PT637297E - Compostos com selectividade para os receptores de retinoide x - Google Patents

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tetrahydro
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Marcus F Boehm
Lin Zhi
Richard A Heyman
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Ligand Pharm Inc
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Description

84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ
DESCR1CÀO “Compostos com selectividade para os receptores de retinóide X”
Este invento refere-se a receptores intracelulares e seus ligandos. Mais especificamente, este invento refere-se a compostos com actividade selectiva para receptores específicos do ácido retinóico e a métodos para usar esses compostos. O ácido retinóico, metabolito da vitamina A, tem de há muito sido reconhecido como indutor de um largo espectro de efeitos biológicos. Foram sintetizados diversos análogos estruturais do ácido retinóico que também se verificou serem bioactivos. Alguns, como a Retin-À® (marca registada da Johnson and Johnson) e a Accutane® (marca registada da Hoffmann-LaRoche), encontraram aplicação como agentes terapêuticos para o tratamento de vários estados patológicos. Os metabolitos da vitamina A e os seus análogos sintéticos são aqui colectivamente denominados "retinóides”.
Verificou-se que os retinóides sintéticos mimetizam muitas das acções farmacológicas do ácido retinóico. Contudo, o largo espectro de acções farmacológicas do ácido retinóico não é completamente reproduzido por todos os retinóides sintéticos bioactivos.
Os profissionais da medicina têm vindo a interessar-se muito pelas aplicações médicas dos retinóides. Entre as suas aplicações aprovadas pelo FDA encontra-se o tratamento de formas graves de acne e de psoríase. Existe também uma grande evidência de que estes compostos podem ser usados para fazer parar e de certo modo inverter os efeitos dos danos sobre a pele derivados de uma prolongada exposição ao sol. Há ainda evidência de que estes compostos podem ser úteis no tratamento de diversos cancros, graves incluindo o melanoma, cancro cervical, algumas formas de leucemia, e carcinomas basais e escamosos. Os retinóides também se mostraram eficazes no tratamentos de lesões de células pré-malignas, como a leucoplaquia e para prevenir a ocorrência de malignidade. O uso de retinóides está associado a vários efeitos colaterais significativos. O mais sério destes é que, como uma classe, eles se encontram entre os mais potentes teratogénios conhecidos. Os teratogénios são compostos que provocam graves defeitos de nascimento durante períodos específicos de exposição fetal. Outros efeitos colaterais incluem a irritação dos 2 84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ tecidos tratados, que pode ser tão grave que os pacientes não tolerem o tratamento.
Realizaram-se várias investigações para elucidar as relações estrutura-actividade que regem a capacidade dos retinóides sintéticos induzirem as várias consequências farmacológicas da exposição ao ácido retinóico. Contudo, isto tem sido uma tarefa difícil pois os ensaios disponíveis para os investigadores têm sido bioensaios realizados em animais intactos ou em tecidos isolados. Restrições técnicas têm ffequentemente ditado a utilização de pequenas espécies de diferentes animais para diferentes ensaios. A interpretação dos resultados tem sido complicada por possíveis efeitos farmacocinéticos e metabólicos nos receptores envolvidos e por possíveis diferenças das espécies. Não obstante, têm sido observadas diferenças definidas nos efeitos farmacológicos dos vários retinóides sintéticos.
Um avanço importante do conhecimento do mecanismo molecular da transdução de sinal do ácido retinóico foi conseguido em 1988. Antes dessa data, foram incorrectamente consideradas várias proteínas de ligação do retinóide celular, altamente abundantes, como sendo os receptores da transdução do sinal para o ácido retinóico. Em 1988, verificou-se que um membro da superfamília de receptores intracelulares das hormonas esteróide/tiróide (Evans, Science, 240:889-95 (1988)) transduzia um sinal de ácido retinóico (Giguere et al., Nature, 330:624-29 (1987); Petkovich et al., Nature, 330: 444-50 (1987)). Este resultado inesperado relacionou o ácido retinóico com outras hormonas não peptídicas e elucidou o mecanismo dos efeitos do ácido retinóico na alteração da função das células. Sabe-se agora que os retinóides regulam a actividade de duas subfamílias distintas de receptores intracelulares: os Receptores de Ácido Retinóico (RARs) e os Receptores de retinóide X (RXRs). O primeiro receptor de ácido retinóico identificado, designado por RAR-alfa, actua modulando a transcrição dos genes de alvos específicos de um modo dependente do ligando, como se mostrou ser o caso de muitos membros da superfamília de receptores intracelulares das hormonas esteróide/tiróide. O ligando endógeno de baixo peso molecular do qual depende a actividade de modulação-transcrição do RAR-alfa, é o ácido todo-nxws-retinóico. As alterações mediadas pelo receptor do ácido retinóico na expressão dos genes têm como resultado alterações características no fenótipo celular com consequências em muitos tecidos que manifestem resposta biológica ao ácido retinóico. Dois genes adicionais intimamente relacionados com RAR-alfa foram recentemente identificados e designados por RAR-beta e RAR-gama e estão altamente relacionados (Brand et al., Nature, 332:850-53 (1988); Ishikawa et al, Mol.
84 342
ΕΡ Ο 637 297/PT
Endocrin., 4: 837-44 (1990)). Na região dos receptores de retinóide que se verificou conferir união ao ligando, as sequências primárias de aminoácidos divergem por menos de 15% entre os três subtipos ou isoformes de RAR. O ácido todo-mmy-retinóico é um ligando natural para os receptores do ácido retinóico (RARs) e é capaz de se ligar a estes receptores com uma elevada afinidade, do que resulta a regulação da expressão dos genes. O recém-descoberto metabolito retinóide, o ácido 9-cA-retinóico, é também um activador dos RARs.
Uma observação a este respeito, mas inesperada, foi realizada recentemente (Manglesdorf èt al., Nature, 345: 224-29 (1990)), onde também'se mostrou que um outro membro da superfamília de receptores de esteróide/tiróide respondia ao ácido retinóico. Este novo subtipo de receptores retinóides foi designado por Receptor de retinóide X (RXR), pois que certos resultados anteriores sugeriam que um derivado do ácido todo-írans-retinóico podia ser o ligando endógeno para o RXR. Como os RARs, os RXRs são também conhecidos por terem pelo menos três subtipos ou isoformes, nomeadamente RXR-alfa, RXR-beta e RXR-gama, com correspondentes esquemas únicos de expressão (Manglesdorf et al., Genes & Devei., 6: 329-44 (1992)). i
Ainda que ambos os RARs e RXRs respondam ao ácido todo-íra/75-retinóico in vivo, os receptores diferem em vários aspectos importantes. Primeiro, os RARs e RXRs são significativamente divergentes na estrutura primária (e.gos domínios da união do ligando dos RARa e RXRa apresentam apenas uma identidade de 27% de aminoácidos). Estas diferenças estruturais reflectem-se nos diferentes graus relativos de capacidade de resposta dos RARs e RXRs a vários metabolitos da vitamina A e a retinóides sintéticos. Além disso, para os RARs e RXRs vêem-se esquemas distintamente diferentes de distribuição nos tecidos. Por exemplo, em contraste com os RARs, os quais não estão expressos em níveis elevados nos tecidos viscerais, mostrou-se que o RXRa mRNA é muito abundante no fígado, rins, pulmões, músculos e intestinos. Finalmente, os RARs e os RXRs têm diferentes especificidades de genes-alvo. Por exemplo, foram recentemente identificados elementos de resposta nos genes celulares da proteína de ligação retinal de tipo II (CRBPII) e da apolipoproteína AI que conferem capacidade de resposta ao RXR mas não ao RAR. Além disso, o RAR também mostrou recentemente reprimir a activação mediada pelo RXR através do elemento de resposta CRBPII RXR (Manglesdorf et al., 66: 555-61 (1991)). Estes resultados indicam que os dois caminhos de resposta do ácido retinóico não são simplesmente redundantes mas que, pelo contrário, manifestam uma interrelação complexa. Recentemente, Heyman et al. (Cell, 68: 397-406
84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ 4 (1992)) e Levin et al, (Nature, 355: 359-61 (1992)) demonstraram, independentemente um do outro, que o ácido 9-cw-retinóico é um ligando endógeno natural para os RXRs. Mostrou-se que o ácido 9-czs-retinóico se liga e transactiva os RXRs, bem como os RARs, e parece portanto actuar como um ligando “bifuncional”.
Em face da citada, embora nitidamente distinta, natureza destes receptores, os ligandos que são mais selectivos para a subfamília dos Receptores de retinóide X terão grande valor para controlar selectivamente os processos mediados por uma ou mais das isoformas de RXR e permitirão o controlo independente dos processos fisiológicos mediados pelos RXRs. Os ligandos que afectam preferencialmente uma ou mais, mas não todas as isoformas dos receptores, oferecem também a possibilidade de uma maior eficácia terapêutica quando usados em aplicações medicinais.
As revelações completas das publicações e referências, acima e adiante citadas nesta especificação, são aqui incorporadas por referência.
Sumário do invento O presente invento refere-se a compostos, composições e métodos para modular processos mediados por um ou mais Receptores de retinóide X. Mais particularmente, o invento refere-se a compostos que activam, selectiva ou preferencialmente, os Receptores de retinóide X, em comparação com os Receptores do Ácido Retinóico. Estes compostos modulam selectivamente os processos mediados pelos Receptores de retinóide X. Assim, o invento também refere métodos para modular processos mediados selectivamente por um ou mais Receptores de retinóide X, em comparação com os Receptores do Ácido Retinóico, usando os compostos deste invento. São exemplos dos compostos aqui usados que fazem parte do invento, o benzilo bicíclico, piridinilo, tiofeno, furanilo e derivados do pirrol. As composições farmacêuticas que contenham os compostos revelados estão também dentro do âmbito deste invento. Também estão incluídos métodos para identificar e purificar Receptores de retinóide X utilizando os compostos deste invento.
Breve descrição das figuras O presente invento pode ser melhor entendido e as suas vantagens apreciadas pelos 5 84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ peritos na arte, por referência aos desenhos em anexo onde: A Figura 1 apresenta perfis de resposta a doses padronizadas que mostram a transactivação de isoformas de RAR e de RXR pelo 3-metil-TTNCB. A Figura 2 apresenta perfis de resposta a doses padronizadas que mostram a transactivação de isoformas de RAR e de RXR pelo ácido todo-tra/75-retinóico. A Figura 3 apresenta perfis de resposta a doses padronizadas que mostram a transactivação de isoformas de RAR e de RXR pelo ácido 9-cA-retinóico. A Figura 4 apresenta perfis de resposta a doses padronizadas que mostram a transactivação de isoformas de RAR e de RXR pelo 3-metil-TTNEB. A Figura 5 apresenta perfis de resposta a doses padronizadas que mostram a transactivação de isoformas de RAR e de RXR pelo 3-bromo-TTNEB. A Figura 6 apresenta perfis de resposta a doses padronizadas que mostra a transactivação de isoformas de RAR e de RXR pelo 3-metil-TTNCHBP. A Figura 7 apresenta perfis de resposta a doses padronizadas que mostram a transactivação |de isoformas de RAR e de RXR pelo 3-metil-TTNEHBP. A Figura 8 apresenta a inibição da actividade da transglutaminase pelo ácido 9-cis-retinóico, ácido todo-íraws-retinóico e pelo 3-metil-TTNCB. A Figura 9 apresenta a Resposta à Dose Tópica, baseada no ensaio sobre ratinhos Rhino, do ácido 9-czs-retinóico, ácido todo-tra/75-retinóico, 3-metil-TTNCB, 1,25-di-hidroxi-Vitamina D. A Figura 10 apresenta 0 efeito sobre o colesterol HDL dos ratos do ácido todo-trans-retinóico, ácido 9-cz.s-retinóico, 3-metil-TTNCB e 3-metil-TTNEB. A Figura 11 apresenta o efeito relacionado com a concentração do 3-metil-TTNEB e 6 84 342 ΕΡ Ο 637 297/ΡΤ ΤΤΝΡΒ, individualmente, sobre a incorporação de timidina radiomarcada no ADN. A Figura 12 apresenta o efeito relacionado com a concentração de uma combinação de 3-metil-TTNEB e de TTNPB, sobre a incorporação, no ADN, de timidina radiomarcada. O invento divulga compostos do tipo retinóide ou ligandos que têm actividade selectiva para os membros da subfamília de Receptores de retinóide X (RXRs), em comparação com os membros da subfamília dos Receptores do Ácido Retinóico (RARs). São exemplos destes compostos os derivados do benzilo bicíclico que podem ser representados pelas fórmulas:
o
ou
ou
84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ 7 onde R, e R2, independentemente um do outro, representam hidrogénio ou alquilo inferior ou acilo com 1-4 átomos de carbono; Y representa C, O, S, N, CHOH, CO, SO, S02, ou um sal farmaceuticamente aceitável; R, representa hidrogénio ou alquilo inferior com 1-4 átomos de carbono onde Y é C ou N; R4 representa hidrogénio ou alquilo inferior com 1-4 átomos de carbono onde Y é C, mas R4 não existe se Y for N, e nem R- ou R4 existem se Y for S, O, CHOH, CO, SO, ou S02; R' e R” representam hidrogénio, alquilo inferior ou acilo com 1-4 átomos de carbono, OH, alcoxi com 1-4 átomos de carbono, tiol ou tioéter, ou amino, ou R' e R", tomados em conjunto, formam um grupo oxo (ceto), metano, tioceto, epoxi, ciclopropilo ou cicloalquilo e onde os grupos epoxi, ciclopropilo e cicloalquilo podem estar substituídos com alquilo inferior com 1-4 carbonos ou halogéneo;
Rt m e n representam hidrogénio, halogéneo, alquilo inferior ou acilo com 1-4 átomos de carbono, ou R'" e R"", tomados em conjunto, formam um grupo cicloalquilo com 3-10 carbonos, e onde o grupo cicloalquilo pode estar substituído com alquilo inferior com 1-4 carbonos ou halogéneo; R5 representa um alquilo inferior com 1-4 carbonos, halogéneo, nitro, OR?, SR7, NR7Rg ou (CF2)„CF3; R6, R10, R,„ Ri2, Ri3, independentemente uns dos outros, representam hidrogénio, um alquilo inferior com 1-4 carbonos, halogéneo, nitro, OR-, SR7, NR7R8 ou (CF2)nCF3, com a condição de um de R, „ R12 ou Rl3 ser X; R7 e Rs, independentemente um do outro, representam hidrogénio ou um alquilo inferior com 1-6 carbonos; R14 representa hidrogénio, um alquilo inferior com 1-4 carbonos, oxo, hidroxi, acilo com 1-4 carbonos, halogéneo, tiol ou tiocetona; X é COOH, tetrazolo, P03H, S03H, CHO, CH2OH, CONH,, COSH, COOR9, COSR,, CONHR<„ ou COOW onde R<, representa um alquilo inferior com 1-4 carbonos, fenilo, alquilo aromático, ou q-hidroxifenilo, q-bromofenilo, q-clorofenilo, q-fluorofenilo ou q-iodofenilo, onde q=2-4, onde W é um sal farmaceuticamente aceitável, e onde X pode ter origem em qualquer C, excepto na posição 2, do anel; n = 0-3. 8 84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ
Os sais farmaceuticamente aceitáveis citados nesta descrição, incluem, mas sem que tal constitua uma limitação: clorídrico, bromídrico, iodídrico, fluorídrico, sulfurico, cítrico, maleico, acético, láctico, nicotínico, succínico, oxálico, fosfórico, malónico, salicílico, fenilacético, esteárico, piridina, amónio, piperazina, dietilamina, nicotinamida, fórmico, ureia, sódio, potássio, cálcio, magnésio, zinco, lítio, cinâmico, metilamino, metanossulfónico, pícrico, tartárico, trietilamino, dimetilamino, e tris(hidroximetil)aminometano. Outros sais farmaceuticamente aceitáveis são já conhecidos dos peritos na arte.
Derivados representativos de acordo com o presente invento incluem os seguintes: ácido p[3,5,5,8,8-pentametil-l,2,3,4-tetra-hidro-2-naftil-(2-carboniÍ)]benzóico, também conhecido como ácido 4-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetra-hidro-2-naftil)carbonil]benzóico e designado por "3-metil-TTNCB"; ácido p[5,5,8,8-tetrametil-l,2,3,4-tetra-hidro-3-isopropil-2-naftil-(2-carbonil)]benzóico, também conhecido como ácido 4-[(3-isopropil-5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetra-hidro-2-naftil)-carboniljbenzóico, e designado por "3-IPR-TTNCB" ou Composto 37; ácido p[5,5,8,8-tetrametil-l,2,3,4-tetra-hidro-3-isopropil-2-naftil-(2-metano)benzóico, também conhecido como ácido 4-[l-(3-isopropil-5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetra-hidro-2-naftil)-etenil]benzóico e designado por "3-IPR-TTNEB" ou Composto 42; ácido p[5,5,8,8-tetrametil-1,2,3,4-tetra.hidro-3-etil-2-naftil-(2-metano)]benzóico, também conhecido como ácido 4-[l-(3-etil-5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetra-hidro-2-naftil)etenil]benzóico, e designado por "3-etil-TTNEB" ou Composto 45; ácido p[5,5,8,8-tetrametil-l,2,3,4-tetra-hidro-3-bromo-2-naftil-(2-metano)]benzóico, também conhecido como ácido 4-[l-(3-bromo-5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetra-hidro-2-naftil)-etenil]benzóico, e designado por "3-bromo-TTNEB" ou Composto 46; ácido p[5,5,8,8-tetrametil-l,2,3,4-tetra-hidro-3-cloro-2-naftil-(2-metano)]benzóico, também conhecido por ácido 4-[l-(3-cloro-5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetra-hidro-2-naflil)-etenil]benzóico, e designado por "3-cloro-TTNEB" ou Composto 43;
84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ 9 ácido ρ[3,5,5,8,8-pentametil-l,2,3,4-tetra-hidro-2-naftil-(2-metano)]benzóico, também conhecido como ácido 4-[l-(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetra-hidro-2-naftil)etenil]benzóico e designado por "3-metil-TTNEB"; ácido p[3,5,5,8,8-pentametil-l,2,3.4-tetra-hidro-2-naftil-(2-hidroximetil)]benzóico, também conhecido como ácido 4-[l-(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetra-hidro-2-naftil)-hidroximetiljbenzóico e designado por "3-metil-TTNHMB"; ácido p[5,5,8,8,-tetrametil-1,2,3,4-tetra-hidro-3-bromo-2-naftil-(2-carbonil)]benzóico, também conhecido como ácido 4-[(3-bromo-5.5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetra-hidro-2-naftil)-carbonil]benzóico e designado por"3-bromo-TTNCB" ou Composto 41; ácido p[5,5,8,8-tetrametil-l,2,3,4-tetra-hidro-3-cloro-2-naftil-(2-carbonil)]benzóico, também conhecido como ácido 4-[(3-cloro-5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetra-hidro-2-naftil)-carboniljbenzóico e designado por "3-çloro-TTNCB" ou Composto 38; ácido p [5,5,8,8 -tetrametil-1,2,3,4-tetra-hidro-3 -hidroxi-2-naftil-(2-carbonil)]benzóico, também conhecido como ácido 4-[(3-hidroxi-5.5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetra-hidro-2-naftil)-carbonil]benzoico e designado por "3-hidroxi-TTNCB" ou Composto 39; ácido p[5,5,8,8-tetrametil-l,2,3,4-tetra-hidro-3-etil-2-naftil-(2-carbonil)]benzóico, também conhecido como ácido 4-[(3-etil-5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetra-hidro-2-naftil)-carbonil]benzóico e designado por "3-etil-TTNCB" ou Composto 40; ácido p[3,5,5,8,8-pentametil-L2,3,4-tetra-hidro-2-naftiI-(2-tioceto)]benzóico, também conhecido como ácido 4-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetra-hidro-2-naftil)tioceto]benzóico e designado por "tiocetona"; p[3,5,5,8,8-pentametil-l,2,3,4-tetra-hidro-2-naftil-(2-carbonil)]-N-(4-hidroxifenil)benza-mida, também conhecida como 4-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetra-hidro-2-naftil)carbonil]-N-(4-hidroxifenil)benzamida e designada por "3-metil-TTNCHBP"; p[3,5,5,8,8-pentametil-l,2,3,4-tetra-hidro-2-naftil-(2-metano)]-N-(4-hidroxifenil)benza-mida, também conhecida como 4-[l-(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetra-hidro-2-naftil)etenil]-N- 10 84 342 ΕΡ Ο 637-297/PT (4-hidroxifenil)benzamida e designada por "3-metil-TTNEHBP" ou Composto 63; ácido 4-[l-(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetra-hidro-2-naftil)epoxi]benzóico, designado por "TPNEB" ou Composto 47; ácido 4-[l-(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetra-hidro-2-naftil)ciclopropil]benzóico, designado por "TPNCB" ou Composto 48; e 4-[l-(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetra-hidro-2-naftil)etenil]-benzenotetrazolo, designado por "3-metil-TTNEBT" ou Composto 55;
As estruturas representativas destes compostos são as seguintes:
C®*H
3-metil-TTNCB 3-metil-TTNHMB
3-metil-TTNCHBP 11 84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ ο
ácido 4-[(3-isopropil-5.5.8.S-tetrametil-5.0.7.8-tetra-iiidro· 2-naftil)carbonil]benzóico (3-IPr-TTNCB) Ο
ácido 4-[(3-cloro-5.5.8.8-tetrameiii-5.6.7.8-tetra-liidro-2-naitil)carbonil]benzóico (3-cloro-1 l NCB1 44 ácido 4-[l-(3-cloro-5.5.8.S-tetrametil-i.(>.7,8-tetra-liidro-2-nartil)etenillbenzóico (3-cloro-1TNEB)
O
45 ácido 4-[l -(3-liidroxi-5.5.S.8-tetrametil-5.6.7,S-tetra-hidro-2-nanil)eienil]benzóico (3-hidroxi- i iNEB)
ácido 4-[l -(3-etil-5.5.3.8-tetrametil-5.ó.7.8-tetra-hidro-2-naftil)etenil]benzòico (3-Et-TTNEBl
ácido 4-{(3-hidroxi-5,5.8.8-tetrairetil-5.6.7.8-tetra-hidro· 2-nat'tillcarbonil]benzòico (3-hidroxi-TTNCB) O
46
ácido 4-[(3-etil-5,5,8,8-tetrametii-5.ó.7.8-tetra-hidro-2-nattincarbonil]benzóico (3-Et-TTNCB)
ácido 4-[l-(3-bromo-5,5.8.S-tetrameril-5,6,7,8-tetra-hidro-2-nattil)etenil]benzóico (3-bromo-TTNEB) 47
ácido 4-[(3-bromo-5,5,8.8-tetrametil-5.6,7,8-tetra-hidro-2-naftiOcarboniljbenzóico (3-bromo-TTNCB)
48 ácido 4-[l-(3-isopropil-5,5.8,8-tetrametil-5,6,7,S-tetra-. hidro-2-naftil)etenil]benzõico (3-IPr-TTNEB) ácido 4-[l -(3,5.5.8.8-pentametiI-5,6,7,S-tetra-hidro-2-naftil)epoxi]benzóico (TPNEB)
ácido 4-[I-(3.5.5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetra-hidro-2-naftil)ciclopropiI]benzóico (TPNCB) 12 84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ
50 ácido 4-[1-(3.5.5,8.8-pentametil-5,6.7,8-tetra-hidro-2-naftil)etil]benzóico (ΡΤΝΕΒ)
51 ácido 4-[1 -(3,5,5.8,8-pentametil-5,6,7,8-tetra-hidro-2-naftil)-metilideno-ciclopentanojbenzóico (PTNCB)
ácido 4-[l-(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetra-hidro-2-naftil)-2-metil-propenil]benzóico (PTNIB)
O
carbonil]benzenotetrazolo (3-metil-TTNCBT) 54 13 84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ
4-[1-(3,5,5,8,8-pentametil-5.6,7,8-tetra-hidro-2-naftil)-etenil]benzenotetrazolo (3-metil-TTNEBT)
etenil]-N-(4-hidroxifenil)benzamida (3-Me-TTNEHBP)
etenil]-N-(4-fluorofenil)benzamida (3-Me-TTNEFBP)
ο
carbonil]-N-(3-hidroxifenil)benzamida (3-Me-m-TTNCHBP) 67
4-[l -(3.5,5,8,8-pentametil-5.6?7,8-tetra-hidro-2-naftil)etenil]-N-(3-hidroxifenil)benzamida (3-Me-m-TTNEHBP) Crt
4-[l-(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetra-hidro-2-naftil)etenil]- N-(2-hidroxifenil)benzamida (3-Me-o-TTNCHBP) 15 84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ
69
4-[l-(j,5,5,8,8-pentametil-5,6.7.8-tetra-hidro-2-aaftil)etenil]-N-(3-carboxifenil)benzamida (3-Me-m-TTNECBP) ' °°*Η
ácido 4-[l-(3.5,5.7J-penrametil-2-indanil)etenil]benzóico
CCjH ácido 4-[l-(3,5.5,6.7,7-hexametil-2-mdanil)etenil]benzóico
16 84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ
Além disto, os grupos tiofeno, furanilo, pirazino, pirazolo, piridazino, tiadiazolo e pirrolo funcionam como isoésteres para os grupos fenilo e podem estar substituídos pelo grupo fenilo nos derivados benzil-bicíclicos acima referidos.
Os derivados representativos do presente invento podem ser preparados de acordo com os seguintes esquemas ilustrativos de síntese:
Rs 1) PC15 2) Αία,
1) KOH/MeOK 2) HC1/H20
Os compostos de estrutura 1 que contenham R5 = alquilo inferior são preparados de acordo com a patente USA N° 2,897,237. Quando Rs = halo, OH, amino ou tio, os produtos são preparados nas condições da reacção padrão de Friedel-Crafts, combinando o benzeno substituído apropriado com 2,5-dicloro-2,5-dimetil-hexano na presença de tricloreto de alumínio. A condensação de 1 com mono-metiltereftalato 2 realizou-se por adição de PC15 a 1 e 2 em CH2C12, seguida da adição de A1C13 à temperatura ambiente.
Os ésteres metílicos 3 resultantes são hidrolisados até ao ácido carboxílico 4 por refluxo em KOH-MeOH aquoso seguido de acidificação. 17 84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ
1) NaBH4/MeOH 2) HCI/H20 (C6H5)3P--CH3Br· 3 __
NaNHj
1) KOH/MeOH 2) HC1/H20 O tratamento da cetona 4 com NaBH4 produziu o álcool 5. O tratamento do éster metílico 3 com brometo de metiltrifosfónio- amida de sódio em THF produziu o composto de metano 6. O ácido carboxílico 7 formou-se juntando KOH ao composto 6 de metano em MeOH, seguido de acidificação.
O tratamento do éster metílico 6 com gás hidrogénio e 5% de paládio sobre carvão, em acetato de etilo, produz o composto hidrogenado 9. O tratamento do composto 9 com KOH aquoso com refluxo de MeOH, seguido de acidificação, produz o ácido carboxílico, composto 10.
14
Os compostos 4,4-dimetilcromano e 4,4-dimetil-7-alquilcromano, dos tipos 13 e 14, bem como análogos de 4,4-dimetiltiocromano, 4,4-dimetil-7-alquiltiocromano, 4,4-dimetil-l,2,3,4-tetra-hidroquinolina e 4,4-dimetil-7-alquil-l,2,3,4-tetra-hidroquinolina, foram sintetizados por métodos semelhantes aos usados para o composto 3, i.e. nas condições de Friedel-Crafts que combinam o dimetilcromano, dimetiltiocromano ou a dimetiltetra-hidroquinolina apropriados com o cloreto ácido de mono-metiltereftalato na presença de A1C13 ou SnCl4, seguido de hidrólise básica e acidificação, para dar o ácido carboxílico. Para a síntese dos análogos da tetra-hidroquinolina foi necessário acilar a amina antes da ligação Friedel-Crafts com o cloreto ácido de mono-metiltereftalato. Para a síntese dos dimetilcromano, dimetiltiocromano e tetra-hidroquinolina apropriados, ver as patentes U.S. nos 5,053,523 e 5,023,341 e a publicação da patente europeia n° 0284288.
Os compostos do tipo 18 foram sintetizados por adição nucleofílica do reagente de Grignard 16 à bromotetralona, bromoindano ou outro derivado bicíclico de cetona. O tratamento do álcool resultante com HC1 metanólico deu o produto intermédio 17. O deslocamento do bromo com CuCN em quinolina deu o nitrilo, que foi depois hidrolisado até se obter o ácido 18, em refluxo de KOH. O composto de bromo 15 foi sintetizado a partir de 2,5-dicloro-2,5-dimetil-hexano e de 2-bromotolueno com uma quantidade catalítica de A1C13. t t
84 342
EP 0 637 297 / PT 20 o
Do tratamento dos compostos 3-metil-TTNCB e 3-metil-TTNEB com DCC, p-amino-fenol e DMAP, resultaram os amino-ésteres 19 e 20. (Seguem Fórmulas) 84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ
22 84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ
Note-se também que os derivados de piridinal, não incluídos nas actuais reivindicações, (compostos 21, 23, 26 e 27), podem ser preparados de acordo com os esquemas de síntese acima indicados como ilustração. A síntese do composto 21 é semelhante à anteriormente descrita para o composto 7. O pentametil-tetra-hidronaftaleno 1, o cloreto ácido de piridinal 24 e A1C13 são agitados em CH,C12 para se obter a cetona 25. O tratamento da cetona 25 com amida de sódio de brometo de metiltrifosfónio em THF produziu o composto etenílico 26. A hidrólise de 26 (KOH, MeOH), seguida de acidificação deu o ácido 21.0 análogo ciclopropílico 23 foi sintetizado por tratamento do composto etenílico 26 com CH2I:, zinco em pó, CuCl em éter sob refluxo (reacção de Simmons-Smith). A hidrólise do éster ciclopropílico 27 resultante foi obtida com KOH metanólico seguida de acidificação obtendo-se o composto 23. Quando R,-R5 forem metilo, por exemplo, obter-se-á o composto 62 (TPNCP), como se mostra no Exemplo 33 abaixo.
Outros derivados ciclopropílicos como o TPNCB (composto 48) podem igualmente ser preparados pelo mesmo método descrito para o análogo 23: a olefina 6 é tratada com o reagente de Simmons-Smith acima descrito, seguido de hidrólise com KOH metanólico e por acidificação (HCI), obtendo-se o derivado ciclopropílico pretendido. Os derivados epoxi, como o TPNEB (composto 47), podem ser sintetizados por tratamento do composto 7 com ácido m-cloroperbenzóico à temperatura ambiente em CH2C12 durante várias horas.
Seguem-se exemplos ilustrativos para a preparação de alguns dos compostos de acordo com o invento:
Exemplo 1
Preparação do composto 3, em que R„ R,, R„ R4 e R5 são metilo, R' e R" são oxo e X=COOMe: A 7 g (34,7 mmol) de l,l,4,4,6-pentametil-l,2,3,4-tetra-hidronaftaleno e 6 g (33,3 mmol) de mono-metiltereftalato em 200 ml de CH;Ch, juntaram-se 8 g (38,8 mmol) de PC15. A mistura reaccional ferveu vigorosamente e tomou-se límpida em 10 min. Depois de agitar por mais 1 h, juntaram-se 6 g (43,5 mmol) de A1C13 em porções de lg ao longo de 15 min e deixou-se a mistura reaccional sob agitação durante a noite. Verteu-se a mistura sobre 300 ml de HCI 20% aquoso è extractou-se com 5% EtOAc/hexanos, secou-se (MgSOJ, concentrou-se e 23 84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ cristalizou-se em MeOH obtendo-se cerca de 6 g (16,5 mmol) do éster metílico 3. ‘HRMN (CD3OCD3) δ 1,20 (s, 2 (CH,)), 1,35 (s, 2 (CH3)), 1,75 (s, 2 (CH,)), 2,31 (s, CH,), 3,93 (s, COOCH3), 7,21 (s. Ar-CH), 7,23 (s, Ar-CH), 7,85 (d, J=8 Hz, Ar-2 (CH)), 8,18 (d, J=8 Hz, Ar-2 (CH)).
Exemplo 2
Preparação do composto 4, em que R,, R2, R3, R4 e R5 são metilo, R' e R" são oxo e X = COOH (3-metil-TTNCB): A 6 g (16,5 mmol) do éster metílico 3 suspenso em 100 ml de MeOH juntaram-se 50 ml de KOH 5N aquoso. A mistura foi aquecida sob refluxo durante lh, arrefecida, acidificada (HC1 20% aquoso) e a parte orgânica foi extractada com EtOAc. Depois de secar (MgS04), o produto foi concentrado e precipitado em 1:4 EtOAc-hexanos, obtendo-se cerca de 5 g (14,3 mmol) do ácido 4. 'HRMN (CD3OCD3) δ 1,20 (s,2(CH-.)), 1,35 (s,2(CH3)), 1,75 (s,2 (CH,)), 2,31 (s,CH3), 7,21 (s,Ar-CH), 7,23 (s,Ar-CH), 7,91 (d,J=8 Hz,Ar-2(CH)), 8,21 (d,J=8 Hz,Ar-2(CH)).
Exemplo 3
Preparação do composto 5, em que R,, R,, R3, R4 e R5 são metilo, R' = H e R" = OH e X = COOH (3-metil-TTNHMB): A uma solução 1:1 THF/MeOH contendo 1 g (2,86 mmol) da cetona 4, juntaram-se 100 mg de NaBH4. A mistura foi aquecida a 50°C durante 10 min, arrefecida, acidificada (HC1 20% aquoso) e a parte orgânica extractada (EtOAc). Após secagem (MgSOJ, o produto foi concentrado e precipitado em 1:3 EtOAc-hexanos, obtendo-se 550 mg (1,56 mmol) do álcool 5. 'HRMN (CD3OCD3) δ 1,20 (s,(CH3)), 1,22 (s,(CH3)), 1,22 (s,2(CH3)), 1,65 (s,2(CH2)), 2,21 (s,CH3), 6,00 (S.-CHOH-), 7,09 (s,Ar-CH), 7,41 (s,Ar-CH), 7,53 (d,J=8 Hz,Ar-2(CH), 8,01 (d,J=8 Hz,Ar-2(CH)).
Exemplo 4
Preparação do composto 6, ondeR,, R;, R3, R4 eR5 são metilo, R' e R" são metano eX = COOMe: A 1 g do éster metílico 3 (2,7 mmol) em 25 ml de THF seco, juntaram-se 1,2 g (3,08
mmol) de brometo de metiltrifosfónio/amida de sódio. Agitou-se a solução a TA durante 3 h ou até se completar (TLC) (20% EtOAc-hexanos). Juntou-se água e a parte orgânica foi extractada com EtOAc, seca (MgS04), concentrada e purificada por cromatografia sobre SiO: (5% EtOAc-hexanos) seguindo-se a cristalização em MeOH, obtendo-se 700 mg (1,93 mmol) do composto de metano 6. 'HRMN (CD3OCD3) Ô 1,22 (s,2(CH3)), 1,30 (s,2(CH3)), 1,72 (s,2(CH;)), 1,95 (s,CH3), 3,85 (s,COOCH3), 5,29 (s,=CH), 5,92 (s,=CH), 7,19 (s,Ar-CH), 7,20 (s,Ar-CH), 7,39 (d,J=8 Hz,Ar-2(CH)), 7,96 (d,J=8 Hz,Ar-2(CH)).
Exemplo 5
Preparação do composto 7, em que R,, R,, R„ R4 e R5 são metilo, R' e R" são metano e X = COOH (3-metil-TTNEB): A 500 mg do metanocomposto 6 (1,38 mmol) em 20 ml de MeOH, juntaram-se 5 ml de KOH 5N aquoso e submeteu-se a suspensão a refluxo durante 1 h. Após acidificação (HC1 20% aquoso) a parte orgânica foi extractada (EtOAc), seca (MgS04), concentrada e os sólidos recristalizados em EtOAc-hexanos 1:5, obtendo-se 350 mg (1,0 mmol) do ácido carboxílico 7. ‘HRMN (CD3OCD,) δ 1,22 (s,2(CH3)), 1,30 (s,2(CH3)), 1,72 (s,2(CH,)), 1,95 (s,CH3), 5,22 (s,=CH), 5,89 (s,=CH), 7,19 (s,Ar-CH), 7,20 (s,Ar-CH), 7,39 (d,J=8 Hz,Ar-2(CH)), 7,96 (d,J=8 Hz,Ar-2(CH)).
Exemplo 6
Preparação do composto 37, em que R,, R2, R3 e R4 são metilo, R3 é isopropilo, R' e R" são oxo e X = COOH (3-IPR-TTNCB): O composto foi preparado de modo semelhante ao do composto 4, excepto que o 6-isopropil-1,1,4,4-tetrametil-1,2,3,4-tetra-hidronaftaleno foi substituir o 1,1,4,4,6-pentametil-1,2,3,4-tetra-hidronaftaleno nos exemplos 1 e 2. P.f.: 254°C; Ή-RMN (CDCI3) δ 1,19 (d,J=7 Hz,CH(CH3)2), 1,21 (s,2(CH3)), 1,33 (s,2(CH3)), 1,70 (s,2(CH:)), 3,12 (q,J=7 Hz,CH(CH3)2), 7,14 (s,Ar-CH), 7,37 (s,Ar-CH), 7,92 (d,J=8 Hz,Ar-2(CH)), 8,18 (d,J=8 Hz,Ar-2(CH)).
Exemplo 7
Preparáção do composto 38, em que R,, R2, R3 e R4 são metilo, R5 é cloro, R' e R" são 25 84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ οχο e X=COOH (3-cloro-TTNCB): Ο composto foi preparado de modo semelhante ao do composto 4, excepto que o 6-cloro-1,1,4,4-tetrametil-l,2,3,4-tetra-hidronaftaleno substituiu o 1,1,4,4,6-pentametil-1,2,3,4-tetra-hidronaftaleno nos exemplos 1 e 2. P.f.= 254°C; Ή-RMN (CDC13) δ 1,26 (s,2(CH3)), 1,32 (s,2(CH,)), 1,72 (s,2(CH2)), 7,35 (s,Ar-CH), 7,36 (s,Ar-CH), 7,91 (d,J=8 Hz,Ar-2(CH)), 8,19 (d,J=8 Hz.Ar-2(CH)).
Exemplo 8
Preparação do composto 39, em que R,, R2, R, e R4 são metilo, R5 é hidroxi, R' e R" são oxo e X = COOH (3-hidroxi-TTNCB): 0 composto foi preparado de modo semelhante ao do composto 4, excepto que o 6-hidroxi-1,1,4,4-tetrametil-l ,2,3,4-tetra-hidronaftaleno substituiu o 1,1,4,4,6-pentametil-1,2,3,4-tetra-hidronaftaleno nos exemplos 1 e 2. P.f.: 264°C; ‘H-RMN (CDC13) δ 1,17 (s,2(CH3)), 1,31 (s,2(CH3)), 1,68 (s,2(CH2)), 7,02 (s,Ar-CH), 7,44 (s,Ar-CH), 7,77 (d,J=8 Hz,Ar-2(CH)), 8,27 (d,J=8 Hz,Ar-2(CH)), 11,50 (s,-OH).
Exemplo 9
Preparação do composto 40, em que R,, R2, R3 e R4 são metilo, R5 é etilo, R' e R" são oxo e X=COOH (3-Et-TTNCB): O composto foi preparado de modo semelhante ao do composto 4, excepto que o 6-etil-l,l,4,4-tetrametil-l,2,3,4-tetra-hidronaftaleno substituiu o 1,1,4,4,6-pentametil-1,2,3,4-tetra-hidronaftaleno nos exemplos 1 e 2. P.f.= 226°C; 'H-RMN (CDC13) δ 1,16 (t,J=7,5 Hz,-CH2CH3), 1,19 (s,2(CH3)), 1,32 (s,2(CH3)), 1,69 (s,2(CH2)), 2,69 (q,J=7,5 Hz,CH2CH3), 7,20 (s,Ar-CH), 7,25 (s,Ar-CH), 7,87 (d largo,Ar-2(CH)), 8,20 (d largo,Ar-2(CH)).
Exemplo 10
Preparação do composto 41, em que R„ R2, R3 e R4 são metilo, R5 é bromo, R' e R” são oxo e X=COOH (3-bromo-TTNCB): O composto foi preparado de modo semelhante ao do composto 4, excepto que o 6- 26
ΕΡ Ο 637 297/PT bromo-l,l,4,4-tetrametil-l,2,3,4-tetra-hidronaftaleno substituiu ο 1,1,4,4,6-pentametil-1,2,3,4-tetra-hidronaftaleno nos exemplos 1 e 2. P.f.: 275°C; Ή-RMN (CDC13) Ô 1,25 (s,2(CH3)), 1,32 (s,2(CH3)), 1,71 (s,2(CH,)), 7,30 (s,Ar-CH), 7,54 (s,Ar-CH), 7,90 (d,J=8 Hz,Ar-2(CH)), 8,18 (d,J=8 Hz,Ar-2(CH)).
Exemplo 11
Preparação do composto 42, em que R,, R2, R3 e R4 são metilo, R5 é isopropilo, R' e R" são metano e X=COOH (3-IPR-TTNEB): O composto foi preparado de modo semelhante ao do composto 7, excepto que 6-isopropil-1,1,4,4-tetrametil-1,2,3,4-tetra-hidro-naftaleno substituiu 1,1,4,4,6-pentametil-1,2,3,4-tetra-hidronaftaleno nos exemplos 1, 2, 4 e 5. P.f.: 252°C; Ή-RMN (CDClj) δ 1,05 (d,J=7 Hz,CH(CH3)2), 1,27 (s,2(CH3)), 1,32 (s,2(CH3)), 1,70 (s,2(CH2)), 2,73 (q,J=7 Hz,CH(CH3)2), 5,32 (s,=CH), 5,87 (s,=CH), 7,06 (s,Ar-CH), 7,23 (s,Ar-CH), 7,40 (d,J=8 Hz,Ar-2(CH)), 8,040 (d,J=8 Hz,Ar-2(CH)).
Exemplo 12
Preparação do composto 43, em que R,, R:, R3 e R4 são metilo, R5 é cloro, R' e R" são metano e X=COOH (3-cloro-TTNEB): O composto foi preparado de modo semelhante ao do composto 7, excepto que 6-cloro-1.1,4,4-tetrametil-1,2,3,4-tetra-hidronaftaleno substituiu 1,1,4,4,6-pentametil-1,2,3,4-tetra- hidronaftaleno nos exemplos 1, 2, 4 e 5. P.f.: 233°C; ‘Η-RMN (CDCI3) δ 1,28 (s,2(CH3)), 1,31 (s,2(CH3)), 1,71 (s,2(CH2)), 5,42 (s,=CH), 5,89 (s,=CH), 7,23 (s,Ar-CH), 7,28 (s,Ar-CH), 7,37 (d,J=8 Hz,Ar-2(CH)), 8,03 (d,J=8 Hz,Ar-2(CH)).
Exemplo 13
Preparação do composto 44, em que R,, R2, R3 e R4 são metilo, Rs é hidroxi, R' e R" são metano e X=COOH (3-hidroxi-TTNEB): O composto foi preparado de modo semelhante ao do composto 7, excepto que 6-hidroxi-1,1,4,4-tetrametil-1,2,3,4-tetra-hidronaftaleno substituiu 1,1,4,4,6-pentametil-1,2,3,4-tetra-hidronaftaleno nos exemplos 1, 2, 4 e 5. P.f.: 216°C; Ή-RMN (CDCI3) δ 1,21 (s,2(CH3)), 1,30 (s,2(CH3)), 1,68 (s,2(CH2)), 5,54 (s,=CH), 5,94 27 84 342
ΕΡ Ο 637 297 /PT (s,=CH), 6,86 (s,Ar-CH), 7,00 (s,Ar-CH), 7,48 (d,J=8,4 Hz,Ar-2(CH)), 8,07 (d,J=8,4 Hz,Ar-2(CH)).
Exemplo 14
Preparação do composto 45, em que R,, R:, R3 e R4 são metilo, R5 é etilo, R' e R" são metano e X=COOH (3-Et-TTNEB): O composto foi preparado de modo semelhante ao do composto 7, excepto que 6-etil- 1.1.4.4- tetrametil-1,2,3,4-tetra-hidronaftaleno substituiu 1,1,4,4,6-pentametil-1,2,3,4-tetra- hidronaftaleno nos exemplos 1,2, 4 e 5. P.f.: 236°C; 'H-RMN (CDClj) δ 0,99 (t,J=7,6 Hz,-CH2CH3), 1,27 (s,2(CH3)), 1,31 (s,2(CH3)), 1,70 (s,2(CH,)), 2,29 (q,J=7,6 Hz,-CH2CH3), 5,34 (s,=CH), 5,83 (s,=CH), 7,08 (s,Ar-CH), 7,12 (s,Ar-CH), 7,38 (d,J=8 Hz,Ar-2(CH)), 8,00 (d,J=8 Hz,Ar-2(CH)).
Exemplo 15
Preparação do composto 46, em que R,, R:, R3 e R4 são metilo, Rs é bromo, R' e R" são metano e X=COOH (3-bromo-TTNEB): O composto foi preparado de modo semelhante ao do composto 7, excepto que 6-bromo- 1.1.4.4- tetrametil-1,2,3,4-tetra-hidronaftaleno substituiu 1,1,4,4,6-pentametil-1,2,3,4-tetra- hidronaftaleno nos exemplos 1, 2, 4 e 5. P.f.: 235°C; Ή-RMN (CDC13) δ 1,27 (s,2(CH3)), 1,31 (s,2(CH3)), 1,71 (s,CH3), 5,40 (s,=CH), 5,90 (s,=CH), 7,26 (s,Ar-CH), 7,36 (s,Ar-CH), 7,43 (d,J=8 Hz,Ar-2(CH)), 8,04 (d,J=8 Hz,Ar-2(CH)).
Exemplo 16
Preparação do composto 47, em que R,, R2, R3 e R4 são metilo, R' e R" tomados em conjunto são CH2-0 (epóxido) e X=COOH (TPNEB): O composto foi preparado a partir do composto 6, onde R,, R2, R3, R4 e R5 são metilo. A lg (2,76 mmol) da olefina 6 em 5 ml de CH2C12 juntaram-se 600 mg (3,46 mmol) de mCPBA e agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 2 h. Deitou-se água e seguiu-se a extracção da parte orgânica com éter. A camada etérea foi lavada com água, Na,C03 IN, salmoura e seca (MgS04), filtrada e concentrada. Por cristalização em MeOH obteve-se 0 éster epóxido-metílico pretendido. O éster metílico foi hidrolisado em KOH metanólico sob refluxo e depois
84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ 28 acidificado (HC1 IN), obtendo-se ο ácido epóxido 47 em bruto, que foi purificado por cristalização em EtOAc-hex, obtendo-se 600 mg (1,64 mmol) de um pó branco (59% de rendimento). P.f.: 168°C; Ή-RMN (CDC13) δ 1,26 (s,CH3), 1,27 (s,CH3), 1,30 (s,CH3), 1,31 (s,CH3), 1,69 (s,2(CH2)), 2,14 (s,CH3), 3,15 (d,J=5,6 Hz,CH-0), 3,41 (d,J=5,6 Hz,CH-0), 7,09 (s,Ar-CH), 7,28 (d,J=8,3 Hz,Ar-2(CH)), 7,32 (s,Ar-CH), 8,01 (d,J=8,3 Hz,Ar-2(CH)).
Exemplo 17
Preparação do composto 48, em que R,, R2, R3, R4 e R5 são metilo, R' e R" em conjunto formam CH2-CH2 (ciclopropil) e X=COOH (TPNCB): O composto foi preparado a partir do composto 6, em que R,, R2, R3, R4 e Rs são metilo. A um balão de 100 ml, seco, de fundo redondo e de três tubuladuras, equipado com um condensador de refluxo, um funil de carga e uma barra de agitação magnética, juntaram-se 722 mg (11,65 mmol) de zinco em pó, 109 mg (1,105 mmol) de cloreto cuproso (CuCl), 7,5 ml de THF seco e 1,48 g (5,52 mmol) de diiodometano. Ao funil de carga juntou-se 1 g (2,76 mmol) do composto 6 em 5 ml de THF seco. Aqueceu-se 0 balão a 80°C, seguiu-se a adição gota a gota de 6. Depois da adição de 6 se completar, fez-se refluxar a mistura durante 30 h ou até fim da reacção, depois diluiu-se com .50 ml de éter e 20 ml de solução aquosa saturada de cloreto de amónio. Lavou-se a camada orgânica com NaOH a 10% (3x20 ml), salmoura e secou-se sobre MgS04 anidro. O produto foi concentrado e purificado por TLC preparativa (2% EtOAc-hexano), obtendo-se 220 mg (0,59 mmol) do éster metílico de 48. Por hidrólise do éster metílico com KOH metanólico sob refluxo, seguida de acidificação (HC1 IN), obtiveram-se 150 mg (0,41 mmol) do composto 48 pretendido, após cristalização em EtOAc-hexano (15% de rendimento). P.f.: 244°C; 'H-RMN (CDClj) δ 1,28 (s,4(CH3)), 1,39 (s,CH2-CH2), 1,69 (s,2(CH2)), 2,12 (s,CH3), 6,98 (d,J=8,4 Hz,Ar-2(CH)), 7,06 (s,Ar-CH), 7,29 (s,Ar-CH), 7,91 (d,J=8,4 Hz,Ar-2(CH)).
Exemplo 18
Preparação do composto 49, em que R„ R2, R3, R4 e R5 são metilo, R'=H e R"=CH3 e XCOOH (PTNEB): O composto foi preparado a partir do composto 7, onde R„ R2, R3, R4 e R5 são metilo. A 1 g (2,87 mmol) do composto 7 em 25 ml de EtOAc juntaram-se 10 mg de 10% Pd/C. A mistura
84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ 29 foi desgaseificada sob vácuo seguido da adição de H, e deixou-se em agitação, sob H2, durante 2h. Filtrou-se a mistura reaccional por celite e cristalizou-se o produto em EtOAc-hexano, obtendo-se 750mg (2,14 mmol) do produto 49 pretendido (75% de rendimento). P.f.: 208°C; Ή-RMN (CDC13) δ 1,24 (s,CH3), 1,25 (s,CH3), 1,26 (s,CH3), 1,29 (s,CH3), 1,61 (d,J=7,2 Hz,CH3), 1,67 (s,2(CH2)), 2,12 (s,CH3), 4,30 (q,J=7,2 Hz,CH), 7,02 (s,Ar-CH), 7,20 (s,Ar-CH), 7,24 (d,J=8,4 Hz,Ar-2(CH)), 7,99 (d,J=8,4 Hz,Ar-2(CH)).
Exemplo 19
Preparação do composto 50, em que R,, R2, R3, R4 e R5 são metilo,R' e R" = metilideno-ciclopentano e X=COOH (PTNCB): O composto foi preparado a partir do composto 4, onde R,, R2, R3, R4 e R5 são metilo. A 1 g (2,87 mmol) de 4 em 25 ml de THF a 0°C, juntaram-se 8,6 ml de uma solução 1M de cloreto de ciclopentenilmagnésio (8,6 mmol). Depois de agitar durante 30 min, juntou-se água e acidificou-se com HC1 5N. A mistura acidificada foi aquecida durante 5 min, arrefecida, e o produto orgânico foi extractado com EtOAc. A camada de EtOAc foi lavada com água e salmoura, seca (MgSOJ, filtrada e concentrada obtendo-se 0 produto em bruto. Por cristalização em EtOAc-hexano, obtiveram-se 340 mg (0,85 mmol) de 50 como um pó branco (30% de rendimento). P.f.: 201°C; Ή-RMN (CDClj) δ 1,27 (s,4(CH3)), 1,64 (t largo,CH2), 1,68 (s,2(CH2)), 1,70 (t largo,CH2), 1,97 (s,CH3), 2,15 (t largo,CH:), 2,56 (t largo,CH2), 7,04 (s,Ar-CH), 7,05 (s,Ar-CH), 7,29 (d,J=8 Hz,Ar-2(CH)), 7,97 (d,J=8 Hz,Ar-2(CH)).
Exemplo 20
Preparação do composto 51, onde R,, R2, R3, R4 e Rs são metilo, R' e R" = isopropilideno e X=COOH (PTNIB): O composto foi preparado a partir do composto 4, onde R,, R2, R3, R4 e R5 são metilo. A 1 g (2,87 mmol) de 4 em 25 ml de THF a 0°C juntaram-se 8,6 ml de uma solução 1M de cloreto de isopropilmagnésio (8,6 mmol). Após agitação durante 30 m, juntou-se água e acidificou-se com HC1 5N. A mistura acidificada foi aquecida durante 5 min, arrefecida, e 0 produto orgânico extractado com EtOAc. A camada de EtOAc foi lavada com água e salmoura, seca (MgS04), filtrada e concentrada obtendo-se 0 produto de isopropilideno em bruto. Por cristalização em EtOAc-hexano, obtiveram-se 550 mg (1,46 mmol) de 51 como um pó branco (51% de
84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ 30 rendimento). P.f.: 297°C; Ή-RMN (CDC13) δ 1,25 (s largo,4(CH3)), 1,64 (s,=CCH3), 1,66 (s,=CCH3), 1,87 (s,2(CH2)), 1,96 (s,CH3), 7,00 (s,Ar-CH), 7,03 (s,Ar-CH), 7,25 (d,J=8 Hz,Ar-2(CH)), 7,97 (d,J=8 Hz,Ar-2(CH)).
Exemplo 21
Preparação do composto 54, em que R,, R,, R3, R4 e R5 são metilo, R' e R" = oxo e X = tetrazolo (3-métil-TTNCBT): A 500 mg (1,51 mmol) de 4-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetra-hidro-2-naftil)carbonil]-benzonitrilo (sintetizado por condensação de 1.1,4,4,6-pentametil-1,2,3,4-tetra-hidronaftaleno com cloreto de ácido 4-cianobenzóico em CH:C1:, catalisada por A1C13) em tolueno, juntaram-se 342 mg (1,66 mmol) de trimetilazida de estanho. A mistura foi submetida a refluxo durante 23 h e arrefecida, obtendo-se 537 mg (1,44 mmol) do tetrazolo 54 pretendido, como um precipitado branco (96% de rendimento). LRMS: 374,15; 'H-RMN (CD3SOCD3) δ 1,19 (s,2(CH3)), 1,32 (s,2(CH3)), 1,70 (s,2(CH;)), 2,25 (s,CH3), 3,19 (s,N-H), 7,30 (s,Ar-CH), 7,32 (s,Ar-CH), 7,90 (d,J=8 Hz,Ar-2(CH)), 8,20 (d,J=8 Hz,Ar-2(CH)).
Exemplo 22
Preparação do composto 55, em que R,, R:, R3, R4 e R5 são metilo, R' e R" = metano e X = tetrazolo (3-metil-TTNEBT): A 500 mg (1,52 mmol) de 4-[l-(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetra-hidro-2-naflil)etenil]-benzonitrilo (sintetizado por condensação de l,l,4,4,6-pentametil-l,2,3,4-tetra-hidronaftaleno com cloreto de; ácido 4-cianobenzóico em CH2C12, catalisada por A1C13, seguida pelo tratamento da cetona com CH3PPh3Br-NaNH2) em tolueno, juntaram-se 342 mg (1,67 mmol) de trimetilazida de estanho. A mistura foi submetida a refluxo durante 23 h e arrefecida, obtendo-se 535 mg (1,44 mmol) do tetrazolo 55 pretendido, como um precipitado branco (95% de rendimento). LRMS: 372,25; 'H-RMN (CD3SOCD3) δ 1,21 (s,2(CH3)), 1,24 (s,2(CH3)), 1,68 (s,2(CH2)), 1,92 (s,CH3), 2,55 (s,N-H), 5,27 (s,=CH), 5,97 (s,=CH), 7,10 (s,Ar-CH), 7,18 (s,Ar-CH), 7,47 (d,J=8 Hz,Ar-2(CH)), 8,00 (d,J=8 Hz,Ar-2(CH)).
84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ 31
Exemplo 23
Preparação do composto 63, em que R,, R:, R3, R4 e R5 são metilo, R' e R" são metano, X = CONHR, eR, = 4-hidroxifenilo (3-metil-TTNEHBP): A 750 mg (10 ml) de DMF em 22 ml de éter anidro, juntaram-se 1,3 g (10 mmol) de cloreto de oxalilo. A mistura reaccional foi agitada durante 1 h, seguiu-se a remoção do solvente para dar uma substância sólida branca, em bruto (cloreto de dimetilcloroformadínio). Ao cloreto de dimetilcloroformadínio juntaram-se 2,87 g (8,24 mmol) do composto 7 em 12 ml de DMF seca. A mistura reaccional foi agitada durante 20 min à temperatura ambiente e depois arrefecida até 0°C. A solução arrefecida do cloreto ácido de 7 foi adicionada gota a gota a uma solução de DMF arrefecida (0°C) contendo 3,62 g (33 mmol) de 4-aminofenol e 1,68 g (16,3 mmol) de trietilamina. Depois de agitar a 0°C durante 30 min, a mistura reaccional foi aquecida até à temperatura ambiente durante 12 h. Juntou-se HC1 a 20% e a substância sólida resultante foi filtrada e lavada com água, acetona e EtOAc, obtendo-se 600 mg (1,36 mmol) do composto 63 pretendido (17% de rendimento). 'H-RMN (CDC13) δ 1,29 (s,2(CH3)), 1,31 (s,2(CH3)), 1,71 (s,(CH,)), 1,99 (s,CH3)), 5,31 (s,=CH), 5,80 (s,=CH), 6,85 (d,Ar-2(CH)), 7,09 (s,Ar-CH), 7,16 (s,Ar-CH), 7,40 (d,Ax-2(CH)), 7.48 (d,Ar-2(CH)), 8,40 (d,Ar-2(CH)).
Exemplo 24
Preparação do composto 64, em que R,, R;, R3, R4 e R5 são metilo, R' e R" são metano, X = CONHR, e R<, = 4-fluorofenilo (3-metil-TTNEFBP): O composto foi preparado de modo semelhante ao do composto 63, excepto que 4-fluoroanilina substituiu 4-aminofenol. P.f.: 203°C; 'H-RMN (CDCI3) δ 1,28 (s,2(CH3)), 1,31 (s,2(CH3)), 1,70 (s,2(CH2)), 1,96 (s,CH3), 5,33 (s,=CH), 5,81 (s,=CH), 7,05 (d,J=9 Hz,Ar-2(CH)), 7,09 (s,Ar-CH), 7,13 (s,Ar-CH), 7,39 (d,J=8,4 Hz,Ar-2(CH)), 7,59 (dd,J=5,9 Hz,Ar-2(CH)), 7,75 (s largo,NH), 7,78 (d,J=8,4 Hz,Ar-2(CH)).
Exemplo 25
Preparação do composto 65, em que R,, R:, R3, R4 e R5 são metilo, R' e R" são metano, X = CONHR, e R, = ácido 4-fenilcarboxílico (3-metil-TTNECBP):
O composto foi preparado de modo semelhante ao do composto 63, excepto que 4-aminofenilcarboxilato de metilo substituiu 4-aminofenol. O éster resultante foi hidrolisado em KOH metanólico, seguido de acidificação (HC1 20%), obtendo-se o composto 65 pretendido. P.f.: 200°C; Ή-RMN (CDClj) δ 1,28 (s,2(CH3)), 1,31 (s,2(CH3)), 1,71 (s,2(CH;)), 1,97 (s,CH3), 5,34 (s,=CH), 5,85 (s,=CH), 7,09 (s,Ar-CH), 7,14 (s,Ar-CH), 7,40 (d,J=8 Hz,Ar-CH), 7,80 (d,J=8 Hz,Ar-2(CH)),7,87 (s largo,Ar-2(CH)), 8,14 (s largo,Ar-2(CH)).
Exemplo 26
Preparação do composto 66, em que R,, R:, R3, R4 e R? são metilo, R' e R" são οχο, X = CONHR, e R, = 3-hidroxifenilo (3-metil-m-TTNCHBP): A 750 mg (10 ml) de DMF em 22 ml de éter anidro juntaram-se 1,3 g (10 mmol) de cloreto de oxalilo. A mistura reaccional foi agitada durante 1 h e depois removeu-se o solvente, obtendo-se uma substância sólida branca, em bruto (cloreto de dimetilcloroformadínio). Ao cloreto de dimetilcloroformadínio juntaram-se 2,88 g (8,24 mmol) do composto 4 em 12 ml de DMF seca. A mistura reaccional foi agitada durante 20 min à temperatura ambiente, em seguida arrefecida até 0°C. A solução arrefecida do referido cloreto ácido de 7 foi adicionada gota a gota a uma solução em DMF arrefecida (0°C) contendo 3.62 g (33 mmol) de 4-aminofenol e 1,68 g (16,3 mmol) de trietilamina. Depois de agitar a 0°C durante 30 min, a mistura reaccional foi aquecida até temperatura ambiente durante 12 h. Juntou-se HC1 20%, aquoso, e a substância sólida resultante foi filtrada e lavada com água, acetona e EtOAc, obtendo-se 750 mg (1,70 mmol) do composto 66 pretendido (21% de rendimento). P.f.: 182°C; 'H-RMN (CDC13) δ 1,22 (s,2(CH3)), 1,32 (s,2(CH3)), 1,70 (s,2(CH2)), 2,37 (s,CH3), 6,58 (m,Ar-2(CH)), 7,20 (d,J=8 Hz,Ar-CH), 7,22 (s,Ar-CH), 7,28 (s,Ar-CH), 7,91 (d,J=8,3 Hz,Ar-2(CH)), 8,26 (d,J=8,3 Hz,Ar-2(CH)).
Exemplo 27
Preparação do composto 67, em que R„ R:, R„ R4 e R5 são metilo, R' e R" são metano, X = CONHR, e R, = 3-hidroxifenilo (3-metil-m-TTNEHBP): O composto foi preparado de modo semelhante ao do composto 63, excepto que 3-aminofenol substituiu 4-aminofenol. P.f.: 136°C; Ή-RMN (CDC13) δ 1,28 (s,2 (CH3)), 1,31 (s,2(CH3)), 1,70 (s,2(CH2)), 1,97 (s,CH3), 5,35 84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ -» Ί
JJ (s,=CH), 5,84 (s,=CH), 6,57 (m,Ar-2(CH)), 7,09 (s,Ar-CH), 7,14 (s,Ar-CH), 7,16 (m,Ar-CH), 7,39 (d,J=8,3 Hz, Ar-2(CH)), 8,09 (d,J=8,3 Hz, Ar-2(CH)).
Exemplo 28
Preparação do composto 68, em que R,. R:, R3, R4 e R5 são metilo, R' e R" são metano, X = CONHR, e R, = 2-hidroxifenilo (3-metil-o-TTNCHBP): O composto foi preparado de modo semelhante ao do composto 63, excepto que 2-aminofenol substituiu 4-aminofenol. P.f.: 180°C; Ή-RMN (CDC13) δ 1,28 (s,2(CH3)), 1,31 (s,2(CH3)), 1,71 (s,2(CH,)), 1,97 (s,CH3), 5,35 (s,CH), 5,84 (s,=CH), 6,9 (m,Ar-CH), 7,08-7,2 (m,Ar-CH), 7,09 (s,Ar-CH), 7,13 (s,Ar-CH), 7,42 (d,J=8,4 Hz,Ar-2(CH)), 7,83 (d,J=8,4 Hz,Ar-2(CH)), 8,03 (s largo,Ar-CH), (8,64 (s,NH).
Exemplo 29
Preparação do composto 69, em que R,, R,, R3, R4 e R5 são metilo, R' e R" são metano, X = CONHR, eR, = ácido 3-fenilcarboxílico (3-metil-m-TTNECBP): O composto foi preparado de modo semelhante ao do composto 63, excepto que carboxilato de metil-3-aminofenilo substituiu 4-aminofenol. O éster resultante foi hidrolisado em KOH metanólico, depois acidificado (HC1 20%), obtendo-se 0 composto 69 pretendido. P.f.: 250°C; Ή-RMN (CDC13) δ 1,28 (s,2(CH3)), 1.31 (s,2(CH3)), 1,71 (s,2(CH2)), 1,97 (s,CH3), 5,34 (s,=CH), 5,85 (s,=CH), 7,09 (s,Ar-CH), 7,14 (s,Ar-CH), 7,40 (d,J=8 Hz,Ar-2(CH), 7,55 (m,Ar-CH), 7,76 (m, Ar-CH), 7,80 (d, J=8 Hz,Ar-2(CH)), 7,87 (s,Ar-CH), 8,14 (s,NH).
Exemplo 30
Preparação do composto 70, em que R,, R:, R3, R4 e R5 são metilo, R' e R" são metano, X = COOH: O composto foi preparado de modo semelhante ao do composto 7, excepto que 1,1,3,3,5-pentametilindano substituiu l,l,4,4,6-pentametil-l,2,3,4-tetra-hidronaftaleno nos exemplos 1, 2, 4 e 5. P.f.: 145°C; Ή-RMN (CDC13) δ 1,05 (s,2(CH3)), 1,28 (s,CH3), 1,31 (s,CH3), 1,38 (s,CH2), 1,98 (s,CH3), 5,34 (s,CH), 5,84 (s,CH), 6,90 (s,Ar-CH), 6,92 (s,Ar-CH), 7,36 (d,J=8,4 Hz,Ar-2(CH)), 34 84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ 8,00 (d,J=8,4 Hz, Ar-2(CH)).
Exemplo 31
Preparação do composto 71, em que R,, R:, R3, R4, R, e R14 são metilo, R' e R" são metano, n=0 e X = COOH: O composto foi preparado de modo semelhante ao do composto 7, excepto que 1,1,2,3,3,5-pentametilindano substituiu l,l,4,4,6-pentametil-l,2,3,4-tetra-hidronaftaleno nos exemplos 1, 2, 4 e 5. P.f.: 217°C; Ή-RMN (CDClj) δ 1,01 (d.J=7,3 Hz,CH3), 1,08 (s,CH3), 1,10 (s,CH3), 1,27 (s,CH3), 1,30 (s,CH3), 1,88 (q,CH), 2,00 (s,CH3), 5,35 (s,=CH), 5,85 (s,=CH), 6,95 (s,Ar-CH), 6,98 (s,Ar-CH), 7,38 (d,J=8,3 Hz, Ar-2(CH)), 8.00 (d,J=8,3 Hz,Ar-2(CH)).
Exemplo 32
Preparação do composto 72, em que R,, R2, R„ R4 e R5 são metilo, R' e R" são H e X = COOH: O composto foi preparado de modo semelhante ao do composto 4 (exemplos 1 e 2), excepto que metil-4-(bromometil)benzoato substituiu cloreto ácido mono-metiltereflálico. P.f.: 237°C; Ή-RMN (CDC13) δ 1,23 (s.2(CH3)), 1,27 (s,2(CH3)), 1,67 (s,2(CH,)), 2,16 (s,CH3), 4,06 (s,CH:), 7,01 (s,Ar-CH), 7,08 (s,Ar-CH), 7,25 (d,J=8 Hz,Ar-2(CH)), 8,01 (d,J=8 Hz,Ar-2(CH)).
Avaliação da Selectividade Subtipo de Receptores de Retinóide
Foram analisados compostos retinóides sintéticos, representativos do corrente invento, tendo-se verificado exibirem selectividade subtipo para os receptores de retinóide e serem capazes de modular processos selectivamente mediados por receptores de retinóide X, como abaixo se discute mais completamente. ' A frase aqui utilizada “processos selectivamente mediados por receptores de retinóide X” refere-se a processos biológicos, fisiológicos, endocrinológicos e outros relativos ao corpo humano, que são mediados por receptores ou combinações de receptores que respondam a processos selectivos de receptores de retinóide X, e.g. compostos que activem selectivamente
84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ 35 um e/ou múltiplos membros da subfamília RXR. A modulação destes processos pode ser conseguida in vitro ou in vivo. A modulação in vivo pode ser realizada numa grande gama de sujeitos, como por exemplo humanos, roedores, carneiros, porcos, vacas, e outros.
Os receptores que respondem a ligandos selectivos de receptor de retinóide X incluem: receptor de retinóide X-alfa, receptor de retinóide X-beta, receptor de retinóide X-gama e variantes de ligação codificadas pelos genes desses receptores, bem como diversas combinações suas (i.e. homodímeros, homotrímeros, heterodímeros, heterotrimeros e semelhantes). Estão também incluídas combinações de receptores de retinóide X com outros membros da superfamília de receptores esteróide/tiróide com os quais os receptores de retinóide X podem interagir formando heterodímeros, heterotrimeros e heteromultímeros superiores. Por exemplo as isoformas do ácido retinóico receptor-alfa, -beta ou -gama, formam um heterodímero com qualquer das isoformas de receptores de retinóide X (i.e. alfa, beta ou gama, incluindo qualquer combinação dos diferentes isoformes de receptores), e os diversos receptores de retinóide X formam um heterodímero com o receptor da tiróide e formam um heterodímero com o receptor da vitamina D. Os membros da subfamília de receptores de retinóide X formam um heterodímero com certos “receptores órfãos” incluindo PP AR (Issemann e Green, Nature, 347:645-49 (1990)); HNF4 (Sladek et al., Genes & Development 4:2353-65 (1990)); a família COUP de receptores (e.g. Miyajima et al., Nucleic Acids Research 16:11057-74 (1988), e Wang et al, Nature, 340:163-66 (1989)); receptores do tipo COUP e homólogos de COUP, como os descritos por Mlodzik et al., (Cell, 60:211-24 (1990)) e por Ladias et al., ( Science, 251:5561-65 (1991)); o receptor ultraespiráculo (p.ex., Oro et al., Nature, 347:298-301 (1990)); e semelhantes. A frase aqui utilizada “membros da superfamília de receptores de esteróide/tiróide” (também conhecidos por “receptores nucleares” ou “receptores intracelulares”) refere-se a proteínas de ligação de hormonas, que operam como factores de transcrição dependentes dos ligandos. Além disto, esta classificação inclui membros identificados da superfamília de receptores de ésteróide/tiróide para os quais ainda não foram identificados ligandos específicos (daqui em diante referidos como “receptores órfãos”). Todos os membros da superfamília de receptores intracelulares apresentam a capacidade intrínseca de se ligarem a sequências específicas do ADN. Após ligação, a actividade transcripcional de um gene-alvo (i.e. um gene associado a sequências específicas do ADN) é modulado em função do ligando unido ao receptor. Veja-se também Heyman et al., Cell. 68:397-406 (1992) e a patente co-pendente U.S.
84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ 36 Série Ν° 809,980, pedida em 18 de Dezembro de 1991, da qual as suas revelações completas são aqui incorporadas apenas por referência. A modulação da expressão do gene pelo ácido retinóico do ligando e seus receptores, pode ser examinada num sistema reconstituído em cultura de células. Tal sistema foi usado para avaliar os compostos retinóides sintéticos deste invento quanto à sua interacção com os subtipos de receptores retinóides RARa, RARp, RARy, RXRa, 132^β e RXRy. O sistema para reconstituir o controlo transcripcional dependente do ligando, foi desenvolvido por Evans et al., Science, 240:889-95 (1988) e denominado "co-transfecção" ou avaliação "cis-trans". Este ensaio está descrito com mais detalhe nas patentes U.S. nos 4,981,784 è 5,071,773, aqui incorporadas por referência. Ver também Heyman et al., Cell, 68:397-406 (1992). O ensaio de co-transfecção apresenta um mecanismo para avaliar a capacidade de um composto para modular a resposta de transcrição iniciada por receptor intracelular. O ensaio de co-transfecção ;é um ensaio funcional, rápido que monitoriza a actividade da hormona ou do ligando e é um bom preditor de um sistema in vivo.
Resumidamente, o ensaio de co-transfecção envolve a introdução de dois plasmídeos por transfecção transitória para um fundo de células de mamífero sem receptores de retinóide. O primeiro plasmídeo contém um receptor de retinóide ADNc e dirige a expressão constitutiva do receptor codificado. O segundo plasmídeo contém um ADNc que codifica uma proteína prontamente quantificável, e.g. a luciferase do pirilampo ou a cloranfenicol-acetil-transferase (CAT) sob o controlo de um promotor que contenha um elemento de resposta ao ácido retinóico, o que confere dependência do retinóide na transcrição do repórter. Nesta avaliação de co-transfecção, todos os receptores de retinóide respondem ao ácido todo-írans-retinóico de modo semelhante. Este ensaio pode ser usado para medir com precisão a eficácia e a potência do ácido retinóico e dos retinóides sintéticos como ligandos que interagem com os subtipos individuais de receptores de retinóide.
Assim, os compostos retinóides sintéticos do corrente invento foram avaliados quanto à sua interacção com subtipos de receptores de retinóide, usando o ensaio de co-transfecção onde células CV-1 foram co-transfectadas com um dos subtipos de receptores de retinóide, com uma construção do repórter e com um controlo interno para permitir a normalização da eficácia da resposta à transfecção. O seguinte exemplo é ilustrativo. 37 84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ
Exemplo 33
Retinóides: Ο ácido todo-o-a/is-retinóico (RA) e o ácido 13-cás-retinóico (13-cA-RA) foram obtidos a partir de Sigma. O ácido 9-c/s-retinóico (9-ds-RA) foi sintetizado como se descreveu em Heyman et al, Cell. 68:397-406 (1992). Verificou-se, por cromatografia líquida de alta eficiência em fase inversa, ser a pureza dos retinóides maior do que 99%. Os retinóides foram dissolvidos em dimetilsulfóxido para utilização nos ensaios de activação transcripcional.
Plasmídeos: Os vectores de expressão dos receptores usados no ensaio de co-transfecção já foram descritos anteriormente (pRShRAR-α: Giguere et al., (1987); pRShRAR-β e pRShRAR-γ: Ishikawa et ai, (1990); pRShRXR-α: Mangelsdorf et al, (1990); pRSmRXR-β e pRSmRXR-γ: Mangelsdorf et al., Genes & Devei, 6:329-44 (1992)). Um plasmídeo repórter basal Δ-MTV-LUC (Hollenberg e Evans, Cell, 55:899-906 (1988)) contendo duas cópias do elemento TRE-palindrómico de resposta 5'-TCAGGTCATGACCTGA-3' (Umesono et al, Nature, 336:262-65 (1988)) foi usado nas transfecções para os RARs, e o CRBPIEFKLUC que contém um RXRE (elemento de resposta a receptor de retinóide X (Mangelsdorf et al., Cell, 66:555-61 (1991)) foi usado em transfecções para os RXRs.
Ensaio de Co-transfeccão Em Células CV-1: Foi usada uma linha de células de rim de macaco, CV-1, no ensaio cis-tmns . As células foram transfectadas com dois plasmídeos. O trans-vector permitiu uma eficiente produção do receptor de retinóide nestas células que normalmente não expressam esta proteína do receptor. O cis-vector contém um produto de gene facilmente avaliável, neste caso a luciferase do pirilampo, ligado ao promotor que responde ao retinóide, i.e. um RARE ou um RXRE. A adição de ácido retinóico ou de um retinóide sintético apropriado resulta na formação de um complexo retinóide-RAR ou -RXR que activa a expressão do gene da luciferase, fazendo com que seja emitida luz dos extractos das células. O nível de actividade da luciferase é directamente proporcional à eficácia do complexo retinóide-receptor na activação da expressão do gene. Esta proposta de co-transfecção sensível e reprodutível permite a identificação de retinóides que interagem com as diferentes isoformas de receptores.
Cultivaram-se células em DMEM suplementado com soro bovino fetal limpo em resina com carvão a 10%, e realizaram-se experiências em placas de 96 poços. Os plasmídeos foram transitoriamente transfectados pelo método do fosfato de cálcio (Umesono e Evans, Cell, 38 84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ 57:1139-46 (1989) e Berger et αί., J.Steroid Biochem. Molec. Biol., 41:733-38 (1992)), usando 10 ng de um vector plasmídeo de expressão de receptor de um pRS (vírus promotor do sarcoma de Rous), 50 ng de plasmídeo da luciferase (LUC) do repórter, 50 ng do pRSp-GAL (β-galactosidase) como controlo interno, e 90 ng de plasmídeo de suporte pGEM. As células foram transfectadas durante 6 h e depois lavadas para remover o precipitado. As células foram depois incubadas durante 36 h com ou sem retinóide. Após transfecção, todos os passos subsequentes foram realizados numa Beckman Biomek Automated Workstation. Os extractos das células foram preparados, depois avaliados quanto às actividades da luciferase e da β-galactosidase, como descrito por Berger et al. (1992). Todas as determinações foram realizadas em triplicado em duas experiências independentes e foram normalizadas quanto à eficiência de transfecção usando a β-galactosidase como controlo interno. A actividade retinóide foi normalizada em relação ao ácido todo-tra/js-retinóico e expressa-se como potência (EC50), que é a concentração de retinóide necessária para produzir 50% de resposta máxima observada, e como eficácia (%), que é a resposta máxima observada em relação ao ácidò to do-tra /75-retinó i c o a 10°M. Os resultados obtidos são a média de pelo menos quatro experiências independentes. Os valores de eficácia inferiores a 5% não são estatisticamente diferentes dum fundo de 0%. Os compostos com uma eficácia inferior a 20% a concentrações de 10° M são considerados como inactivos. A concentrações mais elevadas do composto, tais como 10'4M, estes compostos são geralmente tóxicos para as células e portanto a eficácia máxima a 10°M é a indicada nos quadros e figuras aqui contidas. O composto retinóide sintético 3-metil-TTNCB, como acima se descreveu, foi avaliado quanto à sua capacidade de regular a expressão dos genes mediada pelos receptores de retinóides. Como se mostra na Figura 1, este composto é capaz de activar membros da subfamília RXR, i.e. RARa, ΒΑΒ.β e RARy, mas nitidamente não tem actividade significativa para os membros da subfamília RAR, i.e. RARa, RARβ e RARy. Para referência, fizeram-se correr ensaios usando ácido todo-írans-retinóico (Figura 2) e ácido 9-cz5-retinóico (Figura 3) e foi demonstrado que estes isómeros do ácido retinóico activam membros de ambas as subfamílias RAR e RXR.
Foram calculadas a potência e a eficácia para o composto 3-metil-TTNCB, como se resume no quadro seguinte. Para referência, estão também incluídos õs resultados para o ácido 9-czs-retinóico.
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Quadro 1 3-Metil-TTNCB Potência (nM) Eficácia RXRa 330 130% RXRβ 200 52% RXRX 260 82% RARa >10.000 <2% ΒΑΒβ >10.000 <4% RAR χ >10.000 <4% Ácido 9-cA-retinóico RXRa 150 140% ΒΧΒβ 100 140% RXR'X 110 140% RARa 160 100% ΒΑΒβ 5 82% RARX 47 120%
Como mostram os resultados do Quadro 1, o 3-metil-TTNCB activa facilmente, e em baixas concentrações, os RXRs. Além disso o 3-metil-TTNCB é um activador mais potente dos RXRs do que dos RARs e activa preferencialmente os RXRs em comparação com os RARs, pois são necessárias concentrações muito mais elevadas para activar os RARs. Em contraste, o ácido 9-czs-retinóico não activa preferencialmente os RXRs, como também se mostra no Quadro 1. Pelo contrário, o ácido 9-cw-retinóico activa as isoformas RARp e RARy em concentrações mais baixas e mais prontamente do que as isoformas ΙΙΧΒβ e RXRy e, dentro da precisão de medição, tem substancialmente a mesma actividade para a isoforma RARa que para a isoforma RXRa.
Um extracto que se disse conter ácido 9-c/s-retinóico foi anteriormente considerado como sendo pelo menos 10 vezes mais potente induzindo RXRa do que RARa (Heyman et al., C-ell, 68:397-399 (24 de Janeiro de 1992)). Os resultados actualmente disponíveis indicam que o ácido 9-czs-retinóico não activa preferencialmente os RXRs em comparação com os RARs, como se mostrou e discutiu acima. Os compostos deste invento activam preferencialmente os RXRs em comparação com os RARs, e são de preferência pelo menos três vezes mais fortes como activadores dos RXRs do que dos RARs, e ainda com maior preferência pelo menos cinco vezes mais fortes como activadores dos RXRs do que dos RARs. Foram também calculadas a potência e a eficácia para os compostos 3-metil-TTNEB, 3-bromo-TTNEB, 3-metil-TTNCHBP 40 84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ e 3-metil-TTNEHBP, como se resume no Quadro 2.
Quadro 2 3-Metil-TTNEB Potência (nM) Eficácia RXRa, 40 83% RXRp 21 102% RXRX 34 80% RARa >10.000 6% RARp >10.000 17% RARX >10.000 19% 3-Bromo-TTNEB RXRa 64 88% RXRP 54 49% RXRX 52 71% RARa; >10.000 3% RARP >10.000 18% RARx >10.000 15% 3-Metil-TTNCHBP RXRa 1100 113% RXRP 1100 155% RXRX 300 128% RARa >10.000 <2% RARp >10.000 7% RARx >10.000 17% 3 -Metil-TTNEHBP RXRa 140 125% RXRP 71 121% RXRX 48 163% RARa >10.000 <2% RARP 1.900 25% RARx >10.000 10%
Como mostram os resultados do Quadro 2, o 3-metil-TTNEB, 3-bromo-TTNEB, 3-metil-TTNCHBP e o 3-metil-TTNEHBP activam fácil e preferencialmente os RXRs e são mais potentes como activadores dos RXRs do que dos RARs. A diminuída actividade destes compostos para os RARs em comparação com os RXRs é também mostrada, para alguns destes compostos, nas Figuras 4-7.
84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ 41
Pode tàmbém esperar-se que os ligandos sintéticos dos retinóides, como os exemplificados nos Quadros 1 e 2, que afectam preferencialmente algumas mas não todas as isoformas dos receptores do ácido retinóico, podem, em preparações farmacológicas, dar produtos farmacêuticos com índices terapêuticos mais elevados e com melhor perfil de efeitos colaterais do que os retinóides correntemente usados. Por exemplo, tem-se observado que os compostos do presente invento são menos irritantes para a pele do que os retinóides habituais.
Os compostos retinóides deste invento são úteis no tratamento de certos estados dermatológicos como os distúrbios da queratinização, i.e. diferenciação/proliferação. Um ensaio habitual para determinar a actividade destes compostos é a medida da actividade enzimática quanto à transglutaminase; esta é uma medida da acção antiproliferativa dos retinóides. Os retinóides têm mostrado inibir o caminho da diferenciação, o que é indicado pelo decréscimo de vários marcadores bioquímicos que estão associados à expressão do fenótipo escamoso das células, como a transglutaminase. (Yuspa et al., Ccincer Research, 43:5707-12 (1983)). Como se pode ver na Figura 8, o composto 3-metil-TTNCB é capaz de inibir a actividade da transglutaminase e inibe 50% da actividade do enzima a lxlO‘7M.
Os compostos deste invento também exibem boa actividade comedolítica no ensaio sobre ratinhos ' Rhino, descrita por Kligman et al., J. of Inves. Derm., 73:354-58 (1979)) e Mezick et al., (J. of Inves. Derm.. 83:110-13 (1984)). O ensaio sobre ratinhos Rhino tem sido um modelo para pesquisa de agentes comedolíticos. A actividade do composto retinóide 3-metil-TTNCB, bem como a do 9-cis e a do ácido todo-íra«s-retinóico, está indicada na Figura 9. Uma solução a 0,1% de 3-metil-TTNCB é capaz de inibir o diâmetro utricular em aproximadamente 50%. Também se observou que o 3-metil-TTNCB é menos irritante para pele dos ratinhos Rhino do que o ácido 9-cis- ou o todo-íra/w-retinóico.
Os retinóides sintéticos do corrente invento têm também sido avaliados usando ensaios de deslocamentos de radioligandos. As isoformas de RAR e de RXR, sobre-expressadas em E. coli ou no baculovírus, são capazes de se ligarem ao ácido 9-cri-retinóico radiomarcado, com parâmetros de ligação que são essencialmente semelhantes aos dos receptores sobre-expressos em células de mamíferos. Ensaiando a capacidade dos vários retinóides sintéticos de competirem com o ácido retinóico radiomarcado na ligação às várias isoformas de receptores, pode-se determinar a constante de dissociação relativa do próprio receptor. Esta é uma análise 42 84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ suplementar importante da avaliação de co-transfecção, pois pode detectar discrepâncias importantes que se podem levantar, devidas aos vários determinantes da actividade retinóide no ensaio de co-transfecção. Estes determinantes podem incluir (1) activação ou inactivação de alterações metabólicas nos compostos de ensaio, (2) ligação a proteínas do soro que alteram a concentração livre do composto de ensaio, (3) diferenças na permeação de células entre os compostos de ensaio, (4) diferenças intrínsecas na afinidade dos compostos de ensaio para as proteínas dos receptores, i.e. em Kd, e (5) alterações da configuração produzidas no receptor após ligação do composto de ensaio, reflectidas nos efeitos sobre a expressão do gene do repórter. O composto 3-metil-TTNCB é capaz de deslocar o ácido Ή-9-m-retinóico ligado aos RXRs, mas nãó é capaz de deslocar ligandos radiomarcados que estejam ligados aos RARs. Isto indica que o composto 3-metil-TTNCB se liga preferencialmente aos RXRs em comparação com os RARs, uma propriedade que não seria de esperar de um ligando selectivo para os RXRs.
Foi reconhecido que o ensaio de co-transfecção constitui uma avaliação funcional do ligando a ser testado, quer como agonista quer como antagonista do processo genético específico que se procurou afectar. Pode-se esperar que os ligandos que não reajam significativamente com outros receptores intracelulares, como resultado da avaliação de co-transfecção, apresentem alguns efeitos colaterais farmacológicos. Como o ensaio de co-transfecção se passa em células vivas, a avaliação de um ligando fornece um primeiro indicador da toxicidade potencial do candidato, nas concentrações em que seria de esperar um benefício terapêutico.
Os processos capazes de serem modulados pelos receptores de retinóides, de acordo com o presente invento, incluem a diferenciação celular in vitro, a regulação de processos morfogenéticos incluindo a morfogénese dos membros, a regulação da proteína celular de ligação ao retinol (CRBP), e semelhantes. Como facilmente é reconhecido pelos peritos na arte, a disponibilidade de ligandos para os receptores de retinóide X toma possível, pela primeira vez, elucidar os processos controlados por membros da subfamília receptor de retinóide X. Além disso, permite o desenvolvimento de ensaios para identificação dos antagonistas para estes receptores.
Os processos capazes de serem modulados pelos receptores de retinóide, de acordo com o presente invento, incluem ainda a modulação in vivo do metabolismo de lípidos; a modulação
84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ 43 ίή vivo dos processos relativos à pele (e.g. acne. psoríase, envelhecimento, enrugamento, e semelhantes); a modulação in vivo da morte programada das células (apoptose); a modulação in vivo do desenvolvimento de células malignas tal como ocorrem, por exemplo, na leucemia promielocítica aguda, cancro mamário, cancro da próstata, cancro do pulmão, cancros das vias aerodigestivas, cancro da pele, cancro da vesícula, e sarcomas; a modulação in vivo de lesões premalignas, tal como ocorrem com a leucoplaquia oral e semelhantes; a modulação in vivo de doenças auto-imunes como a artrite reumatóide; modulação in vivo do metabolismo de ácidos gordos; e semelhantes. Pode-se esperar que estas aplicações permitam a modulação de diversos processos biológicos com uma reduzida ocorrência de efeitos colaterais indesejáveis, tais como efeitos teratogénicos, irritação da pele, secura das mucosas, distúrbios lipídicos e semelhantes. As aplicações in vivo podem ser utilizadas com uma larga gama de sujeitos como, por exemplo, humanos, roedores, carneiros, porcos, vacas, e semelhantes.
Por exemplo, no que se refere à modulação in vivo do metabolismo de lípidos acima citado, a apolipoproteína AI é uma proteína importante componente das lipoproteínas de alta densidade (HDL) do plasma de colesterol. Uma vez que o nível de circulação das HDL nos humanos mostra estar inversamente correlacionado com o risco de doenças coronárias vasculares, pode esperar-se que a regulação da síntese da apolipoproteína AI possa ser utilizada no tratamento de doenças coronárias vasculares. Foi estabelecido que a regulação de transcrição da apolipoproteína AI é controlada por membros da família de receptores intracelulares, e ainda que o local de partida A de transcrição dos genes da apolipoproteína AI é um elemento de resposta altamente selectiva a retinóide (RXRE), que responde preferencialmente aos RXRa. Ver Rottman et al., Mol. Cell. Biol.. 11:3814-20 (1991). Os ligandos que activam selectivamente os membros da família RXR de receptores do ácido retinóico podem portanto regular a transcrição da apolipoproteína AI. Demonstrámos em estudos in vivo que os ligandos que têm actividade selectiva para os RXRs podem ser usados para levantar significativamente os níveis de HDL no plasma, como é demonstrado no seguinte exemplo.
Exemplo 34
Obtiveram-se ratos Sprague-Dawley machos (160-200 gramas) a partir de Harland. Os animais foram alimentados com dietas padronizadas de laboratório (Harlan/Teklad) e mantidos em compartimentos de ambiente controlado, com um período de luz que durava das 6 às 18 h. Os animais foram tratados com as drogas preparadas como suspensões em azeite. 44 84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ A fim de verificar que a activação dos RXR pode modular o colesterol HDL, realizou-se um estudo inicial que incluiu administrar a ratos, durante 4 dias, doses de um composto RAR-selectivo, de ácido todo-trans-retinóico, do agonista RAR/RXR não selectivo, do ácido 9-cis-retinóico, e um ou o outro dos dois agentes selectivos de RXR, 3-metil-TTNCB ou 3-metil-TTNEB. Cada droga foi administrada numa dose de 100 mg/kg, i.p.. Os grupos, de controlo positivo receberam azeite como veículo. Vinte e quatro horas depois do último tratamento, os ratos foram sacrificados por inalação de C02, o sangue foi recolhido da veia cava inferior num tubo contendo 0,1 ml de 0,15% EDTA e centrifugado a 1500 x g durante 20 min a 4°C. O plasma foi separado e guardado a 4°C para avaliação do colesterol total no plasma e do colesterol de lipoproteínas de alta densidade (colesterol-HDL). O colesterol total no plasma foi medido enzimaticamente utilizando os métodos ”Boeringer Manheim Diagnostics High Performance Cholesterol” com um ABBOT VP Bichromatic Analyzer. O HDL foi medido, após preparação da fracção que contém HDL, por precipitação do plasma com heparina-manganésio. O HDL-colesterol nesta fracção foi estimado como anteriormente se mencionou. Todas as separações de HDL foram verificadas quanto a contaminação por lipoproteínas por meio de electroforese em gel de agarose.
Os resultados deste estudo estão indicados na Figura 10. Como se vê,, os ratos que receberam os compostos RXR-selectivos mostraram aumentos substanciais e estatisticamente significativos dos níveis de HDL, particularmente quando receberam 3-metil-TTNEB. Como o ligando 3-metil-TTNEB RXR-selectivo foi o mais eficaz, realizaram-se 4 dias de experiências adicionais com este agente, em doses de 0,3, 1,3,6, 10, 30, 100 ou 300 mg/kg i.p. em 0,5 ml de azeite ou 1, 3, 10, 30, 100, 300 mg p.o. em 0,5 ml de azeite durante 4 dias. Realizou-se um estudo de mais 30 dias p.o. com 10, 30 ou 100 mg/kg de 3-metil-TTNEB para determinar se se desenvolveria tolerância às suas acções farmacológicas. Para os ratos que receberam 3-metil-TTNEB em várias doses durante quatro dias, foi também observado que o máximo de elevação de HDL se obtinha com doses relativamente baixas (inferiores a 5 mg/kg) de 3-metil-TTNEB. O estudo de 30 dias com 3-metil-TTNEB não indicou desenvolvimento de tolerância à sua acção farmacológica.
Foram também realizados estudos adicionais in vitro utilizando a avaliação de co-transfecção anteriormente descrita dentro deste pedido, para demonstrar o efeito dos ligandos
84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ 45 RXR-selectivos sobre a regulação da transcrição da apolipoproteína AI, como se descreve no exemplo seguinte.
Exemplo 35
Este trabalho focou o estudo das propriedades transcricionais dos receptores de retinóides RAR e RXR sobre uma molécula repórter (e.g. luciferase), sob o controlo de um promotor basal contendo o elemento de resposta RXR do gene da apolipoproteína AI (local “A”). As construções de plasmídeos que codificam os vários receptores foram transfectadas para uma linha de células de hepatócitos humanos (HepG-2), ao mesmo tempo que o plasmídeo relator. Os plasmídeos repórteres continham multímeros do local “A” da apolipoproteína-AI (-214 a -192 em relação ao local de início da transcrição) que se mostraram ligar a RXR. Ver Widom et ai, Mol. Cell. Biol, 12:3380-89 (1992); Ladias & Karathanasis, Science, 251:561-65 (1991). Depois da transfecção, do tratamento, da colheita e do ensaio, os resultados obtidos foram normalizados para actividade beta-galactosidase transfectada, de modo a controlar a eficiência da transfecção. Os resultados demonstraram a activação no sistema com os ligandos específicos de RXR, 3-metil-TTNCB e 3-metil-TTNEB, demonstrando que os ligandos específicos de RXR podiam regular as propriedades de transcrição via local “A” do gene da apolipoproteína-AI. Estes compostos não têm efeito quando se usa RAR na transfecção o que demonstra a especificidade do receptor. A regulação da transcrição pelo RXR foi dependente da presença do elemento de resposta à hormona.
Surpreendentemente, verificou-se que a administração de um composto que contenha um ligando que tenha actividade específica para os RXRs e não tenha essencialmente nenhuma actividade para os RARs, em combinação com um ligando que tenha actividade específica para os RARs mas não para os RXRs, apresenta uma resposta celular em dosagens extremamente pequenas, dosagens a que os ligandos individualmente não apresentam resposta significativa. Especificamente, o efeito relacionado com a concentração de um ligando RXR-específico e de um ligando RAR-específico sobre a proliferação de uma linha de células de mieloma (RPMI 8226) foi estudado in vitro usando um ensaio de incorporação de timidina. (Ver L.M. Bradley, Selected Methos in Celular Immunology, Ch. 10.1, pp. 235-38, Mishell Shiigi (eds.), Freeman & Co., New York, 1980). Este ensaio permite a incorporação de timidina radiomarcada no ADN e, determinando a capacidade de um composto inibir a incorporação da timidina no ADN, obtém-se uma medida de proliferação de células. Os compostos que inibem a proliferação de células
Sis* 84 342 ^
EP 0 637 297 / VT 46 têm uma utilidade bem conhecida no tratamento de certos cancros.
Como anteriormente se mostrou (Quadro 2), o 3-metil-TTNEB activa os membros da subfamília RXR e não tem actividade significativa sobre os membros da subfamília RAR. O exame dos efeitos de 3-metil-TTNEB sobre a proliferação de células de mieloma mostram uma inibição de incorporação da timidina, dependente da concentração. A IC50 (concentração de 3-metil-TTNEB necessária para produzir 50% de inibição da resposta máxima) é de 10'7M, como se mostra na Figura 11. As concentrações inferiores a 10'8M não têm essencialmente nenhum efeito sobre a proliferação das células, como também se mostra na Figura 11. É já bem sabido que o composto TTNPB activa membros da subfamília RAR e não tem ãctividade significativa sobre os membros da subfamília RXR. Mostra-se em seguida o composto TTNPB e a sua actividade está indicada no Quadro 3.
Quadro 3 TTNPB Potência (NM) Eficácia RXRa >10.000 <5% RXRp >10.000 <5% RXRX >10.000 <5% RARa 52 30 RARp 4 40 RARX 0,4 50 O efeito de TTNB sobre a proliferação está indicado na Figura 11.0 valor ICS0 de TTNPB é de cerca de 5x10"M, e uma concentração inferior a 10‘"M hão produz
84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ 47 essencialmente nenhum efeito sobre a proliferação das células.
Verificou-se contudo que, quando estes dois compostos (3-metil-TTNEB e TTNPB) se apresentam juntos, cada um a uma concentração a que o composto sozinho não produziria nenhum efeito substancial não anti-proliferativo, a combinação destes dois compostos bloqueia efectivamente a proliferação das células. A combinação dos dois compostos parece produzir um efeito maior do que aditivo ou sinérgico.
Por exemplo, como se mostra na Figura 12, a presença de TTNPB numa concentração de 10'“M produz uma inibição de 9% na incorporação da timidina. Contudo, combinando-o com 3-metilTTNEB a uma concentração de 10'SM (que não tem efeito sobre a proliferação das células) produz um efeito inibitório muito aumentado, de 49%. Verificou-se analogamente que o efeito inibitório do 3-metil-TTNEB é muito aumentado pela presença de TTNPB a uma concentração que por si só não produz efeito.
Como é bem sabido que os efeitos tóxicos colaterais de compostos como o TTNPB são dependentes da concentração, pode-se esperar que o efeito sinergístico resultante da combinação de compostos RAR-específicos com compostos RXR-específicos permita que dosagens mais baixas sejam eficazes, e que portanto reduzam os efeitos colaterais tóxicos. Por exemplo, na quimioterapia do cancro, pode-se esperar que o uso de dois destes compostos, em combinação, em doses relativamente baixas, produza o efeito benéfico pretendido, enquanto se minimizam os efeitos colaterais indesejados que resultam de doses mais elevadas dos compostos.
Os estudos in vitro utilizando o ensaio de co-transfecção também mostraram este mesmo efeito sinergístico. Por exemplo, utilizando o ensaio de co-transfecção anteriormente descrito e empregando RAR-α e RXR-a e um repórter que consiste no local “A” do elemento de resposta ApoAl no contexto de TKLUC (Ladias & Karathanasis, Science 251:561-65 (1991)), realizaram-se transfecções em células HEPG2. Neste estudo, usaram-se 100 ng do receptor designado e, como suporte, usou-se RSVCAT para manter constante a quantidade do promotor RSV. Todos os compostos foram adicionados a uma concentração final de 10'7M. Foram utilizados o composto RXR-específico, 3-metil-TTNEB (Quadro 2, acima) e o composto RAR-específico, TTNPB (Quadro 3, acima). Como abaixo se mostra no Quadro 4, a resposta relativa normalizada observada utilizando o ensaio de co-transfecção também demonstrou um efeito sinergístico quando se utilizava uma combinação dos dois compostos, quando se compara com a 84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ
48 resposta obtida utilizando os compostos individualmente.
Quadro 4
Composto 3-metil-TTNEB TTNPB: 3-metil-TTNEB + TTNPB
Actividade do Repórter (Aumento de Indução-) 5 x 32 x 75 x
Como os peritos na arte podem compreender a partir das discussões anteriores, a resposta / biológica de um composto selectivo de RAR a uma dada concentração pode ser aumentada sinergisticamente por combinação do composto com um composto selectivo de RXR. .Analogamente, a resposta biológica de um composto selectivo de RXR pode ser aumentada combinando o composto com um composto selectivo de RAR. Toma-se assim possível obter uma resposta biológica desejável usando uma combinação dos compostos selectivos de RAR e de RXR, a concentrações mais baixas do que no caso de se usarem os compostos sozinhos. Entre as vantagens obtidas por estas combinações de compostos selectivos de RAR e RXR estão os efeitos terapêuticos desejáveis com menos efeitos colaterais. Além disso, podem obter-se novos efeitos, não obteníveis com qualquer dos agentes isolados, por combinações dos compostos selectivos de RAR e RXR.
Foi ainda demonstrado que os compostos RXR-específicos também aumentam sinergisticamente a resposta de outros sistemas hormonais. Especificamente, o receptor activado por proliferador de peroxissomas (PPAR) é um membro da superfamília de receptores intracelulares que desempenha um papel na modulação da homeostase de lípidos. Mostrou-se que o PP AR é activado por carboxilatos anfipáticos, como o ácido clofíbrico, e estes agentes, denominados proliferadores de peroxissomas, têm sido usados no homem como agentes hipolipidémicos. A adição de ácido 9-cA-retinóico (um ligando retinóide que activa ambos os receptores RAR e RXR) e de ácido clofíbrico a células HepG2 transfectadas com RXRa e com plasmídeos de expressão PP AR, resulta na activação do gene receptor, activação que foi maior do que a soma das activações com cada ligando separadamente. (Ver Kliewer et ai, Nature, 358:771 (1992)). Analogamente, quando os dois receptores acima mencionados foram co-transfectados èm células HepG2, a adição de ambos, um ligando RXR-específico (3-metil-TTNEB) e ácido clofíbrico, produzia uma resposta maior do que a resposta aditiva, conforme
determinado por activação de um gene repórter-alvo, como se mostra no seguinte Quadro 5.
Quadro 5
Resposta Normalizada (%) 100 90 425
Composto · Ácido clofíbrico
3-metil-TTNEB
Ácido clofíbrico + 3-metil-TTNEB
Observou-se um efeito sinergístico semelhante com ligandos RXR e RXR-específicos e o receptor de Vitamina D (VDR) e seus ligandos correlacionados. Quando os receptores RXRp e VD foram co-transfectados para células contendo um elemento de resposta de hormona, a adição do 3-metil-TTNCB RXR-selectivo e de 1,25-di-hidroxi-vitamina D (1,25-D) produziu uma resposta maior do que a adição das observadas para cada um dos ligandos individuais, como se mostra no Quadro 6.
Quadro 6
Composto Resposta Normalizada (%) 1.25- D 100 3-metil-TTNCB 13 1.25- D + 3-metil-TTNCB 190
Como se vê, os resultados acima indicam que cada par de receptores (RXRa/PPAR e RXRp/VDR, respectivamente), na presença de ligandos que se sabe activarem especificamente os seus receptores respectivos, é capaz de produzir uma resposta sinergística. Os resultados indicam que a, resposta de um agente único pode ser aumentada pela combinação dos dois agentes, ou que se podem obter respostas, biológicas ou terapêuticas, comparáveis quando se usam esses agentes em combinação em doses menores. A observação de que os ligandos RXR-específicos são capazes de actuar sinergisticamente com ligandos RAR, ligandos PP AR e ligandos da Vitamina D, indica que os ligandos RXR-específicos são úteis não só como agentes terapêuticos sozinhos como também em terapia de combinação para obter melhores respostas biológicas ou terapêuticas pela adição de um ligando RXR-específico. Esta terapia de combinação também apresenta o benefício adicional de reduzir os efeitos colaterais associados ao agente primário pelo emprego de doses mais baixas desse agente. Por exemplo, o uso de Vitamina D ou de um ligando receptor 50 84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ relacionado com a Vitamina D, em conjunção com um composto RXR selectivo, para tratamento de diversos distúrbios incluindo doenças da pele (acne, psoríase), distúrbios hiperproliferativos (cancros benignos e malignos) e distúrbios de homeostase do cálcio, pode reduzir os efeitos colaterais adversos associados à terapia com a Vitamina D isolada.
Como se sabe que o RXR forma heterodímeros com vários membros da superfamília de receptores intracelulares, pode esperar-se que a resposta sinergística observada com o uso de ligandos RXR-selectivos possa ser obtida com outros receptores, com os quais se formem heterodímeros.: Estes incluem PPARs, RARs, Vitamina D, receptores da hormona tiróide, HNF4, a famiíia de receptores COUP, tal como acima referidos, e outros membros ainda não identificados da superfamília de receptores intracelulares.
Como se tomará perceptível para os peritos na arte, os compostos acima descritos podem ser facilmente utilizados em aplicações farmacológicas onde se pretenda uma actividade selectiva do receptor retinóide, e onde se pretenda minimizar reactividades cruzadas com outros receptores intracelulares correlacionados. As aplicações in vivo do invento incluem a administração dos compostos revelados, a sujeitos mamíferos e em particular a humanos.
Os compostos do presente invento são pequenas moléculas relativamente solúveis em gordura ou lipofílicas e entram na célula por difusão passiva através da membrana do plasma. Consequentemente, estes ligandos são bem adequados para administração oral e por injecção, bem como topicamente. Após administração, estes ligandos podem selectivamente activar os receptores de retinóide X e portanto modular selectivamente os processos mediados por estes receptores.
As composições farmacêuticas deste invento são preparadas nas formas convencionais de dosagem unitária, por incorporação do composto activo do invento ou de uma mistura destes compostos, com um suporte farmacêutico não tóxico de acordo com os processos habituais, numa quantidade não tóxica suficiente para produzir a actividade farmacodinâmica pretendida num mamífero e em particular no homem. De preferência a composição contém o princípio activo numa quantidade activa mas não tóxica, escolhida desde cerca de 5 mg até cerca de 500 mg de princípio activo por unidade de dosagem. Esta quantidade depende da actividade biológica específica pretendida e do estado do paciente. 51
84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ Ο suporte farmacêutico ou veículo empregue pode ser, por exemplo, sólido ou líquido. Podem empregar-se diversas formas farmacêuticas. Assim, quando se usar um suporte sólido, a preparação pode ser simplesmente moída, micronizada em óleo, comprimida, colocada em gelatina dura ou em cápsula de revestimento entérico em pó micronizado ou peletizado, ou em forma de pastilha, trocisco ou supositório. Quando se usar um veículo líquido, a preparação pode estar em forma líquida, como uma ampola, ou como uma suspensão líquida aquosa ou não aquosa. Para administração tópica, o princípio activo pode ser formulado usando bases suaves hidratantes, como pomadas e cremes. São exemplos de bases de pomadas adequadas a vaselina, vaselina com silicones voláteis, lanolina, e água em emulsões em óleo, tal como Eucerin (Beiersdorf). São exemplos de bases de cremes adequadas o Creme Nivea (Beiersdorf), creme de limpeza (USP), linimento hidrofílico (USP), Purpose Cream (Johnson & Johnson) e Lubriderm (Warner-Lambert).
Os seguintes exemplos ilustram formulações de composições farmacológicas:
Exemnlo 36
Preparam-se cápsulas de gelatina dura usando os seguintes ingredientes: 3-metil-TTNCB Amido seco Estearato de magnésio Total
Quantidade (mg/cánsulaí 140 100 10 250 mg
Os ingredientes são misturados e vão encher cápsulas de gelatina dura em quantidades de 250 mg.
Exemplo 37
Preparou-se um comprimido usando os .seguintes ingredientes: 3-metil-TTNCB Celulose microcristalina Dióxido de silício, fumado Ácido esteárico
Quantidade (mg/compr.f 140 200 10 10
Total 360 mg 52 84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ
Os componentes são misturados e comprimidos para formarem comprimidos pesando cada 360 mg.
Exemplo 38
Prepararam-se comprimidos, contendo cada 60 mg de princípio activo, do seguinte modo: 3-metil-TTNCB Ouantidade íme/comor.) 60 Amido 45 Celulose, microcristalina 35 Polivinilpirrolidona (PVP) (sol. aquosa 10%) 4 Carboximetilamido de sódio (SCMS) 4,5 Estearato de magnésio 0,5 Talco _L0 Total 150 mg O princípio activo, o amido e a celulose são passados por um peneiro n° 45 malha U.S. e misturados intensamente. A solução de PVP é misturada com os pós resultantes que depois passam por um peneiro n°14 malha U.S.. Os grânulos assim produzidos são secos a 50°C e passados por um peneiro n°18 malha U.S.. O SCMS, o estearato de magnésio e o talco, previamente passados por um peneiro n°60 malha U.S., são depois adicionados aos grânulos que, após mistura, são comprimidos numa máquina obtendo-se comprimidos pesando cada 150mg.
Exemplo 39
Podem ser preparados supositórios, contendo cada 225 mg de princípio activo, do seguinte modo: 3-metil-TTNCB Glicéridos de ácidos gordos saturados
Total 225 mg 2000 mg 2225 mg
O ingrediente activo passa por um peneiro n°60 malha U.S., e é suspenso nos glicéridos de ácidos gordos saturados previamente fundidos, usando o mínimo de calor necessário. A 53 84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ mistura é então vertida num molde de supositório de capacidade normal de 2 g e é deixada arrefecer.
Exemplo 40
Pode ser preparada uma formulação intravenosa do seguinte modo: 100 mg 1000 ml 100 ml
3-metil-TTNCB
Soro salino isotónico Glicerol O composto é dissolvido no glicerol e depois a solução é lentamente diluída com o soro salino isotónico. A solução dos ingredientes acima referidos é depois administrada a um paciente por via intravenosa, a um caudal de 1 ml por minuto.
Os compostos deste invento têm também utilidade quando marcados como ligandos para uso em ensaios, para determinar a presença de RXRs. São particularmente úteis devido à sua capacidade de se ligarem selectivamente a membros da subfamília RXR, e poderem portanto ser usados para determinar a presença de isoformas de RXR na presença de outros receptores correlacionados.
Devido à especificidade selectiva dos compostos deste invento para os receptores de retinóide X, estes compostos podem também ser usados para purificar amostras de receptores de retinóide X in vitro. Esta purificação pode realizar-se misturando amostras contendo receptores de retinóide X com um ou mais dos compostos bicíclicos derivados revelados, de modo que o composto (ligando) se una ao receptor, e depois separando a combinação ligando/receptor por técnicas de separação já conhecidas dos peritos na arte. Estas técnicas incluem separação em coluna, filtração, centrifugação, marcação e separação física, e complexação de anticorpos, entre outras.
Ainda que tenham sido descritas e ilustradas as concretizações preferidas do invento, várias substituições e modificações são possíveis sem afastamento do âmbito do invento. Como

Claims (8)

  1. 84 342 EP 0 637 297 / PT 1/4 . REIVINDICAÇÕES 1 - Composto tendo a fórmula:
    Itll
    R OU 10
    MI M2 l
    2/4 84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ onde R, e R2 representam, independentemente um do outro, hidrogénio, alquilo inferior ou acilo com 1-4 átomos de carbono; Y representa C, O, S, N, CHOH, CO, SO, S02, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; R3 representa hidrogénio ou alquilo inferior com 1-4 átomos de carbono onde Y é C ou N; R4 representa hidrogénio ou alquilo inferior com 1-4 átomos de carbono onde Y é C, mas R4 não existe se Y for N e nem R3 ou R4 existem se Y for S, O, CHOH, CO, SO, ou S02; R' e R" representam hidrogénio, alquilo inferior ou acilo com 1-4 átomos de carbono, OH, alcoxi com 1-4 átomos de carbono, tiol ou tioéter, ou amino, ou R' e R" tomados em conjunto formam um grupo oxo (ceto), metano, tioceto, epoxi, ciclopropilo ou cicloalquilo, e onde os grupos epoxi, ciclopropilo e cicloalquilo podem estar substituídos com alquilo inferior com 1-4 átomos de carbono ou de halogéneo; r. m e R"»representam hidrogénio, halogéneo, alquilo inferior ou acilo com 1-4 átomos de carbono, ou R'" e R"" tomados em conjunto formam um grupo cicloalquilo com 3-10 carbonos e onde o grupo cicloalquilo pode estar substituído com alquilo inferior com 1-4 carbonos ou com halogéneo; Rs representa um alquilo inferior com 1-4 carbonos, halogéneo, nitro, OR7, SR7, NR7R8 ou (CF2)„CF3,; R6, R10, Rn, R12, Ru , cada um independentemente, representa hidrogénio, um alquilo inferior com 1-4 carbonos, halogéneo, nitro, OR7, SR7, NR7RS ou (CF2)nCF3, com a condição de um entre Rn, R12 ou RI2 ser X, R7 e R8, representam, cada um independentemente, hidrogénio ou um alquilo inferior com 1-6 carbonos; R14 representa hidrogénio, um alquilo inferior com 1-4 carbonos, oxo, hidroxi, acilo com 1-4 carbonos, halogéneo, tiol ou tiocetona; X é COOH, tetrazolo, P03H, S03H, CHO, CH2OH, CONH2, COSH, COOR,, COSR,, CONHR,, ou COOW, onde R<, representa um alquilo inferior com 1-4 carbonos, fenilo, alquilo aromático, ou q-hidroxifenilo, q-bromofenilo, q-clorofenilo, q-fluorofenilo ou q-iodofenilo, onde q=2-4, onde W é um sal farmaceuticamente aceitável e onde X pode ter a sua origem em qualquer C, excepto na posição 2, do anel; n=0-3.
    84 342 ΕΡ Ο 637 297 / ΡΤ 3/4
  2. 2 - Composto escolhido entre ο grupo constituído por: ácido 4-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetra-hidro-2-naftil)carbonil]benzóico, ácido 4-[l-(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetra-hidro-2-naftil)etenil]benzóico, ácido 4-[l-(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetra-hidro-2-naftil)ciclopropil]benzóico, ácido 4-[l-(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7„8-tetra-hidro-2-naftil)etenil]benzenotetrazolo, 4-[l-(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetra-hidro-2-naftil)etenil]-N-(4-carboxifenil)-benzamida. 4-[l-(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetra-hidro-2-naftil)etenil]-N-(3-carboxifenil)-benzamida e 4-[l-(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetra-hidro-2-naftil)etenil]-N-(4-hidroxifenil)-benzamida.
  3. 3 - Acido 4-[l-(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetra-hidro-2-naftil)etenil]benzóico.
  4. 4 - Composição farmacêutica que compreende um ou mais compostos de acordo com a reivindicação 1, num veículo farmaceuticamente aceitável adequado para administração entérica, parentérica ou tópica.
  5. 5 - Método para determinar a presença de um ou mais Receptores de Retinóide X, compreendendo a combinação de um composto de acordo com a reivindicação 1 com uma amostra contendo um ou mais receptores desconhecidos, e determinar se o referido ligando se liga a qualquer receptor da referida amostra.
  6. 6 - Método de purificação de Receptores de Retinóide X compreendendo a combinação de um composto como se estabeleceu na reivindicação 1 com uma amostra contendo um ou mais dos referidos Receptores de Retinóide X, deixar que o referido composto se ligue aos Receptores de Retinóide X, e separar a combinação do referido composto unido ao Receptor de Retinóide X.
  7. 7 - Utilização de um composto de acordo com a reivindicação 1 na preparação de um medicamento para a modulação do metabolismo lipídico in vivo, de processos relacionados com a pele, da morte programada de células, do desenvolvimento de células malignas, de lesões pré-malignas, de doenças auto-imunes ou de metabolismo de ácidos gordos. 84 342 ΕΡ Ο 637 297/PT 4/4
  8. 8 - Composto de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3, para administração a um sujeito mamífero, para modular um processo mediado por um ou mais Receptores de Retinóide X. Lisboa, í:^· Por LIGAND PHARMACEUTICALS, INC.
    /
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