JPH11511472A - Ｒｘｒアゴニストを用いたｎｉｄｄｍの治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はＲＸＲアゴニストを単独でまたはチアゾリジンジオン化合物などのＰＰＡＲγアゴニストと組み合わせて使用してインスリン非依存性糖尿病の治療のための方法および組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ＲＸＲアゴニストを用いたＮＩＤＤＭの治療 発明の分野 本発明は糖尿病および関連徴候を治療するための方法および製薬学的化合物に 関する。 発明の背景 インスリン非依存性糖尿病(ＮＩＤＤＭ、II型糖尿病)はインスリン分泌および インスリン作用の異常によって特徴付けられる。ＮＩＤＤＭは米国内で糖尿病と 診断された約６００万人のうちの９０−９５％を構成する。ＮＩＤＤＭは、高血 糖で特徴付けられ、末梢組織（骨格筋および脂肪組織）におけるインスリン耐性 の結果、インスリンで刺激されたグルコースの取込み／利用が鈍化され、肝臓に おいてはインスリンによるグルコース産生の抑圧が不十分である。インスリン作 用におけるこれらの障害は血中グルコースの急激な上昇およびグルコース不寛容 （intolerance）の発達において重要な役割を果たしている。 食事および運動がＮＩＤＤＭ患者の第１段階療法である。ＮＩＤＤＭ患者はま た、血中グルコースレベルを制御する経口低血糖剤を服用する。最も広範囲に使 用されている低血糖剤は、多様なインスリン製剤およびスルホニル剤である。こ れらの治療法の主要な欠点は、高インスリン血症のための潜在的に生命を脅かす 低血糖症の発生である。 これらの治療法で起こり得る高インスリン血症はまた、糖尿病の主要死因であ る心臓血管疾患の危険の上昇にも関する。それゆえ、循環インスリン濃度を増加 させない抗糖尿病剤の存在が必要である。 化合物の新規のクラスであるチアゾリジンジオン（thiazolidinedione）は、 インスリン分泌を促進することよりむしろインスリン作用を増加させることによ って、抗高血糖作用を遂げると示されている。チアゾリジンジオンは、非常に高 投与量でさえも低血糖状態を引き起こさずにインスリン耐性を改善し、および血 漿グルコースおよびインスリン（上昇されたところでさえ）を正常化する。チア ゾリジンジオンインスリン増感剤、例えば、シグリタゾン（ciglitazone）、エ ン グリタゾン（englitazone）、ピオグリタゾン（pioglitazone）、ＢＲＬ ４９６ ５３（５−［［４−［２−（メチル−２−ピリジニルアミノ）エトキシ］フェニ ル］メチル］−２，４−チアゾリジンジオン）、およびトログリタゾン（trogli tazone）は、肝臓グルコース産生のインスリン媒介抑制およびインスリン刺激グ ルコースの取込み、および脂肪組織による利用を増強する。チアゾリジンジオン はまた、インスリン応答性を増加させるのに貢献するグルコーストランスポータ ー（例えばＧlut ４）の発現を変化させる。発明の概要 発明者らは、ＲＸＲアゴニストがチオベンゾリジンジオン化合物の抗糖尿病効 果を模倣または増強することを見い出した。ＲＸＲアゴニストは、ＲＸＲ／ＰＰ ＡＲγヘテロダイマーの転写活性を活性化し、インスリン刺激性グルコース取込 みを増加させ、トリグリセリドのレベルを低下させ、インスリンのレベルを抑圧 し、およびＨＤＬコレステロールのレベルを上昇させる。２つのＲＸＲアゴニス トはグルコース、トリグリセリドおよびインスリンレベルをＮＩＤＤＭの２つの 確立された動物モデル、すなわちob／obおよびdb／dbマウスにおいて低下させる と示されている。それゆえ、ＲＸＲアゴニストはＮＩＤＤＭの治療および関連兆 候におけるインスリン増感剤またはインスリン模倣物（mimetic）として使用す ることができる。 さらに、ＲＸＲアゴニストおよびＰＰＡＲγアゴニスト、例えばチアゾリジン ジオンなどの組合せは、ＰＰＡＲγの脂肪細胞化および抗糖尿病効果を増強すよ うＲＸＲ／ＰＰＡＲγヘテロダイマーの相乗活性化を達成する。db／dbマウスに おいて、ＲＸＲアゴニストおよびＰＰＡＲγアゴニストの組合せは、個々の化合 物が行うより多くグルコースのレベルを低下させることを示した。 それゆえ、本発明は以下に限るものではないが、ＲＸＲアゴニストを含むＲＸ Ｒ／ＰＰＡＲγのアクチベーターの製薬学的に有効な量を含む組成物を宿主に投 与することによって、ＮＩＤＤＭを有する宿主またはインスリン耐性糖尿病を有 する宿主を治療するための方法および組成物に関する。該宿主はヒト患者または ヒトＮＩＤＤＭの動物モデルであってよい。本発明の組成物は宿主内のＮＩＤＤ Ｍの１またはそれ以上の兆候を治療、改善または妨害するように適合させる。好 ましい薬剤は非常に効能がありかつ低い毒性を選択しているものである。この点 において、当業者は本発明のＲＸＲアゴニスト含有化合物および組成物で治療す ることができる代謝疾患の例として、ＮＩＤＤＭを認識するであろう。本発明の 化合物および組成物で治療可能である代謝疾患の他の例には、以下に限るもので はないが、肥満および甲状腺ホルモン異常が含まれる。 「製薬学的に有効な量」とは、ＮＩＤＤＭに対する治療上適切な効果を有して いる製薬学的化合物または組成物の量を意図する。治療上適切な効果は患者にお けるＮＩＤＤＭの１またはそれ以上の兆候をある程度緩和するが、または例えば 、循環しているインスリンに対する細胞応答の感受性を増加させ、以下に限られ るものではないが、高血糖症、高インスリン血症および高トリグリセリド血症を 含むＮＩＤＤＭの１またはそれ以上の臨床兆候を治療、低減または妨害すること などのＮＩＤＤＭ関連または原因の１またはそれ以上の生理学的または生化学的 媒介変数を部分的または完全に正常状態に戻す。好ましい態様において、化合物 または組成物の製薬学的に有効な量は脂肪組織または筋肉組織によるグルコース の取込みを増加させる量を意図する。別の好ましい態様において、化合物または 組成物の製薬学的に有効な量とは、脂肪組織によるトリグリセリドの取込みを増 加させる量を意図する。 「ＲＸＲ／ＰＰＡＲγヘテロダイマーのアクチベーター」とは、ＲＸＲ／ＰＰ ＡＲγヘテロダイマーと組み合わせると該ヘテロダイマーの転写調節作用を増加 させ、以下に限るものではないが、米国特許第４,９８１,７８４号、５,０７１, ７７３号、５,２９８,４２９号、５,５０６,１０２号、ＷＯ８９／０５３５５号 、ＷＯ９１／０６６７７号、ＷＯ９２／０５４４７号、ＷＯ９３／１１２３５号 、ＷＯ９５／１８３８０号、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０４３９９号、ＰＣＴ／ＵＳ９ ４／０３７９５号およびカナダ特許第２,０３４,２２０号など、参照のため本明 細書に包含する）において記載または開示されている「同時トランスフェクショ ン」または「シス−トランス」アッセイにおいて知られているアッセイによって 測定される化合物または組成物を意図する。それには、以下に解説されるもので はな いが、ＲＸＲ、ＰＰＡＲまたはその両方を含む。 「ＲＸＲアゴニスト」は、ＲＸＲホモダイマーまたはヘテロダイマーと組み合 わせるとＲＸＲの転写調節活性を増加させ、以下に限るものではないが、米国特 許第４,９８１,７８４号、５,０７１,７７３号、５,２９８,４２９号、５,５０ ６,１０２号、ＷＯ８９／０５３５５号、ＷＯ９１／０６６７７号、ＷＯ９２／ ０５４４７号、ＷＯ９３／１１２３５号、ＷＯ９５／１８３８０号、ＰＣＴ／Ｕ Ｓ９３／０４３９９号、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０３７９５号およびカナダ特許第２ ,０３４,２２０号など（参照のため本明細書に包含する）に記載または開示され ている「同時トランスフェクション」または「シス−トランス」アッセイを含む （これらに限るものではない）当業者に公知のアッセイによって測定される化合 物または組成物を意図する。また、それにはこれらに限るものではないが、ＲＡ Ｒ（すなわちＲＸＲ特異的アゴニスト）を超えて好ましくＲＸＲを活性化する化 合物およびＲＸＲおよびＲＡＲ（すなわち全アゴニスト）両者を活性化する化合 物を含む。また、ある細胞環境内でＲＸＲを活性化するが、他の細胞環境におい ては活性化しない（すなわち部分的アゴニスト）化合物を含む。ＲＸＲアゴニス ト活性を有する以下の文献、特許特許出願に開示または記載されている化合物は 、参照のため本明細書に包含する：米国特許第５,３９９,５８６号、５,４６６, ８６１号、ＷＯ９６／０５１６５号、ＰＣＴ／ＵＳ９５／１６８４２号、ＰＣＴ ／ＵＳ９５／１６６９５号、ＰＣＴ／ＵＳ９３／１００９４号、ＷＯ９４／１５ ９０１号、ＰＣＴ／ＵＳ９２／１１２１４号、ＷＯ９３／１１７５５号、ＰＣＴ ／ＵＳ９３／１０１６６号、ＰＣＴ／ＵＳ９３／１０２０４号、ＷＯ９４／１５ ９０２号、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３９４４号、ＷＯ９３／２１１４６号暫定的な （provisional）出願６０，００４，８９７号および６０,００９,８８４号、ベ ーム（Ｂoehm）ら、Ｊ．Ｍed．Ｃhem．３８（１６）：３１４６−３１５５、１ ９９４、ベームら、Ｊ．Ｍed．Ｃhem．３７（１８）：２９３０−２９４１、１ ９９４、アントラス（Ａntras）ら、Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．２６６：１１５７−１ １６１（１９９１）、サラザルーオリボ（Ｓalazar-Ｏlivo）ら、Ｂiochem．Ｂi ophys．Ｒes．Ｃommun． ２０４：１５７−２６３（１９９４）およびサファ ノバ（Ｓafanova）、Ｍol．Ｃell．Ｅndocrin．１０４：２０１−２１１（１９ ９４）。ＲＸＲ特異的アゴニストは、以下に限るものではないが、ＬＧ１００２ ６８（すなわち２−［１−（３,５,５,８,８−ペンタメチル−５,６,７,８−テ トラヒドロ−２−ナフチル）−シクロプロピル］−ピリジン−５−カルボン酸） およびＬＧＤ１０６９（すなわち、４−［（３,５,５,８,８−ペンタメチル−５ ,６,７,８−テトラヒドロ−２−ナフチル）−２−カルボニル］−安息香酸）お よび類似体、誘導体および製薬学的に許容し得るその塩を含む。ＬＧ１００２６ ８およびＬＧＤ１０６９の構造および合成は、ベームら、Ｊ．Ｍed．Ｃhem．３ ８（１６）：３１４６−３１５５、１９９４（参照のため本明細書に包含する） に開示されている。全アゴニストには、以下に限られるものではないが、ＡＬＲ Ｔ１０５７（すなわち９−シスレチノイン酸）および類似体、誘導体および製薬 学的に許容し得るその塩を含む。 好ましい態様において、医薬組成物はまたＰＰＡＲγアゴニストの製薬学的に 有効な量を含む。かわりに、ＰＰＡＲγアゴニストの製薬学的に有効な量を含む 第２組成物を別個に宿主に投与する。さらに好ましい態様において、ＲＸＲおよ びＰＰＡＲγの両方のアゴニスト活性を有する化合物を使用する。 「ＰＰＡＲγアゴニスト」は、米国特許第４,９８１,７８４号および第５,０７ １,７７３号およびレーマン（Ｌehman）ら、Ｊ．Ｂiol．Ｃhem.２７０：１２９ ５３−１２９５６（１９９５）（参照のため本明細書に包含する）に記載または 開示されている「同時トランスフェクション」または「シス−トランス」アッセ イを含む当業者に公知のアッセイによって測定される化合物または組成物を意図 する。好ましいＰＰＡＲγアゴニストは以下に限られるものではないが、ＢＲＬ ４９６５３、トログリタゾン、ピオグリタゾン、シグリタゾン、ＷＡＹ−１２０ ,７４４、エングリタゾン、ＡＤ５０７５、ダーグリタゾンおよび類似体、誘導 体および製薬学的に許容し得るその塩を含む。トントネズ（Ｔontonez）ら、Ｇe nes ＆ Ｄevelop． ８：１２２４−１２３４（１９９４）、トントネズら、Ｃell ７９：１１４７−１１５６（１９９４）、レーメンら、Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．２ ７０（２２）：１−４、１９９５、アムリ（Ａmri）ら、Ｊ．Ｌipid Ｒes．３２ ： １１４９−１４５６（１９９１）、アムリら、Ｊ．Ｌipid Ｒes．３２：１４５ ７−１４６３（１９９１）およびグリマルディ（Ｇrimaldi）ら、Ｐroc．Ｎatl ．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ ８９：１０９３０−１０９３４（１９９２）を参照のた め本明細書に包含する。 さらに好ましい態様において、該医薬組成物はまた、製薬学的に有効なインス リン、インスリン誘導体、インスリン分泌促進物質、インスリン増感剤またはイ ンスリン模倣物をも含む。別法として、製薬学的に有効な量のインスリン、イン スリン誘導体、インスリン分泌促進物質、インスリン増感剤またはインスリン模 造物を含む組成物を別個に宿主に投与する。 活性成分の製薬学的に有効な量を含む組成物は、宿主に経口または全身投与す ることができる。好ましい態様において、該組成物は経口投与される。 別の局面において、本発明はＲＸＲアゴニストの製薬学的に有効な量を含むＮ ＩＤＤＭを治療するための医薬組成物を特徴付ける；ＮＩＤＤＭを有する宿主に 適合させた製薬学的に許容し得る担体を含む。好ましい態様において、該医薬組 成物はまた、製薬学的に有効な量のインスリン、インスリン誘導体、インスリン 誘導体、インスリン分泌促進物質、インスリン増感剤、インスリン模倣物または ＰＰＡＲγアゴニストをも含む。 好ましい態様において、該組成物はＮＩＤＤＭの治療または高血糖症、高イン スリン血症または高トリグリセリド血症を治療するため米国におけるＦＤＡ（外 国における同等の調節機関）によって認可されており、該効果に関してラベルは 叙述している容器内に収まらない。そのような容器には宿主に活性成分の治療上 有効な量を提供した。 別の局面において、本発明はＮＩＤＤＭを治療するのに有用である化合物の候 補をスクリーニングするための方法を特徴付ける。これらの方法はＲＸＲ／ＰＰ ＡＲγヘテロヂダイマーと組み合わせると、該ヘテロダイマーの転写調節活性を 増加させ、以下に限るものではないが、米国特許第４,９８１,７８４号、５,０ ７１,７７３号、５,２９８,４２９号、５,５０６,１０２号、ＷＯ８９／０５３ ５５号、ＷＯ９１／０６６７７号、ＷＯ９２／０５４４７号、ＷＯ９３／１１２ ３５号、ＷＯ９５／１８３８０号、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０４３９９号、ＰＣＴ／ ＵＳ９４／０３７９５号およびカナダ特許第２,０３４,２２０号など（参照のた め本明細書に包含する）に記載または開示されている「同時トランスフェクショ ン」または「シス−トランス」アッセイを含む当業者に公知のアッセイによって 測定される化合物または組成物を選択する。１例として、潜在的なＲＸＲアゴニ ストなどの候補化合物は脂肪細胞または前脂肪細胞に投与される。細胞内の脂質 のレベルを計測し、ついで候補化合物による処置後の脂質の蓄積量の増加は候補 化合物がＮＩＤＤＭの治療に有用であることを示している。好ましい態様におい て、脂質のレベルはオイルレッドＯ染色または細胞内のトリグリセリドのレベル の検出によって測定される。 別の実施例において、可能性のあるＲＸＲアゴニストなどの候補化合物を脂肪 細胞または前脂肪細胞に投与し、ついで脂肪細胞特異的遺伝子（例えばリポタン パク質リパーゼ遺伝子またはＰＰＡＲγ遺伝子）の転写レベルを測定する。候補 化合物での処理後の脂肪細胞特異的遺伝子の転写の増加は、該候補化合物がＮＩ ＤＤＭの治療に有用であることを示唆している。 さらに別の例において、可能性のあるＲＸＲアゴニストなどの候補化合物は脂 肪細胞または前脂肪細胞に投与し、ついでグルコースの取込みのレベルを測定す る。候補化合物での処理後のグルコースの取込みの増加は、該候補化合物がＮＩ ＤＤＭの治療に有用であることを示唆している。別法として、候補化合物および インスリンの両者を細胞に投与し、ついで該グルコース取込みのレベルをインス リン単独での処理をした同じ細胞でのレベルと比較する。候補化合物およびイン スリンにより処理された細胞内のグルコース取込みの一層高いレベルは該候補化 合物がインスリン増感剤であり、ＮＩＤＤＭの治療に有用であることを示唆する 。 本発明の他の特徴および利点は、以下の発明の詳細な記載および請求の範囲か ら明らかであるであろう。 図面の簡単な説明 図１ａは、ＲＸＲアゴニスト（ＬＧ１００２６８）、ＰＰＡＲγアゴニスト（ チアゾリジンジオン化合物ＢＲＬ４９６５３）、およびインスリンの多様な組合 せ で処理した３Ｔ３−ＬＩ前脂肪細胞中のトリグリセリドのレベルによって測定さ れるように３Ｔ３−ＬＩ細胞内での脂肪細胞の分化の程度を示すグラフである。 レチノイドおよびＢＲＬ４９６５３は１μＭで使用した。 図１ｂは、ＲＸＲアゴニスト（ＬＧＤ１０６９）、ＰＰＡＲγアゴニスト（チ アゾリジンジオン化合物ＢＲＬ４９６５３）、およびインスリンの多様な組合せ で処理した３Ｔ３−ＬＩ前脂肪細胞中のトリグリセリドのレベルによって測定さ れるように３Ｔ３−ＬＩ細胞内での脂肪細胞の分化の程度を示すグラフである。 レチノイドおよびＢＲＬ４９６５３は１μＭで使用した。 図２ａは、ＲＸＲアゴニスト（ＬＧ１００２６８）、ＰＰＡＲγアゴニスト（ チアゾリジンジオン化合物ＢＲＬ４９６５３）、およびインスリンの多様な組合 せで処理した３Ｔ３−ＬＩ細胞中のＬＰＬｍＲＮＡのレベルを示すグラフである 。レチノイドおよびＢＲＬ４９６５３は１μＭで使用した。 図２ｂは、ＲＸＲアゴニスト（ＬＧ１００２６８）、ＰＰＡＲγアゴニスト（ チアゾリジンジオン化合物ＢＲＬ４９６５３）、およびインスリンの多様な組合 せで処理した３Ｔ３−ＬＩ細胞中のＰＰＡＲ７ｍＲＮＡのレベルを示すグラフで ある。レチノイドおよびＢＲＬ４９６５３は１μＭで使用した。 図３は、それぞれＬＧ１００２６８、ＢＲＬ４９６５３およびＬＧ１００２６ ８とＢＲＬ４９６５３の組合せで処理したdb/dbマウス中のグルコースのレベル を示すグラフである。 図４は、それぞれＬＧ１００２６８、ＢＲＬ４９６５３およびＬＧ１００２６ ８とＢＲＬ４９６５３の組合せで処理したdb/dbマウス中のトリグリセリドのレ ベルを示すグラフである。 図５は、それぞれＬＧ１００２６８、ＢＲＬ４９６５３およびＬＧ１００２６ ８とＢＲＬ４９６５３の組合せで処理したdb/dbマウス中のＨＤＬコレステロー ルのレベルを示すグラフである。 図６は、それぞれＬＧＤ１０６９、ＬＧ１００２６８およびＢＲＬ４９６５３ で処理したob/obマウス中のトリグリセリドのレベルを示すグラフである。 図７は、それぞれＬＧＤ１０６９、ＬＧ１００２６８およびＢＲＬ４９６５３ で処理したob/obマウス中のグルコースのレベルを示すグラフである。 図８は、それぞれＬＧＤ１０６９、ＬＧ１００２６８およびＢＲＬ４９６５３ で処理したob/obマウス中のインスリンのレベルを示すグラフである。 発明の詳細な記載 ＴＺＤはＰＰＡＲγにより抗糖尿病および脂肪細胞化の効果を活性化する チアゾリジンジオンは糖尿病および肥満の動物モデルにおけるグルコースおよ び脂質のレベルを有意に低減させるインスリン増感剤である（キーズ（Ｋees） ら、Ｊ．Ｍedicinal Ｃhem．３８（４）：６１７−６２８、１９９５；ウィルソ ン（Ｗilson）ら、Ｊ．Ｍedicinal Ｃhem．３９（３）：６６５−６６８、１９ ９６；ヤング（Ｙoug）ら、Ｄiabetes ４４：１０８７−１０９２、１９９５） 。チアゾリジンジオンは、インスリン放出を刺激せずにグルコースの利用を改善 する。 例えば、肥満マウスにＢＲＬ４９６５３を繰り返し投与すると、標的組織のイ ンスリン応答性を高めることによって糖血コントロールを改善する。ＢＲＬ４９ ６５３は、インスリン受容体数の増加およびＧＬＵＴ４の転座を促進することの 両者によって、拡張された細胞内プールから細胞表面へのインスリン刺激グルコ ース輸送をインスリン耐性肥満マウス由来の脂肪細胞中で可能にする。 チアゾリジンジオンはまた、選択的なＰＰＡＲγアゴニストである（レーマン ら、Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．２７０（２２）：１−４、１９９５）。ＰＰＡＲγの活 性化のＥＣ₅₀と高血糖活性の最少有効用量（ＭＥＤ）との比較は有意な相関を明 らかにした。イン・ビトロＰＰＡＲγ活性とイン・ビボでのチアゾリジンジオン の抗高血糖活性間の相関は、チアゾリジンジオンの抗糖尿病効果の分子標的とし てのＰＰＡＲγを示唆する。 ＰＰＡＲγはリガンド活性化転写因子の核受容体スーパーファミリーの一員で ある。それは脂肪特異的なやり方で発現され、その発現はいくつかの前脂肪細胞 細胞株の分化の間に早期に誘発される。繊維芽細胞中のＰＰＡＲγの強制発現は 脂肪細胞の分化という結果となる。 インスリン増感活性に加えて、チアゾリジンジオンは顕著な脂肪細胞効果を前 脂肪細胞および間充組織幹細胞に及ぼす（トントノズら、Ｃell ７９：１１４７ −１１５６、１９９４）。ＢＲＬ４９６５３でのＣＨ３／１０Ｔ１／２の処理は 効率よい脂肪細胞の分化となり、その結果はＰＰＡＲγのリガンド媒介活性化が 間充組織幹細胞中の脂肪細胞化シグナルカスケードを開始するのに十分である。 ＰＰＡＲγはチアゾリジンジオンの脂肪細胞化効果の分子標的である。 脂肪細胞化はＮＩＤＤＭの進行において役割を果たしており、それはバランス を失ったグルコース恒常性だけでなく、循環脂肪の上昇したレベルによって特徴 付けられる。脂質のレベルの増加がグルコース処分を邪魔することを示す。 脂肪細胞は、脂質代謝およびエネルギー恒常性における重要な役割を果たす非 常に特異化された細胞である。それらの主要な役割は、カロリー過剰の時期にト リグリセリドを蓄え、栄養不足時にその保存物を動員することである。 脂肪細胞の分化は脂肪細胞特異的遺伝子発現における協調的な増加によって特 徴付けられる。ＰＰＡＲγは脂肪細胞に得意的に発現する。その発現はいくつか の前脂肪細胞細胞株の分化の進行の間の初期に誘発される。繊維芽細胞中のＰＰ ＡＲγの強制発現は、脂肪細胞の分化という結果となる。 ＲＸＲおよびＰＰＡＲγの脂肪細胞への相乗効果 ＰＰＡＲγの発現は培養された脂肪細胞株の分化の間の初期に誘発され、脂肪 組織中で非常に高いレベルで特異的に発現する。ＰＰＡＲγは他の脂肪細胞特異 的遺伝子（例えば、脂肪細胞Ｐ２遺伝子（ａＰ２遺伝子））の転写を調節するこ とによって脂肪細胞化を調節する。ａＰ２遺伝子は細胞内脂質結合タンパク質を コードし、ついで脂肪細胞中にもっぱら発現する。 ａＰ２遺伝子の５’−フランキング領域からの５１８bp ＤＮＡ断片は、培養 された細胞およびトランスジェニックマウスの両方において高レベルの脂肪細胞 特異的遺伝子発現を指令するエンハンサーとして同定されている。ａＰ２エンハ ンサー、ＡＲＥ６およびＡＲＥ７における１対のエレメントは、脂肪細胞由来の 核抽出物においてしか検出されないＡＲＦ６として名付けられた核因子に結合す る。ＡＲＦ６−結合部位は脂肪細胞特異的発現に必要でありかつ十分であり、こ のことはトランス作用因子ＡＲＦ６はａＰ２エンハンサーの分化依存および組織 特異 的スイッチとして機能することを示唆する（トントノズら、Ｇenes ＆ Ｄevelop ment 、８：１２２４−１２３４、１９９４）。 ＡＲＦ６認識配列はＤＲ−１（１−ヌクレオチドスペーサーを有する反復を指 令）として知られる核ホルモン受容体結合部位の１つのタイプに類似する。この モチーフは、ＲＸＲとＣＯＵＰ−ＴＦのヘテロダイマーおよびＲＸＲと該ＰＰＡ Ｒのヘテロダイマーに好んで結合することが示されている。競合物としての多様 なＨＲＥ配列を用いたＤＮＡ移動度遅滞実験（ＤＮＡ mobility retardation ex periment）はＡＲＦ６がＤＲ−１部位を好んで認識することを証明した。 ＡＲＦ６はＲＸＲαとＰＰＡＲγのヘテロダイマー複合体として同定されてい る。ＰＰＡＲγおよびＲＸＲαはイン・ビトロでのＡＲＦ６−結合部位上にヘテ ロダイマーを形成することを示している。一時的なトランスフェクション中のこ れらの因子の強制発現は、繊維芽細胞などの非脂肪細胞中の脂肪細胞特異的ａＰ ２エンハンサーを活性化するのに十分である。この活性化はベルオキシソーム増 殖因子、脂肪酸および９−シスレチノイン酸によって可能となる。ＲＸＲαに対 する抗血清は、脂肪細胞核抽出物におけるＡＲＦ６活性を特異的に阻害する。 ＲＸＲα発現ベクターおよびＰＰＡＲγ発現ベクターの同時トランスフェクシ ョンは、非脂肪細胞におけるａＰ２エンハンサーを活性化するための相乗効果を 有する。ａＰ２エンハンサーの最大の活性化はＰＰＡＲγ、ＲＸＲαおよびその アゴニストの両者が存在する場合に観察される。 いかなる理論にも縛られず、本出願人はＲＸＲアゴニストは、ＲＸＲおよびＰ ＰＡＲγヘテロダイマーの相乗効果により組織中のグルコース利用に影響を及ぼ すことを提案する。ＲＸＲ／ＰＰＡＲγヘテロダイマーは、ＲＸＲアゴニストま たはＲＸＲアゴニストとＰＰＡＲγアゴニストとの組合せによって活性化される 場合、脂肪細胞化を誘発し、グルコースおよびトリグリセリド取込みのレベルを 調節する。別にまたはさらに、ＲＸＲ／ＰＰＡＲγヘテロダイマーはＲＸＲアゴ ニストまたはＲＸＲアゴニストとＰＰＡＲγアゴニストとの組合せによって活性 化される場合、腫瘍壊死因子−αまたはレプチンなどの脂肪組織によって分泌さ れたシグナル分子を調節し、今度は他の組織においてグルコース代謝を調節する 。チアゾリジンジオンの抗糖尿病効果を模擬または増強するＲＸＲアゴニストの使 用 ＰＰＡＲα、βおよびγはすべてＲＸＲとヘテロダイマーを形成する。これら のＲＸＲ／ＰＰＡＲヘテロダイマーはＤＮＡに結合し、転写活性を調節する。Ｒ ＸＲアクチベーターは、ＰＰＡＲαタンパク質の活性を活性化させるＰＰＡＲα アクチベーターと協同する（クリーワー（Ｋliewer）ら、Ｎature ３５８：７７ １−７７４（１９９２）およびマクハージー（Ｍukherejee）ら、Ｓteroid Ｂio chem．Ｍolec．Ｂiol． ５１：１５７−１６６（１９９４））。 本発明において、類似の相乗活性化がＰＰＡＲγアクチベーターといくつかの ＲＸＲアクチベーターと共に観察された。 本発明により、ＲＸＲアゴニスト（例えば、ＬＧＤ１０６９、ＡＬＲＴ１０５ ７およびＬＧ１００２６８）は糖尿病の治療に有用であることができる。本発明 者らはＲＸＲアゴニストの効果、すなわち、形態上の変化、脂質の蓄積、遺伝子 発現および増加したグルコース取込みの調節のための４つの独立したパラメータ ーを試験した。 ２つの前脂肪細胞株をＰＰＡＲγ／ＲＸＲヘテロダイマー中でのＲＸＲ活性化 の理論を試験するために使用した。３Ｔ３−ＬＩおよびＣ３Ｈ／１０ＴＩ／２細 胞はＡＴＣＣから得て、それらはマウス胚由来である。該細胞は接触を阻害され 、ついで細胞質内の大きな脂質小滴を含む脂肪細胞に分化するため誘導され得る 。脂肪細胞の分化は、細胞質レッド内の脂質小滴を染色するオイルレッドＯ染色 によって観察され得る。脂肪細胞の分化の程度は、ついで顕微鏡観察によってモ ニターされることができる。 一層多くの定量アッセイおよび化合物の迅速なスクリーニングのため、９６− ウェルプレートアッセイを脂肪細胞を分化させることによって産生されたトリグ リセリドの量を定量するために開発された。このアッセイにおいて、細胞を９６ −ウェルプレート上で一定の密度に達するまで単層として増殖させ、ＢＲＬ４９ ６５３、インスリンおよびレチノイド単独または多様な組合せで処理する。これ らの処理は３Ｔ３−ＬＩおよびＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞の両者において異なる 程度にまで分化を誘導する。ついで、トリグリセリド蓄積のレベルはプレートリ ーダー中で読み取られることができる酵素発色反応を介して測定されることがで きる。 脂肪細胞の分化の第３の測定は遺伝子発現の調節を試験することである。ＰＰ ＡＲγとリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）の両方のｍＲＮＡ発現レベルは脂肪 細胞分化の間に調節されることを示されている。ノザンブロット分析を使用して 、いかにしてレチノイドが脂肪細胞の分化の標的遺伝子に影響を及ぼすかの分子 的側面を詳細に吟味する。ＰＰＡＲγ、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）およ びβ−アクチン（負荷コントロール）ｍＲＮＡレベルが、細胞がチアゾリジンジ オンおよびレチノイドで処理された後にモニターされた。 ＮＩＤＤＭまたはインスリン耐性糖尿病を治療することにおける化合物の利用 のための第４のインジケーターは、インスリン刺激グルコース取込みを増強する 化合物の能力である。標識された２−デオキシグルコース（２−ＤＯＧ、グルコ ース類似体）アッセイを、インスリンおよび２−ＤＯＧ取込みのレベルを測定す る候補化合物の存在下で前脂肪細胞株にて行う。 （Ａ）オイルレッドＯで染色した３Ｔ３−ＬＩ細胞における脂質の蓄積のレチノ イド調節 表１は、オイルレッドＯ染色アッセイにより観察されるように脂肪細胞に分化 した３Ｔ３−ＬＩ細胞の存在を示す。ＢＲＬ４９６５３およびＬＧ１００２６８ を１μＭで使用し、インスリンを０．０１mg／mlで使用した。ＬＧ１００２６８ で処理したウェルは細胞質内でより大きくより赤い脂質小滴を有した。 ＢＲＬ４９６５３およびＬＧ１００２６８処理単独は、脂肪細胞に分化する細 胞の５０％誘発した。これはインスリンの付加で劇的に増加した。ＢＲＬと組み 合わせたインスリンは、３Ｔ３−ＬＩ細胞の８０％を脂肪細胞に誘発するが、一 方インスリンとＬＧ１００２６８の組合わせは細胞の９０％を分化へと誘発した 。ＢＲＬ４９６５３がＬＧ１００２６８（ＲＸＲアゴニスト）と組合せて使用し た場合、脂肪細胞分化の量はまた、劇的に増加した。他のＲＸＲアゴニストはＬ Ｇ１００２６８の活性を模倣している。例えば、ＡＬＲＴ１０５７（全アゴニス ト） またはＢＲＬ４９６５３と組合せたＬＧＤ１０６９（ＲＸＲ特異的アゴニスト） の添加は、強力なＲＸＲアゴニストＬＧ１００２６８より少ない程度にもかかわ らず分化の量を増加させた。インスリンとＢＲＬ４９６５３およびＬＧＤ１０６ ９の組合せは３Ｔ３−ＬＩ細胞に強力な分化効果（９５％）を有した。 （Ｂ）分化した脂肪細胞におけるトリグリセリド含有量のレチノイド調節 脂質の形成のレチノイド調節は、トリグリセリド形成をモニターすることによ って定量化された。図１ａおよび１ｂはレチノイド（ＬＧ１００２６８またはＬ ＧＤ１０６９）単独またはチアゾリジンジオンおよびインスリンと組み合わせて 処理された３Ｔ３−ＬＩ細胞中のトリグリセリド蓄積を示す。レチノイドおよび ＢＲＬ４９６５３は全実験の組合せに関して１μＭで、インスリンは０.０１mg ／mlで使用した。 インスリン、ＢＲＬ４９６５３およびレチノイドはすべて単独で使用される場 合、幾分トリグリセリド蓄積を誘発し、ＬＧ１００２６８は最大の反応を与えた 。該アッセイにチアゾリジンジオン（ＢＲＬ４９６５３）とレチノイド（ＬＧＤ １０６９、ＬＧ１００２６８）の添加は３Ｔ３−ＬＩ分化脂肪細胞中でのトリグ リセリド蓄積量を増加させた。これは、また、ＢＲＬ４９６５３またはＬＧ１０ ０２６８がインスリンと組み合わせて使用した場合に観察される。トリグリセリ ドの最大の蓄積はＬＧ１００２６８、ＢＲＬ４９６５３およびインスリンを伴っ て治療された細胞において見られる。類似の結果がＬＧＤ１０６９が実験中でＬ Ｇ１００２６８に取って代わる時に観察される。これらの結果はオイルレッドＯ 染色アッセイ中で得られた結果と一致する。 （Ｃ）分化している３Ｔ３−ＬＩ細胞中でのＰＰＡＲγおよびＬＰＬ ｍＲＮＡ 調節 脂肪細胞特異的遺伝子をノザンブロット分析を介してモニターされた。図２ａ および２ｂは、ＢＲＬ４９６５３（１μＭ）、ＬＧ１００２６８（０.０１mｇ／ ml）およびインスリン（０.０１mg／ml）、単独でまたは組合せて７日間処理し た細胞中のＬＰＬ（リポタンパク質リパーゼ）ｍＲＮＡおよびＰＰＡＲγｍＲＮ Ａの発現パターンを示す。 ノザンブロット分析は、いずれかの化合物単独で処理した細胞中でのＬＰＬお よびＰＰＡＲγｍＲＮＡ発現のβ−アクチンへの標準化した相対的シグナルにお ける増加を示した。転写制御がインスリン、ＢＲＬ４９６５３およびＬＧ１００ ２６８による処理で起こることを示すこれらの脂肪細胞標的遺伝子のｍＲＮＡレ ベルにおいて３〜５倍の増加があった。インスリン、ＢＲＬ４９６５３およびＬ Ｇ１００２６８の組合せはさらにｍＲＮＡのレベルを増強しなかった。 これらのデータは、３Ｔ３−ＬＩ細胞において、ＲＸＲアゴニストがそれ自体 またはチアゾリジンジオンまたはインスリンとの組合せにより脂肪細胞の分化を 誘発することを示している。ＲＸＲアゴニストはチアゾリジンジオンおよびイン スリンの活性を増強する。３つの独立した測定が、ＲＸＲアゴニストが脂肪細胞 の分化の調節におけるＲＸＲ／ＰＰＡＲγヘテロダイマーの調節に貢献し、ＮＩ ＤＤＭの治療に有用であることを支持している。 （Ｄ）ＬＧ１００２６８は３Ｔ３−ＬＩ細胞中のインスリン刺激グルコース取込 みを増強する マウス前脂肪細胞株３Ｔ３−ＬＩは、グルコース取込み、脂肪細胞化を調べる ために広く使用され、チアゾリジンジオンおよび他のＰＰＡＲγアクチベーター の特徴付けにおいて使用されている。インスリン刺激した標識した２−デオキシ グルコース（２−ＤＯＧ、グルコース類似体）の取込みはＢＲＬ４９６５３また はＬＧ１００２６８で処理した３Ｔ３−ＬＩ細胞において観察された。 ３Ｔ３−ＬＩ細胞をＢＲＬ４０６５２（１０μＭ）またはＬＧ１００２６８（ １μＭ）で１０日間処理した。インスリンを該細胞に０.０１mg／mlの濃度で５ 日間添加し、その後はインスリンは無添加とした。標識した２−デオキシグルコ ース取込みアッセイを行った（スザルコブスキ（Ｓzalkowski）ら、Ｊ．Ｅndocr in． １３６：１４７４−１４８１、１９９５）。取り込まれた標識した２−ＤＯ Ｇのレベルを総細胞タンパク質の量に標準化した。２−ＤＯＧ取込みにおける約 ５倍の増加がＢＲＬ４９６５３単独で処理した３Ｔ３−ＬＩ細胞おいて観察され た。ＬＧ１００２６８単独で処理した３Ｔ３−ＬＩ細胞においては２−ＤＯＧ取 込みにおいて約２倍の増加が観察された。 これらの実験は、ＲＸＲアゴニストが公知のインスリン増感剤である、チアゾ リジンジオンのように３Ｔ３−ＬＩ細胞中でインスリン媒介グルコース取込みを 増加させることを示している。ＲＸＲアゴニストはＮＩＤＤＭすなわちインスリ ン耐性の主要な兆候を処理するために使用されることができることを直接示して いる。ＮＩＤＤＭの治療に有用な他のＲＸＲアゴニストは、このアッセイを用い て確認することができる。 （Ｅ）オイルレッドＯ染色したＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞中の脂質蓄積のレチノ イド調節 脂肪細胞機能のレチノイド調節をさらに査定するために、本発明者らはＣ３Ｈ ／１０Ｔ１／２細胞（それらは脂肪細胞または筋肉細胞に分化するように誘発さ れることができるマウス胚繊維芽細胞／多能性幹細胞である）を調べた。表２は オイルレッドＯ染色アッセイによって観察されるように、脂肪細胞に分化したＣ ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞のパーセンテージを示す。実験Ａは、ＢＲＬ４９６５３ の存在下で行った。実験ＢはＢＲＬ４９６５３およびインスリンの両方の存在下 で行った。ＡＬＲＴ１０５７およびＬＧＤ１０６９を１μＭで使用し、ＴＴＮＰ Ｂ（ＲＡＲ選択化合物）を１０ｎＭの濃度で使用した。インスリンを０.０１mg ／mlで使用した；およびＢＲＬ４９６５３を０.１、１および１０μＭで使用し た。Ｃ３Ｈ／１０Ｔ１／２細胞を７日間処理し、細胞をオイルレッドＯで染色し 、顕微鏡下で観察した。 形態上の変化が、たとえ該細胞が完全に脂肪細胞に分化しなかったとしても、 レチノイド単独で処理した場合に観察した。ＢＲＬ４９６５３単独では脂肪細胞 の分化を受ける細胞のせいぜい１０％に変化を引き起こした。しかしながら、Ｂ ＲＬ４９６５３がＲＸＲアゴニスト、ＬＧＤ１０６９またはＡＬＲＴ１０５７と 組み合わせて使用された場合、分化の量における多大な増加があり、同様の効果 がＢＲＬ４９６５３がインスリンと組み合わせて使用した場合に見られる。 ＲＸＲアゴニストであるＴＴＮＰＢ（ＲＸＲを活性化させない）はＲＸＲアゴ ニストＬＧＤ１０６９およびＡＬＲＴ１０５７と同様の効果を持たなかった。実 際、ＴＴＮＰＢはＢＲＬ４９６５３またはＢＲＬ／インスリンによって誘発され る分化を阻害した。 上記の実験はチアゾリジンジオン（ＢＲＬ４９６５３）単独がＣ３Ｈ／１０Ｔ １／２細胞における最少量の分化を誘発する。しかしながら、ＢＲＬ４９６５３ はＬＧ１００２６８、ＬＧＤ１０６９またはＡＬＲＴ１０５７（ＲＸＲアゴニス ト）などのレチノイドと組合わせて使用される場合、分化は劇的に増加する。こ れば純粋なＲＡＲアゴニストであるＴＴＮＰＢでは見られない。これらのデータ はＰＰＡＲγ／ＲＸＲヘテロダイマー（脂肪細胞分化プロセスを稼働する）がＲ ＸＲアゴニストの結合によって活性化および増強され得ることを支持する。ＲＸ Ｒアゴニストはグルコースおよびトリグリセリドの取込みのレベルを調節するの に有用である。 ＮＩＤＤＭの動物モデルにおけるグルコースおよびトリグリセリドのレベルを 低下させるＲＸＲアゴニストの使用 （Ａ）db ／dbマウスでのイン・ビボ実験 動物：糖尿病Ｃ５７ＢＬＫＳ／Ｊ−ｍ＋／＋db、８２マウス 起源：ジャクソン・ラブ（Ｊakson Ｌab） 群番号０００６４２ 遺伝子型ｍ＋／＋db ｘｍ＋／＋db ＤＯＢ ６／１９／９６±３ｄ、ＤＯＡ ７／２３／９６−３４日齢 実験日： ８／５／９６−８／２１／９６，４４−６３日齢 マウスは耳のパンチコード（＃１−８２）によって同定され、８群（Ａ−Ｈ） に分けた。各群は１ケージ当たり２−３匹のマウスで４ケージに分けた１０匹の マウスからなる。数匹のマウスは肺への液体注入の実験の進行中に失敗して、２ 群において９匹／群となった。コントロール群Ｃは１２匹のマウスからなる。そ のマウスは５６％炭酸、２６％脂肪および1８％タンパク質のカロリー組成にて ３.８３kcal／ｇを含むペレット化したプリナ・ラブ・食物＃５０１５をマウス に与えた。食物と水は任意に与えた。食物取込みを選択した期間にて測定し、つ いで食物消費ｇ／１００ｇマウス／日として表現した。 実験の日に、午前６時１５分から７時までの間の選択された時間間隔でケージ から食物を取り除いた。動物の体重を絶食開始２時間後に記録し、３時間の絶食 の後に血液サンプルを採取した。血液を尾の先端を切断して流し、ついでヘパリ ン化したキャピラリーチューブに収集した（約７５μｌ容量）。遠心後、ヘマト クリットをマイクロキャピラリーリーダー（microcapillary reader）にて読み 取り、記録し、ついでチューブを壊して、グルコース、トリグリセリドおよびイ ンスリン濃度の分析のための血漿の回収をした。 血液サンプルを０_-1、０、３、７、１０日および実験の最終日、１３−１５日 に収集した。０日の血液サンプルの収集後、動物は再度プリナ食物を与えられ、 ついで引き続きＣ群にはコントロール溶液を、Ａ、Ｂ、Ｄ−Ｈと名付けられた群 には７つの試験溶液のうちの１つで強制飼養した。投与容量は平均０.６ml／４ ２ｇマウス（０.０１４２９ml／ｇ）と同量とした。多様な溶液で、当日朝に計測 された動物の体重に基づくかまたは前日の体重測定時に得た体重に基づきそれぞ れの群に強制飼養した。血漿ＦＦＡにおける変化を査定するため、第１０日に７ ５μｌ血液サンプルを加えて、塩基性のヘパリン化したキャピラリーチューブサ ンプルを収集後、すぐにＥＤＴＡ−コートし、キャピラリーチューブに回収する 。 実験の最終日には、マウスを試験溶液では強制飼養しなかった。最後の強制飼 養を最終日の前日、すなわち、１３日に屠殺する動物は１２日、１４日に屠殺す る動物は１３日に、および１５日に屠殺する動物は１４日に投与した。最終血液 はＨＤＬの評価のための血清を提供するために首を切断することによって収集し た。 結果： 図３は、ＢＲＬ４９６５３およびＬＧ１００２６８が、各々独立にdb／dbマウ スにおけるグルコースレベルを低下させたことを示している。さらに、ＢＲＬ４ ９６５３およびＬＧ１００２６８の組合せを各々の化合物がそれ自体で行ったよ り多くのレベルを低下させた。ＢＲＬ４９６５３（１mg／kg）およびＬＧ１００ ２６８（２０mg／kg）はコントロールに比較して、第１５日までに４０％のグル コースのレベルを低下させた。１mg／kgでチアゾリジンジオンＢＲＬ４９６５３ は類似の効果を示した。ラクチベーターおよびＰＰＡＲアクチベーターの組合せ は多大な効果を示し、グルコースレベルをほぼ５０％低下に導いた。その組合せ の効果は迅速であり、グルコースレベルは実験の第１日までに減少させ、４日ま でに安定状態に達した。これはグルコース恒常性の安定なレベルの迅速な再設定 を示唆する。それゆえ、ＲＸＲアクチベーターはＰＰＡＲγアクチベーターの効 果を増強し、また、逆もまた同様である。 図４は、ＲＸＲアクチベーターが、db／dbマウスにおけるトリグリセリドのレ ベルを低下させることを示す。ＬＧ１００２６８（２０mg／kg）は実験の第１５ 日までに４０％トリグリセリドのレベルを低下させた。ＢＲＬ４９６５３（１mg ／kg）は同様の効果を示した。これらの２つの化合物の組合せはさらによく機能 した。 図５は、ＲＸＲアクチベーターモジュレーターが、db／dbマウスにおけるＨＤ Ｌコレステロールのレベルを増加させたことを示す。ＬＧ１００２６８（２０mg ／kg）は、db／dbマウス注のコントロールに比較して、ＨＤＬ−コレステロール レベル（２０％）を増加させた。ＢＲＬ４９６５３は同様のレベルでの増加を引 き起こした。これらの２つの化合物の組合せは一層多く増加したことを示す。Ｈ ＤＬ−Ｃはベーリンガー・マンハイム（Ｂohringer-Ｍannheim）（カタログ番号 ５４３００４および４２７５７８）から得たキットを用いて沈降法により測定し た。 （Ｂ）ob ／obマウスによるイン・ビボ実験 動物：肥満Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｌep^ob(4)、１２１マウス 起源：ジャクソン・ラブ、ストック番号０００６３２ 群番号０００６３２ 遺伝子型 Ｌep^ob(4)／＋ ｘＬep^ob(4)／＋ ＤＯＢ ５／２２／９６±３ｄ、ＤＯＡ ７／２／４１日齢 実験日： ７／２１／９６−８／２／９６−４９−７０日齢 マウスは耳のパンチコード（＃１−１２１）によって同定され、１２群に分け た。各群は１０匹のマウスからなる（１匹のマウスを実験前に屠殺した。という のは、虫歯は最初の体重減少となるからである。先の実験のように、各群のマウ スは４ケージに飼われ（１ケージ当たり２−３匹）、任意に水およびプリナ・ラ ブ・食物＃５０５＼１５を与えられた。 実験の日に、午前６時１５分から７時までの間の選択された時間間隔でケージ から食物を取り除いた。動物の体重を絶食開始２時間後に記録し、３時間の絶食 の後に血液サンプルを採取した。血液を尾の先端を切断して流し、ついでヘパリ ン化したキャピラリーチューブに収集した（約７５μｌ容量）。遠心後、ヘマト クリットをマイクロキャピラリーリーダーにて読み取り、記録し、ついでチュー ブを壊してグルコース、トリグリセリドおよびインスリン濃度の分析のための血 漿を回収した。 血液サンプルを０_-1、０、３、６、８、１０、１４±１日および実験の最終日 、１５、１または１７日に収集した。ＦＦＡサンプルを非ヘパリン化したＥＤＴ Ａコートしたチューブにおける第２の７５μｌの血液サンプルを流すことによっ て収集した。このチューブをヘパリン化したチューブの回収のすぐ後で回収した 。 Ｈ群の動物は第０日に毎日コントロール強制飼養溶液(０.６mg／４２ｇ)を投 与開始し、最終日の前日に終了する。１１試験溶液をＡ−Ｇ、Ｉ−Ｌと名付けら れた群の動物に投与した。すべての強制飼養溶液はマウスが血液サンプルのため に断食している日に、再度食料を与えた後に投与する。 結果： 図６はＲＸＲモジュレーターがob／obマウス中のトリグリセリドのレベルを低 下させたことを示す。ＲＸＲアクチベーターＬＧＤ１０６９（３０mg／kg）およ びＬＧ１００２６８（２０mg／kg）は実験の第１４日目においてそれぞれ３４％ と６０％トリグリセリドのレベルを低下させた。ＢＲＬ４９６５３はまた、トリ グリセリドのレベルを低下することができたが、ＬＧ１００２６８ほど有効では なかった。 図７はＲＸＲモジュレーターがob／obマウス中のグルコースのレベルを低下さ せたことを示す。ＲＸＲアクチベータ−ＬＧＤＩ０６９（３０mg／kg）およびＬ Ｇ１００２６８（２０mg／kg）は、コントロールに比較してグルコースレベルの ほとんど５０％を低下させた。グルコースのレベルは実験の第１４日目までにほ とんど正常血糖レベルにまで低下した。ＢＲＬ４９６５３（０.４mg／kg）は類 似の効果を示した。 図８はＲＸＲモジュレーター、ＬＧＤ１０６９（３０mg／kg）およびＬＧ１０ ０２６８（２０mg／kg）がob／obマウス中のインスリンのレベルを低下させたこ とを示す。ＬＧ１００２６８は、実験の第１４日目までに６６％のインスリンレ ベルを低下させた。ＬＧＤ１０６９は効果の低下を示した。該化合物の非常に迅 速な効果が、第１日のインスリンレベルなどが滴下を開始以来、見られた。 製薬学的製剤および投与の様式 関心のある障害または状態に影響を及ぼす特定の化合物は、それ自体または適 当な担体または賦形剤と混合される医薬組成物中にて患者に投与されることがで きる。関心のある障害を示す患者の処置において、これらのような治療上有効な 量の薬剤の量が投与される。治療上有効な用量は、患者内の病状の改善または生 存期間の延長という結果となる化合物の量をいう。 該化合物は、また、製薬学的に許容し得る塩として調製することができる。製 薬学的に許容し得る塩の例には、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、スルファミン酸塩 、酢酸塩、クエン酸塩、酪酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスル ホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、シクロヘキススルファミン酸塩およびキ ナ酸塩などの酸付加塩を含む（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９２／０３７３６参照）。 そのような塩は塩酸、硫酸、リン酸、スルファミン酸、酢酸、クエン酸、酪酸、 酒石酸、マロン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸 、ｐ−トルエンスルホン酸、シクロヘキシルファミン酸およびキナ酸などの酸を 用いて用いて得ることができる。これらの塩は標準方法を用いて調製することが できる。例えば、該化合物のフリーの塩基形態は、適当な酸を含む水または水− アルコール溶液などの適当な溶媒中に最初は溶かす。その塩をついで、溶液を蒸 発させることによって単離する。別の実施例においては、その塩を有機溶媒中で フリーの塩基と酸を反応させることによって調製する。 担体または賦形剤を例えば、溶解度を増加させるために該化合物の投与をし易 くするなど使用することができる。担体および賦形剤の例には、炭酸カルシウム 、 リン酸カルシウム、多様な糖または多様な型のスターチ、セルロース誘導体、ゼ ラチン、植物油、ポリエチレングリコールおよび生理学的に調和する溶媒を含む 。 さらに、試験された分子はＲＸＲ／ＰＰＡＲγヘテロダイマーに作用すること ができ、したがって、本発明中において分子を選択することができる構造の特徴 を決定するために使用することができる。当業者は、参照のため本明細書に包含 するＰＣＴ公開番号第９４／１８９５９において開示される技術を使用して、規 範分子から薬剤をいかに設計するかを知るであろう。 そのような化合物の毒性および治療剤の効果は例えば、ＬＤ₅₀（その集団の５ ０％が死に致る用量）およびＥＤ₅₀（その集団の５０％において治療上の効果が ある用量）を決定するため、細胞培養または実験動物中の標準製薬学的手続によ って決定することができる。毒性効果および治療効果の間の用量の割合は治療上 の指標であり、ＬＤ₅₀／ＥＤ₅₀の割合として発現することができる。多大な治療 剤の指標を示す化合物が好ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物実験か ら得られたデータを、ヒトにおける使用のための用量の範囲をまとめるのに使用 することができる。そのような化合物の用量は、毒性がほとんどないかまたは全 くなくＥＤ₅₀を含む循環濃度の範囲内に好ましくは存在する。該用量は、使用さ れる投与形態および利用する投与経路に依存して、この範囲内において変化する ことができる。血漿におけるレベルを例えばＨＰＬＣによって測定することがで きる。 まさにその製剤、投与の形態および用量を、個々の医師により、患者の状態の 点からみて選択することができる（例えば、フィンガル（Ｆingal）ら、ザ・フ ァーマコロジカル・ベーシス・オブ・セラピューティクス（Ｔhe Ｐharmacologi cal Ｂasis of Ｔherapeutics）、１９７５、第１章、第１ページ）。主治医は いかにおよびいつ毒性のためまたは組織機能不全のために投与を終了、阻止また は適合させるかを知るであろうことを注意すべきである。逆に、医師はまた、臨 床的応答が適当でない（毒性を排除する）かもしれない一層高いレベルに治療を 適合させることを知るであろう。関心のある障害の管理において投与された用量 の大きさは、治療されるべき状態の重篤度および投与経路により変化するであろ う。 病状の重篤度は、例えば、部分的には標準的な予防評価法によって評価すること ができる。さらに、投与用量および投与頻度は、また、患者個体の年齢、体重お よび応答により変化するであろう。上記で議論された比較可能なプログラムは、 獣医学において使用することができる。 治療されるべき特異的な状態に依存して、そのような薬剤は製剤され、全身ま たは局所的に投与されることができる。製剤および投与のための技術はレミント ンズ・ファーマシューティカル・サイエンシズ（Ｒemington's Ｐharmaceutical Ｓciences）、１８版、マック・パブリッシング・コ(Ｍack Ｐublishing Ｃo.) 、イーストン、フィラデルフィア（１９９０）において見られる。適当な経路は 、わずかしか挙げられないが、経口、直腸、皮膚、経膣、経粘膜または、腸；筋 肉内、皮下、脊髄内注入ならびに髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内 または眼内注入などの非経口運搬を含む。 注入に関して、本発明の薬剤を水溶液、好ましくはハンクス溶液、リンガー溶 液または生理食塩緩衝液などの生理学的に調和するバッファー中で製剤すること ができる。そのような経粘膜投与に関して、透過すべき障害に適当な貫通刺胞を 製剤中で使用する。そのような貫通刺胞は一般的に当該技術分野において公知で ある。 全身投与のために適当な投与においての本発明の実施に関して、本明細書に開 示の化合物を製剤化するための製薬学的に許容し得る担体の使用は、本発明の範 囲内である。適当な担体の選択と適当な製造実施とともに、本発明は、特に、溶 液として製剤化されたものは、静脈注射によるなどのように非経口投与して良い 。該化合物は経口投与に適当な投与量において当業者に良く知られた製薬学的に 許容し得る担体を用いて容易に製剤化することができる。そのような担体により 、本発明は錠剤、ピル、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液な どとして、治療されるべき患者による経口摂取のために製剤化されることができ る。 細胞内に投与されるよう意図される薬剤は当業者に良く知られた方法を用いて 投与されることができる。例えば、そのような薬剤はリポソームにカプセル化さ れることができ、ついで上記のように投与されることができる。リポソームは球 状の脂質二重層である。リポーム製剤の時に水溶液中に存在するすべての分子は 水性の内部にとりこまれる。リポソーム内容物は、リポソームが細胞膜と融合す るため外部微小環境（external microenvironment）から保護され、細胞質に効 果的に運搬される。さらに、その疎水性のため、小有機分子が直接細胞内に投与 されることができる。 本発明における使用に適当な医薬組成物は、活性成分が意図する目的を達成す る有効量において含まれる組成物を含む。有効量の決定は特に、本明細書に提供 された詳細の開示に照らすと、当業者の能力内に十分ある。活性成分に加えて、 これらの医薬組成物は製薬上使用することができる準備に活性化合物のプロセシ ングを促進させる賦形剤および補助剤（auxiliaries）を含む適当な製薬学的に 許容し得る担体を含むことができる。経口投与のために製剤化された調製物は、 錠剤、糖衣剤（dragee）、カプセルまたは溶液の形態であってよい。本発明の医 薬組成物は例えば、従来の混合、溶解、粒状化、糖衣製造（dragee-making）、 浮揚化（levitating）、エマルジョン化、カプセル化、エントラッピング（entr apping）、または親液化（lyophiize）法を用いてそれ自身が公知である方法に おいて製造されることができる。 非経口投与のための医薬製剤は水溶性形態の活性成分水溶液を含む。さらに、 活性化合物の懸濁液は適当な油性注入懸濁液として調製することができる。適当 な親脂質(lipophilic)溶媒またはビヒクルはゴマ油などの脂肪酸、またはオレイ ン酸エチルまたはトリグリセリドまたはリポソームなどの合成脂肪酸エステルを 含む。水溶性注入懸濁液はカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデ キストランなどの懸濁液の粘性を増加させる物質を含むことができる。時に、懸 濁液はまた安定な安定化剤または高濃度の調製を可能にする化合物の容器度を高 める薬剤をも含む。 経口使用のための製薬学的調製物は固体賦形剤と活性化合物とを組合せ、時に 得た混合物をすり砕き、および顆粒混合物をプロセシングすることによって、所 望ならば適当な補助剤を加えた後に錠剤または糖衣コアを得ることができる。適 当な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトー ルを含む糖などの混ぜ物；例えば、コーンスターチ、小麦スターチ、ライススタ ーチ、ポテトスターチ、ゼラチン、ゴム、トラガカント、メチルセルロース、ヒ ドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、 および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース調製物を含む 。所望ならば、架橋したポリビニルピロリドン、アガーまたはアルギン酸または アルギン酸ナトリウムなどのその塩など崩壊剤を加えることができる。 糖衣コアは適当なコーティング剤とともに提供される。この目的に関して、濃 縮した糖溶液を使用することができ、それはアラビアゴム、タルク、ポリボニル ピロリドン、カーボポル・ゲル（carbopol gel）、ポリエチレングリコールおよ び／またはチタンジオキシド、ラッカー溶液および適当な有機溶媒または溶媒混 合物を含むことができる。活性化合物の異なる組合せの同定またはそれを特徴付 けるために、錠剤または糖衣コーティングに染料または色素を添加することがで きる。 経口使用できる製薬学的調製物には、ゼラチンからできたプッシュフィットカ プセル（push-fit）ならびに軟カプセル、ゼラチンで作られた密封カプセル、グ リセロールまたはソルビトールなどのプラスチサイザー（plasticizer）を含む 。プッシュフィットカプセルはラクトースなどの充填剤、スターチなどの結合剤 および／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、および時 に安定剤などと混合した活性成分を含むことができる。軟カプセルにおいて、活 性化合物は、脂肪酸、液体パラフィンまたは液体ポリエチレングリコールなどの 適当な液体に溶解または懸濁してよい。さらに、安定化剤を加えることができる 。リポソームはカプセル化した運搬のために使用することができる。 ベーム（Ｂoehm）ら、ＷＯ９４／１５９０２に開示または記載される医薬製剤 は参照のために本明細書に包含する。 参照されたすべての出版物（各出版物中に挙げられる核酸配列およびアミノ酸 配列を含む）は、参照のために本明細書に包含する。上記の出版物中に開示およ び参照されたすべての化合物は、参照のため本明細書に包含され、上記出版物に よって引用されている記事に開示および参照されている化合物を含む。 本発明の他の態様は以下の請求の範囲において開示する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ６０／００９，８８４ (32)優先日 1996年１月11日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０１８，３１８ (32)優先日 1996年５月24日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０２１，８３９ (32)優先日 1996年７月10日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 セサリオ，ローズマリー アメリカ合衆国92117カリフォルニア州 サン・ディエゴ、ブリロ・ストリート5076 番 (72)発明者 マクハージー，ランジャン アメリカ合衆国92127カリフォルニア州 サン・ディエゴ、アベニダ・デ・ロス・ロ ボス 11341番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．宿主にＲＸＲアゴニストの製薬学的に有効な量を含む組成物を投与する工 程を含む、ＮＩＤＤＭを有する宿主を治療する方法。 ２．該宿主にＰＰＡＲγアゴニストの製薬学的に有効な量を含む組成物を投与 する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。 ３．該組成物がＰＰＡＲγアゴニストの製薬学的に有効な量をさらに含む請求 項１に記載の方法。 ４．該ＲＸＲアゴニストがＲＸＲ特異的アゴニストである請求項１に記載の方 法。 ５．該ＲＸＲアゴニストがＬＧ１００２６８である請求項４に記載の方法。 ６．該ＲＸＲアゴニストがＬＧＤ１０６９である請求項４に記載の方法。 ７．該ＲＸＲアゴニストがまたレチノイン酸受容体を活性化させる請求項１に 記載の方法。 ８．該ＲＸＲアゴニストが９−シスレチノイン酸である請求項７に記載の方法 。 ９．該ＰＰＡＲγアゴニストがチアゾリジンジオン化合物である請求項２に記 載の方法。 １０．該チアゾリジンジオン化合物がＢＲＬ４９６５３、トログリタゾン、ピ オグリタゾン、シグリタゾン、ＷＡＹ−１２０，７４４、エングリタゾン、ＡＤ ５０７５およびダーグリタゾンよりなる群から選択される請求項９に記載の方法 。 １１．該宿主にインスリン、インスリン誘導体、インスリン分泌促進物質、イ ンスリン増感剤またはインスリン模造物の製薬学的に有効な量を含む組成物を投 与する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。 １２．該組成物がインスリン、インスリン模倣物またはインスリン増感剤の製 薬学的に有効な量をさらに含む請求項３に記載の方法。 １３．（ａ）ＲＸＲアゴニストの製薬学的に有効な量；および （ｂ）製薬学的に許容し得る担体 を含むＮＩＤＤＭの治療に適した医薬組成物。 １４．ＰＰＡＲγアゴニストの製薬学的に有効な量をさらに含む請求項１３に 記載の組成物。 １５．該ＲＸＲアゴニストがＬＧ１００２６８である請求項１３に記載の組成 物。 １６．該ＲＸＲアゴニストがＬＧＤ１０６９である請求項１３に記載の組成物 。 １７．該ＲＸＲアゴニストが９−シスレチノイン酸である請求項１３に記載の 組成物。 １８．該ＰＰＡＲγアゴニストがチアゾリジンジオン化合物である請求項１４ に記載の組成物。 １９．該チアゾリジンジオン化合物が、ＢＲＬ４９６５３、トログリタゾン、 ピオグリタゾン、シグリタゾン、ＷＡＹ−１２０，７４４、エングリタゾン、Ａ Ｄ５０７５およびダーグリタゾンよりなる群から選択される請求項１８に記載の 組成物。 ２０．インスリン、インスリン誘導体、インスリン分泌促進物質、インスリン 増感剤またはインスリン模倣物の製薬学的に有効な量をさらに含む請求項１４に 記載の組成物。 ２１．該組織にＲＸＲアゴニストの製薬学的に有効な量を含む組成物を投与す る工程を含む、脂肪組織または筋肉組織に取り込まれるグルコースを増加させる 方法。 ２２．該組織にＰＰＡＲγアゴニストの製薬学的に有効な量を含む組成物を投 与する工程をさらに含む請求項２１に記載の方法。 ２３．該組成物がＰＰＡＲγアゴニストの製薬学的に有効な量をさらに含む請 求項２１に記載の方法。 ２４．該ＲＸＲアゴニストがＲＸＲ特異的アゴニストである請求項２１に記載 の方法。 ２５．該ＲＸＲアゴニストがＬＧ１００２６８である請求項２４に記載の方法 。 ２６．ＲＸＲアゴニストがＬＧＤ１０６９である請求項２４に記載の方法。 ２７．該ＲＸＲアゴニストがまたレチノイン酸受容体を活性化する請求項２１ に記載の方法。 ２８．該ＲＸＲアゴニストが９−シスレチノイン酸である請求項２７に記載の 方法。 ２９．該ＰＰＡＲγアゴニストがチアオゾリジンジオン化合物である請求項２ ２に記載の方法。 ３０．該チアゾリジンジオン化合物がＢＲＬ４９６５３、トログリタゾン、ピ オグリタゾン、シグリタゾン、ＷＡＹ−１２０，７４４、エングリタゾン、ＡＤ ５０７５およびダーグリタゾンよりなる群から選択される請求項２９に記載の方 法。 ３１．該組織にインスリン、インスリン誘導体、インスリン分泌促進物質、イ ンスリン増感剤またはインスリン模倣物の製薬学的に有効な量を含む組成物を投 与する工程をさらに含む請求項２１に記載の方法。 ３２．該組成物がインスリン、インスリン模倣物またはインスリン増感剤の製 薬学的に有効な量をさらに含む請求項２３に記載の方法。