JP2023526022A - 褐色脂肪生成を誘導する方法及び組成物 - Google Patents
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Abstract
本開示は、糖尿病及び肥満等の代謝疾患の処置のための組成物、方法及びキットに関する。
Description
関連出願を相互参照
本出願は、２０２０年５月１１日出願の米国仮出願第６３／０２２，６４０号の優先権を主張するものであり、全ての図表、アミノ酸又は核酸配列を含む全ての内容を参照することにより援用される。
本出願は、２０２０年５月１１日出願の米国仮出願第６３／０２２，６４０号の優先権を主張するものであり、全ての図表、アミノ酸又は核酸配列を含む全ての内容を参照することにより援用される。
本出願の配列表は、２０２０年５月９日に作成され、２ＫＢである「Seq－List.txt」とラベル付けされたものである。配列表の全内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
技術分野
本開示は、２型糖尿病、肥満、インスリン抵抗性、及び脂質異常症等の状態において、褐色脂肪細胞及び／又は褐色脂肪細胞塊を増強することに関する組成物及び方法に関する。具体的には、本開示は、骨格筋（ＣＤ３４＋細胞）から単離された褐色脂肪組織（ＢＡＴ）前駆細胞の褐色脂肪細胞への分化を増加させる化合物を識別し、説明するものである。さらに、本開示は、褐色脂肪細胞の分化及び／又は質量の規制に関与する遺伝子産物と相互作用する化合物を識別し、説明するものである。さらに、本開示は、２型糖尿病、肥満、インスリン抵抗性、及び脂質異常症の予防及び処置のための化合物の識別及び治療的使用のための方法を提供する。本開示は、肥満、２型糖尿病、インスリン抵抗性及び脂質異常症等の様々な代謝疾患の研究、予防及び処置に有用である。
本開示は、２型糖尿病、肥満、インスリン抵抗性、及び脂質異常症等の状態において、褐色脂肪細胞及び／又は褐色脂肪細胞塊を増強することに関する組成物及び方法に関する。具体的には、本開示は、骨格筋（ＣＤ３４＋細胞）から単離された褐色脂肪組織（ＢＡＴ）前駆細胞の褐色脂肪細胞への分化を増加させる化合物を識別し、説明するものである。さらに、本開示は、褐色脂肪細胞の分化及び／又は質量の規制に関与する遺伝子産物と相互作用する化合物を識別し、説明するものである。さらに、本開示は、２型糖尿病、肥満、インスリン抵抗性、及び脂質異常症の予防及び処置のための化合物の識別及び治療的使用のための方法を提供する。本開示は、肥満、２型糖尿病、インスリン抵抗性及び脂質異常症等の様々な代謝疾患の研究、予防及び処置に有用である。
肥満の流行は、糖尿病、高血圧、冠動脈性心疾患、癌及び他の疾患の有病率の増加と密接に関連している。白色脂肪組織の役割は、脂質を貯蔵することであり、肥満に関連する。褐色脂肪組織（「ＢＡＴ」）の役割は、事実上、逆である。それは、脂質燃焼と熱としてのエネルギーの消散に特化されている。実際、褐色脂肪細胞は、多数のミトコンドリア（細胞の燃焼が起こる）を含み、脱共役タンパク質－１（「ＵＣＰ１」）を独自に発現する。ＵＣＰ１は、酸化的リン酸化の脱共役剤として作用し、熱としてのエネルギーの消散をもたらす。交感神経系は、ミトコンドリア形成、ＵＣＰ１の発現及び活性を刺激する。げっ歯類におけるＢＡＴ関連熱発生は、低温曝露時（例えば、低体温症予防）、又は過食、過剰な吸収脂肪の燃焼、及び体重増加の予防の結果として増加する。ＢＡＴは、体重増加に対する感受性を改変し、大量のグルコースを消費することによって、インスリン感受性も改善する。従って、それは、体温、エネルギーバランス及びグルコース代謝の維持において重要な役割を果たす。
トランスジェニック動物を用いた実験は、ＢＡＴの潜在的な抗肥満特性を支持する。例えば、ＢＡＴの遺伝的アブレーションは、肥満を引き起こすことが報告されているが、ＢＡＴ（及び／又はＵＣＰ１発現）の量及び／又は機能の遺伝的増加は、痩せ及び健康な表現型を促進すると報告されている。具体的には、大量のＢＡＴを有するマウスは、対照マウスよりも体重が少なく、よりインスリン感受性である。近年、マウス筋肉において異所性ＢＡＴデポーが証明され、体重増加及びメタボリックシンドロームからの保護の遺伝的機構を提供することが示されている。
ＵＣＰ１は、げっ歯類におけるエネルギーバランスの制御において役割を果たすことが報告されており、ＵＣＰ１発現ＢＡＴは、新生児に存在するが、成人において生理学的に関連するＵＣＰ１発現はなかったと長く考えられてきた。実際、ＵＣＰ１を発現するＢＡＴは、若年期に消失すると考えられ、成人はＢＡＴを欠いていると考えられた。しかしながら、最近、多くの研究が、新生児や小児よりもかなり低いレベルではあるが、実際に、ほとんどの成人ヒトにおいてＢＡＴが維持されることを実証している。
従って、肥満、２型糖尿病、インスリン抵抗性、脂質異常症及び１型糖尿病等の様々な代謝疾患の研究、予防及び処置のために、成人の体内により多くのＢＡＴを提供し、及び／又はＵＣＰ１発現を刺激する方法を注意深く識別及び研究する必要性がある。
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本開示は、ヒト骨格筋において見出されるＢＡＴ前駆細胞から、インビトロ及びインビボで褐色脂肪細胞を動員するための組成物を提供する。これらの薬剤又はそれらの併用は、ＢＡＴ前駆細胞の褐色脂肪細胞への分化を促進するために、及び／又はＢＡＴ前駆細胞におけるＵＣＰ１、ＦＡＢＰ４（ａＰ２）、ＰＰＡＲγ２、ｍｔＴＦＡ、ＰＧＣ－ｌα及び／又はＣＯＸ ＩＶの発現をインビトロ、インビボ、又はその両方で誘導するために使用することができる。さらに、これらの薬剤は、患者における肥満、過剰な体脂肪、過体重、糖尿病、高血糖、インスリン抵抗性、高脂血症、及び他の状態を含む代謝疾患を処置するために使用することができる。
本開示は、一部には、ＢＡＴ前駆細胞の分化に様々な機構が関与するという知見、及び多様な化合物をスクリーニングすることにより、褐色脂肪細胞を効果的に動員するものを識別することができるという仮説に基づくものである。特に、本明細書に開示される様々な化合物は、ヒト骨格筋から単離されたＢＡＴ前駆細胞の、成熟した、機能的な褐色脂肪細胞への分化を著しく誘導することが見出された。ＢＡＴ前駆細胞をこれらの様々な化合物の１つ以上で処置すると、これらの細胞の褐色脂肪細胞分化への関与が誘発される。
加えて、一緒に使用される２つの異なる化合物は、前駆細胞の褐色脂肪細胞への分化に対して追加的又は相乗的効果を有し、その効果は、いずれかの化合物単独で得られる効果よりも大きいことが見出された。
ある場合、脂肪生成媒体の導入前に１つ以上の化合物で３日間処置すると、褐色脂肪細胞分化が生じる。他の場合には、脂肪生成媒体の導入と同時に１つ以上の化合物で３日間処置すると、褐色脂肪細胞分化が生じる。
褐色脂肪組織（ＢＡＴ）は、エネルギー消費に特化しているので、本明細書に記載の方法は、肥満及び糖尿病等の関連疾患の処置に有用である。本方法はまた、例えば、それに由来する肉の品質を改善するために、食用動物を含む対象における脂肪貯蔵を低下させるために使用することもできる。
従って、一態様において、本開示は、対象を処置する方法、例えば、ヒト等の対象における脂肪貯蔵又は体重を減少させる方法を特徴とする。本方法は、本明細書に開示される化合物又は化合物の組み合わせを対象に投与することを含む。さらなる態様において、本開示は、化合物活性化ＢＡＴ前駆細胞の集団を投与する方法を特徴とし、化合物活性化前駆細胞の集団は、褐色脂肪生成を行う。本方法は、任意で、脂肪貯蔵又は体重の減少を必要とする対象を識別することを含む。さらなる態様において、本開示は、対象、例えば、インスリン抵抗性である対象におけるインスリン感受性を増強する方法を含む。本方法は、化合物又は化合物活性化ＢＡＴ前駆細胞の集団を対象に投与することを含み、化合物活性化ＢＡＴ前駆細胞の集団は、褐色脂肪生成を行う。本方法は、任意で、増強されたインスリン感受性を必要とする対象を識別することを含む。
別の態様において、本開示は、対象における褐色脂肪組織の機能又は発現を調節する、例えば、ＢＡＴ脂肪生成を促進する方法を特徴とする。本方法は、化合物活性化ＢＡＴ前駆細胞の化合物又は集団を対象に投与することを含み、化合物活性化前駆細胞の集団は、褐色脂肪生成を行う。
本明細書で使用される場合、「化合物活性化」は、ＢＡＴ前駆細胞が本明細書に記載の化合物で処置されていることを意味する。細胞は、自家、同種異系、又は異種である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、化合物活性化ＢＡＴ前駆細胞の集団を対象に移植することを含む。化合物活性化細胞は、直接移植するか、又は細胞が付着する足場、マトリックス、又は他の移植可能なデバイス（例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、多糖類、フィブリン、ゼラチン、自己組織化小ペプチド、及びこれらの組み合わせから作製される担体を含む）中に投与することができる。一般に、本方法は、対象における褐色脂肪細胞量の増加を促進するために、例えば、対象における褐色脂肪細胞の量を、少なくとも１％、例えば、２％、５％、７％、１０％、１５％、２０％、２５％又はそれ以上増加させるために、十分な数の細胞を含む化合物活性化ＢＡＴ前駆細胞の集団を移植することを含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、対象から単離されたＢＡＴ前駆細胞を、本明細書に開示された化合物の１つ以上と接触させることによって、対象におけるＢＡＴ脂肪生成のレベルを評価することを含む。ＢＡＴ分化は、ＢＡＴマーカー、例えば、脱共役タンパク質（ＵＣＰ）、具体的には、ＵＣＰ－Ｉ、発現、ＢＡＴ形態（例えば、視覚、具体的には、細胞の顕微鏡検査を使用する）、又はＢＡＴ熱力学、例えば、シトクロムオキシダーゼ活動、Ｎａ＋－Ｋ＋－ＡＴＰアーゼ酵素単位、又はＢＡＴ熱発生に関与する他の酵素のいずれかを測定することによって評価することができる。
一般に、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、対象は、ヒト、例えば、肥満のヒトである。いくつかの実施形態において、対象は、非ヒト哺乳動物、例えば、実験動物、コンパニオンアニマル、又は食用に飼育される食用動物、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジである。いくつかの実施形態において、本方法は、体重、白色脂肪組織貯蔵、褐色脂肪組織貯蔵、脂肪組織形態、インスリンレベル、インスリン代謝、グルコースレベル、発熱能力、及び寒冷感度のうちの１つ以上について対象を評価することを含む。評価は、化合物又は化合物活性化ＢＡＴ前駆細胞の投与前、投与中、及び／又は投与後に行うことができる。例えば、評価は、投与の前及び／又は後の、少なくとも１日、２日、４日、７日、１４日、２１日、３０日に行うことができる。
いくつかの実施形態において、本方法は、例えば、対象における肥満を維持又はさらに減少させるために、例えば、褐色脂肪細胞量を増加させるための、化合物での処置又は化合物活性化ＢＡＴ前駆細胞の移植の１回以上の追加のラウンドを含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、（ａ）ベザフィブラート又はその類似体、及び（ｂ）オキサプロジン又はその類似体を含む組成物を特徴とし、ベザフィブラート及びオキサプロジン又はその類似体は、患者に投与された場合に、代謝疾患（例えば、肥満又は糖尿病）を処置、予防、又は低減するのに十分な量で存在する。
他の実施形態において、本開示は、（ａ）ベザフィブラート又はその類似体、及び（ｂ）ザルトプロフェン又はその類似体を含む組成物を特徴とし、ベザフィブラート及びザルトプロフェン又はその類似体は、患者に投与された場合に、代謝疾患（例えば、肥満又は糖尿病）を処置、予防、又は低減するのに十分な量で存在する。
さらに他の実施形態において、本開示は、（ａ）ベザフィブラート又はその類似体と、（ｂ）オザグレル又はその類似体とを含む組成物を特徴とし、ベザフィブラート及びオザグレル又はその類似体は患者に投与された場合に、代謝疾患（例えば、肥満又は糖尿病）を処置、予防、又は低減するのに十分な量で存在する。
本開示の組成物は、局所投与又は全身投与のために処方される。２つ以上の薬剤が使用される場合、治療剤は、別々に送達されてもよく、又は単一の処方に混合されてもよい。薬剤が異なる医薬組成物中に存在する場合、異なる投与経路を用いることができる。様々な実施形態のための投与経路には、局所、経皮、及び全身投与（静脈内、筋肉内、皮下、吸入、直腸、口腔、膣、腹腔内、関節内、眼、又は経口投与等）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「全身投与」は、全ての非経皮投与経路を指し、具体的には、局所及び経皮投与経路を除外する。望ましくは、本開示の薬剤及び追加の治療剤は、少なくとも１、２、４、６、１０、１２、１８、２４時間、３日、７日、１０日、又は１４日間隔で投与される。併用の各成分の投与量及び頻度は、独立して制御することができる。例えば、１つの化合物は、１日３回投与することができ、第２の化合物は、１日１回投与することができる。併用療法は、患者の身体が予期されていない副作用から回復する機会を有するように、休止期間を含むオン・アンド・オフサイクルで与えられる。化合物はまた、一回の投与で両方の化合物を送達するように一緒に処方されてもよい。任意で、併用の薬剤のいずれかを、低用量又は高用量で投与することができ、その各々は本明細書で定義されている。
一般に、ヒトに投与される場合、本開示の併用の薬剤のいずれかの投与量は、薬剤の性質により変わり、これは当業者であれば容易に決めることができる。典型的には、投与量は、通常、１日当たり約０．００１ｍｇ～２０００ｍｇ、望ましくは、１日当たり約１ｍｇ～１０００ｍｇ、より望ましくは、１日当たり約５ｍｇ～５００ｍｇである。１日２０００ｍｇまでの投与量が必要である。併用における各薬物の投与は、独立して、１日～１年間、毎日１～４回であり、患者の生存のためである場合もある。多くの場合、慢性の長期投与が適応となる。
本開示の治療剤は、例えば、従来の薬学的に許容される担体中で、追加の活性成分又は不活性成分と混合される。薬学的担体は、哺乳動物への本開示の組成物の投与に適した任意の適合性の非毒性物質である。薬学的に許容される担体には、例えば、Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ、Ｒａｈｗａｙ、ＮＪに記載されている水、生理食塩水、緩衝液、及び他の化合物が含まれる。徐放性処方又は徐放性装置もまた、連続投与のために使用される。
２つ以上の薬剤が使用される場合、各薬剤は、当技術分野で公知の様々な方法で処方することができる。望ましくは、薬剤は、薬剤の同時又はほぼ同時投与のために一緒に処方される。このような同時処方組成物は、同じ丸剤、カプセル剤、液体剤等に一緒に処方された２つの薬剤を含むことができる。そのような併用の処方に言及する場合、使用される処方技術は、併用の個々の薬剤の処方、同様に、本開示の他の併用にも有用であると理解されたい。異なる薬剤について異なる処方方針を使用することによって、各薬剤についての薬物動態プロファイルを適切に一致させることができる。
本開示の方法はまた、肥満、糖尿病、又はインスリン抵抗性等の肥満や糖尿病に関連する状態を発症するリスクが高い患者において、予防的に使用される。危険因子には、例えば、糖尿病、肥満又は関連する状態の家族歴、栄養の質、身体活動のレベル、肥満又は糖尿病の分子マーカーの存在、年齢、人種又は性別が含まれる。他の非関連疾患に罹患した患者はまた、二次性肥満又は糖尿病に罹患しやすくなる。
本開示はまた、患者に（ｉ）ベザフィブラート又はその類似体及び（ｉｉ）オキサプロジン又はその類似体を投与することによって、代謝疾患の処置、予防、又は低減を必要とする患者において代謝疾患を処置、予防、又は低減する方法を特徴とし、ベザフィブラート及びオキサプロジン又はその類似体は、一緒になって代謝疾患を処置、予防、又は低減するのに十分な量で投与される。
本開示はまた、患者に（ｉ）ベザフィブラート又はその類似体及び（ｉｉ）ザルトプロフェン又はその類似体を投与することによって、代謝疾患の処置、予防、又は低減を必要とする患者において代謝疾患を処置、予防、又は低減する方法を特徴とし、ベザフィブラート及びザルトプロフェン又はその類似体は、一緒になって代謝疾患を処置、予防、又は低減するのに十分な量で投与される。
本開示はまた、患者に（ｉ）ベザフィブラート又はその類似体及び（ｉｉ）オザグレル又はその類似体を投与することによって、代謝疾患の処置、予防、又は低減を必要とする患者において代謝疾患を処置、予防、又は低減する方法を特徴とし、ベザフィブラート及びオザグレル又はその類似体は、代謝疾患を処置、予防、又は低減するのに十分な量で一緒に投与される。
個々に又は別々に処方された薬剤は、キットとして一緒に包装することができる。例えば、２つの丸剤、丸剤及び粉末、バイアルの坐剤及び液体、２つの局所クリーム等を含有するキットが挙げられるが、これらに限定されない。キットは、粉末形態を再構成するためのバイアル、注入のためのシリンジ、カスタマイズされたＩＶ送達システム、吸入器等の、患者への単位用量の投与を補助する任意の構成要素を含むことができる。さらに、単位用量キットは、組成物の作製及び投与のための説明書を含むことができる。キットは、１人の患者のための単回使用単位用量、特定の患者のための複数回使用（一定用量で、又は個々の化合物が治療が進行することにつれて効力が変化する）として製造される、又はキットは複数の患者への投与に適した複数回用量（「バルクパッケージング」）を含む。キット構成要素は、カートン、ブリスターパック、瓶、チューブ等に組み立てられる。
本開示はまた、（ｉ）ベザフィブラート又はその類似体、及び（ｉｉ）ベザフィブラート及びオキサプロジン又はその類似体を、代謝疾患を有するか又は有するリスクがある患者に投与するための説明書を含むキットを特徴とする。
本開示はまた、（ｉ）オキサプロジン又はその類似体、及び（ｉｉ）オキサプロジン及びベザフィブラート又はその類似体を、代謝疾患を有するか又は有するリスクがある患者に投与するための説明書を含むキットを特徴とする。
本開示はまた、（ｉ）ベザフィブラート又はその類似体、及び（ｉｉ）ベザフィブラート及びザルトプロフェン又はその類似体を、代謝疾患を有するか又は有するリスクがある患者に投与するための説明書を含むキットを特徴とする。
本開示はまた、（ｉ）ザルトプロフェン又はその類似体、及び（ｉｉ）ザルトプロフェン及びベザフィブラート又はその類似体を、代謝疾患を有するか又は有するリスクがある患者に投与するための説明書を含むキットを特徴とする。
本開示はまた、（ｉ）ベザフィブラート又はその類似体、及び（ｉｉ）ベザフィブラート及びオザグレル又はその類似体を、代謝疾患を有するか又は有するリスクがある患者に投与するための説明書を含むキットを特徴とする。
本開示はまた、（ｉ）オザグレル又はその類似体、及び（ｉｉ）オザグレル及びベザフィブラート又はその類似体を、代謝疾患を有するか又は有するリスクがある患者に投与するための説明書を含むキットを特徴とする。
本開示はまた、（ｉ）ベザフィブラート又はその類似体及びオキサプロジン又はその類似体を含有する組成物、及び（ｉｉ）代謝疾患を有するか又は有するリスクがある患者に組成物を投与するための説明書を含むキットを特徴とする。
本開示はまた、（ｉ）ベザフィブラート又はその類似体及びザルトプロフェン又はその類似体を含有する組成物、（ｉｉ）代謝疾患を有するか又は有するリスクがある患者に組成物を投与するための説明書を含むキットを特徴とする。
本開示はまた、（ｉ）ベザフィブラート又はその類似体及びオザグレル又はその類似体を含有する組成物、（ｉｉ）代謝疾患を有するか又は有するリスクがある患者に組成物を投与するための説明書を含むキットを特徴とする。
本開示はまた、（ｉ）ベザフィブラート又はその類似体、（ｉｉ）オキサプロジン又はその類似体、及び（ｉｉｉ）代謝疾患を有するか又は有するリスクがある患者にベザフィブラート及びオキサプロジン又はその類似体を投与するための説明書を含むキットを特徴とする。
本開示はまた、（ｉ）ベザフィブラート又はその類似体、（ｉｉ）ザルトプロフェン又はその類似体、及び（ｉｉｉ）代謝疾患を有するか又は有するリスクがある患者にベザフィブラート及びザルトプロフェン又はその類似体を投与するための説明書を含むキットを特徴とする。
本開示はまた、（ｉ）ベザフィブラート又はその類似体、（ｉｉ）オザグレル又はその類似体、及び（ｉｉｉ）代謝疾患を有するか又は有するリスクがある患者にベザフィブラート及びそのオザグレルター類似体を投与するための説明書を含むキットを特徴とする。
本開示はまた、（ａ）ＰＰＡＲアゴニスト（賦活剤）、及び（ｂ）オキサプロジンを含む組成物を特徴とし、ＰＰＡＲ賦活剤及びオキサプロジンは、患者に投与された場合に、代謝疾患を処置、予防、又は低減するのに十分な量で存在する。
本開示はまた、（ａ）ＰＰＡＲアゴニスト、及び（ｂ）ザルトプロフェン又はその類似体を含む組成物を特徴とし、ＰＰＡＲ賦活剤及びザルトプロフェン又はその類似体は患者に投与された場合に、代謝疾患を処置、予防、又は低減するのに十分な量で存在する。
本開示はまた、（ａ）ＰＰＡＲ賦活剤アゴニスト及び（ｂ）オザグレル又はその類似体を含む組成物を特徴とし、ＰＰＡＲ賦活剤及びオザグレル又はその類似体は患者に投与された場合に、代謝疾患を処置、予防、又は低減するのに十分な量で存在する。
本開示はまた、患者に（ｉ）ＰＰＡＲアゴニスト及び（ｉｉ）オキサプロジン又はその類似体を投与することによって、代謝疾患の処置、予防、又は低減を必要とする患者における代謝疾患を処置、予防、又は低減するための方法を特徴とし、ＰＰＡＲアゴニスト及びオキサプロジン又はその類似体は、代謝疾患を処置、予防、又は低減するのに十分な量で一緒に投与される。
本開示はまた、患者に（ｉ）ＰＰＡＲアゴニスト及び（ｉｉ）ザルトプロフェン又はその類似体を投与することによって、代謝疾患の処置、予防、又は低減を必要とする患者において代謝疾患を処置、予防、又は低減するための方法を特徴とし、ＰＰＡＲアゴニスト及びザルトプロフェン又はその類似体は、代謝疾患を処置、予防、又は低減するのに十分な量で一緒に投与される。
本開示はまた、患者に（ｉ）ＰＰＡＲアゴニスト及び（ｉｉ）オザグレル又はその類似体を投与することによって、代謝疾患の処置、予防、又は低減を必要とする患者において代謝疾患を処置、予防、又は低減するための方法を特徴とし、ＰＰＡＲアゴニスト及びオザグレル又はその類似体は、一緒になって代謝疾患を処置、予防、又は低減するのに十分な量で投与される。
本開示は、（ｉ）ＰＰＡＲアゴニスト、及び（ｉｉ）代謝疾患を有するか又は有するリスクがある患者にＰＰＡＲアゴニスト及びオキサプロジン又はその類似体を投与するための説明書を含むキットを特徴とする。
本開示は、（ｉ）オキサプロジン又はその類似体、及び（ｉｉ）代謝疾患を有するか又は有するリスクがある患者にオキサプロジン又はその類似体、及びＰＰＡＲアゴニストを、投与するための説明書を含むキットを特徴とする。
本開示は、（ｉ）ＰＰＡＲアゴニスト、及び（ｉｉ）代謝疾患を有するか又は有するリスクがある患者にＰＰＡＲアゴニスト及びザルトプロフェン又はその類似体を投与するための説明書を含むキットを特徴とする。
本開示は、（ｉ）ザルトプロフェン又はその類似体、及び（ｉｉ）代謝疾患を有するか又は有するリスクがある患者にザルトプロフェン又はその類似体、及びＰＰＡＲアゴニストを投与するための説明書を含むキットを特徴とする。
本開示は、（ｉ）ＰＰＡＲアゴニスト、及び（ｉｉ）代謝疾患を有するか又は有するリスクがある患者にＰＰＡＲアゴニスト及びオザグレル又はその類似体を投与するための説明書を含むキットを特徴とする。
本開示は、（ｉ）オザグレル又はその類似体、及び（ｉｉ）代謝疾患を有するか又は有するリスクがある患者にオザグレル又はその類似体、及びＰＰＡＲアゴニストを投与するための説明書を含むキットを特徴とする。
本開示はまた、（ｉ）ＰＰＡＲアゴニスト及びオキサプロジン又はその類似体を含有する組成物、及び（ｉｉ）代謝疾患を有するか又は有するリスクがある患者に組成物を投与するための説明書を含むキットを特徴とする。
本開示はまた、（ｉ）ＰＰＡＲアゴニスト及びザルトプロフェン又はその類似体を含有する組成物、及び（ｉｉ）代謝疾患を有するか又は有するリスクがある患者に組成物を投与するための説明書を含むキットを特徴とする。
本開示はまた、（ｉ）ＰＰＡＲアゴニスト及びオザグレル又はその類似体を含有する組成物、及び（ｉｉ）代謝疾患を有するか又は有するリスクがある患者に組成物を投与するための説明書を含むキットを特徴とする。
本開示はまた、（ｉ）ＰＰＡＲアゴニスト、（ｉｉ）オキサプロジン又はその類似体、及び（ｉｉｉ）代謝疾患を有するか又は有するリスクがある患者にＰＰＡＲアゴニスト及びオキサプロジン又はその類似体を投与するための説明書を含むキットを特徴とする。
本開示はまた、（ｉ）ＰＰＡＲアゴニスト、（ｉｉ）ザルトプロフェン又はその類似体、及び（ｉｉｉ）代謝疾患を有するか又は有するリスクがある患者にＰＰＡＲアゴニスト及びザルトプロフェン又はその類似体を投与するための説明書を含むキットを特徴とする。
本開示はまた、（ｉ）ＰＰＡＲアゴニスト、（ｉｉ）オザグレル又はその類似体、及び（ｉｉｉ）代謝疾患を有するか又は有するリスクがある患者にＰＰＡＲアゴニスト及びオザグレル又はその類似体を投与するための説明書を含むキットを特徴とする。
特許文献１及び特許文献２によれば、褐色脂肪細胞に分化できる様々な組織中の細胞の存在は、以前から識別されていた。ＢＡＴ前駆細胞と呼ばれるこのような細胞の集団は、骨格筋に存在することが見出されている。特許文献３には、ＵＣＰ１遺伝子の発現を誘導し、インビトロでＢＡＴ前駆細胞の褐色脂肪細胞への分化を促進し、インビボでＢＡＴ前駆細胞の褐色脂肪細胞への分化を促進する、又はこれらの活動の組み合わせを促す薬剤（例えば、化合物、タンパク質、生物学的製剤等）の識別を可能にするアッセイが提供されていた。
本明細書で提供されるのは、いくつかの実施形態において、添加剤又は相乗的効果を有し、それによって単独の薬剤よりも大きな効力を提供するか、又は低用量の使用を可能にすることによって単独の薬剤に関連する毒性を低減し、肥満、２型糖尿病、インスリン抵抗性、脂質異常症等の代謝疾患を処置するための優れた製品候補を提供する、２つ以上の有効な褐色脂肪細胞動員剤の併用である。例えば、ロシグリタゾンとＢＭＰ７の併用は、いずれかの薬剤単独より大きいインビトロＰＰＡＲγ２及びＵＣＰ１発現をもたらす。代謝疾患において重要な代謝パラメータに対して添加剤又は相乗活性を示す２つの化合物の組み合せを含む多剤の組み合せは、肥満及び２型糖尿病の動物モデル（ＤＩＯマウス）において候補褐色脂肪細胞動員剤を試験することによって識別された。
本開示は、インビトロ及びインビボの両方で、ＢＡＴ前駆細胞の褐色脂肪細胞への分化を促進する薬剤の併用を提供する。有効な褐色脂肪細胞動員剤の併用によって、いずれかの化合物単独よりも高い有効性を与えることができる。ロシグリタゾンとＢＭＰ７の併用は、いずれか単独よりも、大きなＰＰＡＲγ２及びＵＣＰ１発現をもたらす。
従って、いくつかの実施形態において、以下を含む組成物を用いて、ＢＡＴ前駆細胞の褐色脂肪細胞への分化を促進し、及び／又はＢＡＴ前駆細胞におけるＵＣＰ１、ＦＡＢＰ４（ａＰ２）、ＰＰＡＲγ２、ｍｔＴＦＡ、ＰＧＣ－ｌα及び／又はＣＯＸ ＩＶの発現をインビトロ、インビボ、又はその両方で誘導することができる。具体的には、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、例えば、ザルトプロフェン又はオキサプロシン、トロンボキサンシンテターゼの阻害剤、例えば、オザグレル、又はｐａｎ－ＰＰＡＲ（α、δ、γ）配位子、例えば、ベザフィブラート、オキサプロジンと併用されるベザフィブラート、又はアザグレルと併用されるベザフィブラートである。
さらに他の実施形態において、ＢＡＴ前駆細胞の褐色脂肪細胞への分化を促進し、及び／又はＵＣＰ１の発現を誘導するために使用することができるさらなる薬剤又は併用されるものとしては、ロシグリタゾン又はピオグリタゾンと、オキサプロジン又はザルトプロフェン又はオザグレルとの併用、ベザフィブラートとジフルニサル又はプロベネシド又はチアネプチン又はグリメピリドとの併用、ザルトプロフェンとグリメピリド又はプロベネシドとの併用、プロベネシドとチアネプチン又はオザグレル又はジフルニサルとの併用、又はチアネプチンとグリメピリドとの併用が挙げられる。
いくつかの実施形態において、本明細書に示される組成物を用いた、ヒトを含む対象の処置は、対象の骨格筋におけるＵＣＰ１ ｍＲＮＡ又はタンパク質生成の増加をもたらす。例えば、ロシグリタゾンによる対象の処置により、いくつかの実施形態において、骨格筋における褐色脂肪細胞の発生又は分化が誘導されたり、骨格筋（筋線維間、骨格筋組織の表面及び／又は骨格筋組織に隣接する）又は近傍における既存の褐色脂肪細胞におけるＵＣＰ１遺伝子の発現が増強されたり、またはその両方がなされる。いくつかの実施形態において、骨格筋における褐色脂肪細胞の発生又は分化は、代謝疾患に罹患している対象において誘導される。褐色脂肪細胞は、高いミトコンドリア呼吸、細胞呼吸、及び脂肪酸酸化速度を有するグルコースシンクを提供し、熱としてエネルギーを消散させる（非共役酸化的リン酸化）。対象の代謝率を高めることができ、体重の減少を誘導することができる。褐色脂肪細胞の発生又は分化の誘導はまた、インスリン感受性、血中グルコースホメオスタシス及び心血管疾患リスク因子の改善をもたらす。褐色脂肪細胞は、健康なエネルギーバランス及び低体脂肪レベルに達すること、インスリン感受性の増加及び血中グルコースホメオスタシスの改善又は心血管の健康に寄与する因子をさらに分泌する。
従って、いくつかの実施形態において、本明細書に開示される薬剤又はそれらの併用は、ヒトを含む対象の処置に使用することができる。いくつかの態様では、これらの薬剤は、ＢＡＴ前駆細胞の褐色脂肪細胞への分化を促進する。他の態様では、これらの薬剤は、インビトロ、インビボ、又はその両方で、ＢＡＴ前駆細胞におけるＵＣＰ１、ＦＡＢＰ４（ａＰ２）、ＰＰＡＲγ２、ｍｔＴＦＡ、ＰＧＣ－ｌα及び／又はＣＯＸ ＩＶの発現を誘導する。
いくつかの態様において、処置される代謝疾患は、肥満、過体重、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性、高インスリン血症、高血糖、前糖尿病、高血圧、高脂血症、肝臓脂肪症(hepatosteatosis)、脂肪肝（fatty liver）、非アルコール性脂肪肝疾患、高尿酸血症、多嚢胞性卵巣症候群、黒色表皮腫、過食症、内分泌異常、トリグリセリド蓄積症、バーデット－ビードル症候群、ローレンス－ムーン症候群、プラダー－ウィリー症候群、神経変性疾患、及びアルツハイマー病である。
他の実施形態において、組成物は、単離されたＢＡＴ前駆細胞を活性化するために使用され、次いで、ヒトを含む対象の処置のために使用される。
特許文献３によって以前に開示されたアッセイを使用して、ＢＡＴ前駆細胞の褐色脂肪細胞への分化を促進する２種以上の化合物の添加又は相乗的効果を識別することができる。しかしながら、いくつかの化合物は、ほぼ完了（１００％、又は１００％に近い）褐色脂肪細胞分化を個々に誘導するので、２つの化合物の併用と個々の化合物との間の有意な差を検出することは困難である。従って、肥満、インスリン抵抗性、及び耐糖能障害を有するマウスにおけるインビボ研究を用いて、細胞培養アッセイを補完して、目的の代謝パラメータ：体重、体脂肪含量、脂肪蓄積量、血漿レプチン濃度、血糖濃度、血漿グルコース濃度、血漿インスリン濃度、ＨＯＭＡ－ＩＲ（インスリン公差ホメオスタシスモデル評価）、耐糖能、又は血漿トリグリセリド濃度のいずれかに対して添加又は相乗的効果を生じる２つの化合物の併用を識別した。
動物において試験された組み合わせは、異なる既知又は疑わしい分子作用機序を有する化合物を含有する。例えば、脂質異常症を処置するために使用されるフィブラートであるベザフィブラートは、オキサプロジンとは異なる分子標的（ＰＰＡＲ）及び経路を介して作用する。オキサプロジンは、シクロオキシゲナーゼ－１及び－２（プロスタグランジンＧ／Ｈシンターゼ－１及び－２）の阻害剤として作用するＮＳＡＩＤである。しかしながら、オキサプロジンは、シクロオキシゲナーゼ以外の分子標的を介して、体重、体脂肪等に記載したように作用する可能性が高い。
本発明者らは、特定のベザフィブラート含有化合物の併用が、インビトロ及びインビボ活性を有することを知見した。これらの併用は、代謝疾患と診断されたか、又はそのリスクがある患者を処置するのに有用であることが示唆されている。肥満及び糖尿病の場合、例えば、そのような投与は、体重／脂肪及び／又は血中グルコースのレベルを低下させる。
一例において、本発明者らは、肥満又は糖尿病等の代謝疾患を有する患者への１４日以内のベザフィブラート及びオキサプロジンの相互投与が、代謝疾患を処置、予防、又は低減することを提案する。
他の例では、患者への１４日以内のベザフィブラート及びザルトプロフェンの相互投与も、代謝疾患を処置、予防、又は低減する。
他の例では、患者への１４日以内のベザフィブラート及びオザグレルの相互投与も、代謝疾患を処置、予防、又は低減する。
２つの薬剤は、望ましくは、１０日以内に、より望ましくは、７日以内に、さらに望ましくは、２４時間以内に、１時間以内に、又は同時に（すなわち、不随して）相互投与される。必要に応じて、２つの薬剤のいずれか１つを低用量で投与することができる。
この知見を考慮して、前述の薬物の併用は、本明細書に記載されるように、様々な組成物、方法、及びキットにおいて使用することができる。
「代謝疾患を処置、低減、又は予防する」とは、そのような状態が発生する前又は後にその状態を改善することを意味する。同等の未処理対照と比較して、そのような低減又は予防の程度は、任意の標準的な技術によって測定して、少なくとも５％、１０％、２０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％である。
代謝疾患の処置をされている患者は、医師がそのような状態を有すると診断した人である。診断は、本明細書に記載される等、任意の適切な手段によって実施される。糖尿病又は肥満の発症の予防をされている患者は、そのような診断を受けていてもいなくてもよい。当業者であれば、本開示の患者が、家族歴、肥満、特定の民族性（例えば、アフリカ系アメリカ人、ヒスパニック系アメリカ人）、妊娠性糖尿病、又は体重が９ポンドを超える乳児の出産、肥満又は糖尿病の素因となる病理学的状態を有する高血圧、トリグリセリドの高い血中レベル、コレステロールの高い血中レベル、分子マーカーの存在（例えば、自己抗体の存在）、及び年齢（４５歳を超える）等の１つ以上の危険因子の存在に起因して、標準的な試験に供されていてもよく、又は検査なしで高リスクの患者として識別されていてもよいことが理解できるはずである。体重が身長に対して望ましい最大体重の２０％（女性では２５％）以上であれば、その人は肥満とみなされる。１００ポンドを超える過体重の成人は、病的肥満であると考えられる。肥満は、３０ｋｇ／ｍ２を超えるボディマスインデックス（ＢＭＩ）としても定義される。
「代謝疾患」とは、患者の代謝の変化に起因する任意の病理学的状態を意味する。そのような疾患には、例えば、高血糖をもたらすグルコースホメオスタシスの変化から生じる疾患が含まれる。本開示によれば、グルコースレベルの変化は、典型的には、健康な個体におけるそのようなレベルと比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又はさらに１００％のグルコースレベルの増加である。代謝疾患には、肥満及び糖尿病（例えば、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、ＭＯＤＹ、及び妊娠糖尿病）、脂質異常症、及び加齢による内分泌欠乏症が含まれる。
「グルコースレベルを低下させる」とは、未処理対照と比較して、グルコースレベルを少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％低下させることを意味する。望ましくは、グルコースレベルが正常血糖レベル、すなわち、１５０～６０ｍｇ／ｄＬ、１４０～７０ｍｇ／ｄＬ、１３０～７０ｍｇ／ｄＬ、１２５～８０ｍｇ／ｄＬ、好ましくは１２０～８０ｍｇ／ｄＬに低下する。
「患者」とは、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ハムスター、サル、モルモット、ラット、マウス、トカゲ、スネーク、ヒツジ、ウシ、魚、及び鳥を含む任意の動物（例えば、ヒト）を意味する。
「十分な量」とは、臨床的に関連する方法で、糖尿病等の代謝疾患を処置、予防、又は低減するために必要とされる、単独又は他の治療レジメンと併用される化合物の量を意味する。代謝疾患の治療的処置のために本開示を実施するのに使用される十分な量の活性化合物は、投与の方法、哺乳動物又は患者の年齢、体重、及び全身の健康に応じて変わる。最終的に、処方者は、適切な量及び投与レジメンを決定する。さらに、有効量とは、規制当局（米国食品医薬品局等）によって決定され、承認されたように、各薬剤単独よりも糖尿病等の代謝疾患を有する患者の治療において安全かつ有効な、本開示の組み合わせにおける化合物の量である。
「より有効である」とは、処置が、比較される他の処置よりも高い有効性を示すか、より毒性が低く、より安全である、より便利である、又はより安価であることを意味する。有効性は、所与の指示に適した任意の標準的な方法を使用して、当業者によって測定される。
本開示において有用な化合物には、ジアステレオマー及びエナンチオマー、塩、エステル、溶媒和物、及び多形体等の異性体を含む、薬学的に許容される形態のいずれかで本明細書に記載された化合物、同様に、本明細書に記載の化合物のラセミ混合物及び純粋な異性体が含まれる。
特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。方法及び材料は、本開示で使用するために本明細書に記載されており、当技術分野で公知の他の適切な方法及び材料も使用することができる。材料、方法、及び実施例は、例示にすぎず、限定することを意図するものではない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、データベースエントリ、及び他の参考文献は、その全体が参照として援用される。矛盾がある場合、定義を含む本明細書が優先される。
代謝疾患の診断
本開示の方法及び組成物は、肥満又は糖尿病等の代謝疾患と診断されているか、又はそれのリスクがある患者を処置するのに有用である。代謝疾患（例えば、肥満又は糖尿病）の発現が予防されている患者は、そのような診断を受けていてもいなくてもよい。当業者であれば、本開示の患者が標準的な試験に供されていてもよく、又は１つ以上の危険因子の存在に起因する高リスクの患者として、試験なしで識別されていてもよいことが理解されるはずである。
本開示の方法及び組成物は、肥満又は糖尿病等の代謝疾患と診断されているか、又はそれのリスクがある患者を処置するのに有用である。代謝疾患（例えば、肥満又は糖尿病）の発現が予防されている患者は、そのような診断を受けていてもいなくてもよい。当業者であれば、本開示の患者が標準的な試験に供されていてもよく、又は１つ以上の危険因子の存在に起因する高リスクの患者として、試験なしで識別されていてもよいことが理解されるはずである。
ボディマスインデックスが３０ｋｇ／ｍ2以上である場合、個体は肥満であるとみなされる。ＢＭＩが４０を超える大人は、病的肥満であると考えられる。
他の代謝疾患の診断は、本明細書に記載のもの等、当該技術分野で公知の任意の標準的な方法を用いて実施することができる。糖尿病を診断する方法は、例えば、参照により本明細書に援用される特許文献４に記載されている。糖尿病は、例えば、グルコース及びケトンレベル（脂肪の分解産物）を測定する尿検査（検尿）、血中グルコースレベルを測定する検査、耐糖能検査、及び哺乳動物から採取された生物学的試料（例えば、血液、血清又は尿）における代謝疾患に特徴的な分子マーカーを検出するアッセイ（例えば、糖尿病の場合、ヘモグロビンＡｌｃ（Ｈｂ Ａｌｃ）レベルの測定）を使用して、診断及びモニタリングされる。
患者は、ランダム血漿グルコース試験（その日の任意の時間に採取される）が２００ｍｇ／ｄＬ以上の値を示す場合、空腹時血漿グルコース試験が１２６ｍｇ／ｄＬ以上の値を示す場合（８時間後）、又は経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）が水に溶解した７５グラムのグルコースを含有する飲料を摂取した２時間後に採取された血液試料中、２００ｍｇ／ｄＬ以上の血漿グルコース値を示す場合、リスクがあると診断されるか、又は糖尿病を有すると診断される。ＯＧＴＴは、３時間の期間にわたる時間間隔で血漿グルコースを測定する。望ましくは、本開示に従って処置された糖尿病患者における血漿グルコースのレベルは、１６０～６０ｍｇ／ｄＬ、１５０～７０ｍｇ／ｄＬ、１４０～７０ｍｇ／ｄＬ、１３５～８０ｍｇ／ｄＬ、好ましくは、１２０～８０ｍｇ／ｄＬの範囲である。
任意で、過去２ヶ月及び３ヶ月の間の平均血中グルコースレベルを評価するヘモグロビンＡｌｃ（Ｈｂ Ａｌｃ）試験を用いることができる。糖尿病でない人は、典型的には、４％～６％の範囲のＨｂＡｌｃ値を有する。Ｈｂ Ａｌｃの１％増加毎に、血糖値は、約３０ｍｇ／ｄＬ増加し、合併症のリスクは増加する。好ましくは、本開示に従って処置される患者のＨｂ Ａｌｃ値は、９％未満、７％未満、６％未満、最も好ましくは、約５％に低減される。従って、処置される患者のＨｂ Ａｌｃレベルは、好ましくは、処置前のレベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又はそれ以上低下する。
妊娠性糖尿病は、典型的には、ＯＧＴＴ中に測定された血漿グルコース値に基づいて診断される。通常、妊娠中の血糖値は低いので、妊娠中の糖尿病の診断の閾値は、妊娠前の同一人物よりも低い。女性が以下の数のいずれかを満たすか又は超える２つの血漿グルコース測定値を有する場合、女性は、妊娠糖尿病を有するとされる。９５ｍｇ／ｄＬの空腹時血漿グルコースレベル、１８０ｍｇ／ｄＬの１時間レベル、１５５ｍｇ／ｄＬの２時間レベル、又は１４０ｍｇ／ｄＬの３時間レベル。
上記の試験又は当技術分野で公知の任意の他の試験を使用して、処置の有効性をモニターすることができる。ヘモグロビンＡｌｃ（ＨｂＡｌｃ）レベルの測定は、過去２～３ヶ月の間の平均血中グルコースの指標であるので、この試験は糖尿病処置に対する患者の応答をモニターするために使用される。
ベザフィブラート（２－（４－｛２－［（４－クロロベンゾイル）アミノ］エチル｝フェノキシ）－２－メチルプロパン酸）は、以下の構造を有する。
オキサプロジン（３－（４，５－ジフェニルオキサゾール－２－イル）プロピオン酸）は、以下の構造を有する。
ザルトプロフェン（２－（６－オキソ－５Ｈ－ベンゾ［ｂ］［１］ベンゾチエピン－３－イル）プロパン酸）は、以下の構造を有する。
オザグレル（（２Ｅ）－３－｛４－［（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）メチル］フェニル｝プロパ－２－エン酸）は、以下の構造を有する。
実施例
本教示の態様は、以下の実施例に照らしてさらに理解することができ、これは、本教示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
本教示の態様は、以下の実施例に照らしてさらに理解することができ、これは、本教示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例１：ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲを用いた定量化によるヒトＵＣＰ１ｍＲＮＡの電位変調回路のスクリーニング
ＣＤ３４＋細胞は、褐色脂肪細胞への細胞の分化を誘導したり、ＵＣＰ１の発現を調節する薬剤（小分子化合物、タンパク質、生物学的製剤等）を識別するためのツールとして使用することができる。例えば、ＲＴ－ＰＣＲに基づくアプローチを使用して、特定の薬剤によって影響を受けるＵＣＰ１ｍＲＮＡレベルを測定することができる。
ＣＤ３４＋細胞は、褐色脂肪細胞への細胞の分化を誘導したり、ＵＣＰ１の発現を調節する薬剤（小分子化合物、タンパク質、生物学的製剤等）を識別するためのツールとして使用することができる。例えば、ＲＴ－ＰＣＲに基づくアプローチを使用して、特定の薬剤によって影響を受けるＵＣＰ１ｍＲＮＡレベルを測定することができる。
これは、ＵＣＰ１遺伝子の転写を増強することによって、及び／又はＵＣＰ１転写物を安定化することによって、褐色脂肪細胞へのＣＤ３４＋細胞の分化及び／又はＵＣＰ１の発現を増強することができる薬剤の識別を可能にする。
例えば、ロシグリタゾンのようなＰＰＡＲγリガンドを使用して、ＣＤ３４＋前駆細胞の褐色脂肪細胞への分化を促進することができる（図１～１０）。他の例は、組換えタンパク質であるヒトＢＭＰ－７の使用である（図１～２、４、６～９）。
以前に開示されたロバストな方法は、内部対照として使用された褐色脂肪細胞マーカーＵＣＰ１、脂肪細胞マーカーＰＰＡＲγ２、及び「ハウスキーピング」遺伝子シクロフィリンＡに対応するｍＲＮＡ種を同時に定量することによって、褐色脂肪細胞へのＣＤ３４＋細胞分化の検出のために使用された。
この方法は、多数の試料の分析を可能にし、褐色脂肪細胞へのＣＤ３４＋細胞の分化を増強する薬剤を識別する。褐色脂肪細胞に分化すると、ＣＤ３４＋細胞は、所定のレベルのシクロフィリンＡについて、非常に高いレベルのＵＣＰ１及びＰＰＡＲγ２ｍＲＮＡを発現する。シクロフィリンＡ ｍＲＮＡレベルに標準化されたＵＣＰ１及びＰＰＡＲγ２ｍＲＮＡレベルは、試料中の細胞の総数とは無関係に、褐色脂肪細胞へのＣＤ３４＋細胞の分化のレベルの指標を与える。
従って、多重化ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲによるＵＣＰ１、ＰＰＡＲγ２及びシクロフィリンＡ ｍＲＮＡの定量化を用いて、ＣＤ３４＋細胞の褐色脂肪細胞への分化を定量化した。
出願人は、以前に承認された薬物のいくつかが、褐色脂肪細胞の動員において活性（褐色脂肪細胞前駆細胞の褐色脂肪細胞への分化の誘導）を示し、従って、肥満及び糖尿病を処置するのに有益であると仮定した。さらに、異なる分子機構を介して褐色脂肪細胞を動員する２つの薬剤は、個々の薬剤よりも高い褐色脂肪細胞動員に対する効果をもたらし、代謝健康のパラメータに対するインビボ有効性を増強することができた。
材料及び方法
褐色脂肪細胞動員剤のスクリーニング
ＵＣＰ１は、脱共役呼吸に関与する褐色脂肪細胞における重要なタンパク質であり、褐色脂肪細胞分化にも高度に特異的である。これは、完全に分化した褐色脂肪細胞によってのみ発現され、ＣＤ３４＋前駆細胞によっては発現されない。本発明者らは、褐色脂肪細胞動員剤をスクリーニングするために、ＵＣＰ１発現の検出のためのリアルタイム半定量的ＲＴ ＰＣＲベースのアッセイを使用した。ＵＣＰ１（褐色脂肪特定）、ＰＰＡＲγ２（脂肪細胞特定で、ＣＤ３４＋細胞が白色にならず、褐色のみになるので、細胞における褐色分化／成熟を確認する）、及びシクロフィリンＡを同時に検出するために、細胞数に対するメッセージノーマライゼーションについて、このアッセイを多重化する。このアッセイは、褐色脂肪細胞への分化を伴う異なる形態学的変化の光学顕微鏡的可視化を可能にするというさらなる利点を有する。これは、分化のさらなる確認として役立つ。このシステムは、いくつかの陽性対照（ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、シグリタゾンのようなＰＰＡＲγ賦活剤、及びタンパク質ＢＭＰ７を含む）に対して、適切な用量応答挙動で予測されるように応答する。
褐色脂肪細胞動員剤のスクリーニング
ＵＣＰ１は、脱共役呼吸に関与する褐色脂肪細胞における重要なタンパク質であり、褐色脂肪細胞分化にも高度に特異的である。これは、完全に分化した褐色脂肪細胞によってのみ発現され、ＣＤ３４＋前駆細胞によっては発現されない。本発明者らは、褐色脂肪細胞動員剤をスクリーニングするために、ＵＣＰ１発現の検出のためのリアルタイム半定量的ＲＴ ＰＣＲベースのアッセイを使用した。ＵＣＰ１（褐色脂肪特定）、ＰＰＡＲγ２（脂肪細胞特定で、ＣＤ３４＋細胞が白色にならず、褐色のみになるので、細胞における褐色分化／成熟を確認する）、及びシクロフィリンＡを同時に検出するために、細胞数に対するメッセージノーマライゼーションについて、このアッセイを多重化する。このアッセイは、褐色脂肪細胞への分化を伴う異なる形態学的変化の光学顕微鏡的可視化を可能にするというさらなる利点を有する。これは、分化のさらなる確認として役立つ。このシステムは、いくつかの陽性対照（ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、シグリタゾンのようなＰＰＡＲγ賦活剤、及びタンパク質ＢＭＰ７を含む）に対して、適切な用量応答挙動で予測されるように応答する。
化合物の併用は、併用の影響を示す。本発明者らは、ＣＤ３４＋細胞では、ロシグリタゾン及びＢＭＰ７の両方が褐色脂肪細胞の動員をロバストに増加させることを示した。それらが異なるメカニズムを介して作用することを考慮して、それらを最も有効な個々の濃度で一緒に試験して、いずれかの化合物で見られるものを超えてさらなる動員を促進するかどうかを決定した。実際、２つの化合物は共に、いずれかの単独よりもかなり有効であり（図１、２、６：ロシグリタゾン＋ＢＭＰ７対ロシグリタゾン及びＢＭＰ７）、２つの化合物は異なる機構を有し、より一般的には、多剤併用が褐色脂肪細胞動員のための個々の化合物よりも有効である可能性があることが示唆される。より大きな効果のために活性化合物を併用する可能性が実証された。あるいは、化合物の併用との追加的（又は相乗的）効果は、一方又は両方の薬物の低用量での使用を可能にし、それらの使用に関連する副作用を低減する。
細胞培養
細胞を１０，０００／ｃｍ２で播種し（４８ウェル組織培養、Ｃｈｅｍｇｌａｓｓ＃ＣＬＳ－３５００－０４８）、内皮細胞増殖培地－２（ＥＧＭ２）（ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ増殖培地、Ｌｏｎｚａ＃ＣＣ－３１６２）中で３７℃でコンフルエント（１～４日間）になるまで、及び分化（６～１２日間）するまで培養した。ＥＧＭ２培地中で１～４日後、細胞を試験薬剤（又は陽性対照）と共に２～３日間（－３日目又は－２日目から０日目まで）インキュベートした。ロシグリタゾン（１μＭ）及びｒｈＢＭＰ７（６．３ｎＭ）を参照薬剤として使用した（陽性対照）。次いで、（０日目に）培養培地（試験薬剤又は陽性対照を含む）を除去し、最小限脂肪生成培地（ＭＤＭ）を加え、細胞を６～１２日間分化させた。ＭＤＭ媒体は、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら［２１］に記載された副産物媒体の変形例であり、ＤＭＥＭ／ＨａｍのＦ－１２ ５０／５０Ｍｉｘ（３．１５１ｇ／Ｌ、１７．５ｍＭ Ｄ－グルコース、３．６５１ｇ／Ｌ－グルタミン）（Ｃｅｌｌｇｒｏ＃１０－０９０－ＣＶ）、５μｇ／ｍｌ（０．８６μＭ）インシュリン、１μＭデキサソン、１００μＭの３－イソブチル－１－メチルキサンチン、０．２ｎＭの３、３'、５－トリヨド－Ｌ－チロニン、１０μｇ／ｍｌ（１２７ｎＭ）トランスファリン及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含む。脂肪細胞スコアを光学顕微鏡によって決定し、細胞の分化の終わりに、化合物処置の終わりからおよそ６～１２日後に、多房性脂質滴を含有し、ＭＤＭ培地に切り替えた、ウェル毎の細胞数として定義した。
細胞を１０，０００／ｃｍ２で播種し（４８ウェル組織培養、Ｃｈｅｍｇｌａｓｓ＃ＣＬＳ－３５００－０４８）、内皮細胞増殖培地－２（ＥＧＭ２）（ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ増殖培地、Ｌｏｎｚａ＃ＣＣ－３１６２）中で３７℃でコンフルエント（１～４日間）になるまで、及び分化（６～１２日間）するまで培養した。ＥＧＭ２培地中で１～４日後、細胞を試験薬剤（又は陽性対照）と共に２～３日間（－３日目又は－２日目から０日目まで）インキュベートした。ロシグリタゾン（１μＭ）及びｒｈＢＭＰ７（６．３ｎＭ）を参照薬剤として使用した（陽性対照）。次いで、（０日目に）培養培地（試験薬剤又は陽性対照を含む）を除去し、最小限脂肪生成培地（ＭＤＭ）を加え、細胞を６～１２日間分化させた。ＭＤＭ媒体は、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら［２１］に記載された副産物媒体の変形例であり、ＤＭＥＭ／ＨａｍのＦ－１２ ５０／５０Ｍｉｘ（３．１５１ｇ／Ｌ、１７．５ｍＭ Ｄ－グルコース、３．６５１ｇ／Ｌ－グルタミン）（Ｃｅｌｌｇｒｏ＃１０－０９０－ＣＶ）、５μｇ／ｍｌ（０．８６μＭ）インシュリン、１μＭデキサソン、１００μＭの３－イソブチル－１－メチルキサンチン、０．２ｎＭの３、３'、５－トリヨド－Ｌ－チロニン、１０μｇ／ｍｌ（１２７ｎＭ）トランスファリン及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含む。脂肪細胞スコアを光学顕微鏡によって決定し、細胞の分化の終わりに、化合物処置の終わりからおよそ６～１２日後に、多房性脂質滴を含有し、ＭＤＭ培地に切り替えた、ウェル毎の細胞数として定義した。
定量的逆転写、リアルタイムＰＣＲによるＵＣＰ１及びＰＰＡＲγ２ｍＲＮＡの定量
ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１２１８３－０１６）を用いて、細胞から全ＲＮＡを作製した。あるいは、細胞を凍結（－８０℃）によって単に溶解した。第１鎖ｃＤＮＡを、高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）及びランダムプライマーを用いて合成した。
ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１２１８３－０１６）を用いて、細胞から全ＲＮＡを作製した。あるいは、細胞を凍結（－８０℃）によって単に溶解した。第１鎖ｃＤＮＡを、高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）及びランダムプライマーを用いて合成した。
定量的リアルタイムＰＣＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（登録商標）装置、ＴａｑＭａｎ遺伝子発現マスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ＃４３６９０１６）、及びヒト脱共役蛋白質－１「ＵＣＰ１」（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ＿０２１８３３）及びヒトペプチジルプロリルイソメラーゼＡ「シクロフィリンＡ」（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ＿０２１１３０）のためのカスタムＴａｑＭａｎ遺伝子発現プローブ及びプライマーを用いて実施した。カスタムＴａｑＭａｎ遺伝子発現試薬はまた、多重化方式での、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ、転写物変異体２（ＰＰＡＲγ２）（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ＿０１５８６９）の同時測定のために開発された（ＵＣＰ１とシクロフィリンＡによる）。ＵＣＰ１ ＦＡＭ－ＭＧＢプローブ：ＴＣＡ ＡＧＧ ＧＧＴ ＴＧＧ ＴＡＣ ＣＴＴ ＣＣ（配列番号１）、センスプライマー：ＣＡＣ ＴＡＡ ＣＧＡ ＡＧＧ ＡＣＣ ＡＡＣ ＧＧ（配列番号２）アンチセンスプライマー：ＴＴＣ ＣＡＧ ＧＡＴ ＣＣＡ ＡＧＴ ＣＧＣ ＡＡ（配列番号３）、シクロフィリンＡ ＮＥＤ－ＭＧＢプローブ：ＡＣＴ ＧＣＣ ＡＡＧ ＡＣＴ ＧＡＧ ＴＧＧ ＴＴ（配列番号４）、センスプライマー：ＣＡＡ ＡＴＧ ＣＴＧ ＧＡＣ ＣＣＡ ＡＣＡ ＣＡ（配列番号５）、アンチセンスプライマー：ＴＣＡ ＣＴＴ ＴＧＣ ＣＡＡ ＡＣＡ ＣＣＡ ＣＡ（配列番号６）、ＰＰＡＲγ２ ＶＩＣ－ＭＧＢプローブ：ＴＣＡ ＣＡＡ ＧＡＡ ＡＴＧ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＴＴ Ｇ（配列番号７）、センスプライマー：ＡＧＣ ＧＡＴ ＴＣＣ ＴＴＣ ＡＣＴ ＧＡＴ ＡＣＡ Ｃ（配列番号８）及びアンチセンスプライマー：ＣＣＡ ＧＡＡ ＴＧＧ ＣＡＴ ＣＴＣ ＴＧＴ ＧＴ（配列番号９）。
シクロフィリンＡを対照として用いて、逆転写の効率に起因する変動を説明した。任意の単位を、標的ｍＲＮＡレベルをシクロフィリンＡｍＲＮＡレベル（Ｃｔに基づく）に正規化することによって決定した。
細胞形態の画像
細胞の画像を、細胞培養観察のために使用される手持ち式デジタルカメラ（Ｎｉｋｏｎ Ｃｏｏｌｐｉｘ ９５０）及び倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ ＴＭＳ）を使用して撮影した。画像を、自動レベル明るさやコントラストのためにＰａｉｎｔ．ｎｅｔバージョン４．０機能を使用して最適化した。
細胞の画像を、細胞培養観察のために使用される手持ち式デジタルカメラ（Ｎｉｋｏｎ Ｃｏｏｌｐｉｘ ９５０）及び倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ ＴＭＳ）を使用して撮影した。画像を、自動レベル明るさやコントラストのためにＰａｉｎｔ．ｎｅｔバージョン４．０機能を使用して最適化した。
結果
本発明者らは、ＣＤ３４＋褐色脂肪細胞前駆体を、１０１８個のＦＤＡ承認薬物のコレクション（ＦＤＡ承認薬物スクリーニングライブラリーコレクション、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）に含まれる化合物（１０μＭ）と共にインキュベートした。第１のスクリーニング（１０μＭ）において活性であることが見出された化合物を、用量依存性確認のために１ｎＭ～５０μＭの濃度で再試験した。
本発明者らは、ＣＤ３４＋褐色脂肪細胞前駆体を、１０１８個のＦＤＡ承認薬物のコレクション（ＦＤＡ承認薬物スクリーニングライブラリーコレクション、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）に含まれる化合物（１０μＭ）と共にインキュベートした。第１のスクリーニング（１０μＭ）において活性であることが見出された化合物を、用量依存性確認のために１ｎＭ～５０μＭの濃度で再試験した。
この方法を用いて、以下の薬剤がインビトロでのＵＣＰ１及びＰＰＡＲγ２の発現によって示されるように、褐色脂肪細胞への褐色脂肪細胞前駆細胞の分化を促進することが識別又は確認された。プロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）の類似体、例えば、アルプロスタジル、ｐａｎ-ＰＰＡＲ（α、δ、γ）配位子、例えば、ベンゾフィブラート（ベザフィブラート）、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、例えば、ジフルニサル、ザルトプロフェン、インドメタシン、アセメタシン、ジクロフェナク、メフェナム酸、ニフルム酸、メクロフェナメート又はオキサプロジン、トロンボキサンシンテターゼの阻害剤、例えば、オザグレル、スルホニル尿素、例えば、グリメピリド又はグリキドン、又はプロベネシド、チアネプチン、エパルレスタット（図６Ｃ～６Ｇ、７～２１）。
これらの薬剤（ベザフィブラート及びインドメタシンは例外かもしれないが）は、褐色脂肪細胞前駆細胞分化を誘導することは予測されておらず、インビトロでの褐色脂肪細胞動員薬剤としてのそれらの生物学的活性は、それぞれの既知の分子標的又は承認された指示に基づいて予測することはできなかった。
特に断りのない限り、分析又は分子生物学グレードの全ての有機及び無機化学物質は、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（ロシグリタゾン、＃７１７４２を含む）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（組換えヒトＢＭＰ７（ｒｈＢＭＰ７）、１００μｇ／ｍｌ、６．３μＭ、＃３５４－ＢＰ－０１０を含む）、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＩ）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）から購入した。１０１８のＦＤＡ承認薬スクリーニングライブラリーコレクションは、Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ／Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ（ＴＸ、ヒューストン）から購入した。
この方法を用いて、以下の薬剤が、インビトロ、インビボ、又は両方において、ＢＡＴ前駆細胞の褐色脂肪細胞への分化を促進し、及び／又はＢＡＴ前駆細胞におけるＵＣＰ１、ＦＡＢＰ４（ａＰ２）、ＰＰＡＲγ２、ｍｔＴＦＡ、ＰＧＣ－ｌα、及び／又はＣＯＸ ＩＶの発現を誘導することを識別又は確認した。プロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）の類似体、例えば、アルプロスタジル、ｐａｎ－ＰＰＡＲ（α、δ、γ）配位子、例えば、ベンゾフィブラート（ベザフィブラート）、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、例えば、ジフルニサル、ザルトプロフェン、インドメタシン、アセメタシン、ジクロフェナク、メフェナム酸、ニフルム酸、メクロフェナメート、又はオキサプロジン、トロンボキサンシンテターゼの阻害剤、例えば、オザグレル、スルホニル尿素、例えば、グリメピリド又はグリキドン、又はプロベネシド、チアネプチン、エパルレスタット。
実施例２：蛍光免疫組織化学（ＩＨＣ）によるＵＣＰ１タンパク質の定量
褐色脂肪細胞への褐色脂肪細胞前駆体の分化は、免疫組織化学によるＵＣＰ１タンパク質の定量化を通して検出することができる。
褐色脂肪細胞への褐色脂肪細胞前駆体の分化は、免疫組織化学によるＵＣＰ１タンパク質の定量化を通して検出することができる。
ＣＤ３４＋細胞の褐色脂肪細胞への培養及び分化は、１μＭのロシグリタゾンを欠く脂肪生成分化培地（最小分化培地、ＭＤＭ）、又は１μＭのロシグリタゾンを含有する（参照分化培地、ＲＤＭ）脂肪生成分化培地を用いて行った。１５日後、分化細胞を、４％パラホルムアルデヒドＰＢＳ ｐＨ７．４で固定し、ＵＣＰ１抗体（Ａｂｃａｍ ａｂ２３８４１）及びＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗ウサギ抗体と共にインキュベートして、標準プロトコルに従って相対的ＵＣＰ１レベル（緑色）を定量した。細胞を固定する前に、核を５μＭのＤＡＰＩ（青色）で１０分間標識した。各処理条件を、合計で各データポイントについて約３６０～４８０個の細胞に対応する９６ウェルプレートにおいて３重で評価した。ＩｎＣｅｌｌ １０００ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ Ｔｏｏｌｂｏｘソフトウェアを使用して、核及び細胞質検出アルゴリズムを使用して、ＵＣＰ１信号強度を測定するための自動細胞検出スクリプトを開発した。読出しとして、細胞内のＵＣＰ１信号の総強度を使用し、細胞数に対して正規化した。
いくつかの実施形態において、この技術を使用して識別された薬剤又はその組み合わせとしては、ファモチジン、塩酸チアプリド、塩酸グアンファシン、レセルピン、ミノキシジル、スピペロン、ジフルニサル、シロシンゴピン、プロベネシド、メトホルミン、チエチルペラジン、コルヒチン、及びフェロジピンが挙げられる。
実施例３：ＢＯＤＩＰＹを用いた褐色脂肪細胞分化の検出
ＢＯＤＩＰＹ蛍光色素標識中性脂質は、細胞質脂質液滴に取り込まれ、蛍光細胞イメージングによる細胞脂肪酸取り込み及び脂肪細胞分化の分析を可能にする。細胞をＣ１－ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５００／５１０ Ｃ１２（分子プローブ＃Ｄ－３８２３）と共に３～６時間インキュベートした後、マイクロプレートベースのハイスループット、高含有量、明視野及び蛍光細胞イメージャー及びアナライザー（Ｃｙｎｔｅｌｌｅｃｔ Ｃｅｌｉｇｏ（登録商標）又はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ）でイメージングする。
ＢＯＤＩＰＹ蛍光色素標識中性脂質は、細胞質脂質液滴に取り込まれ、蛍光細胞イメージングによる細胞脂肪酸取り込み及び脂肪細胞分化の分析を可能にする。細胞をＣ１－ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５００／５１０ Ｃ１２（分子プローブ＃Ｄ－３８２３）と共に３～６時間インキュベートした後、マイクロプレートベースのハイスループット、高含有量、明視野及び蛍光細胞イメージャー及びアナライザー（Ｃｙｎｔｅｌｌｅｃｔ Ｃｅｌｉｇｏ（登録商標）又はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ）でイメージングする。
実施例４：ベザフィブラート及びオキサプロジンの併用は、肥満及び糖尿病のマウスモデルにおいて、体重減少、インスリン感受性の増加、及び血中グルコースホメオスタシスの向上を誘導する。
褐色脂肪細胞前駆細胞の褐色脂肪細胞への分化を促進する薬剤、すなわち、インビボで褐色脂肪細胞又は褐色脂肪組織を動員する薬剤は、肥満個体又は動物における代謝健康の以下のパラメータのいずれかの向上をもたらすことが予測される。すなわち、体重、体脂肪含量、レプチン、グルコース及びインスリンの血漿レベル、インスリン抵抗性ＨＯＭＡ－ＩＲの指標（ＨＯＭＡ－ＩＲ＝（血漿インスリン［ｍｉｃｒｏＩＵ／ｍｌ］×血漿グルコース［ｍＭ］)／２２．５）の減少。
褐色脂肪細胞前駆細胞の褐色脂肪細胞への分化を促進する薬剤、すなわち、インビボで褐色脂肪細胞又は褐色脂肪組織を動員する薬剤は、肥満個体又は動物における代謝健康の以下のパラメータのいずれかの向上をもたらすことが予測される。すなわち、体重、体脂肪含量、レプチン、グルコース及びインスリンの血漿レベル、インスリン抵抗性ＨＯＭＡ－ＩＲの指標（ＨＯＭＡ－ＩＲ＝（血漿インスリン［ｍｉｃｒｏＩＵ／ｍｌ］×血漿グルコース［ｍＭ］)／２２．５）の減少。
本発明者らは、インビトロで褐色脂肪細胞を動員することが見出された薬剤の、肥満の前糖尿病マウスにおける代謝健康のパラメータに対する影響を調べた。いくつかの化合物間の可能な組み合わせ効果を明らかにするために、本発明者らはまた、インビトロで褐色脂肪細胞を動員し、異なる分子標的及び細胞内シグナル伝達経路に影響を及ぼすことが知られているか、又は影響を及ぼすと考えられる２つの薬剤の併用の影響も調べた。
材料及び方法
動物実験
２型糖尿病（又は前糖尿病）の発症の初期段階である肥満及びインスリン抵抗性を、高脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｄｉｅｔ、Ｃａｔ＃Ｄ１２４９２、６０％脂肪ｋｃａｌ）をマウスに６週齢から１２週間給餌することによってＣ５７Ｂｌ／６マウスにおいて誘導した。マウスを２２～２３℃で多量の床敷材を用いて維持し、投与期間の２週間前から開始し、１２時間／１２時間の光／暗サイクルで全投与期間にわたり、動物をそれらの熱中性に近い環境温度に維持した。
動物実験
２型糖尿病（又は前糖尿病）の発症の初期段階である肥満及びインスリン抵抗性を、高脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｄｉｅｔ、Ｃａｔ＃Ｄ１２４９２、６０％脂肪ｋｃａｌ）をマウスに６週齢から１２週間給餌することによってＣ５７Ｂｌ／６マウスにおいて誘導した。マウスを２２～２３℃で多量の床敷材を用いて維持し、投与期間の２週間前から開始し、１２時間／１２時間の光／暗サイクルで全投与期間にわたり、動物をそれらの熱中性に近い環境温度に維持した。
マウスに、１日１回、経口強制経口投与（マウス１匹あたり２００μｌ）により、最初に、試験への移行に順応させるため、ビヒクル（ＰＢＳ＋０．５％ＣＭＣ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ－８０）を３日間、次いで、ビヒクル単独又はビヒクルに溶解した試験材料のいずれかを２８～５５日間（４～８週間）投与した。
体重を３日毎に記録し、体組成（ＥｃｈｏＭＲＩを用いた脂肪及び除脂肪量）を試験終了時に評価し（シンシナティ大学マウス代謝表現型解析センター）、血糖値（グルコメーターで測定）を、投与期間３～５日前（ベースライン）及び投与期間終了時にモニターした。
投与期間の終わりに、６時間絶食させ、ＣＯ２により安楽死させ、採血し、血漿を単離し、－２０℃で保存した。血漿グルコース、インスリン及びレプチンレベルを、投与期間の３～５日前（ベースライン）及び終了時（マウスを、全ての血漿収集の前に６時間絶食させた）（シンシナティ大学マウス代謝表現型解析センター）に評価した。インスリン感受性は、インスリン抵抗性（ＨＯＭＡ－ＩＲ）のホメオスタシスモデル評価を用いて決定した［３８］。ＨＯＭＡ－ＩＲ＝（血漿インスリン［ｍｉｃｒｏＩＵ／ｍｌ］×血漿グルコース［ｍＭ］）／２２．５。
マウスは、実験を通して高脂肪食（脂肪から６０％カロリー）で維持した。グルコース負荷試験に備えて、実験の最後の夜に一晩絶食を行った。
間接熱量測定（ベザフィブラート（６０）＋オキサプロジン（５０））を用いた動物実験
食餌誘発性肥満マウス：Ｃ５７Ｂｌ／６雄マウスに、高脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔ、Ｃａｔ＃Ｄ１２４９２、６０％脂肪ｋｃａｌ）を６週齢から１２週間与えた。マウスを、２２～２３℃で多量の床敷材を用いて維持し、投与期間の２週間前から開始し、１２時間／１２時間の光／暗サイクルで全投与期間にわたり、動物をそれらの熱中性に近い環境温度に維持した。
食餌誘発性肥満マウス：Ｃ５７Ｂｌ／６雄マウスに、高脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔ、Ｃａｔ＃Ｄ１２４９２、６０％脂肪ｋｃａｌ）を６週齢から１２週間与えた。マウスを、２２～２３℃で多量の床敷材を用いて維持し、投与期間の２週間前から開始し、１２時間／１２時間の光／暗サイクルで全投与期間にわたり、動物をそれらの熱中性に近い環境温度に維持した。
マウスに、ビヒクル単独（ＰＢＳ＋０．５％ＣＭＣ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ－８０）又はビヒクルに溶解した６０ｍｇ／ｋｇのベザフィブラート＋５０ｍｇ／ｋｇのオキサプロジンの併用のいずれかを２４日間、経口強制経口投与（マウス１匹あたり２００μｌ）により１日１回投与した。
体重を毎日記録し、体組成（ＥｃｈｏＭＲＩによる脂肪及び除脂肪量）をベースライン（投与前）及び投与期間の終了時に評価した（ミシガン大学マウス代謝表現型解析センター）。
投与期間の終わりに、６時間絶食させ、ＣＯ２により安楽死させ、採血し、血漿を単離し、－２０℃で保存した。血漿グルコース、インスリン及びレプチンレベルを、ベースライン及び投与期間の終了時に評価した（マウスは、全ての血漿収集の前に６時間絶食させた）（ミシガン大学マウス代謝表現型解析センター）。
２４日間の投与後、マウスを熱量測定室（ケージ当たり１匹のマウス）に移し、マウスの熱中性に近い温度である３０℃で、３日間維持した。熱量測定チャンバ（ＴＳＥ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｈｅｎｏｍａｓｔｅｒ）における３日間の間に、以下のパラメータを測定した。すなわち、間接熱量測定によるエネルギー消費（酸素消費速度（ＶＯ２）、二酸化炭素生成（ＶＣＯ２）、呼吸商（ＲＱ）を使用する）、食物摂取、自発運動、歩行活動及び移動距離（ビームブレーク）。
熱量測定室における最初の日を順応期間として使用した（測定されたパラメータはデータ解析に使用しなかった）。熱量測定室における２日目（２４ｈ以上）に得られた値を、非刺激／休止値として使用した。熱量測定室における３日目に、１ｍｇ／ｋｇのノルエピネフリンの単回注射を用いて、マウスの全身非震え熱発生、全身褐色脂肪組織容量の尺度を測定した［３９］。
統計解析
細胞培養実験のデータを平均±ＳＥＭとして示す。オンラインＧｒａｐｈＰａｄ ＱｕｉｃｋＣａｌｃｓ ｔ検定計算機（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、対又は対になっていないスチューデントｔ検定を使用して、有意性を評価した。有意性はｐ＜０．０５に設定した。
細胞培養実験のデータを平均±ＳＥＭとして示す。オンラインＧｒａｐｈＰａｄ ＱｕｉｃｋＣａｌｃｓ ｔ検定計算機（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、対又は対になっていないスチューデントｔ検定を使用して、有意性を評価した。有意性はｐ＜０．０５に設定した。
インビボマウス実験のデータを平均±ＳＥＭとして示す。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７又は８（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、ボーンフェローニ又はダネットの多重比較検定を用いて、対又はついになっていないスチューデントｔ検定、２元配置ＡＮＯＶＡ（分散分析）又は１元配置ＡＮＯＶＡを用いて有意性を評価した。有意性は、ｐ＜０．０５に設定し、＊：ｐ＜０．０５対ビヒクル、＊＊：ｐ＜０．０１対ビヒクル、＊＊＊：ｐ＜０．００１対ビヒクルであった。
結果
ここで報告された最初の実験では、本発明者らは、ＤＩＯマウスにおけるベザフィブラート（６０ｍｇ／ｋｇ）、オキサプロジン（５０ｍｇ／ｋｇ）及びベザフィブラート（６０）＋オキサプロジン（５０）の併用の、５６日間の投与が、代謝健康パラメータに及ぼす影響を試験した。
ここで報告された最初の実験では、本発明者らは、ＤＩＯマウスにおけるベザフィブラート（６０ｍｇ／ｋｇ）、オキサプロジン（５０ｍｇ／ｋｇ）及びベザフィブラート（６０）＋オキサプロジン（５０）の併用の、５６日間の投与が、代謝健康パラメータに及ぼす影響を試験した。
これらのデータは、高脂血症の処置を受けているヒトにおいて推奨される投与レベルの約半分でベザフィブラートを使用して生成され、現在のＦＤＡガイドラインに従ってマウスについて相対成長的にスケーリングされた。オキサプロジンは、本動物実験において、スケーリングされた推奨のヒト投与量の約４分の１で使用された。
ＤＩＯマウスをベザフィブラート（６０ｍｇ／ｋｇ）又はオキサプロジン（５０ｍｇ／ｋｇ）で５６日間処置すると、ビヒクル処置と比較して、体重（図６０）、体脂肪量（図６５）、血漿レプチン（図７０）、血糖（図７５）、血漿インスリン（図８０）及びインスリン抵抗性指数（ＨＯＭＡ－ＩＲ）（図８５）が大幅に減少した。
加えて、ベザフィブラート（６０ｍｇ／ｋｇ）＋オキサプロジン（５０ｍｇ／ｋｇ）の併用は、これらの全ての代謝パラメータをさらに減少させることを見出した。実際、併用による体重減少誘導効果（図６０）及び体脂肪に対する効果（図６５）は、統計的に相乗的であった（すなわち、添加剤よりも大きい）。
本発明者らは、ベザフィブラート＋オキサプロジンが、５６日間にわたってＤＩＯマウスにおいて体重の大幅な減少をもたらしたことを見出した（ｐ＝２．６ｘ１０－１０）。観察された影響は相乗的であった（２つの個別の薬剤対ビヒクルの影響の合計よりも大きい（ｐ＝０．０４３）。ベザフィブラート（６０）＋オキサプロジンのこの５６日間の実験の図のＰ値は全て、ブートストラップ法によって推定された標準誤差を用いた両側Ｚ検定に基づいて決定した。相乗効果を評価するために、本発明者らは、併用によるベースラインからの変化率が２つの個々の薬物のベースラインからの変化率の合計よりも高いかどうかを試験した。全試験終了時の測定値について、群間差のＺ検定に対数変換を用いた。これらのデータは、高脂血症の治療を受けているヒトにおいて推奨される投与レベルの約半分でベザフィブラートを使用して生成され、現在のＦＤＡガイドラインに従ってマウスについて相対成長的にスケーリングされた。オキサプロジンは、本動物実験において、スケーリングされた推奨ヒト用量の約４分の１で使用された。
ベザフィブラートは、肝臓におけるＰＰＡＲαの活性化を介してトリグリセリド及びＬＤＬコレステロールの血漿レベルを低下させることが知られており、脂質異常症及び心血管リスクの増大を処置するために使用される。オキサプロジンは、シクロオキシゲナーゼ１及び２を阻害する非ステロイド剤抗炎症（ＮＳＡＩＤ）剤であり、関節リウマチを処置するために使用される。
これに基づいて、体重、体脂肪含量及び血漿レプチンレベルに対するベザフィブラート及びオキサプロジンの併用の相乗効果は、これらの個々の薬剤の既知の影響に基づいて予測することができなかった。これらの２つの薬剤の既知の分子標的は、これらの薬剤の褐色脂肪細胞動員（及び代謝）効果を媒介する可能性がある。あるいは、これらの薬剤の一方又は両方が他の分子標的を介して褐色脂肪細胞動員及び代謝の健康に影響を及ぼす可能性がある。
この一般的な手法を使用して、特定の既存の薬剤の組み合わせを含む以下を識別又は確認して、肥満及び糖尿病のマウスモデルにおける体重減少、インシュリン感受性の増大、及び血糖ホメオスタシスの向上を誘導した。オキサプロジン又はザルトプロフェン又はオザグレル又はジフルニサル又はプロベネシド又はチアネプチン又はグリメピリドと併用されるベザフィブラート、オキサプロジン又はザルトプロフェン又はオザグレルと併用されるロシグリタゾン又はピオグリタゾン、グリメピリド又はプロベネシドと併用されるザルトプロフェン、チアネプチン又はオザグレル又はオザグレルと併用されるプロベネシド、及びグリメピリドと併用されるチアネプチン。
第２の実験では、安静時及びノルエピネフリンでの最大交感神経刺激後の代謝健康及びエネルギー消費（代謝速度）のパラメータに及ぼすベザフィブラート（６０ｍｇ／ｋｇ）＋オキサプロジン（５０ｍｇ／ｋｇ）の併用の影響を、２４日間の投与にわたるＤＩＯマウスにおいて調べた。本実験の目的は、ベザフィブラート（６０）＋オキサプロジン（５０）を２４日間投与した後のマウスのエネルギー消費と全身発熱能力を評価することであった。また、目的は、ベザフィブラート（６０）＋オキサプロジン（５０）で処置したマウスがビヒクルを与えたマウスと比較して、褐色脂肪量（及び容量）の増加の証跡を示したかどうかを評価することであった。
ＤＩＯマウスを、ベザフィブラート（６０ｍｇ／ｋｇ）＋オキサプロジン（５０ｍｇ／ｋｇ）で２４日間処置すると、ビヒクル処理に比べて、体重（図８６）、体脂肪量（図８７）、血漿レプチン（図８８）、血糖（図８９）、血漿インスリン（図９０）、インスリン抵抗性指数（ＨＯＭＡ－ＩＲ）が大幅に低下した（図９１）。
加えて、間接熱量測定によるエネルギー消費評価は、ベザフィブラート（６０）＋オキサプロジン（５０）の併用で処置されたマウスが非常に高いエネルギー消費を有することを示した（２４時間超、非刺激、図９２）。
さらに、ノルエピネフリン注射に対する熱発生（エネルギー消費）応答は、ベザフィブラート（６０）＋オキサプロジン（５０）の併用で処置されたマウスにおいて、ビヒクルで処置されたマウスに対して非常に高く（図９３～９４）、動物における熱発生能力、すなわち、褐色脂肪組織の能力／質量の増加が実証された。
食物摂取、自発運動、歩行活動及び移動距離においてマウス群間に有意な差はなかった。
これらのデータは、ＤＩＯマウスにおいて、ベザフィブラート（６０）＋オキサプロジン（５０）の併用が、動員、熱産生茶色／ベージュ脂肪組織の増加を誘導し、この結果、エネルギー消費（代謝速度）の向上及び代謝健康のパラメータの改善（体重、脂肪量、血漿レプチン、グルコースレベル及びインスリンレベルの減少、インスリン抵抗性ＨＯＭＡ－ＩＲの指標）をもたらすことを明らかに実証するものである。
本明細書で使用されるセクションの見出し及び小見出しは、構成の目的だけであり、いかなる形であれ記載された構成要件を限定するものとしては解釈されない。さらに、本教示は種々の実施形態に関連して説明されるが、本教示がそのような実施形態に限定されることは意図されない。むしろ、本教示は、当業者によって理解されるように、様々な変形例、修正例、及び等価物を包含する。
他の実施形態
本開示の様々な態様は、単独で、組み合わせて、又は前述の実施形態で具体的に論じられていない様々な構成で使用され、従って、出願において、前述の説明に記載されるか、又は図面に示される構成要素の詳細及び構成に限定されない。例えば、一実施形態において説明される態様は、他の実施形態で説明される態様と任意の方法で組み合わせることができる。
本開示の様々な態様は、単独で、組み合わせて、又は前述の実施形態で具体的に論じられていない様々な構成で使用され、従って、出願において、前述の説明に記載されるか、又は図面に示される構成要素の詳細及び構成に限定されない。例えば、一実施形態において説明される態様は、他の実施形態で説明される態様と任意の方法で組み合わせることができる。
請求項の構成要素を修正する請求項における「第１の」、「第２の」、「第３の」等の序数用語の使用は、それ自体では、一請求項の構成要素の優先順位、先行性、又は順序が他の請求項の構成要素、又は方法の動作が実行される時間的順序よりも重要であることを意味するものではなく、単に、請求項の構成要素を区別するために、ある名称を有する一請求項の構成要素を、同じ名称を有する別の構成要素から区別するための（ただし、序数用語の使用のための）ラベルとして使用される。
また、本明細書中で使用される表現及び用語は、制限するとは理解されないものとする。「含む」、「具備する」、「有する」、「含有する」、「包含する」及びその変形の使用は、その後に列挙されている項目、等価物及びその他の付加的項目を含むものとする。
本開示は、とりわけ、インビトロ及びインビボで褐色脂肪細胞を動員することができる新規な組成物を提供する。本開示の特定の実施形態について論じてきたが、上記の明細書は例示的なものであり、限定的なものではない。本明細書を検討すれば、本開示の多くの変形が当業者には明らかとなる。本開示の全範囲は、特許請求の範囲、それらの等価物の全範囲、本明細書、及び変形形態を参照することによって決まるものとする。
参照として援用
本明細書において参照される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許、又は特許出願が参照により援用されることが具体的に示されたのと同じ程度に、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に援用される。
本明細書において参照される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許、又は特許出願が参照により援用されることが具体的に示されたのと同じ程度に、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に援用される。
Claims (19)
- 第１の活性成分としてベザフィブラートと、オキサプロジン、ザルトプロフェン及びオザグレルからなる群から選択される第２の活性成分と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
- ベザフィブラート及びオキサプロジンを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
- （ａ）ＢＥＺＡＬＩＰ（登録商標）ＳＲ（ベザフィブラート徐放性）の臨床的に承認された投与量の約２５％～約７５％の範囲のベザフィブラートと、（ｂ）ＤＡＹＰＲＯ（登録商標）（オキサプロジン）の臨床的に承認された投与量の約２５％～約１００％の範囲の治療有効量のオキサプロジンとを含む、請求項２に記載の医薬組成物。
- ベザフィブラートの治療有効量は、約１００ｍｇ～約３００ｍｇの範囲であり、オキサプロジンの治療有効量は、約３００ｍｇ～約１２００ｍｇの範囲である、請求項３に記載の医薬組成物。
- （ａ）ＢＥＺＡＬＩＰ（登録商標）ＳＲの臨床的に承認された投与量の約２５％～約１００％の範囲の治療有効量のベザフィブラートと、（ｂ）ＤＡＹＰＲＯ（登録商標）の臨床的に承認された投与量の約２５％～約７５％の範囲の治療有効量のオキサプロジンとを含む、請求項２に記載の医薬組成物。
- ベザフィブラートの治療有効量は、約１００ｍｇ～約４００ｍｇ又は約５ｍｇ～約５００ｍｇの範囲であり、オキサプロジンの治療有効量は、約３００ｍｇ～約９００ｍｇ又は約５ｍｇ～約５００ｍｇの範囲である、請求項５に記載の医薬組成物。
- ベザフィブラート及びザルトプロフェンを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
- ベザフィブラート及びオザグレルを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
- 前記第１及び第２の活性成分は、患者に投与された場合に、肥満を処置又は低減するのに十分な治療有効量で提供される、請求項１～８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記第１及び第２の活性成分は、患者に投与された場合に、ＩＩ型糖尿病を処置又は低減するのに十分な治療有効量で提供される、請求項１～８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記第１及び第２の活性成分は、インビトロ、インビボ又はその両方においてヒト骨格筋のＢＡＴ前駆細胞におけるＵＣＰ１、ＦＡＢＰ４（ａＰ２）、ＰＰＡＲγ２、ｍｔＴＦＡ、ＰＧＣ－ｌα及び／又はＣＯＸ ＩＶの発現を誘導することが可能な治療有効量で提供される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記組成物は、
（ａ）褐色脂肪組織及び／又は骨格筋組織の発熱の増加、
（ｂ）骨格筋、白色脂肪組織、又は肝臓のインスリン感受性の増加、
（ｃ）耐糖能の増加、
（ｄ）基礎呼吸、最大呼吸数、又は脱共役呼吸の増加、
（ｅ）代謝率の上昇、
（ｆ）肝臓脂肪症(hepatosteatosis)の低下、
（ｇ）体重減少、
（ｈ）体脂肪量の低下、
（ｉ）血漿レプチンレベルの低下、
（ｊ）血糖の低下と、
（ｋ）血漿インスリン濃度の低下、
（ｌ）インスリン抵抗性の低下、
又はそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の生物学的活性を有する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。 - 代謝応答の調節を必要とする対象において使用される、請求項１～８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 代謝疾患の予防又は処置を必要とする対象において使用される、請求項１～８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記代謝疾患は、肥満、過体重、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性、高インスリン血症、高血糖、前糖尿病、高血圧、高脂血症、肝臓脂肪症(hepatosteatosis)、脂肪肝（fatty liver）、非アルコール性脂肪肝疾患、高尿酸血症、多嚢胞性卵巣症候群、黒色表皮腫、過食症、内分泌異常、トリグリセリド蓄積症、バーデット・ビードル症候群、ローレンス・ムーン症候群、プラダー・ウィリー症候群、神経変性疾患、及びアルツハイマー病のうちの１つ以上である、請求項１４に記載の医薬組成物。
- 請求項１～８のいずれか一項に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、褐色脂肪生成の促進を必要とする対象において褐色脂肪生成を促進する方法。
- 前記対象における代謝応答を調節すること、及び／又は前記対象における代謝疾患を予防もしくは処置することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
- 前記代謝疾患は、肥満、過体重、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性、高インスリン血症、高血糖、前糖尿病、高血圧、高脂血症、肝臓脂肪症、脂肪肝、非アルコール性脂肪肝疾患、高尿酸血症、多嚢胞性卵巣症候群、黒色表皮腫、過食症、内分泌異常、トリグリセリド蓄積症、バーデット・ビードル症候群、ローレンス・ムーン症候群、プラダー・ウィリー症候群、神経変性疾患、及びアルツハイマー病のうちの１つ以上である、請求項１７に記載の方法。
- 前記医薬組成物は、約１００ｍｇ～約４００ｍｇ、約１００ｍｇ～約３００ｍｇ又は約５ｍｇ～約５００ｍｇの範囲の治療有効量のベザフィブラートと、約３００ｍｇ～約９００ｍｇ、約３００ｍｇ～約１２００ｍｇ又は約５ｍｇ～約５００ｍｇの範囲の治療有効量のオキサプロジンとを含む、請求項１６に記載の方法。
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