CZ282548B6

CZ282548B6 - Farmaceutický přípravek

Info

Publication number: CZ282548B6
Application number: CS923728A
Authority: CZ
Inventors: Werner Bollag; Joseph Francic Grippo; Arthur Levin
Original assignee: F. Hoffmann-La Roche Ag
Priority date: 1992-01-22
Filing date: 1992-12-17
Publication date: 1997-08-13
Also published as: HUT63053A; JPH06107542A; CY2251B1; NO302274B1; TW226329B; IL104450A; EP0552624B1; ES2148184T3; HU9300116D0; AU3186193A; CN1068200C; CN1074826A; HU211167A9; DE69328910D1; ATE194077T1; CZ372892A3; CA2087251C; DE69328910T2; GR3034323T3; CN1256916A

Abstract

Řešení se týká 9-cis-retinové kyseliny, jejích solí a esterů, které jsou vhodné pro léčbu maligních a premaligních lézí epitelu, foto-poškození pokožky, poruch vyvolaných zvýšenou tvorbou kožního mazu a psoriasis.ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká použití 9-cis-retinové kyseliny pro výrobu určitého specifického léčiva.

Dosavadní stav techniky

Kyselina 9-cis-retinová byla navržena jako složka přípravků určených pro stimulaci růstu vlasů a snížení vypadávání vlasů v DE-A-38 27 467.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je použití 9-cis-retinové kyseliny, jejích farmaceuticky vhodných solí ajejích farmaceuticky vhodných hydrolýzovatelných esterů pro výrobu léčiva pro léčbu premaligních nebo prekancerózních lézí epithelu nebo nádorů epitelu.

Předmětem vynálezu je také použití 9-eis-retinové kyseliny, jejích farmaceuticky vhodných solí ajejích farmaceuticky vhodných hydrolýzovatelných esterů pro výrobu léčiva pro léčbu leukoplakií orální dutiny.

Předmětem vynálezu je také použití 9-cis-retinové kyseliny, jejích farmaceuticky vhodných solí ajejích farmaceuticky vhodných hydrolýzovatelných esterů pro výrobu léčiva pro léčbu epitelových nádorů prsu, kůže, tlustého střeva, močového měchýře, jícnu, žaludku, hrtanu, plic nebo orální dutiny.

Předmětem vynálezu je také použití 9-cis-retinové kyseliny, jejích farmaceuticky vhodných solí ajejích farmaceuticky vhodných hydrolýzovatelných esterů pro výrobu léčiva pro léčbu stavů spojených s foto-poškozenou pokožkou.

Předmětem vynálezu je také použití 9-cis-retinové kyseliny, jejích farmaceuticky vhodných solí ajejích farmaceuticky vhodných hydrolýzovatelných esterů pro výrobu léčiva pro snižování sekrece kožního mazu.

Předmětem vynálezu je také použití 9-cis-retinové kyseliny, jejích farmaceuticky vhodných solí ajejích farmaceuticky vhodných hydrolýzovatelných esterů pro výrobu léčiva pro léčbu psoriasis.

V souvislosti s vynálezem se zjistilo, že 9-cis-retinová kyselina, její farmaceuticky vhodné soli a farmaceuticky vhodné hydrolýzovatelné estery mají antihyperplastické, antimetaplastické, antineoplastické tumor-preventivní a tumor-terapeutické vlastnosti na epitelové léze, přičemž vykazují omezenou toxicitu ajiné nepříznivé účinky, které jsou typické pro retinoidy. Také se zjistilo, že patologické stavy, při jejichž léčbě je zapotřebí používat léčiv s uvedenými vlastnostmi, je možno účinně léčit systemickým nebo topickým podáváním 9-cis-retinové kyseliny, jejích farmaceuticky vhodných solí a farmaceuticky vhodných hydrolýzovatelných esterů.

9-cis-retinová kyselina, její farmaceuticky vhodné soli a farmaceuticky vhodné hydrolýzovatelné estery při podávání savcům vykazujícím premaligní epitelové léze, tj. prekancerózní léze, retardují postup těchto lézí. Tato sloučenina reguluje růst buněk a diferenciaci těchto premaligních nebo prekancerózních lézí a zajišťuje opravu buněk. Tím se zabrání rozvoji těchto

- 1 CZ 282548 B6 lézí na epitelové karcinomy.

Při léčbě premaligních nebo prekancerózních lézí, kterou se má retardovat progrese těchto lézí na karcinomy, se 9-cis-retinová kyselina, její farmaceuticky vhodné soli a farmaceuticky vhodné hydrolýzovatelné estery podávají pacientům, kteří jsou postiženi těmito lézemi, orálně nebo topicky, v množství, které účinně retarduje progresi těchto lézí. Konkrétní množství podávané látky bude závislé na počtu a velikosti lézí a na potřebách pacienta.

9-cis-retinová kyselina, její farmaceuticky vhodné soli a farmaceuticky vhodné hydrolýzovatelné estery jsou obzvláště vhodné pro léčbu premaligních nebo prekancerózních lézí epitelu prsu, pokožky, tlustého střeva, močového měchýře, jícnu, žaludku, hrtanu, plic nebo orální dutiny. Těchto sloučenin se s výhodou používá při léčbě takových premaligních a prekancerózních lézí, jako jsou různé leukoplakie, zejména leukoplakie úst a jazyka a prekancerózní nebo premaligní léze prsu.

9-cis-retinová kyselina, její farmaceuticky vhodné soli a farmaceuticky vhodné hydrolýzovatelné estery mohou také sloužit pro léčbu karcinomů nebo nádorů epitelového původu, přičemž retardují vývoj těchto nádorů. Antikarcinomové a protinádorové vlastnosti těchto sloučenin se při léčbě nádorů projevují snížením jak velikosti, tak počtu těchto nádorů. Používá-li se těchto sloučenin jako protinádorového činidla, jsou obzvláště účinné při retardaci vývoje nádorů prsu, kůže, tlustého střeva, močového měchýře, jícnu, žaludku, hrtanu, plic nebo úst. 9-cis-retinová kyselina se může pacientům podávat výše uvedeným způsobem tak, jako je tomu při výše popsané léčbě pacientů, kteří trpí premaligními nebo prekancerózními lézemi.

Při výše uvedeném léčení se 9-cis-retinová kyselina, její farmaceuticky vhodné soli a farmaceuticky vhodné hydrolýzovatelné estery podávají systemicky nebo topicky, ve formě přípravku obsahujícího 9-cis-retinovou kyselinu a farmaceuticky vhodný nosič, který je s touto sloučeninou kompatibilní. Při výrobě těchto přípravků se může používat jakýchkoliv obvyklých farmaceutických přípravků. Podává-li se léčivo orálně, činí se tak obvykle v pravidelných intervalech, účelně v době hlavních jídel nebo jednou denně. Tato sloučenina je při topickém nebo orálním podávání poměrně málo toxická.

Jako příklady chorob zahrnujících premaligní nebo prekancerózní epitelové léze nebo nádory, které se účinně léčí 9-cis-retinovou kyselinou, je možno uvést aktinické keratózy, arsenové keratózy, xeroderma pigmentosum, Bowenovu chorobu, leukoplakie, metaplasie, dysplasie a papilomy sliznic, například úst, jazyka, hltanu a hrtanu, prekancerózní změny bronchiální sliznice, jako jsou metaplasie a dysplasie (obzvláště časté u těžkých kuřáků a lidí, kteří pracují s asbestem a/nebo uranem), dysplasie a leukoplakie děložního hrdla, dystrofíe vulvy, prekancerózní změny močového měchýře, například metaplasie a dysplasie, papilomy močového měchýře a polypy střevního traktu. Jako příklady nádorů a karcinomů epitelu semimaligní nebo maligní povahy, které je možno účinně léčit 9-cis-retinovou kyselinou, je možno uvést nádory prsu, kožní nádory, například bazaliomy (Carcinoma basocellulare), nádory močového měchýře, například povrchové karcinomy močového měchýře, nádory tlustého střeva, jícnu, žaludku, hrtanu a plic.

Při léčbě prekancerózních lézí a maligních nádorů epitelového typu se může 9-cis-retinová kyselina, její farmaceuticky vhodné soli a farmaceuticky vhodné hydrolýzovatelné estery aplikovat samotná nebo v kombinaci s jinými prostředky, jako jsou chirurgické zákroky, léčba ozařováním, hormonální léčba nebo léčba standardní chemoterapií (podávání cytostatických a cytotoxických látek) nebo léčba pomocí modifikátorů biologické odpovědi (interferony, interleukiny nebo jiné cytokiny).

Dále se zjistilo, že když se 9-cis-retinová kyselina, její farmaceuticky vhodné soli a farmaceuticky vhodné hydrolýzovatelné estery aplikují topicky na pokožku pacienta, může

-2CZ 282548 B6 dojít k reversi stavů, které jsou způsobeny foto-poškozením. Při topické aplikaci těchto sloučenin na pokožku pacientů, která byla poškozena sluneční expozicí, může dojít k reversi stavů, jako jsou vrásky, elastóza a předčasné zestárnutí, což vede ke zlepšení vzhledu pokožky.

Při topické aplikaci 9-cis-retinové kyseliny, jejích farmaceuticky vhodných solí a farmaceuticky vhodných hydrolýzovatelných esterů se dosáhne urychlení opravy dermálního poškození, přičemž pokožka nabude hladšího a mladšího vzhledu.

V souvislosti s vynálezem se také zjistilo, že když se 9-cis-retinová kyselina, její farmaceuticky vhodné soli a farmaceuticky vhodné hydrolýzovatelné estery pacientům aplikují orálně nebo topicky, dojde u nich ke snížení sekrece kožního mazu. Podávání této sloučeniny lze tedy léčit choroby a stavy spojené se zvýšenou sekrecí kožního mazu, jako jsou léze způsobené acne, mastné vlasy a mastná vlasová část pokožky hlavy. Přitom se těchto sloučenin může používat jak pro profylaxi, tak pro léčení těchto chorob a stavů.

Je známo, že inhibice tvorby kožního mazu a/nebo jeho sekrece představuje účinný prostředek při léčbě a/nebo prevenci chorob, jako je acne. Zvýšená sekrece kožního mazu může mít za následek takové dermatologické choroby a poruchy, jako je seborrhea, včetně tvorby lupů, maštění pokožky a vlasů, miliaria a ucpávání mazových žláz.

Topické a orální podávání výše uvedených sloučenin je účinné při léčbě všech forem acne, ať již se jedná o zánětlivou nebo nezánětlivou formu.

Dále se zjistilo, že když se pacientům, kteří trpí psoriázou podá 9-cis-retinová kyselina, její farmaceuticky vhodné soli a farmaceuticky vhodné hydrolýzovatelné estery, dojde u nich k účinné léčbě této choroby. Podáním těchto látek se sníží účinek psoriázy na pokožku pacientů.

Farmaceuticky vhodné soli zahrnují všechny chemicky přípustné soli 9-cis-retinové kyseliny, které je možno podávat humánním pacientům ve formě farmaceuticky vhodných přípravků. Může se použít jakýchkoliv běžných farmaceuticky vhodných solí. Z obvyklých solí, kterých je možno použít, je možno uvést soli s bázemi, například soli alkalických kovů, jako soli sodné nebo draselné, soli kovů alkalických zemin, jako soli vápenaté nebo hořečnaté a amonné nebo alkylamoniové soli.

Podle vynálezu se 9-cis-retinová kyselina může podávat ve formě farmaceuticky vhodných hydrolýzovatelných esterů. V přípravcích podle vynálezu se může používat jakýchkoliv farmaceuticky vhodných hydrolýzovatelných esterů, jako jsou například aromatické estery, jako je benzylester (OBzl) nebo benzylestery, substituované nižší alkylskupinou, halogenem, nitroskupinou; nebo nižší alkylestery, například terc.butylester; nebo cyklopentylester, cyklohexylester nebo cykloheptylester; nebo 9-fluorenylmethylester.

9-cis-retinová kyselina, její farmaceuticky vhodné soli a farmaceuticky vhodné hydrolýzovatelné estery se obvykle zpracovávají na farmaceuticky vhodné orální nebo topické přípravky. Tyto farmaceutické přípravky podle vynálezu obsahují 9-cis-retinovou kyselinu, její farmaceuticky vhodné soli a farmaceuticky vhodné hydrolýzovatelné estery ve spojení s kompatibilním farmaceuticky vhodným nosičem. Může se používat jakýchkoliv běžných farmaceutických nosičů. Nosičem může být organická nebo anorganická inertní látka, která se hodí pro orální podávání. Jako vhodné nosiče je možno uvést vodu, želatinu, arbaskou gumu, laktózu, škrob, stearan hořečnatý, mastek, rostlinné oleje, polyalkylenglykoly, vazelínu apod. Farmaceutické přípravky mohou dále obsahovat také jiné farmaceuticky účinné látky. V souladu s obvyklou praxí farmaceutického průmyslu je možno přidávat přídavné přísady, jako jsou ochucovadla, konzervační látky, stabilizátory, emulgátory, pufry apod.

-3 CZ 282548 B6

Vyráběné farmaceutické přípravky mohou mít jakoukoliv obvyklou formu: může se jednat a) o pevné přípravky pro orální podávání, jako jsou tablety, kapsle, pilule, prášky, granuláty apod. a b) o přípravky vhodné pro topickou aplikaci, jako jsou roztoky, suspenze, masti, krémy, gely, mikronizované prášky, aerosoly apod. Farmaceutické přípravky mohou být sterilizovány a/nebo mohou obsahovat pomocné přísady, jako jsou konzervační činidla, stabilizátory, smáčedla, emulgátory, soli pro změnu osmotického tlaku a/nebo pufry.

Pro topickou aplikaci na pokožku se výše uvedené sloučeniny přednostně zpracovávají na masti, tinktury, krémy, gely, roztoky, lotiony, spreje, suspenze, šampony, vlasová mýdla, parfémy apod. Ve skutečnosti lze použít jakýchkoliv obvyklých přípravků, kterých se běžně používá při ošetřování vlasové části pokožky nebo pokožky vůbec. Přednostní aplikační formou pro sloučeniny podle vynálezu jsou gely, lotiony a krémy. Farmaceutické přípravky pro topické podávání na pokožku je možno vyrábět míšením výše uvedených účinných složek s netoxickými, terapeuticky inertními, pevnými nebo kapalnými nosiči, kterých se v takových přípravcích obvykle používá. Tyto přípravky by měly obsahovat přinejmenším asi 0,01 % hmotnostního účinné přísady, vztaženo na celkovou hmotnost přípravku. Vzhledem ktomu, že účinná složka, 9-cis-retinová kyselina, je poměrně netoxická anedráždivá, může se jí používat vtopických přípravcích v množství nad 0,15 %. Tyto přípravky přednostně obsahují 0,01 až 0,15 % hmotnostního účinné přísady, vztaženo na celkovou hmotnost přípravku. Tyto přípravky se přednostně aplikují na pokožku jednou nebo dvakrát denně nebo podle potřeby pacienta. Účinná složka může být podle vynálezu aplikována ve vodném roztoku nebo v roztoku v alkoholu, jako je ethanol.

Při výrobě výše popsaných topických přípravků se může používat přísad, jako jsou konzervační činidla, zahušťovadla, parfémy a podobné látky, kterých se běžně používá ve farmaceutickém průmyslu. Do topických přípravků, které obsahují výše uvedenou účinnou přísadu, se kromě toho přidávají obvyklé antioxidanty nebo jejich směsi. Jako tyto obvyklé antioxidanty, které se hodí pro přípravky podle vynálezu, je možno uvést N-methyl-a-tokoferolamin, tokoferoly, butylovaný hydroxyanisol, butylovaný hydroxytoluen, ethoxychin apod. Farmaceutické přípravky typu krémů, na bázi výše uvedených účinných látek, se skládají z vodných emulzí obsahujících alkoholy odvozené od mastných kyselin, polopevné ropné uhlovodíky, 1,2-ethylenglykol a emulgační činidlo.

Přípravky na bázi mastí s obsahem účinné přísady podle tohoto vynálezu jsou tvořeny směsmi polopevných ropných uhlovodíků s rozpouštědlovou disperzí účinné přísady. Krémovité přípravky obsahující účinnou přísadu podle vynálezu přednostně zahrnují emulze vytvořené z vodné fáze hydratační přísady, stabilizátoru viskozity a vody, olejovité fáze tvořené alkoholem odvozeným od mastné kyseliny, polopevným ropným uhlovodíkem a emulgátorem a fáze, která obsahuje účinnou přísadu dispergovanou ve vodném roztoku stabilizátoru a pufru. K topickým přípravkům se mohou přidávat stabilizátory. Podle vynálezu se může použít jakýchkoliv stabilizátorů. V olejové fázi působí jako stabilizátor alkohol odvozený od mastné kyseliny. Tyto alkoholické složky se získávají redukcí nasycených mastných kyselin s dlouhým řetězcem (alespoň asi 14 atomů uhlíku). Podle vynálezu je také možno používat obvyklých parfémů a lotionů, kterých se běžně používá v topických přípravcích pro ošetřování vlasů. Je-li to žádoucí, může se v topických přípravcích také používat konvenčních emulgátorů.

Přednostní orální dávkovači formou jsou tablety, kapsle z tvrdé nebo měkké želatiny, methylcelulózy nebo jiného vhodného materiálu, který se snadno rozpouští v zažívacím traktu. Orální dávka podle tohoto vynálezu se bude měnit podle potřeb jednotlivých pacientů a bude ji určovat lékař. Obvykle však přichází v úvahu denní dávka v rozmezí od asi 0,01 do asi 3 mg/kg tělesné hmotnosti, přednostně v rozmezí od asi 0,025 do asi 1,5 mg/kg tělesné hmotnosti pacienta. Tato dávka se bude podávat podle režimu stanoveného lékařem, v závislosti na potřebě pacienta.

-4CZ 282548 B6

Pro enterální podávání podle vynálezu se může do orální jednotkové dávkovači formy uložit terapeuticky účinná látka, popsaná výše v jakémkoliv množství. Přednostně se však přípravky formulují tak, že obsahují účinnou přísadu podle vynálezu v takovém množství, aby na každou jednotkovou dávkovači formu připadalo asi 1 až asi 50 mg této účinné přísady, přičemž zbytek tvoří vhodné terapeuticky inertní plnivo nebo ředidlo. Obzvláštní přednost se jako jednotkovým dávkovacím formám dává měkkým želatinovým kapslím a tabletám.

Účinnost 9-cis-retinové kyseliny při použití podle vynálezu je demonstrována v následujících modelových testech.

A) Protinádorové účinky 9-cis-retinové kyseliny na buněčné linie humánního nádoru a na experimentální nádor

Inhibiční účinek na růst a proliferaci humánních transformovaných buněčných linií epitelu

9-cis-retinová kyselina se zkouší na buněčné linii humánního nádoru SCC 15 (karcinom epitelových buněk jazyka) a A 431 (karcinom epitelových buněk vulvy). Proliferace se měří na základě schopnosti živých buněk redukovat barvivo MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5difenyltetrazoliumbromid] prostřednictvím mitochondriální enzymatické účinnosti (Mosmann T., Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxic Assays, J. Immunol. Methods 65: 55 až 63, 1983).

Výsledky

Humánní karcinom epitelových buněk jazyka (SCC 15) kontrolní (DMSO)

9-cis-retinová kyselina (3x10'⁷ M) interferon α (IFNa) (1000 U/ml) 9-cis-retinová kyselina + IFNa živé buňky v %, vztaženo na kontrolní po 7 dnech inkubace

100 ± 11,4 ± 7,5 p< 0,0025 ±8,3 p < 0,005 ± 2,5 p< 0,001

9-cis-retinová kyselina v koncentraci 3 x 10‘⁷ inhibuje proliferaci o 46 %, v kombinaci s IFNa, dokonce o 80 %.

Humánní karcinom epitelových buněk vulvy (A 431) kontrolní (DMSO)

9-cis-retinová kyselina (3x10‘⁷ M) interferon a (IFNa) (1000 U/ml) 9-cis-retinová kyselina + IFNa živé buňky v %, vztaženo na kontrolní po 7 dnech inkubace

100 ±8,7 ±1,8 p< 0,001 ±0,9 p < 0,0005 ±1,4 p< 0,001

9-cis-retinová kyselina v koncentraci 3 x 10'⁷ inhibuje proliferaci o 64 %, v kombinaci s IFNa, dokonce o 77 %.

9-cis-retinová kyselina vykazuje výrazný inhibiční účinek na růst dvou zkoušených humánních kancerózních buněčných linií epitelu.

Byla také zkoušena účinnost 9-cis-retinové kyseliny na jiné transformované buněčné linie. Zkouška proliferace byla prováděna na buněčné linii obsahující virus. SK.v-11, což je transformovaná keratinocytová buněčná linie obsahující humánní virus papilomu 16 (HPV 16) byla zkoušena, pokud se týče inhibice proliferace 9-cis-retinovou kyselinou, ve dvou experimentech, které byly 4 x opakovány. 5 χ 10⁴ buněk na jamku bylo naneseno na Eaglovo médium a inkubováno po dobu 2 dnů. Před a po inkubaci byly buňky přímo spočítány pomocí hemocytometru, přičemž koncentrace retinoidu a DMSO (v kontrolních vzorcích) činila 10'⁶M. Inhibice růstu byla vyjádřena v %, vzhledem ke kontrolním vzorkům.

Výsledek: 9-cis-retinová kyselina v koncentraci 10'⁶ M výrazně inhibuje proliferaci humánních transformovaných keratinocytů SKv-11, o 32,4 % (p<0,001).

B) Účinek 9-cis-retinové kyseliny na angiogenesi indukovanou nádorovými buňkami

V současné době se považuje za dobře prokázané, že neomezený růst nádorů je závislý na angiogenesi. Nárůstu populace nádorových buněk musí předcházet nárůst nových kapilár, které konvergují do nádoru. Inhibicí angiogenese se tedy inhibuje růst nádoru (Folkman J., How is Blood Vessel Growth Regulated in Normál and Neoplatic Tissue ?, G. H. A. Clowed Memoriál Award Lecture. Cancer Res. 46: 467-473, 1986; Sidky Y. A. a Borden E. C., Inhibition of Angiogenesis by Interferons: Effects on Tumor- and Lymphocyte-induced Vascular Responses. Cancer Res. 47: 5155-5161, 1987).

Zkoušky s angiogenesi již byly dříve popsány (Sidky Y. A. a Aurbach R. Lymphocyte Induced Angiogenesis: A Quantitative and Sensitive Assay of the Graft-vs-host Reaction, J. Exp. Med. 141: 1084-1100, 1975; Majewki S. a další Inhibition of Tumour-induced Angiogenesis by Systemically Administered protemine sulphate, Int. J. Cancer 33: 831-833, 1984). Pro zkoušení 9-cis-retinové kyseliny bylo použito dvou zkoušek. Při první zkoušce byl retinoid přidán in vitro k buněčné linii před injektováním myším. Při druhé zkoušce byl myším retinoid intraperitoneálně vstříknut in vivo před intradermálním vstříknutím nádorové buněčné linie.

Metoda: Buňky dvou tumorigenních buněčných linií SKv-e2 a HeLa a netumorigenní buněčné linie SKv-el se preinkubují in vitro po dobu 48 hodin s 9-cis-retinovou kyselinou v koncentraci 10‘⁷ M a potom se buňky spočítají a promyjí v médiu TC 199. Koncentrace buněk se nastaví na hodnotu 2x10’ živých buněk na 0,1 ml média a buňky se vstříknou intradermálně myším Balc/c, které byly ozářeny rentgenovými paprsky, ale které nebyly ošetřeny retinoidem. Kontrolním zvířatům se vstříknou nádorové buňky preinkubované s DMSO. Angiogenický účinek se stanovuje výše uvedenými metodami.

Výsledky

a) Účinek in vitro preinkubace s 9-cis-retinovou kyselinou na angiogenickou schopnost buněčné linie SKv-e2 (tumorigenní), HeLa (tumorigenní) a SKv-el (netumorigenní) u myší Balc/c střední počet krvinek

SKv-e2 HeLa SKv-el

kontrolní	34,7 + 3,7	32,5 ± 2,7	26,3 ± 1,5
9-cis-retinová kyselina	23,6 ± 4,2	23,8 + 2,9	25,6 ± 2,2
	p< 0,001	p< 0,001	p < 0,1

9-cis-retinová kyselina inhibuje tvorbu nových krvinek indukovanou dvěma tumorigenními buněčnými liniemi, naproti tomu však neinhibuje angiogenesi indukovanou netumorigenní sublinií.

-6CZ 282548 B6

b) Inhibice angiogenního účinku, indukovaného buňkami, předběžným ošetřením myší Balc/c in vivo 9-cis-retinovou kyselinou střední počet krvinek kontrolní 9-cis-retinová kyselina

HeLa (tumorigenní)	28,3 ±0,8	16,3 ± 1,8	p< 0,001
SKv-12 (tumorigenní)	30,3 ± 2,6	15,3 ± 1,0	p< 0,001
SKV-e2 (tumorigenní)	31,3 ±2,7	19,7 ±0,6	p< 0,001
SKv-el (netumorigenní)	19,7 ±3,7	24,3 ± 5,6	p> 0,1

U myší ošetřených 9-cis-retinovou kyselinou byla pozorována inhibice tvorby nových krvinek po vstříknutí buněk tří tumorigenních buněčných linií. Za použití netumorigenní buněčné linie nebyl pozorován žádný angiogenní účinek.

9-cis-retinová kyselina inhibuje in vitro a in vivo tvorbu nových krvinek indukovanou nádorovými buněčnými liniemi. Vzhledem ktomu, že předpokladem pro růst nádoru je neovaskularizace, 9-cis-retinová kyselina nepůsobí pouze přímým protinádorovým účinkem, prostřednictvím inhibice proliferace a/nebo indukce diferenciace, nýbrž i antiangiogenním účinkem, kterým se inhibuje růst nádoru nepřímo.

C) Účinek 9-cis-retinové kyseliny na chemicky indukované kožní papilomy u myší

Preventivní a terapeutický účinek retinoidů na chemicky indukované nádory kůže, respiračního, trávicího a močového traktu, jakož i prsu je dobře znám (Bollag W. a Hartmann H. R., Prevention and Therapy of Cancer with Retinoids in Animal and Man, Cancer Surveys 2: 293 až 314, 1983). 9-cis-retinová kyselina vykazuje výrazný terapeutický účinek na již utvořené kožní papilomy myší, což vede k regresi těchto epitelových nádorů. Zkouška s papilomy představuje standardní zkoušku, které se používá při zkoušení protinádorové účinnosti retinoidů.

Výsledky dávka (mg/kg i. p.) procentická změna průměrného součtu průměrů papilomů, vztažená na ______________________1 myš___________________________________________________________ kontrolní +23,5 ±2,1

9-cis-retinová kyselina

400 -43,3 ±2,4 p < 0,0005

200 -24,8 ±4,5 p < 0,0005

9-cis-retinová kyselina vykazuje podstatný terapeutický protinádorový účinek na již utvořené chemicky indukované kožní papilomy myší, který se projevuje regresí tohoto epitelového nádoru.

D) Antipsoriatická účinnost 9-cis-retinové kyseliny

Antipsoriatická účinnost se může stanovit na základě schopnosti dosáhnout regrese chemicky indukovaných kožních papilomů u myší při modelové zkoušce, která je citována v odstavci C). Zkouška s papilomy představuje standardní zkoušku, kterou se vyhodnocuje antipsoriatická účinnost retinoidů (Teelmann K., Bollag W., The Relevance of the Mouše Papilloma Test as a Predictor of Retinoid Activity in Human Psoriasis, Dermatologica 180: 30 až 35, 1990).

Jak je zřejmé z dat, která jsou uvedena v odstavci C), 9-cis-retinová kyselina má výrazný terapeutický účinek při této modelové zkoušce, kterou se předvídá antipsoriatická účinnost u člověka.

-7CZ 282548 B6

E) Účinnost 9-cis-retinové kyseliny při potlačování acne a tvorby kožního mazu

Etiologii acne způsobuje mnoho faktorů. Při patologii této choroby hraje klíčovou roli nadměrná tvorba kožního mazu, hyperkeratinizace a bakteriální kolonizace.

Jako měřítko účinnosti proti acne byly zvoleny následující dvě modelové zkoušky:

1) Bylo ukázáno, že zkouška antiproliferace humánních sebocytů silně koreluje se sloučeninami, které byly klinicky zkoušeny u člověka, jako léčiva proti acne (Doran T. I. a Shapiro S. S., Retinoid Effects on Sebocyte Proliferation v Retinoids, část B, Cell Differentiation and Clinical Applications, Methods in Enzymology, svazek 190, red. L. Packer, Academie Press, str. 334 až 338, 1990).

2) Jako měřítka účinnosti proti acne bylo též používáno antikeratinizační zkoušky u myší Rhino (Mezick J. A., Bhatia M. C. a Capetola R. J., Topical and Systemic Effects of Retinoids on Homfilled Utriculus Size in the Rhino Mouše; A Model to Quantify Antikeratinizing Effects of Retinoids, J. Invest. Dermatol. 83, 110 až 113, 1984; Mezick J. A., Bhatia M. C., Shea L. M., Thome E. G. a Capetola R. J., Anti-acne Activity of Retinoids in the Rhino-Mouse vModels of Dermatology, red. Maibach a Lowe, Karger (Basilej) svazek 2, str. 59 až 63 (1985).

1) Proliferace sebocytů

I) Metoda

Izolují se mazové buňky z mazových žláz dospělého člověka. Tyto buňky, které pocházejí z obličejové pokožky odstraněné při kosmetickém chirurgickém zákroku, se kultivují na vrstvě myších fibroblastů 3T3 (Doran T. I., Baff R., Jacobs P. a Pacia E., Characterization of Human Sebaceous Cells in vitro, J. Invest. Dermatol. 96, 341 až 348, 1991). Buňky se přenesou do média bez zkoušené sloučeniny. Zkoušená sloučenina v čerstvém médiu se přidá po 24 až 48 hodinách po přenesení buněk. Ke kulturám se přidává čerstvé médium s obsahem zkoušené sloučeniny každých 48 hodin. V den sklizně se kultury propláchnou 0,03 % roztokem EDTA v PBS, aby se odstranily fibroblasty 3T3 a potom se provede inkubace v 0,05 % trypsin/0,03 % EDTA. Buňky se suspendují, suspenze se důkladně promíchá, aby vznikla suspenze jednotlivých buněk a potom se buňky spočítají v hemocytometru. Výsledky se vyjádří hodnotou, která označuje množství sloučeniny, potřebné pro inhibici proliferace mazových buněk o 50 % (IC₅₀) v μΜ, ve srovnání s kontrolní kulturou, která byla ošetřena pouze ředidlem.

II) Výsledky

9-cis-retinová kyselina je účinná in vitro při potlačování proliferace humánních sebocytů při IC₅₀ = 0,1 μΜ.

2. Redukce utricula myši Rhino, antikeratinizační zkouška

I) Metoda

Na zkoušku se použije samic myší Rhino (hiV) o stáří 6 až 8 týdnů, které pocházejí z Jackson Laboratories. Každá skupina obsahuje 6 zvířat. Zkoušené sloučeniny se rozpustí v acetonu a aplikují mikropipetou do hřbetu myší. Po dobu 3 po sobě následujících týdnů se zvířatům takto podá každý den (vždy 5 x za týden) 100 μΐ zkoušené látky. Myši se usmrtí vdechováním oxidu uhličitého. Ze hřbetu myší se odřízne proužek kůže, který se uschová pro histologické vyšetření. Z dermis odstraněná epidermis se umístí do histologických kazet z drátěného pletiva. Provede se

-8CZ 282548 B6 dehydratace v 70 %, 80 %, 95 %, 100 % ethanolu a xylenu, přičemž každý stupeň se provádí 2 hodiny. Z xylenové lázně se odeberou vzorky kůže, které se upevní na podložní mikroskopická sklíčka. Pro stanovení střední plochy utricul (váčků) se použije analýzy obrazu (Ultimage Systém). Analýzuje se přibližně 150 váčků na myš.

II) Výsledky

Účinek 9-cis-retinové kyseliny při redukci velikosti utricul u myší Rhino po topické aplikaci, sledovaný po dobu 3 týdnů:

sloučenina	dávka	velikost (pm², střed ± směrodatná odchylka)	% změna
(% roztok)	(mg/kg)
9-cis-retinová	0,001 %	0,04	2593 ±559	-52
kyselina	0,01 %	0,4	1425 ±167	-74
	0,1 %	4,0	1210± 76	-78
kontrolní	vehikulum		5420± 42	—

Všechny hodnoty- p jsou menší než 0,001 při srovnání skupin ošetřených zkoušenou sloučeninou se skupinami ošetřenými pouze vehikulem. Pro statistické vyhodnocení se použije Studentova ttestu.

9-cis-retinová kyselina se projevila jako účinná při antikeratinizační zkoušce a zkoušce účinnosti proti acne.

F) Klinická data z léčení acne vulgaris pacientů pomocí 9-cis-retinové kyseliny

Kyselinou 9-cis-retinovou bylo po dobu 1 až 3 měsíců léčeno 8 pacientů (2 muži a 6 žen) ve věku od 15 do 48 let. Z 8 pacientů byli dva léčeni po dobu 1 měsíce, 2 po dobu 2 měsíců a 4 po dobu 3 měsíců. 5 pacientů mělo comedony, 7 papule, 6 pustule a 1 noduly. 7 pacientů mělo léze pouze na obličeji a 1 měl léze na obličeji a na zádech. 9-cis-retinová kyselina byla podávána ve formě přípravku tvořeného 0,01 % roztokem účinné sloučeniny ve směsi ethanolu a propylenglykolu (50/50). Roztok byl aplikován 1 x denně, večer, na oblasti, kde byly přítomny léze způsobené acne.

Léze (comedony, papule, pastule a noduly) byly spočítány před zahájením zkoušky a po léčbě v trvání jednoho, dvou a tří měsíců. U každého pacienta byl vypočítán procentický pokles celkového počtu lézí, vztažený na základní hodnotu před zahájením zkoušky a byla vypočítána střední hodnota. Bylo dosaženo těchto výsledků: Po jednom měsíci se celkový počet lézí (u 8 pacientů) snížil v průměru o 48 %, po 2 měsících (u 6 pacientů) o 72 % a po 3 měsících (u 4 pacientů) o 77 %. Zvláštní pozornost byla věnována podráždění pokožky. U dvou pacientů byl na počátku léčby pozorován slabý erytém a slabé odlupování šupinek pokožky. Tento jev byl přechodný a zmizel v průběhu jednoho až dvou týdnů, přestože bylo pokračováno v léčbě. Pacienti se těchto vedlejších účinků téměř nevšimli.

Léčba acne 9-cis-retinovou kyselinou poskytla velmi dobré výsledky, které jsou srovnatelné s výsledky dosaženými s plně trans- nebo 13-cis-retinovou kyselinou. Koncentrace léčiva, která je potřebná pro úspěšnou místní léčbu, je 0,01 % a je podstatně nižší, než u plně trans- nebo 13cis-retinové kyseliny, kde je třeba pro dosažení stejného terapeutického účinku použít koncentrace 0,05 %. Kromě toho, terapeuticky účinná koncentrace 9-cis-retinové kyseliny způsobuje podstatně méně vedlejších účinků než terapeuticky účinná koncentrace plně transnebo 13-cis-retinové kyseliny.

-9CZ 282548 B6

G) Účinnost 9-cis-retinové kyseliny při foto-poškození

I) Metody

Lysé myši se ozáří ultrafialovým zářením (UVB) a potom se topicky léčí 9-cis-retinovou kyselinou, za účelem opravy poškozené kůže.

Kůže z ozářené a léčené oblasti se histologicky vyšetří na rozsah opravy. Oprava je definována vhledem normalizované dermis, zasahující od epidermis dolů, směrem k vrstvě stlačeného elastinu. Měřítkem rozsahu opravy je šířka této zóny.

Tyto metody jsou popsány v Bryce G. F., Bogdan N. J. a Brown C. C., Retinoic Acids Promote the Repair of the Dermal Damage and the Effacement of Wrinkles in the UVB-irradiated Hairless Mouše, J. Invest. Dermatol. 91, 175 až 180, 1988.

II) Výsledky léčba kontrolní 9-cis-retinová kyselina pg pg

100 pg

200 pg oprava plocha v mm² x 10'³ ______ED50______

0,21 ±0,12

0,57 ± 0,48

0,87 ± 0,34

7,37 ±2,04**

6,46 ± 1,57** zvrásnění stupnice 0 až 4

ED50____

3,1 ±0,3

2,6 ± 0,7

1,8 ±0,3**

0,3 ±0,1*** **p < 0,01 ***p < 0,001 vs kontrolní

H) Akutní toxicita

Akutní toxicita se stanovuje u albínských myší Fullinsdorf. 9-cis-retinová kyselina se suspenduje v řepkovém oleji a podá v jedné dávce intraperitoneálně. Lethální dávka (LD) 10 %, 50 % a 90 % myší se zaznamenává po 24 hodinách, 10 dnech a 20 dnech od podání této jediné dávky. Pro každou skupinu se použije 10 myší.

Výsledky (mg/kg podané sloučeniny)

	24 dnů	10 dnů	20 dnů
LD 10%	>4000	1200	1200
LD 50 %	>4000	1400	1400
LD 90 %	>4000	1800	1800

Farmaceutické přípravky podle vynálezu obsahující 9-cis-retinovou kyselinu jsou ilustrovány v následujících příkladech. Tyto příklady v žádném směru neomezují rozsah vynálezu. 9-cisretinovou kyselinu lze také označovat systematickým názvem (E,Z,E,E)-3,7-dimethyl-9-[2,6,6trimethyl-l-cyklohexen-l-yl]-2,4,6,8-nonatetraenová kyselina.

- 10CZ 282548 Β6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Lotion (roztok) složka obsah (g)přednostní obsah (g)

9-cis-retinová kyselina	0,02- 0,30
propylenglykol	5,00 - 20,00	10,00
PEG-glycerylkokoát*	0,00 - 20,00	10,00
dl-a-tokoferol	0,001-0,50	0,02
askorbylpalmitát	0,01 - 0,20	0,10
propylgallát	0,001-0,02	0,002
kys. citrónová (bezv.)**	0,00- 0,20	0,01
isopropylalkohol***	40,00 - 90,00	50,00
voda ad	100,00	100,00

* nebo j iné tensidy ** nebo jiná komplexotvomá činidla, například EDTA *** nebo jiné alkoholy, například ethanol

Příklad 2

Gel složka obsah (g)přednostní obsah (g)

9-cis-retinová kyselina	0,02- 0,30
propylenglykol	5,00 - 20,00	10,00
PEG-glycerylkokoát*	0,00 - 20,00	10,00
dl-a-tokoferol	0,001 -0,50	0,02
askorbylpalmitát	0,01 - 0,20	0,10
propylgallát	0,001 - 0,02	0,002
kys. citrónová (bezv.)**	0,00- 0,20	0,01
isopropylalkohol* * *	40,00 - 90,00	50,00
HPMC ****	0,50- 5,00	3,00
konzerv, činidlo*****	q. s.	q. s.
voda ad	100,00	100,00

*	nebo jiné tensidy
**	nebo jiná komplexotvomá činidla, například EDTA
***	nebo jiné alkoholy, například ethanol
	hydroxypropylmethylcelulóza nebo jiné polymery, například neutralizovaný Carbomer, methylcelulóza nebo sodná sůl karboxymethylcelulózy
*****	konzervační čidla, například estery parabenu (jako je methyl-, ethyl-, propyl nebo butylester), kyselina sorbová nebo kyselina benzoová

- 11 CZ 282548 B6

Příklad 3

Krém

složka	obsah (g)	přednostní obsah (g)
9-cis-retinová kyselina	0,02- 0,30
glycerol	0,00 - 10,00	5,00
Na₂EDTA	0,001 - 0,50	0,03
glyceridy*	5,00 - 20,00	10,00
cetylalkohol	0,50- 5,00	1,00
stearylalkohol	0,50- 5,00	1,00
glycerolmonostearát	1,00- 8,00	4,00
Cetaereth**	0,50- 5,00	2,00
dl-a-tokoferol	0,001-0,50	0,02
konzerv, činidlo***	q. s.	q. s.
voda ad.	100,00	100,00

* například triglycerid kyseliny kaprylové a kaprinové, triglycerid kyseliny kaprylové, kaprinové a linoleové, přírodní glyceridy, jakož i například dikaprylát a dikaprinát propylenglykolu a vosky, jako je sterylstearát, oleyloleát a isopropylmyristát ** Ceteareth 5-30 nebo jiné emulgátory, jako Polysorbate 20-80, sorbitanestery mastných kyselin a estery mastných kyselin s polyethylenglykolem *** konzervační činidla, například estery parabenu (jako je methyl-, ethyl-, propyl- nebo butylester) kyselina sorbová nebo kyselina benzoová

Příklad 4

Náplň pro měkké želatinové kapsle

9-cis-retinová kyselina olej* směs vosků** plnicí objem

5,00 - 50,00 mg

- 3 díly až 5 dílů až 6 min.

* přírodní rostlinné oleje, například sojový olej, arašídový olej a syntetické glyceridy ** směs přírodních a syntetických vosků nebo částečně hydratovaných tuků

- 12CZ 282548 B6

Příklad 5

Tvrdé želatinové kapsle obsahující 20 mg účinné látky složení náplně 1 kapsle:

9-cis-retinová kyselina	20,0 mg
želatina Bloom 30	70,0 mg
maltodextrin MD 05	108,0 mg
dl-a-tokoferol	2,0 mg
askorbát sodný	10,0 mg
mikrokiystalická celulóza	48,0 mg
stearan hořečnatý	2,0 mg

hmotnost obsahu kapsle 260,0 mg

Postup:

Účinná látka se za vlhka rozemele v roztoku želatiny, maltodextrinu, dl-a-tokoferolu a askorbátu sodného, načež se za vlhka rozemletá suspenze vysuší rozprašovacím sušením. Vysušený prášek se smíchá s mikrokrystalickou celulózou a stearanem hořečnatým. 260 mg vzniklé směsi se naplní do tvrdé želatinové kapsle vhodné velikosti a barvy.

Příklad 6

Tablety obsahující 20 mg účinné látky složení jádra tablety:

9-cis-retinová kyselina bezvodá laktóza mikrokrystalická celulóza dl-a-tokoferol askorbát sodný polyvinylpyrrolidon K30 stearan hořečnatý	20,0 mg 130,5 mg 80,0 mg 2,0 mg 10,0 mg 5,0 mg 2,5 mg
hmotnost jádra tablety	250,0 mg

složení povlakového filmu:

9hydroxypropylmethylce!ulóza polyethylenglykol 6000 mastek žlutý oxid železa oxid titaničitý	3,5 mg 0,8 mg 1,3 mg 0,8 mg 0,8 mg
hmotnost povlakového filmu	7,4 mg

Postup:

9-cis-retinová kyselina se smíchá s bezvodou laktózou a mikrokrystalickou celulózou. Vzniklá směs se granuluje ve vodě za použití roztoku/disperze polyvinylpyrrolidonů, dl-a-tcz·:.íezoiu a askorbátu sodného. Granulovaná hmota se smíchá se stearanem hořečnatým a lisováním zpracuje na jádra o hmotnosti 250 mg. Jádra se potáhnou filmem roztoku/suspeeze /ýše uvedeného složení.

- 13 CZ 282548 B6

Příklad 7

Sáčky obsahující 50 mg účinné látky

Složení:

9-cis-retinová kyselina laktóza, jemný prášek mikrokrystalická celulóza sodná sůl karboxymethylcelulózy dl-a-tokoferol askorbát sodný polyvinylpyrrolidon K.30 stearan hořečnatý ochucovadla

50,0 mg

990,0 mg

1400,0 mg

14,0 mg

5,0 mg 20,0 mg 10,0 mg 10,0 mg

1,0 mg hmotnost náplně sáčku

2500,0 mg

Postup:

9-cis-retinová kyselina se smíchá s laktózou, mikrokrystalickou celulózou a sodnou solí karboxymethylcelulózy. Vzniklá směs se granuluje ve vodě za použití roztoku/disperze polyvinylpyrrolidonu, dl-a-tokoferolu a askorbátu sodného. Granule se smíchají se stearanem hořečnatým a ochucovadly. Vzniklou směsí se naplní sáčky vhodné velikosti.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití 9-cis-retinové kyseliny, jejích farmaceuticky vhodných solí a jejích farmaceuticky vhodných hydrolýzovatelných esterů pro výrobu léčiva pro léčbu premaligních nebo prekancerózních lézí epithelu nebo nádorů epitelu.

2. Použití 9-cis-retinové kyseliny, jejích farmaceuticky vhodných solí a jejích farmaceuticky vhodných hydrolýzovatelných esterů pro výrobu léčiva pro léčbu leukoplakií orální dutiny.

3. Použití 9-cis-retinové kyseliny, jejích farmaceuticky vhodných solí a jejích farmaceuticky vhodných hydrolýzovatelných esterů pro výrobu léčiva pro léčbu epitelových nádorů prsu, kůže, tlustého střeva, močového měchýře, j ícnu, žaludku, hrtanu, plic nebo orální dutiny.

4. Použití 9-cis-retinové kyseliny, jejích farmaceuticky vhodných solí a jejích farmaceuticky vhodných hydrolýzovatelných esterů pro výrobu léčiva pro léčbu stavů spojených s fotopoškozenou pokožkou.

5. Použití 9-cis-retinové kyseliny, jejích farmaceuticky vhodných solí ajejích farmaceuticky vhodných hydrolýzovatelných esterů pro výrobu léčiva pro snižování sekrece kožního mazu.

6. Použití 9-cis-retinové kyseliny, jejích farmaceuticky vhodných solí ajejích farmaceuticky vhodných hydrolýzovatelných esterů pro výrobu léčiva pro léčbu psoriasis.

7. Použití podle nároků 1 až 6, kde jednotková dávkovači forma léčiva pro orální podávání obsahuje 1 až 50 mg účinné složky.

- 14CZ 282548 B6

8. Použití podle nároků 1 až 6, kde léčivo pro topické podávání obsahuje 0,01 až 0,15 % hmotnostních účinné složky.

5 9. Použití podle nároků 1 až 6, kde léčivo pro topické podávání obsahuje 0,02 až 0,05 % hmotnostních účinné složky.