JP2002500887A - Ａｃｐｌｄｎａおよびポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、精製されそして単離されている新規ＡＣＰＬポリペプチド、こうしたポリペプチドをコードする核酸、こうしたポリペプチドの組換え型を産生するための方法、これらのポリペプチドに対し生成された抗体、これらのポリペプチド由来の断片化ペプチド、および上記の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野 本発明は、精製されそして単離されているＡＣＰＬポリペプチド、こうしたポ
リペプチドをコードする核酸、こうしたポリペプチドの組換え型を産生するため
の方法、これらのポリペプチドに対し生成された抗体、これらのポリペプチドに
由来する断片化ペプチド、こうしたポリペプチドおよび断片化ペプチドの分子量
マーカーとしての使用、こうしたポリペプチドおよび断片化ペプチドの、ペプチ
ド断片化に関するコントロールとしての使用、並びにこれらの試薬を含むキット
に関する。本発明はさらに、ＩＬ−１８刺激に反応する細胞情報伝達、および細
胞情報伝達におけるＡＣＰＬポリペプチドの関与に基づく誘導性タンパク質発現
系の研究における、ＡＣＰＬポリペプチド、こうしたポリペプチドをコードする
核酸、およびこれらのポリペプチドに対し生成された抗体の使用に関する。

【０００２】 関連技術の説明 ＩＬ−１ Ｉ型受容体（ＩＬ−１Ｒ）は、ＩＬ−１の生物学的影響を仲介する
。ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βに起因すると考えられる活性には、炎症性サイト
カインの誘導、並びにプロスタグランジン、メタロプロテイナーゼ、接着分子、
急性期タンパク質、造血、発熱、骨吸収、およびＴｈ２細胞増殖および分化を含
む、他の炎症性反応の誘導が含まれる。

【０００３】 ＩＬ−１は、慢性関節リウマチおよび炎症性腸疾患などの慢性の炎症性疾患と
関連付けられてきている。ＩＬ−１が骨粗鬆症で役割を果たしている証拠が増え
つつある。これらの働きはすべて、Ｉ型ＩＬ−１Ｒの細胞質部分の情報伝達機能
により開始される。ＩＬ−１ｒａは、Ｉ型ＩＬ−１受容体に結合し、それにより
ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βへの接近を遮断するが、それ自体いかなる生物学的
反応も引き出さないことによりＩＬ−１の活性を阻害する。

【０００４】 ＩＬ−１８はＩＬ−１αおよびＩＬ−１βの相同体（ｈｏｍｏｌｏｇ）であり
、そしてＩＬ−１Ｒに相同な受容体、ＩＬ−１受容体関連タンパク質１（ＩＬ−
１ＲｒｐＩ）（Ｐａｒｎｅｔら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２７１：３９
６７， １９９６およびＴｏｒｉｇｏｅら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２
７２：２５７３７， １９９７を参照されたい）を介しその働きを仲介する可能
性がある。ＩＬ−１８は、Ｔｈ１細胞増殖および分化の刺激因子として作用し、
そしてＴｈ１細胞からのインターフェロン産生の強力な誘導因子である。ＩＬ−
１８はＮＫ細胞殺傷活性を亢進し、そして敗血症性ショック、肝臓破壊、および
糖尿病に関連付けられてきている。さらに、ＩＬ−１８は、マウスで免疫学的に
仲介されるｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を示す（Ｍｉｃａｌｌｅｆら， Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ４３：３６１， １９９７
）。

【０００５】 タンパク質の発見および同定は、現代分子生物学および生化学の最先端である
。

【０００６】 試料タンパク質の一次構造、または配列の同定は、実験の困難な過程が成就し
た結果である。未知の試料タンパク質を同定するため、研究者は、当業者に知ら
れる多様な技術を用い、未知の試料タンパク質の既知のペプチドへの比較に頼る
ことが可能である。例えば、タンパク質は、電気泳動、沈降、クロマトグラフィ
ー、および質量分析などの技術を用い、日常的に解析される。

【０００７】 未知のタンパク質試料を既知の分子量と比較することにより、未知のタンパク
質試料の見かけの分子量を決定することが可能になる（Ｔ．Ｄ． Ｂｒｏｃｋお
よびＭ．Ｔ． Ｍａｄｉｇａｎ， Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａ
ｎｉｓｍｓ ７６−７７（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ， 第６版， １９９１
））。タンパク質分子量標準は、未知のタンパク質試料の分子量概算を援助する
ため、商業的に入手可能である（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉ
ｎｃ．カタログ：１３０−１３１， １９９５；Ｊ．Ｌ． Ｈａｒｔｌｅｙ、米
国特許第５，４４９，７５８号）。しかし、分子量標準は、見かけの分子量の正
確な概算を可能にするには、未知の試料タンパク質に十分近い大きさに相当しな
い可能性がある。

【０００８】 化学的または酵素的手段により断片化にさらされるタンパク質の場合、分子量
概算における困難の度合いが増す（Ａ．Ｌ． Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ， Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ １０６−１０８（Ｗｏｒｔｈ Ｂｏｏｋｓ， 第２版， １
９８１））。化学的断片化は、メチオニン残基のカルボキシル側のペプチド結合
切断を導く臭化シアンなどの化学薬品とタンパク質をインキュベーションするこ
とにより、達成することが可能である（Ｅ． Ｇｒｏｓｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚ． １１：２３８−２５５， １９６７）。タンパク質の酵素的断
片化は、多数のアミノ酸残基で切断するプロテアーゼとタンパク質をインキュベ
ーションすることにより、達成することが可能である（Ｄ．Ｗ． Ｃｌｅｖｅｌ
ａｎｄら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５２：１１０２−１１０６，
１９７７）。タンパク質の酵素的断片化はまた、リジン残基のカルボキシル側の
ペプチド結合切断を導くアクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）プロ
テアーゼＩ（Ｆ． ＳａｋｉｙａｍａおよびＡ． Ｎａｋａｔａ、米国特許第５
，２４８，５９９号；Ｔ． Ｍａｓａｋｉら， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ． Ａｃｔａ ６６０：４４−５０， １９８１；Ｔ． Ｍａｓａｋｉら，
Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ６６０：５１−５５， １
９８１）などのプロテアーゼとタンパク質をインキュベーションすることにより
、達成することも可能である。断片化ペプチドの分子量は、広い範囲の分子量に
及ぶ可能性があり、そして該ペプチドは非常に多い可能性がある。断片化の度合
いの変動もまた、達成することが可能である（Ｄ．Ｗ． Ｃｌｅｖｅｌａｎｄら
， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５２：１１０２−１１０６， １９７７
）。

【０００９】 特定のアミノ酸構成要素に関するタンパク質組成の特有の性質は、タンパク質
内の切断部位の特有の配置を生じる。化学的または酵素的切断によるタンパク質
の特定の断片化は、特有の「ペプチドフィンガープリント」を生じる（Ｄ．Ｗ．
Ｃｌｅｖｅｌａｎｄら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５２：１１０２
−１１０６， １９７７；Ｍ． Ｂｒｏｗｎら， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ
． ５０：３０９−３１６， １９８０）。その結果、特定の部位での切断は、
既定のタンパク質の、正確な分子量のペプチドへの、再現可能な断片化を生じる
。さらに、これらのペプチドは、該ペプチドの等電点ｐＨを決定する特有の電荷
特性を持つ。これらの特有の特性は、多様な電気泳動および他の技術を用い、利
用することが可能である（Ｔ．Ｄ． ＢｒｏｃｋおよびＭ．Ｔ． Ｍａｄｉｇａ
ｎ， Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ７６−７７（Ｐ
ｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ， 第６版， １９９１））。

【００１０】 未知のタンパク質のペプチドフィンガープリントが得られたならば、この未知
のタンパク質の同定を援助するため、既知のタンパク質のデータベースに比較し
てもよい（Ｗ．Ｊ． Ｈｅｎｚｅｌら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５０１１−５０１５， １９９３；Ｂ． Ｔｈｉｅ
ｄｅら， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １９９６， １７：５８８−５９
９， １９９６）。多様なコンピューターソフトウェアプログラム、例えばＭｕ
ｌｔｉＩｄｅｎｔ（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｓｐ
ｒｏｔ／ｍｕｌｔｉｉｄｅｎｔ．ｈｔｍｌ）、ＰｅｐｔｉｄｅＳｅａｒｃｈ（イ
ンターネットサイト：ｗｗｗ．ｍａｎｎ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｅｄｅｌｂｅｒｇ．
ｄｅ．．．ｄｅＳｅａｒｃｈ／ＦＲ＿ＰｅｐｔｉｄｅＳｅａｒｃｈＦｏｒｍ．ｈ
ｔｍｌ）、およびＰｒｏＦｏｕｎｄ（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｃｈａｉ
ｔ−ｓｇｉ．ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔ−ｉ
ｄ−ｆｒａｇ．ｈｔｍｌ）などが、こうした比較を容易にするため、インターネ
ットを介し、当業者に利用可能である。これらのプログラムは、使用者が切断剤
および指示された許容範囲の断片化ペプチドの分子量を特定するのを可能にする
。該プログラムは、試料タンパク質の同定の解明を補助するため、これらの分子
量をタンパク質データベースと比較する。正確な同定には、断片化ペプチドの数
およびこれらのペプチドの正確な分子量に関する正確な情報が必要である。した
がって、断片化ペプチドの数およびこれらのペプチドの正確な分子量の決定の正
確さが増せば、未知のタンパク質の同定における成功は高まるはずである。

【００１１】 タンパク質の断片化はさらに、アミノ酸組成解析およびタンパク質配列決定の
ための断片の産生（Ｐ． Ｍａｔｓｕｄｉａｒａ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅ
ｍ． ２６２：１００３５−１００３８， １９８７；Ｃ． Ｅｃｋｅｒｓｋｏ
ｒｎら， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １９８８， ９：８３０−８３８
， １９８８）、特に「遮断（ｂｌｏｃｋｅｄ）」Ｎ−末端を持つタンパク質か
らの断片の産生に使用される。さらに、タンパク質の断片化は、質量分析のため
のペプチドの調製（Ｗ． Ｊ． Ｈｅｎｚｅｌら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５０１１−５０１５， １９９３；Ｂ．
Ｔｈｉｅｄｅら， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １９９６， １７：５
８８−５９９， １９９６）、免疫感作、アフィニティー選択（Ｒ． Ａ． Ｂ
ｒｏｗｎ、米国特許第５，１５１，４１２号）、修飾部位（例えばリン酸化）の
決定、活性生物学的化合物の生成（Ｔ． Ｄ． ＢｒｏｃｋおよびＭ． Ｔ．
Ｍａｄｉｇａｎ， Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ３
００−３０１（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ， 第６版， １９９１））、およ
び相同タンパク質の識別（Ｍ． Ｂｒｏｗｎら， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ
． ５０：３０９−３１６， １９８０）に用いてもよい。

【００１２】 タンパク質研究並びにタンパク質構造および特性の解明における関心が続いて
いるため、当該分野には、ペプチド断片化研究および分子量測定に用いるのに適
切なポリペプチドに対する必要性が存在する。

【００１３】 発明の概要 本発明は、配列番号１、配列番号３のＤＮＡ配列、配列番号６のコード領域を
含む単離核酸分子、並びに配列番号２および配列番号７のアミノ酸配列をコード
する単離核酸分子を含む。本発明はまた、これらの配列に相補的な核酸分子も含
む。こうしたものとして、本発明は、配列番号１のＤＮＡ配列および配列番号６
のコード領域並びに配列番号２および配列番号７のアミノ酸配列をコードする単
離核酸分子を含む、二本鎖核酸分子を含む。一本鎖および二本鎖両方のＲＮＡお
よびＤＮＡ ＡＣＰＬ核酸分子が本発明に含まれる。これらの分子を用い、本発
明に含まれるＡＣＰＬの一本鎖および二本鎖両方のＲＮＡおよびＤＮＡ変異体（
ｖａｒｉａｎｔ）を検出することが可能である。二本鎖ＤＮＡプローブにより、
核酸分子のどちらかの鎖に同等な（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）核酸分子を検出する
ことが可能になる。配列番号１または配列番号６のＤＮＡ配列、あるいは配列番
号２または配列番号７のアミノ酸配列をコードする単離核酸分子を含む、変性二
本鎖ＤＮＡに、６０℃、０．５ Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄条件を伴
う、５０％ホルムアミドおよび６ Ｘ ＳＳＣ、４２℃における中程度にストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズする単離核酸分子が、本発明に含まれる。

【００１４】 本発明はさらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発により配列番号１または配列
番号６から得られる単離核酸分子を含む。ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発は、限
定されるわけではないが、部位特異的突然変異誘発、無作為突然変異誘発、およ
びｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸合成を含む、当業に知られる多くの技術を含むであろう
。本発明はまた、遺伝暗号の結果として、配列番号１および配列番号６から縮重
している単離核酸分子；ヒトＡＣＰＬ ＤＮＡの対立遺伝子変異体である単離核
酸分子、またはＡＣＰＬ ＤＮＡの種相同体も含む。本発明はまた、これらの核
酸分子の発現を指示する組換えベクターおよびこれらのベクターで形質転換また
はトランスフェクションされている宿主細胞も含む。

【００１５】 本発明はまた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定されるような、およそ７０ ｋＤ
の分子量を有する単離ポリペプチドおよび非糖鎖付加型の単離ポリペプチドを含
む、これらの核酸分子にコードされる単離ポリペプチドも含む。これらのポリペ
プチドに結合する単離ポリクローナルまたはモノクローナル抗体が本発明に含ま
れる。本発明はさらに、宿主細胞を、発現を促進する条件下で培養し、そして培
地からポリペプチドを回収することを含む、ＡＣＰＬポリペプチド産生のための
方法を含む。特に、細菌、酵母、植物、および動物細胞におけるＡＣＰＬポリペ
プチドの発現が、本発明に含まれる。

【００１６】 さらに、ＡＣＰＬポリペプチドを利用し、ＡＣＰＬポリペプチド対構造（ｃｏ
ｕｎｔｅｒ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）分子またはＡＣＰＬ結合タンパク質に関連す
る活性の潜在的な阻害剤をスクリーニングするアッセイ、およびＡＣＰＬポリペ
プチド対構造分子または結合タンパク質により仲介される疾患の治療のための治
療剤として、ＡＣＰＬポリペプチドを用いる方法が、本発明に含まれる。さらに
ＡＣＰＬポリペプチドを、その阻害剤の設計に用いる方法もまた、本発明の側面
である。

【００１７】 本発明はさらに、化学的または酵素的処理により、ＡＣＰＬポリペプチドから
産生される断片化ペプチドを含む。さらに、ＡＣＰＬポリペプチド分子量マーカ
ーおよびその断片化ペプチドの型であって、化学的または酵素的手段による断片
化に必要な部位が少なくとも1つ突然変異している前記型も、本発明の側面であ る。

【００１８】 本発明はまた、電気泳動を用い、ＡＣＰＬポリペプチド分子量マーカーおよび
その断片化ペプチドを視覚化するための方法も含む。本発明はさらに、タンパク
質または断片化タンパク質試料の分子量概算を可能にする分子量マーカーとして
、ＡＣＰＬポリペプチド分子量マーカーおよびその断片化ペプチドを用いるため
の方法を含む。本発明はさらに、試料タンパク質の等電点の決定を援助するマー
カーとして、ＡＣＰＬポリペプチドおよびその断片化ペプチドを用いるための方
法を含む。本発明はまた、タンパク質試料の断片化の程度を確かめるためのコン
トロールとして、ＡＣＰＬポリペプチドおよびその断片化ペプチドを用いるため
の方法も含む。

【００１９】 本発明にさらに含まれるのは、ＡＣＰＬポリペプチド分子量マーカー、その断
片化ペプチド、および化学的または酵素的手段による断片化に必要な部位が少な
くとも1つ突然変異しているＡＣＰＬポリペプチド分子量マーカーを利用し、試 料タンパク質の分子量決定を援助するキットである。

【００２０】 やはり本発明に含まれるのは、ＡＣＰＬ依存誘導に基づく誘導性タンパク質発
現系に関連する過程である。こうした系には、限定されるわけではないが、ＩＬ
−１８刺激に反応するＮＦκＢ仲介情報伝達およびＩＬ−１８刺激に反応するＡ
ｐ−１仲介情報伝達のＡＣＰＬ依存誘導が含まれる。本発明にさらに含まれるの
は、ＭＡＰキナーゼファミリー、キナーゼＪＮＫおよびｐ３８のＩＬ−１８誘導
に対する反応に関連する過程である。

【００２１】 発明の詳細な説明 マウスおよびヒトＡＣＰＬポリペプチドをコードするｃＤＮＡが単離されそし
て配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号６に開示される。ＡＣＰ
ＬポリペプチドをコードするｃＤＮＡのこの発見により、ＡＣＰＬポリペプチド
およびＡＣＰＬポリペプチド断片をコードする核酸配列を含む発現ベクターの構
築；発現ベクターでトランスフェクションまたは形質転換されている宿主細胞の
構築；単離されそして精製されているタンパク質としての、生物学的に活性があ
るＡＣＰＬポリペプチドおよびＡＣＰＬ分子量マーカーの構築；並びにＡＣＰＬ
ポリペプチドに免疫反応性である抗体の調製が可能になる。

【００２２】 ＡＣＰＬヌクレオチドおよびポリペプチドは以下のように得られた。マウス胸
腺由来のＥＳＴ配列ＡＡ２０３９８６のＩＭＡＧＥクローンを得てそして配列決
定した。本配列情報を用い、マウスＴ細胞（ＥＬ４）由来のｃＤＮＡライブラリ
ーをスクリーニングし、そしてＡＣＰＬ ＤＮＡの全長ネズミクローンを単離し
、そして配列決定した。該ＡＣＰＬ配列は、全読み枠に渡る少なくとも３つの別
個の単離体（ｉｓｏｌａｔｅ）由来の配列を代表する。マウスＡＣＰＬ ＤＮＡ
のコード領域配列は、配列番号１に示す。配列番号１にコードされるアミノ酸配
列は、配列番号２に示す。配列番号１にコードされるマウスＡＣＰＬは、１４ア
ミノ酸のシグナルペプチド（配列番号２のＮ−からＣ−末端の残基１−１４）を
含む、３５６アミノ酸の細胞外ドメイン（配列番号２の残基１−３５６）；２４
アミノ酸の膜貫通領域（配列番号２の残基３５７−３８０）およびアミノ酸の細
胞質ドメイン（配列番号２の残基３８１−６１４）を含む。

【００２３】 本クローンの配列は、ＩＬ−１受容体ファミリーのメンバーの配列と類似性を
示し、それによりマウスＡＣＰＬ ＤＮＡ（配列番号１）が、ＩＬ−１受容体フ
ァミリーのメンバーである受容体（配列番号２）をコードすることが示される。

【００２４】 ヒトＮＫ細胞ライブラリー由来のクローン、ＱＱ１３５２は、マウスＡＣＰＬ
ＤＮＡのヒト相同体として同定された。クローンＱＱ１３５２は、一部スプラ
イシングされたｍＲＮＡクローンに相当し、そして本配列の一部は、Ｇｅｎｂａ
ｎｋに寄託番号Ｂ６４４０３にて寄託された、ＢＡＣ由来のゲノムＤＮＡクロー
ン内に見られるエクソンの配列と同一である。さらに、本配列（配列番号５のヌ
クレオチド１７９−２４４）は、ヒトＩ型ＩＬ−１Ｒのエクソン７の位に対応し
、そしてＡＣＰＬポリペプチドが炎症性反応の仲介に関与していることが示され
る。

【００２５】 ＱＱ１３５２クローンにコードされるアミノ酸配列を、マウスＡＣＰＬポリペ
プチド配列と比較した。マウスＡＣＰＬポリペプチド配列と、ヌクレオチド５２
２から始まる、ＱＱ１３５２の３つの異なる読み枠での翻訳物との最適合（ｂｅ
ｓｔｆｉｔ）比較を行った。これらの並列から、配列の位に応じ、３つの読み枠
すべてで、マウスおよびヒト配列間の有意な相同性につながる、少なくとも２つ
のフレームシフトがあることが明らかであり、ＱＱ１３５２がヒトＡＣＰＬの一
部を含むことが立証された。

【００２６】 全長ヒトＡＣＰＬを得るため、ヒトｃＤＮＡクローン、ＱＱ１３５２を用い、
ＰＢＬ、ＰＢＴおよびＮＫ ｃＤＮＡライブラリーからクローンを探査（ｐｒｏ
ｂｅ）した。プローブとして用いたクローンＱＱ１３５２の領域は、ネズミＡＣ
ＰＬヌクレオチド１１９６から１７５３に相同であった。全長クローンは、これ
らのライブラリーのいずれからも得られなかったため、ベクター固定（ｖｅｃｔ
ｏｒ−ａｎｃｈｏｒｅｄ）ＰＣＲを各ライブラリーで行い、読み枠の５’末端を
得た。ヒトＡＣＰＬの全長ＤＮＡ配列は、配列番号６に開示する。配列番号６に
コードされるアミノ酸配列は、配列番号７に示す。配列番号６にコードされるＡ
ＣＰＬは、１４アミノ酸のシグナルペプチド（配列番号７のＮ−からＣ−末端の
残基１−１４）を含む、３５６アミノ酸の細胞外ドメイン（配列番号７の残基１
−３５６）；２５アミノ酸の膜貫通領域（配列番号７の残基３５７−３８１）お
よびアミノ酸の細胞質ドメイン（配列番号７の残基３８２−５９９）を含む。

【００２７】 ＡＣＰＬおよびＩＬ−１Ｒｒｐ１の同時発現は、ＩＬ−１８で刺激された細胞
においてＮＦκＢ活性の劇的な亢進を生じる。対照的に、ＡＣＰＬまたはＩＬ−
１Ｒｒｐ１単独の発現はＩＬ−１８反応性を生じない。したがって、ＡＣＰＬは
ＩＬ−１８反応を仲介するのに役割を果たし、そしてＩＬ−１８受容体複合体の
構成要素である可能性がある。さらに、ＩＬ−１８の受容体を、ＩＬ−１８が誘
導する炎症性反応の阻害剤として用いることが可能である。したがって、本発明
の態様は、細胞外部分を含む。

【００２８】 本発明の好ましいＤＮＡおよびアミノ酸態様には、配列番号１および配列番号
６のコード領域、並びにそれぞれ配列番号２および配列番号７に示される、配列
番号１および配列番号６にコードされるアミノ酸が含まれる。さらなる好ましい
態様は、ＡＣＰＬアミノ酸配列のドメインおよび該ドメインをコードするヌクレ
オチド配列である。配列番号７に関しては、該ドメインは：１４アミノ酸のシグ
ナルペプチド（配列番号７のＮ−からＣ−末端の残基１−１４）を含む、３５６
アミノ酸の細胞外ドメイン（配列番号７の残基１−３５６）；２５アミノ酸の膜
貫通領域（配列番号７の残基３５７−３８１）およびアミノ酸の細胞質ドメイン
（配列番号７の残基３８２−５９９）を含む。配列番号２に関しては、本発明の
ＡＣＰＬアミノ酸配列ドメインは：１４アミノ酸のシグナルペプチド（配列番号
２のＮ−からＣ−末端の残基１−１４）を含む、３５６アミノ酸の細胞外ドメイ
ン（配列番号２の残基１−３５６）；２４アミノ酸の膜貫通領域（配列番号２の
残基３５７−３８０）およびアミノ酸の細胞質ドメイン（配列番号２の残基３８
１−６１４）を含む。

【００２９】 本発明の核酸の発見により、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベ
クターの構築；該発現ベクターでトランスフェクションまたは形質転換されてい
る宿主細胞の構築；および単離されそして精製されている生物学的に活性がある
ポリペプチドおよびその断片の構築が可能になる。さらに、開示される核酸、お
よびその断片またはオリゴヌクレオチドの発見により、ＩＬ−１と相同性を有す
るタンパク質をコードする核酸を同定し、そしてＩＬ−１８仲介反応において役
割を有するタンパク質をコードする核酸を同定するためのプローブとしてそれら
を使用することが可能になる。さらに、本発明の核酸およびオリゴヌクレオチド
は、ヒト染色体２ｑ上のＤＮＡをマッピングし、そしてヒト染色体第２ｑ番に関
連する特定の疾患、症候群または他のヒト異常に関連する遺伝子を同定するのに
使用を見出す。以下の表は、いくつかのこうした疾患、症候群、または異常を確
認する。

【００３０】

【表１】

【００３１】

【００３２】 本発明の核酸により、ＡＣＰＬ遺伝子にコードされるポリヌクレオチドの発現
を阻害するための、該核酸由来の一本鎖センスまたはアンチセンスオリゴヌクレ
オチドの使用が可能になる。本発明のポリペプチドおよび可溶性断片（例えば配
列番号２および配列番号７の細胞外ドメイン並びにその活性断片）を用い、ＩＬ
−１８仲介反応を阻害し、そしてＡＣＰＬ依存誘導に基づく誘導性タンパク質発
現系に関連する過程を研究してもよい。こうした系には、限定されるわけではな
いが、ＩＬ−１８刺激に反応するＮＦκＢ仲介情報伝達およびＩＬ−１８刺激に
反応するＡｐ−１仲介情報伝達のＡＣＰＬ依存誘導が含まれる。同様にこうした
過程には、ＭＡＰキナーゼファミリー、キナーゼＪＮＫおよびｐ３８のＩＬ−１
８誘導に対する反応に関連するものが含まれる。

【００３３】 本発明のポリペプチドおよびその断片化ペプチドは、さらに、分子量マーカー
としての使用、ペプチド断片化のコントロール試薬としての使用、そしてこれら
の試薬を含むキットの構成要素としての使用を見出す。さらに、本発明のポリペ
プチドおよびポリペプチド断片は、抗体の生成に有用である。こうして生成され
る抗体は、本発明に含まれ、そして治療剤として、および本発明のポリペプチド
およびポリペプチド断片を精製するための方法において、有用である。

【００３４】 核酸 １つの態様において、本発明は内因性成分の汚染がない、特定の単離ヌクレオ
チド配列に関する。「ヌクレオチド配列」は、別個の断片の形の、またはより大
きな核酸構築物の構成要素としてのポリヌクレオチド分子を指す。核酸分子は、
実質的に純粋な型で、そして標準的生化学的方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら
， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ， 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）に略述さ
れているものなど）によるその構成要素ヌクレオチド配列の同定、操作、および
回収を可能にする量または濃度で、少なくとも１度単離されているＤＮＡまたは
ＲＮＡから由来している。好ましくは、こうした配列は、真核遺伝子に典型的に
存在する、内部非翻訳配列、またはイントロンにより中断されない読み枠の形で
提供されおよび/または構築される。非翻訳ＤＮＡ配列は、該ＤＮＡ配列がコー ド領域の操作または発現に干渉しない、読み枠の５’または３’に存在していて
もよい。

【００３５】 本発明の核酸分子は、一本鎖および二本鎖型両方のＤＮＡと共に、そのＲＮＡ
相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）も含む。ＤＮＡには、例えばｃＤＮＡ、ゲノム
ＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ、およびそ
れらの組み合わせが含まれる。ゲノムＤＮＡは、例えば、配列番号１、配列番号
３、配列番号６、または適切なその断片をプローブとして用い、慣用技術により
単離してもよい。

【００３６】 本発明のＤＮＡ分子は、全長遺伝子と共にポリヌクレオチドおよびその断片を
含む。全長遺伝子は、Ｎ−末端シグナルペプチドを含んでもよい。他の態様は、
可溶性型をコードする、例えばシグナルペプチドを含むまたは含まない、該タン
パク質の細胞外ドメインをコードするＤＮＡを含む。

【００３７】 本発明の核酸は、好ましくは、ヒト供給源から由来するが、本発明は、非ヒト
種由来のものもまた含む。

【００３８】 １つ以上のコドンが同一のアミノ酸をコードする可能性がある、遺伝暗号の既
知の縮重のため、ＤＮＡ配列は配列番号１、配列番号３および配列番号６に示さ
れるものと異なり、そしてなお配列番号２および配列番号７のアミノ酸配列を有
するポリペプチドをコードする可能性がある。こうした変異体ＤＮＡ配列は、沈
黙（ｓｉｌｅｎｔ）突然変異（例えば、ＰＣＲ増幅中に発生する）から生じても
よいし、または天然配列の意図的な突然変異誘発の産物であってもよい。

【００３９】 したがって、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする単離ＤＮＡ配列で
あって：（ａ）配列番号１、配列番号３および配列番号６のヌクレオチド配列を
含むＤＮＡ；（ｂ）配列番号２および配列番号７のポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ；（ｃ）中程度にストリンジェントな条件下で（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ
にハイブリダイズすることが可能であり、そしてＡＣＰＬ活性を有するポリペプ
チドをコードするＤＮＡ；（ｄ）非常にストリンジェントな条件下で、（ａ）ま
たは（ｂ）のＤＮＡにハイブリダイズすることが可能であり、そして本発明のポ
リペプチドをコードするＤＮＡ；および（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または
（ｄ）に定義されるＤＮＡに対し遺伝暗号の結果として縮重しており、そして本
発明のポリペプチドをコードするＤＮＡより選択される、前記単離ＤＮＡ配列を
提供する。もちろん、こうしたＤＮＡ配列にコードされるポリペプチドが本発明
に含まれる。

【００４０】 本明細書において、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長
さに基づき、一般の技術を有する当業者により、容易に決定することが可能であ
る。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版， Ｖｏｌ． １，
ｐｐ．１．１０１−１０４， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）に示され、そしてニトロセルロース
フィルターに関し、５ Ｘ ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ ｍＭ ＥＤＴ
Ａ（ｐＨ ８．０）の前洗浄溶液、および約４２℃での、約５０％ホルムアミド
、６ Ｘ ＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、例えばスタ
ーク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイ
ゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０℃、０．５ Ｘ
ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。非常にストリンジェ
ントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者により、容易に決定す
ることが可能である。一般的に、こうした条件は、上記のようなハイブリダイゼ
ーション条件、およびおよそ６８℃、０．２ Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの
洗浄を伴うと定義される。当業者は温度および洗浄溶液塩濃度は、プローブの長
さなどの要因にしたがい、必要に応じ調整してもよいことを認識するであろう。

【００４１】 本発明の態様としてやはり含まれるのは、以下に記載されるような、不活性化
Ｎ−糖鎖付加部位、不活性化プロテアーゼプロセシング部位、または保存的アミ
ノ酸置換を含む、ポリペプチド断片およびポリペプチドをコードするＤＮＡであ
る。

【００４２】 別の態様において、本発明の核酸分子はまた、天然配列に少なくとも８０％同
一であるヌクレオチド配列も含む。やはり意図されるのは、核酸分子が、天然配
列に少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一、少
なくとも９９％同一、または少なくとも９９．９％同一である配列を含む、態様
である。

【００４３】 同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算により決定してもよい。あ
るいは、２つの核酸配列の同一性パーセントは、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（Ｎｕｃｌ
． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：３８７， １９８４）に記載され、そしてウ
ィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能な
ＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０を用い配列情報を比較する
ことにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメー
ターには：（１）ヌクレオチドに関する単一（ｕｎａｒｙ）比較マトリックス（
同一に対し１および非同一に対し０の値を含む）、およびＳｃｈｗａｒｔｚおよ
びＤａｙｈｏｆｆ監修，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３−３５８， １９７９
に記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ， Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：６７４５， １９８６の加重比較マトリックス；
（２）各ギャップに対する３．０のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対
しさらに０．１０のペナルティ；および（３）末端ギャップに対するペナルティ
なし、が含まれる。当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用
いてもよい。

【００４４】 本発明はまた、ポリペプチドの産生に有用な単離核酸も提供する。こうしたポ
リペプチドは、いくつかの慣用技術のいずれにより調製してもよい。ＡＣＰＬポ
リペプチド、または望ましいその断片をコードするＤＮＡ配列を、該ポリペプチ
ドまたは断片を産生するための発現ベクター内にサブクローンしてもよい。ＤＮ
Ａ配列は、好都合に、適切なリーダーまたはシグナルペプチドをコードする配列
に融合させる。あるいは、既知の技術を用い、望ましい断片を化学的に合成して
もよい。ＤＮＡ断片はまた、全長クローン化ＤＮＡ配列の制限エンドヌクレアー
ゼ消化により産生し、そしてアガロースゲル上の電気泳動により単離してもよい
。必要であれば、望ましい点まで５’または３’末端を再構築したオリゴヌクレ
オチドを、制限酵素消化により生成されたＤＮＡ断片に連結してもよい。こうし
たオリゴヌクレオチドはさらに、望ましいコード配列、およびコード配列のＮ−
末端の開始コドン（ＡＴＧ）位の上流に、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含
んでもよい。

【００４５】 周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法もまた、望ましいタンパク質断片を
コードするＤＮＡ配列を単離しそして増幅するのに使用してもよい。ＤＮＡ断片
の望ましい末端を定めるオリゴヌクレオチドを、５’および３’プライマーとし
て使用する。該オリゴヌクレオチドはさらに、発現ベクターへの増幅ＤＮＡ断片
の挿入を容易にするため、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含んでもよい。
ＰＣＲ技術は、Ｓａｉｋｉら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７（１９８８）
；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ， Ｗｕら監修，
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．，サンディエゴ（１９８９）；ｐ
ｐ．１８９−１９６；およびＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ
ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｉｎｎｉｓら監
修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．（１９９０）に記載される。

【００４６】 ポリペプチドおよびその断片 本発明は、ポリペプチドおよび多様な型のその断片を含み、天然発生である、
または組換えＤＮＡ技術を伴う方法などの多様な技術を通じ産生されるものを含
む。こうした型には、限定されるわけではないが、誘導体、変異体、およびオリ
ゴマーと共に、融合タンパク質またはその断片が含まれる。

【００４７】 当業者は、上述のＡＣＰＬポリペプチドドメイン（例えば細胞外ドメイン、シ
グナルペプチド、膜貫通領域および細胞質ドメイン）の境界はおよそのものであ
り、そして膜貫通領域およびシグナルペプチド（本目的のため利用可能であるコ
ンピュータープログラムを用いることにより予測することが可能である）境界は
上述のものと異なる可能性があることを認識するであろう。

【００４８】 本発明のポリペプチドは、膜に結合していても、または分泌されそしてしたが
って可溶性であってもよい。可溶性ポリペプチドは、発現される細胞から分泌さ
れることが可能である。一般的に、可溶性ポリペプチドは、例えば遠心分離など
により、望ましいポリペプチドを発現する損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）細
胞を培地から分離し、そして望ましいポリペプチドの存在に関し培地（上清）を
アッセイすることにより、同定する（そして非可溶性膜結合対応物と区別する）
ことが可能である。培地中にポリペプチドが存在することにより、該ポリペプチ
ドが細胞から分泌され、そしてしたがって該タンパク質の可溶性型であることが
示される。

【００４９】 １つの態様において、可溶性ポリペプチドおよびその断片は、細胞外ドメイン
のすべてまたは一部を含むが、細胞膜へのポリペプチドの保持を生じるであろう
膜貫通領域を欠く。可溶性ポリペプチドは、該ポリペプチドが産生細胞から分泌
される限り、細胞質ドメイン、またはその一部を含んでもよい。可溶性ポリペプ
チドのさらなる例は、細胞質ドメインおよび膜貫通領域だけでなく、上述のスペ
ーサー領域のすべてまたは一部も欠いているものである。

【００５０】 一般的に、可溶性型の使用は特定の適用に有益である。可溶性ポリペプチドは
宿主細胞から分泌されるため、組換え宿主細胞からのポリペプチドの精製が容易
になる。可溶性ポリペプチドは、一般的に、静脈内投与に、より適している。さ
らに、可溶性ポリペプチドは、ＡＣＰＬ結合タンパク質に関連する活性を阻害す
るのに有用である可能性がある。

【００５１】 本発明はまた、ＡＣＰＬポリペプチド、および望ましい生物学的活性を保持す
るその断片（例えば細胞外ドメイン）も提供する。特定の態様は、ＡＣＰＬ結合
タンパク質または結合パートナーに結合する能力を保持するポリペプチド断片に
関する。こうした断片は、上述のように可溶性ポリペプチドであってもよい。別
の態様において、ポリペプチドおよび断片は、好都合に、上述のようなＩＬ−１
受容体ファミリーに保存される領域を含む。

【００５２】 本明細書にやはり提供されるのは、配列番号２または配列番号７の配列の隣接
アミノ酸を少なくとも２０、または少なくとも３０含むポリペプチド断片である
。細胞質ドメイン由来の断片は、情報伝達研究において、そして生物学的情報の
伝達に関連する細胞過程の制御において、使用を見出す。ポリペプチド断片はま
た、抗体を産生する際の免疫原として使用してもよい。

【００５３】 変異体 天然発生変異体と共に、ポリペプチドおよび断片由来変異体が本明細書に提供
される。

【００５４】 変異体は、少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を示してもよい。やはり
意図されるのは、ポリペプチドまたは断片が、好ましいポリペプチドまたはその
断片に、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一
、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．９％同一であるアミノ酸配列
を含む、態様である。同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算により
決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の同一性パーセントは、Ｎｅ
ｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏ． ４８：４４３
， １９７０）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コン
ピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログ
ラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラム
の好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎ
ｉｋｏｆｆ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：
１０９１５， １９９２）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、
ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；お
よび（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。当業者に用いら
れる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。

【００５５】 本発明の変異体には、例えば、選択的ｍＲＮＡスプライシング事象またはタン
パク質分解切断から生じるものが含まれる。ｍＲＮＡの選択的スプライシングは
、例えば、一部切除されている（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）が生物学的に活性がある
タンパク質を生じる可能性があり、例えば該タンパク質の天然発生可溶性型など
がある。タンパク質分解に起因すると考えられる変動には、例えば、異なる種類
の宿主細胞における発現に際しての、該タンパク質からの１つまたはそれ以上の
末端アミノ酸（一般的に１−５末端アミノ酸）のタンパク質分解的除去によるＮ
−またはＣ−末端の相違が含まれる。アミノ酸配列の相違を遺伝的多型性（該タ
ンパク質を産生する個体の間の対立遺伝子変動）に起因しうるタンパク質もまた
、本発明に意図される。

【００５６】 本発明の範囲内のさらなる変異体には、他の化学部分、例えばグリコシル基、
脂質、リン酸、アセチル基およびそれらに匹敵するものと共有または凝集結合体
を形成することにより、修飾され、誘導体を生成する可能性があるポリペプチド
が含まれる。共有誘導体は、アミノ酸側鎖上の、あるいはポリペプチドのＮ−末
端またはＣ−末端の、官能基上に、化学部分を連結することにより、調製しても
よい。以下により詳細に記載されるような、結合している診断用剤（検出可能）
または治療剤を含む結合体が本発明に意図される。

【００５７】 他の誘導体には、例えばＮ−末端またはＣ−末端融合体として組換え培養にお
いて合成されることによる、該ポリペプチドと他のタンパク質またはポリペプチ
ドとの共有または凝集結合体が含まれる。融合タンパク質の例は、オリゴマーと
関連し、以下に論じられる。さらに、融合タンパク質は精製および同定を容易に
するため添加されるペプチドを含んでもよい。こうしたペプチドには、例えば、
ポリＨｉｓまたは米国特許第５，０１１，９１２号およびＨｏｐｐら， Ｂｉｏ
／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４， １９８８に記載される抗原性同定ペ
プチドが含まれる。こうしたペプチドの１つはＦＬＡＧ（登録商標）ペプチド、
Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓであり、該
ペプチドは抗原性が高く、そして特異的なモノクローナル抗体が可逆的に結合す
るエピトープを提供し、発現された組換えタンパク質の迅速なアッセイおよび容
易な精製を可能にする。４Ｅ１１と称されるネズミハイブリドーマは、本明細書
に援用される米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるように、特定の二価
金属陽イオンの存在下でＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナ
ル抗体を産生する。４Ｅ１１ハイブリドーマ細胞株は、寄託番号第ＨＢ ９２５
９号下に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されている。ＦＬ
ＡＧ（登録商標）に結合するモノクローナル抗体は、Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａ
ｋ Ｃｏ．， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉ
ｖｉｓｉｏｎ、コネチカット州ニューヘブンより入手可能である。

【００５８】 本明細書に提供される変異体ポリペプチドの中に、天然の生物学的活性を保持
する天然ポリペプチドの変異体または実質的なその同等物（ｅｑｕｉｖａｌｅｎ
ｔ）がある。１つの例は、天然型と本質的に同一の結合親和性でその結合タンパ
ク質または結合パートナーに結合する変異体である。結合親和性は、例えば米国
特許第５，５１２，４５７号に記載されるように、そして以下に示されるように
、簡便な方法により測定することが可能である。

【００５９】 変異体には、実質的に天然型と相同であるが、1つまたはそれ以上の欠失、挿 入または置換のため、天然型と異なるアミノ酸配列を有する、ポリペプチドが含
まれる。特定の態様には、限定されるわけではないが、天然配列と比較して、ア
ミノ酸残基の１ないし１０の欠失、挿入または置換を含むポリペプチドが含まれ
る。

【００６０】 既定のアミノ酸を、例えば同様の物理化学的特性を有する残基により置換して
もよい。こうした保存的置換の例には、１つの脂肪族残基を互いに、例えばＩｌ
ｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａを互いに置換するもの；ＬｙｓおよびＡｒｇ
；ＧｌｕおよびＡｓｐ；またはＧｌｎおよびＡｓｎ間といった、１つの極性残基
から別のものへの置換；あるいは芳香族残基の別のものでの置換、例えばＰｈｅ
、Ｔｒｐ、またはＴｙｒを互いに置換するものが含まれる。他の保存的置換、例
えば、同様の疎水性特性を有する領域全体の置換が、周知である。

【００６１】 同様に、本発明のＤＮＡには、１つまたはそれ以上の欠失、挿入または置換の
ため、天然ＤＮＡ配列とは異なるが、生物学的に活性があるポリペプチドをコー
ドする変異体が含まれる。

【００６２】 本発明はさらに、結合する天然パターン糖鎖付加を含むまたは含まないポリペ
プチドを含む。酵母または哺乳動物発現系（例えばＣＯＳ−１またはＣＯＳ−７
細胞）で発現されたポリペプチドは、発現系の選択に応じ、分子量および糖鎖付
加パターンにおいて、天然ポリペプチドと同様である可能性も、または有意に異
なる可能性もある。細菌発現系、例えば大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）での本発明の
ポリペプチドの発現は、非糖鎖付加分子を提供する。さらに、既定の調製は、多
数の異なって糖鎖付加されたタンパク質種を含む可能性がある。グリコシル基は
、慣用的な方法、特にグリコペプチダーゼを利用するものを通じ、除去してもよ
い。一般的に、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを、モル過剰のグリコペプチダー
ゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）とインキュベーションしてもよ
い。

【００６３】 これに対応して、アミノ酸残基または配列の多様な付加または置換、あるいは
末端または内部の残基または配列の欠失をコードする同様のＤＮＡ構築物が、本
発明に含まれる。例えば、ポリペプチド細胞外ドメインのＮ−糖鎖付加部位を修
飾し、糖鎖付加を妨げてもよく、これにより哺乳動物および酵母発現系における
炭水化物減少類似体（ａｎａｌｏｇ）の発現が可能になる。真核ポリペプチドの
Ｎ−糖鎖付加部位はアミノ酸トリプレットＡｓｎ−Ｘ−Ｙにより特徴付けられ、
ここでＸはＰｒｏ以外のいかなるアミノ酸でもよく、そしてＹはＳｅｒまたはＴ
ｈｒである。これらのトリプレットをコードするヌクレオチド配列に対する適切
な置換、付加または欠失は、Ａｓｎ側鎖での炭水化物残基の結合の防止を生じる
であろう。例えば、Ａｓｎが異なるアミノ酸により置換されるように選択される
、単一のヌクレオチドの改変は、Ｎ−糖鎖付加部位を不活性化するのに十分であ
る。あるいは、ＳｅｒまたはＴｈｒを別のアミノ酸、例えばＡｌａで置換しても
よい。タンパク質のＮ−糖鎖付加部位を不活性化するための既知の方法には、本
明細書に援用される、米国特許第５，０７１，９７２号およびＥＰ ２７６，８
４６に記載されるものが含まれる。

【００６４】 変異体の別の例において、生物学的活性に必須でないＣｙｓ残基をコードする
配列を改変し、Ｃｙｓ残基が欠失され、または他のアミノ酸で置換されるように
し、フォールディングまたは再生の際、誤った分子内ジスルフィド架橋が形成さ
れるのを妨げてもよい。

【００６５】 他の変異体は、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母系における発現を亢
進させるため、隣接する二塩基性アミノ酸残基を修飾することにより調製される
。ＥＰ ２１２，９１４は、タンパク質のＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部
位を不活性化するための部位特異的突然変異誘発の使用を開示する。ＫＥＸ２プ
ロテアーゼプロセシング部位は、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ、およびＬｙ
ｓ−Ａｒｇ対を改変し、これらの隣接する塩基性残基の発生を除去するため、残
基を欠失、付加、または置換することにより、不活性化される。Ｌｙｓ−Ｌｙｓ
対はＫＥＸ２切断にかなり感受性が低く、そしてＡｒｇ−ＬｙｓまたはＬｙｓ−
ＡｒｇのＬｙｓ−Ｌｙｓへの変換は、ＫＥＸ２部位を不活性化する保存的なそし
て好ましいアプローチを代表する。

【００６６】 オリゴマー 本発明に含まれるのは、ＡＣＰＬポリペプチドを含むオリゴマーまたは融合タ
ンパク質である。こうしたオリゴマーは、二量体、三量体、またはより高次のオ
リゴマーを含む、共有結合または非共有結合多量体型であってもよい。上述のよ
うに、好ましいポリペプチドは可溶性であり、そしてしたがってこれらのオリゴ
マーは可溶性ポリペプチドを含んでもよい。本発明の１つの側面において、オリ
ゴマーはポリペプチド構成要素の結合能を維持し、そしてしたがって、二価、三
価などの結合部位を提供する。

【００６７】 本発明の１つの態様は、ポリペプチドに融合しているペプチド部分間の共有ま
たは非共有相互作用を介し結合している多数のポリペプチドを含むオリゴマーに
関する。こうしたペプチドは、ペプチドリンカー（スペーサー）であってもよく
、またはオリゴマー化を促進する特性を有するペプチドであってもよい。以下に
より詳細に記載されるように、ロイシンジッパーおよび抗体由来の特定のポリペ
プチドが、結合するポリペプチドのオリゴマー化を促進することが可能なペプチ
ドに含まれる。

【００６８】 免疫グロブリンに基づくオリゴマー １つの代替物として、免疫グロブリンに由来するポリペプチドを用い、オリゴ
マーを調製する。抗体由来ポリペプチドの多様な部分（Ｆｃドメインを含む）に
融合している特定の異種性ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、例えば
、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら（ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：１０５３５， １９９１）
；Ｂｙｒｎら（Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７， １９９０）；並びにＨｏｌｌ
ｅｎｂａｕｇｈおよびＡｒｕｆｆｏ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉ
ｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中， “Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕ
ｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”， Ｓｕｐｐｌ．４
， １０．１９．１−１０．１９．１１， １９９２）に記載されている。

【００６９】 本発明の１つの態様は、本発明のポリペプチドを抗体由来のＦｃポリペプチド
に融合させることにより生成される２つの融合タンパク質を含む二量体に関する
。ポリペプチド／Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子融合体を適切な発現ベ
クターに挿入する。該組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞でポリペプ
チド／Ｆｃ融合タンパク質を発現し、そして抗体分子によく似た形で集合させ、
その結果、鎖間ジスルフィド結合がＦｃ部分間に形成され、二価分子を生じる。

【００７０】 本明細書において、「Ｆｃポリペプチド」という用語は、Ｆｃ領域のＣＨドメ
インのいずれかまたはすべてを含む抗体のＦｃ領域から構成される天然および突
然変異タンパク質（ｍｕｔｅｉｎ）型ポリペプチドを含む。二量体化を促進する
ヒンジ領域を含むこうしたポリペプチドの一部切除型もまた含まれる。好ましい
ポリペプチドはヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃポリペプチドを含む。

【００７１】 ＰＣＴ出願第ＷＯ ９３／１０１５１号（本明細書に援用される）に記載され
る１つの適切なＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域のＮ−末端ヒ
ンジ領域から天然Ｃ−末端に渡る一本鎖ポリペプチドである。別の有用なＦｃポ
リペプチドは、本明細書に援用される米国特許第５，４５７，０３５号およびＢ
ａｕｍら（ＥＭＢＯ Ｊ． １３：３９９２−４００１， １９９４）に記載さ
れるＦｃ突然変異タンパク質である。本突然変異タンパク質のアミノ酸配列は、
アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変化し、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに
変化し、そしてアミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変化していることを除けば、
ＷＯ ９３／１０１５１に示される天然Ｆｃ配列のものと同一である。該突然変
異タンパク質は、Ｆｃ受容体に対し、減少した親和性を示す。

【００７２】 Ｆｃ部分を含む上述の融合タンパク質（およびそれから形成されるオリゴマー
）は、プロテインＡまたはプロテインＧカラム上のアフィニティークロマトグラ
フィーによる容易な精製という利点を提供する。

【００７３】 他の態様において、本発明のポリペプチドを、抗体重鎖または軽鎖の可変部に
関し置換してもよい。融合タンパク質が抗体の重鎖および軽鎖両方で作成されて
いる場合、４つものＡＣＰＬ細胞外領域を持つオリゴマーを形成することが可能
である。あるいは、ＡＣＰＬまたはＡＣＰＬの可溶性断片、例えば細胞外領域、
およびＩＬ−１Ｒｒｐ１またはＩＬ−１Ｒｒｐ１の可溶性断片、例えば細胞外領
域が、抗体重鎖または軽鎖の可変部に関し置換されるように、融合タンパク質を
調製してもよい。

【００７４】 ペプチドリンカーに基づくオリゴマー あるいは、オリゴマーはペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を含むまた
は含まない多数のポリペプチドを含む融合タンパク質である。適切なペプチドリ
ンカーの中に、本明細書に援用される米国特許第４，７５１，１８０号および第
４，９３５，２３３号に記載されるものがある。望ましいペプチドリンカーをコ
ードするＤＮＡ配列は、いかなる適切な慣用的技術を用い、本発明のＤＮＡ配列
の間に、そして該ＤＮＡ配列と同じ読み枠で挿入してもよい。例えば、リンカー
をコードする化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを、配列間に連結してもよ
い。特定の態様において、融合タンパク質は、ペプチドリンカーにより分離され
た、２ないし４つの可溶性ＡＣＰＬポリペプチドを含む。同様に、上述のように
、融合タンパク質は、２つのＡＣＰＬポリペプチドまたは断片および２つのＩＬ
−１Ｒｒｐ１ポリペプチドまたは断片を含んでもよい。

【００７５】 ロイシンジッパー 本発明のオリゴマーを調製するための別の方法は、ロイシンジッパーの使用を
伴う。ロイシンジッパードメインは、該ドメインが見られるタンパク質のオリゴ
マー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、元々、いくつかのＤＮ
Ａ結合タンパク質で同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
４０：１７５９， １９８８）、そして以来、多様な異なるタンパク質で見出さ
れてきている。既知のロイシンジッパーの中に、二量体化または三量体化する天
然発生ペプチドおよびその誘導体がある。

【００７６】 ジッパードメイン（本明細書において、オリゴマー化、またはオリゴマー形成
ドメインとも呼ばれる）は、繰り返される７残基反復が含まれ、しばしば４つま
たは５つのロイシン残基が、他のアミノ酸に点在する。ジッパードメインの例に
は、酵母転写因子ＧＣＮ４およびラット肝臓に見られる熱安定性ＤＮＡ結合タン
パク質（Ｃ／ＥＢＰ； Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：
１６８１， １９８９）がある。２つの核トランスフォーミングタンパク質、ｆ
ｏｓおよびｊｕｎもまた、ネズミプロトオンコジーンｃ−ｍｙｃの遺伝子産物同
様、ジッパードメインを示す（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
４０：１７５９， １９８８）。核発癌遺伝子、ｆｏｓおよびｊｕｎの産物は、
ヘテロ二量体を優先して形成するジッパードメインを含む（Ｏ'Ｓｈｅａら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５；６４６， １９８９；ＴｕｒｎｅｒおよびＴｉｊａｎ
， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１６８９， １９８９）。ジッパードメインは、
これらのタンパク質の生物学的活性（ＤＮＡ結合）に必要である。

【００７７】 パラミクソウイルス、コロナウイルス、麻疹ウイルスおよび多くのレトロウイ
ルスを含む、いくつかの異なるウイルスの融合体形成性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）
タンパク質もまた、ジッパードメインを所有する（ＢｕｃｋｌａｎｄおよびＷｉ
ｌｄ， Ｎａｔｕｒｅ ３３８：５４７， １９８９；Ｂｒｉｔｔｏｎ， Ｎａ
ｔｕｒｅ ３５３：３９４， １９９１；ＤｅｌｗａｒｔおよびＭｏｓｉａｌｏ
ｓ， ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕ
ｓｅｓ ６：７０３， １９９０）。これらの融合体形成性ウイルスタンパク質
のジッパードメインは、該タンパク質の膜貫通領域の近くにあり；ジッパードメ
インが、該融合体形成性タンパク質のオリゴマー構造に寄与する可能性が示唆さ
れてきている。融合体形成性ウイルスタンパク質のオリゴマー化は、融合孔（ｆ
ｕｓｉｏｎ ｐｏｒｅ）形成に関与している（Ｓｐｒｕｃｅら， Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８８：３５２３， １９９
１）。ジッパードメインはまた、最近、熱ショック転写因子のオリゴマー化に役
割を果たしているとも報告されてきている（Ｒａｂｉｎｄｒａｎら， Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２５９：２３０， １９９３）。

【００７８】 ジッパードメインは、短い、平行コイルドコイル（ｐａｒａｌｌｅｌ ｃｏｉ
ｌｅｄ ｃｏｉｌ）として折りたたまれている（Ｏ'Ｓｈｅａら， Ｓｃｉｅｎ ｃｅ ２５４：５３９， １９９１）。平行コイルドコイルの一般的構造は、Ｃ
ｒｉｃｋにより１９５３年に提唱されたような「ノブを穴へ（ｋｎｏｂｓ−ｉｎ
ｔｏ−ｈｏｌｅｓ）」パッキング（Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． ６：
６８９）により、よく特徴付けられている。ジッパードメインにより形成された
二量体は、ＭｃＬａｃｈｌａｎおよびＳｔｅｗｅｒｔ（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏ
ｌ． ９８：２９３； １９７５）の表記にしたがい、（ａｂｃｄｅｆｇ）_nと 表される、７残基反復により安定化される。ここでａおよびｄは一般的に疎水性
残基であり、ｄはロイシンであり、これらはらせんの同じ面に並ぶ。逆に荷電し
た残基は普通、ｇおよびｅ位にある。したがって、２つのらせん状ジッパードメ
インから形成される平行コイルドコイルにおいて、第一のらせんの疎水性側鎖に
より形成された「ノブ」は、第二のらせんの側鎖間に形成された「穴」にパッキ
ングされる。

【００７９】 ｄ位の残基（しばしばロイシン）は、巨大な疎水性安定化エネルギーに寄与し
、そしてオリゴマー形成に重要である（Ｋｒｙｓｔｅｋら， Ｉｎｔ． Ｊ．
Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ． ３８：２２９， １９９１）。Ｌｏｖｅｊｏｙら（
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１２８８， １９９３）は最近、らせんが上−上−下
に走る、三重鎖αらせん束合成を報告した。彼らの研究により、疎水性安定化エ
ネルギーが、らせん単量体からのコイルドコイルの形成のための主要な原動力を
提供していることが裏付けられた。これらの研究はまた、静電相互作用がコイル
ドコイルの化学量論および形状に寄与していることも示している。ロイシンジッ
パーの構造のさらなる議論は、Ｈａｒｂｕｒｙら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１
４０１， ２６ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９３）に見られる。

【００８０】 可溶性オリゴマータンパク質を産生するのに適したロイシンジッパードメイン
の例は、ＰＣＴ出願第ＷＯ ９４／１０３０８号に記載されると共に、本明細書
に援用されるＨｏｐｐｅら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３４４：１９１， １
９９４）に記載される肺界面活性物質プロテインＤ（ＳＰＤ）由来のロイシンジ
ッパードメインも一例である。修飾ロイシンジッパーに融合している異種性タン
パク質の安定した三量体化を可能にする、該修飾ロイシンジッパーの使用が、Ｆ
ａｎｓｌｏｗら（Ｓｅｍｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：２６７−２７８， １
９９４）に記載されている。ロイシンジッパーペプチドに融合している可溶性ポ
リペプチドを含む組換え融合タンパク質を適切な宿主細胞で発現し、そして形成
される可溶性オリゴマーを培養上清から回収する。

【００８１】 特定のロイシンジッパー部分は、優先的に三量体を形成する。１つの例は、本
明細書に完全に援用されるＨｏｐｐｅら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３４４：
１９１， １９９４）および米国特許第５，７１６，８０５号に記載されるよう
な、上述の肺界面活性物質プロテインＤ（ＳＰＤ）由来のロイシンジッパーであ
る。本肺ＳＰＤ由来ロイシンジッパーペプチドは、アミノ酸配列Ｐｒｏ Ａｓｐ
Ｖａｌ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｇｌｕ
Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｌｅｕ
Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｔｙｒを含む。

【００８２】 三量体化を促進するロイシンジッパーの別の例は、米国特許第５，７１６，８
０５号に記載されるような、アミノ酸配列Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｉ
ｌｅ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｓ
ｅｒ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｉ
ｌｅ Ａｌａ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇ
ｌｕ Ａｒｇを含むペプチドである。１つの別の態様において、Ｎ−末端Ａｓｐ
残基が添加され；別の態様では、該ペプチドはＮ−末端Ａｒｇ残基が欠けている
。

【００８３】 オリゴマー化を促進する特性を保持する、前述のジッパーペプチドの断片もま
た、使用してもよい。こうした断片の例には、限定されるわけではないが、前述
のアミノ酸配列に示される１つまたは２つのＮ−末端またはＣ−末端残基を欠く
ペプチドが含まれる。ロイシンジッパーは、天然発生ロイシンジッパーから、例
えばオリゴマー化を促進するペプチドの能力が保持されるように、天然アミノ酸
配列の保存的置換を介し、得てもよい。

【００８４】 天然発生三量体タンパク質由来の他のペプチドを、三量体ＡＣＰＬを含むオリ
ゴマーＡＣＰＬを調製するのに使用してもよい。あるいは、オリゴマー化を促進
する合成ペプチドを使用してもよい。特定の態様において、ロイシンジッパー部
分のロイシン残基を、イソロイシン残基により置換してもよい。イソロイシンを
含むこうしたペプチドは、イソロイシンジッパーと呼んでもよいが、本明細書に
おいて「ロイシンジッパー」という用語に含まれる。

【００８５】 ポリペプチドおよびその断片の産生 本発明のポリペプチドおよび断片の単離および精製は、いかなる適切な技術に
より達成してもよく、限定されるわけではないが以下を含む： 発現系 本発明はまた、ＤＮＡを含む組換えクローニング用および発現ベクターと共に
、該組換えベクターを含む宿主細胞も提供する。ＤＮＡを含む発現ベクターを用
い、該ＤＮＡにコードされる本発明のポリペプチドまたは断片を調製してもよい
。ポリペプチドを産生するための方法は、ポリペプチドをコードする組換え発現
ベクターで形質転換されている宿主細胞を、該ポリペプチドの発現を促進する条
件下で培養し、その後培養から発現ポリペプチドを回収することを含む。当業者
は、発現ポリペプチドを精製するための方法は使用する宿主細胞の種類、および
該ポリペプチドが膜に結合しているかまたは宿主細胞から分泌される可溶性型か
などの要因にしたがい、多様であろうことを認識するであろう。

【００８６】 いかなる適切な発現系を使用してもよい。ベクターは、例えば、哺乳動物、微
生物、ウイルス、または昆虫遺伝子由来の適切な転写または翻訳制御ヌクレオチ
ド配列に、機能可能であるように連結されている、本発明のポリペプチドまたは
断片をコードするＤＮＡを含む。制御配列の例には、転写プロモーター、オペレ
ーター、またはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、および転写および
翻訳開始および終結を調節する適切な配列が含まれる。ヌクレオチド配列は、制
御配列が該ＤＮＡ配列に機能的に関連しているとき、機能可能であるように連結
されている。したがって、プロモーターヌクレオチド配列は、該プロモーターヌ
クレオチド配列がＤＮＡ配列の転写を調節するならば、ＤＮＡ配列に、機能可能
であるように連結されている。望ましい宿主細胞において複製する能力を与える
複製起点、および形質転換体を同定する選択遺伝子が、一般的に発現ベクターに
取り込まれている。

【００８７】 さらに、適切なシグナルペプチド（天然または異種性）をコードする配列を、
発現ベクターに取り込んでもよい。シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡ
配列を、インフレームで本発明の核酸配列に融合させ、ＤＮＡがまず転写され、
そしてｍＲＮＡがシグナルペプチドを含む融合タンパク質に翻訳されるようにし
てもよい。意図される宿主細胞で機能するシグナルペプチドは、ポリペプチドの
細胞外分泌を促進する。シグナルペプチドは、ポリペプチドの細胞からの分泌に
際し、ポリペプチドから切断される。

【００８８】 当業者はまた、シグナルペプチドが切断される位は、コンピュータープログラ
ムに予測されるものと異なる可能性があり、そして組換えポリペプチドを発現す
るのに使用される宿主細胞の種類などの要因にしたがい、多様である可能性があ
ることも認識するであろう。タンパク質調製は、１つ以上の部位でのシグナルペ
プチドの切断から生じる、異なるＮ−末端アミノ酸を有するタンパク質分子の混
合物を含んでもよい。

【００８９】 ポリペプチドの発現に適した宿主細胞には、原核、酵母またはより高次の真核
細胞が含まれる。宿主細胞としての使用には、哺乳動物または昆虫細胞が一般的
に好ましい。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主に適したクローニング
用および発現ベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら， Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅ
ｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ニューヨーク州エ
ルセビア（１９８５）に記載されている。細胞不含翻訳系もまた、本明細書に開
示されるＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用い、ポリペプチドを産生するのに使用し
てもよい。

【００９０】 原核発現系 原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性生物が含まれる。形質転換に適し
た原核宿主細胞には、例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐ
ｈｉｍｕｒｉｕｍ）、並びにシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ス
トレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、およびブドウ球菌属（Ｓｔａ
ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）内の多様な他の種が含まれる。大腸菌などの原核宿主
細胞において、組換えポリペプチドの該原核宿主細胞における発現を容易にする
ため、ポリペプチドはＮ−末端メチオニン残基を含んでもよい。Ｎ−末端Ｍｅｔ
は、発現された組換えポリペプチドから切断してもよい。

【００９１】 原核宿主細胞に用いるための発現ベクターは、一般的に、１つまたはそれ以上
の表現型選択可能マーカー遺伝子を含む。表現型選択可能マーカー遺伝子は、例
えば、抗生物質耐性を与える、または独立栄養必要条件を供給するタンパク質を
コードする遺伝子である。原核宿主細胞に有用な発現ベクターの例には、クロー
ニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）など、商業的に入手可能
なプラスミド由来のものが含まれる。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテト
ラサイクリン耐性遺伝子を含み、そしてしたがって、形質転換細胞を同定する簡
単な手段を提供する。適切なプロモーターおよびＤＮＡ配列をｐＢＲ３２２ベク
ター中に挿入する。他の商業的に入手可能なベクターには、例えば、ｐＫＫ２２
３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、スウェーデン・
ウプサラ）およびｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ、米国ウィスコン
シン州マディソン）が含まれる。

【００９２】 組換え原核宿主細胞発現ベクターに通常用いられるプロモーター配列には、β
−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら
， Ｎａｔｕｒｅ ２７５：６１５， １９７８； およびＧｏｅｄｄｅｌら，
Ｎａｔｕｒｅ ２８１：５４４， １９７９）、トリプトファン（ｔｒｐ）プ
ロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ８：
４０５７， １９８０； およびＥＰ−Ａ−３６７７６）およびｔａｃプロモー
ター（Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ｐ．４１２， １９８２）が含まれる。特に有用な原
核宿主細胞発現系は、ファージλＰ_LプロモーターおよびｃＩ８５７ｔｓ熱不安 定性リプレッサー配列を使用する。アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョンから入手可能な、λＰ_Lプロモーターの誘導体を組み込んだプラスミドベク ターには、プラスミドｐＨＵＢ２（大腸菌株ＪＭＢ９、ＡＴＣＣ ３７０９２に
常住）およびｐＰＬｃ２８（大腸菌ＲＲ１、ＡＴＣＣ ５３０８２に常住）が含
まれる。

【００９３】 酵母系 あるいは、ポリペプチドは、好ましくはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ）属（例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））由来
の酵母宿主細胞において発現されてもよい。酵母の他の属、例えばピキア属（Ｐ
ｉｃｈｉａ）またはクロイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）もまた
使用してもよい。酵母ベクターは、しばしば、２μ酵母プラスミド由来の複製起
点配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための
配列、転写終結のための配列、および選択可能マーカー遺伝子を含むであろう。
酵母ベクターに適したプロモーター配列には、とりわけ、メタロチオネイン、３
−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃ
ｈｅｍ． ２５５：２０７３， １９８０）または、エノラーゼ、グリセルアル
デヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキ
シラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３
−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメ
ラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼなどの他の解糖
酵素（Ｈｅｓｓら， Ｊ． Ａｄｖ． Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ． ７：１４９，
１９６８；およびＨｏｌｌａｎｄら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． １７：４９００，
１９７８）のプロモーターが含まれる。酵母発現に用いるのに適した他のベク
ターおよびプロモーターはＨｉｔｚｅｍａｎ， ＥＰＡ−７３，６５７にさらに
記載されている。他の代替物は、Ｒｕｓｓｅｌｌら（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅ
ｍ． ２５８：２６７４， １９８２）およびＢｅｉｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ ３
００：７２４， １９８２）に記載されるグルコース抑制可能ＡＤＨ２プロモー
ターである。酵母および大腸菌両方において複製可能なシャトルベクターは、大
腸菌での選択および複製のため、ｐＢＲ３２２由来のＤＮＡ配列（Ａｍｐ^r遺伝 子および複製起点）を上述の酵母ベクターに挿入することにより、構築してもよ
い。

【００９４】 酵母α−因子リーダー配列を使用し、ポリペプチドを直接分泌させてもよい。
α−因子リーダー配列は、しばしば、プロモーター配列および構造遺伝子配列の
間に挿入される。例えば、Ｋｕｒｊａｎら， Ｃｅｌｌ ３０：９３３， １９
８２およびＢｉｔｔｅｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８１：５３３０， １９８４を参照されたい。酵母宿主からの組換え
ポリペプチドの分泌を容易にするのに適した他のリーダー配列が当業者に知られ
る。リーダー配列を、その３’端近傍に、１つまたはそれ以上の制限部位を含む
よう修飾してもよい。これは、リーダー配列が構造遺伝子に融合するのを容易に
するであろう。

【００９５】 酵母形質転換プロトコルが当業者に知られる。こうしたプロトコルの１つがＨ
ｉｎｎｅｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７
５：１９２９， １９７８に記載される。Ｈｉｎｎｅｎらのプロトコルは、Ｔｒ
ｐ⁺形質転換体を選択培地中で選択し、ここで該選択培地は０．６７％酵母窒素 基剤、０．５％カザミノ酸、２％グルコース、１０ｍｇ／ｍｌアデニンおよび２
０ｍｇ／ｍｌウラシルからなる。

【００９６】 ＡＤＨ２プロモーター配列を含むベクターにより形質転換された酵母宿主細胞
は、発現を誘導するため「リッチ」培地中で増殖させてもよい。リッチ培地の例
は、８０ｍｇ／ｍｌアデニンおよび８０ｍｇ／ｍｌウラシルを補った、１％酵母
エキス、２％ペプトン、および１％グルコースからなるものである。ＡＤＨ２プ
ロモーターの抑制解除（ｄｅｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）は、培地からグルコースが
枯渇したとき起こる。

【００９７】 哺乳動物または昆虫系 哺乳動物または昆虫宿主細胞培養系もまた、組換えＡＣＰＬポリペプチドを発
現するのに使用してもよい。昆虫細胞において異種性タンパク質を産生するため
のバキュロウイルス系がＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ， Ｂｉｏ／Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７（１９８８）に概説されている。哺乳動物起源の樹立
細胞株もまた、使用してもよい。適切な哺乳動物宿主細胞株の例には、サル腎臓
細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎら， Ｃ
ｅｌｌ ２３：１７５， １９８１）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（Ａ
ＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｈｅ
Ｌａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞、およびＭｃＭａｈａｎら（
ＥＭＢＯ Ｊ． １０：２８２１， １９９１）に記載されるようなアフリカミ
ドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ ｇｒｅｅｎ ｍｏｎｋｅｙ）腎臓細胞株ＣＶ１（Ａ
ＴＣＣ ＣＣＬ ７０）由来であるＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株が含まれる。

【００９８】 哺乳動物細胞内にＤＮＡを導入するための確立された方法が記載されてきてい
る（Ｋａｕｆｍａｎ， Ｒ．Ｊ．， Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｍａｍｍａｌｉ
ａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ， １９９０， ｐｐ．１５−６９）。商業的
に入手可能な試薬、例えばＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ脂質試薬（Ｇｉｂｃｏ／
ＢＲＬ）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−Ｐｌｕｓ脂質試薬を用いた、さら
なるプロトコルを用い、細胞をトランスフェクションしてもよい（Ｆｅｌｇｎｅ
ｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：７４
１３−７４１７， １９８７）。さらに、エレクトロポレーションを用い、Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版． Ｖｏｌ．１−３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９）における
もののような、慣用的な方法を用い、哺乳動物細胞をトランスフェクションして
もよい。安定形質転換体の選択は、例えば細胞毒性薬剤に対する耐性など、当業
に知られる方法を用い、行ってもよい。Ｋａｕｆｍａｎら， Ｍｅｔｈ． ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：４８７−５１１， １９９０は、いくつかの
選択計画、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）耐性などを記載する。
ＤＨＦＲ選択に適した宿主株は、ＤＨＦＲ不全であるＣＨＯ株ＤＸ−Ｂ１１であ
ってもよい（ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａ
ｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０， １９８０）。ＤＨ
ＦＲ ｃＤＮＡを発現しているプラスミドをＤＸ−Ｂ１１株に導入してもよく、
そしてプラスミドを含む細胞のみを適切な選択培地中で増殖させてもよい。発現
ベクターに組み込んでもよい選択可能マーカーの他の例には、Ｇ４１８およびハ
イグロマイシンＢなどの抗生物質に対する耐性を与えるｃＤＮＡが含まれる。該
ベクターを宿する細胞を、これらの化合物に対する耐性に基づき選択してもよい
。

【００９９】 哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写および翻訳調節配列は、ウイルス
ゲノムより切り出されてもよい。通常用いられるプロモーター配列およびエンハ
ンサー配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０
（ＳＶ４０）、およびヒト・サイトメガロウイルス由来である。ＳＶ４０ウイル
スゲノム由来のＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０起点、初期および後期プロモーター
、エンハンサー、スプライシング、およびポリアデニル化部位を用い、哺乳動物
宿主細胞における構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝要素を提供してもよい
。ウイルス初期および後期プロモーターは、どちらもウイルス複製起点をも含む
可能性がある断片として容易にウイルスゲノムから得られるため、特に有用であ
る（Ｆｉｅｒｓら， Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３， １９７８；Ｋａｕｆｍ
ａｎ， Ｍｅｔｈ． ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １９９０）。ＳＶ４０ウ
イルス複製起点部位に位置するＨｉｎｄ ＩＩＩ部位からＢｇｌ Ｉ部位に渡る
およそ２５０ ｂｐの配列が含まれていれば、より小さいまたはより大きいＳＶ
４０断片もまた用いてもよい。

【０１００】 哺乳動物発現ベクターからの異種性遺伝子の発現を改善することが示されたさ
らなる調節配列には、ＣＨＯ細胞由来の発現増大配列要素（ＥＡＳＥ）（Ｍｏｒ
ｒｉｓら， Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９９７，
ｐｐ．５２９−５３４およびＰＣＴ出願第ＷＯ ９７／２５４２０号）並びにア
デノウイルス２由来の三分割（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー（ＴＰＬ）およ
びＶＡ遺伝子ＲＮＡ（Ｇｉｎｇｅｒａｓら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．
２５７：１３４７５−１３４９１， １９８２）などの要素が含まれる。ウイル
ス起源の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列により、二シストロン性ｍＲ
ＮＡが効率的に翻訳されることが可能になる（ＯｈおよびＳａｒｎｏｗ， Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏ
ｐｍｅｎｔ ３：２９５−３００， １９９３；Ｒａｍｅｓｈら， Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４：２６９７−２７００， １９９６
）。選択可能マーカー（例えばＤＨＦＲ）遺伝子が続く、二シストロン性ｍＲＮ
Ａの一部としての異種性ｃＤＮＡの発現は、宿主のトランスフェクション可能性
および異種性ｃＤＮＡの発現を改善することが示されてきている（Ｋａｕｆｍａ
ｎ， Ｍｅｔｈ． ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １９９０）。二シストロン
性ｍＲＮＡを使用する典型的な発現ベクターは、Ｍｏｓｓｅｒら， Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ ２２：１５０−１６１， １９９７に記載されるｐＴＲ−Ｄ
Ｃ／ＧＦＰ、およびＭｏｒｒｉｓら， Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ， １９９７， ｐｐ．５２９−５３４に記載されるｐ２Ａ５Ｉである
。

【０１０１】 有用な高発現ベクター、ｐＣＡＶＮＯＴがＭｏｓｌｅｙら， Ｃｅｌｌ ５９
：３３５−３４８， １９８９に記載されてきている。哺乳動物宿主細胞におい
て用いるための他の発現ベクターは、ＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇ（Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ３：２８０， １９８３）に開示されるように構築
してもよい。Ｃ１２７ネズミ乳腺上皮細胞における哺乳動物ｃＤＮＡの安定した
高レベル発現に有用な系を、実質的にＣｏｓｍａｎら（Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ． ２３：９３５， １９８６）に記載されるように構築してもよい。Ｃｏｓ
ｍａｎら， Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８， １９８４に記載される有用な高
発現ベクター、ＰＭＬＳＶ Ｎ１／Ｎ４はＡＴＣＣ ３９８９０として寄託され
ている。さらなる有用な哺乳動物発現ベクターは、本明細書に援用される、ＥＰ
−Ａ−０３６７５６６およびＷＯ ９１／１８９８２に記載されている。さらに
別の代替物として、ベクターは、レトロウイルス由来であってもよい。

【０１０２】 さらなる有用な発現ベクター、ｐＦＬＡＧ（登録商標）およびｐＤＣ３１１も
また用いてもよい。ＦＬＡＧ（登録商標）技術は、低分子量（１ｋＤ）疎水性Ｆ
ＬＡＧ（登録商標）マーカーペプチドを、ｐＦＬＡＧ（登録商標）により発現さ
れる組換えタンパク質のＮ−末端に融合させることを中心とする。ｐＤＣ３１１
は、ＣＨＯ細胞でタンパク質を発現させるために用いる、別の特殊化ベクターで
ある。ｐＤＣ３１１は、目的の遺伝子およびジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦ
Ｒ）遺伝子を、ＤＨＦＲ翻訳のための内部リボソーム結合部位、発現増大配列要
素（ＥＡＳＥ）、ヒトＣＭＶプロモーター、三分割リーダー配列、およびポリア
デニル化部位と共に含む、二シストロン性配列により特徴付けられる。

【０１０３】 使用してもよいシグナルペプチドに関し、望ましいならば、天然シグナルペプ
チドを異種シグナルペプチドまたはリーダー配列に置き換えてもよい。シグナル
ペプチドまたはリーダーの選択は、組換えポリペプチドが産生されるべき宿主細
胞の種類などの要因に依存する可能性がある。例えば、哺乳動物宿主細胞で機能
する異種シグナルペプチドの例には、米国特許第４，９６５，１９５号に記載さ
れるインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列；Ｃｏｓｍａｎら， Ｎ
ａｔｕｒｅ ３１２：７６８（１９８４）に記載されるインターロイキン−２受
容体のシグナル配列；ＥＰ ３６７，５６６に記載されるインターロイキン−４
受容体シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号に記載されるＩ型イ
ンターロイキン−１受容体シグナルペプチド；およびＥＰ ４６０，８４６に記
載されるＩＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチドが含まれる。

【０１０４】 単離および精製 本発明はまた、ＡＣＰＬポリペプチドおよびその断片を単離しそして精製する
方法も含む。

【０１０５】 本発明に含まれる「単離」ポリペプチドまたはその断片は、天然に見られる可
能性がある環境と同一でない環境にあるＡＣＰＬポリペプチドまたは断片である
。本発明に含まれる「精製」ポリペプチドまたはその断片は、例えば上述のよう
な組換え発現系の精製産物のように、または天然発生細胞および／または組織な
どの非組換え供給源からの精製産物のように、他のタンパク質またはポリペプチ
ドとの結合を本質的に含まない。

【０１０６】 １つの好ましい態様において、組換えポリペプチドまたは断片の精製は、本発
明のポリペプチドまたは断片の、本発明のポリペプチドまたは断片の精製を補助
する別のポリペプチドへの融合を用い、達成してもよい。こうした融合パートナ
ーは、上述のようなポリ−Ｈｉｓまたは他の抗原性同定ペプチドと共に先に記載
されるＦｃ部分を含んでもよい。

【０１０７】 いかなる種類の宿主細胞に関しても、当業者に知られるように、組換えポリペ
プチドまたは断片を精製するための方法は、使用する宿主細胞の種類および組換
えポリペプチドまたは断片が培地に分泌されるかどうかなどの要因にしたがい、
多様であろう。

【０１０８】 一般的に、組換えＡＣＰＬポリペプチドまたは断片は、分泌されない場合、宿
主細胞から、あるいは可溶性でありそして分泌される場合、培地または上清から
単離してもよく、その後１つまたはそれ以上の濃縮、塩析、イオン交換、疎水性
相互作用、アフィニティー精製またはサイズ排除クロマトグラフィー段階が続く
。これらの段階を達成する特定の方法については、培地をまず、商業的に入手可
能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒ
ｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過装置を用い、濃縮してもよい。濃縮段階に続き、
濃縮物をゲル濾過媒体などの精製マトリックスに適用してもよい。あるいは、陰
イオン交換樹脂、例えばジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）側鎖を有するマトリ
ックスまたは支持体を使用してもよい。マトリックスは、アクリルアミド、アガ
ロース、デキストラン、セルロースまたはタンパク質精製に通常使用される他の
種類であってもよい。あるいは、陽イオン交換段階を使用してもよい。適切な陽
イオン交換体には、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む多様な不溶
性マトリックスが含まれる。さらに、クロマトフォーカシング段階を使用しても
よい。あるいは疎水性相互作用クロマトグラフィー段階を使用してもよい。適切
なマトリックスは、樹脂に結合しているフェニルまたはオクチル部分であっても
よい。さらに、組換えタンパク質に選択的に結合するマトリックスを用いるアフ
ィニティークロマトグラフィーを使用してもよい。使用されるこうした樹脂の例
は、レクチンカラム、色素カラム、および金属キレートカラムである。最後に、
疎水性逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）媒体（例えば、側
鎖メチル、オクチル、オクチルデシルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲルま
たはポリマー樹脂）を使用する１つまたはそれ以上の逆相高性能液体クロマトグ
ラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）段階を使用し、さらにポリペプチドを精製してもよ
い。多様な組み合わせの前記の精製段階のいくつかまたはすべてが周知であり、
そして単離されそして精製されている組換えタンパク質を提供するのに使用して
もよい。

【０１０９】 ＡＣＰＬポリペプチド結合タンパク質、例えばＡＣＰＬポリペプチドまたはそ
の断片に対し生成されたモノクローナル抗体などを含むアフィニティーカラムを
利用し、発現されたポリペプチドをアフィニティー精製することもまた、可能で
ある。これらの精製ＡＣＰＬポリペプチドは、慣用的技術を用い、例えば、高塩
溶出緩衝液中、そしてその後、使用のためより低塩緩衝液中に透析することによ
って、あるいは利用されたアフィニティーマトリックスに応じて、ｐＨまたは他
の構成要素を変化させることによって、あるいは親和性部分の天然発生基質、例
えば本発明由来のポリペプチドを用い、競合的に除去することによって、アフィ
ニティーカラムから除去してもよい。

【０１１０】 本発明の本側面において、ＡＣＰＬポリペプチド結合タンパク質、例えば本発
明の抗ポリペプチド抗体またはＡＣＰＬポリペプチドと相互作用する可能性があ
る他のタンパク質を、その表面に本発明のポリペプチドを発現する細胞を同定し
、分離し、または精製するのに適したカラムクロマトグラフィーマトリックスま
たは同様の支持体などの固相支持体に結合させてもよい。固相接触表面へのＡＣ
ＰＬポリペプチド結合タンパク質の結合は、いかなる手段により達成してもよく
、例えば磁気微小球体をこれらのポリペプチド結合タンパク質で被覆し、そして
磁気場を通じインキュベーション容器に保持してもよい。細胞混合物の懸濁物を
、上にこうしたポリペプチド結合タンパク質を有する固相と接触させる。ＡＣＰ
Ｌポリペプチドを表面上に有する細胞が固定ポリペプチド結合タンパク質に結合
し、そしてその後非結合細胞を洗い流す。本親和性結合法は、溶液からこうした
ポリペプチド発現細胞を精製し、スクリーニングし、または分離するのに有用で
ある。固相から陽性に選択された細胞を遊離させる方法は当業に知られ、そして
例えば酵素の使用を含む。こうした酵素は好ましくは細胞に対し非毒性および非
傷害性であり、そして好ましくは細胞表面結合パートナーを切断するよう、指示
される。

【０１１１】 あるいは、ＡＣＰＬポリペプチド発現細胞を含むと疑われる細胞混合物をまず
、ビオチン化ＡＣＰＬポリペプチド結合タンパク質とインキュベーションしても
よい。インキュベーション時間は、十分な結合を確実にするため、典型的には少
なくとも連続１時間である。生じた混合物をその後、アビジン被覆ビーズを充填
したカラムに通過させ、それによりアビジンに対するビオチンの強い親和性が、
ポリペプチド結合細胞のビーズへの結合を提供する。アビジン被覆ビーズの使用
は当業に知られる。Ｂｅｒｅｎｓｏｎら， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ
．， １０Ｄ：２３９（１９８６）を参照されたい。非結合成分を除去するため
のの洗浄および結合細胞の遊離は、慣用法を用い行う。

【０１１２】 望ましい純度は、タンパク質の意図される使用に依存する。例えば、タンパク
質がｉｎ ｖｉｖｏで投与されるとき、比較的高い純度が望ましい。こうした場
合、ポリペプチドは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）による解析に際し、他のタンパク質に対応するタンパク質バンドが検出不
能であるように精製される。当業者は、異なる糖鎖付加、異なる翻訳後プロセシ
ング、およびそれらに匹敵するもののため、該ポリペプチドに対応する多数のバ
ンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥにより視覚化される可能性があることを認識するであろ
う。最も好ましくは、本発明のポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析の
際、単一のタンパク質バンドにより示されるように、実質的に均一に精製される
。タンパク質バンドは銀染色、クーマシーブルー染色により、または（タンパク
質が放射標識されている場合は）オートラジオグラフィーにより、視覚化しても
よい。

【０１１３】 アッセイ 本発明の精製ポリペプチド（タンパク質、ポリペプチド、断片、変異体、オリ
ゴマー、および他の型を含む）を、慣用的な結合アッセイなど、いかなる適切な
アッセイにおいて、結合能に関し試験してもよい。例として、ポリペプチドを検
出可能試薬（例えば、放射性核種、発色団、比色もしくは蛍光分光反応を触媒す
る酵素、およびそれらに匹敵するもの）で標識してもよい。標識ポリペプチドを
、適切なＡＣＰＬ結合タンパク質、例えば抗ＡＣＰＬ抗体を発現している細胞と
接触させる。細胞をその後、洗浄し、非結合標識ポリペプチドを除去し、そして
細胞に結合している標識の存在を、標識の性質にしたがい選択される適切な技術
により、決定してもよい。

【０１１４】 結合アッセイ法の１つの例は以下の通りである。ＡＣＰＬ結合タンパク質ｃＤ
ＮＡを含む組換え発現ベクターを構築する。１０ ｃｍ²プレート中のＣＶ１− ＥＢＮＡ−１細胞を該組換え発現ベクターでトランスフェクションする。ＣＶ−
１／ＥＢＮＡ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０４７８）は、ＣＭＶ極初期エン
ハンサー／プロモーターからドライブされるＥＢＶ核抗原１を恒常的に発現する
。ＣＶ１−ＥＢＮＡ−１は、ＭｃＭａｈａｎら（ＥＭＢＯ Ｊ． １０：２８２
１， １９９１）に記載されるように、アフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶ−１
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）由来であった。

【０１１５】 トランスフェクション細胞を２４時間培養し、そして各プレート中の細胞をそ
の後、２４ウェルプレートに分ける。さらに４８時間培養した後、トランスフェ
クション細胞（約４ ｘ １０⁴細胞／ウェル）をＢＭ−ＮＦＤＭで洗浄する。 ＢＭ−ＮＦＤＭは５０ ｍｇ／ｍｌ脱脂粉乳が添加されている結合培地（２５
ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、２ ｍｇ／ｍｌアジ化ナトリウム、２０ ｍＭ
Ｈｅｐｅｓ ｐＨ ７．２を含むＲＰＭＩ １６４０）である。該細胞をその
後、多様な濃度の、例えば上述のように作成された可溶性ポリペプチド／Ｆｃ融
合タンパク質と、３７℃で１時間インキュベーションする。細胞をその後、洗浄
し、そして結合培地中で、¹²⁵Ｉマウス抗ヒトＩｇＧの一定の飽和濃度で、穏や かに攪拌しながら３７℃で１時間インキュベーションする。徹底した洗浄の後、
トリプシン処理を介し細胞を遊離させる。

【０１１６】 上記のマウス抗ヒトＩｇＧは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に対して向けられ、そし
てＪａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
， Ｉｎｃ．、ペンシルバニア州ウェストグローブから得ることが可能である。
抗体は標準的クロラミン−Ｔ法を用い、放射ヨウ素標識される。該抗体は、細胞
に結合しているいかなるポリペプチド／Ｆｃタンパク質のＦｃ部分にも結合する
であろう。すべてのアッセイにおいて、¹²⁵Ｉ抗体の非特異的結合をＦｃ融合タ ンパク質／Ｆｃの非存在下でアッセイすると共に、Ｆｃ融合タンパク質および２
００倍のモル過剰の非標識マウス抗ヒトＩｇＧ抗体の存在下でもアッセイする。

【０１１７】 細胞結合¹²⁵Ｉ抗体は、Ｐａｃｋａｒｄ Ａｕｔｏｇａｍｍａカウンターで定 量化する。親和性計算（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ， Ａｎｎ． Ｎ． Ｙ． Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ． ５１：６６０， １９４９）はＭｉｃｒｏｖａｘコンピュータ
ー上で実行されるＲＳ／１（ＢＢＮ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、マサチューセッツ州ボ
ストン）上で生み出される。

【０１１８】 別の種類の適切な結合アッセイは、競合結合アッセイである。例えば、ＡＣＰ
Ｌ変異体の生物学的活性は、該変異体が、ＡＣＰＬ結合タンパク質への結合に関
し、天然タンパク質と競合する能力をアッセイすることにより、決定してもよい
。

【０１１９】 競合結合アッセイは、慣用的方法論により行ってもよい。競合結合アッセイに
使用してもよい試薬には、放射標識ＡＣＰＬ、およびＡＣＰＬ結合タンパク質（
内因性または組換え）を細胞表面に発現している損なわれていない細胞が含まれ
る。例えば、放射標識可溶性ＡＣＰＬ断片を用い、細胞表面ＡＣＰＬ結合タンパ
ク質への結合に関し、可溶性ＡＣＰＬ変異体と競合させてもよい。損なわれてい
ない細胞の代わりに、（固相上の）プロテインＡまたはプロテインＧのＦｃ部分
との相互作用を通じ固相に結合している可溶性ＡＣＰＬ可溶性タンパク質／Ｆｃ
融合タンパク質で代用してもよい。プロテインＡおよびプロテインＧを含むクロ
マトグラフィーカラムには、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．
、ニュージャージー州ピスカタウェイより入手可能なものが含まれる。

【０１２０】 別の種類の競合結合アッセイは、放射標識可溶性ＡＣＰＬ結合タンパク質、例
えばＡＣＰＬ結合タンパク質／Ｆｃ融合タンパク質、およびＡＣＰＬを発現する
損なわれていない細胞を利用する。定性的結果は、競合オートラジオグラフプレ
ート結合アッセイにより得てもよく、一方、定量的結果を生成するのにＳｃａｔ
ｃｈａｒｄプロット（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ， Ａｎｎ． Ｎ． Ｙ． Ａｃａｄ
． Ｓｃｉ． ５１：６６０， １９４９）を利用してもよい。

【０１２１】 ＡＣＰＬ核酸またはオリゴヌクレオチドの使用 上述のように、ポリペプチドを発現するのに用いられるほか、ＤＮＡを含む本
発明の核酸およびそのオリゴヌクレオチドを以下に用いてもよい： ヒト染色体第２ｑ番を同定するため ヒト染色体第２ｑ番上の遺伝子をマッピングするため ヒト染色体第２ｑ番と関連する、特定の疾患、症候群、または他の異常に関連
する遺伝子を同定するため； 一本鎖センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドとして、ＡＣＰＬ遺伝子
にコードされるポリペプチドの発現を阻害するため； 個体において不全遺伝子を検出するのを補助するため；および 遺伝子治療のため。

【０１２２】 プローブ 本発明の核酸の使用の中に、プローブまたはプライマーとしての断片の使用が
ある。こうした断片は、一般的に、ＤＮＡ配列の少なくとも約１７の隣接するヌ
クレオチドを含む。他の態様において、ＤＮＡ断片は、ＤＮＡ配列の少なくとも
３０、または少なくとも６０の隣接するヌクレオチドを含む。

【０１２３】 配列番号１、配列番号３および配列番号４および配列番号６の、他の哺乳動物
種由来の相同体が本明細書に意図されるため、配列番号１、配列番号３、配列番
号４および配列番号６のＤＮＡ配列に基づくプローブを用い、慣用的な種間（ｃ
ｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｅｓ）ハイブリダイゼーション技術を用い、他の哺乳動物
種由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしてもよい。

【０１２４】 遺伝暗号の知識を、上に示されるアミノ酸配列と組み合わせて用い、縮重オリ
ゴヌクレオチドの組を調製してもよい。こうしたオリゴヌクレオチドは、例えば
ＤＮＡ断片を単離しそして増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、
プライマーとして有用である。

【０１２５】 染色体マッピング 配列番号１、配列番号３、および配列番号６の核酸のすべてまたは一部は、オ
リゴヌクレオチドを含め、当業者により、周知の技術を用いる、ヒト２ｑ、並び
にＩＬ−１受容体ＩおよびＩＩ、ＳＴ２およびＩＬ−１Ｒｒｐ１を含む、ＩＬ−
１ＲファミリーメンバーのＤＮＡを含む、特定のその遺伝子座を同定するのに用
いてもよい。有用な技術には、限定されるわけではないが、放射ハイブリッド（
ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄ）マッピング（高解像度）、染色体伸展（ｓ
ｐｒｅａｄ）に対するｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（中程度の解像度
）、および個々のヒト染色体を含むハイブリッド細胞株に対するサザンブロット
ハイブリダイゼーション（低解像度）などの、多様な周知の技術におけるプロー
ブとして、オリゴヌクレオチドを含む配列または部分を使用することを含む。

【０１２６】 例えば、染色体は放射ハイブリダイゼーションによりマッピングしてもよい。
第一に、９３の放射ハイブリッドのＷｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／
ＭＩＴ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｂ
ｒｉｄｇｅ４パネルを用い、ＰＣＲを行う（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍ
ｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｆｔｐ／ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ｈｕｍａｎ＿
ＳＴＳ＿ｒｅｌｅａｓｅｓ／ｊｕｌｙ９７／ｒｈｍａｐ／ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅ
４．ｈｔｍｌ）。目的の遺伝子の推定上のエクソン内にあり、そしてヒトゲノム
ＤＮＡから産物を増幅するが、ハムスターゲノムＤＮＡを増幅しないプライマー
を用いる。ＰＣＲの結果をデータベクトルに変換し、インターネット上のＷｈｉ
ｔｅｈｅａｄ／ＭＩＴ放射マッピングサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｓｅｑ．
ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）に提出する。該データをスコア化し、そして放射ハイブ
リッドマップ上の既知の配列タグ部位（ＳＴＳ）マーカーに比べた割り当ておよ
び配置が提供される。以下のウェブサイトは、放射ハイブリッドマッピングに関
し、さらなる情報を提供する： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｆｔｐ／ｄｉｓ
ｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ｈｕｍａｎ＿ＳＴＳ＿ｒｅｌｅａｓｅｓ／ｊｕｌｙ９７／
０７−９７．ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ。

【０１２７】 関連する疾患の同定 下に示すように、配列番号６のＤＮＡは染色体２ｑにマッピングされている。
該領域は、限定されるわけではないが、上記の表１に同定されるものを含む特定
の疾患に関連している。したがって、当業者は、周知の技術を用い、染色体２ｑ
にマッピングされる遺伝子に関連する異常を解析するのに、配列番号６の核酸ま
たはその断片を用いてもよい。これにより本マーカーが再配置または欠失されて
いる状態を識別することが可能になる。さらに、配列番号６のヌクレオチドまた
はその断片は、未知の位置の他の遺伝子をマッピングする、位置マーカーとして
用いてもよい。

【０１２８】 本発明の核酸に相当する遺伝子の不全または不十分な量により（直接または間
接的に）仲介されるいかなる障害に対する治療を開発するのに、該ＤＮＡを用い
てもよい。天然ヌクレオチド配列の本明細書の開示により、不全遺伝子の検出、
および正常遺伝子でのその置換が可能になる。不全遺伝子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
診断アッセイにおいて、そして本明細書に開示される天然ヌクレオチド配列と、
本遺伝子に不全を宿すると疑われるヒト由来の遺伝子のものとを比較することに
より、検出してもよい。

【０１２９】 センス−アンチセンス 核酸の他の有用な断片には、標的ｍＲＮＡ（センス）またはＤＮＡ（アンチセ
ンス）配列に結合することが可能な一本鎖核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡいずれ
か）を含む、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。本発明
のアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３、
または配列番号６のＤＮＡの断片を含む。こうした断片は一般的に、少なくとも
約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４ないし約３０ヌクレオチドを含む。既定
のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づき、アンチセンスまたはセンスオ
リゴヌクレオチドを得る能力は、例えば、ＳｔｅｉｎおよびＣｏｈｅｎ（Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｒｅｓ． ４８：２６５９， １９８８）およびｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒ
ｏｌら（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８， １９８８）に記載されて
いる。

【０１３０】 アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は、Ｒ
ＮＡｓｅＨによるｍＲＮＡ分解の亢進、スプライシングの阻害、転写または翻訳
の未成熟な終結、あるいは他の手段によるものを含む、いくつかの手段の１つに
より、タンパク質発現を遮断するまたは阻害する二重鎖の形成を生じる。このよ
うに、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用い、タンパク質の発現を遮断しても
よい。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドはさらに、修飾糖−ホスホ
ジエステル骨格（または、ＷＯ ９１／０６６２９に記載されるものなど、他の
糖結合）を有するオリゴヌクレオチドを含み、そしてこのような糖結合は内因性
ヌクレアーゼに耐性である。こうした耐性糖結合を持つオリゴヌクレオチドは、
ｉｎ ｖｉｖｏで安定である（すなわち酵素分解に抵抗することが可能である）
が、標的ヌクレオチド配列に結合することが可能な配列特異性を保持する。

【０１３１】 センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例には、ＷＯ ９０／１
０４４８に記載されるものなどの有機部分、およびポリ（Ｌ−リジン）などの標
的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増加させる他の部分に共有結
合するオリゴヌクレオチドが含まれる。さらに、エリプチシンなどの挿入剤、お
よびアルキル化剤または金属錯体がセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドに結合し、標的ヌクレオチド配列へのアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレ
オチドの結合特異性を修飾してもよい。

【０１３２】 アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、リポフェクション
、ＣａＰＯ₄仲介ＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーションを含む 、いかなる遺伝子トランスファー法により、あるいはエプスタイン・バーウイル
スなどの遺伝子トランスファーベクターを用いることにより、標的核酸配列を含
む細胞に導入してもよい。

【０１３３】 センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、ＷＯ ９１／０４７５
３に記載されるように、リガンド結合分子との結合体の形成により、標的ヌクレ
オチド配列を含む細胞に導入してもよい。適切なリガンド結合分子には、限定さ
れるわけではないが、細胞表面受容体、増殖因子、他のサイトカイン、または細
胞表面受容体に結合する他のリガンドが含まれる。好ましくは、リガンド結合分
子の結合体化は、実質的にリガンド結合分子がその対応する分子または受容体に
結合する能力に干渉せず、あるいはセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドまたはその結合体型が細胞内に入るのを遮断しない。

【０１３４】 あるいは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ ９０／１
０４４８に記載されるように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により、
標的核酸配列を含む細胞に導入してもよい。センスまたはアンチセンスオリゴヌ
クレオチド−脂質複合体は、好ましくは、内因性リパーゼにより、細胞内で分離
される。

【０１３５】 ポリペプチドおよび断片化ポリペプチドの使用 使用には、限定されるわけではないが、以下が含まれる： タンパク質の精製およびその活性の測定 搬送剤 治療および研究用試薬 分子量および等電点電気泳動マーカー ペプチド断片化のコントロール 未知のタンパク質の同定 抗体の調製。

【０１３６】 精製試薬 本発明のポリペプチドは、タンパク質精製試薬として使用を見出す。例えば、
ＡＣＰＬポリペプチドを固体支持体成分に結合させ、そしてアフィニティークロ
マトグラフィーによりＡＣＰＬ結合タンパク質を精製するのに用いてもよい。特
定の態様において、ポリペプチド（ＡＣＰＬ結合タンパク質に結合することが可
能な、本明細書に記載されるいかなる型でもよい）を、慣用的方法により固体支
持体に結合させる。１つの例として、タンパク質のアミノ酸側鎖上の官能基と反
応するであろう官能基を含む、クロマトグラフィーカラムが入手可能である（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタ
ウェイ）。あるいは、ポリペプチド／Ｆｃタンパク質（上述のようなもの）を、
Ｆｃ部分との相互作用を通じ、プロテインＡまたはプロテインＧ含有クロマトグ
ラフィーカラムに結合させる。

【０１３７】 該ポリペプチドはまた、細胞表面上にＡＣＰＬ結合タンパク質を発現する細胞
を精製する、または同定するのに使用を見出す。ポリペプチドを、カラムクロマ
トグラフィーマトリックスまたは同様の適切な支持体などの固相に結合させる。
例えば、磁気微小球体をポリペプチドで被覆し、そして磁気場を通じインキュベ
ーション容器に保持してもよい。ＡＣＰＬ結合タンパク質発現細胞を含む細胞混
合物の懸濁物を、ポリペプチドをその上に有する固相と接触させる。細胞表面上
にＡＣＰＬ結合タンパク質を発現する細胞が固定ポリペプチドに結合し、そして
その後非結合細胞を洗い流す。

【０１３８】 あるいは、ポリペプチドを検出可能な部分に結合させ、その後、結合タンパク
質発現に関し試験すべき細胞とインキュベーションしてもよい。インキュベーシ
ョン後、非結合標識成分を除去し、そして細胞上の検出可能部分の存在または非
存在を測定する。

【０１３９】 さらに別の代替物において、ＡＣＰＬ結合タンパク質細胞を含むと疑われる細
胞混合物をビオチン化ポリペプチドとインキュベーションする。インキュベーシ
ョン時間は、十分な結合を確実にするため、典型的には少なくとも連続１時間で
ある。生じた混合物をその後、アビジン被覆ビーズを装填したカラムに通過させ
、これによりビオチンのアビジンに対する高い親和性が、望ましい細胞のビーズ
への結合を提供する。アビジン被覆ビーズを用いる方法が知られる（Ｂｅｒｅｎ
ｓｏｎら， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０Ｄ：２３９， １９
８６を参照されたい）。非結合成分を除去するための洗浄、および結合細胞の遊
離は、慣用法を用い行う。

【０１４０】 活性測定 ポリペプチドはまた、その結合親和性に関しＡＣＰＬ結合タンパク質の生物学
的活性を測定するのにも使用を見出す。したがって、ポリペプチドは、例えば異
なる条件下でのタンパク質の貯蔵寿命および安定性をモニターするための、「品
質保証」研究を行うものにより、使用してもよい。例えば、ポリペプチドを結合
親和性研究に使用し、異なる温度で保存されている、または異なる細胞種で産生
されたＡＣＰＬ結合タンパク質の生物学的活性を測定してもよい。該タンパク質
はまた、ＡＣＰＬ結合タンパク質の修飾（例えば、化学的修飾、一部切除、突然
変異など）後、生物学的活性が保持されているかどうか決定するのにも用いても
よい。修飾ＡＣＰＬ結合タンパク質の結合親和性を、非修飾ＡＣＰＬ結合タンパ
ク質のものと比較し、ＡＣＰＬ結合タンパク質の生物学的活性に対する該修飾の
いかなる不利な影響も検出する。したがって、例えばＡＣＰＬ結合タンパク質の
生物学的活性を、調査研究において用いる前に確認することが可能である。

【０１４１】 搬送剤 該ポリペプチドはまた、結合する剤を、ＡＣＰＬ結合タンパク質を発現してい
る細胞に搬送するためのキャリアーとしての使用も見出す。したがって、該ポリ
ペプチドを用い、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ法において、診断用剤
または治療剤をこうした細胞に（または細胞表面上にＡＣＰＬ結合タンパク質を
発現することが見出されている他の細胞種に）搬送してもよい。

【０１４２】 ポリペプチドに結合させてもよい検出可能な剤（診断用剤）および治療剤には
、限定されるわけではないが、毒素、他の細胞毒性剤、薬剤、放射性核種、発色
団、比色もしくは蛍光分光反応を触媒する酵素、およびそれらに匹敵するものが
、意図される適用にしたがって選択される特定の剤と共に含まれる。毒素の中に
は、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａ
ｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａ、リボソーム不活性化タンパク質、トリコセセン
などのマイコトキシン、並びにそれらの誘導体および断片（例えば一本鎖）があ
る。診断使用に適した放射性核種には、限定されるわけではないが、¹²³Ｉ、¹³¹ Ｉ、^99mＴｃ、¹¹¹Ｉｎ、および⁷⁶Ｂｒがある。治療使用に適した放射性核種には
、¹³¹Ｉ、²¹¹Ａｔ、⁷⁷Ｂｒ、¹⁸⁶Ｒｅ、¹⁸⁸Ｒｅ、²¹²Ｐｂ、²¹²Ｂｉ、¹⁰⁹Ｐｄ、^{6 4} Ｃｕ、および⁶⁷Ｃｕがある。

【０１４３】 こうした剤は、いかなる適切な慣用法により、ポリペプチドに結合させてもよ
い。ポリペプチドは、例えば、望ましい剤上の官能基と反応し、共有結合を形成
することが可能である、アミノ酸側鎖上の官能基を含む。あるいは、タンパク質
または剤を誘導体化し、望ましい反応性官能基を生成し、または結合させてもよ
い。誘導体化には、多様な分子をタンパク質に結合させるのに利用可能である、
二官能性カップリング試薬（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ
、イリノイ州ロックフォード）の１つの結合を伴ってもよい。タンパク質を放射
標識するためのいくつかの技術が知られる。放射性核種金属を、例えば適切な二
官能性キレート剤を用いることにより、受容体に結合させてもよい。

【０１４４】 ポリペプチドおよび適切な診断用剤または治療剤を含む（好ましくは共有結合
している）結合体をこのように調製する。該結合体を投与し、またはそうでなけ
れば特定の適用に適した量で使用してもよい。

【０１４５】 治療剤 本発明のポリペプチドを、ＡＣＰＬ、またはＩＬポリペプチドを含む、いかな
る結合パートナーの不全、過剰または不十分な量により（直接または間接的に）
仲介されるいかなる障害に対する治療を開発するのに用いてもよい。単離されそ
して精製されているＡＣＰＬポリペプチドまたはその断片はまた、それ自体ＩＬ
−１およびＴＮＦ情報伝達を阻害する治療剤として有用である可能性もある。Ａ
ＣＰＬのこうした治療的使用は、周知の手段による、ＡＣＰＬポリペプチドまた
は断片を細胞内環境へ指示することによる、その投与を伴う可能性がある。こう
した手段の１つは、該タンパク質をリポソームに入れる、または該タンパク質を
特定の細胞種に標的化されているモノクローナル抗体にカップリングさせること
による。

【０１４６】 ポリペプチドはまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ法において、Ａ
ＣＰＬ結合タンパク質の生物学的活性を阻害するのにも使用してもよい。例えば
、ＡＣＰＬ精製ポリペプチドまたはその可溶性断片を用い、内因性細胞表面ＡＣ
ＰＬ結合パートナーへのＡＣＰＬ結合タンパク質の結合を阻害してもよい。こう
して、内因性受容体への結合パートナーの結合から生じる生物学的影響を阻害す
る。

【０１４７】 さらに、ＡＣＰＬポリペプチドを哺乳動物に投与し、ＡＣＰＬ結合パートナー
が仲介する障害を治療してもよい。こうした結合パートナー仲介障害には、該結
合パートナーにより（直接または間接的に）引き起こされるあるいは悪化される
異常が含まれる。

【０１４８】 本発明の組成物は、本明細書に記載されるいかなる型のポリペプチド、例えば
天然タンパク質、変異体、誘導体、オリゴマー、および生物学的に活性がある断
片を含んでもよい。特定の態様において、該組成物は、可溶性ポリペプチド、ま
たは可溶性ＡＣＰＬポリペプチドを含むオリゴマー、例えば結合パートナーに結
合するＡＣＰＬの細胞外ドメインまたは生物学的に活性があるその断片を含む。

【０１４９】 本発明のＡＣＰＬポリペプチドまたはその断片の有効量を、生理学的に許容し
うる希釈剤、キャリアー、または賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）などの他の構成
要素と組み合わせて含む組成物が、本明細書に提供される。ポリペプチドを、薬
学的に有用な組成物を調製するのに用いられる既知の方法にしたがい処方しても
よい。これらは、単一の活性成分として、または既定の徴候に適した他の既知の
活性成分と共に、薬学的に許容しうる希釈剤（例えば、塩水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
、酢酸、およびリン酸緩衝液）、保存剤（例えば、チメロサル、ベンジルアルコ
ール、パラベン類）、乳化剤、可溶化剤、アジュバントおよび／またはキャリア
ーと混合して組み合わせてもよい。薬剤組成物に適した処方には、Ｒｅｍｉｎｇ
ｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， 第１６版， １９８０， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、ペンシルバ
ニア州イーストンに記載されるものが含まれる。

【０１５０】 さらに、こうした組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金属イオン
と複合体化している、またはポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル、デキス
トランなどのポリマー化合物に取り込まれている、またはリポソーム、微小乳剤
、ミセル、単層もしくは多層小胞、赤血球ゴーストもしくはスフェロブラストに
取り込まれていてもよい。こうした組成物は、物理的状態、可溶性、安定性、ｉ
ｎ ｖｉｖｏ放出速度、およびｉｎ ｖｉｖｏクリアランス速度に影響するであ
ろうし、そしてしたがって意図される適用にしたがい、選択される。

【０１５１】 本発明の組成物は、例えば局所、非経口、または吸入によるなど、いかなる適
切な方式で、投与してもよい。「非経口」という用語には、例えば皮下、静脈内
、細胞内または筋内経路による注射が含まれ、また例えば疾患または損傷の部位
での局所化投与も含まれる。移植物からの持続放出もまた、意図される。当業者
は、適切な投薬量が、治療すべき障害の性質、患者の体重、年齢および全身状態
、並びに投与経路などの要因に応じ、多様であろうことを認識するであろう。予
備的用量は動物試験にしたがい決定してもよく、そしてヒト投与のための投薬量
の見積もりを、当業に認められる実施にしたがい、行う。

【０１５２】 生理学的に許容しうる処方中の核酸を含む組成物もまた、意図される。ＤＮＡ
は、例えば注射のため処方してもよい。

【０１５３】 研究用剤 本発明のポリペプチドの別の使用は、異なる細胞種上のＡＣＰＬ結合パートナ
ー／ＡＣＰＬ相互作用を阻害することから生じる生物学的影響を研究するための
研究ツールとしてである。ポリペプチドはまた、ＡＣＰＬ結合パートナーまたは
ＡＣＰＬあるいはそれらの相互作用を検出するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
に使用してもよい。

【０１５４】 ＡＣＰＬポリペプチド、およびＡＣＰＬポリペプチドに対する抗体を、多様な
研究プロトコルにおける試薬として用いてもよい。こうした研究プロトコルの実
例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版， Ｖｏｌ． １−３， Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９
）に提供される。例えば、これらの試薬は、ＲＮＡまたはタンパク質の細胞特異
的または組織特異的発現のマーカーとして利用することが可能である。同様にこ
れらの試薬を用い、ＡＣＰＬ ＲＮＡまたはポリペプチドの恒常的または一過的
発現を調べてもよい。ＡＣＰＬ ＤＮＡを用い、ＡＣＰＬ ＤＮＡの染色体位置
を決定し、そして本染色体位置に関連して遺伝子をマッピングしてもよい。ＡＣ
ＰＬ ＤＮＡはまた、遺伝的フィンガープリンティングなどの技術の使用を通じ
、遺伝的不均一性および遺伝形質を調べると共に、遺伝的障害に関連する危険性
を同定するのに用いてもよい。ＡＣＰＬ ＤＮＡはさらに、ＡＣＰＬ ＤＮＡに
関連するさらなる遺伝子を同定するのに、そして配列比較に基づく、進化系統樹
を確立するのに用いてもよい。ＡＣＰＬ ＤＮＡおよびポリペプチドを用い、サ
ザンブロッティングおよびイムノブロッティングなどの陽性スクリーニング法を
通じ、そしてサブトラクション（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）などの陰性スクリー
ニング法を通じ、ＡＣＰＬ ＤＮＡまたはポリペプチドに相同な遺伝子またはタ
ンパク質を選択してもよい。

【０１５５】 ＡＣＰＬポリペプチドはまた、（ａ）ＡＣＰＬポリペプチドが制御するいかな
るタンパク質も同定する、そして（ｂ）ＡＣＰＬポリペプチドが相互作用する可
能性がある他のタンパク質を同定する試薬としても用いてもよい。ＡＣＰＬポリ
ペプチドは、組換えタンパク質をアフィニティーマトリックスにカップリングさ
せることにより、またはＡＣＰＬポリペプチドを２−ハイブリッド系のおとり（
ｂａｉｔ）として用いることにより、用いてもよい。ＡＣＰＬポリペプチドおよ
びその断片を、ＩＬ−１Ｒファミリーの受容体により用いられる情報伝達経路の
研究における試薬として、そしてＩＬ−１８およびＩＬ−１ファミリーの他のリ
ガンドの可能性があるものによる情報伝達を遮断するのに用いてもよい。

【０１５６】 本発明の別の態様は、細胞情報伝達を研究するＡＣＰＬの使用に関する。ＡＣ
ＰＬポリペプチドは、細胞情報伝達を含む免疫反応において役割を果たす。こう
したものとして、ＡＣＰＬの発現および／または活性の改変は、多くの細胞過程
に激しい影響を有する可能性がある。クローン化されたＡＣＰＬの発現、ＡＣＰ
Ｌの機能的に不活性である突然変異体を用い、特定のタンパク質が特定の情報伝
達事象仲介において果たす役割を同定してもよい。

【０１５７】 細胞情報伝達は、しばしば、分子活性化カスケードを伴い、該カスケード中、
受容体が、標的基質をリン酸化する細胞内キナーゼを特異的に活性化することに
より、リガンド−受容体仲介シグナルを伝播する。これらの基質は、それ自体キ
ナーゼであってもよく、該基質がリン酸化後活性化されてもよい。あるいは、該
基質は、リン酸化後、タンパク質−タンパク質相互作用を通じ、下流情報伝達を
容易にするアダプター分子であってもよい。基質分子の性質に関係なく、発現さ
れたＡＣＰＬの機能的に活性である型は、酵母２−ハイブリッドアッセイなどの
アッセイに用い、ＡＣＰＬ結合パートナーにより、どの基質が認識されそして活
性化されるか同定してもよい。このように、これらの新規ＡＣＰＬは、情報伝達
経路に関与する新規分子を同定する試薬として用いてもよい。

【０１５８】 さらに、ＡＣＰＬポリペプチドおよびその断片は、ＩＬ−１８情報伝達を遮断
する試薬として、ＩＬ−１８情報伝達経路の研究に、試薬として用いてもよい。
ＡＣＰＬポリペプチドがＮＦκＢ情報伝達に役割を果たしているという発見によ
り、ＮＦκＢ情報伝達の、特にＩＬ−１８によるＮＦκＢ情報伝達の誘導に関す
る研究にＡＣＰＬポリペプチドを使用することが可能になる。ＡＣＰＬポリペプ
チドおよびＮＦκＢ情報伝達におけるその役割の発見により、細胞情報伝達にお
けるＩＬ−１Ｒｒｐ１およびＩＬ−１８の役割を解明する研究プロトコルにおけ
る試薬として使用することが可能になる。

【０１５９】 ＩＬ−１８は多くのさらなる情報伝達反応を誘導する。こうした情報伝達反応
の中に、ＭＡＰキナーゼファミリー、キナーゼＪＮＫおよびｐ３８の誘導がある
。したがって、ＡＣＰＬポリペプチドおよびその断片は、ＩＬ−１８が誘導する
、ＭＡＰキナーゼファミリー、キナーゼＪＮＫおよびｐ３８の情報伝達反応の研
究における試薬として用いてもよい。

【０１６０】 ＡＣＰＬポリペプチドがＩＬ−１８に反応し特定のタンパク質産生を刺激する
という発見により、誘導性タンパク質発現系の生成が可能になる。１つの態様に
おいて、目的のタンパク質の発現を仲介する３つのＮＦκＢ部位を含むベクター
内に、該タンパク質をコードする遺伝子を配置してもよい。当業者は、発現が望
ましい細胞の種類に応じ、ＮＦκＢ発現に連結した（ｌｉｎｋｅｄ）発現を達成
するのに、多くの異なるベクターを用いてもよいことを認識する。例として、Ｎ
ＦκＢ連結発現ベクター４０μｇ並びにネズミＡＰＣＬポリペプチドおよびネズ
ミＩＬ−１Ｒ−Ｒｐ１をコードする発現ベクター２０μｇで、９６０μＦおよび
３２０Ｖで、１０⁷のＳ４９．１細胞を０．７ ｍｌ中でエレクトロポレーショ ンによりトランスフェクションしてもよい。細胞を２日間培養してもよく、そし
てその後、４０ ｎｇ／ｍｌのネズミＩＬ−１８（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）で刺激
してもよい。ＩＬ−１８添加は、ＮＦκＢ連結遺伝子発現を３００倍誘導するこ
とが可能である。ＡＣＰＬポリペプチドおよびＩＬ−１８刺激を用い、タンパク
質発現誘導を達成するのに、多くの異なるアプローチを用いてもよく、そして本
態様はいかなる点でも本発明の範囲を限定しないことが理解される。

【０１６１】 ＮＦκＢ連結タンパク質の産生が制御されているため、細胞内の本タンパク質
のレベルは、ＩＬ−１８の刺激にしたがい、調節することが可能である。ルシフ
ェラーゼなどのマーカー遺伝子の使用により、ＩＬ−１８刺激ＮＦκＢ情報伝達
の阻害因子および制御因子の解明が可能になる。さらに、タンパク質発現のレベ
ルおよびタイミングの調節により、当業者が、目的のタンパク質の一時的な影響
および累積的な影響両方を調べることが可能になる。ＡＣＰＬポリペプチドに対
する抗体はさらに、これらの実験におけるＩＬ−１８刺激ＮＦκＢ情報伝達を阻
害するのに用いてもよく、ＮＦκＢ情報伝達に伴われる段階のより詳細な解析が
可能になる。

【０１６２】 本発明にしたがった精製ＡＣＰＬポリペプチドは、ＡＣＰＬポリペプチドの阻
害剤の発見を容易にするであろう。精製ＡＣＰＬポリペプチドを、その潜在的な
阻害剤をスクリーニングするのに使用することは重要であり、そして汚染物質と
の干渉性反応の可能性を除くまたは減少させる可能性がある。

【０１６３】 さらに、ＡＣＰＬポリペプチドを、ＡＣＰＬポリペプチド−阻害剤の構造に基
づく設計のため、用いてもよい。こうした構造に基づく設計は「合理的薬剤設計
」としても知られる。ＡＣＰＬポリペプチドを、例えば、すべて周知の方法であ
る、Ｘ線結晶学、核磁気共鳴または相同性モデリングにより、三次元的に解析し
てもよい。分子モデリングソフトウェア系におけるＡＣＰＬポリペプチド構造情
報を、阻害剤設計および阻害剤−ＡＣＰＬポリペプチド相互作用を補助するのに
使用することもまた、本発明に含まれる。こうしたコンピューター補助モデリン
グおよび薬剤設計は、化学的コンホメーション解析、分子の静電位、タンパク質
フォールディングなどの情報を利用することが可能である。例えば、メタロプロ
テアーゼのクラス特異的阻害剤の設計の大部分は、触媒性亜鉛原子をキレートす
るまたは該原子に結合する試みに重点を置いてきている。合成阻害剤は、通常、
陰性荷電部分を含むよう設計され、該部分に、特定のプロテアーゼの特異性ポケ
ットに適合するよう設計された、一連の他の基が結合している。本発明の特定の
方法は、ＡＣＰＬポリペプチドの三次元構造を、基質の結合部位である可能性が
ある部位に関し解析し、予測される反応性部位を含む新規分子を合成し、そして
新規分子を上述のようにアッセイすることを含む。

【０１６４】 分子量、等電点マーカー 本発明はさらに、ゲル電気泳動により試料タンパク質の見かけの分子量を概算
する分子量マーカーとしてＡＣＰＬポリペプチドを利用する方法を含む。本発明
にしたがい、単離されそして精製されているマウスＡＣＰＬポリペプチド分子量
マーカーは、糖鎖付加がなければ、およそ７０，０４８ダルトンの分子量を有す
る。ＡＣＰＬポリペプチドは、試料タンパク質と共に、慣用的手段による変性ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（Ｕ．Ｋ． Ｌａｅｍｍｌｉ， Ｎａｔｕｒｅ
２２７：６８０−６８５， １９７０）により、ドデシル硫酸ナトリウムおよび
６−２０％の間の濃度のアクリルアミドを含むゲルの２つの別個のレーンにおい
て分離してもよい。ゲル上のタンパク質は、慣用的染色法を用い、視覚化しても
よい。ＡＣＰＬポリペプチド分子量マーカーは、試料タンパク質の見かけの分子
量の概算において、分子量マーカーとして用いてもよい。マウスＡＣＰＬの特有
のアミノ酸配列（配列番号２）は、およそ７０，０４８ダルトンの分子量を特定
する。したがって、ＡＣＰＬポリペプチド分子量マーカーは、７０，０４８ダル
トンに近い見かけの分子量を有する試料タンパク質の見かけの分子量概算のため
の分子量マーカーとして特によく働く。本ポリペプチド分子量マーカーの使用に
より、７０，０４８ダルトンに近い見かけの分子量を有するタンパク質の見かけ
の分子量測定の正確さを増加させることが可能になる。同様に、ヒトＡＣＰＬポ
リペプチド（配列番号７）を、試料タンパク質の見かけの分子量概算のための分
子量マーカーとして用いてもよい。もちろん、ＡＣＰＬポリペプチドを用いた試
料タンパク質の分子量測定に、多くの異なる技術を用いてもよく、そして本態様
はいかなる点でも本発明の範囲を限定しないことが理解される。

【０１６５】 本発明の別の好ましい態様は、ＡＣＰＬポリペプチドの化学的断片化により生
成されるＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーの、ゲル電気泳動により試料タ
ンパク質の見かけの分子量を概算するための分子量マーカーとしての使用である
。単離されそして精製されているＡＣＰＬポリペプチドを、ＡＣＰＬポリペプチ
ド内のメチオニン残基のカルボキシル側での特異的な加水分解により、ＡＣＰＬ
ポリペプチド分子量マーカーの断片化を生じる慣用的条件下で、臭化シアンで処
理してもよい（Ｅ． Ｇｒｏｓｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ． １１：
２３８−２５５， １９６７）。ＡＣＰＬポリペプチドの特有のアミノ酸配列に
より、ＡＣＰＬポリペプチド分子量マーカーの臭化シアンでの断片化は、ＡＣＰ
Ｌ断片化ペプチド分子量マーカーの特有の組を生成する。例えば、ヒトおよびマ
ウスＡＣＰＬポリペプチドは、各々、ＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーの
特有の組を生成するであろう。これらの分子量マーカーの大きさは、利用可能な
コンピュータープログラムを用い、予測することが可能である。メチオニン残基
の分布（ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）が各ペプチドにおけるアミノ酸の数を決定
し、そして各ペプチドの特有のアミノ酸組成がその分子量を決定する。

【０１６６】 マウスＡＣＰＬポリペプチドの臭化シアンでの処理により生成されるＡＣＰＬ
断片化ペプチド分子量マーカーの特有の組は、大きさが少なくとも１０アミノ酸
の１０の断片化ペプチドを含む。配列番号２のアミノ酸２−８７にコードされる
ペプチドは、およそ９，７２４ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ
酸８８−１０５にコードされるペプチドは、およそ２，０２０ダルトンの分子量
を有する。配列番号２のアミノ酸１１１−１３６にコードされるペプチドは、お
よそ３，０９４ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸１３７−１８
８にコードされるペプチドは、およそ５，５０２ダルトンの分子量を有する。配
列番号２のアミノ酸１８９−２０７にコードされるペプチドは、およそ２，３５
４ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸２０８−２９９にコードさ
れるペプチドは、およそ１０，６１７ダルトンの分子量を有する。配列番号２の
アミノ酸３００−３６９にコードされるペプチドは、およそ８，２９３ダルトン
の分子量を有する。配列番号２のアミノ酸３７０−５５８にコードされるペプチ
ドは、およそ２１，５５９ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸５
６８−５９３にコードされるペプチドは、およそ２，９６３ダルトンの分子量を
有する。配列番号２のアミノ酸５９４−６１４にコードされるペプチドは、およ
そ２，３４３ダルトンの分子量を有する。

【０１６７】 したがって、マウスＡＣＰＬポリペプチドの臭化シアンでの化学的処理による
切断は、ＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーの特有の組を生成する。これら
のＡＣＰＬ断片化ペプチドの特有でそして既知のアミノ酸配列により、これらの
ＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーの分子量決定が可能になる。この特定の
場合、ＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーは、およそ９，７２４；２，０２
０；３，０９４；５，５０２；２，３５４；１０，６１７；８，２９３；２１，
５５９；２，９６３；および２，３４３ダルトンの分子量を有する。

【０１６８】 ＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーは、試料タンパク質と共に、慣用的手
段による変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、ドデシル硫酸ナトリウム
および１０−２０％の間の濃度のアクリルアミドを含むゲルの２つの別個のレー
ンにおいて分離してもよい。ゲル上のタンパク質は、慣用的染色法を用い、視覚
化してもよい。ＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーは、試料タンパク質の見
かけの分子量の概算において、分子量マーカーとして用いてもよい。マウスＡＣ
ＰＬの特有のアミノ酸配列は、該ＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーに関し
、およそ９，７２４；２，０２０；３，０９４；５，５０２；２，３５４；１０
，６１７；８，２９３；２１，５５９；２，９６３；および２，３４３ダルトン
の分子量を特定する。したがって、該ＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーは
、９，７２４；２，０２０；３，０９４；５，５０２；２，３５４；１０，６１
７；８，２９３；２１，５５９；２，９６３；または２，３４３ダルトンに近い
見かけの分子量を有する試料タンパク質の見かけの分子量概算のための分子量マ
ーカーとして特によく働く。その結果、これらの断片化ペプチド分子量マーカー
の使用により、９，７２４；２，０２０；３，０９４；５，５０２；２，３５４
；１０，６１７；８，２９３；２１，５５９；２，９６３；または２，３４３ダ
ルトンに近い見かけの分子量を有するタンパク質の見かけの分子量測定の正確さ
を増加させることが可能になる。もちろん、ヒトＡＣＰＬポリペプチドの特有の
アミノ酸配列（配列番号１３）を同様に用い、ヒトＡＣＰＬ断片化ペプチド分子
量マーカーの特有の組を生成してもよい。断片の大きさは、利用可能なコンピュ
ータープログラムを用い、容易に決定することが可能である。

【０１６９】 さらなる態様において、試料タンパク質およびＡＣＰＬポリペプチドを同時に
しかし別個に、試料タンパク質およびＡＣＰＬポリペプチド内のメチオニン残基
のカルボキシル側での特異的な加水分解により、試料タンパク質およびＡＣＰＬ
ポリペプチドの断片化を生じる慣用的条件下で、臭化シアンで処理してもよい。
上述のように、ＡＣＰＬポリペプチドの臭化シアンでの切断により生成されるＡ
ＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーは、およそ９，７２４；２，０２０；３，
０９４；５，５０２；２，３５４；１０，６１７；８，２９３；２１，５５９；
２，９６３；および２，３４３ダルトンの分子量を有する。

【０１７０】 ＡＣＰＬポリペプチドおよび試料タンパク質両方由来の断片化ペプチドを、慣
用的手段による変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、ドデシル硫酸ナト
リウムおよび１０−２０％の間の濃度のアクリルアミドを含むゲルの２つの別個
のレーンにおいて分離してもよい。ゲル上の断片化ペプチドは、慣用的染色法を
用い、視覚化してもよい。ＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーは、試料タン
パク質由来の断片化タンパク質の見かけの分子量の概算において、分子量マーカ
ーとして用いてもよい。上に論じられるように、該ＡＣＰＬ断片化ペプチド分子
量マーカーは、９，７２４；２，０２０；３，０９４；５，５０２；２，３５４
；１０，６１７；８，２９３；２１，５５９；２，９６３；または２，３４３ダ
ルトンに近い見かけの分子量を有する断片化ペプチドの見かけの分子量概算のた
めの分子量マーカーとして特によく働く。その結果、これらのＡＣＰＬ断片化ペ
プチド分子量マーカーの使用により、９，７２４；２，０２０；３，０９４；５
，５０２；２，３５４；１０，６１７；８，２９３；２１，５５９；２，９６３
；または２，３４３ダルトンに近い見かけの分子量を有する断片化ペプチドの見
かけの分子量測定の正確さを増加させることが可能になる。ＡＣＰＬポリペプチ
ドの断片化の度合いをさらに、試料タンパク質の完全な断片化が期待される条件
を決定するコントロールとして用いる。もちろん、ＡＣＰＬポリペプチドを断片
化するのに多くの化学薬品を用いてもよく、そして本態様はいかなる点でも本発
明の範囲を限定しないことが理解される。

【０１７１】 別の態様において、ＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーの特有の組を、特
定のアミノ酸残基でポリペプチドを切断する酵素を用い、ＡＣＰＬポリペプチド
から生成してもよい。ＡＣＰＬポリペプチドのアミノ酸配列の特有の性質により
、異なるアミノ酸残基での切断は、断片化ペプチド分子量マーカーの異なる組を
生成するであろう。

【０１７２】 単離されそして精製されているＡＣＰＬポリペプチドを、ＡＣＰＬポリペプチ
ド内のリジン残基のカルボキシル側での特異的な加水分解により、ＡＣＰＬポリ
ペプチドの断片化を生じる慣用的条件下で、アクロモバクター・プロテアーゼＩ
で処理してもよい（Ｔ． Ｍａｓａｋｉら， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ． Ａｃｔａ ６６０：４４−５０， １９８１；Ｔ． Ｍａｓａｋｉら，
Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ６６０：５１−５５， １９
８１）。ＡＣＰＬポリペプチドの特有のアミノ酸配列により、ＡＣＰＬポリペプ
チド分子量マーカーのアクロモバクター・プロテアーゼＩでの断片化は、ＡＣＰ
Ｌ断片化ペプチド分子量マーカーの特有の組を生成する。リジン残基の分布が各
ペプチドにおけるアミノ酸の数を決定し、そして各ペプチドの特有のアミノ酸組
成がその分子量を決定する。

【０１７３】 マウスＡＣＰＬポリペプチドのアクロモバクター・プロテアーゼＩでの処理に
より生成されるＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーの特有の組は、大きさが
少なくとも１０アミノ酸の２０の断片化ペプチドを含む。ＡＣＰＬポリペプチド
の臭化シアン処理での１０の断片化ペプチドの生成に比べ、ＡＣＰＬポリペプチ
ドの本酵素処理での２０の断片化ペプチドの生成は、断片化ペプチド分子量マー
カーの大きさが、ＡＣＰＬポリペプチドを断片化するのに利用する断片化処理に
応じ、多様であろうことを、明らかに例示する。これらの断片の大きさおよび数
は、共に、ＡＣＰＬポリペプチドのアミノ酸配列により決定される。その結果、
断片化ペプチドの数もまた、ＡＣＰＬポリペプチドを断片化するのに利用する断
片化処理に応じ、多様であろう。さらに、ヒトＡＣＰＬポリペプチド（配列番号
７）の断片化は、該ＡＣＰＬポリペプチドのアミノ酸配列に決定される、断片化
ペプチドの特有の組を生じるであろう。

【０１７４】 配列番号２のアミノ酸１−１６にコードされるペプチドは、およそ１，８９７
ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸１７−２８にコードされるペ
プチドは、およそ１，２３６ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸
３０−５５にコードされるペプチドは、およそ３，１００ダルトンの分子量を有
する。配列番号２のアミノ酸５６−７１にコードされるペプチドは、およそ１，
７２１ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸７９−１４１にコード
されるペプチドは、およそ７，２８５ダルトンの分子量を有する。配列番号２の
アミノ酸１４８−１９２にコードされるペプチドは、およそ４，８９３ダルトン
の分子量を有する。配列番号２のアミノ酸２０３−２３８にコードされるペプチ
ドは、およそ４，１２３ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸２５
０−２６６にコードされるペプチドは、およそ１，８６６ダルトンの分子量を有
する。配列番号２のアミノ酸２６７−２８３にコードされるペプチドは、およそ
１，９８９ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸２９２−３０５に
コードされるペプチドは、およそ１，７５７ダルトンの分子量を有する。配列番
号２のアミノ酸３１３−３３３にコードされるペプチドは、およそ２，６０１ダ
ルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸３３４−３５３にコードされる
ペプチドは、およそ２，３２４ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ
酸３５５−３９５にコードされるペプチドは、およそ４，７６５ダルトンの分子
量を有する。配列番号２のアミノ酸４０６−４７１にコードされるペプチドは、
およそ７，３３９ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸４７３−５
０７にコードされるペプチドは、およそ３，８８５ダルトンの分子量を有する。
配列番号２のアミノ酸５１３−５２７にコードされるペプチドは、およそ１，７
８５ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸５２９−５３９にコード
されるペプチドは、およそ１，２８２ダルトンの分子量を有する。配列番号２の
アミノ酸５４３−５６１にコードされるペプチドは、およそ２，３２９ダルトン
の分子量を有する。配列番号２のアミノ酸５６２−５７６にコードされるペプチ
ドは、およそ１，８５５ダルトンの分子量を有する。配列番号２のアミノ酸５９
６−６１２にコードされるペプチドは、およそ１，８５８ダルトンの分子量を有
する。

【０１７５】 したがって、マウスＡＣＰＬポリペプチドのアクロモバクター・プロテアーゼ
Ｉでの酵素的処理による切断は、ＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーの特有
の組を生成する。これらの断片化ペプチドの特有でそして既知のアミノ酸配列に
より、これらのＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーの分子量決定が可能にな
る。この特定の場合、これらのＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーは、およ
そ１，８９７；１，２３６；３，１００；１，７２１；７，２８５；４，８９３
；４，１２３；１，８６６；１，９８９；１，７５７；２，６０１；２，３２４
；４，７６５；７，３３９；３，８８５；１，７８５；１，２８２；２，３２９
；１，８５５；および１，８５８ダルトンの分子量を有する。

【０１７６】 再び、ＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーは、試料タンパク質と共に、慣
用的手段による変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、ドデシル硫酸ナト
リウムおよび１０−２０％の間の濃度のアクリルアミドを含むゲルの２つの別個
のレーンにおいて分離してもよい。ゲル上のタンパク質は、慣用的染色法を用い
、視覚化してもよい。ＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーは、試料タンパク
質の見かけの分子量の概算において、分子量マーカーとして用いてもよい。ＡＣ
ＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーは、１，８９７；１，２３６；３，１００；
１，７２１；７，２８５；４，８９３；４，１２３；１，８６６；１，９８９；
１，７５７；２，６０１；２，３２４；４，７６５；７，３３９；３，８８５；
１，７８５；１，２８２；２，３２９；１，８５５；または１，８５８ダルトン
に近い見かけの分子量を有するタンパク質の見かけの分子量概算のための分子量
マーカーとして特によく働く。これらの断片化ペプチド分子量マーカーの使用に
より、１，８９７；１，２３６；３，１００；１，７２１；７，２８５；４，８
９３；４，１２３；１，８６６；１，９８９；１，７５７；２，６０１；２，３
２４；４，７６５；７，３３９；３，８８５；１，７８５；１，２８２；２，３
２９；１，８５５；または１，８５８ダルトンに近い見かけの分子量を有するタ
ンパク質の見かけの分子量測定の正確さを増加させることが可能になる。もちろ
ん、ヒトＡＣＰＬポリペプチドの特有のアミノ酸配列（配列番号１３）を同様に
用い、断片化ペプチド分子量マーカーの特有の組を生成してもよい。断片の大き
さは、利用可能なコンピュータープログラムを用い、容易に決定することが可能
である。

【０１７７】 別の態様において、試料タンパク質およびＡＣＰＬポリペプチドを同時にしか
し別個に、試料タンパク質およびＡＣＰＬポリペプチド内のリジン残基のカルボ
キシル側での特異的な加水分解により、試料タンパク質およびＡＣＰＬポリペプ
チドの断片化を生じる慣用的条件下で、アクロモバクター・プロテアーゼＩで処
理してもよい。ＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーおよび試料タンパク質由
来の断片化ペプチドを、慣用的手段による変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動
により、ドデシル硫酸ナトリウムおよび１０−２０％の間の濃度のアクリルアミ
ドを含むゲルの２つの別個のレーンにおいて分離する。ゲル上の断片化ペプチド
は、慣用的染色法を用い、視覚化してもよい。ＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マ
ーカーは、試料タンパク質の見かけの分子量の概算において、分子量マーカーと
して用いてもよい。該ＡＣＰＬ断片化ペプチド分子量マーカーは、１，８９７；
１，２３６；３，１００；１，７２１；７，２８５；４，８９３；４，１２３；
１，８６６；１，９８９；１，７５７；２，６０１；２，３２４；４，７６５；
７，３３９；３，８８５；１，７８５；１，２８２；２，３２９；１，８５５；
または１，８５８ダルトンに近い見かけの分子量を有する断片化ペプチドの見か
けの分子量概算のための分子量マーカーとして特によく働く。これらのＡＣＰＬ
断片化ペプチド分子量マーカーの使用により、１，８９７；１，２３６；３，１
００；１，７２１；７，２８５；４，８９３；４，１２３；１，８６６；１，９
８９；１，７５７；２，６０１；２，３２４；４，７６５；７，３３９；３，８
８５；１，７８５；１，２８２；２，３２９；１，８５５；または１，８５８ダ
ルトンに近い見かけの分子量を有する断片化ペプチドの見かけの分子量測定の正
確さを増加させることが可能になる。ＡＣＰＬポリペプチドの断片化の度合いを
さらに、試料タンパク質の完全な断片化が期待される条件を決定するコントロー
ルとして用いる。もちろん、ＡＣＰＬポリペプチドを断片化するのに多くの酵素
を用いてもよく、そして本態様はいかなる点でも本発明の範囲を限定しないこと
が理解される。

【０１７８】 別の態様において、ＡＣＰＬポリペプチドに対するモノクローナルおよびポリ
クローナル抗体を生成してもよい。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、ＲＩＢＩアジュバン
ト（ＲＩＢＩ Ｃｏｒｐ．、モンタナ州ハミルトン）の存在下で、単離されそし
て生成されているＡＣＰＬポリペプチドまたはＡＣＰＬポリペプチドのアミノ酸
配列に基づくペプチド１０μｇを、３週間間隔で２回、腹腔内注射してもよい。
その後、慣用的ドットブロット技術または抗体捕捉（ＡＢＣ）によりマウス血清
をアッセイし、どの動物のものを融合させるのが最適か決定する。３週間後、マ
ウスに、無菌ＰＢＳ中に懸濁されているＡＣＰＬポリペプチドまたはペプチド３
μｇを静脈内追加投与する。３日後、マウスを屠殺し、そして確立されたプロト
コルにしたがい、Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ）と脾臓細胞を融合させ
る。簡潔には、Ａｇ８．６５３細胞を血清不含培地で数回洗浄し、そして骨髄腫
細胞１に対し脾臓細胞３の割合で、マウス脾臓細胞に融合させる。融合剤は、５
０％ ＰＥＧ：１０％ ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）である。融合物を、ＨＡＴ補足
ＤＭＥＭ培地を含む２０の９６ウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に蒔き、
そして８日間増殖させる。生じたハイブリドーマから上清を集め、そしてまずヤ
ギ抗マウスＩｇで被覆されている９６ウェルプレートに６０分間添加する。洗浄
後、¹²⁵Ｉ−ＡＣＰＬポリペプチドまたはペプチドを各ウェルに添加し、室温で ６０分間インキュベーションし、そして４回洗浄する。陽性ウェルは続いて、Ｋ
ｏｄａｋ Ｘ−Ｏｍａｔ Ｓフィルムを用いた−７０℃でのオートラジオグラフ
ィーにより、検出することが可能である。陽性クローンをバルク培養で増殖させ
てもよく、そして続いて上清をプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で
精製する。もちろん、ＡＣＰＬポリペプチドおよび断片化ペプチドに対する抗体
を生成するのに多くの技術を用いてもよく、そして本態様はいかなる点でも本発
明の範囲を限定しないことが理解される。

【０１７９】 別の態様において、ＡＣＰＬポリペプチドおよびその断片化ペプチドに対し生
成された抗体を、ＡＣＰＬポリペプチドまたは断片化ペプチド分子量マーカーと
組み合わせて用い、試料タンパク質の見かけの分子量および等電点を決定するこ
れらの分子量マーカーの使用における正確さを亢進してもよい。ＡＣＰＬポリペ
プチドまたは断片化ペプチド分子量マーカーを、モル過剰の試料タンパク質と混
合し、そして混合物を、慣用的手段による２次元電気泳動により、分離してもよ
い。ポリペプチドを、慣用的手段により、ニトロセルロースなどの適切なタンパ
ク質結合膜に移してもよい。

【０１８０】 膜上のポリペプチドは、試料タンパク質および分子量マーカー間の区別を可能
にする２つの異なる方法を用い、視覚化してもよい。ＡＣＰＬポリペプチドまた
は断片化ペプチド分子量マーカーは、これらのマーカーに対して生成された抗体
および慣用的なイムノブロッティング技術を用い、視覚化してもよい。本検出は
、試料タンパク質の検出を生じない慣用的な条件下で行われる。小さなペプチド
は免疫原性エピトープを含まない可能性があるため、すべてのＡＣＰＬポリペプ
チド断片に対する抗体を生成することは不可能である可能性があることが理解さ
れる。さらに、本アッセイにおいて、すべての抗体が働くわけではないであろう
ことが理解される；しかしながら、ＡＣＰＬポリペプチドおよび断片に結合する
ことが可能な抗体は、慣用的技術を用い、容易に決定することが可能である。

【０１８１】 試料タンパク質を、慣用的染色法を用い、視覚化する。ＡＣＰＬポリペプチド
または断片ペプチド分子量マーカーに対する試料タンパク質のモル過剰は、慣用
的な染色法が、主に試料タンパク質を検出する程度である。ＡＣＰＬポリペプチ
ドまたは断片化ペプチド分子量マーカーレベルは、慣用的染色法により、これら
のマーカーがほとんどまたはまったく検出されない程度である。ＡＣＰＬポリペ
プチド分子量マーカーに対する試料タンパク質の好ましいモル過剰は、２および
１００，０００倍の間である。より好ましくは、ＡＣＰＬポリペプチド分子量マ
ーカーに対する試料タンパク質の好ましいモル過剰は、１０および１０，０００
倍の間であり、そして特に１００および１，０００倍の間である。

【０１８２】 ＡＣＰＬポリペプチドまたは断片化ペプチド分子量マーカーを、試料タンパク
質の見かけの分子量および等電点の概算において、分子量および等電点マーカー
として用いてもよい。ＡＣＰＬポリペプチドまたは断片化ペプチド分子量マーカ
ーは、ＡＣＰＬポリペプチドまたは断片化ペプチド分子量マーカーのものに近い
見かけの分子量および等電点を有する試料タンパク質の見かけの分子量および等
電点概算のための分子量および等電点マーカーとして、特によく働く。ＡＣＰＬ
ポリペプチドまたは断片化ペプチド分子量マーカーおよび試料タンパク質を、同
一の条件下で同時に分離する能力により、試料タンパク質の見かけの分子量およ
び等電点測定の正確さを増加させることが可能になる。これは、方法の性質が、
いかなるマーカーも試料タンパク質と同時に分離されることを指令する、二次元
電気泳動などの技術に特有の目的である。

【０１８３】 別の態様において、ＡＣＰＬポリペプチドまたは断片化ペプチド分子量マーカ
ーを、切断剤で試料タンパク質を処理することにより得られる断片化ペプチドの
見かけの分子量および等電点の概算において、分子量および等電点マーカーとし
て用いてもよい。ＡＣＰＬポリペプチド分子量マーカーおよびそのペプチド断片
を用いた、試料タンパク質およびその断片化ペプチドの分子量および等電点測定
に、多くの技術を用いることができ、そして本態様はいかなる点でも本発明の範
囲を限定しないことが理解される。

【０１８４】 本発明に含まれるＡＣＰＬポリペプチド分子量マーカーは、該マーカーが発現
される宿主細胞に応じ、多様な分子量を有する可能性がある。多様な細胞種にお
けるＡＣＰＬポリペプチド分子量マーカーおよびペプチド断片の糖鎖付加は、修
飾の度合いに応じ、これらのマーカーの分子量の変動を生じる可能性がある。Ａ
ＣＰＬポリペプチド分子量マーカーの大きさは、該ポリペプチドの細胞外部分由
来のＡＣＰＬポリペプチド断片で最も雑多である可能性がある。一貫した分子量
マーカーは、完全に膜貫通および細胞質領域由来のポリペプチドを用いること、
Ｎ−グリカナーゼで前処理し、糖鎖付加を除くこと、または細菌宿主でポリペプ
チドを発現させることにより、得ることが可能である。

【０１８５】 本発明のポリペプチドは、化学的および酵素的手段により、より小さいペプチ
ドへの断片化にさらされてもよく、そしてこうして産生されるペプチド断片を、
他のタンパク質またはポリペプチドの解析に用いてもよい。例えば、こうしたペ
プチド断片を、ペプチド分子量マーカーとして、ペプチド等電点マーカーとして
、またはペプチド断片化の度合いの解析において、用いてもよい。したがって、
本発明はまた、これらのポリペプチドまたはペプチド断片と共に、未知のタンパ
ク質の見かけの分子量および等電点決定を補助するキット並びに未知のタンパク
質の断片化の度合いを評価するキットも含む。

【０１８６】 もちろん、本発明のペプチドおよびポリペプチドの断片はまた、当業に周知の
慣用的な組換え法および合成法により産生してもよい。組換え法に関し、本発明
に含まれるポリペプチドおよびペプチド断片は、これらが発現される宿主細胞に
応じ、多様な分子量を有する可能性がある。多様な細胞種における本発明のポリ
ペプチドおよびペプチド断片の糖鎖付加は、修飾の度合いに応じ、これらの片（
ｐｉｅｃｅ）の分子量の変動を生じる可能性がある。これらの片の大きさは、該
ポリペプチドの細胞外部分由来のポリペプチド断片で最も雑多である可能性があ
る。一貫したポリペプチドおよびペプチド断片は、完全に膜貫通および細胞質領
域由来のポリペプチドを用いること、Ｎ−グリカナーゼで前処理し、糖鎖付加を
除くこと、または細菌宿主でポリペプチドを発現させることにより、得ることが
可能である。

【０１８７】 これらのポリペプチドの分子量はまた、本発明のポリペプチドのアミノおよび
カルボキシル末端両方に、さらなるペプチド配列を融合させることにより、変化
させてもよい。本発明のポリペプチドのアミノおよびカルボキシル末端でのさら
なるペプチド配列の融合を用い、これらのポリペプチドの発現を亢進し、または
該タンパク質の精製を補助してもよい。さらに、本発明のポリペプチドのアミノ
およびカルボキシル末端でのさらなるペプチド配列の融合は、酵素的または化学
的処理により生成されるポリペプチドの断片化ペプチドを、通常すべてではない
がいくつか、改変するであろう。もちろん、分子生物学の日常的でそして既知の
技術を用い、本発明のポリペプチドに、突然変異を導入してもよい。例えば、特
定の酵素によるタンパク質分解切断部位または特定の化学的に誘導される断片化
法による切断部位を除去するように、突然変異を設計してもよい。該部位の除去
は、特定の酵素または化学的方法での断片化に際し、本発明のポリペプチドのペ
プチドフィンガープリントを改変するであろう。

【０１８８】 ポリペプチドおよび生じた断片化ペプチドは、沈降、電気泳動、クロマトグラ
フィー、および質量分析を含む方法により解析し、それらの分子量を決定しても
よい。各片の特有のアミノ酸配列が分子量を特定するため、これらの片はその後
、未知のタンパク質、ポリペプチドまたはその断片の分子量決定を補助するこう
した解析技術を用い、分子量マーカーとして利用することが可能である。本発明
の分子量マーカーは、同様の見かけの分子量を有するタンパク質の見かけの分子
量概算のための分子量マーカーとして特によく働き、そしてその結果、タンパク
質の見かけの分子量測定の正確さを増加させることが可能になる。

【０１８９】 本発明が断片化ペプチド分子量マーカーの使用に関する場合、これらのマーカ
ーは、好ましくは大きさが少なくとも１０アミノ酸である。より好ましくは、こ
れらの断片化ペプチド分子量マーカーは、大きさが１０および１００アミノ酸の
間である。さらにより好ましいのは、大きさが１０および５０アミノ酸の間の断
片化ペプチド分子量マーカーであり、そして特に大きさが１０および３５アミノ
酸の間のものである。最も好ましいのは、大きさが１０および２０アミノ酸の間
の断片化ペプチド分子量マーカーである。

【０１９０】 分子量測定法の中に、沈降、ゲル電気泳動、クロマトグラフィー、および質量
分析がある。特に好ましい態様は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｕ．
Ｋ． Ｌａｅｍｍｌｉ， Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０−６８５， １９７０
）である。慣用的には、該方法は、ドデシル硫酸ナトリウムおよび６−２０％の
間の濃度のアクリルアミドを含むゲルの２つの別個のレーンを用いる。マーカー
および試料を、同一の条件下で同時に分解する能力により、正確さを増加させる
ことが可能になる。もちろん、本発明のポリペプチドを用いた未知のタンパク質
の分子量測定には、多くの異なる技術を用いてもよく、そして本態様はいかなる
点でも本発明の範囲を限定しないことが理解される。

【０１９１】 各非糖鎖付加ポリペプチドまたはその断片は、その特有のアミノ酸配列により
本質的に決定されるｐＩを有する（このｐＩは、当業者により、現在利用可能な
ｐＩ値を予測するよう設計されたいかなるコンピュータープログラムを用い概算
しても、いかなる周知のアミノ酸ｐＫａ表を用い計算しても、または実験により
測定してもよい）。したがって、これらのポリペプチドおよびその断片は、等電
点電気泳動などの技術を用い、未知のタンパク質、ポリペプチド、または断片化
ペプチドの等電点測定を補助する、特定のマーカーとして利用することが可能で
ある。これらのポリペプチドまたは断片化ペプチドマーカーは、本発明のポリペ
プチドまたは断片化ペプチドマーカーのものと近い見かけの等電点を有する未知
のタンパク質の見かけの等電点概算に、特によく働く。

【０１９２】 等電点電気泳動技術は、さらに、ゲル電気泳動などの他の技術と組み合わせ、
分子量および電荷に基づき、タンパク質を同時に分離してもよい。これらのポリ
ペプチドまたは断片化ペプチドマーカーおよび未知のタンパク質を、同一の条件
下で同時に分離する能力により、未知のタンパク質の見かけの等電点測定の正確
さを増加させることが可能になる。これは、方法の性質が、いかなるマーカーも
未知のタンパク質と同時に分離されることを指令する、二次元電気泳動（Ｔ．Ｄ
． ＢｒｏｃｋおよびＭ．Ｔ． Ｍａｄｉｇａｎ， Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍ
ｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ７６−７７（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ， 第
６版， １９９１））などの技術に特有の目的である。さらに、こうした方法を
用い、これらのポリペプチドおよびその断片化ペプチドは、未知のタンパク質ま
たは断片化ペプチドの等電点および分子量両方の測定を補助することが可能であ
る。

【０１９３】 ポリペプチドおよび断片化ペプチドは、未知のタンパク質および分子量マーカ
ー間の区別を可能にする２つの異なる方法を用い、視覚化してもよい。１つの態
様において、本発明のポリペプチドまたは断片化ペプチド分子量マーカーは、こ
れらのマーカーに対して生成された抗体および慣用的なイムノブロッティング技
術を用い、視覚化してもよい。本検出は、未知のタンパク質の検出を生じない慣
用的な条件下で行われる。小さなペプチドは免疫原性エピトープを含まない可能
性があるため、本発明のすべてのポリペプチド断片に対する抗体を生成すること
は不可能である可能性があることが理解される。さらに、本アッセイにおいて、
すべての抗体が働くわけではないであろうことが理解される；が、本発明のポリ
ペプチドおよび断片に結合することが可能な抗体は、慣用的技術を用い、容易に
決定することが可能である。

【０１９４】 未知のタンパク質もまた、慣用的染色法を用い、視覚化する。本発明のポリペ
プチドまたは断片ペプチド分子量マーカーに対する未知のタンパク質のモル過剰
は、慣用的な染色法が、主に未知のタンパク質を検出する程度である。これらの
ポリペプチドまたは断片化ペプチド分子量マーカーレベルは、慣用的染色法によ
り、これらのマーカーがほとんどまたはまったく検出されない程度である。本発
明のポリペプチド分子量マーカーに対する未知のタンパク質の好ましいモル過剰
は、２および１００，０００倍の間である。より好ましくは、これらのポリペプ
チド分子量マーカーに対する未知のタンパク質の好ましいモル過剰は、１０およ
び１０，０００倍の間であり、そして特に１００および１，０００倍の間である
。

【０１９５】 もちろん、これらのポリペプチド分子量マーカーおよびそのペプチド断片を用
いた未知のタンパク質、ポリペプチド、およびその断片化ペプチドの分子量およ
び等電点の測定および検出に、多くの技術を用いてもよく、そしてこれらの態様
はいかなる点でも本発明の範囲を限定しないことが理解される。

【０１９６】 別の態様において、例えば断片化反応の時間または温度を改変することによる
、本発明のポリペプチドの特定のペプチドへの進行性断片化（Ｄ．Ｗ． Ｃｌｅ
ｖｅｌａｎｄら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５２：１１０２−１１０
６， １９７７）の解析は、未知のタンパク質の切断の度合いのコントロールと
して用いてもよい。例えば、同量のポリペプチドおよび未知のタンパク質の、同
一の条件下での切断により、断片化の度合いの直接比較が可能になる。ポリペプ
チドの完全な断片化を生じる条件はまた、未知のタンパク質の完全な断片化をも
生じる可能性がある。

【０１９７】 最後に、本発明に含まれるキットに関しては、こうしたキットの構成要素は、
多様である可能性があるが、典型的には、ポリペプチドおよび断片化ペプチド分
子量マーカーを含む。また、こうしたキットは、断片化に必要な部位が除去され
ているポリペプチドを含んでもよい。さらに、キットは、ポリペプチドおよび未
知のタンパク質の化学的または酵素的切断による、特異的切断のための試薬を含
んでもよい。キットはさらに、本発明のポリペプチドまたはその断片に対して向
けられる抗体を含んでもよい。

【０１９８】 未知のタンパク質の同定 上述のように、ポリペプチドまたはペプチドフィンガープリントを、既知のタ
ンパク質のデータベースに入力しまたは該データベースと比較し、質量分析を用
いた未知のタンパク質の同定を補助してもよい（Ｗ．Ｊ． Ｈｅｎｚｅｌら，
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５０１１−５
０１５， １９９３；Ｄ． Ｆｅｎｙｏら， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
１９：９９８−１００５， １９９８）。これらの比較を容易にする多様なコ
ンピューターソフトウェアプログラム、例えばＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃ
ｔｏｒ（インターネットサイト：ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｓｃｆ．ｅｄｕ）、
ＭｕｌｔｉＩｄｅｎｔ（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／
ｓｐｒｏｔ／ｍｕｌｔｉｉｄｅｎｔ．ｈｔｍｌ）、ＰｅｐｔｉｄｅＳｅａｒｃｈ
（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｍａｎｎ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｅｄｅｌｂｅｒ
ｇ．ｄｅ．．．ｄｅＳｅａｒｃｈ／ＦＲ＿ＰｅｐｔｉｄｅＳｅａｒｃｈ Ｆｏｒ
ｍ．ｈｔｍｌ）、およびＰｒｏＦｏｕｎｄ（インターネットサイト：ｗｗｗ．ｃ
ｈａｉｔ−ｓｇｉ．ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏ
ｔ−ｉｄ−ｆｒａｇ．ｈｔｍｌ）などが、インターネットを介し利用可能である
。これらのプログラムは、使用者が切断剤および指示された許容範囲の断片化ペ
プチドの分子量を特定するのを可能にする。該プログラムは、未知のタンパク質
の同定の決定を補助するため、観察された分子量を配列データベース由来の予測
されるペプチド分子量と比較する。

【０１９９】 さらに、タンデム型質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）を用い、ポリペプチドまたはペ
プチド消化物を配列決定し、そして生じた配列をデータベースに対し検索しても
よい（Ｊ．Ｋ． Ｅｎｇら， Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ．
５：９７６−９８９（１９９４）；Ｍ． ＭａｎｎおよびＭ． Ｗｉｌｍ，
Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ６６：４３９０−４３９９（１９９４）；Ｊ．Ａ．
ＴａｙｌｏｒおよびＲ．Ｓ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍ． Ｍ
ａｓｓ Ｓｐｅｃ． １１：１０６７−１０７５（１９９７））。本方法に用い
てもよい検索プログラムは、Ｌｕｔｅｆｉｓｋ ９７（インターネットサイト：
ｗｗｗ．ｌｓｂｃ．ｃｏｍ：７０／Ｌｕｔｅｆｉｓｋ９７．ｈｔｍｌ）、並びに
上述のＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅａｒｃｈ
およびＰｒｏＦｏｕｎｄなど、インターネット上に存在する。

【０２００】 したがって、遺伝子配列並びにその予測されるタンパク質配列およびペプチド
断片を配列データベースに添加することにより、質量分析を用いた未知のタンパ
ク質の同定を補助することが可能である。

【０２０１】 抗体 本発明のポリペプチドに免疫反応性である抗体が本明細書に提供される。こう
した抗体は、（非特異的結合と対照的に）抗体の抗原結合部位を介し、該ポリペ
プチドに特異的に結合する。したがって、上述のようなポリペプチド、断片、変
異体、融合タンパク質などを、それと免疫反応性である抗体を産生する際の「免
疫原」として使用してもよい。より詳細には、ポリペプチド、断片、変異体、融
合タンパク質などは、抗体形成を引き出す抗原決定基またはエピトープを含む。

【０２０２】 これらの抗原決定基またはエピトープは、直鎖でもコンホメーション性（ｃｏ
ｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）（断続的）でもどちらでもよい。直鎖エピトープは
、該ポリペプチドのアミノ酸の単一の部分から構成されるが、コンホメーション
性または断続的エピトープは、タンパク質フォールディングに際し、ごく接近す
るポリペプチド鎖の異なる領域由来のアミノ酸部分から構成される（Ｃ．Ａ．
Ｊａｎｅｗａｙ， Ｊｒ．およびＰ． Ｔｒａｖｅｒｓ， Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ ３：９（Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．， 第
２版， １９９６））。フォールディングされたタンパク質は、複雑な表面を有
するため、利用可能なエピトープの数は非常に数多い；が、タンパク質のコンホ
メーションおよび立体障害のため、実際にエピトープに結合する抗体の数は、利
用可能なエピトープの数より少ない（Ｃ．Ａ． Ｊａｎｅｗａｙ， Ｊｒ．およ
びＰ． Ｔｒａｖｅｒｓ， Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２：１４（Ｇａｒ
ｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．， 第２版， １９９６））。エピ
トープは、当業に知られるいかなる手段により同定してもよい。

【０２０３】 したがって、本発明の１つの側面は、本発明のポリペプチドの抗原性エピトー
プに関する。こうしたエピトープは、以下により詳細に記載されるように、抗体
、特にモノクローナル抗体を作成するのに有用である。さらに、本発明のポリペ
プチド由来のエピトープは、アッセイにおいて、そしてポリクローナル血清また
は培養ハイブリドーマ由来の上清などの材料から特異的に結合する抗体を精製す
る研究試薬として用いてもよい。こうしたエピトープまたはその変異体は、固相
合成、ポリペプチドの化学的または酵素的切断などの当業に周知の技術を用い、
あるいは組換えＤＮＡ技術を用い、産生してもよい。

【０２０４】 本発明のポリペプチドのエピトープにより引き出される可能性がある抗体に関
しては、エピトープが単離されていてもまたはポリペプチドの一部のままであっ
ても、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体はどちらも、慣用的技術により
調製することが可能である。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ： Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ． Ｋｅｎｎｅｔら（監修）， Ｐｌｅ
ｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク（１９８０）； およびＡｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ＨａｒｌｏｗおよびＬａ
ｎｄ（監修）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８８）を
参照されたい。

【０２０５】 本発明のポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ細胞株もまた、本明細書に意図される。こうしたハイブリドーマは、慣用的技
術により産生しそして同定してもよい。こうしたハイブリドーマ細胞株を産生す
るための１つの方法は、動物をポリペプチドで免疫感作し；免疫感作された動物
から脾臓細胞を採取し；前記脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによりハ
イブリドーマ細胞を生成し；そして該ポリペプチドに結合するモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することを含む。モノクローナル抗体
は、慣用的技術により回収してもよい。

【０２０６】 本発明のモノクローナル抗体には、キメラ抗体、例えば、ネズミモノクローナ
ル抗体のヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）型が含まれる。こうしたヒト化抗体を既
知の技術により調製し、そして抗体がヒトに投与されるとき、免疫原性の減少と
いう利点を提供してもよい。１つの態様において、ヒト化モノクローナル抗体は
、ネズミ抗体の可変部（またはその抗原結合部位のみ）およびヒト抗体由来の定
常部を含む。あるいは、ヒト化抗体断片は、ネズミモノクローナル抗体の抗原結
合部位およびヒト抗体由来の可変部断片（抗原結合部位を欠く）を含んでもよい
。キメラおよび工学技術で作成されるさらなるモノクローナル抗体の産生法には
、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３， １９８８）、 Ｌ
ｉｕら（ＰＮＡＳ ８４：３４３９， １９８７）、Ｌａｒｒｉｃｋら（Ｂｉｏ
／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９３４， １９８９）、およびＷｉｎｔｅｒおよ
びＨａｒｒｉｓ（ＴＩＰＳ １４：１３９， Ｍａｙ， １９９３）に記載され
るものが含まれる。導入遺伝子的に抗体を生成する方法は、ＧＢ ２，２７２，
４４０、米国特許第５，５６９，８２５号および５，５４５，８０６号並びにそ
れらから優先権を請求する関連特許に見ることが可能であり、該特許はすべて本
明細書に援用される。

【０２０７】 慣用的技術により産生されてもよい、抗体の抗原結合断片もまた、本発明に含
まれる。こうした断片の例には、限定されるわけではないが、ＦａｂおよびＦ（
ａｂ’）₂断片が含まれる。遺伝子工学技術により産生される抗体断片および誘 導体もまた提供される。

【０２０８】 １つの態様において、抗体は本発明のポリペプチドに特異的であり、そして他
のタンパク質と交差反応しない。こうした抗体を同定することが可能なスクリー
ニング法が周知であり、そして例えば、免疫アフィニティクロマトグラフィーを
伴ってもよい。

【０２０９】 抗体の使用 本発明の抗体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、本発明のポリペ
プチドまたは断片の存在を検出するアッセイにおいて用いてもよい。抗体はまた
、免疫アフィニティークロマトグラフィーにより本発明のポリペプチドまたは断
片を精製するのに使用してもよい。

【０２１０】 さらに、本発明のポリペプチドの、その結合パートナーへの結合を遮断するこ
とが可能な抗体を用い、こうした結合から生じる生物学的活性を阻害してもよい
。こうした遮断抗体は、結合パートナーを発現している特定の細胞へのＡＣＰＬ
の結合を阻害する能力に関し、抗体を試験することによるなど、いかなる適切な
アッセイ法を用い、同定してもよい。あるいは、遮断抗体は、ＡＣＰＬ結合パー
トナーの標的細胞への結合から生じる生物学的影響を阻害する能力に関するアッ
セイにおいて同定してもよい。抗体は、結合パートナー仲介活性を阻害する能力
に関しアッセイしてもよい。

【０２１１】 こうした抗体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法で使用し、またはｉｎ ｖｉｖｏで投与
し、抗体を生成した実体により仲介される生物学的活性を阻害してもよい。この
ように、ＡＣＰＬ結合パートナーと細胞表面結合パートナー受容体との相互作用
により、（直接または間接的に）引き起こされるまたは悪化される障害を治療し
てもよい。治療法は、結合パートナー仲介生物学的活性を阻害するのに有効な量
の遮断抗体を、哺乳動物にｉｎ ｖｉｖｏ投与することを伴う。一般的に、こう
した治療法の使用には、モノクローナル抗体が好ましい。１つの態様において、
抗原結合抗体断片が使用される。

【０２１２】 抗体は、アゴニスト性（すなわちリガンド模倣性）特性に関しスクリーニング
してもよい。こうした抗体は、細胞表面結合パートナーへの結合に際し、ＡＣＰ
Ｌ結合パートナーが細胞表面ＡＣＰＬに結合する際に誘導される生物学的影響と
同様の生物学的影響（例えば生物学的情報の伝達）を誘導する。アゴニスト性抗
体を用い、ＩＬ−１８仲介活性を誘導してもよい。

【０２１３】 ＡＣＰＬに対して向けられる抗体、および生理学的に許容しうる希釈剤、賦形
剤、またはキャリアーを含む組成物が、本明細書に提供される。こうした組成物
の適切な構成要素は、ＡＣＰＬタンパク質を含む組成物に関し、上述された通り
である。

【０２１４】 やはり本明細書に提供されるのは、抗体に結合している検出可能（例えば診断
用剤）または治療剤を含む結合体である。こうした剤の例は、上に示される。該
結合体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ法に使用を見出す。

【０２１５】 以下の実施例は、本発明の特定の態様を例示するため提供され、そして本発明
の範囲を限定すると解釈してはならない。本明細書は、本明細書に引用される参
考文献の教える内容を考慮に入れると最も完全に理解され、該参考文献は本明細
書に援用される。本明細書中の態様および以下の実施例は、本発明の態様を例示
するため提供され、そして本発明の範囲を限定すると解釈してはならない。当業
者は、多くの他の態様が、請求される発明に含まれることを認識する。以下の実
施例において、記載されるすべての方法は、他に特定されない限り、慣用的であ
る。

【０２１６】

【実施例】

実施例１：マウス核酸の単離 発現配列標識タグデータベースを検索し、ＩＭＡＧＥクローン６４０６１５（
ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第ＡＡ２０３０９７号）がＩＬ−１ＲＡｃＰに対し相同
性を有することを発見することにより、マウスＡＣＰＬ ｃＤＮＡを単離した。
ＩＭＡＧＥクローン６４０６１５を得て、ランダムプライム化により³²Ｐで標識
し、そしてＥＬ４６．１（マウス胸腺細胞）ｃＤＮＡライブラリーを探査する（
ｐｒｏｂｅ）のに用いた。ハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアミドを含
むハイブリダイゼーション溶液中で、４２℃で行った。ＥＬ４６．１ｃＤＮＡク
ローンにより全長読み枠を定めた後、ＰＣＲ増幅を用い、７Ｂ９（マウスＴ細胞
）およびＬＤＡ１１（マウス骨髄ストローマ性）ｃＤＮＡライブラリー由来の別
個の単離体を得ることにより、該読み枠を確認した。プライマーは、マウスＡＣ
ＰＬヌクレオチド配列の（＋１ないし＋３である開始ＡＴＧに対し）ヌクレオチ
ド−１５ないし＋１３およびヌクレオチド１８９２ないし１９１６に対応した。

【０２１７】 実施例２：ヒトＡＣＰＬ核酸配列の単離 ＮＫ細胞ライブラリーの無作為配列決定により得られたＱＱ１３５２と称され
るヒトｃＤＮＡクローンは、実施例１に記載されるように単離されたネズミＡＣ
ＰＬに対し高い度合いの相同性を有することが見出された。該クローンをプロー
ブとして用い、末梢血リンパ球、末梢血Ｔ細胞、およびＮＫ ｃＤＮＡライブラ
リーからヒトＡＣＰＬクローンを単離した。プローブとして用いたクローンＱＱ
１３５２の領域は、マウスＡＣＰＬヌクレオチド１１９６−１１７５３に対し相
同であった。全長クローンは、いずれのライブラリーからも得られず、そのため
、各ライブラリーでベクター固定ＰＣＲを行い、読み枠（配列番号６）の５’末
端を得た。

【０２１８】 実施例３：染色体マップ位の決定 ヒトＡＣＰＬの染色体マップ位は、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｇ３放射ハイブリッド
パネル（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用い、放射ハイブリッドマッ
ピングにより決定した。プライマーは、ＩＬ−１Ｒに対する相同性に関して選択
した。標準的ＰＣＲ条件下で、４０サイクル、増幅を行った。

【０２１９】 結果により、ヒトＡＣＰＬは、染色体２上に配置され、１２．７２の確率スコ
ア対数で、ＡＦＭ３１６ｔｇ５に最も近く連鎖した。これは、染色体２の、ＩＬ
−１Ｒ Ｉ型、ＩＬ−１Ｒ ＩＩ型、ＩＬ−１Ｒ−ｒｐ１、およびＴ１／ＳＴ２
がマッピングされているのと同じ領域である。

【０２２０】 実施例４：ノーザンブロット解析 ヒト多数組織ブロットをＣＬＯＮＴＥＣＨ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉ
ｎｃ．より購入し、そして該ブロットは、正常ヒト脾臓、胸腺、前立腺、精巣、
卵巣、小腸、結腸、および末梢血リンパ球由来のｍＲＮＡ ２μｇを含んだ。該
ブロットを、５０％ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション緩衝液中で、３
２Ｐ標識アンチセンスヒトＡＣＰＬリボプローブと、６３℃で一晩ハイブリダイ
ズさせ、そしてその後、０．１ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で６８℃で洗浄した
。曝露後、標準化のため、β−アクチンに対するランダムプライム標識化プロー
ブで、該ブロットを再ハイブリダイズした。

【０２２１】 結果により、ヒトＡＣＰＬは末梢血リンパ球および脾臓で強く発現されている
ことが立証された。ヒトＡＣＰＬは、より低い度合いで、結腸で発現している。
結果によりさらに、ヒトＡＣＰＬは前立腺および小腸ｍＲＮＡで弱く発現してい
ることが立証された。主なｍＲＮＡ産物は、およそ３．８キロ塩基であり、およ
そ２．６および８．０キロ塩基の弱いバンドが見られた。発現はまた、ノーザン
解析により、肺ｍＲＮＡでも検出された。

【０２２２】 実施例５：ＡＣＰＬポリペプチドおよびＡＣＰＬ：ＦＣ融合体の発現 マウスおよびヒトＡＣＰＬポリペプチドを発現させるため、全長マウスおよび
ヒトＡＣＰＬヌクレオチド配列を、ＰＣＲにより生成し、そしてｐＤＣ３０２の
変異体であるｐＤＣ３０４にクローン化した。ヒトＡＣＰＬ：Ｆｃ融合タンパク
質を発現させるため、Ｂａｕｍら， ＥＭＢＯ Ｊ． １３：３９９２−４００
１（１９９４）に記載されるように、ヒトＡＣＰＬ発現ベクターの細胞外部分（
アミノ酸１−３５６）をヒトＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインに連結し、
そして生成した。

【０２２３】 実施例６：ＣＯＳおよびＳ４９細胞におけるＡＣＰＬポリペプチドを通じたＮ ＦκＢの誘導 マウスＡＣＰＬポリペプチド（配列番号２）がＩＬ−１８情報伝達に関与する
受容体であるか決定するため、ＡＣＰＬポリペプチドをＣＯＳ細胞およびＳ４９
．１細胞で過剰発現し、そしてＮＦκＢ活性化に対するＩＬ−１８刺激の影響を
評価した。１２ウェル形式で、ＣＯＳ−７細胞をＤＥＡＥ／デキストラン法によ
りトランスフェクションした。受容体をコードする発現ベクター総量２００ｎｇ
、およびルシフェラーゼ発現を仲介する３つのＮＦκＢ部位を含むＮＦκＢ−Ｌ
ｕｃレポータープラスミド８００ｎｇで、各ウェルをトランスフェクションした
。およそ１０⁷のＳ４９．１細胞を、ＮＦκＢ−Ｌｕｃレポータープラスミド４ ０μｇ、および受容体をコードする発現ベクター総量２０μｇで、０．７ ｍｌ
中で、エレクトロポレーションにより、トランスフェクションした。エレクトロ
ポレーションは、９６０μＦおよび３２０Ｖで行った。

【０２２４】 細胞を２日間インキュベーションし、そしてその後４０ｎｇ／ｍｌのネズミＩ
Ｌ−１８（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）で４時間刺激した。細胞を洗浄し、溶解し、そ
して製造者の指示にしたがい、ルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ
Ｃｏｒｐ．）を用い、ルシフェラーゼ活性に関しアッセイした。

【０２２５】 ベクターのみ、ＩＬ−１Ｒｒｐ１をコードする発現ベクターのみ、またはＡＣ
ＰＬポリペプチドをコードする発現ベクターのみでトランスフェクションした細
胞は、ＩＬ−１８刺激に反応性ではなかった。さらに、受容体をコードする発現
ベクターを単独で、あるいはＩＬ−１Ｒ Ｉ型またはＩＬ−１ＲＡｃＰをコード
する発現ベクターと組み合わせてトランスフェクションした場合、ＩＬ−１情報
伝達においてＡＣＰＬのいかなる機能も検出されなかった。しかし、ＩＬ−１Ｒ
ｒｐ１およびＡＣＰＬポリペプチドをコードする発現ベクターで共トランスフェ
クションした細胞にＩＬ−１８を添加すると、ＣＯＳ細胞において１０倍、そし
てＳ４９細胞において３００倍、ＮＦκＢ連結遺伝子の発現が誘導された。ＮＦ
κＢ活性のこの劇的な刺激は、ＡＣＰＬポリペプチドが、ＩＬ−１Ｒｒｐ１と共
同作用するＩＬ−１８受容体の構成要素であり、ＩＬ−１８刺激に反応してＮＦ
κＢ情報伝達を誘導することを示す。

【０２２６】 実施例７：ＪＮＫ活性の活性化 ＪＮＫ活性の誘導は、ＩＬ−１経路の下流情報伝達事象である。上述のＮＦκ
Ｂ誘導実験と同様、ＡＣＰＬのみで、またはＩＬ−１Ｒｒｐ１と組み合わせて、
ＩＬ−１８によるＪＮＫ活性の誘導を仲介することが可能であるか調べた。ＪＮ
Ｋ活性の活性化はＢｉｒｄら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：３１
８３６−３１８４４， １９９４に記載されるように評価した。トランスフェク
ション２日後、ＣＯＳ７細胞をＩＬ−１８で１５分間刺激し、溶解し、そして２
つの抗ＪＮＫ抗体（ｃ−１７およびＦＬ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔａｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．）の組み合わせで免疫沈降した。キナーゼ緩衝液
中で、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−ｃ−Ｊｕｎ（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．）および［γ−³²］ＡＴＰを添加するこ
とにより、この免疫複合体を活性に関しアッセイした。反応を室温で３０分間進
め、その後Ｌａｅｍｍｌｉ装填緩衝液を添加し反応を停止し、そして産物を４−
２０％アクリルアミドゲル上で電気泳動し、染色し、乾燥し、そしてＰｈｏｓｐ
ｈｏＩｍａｇｅｒ上で解析した。

【０２２７】 ＮＦκＢの活性化に関し得られた結果同様、ＪＮＫ活性は、ＩＬ−１Ｒ−Ｒｐ
１およびＡＣＰＬが共発現された際のみ、ＣＯＳ７細胞においてＩＬ−１８によ
り誘導された。

【配列表】

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年２月１０日（２０００．２．１０）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA63 BA80 CA04 CA07 CA09 CA20 DA02 EA04 GA11 HA13 HA14 4B065 AA90X AA91Y AA93Y AB01 AC14 BA02 BD50 CA24 CA44 CA46 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA51 DA75 EA20 EA50 FA71 FA74

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）配列番号１のコード領域； （ｂ）配列番号６のコード領域； （ｃ）配列番号３； （ｄ）配列番号４；および （ｅ）中程度にストリンジェントな（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）条件下で、（ａ）お
   よび（ｂ）のＤＮＡにハイブリダイズすることが可能なＤＮＡ、ここで中程度に
   ストリンジェントな条件は、６０℃、０．５ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄
   条件を伴う、５０％ホルムアミドおよび６ＸＳＳＣ、４２℃を含む からなる群より選択されるＤＮＡ配列を含む、単離核酸分子。
2. 【請求項２】 ポリペプチドをコードする単離核酸分子であって、前記ポ
   リペプチドが配列番号２および配列番号７からなる群より選択されるアミノ酸配
   列に、少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、前記単離核酸分子。
3. 【請求項３】 配列番号２および配列番号７からなる群より選択されるア
   ミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする単離核酸分子。
4. 【請求項４】 配列番号１または配列番号６からｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変
   異誘発により得られる、請求項３の単離核酸分子。
5. 【請求項５】 遺伝暗号の結果として、配列番号１または配列番号６から
   なる群より選択されるＤＮＡから縮重している、単離核酸分子。
6. 【請求項６】 可溶性ポリペプチドをコードする単離核酸であって、前記
   可溶性ポリペプチドが： （ａ）配列番号２のアミノ酸ｘ₁ないし３５６、ここでｘ₁はアミノ酸１または１
   ５である；および （ｂ）配列番号７のアミノ酸ｘ₁ないし３５６、ここでｘ₁はアミノ酸１または１
   ５である からなる群より選択される配列に、少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を
   含む、前記単離核酸。
7. 【請求項７】 （ａ）配列番号２のアミノ酸ｘ₁ないし３５６、ここでｘ₁ はアミノ酸１または１５である；および （ｂ）配列番号７のアミノ酸ｘ₁ないし３５６、ここでｘ₁はアミノ酸１または１
   ５である からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む可溶性ポリペプチドをコードする
   単離核酸。
8. 【請求項８】 （ａ）配列番号２； （ｂ）配列番号７；および （ｃ）生物学的に活性がある（ａ）および（ｂ）の断片 からなる群より選択される配列に、少なくとも８０％同一であるアミノ酸を含む
   ポリペプチド。
9. 【請求項９】 （ａ）配列番号２； （ｂ）配列番号７；および （ｃ）生物学的に活性がある（ａ）および（ｂ）の断片 からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
10. 【請求項１０】 （ａ）配列番号１のコード領域； （ｂ）配列番号６のコード領域；および （ｃ）中程度にストリンジェントな条件下で、（ａ）および（ｂ）のＤＮＡにハ
    イブリダイズすることが可能なＤＮＡ からなる群より選択されるＤＮＡにコードされるポリペプチド。
11. 【請求項１１】 （ａ）配列番号２のアミノ酸ｘ₁ないし３５６、ここで ｘ₁はアミノ酸１または１５である； （ｂ）配列番号７のアミノ酸ｘ₁ないし３５６、ここでｘ₁はアミノ酸１または１
    ５である；および （ｃ）生物学的に活性がある（ａ）および（ｂ）のポリペプチドの断片 からなる群より選択される配列に、少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を
    含むポリペプチド。
12. 【請求項１２】 （ａ）配列番号２のアミノ酸ｘ₁ないし３５６、ここで ｘ₁はアミノ酸１または１５である； （ｂ）配列番号７のアミノ酸ｘ₁ないし３５６、ここでｘ₁はアミノ酸１または１
    ５である；および （ｃ）生物学的に活性がある（ａ）および（ｂ）のポリペプチドの断片 からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
13. 【請求項１３】 請求項１１のポリペプチドおよびＩｇのＦｃ領域を含む
    、融合タンパク質。
14. 【請求項１４】 請求項２のＤＮＡを含む、組換え発現ベクター。
15. 【請求項１５】 請求項１４の発現ベクターで形質転換されている宿主細
    胞を、ポリペプチドの発現を促進する条件下で培養することを含む、ポリペプチ
    ドを調製するための方法。
16. 【請求項１６】 請求項１４の発現ベクターで形質転換またはトランスフ
    ェクションされている宿主細胞。
17. 【請求項１７】 請求項８のポリペプチドに免疫反応性である抗体。