ES2268538T3 - Homologo nl3 del ligando del receptor trirosina quinasa tie. - Google Patents
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Abstract
Molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene por lo menos un 90% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos del polipéptido NL3 humano nativo (SEC ID No: 4).
Description
Homólogo NL3 del ligando del receptor trirosina
quinasa TIE.
La presente invención se refiere a moléculas de
ácido nucleico aisladas que codifican homólogos del ligando TIE
novedosos, las proteínas del homólogo del ligando TIE codificadas
por dichas moléculas de ácido nucleico, así como los procedimientos
y medios para fabricar y utilizar dichas moléculas de ácido nucleico
y proteínas, y anticuerpos que se unen a los homólogos del ligando
TIE descritos.
Las abreviaturas "TIE" o "tie" son
acrónimos, que representan "tirosina quinasa que contienen
dominios de homología Ig y EGF" y se idearon para designar una
nueva familia de receptores de tirosina quinasa que se expresan casi
exclusivamente en células endoteliales vasculares y en células
hematopoyéticas tempranas, y se caracterizan por la presencia de un
dominio tipo EGF y unidades de plegamiento extracelular
estabilizadas por puentes disulfuro entre cadenas, generalmente
denominados como plegamientos del tipo "inmunoglobulina (IG)".
Partanen y otros Proc. Natl Acad. Sci. USA 87,
8913-8917 (1990) describieron un fragmento de ADNc
homólogo de tirosina quinasa de células de leucemia humana (tie). El
ARNm de este receptor "tie" humano se ha detectado en todos los
tejidos embrionarios fetales humanos y de ratón, y se ha indicado
que se pueden localizar en las células endoteliales cardíacas y
vasculares. Korhonen y otros, Blood 80,
2548-2555 (1992); Publicación de la Solicitud de PCT
No: WO 93/14124 (publicada el 22 de julio de 1993). Maisonpierre y
otros, Oncogene 8, 1631-1637 (1993)
identificaron el homólogo de rata de tie humano, denominado como
"tie-1". Otro receptor tie, denominado
"tie-2", se identificó originalmente en ratas
(Dumont y otros, Oncogene 8, 1293-1301
(1993)), mientras que el homólogo humano de tie-2,
denominado como "ork" se describió en la patente de Estados
Unidos No. 5.447.860 (Ziegler). EL homólogo murino de
tie-2 se denominó originalmente "tek". La
clonación de un receptor tie-2 de ratón a partir de
una biblioteca de ADNc capilar de cerebro se describe en la
Publicación de la Solicitud de PCT No: WO 95/13387 (publicada el 18
de mayo de 1995). Se cree que los receptores TIE están implicados
activamente en la angiogénesis, y pueden también jugar un papel
importante en la hematopoyesis.
La clonación de expresiones de ligandos de
TIE-2 humanos se ha descrito en la Publicación de la
Solicitud de PCT No: WO 96/11269 (publicada el 18 de abril de 1996)
y en la Patente de Estados Unidos No. 5.521.073 (publicada el 28 de
mayo de 1996). Bajo el No. de acceso ATCC 75928 se ha depositado un
vector designado como \lambdagt10 que codifica un ligando de
TIE-2 llamado "ligando 1 de
htie-2" o "hTL 1". Bajo el No. de acceso
ATCC 75928 se ha depositado un plásmido que codifica otro ligando de
TIE-2 llamado "htie-2 2" o
"hTL 2". Este segundo ligando se ha descrito como un
antagonista del receptor TAI-2. Davis y otros,
Cell 87, 1161-1169 (1996) han descrito
la identificación de ligandos humanos y de ratón secretados para el
receptor TIE-2. El ligando humano denominado
"Angiopoyetina-1", para reflejar su papel en la
angiogénesis y acción potencial durante la hemopoyesis, es el mismo
ligando que el ligando denominado de forma variada como
"htie-2 1" o "hTL-1" en WO
96/11269. Se ha descrito que la angiopoyetina-1
juega un papel angiogénico posterior y diferente del de VEGF (Suri y
otros, Cell, 87, 1171-1180 (1996)).
Dado que aparentemente se favorece la expresión de
TIE-2 durante la angiogénesis patológica que es un
requisito para el crecimiento tumoral (Kaipainen y otros, Cancer
Res. 54, 6571-6577 (1994)), se ha
sugerido que la angiopoyetina es adicionalmente útil para el
seguimiento específico en la vasculatura tumoral (Davis y otros, ver
anteriormente).
La presente invención se refiere a homólogos de
ligando TIE humanos novedosos con poderosos efectos sobre la
vasculatura. La invención también proporciona moléculas de ácido
nucleico aisladas que codifican dichos homólogos de ligando y
vectores que contienen dichas moléculas de ácidos nucleico. La
invención además se refiere a células huésped transformadas con
dicho ácido nucleico para fabricar los homólogos de ligando TIE
humano nuevos. Los homólogos de ligando nuevos pueden ser agonistas
o antagonistas de receptores TIE, conocidos o descubiertos en la
presente. Su utilización terapéutica o de diagnóstico, incluyendo la
liberación de otros agentes terapéuticos o de diagnóstico a células
que expresan los respectivos receptores TIE, está también dentro del
alcance de la presente invención.
La presente invención proporciona además
anticuerpos que se unen específicamente a los homólogos de ligando
TIE de la presente, y la utilización de dichos anticuerpos para la
utilización en un tratamiento médico.
En otro aspecto, la invención se refiere a
composiciones que comprenden los homólogos de ligando novedosos o
anticuerpos que se unen específicamente a los mismos.
En un aspecto adicional, la invención se refiere
a conjugados de los homólogos de ligando TIE novedosos de la
presente invención con otros agentes terapéuticos o citotóxicos, y
composiciones que comprenden dichos conjugados. Se ha descrito que
se favorece la expresión del receptor TIE-2 durante
la angiogénesis patológica que es un requisito para el crecimiento
tumoral, y que otros receptores TIE podrían tener propiedades
similares. Por consiguiente, los conjugados de los homólogos de
ligando TIE de la presente invención a agentes citotóxicos u otros
agentes antitumorales pueden ser útiles en el seguimiento específico
en la vasculatura tumoral.
Un procedimiento para identificar una célula que
expresa un receptor TIE puede comprender poner en contacto una
célula con un homólogo de ligando TIE de la presente invención
marcado para ser detectado en condiciones que permi-
ten la unión de dicho homólogo de ligando TIE al receptor TIE, y determinar si efectivamente dicha unión tiene lugar.
ten la unión de dicho homólogo de ligando TIE al receptor TIE, y determinar si efectivamente dicha unión tiene lugar.
Un procedimiento para medir la cantidad de un
homólogo de ligando TIE de la presente invención en una muestra
biológica puede comprender poner en contacto la muestra biológica
con por lo menos un anticuerpo que se une específicamente al
homólogo de ligando TIE, y medir la cantidad de complejo homólogo de
ligando TIE-anticuerpo formado.
Un procedimiento de cribado para identificar
polipéptidos o pequeñas moléculas agonistas o antagonistas de un
receptor TIE se puede basar en su capacidad para competir con un
homólogo de ligando TIE nativo o variante de la presente invención
para unirse al receptor TIE correspondiente.
En otro aspecto, la invención se refiere a la
utilización de un homólogo de ligando TIE de la presente invención
en la preparación de un medicamento para inhibir el crecimiento
tumoral.
La apoptosis de células endoteliales puede
inducirse mediante la administración de una cantidad efectiva de un
homólogo de ligando TIE de la presente invención.
Los homólogos de ligando TIE de la presente
invención se pueden administrar solos, o combinados entre sí y/o con
otros agentes terapéuticos o de diagnóstico, incluyendo los miembros
de la familia de VEGF. Las terapias de combinación pueden conducir a
nuevas aproximaciones para el tratamiento de condiciones asociadas
con un crecimiento de células endoteliales no deseada, por ejemplo,
tratamiento de tumores.
La figura 1 es una representación gráfica de la
relación de los homólogos de ligando NL2, NL3 y FLS139 con los dos
homólogos de ligando conocidos del receptor TIE2
(h-TIE2L1 y h-TIE2L2) y con otros
homólogos de ligando TIE descritos en la solicitud de No. de Serie
08/933.821, presentada el 19 de septiembre de 1997.
La figura 2 es la secuencia de nucleótidos del
ligando TIE NL2 (SEC ID No: 1) (ADN 22780).
La figura 3 es la secuencia de aminoácidos del
ligando TIE NL2 (SEC ID No: 2)
La figura 4 es la secuencia de nucleótidos del
ligando TIE NL3 (SEC ID No: 3) (ADN 33457).
La figura 5 es la secuencia de aminoácidos del
ligando TIE NL3 (SEC ID No: 4)
La figura 6 es la secuencia de nucleótidos del
ligando TIE FLS139 (SEC ID No: 5) (ADN 16451).
La figura 7 es la secuencia de aminoácidos del
ligando TIE FLS139, posteriormente renombrado NL6 (SEC ID No:
6).
La figura 9 - "Northern blot" que muestra
la expresión de los ARNm de homólogos de ligando TIE NL3 en varios
tejidos.
Entre los homólogos de ligando TIE de la
presente invención se incluyen los homólogos de ligando humano
nativo denominados NL3 (SEC ID No: 4), y sus homólogos en otras
especies mamíferas no humanas, incluyendo, pero sin limitarse a,
mamíferos superiores, tales como monos; roedores, tales como
ratones, ratas, hámsters; porcinos; equinos; bovinos; variantes
alélicas naturales y de corte y empalme ("splice").
La secuencia de aminoácidos de NL3 nativo, tal y
como se describe en la presente, tiene aproximadamente un 30% de
homología con la de hTL-1 y aproximadamente un 29%
de homología con la de hTL-2. Los homólogos de
ligando TIE nativo de la presente invención están sustancialmente
libres de otras proteínas con las que se asocian en su medio
natural. Esta definición no está limitada en ningún modo por el
procedimiento o procedimientos mediante los cuales se obtienen los
homólogos de ligando TIE de la presente invención, e incluye todos
los homólogos de ligando que están dentro de la definición, tanto si
están purificados a partir de una fuente natural, obtenidos mediante
tecnología de ADN recombinante, sintetizados, o bien, preparados
mediante cualquier combinación de éstas y/u otras técnicas. Las
variantes de las secuencias de aminoácidos de los homólogos de
ligando TIE nativo de la presente invención tendrán por lo menos un
90%, preferiblemente por lo menos un 95%, más preferiblemente por lo
menos un 98%, aún más preferiblemente por lo menos un 99% de
homología en la secuencia con un homólogo de ligando TIE nativo
humano de longitud completa de la presente invención, o con el
dominio de tipo fibrinógeno de un homólogo de ligando TIE nativo
humano de la presente invención. Dichas variantes de las secuencias
de aminoácidos preferiblemente muestran o inhiben una actividad
biológica cualitativa de un homólogo de ligando TIE nativo.
El término "dominio de fibrinógeno" o
"dominio de tipo fibrinógeno" se utiliza para referirse a
aminoácidos desde aproximadamente la posición 278 hasta
aproximadamente la posición 498 en la secuencia de aminoácidos
conocida de hTL-1; aminoácidos desde aproximadamente
la posición 276 hasta aproximadamente la posición 496 en la
secuencia de aminoácidos conocida de hTL-2;
aminoácidos desde aproximadamente la posición 77 hasta
aproximadamente la posición 288 en la secuencia de aminoácidos de
NL3; y a dominios homólogos en otros homólogos de ligando TIE. El
dominio de tipo fibrinógeno de NL3 es idéntico aproximadamente en un
37% al de hTL-1 y hTL-2.
El término "molécula de ácido nucleico"
incluye moléculas de ARN, ADN y ADNc. Se entenderá que, como
resultado de la degeneración del código genético, se pueden fabricar
una multitud de secuencias de nucleótidos que codifican un ligando
de TIE determinado. La presente invención contempla específicamente
cada posible variación de secuencias de nucleótidos, que codifican
los homólogos de ligando TIE de la presente invención, en base a
todas las posibles opciones de codones. Aunque las moléculas de
ácido nucleico que codifican los homólogos de ligando TIE de la
presente invención son capaces preferiblemente de hibridarse, en
condiciones astringentes, a un gen de homólogo de ligando TIE
natural, puede ser ventajoso fabricar secuencias de nucleótidos que
codifican homólogos de ligando TIE que poseen un tratamiento de
codón sustancialmente diferente. Por ejemplo, los codones se pueden
seleccionar para incrementar la velocidad a la que tiene lugar la
expresión del polipéptido en una célula huésped procariota o
eucariota particular, según la frecuencia con la que el huésped
utiliza un codón particular. Además, los transcritos de ARN con
propiedades mejoradas, por ejemplo semivida, se pueden fabricar
mediante la elección correcta de las secuencias de nucleótidos que
codifican un homólogo de ligando TIE determinado.
La "Homología en la secuencia" se
determinará mediante la alineación de las dos secuencias a comparar
siguiendo el método de Clustal de alineación múltiple de secuencias
(Higgins y otros, Comput. Apl. Biosci. 5,
151-153 (1989), y Higgins y otros, Gene
73, 237-244 (1988)) que se incorpora en la
versión 1.6 del software de biocomputación Lasergene (DNASTAR, Inc.,
Madison, Wisconsin), o cualquier otra versión actualizada o
equivalente de este software.
La "astringencia" de las reacciones de
hibridación se puede determinar fácilmente por un experto habitual
en la materia, y generalmente es un cálculo empírico dependiente de
la longitud de la sonda, la temperatura de lavado, y la
concentración de sal. En general, sondas más largas requieren
temperaturas más elevadas para una hibridación más correcta,
mientras que sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La
hibridación depende generalmente de la capacidad del ADN
desnaturalizado para rehibridarse cuando las cadenas complementarias
están presentes en un medio por debajo de su temperatura de fusión.
Cuanto mayor es el grado de homología deseada entre la secuencia de
la sonda y la secuencia de hibridación, mayor es la temperatura
relativa que se puede utilizar. Como resultado, se deduce que
temperaturas relativas superiores tenderían a hacer las condiciones
de reacción más astringentes, mientras que temperaturas inferiores
no tanto. Para detalles adicionales y explicaciones de la
astringencia de las reacciones de hibridación, ver Ausubel y otros,
Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience
Publishers, (1995).
"Condiciones astringentes" o "condiciones
de astringencia elevada", tal y como se definen en la presente,
se pueden identificar por aquéllas que: (1) utilizan una fuerza
iónica baja y una temperatura elevada para el lavado, por ejemplo,
cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/dodecil sulfato
sódico al 0,1% a 50ºC; (2) utilizan durante la hibridación un agente
desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50%
(v/v) con albúmina de suero bovino al 0,1%/Ficol al
0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón de fosfato sódico 50 mM a
pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC; o (3)
utilizan formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico
0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1%,
5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50
\mug/ml), SDS al 0,1% y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC, con
lavados a 42ºC en 0,2 x SSC (cloruro sódico/citrato sódico) y
formamida al 50% a 55ºC, seguido de un lavado de astringencia
elevada que consiste en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55ºC.
Las "condiciones moderadamente
astringentes" se pueden identificar tal y como se describen en
Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluye la utilización
de una solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo,
temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos astringentes que las
descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente
astringentes es la incubación durante toda la noche a 37ºC en una
solución que comprende: formamida al 20%, 5 x SSC (NaCl 150 mM,
citrato sódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5 x solución
de Denhardt, sulfato de dextrano al 10%, y ADN de esperma de salmón
fragmentado desnaturalizado 20 mg/ml, seguido del lavado de los
filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50ºC. El
experto en la materia sabrá como ajustar la temperatura, la fuerza
iónica, etc. necesarias para acomodar factores, tales como la
longitud de la sonda y similares.
El término "epítopo con tag" cuando se
utiliza en la presente invención se refiere a un polipéptido
quimérico que comprende un polipéptido homólogo de ligando TIE
fusionado a un "polipéptido tag". El polipéptido tag tiene
residuos suficientes para proporcionar un epítopo frente al que se
puede fabricar un anticuerpo, aunque es suficientemente corto, de
manera que no interfiere en la actividad del polipéptido al que se
fusiona. El polipéptido tag es también preferiblemente bastante
único, de manera que el anticuerpo sustancialmente no reacciona de
forma cruzada con otros epítopos. Los polipéptidos tag adecuados
tienen generalmente por lo menos seis residuos de aminoácidos y
habitualmente entre aproximadamente 8 y 50 residuos de aminoácidos
(preferiblemente, entre aproximadamente 10 y 20 residuos de
aminoácidos).
Los términos "actividad biológica" y
"biológicamente activo" con respecto a un homólogo de ligando
TIE de la presente invención se refiere a la capacidad de una
molécula de unirse específicamente a y comunicarse a través de un
receptor nativo de un ligando TIE, conocido o descubierto en la
presente, (de aquí en adelante denominado como "receptor TIE"),
por ejemplo un receptor TIE-2 nativo, o para
bloquear la capacidad de un receptor TIE nativo (por ejemplo,
TIE-2) para participar en la transducción de señal.
De este modo, los ligados TIE (nativo y variante) de la presente
invención incluyen agonistas y antagonistas de un receptor TIE
nativo, por ejemplo TIE-2. Las actividades
biológicas preferidas de los ligandos TIE de la presente invención
incluyen la capacidad de inducir o inhibir la vascularización. La
capacidad de inducir la vascularización será útil en el tratamiento
de condiciones biológicas y enfermedades, en las que la
vascularización es deseable, tales como la curación de heridas,
isquemia, y diabetes. Por otro lado, la capacidad de inhibir o
bloquear la vascularización puede ser útil, por ejemplo, para
prevenir o atenuar el crecimiento tumoral. Otra actividad biológica
preferida es la capacidad de afectar al crecimiento o desarrollo
muscular. Una actividad biológica preferida adicional es la
capacidad de influir en el desarrollo, maduración o crecimiento
óseo. Aún otra actividad biológica preferida es la capacidad de
inhibir el crecimiento de células endoteliales y/o inducir la
apoptosis.
El término "agente citotóxico", tal y como
se utiliza en la presente, se refiere a una sustancia que inhibe o
evita la función de células y/o provoca la destrucción de células.
El término pretende incluir isótopos radioactivos (por ejemplo,
I^{131}, I^{125}, Y^{90} y Re^{186}), agente
quimioterapéuticos, y toxinas, tales como toxinas enzimáticamente
activas de bacterias, hongos, de origen animal o vegetal, o
fragmentos de las mismas.
Un "agente quimioterapéutico" es un
compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Entre los
ejemplos de agentes quimioterapéuticos se incluyen adriamicina,
doxorubicina, epirubicina, 5-fluoroacilo,
arabinósido de citosina ("Ara-C"),
ciclofosfamida, tiotepa, busulfano, citosina, taxoides, por ejemplo,
paclitaxel (Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology,
Princeton, NJ) y doxetaxel (Taxotere, Rhône-Poulenc
Rorer, Anthony, Rnace), taxotere, metotrexato, cisplatino,
melfalano, vinblastina, bleomicina, etopósido, ifosfamida,
mitomicina C, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, carboplatino,
tenipósido, daunomicina, carminomicina, aminopterina, dactinomicina,
mitomicinas, esperamicinas (ver Patente de Estados Unidos No.
4.675.187), melfalano y otros gases de nitrógeno relacionados.
También se incluyen en esta definición agentes hormonales que actúan
para regular o inhibir la acción de la hormona en tumores, tales
como tamoxifeno y onapristona.
Cuando se utiliza en la presente un "agente
inhibidor del crecimiento" se refiere a un compuesto o
composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente
células cancerígenas que sobreexpresan cualquiera de los genes
identificados en la presente, ya sea in vitro o in
vivo. De este modo, el agente inhibidor del crecimiento es el
que reduce significativamente el porcentaje de células que
sobreexpresan dichos genes en fase S. Entre los ejemplos de agentes
inhibidores del crecimiento se incluyen agentes que bloquean la
progresión del ciclo celular (en un lugar distinto a la fase S),
tales como agentes que inducen la interrupción de la fase G1 y M.
Los bloqueadores habituales de la fase M incluyen los vincas
(vincristina y vinblastina), taxol e inhibidores topo II, tales como
doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etopósido y bleomicina.
Estos agentes que interrumpen G1 también afectan la interrupción de
la fase S, por ejemplo, agentes alquilantes de ADN, tales como
tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino,
metotrexato, 5-fluoroacilo, y ara-C.
Se puede encontrar más información en The Molecular Basis of
Cancer, Mendelsohn e Israel, eds. Capítulo I, titulado "Cell
cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs" por
Murakami y otros (WB Saunders: Filadelfia, 1995), especialmente p.
13.
"Doxorubicina" es un antibiótico de
antraciclina. El nombre químico completo de doxorubicina es
(8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-tridesoxi-\alpha-L-lixo-hexapiranosil)oxi]-7,8,9,10-tetrahidro-6,8,10-trihidroxi-8-(hidroxiacetil)-1-metoxi-5,12-naftacenodiona.
El término "citoquina" es un término
genérico para proteínas liberadas por una población de células que
actúa sobre otra célula como mediadores intercelulares. Algunos
ejemplos de dichas citoquinas son linfoquinas, monoquinas, y
hormonas de polipéptidos tradicionales. Entre las citoquinas se
incluyen hormonas del crecimiento, tales como hormona del
crecimiento humano, hormona del crecimiento humano
N-metionilo, y hormona de crecimiento bovino;
hormona paratiroidal; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina;
prorelaxina; hormonas de glicoproteínas, tales como hormona
estimulante del folículo (FSH), hormona estimulante de la tiroides
(TSH), y hormona luteínica (LH); factor de crecimiento hepático;
factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactógeno
placentario; factor \alpha y \beta de necrosis tumoral;
sustancia inhibidora mulleriana; péptido asociado a gonadotropina de
ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial
vascular; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento
nervioso, tales como NGF-\beta; factor de
crecimiento plaquetario; factores de crecimiento transformante
(TGFs), tales como TGF-\alpha y
TGF-\beta, factor de crecimiento I y II de tipo
insulina; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductivos;
interferones, tales como interferón-\alpha,
\beta, y \gamma; factores estimulantes de colonias (CSFs), tales
como macrófago-CSF (M-CSF);
granulocito-macrófago-CSF
(GM-CSF); y granulocito-CSF
(G-CSF); interleuquinas (ILs), tales como
IL-1, IL-1\alpha,
IL-2, IL-3, IL-4,
IL-5 IL-6, IL-7,
IL-8, IL-9, IL-11,
IL-12; un factor de necrosis tumoral, tal como
TNF-\alpha o TNF-\beta, y otros
factores de polipéptidos que incluyen LIF y ligando kit (LK). Tal y
como se utiliza en la presente, el término citoquina incluye
proteínas de fuentes naturales o de cultivos de células
recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las
citoquinas de secuencia nativa.
El "factor de crecimiento endotelial
vascular"/"factor de permeabilidad vascular" (VEGF/VPF) es
un mitógeno específico de células endoteliales que se ha observado
recientemente que es estimulado por hipoxia y es necesario para la
angiogénesis tumoral (Senger y otros, Cancer 46:
5629-5632 (1986); Kim y otros, Nature
362: 841-844 (1993); Schweiki y otros,
Nature 359: 843-845 (1992); Plate y
otros, Nature 359: 845-848 (1992)). Es
una glicoproteína dimérica unida por puentes disulfuro de
34-43 kDa (con la especie predominante de
aproximadamente 45 kDa) sintetizada y secretada por un conjunto de
células tumorales y normales. Además, se ha demostrado que células
retinales humanas cultivadas, tales como células epiteliales del
pigmento y pericitos, secretan VEGF e incrementan la expresión del
gen de VEGF en respuesta a la hipoxia (Adamis y otros, Biochem.
Biophys. Res. Común. 193: 631-638 (1993);
Plouet y otros, Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. 34: 900
(1992); Adamis y otros, Invest. Ophtalmol. Vis. Sci.
34: 1440 (1993); Aiello y otros, Invest. Opthalmol. Vis.
Sci. 35: 1868 (1994); Simorre-pinatel y
otros, Invest. Opthalmol. Vis. Sci. 35:
3393-3400 (1994)). En cambio, el VEGF en tejidos
normales es relativamente bajo. De este modo, parece que el VEGF
juega un papel principal en muchos estados y procesos patológicos
relacionados con la neovascularización. La regulación de la
expresión de VEGF en tejidos afectados por las diversas condiciones
descritas anteriormente podría, por lo tanto, ser la clave en
terapias de tratamiento o prevención asociadas con hipoxia.
El término "agonista" se utiliza para
referirse a análogos de péptidos y no péptidos de los homólogos de
ligando TIE nativo de la presente invención siempre y cuando tengan
la capacidad de comunicarse a través de un receptor TIE nativo (por
ejemplo, TIE-2). En otras palabras, el término
"agonista" se define en el contexto del papel biológico del
receptor TIE, y no en relación al papel biológico de un homólogo de
ligando TIE nativo, que, según se ha indicado anteriormente, puede
ser un agonista o antagonista de la función biológica del receptor
TIE. Los agonistas preferidos poseen las actividades biológicas
preferidas de los homólogos de TIE, tal y como se enumera
anteriormente, e incluyen promotores de vascularización, moléculas
que juegan un papel en la formación, maduración o crecimiento óseo y
promotores del crecimiento y/o desarrollo muscular.
El término "antagonista" se utiliza para
referirse a análogos de péptidos y no péptidos de los homólogos de
ligando TIE nativo de la presente invención y a anticuerpos que se
unen específicamente a dichos homólogos de ligando TIE nativo,
siempre y cuando tengan la capacidad de inhibir la función biológica
de un receptor TIE nativo (por ejemplo, TIE-2). Una
vez más, el término "antagonista" se define en el contexto del
papel biológico del receptor TIE, y no en relación a la actividad
biológica de un homólogo de ligando TIE nativo, que puede ser un
agonista o antagonista de la función biológica del receptor TIE. Los
antagonistas preferidos son inhibidores de la vasculogénesis, o el
desarrollo o crecimiento óseo o muscular patológico.
"Tumor", tal y como se utiliza en la
presente, se refiere a todo el crecimiento y proliferación de
células neoplásicas, tanto malignas como benignas, y a todas las
células y tejidos cancerígenos y precancerígenos.
Los términos "cáncer" y "canceroso/a"
se refieren o describen la condición fisiológica en mamíferos que se
caracteriza habitualmente por un crecimiento celular no regulado.
Ente los ejemplos de cáncer se incluyen, pero no se limitan a,
carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más
concretos de dichos cánceres incluyen cáncer de mama, cáncer de
próstata, cáncer de colon, cáncer de células escamosas, cáncer de
pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas,
cáncer gastrointestinasl, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer
cervical, cáncer ovárico, cáncer de hígado, cáncer de vejiga,
hepatoma, cáncer colorectal, carcinoma endométrico, carcinoma de las
glándulas salivares, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de
vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de
cáncer de cabeza y cuello.
"Tratamiento" es una intervención llevada a
cabo con la intención de prevenir el desarrollo o alteración de la
patología de un trastorno. Por consiguiente, "tratamiento" se
refiere al tratamiento terapéutico y profiláctico o a medidas
preventivas. Entre los que tienen necesidad del tratamiento se
incluyen tanto aquéllos que ya tienen el trastorno como aquéllos en
los que el trastorno se puede evitar. En el tratamiento de tumores
(por ejemplo, cáncer), un agente terapéutico puede disminuir
directamente la patología de las células tumorales, o hacer que las
células tumorales sean más susceptibles al tratamiento mediante
otros agentes terapéuticos, por ejemplo, radiación y/o
quimioterapia.
La "patología" del cáncer incluye todos los
fenómenos que comprenden el bienestar del paciente. Esto incluye,
sin limitación, el crecimiento celular anormal o incontrolable, la
metástasis, la interferencia con el funcionamiento normal de células
vecinas, la liberación de citoquinas u otros productos secretores a
niveles anormales, la supresión o empeoramiento de la respuesta
inflamatoria o inmunológica, etc.
"Mamífero" para los objetivos del
tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero,
incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y animales de
zoológico, de deporte o de compañía, tales como perros, caballos,
gatos, vacas, etc. Preferiblemente, el mamífero es humano.
La administración "combinada con" uno o más
agentes terapéuticos incluye la administración simultánea
(concurrente) y consecutiva en cualquier orden.
El término "derivado funcional" se utiliza
para definir las variantes de la secuencia de aminoácidos
biológicamente activas de los homólogos de ligando TIE nativo de la
presente invención, así como modificaciones covalentes, incluyendo
derivados obtenidos por reacción con agentes derivatizantes
orgánicos, modificaciones post-traduccionales;
derivados con polímeros no proteináceos e inmunoadhesinas.
El término "aislado" cuando se utiliza para
describir los diversos polipéptidos descritos en la presente,
significa polipéptidos que se han identificado y separado y/o
recuperado de un componente de su medio natural. Los componentes
contaminantes de su medio natural son materiales que habitualmente
interferirían con usos diagnósticos o terapéuticos del polipéptido,
y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no
proteináceos. En realizaciones preferidas, se purificará el
polipéptido (1) hasta un grado suficiente para obtener por lo menos
15 residuos de una secuencia de aminoácidos
N-terminal o interna mediante la utilización de un
secuenciador de copa giratoria, o (2) hasta una homogeneidad por
SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras
utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción con plata.
Entre el polipéptido aislado se incluye el polipéptido in
situ en el interior de células recombinantes, ya que por lo
menos un componente del medio natural del ligando TIE no estará
presente. Normalmente, sin embargo, el polipéptido aislado se
preparará mediante por lo menos una etapa de purificación.
Una molécula de ácido nucleico "aislada" es
una molécula de ácido nucleico que se identifica y se separa de por
lo menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que está
asociada normalmente en el medio natural del ácido nucleico. Una
molécula de ácido nucleico aislada está en una forma o composición
diferente de la que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las
moléculas de ácido nucleico aisladas se distinguen de la molécula de
ácido nucleico tal como existen en células naturales. Sin embargo,
una molécula de ácido nucleico aislada incluye moléculas de ácido
nucleico contenidas en células que normalmente expresan un ligando
TIE de la presente invención, cuando, por ejemplo, la molécula de
ácido nucleico está en una localización cromosómica diferente de la
de las células naturales.
El término "variante de secuencia de
aminoácidos" se refiere a moléculas con algunas diferencias en
sus secuencias de aminoácidos en comparación a una secuencia de
aminoácidos nativa.
Las variantes sustitutivas son aquéllas que
tienen por lo menos un residuo de aminoácido eliminado en una
secuencia nativa y un aminoácido diferente insertado en su lugar en
la misma posición. Las sustituciones pueden ser simples, en las que
sólo se ha sustituido un aminoácido en la molécula, o pueden ser
múltiples, en las que se han sustituido dos o más aminoácidos en la
misma molécula.
Las variantes de inserción son aquéllas con uno
o más aminoácidos insertados inmediatamente adyacentes a un
aminoácido en una posición particular en una secuencia nativa.
Inmediatamente adyacente a un aminoácido significa conectado al
grupo funcional \alpha-carboxilo o
\alpha-amino del aminoácido.
Las variantes de eliminación son aquéllas con
uno o más aminoácidos eliminados de la secuencia de aminoácidos
nativa. Normalmente, las variantes de eliminación tendrán uno o dos
aminoácidos eliminados en una región concreta de la molécula. Las
variantes de eliminación incluyen eliminaciones (truncados) C- y/o
N-terminales así como variantes con eliminaciones
internas de uno o más aminoácidos. Las variantes de eliminación
preferidas de la presente invención contienen eliminaciones fuera
del dominio tipo fibrinógeno de un homólogo de ligando TIE nativo de
la presente invención.
Las variantes de la secuencia de aminoácidos
pueden contener varias combinaciones de sustituciones, inserciones
y/o eliminaciones de aminoácidos para producir moléculas con
características óptimas.
Los aminoácidos se pueden clasificar según la
composición y las propiedades químicas de sus cadenas laterales. Se
clasifican ampliamente en dos grupos, cargados y no cargados. Cada
uno de estos grupos se divide en subgrupos para clasificar los
aminoácidos de forma más precisa.
- Residuos ácidos: ácido aspártico, ácido glutámico
- Residuos básicos: lisina, arginina, histidina
- Residuos hidrofílicos: serina, treonina, asparagina, glutamina
- Residuos alifáticos: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina
- Residuos no polares: cisteína, metionina, prolina
- Residuos aromáticos: fenilalanina, tirosina, triptófano
Las sustituciones conservativas implican el
intercambio de un miembro en un grupo por otro miembro del mismo
grupo, mientras que las sustituciones no conservativas supondrán un
intercambio de un miembro de una de estas clases por otro. Se espera
que las variantes obtenidas mediante sustituciones no conservativas
den lugar a cambios significativos en las propiedades/funciones
biológicas de la variante obtenida.
Las eliminaciones de las secuencias de
aminoácidos generalmente varían desde aproximadamente 1 a 30
residuos, más preferiblemente desde aproximadamente 1 a 10 residuos,
y habitualmente son contiguas. Las eliminaciones se pueden
introducir en regiones no directamente implicadas en la interacción
con un receptor TIE nativo. Las eliminaciones se realizan
preferiblemente fuera de las regiones tipo fibrinógeno en el extremo
C-terminal de los homólogos de ligando TIE de la
presente invención.
Las inserciones de aminoácidos incluyen fusiones
de extremos N-terminales y/o
carboxi-terminales que varían en longitud desde un
residuo hasta polipéptidos que contienen cien o más residuos, así
como inserciones intrasecuenciales de uno o múltiples residuos de
aminoácidos. Las inserciones intrasecuenciales (es decir,
inserciones dentro de la secuencia de aminoácidos del homólogo de
ligando TIE) puede variar generalmente desde aproximadamente 1 a 10
residuos, más preferiblemente de 1 a 5 residuos, más preferiblemente
de 1 a 3 residuos. Entre los ejemplos de inserciones terminales se
incluyen los homólogos de ligando TIE con un residuo metionilo
N-terminal, un artefacto de su expresión directa en
el cultivo de células recombinantes bacterianas, y fusión de una
secuencia señal N-terminal heteróloga al
N-terminal de la molécula de homólogo de ligando TIE
para facilitar la secreción del homólogo de ligando TIE maduro a
partir de células huésped recombinantes. Dichas secuencias señal se
obtendrán generalmente a partir de, y por lo tanto homólogas a, las
especies de células huésped deseadas. Entre las secuencias adecuadas
se incluyen, por ejemplo, STII o Ipp para E. coli, factor
alfa para levadura, y señales víricas, tales como herpes gD para
células de mamíferos.
Otras variantes de inserción de las moléculas de
ligando TIE nativo incluyen la fusión del extremo N- o
C-terminal de la molécula de homólogo de ligando TIE
a polipéptidos inmunogénicos, por ejemplo, polipéptidos bacterianos,
tales como beta-lactamasa o un enzima codificado por
el locus trp de E.coli, o proteína de levadura, y
fusiones C-terminales con proteínas que tienen una
larga vida media, tales como regiones de inmunoglobulina
(preferiblemente regiones constantes de inmunoglobulina), albúmina o
ferritina, tal y como se describe en la WO 89/02922 publicada el 6
de abril de 1989.
Dado que es habitualmente difícil predecir por
adelantado las características de una variante de homólogo de
ligando TIE, se entenderá que se necesitará cierto cribado para
seleccionar la variante óptima.
Las variantes de la secuencia de aminoácidos de
homólogos de ligando TIE nativo de la presente invención se preparan
mediante procedimientos conocidos en la técnica introduciendo
cambios de nucleótidos apropiados en un ADN de homólogo de ligando
TIE nativo o variante, o mediante la síntesis in vitro del
polipéptido deseado. Existen dos tipos de variables principales en
la construcción de variantes de secuencia de aminoácidos: la
localización del sitio de la mutación y la naturaleza de la
mutación. Con la excepción de los alelos naturales, que no requieren
la manipulación de la secuencia del ADN que codifica el homólogo de
ligando TIE, las variantes de la secuencia de aminoácidos de los
homólogos de ligando TIE se construyen preferiblemente mutando el
ADN, para llegar a un alelo o a una variante de secuencia de
aminoácidos que no existe en la naturaleza.
Se creará un grupo de mutaciones dentro del
dominio o dominios de los homólogos de ligando TIE de la presente
invención identificados por estar implicados en la interacción con
un receptor TIE, por ejemplo, TIE-1 o
TIE-2, o un receptor aún por descubrir.
Alternativamente o adicionalmente, las
alteraciones de aminoácidos se pueden realizar en sitios que
difieren de los homólogos de ligando TIE de varias especies, o en
regiones altamente conservadas, dependiendo del objetivo a
conseguir.
Los sitios en dichas localizaciones se
modificarán habitualmente en serie, por ejemplo, mediante (1) la
sustitución en primer lugar con selecciones conservativas y a
continuación con selecciones más radicales dependiendo de los
resultados conseguidos, (2) la eliminación del residuo o residuos
diana, o (3) la inserción de residuos de la misma o diferente clase
adyacentes al sitio localizado, o combinaciones de las opciones
1-3.
Una técnica útil se denomina "rastreo de
alanina" (Cunningham, y Wells, Science 244,
1081-1085 [1989]). En la misma, un residuo o grupo
de residuos diana se identifican y sustituyen por alanina o
polialanina. A continuación, aquellos dominios que demuestran una
sensibilidad funcional a las sustituciones de alanina se refinan
introduciendo más u otros sustituyentes en o para los sitios de
sustitución de alanina.
Después de identificar la mutación o mutaciones
deseadas, el gen que codifica una variante de la secuencia de
aminoácidos de un homólogo de ligando TIE puede, por ejemplo,
obtenerse por síntesis química tal y como se ha descrito
anteriormente en la presente.
Más preferiblemente, el ADN que codifica una
variante de secuencia de aminoácidos del homólogo de ligando TIE se
prepara mediante mutagénesis dirigida de sitio de ADN que codifica
una variante preparada anteriormente o una versión no variante del
ligando. La mutagénesis dirigida de sitio (específica de sitio)
permite la producción de variantes de ligando a través de la
utilización de secuencias de oligonucleótidos específicos que
codifican la secuencia de ADN de la mutación deseada, así como un
número suficiente de nucleótidos adyacentes, para proporcionar una
secuencia cebadora de suficiente tamaño y complejidad de secuencia
para formar un dúplex estable en ambas partes de la unión de
eliminación que se atraviesa. Habitualmente, se prefiere un cebador
de aproximadamente 20 a 25 nucleótidos de longitud, con
aproximadamente 5 a 10 residuos en ambas partes de la unión de la
secuencia que se altera. En general, las técnicas de mutagénesis
específica de sitio son bien conocidas en la técnica, tal y como se
ejemplifica mediante publicaciones, tales como Edelman y otros,
DNA 2, 183 (1983). Tal y como se entenderá, la técnica
de mutagénesis específica de sitio utiliza habitualmente un vector
fago que existe tanto en forma de cadena única como doble. Entre los
vectores habituales útiles en la mutagénesis dirigida de sitio se
incluyen vectores, tales como el fago M13, por ejemplo, descrito por
Messing y otros, Third Cleveland Symposium on Macromolecules and
Recombinant DNA, A. Walton, ed., Elsevier, Ámsterdam (1981).
Éste y otros vectores fagos están disponibles comercialmente y su
utilización es conocida por los expertos en la materia. Zoller, M.J.
y Smith, M., Nucleic Acids Res. 10,
6487-6500 [1982]) publicaron un procedimiento
versátil y eficaz para la construcción de mutaciones dirigidas
específicas de sitio de oligodesoxiribonucleótidos en fragmentos de
ADN utilizando vectores derivados de M13. Además, se pueden utilizar
vectores plásmido que contienen un origen de replicación de fago de
cadena única (Veira y otros, Meth. Enzymol. 153, 3
[1987]) para obtener ADN de cadena única. Alternativamente, las
sustituciones de nucleótidos se introducen sintetizando el fragmento
de ADN apropiado in vitro, y amplificándolo mediante
procedimientos de PCR conocidos en la técnica.
En general, la mutagénesis específica de sitio
de la presente se lleva a cabo mediante la obtención en primer lugar
de un vector de cadena única que incluye en su secuencia una
secuencia de ADN que codifica la proteína pertinente. Se prepara,
generalmente de forma sintética, un cebador de oligonucleótido que
transporta la secuencia mutada deseada, por ejemplo, mediante el
procedimiento de Crea y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
75, 5765 (1978). A continuación, este cebador se hibrida con
el vector que contiene la secuencia de la proteína de cadena única,
y se somete a enzimas de polimerización de ADN, tales como fragmento
Klenow de polimerasa I de E. Coli, para completar la síntesis
de la cadena que lleva la mutación. De este modo, se forma un
heterodúplex en el que una cadena codifica la secuencia original no
mutada y la segunda cadena lleva la mutación deseada. A
continuación, se utiliza este vector heterodúplex para transformar
células huésped apropiadas, tales como células JP101, y se
seleccionan clones que incluyen vectores recombinantes que llevan la
adaptación de secuencia mutada. A continuación, la región mutada se
puede extraer y colocar en un vector de expresión adecuado para la
producción de proteínas.
La técnica de PCR también se puede utilizar en
la creación de variantes de secuencias de aminoácidos de un ligando
TIE. Cuando se utilizan pequeñas cantidades de ADN plantilla como
material de partida en una PCR, se pueden utilizar cebadores que se
diferencian ligeramente en la secuencia de la región correspondiente
en un ADN plantilla para generar cantidades relativamente grandes de
un fragmento de ADN específico que difiere de la secuencia plantilla
sólo en las posiciones en las que los cebadores difieren de la
plantilla. Para la introducción de una mutación en un ADN plásmido,
se diseña uno de los cebadores para solapar la posición de la
mutación y contener la mutación; la secuencia del otro cebador debe
ser idéntica a un tramo de la secuencia de la cadena opuesta del
plásmido, pero esta secuencia se puede localizar en 200 nucleótidos
desde el primero, de manera que en el extremo toda la región
amplificada de ADN unida por los cebadores se puede secuenciar
fácilmente. La amplificación por PCR utilizando una pareja de
cebadores como la que se acaba de describir da lugar a una población
de fragmentos de ADN que difieren en la posición de la mutación
especificada por el cebador, y posiblemente en otras posiciones, ya
que la copia de plantilla es propensa a error.
Si la proporción de plantilla con respecto al
material producto es extremadamente baja, la gran mayoría de los
fragmentos de ADN producto incorporan la mutación o mutaciones
deseadas. Este material producto se utiliza para sustituir la región
correspondiente en el plásmido que servía como plantilla para la PCR
utilizando tecnología de ADN estándar. Las mutaciones en posiciones
separadas se pueden introducir simultáneamente utilizando un segundo
cebador mutante o bien, llevando a cabo una segunda PCR con
diferentes cebadores mutantes y uniendo de forma simultánea los dos
fragmentos de PCR resultantes al fragmento de vector en una unión de
tres (o más) partes.
En un ejemplo específico de mutagénesis por PCR,
el ADN plásmido de plantilla (1 \mug) se linealiza por digestión
con una endonucleasa de restricción que tiene un único sitio de
reconocimiento en el ADN plásmido fuera de la región a amplificar.
De este material, se añaden 100 ng a una mezcla de PCR que contiene
tampón de PCR, que contiene los cuatro desoxinucleótidos trifosfatos
y se incluyen en los kits de GeneAmp^{R} (obtenido de
Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT y Emeryville, CA), y
25 pmoles de cada cebador de oligonucleótido, hasta un volumen final
de 50 \mul. La mezcla de reacción se cubre con 35 \mul de aceite
mineral. La reacción se desnaturaliza durante 5 minutos a 100ºC,
colocada brevemente sobre hielo, y a continuación se añade 1 \mul
de ADN polimerasa de Thermus aquaticus (Taq) (5 unidades/l),
adquirida de Perkin-Elmer CETUR, Norwalk, CT y
Emeryville, CA) por debajo de la capa de aceite mineral. A
continuación, la mezcla de reacción se inserta en un Ciclador
Térmico de ADN (adquirido de Perkin-Elmer CETUR)
programado tal y como se indica:
2 min a 55ºC,
30 s a 72ºC, a continuación 19 ciclos del
siguiente:
30 s a 94ºC,
30 s a 55ºC, y
30 s a 72ºC
Al final del programa, el recipiente de reacción
se extrae del ciclador térmico y la fase acuosa se transfiere a un
nuevo recipiente, se extrae con fenol/cloroformo (50:50 vol), y se
precipita con etanol, y el ADN se recupera mediante procedimientos
estándar. Este material se somete posteriormente a tratamientos
adecuados para la inserción en un vector.
Otro método para preparar variantes, mutagénesis
por inserción de cassette, se basa en la técnica descrita por Wells
y otros [Gene 34, 315 (1985)]. El material de partida
es el plásmido (o vector) que comprende el ADN del homólogo de
ligando TIE a mutar. Se identifican el codón o codones del homólogo
de ligando TIE a mutar. Debe haber un único sitio de endonucleasa de
restricción en cada parte del sitio o sitios de mutación
identificados. Si no existen dichos sitios de restricción, se pueden
generar utilizando el procedimiento de mutagénesis mediado por
oligonucleótidos descrito anteriormente para introducirlos en
localizaciones adecuadas en el ADN que codifica el homólogo de
ligando TIE. Después de introducir los sitios de restricción en el
plásmido, el plásmido se corta en estos sitios para linealizarlo.
Utilizando procedimientos estándar se sintetiza un oligonucleótido
de doble cadena que codifica la secuencia del ADN entre el sitio de
restricción, pero que contiene la mutación o mutaciones deseadas.
Las dos cadenas se sintetizan por separado y a continuación se
hibridan utilizando técnicas estándar. Este oligonucleótido de doble
cadena se denomina el cassette. Este cassette se diseña con extremos
3' y 5' que son compatibles con los extremos del plásmido
linearizado, de manera que se pueden unir directamente al plásmido.
Este plásmido contiene entonces la secuencia de ADN de homólogo de
ligando TIE mutado.
Adicionalmente, el denominado procedimiento de
expresión de fagémidos puede ser útil en la fabricación de variantes
de secuencias de aminoácidos de homólogos de ligando TIE nativo o
variante. Este procedimiento implica (a) construir un vector de
expresión replicable que comprende un primer gen que codifica un
receptor a mutar, un segundo gen que codifica por lo menos una parte
de un fago de proteína de recubrimiento natural o salvaje en el que
el primer y segundo gen son heterólogos, y un elemento regulador de
la transcripción unido operativamente al primer y segundo genes,
formando así una fusión de genes que codifica una proteína de
fusión; (b) mutar el vector en una o más posiciones seleccionadas
dentro del primer gen formando así una familia de plásmidos
relacionados; (c) transformar las células huésped adecuadas con los
plásmidos; (d) infectar las células huésped transformadas con un
fago de ayuda que tiene un gen que codifica el fago de la proteína
de recubrimiento; (e) cultivar las células huésped infectadas
transformadas en condiciones adecuadas para la formación de
partículas de fagémidos recombinantes que contienen por lo menos una
parte del plásmido y son capaces de transformar el huésped con las
condiciones ajustadas de manera que sólo una pequeña cantidad de
partículas de fagémidos expresan más de una copia de la proteína de
fusión en la superficie de la partícula; (f) poner en contacto las
partículas de fagémidos con un antígeno adecuado de manera que por
los menos una parte de las partículas de fagémidos se unen al
antígeno, y (g) separar las partículas de fagémidos que se unen de
las que no. Las etapas (d) a (g) se pueden repetir una o más veces.
Preferiblemente, en este procedimiento el plásmido está bajo el
estrecho control del elemento regulador de la transcripción, y las
condiciones de cultivo se ajustan de manera que la cantidad o número
de partículas de fagémidos que expresan más de una copia de la
proteína de fusión en la superficie de la partícula es inferior a
aproximadamente el 1%. Además, preferiblemente, la cantidad de
partículas de fagémidos que expresan más de una copia de la proteína
de fusión es inferior al 10% de la cantidad de partículas de
fagémidos que expresan una única copia de la proteína de fusión. Más
preferiblemente, la cantidad es inferior al 20%. Habitualmente en
este procedimiento, el vector de expresión también contendrá una
secuencia señal secretora fusionada al ADN que codifica cada
subunidad del polipéptido y el elemento regulador de la
transcripción será un sistema promotor. Los sistemas promotores
preferidos se seleccionan de entre los promotores lac Z,
\lambda_{PL}, tac, polimerasa T7, triptófano, y fosfatasa
alcalina y combinaciones de los mismos. Además, normalmente, el
procedimiento utilizará un fago de ayuda seleccionado de entre
M13K07, M13R408, M13-VCS, y Phi X174. El fago de
ayuda preferido es M13K07, y la proteína de recubrimiento preferida
es la proteína de recubrimiento del gen III del fago M13. El huésped
preferido es E. coli, y las cepas deficientes de proteasa de
E. coli.
En libros de texto generales, tales como, por
ejemplo, Sambrook y otros, Molecular Cloning: A laboratory
Manual (Nueva Cork: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989),
y Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y otros,
eds., Wiley-Interscience, 1991, se encuentran
más detalles de las técnicas de mutagénesis anteriores y
similares.
Las "inmunoadhesinas" son quimeras que se
construyen habitualmente a partir de una secuencia receptora unida a
una secuencia de dominio constante adecuada de inmunoglobulina
(inmunoadhesinas). Dichas estructuras son conocidas en la técnica.
Entre las inmunoadhesinas descritas en la literatura se incluyen
fusiones del receptor de células T* [Gascoigne y otros, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 84, 2936-2940
(1987)]; CD4* [Capon y otros, Nature 337,
525-531 (1989); Traunecker y otros, Nature
339, 68-70 (1989); Zetmeissl y otros, DNA
Cell Biol. USA 9, 347-353 (1990); Byrn y
otros, Nature 344, 667-670 (1990)];
L-selectina (receptor casero) [Watson y otros, J.
Cell. Biol. 110, 2221-2229 (1990); Watson
y otros, Nature 349, 164-167 (1991)];
CD4* [Aruffo y otros, Cell 61,
1303-1313 (1990)]; CD28* y B7* [Linsley y otros,
J. Exp. Med. 173, 721-730 (1991)];
CTLA-4* [Lisley y otros, J. Exp.Med.
174, 561.569 (1991)]; CD22* [Stamenkovic y otros, Cell
66, 1133-1144 (1991)]; receptor TNF
[Ashkenazi y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,
10535-10539 (1991); Lesslauer y otros, Eur. J.
Inmunol. 27, 2883-2886 (1991); Peppel y
otros, J. Exp. Med. 174, 1483-1489
(1991)]; receptores NP [Bennett y otros, J. Biol. Chem.
266, 23060-23067 (1991)]; cadena \alpha de
receptor IgE* [Ridgway y Gorman, J. Cell. Biol. 115,
resumen 1448 (1991)]; receptor HGF [Mark, M.R. y otros, 1992, J.
Biol. Chem. presentado], donde el asterismo (*) indica que el
receptor es miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas.
Las quimeras
ligando-inmunoglobulina también son conocidas y se
describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nos:
5.304.640 (para ligandos L-selectina); 5.316.921 y
5.328.837 (para variantes HGF). Estas quimeras se pueden fabricar de
una manera similar a la construcción de quimeras
receptor-inmunoglobulina.
Las modificaciones covalentes de los homólogos
de ligando TIE de la presente invención se incluyen dentro del
alcance de la presente invención. Dichas modificaciones se
introducen habitualmente reaccionando los residuos de aminoácidos
marcados del ligando TIE con un agente derivatizante orgánico que es
capaz de reaccionar con residuos laterales o terminales
determinados, o aprovechando mecanismos de modificación
post-traduccionales que actúan en células huésped
recombinantes determinadas. Los derivados covalentes resultantes son
útiles en programas dirigidos a identificar residuos importantes en
la actividad biológica, para inmunoensayos, o para la preparación de
anticuerpos anti-ligando TIE para la purificación
por inmunoafinidad del recombinante. Por ejemplo, la inactivación
completa de la actividad biológica de la proteína después de la
reacción con ninhidrina sugeriría que por lo menos un residuo
arginil o lisil es crítico para su actividad, después de lo cual los
residuos individuales que se modificaron en condiciones determinadas
se identifican mediante el aislamiento de un fragmento de péptido
que contiene el residuo de aminoácido modificado. Dichas
modificaciones están dentro del estado de la técnica y se llevan a
cabo sin una experimentación excesiva.
Los residuos cisteinilos se hacen reaccionar más
habitualmente con \alpha-haloacetatos (y las
correspondientes aminas), tales como ácido cloroacético o
cloroacetamida, para obtener derivados de carboximetilo o
carboxiamidometilo. Los residuos cisteinilos también se derivatizan
mediante la reacción con bromotrifluoroacetona, ácido
\alpha-bromo-\beta-(5-imidozoil)
propiónico, fosfato de cloroacetilo,
N-alquilmaleimidas, disulfuro de
3-nitro-2-piridilo,
disulfuro de metil 2-piridilo,
p-cloromercuribenzoato,
2-cloromercuri-4-nitrofenol,
o
cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.
Los residuos histidilos se derivatizan mediante
la reacción con dietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0 ya
que este agente es relativamente específico para la cadena lateral
de histidilo. El bromuro de para-bromofenacilo
también es útil; la reacción se lleva a cabo preferiblemente en
cacodilato sódico 0,1 M a pH 6,0.
Los residuos lisinilo y amino terminales se
hacen reaccionar con anhídridos de ácido succínico u otros ácidos
carboxílicos. La derivatización con estos agentes tiene el efecto de
invertir la carga de los residuos lisinilos. Entre otros reactivos
adecuados para derivatizar residuos que contienen
\alpha-amino se incluyen imidoésteres, tales como
picolinimidato de metilo; fosfato de piridoxal; piridoxal;
cloroborohidruro; ácido trinitrobencenosulfónico;
O-metilisourea; 2,4-pentanodiona; y
reacción con glioxilato catalizada por transaminasa.
Los residuos arginilos se modifican mediante la
reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos
fenilglioxal, 2,3-butanodiona,
1,2-ciclohexanodiona, y ninhidrina. La
derivatización de residuos de arginina requiere que la reacción se
lleve a cabo en condiciones alcalinas debido al pK_{a} elevado del
grupo funcional guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar
con los grupos de lisina así como con el grupo
epsilon-amino de arginina.
La modificación específica de residuos tirosilo
se puede realizar, con interés particular en la introducción de
marcas espectrales en los residuos tirosilo, mediante la reacción
con compuestos de diazonio aromático o tetranitrometano. Más
habitualmente, se utiliza N-acetilimidizol y
tetranitrometano para formar especies de O-acetilo
tirosilo y 3-nitro derivados, respectivamente. Los
residuos tirosilo se yodan utilizando ^{125}I o ^{131}I para
preparar proteínas marcadas para su utilización en
radioinmunoensayo.
Los grupos laterales carboxilo (aspartilo o
glutamilo) se modifican selectivamente mediante la reacción con
carbodiimidas (R'-N=C=N-R'), tales
como
1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil)
carbodiimida o
1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)
carbodiimida. Además, los residuos aspartilo y glutamilo se
convierten en residuos asparagilo y glutaminilo mediante la reacción
con iones amonio.
Los residuos glutaminilo y asparaginilo
habitualmente se desamidan para obtener los correspondientes
residuos glutamilo y aspartilo. Alternativamente, estos residuos se
desamidan en condiciones ligeramente ácidas. Cualquier forma de
estos residuos está dentro del alcance de la invención.
Entre otras modificaciones se incluyen la
hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo
de residuos serilo, treonilo o tirosilo, metilación de los grupos
\alpha-amino de lisina, arginina y cadenas
laterales de histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and
Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.
79-86 [1983]), acetilación de la amina
N-terminal y la amidación de cualquier grupo
carboxilo C-terminal. Las moléculas se pueden además
unir covalentemente a polímeros no proteináceos, por ejemplo,
polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la
manera establecida en las Patentes de Estados Unidos 4.640.835;
4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 ó 4.179.337.
La derivatización con agentes bifuncionales es
útil para la preparación de agregados intramoleculares del ligando
TIE con polipéptidos así como para reticular el polipéptido de
ligando TIE a una matriz o superficie soporte insoluble en agua para
utilizar en ensayos o purificación de afinidad. Además, un estudio
de las reticulaciones entre cadenas proporcionará una información
directa sobre la estructura conformacional. Entre los agentes de
reticulación utilizados habitualmente se incluyen
1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano,
glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida,
imidoésteres homobifuncionales y maleimidas bifuncionales. Los
agentes derivatizantes, tales como
metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato,
producen intermedios fotoactivables que son capaces de formar
reticulaciones en presencia de luz. Alternativamente, para la
inmovilización y reticulación de proteínas se utilizan matrices
reactivas insolubles en agua, tales como carbohidratos activados con
bromuro de cianógeno y los sustratos reactivos de sistemas descritos
en las Patentes de Estados Unidos Nos: 3.959.642; 3.969.287;
3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; 4.055.635 y
4.330.440.
Ciertas modificaciones
post-traduccionales son el resultado de la acción de
células huésped recombinantes en el polipéptido expresado. Los
residuos glutaminilo y asparaginilo con frecuencia se desamidan
post-traduccionalmente a los correspondientes
residuos de glutamilo y aspartilo. Alternativamente, estos residuos
se desamidan en condiciones ligeramente ácidas. Cualquier forma de
estos residuos está dentro del alcance de la invención.
Entre otras modificaciones
post-traduccionales se incluyen la hidroxilación de
prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos
serilo, treonilo o tirosilo, metilación de los grupos
\alpha-amino de las cadenas laterales de lisina,
arginina e histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure and
Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.
79-86 (1983)].
Otros derivados comprenden los péptidos
novedosos de esta invención unidos covalentemente a un polímero no
proteináceo. El polímero no proteináceo normalmente es un polímero
sintético hidrofílico, es decir, un polímero que no se encuentra en
la naturaleza. Sin embargo, los polímeros que existen en la
naturaleza y se producen por procedimientos recombinantes o in
vitro son útiles, ya que son polímeros que se aíslan de la
naturaleza. Los polímeros de polivinilo hidrofílicos están dentro
del alcance de la presente invención, por ejemplo, polivinilalcohol
y polivinilpirrolidona. Los éteres de polivinilalquileno, tales como
polietilenglicol, polipropilenglicol son particularmente útiles.
Los homólogos de ligando TIE se pueden unir a
varios polímeros no proteináceos, tales como polietilenglicol (PEG),
polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la menara establecida en
las Patentes de Estados Unidos Nos. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144;
4.670.417; 4.791.192 ó 4.179.337. Estas variantes, como las
inmunoadhesinas de la presente invención, se espera que tengan unas
semividas más largas que los correspondientes homólogos de ligando
TIE nativo.
Los homólogos de ligando TIE se pueden
introducir en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante
técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, en
sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo,
liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas
y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen
en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª Edición, Osol, A.
Ed. (1980).
El término "receptor TIE nativo" se utiliza
en la presente para referirse a un receptor TIE de cualquier especia
animal, incluyendo, pero sin limitarse a, humanos, otros primates
superiores, por ejemplo, monos, y roedores, por ejemplo, ratas y
ratones, conocidos o descubiertos en la presente. La definición
incluye específicamente el receptor TIE-2, descrito,
por ejemplo, en la Solicitud PCT de No. de Serie WO 95/13387
(publicada el 18 de mayo de 1995), y el receptor tirosina quinasa de
células endoteliales denominado "TIE" en la Publicación de la
Solicitud de la PCT No. WO 93/14124 (publicada el 22 de julio de
1993), y preferiblemente es TIE-2.
La presente invención cubre anticuerpos que se
unen específicamente a los homólogos de ligando TIE. Los anticuerpos
pueden ser monoclonales o policlonales, e incluyen, sin limitación,
anticuerpos maduros, fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab,
F(ab')_{2}, F_{v}, etc.), anticuerpos de cadena única y
varias combinaciones de cadenas.
El término "anticuerpo" se utiliza en el
sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales
únicos que se unen específicamente a un ligando TIE de la presente
invención y composiciones de anticuerpos con especificidad
poliepitópica.
El término "anticuerpo monoclonal", tal y
como se utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo obtenido
de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es
decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son
idénticos a excepción de posibles mutaciones naturales que pueden
estar presentes en pequeñas cantidades. Los anticuerpos monoclonales
son altamente específicos, dirigiéndose contra un único sitio
antigénico. Además, a diferencia de preparaciones de anticuerpos
convencionales (policlonales) que habitualmente incluyen anticuerpos
diferentes dirigidos contre determinantes (epítopos) diferentes,
cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante en
el antígeno.
Los anticuerpos monoclonales de la presente
incluyen anticuerpos híbridos y recombinantes producidos por
splicing (corte y empalme) de un dominio variable (incluyendo
hipervariable) de un anticuerpo de homólogo de ligando
anti-TIE con un dominio constante (por ejemplo,
anticuerpos "humanizados"), o una cadena ligera con una cadena
pesada, o una cadena de una especie con una cadena de otra especie,
o fusiones con proteínas heterólogas, independientemente de la
especie de origen o la designación de la clase o subclase de la
inmunoglobulina, así como fragmentos de anticuerpos (por ejemplo,
Fab, F(ab')_{2}, F_{v}), siempre y cuando muestren la
actividad biológica deseada. Ver, por ejemplo, la Patente de Estados
Unidos No. 4.816.567 y Mage y otros, en Monoclonal Antibody
Production Techniques and Applications, pp.
79-97 (Marcel Dekker, Inc.: Nueva York, 1987).
De este modo, el modificador "monoclonal"
indica el carácter del anticuerpo que se obtiene de una población
sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se interpreta como la
producción requerida del anticuerpo mediante ningún procedimiento
concreto. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizar según
la presente invención se puede fabricar mediante el procedimiento
del hibridoma descrito por primera vez por Kohler y Milstein,
Nature, 256:495 (1975), o se puede fabricar mediante
procedimientos de ADN recombinante, tal y como se describe en la
Patente de Estados Unidos No. 4.816.567. Los "anticuerpos
monoclonales" también se pueden aislar de bibliotecas de fagos
generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty y otros,
Nature, 348: 552-554 (1990), por
ejemplo.
Formas "humanizadas" de anticuerpos no
humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas
específicas, cadenas de inmunoglobulinas, o fragmentos de las mismas
(tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias
de unión a antígeno de los anticuerpos) que contienen una secuencia
mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Para la mayoría del
grupo, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas
(anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región
determinante de complementariedad (CDR) del receptor se sustituyen
por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo dador)
tal como ratón, rata o conejo que tienen la especificidad, afinidad
y capacidad deseadas. En algunos ejemplos, los residuos de la región
de armazón (FR) Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por
los residuos no humanos correspondientes. Además, el anticuerpo
humanizado puede comprender residuos que no se encuentran ni en el
anticuerpo receptor ni en la CDR importada o las secuencias del
armazón. Estas modificaciones se realizan para refinar
adicionalmente y optimizar la acción del anticuerpo. En general, el
anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos o por lo
menos uno, y habitualmente dos, dominios variables, en que todas o
sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquéllas de
una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las
regiones FR son aquéllas de una secuencia de consenso de
inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá
óptimamente por lo menos una parte de una región o dominio constante
de inmunoglobulina (Fc), habitualmente la de una inmunoglobulina
humana.
Los anticuerpos policlonales a un homólogo de
ligando TIE de la presente invención se desarrollan generalmente en
animales mediante inyecciones múltiples subcutáneas (sc) o
intraperitoneales (ip) del ligando TIE y un adyuvante. Puede ser
útil conjugar el ligando TIE o un fragmento que contiene la
secuencia de aminoácidos diana a una proteína que es inmunogénica en
las especies a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa
californiana, albúmina sérica, tiroglobulina bovina, o inhibidor de
tripsina de soja, utilizando un agente bifuncional o derivatizante,
por ejemplo, éster maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a
través de residuos de cisteína),
N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de
lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl_{2}, o
R^{1}N=C=NR, donde R y R^{1} son grupos alquilo diferentes.
Los animales se inmunizan contra los conjugados
inmunogénicos o derivados combinando 1 mg o 1 \mug de conjugado
(para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de
adyuvante completo de Freud e inyectando la solución de forma
intradérmica en múltiples sitios. Un mes más tarde los animales se
estimularon con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de conjugado en
adyuvante completo de Freud mediante inyección subcutánea en
múltiples sitios. De 7 a 14 días después los animales sangraron y se
examinó el suero para el título de anticuerpo de ligando
anti-TIE. Los animales se estimularon hasta el nivel
adecuado del título. Preferiblemente, el animal se estimuló con el
conjugado del mismo ligando TIE, pero conjugado a una proteína
diferente y/o a través de un reactivo de reticulación diferente. Los
conjugados también se pueden fabricar en un cultivo de células
recombinantes como fusiones de proteínas. Además, los agentes de
agregación, tales como alumbre, se utilizan para aumentar la
respuesta inmunitaria.
Los anticuerpos monoclonales se obtienen de una
población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los
anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos a
excepción de posibles mutaciones naturales que pueden estar
presentes en pequeñas cantidades. De este modo, el modificador
"monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que no es
una mezcla de anticuerpos discretos.
Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales de
homólogo de ligando anti-TIE de la invención se
puede fabricar utilizando el procedimiento del hibridoma descrito
por primera vez por Kohler y Milstein, Nature, 256:495
(1975), o se pueden fabricar mediante procedimientos de ADN
recombinante, [Cabilly y otros, Patente de Estados Unidos No.
4.816.567].
En el procedimiento del hibridoma, se inmuniza
un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster, según
se ha descrito anteriormente en la presente, para obtener linfocitos
que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán
específicamente a la proteína utilizada para la inmunización.
Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in
vitro. A continuación, los linfocitos se fusionan con células de
mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, tal como
polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma [Goding,
Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.
59-103 (Academia Press, 1986)].
Las células de hibridoma preparadas de esta
manera se cultivan y se desarrollan en un medio de cultivo adecuado
que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el
crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parentales
no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales no
tienen la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT
o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá
habitualmente hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT),
cuyas sustancias previenen el crecimiento de células deficientes de
HGPRT.
Las células de mieloma preferidas son aquéllas
que se fusionan de forma eficaz, apoyan un nivel de expresión
elevado y estable de anticuerpo por las células productoras de
anticuerpos determinados, y son sensibles a un medio, tal como medio
HAT. Entre éstas, las líneas de células de mieloma preferidas son
líneas de mieloma murinas, tales como las derivadas de tumores de
ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles
en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California
EEUU, y células SP-2 disponibles en la American Type
Culture Collection, Rockville, Maryland, EEUU. Las líneas celulares
de mieloma humano y heteromieloma ratón-humano
también se han descrito para la producción de anticuerpos
monoclonales humanos [Kozbor, J. Immunol. 133: 3001 (1984);
Brodeur y otros, Monoclonal Antibody Production Techniques and
Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc.,
Nueva Cork, 1987)].
Se hace un ensayo del medio de cultivo en el que
crecen las células del hibridoma para la producción de anticuerpos
monoclonales dirigidos contra el homólogo de ligando TIE.
Preferiblemente, la especificidad de unión de anticuerpos
monoclonales producidos por células del hibridoma se determina
mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in
vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo con sustancias
inmunoabsorbentes unidas a enzima (ELISA).
La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal
se puede determinar, por ejemplo, mediante análisis Scatchard de
Munson y Pollard, Anal. Biochem. 107: 220 (1980).
Después de identificar las células del hibridoma
que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad
deseadas, los clones se pueden subclonar limitando los
procedimientos de dilución y se pueden desarrollar mediante
procedimientos estándar. Goding, Monoclonal Antibodies:
Principles and Practice, pp. 59-104 (Academia
Press, 1986). Entre los medios de cultivo adecuados para este
objetivo se incluyen, por ejemplo, el Medio MEM modificado por
Dulbecco o medio RPMI-1640. Además, las células del
hibridoma se pueden desarrollar in vivo como tumores con
ascitis en un animal.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los
subclones se separan de forma adecuada del medio de cultivo, fluido
de ascitis o suero mediante procedimientos convencionales de
purificación de inmunoglobulinas, tales como, por ejemplo, proteína
A-Sepharose, cromatografía de con hidroxilapatito,
electroforesis en gel, diálisis, cromatografía de afinidad.
El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales
de la invención se puede aislar fácilmente y secuenciar utilizando
procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de
nucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que
codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos murinos). Las
células del hibridoma de la invención sirven como una fuente
preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en
los vectores de expresión, que a continuación se transfectan en
células huésped, tales como células COS de simio, células de ovario
de hámster chino (CHO) o células de mieloma que no producen de
ningún modo proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de
anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. El
ADN también se puede modificar, por ejemplo, sustituyendo la
secuencia codificante de los dominios constantes de cadena pesada y
ligera humana en lugar de las secuencias de murino homólogas,
Morrison y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 6851
(1984) o mediante unión covalente a la secuencia codificante de
inmunoglobulinas de toda o parte de la secuencia codificante de un
polipéptido que no es inmunoglobulina. De esa manera, los
anticuerpos "quiméricos" o "híbridos" se preparan para que
tengan la especificidad de afinidad de un anticuerpo monoclonal de
ligando anti-TIE de la
presente.
presente.
Habitualmente, dichos polipéptidos que no son
inmunoglobulinas se sustituyen por los dominios constantes de un
anticuerpo de la invención, o se sustituyen por los dominios
variables de un sitio de combinación a antígeno de un anticuerpo de
la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico que
comprende un sitio de combinación a antígeno que tiene especificidad
por un ligando TIE de la presente invención y otro sitio de
combinación a antígeno que tiene especificidad por un antígeno
diferente.
Los anticuerpos quiméricos o híbridos se pueden
preparar in vitro utilizando procedimientos conocidos en la
química sintética de proteínas, incluyendo aquéllos que implican
agentes reticuladores. Por ejemplo, se pueden construir
inmunotoxinas utilizando una reacción de intercambio de puentes
disulfuro o mediante la formación de un enlace tioéter. Entre los
ejemplos de reactivos adecuados para este objetivo se incluyen
iminotiolato y
metil-4-mercaptobutirimidato.
Para aplicaciones de diagnóstico, los
anticuerpos de la invención se marcarán habitualmente con una parte
detectable. La parte detectable puede ser cualquiera que sea capaz
de producir, directa o indirectamente, una señal detectable. Por
ejemplo, la parte detectable puede ser un radioisótopo, tal como
^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S o ^{125}I, un compuesto
fluorescente o quimioluminiscente, tal como isotiocianato de
fluoresceína, rodamina, o luciferina; biotina; marcadores isotópicos
radioactivos, tales como, por ejemplo, ^{125}I, ^{32}P,
^{14}C, o ^{3}H o una enzima, tal como fosfatasa alcalina,
beta-galactosidasa o peroxidasa de rábano
picante.
Se puede utilizar cualquier procedimiento
conocido en la técnica para conjugar de forma separada el anticuerpo
a la parte detectable, incluyendo aquellos procedimientos por Hunter
y otros, Nature 144: 945 (1962); David y otros,
Biochemistry 13: 1014 (1974); Pain y otros, J.
Immunol. Meth. 40: 219 (1981); y Nygren, J. Histochem.
and Cytochem. 30: 407 (1982).
Los anticuerpos de la presente invención se
pueden utilizar en cualquier procedimiento de ensayo conocido, tales
como ensayos de unión competitiva, ensayos de sándwich directos e
indirectos, y ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal
Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158
(CRC Press, Inc., 1987).
Los ensayos de unión competitiva dependen de la
capacidad de un patrón marcado (que puede ser un homólogo de ligando
TIE o una parte inmunológicamente reactiva del mismo) para competir
con el analito de muestra de prueba (ligando TIE) para la unión con
una cantidad limitada de un anticuerpo. La cantidad de homólogo de
ligando TIE en la muestra de prueba es inversamente proporcional a
la cantidad de patrón que se une a los anticuerpos. Para facilitar
la determinación de la cantidad de patrón que se une, los
anticuerpos generalmente se insolubilizan antes o después de la
competición, de manera que el patrón y el analito que se unen a los
anticuerpos se pueden separar convenientemente del patrón y analito
que permanecen no unidos.
Los ensayos de sándwich implican la utilización
de dos anticuerpos, cada uno de los cuales capaces de unirse a una
parte inmunogénica diferente, o epítopo, de la proteína a detectar.
En un ensayo de sándwich, el analito de la muestra de prueba se une
mediante un primer anticuerpo que se inmoviliza sobre un soporte
sólido, y a continuación un segundo anticuerpo se une al analito,
formando así un complejo de tres partes insoluble. David y Greene,
Patente de Estados Unidos No. 4.376.110. El segundo anticuerpo se
puede marcar en sí mismo con una parte detectable (ensayos de
sándwich directo) o se pueden medir utilizando un anticuerpo
anti-inmunoglobulina que está marcado con una parte
detectable (ensayo de sándwich indirecto). Por ejemplo, un tipo de
ensayo de sándwich es un ensayo ELISA, en el caso la parte
detectable es una enzima.
Los procedimientos para humanizar anticuerpos no
humanos son conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo
humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en
el mismo a partir de un origen que no es humano. Estos residuos de
aminoácidos no humanos se denominan frecuentemente como residuos de
"importación", que se cogen habitualmente de un dominio
variable "de importación". La humanización se puede llevar a
cabo básicamente siguiendo el método de Winter y colaboradores
[Jones y otros, Nature 321, 522-525
(1986); Riechmann y otros, Nature 332,
323-327 (1988); Verhoeyen y otros, Science
239, 1534-1536 (1988)] sustituyendo
secuencias de CDR o CDRs de roedor por las correspondientes
secuencias de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos
anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Cabilly,
supra), en los que sustancialmente menos de un dominio
variable humano intacto ha sido sustituido por la correspondiente
secuencia de una especie no humana, En la práctica, los anticuerpos
humanizados son habitualmente anticuerpos humanos en los que algunos
residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR están
sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de
roedores.
Es importante que los anticuerpos se humanicen
manteniendo una afinidad elevada por el antígeno y otras propiedades
biológicas favorables. Para conseguir este objetivo, según un
procedimiento preferido, los anticuerpos humanizados se preparan
mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y
varios productos humanizados conceptuales utilizando modelos
tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los
modelos de inmunoglobulinas tridimensionales están disponibles
habitualmente y son conocidos para los expertos en la materia.
Existen programas informáticos disponibles que ilustran y muestran
las probables estructuras conformacionales en tres dimensiones de
secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. El examen de
este muestreo permite el análisis del probable papel de los residuos
en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata,
es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la
inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta manera,
los residuos de FR se pueden seleccionar y combinar a partir de las
secuencias de consenso e importación, de manera que se consigue la
característica deseada del anticuerpo, tal como una mayor afinidad
por el antígeno o antígenos diana. En general, los residuos de CDR
están implicados directamente y más sustancialmente en la influencia
de la unión a antígeno.
Alternativamente, actualmente es posible
producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son
capaces, tras la inmunización, de producir un amplio repertorio de
anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de
inmunoglobulina. Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación
homocigótica del gen de la región de unión (J_{H}) de la cadena
pesada del anticuerpo en ratones mutantes de línea germinal y
quiméricos da lugar a la inhibición completa de la producción
endógena de anticuerpo. La transferencia del grupo de genes de la
inmunoglobulina de línea germinal humana en dichos ratones mutantes
de línea germinal dará lugar a la producción de anticuerpos humanos
tras la estimulación de antígeno. Ver, por ejemplo, Jakobovits y
otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90,
2551-2555 (1993); Jakobovits y otros, Nature
362, 255-258 (1993).
Los anticuerpos biespecíficos son monoclonales,
preferiblemente humanos o humanizados, anticuerpos que tienen
especificidades de unión para por lo menos dos antígenos diferentes.
En el presente caso, una de las especificidades de unión es para un
ligando TIE particular, el otro es para cualquier otro antígeno, y
preferiblemente para otro ligando. Por ejemplo, los anticuerpos
biespecíficos que se unen específicamente a dos homólogos de ligando
TIE diferentes están dentro del alcance de la presente
invención.
Los procedimientos para la fabricación de
anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica.
Habitualmente, la producción recombinante de
anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos parejas
de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina,
donde las dos cadenas pesadas tienen especificidades diferentes
(Millstein y Cuello, Nature 305,
537-539 (1983)). Debido a la variedad aleatoria de
cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina, estos hibridomas
(cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas diferentes
de anticuerpo, de las cuales sólo una tiene la estructura
biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que
se realiza habitualmente mediante etapas de cromatografía de
afinidad, es bastante incómoda, y los rendimientos del producto son
bajos. En la publicación de la solicitud PCT No. WO 93/08829
(publicada el 13 de mayo de 1993) y en Traunecker y otros,
EMBO 10, 3655-3659 (1991) se describen
procedimientos similares.
Según una aproximación diferente y más
preferida, los dominios variables de anticuerpos con las
especificidades de unión deseadas (sitios de combinación
anticuerpo-antígeno) se fusionan a secuencias del
dominio constante de inmunoglobulina. La fusión se produce
preferiblemente con una dominio constante de cadena pesada de la
inmunoglobulina, comprendiendo por lo menos parte de las regiones
flexibles y segunda y tercera región constante de cadena pesada de
inmunoglobulina (CH2 y CH3). Se prefiere que la primera región
constante de cadena pesada (CH1) contenga el sitio necesario para la
unión a cadena ligera, presente en por lo menos una de las fusiones.
Los ADNs que codifican las fusiones de la cadena pesada de
inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina,
se insertan en vectores de expresión separados y se cotransfectan a
un organismo huésped adecuado. Esto proporciona una gran
flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres
fragmentos de polipéptido en realizaciones cuando la proporción
desigual de las tres cadenas de polipéptido utilizadas en la
construcción proporciona rendimientos óptimos. Sin embargo, es
posible insertar las secuencias codificantes para dos o las tres
cadenas de polipéptido en un vector de expresión cuando la expresión
de por lo menos dos cadenas de polipéptido en proporciones iguales
da lugar a rendimientos elevados o cuando las proporciones no tienen
particular importancia. En una realización preferida de esta
aproximación, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una
cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera
especificidad de unión en un brazo, y una pareja de cadena
pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que
proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se
observó que esta estructura asimétrica facilita la separación del
compuesto biespecífico deseado a partir de combinaciones de cadenas
de inmunoglobulinas no deseadas, ya que la presencia de una cadena
ligera de inmunoglobulina en sólo una mitad de la molécula
biespecífica proporciona una vía sencilla de separación.
Para más detalles sobre la generación de
anticuerpos biespecíficos, ver, por ejemplo, Suresh y otros,
Methods in Enzimology 121, 210 (1986).
El término "diabodies" se refiere a
pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a
antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena
pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena ligera
(V_{L}) en la misma cadena de polipéptido
(V_{H}-V_{L}). Utilizando un enlazador que es
demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos
dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a emparejarse
con los dominios complementarios de otra cadena y crean dos sitios
de unión a antígeno. Los diabodies se describen más detalladamente
en, por ejemplo, EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger y otros,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:
6444-6448 (1993).
Un anticuerpo "aislado" se define de forma
similar a la definición proporcionada anteriormente en la presente
para polipéptidos aislados. Específicamente, un anticuerpo
"aislado" es el que se ha identificado y separado y/o
recuperado a partir de un componente de su medio natural. Los
componentes contaminantes de su medio natural son materiales que
podrían interferir con las utilizaciones de diagnóstico y
terapéuticas del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y
otros solutos proteináceos y no proteináceos. En realizaciones
preferidas, el anticuerpo se purificará (1) hasta más de un 95% en
peso de anticuerpo según se determina por el método de Lowry, y más
preferiblemente más de un 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente
para obtener por lo menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos
N-terminal o internos mediante la utilización de un
secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta la homogeneidad mediante
SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras
utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción con plata.
El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de
las células recombinantes ya que por lo menos un componente del
medio natural del anticuerpo no estará presente. Normalmente, sin
embargo, el anticuerpo aislado se preparará mediante por lo menos
una etapa de purificación.
La palabra "marcador" cuando se utiliza en
la presenta se refiere a un compuesto o composición detectable que
se conjuga directa o indirectamente al anticuerpo para generar un
anticuerpo "marcado". El "marcador" puede ser detectable
por sí mismo (por ejemplo, marcadores radioisótopos o marcadores
fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede
catalizar la alteración química de compuesto o composición sustrato
que es detectable.
Por "fase sólida" se entiende una matriz no
acuosa a la que se puede adherir el anticuerpo de la presente
invención. Entre los ejemplos de fases sólidas que se engloban en la
presente se incluyen las formadas parcial o totalmente de vidrio
(por ejemplo, vidrio de poro controlado), polisacáridos (por
ejemplo, agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, polivinilalcohol y
siliconas. En ciertas realizaciones, dependiendo del contexto, la
fase sólida puede comprender el pocillo de una placa de ensayo; en
otras es una columna de purificación (por ejemplo, una columna de
cromatografía de afinidad). Este término también incluye una fase
sólida discontinua de partículas discretas, tales como las descritas
en la Patente de Estados Unidos No. 4.275.149.
Un "liposoma" es una vesícula pequeña
compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensoactivo
que es útil para la liberación de un fármaco (tal como los
anticuerpos anti-ErbB2 descritos en la presente y,
opcionalmente, un agente quimioterapéutico) a un mamífero. Los
componentes del liposoma se disponen habitualmente en una formación
de bicapa, similar a la disposición de los lípidos de las membranas
biológicas.
Los anticuerpos heteroconjugados también están
dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos
heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos
covalentemente. Se ha propuesto, por ejemplo, que dichos anticuerpos
dirigen las células del sistema inmune hacia células no deseadas
(Patente de Estados Unidos No. 4.676.980) y para el tratamiento de
la infección por VIH (publicaciones de solicitud PCT Nos. WO91/00360
y WO 92/200373; EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados se
pueden fabricar utilizando cualquier procedimiento de reticulación
adecuado. En la técnica se conocen agentes de reticulación adecuados
y se describen en la Patente de Estados Unidos No. 4.676.980, junto
con un conjunto de técnicas de reticulación.
Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena
única" o "sFv" comprenden los dominios V_{H} y V_{L} del
anticuerpo, en los que estos dominios se presentan en una única
cadena de polipéptido. Preferiblemente, el polipéptido Fv comprende
además un polipéptido enlazador entre los dominios V_{H} y V_{L}
que permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión a
antígeno. Para una revisión de sFv ver Pluckthun en The
Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y
Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, pp.
269-315 (1994).
En el contexto de la presente invención las
expresiones "célula", "línea celular" o "línea de
células" y "cultivo celular" o "cultivo de células" se
utilizan indistintamente, y todas estas denominaciones incluyen la
progenie. También debe entenderse que toda la progenie puede no ser
precisamente idéntica en el contenido de ADN debido a mutaciones
deliberadas o involuntarias. Se incluye la progenie mutante que
tiene la misma función o propiedad biológica, según se criba en la
célula originalmente transformada.
Los términos "vector de expresión
replicable" y "vector de expresión" se refieren a un trozo
de ADN, habitualmente de doble cadena, al que se le puede insertar
un trozo de ADN extraño. El ADN extraño se define como ADN
heterólogo, que es ADN no natural hallado en la célula huésped. El
vector se utiliza para transportar el ADN extraño o heterólogo a una
célula huésped adecuada. Una vez en la célula huésped, el vector se
puede replicar independientemente del ADN cromosómico huésped, y se
pueden generar varias copias del vector y su ADN insertado
(extraño). Además, el vector contiene los elementos necesarios que
permiten la traducción del ADN extraño al polipéptido. De este modo
se pueden sintetizar rápidamente muchas moléculas del polipéptido
codificado por el ADN extraño.
La expresión y clonación de vectores son
conocidas en la técnica y contienen una secuencia de ácidos
nucleicos que permite la replicación del vector en una o más células
huésped seleccionadas. La selección del vector apropiado dependerá
de 1) si se va a utilizar para la amplificación de ADN o para la
expresión de ADN, 2) el tamaño del ADN a insertar en el vector, y 3)
la célula huésped a transformar con el vector. Cada vector contiene
varios componentes dependiendo de su función (amplificación de ADN o
expresión de ADN) y de la célula huésped para la que es compatible.
Los componentes del vector incluyen generalmente, pro no se limitan
a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de
replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un
promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción.
En general, la secuencia señal puede ser un
componente del vector, o puede ser una parte de la molécula de
ligando TIE que se inserta en el vector. Si la secuencia señal es
heteróloga, debería seleccionarse de manera que es reconocida y
procesada (es decir, dividida por una peptidasa señal) por la célula
huésped.
Las secuencias señal heterólogas adecuadas para
las células huésped procariotas son preferiblemente secuencias señal
procariotas, tales como los líderes de
\alpha-amilasa, ompA, ompC, ompE, ompF, fosfatasa
alcalina, penicilinasa, Ipp, o enterotoxina II estable al calor.
Para la secreción de levadura se pueden utilizar, por ejemplo,
líderes de levadura invertasa, amilasa, factor alfa, o fosfatasa
ácida. En células de mamífero, las secuencias señal de expresión en
mamíferos son las más adecuadas. Las secuencias señal listadas se
muestran únicamente como ilustración, y no limitan de ningún modo el
alcance de la presente invención.
Tanto los vectores de expresión como de
clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite la
replicación del vector en una o más células huésped determinadas.
Generalmente, en vectores de clonación, esta secuencia es la que
permite la replicación del vector independientemente de los
cromosomas del huésped, e incluye orígenes de replicación o
secuencias replicantes autónomas. Dicha secuencia es bien conocida
para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de la
replicación del plásmido pBR322 conocido es adecuado para la mayoría
de bacterias gram negativa, el origen del plásmido \mu para
levadura y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV
o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de
mamíferos. Los orígenes de replicación no son necesarios para
vectores de expresión de mamíferos (el origen SV40 se puede utilizar
habitualmente sólo porque contiene el promotor más temprano). La
mayoría de vectores de expresión son vectores "lanzadera", es
decir, son capaces de replicarse en por lo menos una clase de
organismos, pero se pueden transfectar en otro organismo para su
expresión. Por ejemplo, se clona un vector en E. coli y, a
continuación, el mismo vector se transfecta en células de levadura o
mamífero para la expresión incluso cuando no es capaz de replicarse
independientemente del cromosoma de la célula huésped.
El ADN también se clona por inserción en el
genoma del huésped. Esto se lleva a cabo fácilmente utilizando
especies Bacillus como huéspedes, por ejemplo, incluyendo en
el vector una secuencia de ADN que es complementaria a una secuencia
hallada en el ADN genómico del Bacillus. La transfección de
Bacillus con este vector da lugar a una recombinación
homóloga con el genoma y la inserción del ADN que codifica el
polipéptido heterólogo deseado. Sin embargo, la recuperación del
ADN genómico es más compleja que la de un vector replicado de forma
exógena ya que se requiere la digestión por la enzima de restricción
para escindir la molécula de polipéptido codificada.
Los vectores de expresión y clonación deberían
contener un gen de selección, también denominado un marcador
seleccionable. Este es un gen que codifica una proteína necesaria
para la supervivencia o crecimiento de una célula huésped
transformada con el vector. La presencia de este gen asegura que
cualquier célula huésped que elimina el vector no obtendrá una
ventaja en el crecimiento o reproducción sobre los huéspedes
transformados. Los genes de selección habituales codifican proteínas
que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por
ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b)
complementan deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes
críticos no disponibles del medio complejo, por ejemplo, el gen que
codifica D-alanina racemasa para los Bacillus.
Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un
fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Aquellas
células que se transforman de forma satisfactoria con un gen
heterólogo expresan una proteína que confiere resistencia al fármaco
y, de este modo, sobreviven a la pauta de selección. Los ejemplos de
dicha selección dominante utilizan los fármacos neomicina [Southern
y otros, J. Molec. Appl. Gener. 1, 327 (1982)], ácido
micofenólico [Mulligan y otros, Science 209, 1422
(1980)], o higromicina [Sudgen y otros, Mol. Cel. Biol.
5, 410-413 (1985)]. Los tres ejemplos dados
anteriormente utilizan genes de bacterias bajo control eucariótico
para transmitir resistencia al fármaco adecuado G418 o neomicina
(geneticina), xgpt (ácido micofenólico) o higromicina,
respectivamente.
Otros ejemplos de marcadores seleccionables para
células de mamíferos son la dihidrofolato reductasa (DHFR) o la
timidina quinasa. Dichos marcadores permiten la identificación de
células que eran competentes para captar el ácido nucleico deseado.
Las células de mamíferos transformantes se colocan bajo una presión
de selección a la que sólo los transformantes están adaptados
únicamente para sobrevivir por el hecho de haber captado el
marcador. La presión de selección se impone cultivando los
transformantes en condiciones en las que la concentración del agente
de selección en el medio cambia de forma satisfactoria, conduciendo
así a la amplificación del gen de selección y al ADN que codifica el
polipéptido deseado. La amplificación es el proceso por el cual los
genes con una mayor demanda de fabricación de una proteína crítica
para el crecimiento se repiten en tándem en los cromosomas de
generaciones sucesivas de células recombinantes. A partir del ADN
amplificado se sintetizan cantidades crecientes del polipéptido
deseado.
Por ejemplo, las células transformadas con el
gen de selección DHFR se identifican en primer lugar cultivando
todos los transformantes en un medio de cultivo sin hipoxantina,
glicina y timidina. En este caso, una célula huésped apropiada es
una línea de células de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en
actividad de DHFR, preparada y propagada tal y como se describe por
Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216
(1980). Una DHFR particularmente útil es una DHFR mutante que es
altamente resistente a MTX (EP 117.060). Este agente de selección se
puede utilizar con cualquier otro huésped adecuado, por ejemplo,
ATCC No. CCL61 CHO-K1, a pesar de la presencia de
DHFR endógena. El ADN que codifica la DHFR y el polipéptido deseado,
respectivamente, a continuación, se amplifica mediante exposición a
un agente (metotrexato o MTX) que inactiva la DHFR. Se asegura que
la célula necesite más DHFR (y consecuentemente amplifique todo el
ADN exógeno) mediante la selección de únicamente células que pueden
crecer en rondas sucesivas de una concentración de MTX siempre
superior. Alternativamente, los huéspedes cotransformados con genes
que codifican el polipéptido deseado, DHFR de tipo salvaje, y otro
marcador seleccionable, tal como el gen neo, se pueden
identificar utilizando un agente de selección para el marcador
seleccionable, tal como G418, y a continuación, se seleccionan y
amplifican utilizando metotrexato en un huésped que contiene DHFR
endógena. (Ver también Patente de Estados Unidos No. 4.965.199).
Un gen de selección adecuado para su utilización
en levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido YRp7 de
levadura (Stinchcomb y otros, 1979, Nature 282: 39,
Kingsman y otros, 1979, Gene 7: 141; o Tschemper y
otros, 1980, Gene 10: 157). El gen trp1
proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de
levadura que no tiene la capacidad de crecer en triptófano, por
ejemplo, ATCC No. 44076 p PEP4-1 (Jones, 1977,
Genetics 85: 12). La presencia de la lesión
trp1 en el genoma de la célula huésped de levadura
proporciona a continuación un medio eficaz para la detección de la
transformación mediante el crecimiento en ausencia de triptófano. De
forma similar, las cepas de levaduras deficientes de Leu2
(ATCC 20.622 ó 38.626) se complementan mediante plásmidos conocidos
que transportan el gen Leu2.
Los vectores de expresión, a diferencia de
vectores clonación, deberían contener un promotor que es reconocido
por el organismo huésped y está unido operativamente al ácido
nucleico que codifica el polipéptido deseado. Los promotores son
secuencias no traducidas localizadas en dirección 5' desde el codón
de inicio de un gen estructural (generalmente dentro de
aproximadamente 100 a 1000 pb) que controlan la transcripción y
traducción de ácido nucleico bajo su control. Habitualmente se
incluyen dentro de dos clases, inducible y constitutivo. Los
promotores inducibles son promotores que inician niveles crecientes
de transcripción de ADN bajo su control en respuesta a algunos
cambios en las condiciones de cultivo, por ejemplo, la presencia o
ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. Actualmente,
se conocen un gran conjunto de promotores reconocidos por un
conjunto de células huésped potenciales. Estos promotores se unen
operativamente a ADN que codifica el polipéptido deseado
eliminándolos de su gen de origen mediante la digestión por enzimas
de restricción, seguido de la inserción en 5' hasta el codón de
inicio del polipéptido a expresar. Esto no indica que el promotor
genómico para un ligando TIE no se pueda utilizar. Sin embargo, los
promotores heterólogos generalmente darán lugar a una mayor
transcripción y mayores rendimientos de homólogos de ligando TIE
expresados en comparación con los promotores de ligando TIE
nativo.
Entre los promotores adecuados para su
utilización con huéspedes procarióticos se incluyen los sistemas de
promotores de la \beta-lactamasa y lactosa (Chang
y otros, Nature 275: 615 (1978); y Goeddel y otros,
Nature 281: 544 (1979)), fosfatasa alcalina, un
sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel, Nucleic Acids
Res. 8:4057 (1980) y EPO Appln. Publ. No. 36.776) y
promotores híbridos, tales como promotor tac (H. de Boer y otros,
Proc. Natl. Acad. Sci, USA 80: 21-25
(1983)). Sin embargo, son adecuados otros promotores bacterianos
conocidos. Se han publicado sus secuencias de nucleótidos,
permitiendo así a un técnico unirlas de forma operativa a un ADN que
codifica un ligando TIE (Siebenlist y otros, Cell 20:
269 (1980)) utilizando enlazadores o adaptadores para suministrar
cualquier sitio de restricción requerido. Los promotores para su
utilización en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia
Shine-Dalgarno (S.D.) unida operativamente al ADN
que codifica un ligando TIE.
Entre las secuencias de promotores adecuadas
para su utilización con huéspedes de levadura se incluyen promotores
para 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y otros,
J. Biol. Chem. 255: 2073 (1980)) u otras enzimas
glicolíticas (Hess y otros, J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149
(1978); y Holland, Biochemistry 17: 4900 (1978)),
tales como enolasa,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa,
fosfofructoquinasa,
glucosa-6-fosfato isomerasa,
3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa,
triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucoquinasa.
Otros promotores de levadura, que son promotores
inducibles que tienen la ventaja adicional de una transcripción
controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones de
promotor para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa
ácida, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo del
nitrógeno, metalotioneína,
gliceraldehído-3-fosfatasa
deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de maltosa
y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para su utilización
en la expresión en levadura se describen adicionalmente en R.
Hitzeman y otros, EP 73.657A. Los potenciadores de las levaduras se
utilizan también de forma ventajosa con promotores de levadura.
Se conocen secuencias de promotores para
eucariotas. Prácticamente todos los genes eucariotas tienen una
región rica en AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases en
dirección 5' del sitio en el que se inicia la transcripción. Otra
secuencia hallada 70 a 80 bases en dirección 5' desde el inicio de
la transcripción de muchos genes es una región CXCAAT en la que X
puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de
genes eucariotas hay una secuencia AATAAA que puede ser la señal
para la adición de la cola poliA al extremo 3' de la secuencia
codificante. Todas estas secuencias se insertan de forma adecuada en
vectores de expresión de mamíferos.
La transcripción de ligando TIE de los vectores
en células huésped de mamíferos se puede controlar mediante
promotores obtenidos de los genomas de virus, tales como virus de
polioma, virus de la viruela aviar (UK 2.211.504 publicada el 5 de
julio de 1989), adenovirus (tal como, Adenovirus 2), virus de
papiloma bovino, virus de sarcoma aviar, citomegalovirus, un
retrovirus, virus de la hepatitis-B y más
preferiblemente Virus Simio 40 (SV40), de los promotores heterólogos
de mamíferos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de
inmunoglobulina, de promotores del golpe de calor, y del promotor
normalmente asociado con la secuencia de ligando TIE, siempre y
cuando dichos promotores sean compatibles con los sistemas de
células huésped.
Los promotores tempranos y tardíos del virus
SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción
de SV40 que también contiene el origen viral SV40 de la replicación
[Fiers y otros, Nature 273: 113 (1978), Mulligan y
Berg, Science 209, 1422-1427 (1980);
Pavlakis y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78,
7398-7402 (1981)]. El promotor temprano inmediato
del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un
fragmento de restricción HindIII E [Greenway y otros,
Gene 18, 355-360 (1982)]. En la
Patente US 4.419.446 se describe un sistema para expresar ADN en
huéspedes de mamíferos utilizando el virus de papiloma bovino como
vector. En la Patente US 4.601.978 se describe una modificación de
este sistema. Ver también, Gray y otros, Nature 295,
503-508 (1982) sobre la expresión de ADNc que
codifica interferón inmune humano en células de mono; Reyes y otros,
Nature 297, 598-601 (1982) sobre la
expresión de ADNc de \beta-interferón humano en
células de ratón bajo el control de un promotor timidina quinasa del
virus de herpes simplex; Canaani y Berg., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 79, 5166-5170 (1982) sobre la
expresión del gen del interferón \beta1 humano en células
cultivadas de ratón y conejo; y Gorman y otros, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 79, 6777-6781 (1982) sobre la
expresión de secuencias CAT bacterianas en células
CV-1 de riñón de mono, fibroblastos de embriones de
pollo, células de ovario de hámster chino, células HeLa y células
HIN-3T3 de ratón utilizando la repetición terminal
larga del virus de sarcoma Rous como promotor.
La transcripción de un ADN que codifica los
homólogos de ligando TIE de la presente invención mediante
eucariotas superiores se incrementa frecuentemente mediante la
inserción de una secuencia potenciadora en el vector. Los
potenciadores son elementos de ADN que actúan en cis, normalmente
aproximadamente de 10 a 300 pb, que actúan sobre un promotor para
aumentar su transcripción. Los potenciadores son relativamente
independientes de la orientación y la posición encontrándose en 5'
[Laimins y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 993
(1981)] y 3' [Lasky y otros, Mol. Cel. Biol. 3, 1108
(1983)] con respecto a la unidad de transcripción, dentro de un
intrón [Banerji y otros, Cell 33, 729 (1983)] así como
dentro de la propia secuencia codificante [Osborne y otros, Mol.
Cel. Biol. 4, 1293 (1984)]. Actualmente se conocen muchas
secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa,
albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina).
Habitualmente, sin embargo, se utilizará un potenciador de un virus
de célula eucariota. Entre los ejemplos se incluyen el potenciador
SV40 en la región tardía del origen de la replicación (pb
100-270), el potenciador del promotor temprano del
citomegalovirus, el potenciador del polioma en la región tardía del
origen de la replicación, y potenciadores de adenovirus. Ver también
Yaniv, Nature 297, 17-18 (1982) sobre
elementos potenciadores de la activación de promotores eucariotas.
El potenciador se puede empalmar en el vector en una posición 5' ó
3' con respecto al ADN del ligando TIE, pero se localiza
preferiblemente en un sitio 5' del promotor.
\newpage
Los vectores de expresión utilizados en células
huésped eucariotas (células de levadura, hongo, insecto, planta,
animal, humano o nucleadas de otros organismos multicelulares)
también contendrá secuencias necesarias para la terminación de la
transcripción y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias están
disponibles normalmente desde regiones no traducidas 5' y,
ocasionalmente, 3' de ADNs o ADNcs eucariotas o virales. Estas
regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como
fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm que
codifica el ligando TIE. Las regiones 3' no traducidas también
incluyen sitios de terminación de la transcripción.
La construcción de vectores adecuados que
contienen uno o más de los componentes enumerados anteriormente, las
secuencias de control y codificantes deseadas, utiliza técnicas de
unión estándar. Los plásmidos aislados o fragmentos de ADN se
dividen, se cortan a medida, y se rejuntan en la forma deseada para
generar los plásmidos requeridos.
Para el análisis de confirmación de las
secuencias correctas en plásmidos construidos, las mezclas de unión
se utilizan para transformar la cepa 294 de E. coli K 12
(ATCC 31.446) y transformantes satisfactorios seleccionados por la
resistencia a ampicilina o tetraciclina cuando sea apropiado. Se
preparan los plásmidos a partir de los transformantes, se analizan
mediante la digestión por endonucleasas de restricción, y/o se
secuencian mediante el método de Messing y otros, Nucleic Acids
Res. 9, 309 (1981) o mediante el método de Maxam y otros,
Methods in Enzymology 65, 499 (1980).
Los vectores de expresión que proporcionan la
expresión transitoria en células de mamíferos de ADN que codifica un
ligando TIE son particularmente útiles en la práctica de esta
invención. En general, la expresión transitoria implica la
utilización de un vector de expresión que es capaz de replicarse de
forma eficaz en una célula huésped, de manera que la célula huésped
acumula muchas copias del vector de expresión y, a su vez, sintetiza
niveles elevados de un polipéptido deseado codificado por el vector
de expresión. Los sistemas transitorios, que comprenden un vector de
expresión adecuado y una célula huésped, permiten la identificación
conveniente positiva de polipéptidos codificados por ADNs de clones,
así como el rápido cribado de dichos polipéptidos para propiedades
biológicas o fisiológicas deseadas. De este modo, los sistemas de
expresión transitorios son particularmente útiles en la invención
para el objetivo de identificar análogos y variantes de un ligando
TIE.
Otros procedimientos, vectores y células huésped
adecuados para la adaptación a la síntesis de los polipéptidos TIE
en cultivos de células de vertebrados recombinantes se describen en
Gening y otros, Nature 293, 620-625
(1981); Mantel y otros, Nature 281,
40-46 (1979); Levinson y otros; EP 117.060 y EP
117.058. Un plásmido particularmente útil para la expresión del
polipéptido ligando TIE en el cultivo de células de mamíferos es
pRK5 (EP 307.247), junto con sus derivados, tales como pRK5D, que
tiene un sitio de iniciación de transcripción sp6 seguido por un
sitio de enzima de restricción SfiI que precede los sitios de
clonación de ADNc de Xho/NotII, y pRK5B, un precursor de pRK5D que
no contiene el sitio SfiI; ver, Holmes y otros, Science
253, 1278-1280 (1991).
La construcción de vectores adecuados que
contienen uno o más de los componentes enumerados anteriormente
utiliza técnicas de unión estándar. Los plásmidos aislados o
fragmentos de ADN se dividen, se cortan a medida, y se rejuntan en
la forma deseada para generar los plásmidos requeridos.
Para el análisis de confirmación de las
secuencias correctas en plásmidos construidos, las mezclas de unión
se utilizan para transformar la cepa 294 de E. coli K 12
(ATCC 31.446) y transformantes satisfactorios seleccionados por la
resistencia a ampicilina o tetraciclina cuando sea apropiado. Se
preparan los plásmidos a partir de los transformantes, se analizan
mediante la digestión por endonucleasas de restricción, y/o se
secuencian mediante el método de Messing y otros, Nucleic Acids
Res. 9, 309 (1981) o mediante el método de Maxam y otros,
Methods in Enzymology 65, 499 (1980).
Los vectores de expresión que proporcionan la
expresión transitoria en células de mamíferos de ADN que codifica un
ligando TIE son particularmente útiles en la práctica de esta
invención. En general, la expresión transitoria implica la
utilización de un vector de expresión que es capaz de replicarse de
forma eficaz en una célula huésped, de manera que la célula huésped
acumula muchas copias del vector de expresión y, a su vez, sintetiza
niveles elevados de un polipéptido deseado codificado por el vector
de expresión. Sambrook y otros, supra, pp.
16.17-16.22. Los sistemas de expresión transitorios,
que comprenden un vector de expresión adecuado y una célula huésped,
permiten el cribado conveniente positivo de dichos polipéptidos para
propiedades biológicas o fisiológicas deseadas. De este modo, los
sistemas de expresión transitorios son particularmente útiles en la
invención para el objetivo de identificar análogos y variantes de
homólogos de ligando TIE nativo con el requisito de la actividad
biológica.
Otros métodos, vectores y células huésped
adecuadas para su adaptación a la síntesis de un ligando TIE
(incluyendo los derivados funcionales de proteínas nativas) en el
cultivo de células de vertebrados recombinantes se describen en
Gething y otros, Nature 293, 620-625
(1981); Mantei y otros, Nature 281,
40-46 (1979); Levinson y otros, EP 117.060; y EP
117.058. Un plásmido particularmente útil para la expresión de un
ligando TIE en un cultivo de células de mamífero es pRK5 (EP
307.247) o pSV16B (Publicación de PCT No. WO 91/08291).
Las células huésped adecuadas para la clonación
o expresión de los vectores de la presente invención son las células
procariotas, de levaduras o eucariotas superiores descritas
anteriormente. Entre las procariotas adecuadas se incluyen
organismos gram negativo o gram positivo, por ejemplo E. coli
o bacilli. Un huésped para clonación preferido es E. coli 294
(ATCC 31.446), aunque otras procariotas gram negativo o gram
positivo, tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC
31.537), E. coli W3110 (ATCC 27.325), especie Pseudomonas o
Serratia Marcesans son adecuadas.
Además de los procariotas, los microbios
eucariotas, tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes
adecuados para los vectores de la presente invención. El
Saccharomyces cerevisiae, o levadura de panadería común, es
el microorganismo de huésped eucariota inferior más habitualmente
utilizado. Sin embargo, un conjunto de otros géneros, especies y
cepas están disponibles habitualmente y son útiles en la presente,
tales como S. Pombe [Beach y Nurse, Nature 290,
140 (1981)], Kluyveromyces lactis [Louvencourt y otros, J.
Bacteriol. 737 (1983)]; yarrowia (EP 402.226);
Pichia pastoris (EP 183.070), Trichodermareesia (EP
244.234), Neurospora crassa [Case y otros, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 76, 5259-5263 (1979)]; y
huéspedes Aspergillus, tales como A. nidulans
[Ballance y otros, Biochem. Biophys. Res. Commun. 112,
284-289 (1983); Tilburn y otros, Gene
26, 205-221 (1983); Yelton y otros, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470-1474
(1984)] y A. niger [Kelly y Hynes, EMBO J. 4,
475-479
(1985)].
(1985)].
Las células huésped adecuadas también pueden
derivar de organismos multicelulares. Dichas células huésped son
capaces de procesados complejos y actividades de glicosilación. En
principio, cualquier cultivo de células eucariotas superiores es
factible, tanto de un cultivo de vertebrados como invertebrados,
aunque se prefieren células de mamíferos, tales como humanos. Entre
los ejemplos de células de invertebrados se incluyen células de
plantas e insectos. Se han identificado numerosas cepas de
baculovirus y variantes y las correspondientes células huésped
permisivas de insectos de huéspedes, tales como células huésped de
Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti
(mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila
melangaster (drosófila) y Bombix mori. Ver, por ejemplo,
Luckow y otros, Bio/Technology 6,
47-55 (1988); Miller y otros, en Genetic
Engineering, Setlow, J.K. y otros, eds. Vol. 8 (Plenum
Publishing, 1986) pp. 277-279; y Maeda y otros,
Nature 315, 592-594 (1985). Un
conjunto de dichas cepas virales están públicamente disponibles, por
ejemplo, la variante L-1 de Autographa
californica NPV, y dichos virus se pueden utilizar aquí como el
virus según la presente invención, particularmente para la
transfección de células de Spodoptera frugiperda.
Generalmente, las células vegetales se
transfectan por incubación con ciertas cepas de la bacteria
Agrobacterium tumefaciens, que ha sido previamente manipulada
para que contenga el ADN del ligando TIE. Durante la incubación del
cultivo de células vegetales con A. tumefaciens, el ADN que
codifica un ligando TIE se transfiere a la célula vegetal huésped,
de manera que se transfecta, y, en condiciones apropiadas, expresa
el ADN del ligando TIE. Además, están disponibles secuencias
reguladoras y de señal compatibles con las células vegetales, tales
como el promotor de nopalina sintasa y secuencias señal de
poliadenilación, Depicker y otros, J. Mol. Appl. Gen.
1, 561 (1982). Además, los segmentos de ADN aislados de la
región en dirección 5' del gen T-ADN 780 son capaces
de activar o aumentar los niveles de transcripción de genes
expresables en plantas en tejidos de plantas que contienen ADN
recombinante. Ver, EP 321.196, publicada el 21 de junio de 1989.
Sin embargo, ha habido un mayor interés en
células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados
en cultivos (cultivos de tejido) es per se conocida. Ver
Tissue Culture, Academic Press, Kruse y Patterson, editores (1973).
Algunos ejemplos de líneas de células huésped de mamíferos útiles
son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40
(COS-7, ATCC CRL 1651); línea de células de riñón
embrionario humano [células 293 o células 293 subclonadas para el
crecimiento en el cultivo de suspensión, Graham y otros, J. Gen.
Virol. 36, 59 (1977)]; células de riñón de hámster bebé
9BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR [CHO,
Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216
(1980)]; células de sertolli de ratón [TM4, Mather, Biol.
Reprod, 23, 243-251 (1980)]; células de
riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde
africano (VERO-76, ATCC CRL-1587);
células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de
riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo
(BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC
CCL75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor de mama de
ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI [Mather y otros,
Annals N.Y. Acad. Sci., 383, 44068 (1982)]; células
MRC 5; células FS4; y una línea de células de hepatoma humano (Hep
G2). Las células huésped preferidas son células de riñón embrionario
humano 293 y células de ovario de hámster chino.
Las células particularmente preferidas para el
objetivo de la presente invención son células de vertebrados que
producen los homólogos de ligando TIE de la presente invención.
Las células huésped se transfectan y
preferiblemente se transforman con los vectores de expresión o
clonación descritos anteriormente y se cultivan en medios nutrientes
convencionales modificados según sea apropiado para la inducción de
promotores o la selección de transformantes que contienen genes
amplificados.
Las células procariotas utilizadas para producir
los homólogos de ligando TIE de la presente invención se cultivan en
medios adecuados según se describe de forma general en Sambrook y
otros, supra.
Las células de mamífero se pueden cultivar en un
conjunto de medios. Los medios comercialmente disponibles, tales
como F10 de Ham (Sigma), Medio Mínimo Esencial (MEM, Sigma),
RPMI-1640 (Sigma), y Medio MEM modificado por
Dulbecco (DMEM, Sigma) son adecuados para el cultivo de células
huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham y
Wallace, Meth. Enzymol. 58, 44 (1979); Barnes y Sato,
Anal. Biochem. 102, 255 (1980), US 4.767.404;
4.657.866; 4.927.762; ó 4.560.655; WO 90/03430; WO 87/00195 o la
Patente US Re. 30.985 se pueden utilizar como medios de cultivo
para las células huésped. Cualquiera de estos medios se puede
suplementar según sea necesario con hormonas y/u otros factores de
crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de
crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro sódico, fosfato
cálcico, magnésico), soluciones tampón (tales como HEPES),
nucleósidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales
como el fármaco Gentamycin^{TM}), elementos traza (definidos como
compuestos inorgánicos presentes habitualmente en concentraciones
finales a nivel micromolar), y glucosa o una fuente de energía
equivalente. Cualquier otro suplemento necesario se puede también
incluir en concentraciones apropiadas que serían conocidas por los
expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, tales como la
temperatura, pH y similares, de forma adecuada son las utilizadas
previamente con la célula huésped seleccionada para la clonación o
expresión, según sea el caso, y serán obvias para un técnico
habitual.
Las células huésped a las que se hace referencia
en esta descripción abarcan células en cultivos de células in
vitro así como células que están en el interior de un animal o
planta huésped.
También se prevé que los homólogos de ligando
TIE de la presente invención se pueden producir mediante
recombinación homóloga, o con procedimientos de producción
recombinante que utilizan elementos de control introducidos en
células que ya contienen ADN que codifica el ligando TIE
particular.
La amplificación y/o expresión del gen se puede
medir directamente en una muestra, por ejemplo, mediante "Southern
blotting" convencional, "Northern blotting" para cuantificar
la transcripción de ARNm [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
77, 5201-5205 (1980)], "dot blotting"
(análisis de ADN), o hibridación in situ, utilizando una
sonda marcada de forma apropiada, basada en las secuencias que se
proporcionan en la presente. Se pueden utilizar varios marcadores,
más habitualmente radioisótopos, particularmente ^{32}P. Sin
embargo, también se pueden utilizar otras técnicas, tales como la
utilización de nucleótidos modificados con biotina para la
introducción en un polinucleótido. A continuación, la biotina sirve
como sitio para unirse a avidina o anticuerpos, que pueden estar
marcados con una amplia variedad de marcadores, tales como
radionúcleos, sustancias fluorescentes, enzimas, o similares.
Alternativamente, se pueden utilizar anticuerpos que pueden
reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de
ARN, y dúplex de híbridos ADN-ARN o dúplex de
ADN-proteína. Los anticuerpos a su vez se pueden
marcar y se puede llevar a cabo el ensayo cuando el dúplex está
unido a la superficie, de manera que tras la formación de dúplex en
la superficie, se puede detectar la presencia de anticuerpo unido al
dúplex.
Alternativamente, la expresión génica se puede
medir mediante procedimiento inmunológicos, tales como la tinción
inmunohistoquímica de secciones de tejido y el ensayo de cultivos
celulares o fluidos corporales, para cuantificar directamente la
expresión del producto génico. Con las técnicas de tinción
inmunohistoquímica, se prepara una muestra de células, habitualmente
por deshidratación y fijación, seguido por la reacción con
anticuerpos marcados específicos del producto génico acoplado, donde
los marcadores son normalmente detectables de forma visual, tales
como marcadores enzimáticos, marcadores fluorescentes, marcadores
luminiscentes, y similares. Una técnica de tinción particularmente
sensible adecuada para su utilización en la presente invención se
describe en Hse y otros, Am. J. Clin. Pharm., 75,
734-738 (1980).
Los anticuerpos útiles para la tinción
inmunohistoquímica y/o ensayo de fluidos de muestra pueden ser
monoclonales o policlonales, y se pueden preparar en cualquier
animal. De forma conveniente, los anticuerpos se pueden preparar
contra un polipéptido de ligando TIE nativo de la presente
invención, o contra un péptido sintético basado en la secuencia de
ADN proporcionada en la presente tal y como se describe
posteriormente en la presente.
El homólogo de ligando TIE se puede producir en
células huésped en forma de cuerpos de inclusión o secretado en el
espacio periplásmico o el medio de cultivo, y se recupera
habitualmente de los lisados de células huésped. Los homólogos de
ligando recombinantes se pueden purificar mediante cualquier técnica
que permite la posterior formación de una proteína estable.
Cuando el homólogo de ligando TIE se expresa en
una célula recombinante diferente de una de origen humano, está
completamente libre de proteínas o polipéptidos de origen humano.
Sin embargo, es necesario purificar el homólogo de ligando TIE de
proteínas o polipéptidos de células recombinantes para obtener
preparaciones que son sustancialmente homogéneas en cuanto al
ligando. Como primera etapa, el medio de cultivo o lisado se
centrifuga para extraer los debris de células particuladas. A
continuación, se separan la membrana y las fracciones de proteínas
solubles. A continuación, el homólogo de ligando TIE se puede
purificar a partir de la fracción de proteína soluble. Los
siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de
purificación adecuados: fraccionamiento en columnas de
inmunoafinidad o de intercambio iónico; precipitación con etanol;
HPLC de fase inversa; cromatografía sobre sílice o sobre una resina
de intercambio catiónico, tal como DEAE; cromatoenfoque;
SDS-PAGE; precipitación con sulfato amónico;
filtración en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex
G-75; y columnas de proteína A Sepharosa para
eliminar los contaminantes, tales como IgG.
Los derivados funcionales de los homólogos de
ligando TIE en los que los residuos se han eliminado, insertados y/o
sustituidos se recuperan de la misma manera que los ligandos
nativos, teniendo en cuenta cualquier cambio sustancial en las
propiedades ocasionadas por la alteración. Por ejemplo, la fusión
del homólogo de ligando TIE con otra proteína o polipéptido, por
ejemplo, un antígeno bacteriano o viral, facilita la purificación;
se puede utilizar una columna de inmunoafinidad que contiene un
anticuerpo para el antígeno para absorber la fusión. Se pueden
utilizar columnas de inmunoafinidad, tales como una columna de
homólogo de ligando anti-TIE policlonal de conejo,
para absorber las variantes de homólogo de ligando TIE mediante la
unión de por lo menos un epítopo inmune remanente. Un inhibidor de
proteasa, tal como fluoruro de fenil metil sulfonilo (PMSF), también
puede ser útil para inhibir la degradación proteolítica durante la
purificación, y se pueden incluir antibióticos para evitar el
crecimiento de contaminantes accidentales. Los homólogos de ligando
TIE de la presente invención se purifican de forma conveniente
mediante cromatografía de afinidad, basándose en su capacidad de
unirse a un receptor TIE, por ejemplo,
TIE-2.
TIE-2.
Un experto en la materia entenderá que los
procedimientos de purificación adecuados para los homólogos de
ligando TIE pueden necesitar modificaciones para justificar los
cambios en el carácter de un homólogo de ligando TIE nativo o sus
variantes tras la expresión en cultivo de células recombinantes.
Se espera que los homólogos de ligando TIE de la
presente invención sean útiles en la estimulación de la
supervivencia y/o crecimiento y/o diferenciación de células que
expresan receptores TIE en un cultivo celular.
Los homólogos de ligando TIE se pueden utilizar
adicionalmente para identificar células que expresan receptores TIE
nativos. Para este objetivo, se pone en contacto un ligando marcado
para su detección con una célula diana en condiciones que permiten
su unión a sus receptores (receptor TIE), y se monitoriza la
unión.
Los homólogos de ligando TIE de la presente
también se pueden utilizar para identificar moléculas que muestran
una actividad biológica de un homólogo de ligando TIE, por ejemplo,
exponiendo una célula que expresa un homólogo de ligando TIE de la
presente a una molécula de prueba y detectando la unión específica
de la molécula de prueba a un receptor TIE, mediante detección
directa o basándose en efectos biológicos secundarios. Esta
aproximación es particularmente adecuada para identificar nuevos
miembros de la familia del ligando TIE, o para cribar bibliotecas de
pequeñas moléculas de péptidos o no péptidos.
Los homólogos de ligando TIE descritos en la
presente son también útiles en ensayos de cribado diseñados para
identificar agonistas o antagonistas de un receptor TIE nativo que
juega un papel importante en el desarrollo, maduración o crecimiento
óseo, o en el crecimiento o desarrollo muscular y/o estimulación o
inhibición de la angiogénesis. Por ejemplo, los antagonistas de un
receptor TIE se pueden identificar en base a su capacidad de
bloquear la unión de un homólogo de ligando TIE de la presente
invención a un receptor TIE nativo, tal y como se mide, por ejemplo,
utilizando tecnología de biosensores BiAcore (BiAcore; Pharmacia
Biosensor, Midscataway, N.J.); o monitorizando su capacidad de
bloquear la respuesta biológica provocada por un homólogo de ligando
TIE biológicamente activo de la presente. Entre las respuestas
biológicas que se pueden monitorizar se incluyen, por ejemplo, la
fosforilación del receptor TIE o componentes "downstream" del
mecanismo de traducción de señal de TIE, o la supervivencia,
crecimiento o diferenciación de células que expresan el receptor
TIE. Los ensayos basados en células, que utilizan células que no
producen normalmente el receptor TIE, diseñados para expresar este
receptor, o coexpresar el receptor TIE y un homólogo de ligando TIE
de la presente invención, son particularmente convenientes para
utilizar.
En una realización particular, se pueden
identificar los agonistas y antagonistas de molécula pequeña de un
receptor TIE nativo basándose en su capacidad para interferir con la
interacción ligando TIE/receptor TIE. Existen numerosas maneras para
medir la unión específica de una molécula de prueba a un receptor
TIE, incluyendo, pero sin limitarse a, la detección o medición de la
cantidad de una molécula de prueba unida a la superficie de células
intactas que expresan el receptor TIE, reticulada al receptor TIE en
lisados celulares, o unida al receptor TIE in vitro.
Entre los homólogos de ligando TIE marcados para
su detección se incluyen, por ejemplo, homólogos de ligando TIE
unidos covalentemente o no covalentemente a una sustancia
radioactiva, por ejemplo ^{125}I, una sustancia fluorescente, una
sustancia que tiene actividad enzimática (preferiblemente adecuada
para la detección colorimétrica), un sustrato para una enzima
(preferiblemente adecuada para la detección colorimétrica), o una
sustancia que puede reconocerse mediante una molécula de anticuerpo
(marcada para su detección).
Los ensayos se pueden llevar a cabo de manera
similar a la descrita en la Publicación de PCT WO 96/11269,
publicada el 18 de abril de 1996.
Los homólogos de ligando TIE de la presente
invención son también útiles para purificar receptores TIE,
utilizados opcionalmente en forma de inmunoadhesinas, en las que el
ligando TIE o la parte de unión del receptor TIE del mismo se
fusiona a una región constante de cadena pesada o ligera de
inmunoglobulina.
Además, los nuevos homólogos de ligando TIE de
la presente se pueden utilizar para inhibir el crecimiento
tumoral.
Las moléculas de ácido nucleico de la presente
invención son útiles para detectar la expresión de homólogos de
ligando TIE en células o secciones de tejido. Las células o
secciones de tejido se pueden poner en contacto con una molécula de
ácido nucleico marcada para su detección que codifica el ligando TIE
de la presente invención en condiciones de hibridación, determinar
la presencia de ARNm hibridado a una molécula de ácido nucleico,
detectando así la expresión del ligando TIE.
Los anticuerpos de la presente invención se
pueden utilizar, por ejemplo, en inmunoensayos para medir la
cantidad de un ligando TIE en una muestra biológica. La muestra
biológica se pone en contacto con un anticuerpo o mezcla de
anticuerpos que se unen específicamente a un ligando TIE de la
presente invención, y se mide la cantidad del complejo formado con
un ligando presente en la muestra de prueba.
Los anticuerpos para los homólogos de ligando
TIE de la presente se pueden utilizar adicionalmente para la
liberación de moléculas citotóxicas, por ejemplo, radioisótopos o
toxinas, o agentes terapéuticos a células que expresan el
correspondiente receptor TIE. Los agentes terapéuticos pueden ser,
por ejemplo, diferentes de homólogos de ligando TIE, incluyendo el
ligando TIE-2, miembros de la familia del factor de
crecimiento endotelial vascular (VEGF), o agentes
anti-tumorales conocidos, y agentes que se sabe que
se asocian con el crecimiento o desarrollo muscular, o el
desarrollo, la maduración o crecimiento óseo.
Para el uso terapéutico, los homólogos de
ligando TIE o los anticuerpos de ligando anti-TIE de
la presente invención se formulan como composiciones terapéuticas
que comprenden el principio o principios activos en una mezcla con
un vehículo farmacológicamente aceptable, adecuada para la
aplicación sistémica o tópica. Las composiciones farmacéuticas de la
presente invención se prepararan para su almacenamiento mezclando el
principio activo que tiene el grado deseado de pureza con
portadores, excipientes o estabilizantes opcionales fisiológicamente
aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences 16ª edición,
Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o
soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizantes
aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y
concentraciones empleadas, e incluyen soluciones tampón, tales como
fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que
incluyen ácido ascórbico; polipéptidos de peso molecular bajo (menos
de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina
sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales
como polivinilpirrolidona, aminoácidos, tales como glicina,
glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos
y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas;
agentes quelantes, tales como EDTA, alcoholes de azúcares, tales
como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como
sodio; y/o tensoactivos no iónicos, tales como Tween, Pluronics o
PEG.
Los principios activos también se pueden
introducir en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante
técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por
ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y
microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, en
sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo,
liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas
y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen
en Remington's Pharmaceutical Sciences, supra.
Las formulaciones a utilizar para ser
administradas in vivo deben ser estériles. Esto se consigue
fácilmente mediante la filtración a través de membranas de
filtración estériles, anterior o posteriormente a la liofilización y
reconstitución.
Las composiciones terapéuticas de la presente se
colocan generalmente en un contenedor que tiene un puerto de acceso
estéril, por ejemplo, una bolsa o vial con solución intravenosa que
tiene un tapón traspasable por una aguja de inyección
hipodérmica.
La vía de administración se corresponde con los
procedimientos conocidos, por ejemplo, inyección o infusión por vía
intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular,
intraocular, intraarterial o inatralesional, administración tópica o
mediante sistemas de liberación controlada.
Entre los ejemplos de preparaciones de
liberación controlada se incluyen matrices de polímeros
semipermeables en forma de artículos conformados, por ejemplo,
películas o microcápsulas. Entre las matrices de liberación
controlada se incluyen poliésteres, hidrogeles, poliláctidos
(Patente de Estados Unidos 3.773.919, EP 58.481), copolímeros de
ácido L-glutámico y gamma
etil-L-glutamato (U. Sidman y otros,
1983, "Biopolymers" 22 (1): 547-556),
poli (2-hidroxietilmetilacrilato) (R. Langer, y
otros, 1981, "J. Biomed. Mater. Res." 15:
167-277 y "R: Langer, 1982, Chem. Tech."
12: 98-105), etileno vinil acetato (R. Langer
y otros, Id.) o ácido
poli-D-(-)-3-hidroxibutírico
(EP 133.988A). Entre las composiciones de liberación controlada se
incluyen liposomas. Los liposomas que contienen una molécula dentro
del alcance de la presente invención se preparan mediante
procedimientos conocidos per se: DE 3.218.121 A; Epstein y
otros, 1985, "Proc. Natl. Acads. Sci. USA" 82:
3688-3692; Hwang y otros, 1980, "Proc Natl. Acad.
Sci. USA", 77: 4030-4034; EP 52322A; EP
36676A; EP 88046A; EP 143949A; EP 142641A; solicitud de patente
japonesa 83-118008; patentes de Estados Unidos
4.485.045 y 4.544.545, y EP 102.324A. Habitualmente, los liposomas
son del tipo unilamelar pequeño (aproximadamente
200-800 Angstroms) en los que el contenido de
lípidos es superior a aproximadamente un 30% molar de colesterol,
ajustándose la proporción seleccionada a la terapia óptima con
NT-4.
Una cantidad eficaz de una molécula de la
presente invención a utilizar terapéuticamente dependerá, por
ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la vía de administración, y
la condición del paciente. Por consiguiente, será necesario para el
terapeuta titular la dosis y modificar la vía de administración
según se necesite para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una
dosis diaria habitual podría variar desde aproximadamente 1
\mug/kg hasta 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores
mencionados anteriormente. Habitualmente, el profesional sanitario
administrará una molécula de la presente invención hasta alcanzar
una dosis que proporciona el efecto biológico requerido. El progreso
de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante ensayos
convencionales.
Si el objetivo terapéutico es prevenir o tratar
tumores, los compuestos de la presente se pueden combinar con otras
terapias. Por ejemplo, el paciente a tratar con dichos agentes
anticancerígenos también puede recibir terapia de radiación.
Alternativamente, o adicionalmente, se puede administrar un agente
quimioterapéutico al paciente. La preparación y los programas de
dosificación para dichos agentes quimioterapéuticos se pueden
utilizar según las instrucciones del fabricante o según se determina
empíricamente por el técnico. La preparación y los programas de
dosificación para dicha quimioterapia también se describen en
Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins,
Baltimore, MD (1992). El agente quimioterapéutico puede preceder o
seguir a la administración del agente antitumoral, o se puede
suministrar de forma simultánea con el mismo.
Se puede desear administrar también anticuerpos
contra otros antígenos asociados a tumores, tales como anticuerpos
que se unen a ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4 o factor endotelial vascular
(VEGF). Alternativamente, o adicionalmente, dos o más anticuerpos
que se unen al mismo o dos o más antígenos diferentes descritos en
la presente se pueden coadministrar al paciente. Algunas veces,
puede ser beneficioso administrar también una o más citoquinas al
paciente. En una realización preferida, los compuestos antitumorales
de la presente se coadministran con un agente inhibidor del
crecimiento adicional.
Para la prevención o tratamiento de la
enfermedad, la dosis apropiada de un agente antitumoral, por
ejemplo, un anticuerpo de la presente dependerá del tipo de
enfermedad a tratar, tal y como se ha definido anteriormente, la
gravedad y el transcurso de la enfermedad, tanto si el agente se
administra con objetivos preventivos como terapéuticos, terapia
previa, el historial clínico del paciente y la respuesta al agente,
y la discreción del asistente sanitario. El agente se administra de
forma adecuada al paciente en una sola vez o durante una serie de
tratamientos.
Ejemplo
1
Se identificó NL3 mediante cribado de la base de
datos del Banco de Genes utilizando el programa informático BLAST
(Altshul y otros, Methods in Enzymology 266:
460-480 (1996).
NL-3 muestra homología con las
secuencias EST conocidas T57280 y T50719. Ninguna de estas
secuencias EST conocidas se ha identificado como secuencias de
longitud completa o descrito como ligandos asociados con los
receptores TIE.
Tras su identificación, NL3 se clonó de una
biblioteca de pulmón fetal humano preparada a partir de ARNm
adquirido de Clontech, Inc. (Palo Alto, CA, Estados Unidos),
catálogo # 6528-1, siguiendo las instrucciones del
fabricante. La biblioteca se cribó mediante la hibridación con
sondas de oliglonucleótidos sintéticos:
Para NL3:
| NL3,5-1 | TGGTTGGCAAAGGCAAGGTGGCTGACGATCCGG | SEC ID No: 10 |
| NL3,3-1 | GTGGCCCTTATCTCTCCTGTACAGCTTCCGGATCGTCAGCCAC | SEC ID No: 11 |
| NL3,3-2 | TCCATTCCCACCTATGACGCTGACCCA | SEC ID No: 12 |
basadas en las ESTs de la base de
datos del Banco de Genes, se secuenciaron las secuencias de ADNc en
su
totalidad.
Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de
NL3 se muestran en la figura 4 (SEC ID No: 3) y figura 5 (SEC ID No:
4), respectivamente.
Se depositó un clon de NL-3 con
la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive,
Rockville, Maryland 20852, el 18 de septiembre de 1997 bajo los
términos del Tratado de Budapest, y se le asignó el número de
depósito ATCC 209283.
Ejemplo
2
Se examinó la expresión del ARNm de NL3 en
tejidos humanos mediante análisis por "Northern blot". Los
"blots" de ARNm humano se hibridaron a una sonda de ADN marcada
con ^{32}P basada en ADNcs de longitud completa; las sondas se
generaron digiriendo y purificando los insertos de ADNc. El
"blot" de ARN fetal humano MTN - (Clontech) y el "blot" de
ARN adulto humano MTN-II (Clontech) se incubaron con
las sondas de ADN. Los "blots" se incubaron con las sondas en
un tampón de hibridación (5 x SSPE; 2 solución de Denhardt; 100
mg/ml de ADN desnaturalizado de esperma de salmón triturado; 50%
formamida, 2% SDS) durante 60 horas a 42ºC. Los blots se lavaron
varias veces en 2 x SSC; 0,05% SDS durante 1 hora a temperatura
ambiente, seguido de un lavado de 30 minutos en 0,1 x SSC; 0,1% SDS
a 50ºC. Los blots se desarrollaron después de una exposición durante
toda la noche mediante análisis con phosphorimager (Fuji).
Tal y como se muestra en la figura 9, se
detectaron los transcritos de ARNm de NL3.
El patrón de expresión de tejido de NL3 se
determinó también mediante hibridación in situ (observando la
hibridación al ARN celular), utilizando un protocolo optimizado que
utiliza ribosondas marcadas con ^{32}P generadas por PCR. (Lu y
Gillett, Cell Vision 1: 169-176
(1994)). Se seccionaron tejidos humanos adultos y fetales bañados en
parafina y fijados a formalina, se desparafinaron, se desproteinaron
en proteinasa K (20 g/ml) durante 15 minutos a 37ºC, y se procesaron
adicionalmente para una hibridación in situ tal y como se
describe por Lu y Gillett (1994). Se generó una ribosonda
antisentido marcada con [^{33}-P] UTP a partir de
un producto de PCR y se hibridó a 55ºC durante toda la noche. Los
portaobjetos se sumergieron en una emulsión nuclear Kodak NTB2 y se
expusieron durante 4 semanas.
Se secaron con concentradores centrífugos de
tipo Speed-Vac 6,0 \mul (125 mCi) de
^{33}P-UTP (Amersham BF 1002, SA < 2000
Ci/mol). A cada tubo que contenía ^{33}P-UTP
secado, se añadieron los siguientes ingredientes:
2,0 \mul 5x de tampón de transcripción
1,0 \mul de DTT (100 mM)
2,0 \mul de mezcla de NTP (2,5 mM: 10 \mul;
cada uno de 10 mM de GTP, CTP y ATP + 10 \mul de H_{2}O)
1,0 \mul de UTP (50 \muM)
1,0 \mul Rnasina
1,0 \mul de plantilla de ADN (1 \mug)
1,0 \mul de H_{2}O
1,0 \mul de ARN polimerasa (para productos de
PCR T3 = AS, T7 = S, normalmente)
Los tubos se incubaron a 37ºC durante una hora.
Se añadió 1,0 \mul de RQ1 ADNasa, seguido de incubación a 37ºC
durante 5 minutos. Se añadieron 90 \mul de TE (Tris 10 mM pH 7,6/1
mM EDTA pH 8,0), y la mezcla se pipeteó sobre papel DE81. La
solución remanente se cargó en una unidad de microfiltración
Microcon-50, y se centrífugo utilizando el programa
10 (6 minutos). La unidad de filtración se invirtió sobre un segundo
tubo y se centrifugó utilizando el programa 2 (3 minutos). Después
del giro final de recuperación, se añadieron 100 \mul de TE. Se
pipeteó 1 \mul del producto final sobre papel DE81 y se contó en 6
ml de Biofluor 11.
La sonda se extendió sobre un gel de TBE/urea.
Se añadieron 1-3 \mul de la sonda o 5 \mul de
ARN MrkII a 3 \mul de solución tampón de carga. Después de
calentar sobre un bloque de calor a 95ºC durante 3 minutos, el gel
se colocó inmediatamente sobre hielo. Los pocillos del gel se
nivelaron, se cargó la muestra y se operó a 180-245
voltios durante 45 minutos. El gel se envolvió en un envoltorio
"saran wrap" y se expuso a una película XAR con una pantalla
intensificadora en un congelador a -70ºC desde una hora hasta toda
la noche.
Pretratamiento de las secciones
congeladas. Los portaobjetos se extrajeron del congelador, se
colocaron sobre bandejas de aluminio y se descongelaron a
temperatura ambiente durante 5 minutos. Las bandejas se colocaron en
una incubadora a 55ºC durante cinco minutos para reducir la
condensación. Los portaobjetos se fijaron durante 10 minutos en
paraformaldehído al 4% sobre hielo en la campana de extracción, y se
lavaron en 0,5 x SSC durante 5 minutos a temperatura ambiente (25 ml
20 x SSC + 975 ml SQ H_{2}O). Después de la desproteinación en 0,5
\mug/ml de proteinasa K durante 10 minutos a 37ºC (12,5 \mul de
10 mg/ml de reserva en 250 ml de tampón de ARNasa sin ARNasa
precalentado), las secciones se lavaron en 0,5 x SSC durante 10
minutos a temperatura ambiente. Las secciones se deshidrataron en
etanol al 70%, 95%, 100% durante 2 minutos cada una.
Pretratamiento de las secciones bañadas en
parafina. Los portaobjetos se desparafinaron, se colocaron en SQ
H_{2}O, y se enjuagaron dos veces en 2 x SSC a temperatura
ambiente, durante 5 minutos casa uno. Las secciones se
desproteinaron en 20 \mug/ml de proteinasa K (500 \mul de 10
mg/ml en 250 ml de tampón de ARNasa sin ARNasa; 37ºC, 15 minutos) -
embrión humano, u 8 x proteinasa K (100 \mul en 250 ml de tampón
de ARNasa, 37ºC, 30 minutos) - tejidos en formalina. El posterior
enjuague en 0,5 x SSC y deshidratación se llevaron a cabo tal y como
se ha descrito anteriormente.
Prehibridación. Los portaobjetos se
dispusieron en una caja de plástico recubierta por papel de filtro
saturado con tampón de Caja (4 x SSC, formamida al 50%). El tejido
se recubrió con 50 \mul de tampón de hibridación (3,75 g de
sulfato de dextrano + 6 ml de SQ H_{2}O), se centrifugó y se
calentó en el microondas durante 2 minutos con la tapa aflojada.
Después de enfriar sobre hielo, se añadieron 18,75 ml de formamida,
3,75 ml de 20 x SSC y 9 ml de SQ H_{2}O, el tejido se centrifugó
bien y se incubó a 42ºC durante 1-4 horas.
Hibridación. Se calentaron a 95ºC durante
3 minutos 1,0 x 10^{6} cpm de sonda y 1,0 \mul de ARNt (50 mg/ml
reserva) por portaobjetos. Los portaobjetos se enfriaron sobre
hielo, y se añadieron 48 \mul de tampón de hibridación por
portaobjeto. Después de centrifugar, se añadieron 50 \mul de una
mezcla de ^{33}P a 50 \mul de prehibridación en el portaobjetos.
Los portaobjetos se incubaron durante toda la noche a 55ºC.
Lavados. El lavado se realizó 2 x 10
minutos con 2 x SSc, EDTA a temperatura ambiente (400 ml de 20 x SSC
+ 16 ml de EDTA 0,25 M, V_{f}=4 L), seguido de un tratamiento con
ARNasaA a 37ºC durante 30 minutos (500 \mul de 10 mg/m) en 250 ml
de tampón de ARNasa = 20 \mug/ml). Los portaobjetos se lavaron 2 x
10 minutos con 2 x SSC, EDTA a temperatura ambiente. Las condiciones
de lavado de astringencia fueron las siguientes: 2 horas a 55ºC, 0,1
x SSC, EDTA (20 ml 20 x SSC + 16 ml de EDTA, V_{f}=4 L)
C-141 F - NL3p1: 48
mer GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC AAG TTG TCC TCC (SEC ID No:
16)
C-141 G - NL3p2: 47
mer CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA CGT GGT CAG CGT (SEC ID No:
17)
\vskip1.000000\baselineskip
Los tejidos adultos que se examinaron fueron:
hígado, riñón, glándulas adrenales, miocardio, aorta, bazo, nódulos
linfáticos, páncreas, pulmón, piel, córtex cerebral, hipocampo,
cerebelo, pene, ojo, vejiga, estómago, carcinoma gástrico, colon,
carcinoma colónico y condrosarcoma, daño en el hígado y cirrosis
hepática causada inducida por acetaminofeno. Los tejidos fetales que
se examinaron fueron: placenta, cordón umbilical, hígado, riñón,
glándulas adrenales, tiroides, pulmones, corazón, vasos mayores,
esófago, estómago, intestino delgado, bazo, timo, páncreas, cerebro,
ojo, médula espinal, pared abdominal, pene y extremidad inferior. No
se observó expresión en ninguno de los tejidos normales o fetales.
La expresión se detectó en células sinusoidales hepáticas
(probablemente endoteliales) en el daño hepático agudo (inducido por
acetaminofeno) y el daño hepático crónico (cirrosis y adyacente a la
metástasis de carcinoma colorrectal). Estos resultados indican que
el NL3 juega un papel importante en la regulación de la regeneración
hepática.
La expresión de NL1 también se examinó en una
selección similar de tejidos de adulto y fetales pero no se observó
expresión bajo las condiciones indicadas anteriormente.
Ejemplo
3
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma
no glicosilada de los homólogos de ligando TIE de la presente
invención en E. coli. La secuencia de ADN que codifica un
ligando NL-3 (SEC ID No: 3) se amplifica
inicialmente utilizando cebadores de PCR determinados. Los cebadores
deberían contener sitios para enzimas de restricción que
correspondan a los sitios para enzimas de restricción en el vector
de expresión seleccionado. Se pueden utilizar un conjunto de
vectores de expresión. El vector codificará preferiblemente un gen
de resistencia a antibiótico, un origen de replicación, un promotor,
y un sitio de unión a ribozima. Un ejemplo de un vector adecuado es
pBR322 (derivado de E. coli; ver Bolivar y otros, Gene
2: 95 (1977)) que contiene genes para la resistencia a
ampicilina y tetraciclina. El vector se digiere con enzima de
restricción y se desfosforila. A continuación, las secuencias
amplificadas por PCR se unen al vector.
A continuación, se utiliza la mezcla de unión
para transformar una cepa de E. coli seleccionada, utilizando
los procedimientos descritos en Sambrook y otros, supra. Los
transformantes se identifican por su capacidad para crecer en placas
LB y, a continuación, se seleccionan las colonias resistentes a
antibiótico. El ADN plásmido se puede aislar y confirmar mediante
análisis de restricción.
Los clones seleccionados se pueden desarrollar
durante toda la noche en un medio de cultivo líquido, tal como caldo
IB seleccionado con antibióticos. EL cultivo de toda la noche se
puede utilizar posteriormente para inocular un cultivo a escala
posterior. A continuación, se desarrollan las células hasta una
densidad óptica deseada. Se puede añadir un inductor, tal como
IPTG.
Después del cultivo de las células durante
varias horas más, se pueden recoger las células por centrifugación.
El pélet de células obtenido mediante la centrifugación se puede
solubilizar utilizando varios agentes conocidos en la técnica, y la
proteína solubilizada se puede purificar a continuación utilizando
una columna quelante de metales en condiciones que permiten una
estrecha unión de la proteína.
Ejemplo
4
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma
glicosilada de los homólogos de ligando NL3 mediante expresión
recombinante en células de mamíferos.
El vector pRK5 (ver EP 307.247 publicada el 15
de marzo de 1989) se utiliza como vector de expresión.
Opcionalmente, el ADN de NL3 se une a pRK5 con los enzimas de
restricción seleccionados para permitir la inserción del ADN de NL3
utilizando procedimientos de unión, tales como los descritos en
Sambrook y otros, supra. El vector resultante se denomina
pRK5-NL3.
En una realización, las células huésped
seleccionadas pueden ser células 293. Se desarrollan células 293
humanas (ATCC CCL 1573) para confluir en placas de cultivo de
tejidos en un medio, tal como DMEM suplementado con suero de ternera
fetal y opcionalmente, componentes de nutrientes y/o antibióticos.
Aproximadamente 10 \mug de ADN de pRK5-NL2 se
mezclan con aproximadamente 1 \mug de ADN que codifica el gen de
ARN VA [Thimmappaya y otros, Cell., 31: 543 (1982)] y
se disolvió en 500 \mul de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1
mM, CaCl_{2} 0,227 M. A esta mezcla se añade, gota a gota, 500
\mul de HEPES 50 mM (pH 7,35), NaCl 280 mM, Na_{3}PO_{4} 1,5
mM, y se deja formar un precipitado durante 10 minutos a 25ºC. El
precipitado se suspende y se añade a las células 293 y se dejan
reposar durante aproximadamente 4 horas a 37ºC. El medio de cultivo
se aspira y se añaden 2 ml de glicerol al 20% en PBS durante 30
segundos. A continuación, las células 293 se lavan con medio sin
suero, se añade medio fresco y se incuban las células durante
aproximadamente 5 días.
Aproximadamente 24 horas después de las
transfecciones, se extrae el medio de cultivo y se sustituye por
medio de cultivo (solo) o medio de cultivo que contiene 200
\muCi/ml de ^{35}S-cisteína y 200 \muCi/ml de
^{35}S-metionina. Después de 12 horas de
incubación, se recoge el medio acondicionado, se concentra en un
filtro giratorio, y se carga en gel de SDS al 15%. El gel procesado
se puede secar y exponer a una película durante un período de tiempo
determinado para revelar la presencia de polipéptido NL3. Los
cultivos que contienen células transfectadas pueden sufrir una
incubación adicional (en medio libre de suero) y se examina el medio
en bioensayos determinados.
En una técnica alternativa, se puede introducir
NL3 en células 293 de forma transitoria utilizando el procedimiento
de sulfato de dextrano descrito por Somparyrac y otros, Proc.
Natl. Acad. Sci., 12: 7575 (1981). Se desarrollan células
293 hasta la densidad máxima en un matraz de centrifugación y se
añaden 700 \mug de ADN de pRK5-FLS139, -NL2 y
-NL3. En primer lugar, las células se concentran a partir del matraz
de centrifugación mediante centrifugación y se lavan con PBS. El
precipitado de ADN-dextrano se incuba en el pélet de
células durante 4 horas. Las células se tratan con glicerol al 20%
durante 90 segundos, se lavan con medio de cultivo de tejido, y se
reintroducen en el matraz de centrifugación que contiene medio de
cultivo de tejido, 5 \mug/ml de insulina bovina y 0,1 \mug/ml de
transferrina bovina. Después de aproximadamente cuatro días, el
medio acondicionado se centrifuga y se filtra para eliminar las
células y debris. La muestra que contiene NL3 expresado se puede
entonces concentrar y purificar mediante cualquier procedimiento
seleccionado, tal como diálisis y/o cromatografía en columna.
En otra realización, NL3 se puede expresar en
células CHO. El pRK5-NL3 se puede transfectar en
células CHO utilizando reactivos conocidos, tales como
Ca_{3}PO_{4} o DEAE-dextrano. Tal y como se ha
descrito anteriormente, los cultivos de células se pueden incubar, y
el medio se puede sustituir por medio de cultivo (solo) o medio de
cultivo que contiene un radiomarcador tal como
^{35}S-metionina. Después de determinar la
presencia de polipéptido NL3, el medio de cultivo se puede sustituir
por un medio libre de suero. Preferiblemente, los cultivos se
incuban durante aproximadamente 6 días y, a continuación, se recoge
el medio acondicionado. El medio que contiene NL3 expresado se puede
entonces concentrar y purificar mediante cualquier procedimiento
determinado.
El NL3 con epítopo con tag también se puede
expresar en células CHO huésped. El NL3 se puede subclonar fuera del
vector pRK5. La inserción del subclón puede someterse a la PCR para
fusionar en el marco con un epítopo con tag determinado, tal como un
tag poli-his, en un vector de expresión de
Baculovirus. La inserción de NL3 con tag poli-his se
puede subclonar a continuación en un vector dirigido SV40 que
contiene un marcador de selección, tal como DHFR para la selección
de clones estables. Finalmente, las células CHO se pueden
transfectar (tal y como se ha descrito anteriormente) con el vector
dirigido SV40. El marcaje se puede llevar a cabo, tal y como se ha
descrito anteriormente, para verificar la expresión. A continuación,
el medio de cultivo que contiene FLS139, NL2 y NL3 con tag
poli-His expresados se puede concentrar y purificar
mediante cualquier procedimiento determinado, tal como mediante
cromatografía de afinidad con quelato-Ni^{2+}.
De hecho las formas glicosiladas de NL3 se
expresaron en células CHO en las formas con tag
poli-His. Tras la amplificación por PCR, el ADN de
NL3 se subclonó en un vector de expresión de CHO utilizando técnicas
estándar tal y como se describe en Ausubel y otros, Current
Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley e Hijos
(1997). Los vectores de expresión de CHO se construyen para que
tengan sitios de restricción 5' y 3' compatibles del ADN de interés
para permitir el lanzamiento conveniente de ADNcs. El vector
utilizado para la expresión de NL3 en células CHO es tal y como se
describe en Lucas y otros, Nucl. Acids. Res. 24: 9
(1774-1779 (1996), y utiliza el promotor/potenciador
temprano SV40 para dirigir la expresión del ADNc de interés y
dihidrofolato reductasa (DHFR). La expresión de DHFR permite la
selección del mantenimiento estable del plásmido tras la
transfección.
Se introdujeron doce microgramos de ADN plásmido
que codifica NL3 en aproximadamente 10 millones de células CHO
utilizando reactivos de transfección disponibles comercialmente
Superfect® (Quiagen), Dosper® o Fugene® (Boehringer Mannheim). Las
células se desarrollaron y se describieron en Lucas y otros, supra.
Se congelaron aproximadamente 3 x 10^{-7} células en una ampolla
para el posterior crecimiento y producción tal y como se describe a
continuación.
La ampolla que contenía el ADN plásmido del NL3
se descongeló al colocarlo en una baño de agua y se mezcló por
centrifugación. El contenido se pipeteó a un tubo de centrifugación
que contenía 10 ml de medio y se centrifugó a 1000 rpm durante 5
minutos. El sobrenadante se aspiró y las células se resuspendieron
en 10 ml de medio selectivo (PS20 filtrado a 0,2 \mum con 5% de
suero bovino fetal diafiltrado a 0,2 \mum). A continuación, las
células se pusieron por alícuotas en un tubo de centrifugación de
100 ml que contenía 90 ml de medio selectivo. Después de
1-2 días, las células se transfirieron a un tubo de
centrifugación de 250 ml rellenado con 150 ml de medio de
crecimiento selectivo y se incubaron a 37ºC. Después de otros
2-3 días, se sembraron tubos de centrifugación de
250 ml, 500 ml y 2000 ml con 3 x 10^{5} células/ml. El medio se
intercambió por medio nuevo mediante centrifugación y resuspensión
en el medio de producción. Se puede utilizar cualquier medio de CHO
adecuado, por ejemplo, tal y como se describe en la Patente de
Estados Unidos 5.122.469 concedida el 16 de junio de 1992. Se sembró
un tubo de centrifugación de producción de 3 ml a 1,2 x 10^{6}
células/ml. En el día 0, se determinaron el número de células y el
pH. En el día 1, se tomaron muestras del tubo de centrifugación y se
inició la agitación con aire filtrado. En el día 2, se tomaron
muestras del tubo de centrifugación, la temperatura se desplazó
hasta 33ºC y se añadieron 30 ml de 500 g/l de glucosa y 0,6 ml de
antiespuma al 10% (por ejemplo, emulsión de polidimetilsiloxano al
35%, Dow Coming 365 Medical Grade Emulsion). A lo largo de la
producción, se ajustó el pH según fuera necesario para mantenerlo
alrededor de 7,2. Después de 10 días, o hasta que la viabilidad bajó
por debajo del 70%, el cultivo de células se recogió mediante
centrifugación
y se filtró a través de un filtro de 0,22 \mum. El filtrado se guardó a 4ºC hasta cargarlo en una columna de purificación.
y se filtró a través de un filtro de 0,22 \mum. El filtrado se guardó a 4ºC hasta cargarlo en una columna de purificación.
El tag poli-His se purificó
utilizando una columna de Ni-NTA (Qiagen). Antes de
la purificación, se añadió imidazol al medio acondicionado hasta una
concentración de 5 mM. El medio acondicionado se bombeó a 6 ml de
una columna de Ni-NTA equilibrada en Hepes 20 mM, pH
7,4, solución tampón que contenía NaCl 0,3 M e imidazol 5 mM a un
caudal de 4-5 ml/min a 4ºC. Después de la carga, se
lavó la columna con solución tampón de equilibrio adicional y se
eluyó la proteína con solución tampón de equilibrio que contenía
imidazol 0,25 M. La proteína purificada se desaló posteriormente en
una solución tampón de almacenamiento que contenía Hepes 10 mM, NaCl
0,14 M y manitol al 4%, pH 6,8, con una columna G25 Superfine
(Pharmacia) de 25 ml y se guardó a -80ºC.
La homogeneidad de las proteínas purificadas se
confirmó mediante SDS-PAGE y la secuenciación de
aminoácidos N-terminales llevada a cabo mediante la
degradación de Edman.
Ejemplo
5
En primer lugar, se construyen los vectores de
expresión de levadura para la producción o secreción intracelular de
NL3 del promotor ADH2/GADPH. El ADN que codifica NL3, un péptido
señal determinado y el promotor se insertan en sitios de enzimas de
restricción adecuados en el plásmido seleccionado para dirigir la
expresión intracelular de NL3. Para la secreción, el ADN que
codifica NL3 se puede clonar en el plásmido determinado, junto con
el ADN que codifica el promotor ADH2/GAPDH, la secuencia líder/señal
secretora de factor alfa de levadura, y secuencias enlazadoras (si
es necesario) para la expresión de NL3.
Las células de levadura, tales como la cepa
AB110 de levadura, se pueden a continuación transformar con los
plásmidos de expresión descritos anteriormente y cultivarse en
medios de fermentación seleccionados. Los sobrenadantes de la
levadura transformada se pueden analizar mediante precipitación con
ácido tricloroacético al 10% y mediante separación por
SDS-PAGE, seguido de la tinción de los geles con
colorante Azul de Coomassie.
Posteriormente, el NL3 recombinante se puede
aislar y purificar extrayendo las células de levadura del medio de
fermentación mediante centrifugación y, a continuación, concentrar
el medio utilizando filtros de cartucho. El concentrado que contiene
NL3 se puede purificar adicionalmente utilizando resinas de
cromatografía en columna determinadas.
Ejemplo
6
El siguiente procedimiento describe la expresión
recombinante de NL3 en células de insectos transfectadas en
Baculovirus.
El NL3 se fusiona en dirección 5' de un epítopo
con tag que contiene un vector de expresión de baculovirus. Dichos
epítopos con tag incluyen tags de poli-his y tags de
inmunoglobulina (como regiones Fc de IgG). Se puede utilizar un
conjunto de plásmidos, incluyendo plásmidos derivados de plásmidos
disponibles comercialmente, tales como pVL1393 (Novagen).
Brevemente, el NL3 o la parte deseada del NL3 (tal como la secuencia
que codifica el dominio extracelular de una proteína transmembrana)
se amplifican por PCR con cebadores complementarios a la regiones 5'
y 3'. El cebador 5' puede incorporar sitios de enzimas de
restricción (seleccionados) flanqueantes. A continuación, el
producto se digiere con los enzimas de restricción seleccionados y
se subclona en el vector de expresión.
El baculovirus recombinante se genera mediante
la cotransfección del plásmido anterior y el ADN del virus
BaculoGold^{TM} (Pharmingen) en células de Spodoptera
frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) utilizando lipofectina
(disponible comercialmente en GIBCO-BRL). Después de
4-5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados
se recogen y se utilizan para amplificaciones posteriores. La
infección vírica y la expresión de la proteína se llevan a cabo tal
y como se describe por O'Reilley y otros, Baculovirus expression
vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press
(1994).
A continuación, se pueden purificar los NL3 con
tag poli-His expresados, por ejemplo, mediante las
siguientes cromatografías de afinidad de
quelato-Ni^{2+}. Los extractos se preparan a
partir de células Sf9 infectadas con virus recombinante tal y como
se describe por Rupert y otros, Nature 362:
175-179 (1993). Brevemente, se lavan las células
Sf9, se resuspenden en la solución tampón de sonicación (25 ml de
Hepes, pH 7,9; 12,5 mM de MgCl_{2}; 0,1 mM de EDTA; glicerol al
10%, NP-40 al 0,1%; 0,4 M de KCl) y se sonican dos
veces durante 20 segundos en hielo. Los sonicatos se aclaran por
centrifugación y el sobrenadante se diluye 50 veces en una solución
tampón de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH
7,8) y se filtra a través de un filtro de 0,45 \muM. Se prepara
una columna de Ni^{2+}-NTA agarosa (comercialmente
disponible en Qiagen) con un volumen de lecho de 5 ml, se lava con
25 ml de agua y se equilibra con 25 ml de solución tampón de carga.
El extracto de células filtrado se carga en la columna a 0,5 ml por
minuto. La columna se lava hasta la línea base A_{280} con la
solución tampón de carga, en cuyo punto se inicia la recolección de
la fracción. A continuación, la columna se lava con una segunda
solución tampón de lavado (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol al
10%, pH 6,0), que eluye la proteína unida no específicamente.
Después de alcanzar la línea base A_{280} de nuevo, la columna se
desarrolla con un gradiente de imidazol de 0 a 500 mM en la segunda
solución tampón de lavado. Se recogen fracciones de 1 ml y se
analizan por SDS-PAGE y tinción con plata o
"western blot" con Ni^{2+}-NTA conjugada con
fosfatasa alcalina (Qiagen). Las fracciones que contienen el NL3 con
tag His_{10} eluido se juntan y se dializan frente a una solución
tampón de carga.
Alternativamente, la purificación del FLS139,
NL2 y NL3 con tag en IgG (o tag en Fc) se puede llevar a cabo
utilizando técnicas cromatográficas conocidas, incluyendo, por
ejemplo, cromatografía en columna de Proteína A o Proteína G.
Ejemplo
7
Este ejemplo ilustra la preparación de
anticuerpos monoclonales que pueden unirse específicamente a
NL3.
Las técnicas para fabricar anticuerpos
monoclonales son conocidas en la técnica y se describen, por
ejemplo, en Goding, supra. Entre los inmunógenos que se
pueden utilizar se incluyen homólogos de ligando purificados de la
presente invención, proteínas de fusión que contienen dichos
homólogos de ligando, y células que expresan homólogos de ligando
recombinantes en la superficie de la célula. La selección del
inmunógeno se puede realizar por un experto en la materia sin una
excesiva experimentación.
Se inmunizan ratones, tales como Balb/c, con el
inmunógeno emulsionado en adyuvante de Freund completo y se inyecta
subcutáneamente o intraperitonealmente en una cantidad de
1-100 microgramos. Alternativamente, el inmunógeno
se emulsiona en adyuvante MPL-TDM (Ribi
Immunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyecta en las plantas
de las patas traseras de los animales. A continuación, los ratones
inmunizados se estimulan 10 a 12 días después con inmunógeno
adicional emulsionado en el adyuvante seleccionado. Desde ese
momento, durante varias semanas, los ratones también se pueden
estimular con inyecciones de inmunización adicionales. Las muestras
de suero se pueden obtener periódicamente a partir de los ratones
mediante el sangrado retro-orbital para realizar los
ensayos ELISA y así detectar los anticuerpos.
Después de detectar una titulación de
anticuerpos adecuada, los animales "positivos" para los
anticuerpos se pueden inyectar con una inyección intravenosa final
del ligando determinado. Tres a cuatro días después, los ratones se
sacrifican y se recogen las células del bazo. A continuación, las
células del bazo se fusionan (utilizando polietilenglicol al 35%) a
una línea de células de mieloma murina determinada, tal como
P3X63AgU.I, disponible en ATCC, No. CRL 1597. Las fusiones generan
células de hibridoma que a continuación se pueden sembrar en placas
de cultivo de tejidos de 96 pocillos que contienen medio HAT
(hipoxantina, aminopterina, y timidina) para inhibir la
proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma, e
híbridos de células del bazo.
Las células del hibridoma se cribarán en un
ELISA de reactividad frente al antígeno. La determinación de células
del hibridoma "positivos" que secretan los anticuerpos
monoclonales deseados contra los homólogos de ligando TIE de la
presente se conoce en el estado de la técnica.
Las células del hibridoma positivas se pueden
inyectar de forma intraperitoneal en ratones Balb/c singeneicos para
producir ascitis que contiene los anticuerpos monoclonales de
ligando anti-TIE. Alternativamente, las células del
hibridoma se pueden desarrollar en matraces o botellas "roller"
para el cultivo de tejidos. La purificación de los anticuerpos
monoclonales producidos en la ascitis se pueden llevar a cabo
utilizando la precipitación con sulfato amónico, seguido de una
cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, se puede
utilizar la cromatografía de afinidad basada en la unión de
anticuerpos a proteína A o proteína G.
Ejemplo
8
Se estudió la capacidad de NL3 para inducir la
apoptosis en células endoteliales con células endoteliales de vena
umbilical humana (HUVEC, Cell Systems), utilizando un formato de 96
pocillos, en un medio con un 0% de suero suplementado con VEGF 100
ng/ml. (Dado que las células HUVEC se sacan fácilmente de la
superficie de las placas, todo el pipeteo en los pocillos se debe
realizar de forma tan suave como práctica).
El medio se aspiró y las células se lavaron una
vez con PBS. Se añadieron 5 ml de I x tripsina a las células en un
matraz T-175, se dejaron reposar las células hasta
que se sacaron de la placa (aproximadamente 5-10
minutos). La tripsinización se detuvo añadiendo 5 ml de medio de
crecimiento. Las células se centrifugaron a 1000 rpm durante 5
minutos a 4ºC. El medio se aspiró y las células se resuspendieron en
10 ml de medio complementado con 10% de suero (Cell Systems), 1 x
penicilina/estreptomicina.
Las células se sembraron en placas de
microtitulación de 96 pocillos (Amersham Life Science, microplaca
para recuento por centelleo citostar-T, RPNQ160,
estéril, cultivo de tejido tratado, envuelto individualmente), en
suero al 10% (medio CSG, Cell Systems), a una densidad de 2 x
10^{4} células por pocillo en un volumen total de 100 \mul. Los
polipéptidos NL5 y NL8 se añadieron por triplicado en diluciones del
1%, 0,33% y 0,11%. Los pocillos sin células se utilizaron como
blanco y los pocillos con células sólo como control negativo. Como
control positivo se utilizaron diluciones en serie 1:3 de 50 \mul
de una reserva 3x de estaurosporina. La capacidad del polipéptido
NL5 para inducir la apoptosis se determinó utilizando Annexin V, un
miembro de las proteínas de unión a calcio y fosfolípido, para
detectar la apoptosis.
Se diluyeron 0,2 ml de solución de reserva de
Annexina V-Biotina (100 \mug/ml) en 4,6 ml 2 x
solución tampón de unión de Ca^{2+} y 2,5% de BSA (dilución 1:25).
Se añadieron 50 \mul de la solución de Annexina
V-Biotina diluida a cada pocillo (excepto a los
controles) hasta una concentración final de 1,0 \mug/ml. Las
muestras se incubaron durante 10-15 minutos con
Annexina-Biotina antes de la adición directa de
^{35}S-Estreptavidina. Se diluyó
^{35}S-Estreptavidina en 2 x solución tampón de
unión de Ca^{2+}, 2,5% BSA y se añadió a todos los pocillos a una
concentración final de 3 x 10^{4} cpm/pocillo. A continuación, se
taparon las placas, se centrifugaron a 1000 rpm durante 15 minutos y
se colocaron en un agitador orbital durante 2 horas. El análisis se
llevó a cabo en 1450 Microbeta Trilux (Wallac).
NL3 fue positivo en este ensayo. Este resultado
confirma adicionalmente la potencial utilidad de estas, y
potencialmente relacionadas, moléculas en la terapia contra el
cáncer.
Tal y como se ha indicado anteriormente, se han
depositado los siguientes materiales con la American Type Culture
Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA (ATCC):
| Material | ATCC Dep. No. | Fecha del depósito |
| NL2-DNA 22780-1078 | 209284 | 9/18/97 |
| NL3-DNA 33457-1078 | 209283 | 9/18/97 |
| FLS139-DNA 16451-1078 | 209281 | 9/18/97 |
Estos depósitos se realizaron bajo las
disposiciones del Tratado de Budapest en el Reconocimiento
Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del
Procedimiento en materia de Patentes y las Regulaciones que las
rigen (Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de un
cultivo viable del depósito durante 30 años desde la fecha del
depósito. El depósito estará disponible por la ATCC en los términos
del Tratado de Budapest, y sujeto a un acuerdo entre Genentech, Inc.
y ATCC, que asegura la disponibilidad permanente y no restrictiva de
la progenie del cultivo del depósito al público tras la concesión de
la patente de Estados unidos correspondiente o tras la divulgación
al público de cualquier solicitud de Patente de Estados Unidos o
extranjera, cualquiera que sea la primera, y asegura la
disponibilidad de la progenie a quien se le otorga el derecho a las
mismas determinado por el Comisionado de Estados Unidos de Patentes
y Marcas según 35 USC \NAK 122 y las reglas del Comisionado con
respecto a la misma (incluyendo 37 C.F.R. \NAK 1.14 con particular
referencia a 886 OG 683).
El cesionario de la presente solicitud está de
acuerdo en si un cultivo de los materiales en el depósito se muriera
o perdiera o destruyera cuando se cultiva en condiciones adecuadas,
los materiales se sustituirán rápidamente en notificación con otros
de los mismos. La disponibilidad de los materiales depositados no se
interpreta como una licencia para realizar la invención en contra de
los derechos concedidos bajo la autoridad de cualquier gobierno
según sus leyes de patentes.
El presente documento se considera que es
suficiente para permitir que un experto en la materia realice la
invención. La presente invención no está limitada en su alcance por
la construcción depositada, ya que la realización depositada tiene
la intención de ser una única ilustración de ciertos aspectos de la
invención y cualquier construcción que sea funcionalmente
equivalente está dentro del alcance de la invención. El depósito del
material de la presente no constituye un reconocimiento de que la
descripción escrita sea inadecuada para permitir la realización de
cualquier aspecto de la invención, incluyendo el modo óptimo de la
misma, ni se debe interpretar como limitante del alcance de las
reivindicaciones a las ilustraciones específicas que representan. De
hecho, las diversas modificaciones de la invención además de las
mostradas y descritas en la presente serán evidentes para los
expertos en la materia a partir de la descripción anterior y caen
dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Genentech, Inc.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DEL INVENTO: Homólogos de ligando de receptor de tirosina quinasa tie.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID No: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1869 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: Única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SE. ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID No: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 406 aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID No: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID No: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1024 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: Única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID No: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID No: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 288 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID No: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID No: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2042 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: Única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID No: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID No: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 460 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID No: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID No: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: Única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID No: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATGAGGTGGC CAAGCCTGCC CGAAGAAAGA GGC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID No: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: Única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID No: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAACTGGCTG GGCCATCTCG GGCAGCCTCT TTCTTCGGG
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID No: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: Única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.500000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID No: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCAGCCAGA ACTCGCCGTG GGGA
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID No: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: Única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID No: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGTTGGCAA AGGCAAGGTG GCTGACGATC CGG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID No: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 43 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: Única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID No: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGGCCCTTA TCTCTCCTGT ACAGCTTCCG GATCGTCAGC CAC
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID No: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: Única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID No: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCATTCCCA CCTATGACGC TGACCA
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID No: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: Única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID No: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCACGTTGGC TTGAAATTGA
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID No: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: Única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID No: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTCCAGAAT TGATCAAGAC AATTCATGAT TTGATTCTCT ATCTCCAGAG
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID No: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: Única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID No: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCGTCTAACA TAGCAAATC
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID No: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: Única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID No: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTCATAATACG ACTCACTATA GGGCAAGTTG TCCTCC
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID No: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: Única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID No: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGAAATTAAC CCTCACTAAA GGGACGTGGT CAGCGT
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
LISTADO DE
SECUENCIAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Genentech Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Homólogos de ligando de receptor de
tirosina quinasa tie
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> GRF/FP6182638
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 04012203.8
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
24-05-2004
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 98946988.7
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
14-09-1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT/US98/19094
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
14-09-1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 08/934.494
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
19-09-1997
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170>
PC-DOS/MS-DOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1869
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 406
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> no seguro
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 221
\vskip0.400000\baselineskip
<223> aminoácido desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1024
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<220> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 288
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2042
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 460
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<221> fuente
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Artificial: Sonda de oligonucleótidos sintética"
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<400> 7
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill33
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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Artificial: Sonda de oligonucleótidos sintética"
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaactggctg ggccatctcg ggcagcctct ttcttcggg
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
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Artificial: Sonda de oligonucleótidos sintética"
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<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccagccaga actcgccgtg ggga
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
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Artificial: Sonda de oligonucleótidos sintética"
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<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggttggcaa aggcaaggtg gctgacgatc cgg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<221> fuente
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Artificial: Sonda de oligonucleótidos sintética"
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtggccctta tctctcctgt acagcttccg gatcgtcagc cac
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota= "Descripción de Secuencia
Artificial: Sonda de oligonucleótidos sintética"
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccattccca cctatgacgc tgaccca
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota= "Descripción de Secuencia
Artificial: Sonda de oligonucleótidos sintética"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccacgttggc ttgaaattga
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota= "Descripción de Secuencia
Artificial: Sonda de oligonucleótidos sintética"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctccagaat tgatcaagac aattcatgat ttgattctct atctccagag
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota= "Descripción de Secuencia
Artificial: Sonda de oligonucleótidos sintética"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgtctaaca tagcaaatc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota= "Descripción de Secuencia
Artificial: Sonda de oligonucleótidos sintética"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttctaatacg actcactata gggcaagttg tcctcc
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota= "Descripción de Secuencia
Artificial: Sonda de oligonucleótidos sintética"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgaaattaac cctcactaaa gggacgtggt cagcgt
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
LISTADO DE
SECUENCIAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Genentech, Inc.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DEL INVENTO: Homólogos de ligando de receptor de tirosina quinasa tie
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID No:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1869 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: Única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID No: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 406 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID No: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID No: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1024 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: Única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID No: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID No: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 288 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID No: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID No: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2042 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: Única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID No: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID No: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 460 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID No: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID No: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: Única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID No: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATGAGGTGGC CAAGCCTGCC CGAAGAAAGA GGC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID No: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: Única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID No: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAACTGGCTG GGCCATCTCG GGCAGCCTCT TTCTTCGGG
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID No: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: Única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID No: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCAGCCAGA ACTCGCCGTG GGGA
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID No: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: Única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID No: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGTTGGCAA AGGCAAGGTG GCTGACGATC CGG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID No: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 43 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: Única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID No: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGGCCCTTA TCTCTCCTGT ACAGCTTCCG GATCGTCAGC CAC
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID No: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: Única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID No: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCATTCCCA CCTATGACGC TGACCCA
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID No: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: Única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID No: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCACGTTGGC TTGAAATTGA
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID No: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: Única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID No: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTCCAGAAT TGATCAAGAC AATTCATGAT TTGATTCTCT ATCTCCAGAG
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID No: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: Única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA :Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID No: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCGTCTAACA TAGCAAATC
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID No: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: Única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA :Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID No: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTCTAATACG ACTCACTATA GGGCAAGTTG TCCTCC
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID No: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: Única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA :Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID No: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGAAATTAAC CCTCACTAAA GGGACGTGGT CAGCGT
\hfill36
Claims (27)
1. Molécula de ácido nucleico aislada que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido
que tiene por lo menos un 90% de identidad en la secuencia con la
secuencia de aminoácidos del polipéptido NL3 humano nativo (SEC ID
No: 4).
2. Molécula de ácido nucleico aislada según la
reivindicación 1, en la que el polipéptido codificado tiene por lo
menos un 95% de identidad en la secuencia con la secuencia de
aminoácidos del polipéptido NL3 humano nativo (SEC ID No: 4).
3. Molécula de ácido nucleico aislada según la
reivindicación 2, en la que el polipéptido codificado tiene por lo
menos un 98% de identidad en la secuencia con la secuencia de
aminoácidos del polipéptido NL3 humano nativo (SEC ID No: 4).
4. Molécula de ácido nucleico aislada según la
reivindicación 3, en la que el polipéptido codificado tiene por lo
menos un 99% de identidad en la secuencia con la secuencia de
aminoácidos del polipéptido NL3 humano nativo (SEC ID No: 4).
5. Molécula de ácido nucleico aislada según la
reivindicación 4, en la que el polipéptido codificado tiene la
secuencia de aminoácidos del polipéptido NL3 humano nativo (SEC ID
No: 4).
6. Molécula de ácido nucleico aislada según la
reivindicación 5, que comprende la región codificante de SEC ID No:
3.
7. Molécula de ácido nucleico aislada según la
reivindicación 1, que comprende el dominio de tipo fibrinógeno de
SEC ID No: 3.
8. Vector que comprende una molécula de ácido
nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Célula huésped recombinante transformada con
una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7.
10. Célula huésped recombinante según la
reivindicación 9 que es una célula procariota.
11. Célula huésped recombinante según la
reivindicación 9 que es una célula eucariota.
12. Polipéptido aislado, que comprende una
secuencia de aminoácidos de NL3 que tiene por lo menos un 90% de
identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos del
polipéptido NL3 humano nativo (SEC ID No: 4).
13. Polipéptido aislado según la reivindicación
12, que comprende una secuencia de aminoácidos de NL3 que tiene por
lo menos un 95% de identidad en la secuencia con la secuencia de
aminoácidos del polipéptido NL3 humano nativo (SEC ID No: 4).
14. Polipéptido aislado según la reivindicación
13, que comprende una secuencia de aminoácidos de NL3 que tiene por
lo menos un 98% de identidad en la secuencia con la secuencia de
aminoácidos del polipéptido NL3 humano nativo (SEC ID No: 4).
15. Polipéptido aislado según la reivindicación
14, que comprende una secuencia de aminoácidos de NL3 que tiene por
lo menos un 99% de identidad en la secuencia con la secuencia de
aminoácidos del polipéptido NL3 humano nativo (SEC ID No: 4).
16. Polipéptido aislado según la reivindicación
15, que comprende una secuencia de aminoácidos de NL3 que tiene la
secuencia de aminoácidos del polipéptido NL3 humano nativo (SEC ID
No: 4).
17. Anticuerpo que se une específicamente a la
secuencia de aminoácidos de NL3 del polipéptido según cualquiera de
las reivindicaciones 12 a 16.
18. Anticuerpo según la reivindicación 17 que es
un anticuerpo monoclonal.
19. Anticuerpo según la reivindicación 18 que
tiene residuos de una región determinante de complementariedad (CDR)
no humana y residuos de una región de armazón (FR) humana.
20. Anticuerpo según la reivindicación 17 que
está marcado.
21. Composición que comprende un polipéptido
según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16 en asociación con
un portador.
22. Composición que comprende un anticuerpo
según la reivindicación 17 en asociación con un portador.
23. Composición según la reivindicación 22 que
comprende además un segundo anticuerpo o un agente citotóxico o
quimioterapéutico.
24. Conjugado que comprende un polipéptido según
cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16 o un anticuerpo según la
reivindicación 17, fusionado a un agente citotóxico o
quimioterapéutico adicional.
25. Conjugado según la reivindicación 25, en el
que el agente terapéutico adicional es una toxina, un ligando TIE
diferente, o un miembro de la familia del factor de crecimiento
endotelial vascular (VEGF).
26. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 16, o un anticuerpo según la reivindicación
17, para la utilización en un procedimiento de tratamiento
médico.
27. Utilización de un polipéptido según
cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16 en la preparación de un
medicamento para la inducción de la apoptosis de células
endoteliales o la inhibición del crecimiento tumoral.
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