JPH01500964A - ホルモン受容体組成物および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はホルモン受容体蛋白質およびそれらをコードする遺伝子、組換えＤＮＡ 法その他の遺伝子工学的技術によるこれら受容体および遺伝子の修飾、ならびに これら受容体および遺伝子（修飾されていないものおよび修飾されたもの）の利 用に関する。より詳細には本発明はステロイドホルモンおよび甲状腺ホルモン受 容体、ならびに関連遺伝子に関する。きわめて詳細には本発明はヒトのグルココ ルチコイド、ミネラルコルチコイドおよび甲状腺ホルモンの受容体、ならびにそ れらに対する遺伝子に関する。さらに本発明は受容体ＤＮＡクローンによりコー ドされるホルモン受容体蛋白質の機能性を測定するための新規なバイオアッセイ 系、および受容体蛋白質と複合体を形成したホルモンによってその転写が活性化 される遺伝子の発現を誘導および制御するための新規な方法に関する。

ｌ肌＠１１ ヒトその他の哺乳動物、鳥類および魚類を含む複雑な真核生物における発育およ び恒常性の転写調節は、ステロイドホルモンおよび甲状腺ホルモンを含む種々の 調節物質によって制御されている。これらのホルモンは系統発生的に異なる生物 における発育および分化に強い影響を与え、それらの作用はそれらと受容体と呼 ばれる特異的な高親和性結合蛋白質との相互作用の結合として媒介される。一般 にジエンセン（Ｊｅｎｓｅｎ）ら（１９７２）　；ゴルスキ−（Ｇｏｒｓｋｉ） ら（１９７６）；ヤマモト（Ｙａ鵬ａｍｏｔｏ）ら（１９７６）；オマレイ（０ ’Ｍａｌｌｅｙ）ら（１９６９）；ヘイワード（Ｈａｙｗａｒｄ）ら（１９８２ ）；およびアスバーナー（Ａ　５ｂｕｒｎｅｒ）ら（１９７８）を参照されたい 。

それぞれ幾つかの群の同系ステロイドホルモン（すなわちエストロゲン（エスト ロゲン受容体）、ゲスターゲン（プロゲステロン受容体）、グルココルチコイド （グルココルチコイド受容体）、アンドロゲン（アンドロゲン受容体）、アルド ステロン（ミネラルコルチコイド受容体）のうちの１種、または同系甲状腺ホル モン（甲状腺ホルモン受容体）に対して特に特異的である受容体蛋白質が知られ ており、組織特異的な様式で分布している。ホルビッツら（Ｈｏｒｗｉｔｚ）ら （１９７８）およびバルミテール（Ｐａｍｉｔｅｒ）ら（１９７６）を参照され たい。

ホルモンと受容体の相互作用については、ステロイドホルモンまたは甲状腺ホル モンが拡散の促進により細胞に入り、その特異的受容体蛋白質に結合し、蛋白質 のアロステリック変化を開始することが知られている。この変化の結果、ホルモ ン／受容体−複合体はクロマチン上の特定の特異的部位に高い親和性で結合する ことができる。ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら（１９７２＞およびジエンセン （Ｊ　ｅｎｓｅｎ）ら（１９６８）を参照されたい。

ステロイドホルモンおよび甲状腺ホルモンの一次効果の多くが、特異的細胞型に おける一組の遺伝子の転写の増大を伴うことも知られている。ベテルコフスキー （Ｐｅｔｅｒｋｏｆｓｋｙ）ら（１９６８）およびマツフナイト（Ｍｃｋｎｉｇ ｈｔ）ら（１９６８）を参照されたい。

さらにステロイドホルモンおよび甲状腺ホルモンに応答する（クロマチンとホル モン受容体／ホルモン−複合体との相互作用により）遺伝子の転写の可活性化（ 結果的に発現の増大）は複合体が遺伝子に付随するエンハンサ−に結合すること によって行われることも証明されている（ホーリー（Ｋ　ｈｏｕｒｙ）ら、１９ ８３）を参照されたい。

いずれにしろ多数のステロイドホルモンおよび甲状腺ホルモン応答性転写制御ユ ニット（それらのうちあるものはエンハンサ−を含むことが示されている）が同 定されている。これらには下記のものが含まれる。マウス乳腺腫瘍ウィルス５′ 側長鎖末端反復（ＭＴＶ　ＬＴＲ）：グルココルチコイド、アルドステロンおよ びアンドロゲンホルモンに応答；哺乳動物成長ホルモン遺伝子に対する転写制御 遺伝子：グルココルチコイド、エストロゲンおよび甲状腺ホルモンに応答；哺乳 動物プロラクチン遺伝子およびプロゲステロン受容体遺伝子に対する転写制御ユ ニット：エストロゲンに応答：烏頚卵アルブミン遺伝子に対する転写制御ユニッ ト：プロゲステロンに応答；哺乳動物メタロチオネイン（ｍｅｔａｌ　Ｉｏｔｈ ｉｏｎｅｉｎ）遺伝子転写制御ユニット：グルココルチコイドに応答：ならびに 補乳動物肝α２ｕ−グロブリン遺伝子転写制御ユニット：アンドロゲン、エスト ロゲン、甲状腺ホルモンおよびグルココルチコイドに応答、（本明細書の実験の 部Ｉの序文を参照されたい）。

ステロイドホルモンおよび甲状腺ホルモン受容体の十分な理解およびいっそうの 実用に対する障害は、これらの特性を調べるのに十分な量および十分な程度に純 粋な形で入手できないことであった。これはそれらをコードするＤＮＡ遺伝子セ グメントについても同じであった。これらのＤＮＡセグメントを入手できないた め、受容体コード遺伝子のインビトロ操作およびインビボ発現が妨げられ、結果 的にこれらの操作および発現が与えられる知見が得られなかった。

１１文に！圧 本明細書の背景の項では以下の刊行物を参照する。

五−１−ｈ １、　Ａｓｂｕｒｎｅｒ、Ｍ、、ａｎｄ　Ｂｅｒｅｎｄｅｓ、Ｈ，Ｄ、　ｉｎ　 ＴｈｅＧｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏ　ｏｆ　Ｄｒｏｓｏｈｉｌａ、Ｅ ｄｓ。

Ａｓｈｂｕｒｎｅｒ、Ｍ、、ａｎｄ　Ｗｒｉｇｈｔ、Ｔ、Ｒ，Ｆ、、Ｖｏｌ、　 ２．ｐｐ。

３１５−３９５．Ａｃａｄｅｍｉｃ、　Ｌｏｎｄｏｎ（１９７８）。

２、　Ｇｏｒｓｋｉ、　Ｊ、、ａｎｄ　Ｇａｎｎｏｎ、Ｆ、、Ａ、　Ｒｅｖ、　 Ｐｈ　５ｉｏ１．。

３８：４２５−４５０（１９７６）。

３、Ｈａｙｗａｒｄ、Ｍ、Ａ、、Ｂｒｏｅｋ、Ｍ、Ｌ、ａｎｄ　５ｈａｐｉｒｏ 、Ｄ、Ｊ、。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１０：８２７３　８２８４（１９８２ ）。

４、Ｈｏｒｗｉｔｚ、に、Ｂ、、ａｎｄ　ＭｃＧｕｉｒｅ、Ｗ、Ｌ、、Ｊ、Ｂｉ ｏｌ。

Ｃｈｅｗ　２５３：２２２３−２２２８（１９７８）。

５、　Ｊｅｎｓｅｎ、Ｅ、　Ｖ、、ａｎｄ　ＤｅＳｏｍｂｒｅ、Ｅ、　Ｒ，、Ａ 、　Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｃｈｅｎ、、４１：２０３　２３０（１９７２）。

６、　Ｊｅｎｓｅｎ、Ｅ、　Ｖ、、ｅｔ　ｉｆ、　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、、５９：６３２−６３８（１９６８）。

７、　Ｋｈｏｕｒｙ、Ｇ、、ａｎｄ　Ｇｒｕｓｓ、Ｐ、、Ｃｅｌ↓、３３：３１ ３−３１４（１９８３）。

８、ＭｃＫｎｉｇｈＬ、Ｇ、Ｓ、、ａｎｄ　Ｐａ１ｖｉｔｒｅ、Ｒ，Ｄ、、Ｊ、 Ｂｉｏｌ。

Ｃｂｃ論、、２５４：９０５０−９０５８（１９６８）。

９．０°Ｍ、ａｌｌｅｙ、Ｂ、Ｗ、、　ＭｃＧｕｉｒｅ、Ｗ、Ｌ、、Ｋｏｈｌｅ ｒ、Ｐ、○、。

ａｎｄ　Ｋｏｒｎｍａｎ、Ｓ、　Ｇ、、Ｒｅｃｅｎｔ　Ｐｒｏ　、Ｈｏｒｎ、　 Ｒｅｓ、。

２５：１０５−１６０（１９６９）。

１０、　Ｐａｍ１ｔｅｒ、Ｒ，Ｄ、、Ｍｏｏｒｅ、Ｐ、　Ｂ、、Ｍｕｌｖｉｈｉ ｌｌ、Ｅ、　Ｒ。

ａｎｄ　Ｅｍｔａｇｅ、Ｓ、、Ｃｅ１ｌ、８：５５７　５７２（１９７６）。

１１、　Ｐｅｔｅｒｋｏｆｓｋｙ、Ｂ、、ａｎｄ　Ｔｏｍｋｉｎｓ、Ｇ、、Ｐｒ ｏｅ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃ１ｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、６０：２２２　２２８（１９６８）。

１２、　Ｙａｍａｍｏｔｏ、に、　Ｒ，、ａｎｄ　Ａｌｂｅｒｔｓ、Ｂ、　Ｍ、 、Ａ、　Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｅｈｅｍ、　、４５ニア　２１−７４６（１９７６）。

１３、　Ｙｉｍａｍｏｔｏ、に、　Ｒ，、ａｎｄ　Ａｌｂｅｒｔｓ、Ｂ、　Ｍ、 、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、６９：２１０５−２１０９（１９ ７２）。

雌９迂封」１ 本明細書に示される情報のうち若干は公表されている。

実験の部Ｉに示される研究は下記に公表されている。

Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、Ｓ、　Ｍ、、　Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ、Ｃ，、Ｏｎｇ、 Ｅ、　Ｓ、。

Ｃｅｒｅｌｌｉ、　Ｇ、、　Ｏｒｏ、　Ａ、、　Ｌｅｂｏ、　Ｒ，、Ｔｈｏ＠ｐ ｓｏｎ、Ｅ、　Ｂ、。

Ｒｏｓｅｎｆｅｉｃ（、Ｍ、　Ｇ、、　ａｎｄ　Ｅｖａｎｓ、Ｒ，Ｍ、、”機能 性ヒトグルココルチコイド受容体ｃＤＮＡの一次構造と発現″Ｎａｔｕｒｅ。

（Ｌｏｎｄｏｎ）、３　１　８：６　３　５−６４　１　（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ、 １　９８　５）。

実験の部■に示される研究は下記に公表されている。

Ｇｉｇｕｅｒｅ、Ｖ、、　Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、　Ｓ、　Ｍ、、　Ｒｏｓｅｎ ｆｉｅｌｄ、　Ｍ、　Ｇ、。

ａｎｄ　Ｅｖｅｎｓ、Ｒ，Ｍ、　、”ヒトグルココルチコイド受容体の機能区” 、Ｃｅｔｌ、４６：６４５−６５２（Ａｕｇｕｅｔ、１９８６）。

実験の部■に示される研究は下記に公表されている。

Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ、Ｃ，、Ｔｈｏ＋ｅｐｓｏｎ、Ｃ，Ｃ，、Ｏｎｇ、Ｅ、　 Ｓ、、　Ｌｅｂｏ。

Ｒ，、Ｇｒｕｏｌ、Ｄ、　Ｊ、、　ａｎｄ　Ｅｖａｎｓ、”ｃ−ｅｒｂ−Ａ遺伝 子は甲状腺ホルモンをコードする“Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｃｌｏｎ）、　３２４ 　：６４１−６４６　（Ｄ　ｅｃｅｍｂｅｒ、　１９８６　）。

実験の部■に示される研究は下記に公表されている。

Ａｒｒｉｚａ、Ｊ　、　Ｌ、、　Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ、Ｃ，、Ｃｅｒｅｌｌｉ 、Ｇ、、　Ｇｌａｓｅｒ。

Ｔ、　Ｍ、、　Ｈａｎｄｅｌｉｎ、Ｂ、　Ｌ、、　Ｈｏｕｓｅ−ｍａｎ、Ｄ、　 Ｅ、、　ａｎｄＥｖａｎｓ、Ｒ，Ｍ、、“ヒトミネラルコルチコイド受容体相補 的ＤＮＡのクローニング：グルココルチコイド受容体との構造的および機能的関 連”５ｃｉｅｎｃｅ、２３７：２６８　２７５（Ｊｕｌｙ。

１９８７）。

実験の部Ｖに示される研究は以下のとおり印刷中である。

Ｇｉｇｕｅｒｅ、Ｖ、　、Ｙａｎｇ、Ｎ、　、Ｓｅｇｕｉ、Ｐ、　、ａｎｄ　Ｅ ｖａｎｓ。

Ｒ，Ｍ、、“新しい一群のステロイドホルモン受容体の同定”。

実験の部■に示される研究は以下のとおり印刷中である。

Ｇｌａｓｓ、Ｃ，Ｋ１．Ｆｒａｎｃｏ、Ｒ，、Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ、Ｃ，、Ａ ｌｂｅｒｔ。

Ｖ、Ｒ，、Ｅｖａｎｓ、Ｒ，Ｍ、、ａｎｄ　Ｒｏｓｅｎｆｅｌｃｌ、Ｍ、Ｇ、、 ”ラット成長ホルモン遺伝子のｃ−ｅｒｂ−Ａ部位は甲状腺ホルモンによるトラ ンザクションを媒介する”。

実験の部■に示される研究は下記に公表されている。

Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ　Ｃ、、Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ、Ｃａｒ ｙ、Ｌｅｂｏ。

Ｒｏｇｅｒ、ａｎｄ　Ｅｖａｎｓ、Ｒｏｎａｉｄ　Ｍ　、　、“哺乳動物中枢神 経系に発現される新規な甲状腺ホルモン受容体の同定”、５ｃｉｅｎｃｅ。

２３７：１６１０　１６１４（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ、１９８７）。

区】ぎり１巣な」Ｕｌ 以下は図面の簡単な説明である。より詳細な説明は本明細書の実験の部に示され る。混同を避けるために実験の部Ｉに述べた図面には頭部に点字“Ｉ”を付し、 実験の部Ｈに述べた図面には頭部に点字“■”を付した。以下同様である。

図面は以下の４０図からなる。

Ｋ１へ１１ 第１−１図（ＡおよびＢ）はヒトグルココルチコイド受容体ｃＤＮ、Ａ配列決定 法（第１−１　（Ａ）［Ｍ）、およびｅＤＮＡクローンの模式図を示す図である 。

第１−２図はヒトグルココルチコイド受容体（ｈＧＲ）のｅＤＮＡおよび推定− 次蛋白質配列を示す図である。（第１−２図は２部分に分かれている：第１−２ （１）およびｌ−２（２）図）。

第１−３（ＡおよびＢ）図はヒトグルココルチコイド受容体β−ｃＤＮＡ（β− ｈＧＲ）の３′末端の制限地図（第１−３（Ａ）図）およびヌクレオチド配列（ 第１−３（Ｂ）図）を示す図である。

第１−４図（ＡおよびＢ）はインビトロで翻訳されたｈＧＲと細胞抽出物からの インビボｈＧＲとのイムノプロット比較に関する。第１−４（Ａ）図はｂＧＲｃ ＤＮＡ配列のインビトロ転写のために構成されたベクターを示す図である。第１ −４（Ｂ）図はインビトロ翻訳生成物および細胞抽出物のウェスターンプロット 分析を示す写真である。

第１−５図はインビトロで翻訳されたアルファーｈＧ　Ｒ（Ｇ　Ｒ１０７）のス テロイド結合を示すグラフである。

第１−６　（ＡおよびＢ）図は発現プラスミドｐＧＥＲＲ１（第１−６（Ａ）図 ）およびｐＧＥＲＲ２（第１−６（Ｂ）図）の模式図である。１ラスミドｐＧＥ ＲＲ１はエストロゲン関連受容体ｈＥＲＲ１の発現に用いられ；ｐｃ　Ｅ　ＲＲ ２はｈＥＲＲ２の発現に用いられた。

失態９１」− 第１１−１図はｈＧＲ機能的アッセイ法を模式的に表わした図である。

第１１−２図はｈＧＲ蛋白質の発現を表わすウェスターンプロット分析を示す写 真である。

第１１−３図はｈＧＲによるＣＡＴ活性の誘導を示すプロットの写真である。

第１ｒ４（ＡおよびＢ）図はグラフである。第１ｌ−４（Ａ）図はｐＲｓｈＧＲ αのＤＥＸに対する用量応答を示し、第１Ｉ−４（Ｂ）はｐＲＳｈＧＲαの滴定 を示す。

第Ｕ−５図はｈＧＲにおける機能区の位置を示す模式図である。

犬上１」Ｌ［ 第１！Ｉ　−１（ＡおよびＢ）図はヒト胎ｑｌｃ−ｅｒｂ−Ａ　ｃＤＮＡの（Ａ ）制限地図および配列決定法、ならびに（Ｂ）ヌクレオチドおよび推定アミノ酸 配列を示す、（第１［［−１Ｂ図は２部分に分かれている：第１１１−１（Ｂ） −１およびＩ［ｌ−１（Ｂ）−２図）。

第ｍ−２図はＶ−肛旦−Ａ発癌遺伝子生成物、ヒト胎磐Ｃ−虹上−Ａポリペプチ ド、ならびにヒトグルココルチコイドおよびエストロゲン受容体のカルボキシ末 端部分間のアミノ酸配列比較を示す図である。

第１ＩＩ−３（Ａ、ＢおよびＣ）図はｅ−ｅｒｂ　−Ａ　Ｄ　Ｎ　Ａプローブに よるヒト胎ｆｆ１ＤＮＡのサザーン分析および染色体マツピングを示すプロット の写真である。第１Ｉ［−３（Ａ）図はエンドヌクレアーゼにより消化し、アガ ロースゲル上で分離したヒト満期胎磐ＤＮＡを示す、第１１１−３（Ｂ）図はＣ −虹互−Ａをプローブとして用いた胎！ＤＮＡの分析を示す、第１［１−３（Ｃ ）はヒトｃ　−ｅｒｂ−Ａ遺伝子の染色体マツピングを示す。

第１１１−４（ＡおよびＢ）図はヒトｃ−ｅｒｂ−Ａ発現を示す写真である。第 １１１−４（Ａ）図はヒト細胞系およびヒト胎磐から得たＲＮＡのノーザン分析 を示すプロットである。第［１−４（Ｂ）図はインビトロにおけるｅｒｂ−Ａポ リペプチドの合成を示す。

第１［１−５（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）図はインビトロで合成されたｅｒｂ−Ａポ リペプチドへの甲状腺ホルモンの結合に関連する４種のグラフである。第１［［ −５（Ａ＞図はインビトロで形成されたｅｒｂ−Ａポリペプチドへの１２５■− Ｔ、の結合のスカッチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）分析である。第１１１−５ （Ｂ）図はインビトロにおける甲状腺ホルモン同族体の競合を示す、第１−５（ Ｃ）図はインビトロで合成されたｅｒｂ−Ａポリペプチドへの”ｌ−７３結合に 対するトリョードチロニン異性体の競合を示す、第１［［−５（Ｄ）図は０．４ ＫＣＩ　ＨｅＬａ［胞核抽出物への’２ＳＩ−７３結合に対する甲状腺ホルモン 同族体の競合を示す。

第ｆｉｒ−６図はステロイドホルモンおよび甲状腺ホルモン受容第ｍ−７図はヒ ト甲状腺ホルモン受容体ｂＥ　ＲＢ　Ａ８．７のｃＤＮＡヌクレオチド配列およ び推定−次蛋白質配列を示す区である、（甲状腺ホルモン受容体ｈＦＡ８の配列 はｈＥＲＢＡ８．７に関連がある。後記の発明の説明の項を参照されたい）。

Ｋ１些ＬＬ 第Ｎ−１（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）は３種の写真および１種の模式図からなり、こ れらはすべてｈＧＲ遺伝子に関連するゲノム配列の単離に関する。第Ｎ−１（Ａ ＞図は指示されたヌクレアーゼにより消化したヒト胎ｚｐＮＡの高ストリンジェ ンシーサザーン分析を示す写真である、第Ｎ−４（Ｂ）図は低ストリンジェンシ ーサザーン分析を示す以外は同じである。第１Ｖ−４（Ｃ）図もサザーンプロッ トの写真であり、これはラムダＨＧＨと表示されるクローンにおけるゲノム配列 の単離を示す、第Ｎ−４（Ｄ＞はラムダＨＧＨゲノム断片のイントロン−エクソ ン構造およびそれとｈＧＲとの相同を示す模式図である。

第Ｎ−２（ＡおよびＢ）図はヒトミネラロコルチコイド受容体のｃＤＮＡヌクレ オチド配列および推定−次歪白質配列を示す図である。第１Ｖ−２（Ａ＞図は若 干の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位の線図と並んだｈＭＲの複合構造を示す。

第１’Ｖ−２（Ｂ）図はｈＭＲの全ヌクレオチド配列およびその一次推定アミノ 酸配列を示す、（第１Ｖ−２（Ｂ）図は２部分に分かれている：第Ｎ−２（Ｂ） −１およびｌ’Ｖ−２（Ｂ）２図）。

第ｆｆ−３図はミネラロコルチコイド受容体とグルココルチコイド受容体のアミ ノ酸相同を示す図である。

第Ｎ−４（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）図は発現したｈＭＲのステロイド結合特性に関 する区および３種のグラフである。第Ｎ−４（Ａ）図は発現プラスミドｐＲＳ　 ｈＭ　Ｒ１すなわちｈＭＲの発現に用いたプラスミドの構造を示す、第］’Ｖ− ４（Ｂ）図はｐＲＳ　ｈＭ　Ｒトランスフェクションしたｃｏｓｓ胞から調製し た抽出物におけるトリチウム化アルドステロン結合のスカッチャード分析を示す 。第１Ｖ−４（Ｃ）および＜Ｄ＞図はトランスフェクションしたＣＯ８細胞にお ける［３Ｈ］アルドステロンとの結合に対する非標識ステロイド類の競合を示す グラフである。

第１Ｖ−５（Ａ、ＢおよびＣ）図はトランスフェクションしたＣＶ−１＋ＩＥＩ 胞におけるｈＭＲおよびｈＧＲ発現プラスミドによるＭ　Ｍ　Ｔ　Ｖ　Ｌ　Ｔ　 Ｒの転写活性化を示す図および２種の写真である。第１Ｖ−５（Ａ）図はプラス ミドＧＭＣＡＴの模式図である。

第１Ｖ−５（Ｂ）図は正常血清によるｈＭＲまたはｈＧＲ）ランスフェクション 後に見られたＣＡＴ酵素活性の差を示すプロットの写真である。第Ｎ−５（Ｃ） 図はｈＭＲまたはｈＧＲによりトランスフェクションした細胞における、アルド ステロンまたはデキサメタシンによるＣＡＴ活性誘導の差を示すプロットの写真 である。

第Ｎ−６図はラット組織におけるミネラロコルチコイド受容体−ＲＮＡのノーザ ーン分析を示すプロットの写真である。

第１Ｖ−７図はマイクロセルハイブリッドのサザーン分析によるｈＭＲ遺伝子の 染色体局在を示す写真である。

第１Ｖ−８図はｈＧ　Ｒ、ｈＭ　ＲおよびｈＰ　Ｒｆｌｌ造のアミノ酸比較を示 す模式図である。

Ｋ１＠龜ぬ 第Ｖ−１（ＡおよびＢ）図はｈＥＲＲｌのｃＤＮＡヌクレオチド配列および推定 −次歪白質配列を示す図である。第Ｖ−１（Ａ）図は若干の制限エンドヌクレア ーゼ開裂部位の線区と並んだｈＥＲＲｌの複合構造を示す、第ｖ−１（Ｂ）図は ｂＥＲＲｌの全ヌクレオチド配列および一次推定アミノ酸配列を示す、（第Ｖ− １（Ｂ）図は２部分に分かれている：第Ｖ−１（Ｂ）−１およびＶ−１（Ｂ）− ２図）。

第Ｖ−２（ＡおよびＢ）はｈＥＲＲ２のｃＤＮＡヌクレオチド配列および推定− 次歪白質配列を示す図である。第Ｖ−２（Ａ）図は若干の制限エンドヌクレアー ゼ開裂部位の線図と並んだｈＥＲＲ２の複合構造を示す、第Ｖ−：２（Ｂ）図は ｈＥＲＲ２の全ヌクレオチド配列およびその一次推定アミノ酸配列を示す。

（第Ｖ−２（Ｂ）図は２部分に分かれている：第Ｖ−２（Ｂ）−１およびＶ−２ （Ｂ）−２図）。

第Ｖ−３図はｈＥＲＲｌ、ｈＥＲＲ２，ヒトエストロゲンおよびグルココルチコ イド受容体のカルボキシ末端領域間のアミノ酸配列比較を示す図である。

第Ｖ−４図はラットおよびヒトの組織におけるｈＥＲＲｌ（第Ｖ−４（Ａ）図） およびｗＩＲＮ　Ａ　（第Ｖ−４（Ｂ）図）ノノーザンプロットハイプリダイゼ ーション分析を示す写真である。

第Ｖ−５図はｈＥＲＲｌおよびｈＥＲＲ２，ｈＥＲおよびヒト甲状腺ホルモン受 容体（ｈＴ３Ｒβ）の間のアミノ酸の比較を示す図である。

東Ｉ１１綴ｊ− 第Ｖｌ−１（Ａ、ＢおよびＣ）図は２種の図、および図と写真からなり、これら はすべてラットＧＨ５’側非翻訳配列を含む種々の遺伝子融合体の甲状腺ホルモ ン応答性に関する。第Ｖｌ−１（Ａ）はラットＧＨ遺伝子の５′側および３“側 欠失体の応答性を示す図である。第Ｖｌ−１（Ｂ）図は推定Ｔ３受容体結合部位 の機能分析を示す図である。第Ｖｌ−１（Ｃ）図はｍＲＮＡ転写開始部位分析を 示す図／写真の組合わせである。

第Ｖｌ−２（ＡおよびＢ）図はビオチン−１１−ｄＵＴＰを含むオリゴヌクレオ チドグローブへのＴコ受容体の結合に関する図である。第■−１（Ａ）図はＧＨ ５’側非翻訳配列へのＴ３受容体の結合をアッセイするために用いられる２種の オリゴヌクレオチドプローブの模式図である。第Ｖｌ−２（Ｂ）図は各種オリゴ ヌクレオチドプローブによる、ＧＣ２核抽出物からの＋２５Ｉ−Ｔ：１標識Ｔ３ 受容体の沈殿を示すグラフである。

第Ｖｌ−３図はＧＣ２核抽出物によるラットＧＨエンハンサー要素のＤＮアーゼ Ｉフットプリンティング（ｆｏｏｔｐｒｉｎｔｉｎｇ）を示す写真である。

第Ｖｌ−４図は６４および２９塩基対を含むオリゴヌクレオチドへの、ラット下 垂体細胞Ｔ、受容体およびｈｅ−ｅｒｂ−Ａインビトロ翻訳生成物の５′側非翻 訳ＧＨ配列の結合を示すグラフである。

火１へ１１ 第■−１（ＡおよびＢ）図はラット脳クローンｒｂｅＡ　１２由来の甲状腺ホル モン受容体ｃＤＮＡの制限地図（Ａ）、ならびにヌクレオチドおよび推定アミノ 酸配列（Ｂ）を示す模式図である。

第■−２図はラット甲状腺ホルモン受容体（ｒＴＲアルファ）蛋白質をヒト甲状 腺ホルモン受容体（ｈＴＲベータ）およびニワトリ甲状腺ホルモン受容体（ｅＴ Ｒフルファ）蛋白質と比較した模式図である。

第■−３（Ａ、ＢおよびＣ）図はｒＴＲアルファ遺伝子のサザーンプロット分析 およびヒト染色体局在を示す写真である。第■−３（Ａ）図はｒｂｅＡ　１２由 来の５００　ｂｐ　Ｐｖｕｌ？断片にハイブリダイズしたヒト胎盤ＤＮＡを示す プロットである。第■−３（Ｂ）図はｈＴＲベータ由来の４５０−ｂｐ　斗畦Ｉ 断片にハイブリダイズした胎盤ＤＮＡを示す、第■−３〈Ｃ）図はｒＴＲアルフ ァ遺伝子の染色体マツピングを示す。

第■−４（Ａ、ＢおよびＣ）［ＪはｒＴＲアルファのインビトロ翻訳および甲状 腺ホルモン結合に関する写真および２種のグラフである。第■−４（Ａ）図はｒ ＴＲアルファのインビトロ翻訳生成物を示す５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの 写真である。第■−４（Ｂ）図はインビトロ翻訳されたｒＴＲアルファへのｌ２ ｓＩ−Ｔ、結合のスカツチャード分析を示すグラフである。第■−４（Ｃ）図は インビトロ翻訳されたｒＴＲアルファへの１２５１−Ｔ３結合に対する甲状腺ホ ルモン同族体の競合を示すグラフである。

第■−５図はｒＴＲアルファｍＲＮＡの組織分布を示すゲルの写真である。

支−１ 本明細書および請求の範囲においては、ここで以下のとおり明確に定義された技 術的な句および用語が用いられるであろう。

ここで用いるＧＲはグルココルチコイド受容体を意味する。

開示されたＤＮＡ　ｈＧＲがグルココルチコイド受容体ＧＲをコードする。

ここで用いるＭＲはミネラルコルチコイド受容体を意味する。

開示されたＤＮＡ　ｈＭＲがミネラルコルチコイド受容体ＭＲをコードする。

ここで用いるＴＲは甲状腺ホルモン受容体を意味する。開示されたヒトＤＮＡ　 ｃ−ｅｒｂ−Ａ、ｈＥＲＢＡ８．７およびｈＦＡ８、ならびにラットｒｂｅＡ　 １２がすべて甲状腺ホルモン受容体をコードする。

ここで用いるｈＥＲＲｌおよびｈＥＲＲ２はエストロゲン関連受容体蛋白質をコ ードするＤＮＡを表わす。

ここで用いるグルココルチコイドホルモンにはコルチゾル、ヒドロコルチゾン（ ＨＣ）、およびコルチコステロン（ＣＳ）が含まれ、その同族体にはデキサメタ シン（Ｄｅｘ）、デオキシコルチコステロン＜Ｄｏｃ）およびトリアムシノロン アセトニドが含まれる。

ここで用いるミネラルコルチコイドにはアルドステロン（Ａｌｄｏ）、ならびに コルチコステロン（ＣＳ）、およびデオキシコルチコステロン（Ｄｏｃ）が含ま れる。

ここで用いる甲状腺ホルモンにはチロキシン（Ｔ４）およびトリョードチロニン （Ｔ３）が含琥れる。

ここで用いるエストロゲンにはエストラジオール−１７ベータが含まれ、その同 族体にはジエチルスチルベストロールが含まれる。

ここで用いるゲスターゲンにはプロゲステロン（Ｐ　ｒｏｇ）が含まれ、その同 族体には１０メゲストンが含まれる。

ここで用いるアンドロゲンにはジヒドロキシテストステロンが含まれ、その同族 体にはメチルトリエノロンが含まれる。

ここで用いるＭＴＶは乳腺腫瘍ウィルスを意味し、ＭＭＴＶはマウス乳腺腫瘍ウ ィルスを意味する。

ここで用いるＲＳＶはラウス肉腫ウィルスを意味し；ＳＶはサルウィルスを意味 する。

ここで用いるＣＡＴはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを意味 する。

ここで用いるＣＯ８はＴ抗原（Ｔａｇ）を発現するサル腎細胞を意味する。グル ッツマン、堕、２３：１７５（１９８１）を参照されたい、ｃｏｓ、ｔｉ胞は本 発明のバイオアッセイ系に有用である。

ここで用いるＣＶ−１はＣＶ−１”と呼ばれる細胞系に由来するマウス腎細胞を 意味する。ＣＶ−１はＣＯ８の親細胞系である。ＳＶ４０　Ｔ抗原（Ｔａｇ）を 発現すべく形質転換されたＣＯ８細胞と異なり、ＣＶ−１細胞はＴ抗原を発現し ない。

ＣＶ−１細胞はＣＯ８細胞と同様に本発明のバイオアッセイ系および方法に有用 である。

ここで、ある蛋白質が“ホルモン受容体に特有のホルモン結合性”をもつと述べ た場合、これはある種に由来するホルモンまたはその合成同族体とその種に由来 する同系の受容体との結合親和性に関する標準アッセイ法のいずれにおいても、 ホルモンまたはその合成同族体に対する当該蛋白質の親和性が当該ホルモンまた はその同族体とその種に由来する同系の受容体との親和性の少なくとも約１０％ であることを意味する。

ここで、ある蛋白質（Ｘ）の転写活性化特性が、あるホルモン受容体（Ｒ）の特 性に“特有”であると述べた場合、これは下記を意味する。すなわち、たとえば 本発明の”シス−トランス”受容体機能性バイオアッセイ系（発明の記述の項を 参照されたい；またこのアッセイ法をｈＧＲの機能性発現の証明に用いることに 関する実験の部■、特に第１１−１図、ならびに“結果”および“実験法”と表 示した小区分も参照されたい）などのアッセイ法において試験する場合、遺伝子 （Ｇ）（その転写はホルモンまたはホルモン同族体と複合体形成した受容体の結 合によって活性化される）からの発現率が、受容体（Ｒ）の代わりに蛋白質（Ｘ ）を用いた場合、受容体（Ｒ）自体が用いられた場合に示されるものの少なくと も約１０％である。ただし、“受容体（Ｒどおよび”蛋白質（Ｘ）”いずれの場 合も、関与する細胞は同一濃度のホルモンまたはその同族体中に装入される。

ここで、ある蛋白質が“あるホルモン受容体に特有のホルモン結合特性または転 写活性化特性”をもつと述べた場合、これはそのホルモン受容体自体がこの定義 に包含されることを意味する。

ここで、ある遺伝子（Ｇ）の転写が”ホルモン（Ｈ）またはホルモン同族体（ａ Ｈ）によって実質的に活性化される”と述べた場合、これは遺伝子（Ｇ）が位置 する付近のクロマチンへのホルモン／受容体［（Ｈ）または（ａＨ）／（Ｒ）ま たは（「）コ複合体の結合によって遺伝子（Ｇ）の転写が誘導されることを意味 する。この定義において（Ｒ）は“野生型”または未変化のホルモン受容体を表 わすものとする。　１１者の（「）という表示は、機能性の“工学的に処理され た”もしくは“修飾された”受容体蛋白質、または“野生型”受容体遺伝子の− ＲＮＡ変異型によりコードされた蛋白質を意味するものとする。

ここで用いるＧＲＥはグルココルチコイド応答要素を意味し、ＴＨＥは甲状腺ホ ルモン受容体エンハンサ一様ＤＮＡ配列を意味する。ＧＲＥはＧＲと相互作用に よりグルココルチコイド応答性を与えるエンハンサ一様ＤＮＡ配列である。ベイ バーら、がＴＲとの相互作用により甲状腺ホルモン応答性を与える点以外はＧＲ Ｅと同様である。

ここで用いる“転写制御ユニット”、“転写制御要素”、“ホルモン応答性プロ モーター／エンハンサ−要素”および“転写刺激作用を媒介するＤＮＡ配列”と いう語は同じことを意味し、入れ換えて用いることができる。

ここで“作用性レポーター遺伝子に機能性結合した作用性ホルモン応答性フロモ ーター／エンハンサ−要素”という句において“作用性（ｏｐｅｒａｔｉｖｅ） ”という語はそれらのＤＮＡ配列（“ホルモン応答性プロモーター／エンハンサ −要素”および“レポーター遺伝子”という語で表わされる）が作用性であるこ と、すなわちそれらの意図する目的に対して作用することを意味し；“機能性（ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｌｙ）”という語はそれら２セグメントが結合したのち ホルモン／受容体−複合体によって適宜活性化された際に、“ホルモン応答性プ ロモーター”が“作動開始した（ｔｕｒｎｅｄｏｎ）”、すなわち活性化された 結果、レポーター遺伝子が発現することを意味する。

ここで用いる“受容体陰性”という語は細胞中に受容体が検出されないか、また は検出されたとしてもごく少量（すなわちかろうじて検出できる量）の受容体が 存在するにすぎないことを意味する。

ここで用いる本発明のＤＮＡの“変異体”とは“野生型”のまたは修飾されてい ない配列と異なるべく遺伝子工学的に処理された本発明のＤＮＡを意味する。こ の種の遺伝子工学的処理には野性型配列中への新たなヌクレオチドの挿入、野生 型配列からのヌクレオチドの失火、または野生型配列におけるヌクレオチドの置 換が含まれる。

本明細書および請求の範囲において用いられる“実質的な配列相同”という語は 、ここに開示され、特許請求された実際の配列からの配列の変動がごくわずかで あるＤＮＡまたはＲＮＡ配列は請求の範囲に示された範囲内に含まれることを意 味する。

ここに示される各種アミノ酸配列を構成するアミノ酸は下記の３文字または１文 字の略語によって表示できる。

アミノ　１文吏乱１−一　１文も１４ Ｌ−アラニン　Ａｂ　Ａ Ｌ−アルギニン　Ａｒｇ　Ｒ Ｌ−アスパラギン　Ａｓｎ　Ｎ Ｌ−アスパラギン酸　Ａｓｐ　Ｄ Ｌ−システィン　Ｃｙｓ　Ｃ Ｌ−グルタミン　Ｇｉｎ　Ｑ Ｌ−グルタミン′ｅｉＧ１ｕＥ Ｌ−ヒスチジン　Ｈｉｓ　Ｈ Ｌ−メチオニン　Ｍｅｔ　Ｍ Ｌ−フェニルアラニン　Ｐｂｅ　Ｆ Ｌ−プロリン　Ｐｒｏ　Ｐ Ｌ−）リプトファン　Ｔｒｏ　Ｗ ここに示される各種ヌクレオチド配列を構成するヌクレオチドは当技術分野でル ーチンに用いられている通常の１文字表示（Ａ　、Ｇ　、Ｔ　、ＣまたはＵ）に よる。

本明細書の本文および請求の範囲においてギリシャ文字についての言及はアルフ ァ、ベータなどと記載される０図面においては時には対応するギリシャ文字記号 が用いられる。

発現プラスミドｐＧＥＭ３はプロメガ・バイオチク、５３７１１ワイオミング州 マジソン、プラス・フィッシュ・ハツチエリ−・ロード２８００から市販されて いる。

Ｌｌ、− プラスミドｐＲＳｈＧＲ−アルファ、ｐＲＳｈＭ　Ｒ、ｐｅＡ　１０１、ｒｂｅ Ａ　１２およびＧＭＣＡＴ（これらはすべて大腸菌（旦ユ」旦Ｕツとも大腸菌Ｄ Ｈ５中）、ならびにプラスミドｐｈＨ３、ｐｈＥ　ＲＢ　Ａ８．７およびｐｈＦ Ａ８はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、米国マリ−ランド州ロ ックビル（ＡＴＣＣ）に特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタベ スト条約、およびこの条約に基づく規則の条件下に寄託されている。上記プラス ミドの試料は上記の条約および規則の条件下で、または米国そのほか本出願もし くは本出願の優先権を主張する出願がなされるか、もしくはその出願に対する特 許権が付与される他のすべての国の特許法および規則に従ってそれらを受けるべ く合法的権利を有する企業事務所および他の個人が現在および将来入手できる。

上記１０種の寄託物に対するＡＴＣＣ寄託番号は下記のとおりである。

ｐＲＳｈＧＲ−アルファ　６７２００ ｐＲＳ　ｈＭ　Ｒ６７２０１ ｐｅＡ　１０１　６７２４４ ｒｂｅＡ　１２　６７２８１ Ｇ　Ｍ　ＣＡ　７　６７２８２ ｐＥ　４　６７３０９ ｐＨＫＡ　６７３１０ ｐｈ　Ｅ　ＲＢ　Ａ　８．７　４０３７４ｐｈＦ　Ａ　８　４０３７２ ｐｈ８３　４０３７３ 光朋ｍケ ー観点においては本発明は、セグメントのプラスまたはセンスストランドが、グ ルココルチコイド受容体、ミネラロコルチコイド受容体および甲状腺ホルモン受 容体よりなる群から選ばれるホルモン受容体蛋白質に特有のホルモン結合特性お よび／または転写活性化特性を有する蛋白質の一次配列をコードするトリブレッ トの配列を含む二重鎖ＤＮＡセグメントからなる。

本発明のこの観点によれば、この二重鎖ＤＮＡセグメントは受容体蛋白質中に発 現されうるちのである。

他の観点においては本発明は、本発明による二重１ＤＮＡのセンスストランドで ある一重鎖ＤＮＡ、および本発明の二重鎖ＤＮＡの転写により形成されたＲＮＡ からなる。

他の観点においては本発明は、本発明のＤＮＡの実例であるＤＮＡを含むプラス ミドからなる。これらの１ラスミドはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク ションに特許の目的で寄託されている０本発明のプラスミドには下記の群から選 ばれるプラスミドが含まれる。

ｐＲＳｈＧＲ−アルファ（ＡＴＣＣ＃６７２００）、ｐＲ３ｈＭＲ（ＡＴＣＣ＃ ６７２０１）、ｐｅＡｌｏｌ（ＡＴＣＣ＃６７２４４）。

ｒｂｅＡｌ　２（ＡＴＣＣ＃６７２８１）、ＧＭＣＡＴ（ＡＴＣＣ＃６７２８２ ）、ｐＥ４（ＡＴＣＣ＃６７３０９）、ｐＨＫＡ（ＡＴＣＣ＃６７３１０）、ｐ ｈＥＲＢＡ８．７（ＡＴＣＣ＃４０３７４）、ｐｈＦＡ８（ＡＴＣＣ＃４０３７ ２）、およびｐｈＨ３（ＡＴＣＣ＃４０３７３）。

さらに他の観点においては本発明は、本発明のＤＮＡにより形質転換された細胞 、好ましくは哺乳動物細胞からなる９本発明のこの観点によれば、形質転換を行 うＤＮＡはこの細胞において発現可能であり、これによりこのＤＮＡがコードす る受容体の量が細胞中において増加する。

さらに本発明は、本発明のＤＮＡにより形質転換された、酵母細胞および細菌細 胞、たとえば大腸菌および枯草菌（Ｂ　、　５ｕｂｔｉｌｉｓ）を含む細胞から なる。

さらに本発明は、本発明のＤＮＡの発現、または本発明の５ＲＮＡの翻訳によっ て形成された新規な受容体からなる０本発明のこの観点によれば、受容体は“修 飾されていない”本発明のＤＮＡおよびｍ　ＲＮ−Ａの蛋白質生成物であるか、 または受容体ＤＮＡ配列における工学的変異の結果、対応する天然の“野生型” もしくは同系の受容体く新規受容体ときわめて大幅なアミノ酸配列相同を有する 既知配列の天然受容体〉と１もしくは２以上のアミノ酸配列の相違を有する、修 飾された、もしくは遺伝子工学的に処理された蛋白質生成物であろう、好ましく はこれらの受容体は“修飾されていないもの”または“工学的に処理されたもの ”のいずれであっても、対応する天然の同系受容体のホルモン結合活性の少なく とも１０％、および／または転写活性化活性の少なくとも１０％を有するであろ う。

本発明はまた本発明のＤＮＡ（またはｍ　ＲＮ　Ａ　）から得たホルモン受容体 蛋白質の機能性を測定するための新規方法からなる。

ここでは“シス−トランス”バイオアッセイ法と呼ぶこの新規方法は２種のプラ スミド、すなわち“発現”プラスミドおよび“レポーター”プラスミドを用いる ０本発明によれば発現プラスミドは、本発明の受容体ＤＮＡまたはその工学的処 理による変異体を含有しており、それを適切な受容体陰性宿主細胞中において発 現しうるいかなるプラスミドであってもよい、また本発明によればレポータープ ラスミドは作動性レポーター遺伝子に機能性結合した作動性ホルモン応答性プロ モーター／エンハンサ−要素を含有するいかなるプラスミドであってもよい。

本発明の“シス−トランス”バイオアッセイを実施する際には、発現プラスミド （本発明の“受容体”ＤＮＡを含有する）およびレポータープラスミドを適切な 受容体陰性宿主細胞中へ共トランスフェクションするトランスフェクションされ た宿主細胞は、次いでレポータープラスミドのホルモン応答性プロモーター／エ ンハンサ−要素を活性化しうるホルモンまたはその同族体の存在下および不在下 に培養される０次いでトランスフェクションおよび培養された宿主細胞を、レポ ーター遺伝子配列の生成物の誘導（すなわち存在）について監視するｌ後に本発 明に従って受容体蛋白質（発現プラスミド上の受容体ＤＮＡ配列によりコードさ れ、そしてトランスフェクションおよび培養された宿主細胞中で産生されたもの ）の発現およびステロイド結合能を測定する。（この“シス−トランス”バイオ アッセイ系の模式図については第１Ｉ−１図を参照されたい、）“シス−トラン ス”バイオアッセイ系は本発明の受容体ＤＮＡが形質転換された宿主細胞中にお いて発現したか否かを判定するために特に有用である。これは本発明の受容体が 対応する天然の同系受容体の結合活性の少なくとも約１０％を含有するか否か、 および本発明の受容体が対応する天然の同系受容体の転写活性化活性の少なくと も１０％を有するか否かを判定するためにも有用である。

最後に、その転写が受容体との複合体を形成したホルモンによって活性化される 遺伝子（Ｇ）の転写を活性化するのに必要な、かつそれに十分な条件は、（Ｇ） と同じ細胞中にホルモンおよびその受容体が存在することであることが、本発明 のＤＮＡを用いて見出された。この知見から遺伝子工学的に処理された細胞にお いて目的蛋白質を生成するための改良された組成物および方法を得ることが可能 となった。

これらの方法のうち２種類が本発明方法である。第１はその転写が受容体との複 合体を形成したホルモンによって活性化される遺伝子の転写を誘導する方法であ る。第２は細胞を遺伝子工学的に処理し、次いでその転写が受容体蛋白質との複 合体を形成したホルモンによって活性化される遺伝子によりコードされる蛋白質 の生成を増加させ、かつ制御する方法である。

これら２方法につき論じる際に、その転写が受容体蛋白質との複合体を形成した ホルモンによって活性化される遺伝子を遺伝子（Ｇ）と呼ぶ、遺伝子（Ｇ）を活 性化するホルモンを（Ｈ）、その同族体をいずれも（ａＨ）と呼ぶ、受容体蛋白 質は（Ｒ）、その機能性修飾体は（ｒ）と呼ばれる。最後に、遺伝子（Ｇ）が位 置する細胞を（Ｃ）、遺伝子（Ｇ）によりコードされる蛋白質を（Ｐ）と呼ぶ。

本発明の遺伝子誘導法によれば、遺伝子ＣＧ）を含有する細胞（Ｃ）を、細胞（ Ｃ）において発現可能であり、かつ受容体（Ｒ）またはそれから修飾された機能 性形Ｗ（ｒ）をコードする本発明のＤＮＡによって形質転換し：そして細胞（Ｃ ）におけるホルモン（Ｈ）またはその同族体（ａＨ）の濃度を少なくとも遺伝子 （Ｇ）の発現の誘導を保証するのに十分な程度にまで高める。

細胞を工学的に処理したのち蛋白質（Ｐ）を生成させる方法によれば、ホルモン （）Ｉ）が受容体（Ｒ）との複合体を形成した状態で結合することができ、これ により遺伝子（Ｇ）の転写を誘導する転写制御要素の制御下に置かれる状態に、 蛋白質（Ｐ）をコードする遺伝子（Ｇ）を細胞（Ｃ）内に配置する。この蛋白質 製造法によれば、ホルモン（Ｈ）および受容体（Ｒ）の双方が細胞（Ｃ）中に存 在する。受容体（Ｒ）の存在は、受容体（Ｒ）またはその機能性の修飾された形 態（「）をコードする本発明のＤＮＡにより細胞（Ｃ）を形質転換することによ って保証される。ホルモン（Ｈ）またはその合成同族体（ａＨ）の存在は、ホル モン（Ｈ）またはその同族体（ａＨ）を含有する浸漬液中に形質転換した細胞（ Ｃ）を浸漬することによって保証される０次いで本方法に従って、形質転換した 細胞（Ｃ）を浸漬するために用いられる浸漬液中の（Ｈ）または（ａＨ）の濃度 を制御することによって、遺伝子（Ｇ）の転写が制御される。こうして遺伝子（ Ｇ）の転写を制御することによって、細胞（Ｃ）における蛋白質（Ｐ）の生成を 制御することができる。

この教示に基づいて当業者が認識するように、転写がホルモン／受容体−複合体 によって活性化される遺伝子（Ｇ）によりコードされる蛋白質（Ｐ）の生成が遺 伝子（Ｇ）の位置する細胞（Ｃ）内にホルモン（）（）およびその受容体を確実 に存在させ、次いで細胞（Ｃ）中に存在するホルモン（Ｈ）またはその同族体の 濃度を制御するだけで制御される状態に、細胞を工学的に処理することが可能と なるであろう。

光朋！Ｉ魁児 本発明は一部は、グルココルチコイド、ミネラルコルチコイドおよび甲状腺ホル モンの受容体に特有のホルモン結合特性および／または転写活性化特性を有する 蛋白質をコードするＤＮＡセグメントに関する０本発明のこの観点によれば、こ れらのＤＮＡセグメントは適切な宿主細胞において発現され、これによりグルコ コルチコイド、ミネラルコルチコイドおよび甲状腺ホルモンの受容体、または受 容体様蛋白質を生成しうるちのである０本発明は本発明のＤＮＡのセンスストラ ンドの転写の結果生成したｍＲＮＡにも関する。

本発明のＤＮＡはここでは以下のとおり呼ばれるＤＮＡによって例示される。ヒ トグルココルチコイド受容体ＤＮＡ（ｈＧＲ）；ヒト甲状腺ホルモン受容体ＤＮ Ａ（ｈＴＲ：ｈＴＲアルファおよびｈＴＲベータ、ｈＴＲアルファはたとえばｈ Ｅ　ＲＢ　Ａ８．７およびｈＦＡ８である；ｈ’ｒ　Ｒベータはたとえば細胞性 のもの、すなわち“ｃ−ｅｒｂ−Ａ“である）；ラット甲状腺ホルモン受容体（ ｒｂｅＡ　１２）、これはヒト甲状腺ホルモン受容体アルファのラット同族体で ある；ヒトミネラルコルチコイド受容体（ｈＭＲ）；ならびに新規なヒトステロ イドホルモン受容体（ｈＥＲＲｌおよびｈＥＲＲ２＞、センスストランドｃＤＮ Ａヌクレオチド配列、およびこれらによりコードされる推定−次歪白質配列は以 下の図に示される。第１−２（１）および１−２（２）図：ｈＧＲについて；第 １１１−１（Ｂ）−１およびＩＩ［−１（Ｂ）−２図：ヒトＣ−虹旦−Ａについ て、ならびに第１ＩＩ−７図：ｈＥ　ＲＢ　Ａ８．７およびｈＦＡ８について； 第Ｆｉ’−２（Ｂ）−１およびＩＶ−２（Ｂ）−２図：ｈＭＲにツイテ；第Ｖ− １（Ｂ）−１およびＶ−１（Ｂ）−２、ならび４：：Ｖ−２（Ｂ）−１およびＶ −２（Ｂ）−２図：それぞれｂＥＲＲｌおよびｈＥＲＲ２について：ならびに第 ■−１（Ｂ）図：ラット甲状腺ホルモン受容体ｒｂｅＡ　１２について。

ＤＮＡ、たとえばｈＧＲ、ヒトｃ−ｅｒｂ　−Ａ　ＳｈＥ　ＲＢ　Ａ８．７、ｈ ＦＡ８、ｈＭＲ，ｈＥＲＲｌおよびｈＥＲＲ２は本発明の好ましいＤＮＡである 。同様にこれらおよび他の本発明のＤＮＡを保有するプラスミドも好ましい、好 ましいプラスミドは以下のものが含まれる。ｐＲＳｈＧＲ−アルファ、ｐＲＳｈ ＭＲ，ｐｅＡｌ　０１゜ｒｂｅＡ　１２　、ＧＭＣＡＴ、ｐＥ　４　、ｐＨＫＡ 　、ｐｈＥ　ＲＢ　Ａ８．７．ｐｈＦ　Ａ８、およびｐｈＨ３。

ｐＲＳ　ｂＧ　Ｒ−アルファのほかに好ましいＤＮＡにはｐＲＳｈＧＲ−アルフ ァの修飾体も好まれ、これらはここでは下記のように表示される。！９．Ｉ３７ ，１１０２，１１２０゜Ｉ２０４．Ｉ２１４．Ｉ２６２．Ｉ２８９．ｌ３０５． ｌ３４６゜ｌ３８４．Ｉ４０３．Ｉ４０８．Ｉ４２２．Ｉ４２８．Ｉ４４０゜Ｉ ４４８．Ｉ４９０．ｌ５１５．ｌ５３２．ｌ５５０．およびｌ６８４．ここで“ Ｉ”は“挿入配列（Ｉ　ｎ５ｅｒｔ）”を表わし、“工”に続く数字はＤＮＡ修 飾の表示を表わす、修飾されたｐＲｓｂＧＲ系ＤＮＡのうちきわめて好ましいも のは、ヒトグルココルチコイド受容体に特有な転写活性化特性の少なくとも１０ ％を有する蛋白質をコードするものである。これらのＤＮＡには、Ｉ９．Ｉ３７ ，１１０２，１１２０，１２０４゜Ｉ　２１４．Ｉ　２６２，１２８９．Ｉ　３ ０５．Ｉ　３４６．Ｉ　３８４゜Ｉ４０３．Ｉ４０８．Ｉ４２２．Ｉ４２８，１ ４４０．Ｉ４４８゜Ｉ４９０，１５１５，１５３２．ｌ５５０．および工６８４ が含まれる。

ｐＲＳｈＧＲ−アルファの構造は本明細書の“実験の部■”と表示される部分に 詳述されている。（特に項目１１．Ｆ、（ｂ）、“組換えプラスミド”を参照さ れたい）、実験の部■には上記の章に述べたｐＲＳｈＧＲ−アルファ修飾体の構 造および特性についても詳述されている。

第１−２（１）およびｌ−２（２）図に示したｈＧＲに対する二ＤＮＡ配列に関 しては、図示された配列の５′末端の２個のＣはＲＳＶ−ＬＴＲを含むセグメン トの３°末端に図示したセグメントを結合させるＫＪｉ１部位の部分である６図 示した配列の３′末端のＴは、図示したセグメントがＳＶ４０ポリアデニル化信 号を含むセグメントに結合する地点の５′側へ数個の塩基の位置にある。

ｐＲＳｈＭＲは本質的にｐＲＳ　ｈＧ　Ｒ−アルファと同じ様式で構成され、本 質的にｐＲＳ　ｈＧ　Ｒ−アルファと等しい、言い換えると、挿入部位における わずかな修飾を除いて、第１Ｖ−２（Ａ＞図に示したｂＭＲセグメントが、第１ −２（１）およびｌ−２（２）図に配列を示したｈＧＲに置換している。ｐＲＳ ｈＧＲと同様にｐＲＳ　ｈＭ　Ｒはラウス肉腫ウィルス由来のプロモーターおよ びＳＶ４０複製開始点の制御下に受容体蛋白質ＤＮＡコード配列を含有する。実 験の部■の参考文獣部分の脚注４１を参照されたい、第Ｆｉ’−４（Ａ）図も参 照し、第１１−１図と比較されたい。

第ｆｆ−２（Ｂ）−１およびｆｆ−２（Ｂ）−２図に示したｈＭＲ配・　列に関 しては、このセグメントの５°末端にあるＡＧはＨｉｎｃＨＩＩ部位から数塩基 対下流にあり、これによってｈＭＲセグメントはＲ３Ｖ−ＬＴＲ含有セグメント に結合している。第■−２（Ｂ）−２図に示したセグメントの３°末端のＡＡは ＳＶ４０ポリアデニル化信号を含むセグメントの５°末端から塩基数個上流にあ る。

プラスミドｐｅＡ　１０１はヒト甲状腺ホルモン受容体Ｃ−→−Ａのコード領域 全体を保有する。（ｃ−→−Ａに対する遺伝子はヒト染色体３に局在する；この 受容体遺伝子によりコードされる蛋白質生成物なここではｈＴＲベータと呼ぶ、 実験の部■を参照し、実験の部■と比較されたい）。

プラスミドｐｅＡ　１０１はｐｈｅＡ　１２　（第１［１−１（Ａ）図参照）か らのＥｃｏＲＩ断片を発現ベクターｐＧＥＭ３（プロメガ・バイオチク）のＥｅ ｏＲＩ部位に適正な向きに挿入することにより精成された。この構造についての 詳細は実験の部■、項目Ｉ［［、１の第ｍ−４法と表示する項目を参照されたい 。

ヒト染色体３に局在しているｈＴＲ受容体のほかに、本発明者らはプラスミドｐ ｅＡ　１０１により推定される蛋白質配列と異なる第２の甲状腺ホルモン受容体 を見出した０本発明者らはこの新規な予想されなかった甲状腺ホルモン受容体を ラットおよびヒトの双方から単離し、特性を調べた。ラットの場合、この新規な 甲状腺ホルモン受容体はプラスミドｒｂｅＡ　１２のＤＮＡによりコードされる 。　（ｒｂｅＡ　１２に関するＤＮＡおよび推定−次歪白質配列を第■−１（Ｂ ）図に示す、）ヒトの場合、この新規な甲状腺ホルモン受容体はプラスミドクロ ーンｈＥ　ＲＢ　Ａ８．７およびその関連クローンｈＦＡ８によりコードされる 。

（ｈＥＲＢＡの配列については第１１１−７図を参照されたい、）ｈＥ　ＲＢ　 Ａ８．７およびｈＦＡ８は同一遺伝子からのｃＤＮＡ生成物である。クローンｈ ＦＡ８のＤＮＡ配列は下記の点を除いてｈＥＲＢＡ８．７（第ｍ−７図に示す） と等しい、ｈＦＡ８の配列は第ｍ−７図に示す配列より短い、より詳細には、ｈ ＥＲＢＡ８．７のヌクレオチド１（Ｇ）から５１４（Ａ＞までがｈＦＡ配列には ない、さらにｈＦＡ８配列は塩基対位置１１３８のグアニン（Ｇ）から塩基対１ ２４４のグアニン（Ｇ）に及ぶ欠失を有する。この欠失によってアミノ酸３６８ 　（Ｇ　Ｉｕ）から４０６　（Ｇ　Ｉｎ）までがｈＦＡ８クローンによりコード されるポリペプチドから失われる。前記のように本発明の最初の甲状腺ホルモン 受容体は染色体３に局在している。実験の部■に示すように、新規な甲状腺ホル モン受容体に対するヒト遺伝子はヒト染色体１７に局在している。ラット甲状腺 ホルモン受容体ｒｂｅＡ　１２は染色体１７からのヒト遺伝子生成物のラット型 同族体を表わす。

それらは異なる遺伝千生によりコードされるので、染色体１７遺伝子生成物はｈ ＴＲアルファとして分類され、染色体３遺伝子生成物はｈＴＲベータとして分類 されている。関連性は高いが、アルファおよびベータ遺伝子生成物はそれらの一 部アミノ酸配列において特異的変化を含む、またアルファおよびベータ生成物は 特徴的に異なる発現パターンを示す。

甲状腺ホルモンの作用は多岐にわたり、それらの受容体に依存している０本発明 者らが甲状腺ホルモン受容体をクローニングする以前はこの受容体は精製または 生化学的特性の解明はなされていなかった。科学文献にも多種の甲状腺ホルモン 受容体遺伝子生成物の存在を示唆する証拠は全くなかった。多種の受容体が存在 することは、これら受容体のうち１種類のみを選択的に活性化する甲状腺ホルモ ン同族体を開発する基礎として有用である。これは広範な臨床的威力をもつと思 われるので、興味ある重要な知見である。

本発明者らが特性を明らかにした最初の甲状腺ホルモン受容体はｐｅＡ　１２、 すなわち現在ヒト甲状腺ホルモン受容体ベータと呼ばれる受容体であった０本発 明者らは分子ハイブリダイゼーションによってラット脳ｃＤＮＡライブラリーを 関連配列につきスクリーニングするためにこのベータクローンを用いた。

これによってプラスミドｒｂｅＡ　１２が同定され、のちにこれがアルファ群の 新規な甲状腺ホルモン受容体として同定された。

このラットｒｂｅＡ　１２はｒｂｅＡ　１２遺伝子生成物に対するヒト同族体を クローニングするための分子ハイブリダイゼーションプローブとして用いられた 。このヒト生成物はクローンｈＥ　ＲＢ　Ａ８．７およびｈＦＡ８によりコード される。

他の甲状腺ホルモン受容体ｃＤＮＡ（ラット甲状腺ホルモン受容体ｒｂｅＡ　１ ２、ならびにヒト甲状腺ホルモン受容体ｈＥ　ＲＢ　Ａ８．７およびｈＦＡ８） はそれらのｃＤＮＡをｃ−ｅｒｂ−Ａについて行ったと同様に適正な向きで発現 ベクターｐＧＥＭＢ中へ挿入することによって発現させることができる。

ここでプラスミドＧＭＣＡＴについて述べると、これはクロラムフェニコールア セチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）に対する細胞遺伝子に結合したＭＴＶ　Ｌ ＴＲを含むレポータープラスミドである。この結合の結果、ｐＧＭＣＡＴを用い てＭＴＶプロモーターの転写活性を評価するための酵素アッセイを行うことがで きる０ＭＴＶプロモーターは数種のグルココルチコイド応答要素（Ｇ　ＲＥ　） を含むので、レポータープラスミドｐＧＭＣＡＴはグルココルチコイドまたはミ ネラルコルチコイドレポーターＤＮＡ（現在知られているか、またはのちに見出 された）を保有する発現プラスミドと共に適切な宿主細胞中へ共トランスフェク ションすることができる。（このような共トランスフェクションは本発明の“シ スートランス″機能性バイオアッセイ系の一部である０本発明のこの観点につい てはのちに詳述する。）共トランスフェクションした宿主細胞においてＣＡＴ活 性が検出されたことは、受容体発現プラスミドにより産生されたポリペプチドが 機能性であること、すなわち受容体蛋白質に特有の転写活性化特性を有すること を示す、プラスミドｐＧＭＣＡＴはＡＴＣＣに特許の目的で寄託され、ＡＴＣＣ ＃６７２Ｂ２を得た。（ｐＧＭＣＡＴの模式図については第■−５（Ａ）図を参 照されたい、） プラスミドｐＧＨＣＡＴは本発明に有用な他のレポーター１ラスミドの一例であ る。ｐＧＨＣＡＴはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ ）に対する細菌遺伝子に機能性結合した成長ホルモンプロモーターの一部を含む 、この結合のため、ｐＧＨＣＡＴを用いて成長ホルモン（ＧＨ）プロモーターの 転写活性を評価するための酵素アッセイを行うことができる。ＧＨプロモーター は甲状腺ホルモン応答要素（ＴＨＥ）を含むので、レポータープラスミドｐＧＨ ＣＡＴは甲状腺ホルモンレポーターＤＮＡ（現在知られているか、またはのちに 見出された）を保有する発現ベクターと共に適切な宿主細胞中へ共トランスフェ クションすることができる。（このような共トランスフェクションら本発明の“ シス−トランス”レポーター機能性バイオアッセイ系の一部である０本発明のこ の観点についてはのちに詳述する。）ρＧＨＣＡＴをＴＲ発現プラスミド（これ はたとえばｈＴＲアルファまたはｈＴＲベータＤＮＡを保有する）と共に用いて 適切な宿主細胞を共トランスフェクションした場合、共トランスフェクションし た宿主細胞におけるＣＡＴ活性の検出は、甲状腺ホルモン受容体（ＴＲ）発現プ ラスミドにより産生されたポリペプチドが機能性であること、すなわち甲状腺ホ ルモン受容体蛋白質に特有の転写活性化特性を有することを示すために用いられ る。

プラスミドｐＥ４および９ＨＫＡは、ここではｈＥＲＲｌと呼ばれるエストロゲ ン関連受容体をコードするｃＤＮＡに関係する。（実験の部■、特に第Ｖ−１（ Ａ）および（Ｂ）図を参照されたい。）プラスミドｐＥ４は第Ｖ−１（Ａ＞図に おいてラムダｈＫＥ４とよばれるｃＤＮＡセグメントを保有し；ｐ）Ｉ　Ｋ　Ａ は同図においてラムダｈＫＡ１と呼ばれるセグメントを保有する。ρＥ４および ｐＨＫＡ共方ともＡＴＣＣに特許の目的で寄託されている。これら２種のプラス ミドを後記に従って結合させて、エストロゲン関連受容体ｈＥＲＲ１に対する全 コード配列を含む単一プラスミド（ｐＧＭＥＲＲｌ）を得ることができる。

２種のｃＤＮＡクローンｐＥ４およびｐＨＫＡを結合させるための好ましい方法 は、各ｅＤＮＡに存在する特異的制限酵素部位に対し各末端において相補的であ る合成リンカ−を利用する。

より詳細には、ラムダｈＫＡ１およびラムダｈＫＥ４からの挿入配列をＥｅｏＲ Ｉｉｌ１片としてプラスミドベクターｐＧＭ３（プロメガ・バイオチク）中へク ローニングする：本発明者らはこれらをそれぞれｐＧＭＫＡおよびｐＧＭＫＥと 命名した。次いでｐＧＭＫＡをＮａｒＩおよび比ｉｎｄ［［により切断し、ｈＥ ＲＲｌをコードする断片をアガロースゲルから精製する（断片１）。

ｐＧＭＫＥを旦」」およびＨ力は■により切断し、ｈＥＲＲｌの５′末端領域お よびベクター配列をコードする断片をアガロースゲルから精製する（断片２）。

第３に、互いに相補的な２種の合成オリゴヌクレオチドな合成する。これらのオ リゴヌクレオチドは下記のものである。

オリゴ■： ＧＴＧＣＣＴＧＧＴＧＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧＡＡＡＡＣＣＡＧＡＧＴＧＴＡＴＧ ＣＴＡＣＡＡＧＣＡＧＣＣＧＧＣＧＧＧ；オリゴ■： ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＧＣＴＧＣＴＴＧＴＡＧＣＡＴＡＣＡＣＴＣＴＧＧＴＴＴＴ ＣＣＴＣＣＣＡＣＣＧＣＡＣＣＡＧＧＣＡＣＴＴＴ。

最後に断片１および２ならびにオリゴＩおよび■を当業者に周知の標準法に従っ て互いにリゲートさせ、次いで細菌ＤＨ５株中へ形質転換する。得られたコロニ ーをここではｐＧＭＥＲＲｌと呼ばれるＤＮＡ構造物につきスクリーニングする 。プラスミドｐＧＭＥＲＲ１を用いてｈＥＲＲｌを発現させることができる。ｐ ＧＭＥＲＲｌの模式図については第１−６（Ａ）図を参照されたい。

プラスミドｐｈＨ３は、ヒト心臓ラムダｇｔｌｌ　ｃＤＮＡライブラリーから、 ラムダｈＫＡ１の５°部分を表わす、ニックトランスレーションされた７００− ｂｐ　旦ｅｏＲＩ　−Ｓ　ｍａ　Ｉ断片を用いて単離されたラムダｈＨ３クロー ンに関連する。（ラムダｈＫＥ４およびラムダｈＫＡ１クローンはヒト腎ラムダ εｔｌ。

ｃＤＮＡライブラリーから単離された；実験の部Ｖ、Ｈ，特に第Ｖ−１およびＶ −２図法と表示される項目を参照されたい、）ラムダｈＨ３クローンはここでは ｂＥＲＲ２と呼ばれるエストロゲン関連受容体をコードするｃＤＮＡを保有する 。ｐｈＨ３からのｃＤＮＡをｐＧＭ３中へ挿入してｐＧＭＥＲＲ２を形成するこ とができる。その図は第１−６（Ｂ）図に示されている。受容体様ポリペプチド ｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２の機能上および構造上の特性を実験の部Ｖに示す。

本発明者らが本発明のＤＮＡを用いて得た知見の１つは、同一種内の各種ホルモ ン受容体間の、また特定のいずれかの受容体については種間の著しい配列相同で ある。（たとえばｖ−ｅｒｂ−へ発癌道伝子生成物、ヒト胎盤Ｃ−虹亙−Ａポリ ペプチド、ならびにヒトグルココルチコイドおよびエストロゲン受容体のカルボ キシ末端部分を比較した第ｍ−２図；ステロイドおよび甲状腺ホルモン受容体を 比較した第１１１−６図；ミネラルコルチコイド受容体とグルココルチコイド受 容体のアミノ酸相同を比較した第■−３図、ｈＧＲ，ｈＭＲおよびｈＰＲ間のア ミノ酸比較を示した第■−８図、ｈＥＲＲ１，ｈＥＲＲ２、ヒトエストロゲンお よびヒトグルココルチコイド受容体のカルボキシ末端領域を比較した第Ｖ−３図 ；ならび４：ｌ：ｈＥＲＲｌ、ｈＥＲＲ２，ｂＥＲ。

ｈＧＲおよびヒト甲状腺ホルモン受容体ｈＴ、Ｒベータ間のアミノ酸の比較を示 す第Ｖ−５図を参照されたい、）この相同性があるため本発明のＤＮＡおよびＲ ＮＡは、ホルモンと複合体を形成したのちクロマチンＤＮＡに結合することによ り転写を活性化するホルモン受容体をコードする遺伝子を実質的にいかなる種か らも検出および単離することができる０本発明のＤＮＡおよびＲＮＡ、特にＡＴ ＣＣに特許の目的で寄託された好ましいＤＮＡを用いることにより、当業者は多 大な試験を行うことなくゲノムライブラリーをスクリーニングして、本発明の範 囲に含まれる他のグルココルチコイド、ミネラルコルチコイドおよび甲状腺ホル モン受容体を見出すことができる０本発明のこの観点は本発明者らによりエスト ロゲン関連受容体ｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２（実験例Ｖ、特に項目Ａ、序、お よび項目Ｂ、受容体ｈＥＲＲに対するｃＤＮＡクローンの項を参照されたい）、 ならびにラット甲状腺ホルモン受容体およびヒト甲状腺ホルモン受容体ＴＲアル ファ（実験の部■、特に項目Ｃ５第２甲状腺ホルモン受容体ＤＮＡの単離、なら びに第■−１（Ａ）および（Ｂ）図を参照されたい）が見出されたことにより説 明される。

本発明のＤＮＡおよびセンスストランドＤＮＡはたとえば本発明の誘導法および 蛋白質製造法と組合わせて使用して、大量の実質的に純粋な受容体蛋白質を製造 することができる。さらに、こうして製造された実質的に純粋な受容体蛋白質を 周知の方法により診断アッセイ法に使用して、各種の体液および組織試料におけ る特定のホルモンの存在を調べることができる。

さらに本発明の受容体蛋白質を結合アッセイ法、たとえば実験の部ｍに述べるｐ ｅＡ　１０１によりコードされる受容体へのＴ、の結合に関する方法、または後 述する本発明の“シス−トランス”受容体機能性バイオアッセイ法により、受容 体作用素および受容体拮抗薬をスクリーニングするのに用いることができる。

最後に、本発明の受容体蛋白質は実質的に純粋な形で製造されるので、それらと 結晶化し、Ｘ線回折法によりそれらの構造を調べることができる。当業者に周知 のように、これらの測定は“合成”または修飾された受容体蛋白質同族体を工学 的に製造する際にきわめて有用である。

ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにこれらにより製造された新規な受容体蛋白質のほ かに、本発明は以下の３種の一般法を開示する。一方法は受容体蛋白質の機能性 を測定するためのバイオアッセイ法に関する。他の三方法はそれらの転写がクロ マチンＤＮＡに結合したホルモン−受容体−複合体により活性化される遺伝子の 発現を誘導および制御する方法に関する。これら３種の一般法それぞれにつき別 個に述べる。

本発明者らが“シス−トランス”バイオアッセイ系と呼ぶ、受容体機能性を試験 するための新規なバイオアッセイ系は２種のプラスミド、すなわち“発現”プラ スミドおよび“レポーター”プラスミドを使用する０本発明によれば発現プラス ミドは本発明の受容体ＤＮＡまたはそれらの変異体を適切な受容体陰性宿主細胞 において発現しうるいかなるプラスミドであってもよい。

同様に本発明によればレポータープラスミドは作動性レポーター遺伝子に機能性 結合した作動性ホルモン応答性プロモーター／エンハンサ−要素を含むいかなる プラスミドであってもよい。

（ここで用いる用語の説明については本明細書の定義の項を参照されたい、）プ ラスミドｐＧＭＣＡＴおよびｐＧＨＣＡＴは作動性レポーター遺伝子に機能性結 合した作動性ホルモン応答性プロモーター／エンハンサ−要素を含むレポーター １ラスミドの例であり、従って本発明の受容体機能性バイオアッセイに使用でき る。ｐＧＭＣＡＴの場合、作動性ホルモン応答性プロモーター／エンハンサ−要 素はＭＴＶ　ＬＴＲであり；ｐＧＨＣＡＴの場合、これは成長ホルモン受容体の 機能性部分である。ｐＧＭＣＡＴおよびｐＧＨＣＡＴの双方において作動性レポ ーター遺伝子はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）に 対する細菌性遺伝子である。

本発明の“シス−トランス”受容体機能性バイオアッセイを実施する際には、発 現プラスミドおよびレポータープラスミドを適切な受容体陰性宿主細胞中へ共ト ランスフェクションする。

トランスフェクションされた宿主細胞は次いでホルモンまたは同族体の存在下ま たは不在下で培養され、レポータープラスミドのホルモン応答性プロモーター／ エンハンサ−要素を活性化することができる。トランスフェクションおよび培養 された宿主細胞を次いでレポーター遺伝子配列の生成物の誘導（すなわち存在） につき監視する。Ｉ！を後に、ホルモン受容体蛋白質またはそれらの変異体（発 現プラスミド上の受容体ＤＮＡ配列によりコードされ、トランスフェクションお よび培養された宿主細胞において産生されたもの）の発現および／またはステロ イド結合能を本発明に従って測定する。（この“シス−トランス”バイオアッセ イ系の模式図については第１Ｉ−１図を参照されたい、） 本発明の”シス−トランス”受容体機能性バイオアッセイ系を好ましい形態にお いてグルココルチコイドまたはミネラルコルチコイド受容体の機能性の測定に用 いる場合、プラスミドは選択可能なマーカー、たとえばす且遺伝子を保有するで あろう。

さらに、好ましい形態においてはレポータープラスミドはＭＴＶ　ＬＴＲまたは 成長ホルモンプロモーターの機能性部分をホルモン応答性プロモーター／エンハ ンサ−要素として含むであろう、ＭＴＶ　ＬＴＲが好ましいのは、グルココルチ コイドホルモンがＭＴＶ　ＬＴＲ内の特異的部位において転写開始の効率を高め ることによりＭＴＶ　ＤＮＡの転写速度を刺激することが知られているからであ る。さらにグルココルチコイド受容体はＭＴＶ　ＬＴＲ内にマツピングされたＤ ＮＡ配列に特異的に結合し、従って異種プロモーターに対するグルココルチコイ ドの応答性を与えることができる。（実験の部■、特に項目Ｃ，（ａ）、アッセ イ系および実験様式を参照されたい、）またミネラルコルチコイド受容体がグル ココルチコイド受容体と機能的関連を示すこと、およびｈＭＲのＤＮＡ結合区が Ｍ　Ｔ　ＶＬＴＲを認識することも知られている。（実験の部■、特に項目Ｅ、 ：発現およびホルモンの結合、および項目Ｆ、：転写活性化を参照されたい、） 成長ホルモンプロモーターが好ましいのは、その活性化が甲状腺ホルモン−受容 体−複合体による結合に応答するからである。

本発明の“シス−トランス”バイオアッセイ系に用いるために好ましい宿主細胞 はＣｏＳ細胞およびＣＶ−１細胞である。

（本発明のバイオアッセイ系に用いられる好ましい宿主細胞については、実験の 部■、項目Ｃ，（ｉ）アッセイ系および実験様式を参照されたい、）ＣＯＳ−１ （ＣＯＳと呼ぶ）細胞は５Ｖ４０Ｔ抗原（Ｔａｇ）を発現するマウス腎細胞であ り；ｃｖ−１はＳＶ４０　Ｔａｇを発現しない、ＣＶ−１細胞は内在性グルココ ルチコイドもしくはミネラルコルチコイドまたは他の既知のステロイドホルモン もしくは甲状腺ホルモンの受容体をいずれも欠如するので好都合である。従って 適宜な発現ベクターを用いる遺伝子転写によりこれらの宿主細胞を受容体陰性か ら受容体陽性へ転換させることが可能である。ＣＯ５−１誘導体系にＴａｇが存 在することによって、導入された発現プラスミドを複製し、アッセイ期間中に生 成する受容体の量を相対的に高めることができる。

ＳＶ４０複製開始点（ｏｒｉ）を含む発現プラスミドは、Ｓ■４０Ｔａｇを発現 するいかなる宿主細胞においても高いコピー数にまで増殖することができる。従 ってＳＶ４０“ｏｒｉ”を保有する本発明の発現プラスミドはＣＯ５＠胞におい て複製しうるが、ＣＶ−１細胞においては複製されない、高いコピー数によって 与えられる高い発現が望ましいが、これは開示されたバイオアッセイ系にとって 決定的なものではない、いずれかの特定の細胞系を“宿主”として用いることも 決定的なものではない、上記発現ベクターはきわめて有効であるので、本発明者 らによればこのアッセイ法は本発明者らが試験したすべての宿主において作動し た。ＣＶ−１細胞が好ましいのは、それが遺伝子転移の研究に好都合であり、感 受性の、かつ十分に報告された宿主細胞系を提供するからにすぎない。

“シス−トランス”バイオアッセイ系は、本発明の受容体Ｄ　Ｎ　、Ａが転移し た宿主細胞中に発現したが否かを判定するために特に有用である。これは本発明 の受容体が対応する天然の同系受容体の結合活性の少なくとも約１０％を有する が否が、またこの受容体が対応する天然の同系受容体の転写活性化活性の少なく とも１０％を有するか否かを判定する際にも有用である。

第１１−１図は本発明の“シス−トランス”受容体機能性バイオアッセイ系をｈ ＧＲｃＤＮＡによりコードされる受容体ポリペプチドの機能性の測定に用いる方 法につき模式的に示す。このバイオアッセイ法の詳細、および受容体の機能性分 試験するための定量性バイオアッセイ系としてのその有効性は実験の部■に開示 および論述される。（特に項目Ｆ、実験法；および項目Ｃ（ｂ）、機能性ｈＧＲ の発現を参照されたい、）同実験の部に示されるように、ホルモン応答性プロモ ーター／エンハンサ−要素の活性化を証明するために採用できるＣＡＴ酵素アッ セイ法のほかに、転移宿主細胞のウェスターンプロット分析法を採用して、対照 として用いられる同系受容体から移動性に関して区別できない受容体ポリペプチ ドの合成を証明することができる。

さらに本発明の“シス−トランス”バイオアッセイ系を採用して、特異的ホルモ ンによる受容体（トランスフェクションおよび培養された宿主細胞において産生 されたもの）の活性化、ならびにそれらのホルモン結合能および特性を調べるこ とができる。

実験の部■に証明されるように、これがｈＥＲについて行われた場合本発明のｈ ＧＲは機能性であり、同系受容体の場合と同じ特異性および濃度でグルココルチ コイドホルモンと結合することが示された。

最後に本発明者らは要約の項に示すように本発明のＤＮＡを用いて、その転写が 受容体との複合体を形成したホルモンにより活性化される遺伝子（Ｇ）の転写活 性化に必要かつ十分な条件は、（Ｇ）が存在する細胞（Ｃ）中にホルモンおよび その受容体が存在することであることを見出した。（ホルモン（Ｈ）および受容 体（Ｒ）が遺伝子（Ｇ）の転写に作用する様式は完全には理解されていない。し かし受容体（Ｒ）はホルモン（Ｈ）と複合体を形成した場合、特異的ＤＮＡ部位 、すなわち当技術分野で“転写制御要素”または゛″転写刺激を媒介するＤＮＡ 配列”と呼ばれ、遺伝子（Ｇ）が位置する付近のクロマチン上に存在するものに 結合すると考えられる。ホルモン／受容体−すなわち（Ｈ）／（Ｒ）−複合体に よるこの結合は、まだ解明されていない様式で、遺伝子（Ｇ）に対するプロモー ターを“始動させる（ｔｕｒｎ　ｏｎ＞”かまたは何らかの他の方法で活性化し 、これにより（Ｇ）遺伝子の転写を刺激するホルモン依存性“スイッチ”として 作用すると思われる。） 本発明者らの知見によって、遺伝子工学的に処理された細胞において目的蛋白質 を産生させるための改良された組成物および方法が得られた。これらの方法２種 が本発明方法である。第１はその転写が受容体との複合体を形成したホルモンに よって活性化される遺伝子の転写を誘導する方法である。第２は細胞を遺伝子工 学的に処理し、次いでその転写が受容体との複合体を形成したホルモンによって 活性化される遺伝子によりコードされる蛋白質の生成を増大および制御する方法 である。

これら２方法につき述べる際にも、受容体蛋白質との複合体を形成したホルモン により転写が活性化される遺伝子を遺伝子（Ｇ）と呼ぶ、遺伝子（Ｇ）を活性化 するホルモンを（Ｈ）、その同族体をいずれも（ａＨ）と呼ぶ、受容体蛋白質は （Ｒ）、その機能性修飾体は（ｒ）と呼ばれる。最後に、遺伝子（Ｇ）が存在す る細胞を（Ｃ）と呼び、遺伝子（Ｇ）によりコードされる蛋白質を（Ｐ）と呼ぶ 。

本発明の遺伝子誘導法によれば、遺伝子（Ｇ）を含む細胞（Ｃ）が、細胞（Ｃ） において発現可能であり、受容体（Ｒ）またはその修飾された機能性形！！！（ ｒ）をコードする本発明のＤＮＡにより形質転換される。そして細胞（Ｃ）にお けるホルモン（Ｈ）の濃度または同族体（ａＨ）の濃度を少なくとも遺伝子（Ｇ ）の発現を確実に誘導するのに十分な水準にまで高める。

実験の部■に示したように本発明の誘導法を採用した場合、意外にも遺伝子（Ｇ ）が位置する細胞に（Ｈ）および（Ｒ）が存在することによって遺伝子（Ｇ）の 転写が誘導されるだけでなく、蛋白質（Ｐ）の産生が５００〜１０００倍高約１ ００．この知見はこの誘導法が転写を誘導するためにだけでなく、これを増大お よび制御するためにも採用されることを本発明者らに示した。

この知見から、細胞を工学的に処理し、次いでその転写が受容体との複合体と形 成したホルモンにより活性化される遺伝子（Ｇ）によりコードされる蛋白質の生 成を制御する本発明方法も開発された。この方法についてはのちにより詳細に述 べる。

本発明の誘導法は細胞に与えられるホルモン（Ｈ）またはその同族体（ａＨ）の 濃度を調節するだけで蛋白質（Ｐ）の生成を増大させ、および制御するためにも 採用できる。（当業者に自明のとおり、細胞（Ｃ）を本発明のＤＮＡで形質転換 すると、細胞（Ｃ）において（Ｒ）または（ｒ）の適切な供給が保証されるので 、（Ｒ）または（「）の欠如はもはや遺伝子（Ｇ）の転写における制限因子とは ならない、このため、培養液中の（Ｈ）または（ａＨ）の量を増加させるだけで 遺伝子（Ｇ）の転写を増加させ、結果的に細胞（Ｃ）において産生される蛋白質 の量を増加させることができるであろう、） 本発明の誘導法は下記の条件を満たす限り、ホルモン（Ｈ）またはその同族体（ ａＨ）のうちのいずれかと複合体を形成したステロイドホルモンまたは甲状腺ホ ルモン受容体が結合することによって活性化される転写制御要素による転写制御 下にあるいかなる遺伝子（Ｇ）の発現をも誘導するために採用できる：（１）受 容体（Ｒ）、または（Ｒ）の転写活性化特性を備えたその機能的な修飾された形 ！！（ｒ）とコードするＤＮＡを使用できる；（２）細胞（Ｃ）が培養可能な細 胞である；（３）細胞（Ｃ）がホルモン（Ｈ）または同族体（ａＨ）との複合体 形成のために必要な（Ｒ）−または（ｒ）−コード化ＤＮＡを発現すべく形質転 換されうる。

当業者は寄託された本発明のＤＮＡのいずれをも７０−プとして用いて、現在入 手できない（Ｒ）−または＜ｒ）−コード化ＤＮＡのゲノムライブラリーを多大 な実験なしに探査することができる。これらのＤＮＡが見出されると、これらが 遺伝子（Ｇ）の存在する細胞（Ｃ）において発現可能である場合には細胞（Ｃ） の形質転換に使用できる。培養細胞を形質転換する方法は周知であり、当業者が 多大な実験なしに用いることができる。

同様に多大な実験なしに、細胞（Ｃ）に（Ｈ）が存在する場合その基礎水準はど の程度であるが、また遺伝子（Ｇ）の転写な、従って蛋白質（Ｐ）の生成を誘導 および制御するためには（Ｈ）または（ａＨ）の濃度はどの程度でなければなら ないかを当業者は判定できる。培養細胞（Ｃ）の浸漬に用いられる培養液に（Ｈ ）または（８Ｈ）を添加することにより、必要な濃度の（Ｈ）を形質転換細胞（ Ｃ）に供給することができる。

本発明により、遺伝子（Ｇ）の転写に必要かつ十分な条件は遺伝子（Ｇ）が存在 する細胞（Ｃ）に（Ｈ）または（＆Ｈ）および（Ｒ）または（ｒ）が存在するこ とであり、遺伝子（Ｇ）の転写、従って蛋白質（Ｐ）の生成は形質転換細胞（Ｃ ）の浸漬に用いられる培養液中の（Ｈ）または（ａＨ）の量を増加させるだけで 誘導および制御できるこ、とが教示された。当業者に自明のとおりこれらの知見 に基づいて細胞を工学的に処理し、その結果遺伝子（Ｇ）が位置する細胞（Ｃ） 中にホルモン（Ｈ）およびその受容体を確実に存在させ、次いで細胞（Ｃ）中に 存在するホルモン（Ｈ）またはその同族体の濃度を制御するだけで、その転写が ホルモン／受容体−複合体により活性化される遺伝子によってコードされる蛋白 質の生成を制御することができる。この概念は本発明による細胞の工学的処理お よび蛋白質の製造のための方法の基礎である。

本発明による細胞の工学的処理法および蛋白質の製法によれば、（１）細胞（Ｃ ）を遺伝子（Ｇ）が含有されるべく工学的に処理し、その結果遺伝子（Ｇ）の転 写は適宜なホルモン／受容体、（Ｈ）／（Ｒ）、複合体が結合し、これにより遺 伝子（Ｇ）の転写が活性化される転写制御要素による制御下に置かれ：（２）こ の時点で転写制御要素による制御下にある遺伝子（Ｇ）が含有される細胞（Ｃ） を、細胞＜Ｃ＞において発現可能であり、受容体（Ｒ）またはその修飾された機 能的形態（ｒ）をコードする本発明のＤＮＡにより形質転換し；（３）最後に、 細胞（Ｃ）におけるホルモン（Ｈ）またはその同族体の濃度を調節して、形質転 換細胞（Ｃ）の浸漬に用いる培養液から細胞が利用しうるホルモン（Ｈ）の量を 増大および制御することにより、遺伝子（Ｇ）の転写が誘導されるだけでなく効 果的に増大および制御される。このように遺伝子（Ｇ）の転写を増大および制御 することにより、蛋白質（Ｐ）の生成も増大および制御される。

上記の誘導法の場合、本発明による細胞の工学的処理および蛋白質製造のための 方法においてはホルモン（Ｈ）および受容体（Ｒ）の双方が細胞（Ｃ）中に存在 する。また誘導法の場合、受容体（Ｒ）またはその機能的な修飾された形態（「 ）の存在が本発明の（Ｒ）−または（ｒ）−コード化ＤＮＡにより細胞（Ｃ）を 形質転換することにより保証される。前記のように、培養細胞を形質転換する方 法は周知であり、当業者が多大な実験なしに用いることができる。適宜な濃度の （Ｈ）または（ａＨ）を含有する浸漬液中に形質転換細胞（Ｃ）を浸漬するだけ で、（Ｈ）またはその同族体（ａＨ）の存在を保証し、かつ（Ｈ）または（ａＨ ）の濃度を制御することができる。ｆ４宜な濃度、すなわち一定量の蛋白質を生 成するために細胞（Ｃ）が必要とする（Ｈ）または（ａＨ）の濃度は、一定の条 件下で多大の実験なしに当業者が判定することができ同様に当業者に自明のとお り、細胞（Ｃ）を本発明のＤＮＡにより形質転換することによって細胞（Ｃ）に おける適切な（Ｒ）または（ｒ）の供給が保証され、従って（Ｒ）または（ｒ） の欠如が遺伝子（Ｇ）の転写における制限因子となることはない、このため、培 養液中の（Ｈ）またはく＆Ｈ）の量を増加させるだけで、細胞（Ｃ）中に産生さ れる蛋白質の（Ｐ）の量を増加させることができるであろう。

本発明の誘導法の場合と同様に１本発明による細胞の工学的処理および蛋白質の 製造のための方法は下記の条件を満たす限り、細胞（Ｃ）に挿入することができ 、その結果ホルモン（Ｈ）またはその同族体のいずれかと複合体を形成したステ ロイドホルモンまたは甲状腺ホルモン受容体（Ｒ）の結合によって活性化される 転写制御要素による転写制御下に置かれるいかなる遺伝子（Ｇ）の発現の制御に も採用することができる：（１）受容体（Ｒ）、または（Ｒ）の転写活性化特性 を備えたその機能的な修飾された形Ｂ　（ｒ）をコードするＤＮＡを使用できる ；（２）細胞（Ｃ）が培養可能な細胞である；（３）（Ｒ）−または（ｒ）−コ ード化ＤＮＡは遺伝子（Ｇ）が存在する細胞において発現可能である。

この場合も多大な実験なしに当業者は寄託された本発明のＤＮＡのいずれをもプ ローブとして用いて、現在入手できない（Ｒ）−または（「）・−コード化ＤＮ Ａのゲノムライブラリーを探査することができる。これらのＤＮＡが見出される と、これらが遺伝子（Ｇ）の存在する細胞（Ｃ）において発現可能である場合に は本発明の工学的蛋白質製造法に使用できる。

同様に多大な実験なしに、細胞（Ｃ）に（Ｈ）が存在する場合その基礎水準はど の程度であるか、また遺伝子（Ｇ）の転写を、従って蛋白質（Ｐ）の生成を誘導 および制御するためには（Ｈ）または（ａＨ）の濃度はどの程度でなければなら ないかを当業者は判定できる。培養細胞（Ｃ）の浸漬に用いられる培養液に（Ｈ ）または（ａＨ）を添加することにより、目的量の蛋白質（Ｐ）を確実に生成さ せるのに必要な濃度の（Ｈ）を形質転換細胞（Ｃ）に供給することができる。

本発明の種々の観点を以下の７実験例に詳述し、例示する。

実験の部Ｉはヒトグルココルチコイド受容体に関する。より詳細にはこの例はｈ ＧＲｅＤＮＡの一次構造、およびこれまで報告されたｈＧＲ蛋白質と機能的に区 別できないポリペプチドへのその発現を示す、実験の部■はｈＧＲｃｒ）機能区 に関する。この例に示されるように、ＧＲは少なくとも４個の機能区を含み、そ れらのうち２個は予想されたものであり、予想されたＤＮＡ−およびステロイド −結合区に対応し、それらのうち２個は予想されなかったものであり、転写に対 し強い作用をもつ、実験の部■は甲状腺ホルモン受容体ｃ−ｅｒｂ−Ａに関する 。この実験例に示すように、ｃ−ｅｒｂ−Ａは本発明者らがここでｈＴＲアルフ ァと呼ぶ甲状腺ホルモン受容体をコードする０本発明者らが予想外に第２の甲状 腺ホルモン受容体を見出したことと合わせて（実験例■参照）、実験の部ｍに示 されたｅ　−ｅｒｂに関するデータは甲状腺ホルモン受容体蛋白質についてのよ り詳細な知見を得るのにきわめて有用であろう、実験の部■はヒトミネラルコル チコイド受容体に関する。これは本発明者らが示すようにグルココルチコイド受 容体に対し構造的および機能的類似性ともつ、実験Ｖは本発明者らがｈＥＲＲｌ およびｈＥＲＲ２と呼ぶ新規な予想されなかった一部のステロイドホルモン受容 体を示す。

これらの受容体は新規なステロイドホルモン系の存在に対する最初の証拠を与え る。新規な“シス−トランス”バイオアッセイ系に関する本明細書の記述と合わ せて、この新規なエストロゲン関連受容体ｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２は新規な ホルモンの同定へ系統的に導くアッセイ系を開発するための基礎を与えるであろ う、このような新規な系の同定は広範な生理学的および臨床上の重要性をもつと 思われる。実験の部■にはラット甲状腺ホルモン受容体ｃ−ｅｒｂ−Ａオリゴヌ クレオチドにおいて本発明者らがＴ、調節に必要であることを見出した部位に関 する本発明者らのデータを若干示す、これらの知見は、実験の部■、およびヒト 染色体１７に結合した新規な予想されなかった甲状腺ホルモン受容体に間する実 験■の記述と合わせて、甲状腺ホルモン受容体蛋白質の特性を開明する際に有用 であろう。

これ以上詳述しなくても当業者は以上の記述および以下の実験の部によって本発 明を最大限に利用することができると考えられる。実験の部に示した材料は特に 指示しない限り例示の目的で示されたものであり、従って何らかの形で請求の範 囲の記載を限定するものと解すべきではない。

火１へ１１ 機能性ヒトグルココルチコイド受容体ｃＤＮＡの一次構造および発現 上ｆｆ ヒトリンパ様細胞および線維芽細胞ｃＤＮＡクローンから推定したヒトグルココ ルチコイド受容体（ｈＧＲ）の全アミノ酸配列を報告する。この配列はこの受容 体の構造上の種々の特性を明らかにする。これには主免疫原区、およびＤＮＡ結 合区の一部をなすと思われるシスティン／アルギニン／リジンに富む領域が含ま れる０分析量の全長蛋白質を生成するためのＳＰ６転写ベクター系の使用につき 記述し、無細胞転写された蛋白質が免疫原性であり、かつ天然のグルココルチコ イド受容体に特有のステロイド結合特性な備えていることを証明する。ワインバ ーガー（Ｗ’ｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら（１９８５ｂ）はｈＧＲ配列と発癌遺伝子 ｖ−ｅｒｂ−Ａの配列の相同性を報告している。

上」しコ五ｌ グルココルチコイド受容体は多種の培養細胞系に広く分布し、発現しているので 、グルココルチコイドによる遺伝子発現の制御は転写調節のモデルとして広く研 究されている。多数のグルココルチコイド応答性転写ユニットが確認されており 、これにはマウス乳腺腫瘍ウィルス（ＭＭＴＶ＞（リンゴールド（Ｒｉｎｇｏｌ ｄ）ら、１９７５．バークス（Ｐａｒｋｓ）ら、１９７４）、マウスおよびヒト メタロチオネイン（バーガー（Ｈａｇｅｒ）ら、１９８１；カーリン（Ｋａｒｉ ｎ）ら、１９８０）、ラットアルフｙ２Ｍ−グロブリン（クルゾ（Ｋ　ｕｒｔｚ ）ら、１９７７）ならびにラットおよびヒト成長ホルモン（スピントラ−（Ｓｐ ｉｎｄｌｅｒ）ら、１９８２；エバンス（Ｅ　ｖａｎｓ）ら、１９８２；ロビン ス（Ｒｏｂｉｎｓ）ら、１９８２）の遺伝子が含まれる。これらの遺伝子数種の 転写刺激を媒介するＤＮＡ配列の位置が決定された。ＭＭＴＶについては、これ らの配列は転写開始部位の上流にある別個のゲノム領域であり、これらは方向お よび位置と無関係にそれらの作用を及ぼすと思われる（チャンドラ−（Ｃｈａｎ ｄｌｅｒ）ら、１９８３；オストロフスキー（Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ）ら、１９８ ４）、ステロイド／受容体−複合体はこれらの調節配列に結合すると思われ、精 製された受容体を用いて特異的結合部位が決定された（ゴビンダ（Ｇｏｖｉｎｄ ａ）ら、１９８２：シャイブライト（Ｓ　ｅｈｅｉｄｅｒｅｉｔ）ら、１９８３ ．プファール（Ｐｆａｈｌ）　１９８２　；ベイバール（ｐ　ａｙｖａｒ）ら、 １９８３）、数種の応答性遺伝子のフットプリンティング分析に基づいて、コア 配列５°７ＧＴ／ＣＴＣ”ｒ３’ｅ共有するコンセンサスＤＮＡ結合配列が提唱 された（カーリン（Ｋａｒｉｎ）ら、１９８４）。

グルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）がその位置および方向を変えてもなおプ ロモーター誘導性を保持しうろことは、これがエンハンサ−と命名される一部の シス作用性調節配列に類似することを示唆する（チャンドラ−（Ｃｈａｎｄｌｅ ｒ）ら、１９８３＞。

最初にウィルス中に、次いで細胞遺伝子中に見出されたこれらの配列はインビボ における効果的な転写のために必要である（ライモニス（Ｌａｉｍｏｎｉｓ）ら 、１９８２．ベノイスト（Ｂｅｎｏｉｓｔ）ら、１９８１；ベルジ（Ｂａｅｒｊ ｉ）ら、１９８３）、エンハンサ−は組織特異性転写制御により調節作用を媒介 するトランス作用性因子により認識されることが示された。エンハンサ−因子は 十分には解明されていないが、グルココルチコイド受容体はこれら推定遺伝子活 性化蛋白質の一例であると考えられる。

放射性標識された高親和性グルココルチコイド同族体、たとえばデキサメサゾン およびトリアムシノロンアセトニドの入手が容易であるため、精製法が開発され 、その結果はぼ純粋なラットおよびヒト受容体が単離されたくシモンズ（Ｓ　ｉ ｍｏｎｓ）ら、１９８１；ゲージング（Ｇｅｈｒｉｎｇ）ら、１９８３）、受容 体はショ糖濃度勾配液中を二量体として移動するが、変性作用性５ＤＳ−ポリア クリアミドゲル上での分析によれば相対分子量（Ｍ　ｔ）−９４，０００（９４ Ｋ　）の単一ポリペプチドが検出される（ウェストパール（Ｗｅｓｔｐａｈｌ） ら、１９８２；ラング（Ｗｒａｎｇｅ）ら、１９７９）。

その天然のポリペプチドはステロイド結合およびＤＮＡ配列認識に対する固有の 特異性を備えている。精製されたラットおよびヒト受容体に対して産生されたモ ノクローナル抗体およびポリクローナル抗体（オフレット（Ｏｋｒｅｔ）ら、１ ９８１；ハーモン（Ｈａｒｍｏｎ）ら、１９８４；ガメッチュ（Ｇａｍｅｔｅｈ ｕ）ら、１９８４）をプローブとして用いて、ステロイド−およびＤＮＡ−結合 領域と別個の分子部分上にある主免疫原領域を確認することができた（カールス テッドーデューク（Ｃａｒｌｓｔｅｄｔ−Ｄｕｋｅ）ら、１９８２、ラング（Ｗ ｒａｎｇｅ）ら、１９８４；デルウェーク（Ｄｅｌｌｗｅｇ）ら、１９８２＞、 この分子の構造につきさらに情報を得るために、またこれが遺伝子の転写を調節 する分子機構の分析に着手するために、本発明者らは受容体ｃＤＮＡ配列のクロ ーニングを試みた。受容体特異性抗体をプローブとして用いて、本発明者らはヒ トまたはラットグルココルチコイド受容体ｃＤＮＡ挿入配列を含むクローンを分 離した（ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら、１９８５ａ；ミースフェ ルド（Ｍｉｅｓｆｅｌｄ）ら、１９８４）。

ニー９−１Ｕ」 ａ　ルココル　コイドＰ穴　ｅＤＮＡ 先きに報告されたように（ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら、１９８ ５ａ）ヒトリンパ様細胞系ＩＭ−９から得たポリ（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型として用 いてファージ発現ベクターラムダｇｔｌｌにおいてｃＤＮＡクローンのライブラ リーを構成した。このライブラリーをまず精製グルココルチコイド受容体に対す る家兎ポリクローナル抗血清によりスクリーニングした結果、約２．５×１０’ プラークから免疫陽性の候補クローン数種が分離された。

これらのクローンから得たベータガラクトシダーゼ融合蛋白質を用いて受容体エ ピトープ特異性抗体をアフィニティ精製し、次いでこれを採取し、細胞抽出物の 蛋白質プロットへの結合により同定した。ヒトグルココルチコイド受容体の抗原 決定因子を発現する挿入配列を含むクローン３種を分離した。これらのクローン の挿入配列は異なるサイズであったが交差ハイブリダイズした。それはそれらが 恐らく受容体の主免疫原区の境界を定めると思われる共通配列を含むことを示す ０合わせてこれらのクローンは１．４ｋｂｐの長さに及んだが、明らかに受容体 全体をコードするのに十分なほど長くはなかった。これはＭｔ９４にのポリペプ チドをコードするために約２，５００個のヌクレオチドを必要とすると推定され た。

他のｃＤＮＡクローンを分離するために本発明者らは最初のライブラリーを再び スクリーニングし、かつオカヤマ（○ｋｍ）＋ａｍ＋ａ）およびベータ（Ｂｅｒ ｇ）（１９８３＞により報告されたベクターにおいてヒト線維芽細胞からのポリ （Ａ）”　ＲＮＡを用いて得た第２のライブラリー（オカヤマにより供与）をも 試験した。免疫陽性ｃＤＮＡ挿入配列（ｈＧＲｌ、２）の１種をプローブとして 用いて１２クローンと分離した。これらは合わせて４．０ｋｂｐ以上となった。

これらのクローンのヌクレオチド配列をマキサム（Ｍａｙａｍ）およびギルバー ト（Ｇ　１ｌｂｅｒｔ）（１９７７）の方法により、第１−１　（Ａ）図に示し た手法に従って調べた。ＲＮ、Ａプロット分析から全長クローンを得るためには ５〜７ｋｂのｃＤＮＡ挿入配列が必要であろうということが示された。配列分析 から重複クローン○Ｂ７およびｈＧ　Ｒ５，１６はアミノ酸７２０個のオープン リーディングフレームに及ぶことが示されたが、これは完全な受容体をコードす るのに十分な長さではない、従って約２Ｘ１０’個の形質転換体を含む第２の線 維芽細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、推定翻訳開始部位の上７Ｘ １５０ｂｐに及ぶ大型の挿入配列を含むクローン（ＯＢｌｏ）を得た（第１−１ （Ａ）図９照）、配列分析により２種の蛋白質の形態（アルファおよびベータと 命名）が予想された。これらはアミノ酸７２７において異なり、それらのカルボ キシ末端にそれぞれアミノ酸５０個および１５個の付加的な異なるオーブンリー ディングフレームを含む（第１−１（Ｂ）図参照）、クローンＯＢ７により表わ されるアルファ形はグルココルチコイド受容体の主要な形態である。各種ライブ ラリーから分離された８種のｅＤＮＡクローンがこの配列を含むからである。

直用Ａおび　の 第１−２（１）およびｌ−２（２）図はクローンｈＧＲ１，２、ｈＧＲ５，１６ 、ＯＢ　７および０Ｂ１０を用いて判定された、ヒトアルファグルココルチコイ ド受容体をコードする４、８００ヌクレオチド配列を示す、翻訳開始部位はヌク レオチド１３３−１３５に対応するメチオニンコドンに帰属すると判定された。

これがフレーム内ターミネータ−ＴＧＡ（ヌクレオチド１２１−１２３）から下 流に現われる最初のＡＴＧ）リブレットだからである。

しかしアミノ末端ペプチド配列に関する情報がなければ開始部位の明確な決定は まだ不可能である。７７７位のリジンに特異的なコドンの後に翻訳終止コドンＴ ＧＡがある。残りのコード化配列は多数の重複クローンに包含され、ＯＢ７はポ リ（Ａ）付加部位に続＜　４．３ｋｂの挿入配列を含み、ｏＢｌｏは推点イニシ エーターであるメチオニンを含む、クローンＯＢ７およびＯＢｌｏの３′領域は 制限エンドヌクレアーゼおよびｃＤＮＡ配列分析の双方により示されるようにヌ クレオチド２，３１４において異なる。この分岐点においてアルファ受容体には さらに５０個のアミノ酸をコードする独自の配列が続き、一方ベータ受容体には わずか１５個のアミノ酸をコードする配列が続く（第１−３（Ｂ）図）、ＯＢ７ の３゛側非翻訳領域はヌクレオチド２．３２５個の長さであり、一方０ＢＩＯの 場合はヌクレオチド１．４３３個である。直接的な配列比較により（第１−２（ １）、ｌ−２（２）およびｌ−３（Ｂ））、またはストリンジェント条件下での ハイブリダイゼーション分析により（データは示されていない）示されるように 、これら２領域間には有志の相同性はない。

さらに本発明者らはヒト一部！！維芽細胞ライブラリーから他のｃＤＮＡクロー ン、ＯＢ　１２＜データは示されていない）を分離した。これはＯＢ７と等しい 配列を含むがヌクレオチド３．１０１におけるポリアデニル化信号を使用しく第 １−１　（Ｂ）およびｌ−２（１）およびｌ−２（２）図）、より短い３°側非 翻訳領域を生じる。ＯＢ７の３°側非翻訳領域に特異的なプローブを用いてヒト 胎ｆｉｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、大部分のクロー ンはＯＢ７の第１ポリ（Ａ）部位において終止することが明らかになった。従っ てメツセンジャーＲＮＡの相違は択一的ポリアデニル化および択一的ＲＮＡスプ ライシング双方による見掛けの結果である（後記参照）、ヒト線維芽細胞ライブ ラリーが双方のｅＤＮＡを含んでいたという事実は、双方の形の受容体が同一細 胞内に存在する可能性を示唆配列分析によって、アルファ形およびベータ形双方 のヒトグルココルチコイド受容体はそれぞれ残基７７７個および７４２個の長さ であることが明らかになった。これら２形態は残基７２７までは等しく、その後 でこれらは相違する。インビボにおける受容体の水準を調べるために、数種のヒ トおよびマウス細胞系からの細胞質抽出物を、ヒトグルココルチコイド受容体に 対するポリクローナル抗体を用いるイムノプロット分析法により検査した（ハー モン（Ｈａｒ論ｏｎＨ９８４）、アルファーおよびベーター受容体ｃＤＮＡをＳ ｐｂ転写ベクターに挿入してインビトロ翻訳用の合成＊ＲＮＡを作成した（第１ −４（Ａ）図）、これらのＲＮＡを別個に家兎網赤血球溶解系に添加し、非標識 生成物を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓ　Ｄ　Ｓ　−ＰＡＧＥ） により分析した。これら２種のＲＮＡは、移動の相違が２種の形態の予想ポリペ プチド長さと一致する異なる翻訳生成物の合成をプログラムする（第１−４（Ｂ ）図、レーン２．３）、未処理■へ１−９細胞、および１μ八クトリアムシノロ ンアセトニド処理したＩＭ−９ｍ胞がらの細胞質抽出物が９４に受容体（７９に 形は推定受容体分解生成物を表わす）に対するマーカー（第１−４（Ｂ）図、レ ーン４．５）として用いられる（ランデ（Ｗｒａｎｇｅ）ら、１９８４）、ステ ロイド処理後に、受容体／クロマチンの結合がより強くなること、従って受容体 が核へ転位することと対応して、９４にバンドの強度が低下する点を留意された い、アルファ形は受容体陰性の９４にバンドと共に移動し、一方ベータ形はより 速やかに移動する（第１−４（Ｂ）図参照、レーン２．３をレーン４．５と比較 されたい）。各種のヒトおよびマウス細胞系からの細胞質抽出物を比較すること により、アルファ受容体のみが存在することが明らかになった（第１−４ＣＢ） 図、レーン６〜９参照）。興味深いことに、ステロイド誘導性細胞溶解に対する 抵抗性に関して選択されたマウスＡＤＲ６リンパ腫細胞系（ダニエルンン（Ｄａ ｎｉｅｌｓｅｎ）ら、１９８４）はステロイド結合活性をもたず、免疫反応性受 容体を示さない（第１−４（Ｂ）図、レーン７）、従ってイムノプロット分析法 による多種の受容体ｃＤＮＡクローンおよび受容体蛋白質の解明に基づいて、本 発明者らはグルココルチコイド受容体の主要な生理学的形態はアルファ（９４Ｋ ）種であると結論する。

ｄインビ　ロにお【　ｈＧＲの クローニングされた受容体が機能性であるという他の証拠を提示するために、本 発明者らはインビトロ翻訳生成物がコルチコステロイドを選択的に結合しうる能 力を調べた。従って家兎の網赤血球溶Ｍ物をインビトロ合成したアルファまたは ベータｈＧＲＲＮＡの添加前または添加後に、放射性標識された合成グルココル チコイド同族体３Ｈ−トリアムノシロンアセトニド（’Ｈ−ＴＡ）と共にインキ ュベートした。第１−５図に示すようにｈＧＲＲＮＡによりプログラムされた溶 解物は選択的にステロイド結合能を獲得した。意外に６インビトロき成したベー タ受容体は競合性’Ｈ−ＴＡを結合しなかった。インビトロ合成したアルファー ｈＧＲは、過剰の非標識コルチゾルまたはデキサメサゾンの添加によって競合す る可能性のある放射性標識ステロイドを結合した。しかし’Ｈ−ＴＡの結合は過 剰の非標識エストロゲンまたはテストステロンによっては効果的に競合されなか った。これに対し過剰のプロゲステロンは有効な競合体となり、これは先に報告 されたプロゲステロンの抗グルココルチコイド活性と一致する（ルソー（Ｒｏｕ ｓｓｅａｕ）ら、１９７２）、これらの結果ご確認するために、ヒトリンパ様細 胞の抽出物から調製された天然グルココルチコイド受容体を用いて競合実験を反 復した。インビトロ翻訳された受容体および天然のインビボ受容体の双方とも、 ステロイドの結合、および過剰の非標識ステロイド同族体との競合に関してほぼ 等しい特性を示す（第１−５図参照）。

ｅｌｌ・ｔ　２　の　に　ｈＧＲ； ヒトグルココルチコイド受容体は染色体５に機能的にマツピングされている。受 容体欠損マウスＴ細胞（ＥＬ４）をヒト受容体含有子細胞（ＣＥＭ−Ｃ７）と融 合させることにより構成された体細胞ハイブリッドの分析から、野生型ＯＥＭ− Ｃ７受容体を発現する分離体はヒト染色体５と保持するが、デキサメサゾン酎性 分離体はこの染色体を失っていることが示された（ゲーゾング（Ｇｅｈｒｉｎｇ ）ら、１９８５）。

明者らはヒト染色体５のみを保有する、チャイニーズハムスター／ヒト体細胞ハ イブリッド（ＨＨＷ４５４）を用いて受容体ｅＤＮＡ配列をマツピングした。ヒ ト胎盤ＨＨＷ４５４ハイブリッド細胞およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ Ｏ）１！！胞から抽出したＤＮＡを旦ｅｏＲＩまたは旦力ｔｄｌｌｒ制限エンド ヌクレアーゼにより消化し、０．８ｚアガロースゲル上で分離した。ニトロセル ロースへ移したＤＮＡ断片をヌクレオチド５７０〜１．６４０から誘導される受 容体コード領域の一部（第１−１　（Ａ）図のｈＧＲｌ、２を参照されたい）に より試験した。ハイブリッド細胞系からのＤＮＡは、６．８オよび１７　ｋｂｐ ノＣＨＯ特異性ＥｃｏＲＩバントのほかに３．０および５．０ｋｂｐのヒト特異 性バンドをも含む（ホレンバーグ（Ｈｏｆ　ｌｅｎｂｅｒｇ）ら、１９８５の図 ６８、レーン２．３を参照されたい）、（ここに実験の部Ｉとして示した研究は ホレンバーグ（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ）ら、１９８５として公表された。図６お よび７は同報文中に示され、本明細書には示されていない。）意外にも９．５ｋ ｂｐのＤＮＡ断片は全ヒトＤＮＡ中に見出されたが、ハイブリッド系には見出さ れなかった（ホレンバーグ（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ）ら、１９８５、図６ａ、レ ーン１を参照されたい）、同様にＨｉｎｄｌｌ［消化によって染色体５ハイブリ ツド細胞ＤＮＡ中に存在しない７．５ｋｂｐのバンドが示された（ホレンバーグ （Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ）ら、１９８５、図６８、レーン４を参照されたい）、 これらの結果は、受容体ｃＤＮＡはヒト染色体５にマツピングされるが、このゲ ノムの他のいずれかの位置に付加的な受容体関連配列があることを示す、これら の配列をマツピングするために、デュアルレーザー蛍光活性化細胞ソーター（Ｆ ＡＣ５）！使用し、ＤＩＰＩ／クロモマイシン（ベキスト３３２５８クロモマイ シンと併用）により染色した分裂期染色体懸濁液を識別した；この方法により２ ４種のヒト染色体を２２画分に分離することができたくレボ（Ｌｅｂｏ）ら、１ ９８４）。染色体を直接にニトロセルロース上に識別したのち、染色体ＤＮＡを 変性し、ｈ　Ｇ　Ｒｃ　Ｄ　Ｎ　Ａプローブにハイブリダイズした。染色体５の 配置確認のほかに、染色体１６上に付加的配列が見出されたくホレンバーグ（Ｈ ｏｌｌｅｎｂｅｒｇ）ら、１９８５、図６ｂを参照されたい）。この配置を確認 するために、マウス赤白血病細胞、およびヒト染色体１６を含むマウス赤白血病 細胞系（ボーア（Ｂ　ｏｄｅ）ら、１９８１参照）からのＤＮＡをＨｉｎｄｍに より消化し、ｈＧＲｃＤＮＡにより調べた（ホレンバーグ（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒ ｇ）ら、１９８５、図６　ｅ　ｆ！：９照されたい）；予想されたようにハイブ リッド中に見出され、対照中には見出されなかった唯一のＤＮＡが７．５ｋｂｆ ）Ｄ　Ｎ　ＡｉＪｉ片テア’）、これにより染色体１６の帰属が確立したくホレ ンバーグ（Ｈｏ　ｔ　Ｉｅｎｂｅｒｇ）ら、１９８５、図６ｃ、レーン１．２を 参照されたい）。

ＯＲ３および０Ｂ１０の３′側非翻訳領域からの旦ｅｏＲＩ−ＸｂａＩ断片を用 いた他のサザーンプロット分析により、染色体５のみへのハイブリダイゼーショ ンが明らかになった（データは示されていない）０本発明者らは、アルファーお よびベーター受容体ｃＤＮＡは共に恐らく染色体５上の羊−遺伝子によってコー ドされると結論し、これら２形態のｃＤＮＡが択一的スプライシングにより生じ ることを示唆する。さらに本発明者らは、染色体１６上に位置する他の遺伝子は 少なくともヌクレオチド５７０〜１．６４０においてグルココルチコイド受容体 遺伝子との相同性を有すると結論する。これらの染色体１６上の配列が関連ステ ロイド受容体遺伝子、処理された遺伝子もしくは偽遺伝子、またはグルココルチ コイド受容体に対する遺伝子と共通の区域を共有する遺伝子のいずれを表わすか は明らかでない、ゲノムクローニングおよびＤＮＡ配列決定により解答が得られ るであろう。

グルココルチコイド受容体をコードするｍＲＮＡのサイズを測定するために、ヒ ト線維芽細胞系ＨＴ１０８０から分離された細胞質−ＲＮＡを用いてノーザンブ ロットハイプリダイゼーション実験を行った（ボーア（Ｂｏｄｅ）ら、１９８１ ）、ｈＧＲｌ、２コ一ド化配列をプローブとして用いて、５．６．６．１および ７．１ｋｂｐの多数のｍＲＮＡを検出した。これらの細胞をグルココルチコイド と共に２４時間処理すると受容体ｍＲＮＡが２〜３倍減少し、潜在的な負のフィ ードバック調節が示唆された。

上］し三１色 グルココルチコイド受容体の構造分析は、この調節分子が遺伝子の転写に作用な 及ぼす機構を洞察するための前提条件である。ここに本発明者らはｅＤＮＡクロ ーンのヌクレオチド配列分析から推定したヒトグルココルチコイド受容体の一次 配列を提示した。

ｈＧＲｃＤＮＡの分離によって、少なくとも２形態のポリペプチドをコードする 多数のｍＲＮＡの存在が明らかになった。

これらの推定蛋白質はそれらのカルボキシ末端において、アルファーｈＧＲの場 合は５０個アミノ酸、ベーターｈＧＲの場合は１５個のアミノ酸の置換によって 異なる。アルファグルココルチコイド受容体は数種のヒト細胞系およびｃＤＮＡ ライブラリーにおいて同定された主要な形態である。しかしノースロップ（Ｎ　 ｏｒｔｈｒｏｐ）ら（１９８５）による最近の雑文では、これら２形態の受容体 がマウスリンパ様細胞において明らかにされている。

マウスダブレット種に対するアルファーおよびベーターｈＧＲの関係は未確認で ある。ベーターｈＧＲの細胞分布および潜在的機能も明らかでないが、変異型受 容体がＲＩＡｍ特異性の機能に用いられている可能性はある。本発明者らは現在 それらの組織特異性発現を解明するために各形懇のヒト受容体に特異的な合成ペ プチドに対する抗血清を生成している。

免疫陽性ファージＤＮＡ挿入配列ｈＧＲ１，２Ａをプローブとして用いて選ばれ たｅＤＮＡには、ヌクレオチド３１０１にあるＡＡＴＡＡＡを用いてポリアデニ ル化がより早期に信号化されている点以外はＯＲ３と同様な３°末端を含むもの がある。これらのクローンはヒト線維芽細胞および胎盤双方のライブラリーから 分離されたくデータは示されていない）、択一的ポリ（Ａ）部位の選択は多くの 真核転写ユニットの特色である（ダーネル（Ｄａｒｎｅｌｌ）　１９８２　＞、 ある場合にはポリ（Ａ）部位の選択によって特定のポリペプチド生成物が定めら れる（アマラ（Ａｍａｒａ）ら、１９８２；ｏ−ゼンフィールド（Ｒｏｓｅｎｆ ｅｌｄ）ら、１９８３；アル）（Ａｌｔ）ら、１９８０；シュワルツバラエル（ Ｓ　ｃｈｗａｒｚｂａｕｅｒ）ら、１９８３）が、他の場合にはいずれかのポリ （Ａ）部位の選択によってポリペプチドの一次構造に何ら変化が生じない（ゼツ ツエル（Ｓｅｔｚｅｒ）ら、１９８２）、受容体の転写に際してポリ（Ａ＞部位 の選択は（１）特定の組織におけるーＲＮＡの安定性を変えるか、（２）スプラ イシングを変化させるか、または（３）ランダムであり、生理学的結果を生じな い。

ここに記載したインビトロ翻訳実験から、クローニングされた分子が完全なグル ココルチコイド受容体をコードするという直接的証明が得られる。第１にインビ トロ翻訳生成物はサイズが天然のグルココルチコイド受容体と等しく、受容体特 異性抗血清と免疫学的に区応する。第２に、インビトロ翻訳された蛋白質は、合 成グルココルチコイドであるトリアムシノロンアセトニドを選択的に結合させる という点で、機能的にグルココルチコイド受容体として作用する。この結合グル ココルチコイド、グルココルチコイド同族体およびプロゲステロンにより特異的 に競合されるが、性ステロイドであるテストステロンおよびエストロゲンによっ ては競合されない、この点に間して、インビトロ翻訳された受容体はヒトリンパ 様細胞から得たインビボ受容体と等しい挙動を示し、クローニングされた分子に 関する機能の第１の証拠を与える。ステロイド結合性の獲得は何ら特定の修飾を 要しないと思われるが、これが必要であったとしてもこれらの修飾はインビトロ 翻訳混合物中で行われる。

ここに示した結果は真核細胞の転写調節蛋白質とその標的遺伝子の分子レベルで の相互作用を研究するために必要な情報を提供した。これらの構造研究から、グ ルココルチコイド受容体、その遺伝子、およびそのＲＮＡ生成物を分析しうる基 礎が得られる。さらにインビトロで受容体を発現しうろことにより、特異的イン ビトロ突然変異生成の結果を速やかに試験しうる新規な方法が得られる。最後に 突然変異生成および蛋白質結合双方の実験によるグルココルチコイドおよび特異 的調節要素に応答する遺伝子の分離から、この蛋白質が誘導性真核遺伝子調節の 分析に対するきわめて有用なモデルとして役立つことが示唆さヒトグルココルチ コイド受容体ｅＤＮＡ配列決定法およびｃＤＮＡクローンの模式図、Ａ、アルフ ァグルココルチコイド受容体に対する複合ｃＤＮＡを最上部に示し、非コード化 配列（直線）およびコード化配列（点彩部分）を示す、共通の６ヌクレオチド制 限酵素部位を示す、配列を決定するために用いた重複ｃＤＮＡ挿入配列が示され 、配列決定された領域の下方の矢印は配列決定の方向および範囲を表わす、０Ｂ ＩＯの３°末端の破線は相違する配列を示す、数字は０ＢＩＯにおいて５°側寄 りの転写された配列に対するヌクレオチドの位置を意味する。

Ｂ、アルファ形およびベータ形の受容体をコードするｅＤＮＡ（それぞれＯＲ３ および０ＢＩＯ）、ＯＲ３の５゛末端（破線）は０Ｂ１０クローンにより与えら れる。蛋白質コード化情報は幅広い棒により表わされ：非翻訳配列は細い棒によ り示される。

ヌクレオチドおよびアミノ酸はコード化配列のそれぞれ上方および下方に番号が 示される。共通ＤＮＡ配列はヌクレオチド２．３１３（アミノ酸残基７２７）に まで及び、この地点でアルファ形とベータ形の受容体が分かれ、アルファｃＤＮ Ａ（ＯＲ１２゜０Ｂ７）は１５０個のヌクレオチド（５０個のアミノ酸）のオー プンリーディングフレームへと続き、ベータｃＤＮＡ＜０Ｂ１０）は４５個のヌ クレオチド（１５個のアミノ酸）へと続く（第１−３（Ｂ）図参照）、これらの クローンにおいてポリ（Ａ）のすぐ上流にヘキサヌクレオチド信号（ＡＡＴＡＡ Ａ）が示されており、ＯＲ３の最初のへキサヌクレオチドは０Ｂ１２においてポ リ（Ａ）として作用する。

■−ＩＡおび（Ｂ゛の′ 挿入配列ｈＧ　Ｒ１，２、ｈＧ　Ｒ２，９およびｈＧ　Ｒ５，１６を前記に従っ てラムダｇｔｌｌＩＭ−９リンパ様細胞ｃＤＮＡライブラリーから分離した（ワ インバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら、１９８５）。２種のクローンがρｃ ＤにおいてＨ，オクヤマにより（オクヤマ（○ｋａｙａｍａ）ら、１９８３）、 ＧＭ６３７ヒト線維芽細胞＜ＯＢ　７　）および−次ヒト線維芽細胞（ＯＢＩＯ ＞からのポリ（Ａ）３ｍＲＮＡを用いて構成されたｃＤＮＡライブラリーから分 離された。スクリーニングは”Ｐ−ｄＣＴＰを用いるニックトランスレーション により放射性標識されたｈＧ　Ｒ１，２−ｃＤ　Ｎ　Ａを用いて行われた。マキ サム（Ｍａｘａｍ）およびギルバー）　（Ｇ　１ｌｂｅｒＬ）＜１９７７）の化 学的開裂法により配列が決定された。

第１−２（１お　び（２゛ ヒトグルココルチコイド受容体のｃＤＮＡおよび推定蛋白質配列。完全なアルフ ァコード化配列およびＯＲ７の３′側非翻訳領域を図示し、推定アミノ酸を長い オープンリーディングフレームの上方に示す。ヌクレオチド１２１−１２３にお ける上流フレーム内終止コドンおよびＯＲ７における推定の付加的ポリアデニル 化信号に下線な施した。

１−３（Ａおよび（Ｂ）゛ ヒトグルココルチコイド受容体ベータｃＤＮＡの３′側の制限地図およびヌクレ オチド配列。Ａ、共通の６ヌクレオチド制限酵素部位と０ＢＩＯの３゛側非翻訳 領域につき示す。ベータ形（ＯＢＩＯ）のヌクレオチド２，２８１から３．８２ ０まテノｃＤＮＡ配列をアルファ形（ＯＲ７）の３゛末端コ一ド化部分に見られ る蛋白質コード化情報と比較したもの、各ｅＤＮＡによりコードされるアミノ酸 をヌクレオチド配列の上方に示す。０Ｂ１０の３′側非翻訳配列における推定ポ リアデニル化信号（ＡＡＴＡＡＡ）に下線を施した。

−１Ｉ−４ＡＰ３　Ｂ； インビトロにおいて翻訳されたｈＧＲと細胞抽出物からのインビボｈＧＲのイム ノプロット比較、Ａ、ｈＧＲｃＤＮＡ配列インビトロ転写のために構成されたベ クター。完全なアルファ（１）ＯＲ１０７）およびベータ（ｐＧＲ１０８）コー ド化配列はｐＧＥＭｌ中のＳＰ６プロモーターの転写制御下に置かれた。

ベクター配列、非コード化ｃＤＮＡ配列、およびコード化配列はそれぞれ細い直 線、太い欅、および四角で囲った領域により示される。約６０個のヌクレオチド のポリ（Ａ）領域をＡｐｉにより示す、異なるコード化配列は斜線領域および点 彩領域により示される。Ｂ、インビトロ翻訳生成物および細胞抽出物のウェスタ ンプロット分析、ＲＮＡを添加して（レーン１）またはｐＧＲ１０８から（ベー タ、レーン２）もしくはｐＧＲ１０７から（アルファ、レーン３）合成されたＲ ＮＡを添加して家兎の網赤血球溶解系において合成した非標諾翻訳生成物を７． ５ＳＳ　Ｄ　Ｓ　−ポリアクリルアミドゲル上で分画した。他のレーンは下記の ものである。ＩＭ−９（レーン４）、１μＭトリアムシノロンアセトニドで処理 したＩＭ−９（レーン５）、ＨｅＬａ（レーン６）、ＡＤＲ６，Ｍ１８９０．Ａ ＤＩマウスリンパ腫（レーン７）、Ｓ４９マウスリンパ腫（レーン８）およびＥ Ｌ４リンパＭ（レーン９）からの細胞質抽出物、蛋白質をニトロセルロースに移 し、抗ｈＧＲ抗体、次いで＋２１１標識黄色ぶどう球菌（旦口励ｆ二μ：ｃｕｓ 　ａｕｒｅｕｓ）蛋白質Ａにより前記に従って試験した（ワインバーガー（Ｗｅ ｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら、１９８５）。

■−４Ａお　Ｂ゛の゛ 第１−２（１）およびｌ−２（２）図に示したアルファコード化配列全体を含む 発現ベクターを構成するために、ＯＲ７の３′側コ一ド化配列を０Ｂ１０の５“ 側コード化配列に融合させた。

ＯＲ３をＥｃｏＲＩにより部分的に消化し、ＸｂａＩによって完全に消化し、１ ．２０ｋｂｐの断片をゲル精製してＥ　ｃｏＲＩ　／　Ｘ巨Ｉ消化０ＢＩＯとリ ゲートさせて、中間体ｐＯＢ１０７を得た。５゜側ポリ（Ｇ）領域（１１個のヌ クレオチド、ｎｔ）および３′側ポリ（Ａ）領域（約６０個のｎｔ）を含む全ｐ ＯＢ１０７　ｃＤＮＡ配列と部分凡ｓｔＩ／完全ＢａｍＨＩ消化により切断した 。得られた３、５ｋｂｐの断片をゲル精製し、ｐＧＥＭｌ（プロメガ・バイオチ ク）のＰｓｔＩおよびＢａ＋ｓＨｒ部位間に挿入してｐＧＲ１０７を得た。

プラスミドｐＧＲ１０８は直接にｐＯＢｌｏから、部分江Ｉ／完全旦■ＨＩ消化 し、得られたｃＤＮＡ挿入配列をｐＧＥＭｌの対応する部位へ挿入することによ り構成された。キャッグ付きＳＰ６転写体はＰｖｕＩＩ−直線化されたｐＧＲＬ Ｏ７およびｐＧＲ１０８からクリープ（Ｋ　ｒｉｅｇ）およびメルトン（Ｍｅｌ ｔｏｎ）（１９８４）の記載に従って合成され、ＧＴＰ濃度を４００ＪｉＭから １００μＭに低下させかつｍ’ＧｐｐＧ（ファルマシア）を５００μＭにまで添 加することにより同時キャッピングが行われた。転写体をＰ６０クロマトグラフ ィーにより精製し、ミクロコツカスヌクレアーゼ処理した家兎網赤血球溶解物（ プロメガ・バイオチク）により、製造業者が指示する条件で翻訳した。

ステロイド処理細胞からのＩＭ−９サイドシルの調製は先きに報告されたとおり である（ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら、１９８５）、サイズマー カーはホスフオリラーゼＢ（９７Ｋ）、ウシ血清アルブミン（６６Ｋ＞および卵 アルブミン（４５Ｋ）であった。

第」二二ｉロー インビトロ翻訳されたアルファーｈＧＲのステロイド結合性。

ＩＭ−９サイドシル抽出物（点彩した棒）およびＳＰ６産生アルファーｈＧＲＲ ＮＡを含む網赤血球溶解物（ＯＲ１０７，無地の棒）への結合を示す、各棒は１ ００倍過剰の各種ステロイド競合体と用いて測定した結合’Ｈ−）リアムシノロ ンアセトニド（ＴＡ）を表わす；非標識ＴＡを競合体として用いて１００％の競 合が測定された。各値は３回測定の平均を表わし、誤差の棒はＰ＜０．０５を示 す。ステロイド系競合体はデキサメサゾン（Ｄ　ｅｘ）、コルチゾル（Ｃｏｒｔ ）、プロゲステロン（Ｐ　ｒａｇ）、テスト第」二」４１ケ方恭− 結合アッセイは１０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　ｐＨ７，４，１００ｍＭ・ＮａＣ１， １ｎ＋Ｍ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭモリブデン酸ナトリウム、１０ジチオトレイトー ル、１５０ｎ＋Ｍ’ＨＴＡ（２０Ｃｉｏｎｏｌ−’；アメルシャム）と含有する １００μｌ、および翻訳混合物１０μｍまたは新鮮なＩ　Ｍ　−９シストゾル１ ００μｓ中で行なわれた。非標識競合体（１５μＭ）を指示に従って添加した。

０℃で２時間後に５０％デキストラン被覆活性炭５μりにより５分ずつ２回抽出 して未結合ステロイドを除去し、計数した。

アルファグルココルチコイド受容体（ＧＲ１０７）に対する非競合値および完全 競合値はそれぞれ４９０および２９０ｃ、　ｐ、　＋ｓ。

であった、転写体を添加せずに、またはベータ受容体５Ｐ６ＲＮＡ（ＧＲ１０８ ）を用いてプログラムした網赤血球溶解物翻訳混合物は競合性’Ｈ−ＴＡ結合を 含まなかった。

Ａへ圀 ここに実験の部Ｉとして提示した科学研究はＮａｔｕｒｅ、　３１８：６３５− ６４１（１９８５）に発表された。そのＮ　ａｔｕｒｅの和文はこの実験例に含 まれない２図を含む。それらの図は図６、ｈＧ　ＲｅＤ　Ｎ　Ａの染色体マツピ ング分析；図７、ｈＧＲｅＤＮＡのノーザーンプロット分析である。

１、Ｆ、のＩ−１昭ｔ・ １、　Ａｌｔ、　Ｆ、　Ｗ、、　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅｌ±、２０＋２９３−３０ １（１９８３＞。

２、　Ａｍａｒａ、Ｓ、　Ｇ、、Ｊｏｎａｓ、Ｖ、、　Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ、　 Ｍ、　Ｇ、、Ｏｎｇ。

Ｅ、　Ｓ、　、ａｎｄ　Ｅｖａｎｓ、Ｒ，Ｍ、、Ｎａｔｕｒｅ、２９８：２４０ −２４４（１９８２）。

３、　Ｂａｅｒｊｉ、Ｊ、、　０ｌｓｏｎ、Ｌ、　、ａｎｃｌ　５ｃｈａｆｆｎ ｅｒ、Ｗ、、Ｃｅ１ｌ。

３３ニア２９−７４０（１９８３）。

４、　Ｂｅｎｏｉｓｔ、Ｃ，、ａｎｄ　Ｃｈａｍｂｏｎ、Ｐ、、Ｎａｔｕｒｅ、 ２９８：３０４−３１０（１９８１）。

５、　Ｂｏｄｅ、　Ｕ、、ＤｅｉｓｓｅｒｏＬｈ、Ａ、、ａｎｄ　Ｈｅｎｄｒｉ ｋ、Ｄ、。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、、７８：２ ８１５−２８１９（１９８１）。

６、　ＢｏｕｒＨｅｏｉｓ、Ｓ、、ａｎｄ　Ｎｅｗｂｙ、Ｒ，Ｆ、、Ｃｅｌ↓、 １１：４２３−４３０（１９７７）。

７　、　Ｃａｒｌｓｔｅｄｔ　−Ｄ　ｕｋｅ、　Ｊ　、、０ｋｒｅｔ、　Ｓ　、 、Ｗｒａｎｇｅ、０．、ａｎｄＧｕｓｔａｆｓｓｏｎ、Ｊ　、　−Ａ、、Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、、７９：４２６０−４２６４（１９８２）。

８、　Ｃｈａｎｄｌｅｒ、Ｖ、　Ｌ、、Ｍａｌｅｒ、Ｂ、　Ａ、、ａｎｄ　Ｙａ ｍａｍｏｔｏ。

Ｋ、Ｒ，、Ｃｅ１ｌ、３３：４８９　４９９（１９８３）。

９、　Ｄａｎｉｅｌｓｅｎ、Ｍ、、ａｎｄ　５ｔａｌｌｃｕｐ、　Ｍ、　Ｒ，、 Ｍｏ１ｅ、　Ｃｅ１ｌ。

互違＋１．，４：４４９　４５３（１９８４）。

１０、　Ｄａｒｎｅｌｌ、Ｊ、　Ｅ、、　Ｎａｔｕｒｅ、２９７：３６５　３７ １（１９８２）。

１１、ＤｅｌｌｗｅＨ，Ｈ，Ｇ、、Ｈｏｔｚ、Ａ、、　Ｍｕｇｅｌｅ、に、、　 ａｎｄＧｅｈｒｉｎｇ、　Ｕ　、　、　Ｅ　ＩＮりＢＯＪ、、１：２８５−２８ ９（１９８２）。

１２、　Ｅｖａｎｓ、Ｒ，Ｍ、、Ｂｉｒｎｂｅｒｇ、Ｎ、　Ｃ，、ａｎｄ　Ｒｏ ｓｅｎｆｅｌｄ。

Ｍ、Ｇ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ。

７９ニア６５９−７６３３（１９８２）。

１３、　Ｇａｍｅｔｃｈｕ、Ｂ、、ａｎｄ　Ｈａｒｒｉｓｏｎ、Ｒ，Ｗ、、Ｅｎ ｄｏｃｒｉｎｏｌｏ　。

１１４：２７４−２７９（１９８４）。

１４、　Ｇｅｈｒｉｎｇ、Ｕ、、ａｎｄ　Ｈｏｔｚ、Ａ、、Ｂｉｏｃｈｅ＋＊ｉ ｃ±ｇ、　２２　：４０１３−４０１８（１９８３）。

１．５．　Ｇｅｈｒｉｎｇ、Ｕ、、Ｓｅｇｎｉｔｚ、Ｂ、、Ｆｏｅｌｌｍｅｒ、 Ｂ、、　ａｎｄＦｒａｎｃｋｅ、Ｕ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓｃｉ 、Ｕ、Ｓ、Ａ。

８２：３７５１−３７５５（１９８５）。

１６、　Ｇｏｖｉｎｄａ、Ｍ、　Ｖ、、５ｐｉｅｓｓ、Ｅ、、　ａｎｄ　Ｍａｊ ｏｒｓ、Ｊ、。

Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、７９：５１５７−５１ ６　Ｈｌ　９８２）。

１７、Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ、Ｒ，、ａｎｄ　Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌ、Ｍ、Ｌ、、 Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、７７：７１０２−７１０６（１９ ８０）。

１８、　Ｇｒｏｖｅ、Ｊ、　Ｒ，、Ｄｉｅｃｋ＋＋＋ａｎｎ、Ｂ、Ｓ、、５ｃｈ ｒｏｅｒ、Ｔ、　Ａ、。

ａｎｄ　Ｒｉｎｇｏｌｄ、Ｇ、　Ｍ、　、Ｃｅｌ±、２１：４７−５６（１９８ ０）。

１９、　Ｈａｇｒ、Ｌ、Ｊ、、　ａｎｄ　Ｐａ１ｍ１ｔｅｒ、Ｒ，Ｄ、、Ｎａｔ ｕｒｅ２９１：３４０−３４２（１９８１）。

２０、Ｈａｒｍｏｎ、Ｊ、Ｍ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４４： ４５４０−４５４７（１９８４）。

２１、Ｋａｒｉｎ、Ｍ、、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｒ，Ｄ、、Ｓ！ａｔｅｒ、Ｅ、、 Ｓｍ１ｔｈ。

Ｋ、、　ａｎｄ　Ｈｅｒｓｃｈｍａｎ、Ｈ，Ｒ，、Ｎａｔｕｒｅ、２８６：２９ ５−２９７（１９８０）。

２２、　Ｋｉｒｉｎ、Ｍ、　、ｅｔ　ａｌ、　、Ｎａｔｕｒｅ、３０８：５１３ 　５１９Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、、１２ニア０５７−７０７０（１９８４）。

Ａｃａｄ、Ｓｅｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、７４：４７９１　４７９５（１９７７＞。

２５、Ｌａｉｍｏｎｉｓ、Ｌ、　Ａ、、Ｋｈｏｕｒｙ、Ｇ、、Ｇｏｒｍａｎ、Ｃ ，、Ｈｏｗａｒｄ。

Ｂ、、ａｎｄ　Ｇｒｕｓｓ、Ｐ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、、７９：６４５３−６４５７（１９８２）。

２６、　Ｌｅｂｏ、Ｒ，Ｖ、　、ａｎｄ　Ｂａ５ｔｉａｎ、Ａ、　Ｍ、　、ｐ３ ：２１３−２１９（１９８２）。

２７、Ｌｅｂｏ、Ｒ，Ｖ、、ｅｔ　ａｉ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２２５：５７　５ ９（１９８４）。

２Ｂ、Ｍａｘｉｍ、Ａ、、ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ、Ｗ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、７４：５６０　５６４（１９７７）。

２９、　Ｍｉｅｓｆｅｌｄ、Ｒ，、ｅｔ　ａｔ、、Ｎａｔｕｒｅ、３１２　ニア 　７９−７８１（１９８４）。

３０、　Ｎｏｒｔｈｒｏｐ、Ｊ　、　Ｐ、、　Ｇａｍｅｔｅｈｕ、Ｂ、、　Ｈａ ｒｒｉｓｏｎ、Ｒ，Ｗ、。

ａｎｄ　Ｒｉｎｇｏｌｄ、Ｇ、Ｍ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、、２６０：６３ ９８−６４０３（１９８５）。

３１、Ｏｋａｙａｍａ、Ｈ，、ａｎｄ　Ｂｅｒｇ、Ｐ、、Ｍｏ１ｅｅ、Ｃｅ１１ ．　Ｂｉｏｌ、。

３：２８０−２８９（１９８３）。

３２、　０ｋｒｅｔ、Ｓ、、Ｃａｒｌｓｔｅｄｔ−Ｄｕｋｅ、Ｊ　、、Ｗｒａｎ ｇｅ、Ｏ，。

ＣａｒｌｓＬｒｏｍ、に、、ａｎｄ　Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ、Ｊ、−Ａ、、Ｂｉ ｏｃｈｅ＋ｅ。

互違１回シーΔσ、ａ、６７７：２０５　２１９（１９８１）。

３３、Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ、Ｍ、Ｃ，、Ｈｕａｎｇ、Ａ、Ｌ、、Ｋｅｓｓｅｌ、 Ｍ、。

Ｗｏｏｌｆｏｒｄ、Ｒ，Ｇ、、ａｎｄ　Ｈａｇｅｒ、Ｇ、Ｌ、、ＥＭＢＯ工、、 ３：１８９１−１８９９（１９８４）。

３４、Ｐａｒｋｓ、Ｗ、Ｐ、、５ｃｏｌｎｉｃｋ、Ｅ、Ｍ、、ａｎｄ　Ｋｏｚｉ ｋｏｗｓｋｉ。

Ｅ、Ｈ，，５ｃｉｅｎｃｅ、１８４：１５８　１６０（１９７４）。

３５、Ｐａｙｖａｒ、Ｆ　、、ｅｔ　ａｔ、、Ｃｅｌ±、３５：３８１−３９２ （１９８３）。

３６、Ｐｆａｈｌ、Ｍ、、Ｃｅｌ±、３１：４７５−４８２（１９８２）。

３７、Ｒｉｎｇｏｌｄ、Ｇ、Ｍ、、Ｙａｍａｍｏｔｏ、に、Ｒ，、Ｔｏｍｋｉｎ ｓ。

Ｇ、Ｍ、、Ｂ１５ｈｏｐ、Ｊ、Ｍ、、ａｎｄ　Ｖａｒｍｕｓ、Ｈ，Ｅ、。

ｑ刺↓、６：２９９−３０５（１９７５）。

３８、Ｒｏｂｉｎｓ、Ｄ、Ｍ、、Ｐａｃｋ、Ｉ　、、Ｓｅｅｂｕｒｇ、Ｐ、Ｈ， 、ａｎｄＡｚｅｌ、Ｒ，、Ｃｅ１ｌ　２９：６２３−６３１（１９８２）。

３９、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ、Ｍ、Ｇ、、　ｅｔ　ｍｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、３０４ 　：１２９＝１３５（１９８３）。

４０、Ｒｏｕｓｓｅａｕ、Ｇ、Ｇ、、Ｂｉｘｔｅｒ、Ｊ、Ｄ、、　ａｎｄ　Ｔｏ 論ｋｉｎｓ。

Ｇ、Ｍ、、Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、Ｂｉｏｌ、、６７：９９−１１５（１９７２）。

４１、　５ｅｈｅｉｄｅｒｅｉｔ、Ｃ，、Ｇｅ１ｓｓｅ、Ｓ、、Ｗｅｓｔｐｈａ ｌ、Ｈ，Ｍ、。

ａｎｄ　Ｂｅａｔｏ、Ｍ、、Ｎａｔｕｒｅ、３８４ニア４９−７５２（１４９８ Ｂ）。

４２、Ｓｅｈｗａｒｚｂａｕｅｒ、Ｊ　、Ｅ、、Ｔａｍｋｕｎ、Ｊ　、　Ｗ、、 Ｌｅ＋ｍ１ｓｃｈｋａ。

１　、Ｒ，、ａｎｄ　Ｈｙｎｅｓ、Ｒ，Ｏ，、Ｃｅ１ｌ、３５　：４２１−４３ Ｈ１９８３）。

４３、　５ｅｔｚｅｒ、Ｄ、Ｒ，、ＭｃＧｒｏｇａｎ、Ｍ、、ａｎｄ　Ｓｃｈ’ ｒｗ＋ｋｅ。

Ｒ，Ｔ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、、２５７：５１４３−５１４７（１９８２ ）。

４４、　Ｓ　ｉｍｏｎｓ、　Ｓ　、　Ｓｌ、ａｎｄ　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｅ、　 Ｂ、、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｉ、Ｕ、Ｓ、、Ａ、、７８：３５４１−３５４５（１ ９８１）。

４５、　５ｐｉｎｄｌｅｒ、Ｓ、Ｒ，、Ｍｅｌｌｏｎ、Ｓ、Ｈ，、ａｎｄ　Ｂａ ｘｔｅｒ。

Ｊ、Ｄ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、、２５７：１１６２７−１１６３２（１９ ８２）。

４Ｂ、Ｔｈｏｍａｓ、Ｐ、Ｓ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、、７７：５２０１−５２０５（１９８０）。

４７、　Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ、Ｃ，、Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、Ｓ、Ｍ、、Ｒｏ ｓｅｎｆｅｌｄ。

Ｍ、Ｇ、、ａｎｄ　Ｅｖａｎｓ、Ｒ，Ｍ、、Ｎａｔｕｒｅ、３１８：６７０−６ ７２（１９８５ｂ）。

４８、Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ、Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ、２２８ニア ４０４０−７４２（１９８５゜ ４９、　Ｗｅｓｔｐｈｉｌ、Ｈ，Ｍ、、Ｍｏ１ｄｅｎｈａｕｅｒ、Ｇ、、ａｎｄ 　Ｂｅａｔｏ。

Ｍ、、ＥＭＢＯＪ、、１：１４６７−１４７１（１９８２）。

５０、　Ｗｒａｎｇｅ、Ｏ，、Ｃａｒｌｓｔｅｄｔ−Ｄｕｋｅ、Ｊ、、ａｎｄ　 Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ。

Ｊ、−Ａ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、、２５４：９２８４−９２９０（１９７ ９）。

５１、Ｗｙａｎｇｅ、Ｏ，，０ｋｒｅｔ、Ｓ、、Ｒａｄｏｊｃｉｃ、Ｍ、、Ｃａ ｒｌｓｔｅｄｔ−Ｄｕｋｅ、Ｊ、、ａｎｄ　Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ、Ｊ、−Ａ、 、Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ω畑！Ｔ１．，２５９：４５３４　４５４１［１９８４）。

５２、Ｙａｍａｍｏｔｏ、に、Ｒ，、Ｓｔａｍｐｆｅｒ、Ｍ、Ｒ，、ａｎｄ　Ｔ ｏａ＋ｋｉｎｓ。

Ｇ、Ｍ、、Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、。

７１：３９０１−３９０５（１９７４）。

犬１ｍ ヒトグルココルチコイド受容体の機能区■−ノし二阻！− ＣＶ−１４１１胞においてｈＧＲ発現ベクターのトランスフェクションにより産 生されたヒトグルココルチコイド受容体（ｈＧＲ）はＭＴＶ−ＣＡＴ融合遺伝子 の転写活性化のために必要かつ十分な因子として機能する。誘導の規模（５００ 〜１０００倍）から、ｈＧＲは転写“スイッチ”として作用し、グルココルチコ イド応答要素を含む休止状店のプロモーターを活性化状態に変換するのであろう ということが明らかになった。ｈＧＲによるＭＴＶ−ＣＡＴｌｄ合遺伝子の転写 の刺激はＣＶ−１細胞において制限的な転写因子に依存しない、ｈＧＲの挿入変 異体２７種の特性を調べることにより少なくとも４種の機能区の位置が決定され た。それらのうち２種は推定ＤＮＡ−およびステロイド−結合区に対応する。他 の２区は転写に対するそれらの有効な作用のため、タウ（τ）と呼ばれる。これ は、この受容体における他の領域は完全な転写活性化のために必要でるが、ステ ロイドまたはＤＮＡの結合に特異的には関与していないという可能性を示す。

、Ｂ、　＝組 ２群のステロイドホルモン受容体の一次構造がそれらのｅＤＮＡのクローニング および配列決定により解明された。実験の部Ｉに示すように、ヒトグルココルチ コイド受容体（ｈＧＲ）をコード化するｃＤＮＡの同定により２形態の蛋白質、 すなわちアミノ酸７７７個のもの（アルファ）および７４２個のもの（ベータ） が明らかになった。これらはそれらのカルボキシル末端において異なる。（実験 の部工の記載はホレンバーグ（Ｈｏｌ　ｌｅｎｂｅｒｇ）ら、１９８５として発 表された。）ヒトエストロゲン受容体はこれよりも若干小さな、アミノ酸５９５ 個の蛋白質である（グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）ら、１９８６；グリーン（Ｇｒｅ ｅｎ）ら、１９８６）、アミノ酸配列の比較により、これら２群の受容体間のみ でなく、鳥類赤芽球症ウィルスのｖ−ｅｒｂ−Ａ発癌遺伝子生成物とも広範な相 同性が明らかになった（ワインバーガー　（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら、１９８ ５．グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）ら、１９８６、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら、１９ ８６）、これはステロイド受容体遺伝子およびｃ−ｅｒｂＡプロト発癌遺伝子が 共通の原始的な先祖由来の調節遺伝子に由来するという示唆を支持する（ワイン バーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら、１９８５）。

クローニングされたｅＤＮＡから推定されたｈＧＲのアミノ酸配列（実験の部Ｉ 参照）に基づいて、この蛋白質の機能的および免疫学的に重要な領域の配置を提 示した（ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら、１９８５）、これらには 、蛋白質のアミノ末端側半分に位置する免疫区、他のＤＮＡ結合性蛋白質との構 造的類似性を示すＤＮＡ結合区、および分子のカルボキシル末端付近に位置する グルココルチコイド結合区が含まれる。しかし各区の位置は仮定であり、転写自 体の活性化に関与する区は確認されていなかった。この研究において本発明者ら はｈＧＲ蛋白質に代替アミノ酸を導入することによりｈＧＲ内に提唱されている 機能区の部位を確認し、かつ他の重要な領域を見出すことを試みた。本発明者ら はまずサル腎細胞における新規な発現系を開発した。この系では機能性ｈＧＲの 合成がラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）の長鎖末なリピートの制御下でのｃＤＮＡ の転写によって方向づけちれる。合成受容体の機能はクロラムフェニコールアセ チルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）アッセイ（ボルマン（Ｇｏｒｍａｎ）ら、１ ９８２ｍ）およびステロイドホルモン結合により測定した、マウス乳ｉ腫瘍ウィ ルス（ＭＴＶ）ＬＴＲの転写誘導によって監視された。この新規な発現系によっ て本発明者らは挿入変異生成が受容体の種々の機能に与える影響を調べることが でき、これによってｈＧＲの機能区構造のより詳細なモデルを提唱した。２７種 の挿入変異体の分析に基づく本発明者らの結果から、グルココルチコイド受容体 は別個の機能区からなることが確認された（ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｅｒ）ら、１９８５＞、さらにこれらにより、提唱したＤＮＡ−およびステロイ ド−結合区外の他の配列が確認され、これを前記のように本発明者らは転写に対 するそれらの有効な作用のためτと呼ぶ。

ｌ−ゴＬ」前玉− ａ　ツセ　二お　び クローニングされたｃＤＮＡからの機能性ｈＧＲ（実験の部Ｉ）の発現を調べる ために用いたアッセイ系および方法を第１１−１図に示す、これらの実験におい ては、レポーター遺伝子に結合したグルココルチコイド応答性プロモーター／エ ンハンサ−要素を受容体陰性細胞に導入した。従って原理的にこの構造物は転写 不活性のはずである０本発明者らのアッセイ法にはクロラムフェニコールアセチ ルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする配列に融合させたＭＴＶ　ＬＴＲ を選択使用した（ＥＣ２゜３．１．２８）。グルココルチコイドホルモンがＭＴ ＶＬＴＲ内の独自の部位における転写開始の効率を高めることにより（ラッカー （Ｕｅｋｅｒ）ら、１９８３）ＭＴＶ　ＤＮＡの転写速度を高めることは先に証 明されている。（ロンゴールド（Ｒｉｎｇｏｌｇ）ら、１９８３）、さらにグル ココルチコイド受容体はＭＴＶ　ＬＴＲ内にマツピングされたＤＮＡ配列に特異 的に結合しくベイバー（Ｐ　ａｙｖａｒ）ら、１９８３）、これがグルココルチ コイド応答性を異種プロモーターに与えうる（チャンドラ−（Ｃｈａｎｃ（Ｉｅ ｒ）ら、１９８３）、ｐＭＴＶＣＡＴ（またはｐＧＭＣＡＴ）を受容体発現プラ スミドと共トランスフェクションすることにより、トランスフェクションされた 細胞をグルココルチコイドホルモンで処理した際に活性を誘導しうる機能性受容 体が得られる。さらに生化学的実験、たとえば発現した受容体のステロイド結合 活性およびウェスタンプロット分析を同時に行うことができる。

ＲＳＶ　ＬＴＲを全長ｈＧＲｃＤＮＡ（ｐＲ３ｈＧＲアルファ）に結合させる発 現ベクターをデザインして、広範な宿主細胞型において高水準の発現を得た。ベ クターｐＲＳ　ｈＧ　ＲアルファはｐＲ３ＶＣＡＴ（ボルマン（Ｇｏｒｍａｎ） ら、１９８２ｂ）の誘導体であり、ＣＡＴ遺伝子のコード化配列がｈＧ　ＲｃＤ 　Ｎ　Ａにより置換されている。ＳＶ４０の複製開始点をこのベクターに導入し 、これにより組換えプラスミドはＴ抗原（Ｔａｇ）を発現するＣＯ３−１ｃｃｏ ｓと呼ぶ）サル腎細胞において高いコピー数にまで増殖可能となった（グルッツ マン（Ｇｌｕｚｍａｎ）１９８１）、　ＣＯ３細胞および親細胞系ＣＶ−１はグ ルココルチコイド受容体の水準が検出不可能であるという付加的な利点をも与え る（未発表の所見ならびに第１［−２およびｌｌ−３図）。

ｂ　、、ｈＧＲの 上記のアッセイ法はステロイドホルモン受容体の作用機構を研究する際に遭遇す る主な難点の幾つかを克服するために企画された。これらの難点には受容体の細 胞内水準が低いこと、受容体の異質性の可能性があったこと、および受容体の機 能を試験する定量可能なバイオアッセイ系がなかったことが含まれる。

従って本発明者らはｐＲＳｈＧＲアルファでトランスフェクションしたＣｏＳｍ 胞が産生しうるｈＧＲの相対量をまず調べた。

第ｎ−２図（右のレーン）のトランスフェクションされたＣＯ８細胞のウェスタ ンプロット分析は、ＣｏＳ細胞が１Ｍ９ａｌ胞系（左レーン）に存在するｈＧＲ と移動性に関して区別できない９４ｋｄのｈＧＲポリペプチドを合成したことを 証明する。さらに一時的にトランスフェクションされたＣＯ８細胞中に存在する ｈＧＲの量はＩＭ９細胞、すなわち細胞当たりｉｏｏ、ｏｏｏ−２００，０００ の受容体を含むもの（ハーモン（Ｈａｒ霧ｏｎ）ら、１９８４）に見出される水 準よりも多い、この発現系は高い細胞内）ＩＧＲ水準を有する細胞を提供するだ けでなく、ｈＧＲの機能研究を妨げる可能性のある受容体ミクロ異質性の可能性 をも除く。

発現したｈＧＲの有効な転写因子としての機能性を試験するために、ｐＭＴＶＣ ＡＴおよびｐＲＳ　ｈＧ　Ｒアルファを共トランスフェクションしたのちに得た 細胞抽出物を用いてＣＡＴアッセイを行った。ＣＯＳおよび親細胞であるｃｖ− ＩＭＪ胞の双方へのトランスフェクションを調べた。予想どおり（アービン（Ａ ｌｗｉｎｅ）１９８５）ＣＯ５中にＳＶ４０　Ｔａｇが存在するとＭＴＶ　ＬＴ Ｒの基礎活性が高まった（データは示されていない）、従って最大の誘導を得る ために、Ｓ　Ｖ　４０　Ｔａｇを発現しないＣＶ−１図胞を用いた。第１ｆ−３ 図に示すように、ｐＭＴＶＣＡＴを対照プラスミドと共トランスフェクションし た場合、ＣＶ−１細胞中にＣＡＴ活性は生じなかった。同様にｐＭＴＶＣＡＴお よびｐＲ３ｈＧＲアルファを共トランスフェクションした場合もＣＡＴ活性は生 じなかった。しかし同じく共トランスフェクションされたＣＶ−１図胞をデキサ メサゾン（ＤＥＸ）で処理すると、ＭＴＶ−ＣＡＴ融合遺伝子の転写が開始され る。ｐＭＴＶＣＡＴにより生じるＣＡＴ活性の基礎水準はｃｖ−１図ｍにおいて かろうじて検出しうる程度（しばしばゼロ）であるので、この誘導係数はきわめ て大きい（約５００〜１０００倍）、対照実験として本発明者らはベータ形のｈ ＧＲを共トランスフェクションした（実験の部Ｉ）、これはステロイドを結合し 得ないことが示されているものである（第１［−１表参照）、第１Ｉ−３図はｈ ＧＲベータが本発明の発現アッセイ法において機能しないことを証明する。また 、ｈＧＲによる転写の活性化はグルココルチコイド応答性要素を含むプロモータ ーに限定される。ｐＭＴＶＣＡＴの代わりにｐＭ　Ｔ　Ｉ　ａＣ，１ｓ、　Ｔ、 すなわち重金属には応答するがグルココルチコイドには応答しないヒトメタロチ オネインＩａ遺伝子の調節領域を含むプラスミドを用いた場合、トランスフェク ションしたＣＶ−１のホルモン処理後にＣＡＴ活性の誘導は認められながった（ データは示されていない）、これらの結果は、細胞内でｈＧＲがステロイド依存 性転写スイッチとして機能するのに必要かつ十分な因子として作用することを証 明する。

・　このアッセイに基づいて、ステロイドによる受容体の活性化を試験すること ができた。第Ｕ−４（Ａ＞図に示したように、ＤＥＸはｈＧＲにより誘導された ＣＡＴ活性に対し３ｎＭのＥＤ、。値を示す、これは種々の生理学的作用におい てＤＥＸにつき観察されたＥＤ、。値（５ｎＭ）と一致する。共トランスフェク ションされたｃｖ−１細胞を１１００ｎのテストステロン、エストラジオールお よびプロゲステロンで処理することによりｈＧＲつ作用の特異性をさらに調べた 。これらのステロイドはプロゲステロン以外はＣＡＴ活性を誘導し得なかった。

プロゲステロンはＤＥＸにより生じた最大誘導の１％の値でｈＧＲの機能を刺激 した（データは示されていない）。これらの結果は、トランスフェクションされ たｃｖ−ｉ細胞が、天然受容体の特異性および濃度において薬理学的リガンドと 相互作用する機能性ｈＧＲを合成することを示す。

エンハンサ−含有分子と細胞成分との特異的相互作用に関する研究から、ＣＶ− １細胞は特定のウィルス性エンハンサ−の機能に必要なＭ３胞性因子を限定され た量含有することが示されたくショラー（Ｓｅｈｏｌｅｒ）およびグルメ（Ｇ　 ｒｕｓｓ）　１９８４　）、これらの細胞においてはトランスフェクションされ たｐＳＶ２ＣＡＴ（ボルマン（Ｇｏｒｍａｎ）ら、１９８２ａ）により生じるＣ ＡＴ活性はプラスミド０．３ｐｍｏｌ／ディツシュでプラトーに達する。同様に 、ｈＧＲが限定因子と相互作用するならば漸増する量のｐＲＳｈＧＲアルファの トランスフェクションにより誘導されるＣＡＴ活性を一定量のｐＭＴＶＣＡＴで 飽和させることができるはずである。この実験では２＋）＋１０１（５μ２）の ｐＭＴＶＣＡＴ　ＤＮＡを使用し、漸増する量のｐＲＳｈＧＲフルファＤＮＡを 非特異的キャリヤーＤＮＡと共に添加して、合計３０ｔｔｇ／ディツシュを得た 。第１ｔ−４（Ｂ）図は０．０３ｐｍｌ（１００ｒ＋ｙ）程度の少量のｐＲ５ｈ ＧＲアルファ（ディツシュ当たり）をトランスフェクションした際にＣＡＴ活性 を検出しうろこと、およびＣＡＴ活性においてプラトーに達することはないこと を証明する。これらデータは、ｈＧＲによるＭ　Ｔ　Ｖ　−ＣＡＴ融合遺伝子の トランスフェクションの刺激はＣＶ−１細胞中で限定する転写因子に依存しない ことを示唆する。

ＣｈＧＲの　のマツピン ｈＧＲが遺伝子転写を調節するｉ構を理解するためには、まずその機能図の解明 が必要であった。グルココルチコイド受容体の蛋白質分解に関する限定された研 究（カールスデットーデューク（Ｃａｒｌｓｄｅｄｔ　−Ｄ　ｕｋｅ）　１９８ ２　；デルウェーク（Ｄｅｌｌｗｅｇ）ら、１９８２、タンプ（Ｗｒａｎｇｅ） ら、１９８４．ライヒマン（Ｒｅｉｃｈ論ａｎ）ら、１９８４）、およびｈＧＲ の一次構造の分析（実験の部Ｉ９照）に基づいて、受容体の構造に対するモデル が提示されている（ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら、１９８５＞。

このモデルにより主要な３区域が確認される。すなわちアミノ酸１４５から２８ ０に及ぶ免疫区、アミノ酸４２１から４８１に及ぶＤＮＡ結合区、および蛋白質 のカルボキシル末端付近に位置するステロイド結合区である。このモデルを試験 するために本発明者らはグルココルチコイド受容体コード化配列における２７種 の部位特異性挿入変異体をリンカ−スキャニング法により形成した０次いでこれ らの遺伝子工学的に形成された変異体につき、遺伝子転写およびステロイドホル モン結合に対するそれらの能力をアッセイした。

ｈＧＲのリンカ−挿入変異体を形成するために、ＤＮＡ分子を高い頻度で開裂さ せる制限酵素を用いて部分開裂することによりプラスミドｐＲＳ　ｈＧ　Ｒアル ファをまず線状化した。線状プラスミドを分離し、ＢａｐｅＨＩリンカ−を添加 して、ｈＧＲをコードするオーブンリーディングフレームを再生した。得られた 変異体は３個または４個の付加的アミノ酸を保有し、これらが野生型の蛋白質の 配列を中断している。この方法により本発明者らは一連のランダムなｈＧＲ変異 体を形成した（第ｎ−５図）。

これらの変異体が全長ｈＧＲを発現する能力をウェスタンプロット分析により推 定した。産生されたｈＧＲは３０％以上は異ならないことが示され、従ってこれ らの変異体はいずれも発現された蛋白質を不安定化しないと思われた。

各変異体の機能性を第１［−１表の野生型ｈＧＲのものと比較した。２７種のｈ ＧＲ変異体のうち１２種により誘導されるＣＡＴ活性は野生型の水準に匹敵した 。ＣＡＴ活性の誘導によりアッセイして機能が低下し、または完全に失われてい る１５種のｈＧＲ変異体の分析により、これらは別個の４群に属することが示さ れた。いわゆる免疫原区のアミノ酸１２０と２１５の間に位置する一部のこれら 変異体が第１群を形成する。受容体分子のこの領域には特異的機能は帰属されて いないが、３種の変異体（１１２０，Ｉ２０４およびＩ２１４）は低イＣＡ　Ｔ 活性誘導能を示す、これらの変異体はステロイド結合能を完全に維持した。

意外ではないと思われるが、第２群の欠損変異体は受容体の推定ＤＮＡ結合区に 見出される。この機能図はシスティンに富み、それぞれアミノ酸約２５個の２反 復単位がらなり、これがＺｎ”リガンドにより調整されたループ構造に折れ曲が っている（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、１９８５）、変異体Ｉ４２２の場合は、 配列モチーフＣｙｓ−Ｘ２−Ｃ３１ＳがＣｙｓ−Ｘ５−Ｃｙｓに変わっている。

付加的アミノ酸の存在が受容体の機能を完全に失わせている。変異木工４４０は 第１ループの形成に関与する他の２個のシスティン間に同様にアミノ酸４個の挿 入配列を有し、同様に検出可能な水準のＣＡＴ活性を誘導できない、他方、変異 体Ｉ４２８ではループ自体の長さがアミノ′ｆＩｉ１３個から１７個に伸長して いる。著しく低下してはいるが、Ｉ４２８にょるＣＡＴ活性の誘導はなお検出可 能である。３種の変異体すべてについてＤＮＡ結合区に存在するステロイド結合 容量は野生型の水準の範囲内にあることが示された。突然変異により影響を受け る第３の領域はＤＮＡ結合区に隣接した位置にある。変異体Ｉ４８８およびＩ　 ４．９０は低い水準のＣ−Ａ　Ｔ活性を示すが、ステロイドを効果的に結合する 。第４群は受容体蛋白質の最後の２００個のアミノ酸を包含する。５種の変異体 は（ｌ５８２゜Ｉ　５８９．Ｉ　５９９．Ｉ　６２６およびｌ６９６）は検出可 能な水準のＣＡＴ活性な示さない。この機能活性の欠如はそれらがデキサメサゾ ンを全く結合し得ないことと関係がある。これらの結果は、ステロイド結合領域 が蛋白質の大部分を包含することを示す、これらはすべて−Ｃ末端付近に集中し ている。分子のアミノ末端と異なりこの領域は受容体の一次構造の変化に対して きわめて敏怒である。

包■口り二り邑 ｈＧＲ′″　イ　の　。

挿入　ＣＡＴ　ＤＥＸ ｈＧＲ７ミ／　’　？＞　４Ａ！ アルフア　−１００１００ １９Ｆ！、ＩＲ１１７ＮＴ ｌ３７　ＲＩＲ＾　９５　ＮＴ １１０２　にＳＶ　１３０　ＮＴ ｌ１２０　ＲにＳ＾　２７６ １２０４　ＲＩＲ３１２５ １２１４ＲにＳ＾　２７９ Ｉ２６２　ＡＤＰＲ９７ＮＴ １２８９　ＲＩＲ１２５ＮＴ １３０５　ＡＤＰＲ８６ＮＴ ｌ３４６　八ＤＰＲ１９１０７ １３８４ＲＩＲ１０１ＮＴ ｌ４０３　ＡＤＰＲ１１４ＮＴ ｌ４０８　ＡＤＰＲ５５ＮＴ １４２２　ＧＳＶ　０　１０５ １４２８　ＲＩＲ＾　２９２ １４４０　ＡＤＰＲＯ６９ １４８８ＧＳＶ　１５　９６ １４９０　ＲＩＲ＾　１０　１１５ １５１５　ＲＩＲ１０９ＮＴ ｌ５３２　ＧＳＶ　１１５　ＮＴ ｌ５５０　ＡＤＰＲ５１９ Ｉ５８２　ＲＩＲＯ０ Ｉ５８９　にＳＶ　０　０ １５９９　ＳＤＰ　ＯＯ ｌ６２６　ＡＤＰＲＯ０ １６８４ＲＧＳ＾　７９８１ １６９６　Ｒ（：ＳＡ　ＯＯ ベー　Ｃ，、軸／″″００ ＣＶ−１またはＣＯＳ細胞をＩ）Ｒ５ｈＧＲフル７７、ｐＲＳ　ｈＧ　Ｒベータ 、または突然変異したｈＧＲアルファによりトランスフェクションし、ＣＡＴ活 性およびステロイド結合能につきアッセイした。トランスフェクション後にＣＶ −１細胞をｌｏｎＭ−ＤＥＸの存在下で２日間培養したのち、細胞溶解およびＣ ＡＴアッセイを行った。ＣＯＳ細胞は普通の培地に維持された。これら２パラメ ーターを野生型ｈＧＲ活性に対する％として定量した。ｈＧＲアルファに挿入さ れたアミノ酸を１文字コードで表示する。ＮＴは試験しなかったことを意味する 。

ｈＧＲアルファとｈＧＲベータのアミノ酸組成の相違を第１１−５図および実験 の部■に示す。

Ｌ−以−１匙 ｈＧＲ発現ベクターのトランスフェクションによりＣＶ−１細胞中で産生された ｈＧＲがＭＴＲ−ＣＡＴ！！合遺伝子の転写活性化に必要かつ十分な因子である ことを示した。誘導の規模から、ｈＧＲは転写“スイッチ”として作用し、これ がグルココルチコイド応答要素を含む静止状態のプロモーターを活性化状態に変 換しつることが明らかになった。ｆ＃成性活性を示す他の転写因子と異なり、ｈ ＧＲによる転写刺激は完全にグルココルチコイドホルモンの存在に依存性である （第１ｆ−３および■−４（Ａ）図）、細胞内で蛋白質が大量に産生されるだけ では調節された遺伝子の転を誘導するのに十分ではない、ｈＧＲがホルモンによ って活性化される機構は十分には解明されていないがサイクリックＡＭＰ結合蛋 白質の場合と同様に、蛋白質内におけるアロステリック転移を伴うものと思われ る（マツケイ（Ｍｅｋｉｙ）およびスタイッ（Ｓ　ｔｅｉｔｚ）　１９８１　； ゲージス（Ｇａｇｅｓ）およびアジャ（Ａｄｈｙａ＞　１９８５　）。

本発明者らは、ｈＧＲによる転写の活性化はＣＶ−１細胞中に限定された量で存 在する因子によって制限されないことを認めた（第ｎ−４（Ｂ）図）、これらの 結果はグルココルチコイド応答性エンハンサ−へのｈＧＲ−ステロイド−複合体 の結合がプロモーター付近の一般的転写因子の活性を高めるのに十分であること を示唆する。他の数種の転写因子について同様な特性が報告されている。たとえ ばＡｄｆｌ、すなわちメラノガスター（ツユｔｎｅｌａｎｏ　ａｓｔｅｒ）にお けるアルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｄｈ）の近位プロモーターを活性化する転 写因子は他の蛋白質因子の不在下でＡｄｈ鋳型ＤＮＡを結合し、Ａｄｈ　ＲＮＡ 合成の開始を活性化するために内在性ＲＮＡポリメラーゼＩｉ、および他の一般 的転写因子を含む画分を必要とするにすぎない（ヘーベライン（Ｈｅｂｅｒｌｅ ｉｎ）ら、１９８５）。ＳＶ４０エンハンサ−／プロモーター要素を含む組換え プラスミドｐＳＶ２ＣＡＴを用いる他の型の実験において、ショーラー（Ｓｃｈ ｏｌｅｒ）およびグルス（Ｇｒｕｓｓ）（１９８４）は、エンハンサ−含有ＤＮ Ａの機能に細胞性分子が必要であることを示した。彼らの実験によれば、ＳＶ４ ０エンハンサ−要素によるＣＡＴ遺伝子の活性化に必要な限られた量の細胞性因 子の存在が示された。しかし一般的転写因子の枯渇は観察されなかった。これら のデータは特定の有効な転写因子の作用機作が一般的転写因子の活性を高める因 子自身、またはポリメラーゼ自身によって誘導されるクロマチンの構造における 変化なもたらすらしいということを示唆しているモロ−（Ｍｏｒｅａｕ）ら、１ ９８１．ウェイシリク（Ｗａｓｙｌｙｋ）ら、１９８Ｂ）、グルココルチコイド 処理によってＭ　Ｔ　Ｖ　Ｌ　Ｔ　Ｒのセグメントを含むＤＮＡ領域に可逆的お よび永続的双方の変化が生じることはすでに示されている（ザレット（Ｚａｒｅ ｔ）およびヤマモト（Ｙａｍａ、ｎｏｔｏ）　１９８４　）、結合した受容体が プロモーター活性を高める機構は完全に解明されている。しかしｈＧＲを過剰に 発現する系が得られれば、有効な転写因子による分子基磐での転写活性化につい ての将来の研究が容易になるであろう。

２７種の挿入変異体の解明の結果は、ヒトグルココルチコイド受容体が一連の機 能図からなるという本発明者らの先の示唆を支持し、拡大する。ステロイド結合 に影響を与える変異体がすべてカルボキシル末端に集中していることは注目に値 する。

この領域がホルモンの特異性をコードする別個の機能図として機能することが示 唆されるほか、これらの結果はこの受容体内に確認された他の機能図が別個の機 能を果たすとい可能性をも暗示する。従って、受容体が特定のＤＮＡ配列を認識 し、これと相互作用する能力は、エストロゲン受容体および発癌遺伝子生成物ｖ −ｅｒ上−Ａによって高度に保持されているＣｙｓ−Ｌｙｓ　−Ａｒｇに富む領 域にあると思われる。これらの領域における突然変異は受容体分子が転写を活性 化する能力を低下させるというのは論理的であると思われる。活性化はリガンド がアロステリック形質転換を誘導する能力、および形質転換した分子がＤＮＡを 認識し、これと相互作用する能力の双方に依存するからである。ステロイド受容 体構造の最初のモデル（ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら、１９８５ ）に基づけば、これらは突然変異誘発の解明に際し予想された結果であった。し かし予想されなかった結果は、転写活性に影響を与える他の領域が少なくとも２ か所確認されたことである。これは、転写活性化に必要であるがステロイドまた はＤＮＡの結合のいずれにも特異的に関与してはいない他の機能図が受容体中に 存在するという興味深い可能性を与える。変異体１１２０．１２０４および１２ １４は野生型の親和性なもってステロイドと結合するが、転写活性が低下してい る。これらの変異体は本発明者らがτ、と呼ぶこの機能図が完全なｈＧＲ活性を 得るために機能的に重要であり、かつ必要であることを明瞭に証明している。興 味深いことに、数系列のグルココルチコイド耐性細胞に見出された非機能性の切 除型変異体（すなわち４０ｋｄ）は野生型受容体よりも効率的に核内に保持され るが、転写を活性化し得ないくヤマモト（Ｙａ蒙ａｍｏｔｏ）ら、１９７６：ア ンドレアセン（Ａ　ｎｄｒｅａｓｅｎ）およびゲージング（Ｇｅｈｒｉｎｇ）　 １９８１　；ウエストファル（Ｗｅｓｔｐｈａｌ）ら、（１９８４＞、これらの “核転移増加型”（Ａｔ　）変異体において失われた受容体断片は明らかに蛋白 質のアミノ末端である。それらはホルモン結合能を保持しているからである０本 発明者らはτ、がｈＧＲの主免疫原区と一致することを指摘したくワインバーガ ー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら、１９８５）、これは恐らくこれが分子の外表に あることを示す、この機能図がその機能を果たす様式についての考察には、受容 体の三量化をもたらす自己相互作用、ＲＮＡポリメラーゼＨなどの一般的転写因 子との相互作用の可能性、および／または活性化された受容体の残りの部分にア ロステリック作用を及ぼすことによるＤＮＡ結合の調節が含まれる（デルウェー ク（Ｄｅｌｌｗｅｇ）ら、１９８２）、τ１は受容体のアミン末端、すなわちよ り小型のエストロゲン受容体とは共有されない領域に含まれる。恐らくエストロ ゲン受容体が第２の蛋白質との相互作用によりこの機能図と同等の機能を得るか 、またはτ、が他の調節分子との相互作用ではなくグルココルチコイド受容体自 体の内部の他の残基と相互作用するのであろう。

転写活性化に影響を及ぼす他のτ領域（τ２と呼ぶ）はエストロゲン受容体およ びＶ−虹ｂ−Ａ発癌遺伝子中に存在する領域である。その位置からも、これがス テロイド−およびＤＮＡ−結合区を結合させる“ちょうつがい”領域として作用 するという可能性が示唆される。従ってこれらの変異体は受容体の活性化に必要 なアロステリック形質転換を遮断するであろう。

アミノ酸挿入配列により影響を受ける第３の領域は、ワインバーガー（Ｗｅｉｎ ｂｅｒｇｅｒ）ら（１９８５）により報告される推定ＤＮＡ結合区内に位置する 。この機能図はＣｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇに富む配列を含む２個の反復単位からな り、ｖ−ｅｒｂＡ発癌遺伝子およびエストロゲン受容体と比較して最も強く保守 されるものである（ワインバーガー（ＷｅｉｎｂｅｒＢｅｒ）ら、１９８５．グ リーン（Ｇ　ｒｅｅｎ）ら、１９８６；グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら、１９８６） 、これらの反復単位はまず因子ＴＦ−１１１ａ（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、１ ９８５）に観察され、それ以来多数の他の核酸結合性蛋白質中に配列相同性研究 によって見出された、（ループ（Ｂ　ｅｒｇ）１９８６）、因子ＴＦ　ｍｉの実 験的および理論的研究に基づいてミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら（１９８５）は蛋白 質がＤＮＡ分子を結合する新規な機構を提示した。彼らのモデルにおいては各ユ ニットは亜鉛イオンを中心とした“フィンガー状”構造に折れ曲がっている。１ 本のフィンガーがＤＮＡの半回転に結合する。変異体重４２２およびＩ４４０は フィンガーモデルの中心となるモチーフＣｙｓ　−Ｘ　２−　ＣＦＳを乱すアミ ノ酸挿入配列を有する。これらの変異体は転写活性化に関しては全く不活性であ るが、それらグルココルチコイド結合能は保持する。予備実験が示すように、こ れらの変異体もホルモン処理後に核に転座することができず、インビトロにおい てＤＮＡを結合するこができない（ニス・ホレンルーグ、未発表の所見）、これ らの突然変異した受容体はｈＧＲ中に存在するフィンガーモチーフの機能的重要 性を証明する。この領域に位置する第３の変異体重４２８は４個のアミノ酸の添 加によりフィンガーが伸びている。Ｉ４２８の転写活性は大幅に損われる（野生 型水準の２％）が、なお検出可能である。従って各ループは亜鉛結合モチーフよ りも変化に耐えると思われる。フィンガ一様機能区がｈＧＲにおいて機能的に重 要であるという証明から、本発明者らはステロイドホルモン結合体が原始的な祖 先由来のＤＮＡ結合蛋白質から進化した金属蛋白質であると提唱するに至った。

これらのデータを合わせると、受容体は調節機能図の集合体からなり、これらは 原始的なステロイドホルモン受容体中へ進化の過程で侵入凝縮されたものと思わ れ、これが哺乳動物ゲノム中に存在する一部の多数のホルモン応答遺伝子を生じ たことが示唆される。この分子の転写活性はそれが遺伝学的スイッチとして作用 する潜在的能力をもつことを証明する。これは各種の進化上の種族および恒常的 機能の活性化におけるステロイドホルモンの役割りと一致する。この突然変異の 方式によれば、希望する小規模または大規模の欠失変異体のいかなる組をも好都 合に形成することができ、機能を研究するために関連分子間の機能区を始動させ ることができる。この実験例に記載した迅速かつ定量的な機能アッセイと合わせ て、τ、ＤＮＡ−およびステロイド−結合区の機能性に関して特定の問題を提起 することが可能となった。

、の）　に述べた゛に　る ｌ乱ｒ調哩 ！■二上区 ｈＧＲアッセイ゛の　゛ このアッセイ法においては、ｈＧＲアルファｃＤＮＡを含む発現ベクターまたは それから誘導される変異体を、ＣＡＴ遺伝子を保有するプラスミドと共にＭＴＶ 　ＬＴＲの制御下にＣＶ−１またはｃｏｓｇ胞中へ共トランスフェクションする 。次いで細胞をホルモンの存在下または不在下で培養する。ＣＶ−１細胞はＣＡ Ｔ活性の誘導を監視するために用いられ、ＣｏＳ細胞はステロイド結合能および ｈＧＲ蛋白質の発現を測定するために用いられた。

策ｌ二１１ ｈＧＲの ＣＯ８細胞を偽トランスフェクションしく中央レーン）、またはプラスミドｐＲ ３ｈＧＲアルファでトランスフェクションしく右レーン）、２日後にｈＧＲ蛋白 質の存在につき分析した。粗製の細胞質抽出物を５ＤＳ−ＰＡＧＥにより溶解し 、ウェスタンプロットにより分析した。ＩＭ９細胞からの細胞質抽出物な比較の ため同一ゲルに付与したく左レーン）。

サブコンフルエンシー状態のＣＶ−ＩＭ！Ａ胞をｐＲＳ　Ｖｇａｌ（対照）、ｐ Ｒ３ｈＧＲアルファ、またはｐＲＳｈＧＲベータ、およびレポータープラスミド ｐＭＴＶＣＡＴで共トランスフェクションし、１０ｎＭデキサメサゾンの存在下 （＋）または不在下（−）で２日間培養した。ＣＡＴアッセイは実験法（実験の 部■。

Ｆ、）に示したとおり行われた。Ｃ，クロラムフェニコール；ＡＣ１３−アセチ ルクロラムフェニコール。

（Ａ　）ｐＲＳ　ｈＧ　ＲアルファおよびｐＭＴＶＣＡＴ（各プラスミド１０μ ｌＦ）で共トランスフェクションしたＣＶ−１細胞を漸増する濃度のデキサメサ ゾンの存在下に培養した。ＤＥＸに対する見掛けのＥＤ、。値は３ｎＭであった 。ＣＡＴ活性の水準を特定の実験において観察された最大応答に対する％として プロットした。ＤＥＸの不在下ではＣＡＴ活性は検出されなかった。

（Ｂ）滴定。漸増する量のｐＲ３ｈＧＲアルファをサブコンフルエンシー状態の ＣＶ−１細胞中へ一定量のｐＭＴＶＣＡＴ（５μ２）と共に共トランスフェクシ ョンした。プラスミドｐＢＲ３２２をキャリヤーＤＮＡとして用いて全体として ＤＮＡ結合区ｇ／プレートを得た。１０ｎＭ−ＤＥＸの存在下に細胞を２日間培 養し、ＣＡＴ活性を測定し、（Ａ）の場合と同様にプロットした。

！に」」乙 ｈＧＲにお番る　、の位！ ｈＧＲを転写活性化に関与する推定機能図τ１およびτ２（斜線を施した領域に より示す）と共に模式的に示す、ＤＮＡ結合区は点彩を施した四角で、ステロイ ド結合区は点を施した四角により表わされる。Ｂａ５ＨＩリンカ−挿入配列は三 角形および丸印で表わす、数字はその後で挿入が起こるアミノ酸の位置を意味す る（実験の部Ｉ参照）、白地の記号はＣＡＴ活性により測定して野生型水準のホ ルモン依存性転写活性を誘導しうる変異体を表わす、黒地の記号は大幅に低下し た、または無効になった機能を示す、棒は機能を示さないｈＧＲベータ中に存在 する異なるアミノ酸の位置を示す。

、Ｆ、に１汲 玩Ｌ」創１に生 ＣＶ−１およびＣ０８−１細胞は３７０℃で、５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清、ア ンピシリン４００μｇ／ｚｌ、およびストレプトマイシン１００μｍＦ／ｌｌｌ を補充したダルベツコの改良イーグル培地において増殖させた。良好なトランス フェクション効率を得るために細胞を３日毎に継代し、コンフルエンシーに到達 させながった。

トランスフェクションされた培養物は５％ＣＯ２下で３７℃に保持された。

ｂ　″　′ブースミド プラスミドｐＲＳ　ｈＧ　ＲアルファおよびｐＲ３ｈＧＲベータ、す、なわちｃ ｖ−１およびＣＯ８細胞において２形態のｈＧＲの合成を方向づけるものは、３ 個のＤＮＡ断片から構成された。第１断片はｐＲＳＶＣＡＴゴルマン（Ｇｏｒｍ ａｎ）ら、１９８２ｂ）から誘導され、ＲＳＶ　ＬＴＲ，ｐＢＲ３２２配列、お よびＳＶ４０；ｆ？！Ｊ７デニル化部位を含む、この断片を得るためにはｐＲ３ ＶＣＡＴをＨｉｎｄｌ［Ｉで切断し、各末端をＤＮＡポリメラーゼ■のクレノー 断片で処理することにより修復した。□Ｉロリンーを標準法によりこれらの末端 に付加しくマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、１９８２）、このプラスミドを 次いでｈ■で切断し、これによってＣＡＴコード化配列配列去した。第２の断片 はｈＧＲアルファまたはｈＧＲベータのいずれのコード化配列をも含む、プラス ミドｐ。

Ｂ１１３およびｐＯＢ１１７（ニス、エム、ホレンルーグ、未発表の結果）、す なわちそれぞれアルファ形およびベータ形のｈＧＲのコード化配列全体を含むも のを旦ａｍＨＩで切断した。各末端をクレノー断片で修復し、これらの１ラスミ ドをｂすで切断した。

第１および第２断片のリゲーションによりプラスミドｐＲｈＧＲアルファおよび ｐＲｈＧＲベータを形成した。付加すべき第３の断片はプラスミドｐ　Ｓ　Ｖ　 ２　ＣＡ　Ｔから得た５Ｖ４００ＲＩを含む几翌■一旦道は■からなる（ゴルマ ン（Ｇｏｒｍａｎ）ら、１９８２ｇ）、この断片の各末端をクレノー断片で処理 することにより修復し、これらにＮｄｅＩリンカ−を付加した。ＳＶ４０　０Ｒ Ｉを含むこのＤＮＡ断片を次いでｐＲｈＧＲアルファおよびｐＲｈＧＲベータ中 に存在する１個のＮｄｅ１部位に導入した。最後にこれらのはｐＲ３ｈＧＲアル ファおよびｐＲＳ　ｈＧ　Ｒベータであった。プラスミドｐＭＴＶＣＡＴおよび ｐＭＴＩａＣＡＴはニス、ゴールド氏からの供与であった。

（Ｃ殉然六　ン ｈＧＲアルファの野性型配列を乱すアミノ酸の挿入は下記の方法により行われた 。全長線状ｐＲ５ｈＧＲアルファＤＮＡはＡｌｕｌ、匣１．およびＢｓｔＮＩ制 限酵素による部分消化によって形成された。ＢｓｔＮＩにより切断したＤＮＡの 場合、各末端をまずクレノー断片で修復した０次いでＤＮＡ分子をアガロースゲ ル電気泳動により分画し、線状の１ラスミドを抽出しな。

８−または１２−１１ｅｒのｌ阻ＨＩリンカ−を付加してｈＧＲアミノ酸配列配 列来の解読フレームを再生した。ｈＧＲのコード化領域に１個のＢ堕ＨＩリンカ −を保有するプラスミドの配列を決定しくマクサム（Ｍａｙｉｍ）およびギｌレ バート（Ｇ　１ｌｂｅｒｔ）１９８０）、リンカ−の位置およびｈＧＲ変異体の 全体性を確認した。

ｄ　トランスフェクションお　ＣＡＴアッセイ組換えＤＮＡ構造体をリン酸カル シウム共沈法によりｃ■−１細胞中へ（ウィグラー（Ｗｉｇｌｅｒ）ら、１９７ ９）、またはＤＥＡＥ−デキストランによりＣＯ５細胞中へ（ディーンズ（Ｄ　 ｅａｎｓ）ら、１９８４）導入した。トランスフェクションに用いた各プラスミ ド調製物は２種の連続ＣｓＣ１−ＥｔＢｒ平衡濃度勾配により精製された。ＣＡ Ｔ遺伝子構造物でトランスフェクションしたのち、ボルマン（Ｇｏｒｍａｎ）ら （１９８２ａ）の記載に従ってＣＶ−１細胞をＣＡＴアッセイ用に調製した。こ れらのアッセイは全細胞抽出物の３分の１を用いて、インキュベーション時間６ 時間で行われた。

（ｅ）　ウェスタンプロッド　布 ｃｏｓ′ＭＡ胞からの粗抽出物は１０＋＊Ｍ）リス−ＨＣｆ（ｐＨ７，５）、１ ００＋ｍＭ　ＮｔＣｌ、　１　ｓＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　、０．５％トライトンＸ −１００を含有するｖｌ、ＷＩ液を用いる細胞溶解により調製された６等量の蛋 白質（１００μｇ）ｐ７．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により溶解し、 ニトロセルロースフィルターに移し、抗ｈＧＲ抗体ＧＲ８８４（ハーモン（Ｈａ ｒｓｏｎ）ら、１９８４）により検査したのち１２５１標諏−黄色ぶどう球菌蛋 白ｉＡにより検出した。フィルターを風乾し、フィルムに露光しな。受容体の量 をオートラジオグラフのスキャニングにより定量した。

（ｆ　ステロイド結合のアッセイ ＣＯＳ細胞を、１０ｍＭ）リス−ＨＣ１（ｐＨ７，５）、１０ｗ＋Ｍ　ＮａＣ１ ゜１　ｖａ　Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　、　５μｇ／ｘｉアンチベイン、５μｇ／　 ｌ　１０イベブチンおよび０．５ｍＭ−Ｐ　Ｍ　Ｓ　Ｆを含有する低張緩衝液中 でダウンスホモジナイゼーションにより細胞溶解し、１５，０ＯＯＸｙで１０分 間遠心分離してサイドシル画分を得た。１００ｍＭ−ＮａＣ１に調整され、サイ ドシル画分からの蛋白質１０μｓおよび２　ｘｌＯ−”（’Ｈ）ＤＥＸ（アメル シャム、９５０　ｉ／　ｗｎａｌ）を全容量２００μｍに含有する低張緩衝液中 でインキュベーションを行った。非特異的結合は２Ｘ１０−１非標識ＤＥＸの添 加により測定された０反応は０℃で２時間行われ、次いで５０％デキストラン被 覆活性炭（１０：１活性炭：デキストラン）２０μｌと共にインキュベーション し、ｉｓ、ｏｏ。

×３で４℃において２分間、遠心分離した。上層液をベックマンＬ　Ｓ　−７８ ００液体シンチレーション分光先度計による液体シンチレーション法によって計 数した。各アッセイは通常２５００〜３０００ｅｐｍ　（’　Ｈ）標識ステロイ ドを与えた。非標識ＤＥＸはこの結合の７０％に対し競合した。

、　の　で　昭した １　、　Ａ　１ｗ１ｎｅ、　Ｊ　、Ｃ、、Ｍｏ１．（≧１１．Ｂｉｏ１．５：１ ０３４−１０４３＜１９８５＞。

２、　Ａｎｄｒｅａｓｅｎ、Ｐ、Ａ、、ａｎｄ　Ｇｅｈｒｉｎｇ、Ｕ、、旦ｕｒ 、Ｊ　、Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ。

１２０　：４４３−４４９（１９８１）　、　’３、　Ｂａｚｅｔｔ−Ｊｏｎｅ ｓ、Ｄ、Ｐ、、Ｙｅｅｋｅｌ、Ｍ、、ａｎｄ　Ｇｏｔｔｅｓｆｅｌｄ。

Ｊ　、　Ｆ　、　、　Ｎ　ａｔｕｒｅ、３１７：８２４−８２８（１９８５）　 。

４　、　Ｂ　ｅｒｇ、　Ｊ　、　、　Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ、２３２：４８５−４８ ７（１９８６）　。

５　、　ＣａｒｌｓＬｅｄｔ−Ｄ　ｕｋｅ、　Ｊ　、　、　Ｏｋｒｅｔ、　Ｓ　 、　、Ｗｒａｎｇｅ、Ｏ、、ａｎｄＧｕｓｔａｆｓｓｏｎ、　Ｊ　、　−Ａ　、 、　Ｐ　ｒｏｅ、Ｎ　ａｔｌ　、Ａｃａｄ、　Ｓ　ｅｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ　。

７９：４２６０−４２６４＜１９８２）　。

６　、Ｃｈａｎｄｌｅｒ、Ｖ　、Ｌ　、、Ｍａｌｅｒ、Ｂ　、Ａ　、、ａｎｄ　 Ｙａ餉ａｍｏｔｏ、Ｋ　、Ｒ、。

Ｑｍｌ↓、３３：４８９−４９９（１９８３）　。

７　、Ｄｅａｎｓ、Ｒ、Ｊ　、、Ｄｅｎｉｓ、Ｋ　、Ａ　、、Ｔａｙｌｏｒ、Ａ 　、、ａｎｄｗａｌ　Ｉ　。

Ｒ，、Ｐｒｏｅ、Ｎ１ｔ１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ　Ｓ　Ａ　、８１：１２９ ２−１２９６（１９８４）　。

８、　Ｄｅｌｌｗｅｇ、Ｈ，−Ｇ、、ＨｏＬｚ、Ａ、、ＭｕｇｅＩｅ、に、、ａ ｎｄ　Ｇｅｈｒｉｎｇ。

Ｕ、、ＥＭＢＯＪ、、１：２８５−２８９（１９８２）。

９、　Ｄｙｎａｎ、Ｗ、Ｓ、、ａｎｄ　Ｔｊｉａｎ、Ｒ，、Ｃｅ１ｌ、３２二６ ６９−６８０（１９８３）。

１０、　ＧａｒＢｅｓ、Ｓ、、ａｎｄ　Ａｄｈｙａ、Ｓ、、Ｃｅｌ±、４１ニア ４５−７５１（１９８５）。

１１、　Ｇｌｕｚｍａｎ、Ｙ、、Ｃｅｌユ、２３：１７５−１８２＜１９８１） 。

１２、　Ｇｏｒｍａｎ、Ｃ，Ｍ、、Ｍｏｆｆａｔ、Ｌ、Ｆ、、ａｎｄ　Ｈｏｗａ ｒｄ、Ｂ、Ｈ，。

Ｍｏ！、Ｃｅ１１．Ｂ　ｉｏｌ、、２二１０４４−１０５１（１９８２ａ）。

１３、Ｇｏｒｍａｎ、Ｃ、Ｍ　、、Ｍｅｒｌｉｎｏ、Ｇ　、Ｔ　、、Ｗ　ｉｌｌ ｉｎｇｈａｍ、Ｍ　、Ｃ、。

Ｐ　ａｓｔａｎ、　Ｉ　、　、ａｎｄ　Ｈｏｗａｒｄ、　Ｂ　、Ｈ、、Ｐ　ｒｏ ｅ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

旦杉工ＵＳ、と、７９：６７７７−６７８１　＜１９８２ｂ）　。

１４、Ｇ　ｒｅｅｎ、　Ｓ　、　、Ｗａｌｔｅｒ、　Ｐ　、、Ｋ　ｕｍａｒ、　 Ｖ　、、　Ｋ　ｒｕｓｔ、Ａ　、　、ＢｏｒｎｅｒＬ。

Ｊ　、Ｍ、、Ａｒｇｏｓ、Ｐ　、、ａｎｄ　Ｃｈａｍｂｏｎ、Ｐ　、、Ｎａｔｕ ｒｅ。

３２０：１３４−１３９（１９８６）　。

１５、Ｇｒｅｅｎ、Ｇ、Ｌ、、Ｇ１１ｎａ、Ｐ、、Ｗａｔｅｒｆｉｅｌｄ、Ｍ、 、Ｂａｋｅｒ、Ａ、。

Ｈｏｒｔ、Ｙ、、ａｎｄ　５ｈｉｎｅｊ、、５ｃｉｅｎｃｅ、３２１：１１５０ −１ｔ５４（１９８６）。

１６、Ｈａｒｍｏｎ、Ｊ　、Ｍ　、、Ｅ　１ｓｅｎ、Ｈ、Ｊ　、、Ｂｒｏｗｅｒ 、Ｓ　、Ｔ　、、Ｓ　ｉｍｏｎｓ。

Ｓ　、　Ｓ　、、　Ｌａｎｇｌｅｙ、Ｃ、Ｌ　、　、ａｎｄ　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ 、　Ｅ　、　Ｂ　、　、Ｃ５ｎｅｅｒ上ζ！じ孔、、４４二４５４０−４５４７ （１９８４＞。

１７、Ｈｅｂｅｒｌｅｉｎ、Ｕ、、Ｅｎｇｌａｎｄ、Ｂ、、ａｎｄ　Ｔｊｉａｎ 、Ｒ，、Ｃｅｌ±。

４１　：９６５−９７７＜１９８５）　。

１８、Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、　Ｓ　、Ｍ　、　、Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ、　Ｃ 、、Ｏｎｇ、　Ｅ　、　Ｓ　、　。

Ｃｅｒｅｌ　ｌｉ、Ｇ　、、Ｏｒｏ、Ａ　、、Ｌｅｂｏ、Ｒ、、Ｔｈｏｍｐｓｏ ｎ、Ｅ　、Ｂ　、。

Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ、Ｍ　、Ｇ　、、ａｎｄ　Ｅｖａｎｓ、Ｒ、Ｍ　、、ＮａＬ ｕｒｅ。

３１８：６３５−６４１（１９８５）　。

１９、Ｋｈｏｕｒｙ、Ｇ、、ａｎｄＧｒｕｓｓ、Ｐ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ Ｉｏｎｉｎｇ＋Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ ｇ　Ｈａｒｂｏｒ。

Ｎ　ｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８２）。

２０、Ｍａｘａ＋ｓ、Ａ、Ｍ、、ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ、Ｗ、、Ｐｒｏｅ、Ｎ ａｔｌ、Ａｃａｄ。

旦杉よ４口３　Ａ　、　７４：５８０−５６４（１９７７）　。

２１、ＭｃＫａｙ、Ｄ　、Ｂ　、、ａｎｄＳ　ｔｅｉｔｚ、Ｔ　、Ａ　、、Ｎａ ｔｕｒｅ。

２９０ニア４４７４９（１９８１） ２２、　Ｍｉｌｌｅｒ、Ｊ、、ＭｅＬａｅｈｌａｎ、Ａ、Ｄ、、ａｎｄ　Ｋｌｕ ｇ、Ａ、。

ＥＭＢＯＪ、、４：１８０９−１８１４（１９８５）。

２３、Ｍｏｒｅａｕ、　Ｐ　、　、　Ｈｅｎ、　Ｒ、、Ｗａｓｙｌｙｋ、　Ｂ　 、　、　Ｅ　ｖｅｒｅｔｔ、　Ｒ、、Ｇａｕｂ。

Ｍ、Ｐ、、ａｎｄ　Ｃｈａｍｂｏｎ、Ｐ、、Ｎｕｃｉ、Ａｅｉｄｓ　Ｒｅｓ、。

９：６０４７−６０６７＜１９８１）。

２４、Ｐａｒｋｅｒ、Ｃ，Ｓ、、ａｎｄ　Ｔｏｐｏｌ、Ｊ、、Ｃｅｌ↓、３７： ２７３−２８３＜１９８４）　。

２５、Ｐｉｙｖａｒ、Ｆ、、ＤｅＦｒａｎｃｏ、Ｄ、、Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅ、Ｇ 、Ｌ、、Ｅｄｇａｒ。

Ｂ　、Ｗｒａｎｇｅ、Ｏ、，０ｋｒｅｔ、Ｓ　、、Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ、Ｊ　 、−Ａ　、、ａｎｄＹａｓａｍｏｔｏ、に、Ｒ，、Ｃｅ１１，３５：３８１−３ ９２（１９８３）。

２６、　Ｒｅｉｃｈｍａｎ、Ｍ　、Ｅ　、、　Ｆ　ｏｓｔｅｒ、Ｃ、Ｍ　、、　 Ｅ　１ｓｅｎ、　Ｌ　、Ｐ　、、　Ｅ　１ｓｅｎ。

Ｈ，Ｊ　、、Ｔｏｒａｉｎ、Ｂ　、Ｆ　、、ａｎｄ　Ｓ　ｉｍｏｎｓ、Ｓ　、Ｓ 　、、Ｊ　ｒ、。

Ｂ　ｉｏｅｈｅｍｉｓｔｒ　、２３：５３７６−５３８４（１９８４）　。

２７、Ｒｉｎｇｏｌｄ、Ｇ　、Ｍ　、　、Ｙａｍａｍｏｔｏ、　Ｋ　、Ｒ、、Ｂ 　１ｓｈｏｐ、　Ｊ　、Ｍ　、、ａｎｄＶａｒｍｕｓ、Ｈ、Ｅ　、、上−ｒｏｅ 、Ｎａｔｌ、ｙ＼ｃａｄ、ｓｃｉ、、リニＳＡ。

７４：２８７９−２８８３（１９７７）。

２８、Ｓａｗａｄｏｇｏ、Ｍ、、ａｎｄ　Ｒｏｅｄｅｒ、Ｒ，Ｇ、、Ｃｅｌ↓。

４３：１６５−１７５＜１９８５）。

２９、　５ｃｈｏｌｅｒ、Ｈ，Ｒ，、ａｎｄ　Ｇｒｕｓｓ、Ｐ、、Ｃｅ１１，３ ６：４０３−４１１（１９８４）。

３０、　５ｈｙａ＋ｍａｌａ、Ｇ、、旦ｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、Ｒｅｓ 、ｃｏｗｍｕｎ、。

６４：４０８−４１５（１９７５）。

３１　、Ｕｃｋｅｒ、　Ｄ　、　Ｓ　、、　Ｆ　１ｒｅｓｔｏｎｅ、Ｇ　、　Ｌ 　、、ａｎｄ　Ｙａｍａｍｏｔｏ、　Ｋ　、Ｒ、。

Ｍｏ１．Ｃｅｌ　Ｉ　、　Ｂ　ｉｏｌ　、、３：５５１−５６１（１９８３）　 。

３２、　Ｗａｓｙｌｙｋ、　Ｂ　、　、Ｗａｓｙｌｙｋ、Ｃ、、Ａ　ｕｇｅｒｅ ａｕ、　Ｐ　、　、ａｎｄ　Ｃｈａｍｂｏｎ　。

Ｐ、、Ωｍｌ↓、３２：５０３−５１４（１９８３）　。

３３、Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ、　Ｃ、、Ｈｅｌ　Ｉｅｎｂｅｒｇ、　Ｓ　、Ｍ　 、　、　Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ、　Ｍ　、　Ｇ　、　。

ａｎｃｌ　Ｅｖａｎｓ、Ｒ，Ｍ、、Ｎａｔｕｒｅ　３１８：６７０−６７２（１ ９８５）。

３４、　Ｗｅｓｔｐｈａｌ　、　Ｈ、Ｍ　、、Ｍｕｇｅｌｅ、　Ｋ　、、　Ｂｅ ａｔｏ、Ｍ　、　、ａｎｄ　Ｇｅｈｒｉｎｇ。

Ｕ、、ＥＭＢＯＪ、、　３：１４９３−１４９８　（１９８４）。

３５、Ｗｉｇｌｅｒ、Ｍ　、、Ｓｗｅｅｔ、Ｒ，、Ｓ　ｉ（Ｇ　、Ｋ　、、Ｗｏ ｌｄ、Ｂ　、。

Ｐｅ１ｆｉｃｅｒ、Ａ、、Ｌａｅｙ、Ｅ　、、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、Ｓ　１ ｌｖｅｒｓｔｅｉｎ。

Ｓ、、ａｎｄ　Ａｘｅｌ、Ｒ，、Ｃｅｌ↓、　１６：７７７−７８５　（１９７ ９）。

３６、Ｗｒａｎｇｅ、Ｏ，，０ｋｒｅｔ、Ｓ　、、Ｒａｄｏｊｃｉｅ、Ｍ、、Ｃ ａｒｌｓｔｅｄｔ−Ｄｕｋｅ、Ｊ　、、ａｎｄ　Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ、Ｊ　、 −Ａ　、、Ｊ　、Ｂ　ｉｏｌ、ｃｈｅｍ、。

２５９：４５３４−４５４１　（１９８４）。

３７、Ｙａｍａｍｏｔｏ、に、Ｒ，、Ｇｅｈｒｉｎｇ、Ｕ、、Ｓｔａ＋ａｐｆｅ ｒ、Ｍ、Ｒ，、ａｎｄＳｉｂｌｅｙ、Ｃ，、Ｒｅｅ、Ｐｒｏ　、Ｈｏｒｓｏｎｅ 　Ｒｅｓ、、３２：３−３２　（１９７６）。

３８、Ｚａｒｅｔ、に、Ｓ、、ａｎｄ　Ｙａｍａｍｏｔｏ、に、Ｒ，、Ｃｅｌユ 、３８：２９−３８ｅ−ｅｒｂ−Ａ遺伝子は甲状腺ホルモン受容体をコードする 、Ａ、および　＝ ヒトグルココルチコイド受容体（ｈＧＲ）の相補ＤＮＡはその塩基配列が決定さ れており（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら、１９８５ｂおよび実験の部Ｉを参照）、機 能的に活性であることが分かつている（実験の部■を参照）、興味あることには 、その受容体の塩基配列解析により、それは鳥類の赤芽球症ウィルス（ＡＥＶ） のｖ−ｅｒｂ−Ａ腫ｉ遺伝子産物に関係のあることが見出された（Ｗｅｉｎｂｅ ｒｇｅｒら、１９８５を参照）、これはステロイド受容体とｅｒｂ−Ａ［ｉ瘍遺 伝子産物が共通の原子的原型（ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ　ａｒｅｈｅｔｙｐｅ）を 共有し、そしてｅｒｂ−Ａ原腫瘍遺伝子産物もまたＤＮＡエンハンサ−因子と結 合するタンパク質でありうるという提案へ導いた。ヒトエストロゲン（Ｇｒｅｅ ｎら、１９８６およびＧｒｅｅｎｅら、１９８８）、ニワトリプロゲステロン（ Ｊｅｌｔｓｅｈら、１９８６およびＣｏｎｎｅｅｌＦら、１９８６）およびヒト アルドステロン（Ｊ　、　Ａｒｒｉｚａ、Ｃ、Ｗ、およびＲ９Ｍ、Ｅ、、未発表 データ）の最近の特性決定はこれらの結論をさらに支持するものである。

従って、我々はたとえヒトｃ−ｅｒｂ−Ａ原腫瘍遺伝子が機能的に確実に固定さ れなくとも、その遺伝子の配列を決定することから始めた。これらの実験の進行 中に、グルココルチコイド受容体の機能的ドメイン（実験の部■を参照）の解説 において進歩が見られ、ｈＧＲのホルモン結合ドメインはカルボキシ末端の３０ ０個のアミノ酸を包含する異常に大きい領域であることが判明した。この全領域 はｖ−ｅｒｂ−Ａのカルボキシ末端とのわずかではあるが有意な類似性を有し、 それ故にステロイドホルモンの作用と類似した転写調節作用を及ぼしうる分子の 部類に我々の関心が集中した。

遺伝子発現の甲状腺ホルモン刺激の分子ｔ！１ｔＩＩはステロイドについて概略 したものと類似していると思われる（Ｅｂｅｒｈａｒｄｔら、１９８０を参照） 、甲状腺ホルモンは試験したすべてのを索動物種に存在し、そして発生および分 化（例えば両生類の変態）に対して重要な作用を及ぼす（Ｅ　ｂｅｒｈａｒｃｌ ｔら、１９８０を参照〉、ステロイドと同様に、甲状腺ホルモンは受動拡散によ って細胞に入り、高親和性該受容体と結合し、その後遺伝子発現の迅速かつ選択 的な活性化を仲介する（Ｔａｔａら、１９６６およびＯｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒら 、１９７２）　、この仮説を支持する証拠は、ラット下垂体前葉のツマ・トトロ ビン生成細胞および多数の関連するラットソマトトロピン生成細胞株における成 長ホルモンおよびそのメツセンジャーＲＮＡの誘導の研究からもたらされた（Ｓ ａｓｕｅｌｓら、１９７３およびＴａｔａら、１９７４）　、甲状腺ホルモンは これらの細胞における成長ホルモン遺伝子の転写を速やかに増強する（Ｍａｒｔ ｉａｌらｊ　９７７およびＥ　ｖａｎｓら、１９８２）　、この転写増強は核甲 状腺ホルモンー受容体複合体のレベルが上昇することにより達成され、時間およ び濃度に依存しているが、タンパク質合成とは無関係である（　Ｓ　ａｍｕｅｌ ｓら、１９７６；　Ｓ　ｐｉｎｄｌｅｒら、１９８２．およびＹａｆｆｅら、１ ９８４を参照）。

ステロイドホルモン作用と甲状腺ホルモン作用との類似性は、ｅｒｂ−Ａタンパ ク質それ自体が甲状腺ホルモン受容体でありうるという可能性を調べることへ導 いた。我々は初めにヒトＣ−ｅｒｂ−ＡのｅＤＮＡを単離して、その配列を決定 した。その塩基配列から、ステロイドホルモン受容体の推定上のＤＮＡ結合ドメ インに類似したシスティン／リシン／アルギニンに富む領域、およびそのステロ イド結合ドメインとわずかに関連したカルボキシ末端領域を含む４５６個のアミ ノ酸から成るポリペプチドが推定された。クローン化したステロイド受容体のホ ルモン結合特性を調べるために＃４発された機能検定（実験の部Ｉを参照）を用 いて、我々はヒトｃ−ｅｒｂ−ＡｅＤＮＡの翻訳産物が天然甲状腺ホルモン受容 体分子に特徴的な、固有の甲状腺ホルモン結合活性を保持することを証明した。

、　Ｂ、　ｃ−ｅｒｂ−Ａ　ｅＤＮＡの、　゛ヒトｅ−ｅｒｂ　−Ａ　ｅＤ　Ｎ 　Ａを単離するために、ｖ−ｅｒｂ−Ａ遺伝子のみを含むＡＥＶゲノム領域から 分離した５００塩基対（ｂｐ）のＰｓｔＩＤＮＡフラグメント（Ｖｅｎｎｓｔｒ ｏｍら、１９８０）を３２　Ｐ　［％　ｇプローブとして使用して、２つのヒト 胎ｆｉｅＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。それぞれ約１０６個のファ ージ組換え体の２つの独立したライブラリーと選択することにより、２つの重複 するラムダＢｔｌＯｃＤ　Ｎ　Ａクローンが得られた。ｐＵｃ８サブクローンか らのｃＤＮＡクローンＥｃｏＲＩ挿入物ｐｈｅＡ４およびｐｈｅＡ１２のそれぞ れの制限地図を作成したく第１１１−１（Ａ）図）。

これらの重複する１、５キロ塩基（ｋｂ）ｅＤ　Ｎ　Ａクローンのヌクレオチド 配列解析により、ヌクレオチド番号３０１に推定上のイニシエーターメチオニン コドンおよびヌクレオチド番号１６６９にターミネータ−コドンを有する４５６ 個のアミノ酸の長いオーブン・リーディング・フレームを含むことが明らかにな った（第■−１（Ｂ）−１図および第１ｎ　−１（Ｂ）−２図）、ＡＴＧの７コ ドン上流には読み枠内のターミネータ−ＴＡＡが存在してイニシエーターメチオ ニンに対する支持を与えているが、２６コドン下流に存在する別のメチオニンは この割当てを不確かなものにする。

共通のポリアデニル化付加シグナル（ＡＡ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ａ　、　Ｐ　ｒｏｕｄ ｆｏｏｔら、１９７６を参照）はｐｈｅＡ１２のターミネータ−とポリ（Ａ）領 域の間の２７ヌクレオチド中に存在しない。

ヒトｅ−ｅｒｂ　−Ａ　ｅＤ　Ｎ　Ａ翻訳オーブン・リーディング・フレーム内 にコードされる相対分子量５２０００（Ｍ　、　＝　５２Ｋ　’）の推定上のポ リペプチドは、ＡＥＶ中のウィルスｇａｇ配列（Ｄｅｂｕｉｒｅら、１９８４） から下流の領域と８２％のアミノ酸同一性を共有する。アミノ酸の比較において 大きな相違は見られなかったやヒトｅ　−ｅｒｂ−Ａアミノ酸配列はウィルスの アミノ酸残基３７から始まるウィルスタンパク質と相同である（第ｍ−２図）、 ｃ−ｅｒｂ−Ａのカルボキシ末端はｖ−ｅｒｂ−Ａのそれと次の点で相違する： すなわち、２種のポリペプチドのアミノ酸配列類似性がｅ−ｅｒｂ−Ａの残基４ ４５およびｖ−ｅｒｂ−Ａの残基３８０で終止する（第ｍ−２図）。

ヒトｃ−ｅｒｂ−Ａ核酸配列とｖ−ｅｒｂ−Ａのそれとを整列させると、ヒト遺 伝子の約７４％がアミノ酸の相同領域（ｃ　−ｅｒｂ　−Ａのヌクレオチド５６ ３−１６３６　、データは示さず）においてウィルス遺伝子と同一であることが 分かる。これらの比較は、染色体１７にマツピングされる他のヒトｅｒｂ−Ａ遺 伝子に関する以前のデータ（Ｊ　ａｎｓｓｏｎら、１９８３　；　Ｓ　ｐｕｒｒ ら、１９８４．およびＤ　ａｙｔｏｎら、１９８４）と考え合わせると、我々の 分離したヒト結盟ｃ−ｅｒｂ−Ａ遺伝子が別個のものであることを示す、２種の 染色体１７ｅｒｂ−Ａ遺伝子（我々は両方ともｈｅ−ｅｒｂ−Ａアルファと呼ぶ よう提案する）のうちの１種はヌクレオチド配列に関して８２％がｖ　−ｅｒｂ 　−Ａ遺伝子と類似しており、アミノ酸配列に関しては８９％が同一である（Ｄ ａｙｔｏｎ、１９８４を参照）、従って、我々がｈｅ−ｅｒｂ−Ａベータと呼ぶ よう提案する胎盤ｃ−ｅｒｂ−Ａ　ｃＤＮＡは、ｈｅ　−ｅｒｂ　−Ａアルファ 遺伝子よりもウィルスｅｒｂ−Ａ遺伝子との関連性かうすい。

ウィルスおよび細胞ｅｒｂ　Ａタンパク質産物とグルココルチコイド受容体との アミノ酸配列の比較は、ｈＧＲのカルボキシ末端半分との段階的レベルの相同性 を示す（第ｎｌ−２図）、！にも高い類似性はｃ−ｅｒｂ−Ａアミノ酸残基１０ ２から始まって６５個のアミノ酸から成るシスティンに富む配列に見られる（Ｗ ｅｉｎｂｅｒｇｅｒら、１９８５を参照）、ｈＧＲと比較した場合には４７％の アミノ酸同一性が見られ、そしてｃ−ｅｒｂＡをヒトエストロゲン受容体（ｈＥ Ｒ）のアミノ酸配列と比較した場合には５２％の同一性が存１′　メイン４を表 すと提案した。突然変異誘発および発現実験により、転写活性化におけるその役 割の直接的証拠が得られたく実験の部■を参照）、システィンに富むドメインか ら下流の領域（ホルモン結合ドメインに相当する）には、ウィルスｅｒｂ−Ａ産 物において先に述べたようなｈＧＲおよびｈＥＲとの低下したしかし有意な（１ ７％）相同性が存在する（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら、１９８５゜Ｇｒｅｅｎｅら 、１９８６．およびＧ　ｒｅｅｎら、１９８６を参照）。

ＦＡ−”Ｃ，ｅｒｂ　Ａ　− 制限エンドヌクレアーゼ消化ヒト胎盤ＤＮＡ、　Ｄ、　ｃ−ｅｒｂ−Ａ−の 種々のヒト細胞株またはヒト胎盤から分離した細胞質ポリ（Ａ）含有ＲＮＡと、 ｐｈｅＡ４からの６５０ｂｐ　Ｂ　ａｍＨＩ　−Ｐ　ｓｔ　Ｉフラグメント（第 １１１−１（Ａ）図）と、をハイブリダイズする）ザン・ブＯ−／ト（Ｎｏｒｔ ｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ）は、ＨｅＬａおよびＭＣＦ−７細胞中に最も豊富に存在す る２０００ヌクレオチドの単一のＲＮＡ種を明らかにした（第１１１−４（Ａ） 図）、ｍＲＮＡの大きさは、我々がほぼ全長のｃ−ｅｒｂ　−ＡｅＤ　Ｎ　Ａを 分離したことを示す、　ＨＴ１０８０細胞は少量の２ｋｂ転写物を含み、一方そ れはＩＭ−９細胞中に検出されない、ヒト胎盤は２．０ｋｂのＲＮＡに加えて５ ．３および２．５ｋｂの多数のＲＮＡ種を含むと思われる。多数の胎盤バンドが 核前駆体、または単一遺伝子からの成熟ａｓ　ＲＮ　Ａ、もしくは他のｅｒｂ− Ａ遺伝子の産物を表すかどうかは定かでない。

ヒトｃ−ｅｒｂ　−Ａ　ｅＤ　Ｎ　Ａのタンパク質産物はｉｎ　ｖｉｔｒｏｌｌ 訳により同定した。全ｃ−ｅｒｂ−Ａコード領域を含むｃＤＮＡは両方の向きで 発現ベクターｐＧＥＭ３のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。

ウサギ網状赤血球溶解液中でのタンパク質合成をプログラミングするために、こ れらの鋳型からＴ７ボリメラーゼにより合成したキャップ（ｃａｐ）をもつＲＮ Ａ転写物を使用し、そして３ｓＳ−メチオニン標識産物を５ＤＳ−ポリアクリル アミドゲル上で分離した（Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７０）、　９Ａ型としてｐｅＡ ｌｏｌＤＮＡ（ｅ、ｙｂ−Ａセンス転写物）を用いたときにはＭｒ５５．５２お よび３５にのタンパク質が検出されたが（第ｎｌ−４（Ｂ）図、レーン３および ４）、ｐｅＡ　１０２Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｅｒｂ　−Ａアンチセンス転写’ｓ＞を用 いたときには検出されなかった（第１［［−４（Ｂ）図、レーン２）、５５およ び５２にの産物はそれぞれメチオニン１および２７で翻訳を開始するポリペプチ ドに相当しく第１［［−１（Ｂ）−１図）、３５に産物はタンパク質分解産物で ありうる。

、Ｅ、゛　ホルモンの４：Ａ ｈＧＲのカルボキシ末端とｈＥＲのカルボキシ末端（ホルモン結合ドメインを定 めるＨＫｒｕｓｔら、１９８６を参照）の間の部分的アミノ酸配列相同性（４０ ％）並びにステロイドリガンドの構造的類似性は、ステロイド受容体が調節タン パク質の１つのファミリーから成るという仮説を支持するものである。ｅｅｒｂ Ａのカルボキシ末端とステロイド受容体のカルボキシ末端との比較的少ない相同 性は、ｅｒｂ　Ａ原ｍ瘍遺伝子が恐らくステロイド受容体をコードしないことを 示唆しており、ｅｒｂ−Ａが他の分子に応答しうるという仮説に一致する。我々 はｉｎ　ｖｉｔｒｏｆ！訳がクローン化したステロイド受容体のホルモン結合活 性を同定する手段として使えることを示したく実験の部■と参照）、従って、推 定上のｃ−ｅｒｂ−Ａリガンドを同定するために、この検定分利用した。

ステロイドホルモンおよび甲状腺ホルモンは基本的に類似した樋楕によりそれら の作用を及ぼす。ｅｒｂ−Ａ甲状腺ホルモン受容体でありうる可能性を引き出す ために、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳産物を”’Ｉ−３，５，３’　−）リョードーチ ロニン（”５１−Ｔ））とホルモン結合反応条件下で混合した（Ｓａｍｕｅｌｓ ら、１９７４を参照）、非特異的ホルモン結合は同様な試料に５００倍過剰モル 量の冷却Ｔ、を加えることにより調べた。驚いたことに、５５および５２にポリ ペプチドを含む混合物（ｐｅＡｌｏｌ）は”Ｊ−７３と結合したが、アンチセン スＲＮＡ−プログラム化溶解液（ｐｅＡ１０２）はバックグラウンド結合のみを 示した。ホルモン結合はプロテアーゼに対して感受性であるが、ヌクレアーゼに は非Ｓ受性である（データは示さず）、クローン化ｅｒｂ−Ａタンパク質に対す る手段として使えることを示したく実験の部Ｉを参照）、従って、推定上のｃ− ｅｒｂ−Ａリガンドを同定するために、この検定を利用した。

ステロイドホルモンおよび甲状腺ホルモンは基本的に類似したＦＲ横によりそれ らの作用を及ぼす、ｅｒｂ−Ａ甲状腺ホルモン受容体でありうる可能性を引き出 すために、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳産ｍヲ１２’１　Ｂ、’５．３’　−ト’）ヨ Ｆ−チＯニン（”’Ｉ　Ｔ３）とホルモン結合反応条件下で混合した（　Ｓ　ａ ＋ｍｕｅｌｓら、１９７４を参照）、非特異的ホルモン結合は同様な試料に５０ ０倍過剰モル量の冷却Ｔコを加えることにより調べた。驚いたことに、５５およ び５２にポリペプチドを含む混合物（ｐｅＡｌｏｌ）は１２Ｊ−Ｔ３と結合した が、アンチセンスＲＮＡ−プログラム化溶解液（ｐｅＡ　１０２）はバックグラ ウンド結合のみを示した。ホルモン結合はプロテアーゼに対して感受性であるが 、ヌクレアーゼには非感受性である（データは示さず）。クローン化ｅｒｂ−Ａ タンパク質に対するＴｓＭ和性はスカツチャード分析により測定した（第１Ｉｆ −５（Ａ）図）、５Ｘ１０−１１ＭのＫｄ値がか得られ、これはＨｅ　Ｌ　ａ細 胞の核抽出物におけるＴ、結合（６Ｘ１０−ＩＭ）とほとんど同じである（デー タは示さず）。

特殊な甲状腺ホルモン類似体は、天然甲状腺ホルモン受容体へのＴ、結合に対し 特徴的な競合パターンを有する。我々はｉｎν１ｔｒｏで合成したｅｒｂ−Ａ産 物が天然および合成甲状腺ホルモンに対して同じ固有の親和性を有するかどうが 調べた　１２５Ｉ−Ｔ、結合は３．５’　、３′−トリヨードチロ酸１！！（Ｔ 　ＲＩ　Ａ　Ｃ）ノ場合に最も効果的に競合され、それは３００ｐＭで１２’Ｉ −Ｔ、結合の５０％を阻害した（第１［［−５（Ｂ）図）、さらに、し−チロキ シン（第１［１−５（Ｂ）図）、Ｄ−Ｔ、およびｒＴｓ（３、３’　、　５　’ 　−）リョードーし一チロニン）はＴ、よりら弱く競合しく第１１１−５（Ｃ） 図）、一方１００μＭのビタミンＤ１、アルドステロン、コルチゾル、テストス テロン、プロゲステロンまたはエストラジオールは競合せず（データは示さず） 、ラット甲状腺ホルモン受容体の生化学的性質と一致する（Ｓａｍｕｅｌｓら、 １９７４；Ｓａｍｕｅ！ｓら、１９７９．およびＬ　ａｔｈａ−ら、１９７６を 参照）。

高塩（０，４Ｍ　ＫＣＩ）ＨｅＬａ細胞核抽出物は甲状腺ホルモン（１２’　Ｉ −Ｔ、）結合活性を含むが、細胞質または低塩（０，１ＭＫＣｆ）核抽出物には 全く見られなかった（データは示さず）、核抽出物における甲状腺ホルモン結合 の競合は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで調製したｅ−ｅｒｂ−Ａ含有溶解液のそれと定量 的に類似していた（第１１１−５（Ｂ）図および（Ｄ）図を比較されたい）、さ らに、検出不能なレベルのｃ−ｅｒｂ−Ａ　＠ＲＮＡ（第１１１−４（Ａ）図、 レーン４）を含むＩＭ−９細胞由来の０．４Ｍ　ＫＣＩ核抽出物を用いた甲状腺 ホルモン結合は、類似のＨｅＬａｍ胞抽出物と比較したとき、ごくわずかである 、これらの結果はｃ−ｅｒｂ−Ａ甲状腺ホルモン受容体であるという直接的証拠 を提供する。

１−Ｌ−級友 ここで得られたデータは、ｅ−ｅｒｂ−Ａ産物を甲状腺ホルモン受容体として同 定するための３つの基準を６たらす、第一に、ｃ−ｅｒｂ−Ａの全体的な構造相 同性はリガンド応答性調節タンパク質である可能性を示している。第二に、発現 されたタンパク質産物は天然および合成甲状腺ホルモンに対して天然受容体左向 じ固有の親和性を有している。第三に、ｅｒｂ−Ａのｉｎ　ｖｉｔｒ。

翻訳産物の分子量はフォトアフィニティ標識ラット甲状腺ホルモン受容体と類似 している（Ｐａｓｃｕａｌら、１９８２）、甲状腺ホルモン受容体としてのｅｒ ｂ−Ａの本性は、成長ホルモン遺伝子のようなＴ３一応答性遺伝子のその転写調 節を証明することによりさらに実証されるであろう。

ｈＧＲおよびｈＭの分析により、これらのタンパク質は一連の機能的ドメインか ら構成されていることが明らかになった。

（実験の部■および■；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら、１９８５ａ；Ｃａｒｌｓｔｅ ｄｔ　−Ｄｕｋｅら、１９８２；Ｄｅｌｌｗｅｇら、１９８２；Ｒｅｉｅｈｍａ ｎら、１９８４．およびＳｈｅｒｍａｎら、１９７８を参照されたい、）これら はキセノブス（Ｘ　ｅｎｏｐｕｓ）　５　Ｓ遺伝子の第ｍＡ転写因子および他の 転写調節タンパク質（Ｍｉｌｌｅｒら、１９８５　；　Ｂ　ｅｒｇ　、　１９８ ５）に見られる反復したシスティンに富む配列とのｉ造的類似性を有するシステ ィンに富む領域、並びにステロイド結合ドメインをコードするカルボキシ末端領 域（実験の部Ｉｆ　；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら、１９８５ａ；およびＫ　ｕｍａ ｒら、１９８６を参照）を含む、甲状腺ホルモン受容体に類似したこの範囲はそ のホルモン結合領域がその分子のカルボキシ末端近傍に局在化することを予告す るであろう（第ｍ−６７）、推定上のＤＮＡ結合配列はシスティンに富む領域に 存在しく第ｆｉｒ−６図）、ｈＧＲおよびｈＥＲのＤＮＡ結合特性は局在化され ると思われる（実験の部１；Ｋｕｍａｒら、１９８６；Ｓ、　Ｈｏｌｌｅｎｂｅ ｒｇおよびＲｌＭ、Ｅ、、未発表データを参照）。

［１，Ｇ、　ホルモン　０　お　び　多鳥類の赤芽球によるｖ−ｅｒｂ−Ａ産物 の発現は、完全に形質転換された表現型の維持のために必要とされる（Ｇｒａｆ ら、１９８３゜Ｆ　ｒｙｋｂｅｒｇら、１９８３；５ｅａｌｙら、１９８３　、 およびＫ　ａｈｎら、１９８６を参照）、ｖ−ｅｒｂ７Ａ遺伝子を欠失したウィ ルスに感染したニワトリは比較的悪性でない症状を呈するが、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ においてこれらの感染赤芽球は自然に分化して、複合培地を補給したときだけ生 育する。しかしながら、ｅｒｂ　−Ａ　”　／　ｅｒｂ　−Ｂ＋ウィルスに感染 した細胞は増大した自己回復能を有し、比較的未分化の表現型を呈する。ｖ−ｅ ｒｂ−Ａタンパク質の構造的変化は異常な成長調節特性を及ぼす産物を生じさせ るであろう０例えば、カルボキシ末端における変化は甲状腺ホルモン結合活性に 影響を及ぼして、以前にヒトグルココルチコイド受容体のベータ型において示し たように、構成的に活性な分子をもたらすかも知れない（実験の部■および［１ ；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら、１９８５ａを参照）。この場合の変化はステロイド 結合活性を排除する。このドメインにおける挿入変異もまたステロイド結合特性 を不活性化する（実験の部■を参照）、シかしながら、ホルモン結合領域の欠失 は構成的に活性な受容体を生じさせ、このことはこのドメインが転写活性化にお いて調節的役割を演じていることを示す（■。

Ｇ：ｇｕｅｒｅおよびＲ，Ｍ、Ｅ、、未発表データ）、これらのデータは、ｖ− ｅｒｂ−Ａがホルモンと結合しそうもなく、むしろ甲状腺ホルモン受容体の構成 的に活性な形体であることを推測させる。甲状腺ホルモン受容体としてのｅｒｂ −Ａの同定は、腫瘍の原因となる形質転換にエンハンサ−およびそれらの結合タ ンパク質を巻き込む最初の直接的証拠を提供する。

、Ｈ６・　−のスーツ寸−フアミ１− ステロイド受容体とｖ−ｅｒｂ−Ａ腫瘍遺伝子産物との類似性は、これらが原始 的な受容体遺伝子から進化したものであると我々が提案するのに十分であったＣ Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら、１９８５ａ）、　２つの驚くべき結果がここに示した 実験から得られた。第一は、ｅｒｂ−Ａ［腫瘍遺伝子のファミリーの存在が甲状 腺ホルモン受容体と密接に関連したｌＮまたはそれ以上の他の分子の存在を暗示 するということである。生理学的研究は第二のクラスの甲状腺ホルモン受容体の 存在を予告しなかった。従ってこのファミリーの同定は発生およびホメオスタシ ス調節の８！楕に新たな光を投げかけるかも知れない、これらの結果から得られ た第二の驚くべき観察は、甲状腺ホルモン受容体とステロイドホルモン受容体フ ァミリーとの密接な関係である。この関係は、これらの分子がすべてより複雑な 真核生物の次第に高まる発生学的および生理学的要求に適合すべく進化の過程で 生じた調節タンパク質のスーパーファミリーの一部でありうることを示している 。

ＩＩ［，１，の部■に関連した面の詳細ｔ＝日１１１−１（Ａ）および（Ｂ）゛ ヒト胎盤ｃ−ｅｒｂ　−Ａ　ｃＤ　Ｎ　Ａの制限地図および塩基配列決定計画（ Ａ）、並びにそのヌクレオチド配列および推定上のアミノ酸配列（Ｂ）、　ａ、 複合制限地図に対する２つのサブクローンｐｈｅＡ４およびｐｈｅＡ１２の方向 性。共通の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を線状地図の上に示す。ＩｉＩ線、 非翻訳配列；斜線ボックス、ｅｒｂ−Ａコード領域；矢印塩基配列を決定したＤ ＮＡフラグメント、ｂ、複合ｅｒｂ−Ａ　ｅＤＮＡのヌクレオチド配列を５′− ４３′の方向で示す。ウィルスｅｒｂ−Ａタンパク質２１に関する翻訳オープン ・リーディング・フレームをヌクレオチド配列の上に示す、アデノシン残基（約 １３０個）がｐｈｅＡ１２の３′末端に存在する。翻訳配列の上の番号はアミノ 酸残基を示し、そしてヌクレオチド番号はその配列の右側に示す。

−Ａお　Ｂ゛の　゛ ２つのヒト胎盤ラムダｇｔｌＯＤ　Ｎ　Ａライブラリー（Ｈｕｙｎｈら、１９８ ５）のそれぞれからの組換えファージ（約１０６個は）は、ｐＡＦ。

Ｖ−１１（Ｖ　ｅｎｎｓｔｒｏｍら、１９８０）から単離した５００ｂｐ　Ｐ　 ｓｔ　Ｉフラグメントにツク・トランスレーションを行なったものＨＲｉｇｂｙ ら、１９７７）を用いてスクリーニングした。ハイブリダイゼーション混合物は ５０％ホルムアミド、１×デンハート溶液、５ｘＳＳＰＥ、０．１％ドデシル硫 酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび１０’ｃ ｐａ＋／　ｘｉの３２ｐ標識ＰｓｔＩフラグメント（比活性＝　Ｉ　Ｘ　１０” ｃｐｍ／μｇ）を含んでいた。２通りのニトロセルロースフィルターを３７℃で １８時間ハイブリダイズさせ、ｏ、ｔｘｓｓｃ　、　０．１％ＳＤＳ（ＩＸＳＳ Ｃ＝１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１５−Ｍクエン酸三ナトリウム）で２０分ずつ３回 洗い、そして増感紙を用いて一７０℃でオートラジオグラフィーにかけた。２つ のハイブリダイゼーション陽性クローンが単離され、それをｐＣＵ８のＥＣＯＲ ■部位にサブクローニングし、その後化学的切断方法により塩基配列を決定した （Ｍ＋１ｘｉ−ら、１９７７）。

１１１１区 ｖ　−ｅｒｂ　−Ａ　５１瘍遺伝子産物、ヒト胎ｊ！１ｊｅ−ｅｒｂ−Ａポリペ プチド、およびヒトグルココルチコイド受容体並びにヒトエストロゲン受容体の カルボキシ末端部分のアミノ酸配列比較、ｖ−ｅｒｂ−Ａタンパク質（上段の配 列）とヒト胎盤ｃ−ｅｒｂ−Ａポリペプチド（第二段の配列）との翻訳アミノ酸 配列は、対応する残基を整列させることにより比較した。３個以上のアミノ酸配 列の同時比較用のコンピュータプログラム（Ｊ　ｏｈｎｓｏｎら、１９８６）は 、Ｃ−ｅｒｂ　Ａ、ヒトグルココルチコイド受容体（第三段のｈＧＲ配列；実験 の部Ｉ、第１−２（１）およびｌ−２（２）図を参照）、およびヒトエストロゲ ン受容体（下段のｈＥＲ配列；Ｇｒｅｅｎら、１９８６を参照）のカルボキシ末 端アミノ酸配列を、各配列の所定のセグメントの漸進的評価に基づいて整列させ るべく用いられた。

少なくとも３種のポリペプチド間で一致するアミノ酸残基をボックスで囲った。

２種のｅｒｂ−Ａポリペプチド間のアミノ酸の一致は、各欄の上段配列の上に星 印で示した。ステロイド受容体間のアミノ酸配列の同一性は、配列の下に十字形 の印で示したやハイフン、ギャップは比較の際にアミノ酸の同一性の数を最大と するために挿入した。４種のポリペプチド間に保存されたシスティン残基は黒地 に白で印刷した。

１１１−３（Ａ＞（Ｂおよび（Ｃ）パ ｃ−ｅｒｂＡＤＮＡプローブによるヒト胎盤ＤＮＡのサザン分析および染色体マ ツピング、Ａ、妊娠期間終決後のヒト胎盤ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消 化し、生成物を０．８％アガロースゲルで分離した。ＤＮＡはニトロセルロース 紙に移行させ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、１９７５）、ｐｈｅＡ４由来の４５０ｂｐ　 Ｓｓｔ　Ｉフラグメントにツク・トランスレーションを行って、比活性５Ｘ１０ ”ｃｐｓ／μｇとしたもの）を用いて５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＰＥ、１× デンハート溶液、０，１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｗｌサケ精子ＤＮＡ中でハイブ リダイズさせた。フィルターを０．ｌＸ５ＳＣＯ９１％ＳＤＳ中で６０℃にて洗 い、その後増感紙を用いて一７０℃でＸ線フィルムに露光した。ラムダＨ１ｎｄ Ｉ［［Ｄ　Ｎ　Ａマーカー（Ｋｂでのサイズ）をオートラジオグラムの左側に並 べる。

Ｂ、非ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下での上記セクションａと 同じｅ−ｅｒｂ−Ａプローブを用いた胎盤ＤＮＡの分析、同じ試料を含む類似の プロットをセクション８のようにハイブリダイズさせた（但し、３５％ホルムア ミドを使用）、ハイブリダイズしたフィルターは２ＸＳＳＣ１０，１％ＳＤＳ中 で５５℃にて洗い、その後上記の如＜ｘｍフィルムに露光した。

Ｃ，ヒトｃ−ｅｒｂ−Ａ遺伝子の染色体マツピング、ヒトリンパ球染色体をレー ザー・サイトフルオロメトリー（Ｌｅｂｏら、１９８４）により分離し、セクシ ョンｂて説明した非ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下に、ｐｈｅ Ａ４由来の１．５ｋｂ　ＥｃｏＲＩ挿入物ドブローブとして使用して検索した。

第１−４（Ａ）およびＢ）パ ヒトｃ−ｅｒｂ−Ａの発現。Ａ、ヒト細胞株およびヒト胎盤がらのＲＮＡのノザ ン分析、ＨｅＬａ、ＭＣＦ−７およびＩＭ−９細胞からｙ）ＨＢ胞資質ポリＡ） 含有ＲＮ　Ａ　（１２ｔｔ　ｙ）、またはＨＴ１０８０もしくは胎馨からの全ポ リ（Ａ）ＲＮＡはホルムアルデヒドを含有する１％アガロースゲル上で分離し、 ニトロセルロースに移行させ（Ｔｈｏｍａｓ、１９８０）、モしてニック・トラ ンスレーションを行った６５０ｂｐ　Ｂ　ａｍＨＩ　−Ｐ　ｓｔ　Ｉ　ｐｈｅＡ 　４フラグメントを用いて検索した。細胞質ＲＮＡは等張′Ｍ街液および０．５ ％ＮＰ４０を用いて細胞株から分離し、一方胎盤ＲＮＡはグアニジンチオシアネ ートを用いて新鮮な組織から抽出した（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、１９７９）　。

レーン１．ＨｅＬａ；レーン２．　ＨＴ１０８０；レーン３．ヒト胎盤；レーン ４．ＩＭ−９；レーン５．ＭＣＦ−７，Ｂ、　ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのｅｒｂ−Ａ ポリペプチドの合成、Ｔ７ポリメラーゼにより触媒されたＲＮＡ転写物を用いて 合成した３５ｓ−メチオニン標識産物は１２．５％５ＤＳ−ポリアクリルアミド ゲル上で分離し、フルオログラフィー（ＥＮ’ＨＡＮＣＥ、ニューイングランド ヌクレアー）にかけた、レーン１．対照（ｍＲＮＡ不含）；レーン２．ｐｅＡ１ ０２（アンチセンスＲＮＡ、４μｌ）；レーン３．ｐｅＡｌｏｌ（センスＲＮＡ 。

１μｌ）：レーン４　、ｐｅＡ　１０１　（４μｌＲＮ　Ａ　）、タンパク質標 準のサイズ：ウシ血清アルブミン、６６．２Ｋ　；卵アルブミン、４．５に；お よびカルボニックアンヒドラーゼ、３１Ｋ。

−４ＡおびＢ・・の゛ ｅ　−ｅｒｂ　−Ａの全コード領域を含むｐｈｅＡ１２由来のＥｃｏＲＩ挿入物 は両方の向きでｐＧ　Ｅ　Ｍ　３　（Ｐ　ｒｏｍｅｇａ　Ｂ　１ｏｔｅｃ社）の Ｅｃ。

ＲＩ部位へ挿入した。プラスミドＤＮＡのｐｅＡｌｏｌおよびｐｅＡ１０２をＨ ｉｎｄＩ［ｌで線状となし、０．８％アガロースゲル上で精製し、モしてＴ７ボ リメラーゼにより触媒されるｉｎ　ｖｉｔｒｏＲＮ　Ａ合成のための鋳型として 使用した（実験の部１ｅ参照）。Ｐ６０クロマトグラフィー後に、全核酸物質（ ２μｔ）はウサギ網状赤血球溶解液系（Ｐｒｏｍｅｇａ　ＢｉｏＬｅｅ社）中で ３５Ｓ−メチニオン（２５μＣｉ、ｌ１００Ｃｉ／　Ｍ　ｇａｏｌ＞を用いて最 終容量２５μｐにてタンパク質翻訳を行わせるべく使用した。

第１１１−５（Ａ）（Ｂ　（Ｃ）および（Ｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏで合成したｅｒ ｂ−Ａポリペプチドへの甲状腺ホルモンの結合、Ａ、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで合成し たｅｒｂ−Ａポリペプチドの１２ｓｉＴｓ結合のスカツチャード分析、ｅｒｂＡ ポリペプチド（全容＆２ｗｌ中のｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳混合物からの２μｍ）は 異なる＋２５Ｉ−７４度での結合した標識ホルモン量および遊離の標識ホルモン 量を測定するためにヒドロキシルアパタイトを用いて特異的甲状腺ホルモン結合 活性について検定した（Ｇｒｕｏｌ　、１９８０）。

Ｂ　、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで合成したｅｒｂ−Ａポリペプチドへの”’１−Ｔ３結 合に対する甲状腺ホルモン類似体の競合、　ｐｅＡｌｏｌ（センス鎖）−プログ ラム化反応からの試料（２μりは、次第に増加する濃度の未標識甲状腺ホルモン または類似体く標識ホルモンと競合する）と共に”Ｉ−Ｔ３標識結合反応＜　Ｓ 　ａ餉ｕｅｌｓら、１９７４）において使用した。特異的に結合した甲状腺ホル モンを競合化合物の濃度に対してプロットする。Ｃ，ｉｎ　ｖｉｔｒｏで合成し たｅｒｂ　−Ａポリペプチドへの”ｌ−７３結合に対するトリョードチロニン異 性体の競合、結合反応は次第に増加する濃度のＴ、異性体を加えて上記の通りに 行った。ｅｒｂ−Ａに結合した甲状腺ホルモンは縦座標上にプロットする。Ｄ、 ０．４Ｍ　ＫＣＩ　ＨｅＬａ＃胞核抽出物への”５Ｉ−Ｔ３結合に対する甲状腺 ホルモン類似体の競合、ＨｅＬａ１胞核は０．４Ｍ　ＫＣＩを含む緩衝液で抽出 した（Ｓａｍｕｅｌｓら、１９７４）　、タンパク質抽出物（２５μＩり　（パ イオーラッドタンパク質検定法により測定）は次第に増加する濃度の甲状腺ホル モンおよび類似体を含む標準結合反応混合物中で０．６ｍＭＩ２’ｌ−７３と混 合した（ＳａｍｕｅｌＳら、１９７４；Ｌａｔｈａ−ら、１９７６）。

−５Ａ（Ｂ（ＣおよびＤ）の　゛ 標識＋２’Ｉ−３，３’　、５−トリヨード−Ｌ−チロニン（ＮｅｗＥｎｇｌａ ｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ社製、２２００Ｃｉ／＋＊　ｍｏｌ、０．３ｍＭ最終）は Ｔｓ−結合緩衝液（０，２５Ｍシェークロース、０．２５Ｍ　ＭＣＩ、２０ａｘ ＭトリスーＨ（，１（ｐＨ７，５）、１ｍＭ　ＭＩＦＣＩＩ！２，２１１Ｍ　Ｅ ＤＴＡ、５ｍＭジチオトレイトール（Ｄ　Ｔ　Ｔ　＞＞　（Ｓ　ａｍｕｅｌｓら 、　１９７４）中でｉｎ　ｖｉｔｒ。

翻訳混合物（第１１１−４（Ａ）にて説明）中で合成したｅｒｂ−Ａポリペプチ ドと最終容量２５０μｌにて０℃で２時間混合した。特異的ホルモン結合は１０ ００倍過剰の未標識ホルモンを加えることにより測定し、セファデックスＧ−２ ５微粒子（Ｐｈａｒｍｉｃｉａ社）０．９Ｘ４、ＯＣ−カラムから排除容量中に 溶出される放射能を計数することにより検定した（Ｓａｍｕｅｌｓら、１９７４ ）　。

！に１ｍ ステロイドホルモン受容体と甲状腺ホルモン受容体との模式図による比較、第ｍ −２図に示した受容体分子のアミノ酸配列を模式図で表す、ＣＹＳ、受容体タン パク質に見られる推定上のＤＮＡ結合ドメインをコードするシスティンに富む領 域（Ｃｙｓに富む領域の残基は：ｅ−ｅｒｂ　−Ａ　、１０２−１６９；ｈＧ　 Ｒ，４２１−４８６；ｈＥ　Ｒ，１８５−２５０）　；Ｃｏｒｔｉｓｏｌ、　Ｅ ｓｔｒａｄｉｏｌおよび’ｒ　ｓ／　Ｔ　４　、カルボキシル末端のホルモン結 合領域；ＩＭＭ、ヒトグルココルチコイド受容体の免疫原領域、ボックスを分離 する数学、垂直破線間の受容体種同士のアミノ酸同一性のパーセンテージ；ｈＥ Ｒ。

ヒトエストロゲン受容体、ｈＧＲ，ヒトグルココルチコイド受容体；ｈｅ−ｅｒ ｂ−Ａベータ、ヒト甲状腺ホルモン受容体。

１１Ｔ、　Ｊ、　の部■で　した １　、　Ｂｅｒｇ、Ｊ　、、５ｃｉｅｎｃｅ、２３２：４８５−４８７　（１９ ８５）。

２　、　Ｃａｒｌｓｔｅｄｔ　−Ｄ　ｕｋｅ、　Ｊ　、　、０ｋｒｅｔ、　Ｓ　 、　、Ｗｒａｎｇｅ、Ｏ、、ａｎｄＧｕｓｔａｆｓｓｏｎ、Ｊ、−Ａ、、Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

７９：４２６０−４２６４　（１９８２）。

３　、　Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、　Ｊ　、Ｍ　、、　Ｐｒｚｙｂｙｌａ、Ａ　、Ｆ　 、　、ＭａｃＤｏｎａｌｃｌ、　Ｒ、Ｊ　、。

ａｎｄ　Ｒｕｔｔｅｒ、Ｗ、Ｆ　、、Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　、１８：５２ ９４−５２９９　（１９７９）。

４　、　Ｃｏｎｎｅｅｌｙ、Ｏ，Ｍ、、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、、２３ ３ニア６アー７７０　（１９８６）。

５　、　Ｄａｙｔｏｎ、Ａ　、　Ｉ　、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、Ｕ　Ｓ　Ａ　。

８１：４４９５−４４９９　（１９８４）。

６　、　Ｄｅｂｕｉｒｅ、Ｂ、、ｅｔ　ｍｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２２４：１４ ５６−１４５９（１９８４）。

７　、　Ｄ　ｅｊｅａｎ、Ａ　、　、　Ｂｏｕｇｕｅｌｅｒｅｔ、　Ｌ　＋、Ｇ ｒｚｅｓｃｈｉｋ、Ｋ　、　−Ｈ、、ａｎｃｌ８、Ｄｅｌｌｗｅｇ、Ｈ，−Ｇ、 、ＨｏＬｚ、Ａ、、ＭＢｅｌｅ、に、、ａｎｄ　Ｇｅｈｒｉｎｇ。

Ｕ　、、Ｅ　Ｍ　Ｂ　ＯＪ、Ｊ：２８５−２８９（１９８２）　。

９　、Ｅ　ｂｅｒｈａｒｄｔ、　Ｎ　、　Ｌ　、、Ａ　ｐｒｉｌｅｔｔｉ　、　 Ｊ　、Ｗ、、ａｎｄ　Ｂ　ａｘｔｅｒ、　Ｊ　。

Ｄ、ｉｎ　Ｂｉｏｅｈｅ＋＊１ｅａｌ　Ａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｈｏｒｍｏｎｅ ｓ、Ｖｏｌ。

Ｖ　Ｉ　Ｉ　（ｅｄ、Ｌｉｔｗａｃｋ、Ｇ、）、ｐｐ、　３１１−３９４．Ａｅ ａｄｅ＋ｓｉｃ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８０）。

１０、Ｅｖａｎｓ、Ｒ，Ｍ、、Ｂｉｒｎｂｅｒｇ、Ｎ、Ｃ，、ａｎｄ　Ｒｏｓｅ ｎｆｅｌｄ、Ｍ、Ｇ、。

Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｉ、ＵＳＡ、７９ニア６５９−７６６３（ １９８２）。

１１、Ｆｒｙｋｂｅｒｇ、Ｌ−、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅｌユ、３２：２２７−２３ ８　（１９８３）。

１２、　Ｇｒａｆ、Ｔ、、ａｎｄ　Ｂｅｕｇ、Ｈ，、旦ｍｌユ、３４ニア−９（ １９８３）。

１３、Ｇｒｅｅｎ、Ｓ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、３２０：１３４４３９ 　（２９８６）。

１４、Ｇｒｅｅｎｅ、Ｇ、Ｌ、、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２３１：１１ ５０−１１５４　（１９８６）。

１５、　Ｇｒｕｏｌ、Ｄ　、Ｊ　、、Ａｎｉｎ上山Ｂｉｏｃｈｅｓ＋、、１０１ ：３８７−３９３　（ｆ９８０）−１６、Ｈｕｙｎｈ、Ｔ　、Ｖ　、　、Ｙｏｕ ｎｇ、　Ｒ、Ａ　、　、ａｎｄ　Ｄａｖｉｓ、　Ｒ、Ｗ　、、　１ｎＤＮＡ　Ｃ Ｉｏｎｉｎ　ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａ　ｒｏａｃｈ、Ｖｏｌ、Ｉ　（ｅｄ。

Ｇ　１ｏｖｅｒ、Ｄ　、、ｐｐ、４９−７８．　Ｉ　ＲＬ　Ｐ　ｒｅｓｓ、０ｘ ｆｏｒｄ（１９８５）　。

１７、Ｊｉｒ＋ｓｏｎ、Ｍ、、Ｐｈ１ｌｉｐｓｏｎ、Ｌ、、ａｎｄ　Ｖｅｎｎｓ ｔｒｏｍ、Ｂ、。

ＥＭＢＯＪ、、２：５６１−５６５　（１９８３）。

１８、Ｊ　ｅｌｔｓｅｈ、　Ｊ　Ｊ’ｉ　、、　Ｐ　ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ ｄ、ｓｃｉ　、Ｕ　Ｓ　Ａ　。

８３：５４２４−５４２８　（１９８６）。

１９、Ｊ　ｏｈｎｓｏｎ、Ｍ　、　Ｓ　、４ｎｄ　Ｄ　ｏｏｌｉＬｔｌｅ、　Ｒ 、Ｆ　、　、　Ｊ　、Ｍｏ１ｅｅ。

旦ヱリエ、２３：２６７−２７８　（１９８６）。

２０、　Ｋａｈｎ、Ｐ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１１，４５二３４９−３５６　（ １９８６）。

２１、Ｋｒｕｓｔ、Ａ、、ｅｔ　ａｌ、、ＥＭＢＯＪ　、、５：８９１−８９７ 　（１９８６）。

２２、Ｋ　ｕｍｍａｒ、Ｖ　、、Ｇｒｅｅｎ、Ｓ　、、Ｓ　ｔａｕｂ、Ａ　、、 ａｎｄ　Ｃｈａ＋＊ｂｏｎ、Ｐ　、。

ＥＭＢＯＪ、、５：２２３１−２２３６　（１９８６）。

２３、Ｌａｅｍ＋ｍ１ｉ、Ｕ、に、、Ｎａｔｕｒｅ、２２７：６８０−６８５　 （１９７０）。

２４、Ｌａｔｈａｍ、　Ｋ　、Ｒ、、Ｒｉｎｇ、　Ｊ　、Ｃ、、ａｎｄ　Ｂａｘ ｔｅｒ、Ｊ　、Ｄ　、。

Ｊ　、Ｂ　ｉｏｌ、ｃｈｅｍ、、２５１ニア３８８−７３９７　（１９７６）。

２５、Ｌｅｂｏ、Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２２５：５７−５９　 （１９８４）。

２６、Ｍａｒｔｉａｌ　、　Ｊ　、Ａ　、　、　Ｂ　ａｘｔｅｒ、　Ｊ　、Ｄ　 、　、Ｇｏｏｄ餉ａｎ、Ｈ、Ｍ　、　、ａｎｄＳｅｅｂｕｒｇ、Ｐ　、Ｈ，、Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　。

７４：１８１６−１８２０　（１９７７）。

２７、Ｍａｘａｍ、Ａ、、ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ、Ｗ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、Ａｅａｄ、Ｓｅｉ、。

Ｕ　Ｓ　Ａ　、７４：５６０−５６４　（１９７７）　。

２８、　Ｍ　１ｌｌｅｒ、　Ｊ　、　、Ｍｅｌａｃｈｌａｎ、Ａ　、Ｄ　、、ａ ｎｄ　Ｋ　ｌｕｇ、Ａ　、　。

ＥＭＢＯＪ　、、４：１６０９−１６１４　（１９８５）。

２９、　０ｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒ、　Ｊ　、　Ｈ、、Ｋｏｅｒｎｅｒ、Ｄ　、、 　Ｓｃｈｗａｒｔｚ、Ｈ、Ｌ　、。

ａｎｄ　５ｕｒｋｓ、Ｍ、Ｉ　、Ｊ　、、ＣＩｉｎ、Ｅｎｄｏｅｒ、Ｍｅｔａｂ 、。

３５：３３０−３３３　（１９７２）。

３０、Ｐａ５ｃｕａｌ　、Ａ　、、Ｃａｓａｎｏｖａ、　Ｊ　、　、ａｎｃｌ　 Ｓ　ａｍｕｅｌｓ、　Ｈ、Ｈ、。

Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ　、　Ｃｈｅｍ、　、２５７：９６４０−９６４７（１９８ ２）　。

３１、Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、Ｎ、Ｊ、、ａｎｄ　Ｂｒｏｗｎｌｅｅ、Ｇ、Ｇ、、 Ｎａｔｕｒｅ。

２６３：２１１−２１４　（１９７６）。

３２、Ｒｅｉｃｈｍａｎ、Ｍ、Ｅ、、ｅｔ　ａｔ、、旦ｉｏｅｈｅｍｉｓｔｒ　 。

２３：５３７６−５３８４　（１９８４）。

３３、Ｒｉｇｂｙ、　Ｐ　、Ｗ　、　Ｊ　、　、　Ｄ　１ｅｅｋＩ−ａｎｎ、Ｍ 　、　、　Ｒｈｏｄｅｓ、Ｃ、、ａｎｄＢｅｒｇ、Ｐ　、、Ｊ　、Ｍｏ１ｅｃ、 Ｂ　ｉｏｌ、、１１３：２３７−２５１　（１９７７）。

３４、Ｓｊ＋＊ｕｅｌｓ、Ｈ，Ｈ，、ａｎｄ　５ｈａｐｉｒｏ、Ｌ、Ｅ、。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、Ｌ］　Ｓ　Ａ　、７３：３３６９− ３３７３　（１９７６）−３５、Ｓａｍｕｅｌｓ、Ｈ，Ｈ、，５ｔａｎｌｅｙ、 Ｆ　、、ａｎｄ　Ｃａ５ａｎｏｖａ、Ｊ　、。

Ｊ　、ＣＩｉｎ、　Ｉ　ｎｖｅｓｔ、、６３：１２２９−１２４０　（１９７９ ）−３６、Ｓａｍｕｅｌｓ、Ｈ，Ｈ，、Ｔｓａｉ、Ｊ、Ｓ、、Ｃａ５ａｎｏｖａ 、Ｊ、、ａｎｄＳ　ｔａｎｌｅｙ、　Ｆ　、Ｊ　、、　Ｊ　、ＣＩｉｎ、　ｉ　 ｎｖｅｓｔ、、５４：８５３−８６５　（１９７４）　。

３７、Ｓａｍｕｅｌｓ、Ｈ，Ｈ，、Ｔｓａｉ、Ｊ、Ｓ、、ａｎｄ　Ｃ１ｎｔｒｏ ｎ、Ｒ，。

５ｃｉｅｎｅｅｊ８１：１２５３−１２５６　（１９７３）。

３Ｂ、　５ｅａｌｙ、Ｌ、、Ｐｒ１ｖａｌｓｋｙ、Ｎ、Ｌ、、Ｍｏ５ｅｏｖｉｅ ｉ、Ｇ、、Ｍｏ５ｃｏｖｉｃｉ。

Ｃ、、ａｎｄ　Ｂ　１ｓｈｏｐ、　Ｊ　、Ｍ　、　、　竺亘昶μｍ、１３０：１ ５５−１７８　（１９８３）　。

３９、Ｓ　ｈｅｒｍａｎ、Ｍ　、Ｒ、、Ｐ　ｉｃｋｅｒｉｎｇ、Ｌ　、Ａ　、、 Ｒｏ！　１ｕｎｇｅｎ、Ｆ　、Ｍ　、。

ａｎｄ　Ｍ　１ｌｌｅｒ、　Ｌ　、Ｋ　、、　Ｆ　ｅｄｎ、Ｐ　ｒｏｅ、　、３ ７：１６７−１７３　（１９７ｇ）　。

４１、　５ｐｉｎｄｌｅｒ、Ｂ、Ｊ　、、Ｍｅｌｌｏｎ、Ｓ、Ｈ，、ａｎｄ　Ｂ ａｘｔｅｒ、Ｊ　、Ｄ、。

Ｊ　、Ｂ　ｉｏｌ　、Ｃｈｅｍ、、２５７：［６２７−１１６３２（１９８２） 。

４２、　５ｐｕｒｒ、Ｎ、に、、ｅｔ　ａｌ、、ＥＭＢＯＪ　、、３：１５９− １６３　（１９８４）−４３、Ｔａｔａ、　Ｊ　、Ｒ、、ａｎｄ　Ｗｉｄｎｅｌ ｌ、Ｃ、Ｃ、、Ｂ　１ｏｅｈｅ＋＊、　Ｊ　、。

９８：６０４−６２０　（１９８６）。

４４、　Ｔｈｏｍａｓ、Ｐ　、、Ｐｒｏｃ二Ｎａｔ±、Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ Ａ。

７７：５２０１−５２０５　（１９８０）。

４５、Ｔｓａｉ　、Ｊ　、Ｓ　、、ａｎｄ　５ａｓｕｅｌｓ、Ｈ、Ｈ、、Ｂ　ｉ ｏｃｈｅｗ、Ｂ　ｉｏ　ｈ　ｓ。

Ｒｅｓ、Ｃｏｍ５ｕｎ、、５９：４２０−４２８　（１９７４）−４６、Ｖｅｎ ｎｓｔｒｏｍ、　Ｂ　、　、　Ｆ　ａｎｓｈｉｅｒ、　Ｌ　、　、　Ｍｏ５ｅｏ ｖｉｃｉ　、　Ｃ、、ａｎｄＢｉｓｈｏｐ、Ｊ　、Ｍ、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、３ ８：５７５−５８５　（１９８０）。

４７、Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ、　Ｃ、、Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、　Ｓ　、　Ｍ　 、、　ＲｏｓｅｎｆｅｌｅＪ、Ｍ　、　Ｇ　、。

ａｎｄ　Ｅｖａｎｓ、Ｒ，Ｍ、、Ｎａｔｕｒｅ、３１８：６７０−６７２　（１ ９８５ｍ）。

４８、　Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ、　Ｃ、、Ｈｏ！　ｌｅｎｂｅｒｇ、　Ｓ　、Ｍ 　、　、　Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ、　Ｍ　、　Ｇ　、　。

ａｎｄ　Ｅ　ｖａｎｓ、　Ｒ、Ｍ　、　、　Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ　、２２８ニア４ ０−７４２　（１９８５ｂ）　。

４９、Ｙａｆｆｅ、Ｂ　、Ｍ　、、ａｎｄ　Ｓａｍｕｅｌｓ、Ｈ、Ｈ、、Ｊ　、 Ｂ　ｉｏ！、Ｃｈｅｍ、。

２５９：６２８４−６２９１　（１９８４）。

寒皇ｌυＬ酊 ヒトグルココルチコイド受容体相補ＤＮＡのクローニング：グルココルチコイド 受容体とのｉ造的および機能的類似性り一ん工」灸 推定上の１０７キロダルトンのポリペプチドをコードする新しい遺伝子を単離す るために、ヒトグルココルチコイド受容体（ｈＧＲ）相補ＤＮＡとの低ストリン ジェントハイブリダイゼーションを使用した４発現試験により、高親和性でもっ てアルドステロンと結合し、そしてアルドステロンに応答して遺伝子転写を活性 化するその能力が証明され、それによりヒトグルココルチコイド受容体（ｈＭＲ ）としてのその本性が確立される。

この分子はまたグルココルチコイドに対して高い親和性を示し、グルココルチコ イド応答性１０モーターを刺激する。ｈＭＲおよびｈＧＲは一緒になって、ホル モン結合特性、標的遺伝子相互作用および組織特異的発現パターンが組合わされ た様式で使用され、複雑な生理学的コントロールを達成する予期せぬ機能的多様 性をもたらす。

Ｌ−」し−チ論− 視床下部一下垂体一副腎軸はいろいろな神経内分泌の入力信号を統合して、副腎 コルチコステロイドの合成および分泌を調節している。これらのステロイドホル モンは数組の標的遺伝子の転写を直接的に調節する細胞内受容体タンパク質との 相互作用によって成長、発生およびホメオスタシスに影響を及ぼす（１，２）、 ２つの受容体系がコルチコステロイドのために定められ、これらはグルココルチ コイド受容体（ＧＲ）およびミネラロコルチコイド受容体（ＭＲ＞と名づけられ な、初期の機能検定により、コルチコステロイドは肝臓へのグルコーゲン貯蔵を 促進するそれらの作用によりグルココルチコイド、または腎臓によるナトリウム 貯留を促進するそれらの作用によりミネラロコルチコイドのいずれかに類別され た。しかしながら、それぞれのステロイドクラスはその同族受容体とのみ相互作 用するように制限されておらず、とりわけグルココルチコイドは実質上のミネラ ロコルチコイド活性を示すことができる（１−３＞。

今や、ＭＲはグルココルチコイドとミネラロコルチコイドの両方に対して有意な ｉｎ　ｖｉｔｒｏ親和性を有することが明らかである（３．４＞、グルココルチ コイドの循環濃度はアルドステロン（代表的なミネラロコルチコイド）よりも数 段高いので、ＭＲのグルココルチコイド活性化は機能的に意義がある。腎および 腸のような組織の分泌上皮はアルドステロンに応答して電解質と水のバランスを 調節しているが、別の機構はこれらの組織にミネラロコルチコイドに対する６受 性を付与することが可能である（５）、他の組織において発現されるＭＲの機能 的役割は全く明らかになっていないが、脳での生理学的応答はＭＲとグルココル チコイドとの相互作用の結果として起こる（５−７＞。

高親和性の放射性標識リガンドの利用可能性にもかかわらず、ＭＲは精製が困難 であり、その生化学的性質はＧＲに比べて十分に理解されていない０ＭＲの研究 に分子生物学の技術を応用することにより、ＭＲの生化学的同定が容易となり、 終局的にその転写制御下にある遺伝子およびそれらの産物がホメオスタシスにお いて演する役割が理解されるであろう。

グルココルチコイド（実験の部Ｉおよび文献８，９を参照）、エストロゲン（１ ０）、およびプロゲステロン（１１）受容体の分子クローニングはそれらの一部 アミノ酸構造の決定およびこのファミリーの調節タンパク質に共通の機能的ドメ インの推定を可能にした。グルココルチコイド（実験の部■および文献１２を参 照）およびエストロゲン（１３）受容体の実験的解析はシスティン、リジンおよ びアルギニンに富む中央に位置するＤＮＡ結合ドメイン、およびステロイドホル モンが作用するカルボキシル末端領域を明らかにした。ＧＲの機能的研究は、カ ルボキシル末端へのホルモン結合が、受容体とＤＮＡとの相互作用および転写の 活性化を可能にすべくＤＮＡ結合領域をアンマスキング（ｕｎｍａｓｋｉｎｇ） すると示唆した（１４．１５）、ステロイド受容体および甲状腺ホルモン受容体 のシスティンに富むＤＮＡ結合領域の比較は、これらの分子間に高度の関連性を 示す（１６）、不変のシスティン残基は、Ｚｎ２＋金属原子の配位がキセノプス （Ｘｅｎｏｐｕｓ）５８遺伝子第ｍＡ転写因子について提案されたものに類似し たＤＮＡ結合の構造的形状を維持するという仮説へ導いた（１７）　。

また、ステロイド受容体ファミリーのステロイド結合領域も、共通の原始的前駆 物質からの種々の受容体クラスの進化と矛盾しない実質的保存（ｃｏｎｓｅｒｖ ａｔｉｏｎ）を示す（１１，１６）　。

我々はヒトグルココルチコイド受容体（ｈＧＲ）に密接に関連した遺伝子産物を 単離するために、ステロイドホルモン受容体間の構造的類似性を利用した。ｈＧ Ｒプローブとの非ストリンジェントハイブリダイゼーションにより、ｈＧＲのシ スティンに冨む配列と高度に関連したヒトゲノムＤＮＡフラグメントを分離した 。このＤＮＡをプローブとして使用して、我々はシスティンに富む領域からカル ボキシル末端までのｈＧＲと強い相同性を有する分子をコードする相補ＤＮＡ（ ｃＤＮＡ）を得た。

細胞内で発現させたとき、この分子は高い親和性でもってアルドステロンと結合 し、しかもマウス乳腺癌ウィルス（ＭＭＴＶ）のロング・ターミナル・リピート （ＬＴＲ）のアルドステロン応答性転写を活性化する。このヒトグルココルチコ イド受容体のリガンドおよびＤＮＡ配列特異性とｈＧＲのそれらとのオーバーラ ツプは、これらの調節分子に対して伝統的に割り当てられている別々の役割が再 考されるべきであることを示唆している。

、Ｃ３ｂＭＲｅＤＮＡの グルココルチコイド受容体関連遺伝子を同定するために、ヒト胎盤ＤＮＡを制限 エンドヌクレアーゼで消化し、アガロースゲル電気泳動で分画化し、そしてその 分画をｈＧ　Ｒ１，２（Ｄ　Ｎ　Ａ結合ドメインをコードする配列を含むｈＧ　 ＲｃＤ　Ｎ　Ａの１１００ｂｐフラグメント）とハイブリダイズさせた（実験の 部Ｉおよび文献１５を参照）、サザンプロット分析は低ストリンジェントハイブ リダイゼーション条件に特有の数本のバンドを示した（第Ｎ−１、＜Ａ）および （Ｂ）図を比較されたい）、　２．５キロ塩基対（Ｋｂｐ）のＨｉｎｄＩ［Ｉフ ラグメント（第Ｎ−１（Ｂ）図中に星印で示したもの）は他のハイブリッド形成 バンドからよく分割され、直接的ゲノムクローニングに適していると判定された 。ヒト胎盤からのＨ：ｎｄｍ消化ＤＮＡはアガロースゲル上で大きさに基づいて 分画化し、そしてゲノムライブラリーの横築のために２．５Ｋｂｐ領域を分離し た。その後、このラムダ８ｔ１０ライブラリーはプローブとしてｈＧＲｌ、２を 用いて低ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でスクリーニングした 。１つの陽性ゲノムクローン（ラムダＨＧＨ）からの挿入物はニックトランスレ ーションを行って、高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でのサザ ンプロットにおいてプローブとして使用したく第Ｎ−１（Ｃ）図）、　２．５Ｋ ｂｐ　Ｈｉｎｄｌ［［シグナルは非ストリンジェント条件下で見られたものに相 当し、所望のゲノムフラグメントの一部が分離されたことを示している。ラムダ ＨＧＨ由来の挿入物の塩基配列解析は、イントロン配列によってはさまれた１４ ０塩基対（ｂｐ）のエクソンを明らかにしたく（第］’Ｖ−１（Ｄ）図）、この 全エクソンは相同性のｈ　Ｇ　Ｒｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列と６８％のヌクレオチド同 一性を有するが、１０４個のヌクレオチドのうち８５個を保存する領域がその交 差ハイブリダイゼーション特性を与えるものと思われる。この高度に保存された 領域はｈＧＲのＤＮＡ結合ドメインの一部に対応する＜１５）　、ラムダＨＧＨ エクソンは１６個の非交換残基から始まってその後にステロイドホルモン受容体 に特徴的な高度に保存されたシスティン残基の最初の残基が続＜４６個のアミノ 酸をコードしている（８−１１）、次の３０個の残基のうち、２８個がｈＧＲと 同一である。これらの分析は、ｈＧＲｃＤＮＡ配列中に存在するものと関連があ るが、それとは明らかに異なる配列を含むゲノムフラグメントが分析されたこと を示す（実験の部■を参照）。

ラムダ）（ＧＨからの挿入物は、このｈＧＲ関連遺伝子に対応するクローンにつ いて、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための１０−ブとして使用し た。ミネラロコルチコイド受容体はこの種の遺伝子によってコードされる候補Ｔ ｈｆｆであると考えられた。腎臓はミネラロコルチコイド応答性組織であること が知られているので、数人のヒト腎１１ｉｃＤＮＡライブラリーをスクリーニン グした。１１個の陽性クローンが１０’組変えファージ当たり３〜４の頻度でこ れらのラムダｇｔｌｏライブラリーがら分離された。２つの重複するクローン、 ラムダｈＫ２および、ラムダｈＫ１０、をヌクレオチド配列分析にかけ、合わせ て５８２３ヌクレオチドに及ぶことが見出された（第ｆＶ−２（Ａ）、ＩＶ−２ （Ｂ）−１およびＩ’Ｖ−２（Ｂ）−２図）、ラムダ）（Ｇ）（のエクソン−イ ントロン境界はこれらのｅＤＮＡクローンの塩基配列を決定することにより証明 した。ラムダｈＫ１０（ヌクレオチド１から３７５０まで）は大きいオープン・ リーディング・フレームを含み、完全な一部アミノ酸配列を予告している。ラム ダｈＫ２がらのＤＮＡ挿入物はヌクレオチド８０２から５８２３にまで伸長して いるが、２２３５から２５８６までの３５１ｂ、内部欠失を有している。３個の 別のクローンも試験し、欠失領域がラムダｈＫ１０と同じ構造であることを確か めた。ラムダｈＫ２における欠失はクローニングアーチファクト（人工産物）を 表すか、あるいはまれなメツセンジャーＲＮ　Ａ　（ｗｅ　ＲＮ　Ａ　）のスプ ライシングエラー（切り継ぎの誤り）を表すと思われる（１８）　、ヌクレオチ ド３７５ｏの下流側の報告された３′非翻訳領域の配列はラムダｈＫ２から誘導 される。

これらの２つのｃＤＮＡの複合配列とｈＭＲと名づける（第Ｎ−２（Ａ）図）、 読み枠内終止コドン（１３６位）の下流側に最初の読み枠内Ａ　Ｔ　Ｇ　（２２ ３位）があり、ｈＭＲは少なくとも２１６ヌクレオチドの５′非翻訳領域を有し ている。この最初のＡＴＧをとりまく配列はＫ　ｏｚａｋ（１９）によって示さ れたコンセンサス配列と一致する。この推定されたイニシエーターメチオニンコ ドンは、９８４個のアミノ酸をコードする大きいオープン・リーディング・フレ ームの最初の部分をなす。終止コドン（３１７５位）に続いて、７０ヌクレオチ ド−ポリ（Ａ）（ポリアデニル化）尾部の１７ヌクレオチド上流にポリアデニル 化シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）を有する２゜６Ｋｂの３′非翻訳領域が存在する。

長い３′非翻訳領域はステロイドホルモン受容体のｗＲＮＡに特徴的な性質であ る（実験の部１および文献９−１１を参照）。

１’Ｖ、Ｄ、ＤＮＡ−およびホルモン−＋４　。

ｈ　Ｍ　Ｒｃ　Ｄ　Ｎ　Ａによりコードされるタンパク質は、ｈＧＲと密接に関 連したステロイドホルモン受容体の構造的特性を有する。ｈＭＲの推定上のアミ ノ酸配列とｈＧＲのそれとの比較により、ｈＧＲのＤＮＡ結合ドメインおよびス テロイド結合ドメインの両方と高度に相同であることが立証された。ｈＭＲ遺伝 子は７７７残基のｈＧＲよりもはるかに太き（，９８４個のアミノ酸からなるタ ンパク質（推定分子量１０７ＫＤ）をコードする。この大きさの不一致は主とし てｈＧＲと相同でない大きいアミノ末端のためである。この領域のサイズおよび 配列の相当な不均一性はグルココルチコイド、エストロゲンおよびプロゲステロ ンのそれぞれの受容体間に存在する（実験の部Ｉ；文献９−１１を参照）。

アミノ酸相同は６８残基中９４％のアミノ酸が同一である中央のＤＮＡ領域から 始まる（第Ｎ−３図）、他のステロイドホルモン受容体に見られる配列保存の比 較的低い領域が、ＤＮＡ結合ドメインとカルボキシル末端ステロイド結合ドメイ ンとを隔てている。この領域は２つのドメイン間の分子ヒンジ（ｍｏｌｅｃｕｌ ａｒｈｉｎｇｅ）として役立つことが推測されたく実験の部■および文献１３を 参照）、ｈＧＲとの比較は、ｈＭＲのこの領域が反復ヌクレオチド配列によって コードされる４個のグルタミンそれに続く８個のプロリンの配列を含む２４個の 追加のアミノ酸を含むことを示す、起源および機能に関してこの例外的配列の意 義は明らかでないが、構造を切断するプロリンはヒンジ領域と一致する。

ｈＭＲとｈＧＲのカルボキシル末端の２５０個のアミノ酸を比較すると、５７％ のアミノ酸同一性および多数の保存的アミノ酸置換が見られる。これらの置換の いくつかはステロイドホルモンとの相互作用に必要な疎水領域を維持している。

、Ｅ、およびホルモン　ム 我々はグルココルチコイド受容体機能を調べるために、サル腎ａｍ胞株Ｃ■１お よびその誘導的（すなわち、５Ｖ４０Ｔ抗原−形質転換）細胞株ＣＯ５−１（Ｃ Ｏ３と呼ばれる）のトランスフェクションを使用したく実験の部■を参照）、ト ランスフェクションされたｈＭＲからの高レベルのポリペプチド発現は、トラン スフェクションした細胞によるステロイド結合実験を容易にするために不可決で あった。ＳＶ４０複製起点を含むプラスミドはｃｏｓｍ胞内で高コピー数に複製 することができるので、ｂＧＲの研究において以前に使用したｐＲ８ｈＧＲアル ファと類似したｈＭＲコード配列用の発現ベクターを構築した。プラスミドｐＲ Ｓ　ｈＭ　Ｒはラウス肉腫ウィルス由来の１０モーターの支配下にあるｈＭＲコ ード配列、およびＳＶ４０複製起点を含む（第Ｎ−４（Ａ）図）。

ｈＭＲタンパク質のリガンド特異性はｐＲＳ　ｈＭ　Ｒでトランスフェクション したＣＯ８細胞からの細胞質ゾル抽出物を調製することにより調べた。トランス フェクションの２日後に細胞を回収して、デキストラン処理チャーコール検定に よりホルモン結合を測定した。疑似トランスフェクションした対照の抽出物は〔 ３Ｈ〕アルドステロンに対して特異的結合活性を全く示さなかったが、ｐＲ９ｈ ＭＲでトランスフェクションした細胞からの抽出物は高親和性でもって有意量の 〔３Ｈ〕アルドステロンと結合した。スカツチャード分析により、（’Ｈ）アル ドステロン結合に関する解離定数（Ｋ、）は１．３ｎＭと測定されたく第Ｎ−４ （Ｂ）図）、この値はミネラロコルチコイド受容体へのアルドステロン結合につ いて報告されたものとよく一致している（２゜２０）、その後、１−．１０−ま たは１０〇−倍過剰モル量で存在させたときに、結合を５ｎＭ［：３Ｈ）アルド ステロンと競合する異なる未標識ステロイドの能力を調べるために、競合試験を 行った（第Ｎ−４（Ｃ）および（Ｄ）図）、これはｈＭＲに対するこれらのステ ロイドのそれぞれの相対親和性の度合を提供した。これらの実験の結果は、アル ドステロン、コルチコステロン、デオキシコルチコステロン、ヒドロコルチゾン （コルチゾル）の全てがｈＭＲに対して非常に類似した親和性をもつことを示し た。デキサメタシン、プロゲステロン、およびスピロノラクトンは比較的弱い結 合親和性を示し、一方エストラジオールはｈＭＲの結合に対して極めて弱く競合 した。結局、この親和性の差異はｈＭＲがヒトミネラロコルチコイド受容体をコ ードすることを表している（２．２０）。

１　Ｆ、計　パ ステロイドホルモン作用は標的遺伝子転写のホルモン依存性調節により特徴づけ られる。ＣＶＩ細胞内にトランスフェクションされたｈＧＲによる転写調節検定 （実験の部■を参照）がｈＭＲ用に改変されたく第■−５（Ａ＞、（Ｂ）および （Ｃ）図）。ステロイド結合検定に用いた発現プラスミドｐＲ３ｈＭＲは、タロ ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の細菌遺伝子に連結さ れたＭＭＴＶ−ＬＴＲを含むＧＭＣＡＴと呼ばれるリポータ−プラスミドと共に 同時トランスフェクションされた。こうして、ＣＡＴ活性はＭＭＴＶプロモータ ーの転写活性に関する酵素検定を与える。Ｍ　Ｍ　Ｔ　ＶプロモーターはＧＲと の相互作用を介してグルココルチコイド応答性を与える数種のグルココルチコイ ド応答因子（Ｇ　ＲＥ　）、エンハンサ一様ＤＮＡ配列を含む（２１）、ｈＭＲ は、そのＤＮＡ結合ドメインがｈＧＲのそれとほぼ同一であるために、Ｍ　Ｍ　 Ｔ　Ｖ　−Ｌ　Ｔ　Ｒを認識できるかも知れないと考えた。ＣＶＩ細胞をｐＲＳ ｈＭＲおよびＧＭＣＡＴで同時トランスフェクションしたとき、我々は十分なＣ ＡＴ活性を観察した。この活性は添加したアルドステロンの影響を受けず、この ことはトランスフェクションされたｈＧＲと対照的に、ｈＭＲを十分に活性化す るに足るホルモンが血清くウシ胎児血清、５％）中に存在していたことを示唆す る（第■−５（Ｂ）図）、チャーコール処理血清（２２）の存在下では、ＣＡＴ 活性は外因性アルドステロンの添加に応答するようになり、このことはｈＭＲｃ ＤＮＡが機能的ステロイドホルモン受容体をコードすることを示している。ｈＭ Ｒはまたグルココルチコイド・アゴニストのデキサメタシンによって活性化され たが、ｈＧＲは生理学的濃度以上（１０ｎＭ）のアルドステロンにさえも応答し な我々はノザン・プロット・ハイブリダイゼーションによりラット組織内でのｈ ＭＲｅＤＮＡに相応するＭＲｍＲＮＡの発現を調べた。脳、下垂体および心臓ば かりでなく、腎１ｉＵ（２４）や腸（２５）のような古典的ミネラロコルチコイ ド標的組織はｈＭＲに相応するｍＲＮＡを含んでいた（第■−６図）、腎臓にお けるアルドステロン恐受性細胞は主として遠位の皮質性集合管に局限されており （２）、それ故にこの組織によるわずかな発現レベルは意外なことではなかった 。高レベルのＭ　Ｒ（Ｉ型コルチコステロイド結合部位）はラットの脳、特に海 馬体（ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌｆｏｒ　ｎａｔｉｏｎ）において報告された（４ ．６）、切開した海馬ＲＮＡと全脳から調製したＲＮＡとを比較した際に、我々 は海馬中に著しく豊富な鋤ＲＮＡを見出した。アルドステロン結合は下垂体（２ ６）、培養大動脈細胞（２７）およびｌｆｆ１ｉ（２８）において報告されてい るが、この種の活性は筋肉では報告されていない、肝臓はＧＲと発現するが、検 出しうる高親和性のアルドステロン結合活性を示さず（２９）、予期されるよう に肝ｌｌ１ＩＲＮＡとのハイブリッド形成は観察されなかった。　ｈＧ　ＲｃＤ 　Ｎ　Ａの類似部分を用いる同じノザン・プロットの再検索は異なる大きさの鋤 ＲＮＡ種とのハイブリッド形成を示し、ＭＲとＧＲとが異なる組織特異的発現パ ターンを示すことが分かった。

ｒｖ、　Ｈ，：九　マッピング ミネラロコルチコイド受容体遺伝子の染色体位置を決定するために、我々はヒト 染色体の異なる組合わせな保有するネズミーヒト体細胞ハイブリッドのパネルに 対してｈＭＲを調べた（３０）　、ミネラロコルチコイド受容体遺伝子に特異的 なりＮＡフラグメントは、１５種のハイブリッド細胞株においてヒト染色体４と 一致して分離された。染色体５（グルココルチコイド受容体遺伝子部位）を含む 他のすべてのヒト染色体については、不一致の分Ｆｌ！　（ｓｅｇｒｅｇａｔｉ ｏｎ）が観察された（実験の部Ｉおよび文献３１を参照）、染色体４への割当て を確認するために、我々はサザン分析を用いてｈＭＲ遺伝子について限定組の微 小核ハイブリッド（それぞれは１〜３本のヒト染色体を保有する（３２））を試 験した（第■−７図）、ラムダｈＫ２のコード部分により検出された６本のＥｅ ｏＲＩフラグメントは、このハイブリッドパネルにおいて染色体４と同時分離さ れる。とりわけ、ｈＭＲ遺伝子は唯一のヒト染色体として染色体４を保有する細 胞株ＨＤｍ−１１３２Ｂ中に存在する。

、■、！　コル　コスーロイドの　理　との・　ｔヒトミネラロコルチコイド受 容体ｃＤＮＡはヒトグルココルチコイド受容体に高度に相同であるポリペプチド をコードする。

ＤＮＡ結合ドメインにおいて、ｈＭＲはｈＧＲと約９４％のアミノ酸同一性を維 持するが、カルボキシル末端に局在化されるステロイド結合ドメインは５７％の 同一性を有する。最近報告されたウサギプロゲステロン受容体（ｒＰＲ）配列も またｈＭＲとの高度な関連性をもっている。ｈＧＲおよびｒＰＲｔｌ造ドメイノ ドメインのそれとのアミノ酸同一性の比較（第ｆｆ−８図）は、これらの機能的 に異なる調節タンパク質の驚くべき類似性を示す。

ｈＭＲとｒＰＲとの相同性はｈＧ　Ｒ−ｈＭ　Ｒ比較にほとんど一致し、ＤＮＡ 結合ドメインでは９０％のアミノ酸を共有し、そしてステロイド結合ドメインで は５６％を共有していた。対照的に、ｈＭＲとヒトエストロゲン受容体（１０） との同一領域の比較は、ＤＮＡ結合ドメインにおいて５６％の同一性およびステ ロイド結合ドメインカルボキシル末端において２１％の配列同一性を示す。

ｈＭ　Ｒ、ｈＧ　ＲおよびｒＰＲによって共有される構造的関連性およびそれら のリガンドの構造的関連性は、それらがステロイドホルモン受容体のサブファミ リーから成ることを示唆している。

一時的トランスフェクションによるｃｏＳｍ胞内でのｈＭＲポリペプチドの発現 は、そのステロイド結合能の評価を可能にした。これらの分析結果は、ｈＭＲｅ ＤＮＡがヒトミネラロコルチコイド受容体をコードしていることを明らかにした 。スカツチャード分析は、ｐＲＳｈＭＲでトランスフェクションした細胞からの 抽出物が１．３ｎＭのＫＤ値でもって（’Ｈ）アルドステロンと結合することを 示した。ＭＲと結合するアルドステロンの報告されたＫＤ値は０．５〜３ｎＭの 範囲である（２）、これはこの遺伝子産物をヒトグルココルチコイド受容体とし て定める際のただ１つの最も重要な基準である。ステロイド結合競合実験は、ｈ ＭＲのこの同定をさらに支持した。ミネラロコルチコイドのデオキシコルチコス テロンおよびグルココルチコイドのコルチコステロイドよびコルチゾルはアルド ステロンそれ自体と同様に競合するが、一方合成グルココルチコイドのデキサメ タシンおよびプロゲステロンはｈＭＲに対して比較的低い親和性を有する。ｈＭ Ｒ，ｈＧＲおよびｒＰＲの推定上のステロイド結合ドメインにおける十分なアミ ノ酸配列同一性は、これらの受容体の類似リガンド結合特性とよく合っている。

ミネラロコルチコイド受容体、グルココルチコイド受容体およびプロゲステロン 受容体はミネラロコルチコイド、グルココルチコイドおよびプロゲスチンの類似 した２１−炭素原子構造間な識別するのに限られた能力を示す、この特異性の欠 如は特にＭＲとＧＲに当てはまる０例えば、ＭＲはアルドステロンと等しい親和 性でもってグルココルチコイドと結合する。実際に、別の８！福がアルドステロ ンへの選択的応答を与える腎臓のような組織においてのみ、ＭＲは古典的ミネラ ロコルチコイド受容体として機能するのかも知れない（３，５）、ＭＲはまたプ ロゲステロンと高い親和性で、しかしコルチコステロイドに対するその親和性よ りも低い親和性でもって結合する。１０ゲステロンはミネラロコルチコイド作用 の部分アゴニストまたはアンタゴニストとして作用するいくつかの徴候があり（ ３３）、またグルココルチコイドはミネラロコルチコイド受容体への結合におい て十分なアゴニストとして作用するかどうか明らかでない、同様に、ＧＲは２０ 〜４０ｎ　ＭのＫｄ値でグルココルチコイドと結合し、それは２５〜６５ｎＭの Ｋｄ値でアルドステロンと結合する（２）、従って、ＭＲとＧＲのホルモン結合 特性間の重要な差異はリガンド特異性のそれではなく、むしろコルチコステロイ ドに対する高親和性対低親和性受容体の差異である。

ｈＭＲのｉｎ　ｖｉｖｏｉ能は血清コルチゾン結きタンパク質のトランスコルチ ンによって複雑になっている。このタンパク質はコルチゾルを結合封鎖し、その 特異な分布のために、トランスコルチンは局部のグルココルチコイド濃度に影響 を及ぼすであろう、腎臓における高レベルのトランスコルチンは血漿からの利用 可能なコルチゾルを減少させて、アルドステロン感受性を与え、−左脳における 低レベルのトランスコルチンは、中枢神経系において、グルココルチコイドが主 なｈＭＲリガンドでありうることを示唆するであろう。従って、ｈＭＲのための 好適な生理学的リガンドは受容体発現の部位に応じて明らかに変化する（３）。

このモデルおよび他のモデル（５）は、より一層高いレベルの競合性グルココル チコイドにもかかわらず、アルドステロンへの若干の組織の応答性な説明するた めに提案されたものである。

ｈＭＲとｈＧＲのＤＮＡ結合ドメイン間の相同度（この保存された６８残基領域 中で４個のアミノ酸残基のみが相違する）は、これらの受容体が類似の調節因子 を認識しうろことを示唆する。

アルドステロンおよびデキサメタシンの両方に応答してトランスフェクションさ れたｈＭＲがＭ　Ｍ　Ｔ　Ｖ　−Ｌ　Ｔ　Ｒを活性化することはこの結論を支持 するが、プロゲステロン受容体もまたこのプロモーターを調節することが立証さ れている（２１）、さらに、ＤＮＡ結合ドメインにおけるｈＭＲとｈＧＲの差異 、またはこれらの分子の高度に異なるアミノ末端のような他の領域における差異 が、この検定では立証できないやり方で標的遺伝子特異性に影響を及ぼすのかも 知れない、しかしながら、我々はｈＭＲおよびｈＧＲによるＭＭＴＶ−ＬＴＲの 転写調節を利用して、ミネラロコルチコイドおよびグルココルチコイドによるそ れらの活性化を調べた。ｈＭＲ応答は１０ｎＭアルドステロンまたはデキサメタ シンの場合にほぼ等しかった。一方ｈＧＲはこの検定においてデキサメタシンに よって活性化されたが、アルドステロンには不感受性であった。外因性コルチゾ ルに応答するｈＭＲによる転写活性化も観察された。これらのデータは、トラン スフェクションした細胞において、ミネラロコルチコイドとグルココルチコイド の両方がｈＭＲ媒介遺伝子転写を活性化しうろことを示している。この機能的特 性に基づいて、我々はｈＭＲが副腎コルチコステロイドに対して高度に応答し、 それ故にグルココルチコイド受容体として機能しうると結論を下した。

コルチコステロイドに協調応答するミネラロコルチコイド受容体の薬理学的およ び生理学的機能を明らかにするほかに、ｈＭＲｃＤＮＡの分離は多数の病気、な かでも高血圧および偽低アルドステロン症（ｐｓｅｕｄｏ　ｂｙｐｏ　ａｌｄｏ ｓｔｅｒｏｎｉｓ−；Ｐ　ＨＡ　）におけるｈＭＲの役割の証明をうながす、ミ ネラロコルチコイドと高血圧の関連性は数十年の間認められており、ｈＭＲ媒介 ナトリウム貯留および血液量の増加がいくつかの形態の高血圧症に部分的に関与 しているのかも知れない（３４）、ＰＨＡは正常レベルまたは高レベルのアルド ステロンへの応答性の欠如によって特徴づけられる常染色体劣性疾患であるｌ近 の研究により、この疾患をもつ患者では高親和性アルドステロン結合部位が減少 しているか又は完全に消失していることが証明され（３５）、このごとはミネラ ロコルチコイド受容体遺伝子の欠陥により生ずると思われる。ｈＭＲ遺伝子の染 色体マツピングはＰＨＡの遺伝子座が染色体４に存在することを示唆する。

機能的ｈＭＲのクローニングおよび発現は予期しない考察をもたらし、生理学的 複雑性の下に横たわる機構への新たな興味を刺激し、そして遺伝子ネットワーク の協調調節のための新しいモデルの開発および試験を可能にするであろう。

ｌＶ、Ｊ、験の部■に　達した図面の詳細ｔ・日ＩＶ−１（Ａ　（Ｂ）　（Ｃお よび（Ｄ　＞ＧｈＧＲ遺伝子に関連したゲノム配列の分離、（Ａ）表示した制限 エンドヌクレアーゼで消化したヒト胎ｆｉＤＮＡの高ストリンジェントハイブリ ダイゼーション、ｈＧＲｅＤＮＡ（ｈＧＲｌ、２）をプローブとして使用した。

　Ｈｉｎｄｌｌ消化により作ったラムダＤＮＡフラグメントマーカーの大きさく キロ塩基対で表す）をオートラジオグラムの隣に示す、（Ｂ）低ストリンジエン トサザン分析、　Ｈｉｎｄｌｌレーンに星印ではさまれた２、５ｋｂ、バンドは 直接ゲノムクローニングの的にされた配列であった。（Ｃ）ラムダＨＧＨと命名 されたクローン中のこのゲノム配列の分離は、類似のサザンプロットでプローブ として使用することにより証明される。ラムダＨＧＨゲノムフラグメントは、こ のクローニングから分離されたハイブリッド形成性内部ＥｃｏＲＩフラグメント を含む、（Ｄ）ラムダＨＧＨゲノムフラグメントのイントロン−エクソン構造お よびｈＧＲとのその相同性、ラムダＨＧＨに存在するｈＧＲ関連エクソンは、そ の推定アミノ酸配列と共に黒地に白で示される。保存されたシスティン残基は白 い点て示される、アンダーラインを施した共通のスプライス供与部位および受容 部位を有するイントロン配列部分がエクソンの両側に存在することが分かる。ｈ ＧＲとのヌクレオド相同性を下側に示す、ｈＧＲのヌクレオド番号は実験の部Ｉ で論じた第１−２（１）およびｌ−２（２＞図からのものであり、また実験の部 ■としてここで使用した研究を発表したＨｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９８５）（ 文献８）を参照されたい。サザン分析のために、我々は妊娠期間終結後のヒト胎 盤由来のＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化し、消化産物を０．８％アガロ ースゲル上で分離した。ＤＮＡをニトロセルロース紙へ移行させ、ストリンジェ ントまたは非ストリンジェント条件下でハイブリダイズさせた。ストリンジェン トハイブリダイゼーションは５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＰＥ　（Ｎ　ａ　Ｃ ｌ　、　Ｎ　ａ　Ｈ２Ｐ　Ｏ、、Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　、　ｐＨ７、４）、１×デン ハート溶液、０．１％ｓｐｓ、ｉｏｏμｇ／ｘｉのサケ精子ＤＮＡおよびプロー ブ（１０’ｅｐｍ／　ｍｌ）を用いて４２℃で行った。非ストリンジェントハイ ブリダイゼーションの場合は、５０％ホルムアミドの代わりに３５％ホルムアミ ドを用いた。洗浄条件はストリンジェント条件の場合が６０℃で０．１％ＳＤＳ を含む０．ｌＸ５ＳＣ（標準ＮａＣ１−クエン酸塩）、そして非ストリンジェン トフィルターの場合が５５℃で０．１％ＳＤＳを含む２ＸＳＳＣから成っていた 。プローブとしてラムダＨＧＨ由来の３３８ｂｐ挿入物を用いたときの洗浄条件 は、６８℃で０．１％ＳＤＳを含む２ＸＳＳＣに変更した。ラムダＨＧＨの分離 のために、ヒト胎盤Ｄ　Ｎ　Ａ　（３００μｆＩ）はＨｉｎｄＩ［Ｉで消化し、 １％低融点アガロースゲル（Ｓｅａｐｌａｑｕｅ、ＦＭＣ）上で大きさにより分 画化した。ゲルを０．５ｃｉの細片に切り取り、フェノール抽出およびエタノー ル沈澱によりＤＮＡを精製した。

（Ｂ）において星印ではさまれたバンドに大きさの点で対応する分画からのＤＮ Ａ（２μｇ）は、ＥｅｏＲＩリンカ−を付加するためにフレノウＤＮＡポリメラ ーゼで修復した。ＥｅｏＲＴでの消化およびセファロース４Ｂカラムによる過剰 リンカ−の除去後に、このＤＮＡをＥｃｏＲＩ消化ラムダｇうｌＯＤ　Ｎ　Ａに 連結し、１ｎｖｉｔｒｏでパッケージした（カリフォルニア州すンジエゴ、ベク ター・クローニング・システムズ社からのラムダアームおよび抽出物）。約４Ｘ １０’個の独立した組換え体と非ストリンジェントサザン分析のために使用した 条件と同じ条件下でスクリーニングしてラムダＨＧ　Ｈを得た。

第Ｎ　−２（Ａおよび（Ｂ・ ヒトミネラロコルチコイド受容体のヌクレオド配列および一部アミノａ構造。（ Ａ）いくつかの制限エンドヌクレアーゼ切断部位の線図と整列したｂＭＲの複合 構造（ＥｃｏＲＩ部位はヌクレオド１および５８２３に示され、リンカ−から誘 導される）、この複合体は２つの重複するラムダｇｔｌＯクローンのラムダｈｋ ｌＯおよびラムダｈｋ２から組み立てられた。ラムダｈｋ２の線区におけるかっ こは３５１ｂｐの欠失を示す、斜線ボックスはイニシヱーターコドンと終結コド ンを含む推定されたコード配列を示す、（Ｂ）ｈＭＲの完全なヌクレオド配列お よびその推定上の一部アミノ酸配列、推定されたイニシエーターメチオニンの上 流にある読み枠内の５′終結コドンおよび４つの可能なポリアデニル化部位（Ａ ＡＴＡＡＡ）にはアンダーラインが施しである。ヒト腎臓ラムダｇｔｌＯライブ ラリー（１８）はラムダＨＧＨ由来の挿入物を用いて、このプローブによる高ス トリンジェント条件下でのサザン分析のために記載した条件と同じ条件でスクリ ーニングした。

それぞれのｃＤＮＡの重複欠失はサイクロン高速欠失サブクローニング法（イン ターナショナル・バイオテクノロジー）により得られた（３６）、欠失クローン はジデオキシ法（３７）によりその塩基配列を決定し、そしてギャップやアンビ ギュイテイ（ａ＋＊ｂｉｇｕｉｔｙ）を化学的切断法（３８）により解明した。

ＤＮＡ配列は編集してＤ　ｅｖｅｒｅｕｘら（３９）およびＳ　ｔａｄｅｎ　（ ４０）のプログラムにより分析した。

寒り二１１ ミネラロコルチコイド受容体とグルココルチコイド受容体のアミノ酸相同性、ｈ ＭＲの一部アミノ酸配列は、ギャップ（点で表示）を導入することにより最大の 相同性を得るように、ｈＧＲのアミノ酸配列と整列させた。数字はｈＭＲについ ては第Ｎ−２（Ｂ）−１およびＩＶ−２（Ｂ）−２図から、モしてｈＧＲについ ては第１−２（１）およびｌ−２（２＞図から引用した０表示した領域の上流に は有意な相同性が全く見られなかった。縦線は同一のアミノ酸残基を示す、矢印 はＤＮＡ結合ドメイン（ＤＮＡ）およびステロイド結合ドメイン（ＳＴＥＲＯＩ Ｄ）の推定上の境界を示す、ＤＮＡ結合ドメインのアミノ末端境界は最初の保存 システィン残基によって任意に定められたが、カルボキシル末端限界はＤＮＡ結 合および転写活性化に必要な配列を示す突然変異誘発実験に基づいて選択された （１５）、ＤＮＡ結合ドメインに続く数個の保存的塩基性残基もまたこれらの機 能にとって重要でありうる。アミノ酸相同領域により定められたステロイド結合 ドメインの境界もまた突然変異分析と一致する。アミノ酸残基の一文字略号はＡ 　、Ａｆａ；Ｃ、Ｃｙｓ；Ｄ　、Ａｓｐ；Ｅ　、Ｇｌｕ；Ｐ　。

Ｐｈｅ、Ｇ　、Ｇｌｙ；Ｈ、Ｈｉｓ；　Ｉ　、　Ｉ　ｌｅ；Ｋ　、　Ｌｙｓ；Ｌ 　、　Ｌｅｕ；Ｍ　、Ｍｅｔ；Ｎ　。

Ａｓｎ；Ｐ　、　Ｐ　ｒｏ；Ｑ　、Ｇｌ’ｎ；Ｒ、Ａｒｇ；　Ｓ　、　Ｓｅｒ； Ｔ　、Ｔｈｒ；Ｖ　、Ｖａｌ；Ｗ　。

Ｔｒｐ；およびＹ、Ｔｙｒである。

−４ＡＢＣおびＤ゛ 発現されたｈＭＲのステロイド結合特性、（Ａ）ｈＭＲ発現プラスミドｐＲＳｈ ＭＲの構造（４１）、　（Ｂ）ρＲ９ｈｌｌでトランスフェクションした細胞か ら調製された抽出物における〔３Ｈ〕アルドステロン結合のスカッチャード分析 、各点は２００μｅ中の抽出タンパク質１００μ２を０℃で２．５時間インキュ ベーションする３通りの実験により検定した。５００倍過剰の未標識アルドステ ロンを用いて測定した非特異的結合は全カウント数の約２０％であった。疑似ト ランスフェクションした細胞では特異的結合が全く見られなかった。（Ｃおよび Ｄ））ランスフェクションしたＣＯ８細胞の抽出物における５ｎＭ（’Ｈ）アル ドステロンと未標識ステロイドとの競合結合、これらの競合実験を代表する２つ の独立した実験の結果を示す、冷却競合剤は１−．１０−．１００−倍過剰モル 量で存在していた。１００％結合の値は、１０００倍過剰の未標識アルドステロ ンの存在下で結合したｅｐ−数を、競合剤の不在下で結合したカウント数から減 算することにより決定した。略号：ＡＬＤＯ，アルドステロン；ＤＯＣ，デオキ シコルチコステロン、Ｄ　Ｅ　Ｘ　、デサメタゾン；５ＰＩＲＱ、スピロノラク トン、Ｅ２１，１７β−エストラジオール；Ｃ３，コルチコステロン：ＨＣ，ヒ ドロコルチゾン；およびＰＲＯＧ、プロゲステロン、亜Ｓ密約生長（ｓｕｂｅｏ ｎｆｌｕｅｎｔ）　ＣＯＳ細胞はＤＥＡＥ−デキストラン法（４２）により培養 皿当たり１０μ２のｐＲｓｈＭＲｐ用いてトランスフェクションした。細胞は５ ％チャーコール処理ウつ胎児血清を含むＤＭＥＭ（イグール最少培地のダルベツ コ修飾）中に２日間維持し、その後４０ｍＭ）リス−ＨＣ／（ｐＨ７，８）、１ ０信ＭＮａＣ１，１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭ　Ｎ１１２Ｍ００−１５ｍＭ　ジチ オトレイトール、アンチパイン（５μｇ／ｘｌ）、ロイペプチン（５μ２／１１ ）および５００μＭ弗化フェニルメチルスルホニル中に収集した。　１５０００ Ｘｙで１０分遠心した後、抽出物は結合に先立って１００、曽ＭＮａＣ１および ５％グリセロールへ調整した。［：’Ｈ）アルドステロン（比活性７８Ｃｉ／ｍ ｍｏｆ、アマージャム社製）との標識反応は全容量２００μｌ中Ｏ℃で２．５時 間インキュベーションし、その後２０μｐの５０％デキストラン被覆チャーコー ル（活性チャーコールコブキストラン１０：　１　）と共に１０分間インキュベ ーションした。１５０００Ｘ４．４℃で２分遠心した後、上清中の三重水素を液 体シンチレーション分光光度計により定量化しな。

づＡ　Ｂお　Ｃパ トランスフェクションしたＣＶＩ細胞内でのｈＭＲおよびｈＧＲ発現プラスミド によるＭＭＴＶ−ＬＴＲの転写活性化。

（Ａ）ＧＭＣＡＴの構造、このプラスミドはホルモン依存性転写活性化のための リポータ−遺伝子としてステロイド受容体と同時トランスフェクションされた（ 実験の部■を参照）、（Ｂ）正常血清の存在下でのｈＭＲまたはｈＧＲ）ランス フエクション後に見られた示差的ＣＡＴ酵素活性、トランスフェクションした細 胞は５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中に維持した。血清はその後の実験におい て遊離ステロイドを排除するためにチャーコールで処理した。その結果外因性ス テロイドの効果が測定できるであろう、（Ｃ）ｈＭＲまたはｈＧＲでトランスフ ェクションした細胞におけるアルドステロンまたはデキサメタシンによるＣＡＴ 活性の示差的誘導、ｃｖｘａ胞は１０μ２のｐＲ３Ｖｇａｌ（対照）、ｐＲＳ　 ｈＭ　Ｒまたはｐ　ＲＳ　ｈ　Ｇ　Ｒアルファのいずれかおよび１０μｇのリポ ータ−ＧＭＣＡＴで同時トランスフェクションし、そして１０ｎＭアルドステロ ン（Ａ）または１０ｎＭデキサメタシン（Ｄ）の存在下または不在下（−）で培 簑した。ＡＣ，３−アセチルクロラムフェニコール；Ｃ，クロラムフェニコール 。リン酸カルシウム共沈によるトランスフェクション（４３）の２日後、抽出物 をＣＡＴ検定のために調製した（４４）、検定は５０μｇのタンパク質抽出物を 用いて６時間インキュベーションした。

１Ｌ二ｉ区 ラット組織中のミネラロコルチコイド受容体ｖａ　ＲＮ　Ａのノザン分析、ラム ダｈｋｌｏからの１２７０　ｂｐ　ＥｃｏＲＩフラグメント（１７７０−３０４ ０）を、ラットでの相同−ＲＮＡ発現のためのプローブとして使用した。すべて のレーンにおいて、１０μｇのポリ（Ａ）中輪ＲＮＡを用いた。リポソームＲＮ Ａ（２８Ｓおよび１８Ｓ）の泳動をサイズマーカーとして示す、ストリンジェン ト条件下でのハイブリダイゼーション後に、フィルターは０．１％ＳＤＳを含む ２ｘｓｓｃで３０分ずつ２回、６８℃で洗浄した。

λＬ二ＺＪｉ 微小核ハイブリッドのサザン分析によるｈＭＲ遺伝子の染色体局在化、これらの ハイブリッドの構築および特性決定は以前に開示されている（３２）　、それぞ れのヒト染色体含有物は次の通りである：ＨＤｅ＋−４Ａ（染色体２０）、ＨＤ ｍ−５（染色体１４および非特定化Ｅグループ染色体）、ＨＤ簡−９（染色体２ ０．１４およびｚｉ）、ＨＤｍ−１５（染色体２１．１１および４）、ＨＤｍ− ２０（染色体７および１４）、およびＨＤａ−１１３２Ｂ　（染色体４のみ）、 ヒト（ＨｅＬａ）およびマウス（３Ｔ＃）対照ＤＮＡ試料も示す、微小核体由来 のゲノムＤ　Ｎ　Ａ　（１０，ｃｚ　ｇ＞はＥｃｏＲＩで消化し、１．０％アガ ロースゲルで電気泳動にかけ、ナイロン膜（Ｎｙｔｒａｎ、５ｅｈｌｅｉｃｈｅ ｒ　＆５ｅｈｕｅｌ１社）に移行させ、そして高ストリンジェント条件下でｂＭ ＲｃＤＮＡプローブを用いてハイブリダイズさせたく第■−１（Ａ））、放射性 プローブは２つのランダムにプライムした（４５）ｈＭＲｃＤＮＡＭ型（ラムダ ｈｋ２の１０００−および８００−　ｂｐ　Ｅ　ｃ。

ＲＩフラグメント）から大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片により合成し た。　Ｈｉｎｄｌ［Ｉ消化ラムダＤＮＡのサイズをオートラジオグラムに近接し て示す。

ｌＬ二比区 ｈＧ　Ｒ、ｈＭ　ＲおよびｒＰＲ構造の模式図によるアミノ酸比較。

−次アミノ酸配列を模式図的に整列させ、点線の間のそれぞれの相同領域につい てアミノ酸同一性のパーセンテージを示す。

各ドメイン境界のアミノ酸位置をそれぞれの受容体について示す、ＮおよびＣは アミノ末端およびカルボキシル末端を表す。

Ｃｙｓは推定上のＤＮＡ結合ドメインをコードするシスティンに富む領域に相当 し、一方Ｓ　ｔｅｒｏｉｄ（コルチゾル、アルドステロンまたはプロゲステロン ）はステロイド結合ドメインを表す。

ｈＧＲの免疫原領域（ＩＭＭ）も示す、アミノ酸残基番号はｈＧＲについては実 験の部Ｉから、ｒＰＲについてはＬｏｏｓｆｅｌｔら（１１）から、そしてｈＭ Ｒについては我々のデータから引用する。

ｆｆ、　Ｋ、　の部■で　した １　、　Ｂａｘｔｅｒ、Ｊ　、Ｄ　、、ａｎｄ　Ｔｙｒｒｅｌｌ、Ｊ　、Ｂ　、 、ｉｎ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ。

ａｎｄ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｆ　ｅｌｉｇ、Ｐ　、、Ｂ　ａｘｔｅｒ、Ｊ　 、Ｄ　、、Ｂ　ｒｏａｄｕｓ。

Ａ　、Ｅ　、　、ａｎｄ　Ｆ　ｒｏｈｖａｎ、　Ｌ　、　Ｓ　、、　Ｅ　ｄｓ、 　、ｐｐ、３８５−５１０．Ｍ　ｅＧ　ｒａｗ−）ｌｉｌｌ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ 　（１９８１）；Ｍａｒｖｅｒ、Ｄ、、ｉｎ　ＢｉｏｅｈｅｍｉｃａｌＡｃｔｉ ｏｎｓ　ｏｆ　Ｈｏｒｍｏｎｅｓ、Ｌｉｔｗａｃｋ、Ｇ、、Ｅｄ、、ｖｏｌ、１ ２．　ｐｐ。

３８５−４３１．Ａｃａｄｅ＋ｍｉｅ　Ｐｒｅｓｓ、０ｒｌａｎｄｏ　Ｆ　Ｌ　 （１９８５）。

２、　Ｆａｎｅｓｔｉｌ、Ｄ、Ｄ、、ａｎｄ　Ｐａｒｋ、Ｃ，Ｓ、。

Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、Ｐｈ　５ｉｏ１．．４３：６３７　（１９８１）。

３、Ｆ　ｕｎｄｅｒ、　Ｊ　、Ｗ　、　、　ｉｎ　Ａｄｒｅｎａｌ　Ｃｏｒｔｅ ｘ、Ａ　ｎｄｅｒｓｏｎ、　Ｄ　、Ｃ、。

ａｎｄ　Ｗ　１ｎｔｅｒ、Ｊ　、Ｓ　、Ｄ　、、Ｅｄｓ、、ｐｐ、８６−９５． Ｂ　ｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ。

Ｌｏｎｄｏｎ　（１９８５）。

４、Ｂｅａｕｍｏｎｔ、に、、ａｎｄ　Ｆｉｎｅｓｔｉｌ、Ｄ、Ｄ、、Ｅｎｄｏ ｃｒｉｎｏｌｏ　。

１１３：２０４３　（１９８３；Ｋ　ｒｏｚｏｗｓｋｉ、　Ｚ　、　Ｓ　、、ａ ｎｄ　Ｆ　ｕｎｄｅｒ、　Ｊ　、Ｗ、　。

几ユニＮ廊上Ｊヱ組、Ｓｃｉ、工膳亀Ａ、８０：６０５６　（１９８３）。

５、　Ｆｕｎｄｅｒ、Ｊ　、Ｗ、、ａｎｄ　５ｈｅｐｐａｒｃ（、に、、Ａｎｎ ｕ、ｒｅｖ、Ｐｈ　５ｉｏｌ。

４９：３９７　（１９８７）。

６　、　Ｒｅｕｉ、　Ｊ　Ｊｌ　、Ｈ、Ｍ　、、ａｎｄ　ｄｅＫ　１ｏｅｔ、Ｅ 　、Ｒ、。

Ｅ　ｎｄｏｅｒｉｎｏｌｏ　、１１７：２５０５　（１９８５）　。

７　、　ＭｅＥｗｅｎ、　Ｂ　、Ｓ　、、ｄｅＫ　１ｏｅｔ、Ｅ　、Ｒ、、ａｎ ｄ　Ｒｏｓｔｅｒｎｅ、Ｗ、。

２社１星ニジ□、、６６：１１２１　（１９８６）。

８、　Ｈｏｌｔｅｎｂｅｒｇ、Ｓ、Ｍ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、３１８ ：６３５　（４９８５）。

９　、　Ｍｉｅｓｆｅｌｄ、Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅｌ±、４６：３８９　（ １９８６）。

１０、Ｇｒｅｅｎ、Ｓ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、３２０：１３４　（１ ９８６）。

Ｇｒｅｅｎｅ、Ｇ、Ｌ、、ｅＬ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２３１：１１５０　 （１９８６）。

１１、Ｌｏｏｓｆｅｌｔ、Ｈ，、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ。

８３：９０４５　（１９８６）。

１２、Ｇ　ｉｇｕｅｒｅ、Ｖ　、　、　Ｈｏｌ　ｌｅｎｂｅｒｇ、　Ｓ　Ｊｉ　 、、　Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ、Ｍ　、Ｇ　、。

ａｎｄ　Ｅｖｌｌｎｓ、Ｒ，Ｍ、、Ｃｅｌ↓、４６：６４５　（１９８６）。

１３、Ｋｕｍａｒ、Ｖ、、Ｇｒｅｅｎ、Ｓ、、５ｔａｕｂ、Ａ、、ａｎｄ　Ｃｈ ａｍｂｏｎ、Ｐ、。

ＥＭＢＯＪ、、５：２２３１　（１９８６）；Ｇｒｅｅｎ、Ｓ、、ａｎｄ　Ｃｈ ａｍｂｏｎ。

Ｐ　、、Ｎａｔｕｒｅ、２３５ニア５　（１９８７）。

１４、Ｇｏｄｏｗｓｋｉ　、Ｐ　、Ｊ　、、Ｒｕ５ｅｏｎｉ　、Ｓ　、、Ｍ　１ ｅｓｆｅｌｄ、Ｒ、、ａｎｄＹａ＠ａ＠ｏｔｏ、に、Ｒ，、Ｎａｔｕｒｅ、３２ ５：３６５　（１９８７）。

１５、Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、　Ｓ　Ｊ（、、Ｇ　ｉｇｕｅｒｅ、Ｖ　、、　Ｓ 　ｅｇｕｉ、　Ｐ　、　、ａｎｄＥｖａｎｓ、Ｒ，Ｍ、、Ｃｅｌ↓、４９：３９ 　（１９８７）。

１６、Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ、　Ｃ、、Ｈｏｆ　ｌｅｎｂｅｒｇ、　Ｓ　、Ｍ　 、　、　Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ、　Ｍ　、Ｇ　、　。

ａｎｄ　Ｅｖａｎｓ、Ｒ，Ｍ、、Ｎａｔｕｒｅ、３１８：６７０　（１９８５） ；Ｋｒｕｓｔ、Ａ、。

ｅｔ　ａｌ、、ＥＭＢＯＪ　、、５：８９１　（１９８６）；Ｓａｐ、Ｊ　、、 ｅｔ　ａｌ、。

Ｎａｔｕｒｅ、３２４：６３５（１９８６）　；Ｗｅ＋ｎｂｅｒｇｅｒ、　Ｃ、 、Ｈｏｌ　ｌｅｎｂｅｒｇ、　Ｓ　、Ｍ　、　、　Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ、　Ｍ　 、Ｇ　、　。

ａｎｄ　Ｅ　ｖａｎｓ、　Ｒ、Ｍ　、　、　Ｎ　ａｔｕｒｅ、３１８：６４１（ １９８５）　−１７、Ｆｉ４ｉ１１ｅｒ、Ｊ−、ＭｃＬａｃｈｌａｎ、Ａ、Ｄ、 、ａｎｄ　Ｋ！ｕｇ、Ａ、。

ＥＭＢＯＪ、、４：１６０９　（１９８５）。

１８、その他のｃＤＮＡクローンの欠失はこれらのライブラリーに報告されてい る（Ｇ、Ｉ　、Ｂｅ１ｌ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、 、１４：８４２７　（１９８６））　。

１９、　Ｋｏｚａｋ、Ｍ、、Ｎａｔｕｒｅ、３０８：２４１　（１９８４）。

２０、　Ａ　ｒｍａｎｉｎｉ　、　Ｄ　、、　Ｓ　ｔｒａｓｓｅｒ、Ｔ　、　、 ａｎｄ　Ｗｅｂｅｒ、　Ｐ　、Ｃ、。

Ａｍ、Ｊ　、Ｐｈ　５ｉｏ１．．２４８：Ｅ３Ｓ８　（１９８５）。

２１、Ｒｉｎｇｏｌｄ、　Ｇ　、Ｍ　、　、Ｙａ＋＋＋ａｍｏｔｏ、　Ｋ　、Ｒ 、、Ｂ　１ｓｈｏｐ、　Ｊ　、Ｍ　、、ａｎｄＶａｒｍｕｓ、Ｈ、Ｅ　、、Ｐｒ ｏｅ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ　Ｓ　Ａ　。

７４：２８７９　（１９７７）；Ｐａｙｖａｒ、Ｆ　、、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ １，３５：３８１（１９８３）；Ｓ　ｃｈｉｅｄｅｒｅｉｔ、　Ｃ、、Ｇｅ１ｓ ｓｅ、　Ｓ　、　、　Ｗｅｓｔｐｈａｌ　、　Ｈ、Ｍ　、　、ａｎｄＢ　ｅａｔ ｏ、　Ｍ　、　、　Ｎ　ａｔｕｒｅ、３０４ニア４９　（１９８３）　。

２２、内因性ステロイドの除去のために、洗浄チャーコールを血清に加え（１０ ０ｚｆ当たり２９〈乾燥重量））　、３７℃で４０分間、次に５５℃で３０分間 インキュベーションした。チャーコールは０．４５ミクロンその後０．２ミクロ ンのフィルターを通してＰ遇することにより除いた。

２３、ヒト細胞株は高親和性アルドステロン結合部位を発現すると報告されてい ない。ヒト卵巣ＲＮＡのノザンプロット分析により、大きさが約６ｋｂおよび４ ｋｂの２つのハイブリッド形成ＲＮＡ種が明らかになにっな、卵巣でのアルドス テロン結合活性は報告されていない。

２４、　Ｆｕｌｌｅｒ、Ｐ、Ｊ、、ｔｎｄ　Ｆｕｎｄｅｒ、Ｊ、Ｗ、、Ｋｉｄｎ ｅ　Ｉｎｋ、。

１０：１５４　（１９７６）　；Ｍａｔｕｌｉｃｈ、　Ｄ　、Ｔ　、　、　Ｓ　 ｐｉｎｄｌｅｒ、　Ｂ　、　Ｊ　、　。

Ｓ　ｃｈａ＋ａｂｅｌａｎ　、Ｍ　、、ａｎｄ　Ｂ　ａｘｔｅｒ、Ｊ、Ｄ　、、 Ｊ、ＣＩ　ｉｎ　、Ｅ　ｎｄｏｅｒｉｎｏｌ　。

Ｍｅｔａｂ、、４３：１１７０　（１９７６）。

２５、Ｐｒｅｓｓｌｅｙ、Ｌ　、ａｎｄ　Ｆｕｎｄｅｒ、Ｊ、Ｗ、、Ｅｎｄｏｅ ｒｉｎｏｌｏ　。

９７：５８８　（１９７５）。

２６、　Ｌａｎ、Ｎ、Ｃ，、Ｍａｔｕｌｉｅｈ、Ｄ、Ｔ、、Ｍｏｒｒｉｓ、Ｊ、 Ａ、、ａｎｄＢａｘｔｅｒ、　Ｊ　、Ｄ　、、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１ ０９：１９６３　（１９８１）。

２６、Ｋｒｏｚｏｗｓｋｉ、Ｚ、、ａｎｄ　Ｆｕｎｄｅｒ、Ｊ　、Ｗ、、Ｅｎｄ ｏｃｒｉｎｏｌｏ　。

１０９：１２２１　（１９８１）。

２７、Ｍｅｙｅｒ、Ｗ、Ｊ、、ａｎｄ　Ｎ１ｃｈｏｌｓ、Ｎ、Ｒ，、Ｊ、５ｔｅ ｒｏｉｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、。

１４：１１５７　（１９８１）；Ｉ型費容体は心臓において初期の研究では検出 されなかった（　Ｆ　ｕｎｄｅｒ、　Ｊ　、Ｗ、、Ｄｕｖａｌ、Ｄ　、、ａｎｄ Ｍｅｙｅｒ、Ｐ、、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ　、９３：１３００　（１９７３） ）　。

２８、Ｓｗａｎｅｃｋ、Ｇ　、Ｅ　、、Ｈｉｇｈｌａｎｄ、Ｅ　、、ａｎｄ　Ｅ ｄｅｌｍａｎ、Ｊ　、Ｓ　、。

反、屁ｏｎ、６：２９７　（１９６９）。

２９、　Ｄｕｖａｌ、Ｄ、、ａｎｄ　Ｆｕｎｄｅｒ、Ｊ　、Ｗ、、Ｅｎｄｏｃｒ ｉｎｏｌｏ　。

９４：５７５　（１９７４）。

３０、　Ｄｒａｅｏｐｏｌｉ、Ｎ　、Ｃ、、ｅｔ　ａｌ、、Ａｍ、Ｊ　、Ｈｕｍ 、ＧｅｎｅＬ、。

３７：１９９　（１９８５）；Ｒｅｔｔｉｇ、Ｗ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ　、Ｅｘ 　、Ｍｅｄ、。

１８２：１６０３　（１９８５）、３１．　Ｇｅｈｒｉｎｇ、Ｕ、、Ｓｅｇｎｉ ｔｚ、Ｂ、。

Ｆｏｅｌｌｍｅｒ、Ｂ、、ａｎｄ　Ｆｒａｎｃｋｅ、Ｕ、、Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ 、Ａｅａｄ。

旦住ユ止ジＡ、８２：３７５１　（１９８５）。

３２、　Ｌｕｇｏ、Ｔ、Ｇ、、Ｈａｎｄｅｌｉｎ、Ｂ、Ｌ、、Ｋ１１ｌａｒｙ、 Ａ、Ｍ、。

Ｈｏｕｓ＋ｓａｎ、Ｄ　、Ｅ　、、ａｎｄ　Ｆ　ｏｕｒｎｉｅｒ、Ｋ　、、Ｍｏ １．Ｃｅｌｆ、Ｂ　ｉｏｌ　、。

ｉｎ　ｐｒｅｓｓ、　３３．　Ｗａｍｂａｅｈ、Ｇ、、ａｎｄ　Ｈｉｇｇｉｎｓ 、Ｊ　、Ｒ，。

旦岨虻吐阻肢江、１０２：１６８６　（１９７８）。

３４、　Ｖａｌｌｏｔｔｏｎ、Ｍ、Ｂ、、ａｎｄ　Ｆａｖｒｅ、Ｌ、、ｉｎ　Ａ ｄｒｅｎａｌ　Ｃｏｒｔｅｘ。

Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｄ　、Ｃ、、ａｎｄ　Ｗｉｎｔｅｒ、Ｊ　、Ｓ　、Ｄ　、、 Ｅｄｓ、、ｐｐ。

１６９−１８７．Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｌｏｎｄｏｎ　（１９８５）。

３５、　Ａｒｍａｎｉｎｉ、Ｄ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｎ　、Ｅｎ　１．Ｊ　、Ｍｅ ｄ、。

３１３：１１７８　（１９８５）。

Ｊ、Ｐ、、Ｐｌａｓｍｉｄ、１３：３１　（１９８５）。

３７、Ｓａｒ＋ｇｅｒ、Ｆ、、Ｎ１ｃｋｌｅｎ、Ｓ、、ａｎｄ　Ｃｏｕｌｓｏｎ 、Ａ、Ｒ，、Ｐｒｏｃ。

Ｎ　ａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓ　ｅｉ、Ｕ　Ｓ　Ａ　、７４：５４６３　（１９７ ７）　。

３８、Ｍａｘａ（Ａ、Ｍ、、ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ、Ｗ、、Ｍｅｌすｒｏｄｓ 　Ｅｎｚ　＋＊ｏ１．。

６５：４９９　（１９８０）。

３９、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ、、Ｈａｅｂｅｒｌｉ、Ｐ、、ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ ｉｅｓ、Ｏ，。

Ｎｕｅｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１２二３８７　（１９８４＞。

４０、　５ｔａｄｅｎ、Ｒ，、Ｎｕｃｌｅｉｅ　Ａｅｉｄｓ　Ｒｅｓ、、１０： ４７３１　（１９８２）；５ｔａｄｅｎ、Ｒ，、Ｎｕｃｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄｓ　 Ｒｅｓ、、１２：５２１　（１９８４）。

４１、ｐＲＳｈＭＲの構築、ラムダｈｋｌｏからの３．７５ｋｂ挿入物は、ｈＭ Ｒコード配列の５′末端に−ｐｔｓポリリンカーが隣接する方向で、ｐＧ　Ｅ　 Ｎ　４　（Ｐ　ｒｏｍｅｇａ社）のＥｃｏＲＩ部位へ連結した。このプラスミド （ｐｈｋｌＯ）をＨｉｎｄｕｌで消化してポリリンカ一部位から３５６２位のｈ ＭＲ部位に及ぶＨｉｎｄＤＩフラグメントを形成させ、このフラグメントを単離 し、ＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウ断片を用いて両末端を修復しな、プラスミ ドｐＲＳ　ＶＣＡ　Ｔ　（Ｃ、Ｍ、Ｇｏｒｅａａｎ、Ｇ、Ｔ　、Ｍｅｒｌｉｎｏ 。

Ｍ、Ｃ、Ｓ　ｉｌｌｉｎｇｈａｍ、　Ｉ　、Ｐａ５ｔａｎ、Ｂ　、Ｈ、Ｈｏｗａ ｒｄ、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ弓旦旦人、７９：６７７７　（１９８２））はＨｉｎ ｄＩ［ＩおよびＨｐａ）で消化し、そしてｐＢＲ３２２配列、ＲＳＶ−ＬＴＲお よびＳＶ４０ポリＡ部位を含むＨ１ｎｄｌｌ　−Ｈｐａ　Ｉフラグメントもまた 修復した。ｈＭＲフラグメントと９ＲＳＶＣＡＴ由来のフラグメントとの連結は 、正しい方向でＲＳＶプロモーターにより支配されるｈＭＲコード配列を含むベ クターをもたらした。第■−４（Ａ）図でかっこに入れた部位はこのクローニン グ段階で失われた。翻訳効率を改良するために、５′非翻訳領域中のいくつかの 上流の開始コドンおよび終結コドンが、このベクターをＡｃｃｌで消化してり１ ８ポリリンカーからｈＭＲ５’　−ＵＴ領域中の１８８位までの約ｚｏｏｂｐ配 列を除去することにより欠失された。最後に、Ｎｄｅ（リンカ−を付加したＳＶ ４０複製起点をＮｔＪｅ１部位（１２）に導入してｐＲ３ｈＭＲを形成させた。

４２、　Ｄｅａｎｓ、Ｒ，Ｊ、、Ｄｅｎｉｓ、に、Ａ、、Ｔａｙｌｏｒ、Ａ、、 ａｎｄ　Ｗａｌｌ。

Ｒ，、Ｐ阻虹Ｎ畦り戊組しジ吐ユ止斗戊、８１：２２９２　（１９８４）。

４３、　Ｗｉｇｌｅｒ、Ｍ、、ｅｔ　ｍｌ、、Ｃｅｌ↓、１６：７７７　（１９ ７９）。

４４、Ｇｏｒｍａｎ、Ｃ，Ｍ、、Ｍｏｆｆａｔ、Ｌ、Ｆ、、ａｎｄ　Ｈｏｗａｒ ｄ、Ｂ、Ｈ，。

Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂ　ｉｏｌ、、２：１０４４　（１９８２）。

４５、Ｆｅｉｎｂｅｒｇ、Ａ、Ｐ、、ａｎｄ　Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、Ｂ、、Ａ ｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、。

１３７：２６６　（１９８４）。

尺１α罷■ 新しいクラスのステロイドホルモン受容体の同定Ｖ、Ａ、＝星論− 生殖腺および副腎はエストロゲン、プロゲスチン、アンドロゲン、グルココルチ コイドおよびミネラロコルチコイドを含む５つの主なグループに類別される多種 類のステロイドを産生ずる。生殖腺ステロイドは生殖系の分化および成長をコン トロールし、性的特徴を誘導・維持し、そして生殖行動を調節する。

同様に、副腎ステロイドは代謝調節剤としての重要な役割のほかに分化にも影響 を与える。この広範囲の生理学的作用にもかかわらず、各ステロイドの効果は主 としてそれが結合する特定の同族受容体に基づいており、従ってステロイドホル モン作用はそれらの生理活性を媒介する受容体に従ってより正確に分類できるか も知れない、ヒトグルココルチコイド受容体（ｈＧＲ）ｅＤＮＡ（実験の部Ｉを 参照されたい、これは文献１として発表した）、すぐその後に実施されたエスト ロゲン２°３（ｈＥＲ）、プロゲステロン’（ｈＰＲ）およびミネラロコルチコ イド受容体（ｈＭＲ）をコードするｃＤＮＡ（実験の部■を参照、これは文献５ として発表）、ならびにいろいろな種ｉ−口からの相同体の上首尾のクローニン グ、塩基配列決定および発現は受容体の構造およびこれらの分子が遺伝子発現を 制御する分子１ｌｌｌｌＩＩを研究するための機会を提供する。これらのタンパ ク質の配列比較および突然変異分析は、すべてのクラスのステロイドホルモン受 容体に共通した構造的特徴を明らかにする（文献１２として発表した実験の部■ を参照；また文献１３および１４を参照）、とりわけ、受容体は高度に保存され たシスティンに富む領域（今や、ＤＮＡ−タウドメインと呼ばれる）を共有し、 その領域はグルココルチコイド受容体＋５１１１！のＤＮＡ結合機能およびトラ ンス活性化機能の両方に必要な情報をすべて含む、受容体間の共通セグメントの 存在は、関連遺伝子産物についてゲノムを走査する可能性を与える０例えば、ｈ ＭＲｃＤＮＡはハイブリダイゼーションプローブとしてｈＧＲを用いることによ り分離された（文献５として発表した実験の部■を参照）０分子生物学が健康お よびヒトの病気ならびにこれらの現象を支配する生理学の我々の理解を促し得る １つの方法は、新しいホルモン応答系の同定と通してである。この研究において 、ヒトエストロゲン受容体ｃＤＮＡの高度に保存されたＤＮＡ−タウ領域をハイ ブリダイゼーションプローブとして使用することにより、我々はステロイドホル モン受容体の構造的特徴をポリペプチドをコードする２つのｅＤＮＡクローンを 単離した。

Ｖ、Ｂ、”　ｈＥＲＲｌのｅＤＮＡクローン認定されていないホルモン応答系を 検索する１つの方法は、低下したストリンジェントハイブリダイゼーションを系 統的に利用して、新規なホルモン受容体について組換えＤＮＡライブラリーをス クリーニングすることである。エストロゲン受容体のＤＮＡ−タウセグメントが これらの研究を開始するために用いられた。ラムダｇｔｌＯヒト精巣ｃＤＮＡラ イブラリーの分析により、３ｘｌＯ’組換えファージ当たり１個のクローンの頻 度で３個の陽性クローンが同定された。ヌクレオチド配列分析は、これらのクロ ーンのうち２個が実際にエストロゲン受容体をコードしており、３番目のクロー ン（２，０キロ塩基に及び、ラムダｂＴ１６と命名した）が部分的な配列相同を 示すことを明らかにした。その後、このクローンを使用してヒト胎児腎臓および 成人心臓ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、それにより３個の追加クロ ーンを同定した。腎臓ライブラリーからの２個のクローン（ラムダｈＫＥ４およ びラムダｈＫＡ１）はラムダｈＴ１６と同じ遺伝子産物を表すが、心臓クローン （ラムダｈ）１３）は部分的に関連しているにすぎない、同一配列を共有する３ つのｅＤＮＡの複合配列（ここではｈＥＲＲｌと呼ぶ）を第Ｖ−１（Ｂ）−１お よびＶ−１（Ｂ）−２図に示す、約１５０〜２００ヌクレオチド１′のポリ（Ａ ）尾部を仮定すると、この配列（約２４３０ｎｔ）はほぼ全長であるにちがいな い、ラムダｈＫＡ１からのｃＤＮＡ挿入物はヌクレオチド１７９から２４３０ま でを含み、一方ラムダｈＫＥ４はまれなメツセンジャーＲＮＡのスプライシング エラー（ｓｐｌ　ｉｅｉｎｇｅｒｒｏｒ）を示し、エクソン２の欠失およびイン トロン配列の挿入を有する。ラムダｈＫＥ４によって示唆されたエクソン／イン トロン境界は、この遺伝子をコードするゲノムフラグメントをクローニングして 部分的に塩基配列を決定することにより確かめた（データは示さず）、最初のＡ ＴＧをとりまく配列は、翻訳開始部位についてＫ　ｏｚａｋ’　”によって開示 されたコンセンサス配列と一致する。　Ｍｒ５７３００のポリペプチドを予告す る５２１個のアミノ酸のオープン・リーディング・フレームは、７７５ヌクレオ チドの３′非翻訳領域と接している。

Ｖ、Ｃ，””　ｈＥＲＲ２のｅＤＮＡクローンクローンラムダｈＨ３の特性決定 により、それはｈＥＲＲｌと高度に関連した唯一のポリペプチドをコードするこ とが分かった。第Ｖ−２（Ｂ）−１およびＶ−２（Ｂ）−２図は、ラムダｈＨ３ の２１５３ヌクレオチド配列およびそのタンパク質屋１（ｈＥＲＲ２と呼ぶ）の −次構造を示す、その翻訳開始部位はヌクレオチド１００−１０２に一致するメ チオニンコドンに指定された。その理由は、これが読み枠内（ｉｎ　ｆｒａｍｅ ）ターミネータ−ＴＧＡ（ヌクレオチド３１−３３）から下流に現れる最初のＡ ＴＧ）リプレットであるからである。４３３個のアミノ酸を含むオーブン・リー ディング・フレームはＭｒ４７６００のポリペプチドをコードし、７５２ヌクレ オチドの３′非翻訳領域が後に続く。

Ｖ、Ｄ、ｈＥＲＲＩおよびｈＥＲＲ２の　性゛、先に述べたように、ステロイド ホルモン受容体は配列分析により同定しうる別個の機能的ドメインから精成され る。＋４推定されたｈＥＲＲＩおよびｈＥＲＲ２ポリペプチドはステロイド受容 体の予測されたドメイン特徴を含む、ｈＥＲＲｌとｈＥＲＲ２との間のアミノ酸 比較は、これらの２種のタンパク質が分岐（ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ）アミノ末端を 有し、この領域内では他のクラスの受容体との相同性が全く検出されないことを 示す（データは示さず）、この発見はこの領域の配列が高度に変化しうろことを 示した先の比較研究〈実験の部■を参照：また文献５．８．１０．１４を参照） と一致している。ｈＥＲＲｌ、ｈＥＲＲ２，ｈＥＲおよびｈＧＲの整列（第Ｖ− ３図）により、これらのタンパク質の間には最高の相同度がｈＥＲＲｌのアミノ 酸１７５から２４０までの６６個のアミノ酸のシスティンに富む領域〔ステロイ ドホルモン受容体のＤＮＡ−タウドメイン（実験の部■および文献１５を参照） に相当する〕に見られる。ｈＥＲＲｌとｈＥＲＲ２との比較においては９１％の アミノ酸同一性が存在し、ｈＥＲとの比較では６８％、そしてｈＧＲとの比較で は５６％の同一性が存在する。９個のシスティン残基の位置は厳格に保存されて いるが、ｈＥＲＲｌの２０６位およびｈＥＲＲ２の１３４位におけるヒスチジン 残基の不在は前述のステロイドホルモン受容体と大きく相違するところである。

このヒスチジン残基は元来保存性システィン残基と共にＤＮＡ結合フィンガーの 形成に関与すると考えられていた。リガンド結合トランス活性化因子スーパーフ ァミリーの他の一員であるビタミンＤ受容体＋９の対応するアミノ酸配列にもこ のヒスチジン残基の存在しないことが最近になって分かり、このことはＺｎ２＋ 原子がこれらのタンパク質に存在する提案されたＤＮＡ結合フィンガーの形成を 調整するために、排他的にシスティン残基と相互作用することを示唆している。

ｈＥＲＲｌのアミノ酸２９５と５２１の間に位置づけられる推定上のステロイド 結合ドメインは、ｈＥＲＲ２と比較したとき６３％の同一性を示し、ｈＥＲとは ３６％、そしてｈＧＲとは２８％の同一性を示す。

Ｖ、Ｅ、ｈＥＲＲｌおよびｈＥＲＲ２の−ＲＮＡの４ステロイド受容体はそれら の一次生理作用に直接間係する特徴的な組織特異的パターンで発現される。恐ら く、これらの推定受容体の分布はそれらの隠された本性に手がかりを与えるであ ろう、従って、多種類のラットおよびヒト組織から分離した全ＲＮＡはホルムア ルデヒド−アガロースゲル電気泳動で分画化し、ニトロセルロースフィルターへ 移行させた。プローブとしてラムダｈＫＡ１を用いることにより、ｈＥＲＲｌを コードする２、６ｋｂ　ｍＲＮ　Ａが検査したすべてのラットおよびヒト組織に 検出された。その際、驚いたことに、小脳および海馬では高レベルで、そして肝 臓、肺、精嚢および牌臓では最低レベルで検出された（第Ｖ−４（Ａ）図）、こ うして、ｈＥＲＲ１遺伝子は広く豊富に発現されるが、ラット中枢神経系により 一層高いレベルで存在すると思われる。ｈＥＲＲｌ　ｍＲＮＡ発現パターンとは 対照的に、ｈＥＲＲ２タンパク質をコードするｍＲＮＡの分布は、極めて低レベ ルのｍＲＮＡが検出される少数の特定組織に限られる（第Ｖ−４（Ｂ）図）、ク ローンラムダｂＨ３から誘導されたプローブを用いて、４．８ｋｂ　ｍ　ＲＮ　 Ａが腎臓、心臓、精巣、視床下部、海馬、小脳およびラット前立腺から検出され た。しかしながら、ヒト胎笈または前立腺ではハイブリダイゼーションが全く検 出されなかった。露出時間の差異および生成する信号強度を考慮すると、ｈＥ　 ＲＲ２＋＊ＲＮ　ＡのレベルはｈＥＲＲｌのそれよりも約１０〜１００倍低下す る。

Ｖ、Ｆ、ｈＥＲＲｌとｈＥＲＲ２との　１従来の研究は、ステロイドホルモン受 容体間のリガンド結合ドメインの相同度がそれらのリガンドの構造的関連性を反 映すると指摘している０例えば、リガンド結合ドメインが５６％の同一性を示す ｈＧＲ，ｈＭＲおよびｈＰＲ（実験の部■を参照）は関連ホルモンと親密に結合 する。実際、ｈＭＲはアルドステロンに等しい親和性でもってグルココルチコイ ドと結合し、また比較的高い親和性でプロゲステロンと結合する（実験の部■を 参照）、ｈＥＲＲ遺伝子産物の場合には、アミノ酸配列相同がｈＥＲとの比較的 遠い関係を示し、ＤＮＡ−タウ領域では７０％およびステロイド結合領域では３ ６％の同一性を示す（第Ｖ−５図）。

これらの相同レベルはｈＧＲ，ｈＭＲおよびｈＰＲの間にａ察されたものよりも 低く、従って推定上のｈＥＲＲタンパク質はエストロゲンとは異なるクラスのス テロイドホルモンと相互作用することが推測される。しかしながら、ｈＥＲＲｌ とｈＥＲＲ２との相同性は、それらが単一のまたは２つの密接に関連したステロ イド中間代謝物の受容体であることを示唆している。ｈＥＲＲＩおよびｈＥＲＲ ２コード配列から作製したキャップ構造をもつＳ　Ｐ　６　ＲＮＡのｉｎ　ｖｉ ｔｒｏ翻訳産物またはＣｏｓ、−ＩＮ胞による２つのｃＤＮＡの発現産物を使用 する予備ステロイド結合実験（実験の部■および■を参照）は、エストロゲンお よびアンドロゲンを含む主要クラスのステロイドとの結合を証明できｈＥＲＲｌ およびｈＥＲＲ２ｅ＊ＲＮＡ発現の組織分布は、それぞれの推定上の受容体が別 々の生物学的機能をコントロールするであろうことを示唆する。これらのステロ イドホルモン受容体の機能は何故見落されたのであろうか、多分、それらの活性 の多くは非定形の作用として分類される差異をもつ他の受容体に誤って属すると みなされたのであろう、神経細胞ステロイド！Ｏｌ　２＋の最近の同定は、脳内 でバラクリン作用をもつと思われる新しいステロイドホルモンの証拠を提供する 。このような系は従来の生理学的検出を容易に免れた。従って、２種類の新規な ステロイドホルモン受容体ｃＤＮＡの単離は、新しいホルモン応答系の同定へ向 けて第一歩を踏み出すことになろう。

ｈＥＲＲｌの制限地図（Ａ）およびＤＮＡ配列と推定されたアミノ酸配列（Ｂ） 、Ａ、ｈＥＲＲｌの複合ｃＤＮＡを上段に表し、非コード配列（細線）およびコ ード配列（斜線部分）を示す０通常の６−ヌクレオチド制限酵素部位は線状地図 の上に記す、配列決定に使用した重複するｃＤＮＡ挿入物を示す、ラムダｈＫＥ ４の５′未満付近の波線は分岐配列を示す、Ｂ、ロング・オープン・リーディン グ・フレーム上に与えられた推定アミノ酸を伴う複合ｈＥＲＲ１ｅＤＮＡのヌク レオチド配列。

第Ｖ−１（Ａおよび（Ｂ）図の　法 クローンラムダｈＴ１６はｈＥ　ＲｃＤ　Ｎ　Ａ　（Ｖ　、Ｇ　ｉｇｕｅｒｅお よびＲ，Ｍ、Ｅｖａｎｓ、未発表データ）から誘導されたリンカ−走査突然変異 体”（Ｉｉｎｋｅｒ−ｓｃａｎｎｉｎｇ　ｍｕｔａｎｔ）のｐＥＲ９４５に由来 するニックトランスレーション２２を行った４４６　ｂｐ　Ｂｇｌ　Ｉ　Ｂａｍ ＨＩフラグメントを用いて、ヒト精巣ラムダｇｔｌＯｅＤ　Ｎ　Ａライブラリ（ ＣＩｏｎｅＬｅｃｈ社）から分離された。ハイブリダイゼーション混合物は３５ ％ホルムアミド、１×デンハート溶液、５ＸＳＳＰＥ、０．１％ドデシル硫酸ナ トリウム（ＳＤＳ）、１００μｇ／ｘｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび１０’ｃｐｍ ／ｚｐのコ２Ｐ標１ＮＢｙｆｌ　ＢａｍＨＩフラグメント（＞１０”ｅｐｍ／μ ２）を含んでいた。２通りのニトロセルロースフィルターを４２℃で１６時間ハ イブリダイズさせ、２ＸＳＳＣ１０，１％Ｓ　Ｄ　Ｓ　（Ｉ　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ＝ １５０ｍＭ　ＮａＣ１，１５−Ｍ　クエン酸ナトリウム）を用いて５５℃で２０ 分ずつ３回洗浄し、そして増悪紙を使って一７０℃でオートラジオグラフィー分 行った。クローンラムダｈＫＥ４およびラムダｈＫＡ１は、ラムダｈＴ１６由来 のニックトランスレーションした挿入物を用いて、ヒト腎臓ラムダｇｔｌｏｃＤ ＮＡライブラリー２３から分離された。このスクリーニングのために、ハイブリ ダイゼーション混合物は５０％ホルムアミドに変更し、洗浄条件は６８℃で０， １％ＳＤＳを含む２ｘｓｓｃに変えた。ｃＤＮＡクローンは多数の制限酵素で消 化し、生成したフラグメントをＭ１３塩基配列決定ベクター５ｐ１８およびｍｐ １９に両方の向きでサブクローニングし、そしてジデオキシ法２４で塩基配列を 決定した。ギャップやアンビギュイテイは化学的切断法２Ｓにより解明した。Ｄ ＮＡ配列は編集してＤｅｖｅｒｅｕｘら２６およびＳ　ｔａｄｅｎ”のプログラ ムにより分析した。

Ｖ−２（Ａおよび（Ｂ゛ ｈＥＲＲ２の制限地図（Ａ）およびＤＮＡ配列と推定されたアミノ酸配列（Ｂ） 。Ａ　、　ｈ　Ｅ　ＲＲ２ｅ　Ｄ　Ｎ　Ａの模式図：いくっかの通常の制限酵素 部位を示す、斜線ボックスは推定されたオーブン・リーディング・フレームを表 す。Ｂ、ラムダｈＨ３の完全なヌクレオチド配列を、ロング・オーブン・リーデ ィング・フレーム上の推定アミノ酸配列と共に示す、５′非翻訳領域におけるシ ョート・オーブン・リーディング・フレームは肉太の活字で示す。

■−２ＡおよびＢ゛の　゛ クローンラムダｈＨ３は、ラムダｈＫＡ１の５′部分を表すニック　トランスレ ーションした７００ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−５ＩＩＩＪＬ　Ｉフラグメントを用い て、ヒト心臓ラムダｇｔｌｌ　ｅＤＮＡライブラリー（アルバート・アインシュ タイン医科大学のり、Ａ、Ｌｅｉｎｗａｎｄ博士から寄贈）から分離された。ハ イブリダイゼーション、洗浄条件および塩基配列決定の手法はヒト腎臓ライブラ リーについて第Ｖ−１（Ａ）および（Ｂ）図で説明した通りであった。

第ｙヨニ１図− ｈＥＲＲｌ、ｈＥＲＲ２、ヒトエストロゲンおよびグルココルチコイド受容体の カルボキシ末端領域間のアミノ酸配列の比較。

４種のアミノ酸配列はギャップ（ハイフンで示す）を導入することにより最大相 同性を得るように整列させた０番号はｈＥＲＲｌおよびｈＥＲＲ２については第 Ｖ−１（Ｂ）−１およびＶ−１（Ｂ）−２図ならびに第Ｖ−２（Ｂ）−１および Ｖ−２（Ｂ）−２図から、ｂＧＲについては第１−２図から、モしてｈＥＲにつ いてはＧｒｅｅｎら２から引用した。少なくとも３種のポリペプチドにおいて一 致するアミノ酸残基はボックスで囲った。ｈＥＲＲｌの残基２０６の上の星印は 、ｈＥＲ配列中に存在するがｈＥＲＲｌとｈＥＲＲ２の′前記列中には存在しな いヒスチジン残基の位置を示す。

■−４ＡおよびＢ゛ ラットおよびヒト組織におけるｈＥＲＲｌ（Ａ）およびｈＥＲＲ２（Ｂ）ｍＲＮ Ａのノザン・プロット・ハイブリダイゼーション。

■−４Ａおよび（Ｂ　゛の　゛ 全ＲＮＡはグアニジンチオシアネート２８を用いて種々の組織から分離し、１％ アガロース−ホルムアルデヒドゲル上で分画化し、ニトロセルロースへ移行させ 、そしてストリンジェント条件下でラムダｈＫＡ１由来のニックトランスレーシ ョンしなＥｅｏＲｌ−５ＩＩ＆　（フラグメント（ａ）およびラムダｈＨ３由来 のニックトランスレーションした１１９２ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄＩ［Ｉ フラグメント（ｂ）を用いてハイブリダイズさせた。すべてのレーンにおいて２ ０μｇの全ＲＮＡを使用した。リポソームＲＮＡ（２８Ｓおよび１８Ｓ）の泳動 をサイズマーカーとして示す、ニトロセルロースフィルターは増感紙を使って一 ７０℃で２４時間（ａ）および６日間（ｂ）オートラジオグラフィーにかけた。

（ａ）におけるＭＲＮＡの泳動速度の明らかな差はゲルからのアーチファクト（ ａｒｔｉｆａｃｔ）である。

１Ｌ二１ ｈＥＲＲｌおよびｈＥＲＲ２、ｈＥＲ，ｈＧＲおよびヒト甲状腺ホルモン受容体 （ｈＴ’ｓＲベータ）間の模式図によるアミノ酸比較。

アミノ酸配列はステロイドおよび甲状腺ホルモン受容体スーパーファミリー４の 機能的ドメイン構造に従って模式図により整列させた。それぞれの受容体とｈＥ ＲＲｌとのアミノ酸同一性のパーセンテージは各ドメインの内側に示す、それぞ れのドメイン境界のアミノ酸位置を各受容体について示す。

Ｖ、１．　の　Ｖ・　した １　、　Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、Ｓ、Ｍ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、３１ ８：６３５−６４１（１９８５）。

２、　Ｇｒｅｅｎ、Ｓ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、３２０：１３４−１３ ９　（１９８６）。

３、　Ｇｒｅｅｎｅ、Ｇ、Ｌ、、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２３１：１１ ５０−１１５４　（１９８６）。

４　、Ｍ　ｉｓｒａｃｈｉ（Ｍ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｂ　ｉｏｅｈｅｍ、Ｂ　ｉｏ 　ｈ　ｓ、Ｒｅｓ、ｃｏｍｉ＊、。

１４３ニア４Ｏ−７４８（１９８７）　。

５　、　Ａ　ｒｒｉｚａ　、　Ｊ　、　Ｌ　、　、ｅｔ　ａｌ　、　、　Ｓ　ｃ ｉｅｎｃｅ、２３７：２６８−２７５（１９８７）　。

６、　Ｍｉｅｓｆｅｌｄ、Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅｌ↓、４６：３８９−３９ ９（１９８６）　。

７　、　Ｄａｎｉｅｌｓｅｒ＋、Ｍ　、　、　Ｎｏｒｔｈｒｏｐ、、　Ｊ　、Ｐ 　、　、ａｎｄ　Ｒｉｎｇｏｌｄ、　Ｇ　、Ｍ　、。

ＥＭＢＯＪ、、５：２５１３−２５２２（１９８８）。

８、　Ｋｒｕｓｔ、Ａ、、ｅｔ　ａｌ、、ＥＭＢＯＪ、、５：８９１−８９７（ １９８６）。

９　、　Ｍａｘｗｅｌｌ、Ｂ、Ｌ、、ｅｔ　ｍｌ、、Ｍｏ１．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ ｏｌ、。

１　：２５−３５（１９８７）　。

１０、　Ｌｏｏｓｆｅｌｔ、Ｈ，、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ ｄ、Ｓｃｉ、Ｕ　ＳＡ。

８３：９０４５−９０４９（１９８８）　。

１１、　Ｗｅｉｌｅｒ、　Ｉ　、Ｊ　、、Ｌｅｗ、Ｄ　、、ａｎｄ　５ｈａｐｉ ｒｏ、Ｄ　、Ｊ　、、Ｊ　、Ｍｏｌ。

Ｅ　ｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　、　、　１　：３５５−３６２（１９８７）　。

１２、　Ｇ　ｉｇｕｅｒｅ、　Ｖ　、　、　Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、　Ｓ　、Ｍ 　、　、　ＲｏｓｅｎｆｅＩｄ、　Ｇ　、Ｍ　、　。

ａｎｄ　Ｅ　ｖａｎｓ、　Ｒ、Ｍ　、　、　Ｃｅｌ±、４６：６４５−６５２（ １９８６）　。

１３、Ｋｕ＋＋＋ａｒ、Ｖ、、Ｇｒｅｅｎ、Ｓ、、５ｔａｕｂ、Ａ、、ａｎｄ　 Ｃｈａｓｂｏｎ、Ｐ、。

ＥＭＢＯＪ、、５：２２３１−２２３６　（１９８６）。

１＝Ｌ　Ｅｖａｎｓ、Ｒ，Ｍ、、５ｃｉｅｎｃｅ、（ｉｎ　ｐｒｅｓｓ）。

１５、Ｈｏｆ　Ｉｅｎｂｅｒｇ、　Ｓ　、Ｍ　、、Ｇ　ｉｇｕｅｒｅ、Ｖ　、、 　Ｓ　ｅｇｕｉ、　Ｐ　、、ａｎｄＥｖａｎｓ、Ｒ，Ｍ、、Ｃｅｌ↓、４９：３ ９−４６（１９８７）　。

１６、　Ｍ　１ｅｓｆｅｌｄ、　Ｒ、、Ｇｏｄｏｗｓｋｉ　、　Ｐ　、　Ｊ　、 　、Ｍａｌｅｒ、　Ｂ　、Ａ　、　、ａｎｄＹａｍａｍｏｔｏ、　Ｋ　、Ｒ、、 Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ、２３６：４２３−４２７（１９８７）　。

１７、Ｓａｗｉｋｉ、Ｓ、Ｇ、、Ｊｅｌｉｎｅｋ、Ｗ、、ａｎｄ　Ｄａｒｎｅｌ ｌ、Ｊ、Ｅ、。

Ｊ　、Ｍｏ１．Ｂ　ｉｏｌ、、１１３：２１９−２３５（１９７７）。

１８、　Ｋｏｚａｋ、Ｍ、、Ｎａｔｕｒｅ、３０８：２４１−２４６（１９８４ ）。

１９、　ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ、Ｄ、Ｐ、、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ。

２３５：１２１４−１２１７（１９８７）　。

２０、Ｌｅ　Ｇｏａｓｃｏｇｎｅ、Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ。

２３７：１２１２−１２１５　（１９８７）。

２１、　Ｈｕ、Ｚ、Ｙ、、Ｂｏｕｒｒｅａｕ、Ｅ、、Ｒｏｂｅｌ、Ｐ、、ａｎｄ 　Ｂａｕｌｉｅｕ、Ｅ。

Ｅ　、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ　Ｓ　Ａ　、（ｉｎ　ｐｒ ｅｓｓ）。

２２、　Ｒ，ｉｇｂｙ、　Ｐ　、ＷＪ　、、　Ｄ　ｉｅｅｋｍａｎｎ、Ｍ　、、 　Ｒｈｏｄｅｓ、Ｃ、、ａｎｄＢｅｒｇ、Ｐ　、Ｊ　、、Ｊ　、Ｍｏ１．Ｂｉｏ ｌ、、１１３：２３７−２５１　（１９７７）。

２３、Ｂｅ１ｌ、Ｇ、　Ｉ　、、ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒ ｅｓ、。

１４：８４２７−８４４６（１９８６）　。

２４、　Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ、、Ｎ１ｅｋｌｅｎ、Ｓ、、ａｎｄ　Ｃｏｕｌｓｏｎ 、Ａ、Ｒ，、Ｐｒｏｃ。

Ａｅａｄ、　Ｓ　ｅｉ、Ｕ　Ｓ　Ａ　、７４：５４６３−５４６７（１９７７） 　。

２５、Ｍａｘａ（Ａ、、ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ、Ｗ、、Ｐｒｏｅ、Ｎａｔ、１ ．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、。

Ｕ　Ｓ　Ａ　、７４：５６０−５６４　（１９７７）　。

２６、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ、、Ｈａｅｂｅｒｌｉ、Ｐ、、ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ ｉｅｓ、Ｏ，。

Ｎｕｅ！ｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、、１２：３８７−３９５（１９８４）。

２７、　５ｔａｄｅｎ、Ｒ，、Ｎｕｅｌｅｉｅ　Ａｅｉｄ　Ｒｅｓ、、１０：２ ９５１−２９６１（１９８２）。

２８、　Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、　Ｊ　、Ｍ　、　、　Ｐ　ｒｚｙｂｙｌａ、Ａ　、 Ｆ　、　、ＭｅＤ　ｏｎａｌｄ、　Ｒ、Ｊ　＋１ａｎｄ　Ｒｕｔｔｅｒ、Ｗ、Ｆ 　、、Ｂ二Ｌ９ｓ」Ｌ竺！ＬＬ巨Ｊコ−ｔ２１８：５２９４−５２９９（１９８ ０）。

天上ｆＩＬ１ ラット成長ホルモン遺伝子のｅ−ｅｒｂＡ結合部位は甲状腺ホルモンによるトラ ンス作用を仲介する１−Ｎ−Ｌ襄 １．３．３−）リョードチロニン（Ｔ、）物質はラット下垂体腫瘍細胞１−４に おいて成長ホルモン遺伝子転写を刺激する。この刺激は、その転写開始部位の５ ′側の調節因子に核Ｔ、受容体が結合することにより仲介されると考えられる。

５−８甲状腺ホルモンが遺伝子転写を活性化するメカニズムの理解は、核Ｔ、受 容体が豊富に存在しないためにそれらを精製するのが困難であること、およびＴ ユ調節に作用するＴ、受容体−ＤＮＡ結合部位が明確でないことにより制限され ている。最近、ヒトおよびトリｃ−ｅｒｂ−Ａ遺伝子産物は、高親和性でもって 甲状腺ホルモンと結合しく文献１０として発表した実験の部■を参照）、甲状腺 ホルモン受容体の分子量および核結合特性をもつことが見出された。目下の研究 において、我々はラット成長ホルモン遺伝子の転写開始部位の５′側の１６４塩 基対に位置する配列５′ＣＡＧＧＧＡＣＧＴＧＡＣＣＧＣＡ３’へのラット下垂 体細胞Ｔｓ受容体の特異的高親和性結合を検出できるアビジン−ビオチン複合Ｄ ＮＡ結合検定の開発について説明する。この配列を含むオリゴヌクレオチドは、 トランスフェクションしたラット下垂体ａｃ　：ｚａ＋胞においてＴ３調節を単 純庖疹ウィルスチミジンキナーゼプロモーターへ転移し、またヒト胎盤ｃ−ｅｒ ｂ−Ａ遺伝子のｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳産物と特異的に結合した。このデータは。

ヒトｅ−ｅｒｂ−Ａ遺伝子がＴ３の転写作用を仲介し、またＧＣ２細胞核抽出物 がラット成長ホルモン遺伝子Ｔ、応答因子への下垂体Ｔ、受容体の結合を変更す る別の因子を含むことを支持する証拠を提供する。

Ｖｉ、　Ｂ、　Ｔ、−に必　ｔ−ット　長ホルモンＤＮＡ【差α１１汲支 （ａ）−ットＧＨ Ｔ、調節に必要な成長ホルモン（ＧＨ）５’側ゲノム配列中のシス活性因子を同 定するために、我々は細菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ ＣＡＴ）遺伝子へ融合し且つラット下垂体ＧＣ２細胞にトランスフェクションし た、ラットＧＨ遺伝子の一連の５′欠失フラグメントを使用した（第■−１（Ａ ）図）、−２３５位から転写開始（ＣＡＰ）部位までの５′欠失物はＴ、に対す る調節を転移させ（４，６倍、第ＶＩ　−１（Ａ）図）、以前の研究５″に一致 して１．７キロ塩基（ｋｂ）または３０７塩基対（ｂｐ）の５′側ラツトＧＨ情 報を含む構築物に等しかったくデータは示さず）、（ヌクレオチド位置はＣＡＰ 部位に対して番号付けされており、負の位置番号はそれに対して５′側であるこ とを意味する。）２３５ｂｐより少ない５”１ｌｌＧＨ情報を含む欠失物は、Ｔ ｓの不在下でのＣＡＴ発現レベルが有意にバックグラウンド以上でなかったので 、Ｔ、誘導について検定できなかった。この問題を解決するために、ラットプロ ラクチンエンハンサ−因子ＩＩを１８１ｂｐおよび１１０ｂ、の５′側情報を含 むラットＧＨ遺伝子フラグメントに近接して融合させた。−１８１位まで延びる ５′欠失フラグメントはＴ、によって２．６倍の誘導を与え、そしてＣＡＰ部位 から一１０７位までの別の欠失はＴＪＩ節を示さなかった（第Ｖｌ　−１（Ａ） 図）。

（ｂ繕ヲー」１ｌ九区 ３′欠失について検定するために、ラットＧＨ遺伝子のフラグメントは単純庖疹 ウィルスチミジンキナーゼ（Ｈ３Ｖｔｋ）プロモーターに融合した。ＣＡＰ部位 から一２３５位ないし一４５位まで延びるＧＨ遺伝子フラグメントは、天然のま まの向きでおよび逆向きでｔｋプロモーターに融合したとき、それぞれ２．５倍 および２．３倍のＣＡＴ活性刺激をもたらした（第Ｖｌ−１（Ｂ）図）。

ＧＨＣＡＰ部位から２３５位ないし１４５位まで延びる９０ｂ、フラグメントは 、２３５−４５ｂ、フラグメントよりも一層効果的にＴ、調節を転移させ、この ことはネガティブＴ、調節因子がＣＡＰ部位から４５ｂｐと１４５ｂｐの間に存 在しうろことを示唆している（第■−１（Ａ）図）、ＣＡＴメツセンジャーＲＮ Ａは、ｔｋプロモーターを含むプラスミドでトランスフェクションした細胞にお いて観察されたＣＡＴ活性のＴ、依存性刺激が適当に開始された転写物の増加に よって起こるのかどうかを調べるために、プライマー伸長技術Ｉ２を用いて分析 した。　ｔｋプロモーターに融合した２３５−４５ｂ、　ＧＨフラグメントはＴ ｚの存在下で正しく開始されたＣＡＴｍＲＮＡを約４倍増加させ（第Ｖｌ−１（ Ｃ）図）、これは観察されたＣＡＴ活性の測定値と一致する結果であった。

（ｅ）アビジン−ビオチン　合ＤＮＡ結合２　（ＡＢＣＤ検、）Ｔ、調節に必要 とされる配列をさらに明確に定めるために、成長ホルモンＴ、調節因子への核Ｔ 、受容体の特異的結合を証明する必要があった。ゲルシフトおよびフットプリン ト検定によりＴ、受容体結合部位をマツピングする試みが初め不成功に終わった ので、特異的結合を検出する新しい検定法、アビジン−ビオチン′Ｗ、きＤＮＡ 結合＜ＡＢＣＤ）検定法、が創案された。第Ｖ？　−２（Ａ）図に示すような、 いろいろな位置にビオチン−１１−ｄＵＴＰを有する、Ｔ、調節に必要なＧＨ遺 伝子の５′側領域を含む二本鎖オリゴヌクレオチドが作製された。初めに一２０ ９位から一１４６位までの成長ホルモンゲノム配列を含む７７ｂｐオリゴヌクレ オチド（Ｇ２０９−１４６）を使用した。ＧＣ２核抽出物がらのＴ、受容体は” ’ｌ−７３を用いて高い比活性へ標識し、そしてビオチニル化オリゴヌクレオチ ドとインキュベートした。タンパク質−ＤＮＡ複合体は、その結合反応後に、ア ガロースビーズに結合したストレプトアビジンを用いて溶液から沈澱させた。

第Ｖｌ−２（Ｂ）図から明らかなように、プローブＧ２０９−１４６は６９００ ｃｐｍの”’ｌ−７３活性の沈澱を生じさせた。これは約３．２フ工ムトモルの Ｔ３受容体の結合を表し、結合反応温き物中に存在する全Ｔ、受容体の約４０％ を占める。　’２’Ｉ　−Ｔ、標識受容体の沈澱はプローブ依存性であった；沈 澱した’２５Ｉ−Ｔ）の全放射能のく１５％がＧ２０９−１４９の不在下で回収 された。１００倍過剰モル量の未標識Ｔ、の添加は沈澱した１２’Ｉ−Ｔ３をバ ックグラウンドレベルにまで低下させ（第Ｖｌ−２（Ｂ）図）、このことはプロ ーブによって沈澱されるはずのＴ、結合タンパク質が制限された量で存在してい たことを示している。Ｔ、受容体−ＤＮＡ複合体の平衡結合定数は１．４ｘｌＯ −’Ｍであると概算された（データは示さず）。

Ｇ２０９−１４６による標識Ｔ、受容体の沈澱が特定のラットＧＨ配列に依存す るかどうかを調べるために、成長ホルモンエンハンサ−との明らかな配列類似性 をもたないがＧ２０９−１４６と同じ長さであり且つ同じ数のビオチン−１１− ｄＵＴＰ残基を含む一連のビオチニル化プローブ分作製した。第Ｖｌ−２（Ｂ） ＩＩＩに示すように、ＧＣ２核抽出物への１００１００ｆの各プローブの添加は 測定しうる１２’Ｉ−Ｔｆｆの沈澱を与えなかった。これはＧ２０９−１４６に よる＋２５Ｉ−Ｔ：ｌの沈澱がこのプローブに含まれるラットＧＨ配列に依存す ることを示している。

（ｄ）フッドブ１ント　。

通常のフットプリント法を用いてＴ、受容体結合部位を局在化するための初期の 試みは成功しなかったが、ＡＢＣＤ結合検定における緩衝条件の変化は、もしも ＤＮＡ結合のための塩およびｐＨ条件が最適であるならば、￥！製製油抽出物場 合にもフットプリントが達成しうろことを示唆した（データは示さず）、ＧＨエ ンハンサ−の末端標識フラグメントはＧＣ２核抽出物とインキュベートし、ＤＮ アーゼＩで消化した。変性条件下での消化物のＰＡＧＥ分析（第Ｖｌ−３図）は 以前に記載された２つのフットプリントを与えｌｆｆ１＋４．これらのうちの１ つはヌクレオチド−１７９と−１６４の間のアンチセンス鎖中の１６ｂ、保護領 域により示される。センス鎖において５’　ＣＡＧＧＧＡＣＧＴＧＡＣＣＧＣＡ ３’に相当するこの配列は、Ｔ、受容体と特異的に結合するオリゴヌクレオチド プローブ中に含まれ、以前に同定されたＴ、依存性ＤＮアーゼ■高Ｓ受性部位Ｉ ９の位置に対応する。

センス鎖それ自体中にはっきりしたフットプリントは検出されなかったが、それ は主としてこのＧに富む領域におけるＤＮアーゼＩによる不完全消化のためであ る。

、Ｃ，Ｔ、ｌゴ　フレ　ドの ＧＨ遺伝子のＴ、調節におけるこの配列の機能を調べるために、特定部位の突然 変異誘発を用いて野生型エンハンサ−から１１ｂｐのフットプリントを欠失させ たく突然変異体Ｇデルタ１６６／１７７）、　ｔｋプロモーターに融合した突然 変異体Ｇデルタ１６６／１７７でトランスフェクションした細胞へのＴ、の添加 はＣＡＴの発現量に何ら影響を及ぼさなかったが、野生型エンハンサ−はＣＡＴ 発現を９倍刺激した（第Ｖｌ−１（Ｂ）図ン、従って、オリゴヌクレオチドおよ びＤＮアーゼＩ結合検定により同定した推定上のＴ、受容体結合領域の除去は、 ｔｋプロモーターにＴ３調節を付与するＧＨエンハンサ−の能力を失わせた。

−１６４位から一１７９位までの１６塩基対が機能的なＴ、調節因子を構成する ことを証明するために、５′末端側および３′末端側にそれぞれ７塩基および６ 塩基を付加したこの配列を含む二本鎖オリゴヌクレオチドが作製された。このオ リゴヌクレオチドはｔｋプロモーターに近接して天然のままの向きで挿入した（ 構築物Ｇ２９ＴＫ、第■−１（Ｂ）図）、この構築物でトランスフェクションし た細胞では、ＣＡＴ発現がＴ、によって２．９倍刺激された。この配列３つを直 列に配置したもの（構築物Ｇ２９３ＴＫ）を挿入すると、Ｔ、によって５倍の刺 激が生じた。

ｔｋプロモーターへのＴｓｍ節の転移のために使用した短いオリゴヌクレオチド （Ｇ１８６−１５８）もまた、Ｇ２０９−１４６中ｆ）ｎＴｓ受容体結合部位と 特異的に結合したが、これはヌクレオチド位置−１７７から−２３５までのラッ トＧＨ配列を含むオリゴヌクレオチド（測定可能な量のＴ、受容体と結合しなか った）を用いることにより失われた（データは示さず）、非ビオチニル化Ｇ２０ ９−１４６オよびＧ　１８６−１５８はまたビオチニル化Ｇ２０９−１４６とＴ ３受容体との結合を競合させるべく使用した。Ｇ２０９−１４６に対するＴ。

受容体の相対親和性はＧ１８６−１５８よりも２〜３倍高がった（データは示さ ず）、短い方のプローブに対する明らかな親和性の低下は、Ｔ、受容体結合反応 に直接関与する塩基の欠乏により生ずるのかも知れない、このことは、ＤＮアー ゼＩフットプリントの境界がこのプローブの両末端内にあるので、ありそうもな い、その他に考えられることとして、ＧＣ２核抽出物は長いプローブへのＴ、受 容体の結合を安定化させる他の因子を含むのかも知れない。

、Ｄ、　′″・および結論 これらの実験は、ＣＡＰ部位に対して５′側の一１６４位がら−１７９位まで延 びる１６ｂｐノツトプリントを含む２９塩基対のＧＩ（遺伝子がＴ３受容体と結 合し、ラットＧＨエンハンサ−のＴ。

調節にとって必要であり、またＴ３調節をｔｋプロモーターへ転移できることを 証明した。ヒトｃ−ｅｒｂ−Ａがこの因子と結合するかどうかを試験するために 、ｉｎ　ｖｉｖｏ翻訳産物を３５８−メチオニンで標識した（実験の部■を参照 ）、この産物はＳＤＳゲル電気泳動上で相対分子量（Ｍｒ＞４８０００＜４８Ｋ ）および５２にのダブレットとして泳動し、そして５Ｘ１０”’のｈｄ値でＴ、 と結合した。ヒトｃ−ｅｒｂ−Ａ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳産物のラットＧ　ＨＴ 　ｓ調節因子と含むＧ２０９−１４６およびＧ１８６−１５８オリゴヌクレオチ ドブ１フープへの結合は第Ｖｌ−４図に示す、長いプローブおよび短いプローブ は両方ともｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳産物と有意に結合したが、ＧＨ遺伝子のＴコ受 容体結合部位に対して相同性を欠くプローブに存在する（ｊｌＳ）メチオニンの 概算上の比活性に基づいて、第■−４図に示した結合活性は１〜２　ｆｍｏｌの ｅｒｂ−Ａタンパク質に相当する。　＋２５Ｉ−Ｔ３受容体を含むＧＣ２細胞核 抽出物と相違して、ｃ−ｅｒｂ−Ａ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳産物は長いオリゴヌ クレオチドと短いオリゴヌクレオチドの両方に同程度に結合した。

類似のデータが＋２’ｌ−７３で標識したヒトｃ　−ｅｒｂ　−Ａの１ｎｖｉｔ ｒｏ翻訳産物を用いて得られた（データは示さず）、これらの結果は、ｃ−ｅｒ ｂ−Ａ遺伝子産物がＧＣ２核抽出物からのＴ、受容体によって結合される同じＴ 、調節配列と特異的に結合することを示している。それらは、ｃ−ｅｒｂ−Ａ遺 伝子産物の機能が７３の転写作用を仲介することであるという更なる証拠を提供 する。

Ｐｌｕｇら（１９８７）は、ヌクレオチド位置−２１０と−１８１の間のＧＨ配 列が一時的にトランスフェクションしたＧＣ紺胞におけるＴ’ｓの完全刺激作用 に不可欠であることを最近報告し、さらにこの領域がＴ、調節される他の遺伝子 に対し限られた類似性を保有することを指摘した。我々の実験は、Ｔ、受容体− ＤＮＡ結合部位をＣＡＰ部位から１６４ｂ、と１７９ｂｐの間に位置づけ、さら にＧＨ遺伝子のＴＡＮ節におけるヌクレオチド位置−２１０と−１８１の間の配 列の機能的重要性について証明する。これは、我々がＴ、受容体源として粗製核 抽出物を用いてｉｎ　、ｖｉｔｒｏ　Ｄ　Ｎ　Ａ結合実験で観察したように、ｉ ｎ　ｖｉｖｏにおいてこの上流因子を含むＧＨエンハンサ−フラグメントに対す るＴ、受容体の増大した親和性を反映するであろう、ｅｒｂ−Ａ　ｉｎ　ｖｉｔ ｒｏ翻訳産物がＧ　２０９−１４６およびＧ１８６−１５８と同程度に結合する ということは、粗製ＧＣ２核抽出物がヌクレオチド位置−２１０と−１８１の間 の配列と結合し且つその結合部位に対するＴ、受容体の結合を安定化する別の因 子（１種または２種以上）を含む可能性と一致する。

真核細胞の転写因子間の協同的相互作用は十分に確立されている１ｇ−１１，い くつかの場合において、これは別の因子のＤＮＡ結合親和性を変更するある因子 の能力を反映している。この種の相互作用は甲状腺ホルモン作用の組織特異的調 節において重要であるだろう、″にこで使用したＡＢＣＤ結合検定はこれらの問 題を処理するのに有用であり、それはまた標識リガンド、化学的修飾または標識 アミノ酸によるｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳を用いて選択的に放射性標識しうるすべて のＤＮＡ結合タンパク質に応用できるであろう。

ラットＧＨ５’−フランキング配列を含む種々の遺伝子融合物の甲状腺ホルモン 応答性、Ａ、ラットＧＨ遺伝子の５′および３′欠失の応答性、ラットＧＨ遺伝 子の５′欠失フラグメントは、ｐＳＶ２ＣＡＴをヘーストしたベク９−”（ＳＶ ４０複製起点およびプロモーターを除去したもの）中のＣＡＴ遺伝子に融合させ た。これらの構築物はＧＣ２細胞にトランスフェクションし、Ｔ、に対する応答 性について検定した。ヌクレオチド位置−１０７ないし＋８および−１８１ない し＋８のフラグメントの基礎発現は低レベルであるため、Ｔ、によって調節され ないラットプロラクチンエンハンサ−（Ｐｒ１）”をこれらのフラグメントに近 接して配置した０例示した３′欠失フラグメントは、−１９７位から＋５４位ま でのｔｋプロモーターフラグメントに融合させ、同じベクター中のＣＡＴ遺伝子 に近接して配置した。Ｂ、推定上のＴ、受容体結合部位の機能的分析、突然変異 体Ｇデルタ１７７／１６６はＣＡＰ部位から１７７−１６６塩基対のＴ、受容体 結合部位の１１個の塩基の欠失を含む、プラスミドＧ２９ＴＫおよびＧ２９３Ｔ Ｋは、それぞれ１および３のコピー数でＴ、受容体と結合するラットＧＨ遺伝子 の２８ｂｐ領域を含む、Ｔ、の作用は１０−”Ｍ　Ｔ。

の存在下でのクロラムフェニコールの転化百分率を７５の不在下でのその転化百 分率で割ることにより決定した。３通、りのプレートはＤＥＡＥ−デキストラン １１を用いる被験プラスミドでのトランスフェクション前に、イオン交換クロマ トグラフィーでＴ、を除いた１０％ウシ胎児血清中に２日間維持した０ｍ胞はト ランスフェクションの２４時間後にホルモンで処理し、Ｔ、暴露の２４時間後に ＣＡＴ活性について検定した。誤差限界は平均値の標準誤差を表す、ＡｎはＳＶ ４０ポリ°アデニル化部位を表す。

Ｃ，メツセンジャーＲＮＡ転写開始部位の分析、模式図はｔｋｊロモーターを含 むプラスミドの転写物のＣＡＰ部位を決定するために用いられた。ＣＡＴコード 配列のヌクレオチド６７〜８９に相補的な３３ヌクレオチドプライマーを表す、 ａｃ４ａ＋胞はパネルａおよびｂて示した実験において説明したように、被験プ ラスミドでトランスフェクションし、ホルモン処理を行った。プライマー伸長分 析は５０μ２の全ＲＮＡに対して実施した。レーンＡおよびＢはｔｋプロモータ ーに融合したＣＡＰ部位から２３５−４５位に及ぶＧＨフラグメントを含むプラ スミドでトランスフェクションした細胞からの伸長産物を表す、レーンＣおよび Ｄはｔｋプロモーターのみを含むプラスミドでトランスフェクションした細胞か らの伸長産物を表す、伸長産物は全く観察されなかった。レーンＡおよびレーン Ｃに示した産物はＴ、の不在下でインキュベートした細胞からのものであり、そ してレーンＢおよびＤに示した産物は１０−　ｔ　Ｍの濃度のＴ、で処理した細 胞からのものであった。レーンＥは（ヌクレオチドの）サイズ測定のために使用 したｐＢＲ３２２のＨｉｎｄｌ［［消化物を示す。

−■Ａ　ＢおびＣ゛の′ ＣＡＰ部位の−１，７ｋｂから＋８ｂｐまでのラットＧＨ遺伝子の５′フランキ ング配列を含むＣＡＴ発現ベクターの構築は開示されている。■ラットプロラク チンエンハンサーを含む融合物は、プラスミドｐＰＳＳ■からこのフラグメント （ラットプロラクチン配列ヌクレオチド位置１８３１−１５３０に相当する）を 切り出し、それを成長ホルモン因子の５′欠失物に近接して逆向きに挿入するこ とにより作製した。ＨＳＶｔｋＳＶｔ−ターを含む融合物は、プラスミドｐ　ａ 　Ｐ　Ｏ（文献１１？照）からＧＨエンハンサ−のフラグメントを切り出し、そ れらを−１９７位から＋５４位までのｔｋプロモーターに近接してｐＳＶ２ＣＡ Ｔをベースとした発現ベクターのＢａｍＨＩおよびＳａ１■部位に挿入すること により作製した。別法として、ＧＨエンハンサ−はＢａｍＨＩおよび５ａｉｌポ リリン力一部位に挿入することにより、ｐＵｃ８をベースとしたベクター２０中 の一１０７位から＋５４位のｔｋプロモーターに近接して配置した。ＧＨエンハ ンサ−因子の特定部位突然変異誘発は、ＣＡＰ部位から２３５−４５ｂｐのフラ グメントｆ！−Ｍ１３ｍｐ１８のＩ３ａｍＨＩおよび５ａ１１部位に挿入するこ とにより行った。アンチセンスＧＨヌ２レオチド−１８８ないし−１５７に相当 する２１塩基オリゴヌクレオチド（ヌクレオチド−１７７ないし−１６６を欠失 させて、Ａヌクレオチドで置換したもの）は合成した。

このオリゴヌクレオチドを用いて、Ｋｕｎｋｅｌの方法２１によりＧＨエンハン サ−中の塩基−１７７から−１６６を欠失させた。ＣＡＴ活性は薄層クロマトグ ラフィー１ｇ後にメチル化クロラムフェニコール誘導体のラジオアッセイにより 測定した。プライマー伸長はＥ　ｌ５ｈｏｌｔｚらの方法＋２を用いた。

−２ＡおびＢ゛ ビオチン−１１−ｄＵＴＰを含むオリゴヌクレオチド７０−ブへの７３受容体の 結合、Ａ、ＧＨ５’−フランキング配列へのＴ、受容体結合を検定するために用 いた２つのオリゴヌクレオチドプローブの模式図、太い線、相補的３′末端を有 する合成オリゴヌクレオチド、細い線、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼの大フラグメ ントを用いて５′突出部を修復することにより組込まれた塩基、星印、ビオチン −１１−ｄＵＴＰ残基、ＢａｍＨＩおよびＢｇｌｍの制Ｗ敵位も示される。Ｇ２ ０９−１４６およびＧ１８６−１５８は図示した５′および３′境界をもつラッ トＧＨエンハンサー配列を含む、Ｂ１種々のビオチン−１１−ｄＵＴＰ含有オリ ゴヌクレオチドプローブによるＧＣ２核抽出物からの”’Ｉ−Ｔ：＋標識Ｔ、受 容体の沈澱、Ｐ−ＥＧＦ、ＰＢＩ−Ｂ、ＰＨ１−ＢおよびＰＨ４−Ｂはそれぞれ １０．１１．１０および１０個のビオチン−１１−ｄＵＴＰを含む６８．５３． ５５および５８塩基対のオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチ ドはＧ２０９−１８６に含まれるラットＧＨ配列に対して明らかに相同性を欠く ラットプロラクチン遺伝子の５′フランキング配列を含む、沈澱は１００フェム トモルの各プローブを用いて行った。ビオチニル化オリゴヌクレオチドプローブ の不在下でストレプトアビジンアガロースビーズに付随する＋２５Ｉ活性を示す バックグラウンドは、本実験において１４００ｃｐｍであった。結果は３通りの ポイントの平均値および標準誤差としてプロットした０本実験は１２Ｊ−Ｔ３結 合の配列特異性を調べる６通りの実験を表す。

第Ｖｒ　−２（ＡおよびＢ　゛の　 核はＤ　ｉｎｇｈａｍらの技法２２に従ってフットＧＣ２細胞から分離し、そし て０．６Ｍ　ＫＣＩ、１０−Ｍヘベス（ｐＨ７，９）、０．５ｍＭジチオトレイ トール（ＤＴＴ）、０．２ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ、２０μＭ　Ｚｎ　Ｃ１２中で 氷上にて３０分間塩抽出した。その核抽出物は緩衝液Ａ（５μＭＭＣＩ、２０ｍ Ｍ　ＫｓＰ　Ｏ−（ｐＨ７，４）、１ｍＭ　ＭｇＣｂ、１ｍＭ７９−メルカプト エタノールおよび２０％グリセロール）中でゲル枦遇することにより脱塩し、− ７０°Ｃで貯蔵した。ＧＣ２核受容体に対するＴ、の特異的結合の検定は５ａｓ ｕｅｌｓら２コによって記載されたように行われたが、ただしＴ、結合反応は２ ００Ｍｇ／ｄポリ（ｄＩ−ｄＣ）の存在下に緩衝液Ａ中で実施した。ＤＮＡ結合 を検定するために、初めに核抽出物を１μＭの＋２’　Ｉ　−Ｔ、（２２００Ｃ ｉ／ｍｍｏｌ）と２２℃で２０分間インキュベートして、Ｔ、受容体を高い比活 性へ標識した。その後、核抽出物のアリコート（４０Ａｔ１）は２００Ｉｉｌポ リ（ｄＩ−ｄＣ）の存在下にビオチニル化プローブと共に２２”Ｃで４０分間イ ンキュベートした。タンパク質−ＤＮＡ複合体はアガロースビーズ（ＢＲＬ）に 結合したストレプトアビジンを加えることにより沈澱させた。アガロースビーズ をベレットとなし、緩衝液Ａ（ｌｉｌ）で３回洗い、その後１２５）活性につい て検定した。

１１１１区 ＧＣ２核抽出物によるラットＧＨエンハンサー因子のＤＮアーゼＩフットプリン ト、アンチセンス鎖中の１６ｂｐ保護領域が示される。ＣＡＰ部位から一１１０ 位ないし一１４０位まで延びる第二ワットプリントもはっきりと示される。レー ンＡ−Ｃ１それぞれ２４．１２および４μｇのＤＮアーゼＩを用いた、ＧＣ２核 抽出物とのインキュベーション後の標ｉＧＨエンハンサ−の消化、レーンＤ−Ｆ 、ＧＣ２核抽出物の不在下での２４．１２および４μ２のＤＮアーゼＩによる標 識ＧＨエンハンサ−の消化、レーンＧおよびＭ、マーカー、表示した配列はフッ トプリントされた領域内のセンス鎖の配列に相当する。

第１１」■シュ友恭− 成長ホルモンエンハンサ−のアンチセンス鎖は、ｐｃｐｏのＢａｍＨＩ消化およ びウシ腸ホスファターゼ処理後に、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてその ５′末端を３’Ｐ−ｄＡＴＰで標識した。エンハンサ−フラグメントはＸｈｏＩ 消化でｐＧＰＯから切り離し、アガロースゲル電気泳動で精製した。標識ＧＨエ ンハンサーフラグメント（１ｎｌＦ、８ｆｍｏｊりは１２℃ｍｏ１の特異的Ｔ３ ３受容結合活性を含む２５μｌのＧＣ２核抽出物とインキュベートした。ＤＮＡ 結合反応は緩衝液Ａ中２２℃で３０分間行った。

ＤＮアーゼ消化は最終容量５０μ！中で上記濃度のＤＮアーゼ■を用いて２２℃ で２分間行った。この反応は２０μｌの５０５Ｍ　ＥＤＴＡおよび１％ＳＤＳで 停止させた。試料はフェノール／クロロホルムで一回抽出し、エタノール沈澱さ せ、そして標準１０％塩基配列決定用ゲル上で電気泳動により分析した。

１１二±圀 ラット下垂体細胞Ｔコの６４ｂｐおよび２９ｂｐの５′側ＧＨ配列を含むオリゴ ヌクレオチドへの結合、　１００ｆｓｏ１のＧ２０９−１４６、Ｇ１８６−１５ ８またはＰ−ＥＧＦとインキュベートし、第ＶＩ　−２（Ａ）および（Ｂ）に記 載の如く結合について検定した。また、ｙｓＳ−メチオニンで標識したｈｅ−ｅ ｒｂ−Ａ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳産物＜４μｌ＞は、１０ｎＭ　Ｔｓの存在下で のこれらのオリゴヌクレオチドへの結合について検定した。　ｈｅ−ｅｒｂ−Ａ 　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳産物を調製するために、ｂｅ−ｅｒｂ−Ａ相補的ＤＮＡ のキャップ構造を６つ−ＲＮＡ転写物を用いて、ウサギ網状赤血球溶解液系１６ における翻訳をプログラミングした。アンチセンスｈｅ−ｅｒｂ−Ａ　＊ＲＮＡ を組み入れた網状赤血球溶解液は、いずれのＧＨ−プローブにも測定可能な結合 活性を示さなかった（データは示さず）、結果は３通りのポイントの平均値およ び標準誤差としてプロットした。示した実験は、２種類のＧＨプローブへのＧＣ ２核Ｔ３受容体の結合を比較する３回の実験、およびｈｅ−ｅｒｂ−Ａ　ｉｎｖ ｉｔｒｏ翻訳産物の結合を調べる４回の実験を代表するものである。

■、Ｆ、　の　で　した 、ｌ、　Ｅ　ｖａｎｓ　、　Ｒ、１−グ　、　、Ｂ　ｉｒｎｂｅｒｇ、　Ｎ　、 　Ｃ、、ａｎｄ　Ｒｏｓｅｎｆｅ　Ｉｄ、　ｌり　、Ｇ　、@。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７９ニア６５９−７６６３（ １９８２）−２、Ｄ　ｉａｍｏｎｄ、Ｄ　、Ｊ　、、ａｎｄ　Ｇｏｏｄｍａｎ、 Ｈ、Ｍ　、、Ｊ　、Ｍｏ１ｅｅ、Ｂ　ｉｏｌ　、。

１８１　：４ｌ−６２（１９８５）　。

３　、　Ｓ　ｐｉｎｄｌｅｒ、　Ｓ　、Ｒ、、Ｍｅｌ　Ｉｏｎ、　Ｓ　、Ｈ、、 ａｎｄ　Ｂａｘｔｅｒ、　Ｊ　、Ｄ　、。

Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、　Ｃｂｅｓ、　、２５７：１１６２７−１１６３２　（１ ９８２）　。

４　、Ｙａｆｆｅｅ、　Ｂ　、Ｍ　、、ａｎｄ　Ｓａ＋＊ｕｅｌｓ、Ｈ、Ｈ、、 Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、ｃｈｅｍ、。

２５９：６２８４−６２９１　（１９８４）。

５　、Ｌａｒｓｅｎ、　Ｐ　、Ｒ、、Ｈａｒｎｅｙ、　Ｊ　、Ｗ、　、ａｎｄ　 Ｍｏｏｒｅ、Ｄ　、Ｄ　、。

Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ　、Ｃｈｅｍ、　、２６１：１４３７３−１４３７６（１９ ８６）　。

６　、Ｆ　Ｉｕｇ、　Ｆ　、、ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、ｃ　ｈｅ ｍ、、２８２：６３７３−６３８２（１９８７）。

７　、Ｃａ５ａｎｏｖａ、　Ｊ　、、Ｃｏｐｐ、　Ｒ、Ｐ　、、　Ｊ　ａｎｏｃ ｋｏ、　Ｌ、、ａｎｃｊ　Ｓ　ａｍｕｅｌｓ。

Ｔ−１、Ｈ、、Ｊ　、Ｂ　ｉｏｌ　、Ｃｈｅｍ、、２６０：１１７４４−１１７ ４８（１９８５）。

８、Ｃｒｅｗ、Ｍ、、ａｎｄ　５ｐｉｎｄｌｅｒ、Ｓ、Ｒ，、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ ｈｅｍ、。

２６１　：５０１８−５０２２（１９８６）　。

９　、Ｓａｐ、Ｊ　、、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、３２４：６３５−６４０ （１９８６）。

１０、Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ、Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、、ＮａＬｕｒｅ、３２４：６ ４１−６４６（１９８６）。

１１、Ｎｅ１ｓｏｎ、Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、３２２：５５７−５ ６２＜１９８６）。

１２、Ｅｌｓｈｏｌｔｚ、Ｈ，Ｐ、、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２３４： １５５２−１５５７（１９８６）。

１３、Ｗｅｓｔ、Ｂ、Ｌ、、ｅｔ　ｍｌ、、Ｍｏ１ｅｅ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、 。

７：１１９３−１１９８（１９８７）　。

１４、Ｃａｔａｎｚａｒｏ、　Ｄ　、　Ｆ　、、Ｗｅｓｔ、　Ｂ　、Ｌ　、、　 Ｂａｘｔｅｒ、　Ｊ　、Ｄ　、、ａｎｄＲｅｕｄｅｌｈｕｂｅｒ、　Ｔ　、　Ｌ 　、　、　Ｍｏ１ｅｅ、　Ｅ　ｎｄｏ、　、　１　：９Ｏ−９６（１９８７）　 。

１５、Ｎｙｂｏｒｇ、Ｊ　、Ｋ　、、ａｎｄ　５ｐｉｎｄｌｅｒ、Ｓ　、Ｒ，、 Ｊ　、Ｂ　ｉｏｌ、ｃｂｅｓｓ−。

２６１　：５６８５−５６８８（１９８６）　。

１Ｂ、　Ｔｏｐｏｌ、Ｊ、、Ｒｕｄｅｎ、Ｄ、Ｍ、、ａｎｔＪ　Ｐａｒｋｅｒ、 Ｃ，Ｓ、、Ｃｅ１ｌ。

４２：５２７−５３７（１９８５）。

１７、　Ｒｅｉｎｂｅｒｇ、Ｄ、、Ｈｏｒｉｋｏｓｂｉ、Ｍ、、ａｎｄ　Ｒｏｅ ｄｅｒ、ＲＪ、。

Ｊ　、Ｂ　ｉｏｌ　、Ｃｈｅｍ、、２６２：３３２２−３３３０（１９８７）。

１８、　Ｍｃｋｎｉｇｈｔ、Ｓ、、ａｎｄ　Ｔｊｉａｎ、Ｒ，、Ｃｅ１ｌ、４６ ：７９５−８０５（１９８６）。

１９、　Ｇｏｒｍａａ、Ｃ、Ｍ　、、ＭｏｆｆａＬ、　Ｌ　、　Ｆ　、　、ａｎ ｄ　Ｈｏｗａｒｄ、　Ｂ　、　Ｈ、。

Ｍｏ１ｅｃ、Ｃｅｌ　１．Ｂ　ｉｏｌ、、２：１０４４−１０５Ｈ１９８２）　 。

２０、　Ｌｉｎｎｅｙ、Ｅ、４ｎｄ　Ｄｏｎｅｒｌｙ、Ｓ、Ｃｅ１１，３５：６ ９３−６９９　（１９８３）。

２１、　Ｋｕｎｋｅｌ、Ｔ、、Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ 。

８２：４８８−４９２　（１９８５）。

２２、　Ｄ　ｉｎｇｈａｒａ、　Ｊ　、Ｄ　、　、　Ｌｅｂｏｖｉ　ｔｚ、　Ｒ ，Ｍ　、　、ａｎｄ　Ｒｏｅｄｅｒ、Ｒ、Ｇ　、　。

Ｎｕｅｌｅｉｃ　Ａｅｉｄｓ、Ｒｅｓ、、１１：１４７５−１４８９（１９８３ ）−２３、５ａａｓｕｅ！ｓ、Ｈ，Ｈ，、Ｔｓａｉ、Ｊ、Ｓ、、Ｃａ５ａｎｏｖ ａ、Ｊ、、ａｎｄＳ　Ｌａｎ１ｅｙ、　Ｆ　、　、　Ｊ　、ＣＩ　ｉｎ　、　Ｉ 　ｎｖｅｓｔ、　、５４：８５３−８６５（１９７４）　。

衷致０１１ ｒ＠乳動物中枢神経系で発現された新規な甲状腺ホルモン受容体の同定 蚤−ムー且！ ラット脳メツセンジャーＲＮＡから誘導された相補的ＤＮＡクローンは、ヒト甲 状腺ホルモン受容体遺伝子に対する相同性に基づいて分離された。この相補的Ｄ ＮＡの発現は甲状腺ホルモンに高い親和性を示す結合タンパク質をもたらす、塩 基配列の分析および特定のヒト遺伝子座へのこの遺伝子のマツピングは、複数の ヒト甲状腺ホルモン受容体の存在を示す、この遺伝子からのメツセンジャーＲＮ Ａは組織特異的であり、中枢神経系において最高レベルで発現される。

！ユｌ−装置 甲状腺ホルモンは高等を椎動物の多くの組織において発生学的および生理学的応 答の複雑な機構に関与している（１）、それらの多種多様な作用には重要な代謝 酵素、ホルモンおよび受容体の調節が含まれる（２）、甲状腺ホルモンの作用は 油受容体により仲介され、標的細胞による特定遺伝子の発現を調節する（３−５ ）、これらの性質はステロイドホルモンとそれらの受容体との相互作用に類似し ており、最近観察されたステロイドホルモン受容体と甲状腺ホルモン受容体との 構造類似性に合致している（実験の部■を参照）。

、０．２　ホルモンＰ−六　ＤＮＡの 甲状腺ホルモン作用の多様性にもかかわらず、一般に甲状腺ホルモン機能は単一 の高親和性該受容体を介して起こることが認められている。しかしながら、ｖ− ｅｒｂ−Ａ腫瘍遺伝子産物の細胞相同体としての甲状腺ホルモン受容体の最近の 同定（実験の部■および文献７を参照）は、ヒ１〜染色体３および１７上の複数 のｃ−ｅｒｂ−Ａ遺伝子の先の同定（実験の部■および文献８を参照）と合わせ て、複数の甲状腺ホルモン受容体の存在を示唆している。複数の甲状腺ホルモン 応答の基礎をなすｔｌ＆楕が、構造的に異なる甲状腺ホルモン受容体の発現から 誘導されうる可能性を調べるために、我々はこれらの関連遺伝子座の１つの産物 をコードする相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）クローンを分離した。

推定上の神経細胞型甲状腺ホルモン受容体は、ヒト甲状腺ホルモン受容体ｃＤＮ Ａの１５００ｂｐフラグメントを用いて、ラット脳メツセンジャーＲＮＡ（ｍＲ ＮＡ）から作製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより分離 された。（文献６として発表した実験の部■を参照されたい、）約１０６個のフ ァージから３個の陽性クローンを分離し、それらのうちで最も大きいもの、ｒｂ ｅＡ１２、の完全ヌクレオチド配列を決定したく第■−１（Ｂ）図）、この配列 は２０７９ｂｐの鎖長であり、ヌクレオチド位Ｗ３２５にイニシエーターメチオ ニンコドンおよびヌクレオチド位置１５５４にターミネータ−コドンを有する１ ２３０ｂｐの長いオープン・リーディング・フレーム（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎ ｇ　ｆｒａｍｅ）を含む、このオープン・リーディング・フレームは推定上のイ ニシェーターメチオニンの上流に３つの短いオープン−リーディング・フレーム を含む少なくとも３２０ｂｐの５′非翻訳領域によって先行され、４１０個のア ミノ酸残基から成るタンパク質（計算した分子量４５ＫＤ）をコードしている。

ホルモン罵”　タンパク　との ｒｂｅＡ１２からの推定アミノ酸配列とヒト甲状腺ホルモン受容体のアミノ酸配 列（実験の部■を参照）との比較により、これらの２種類のタンパク質は異なる アミノ末端をもっことが分った（第■−２図）、神経細胞タンパク質の最初の４ １個のアミノ酸とヒト甲状腺ホルモン受容体の最初の９０個のアミノ酸は有意な 相同性を示さず、一方カルボキシル末端の３６７個のアミノ酸は７５％のヌクレ オチド同一性と８２％のアミノ酸同一性を共有している。ラットのタンパク質は 予告された大きさおよび相同性の両方の点でニワトリの甲状腺ホルモン受容体（ ７）とより一層関連が深く、８２％のヌクレオチド同一性と８９％のアミノ酸同 一性を共有している。参考として、ニワトリ甲状腺ホルモン受容体は以前に分能 されたｅｒｂ−Ａ遺伝子との相同性ゆえにアルファ（ｃＴＲα）と称せられそし てヒト甲状腺ホルモン受容体はベータ（ｈＴＲβ）と称せられる。ラット神経細 胞型はニワトリの受容体とより一層関連が深いので、それはアルファ（ｒＴＲα ）と呼ばれている。

ステロイドホルモン受容体との類似性により、甲状腺ホルモン受容体のシスティ ンに富む領域はＤＮＡ結合ドメインであると予想される（実験の部■および■を 参照：また文献１０を参照）。

この領域において、ｒＴＲαタンパク質はｅＴＲαタンパク質と９７％のアミノ 酸同一性と有し、そしてｈＴＲβと９０％のアミノ酸同一性を有する。これらの タンパク質はまた、ステロイド受容体から類推して、ホルモン結合ドメインであ ると思われるカルボキシル末端部分において十分に保存されている（実験の部■ および文献１１を参照）、ｒＴＲαのこの領域はｃＴＲαと９４％のアミノ酸同 一性を示し、そしてｈＴＲβと８５％のアミノ酸同一性を示す。

■、Ｅ、　しい　゛　ホルモンμ′　の１塩基配列データに基づくと、我々が分 離したｃＤＮＡは以前に同定されたヒト甲状腺ホルモン受容体とは異なるタンパ ク質をコードすると思われる（実験の部■を参照）、神経細胞クローンが別の遺 伝子産物であることを立証するために、ｒｂｅＡ１２を用いてサザンプロットお よび染色体分析によりヒト相同体と同定した。種々の制限酵素で消化したヒト胎 磐ＤＮＡはアガロースゲル上で分にし、ニトロセルロースへ移行させ、そしてラ ットまたはヒトＴＲ特異的プローブ（それぞれの遺伝子の重複領域から誘導され たもの）とハイブリダイズさせたく第■−３（Ａ）および（Ｂ）図）。試験した 全ての制限酵素に対して異なるハイブリダイゼーションパターンが観察され、こ のことは２つのｃＤＮＡが全く別の遺伝子であることを示している。ｒｂｅＡ１ ２由来の同じプローブは、ヒトリンパ様細胞から調製したレーザー還別染色体と ハイブリダイズさせたく第■−３（Ｃ）図）、ハイブリダイゼーションは染色体 １７にのみ観察され、ｃ−ｅｒｂ−Ａ遺伝子をヒト染色体１７に局在化した以前 のマツピング実験と一致した（８）、これはヒト染色体３に存在するｈＴＲβと ｒＴＲαとを区別している（実験の部■を９照）。

１−凡工凡１夫牧 ｒＴＲα　ｃＤＮＡが機能的な受容体タンパク質をコードするか否かを調べるた めに、発現実験を行った。ｒＴＲの遺伝子の産物は初めにｉｎ　ｖｉｔｒｏｉ写 それに続（ｉｎ　ｖｉｔｒｏｉ訳により同定された。　ｉｎ　ｖｉｔｒｏｉ写の ために、ｒｂｅＡ　１２のＥｃｏＲＩ挿入物は、発現ベクターｐＧＥＭ１にサブ クローニングすることによりバクテリオファージＳＰ６プロモーターへ連結した 。第２構築物のｒｂｅＡ　１２　Ｂは翻訳効率を高める目的で作製された。

ヌクレオチド位１９７までの５′非翻訳領域は欠失させて、この領域内の３つの 短いオーブン・リーディング・フレームのうち２つを除去した。ＳＰ６ボリメラ ーゼを用いて合成した転写物はウサギ網状赤血球溶解液と共にｉｎ　ｖｉｔｒｏ ′″Ｃ翻訳し、［３ＳＳ］メチオニン標識産物を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ ル上で分析した（第■−４（Ａ）図）、約５２．４８．３５および３３ＫＤの４ 種のタンパク質がセンス鎖を翻訳したときだけ観察された。

同じ４種のバンドがｒｂｅＡ　１２およびｒｂｅＡ　１２　Ｂについて観察され た。これらの翻訳産物はその後甲状腺ホルモン結合を試験するために使用した。

■、Ｇ、ホルモンＰム 甲状腺ホルモン結合は［１２ＳＩコ３，５．３’−トリヨード−Ｌ−チロニン（ ”’　■−’ｒ、）を用いて測定した一ｒＴＲαの特定タンパク質を含む試料の みがＴ、結合と示した。ホルモン親和性はスカッチャード分析により決定し、解 離定数（Ｋ　ｄ）２．９　ｘ　１０−　”Ｍを与え（第■−４（Ｂ）図）、これ はｈＴＲβタンパク質について観察されたＫｄ値（５Ｘ　１０−”Ｍ）と類似す るが＜４．５＞、ｅＴＲαタンパク質に対して測定されたＫｄ値（２，Ｉ　Ｘ　 １０−　”〜３．３Ｘ　１０−　”　Ｍ）よりも低かった（実験の部■を参照） 、得られたＫｄ値の差異は使用した検定系が異なることによるのかも知れない。

競合実験において、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ９訳したｒＴＲαタンパク質はｈＴＲβタ ンパク質と同じ＜Ｌ　Ｔｓおよびし一チロキシン（Ｌ−Ｔ、）に対して特有の親 和性を示したが、３，５”、３°−トリヨードチロ酢酸（ＴＲＩＡＣ）に対して は異なるパターンを示した（第■−４（Ｃ）図）、ＴＲＩＡＣはｈＴＲβタンパ ク質の場合Ｔ、結合に対して比較的良好に競合したが、ｒＴＲαタンパク質への 結合に対してはＴ、とほぼ同程度に競合した。ｈＴＲβおよびｃＴＲαのタンパ ク質の場合のように、過剰のアルドステロン、エストロゲン、プロゲステロン、 テストステロンまたはビタミンＤ、によるｒＴＲαタンパク質へのＴ、結合に対 する競合は見られなかった。従って、我々は以前に開示された甲状腺ホルモン受 容体と類似した結合特性をもつが、それとは同一でない甲状腺ホルモン受容体を 単離したと思われる（実験の部■および文献７を参照）。

■、Ｈ１組特　験 甲状腺ホルモンに対する代謝応答のＭｉ織持持異性より、この甲状腺ホルモン受 容体は特定の組紐において発現されるものかも知れないと考えた。こうして、ｒ ＴＲα遺伝子の発現パターンがノザンプロット分析により調べられた（第■−５ 図）、いろいろなラット組織から分離した全ＲＮＡはホルムアルデヒド−アガロ ースゲル上で分画化し、ニトロセルロースへ移行させ、そしてサザンプロット分 析および染色体マツピングの際に使用したものと同じｒｂｅＡ　１２フラグメン トとハイブリダイズさせた。２．６Ｋｂ　ＲＮＡが肝臓と除いて試験した全ての 組織に観察された。このＲＮＡは下垂体や筋肉にも存在し、そしてＧＣ、ラット −１およびＰＣＩ２細胞株において発現される。デンシトメーター走査は、ｒＴ Ｒαの発現レベルが試験した他のどの組織よりも脳において１０〜２０倍高いこ とを示した。約５．ＯＫｂと６．ＯＫｂの別の２種類のＲＮＡが全ての組織にほ ぼ等しい量で存在するが、それらは２．６Ｋｂ　ＲＮＡよりもはるかに少量であ る。これらのバンドは２．６Ｋｂ　ＲＮＡの前駆体または関連遺伝子の産物であ りうる。

■、■、論議および結論 第２の哺乳動物甲状腺ホルモン受容体の分離は、以前の生化学的研究が単一の甲 状腺ホルモン受容体よりも多くの受容体の存在を予告していないので、驚くべき ことである。振り返ってみると、多くの臨床生理学的研究は複数の受容体の存在 を示すものとして解釈することができる０機能的異質性の１つの形態は、家族性 甲状腺ホルモン抵抗（甲状腺ホルモンに対する末梢応答が喪失または減少するが 、神経細胞機能は維持される）を有する患者の確認により示唆された（１２．１ ３）、さらに、循環性甲状腺ホルモンの低レベルと関連した苛酷な発生学的作用 （フレチン病）は、神経系に強く影響を与えるタイプと周辺機能により胴的に作 用するタイプとに分類された（１３．１４＞。

構造的に異なる形の甲状腺ホルモン受容体の存在を証明したのに加えて、我々が 同定した受容体はラット中枢神経系において高レベルで発現される＊　ｉｎ　５ ｉｔｕハイブリダイゼーシヨンを利用する予備実験は海馬、視床下部、大脳皮質 および扁桃での高レベル発現を明らかにした。ＲＮＡハイブリダイゼーション実 験もまた小脳において異例に高いレベルを示す、甲状腺ホルモンは初期の脳発生 において重要な役割を演することが知られているが（１４）、この高レベル発現 は予期されないことである。

なぜならば、生化学的研究により、脳は他の多くの組織よりも甲状腺ホルモン受 容体が少なく（５，１６）、しかも成人の脳はリン酸脱水素酵素活性によって甲 状腺ホルモンに応答しないことが示されたからである。　（１７）。

発現実験からの第２の興味ある結果は、この転写物が肝臓に存在しないというこ とである。肝臓は通常甲状腺ホルモン受容体が分離される組織である。この不在 はさらに別の形の甲状腺ホルモン受賽体の存在と暗示している。この提案は、肝 臓と心臓に薬理学的に区別しうる甲状腺ホルモン応答が存在することを示すＵｎ ｄｅｒｗｏｏｄらのデータ（１８）と一致するであろう、さらに、ＤＮＡハイブ リダイゼーション実験からのデータは、吐乳動物甲状腺ホルモン受容体のｃＤＮ Ａクローンとハイブリダイズする複数の遺伝子座の存在を示し、異なる関連遺伝 子座が５つも存在しうろことを示唆する（実験の部■および文献８を参照）、こ れらの遺伝子座のいくっがは恐らく別の機能分子をコードすると思われ、このこ とは発生およびホメオスタシス機能をコントロールする遺伝子の重なり合ったネ ットワークな協調的に調整する甲状腺ホルモン受容体のファミリーの存在３うが がわせる。

■、Ｊ、の部■に　る面のテ細を説Ｂ 第■−１（ＡおよびＢ・。

ラット脳からの甲状腺ホルモン受容体ｅＤＮＡの制限地図、ならびにヌクレオチ ドおよび推定アミノ酸配列、（Ａ）ラット脳からの甲状腺ホルモン受容体ｃＤＮ Ａの模式図；通常の制限エンドヌクレアーゼ切断部位をいくつが示す。斜線ボッ クスは推定されたコード領域を示す、ハイブリダイゼーション実験で用いた５０ ０ｂｐ　Ｐ　ｖυ■フラグメント（ヌクレオチド位置６０７−１１１３に相当す る）は制限地図の下に実線で示す、　（Ｂ）ｒｂｅＡ　１２の完全なヌクレオチ ド配列を、長いオープン・リーディング・フレー上の推定アミノ酸配列と共に示 す、５′非翻訳領域内の３つの短いオーブン・リーディング・フレームは肉太の 活字で示され、終結コドンにはアンダーラインが引いである。クローンｒｂｅＡ １２はニック・トランスレーションしたプローブとしてｐｈｅＡ４（Ｓｉｇｍａ 社）の全ＥｃｏＲＩ挿入物を用いて、Ｊ　、　Ａｒｒｉｚａから得たラット脳ｃ ＤＮＡライブラリーからの約１０８個のファージなスクリーニングすることによ り分離した（１９）、３個の陽性クローンが分離され、そのうちで最も大きいも の（ｒｂｅＡ、　１２　）の完全ヌクレオチド配列をＭａｘａｍ　ａ　Ｇ　１ｌ ｂｃｒｔの化学的切断法（２０）により両鎖について決定した。

呆立二ｌ圀 ラット甲状腺ホルモン受容体（ｒ　Ｔ　Ｒα）タンパク質とヒト甲状腺ホルモン 受容体（ｈＴＲβ）およびニワトリ甲状腺ホルモン受容体（ｃＴＲα）タンパク 質との略図による比較、ボックス上の番号はアミノ酸残基を示し；ボックス内の 数字は閉じた領域内のｒＴＲαタンパク質とのアミノ酸同一性のパーセントを示 す、ＤＮＡはヒトグルココルチコイド受容体くアミノ酸４２１から４８６まで） との類似性から推定されたＤＮＡ結合ドメインを表し、一方Ｔ、／Ｔ、は推定上 のホルモン結合ドメインを表す。

−Ａ　Ｂお　Ｃ： ｒＴＲα遺伝子のサザンプロット分析およびヒト染色体局在化、ヒト胎笈ＤＮＡ を種々の制限酵素で消化し、０．８％アガロースゲル上で分離し、ニトロセルロ ースへ移行させ、ＤＮＡ結合領域を含むｒｂｅＡ　１２由来の５００ｂｐ　Ｐｖ ｕＩ［フラグメント（Ａ）またはｂＴＲβ由来の４５０ｂｐ　５ｓｔＩフラグメ ント（実験の部■と９照）（Ｂ）とハイブリダイズさせた０両プロットは５０％ ホルムアミド、５ＸＳＳＰＥ（０，１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．ＯＩＭＮ　ａ　Ｈ２ Ｐ　Ｏ，、Ｏ，ＯＯＩＭ　ＥＤＴＡ）、１×デンハート溶液、０．１％ＳＤＳ、 およびサケ精子ＤＮＡ（１００μｙ／ｘｌ）中４２℃でハイブリダイズさせ、２ ＸＳＳＣ（ｓｔａｎｄａｒｄ　５ａｌｉｎｅ　ｃｉｔｒａｔｅ）および０．１％ ＳＤＳを用いて６８℃で洗浄した。ラムダＨｉｎｄｌ［マーカーのサイズをキロ 塩基対で示す、（Ｃ）、ｒＴＲα遺伝子の染色体マツピング、ヒトリンパ球染色 体をレーザーサイトフルオロメトリー（２１）で分離し、上記条件と同じ条件下 でｒｂｅＡ１２の５００ｂｐ　Ｐｖｕ［フラグメントとハイブリダイズさせた。

■−４（Ａ　（ＢおびＣ゛ ｒＴＲαのｉｌ　ｖｉｔｒｏＲ訳および甲状腺ホルモン結合、（Ａ）ｒＴＲαは ｉｎ　ｖｉｔｒｏで転写し、ウサギ網状赤血球溶解液中で翻訳した。［”Ｓ］メ チオニン標識産物は７．５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、フル オログラフィーで視覚化した。

レーン１、添加ＲＮＡなし；レーン２、全５′非翻訳領域を含むｒｂｅＡ　１２ 　；レーン３．９７ｂｐの５゛非翻訳配列のみを含むｒｂｅＡ１２Ｂ、タンパク 質マーカーのサイズ：ウシ血清アルブミン、６６．２Ｋ　Ｄ　；卵アルブミン、 ４５ＫＤ；カルボニックアンヒドラーゼ、３１　ＫＤ、　（Ｂ）ｉｎ　ｖｉｔｒ ｏＨ訳したｒＴＲαに対する１２５ＩＴｙ結合のスカツチャード分析、　ｉｎ　 ｖｉｔｒｏ翻訳したｒｂｅＡ１２Ｂ転写物を含む溶解液は、”’Ｉ−Ｔ：ｌの異 なる濃度で結合したホルモン量を測定することにより、甲状腺ホルモン結合活性 について検定した。　Ｋｄ＝２．．９Ｘ１０−”Ｍ、（Ｃ）ｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻 訳したｒＴＲαへの＋２’Ｉ−Ｔ）結合に対する甲状腺ホルモン類似体の競合、 　ｒｂｅＡ　１２　Ｂプログラム化溶解液からの試料は、標識ホルモンと競合さ せるべく次第に増加する濃度の未標識甲状腺ホルモンまたは類似体と混合した。

７！異的に結合した＋２５１−Ｔ、はＭ合化合物の濃度に対してプロットする。

４つの別々の実験において同じ競合パターンが観察された。　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ 転写／翻訳およびホルモン結合は記載した通りに行った（２２゜２３）、白の円 はＴＲＩＡＣ１黒の円はＬ　Ｔ３、黒の三角形はｒ　Ｔ　Ｒａｍ　ＲＮ　Ａの組 織分布、全ＲＮＡはグアニジンチオシアネートを用いて種々のラット組織から分 離しく２４）、１％アガロース／ホルムアルデヒドゲル上で分高２し、ニトロセ ルロースへ移行させ、そしてｒｂｅＡ　１２由来のニック・トランスレーション した５００ｂｐ　ＰｖｕＩ［ｌフラグメントとハイブリダイズさせた６組織型お よび負荷した全ＲＮＡ１を各レーンの上に示す。

ＣＨＯ−Ｂのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（試験したすべての組織において等しいレベルで 発現されたチャイニーズハムスター卵巣細胞ｍＲＮＡ）（２５）を内部標準とし て使用した。２８Ｓおよび１８ＳリポソームＲＮＡの位置を示す。

〜、に、　拳のハ１で　した １、Ｗｏｌｆｆ　、Ｅ、　Ｃ，ａｎｄ　Ｗｏｌｆｒ、Ｊ、　ｉｎ　Ｔｈｅ　Ｔｈ 　ｒｏｉｄＧｌａｎｄ、Ｐｉｔｔ−Ｒｉｖｅｒｓ、Ｒ，Ｖ、　ａｎｄ　Ｔｒｏｔ ｔｅｒ、Ｗ、　Ｒ，。

Ｅｄｓ、　（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９６４）、ｖｏｌ、 　１　、ｐｐ−２３７−２８２；　Ｓｃｈｗａｒｔｚ、Ｈ，Ｌ、　、ｉｎ　Ｍｏ １ｅｃｕｌａｒＢａｓｉｓ　ｏｆ　Ｔｈ　ｒａｉｄ　Ｈｏｒｔａｏｎｅ　Ａｃｔ ｉｏｎ、　Ｏｐｐｅｎｈｅｉｗａｅｒ。

Ｊ、　Ｈ，ａｎｄ　Ｓａｍｕｅｌｓ、Ｈ，Ｈ，、Ｅｄｓ、　（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１３）、ｐｐ、　４１３−４４４゜２、　Ｅ ｂｅｒｈａｒｄｔ、Ｎ、　Ｌ、、Ａｐｒｉｌｅｔｔｉ、Ｊ、　Ｗ、、ＢａｘＬｅ ｒ。

Ｊ、　Ｅ、、　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｈｏｒ ｍｏｎｅｓ。

Ｌｉｅｗａｃｋ、Ｇ、、Ｅｄ、　（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙ ｏｒｋ。

１９８０）、ｖｏｌ、７．ｐｐ、　３１１−３９４゜３、　０ｐｐｅｎｈｅｉｍ ｅｒ、Ｊ、　Ｈ，、Ｋｏｅｒｎｅｒ、Ｄ、、Ｓｃｈｗａｒｔｚ、Ｈ，Ｌ、。

５ｕｒｋｓ、Ｍ、　Ｊ、　Ｊ、、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎａｌ　Ｍ ｅｔａｂ、。

３５：３３０（１９７２）；Ｓａｍｕｅｌｓ、Ｈ，Ｈ，ａｎｄ　Ｔｓａｉ、Ｊ、 　Ｓ、。

４、Ｔａｔａ、Ｊ、　Ｒ，ａｎｄ　Ｗｉｄｎｅｌｌ、Ｃ，Ｃ，、Ｂｉｏｃｈｅｍ 、Ｊ、。

９８：６０４（１９６６）；Ｍａｒｔｉａ！、Ｊ　、　Ａ、、Ｂａｘｔｅｒ、Ｊ 　、　Ｄ、。

Ｇｏｏｄｍａｎ、Ｈ，Ｍ、、Ｓｅｅｂｕｒｇ、Ｐ、Ｈ，、Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｅｉ、　Ｕ、Ｓ、　Ａ、、７４：１８１６（１９７７）；Ｅｖａｎ ｓ。

Ｒ，Ｍ、、Ｂｉｍｂｅｒｇ、Ｎ、Ｃ，、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ、Ｍ、Ｇ、、１ｂｉ ｄ、。

７９．７６５９（１９８２）。

５、　Ｓｃｈｗａｒｔｚ、Ｈ，Ｌ、、ａｎｄ　Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒ、Ｊ、Ｈ ，。

旦上嫡工順復四江、１０３：２８７（１９７８）　。

６、Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ、Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、３２４：６ ４１（１９８６）。

７、Ｓａｐ、Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　１ｂｉｄ、、　ｐ、　６３５゜８、　５ｐ ｕｒｒ、Ｎ、　Ｋ、、　ｅｔ　ａｌ、　ＥＭＢＯＪ、、　３：１５９（１９８４ ）；　Ｄａｙｔｏｎ、Ａ、Ｊ　、　ｅｔ　ａｌ、Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ。

Ｊｈａｎｗａｒ、Ｓ、Ｃ，Ｃｈａｇａｎｔｉ、Ｒ，Ｓ、Ｋ、、Ｃｒｏｃｅ。

Ｃ，Ｍ、、Ｓｏｍａｒｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｍｏ１．　Ｇｅｎｅｔ、、　１１：９９ （１９８５）。

９、ＧｉＨｕｅｒｅ、Ｖ、、　Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、Ｓ、　Ｍ、、　Ｒｏｓｅ ｎｆｅｌｄ。

Ｍ、　Ｇ、、　Ｅｖａｎｓ、Ｒ，Ｍ、、　（：Ｃｌユ、４６：６４５（１９８６ ）。

１０、　Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、Ｓ、　Ｍ、、　Ｇｉｇｕｅｒｅ、Ｖ、、Ｓｅｇ ｕｉ、Ｐ、、Ｅｖａｎｓ。

Ｒ，Ｍ、、胆坦、、４９：３９（１９８７）。

１１、　Ｋｕｍａｒ、Ｖ、、　Ｇｒｅｅｎ、Ｓ、、５ｔａｕｄ、Ａ、、　Ｃｈａ ｍｂｏｎ、Ｐ、。

ＥＭＢＯＪ、、５：２２３１（１９８６）。

１２、　Ｍｅｎｅｚｅｓ−Ｆｅｒｒｅｉｒａ、　Ｍ、　Ｍ、、Ｂｉｌ、Ｃ，、Ｗ ｏｒｔｓｍａｎ。

Ｊ　、、Ｗｅ：ｎＬｒａｕｂ、Ｂ、Ｄ、、Ｊ　、Ｃｌ１ｎ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎａ ｌＭｅｔａｂ、、５９：１０８］（１９８４）。

１３、　Ｂｕｒｒｏｗ、　Ｇ、　Ｎ、、　ｉｎ　Ｅ回ｏｃｒｉｎｏｌｏ　ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓ（Ｆｅ１１ｇ、Ｐ、、Ｂａｘｔｅｒ、Ｊ、Ｄ、、Ｂｒｏａｄ ｈｕｓ。

Ａ、Ｆ、、、Ｆｒｏｈｍａｎ、Ｌ、Ａ、、Ｅｄｓ、（ＭｅＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８１）、　ｐｐ、　３５１−３８５゜１４、ＤｅＧｒｏ ｏｔ、Ｌ、Ｊ、　ａｎｄ　５ｔａｎｂｕｒｙ、Ｊ、Ｂ、、ＴｈｅＴｈｒｏｉｄ　 ａｎｄ　Ｉｔ’ｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　（Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

ｅｄ、４．１９７５）。

１５、Ｂａｙｒｓ、Ｊ、Ｔ、、Ｂｒ、Ｊ、Ａｎｉｓ、Ｂｅｈａｖ、、１　：１４ ４（１９５Ｂ）；　Ｆｏｒｄ、Ｄ、　Ｈ，ａｎｄ　Ｃｒｉｍｅｒ、Ｅ、Ｂ、、１ ｎＴｈ　ｒａｉｄ　Ｈｏｒｍｏｎｅｓ　ａｎｄ　Ｂｒａｉｎ　Ｄｅｖｅｌｏ　ｗ ｅｎｔ。

Ｇｒａｖｅ、　Ｇ、、　Ｅｄ、　＜Ｒａｖｅｎ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９７７） 、ｐｐ。

１−１７゜ １６、　０ｐｐｅｎｈｅｉ＋＊ｅｒ、Ｊ、Ｈ，、Ｓｃｈｗａｒｔｚ、Ｈ，Ｌ、、 ５ｕｒｋｓ。

Ｍ、１．、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ　、９５：８９５（１９７４）。

１７、Ｂａｒｋｅｒ、Ｓ、Ｐ、ａｎｄ　ＫＩｉｔＨａａｒｄ、Ｈ，Ｍ、、、Ａｊ 　Ｊ。

旦ｂ１ム状、、　１７０：８０（１９５２）；Ｌｅｅ、Ｙ、Ｐ、　ａｎｄ　Ｌａ ｒｄｙ。

Ｈ，Ａ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｅａ、、２４０：１４２７（１９６５）。

１８、Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ、Ａ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、３２４：４ ２５（１９８６）。

１９、ラット１ｌｉｊｃＤＮＡライブラリーは全ライブラリー脳からオリゴ（ｄ Ｔ）ｉ別ＲＮＡを用いて作製された。第１鎖合成のためにモロニーネズミ白血病 ウィルス（Ｍ　Ｍ　ｕ　Ｌ　Ｖ　）の逆転写酵素ＣＲＴ）を使用し；第２ａ合成 はＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ断片を使用し、その後Ｍ　−Ｍｕ　Ｌ　Ｖ　 ＲＴ−ｃＤＮＡはＳＩヌクレアーゼで処理し、メチル化し、セファロース４Ｂ上 でサイズにより分画化し、ラムダｇｔＩ［アームへ連結し、そしてバラゲージン グを行った。このライブラリーは５００ｂｐ以上の挿入物を含む２５Ｘ１０’個 の独立した組換え体から成る。

２０、　Ｍａｘａｍ、Ａ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ、Ｗ、、　Ｐｒｏｃ 、　Ｎａ１ｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、、　７４：５６０（１９７７）。

２１、　Ｌｅｂｏ、Ｒ，Ｖ、　ｅｔ　ｍｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２２５：５７（ １９８４）。

２２、　Ｋｒ１ｅ８．Ｐ、　Ａ、　ａｎｄ　Ｍｅｌｔｏｎ、Ｄ、　Ａ、、　Ｎｕ ｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、１２ニア０５７（１９８４）；）ｊｏｌｌｅｎ ｂｅｒｇ、Ｓ、　Ｍ。

ｅｔ　ｍｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、３１８：６３５（１９８５）。

２３、　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写のために、ｒｂｅＡ　１２の全ＥｃｏＲＩ挿入物 はｐＧ　Ｅ　Ｍ　１　（Ｐ　ｒｏａｈｅｇａ　Ｂ　１ｏｔｅｃ社）にクローニン グした。

２２７　ｂｐの５°非翻訳配列を欠く第２構築物（ｒｂｅＡ　１２　Ｂ　）は、 Ｔ、ＤＮＡポリメラーゼ修復したｒｂｅＡ　１２のＢｇｌｌ−３＊ａＩフラグメ ント（ヌクレオチド位置２２７からポリリンカーまで）をｐＧＥＭ３のＳｍａＩ 部位に挿入することにより作製した。甲状腺ホルモン結合のために、転写はＳＰ ６ボリメラーゼおよび５ｓｔＩｒ線状化したｒｂｅＡ　１２　Ｂ　５〜１０μｇ を用いて行った。転写物はＰ６０クロマトグラフィーで精製し、１５０〜２００ μｌのウサギ網状赤血球溶解液（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ社）中で製造者 の指示した条件下に翻訳した。スカツチャード分析および競合分析の両方におい て、甲状腺ホルモン結合は同じ方法で測定した（但し、スカツチャード分析の場 合には未標識タンパク質を使用した）［１２５エコ３，３’、５−）リョードチ ロニン（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ社、２２２０　Ｃｉ／　＋＋ｍ ｏｌ、最終濃度０．３ｎ　Ｍ　）はＴ、結合緩衝液中でｉｎ　ｖｉｔｒｏ合成し たｒＴＲαポリペプチド（結合反応あたり溶解液２００μｌの５〜８μｍ）と０ ℃で２時間２５０μｌの最終容量にて混きした。特異的ホルモン結合は１０００ 倍過剰未標識ホルモンを加えることにより測定し、セファデックスＧ−２５フア イン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）０．９Ｘ４．Ｏｃ−カラムから排除容量中に溶出 される放射能をカウントすることにより検定した。

２４、　Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、Ｊ、　Ｍ、、　Ｐｒｚｂｙｌａ、Ａ、　Ｆ、、　Ｍ ａｃＤｏｎａｌｄ。

Ｒ，Ｊ、、　Ｒｕｔｔｅｒ、Ｗ、　Ｆ、、　Ｂｉｏｃｈｅ＋ａｉｓｔｒ　、　１ ８：５２９４（１９７４）　。

２５、　Ｈａｒｐｏｌｄ、Ｍ、Ｍ、、　Ｅｖａｎｓ、Ｒ，Ｍ、、　５ａｌｄｉｔ ｔ　−Ｇｏｅｏｒｇｉｅｆｆ、Ｍ、、　Ｄａｒｎｅｌｌ、Ｊ、　Ｅ、、　Ｃｅｌ ユ、１７：１０２５肌団１！Ｊ１ケ 前述の説明により、当分野で通常の知識を有する者は、本発明がグルココルチコ イド受容体、ミネラルコルチコイド受容体または甲状腺ホルモン受容体のホルモ ン結き特性および／または転写活性化特性を有するタンパク質をコードする配列 から成る実質的に純粋なりＮＡを提供することを理解できるであろう。

本発明はまた本発明Ｄ　Ｎ　、Ａの実例となる受容体配列を含む種々のプラスミ ドを提供する０本発明の代表的なプラスミドは特許目的のためにアメリカン・タ イプ・カルチャー・コレクションに寄託された。

本発明はさらに本発明ＤＮＡ（または−ＲＮＡ）から発現された受容体タンパク 質（その修飾された機能形体を含む）を提供する。

新規な受容体ＤＮＡ−ＲＮＡおよびタンパク質組成物に加えて、本発明は受容体 タンパク質の機能性５：調べるためのバイオアッセイを包含する。それはまた遺 伝子工学的に処理された細胞において所望タンパク質を生産するための２つの新 しい方法を包含する。第１の方法は受容体と結合したホルモンによって転写が活 性化される遺伝子の転写を誘発する方法である。第２の方法は細胞を遺伝子工学 的に操作し、その後受容体タンパク質と結合したホルモンによって転写が活性化 される遺伝子によりコードされるタンパク質の生産を増大し且つ制御する方法で ある。

本発明ＤＮＡは、ホルモン受容体タンパク質およびその機能的修飾体を以前には 不可能であった量で生産させるべく使用できる０本発明の結果として利用し得る 受容体の量を用いれば、今やこのタンパク質の詳細な構造解析が受容体結晶を分 析するＸ線回折法により可能である。さらに、受容体タンパク質の十分な供給は 、重合体−アゴニストまたは受容体−アンタゴニスト活性について多くの化合物 をスクリーニングするために、それらを使用しうろことを意味している。また、 受容体タンパク質の利用可能性は、診断検定においてそれらを使用しうろことを 意味している。

本発明の精神および範囲から逸脱するこなく、当業者は多種多様の用法および条 件に適合させるべく本発明をいろいろに変更および修飾することができる。これ らの変更および修飾は当然であり、公正であり、そして次の請求の範囲の均等の 範囲内に含まれるものである。

特表千１−５００９に４　（５７） １．Ｊ　Ｌ、ｌ　Ｗ　ｌ、Ｊ　Ｌ、ｌ−Ｌ、Ｊ　Ｌ、Ｊ４ｘ　■ −□ 丁 ○ 刀 冒＝乏　８片足　：二ｉ　； ロ　ロ　′　０　ロ　ｏ　０ ２９７　Ｍ　Ｉ　Ｋ　Ｒ５ ２０８Ｐ　Ａ　Ｉ　Ｔ　Ｒ ２７３Ｐ　Ａ　Ｉ　Ｔ　Ｒ ＋ ★嚢　會★　★　★　★　★會會★★冑　★き ≧ ＦＩＧ、　ｌｌｌ−４（Ａ） ＦＩＧ、　ｌｌｌ−４（Ｂ） ６ｋＤ− ０ｋＤ− ρ 〇 １Ｉ　１ｌｌ１ １１１ｉｊ ｚ　％ａｔＱ　３Ｈ−ＡＬＤＯｇＡ ％　将墨ｔ’Ｊ　３Ｈ−ＡＬ［）０１ ＦＩＧ、　ＩＶ−５（Ａ）　ＦＩＧ、　ＩＶ−５（Ｂ）廿　黙、　Ｒ３ｈＭＲＲ ＳｈＧＲα ［−一一一一］［−一一一一］「−一一一−］・・　・ −ＡＤ　−ＡＤ　−ＡＤ ＦＩＧ、、−ＩＶ−６ ＦＩＧ、ＩＶ−７ ―−＠Ｉ！４Ｉ−一一 ２、− ２、（ 鴫― ＦＩＧ、　ＶＩＩ−３（Ｂ） 国際調査報告 ＋ｍｙ＋＋ａ＋ｍ−＾−−”−−’　：ａ＋＝τ！＝ｑ！１７１０２７８２１す ａ＋゛−Ｉ　Ａ　ｅｏ＋ｃａｈ叶’Ｉｓ、　ｐ（７７Ｃ５Ｂ　−、／　０２−、 　Ｂ　２

Claims (46)

【特許請求の範囲】
1. １．センスストランドが、グルココルチコイド受容体、ミネラルコルチコイド受 容体および甲状腺ホルモン受容体よりなる群から選ばれるホルモン受容体に特有 のホルモン結合特性および／または転写活性化特性を有する蛋白質の一次配列を コードするトリプレットの配列を有するセグメントからなり、該セグメントが上 記蛋白質に発現可能である、実質的に純粋な二重鎖ＤＮＡ。
2. ２．該セグメントにおけるトリプレットの配列が、グルココルチコイド受容体に 特有のホルモン結合特注および／または転写活性化特性を有する蛋白質の一次配 列をコードする、請求の範囲第１項に記載の実質的に純粋なＤＮＡ。
3. ３．該セグメントにおけるトリプレットの配列が、ミネラルコルチコイド受容体 に特有のホルモン結合特性および／または転写活性化特性を有する蛋白質の一次 配列をコードする、請求の範囲第１項に記載の実質的に純粋なＤＮＡ。
4. ４．該セグメントにおけるトリプレットの配列が、甲状腺ホルモン受容体に特有 のホルモン結合特性および／または転写活性化特性を有する蛋白質の一次配列を コードする、請求の範囲第１項に記載の実質的に純粋なＤＮＡ。
5. ５．該セグメントにおけるトリプレットの配列が、鳥類または哺乳類のグルココ ルチコイド受容体に特有のホルモン結合特注および／または転写活性化特性を有 する蛋白質の一次配列をコードする、請求の範囲第２項に記載の実質的に純粋な ＤＮＡ。
6. ６．該セグメントにおけるトリプレットの配列が、ヒトグルココルチコイド受容 体に特有のホルモン結合特性および／または転写活性化特性を有する蛋白質の一 次配列をコードする、請求の範囲第５項に記載の実質的に純粋なＤＮＡ。
7. ７．該セグメントにおけるトリプレットの配列が、哺乳類または鳥類のミネラル コルチコイド受容体に特有のホルモン結合特性および／または転写活性化特性を 有する蛋白質の一次配列をコードする、請求の範囲第３項に記載の実質的に純粋 なＤＮＡ。
8. ８．該セグメントにおけるトリプレットの配列が、ヒトミネラルコルチコイド受 容体に特有のホルモン結合特注および／または転写活性化特性を有する蛋白質の 一次配列をコードする、請求の範囲第３項に記載の実質的に純粋なＤＮＡ。
9. ９．該セグメントにおけるトリプレットの配列が、哺乳類または鳥類の甲状腺ホ ルモン受容体に特有のホルモン結合特性および／または転写活性化特性を有する 蛋白質の一次配列をコードする、請求の範囲第４項に記載の実質的に純粋なＤＮ Ａ。
10. １０．該セグメントにおけるトリプレットの配列が、ヒト甲状腺ホルモン受容体 に特有のホルモン結合特性および／または転写活性化特性を有する蛋白質の一次 配列をコードする、請求の範囲第４項に記載の実質的に純粋なＤＮＡ。
11. １１．甲状腺ホルモン受容体がヒト甲状腺ホルモン受容体アルファおよびヒト甲 状腺ホルモン受容体ベータよりなる群から選ばれる、請求の範囲第１０項に記載 の実質的に純粋なＤＮＡ。
12. １２．ｐＲＳｈＧＲアルファ、（ＡＴＣＣ♯６７２００）、ｐＲＳｈＭＲ（ＡＴ ＣＣ♯６７２０１）、ｐｅＡ１０１（ＡＴＣＣ♯６７２４４）、ｒｂｅＡ１２（ ＡＴＣＣ♯６７２８１）、ＧＭＣＡＴ（ＡＴＣＣ♯６７２８２）、ＰＥ４（ＡＴ ＣＣ♯６７３０９）、ｐＨＫＡ（ＡＴＣＣ♯６７３１０）、ｐｈＥＲＢＡ８．７ （ＡＴＣＣ♯４０３７４）、ｐｈＦＡ８（ＡＴＣＣ♯４０３７２、およびｐｈＨ ３（ＡＴＣＣ♯４０３７３）よりなる群から選ばれるプラスミド。
13. １３．ｐＲＳｈＧＲ−アルファ（ＡＴＣＣ♯６７２００）、ｐＲＳｈＧＲ−アル ファ修飾体１９，１３７，１１０２，１１２０，１２０４，１２１４，１２６２ ，１２８９，１３０５，１３４６，１３８４，１４０３，１４０８，１４２２， １４２８，１４４０，１４８８，１４９０，１５１５，１５３２，１５５０，お よび１６８４よりなる群から選ばれるＤＮＡ。
14. １４．（ａ）翻訳終止コドンに相当する１トリプレットであって、翻訳開始コド ンに相当するトリプレットとフレームをなし、かつ該開始コドントリプレットの 下流にあるもの、ならびに（ｂ）最長オーブンリーディングフレームとして、ヒ トグルココルチコイド受容体ならびにｐＲＳｈＧＲ−アルファから発現されるそ の修飾体であって、修飾体１９，１３７，１１０２，１１２０，１２０４，１２ １４，１２６２，１２８９，１３０５，１３４６，１３８４，１４０３，１４０ ８，１４２２，１４２８，１４４０，１４８８，１４９０，１５１５，１５３２ ，１５５０，および１６８４として知られているもの；ヒトミネラルコルチコイ ド受容体；ヒト甲状腺ホルモン受容体；ならびにｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２と して知られているヒトステロイドホルモン受容体よりなる群から選ばれる蛋白質 の一次配列をコードするトリプレットの配列を有する実質的に純粋なセグメント を含むＤＮＡセグメント。
15. １５．ヒト甲状腺ホルモン受容体がｈＥＲＢＡ８．７、ｈＦＡ８、およびｐｅＡ １０１として知られるＤＮＡよりなる群から選ばれるアルファまたはベータ受容 体である、請求の範囲第１４項に記載の実質的に純粋なＤＮＡ。
16. １６．第Ｉ−２（１）およびＩ−２（２）図（ｈＧＲ）、第ＩＩＩ−１（Ｂ）− １およびＩＩＩ−１（Ｂ）−２図（ｈＴＲベータ）、第ＩＩＩ−７図（ｈＴＲア ルファ）、第ＩＶ−２（Ｂ）−１およびＩＶ−２（Ｂ）−２図（ｈＭＲ）、第Ｖ −１（Ｂ）−１およびＶ−１（Ｂ）−２図（ｈＥＲＲ１）、ならびに第Ｖ−２（ Ｂ）−１およびＶ−２（Ｂ）−２図（ｈＥＲＲ２）に示されたＤＮＡ配列よりな るＤＮＡ配列群から選ばれる実質的に純粋なＤＮＡ配列。
17. １７．第ＩＩＩ−１（Ｂ）図（ｈＴＲベータ）、第ＩＩＩ−７図（ｈＴＲアルフ ァ）、第ＩＶ−２（Ｂ）図（ｈＭＲ）、第Ｖ−１（Ｂ）図（ｈＥＲＲ１）、およ び第Ｖ−２（Ｂ）図（ｈＥＲＲ２）に示されたアミノ酸配列よりなる群から選ば れるアミノ酸配列からなる実質的に純粋な一次蛋白質配列。
18. １８．ヒトミネラルコルチコイド受容体をコードする実質的に純粋なＤＮＡ。
19. １９．受容体がヒト甲状腺ホルモン受容体アルファおよびヒト甲状腺ホルモン受 容体ベータよりなる群から選ばれる、ヒト甲状腺ホルモン受容体をコードする実 質的に純粋なＤＮＡ。
20. ２０．受容体がｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２よりなる群から選ばれる、エストロ ゲン関連受容体をコードする実質的に純粋なＤＮＡ。
21. ２１．請求の範囲第１項ないし第２０項のいずれかに記載のＤＮＡのいずれかと 実質的な配列相同性を有するＤＮＡ。
22. ２２．請求の範囲第１項ないし第２０項のいずれかに記載のＤＮＡのいずれかの 変異体。
23. ２３．請求の範囲第１項ないし第２０項のいずれかに記載の実質的に純粋なＤＮ Ａ配列のいずれかから転写されたｍＲＮＡ。
24. ２４．請求の範囲第１項ないし第２０項のいずれかに記載の実質的に純粋なＤＮ Ａ配列のいずれかによりコードされる実質的に純粋な蛋白質。
25. ２５．哺乳類および鳥類の甲状腺ホルモン受容体、哺乳類および鳥類のミネラル コルチコイド受容体、ならびに哺乳類および鳥類のステロイド系ホルモン受容体 ｈＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２よりなる群から選ばれる実質的に純粋な受容体蛋白 質。
26. ２６．甲状腺ホルモン受容体が甲状腺ホルモン受容体アルファおよび甲状腺ホル モン受容体ベータよりなる群から選ばれる、請求の範囲第２５項に記載の実質的 に純粋な甲状腺ホルモン受容体。
27. ２７．請求の範囲第１項ないし第２０項のいずれかに記載の実質的に純粋なＤＮ Ａのいずれかにより形質転換された細胞。
28. ２８．（ａ）受容体陰性の細胞中へ、作動性レポーター遺伝子に機能性結合した 本質的に作動性ホルモン応答性プロモーター／エンハンサー要素からなる第１プ ラスミド、および本質的に、ホルモン受容体蛋白質（Ｒ）またはその修飾された 機能性形態（ｒ）をコードする作動性ＤＮＡ配列からなる第２の受容体発現プラ スミドを共トランスフェクションし、 （ｂ）工程（ａ）で得た共トランスフェクションされた細胞を、第１プラスミド のホルモン応答性プロモーター／エンハンサー要素を活性化しうるまたはその同 族体の存在下または不在下に培養し、 （ｃ）該細胞において上記レポーター遺伝子のＤＮＡ配列の生成物の誘導を監視 し、そして （ｄ）該細胞において、上記第２プラスミドのＤＮＡ配列によりコードされるホ ルモン受容体蛋白質（Ｒ）またはその修飾された機能性形態（ｒ）の発現および ステロイド結合能を測定することよりなる、修飾された機能性形態（ｒ）は受容 体（Ｒ）が有する転写活性化特性を備えており、かつ（Ｒ）および（ｒ）は発現 可能なＤＮＡ配列によりコードされるものである、ホルモン受容体（Ｒ）または その工学的に処理された、修飾された機能性形態（ｒ）の機能性を測定するため のバイオアッセイ法。
29. ２９．受容体陰性の細胞がＣＶ−１およびＣＯＳ細胞よりなる群から選ばれる、 請求の範囲第２８項に記載のバイオアッセイ法。
30. ３０．第１および第２プラスミドがＳＶ−４０の複製開始点をも含む、請求の範 囲第２８項に記載のバイオアッセイ法。
31. ３１．第１および第２プラスミドが選択可能なマーカーをも含む、請求の範囲第 ２８項に記載のバイオアッセイ法。
32. ３２．作動性ホルモン応答性プロモーター／エンハンサー要素がマウス乳腺腫瘍 ウィルス長鎖ターミナルリピート（ＭＴＶＬＴＶ）および哺乳類成長ホルモンプ ロモーターよりなる群から選ばれ、レポーター遺伝子がＣＡＴである、請求の範 囲第２８項に記載のバイオアッセイ法。
33. ３３．ホルモン受容体蛋白質（Ｒ）がグルココルチコイド受容体（ＧＲ）、ミネ ラルコルチコイド受容体（ＭＲ）および甲状腺ホルモン受容体（ＴＲ）よりなる 群から選ばれる、請求の範囲第２８項に記載のバイオアッセイ法。
34. ３４．遺伝子（Ｇ）−すなわちホルモン（Ｈ）またはその同族体（ａＨ）が受容 体（Ｒ）またはその修飾された機能性形態（ｒ）との複合体を形成した状態でか つこの［（Ｈ）または（ａＨ）／（Ｒ）または（ｒ）］複合体が遺伝子（Ｇ）の 位置するクロマチン上の転写制御要素に結合した状態でその転写がホルモン（Ｈ ）またはその同族体（ａＨ）によって活性化される遺伝子−を含む細胞（Ｃ）に おいて、遺伝子（Ｇ）の発現を誘導し、結果的に遺伝子（Ｇ）によりコードされ る蛋白質（Ｐ）の生成を誘導する方法であって、（１）細胞（Ｃ）において、受 容体（Ｒ）、または受容体（Ｒ）の転写活性化特性を有するその修飾された機能 性形態（ｒ）をコードするＤＮＡを発現させ、そして（２）遺伝子（Ｇ）の発現 、すなわち結果的に蛋白質（Ｐ）の生成を誘導するのに十分な水準にまで細胞（ Ｃ）におけるホルモン（Ｈ）またはその同族体（ａＨ）の濃度を増大させること よりなる方法。
35. ３５．ホルモン（Ｈ）またはその同族体（ａＨ）の濃度の増大が、遺伝子（Ｇ） の転写、従って蛋白質（Ｐ）の生成を制御すべく制御される、請求の範囲第３４ 項に記載の方法。
36. ３６．細胞（Ｃ）が真核細胞である、請求の範囲第３４項および第３５項のいず れかに記載の方法。
37. ３７．真核細胞（Ｃ）が哺乳類の細胞である、請求の範囲第３４項および第３５ 項のいずれかに記載の方法。
38. ３８．真核細胞（Ｃ）がヒトの細胞である、請求の範囲第３４項および第３５項 のいずれかに記載の方法。
39. ３９．ホルモン（Ｈ）がグルココルチコイドホルモン、ミネラルコルチコイドホ ルモンおよび甲状腺ホルモン、ならびにそれらの同族体よりなる群から選ばれる ホルモンである、請求の範囲第３４項および第３５項のいずれかに記載の方法。
40. ４０．受容体（Ｒ）がグルココルチコイド受容体、ミネラルコルチコイド受容体 および甲状腺ホルモン受容体よりなる群から選ばれる受容体である、請求の範囲 第３４項および第３５項のいずれかに記載の方法。
41. ４１．細胞を工学的に処理し、そして遺伝子（Ｇ）−すなわちホルモン（Ｈ）ま たはその同族体（ａＨ）が受容体（Ｒ）またはその修飾された機能性形態（ｒ） との複合体を形成した状態でかつこの［（Ｈ）または（ａＨ）／（Ｒ）または（ ｒ）］複合体が遺伝子（Ｇ）の位置するクロマチン上の転写制御要素に結合した 状態でその転写がホルモン（Ｈ）またはその同族体（ａＨ）によって活性化され る遺伝子−によりコードされる蛋白質（Ｐ）を製造する方法であって、（１）転 写制御要素に結合した状態の［（Ｈ）または（ａＨ）／（Ｒ）または（ｒ）］複 合体によって活性化されうる転写制御要素の制御下に遺伝子（Ｇ）が置かれるべ く遺伝子（Ｇ）を細胞（Ｃ）内に配置し；（２）受容体（Ｒ）、または受容体（ Ｒ）が有する転写活性化特性を備えたその修飾された機能性形態（ｒ）をコード するＤＮＡにより細胞（Ｃ）を形質転換し；そして（３）遺伝子（Ｇ）の発現、 すなわち結果的に蛋白質（Ｐ）の生成を誘導および制御するのに十分な水準にま で細胞（Ｃ）におけるホルモン（Ｈ）またはその同族体（ａＨ）の濃度を増大さ せることよりなる方法。
42. ４２．細胞（Ｃ）が真核細胞である、請求の範囲第４１項に記載の方法。
43. ４３．真核細胞（Ｃ）が哺乳類の細胞である、請求の範囲第４２項に記載の方法 。
44. ４４．真核細胞（Ｃ）がヒトの細胞である、請求の範囲第４３項に記載の方法。
45. ４５．ホルモン（Ｈ）がグルココルチコイドホルモン、ミネラルコルチコイドホ ルモンおよび甲状腺ホルモン、ならびにそれらの同族体よりなる群から選ばれる ホルモンである、請求の範囲第４１項に記載の方法。
46. ４６．受容体（Ｒ）がグルココルチコイド受容体、ミネラルコルチコイド受容体 および甲状腺ホルモン受容体よりなる群から選ばれる受容体である、請求の範囲 第４１項に記載の方法。