NO316448B1 - Nukleinsyre kodende for melanocytt-stimulerende hormonreseptorer, dens DNAog aminosyresekvens, homogen sammensetning av nevnte reseptor,hybridiseringsprobe, rekombinant ekspresjonskonstruksjon og cellekulturinneholdende denne - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører melanocytt-stimulerende hormonreseptorer fra pattedyr og gener som tilsvarer slike reseptorer Oppfinnelsen vedrører spesielt isolering, kloning og sekvensering av et humant melanocytt-stimulerende hormonreseptor gen Isolering, kloning og sekvensering av et muse melanocytt-stimulerende hormonreseptorgen er også beskrevet Foreliggende oppfinnelse vedrører videre konstruksjon av eukaryote rekombinante ekspresjonskonstruksjoner som kan uttrykke disse melanocytt-stimulerende hormonreseptorerene i kulturer av transformerte eukaryote celler, og produksjon av melanocytt-stimulerende hormonreseptor i slike kulturer Oppfinnelsen vedrører videre anvendelse av slike kulturer av transformerte eukaryote celler for å produsere homogene sammensetninger av slike melanocytt-stimulerende hormonreseptorer Oppfinnelsen tilveiebringer også kulturer av slike celler som produserer melanocytt-stimulerende hormonreseptor

Proopiomelanocortin (POMC) genproduktet blir prosessert for å produsere et stort antall biologiske aktive peptider To av disse peptidene, a-melanocytt-stimulerende hormon (cc-MSH) og adrenokortikotropisk hormon (ACTH) har kjente roller innen kontroll av henholdsvis melanocytt og adrenokortikal-funksjonen Begge disse hormonene finnes i forskjellige former med ukjente funksjoner Melanokortin-peptidene har også forskjellige biologiske aktiviteter i andre vev, inkludert hjernen og immunsystemet, og blir bun-det til spesifikke reseptorer der med bestemt farmakologi (se Hanneman et al, i Peptide Hormone as Prohormones, G martmez, ed (Ellis Horwood Ltd Chichester, UK) s 53-82, DeWied & Jolles, 1982, Physiol Rev 62 976-1059 for en oversikt)

En fullstendig forståelse av disse peptidene og deres mange biologiske aktiviteter krever isolering og karakterisering av deres korresponderende reseptorer Noen biologiske studier er blitt rapportert tidligere

Shimuze, 1985, Yale J Biol Med 58 561-570 beskriver fysiologien til melanocytt-stimulerende hormon

Tatro & Reichlm, 1987, Endocnnology 121 1900-1907 beskriver at MSH-reseptorer er omfattende distribuert i vev fra gnagere

Solca et al, 1989, J Biol Chem 264 14277-14280 beskriver karakterisering av molekylvekten til mus og human MSH-reseptorer koblet til radioaktivt og fotoaffimtets-mer-kede MSH-analoger

Siegnst et al, 1991, J Reseptor Res 11 323-331 beskriver kvantifisering av reseptorer på melanomvev fra mus ved reseptor autoradiografi

Foreliggende oppfinnelse omfatter en isolert nukleinsyre, kjennetegnet ved at den koder for en mammalsk melanocytt-stimulerende hormonreseptor som omfatter aminosyresekvensen identifisert ved SEQ ID nr 4 eller 6

Omfattet av oppfinnelsen er også en DNA-sekvens som angitt over, kjennetegnet ved at pattedyr-melanocyttstimulerende-hormonreseptoren som blir kodet den har melanotropiske peptidresponsegenskaper som beskrevet i figur 3

Videre omfatter oppfinnelsen en homogen sammensetning av en 35 3 kilodalton melanocytt-stimulerende hormonreseptor eller denvat derav, kjennetegnet ved at aminosyre-sekvensen til melanocytt-stimulerende hormon reseptor eller derivatet derav omfatter MSH-R sekvensen fra mus vist i figur 2 (SEQ ID Nr 4)

Foreliggende oppfinnelse omfatter også en nukleinsyre-hybndisenngsprobe for deteksjon av pattedyr melanocytt-stimulerende hormonreseptor-ekspresjon som omfatter nukleotidsekvensen ifølge krav 5, der proben er tilpasset for anvendelse ved deteksjon og diagnostikk av genetisk sykdom i et menneske eller er tilpasset for anvendelse ved deteksjon, isolering og karakterisering av nye pattedyr reseptorgener og en rekombinant ekspresjons-konstruksjon, samt at den omfatter en nukleotidsekvens kodende for en pattedyr melanocytt-stimulerende hormonresptor, eller omfatter pcDNAI/Neo-sekvenser

Omfattet av oppfinnelsen er også en eukaryot cellekultur transformert med ekspresjonskonstruksjonen angitt ovenfor, der den transformerte eukaryote cellekulturen kan uttrykke musemelanocytt-stimulerende hormonreseptor

BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Figur 1 illustrerer nukleotidsekvensen til mus (SEQ ID NO 3) og human (SEQ ID NO 5) melanocytt-stimulerende hormonreseptor Figur 2 presenterer en sammenligning av aminosyresekvensen mellom mus og human melanocytt-stimulerende hormonreseptorproteiner Figur 3 illustrerer binding av melanocytt-stimulerende hormonreseptoragomster til musemelanocytt-stimulerende hormonreseptor uttrykt i humane 293-celler Figur 4 illustrerer vevsfordehngen av human (panel A) og mus (panel B) melanocyttstimulerende hormonreseptorgen-ekspresjon ved Northern blothybndisenng

Foreliggende oppfinnelse vedrører kloning, ekspresjon og funksjonell karakterisering av pattedyr melanocytt-stimulerende hormonreseptor (MSH<R>) gener Oppfinnelsen omfatter nukleotidsekvensen til disse genene som koder for pattedyr MSH<R> og de avledede aminosyresekvensene til beslektede proteiner, samt

vevsdistnbusjonsmønstrene til ekspresjon av disse genene

Foreliggende oppfinnelse er spesielt rettet mot isolering og karakterisering av human MSH<R>, genet tilsvarende denne reseptoren, en nukleinsyre hybndisenngsprobe bestående av DNA-sekvenser av human MSH<R>, en rekombinant eukaryot ekspresjons-konstruksjon som kan uttrykke human MSH<R> i kulturer av transformerte eukaryote celler og slike kulturer av transformerte eukaryote celler som syntetiserer human MSH<R>, og en homogen sammensetning av human MSH<R>

Foreliggende oppfinnelse er også rettet mot isolering, karakterisering av muse MSHR genet som tilsvarer denne reseptoren, en nukleinsyrehybndisenngsprobe omfattende DNA-sekvenser av muse MSHR en rekombinant eukaryot ekspresjonskonstruksjon som kan uttrykke muse MSH<R> i kulturer av transformerte eukaryote celler og slike kulturer av transformerte eukaryote celler som syntetiserer muse mshR og en homogen sammensetning av muse MSH<R>

Det er en hensikt ifølge oppfinnelsen å tilveiebringe en nukleinsyre som omfatter en nukleotidsekvens kodende for en pattedyr MSH<R> I en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen koder nukelotidsekvensen for human MSH<R> I en annen foretrukket utfø-relsesform koder nukleotidsekvensen for muse MSH<R>

Foreliggende oppfinnelse innbefatter en nukleinsyre som omfatter en nukleotidsekvens kodende for en human MSH<R> reseptor avledet fra et DNA molekyl isolert fra et humant genomisk bibliotek (SEQ ID NO 5) I denne utførelsesformen av oppfinnelsen innbefatter nukeleotidsekvensen 1635 nukleotider av det humane MSH<R> genet omfattende 953 nukleotider av kodende sekvens, 462 nukleotider av 51 utranslatert sekvens og 220 nukleotider av 3' utranslatert sekvens

Foreliggende oppfinnelse innbefatter også en nukleinsyre som omfatter en nukleotidsekvens kodende for en mus MSH<R> avledet fra et cDNA molekyl isolert fra et cDNA bibliotek konstruert med RNA fra muse Cloudman melanom celler (SEQ ID NO 3) I denne utførelsesformen av oppfinnelsen innbefatter nukleotidsekvensen 1260 nukleotider av muse MSH<R> genet omfattende 947 nukleotider av kodende sekvens, 15 nukleotider av 5' utranslatert sekvens og 298 nukleotider av 3' utranslatert sekvens

Oppfinnelsen innbefatter nukleinsyre som omfatter nukleotidsekvensene til pattedyr MSH<R>, fortrinnsvis mus og human MSH<R> (SEQ ID NOs 3 og 5), og innbefatter allele-vanasjoner av disse nukleotidsekvensene og tilsvarende MSH<R> molekyl, enten naturlig forekommende eller produktet av in vitro kjemisk eller genetisk modifikajson, idet enhver slik variant har vesentlig samme nukleotidsekvens som nukleotidsekvensen til tilsvarende MSH<R> beskrevet hen, hvor det resulterende MSH<R> molekylet har vesentlig samme biologiske egenskaper som MSH<R> molekylet som tilsvarer nukleotidsekvensen beskrevet hen Betegnelsen "vesentlig homolog med" som anvendt i denne oppfinnelsen omfatter en slik allehsk vanabihtet som beskrevet i denne paragrafen

Oppfinnelsen omfatter også et protein bestående av en forutbestemt aminosyresekvens for mus (SEQ ID NO 4) og human (SEQ ID NO 6) MSH<R> utledet fra nukleotidsekvensen som omfatter den fullstendige kodende sekvensen til mus (SEQ ID NO 3) og human (SEQ ID NO 5) genet som beskrevet hen

Et annet aspekt av oppfinnelsen omfatter en homogen sammensetning av et 35 3 kilodalton mus MSH<R> eller denvat derav, hvor aminosyresekvensen til MSH<R> eller denva-tet derav omfatter mus MSH-R sekvensen vist i figur 2 (SEQ ID NO 4)

I et annet aspekt omfatter oppfinnelsen en homogen sammensetning av et 34 7 kilodalton human MSH<R> eller denvat derav, hvor aminosyresekvensen til MSH<R> eller denva-tet derav omfatter den humane MSH-R sekvensen vist i figur 2 (SEQ ID NO 6)

Foreliggende oppfinnelse tilveiebnnger både nukleotid og aminosyreprober avledet fra disse sekvensene Oppfinnelsen innbefatter prober isolert fra enten cDNA eller genomiske DNA-kloner, samt prober dannet syntetisk med sekvensinformasjonen avledet derfra Oppfinnelsen omfatter spesifikt, men er ikke begrenset til, ohgonukleotidet, nick-translatert, tilfeldig pnmet eller in vitro amplifiserte prober dannet ved anvendelse av cDNA eller genomisk klon som omfatter oppfinnelsen, og ohgonukleotidet eller andre syntetiske prober syntetisert kjemisk ved anvendelse av nukleotidsekvensinformasjonen til cDNA eller genomisk klon innbefattet i oppfinnelsen

Det er en ytterligere hensikt ifølge denne oppfinnelsen å tilveiebringe sekvenser av pattedyr MSHR fortrinnsvis mus eller human MSH<R>, for anvendelse som nukleinsyre-hybndisenngsprober for å bestemme mønsteret, mengden og grad av ekspresjon av denne reseptoren i forskjellige vev fra pattedyr, inkludert mennesker Det er også en hensikt ifølge oppfinnelsen å tilveiebringe nukleinsyre-hybndisenngsprober avledet fra sekvenser fra mus eller human MSH<R> for og anvendes for deteksjon og diagnostikk av genetiske sykdommer Det er en hensikt ifølge denne oppfinnelsen å tilveiebringe nuk-leinsyrehybndisenngsprober avledet fra DNA-sekvensene til mus eller human MSH<R >for å bh anvendt for deteksjon av nye beslektede reseptorgener

Foreliggende oppfinnelse innbefatter også syntetiske peptider som er dannet ved anvendelse av nukleotidsekvensinformasjonen omfattende cDNA eller genomisk klon innbefattet ifølge oppfinnelsen Oppfinnelsen innbefatter enten naturlig forekommende eller syntetiske peptider som kan bh anvendt som antigener for produksjon av MSH<R> -spesifikke antistoffer, eller anvendt for konkurrenter for MSH<R> molekylet for medikament-binding, eller bh anvendt for produksjon av inhibitorer for binding av agonister eller antagonister eller analoger derav til MSH<R> molekylet

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en rekombinant ekspresjonskonstruksjon omfattende nukleotidsekvensen til et pattedyr MSH<R>, fortrinnsvis mus eller humant MSH<R >og sekvenser tilstrekkelig for å lede syntesen av mus eller human MSH<R> i kulturer av transformerte eukaryote celler I en foretrukket utførelsesform består den rekombinante ekspresjonskonstruksjonen av plasmidsekvenser avledet fra plasmid pcDNAI/neo og cDNA eller genomisk DNA fra mus eller humant MSH<R> gen Foreliggende oppfinnelse innbefatter en rekombinant ekspresjonskonstruksjon omfattende vesentlig nukleotidsekvensene til genomisk eller cDNA kloner fra mus eller human MSH<R> i en utførelsesform som tilveiebringer ekspresjon derav i kulturer av transformerte eukaryote celler

Det er også en hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe kulturer av transformerte eukaryote celler som er blitt transformert med en slik rekombinant ekspresjonskonstruksjon og som syntetiserer pattedyr, fortrinnsvis mus eller humant, MSH<R >protein I en foretrukket utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen humane 293 celler som syntetiserer muse MSH<R> I en ytterligere foretrukket utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen humane 293 celler som syntetiserer humant MSH<R> protein

Foreliggende oppfinnelse innbefatter også proteinpreparater av pattedyr, fortrinnsvis mus eller humant MSH<R>, og preparater av membraner inneholdende pattedyr MSHR avledet fra kulturer av transformerte eukaryote celler I en foretrukket utførelsesform blir cellemembraner inneholdende muse MSH<R> protein isolert fra 293 cellekulturer transformert med en rekombinant ekspresjonskonstruksjon som leder syntesen av muse MSH<R> I en annen foretrukket utførelsesform blir cellemembraner inneholdende humant MSH<R> protein isolert fra 293 cellekulturer transformert med en rekombinant ekspresjonskonstruksjon som leder syntesen av humant MSH<R> Det er også en hensikt ifølge oppfinnelsen å tilveiebringe pattedyr, fortrinnsvis mus eller humant MSH<R> for anvendelse i in vitro screening i ny adenosinagonist og antagonistforbindelser I en foretrukket utførelsesform blir membranpreparater inneholdende muse MSH<R>, avledet fra kulturer av transformerte eukaryote celler, anvendt for å bestemme medikamentets dis-sosienngsegenskaper til forskjellige nye adenosinagonist og antagonist forbindelser in vitro I en annen foretrukket utførelsesform blir membranpreparater inneholdende humant MSHR avledet fra kulturer av transformerte eukaryote celler, anvendt for å bestemme medikamentdissosiasjonsegenskapene til forskjellige nye adenosinagonist og antagonist forbindelser in vitro Disse egenskapene blir deretter anvendt for å karakterisere slike nye forbindelser ved sammenligning av bindingsegenskapene til kjente mus eller humane MSH<R> agonister og antagonister

Foreliggende oppfinnelse er også nyttig for in vtvo deteksjon av analoger av agonister eller antagonister av MSH<R>, kjente eller ukjente, enten naturlig forekommende eller som utførelsesformer av et medikament

Det er mulig å tilveiebringe en fremgangsmåte for kvantitativ deteksjon av agonister eller antagonister, eller analoger derav, av MSH<R>, kjente eller ukjente, enten naturlig forekommende eller som utførelsesformer av et medikament

Spesifikt foretrukne utførelsesformer ifølge foreliggende oppfinnelse vil fremkomme ut fra den følgende beskrivelsen og kravene

Betegnelsen "melanocytt-stimulerende hormonreseptor" som anvendt hen refererer til proteiner som er vesentlig homologe med, og som har vesentlig samme biologiske aktivitet som, proteinet som blir kodet for av nukleotidsekvensen angitt i figur 1 (SEQ ID NO 3) Denne definisjonen skal omfatte naturlige allehske vanasjoner i den melanocyttstimulerende hormonreseptorsekvensen Klonede gener ifølge foreliggende oppfin-neise kan kode for MSH<R> fra forskjellige artsoppnnnelser, inkludert for eksempel mus, rotte, kanin, katt og mennesker, men koder fortrinnsvis for reseptorer fra pattedyr, mest foretrukket er en opprinnelse fra mus eller mennesker

Nukleinsyre-hybndisenngsprober tilveiebrakt ifølge oppfinnelsen omfatter DNA-sekvenser som er vesentlig homologe med DNA-sekvensene i figur IA (SEQ ID NO 3) og IB (SEQ ID NO 5) Nukleinsyreprober er nyttige for detektering av MSH<R> genekspre-sjonen i celler og vev ved anvendelse av velkjente teknikker innenfor fagområdet, inkludert, men ikke begrenset til Northern blot hybridisering, in situ hybridisering og Southern hybndisenng til revers transknptase-polymerasekjedereaksjonsprodukt DNA Probene tilveiebrakte ifølge foreliggende oppfinnelse, inkludert ohgonukleotidprober avledet derfra, er også nyttige for Southern hybndisenng av pattedyr, fortnnnsvis human, genomisk DNA for screening for restnksjonsfragmentlengde polymorfisme (RFLP) assosiert med visse genetiske forstyrrelser

Produksjon av proteiner så som MSH<R> fra klonede gener ved genetisk modifisenng er velkjent Se for eksempel US-PS 4 761 371 til Bell et al i kol 6 linje 3 til kol 9 linje 65 (Besknvelsen av alle US patentreferansene sitert hen er lnnkorporert hen som referanse) Diskusjonen som følger skal omfatte en oversikt over dette området og ikke reflektere den fullstendige tilstanden ifølge dette fagområdet

DNA som koder for MSH<R> kan oppnås, i lys av foreliggende oppfinnelse, ved kjemisk syntese, ved screening av reverse transknpter av mRNA fra hensiktsmessige celler eller cellehnjekulturer, ved screening av genomiske bibliotek fra hensiktsmessige celler, eller ved kombinasjoner av disse prosedyrene, som angitt nedenfor Screening av mRNA eller genomisk DNA kan utføres med ohgonukleotidprober dannet fra MSH<R> gensek-vensinformasjon gitt hen Prober kan bh merket med en detekterbar gruppe såsom en fluorescensgruppe, et radioaktivt atom eller en kjemilumimscens gruppe i henhold til kjente prosedyrer og anvendt i konvensjonelle hybndisenngsanalyser, som beskrevet i detalj i eksemplene nedenfor I alternativer kan MSH2R gensekvensene oppnås ved anvendelse av polymerasekjedereaksjon (PCR) i det PCR ohgonukleotidpnmerene blir produsert fra MSH<R> gensekvensen gitt hen Se US-PS 4 683 195 til Mulhs et al og 4 683 202 til Mulhs

MSH<R> kan bh syntetisert i vertsceller transformert med en rekombinant ekspresjons-konstruksjon omfattende en DNA-sekvens kodende for MSH<R> En slik rekombinant ekspresjonskonstruksjon kan også bestå av en vektor som er en replikerbar DNA-konstruksjon Vektorer blir anvendt hen enten for å amplifisere DNA kodende for MSH<R >og/eller for å uttrykke DNA som koder for MSH<R> I denne oppfinnelsen er en rekombinant ekspresjonskonstruksjon en replikerbar DNA-konstruksjon hvor en DNA-sekvens kodende for MSH<R> er operabelt koblet til egnede kontrollsekvenser som kan tilveiebringe ekspresjon av MSH<R> i en egnet vert Behovet for slike kontrollsekvenser vil vanere av verten som blir valgt og transformasjonsmetoden som blir valgt Generelt omfatter kontrollsekvenser en transknpsjonell promoter, en valgfri operatorsekvens for å kontrollere transkripsjonen, en sekvens kodende for egnede mRNA nbosomale bin-dingsseter og sekvenser som kontrollerer terminenng av transknpsjon og translasjon Apphkasjonsvektorer trenger ikke ekspresjonskontrolldomener Det som det er behov for er evnen til å rephkere i en vert, vanligvis gitt av et rephkasjonsongo og et selek-sjonsgen for å lette gjenkjenning av transformanter

Vektorer som er nyttige for å utføre foreliggende oppfinnelse innbeftater plasmider, virus (inkludert fag), retrovirus og lntegrerbare DNA fragmenter (dvs fragmenter som er integrerbare mn i vertsgenomet ved homolog rekombinasjon) Vektorer rephkerer og fungerer uavhengig av vertsgenomet, eller kan i noen tilfeller integrere inn i selve genomet Egnede vektorer vil inneholde rephkon og kontrollsekvenser som er avledet fra arter som er kompatible med ekspresjons verten som skal anvendes En foretrukket vektor er plasmid pcDNAI/Neo Transformerte vertsceller er celler som er blitt trans formert eller transfektert med rekombinante ekspresjonskonstruksjoner dannet ved anvendelse av rekombinante DNA teknikker og som omfatter et pattedyr MSH<R> Transformerte vertsceller kan vanligvis uttrykke pattedyr MSHR men vertsceller transformert for kloning eller amphfisenng av nukleinsyrehybndisenngsprobe DNA behøver ikke å uttrykke reseptoren Når uttrykt, vil pattedyr MSH<R> vanligvis være beliggende i vertscellemembranen

DNA-regioner er operabelt koblet når de er funksjonelt relatert til hverandre For eksempel er en promoter operabelt koblet til en kodende sekvens dersom den kontrollerer transknpsjonen av sekvensen, et nbosom bindingssete er operabelt koblet til en kodende sekvens dersom det er plassert slik at det muliggjør translasjon Generelt betyr operabelt koblet tilgrensende og når det gjelder ledersekvenser, tilgrensende og i samme transla-sjonelle leseramme

Kulturer av celler avledet fra flercellede organismer er ønskelig vert for rekombinant MSH<R> syntese I pnnsippet kan en hvilken som helst høyere eukaryot cellekultur anvendes enten fra vertebrat eller invertebrat kultur Pattedyrceller er foretrukket som illustrert i eksemplene Propagenng av slike celler i cellekultur har blitt til en rutinemes-sig prosedyre Se Tissue Culture, Academic press, Kruse & Patterson, editors (1973) Eksempler på nyttige vertscellelinjer er humane 293 celler, VERO- og HeLa-celler, ki-nesisk hamsterovane (CHO) cellelinjer og WI138, BHK, COS-7, CV og MDCK cellelinjer Humane 293 celler er foretrukket Ekspresjonsvektorer for slike celler innbefatter vanligvis (om mødvendig) et rephkasjonsongo, en promoter beliggende oppstrøms fra genet som skal bh uttrykt, sammen med et nbosombindingssete, RNA spleiseseter (dersom intron-inneholdende genomisk DNA blir anvendt), et polyadenylenngssete og en transkripsjonen terminenngssekvens

Et rephkasjonsongo kan tilveiebnnges enten ved konstruksjon av vektoren slik at den innbefatter et eksogent ongo, såsom avledet fra SV40 eller andre virale kilder (for eksempel polyoma, adenovirus, VSV eller MPV), eller kan bh tilveiebrakt fra vertscellens kromosomale replikasjonsmekanisme Dersom vektoren er integrert inn i vertscellekro-mosomet kan sistnevnte være tilstrekkelig

Foreliggende oppfinnelse tilveiebnnger homogene sammensetninger av pattedyr MSH<R >protein produsert av transformerte eukaryote celler som tilveiebrakt hen Slike homogene sammensetninger skal omfatte pattedyr MSH<R> protein som omfatter 90% av proteinet i en slik homogen sammensetning

Pattedyr MSH<R> protein dannet fra klonede gener i henhold til foreliggende oppfinnelse kan anvendes for screening av agonist-forbindelser for MSH<R> aktivitet, eller for å bestemme mengden av et MSH<R> agonist- eller antagonistmedikament i en oppløsning (for eksempel blodplasma eller serum) Vertsceller kan for eksempel bh transformert med en rekombinant ekspresjonskonstruksjon ifølge foreliggende oppfinnelse, MSH<R> uttrykt i verten, celler lysert og membraner fra de cellene kan bh anvendt for å screene forbindelser for MSH<R> bindingsaktivitet Konkurrerende bindingsanalyser hvor slike prosedyrer kan utføres er velkjente innenfor dette fagområdet Ved valg av vertsceller som ikke vanligvis uttrykker MSH<R> kan rene preparater av membraner inneholdende MSH<R> bh oppnådd MSH<R> agonister og antagonister kan videre bh identifisert ved transformenng av vertsceller med vektorer ifølge foreliggende oppfinnelse Membraner oppnådd fra slike celler kan bh anvendt i bindingsstudier hvor medikamentets dissosiasjonsaktivitet blir registrert

Rekombinante ekspresjonskonstruksjoner ifølge foreliggende oppfinnelse er nyttige innen molekylær biologi for å transformere celler som ikke ordinært uttrykker MSH<R >for deretter å uttrykke denne reseptoren Slike celler er nyttige som mellomledd for å

danne cellemembranpreparater nyttige for reseptorbmdingsanalyser som igjen er nyttige for screening av medikament Gener og vektorer omfattende den rekombinante ekspresjonskonstruksjonen ifølge foreliggende oppfinnelse er nyttig innen genterapi For slike formål er retrovirale virus beskrevet i US-PS 4 650 764 til Temm & Watanable eller

US-PS 4 861 719 til Miller anvendt Klonede gener ifølge foreliggende oppfinnelse, eller fragmenter derav, kan også bli anvendt i genterapi som utfører homolog rekombinasjon eller seterettet mutagenese Se generelt Thomas & Capecchi, 1987, Cell 51 503-512, Berthng, 1987, Bioscience Reports 7 107-112, Smithies et al, 1985, Nature 317 230-234

Ohgonukleotider ifølge foreliggende oppfinnelse er nyttig som diagnostiske redskaper for probmg av MSH reseptorgenekspresjon i vev Vev kan for eksempel bli probet in situ med ohgonukleotidprober som bærer detekterbare grupper ved hjelp av konvensjonelle autoradiograifteknikker, som forklart nærmere i eksemplene nedenfor, for å under-søke nativ ekspresjon av denne reseptoren eller patologiske tilstander som er relatert dertil Videre kan kromosomer bh probet for å undersøke tilstedeværelse eller fråvær av MSH<R> genet, og potensielle patologiske tilstander relatert dertil, som illustrert i eksemplene nedenfor

Oppfinnelsen tilveiebringer også antistoffer som er immunologisk reaktive med et pattedyr MSH<R>

Antistoffene tilveiebrakt ifølge oppfinnelsen kan bh dannet i dyr ved inokulering med celler som uttrykker et pattedyr MSH<R> eller epitopr av et pattedyr MSH<R> ved anvendelse av velkjente fremgangsmåter innenfor fagområdet Dyr som kan bh anvendt for slike inokuleringer innbefatter individer fra arter som omfatter kuer, sauer, griser, mus, rotter, kaniner, hamstere, geiter og pnmater Foretrukne dyr for inokulering er gnagere (inkludert mus, rotter, hamster) og kaniner Det mest foretrukne dyret er mus Celler som kan bh anvendt for slike inokuleringer, eller for hvilke som helst av de andre meto-dene anvendt i oppfinnelsen, innbefatter en hvilken som helst cellelinje som naturlig uttrykker et pattedyr MSH<R>, eller en hvilken som helst celle eller cellelinje som uttrykker et pattedyr MSH<R> eller en hvilken som helst epitop den som et resultat av molekylær eller genetisk modifisenng, eller som er blitt behandlet for å øke ekspresjonen av et pattedyr MSH<R> ved fysiske, biokjemiske eller genetiske midler Foretrukne celler er humane celler, mest foretrukket er humane 293 celler som er blitt transformert med en

rekombinant ekspresjonskonstruksjon omfattende DNA-sekvenser kodende for et pattedyr MSH<R> og som uttrykker pattedyr MSH<R> genproduktet

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer monoklonale antistoffer som er immunologisk reaktive med en epitop som er et pattedyr MSH<R> Ul stede på overflaten av pattedyrceller, fortrinnsvis humane eller museceller Disse antistoffene blir dannet ved anvendelse av fremgangsmåter og teknikker som er velkjente for fagfolk innenfor dette området

Monoklonale antistoffer tilveiebrakt ifølge foreliggende oppfinnelse blir produsert av hybndomcellehnjer som også er gitt ifølge oppfinnelsen og som blir dannet ved hjelp av kjente fremgangsmåter innenfor dette fagområdet Hybndomcellehnjer blir dannet ved fusjonenng av individuelle celler fra en myleomcellelinje med miltceller avledet fra dyr immunisert med celler som uttrykker et pattedyr MSH<R>, inkludert humane celler, som beskrevet ovenfor Myelomcellehnjene som blir anvendt i oppfinnelsen innbefatter linjer avledet fra myelomer fra mus, rotter, hamstere, pnmater og mennesker Foretrukne myelomcellehnjer er fra mus, og den mest foretrukne myelomcellehnjen fra mus er P3X63-Ag8 653 Dyr hvorfra milter er blitt samlet inn etter immunisenng, er rotter, mus og hamstere, fortrinnsvis mus, mest foretrukket er Balb/c mus Miltceller og mye-lomceller blir fusjonert ved anvendelse av et antall kjente fremgangsmåter, inkludert, men ikke begrenset til inkubasjon med inaktiverte Sendai virus og inkubasjon i nærvær av polyetylenglykol (PEG) Den mest foretrukne fremgangsmåten for cellefusjon er inkubasjon i nærvær av en oppløsning av 45% (w/v) PEG-1450 Monoklonale antistoffer produsert av hybndomcellehnjer kan bli høstet fra cellekultur supernatantfluider fra w vitro cellevekst, alternativt kan hybndomceller bh injisert subkutant og/eller inn i pen-tonealhulrommet til et dyr, mest foretrukket i en mus og de monoklonale antistoffene oppnådd fra blod og/eller ascites væske

Monoklonale antistoffer kan også produseres ved hjelp av rekombinante genetiske me-toder som er velkjent for fagfolk innenfor dette området, og dannes ved hjelp av slike fremgangsmåter og som er immunologisk reaktive med en epitop av et pattedyr MSH<R>

Fragmenter av antistoffet som er immunologisk reaktive med en epitop av et pattedyr MSH<R> kan produseres ved hjelp av et antall fremgangsmåter, inkludert, men ikke begrenset til proteolytisk spaltning, kjemisk syntese eller preparenng av slike fragmenter ved hjelp av genetisk modifisenngsteknologi Også enkelt-kjedeantistoffer som er immunologisk reaktive med en epitop av et pattedyr MSH<R> dannet ved hjelp av fremgangsmåter som er kjent for fagfolk innenfor dette området kan anvendes

Et epitop av et pattedyr MSH<R> som består av sekvenser og/eller en konformasjon av sekvenser til stede i pattedyr MSH<R> molekylet kan anvendes Dette epitopet kan være naturlig forekommende, eller kan være resultatet av proteolytisk spaltmng av pattedyr MSH<R> molekylet og isolering av et epitop-inneholdende peptid eller kan bh oppnådd ved syntese av et epitop-inneholdende peptid ved anvendelse av fremgangsmåter som er velkjente for fagfolk innenfor dette området

Eksemplene nedenfor illustrerer oppfinnelsen og forskjellige anvendelser derav

EKSEMPEL 1

Isolering av en ctMSH reseptorprobe ved tilfeldig PCR-ampIifikasjon av human melanom cDNA ved anvendelse av degenererte oligonukleotidpnmere

For å klone nye G-protein-koblede reseptorer ble human melanom cDNA anvendt som templat for polymerasekjedereaksjons (PCR)-basert tilfeldig kloningsekspenment PCR ble utført ved anvendelse av et par av degenererte oligonukleotidpnmere som tilsvarer antatte tredje og sjette transmembranregioner til G-protein-koblede reseptorer (Libert et al, 1989, Science 244 569-72, Shou et al, 1990, Nature 347 77-80) PCR-produktene oppnådd i dette ekspenmentet ble karaktensert ved nukleotidsekvensenng To nye sekvenser som representerer nye G-protein-koblede reseptorer ble identifisert

PCR-amphfikasjon ble utført som følger Totalt RNA ble isolert fra en human myelom tumor prøve ved guanidimumthiocyanat metoden (Chirgwin et al, 1979, Biochemistry 18 5294-5299) Dobbelttrådet cDNA ble syntetisert fra totalt RNA med munn revers transknptase (BRL, Gaithersburg, MD) ved oligo-dT pnming [Mamatis et al, Molecular Clomng A Laboratory Manual, (Cold Spnng Harbor Laboratory Press, Cold Spnng Harbor, NY) 1990] Melanom cDNA-blandingen ble deretter utsatt for 45 syklu-ser av PCR-amphfikasjon ved anvendelse av 500 pikomol degenererte oligonukleotidpnmere med følgende sekvens

Primer III (sens)

og

pnmer VI (antisens)

i 100 ul av en oppløsning inneholdende 50 mM Tns-HCl (ph 8 3), 2 5 mM MgCl2»

0 01% gelatin, 200 uM hver dNTP og 2 5 enheter Taq polymerase (Saiki et al, 1988, Science 239 487-491) Disse primerne ble syntetisert kommersielt av Research Genetics Inc (Hunstville, AL) Hver PCR amphfikasjossyklus besto av inkubasjon ved 94°C i 1 minutt (denaturenng), 45°C 12 min (sammensmeltning) og 72°C 12 min (ekstensjon)

Amplifiserte produkter av PCR-reaksjonen ble ekstrahert med fenol/kloroform og presi-pitert med etanol Etter spaltning med EcoRI og Sali ble PCR produktene separert på 1 2% agarosegel En bit av denne gelen, tilsvarende PCR produktene med en størrelse på 300 basepar (bp) ble spaltet ut og renset ved anvendelse av glasskuler og natnum-iodid, og innskuddet ble deretter klonet inn i en pBKS kloningsvektor (Stratagene, LaJolla, CA)

Totalt 172 av slike pBKS-kloner inneholdende innskudd ble sekvensert ved anvendelse av Sequenase (U S Biochemical Corp, Cleveland, OH) ved dideoksynukleotidkjedeter-minenngsmetoden (Sanger et al, 1977, Proe Nati Acad Sei USA 74 5463-5467) To typer av sekvenser som er homologe med andre G-protein koblede reseptorer ble identifisert

EKSEMPEL 2

Isolering oe sekvensanalvse av muse otMSH- reseptor cDNA

Prober isolert i eksempel 1 ble anvendt for å screene et Cloudman melanom cDNA bibliotek for å isolere et full-lengde cDNA tilsvarende den klonede proben En klon ble isolert fra et bibliotek av 5 x 10^ kloner screenet som beskrevet nedenfor Denne klonen inneholdt et innskudd på 2 6 kilobaser (kb) Nukleotidsekvensen til den fullstendige kodende regionen ble bestemt som vist i figur IA (SEQ ID NO 3)

PCR-proben ble merket ved tilfeldig-pnrmngsmetoden (Stratagene Pnmelt, #300387, LaJolla, CA) og anvendt for å screene et Cloudman melanomhnje cDNA bibliotek konstruert i yZAP-vektoren (Stratagene) Bibhotekscreemng ble anvendt ved anvendelse av teknikker som er velkjente innenfor fagområdet som beskrevet i Bunzow et al (1988, Nature 336 783-787) ved moderat stnngenthet (40% formamid, IM naCl, 50mM Tns-HC1, pH 7,5,0 1% natnumpyrofosfat, 0 2% natnumdodecylsulfat, 100ug/ml laksesperm DNA, 10X Denhardts oppløsning) En cDNA-klon ble identifisert (betegnet mmelA) og 2 6 kb cDNA-innskuddet ble isolert og subklonet inn i pBKS (Stratagene) Det resulterende plasmidet ble betegnet pmmelA Nukelotidsekvensanalyse og homologi sammen-ligninger ble utført på OHSU computersystemet med software gitt av Intelhgentics Inc

(Mountain View, CA)

Nukleotidsekvensen til pmmelA (cDNA-klonen isolert som beskrevet ovenfor) er vist i figur IA (SEQ ID NO 3) Den lengste åpne leserammen til dette cDNA koder for et forutbestemt proteinprodukt på 315 aminosyrer med en beregnet molekylvekt på 35 3 kilodalton (kD) Den utledede aminosyresekvensen er vist i figur 2 (SEQ ID NO 4) som muse MSH-R Aminosyre med enkeltbokstav bin- anvendt (se G Zubay, Biochemistry (2d ed), 1988 (MacMillen Publishing New York) s 33] Opphevet bok-stav indikerer ammosyreresidier som er felles mellom reseptorproteinet som er vist og bokstaver som står nedenfor indikerer divergente residier

Hydrofobisitetsanalyse (Kyte & Doohttle, 1982, J Mol Biol 157 105-132) av den ule-dede aminosyresekvensen viste at proteinet inneholder 7 hydrofobe områder med 21-26 aminosyrer hver Antatte transmembrandomener er satt strek over og angitt med romer-tall

EKSEMPEL 3

Konstruksjon av muse aMSH<R> ekspresjonsplasmider, DNA transfeksion og funksionell ekspresion av aMSH^- genproduktet

For biokjemisk å karakterisere det antatt muse aMSH<R> cDNA isolert som i eksempel 2 og å bekrefte at det koder for en ctMSH-reseptor, ble mmelA klonet inn i en pattedyr-ekspresjonsvektor Denne vektoren ble transfektert inn i humane 293 celler og cellelin-jene som uttrykte den antatte aMSH<R> reseptoren på celleoverflaten ble dannet Slike celler og membraner isolert fra slike celler ble anvendt for biokjemisk karakterisenngs-ekspenmenter beskrevet nedenfor

Hele den kodende regionen til aMSH<R> cDNA innskuddet fra mmelA innbefattet i et 2 1 kb fragment ble tatt ut fra pBSK og subklonet inn i BamHI/XhoI setene til pcDNAI/neo ekspresjonsvektoren (Invitorgen, San Diego, CA) Det resulterende plasmidet ble betegnet pcDNA-mmelA pcDNA-mmelA plasmid DNA ble dannet i stor skala gjennom en syklus av CsCl gradient ultrasentnfugenng og 20 ug pcDNA-mmelA DNA ble transfektert inn i hver 100 mm skål av 293 celler ved anvendelse av kalsiumfosfatmetoden (se Chen & Okayama, 1987, Mol Cell Biol 7 2745-2752) Etter transfeksjon ble cellene dyrket i DMEM medium supplert med 10% kalveserum i en 3% CO2 atmosfære ved 37°C Seleksjon ble utført med neomycin (G418, GIBCO) ved en konsentrasjon på 1000 ug/ml Seleksjon ble begynt 72 timer etter transfeksjon og varte 1 3 uker

aMSHR er kjent for å bh koblet til G-proteiner og derved aktivere adenylsyklase og dermed øke intracellulære nivåer av cAMP (se Buckley & Ramachandran, 1981, Proe Nati Acad Sei USA 78 7431-7435, Grahame-Smith et al, 1967, J Biol Chem 242 5535-5541, Mertz&Catt, 1991, Proe Nati Acad Sei USA 88 8525-8529, Pawalek et al, 1976, Invest Dermatol 66 200-209) Denne egenskapen at celler som uttrykker otMSH reseptor ble anvendt for analysenng av ekspresjonen av aMSH reseptoren 1 cel-lekolonier transfektert med ekspresjonsvektorene beskrevet nedenfor Celler (-1x10°) ble sådd ut 1 6-brønns skåler, vasket en gang med DMEM inneholdende 1% bovint se-rumalbumin (BSA) og 0 5 mM IBMX (en fosfodiesteraseinhibitor) og deretter inkubert 145 minutter ved 37°C med vanerende konsentrasjoner av melanotropiske peptider aMSH, PMSH, yMSH, MSH-peptidanalogene Nie<4>, D-Phe<7->ccMSH (NDP-MSH) og ACTH Etter hormonbehandling ble cellene vasket to ganger med fosfatbufftet saltvann og intracellulært cAMP ble ekstrahert ved lysenng av cellene med en 1 ml 60% etanol Intracellulære cAMP konsentrasjoner ble bestemt ved anvendelse av en analyse

(Amersham) som måler evnen som cAMP har til å erstatte [8-^H] cAMP fra et cAMP bindingsprotein med høy affinitet (se Gilman, 1970, Proe Nati Acad Sei USA 67 305-312

Resultatene av disse ekspenmentene er vist i figur 3 Abscissen indikerer konsentrasjo-nen til hvert hormon og ordtnaten indikerer prosentandel av basal intracellulær cAMP konsentrasjon oppnådd ved hver behandling Punktene angir gjennomsnittlige duplikate inkubasjoner og standardavviket overskred ikke 15% av noen av datapunktene Ingen av peptidene som ble testet induserte noen forandring i intracellulær cAMP i celler inneholdende bare vektoren Celler som uttrykker munn aMSH reseptor reagerte overfor melanotropiske peptider med en 2-3 ganger forhøyning av intracellulær cAMP som ligner nivåer av cAMP indusert av disse peptidene i Cloudman cellelinjen (se Pawalek, 1985, Yale J Biol Med 58 571-578) EC50 verdiene bestemt for aMSH 12 0x10"<9>M), ACTH (8 0xl0"<9>M) og superpotent MSH analogNDP-MSH (2 8x10"! lM) korrespon-derer nært opp til de rapporterte verdiene (se Tatro et al, 1990, Cancer Res 50 1237-1242) Som ventet hadde ØMSH-peptidet en EC50 verdi som var sammenlign-bar med aMSH<22> mens yMSH hadde liten eller ingen aktivitet (se Slominski et al, 1992, Life Sei 50 1103-1108), og dette bekrefter identiteten til denne reseptoren som en melanocytt aMSH-reseptor

EKSEMPEL 4

Isolering og karakterisering av en human aMSH<R> genomisk klon

For å isolere et humant motstykke av munn melanocytt aMSH reseptorgenet ble et humant genomisk bibliotek screenet ved høy stnngenthet (50% formamid, 42°C) ved anvendelse av de humane PCR-fragmentene isolert som beskrevet 1 eksempel 1 To forskjellige typer av sekvenser ble isolert, tilsvarende to PCR-fragmenter, og ble funnet å kode for sterkt beslektede G protein-koblede reseptorer Disse genomiske klonene ble sekvensert som beskrevet 1 eksempel 2 En av disse genomiske klonene ble bestemt å kode for en human MSH reseptor (SEQ ID NO 5) Den humane MSH-reseptoren har en forutbestemt aminosyresekvens (SEQ ID NO 6) som er 75% identisk og ko-hneær med muse aMSH-reseptor cDNA-sekvensen (figir 2), representert som human MSH-R Den forutbestemte molekylvekten til human MSH<R> er 34 7 kD

De antatte aminosyresekvensene til muse aMSH<R> (SEQ ID NO 4) og human MSH<R >(SEQ ID NO 6) er oppstilt 1 figur 2 Disse sekvensene definerer melanokortin-reseptorene som en ny underfamilie av G-protein-koblede reseptorer med et antall uvanlige trekk Melanokortin-reseptorene er de minste G protein-koblede reseptorene identifisert til nå (297-317aa) som resulterer fra en kort aminoterminal ekstracellulær domene, en kort karboksyterminal intracellulær domene og en meget liten tredje intracellulær løkke Melanokortinreseptorene mangler flere aminosyreresidier til stede i de fleste G protein-koblede reseptorene (se Probst et al, 1992, DNA & Cell Biol 11 1-20), inkludert pro-hnresidiene i fjerde og femte transmembrane domener, som sannsynligvis innfører en kurve i den alfa-hehske strukturen til transmembrandomenene og antatt å være involvert i dannelsen av bindingslommene (se Applebury & Hargrave, 1986, Vision Res 26 1881-1895) og en eller begge av cysteinresidiene antas å danne en disulfidbinding mellom de første og andre ekstracellulære løkkene (se Dixon et al, 1987, EMBO J 6 3269-3275 og Karnik et al, 1988, Proe Nati Acad Sei USA 85 8459-8463) Melanocytt-reseptorene ser ikke ut til å være sterkt relatert til andre G protein-koblede reseptorer som gjenkjenner peptidhgander, så som reseptorer for bombesin (se Spindel et al, 1990, Mol Endocnonol 4 1956-1963) eller forbindelse K (se Masu et al, 1987, Nature 329 836-838), men er heller mer nært relatert til reseptoren for A^-tetrahydrocannabinol (se Matsuda et al, 1990, Nature 346 561-564) Cannabinoid-reseptoren mangler også konservert prohn i transmembran 5 og cystein i den første ekstracellulære løkken nød-vendig for dannelsen av disulfidbindingen "Lear parsimony"-analyse med reseptorsek-venser vist i figur 2 tyder på at cannabinoid og melanokortinreseptorer kan være evolusjonsmessig beslektede og danne en underfamilie som er forskjellig fra peptidresepto-rene og aminreseptorene Uansett om likhetene er resultat av evolusjonsmessig konser-vering eller konvergens kan sekvens og antatt strukturelle likheter mellom melanokortin og cannabinoid-reseptorer være informativt i søken etter endogen cannabinoid-hgnende ligand

sEKSEMPEL 5

Vevsdistribusion av aMSH reseptorer

For å ytterligere oppnå innsikt i disse reseptorene er vevsfordelmgen til deres tilsvarende mRNA fra forskjellige vev ved utførelse av Northern hybndisenngsekspenmenter på RNA isolert fra forskjellige vev undersøkt (se Maniatis et al, ibid) Resultatene av disse eksperimentene er vist i figur 4

Et panel av vevsprøver er undersøkt ved Northern hybndisenngsanalyse utført under betingelser med høy stnngenthet Det samme nitrocellulosefilteret ble hybndisert fort-løpende med en human MSH reseptorprobe og en muse MSH reseptorprobe for å bestemme fordelingen av hver reseptor mRNA Den munne MSH reseptoren blir hovedsakelig kodet av en enkelt mRNA art på 3 9 kb, mens den humane MSH reseptoren blir kodet, i to melanomprøver, hovedsakelig av en 3 0 kb art Høye nivåer av reseptor mRNA finnes i både primære musemelanocytter og musemelanom cellelinjer I kontrast til dette ble ekstremt lave nivåer av reseptor mRNA detektert i pnmære humane mela-nocytter og mange humane melanomprøver (se melanom 1, figur 4) Det mest avgjø-rende er den dramatiske forhøyningen av MSH-R mRNA som sees 13 av 11 prøver som ble testet, som i melanomprøve nr 2 (fig 2)

Det har ikke vært mulig å detektere ekspresjon i hjernen til noen av reseptorene beskrevet hen til tross for omfattende dokumentenng av MSH bindingseter der og i andre vev Dette funnet tyder på eksistensen av andre fonner av disse eller beslektede reseptorer som kan bh spesifikt uttrykt i hjernevev

Claims (16)

1 Isolert nukleinsyre, karakterisert ved at den koder for en manimalsk melanocytt-stimulerende hormonreseptor som omfatter aminosyresekvensen identifisert ved SEQ ID nr 4 eller 6

2 Isolert nukleinsyre, karakterisert ved at det er i stand til å hybndisere til nukleinsyren ifølge krav 1, og som koder for en mammalsk melanocytt-stimulerende hormonreseptor

3 Isolert nukleinsyre ifølge krav 1, karakterisert ved at den koder for en muse-melanocytt-stimulerende hormonreseptor som omfatter aminosyresekvensen identifisert ved SEQ ID nr 4

4 Isolert nukleinsyre, karakterisert ved at det er i stand til å hybndisere til nukleinsyren ifølge krav 3, og som koder for en muse-melanocytt-stimulerende hormonreseptor

5 Isolert nukleinsyre ifølge krav 1, karakterisert ved at nukleotidsekvensen er homolog med sekvensen i figur IA (SEQ ID nr 3) eller med sekvensen i figur IB (SEQ ID nr 5)

6 Isolert nukleinsyre ifølge krav 1, karakterisert ved at den koder for en human melanocytt-stimulerende hormonreseptor som omfatter aminosyre-sekvensen identifisert ved SEQ ID nr 6

7 Isolert nukleinsyre, karakterisert ved at det er i stand til å hybndisere til nukleinsyren ifølge krav 6, og som koder for en human melanocytt-stimulerende hormonreseptor

8 DNA-sekvensen ifølge krav 1, karakterisert ved at pattedyr-melanocyttstimulerende-hormonreseptoren som blir kodet den har melanotropiske peptidresponsegenskaper som beskrevet i figur 3

9 Homogen sammensetning av en 35 3 kilodalton melanocytt-stimulerende hormonreseptor eller denvat derav, karakterisert ved at aminosyresekvensen til melanocytt-stimulerende hormon reseptor eller derivatet derav omfatter MSH-R sekvensen fra mus vist i figur 2 (SEQ ED Nr 4)

10 Homogen sammensetning av en 34 6 kilodalton melanocyttstimulerende hormonreseptor eller denvat derav, karakterisert ved at aminosyresekvensen til melanocytt-stimulerende hormonreseptor eller denvat derav omfatter den humane MSH-R sekvensen vist i figur 2 (SEQ ID Nr 6)

11 Nukleinsyre-hybndisenngsprobe, karakterisert ved at den er for deteksjon av pattedyr melanocytt-stimulerende hormonreseptor ekspresjon omfattende nukleotidsekvensen ifølge krav 5, proben er tilpasset for anvendelse ved deteksjon og diagnostikk av genetisk sykdom i et menneske eller proben er tilpasset for anvendelse ved deteksjon, isolenng og karaktensenng av nye pattedyr reseptorgener

12 Rekombinant ekspresjons-konstruksjon, karakterisert v e d at den omfatter en nukleotidsekvens kodende for en pattedyr melanocytt-stimulerende hormonresptor, eller omfatter pcDNAI/Neo-sekvenser

13 Rekombinant ekspresjonskonstruksjon, karakterisert v e d at den omfatter DNA-sekvensen ifølge krav 5 ved at konstruksjonen kan uttrykke muse-melanocytt-stimulerende hormonreseptor i en transformert eukaryot cellekultur

14 Rekombinant ekspresjonskonstruksjon omfattende DNA-sekvensen ifølge krav 4, karakterisert ved at konstruksjonen kan uttrykke den humane melanocytt-stimulerende hormonreseptoren i en transformert eukaryot cellekultur

15 Eukaryot cellekultur transformert med ekspresjonskonstruksjonen ifølge krav 14, karakterisert ved at den transformerte eukaryote cellekulturen kan uttrykke musemelanocytt-stimulerende hormonreseptor

16 Eukaryot cellekultur transformert med ekspresjonskonstruksjon ifølge krav 15, karakterisert ved at den transformerte eukaryote cellekulturen kan uttrykke den humane melanocytt-stimulerende hormonreseptoren