，其中该核苷酸序列选自：
(a)含有图6A-6B所示的TIE配体-3编码区的核苷酸序列；
(b)含有图6A-6B所示的TIE配体-3纤维蛋白原样结构域的编码区的核苷酸序列；
(c)在中等严格条件下与(a)或(b)的核苷酸序列杂交且编码结合TIE受体的配体的核苷酸序列；和
(d)除了遗传密码子的简并性外能与(a),(b)或(c)的核苷酸序列杂交且编码能结合TIE受体的配体的核苷酸序列。
本发明进一步提供了分离并纯化的由本发明分离的核酸分子编码的TIE配体-3。本发明还提供了一种载体，它含有包含编码哺乳动物TIE配体-3的核酸序列的分离的核酸分子。
本发明还包含一种分离并纯化的核酸分子，它含有编码人TIE配体-4的核苷酸序列，其中该核苷酸序列选自：
(a)含有包含在1996年7月2日保藏的命名为hTL-4的载体(ATCC保藏号98095)中的人TIE配体-4编码区的核酸序列；
(b)含有包含在1996年7月2日保藏的命名为hTL-4的载体(ATCC保藏号98095)中的TIE配体-4纤维蛋白原样结构域编码区的核酸序列；
(c)在中等严格条件下与(a)或(b)的核苷酸序列杂交且编码结合TIE受体的配体的核苷酸序列；和
(d)除了遗传密码的简并性外，能与(a),(b)或(c)的核苷酸序列杂交并编码结合TIE受体的配体的核苷酸序列。
本发明进一步包含一种分离并纯化的核酸分子，它含有编码人TIE配体-4的核苷酸序列，其中该核苷酸序列选自：
(a)含有图8A-8C所示的人TIE配体-4编码区的核苷酸序列；
(b)含有图8A-8C所示的人TIE配体-4纤维蛋白原样结构域的编码区的核苷酸序列；
(c)在中等严格条件下与(a)或(b)的核苷酸序列杂交并编码结合TIE受体的配体的核苷酸序列；和
(d)由于遗传密码的简并性而不同于(a),(b)或(c)的核苷酸序列，但编码结合TIE-2受体的TIE-2配体的核苷酸序列。
本发明进一步提供了分离并纯化的由本发明分离的核酸分子编码的TIE配体-4。本发明还提供了一种载体，它含有包含编码人TIE配体-4的核酸序列的分离的核酸分子。
使用本领域的技术人员已知的任何将DNA片段插入载体的方法可利用合适的转录/翻译控制信号和蛋白质编码序列构建编码TIE配体-3或TIE配体-4的表达载体。这些方法可包括体外重组DNA和合成技术及体内重组(遗传重组)。编码TIE配体-或TIE配体-4或其肽片段的核酸序列的表达可用有效连接到TIE配体-3或TIE配体-4编码序列上的第二种核酸序列来调节以便在用重组DNA分子转化的宿主中表达TIE配体-3或TIE配体-4蛋白质或肽。例如，本文描述的TIE配体-3或TIE配体-4的表达可用本领域已知的任何启动子/增强子元件来控制。可用于控制配体表达的启动子包括，但不限于在Squinto等，(细胞，65:1-20(1991))中所述的长末端重复序列；SV40早期启动子区域(Bernoist和Chambon，自然，290:304-310)；CMV启动子，M-MuLV5′末端重复序列，在Rous肉瘤病毒3′长末端重复中包含的启动子(Yamamoto等，细胞，22:787-797(1980))，疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等，美国国家科学院院刊，78:144-1445(1981))，腺病毒启动子，金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等，自然，296:39-42(1982))。原核表达载体，如β内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等，美国国家科学院院刊，75:3727-3731(1978))，或tac_启动子(DeBoer等，美国国家科学院院刊，80:21-25(1983))，也见“来自重组细菌的有用蛋白质”，科学的美国人，242:74-94(1980)；来自酵母或其它真菌的启动子成分如Gal4启动子，ADH(乙醇脱氢酶)启动子，PGK(磷酸甘油激酶)启动子，碱性磷酸酶启动子，和下面的表现出组织特异性并用于转基因动物的动物转录控制区：在胰腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等，细胞，38:639-646(1984))；Ornitz等，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50:399-409(1986),MacDonald，肝学，7:425-515(1987)；在胰腺β细胞中有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan，自然，315_:115-122(1985))，在淋巴样细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等，1984，细胞，38:647-658；Adames等，1985，自然，318:533-538；Alexander等，1987，分子细胞生物学，7:1436-1444)，在睾丸，乳腺，淋巴样和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺瘤病毒控制区(Leder等，1986，细胞，45:485-495)，在肝脏中有活性的白蛋白基因控制区(Pinkert等，1987，基因和发育，1:268-276)，在肝脏中有活性的甲胎蛋白基因控制区(Krumlauf等，1985，分子细胞生物学，5:1639-1648；Hammer等，1987，科学，235:53-58)；在肝脏中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等，1987，基因和发育，1-:161-171)，在髓样细胞中有活性的β-球蛋白基因控制区(Mogram等，1985，自然，315:338-340；Kollias等，1986，细胞，46_:89-94)；在脑少突神经胶质细胞中有活性的髓磷脂碱性蛋白质基因控制区(Readhead等，1987，细胞，48:703-712)；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区(Shani,1985，自然，314:283-286)，在下丘脑中有活性的促性腺释放激素基因控制区(Mason等，1986，科学，234:1372-1378)。本发明进一步包含能与编码TIE配体-3或TIE配体-4的RNA序列特异性地杂交以调节其表达的反义化合物的生产。(Ecker,U.S.专利号5,166,195,1992年11月24日出版)。
因此，根据本发明，将能在细菌或真核宿主中复制的包含编码本文所述的TIE配体-3或TIE配体-4的核酸的表达载体用于转染宿主，从而使该核酸表达以生产TIE配体-3或TIE配体-4，然后以生物学活性形式回收。本文所使用的生物学活性形式包括能与TIE受体结合并引起诸如分化功能的生物学反应或影响表达受体的细胞表型的形式。例如，这种生物学活性形式可诱导TIE受体酪氨酸激酶结构域的磷酸化。另外，该生物学活性可以是作为TIE受体的拮抗剂的效应。在另一实施方案中，TIE配体-3或TIE配体-4的活性形式是能识别TIE受体并从而在诊断和治疗中均用作靶向试剂的形式。根据该实施方案，该活性形式不必给任何表达TIE的细胞提供任何表型变化。
含基因插入物的表达载体可用4种常规方法鉴定：(a)DNA-DNA杂交，(b)“标记”基因功能的存在或缺失，(c)插入序列的表达和(d)PCR检测。在第一种方法中，插入表达载体中的外源基因的存在可使用包含与插入的TIE配体-3或TIE配体-4编码基因同源的序列的探针经DNA-DNA杂交检测。在第二种方法中，重组载体/宿主系统可基于载体中外源基因的插入引起的某些“标记”基因功能(例如，胸苷激酶活性，对抗生素的抗性，转化表型，杆状病毒中包含体形成等)的存在或缺乏来鉴定和选择。例如，如果编码TIE配体-3或TIE配体-4的核酸插入到载体的标记基因序列内，含该插入子的重组体以缺乏标记基因功能来鉴定。在第三种方法中，重组表达载体经过测定重组体表达的外源基因产物来鉴定。这种测定可基于诸如TIE配体-3或TIE配体-4基因产物的物理或功能特征，例如：以配体与用诸如可检测的抗体或其部分示踪的TIE受体或其部分的结合或以与产生的抗TIE配体-3或TIE配体-4蛋白或其部分的抗体的结合来测定。本发明的细胞可瞬时或优选在组成性永久地表达本文所述的TIE配体-3或TIE配体-4。在第四种方法中，可制备相应于tie特异性DNA序列的DNA核苷酸引物。然后，这些引物用于PCR tie基因片段。(PCR流程：方法和应用指南，Michael A.Innis等编辑，Academic Press(1990))。
可用允许随后形成稳定生物活性蛋白质的任意技术纯化重组配体。优选的是，该配体分泌进培养基中并从中回收它。另外，该配体可从细胞中以可溶性蛋白质或作为包含体回收，对于包含体，可用8M盐酸胍并根据熟知方法经透析大量提取。为了进一步纯化配体，可使用亲和色谱，常规离子交换层析，疏水相互作用层析，反相色谱或凝胶过滤。
在本发明的另外的实施方案中，正如在实施例中更详细所描述的，重组TIE配体-3或TIE配体-4编码基因可用于经同源重组灭活或“敲除”(khock out)内源基因，从而产生TIE配体-3或TIE配体-4缺陷细胞，组织或动物。例如但并非用作限制，重组TIE配体-3或IIE配体-4编码基因可改造成含插入突变，例如，neo基因，它可灭活本身的TIE配体-3或TIE配体-4编码基因。这种构建体在合适的启动子控制下可经过诸如转染，转导或注射的技术导入细胞，如胚胎干细胞。含该构建体的细胞可用G418抗性来选择。然后可经过诸如Southern印迹，PCR检测，Northern印迹或表达测定鉴定缺乏完整的TIE配体-3或TIE配体-4编码基因的细胞。然后将缺乏完整TIE配体-3或TIE配体-4编码基因的细胞与早期胚细胞融合以产生该配体缺陷型的转基因动物。该动物可用于限定在正常情况下依赖于该配体的特定体内过程。
本发明还提供了抗本文所述的TIE配体-3或TIE配体-4的抗体，它在配体的检测，例如诊断应用中有用。为了制备针对TIE配体-3或TIE配体4的单克隆抗体，可使用提供经培养物中的连续细胞系生产抗体分子的任何技术。例如，最早由Kohler和Milstein建立的杂交瘤技术(1975，自然，256:495 497)，以及三体瘤技术，人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983，当今免疫学，4:72)和生产人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(Cole等，1985，见“单克隆抗体和癌症治疗”Alan R.Liss,Inc.pp.77-96)和类似方法在本发明范围内。
单克隆抗体可以是人单克隆抗体或嵌合人-小鼠(或其它种类)单克隆抗体。可用多种本领域已知的任意技术制备人单克隆抗体(例如，Teng等，1983，美国国家科学院院刊，80:7308-7312；Kozbor等，1983，当今免疫学，4:72-79；Olsson等，1982，酶学方法，92:3-16)。可制备含小鼠抗原结合结构域及人恒定区的嵌合抗体分子(Marrison等，1984，美国国家科学院院刊，81:6851,Takeda等，1985，自然，314:452)。
本领域已知的各种方法可用于生产抗本文所述的TIE配体-3或TIE配体-4的表位的多克隆抗体，为了生产抗体，可用TIE配体-3或TIE配体-4或其片段或衍生物注射免疫各种宿主动物，包括但不限于兔，小鼠和大鼠。根据宿主种类，可使用各种佐剂增强免疫反应，包括但不限于弗氏(完全和不完全佐剂)，矿物胶，如氢氧化铝，表面活性物质，如溶血卵磷脂，pluronic多元醇，多聚阴离子，肽，油乳剂，钥孔血蓝蛋白，二硝基苯酚，和潜在有用的人佐剂，如BCG(卡介苗)和小棒杆菌。
可用已知技术制备抗选定TIE配体-3或TIE配体-4表位的抗体的分子克隆。重组DNA方法(例如，见Maniatis等，1982，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室，纽约冷泉港)可用于构建编码单克隆抗体分子或其抗原结合区的核酸序列。
本发明提供了抗体分子及该抗体分子的片段。含该分子独特型的抗体片段可用已知技术生产。例如，该片段包括但不限于：经胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab′)2片段；经还原F(ab′)2片段的二硫桥产生的Fab′片段，经过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生的Fab片段。可用已知技术纯化抗体分子，例如，免疫吸附或免疫亲和层析，色谱方法如HPLC(高效液相色谱)或其组合。
本发明进一步包含测量生物学样品中TIE配体-3或TIE配体-4含量的免疫试验，经过：
a)将生物学样品与至少一种能特异性地结合TIE配体-3或TIE配体-4的抗体结合以便该抗体与存在于样品中的任何TIE配体-3或TIE配体-4形成复合物；和
b)测量复合物的量并由此测定生物学样品中TIE配体-3或TIE配体-4的总量。
本发明进一步包含一种测定生物学样品中TIE受体总量的试验，经过：
a)将生物学样品与至少一种本发明的配体接触从而使配体与TIE受体形成复合物；和
b)测定复合物的总量，从而测定生物学样品中TIE受体总量。
本发明还提供了使用TIE配体-3或TIE配体-4支持TIE受体表达细胞存活和/或生产和/或迁移和/或分化。因此，该配体可用作一种添加剂以支持例如培养物中的内皮细胞。
另外，申请人对TIE受体的其它配体的发现使试验系统的利用对TIE受体激动剂或拮抗剂的鉴定有用。该试验系统在鉴定能启动或抑制血管形成的分子中有用。例如，在一个实施方案中，TIE受体拮抗剂可鉴定为能干扰TIE受体与生物活性TIE配体-3或TIE配体-4相互作用的试验分子。按其能力鉴定该拮抗剂是：1)使用例如BIAcore生物传感器技术(BIAcore；Pharmacia Biosensor,Piscataway,NJ)测量时抑制生物活性TIE配体-3或TIE配体-4与受体的结合；或2)抑制生物活性TIE配体-3或TIE配体-4引起生物学反应的能力。该生物学反应包括但不限于TIE受体或TIE信号转导途径下游成分的磷酸化，或携带TIE受体的细胞的存活，生长或分化。
在一个实施方案中，改造成表达TIE受体的细胞可依赖于加入TIE配体-3或TIE配体-4的生长。该细胞提供鉴定TIE受体的其它激动剂或能干扰TIE配体3或TIE配体-4对该细胞之活性的拮抗剂的有用的试验系统。另外，改造成能共同表达TIE配体-3和受体，或TIE配体-4和受体的自分泌型细胞可在分析潜在的激动剂或拮抗剂中提供有用的系统。
因此，本发明提供了将TIE受体导入正常情况下不表达该受体的细胞，从而使该细胞表现出深度的且易于区分的对结合该受体的配体的反应。诱导的反应类型取决于所用的细胞，而不是导入细胞的特定受体。可选择合适的细胞系以产生对分析及发现能作用于酪氨酸激酶受体的分子最有用的反应。该分子可以是任意类型的分子，包括但不限于将在受体特异性方式中进行描述的在系统中发挥作用的肽和非肽分子。
采用的一个更有用的系统包括将TIE受体(或含有另一受体酪氨酸激酶，例如，trkC的胞外结构域和TIE受体胞内结构域的嵌合受体)导入成纤维细胞系(例如，NIH3T3细胞)，从而在正常情况下不介导增生反应的这类受体在导入成纤维细胞后可经过许多已建立的方法定量成纤维细胞生长因子的效应来分析(例如，胸苷掺入或其它类型的增生试验；见van Zoelen,1990，“检测多肽生长因子的生物学分析的应用”，Progress.Fatcor Research,Vol.2.pp.131-152；Zhan和M.Goldfarb,1986，分子细胞生物学，Vol.6,pp.3541-3544)。这些分析的额外优势是可能具有导入的受体的细胞系及缺乏该受体的亲本细胞系分析任何制品；由于通过导入的受体介导，仅可判断对具有受体的细胞系的特定影响。该细胞可进一步改造成表达TIE配体-3或TIE配体-4，从而产生对分析以拮抗剂/激动剂相互作用起作用的分子有用的自分泌型系统。因此，本发明提供了包含编码TIE配体-3或TIE配体-4的核酸及编码TIE受体的核酸的宿主细胞。
TIE受体/TIE配体-3或TIE配体-4的相互作用还提供了对鉴定小分子TIE受体的激动剂或拮抗剂有用的系统。例如，可鉴定结合TIE受体但不诱导任何其它生物学活性的TIE配体-3或TIE配体-4片段，突变体或衍生物。另外，TIE配体-3或TIE配体-4的鉴定使该分子的活性部分的测定成为可能。而且，配体的鉴定使受体/配体复合物X-射线晶体结构的测定成为可能，从而能够鉴定受体的结合位点。对结合位点的认识将提供合理设计新激动剂和拮抗剂的有用参考。
试验分子与TIE受体的特异性结合可以许多方法来测定。例如，试验分子与表达TIE的细胞的实际结合可经过检测或测量下列物质来检测或测量：(ⅰ)结合到完整细胞表面的试验分子；(ⅱ)与细胞溶胞产物中TIE蛋白质交联的试验分子；或(ⅲ)体外与TIE结合的试验分子。试验分子与TIE之间的特定相互作用可经过使用证实该相互作用独特特征的试剂来评价。
作为一个具体的非限制性的例子，可如下使用本发明的方法，考虑其中样品中的TIE配体3或TIE配体-4待测的情况。将各种稀释度的样品(试验分子)与不含TIE配体-3或TIE配体-4活性的阴性对照(NC)和含已知量TIE配体-3或TIE配体-4的阳性对照(PC)在可检测标记的TIE配体-3或TIE配体-4(在本实施例中是放射性碘标记的配体)存在下平行地与表达tie的细胞接触。试验样品中TIE配体-3或TIE配体-4的总量可经过测定与对照及在各稀释度下结合的125I-标记的TIE配体-3或125I-标记的TIE配体-4总量，然后比较样品值与标准曲线来评价。样品中TIE配体-3或TIE配体-4越多，与TIE结合的125I-配体越少。
125I-配体结合总量可经过测量每细胞中的放射活性总量或按Meakin和Shooter,1991-,Neuron 6:153-163所述使用DSS将TIE配体-3或TIE配体-4交联到细胞表面蛋白上并使用诸如能揭示具有相应于TIE受体/TIE配体-3或TIE受体/TIE配体-4大小的标记蛋白的SDS聚丙烯凝胶电泳检测细胞提取物中标记蛋白质的总量来测定。特定的试验分子/TIE相互作用可进一步经过向分析物中加入各种稀释度的不结合TIE受体并因此对标记的TIE配体-3或TIE配体-4和试验分子竞争结合TIE基本上无影响的未标记的对照配体来测定。另外，已知能破坏TIE受体/TIE配体-3或TIE配体-4结合的分子，例如，但不局限于抗TIE抗体，或本文所述的TIE受体融合体预期会干扰125I-TIE配体-3或125I TIE配体-4和试验分子对TIE受体结合的竞争。
可检测的标记的TIE配体-3或TIE配体-4包括，但不限于共价或非共价连接到放射活性物质，荧光物质，具有酶活性的物质，用作酶底物的物质(优选与比色法可检测到的相关的酶和底物)或能被抗体分子(优选可检测标记的抗体分子)识别的物质上的TIE配体-3或TIE配体-4。
另外，试验分子与TIE的特异性结合可经过评价TIE配体-3或TIE配体-4/TIE受体结合的次级生物学效应，包括但不限于细胞生长和/或分化或立即早期基因表达或TIE磷酸化来测定。例如，试验分子诱导分化的能力可在缺乏tie的细胞及在表达tie的可比较细胞中测定，在表达tie的细胞中分化但不在缺乏tie的可比较细胞中分化表明有特异性的试验分子/TIE相互作用，经过测定立即早期基因(例如fos和jun)在tie阴性和tie阳性细胞中的诱导，或经过使用本领域已知的标准磷酸化测定检测TIE的磷酸化可进行相似分析。这类分析在鉴定激动剂或不竞争性结合TIE的拮抗剂中可能有用。
同样，本发明提供了一种鉴定具有TIE配体-3或TIE配体-4生物学活性的分子的方法，包括：(ⅰ)将表达tie的细胞与试验分子接触，(ⅱ)检测试验分子与TIE受体的特异性结合，其中与TIE的特异性结合与TIE样活性正相关。如上文所述，可经过分析直接结合或结合的次级生物学效应来检测特异性结合。该方法在鉴定TIE配体家族的新成员或在制药工业中，在筛选大量肽和非肽分子(例如，肽类似物)与TIE相关的生物学活性中特别有用。在本发明的一个优选的、具体的非限制性实施方案中，制备许多孔的培养物孔，在不同的孔排中含有PC12(或成纤维细胞，见下面)细胞，它们是tie阴性或改造成tie阳性。然后加入各类试验分子，使各孔中或其一部分中含有不同的试验分子。然后计数各孔是否存在生长和/或分化。以这种方式可筛选出极大数目的试验分子的该活性。
在另一实施方案中，本发明提供了检测或测量TIE配体样活性或鉴定具有该活性的分子的方法，包含：(ⅰ)在允许发生结合的条件下，将试验分子与体TIE受体蛋白质接触，(ⅱ)检测试验分子与TIE受体蛋白质的结合，其中试验分子与TIE受体的结合与TIE配体样活性相关。根据该方法，TIE受体可以是或不是基本上纯化的，可以固定于固相支持物上(例如，作为亲和柱或作为ELISA试验)，或可以掺入人工膜上。试验分子与TIE受体的结合可用本领域已知的任何方法来评价。在优选的实施方案中，试验分子的结合可经过评价其与可检测标记的已知TIE配体竞争结合TIE受体的能力来评价。
本发明还提供了检测试验分子发挥TIE配体样活性拮抗剂的能力的方法，包含检测该分子抑制TIE配体结合表达该受体的细胞上TIE受体的效应的能力。该拮抗剂可干扰或不干扰TIE受体/TIE配体-3或TIE配体4结合。TIE配体-3或TIE配体-4与TIE受体结合的效应优选是生物学或生化效应，包括但不限于细胞存活或增生，细胞转化，立即早期基因诱导或TIE磷酸化。
本发明进一步提供了鉴定抗体或其它能中和配体或抑制与受体结合的分子的方法以及该方法鉴定的分子。作为非限制性例子，该方法可以经过在概念上相似于ELISA试验的试验来进行。例如，TIE受体融合体可结合于固相支持物上，如塑料多孔板。作为对照，将已进行Myc标记的已知量的TIE配体-3或TIE配体-4导入孔中，然后借助于抗Myc-标记的报道抗体鉴定结合受体融合体的任何标记的TIE配体-3或TIE配体-4。然后，该试验系统可用于筛选试验样品中具下列能力的分子：(ⅰ)结合标记的配体，(ⅰ)结合受体融合体，从而抑制标记的配体与受体融合体的结合。例如，将含推定的目的分子及已知量标记配体的试验样品导入孔中并测定结合受体融合体的标记配体的总量。经过比较试样中结合的标记配体总量与对照的总量，可鉴定含有能抑制配体与受体结合的分子的样品。由此鉴定的目的分子可使用本领域的技术人员已知的方法分离。
一旦发现了配体结合的阻断剂，本领域的技术人员将知道进行次级试验以确定该阻断剂是与受体还是与配体结合，以及进行确定是否阻断剂分子能中和配体生物学活性的试验。例如，经过使用采用BIAcore生物传感器技术(或相当技术)的结合试验，其中TIE受体融合体或TIE配体-3或TIE配体-4或配体融合体共价附着于固相支持物(例如，在金表面的羧甲基葡聚糖)上，本领域的技术人员将能测定阻断剂分子是否能特异性地结合配体，配体融合体或结合受体融合体。为了确定阻断剂分子是否能中和配体的生物学活性，本领域的技术人员可进行磷酸化试验(见1996年10月10日公开的国际公开号WO 96/31598中的实施例5)或另外的功能生物测定，如经过使用诸如内皮细胞的原代培养物进行存活测定。另外，结合受体融合体的抑制剂分子可以是一种激动剂，本领域的技术人员经过进行合适的分析鉴定TIE受体的其它激动剂将了解如何进行确定。
另外，本发明还涉及组合物，其中TIE配体是本文所述的TIE配体-3或TIE配体-4的受体结合结构域。例如，TIE-2配体1含有“螺旋圈”结构域和纤维蛋白原样结构域。据信TIE-2配体2的纤维蛋白原样结构域与配体1在相同的氨基酸序列处或附近开始(FRDAC)。据信TIE配体-3的纤维蛋白原样结构域开始或大约开始的氨基酸序列由大约图6A-6B所示的位置929处开始的核苷酸编码。配体产生期间螺旋状圈结构域的多聚体化妨碍了纯化。如实施例7所述，申请人却发现了含有TIE-2受体结合结构域的纤维蛋白原样结构域。
然而，纤维蛋白原样结构域的单聚体形式似乎不结合受体。利用以抗myc抗体“聚集”的myc-标记的纤维蛋白原样结构域进行研究却结合TIE-2受体。[产生“聚集的”配体和配体融合体的方法在Davis等，科学，266:816-819(1994)中描述]。根据这些发现，申请人生产了“配体融合体”，它含有偶联到IgG Fc结构域上的TIE-2配体的纤维蛋白原样结构域(“fFc′s”)。这些形成二聚体的配体融合体有效结合TIE-2受体。因此，本发明涉及生产TIE配体-3或TIE配体-4的配体融合体，它们在诊断或治疗应用中可用作靶向试剂，例如，用于肿瘤和/或有关维管结构的靶向试剂，其中指示TIE拮抗剂。
在本文中本发明进一步提供了配体，其片段或衍生物，或作为受体激动剂或拮抗剂并用于治疗患有涉及表达TIE受体的细胞，组织或器官的疾病的病人的治疗剂的另一分子的形成。该分子可用于人或动物体的治疗方法或诊断方法。
由于已确定TIE受体与内皮细胞相关，且正如本文所证实的，对TIE-2配体1的阻断似乎防止血管形成，申请人预期TIE配体-3或TIE配体-4对于表明有血管形成的疾病或紊乱中血管形成的诱导有用。该疾病或紊乱包括伤口愈合，局部缺血和糖尿病。该配体可在动物模型中试验并按对其它试剂所述在治疗上使用，如血管内皮生长因子(VEGF)，但血管形成的另一内皮细胞特异性因子，Ferrara等，1994年7月26日出版的美国专利号5,332,671。Ferrara的参考文献，及其它研究描述了体外和体内的研究，可用于证实血管生成因子在促进血液流进局部缺血心肌，促进伤口愈合及在需要新血管形成的其它治疗情况中的效应。[见Sudo等，1993年7月7日公开的欧洲专利申请0 550 296A2；Banai等，循环，89:2183-2189(1994)；Unger等，美国生理学杂志，266:H1588-H1595(1994)；Lazarous等，循环，91:145 153(1995)]。根据本发明，TIE配体-3或TIE配体-4可单独或与一种或多种其它药用上有活性的化合物，如VEGF或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，以及细胞因子，神经营养蛋白等结合使用。
相反，TIE受体的拮抗剂，如本文实施例2和3所述的受体融合体，和1996年10月10日公开的国际申请号WO 96/31598中的实施例9中所述的TIE-2配体2对于防止或减缓血管形成，从而防止或延缓，例如肿瘤生长有用。这些试剂可单独或与其它成分结合使用，如已显示在治疗其中治疗目的是抑制血管形成的症状中有用的抗-VEGF抗体。申请人预期本文所述的TIE配体-3或TIE配体-4也可与诸如细胞因子拮抗剂，如已知抑制炎症的IL-6拮抗剂的试剂结合使用。
例如，申请人已确定TIE配体在肿瘤内的或与肿瘤相关的细胞中表达。例如，TIE-2配体2似乎与肿瘤内皮细胞密切相关。因此，它和其它TIE拮抗剂也在防止或减缓诸如肿瘤生长中有用。而且，TIE配体或配体融合体对于将毒素传递给携带受体的细胞中有用。另外，其它分子，如生长因子，细胞因子或营养物可经过TIE配体或配体融合体传递给携带TIE受体的细胞。诸如TIE配体-3或TIE配体-4的TIE配体或配体融合体也可用作TIE受体的诊断剂以检测体内或体外的受体。在与TIE受体相关的疾病状态中，诸如TIE配体-3或TIE配体-4的TIE配体或配体融合体可用作经过诸如组织染色或全身造影检测该疾病的诊断剂。该试剂包括放射性同位素、荧光染料，染料，酶和生物素。该诊断或靶向试剂可按Alitalo等，1995年10月5日公开的WO 95/26364和Burrows,F.和P.Thorpe,PNAS(USA)90:8996-9000(1993)所述来制备，本文以其全文进行引用。
在其它实施方案中，本文所述的诸如TIE配体-3或TIE配体-4的TIE配体用作造血因子。在血液中含有的各种细胞类型的增殖和/或分化和/或迁移中涉及许多造血因子及其受体。由于TIE受体在早期造血细胞中表达，所以预期TIE配体在这些细胞的增殖或分化或迁移中起相当大的作用。因此，例如，可制备，测定，在体外和体内生物学系统中检查含TIE的组合物并在治疗上使用，如下列任一文献所述：Sousa，美国专利号4,810,643,Lee等，美国国家科学院院刊，82:4360-4364(1985)；Wong等，科学，228:810-814(1985)；Yokota等，美国国家科学院院刊，81:1070(1984)；Bosselman等，1991年5月2日公开的题目为“干细胞因子”的WO 9105795和Kirkness等，1995年7月27日公开的题目为“造血成熟因子”的WO 95/19985。因此，TIE配体-3或TIE配体-4可用于诊断或治疗正常造血受抑制的症状，包括，但不限于贫血，血小板减少症，白细胞减少症和粒性白细胞减少症。在优选的实施方案中，TIE配体-3或TIE配体-4可用于刺激在如下情况中的血细胞前体分化，即具有引起正常血细胞水平下降的诸如获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的疾病的病人的情况中，或在需要造血群体增强的临床情况中，如在与骨髓移植相联的情况中，或在治疗由辐射，化学处理或化疗引起的发育不全或骨髓抑制中。
本发明的TIE配体-3或TIE配体-4可单独或与诸如细胞因子，神经营养因子，白细胞介素等的另一药用活性剂结合使用。在优选的实施方案中，该配体可以与已知诱导干细胞或其它造血前体增殖的任一上述众多因子或作用于造血途径晚期细胞的因子，包括，但不限于造血成熟因子，血小板生成素，干细胞因子，促红细胞生成素，G-CSF，GM-CSF等结合使用。
在另一实施方案中，TIE受体拮抗剂可用于诊断或治疗病人，其中所需结果是抑制造血途径，如治疗血液形成器官的骨髓增生或其它增生疾病，如血小板增多症，红细胞增多症和白血病。在该实施方案中，治疗可包括使用治疗上有效量的TIE配体-3或TIE配体-4,TIE抗体，TIE受体融合体，TIE配体-3或TIE配体-4连接物或配体融合体或本文所述的fFC。
本发明还提供了药用组合物，包含存在于药物学上可接受的载体中的本文所述的TIE配体-3或TIE配体-4或配体融合体，其肽片段或衍生物，可全身性或局部施用TIE配体-3或TIE配体-4蛋白，肽片段或衍生物。可使用本领域已知的任何合适的用药方式，包括但不限于静脉内，鞘内，动脉内，鼻内，口内，皮下，腹膜内或经过局部注射或手术移植用药。还提供了缓释制剂。
本发明还提供了特异性地结合该治疗分子的抗体。该抗体可以是单克隆或多克隆的。本发明还提供了使用该单克隆或多克隆抗体测定取自病人的样品中的治疗性分子总量方法以监测治疗过程。
本发明进一步提供了包含TIE配体-3或TIE配体-4或配体融合体和连接到其上的细胞毒剂的治疗组合物。在一个实施方案中，细胞毒剂可以是放射性同位素或毒素。
本发明还提供了特异性地结合TIE配体-3或TIE配体-4的抗体。该抗体可以是单克隆或多克隆的。
本发明进一步提供了纯化TIE配体-3或TIE配体-4的方法，包括：
a)将至少一种TIE结合底物偶联到固相基质上；
b)保温a)的底物与细胞溶胞产物使底物与细胞溶胞产物中的TIE配体-3或TIE配体-4形成复合物；
c)洗涤固相基质；和
d)从偶联的底物上洗脱出TIE配体-3或TIE配体-4。
该底物可以是特异性地接合TIE配体-3或TIE配体-4的任意底物。在一个实施方案中，该底物选自抗-TIE配体-3或抗-TIE配体-4抗体，TIE受体和TIE受体融合体。本发明进一步提供了特异性地结合TIE配体-3或TIE配体-4的受体融合体以及包含在药用上可接受的载体中的受体融合体的治疗组合物和抑制人体血管生长的方法，包括施用有效量的治疗组合物。
本发明还提供了包含在药用上可接受的载体中的TIE配体-3或TIE配体-4或配体融合体的治疗组合物，以及促进病人新血管形成的方法，包含给病人施用有效量的治疗组合物。
另外，本发明提供了鉴定表达TIE受体的细胞的方法，包含在允许可检测标记的配体与TIE受体结合的条件下将细胞与可检测标记的TIE配体-3或TIE配体-4或配体融合体接触并测定可检测标记的配体是否结合到TIE受体上，从而鉴定表达TIE受体的细胞。本发明还提供了治疗组合物，包含TIE配体-3或TIE配体-4或配体融合体和连接到其上的细胞毒剂。细胞毒剂可以是放射性同位素或毒素。
本发明还提供了检测细胞表达TIE配体-3或TIE配体-4的方法，包含从细胞获得mRNA，在杂交条件下将所获得的mRNA与编码TIE配体-3或TIE配体-4的标记的核酸分子接触，测定与标记分子杂交的mRNA的存在，从而检测细胞中TIE配体-3或TIE配体-4的表达。
本发明进一步提供了检测组织切片中TIE配体-3或TIE配体-4表达的方法，包含在杂交条件下，将组织切片与编码TIE配体-3或TIE配体-4的标记的核酸分子接触，测定与标记分子杂交的mRNA的存在，从而检测组织切片中TIE配体-3或TIE配体-4的表达。
实施例1-ABAE细胞系作为TIE-2受体报告细胞的鉴定
成年BAE细胞以ECACC#92010601在欧洲细胞培养物保藏中心登记(见PNAS 75:2621(1978))。Northern(RNA)分析揭示在ABAE(成年牛动脉内皮细胞)细胞系中tie-2转录子的中等水平，这与证实tie-2 RNA几乎专一性地位于血管内皮细胞的原位杂交结果一致。因此，我们检查了ABAE细胞溶胞产物中TIE-2蛋白质的存在，以及在正常情况下相对于无血清生长条件时TIE-2蛋白质酪氨酸磷酸化的程度。收获ABAE细胞溶胞产物并进行免疫沉淀，接着对用TIE-2特异的和磷酸酪氨酸特异性的抗血清免疫沉淀的蛋白质进行Western印迹分析。在TIE-2免疫沉淀期间包含或者去作为特异性抑制分子的TIE-2肽允许明确鉴定TIE-2是一种约150 KD的中等可测蛋白，其稳定状态的磷酸酪氨酸水平经预先的细胞血清饥饿减少到几乎不可检测的水平。
按下面所述进行ABAE细胞的培养和细胞溶胞产物的收获。低传代数的ABAE细胞以2×106个细胞/150mm塑料培养板(Falcon)的密度涂布成单层并在含10％小牛血清(10％BCS),2mM L-谷氨酰胺(Q)和青霉素及链霉素(P-S)各1％的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM)中在5％CO2气体中培养。收获细胞溶胞产物前，细胞在DMEM/Q/P-S中血清饥饿24小时，接着吸出培养基并用加有正钒酸钠，氟化钠及苯甲脒钠的冰冻磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗平板。细胞在加有1％NP40去污剂和蛋白酶抑制剂，PMSF和抑蛋白酶肽的少量体积的该漂洗缓冲液中溶胞。经过在4℃以14000×G离心10分钟从细胞溶胞产物中去掉不溶性碎片，在含有或不含加至～20μg/ml溶胞产物的抑制肽的条件下用对TIE-2受体特异性的抗血清对上清液进行免疫沉淀。免疫沉淀的蛋白质经PAGE(7.5％Laemmli凝胶)分辨，然后电转移到PVDF膜上并与各种TIE-2或磷酸酪氨酸特异性的抗血清保温。经过将膜与HRP-连接的第二抗血清保温，接着用ECL试剂(Amersham)处理可观察TIE-2蛋白质。实施例2-TIE-2受体融合体的克隆和表达以便对TIE-2配体相互
                 作进行亲和性研究
构建了一个表达构建体以产生由大鼠TIE-2受体完整细胞外部分与人免疫球蛋白γ-1恒定区(IgG1 Fc)融合组成的分泌蛋白质。该融合蛋白质称为TIE-2“受体融合体”(RB)，且在正常情况下根据在单个IgG1 Fc尾之间形成二硫键预期在溶液中以二聚体存在。TIE-2 RB的Fc部分制备如下。用相应于公开的人IgG1序列的寡核苷酸经PCR从人胎盘cDNA中扩增编码跨越铰合区到该蛋白质羧基末端的人IgG1 Fc部分的DNA片段；将所得的DNA片段克隆进质粒载体。将来自编码全长TIE-2受体的质粒和来自人IgG1 Fc质粒的合适的DNA限制性片段连接到短的PCR产生的片段任一侧，设计成融合的符合阅读框的TIE-2和人IgG1 Fc蛋白编码序列。因此，所得TIE-2胞外域-Fc融合蛋白质被精确取代，由IgG1 Fc代替跨越TIE-2跨膜和胞质域的区域。另一种制备RB的方法在Goodwin等，细胞，73:447-456(1993)中描述。
经过将TIE-2RB DNA片段克隆进pVL1393杆状病毒载体并随后感染草地叶蛾SF-21AE昆虫细胞系可获得毫克量的TIE-2 RB。另外，也可使用细胞系SF-9(ATCC保藏号CRL-1711)或细胞系BT1-TN-561-4。编码TIE-2RB的DNA以EcoRⅠ-NotⅠ片段克隆进杆状病毒转移质粒pVL1393。经过氯化铯密度梯度离心纯化的质粒DNA经过将3μg该质粒DNA与0.5μg Baculo-Gold DNA(Pharminigen)混合重组进病毒DNA中，接着使用30μg Lipofectin(GIBCO-BRL)导入脂质体中。将DNA脂质体混合物加入在TMN-FH培养基(改良的Grace氏昆虫细胞培养基(GIBCO-BRL))中的SF-21AE细胞(2×106细胞/60mm培养皿)中27℃保温5小时，接着在补充有5％小牛血清的TMN-FH培养基中27℃5天。收获组织培养基，对重组病毒进行噬斑纯化，该步骤使用以前描述的方法(O′Reilly,D.R.,L. K.Miller，和V.A.Luckow，杆状病毒表达载体-实验手册，1992,New York；W.H.Freeman)进行，除了琼脂糖覆盖层含125μg/ml X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖吡喃糖苷；GIBCO-BRL)。27℃培养5天后，以对X-gal底物的阳性生色反应计数非重组噬斑，标记其位置。然后经过加入含100μg/ml MTT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基-2,5-二苯基溴化四唑；Sigma)的第二层观察重组噬斑。经栓塞吸出挑选推定的重组病毒噬斑，经多轮噬斑分离来纯化以保证其均一性。经过对噬斑纯化的病毒进行系列低复数传代生产病毒种子。生产了一个病毒克隆(vTIE-2受体融合体)的低传代种子。
在含1×抗生素/抗真菌溶液(Gibco BRL)和25mg/L庆大霉素(Gibco BRL)的无血清培养基(SF-900Ⅱ,Gibco BRL)中培养基SF-21AE细胞。加入Pluronic F-68作为表面活性剂至终浓度为1g/L。感染前在生物反应器(Artisan Cell Station System)中培养细胞(4L)至少3天。以80mL/分的气体流速(在喷气环中通气)通气至50％溶氧，在27℃生长细胞。借助于船用叶轮以100rpm的速度搅拌。在对数生长中期(-2×106个细胞/mL)收获细胞，离心浓缩并用每细胞5个噬斑形成单位的vTIE-2受体融合体感染。用新鲜培养基使细胞和接种物为400mL，在转瓶中27℃吸收病毒2小时。然后用新鲜无血清培养基重悬培养物至8L终体积，使用前面描述的条件在生物反应器中培养细胞。
感染72小时后离心(500×g,10分钟)收集vTIE-2受体融合体感染的SF21AE细胞的培养基。用NaOH将细胞上清液调至pH8。加入EDTA至终浓度为10mM，将上清pH重调至8。过滤(0.45μm，Millipore)上清并上样到蛋白质A柱(蛋白质A琼脂糖4快速流动或HiTrap蛋白质A，均来自Pharmacia)。用含0.5M NaCl的PBS洗柱至280mm吸光率减少到基线。在PBS中洗涤柱并用0.5M乙酸洗脱。经过洗脱进含1M Tris pH9的管立即中和柱级分。合并含TIE-2RB的峰级分并用PBS透析。实施例3-证实TIE-2在血管形成中起关键作用
经过将“过多的”可溶性TIE-2受体融合体(TIE-2RB)导入发育系统可获得对TIE-2功能的了解。TIE-2RB结合，从而中和现存TIE-2配体的潜在能力可导致正常血管形成的可见的破坏及配体的鉴定。为了检查TIE-2 RB是否能用于破坏早期鸡胚的血管形成，用TIE-2RB浸泡小片生物学可吸收泡并在正靠原胚侧面的位置立即插入到绒毛膜尿囊膜下面。
早期鸡胚在卵黄顶上从被绒毛膜尿囊膜(CAM)覆盖的一小盘细胞上形成。将要在胚胎中排成血管的内皮细胞来自胚外和胚内细胞。胚外来源的内皮细胞提供胚胎内皮细胞的主要来源，它由位于固有胚侧面周围CAM正下方的间质的添加生长产生。随着这些间质细胞的成熟，产生内皮和造血细胞的共同祖先，称为血管母细胞。接着，血管母细胞产生成血管细胞(内皮细胞祖先)和成血细胞(多能造血前体)的混合群体。当内皮细胞后代围绕原始血细胞分开形成一个细胞厚的导管时开始形成循环系统原基。这些细胞成分的增生和迁移最终在CAM下产生庞大的充满血液的毛细血管的网络，并最后侵入胚胎与有限的胚内来源的血管单元连接。
从Spafas,Inc.(Boston,MA)获得的刚受精的鸡卵在99.5 F°,55％RH下培养。在发育大约24小时时，用70％乙醇消毒蛋壳并用牙医钻在每个蛋的钝端钻一个1.5cm的孔。去掉壳膜以暴露胚上方的气室。用解剖刀切下无菌Gelfoan(Upjohn)的小矩形片并浸泡于等浓度的TIE-2或EHK-1受体融合体中。使用EHK-1胞外区域代替TIE-2细胞外域按实施例2所述制备EHK-1受体融合体(Maisonpierre等，癌基因，8:3277-3288(1993))。各Gelfoam片大约吸收30μl中的6μg蛋白。在原胚侧面几毫米的位置用无菌钟表镊在CAM上撕一缺口。将浸泡有RB的Gelfoam片大部分插入到CAM下面，用一片胶粘带密封蛋壳。其它相似状态的卵平行地用无关RB，神经表达受体酪氨酸激酶，EHK-1处理((Maisonpierre等，癌基因，8:3277-3288(1993))。使发育进行4天，然后经肉眼观察检查胚。经过在温PBS碟中小心弄破壳并小心切下带有周围CAM的胚来取出胚。在12个用各种RB处理蛋中，6个TIE-2RB和5个EHK-1RB处理的胚发育超过实验开始观察的状态。在这些形成的胚中观察到显著区别，如图1A和1B所示。那些用EHK-1RB处理的胚似乎相当正常地发育。以存在跳动的心脏判断5个EHK-1胚中4个是活的。而且，胚外血管丰富并在CAM下侧面延伸几厘米，由于存在红血细胞，这肉眼观察明显。与此相反，TIE-2RB处理的胚与直径超过10mm的EHK-1RB胚相比发育严重受阻，直径范围为2-5mm。全部TIE-2处理的胚死亡且其CAM无血管。TIE-2RB在鸡中抑制血管形成的能力证实TIE-2RB配体对血管发育是必须的。实施例4-TIE-2配体融合体的构建
构建一个表达构建体，它产生分泌型蛋白质，由人TIE-2配体1(TL1)或TIE-2配体2(TL2)的完整编码序列与人免疫球蛋白γ-1恒定区(IgG1 Fc)融合组成。这些融合蛋白质称为TIE-2“配体融合体”(TL1-Fc或TL2-Fc)。按下面制备TL1-Fc和TL2-Fc的Fc部分。用相应于人IgG1公开序列的寡核苷酸经PCR从人胎盘cDNA扩增编码跨越铰合区到羧基末端的人IgG1 Fc部分的DNA片段；所得的DNA片段被克隆进质粒载体。来自编码全长TL1或TL2的质粒或来自人IgG1 Fc质粒的合适的DNA限制性片段在来自短PCR片段的任一侧连接，设计成融合的，符合阅读框的TL1或TL2与人IgG1 Fc蛋白质的编码序列。
经过将TL2-Fc DNA片段克隆进pVL 1393杆状病毒载体并随后感染草地夜蛾SF-21AE昆虫细胞系获得毫克量的TL2-Fc。另外，可使用细胞系SF-9(ATCC保藏号CRL-1711)或细胞系BTI-TN-5b1-4。编码TL2-Fc的DNA以EcoRI-NotⅠ片段克隆进杆状病毒转移质粒pVL 1393。经过将3μg质粒DNA与0.5μgBaculo-Gold DNA(Pharminigen)混合将质粒DNA重组进病毒DNA，接着使用30μg Lipofectin(GIBCO-BRL)导入脂质体。将DNA-脂质体混合物加入在TMN-FH培养基(改良的Grace′s昆虫细胞培养基(GIBCO-BRL))中的SF-21AE细胞(2×106细胞/60mm平皿)中27℃保温5小时，接着在补充有5％胎牛血清的TMN-FH培养基中27℃培养5天。收获组织培养基用于对重组病毒进行噬斑纯化，使用以前所述的方法(O′Reilly,D.R.,L.K.Miller，和V.A.Luckow，杆状病毒表达载体-实验手册，1992,New York.W.H.Freeman)进行该步骤，除了琼脂糖覆盖层含有125mg/ml X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-吡喃半乳糖苷，GIBCO-BRL)。27℃培养5天后，经过与X-gal底物的阳性生色反应计数非重组噬斑并标记其位置。然后经过加入含100mg/mL MTT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]2,5-二苯基溴化四唑；Sigma)的第二层观察重组噬斑。经栓塞吸出挑出推定的重组病毒噬斑，经多轮噬斑分离纯化以保证均一性。经系列低复数传代噬斑纯化的病毒产生病毒贮液。产生一个病毒克隆(vTL2-Fc克隆#7)的低传代种子。
在含1X抗生素/抗真菌剂溶液(Gibco BRL)和25mg/L庆大霉素(Gibco BRL)的无血清培养基(SF-900Ⅱ,Gibco BRL)中培养SF-21AE细胞。加入Pluronic F-68作为表面活性剂至终浓度为1g/L。感染前在生物反应器(Artisan Cell Station System)中培养培养物(4L)至少3天。细胞在27℃，通入50％溶氧，气体流速为80mL/min(在喷气环中通气)的条件下生长。借助于船用叶轮以100rpm的速率搅拌。在对数生长中期(～2×106细胞/mL)收获细胞，经离心浓缩，用每细胞5个vTL2-Fc噬斑形成单位感染。细胞和接种物用新鲜培养基加至400mL，在烧瓶中27℃吸收病毒2小时。然后将培养物重悬于新鲜无血清培养基中至终体积8L，使用以前描述的条件在生物反应器中培养细胞。
感染72小时后经离心(500×g,10分钟)收集vTL2-Fc-感染的SF21AE细胞的细胞培养基。细胞上清用NaOH调成pH8。加EDTA至终浓度为10mM，将上清pH重调成8。过滤(0.45μm,Millipore)上清并上样到蛋白质A柱(蛋白质A琼脂糖4快速流动或HiTrap蛋白质A，均来自Pharmacia)。用含0.5M NaCl的PBS洗柱至280nm处吸光率减至基线。在PBS中洗柱并用0.5M乙酸洗脱。经过洗脱进含1M Tris pH9的管中立即中和柱级分。合并含TL2-Fc的峰值级分并用PBS透析。实施例5-血管形成中的TIE受体/配体系统
尽管TIE-2/TIE配体系统似乎在内皮细胞生物学中起重要作用，但尚未显示在血管形成的早期到中期(例如，成血管细胞或内皮细胞增生和迁移，血管形成和在血管成型中的其它早期事件)发挥明显的活性作用。与已知介导血管形成的这些方面的受体和因子相反，在血管形成过程中TIE-2和TL1表达在时间上较晚的情况表明：该系统在晚期血管发育，包括新血管结构和功能分化和稳定中发挥明显的作用。TIE-2/TL1的表达方式也与在维持结构完整和/或形成的血管的生理学特征中的连续作用一致。
TIE配体2(TL2)似乎是TL1的竞争抑制剂。TL2表达的时空特性表明该单独的抑制分子可能发挥对适当的血管发育或再成型(例如，允许从现存的血管形成新血管的成熟内皮细胞的去稳定/去分化，抑制不合适的血管形成，成熟血管的退化/衰退)所必需的多种环境依赖性作用)。图2是血管形成中TIE-2/TIE配体的假定作用的示意图。在该附图中，TL1由(·)表示，TL2由(*)表示，TIE-2由(T)表示，VEGF由(□)表示，flk-1(VEGF受体)由(Y)表示。实施例6-Cys-TL1突变体的构建和鉴定
TIE-2配体具有2个主要的结构域，一个描述为“螺旋圈”结构域，含有该蛋白质的合适的C端三级结构，另一个为“纤维蛋白原样”结构域，含有该蛋白质的接近N-末端的两个三级结构。尽管称为TL1和TL2的TIE-2配体具有相似的结构同源性，但它们表现出不同的物理和生物学特性。在非还原电泳条件下，两种蛋白质表现出共价多聚体结构，其中TL1主要表现为三聚体，TL2主要表现为二聚体。图3是TIE-2配体如何相互作用形成多聚体的示意图。至于生物学活性，经过在表达TIE-2的细胞中诱导磷酸化证实TL1表现为TIE-2受体的激动剂。另一方面TL2似乎是TL1的竞争性抑制剂。对何种因素负责该两种分子的不同物理和生物学特性的研究表明在TL1纤维蛋白原样结构域前存在半胱氨酸(CYS 265)而在TL2中没有。TL1中的CYS 265残基由TGC编码且位于大约在螺旋圈和纤维蛋白原样结构域之间的大约核苷酸1102-1104处。由于半胱氨酸残基一般涉及二硫键形成，因此其存在可能有助于分子的三级结构和生物学特性，据认为在TL1中存在CYS 265也许至少部分负责两种分子的不同特性。为了试验该假设，构建了一种表达质粒，它含有突变的TL1，其中用不形成二硫键的氨基酸代替CYS。除了这种TL1/CYS-突变体外，还构建了第二种表达质粒，它在TL2的相应位置突变使该残基变为半胱氨酸。将TL1和TL2的非突变和突变的表达质粒瞬时转染进COS细胞。收获含重组蛋白质的细胞上清并对样品进行还原和非还原的SDS/PAGE电泳并随后进行Western印迹。未突变的和突变的TL1和TL2蛋白质的Western印迹表明TL1/CYS-突变体行为更象TL2，其以二聚体形式迁移，TL2/CYS+突变体行为更象TL1，它能形成三聚体及更高级的多聚体。令人感兴趣的是，当在表达TIE-2的细胞中试验两种突变蛋白质诱导磷酸化的能力时，TL1/CYS-突变体能激活TIE-2受体，而TL2/CYS+突变体不能得到任何激活活性。实施例7-构建并鉴定仅含纤维蛋白原样结构域的突变体
为了试验TIE-2配体的纤维蛋白原样结构域(F-结构域)是否含有TIE-2激活活性，构建去掉螺旋圈结构域，仅制编码F-结构域的部分DNA序列(开始于大约核苷酸1159，氨基酸残基ARG 284)的表达质粒。将该突变构建体瞬时转染进COS细胞。收获含重组蛋白的上清。试验TL1/F-结构域突变体结合TIE-2受体的能力。结果表明，作为单体，TL1/F-结构域突变体在可检测水平上不能结合TIE-2。然而，当TL1/F-结构域单体用myc标记并随后用针对myc标记的抗体聚集时，它表现出可检测到的与TIE-2的结合。然而，抗体聚集的TL1/F-结构域突变体在表达TIE-2的细胞系中不能诱导磷酸化。图3显示了F-结构域构建体的示意图及其在经过和不经过抗体聚集时的结合能实施例8-受体融合体结合试验及配体结合和竞争试验
用2种任选的方式进行定量无细胞结合试验以检测TIE-2受体融合体结合或配体结合及竞争。在受体融合体结合型试验中，将TIE-2配体(纯化的或部分纯化的：TL1或TL2)覆盖到ELISA平板上。然后加入不同浓度的受体融合体，它以剂量依赖性方式结合固定配体。在2小时末，洗去剩余的受体融合体，然后使用碱性磷酸酶标记的特异性抗-人Fc抗体报道结合在平板上的量。洗去剩余的报道抗体，然后使用有色底物进行AP反应。使用分光光度计定量该试验。图4显示了典型的TIE-2-IgG结合曲线。使用该测定评价注射进大鼠和小鼠后TIE-2-IgG的完整性。该试验也可以这一方式用作配体竞争试验，其中，纯化的或部分纯化的TIE配体与受体融合体的固着配体竞争。在该结合试验的配体结合和竞争形式中，将TIE-2胞外结构域覆盖到ELISA平板上。然后将TIE配体的Fc-标记的纤维蛋白原样结构域片段(TL1-fFc和TL2-fFc)结合到胞外结构域上并按上述使用相同抗人Fc抗体检测。图5显示了结合TIE-2胞外结构域的TL1-fFc的例子。该试验方式也可用于血清或其它样品中TL1-fFc的定量水平。如果未标记的配体(同样可以是纯化的或未纯化的)与TL1-fFc同时加入，那么在标记的配体片段与全长配体间形成竞争。全长配体可代替Fc-标记的片段并绘制了竞争曲线。实施例9-EA.hy926细胞系可用作TIE配体活性的报道细胞系
EA.hy 926是经过融合HUVEC与来自人肺癌的细胞系A549建立的细胞杂交系[Edgell等，美国国家科学院院刊，80,3734-3737(1983)]。已发现EA.hy 926细胞表达明显水平的具有低碱性磷酸酪氨酸水平的TIE-2受体蛋白质。在其用于受体测定前传代EA.hy 926细胞的密度以及在测定时其汇合程度可影响TIE-2受体丰度及与配体处理反应的相对诱导力。经过采用下面的方案生长细胞可将EA.hy 926细胞系用作测定TIE-2配体活性的可依赖的系统。
EA.hy 926细胞在T-75瓶(Falconware)中以1.5×106个细胞接种，并隔天用高葡萄糖Dulbecco′s MEM，10％胎牛血清，L-谷氨酰胺，青霉素-链霉素和1×次黄嘌呤-氨基喋呤-胸苷(HAT，Gibco/BRL)更新培养基。生长3至4天后，将细胞以每T-75瓶1.5×106个细胞再次传代一次并再培养3到4天。对于磷酸化试验，经过用高葡萄糖DMEM代替培养基并在37℃培养2-3小时血清饥饿按上述制备的细胞。从瓶中吸出该培养基并以1.5ml的总体积向瓶中加入条件培养基样品或纯化的配体，随后在37℃培养5分钟。从培养箱取出培养瓶并放置于冰床上。去掉培养基并用1.25ml含1％乙基苯基聚乙二醇，0.5％脱氧胆酸钠，在20mM Tris,pH7.6中的0.1％SDS,150mMNaCl,50mM NaF,1mM原钒酸钠，5mM苄脒，和含蛋白酶抑制剂PMSF，抑酶肽和亮抑蛋白酶肽的1mM EDTA的裂解缓冲液代替。在冰上使膜溶解10分钟后，刮下平板并经过4℃以顶级速度微量离心10分钟澄清细胞溶解产物。经过用抗-TIE-2多克隆抗血清和蛋白质G-连接的琼脂糖珠冷培养从澄清上清中免疫沉淀TIE-2受体。用冷细胞溶解缓冲液洗涤珠3次并在Laemmli样品缓冲液中煮沸5分钟，然后上样到7.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上。将分辨出的蛋白质电转移到PVDF(Lamblia-P)膜上，然后使用抗磷酸酪氨酸抗体和ECL试剂对其进行Western印迹。随后经过去掉抗磷酸酪氨酸抗体并用对TIE-2胞外结构域特异性的多克隆抗血清再培养对相同印迹上的总TIE-2蛋白质水平进行比较。实施例10-分离和测序编码哺乳动物TIE配体-3的全长cDNA克隆
经过用相应于该基因全长编码序列的小鼠TL1或小鼠TL2探针杂交文库拷贝从小鼠BAC基因组文库(Research Genetics)克隆TIE配体-3(TL3)。使用磷酸缓冲液在55℃杂交各文库拷贝过夜。杂交后，用2×SSC,0.1％SDS在60℃洗涤滤膜，随后用X射线胶片曝光滤膜。鉴定相应于小鼠TL1和小鼠TL2的强杂交信号。另外，鉴定了与小鼠TL1和小鼠TL2微弱杂交的信号。纯化相应于这些克隆的DNA，然后用限制性酶消化，将与原始探针杂交的两个片段亚克隆进细菌质粒并测序。该片段的序列含与小鼠TL1和小鼠TL2均同源的两个外显子。对这些序列特异性的引物用作鉴定含相应于TL3的转录子的组织的PCR引物。在N gt-11的小鼠子宫cDNA文库(Clontech Laboratories,Inc.,Palo Alto,CA)中鉴定相当于TL3的PCR带。
以1.25×106/20×20cm平板的密度涂布噬斑并按标准方法取复制滤膜(Sambrook等，分子克隆，实验手册，第2版，第8.46页，冷泉港实验室，纽约冷泉港)。在“正常”严格(2×SSC,65℃)条件下用针对小鼠TL3序列制备的200bp PCR放射活性探针筛选复制滤膜。杂交在含0.5mg/ml鱼精DNA的溶液中65℃下进行。滤膜在2×SSC中65℃下洗涤并对X射线胶片曝光6小时。挑出在复制膜中杂交的2个阳性克隆。EcoRⅠ消化从这些克隆获得的噬菌体DNA显示出具有插入大小约1.2kb和大约2.2kb的两个独立的克隆。将2.2kb EcoRⅠ插入片段亚克隆进pBluescript KS(Stratagene)的EcoRⅠ位点。序列分析表明较长的克隆缺乏起动子甲硫氨酸和信号肽，但编码同源于小鼠TL1和小鼠TL2的探针。
然后，合成两个TL3-特异性PCR引物如下：
US2:cctctgggctcgccagtttgttagg
US1:ccagctggcagatatcagg
使用来自小鼠细胞系C2C12ras和MG87的表达文库进行下列PCR反应。在一级PCR反应中，使用特异性引物US2与载体特异性寡聚体结合以允许以任一方向扩增。PCR使用94℃，1分钟；42℃或48℃1分钟；72℃1分钟循环35次在100ml的总体积中进行。二级PCR反应包括二级特异性引物US1(它包含于一级PCR产物中)与相同的载体寡聚体结合。二级反应使用前述相同的温度和时间循环30次。凝胶分离PCR产物并进行序列分析。根据使用2个不同的cDNA文库从总共4个独立的PCR反应获得的序列推断TL3序列的5′端。Northern分析表明在小鼠胎盘中有中等到低等水平的小鼠TL3转录子。小鼠TL3的表达由大约3kb的转录子组成。全长TL3编码序列在图6A-6B中表示。
然后可使用小鼠TL3序列经过用相应于以前所述，例如，在1996年10月10日公开的国际公开号WO 96/31598的实施例8中，小鼠TL3的探针杂交人基因组或cDNA文库可获得含有其人配偶体编码序列的人克隆。实施例11-分离编码人TIE配体-4的全长基因组克隆
经过用相应于TL1完整纤维蛋白原编码序列(核苷酸1153至1806)的人TL1放射活性探针或相应于小鼠TL3纤维蛋白原区域186核苷酸片段(图6A-6B的核苷酸1307至1492)的小鼠TL3放射活性探针杂交文库复制膜从小鼠BAC基因组文库(BAC HUMAN(Ⅱ)，基因组系统公司)克隆TIE配体-4(TL4)。使用精确的寡核苷酸和标准PCR条件标记各探针，除了用P32dCTP代替dCTP外。然后将PCR混合物通过凝胶过滤柱以便从游离的P32dCTP分离该探针。使用标准杂交条件用磷酸缓冲液和放射活性探针在55℃杂交各文库拷贝过夜，用2×SSC,0.1％SDS在55℃洗涤滤膜，随后对X射线胶片曝光。观察到相应于人TL1的强杂交信号。另外，鉴定出与人TL1和TL3均微弱杂交的信号。使用标准程序纯化相应于这些克隆的DNA，然后用限制性酶消化，将与原始探针杂交的一个片段亚克隆进细菌质粒并测序。片段的序列含有与人TL1和小鼠TL3及TIE配体家族的其它成员均同源的一个外显子。对这些序列特异性的引物可用作鉴定含相应于TL4转录子的组织的PCR引物。
经过测序包含于保藏的细菌细胞中的全长BAC克隆可获得人TL4的完整序列。以同源于TIE配体家族的已知成员，如TL1,TL2和TL3可鉴定外显子。然后，经过将TL4基因组克隆的外显子剪接在一起可测定TL4的完整编码序列，随后，后者可用于产生TL4蛋白质。另外，该外显子可用作探针以获得全长cDNA克隆，然后可用后者生产TL4蛋白质。也可经过与诸如纤维蛋白原结构域，螺旋圈结构域的蛋白质结构域或诸如信号肽序列的蛋白质信号的同源性从BAC克隆序列鉴定外显子。经过鉴定连续的BAC克隆，例如，经过使用保藏的BAC克隆两端作探针筛选诸如本文所用的人基因组文库，经过使用包含于BAC克隆中的外显子序列筛选cDNA文库，或经过使用根据TL4外显子序列的寡核苷酸引物进行5′或3′RACE程序可获得从BAC克隆丢失的外显子。鉴定另外的TIE配体家族成员
在对TIE配体家族的其它成员的合理研究中可使用新TIE配体-4序列，其中使用利用已知家族成员间存在强同源性的保守片段的方案。例如，TIE配体氨基酸序列的序列对比显示了一些保守序列区域(见图7中下划线的区域)。
可使用基本上根据这些盒中的简并寡核苷酸结合以前已知的或新的TIE配体同源性片段鉴定新的TIE配体。
TL1,TL2和TL3之间的高度保守区域可用于设计简并的寡核苷酸引物，用该引物引发使用cDNA的PCR反应。使用寡聚d(T)或其它合适的引物经组织RNA的逆转录产生cDNA模板。然后将PCR反应的等分试样在琼脂糖凝胶上进行电泳。所得的扩增的DNA片段可经过插入质粒进行克隆，测序并将该DNA序列与全部已知的TIE配体进行比较。
从这些PCR反应选定大小扩增的DNA片段可克隆进质粒，经电穿孔导入大肠杆菌，并将转化子涂布在选择琼脂上。经过测序以标准质粒方法纯化的质粒DNA可分析PCR转化的细菌菌落。
含新TIE配体片段的克隆片段可用作杂交探针以获得cDNA文库的全长cDNA克隆。例如，人TL4基因组序列可用于经过用相应于前面所述的人TL4的探针杂交人cDNA文库获得含人TL4完整编码序列的人cDNA克隆。实施例12-克隆hTL4的全长编码序列
经过限制性酶消化，Southern印迹并将hTL-4克隆与小鼠TL3编码序列杂交，随后亚克隆和测序杂交片段可获得编码人TIE配体-4的基因组人TL-4克隆(hTL-4ATCC保藏号98095)的5′和3′编码序列。相应于hTL4的N-端和C-端氨基酸的编码序列可用于设计PCR引物(下面显示)，随后该引物用于以人卵巢cDNA进行TL4的PCR扩增。经过使用ABI 373A DNA测序仪和Taq双氧脱末端循环测序试剂盒(应用生物系统公司，Foster City,CA)进行DNA测序可鉴定相应于人TL4的PCR带。然后将PCR带亚克隆进载体pCR-script并经测序分析一些质粒克隆。然后编辑完整的人TL4编码序列且在图8A-8C中显示。在本发明的另一实施方案中，569位的核苷酸从A变为G，导致氨基酸从Q变为R。
上述使用的PCR引物设计如下：
hTL4atg 5′-gcatgctatctcgagccaccATGCTCTCCCAGCTAGCCA
           TGCTGCAG-3′
hTL4not 5′-gtgtcgacgcggccgctctagatcagacTTAGATGTCCAAAG
           GCCGTATCATCAT-3′
小写字母表示加到PCR引物上的“尾巴”序列以帮助克隆扩增的PCR片段。
                         保藏
下面按布达佩斯条约在美国典型培养物保藏中心，Parklawn Drive12301,Rockville,Maryland 20852进行了保藏。编码TIE-2受体融合体的重组苜银纹夜蛾杆状病毒于1994年10月7日保藏在ATCC，命名为“vTIE-2受体融合体”，ATCC保藏号：VR 2484。含编码人TIE配体-4的人TL-4基因插入片段的质粒pBeLoBac11的大肠杆菌菌株DH10B于1996年7月2日保藏在ATCC，命名为“hTL-4”,ATCC保藏号为98095。
本发明范围不受本文所述具体实施方案的限制。事实上，除了上文所述外，对本发明的各种修改对本领域的技术人员而言从上面说明书和附图来看是显而易见的。这些修改试图落入所附权利要求的范围内。

Claims (41)

1．一种组合物，包括基本上不含其它蛋白质的TIE配体。
2．一种分离的编码TIE配体的核酸分子。
3．一种分离的编码TIE配体-3或TIE配体-4的核酸分子。
4．一种分离并纯化的核酸分子，包括编码人TIE配体-4的核苷酸序列，其中该核苷酸序列选自：
(a)包含图8A-8C所列的人TIE配体-4编码区的核苷酸序列；
(b)包含图8A-8C所列的人TIE配体-4纤维蛋白原样结构域编码区的核苷酸序列；
(c)在中等严格条件下与(a)或(b)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，且它编码结合TIE受体的配体；
(d)由于遗传密码的简并性而不同于(a)，(b)或(c)的核苷酸序列且编码结合TIE-2受体之TIE-2配体的核苷酸序列。
5．一种载体，包括权利要求4的核酸分子。
6．根据权利要求5的载体，其中该核酸分子可操作地连接到在宿主细胞中能指导其表达的表达控制序列上。
7．根据权利要求6的载体，它是一种质粒。
8．一种分离的基本上不含其它蛋白质的TIE配体-4。
9．由根据权利要求4的核酸分子编码的分离的TIE配体-4。
10．用于生产人TIE配体-4的宿主载体系统，包括在宿主细胞中的根据权利要求6的载体。
11．根据权利要求10的宿主载体系统，其中宿主细胞是细菌、酵母，昆虫或哺乳动物细胞。
12．一种宿主载体系统，包括权利要求10的宿主载体系统和编码TIE受体的核酸。
13．生产TIE配体-4的方法，包括在允许TIE配体-4生产的条件下培养权利要求11的宿主-载体系统的细胞并回收所产生的TIE配体-4。
14．一种与权利要求9的配体特异性结合的抗体。
15．根据权利要求14的抗体，它是一种单克隆抗体。
16．一种特异性地结合权利要求9的配体的受体融合体(receptorbody)。
17．包含与细胞毒剂连接的根据权利要求8的配体的偶联物。
18．根据权利要求17的偶联物，其中细胞毒剂是放射性同位素或毒素。
19．一种药用组合物，包括根据权利要求9的配体和药用上可接受的载体。
20．一种药用组合物，包括权利要求14的抗体和药用上可接受的载体。
21．一种药用组合物，包括权利要求16的受体融合体和药用上可接受的载体。
22．一种药用组合物，包括权利要求17的偶联物和药用上可接受的载体。
23．一种分离并纯化的核酸分子，包括编码哺乳动物TIE配体-3的核苷酸序列，其中该核苷酸序列选自：
(a)包含图6A-6B所列的TIE配体-3编码区的核苷酸序列；
(b)包含图6A-6B所列的TIE配体-3纤维蛋白原样结构域编码区的核苷酸序列；
(c)在中等严格条件下与(a)或(b)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，且它编码结合TIE受体的配体；和
(d)除了遗传密码的简并性外能与(a),(b)或(c)的核苷酸序列杂交且编码结合TIE受体之配体的核苷酸序列。
24．包括权利要求23的核酸分子的载体。
25．根据权利要求24的载体，其中该核酸分子可操作地连接到在宿主细胞中能指导其表达的表达控制序列上。
26．根据权利要求25的载体，它是一种质粒。
27．一种分离的基本上不含其它蛋白质的TIE配体-3。
28．分离的由根据权利要求23的核酸分子编码的TIE配体-3。
29．用于生产哺乳动物TIE配体-3的宿主-载体系统，包括在宿主细胞中的权利要求25的载体。
30．根据权利要求29的宿主载体系统，其中宿主细胞是细菌、酵母，昆虫或哺乳动物细胞。
31．一种宿主载体系统，包括权利要求29的宿主载体系统和编码TIE受体的核酸。
32．生产TIE配体-3的方法，包括在允许TIE配体-3生产的条件下培养权利要求30的宿主-载体系统的细胞并回收所产生的TIE配体-3。
33．一种与权利要求28的配体特异性结合的抗体。
34．根据权利要求33的抗体，它是一种单克隆抗体。
35．一种特异性地结合权利要求28的配体的受体融合体(receptorbody)。
36．包含与细胞毒剂连接的根据权利要求28的配体的偶联物。
37．根据权利要求36的偶联物，其中细胞毒剂是放射性同位素或毒素。
38．一种药用组合物，包括根据权利要求28的配体和药用上可接受的载体。
39．一种药用组合物，包括权利要求33的抗体和药用上可接受的载体。
40．一种药用组合物，包括权利要求35的受体融合体和药用上可接受的载体。
41．一种药用组合物，包括权利要求36的偶联物和药用上可接受的载体。
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