JPH10108684A - ホルモン受容体組成物および方法 - Google Patents

ホルモン受容体組成物および方法

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JPH10108684A
JPH10108684A JP9224963A JP22496397A JPH10108684A JP H10108684 A JPH10108684 A JP H10108684A JP 9224963 A JP9224963 A JP 9224963A JP 22496397 A JP22496397 A JP 22496397A JP H10108684 A JPH10108684 A JP H10108684A
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receptor
protein
amino acid
acid sequence
hormone
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JP9224963A
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Ronald M Evans
エバンズ，ロナルド・マーク
Cary A Weinberger
ウェインバーガー，キャリー・エイ
Stanley M Hollenberg
ホーレンバーグ，スタンレイ・マーク
Vincent Giguere
ギグエル，ビンセント
Jeffrey Louis Arriza
アリザ，ジェフリー・ルイス
Catherine C Thompson
トンプソン，キャサリン・キャロライン
Estelita S Ong
オング，エステリタ・セバスティアン
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Salk Institute for Biological Studies
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規なホルモン受容体蛋白質をコードする遺
伝子を提供すること。 【解決手段】 甲状腺ホルモン受容体に特有のホルモン
結合特性および／または転写活性化特性を有する蛋白質
をコードする遺伝子。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はホルモン受容体蛋白
質およびそれらをコードする遺伝子、組換えＤＮＡ法そ
の他の遺伝子工学的技術によるこれら受容体および遺伝
子の修飾、ならびにこれら受容体および遺伝子（修飾さ
れていないものおよび修飾されたもの）の利用に関す
る。より詳細には本発明はステロイドホルモンおよび甲
状腺ホルモン受容体、ならびに関連遺伝子に関する。き
わめて詳細には本発明はヒトのグルココルチコイド、ミ
ネラルコルチコイドおよび甲状腺ホルモンの受容体、な
らびにそれらに対する遺伝子に関する。さらに本発明は
受容体ＤＮＡクローンによりコードされるホルモン受容
体蛋白質の機能性を測定するための新規なバイオアッセ
イ系、および受容体蛋白質と複合体を形成したホルモン
によってその転写が活性化される遺伝子の発現を誘導お
よび制御するための新規な方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒトその他の哺乳動物、鳥類および魚類
を含む複雑な真核生物における発育および恒常性の転写
調節は、ステロイドホルモンおよび甲状腺ホルモンを含
む種々の調節物質によって制御されている。これらのホ
ルモンは系統発生的に異なる生物における発育および分
化に強い影響を与え、それらの作用はそれらと受容体と
呼ばれる特異的な高親和性結合蛋白質との相互作用の結
合として媒介される。一般にジェンセン(Ｊensen)ら(１
９７２)；ゴルスキー(Ｇorski)ら(１９７６)；ヤマモト
（Ｙamamoto）ら（１９７６）；オマレイ（Ｏ'Ｍalle
y）ら(１９６９)；ヘイワード（Ｈayward）ら(１９８
２)；およびアスバーナー(Ａsburner）ら(１９７８）を
参照されたい。
【０００３】それぞれ幾つかの群の同系ステロイドホル
モン（すなわちエストロゲン（エストロゲン受容体）、
ゲスターゲン（プロゲステロン受容体）、グルココルチ
コイド（グルココルチコイド受容体）、アンドロゲン
（アンドロゲン受容体）、アルドステロン（ミネラルコ
ルチコイド受容体）のうちの１種、または同系甲状腺ホ
ルモン（甲状腺ホルモン受容体）に対して特に特異的で
ある受容体蛋白質が知られており、組織特異的な様式で
分布している。ホルビッツら（Ｈorwitz）ら(1978)およ
びパルミテール（Ｐamiter）ら（１９７６）を参照され
たい。
【０００４】ホルモンと受容体の相互作用については、
ステロイドホルモンまたは甲状腺ホルモンが拡散の促進
により細胞に入り、その特異的受容体蛋白質に結合し、
蛋白質のアロステリック変化を開始することが知られて
いる。この変化の結果、ホルモン／受容体−複合体はク
ロマチン上の特定の特異的部位に高い親和性で結合する
ことができる。ヤマモト(Ｙamamoto)ら(１９７２)およ
びジェンセン(Ｊensen)ら（１９６８）を参照された
い。
【０００５】ステロイドホルモンおよび甲状腺ホルモン
の一次効果の多くが、特異的細胞型における一組の遺伝
子の転写の増大を伴うことも知られている。ペテルコフ
スキー(Ｐeterkofsky)ら(１９６８)およびマックナイト
(Ｍcknight）ら（１９６８）を参照されたい。さらにス
テロイドホルモンおよび甲状腺ホルモンに応答する（ク
ロマチンとホルモン受容体／ホルモン−複合体との相互
作用により）遺伝子の転写の可活性化(結果的に発現の
増大)は複合体が遺伝子に付随するエンハンサーに結合
することによって行われることも証明されている(ホー
リー(Ｋhoury)ら、１９８３）を参照されたい。
【０００６】いずれにしろ多数のステロイドホルモンお
よび甲状腺ホルモン応答性転写制御ユニット(それらの
うちあるものはエンハンサーを含むことが示されてい
る)が同定されている。これらには下記のものが含まれ
る。マウス乳腺腫瘍ウイルス５’側長鎖末端反復（ＭＴ
Ｖ ＬＴＲ）：グルココルチコイド、アルドステロンお
よびアンドロゲンホルモンに応答；哺乳動物成長ホルモ
ン遺伝子に対する転写制御遺伝子；グルココルチコイ
ド、エストロゲンおよび甲状腺ホルモンに応答；哺乳動
物プロラクチン遺伝子およびプロゲステロン受容体遺伝
子に対する転写制御ユニット：エストロゲンに応答；鳥
類卵アルブミン遺伝子に対する転写制御ユニット；プロ
ゲステロンに応答；哺乳動物メタロチオネイン(metallo
thionein）遺伝子転写制御ユニット：グルココルチコイ
ドに応答；ならびに哺乳動物肝α2u−グロブリン遺伝子
転写制御ユニット：アンドロゲン、エストロゲン、甲状
腺ホルモンおよびグルココルチコイドに応答。（本発明
の実験の部Ｉの序文を参照されたい）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】ステロイドホルモンお
よび甲状腺ホルモン受容体の十分な理解およびいっそう
の実用に対する障害は、これらの特性を調べるのに十分
な量および十分な程度に純粋な形で入手できないことで
あった。これはそれらをコードするＤＮＡ遺伝子セグメ
ントについても同じであった。これらのＤＮＡセグメン
トを入手できないため、受容体コード遺伝子のインビト
ロ操作およびインビボ発現が妨げられ、結果的にこれら
の操作および発現が与えられる知見が得られなかった。
【０００８】参考文献一覧表 刊 行 物 本明細書の背景の項では以下の刊行物を参照する。
【０００９】１．Ａsburner,Ｍ.，and Ｂerendes,Ｈ.
Ｄ．in Ｔhe Ｇenetics and Ｂiology of Ｄrosophila，
Ｅds.Ａshburner,Ｍ.，and Ｗright,Ｔ.Ｒ.Ｆ.,Ｖol.
２，pp．315−395，Ａcademic，Ｌondon（1978）。
【００１０】２．Ｇorski,Ｊ.，and Ｇannon，Ｆ.,Ａ.
Ｒev.Ｐhysiol.,38：425−450（1976)。３．Ｈayward,
Ｍ.Ａ.，Ｂrock,Ｍ.Ｌ. and Ｓhapiro,Ｄ.Ｊ.，Ｎuclei
c Ａcid s Ｒes.，10：8273−8284（1982）。
【００１１】４．Ｈorwitz，Ｋ.Ｂ.，and ＭcＧuire，
Ｗ.Ｌ.，Ｊ.Ｂiol.Ｃhem，253：2223−2228（1978）。
【００１２】５．Ｊensen，Ｅ.Ｖ.，and ＤeＳombre,
Ｅ.Ｒ.，Ａ.Ｒev.Ｂiochen.,41：203−230（1972）。
【００１３】６．Ｊensen，Ｅ.Ｖ.,et al.，Ｐroc.Ｎat
l.Ａcad.Ｓci．Ｕ.Ｓ.Ａ.,59：632−638（1968）。
【００１４】７．Ｋhoury，Ｇ.，and Ｇruss，Ｐ.，Ｃe
ll.，33：313−314（1983）。
【００１５】８．ＭcＫnight，Ｇ.Ｓ.，and Ｐalmitr
e，Ｒ.Ｄ.,Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.，254：9050−9058（196
8）。
【００１６】９．Ｏ'Ｍalley,Ｂ.Ｗ.，ＭcＧuire,Ｗ.
Ｌ.，Ｋohler，Ｐ.Ｏ.，and Ｋornman,Ｓ.Ｇ.，Ｒecent
Ｐrog．Ｈorm．Ｒes.，25：105−160（1969）。
【００１７】10．Ｐamiter，Ｒ.Ｄ.，Ｍoore，Ｐ.Ｂ.，
Ｍulvihill，Ｅ.Ｒ.，and Ｅmtage，Ｓ.，Ｃell，8：55
7−572（1976）。
【００１８】11．Ｐeterkofsky，Ｂ.，and Ｔomkins，
Ｇ.，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．Ｕ.Ｓ.Ａ．，60：22
2−228（1968）。
【００１９】12．Ｙamamoto，Ｋ.Ｒ.，and Ａlberts，
Ｂ.Ｍ.，Ａ．Ｒev．Ｂiochem.，45：721−746（197
6）。
【００２０】13．Ｙamamoto，Ｋ.Ｒ.，and Ａlberts，
Ｂ.Ｍ.，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci. Ｕ．Ｓ．Ａ．，6
9：2105−2109（1972）。
【００２１】他の刊行物 本発明に示される情報のうち若干は公表されている。
【００２２】実験の部Ｉに示される研究は下記に公表さ
れている。
【００２３】Ｈollenberg，Ｓ.Ｍ.,Ｗeinberger,Ｃ.,Ｏ
ng,Ｅ.Ｓ.,Ｃerelli，Ｇ.,Ｏro,Ａ.,Ｌebo，Ｒ.，Ｔhom
pson，Ｅ.Ｂ.，Ｒosenfeid，Ｍ.Ｇ.，and Ｅvans，Ｒ.
Ｍ.，“機能性ヒトグルココルチコイド受容体ｃＤＮＡ
の一次構造と発現”Ｎature，（Ｌondon），３１８：６
３５−６４１（Ｄecember，１９８５）。
【００２４】実験の部IIに示される研究は下記に公表さ
れている。
【００２５】Ｇiguere，Ｖ.，Ｈollenberg，Ｓ.Ｍ.，Ｒ
osenfield，Ｍ.Ｇ．and Ｅvans，Ｒ.Ｍ.,“ヒトグルコ
コルチコイド受容体の機能区”Ｃell，４６：６４５−
６５２（Ａuguet，１９８６）。
【００２６】実験の部IIIに示される研究は下記に公表
されている。
【００２７】Ｗeinberger，Ｃ.,Ｔhompson，Ｃ.Ｃ.,Ｏn
g，Ｅ.Ｓ.,Ｌebo,Ｒ.,Ｇruol,Ｄ.Ｊ.，and Ｅvans,“ｃ
−erb−Ａ遺伝子は甲状腺ホルモンをコードする“Ｎatu
re，(Ｌondon）,３２４：６４１−６４６（Ｄecember，
１９８６）。
【００２８】実験の部IVに示される研究は下記に公表さ
れている。
【００２９】Ａrriza,Ｊ.Ｌ.，Ｗeinberger,Ｃ.,Ｃerel
li,Ｇ.,Ｇlaser,Ｔ.Ｍ.，Ｈandelin，Ｂ.Ｌ.，Ｈousema
n，Ｄ.Ｅ.，and Ｅvans，Ｒ.Ｍ.,“ヒトミネラルコルチ
コイド受容体相補的ＤＮＡのクローニング：グルココル
チコイド受容体との構造的および構造的関連”Ｓcienc
e，２３７：２６８−２７５（Ｊuly，１９８７）。
【００３０】実験の部Vに示される研究は以下のとおり
印刷中である。
【００３１】Ｇiguere，Ｖ.，Ｙang，Ｎ.，Ｓegui，
Ｐ.，and Ｅvans，Ｒ.Ｍ.，“新しい一群のステロイド
ホルモン受容体の同定”。
【００３２】実験の部VIに示される研究は以下のとおり
印刷中である。
【００３３】Ｇlass，Ｃ.Ｋ.，Ｆranco，Ｒ.，Ｗeinber
ger，Ｃ.,Ａlbert，Ｖ.Ｒ.,Ｅvans，Ｒ．Ｍ.，and Ｒos
enfeld，Ｍ.Ｇ.,“ラット成長ホルモン遺伝子の c−erb
−Ａ部位は甲状腺ホルモンによるトランザクションを媒
介する。”実験の部VIIに示される研究は下記に公表さ
れている。
【００３４】Ｔhompson，Ｃatherine Ｃ.，Ｗeinberge
r，Ｃary，Ｌebo，Ｒoger，and Ｅvans，Ｒonaid Ｍ.，
“哺乳動物中枢神経系に発現される新規な甲状腺ホルモ
ン受容体の同定"、Ｓcience，２３７：１６１０−１６
１４（Ｓeptember，１９８７）。
【００３５】定 義 本明細書および請求の範囲においては、ここで以下のと
おり明確に定義された技術的な句および用語が用いられ
るであろう。
【００３６】ここで用いるＧＲはグルココルチコイド受
容体を意味する。開示されたＤＮＡｈＧＲがグルココル
チコイド受容体ＧＲをコードする。
【００３７】ここで用いるＭＲはミネラルコルチコイド
受容体を意味する。開示されたＤＮＡｈＭＲがミネラル
コルチコイド受容体ＭＲをコードする。
【００３８】ここで用いるＴＲは甲状腺ホルモン受容体
を意味する。開示されたヒトＤＮＡc−erb−Ａ，ｈＥＲ
ＢＡ 8.7および hＦＡ８、ならびにラットrbeＡ１２が
すべて甲状腺ホルモン受容体をコードする。
【００３９】ここで用いるｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２
はエストロゲン関連受容体蛋白質をコードするＤＮＡを
表わす。
【００４０】ここで用いるグルココルチコイドホルモン
にはコルチゾル、ヒドロコルチゾン（ＨＣ）、およびコ
ルチコステロン（ＣＳ）が含まれ、その同族体にはデキ
サメタゾン(Ｄex）、デオキシコルチコステロン（Ｄoc）
およびトリアムシノロンアセトニドが含まれる。
【００４１】ここで用いるミネラルコルチコイドにはア
ルドステロン(Ａldo）ならびにコルチコステロン（Ｃ
Ｓ）、およびデオキシコルチコステロン（Ｄoc）が含ま
れる。
【００４２】ここで用いる甲状腺ホルモンにはチロキシ
ン（Ｔ４）およびトリヨードチロニン（Ｔ３）が含まれ
る。
【００４３】ここで用いるエストロゲンにはエストラジ
オール−１７ベータが含まれ、その同族体にはジエチル
スチルベストロールが含まれる。
【００４４】ここで用いるゲスターゲンにはプロゲステ
ロン(Ｐrog）が含まれ、その同族体にはプロメゲストン
が含まれる。
【００４５】ここで用いるアンドロゲンにはジヒドロキ
シテストステロンが含まれ、その同族体にはメチルトリ
エノロンが含まれる。
【００４６】ここで用いるＭＴＶは乳腺腫瘍ウイルスを
意味し；ＭＭＴＶはマウス乳腺腫瘍ウイルスを意味す
る。
【００４７】ここで用いるＲＳＶはラウス肉腫ウイルス
を意味し；ＳＶはサルウイルスを意味する。
【００４８】ここで用いるＣＡＴはクロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼを意味する。
【００４９】ここで用いるＣＯＳはＴ抗原（Ｔag）を発
現するサル腎細胞を意味する。グルッツマン，セル，２
３：１７５（１９８１）を参照されたい。ＣＯＳ細胞は
本発明のバイオアッセイ系に有用である。
【００５０】ここで用いるＣＶ−１は“ＣＶ−１”と呼
ばれる細胞系に由来するマウス腎細胞を意味する。ＣＶ
−１はＣＯＳの親細胞系である。ＳＶ４０ Ｔ抗原(Ｔa
g）を発現すべく形質転換されたＣＯＳ細胞と異なり、
ＣＶ−１細胞はＴ抗原を発現しない。ＣＶ−１細胞はＣ
ＯＳ細胞と同様に本発明のバイオアッセイ系および方法
に有用である。
【００５１】ここで、ある蛋白質が“ホルモン受容体に
特有のホルモン結合性”をもつと述べた場合、これはあ
る種に由来するホルモンまたはその合成同族体とその種
に由来する同系の受容体との結合親和性に関する標準ア
ッセイ法のいずれにおいても、ホルモンまたはその合成
同族体に対する当該蛋白質の親和性が当該ホルモンまた
はその同族体とその種に由来する同系の受容体との親和
性の少なくとも約１０％であることを意味する。
【００５２】ここで、ある蛋白質（Ｘ）の転写活性化特
性が、あるホルモン受容体（Ｒ）の特性に“特有”であ
ると述べた場合、これは下記を意味する。すなわち、た
とえば本発明の“シス−トランス”受容体機能性バイオ
アッセイ系（発明の記述の項を参照されたい；またこの
アッセイ法をｈＧＲの機能性発現の証明に用いることに
関する実験の部II、特に第９図、ならびに“結果”およ
び“実験法”と表示した小区分も参照されたい）などの
アッセイ法において試験する場合、遺伝子（Ｇ）（その
転写はホルモンまたはホルモン同族体と複合体形成した
受容体の結合によって活性化される）からの発現率が、
受容体（Ｒ）の代わりに蛋白質(Ｘ)を用いた場合、受容
体（Ｒ）自体が用いられた場合に示されるものの少なく
とも約１０％である。ただし、“受容体（Ｒ）”および
“蛋白質（Ｘ）”いずれの場合も、関与する細胞は同一
濃度のホルモンまたはその同族体中に装入される。
【００５３】ここで、ある蛋白質が“あるホルモン受容
体に特有のホルモン結合特性または転写活性化特性”を
もつと述べた場合、これはそのホルモン受容体自体がこ
の定義に包含されることを意味する。
【００５４】ここで、ある遺伝子（Ｇ）の転写が“ホル
モン（Ｈ）またはホルモン同族体（aＨ)によって実質的
に活性化される”と述べた場合、これは遺伝子（Ｇ）が
位置する付近のクロマチンへのホルモン／受容体［(Ｈ)
または（aＨ)／(Ｒ)または(ｒ)］複合体の結合によって
遺伝子（Ｇ）の転写が誘導されることを意味する。この
定義において（Ｒ）は“野生型”または未変化のホルモ
ン受容体を表わすものとする。後者の（ｒ）という表示
は、機能性の“工学的に処理された”もしくは“修飾さ
れた”受容体蛋白質、または“野生型”受容体遺伝子の
ｍＲＮＡ変異型によりコードされた蛋白質を意味するも
のとする。
【００５５】ここで用いるＧＲＥはグルココルチコイド
応答要素を意味し、ＴＲＥは甲状腺ホルモン受容体エン
ハンサー様ＤＮＡ配列を意味する。ＧＲＥはＧＲと相互
作用によりグルココルチコイド応答性を与えるエンハン
サー様ＤＮＡ配列である。ペイバーら、セル，３５；３
８１（１９８３）およびシーデライトら、ネイチャー，
３０４：７４９（１９８３）を参照されたい。ＴＲＥは
それらがＴＲとの相互作用により甲状腺ホルモン応答性
を与える点以外はＧＲＥと同様である。
【００５６】ここで用いる“転写制御ユニット”、“転
写制御要素”、“ホルモン応答性プロモーター／エンハ
ンサー要素”および“転写刺激作用を媒介するＤＮＡ配
列”という語は同じことを意味し、入れ換えて用いるこ
とができる。
【００５７】ここで“作用性レポーター遺伝子に機能性
結合した作用性ホルモン応答性プロモーター／エンハン
サー要素”という句において“作用性（operative)”と
いう語はそれらのＤＮＡ配列（“ホルモン応答性プロモ
ーター／エンハンサー要素”および“レポーター遺伝
子”という語で表わされる）が作用性であること、すな
わちそれらの意図する目的に対して作用することを意味
し;“機能性（functionally）”という語はそれら２セ
グメントが結合したのちホルモン／受容体−複合体によ
って適宜活性化された際に、“ホルモン応答性プロモー
ター”が“作動開始した（turned on）"、すなわち活性
化された結果、レポーター遺伝子が発現することを意味
する。
【００５８】ここで用いる“受容体陰性”という語は細
胞中に受容体が検出されないか、または検出されたとし
てもごく少量（すなわちかろうじて検出できる量）の受
容体が存在するにすぎないことを意味する。
【００５９】ここで用いる本発明のＤＮＡの“変異体”
とは“野生型”のまたは装飾されていない配列と異なる
べく遺伝子工学的に処理された本発明のＤＮＡを意味す
る。この種の遺伝子工学的処理には野性型配列中への新
たなヌクレオチドの挿入、野生型配列からのヌクレオチ
ドの失欠、または野生型配列におけるヌクレオチドの置
換が含まれる。
【００６０】本明細書および請求の範囲において用いら
れる“実質的な配列相同”という語は、ここに開示さ
れ、特許請求された実際の配列からの配列の変動がごく
わずかであるＤＮＡまたはＲＮＡ配列は請求の範囲に示
された範囲内に含まれることを意味する。
【００６１】ここに示される各種アミノ酸配列を構成す
るアミノ酸は下記の３文字または１文字の略語によって
表示できる。
【００６２】アミノ酸 ３文字略語 １文字略語 Ｌ−アラニン Ａｌａ Ａ Ｌ−アルギニン Ａｒｇ Ｒ Ｌ−アスパラギン Ａｓｎ Ｎ Ｌ−アスパラギン酸 Ａｓｐ Ｄ Ｌ−システィン Ｃｙｓ Ｃ Ｌ−グルタミン Ｇｌｎ Ｑ Ｌ−グルタミン酸 Ｇｌｕ Ｅ Ｌ−ヒスチジン Ｈｉｓ Ｈ Ｌ−イソロイシン Ｉｌｅ Ｉ Ｌ−ロイシン Ｌｅｕ Ｌ Ｌ−リジン Ｌｙｓ Ｋ Ｌ−メチオニン Ｍｅｔ Ｍ Ｌ−フェニルアラニン Ｐｈｅ Ｆ Ｌ−プロリン Ｐｒｏ Ｐ Ｌ−セリン Ｓｅｒ Ｓ Ｌ−スレオニン Ｔｈｒ Ｔ Ｌ−トリプトファン Ｔｒｐ Ｗ Ｌ−チロシン Ｔｈｒ Ｙ Ｌ−バリン Ｖａｌ Ｖ ここに示される各種ヌクレオチド配列を構成するヌクレ
オチドは当技術分野でルーチンに用いられている通常の
１文字表示（Ａ，Ｇ，Ｔ，ＣまたはＵ）による。
【００６３】本明細書の本文および請求の範囲において
ギリシャ文字についての言及はアルファ、ベータなどと
記載される。図面においては時には対応するギリシャ文
字記号が用いられる。
【００６４】発現プラスミド pＧＥＭ３はプロメガ・バ
イオテク、53711 ワイオミング州マジソン，サウス・フ
ィッシュ・ハッチェリー・ロード 2800 から市販されて
いる。
【００６５】寄 託 プラスミドｐＲＳｈＧＲ−アルファ、ｐＲＳｈＭＲ、pe
Ａ１０１、rbeＡ１２およびＧＭＣＡＴ（これらはすべ
て大腸菌（Ｅ．coli）ＨＢ１０１中）、プラスミド pＥ
４および pＨＫＡ（これらは両者とも大腸菌ＤＨ５
中）、ならびにプラスミドphＨ３，pｈＥＲＢＡ 8.7 お
よび phＦＡ８はアメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション、米国マリーランド州ロックビル（ＡＴＣ
Ｃ）に特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関する
ブタペスト条約、およびこの条約に基づく規則の条件下
に寄託されている。上記プラスミドの試料は上記の条約
および規則の条件下で、または米国そのほか本出願もし
くは本出願の優先権を主張する出願がなされるか、もし
くはその出願に対する特許権が付与される他のすべての
国の特許法および規則に従ってそれらを受けるべく合法
的権利を有する企業事務所および他の個人が現在および
将来入手できる。
【００６６】上記１０種の寄託物に対するＡＴＣＣ寄託
番号は下記のとおりである。
【００６７】 ｐＲＳ ｈＧＲ−アルファ ６７２００ ｐＲＳ ｈＭＲ ６７２０１ ｐｅＡ１０１ ６７２４４ ｒｂｅＡ１２ ６７２８１ ＧＭＣＡＴ ６７２８２ ｐＥ４ ６７３０９ ｐＨＫＡ ６７３１０ ｐｈＥＲＢＡ ８．７ ４０３７４ ｐｈＦＡ８ ４０３７２ ｐｈＨ３ ４０３７３
【００６８】
【課題を解決するための手段】発明の要約 一観点においては本発明は、セグメントのプラスまたは
センスストランドが、グルココルチコイド受容体、ミネ
ラロコルチコイド受容体および甲状腺ホルモン受容体よ
りなる群から選ばれるホルモン受容体蛋白質に特有のホ
ルモン結合特性および／または転写活性化特性を有する
蛋白質の一次配列をコードするトリプレットの配列を含
む二重鎖ＤＮＡセグメントからなる。本発明のこの観点
によれば、この二重鎖ＤＮＡセグメントは受容体蛋白質
中に発現されうるものである。
【００６９】他の観点においては本発明は、本発明によ
る二重鎖ＤＮＡのセンスストランドである一重鎖ＤＮ
Ａ、および本発明の二重鎖ＤＮＡの転写により形成され
たＲＮＡからなる。
【００７０】他の観点においては本発明は、本発明のＤ
ＮＡの実例であるＤＮＡを含むプラスミドからなる。こ
れらのプラスミドはアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクションに特許の目的で寄託されている。本発明の
プラスミドには下記の群から選ばれるプラスミドが含ま
れる。
【００７１】ｐＲＳｈＧＲ−アルファ（ＡＴＣＣ＃６７
２００)，pＲＳｈＭＲ（ＡＴＣＣ＃６７２０１），peＡ
１０１（ＡＴＣＣ＃６７２４４），rbeＡ１２（ＡＴＣ
Ｃ＃６７２８１），ＧＭＣＡＴ（ＡＴＣＣ＃６７２８
２），pＥ４（ＡＴＣＣ＃６７３０９），pＨＫＡ（ＡＴ
ＣＣ＃６７３１０），pｈＥＲＢＡ 8.7（ＡＴＣＣ＃４
０３７４），phＦＡ８（ＡＴＣＣ＃４０３７２），およ
び phＨ３（ＡＴＣＣ＃４０３７３）。
【００７２】さらに他の観点においては本発明は、本発
明のＤＮＡにより形質転換された細胞、好ましくは哺乳
動物細胞からなる。本発明のこの観点によれば、形質転
換を行うＤＮＡはこの細胞において発現可能であり、こ
れによりこのＤＮＡがコードする受容体の量が細胞中に
おいて増加する。
【００７３】さらに本発明は、本発明のＤＮＡにより形
質転換された、酵母細胞および細菌細胞、たとえば大腸
菌および枯草菌（Ｂ．subtilis）を含む細胞からなる。
【００７４】さらに本発明は、本発明のＤＮＡの発現、
または本発明のｍＲＮＡの翻訳によって形成された新規
な受容体からなる。本発明のこの観点によれば、受容体
は“修飾されていない”本発明のＤＮＡおよびｍＲＮＡ
の蛋白質生成物であるか、または受容体ＤＮＡ配列にお
ける工学的変異の結果、対応する天然の“野生型”もし
くは同系の受容体（新規受容体ときわめて大幅なアミノ
酸配列相同を有する既知配列の天然受容体）と１もしく
は２以上のアミノ酸配列の相違を有する、修飾された、
もしくは遺伝子工学的に処理された蛋白質生成物であろ
う。好ましくはこれらの受容体は“修飾されていないも
の"または“工学的に処理されたもの"のいずれであって
も、対応する天然の同系受容体のホルモン結合活性の少
なくとも１０％、および／または転写活性化活性の少な
くとも１０％を有するであろう。
【００７５】本発明はまた本発明のＤＮＡ（またはｍＲ
ＮＡ）から得たホルモン受容体蛋白質の機能性を測定す
るための新規方法からなる。ここでは“シス−トラン
ス”バイオアッセイ法と呼ぶこの新規方法は２種のプラ
スミド、すなわち“発現”プラスミドおよび“レポータ
ー”プラスミドを用いる。本発明によれば発現プラスミ
ドは、本発明の受容体ＤＮＡまたはその工学的処理によ
る変異体を含有しており、それを適切な受容体陰性宿主
細胞中において発現しうるいかなるプラスミドであって
もよい。また本発明によればレポータープラスミドは作
動性レポーター遺伝子に機能性結合した作動性ホルモン
応答性プロモーター／エンハンサー要素を含有するいか
なるプラスミドであってもよい。
【００７６】本発明の“シス−トランス”バイオアッセ
イを実施する際には、発現プラスミド（本発明の“受容
体”ＤＮＡを含有する）およびレポータープラスミドを
適切な受容体陰性宿主細胞中へ共トランスフェクション
する。トランスフェクションされた宿主細胞は、次いで
レポータープラスミドのホルモン応答性プロモーター／
エンハンサー要素を活性化しうるホルモンまたはその同
族体の存在下および不在下に培養される。次いでトラン
スフェクションおよび培養された宿主細胞を、レポータ
ー遺伝子配列の生成物の誘導（すなわち存在）について
監視する。最後に本発明に従って受容体蛋白質（発現プ
ラスミド上の受容体ＤＮＡ配列によりコードされ、そし
てトランスフェクションおよび培養された宿主細胞中で
産生されたもの）の発現およびステロイド結合能を測定
する。（この“シス−トランス”バイオアッセイ系の模
式図については第９図を参照されたい。） “シス−トランス”バイオアッセイ系は本発明の受容体
ＤＮＡが形質転換された宿主細胞中において発現したか
否かを判定するために特に有用である。これは本発明の
受容体が対応する天然の同系受容体の結合活性の少なく
とも約１０％を含有するか否か、および本発明の受容体
が対応する天然の同系受容体の転写活性化活性の少なく
とも１０％を有するか否かを判定するためにも有用であ
る。
【００７７】最後に、その転写が受容体との複合体を形
成したホルモンによって活性化される遺伝子（Ｇ）の転
写を活性化するのに必要な、かつそれに十分な条件は、
（Ｇ)と同じ細胞中にホルモンおよびその受容体が存在
することであることが、本発明のＤＮＡを用いて見出さ
れた。この知見から遺伝子工学的に処理された細胞にお
いて目的蛋白質を生成するための改良された組成物およ
び方法を得ることが可能となった。
【００７８】これらの方法のうち２種類が本発明方法で
ある。第１はその転写が受容体との複合体を形成したホ
ルモンによって活性化される遺伝子の転写を誘導する方
法である。第２は細胞を遺伝子工学的に処理し、次いで
その転写が受容体蛋白質との複合体を形成したホルモン
によって活性化される遺伝子によりコードされる蛋白質
の生成を増加させ、かつ制御する方法である。
【００７９】これら２方法につき論じる際に、その転写
が受容体蛋白質との複合体を形成したホルモンによって
活性化される遺伝子を遺伝子（Ｇ）と呼ぶ。遺伝子
（Ｇ）を活性化するホルモンを（Ｈ）、その同族体をい
ずれも（aＨ）と呼ぶ。受容体蛋白質は（Ｒ）、その機
能性修飾体は（ｒ）と呼ばれる。最後に、遺伝子（Ｇ）
が位置する細胞を（Ｃ）、遺伝子（Ｇ）によりコードさ
れる蛋白質を（Ｐ）と呼ぶ。
【００８０】本発明の遺伝子誘導法によれば、遺伝子
（Ｇ）を含有する細胞（Ｃ）を、細胞（Ｃ）において発
現可能であり、かつ受容体（Ｒ）またはそれから修飾さ
れた機能性形態(ｒ)をコードする本発明のＤＮＡによっ
て形質転換し；そして細胞(Ｃ)におけるホルモン(Ｈ)ま
たはその同族体（aＨ）の濃度を少なくとも遺伝子
（Ｇ）の発現の誘導を保証するのに十分な程度にまで高
める。
【００８１】細胞を工学的に処理したのち蛋白質（Ｐ）
を生成させる方法によれば、ホルモン（Ｈ）が受容体
（Ｒ）との複合体を形成した状態で結合することがで
き、これにより遺伝子（Ｇ）の転写を誘導する転写制御
要素の制御下に置かれる状態に、蛋白質（Ｐ）をコード
する遺伝子（Ｇ）を細胞（Ｃ）内に配置する。この蛋白
質製造法によれば、ホルモン（Ｈ）および受容体（Ｒ）
の双方が細胞（Ｃ）中に存在する。受容体（Ｒ）の存在
は、受容体（Ｒ）またはその機能性の修飾された形態
（ｒ）をコードする本発明のＤＮＡにより細胞（Ｃ）を
形質転換することによって保証される。ホルモン（Ｈ）
またはその合成同族体（aＨ)の存在は、ホルモン（Ｈ）
またはその同族体（aＨ)を含有する浸漬液中に形質転換
した細胞（Ｃ）を浸漬することによって保証される。次
いで本方法に従って、形質転換した細胞（Ｃ）を浸漬す
るために用いられる浸漬液中の（Ｈ）または（aＨ)の濃
度を制御することによって、遺伝子（Ｇ）の転写が制御
される。こうして遺伝子（Ｇ）の転写を制御することに
よって、細胞（Ｃ）における蛋白質（Ｐ）の生成を制御
することができる。
【００８２】この教示に基づいて当業者が認識するよう
に、転写がホルモン／受容体−複合体によって活性化さ
れる遺伝子（Ｇ）によりコードされる蛋白質（Ｐ）の生
成が遺伝子（Ｇ）の位置する細胞（Ｃ）内にホルモン
（Ｈ）およびその受容体を確実に存在させ、次いで細胞
（Ｃ）中に存在するホルモン（Ｈ）またはその同族体の
濃度を制御するだけで制御される状態に、細胞を工学的
に処理することが可能となるであろう。
【００８３】
【発明の実施の形態】発明の説明 本発明は一部は、グルココルチコイド、ミネラルコルチ
コイドおよび甲状腺ホルモンの受容体に特有のホルモン
結合特性および／または転写活性化特性を有する蛋白質
をコードするＤＮＡセグメントに関する。本発明のこの
観点によれば、これらのＤＮＡセグメントは適切な宿主
細胞において発現され、これによりグルココルチコイ
ド、ミネラルコルチコイドおよび甲状腺ホルモンの受容
体、または受容体様蛋白質を生成しうるものである。本
発明は本発明のＤＮＡのセンスストランドの転写の結果
生成したｍＲＮＡにも関する。
【００８４】本発明のＤＮＡはここでは以下のとおり呼
ばれるＤＮＡによって例示される。ヒトグルココルチコ
イド受容体ＤＮＡ（ｈＧＲ)；ヒト甲状腺ホルモン受容
体ＤＮＡ（hＴＲ：hＴＲアルファおよびhＴＲベータ；h
ＴＲアルファはたとえばｈＥＲＢＡ 8.7 および hＦＡ
８である；hＴＲベータはたとえば細胞性のもの、すな
わち“c−erb−Ａ”である）；ラット甲状腺ホルモン受
容体（rbeＡ１２)、これはヒト甲状腺ホルモン受容体ア
ルファのラット同族体である；ヒトミネラルコルチコイ
ド受容体(hＭＲ)；ならびに新規なヒトステロイドホル
モン受容体（ｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２）。センスス
トランドｃＤＮＡヌクレオチド配列、およびこれらによ
りコードされる推定一次蛋白質配列は以下の図に示され
る。第３および４図：ｈＧＲについて；第１５および１
６図：ヒトc−erb−Ａについて、ならびに第２２図：ｈ
ＥＲＢＡ8.7 および hＦＡ８について；第２５および２
６図：hＭＲ について；第３４および３５、ならびに３
７および３８図：それぞれｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２
について；ならびに第４６(Ｂ）図：ラット甲状腺ホル
モン受容体rbeＡ１２について。
【００８５】ＤＮＡ、たとえばｈＧＲ、ヒトc−erb−
Ａ、ｈＥＲＢＡ8.7、hＦＡ８、hＭＲ、ｈＥＲＲ１およ
びｈＥＲＲ２は本発明の好ましいＤＮＡである。同様に
これらおよび他の本発明のＤＮＡを保有するプラスミド
も好ましい。好ましいプラスミドは以下のものが含まれ
る。pＲＳｈＧＲ−アルファ，pＲＳｈＭＲ，peＡ１０
１，rbeＡ１２，ＧＭＣＡＴ，pＥ４，pＨＫＡ，pｈＥＲ
ＢＡ 8.7，phＦＡ８，およびphＨ３。
【００８６】ｐＲＳｈＧＲ−アルファのほかに好ましい
ＤＮＡにはｐＲＳｈＧＲ−アルファの修飾体も好まれ、
これらはここでは下記のように表示される。Ｉ９，Ｉ３
７，Ｉ１０２，Ｉ１２０，Ｉ２０４，Ｉ２１４，Ｉ２６
２，Ｉ２８９，Ｉ３０５，Ｉ３４６，Ｉ３８４，Ｉ４０
３，Ｉ４０８，Ｉ４２２，Ｉ４２８，Ｉ４４０，Ｉ４４
８，Ｉ４９０，Ｉ５１５，Ｉ５３２，Ｉ５５０，および
Ｉ６８４。ここで“Ｉ”は“挿入配列（Ｉnsert）”を
表わし、“Ｉ”に続く数字はＤＮＡ修飾の表示を表す。
修飾されたｐＲＳｈＧＲ系ＤＮＡのうちきわめて好まし
いものは、ヒトグルココルチコイド受容体に特有な転写
活性化特性の少なくとも１０％を有する蛋白質をコード
するものである。これらのＤＮＡには、Ｉ９，Ｉ３７，
Ｉ１０２，Ｉ１２０，Ｉ２０４，Ｉ２１４，Ｉ２６２，
Ｉ２８９，Ｉ３０５，Ｉ３４６，Ｉ３８４，Ｉ４０３，
Ｉ４０８，Ｉ４２２，Ｉ４２８，Ｉ４４０，Ｉ４４８，
Ｉ４９０，Ｉ５１５，Ｉ５３２，Ｉ５５０，およびＩ６
８４が含まれる。
【００８７】ｐＲＳｈＧＲ−アルファの構造は本明細書
の“実験の部 II”と表示される部分に詳述されてい
る。（特に項目II．Ｆ.（ｂ）、“組換えプラスミド”を
参照されたい）。実験の部IIには上記の章に述べたｐＲ
ＳｈＧＲ−アルファ修飾体の構造および特性についても
詳述されている。
【００８８】第３および４図に示したｈＧＲに対するｃ
ＤＮＡ配列に関しては、図示された配列の５’末端の２
個のＣはＲＳＶ−ＬＴＲを含むセグメントの３’末端に
図示したセグメントを結合させるＫpnＩ部位の部分であ
る。図示した配列の３’末端のＴは、図示したセグメン
トがＳＶ４０ポリアデニル化信号を含むセグメントに結
合する地点の５’側へ数個の塩基の位置にある。
【００８９】ｐＲＳｈＧＲ は本質的にｐＲＳｈＧＲ−
アルファと同じ様式で構成され、本質的にｐＲＳｈＧＲ
−アルファと等しい。言い換えると、挿入部位における
わずかな修飾を除いて、第２４図に示したhＭＲセグメ
ントが、第３および４図に配列を示したｈＧＲに置換し
ている。ｐＲＳｈＧＲと同様にｐＲＳｈＭＲはラウス肉
腫ウイルス由来のプロモーターおよびＳＶ４０複製開始
点の制御下に受容体蛋白質ＤＮＡコード配列を含有す
る。実験の部IVの参考文献部分の脚注４１を参照された
い。第２８（Ａ）図も参照し、第９図と比較されたい。
【００９０】第２５および２６図に示したｈＭＲ配列に
関しては、このセグメントの５’末端にあるＡＧはＨin
dIII部位から数塩基対下流にあり、これによってｈＭＲ
セグメントはＲＳＶ−ＬＴＲ含有セグメントに結合して
いる。第２６図に示したセグメントの３’末端のＡＡは
ＳＶ４０ポリアデニル化信号を含むセグメントの５’末
端から塩基数個上流にある。
【００９１】プラスミドpeＡ１０１はヒト甲状腺ホルモ
ン受容体c−erb−Ａのコード領域全体を保有する。（c
−erb−Ａに対する遺伝子はヒト染色体３に局在する；
この受容体遺伝子によりコードされる蛋白質生成物をこ
こでは hＴＲベータと呼ぶ。実験の部IIIを参照し、実
験の部VIIと比較されたい）。
【００９２】プラスミドpeＡ１０１はpheＡ１２（第１
４図参照）からのＥcoＲＩ断片を発現ベクターpＧＥＭ
３（プロメガ・バイオテク）のＥcoＲＩ部位に適正な向
きに挿入することにより構成された。この構造について
の詳細は実験の部III、項目III．１の第III−４法と表
示する項目を参照されたい。
【００９３】ヒト染色体３に局在している hＴＲ受容体
のほかに、本発明者らはプラスミドpeＡ１０１により推
定される蛋白質配列と異なる第２の甲状腺ホルモン受容
体を見出した。本発明者らはこの新規な予想されなかっ
た甲状腺ホルモン受容体をラットおよびヒトの双方から
単離し、特性を調べた。ラットの場合、この新規な甲状
腺ホルモン受容体はプラスミドrbeＡ１２のＤＮＡによ
りコードされる。（rbeＡ１２に関するＤＮＡおよび推
定−次蛋白質配列を第４６（Ｂ）図に示す。）ヒトの場
合、この新規な甲状腺ホルモン受容体はプラスミドクロ
ーンｈＥＲＢＡ8.7およびその関連クローン hＦＡ８に
よりコードされる。（ｈＥＲＢＡの配列については第２
２図を参照されたい。）ｈＥＲＢＡ 8.7および hＦＡ８
は同一遺伝子からのｃＤＮＡ生成物である。クローン h
ＦＡ８のＤＮＡ配列は下記の点を除いてｈＥＲＢＡ 8.7
（第２２図に示す）と等しい。 hＦＡ８の配列は第２２
図に示す配列より短い。より詳細には、ｈＥＲＢＡ 8.7
のヌクレオチド１（Ｇ）から１４（Ａ）までが hＦＡ配
列にはない。さらに hＦＡ８配列は塩基対位置１１３８
のグアニン（Ｇ）から塩基対１２４４のグアニン（Ｇ）
に及ぶ欠失を有する。この欠失によってアミノ酸３６８
（Ｇlu)から４０６（Ｇｌn）までが hＦＡ８クローンに
よりコードされるポリペプチドから失われる。前記のよ
うに本発明の最初の甲状腺ホルモン受容体は染色体３に
局在している。実験の部VIIに示すように、新規な甲状
腺ホルモン受容体に対するヒト遺伝子ヒト染色体１７に
局在している。ラット甲状腺ホルモン受容体rbeＡ１２
を染色体１７からのヒト遺伝子生成物のラット型同族体
を表わす。
【００９４】それらは異なる遺伝子坐によりコードされ
るので、染色体１７遺伝子生成物はhＴＲ アルファとし
て分類され、染色体３遺伝子生成物は hＴＲベータとし
て分類されている。関連性は高いが、アルファおよびベ
ータ遺伝子生成物はそれらの一次アミノ酸配列において
特異的変化を含む。またアルファおよびベータ生成物は
特徴的に異なる発現パターンを示す。
【００９５】甲状腺ホルモンの作用は多岐にわたり、そ
れらの受容体に依存している。本発明者らが甲状腺ホル
モン受容体をクローニングする以前はこの受容体は精製
または生化学的特性の解決はなされていなかった。科学
文献にも多種の甲状腺ホルモン受容体遺伝子生成物の存
在を示唆する証拠は全くなかった。多種の受容体が存在
することは、これら受容体のうち１種類のみを選択的に
活性化する甲状腺ホルモン同族体を開発する基礎として
有用である。これは広範な臨床的威力をもつと思われる
ので、興味ある重要な知見である。
【００９６】本発明者らが特性を明らかにした最初の甲
状腺ホルモン受容体はpeＡ１２、すなわち現在ヒト甲状
腺ホルモン受容体ベータと呼ばれる受容体であった。本
発明者らは分子ハイブリダイゼーションによってラット
脳ｃＤＮＡライブラリーを関連配列につきスクリーニン
グするためにこのベータクローンを用いた。これによつ
てプラスミドrbe１２が同定され、のちにこれがアルフ
ァ群の新規な甲状腺ホルモン受容体として同定された。
このラット rbeＡ１２は rbeＡ１２遺伝子生成物に対す
るヒト同族体クローニングするための分子ハイブリダイ
ゼーションプローブとして用いられた。このヒト生成物
はクローンｈＥＲＢＡ 8.7および hＦＡ８によりコード
される。
【００９７】他の甲状腺ホルモン受容体ｃＤＮＡ（ラッ
ト甲状腺ホルモン受容体 rbeＡ１２、ならびにヒト甲状
腺ホルモン受容体ｈＥＲＢＡ 8.7および hＦＡ８）はそ
れらのcＤＮＡを−erb−Ａについて行ったと同様に適正
な向きで発現ベクター pＧＥＭ３中へ挿入することによ
って発現させることができる。
【００９８】ここでプラスミドＧＭＣＡＴについて述べ
ると、これはクロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ（ＣＡＴ）に対する細胞遺伝子に結合したＭＴ
ＶＬＴＲを含むレポータープラスミドである。この結合
の結果、pＧＭＣＡＴを用いてＭＴＶプロモーターの転
写活性を評価するための酵素アッセイを行うことができ
る。ＭＴＶプロモーターは数種のグルココルチコイド応
答要素（ＧＲＥ）を含むので、レポータープラスミド p
ＧＭＣＡＴはグルココルチコイドまたはミネラルコルチ
コイドレポーターＤＮＡ（現在知られているか、または
のちに見出された）を保有する発現プラスミドと共に適
切な宿主細胞中へ共トランスフェクションすることがで
きる。（このような共トランスフェクションは本発明の
“シス−トランス”機能性バイオアッセイ系の一部であ
る。本発明のこの観点についてはのちに詳述する。）共
トランスフェクションした宿主細胞においてＣＡＴ活性
が検出されたことは、受容体発現プラスミドにより産生
されたポリペプチドが機能性であること、すなわち受容
体蛋白質に特有の転写活性化特性を有することを示す。
プラスミド pＧＭＣＡＴはＡＴＣＣに特許の目的で寄託
され、ＡＴＣＣ＃６７２８２を得た。（pＧＭＣＡＴの
模式図については第２９（Ａ）図を参照されたい。
【００９９】プラスミド pＧＨＣＡＴは本発明に有用な
他のレポータープラスミドの一例である。pＧＨＣＡＴ
はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
(ＣＡＴ)に対する細菌遺伝子に機能性結合した成長ホル
モンプロモーターの一部を含む。この結合のため、pＧ
ＨＣＡＴを用いて成長ホルモン（ＧＨ）プロモーターの
転写活性を評価するための酵素アッセイを行うことがで
きる。ＧＨプロモーターは甲状腺ホルモン応答要素（Ｔ
ＲＥ）を含むので、レポータープラスミド pＧＨＣＡＴ
は甲状腺ホルモンレポーターＤＮＡ（現在知られている
か、またはのちに見出された）を保有する発現ベクター
と共に適切な宿主細胞中へ共トランスフェクションする
ことができる。（このような共トランスフェクションも
本発明の“シス−トランス”レポーター機能性バイオア
ッセイ系の一部である。本発明のこの観点についてはの
ちに詳述する。） pＧＨＣＡＴをＴＲ発現プラスミド
（これはたとえば hＴＲアルファまたは hＴＲベータＤ
ＮＡを保有する）と共に用いて適切な宿主細胞を共トラ
ンスフェクションした場合、共トランスフェクションし
た宿主細胞におけるＣＡＴ活性の検出は、甲状腺ホルモ
ン受容体（ＴＲ）発現プラスミドにより産生されたポリ
ペプチドが機能性であること、すななわち甲状腺ホルモ
ン受容体蛋白質に特有の転写活性化特性を有することを
示すために用いられる。
【０１００】プラスミド pＥ４および pＨＫＡは、ここ
ではｈＥＲＲ１と呼ばれるエストロゲン関連受容体をコ
ードするｃＤＮＡに関係する。（実験の部Ｖ、特に第３
３−３５図を参照されたい。）プラスミド pＥ４は第３
３図においてラムダ hＫＥ４とよばれるｃＤＮＡセグメ
ントを保有し、； pＨＫＡは同図においてラムダhＫＡ
１と呼ばれるセグメントを保有する。pＥ４およびpＨＫ
Ａ共方ともＡＴＣＣに特許の目的で寄託されている。こ
れら２種のプラスミドを後記に従って結合させて、エス
トロゲン関連受容体ｈＥＲＲ１に対する全コード配列を
含む単一プラスミド（pＧＭＥＲＲ１）を得ることがで
きる。
【０１０１】２種のｃＤＮＡクローン pＥ４および pＨ
ＫＡを結合させるための好ましい方法は、各ｃＤＮＡに
存在する特異的制限酵素部位に対し各末端において相補
的である合成リンカーを利用する。より詳細には、ラム
ダhＫＡ１およびラムダhＫＥ４からの挿入配列をＥcoＲ
Ｉ断片としてプラスミドベクター pＧＭ３（プロメガ・
バイオテク）中へクローニングする；本発明者らはこれ
らをそれぞれ pＧＭＫＡおよびpＧＭＫＥと命名した。
次いで pＧＭＫＡをＮarＩおよびＨindIIIにより切断
し、ｈＥＲＲ１をコードする断片をアガロースゲルから
精製する（断片１）。pＧＭＫＥをＤraIIIおよびＨindI
II により切断し、ｈＥＲＲ１の５’末端領域およびベ
クター配列をコードする断片をアガロースゲルから精製
する（断片２）。第３に、互いに相補的な２種の合成オ
リゴヌクレオチドを合成する。これらのオリゴヌクレオ
チドは下記のものである。
【０１０２】オリゴＩ：ＧＴＧＣＣＴＧＧＴＧＣＧＧＴ
ＧＧＧＡＧＧＡＡＡＡＣＣＡＧＡＧＴＧＴＡＴＧＣＴＡ
ＣＡＡＧＣＡＧＣＣＧＧＣＧＧＧ； オリゴII：ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＧＣＴＧＣＴＴＧＴＡＧ
ＣＡＴＡＣＡＣＴＣＴＧＧＴＴＴＴＣＣＴＣＣＣＡＣＣ
ＧＣＡＣＣＡＧＧＣＡＣＴＴＴ。
【０１０３】最後に断片１および２ならびにオリゴIお
よびIIを当業者に周知の標準法に従って互いにリゲート
させ、次いで細菌ＤＨ５株中へ形質転換する。得られた
コロニーをここでは pＧＭＥＲＲ１と呼ばれるＤＮＡ構
造物につきスクリーニングする。プラスミド pＧＭＥＲ
Ｒ１を用いてｈＥＲＲ１を発現させることができる。p
ＧＭＥＲＲ１の模式図については第８（Ａ）図を参照さ
れたい。
【０１０４】プラスミド phＨ３は、ヒト心臓ラムダ gt
llｃＤＮＡライブラリーから、ラムダ hＫＡ１の５’部
分を表わす、ニックトランスレーションされた７００−
bpＥ coＲＩ−ＳmaＩ断片を用いて単離されたラムダ hＨ
３クローンに関連する。（ラムダ hＫＥ４およびラムダ
hＫＡ１クローンはヒト腎ラムダgt１０ｃＤＮＡライブ
ラリーから単離された；実験の部Ｖ.Ｈ，特に第３３−
３８図の方法と表示される項目を参照されたい。）ラム
ダhＨ３クローンはここではｈＥＲＲ２と呼ばれるエス
トロゲン関連受容体をコードするｃＤＮＡを保有する。
phＨ３からのｃＤＮＡを pＧＭ３中へ挿入して pＧＭＥ
ＲＲ２を形成することができる。その図は第８（Ｂ）図
に示されている。受容体様ポリペプチドｈＥＲＲ１およ
びｈＥＲＲ２の機能上および構造上の特性を実験の部Ｖ
に示す。
【０１０５】本発明者らが本発明のＤＮＡを用いて得た
知見の１つは、同一種内の各種ホルモン受容体間の、ま
た特定のいずれかの受容体については種間の著しい配列
相同である。（たとえばv−erb−Ａ発癌遺伝子生成物、
ヒト胎盤c−erb−Ａポリペプチド、ならびにヒトグルコ
コルチコイドおよびエストロゲン受容体のカルボキシ末
端部分を比較した第１７図；ステロイドおよび甲状腺ホ
ルモン受容体を比較した第２１図；ミネラルコルチコイ
ド受容体とグルココルチコイド受容体のアミノ酸相同を
比較した第２７図；ｈＧＲ、hＭＲおよび hＰＲ間のア
ミノ酸比較を示した第３２図；ｈＥＲＲ１、ｈＥＲＲ
２、ヒトエストロゲンおよびヒトグルココルチコイド受
容体のカルボキシ末端領域を比較した第３９図；ならび
にｈＥＲＲ１，ｈＥＲＲ２，ｈＥＲ，ｈＧＲおよびヒト
甲状腺ホルモン受容体 hＴ3Ｒベータ間のアミノ酸の比
較を示す第４１図を参照されたい。）この相同性がある
ため本発明のＤＮＡおよびＲＮＡは、ホルモンと複合体
を形成したのちクロマチンＤＮＡに結合することにより
転写を活性化するホルモン受容体をコードする遺伝子を
実質的にいかなる種からも検出および単離することがで
きる。本発明のＤＮＡおよびＲＮＡ、特にＡＴＣＣに特
許の目的で寄託された好ましいＤＮＡを用いることによ
り、当業者は多大な試験を行うことなくゲノムライブラ
リーをスクリーニングして、本発明の範囲に含まれる他
のグルココルチコイド、ミネラルコルチコイドおよび甲
状腺ホルモン受容体を見出すことができる。本発明のこ
の観点は本発明者らによりエストロゲン関連受容体ｈＥ
ＲＲ１およびｈＥＲＲ２（実験例Ｖ、特に項目Ａ、序、
および項目Ｂ、受容体ｈＥＲＲに対する cＤＮＡクロー
ンの項を参照されたい）、ならびにラット甲状腺ホルモ
ン受容体およびヒト甲状腺ホルモン受容体ＴＲアルファ
（実験の部VII、特に項目Ｃ、第２甲状腺ホルモン受容
体ＤＮＡの単離、ならびに第４６（Ａ）および（Ｂ）図
を参照されたい）が見出されたことにより説明される。
【０１０６】本発明のＤＮＡおよびセンスストランドＤ
ＮＡはたとえば本発明の誘導法および蛋白質製造法と組
合わせて使用して、大量の実質的に純粋な受容体蛋白質
を製造することができる。さらに、こうして製造された
実質的に純粋な受容体蛋白質を周知の方法により診断ア
ッセイ法に使用して、各種の体液および組織試料におけ
る特定のホルモンの存在を調べることができる。
【０１０７】さらに本発明の受容体蛋白質を結合アッセ
イ法、たとえば実験の部IIIに述べるpeＡ１０１により
コードされる受容体へのＴ3の結合に関する方法、また
は後述する本発明の“シス−トランス”受容体機能性バ
イオアッセイ法により、受容体作用薬および受容体拮抗
薬をスクリーニングするのに用いることができる。
【０１０８】最後に、本発明の受容体蛋白質は実質的に
純粋な形で製造されるので、それらを結晶化し、Ｘ線回
折法によりそれらの構造を調べることができる。当業者
に周知のように、これらの測定は“合成”または修飾さ
れた受容体蛋白質同族体を工学的に製造する際にきわめ
て有用である。
【０１０９】ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにこれにより
製造された新規な受容体蛋白質のほかに、本発明は以下
の３種の一般法を開示する。一方法は受容体蛋白質の機
能性を測定するためのバイオアッセイ法に関する。他の
二方法はそれらの転写がクロマチンＤＮＡに結合したホ
ルモン−受容体−複合体により活性化される遺伝子の発
現を誘導および制御する方法に関する。これら３種の一
般法それぞれにつき別個に述べる。
【０１１０】本発明者らが“シス−トランス”バイオア
ッセイ系と呼ぶ、受容体機能性を試験するための新規な
バイオアッセイ系は２種のプラスミド、すなわち“発
現”プラスミドおよび“レポーター”プラスミドを使用
する。本発明によれば発現プラスミドは本発明の受容体
ＤＮＡまたはそれらの変異体を適切な受容体陰性宿主細
胞において発現しうるいかなるプラスミドであってもよ
い。同様に本発明によればレポータープラスミドは作動
性レポーター遺伝子に機能性結合した作動性ホルモン応
答性プロモーター／エンハンサー要素を含むいかなるプ
ラスミドであってもよい。（ここで用いる用語の説明に
ついては本明細書の定義の項を参照されたい。）プラス
ミド pＧＭＣＡＴおよび pＧＨＣＡＴは作動性レポータ
ー遺伝子に機能性結合した作動性ホルモン応答性プロモ
ーター／エンハンサー要素を含むレポータープラスミド
の例であり、従って本発明の受容体機能性バイオアッセ
イに使用できる。 pＧＭＣＡＴの場合、作動性ホルモン
応答性プロモーター／エンハンサー要素はＭＴＶ ＬＴ
Ｒであり；pＧＨＣＡＴの場合、これは成長ホルモン受
容体の機能性部分である。 pＧＭＣＡＴおよび pＧＨＣ
ＡＴの双方において作動性レポーター遺伝子はクロラム
フェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）に
対する細菌性遺伝子である。
【０１１１】本発明の“シス−トランス”受容体機能性
バイオアッセイを実施する際には、発現プラスミドおよ
びレポータープラスミドを適切な受容体陰性宿主細胞中
へ共トランスフェクションする。トランスフェクション
された宿主細胞は次いでホルモンまたは同族体の存在下
または不在下で培養され、レポータープラスミドのホル
モン応答性プロモーター／エンハンサー要素を活性化す
ることができる。トランスフェクションおよび培養され
た宿主細胞を次いでレポーター遺伝子配列の生成物の誘
導（すなわち存在）につき監視する。最後に、ホルモン
受容体蛋白質またはそれらの変異体（発現プラスミド上
の受容体ＤＮＡ配列によりコードされ、トランスフェク
ションおよび培養された宿主細胞において産生されたも
の）の発現および／またはステロイド結合能を本発明に
従って測定する。（この“シス−トランス”バイオアッ
セイ系の模式図については第９図を参照されたい。） 本発明の“シス−トランス”受容体機能性バイオアッセ
イ系を好ましい形態においてグルココルチコイドまたは
ミネラルコルチコイド受容体の機能性の測定に用いる場
合、プラスミドは選択可能なマーカー、たとえば amp遺
伝子を保有するであろう。さらに、好ましい形態におい
てはレポータープラスミドは ＭＴＶ ＬＴＲまたは成長
ホルモンプロモーターの機能性部分をホルモン応答性プ
ロモーター／エンハンサー要素として含むであろう。Ｍ
ＴＶ ＬＴＲが好ましいのは、グルココルチコイドホル
モンがＭＴＶ ＬＴＲ内の特異的部位において転写開始
の効率を高めることによりＭＴＶ ＤＮＡの転写速度を
刺激することが知られているからである。さらにグルコ
コルチコイド受容体はＭＴＶ ＬＴＲ内にマッピングさ
れたＤＮＡ配列に特異的に結合し、従って異種プロモー
ターに対するグルココルチコイドの応答性を与えること
ができる。（実際の部II、特に項目Ｃ．（a)アッセイ系
および実験様式を参照されたい。）またミネラルコルチ
コイド受容体がグルココルチコイド受容体と機能的関連
を示すこと、およびｈＭＲのＤＮＡ結合区がＭＴＶ Ｌ
ＴＲを認識することも知られている。（実験の部IV、特
に項目Ｅ．：発現およびホルモンの結合、および項目
Ｆ．：転写活性化を参照されたい。）成長ホルモンプロ
モーターが好ましいのは、その活性化が甲状腺ホルモン
−受容体−複合体による結合に応答するからである。
【０１１２】本発明の“シス−トランス”バイオアッセ
イ系に用いるために好ましい宿主細胞はＣＯＳ細胞およ
びＣＶ−１細胞である。（本発明のバイオアッセイ系に
用いられる好ましい宿主細胞については、実験の部II、
項目Ｃ．（a）アッセイ系および実験様式を参照された
い。）ＣＯＳ−１（ＣＯＳと呼ぶ）細胞はＳＶ４０Ｔ抗
原（Ｔag）を発現するマウス腎細胞であり；ＣＶ−１は
ＳＶ４０ Ｔagを発現しない。ＣＶ−１細胞は内在性グ
ルココルチコイドもしくはミネラルコルチコイドまたは
他の既知のステロイドホルモンもしくは甲状腺ホルモン
の受容体をいずれも欠如するので好都合である。従って
適宜な発現ベクターを用いる遺伝子転写によりこれらの
宿主細胞を受容体陰性から受容体陽性へ転換させること
が可能である。ＣＯＳ−１誘導体系にＴagが存在するこ
とによって、導入された発現プラスミドを複製し、アッ
セイ期間中に生成する受容体の量を相対的に高めること
ができる。
【０１１３】ＳＶ４０複製開始点（ori）を含む発現プ
ラスミドは、ＳＶ４０Ｔagを発現するいかなる宿主細胞
においても高いコピー数にまで増殖することができる。
従ってＳＶ４０“ori”を保有する本発明の発現プラス
ミドはＣＯＳ細胞において複製しうるが、ＣＶ−１細胞
においては複製されない。高いコピー数によって与えら
れる高い発現が望ましいが、これは開示されたバイオア
ッセイ系にとつて決定的なものではない。いずれかの特
定の細胞系を“宿主”として用いることも決定的なもの
ではない。上記発現ベクターはきわめて有効であるの
で、本発明者らによればこのアッセイ法は本発明者らが
試験したすべての宿主において作動した。ＣＶ−１細胞
が好ましいのは、それが遺伝子転移の研究に好都合であ
り、感受性の、かつ十分に報告された宿主細胞系を提供
するからにすぎない。
【０１１４】“シス−トランス”バイオアッセイ系は、
本発明の受容体ＤＮＡが転移した宿主細胞中に発現した
か否かを判定するために特に有用である。これは本発明
の受容体が対応する天然の同系受容体の結合活性の少な
くとも約１０％を有するか否か、またこの受容体が対応
する天然の同系受容体の転写活性化活性の少なくとも１
０％を有するか否かを判定する際にも有用である。
【０１１５】第９図は本発明の“シス−トランス”受容
体機能性バイオアッセイ系をｈＧＲｃＤＮＡ によりコ
ードされる受容体ポリペプチドの機能性の測定に用いる
方法につき模式的に示す。このバイオアッセイ法の詳
細、および受容体の機能性を試験するための定量性バイ
オアッセイ系としてのその有効性は実験の部IIに開示お
よび論述される。（特に項目Ｆ．実験法；および項目
Ｃ.（b）機能性ｈＧＲの発現を参照されたい。）同実験
の部に示されるように、ホルモン応答性プロモーター／
エンハンサー要素の活性化を証明するために採用できる
ＣＡＴ酵素アッセイ法のほかに、転移宿主細胞のウェス
ターンブロット分析法を採用して、対照として用いられ
る同系受容体から移動性に関して区別できない受容体ポ
リペプチドの合成を証明することができる。さらに本発
明の“シス−トランス”バイオアッセイ系を採用して、
特異的ホルモンによる受容体（トランスフェクションお
よび培養された宿主細胞において産生されたもの）の活
性化、ならびにそれらのホルモン結合能および特性を調
べることができる。実験の部IIに証明されるように、こ
れがｈＥＲについて行われた場合本発明のｈＧＲは機能
性であり、同系受容体の場合と同じ特異性および濃度で
グルココルチコイドホルモンと結合することが示され
た。
【０１１６】最後に本発明者らは要約の項に示すように
本発明のＤＮＡを用いて、その転写が受容体との複合体
を形成したホルモンにより活性化される遺伝子（Ｇ）の
転写活性化に必要かつ十分な条件は、（Ｇ）が存在する
細胞（Ｃ）中にホルモンおよびその受容体が存在するこ
とであることを見出した。（ホルモン（Ｈ）および受容
体（Ｒ）が遺伝子（Ｇ）の転写に作用する様式は完全に
は理解されていない。しかし受容体（Ｒ）はホルモン
（Ｈ）と複合体を形成した場合、特異的ＤＮＡ部位、す
なわち当技術分野で“転写制御要素”または“転写刺激
を媒介するＤＮＡ配列”と呼ばれ、遺伝子（Ｇ）が位置
する付近のクロマチン上に存在するものに結合すると考
えられる。ホルモン／受容体−すなわち（Ｈ）／（Ｒ）
−複合体によるこの結合は、まだ解明されていない様式
で、遺伝子（Ｇ）に対するプロモーターを“始動させる
（turn on）”かまたは何らかの他の方法で活性化し、
これにより（Ｇ）遺伝子の転写を刺激するホルモン依存
性“スイッチ”として作用すると思われる。） 本発明者らの知見によって、遺伝子工学的に処理された
細胞において目的蛋白質を産生させるための改良された
組成物および方法が得られた。これらの方法２種が本発
明方法である。第１はその転写が受容体との複合体を形
成したホルモンによって活性化される遺伝子の転写を誘
導する方法である。第２は細胞を遺伝子工学的に処理
し、次いでその転写が受容体との複合体を形成したホル
モンによって活性化される遺伝子によりコードされる蛋
白質の生成を増大および制御する方法である。
【０１１７】これら２方法につき述べる際にも、受容体
蛋白質との複合体を形成したホルモンにより転写が活性
化される遺伝子を遺伝子（Ｇ）と呼ぶ。遺伝子（Ｇ）を
活性化するホルモンを（Ｈ）、その同族体をいずれも
（aＨ）と呼ぶ。受容体蛋白質は（Ｒ）、その機能性修
飾体は（r）と呼ばれる。最後に、遺伝子（Ｇ）が存在
する細胞を（Ｃ）と呼び、遺伝子（Ｇ）によりコードさ
れる蛋白質を（Ｐ）と呼ぶ。
【０１１８】本発明の遺伝子誘導法によれば、遺伝子
（Ｇ）を含む細胞（Ｃ）が、細胞(Ｃ)において発現可能
であり、受容体（Ｒ）またはその修飾された機能性形態
（r)をコードする本発明のＤＮＡにより形質転換され
る。そして細胞（Ｃ）におけるホルモン（Ｈ）の濃度ま
たは同族体（aＨ）の濃度を少なくとも遺伝子（Ｇ）の
発現を確実に誘導するのに十分な水準にまで高める。
【０１１９】実験の部IIに示したように本発明の誘導法
を採用した場合、意外にも遺伝子(Ｇ)が位置する細胞に
（Ｈ）および（Ｒ）が存在することによって遺伝子
（Ｇ）の転写が誘導されるだけでなく、蛋白質（Ｐ）の
産生が５００〜１０００倍高められた。この知見はこの
誘導法が転写を誘導するためにだけでなく、これを増大
および制御するためにも採用されることを本発明者らに
示した。この知見から、細胞を工学的に処理し、次いで
その転写が受容体との複合体を形成したホルモンにより
活性化される遺伝子（Ｇ）によりコードされる蛋白質の
生成を制御する本発明方法も開発された。この方法につ
いてはのちにより詳細に述べる。
【０１２０】本発明の誘導法は細胞に与えられるホルモ
ン（Ｈ）またはその同族体（aＨ)の濃度を調節するだけ
で蛋白質（Ｐ）の生成を増大させ、および制御するため
にも採用できる。（当業者に自明のとおり、細胞（Ｃ）
を本発明のＤＮＡで形質転換すると、細胞（Ｃ）におい
て（Ｒ）または（r）の適切な供給が保証されるので、
（Ｒ)または（r）の欠如はもはや遺伝子（Ｇ）の転写に
おける制限因子とはならない。このため、培養液中の
（Ｈ）または（aＨ)の量を増加させるだけで遺伝子
（Ｇ）の転写を増加させ、結果的に細胞（Ｃ）において
産生される蛋白質の量を増加させることができるであろ
う。） 本発明の誘導法は下記の条件を満たす限り、ホルモン
（Ｈ）またはその同族体（aＨ）のうちのいずれかと複
合体を形成したステロイドホルモンまたは甲状腺ホルモ
ン受容体が結合することによって活性化される転写制御
要素による転写制御下にあるいかなる遺伝子（Ｇ）の発
現をも誘導するために採用できる：（１）受容体
（Ｒ）、または（Ｒ）の転写活性化特性を備えたその機
能的な修飾された形態（r)をコードするＤＮＡを使用で
きる；（２）細胞（Ｃ）が培養可能な細胞である；
（３）細胞（Ｃ）がホルモン（Ｈ）または同族体（aＨ)
との複合体形成のために必要な（Ｒ）−または（r)−コ
ード化ＤＮＡを発現すべく形質転換されうる。
【０１２１】当業者は寄託された本発明のＤＮＡのいず
れをもプローブとして用いて、現在入手できない（Ｒ）
−または（r)−コード化ＤＮＡのゲノムライブラリーを
多大な実験なしに探査することができる。これらのＤＮ
Ａが見出されると、これらが遺伝子（Ｇ）の存在する細
胞（Ｃ）において発現可能である場合には細胞（Ｃ）の
形質転換に使用できる。培養細胞を形質転換する方法は
周知であり、当業者が多大な実験なしに用いることがで
きる。同様に多大な実験なしに、細胞（Ｃ）に（Ｈ）が
存在する場合その基礎水準はどの程度であるか、また遺
伝子(Ｇ)の転写を、従って蛋白質（Ｐ）の生成を誘導お
よび制御するためには(Ｈ)または(aＨ）の濃度はどの程
度でなければならないかを当業者は判定できる。培養細
胞（Ｃ）の浸漬に用いられる培養液に（Ｈ）または（a
Ｈ）を添加することにより、必要な濃度の（Ｈ）を形質
転換細胞（Ｃ）に供給することができる。
【０１２２】本発明により、遺伝子（Ｇ）の転写に必要
かつ十分な条件は遺伝子（Ｇ）が存在する細胞（Ｃ）に
（Ｈ）または（aＨ)および（Ｒ）または（ｒ）が存在す
ることであり、遺伝子（Ｇ）の転写、従って蛋白質
（Ｐ）の生成は形質転換細胞(Ｃ)の浸漬に用いられる培
養液中の（Ｈ）または（aＨ)の量を増加させるだけで誘
導および制御できることが教示された。当業者に自明の
とおりこれらの知見に基づいて細胞を工学的に処理し、
その結果遺伝子（Ｇ）が位置する細胞（Ｃ）中にホルモ
ン（Ｈ）およびその受容体を確実に存在させ、次いで細
胞（Ｃ）中に存在するホルモン（Ｈ）またはその同族体
の濃度を制御するだけで、その転写がホルモン／受容体
−複合体により活性化される遺伝子によってコードされ
る蛋白質の生成を制御することができる。この概念は本
発明による細胞の工学的処理および蛋白質の製造のため
の方法の基礎である。
【０１２３】本発明による細胞の工学的処理法および蛋
白質の製法によれば、(１)細胞(Ｃ)を遺伝子（Ｇ）が含
有されるべく工学的に処理し、その結果遺伝子（Ｇ）の
転写は適宜なホルモン／受容体、（Ｈ）／（Ｒ）、複合
体が結合し、これにより遺伝子（Ｇ）の転写が活性化さ
れる転写制御要素による制御下に置かれ；（２）この時
点で転写制御要素による制御下にある遺伝子（Ｇ）が含
有される細胞（Ｃ）を、細胞（Ｃ）において発現可能で
あり、受容体（Ｒ）またはその修飾された機能的形態
（r）をコードする本発明のＤＮＡにより形質転換し；
（３）最後に、細胞（Ｃ）におけるホルモン（Ｈ）また
はその同族体の濃度を調節して、形質転換細胞（Ｃ）の
浸漬に用いる培養液から細胞が利用しうるホルモン
（Ｈ）の量を増大および制御することにより、遺伝子
（Ｇ）の転写が誘導されるだけでなく効果的に増大およ
び制御される。このように遺伝子（Ｇ）の転写を増大お
よび制御することにより、蛋白質（Ｐ）の生成も増大お
よび制御される。
【０１２４】上記の誘導法の場合、本発明による細胞の
工学的処理および蛋白質製造のための方法においてはホ
ルモン（Ｈ）および受容体（Ｒ）の双方が細胞（Ｃ）中
に存在する。また誘導法の場合、受容体(Ｒ)またはその
機能的な修飾された形態(r）の存在が本発明の（Ｒ）−
または（r)−コード化ＤＮＡにより細胞（Ｃ）を形質転
換することにより保証される。前記のように、培養細胞
を形質転換する方法は周知であり、当業者が多大な実験
なしに用いることができる。適宜な濃度の(Ｈ)または
（aＨ）を含有する浸漬液中に形質転換細胞(Ｃ）を浸漬
するだけで、(Ｈ)またはその同族体（aＨ）の存在を保
証し、かつ（Ｈ）または（aＨ）の濃度を制御すること
ができる。適宜な濃度、すなわち一定量の蛋白質を生成
するために細胞（Ｃ）が必要とする（Ｈ）または（aＨ)
の濃度は、一定の条件下で多大の実験なしに当業者が判
定することができる。
【０１２５】同様に当業者に自明のとおり、細胞（Ｃ）
を本発明のＤＮＡにより形質転換することによって細胞
（Ｃ）における適切な（Ｒ）または（ｒ）の供給が保証
され、従って（Ｒ）または（r)の欠如が遺伝子（Ｇ）の
転写における制限因子となることはない。このため、培
養液中の（Ｈ）または（aＨ)の量を増加させるだけで、
細胞（Ｃ）中に産生される蛋白質の（Ｐ）の量を増加さ
せることができるであろう。
【０１２６】本発明の誘導法の場合と同様に、本発明に
よる細胞の工学的処理および蛋白質の製造のための方法
は下記の条件を満たす限り、細胞（Ｃ）に挿入すること
ができ、その結果ホルモン（Ｈ）またはその同族体のい
ずれかと複合体を形成したステロイドホルモンまたは甲
状腺ホルモン受容体（Ｒ）の結合によって活性化される
転写制御要素による転写制御下に置かれるいかなる遺伝
子（Ｇ）の発現の制御にも採用することができる：
（１）受容体（Ｒ）、または（Ｒ）の転写活性化特性を
備えたその機能的な修飾された形態（r）をコードする
ＤＮＡを使用できる；(２）細胞（Ｃ）が培養可能な細
胞である；（３）（Ｒ）−または（ｒ）−コード化ＤＮ
Ａは遺伝子（Ｇ）が存在する細胞において発現可能であ
る。
【０１２７】この場合も多大な実験なしに当業者は寄託
された本発明のＤＮＡのいずれをもプローブとして用い
て、現在入手できない（Ｒ)−または（r）−コード化Ｄ
ＮＡのゲノムライブラリーを探査することができる。こ
れらのＤＮＡが見出されると、これらが遺伝子（Ｇ）の
存在する細胞（Ｃ）において発現可能である場合には本
発明の工学的蛋白質製造法に使用できる。
【０１２８】同様に多大な実験なしに、細胞（Ｃ）に
（Ｈ）が存在する場合その基礎水準はどの程度である
か、また遺伝子（Ｇ）の転写を、従って蛋白質（Ｐ）の
生成を誘導および制御するためには（Ｈ）または（aＨ)
の濃度はどの程度でなければならないかを当業者は判定
できる。培養細胞(Ｃ)の浸漬に用いられる培養液に
（Ｈ）または（aＨ)を添加することにより、目的量の蛋
白質（Ｐ）を確実に生成させるのに必要な濃度の（Ｈ）
を形質転換細胞（Ｃ）に供給することができる。
【０１２９】本発明の種々の観点を以下の７実験例に詳
述し、例示する。実験の部Ｉはヒトグルココルチコイド
受容体に関する。より詳細にはこの例はｈＧＲｃＤＮＡ
の一次構造、およびこれまで報告されたｈＧＲ蛋白質と
機能的に区別できないポリペプチドへのその発現を示
す。実験の部IIはｈＧＲの機能区に関する。この例に示
されるように、ＧＲは少なくとも４個の機能区を含み、
それらのうち２個は予想されたものであり、予想された
ＤＮＡ−およびステロイド−結合区に対応し、それらの
うち２個は予想されなかったものであり、転写に対し強
い作用をもつ。実験の部IIIは甲状腺ホルモン受容体c−
erb−Ａに関する。この実験例に示すように、c−erb−
Ａは本発明者らがここで hＴＲアルファと呼ぶ甲状腺ホ
ルモン受容体をコードする。本発明者らが予想外に第２
の甲状腺ホルモン受容体を見出したことと合わせて（実
験例VII参照）、実験の部IIIに示された。c−erbに関す
るデータは甲状腺ホルモン受容体蛋白質についてのより
詳細な知見を得るのにきわめて有用であろう。実験の部
IVはヒトミネラルコルチコイド受容体に関する。これは
本発明者らが示すようにグルココルチコイド受容体に対
し構造的および機能的類似性をもつ。実験Vは本発明者
らがｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２と呼ぶ新規な予想され
なかった一群のステロイドホルモン受容体を示す。これ
らの受容体は新規なステロイドホルモン系の存在に対す
る最初の証拠を与える。新規な“シス−トランス”バイ
オアッセイ系に関する本明細書の記述と合わせて、この
新規なエストロゲン関連受容体ｈＥＲＲ１およびｈＥＲ
Ｒ２は新規なホルモンの同定へ系統的に導くアッセイ系
を開発するための基礎を与えるであろう。このような新
規な系の同定は広範な生理学的および臨床上の重要性を
もつと思われる。実験の部VIにはラット甲状腺ホルモン
受容体c−erb−Ａオリゴヌクレオチドにおいて本発明者
らがＴ3 調節に必要であることを見出した部位に関する
本発明者らのデータを若干示す。これらの知見は、実験
の部III、およびヒト染色体１７に結合した新規な予想
されなかった甲状腺ホルモン受容体に関する実験VIIの
記述と合わせて、甲状腺ホルモン受容体蛋白質の特性を
開明する際に有用であろう。
【０１３０】これ以上詳述しなくても当業者は以上の記
述および以下の実験の部によって本発明を最大限に利用
することができると考えられる。実験の部に示した材料
は特に指示しない限り例示の目的で示されたものであ
り、従って何らかの形で請求の範囲の記載を限定するも
のと解すべきではない。
【０１３１】
【実施例】実験の部I 機能性ヒトグルココルチコイド受容体ｃＤＮＡの一次構
造および発現Ｉ．Ａ．概要 ヒトリンパ様細胞および線維芽細胞cＤＮＡクローンか
ら推定したヒトグルココルチコイド受容体（ｈＧＲ）の
全アミノ酸配列を報告する。この配列はこの受容体の構
造上の種々の特性を明らかにする。これに主免疫原区、
およびＤＮＡ結合区の一部をなすと思われるシスティン
／アルギニン／リジンに富む領域が含まれる。分析量の
全長蛋白質を生成するためのＳＰ６転写ベクター系の使
用につき記述し、無細胞転写された蛋白質が免疫原性で
あり、かつ天然のグルココルチコイド受容体に特有のス
テロイド結合特性を備えていることを証明する。ワイン
バーガー（Ｗeinberger）ら（１９８５b）はｈＧＲ配列
と発癌遺伝子v−erb−Ａの配列の相同性を報告してい
る。
【０１３２】Ｉ．Ｂ．序論 グルココルチコイド受容体は多種の培養細胞系に広く分
布し、発現しているので、グルココルチコイドによる遺
伝子発現の制御は転写調節のモデルとして広く研究され
ている。多数のグルココルチコイド応答性転写ユニット
が確認されており、これにはマウス乳腺腫瘍ウイルス
（ＭＭＴＶ）(リンゴールド)（Ｒingold）ら、１９７
５；パークス（Ｐarks）ら、１９７４）、マウスおよび
ヒトメタロチオネイン（ハーガー(Ｈager）ら、１９８
１；カーリン(Ｋarin）ら、１９８０)、ラットアルファ
２Ｍ−グロブリン（クルツ（Ｋurtz）ら、１９７７）な
らびにラットおよびヒト成長ホルモン（スピンドラー
（Ｓpindler）ら、１９８２；エバンス（Ｅvans）ら、
１９８２；ロビンス（Ｒobins）ら、１９８２）の遺伝
子が含まれる。これらの遺伝子数種の転写刺激を媒介す
るＤＮＡ配列の位置が決定された。ＭＭＴＶについて
は、これらの配列は転写開始部位の上流にある別個のゲ
ノム領域であり、これらは方向および位置と無関係にそ
れらの作用を及ぼすと思われる（チャンドラー（Ｃhand
ler）ら、１９８３；オストロフスキー（Ｏstrowski）
ら、１９８４）。ステロイド／受容体−複合体はこれら
の調節配列に結合すると思われ、精製された受容体を用
いて特異的結合部位が決定された（ゴビンダ（Ｇovind
a）ら、１９８２；シャイデライト(Ｓcheidereit)ら、
１９８３；プファール(Ｐfahl）１９８２；ペイバール
（Ｐayvar）ら、１９８３）。数種の応答性遺伝子のフ
ットプリンティング分析に基づいて、コア配列５’ＴＧ
Ｔ／ＣＴＣＴ３'を共有するコンセンサスＤＮＡ結合配
列が提唱された（カーリン(Ｋarin）ら、１９８４）。
【０１３３】グルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）が
その位置および方向を変えてもなおプロモーター誘導性
を保持しうることは、これがエンハンサーと命名される
一群のシス作用性調節配列に類似することを示唆する
(チャンドラー(Ｃhandler)ら、１９８３）。最初にウイ
ルス中に、次いで細胞遺伝子中に見出されたこれらの配
列はインビボにおける効果的な転写のために必要である
(ライモニス(Ｌaimonis)ら、１９８２；ベノイスト（Ｂ
enoist）ら、１９８１；ベルジ（Ｂaerji）ら、１９８
３）。エンハンサーは組織特異性転写制御により調節作
用を媒介するトランス作用性因子により認識されること
が示された。エンハンサー因子は十分には解明されてい
ないが、グルココルチコイド受容体はこれら推定遺伝子
活性化蛋白質の一例であると考えられる。
【０１３４】放射性標識された高親和性グルココルチコ
イド同族体、たとえばデキサメサゾンおよびトリアムシ
ノロンアセトニドの入手が容易であるため、精製法が開
発され、その結果ほぼ純粋なラットおよびヒト受容体が
単離された(シモンズ(Simons)ら、１９８１；ゲーリン
グ（Ｇehring）ら、１９８３）。受容体はショ糖濃度勾
配液中を二量体として移動するが、変性作用性ＳＤＳ−
ポリアクリアミドゲル上での分析によれば相対分子量
（Ｍｔ)- 94,000（９４Ｋ）の単一ポリペプチドが検出
される（ウェストパール（Ｗestpahl）ら、１９８２；
ランゲ（Ｗrange)ら、１９７９）。その天然のポリペプ
チドはステロイド結合およびＤＮＡ配列認識に対する固
有の特異性を備えている。精製されたラットおよびヒト
受容体に対して産生されたモノクローナル抗体およびポ
リクローナル抗体(オクレット(Ｏkret）ら、１９８１；
ハーモン（Ｈarmon）ら、１９８４；ガメッチュ(Ｇamet
chu）ら、１９８４）をプローブとして用いて、ステロ
イド−およびＤＮＡ−結合領域と別個の分子部分上にあ
る主免疫原領域を確認することができた（カールステッ
ド−デューク（Ｃarlstedt−Ｄuke)ら、１９８２；ラン
ゲ（Ｗrange）ら、１９８４；デルウェーク（Ｄellweg）
ら、１９８２）。この分子の構造につきさらに情報を得
るために、またこれが遺伝子の転写を調節する分子機構
の分析に着手するために、本発明者らは受容体ｃＤＮＡ
配列のクローニングを試みた。受容体特異性抗体をプロ
ーブとして用いて、本発明者らはヒトまたはラットグル
ココルチコイド受容体ｃＤＮＡ挿入配列を含むクローン
を分離した（ワインバーガー（Ｗeinberger）ら、１９
８５a；ミースフェルド（Ｍiesfeld）ら、１９８４）。
【０１３５】Ｉ．Ｃ．結果 （a） グルココルチコイド受容体ｃＤＮＡ 先きに報告されたように（ワインバーガー（Weinberge
r）ら、１９８５ａ）ヒトリンパ様細胞系ＩＭ−９から
得たポリ（Ａ)+ ＲＮＡを鋳型として用いてファージ発
現ベクターラムダgtllにおいてｃＤＮＡクローンのライ
ブラリーを構成した。このライブラリーをまず精製グル
ココルチコイド受容体に対する家兎ポリクローナル抗血
清によりスクリーニングした結果、約2.5×１０5プラー
クから免疫陽性の候補クローン数種が分離された。これ
らのクローンから得たベータガラクトシダーゼ融合蛋白
質を用いて受容体エピトープ特異性抗体をアフィニティ
精製し、次いでこれを採取し、細胞抽出物の蛋白質ブロ
ットへの結合により同定した。ヒトグルココルチコイド
受容体の抗原決定因子を発現する挿入配列を含むクロー
ン３種を分離した。これらのクローンの挿入配列は異な
るサイズであったが交差ハイブリダイズした。それはそ
れらが恐らく受容体の主免疫原区の境界を定めると思わ
れる共通配列を含むことを示す。合わせてこれらのクロ
ーンは 1.4 kbpの長さに及んだが、明らかに受容体全体
をコードするのに十分なほど長くはなかった。これはＭ
ｔ９４Ｋのポリペプチドをコードするために約 2,500個
のヌクレオチドを必要とすると推定された。
【０１３６】他のｃＤＮＡクローンを分離するために本
発明者らは最初のライブラリーを再びスクリーニング
し、かつオカヤマ（Ｏkayama）およびバーグ（Ｂerg)
（１９８３）により報告されたベクターにおいてヒト線
維芽細胞からのポリ（Ａ)+ ＲＮＡを用いて得た第２の
ライブラリー（オカヤマにより供与）をも試験した。免
疫陽性cＤＮＡ挿入配列（ｈＧＲ１.２）の１種をプロー
ブとして用いて１２クローンを分離した。これらは合わ
せて4.0kbp以上となった。これらのクローンのヌクレオ
チド配列をマキサム（Ｍaxam）およびギルバート（Ｇil
bert）（１９７７）の方法により、第１図に示した手法
に従って調べた。ＲＮＡブロット分析から全長クローン
を得るためには５〜７ kbのｃＤＮＡ挿入配列が必要で
あろうということが示された。配列分析から重複クロー
ンＯＢ７およびｈＧＲ5.16はアミノ酸７２０個のオープ
ンリーディングフレームに及ぶことが示されたが、これ
は完全な受容体をコードするのに十分な長さではない。
従って約２×１０6個の形質転換体を含む第２の線維芽
細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、推定翻
訳開始部位の上流１５０ bpに及ぶ大型の挿入配列を含
むクローン（ＯＢ１０）を得た（第１図参照）。配列分
析により２種の蛋白質の形態（アルファおよびベータと
命名）が予想された。これらはアミノ酸７２７において
異なり、それらのカルボキシ末端にそれぞれアミノ酸５
０個および１５個の付加的な異なるオープンリーデング
フレームを含む（第２図参照）。クローンＯＢ７により
表わされるアルファ形はグルココルチコイド受容体の主
要な形態である。各種のライブラリーから分離された８
種のｃＤＮＡクローンがこの配列を含むからである。
【０１３７】(b)ｃＤＮＡおよび蛋白質の配列 第３および４図はクローンｈＧＲ 1.2、ｈＧＲ5.16 、
ＯＢ７およびＯＢ１０を用いて判定された、ヒトアルフ
ァグルココルチコイド受容体をコードする4,800 ヌクレ
オチド配列を示す。翻訳開始部位はヌクレオチド１３３
−１３５に対応するメチオニンコドンに帰属すると判定
された。これがフレーム内ターミネーターＴＧＡ（ヌク
レオチド１２１−１２３）から下流に現われる最初のＡ
ＴＧトリプレットだからである。しかしアミノ末端ペプ
チド配列に関する情報がなければ開始部位の明確な決定
はまだ不可能である。７７７位のリジンに特異的なコド
ンの後に翻訳終止コドンＴＧＡがある。残りのコード化
配列は多数の重複クローンに包含され、ＯＢ７はポリ
（Ａ）付加部位に続く4.3 kbの挿入配列を含み、ＯＢ１
０は推点イニシエーターであるメチオニンを含む。クロ
ーンＯＢ７およびＯＢ１０の３’領域は制限エンドヌク
レアーゼおよびｃＤＮＡ配列分析の双方により示される
ようにヌクレオチド 2,314において異なる。この分岐点
においてアルファ受容体にはさらに５０個のアミノ酸を
コードする独自の配列が続き、一方ベータ受容体にはわ
ずか１５個のアミノ酸をコードする配列が続く（第５
（Ｂ）図）。ＯＢ７の３’側非翻訳領域はヌクレオチド
2,325個の長さであり、一方ＯＢ１０の場合はヌクレオ
チド１，４３３個である。直接的な配列比較により（第
３、４および５（Ｂ））、またはストリンジェント条件
下でのハイブリダイゼーション分析により（データは示
されていない）示されるように、これら２領域間には有
意の相同性はない。
【０１３８】さらに本発明者らはヒト一次線維芽細胞ラ
イブラリーから他のｃＤＮＡクローン、ＯＢ１２（デー
タは示されていない）を分離した。これはＯＢ７と等し
い配列を含むがヌクレオチド 3,101におけるポリアデニ
ル化信号を使用し（第２および３および４図）、より短
い３’側非翻訳領域を生じる。ＯＢ７の３’側非翻訳領
域に特異的なプローブを用いてヒト胎盤ｃＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングすることにより、大部分のクロ
ーンはＯＢ７の第１ポリ（Ａ）部位において終止するこ
とが明らかになった。従ってメッセンジャーＲＮＡの相
違は択一的ポリアデニル化および択一的ＲＮＡスプライ
シング双方による見掛けの結果である（後記参照）。ヒ
ト線維芽細胞ライブラリーが双方のｃＤＮＡを含んでい
たという事実は、双方の形の受容体が同一細胞内に存在
する可能性を示唆する。
【０１３９】（c）アルファ−およびベータ−受容体蛋
白質の分析 配列分析によって、アルファ形およびベータ形双方のヒ
トグルココルチコイド受容体はそれぞれ残基７７７個お
よび７４２個の長さであることが明らかになった。これ
ら２形態は残基７２７までは等しく、その後でこれらは
相違する。インビボにおける受容体の水準を調べるため
に、数種のヒトおよびマウス細胞系からの細胞質抽出物
を、ヒトグルココルチコイド受容体に対するポリクロー
ナル抗体を用いるイムノブロット分析法により検査した
(ハーモン(Ｈarmon）1984）。アルファ−およびベータ
−受容体ｃＤＮＡをＳpb転写ベクターに挿入してインビ
トロ翻訳用の合成ｍＲＮＡを作成した（第６（Ａ）
図）。これらのＲＮＡを別個に家兎網赤血球溶解系に添
加し、非標識生成物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析した。これら
２種のＲＮＡは、移動の相違が２種の形態の予想ポリペ
プチド長さと一致する異なる翻訳生成物の合成をプログ
ラムする（第６（Ｂ）図、レーン２、３）。未処理ＩＭ
−９細胞、および１μＭトリアムシノロンアセトニド処
理したＩＭ−９細胞からの細胞質抽出物が９４Ｋ受容体
（７９Ｋ形は推定受容体分解生成物を表わす）に対する
マーカー(第６（Ｂ）図、レーン４、５)として用いられ
る(ランゲ（Ｗrange）ら、１９８４）。ステロイド処理
後に、受容体／クロマチンの結合がより強くなること、
従って受容体が核へ転位することと対応して、９４Ｋバ
ンドの強度が低下する点を留意されたい。アルファ形は
受容体陰性の９４Ｋバンドと共に移動し、一方ベータ形
はより速やかに移動する（第６（Ｂ）図参照、レーン
２、３をレーン４、５と比較されたい）。各種のヒトお
よびマウス細胞系からの細胞質抽出物を比較することに
より、アルファ受容体のみが存在することが明らかにな
った（第６（Ｂ）図、レーン６〜９参照）。興味深いこ
とに、ステロイド誘導性細胞溶解に対する抵抗性に関し
て選択されたマウスＡＤＲ６リンパ腫細胞系（ダニエル
ソン（Ｄanielsen）ら、１９８４）はステロイド結合活
性をもたず、免疫反応性受容体を示さない（第６（Ｂ）
図、レーン７）。従ってイムノブロット分析法による多
種の受容体ｃＤＮＡクローンおよび受容体蛋白質の解明
に基づいて、本発明者らはグルココルチコイド受容体の
主要な生理学的形態はアルファ（９４Ｋ）種であると結
論する。
【０１４０】（d）インビトロにおけるｈＧＲの発現 クローニングされた受容体が機能性であるという他の証
拠を提示するために、本発明者らはインビトロ翻訳生成
物がコルチコステロイドを選択的に結合しうる能力を調
べた。従って家兎の網赤血球溶解物をインビトロ合成し
たアルファまたはベータｈＧＲ ＲＮＡ添加前または添
加後に、放射性標識された合成グルココルイド同族体 3
Ｈ−トリアムシノロンアセトニド(3Ｈ−ＴＡ)と共にイ
ンキュベートした。第７図に示すようにｈＧＲ ＲＮＡ
によりプログラムされた溶解物は選択的にステロイド結
合能を獲得した。意外にもインビトロ合成したベータ受
容体は競合性 3Ｈ−ＴＡを結合しなかった。インビトロ
合成したアルファ−ｈＧＲは、過剰の非標識コルチゾル
またはデキサメサゾンの添加によって競合する可能性の
ある放射性標識ステロイドを結合した。しかし3Ｈ−Ｔ
Ａの結合は過剰の非標識エストロゲンまたはテストステ
ロンによっては効果的に競合されなかった。これに対し
過剰のプロゲステロンは有効な競合体となり、これは先
に報告されたプロゲステロンの抗グルココルチコイド活
性と一致する(ルソー(Ｒousseau)ら、１９７２）。これ
らの結果を確認するために、ヒトリンパ様細胞の抽出物
から調製された天然グルココルチコイド受容体を用いて
競合実験を反復した。インビトロ翻訳された受容体およ
び天然のインビボ受容体の双方とも、ステロイドの結
合、および過剰の非標識ステロイド同族体との競合に関
してほぼ等しい特性を示す（第７図参照）。
【０１４１】（e）少なくとも２種の遺伝子に対するｈ
ＧＲ配列地図 ヒトグルココルチコイド受容体は染色体５に機能的にマ
ッピングされている。受容体欠損マウスＴ細胞（ＥＬ
４）をヒト受容体含有Ｔ細胞（ＣＥＭ−Ｃ７）と融合さ
せることにより構成された体細胞ハイブリッドの分析か
ら、野生型ＣＥＭ−Ｃ７受容体を発現する分離体はヒト
染色体５を保持するが、デキサメサゾン耐性分離体はこ
の染色体を失っていることが示された（ゲーリング（Ｇ
ehring)ら、１９８５）。
【０１４２】本発明のｃＤＮＡクローンの信頼性を確認
するために、本発明者らはヒト染色体５のみを保有す
る、チャイニーズハムスター／ヒト体細胞ハイブリッド
（ＨＨＷ454）を用いて受容体ｃＤＮＡ配列をマッピン
グした。ヒト胎盤ＨＨＷ454ハイブリッド細胞およびチ
ャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞から抽出した
ＤＮＡをＥcoＲＩまたはＨindIII制限エンドヌクレアー
ゼにより消化し、0.8％アガロースゲル上で分離した。
ニトロセルロースへ移したＤＮＡ断片をヌクレオチド57
0〜1,640から誘導される受容体コード領域の一部（第１
図）のｈＧＲ1.2を参照されたい）により試験した。ハ
イブリッド細胞系からのＤＮＡは、6.8および１７kbpの
ＣＨＯ特異性ＥcoＲＩバンドのほかに3.0および 5.0 kb
pのヒト特異性バンドをも含む（ホレンバーグ(Ｈollenb
erg）ら、１９８５の図６a、レーン２、３を参照された
い）。（ここに実験の部Ｉとして示した研究はホレンバ
ーグ（Ｈollenberg）ら、１９８５として公表された。
図６および７は同報文中に示され、本明細書には示され
ていない。）意外にも9.5 kbpのＤＮＡ断片は全ヒトＤ
ＮＡ中に見出されたが、ハイブリッド系には見出されな
かった（ホレンバーグ（Ｈollenberg）ら、１９８５、
図６a、レーン１を参照されたい）。同様にＨindIII消
化によって染色体５ハイブリッド細胞ＤＮＡ中に存在し
ない7.5kbp のバンドが示された（ホレンバーグ（Ｈoll
enberg）ら、１９８５、図６a 、レーン４を参照された
い）。これらの結果は、受容体ｃＤＮＡはヒト染色体５
にマッピングされるが、このゲノムの他のいずれかの位
置に付加的な受容体関連配列があることを示す。これら
の配列をマッピングするために、デュアルレーザー蛍光
活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）を使用し、ＤＩＰＩ／
クロモマイシン（ヘキスト33258 クロモマイシンと併
用）により染色した分裂期染色体懸濁液を識別した；こ
の方法により２４種のヒト染色体を２２画分に分離する
ことができた（レボ（Ｌebo）ら、１９８４）。染色体
を直接にニトロセルロース上に識別したのち、染色体Ｄ
ＮＡを変性し、ｈＧＲｃＤＮＡプローブにハイブリダイ
ズした。染色体５の配列確認のほかに、染色体１６上に
付加的配列が見出された。（ホレンバーグ（Ｈollenber
g）ら、1985、図６ｃを参照されたい））。この配置を
確認するために、マウス赤白血病細胞、およびヒト染色
体１６を含むマウス赤白血病細胞系（ボーデ（Bode）
ら、１９８１参照）からのＤＮＡをＨindIIIにより消化
し、ｈＧＲｃＤＮＡにより調べた（ホレンバーグ（Ｈol
lenberg）ら、1985、図６ｃを参照されたい）；予想さ
れたようにハイブリッド中に見出され、対照中には見出
されなかった唯一のＤＮＡが7.5kbpのＤＮＡ断片であ
り、これにより染色体１６の帰属が確立した（ホレンバ
ーグ（Ｈollenberg）ら、１９８５、図６ｃ、レーン１、
２を参照されたい）。
【０１４３】ＯＢ７およびＯＢ１０の３’側非翻訳領域
からのＥcoＲＩ−ＸbaＩ 断片を用いた他のサザンブロ
ット分析により、染色体５のみへのハイブリダイゼーシ
ョンが明らかになった（データは示されていない）。本
発明者らは、アルファ−およびベータ−受容体ｃＤＮＡ
は共に恐らく染色体５上の単一遺伝子によってコードさ
れると結論し、これら２形態のｃＤＮＡが択一的スプラ
イシングにより生じることを示唆する。さらに本発明者
らは、染色体１６上に位置する他の遺伝子は少なくとも
ヌクレオチド 570〜1,640 においてグルココルチコイド
受容体遺伝子との相同性を有すると結論する。これらの
染色体１６上の配列が関連ステロイド受容体遺伝子、処
理された遺伝子もしくは偽遺伝子、またはグルココルチ
コイド受容体に対する遺伝子と共通の区域を共有する遺
伝子のいずれを表わすかは明らかでない。ゲノムクロー
ニングおよびＤＮＡ配列決定により解答が得られるであ
ろう。
【０１４４】グルココルチコイド受容体をコードするｍ
ＲＮＡのサイズを測定するために、ヒト線維芽細胞系Ｈ
Ｔ１０８０から分離された細胞質ｍＲＮＡを用いてノー
ザンブロットハイブリダイゼーション実験を行った(ボ
ーデ（Ｂode)ら、１９８１)。ｈＧＲ1.2コード化配列を
プローブとして用いて、5.6、6.1 および7.1kbpの多数
のｍＲＮＡを検出した。これらの細胞をグルココルチコ
イドと共に２４時間処理すると受容体ｍＲＮＡが２〜３
倍減少し、潜在的な負のフィードバック調節が示唆され
た。
【０１４５】Ｉ.Ｄ．考察 グルココルチコイド受容体の構造分析は、この調節分子
が遺伝子の転写に作用を及ぼす機構を洞察するための前
提条件である。ここに本発明者らはｃＤＮＡクローンの
ヌクレオチド配列分析から推定したヒトグルココルチコ
イド受容体の一次配列を提示した。
【０１４６】ｈＧＲｃＤＮＡの分離によって、少なくと
も２形態のポリペプチドをコードする多数のｍＲＮＡの
存在が明らかになった。これらの推定蛋白質はそれらの
カルボキシ末端において、アルファ−ｈＧＲの場合は５
０個アミノ酸、ベータ−ｈＧＲの場合は１５個のアミノ
酸の置換によって異なる。アルファグルココルチコイド
受容体は数種のヒト細胞系およびｃＤＮＡライブラリー
において同定された主要な形態である。しかしノースロ
ップ（Ｎorthrop）ら(１９８５）による最近の報文で
は、これら２形態の受容体がマウスリンパ様細胞におい
て明らかにされている。マウスダブレット種に対するア
ルファ−およびベータ−ｈＧＲの関係は未確認である。
ベータ−ｈＧＲの細胞分布および潜在的機能も明らかで
ないが、変異型受容体が組織特異性の機能に用いられて
いる可能性はある。本発明者らは現在それらの組織特異
性発現を解明するために各形態のヒト受容体に特異的な
合成ペプチドに対する抗血清を生成している。
【０１４７】免疫陽性ファージＤＮＡ挿入配列ｈＧＲ
1.2Ａをプローブとして用いて選ばれたcＤＮＡ には、
ヌクレオチド３１０１にあるＡＡＴＡＡＡを用いてポリ
アデニル化がより早期に信号化されている点以外はＯＢ
７と同様な３’末端を含むものがある。これらのクロー
ンはヒト線維芽細胞および胎盤双方のライブラリーから
分離された（データは示されていない）。択一的ポリ
（Ａ）部位の選択は多くの真核転写ユニットの特色であ
る（ダーネル（Ｄarnell）１９８２）。ある場合にはポ
リ（Ａ）部位の選択によって特定のポリペプチド生成物
が定められる（アマラ（Ａmara）ら、１９８２；ローゼ
ンフィールド（Ｒosenfeld）ら、１９８３；アルト（Ａ
lt）ら、１９８０；シュワルツバウエル(Ｓchwarzbaue
r）ら、１９８３)が、他の場合にはいずれかのポリ
（Ａ）部位の選択によってポリペプチドの一次構造に何
ら変化が生じない（ゼッツエル（Ｓetzer）ら、１９８
２）。受容体の転写に際してポリ（Ａ）部位の選択は
（１）特定の組織におけるｍＲＮＡの安定性を変える
か、（２）スプライシングを変化させるか、または
（３）ランダムであり、生理学的結果を生じない。
【０１４８】ここに記載したインビトロ翻訳実験から、
クローニングされた分子が完全なグルココルチコイド受
容体をコードするという直接的証明が得られる。第１に
インビトロ翻訳生成物はサイズが天然のグルココルチコ
イド受容体と等しく、受容体特異性抗血清と免疫学的に
反応する。第２に、インビトロ翻訳された蛋白質は、合
成グルココルチコイドであるトリアムシノロンアセトニ
ドを選択的に結合されるいう点で、機能的にグルココル
チコイド受容体として作用する。この結合グルココルチ
コイド、グルココルチコイド同族体およびプロゲステロ
ンにより特異的に競合されるが、性ステロイドであるテ
ストステロンおよびエストロゲンによっては競合されな
い。この点に関して、インビトロ翻訳された受容体はヒ
トリンパ様細胞から得たインビボ受容体と等しい挙動を
示し、クローニングされた分子に関する機能の第１の証
拠を与える。ステロイド結合性の獲得は何ら特定の修飾
を要しないと思われるが、これが必要であったとしても
これらの修飾はインビトロ翻訳混合物中で行われる。
【０１４９】ここに示した結果は真核細胞の転写調節蛋
白質とその標的遺伝子の分子レベルでの相互作用を研究
するために必要な情報を提供した。これらの構造研究か
ら、グルココルチコイド受容体、その遺伝子、およびそ
のＲＮＡ生成物を分析しうる基礎が得られる。さらにイ
ンビトロで受容体を発現しうることにより、特異的イン
ビトロ突然変異生成の結果を速やかに試験しうる新規な
方法が得られる。最後に突然変異生成および蛋白質結合
双方の実験によるグルココルチコイドおよび特異的調節
要素に応答する遺伝子の分離から、この蛋白質が誘導性
真核遺伝子調節の分析に対するきわめて有用なモデルと
して役立つことが示唆される。
【０１５０】Ｉ.Ｅ．実験の部Ｉに述べた図に関する 詳細な説明 第１および２図 ヒトグルココルチコイド受容体ｃＤＮＡ配列決定法およ
びｃＤＮＡクローンの模式図。１．アルファグルココル
チコイド受容体に対する複合ｃＤＮＡを最上部に示し、
非コード化配列（直線）およびコード化配列（点彩部
分）を示す。共通の６ヌクレオチド制限酵素部位を示
す。配列を決定するために用いた重複ｃＤＮＡ挿入配列
が示され、配列決定された領域の下方の矢印は配列決定
の方向および範囲を表わす。ＯＢ１０の３’末端の破線
は相違する配列を示す。数字はＯＢ１０において５’側
寄りの転写された配列に対するヌクレオチドの位置を意
味する。２．アルファ形およびベータ形の受容体をコー
ドするｃＤＮＡ（それぞれＯＢ７およびＯＢ１０)。Ｏ
Ｂ７の５'末端（破線）はＯＢ１０クローンにより与え
られる。蛋白質コード化情報は幅広い棒により表わさ
れ；非翻訳配列は細い棒により示される。ヌクレオチド
およびアミノ酸はコード化配列のそれぞれ上方および下
方に番号が示される。共通ＤＮＡ配列はヌクレオチド
2,313（アミノ酸残基７２７）にまで及び、この地点で
アルファ形とベータ形の受容体が分かれ、アルファｃＤ
ＮＡ（ＯＢ１２，ＯＢ７）は１５０個のヌクレオチド
（５０個のアミノ酸）のオープンリーディングフレーム
へと続き、ベータｃＤＮＡ（ＯＢ１０）は４５個のヌク
レオチド（１５個のアミノ酸）へと続く（第５（Ｂ）図
参照）。これらのクローンにおいてポリ（Ａ）のすぐ上
流にヘキサヌクレオチド信号（ＡＡＴＡＡＡ）が示され
ており、ＯＢ７の最初のヘキサヌクレオチドはＯＢ１２
においてポリ（Ａ）として作用する。
【０１５１】第１および２図の方法 挿入配列ｈＧＲ 1.2、ｈＧＲ 2.9 およびｈＧＲ 5.16
を前記に従ってラムダgtｌｌＩＭ−９リンパ様細胞ｃＤ
ＮＡライブラリーから分離した(ワインバーガー(Ｗeinb
erger）ら、１９８５)。２種のクローンが pcＤにおいて
Ｈ．オカヤマにより（オカヤマ（Ｏkayama）ら、１９８
３)、ＧＭ６３７ヒト線維芽細胞(ＯＢ７)および一次ヒ
ト線維芽細胞（ＯＢ１０）からのポリ（Ａ)+ｍＲＮＡを
用いて構成されたcＤＮＡライブラリーから分離され
た。スクリーニングは 32Ｐ−dＣＴＰを用いるニックト
ランスレーションにより放射性標識されたｈＧＲ1.2−c
ＤＮＡを用いて行われた。マキサム（Ｍaxam）およびギ
ルバート（Ｇiblbert）(1977）の化学的開裂法により配
列が決定された。
【０１５２】第３および４図 ヒトグルココルチコイド受容体のｃＤＮＡおよび推定蛋
白質配列。完全なアルファコード化配列およびＯＢ７の
３’側非翻訳領域を図示し、推定アミノ酸を長いオープ
ンリーディングフレームの上方に示す。ヌクレオチド１
２１−１２３における上流フレーム内終止コドンおよび
ＯＢ７における推定の付加的ポリアデニル化信号に下線
を施した。
【０１５３】第５（Ａ）および（Ｂ）図 ヒトグルココルチコイド受容体ベータｃＤＮＡの３’側
の制限地図およびヌクレオチド配列。Ａ．共通の６ヌク
レオチド制限酵素部位をＯＢ１０の３’側非翻訳領域に
つき示す。ベータ形（ＯＢ１０）のヌクレオチド2,281
から3,820までのcＤＮＡ配列をアルファ形（ＯＢ７）の
３’末端コード化部分に見られる蛋白質コード化情報と
比較したもの。各ｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸
をヌクレオチド配列の上方に示す。ＯＢ１０の３’側非
翻訳配列における推定ポリアデニル化信号（ＡＡＴＡＡ
Ａ）に下線を施した。
【０１５４】第６（Ａ）および（Ｂ）図 インビトロにおいて翻訳されたｈＧＲと細胞抽出物から
のインビボｈＧＲのイムノブロット比較。Ａ．ｈＧＲｃ
ＤＮＡ配列インビトロ転写のために構成されたベクタ
ー。完全なアルファ（pＧＲ１０７）およびベータ（pＧ
Ｒ１０８）コード化配列は pＧＥＭ１中のＳＰ６プロモ
ーターの転写制御下に置かれた。ベクター配列、非コー
ド化ｃＤＮＡ配列、およびコード化配列はそれぞれ細い
直線、太い棒、および四角で囲った領域により示され
る。約６０個のヌクレオチドのポリ（Ａ）領域をＡpiに
より示す。異なるコード化配列は斜線領域および点彩領
域により示される。Ｂ．インビトロ翻訳生成物および細
胞抽出物のウェスタンブロット分析。ＲＮＡを添加して
（レーン１）または pＧＲ１０８から（ベータ、レーン
２）もしくは pＧＲ１０７から（アルファ、レーン３）
合成されたＲＮＡを添加して家兎の網赤血球溶解系にお
いて合成した非標識翻訳生成物を7.5 ％ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル上で分画した。他のレーンは下記のも
のである。ＩＭ−９（レーン４）、１μＭトリアムシノ
ロンアセトニドで処理したＩＭ−９（レーン５）、Ｈe
Ｌa（レーン６）、ＡＤＲ６．Ｍ１８９０．ＡＤ１マウ
スリンパ腫（レーン７）、Ｓ４９マウスリンパ腫（レー
ン８）およびＥＬ４リンパ腫（レーン９）からの細胞質
抽出物。蛋白質をニトロセルロースに移し、 抗ｈＧＲ抗
体、次いで125Ｉ標識黄色ぶどう球菌（Ｓtaphylococcus
aureus）蛋白質Ａにより前記に従って試験した（ワイ
ンバーガー（Ｗeinberger）ら、１９８５）。
【０１５５】第６（Ａ）および（Ｂ）図の方法 第３および４図に示したアルファコード化配列全体を含
む発現ベクターを構成するために、ＯＢ７の３’側コー
ド化配列をＯＢ１０の５’側コード化配列に融合させ
た。ＯＢ７をＥcoＲＩにより部分的に消化し、ＸbaＩに
よって完全に消化し、1.20 kbpの断片をゲル精製してＥ
coＲＩ／ＸbaＩ消化ＯＢ１０とリゲートさせて、中間体
pＯＢ１０７を得た。５'側ポリ（Ｇ）領域(１１個のヌ
クレオチド、nt）および３’側ポリ（Ａ）領域（約６０
個のnt）を含む全pＯＢ１０７ｃＤＮＡ配列を部分Ｐst
Ｉ／完全 ＢamＨＩ消化により切断した。得られた 3.5k
bpの断片をゲル精製し、pＧＥＭ１(プロメガ・バイオテ
ク)の ＰstＩおよびＢamＨＩ部位間に挿入して pＧＲ１
０７を得た。プラスミド pＧＲ１０８は直接に pＯＢ１
０から、部分ＰstＩ／完全ＢamＨＩ消化し、得られたｃ
ＤＮＡ挿入配列を pＧＥＭ１の対応する部位へ挿入する
ことにより構成された。キャップ付きＳＰ６転写体はＰ
vuＩＩ−直線化された pＧＲ１０７およびpＧＲ１０８
からクリーブ（Ｋrieg）およびメルトン（Ｍelton）(１
９８４)の記載に従って合成され、ＧＴＰ濃度を４００
μＭから１００μＭに低下させかつm7ＧppＧ（ファルマ
シア）を５００μＭまで添加することにより同時キャッ
ピングが行われた。転写体をＰ６０クロマトグラフィー
により精製し、ミクロコッカスヌクレアーゼ処理した家
兎網赤血球溶解物（プロメガ・バイオテク）により、製
造業者が指示する条件で翻訳した。ステロイド処理細胞
からのＩＭ−９サイトゾルの調製は先に報告されたとお
りである（ワインバーガー（Ｗeinberger）ら、１９８
５）。サイズマーカーはホスフォリラーゼＢ（９７
Ｋ）、ウシ血清アルブミン（６６Ｋ）および卵アルブミ
ン（４５Ｋ）であった。
【０１５６】第７図 インビトロ翻訳されたアルファ−ｈＧＲのステロイド結
合性。ＩＭ−９サイトゾル抽出物（点彩した棒）および
ＳＰ６産生アルファ−ｈＧＲ ＲＮＡを含む網赤血球溶
解物（ＧＲ１０７；無地の棒）への結合を示す。各棒は
１００倍過剰の各種ステロイド競合体を用いて測定した
結合 3Ｈ−トリアムシノロンアセトニド（ＴＡ）を表わ
す；非標識ＴＡを競合体として用いて１００％の競合が
測定された。各値は３回測定の平均を表わし、誤差の棒
はＰ＜0.05を示す。ステロイド系競合体はデキサメサゾ
ン(Ｄex)、コルチゾル(Ｃort)、プロゲステロン(Ｐro
g)、テストステロン（Ｔest）、およびエストラジオー
ル（Ｏest）である。
【０１５７】第７図の方法 結合アッセイは１０ mＭトリス−ＨＣｌ pＨ7.4，１０
０mＭ・ＮaＣｌ，１mＭＥＤＴＡ，１０mＭモリブテン酸
ナトリウム、１０mＭジチオトレイトール、１５０mＭ3
Ｈ−ＴＡ（２０Ｃi mmol-1；アメルシャム）を含有する
１００μｌ、および翻訳混合物１０μｌまたは新鮮なＩ
Ｍ−９シストゾル１００μｇ中で行なわれた。非標識競
合体（１５μＭ）を指示に従って添加した。０℃で２時
間後に５０％デキストラン被覆活性炭５μｌにより５分
ずつ２回抽出して未結合ステロイドを除去し、計数し
た。アルファグルココルチコイド受容体（ＧＲ１０７）
に対する非競合値および完全競合値はそれぞれ４９０お
よび２９０c.p.m.であった。転写体を添加せずに、また
はベータ受容体ＳＰ６ ＲＮＡ（ＧＲ１０８）を用いて
プログラムした網赤血球溶解物翻訳混合物は競合性 3Ｈ
−ＴＡ結合を含まなかった。
【０１５８】他の図 ここに実験の部Ｉとして提示した科学研究はＮature，
３１８：６３５−６４１（１９８５）に発表された。そ
の Ｎature の報文はこの実験例に含まれない２図を含
む。それらの図は図６、ｈＧＲｃＤＮＡの染色体マッピ
ング分析；図７、ｈＧＲｃＤＮＡのノーザーンブロット
分析である。
【０１５９】Ｉ．Ｆ．実験の部Ｉで参照した参考文献 １．Ａlt，Ｆ．Ｗ.，et al.，Ｃell，２０：２９３−３
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ad．Ｓci．Ｕ.Ｓ.Ａ.,７７：５２０１−５２０５（１９
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Ｓ．Ｍ.，Ｒosenfeld，Ｍ．Ｇ.，and Ｅvans，Ｒ．
Ｍ.，Ｎature，３１８：６７０−６７２（１９８５
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【０２０５】48．Ｗeinberger，Ｃ.，et al．Ｓcience,
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【０２０６】49．Ｗestphal，Ｈ.Ｍ.，Ｍoldenhauer，
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１４７１（１９８２）。
【０２０７】50．Ｗrange，Ｏ.，Ｃarlstedt−Ｄuke，
Ｊ.，and Ｇustafsson，Ｊ.−Ａ.，Ｊ．Ｂiol．Ｃhe
m.，２５４：９２８４−９２９０（１９７９）。
【０２０８】51．Ｗyange，Ｏ.，Ｏkret，Ｓ.，Ｒadojc
ic，Ｍ.，Ｃarlstedt−Ｄuke，ｊ.，and Ｇustafsson,
Ｊ.−Ａ.,Ｊ.Ｂiol．Ｃhem.,２５９：４５３４−４５４
１（１９８４）。
【０２０９】52．Ｙamamoto，Ｋ.Ｒ.，Ｓtampfer，Ｍ.
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ci．Ｕ.Ｓ.Ａ.，７１：３９０１−３９０５(１９７
４)。
【０２１０】実験の部II ヒトグルココルチコイド受容体の機能区II．Ａ．概要 ＣＶ−１細胞においてｈＧＲ発現ベクターのトランスフ
ェクションにより産生されたヒトグルココルチコイド受
容体（ｈＧＲ）はＭＴＶ−ＣＡＴ融合遺伝子の転写活性
化のために必要かつ十分な因子として機能する。誘導の
規模（５００〜１０００倍）からｈＧＲは転写“スイッ
チ”として作用し、グルココルチコイド応答要素を含む
休止状態のプロモーターを活性化状態に変換するのであ
ろうということが明らかになった。ｈＧＲによるＭＴＶ
−ＣＡＴ融合遺伝子の転写の刺激はＣＶ−１細胞におい
て制限的な転写因子に依存しない。ｈＧＲの挿入変異体
２７種の特性を調べることにより少なくとも４種の機能
区の位置が決定された。それらのうち２種は推定ＤＮＡ
−およびステロイド−結合区に対応する。他の２区は転
写に対するそれらの有効な作用のため、タウ（τ）と呼
ばれる。これは、この受容体における他の領域は完全な
転写活性化のために必要であるが、ステロイドまたはＤ
ＮＡの結合に特異的には関与していないという可能性を
示す。
【０２１１】II．Ｂ．序論 ２群のステロイドホルモン受容体の一次構造がそれらの
ｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定により解明され
た。実験の部Ｉに示すように、ヒトグルココルチコイド
受容体（ｈＧＲ）をコード化するｃＤＮＡの同定により
２形態の蛋白質、すなわちアミノ酸７７７個のもの（ア
ルファ）および７４２個のもの（ベータ）が明らかにな
った。これらはそれらのカルボキシル末端において異な
る。（実験の部Ｉの記載はホレンバーグ（Ｈollenber
g）ら、１９８５として発表された。）ヒトエストロゲ
ン受容体はこれによりも若干小さな、アミノ酸５９５個
蛋白質である（グリーン（Ｇreene）ら、１９８６；グ
リーン（Ｇreene）ら、１９８６）。アミノ酸配列の比
較により、これら２群の受容体間のみでなく、鳥類赤芽
球症ウイルスのv−erb−Ａ発癌遺伝子生成物とも広範な
相同性が明らかになった（ワインバーガー（Ｗeinberge
r）ら、１９８５；グリーン（Ｇreene）ら、１９８６；
グリーン(Ｇreene)ら、１９８６）。これはステロイド
受容体遺伝子およびc−erb−Ａプロト発癌遺伝子が共通
の原始的な先祖由来の調節遺伝子に由来するという示唆
を支持する（ワインバーガー（Ｗeinberger）ら１９８
５）。
【０２１２】クローニングされたｃＤＮＡから推定され
たｈＧＲのアミノ酸配列（実験の部Ｉ参照）に基づい
て、この蛋白質の機能的および免疫学的に重要な領域の
配置を提示した（ワインバーガー（Ｗeinberger）ら、
１９８５）。これらには、蛋白質のアミノ末端側半分に
位置する免疫区、他のＤＮＡ結合性蛋白質との構造的類
似性を示すＤＮＡ結合区、および分子のカルボキシル末
端付近に位置するグルココルチコイド結合区が含まれ
る。しかし各区の位置は仮定であり、転写自体の活性化
に関与する区は確認されていなかった。この研究におい
て本発明者らはｈＧＲ蛋白質に代替アミノ酸を導入する
ことによりｈＧＲ内に提唱されている機能区の部位を確
認し、かつ他の重要な領域を見出すことを試みた。本発
明者らはまずサル腎細胞における新規な発現系を開発し
た。この系では機能性ｈＧＲの合成がラウス肉腫ウイル
ス（ＲＳＶ）の長鎖末端リピートの制御下でのｃＤＮＡ
の転写によって方向づけられる。合成受容体の機能はク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡ
Ｔ）アッセイ（ゴルマン（Ｇorman）ら、１９８２a）お
よびステロイドホルモン結合により測定した、マウス乳
腺腫瘍ウイルス(ＭＴＶ)ＬＴＲの転写誘導によって監視
された。この新規な発現系によって本発明者らは挿入変
異生成が受容体の種々の機能に与える影響を調べること
ができ、これによってｈＧＲの機能区構造のより詳細な
モデルを提唱した。２７種の挿入変異体の分析に基づく
本発明者らの結果から、グルココルチコイド受容体は別
個の機能区からなることが確認された（ワインバーガー
（Ｗeinberger）ら、１９８５）。さらにこれらによ
り、提唱したＤＮＡ−およびステロイド−結合区外の他
の配列が確認され、これを前記のように本発明者らは転
写に対するそれらの有効な作用のためτと呼ぶ。
【０２１３】II．Ｃ．結果 (a)アッセイ系および実験様式 クローニングされたｃＤＮＡからの機能性ｈＧＲ（実験
の部Ｉ）の発現を調べるために用いたアッセイ系および
方法を第９図に示す。これらの実験においては、レポー
ター遺伝子に結合したグルココルチコイド応答性プロモ
ーター／エンハンサー要素を受容体陰性細胞に導入し
た。従って原理的にこの構造物は転写不活性のはずであ
る。本発明者らのアッセイ法にはクロラムフェニコール
アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする配
列に融合させたＭＴＶ ＬＴＲを選択使用した（ＥＣ
２．３．１．２８）。グルココルチコイドホルモンがＭ
ＴＶＬＴＲ内の独自の部位における転写開始の効率を高
めることにより(ウッカー(Ｕcker）ら、１９８３）ＭＴ
Ｖ ＤＮＡの転写速度を高めることは先に証明されてい
る。（ロンゴールド（Ｒingolg）ら、１９８３）。さら
にグルココルチコイド受容体はＭＴＶ ＬＴＲ内にマッ
ピングされたＤＮＡ配列に特異的に結合し（ペイバー
(Ｐayvar)ら、１９８３)、これがグルココルチコイド応
答性を異種プロモーターに与えうる（チャンドラー（Ｃ
handler）ら、１９８３)。pＭＴＶＣＡＴ(またはｐＧＮ
ＣＡＴ）を受容体発現プラスミドと共トランスフェクシ
ョンすることにより、トランスフェクションされた細胞
をグルココルチコイドホルモンで処理した際に活性を誘
導しうる機能性受容体が得られる。さらに生化学的実
験、たとえば発現した受容体のステロイド結合活性およ
びウェスタンブロット分析を同時に行うことができる。
【０２１４】ＲＳＶ ＬＴＲを全長ｈＧＲｃＤＮＡ（pＲ
ＳｈＧＲアルファ）に結合させる発現ベクターをデザイ
ンして、広範な宿主細胞型において高水準の発現を得
た。ベクターｐＲＳｈＧＲアルファはｐＲＳＶＣＡＴ
(ゴルマン（Ｇorman）ら、1982b）の誘導体であり、Ｃ
ＡＴ遺伝子のコード化配列がｈＧＲｃＤＮＡにより置換
されている。ＳＶ４０の複製開始点をこのベクターに導
入し、これにより組換えプラスミドはＴ抗原(Ｔag)を発
現するＣＯＳ−１（ＣＯＳと呼ぶ）サル腎細胞において
高いコピー数にまで増殖可能となった（グルッツマン
（Ｇluzman）１９８１）。ＣＯＳ細胞および親細胞系Ｃ
Ｖ−１はグルココルチコイド受容体の水準が検出不可能
であるという付加的な利点をも与える（未発表の所見な
らびに第１０および１１図）。
【０２１５】(b)機能性ｈＧＲの発現 上記のアッセイ法はステロイドホルモン受容体の作用機
構を研究する際に遭遇する主な難点の幾つかを克服する
ために企画された。これらの難点には受容体の細胞内水
準が低いこと、受容体の異質性の可能性があったこと、
および受容体の機能を試験する定量可能なバイオアッセ
イ系がなかったことが含まれる。従って本発明者らはp
ＲＳｈＧＲアルファでトランスフェクションしたＣＯＳ
細胞が産生しうるｈＧＲの相対量をまず調べた。第１０
図（右のレーン）のトランスフェクションされたＣＯＳ
細胞のウェスタンブロット分析は、ＣＯＳ細胞がＩＭ９
細胞系(左レーン)に存在するｈＧＲと移動性に関して区
別できない９４kdのｈＧＲポリペプチドを合成したこと
を証明する。さらに一時的にトランスフェクションされ
たＣＯＳ細胞中に存在するｈＧＲの量はＩＭ９細胞、す
なわち細胞当たり100,000−200,000の受容体を含むもの
（ハーモン（Ｈarmon）ら、１９８４）に見出される水
準よりも多い。この発現系は高い細胞内ｈＧＲ水準を有
する細胞を提供するだけでなく、ｈＧＲの機能研究を妨
げる可能性のある受容体ミクロ異質性の可能性をも除
く。
【０２１６】発現したｈＧＲの有効な転写因子としての
機能性を試験するために、pＭＴＶＣＡＴおよびｐＲＳ
ｈＧＲアルファを共トランスフェクションしたのちに得
た細胞抽出物を用いてＣＡＴアッセイを行った。ＣＯＳ
および親細胞であるＣＶ−１細胞の双方へのトランスフ
ェクションを調べた。予想どおり（アービン（Ａlwin
e）１９８５）ＣＯＳ中にＳＶ４０ Ｔagが存在すると
ＭＴＶ ＬＴＲの基礎活性が高まった（データは示され
ていない）。従って最大の誘導を得るために、ＳＶ４０
Ｔagを発現しないＣＶ−１細胞を用いた。第１１図に示
すように、pＭＴＶＣＡＴを対照プラスミドと共トラン
スフェクションした場合、ＣＶ−１細胞中にＣＡＴ活性
は生じなかった。同様に pＭＴＣＡＴおよびｐＲＳｈＧ
Ｒアルファを共トランスフェクションした場合もＣＡＴ
活性は生じなかった。しかし同じく共トランスフェクシ
ョンされたＣＶ−１細胞をデキサメサゾン（ＤＥＸ）で
処理すると、ＭＴＶ−ＣＡＴ融合遺伝子の転写が開始さ
れる。pＭＴＶＣＡＴにより生じるＣＡＴ活性の基礎水
準はＣＶ−１細胞においてかろうじて検出しうる程度
（しばしばゼロ）であるので、この誘導係数はきわめて
大きい（約５００〜１０００倍）。対照実験として本発
明者らはベータ形のｈＧＲを共トランスフェクションし
た（実験の部Ｉ）。これはステロイドを結合し得ないこ
とが示されているものである。（第II−１表参照）。第
１１図はｈＧＲベータが本発明の発現アッセイ法におい
て機能しないことを証明する。また、ｈＧＲによる転写
の活性化はグルココルチコイド応答性要素を含むプロモ
ーターに限定される。pＭＴＶＣＡＴの代わりに pＭＴ
Ｉa ＣＡＴ、すなわち重金属には応答するがグルココル
チコイドには応答しないヒトメタロチオネインＩa 遺伝
子の調節領域を含むプラスミドを用いた場合、トランス
フェクションしたＣＶ−１のホルモン処理後にＣＡＴ活
性の誘導は認められなかった（データは示されていな
い）。これらの結果は、細胞内でｈＧＲがステロイド依
存性転写スイッチとして機能するのに必要かつ十分な因
子として作用することを証明する。
【０２１７】このアッセイに基づいて、ステロイドによ
る受容体の活性化を試験することができた。第１２
（Ａ）図に示したように、ＤＥＸはｈＧＲにより誘導さ
れたＣＡＴ活性に対し３nＭのＥＤ50値を示す。これは
種々の生理学的作用においてＤＥＸにつき観察されたＥ
Ｄ50値（５nＭ）と一致する。共トランスフェクション
されたＣＶ−１細胞を１００nＭのテストステロン、エ
ストラジオールおよびプロゲステロンで処理することに
よりｈＧＲの作用の特異性をさらに調べた。これらのス
テロイドはプロゲステロン以外はＣＡＴ活性を誘導し得
なかった。プロゲステロンはＤＥＸにより生じた最大誘
導の１％の値でｈＧＲの機能を刺激した（データは示さ
れていない）。これらの結果は、トランスフェクション
されたＣＶ−１細胞が、天然受容体の特異性および濃度
において薬理学的リガンドと相互作用する機能性ｈＧＲ
を合成することを示す。
【０２１８】エンハンサー含有分子と細胞成分との特異
的相互作用に関する研究から、ＣＶ−１細胞は特定のウ
イルス性エンハンサーの機能に必要な細胞性因子を限定
された量含有することが示された（ショラー（Ｓchole
r）およびグルス（Ｇruss）１９８４）。これらの細胞
においてはトランスフェクションされたpＳＶ２ＣＡＴ
（ゴルマン（Ｇorman）ら、１９８２a）により生じるＣ
ＡＴ活性はプラスミド0.3pmol／ディッシュでプラトー
に達する。同様に、ｈＧＲが限定因子と相互作用するな
らば漸増する量のｐＲＳｈＧＲアルファのトランスフェ
クションにより誘導されるＣＡＴ活性を一定量の pＭＴ
ＶＣＡＴで飽和させることができるはずである。この実
験では２pmol（５μｇ)の pＭＴＶＣＡＴ ＤＮＡを使用
し、漸増する量のｐＲＳｈＧＲアルファＤＮＡを非特異
的キャリヤーＤＮＡと共に添加して、合計３０μｇ／デ
ィッシュを得た。第１２（Ｂ）図は0.03pml(１００n
ｇ）程度の少量のｐＲＳｈＧＲアルファ（ディッシュ当
たり）をトランスフェクションした際にＣＡＴ活性を検
出しうること、およびＣＡＴ活性においてプラトーに達
することはないことを証明する。これらデータは、ｈＧ
ＲによるＭＴＶ−ＣＡＴ融合遺伝子のトランスフェクシ
ョンの刺激はＣＶ−１細胞中で限定する転写因子に依存
しないことを示唆する。
【０２１９】(c)ｈＧＲの機能区のマッピング ｈＧＲが遺伝子転写を調節する機構を理解するために
は、まずその機能区の解明が必要であった。グルココル
チコイド受容体の蛋白質分解に関する限定された研究
(カールスデット−デューク(Ｃarlsdedt−Ｄuke)１９８
２；デルウェーク(Ｄellweg)ら、１９８２；ランゲ(Ｗra
nge)ら、１９８４；ライヒマン(Reichman）ら、１９８
４、およびｈＧＲの一次構造の分析（実験の部Ｉ参照）
に基づいて、受容体の構造に対するモデルが提示されて
いる（ワインバーガー(Ｗeinberger)ら、１９８５）。
このモデルにより主要な３区域が確認される。すなわち
アミノ酸１４５から２８０に及ぶ免疫区、アミノ酸４２
１から４８１に及ぶＤＮＡ結合区、および蛋白質のカル
ボキシル末端付近に位置するステロイド結合区である。
このモデルを試験するために本発明者らはグルココルチ
コイド受容体コード化配列における２７種の部位特異性
挿入変異体をリンカースキャニング法により形成した。
次いでこれらの遺伝子工学的に形成された変異体につ
き、遺伝子転写およびステロイドホルモン結合に対する
それらの能力をアッセイした。
【０２２０】ｈＧＲのリンカー挿入変異体を形成するた
めに、ＤＮＡ分子を高い頻度で開裂させる制限酵素を用
いて部分開裂することによりプラスミドｐＲＳｈＧＲア
ルファをまず線状化した。線状プラスミドを分離し、Ｂ
amＨＩリンカーを添加して、ｈＧＲをコードするオープ
ンリーディングフレームを再生した。得られた変異体は
３個または４個の付加的アミノ酸を保有し、これらが野
生型の蛋白質の配列を中断している。この方法により本
発明者らは一連のランダムなｈＧＲ変異体を形成した
（第１３図）。これらの変異体が全長ｈＧＲを発現する
能力をウェスタンブロット分析により推定した。産生さ
れたｈＧＲは３０％以上は異ならないことが示され、従
ってこれらの変異体はいずれも発現された蛋白質を不安
定化しないと思われた。
【０２２１】各変異体の機能性を第II−１表の野生型ｈ
ＧＲのものと比較した。２７種のｈＧＲ変異体のうち１
２種により誘導されるＣＡＴ活性は野生型の水準に匹敵
した。ＣＡＴ活性の誘導によりアッセイして機能が低下
し、または完全に失われている１５種のｈＧＲ変異体の
分析により、これらは別個の４群に属することが示され
た。いわゆる免疫原区のアミノ酸１２０と２１５の間に
位置する一群のこれら変異体が第１群を形成する。受容
体分子のこの領域には特異的機能は帰属されていない
が、３種の変異体（Ｉ１２０，Ｉ２０４およびＩ２１
４）は低いＣＡＴ活性誘導能を示す。これらの変異体は
ステロイド結合能を完全に維持した。
【０２２２】意外ではないと思われるが、第２群の欠損
変異体は受容体の推定ＤＮＡ結合区に見出される。この
機能区はシスティンに富み、それぞれアミノ酸約２５個
の２反復単位からなり、これがＺn2+ リガンドにより調
整されたループ構造に折れ曲がっている（ミラー（Ｍil
ler）ら、１９８５）。変異体Ｉ４２２の場合は、配列モ
チーフＣys−Ｘ2−ＣysがＣys−Ｘ5−Ｃysに変わってい
る。付加的アミノ酸の存在が受容体の機能を完全に失わ
せている。変異体Ｉ４４０は第１ループの形成に関与す
る他の２個のシスティン間に同様にアミノ酸４個の挿入
配列を有し、同様に検出可能な水準のＣＡＴ活性を誘導
できない。他方、変異体Ｉ４２８ではループ自体の長さ
がアミノ酸１３個から１７個に伸長している。著しく低
下してはいるが、Ｉ４２８によるＣＡＴ活性の誘導はな
お検出可能である。３種の変異体すべてについてＤＮＡ
結合区に存在するステロイド結合容量は野生型の水準の
範囲内にあることが示された。突然変異により影響を受
ける第３の領域はＤＮＡ結合区に隣接した位置にある。
変異体Ｉ４８８およびＩ４９０は低い水準のＣＡＴ活性
を示すが、ステロイドを効果的に結合する。第４群は受
容体蛋白質の最後の２００個のアミノ酸を包含する。５
種の変異体は（Ｉ５８２，Ｉ５８９，Ｉ５９９，Ｉ６２
６およびＩ６９６）は検出可能な水準のＣＡＴ活性を示
さない。この機能活性の欠如はそれらがデキサメサゾン
を全く結合し得ないことと関係がある。これらの結果
は、ステロイド結合領域が蛋白質の大部分を包含するこ
とを示す。これらはすべてＣ末端付近に集中している。
分子のアミノ末端と異なりこの領域は受容体の一次構造
の変化に対してきわめて敏感である。
【０２２３】(d)第II−１表
【表１】 ｈＧＲ変異体の機能性 挿入 ＣＡＴ ＤＥＸｈＧＲ アミノ酸 活性（％） 結合（％） アルファ − １００ １００ Ｉ９ ＲＩＲ １１７ ＮＴ Ｉ３７ ＲＩＲＡ ９５ ＮＴ Ｉ１０２ ＧＳＶ １３０ ＮＴ Ｉ１２０ ＲＧＳＡ ２ ７６ Ｉ２０４ ＲＩＲ ３ １２５ Ｉ２１４ ＲＧＳＡ ２ ７９ Ｉ２６２ ＡＤＰＲ ９７ ＮＴ Ｉ２８９ ＲＩＲ １２５ ＮＴ Ｉ３０５ ＡＤＰＲ ８６ ＮＴ Ｉ３４６ ＡＤＰＲ １９ １０７ Ｉ３８４ ＲＩＲ １０１ ＮＴ Ｉ４０３ ＡＤＰＲ １１４ ＮＴ Ｉ４０８ ＡＤＰＲ ５５ ＮＴ Ｉ４２２ ＧＳＶ ０ １０５ Ｉ４２８ ＲＩＲＡ ２ ９２ Ｉ４４０ ＡＤＰＲ ０ ６９ Ｉ４８８ ＧＳＶ １５ ９６ Ｉ４９０ ＲＩＲＡ １０ １１５ Ｉ５１５ ＲＩＲ １０９ ＮＴ Ｉ５３２ ＧＳＶ １１５ ＮＴ Ｉ５５０ ＡＤＰＲ ５ １９ Ｉ５８２ ＲＩＲ ０ ０ Ｉ５８９ ＧＳＶ ０ ０ Ｉ５９９ ＳＤＰ ０ ０ Ｉ６２６ ＡＤＰＲ ０ ０ Ｉ６８４ ＲＧＳＡ ７９ ８１ Ｉ６９６ ＲＧＳＡ ０ ０ ベータ Ｃ末端欠失 ０ ０ ＣＶ−１またはＣＯＳ細胞をｐＲＳｈＧＲアルファ、p
ＲＳｈＧＲベータ、または突然変異したｈＧＲアルファ
によりトランスフェクションし、ＣＡＴ活性およびステ
ロイド結合能につきアッセイした。トランスフェクショ
ン後にＣＶ−１細胞を１０nＭ−ＤＥＸの存在下で２日
間培養したのち、細胞溶解およびＣＡＴアッセイを行っ
た。ＣＯＳ細胞は普通の培地に維持された。これら２パ
ラメーターを野生型ｈＧＲ活性に対する％として定量し
た。ｈＧＲアルファに挿入されたアミノ酸を１文字コー
ドで表示する。ＮＴは試験しなかったことを意味する。
ｈＧＲアルファとｈＧＲベータのアミノ酸組成の相違を
第１３図および実験の部Ｉに示す。
【０２２４】II．Ｄ．考察 ｈＧＲ発現ベクターのトランスフェクションによりＣＶ
−１細胞中で産生されたｈＧＲがＭＴＲ−ＣＡＴ融合遺
伝子の転写活性化に必要かつ十分な因子であることを示
した。誘導の規模から、ｈＧＲは転写”スイッチ”とし
て作用し、これがグルココルチコイド応答要素を含む静
止状態のプロモーターを活性化状態に変換しうることが
明らかになった。構成性活性を示す他の転写因子と異な
り、ｈＧＲによる転写刺激は完全にグルココルチコイド
ホルモンの存在に依存性である（第１１および１２
（Ａ）図）。細胞内で蛋白質が大量に産生されるだけで
は調節された遺伝子の転写を誘導するのに十分ではな
い。ｈＧＲがホルモンによって活性化される機構は十分
には解明されていないがサイクリックＡＭＰ結合蛋白質
の場合と同様に、蛋白質内におけるアロステリック転移
を伴うものと思われる（マッケイ（Ｍckay）およびスタ
イツ（Ｓteitz）１９８１；ゲージス(Ｇages）およびア
ジヤ（Ａdhya）１９８５）。
【０２２５】本発明者らは、ｈＧＲによる転写の活性化
はＣＶ−１細胞中に限定された量で存在する因子によっ
て制限されないことを認めた（第１２（Ｂ）図）。これ
らの結果はグルココルチコイド応答性エンハンサーへの
ｈＧＲ−ステロイド−複合体の結合がプロモーター付近
の一般的転写因子の活性を高めるのに十分であることを
示唆する。他の数種の転写因子について同様な特性が報
告されている。たとえばＡdf１、すなわちメラノガスタ
ー（Ｄ. melanogaster）におけるアルコールデヒドロゲ
ナーゼ（Ａdh）の近位プロモーターを活性化する転写因
子は他の蛋白質因子の不在下でＡdh鋳型ＤＮＡを結合
し、Ａdh ＲＮＡ合成の開始を活性化するために内在性
ＲＮＡポリメラーゼＩｉ、および他の一般的転写因子を
含む画分を必要とするにすぎない（ヘーベライン（Ｈeb
erlein）ら、 1985)。ＳＶ４０エンハンサー／プロモー
ター要素を含む組換えプラスミド pＳＶ２ＣＡＴを用い
る他の型の実験において、ショーラー（Ｓcholer）およ
びグルス(Ｇruss）(1984）は、エンハンサー含有ＤＮＡ
の機能に細胞性分子が必要であることを示した。彼らの
実験によれば、ＳＶ４０エンハンサー要素によるＣＡＴ
遺伝子の活性化に必要な限られた量の細胞性因子の存在
が示された。しかし一般的転写因子の枯渇は観察されな
かった。これらのデータは特定の有効な転写因子の作用
機作が一般的転写因子の活性を高める因子自身、または
ポリメラーゼ自身によって誘導されるクロマチンの構造
における変化をもたらすらしいということを示唆してい
るモロー（Ｍoreau）ら、1981；ウェイジリク（Ｗasyly
k）ら、1983）。グルココルチコイド処理によってＭＴ
Ｖ ＬＴＲのセグメントを含むＤＮＡ領域に可逆的およ
び永続的双方の変化が生じることはすでに示されている
（ザレット（Ｚaret）およびヤマモト（Ｙamamoto） 19
84）。結合した受容体がプロモーター活性を高める機構
は完全に解明されている。しかしｈＧＲを過剰に発現す
る系が得られれば、有効な転写因子による分子基盤での
転写活性化についての将来の研究が容易になるであろ
う。
【０２２６】２７種の挿入変異体の解明の結果は、ヒト
グルココルチコイド受容体が一連の機能区からなるとい
う本発明者らの先の示唆を支持し、拡大する。ステロイ
ド結合に影響を与える変異体がすべてカルボキシル末端
に集中していることは注目に値する。この領域がホルモ
ンの特異性をコードする別個の機能区として機能するこ
とが示唆されるほか、これらの結果はこの受容体内に確
認された他の機能区が別個の機能を果たすという可能性
をも暗示する。従って、受容体が特定のＤＮＡ配列を認
識し、これと相互作用する能力は、エストロゲン受容体
および発癌遺伝子生成物 v−erb−Ａによって高度に保
持されているＣys−Ｌys−Ａrg に富む領域にあると思
われる。これらの領域における突然変異は受容体分子が
転写を活性化する能力を低下させるというのは論理的で
あると思われる。活性化はリガンドがアロステリック形
質転換を誘導する能力、および形質転換した分子がＤＮ
Ａを認識し、これと相互作用する能力の双方に依存する
からである。ステロイド受容体構造の最初のモデル（ワ
インバーガー（Ｗeinberger）ら、1985）に基づけば、
これらは突然変異誘発の解明に際し予想された結果であ
った。しかし予想されなかった結果は、転写活性に影響
を与える他の領域が少なくとも２か所確認されたことで
ある。これは、転写活性化に必要であるがステロイドま
たはＤＮＡの結合のいずれにも特異的に関与してはいな
い他の機能区が受容体中に存在するという興味深い可能
性を与える。変異体Ｉ１２０，Ｉ２０４およびＩ２１４
は野生型の親和性をもってステロイドと結合するが、転
写活性が低下している。これらの変異体は本発明者らが
τ1と呼ぶこの機能区が完全なｈＧＲ 活性を得るために
機能的に重要であり、かつ必要であることを明瞭に証明
している。興味深いことに、数系列のグルココルチコイ
ド耐性細胞に見出された非機能性の切除型変異体（すな
わち４０kd）は野生型受容体よりも効率的に核内に保持
されるが、転写を活性化し得ない（ヤマモト（Ｙamamot
o）ら、1976；アンドレアセン（Ａndreasen）およびゲ
ーリング（Ｇehring）1981；ウェストファル（Ｗestpha
l）ら、(1984)。これらの“核転移増加型”（nti）変異
体において失われた受容体断片は明らかに蛋白質のアミ
ノ末端である。それらはホルモン結合能を保持している
からである。本発明者らはτ1 がｈＧＲの主免疫原区と
一致することを指摘した（ワインバーガー（Ｗeinberge
r）ら、1985）。これは恐らくこれが分子の外表にある
ことを示す。この機能区がその機能を果たす様式につい
ての考察には、受容体の二量化をもたらす自己相互作
用、ＲＮＡポリメラーゼIIなどの一般的転写因子との相
互作用の可能性、および／または活性化された受容体の
残りの部分にアロステリック作用を及ぼすことによるＤ
ＮＡ結合の調節が含まれる(デルウェーク（Ｄellweg）
ら、1982）、τ1は受容体のアミノ末端、すなわちより
小型のエストロゲン受容体とは共有されない領域に含ま
れる。恐らくエストロゲン受容体が第２の蛋白質との相
互作用によりこの機能区と同等の機能を得るか、または
τ1 が他の調節分子との相互作用ではなくグルココルチ
コイド受容体自体の内部の他の残基と相互作用するので
あろう。転写活性化に影響を及ぼす他のτ領域（τ2と
呼ぶ）はエストロゲン受容体および v−erb−Ａ発癌遺
伝子中に存在する領域である。その位置からも、これが
ステロイド−およびＤＮＡ−結合区を結合させる“ちょ
うつがい”領域として作用するという可能性が示唆され
る。従ってこれらの変異体は受容体の活性化に必要なア
ロステリック形質転換を遮断するであろう。
【０２２７】アミノ酸挿入配列により影響を受ける第３
の領域は、ワインバーガー(Ｗeinberger）ら（1985）に
より報告される推定ＤＮＡ結合区内に位置する。この機
能区はＣys−Ｌys−Ａrgに富む配列を含む２個の反復単
位からなり、v−erb−Ａ発癌遺伝子およびエストロゲン
受容体と比較して最も強く保守されるものである（ワイ
ンバーガー（Ｗeinberger）ら、1985；グリーン（Ｇree
n）ら、1986；グリーン（Ｇreen）ら、1986）。これら
の反復単位はまず因子ＴＦ−IIIa（ミラー（Ｍiller）
ら、1985）に観察され、それ以来多数の他の核酸結合性
蛋白質中に配列相同性研究によって見出された（バーグ
（Ｂerg）1986）。因子ＴＦ IIIaの実験的および理論的
研究に基づいてミラー（Ｍiller）ら、（1985）は蛋白質
がＤＮＡ分子を結合する新規な機構を提示した。彼らの
モデルにおいては各ユニットは亜鉛イオンを中心とした
“フィンガー状”構造に折れ曲がっている。１本のフィ
ンガーがＤＮＡの半回転に結合する。変異体Ｉ４２２お
よびＩ４４０はフィンガーモデルの中心となるモチーフ
Ｃys−Ｘ2−Ｃysを乱すアミノ酸挿入配列を有する。こ
れらの変異体は転写活性化に関しては全く不活性である
が、それらグルココルチコイド結合能は保持する。予備
実験が示すように、これらの変異体もホルモン処理後に
核に転座することができず、インビトロにおいてＤＮＡ
を結合することができない（エス・ホレンバーグ、未発
表の所見）。これらの突然変異した受容体はｈＧＲ中に
存在するフィンガーモチーフの機能的重要性を証明す
る。この領域に位置する第３の変異体Ｉ４２８は４個の
アミノ酸の添加によりフィンガーが伸びている。Ｉ４２
８の転写活性は大幅に損われる（野生型水準の２％）
が、なお検出可能である。従って各ループは亜鉛結合モ
チーフよりも変化に耐えると思われる。フィンガー様機
能区がｈＧＲにおいて機能的に重要であるという証明か
ら、本発明者らはステロイドホルモン結合体が原始的な
祖先由来のＤＮＡ結合蛋白質から進化した金属蛋白質で
あると提唱するに至った。
【０２２８】これらのデータを合わせると、受容体は調
節機能区の集合体からなり、これらは原始的なステロイ
ドホルモン受容体中へ進化の過程で侵入凝縮されたもの
と思われ、これが哺乳動物ゲノム中に存在する一群の多
数のホルモン応答遺伝子を生じたことが示唆される。こ
の分子の転写活性はそれが遺伝学的スイッチとして作用
する潜在的能力をもつことを証明する。これは各種の進
化上の種族および恒常的機能の活性化におけるステロイ
ドホルモンの役割りと一致する。この突然変異の方式に
よれば、希望する小規模または大規模の欠失変異体のい
かなる組をも好都合に形成することができ、機能を研究
するために関連分子間の機能区を始動させることができ
る。この実験例に記載した迅速かつ定量的な機能アッセ
イと合わせて、τ、ＤＮＡ−およびステロイド−結合区
の機能性に関して特定の問題を提起することが可能とな
った。
【０２２９】II．実験の部IIに述べた図に関する詳細な
説明 第９図 ｈＧＲ機能アッセイ法の模式図 このアッセイ法においては、ｈＧＲアルファｃＤＮＡを
含む発現ベクターまたはそれから誘導される変異体を、
ＣＡＴ遺伝子を保有するプラスミドと共にＭＴＶ ＬＴ
Ｒの制御下にＣＶ−１またはＣＯＳ細胞中へ共トランス
フェクションする。次いで細胞をホルモンの存在下また
は不在下で培養する。ＣＶ−１細胞はＣＡＴ活性の誘導
を監視するために用いられ、ＣＯＳ細胞はステロイド結
合能およびｈＧＲ蛋白質の発現を測定するために用いら
れた。
【０２３０】第１０図 ｈＧＲ蛋白質の発現 ＣＯＳ細胞をトランスフェクションし(中央レーン)、ま
たはプラスミドｐＲＳｈＧＲアルファでトランスフェク
ションし（右レーン）、２日後にｈＧＲ蛋白質の存在に
つき分析した。粗製の細胞質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ
により溶解し、ウェスタンブロットにより分析した。Ｉ
Ｍ９細胞からの細胞質抽出物を比較のため同一ゲルに付
与した（左レーン）。
【０２３１】第１１図 ｈＧＲによるＣＡＴ活性の誘導 サブコンフルエンシー状態のＣＶ−１細胞をｐＲＳＶga
l(対照)、ｐＲＳｈＧＲアルファ、またはｐＲＳｈＧＲベ
ータ、およびレポータープラスミドｐＭＴＶＣＡＴで共
トランスフェクションし、１０nＭデキサメサゾンの存
在下(＋)または不在下(−）で２日間培養した。ＣＡＴ
アッセイは実験法（実験の部II・Ｆ．）に示したとおり
行われた。Ｃ．クロラムフェニコール；ＡＣ、３−アセ
チルクロラムフェニコール。
【０２３２】第１２図 ＤＥＸに対する用量応答性およびpＲＳｈＧＲアルファ
の滴定 （Ａ）pＲＳｈＧＲアルファのおよび pＭＴＶＣＡＴ
（各プラスミド１０μｇ）で共トランスフェクションし
たＣＶ−１細胞を漸増する濃度のデキサメサゾンの存在
下に培養した。ＤＥＸに対する見掛けのＥＤ50 値は３n
Ｍであった。ＣＡＴ活性の水準を特定の実験において観
察された最大応答に対する％としてプロットした。ＤＥ
Ｘの不在下ではＣＡＴ活性は検出されなかった。
【０２３３】（Ｂ）滴定。漸増する量のｐＲＳｈＧＲア
ルファをサブコンフルエンシー状態のＣＶ−１細胞中へ
一定量の pＭＴＶＣＡＴ（５μｇ）と共に共トランスフ
ェクションした。プラスミド pＢＲ３２２をキャリヤー
ＤＮＡとして用いて全体としてＤＮＡ３０μｇ／プレー
トを得た。１０nＭ・ＤＥＸの存在下に細胞を２日間培
養し、ＣＡＴ活性を測定し、（Ａ）の場合と同様にプロ
ットした。
【０２３４】第１３図 ｈＧＲにおける機能区の位置 ｈＧＲを転写活性化に関与する推定機能区τ1およびτ2
（斜線を施した領域により示す）と共に模式的に示す。
ＤＮＡ結合区は点彩を施した四角で、ステロイド結合区
は点を施した四角により表わされる。ＢamＨＩリンカー
挿入配列は三角形および丸印で表わす。数字はその後で
挿入が起こるアミノ酸の位置を意味する（実験の部Ｉ参
照）。白地の記号はＣＡＴ活性により測定して野生型水
準のホルモン依存性転写活性を誘導しうる変異体を表わ
す。黒地の記号は大幅に低下した、または無効になった
機能を示す。棒は機能を示さないｈＧＲベータ中に存在
する異なるアミノ酸の位置を示す。
【０２３５】II．Ｆ．実験法 （a）培養条件 ＣＶ−１およびＣＯＳ−１細胞は３７℃で、５％（v／
v）ウシ胎仔血清、アンピシリン４００μｇ／mｌ、およ
びストレプトマイシン１００μｇ／mｌを補充したダル
ベッコの改良イーグル培地において増殖させた。良好な
トランスフェクション効率を得るために細胞を３日毎に
継代し、コンフルエンシーに到達させなかった。トラン
スフェクションされた培養物は５％ＣＯ2下で３７℃に
保持された。
【０２３６】（b）組換えプラスミド プラスミドｐＲＳｈＧＲアルファおよびｐＲＳｈＧＲベ
ータ、すなわちＣＶ−１およびＣＯＳ細胞において２形
態のｈＧＲの合成を方向づけるものは、３個のＤＮＡ断
片から構成された。第１断片はｐＲＳＶＣＡＴゴルマン
（Ｇorman）ら、１９８２b）から誘導され、ＲＳＶ Ｌ
ＴＲ，pＢＲ３２２配列、およびＳＶ４０ポリアデニル
化部位を含む。この断片を得るためにはpＲＳＶＣＡＴ
をＨinｄIIIで切断し、各末端をＤＮＡポリメラーゼＩ
のクレノー断片で処理することにより修復した。ＫpnＩ
リンカーを標準法によりこれらの末端に付加し(マニア
チス（Ｍaniatis)ら、１９８２）、このプラスミドを次
いでＨpaＩで切断し、これによってＣＡＴコード化配列
を除去した。第２の断片はｈＧＲアルファまたはｈＧＲ
ベータのいずれのコード化配列をも含む。プラスミド p
ＯＢ１１３および pＯＢ１１７（エス．エム．ホレンバ
ーグ、未発表の結果）、すなわちそれぞれアルファ形お
よびベータ形のｈＧＲのコード化配列全体を含むものを
ＢamＨＩで切断した。各末端をクレノー断片で修復し、
これらのプラスミをＫpnＩで切断した。第１および第２
断片のリゲーションによりプラスミド pＲｈＧＲアルフ
ァおよびpＲｈＧＲベータを形成した。付加すべき第３
の断片はプラスミドpＳＶ２ＣＡＴから得たＳＶ ４０Ｏ
ＲＩを含むＰvuII−ＨindIIIからなる（ゴルマン(Ｇorm
an）ら、１９８２a)。この断片の各末端をクレノー断片
で処理することにより修復し、これらにＮdeＩリンカー
を付加した。ＳＶ４０ ＯＲＩを含むこのＤＮＡ断片を
次いで pＲｈＧＲアルファおよび pＲｈＧＲベータ中に
存在する１個のＮdeＩ部位に導入した。最後にこれらの
プラスミド中に存在する１個のＢamＨＩ部位を破壊し、
合成アダプターの挿入によりＸhoＩと置換した。得られ
たプラスミドはpＲＳｈＧＲアダプターおよびｐＲＳｈ
ＧＲベータであった。プラスミド pＭＴＶＣＡＴおよび
pＭＴＩaＣＡＴはエス．ゴールド氏からの供与であっ
た。
【０２３７】（c）挿入突然変異形成 ｈＧＲアルファの野性型配列を乱すアミノ酸の挿入は下
記の方法により行われた。全長線状ｐＲＳｈＧＲアルフ
ァＤＮＡはＡluＩ，ＤpnＩ，およびＢstＮＩ制限酵素に
よる部分消化によって形成された。ＢstＮＩにより切断
したＤＮＡの場合、各末端をまずクレノー断片で修復し
た。次いでＤＮＡ分子をアガロースゲル電気泳動により
分画し、線状のプラスミドを抽出した。８−または１２
−merのＢ amＨＩリンカーを付加してｈＧＲアミノ酸配
列の本来の解読フレームを再生した。ｈＧＲのコード化
領域に１個のＢamＨＩリンカーを保有するプラスミドの
配列を決定し（マクサム（Ｍaxam）およびギルバート
（Ｇilbert）、1980）、リンカーの位置およびｈＧＲ変
異体の全体性を確認した。
【０２３８】（d）細胞トランスフェクションおよびＣ
ＡＴアッセイ 組換えＤＮＡ構造体をリン酸カルシウム共沈法によりＣ
Ｖ−１細胞中へ（ウィグラー（Ｗigler）ら、1979）、
またはＤＥＡＥ−デキストランによりＣＯＳ細胞中へ
（ディーンズ（Ｄeans）ら、1984）導入した。トランス
フェクションに用いた各プラスミド調製物は２種の連続
ＣsＣｌ−ＥtＢr平衡濃度勾配により精製された。ＣＡ
Ｔ遺伝子構造物でトランスフェクションしたのち、ゴル
マン(Ｇorman）ら（１９８２a）の記載に従ってＣＶ−
１細胞をＣＡＴアッセイ用に調製した。これらのアッセ
イは全細胞抽出物の３分の１を用いて、インキュベーシ
ョン時間６時間で行われた。
【０２３９】（e）ウェスタンブロット分析 ＣＯＳ細胞からの粗抽出物は１０mＭトリス−ＨＣｌ（p
Ｈ７.5）、１００mＭＮaＣｌ，１mＭ ＥＤＴＡ，０.５
％トライトンＸ−１００を含有する緩衝液を用いる細胞
溶解により調製された。等量の蛋白質(１００μｇ)を
７.５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により溶解
し、ニトロセルロースフィルターに移し、抗ｈＧＲ抗体
ＧＲ８８４（ハーモン（Ｈarmon）ら、１９８４）によ
り検査したのち125Ｉ標識−黄色ぶどう球菌蛋白質Ａに
より検出した。フィルターを風乾し、フィルムに露光し
た。受容体の量をオートラジオグラフのスキャニングに
より定量した。
【０２４０】（f）ステロイド結合のアッセイ ＣＯＳ細胞を、１０mＭトリス−ＨＣｌ（pＨ７.５）、
１００mＭ ＮaＣｌ，１mＭＥＤＴＡ，５μｇ／mｌ ア
ンチペイン、５μｇ／mｌロイペプチンおよび０.５mＭ
ＰＭＳＦを含有する低張緩衝液中でダウンスホモジナ
イゼーションにより細胞溶解し、15,000×ｇで１０分間
遠心分離してサイトゾル画分を得た。１００mＭ ＮaＣ
ｌに調整され、サイトゾル画分からの蛋白質１０μｇお
よび２×１０-8〔3Ｈ〕ＤＥＸ（アメルシャム，９５Ｃi
／mmoｌ）を全容量２００μｌに含有する低張緩衝液中
でインキュベーションを行った。非特異的結合は２×１
０-6非標識ＤＥＸの添加により測定された。反応は０℃
で２時間行われ、次いで５０％デキストラン被覆活性炭
（１０：１活性炭：デキストラン）２０μｌと共にイン
キュベーションし、15,000×ｇで４℃において２分間、
遠心分離した。上層液をベックマンＬＳ−７８００液体
シンチレーション分光光度計による液体シンチレーショ
ン法によって計数した。各アッセイは通常２５００〜３
０００cpm〔3Ｈ〕標識ステロイドを与えた。非標識ＤＥ
Ｘはこの結合の７０％に対し競合した。
【０２４１】II．実験の部IIで参照した参考文献 １．Ａlwine，Ｊ．Ｃ.，Ｍol．Ｃell．Ｂiol.，5：1034
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【０２７４】35. Ｗigler,Ｍ.,Ｓweet,Ｒ.,Ｓim,Ｇ.
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【０２７５】36. Ｗrange，Ｏ.，Ｏkret，Ｓ.,Ｒadojci
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Ａ.,Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.,259：4534−4541（1984）。
【０２７６】37 Ｙamamoto,Ｋ.Ｒ.,Ｇehring,Ｕ.,Ｓta
mpfer,Ｍ.Ｒ.,and Ｓibley,Ｃ.,Ｒec.Ｐrog.Ｈormone
Ｒes.,32：3−32（1976）。
【０２７７】38 Ｚaret,Ｋ.Ｓ.,and Ｙamamoto,Ｋ.
Ｒ.,Ｃell,38：29−38（1984）。
【０２７８】実験の部III c−erb−Ａ遺伝子は甲状腺ホルモン受容体をコードするIII．Ａ．概要および序論 ヒトグルココルチコイド受容体（ｈＧＲ)の相補ＤＮＡ
はその塩基配列が決定されており（Ｗeinbergerら、198
5bおよび実験の部Ｉを参照）、機能的に活性であること
が分かっている（実験の部IIを参照）。興味あることに
は、その受容体の塩基配列解析により、それは鳥類の赤
芽球症ウイルス(ＡＥＶ)のv−erb−Ａ腫瘍遺伝子産物に
関係のあることが見出された（Ｗeinberger ら、1985を
参照）。これはステロイド受容体とerb−Ａ腫瘍遺伝子
産物が共通の原始的原型(primordial archetype)を共有
し、そしてerb−Ａ原腫瘍遺伝子産物もまたＤＮＡエン
ハンサー因子と結合する蛋白質でありうるという提案へ
導いた。ヒトエストロゲン（Ｇreenら、1986 およびＧr
eeneら、1986）、ニワトリプロゲステロン(Ｊeltschら、
1986およびＣonneelyら、1986）およびヒトアルドステ
ロン（Ｊ.Ａrriza，Ｃ．Ｗ．およびＲ．Ｍ．Ｅ．，未発
表データ）の最近の特性決定はこれらの結論をさらに支
持するものである。
【０２７９】従って、我々はたとえヒトc−erb−Ａ原腫
瘍遺伝子が機能的に確実に固定されなくとも、その遺伝
子の配列を決定することから始めた。これらの実験の進
行中に、グルココルチコイド受容体の機能的ドメイン
（実験の部IIを参照）の解説において進歩が見られ、ｈ
ＧＲのホルモン結合ドメインはカルボキシ末端の３００
個のアミノ酸を包含する異常に大きい領域であることが
判明した。この全領域はv−erb−Ａのカルボキシ末端と
のわずかではあるが有意な類似性を有し、それ故にステ
ロイドホルモンの作用と類似した転写調節作用を及ぼし
うる分子の部類に我々の関心が集中した。
【０２８０】遺伝子発現の甲状腺ホルモン刺激の分子機
構はステロイドについて概略したものと類似していると
思われる（Ｅberhardtら、1980を参照）。甲状腺ホルモ
ンは試験したすべての脊索動物種に存在し、そして発生
および分化（例えば両生類の変態）に対して重要な作用
を及ぼす（Ｅberhardtら、1980を参照）。ステロイドと
同様に、甲状腺ホルモンは受動拡散によって細胞に入
り、高親和性核受容体と結合し、その後遺伝子発現の迅
速かつ選択的な活性化を仲介する（Ｔataら、1966およ
びＯppenheimerら、1972）。この仮説を支持する証拠
は、ラット下垂体前葉のソマトトロピン生成細胞および
多数の関連するラットソマトトロピン生成細胞株におけ
る成長ホルモンおよびそのメッセンジャーＲＮＡの誘導
の研究からもたらされた（Ｓamuelsら、1973 およびＴa
taら、1974）。甲状腺ホルモンはこれらの細胞における
成長ホルモン遺伝子の転写を速やかに増強する（Ｍarti
al ら、1977 およびＥvansら、1982）。この転写増強は
核甲状腺ホルモン−受容体複合体のレベルが上昇するこ
とにより達成され、時間および濃度に依存しているが、
蛋白質合成とは無関係である(Ｓamuelsら、1976；Ｓpind
lerら、1982；およびＹaffeら、1984を参照）。
【０２８１】ステロイドホルモン作用と甲状腺ホルモン
作用との類似性は、erb−Ａ蛋白質それ自体が甲状腺ホ
ルモン受容体でありうるという可能性を調べることへ導
いた。我々は初めにヒトc−erb−ＡのｃＤＮＡを単離し
て、その配列を決定した。その塩基配列から、ステロイ
ドホルモン受容体の推定上のＤＮＡ結合ドメインに類似
したシステイン／リシン／アルギニンに富む領域、およ
びそのステロイド結合ドメインとわずかに関連したカル
ボキシ末端領域を含む４５６個のアミノ酸から成るポリ
ペプチドが推定された。クローン化したステロイド受容
体のホルモン結合特性を調べるために開発された機能決
定（実験の部Ｉを参照）を用いて、我々はヒト c−erb
−ＡｃＤＮＡの翻訳産物が天然甲状腺ホルモン受容体分
子に特徴的な、固有の甲状腺ホルモン結合活性を保持す
ることを証明した。
【０２８２】III．Ｂ．c−erb−Ａ cＤＮＡの特性決定 ヒトc−erb−ＡｃＤＮＡを単離するために、ｖ−erb−
Ａ遺伝子のみを含むＡＥＶゲノム領域から分離した５０
０塩基対（bp）のＰstＩＤＮＡフラグメント（Ｖennstr
omら、1980）を32Ｐ標識プロープとして使用して、２つ
のヒト胎盤cＤＮＡライブラリーをスクリーニングし
た。それぞれ約１０6個のファージ組換え体の２つの独
立したライブラリーを選択することにより、２つの重複
するラムダgt１０ｃＤＮＡクローンが得られた。 pＵＣ
８サブクローンからのｃＤＮＡクローンＥcoＲＩ挿入物
pheＡ４およびpheＡ１２のそれぞれの制限地図を作成し
た（第１４図）。これらの重複する1.5キロ塩基（kb）c
ＤＮＡクローンのヌクレオチド配列解析により、ヌクレ
オチド番号３０１に推定上のイニシエーターメチオニン
コドンおよびヌクレオチド番号１６６９にターミネータ
ーコドンを有する４５６個のアミノ酸の長いオープン・
リーディング・フレームを含むことが明らかになった
（第１５図および第１６図）。ＡＴＧの７コドン上流に
は読み枠内のターミネーターＴＡＡが存在してイニシエ
ーターメチオニンに対する支持を与えているが、２６コ
ドン下流に存在する別のメチオニンはこの割当てを不確
かなものにする。共通のポリアデニル化付加シグナル
（ＡＡＴＡＡＡ，Ｐroudfootら、１９７６を参照）はph
eＡ１２のターミネーターとポリ（Ａ）領域の間の２７
ヌクレオチド中に存在しない。
【０２８３】ヒトc−erb−Ａ ｃＤＮＡ翻訳オープン・
リーディング・フレーム内にコードされる相対分子量 5
2000（Ｍ1＝５２Ｋ）の推定上のポリペプチドは、ＡＥ
Ｖ中のウイルスgag配列（Ｄebuireら、１９８４）から
下流の領域と８２％のアミノ酸同一性を共有する。アミ
ノ酸の比較において大きな相違は見られなかった。ヒト
c−erb−Ａアミノ酸配列はウイルスのアミノ酸残基３７
から始まるウイルス蛋白質と相同である（第１７図）。
c−erb−Ａのカルボキシ末端はv−erb−Ａのそれと次の
点で相違する：すなわち、２種のポリペプチドのアミノ
酸配列類似性がc−erb−Ａの残基４４５およびv−erb−
Ａ残基３８０で終止する（第１７図）。
【０２８４】ヒトc−erb−Ａ核酸配列とv−erb−Ａのそ
れとを整列させると、ヒト遺伝子の約７４％がアミノ酸
の相同領域（c−erb−Ａのヌクレオチド 563−1636，デ
ータは示さず）においてウイルス遺伝子と同一であるこ
とが分かる。これらの比較は、染色体１７にマッピング
される他のヒトerb−Ａ遺伝子に関する以前のデータ
（Ｊanssonら、1983；Ｓpurrら、1984；およびＤayton
ら、1984）と考え合わせると、我々の分離したヒト胎盤
c−erb−Ａ遺伝子が別個のものであることを示す。２種
の染色体１７erb−Ａ遺伝子（我々は両方ともhc−erb−
Ａアルファと呼ぶよう提案する）のうちの１種はヌクレ
オチド配列に関して８２％がv−erb−Ａ遺伝子と類似し
ており、アミノ酸配列に関しては８９％が同一である
（Ｄayton ら、1984 を参照）。従って、我々が hc−er
b−Ａベータと呼ぶよう提案する胎盤c−erb−Ａ ｃＤ
ＮＡは、hc−erb−Ａアルファ遺伝子よりもウイルスerb
−Ａ遺伝子との関連性がうすい。
【０２８５】ウイルスおよび細胞erb−Ａ蛋白質産物と
グルココルチコイド受容体とのアミノ酸配列の比較は，
ｈＧＲのカルボキシ末端半分との段階的レベルの相同性
を示す（第１７図）。最も高い類似性はc−erb−Ａアミ
ノ酸残基１０２から始まって６５個のアミノ酸から成る
システインに富む配列に見られる（Ｗeinbergerら、１
９８５を参照）。ｈＧＲと比較した場合には４７％のア
ミノ酸同一性が見られ、そしてc−erb−Ａをヒトエスト
ロゲン受容体（ｈＥＲ）のアミノ酸配列と比較した場合
には５２％の同一性が存在する（第１７図）。我々はｈ
ＧＲのこの領域がＤＮＡ結合ドメン4を表すと提案し
た。突然変異誘発および発現実験により、転写活性化に
おけるその役割の直接的証拠が得られた（実験の部IIを
参照）。システインに富むドメインから下流の領域（ホ
ルモン結合ドメインに相当する）には、ウイルスerb−
Ａ産物において先に述べたようなｈＧＲおよびｈＥＲと
の低下したしかし有意な(１７％)相同性が存在する（Ｗ
einbergerら、1985；Ｇreeneら、1986；およびＧreen
ら、1986 を参照）。
【０２８６】III．Ｃ．多重 erb−Ａ遺伝子 制限エンドヌクレアーゼ消化ヒト胎盤ＤＮＡIII．Ｄ．c−erb−Ａ遺伝子の発現 種々のヒト細胞株またはヒト胎盤から分離した細胞質ポ
リ（Ａ）含有ＲＮＡと、pheＡ４からの６５０bpＢamＨ
Ｉ−ＰstＩフラグメント（第１４図）と、をハイブリダ
イズするノザン・ブロット（Ｎorthern blot）は、Ｈe
Ｌa およびＭＣＦ−７細胞中に最も豊富に存在する 200
0ヌクレオチドの単一のＲＮＡ種を明らかにした（第１
９（Ａ）図）。ｍＲＮＡの大きさは、我々がほぼ全長の
c−erb−ＡｃＤＮＡを分離したことを示す。ＨＴ１０８
０細胞は少量の２kb 転写物を含み、一方それはＩＭ−
９細胞中に検出されない。ヒト胎盤は２.０kbのＲＮＡ
に加えて５,３および2.5kbの多数のＲＮＡ種を含むと思
われる。多数の胎盤バンドが核前駆体、または単一遺伝
子からの成熟ｍＲＮＡ、もしくは他のerb−Ａ遺伝子の
産物を表すかどうかは定かでない。
【０２８７】ヒトc−erb−Ａ ｃＤＮＡの蛋白質産物は
in vitro翻訳により同定した。全c−erb−Ａコード領
域を含むcＤＮＡは両方の向きで発現ベクターpＧＥＭ３
のＥcoＲＩ部位に挿入した。ウサギ網状赤血球溶解液中
での蛋白質合成をプログラミングするために、これらの
鋳型からＴ７ポリメラーゼにより合成したキャップ(ca
p)をもつＲＮＡ転写物を使用し、そして35Ｓ−メチオニ
ン標識産物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離
した（Ｌaemmli，1970）。鋳型としてpeＡ１０１ＤＮＡ
（erb−Ａセンス転写物）を用いたときにはＭr５５,５
２および３５Ｋの蛋白質が検出されたが（第１９（Ｂ）
図、レーン３および４)、peＡ１０２ＤＮＡ（erb−Ａア
ンチセンス転写物）を用いたときには検出されなかった
（第１９（Ｂ）図、レーン２）。５５および５２Ｋの産
物はそれぞれメチオニン１および２７で翻訳を開始する
ポリペプチドに相当し（第１５図）、３５Ｋ産物は蛋白
質分解産物でありうる。
【０２８８】III．Ｅ．甲状腺ホルモンの結合 ｈＧＲのカルボキシ末端とｈＥＲのカルボキシ末端（ホ
ルモン結合ドメインを定める；Ｋrustら、1986を参照）
の間の部分的アミノ酸配列相同性（４０％）並びにステ
ロイドリガンドの構造的類似性は、ステロイド受容体が
調節蛋白質の１つのファミリーから成るという仮説を支
持するものである。c−erb−Ａのカルボキシ末端とステ
ロイド受容体のカルボキシ末端と比較的少ない相同性
は、erb−Ａ原腫瘍遺伝子が恐らくステロイド受容体を
コードしないことを示唆しており、erb−Ａが他の分子
に応答しうるという仮説に一致する。我々はin vitro
翻訳がクローン化したステロイド受容体のホルモン結合
活性を同定する手段として使えることを示した（実験の
部Ｉを参照）。従って、推定上のc−erb−Ａリガンドを
同定するために、この検定を利用した。
【０２８９】ステロイドホルモンおよび甲状腺ホルモン
は基本的に類似した機構によりそれらの作用を及ぼす。
erb−Ａ甲状腺ホルモン受容体でありうる可能性を引き
出すために、in vitro翻訳産物を125Ｉ−３，５，３’
−トリヨード−チロニン（125Ｉ−Ｔ3）とホルモン結合
反応条件下で混合した（Ｓamuelsら、1974を参照）。非
特異的ホルモン結合は同様な試料に５００倍過剰モル量
の冷却Ｔ3を加えることにより調べた。驚いたことに、
５５および５２Ｋポリペプチドを含む混合物(peＡ１０
１）は125Ｉ−Ｔ3と結合したが、アンチセンスＲＮＡ−
プログラム化溶解液（peＡ１０２）はバックグラウンド
結合のみを示した。ホルモン結合はプロテアーゼに対し
て感受性であるが、ヌクレアーゼには非感受性である
（データは示さず）。クローン化 erb−Ａ蛋白質に対す
る手段として使えることを示した（実験の部Ｉを参
照）。従って、推定上のc−erb−Ａリガンドを同定する
ために、この検定を利用した。
【０２９０】ステロイドホルモンおよび甲状腺ホルモン
は基本的に類似した機構によりそれらの作用を及ぼす。
erb−Ａ甲状腺ホルモン受容体でありうる可能性を引き
出すために、in vitro翻訳産物を125Ｉ−３，５，３’
−トリヨード−チロニン(125Ｉ−Ｔ3）とホルモン結合
反応条件下で混合した（Ｓamuelsら、１９７４を参
照）。非特異的ホルモン結合は同様な試料に５００倍過
剰モル量の冷却Ｔ3を加えることにより調べた。驚いた
ことに、５５および５２Ｋポリペプチドを含む混合物
（peＡ１０１）は125Ｉ−Ｔ3と結合したが、アンチセン
スＲＮＡ−プログラム化溶解液（peＡ１０２）はバック
グラウンド結合のみを示した。ホルモン結合はプロテア
ーゼに対して感受性であるが、ヌクレアーゼには非感受
性である（データは示さず）。クローン化erb−Ａ蛋白
質に対するＴ3親和性はスカッチャード分析により測定
した（第２０（Ａ）図）。５×１０-11 ＭのＫd 値が得
られ、これはＨeＬa細胞の核抽出物におけるＴ3結合
（６×１０-11Ｍ）とほとんど同じである（データは示
さず）。
【０２９１】特殊な甲状腺ホルモン類似体は、天然甲状
腺ホルモン受容体へのＴ3 結合に対し特徴的な競合パタ
ーンを有する。我々はin vitro で合成したerb−Ａ産物
が天然および合成甲状腺ホルモンに対して同じ固有の親
和性を有するかどうか調べた。125Ｉ−Ｔ3結合は３，
５’，３’−トリヨードチロ酢酸（ＴＲＩＡＣ）の場合
に最も効果的に競合され、それは３００pＭで125Ｉ−Ｔ
3結合の５０％を阻害した（第２０（Ｂ）図）。さら
に、Ｌ−チロキシン（第２０（Ｂ）図）、Ｄ−Ｔ3およ
びrＴ3（３，３’，５’，−トリヨード−Ｌ−チロニ
ン）はＴ3よりも弱く競合し（第２０（Ｃ）図）、一方
１００μＭのビタミンＤ3、アルドステロン、コルチゾ
ル、テストステロン、プロゲステロンまたはエストラジ
オールは競合せず（データは示さず）、ラット甲状腺ホ
ルモン受容体の生化学的性質と一致する（Ｓamuelsら、
1974；Ｓamuelsら、1979；およびＬathamら、1976を参
照）。
【０２９２】高塩（0.4Ｍ ＫＣｌ）ＨeＬa細胞核抽出物
は甲状腺ホルモン（125Ｉ−Ｔ3）結合活性を含むが、細
胞質または低塩（0.1ＭＫＣｌ）核抽出物には全く見ら
れなかった（データは示さず）。核抽出物における甲状
腺ホルモン結合の競合は、invitroで調製したc−erb−
Ａ含有溶解液のそれと定量的に類似していた（第２０
（Ｂ）図および（Ｄ）図を比較されたい）。さらに、検
出不能なレベルのc−erb−ＡｍＲＮＡ（第１９（Ａ）
図、レーン４）を含むＩＭ−９細胞由来の0.4ＭＫＣｌ
核抽出物を用いた甲状腺ホルモン結合は、類似のＨeＬa
細胞抽出物と比較したとき、ごくわずかである。これら
の結果はc−erb−Ａ甲状腺ホルモン受容体であるという
直接的証拠を提供する。
【０２９３】III．Ｆ．結論 ここで得られたデータは、c−erb−Ａ産物を甲状腺ホル
モン受容体として同定するための３つの基準をもたら
す。第一に、c−erb−Ａの全体的な構造相同性はリガン
ド応答性調節蛋白質である可能性を示している。第二
に、発現された蛋白質産物は天然および合成甲状腺ホル
モンに対して天然受容体と同じ固有の親和性を有してい
る。第三に、erb−Ａのin vitro 翻訳産物の分子量はフ
ォトアフィニティ標識ラット甲状腺ホルモン受容体と類
似している（Ｐascualら、１９８２）。甲状腺ホルモン
受容体としてのerb−Ａの本性は、成長ホルモン遺伝子
のようなＴ3−応答性遺伝子のその転写調節を証明する
ことによりさらに実証されるであろう。
【０２９４】ｈＧＲおよびhＭの分析により、これらの
蛋白質は一連の機能的ドメインから構成されていること
が明らかになった。（実験の部ＩおよびIV；Ｗeinberge
rら、1985a；Ｃarlstedt−Ｄukeら、1982；Dellwegら、
1982；Ｒeichmanら、1984；およびＳhermanら、1978を
参照されたい。）これらはキセノプス（Ｘenopus）５Ｓ
遺伝子の第IIIＡ転写因子および他の転写調節蛋白質
（Ｍillerら、1985；Berg，1985）に見られる反復した
システインに富む配列との構造的類似性を有するシステ
インに富む領域、並びにステロイド結合ドメインをコー
ドするカルボキシ末端領域（実験の部II；Ｗeinberger
ら、1985a；およびＫumarら、1986を参照）を含む。甲
状腺ホルモン受容体に類似したこの範囲はそのホルモン
結合領域がその分子のカルボキシ末端近傍に局在化する
ことを予告するであろう（第２１図）。推定上のＤＮＡ
結合配列はシステインに富む領域に存在し（第２１
図）、ｈＧＲおよびｈＥＲのＤＮＡ結合特性は局在化さ
れると思われる（実験の部II;Ｋumarら、1986；Ｓ．Ｈo
llenbergおよびＲ．Ｍ．Ｅ．、未発表データを参照）。
【０２９５】III．Ｇ．甲状腺ホルモン受容体および腫
瘍形成 鳥類の赤芽球によるv−erb−Ａ産物の発現は、完全に形
質転換された表現型の維持のために必要とされる（Ｇra
fら、1983；Ｆrykberg ら、1983；Ｓealy ら、1983；お
よびＫahnら、1986を参照）。v−erb−Ａ遺伝子を欠失
したウイルスに感染したニワトリは比較的悪性でない症
状を呈するが、in vitroにおいてこれらの感染赤芽球は
自然に分化して、複合倍地を補給したときだけ生育す
る。しかしながら、erb−Ａ+／erb−Ｂ+ウイルスに感染
した細胞は増大した自己回復能を有し、比較的未分化の
表現型を呈する。v−erb−Ａ蛋白質の構造的変化は異常
な成長調節特性を及ぼす産物を生じさせるであろう。例
えば、カルボキシ末端における変化は甲状腺ホルモン結
合活性に影響を及ぼして、以前にヒトグルココルチコイ
ド受容体のベータ型において示したように、構成的に活
性な分子をもたらすかも知れない（実験の部IIおよびII
I；Ｗeinbergerら、1985aを参照）。この場合の変化は
ステロイド結合活性を排除する。このドメインにおける
挿入変異もまたステロイド結合特性を不活性化する（実
験の部IIを参照）。しかしながらホルモン結合領域の欠
失は構成的に活性な受容体を生じさせ、このことはこの
ドメインが転写活性化において調節的役割を演じている
ことを示す（Ｖ．ＧiguereおよびＲ．Ｍ．Ｅ．，未発表
データ）。これらのデータは、v−erb−Ａがホルモンと
結合しそうもなく、むしろ甲状腺ホルモン受容体の構成
的に活性な形体であることを推測させる。甲状腺ホルモ
ン受容体としてのerb−Ａ同定は、腫瘍の原因となる形
質転換にエンハンサーおよびそれらの結合蛋白質を巻き
込む最初の直接的証拠を提供する。
【０２９６】III．Ｈ．調節遺伝子のスーパーファミリ
ー ステロイド受容体とv−erb−Ａ腫瘍遺伝子産物との類似
性は、これらが原始的な受容体遺伝子から進化したもの
であると我々が提案するのに十分であった（Ｗeinberge
rら、１９８５a）。２つの驚くべき結果がここに示した
実験から得られた。第一は、erb−Ａ原腫瘍遺伝子のフ
ァミリーの存在が甲状腺ホルモン受容体と密接に関連し
た１種またはそれ以上の他の分子の存在を暗示するとい
うことである。生理学的研究は第二のクラスの甲状腺ホ
ルモン受容体の存在を予告しなかった。従ってこのファ
ミリーの同定は発生およびホメオスタシス調節の機構に
新たな光を投げかけるかも知れない。これらの結果から
得られた第二の驚くべき観察は、甲状腺ホルモン受容体
とステロイドホルモン受容体ファミリーとの密接な関係
である。この関係は、これらの分子がすべてより複雑な
真核生物の次第に高まる発生学的および生理学的要求に
適合すべく進化の過程で生じた調節蛋白質のスーパーフ
ァミリーの一部でありうることを示している。
【０２９７】III．Ｉ．実験の部IIIに関連した図面の詳
細な説明 第１４−１６図 ヒト胎盤c−erb−Ａ ｃＤＮＡの制限地図および塩基配
列決定計画（１４）、並びにそのヌクレオチド配列およ
び推定上のアミノ酸配列（１５−１６）。ａ．複合制限
地図に対する２つのサブクローンpheＡ４およびpheＡ１
２の方向性。共通の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を
線状地図の上に示す。細線、非翻訳配列；斜線ボック
ス、erb−Ａコード領域；矢印、塩基配列を決定したＤ
ＮＡフラグメント。ｂ．複合erb−ＡｃＤＮＡのヌクレ
オチド配列を５’→３’の方向で示す。ウイルスerb−
Ａ蛋白質21に関する翻訳オープン・リーディング・フレ
ームをヌクレオチド配列の上に示す。アデノシン残基
（約１３０個）がpheＡ１２の３’末端に存在する。翻
訳配列の上の番号はアミノ酸残基を示し、そしてヌクレ
オチド番号はその配列の右側に示す。
【０２９８】第１４−１６図の方法 ２つのヒト胎盤ラムダgt１０ＤＮＡライブラリー（Ｈuy
nhら、1985）のそれぞれからの組換えファージ（約１０
6個）はpＡＥＶ−１１（Vennstromら、1980）から単離
した５００bp ＰstＩフラグメント（ニック・トランス
レーションを行ったもの；Rigbyら、1977）を用いてス
クリーニングした。ハイブリダイゼーション混合物は５
０％ホルムアミド、１×デンハート溶液、５×ＳＳＰ
Ｅ、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１００
μｇ／mｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび１０6cpm／mｌの32
Ｐ標識ＰstＩフラグメント（比活性＝１×１０8cpm／μ
ｇ）を含んでいた。２通りのニトロセルロースフィルタ
ーを３７℃で１８時間ハイブリダイズさせ、0.1×ＳＳ
Ｃ、0.1％ＳＤＳ(１×ＳＳＣ＝１５０mＭ ＮaＣｌ、１５m
Ｍクエン酸三ナトリウム）で２０分ずつ３回洗い、そし
て増感紙を用いて−７０℃でオートラジオグラフィーに
かけた。２つのハイブリダイゼーション陽性クローンが
単離され、それをpＵＣ８のＥcoＲＩ部位にサブクロー
ニングし、その後化学的切断方法により塩基配列を決定
した(Ｍaxamら、1977）。
【０２９９】第１７図 v−erb−Ａ腫瘍遺伝子産物、ヒト胎盤c−erb−Ａポリペ
プチド、およびヒトグルココルチコイド受容体並びにヒ
トエストロゲン受容体のカルボキシ末端部分のアミノ酸
配列比較。v−erb−Ａ蛋白質（上段の配列）とヒト胎盤
c−erb−Ａポリペプチド（第二段の配列）との翻訳アミ
ノ酸配列は、対応する残基を整列させることにより比較
した。３個以上のアミノ酸配列の同時比較用のコンピュ
ータプログラム（Ｊohnsonら、１９８６）は、c−erb−
Ａ、ヒトグルココルチコイド受容体（第三段のｈＧＲ配
列；実験の部Ｉ、第３および４図を参照）、およびヒト
エストロゲン受容体（下段のｈＥＲ配列；Ｇreen ら、1
986を参照）のカルボキシ末端アミノ酸配列を、各配列
の所定のセグメントの漸進的評価に基づいて整列させる
べく用いられた。少なくとも３種のポリペプチド間で一
致するアミノ酸残基をボックスで囲った。２種の erb−
Ａポリペプチド間のアミノ酸の一致は、各欄の上段配列
の上に星印で示した。ステロイド受容体間のアミノ酸配
列の同一性は、配列の下に十字形の印で示した。ハイフ
ン、ギャップは比較の際にアミノ酸の同一性の数を最大
とするために挿入した。４種のポリペプチド間に保存さ
れたシステイン残基は黒地に白で印刷した。
【０３００】第１８（Ａ），（Ｂ）および（Ｃ）図 c−erb−Ａ ＤＮＡプローブによるヒト胎盤ＤＮＡのサ
ザン分析および染色体マッピング。Ａ．妊娠期間終決後
のヒト胎盤ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化し、
生成物を0.8％アガロースゲルで分離した。ＤＮＡはニ
トロセルロース紙に移行させ（Ｓouthern，１９７
５）、pheＡ４由来の４５０bp ＳstＩフラグメント（ニ
ック・トランスレーションを行って、比活性５×１０8c
pm／μｇとした）を用いて５０％ホルムアミド、５×Ｓ
ＳＰＥ、１×デンハート溶液、0.1％ＳＤＳ、１００μ
ｇ／mｌサケ精子ＤＮＡ中でハイブリダイズさせた。フ
ィルターを０.１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中で６０℃に
て洗い、その後増感紙を用いて−７０℃でＸ線フィルム
に露光した。ラムダＨindIIIＤＮＡマーカー（Ｋｂでの
サイズ）をオートラジオグラムの左側に並べる。Ｂ．非
ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下での上
記セクションaと同じc−erb−Ａプローブを用いた胎盤
ＤＮＡの分析。同じ試料を含む類似のブロットをセクシ
ョンａのようにハイブリダイズさせた（但し、３５％ホ
ルムアミドを使用）。ハイブリダイズしたフィルターは
２×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ中で５５℃にて洗い、その後
上記の如くＸ線フィルムに露光した。Ｃ．ヒトc−erb−
Ａ遺伝子の染色体マッピング。ヒトリンパ球染色体をレ
ーザー・サイトフルオロメトリー（Ｌebo ら、1984）に
より分離し、セクションｂで説明した非ストリンジェン
トハイブリダイゼーション条件下に、pheＡ４由来の１.
５kb ＥcoＲＩ挿入物をプローブとして使用して検索し
た。
【０３０１】第１９（Ａ）および（Ｂ）図 ヒトc−erb−Ａの発現。Ａ．ヒト細胞株およびヒト胎盤
からのＲＮＡのノザン分析。ＨeＬa、ＭＣＦ−７および
ＩＭ−９細胞からの細胞質ポリ(Ａ)含有ＲＮＡ（１２μ
ｇ）、またはＨＴ１０８０もしくは胎盤からの全ポリ
（Ａ）ＲＮＡはホルムアルデヒドを含有する１％アガロ
ースゲル上で分離し、ニトロセルロースに移行させ(Ｔh
omas，1980）、そしてニック・トランスレーションを行
った６５０bp ＢamＨＩ−ＰstＩpheＡ４フラグメント
を用いて検索した。細胞質ＲＮＡは等張緩衝液および0.
5％ＮＰ４０を用いて細胞株から分離し、一方胎盤ＲＮ
Ａはグアニジンチオシアネートを用いて新鮮な組織から
抽出した(Ｃhirgwinら、1979)。レーン１，ＨeＬa；レ
ーン２、ＨＴ１０８０；レーン３，ヒト胎盤；レーン
４，ＩＭ−９；レーン５，ＭＣＦ−７。Ｂ．in vitroで
のerb−Ａポリペプチドの合成。Ｔ７ポリメラーゼによ
り触媒されたＲＮＡ転写物を用いて合成した35Ｓ−メチ
オニン標識産物は12.5％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル上で分離し、フルオログラフィー（ＥＮ3ＨＡＮＣ
Ｅ，ニューイングランドヌクレアー）にかけた。レーン
１，対照（ｍＲＮＡ不含）；レーン２，peＡ１０２（ア
ンチセンスＲＮＡ，４μｌ）；レーン３，peＡ１０１
（センスＲＮＡ，１μｌ）；レーン４，peＡ１０１(４
μｌＲＮＡ)。蛋白質標準のサイズ：血清アルブミン，6
6.2Ｋ；卵アルブミン，4.5Ｋ；およびカルボニックアン
ヒドラーゼ，３１Ｋ。
【０３０２】第１９（Ａ）および（Ｂ）図の方法 c−erb−Ａの全コード領域を含むphrＡ１２由来のＥco
ＲＩ挿入物は両方の向きでｐＧＥＭ３（Ｐromega Ｂio
tec社）のＥcoＲＩ部位へ挿入した。プラスミドＤＮＡ
のpｅＡ１０１およびpeＡ１０２をＨindIIIで線状とな
し、0.8％アガロースゲル上で精製し、そしてＴ７ポリ
メラーゼにより触媒されるin vitroＲＮＡ合成のための
鋳型として使用した（実験の部Ｉを参照）。Ｐ６０クロ
マトグラフィー後に、全核酸物質(２μｇ)はウサギ網状
赤血球溶解液系（Ｐromega Ｂiotec社）中で35Ｓ−メ
チニオン（２５μＣi，１１００Ｃi／m moｌ）を用いて
最終容量２５μｌにて蛋白質翻訳を行わせるべく使用し
た。
【０３０３】第２０（Ａ）,（Ｂ）,（Ｃ）および（Ｄ）
図 in vitroで合成したerb−Ａポリペプチドへの甲状腺ホ
ルモンの結合。Ａ．invitro で合成したerb−Ａポリペ
プチドの125Ｉ−Ｔ3結合のスカッチャード分析。erb−
Ａポリペプチド（全容量２mｌ中のin vitro翻訳混合物
からの２μｌ）は異なる125Ｉ−Ｔ3濃度での結合した標
識ホルモン量および遊離の標識ホルモン量を測定するた
めにヒドロキシルアパタイトを用いて特異的甲状腺ホル
モン結合活性について検定した（Ｇruol，1980）。Ｂ．
in vitroで合成した erb−Ａポリペプチドへの125Ｉ−
Ｔ3結合に対する甲状腺ホルモン類似体の競合。peＡ１
０１（センス鎖）−プログラム化反応からの試料（２μ
ｌ）は、次第に増加する濃度の未標識甲状腺ホルモンま
たは類似体（標識ホルモンと競合する）と共に125Ｉ−
Ｔ3標識結合反応（Ｓamuelsら、1974）において使用し
た。特異的に結合した甲状腺ホルモンを競合化合物の濃
度に対してプロットする。Ｃ．in vitroで合成したerb
−Ａポリペプチドへの125Ｉ−Ｔ3結合に対するトリヨー
ドチロニン異性体の競合。結合反応は次第に増加する濃
度のＴ3異性体を加えて上記の通りに行った。erb−Ａに
結合した甲状腺ホルモンは縦座標上にプロットする。
Ｄ．０.４ＭＫＣｌ ＨeＬa 細胞核抽出物への125Ｉ−
Ｔ3結合に対する甲状腺ホルモン類似体の競合。ＨeＬa
細胞核は0.4 Ｍ ＫＣｌを含む緩衝液で抽出した（Ｓam
uelsら、1974）。蛋白質抽出物（２５μｌ）（バイオー
ラッド蛋白質検定法により測定）は次第に増加する濃度
の甲状腺ホルモンおよび類似体を含む標準結合反応混合
物中で0.6nＭ125Ｉ−Ｔ3と混合した（Ｓamuelsら、197
4；Ｌathamら、1976）。
【０３０４】第２０(Ａ),(Ｂ),(Ｃ)および(Ｄ)図の方法 標識125Ｉ−３,３’,５−トリヨード−Ｌ−チロニン
（Ｎew Ｅngland Ｎuclear社製，２２００Ｃi／m moｌ
0.3ｎＭ最終）はＴ3−結合緩衝液（0.25Ｍシュークロ
ース，0.25Ｍ ＫＣｌ，２０mＭトリス−ＨＣｌ（pＨ7.
5）,１mＭ ＭｇＣｌ2，２mＭ ＥＤＴＡ，５mＭジチオ
トレイト−ル（ＤＴＴ））（Ｓamuelsら、1974）中でin
vitro 翻訳混合物（第１９（Ａ)にて説明）中で合成し
たerb−Ａポリペプチドと最終容量２５０μｌにて０℃
で２時間混合した。特異的ホルモン結合は 1000倍過剰
の未標識ホルモンを加えることにより測定し、セファデ
ックスＧ−２５微粒子（Ｐharmacia社）0.9×4.0cmカラ
ムから排除容量中に溶出される放射能を計数することに
より検定した（Samuelsら、1974）。
【０３０５】第２１図 ステロイドホルモン受容体と甲状腺ホルモン受容体との
模式図による比較。第１７図に示した受容体分子のアミ
ノ酸配列を模式図で表す。ＣＹＳ，受容体蛋白質に見ら
れる推定上のＤＮＡ結合ドメインをコードするシステイ
ンに富む領域（Ｃysに富む領域の残基は：c−erb−Ａ,
１０２−１６９;ｈＧＲ，４２１−４８６；ｈＥＲ,１８
５−２５０）；Ｃortisol，ＥstradiolおよびＴ3／
Ｔ4，カルボキシル末端のホルモン結合領域；ＩＭＭ，
ヒトグルココルチコイド受容体の免疫原領域。ボックス
を分離する数字，垂直破線間の受容体種同士のアミノ酸
同一性のパーセンテージ；ｈＥＲ，ヒトエストロゲン受
容体；ｈＧＲ，ヒトグルココルチコイド受容体；hc−er
b−Ａベータ，ヒト甲状腺ホルモン受容体。
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【０３５４】実験の部IV ヒトミネラロコルチコイド受容体相補ＤＮＡのクローニ
ング：グルココルチコイド受容体との構造的および機能
的類似性IV．Ａ．概要 推定上の１０７キロダルトンのポリペプチドをコードす
る新しい遺伝子を単離するために、ヒトグルココルチコ
イド受容体（ｈＧＲ）相補ＤＮＡとの低いストリンジェ
ントハイブリダイゼーションを使用した。発現試験によ
り、高親和性でもってアルドステロンと結合し、そして
アルドステロンに応答して遺伝子転写を活性化するその
能力が証明され、それによりヒトミネラロコルチコイド
受容体（hＭＲ）としてのその本性が確立される。この
分子はまたグルココルチコイドに対して高い親和性を示
し、グルココルチコイド応答性プロモーターを刺激す
る。ｈＭＲおよびｈＧＲは一緒になって、ホルモン結合
特性、標的遺伝子相互作用および組織特異的発現パター
ンが組合わされた様式で使用され、複雑な生理学的コン
トロールを達成する予期せぬ機能的多様性をもたらす。
【０３５５】IV．Ｂ．序論 視床下部−下垂体−副腎軸はいろいろな神経内分泌の入
力信号を結合して、副腎コルチコステロイドの合成およ
び分泌を調節している。これらのステロイドホルモンは
数組の標的遺伝子の転写を直接的に調節する細胞内受容
体蛋白質との相互作用によって成長、発生およびホメオ
スタシスに影響を及ぼす（１，２）。２つの受容体系が
コルチコステロイドのために定められ、これらはグルコ
コルチコイド受容体（ＧＲ）およびミネラロコルチコイ
ド受容体（ＭＲ）と名づけられた。初期の機能検定によ
り、コルチコステロイドは肝臓へのグルコーゲン貯蔵を
促進するそれらの作用によりグルココルチコイド、また
は腎臓によるナトリウム貯留を促進するそれらの作用に
よりミネラロコルチコイドのいずれかに類別された。し
かしながら、それぞれのステロイドクラスはその同族受
容体とのみ相互作用するように制限されておらず、とり
わけグルココルチコイドは実質上のミネラロコルチコイ
ド活性を示すことができる（１−３）。
【０３５６】今や、ＭＲはグルココルチコイドとミネラ
ロコルチコイドの両方に対して有意なin vitro親和性を
有することが明らかである（３，４）。グルココルチコ
イドの循環濃度はアルドステロン（代表的なミネラロコ
ルチコイド）よりも数段高いので、ＭＲのグルココルチ
コイド活性化は機能的に意義がある。腎および腸のよう
な組織の分泌上波はアルドステロンに応答して電解質と
水のバランスを調節しているが、別の機構はこれらの組
織にミネラロコルチコイドに対する感受性を付与するこ
とが可能である（５）。他の組織において発現されるＭ
Ｒの機能的役割は全く明らかになっていないが、脳での
生理学的応答はＭＲとグルココルチコイドの相互作用の
結果として起こる（５−７）。高親和性の放射性標識リ
ガンドの利用可能性にもかかわらず、ＭＲは精製が困難
であり、その生化学的性質はＧＲに比べて十分に理解さ
れていない。ＭＲの研究に分子生物学の技術を応用する
ことにより、ＭＲの生化学的同定が容易となり、終局的
にその転写制御下にある遺伝子およびそれらの産物がホ
メオスタシスにおいて演ずる役割が理解されるであろ
う。
【０３５７】グルココルチコイド（実験の部Ｉおよび文
献８，９を参照）、エストロゲン（１０）、およびプロ
ゲステロン（１１）受容体の分子クローニングはそれら
の一次アミノ酸構造の決定およびこのファミリーの調節
蛋白質に共通の機能的ドメインの推定を可能にした。グ
ルココルチコイド（実験の部IIおよび文献１２を参照）
およびエストロゲン（１３）受容体の実験的解析はシス
テイン、リシンおよびアルギニンに富む中央に位置する
ＤＮＡ結合ドメイン、およびステロイドホルモンが作用
するカルボキシル末端領域を明らかにした。ＧＲの機能
的研究は、カルボキシル末端へのホルモン結合が、受容
体とＤＮＡとの相互作用および転写の活性化を可能にす
べくＤＮＡ結合領域をアンマスキング（unmasking）す
ると示唆した(１４，１５)。ステロイド受容体および甲
状腺ホルモン受容体のシステインに富むＤＮＡ結合領域
の比較は、これらの分子間に高度の関連性を示す(１
６)。不変のシステイン残基は、Ｚn2+ 金属原子の配置
がキセノプス（Ｘenopus）５Ｓ遺伝子第IIIＡ転写因子
について提案されたものに類似したＤＮＡ結合の構造的
形状を維持するという仮説へ導いた（１７）。また、ス
テロイド受容体ファミリーのステロイド結合領域も、共
通の原子的前駆物質からの種々の受容体クラスの進化と
矛盾しない実質的保存（conservation）を示す（１１，
１６）。
【０３５８】我々はヒトグルココルチコイド受容体（ｈ
ＧＲ）に密接に関連した遺伝子産物を単離するために、
ステロイドホルモン受容体間の構造的類似性を利用し
た。ｈＧＲプローブとの非ストリンジェントハイブリダ
イゼーションにより、ｈＧＲのシステインに富む配列と
高度に関連したヒトゲノムＤＮＡフラグメントを分離し
た。このＤＮＡをプローブとして使用して、我々はシス
テインに富む領域からカルボキシル末端までのｈＧＲと
強い相同性を有する分子をコードする相補ＤＮＡ（cＤ
ＮＡ）を得た。細胞内で発現させたとき、この分子は高
い親和性でもってアルドステロンと結合し、しかもマウ
ス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）のロング・ターミナル・
リピート（ＬＴＲ）のアルドステロン応答性転写を活性
化する。このヒトミネラロコルチコイド受容体のリガン
ドおよびＤＮＡ配列特異性とｈＧＲのそれらとのオーバ
ーラップは、これらの調節分子に対して伝統的に割り当
てられている別々の役割が再考されるべきであることを
示唆している。
【０３５９】IV．Ｃ．hＭＲｃＤＮＡの分離 グルココルチコイド受容体関連遺伝子を同定するため
に、ヒト胎盤ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化
し、アガロースゲル電気泳動で分画化し、そしてその分
画をｈＧＲ1.2(ＤＮＡ結合ドメインをコードする配列を
含むｈＧＲｃＤＮＡの１１００bp フラグメント）とハ
イブリダイズさせた(実験の部Ｉおよび文献１５を参
照）。サザンブロット分析は低ストリンジェントハイブ
リダイゼーション条件に特有の数本のバンドを示した
（第２３（Ａ）および（Ｂ）図を比較されたい）。2.5
キロ塩基対（Ｋbp）のＨindIIIフラグメント（第２３
（Ｂ）図中に星印で示したもの）は他のハイブリッド形
成バンドからよく分割され、直接的ゲノムクローニング
に適していると判定された。ヒト胎盤からのＨindIII消
化ＤＮＡはアガロースゲル上で大きさに基づいて分画化
し、そしてゲノムライブラリーの構築のために2.5Ｋbp
領域を分離した。その後、このラムダgt１０ライブラリ
ーはプローブとしてｈＧＲ1.2を用いて低ストリンジェ
ントハイブリダイゼーション条件下でスクリーニングし
た。１つの陽性ゲノムクローン（ランダムＨＧＨ）から
の挿入物はニックトランスレーションを行って、高スト
リンジェントハイブリダイゼーション条件下でのサザン
ブロットにおいてプローブとして使用した（第２３
（Ｃ）図）。2.5Ｋbp ＨindIIIシグナルは非ストリン
ジェント条件下で見られたものに相当し、所望のゲノム
フラグメントの一部が分離されたことを示している。ラ
ムダＨＧＨ由来の挿入物の塩基配列解析は、イントロン
配列によってはさまれた１４０塩基対（bp）のエクソン
を明らかにした(（第２３(Ｄ)図）。この全エクソンは
相同性のｈＧＲｃＤＮＡ配列と６８％のヌクレオチド同
一性を有するが、１０４個のヌクレオチドのうち８５個
を保存する領域がその交差ハイブリダイゼーション特性
を与えるものと思われる。この高度に保存された領域は
ｈＧＲのＤＮＡ結合ドメインの一部に対応する（１
５）。ラムダＨＧＨエクソンは１６個の非交換残基から
始まってその後にステロイドホルモン受容体に特徴的な
高度に保存されたシステイン残基の最初の残基が続く４
６個のアミノ酸をコードしている（８−１１）。次の３
０個の残基のうち、２８個がｈＧＲと同一である。これ
らの分析は、ｈＧＲｃＤＮＡ配列中に存在するものと関
連があるが、それとは明らかに異なる配列を含むゲノム
フラグメントが分析されたことを示す（実験の部Ｉを参
照）。
【０３６０】ラムダＨＧＨからの挿入物は、このｈＧＲ
関連遺伝子に対応するクローンについて、cＤＮＡライ
ブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使
用した。ミネラロコルチコイド受容体はこの種の遺伝子
によってコードされる候補物質であると考えられた。腎
臓はミネラロコルチコイド応答性組織であることが知ら
れているので、数人のヒト腎臓cＤＮＡライブラリーを
スクリーニングした。１１個の陽性クローンが１０6組
換えファージ当たり３〜４の頻度でこれらのラムダgt１
０ライブラリーから分離された。２つの重複するクロー
ン、ラムダ hＫ２およびラムダ hＫ１０、をヌクレオチ
ド配列分析にかけ、合わせて５８２３ヌクレオチドに及
ぶことが見出された（第２４，２５および２６図）。ラ
ムダＨＧＨのエクソン−イントロン境界はこれらのcＤ
ＮＡクローンの塩基配列を決定することにより証明し
た。ラムダhＫ１０（ヌクレオチド１から ３７５０ま
で）は大きいオープン・リーディング・フレームを含
み、完全な一次アミノ酸配列を予告している。ラムダh
Ｋ２からのＤＮＡ挿入物はヌクレオチド８０２から５８
２３にまで伸長しているが、２２３５から２５８６まで
の３５１bp内部欠失を有している。３個の別のクローン
も試験し、欠失領域がラムダ hＫ１０と同じ構造である
ことを確かめた。ラムダhＫ２における欠失はクローニ
ングアーチファクト（人工産物）を表すか、あるいはま
れなメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のスプライシン
グエラー(切り継ぎの誤り）を表すと思われる（１
８）。ヌクレオチド３７５０の下流側の報告された３’
非翻訳領域の配列はラムダ hＫ２から誘導される。これ
らの２つのcＤＮＡの複合配列をhＭＲと名づける（第２
４図）。読み枠内終止コドン(１３６位）の下流側に最
初の読み枠内ＡＴＧ（２２３位）があり、hＭＲは少な
くとも２１６ヌクレオチドの５’非翻訳領域を有してい
る。この最初のＡＴＧをとりまく配列はＫozak（１９）
によって示されたコンセンサス配列と一致する。この推
定されたイニシエーターメチオニンコドンは、９８４個
のアミノ酸をコードする大きいオープン・リーディング
・フレームの最初の部分をなす。終止コドン（３１７５
位）に続いて７０ヌクレオチド−ポリ(Ａ)（ポリアデニ
ル化）尾部の１７ヌクレオチド上流にポリアデニル化シ
グナル（ＡＡＴＡＡＡ）を有する2.6Ｋbの３’非翻訳領
域が存在する。長い３’非翻訳領域はステロイドホルモ
ン受容体のｍＲＮＡに特徴的な性質である（実際の部Ｉ
および文献９−１１を参照）。
【０３６１】IV．Ｄ．ＤＮＡ−およびホルモン−結合領
域 ｈＭＲｃＤＮＡによりコードされる蛋白質は、ｈＧＲと
密接に関連したステロイドホルモン受容体の構造的特性
を有する。ｈＭＲの推定上のアミノ酸配列とｈＧＲのそ
れとの比較により、ｈＧＲののＤＮＡ結合ドメインおよ
びステロイド結合ドメインの両方と高度に相同であるこ
とが立証された。ｈＭＲ遺伝子は７７７残基のｈＧＲよ
りもはるかに大きく、９８４個のアミノ酸からなる蛋白
質（推定分子量１０７ＫＤ）をコードする。この大きさ
の不一致は主としてｈＧＲと相同でない大きいアミノ末
端のためである。この領域のサイズおよび配列の相当な
不均一性はグルココルチコイド、エストロゲンおよびプ
ロゲステロンのそれぞれの受容体間に存在する（実験の
部Ｉ；文献９−１１を参照）。アミノ酸相同は６８残基
中９４％のアミノ酸が同一である中央のＤＮＡ領域から
始まる(第２７図)。他のステロイドホルモン受容体に見
られる配列保存の比較的低い領域が、ＤＮＡ結合ドメイ
ンとカルボキシル末端ステロイド結合ドメインとを隔て
ている。この領域は２つのドメイン間の分子ヒンジ（mo
lecular hinge）として役立つことが推測された（実験
の部IIおよび文献１３を参照）。ｈＧＲとの比較は、ｈ
ＭＲのこの領域が反復ヌクレオチド配列によってコード
される４個のグルタミンそれに続く８個のプロリンの配
列を含む２４個の追加のアミノ酸を含むことを示す。起
源および機能に関してこの例外的配列の意義は明らかで
ないが、構造を切断するプロリンはヒンジ領域と一致す
る。hＭＲとｈＧＲのカルボキシル末端の２５０個のア
ミノ酸を比較すると、５７％のアミノ酸同一性および多
数の保存的アミノ酸置換が見られる。これらの置換のい
くつかはステロイドホルモンとの相互作用に必要な疎水
領域を維持している。
【０３６２】IV．Ｅ．発現およびホルモン結合 我々はグルココルチコイド受容体機能を調べるために、
サル腎臓細胞株ＣＶ１およびその誘導的（すなわち、Ｓ
Ｖ４０Ｔ抗原−形質転換）細胞株ＣＯＳ−１（ＣＯＳと
呼ばれる）のトランスフェクションを使用した（実験の
部IIを参照）。トランスフェクションされたｈＭＲから
の高レベルのポリペプチド発現は、トランスフェクショ
ンした細胞によるステロイド結合実験を容易にするため
に不可決であった。ＳＶ４０複製起点を含むプラスミド
はＣＯＳ細胞内で高コピー数に複製することができるの
で、ｈＧＲの研究において以前に使用したｐＲＳｈＧＲ
アルファと類似したｈＭＲコード配列用の発現ベクター
を構築した。プラスミドpＲＳｈＭＲはラウス肉腫ウイ
ルス由来のプロモーターの支配下にあるｈＭＲコード配
列、およびＳＶ４０複製起点を含む（第２８（Ａ）
図）。
【０３６３】ｈＭＲ蛋白質のリガンド特異性はｐＲＳｈ
ＭＲでトランスフェクションしたＣＯＳ細胞からの細胞
質ゾル抽出物を調製することにより調べた。トランスフ
ェクションの２日後に細胞を回収して、デキストラン処
理チャーコール検定によりホルモン結合を測定した。疑
似トランスフェクションした対照の抽出物は〔3Ｈ〕ア
ルドステロンに対して特異的結合活性を全く示さなかっ
たが、pＲＳｈＭＲでトランスフェクションした細胞か
らの抽出物は高親和性でもって有意量の〔3Ｈ〕アルド
ステロンと結合した。スカッチャード分析により、〔3
Ｈ〕アルドステロン結合に関する解離定数（ＫD）は1.3
ｎＭと測定された（第２８（Ｂ）図）。この値はミネラ
ロコルチコイド受容体へのアルドステロン結合について
報告されたものとよく一致している（２，２０）。その
後、１−,１０−または１００−倍過剰モル量で存在さ
せたときに、結合を５nＭ〔3Ｈ〕アルドステロンと競合
する異なる未標識ステロイドの能力を調べるために、競
合試験を行った（第２８（Ｃ）および（Ｄ）図）。これ
はｈＭＲに対するこれらのステロイドのそれぞれの相対
親和性の度合を提供した。これらの実験の結果は、アル
ドステロン、コルチコステロン、デオキシコルチコステ
ロン、ヒドロコルチゾン（コルチゾル）の全てがｈＭＲ
に対して非常に類似した親和性をもつことを示した。デ
キサメタゾン、プロゲステロン、およびスピロノラクト
ンは比較的弱い結合親和性を示し、一方エストラジオー
ルはhＭＲの結合に対して極めて弱く競合した。結局、
この親和性の差異はhＭＲがヒトミネラロコルチコイド
受容体をコードすることを表している（２,２０）。
【０３６４】IV．Ｆ．転写活性化 ステロイドホルモン作用は標的遺伝子転写のホルモン依
存性調節により特徴づけられる。ＣＶＩ細胞内にトラン
スフェクションされたｈＧＲによる転写調節検定（実験
の部IIを参照）がｈＭＲ用に改変された（第２９
（Ａ）,（Ｂ）および（Ｃ）図）。ステロイド結合検定
に用いた発現プラスミドｐＲＳｈＭＲは、クロラムフェ
ニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の細菌
遺伝子に連結されたＭＭＴＶ−ＬＴＲを含むＧＭＣＡＴ
と呼ばれるリポータープラスミドと共に同時トランスフ
ェクションされた。こうして、ＣＡＴ活性はＭＭＴＶプ
ロモーターの転写活性に関する酵素検定を与える。ＭＭ
ＴＶプロモーターはＧＲとの相互作用を介してグルココ
ルチコイド応答性を与える数種のグルココルチコイド応
答因子（ＧＲＥ）、エンハンサー様ＤＮＡ配列を含む
（２１）。ｈＭＲは、そのＤＮＡ結合ドメインが ｈＧ
Ｒのそれとほぼ同一であるために、ＭＭＴＶ−ＬＴＲを
認識できるかも知れないと考えた。ＣＶＩ細胞をpＲＳh
ＭＲおよびＧＭＣＡＴで同時トランスフェクションした
とき、我々は十分なＣＡＴ活性を観察した。この活性は
添加したアルドステロンの影響を受けず、このことはト
ランスフェクションされたｈＧＲと対照的にｈＭＲを十
分に活性化するに足るホルモンが血清（ウシ胎児血清，
５％）中に存在していたことを示唆する（第２９（Ｂ）
図）。チャーコール処理血清（２２）の存在下では、Ｃ
ＡＴ活性は外因性アルドステロンの添加に応答するよう
になり、このことはhＭＲ ｃＤＮＡが機構的ステロイド
ホルモン受容体をコードすることを示している。hＭＲ
はまたグルココルチコイド・アゴニストのデキサメタゾ
ンによって活性化されたが、ｈＧＲは生理学的濃度以上
（１０ｎＭ）のアルドステロンにさえも応答しなかっ
た。
【０３６５】IV．Ｇ．組織特異的発現 我々はノザン・ブロット・ハイブリダイゼーションによ
りラット組織内でのhＭＲｃＤＮＡに相応するＭＲｍＲ
ＮＡの発現を調べた。脳、下垂体および心臓ばかりでな
く、腎臓(２４)や腸(２５)のような古典的ミネラロコル
チコイド標的組織はｈＭＲに相応するｍＲＮＡを含んで
いた（第３０図）。腎臓におけるアルドステロン感受性
細胞は主として遠位の皮質性集合管に局限されており
(２)、それ故にこの組織によるわずかな発現レベルは意
外なことではなかった。高レベルのＭＲ(Ｉ型コルチコ
ステロイド結合部位)はラットの脳、特に海馬体（hippo
campal formation)において報告された(４,６)。切開し
た海馬ＲＮＡと全脳から調製したＲＮＡとを比較した際
に、我々は海馬中に著しく豊富なｍＲＮＡを見出した。
アルドステロン結合は下垂体(２６)、培養大動脈細胞
(２７)および脾臓(２８)において報告されているが、こ
の種の活性は筋肉では報告されていない。肝臓はＧＲを
発現するが、検出しうる高親和性のアルドステロン結合
活性を示さず(２９)、予期されるように肝臓ＲＮＡとの
ハイブリッド形成は観察されなかった。ｈＧＲｃＤＮＡ
の類似部分を用いる同じノザン・ブロットの再検索は異
なる大きさのｍＲＮＡ種とのハイブリッド形成を示し、
ＭＲとＧＲとが異なる組織特異的発現パターンを示すこ
とが分かった。
【０３６６】IV．Ｈ．染色体マッピング ミネラロコルチコイド受容体遺伝子の染色体位置を決定
するために、我々はヒト染色体の異なる組合わせを保有
するネズミ−ヒト体細胞ハイブリッドのパネルに対して
ｈＭＲを調べた（３０）。ミネラロコルチコイド受容体
遺伝子に特異的なＤＮＡフラグメントは、１５種のハイ
ブリッド細胞株においてヒト染色体４と一致して分離さ
れた。染色体５（グルココルチコイド受容体遺伝子部
位）を含む他のすべてのヒト染色体については、不一致
の分離（segregation）が観察された（実験の部Ｉよび
文献３１を参照）。染色体４への割当てを確認するため
に、我々はサザン分析を用いてｈＭＲ遺伝子について限
定組の微小核ハイブリッド（それぞれは１〜３本のヒト
染色体を保有する（３２))を試験した(第３１図)。ラム
ダhＫ２のコード部分により検出された６本のＥcoＲＩ
フラグメントは、このハイブリッドパネルにおいて染色
体４と同時分離される。とりわけ、hＭＲ遺伝子は唯一
のヒト染色体として染色体４を保有する細胞株ＨＤm−
１１３２Ｂ中に存在する。
【０３６７】IV．Ｉ．副腎コルチコステロイドの生理機
能との密接な関係 ヒトミネラロコルチコイド受容体cＤＮＡはヒトグルコ
コルチコイド受容体に高度に相同であるポリペプチドを
コードする。ＤＮＡ結合ドメインにおいて、hＭＲはｈ
ＧＲと約９４％のアミノ酸同一性を維持するが、カルボ
キシル末端に局在化されるステロイド結合ドメインは５
７％の同一性を有する。最近報告されたウサギプロゲス
テロン受容体（ rＰＲ）配列もまたｈＭＲとの高度な関
連性をもっている。ｈＧＲおよび rＰＲ構造ドメインと
ｈＭＲのそれとのアミノ酸同一性の比較（第３２図）
は、これらの機能的に異なる調節蛋白質の驚くべき類似
性を示す。hＭＲとrＰＲとの相同性はｈＧＲ−ｈＭＲ比
較にほとんど一致し、ＤＮＡ結合ドメインでは９０％の
アミノ酸を共有し、そしてステロイド結合ドメインでは
５６％を共有していた。対照的に、hＭＲとヒトエスト
ロゲン受容体（10）との同一領域の比較は、ＤＮＡ結合
ドメインにおいて５６％の同一性およびステロイド結合
ドメインカルボキシル末端において２１％の配列同一性
を示す。hＭＲ，ｈＧＲおよびrＰＲによって共有される
構造的相同度およびそれらのリガンドの構造的関連性
は、それらがステロイドホルモン受容体のサブファミリ
ーから成ることを示唆している。
【０３６８】一時的トランスフェクションによるＣＯＳ
細胞内でのｈＭＲポリペプチドの発現は、そのステロイ
ド結合能の評価を可能にした。これらの分析結果は、h
ＭＲcＤＮＡがヒトミネラロコルチコイド受容体をコー
ドしていることを明らかにした。スカッチャード分析
は、pＲＳｈＭＲでトランスフェクションした細胞から
の抽出物が1.3 nＭのＫD値でもって〔3Ｈ〕アルドステ
ロンと結合することを示した。ＭＲと結合するアルドス
テロンの報告されたＫD値は0.5〜３nＭの範囲である
（２）。これはこの遺伝子産物をヒトミネラロコルチコ
イド受容体として定める際のただ１つの最も重要な基準
である。ステロイド結合競合実験は、ｈＭＲのこの同定
をさらに支持した。ミネラロコルチコイドのデオキシコ
ルチコステロンおよびグルココルチコイドのコルチコス
テロンおよびコルチゾルはアルドステロンそれ自体と同
様に競合するが、一方合成グルココルチコイドのデキサ
メタゾンおよびプロゲステロンはｈＭＲに対して比較的
低い親和性を有する。hＭＲ，ｈＧＲおよびrＰＲの推定
上のステロイド結合ドメインにおける十分なアミノ酸配
列同一性は、これらの受容体の類似リガンド結合特性と
よく合っている。ミネラロコルチコイド受容体、グルコ
コルチコイド受容体およびプロゲステロン受容体はミネ
ラロコルチコイド、グルココルチコイドおよびプロゲス
テロンの類似した２１−炭素原子構造間を識別するのに
限られた能力を示す。この特異性の欠如は特にＭＲとＧ
Ｒに当てはまる。例えば、ＭＲはアルドステロンと等し
い親和性でもってグルココルチコイドと結合する。実際
に、別の機構がアルドステロンへの選択的応答を与える
腎臓のような組織においてのみ、ＭＲは古典的ミネラロ
コルチコイド受容体として機能するのかも知れない
（３,５）。ＭＲはまたプロゲステロンと高い親和性
で、しかしコルチコステロイドに対するその親和性より
も低い親和性でもって結合する。プロゲステロンはミネ
ラロコルチコイド作用の部分アゴニストまたはアンタゴ
ニストとして作用するいくつかの徴候があり（３３）、
またグルココルチコイドはミネラロコルチコイド受容体
への結合において十分なアゴニストとして作用するかど
うか明らかでない。同様に、ＧＲは２０〜４０nＭのＫd
値でグルココルチコイドと結合し、それは２５〜６５ n
ＭのＫｄ値でアルドステロンと結合する（２）。従っ
て、ＭＲとＧＲのホルモン結合特性間の重要な差異はリ
ガンド特異性のそれではなく、むしろコルチコステロイ
ドに対する高親和性対低親和性受容体の差異である。
【０３６９】ｈＭＲのin vivo機能は血清コルチゾル結
合蛋白質のトランスコルチンによって複雑になってい
る。この蛋白質はコルチゾルを結合封鎖し、その特異な
分布のために、トランスコルチンは局部のグルココルチ
コイド濃度に影響を及ぼすであろう。腎臓における高レ
ベルのトランスコルチンは血漿からの利用可能なコルチ
ゾルを減少させて、アルドステロン感受性を与え、一方
脳における低レベルのトランスコルチンは、中枢神経系
において、グルココルチコイドが主なｈＭＲリガンドで
ありうることを示唆するであろう。従って、ｈＭＲのた
めの好適な生理学的リガンドは受容体発現の部位に応じ
て明らかに変化する（３）。このモデルおよび他のモデ
ル（５）は、より一層高いレベルの競合性グルココルチ
コイドにもかかわらず、アルドステロンへの若干の組織
の応答性を説明するために提案されたものである。
【０３７０】ｈＭＲとｈＧＲのＤＮＡ結合ドメイン間の
相同度（この保存された６８残基領域中で４個のアミノ
酸残基のみが相違する）は、これらの受容体が類似の調
節因子を認識しうることを示唆する。アルドステロンお
よびデキサメタゾンの両方に応答してトランスフェクシ
ョンされたｈＭＲがＭＭＴＶ−ＬＴＲを活性化すること
はこの結論を支持するが、プロゲステロン受容体もまた
このプロモーターを調節することが立証されている（２
１）。さらに、ＤＮＡ結合ドメインにおけるｈＭＲとｈ
ＧＲの差異、またはこれらの分子の高度に異なるアミノ
末端のような他の領域における差異が、この検定では立
証できないやり方で標的遺伝子特異性に影響を及ぼすの
かも知れない。しかしながら、我々はhＭＲおよびｈＧ
ＲによるＭＭＴＶ−ＬＴＲの転写調節を利用して、ミネ
ラロコルチコイドおよびグルココルチコイドによるそれ
らの活性化を調べた。hＭＲ応答は１０nＭアルドステロ
ンまたはデキサメタゾンの場合にほぼ等しかった。一方
ｈＧＲはこの検定においてデキサメタゾンによって活性
化されたが、アルドステロンには不感受性であった。外
因性コルチゾルに応答するｈＭＲによる転写活性化も観
察された。これらのデータは、トランスフェクションし
た細胞において、ミネラロコルチコイドとグルココルチ
コイドの両方がｈＭＲ媒介遺伝子転写を活性化しうるこ
とを示している。この機能的特性に基づいて、我々はｈ
ＭＲが副腎コルチコステロイドに対して高度に応答し、
それ故にグルココルチコイド受容体として機能しうると
結論を下した。
【０３７１】コルチコステロイドに協調応答するミネラ
ロコルチコイド受容体の薬理学的および生理学的機能を
明らかにするほかに、hＭＲｃＤＮＡの分離は多数の病
気、なかでも高血圧および偽低アルドステロン症（pseu
do hypo aldosteronism；ＰＨＡ）におけるｈＭＲの役
割の証明をうながす。ミネラロコルチコイドと高血圧の
関連性は数十年の間認められており、hＭＲ媒介ナトリ
ウム貯留および血液量の増加がいくつかの形態の高血圧
症に部分的に関与しているのかも知れない（３４）。Ｐ
ＨＡは正常レベルまたは高レベルのアルドステロンへの
応答性の欠如によって特徴づけられる常染色体劣性疾患
である。最近の研究により、この疾患をもつ患者では高
親和性アルドステロン結合部位が減少しているか又は完
全に消失していることが証明され（３５）、このことは
ミネラロコルチコイド受容体遺伝子の欠陥により生ずる
と思われる。hＭＲ遺伝子の染色体マッピングはＰＨＡ
の遺伝子座が染色体４に存在することを示唆する。
【０３７２】機能的ｈＭＲのクローニングおよび発現は
予期しない考察をもたらし、生理学的複雑性の下に横た
わる機構への新たな興味を刺激し、そして遺伝子ネット
ワークの協調調節のための新しいモデルの開発および試
験を可能にするであろう。
【０３７３】IV．Ｊ．実験の部IVに関連した図面の詳細
な説明 第２３（Ａ）,（Ｂ）,（Ｃ）および（Ｄ）図 ｈＧＲ遺伝子に関連したゲノム配列の分離。（Ａ）表示
した制限エンドヌクレアーゼで消化したヒト胎盤ＤＮＡ
の高ストリンジェントハイブリダイゼーション。ｈＧＲ
ｃＤＮＡ（ｈＧＲ1.2）をプローブとして使用した。Ｈi
ndIII消化により作ったラムダＤＮＡフラグメントマー
カーの大きさ（キロ塩基対で表す）をオートラジオグラ
ムの隣に示す。（Ｂ）低ストリンジェントサザン分析。
ＨindIIIレーンに星印ではさまれた2.5kbpバンドは直接
ゲノムクローニングの的にされた配列であった。（Ｃ）
ラムダＨＧＨと命名されたクローン中のこのゲノム配列
の分離は、類似のサザンブロットでプローブとして使用
することにより証明される。ラムダＨＧＨゲノムフラグ
メントは、このクローニングから分離されたハイブリッ
ド形成性内部ＥcoＲＩフラグメントを含む。（Ｄ）ラム
ダＨＧＨゲノムフラグメントのイントロン−エクソン構
造およびｈＧＲとのその相同性。ラムダＨＧＨに存在す
るｈＧＲ関連エクソンは、その推定アミノ酸配列と共に
黒地に白で示される。保存されたシステイン残基は白い
点で示される。アンダーラインを施した共通のスプライ
ス供与部位および受容部位を有するイントロン配列部位
がエクソンの両側に存在することが分かる。ｈＧＲとの
ヌクレオチド相同性を下側に示す。ｈＧＲのヌクレオチ
ド番号は実験の部Ｉで論じた第３および４図からのもの
であり、また実験の部Ｉとしてここで使用した研究を発
表したＨollenbergら（1985）（文献８）を参照された
い。サザン分析のために、我々は妊娠期間終結後のヒト
胎盤由来のＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化し、
消化産物を 0.8％アガロースゲル上で分離した。ＤＮＡ
をニトロセルロース紙へ移行させ、ストリンジェントま
たは非ストリンジェント条件下でハイブリダイズさせ
た。ストリンジェントハイブリダイゼーションは５０％
ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ（ＮaＣｌ，ＮaＨ2ＰＯ4，
ＥＤＴＡ，pＨ7.4）、１×デンハート溶液、0.1％ＳＤ
Ｓ，100μｇ／mｌのサケ精子ＤＮＡおよびプローブ(１
０6cpm／mｌ）を用いて４２℃で行った。非ストリンジ
ェントハイブリダイゼーションの場合は、５０％ホルム
アミドの代わりに３５％ホルムアミドを用いた。洗浄条
件はストリンジェント条件の場合が６０℃で0.1％ＳＤ
Ｓを含む0.1×ＳＳＣ(標準ＮaＣｌ−クエン酸塩)、そし
て非ストリジェントフィルターの場合が５５℃で ０.１
％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣから成っていた。プローブと
してラムダＨＧＨ由来の３３８bp挿入物を用いたときの
洗浄条件は、６８℃で 0.1％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣに
変更した。ラムダＨＧＨの分離のために、ヒト胎盤ＤＮ
Ａ(300μｇ）はＨindIIIで消化し、１％低融点アガロー
スゲル（Ｓeaplaque,ＦＭＣ）上で大きさにより分画化
した。ゲルを 0.5cmの細片に切り取り、フェノール抽出
およびエタノール沈澱によりＤＮＡを精製した。（Ｂ）
において星印ではさまれたバンドに大きさの点で対応す
る分画からのＤＮＡ（２μｇ）は、ＥcoＲＩリンカーを
付加するためにクレノウＤＮＡポリメラーゼで修復し
た。ＥcoＲＩでの消化およびセファロース４Ｂカラムに
よる過剰リンカーの除去後に、このＤＮＡをＥcoＲＩ消
化ラムダｇｔ１０ＤＮＡに連結し、in vitroでパッケー
ジした（カリフォルニア州サンジェゴ，ベクター・クロ
ーニング・システムズ社からのラムダアームおよび抽出
物）。約４×１０5個の独立した組換え体を非ストリン
ジェントサザン分析のために使用した条件と同じ条件下
でスクリーニングしてラムダＨＧＨを得た。
【０３７４】第２４−２６図 ヒトミネラロコルチコイド受容体のヌクレオチド配列お
よび一次アミノ酸構造。（２４）いくつかの制限エンド
ヌクレアーゼ切断部位の線図と整列したｈＭＲの複合構
造（ＥcoＲＩ部位はヌクレオチド１および５８２３に示
され、リンカーから誘導される）。この複合体は２つの
重複するラムダgt１０クローンのラムダhk１０およびラ
ムダhk２から組み立てられた。ラムダhk２の線図におけ
るかっこは３５１bpの欠失を示す。斜線ボックスはイニ
シエーターコドンと終結コドンを含む推定されたコード
配列を示す。（２５−２６）ｈＭＲの完全なヌクレオチ
ド配列およびその推定上の一次アミノ酸配列。推定され
たイニシエーターメチオニンの上流にある読み枠内の
５’終結コドンおよび４つの可能なポリアデニル化部位
（ＡＡＴＡＡＡ）にはアンダーラインが施してある。ヒ
ト腎臓ラムダgt１０ライブラリー（１８）はラムダＨＧ
Ｈ由来の挿入物を用いて、このプローブによる高ストリ
ンジェント条件下でのサザン分析のために記載した条件
と同じ条件でスクリーニングした。それぞれのｃＤＮＡ
の重複欠失はサイクロン高速欠失サブクローニング法
（インターナショナル・バイオテクノロジー）により得
られた（３６）。欠失クローンはジデオキシ法（３７）
によりその塩基配列を決定し、そしてギャップやアンビ
ギュイティ（ambiguity）を化学的切断法（３８）によ
り解明した。ＤＮＡ配列は編集してＤevereuxら（３
９）およびＳtaden（４０）のプログラムにより分析し
た。
【０３７５】第２７図 ミネラロコルチコイド受容体とグルココルチコイド受容
体のアミノ酸相同性。hＭＲの一次アミノ酸配列は、ギ
ャップ（点で表示）を導入することにより最大の相同性
を得るように、ｈＧＲのアミノ酸配列と整列させた。数
字はhＭＲについては第２５および２６図から、そして
ｈＧＲについては第３および４図から引用した。表示し
た領域の上流には有意な相同性が全く見られなかった。
縦線は同一のアミノ酸残基を示す。矢印はＤＮＡ結合ド
メイン（ＤＮＡ）およびステロイド結合ドメイン(ＳＴ
ＥＲＯＩＤ)の推定上の境界を示す。ＤＮＡ結合ドメイ
ンのアミノ末端境界は最初の保存システイン残基によっ
て任意に定められたが、カルボキシル末端限界はＤＮＡ
結合および転写活性化に必要な配列を示す突然変異誘発
実験に基づいて選択された（１５）。ＤＮＡ結合ドメイ
ンに続く数個の保存的塩基性残基もまたこれらの機能に
とって重要でありうる。アミノ酸相同領域により定めら
れたステロイド結合ドメインの境界もまた突然変異分析
と一致する。アミノ酸残基の一文字略号はＡ，Ａｌa；
Ｃ，Ｃys；Ｄ，Ａsp；Ｅ，Ｇｌu；Ｆ，Ｐhe，Ｇ，Ｇｌ
y；Ｈ，Ｈis；Ｉ，Ｉｌe；Ｋ，Ｌys；Ｌ，Ｌeu；Ｍ，Ｍ
et；Ｎ，Ａsn；Ｐ，Ｐro；Ｑ，Ｇｌn；Ｒ，Ａrg；Ｓ，
Ｓer；Ｔ，Ｔhr；Ｖ，Ｖaｌ；Ｗ，Ｔrp；およびＹ，Ｔy
rである。
【０３７６】第２８(Ａ),（Ｂ）,（Ｃ）および(Ｄ)図 発現されたｈＭＲのステロイド結合特性。（Ａ）hＭＲ
発現プラスミドｐＲＳhＭＲの構造（４１）。（Ｂ）pＲ
ＳｈＭＲでトランスフェクションした細胞から調製され
た抽出物における〔3Ｈ〕アルドステロン結合のスカッ
チャード分析。各点は２００μｌ中の抽出蛋白質１００
μｇを０℃で2.5時間インキュベーションする３通りの
実験により検定した。５００倍過剰の未標識アルドステ
ロンを用いて測定した非特異的結合は全カウント数の約
２０％であった。疑似トランスフェクションした細胞で
は特異的結合が全く見られなかった。（ＣおよびＤ）ト
ランスフェクションしたＣＯＳ細胞の抽出物における５
nＭ〔3Ｈ〕アルドステロンと未標識ステロイドとの競合
結合。これらの競合実験を代表する２つの独立した実験
の結果を示す。冷却競合剤は１−，１０−，１００−倍
過剰モル量で存在していた。１００％結合の値は、１０
００倍過剰の未標識アルドステロンの存在下で結合した
cpm数を、競合剤の不在下で結合したカウント数から減
算することにより決定した。略号：ＡＬＤＯ，アルドス
テロン；ＤＯＣ，デオキシコルチコステロン；ＤＥＸ，
デキサメタゾン；ＳＰＩＲＯ，スピロノラクトン；Ｅ2
1,17β−エストラジオールＣＳ,コルチコステロン；Ｈ
Ｃ,ヒドロコルチゾン；およびＰＲＯＧ，プロゲステロ
ン。亜集密的生長（subconfluent）ＣＯＳ細胞はＤＥＡ
Ｅ−デキストラン法（４２）により培養皿当たり１０μ
ｇのpＲＳｈＭＲを用いてトランスフェクションした。
細胞は５％チャーコール処理ウシ胎児血清を含むＤＭＥ
Ｍ（イーグル最少培地のダルベッコ修飾）中に２日間維
持し、その後４０mＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.8）、１０
mＭ ＮaＣｌ、１mＭＥＤＴＡ、１０mＭ Ｎa2ＭoＯ4、５
mＭジチオトレイトール、アンチパイン（５μｇ/m
ｌ）、ロイペプチン(５μｇ/mｌ）および５００μＭ弗
化フェニルメチルスルホニル中に収集した。１５０００
×ｇで１０分遠心した後、抽出物は結合に先立って１０
０mＭ ＮaＣｌおよび５％グリセロールへ調整した。〔
3Ｈ〕アルドステロン（比非活性７８Ｃi／mmoｌ，アマ
−シャム社製）との標識反応は全容量２００μｌ中０℃
で2.5時間インキュベーションし、その後２０μｌの５
０％デキストラン被覆チヤーコール（活性チャーコー
ル：デキストラン１０：１）と共に１０分間インキュベ
ーションした。１５０００×ｇ、４℃で２分間遠心した
後、上清中の三重水素を液体シンチレーション分光光度
計により定量化した。
【０３７７】第２９(Ａ),（Ｂ）および(Ｃ)図 トランスフェクションしたＣＶＩ細胞内でのhＭＲおよ
びｈＧＲ発現プラスミドによるＭＭＴＶ−ＬＴＲの転写
活性化。（Ａ）ＧＭＣＡＴの構造。このプラスミドはホ
ルモン依存性転写活性化のためのリポーター遺伝子とし
てステロイド受容体と同時トランスフェクションされた
（実験の部IIを参照）。（Ｂ）正常血清の存在下でのh
ＭＲまたはｈＧＲトランスフェクション後に見られた示
差的ＣＡＴ酵素活性。トランスフェクションした細胞は
５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中に維持した。血清は
その後の実験において遊離ステロイドを排除するために
チャーコールで処理した。その結果外因性ステロイドの
効果が測定できるであろう。（Ｃ）hＭＲまたはｈＧＲ
でトランスフェクションした細胞におけるアルドステロ
ンまたはデキサメタゾンによるＣＡＴ活性の示差的誘
導。ＣＶＩ細胞は１０μｇのｐＲＳＶｇaｌ（対照）、p
ＲＳhＭＲまたはpＲＳｈＧＲアルファのいずれかおよび
１０μｇのリポーターＧＭＣＡＴで同時トランスフェク
ションし、そして１０nＭアルドステロン（Ａ）または
１０nＭデキサメタゾン（Ｄ）の存在下または不在下
（−）で培養した。ＡＣ，３−アセチルクロラムフェニ
コール；Ｃ，クロラムフェニコール。リン酸カルシウム
共沈によるトランスフェクション（４３）の２日後、抽
出物をＣＡＴ検定のために調製した（４４）。検定は５
０μｇの蛋白質抽出物を用いて６時間インキュベーショ
ンした。
【０３７８】第３０図 ラット組織中のミネラロコルチコイド受容体ｍＲＮＡの
ノザン分析。ラムダhk１０からの１２７０ bp ＥcoＲＩ
フラグメント（1770−3040）を、ラットでの相同ｍＲＮ
Ａ発現のためのプローブとして使用した。すべてのレー
ンにおいて、１０μｇのポリ（Ａ)+ｍＲＮＡを用いた。
リボソームＲＮＡ（２８Ｓおよび１８Ｓ）の泳動をサイ
ズマーカーとして示す。ストリンジェント条件下でのハ
イブリダイゼーション後に、フィルターは0.1％ＳＤＳ
を含む２×ＳＳＣで３０分ずつ２回、６８℃で洗浄し
た。
【０３７９】第３１図 微小核ハイブリッドのサザン分析によるhＭＲ遺伝子の
染色体局在化。これらのハイブリッドの構築および特性
決定は以前に開示されている（３２）。それぞれのヒト
染色体含有物は次の通りである：ＨＤm−４Ａ（染色体
２０）、ＨＤm−５（染色体１４および非特定化Ｅグル
ープ染色体）、ＨＤm−９（染色体２０，１４および２
１）、ＨＤm−１５（染色体２１，１１および４）、Ｈ
Ｄm−２０（染色体７および１４）、およびＨＤm−１１
３２Ｂ（染色体４のみ）。ヒト（ＨeＬa）およびマウス
（３Ｔ＃）対照ＤＮＡ試料も示す。微小核体由来のゲノ
ムＤＮＡ（１０μｇ）はＥcoＲＩで消化し、1.0％アガ
ロースゲルで電気泳動にかけ、ナイロン膜（Ｎytran,
Ｓchleicher ＆ Ｓchuell社）に移行させ、そして高ス
トリンジェント条件下でhＭＲｃＤＮＡプローブを用い
てハイブリダイズさせた（第２３（Ａ）)。放射性プロ
ーブは２つのランダムにプライムした（４５)hＭＲｃＤ
ＮＡ（鋳型（ラムダ hk２の1000−および800−bp Ｅco
ＲＩフラグメント）から大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのク
レノウ断片により合成した。ＨindIII消化ラムダＤＮＡ
のサイズをオートラジオグラムに近接して示す。
【０３８０】第３２図 ｈＧＲ，hＭＲおよび rＰＲ構造の模式図によるアミノ
酸比較。一次アミノ酸配列を模式図的に整列させ、点線
の間のそれぞれの相同領域についてアミノ酸同一性のパ
ーセンテージを示す。各ドメイン境界のアミノ酸位置を
それぞれの受容体について示す。ＮおよびＣはアミノ末
端およびカルボキシル末端を表す。Ｃysは推定上のＤＮ
Ａ結合ドメインをコードするシステインに富む領域に相
当し、一方Ｓteroid（コルチゾル、アルドステロンまた
はプロゲステロン）はステロイド結合ドメインを表す。
ｈＧＲの免疫原領域（ＩＭＭ）も示す。アミノ酸残基番
号はｈＧＲについては実験の部Ｉから、rＰＲについて
はＬoosfeltら(１１)から、そしてhＭＲについては我々
のデータから引用する。
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【０４０１】22. 内因性ステロイドの除去のために、洗
浄チャーコールを血清に加え〔100 mｌ当たり２ｇ(乾燥
重量)〕 、３７℃で４０分間、次に５５℃で３０分間イ
ンキュベーションした。チャーコールは０.４５ミクロ
ンその後０.２ミクロンのフィルターを通して濾過する
ことにより除いた。
【０４０２】23. ヒト細胞株は高親和性アルドステロン
結合部位を発現すると報告されていない。ヒト卵巣ＲＮ
Ａのノザンブロット分析により、大きさが約６kbおよび
４kbの２つのハイブリッド形成ＲＮＡ種が明らかになっ
た。卵巣でのアルドステロン結合活性は報告されていな
い。
【０４０３】24. Ｆuller，Ｐ.Ｊ.,and Ｆunder,Ｊ.
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【０４２０】41.ｐＲＳｈＭＲの構築。ラムダhk１０か
らの３.７５kb挿入物は、hＭＲコード配列の５’末端に
mp１８ポリリンカーが隣接する方向で、pＧＥＮ４（Ｐr
omega社）のＥcoＲＩ部位へ連結した。このプラスミド
（phk１０）をＨindIIIで消化してポリリンカー部位か
ら3562位のｈＭＲ部位に及ぶＨindIIIフラグメントを形
成させ、このフラグメントを単離し、ＤＮＡ ポリメラ
ーゼＩのクレノウ断片を用いて両末端を修復した。プラ
スミドｐＲＳＶＣＡＴ〔Ｃ.Ｍ.Ｇorman，Ｇ.Ｔ.Ｍerlin
o，Ｍ.Ｃ.Ｓillingham，Ｉ.Ｐastan,Ｂ．Ｈ．Ｈoward，
Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci.，ＵＳＡ，79：6777（198
2）〕はＨindIIIおよびＨpa I で消化し、そして pＢＲ
３２２配列、ＲＳＶ−ＬＴＲおよびＳＶ４０ポリＡ部位
を含むＨindIII−Ｈpa I フラグメントもまた修復し
た。hＭＲ フラグメントとｐＲＳＶＣＡＴ由来のフラグ
メントとの連結は、正しい方向でＲＳＶプロモーターに
より支配されるｈＭＲコード配列を含むベクターをもら
した。第２８（Ａ）図でかっこに入れた部位はこのクロ
ーニング段階で失われた。翻訳効率を改良するために、
５’非翻訳領域中のいくつかの上流の開始コドンおよび
終結コドンが、このベクターをＡccＩで消化して mp１
８ポリリンカーからｈＭＲ５'−ＵＴ領域中の１８８位
までの約２００bp 配列を除去することにより欠失され
た。最後に、ＮdeＩリンカーを付加したＳＶ４０複製起
点をＮdeＩ部位（１２）に導入してｐＲＳｈＭＲを形成
させた。
【０４２１】42. Ｄeans，Ｒ.Ｊ.，Ｄenis.，Ｋ.Ａ.，
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【０４２５】実験の部V 新しいクラスのステロイドホルモン受容体の同定V．Ａ．序論 生殖腺および副腎はエストロゲン、プロゲスチン、アン
ドロゲン、グルココルチコイドおよびミネラロコルチコ
イドを含む５つの主なグループに類別される多種類のス
テロイドを産生する。生殖腺ステロイドは生殖系の分化
および成長をコントロールし、性的特徴を誘導・維持
し、そして生殖行動を調節する。同様に、副腎ステロイ
ドは代謝調節剤としての重要な役割のほかに分化にも影
響を与える。この広範囲の生理学的作用にもかかわら
ず、各ステロイドの効果は主としてそれが結合する特定
の同族受容体に基づいており、従ってステロイドホルモ
ン作用はそれらの生理活性を媒介する受容体に従ってよ
り正確に分類できるかも知れない。ヒトグルココルチコ
イド受容体（ｈＧＲ）cＤＮＡ（実験の部Ｉを参照され
たい、これは文献１として発表した）、すぐその後に実
施されたエストロゲン2'3（ｈＥＲ）、プロゲステロン4
（hＰＲ）およびミネラロコルチコイド受容体（hＭＲ)
をコードするcＤＮＡ（実験の部IVを参照、これは文献
５として発表）、ならびにいろいろな種6-11からの相同
体の上首尾のクローニング、塩基配列決定および発現は
受容体の構造およびこれらの分子が遺伝子発現を制御す
る分子機構を研究するための機会を提供する。これらの
蛋白質の配列比較および突然変異分析は、すべてのクラ
スのステロイドホルモン受容体に共通した構造的特徴を
明らかにする(文献１２として発表した実験の部IIを参
照；また文献１３および１４を参照)。とりわけ、受容体
は高度に保存されたシステインに富む領域（今や、ＤＮ
Ａ−タウドメインと呼ばれる）を共通し、その領域はグ
ルココルチコイド受容体15 '16のＤＮＡ結合機能および
トランス活性化機能の両方に必要な情報をすべて含む。
受容体間の共通セグメントの存在は、関連遺伝子産物に
ついてゲノムを走査する可能性を与える。例えば、hＭ
Ｒ ｃＤＮＡはハイブリダイゼーションプローブとして
ｈＧＲを用いることにより分離された（文献５として発
表した実験の部IVを参照）。分子生理学が健康およびヒ
トの病気ならびにこれらの現象を支配する生理学の我々
の理解を促し得る１つの方法は、新しいホルモン応答系
の同定を通してである。この研究において、ヒトエスト
ロゲン受容体ｃＤＮＡの高度に保存されたＤＮＡ−タウ
領域をハイブリダイゼーションプローブとして使用する
ことにより、我々はステロイドホルモン受容体の構造的
特徴をポリペプチドをコードする２つのｃＤＮＡクロー
ンを単離した。
【０４２６】V．Ｂ．受容体ｈＥＲＲ１のｃＤＮＡクロ
ーン 認定されていないホルモン応答系を検索する１つの方法
は、低下したストリンジェントハイブリダイゼーション
を系統的に利用して、新規なホルモン受容体について組
換えＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることであ
る。エストロゲン受容体のＤＮＡ−タウセグメントがこ
れらの研究を開始するために用いられた。ラムダgt１０
ヒト精巣ｃＤＮＡライブラリーの分析により、３×１０
5組換えファージ当たり１個のクローンの頻度で３個の
陽性クローンが同定された。ヌクレオチド配列分析は、
これらのクローンのうち２個が実際にエストロゲン受容
体をコードしており、３番目のクローン（２.０キロ塩
基に及び、ラムダ hＴ１６と命名した）が部分的な配列
相同を示すことを明らかにした。その後、このクローン
を使用してヒト胎児腎臓および成人心臓ｃＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングし、それにより３個の追加クロ
ーンを同定した。腎臓ライブラリーからの２個のクロー
ン（ラムダ hＫＥ４およびラムダ hＫＡ１）はラムダ h
Ｔ１６と同じ遺伝子産物を表すが、心臓クローン（ラム
ダ hＨ３）は部分的に関連しているにすぎない。同一配
列を共有する３つのｃＤＮＡの複合配列（ここではｈＥ
ＲＲ１と呼ぶ）を第３４および３５図に示す。約１５０
〜２００ヌクレオチド17のポリ(Ａ)尾部を仮定すると、
この配列（約2430nt）はほぼ全長であるにちがいない。
ラムダ hＫＡ１からのｃＤＮＡ挿入物はヌクレオチド１
７９から2430までを含み、一方ラムダ hＫＥ４はまれな
メッセンジャーＲＮＡのスプライシングエラー（splici
ng error）を示し、エクソン２の欠失およびイントロン
配列の挿入を有する。ラムダ hＫＥ４によって示唆され
たエクソン／イントロン境界は、この遺伝子をコードす
るゲノムフラグメントをクローニングして部分的に塩基
配列を決定することにより確かめた（データは示さ
ず）。最初のＡＴＧをとりまく配列は、翻訳開始部位に
ついてＫozak18によって開示されたコンセンサス配列と
一致する。Ｍr 57300のポリペプチドを予告する５２１
個のアミノ酸のオープン・リーディング・フレームは、
７７５ヌクレオチドの３’非翻訳領域と接している。
【０４２７】V．Ｃ．受容体ｈＥＲＲ２のcＤＮＡクロー
ン クローンラムダhＨ３の特性決定により、それはｈＥＲ
Ｒ１と高度に関連した唯一のポリペプチドをコードする
ことが分かった。第３７および３８図は、ラムダ hＨ３
の2153ヌクレオチド配列およびその蛋白質産物（ｈＥＲ
Ｒ２と呼ぶ）の一次構造を示す。その翻訳開始部位はヌ
クレオチド100−102 に一致するメチオニンコドンに指
定された。その理由は、これが読み枠内（in−frame）
ターミネーターＴＧＡ（ヌクレオチド３１−３３）から
下流に現れる最初のＡＴＧトリプレットであるからであ
る。４３３個のアミノ酸を含むオープン・リーディング
・フレームはＭr 47600のポリペプチドをコードし、７
５２ヌクレオチドの３’非翻訳領域が後に続く。
【０４２８】V．Ｄ．ｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２の特
性決定 先に述べたように、ステロイドホルモン受容体は配列分
析により同定しうる別個の機能的ドメインから構成され
る。14推定されたｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２ポリペプ
チドはステロイド受容体の予測されたドメイン特徴を含
む。ｈＥＲＲ１とｈＥＲＲ２との間のアミノ酸比較は、
これらの２種の蛋白質が分岐(divergent)アミノ末端を
有し、この領域内では他のクラスの受容体との相同性が
全く検出されないことを示す（データは示さず）。この
発見はこの領域の配列が高度に変化しうることを示した
先の比較研究（実験の部IVを参照；また文献５，８，１
０，１４を参照）と一致している。ｈＥＲＲ１，ｈＥＲ
Ｒ２，ｈＥＲおよびｈＧＲの整列（第３９図）により、
これらの蛋白質の間には最高の相同度がｈＥＲＲ１のア
ミノ酸１７５から２４０までの６６個のアミノ酸のシス
テインに富む領域〔ステロイドホルモン受容体のＤＮＡ
−タウドメイン（実験の部IIおよび文献１５を参照）に
相当する〕に見られる。ｈＥＲＲ１とｈＥＲＲ２との比
較においては９１％のアミノ酸同一性が存在し、ｈＥＲ
との比較では６８％、そしてｈＧＲとの比較では５６％
の同一性が存在する。９個のシステイン残基の位置は厳
格に保存されているが、ｈＥＲＲ１の２０６位およびｈ
ＥＲＲ２の１３４位におけるヒスチジン残基の不在は前
述のステロイドホルモン受容体と大きく相違するところ
である。このヒスチジン残基は元来保存性システイン残
基と共にＤＮＡ結合フィンガーの形成に関与すると考え
られていた。リガンド結合トランス活性化因子スーパー
ファミリーの他の一員であるビタミンＤ受容体19の対応
するアミノ酸配列にもこのヒスチジン残基の存在しない
ことが最近になって分かり、このことはＺn2+原子がこ
れらの蛋白質に存在する提案されたＤＮＡ結合フィンガ
ーの形成を調整するために、排他的にシステイン残基と
相互作用することを示唆している。ｈＥＲＲ１のアミノ
酸２９５と５２１の間に位置づけられる推定上のステロ
イド結合ドメインは、ｈＥＲＲ２と比較したとき６３％
の同一性を示し、ｈＥＲとは３６％、そしてｈＧＲとは
２８％の同一性を示す。
【０４２９】Ｖ．Ｅ．ｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２のｍ
ＲＮＡの組織分布 ステロイド受容体はそれらの一次生理作用に直接関係す
る特徴的な組織特異的パターンで発現される。恐らく、
これらの推定受容体の分布はそれらの隠された本性に手
ががかりを与えるであろう。従って、多種類のラットお
よびヒト組織から分離した全ＲＮＡはホルムアルデヒド
−アガロースゲル電気泳動で分画化し、ニトロセルロー
スフィルターへ移行させた。プローブとしてラムダ hＫ
Ａ１を用いることにより、ｈＥＲＲ１をコードする２.
６kbｍＲＮＡが検査したすべてのラットおよびヒト組織
に検出された。その際、驚いたことに、小脳および海馬
では高レベルで、そして肝臓、肺、精嚢および脾臓では
最低レベルで検出された（第４０（Ａ）図）。こうし
て、ｈＥＲＲ１遺伝子は広く豊富に発現されるが、ラッ
ト中枢神経系により一層高いレベルで存在すると思われ
る。ｈＥＲＲ１ｍＲＮＡ発現パターンとは対照的に、ｈ
ＥＲＲ２蛋白質をコードするｍＲＮＡの分布は、極めて
低レベルのｍＲＮＡが検出される少数の特定組織に限ら
れる（第４０（Ｂ）図）。クローンラムダ hＨ３から誘
導されたプローブを用いて、４.８kbｍＲＮＡが腎臓、
心臓、精巣、視床下部、海馬、小脳およびラット前立腺
から検出された。しかしながら、ヒト胎盤または前立腺
ではハイブダイゼーションが全く検出されなかった。露
出時間の差異および生成する信号強度を考慮すると、ｈ
ＥＲＲ２ｍＲＮＡのレベルはｈＥＲＲ１のそれよりも約
１０〜１００倍低下する。
【０４３０】Ｖ．Ｆ．ｈＥＲＲ１とｈＥＲＲ２との相同
性 従来の研究は、ステロイドホルモン受容体間のリガンド
結合ドメインの相同度がそれらのリガンドの構造的関連
性を反映すると指摘している。例えば、リガンド結合ド
メインが５６％の同一性を示すｈＧＲ、hＭＲおよびhＰ
Ｒ（実験の部IVを参照）は関連ホルモンと親密に結合す
る。実際、hＭＲはアルドステロンに等しい親和性でも
ってグルココルチコイドと結合し、また比較的高い親和
性でプロゲステロンと結合する（実験の部IVを参照）。
ｈＥＲＲ遺伝子産物の場合には、アミノ酸配列相同がｈ
ＥＲとの比較的遠い関係を示し、ＤＮＡ−タウ領域では
７０％およびステロイド結合領域では３６％の同一性を
示す（第４１図）。これらの相同レベルはｈＧＲ、ｈＭ
Ｒおよび hＰＲの間に観察されたものよりも低く、従っ
て推定上のｈＥＲＲ蛋白質はエストロゲンとは異なるク
ラスのステロイドホルモンと相互作用することが推測さ
れる。しかしながら、ｈＥＲＲ１とｈＥＲＲ２との相同
性は、それらが単一のまたは２つの密接に関連したステ
ロイド中間代謝物の受容体であることを示唆している。
ｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２コード配列から作製したキ
ャップ構造をもつＳＰ６ＲＮＡの in vitro 翻訳産物ま
たはＣＯＳ−１細胞による２つのｃＤＮＡの発現産物を
使用する予備ステロイド結合実験（実験の部IVおよびII
を参照）はエストロゲンおよびアンドロゲンを含む主要
クラスのステロイドとの結合を証明できなかった。
【０４３１】Ｖ．Ｇ．結論 ｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２ｍＲＮＡ発現の組織分布
は、それぞれの推定上の受容体が別々の生物学的機能を
コントロールするであろうことを示唆する。これらのス
テロイドホルモン受容体の機能は何故見落されたのであ
ろうか。多分、それらの活性の多くは非定形の作用とし
て分類される差異をもつ他の受容体に誤って属するとみ
なされたのであろう。神経細胞ステロイド20'21の最近
の同定は、脳内でパラクリン作用をもつと思われる新し
いステロイドホルモンの証拠を提供する。このような系
は従来の生理学的検出を容易に免れた。従って、２種類
の新規なステロイドホルモン受容体ｃＤＮＡの単離は、
新しいホルモン応答系の同定へ向けて第一歩を踏み出す
ことになろう。
【０４３２】V．Ｈ．実験のVに関する図面の詳細な説明 第３３−３５図 ｈＥＲＲ１の制限地図(３３)およびＤＮＡ配列と推定さ
れたアミノ酸配列（３４−３５）。３３．ｈＥＲＲ１の
複合ｃＤＮＡを上段に表し、非コード配列（細線）およ
びコード配列（斜線部分）を示す。通常の６−ヌクレオ
チド制限酵素部位は線状地図の上に記す。配列決定に使
用した重複するｃＤＮＡ挿入物を示す。ラムダhＫＥ４
の５’末端付近の波線は分岐配列を示す。３４−３５．
ロング・オープン・リーディング・フレーム上に与えられ
た推定アミノ酸を伴う複合ｈＥＲＲｃＤＮＡのヌクレオ
チド配列。
【０４３３】第３３−３５図の方法 クローン ラムダ hＴ１６はｈＥＲｃＤＮＡ（Ｖ．Ｇigu
ereおよびＲ.Ｍ.Evans，未発表データ）から誘導された
リンカー走査突然変異体12（linker−scanningmutant）
の pＥＲ９４５に由来するニックトランスレーション22
を行った４４６bp ＢgｌＩ−ＢamＨＩフラグメントを用
いて、ヒト精巣ラムダ gt１０ｃＤＮＡライブラリ−
（Ｃlonetech社）から分離された。ハイブリダイゼーシ
ョン混合物は３５％ホルムアミド、１×デンハート溶
液、５×ＳＳＰＥ、０.１％ドデシル硫酸ナトリウム(Ｓ
ＤＳ)、１００μｇ／mｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび１０6
cpm／mｌの32Ｐ標識ＢｇｌＩ−ＢamＨＩフラグメント
（＞１０8cpm／μｇ）を含んでいた。２通りのニトロセ
ルロースフィルターを４２℃で１６時間ハイブリダイズ
させ、２×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ（１×ＳＳＣ＝１５０m
Ｍ ＮaＣｌ、１５mＭクエン酸ナトリウム）を用いて５
５℃で２０分ずつ３回洗浄し、そして増感紙を使って−
７０℃でオートラジオグラフィーを行った。クローンラ
ムダ hＫＥ４およびラムダ hＫＡ１は、ラムダhＴ１６
由来のニックトランスレーションした挿入物を用いて、
ヒト腎臓ラムダgt１０ｃＤＮＡライブラリー23から分離
された。このスクリーニングのために、ハイブリダイゼ
ーション混合物は５０％ホルムアミドに変更し、洗浄条
件は６８℃で０.１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣに変え
た。cＤＮＡクローンは多数の制限酵素で消化し、生成
したフラグメントをＭ１３塩基配列決定ベクターmp１８
およびmp１９に両方の向きでサブクローニングし、そし
てジデオキシ法24で塩基配列を決定した。ギャップやア
ンビギュイティは化学的切断法25により解明した。ＤＮ
Ａ配列は編集してＤevereuxら26およびＳtaden27のプロ
グラムにより分析した。
【０４３４】第３６−３８図 ｈＥＲＲ２の制限地図(３６)およびＤＮＡ配列と推定さ
れたアミノ酸配列（３７−３８）。３６．ｈＥＲＲ２ｃ
ＤＮＡの模式図；いくつかの通常の制限酵素部位を示
す。斜線ボックスは推定されたオープン・リーディング
・フレームを表す。３７−３８．ラムダhＨ３の完全な
ヌクレオチド配列を、ロング・オープン・リーディング
・フレーム上の推定アミノ酸配列と共に示す。５’非翻
訳領域におけるショート・オープン・リーディング・フ
レームは肉太の活字で示す。
【０４３５】第３６−３８図の方法 クローン ラムダｈＨ３は、ラムダｈＫＡ１の５’部分
を表すニックトランスレーションした７００bp ＥcoＲ
Ｉ−ＳmaＩフラグメントを用いて、ヒト心臓ラムダgt１
１ｃＤＮＡライブラリー(アルバート・アインシュタイ
ン医科大学のＬ．Ａ．Ｌeinwand 博士から寄贈）から分
離された。ハイブリダイゼーション、洗浄条件および塩
基配列決定の手法はヒト腎臓ライブラリーについて第３
３−３５図で説明した通りであった。
【０４３６】第３９図 ｈＥＲＲ１、ｈＥＲＲ２、ヒトエストロゲンおよびグル
ココルチコイド受容体のカルボキシ末端領域間のアミノ
酸配列の比較。４種のアミノ酸配列はギャップ（ハイフ
ンで示す）を導入することにより最大相同性を得るよう
に整列させた。番号はｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２につ
いては第３４および３５図ならびに第３７および３８図
から、ｈＧＲについては第３，４図から、そしてｈＥＲ
についてはＧreenら2 から引用した。少なくとも３種の
ポリペプチドにおいて一致するアミノ酸残基はボックス
で囲った。ｈＥＲＲ１の残基２０６の上の星印は、ｈＥ
Ｒ配列中に存在するがｈＥＲＲ１とｈＥＲＲ２の両配列
中には存在しないヒスチジン残基の位置を示す。
【０４３７】第４０（Ａ）および（Ｂ）図 ラットおよびヒト組織におけるｈＥＲＲ１(Ａ)およびｈ
ＥＲＲ２(Ｂ)ｍＲＮＡのノザン・ブロット・ハイブリダ
イゼーション。
【０４３８】第４０（Ａ）および（Ｂ）図の方法 全ＲＮＡはグアニジンチオシアネート28を用いて種々の
組織から分離し、１％アガロース−ホルムアルデヒドゲ
ル上で分画化し、ニトロセルロースへ移行させ、そして
ストリンジェント条件下でラムダ hＫＡ１由来のニック
トランスレーションしたＥcoＲＩ−ＳmaＩフラグメント
（ａ）およびラムダ hＨ３由来のニックトランスレーシ
ョンした1192 bp ＥcoＲＩ−ＨindIIIフラグメント
（ｂ）を用いてハイブリダイズさせた。すべてのレーン
において２０μｇの全ＲＮＡを使用した。リボソームＲ
ＮＡ（２８Ｓおよび１８Ｓ）の泳動をサイズマーカーと
して示す。ニトロセルロースフィルターは増感紙を使っ
て−７０℃で２４時間(ａ)および６日間（ｂ）オートラ
ジオグラフィーにかけた。（ａ）におけるｍＲＮＡの泳
動速度の明らかな差はゲルからのアーチファクト（arti
fact）である。
【０４３９】第４１図 ｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２、ｈＥＲ、ｈＧＲおよびヒ
ト甲状腺ホルモン受容体(hＴ3Ｒベータ）間の模式図に
よるアミノ酸比較。アミノ酸配列はステロイドおよび甲
状腺ホルモン受容体スーパーファミリー4の機能的ドメ
イン構造に従って模式図により整列させた。それぞれの
受容体とｈＥＲＲ１とのアミノ酸同一性のパーセンテー
ジは各ドメインの内側に示す。それぞれのドメイン境界
のアミノ酸位置を各受容体について示す。
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【０４６４】25. Ｍaxam，Ａ.,and Ｇilbert，Ｗ.,Ｐro
c．Ｎatl.Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ，74：560−564（197
7）。
【０４６５】26. Ｄevereux,Ｊ.,Ｈaeberli,Ｐ.,and Ｓ
mithies,Ｏ.,Ｎucleic Ａcid Ｒes.,12：387−395（198
4）。
【０４６６】27. Ｓtaden，Ｒ.,Ｎucleic Ａcid Ｒes.,
10：2951−2961（1982）。
【０４６７】28. Ｃhirgwin，Ｊ.Ｍ.,Ｐrzybyla，Ａ．
Ｆ.,ＭcＤonald，Ｒ.Ｊ.,and Ｒutter．Ｗ．Ｆ.,Ｂioch
emistry，18：5294−5299（1980）。
【０４６８】実験の部VI ラット成長ホルモン遺伝子のc−erb−Ａ結合部位は甲状
腺ホルモンによるトランス作用を仲介するVI．Ａ．序論 １．３．３−トリヨードチロニン（Ｔ3）物質はラット
下垂体腫瘍細胞1-4において成長ホルモン遺伝子転写を
刺激する。この刺激は、その転写開始部位の５’側の調
節因子に核Ｔ3受容体が結合することにより仲介される
と考えられる。5-8甲状腺ホルモンが遺伝子転写を活性
化するメカニズムの理解は、核Ｔ3受容体が豊富に存在
しないためにそれらを精製するのが困難であること、お
よびＴ3調節に作用するＴ3受容体−ＤＮＡ結合部位が明
確でないことにより制限されている。最近、ヒトおよび
トリc−erb−Ａ遺伝子産物は、高親和性でもって甲状腺
ホルモンと結合し（文献１０として発表した実験の部II
Iを参照）、甲状腺ホルモン受容体の分子量および核結
合特性をもつことが見出された。目下の研究において、
我々はラット成長ホルモン遺伝子の転写開始部位の５’
側の１６４塩基対に位置する配列５’ＣＡＧＧＧＡＣＧ
ＴＧＡＣＣＧＣＡ３’へのラット下垂体細胞Ｔ3受容体
の特異的高親和性結合を検出できるアビジン−ビオチン
複合ＤＮＡ結合検定の開発について説明する。この配列
を含むオリゴヌクレオチドは、トランスフェクションし
たラット下垂体ＧＣ２細胞においてＴ3調節を単純疱疹
ウイルスチミジンキナーゼプロモーターへ転移し、また
ヒト胎盤c−erb−Ａ遺伝子のin vitro 翻訳産物と特異
的に結合した。このデータは、ヒトc−erb−Ａ遺伝子が
Ｔ3の転写作用を仲介し、またＧＣ２細胞核抽出物がラ
ット成長ホルモン遺伝子Ｔ3応答因子への下垂体Ｔ3受容
体の結合を変更する別の因子を含むことを支持する証拠
を提供する。
【０４６９】VI．Ｂ．Ｔ3調節に必要なラット成長ホル
モンＤＮＡ配列の特性決定 （a）ラットＧＨ遺伝子欠失検定 Ｔ3調節に必要な成長ホルモン（ＧＨ）５’側ゲノム配
列中のシス活性因子を同定するために、我々は細菌クロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡ
Ｔ）遺伝子へ融合し且つラット下垂体ＧＣ２細胞にトラ
ンスフェクションした、ラットＧＨ遺伝子の一連の５’
欠失フラグメントを使用した（第４２（Ａ）図）。−２
３５位から転写開始（ＣＡＰ）部位までの５’欠失物は
Ｔ3に対する調節を転移させ（４.６倍，第４２（Ａ）
図）、以前の研究5 ’6に一致して１.７キロ塩基（kb）
または３０７塩基対（bp）の５'側ラットＧＨ情報を含
む構築物に等しかった（データは示さず）。（ヌクレオ
チド位置はＣＡＰ部位に対して番号付けされており、負
の位置番号はそれに対して５’側であることを意味す
る。）２３５bpより少ない５’側ＧＨ情報を含む欠失物
は、Ｔ3の不在下でのＣＡＴ発現レベルが有意にバック
グラウンド以上でなかったので、Ｔ3誘導について検定
できなかった。この問題を解決するために、ラットプロ
ラクチンエンハンサー因子11を１８１bpおよび１１０bp
の５’側情報を含むラットＧＨ遺伝子フラグメントに近
接して融合させた。−１８１位まで延びる５’欠失フラ
グメントはＴ3によって２.６倍の誘導を与え、そしてＣ
ＡＰ部位から−１０７位までの別の欠失はＴ3調節を示
さなかった（第４２（Ａ）図）。
【０４７０】（b）ＣＡＴ酵素検定 ３’欠失について検定するために、ラットＧＨ遺伝子の
フラグメントは単純庖疹ウイルスチミジンキナーゼ（Ｈ
ＳＶ tk）プロモーターに融合した。ＣＡＰ部位から−
２３５位ないし−４５位まで延びるＧＨ遺伝子フラグメ
ントは、天然のままの向きでおよび逆向きでtkプロモー
ターに融合したとき、それぞれ２.５倍および2.3倍のＣ
ＡＴ活性刺激をもたらした（第４２（Ｂ）図）。ＧＨ
ＣＡＰ部位から２３５位ないし１４５位まで延びる９０
bpクラブメントは，２３５−４５bpフラグメントよりも
一層効果的にＴ3調節を転移させ，このことはネガティ
ブＴ3調節因子がＣＡＰ部位から４５bpと１４５bpの間
に存在しうることを示唆している（第４２（Ａ）図）。
ＣＡＴメッセンジャーＲＮＡは，tkプロモーターを含む
プラスミドでトランスフェクションした細胞において観
察されたＣＡＴ活性のＴ3依存性刺激が適当に開始され
た転写物の増加によって起こるのかどうかを調べるため
に，プライマー伸長技術12を用いて分析した。tkプロモ
ーターに融合した２３５−４５bp ＧＨフラグメントト
はＴ3の存在下で正しく開始されたＣＡＴ mＲＮＡを約
４倍増加させ（第４２（Ｃ）図），これは観察されたＣ
ＡＴ活性の測定値と一致する結果であった。
【０４７１】（ｃ）アビジン−ビオチン複合ＤＮＡ結合
検定（ＡＢＣＤ検定） Ｔ3調節に必要とされる配列をさらに明確に定めるため
に，成長ホルモンＴ3調節因子への核Ｔ3受容体の特異的
結合を証明する必要があった。ゲルシフトおよびフット
プリント検定によりＴ3受容体結合部位をマッピングす
る試みが初め不成功に終わったので，特異的結合を検出
する新しい検定法、アビジン−ビオチン複合ＤＮＡ結合
（ＡＢＣＤ）検定法、が創案された。第４３（Ａ）図に
示すような、いろいろな位置にビオチン−１１−dＵＴ
Ｐを有する、Ｔ3調節に必要なＧＨ遺伝子の５’側領域
を含む二本鎖オリゴヌクレオチドが作製された。初めに
−２０９位から−１４６位までの成長ホルモンゲノム配
列を含む７７bpオリゴヌクレオチド（Ｇ２０９−１４
６）を使用した。ＧＣ２核抽出物からのＴ3受容体は125
Ｉ−Ｔ3を用いて高い比活性へ標識し、そしてビオチニ
ル化オリゴヌクレオチドとインキュベートした。蛋白質
−ＤＮＡ複合体は、その結合反応後に、アガロースビー
ズに結合したストレプトアビジンを用いて溶液から沈澱
させた。第４３（Ｂ）図から明らかなように，プローブ
Ｇ２０９−１４６は 6900cpmの125Ｉ−Ｔ3活性の沈澱を
生じさせた。これは約3.2フェムトモルのＴ3受容体の結
合を表し、結合反応混合物中に存在する全Ｔ3受容体の
約４０％を占める。125Ｉ−Ｔ3標識受容体の沈澱はプロ
ーブ依存性であった；沈澱した125Ｉ−Ｔ3の全放射能の
＜１５％がＧ２０９−１４６の不在下で回収された。１
００倍過剰モル量の未標識Ｔ3の添加は沈澱した125Ｉ−
Ｔ3をバックグラウンドレベルにまで低下させ（第４３
（Ｂ）図）、このことはプローブによって沈澱されるは
ずのＴ3結合蛋白質が制限された量で存在していたこと
を示している。Ｔ3受容体−ＤＮＡ複合体の平衡結合定
数は１.４×１０-9Ｍであると概算された（データは示
さず）。
【０４７２】Ｇ２０９−１４６による標識Ｔ3受容体の
沈澱が特定のラットＧＨ配列に依存するかどうかを調べ
るために、成長ホルモンエンハンサーとの明らかな配列
類似性をもたないがＧ２０９−１４６と同じ長さであり
且つ同じ数のビオチン−１１−dＵＴＰ残基を含む一連
のビオチニル化プローブを作製した。第４３（Ｂ）図に
示すように、ＧＣ２核抽出物への１００ fmoｌの各プロ
ーブの添加は測定しうる125Ｉ−Ｔ3の沈澱を与えなかっ
た。これはＧ２０９−１４６による125Ｉ−Ｔ3の沈澱が
このプローブに含まれるラットＧＨ配列に依存すること
を示している。
【０４７３】（d）フットプリント分析 通常のフットプリント法を用いてＴ3受容体結合部位を
局在化するための初期の試みは成功しなかったが、ＡＢ
ＣＤ結合検定における緩衝条件の変化は、もしもＤＮＡ
結合のための塩およびpＨ条件が最適であるならば、粗
製核抽出物の場合にもフットプリントが達成しうること
を示唆した（データは示さず）。ＧＨエンハンサー末端
標識フラグメントはＧＣ２核抽出物とインキュベート
し、ＤＮアーゼＩで消化した。変性条件下での消化物の
ＰＡＧＥ分析（第４４図）は以前に記載された２つのフ
ットプリントを与え13’14；これらのうちの１つはヌク
レオチド−１７９と−１６４の間のアンチセンス鎖中の
１６bp保護領域により示される。センス鎖において５’
ＣＡＧＧＧＡＣＧＴＧＡＣＣＧＣＡ３’に相当するこの
配列は、Ｔ3受容体と特異的に結合するオリゴヌクレオ
チドプローブ中に含まれ、以前に同定されたＴ3依存性
ＤＮアーゼＩ高感受性部位19の位置に対応する。センス
鎖それ自体中にはっきりしたフットプリントは検出され
なかったが、それは主としてこのＧに富む領域における
ＤＮアーゼＩによる不完全消化のためである。
【０４７４】VI．Ｃ．Ｔ3オリゴヌクレオチドの機能性 ＧＨ遺伝子のＴ3調節におけるこの配列の機能を調べる
ために、特定部位の突然変異誘発を用いて野生型エンハ
ンサーから１１bpのフットプリントを欠失させた（突然
変異体Ｇデルタ１６６／１７７）。tkプロモーターに融
合した突然変異体Ｇデルタ１６６／１７７でトランスフ
ェクションした細胞へのＴ3の添加はＣＡＴの発現量に
何ら影響を及ぼさなかったが、野生型エンハンサーはＣ
ＡＴ発現を９倍刺激した（第４２（Ｂ）図）。従って、
オリゴヌクレオチドおよびＤＮアーゼＩ結合検定により
同定した推定上のＴ3受容体結合領域の除去は、tkプロ
モーターにＴ3調節を付与するＧＨエンハンサーの能力
を失わせた。
【０４７５】−１６４から−１７９位までの１６塩基対
が機能的なＴ3調節因子を構成することを証明するため
に、５’末端側および３’末端側にそれぞれ７塩基およ
び６塩基を付加したこの配列を含む二本鎖オリゴヌクレ
オチドが作製された。このオリゴヌクレオチドは、tkプ
ロモーターに近接して天然のままの向きで挿入した（構
築物Ｇ２９ＴＫ、第４２（Ｂ）図）。この構築物でトラ
ンスフェクションした細胞では、ＣＡＴ発現がＴ3によ
って２.９倍刺激された。この配列３つを直列に配置し
たもの（構築物Ｇ２９３ＴＫ）を挿入すると、Ｔ3によ
って５倍の刺激が生じた。
【０４７６】tkプロモーターへのＴ3 調節の転移のため
に使用した短いオリゴヌクレオチド（Ｇ１８６−１５
８）もまた、Ｇ２０９−１４６中の核Ｔ3受容体結合部
位と特異的に結合したが、これはヌクレオチド位置−１
７７から−２３５までのラットＧＨ配列を含むオリゴヌ
クレオチド（測定可能な量のＴ3受容体と結合しなかっ
た）を用いることにより失われた（データは示さず）。
非ビオチニル化Ｇ２０９−１４６およびＧ１８６−１５
８はまたビオチニル化Ｇ２０９−１４６とＴ3受容体と
の結合を競合させるべく使用した；Ｇ２０９−１４６に
対するＴ3受容体の相対親和性はＧ１８６−１５８より
も２〜３倍高かった（データは示さず）。短い方のプロ
ーブに対する明らかな親和性の低下は、Ｔ3受容体結合
反応に直接関与する塩基の欠乏により生ずるのかも知れ
ない。このことは、ＤＮアーゼＩフットプリントの境界
がこのプローブの両末端内にあるので、ありそうもな
い。その他に考えられることとして、ＧＣ２核抽出物は
長いプローブへのＴ3受容体の結合を安定化させる他の
因子を含むのかも知れない。
【０４７７】VI．Ｄ．要約および結論 これらの実験は、ＣＡＰ部位に対して５’側の−１６４
位から−１７９位まで延びる１６bpフットプリントを含
む２９塩基対のＧＨ遺伝子がＴ3受容体と結合し、ラッ
トＧＨエンハンサーのＴ3調節にとって必要であり、ま
たＴ3調節を tkプロモーターへ転移できることを証明し
た。ヒトc−erb−Ａがこの因子と結合するかどうかを試
験するために、in vivo 翻訳産物を35Ｓ−メチオニンで
標識した（実験の部IIIを参照）。この産物はＳＤＳゲ
ル電気泳動上で相対分子量（Ｍr）48000(４８ｋ)および
５２Ｋのダブレットとして泳動し、そして５×１０+11の
hd値でＴ3と結合した。ヒトc−erb−Ａ in vitro翻訳産
物のラットＧＨ Ｔ3調節因子を含むＧ２０９−１４６お
よびＧ１８６−１５８オリゴヌクレオチドプローブへの
結合は第４５図に示す。長いプローブおよび短いプロー
ブは両方ともin vitro翻訳産物と有意に結合したが，Ｇ
Ｈ遺伝子のＴ3受容体結合部位に対して相同性を欠くプ
ローブ(例えばＰ−ＥＧＦ)は結合しなかった。in vitro
翻訳混合物中に存在する〔35Ｓ〕メチオニンの概算上の
比活性に基づいて，第４５図に示した結合活性は１〜２
fmoｌの erb−Ａ蛋白質に相当する。125Ｉ−Ｔ3受容体
を含むＧＣ２細胞核抽出物と相違して、c−erb−Ａ in
vitro翻訳産物は長いオリゴヌクレオチドと短いオリゴ
ヌクレオチドの両方に同程度に結合した。類似のデータ
が125Ｉ−Ｔ3で標識したヒトc−erb−Ａのin vitro翻訳
産物を用いて得られた（データは示さず）。これらの結
果は、c−erb−Ａ遺伝子産物がＧＣ２核抽出物からのＴ
3受容体によって結合される同じＴ3調節配列と特異的に
結合することを示している。それらは、c−erb−Ａ遺伝
子産物の機能がＴ3の転写作用を仲介することであると
いう更なる証拠を提供する。
【０４７８】Ｆlugら（1987）は、ヌクレオチド位置−
２１０と−１８１の間のＧＨ配列が一時的にトランスフ
ェクションしたＧＣ細胞におけるＴ3の完全刺激作用に
不可欠であることを最近報告し、さらにこの領域がＴ3
調節される他の遺伝子に対し限られた類似性を保有する
ことを指摘した。我々の実験は、Ｔ3受容体−ＤＮＡ結
合部位をＣＡＰ部位から１６４bpと１７９bpの間に位置
づけ、さらにＧＨ遺伝子のＴ3調節におけるヌクレオチ
ド位置−２１０と−１８１の間の配列の機能的重要性に
ついて証明する。これは、我々がＴ3受容体源として粗
製核抽出物を用いてin vitro ＤＮＡ結合実験で観察し
たように、in vivoにおいてこの上流因子を含むＧＨエ
ンハンサーフラグメントに対するＴ3受容体の増大した
親和性を反映するのであろう。erb−Ａ in vitro翻訳産
物がＧ２０９−１４６およびＧ１８６−１５８と同程度
に結合するということは、粗製ＧＣ２核抽出物がヌクレ
オチド位置−２１０と−１８１の間の配列と結合し且つ
その結合部位に対するＴ3受容体の結合を安定化する別
の因子（１種または２種以上）を含む可能性と一致す
る。真核細胞の転写因子間の協同的相互作用は十分に確
立されている16-18；いくつかの場合において、これは
別の因子のＤＮＡ結合親和性を変更するある因子の能力
を反映している。この種の相互作用は甲状腺ホルモン作
用の組織特異的調節において重要であるだろう。5 '6こ
こで使用したＡＢＣＤ結合検定はこれらの問題を処理す
るのに有用であり、それはまた標識リガンド、化学的修
飾または標識アミノ酸によるin vitro翻訳を用いて選択
的に放射性標識しうるすべてのＤＮＡ結合蛋白質に応用
できるであろう。
【０４７９】VI．Ｅ．実験の部VIに関する図面の詳細な
説明 第４２（Ａ）,（Ｂ）および（Ｃ）図 ラットＧＨ５’−フランキング配列を含む種々の遺伝子
融合物の甲状腺ホルモン応答性。Ａ．ラットＧＨ遺伝子
の５’および３’欠失の応答性。ラットＧＨ遺伝子の
５’欠失フラグメントは、pＳＶ２ＣＡＴをベースとし
たベクター18(ＳＶ４０複製起点およびプロモーターを
除去したもの）中のＣＡＴ遺伝子に融合させた。これら
の構築物はＧＣ２細胞にトランスフェクションし、Ｔ3
に対する応答性について検定した。ヌクレオチド位置−
１０７ないし＋８および−１８１ないし＋８のフラグメ
ントの基礎発現は低レベルであるため、Ｔ3 によって調
節されないラットプロラクチンエンハンサー（Ｐrｌ）
11をこれらのフラグメントに近接して配置した。例示し
た３’欠失フラグメントは、−１９７位から＋５４位ま
でのtkプロモーターフラグメントに融合させ、同じベク
ター中のＣＡＴ遺伝子に近接して配置した。Ｂ．推定上
のＴ3 受容体結合部位の機能的分析。突然変異体Ｇデル
タ１７７／１６６はＣＡＰ部位から１７７−１６６塩基
対のＴ3 受容体結合部位の１１個の塩基の欠失を含む。
プラスミドＧ２９ＴＫおよびＧ２９３ＴＫは、それぞれ
１および３のコピー数で Ｔ3受容体と結合するラットＧ
Ｈ遺伝子の２８bp領域を含む。Ｔ3の作用は、１０-9Ｍ
Ｔ3 の存在下でのクロラムフェニコールの転化百分率を
Ｔ3の不在下でのその転化百分率で割ることにより決定
した。３通りのプレートはＤＥＡＥ−デキストラン11を
用いる被験プラスミドでのトランスフェクション前に、
イオン交換クロマトグラフィーでＴ3 を除いた１０％ウ
シ胎児血清中に２日間維持した。細胞はトランスフェク
ションの２４時間後にホルモンで処理し、Ｔ3暴露の２
４時間後にＣＡＴ活性について決定した。誤差限界は平
均値の標準誤差を表す。Ａn はＳＶ４０ポリアデニル化
部位を表す。Ｃ．メッセンジャーＲＮＡ転写開始部位の
分析。模式図はtkプロモーターを含むプラスミドの転写
物のＣＡＰ部位を決定するために用いられた。ＣＡＴコ
ード配列のヌクレオチド６７−８９に相補的な３３ヌク
レオチドプライマーを表す。ＧＣ細胞はパネルａおよび
ｂで示した実験において説明したように、被験プラスミ
ドでトランスフェクションし、ホルモン処理を行った。
プライマー伸長分析は５０μｇの全ＲＮＡに対して実施
した。レーンＡおよびＢはtkプロモーターに融合したＣ
ＡＰ部位から２３５−４５位に及ぶＧＨフラグメントを
含むプラスミドでトランスフェクションした細胞からの
伸長産物を表す。レーンＣおよびＤはtkプロモーターの
みを含むプラスミドでトランスフェクションした細胞か
らの伸長産物を表す。伸長産物は全く観察されなかっ
た。レーンＡおよびレーンＣに示した産物はＴ3 の不在
下でインキュベートした細胞からのものであり、そして
レーンＢおよびＤに示した産物は１０-9Ｍの濃度のＴ3
で処理した細胞からのものであった。レーンＥは(ヌク
レオチドの)サイズ測定のために使用したpＢＲ３２２の
ＨindIII消化物を示す。
【０４８０】第４２(Ａ),(Ｂ)および(Ｃ)図の方法 ＣＡＰ部位の−１.７kbから＋８bpまでのラットＧＨ遺
伝子の５'フランキング配列を含むＣＡＴ発現ベクター
の構築は開示されている。11ラットプロラクチンエンハ
ンサーを含む融合物は、プラスミド pＰＳＳ11からこの
フラグメント（ラットプロラクチン配列ヌクレオチド位
置１８３１−１５３０に相当する）を切り出し、それを
成長ホルモン因子の５’欠失物に近接して逆向きに挿入
することにより作製した。ＨＳＶtkプロモーターを含む
融合物は、プラスミド pＧＰＯ（文献１１参照）からＧ
Ｈエンハンサーのフラグメントを切り出し、それらを−
１９７位から＋５４位までのtkプロモーターに近接して
pＳＶ２ＣＡＴをベースとした発現ベクターのＢamＨＩ
およびＳaｌＩ部位に挿入することにより作製した。別
法として、ＧＨエンハンサーはＢamＨＩおよびＳaｌｌ
ポリリンカー部位に挿入することより、 pＵＣ８をベー
スとしたベクター20中の−１０７位から＋５４位のtkプ
ロモーターに近接して配置した。ＧＨエンハンサー因子
の特定部位突然変異誘発は、ＣＡＰ部位から２３５−４
５bpのフラグメントをＭ１３mp１８のＢamＨＩおよびＳ
aｌＩ部位に挿入することにより行った。アンチセンス
ＧＨヌクレオチド−１８８ないし−１５７に相当する２
１塩基オリゴヌクレオチド（ヌクレオチド−１７７ない
し−１６６を欠失させて、Ａヌクレオチドで置換したも
の）は合成した。このオリゴヌクレオチドを用いて、Ｋ
unkel の方法21によりＧＨエンハンサー中の塩基−１７
７から−１６６を欠失させた。ＣＡＴ活性は薄層クロマ
トグラフィー19後にメチル化クロラムフェニコール誘導
体のラジオアッセイにより測定した。プライマー伸長は
Ｅlsholtzらの方法12を用いた。
【０４８１】第４３(Ａ)および(Ｂ)図 ビチオン−１１−dＵＴＰを含むオリゴヌクレオチドプ
ローブへのＴ3受容体の結合。Ａ．ＧＨ５’−フランキ
ング配列へのＴ3受容体結合を検定するために用いた２
つのオリゴヌクレオチドプロ−ブの模式図。太い線、相
補的３’末端を有する合成オリゴヌクレオチド。細い
線、大腸菌ＤＮＡポリメラ−ゼの大フラグメントを用い
て５’突出部を修復することにより組込まれた塩基。星
印、ビオチン−１１−dＵＴＰ残基。ＢamＨＩおよびＢg
ｌII の制限部位も示される。Ｇ２０９−１４６および
Ｇ１８６−１５８は図示した５’および３’境界をもつ
ラットＧＨエンハンサ−配列を含む。Ｂ．種々のビオチ
ン−１１− dＵＴＰ含有オリゴヌクレオチドプロ−ブに
よるＧＣ２核抽出物からの125Ｉ−Ｔ3 標識Ｔ3受容体の
沈澱。Ｐ−ＥＧＦ、ＰＢ１−Ｂ、ＰＢ２−ＢおよびＰＢ
４−Ｂはそれぞれ１０、１１、１０および１０個のビオ
チン−１１ dＵＴＰを含む６８、５３、５５および５８
塩基対のオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌ
クレオチドはＧ２０９−１８６に含まれるラットＧＨ配
列に対して明らかに相同性を欠くラットプロラクチン遺
伝子の５’フランキング配列を含む。沈澱は１００フェ
ムトモルの各プロ−ブを用いて行った。ビオチニル化オ
リゴヌクレオチドプロ−ブの不在下でストレプトアビジ
ンアガロ−スビ−ズに付随する125Ｉ 活性を示すバック
グラウンドは、本実験において 1400 cpmであった。結
果は３通りのポイントの平均値および標準誤差としてプ
ロットした。本実験は125Ｉ−Ｔ3結合の配列特異性を調
べる６通りの実験を表す。
【０４８２】第４３（Ａ）および（Ｂ）図の方法 核はＤinghamらの技法22 に従ってラットＧＣ２細胞か
ら分離し，そして０.６Ｍ ＫＣｌ、１０mＭへペス（pＨ
７.９），０.５mＭジチオトレイトール(ＤＴＴ)、０.２
mＭ ＥＤＴＡ、２０μＭ Ｚn Ｃｌ2中で氷上にて３０分
間塩抽出した。その核抽出物は緩衝液Ａ（５０mＭ ＫＣ
ｌ、２０mＭ Ｋ3ＰＯ4（ pＨ７.４）、１mＭＭｇＣ
ｌ2，１mＭ β−メルカプトエタノ−ルおよび２０％グ
リセロ−ル）中でゲル濾過することにより脱塩し、−７
０℃で貯蔵した。ＧＣ２核受容体に対するＴ3の特異的
結合の検定はＳamuelsら23によって記載されたように行
われたが，ただし、Ｔ3結合反応は２００μｇ／mｌ ポ
リ(dＩ−dＣ)の存在下に緩衝液Ａ中で実施した。ＤＮＡ
結合を検定するために、初めに核抽出物を１μＭの12 5
Ｉ−Ｔ3（2200Ｃi／m moｌ）と２２℃で２０分間インキ
ュベートして、Ｔ3 受容体を高い比活性へ標識した。そ
の後、核抽出物のアリコート（４０μｌ）は２００μｌ
ポリ(dＩ−dＣ）の存在下にビオチニル化プローブと共
に２２℃で４０分間インキュベートした。蛋白質−ＤＮ
Ａ複合体はアガロースビーズ（ＢＲＬ）結合したストレ
プトアビジンを加えることにより沈澱させた。アガロー
スビーズをペレットとなし、緩衝液Ａ（１mｌ）で３回
洗い、その後125Ｉ活性について検定した。
【０４８３】第４４図 ＧＣ２核抽出物によるラットＧＨエンハンサー因子のＤ
ＮアーゼＩフットプリント。アンチセンス鎖中の１６bp
保護領域が示される。ＣＡＰ部位から−１１０位ないし
−１４０位まで延びる第二フットプリントもはっきりと
示される。レ−ンＡ−Ｃ、それぞれ２４，１２および４
μｇのＤＮア−ゼＩを用いた、ＧＣ２核抽出物とのイン
キュベ−ション後の標識ＧＨエンハンサーの消化。レ−
ンＤ−Ｆ、ＧＣ２核抽出物の不在下での２４，１２およ
び４μｇのＤＮア−ゼＩによる標識ＧＨエンハンサーの
消化。レ−ンＧおよびＭ、マ−カ−。表示した配列はフ
ットプリントされた領域内のセンス鎖の配列に相当す
る。
【０４８４】第４４図の方法 成長ホルモンエンハンサーのアンチセンス鎖は、pＧＰ
ＯのＢam ＨＩ消化およびウシ腸ホスファターゼ処理後
に、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてその５’末
端を32Ｐ−dＡＴＰで標識した。エンハンサーフラグメ
ントはＸhoＩ消化で pＧＰＯから切り離し、アガロース
ゲル電気泳動で精製した。標識ＧＨエンハンサーフラグ
メント（１nｇ，８fmoｌ）は１２ fmoｌの特異的Ｔ3受
容体結合活性を含む２５μｌのＧＣ２核抽出物とインキ
ュベートした。ＤＮＡ結合反応は緩衝液Ａ中２２℃で３
０分間行った。ＤＮアーゼ消化は最終容量５０μｌ中で
上記濃度のＤＮアーゼＩを用いて２２℃で２分間行っ
た。この反応は２０μｌの５０mＭＥＤＴＡおよび１％
ＳＤＳで停止させた。試料はフェノール／クロロホルム
で一回抽出し、エタノール沈澱させ、そして標準１０％
塩基配列決定用ゲル上で電気泳動により分析した。
【０４８５】第４５図 ラット下垂体細胞Ｔ3の６４bpおよび２９bpの５’側Ｇ
Ｈ配列を含むオリゴヌクレオチドへの結合。１００fmo
ｌのＧ２０９−１４６、Ｇ１８６−１５８またはＰ−Ｅ
ＧＦとインキュベートし、第VI−２（Ａ）および（Ｂ）
に記載の如く結合について検定した。また、35Ｓ−メチ
オニンで標識した hc−erb−Ａ in vitro翻訳産物（４
μｌ）は、１０nＭ Ｔ3の存在下でのこれらのオリゴヌ
クレオチドへの結合について検定した。hc−erb−Ａ in
vitro翻訳産物を調製するために、hc−erb−Ａ相補的
ＤＮＡのキャップ構造をもつｍＲＮＡ転写物を用いて、
ウサギ網状赤血球溶解液系10における翻訳をプログラミ
ングした。アンチセンス hc−erb−ＡｍＲＮＡを組み入
れた網状赤血球溶解液は、いずれのＧＨプローブにも測
定可能な結合活性を示さなかった（データは示さず）。
結果は３通りのポイントの平均値および標準誤差として
プロットした。示した実験は、２種類のＧＨプローブへ
のＧＣ２核Ｔ3受容体の結合を比較する３回の実験、お
よびhc−erb−Ａ in vitro翻訳産物の結合を調べる４
回の実験を代表するものである。
【０４８６】VI．Ｆ．実験の部VIで引用した文献 １．Ｅvans，Ｒ．Ｍ．，Ｂirnberg，Ｎ．Ｃ．，and Ｒ
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【０５０７】23．Ｓamuels，Ｈ.Ｈ.，Ｔsai，Ｊ.Ｓ.，
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【０５０８】実験の部VII 哺乳動物中枢神経系で発現された新規な甲状腺ホルモン
受容体の同定VII．Ａ．概要 ラット脳メッセンジャーＲＮＡから誘導された相補的Ｄ
ＮＡクローンは、ヒト甲状腺ホルモン受容体遺伝子に対
する相同性に基づいて分離された。この相補的ＤＮＡの
発現は甲状腺ホルモンに高い親和性を示す結合蛋白質を
もたらす。塩基配列の分析および特定のヒト遺伝子座へ
のこの遺伝子のマッピングは、複数のヒト甲状腺ホルモ
ン受容体の存在を示す。この遺伝子からのメッセンジャ
ーＲＮＡは組織特異的であり、中枢神経系において最高
レベルで発現される。
【０５０９】VII．Ｂ．序論 甲状腺ホルモンは高等脊椎動物の多くの組織において発
生学的および生理学的応答の複雑な機構に関与している
（１）。それらの多種多様な作用には重要な代謝酵素、
ホルモンおよび受容体の調節が含まれる（２）。甲状腺
ホルモンの作用は核受容体により仲介され、標的細胞に
よる特定遺伝子の発現を調節する（３−５）。これらの
性質はステロイドホルモンとそれらの受容体との相互作
用に類似しており、最近観察されたステロイドホルモン
受容体と甲状腺ホルモン受容体との構造類似性に合致し
ている（実験の部IIIを参照）。
【０５１０】VII．Ｃ．第２甲状腺ホルモン受容体ＤＮ
Ａの分離 甲状腺ホルモン作用の多様性にもかかわらず、一般に甲
状腺ホルモン機能は単一の高親和性核受容体を介して起
こることが認められている。しかしながら、v−erb−Ａ
腫瘍遺伝子産物の細胞相同体としての甲状腺ホルモン
受容体の最近の同定（実験の部IIIおよび文献７を参
照）は、ヒト染色体３および１７上の複数のc−erb−Ａ
遺伝子の先の同定（実験の部IIIおよび文献８を参照）
と合わせて、複数の甲状腺ホルモン受容体の存在を示唆
している。複数の甲状腺ホルモン応答の基礎をなす機構
が、構造的に異なる甲状腺ホルモン受容体の発現から誘
導されうる可能性を調べるために、我々はこれらの関連
遺伝子座の１つの産物をコードする相補的ＤＮＡ（cＤ
ＮＡ）クローンを分離した。
【０５１１】推定上の神経細胞型甲状腺ホルモン受容体
は、ヒト甲状腺ホルモン受容体ｃＤＮＡの１５００bpフ
ラグメントを用いて、ラット脳メッセンジャーＲＮＡ
（ｍＲＮＡ）から作製したｃＤＮＡライブラリーをスク
リーニングすることにより分離された。（文献６として
発表した実験の部IIIを参照されたい。）約１０6 個の
ファージから３個の陽性クローンを分離し、それらのう
ちで最も大きいもの、rbeＡ１２、の完全ヌクレオチド
配列を決定した（第４６（Ｂ）図）。この配列は２０７
９bpの鎖長であり、ヌクレオチド位置３２５にイニシエ
ーターメチオニンコドンおよびヌクレオチド位置１５５
４にターミネーターコドンを有する 1230bpの長いオー
プン・リーディング・フレーム（open reading fram
e）を含む。このオープン・リーディング・フレームは
推定上のイニシエーターメチオニンの上流に３つの短い
オープン・リーディング・フレームを含む少なくとも３
２０bpの５’非翻訳領域によって先行され、４１０個の
アミノ酸残基から成る蛋白質（計算した分子量４５Ｋ
Ｄ）をコードしている。
【０５１２】VII．Ｄ．第２甲状腺ホルモン受容体と他
の既知甲状腺ホルモン受容体蛋白質との比較 rbeＡ１２ からの推定アミノ酸配列とヒト甲状腺ホルモ
ン受容体のアミノ酸配列（実験の部IIIを参照）との比
較により、これらの２種類の蛋白質は異なるアミノ末端
をもつことが分った（第４７図）。神経細胞蛋白質の最
初の４１個のアミノ酸とヒト甲状腺ホルモン受容体の最
初の９０個のアミノ酸は有意な相同性を示さず、一方カ
ルボキシル末端の３６７個のアミノ酸は７５％のヌクレ
オチド同一性と８２％のアミノ酸同一性を共有してい
る。ラットの蛋白質は予告された大きなおよび相同性の
両方の点でニワトリの甲状腺ホルモン受容体（７）とよ
り一層関連が深く、８２％のヌクレオチド同一性と８９
％のアミノ酸同一性を共有している。参考として、ニワ
トリ甲状腺ホルモン受容体は以前に分離されたerb−Ａ
遺伝子との相同性ゆえにアルファ（cＴＲα）と称せら
れそして甲状腺ホルモン受容体はベ−タ（hＴＲβ）と
称せられる。ラット神経細胞型はニワトリの受容体とよ
り一層関連が深いので、それはアルファ（rＴＲα）と
呼ばれている。
【０５１３】ステロイドホルモン受容体との類似性によ
り、甲状腺ホルモン受容体のシステインに富む領域はＤ
ＮＡ結合ドメインであると予想される（実験の部IIIお
よびIIを参照；また文献１０を参照）。この領域におい
て、 rＴＲα蛋白質は cＴＲα蛋白質と９７％のアミノ
酸同一性を有し、そして hＴＲβと９０％のアミノ酸同
一性を有する。これらの蛋白質はまた、ステロイド受容
体から類推して、ホルモン結合ドメインであると思われ
るカルボキシル末端部分において十分に保存されている
（実験の部IIおよび文献１１を参照）。 rＴＲαのこの
領域は cＴＲαと９４％のアミノ酸同一性を示し、そし
て hＴＲβと８５％のアミノ酸同一性を示す。
【０５１４】VII．Ｅ．新しい甲状腺ホルモン受容体の
同定 塩基配列データに基づくと、我々が分離したｃＤＮＡは
以前に同定されたヒト甲状腺ホルモン受容体とは異なる
蛋白質をコードすると思われる（実験の部IIIを参
照）。神経細胞クローンが別の遺伝子産物であることを
立証するために、rbeＡ１２を用いてサザンブロットお
よび染色体分析によりヒト相同体を同定した。種々の制
限酵素で消化したヒト胎盤ＤＮＡはアガロースゲル上で
分離し、ニトロセルロースへ移行させ、そしてラットま
たはヒトＴＲ特異的プローブ（それぞれの遺伝子の重複
領域から誘導されたもの）とハイブリダイズさせた（第
４８（Ａ）および（Ｂ）図）。試験した全ての制限酵素
に対して異なるハイブリダイゼーションパターンが観察
され、このことは２つのｃＤＮＡが全く別の遺伝子であ
ることを示している。rbeＡ１２由来の同じプローブ
は、ヒトリンパ様細胞から調製したレーザー選別染色体
とハイブリダイズさせた（第４８（Ｃ）図）。ハイブリ
ダイゼーションは染色体１７にのみ観察され、c−erb−
Ａ遺伝子をヒト染色体１７に局在化した以前のマッピン
グ実験と一致した（８）。これはヒト染色体３に存在す
る hＴＲβと rＴＲαとを区別している（実験の部IIを
参照）。
【０５１５】VII．Ｆ．発現実験 rＴＲαｃＤＮＡが機能的な受容体蛋白質をコードする
か否かを調べるために、発現実験を行った。rＴＲの遺
伝子の産物は初めにin vitro 転写それに続くinvitro翻
訳により同定された。in vitro転写のために、rbeＡ１
２のＥcoＲＩ挿入物は、発現ベクターpＧＥＭ１にサブ
クローニングすることによりバクテリオファージＳＰ６
プロモーターへ連結した。第２構築物のrbeＡ１２Ｂは
翻訳効率を高める目的で作製された。ヌクレオチド位置
９７までの５’非翻訳領域は欠失させて、この領域内の
３つの短いオープン・リーディング・フレームのうち２
つを除去した。ＳＰ６ポリメラーゼを用いて合成した転
写物はウサギ網状赤血球溶解液と共に in vitro で翻訳
し、［35Ｓ］メチオニン標識産物をＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル上で分析した（第４９(Ａ)図）。約５２，
４８，３５および３３ＫＤの４種の蛋白質がセンス鎖を
翻訳したときだけ観察された。同じ４種のバンドがrbe
Ａ１２およびrbeＡ１２Ｂについて観察された。これら
の翻訳産物はその後甲状腺ホルモン結合を試験するため
に使用した。
【０５１６】VII．Ｇ．ホルモン結合実験 甲状腺ホルモン結合は〔125Ｉ〕３，５，３’−トリヨ
ード−Ｌ−チロニン(12 5Ｉ−Ｔ3）を用いて測定した。r
ＴＲαの特定蛋白質を含む試料のみがＴ3 結合を示し
た。ホルモン新和性はスカッチャード分析により決定
し、解離定数(Ｋd)２.９×１０-11Ｍを与え（第４９
（Ｂ）図）、これは hＴＲβ蛋白質について観察された
Ｋd値（５×１０-11Ｍ）と類似するが（４，５)、cＴＲ
α蛋白質に対して測定されたＫd 値（２.１×１０-10〜
３.３×１０-10 Ｍ）よりも低かった（実験の部IIIを参
照）。得られたＫd 値の差異は使用した検定系が異なる
ことによるのかも知れない。競合実験において、in vi
tro 翻訳したrＴＲα蛋白質はhＴＲβ蛋白質と同じくＬ
−Ｔ3およびＬ−チロキシン（Ｌ−Ｔ4）に対して特有の
新和性を示したが、３，５’，３’−トリヨードチロ酢
酸（ＴＲＩＡＣ）に対しては異なるパターンを示した
（第４９（Ｃ）図）。ＴＲＩＡＣは hＴＲβ蛋白質の場
合Ｔ3 結合に対して比較的良好に競合したが、 rＴＲα
蛋白質への結合に対してはＴ3とほぼ同程度に競合し
た。 hＴＲβおよび cＴＲαの蛋白質の場合のように、
過剰のアルドステロン、エストロゲン、プロゲステロ
ン、テストステロンまたはビタミンＤ1による rＴＲα
蛋白質へのＴ3結合に対する競合は見られなかった。従
って、我々は以前に開示された甲状腺ホルモン受容体と
類似した結合特性をもつが、それとは同一でない甲状腺
ホルモン受容体を単離したと思われる（実験の部IIIお
よび文献７を参照）。
【０５１７】VII．Ｈ．組織特異性実験 甲状腺ホルモンに対する代謝応答の組織特異性により、
この甲状腺ホルモン受容体は特定の組織において発現さ
れるものかも知れないと考えた。こうして、rＴＲα遺
伝子の発現パターンがノザンブロット分析により調べら
れた（第５０図）。いろいろなラット組織から分離した
全ＲＮＡはホルムアルデヒド−アガロ−スゲル上で分画
化し、ニトロセルロ−スへ移行させ、そしてサザンブロ
ット分析および染色体マッピングの際に使用したものと
同じ rbeＡ１２フラグメントとハイブリダイズさせた。
２.６Ｋb ＲＮＡ が肝臓を除いて試験した全ての組織に
観察された。このＲＮＡは下垂体や筋肉にも存在し、そ
してＧＣ、ラット−１およびＰＣ１２細胞株において発
現される。デンシトメ−タ−走査は、rＴＲαの発現レ
ベルが試験した他のどの組織よりも脳において１０〜２
０倍高いことを示した。約５.０Ｋbと６.０Ｋbの別の２
種類のＲＮＡが全ての組織にほぼ等しい量で存在する
が、それらは２.６Ｋb ＲＮＡ よりもはるかに少量であ
る。これらのバンドは２.６Ｋb ＲＮＡの前駆体または
関連遺伝子の産物でありうる。
【０５１８】VII．Ｉ．論議および結論 第２の哺乳動物甲状腺ホルモン受容体の分離は、以前の
生化学的研究が単一の甲状腺ホルモン受容体よりも多く
の受容体の存在を予告していないので、驚くべきことで
ある。振り返ってみると、多くの臨床生理学的研究は複
数の受容体の存在を示すものとして解釈することができ
る。機能的異質性の１つの形態は、家族性甲状腺ホルモ
ン抵抗（甲状腺ホルモンに対する末梢応答が喪失または
減少するが、神経細胞機能は維持される）を有する患者
の確認により示唆された（１２，１３）。さらに、循環
性甲状腺ホルモンの低レベルと関連した苛酷な発生学的
作用（クレチン病）は、神経系に強く影響を与えるタイ
プと周辺機能により劇的に作用するタイプとに分類され
た（１３，１４）。
【０５１９】構造的に異なる形の甲状腺ホルモン受容体
の存在を証明したのに加えて、我々が同定した受容体は
ラット中枢神経系において高レベルで発現される。in
situハイブリダイゼーションを利用する予備実験は海
馬、視床下部、大脳皮質および扁桃での高レベル発現を
明らかにした。ＲＮＡハイブリダイゼーション実験もま
た小脳において異例に高いレベルを示す。甲状腺ホルモ
ンは初期の脳発生において重要な役割を演ずることが知
られているが（１４）、この高レベル発現は予期されな
いことである。なぜならば、生化学的研究により、脳は
他の多くの組織よりも甲状腺ホルモン受容体が少なく
（５，１６）、しかも成人の脳はリン酸脱水素酵素活性
によって甲状腺ホルモンに応答しないことが示されたか
らである。（１７）。
【０５２０】発現実験からの第２の興味ある結果は、こ
の転写物が肝臓に存在しないということである。肝臓は
通常甲状腺ホルモン受容体が分離される組織である。こ
の不在はさらに別の形の甲状腺ホルモン受容体の存在を
暗示している。この提案は、肝臓と心臓に薬理学的に区
別しうる甲状腺ホルモン応答が存在することを示すＵnd
erwoodらのデータ（１８）と一致するであろう。さら
に、ＤＮＡハイブリダイゼーション実験からのデータ
は、哺乳動物甲状腺ホルモン受容体のｃＤＮＡクローン
とハイブリダイズする複数の遺伝子座の存在を示し、異
なる関連遺伝子座が５つも存在しうることを示唆する
（実験の部IIIおよび文献８を参照）。これらの遺伝子
座のいくつかは恐らく別の機能分子をコードすると思わ
れ、このことは発生およびホメオスタシス機能をコント
ロールする遺伝子の重なり合ったネットワークを協調的
に調整する甲状腺ホルモン受容体のファミリーの存在を
うかがわせる。
【０５２１】VII．Ｊ．実験の部VIIに関する図面の詳細
な説明 第４６（Ａ）および（Ｂ）図 ラット脳からの甲状腺ホルモン受容体ｃＤＮＡの制限地
図、ならびにヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列。
（Ａ）ラット脳からの甲状腺ホルモン受容体ｃＤＮＡの
模式図；通常の制限エンドヌクレアーゼ切断部位をいく
つか示す。斜線ボックスは推定されたコード領域を示
す。ハイブリダイゼーション実験で用いた５００bp Ｐv
uII フラグメント（ヌクレオチド位置６０７−１１１３
に相当する）は制限地図の下に実線で示す。（Ｂ）rbe
Ａ１２の完全なヌクレオチド配列を、長いオープン・リ
ーディング・フレーム上の推定アミノ酸配列と共に示
す。５’非翻訳領域内の３つの短いオープン・リーディ
ング・フレームは肉太の活字で示され、終結コドンには
アンダーラインが引いてある。クロ−ンrbeＡ１２はニ
ック・トランスレーションしたプローブとしてpheＡ４
（Ｓigma社）の全ＥcoＲＩ挿入物を用いて、Ｊ．Ａrriz
a から得たラット脳ｃＤＮＡライブラリーからの約１０
6 個のファージをスクリーニングすることにより分離し
た（１９）。３個の陽性クローンが分離され、そのうち
で最も大きいもの（rbeＡ１２）の完全ヌクレオチド配
列をＭaxam ＆ Ｇilbertの化学的切断法（２０）により
両鎖について決心した。
【０５２２】第４７図 ラット甲状腺ホルモン受容体（rＴＲα）蛋白質とヒト
甲状腺ホルモン受容体（hＴＲβ）およびニワトリ甲状
腺ホルモン受容体（cＴＲα）蛋白質との略図による比
較。ボックス上の番号はアミノ酸残基を示し；ボックス
内の数字は閉じた領域内の rＴＲα蛋白質とのアミノ酸
同一性のパーセントを示す。ＤＮＡはヒトグルココルチ
コイド受容体（アミノ酸４２１から４８６まで）との類
似性から推定されたＤＮＡ結合ドメインを表し、一方Ｔ
3／Ｔ4は推定上のホルモン結合ドメインを表す。
【０５２３】第４８（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）図 rＴＲα遺伝子のサザンブロット分析およびヒト染色体
局在化。ヒト胎盤ＤＮＡを種々の制限酵素で消化し、
０.８％ アガロースゲル上で分離し、ニトロセルロース
へ移行させ、ＤＮＡ結合領域を含むrbeＡ１２由来の５
００bp ＰvuIIフラグメント（Ａ）または hＴＲβ由来
の４５０bp ＳstＩフラグメント(実験の部IIIを参照）
（Ｂ）とハイブリダイズさせた。両ブロットは５０％ホ
ルムアミド、５×ＳＳＰＥ（０.１５Ｍ ＮaＣｌ、０.０
１Ｍ ＮaＨ2ＰＯ4、０.００１Ｍ ＥＤＴＡ）、１×デ
ンハート溶液、０．１％ＳＤＳ、およびサケ精子ＤＮＡ
（１００μｇ／ｍｌ）中４２℃でハイブリダイズさせ、
２×ＳＳＣ(standard saline citrate)および０.１％Ｓ
ＤＳを用いて６８℃で洗浄した。ラムダＨindIIIマーカ
ーのサイズをキロ塩基対で示す。（Ｃ）、 rＴＲα遺伝
子の染色体マッピング。ヒトリンパ球染色体をレーザー
サイトフルオロメトリー（２１）で分離し、上記条件と
同じ条件下でrbeＡ１２の５００bp ＰvuIIフラグメント
とハイブリダイズさせた。
【０５２４】第４９（Ａ），（Ｂ）および（Ｃ）図 rＴＲαのin vitro翻訳および甲状腺ホルモン結合。
（Ａ）rＴＲαはin vitroで転写し、ウサギ網状赤血球
溶解液中で翻訳した。［35Ｓ］メチオニン標識産物は
７.５％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、
フルオログラフィーで視覚化した。レーン１、添加ＲＮ
Ａなし；レーン２、全５'非翻訳領域を含むrbeＡ１２；
レーン３、９７bp の５’非翻訳配列のみを含む rbeＡ
１２Ｂ。蛋白質マーカーのサイズ：ウシ血清アルブミ
ン、６６．２ＫＤ；卵アルブミン、４５ＫＤ；カルボニ
ックアンヒドラーゼ、３１ＫＤ。（Ｂ）in vitro 翻訳
したrＴＲαに対する125Ｉ−Ｔ3結合のスカッチャード
分析。in vitro 翻訳したrbeＡ１２Ｂ転写物を含む溶解
液は、125Ｉ−Ｔ3の異なる濃度で結合したホルモン量を
測定することにより、甲状腺ホルモン結合活性について
検定した。Ｋd＝２.９×１０-11Ｍ。（Ｃ）in vitro翻
訳した rＴＲαへの125Ｉ−Ｔ3結合に対する甲状腺ホル
モン類似体の競合。rbeＡ１２Ｂ プログラム化溶解液か
らの試料は、標識ホルモンと競合させるべく次第に増加
する濃度の未標識甲状腺ホルモンまたは類似体と混合し
た。特異的に結合した125Ｉ−Ｔ3は競合化合物の濃度に
対してプロットする。４つの別々の実験において同じ競
合パターンが観察された。in vitro転写／翻訳およびホ
ルモン結合は記載した通りに行った（２２，２３）。白
の円はＴＲＩＡＣ、黒の円はＬ−Ｔ3、黒の三角形はＬ
−Ｔ4を表す。
【０５２５】第５０図 rＴＲαｍＲＮＡの組織分布。全ＲＮＡはグアニジンチ
オシアネートを用いて種々のラット組織から分離し（２
４）、１％アガロース／ホルムアルデヒドゲル上で分離
し、ニトロセルロースへ移行させ、そしてrbeＡ１２由
来のニック・トランスレーションした５００bp ＰvuII
フラグメントとハイブリダイズさせた。組織型および負
荷した全ＲＮＡ量を各レーンの上に示す。ＣＨＯ−Ｂの
ｃＤＮＡ（試験したすべての組織において等しいレベル
で発現されたチャイニーズハムスター卵巣細胞ｍＲＮ
Ａ）（２５）を内部標準として使用した。２８Ｓおよび
１８ＳリボソームＲＮＡの位置を示す。
【０５２６】VII．Ｋ．実験の部VIIで引用した文献 １．Ｗolff，Ｅ．Ｃ．and Ｗolff，Ｊ．in Ｔhe Ｔh
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【０５３０】５．Ｓchwartz，Ｈ.Ｌ.，and Ｏppenheim
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【０５３１】６．Ｗeinberger，Ｃ.，et al.，Ｎatur
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【０５３２】７．Ｓap，Ｊ．et al.，ibid.，p.635。
【０５３３】８．Ｓpurr，Ｎ.Ｋ.，et al．ＥＭＢＯ
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c．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．Ｕ.Ｓ.Ａ.，81：4495（198
4）； Ｊhanwar，Ｓ.Ｃ.，Ｃhaganti，Ｒ．Ｓ．Ｋ.，Ｃ
roce，Ｃ.Ｍ.，Ｓomaric ＣellＭol．Ｇenet．，11：9
9（1985）。
【０５３４】９．Ｇiguere，Ｖ.，Ｈollenberg，Ｓ.
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【０５３５】10．Ｈollenberg，Ｓ.Ｍ.，Ｇiguere，
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【０５３６】11．Ｋumar，Ｖ.，Ｇreen，Ｓ.，Ｓtaud，
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【０５３７】12．Ｍenezes−Ｆerreira，Ｍ．Ｍ．，Ｂi
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【０５３８】13．Ｂurrow，Ｇ.Ｎ.，in Ｅndocrinology
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【０５４０】15. Ｂayrs，Ｊ．Ｔ.,Ｂr.Ｊ．Ａnim．Ｂe
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【０５４１】16. Ｏppenheimer，Ｊ.Ｈ.,Ｓchwartz,Ｈ.
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【０５４２】17. Ｂarker，Ｓ.Ｐ．and Ｋlitgaard，
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0： 1427(1965)。
【０５４３】18. Ｕnderwood，Ａ．Ｈ．et al.,Ｎatur
e，324:425(1986)。
【０５４４】19. ラット脳ｃＤＮＡライブラリーは全ラ
イブラリー脳からオリゴ(ｄＴ)選別ＲＮＡを用いて作製
された。第１鎖合成のためにモロニーネズミ白血病ウイ
ルス（Ｍ−Ｍn ＬＶ）の逆転写酵素（ＲＴ）を使用し；
第２鎖合成はＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を使
用し、その後Ｍ−Ｍn ＬＶ ＲＴ−cＤＮＡはＳＩヌクレ
アーゼで処理し、メチル化し、セファロース４Ｂ上でサ
イズにより分画化し、ラムダgtIIアームへ連結し、そし
てパッケージングを行った。このライブラリーは５００
bp 以上の挿入物を含む２５×１０6個の独立した組換え
体から成る。
【０５４５】20. Ｍaxam，Ａ.Ｍ. and Ｇilbert,Ｗ.,Ｐ
roc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．Ｕ.Ｓ.Ａ.,74：560（197
7）。
【０５４６】21. Ｌebo，Ｒ．Ｖ.et al．,Ｓcience，2
25：57（1984）。
【０５４７】22. Ｋrieg，Ｐ．Ａ．and Ｍelton，Ｄ．
Ａ.,Ｎucleic Ａcids Ｒes，12：7057（1984）；Ｈoll
enberg，Ｓ.Ｍ．et al.，Ｎature，318：635（1985）。
【０５４８】23. in vitro転写のために、rbeＡ１２の
全ＥcoＲＩ挿入物は pＧＥＭ１(Promega Ｂiotec 社）
にクローニングした。２２７bpの５’非翻訳配列を欠く
第２構築物（rbeＡ１２Ｂ）は、Ｔ4ＤＮＡポリメラーゼ
修復したrbeＡ１２のＢglI−ＳmaＩフラグメント（ヌク
レオチド位置２２７からポリリンカーまで）を pＧＥＭ
３のＳmaＩ部位に挿入することにより作製した。甲状腺
ホルモン結合のために、転写はＳＰ６ポリメラーゼおよ
びＳstＩで線状化したrbe Ａ１２Ｂ５〜１０μgを用い
て行った。転写物はＰ６０クロマトグラフィーで精製
し、１５０〜２００μｌのウサギ網状赤血球溶解液（Ｐ
romege Ｂiotec社）中で製造者の指示した条件下に翻訳
した。スカッチード分析および競合分析の両方におい
て、甲状腺ホルモン結合は同じ方法で測定した（但し、
スカッチャード分析の場合には未標識蛋白質を使用し
た。）。〔125Ｉ〕３，３’５−トリヨードチロニン
（Ｎew EnglandＮuclear社、2220Ｃi／m mol、最終濃度
0.3nＭ）はＴ3結合緩衝液中でin vitro合成したrＴＲ
αポリペプチド（結合反応あたり溶解液２００μｌの５
〜８μｌ）と０℃で２時間２５０μｌの最終容量にて混
合した。特異的ホルモン結合は 1000倍過剰未標識ホル
モンを加えることにより測定し、セファデックスＧ−２
５ファイン（Ｐharmacia社）0.9×4.0cmカラムから排除
容量中に溶出される放射能をカウントすることにより検
定した。
【０５４９】24. Ｃhirgwin，Ｊ.Ｍ.,Ｐrzbyla，Ａ.
Ｆ.,ＭacDonald，Ｒ.Ｊ.，Ｒutter，Ｗ．Ｆ.，Ｂiochem
istry，18：5294（1974）。
【０５５０】25. Ｈarpold,Ｍ．Ｍ.,Ｅvans，Ｒ．Ｍ.,
Ｓalditt−Ｇoeorgieff，Ｍ.,Ｄarnell，Ｊ．Ｅ．，Ｃe
ll，17：1025（1979）。
【０５５１】明細書の要約 前述の説明により、当分野で通常の知識を有する者は、
本発明がグルココルチコイド受容体、ミネラルコルチコ
イド受容体または甲状腺ホルモン受容体のホルモン結合
特性および／または転写活性化特性を有する蛋白質をコ
ードする配列から成る実質的に純粋なＤＮＡを提供する
ことを理解できるであろう。本発明はまた本発明ＤＮＡ
の実例となる受容体配列を含む種々のプラスミドを提供
する。本発明の代表的なプラスミドは特許目的のために
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託
された。
【０５５２】本発明はさらに本発明ＤＮＡ（またはｍＲ
ＮＡ）から発現された受容体蛋白質（その修飾された機
能形体を含む）を提供する。
【０５５３】新規な受容体ＤＮＡ、ＲＮＡおよび蛋白質
組成物に加えて、本発明は受容体蛋白質の機能性を調べ
るためのバイオアッセイを包含する。それはまた遺伝子
工学的に処理された細胞において所望蛋白質を生産する
ための２つの新しい方法を包含する。第１の方法は受容
体と結合したホルモンによって転写が活性化される遺伝
子の転写を誘発する方法である。第２の方法は細胞を遺
伝子工学的に操作し、その後受容体蛋白質と結合したホ
ルモンによって転写が活性化される遺伝子によりコード
される蛋白質の生産を増大し且つ制御する方法である。
【０５５４】本発明ＤＮＡは、ホルモン受容体蛋白質お
よびその機能的修飾体を以前には不可能であった量で生
産させるべく使用できる。本発明の結果として利用し得
る受容体の量を用いれば、今やこの蛋白質の詳細な構造
解析が受容体結晶を分析するＸ線回折法により可能であ
る。さらに、受容体体蛋白質の十分な供給は、重合体−
アゴニストまたは受容体−アンタゴニスト活性について
多くの化合物をスクリーニングするために、それらを使
用しうることを意味している。また、受容体蛋白質の利
用可能性は、診断検定においてそれらを使用しうること
を意味している。
【０５５５】本発明の精神および範囲から逸脱すること
なく、当業者は多種多様の用法および条件に適合させる
べく本発明をいろいろに変更および修飾することができ
る。これらの変更および修飾は当然であり、公正であ
り、そして次の請求の範囲の均等の範囲内に含まれるも
のである。
【０５５６】
【配列表】
【０５５７】配列番号：１ 配列の長さ：４５６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 ハイポセティカル：ＹＥＳ 配列：
【０５５８】配列番号：２ 配列の長さ：４８７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 ハイポセティカル：ＹＥＳ 配列：
【０５５９】配列番号：３ 配列の長さ：１７１０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列：
【０５６０】配列番号：４ 配列の長さ：１９８０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 配列：
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ヒトグルココルチコイド受容体ｃＤ
ＮＡ配列決定法を示す図である。
【図２】 図２は、ヒトグルココルチコイド受容体ｃＤ
ＮＡクローンの模式図を示す図である。
【図３】 図３は、ヒトグルココルチコイド受容体（ｈ
ＧＲ）のｃＤＮＡおよび推定一次蛋白質配列を示す図で
ある。（配列Ｉ−２は２部分に分かれている：図３およ
び図４）。
【図４】 図４は、ヒトグルココルチコイド受容体（ｈ
ＧＲ）のｃＤＮＡおよび推定一次蛋白質配列を示す図で
ある。（配列Ｉ−２は２部分に分かれている：図３およ
び図４）。
【図５】 図５Ａは、ヒトグルココルチコイド受容体β
−ｃＤＮＡ（β−ｈＧＲ）の３’末端の制限地図を示す
図である。図５Ｂは、ヒトグルココルチコイド受容体β
−ｃＤＮＡ（β−ｈＧＲ）の３’末端のヌクレオチド配
列を示す図である。
【図６】 図６ＡおよびＢは、インビトロで翻訳された
ｈＧＲと細胞抽出物からのインビボｈＧＲとのイムノブ
ロット比較に関する図である。図６Ａは、ｈＧＲｃＤＮ
Ａ配列のインビトロ転写のために構成されたベクターを
示す図である。図６Ｂは、インビトロ翻訳生成物および
細胞抽出物のウェスターンブロット分析を示す、電気泳
動を表す写真図面である。
【図７】 図７は、インビトロで翻訳されたアルファ−
ｈＧＲ（ＧＲ１０７）のステロイド結合を示すグラフで
ある。
【図８】 図８Ａは、発現プラスミド pＧＥＲＲ１の模
式図である。図８Ｂは、発現プラスミド pＧＥＲＲ２の
模式図である。プラスミド pＧＥＲＲ１はエストロゲン
関連受容体ｈＧＲＲ１の発現に用いられ； pＧＥＲＲ２
はｈＥＲＲ２の発現に用いられた。
【図９】 図９は、ｈＧＲ機能的アッセイ法を模式的に
表わした図である。
【図１０】 図１０は、ｈＧＲ蛋白質の発現を表わすウ
ェスタンブロット分析を示す、電気泳動を表す写真図面
である。
【図１１】 図１１は、ｈＧＲによるＣＡＴ活性の誘導
を示すブロットを示す、電気泳動を表す写真図面であ
る。
【図１２】 図１２ＡおよびＢは、ｈＧＲによるＣＡＴ
活性の誘導を示すグラフである。図１２Ａは、ｐＲＳｈ
ＧＲαのＤＥＸに対する用量応答を示し、図１２Ｂはｐ
ＲＳｈＧＲαの滴定を示す。
【図１３】 図１３は、ｈＧＲにおける機能区の位置を
示す模式図である。
【図１４】 図１４は、ヒト胎盤 c−erb−ＡｃＤＮＡ
の制限地図および配列決定法を示す図である。
【図１５】 図１５は、ヒト胎盤 c−erb−ＡｃＤＮＡ
のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す。（配列
III−１Ｂは２部分に分かれている：図１５および図１
６）。
【図１６】 図１６は、ヒト胎盤 c−erb−ＡｃＤＮＡ
のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す。（配列
III−１Ｂは２部分に分かれている：図１５および図１
６）。
【図１７】 図１７は、v−erb−Ａ発癌遺伝子生成物、
ヒト胎盤 c−erb−Ａポリペプチド、ならびにヒトグル
ココルチコイドおよびエストロゲン受容体のカルボキシ
末端部分間のアミノ酸配列比較を示す図である。
【図１８】 図１８Ａ、ＢおよびＣは、c−erb−Ａ Ｄ
ＮＡプローブによるヒト胎盤ＤＮＡのサザーン分析およ
び染色体マッピングを示すブロットを示す、電気泳動を
表す写真図面である。図１８Ａは、エンドヌクレアーゼ
により消化し、アガロースゲル上で分離したヒト満期胎
盤ＤＮＡを示す。図１８Ｂは、c−erb−Ａ をプローブ
として用いた胎盤ＤＮＡの分析を示す。図１８Ｃは、ヒ
ト c−e rb−Ａ 遺伝子の染色体マッピングを示す。
【図１９】 図１９ＡおよびＢは、ヒト c−erb−Ａ 発
現を示す、電気泳動を表す写真図面である。図１９Ａ
は、ヒト細胞系およびヒト胎盤から得たＲＮＡのノーザ
ン分析を示すブロットである。図１９Ｂは、インビトロ
における erb−Ａポリペプチドの合成を示す。
【図２０】 図２０Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、インビトロ
で合成された erb−Ａポリペプチドへの甲状腺ホルモン
の結合に関連する４種のグラフである。図２０Ａは、イ
ンビトロで形成された erb−Ａポリペプチドへの125Ｉ
−Ｔ3の結合のスカッチャード（Ｓcatchard）分析であ
る。図２０Ｂは、インビトロにおける甲状腺ホルモン同
族体の競合を示す。図２０Ｃは、インビトロで合成され
た erb−Ａポリペプチドへの125Ｉ−Ｔ3結合に対するト
リヨードチロニン異性体の競合を示す。図２０Ｄは、0.
4 ＫＣｌＨeＬa 細胞核抽出物への125Ｉ−Ｔ3結合に対
する甲状腺ホルモン同族体の競合を示す。
【図２１】 図２１は、ステロイドホルモンおよび甲状
腺ホルモン受容体を比較した模式図である。
【図２２】 図２２は、ヒト甲状腺ホルモン受容体ｈＥ
ＲＢＡ 8.7のｃＤＮＡヌクレオチド配列および推定一次
蛋白質配列を示す図である。（甲状腺ホルモン受容体 h
ＦＡ８の配列はｈＥＲＢＡ 8.7に関連がある。発明の説
明の項を参照されたい）。
【図２３】 図２３Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、ｈＧＲ遺伝
子に関連するゲノム配列の単離に関する図である。図２
３Ａは、指示されたヌクレアーゼにより消化したヒト胎
盤ＤＮＡの高ストリンジェンシーサザーン分析を示す、
電気泳動を表す写真図面である。図２３Ｂは、指示され
たヌクレアーゼにより消化したヒト胎盤ＤＮＡの低スト
リンジェンシーサザーン分析を示す、電気泳動を表す写
真図面である。図２３Ｃ図は、ラムダＨＧＨと表示され
るクローンにおけるゲノム配列の単離を示すサザーンブ
ロットを示す、電気泳動を表す写真図面である。図２３
Ｄは、ラムダＨＧＨゲノム断片のイントロン−エクソン
構造およびそれとｈＧＲとの相同を示す模式図である。
【図２４】 図２４は、ヒトミネラロコルチコイド受容
体のｃＤＮＡの若干の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位
の線図と並んだｈＭＲの複合構造を示す。
【図２５】 図２５は、ヒトミネラロコルチコイド受容
体のｃＤＮＡの全ヌクレオチド配列およびその一次推定
アミノ酸配列を示す。（配列IV−２は２部分に分かれて
いる：図２５および図２６）。
【図２６】 図２６は、ヒトミネラロコルチコイド受容
体のｃＤＮＡの全ヌクレオチド配列およびその一次推定
アミノ酸配列を示す。（配列IV−２は２部分に分かれて
いる：図２５および図２６）。
【図２７】 図２７は、ミネラロコルチコイド受容体と
グルココルチコイド受容体のアミノ酸相同を示す図であ
る。
【図２８】 図２８Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、発現したｈ
ＭＲのステロイド結合特性に関する図および３種のグラ
フである。図２８Ａは、発現プラスミドｐＲＳｈＭＲ、
すなわちｈＭＲの発現に用いたプラスミドの構造を示
す。図２８Ｂは、ｐＲＳｈＭＲトランスフェクションし
たＣＯＳ細胞から調製した抽出物におけるトリチウム化
アルドステロン結合のスカッチャード分析を示す。図２
８ＣおよびＤは、トランスフェクションしたＣＯＳ細胞
における［3Ｈ］アルドステロンとの結合に対する非標
識ステロイド類の競合を示すグラフである。
【図２９】 図２９Ａ、ＢおよびＣは、トランスフェク
ションしたＣＶ−１細胞におけるｈＭＲおよびｈＧＲ発
現プラスミドによる ＭＭＴＶ ＬＴＲの転写活性化を示
す図である。図２９Ａは、プラスミドＧＭＣＡＴの模式
図である。図２９Ｂは、正常血清によるｈＭＲまたはｈ
ＧＲトランスフェクション後に見られたＣＡＴ酵素活性
の差を示すブロットを示す、電気泳動を表す写真図面で
ある。図２９Ｃは、ｈＭＲまたはｈＧＲによりトランス
フェクションした細胞における、アルドステロンまたは
デキサメタゾンによるＣＡＴ活性誘導の差を示すブロッ
トを示す、電気泳動を表す写真図面である。
【図３０】 図３０は、ラット組織におけるミネラロコ
ルチコイド受容体ｍＲＮＡのノーザーン分析を示すブロ
ットを示す、電気泳動を表す写真図面である。
【図３１】 図３１は、マイクロセルハイブリッドのサ
ザーン分析によるｈＭＲ遺伝子の染色体局在を示す、電
気泳動を表す写真図面である。
【図３２】 図３２は、ｈＧＲ，ｈＭＲおよび hＰＲ構
造のアミノ酸比較を示す模式図である。
【図３３】 図３３は、ｈＥＲＲ１のｃＤＮＡの若干の
制限エンドヌクレアーゼ開裂部位の線図と並んだｈＥＲ
Ｒ１の複合構造を示す。
【図３４】 図３４は、ｈＥＲＲ１のｃＤＮＡの全ヌク
レオチド配列およびその一次推定アミノ酸配列を示す。
（配列V−１（Ｂ）は２部分に分れている：図３４およ
び図３５）。
【図３５】 図３５は、ｈＥＲＲ１のｃＤＮＡの全ヌク
レオチド配列およびその一次推定アミノ酸配列を示す。
（配列V−１（Ｂ）は２部分に分れている：図３４およ
び図３５）。
【図３６】 図３６は、ｈＥＲＲ２のｃＤＮＡの若干の
制限エンドヌクレアーゼ開裂部位の線図と並んだｈＥＲ
Ｒ２の複合構造を示す。
【図３７】 図３７は、ｈＥＲＲ２のｃＤＮＡの全ヌク
レオチド配列およびその一次推定アミノ酸配列を示す。
（配列V−２（Ｂ）は２部分に分れている：図３７およ
び図３８）。
【図３８】 図３８は、ｈＥＲＲ２のｃＤＮＡの全ヌク
レオチド配列およびその一次推定アミノ酸配列を示す。
（配列V−２（Ｂ）は２部分に分れている：図３７およ
び図３８）。
【図３９】 図３９は、ｈＥＲＲ１，ｈＥＲＲ２，ヒト
エストロゲンおよびグルココルチコイド受容体のカルボ
キシ末端領域間のアミノ酸配列比較を示す図である。
【図４０】 図４０Ａは、ラットおよびヒトの組織にお
けるｈＥＲＲ１ｍＲＮＡのノーザンブロットハイブリダ
イゼーション分析を示す、電気泳動を表す写真図面であ
る。図４０Ｂは、ラットおよびヒトの組織におけるｈＥ
ＲＲ２ｍＲＮＡのノーザンブロットハイブリダイゼーシ
ョン分析を示す、電気泳動を表す写真図面である。
【図４１】 図４１は、ｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２,
ｈＥＲおよびヒト甲状腺ホルモン受容体（hＴ3Ｒβ）の
間のアミノ酸の比較を示す図である。
【図４２】 図４２Ａ、ＢおよびＣは、ラットＧＨ５’
側非翻訳配列を含む種々の遺伝子融合体の甲状腺ホルモ
ン応答性に関する図である。図４２Ａは、ラットＧＨ遺
伝子の５’側および３’側欠失体の応答性を示す図であ
る。図４２Ｂは、推定Ｔ3 受容体結合部位の機能分析を
示す図である。図４２Ｃは、ｍＲＮＡ転写開始部位分析
を示す、電気泳動を表す写真図面である。
【図４３】 図４３ＡおよびＢは、ビオチン−１１− d
ＵＴＰを含むオリゴヌクレオチドプローブへのＴ3 受容
体の結合に関する図である。図４３Ａは、ＧＨ５’側非
翻訳配列へのＴ3 受容体の結合をアッセイするために用
いられる２種のオリゴヌクレオチドプローブの模式図で
ある。図４３Ｂは、各種オリゴヌクレオチドプローブに
よる、ＧＣ２核抽出物からの 125Ｉ−Ｔ3標識Ｔ3受容体
の沈殿を示すグラフである。
【図４４】 図４４は、ＧＣ２核抽出物によるラットＧ
Ｈエンハンサー要素のＤＮアーゼＩフットプリンティン
グ（footprinting）を示す、電気泳動を表す写真図面で
ある。
【図４５】 図４５は、６４および２９塩基対を含むオ
リゴヌクレオチドへの、ラット下垂体細胞Ｔ3受容体お
よびhc−erb−Ａインビトロ翻訳生成物の５’側非翻訳
ＧＨ配列の結合を示すグラフである。
【図４６】 図４６Ａは、ラット脳クローン rbeＡ１２
由来の甲状腺ホルモン受容体ｃＤＮＡの制限地図であ
る。図４６Ｂは、ラット脳クローン rbeＡ１２由来の甲
状腺ホルモン受容体ｃＤＮＡのヌクレオチドおよび推定
アミノ酸配列を示す模式図である。
【図４７】 図４７は、ラット甲状腺ホルモン受容体
（rＴＲアルファ)蛋白質をヒト甲状腺ホルモン受容体
（hＴＲベータ）およびニワトリ甲状腺ホルモン受容体
（cＴＲアルファ)蛋白質と比較した模式図である。
【図４８】 図４８Ａ、ＢおよびＣは、rＴＲアルファ
遺伝子のサザーンブロット分析およびヒト染色体局在を
示す、電気泳動を表す写真図面である。図４８Ａは、rb
eＡ１２由来の５００−bp ＰvuII断片にハイブリダイズ
したヒト胎盤ＤＮＡを示すブロットである。図４８Ｂ
は、hＴＲベータ由来の４５０−bp ＳstＩ断片にハイブ
リダイズした胎盤ＤＮＡを示す。図４８Ｃは、rＴＲア
ルファ遺伝子の染色体マッピングを示す。
【図４９】 図４９Ａ、ＢおよびＣは、rＴＲアルファ
のインビトロ翻訳および甲状腺ホルモン結合に関する図
である。図４９Ａは、rＴＲアルファのインビトロ翻訳
生成物を示すＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの、電気
泳動を表す写真図面である。図４９Ｂは、インビトロ翻
訳された rＴＲアルファへの125Ｉ−Ｔ3結合のスカッチ
ャード分析を示すグラフである。図４９Ｃは、インビト
ロ翻訳された rＴＲアルファへの 125Ｉ−Ｔ3 結合に対
する甲状腺ホルモン同族体の競合を示すグラフである。
【図５０】 図５０は、rＴＲアルファｍＲＮＡの組織
分布を示すゲルの、電気泳動を表す写真図面である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (71)出願人 596086505 10010 Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉ ｎｅｓ Ｒｏａｄ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃ ａｌｉｆｏｒｎｉａ 92037，Ｕｎｉｔｅ ｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (72)発明者 エバンズ，ロナルド・マーク アメリカ合衆国カリフォルニア州92110, サン・ディエゴ，クラーク・ストリート 3702 (72)発明者 ウェインバーガー，キャリー・エイ アメリカ合衆国メリーランド州20906，シ ルバー・スプリング，デールウッド・ドラ イブ 12620 (72)発明者 ホーレンバーグ，スタンレイ・マーク アメリカ合衆国カリフォルニア州92122, サン・ディエゴ，カミノ・ジョネート 7894 (72)発明者 ギグエル，ビンセント アメリカ合衆国カリフォルニア州92122, サン・ディエゴ，レボン・ドライブ 3425，ナンバー 731 (72)発明者 アリザ，ジェフリー・ルイス アメリカ合衆国カリフォルニア州92008, カールスバッド，レッドウッド 331 (72)発明者 トンプソン，キャサリン・キャロライン アメリカ合衆国カリフォルニア州92037, ラ・ホーラ，ミラマー・ストリート 3903 (72)発明者 オング，エステリタ・セバスティアン アメリカ合衆国カリフォルニア州92117, サン・ディエゴ，ハノン・コート 6307

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 次の（ａ）〜（ｄ）のいずれかの蛋白
    質： （ａ） 配列番号１に規定されるアミノ酸配列からなる
    蛋白質； （ｂ） アミノ酸配列（ａ）において１もしくは複数の
    アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
    からなり、かつ甲状腺ホルモン受容体に特有のホルモン
    結合特性および／または転写活性化特性を有する蛋白
    質； （ｃ） 配列番号２に規定されるアミノ酸配列からなる
    蛋白質； （ｄ） アミノ酸配列（ｃ）において１もしくは複数の
    アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
    からなり、かつ甲状腺ホルモン受容体に特有のホルモン
    結合特性および／または転写活性化特性を有する蛋白
    質；をコードするＤＮＡ。
  2. 【請求項２】 哺乳類または鳥類の甲状腺ホルモン受容
    体に特有のホルモン結合特性および／または転写活性化
    特性を有する蛋白質をコードする、請求項１に記載のＤ
    ＮＡ。
  3. 【請求項３】 ヒト甲状腺ホルモン受容体に特有のホル
    モン結合特性および／または転写活性化特性を有する蛋
    白質をコードする、請求項２に記載のＤＮＡ。
  4. 【請求項４】 甲状腺ホルモン受容体がヒト甲状腺ホル
    モン受容体アルファおよびヒト甲状腺ホルモン受容体ベ
    ータよりなる群から選ばれる、請求項３に記載のＤＮ
    Ａ。
  5. 【請求項５】 ヒト甲状腺ホルモン受容体c−erb−Ａを
    コードするＤＮＡを保有するプラスミドｐｅＡ１０１
    （ＡＴＣＣ ＃６７２４４）、ラット甲状腺ホルモン受
    容体をコードするＤＮＡを保有するプラスミドｒｂｅＡ
    １２（ＡＴＣＣ＃６７２８１）、ヒト甲状腺ホルモン受
    容体をコードするＤＮＡを保有するプラスミドｐｈＥＲ
    ＢＡ８．７（ＡＴＣＣ ＃４０３７４）、およびヒト甲
    状腺ホルモン受容体をコードするＤＮＡを保有するプラ
    スミドｐｈＦＡ８（ＡＴＣＣ＃４０３７２）よりなる群
    から選ばれるプラスミド。
  6. 【請求項６】 （ｉ）翻訳終止コドンに相当する１トリ
    プレットであって、翻訳開始コドンに相当するトリプレ
    ットと同じリーディングフレーム内にあり、かつ翻訳開
    始コドンに相当するトリプレットの下流にあるもの、な
    らびに（ｉｉ）最長オープンリーディングフレームとし
    て、次の（ａ）〜（ｄ）のいずれかの蛋白質： （ａ） 配列番号１に規定されるアミノ酸配列からなる
    蛋白質； （ｂ） アミノ酸配列（ａ）において１もしくは複数の
    アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
    からなり、かつ甲状腺ホルモン受容体に特有のホルモン
    結合特性および／または転写活性化特性を有する蛋白
    質； （ｃ） 配列番号２に規定されるアミノ酸配列からなる
    蛋白質； （ｄ） アミノ酸配列（ｃ）において１もしくは複数の
    アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
    からなり、かつ甲状腺ホルモン受容体に特有のホルモン
    結合特性および／または転写活性化特性を有する蛋白
    質；をコードする配列を有する実質的に純粋なセグメン
    トを含むＤＮＡセグメント。
  7. 【請求項７】 ヒト甲状腺ホルモン受容体がｈＥＲＢＡ
    ８．７、ｈＦＡ８、およびｐｅＡ１０１として知られる
    ＤＮＡよりなる群から選ばれるアルファまたはベータ受
    容体である、請求項６に記載の実質的に純粋なＤＮＡセ
    グメント。
  8. 【請求項８】 配列番号３に規定されるＤＮＡ配列およ
    び配列番号４に規定されるＤＮＡ配列よりなるＤＮＡ配
    列群から選ばれる実質的に純粋なＤＮＡ。
  9. 【請求項９】 次の（ａ）〜（ｄ）のいずれかの蛋白
    質： （ａ） 配列番号１に規定されるアミノ酸配列からなる
    蛋白質； （ｂ） アミノ酸配列（ａ）において１もしくは複数の
    アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
    からなり、かつ甲状腺ホルモン受容体に特有のホルモン
    結合特性および／または転写活性化特性を有する蛋白
    質； （ｃ） 配列番号２に規定されるアミノ酸配列からなる
    蛋白質； （ｄ） アミノ酸配列（ｃ）において１もしくは複数の
    アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
    からなり、かつ甲状腺ホルモン受容体に特有のホルモン
    結合特性および／または転写活性化特性を有する蛋白
    質；をコードするＤＮＡと実質的な配列相同性を有する
    ＤＮＡ。
  10. 【請求項１０】 次の（ａ）〜（ｄ）のいずれかの蛋白
    質： （ａ） 配列番号１に規定されるアミノ酸配列からなる
    蛋白質； （ｂ） アミノ酸配列（ａ）において１もしくは複数の
    アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
    からなり、かつ甲状腺ホルモン受容体に特有のホルモン
    結合特性および／または転写活性化特性を有する蛋白
    質； （ｃ） 配列番号２に規定されるアミノ酸配列からなる
    蛋白質； （ｄ） アミノ酸配列（ｃ）において１もしくは複数の
    アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
    からなり、かつ甲状腺ホルモン受容体に特有のホルモン
    結合特性および／または転写活性化特性を有する蛋白
    質；をコードするＤＮＡのいずれかの変異体。
  11. 【請求項１１】 次の（ａ）〜（ｄ）のいずれかの蛋白
    質： （ａ） 配列番号１に規定されるアミノ酸配列からなる
    蛋白質； （ｂ） アミノ酸配列（ａ）において１もしくは複数の
    アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
    からなり、かつ甲状腺ホルモン受容体に特有のホルモン
    結合特性および／または転写活性化特性を有する蛋白
    質； （ｃ） 配列番号２に規定されるアミノ酸配列からなる
    蛋白質； （ｄ） アミノ酸配列（ｃ）において１もしくは複数の
    アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
    からなり、かつ甲状腺ホルモン受容体に特有のホルモン
    結合特性および／または転写活性化特性を有する蛋白
    質；をコードするＤＮＡのいずれかから転写されたｍＲ
    ＮＡ。
  12. 【請求項１２】 次の（ａ）〜（ｄ）のいずれかの蛋白
    質： （ａ） 配列番号１に規定されるアミノ酸配列からなる
    蛋白質； （ｂ） アミノ酸配列（ａ）において１もしくは複数の
    アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
    からなり、かつ甲状腺ホルモン受容体に特有のホルモン
    結合特性および／または転写活性化特性を有する蛋白
    質； （ｃ） 配列番号２に規定されるアミノ酸配列からなる
    蛋白質； （ｄ） アミノ酸配列（ｃ）において１もしくは複数の
    アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
    からなり、かつ甲状腺ホルモン受容体に特有のホルモン
    結合特性および／または転写活性化特性を有する蛋白
    質；をコードするＤＮＡにより形質転換された細胞。
  13. 【請求項１３】 甲状腺ホルモン受容体（Ｒ）またはそ
    の工学的に処理された、修飾された機能性形態（ｒ）の
    機能性を測定するためのバイオアッセイ法であって、 （１） 受容体陰性の細胞中へ、作動性レポーター遺伝
    子に機能性結合した本質的に作動性ホルモン応答性プロ
    モーター／エンハンサー要素からなる１プラスミド、お
    よび本質的に、ホルモン受容体蛋白質（Ｒ）またはその
    修飾された機能性形態（ｒ）をコードする作動性ＤＮＡ
    配列からなる２の受容体発現プラスミドを共トランスフ
    ェクションし、ここで、該作動性ＤＮＡ配列は次の
    （ａ）〜（ｄ）のいずれかの蛋白質： （ａ） 配列番号１に規定されるアミノ酸配列からなる
    蛋白質； （ｂ） アミノ酸配列（ａ）において１もしくは複数の
    アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
    からなり、かつ甲状腺ホルモン受容体に特有のホルモン
    結合特性および／または転写活性化特性を有する蛋白
    質； （ｃ） 配列番号２に規定されるアミノ酸配列からなる
    蛋白質； （ｄ） アミノ酸配列（ｃ）において１もしくは複数の
    アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
    からなり、かつ甲状腺ホルモン受容体に特有のホルモン
    結合特性および／または転写活性化特性を有する蛋白
    質；をコードするＤＮＡを含み、 （２） 工程（１）で得た共トランスフェクションされ
    た細胞を、１プラスミドのホルモン応答性プロモーター
    ／エンハンサー要素を活性化しうるホルモンまたはその
    同族体の存在下または不在下に培養し、 （３） 該細胞において上記レポーター遺伝子のＤＮＡ
    配列の生成物の誘導を監視し、そして （４） 該細胞において、上記２プラスミドのＤＮＡ配
    列によりコードされるホルモン受容体蛋白質（Ｒ）また
    はその修飾された機能性形態（ｒ）の発現およびステロ
    イド結合能を測定することよりなり、修飾された機能性
    形態（ｒ）は受容体（Ｒ）が有する転写活性化特性を備
    えており、かつ（Ｒ）および（ｒ）は発現可能なＤＮＡ
    配列によりコードされるものであることを特徴とする方
    法。
  14. 【請求項１４】 受容体陰性の細胞がＣＶ−１およびＣ
    ＯＳ細胞よりなる群から選ばれる、請求項１３に記載の
    バイオアッセイ法。
  15. 【請求項１５】 １および２プラスミドがＳＶ−４０の
    複製開始点をも含む、請求項１３に記載のバイオアッセ
    イ法。
  16. 【請求項１６】 １および２プラスミドが選択可能なマ
    ーカーをも含む、請求項１３に記載のバイオアッセイ
    法。
  17. 【請求項１７】 作動性ホルモン応答性プロモーター／
    エンハンサー要素がマウス乳腺腫瘍ウィルス長鎖ターミ
    ナルリピート（ＭＴＶ ＬＴＶ）および哺乳類成長ホル
    モンプロモーターよりなる群から選ばれ、レポーター遺
    伝子がＣＡＴである、請求項１３に記載のバイオアッセ
    イ法。
  18. 【請求項１８】 遺伝子（Ｇ）−すなわち甲状腺ホルモ
    ン（Ｈ）またはその同族体（ａＨ）が甲状腺ホルモン受
    容体（Ｒ）またはその修飾された機能性形態（ｒ）との
    複合体を形成した状態でかつこの［（Ｈ）または（ａ
    Ｈ）／（Ｒ）または（ｒ）］複合体が遺伝子（Ｇ）の位
    置するクロマチン上の転写制御要素に結合した状態でそ
    の転写がホルモン（Ｈ）またはその同族体（ａＨ）によ
    って活性化される遺伝子−を含む細胞（Ｃ）において、
    遺伝子（Ｇ）の発現を誘導し、結果的に遺伝子（Ｇ）に
    よりコードされる蛋白質（Ｐ）の生成を誘導する方法で
    あって、 （１） 細胞（Ｃ）において、受容体（Ｒ）、または受
    容体（Ｒ）の転写活性化特性を有するその修飾された機
    能性形態（ｒ）をコードするＤＮＡを発現させ、ここで
    該ＤＮＡは次の（ａ）〜（ｄ）のいずれかの蛋白質： （ａ） 配列番号１に規定されるアミノ酸配列からなる
    蛋白質； （ｂ） アミノ酸配列（ａ）において１もしくは複数の
    アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
    からなり、かつ甲状腺ホルモン受容体に特有のホルモン
    結合特性および／または転写活性化特性を有する蛋白
    質； （ｃ） 配列番号２に規定されるアミノ酸配列からなる
    蛋白質； （ｄ） アミノ酸配列（ｃ）において１もしくは複数の
    アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
    からなり、かつ甲状腺ホルモン受容体に特有のホルモン
    結合特性および／または転写活性化特性を有する蛋白
    質；をコードするＤＮＡを含み、そして （２） 遺伝子（Ｇ）の発現、すなわち結果的に蛋白質
    （Ｐ）の生成を誘導するのに十分な水準にまで細胞
    （Ｃ）におけるホルモン（Ｈ）またはその同族体（ａ
    Ｈ）の濃度を増大させることよりなる方法。
  19. 【請求項１９】 ホルモン（Ｈ）またはその同族体（ａ
    Ｈ）の濃度の増大が、遺伝子（Ｇ）の転写、従って蛋白
    質（Ｐ）の生成を制御すべく制御される、請求項１８に
    記載の方法。
  20. 【請求項２０】 細胞（Ｃ）が真核細胞である、請求項
    １８および１９のいずれかに記載の方法。
  21. 【請求項２１】 真核細胞（Ｃ）が哺乳類の細胞であ
    る、請求項１８および１９のいずれかに記載の方法。
  22. 【請求項２２】 真核細胞（Ｃ）がヒトの細胞である、
    請求項１８および１９のいずれかに記載の方法。
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