DE69726182T2

DE69726182T2 - Methoden und pharmazeutische zusammenstellungen zur wachstumsverhinderung von tumorzellen enthaltend einen ppar-gamma agonisten und einen map kinase inhibitor

Info

Publication number: DE69726182T2
Application number: DE69726182T
Authority: DE
Inventors: M. Bruce SPIEGELMAN; Soner Altiok; Elisabetta Mueller; Pasha Serraf; Peter Tontonoz
Original assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc
Current assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc
Priority date: 1996-12-11
Filing date: 1997-12-11
Publication date: 2004-08-12
Anticipated expiration: 2017-12-12
Also published as: EP0948324B1; JP2009063566A; ATE462433T1; DE69726182D1; JP4550133B2; WO1998025598A2; WO1998025598A3; DE69739828D1; EP1410799B1; EP1410799A1; CA2274756A1; US7635708B2; EP0948324A2; CA2274756C; JP2001510462A; JP4549443B2; AU5601898A; US20030144330A1; ATE253903T1

Description

Ausgangspunkt der Erfindung
Adipozyten bzw. Fettzellen sind hoch spezialisierte Zellen, die im Energieaushalt und der Homöostase eine entscheidende Rolle spielen. Ihre primäre Rolle besteht darin, Triglyceride in Zeiten eines Kalorienüberschusses zu speichern und diese Reserve während Zeiten einer Nahrungsverarmung zu mobilisieren. Fettzellen werden aus multipotenten Stammzellen mesodermalen Ursprungs gewonnen, die ebenfalls Muskel- und Knorpel-Zelllinien entstehen lassen. Die Adipozyten-Differenzierung ist durch eine koordinierte Zunahme der Adipozytenspezifischen Genexpression gekennzeichnet.
In den letzten Jahren zeigten sich bedeutende Fortschritte im Verständnis der molekularen Grundlage der Adipozyten-Differenzierung (Überblick in Cornelius, P. et al. (1994), Annu. Rev. Nutr. 14: 99–129; Tontonoz, P. et al. (1995), Curr. Opin. Genet. Dev. 5: 571–576). Mehrere Transkriptionsfaktoren werden bei der Fettzelldifferenzierung induziert (C/EBPα C/EBPβ und ADDI/SREBPI) und beeinflussen diesen Prozess in einem bestimmten Umfang (Freytag, S. O. et al. (1994), Genes Dev. 8: 1654–63; Kim, J. B. und Spiegelmau, B. M. (1996), Genes Dev. 10: 1096–1107; Lin, F. T. und Lane, M. D. (1994), PNAS USA 91: 8757–61; Samuelsson, L. et al. (1991), EMBO J. 10: 3787–93; Tontonoz, P. et al. (1993), Mol. Cell. Biol. 13: 4753–9; Umek, R. M. et al. (1991), Science 251: 288–92; Wu, C. L. et al. (1995), Mol. Cell. Biol. 15: 253646; Yeh, W. C. et al. (1995), Genes Dev. 9: 168–81).
Die Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptoren oder „PPAR" sind Mitglieder der Typ-II-Klasse der Steroid/Thyroid-Superfamilie von Rezeptoren und vermitteln die pleiotropen Wirkungen der Peroxisom-Proliferatoren. Die Typ-II-Klasse von Kernrezeptoren schließt PPAR ein, den Thyroid-Hormonrezeptor (T₃R) und den Vitamin D₃-Rezeptor (VD₃R). Typ-II-Rezeptoren sind funktionell von den klassischen Steroid-Rezeptoren verschieden, wie beispielsweise dem Glucocorticoid-Rezeptor, dem Progesteron-Rezeptor und dem Östrogen-Rezeptor (Überblick bei Stunnenberg, H. G. (1993), BioEssays Bd. 15 (5): 309–15). Drei Eigenschaften unterscheiden diese beiden Klassen. Zunächst sind Typ-II-Rezeptoren dazu in der Lage, an ihre responsiven Elemente in Abwesenheit eines Liganden zu binden (Damm et al. (1989), Nature 339: 593–597; Sap et al., Nature 340: 242–244; De The et al. (1990), Nature 343: 177–180), wohingegen eine Ligandenbindung dazu erforderlich ist, den Typ-I-Rezeptorhsp90-Komplex zu dissoziieren und steuert daher indirekt die DNA-Bindung. Zweitens binden und transaktivieren Typ-II-Rezeptoren durch responsive Elemente, die aus Halbseiten bzw. half sites zusammengesetzt sind, die als direkte Wiederholungen angeordnet sind, im Gegensatz zu palindromisch angeordneten Halbseiten, die invariabel durch drei Nukleotide getrennt sind, die von Typ-I-Rezeptoren benötigt werden. Zuletzt binden Typ-II-Rezeptoren nicht an ihre jeweiligen Bindungsstellen als Homodimere, sondern erfordern einen Hilfsfaktor, nämlich RXR (beispielsweise RXRα, RXRβ RXRγ) für eine Hochaffinitätsbindung (Yu et al. (1991), Cell 67: 1251–1266; Bugge et al. (1992), EMBO J. 11: 1409–1418; Kliewer et al. (1992), Nature 355: 446–449; Leid et al. (1992), Cell 68: 377– 395; Marks et al. (1992), EMBO J. 11: 1419–1435; Zhang et al. (1992), Nature 355: 441–446). Die Wechselwirkung zwischen Typ-II-Rezeptoren erfordert eine Region in der C-terminalen Domäne (Yu et al. (1991), Cell 67: 1251–1266; Kliewer et al. (1992), Nature 355: 446–449; Leid et al. (1992), Cell 68: 377–395; Marks et al. (1992), EMBO J. 11: 1419–1435). Im Anschluss an die Bindung wird die Transkriptionsaktivität eines Ziel- bzw. Target-Gens (d. h. ein Gen, das mit einer spezifischen DNA-Sequenz in Verbindung steht) als Funktion des Liganden gesteigert, der an das Rezeptorheterodimer gebunden ist.
WO 96/34943 offenbart die Verwendung von 12-Lipogenase-Inhibitoren, beispielsweise Thiazolidindion-Pioglitazon, zur Behandlung von Brustkrebs.
WO 93/21146 offenbart, dass Retinoid-artige Verbindungen, beispielsweise Ringsubstituierte bizyklische Phenyle, die eine Affinität für den Retinoid-RXR-Rezeptor aufweisen, die Entwicklung maligner Zellen modulieren können. Zusätzlich ist eine Kombination von RXR-Liganden und PPAR-Liganden zu diesem Zweck offenbart.
WO 95/10271 offenbart, dass Phenylazetatderivate, die PPAR aktivieren, zur Behandlung neoplastischer Störungen verwendet werden können.
Eur. J. Biochem. 239, 1–7 (1996) zeigt, dass hPPARγ durch Induktoren der Adipogenese, beispielsweise antidiabetische Thiazolidindion-Arzneistoffe wie Pioglitazon, Ciglitazon, Troglitazon und Englitazon aktiviert werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Erkenntnis, dass die Aktivierung von PPARγ eine Schlüsselrolle bei der Induktion des Wachstumsstillstandes durch terminale Differenzierung aktiv proliferierender PPARγ-exprimierender Zellen spielt, insbesondere von transformierten Fettvorläufer-Zellen.
Demgemäß stellt ein Aspekt der Erfindung ein Verfahren zur Hemmung der Proliferation einer PPARγ-responsiven hyperproliferativen Zelle in einer Probe bereit, umfassend das In-Berührung-Bringen der Zelle mit (a) einem PPARγ-Agonisten in einer Menge, die zum Induzieren der Differenzierung der Zelle wirksam ist, und (b) einem MAP-Kinase-Inhibitor. Beispielsweise kann das vorliegende Verfahren zur Behandlung oder zur prophylaktischen Vorbeugung einer Krankheit bzw. Störung verwendet werden, die durch ein aberrantes Zellwachstum PPARγ-responsiver hyperproliferativer Zellen charakterisiert ist, beispielsweise durch Verabreichung einer pharmazeutischen Zubereitung eines PPARγ-Agonisten in einer Menge, die zur Hemmung des Wachstums der PPARγ-responsiven hyperproliferativen Zellen wirksam ist.
In einer Ausführungsform wird die Erfindung in der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Sarkomen, Karzinomen und/oder Leukämien verwendet. Beispielhafte krankhafte Störungen, für die das gegenständliche Verfahren alleine oder als Teil einer Behandlungsvorschrift verwendet werden kann schließen ein: Fibrosarkom, Myxosarkom, Liposarkom, Chondrosarkom, osteogenes Sarkom, Chordom, Angiosarkom, Endotheliosarkom, Lymphangiosarkom, Lymphangioendotheliosarkom, Synoviom, Mesotheliom, Ewing-Sarkom, Leiomyosarkom, Rhabdomyosarkom, Kolonkarzinom, Pankreaskrebs, Brustkrebs, Ovarialkarzinom, Prostatakarzinom, Plattenepithelkarzinom, Basalzellkarzinom, Adenokarzinom, Schweißdrüsenkarzinom, Talgdrüsenkarzinom, papilläres Karzinom, papilläres Adenokarzinom, Cystadenokarzinom, medulläres Karzinom, bronchogenes Karzinom, Nierenzellkarzinom, Hepatom, Gallengangkarzinom, Choriokarzinom, Seminom, Embryonalkarzinom, Wilms-Tumor, Zervikalkarzinom, Hodenkrebs, Lungenkarzinom, kleinzelliges Lungenkarzinom, Blasenkarzinom, Epithelkarzinom, Gliom, Astrozytom, Medulloblastom, Craniopharyngiom, Ependymom, Pinealom, Hämangioblastom, Akustikusneurinom, Oligodendrogliom, Meningiom, Melanom, Neuroblastom und Retinoblastom.
Die Erfindung kann zur Behandlung von Störungen wie beispielsweise Karzinomen verwendet werden, die sich aus dem Gewebe der Brust, der Prostata, der Nieren, der Blase oder des Darms bilden.
Die Erfindungen können zur Behandlungen hyperplastischer oder neuroplastischer Störungen verwendet werden, die sich aus Fettgewebe ergeben, wie beispielsweise Fettzelltumoren, beispielsweise Lipome, Fibrolipome, Lipoblastome, Lipomatose, Hibemome, Hämangiome und/oder Liposarkome.
Die Erfindung kann zur Behandlung hyperplastischer oder neuroplastischer Störungen verwendet werden, die in Fettgewebe entstehen, beispielsweise Fettzelltumoren, beispielsweise Lipome, Fibrolipome, Lipoblastome, Lipomastose, Hibemome, Hämangiome und/oder Liposarkome.
Die Erfindung kann zur Behandlung hyperplastischer oder neoplastischer Störungen des hämatopoetischen Systems verwendet werden, beispielsweise von leukämischem Krebs. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Subjekt ein Säugetier, beispielsweise ein Primat, beispielsweise ein Mensch.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der in der Erfindung verwendete PPARγ-Agonist ein Ligand eines PPARγ-Proteins, der eine Transkriptionsaktivität des PPARγ-Proteins aktiviert. Beispielsweise kann der PPARγ-Agonist ein Thiazolidindion oder ein Analog hiervon sein. Beispielhafte PPARγ-Agonisten schließen Pioglitazon, Troglitazon, Ciglitazon, Englitazon, BRLA9653 und chemische Derivate hiervon ein. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen wird der PPARγ-Agonist in der allgemeinen Formel:
repräsentiert, oder eine tautomere Form hiervon, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz hiervon oder ein pharmazeutisch verträgliches Solvat hiervon, wobei A₁ eine substituierte oder unsubstituierte aromatische Heterocyclyl-Gruppe repräsentiert; R₁ ein Wasserstoffatom, eine Alkyl-Gruppe, eine Acyl-Gruppe eine Aralkyl-Gruppe repräsentiert, wobei die Aryl-Komponente substituiert oder unsubstituiert sein kann, oder eine substituierte oder unsubstituierte Ary1-Gruppe; R₂ und R₃ jeweils Wasserstoff repräsentierten oder R₂ und R₃ zusammen eine Bindung repräsentiert; A₂ eine Benzyl- oder Chromanyl-Komponente repräsentiert, die, wenn es die Valenz erlaubt, bis zu 5 Substituenten aufweisen; und n eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 6 repräsentiert.
In anderen Ausführungsformen kann der PPARγ-Agonist ein natürlich vorkommender Ligand des Rezeptors sein, wie beispielsweise ein Arachidonat-Metabolit, beispielsweise ein Metabolit von PGD₂.
Um bestimmte unerwünschte Nebenwirkungen der Behandlung mit PPARγ-Agonisten zu vermeiden oder zu minimieren, kann es in bestimmten Ausführungsformen des gegenständlichen Verfahrens wünschenswert sein, dass der PPARγ-Agonist die PPARγ-abhängige Transkription in einer Konzentration aktiviert, die in zumindest einer Größenordnung geringer ist als diejenige, die für dieselbe Aktivierungsebene von PPARα-, PPARδ- oder RAR-abhängiger Transkription erforderlich ist.
Der PPARγ-Agonist kann alleine oder mit einem anderen Mittel als Teil einer therapeutischen Vorschrift verabreicht werden. Beispielsweise kann der PPARγ-Agonist gleichzeitig mit einem oder mehreren Mitteln, wie beispielsweise Mitose-Hemmern, Alkylierungsmitteln, Antimetaboliten, Nukleinsäure-interkalierenden Mitteln, Topoisomerasehemmern, Mitteln, die die Apoptose fördern und/oder Mitteln, die Immunreaktionen fördern, verabreicht werden. In anderen Ausführungsformen kann der PPARγ-Agonist mit einem RXR-Agonisten verabreicht werden. Ein solcher RXR-Agonist kann natürliche oder synthetische Retinoide sein. Ein beispielhafter RXR-Agonist wird in der allgemeinen Formel:
repräsentiert.
Der PPARγ-Agonist wird mit einem MAP-Kinase-Inhibitor verabreicht. Ein solcher Inhibitor bzw. Hemmer kann ein natürliches oder synthetisches Mittel sein, das speziell die MAP-Kinase-Aktivität blockiert, beispielsweise PD098059 (Parke-Davis).
Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt Zusammensetzungen und Kits zum gleichzeitigen Verabreichen zumindest eines PPARγ-Agonisten und zumindest eines MAP-Kinase-Inhibitors bereit. Beispielsweise können beide Mittel vorgemischt werden, vorzugsweise in einem pharmazeutisch verträglichen Träger. Alternativ können die Mittel separat in Form eines Kits bereitgestellt werden, der (i) eine erste pharmazeutische Zusammensetzung umfasst, die einen PPARγ-Liganden in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger einschließt und (ii) eine zweite pharmazeutische Zusammensetzung umfasst, die einen MAP-Kinase-Inhibitor in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger einschließt, wobei der PPARγ-Ligand und der MAP-Kinase-Inhibitor in einer therapeutisch wirksamen Menge vorliegen, um, nach gleichzeitiger Verabreichung, eine terminale Differenzierung einer PPARγ-responsiven hyperproliferativen Zelle in einem Subjekttier zu induzieren.
Desgleichen kann der PPARγ-Agonist, der in der vorliegenden Erfindung von Nutzen ist, mit anderen Mitteln verabreicht werden, die beispielsweise das Wachstum von oder die Immunreaktion gegen die zu behandelnden hyperproliferativen Zellen bewirken. Wie oben können die zweiten Mittel mit dem PPARγ-Agonisten vorgemischt werden oder als Teil eines Kits bereitgestellt werden, der (i) eine erste pharmazeutische Zusammensetzung, die einen PPARγ-Liganden in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, und (ii) einen oder mehrere zusätzliche pharmazeutische Zusammensetzungen) umfasst, die ein oder mehrere Mittel einschließen, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Mitose-Inhibitoren, Alkylierungsmitteln, Antimetaboliten, Nukleinsäure-interkalierenden Mitteln, Topoisomerase-Hemmern, Mitteln, die die Apoptose fördern und Mitteln, die Immunreaktionen auf Tumoren erhöhen, besteht.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist in den Ansprüchen definiert.
Die Ausübung der vorliegenden Erfindung verwendet, soweit nichts anderes angezeigt ist, herkömmliche Techniken der Zellbiologie, Zellkultur, Molekularbiologie, transgenen Biologie, Mikrobiologie, DNA-Rekombination und Immunologie, die innerhalb des Fachwissens liegen. Solche Techniken sind in der Literatur beschrieben. Siehe beispielswesie Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, herausgegeben von Sambrook, Fritsch und Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Band 1 und 2 (D. N. Glover, Hsg., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, Hsg., 1984); Mullis et al., US-Patent Nr. 4 683 195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins, Hsg., 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins, Hsg., 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Feshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N. Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller und M. P. Calos, Hsg., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Bd. 154 und 155 (Wu et al., Hsg.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer und Walker, Hsg., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Bd. I–IV (D. M. Weir und C. C. Blackwell, Hsg., 1986); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1986).
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung sind aus der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung und aus den Ansprüchen erkennbar.
Ausführliche Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Gruppe von Fotografien, die die Wirkungen von Pioglitazon bei der Stimulierung des Wachstumsstopps und der Fett-Differenzierung von NIH-3T3-Zellen, die ektopisch PPARγ (NIH-PPARγ) exprimieren, im Vergleich mit Kontrollzellen, die mit dem leeren Vektor (NIH-Vektor) infiziert werden, zeigen. Pfeile zeigen eine differenzierte Fettzelle an, die Fetttropfen im Cytoplasma enthält. Die 2A, 2B und 2C zeigen grafische Darstellungen, die das Wachstum von NIH-PPARγ, NIH-Vektor oder HIB1B-Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von PPARγ-Liganden darstellen. 2A ist eine graphische Darstellung, die das kumulative Wachstum von Zellen zeigt, die mit 5 um Pioglitazon unbehandelt oder behandelt sind. 2B ist ein Balkendiagramm, das die prozentuale Abnahme der Zellzahl in den Pioglitazon-behandelten Platten bezüglich der unbehandelten Platten darstellt. 2C ist ein Balkendiagramm, das exponentiell wachsende Zellen darstellt, die mit oder ohne zwei Thiazolidindionen, Pioglitazon (5 μM) oder BRL49653 (1 μM) für 5 Tage behandelt wurden.
3 ist ein Balkendiagramm, das die Wirkungen der Transkriptionsfaktoraktivität von PPARγ auf die negative regulatorische Funktion des Zellwachstums zeigt. Die linke Tafel zeigt die schematischen Darstellungen von Wildtyp PPARγ1 und 2 oder mutierter PPARγ2 cDNAs. Die rechte Tafel zeigt die Wirkungen der Pioglitazon-Behandlung auf die Wachstumsrate bzw. Geschwindigkeit von Zellen, die Wildtyp- oder mutierte Formen von PPARγ exprimieren, behandelt mit oder ohne Pioglitazon.
4 zeigt eine Northern-Analyse von RNA, hergestellt aus einer Vielzahl von humanen Geweben. Wie zur Linken der Figur angezeigt, wurde der Blot mit cDNA für PPARγ und für das Adipozyten-spezifische Bindungsprotein AP2 hybridisiert.
5A zeigt eine Northern-Analyse der Expression von PPARγ RNA in RNA, die aus einer Vielzahl von Liposarkomen präpariert wurde (SP107, SP144, SP147, SP154, SP158, SP160, SP115, SP155, SP156, SP200, SP204, SP116). RNAs, die aus Fett- und Muskelgeweben hergestellt wurden, sind als Kontrollen dargestellt. Der Blot wurde mit PPARγ cDNA hybridisiert.
5B zeigt eine Northern-Analyse der Expression von PPARγ RNA in zwei Liposarkomen (SP155 und SP156) im Vergleich mit einer Vielzahl anderer Typen an Weichteilsarkomen, die malignes fibröses Histiocytom (MFH), Leiomyosarkom, Angiosarkom, maligner peripherer Nervenscheidentumor (Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor = MPNS) oder malignes fibröses Histiocytom (MFH) einschließen. RNA, hergestellt aus Fettgewebe, ist als Kontrolle dargestellt. Der Blot wurde mit PPARγ cDNA hybridisiert.
6 ist eine grafische Darstellung, die die relativen Wirkstärken der Thiazolidindion-Verbindungen bei der Induktion der Expression in CV1-Zellen eines Reporterplasmides darstellt, das die GAL4 stromaufwärts aktivierende Sequenz enthält, koexprimiert mit einem Fusionsexpressionsplasmid, wobei die Hefe GAL4-DNA-Bindungsdomäne an die Liganden-Bindungsdomäne von h PPARy gebunden ist, enthält. Das Aktivierungsniveau ist bezüglich der Konzentration der Thiazolodindion-Verbindungen, BRL49653 (dargestellt durch ausgefüllte Kreise), Pioglitazon (dargestellt durch nicht ausgefüllte Kreise) und Troglitazon (dargestellt durch ausgefüllte Quadrate) angezeigt.
7 ist eine Anordnung von Fotografien, die primäre Kulturen von Liposarkom-Zellen zeigen, kultiviert in Abwesenheit (Tafeln A, C und E) und in Anwesenheit des PPARγ-Liganden Pioglitazon (Tafeln B, D und F). Die Tafeln A und B repräsentieren jeweils unbehandelte und behandelte Zellen; die Tafeln C und D repräsentieren unbehandelte bzw. behandelte Zellen; und die Tafeln E und F repräsentieren unbehandelte bzw. behandelte Zellen.
8 ist eine Northern-Analyse, die die Expression Adipozyten-spezifischer Marker in untransfizierten NIH-Zellen (NIH-Vektoren), NIH-Zellen, die PPARγ aus einem retroviralen Vektor exprimieren (NIH- PPARγ) und humanen Liposarkom-Zellen (LS 857) darstellt. Angezeigt sind unbehandelte Kulturen (-) und Kulturen, die mit Pioglitazon alleine (pio), dem RXR-spezifischen Liganden LG 268 oder beidem behandelt wurden. Wie links angezeigt, wurde der Blot mit PPARγ, aP2 und Adipsin hybridisiert.
9 ist eine Fotografie, die die morphologischen Wirkungen der Behandlung von RXR- oder PPARγ-spezifischen Liganden auf primäre Kulturen humaner Liposarkom-Zellen (LS 857) mit den angezeigten Liganden zeigt; LG 268, Pioglitazon (pio), beide Liganden (pio und LG 268), BRL49653 alleine (BRL) oder in Kombination mit LG 268 (BRL und LG 268).
10 ist eine grafische Darstellung, die die Wirkungen der Verabreichung des Thiazolidindions Troglitazon auf die Reduzierung der Größe von Fettzelltumoren in nackten Mäusen zeigt.
11 zeigt einen Northern Blot, der die Expression von PPARγ-Subtypen in verschiedenen humanen Krebszelllinien zeigt.
12 und 13 sind grafische Darstellungen, die die Wirkung von LG 268 („Ig") und Pioglitazon („pio") auf die HL-60 (Leukämie)-Zelllinie darstellt.
14 ist eine grafische Darstellung, die die Wirkung von LG 268 („Verbindung 268") und Pioglitazon („pio") auf die humane Prostatakrebszelllinie PC3 darstellt.
15 ist eine Northern-Analyse, die die PPARγ mRNA-Expression in Brustkrebszelllinien und Tumoren darstellt. Eine Northern-Blot-Analyse von Brustkrebszellen und Tumoren wurde mit 30 μg Gesamt-RNA pro Bahn durchgeführt. Eine Probe von mRNA aus humanem Fett ist zum Vergleich dargestellt. Eine Hybridisierung an cDNA-Sonden für PPARγ, 36B4 und Aktin wurde wie in den Verfahren beschrieben durchgeführt.
16 zeigt eine immuncytochemische Färbung von metastatischem Brustkrebs- und normalem Brustgewebe mit einem Antikörper gegen PPARγ. Aufeinanderfolgende Schnitte wurden mit Hämatoxilin und Eosin oder mit PPARγ-Kaninchen-Antikörper in einer Verdünnung von 1 : 1000 angefärbt. Die Tafeln A und B zeigen einen histologischen Schnitt eines metastatischen Brustadenokarzinoms zur Lunge, gefärbt mit Hämatoxilin-Eosin (a) oder PPARγ-Antikörper (b). Man bemerke die intensive Braunfärbung des Kerns der metastatischen Adenokarzinomzellen (Pfeil 1) und die Braunfärbung des Kerns von Lungenpneumozyten (Pfeil 2). Die Tafeln C und D zeigen einen histologischen Schnitt von normalem Brustgewebe, gefärbt mit Hämatoxilin und Eosin (c) oder PPARγ-Antikörper (d).
Man bemerke die intensive Braunfärbung des Kerns der umgebenden normalen Fettzellen (Pfeil 4).
17 zeigt die Fettakkumulation in Brustkrebszellen, induziert durch PPARγ-Liganden. Eine Färbung für Lipide wurde mit Oil red O (a, c) oder durch Nilrot-Fluoreszenzfarbstoff (b) durchgeführt. Neutrales Lipid bzw. Neutralfett färbt mit Oil red O und mit Nilrot gelb. 21PT-Zellen wurden mit 10 μM Pioglitazon oder Troglitazon oder Träger für 7 Tage behandelt. b. 21PT-Zellen wurden mit 10 μM M2-Verbindung, einem inaktiven Metaboliten von Troglitazon ohne Affinität für PPARγ, 10 μM Troglitazon oder 5 μM 15 DesoxyΔ^12,14PGJ₂ für 5 Tage behandelt. c. 21MT-Zellen, behandelt mit 10 μM Pioglitazon, Troglitazon oder Träger für 15 Tage.
18 zeigt die Wirkungen der PPARγ-Aktivierung auf Wachstum und Genexpression von 21PT Brustkrebszellen. (a) Northern-Blot-Analyse von RNA aus 21PT-Zellen, behandelt für 7 Tage mit Pioglitazon (10 μM), LG268 (100 nM) oder mit einer Kombination aus Pioglitazon und 1 G268 oder Träger alleine. 30 μg der Gesamt-RNA wurden pro Bahn aufgetragen. (b) Einbau von Thymidin in Zellen, die exponentiell wachsen, wenn sie gegenüber 10 μM Pioglitazon oder Troglitazon für 3 oder 7 Tage exponiert wurden. Die Zellen wurden mit 2 μCi/ml³H-Thymidin für weitere 24 Stunden mit Troglitazon, Pioglitazon oder Träger inkubiert. Fehler-Balken repräsentieren die Standardabweichung: (c) Klonogener Assay in Zellen, die zuerst mit Troglitazon oder Träger für 15 Tage (siehe Verfahren) behandelt wurden und dann zu 10⁴-Zellen pro 10 cm Schale wieder ausplattiert wurden, in Gegenwart oder Abwesenheit von Troglitazon (10 μM). Zellen, die gegenüber Troglitazon exponiert wurden, zeigen eine Reduktion des Klonwachstums.
19 zeigt, dass die MAP-Kinase-Hemmung die Ligandenaktivierung von PPARγ in 21MT-Zellen potenziert bzw. vermehrt. (a) Oil-red-O-Färbung für Lipidakkumulation und (b) Northern-Blot-Analyse von mRNA 21MT-Zellen wurden für 7 Tage mit 10 μM Troglitazon, 4 μM MEK-Inhibitor PD098059 oder der Kombination von beidem behandelt. (c) Western-Blot-Analyse von Proteinextrakten aus Zellen, die mit 10 μM Troglitazon, mit 40 μM MEK-Inhibitor PD098059, mit der Kombination aus beidem oder Träger für 4 Stunden kultiviert wurden. Der Antikörper gegen MAP-Kinase wurde speziell hergestellt, um nur die phosphorylierte, aktivierte Form dieses Enzyms zu erkennen. Der Antikörper gegen PPARγ erkennt sowohl die rascher migrierende, unphosphorylierte Form (–) und die langsamer migrierende, phosphorylierte Form (P).
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Induktion einer terminalen Differenzierung repräsentiert eine viel versprechende Alternative zur herkömmlichen Chemotherapie bestimmter maligner Erkrankungen. Das als „Differenzierungstherapie" bekannte Prinzip basiert auf der Beobachtung, dass Krebszellen in einem unreifen Stadium der Entwicklung angehalten werden. Es wurde demonstriert, dass bestimmte Tumorzellen induziert werden können, um terminal, sowohl in vitro als auch in vivo, zu Zellen zu differenzieren, die nicht so rasch wie die unbehandelten Tumorzellen proliferieren, beispielsweise, die zu einem apparent ruhenden Phänotyp zurückkehren. Eine Gruppe von Mitteln, von der bekannt ist, dass sie die terminale Differenzierung von Zellen induzieren, sind Retinoide. Der Retinsäurerezeptor a (RARα), der eine bedeutende Rolle bei der Differenzierung und malignen Transformation von Zellen der Myelocyten-Linie spielt, wurde als Target zur Intervention der akuten promyelotischen Leukämie (Acute Promyelotic Leukemia = APML) verwendet (Warrel, R. P. et al. (1993), N. Engt. J. Med. 329: 177–189). Die Differenzierungstherapie mit All-Trans-Retinsäure wurde der Standard zur Behandlung dieser Erkrankung.
Gemäß der vorliegenden Erfindung repräsentieren ebenfalls Rezeptoren der Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptor (PPAR)-Familie Targets zur Differenzierungstherapie. Wie ausführlicher hierin beschrieben wird, können Agonisten der PPARγ-Sub-Familie dazu verwendet werden, die Proliferation einer Vielzahl hyperplastischer und neoplastischer Gewebe zu hemmen. Gemäß der vorliegenden Erfindung können PPARγ-Agonisten in der Behandlung sowohl pathologischer als auch nicht-pathologischer proliferativer Zustände verwendet werden, die durch ein unerwünschtes Wachstum PPARγ-responsiver Zellen charakterisiert sind. Solche Bedingungen schließen Gewebe mit transformierten Zellen ein, beispielsweise Karzinome, Sarkome, Leukämien ebenso wie fortgeschrittene metastatische Brusttumore.
Liposarkome sind in der Häufigkeit nur gegenüber malignem fibrösem Histiocytom unter den Weichteilsarkomen an zweiter Stelle. Liposarkome entstehen aus transformierten Fettvorläuferzellen. Diese Tumoren sind bei Erwachsenen die häufigsten Weichteilmalignitäten bzw- malignen Erkrankungen, und machen zumindest 20% aller Sarkome in dieser Altersgruppe aus. Liposarkom-Tumore treten am häufigsten in den Extremitäten auf, insbesondere im Oberschenkel und im Retroperitonealraum. Drei histologische Hauptklassifizierungen des Liposarkoms sind bekannt: gut differenziert/entdifferenziert, myxoid/Rundzelle und pleomorph. Ein chirurgischer Eingriff, einschließlich einer Amputation betroffener Gliedmaßen bleibt die primäre Art und Weise der Therapie für eine lokalisierte Erkrankung. Ein metastatisches Liposarkom ist mit einer extrem schlechten Prognose verbunden, mit durchschnittlichen 5-Jahres-Überlebensraten im Bereich von 70–25% abhängig von der Art des Tumors. Eine konventionelle Chemotherapie führt für metastatisches Liposarkom nur in ungefähr 10% der Fälle zu einer vollständigen Reaktion und für die meisten Patienten ist sie überwiegend palliativ (Sreekantaiah et al. (1994), Am. J. Pathol. 144: 1121–1134).
Brustkrebs verursacht unter amerikanischen Frauen mehr Todesfälle als jede andere maligne Erkrankung. Die gegenwärtige Therapie für primären Brustkrebs schließt eine chirurgische Entfernung mit oder ohne Bestrahlung oder Chemotherapie ein, abhängig vom Umrang der Erkrankung. Eine herkömmliche adjuvante Chemotherapie ist aus zwei Hauptgründen suboptimal: Sie ist mit einer signifikanten Toxizität verbunden und sie kommt nur ungefähr 20–25% der Patienten zugute. Für fortgeschrittenen metastatischen Brustkrebs ist die zytotoxische Standardchemotherapie überwiegend palliativ und verursacht eine nur geringe Verbesserung der Überlebensrate.
In einem Aspekt zeigt klinischer und experimenteller Beweis, dass die Differenzierung und Malignität in Adipozytenzellen umgekehrt korreliert ist. Insbesondere kann die therapeutische Behandlung maligner Transformationen von Fettzelllinien beispielsweise bei der Behandlung von Liposarkomen durch Induzieren einer terminalen Adipozyten-Differenzierung mit einem Mittel(n) dürchgeführt werden, das eine Aktivierung transkriptionaler Komplexe verursacht, die PPARγ einschließen. Die vorliegende Erfindung basiert teilweise auf der unerwarteten Erkenntnis, dass eine Verabreichung von PPARγ-Agonisten, wie beispielsweise den synthetischen Thiazolidindion-Liganden (TZDs) beim Reduzieren der Größe von Fettzelltumoren in vivo wirksam ist. Wie in den beigefügten Beispielen beschrieben wird, wird gezeigt, dass die Aktivierung von PPARγ ausreichend ist, um ein Anhalten des Zellzyklus zu verursachen, ebenso wie eine Adipogenese in logarithmisch wachsenden Zellen zu initiieren. Es wird zusätzlich dargestellt, dass PPARγ konsistent in jedem der histologischen Haupttypen von humanem Liposarkom und in Adenokarzinomen aus Brustkrebszellen exprimiert wird. Es wird dargestellt, dass die Aktivierung dieses Rezeptors mit ektopisch zugesetztem Rezeptorligand die terminale Differenzierung primärer Liposarkomzellen in vitro und in vivo fördert.
Die vorliegende Erfindung basiert ebenfalls teilweise auf der Erkenntnis, dass die Hemmung der MAP-Kinase, von der kürzlich gezeigt wurde, dass sie ein kraftvoller negativer Regulator vom PPARγ ist, die TZD-Ligandenempfindlichkeit relativ nicht-responsiver Zellen verbessert, was nahelegt, dass dieses Enzym mit der Funktion von PPARγ interferieren kann. Überdies wurde demonstriert, dass die Ligandenaktivierung dieses Rezeptors in kultivierten Zellen, die sowohl von primären als auch metastatischen humanen Brusttumoren gewonnen wurden, eine dramatische morphologische Konversion mit einer umfassenden Lipidakkumulation verursacht. Zusätzlich existieren Veränderungen in der Brustkrebs-Epithelgenexpression, die mit einem differenzierteren, weniger malignen Zustand assoziiert sind. Koinzident mit diesen Veränderungen der Morphologie und Genexpression erfolgt eine Reduktion der Wachstumsgeschwindigkeit und der klonogenen Kapazität der Zellen. Zusammengenommen können PPARγ-Liganden und MAP-Kinase-Inhibitoren die terminale Differenzierung maligner Brustepithelzellen induzieren und somit eine neue, nicht-toxische Therapie bereitstellen.
Zusätzlich zu Weichteilläsionen können PPARγ-Agonisten ebenfalls in vorteilhafter Weise bei der Behandlung proliferativer Störungen verwendet werden, die hämopoetisches und lymphatisches Gewebe mit einschließen, ebenso wie bei bestimmten proliferativen Störungen von Weichteilen. Die beigefügten Beispiele beschreiben die Expression von PPARγ in Zellen, die aus einer Vielzahl von Karzinomen und Leukämien gewonnen wurden. Darüber hinaus wurde demonstriert, dass PPARγ-Agonisten dazu in der Lage sind, die Proliferation solcher Zellen zu hemmen, und es wurde demgemäß ein allgemeines Paradigma etabliert, durch das das Wachstum PPARγ-responsiver hyperproliferativer Zellen reguliert werden kann.
Es wurde ebenfalls demonstriert, dass RXR-spezifische Liganden potente adipogene Mittel in Zellen sind, die das PPARγ/RXRα-Heterodimer exprimieren, und dass eine Behandlung von Liposarkomzellen sowohl mit PPARγ- als auch RXR-spezifischen Liganden eine additive Stimulierung der Differenzierung zur Folge hat. Diese Ergebnisse zeigen, dass PPARγ- Liganden, wie beispielsweise Thiazolidindione und RXR-spezifische Retinoide alleine oder in Kombination als Differenzierungstherapie für Liposarkome von Nutzen sind.
Vor einer weiteren Beschreibung der Erfindung werden bestimmte Begriffe, die in der Beschreibung, den Beispielen und den beigefügten Ansprüchen verwendet werden, praktischerweise hier zusammengestellt.
Der Begriff „PPARγ" betrifft Mitglieder der Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptorenfamilie, die unter anderem in Adipozyten- und hämatopoetischen bzw. hämopetischen Zellen exprimiert werden (Braissant, O. et al., Endocrinology 137 (1): 354– 66), und die als Schlüsselregulatoren der Differenzierung dienen. In diese Definition mit eingeschlossen sind Varianten hiervon, wie beispielsweise PPARγ1 und PPARγ2, die zwei Isoformen sind, die einen unterschiedlichen N-Terminus aufweisen, erzeugt durch alternatives Spleißen eines primären RNA-Transkriptes (Tontonoz, P. et al. (1994), Genes & Dev. 8: 1224–34; Zhu et al. (1993), J. Biol. Chem. 268: 26817–20).
Die Begriffe „PPARγ-responsive hyperproliferative Zelle" und „PPARγ-responsive neoplastische Zelle" werden hierin austauschbar verwendet und betreffen eine neoplastische Zelle, die gegenüber PPARγ-Agonisten responsiv ist. Diese neoplastische Zelle reagiert auf eine PPARγ-Rezeptoraktivierung durch Hemmung der Zellproliferation und/oder durch Induzieren der Expression Differentiations-spezifischer Gene. Dieser Begriff schließt Tumorabgeleitete Zellen ein, die sich zu Adipozyten-Zelllinien in Reaktion auf PPARγ-Liganden, beispielsweise humane Liposarkom-Zellen, differenzieren.
Wie hierin verwendet, betrifft ein „PPARγ-Agonist", der im Verfahren der Erfindung von Nutzen ist, ein Mittel, das die Transkriptionsaktivität eines PPARγ-Rezeptors in einer neoplastischen Zelle vermehrt, induziert oder in anderer Weise verbessert. In bestimmten Ausführungsformen kann ein Agonist die Aktivierung der Transkription von PPARγ-Transkriptionskomplexen induzieren, bespielsweise durch Nachahmen eines natürlichen Liganden für den Rezeptor. In anderen Ausführungsformen steigert der Agonist die Empfindlichkeit des Rezeptors gegenüber einem PPARγ-Ligand, beispielsweise senkt eine Behandlung mit dem Agonisten die Konzentration des Liganden, die zum Induzieren einer speziellen Konzentration einer Rezeptor-abhängigen Genaktivierung erforderlich ist.
Wie hierin verwendet, schließt der Begriff „PPARγ-Ligand", der im Verfahren der Erfindung von Nutzen ist, jedes natürlich vorkommende oder nicht-natürlich vorkommende Mittel ein, das selektiv und spezifisch an ein PPARγ-Protein bindet und das nach Bindung die Transkription der Gene aktiviert, die ein PPARγ-responsives Element enthalten. Beispiele für solche Liganden schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Thiazolidindion-Verbindungen, beispielsweise Pioglitazon, Troglitation, BRL49563 und Derivate hiervon, oder Prostaglandin (PG) Metabolite, beispielsweise Prostaglandin 15-Desoxy^Δ12,14PGJ₂ und Derivate hiervon.
Der Begriff „MAP-Kinase-Inhibitor" wird hierin verwendet, um jedes Mittel zu bezeichnen, das spezifisch die MAP-Kinaseaktivität blockiert, beispielsweise PD980-59.
Der Begriff „Mittel", wie hierin verwendet, bezeichnet eine chemische Verbindung, ein Gemisch chemischer Verbindungen, ein biologisches Makromolekül oder einen Extrakt, der aus biologischen Materialien, wie beispielsweise Bakterien, Pflanzen, Pilz- oder Tier-(insbesondere Säugetier-)Zellen oder -geweben hergestellt ist. Die Mittel können bezüglich ihrer Aktivität als antiproliferative Mittel durch Anwendung eines Screening-Assays evaluiert werden, wie er beispielsweise hierin nachstehend beschrieben ist.
Der Begriff „Aktivierung von PPARγ" betrifft die Fähigkeit einer Verbindung, die PPARγ-abhängige Genexpression selektiv zu aktivieren, beispielsweise durch Erhöhung der PPARγ-abhängigen Transkription eines Gens.
Die „Transkriptionsaktivität" eines PPARγ-Rezeptors betrifft die Fähigkeit des Rezeptors, in einer Liganden-abhängigen Weise an DNA zu binden und durch sich selbst oder im Komplex mit anderen Faktoren eine Aktivierung der RNA-Polymerase zu verursachen, um eine Transkription von DNA-Sequenzen zu verursachen, die dem Ort auf der DNA benachbart sind, an die der PPARγ-Rezeptor band. Ein PPARγ-Rezeptor ist „transkriptionell aktiviert", wenn er in einem Liganden-komplexierten Zustand ein höheres Niveau der Expression eines Genes verursacht als in Abwesenheit des Liganden.
Die übliche medizinische Bedeutung des Begriffs „Neoplasie" betrifft „neues Zellwachstum", das sich als Verlust der Ansprechbarkeit gegenüber den Kontrollen normalen Wachstums ergibt, beispielsweise ein neopastisches Zellwachstum. Eine „Hyperplasie" betrifft Zellen, die eine abnormal hohe Wachstumsrate durchlaufen. Jedoch können, wie hierin verwendet, die Begriffe „Neoplasie" und „Hyperplasie" austauschbar verwendet werden, weil, wie der Kontext zeigen wird, sie im Allgemeinen Zellen betreffen, die abnormale Zellwachstumsraten erfahren. Neoplasien und Hyperplasien schließen „Tumore" ein, die entweder benign, prämalign oder malign sein können.
Wie hierin verwendet, werden die Begriffe „hyperproliferativ" und „neoplastisch" austauschbar verwendet und betreffen solche Zellen eines abnormalen Zustandes oder Bedingung, der durch eine rasche Proliferation oder Neoplasma charakterisiert ist. Die Begriffe sollen alle Typen von kanzerösem Wachstum oder onkogenen Prozessen, metastatischen Geweben oder malignen transformierten Zellen, Geweben oder Organen einschließen, unabhängig vom histopathologischen Typ oder Stadium der Invasion. „Pathologische hyperproliferative" Zellen treten in Krankheitsstadien auf, die durch ein malignes Tumorwachstum gekennzeichnet sind.
Der Begriff "Fettzelltumor" betrifft alle Krebsarten oder Neoplasien, die sich aus Zellen der Adipozyten-Zelllinie ergeben, beispielsweise die sich aus Fett- oder Fettvorläuferzellen ergeben. Die Fettzelltumore schließen sowohl übliche als auch unübliche, benigne und maligne Läsionen ein, wie beispielsweise Lipom, intramuskuläres und intermuskuläres Lipom, neurales Fibrolipom, Lipoblastom, Lipomatose, Hibemom, Hämangiom und Liposarkom ebenso wie Läsionen, die Fett enthaltende Weichteilmassen nachahmen.
Der Begriff „Karzinom" wird vom Fachmann auf dem Gebiet als solches erkannt und betrifft maligne Erkrankungen von Epithel- oder Endokringeweben, einschließlich von Karzinomen des Atemsystems, Karzinomen des Gastrointestinalsystems, des Genitourinarsystemes, der Hoden, Brustkarzinom, Prostatakarzinom, Karzinom des Endokrinsystems und Melanome. Beispielhafte Karzinome schließen solche ein, die sich aus Geweben der Zervix, Lunge, Prostata, Brust, Kopf und Hals, Darm und Ovarien bzw. Eierstöcken bilden. Der Begriff schließt ebenfalls Karzinosarkome ein, beispielsweise die maligne Tumoren einschließen, die aus karzinomatösen und sarkomatösen Geweben zusammengesetzt sind. Ein „Adenokarzinom" betrifft ein Karzinom, das aus Drüsengewebe abgeleitet ist oder bei dem die Tumorzellen erkennbare Drüsenstrukturen bilden.
Der Begriff „Sarkom" wird vom Fachmann auf dem Gebiet erkannt und betrifft maligne Tumoren mesenchymaler Abstammung.
Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff „leukämischer Krebs" alle Krebsarten oder Neoplasien der hämatopoetischen und Immunsysteme (Blutsystem und lymphatisches System). Die akuten und chronischen Leukämien zusammen mit den anderen Typen von Tumoren des Blutes, von Knochenmarkszellen (Myelome) und des Lymphgewebes (Lymphome) verursachen ungefähr 10% aller Krebstodesfälle und ungefähr 50% aller Krebstodesfälle bei Kindern und Erwachsenen von weniger als 30 Jahren Alter. Die chronische myelogene Leukämie (CML), die ebenfalls als chronische granulozytäre Leukämie (CGL) bekannt ist, ist eine neoplastische Störung der hämatopoetischen Stammzellen.
Der Begriff „Leukämie" ist dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und betrifft eine progressive, maligne Erkrankung der blutbildenden Organe, markiert durch eine gestörte Proliferation und Entwicklung von Leukozyten und deren Vorläufern im Blut und im Knochenmark.
Die Begriffe „antineoplastisches Mittel" und „antiproliferatives Mittel" werden hierin austauschbar verwendet und betreffen Mittel, die die funktionelle Eigenschaft haben, die Proliferation von PPARγ-responsiven Zellen zu hemmen, beispielsweise die Entwicklung oder das Fortschreiten einer Neoplasie zu hemmen, die eine solche Eigenschaft aufweist, insbesondere ein Adipozyten-Neoplasma oder eine hämatopoetisches Neoplasma.
Wie hierin verwendet, betrifft eine „therapeutisch wirksame antineoplastische Menge" eines PPARγ-Agonisten eine Menge eines Mittels, das nach einzelner oder mehrfacher Dosisverabreichung an den Patienten zur Hemmung des Wachstums der neoplastischen PPARγ-responsiven Zellen oder zur Verlängerung des Überlebens des Patienten mit solchen neoplastischen Zellen über das hinaus wirksam ist, was in Abwesenheit einer solchen Behandlung zu erwarten wäre. Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff „Hemmung des Wachstums" des Neoplasmas eine Verlangsamung, Störung, Anhaltung oder Stoppen dessen Wachstums und der Metastasen und zeigt nicht notwendigerweise eine totale Elimination des neoplastischen Wachstums an.
Wie hierin verwendet, betrifft eine „prophylaktisch wirksame antineoplastische Menge" einer Verbindung eine Menge eines PPARγ-Agonisten, die nach Einzel- oder Mehrfachdosisverabreichung an den Patienten zur Vorbeugung oder Verzögerung des Ausbruchs oder des Wiederauftretens eines neoplastischen Erkrankungszustandes wirksam ist.
Der Begriff „proliferativer Index" ist dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und betrifft die Rate bzw. Geschwindigkeit, in der die Zellteilung auftritt.
Die Begriffe induzieren" hemmen" potenzieren" erhöhen" zunehmen" abnehmen" oder dergleichen, die beispielsweise quantitative Unterschiede zwischen zwei Zuständen bezeichnen, betreffen zumindest statistisch signifikante Unterschiede zwischen den beiden Zuständen. Beispielsweise bedeutet „eine Menge, die zur Hemmung des Wachstums der PPARγ-responsiven hyperproliferativen Zellen wirksam ist", dass die Wachstumsgeschwindigkeit der Zellen von den unbehandelten Zellen zumindest statistisch signifikant verschieden sein wird. Solche Begriffe werden hierin beispielsweise auf Geschwindigkeiten der Zellproliferation, Expressionsniveaus und Niveaus einer Transkriptionsaktivität angewendet.
„Signaltransduktion eines PPARγ-Rezeptorproteins" ist die intrazelluläre Prozessierung chemischer Signale, die als Folge der Aktivierung des Kernrezeptors auftreten und können durch ein oder mehrere Mechanismen auftreten, wie beispielsweise Ligandenbindung, Heterodimerkomplexbildung, DNA-Bindung und/oder direkte oder indirekte Aktivierung der Transkription. Veränderungen des Signaltransduktionsweges werden letztendlich durch die erhöhte Expression und Differentiation spezifischer Gene und/oder Entfernung aus dem Zellzyklus nachgewiesen werden.
Wie hierin verwendet, ist ein „Reportergen-Konstrukt" eine Nukleinsäure, die ein „Reportergen" operativ gebunden an transkriptionelle regulatorische Sequenzen einschließt. Die Transkription des Reportergens wird durch diese Sequenzen kontrolliert. Typischerweise schließt das Reportergenkonstrukt ein Reportergen in operativer Bindung mit einem oder mehreren responsiven Elementen ein, die als direkte Repeats bzw. Wiederholungen eines PPARγ-Response-Elementes (PPRE) angeordnet sind. Die Aktivität zumindest eines oder mehrerer dieser Kontrollsequenzen wird direkt durch das PPARγ-Kernrezeptorprotein reguliert. Die transkriptionellen regulatorischen Sequenzen schließen den Promotor und andere regulatorische Regionen, wie beispielsweise Enhancer-Sequenzen ein, die die Aktivität des Promotors regulieren. Beispielsweise kann die Aktivierung des Hochaffinitätsheterodimer-Komplexes aus PPARγ/RXR mit einem PPARγ-Liganden, der an zumindest ein oder mehrere PPRE-Response-Elemente gebunden ist, die Aktivität des Promotors durch Veränderung der RNA-Polymerase-Bindung an die Promotorregion oder alternativ durch Steigern der Initiation der Transkription oder der Verlängerung der mRNA steigern.
I. Verfahren zur Hemmung der Proliferation von PPARγ-responsiven hyperproliferativen Zellen.
Bei einem Aspekt kann die Erfindung in Verfahren zur Hemmung der Proliferation und/oder der Umkehrung des transformierten Phänotyps von PPARγ-responsiven hyperproliferativen Zellen verwendet werden, indem die Zellen mit einem PPARγ-Agonisten in Berührung gebracht werden. Im Allgemeinen schließt das Verfahren einen Schritt des In-Berührung-Bringens von pathologischen hyperproliferativen Zellen mit einer Menge eines PPARγ-Agonisten ein, die wirksam ist, die Differenzierung der hyperproliferativen Zellen zu fördern. Das vorliegende Verfahren kann mit Zellen in Kultur durchgeführt werden, beispielsweise in vitro oder ex vivo, oder kann mit Zellen durchgeführt werden, die in einem Tier-Subjekt vorliegen, beispielsweise als Teil einer therapeutischen In-vivo-Vorschrift. Die Therapievorschrift kann bei einem Menschen oder einem anderen Tiersubjekt durchgeführt werden. Die Induktion der terminalen Differenzierung transformierter Zellen in vivo in Reaktion auf PPARγ-Agonisten repräsentiert eine Alternative zu herkömmlicherweise hoch toxischen Vorschriften der Chemotherapie.
Während die PPARγ-Agonisten alleine verwendet werden können, kann die gegenständliche Differenzierungstherapie in Kombination mit anderen Therapeutika durchgeführt werden, beispielsweise Zellzyklusinhibitoren, Mittel, die die Apoptose fördern, Mittel, die die Immunreaktion stärken, RXR-Agonisten und/oder MAP-Kinase-Inhibitoren. Einige der gleichzeitig verabreichten Therapeutika, insbesondere solche mit zytotoxischen Wirkungen, ohne die eine Spezifität für die behandelten Zellen fehlt, können in kleineren Dosen gegeben werden, was auf ein Additiv zurückzuführen ist, und manchmal auf eine synergistische Wirkung mit dem PPARγ-Agonisten.
In einer Ausführungsform sind die zu behandelnden Zellen hyperproliferative Zellen einer Adipozyten-Zelllinie bzw. -Abstammung, die beispielsweise aus Fett- oder Fettvorläuferzellen entstehen. Beispielsweise kann das vorliegende Verfahren durchgeführt werden, um die Proliferation eines Fettzelltumors zu verhindern. Die Fetttumorzellen können ein Liposarkom sein. Der Begriff „Liposarkom" ist dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und betrifft einen malignen Tumor, der durch große anaplastische Lipoblasten charakterisiert ist, manchmal mit Foci von normalen Fettzellen. Beispielhafte Liposarkom-Typen, die durch die vorliegende Erfindung behandelt werden können, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, gut differenziert/entdifferenziert, Myxoid/Rundzellen und pleiomorph (Überblick in Sreekantaiah, C. et al. (1994), s. o.).
Ein weiterer Fettzelltumor, der durch das vorliegende Verfahren behandelt werden kann, schließt Lipome ein, beispielsweise benigne Fetttumore, die üblicherweise aus reifen Fettzellen zusammengesetzt sind. Desgleichen kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung bei der Behandlung und/oder Prophylaxe von Lipochondromen, Lipofibromen und Lipogranulomen verwendet werden. Lipochondrome sind Tumore, die aus reifen lipomatösen und kartilaginösen Elementen zusammengesetzt sind; Lipofibrome sind Lipome, die Gebiete einer Fibrose enthalten; und Lipogranulome sind durch Knoten eines lipoiden Materials gekennzeichnet, die mit einer granulomatösen Entzündung assoziiert sind.
Das gegenständliche Verfahren kann ebenfalls dazu verwendet werden, die Proliferation hyperplastischer/neoplastischer Zellen hämatopoetischen Ursprungs zu hemmen, die sich beispielsweise aus myeloiden, lymphoiden oder erythroiden Zellabstammungslinien ergeben oder Vorläuferzellen hiervon. Beispielsweise umfasst die vorliegende Erfindung die Behandlung verschiedener Myeloid-Störungen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, akute promyeloide Leukämie (Acute Promyeloid Leukemia = APML), akute myelogene Leukämie (Acute Myelogeneous Leukemia = AML) und chronische myelogene Leukämie (Chronic Myelogenous Leukemia = CML) (Überblick in Vaickus, L. (1991), Crit. Rev. in Oncol/Hemotol. 11: 267–97). Lymphoide Malignitäten, die durch das gegenständliche Verfahren behandelt werden können, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, akute lymphoplastische Leukämie (ALL), die eine B-Abstammungs-ALL und eine T-Abstammungs-ALL einschließt, chronische Lymphozytenleukämie (CLL), prolymphozytische Leukämie (PLL), Haarzellleukämie (HLL) und Waidenstrom's Makroglubulinämie (WM). Zusätzliche Formen maligner Lymphome, die durch das Behandlungsverfahren der vorliegenden Erfindung miteingeschlossen sind, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Non-Hodgkin-Lymphom und Varianten hiervon, periphere T-Zell-Lymphome, adulte T-Zell-Leukämie/Lymphom (ATL), kutanes T-Zell-Lymphom (CTCL), großkernige lymphozytische Leukämie (LGF) und Hodgkin-Krankheit.
Das gegenständliche Verfahren kann bei der Behandlung von Malignitäten der verschiedenen Organsysteme verwendet werden, die beispielsweise die Lunge, Brust, das Lymphsystem, den Gastrointestinaltrakt und den Urogenitaltrakt betreffen, ebenso wie Adenokarzinome, die Malignitäten, die beispielsweise die meisten Darmkrebstypen, Nierenzellkarzinom, Prostatakrebs und/oder Hodentumore einschließen, Nicht-kleinzelliges-Lungenkarzinom, Krebs des Dünndarms und Speiseröhrenkrebs einschließen. Gemäß des allgemeinen Paradigmas der PPARγ-Einbeziehung in die Differenzierung transformierter Zellen schließen beispielhafte feste Tumore, die gemäß des Verfahrens der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, Sarkome und Karzinome mit PPARγ-responsiven Phänotypen ein, wie beispielsweise, jedoch nicht beschränkt auf: Fibrosarkom, Myxosarkom, Liposarkom, Chondrosarkom, osteogenes Sarkom, Chordom, Angiosarkom, Endotheliosarkom, Lymphangionsarkom, Lymphangioendotheliosarkom, Synoviom, Mesotheliom, Ewing-Tumor, Leiomyosarkom, Rhabdomyosarkom, Darmkrebs, Pankreaskrebs, Brustkrebs, Eierstockkrebs, Prostatakrebs, Plattenepithelkarzinom, Basalzellkarzinom, Adenokarzinom, Schweißdrüsenkarzinom, Talgdrüsenkarzinom, papilläres Karzinom, papilläres Adenokarzinom, Zystadenokarzinom, medulläres Karzinom, bronchogenes Karzinom, Nierenzellkarzinom, Hepatom, Gallenwegskarzinom, Choriokarzinom, Seminom, embryonales Karzinom, Wilms-Tumor, Zervikalkrebs, Hodenkrebs, Lungenkarzinom, kleinzelliges Lungenkarzinom, Blasenkarzinom, Epithelkarzinom, Gliom, Astrozytom, Medulloblastom, Kraniopharyngiom, Ependymom, Pinealom, Hämangioblastom, Akustikusneurinom, Oligodendrogliom, Meningiom, Melanom, Neuroblastom und Retinoblastom.
Spezielle Beispiele nicht natürlich vorkommender PPARγ-Liganden schließen Thiazolidin (TZD)-Derivate ein, die als Thiazolidindion bekannt sind, beispielsweise Proglitazon (ebenfalls als AD-4833 und U-72107E bekannt), Troglitazon (ebenfalls als CS-045) (Sankyo) und C1-991 (Parke-Davis) bekannt, BRL 49653, Ciglitazon, Englitazon und chemische Derivate hiervon. Diese Verbindungen sind herkömmlicherweise zur Behandlung der Diabetes bekannt. Siehe beispielsweise US-Patent Nr. 4 812 570; 4 775 687; 4 725 610; 4 582 839 und 4 572 912 für beispielhafte Quellen solcher Verbindungen. Die US-Patent 5 521 201 und die europäischen Patentanmeldungen 0008203, 0139421, 0155845, 0177353, 0193256, 0207581 und 0208420 und Chem. Pharm. Bull. 30(10) 3580–3600 betreffen Thiazolidindion-Derivate und beschreiben kommerzielle Quellen/Syntheseschemen für eine Vielzahl von TZD und TZD-artigen Analoga, die bei der Durchführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung von Nutzen sein können.
Spezielle Beispiele natürlich vorkommender PPARγ-Liganden schließen Arachidonsäuremetaboliten, beispielsweise Prostaglandin J₂ (PGJ₂) Metaboliten, beispielsweise 15-Desoxy-^Δ12,14-Prostaglandin J₂ ein. Die Prostaglandin J₂ Dehydratisierungs- und Isomerisierungsprodukte, einschließlich Δ¹²-PGJ₂ und 15-Desoxy-^Δ12,14-PGJ₂ traten erwiesenermaßen durch Inkubation von Prostaglandin D₂ (PGD₂) in Gegenwart humanem Plasmas oder humanem Serumalbumins auf (Fitzpatrick und Wyvalda (1983), J. Biol. Chem. 258: 11713–18). Δ¹²-PGJ₂- zeigte sich als ein signifikanter PGD₂ Metabolit, der in humanem und Affen-Urin vorliegt, was darauf hinweist, dass PGJ₂ Metaboliten ebenfalls in vivo zu finden sind (Hirata et al. (1994), PNAS USA 91: 11192–96).
Weitere Mittel zur Verwendung in der Erfindung schließen Chemikalien ein, die die endogene Produktion von Arachidonsäure-Metaboliten stimulieren, wenn sie systemisch oder in vitro verabreicht werden. Die gesteigerte Produktion endogener Arachidonsäure-Metaboliten kann durch Stimulieren zumindest eines des folgenden, d. h. der Freisetzung von Arachidonsäure aus Vorläufer-Glycerophospholipiden, der Oxygenierung freier Arachidonsäure durch ein Cyclooxigenase-Enzym und den Metabolismus von Prostaglandin H₂ zu einem spezifisch biologisch aktiven Prostaglandin-Metaboliten eintreten (Überblick in Smith, W. (1989), Biochem. J. 259: 315–324).
Es wird im Allgemeinen bevorzugt, einen PPARγ-Agonisten zu wählen, der die PPAR-Isoform bezüglich beispielsweise PPARα und/oder PPARδ spezifisch aktiviert. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Spezifität für die PPARγ-Isoform unerwünschte Nebenwirkungen reduzieren, wie beispielsweise eine PPARα-vermittelte Hepatokarzinogenese. Insbesondere aktiviert der PPARγ-Agonist der vorliegenden Erfindung vorzugsweise eine PPARγ-abhängige Transkription in einer Konzentration in zumindest einer Größenordnung weniger als diejenige, die eine PPARα-abhängige Transkription aktiviert, und sogar noch mehr bevorzugt bei einer Konzentration von zumindest 2, 3, 4 oder 5 Größenordnungen weniger.
In einer Ausführungsform wird der PPARγ-Agonist durch die allgemeine Formel:
präsentiert oder eine tautomere Form hiervon und/oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz hiervon und/oder ein pharmazeutisch akzeptables Solvat hiervon, bei dem A₁ eine substituierte oder unsubstituierte aromatische Heterocyclyl-Gruppe repräsentiert; R₁ ein Wasserstoffatom, eine Alkyl-Gruppe, eine Acyl-Gruppe, eine Aralkyl-Gruppe repräsentiert, wobei die Aryl-Komponente substituiert oder unsubstituiert sein kann, oder eine substituierte oder unsubstituierte Aryl-Gruppe; R₂ und R₃ jeweils Wasserstoff repräsentieren, oder R₂ und R₃ zusammen eine Bindung bilden; A₂ eine Benzyl- oder Chromanyl-Komponente repräsentiert, die, wenn es die Valenz erlaubt, bis zu 5 Substituenten aufweist; und N eine ganze Zahl im Bereich von 1–6 repräsentiert.
Geeignete aromatische Heterocyclyl-Gruppen schließen substituierte oder unsubstituierte einzelne oder aromatische Heterocyclyl-fusionierte Ringgruppen ein, die bis zu 4 Heteroatome in jedem Ring umfassen, ausgewählt aus Sauerstoff, Schwefel oder Stickstoff. Bevorzugte aromatische Heterocyclyl-Gruppen schließen substituierte oder unsubstituierte Einzelring-aromatische Heterocyclyl-Gruppen mit 4–7 Ringatomen ein, vorzugsweise 5 oder 6 Ringatomen. Insbesondere umfasst die aromatische Heterocyclyl-Gruppe 1, 2 oder 3 Heteroatome, insbesondere 1 oder 2, ausgewählt aus Sauerstoff, Schwefel oder Stickstoff.
Geeignete Substituenten für A₁, wenn es eine 5-gliedrige aromatische Heterocyclyl-Gruppe repräsentiert, schließen Thiazolyl und Oxazolyl, insbesondere Oxazolyl ein. Geeignete Substituenten für A₁, wenn es eine 6-gliedrige aromatische Heterocyclyl-Gruppe repräsentiert, schließen Pyridyl oder Pyrimidinyl ein.
In bevorzugten Ausführungsformen repräsentieren R₂ und R₃ jeweils Wasserstoff.
Vorzugsweise repräsentiert A₁ eine Komponente der Formel (a), (b) oder (c):
wobei:
R₄ und R₅ jeweils unabhängig ein Wasserstoffatom, eine Alkyl-Gruppe oder eine substituierte oder unsubstituierte Aryl-Gruppe repräsentieren, oder, wenn R₄ und R₅ jeweils an benachbarten Kohlenstoffatomen gebunden sind, dann R₄ und R₅ zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an denen sie gebunden sind, einen Benzol-Ring bilden, wobei jedes durch R₄ und R₅ repräsentierte Kohlenstoffatom, zusammen substituiert oder unsubstituiert sein kann; und in der Komponente der Formel (a); und X Sauerstoff oder Schwefel repräsentiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform repräsentieren R₄ und R₅ jeweils unabhängig Wasserstoff, Alkyl oder eine substituierte oder unsubstituierte Phenyl-Gruppe und besonders vorteilhaft repräsentieren R₄ und R₅ jeweils unabhängig Wasserstoff, Alkyl oder Phenyl. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform repräsentieren R₄ und R₅ zusammengenommen eine Komponente der Formel (d):
wobei R₆ und R₇ jeweils unabhängig Wasserstoff, Halogen, substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl oder Alkoxy repräsentieren. In bevorzugten Ausführungsformen repräsentieren R₆ und R₇ Wasserstoff.
Vorzugsweise repräsentieren für die Komponente von Formel (a) R₄ und R₅ zusammen die Komponente der Formel (d).
Vorzugsweise repräsentieren für die Komponenten der Formeln (b) oder (c) R₄ und R₅ beide Wasserstoff.
Es wird klar sein, dass die fünf Substituenten von A₂ drei wahlweise bzw. optionale Substituenten einschließen. Geeignete optionale Substituenten für die Komponente A₂ schließen Halogen, substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl oder Alkoxy ein.
Vorzugsweise repräsentiert A₂ eine Komponente der Formel (e):
wobei R₈ und R₉ jeweils unabhängig Wasserstoff, Halogen, substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl oder Alkoxy repräsentieren.
In einem bevorzugten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Klasse von Verbindungen bereit, die durch die allgemeine Formel:
oder tautomere Formen hiervon und/oder pharmazeutisch verträgliche Salze hiervon und/oder pharmazeutisch verträgliche Solvate hiervon repräsentiert werden, wobei A₁, R₁, R₂, R₃ und n wie oben definiert sind und wobei R₈ und R₉ wie in Bezug auf Formel (e) definiert sind.
Vorzugsweise repräsentiert n eine ganze Zahl 2, 3 oder 4, insbesondere 2 oder 3 und ganz besonders 2.
Geeignete Substituenten für jede Heterocyclyl-Gruppe schließen bis zu 4 Substituenten ein, ausgewählt aus der Gruppe, die aus: Alkyl, Alkoxy, Aryl und Halogen oder irgendwelchen zwei Substituenten an benachbarten Kohlenstoffatomen besteht, zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an denen sie gebunden sind, eine Aryl-Gruppe bilden können, vorzugsweise einen Benzol-Ring, und wobei die Kohlenstoffe der Aryl-Gruppe, die durch die beiden Substituenten repräsentiert sind, selbst substituiert oder unsubstituiert sein können.
Wenn der Begriff „Aryl" hierin verwendet wird, schließt er Phenyl und Naphthyl ein, optional substituiert mit bis zu 5, vorzugsweise bis zu 3 Gruppen, ausgewählt aus Halogen, Alkyl, Phenyl, Alkoxy, Haloalkyl, Hydroxy, Amino, Nitro, Carboxy, Alkoxycarbonyl, Alkoxycarbonylalkyl, Alkylcarbonyloxy oder Alkylcarbonyl-Gruppen.
Wenn der Begriff „Halogen" hierin verwendet wird, betrifft er Fluor, Chlor, Brom und Jod; vorzugsweise Chlor.
Wenn die Begriffe „Alkyl" und „Alkoxy" hierin verwendet werden, betreffen sie Gruppen mit geradkettigen oder verzweigtkettigen Kohlenstoffketten, die bis zu 12 Kohlenstoffatome enthalten.
Wenn der Begriff „Acyl" hierin verwendet wird, schließt er Alkylcarbonyl-Gruppen ein.
Geeignete Alkyl-Gruppen sind C1-12-Alkyl-Gruppen, insbesondere C1-6-Alkyl-Gruppen, beispielsweise Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl oder Tert-Butyl-Gruppen.
Geeignete Substituenten für jede Alkyl-Gruppe schließen solche ein, die oben in Bezug auf den Begriff „Aryl" angegeben sind.
Verbindungen, die zur Ausübung der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, und Verfahren, diese Verbindungen herzustellen, sind bekannt. Beispiele für PPARγ-Agonisten sind in den PCT-Veröffentlichungen WO91/07107, WO92/02520; WO94/01433; WO89/08651; WO95/18533; WO95/35108; in der japanischen Patentveröffentlichung 69383/92; und US-Patenten 5 523 314; 5 521 202; 5 510 360; 5 498 621; 5 496 621; 5 494 927; 5 480 896; 5 478 852; 5 468 762; 5 464 856; 5 457 109; 4 287 200; 4 340 605; 4 438 141; 4 444 779; 4 461 902; 4 572 912; 4 687 777; 4 703 052; 4 725 610; 4 873 255; 4 897 393; 4 897 405; 4 918 091: 4 948 900; 5 002 953; 5 061 717; 5 120 754; 5 132 317; 5 194 443; 5 223 522; 5 232 925; and 5 260 445 offenbart.
Beispielhafte PPARγ-Agonisten können unter solchen Verbindungen wie 5-[4-[2-(5-ethylpyridin-2-yl)ethoxyl]benzyl]thiadiazolidin-2,4-dion: (Pioglitazon); 5-[4-[(1-methylcyclohexyl)-methoxy]benzyl]thiadiazolidin-2,4-dion: (Ciglitazon); 5-[(2-benzyl-2,3-dihydrobenzopyran)-5-yl-methyl]thiadiazolin-2,4-dion: (Englitazon); 5-[(2-alkoxy-5-pyridyl)methyl]-2,4-thiazolidindion; 5-[(substituiertes-3-pyridyl)methyl]-2,4-thiazolidindion; 5-[4-(2-methyl-2-phenylpropoxy)benzyl]-thiazolidin-2,4-dion; 5-[4-[3-(4-methoxyphenyl)-2-oxooxazolidin-5-yl]-methoxy]benzyl-2,4-thiazolidindion; 5-[4-[3-(3,4-difluorphenyl)-2-oxooxazolidin-5-yl]-methoxy]benzyl-2,4-thiazolidindion; 5-[4-[3-(4-chlor-2-fluorphenyl)-2-oxooxazolidin-5-yl]methoxy]benzyl-2,4-thiazolidindion; 5-[4-[3-(4-tri-fluormethoxyphenyl)-2-oxooxazolidin-5-yl]methoxy]benzyl-2,4-thiazolidindion; 5-[4-[3-(4-trifluormethylphenyl)-2-oxooxazolidin-5-yl]methoxy]benzyl-2,4-thiazolidindion; 5-[4-[2-[3-(4-trifluormethylphenyl)-2-oxooxazolidin-5-yl]ethoxy]benzyl]-2,4-thiazolidindion; 5-[4-[2-[3-(4-chlor-2-fluorphenyl)-2-oxooxazolidin-5-yl]ethoxy]benzyl]-2,4-thiazolidindion; 5-[4-[3-(4-pyridyl)-2-oxooxazolidin-5-yl]methoxy]-benzyl-2,4-thiazolidindion; 5-[[4-[(3,4-dihydro-6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethyl-2H-1-benzopyran-2-yl)methoxy]phenyl]methyl]-2,4-thiazolidindion: (Troglitazon); 4-(2-naphthylmethyl)-1,2,3,5-oxathiadiazol-2-oxid; 5-[4-[2-[N-(benzoxazol-2-yl)-N- methylamino]ethoxy]benzyl]-5-methylthiazolidin-2,4-dion; 5-[4-[2-[2,4-dioxo-5-phenylthiazolidin-3-yl)ethoxy]benzyl]thiazolidin-2,4-dion; 5-[4-[2-[N-methyl-N-(phenoxy-carbonyl)-amino]ethoxy]benzyl]thiazolidin-2,4-dion; 5-[4-(2-phenoxyethoxy)benzyl]thiazolidin-2,4-dion; 5-[4-[2-(4-chlorphenyl)ethylsulfonyl]benzyl]thiazolidin-2,4-dion; 5-[4-[3-(5-methyl-2-phenyloxazol-4-yl)propionyl]benzyl]thiazolidin-2,4-dion; 5-[[4-(3-hydroxy-1-methylcyclohexyl)methoxy]benzyl]thiadiazolidin-2,4-dion; 5-[4-[2-(5-methyl-2-phenyl-oxazol-4-yl)-ethoxyl]benzyl]thiadizolidion-2,4-dion; 5-[[2-(2-naphthylmethyl)benzoxazol]-5-yl-methyl]-thiadiazolin-2,4-dion; 5-[4-[2-(3-phenylureido)ethoxyl]benzyl]thiadiazolin-2,4-dion; 5-[4-[2-[N-(benzoxazol-2-yl)-N-methylamino]ethoxy]benzyl]thiadiazolin-2,4-dion; 5-[4-[3-(5-methyl-2-phenyloxazol-4-yl)propionyl]benzyl]thiadiazolin-2,4-dion; 5-[2-(5-methyl-2-phenyloxazol-4-yl-methyl)benzofuran-5-yl-methyl]-oxazolidin-2,4-dion; 5-[4-[2-[N-methyl-N-(2-pyridyl)amino]-ethoxy]benzyl]thiazolidin-2,4-dion; und 5-[4-[2-[N-(benzoxazol-2-yl)-N-methylamino]ethoxy]-benzyl]-oxazolidin-2,4-dion ausgewählt sein.
Die gegenständlichen Verfahren kombinieren die Verwendung von PPARγ-Agonisten mit ein oder mehreren MAP-Kinase-Inhibitoren. Beispielsweise kann das gegenständliche Verfahren durch Behandlung unter Verwendung eines PPARγ-Agonisten wie oben beschrieben und eines MAP-Kinase-Inhibitors ausgeübt werden. Ein Beispiel für einen solchen Inhibitor ist PD098059.
Das gegenständliche Verfahren kann zusätzlich zur Verwendung eines PPARγ-Agonisten (und wahlweise RXR-Agonisten und/oder MAP-Kinase-Inhibitoren) ein oder mehrere andere Anti-Tumor-Substanzen miteinschließen. Beispielhafte kombinatorische Therapien, die mit PPARγ-Agonisten kombinierbar sind, schließen die Verwendung solcher Mittel wie: Mitose-Inhibitoren, wie beispielsweise Vinblastin; Alkylierungsmitteln, wie beispielsweise Cisplatin, Carboplatin und Cyclophosphamid, Antimetaboliten, wie beispielsweise 5-Fluoruracil, Cytosinarabinosid, Hydroxyurea oder N-[5-[N-(3,4-Dihydro-2-methyl-4-oxochinazolin-6-ylmethyl)-N-methylamino]-2-thenoyl]-L-Glutaminsäure; interkalierende Antibiotika, wie beispielsweise Adriamycin und Bleomycin; Enzyme, wie beispielsweise Asparaginase; Topoisomerase-Inhibitoren, wie beispielsweise Etoposid; biologische Reaktionsmodifikatoren beispielsweise zur Erhöhung der Antitumor-Reaktionen, wie beispielsweise Interferon; Apoptose-Mittel, wie beispielsweise Aktinomycin D; und Anti-Hormone, beispielsweise Antiöstrogene, wie beispielsweise Tamoxifen oder, beispielsweise Antiandrogene, wie beispielsweise 4'-Cyano-3-(4-fluorphenylsulphonyl)-2-hydroxy-2-methyl-3'(trifluormethyl)- propionanilid ein. Eine solche verbundene Behandlung kann mittels simultaner, aufeinanderfolgender oder getrennter Dosierung der individuellen Komponenten der Behandlung erreicht werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft demgemäß Kits bzw. Bausätze zur Durchführung der Verabreichung des PPARγ-Agonisten mit anderen therapeutischen Verbindungen. In einer Ausführungsform umfasst der Kit einen PPARγ-Agonisten, der in einem pharmazeutischen Träger formuliert ist bzw. zubereitet ist und zumindest eines von einem MAP-Kinase-Inhibitor, einem Mitose-Hemmer, einem Alkylierungsmittel, einem Antimetaboliten, einem Nukleinsäure-interkalierenden Mittel, einem Topoisomerase-Hemmer, Interferon, formuliert mit dem PPARγ-Agonisten oder wie geeignet in einen oder mehreren getrennten pharmazeutischen Zubereitungen einschliesst.
Die Bestimmung einer therapeutisch wirksamen antineoplastischen Menge und einer prophylaktisch wirksamen antineoplastischen Menge eines PPARγ-Agonisten, beispielsweise das Design bzw. die Entwicklung der Differentiationstherapie, kann durch den Arzt oder Tierarzt (den „behandelnden Arzt") wie durch den Fachmann auf dem Gebiet leicht durchgeführt werden, durch Verwendung bekannter Techniken und durch Beobachten der Ergebnisse, die unter analogen Bedingungen erzielt wurden. Die Dosierungen können abhängig von den Erfordernissen des Patienten bei der Beurteilung des behandelnden Arztes; dem Schweregrad des Zustandes, der behandelt wird, und der speziellen verwendeten Verbindung variiert werden. Bei der Bestimmung einer therapeutisch wirksamen antineoplastischen Menge oder Dosis und der prophylaktisch wirksamen antineoplastischen Menge oder Dosis werden mehrere Faktoren durch den behandelnden Arzt in Erwägung gezogen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf: die spezifische hyperplastische/neoplastische Zelle, die involviert ist; pharmakodynamische Eigenschaften des speziellen Mittels und dessen Verabreichungsart und -weg; des erwünschten Zeitverlaufes der Behandlung; der Säugetierspezies; seines Alters, seiner Größe und des allgemeinen Gesundheitszustandes; die spezifische involvierte Krankheit; das Ausmaß oder die Einbeziehung des Schweregrades der Erkrankung; die Reaktion des individuellen Patienten; die spezielle verabreichte Verbindung; der Verabreichungsart; der Bioverfügbarkeitseigenschaften der verabreichten Zubereitung; der ausgewählten Dosisvorschrift; der Art der gleichzeitig auftretenden Behandlung (d. h. die Interaktion der PPARγ-Agonisten mit anderen gleichzeitig verabreichten Therapeutika); und anderen relevanten Umständen. US-Patent Nr. 5 427 916 beschreibt beispielsweise ein Verfahren zur Vorhersage der Wirksamkeit einer antineoplastischen Therapie bei individuellen Patienten und veranschaulicht bestimmte Verfahren, die in Verbindung mit den Behandlungsvorschriften der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
Die Behandlung kann mit kleineren Dosen begonnen werden, die weniger als die optimale Dosis der Verbindung betragen. Danach sollte die Dosierung durch kleine Zunahmen erhöht werden, bis die optimale Wirkung unter den Umständen erreicht ist. Zur Vereinfachung der Verabreichung kann die gesamte tägliche Dosis aufgeteilt und während des Tages in Portionen verabreicht werden, falls dies erwünscht ist. Eine therapeutisch wirksame antineoplastische Menge und eine prophylaktisch wirksame antineoplastische Menge eines PPARγ-Agonisten variiert erwarteterweise von ungefähr 0,1 mg/kg Körpergewicht pro Tag (mg/kg/Tag) bis ungefähr 100 mg/kg/Tag.
Die Verbindungen, die als zur Vorbeugung oder Behandlung von Tumoren in Tieren wirksam bestimmt werden, beispielsweise Hunde, Nagetiere, können ebenfalls bei der Behandlung von Tumoren in Menschen von Nutzen sein. Der Fachmann auf dem Gebiet der Behandlung von Tumoren im Menschen wird auf Grundlage der in Tierstudien erzielten Daten die Dosierung und den Verabreichungsweg der Verbindung an Menschen wissen. Im Allgemeinen wird erwartet, dass die Bestimmung der Dosis und des Verabreichungsweges beim Menschen derjenigen zur Bestimmung der Verabreichung bei Tieren ähnlich ist.
Die Identifizierung solcher Patienten, die einer prophylaktischen Behandlung für hyperplastische/neoplastische Krankheitszustände erfordern, liegt wohl innerhalb des Vermögens und der Kenntnisse eines Durchschnittfachmanns auf dem Gebiet. Bestimmte der Verfahren zur Identifizierung von Patienten, die dem Risiko der Entwicklung von neoplastischen Krankheitszuständen unterliegen, und die durch das gegenständliche Verfahren behandelt werden können, werden auf dem medizinischen Fachgebiet gewürdigt werden, wie beispielsweise die Familiengeschichte der Entwicklung eines speziellen Krankheitszustandes und das Vorliegen von Risikofaktoren, die mit der Entwicklung dieses Krankheitszustandes im Subjekt/Patienten assoziiert sind. Die vorliegende Anmeldung beschreibt ebenfalls weitere prognostische Tests, die zur Herstellung oder zur Förderung einer klinischen Vorhersage über die Anwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Ein Kliniker mit Fachwissen auf dem Gebiet kann solche Kandidatenpatienten in einfacher Weise durch Verwendung beispielsweise von klinischen Tests, einer körperlichen bzw. physischen Überprüfung und der medizinischen/Familiengeschichte identifizieren.
II. Pharmazeutische Zusammensetzungen
Bei einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzungen gemäß den Ansprüchen 25–33 bereit, die zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern (Additiven) und/oder Verdünnungsmitteln, formuliert sind. Wie unten ausführlich beschrieben wird, können die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung speziell zur Verabreichung in fester oder flüssiger Form formuliert werden, einschließlich solcher, die für das Folgende angepasst sind: (1) orale Verabreichung, beispielsweise Arzneitränke (wässrige oder nicht-wässrige Lösungen oder Suspensionen), Tabletten, Boli, Pulver, Granulate, Pasten; (2) parenterale Verabreichung, beispielsweise durch subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion, wie beispielsweise eine sterile Lösung oder Suspension; (3) topische Verabreichung, beispielsweise als Creme, Salbe oder Spray, aufgebracht auf die Haut; (4) intravaginal oder intrarektal, beispielsweise als Pessar, Creme oder Schaum; oder (5) Aerosol, beispielsweise als wässriges Aerosol, liposomale Zubereitung oder feste Teilchen, die die Verbindung enthalten.
Der Satz „therapeutisch wirksame Menge", wie hierin verwendet, bedeutet, dass eine Menge eines PPARγ-Agonisten, Material oder Zusammensetzung, die eine Verbindung umfasst, zur Erzeugung eines erwünschten therapeutischen Effektes durch Hemmung der Proliferation und/oder Induzieren der Differentiation zumindest einer Subpopulation von Zellen in einem Tier bei einem vernünftigen Nutzen/Risiko-Verhältnis, das auf jede medizinische Behandlung anwendbar ist, effektiv ist.
Der Satz „pharmazeutisch verträglich" wird hierin verwendet, um auf solche PPARγ-Agonisten, Materialien, Zusammensetzungen und/oder Dosierungsformen Bezug zu nehmen, die innerhalb des Umfangs einer vernünftigen medizinischen Beurteilung liegen, geeignet zur Verwendung in Berührung mit den Geweben von Menschen und Tieren ohne übermäßige Toxizität, Reizung, allergische Reaktion oder ein anderes Problem oder Komplikation, und die mit einem vernünftigen Nutzen/Risiko-Verhältnis übereinstimmen.
Der Satz „pharmazeutisch verträglicher Träger", wie hierin verwendet, bedeutet ein pharmazeutisch verträgliches Material, Zusammensetzung oder Träger, wie beispielsweise ein flüssiges oder festes Füllmaterial, Verdünnungsmittel, Trägermittel, Lösungsmittel oder Verkapselungsmaterial, das in das Tragen oder Transportieren der gegenständlichen Chemikalie von einem Organ oder Teil eines Organs zu einem anderen Organ oder Teil des Körpers involviert ist. Jeder Träger muss in dem Sinne „verträglich" sein, dass er mit den anderen Inhaltsstoffen der Formulierung kompatibel ist und für den Patienten nicht gefährlich ist. Andere Beispiele für Materialien, die als pharmazeutisch verträgliche Träger dienen können, schließen Folgendes ein: (1) Zucker, beispielsweise Lactose, Glucose und Saccharose; (2) Stärken, beispielsweise Maisstärke und Kartoffelstärke; (3) Zellulose und ihre Derivate, wie beispielsweise Natriumcarboxymethylcellulose, Ethylcellulose und Celluloseacetat; (4) pulverförmiges Tragant; (5) Malz; (6) Gelatine; (7) Talkum; (8) Trägerstoffe, wie beispielsweise Kakaobutter und Suppositorien-Wachse; (9) Öle, wie beispielsweise Erdnussöl, Baumwollsamenöl, Färberdistelöl, Sesamöl, Olivenöl, Maisöl und Sojaöl; (10) Glycole, beispielsweise Propylenglycol; (11) Polyole, beispielsweise Glycerin, Sorbitol, Mannitol und Polyethylenglycol; (12) Ester, beispielsweise Ethyloleat und Ethyllaurat; (13) Agar; (14) Puffermittel, beispielsweise Magnesiumhydroxid und Aluminiumhydroxid; (15) Alginsäure; (16) Pyrogen-freies Wasser; (17) isotonische Salzlösung; (18) Ringersche Lösung; (19) Ethanol; (20) Phosphat-gepufferte Lösungen; und (21) weitere nicht-toxische kompatible Substanzen ein, die in den pharmazeutischen Zubereitungen verwendet werden.
Der Begriff „pharmazeutisch verträgliche Salze" betrifft die relativ untoxischen, anorganischen und organischen Säure-Additionssalze von PPARγ-Agonisten. Diese Salze können in situ während der endgültigen Isolierung und Aufreinigung der PPARγ- und/oder RXR-Agonisten oder durch getrenntes Umsetzen eines gereinigten PPARγ- und/oder RXR-Agonisten in seiner freien Base-Form mit einer geeigneten organischen oder anorganischen Säure und Isolierung des so geformten Salzes hergestellt werden. Repräsentative Salze schließen das Hydrobromid, Hydrochlorid, Sulfat, Bisulfat, Phosphat, Nitrat, Acetat, Valerat, Oleat, Palmitat, Stearat, Laurat, Benzoat, Lactat, Phosphat, Tosylat, Citrat, Melat, Fumarat, Succinat, Tartrat, Naphthylat, Mesylat, Glucoheptonat, Lactobionat und Laurylsulphonat-Salz und dergleichen ein (siehe beispielsweise Berge et al. (1977), „Pharmazeutische Salze", J. Pharm., Sci. 66: 1–19).
In anderen Fällen können die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen PPARγ-Agonisten ein oder mehrere saure funktionelle Gruppen enthalten und somit dazu in der Lage sein, pharmazeutisch verträgliche Salze mit pharmazeutisch verträglichen Basen zu bilden. Der Begriff „pharmazeutisch verträgliche Salze" betrifft in diesen Beispielen bzw. Fällen die relativ untoxischen, anorganischen oder organischen Basen-Additionssalze von PPARγ-Agonisten. Diese Salze können desgleichen in situ während der endgültigen Isolierung und Aufreinigung der PPARγ-Agonisten oder durch getrenntes Umsetzen des gereinigten PPARγ-Agonisten in seiner freien Säureform mit einer geeigneten Base, wie beispielsweise dem Hydroxid, Carbonat oder Hydrogencarbonat eines pharmazeutisch verträglichen Metallkations, mit Ammoniak oder mit einem pharmazeutisch verträglichen organischen primären, sekundären oder tertiären Amin hergestellt werden. Repräsentative Alkali- oder Erdalkali-Salze schließen die Lithium-, Natrium-, Kalium-, Kalzium-, Magnesium- und Aluminiumsalze und dergleichen ein. Repräsentative organische Amine, die zur Bildung von Basenzusatzsalzen von Nutzen sind, schließen Ethylamin, Diethylamin, Ethylendiamin, Ethanolamin, Diethanolamin, Piperazin und dergleichen ein (siehe beispielsweise Berge et al., s. o.).
Benetzungs- bzw. Befeuchtungsmittel, Emulgatoren und Gleitmittel, beispielsweise Natriumlaurylsulfat und Magnesiumstearat, ebenso wie Farbstoffe, Freisetzungsmittel, Beschichtungsmittel, Süßstoffe, Aromastoffe und parfümierende Mittel, Konservierungsmittel und Antioxidantien können ebenfalls in den Zusammensetzungen vorliegen.
Beispiele pharmazeutisch verträglicher Antioxidantien schließen Folgendes ein: (1) wasserlösliche Antioxidantien, beispielswiese Ascorbinsäure, Cysteinhydrochlorid, Natriumbisulfat, Natriummetabisulfat, Natriumsulfit und dergleichen; (2) Öl-lösliche Antioxidantien, beispielsweise Ascorbylpalmitat, butyliertes Hydroxyanisol (BHA), butyliertes Hydroxytoluol (BHT), Lecitin, Propylgallat, Alpha-Tocopherol und dergleichen; und (3) Metallkomplexbildner, beispielsweise Citronensäure, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Sorbitol, Weinsäure, Phosphorsäure und dergleichen.
Formulierungen, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, schließen solche ein, die zur oralen, nasalen, topischen (einschließlich bukkalen und sublingualen), rektalen, vaginalen, Aerosol- und/oder parenteralen Verabreichung geeignet sind. Die Zubereitungen können in geeigneter Weise in einer Einzeldosisform vorliegen und können durch irgendwelche Verfahren hergestellt werden, die in der pharmazeutischen Wissenschaft bekannt sind. Die Menge des aktiven Inhaltsstoffes, die mit einem Trägermaterial zur Erzeugung eines Einzeldosisform kombiniert werden kann, variiert abhängig von dem zu behandelnden Wirt, und der speziellen Art der Verabreichung. Die Menge des aktiven Inhaltsstoffes, die mit einem Trägermaterial zur Erzeugung einer Einzeldosisform kombiniert werden kann, ist im Allgemeinen die Menge der Verbindung, die eine therapeutische Wirkung erzeugt. Im Allgemeinen bezogen auf 100% wird diese Menge von ungefähr 1% bis ungefähr 99% aktiver Inhaltsstoff variieren, vorzugsweise von ungefähr 5% bis ungefähr 70%, am meisten bevorzugt ungefähr 10% bis ungefähr 30%.
Verfahren zur Herstellung dieser Formulierungen oder Zusammensetzungen schließen den Schritt ein, einen PPARγ-Agonist (Agonisten) mit dem Träger und wahlweise mit ein oder mehreren zusätzlichen Inhaltsstoffen in Verbindung zu bringen. Im Allgemeinen werden die Zusammensetzungen durch gleichförmiges und inniges In-Berührung-Bringen eines PPARγ-Agonisten mit flüssigen Trägern oder fein verteilten festen Trägern oder beiden und dann, falls notwendig, Ausformen zum Produkt, hergestellt.
Zubereitungen, die zur oralen Verabreichung geeignet sind, können in Form von Kapseln, Oblatenkapseln, Pillen, Tabletten, Longsetten (unter Verwendung einer schmackhaften Grundlage, üblicherweise Saccharose und Akazie oder Tragant), Pulver, Granulate oder als eine Lösung oder Suspension in einer wässrigen oder nicht-wässrigen Flüssigkeit, oder als Öl-in-Wasser- oder Wasser-in-Öl-Flüssigkeits-Emulsion oder als Elixier oder Sirup oder als Pastillen (unter Verwendung einer inerten Basis, beispielsweise Gelatine und Glycerin, oder Saccharose und Akazie) und/oder als Mundwaschungen und dergleichen vorliegen, wobei jede eine vorherbestimmte Menge eines PPARγ-Agonist(en) als aktiven Inhaltsstoff enthält. Eine Verbindung kann ebenfalls als Bolus, Elektuarium oder Paste verabreicht werden.
In festen Dosierungsformen zur oralen Verabreichung (Kapseln, Tabletten, Pillen, Dragees, Pulver, Granulate und dergleichen) wird der aktive Inhaltsstoff mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern vermischt, beispielsweise Natriumcitrat oder Dicalciumphosphat und/oder mit irgendeinem des Folgenden: (1) Füllmittel oder Verlängerungsmittel, beispielsweise Stärken, Laktose, Saccharose, Glukose, Mannitol und/oder Kieselsäure; (2) Bindemittel, beispielsweise Carboxymethylcellulose, Alginate, Gelatine, Polyvinylpyrrolidon, Saccharose und/oder Akazie; (3) Befeuchtungsmittel wie beispielsweise Glycerol; (4) Sprengmittel, beispielsweise Agar-Agar, Calicumcarbonat, Kartoffel- oder Tapioka-Stärke, Alginsäure, bestimmte Silikate und Natriumcarbonat; (5) Lösungs-verzögernde Mittel, beispielsweise Paraffin; (6) Absorptionsbeschleuniger, beispielsweise quartäre Ammoniumverbindungen; (7) Benetzungsmittel, beispielsweise Acetyalkohol und Glycerolmonostearat; (8) Absorbenzien, beispielsweise Kaolin und Bentonit-Tonerde; (9) Gleitmittel, beispielsweise Talkum, Kalziumstearat, Magnesiumstearat, feste Polyethylenglycole, Natriumlaurylsulfat und Gemische hiervon; und (10) Farbstoffe. Im Falle von Kapseln, Tabletten und Pillen können die pharmazeutischen Zusammensetzungen Puffermittel enthalten. Feste Zusammensetzungen eines ähnlichen Types können ebenfalls als Füllmittel in Weich- oder Hartgelatinekapseln unter Verwendung solcher Trägerstoffe wie Laktose oder Milchzucker ebenso wie Hochmolekulargewichts-Polyethylenglycolen und dergleichen verwendet werden.
Eine Tablette kann durch Pressen oder Gießen hergestellt werden, wahlweise mit einem oder mehreren begleitenden Inhaltsstoffen. Komprimierte Tabletten können unter Verwendung von Bindemittel (beispielsweise Gelatine oder Hydroxypropylmethylcellulose), Gleitmittel, inertem Verdünnungsmittel, Konservierungsmittel, Sprengmittel (beispielsweise Natriumstärke-Glycolat oder vernetzte Natriumcarboxymethylcellulose), oberflächenaktivem oder Dispersionsmittel, hergestellt werden. Gegossene Tabletten können durch Gießen eines Gemisches des pulverförmigen Peptids oder Peptidomimetikums, das mit einem inerten flüssigen Verdünnungsmittel befeuchtet ist, gegossen werden.
Tabletten und andere feste Dosierungsformen, wie beispielsweise Dragees, Kapseln, Pillen und Granulate können wahlweise mit Beschichtungen und Hüllen, beispielsweise magensaftresistenten Beschichtungen und anderen Beschichtungen, die in der pharmazeutischen Wissenschaft bekannt sind, gekerbt oder hergestellt werden. Sie können ebenfalls so formuliert werden, dass eine langsame oder gesteuerte Freisetzung des aktiven Inhaltsstoffes darin bereitgestellt wird, beispielsweise unter Verwendung von Hydroxypropylmethylcellulose in verschiedenen Anteilen, um das erwünschte Freisetzungsprofil bereitzustellen, unter Verwendung anderer Polymermatrices, Liposomen und/oder Mikrosphären. Sie können beispielsweise durch Filtration durch einen Bakterien zurückhaltenden Filter oder durch Einbauen von sterilisierenden Mitteln in Form von sterilen festen Zusammensetzungen sterilisiert werden, die in sterilem Wasser oder in einem anderen sterilen injizierbaren Medium unmittelbar vor Verwendung gelöst werden können. Diese Zusammensetzungen können wahlweise opakisierende Mittel enthalten und können eine Zusammensetzung aufweisen, so dass sie den aktiven Inhaltsstoff vorzugsweise oder alleine in einem bestimmten Anteil im Gastrointestinaltrakt vorzugsweise in einer verzögerten Art und Weise freisetzen. Beispiele für eingebettete Zusammensetzungen, die verwendet werden können, schließen Polymersubstanzen und Wachse ein. Der aktive Inhaltsstoff kann ebenfalls in mikro-verkapselter Form, falls geeignet, vorliegen, mit einem oder mehreren der oben beschriebenen Trägerstoffe.
Flüssige Dosierungsformen zur oralen Verabreichung schließen pharmazeutisch verträgliche Emulsionen, Mikroemulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirupe und Elixiere ein. Zusätzlich zu aktiven Inhaltsstoff können die flüssigen Dosierungsformen inerte Verdünnungsmittel enthalten, die üblicherweise auf dem Gebiet verwendet werden, wie beispielsweise Wasser oder andere Lösungsmittel, solubilisierende Mittel und Emulgatoren, wie beispielsweise Ethylalkohol, Isopropylalkohol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglycol, 1,3-Butylenglycol, Öle (insbesondere Baumwollsamen-, Erdnuss-, Mais-, Keimöl, Olivenöl, Rizinusöl und Sesamöl), Glycerol, Tetrahydrofurylalkohol, Polyethylenglycole und Fettsäureester von Sorbitan und Gemische hiervon.
Abgesehen von inerten Verdünnungsmitteln können die oralen Zusammensetzungen ebenfalls Adjuvantien bzw. Hilfsstoffe, wie beispielsweise Benetzungsmittel, emulgierende und suspendierende Mittel, Süßstoffe, Aromastoffe, Farbstoffe, Parfüm- und Konservierungsmittel einschließen.
Suspensionen können zusätzlich zum aktiven PPARγ-Agonist(en) suspendierende Mittel enthalten, beispielsweise ethoxylierte Isostearylalkohole, Polyoxyethylensorbitol und Sorbitanester, mikrokristalline Zellulose, Aluminiummetahydroxid, Bentonit, Agar-Agar und Tragant und Gemische hiervon.
Zubereitungen zur rektalen oder vaginalen Verabreichung können als Suppositorium präsentiert werden, das durch Mischen eines oder mehrerer PPARγ-Agonisten mit einem oder mehreren geeigneten nicht-reizenden Trägerstoff oder Trägern hergestellt werden können, die beispielsweise Kakaobutter, Polyethylenglycol, Suppositorienwachs oder Salicylat enthalten kann und die bei Raumtemperatur fest ist, jedoch bei Körpertemperatur flüssig ist und deswegen im Rektum oder in der Vaginalhöhle schmelzen und den aktiven Inhaltsstoff freisetzen wird.
Formulierungen, die zur vaginalen Verabreichung geeignet sind, schließen ebenfalls Pessare, Tampons, Creme, Gel, Pasten, Schäume oder Spray-Zubereitungen ein, die solche Träger enthalten, wie sie als geeignet auf dem Fachgebiet bekannt sind.
Dosierungsformen zur topischen oder transdermalen Verabreichung eines PPARγ-Agonisten schließen Pulver bzw. Puder, Sprays, Salben, Pasten, Cremes, Lotionen, Gel, Lösungen, Pflaster und Inhalate ein. Der aktive Bestandteil kann unter sterilen Bedingungen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger und mit allen denkbaren Konservierungsmittel, Puffer oder Treibgasen, die erforderlich sein mögen, vermischt werden.
Die Salben, Pasten, Cremes und Gele können zusätzlich zu PPARγ- und/oder RXR-Agonisten Trägerstoffe, beispielsweise tierische oder pflanzliche Fette, Öle, Wachse, Paraffine, Stärke, Tragant, Cellulosederivate, Polyethylenglycole, Silikone, Bentonite, Kieselsäure, Talkum und Zinkoxid oder Gemische hiervon enthalten.
Pulver oder Sprays können zusätzlich zu einem PPARγ-Agonisten (mehreren PPARγ-Agonisten) Trägerstoffe wie beispielsweise Laktose, Talkum, Kieselsäure, Aluminiumhydroxid, Kalziumsilikate und Polyamid-Pulver oder Gemische dieser Substanzen enthalten. Sprays können zusätzlich übliche Treibgase enthalten, wie beispielsweise Chlorfluorkohlenwasserstoffe und flüchtige unsubstituierte Kohlenwasserstoffe, beispielsweise Butan und Propan.
Der (die) PPARγ-Agonisten) können alternativ durch ein Aerosol verabreicht werden. Dies wird durch Herstellen eines wässrigen Aerosols, einer Liposomen-Zubereitung oder von festen Teilchen, die die Verbindung enthalten, erreicht. Eine nicht-wässrige (beispielsweise Fluorkohlenstoff-Treibgas) Suspension kann verwendet werden. Ultraschall-Vernebler werden bevorzugt, weil sie die Exposition des Mittels bzw. Wirkstoffs gegenüber einer Scherung minimieren, die einen Abbau der Verbindung verursachen kann.
Üblicherweise wird ein wässriges Aerosol durch Formulieren einer wässrigen Lösung oder Suspension des Mittels zusammen mit konventionellen pharmazeutisch verträglichen Trägern und Stabilisatoren hergestellt. Die Träger und Stabilisatoren variieren mit den Erfordernissen der speziellen Verbindung, schließen jedoch typischerweise nicht-ionische Tenside (Tween, Pluronics oder Polyethylenglycol), ungefährliche Proteine wie Serumalbumin, Sorbitanester, Ölsäure, Lecithin, Aminosäuren, wie beispielsweise Glycin, Puffer, Salze, Zucker oder Zuckeralkohole ein. Aerosole werden im Allgemeinen aus isotonischen Lösungen hergestellt.
Transdermale Pflaster weisen den zusätzlichen Vorteil auf, eine kontrollierte bzw. gesteuerte Abgabe eines (mehrerer) PPARγ-Agonist(en) an den Körper bereitzustellen. Solche Dosierungsformen können durch Lösen oder Dispergieren des Mittels im geeigneten Medium hergestellt werden. Absorptionsverbesserer können ebenfalls dazu verwendet werden, den Fluss des Peptidomimetikums durch die Haut hinweg zu verbessern. Die Geschwindigkeit eines solchen Flusses kann entweder durch Bereitstellen einer Geschwindigkeitskontrollierenden Membran oder durch Dispergieren des Peptidomimetikums in einer Polymermatrix oder -gel gesteuert werden.
Ophthalmische Zubereitungen, Augensalben, Pulver, Lösungen und dergleichen werden ebenfalls als im Umfang der Erfindung liegend betrachtet.
Pharmazeutische Zusammensetzungen dieser Erfindung, die zur parenteralen Verabreichung geeignet sind, umfassen ein oder mehrere PPARγ-Agonist(en) in Kombination mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen sterilen isotonischen wässrigen oder nicht-wässrigen Lösungen, Dispersionen, Suspensionen oder Emulsionen, oder sterile Pulver, die knapp vor Anwendung zu sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen rekonstituiert werden können, die Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika, gelöste Stoffe, die die Formulierung mit dem Blut des beabsichtigten Empfängers isotonisch machen oder Suspendierungs- oder Verdickungsmittel, enthalten.
Beispiele für geeignete wässrige und nicht-wässrige Träger, die in den pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung verwendet werden können, schließen Wasser, Ethanol, Polyole (beispielsweise Glycerol, Propylenglycol, Polyethylenglycol und dergleichen) und geeignete Gemische hiervon, Pflanzenöle wie beispielsweise Olivenöl und injizierbare organische Ester, beispielsweise Ethyloleat, ein. Eine geeignete Fließfähigkeit kann beispielsweise durch Verwendung von Hüllmaterialien wie beispielsweise Lecithin, durch Aufrechterhaltung der erforderlichen Teilchengröße im Falle von Dispersionen und durch Verwendung von Tensiden bzw. Oberflächen-aktiven Stoffen aufrechterhalten werden.
Diese Zusammensetzungen können ebenfalls Adjuvantien bzw. Hilfsstoffe, wie beispielsweise Konservierungsmittel, Benetzungsmittel, emulgierende Mittel und dispergierende Mittel enthalten. Die Vorbeugung der Wirkung von Mikroorganismen kann durch Einschluss verschiedener antibakterieller und Antipilz-Mittel, Paraben, Chlorbutanol und Phenolsorbinsäure und dergleichen sichergestellt werden. Es kann ebenfalls erwünscht sein, isotonische Mittel, beispielsweise Zucker, Natriumchlorid und dergleichen in die Zusammensetzungen mit einzuschließen. Zusätzlich kann die verlängerte Absorption der injizierbaren pharmazeutischen Form durch Einfluss von Mitteln erreicht werden, die die Absorption verzögern, beispielsweise Aluminiummonostearat und Gelatine.
In einigen Fällen ist es wünschenswert, um die Wirkung eines Arzneistoffs zu verlängern, die Absorption des Arzneistoffes aus einer subkutanen oder intramuskulären Injektion zu verlangsamen. Dies kann durch Anwendung einer Flüssigsuspension kristallinen oder amorphen Materials mit schlechter Wasserlöslichkeit erreicht werden. Die Absorptionsgeschwindigkeit des Arzneistoffes hängt dann von der Geschwindigkeit seiner Auflösung ab, die wiederum von Kristallgröße und Kristallform abhängig sein kann. Alternativ wird eine verzögerte Absorption einer parenteral verabreichten Arzneistoff-Form durch Lösen oder Suspensieren des Arzneistoffes in einem Öl-Träger erreicht.
Injizierbare Depotformen werden durch Bilden von Mikrokapsel-Matrices von PPARγ-Agonist(en) in biodegradierbaren Polymeren, wie beispielsweise Polylaktit-Polyglycolid hergestellt. Abhängig vom Verhältnis des Arzneistoffes zum Polymer und der Art des speziell verwendeten Polymers, kann die Geschwindigkeit der Arzneistofffreisetzung kontrolliert werden. Beispiele für andere biodegradierbare Polymere schließen Poly(orthoester) und Poly(anhydride) ein. Injizierbare Depotformulierungen werden ebenfalls durch Einfangen des Arzneistoffes in Liposomen oder Mikroemulsionen, die mit Körpergewebe kompatibel sind, hergestellt.
Wenn der (die) PPARγ-Agonist(en) der vorliegenden Erfindung als pharmazeutische Mittel an Menschen oder Tiere verabreicht werden, können diese per se oder als pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht werden, die beispielsweise 0,1 bis 99,5% (bevorzugter 0,5 bis 90%) aktiven Inhaltsstoff in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthält.
Die Zubereitungen von Mitteln können oral, parenteral, topisch oder rektal verabreicht werden. Sie werden selbstverständlich durch Formen verabreicht, die für jeden Verabreichungsweg geeignet sind. Sie werden beispielsweise in Tabletten- oder Kapselform durch Injektion, Inhalation, Augenlotion, Salbe, Suppositorium etc. Verabreichung durch Injektion, Infusion oder Inhalation; topisch durch Lotion oder Salbe; und rektal durch Suppositorien, verabreicht. Die orale Verabreichung wird bevorzugt.
Die Sätze „parenterale Verabreichung" und „parenteral verabreicht" wie hierin verwendet bedeuten Verabreichungsarten, die von der enteralen und topischen Verabreichung verschieden sind, üblicherweise durch Injektion und schließt ohne Einschränkung, intravenöse, intramuskuläre, intraarterielle, intratekale, intrakapsuläre, intraorbitale, intrakardiale, intradermale, intraperitoneale, transtracheale, subkutane, subkutikuläre, intraartikulare, subkapsuläre, subarachnoidale, intraspinale und intrasternale Injektion und Infusion ein.
Die Begriffe „systemische Verabreichung", „systemisch verabreicht" und „periphere Verabreichung" und „peripher verabreicht", wie hierin verwendet, bedeutet die Verabreichung eines (mehrerer) PPARγ-Agonist(en), Arzneistoffs oder anderen Materials auf andere Weise als direkt in das Zentralnervensystem, so dass es beispielsweise in das System des Patienten eintritt und somit Gegenstand des Stoffwechsels und anderer ähnlicher Prozesse ist, beispielsweise eine subkutane Verabreichung.
Diese PPARγ-Agonisten können Menschen und anderen Tieren zur Therapie durch irgendeinen geeigneten Weg der Verabreichung verabreicht werden, einschließlich oral, nasal, wie beispielsweise Spray, rektal, intravaginal, parenteral, intracisternal und topisch, wie durch Pulver, Salben oder Tropfen, einschließlich bukkal und sublingual.
Ohne Berücksichtigung des Verabreichungswegs, der ausgewählt ist, werden die PPARγ-Agonisten, die in einer geeigneten hydrierten bzw. hydratisierten Form verwendet werden und/oder die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zu pharmazeutisch verträglichen Dosierungsformen durch herkömmliche Verfahren formuliert werden, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind.
Die tatsächlichen Dosierungskonzentrationen der aktiven Inhaltsstoffe in den pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung können so variiert werden, dass eine Menge des aktiven Inhaltsstoffes erreicht wird, die zum Erzielen der erwünschten therapeutischen Reaktion für einen speziellen Patienten, für eine Zusammensetzung und Art der Verabreichung wirksam sein kann, ohne für den Patienten toxisch zu sein.
Beispiele
Beispiel 1
PPARγ induziert den Abbruch des Zellzyklus
(i) Experimentelle Verfahren
Zellkultur, Transfektionen und Plasmide
Die Herstellung der viralen PPARγ2, PPARγ1, PPARγ-M2, PPARγ-M1 Expressionsvektoren (Tontonoz, P. et al. (1994), siehe oben; Tontonoz, P. et al. (1994}, Cell 79: 1147–56) und des 3xwt-E2F-Luciferase (Krek, W. et al. (1993), Science 262: 1557–60) -Konstruktes wurden früher beschrieben. Die PPARγ2-CD cDNA (die die Aminosäuren 1–494 kodiert) wurde aus der PPARγ2 cDNA durch PCR amplifiziert und in den retroviralen pBabe-Puro Expressionsvektor eingefügt.
Stabile Zelllinien, die Wildtyp- oder mutierte Formen von PPARγ exprimieren, wurden wie beschrieben gewonnen (Tontonoz, P. et al. (1993), Cell 79: 1147–56). BOSC23-Zellen wurden in 90-mm-Schalen kultiviert und bei 80%ige Konfluenz durch Kalziumphosphat-Kopräzipitation mit 10 μg pBabe-abgeleitetem Expressionsvektor wie beschrieben transfiziert (Pear, W. S. et al. (1993), PNAS USA 90: 8392–6). 48 Stunden nach Transfektion wurden virale Überstände gesammelt und NIH3T3-Zellen wurden bei 50% Konfluenz mit gleichen Titern rekombinanter Viren infiziert. Die Überstände wurden auf die Zellen in DMEM aufgebracht, das 10% Cosmic-Calf-Serum (Hyclone) und 4 μg/ml Polybren enthält. 24 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen aufgeteilt und in DMEM ausplattiert, das 10% Kalbserum und 2 μg/ml Puromycin enthielt, um infizierte Zellen zu selektieren. NIH-3T3-Zelllinien, die mit einem leeren Vektor oder mit viralen Expressionsvektoren infiziert waren, die Wildtyp- oder mutierte Formen von PPARγ cDNA enthielten, ebenso wie HIB1B und 3T3-F442A Zelllinien wurden in DMEM kultiviert, das 10% Cosmic-Calf-Serum enthielt. Pioglitazon (5-[4-[2-(5-Ethyl-2-pyridyl)-ethoxy]-benzyl]-2,4-thiazolidindion) (Upjohn) wurden in DMSO gelöst und in Zellkulturexperimenten verwendet.
RNA und Protein-Analyse
Gesamt-RNA wurde aus kultivierten Zellen durch Guanidinisothiocyanat-Extraktion isoliert (Chirgwin, J. M. et al. (1979), Biochemistry 18: 5294–9). RNA, denaturiert in Formamid und Formaldehyd, wurde durch Formaldehyd enthaltende Agarose-Gele wie beschrieben elektrophoretisiert (Maniatis, T. et al. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Für eine Western-Blot-Analyse wurden zelluläre Extrakte wie beschrieben hergestellt (Maniatis, T. et al. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), geblottet und mit einem geeigneten Antikörper sondiert (Upstate Biotech. Inc.).
BrdU-Einbauexperimente
BrdU-Einbauexperimente wurden wie in der Vorschrift beschrieben durchgeführt, die durch den Lieferanten bereitgestellt wurde (Boehringer Mannheim Biochemical). Kurz gesagt, wurden die Zellen, die auf Objektträgern gezüchtet wurden, mit 10 μM BrdU für 1 Stunde markiert. Die Proben wurden gewaschen und mit Ethanol-Glycin-Puffer fixiert und mit Anti-BrdU-monoklonalem Antikörper inkubiert. Nach der Inkubation mit Anti-Maus-Ig-alkalischer Phosphatase, gefolgt von der Substratreaktion wurde gebundenes Anti-BrdU-Antikörper durch Lichtmikroskopie visualisiert.
(ii) Aktivierung von PPARγ führt zum Zellzyklusabbruch
Um die Wirkung der PPARγ-Aktivierung auf das Zellwachstum zu untersuchen, verwendeten wir ein retrovirales Transfektiossystem, um PPARγ in NIH3T3-Zellen zu exprimieren. Dieses System ermöglichte es uns, ektopisch Gene in vielen Tausenden Zellen zu relativ gleichen Konzentrationen bzw. Niveaus zu exprimieren. PPARγ weist zwei Isoformen auf, nämlich PPARγ1 und PPARγ2, die zwei unterschiedliche N-Termini aufweisen, gebildet durch alternatives Spleißen (Tontonoz P, et al. (1994), siehe oben; Zhu, Y. et al. (1993), J. Biol. Chem. 268: 26817–20). NIH373-Fibroblasten wurden mit dem retroviralen Expressionsvektor infiziert, der PPARγ1 oder 2 (NIH-PPARγ)-kodierende cDNA enthielt oder mit dem leeren Vektor (NIH-Vektor), um stabile Zelllinien zu erzeugen. NIH-PPARγ-Zellen exprimierten ungefähr ein Drittel des Niveaus des endogenen PPARγ, beobachtet in differenzierten Fettzellen, wie bestimmt durch Northern-Analyse (Daten nicht dargestellt).
Exponentiell wachsendes NIH-PPARγ und NIH-Vektorzellen wurden mit einem synthetischen PPARγ-Liganden Pioglitazon-behandelt, der zur Klasse der antidiabetischen Thiazolidindion-Wirkstoffe zählt (Lehmann, J. M. et al. (1995), J. Biol. Chem. 270: 12953–6). Nach Selektion in Puromycin wurden die Zellen gepooled und mit oder ohne Pioglitazon (5 μM) für 5 Tage kultiviert. Wie in 1 dargestellt ist, wies eine Behandlung mit Pioglitazon bei 5 μM Konzentration keine offensichtliche Wirkung auf die Zellen auf, die den leeren Vektor enthielten. Im Gegensatz hierzu wies dieses Mittel dramatische Wirkungen auf NIH-PPARγ-Zellen auf, unter Hemmung der Zellproliferation und Induzierung drastischer morphologischer Veränderungen. Beginnend bei ungefähr 48 Stunden nach Behandlung veränderten sich steigende Zahlen von NIH-PPARγ-Zellen von der verlängerten fibroblastischen Form zu einer Adipozyten-artigen Morphologie mit einer runden Form und einer Akkumulation kleiner Tropfen von Lipiden innerhalb des Zytoplasmas (1, siehe Pfeil).
Zeitverlaufsstudien zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Pioglitazon-Behandlung zeigten, dass die Anzahl an NIH-PPARγ-Zellen in Liganden-behandelten Platten um ungefähr 40% bezüglich der Kontrollen am Tag 2 nach der Behandlung und um 80% am Tag 5 mit Pioglitazon reduziert wurde (2A, B). Dieselbe Anzahl an NIH-PPARγ, NIH-Vektor oder HIB1B-Zellen wurde entweder in Anwesenheit (+) oder Abwesenheit (-) von PPARγ-Liganden kultiviert. Die Zellzahlen wurden zu den angezeigten Zeitpunkten bestimmt. Die Wirkung der Liganden auf das Zellwachstum ist als prozentuale Abnahme der Zellzahlen in den behandelten Platten bezüglich der unbehandelten Kontrollplatten repräsentiert. Das Wachstum von Pioglitazon-behandelten NIH-Vektorzellen sank über diese Zeitspanne um 10 im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen, was auf das Vorhandensein einer geringen Menge an PPARγ in diesen Zellen zurückzuführen sein kann (Daten nicht dargestellt). Der Zusatz von 1 μM BRL49653, einem anderen synthetischen Thiazolodindion-Liganden von PPARγ (Lehmann, J. M. et al. (1995), siehe oben) zeigte denselben Grad der Hemmung auf das Zellwachstum von NIH-PPARγ-Zellen (2C). Keine offensichtlichen zytotoxischen Wirkungen wurden bei den Konzentrationen beobachtet, in denen wir diese Verbindungen verwendeten.
Um zu untersuchen, ob die Pioglitazon-Behandlung von Zellen, die PPARγ exprimieren, die Progression durch ein spezifisches Zellzyklusstadium beeinflussen, führten wir eine Fluoreszenz-aktiviertes Zellsortieren (Fluorenscence Activated Cell Sorting = FACS)-Analyse und BrdU-Einbauexperimente durch. Die Ligandenbehandlung führte zu einer Akkumulation der Zellpopulationen in der G0/G1-Phase des Zellzyklus (Daten nicht dargestellt). Der Prozentsatz von Zellen, die eine DNA-Synthese nach 5 Tagen der Pioglitazon-Behandlung durchmachten, wurde durch das Vermögen der Zellen bestimmt, BrdU einzubauen. Wie in Tabelle 1 dargestellt ist, veränderte eine Ligandenbehandlung die BrdU-Einbaurate in NIH-Vektorzellen nicht, verursachte jedoch eine 80%ige Abnahme der BrdU-Einbaurate bzw. -Geschwindigkeit in NIH-PPARγ- und 3T3-F442A-Präadipozyten nach 5 Tagen der Behandlung. Zusammen demonstrieren diese Ergebnisse, dass die Ligandenaktivierung von PPARγ ausreichend ist, um sogar bei rasch proliferierenden Zellen einen Zellzyklus-Abbruch zu verursachen. Insbesondere in Tabelle 1 sind auf Deckgläser kultivierte Zellen dargestellt, die mit 5 μM Pioglitazon für 5 Tage unbehandelt oder behandelt waren und darauf mit BrdU für 1 Stunde gepulst wurden. Deckgläser wurden fixiert und wie in Materialien und Methoden beschrieben prozessiert. Zellen, die eine DNA-Synthese während der Exposition gegenüber BrdU durchmachten, wurden durch immunhistochemisches Färben bestimmt und als BrdU positiv angesehen. Die Daten repräsentieren den Durchschnitt zweier unabhängiger Experimente, bei denen ungefähr 400 Zellen pro Probe gezählt wurden.
Tabelle 1
(iii) Transkriptionsfaktor-Aktivität ist für den PPARγ-vermittelten Zellzyklus-Abbruch erforderlich
Um einige der strukturellen Erfordernisse von PPARγ zu bestimmen, die für den Wachstumsstopp notwendig sind, wurden NIH3T3-Zellen mit retroviralen Expressionsvektoren infiziert, die Wildtyp- oder verschiedene mutierte Formen von PPARγ cDNA enthielten. Exponentiell wachsende Zellen wurden für 5 Tage mit Pioglitazon behandelt und die Zellzahlen wurden bestimmt. Wie in 3 dargestellt ist, induzierte eine Ligandenaktivierung sowohl von PPARγ1 als auch PPARγ2 einen ähnlichen Wachstumsstillstand. Wir überprüften ebenfalls ein Allel von PPARγ (PPARγ-M1), dem die N-terminalen 127 Aminosäuren von PPARγ2 fehlen. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass dieses Allel aktiver als der Wildtyp bezüglich der Induktion der Adipogenese ist (Tontonoz, P. und Spiegelman, B. M. 18994), Cell 79: 1147–56). Die Wachstumshemmung in NIF-I3T3-Zellen, die PPARγ-M1 (NIH-M1) enthielten, war sogar höher als die Zellen, die ektopisch Wildtyp-PPARγ1 oder – PPARγ2 exprimierten. Um zu untersuchen, ob die DNA-Bindung und die transkriptionelle Aktivierungsdomäne von PPARγ für dessen Wirkung auf das Zellwachstum erforderlich sind, wurden die NIH3T3-Zellen mit zwei mutierten Formen von PPARγ, PPARγ-M2 infiziert, die zwei Punktmutationen in der DNA-Bindungsdomäne enthielen und mit einer Carboxy-End-deletierten PPARγ-CD, der die Aktivierungsdomäne (AF-2), angeordnet in der Carboxy-terminalen Region aller Kernrezeptoren, enthielt (ein Überblick s. Mangelsdorf und Evans, 1995). NIH-M2-Zellen exprimieren einen PPARγ2-Rezeptor, bei dem Cystein-Reste an der DNA-Bindungsdomäne an den Positionen 156 und 159 mit Serin vertauscht wurden. NIH-CD-Zellen exprimieren eine trunkierte Form von PPARγ2, dem die konservierte Carboxy-terminale Transaktivierungsdomäne fehlt. Somit wies die Pioglitazon-Behandlung keine Wirkung auf das Zellwachstum und die Adipogenese in NIH-M2- und NIH-CD-Zellen auf. Eine Behandlung mit Pioglitazon verursachte eine ungefähr 10%ige Abnahme des Zellwachstums in NIH-Vektorzellen. Zellzahlen wurden nach 5-tägiger Behandlung mit oder ohne 5 μM Pioglitazon bestimmt. Eine Abnahme der Zellzahl in den behandelten Platten wurde als relative Veränderung gegenüber unbehandelten Kontrollplatten repräsentiert. Die Daten repräsentieren den Durchschnitt von zumindest drei unabhängigen Experimenten. Diese Ergebnisse zeigen, dass sowohl PPARγ1 als auch 2 den Zellzyklus-Abbruch simulieren können. Diese Daten legen ebenfalls nahe, dass die Aktivität von PPARγ als DNA-Bindungsprotein und Transkriptionsfaktor für dessen Wirkung auf das Zellwachstum erforderlich sind.
(iv) Ligandenaktivierung von PPARγ induziert einen Wachstumsstopp in transformierten Zellen
Wir zeigten, dass die PPARγ-Aktivierung zum Zellzyklus-Abbruch normaler fibroblastischer Zellen führt, die ektopisch PPARγ exprimieren. Um zu testen, ob die Aktivierung von PPARγ dieselbe Wirkung auf transformierte Zellen aufweist, verwendeten wir HIB1B-Zellen, die mit dem großen SV40 T-Antigen (SV40LT) transformiert wurden, als Modellsystem. HIB1B-Zellen, die hohe Mengen an PPARγ1 exprimierten, wurden aus braunen Fetttumoren transgener Mäuse etabliert, die konstitutiv SV40LT unter der Kontrolle des Adipozytenspezifischen aP2-Promotors exprimieren (Ross, S. R. et al. (1992), PNAS USA 89: 7561–5). Exponentiell wachsende HIB1B-Zellen wurden mit Pioglitazon behandelt, die Zellzahlen wurden bestimmt und BrdU-Einbauexperimente wurden durchgeführt, um die Wirkung der PPARγ-Aktivierung auf das Fortschreiten des Zellzyklus auszuwerten. Wie in 2A, 2C und 3 dargestellt ist, unterdrückte die PPARγ-Aktivierung durch Pioglitazon oder BRL49653 das Wachstum dieser Zellen stark. Der BrdU-Einbau in neu synthetisierte DNA wurde ebenfalls nach 5 Tagen der Behandlung mit Pioglitazon um 85% gesenkt (Tabelle 1). Diese Ergebnisse zeigen, dass die PPARγ-Aktivierung die SV40LT-angetriebene Transformation überwinden und einen Zellzyklus-Abbruch in HIB1B-Zellen verursachen kann.
Beispiel 2
Terminale Differenzierung humaner Liposarkomzellen, die durch PPARγ- und RXIZ-spezifische Liganden induziert wurden
(i) Experimentelle Verfahren
Gewebsproben und Zytogenetik
Normale humane Gewebe, Liposarkome und andere Weichteilsarkome wurden aus chirurgischen Eingriffen am Bridham and Women's Hospital, Boston, gewonnen. Alle Gewebstypen wurden aus homogenen und lebensfähigen Teilen der ausgeschnittenen Probe durch den Pathologen entnommen und innerhalb von 10 Minuten nach der Excision eingefroren. Hämatoxylin- und Eosin-gefärbte Schnitte jedes Weichteilsarkoms wurden durch einen einzelnen Pathologen (C. F.) begutachtet und gemäß des histologischen Typs, des Grades, der Mitose-Aktivität und der chirurgischen Eingrenzung klassifiziert. Die histologische Klassifikation basierte nur auf dem morphologischen Erkennungsmuster unter Verwendung herkömmlicher diagnostischer Kriterien (Enzinger 95, Fletcher CDM 95 1043– 1096). Die Mitose-Aktivitätszähler wurden mit hoher Feldstärke von 0,120 mm² durchgeführt und zumindest 50 Hochenergiefelder wurden aus den meisten zellulären Bereichen des Tumors gezählt. Bezüglich einer zytogenetischen Analyse wurden Tumoren mit Kollagenase disaggregiert und nach 3–7 Tagen der Kultur in T25-Kolben geerntet (Fletcher et al, 1990, Cancer Res.). Metaphasezell-Ernten und Objektträgerherstellungsverfahren wurden früher beschrieben (CR). Metaphasenzellen wurden durch Trypsin-Giemsa (Seabright (1971) Lancet) und Chinacrin-Senf-Banding (Fletcher (1991), Am. J. Path.) untersucht.
Northern-Analyse
Gesamt-RNA wurde aus Tumoren und normalen humanen Geweben durch Guanidinisothiocyanat-Extraktion und CsCI-Zentrifugation präpariert (Chirgwin, J. M. et al. (1979), Biochemistry 18: 5294–5299). Die RNA wurde durch Formaldehyd-Agarose-Gel elektrophoretisiert, auf Bio Trans Nylon-Membranen (ICN) geblottet und wie vom Hersteller vorgeschrieben hybridisiert. cDNA-Sonden wurden mit [α-³²P]-dCTP durch das Random-Priming-Verfahren bis zu einer spezifischen Aktivität von zumindest 10⁹ cpm/μg markiert.
Zellkultur
Primäre Liposarkomzellen wurden aus ausgewählten frisch gewonnenen Tumoren isoliert, wie an früherer Stelle beschrieben wurde (Fletcher, J. A. et al. (1991), NEJM 324: 436–443) und die darin enthaltenen Bezugnahmen. Primäre Zellen wurden in einer Dichte von zumindest 2 × 10⁵ Zellen/ml ausplattiert und in 60-mm-Schalen in RPMI kultiviert, das 15% Cosmic-Calf-Serum (Hycone) und 5 μ/ml Insulin enthielten. Pioglitazon (Upjohn), Troglitazon (Warner-Lambert), BRL49653 (BIOMOL) und LG268 (Ligand Pharmaceuticals) wurden in DMSO gelöst und auf Zellen in einem Volumen von weniger als 5 μl aufgebracht. Die NIH-PPARγ- und NIH-Vektorzellen wurden durch retrovirale Infektion wie beschrieben gewonnen (Tontonoz, P. et al. (1994), siehe oben). Differenzierte Zellen wurden bezüglich Neutralfett mit Oil Red-O gefärbt (Green, H. und Kehinde, O. (1974), Cell 1: 113–116). Die BrdU-Markierung wurde unter Verwendung des Markierungs-Kits (Boehringer Mannheim) gemäß den Instruktionen des Herstellers durchgeführt.
Transfektions-Assays
Der GAL4-PPARγ-Expressionsvektor wurde durch PPARγ konstruiert. CV-1-Zellen wurden in DMEM kultiviert, die 10% Harz-Kohle-gestripptes Kalbserum enthielt. Die Transfektionen wurden in Phenolrot-freiem DMEM durchgeführt, das 10% Harz-Kohlegestripptes fötales Kalbserum enthielt, durch das Lipofektionsverfahren unter Verwendung von DOTAP (Boehringer Mannheim) gemäß den Instruktionen des Herstellers. Nach 2 Stunden wurden die Liposomen entfernt und die Zellen wurden für zusätzliche 40 Stunden in Gegenwart oder Abwesenheit von Thiazolidindionen wie angezeigt kultiviert. Luciferase und β-Galactosidase-Assays wurden wie früher beschrieben durchgeführt (Forman, B. M. et al. 1995), Cell 83: 803–812).
(ii) Verteilung von PPARγ mRNA in humanen Geweben
PPARγ wird in hohen Konzentrationen in Fettgeweben der Maus und der Ratte exprimiert (Tontonoz, P. et al. (1994), Nucleic Acids Res. 22: 5628–5634; Braissant, O. et al. (1996), siehe oben). Um die Gewebsverteilung dieses Rezeptors beim Menschen zu bestimmen, führten wir eine Northern-Analyse der RNA durch, die aus einer Vielzahl von menschlichen Geweben präpariert wurde. Wie in 4 dargestellt ist, wird humanes PPARγ in den höchsten Konzentrationen in Fettgewebe exprimiert und in viel geringeren Konzentrationen in mehreren anderen Geweben, einschließlich Lunge und Nieren. Um zu bestimmen, ob irgendwelche der anderen Gewebsproben ebenfalls Fettzellen enthielten, wurde der Blot ebenfalls mit cDNA für das Adipozyten-spezifische Bindungsprotein aP2 hybridisiert. Die Herz- und Muskelproben enthalten ersichtlich signifikante Mengen an aP2 mRNA, was nahelegt, dass zumindest ein gewisser Grad der niedrigen Konzentration der PPARγ-Expression in diesen Geweben aus dem Vorhandensein kleiner Zahlen an Fettzellen resultiert.
(iii) Expression von PPARγ in humanen Liposarkomen
Die Tumorigenese schließt häufig die Inaktivierung oder Down-Regulierung von Genen ein, die für die Initiierung und Aufrechterhaltung eines differenzierten Phänotyps verantwortlich sind. Weil PPARγ im Fettzellendifferenzierungsprozess eine zentrale Rolle zu spielen scheint, überprüften wird die Expression von PPARγ in einer Reihe von humanen Liposarkomen. Die Reihe schloss RNA ein, die aus jedem der drei histologischen Haupt-Subtypen der Liposarkome präpariert wurde: gut differenziert/entdifferenziert, Myoxid/Rundzell und pleiomorph. Die histologischen und zytogenetischen Eigenschaften jedes Tumors sind in Tabelle 2 angegeben. Für den größten Teil zeigten die gut differenzierten/entdifferenzierten Tumore Ringchromosomen und gigantische Markerchromosome, die Myxoid/Rundzell-Liposarkome zeigten, die charakteristische T (12;16) (Q13p11) Translokation und die pleiomorphen Formen zeigten komplexe Anordnungen. Überraschenderweise zeigte sich, dass trotz der Blockierung in der Differenzierung jedes Liposarkom Konzentrationen an PPARγ RNA exprimierte, die zu derjenigen von normalem Fett vergleichbar war (5A). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die meisten, wenn nicht alle, Liposarkome zu einem Punkt im Differenzierungsprozess nach Induktion einer PPARγ-Expression transformiert wurden. Im Gegensatz hierzu wurde RNA in irgendeinem anderen Typ von Weichteilsarkomen, die überprüft wurden, nicht in signifikanten Konzentrationen exprimiert, einschließlich Leiomyosarkomen, Fibrosarkomen, Angiosarkomen, malignem peripheren Nervenscheidentumor (MPNS) oder malignem fibrösen Histozytom (MFH) (5B). Somit scheint PPARγ ein sensibler Marker zur Unterscheidung eines Liposarkoms von anderen histologischen Typen von Weichteilsarkomen zu sein.
Tabelle 2
(iv) Differenzierung humaner Liposarkomzellen, die durch PPARγ- und RXR-spezifische Liganden induziert wurden
Vorübergehende Transfektionsexperimente wurden durchgeführt, um das Aktivierungsprofil von humanem PPARγ zu charakterisieren. Um eine Störung durch einen endogenen Rezeptor in den transfizierten Zellen zu eliminieren, wurde ein chimärer hPPARγ-Rezeptor verwendet, der die Transkription durch ein heterologes Response-Element aktivieren konnte (Forman, B. M. et al. (1995), siehe oben). Ein Fusionsprotein-Expressionsvektor wurde konstruiert, der die Hefe GAL4-DNA-Bindungsdomäne, gebunden an die Ligandenbindungsdomäne von hPPARγ enthielt. Dieses Konstrukt wurde dann in CV-1-Zellen mit einem Reporterplasmid kotransfiziert, das die GAL4 stromaufwärts aktivierende Sequenz enthielt. Die antidiabetischen Thiazolidindion-Arzneistoffe wurden kürzlich als Ligandenaktivatoren des murinen Homologs von PPARγ identifiziert. Wie in 4 dargestellt ist, sind die Thiazolidindione BRL49653, Troglitazon und Pioglitazon effektive Aktivatoren von humanem PPARγ und ihre relative Wirkstärke läuft parallel mit ihrer Wirkstärke als Insulinsensibilisierende Mittel in vivo (BRL > Troglitation > Pioglitazon).
Liposarkome haben vermutlich ein oder mehrere genetische Defekte erworben, die den Verlauf der normalen Fettzellentwicklung stören (Crozat, A. et al. (1993), Nature 363: 640– 644; Fletcher, J. A. et al. (1991), siehe oben. Die Beobachtung, dass PPARγ konsistent in diesen Tumoren exprimiert wird, erhöhte die Möglichkeit, dass die malignen Zellen dazu gezwungen werden könnten, das Differenzierungsprogramm durch maximale Aktivierungen der PPARγ-Weges zu vervollständigen. Um diese Möglichkeit anzugehen, wurden primäre Zellen, die aus 3 humanen Liposarkomen isoliert wurden, in vitro kultiviert (s. Materialen und Methoden). Die primären Zellstämme LS857 und LS 175 wurden aus gut differenzierten Tumoren gewonnen und LS707 wurde aus einem Myxoid-Rezeptor gewonnen (s. Tabelle 2). Hochgradige pleiomorphe Liposarkomzellen konnten nicht in ausreichenden Anzahlen expandiert werden, um Studien der Differenzierung zu ermöglichen. Eine primäre Leiomyosarkom-Zelllinie LM203 wurden als Kontrolle kultiviert. Um zu bestätigen, dass diese Kulturen aus malignen Tumor abgeleiteten Zellen bestanden, wurde eine zytogenetische Analyse durchgeführt. Wie in Tabelle 2 gezeigt, war der Karyotyp der Zellen in jeder Kultur des Stamm-Liposarkoms charakteristisch. Gut differenzierte Liposarkome enthalten häufig Ringchromosomen und Riesenmarkerchromosomen, wohingegen Myxoid-Liposarkome durch die t(12;16) Translokation (Fletcher, J. A. et al. (1991), siehe oben) gekennzeichnet sind. Wenn sie in Gegenwart von fötalem Rinderserum und Insulin kultiviert werden, Bedingungen, die für eine Adipozyten-Differenzierung permissiv sind, behalten alle drei Zelllinien eine fibroblastische Morphologie bei. LS175-Zellen enthielten unter diesen Bedingungen kleine Mengen an färbbarem Lipid. Wenn die Kulturen für 7 Tage mit 10 pM des PPAR-Liganden Pioglitazon behandelt wurden, akkumulierten die Zellen leicht lipid und nahmen eine Morphologie an, die für reife kultivierte Adipozyten charakteristisch ist (7). Keine Lipid-Akkumulation wurde bei den LM203 Leiomyosarkom-Zellen beobachtet, die PPARγ nicht exprimieren (nicht dargestellt). Der Grad der morphologisch erkennbaren Differenzierung variierte von 40% in den LS857-Zellen bis 75% in den LS 175-Zellen. Nach Induktion für 7 Tage mit Thiazolidindion behielten die Zellen ihre differenzierte Morphologie sogar dann bei, wenn Pioglitazon entzogen wurde. Dieses Experiment wurde zumindest zweimal durchgeführt, wobei jeder Zellstamm quantitativ und qualitativ ähnliche Ergebnisse aufwies. Die Induktion der Differenzierung wurde ebenfalls bei den Thiazolidindionen BRL49653 und Troglitazon beobachtet, wohingegen keine Wirkung bei Verbindung 66 beobachtet wurde, dem inaktiven synthetischen Vorläufer von BRL49653.
Frühere Arbeiten haben nahegelegt, dass die maximale Transkriptionsaktivität des PPAR/RXR-Heterodimers erreicht wird, wenn beide Rezeptoren von ihren jeweiligen Liganden gebunden werden (Kliewer, S. A. et al. (1992), Nature 358: 771–774; Tontonoz, P. et al. (1994), siehe oben). Wir haben die Hypothese zugrundegelegt, dass eine simultane Exposition kompetenter Zellen gegenüber sowohl PPARγ- als auch RXR-spezifischen Liganden ein stärkeres adipogenes Signal als PPARγ-Ligand alleine bereitstellen könnte. Die Fähigkeit des RXR-spezifischen Liganden LG268, die Adipozyten-Differenzierung zu fördern, wurde unter Verwendung von NIH-3T3-Fibroblasten untersucht, die PPARγ aus einem retroviralen Vektor exprimieren (Tontonoz, P: et al. (1994), siehe oben). Wir haben kürzlich gezeigt, dass Wildtyp-NIH-3T3-Zellen RXRα, jedoch nicht PPARγ exprimieren. Wie in Tabelle 3 dargestellt, hatte die Behandlung konfluenter NIH-PPARγ-Zellen für 7 Tage mit 50 nM LG268 eine signifikante Stimulierung der Adipozyten-Differenzierung zur Folge, im Vergleich zu derjenigen, die bei einer 7-tägigen Behandlung mit 1 μM Pioglitazon alleine ersichtlich war. Eine simultane Exposition gegenüber beiden Aktivatoren hatte eine additive Wirkung zur Folge. LG268 wies keine Wirkung auf NIH-Vektorzellen auf, was darauf hinweist, dass die adipogene Aktivität dieser Verbindung, wie diejenige von Pioglitazon, vom Vorhandensein von PPARγ abhängig ist. Ähnliche Ergebnisse wurden mit den Präadipozyten-Zelllinien 3T3-L1 und 3T3-F442A erzielt, die beide PPARγ und RXRα exprimieren (Daten nicht dargestellt). Eine Northern-Analyse bestätigte, dass Pioglitazon und LG268 eine additive Wirkung auf die Induktion der Adipozyten-spezifischen Gene aP2 und Adipsin in NIH-PPARγ-Zellen (8) aufwiesen. Keine Induktion einer Adipozyten-Genexpression wurden in NIH-Vektorzellen unter ähnlichen Bedingungen beobachtet.
Tabelle 3
Wir überprüften als Nächstes die Fähigkeit von LG268, die Differenzierung humaner Liposarkomzellen zu fördern. Wie in 9 dargestellt ist, führte die Behandlung von LS857-Zellen mit 50 nM LG268 zu einem signifikanten Grad der Adipozyten-Differenzierung, ähnlich derjenigen, die mit 10 μM Pioglitazon alleine zu sehen ist. Wenn LS857-Zellen simultan mit LG268 und einem Thiazolidindion (entweder Pioglitazon oder BRL49653) behandelt wurden, wurde ein additiver Effekt auf die Differenzierung beobachtet. Um weiter die Wirkungen von PPARγ- und RXR-Liganden auf Liposarkomzellen zu charakterisieren, überprüften wir die Expression Adipozyten-spezifischer Marker durch Northern Blotting ( 8). LS857-Zellen, wie die Tumorform aus der sie stammen, exprimieren PPARγ mRNA (s. 5A, Tumor 204SP). Die Behandlung von LS857-Zellen mit Pioglitazon führt zur Induktion zweier Marker der terminalen Adipozyten-Differenzierung, die mRNAs, die ein aP2 und Adipsin kodieren (8). Eine simultane Behandlung mit Piglitazon und LG268 hat eine zusätzliche Induktion einer Adipozyten-Genexpression zur Folge. Zusammenfassend führt die Behandlung von LS857-Zellen mit Thiazolidindionen und RXR-spezifischen Retinoiden zu Veränderungen in der Morphologie und Genexpression, die mit der terminalen Adipozyten-Differenzierung konsistent sind.
Die terminale Differenzierung weißer Adipozyten in vitro und in vivo ist durch permanenten Entzug aus dem Zellzyklus charakterisiert. Eine entscheidende Frage besteht darin, ob die Thiazolodindion-induzierte Differenzierung von Liposarkomzellen durch einen Wachstumsstopp begleitet wird. Um dieses Thema anzugehen, wurden LS857-Zellen in An- oder Abwesenheit von Pioglitazon kultiviert. Im Anschluss an die Induktion der morphologischen Differenzierung wurde Pioglitazon entfernt. Nach 48 Stunden kontinuierlicher Kultur in Abwesenheit von Pioglitazon wurden die Zellen für 48 Stunden mit Bromdesoxyuridin (BrdU) markiert. Zellen, die während der Markierungsperiode eine DNA-Synthese durchmachten, sollten für den BrdU-Einbau nach Fixierung und Inkubation mit einem Enzym-gebundenen monoklonalen Antikörper positiv färben (s. experimentelle Verfahren). Im in Tabelle 4 dargestellten Ergebnis enthielten 35% der Zellen sichtbares zytoplasmatisches Fett. 28% der Zellen in dieser Kultur färbten für einen BrdU-Einbau durch Lichtmikroskopie positiv; jedoch färben von solchen Zellen, die Lipid enthalten, nur 2% für BrdU positiv. Wenn differenzierte Kulturen typsidisiert und erneut ausplattiert wurden, versagten Lipid-enthaltende Zellen dabei, erneut in den Zellzyklus einzutreten, wie durch BrdU-Markierung (Daten nicht dargestellt) bestimmt wurde. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass eine Thiazolidindion-induzierte Differenzierung von LS857-Zellen zu einem permanenten Zellzyklus-Abbruch bzw. -Entzug führt.
Tabelle 4
Beispiel 3
Die Verabreichung von Thiazolidindion ist bei der Reduktion der Größe von Fettzelltumoren in vivo wirksam.
(i) Experimentelle Verfahren
Studien an nackten Mäusen
HIB1B-Zellen (2 × 10⁶ Zellen/Tier) wurden subkutan in den oberen Rücken von 24 männlichen nackten Mäusen (7 Wochen NCR w/w) injiziert. 13 Tage nach der Injektion wurden die Mäuse mit Troglitazon (0,2% Gemisch mit pulverförmiger Nahrung) behandelt. Die Entwicklung des Tumorvolumens (gemessen in mm³) wurde bei den Tagen 14, 19 und 26 nach Troglitazon-Behandlung im Vergleich mit unbehandelten Kontrollen bestimmt. Jeder Punkt repräsentiert die durchschnittliche ± Standarddauer (SD) von 12 Mäusen (außer dem letzten Punkt, bei dem n = 11), behandelt oder unbehandelt mit Troglitazon für die indizierten Zeitintervalle.
Probengrößenberechnungen
Um die Veränderungen der Tumorgröße zu evaluieren, wurde der Durchschnitt (SD) von 11– 12 Fällen für jede Tiergruppe überprüft, um eine 85%ige Chance sicherzustellen, einen statistisch signifikanten Unterschied nachzuweisen (unter der Annahme eines zweiseitigen Proben-t-Testes).
Wie von 10 und Tabelle 5 demonstriert wird, ist die Verabreichung des Thiazolidindions Troglitazon beim Reduzieren der Größe von Fetttumoren in nackten Mäusen wirksam. Diese Tumoren wurden experimentell durch Implantieren des großen SV40 T-Antigentransformierten HIB1B-Zellen in nackte Mäuse induziert. 10 zeigt, dass die Entwicklung von Fetttumoren in implantierten nackten Mäusen, die unbehandelt und mit Troglitazon für 14, 19 und 26 Tage behandelt wurden. Die Punkte A-C und D-F repräsentieren jeweils unbehandelte und mit Troglitazon behandelte Tiere. Jeder Punkt repräsentiert den Durchschnitt ± Standardabweichung von 12 Mäusen (außer dem letzten Punkt, bei dem n = 11). Statistisch signifikante Abnahme des Tumorvolumens wurden bei implantierten Mäusen nachgewiesen, die mit Troglitazon im Vergleich mit unbehandelten Kontrollen behandelt wurden. Tabelle 1 fasst den Durchschnitt (SD) des Tumorvolumens (gemessen in mm³) bei behandelten Mäusen (Gruppe 2) im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle (Gruppe 1) zusammen. Das Tumorvolumen wurde nach 14, 19 und 26 Tagen der Behandlung bestimmt. Die Volumina sind mit und ohne Ausreißer-Punkten in jeder Tiergruppe angezeigt. Ein Vergleich des Tumorvolumens durch zweiseitigen 2-Proben-t-Test nach 26 Tagen der Behandlung zeigt p = 0,0019 (ohne Ausreißer); p = 0,037 (mit Ausreißer). Um die Tumorzunahme über die Zeit hinweg zu evaluieren, wurden wiederholte Messungen der Varianzanalyse bestimmt, p = 0,0014 ohne Ausreißer; p = 0,044 mit Ausreißer.
Tabelle 5
Beispiel 4
PPARγ wird in verschiedenen humanen Krebszelllinien exprimiert.
11 repräsentiert einen Northern-Blot, der die Expression von PPARγ-Subtypen in verschiedenen humanen Krebszelllinien demonstriert. Der Northern Blot wurde mit Gesamt-RNA aus verschiedenen Zelllinien wie angezeigt durchgeführt. Die RNA-Beladung ist ungleichmäßig und nicht vergleichbar.
Beispiel 5
PPARγ-Agonisten hemmen die Proliferation von leukämischen Zellen.
Wir untersuchten die Wirkung von PPARγ-Agonisten auf die Proliferation und Differentiation der humanen HL-60 myeloische Leukämiezelllinie. 12, die die HL-60 Zellzahlen nach 5 Tagen der Behandlung zeigt, demonstriert, dass PPARγ-Agonisten eine Dosis-abhängige Hemmung der Zellproliferation verursachen können. Kurz gesagt, wurden HL-50-Zellen zu 5000 Zellen/Well in 24-Wellplatten ausplattiert und mit variierenden Konzentrationen von LG268 und Pioglitazon behandelt. Nach 5 Tagen wurden Teilmengen entfernt und zur Messung der Zellzahl über einen Counter-Counter verwendet. Die im gegenständlichen Graph bereitgestellten Werte sind Durchschnittswerte für dreifache Bestimmungen.
13 zeigt, dass PPARγ-Agonisten eine Differenzierung transformierter leukämischer Zellen entlang eines myelomonozytischen Weges induzieren können, wie es durch Nitroblautetrazolium(NBT)-Reduktion bestimmt wurde. Kurz gesagt, wurden HL-60-Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase in 24-Wellplatten zu 5000 Zellen/Well angeordnet und mit variierenden Konzentrationen von LG268 und Pioglitazon behandelt. Nach 5 Tagen wurden die Zellen bezüglich einer Granulozyten/Monozyten-Differentiation über den NBT-Assay überprüft. Höhere Niveaus der Umwandlung von NBT entsprechen größeren Anzahlen differenzierter Zellen in der Testprobe.
Beispiel 6
PPARγ-Agonisten hemmen die Proliferation von Prostata-Krebszellen
14 ist eine graphische Darstellung, die die Wirkung von LG268 („Verbindung 268") und Pioglitazon („Pio") auf die humane Prostata-Krebszelllinie PC3 darstellt. Kurz gesagt, wurden PC3-Zellen zu 2000 Zellen/Welt in 96 Wellplatten ausplattiert und mit variierenden Konzentrationen an LG268 und Pioglitazon behandelt. Nach 5 Tagen wurde die Lebensfähigkeit durch den 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium-bromid-(MTT-)Assay bestimmt, um das Ausmaß der Arzneistoff-induzierten Hemmung zu bestimmen. Der MTT-Assay basiert auf der Spaltung von Tetrazoliumbromid durch metabolisch aktive Zellen, was eine quantitative Blaufärbung zur Folge hat.
Beispiel
Terminale Differenzierung von humanem Brustkrebs: Expression und Ligandenaktivierung von PPARγ.
Experimentelle Verfahren
Chemische Reagenzien und Zellinien
Pioglitazon wurde von Upjohn Co., Kalmazoo, MI., bereitgestellt. Troglitazon und PD147275 (M2) wurden von Parke-Davies/Warner-Lambert, Ann Arbor, MI., bezogen. 15-DesoxyΔ^12,14-Prostaglandin J₂ und PD98059 stammten von Cayman Chemical und New England Biolabs. LG268 wurde von Ligand Pharmaceuticals, La Jolla, CA, bezogen.
Zellkultur
Die Zelllinien ZR-75-1, MCF-7, BT-20, SK-BR3 wurden von ATCC bezogen und in den vorgeschlagenen Medien kultiviert. 21NT, 21PT und 21MT (Band, V. et al., Cancer Research 50: 7351–7357 (1990)) Zellen wurden in α-Medium gezüchtet (Band, V. et al., Genes, Chromosomes & Cancer 48–58 (1989). Für Differenzierungs-Assays wurden die Zellen in α-MEM kultiviert, das 10% Cosmic-Calf-Serum (Hyclone), 2 mM L-Glutamin, 2 mM Natriumpyruvat, 0,1 mM nichtessentielle Aminosäuren, 5 μg/ml Insulin, 2,8 μM Hydrocortison und, für 21MT, 1 μg/ml Schaf-Prolaktin enthielten. Die Zellen wurden alle 48 Stunden erneut beschickt bzw. ernährt. Bei 7–10 Tagen nach der Behandlung wurde die Gesamt-RNA isoliert und die Zellen wurden mit Oil Red-O oder mit Nilrot fixiert und gefärbt (Greene, H. * Kehinde, Biochemistry 18: 5294–5299 (1979). Für ein Wachstums-Assay wurden exponentiell wachsende Zellen zu 500 Zellen/Welt in 24-Wellplatten ausplattiert. Nach einem Tag wurden die Zellen mit α-MEM behandelt, das 10% Kohle-gestripptes FBS (Hyclone), 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 0,1 mM nichtessentielle Aminosäuren, 5 μg/ml Insulin, 1 mM Dexamethason, enthielt. Die Zellen wurden erneut alle 36–40 Stunden beschickt. Zum Tag 3 und 7 nach der Behandlung wurde 3H-Thymidin (2 μCi/ml) den Zellen für 18–24 Stunden zugesetzt und der Einbau in die DNA wurde durch Szintillationszählen nachgewiesen. Für einen klonogenen Assay wurden die Zellen nach 7–10 Tagen Kultur in Differentiationsmedium in Gegenwart von Vehikel (DMSO) oder 10 μM Troglitazon tripsinisiert, mit Triptan Blau-Ausschluss gefärbt. Die Zellen wurden erneut in 10-cm²-Platten zu 10³ Zellen pro Platte ausplattiert. Nach 15 Tagen wurden die Kulturen mit Kristallviolett angefärbt.
RNA-Analyse
Gesamt-RNA wurde aus kultivierten Zellen und Geweben durch Guanidinisothiocyanat-Extraktion (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry 18: 5294–5299 (1979)) isoliert. Die RNA wurde in Formamid und Formaldehyd denaturiert und in Agarose-Gelen elektrophoretisiert, die Formaldehyd wie beschrieben enthielten (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989)). Die RNA wurde auf Bio Trans-Nylon (ICN Pharmaceuticals) übertragen und die Membranen wurden vernetzt, hybridisiert und wie durch den Hersteller angewiesen gewaschen. Jede Aufladung der RNA wurde durch Ethidiumbromid-Färbung und durch Hybridisierung an cDNA für humanes saures ribosomales Phosphorprotein PO (26B40 (Laborada, J. Nucleic Acids Res. 19: 3998 (1991)) sichergestellt und Actin-cDNA-Sonden wurden mit α-^32PdCTP markiert (6000 Ci/mmol) durch das Random-Priming-Verfahren (Finberg, A. P. & Vogelstien, B. A. et al., Anal. Biochem. 137: 266–267 (1984)) bis zu einer spezifischen Aktivität von zumindest 10⁹ cpm/μg.
Western-Blot-Analyse
Gesamt-Zellextrakte von MT-Zelllen, SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE) und Proteinimmunblots wurden wie beschrieben durchgeführt (Hu, E. et al. Science 274: 2100– 2103 (1996)). Der Antikörper gegen PPARγ wurde früher beschrieben (ebd.). Der Antikörper gegen die aktivierte phosphorylierte MAP-Kinase wurde von Promega bezogen und wie empfohlen verwendet. Polyklonale Kaninchen-anti-humane PPARγ-Antiseren wurden gegen ein Affinitäts-gereinigtes Glutathion-S-Transferase – volle Länge humanes PPARγ-Fusionsprotein gezüchtet.
(ii) PPARγ-Expression in der Brustentwicklung
Um zu untersuchen, ob PPARγ in der pathologischen Brustentwicklung funktionieren könnte, überprüften wir zunächst die Expression auf der mRNA-Ebene in einer Vielzahl von Säugetier-Epithel-Krebszelllinien. Als Kontrolle luden wir eine RNA-Probe für Fettgewebe auf, von der bekannt ist, dass sie die höchste Konzentration an PPARγ-mRNA aufwies ( 15), wohingegen die Hälfte eine signifikante Expression zeigte, mit Konzentrationen im Bereich von 17–40% derjenigen, die in Fett ersichtlich war. Drei dieser Zelllinien, alle Östrogenrezeptor-negativ, repräsentieren eine Reihe, die vom Labor von Dr. Ruth Sager von einem einzigen Patienten entwickelt wurde, bei dem ein infiltrierendes und intraduktales Karzinom der Brust diagnostiziert wurde (Band, V. et al., Cancer Research 50: 7351–7357 (1990)). Die 21NT- und 21PT-Zellen wurden vom primären Tumor abgeleitet, wohingegen die 21MT-Zellen von einer pleuralen Effusion gewonnen wurden, wenn derselbe Patient einen Rückfall des Brustkrebses erlitt, mit Metastasen an die Lunge. Während sowohl die primären als auch metastatischen Brustzelllinien PPARγ exprimieren, exprimieren die 21MT-Zellen die höchste Konzentration, die 30% derjenigen ausmachte, die in Fettgewebe zu sehen war.
(iii) PPARγ-Expression in normalem Brustepithelgewebe
Die Bestimmung der PPARγ-Expression in normalem Brustepithel und von primären Brusttumoren kann durch eine große Menge an Fett verschlechtert werden, die in der normalen Brust enthalten ist, und die schwierig vollständig aus dem primären Brusttumor abzutrennen ist. Aus diesem Grund untersuchten wir 4 unterschiedliche Patienten mit einer Erkrankung, die zur Lunge metastatisiert war. Chirurgisch ausgeschnittene metastatische Brusttumoren wurden vollständig aus der normal umgebenden Lunge abgetrennt und bezüglich einer PPARγ-mRNA-Expression durch Northern Blotting untersucht. Wie in 15 dargestellt, waren jede dieser Proben positiv, und zeigten ungefähr 10% der Konzentration von PPARγ-mRNA, die in Fett ersichtlich war.
Um die Verteilung des PPARγ-Proteins in benignen und malignen Brustgeweben zu bestimmen, führten wir eine Avidin-Biotin-Kompleximmunzytochemie durch unter Verwendung eines Antikörpers, der gegen Maus-PPARγ hergestellt wurde, entwickelt in unserem Labor; 16A zeigt die typische Erscheinungsform eines metastatisch infiltrierenden duktalen Adenokarzinoms der Lunge in einer Standard-Hämatoxylin- und Eosin-(H und E)Färbung. Auf demselben histologischen Schnitt, gefärbt mit PPARγ-Antikörper (16B) existiert eine intensiv(braune) Kernfärbung der metastatischen Brustadenokarzinomzellen (Pfeil 1). Es existiert ebenfalls eine positive Kernfärbung von Lunge-Typ-II-Pneumozyten (Pfeil 2) im im allgemein negativen Lungengewebe. Wir sahen ein ähnliches PPARγ-Färbemuster für alle vier metastatischen humanen Brustgewebe, die untersucht wurden. Die PPARγ-Immunhistochemie von normalem Brustgewebe zeigte intensiv-braune Kernfärbung der normalen Brustepithelzellauskleidung der Kanäle (Pfeil 3), ebenso wie der benachbarten normalen Fettzellen (Pfeil 4) (16C–D). Präimmun-Seren zeigten keine Kernfärbung von Brustkrebs, normalem Brustkrebs, Adipozyten oder Lungenpneumozyten (Daten nicht dargestellt).
iv) Aktivierung von PPARγ
Um die Wirkungen der Aktivierung von PPARγ in malignen Brustzellen zu bestimmen, wurden TZD-Liganden auf die 21PT- und 21MT-Zellen, oben diskutiert, angewendet. Wenn die 21PT-Zellen für 7 Tage mit zwei unterschiedlichen PPARγ-Liganden, nämlich Pioglitazon und Troglitazon, behandelt wurden, machten die Zellen eine morphologische Umwandlung durch, rundeten sich ab und füllten. sich mit Neutralfett, das mit Oil Red-O färbte (17A). Im Gegensatz zu diesen Zellen wurde nur ein kleiner Grad einer morphologischen Umwandlung bei der 21NT-Zelllinie beobachtet (17C), trotz der Tatsache, dass sie höhere Konzentrationen an PPARγ-mRNA exprimierte (15).
Diese Daten legen eine bemerkenswerte zelluläre Reaktion in einigen Brustkrebszellen gegenüber TZDs nahe. Um zu bestätigen, dass diese Reaktion das Ergebnis einer PPARy-Aktivierung ist, verwendeten wir einen anderen Liganden für PPARγ einer vollkommen unterschiedlichen chemischen Klasse, nämlich 15-Desoxy-Δ^12,14-Prostaglandin J₂ (PGJ₂) (Kliewer, S. A. et al., Cell 83: 813–810 (1995)). Diese Verbindung stimuliert ebenfalls signifikante Lipid-Akkumulation in 21PT-Zellen, wie in 3B dargestellt ist, mit Nilrot-Färbung für Lipide. Im Gegensatz hierzu induziert ein Metabolit von Troglitazon, der keine Affinität für PPARγ aufweist, bezeichnet als MS (A. Slatiel, pers. Com), diese Reaktion nicht (17B). Somit kann die Aktivierung von PPARγ eine dramatische morphologische Umwandlung und Fettakkumulation in einer malignen Brustzelllinie stimulieren. Jedoch zeigt zumindest eine Brustkrebs-Zelllinie (21MT), die hohe Konzentrationen an PPARγ exprimiert, eine relative Resistenz gegenübe dieser Folge einer Rezeptor-Aktivierung.
Um die Wirkungen einer PPARγ-Aktivierung auf dem molekularen Niveau zu charakterisieren, überprüften wird die Muster der Genexpression in 21PT-Zellen, die für eine Woche mit TZDs behandelt wurden (18A). Pioglitazon(Pio)-Behandlung induziert mRNA für PPARγ in diesen Zellen, wie es bei der Fettdifferenzierung gezeigt wurde (Brun, R. P. et al., Genes & Development 10: 974–984 (1996)). 1g268 (LG), ein RXR-spezifischer Ligand, vermag dies ebenso, jedoch nur in eingeschränktem Umfang. Die Kombination von Pioglitazon und LG268 in diesen Dosen ist nicht effektiver als das TZD alleine. Diese Mittel führen nicht zur Expression von Adipsin (Daten nicht dargestellt) und aP2, zwei wohl etablierten Markern der Adipogenese, was darauf hinweist, dass diese Lipid-beladenen Zellen keine „Trans-Differenzierung" zu Adipozyten durchmachen. Wir überprüften ebenfalls Maspin, einen Serinprotease-Inhibitor, der üblicherweise in normalem Säugetierepitel exprimiert wird, und der ebenfalls eine Tumorsuppressor-Aktivität in Tiermodellen aufweist (Zou, Z. et al., Science 256: 526–529 (1984)). Die Expression dieser mRNA ist in Trägerbehandelten Zellen banal und nicht nachweisbar, wird jedoch durch eine Pioglitazon-Behandlung induziert. Umgekehrt werden Keratin 19 (K19) und Mucin-1 (Muc-1), zwei Gene, deren Expression als Marker der Malignität verwendet wurden, (Regimbald, L. H. et al., Cancer Research 56: 4244–4249 (1995)) durch Behandlung entweder mit Pioglitazon oder LG268 unterdrückt. Einige Marker (Muc-1 und K19) sind beinahe genauso empfindlich gegenüber einer RXR-Stimulation, wie gegenüber der Aktivierung von PPARγ, jedoch ist eine gleichzeitig Aktivierung beider Rezeptoren über diese (vermutlich maximale) Stimulierung von PPARγ alleine hinaus nicht additiv. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Aktivierung des PPARγ/RXR-Heterodimers Veränderungen in der Genexpression verursacht, die für den normalen, nicht malignen Phänotyp charakteristischer sind.
Die Wirkungen einer Liganden-Aktivierung von PPARγ auf das Zellwachstum wurde zunächst durch Überprüfen der Thymidin-Inkorporation in wenigen rasch wachsenden Kulturen von 21PT-Zellen untersucht. Wie in 18B dargestellt, hat eine 4-tägige Behandlung mit Pioglitazon oder Troglitazon eine 30%ige Abnahme des Einbaus von Thymidin zur Folge. Nach 8 Tagen existierte eine weitere Zunahme der Thymidin-Inkorporation in die Träger-behandelten Zellen, was ein kontinuierliches Zellwachstum widerspiegelt. Im Gegensatz hierzu existierte in Kulturen, die mit zwei TZD-Liganden behandelt wurden, nämlich Troglitazon und Pioglitazon, im Wesentlichen keine weitere Zunahme des Thymidin-Einbaus, was vermutlich auf die gesenkte Wachstumsrate in diesen Zellen zurückzuführen ist. Es ist erwähnenswert, dass dies nicht nur ein akuter Effekt ist, sondern einer Entwicklung über mehrere Tage hinweg bedarf, was mit einer Differentiationstyp-Reaktion konsistent ist.
(v) MAP-Kinase-Inhibitoren verstärken die Aktivierung von PPARγ
Das Wachstum wurde ebenfalls in einem klonogenen Zwei-Schritt-Assay untersucht. Dieselben Zellen wurden zunächst für 15 Tage mit Troglitazon oder Träger (DMSO) behandelt. Sie wurden darauf trypsinisiert und in einer geringen Dichte im selben Medium oder „cross over" gegenüber der anderen Bedingung ausplattiert. Die Äquivalenz der Zellzahl, die ausplattiert wurde, und die Zell-Lebensfähigkeit wurde durch Zählen der Zellen und durch Überprüfen ihrer Fähigkeit, Tryptanblau auszuschließen, sichergestellt. Das klonogene Wachstum ließ man für 2 Wochen fortschreiten. Wie in 18C dargestellt, entwickelten sich die Zellen, die in Träger sowohl für die Vorbehandlung als auch Behandlung am zahlreichsten waren, den größten Umfang und in den dichtesten Kolonien. Zellen, die gegenüber Troglitazon sowohl für Prä- und Nachbehandlungen ausgesetzt wurden, zeigten die wenigsten Kolonien, wiesen kleinere Größe auf und färbten weniger intensiv.
Interessanterweise wiesen Zelle, die mit Kontrollmedium vorbehandelt und dann in Troglitazon „überkreuzt" wurden, eine gewisse Reduktion der Koloniezahl und Dichte, wohingegen Zellen, die mit Troglitazon vorbehandelt wurden und darauf in Kontrollmedium freigesetzt wurden, eine bemerkenswerte Reduktion des klonogenen Wachstums aufwiesen, das im Wesentlichen demjenigen äquivalent war, das kontinuierlich in Ligand gehalten wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Aktvierung von PPARγ das klonogene Zellwachstum reduziert und legt ebenfalls nahe, dass diese Wirkung, einmal entwickelt, nicht unmittelbar durch Liganden-Entfernung umgekehrt wird.
Es ist auffallend, dass die Brustzelllinie, die die höchste Konzentration der PPARγ-Expression aufweist, eine minimale Reaktion gegenüber einer TZD-Aktivierung zeigt. Wir (Hu, E. et al, Science 274: 2100–2103 (1996)) und andere (Adams et al., J. Biol. Chem. 272: 5128–5132 (1997); Camp et al., J. Biol. Chem. 272: 10811–10816 (1977)) haben kürzlich gezeigt, dass MAP-Kinase PPARγ an Serin 112 direkt phosphorylieren kann und diese phosphorylierte Form des Rezeptors weist in großem Maße reduzierte Transkriptionsaktivität und eine geringere Fähigkeit auf, eine Differenzierung zu fördern. Wir haben deswegen gefragt, ob eine hohe endogene MAP-Kinaseaktivität, die in 21MT-Zellen vorliegt, für die schlechte Reaktion verantwortlich sein könnte. Wie in 19A dargestellt ist, verursachte die Aufbringung von PD89-59, einem MAP-Kinase (MEK) Inhibitor auf diese Zellen eine Zunahme der Lipid-Akkumulation bezüglich Vehikel-behandelter Zellen. Weiterhin verursachte die Kombination aus Troglitazon und PD98059, wohingegen nicht mehr als 10 der Zellen mit Troglitazon alleine mit Ölrot-O färbten, dass zumindest die Hälfte der Zellen lipid akkumulieren. 19C zeigt, dass PD98059 die Niveaus der aktivierten MAP-Kinase in diesen reduzierte. Mit diesen Daten konsistent zeigen PD98059-behandelte Zellen eine größere Menge der unphosphorylierten, aktiveren Form von PPARγ, von der gezeigt wurde, dass sie eine schnellere elektrophoretische Mobilität als die MAP-Kinase-phosphorylierte Form aufweist (Hu, E. et al., Science 274: 2100–2103 (1996)).
Eine deutliche Kooperation zwischen Troglitazon und PD98059 ist ebenfalls auf der Ebene der Genexpression ersichtlich. 19B zeigt, dass Troglitazon bei der Aktivierung der Maspin-Expression in den 21MT-Zellen unwirksam ist, genauso wie es PD98059 ist. Jedoch aktiviert die Kombination beider Mittel effektiv diesen Marker, der für den Normalzustand charakteristisch ist. In ähnlicher Weise ist Troglitazon ein wirksamerer Suppressor der Muc- 1-mRNA-Expression in Gegenwart des MEK-Inhibitors, was stark nahelegt, dass die MAP-Kinase die Aktivität von PPARγ in diesen hoch malignen Zellen reduziert.
Die Aktivierung von PPARγ durch TZDs verursacht eine bemerkenswerte morphologische und biochemische Reaktion in Brustkrebszellen. Die Neutralfett-Akkumulation ist vorherrschend, genauso wie es Veränderungen in der Genexpression sind. Dies schließt eine erhöhte Expression eines Markers einer normalen Brustentwicklung, des Protease-Inhibitors Maspin ein, von dem gezeigt wurde, dass er eine Tumorsuppressor-Aktivität in ektopischen Expressions/Transplantations-Studien aufweist (Zou, Z. et al., Science 256: 526–529 (1994)). Umgekehrt werden die beiden Epithelmarker, die mit einem malignen Zustand assoziiert sind, nämlich Mucin-1 und Karatin 19, beide durch eine PPARγ-Aktivierung unterdrückt. Während die Zellen morphologisch ähnlich zu kultivierten Fettzellen zu sein scheinen, exprimieren sie keine Marker, die für diese Zelllinie charakteristisch sind. Daher können diese Zellen am besten als eine Fettepithel-Differenzierung durchmachend beschrieben werden, durch die vielleicht eine gewisse Version einer Laktations-Reaktion rekapituliert wird. Diese Reaktion scheint für Krebszellen nicht spezifisch zu sein. HC11, eine murine Zelllinie, die aus normalem Gewebe etabliert wurde, zeigt eine ähnliche Lipidakkumulation und verändert mit TZD-Aktivierung von PPARγ (Daten nicht dargestellt) die Genexpression.
Es ist ebenfalls bemerkenswert, dass Maspin und Muc-1 signifikante Rollen in der Malignität selbst spielen können. Maspin ist ein Serinprotease-Inhibitor, der zuerst in Säugetiergewebe bzw. Brust-Gewebe identifiziert wurde, und es wurde auf Grundlage mehrerer In-vitro- und In-vivo-Beobachtungen vorgeschlagen, dass es ein Tumorsuppressor-Gen ist (Zou, Z. et al., Science 256: 526–529 (1994)). Sein Expressionsmuster ist in normalem Brustgewebe und Brust-abgeleiteten Zellen hoch, während verschiedene Tumorzelllinien keine oder eine geringe Expression zeigen. Funktionelle Studien demonstrierten, dass die Maspin-Expression die Motilität humaner Brusttumorzellen in Kultur hemmen, ebenso wie das Wachstum und die Metastase von Tumoren in nackten Mäusen. Muc-1 ist eine Zelle, die mit Mucin-Glycoprotein assoziiert ist, das üblicherweise auf den apikalen Grenzlinien sekretorischer Brustepithelzellen exprimiert wird. Es wird aberrant in sehr hohen Konzentrationen im metastatischen Brustkrebs exprimiert (Kufe, D. et al., Hybridoma 3: 223–232 (1984)). Obwohl die präzise Funktion von Muc-1 nicht bekannt ist, reduziert seine hohe Expression in Karzinomen sich von Zelle zu Zelle und von Zelle zu extrazellulärem Matrix-Kontakt, was möglicherweise auf seine Größe und hohe negative Ladung zurückzuführen ist. Eine direkte Rolle für Muc-1 in der Tumorprogression wurde in Muc-1-/-Mäusen demonstriert, bei sich tzeigte, dass Tumore, die durch das Polyoma-Mittel-T-Antigen in Brustgewebe induziert wurden, eine signifikant langsamere Wachstumsrate in Muc-1-defizienten Mäusen im Vergleich zu Kontrollmäusen aufweisen (Spicer, A. P. et al., J. B. C. 270: 30093–30101 (1995)).
Die Aktivierung von PPARγ verursacht eine Verlangsamung oder eine Beendigung des. Zellwachstums in Brustkrebszellen, die hier untersucht wurden. Dies ist keine plötzliche, zytotoxische Reaktion, sondern scheint mehr eine differentiative Reaktion zu sein, die über mehrere Tage hinweg auftritt, genauso wie es die Lipid-Akkumulation tut. Eine potentiell bedeutende Erkenntnis besteht darin, dass, wenn die TZD-Aktivierung von PPARγ einmal für mehrere Tage auftritt, der Arzneistoff entfernt werden kann, und, während die meisten Zellen lebensfähig bleiben, sie eine stark reduzierte Fähigkeit für das klonogene Wachstum beibehalten. Wir (Hu, E. et al., Science 274: 2100–2103 (1996)) und andere (Adams et al., J. Biol. Chem. 272: 5128–5132 (1997)) haben kürzlich gezeigt, dass PPARγ ein direktes Target für die Phosphorylierung durch MAP-Kinase ist und diese Modifikation hat eine dramatische Reduktion der Transkriptions- und adipogenen Aktivität dieses Rezeptors zur Folge. Weil viele Krebsarten, einschließlich Brustkrebs, mit erhöhten Konzentrationen und/oder Aktivität einer MAP-Kinase verbunden sind (Sivamaran, V. S. et al., Journal Clinical Investigation 99: 1478–1483 (1997)), ist es ein Anliegen, dass dies die PPARγ-Funktion im Malignitätsprozess blockieren könnte und ebenfalls die Effektivität der Aktivierung dieses Rezeptors mit synthetischen Verbindungen beschränken könnte. Studien mit der 21MT-Zelllinie zeigen eine synergistische Wirkung von Troglitazon mit einem MAP-Kinase-Inhibitor, was stark nahelegt, dass diese Proteinkinase die PPARγ-Funktion in diesen Zellen regulieren kann.

Claims

Verfahren zum Hemmen der Proliferation einer PPARγ-responsiven hyperproliferativen Zelle in einer Probe, umfassend das in Berührung bringen der Zelle mit a) einem PPARγ-Agonisten in einer Menge, die zur Hemmung der Proliferation der Zelle wirksam ist und b) mit einem MAP Kinase-Inhibitor.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der PPARγ-Agonist ein Ligand des PPARγ-Proteins ist, wobei der Ligand eine Transkriptionsaktivität des PPARγ-Proteins aktiviert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der PPARγ-Agonist ein Thiazolidindion oder ein Analogon hiervon ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der PPARγ-Agonist durch die allgemeine Formel:
oder eine tautomere Form hiervon, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz hiervon, oder ein pharmazeutisch verträgliches Solvat hiervon, repräsentiert wird, wobei A₁ eine substituierte oder unsubstituierte aromatische Heterocyclyl-Gruppe repräsentiert; R₁ ein Wasserstoffatom, eine Alkyl-Gruppe, eine Acyl-Gruppe, eine Aralkyl-Gruppe repräsentiert, wobei die Aryl-Komponente substituiert oder unsubstituiert sein kann, oder eine substituierte oder unsubstituierte Aryl-Gruppe; wobei R₂ und R₃ jeweils Wasserstoff repräsentieren oder R₂ und R₃ zusammen eine Bindung repräsentieren; wobei A₂ eine Benzyl- oder Chromanyl-Komponente repräsentiert die, soweit es die Valenz und die Stabilität erlauben, bis zu fünf Substituenten trägt; und n eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 6 repräsentiert.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der PPARγ-Agonist eine Verbindung ist, ausgewählt aus der Gruppe aus Proglitazon, Troglitazon, Ciglitazon, Englitazon und BRL49653.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der PPARγ-Agonist ein Arachidonat-Metabolit ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der PPARγ-Agonist ein Metabolit von PGD₂ ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der PPARγ-Agonist eine PPARy-abhängige Transkription in einer Konzentration von zumindest einer Größenordnung weniger als diejenige aktiviert, die für dasselbe Aktivierungsniveau von PPARα, PPARδ oder eine RAR-abhängige Transkription erforderlich ist.
Verfahren nach Anspruch 1, das weiterhin ein in Berührung bringen der Zelle mit einem Mittel umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Mitose-Inhibitoren, Alkylierungsmitteln, Antimetaboliten, Nukleinsäure, interkalierenden Mitteln, Topoisomerase-Inhibitoren, Mitteln, die die Apoptose fördern und Mitteln, die die Immunreaktionen gegenüber Tumoren steigern, besteht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der MAP-Kinase-Inhibitor PD098059 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zelle aus einer Adipozyte oder einer Adipozyten-Vorläuferzelle ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Zelle eine Liposarkoma-Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zelle von einer hämopoetischen Zelle oder einer hämopoetischen Vorläuferzelle abgeleitet ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Zelle aus einer malignen Transformation einer Zelle der Lymphoid- oder Myeloid-Linie abgleitet ist.
Verwendung eines a) PPARγ-Agonisten und b) eines MAP-Kinase-Inhibitors in der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung oder prophylaktischen Vorbeugung einer Störung in einem Tier, die durch eine unerwünschte Proliferation PPARγ-responsiver hyperproliferativer Zellen gekennzeichnet ist.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei die Störung einen Adipozyten-Tumor umfasst.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei die Adipozyten-Tumor-Störung aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Lipomen, Fibrolipomen, Lipoblastomen, Lipomatose, Hibernomen, Hämangiomen und Liposarkomen besteht.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei die Adipozyten-Tumorstörung ein Liposarkom ist.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei die Störung aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Sarkom, Karzinom und Leukämie besteht.
Verwendung nach Anspruch 19, wobei die Störung aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Fibrosarkom, Myxosarkom, Liposarkom, Chondrosarkom, osteogenetischem Sarkom, Chodoma, Angiosarkom, Endotheliosarkom, Lymphangiosarkom, Lymphangioendotheliosarkom, Synoviom, Mesotheliom, Ewing's Tumor, Leiomyosarkom, Rhabdomyosarkom, Kolonkarzinom, Pankreaskrebs, Brustkrebs, Eierstockkrebs, Prostatakrebs, Plattenepithelkarzinom, Basalzellkarzinom, Adenokarzinom, Schweißdrüsenkarzinom, Talgdrüsenkarzinom, papillärem Karzinom, papillärem Adenokarzinom, Cystadenokarzinomen, medullärem Karzinom, bronchiogenem Karzinom, Nierenzellkarzinom, Hepatom, Gallengangkarzinom, Choriokarzinom, Seminom, Embryonalkarzinom, Wilm's Tumor, Zervikalkrebs, Testiculartumor, Lungenkarzinom, kleinzelligem Lungenkarzinom, Blasenkarzinom, Epithelkarzinom, Gliom, Astrocytom, Medulloblastom, Craniopharyngiom, Ependymom, Pinealom, Hämangioblastom, akustischem Neurom, Oligodendrogliom, Meningiom, Melanom, Neuroblastom und Retinoblastom besteht.
Verwendung nach Anspruch 19, wobei die Störung ein Karzinom umfasst, das sich aus dem Gewebe der Brust, der Prostata, der Niere, der Blase oder des Kolons bildet.
Verwendung nach Anspruch 19, wobei die Störung einen leukämischen Krebs umfasst.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei das Tier ein Säugetier ist.
Verwendung nach Anspruch 23, wobei das Tier ein Mensch ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die (i) einen PPARγ-Agonisten in einer therapeutisch wirksamen Menge zum Induzieren der terminalen Differenzierung einer PPARγ-responsiven hyperproliferativen Zelle in einem Tier; (ü) zumindest ein Mittel ausgewählt aus der Gruppe, die aus Mitose-Inhibitoren, Alkylierungsmitteln, Anti-Metaboliten, Nukleinsäure, interkalierenden Mitteln, Topoisomerase-Inhibitoren, Mitteln, die die Apoptose fördern und Mitteln, die die Immunreaktion auf Tumoren erhöhen; (iii) einen MAP-Kinase-Inhibitor; und (iv) einen pharmazeutisch verträglichen Träger, umfasst. 26. Pharmazeutische Zusammensetzung, die einen PPARγ-Agonisten und einen MAP-Kinase-Inhibitor in einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst, wobei der PPARγ-Agonist in einer therapeutisch wirksamen Menge vorliegt, um die terminale Differenzierung einer PPARγ-responsiven hyperproliferativen Zelle in einem Tier zu induzieren.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 25, wobei der PPARγ-Agonist ein Thiazolidindion oder ein Analogon hiervon ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 25, wobei der PPARγ-Agonist durch die nachfolgende Formel repräsentiert wird:
oder eine tautomere Form hiervon, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz hiervon, oder ein pharmazeutisch verträgliches Solvat hiervon, wobei A₁ eine substituierte oder unsubstituierte aromatische Heterocyclyl-Gruppe repräsentiert; R₁ ein Wasserstoffatom, eine Alkyl-Gruppe, eine Acyl-Gruppe, eine Aralkyl-Gruppe repräsentiert, wobei die Aryl-Komponente substituiert oder unsubstituiert sein kann, oder eine substituierte oder unsubstituierte Ary1-Gruppe; wobei R₂ und R₃ jeweils Wasserstoff repräsentiert oder R₂ und R₃ zusammen eine Bindung repräsentieren, wobei A₂ eine Benzyl- oder Chromanyl-Komponente repräsentiert, die, wenn es die Valenz und die Stabilität erlauben, bis zu fünf Substituenten trägt; und n eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 6 repräsentiert.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 28, wobei der PPARγ-Agonist eine Verbindung ist, ausgewählt aus der Gruppe von Pioglitazon, Troglitazon, Ciglitazon, Englitazon und BRL49653.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 25, wobei der PPARγ-Agonist ein Arachidonat-Metabolit ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 30, wobei der PPARγ-Agonist ein Metabolit von PGD₂ ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 25, wobei der PPARγ-Agonist eine PPARγ-abhängige Transkription in einer Konzentration in zumindest einer Größenordnung weniger als diejenige aktiviert, die für dasselbe Aktivierungsniveau von PPARα, PPARδ oder eine RaR-abhängige Transkription erforderlich ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 26, wobei der MAP-Kinase-Inhibitor PD098059 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Hemmung der Proliferation der Zelle eine Differenzierung der Zelle zu einem Phänotyp mit einem geringeren proliferativen Index induziert.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei der MAP-Kinase-Inhibitor PD098059 ist.
Verfahren zum Hemmen der Proliferation einer PPARγ-responsiven hyperproliferativen Zelle in einer Probe, umfassend ein in Berührung bringen der Zelle mit einem PPARγ-Agonisten, wobei der PPARγ-Agonist eine Verbindung ist, ausgewählt aus der Gruppe von Pioglitazon, Troglitazon, Ciglitazon, Englitazon und BRL49653 oder einer tautomeren Form hiervon, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz hiervon oder ein pharmazeutisch verträgliches Solvat hiervon, in einer Menge, die zur Differenzierung der Zelle zu einem Phänotyp mit einem geringeren proliferativen Index wirksam ist.
Verwendung eines PPARγ-Agonisten ausgewählt aus Pioglitazon, Troglitazon, Ciglitazon, Englitazon und BLR49653 oder einer tautomeren Form hiervon, oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes hiervon, oder eines pharmazeutisch verträglichen Solvats hiervon bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung oder prophylaktischen Vorbeugung einer Störung, die durch eine unerwünschte Proliferation von PPARγ-responsiven hyperproliferativen Zellen gekennzeichnet ist.