JP5987175B2 - 乳癌，胃癌及び卵巣癌等に対する制癌剤 - Google Patents

Description

本発明は，癌の治療薬ないし薬剤の使用方法に関する。

乳癌，胃癌及び卵巣癌は，その発生頻度が加速度的に増加している悪性腫瘍である。乳癌，胃癌及び卵巣癌を合わせた女性の乳癌による死亡数は，日本において四分の一を占めている（非特許文献１）。

乳癌，胃癌及び卵巣癌に対してタキソールをはじめとする抗癌剤が使われているが，十分な治療効果が得られているとはいえない。また，乳癌，胃癌及び卵巣癌における予後因子でもあるEGFRやHER2に対する分子標的治療薬も開発され，臨床試験が行われている（非特許文献２，３，４）。しかし，これら分子標的治療薬の明らかな有効性は，未だ実証されていない。
このように，従来の治療薬では乳癌，胃癌及び卵巣癌について十分な治療効果を得ることができず，有効な治療法は確立されていないのが現状である。

また，新たな治療薬として，CRM197の開発が進められている（特許文献１，２，３）。CRM197は，乳癌等の悪性腫瘍で高発現する分子であるHB-EGF（heparin binding-epidermal growth factor-like growth factor）をターゲットとした化合物であり，HB-EGFの発現を抑制することにより，抗腫瘍作用を発揮する薬剤である。

特開２００４−１５５７７６ 特開２００６−２３２７６１ 特開２００９−０１３１４１

人口動態統計（2010年，厚生労働省大臣官房統計情報部編） Nicolini A, Carpi A, Tarro G. Front Biosci 2006;11:p1818-1843 Scartozzi M, Galizia E, FreddariF et al. Cancer Treat Rev 2004;30:p451-459 Crijns AP，Duiker EW，de Jong S et al. Int J Gynecol Cancer 2006;16 Suppl 1:p152-165

上記事情を背景として本発明では，乳癌，胃癌及び卵巣癌等を治療するための薬剤ないし薬剤の使用方法の提供を課題とする。

発明者らは，HB-EGFとPPARγの関連性を見出すことにより，本発明を完成させた。

発明者らは，動脈硬化等の脂質代謝異常に関与する分子であるOxLDL（oxidized low-density lipoprotein）が，その受容体であるCD36に結合することにより，HB-EGFが高発現する一連の経路を発見した。この発見に加え，CD36の発現調節には，PPARγ（peroxisome proliferator-activated receptor γ）が関与することが知られている。

これらの知見から，癌において高発現するHB-EGFについても，同様の経路が関与するのではないかと発明者らは考えた。このことから，HB-EGFを抑制する抗がん剤に加え，PPARγに対してアゴニスト活性を有する薬剤を併用して用いることにより，相乗的にHB-EGFを抑制し，顕著な抗癌作用を示すことを発明者らは発見し，本発明を完成させた。

本発明は，以下の構成からなる。

本発明は、HB-EGF抑制薬としてCRM197、及びPPARγ作動薬としてピオグリタゾンを含む、癌を治療するための薬剤である。

本発明において，PPARγ作動薬とは，直接的または間接的にPPARγに作用することにより，PPARγにアゴニスト活性を有する化合物を有効成分とする薬剤として定義される。
また，本発明において，HB-EGF抑制薬とは，直接的又は間接的にHB-EGFに作用することにより，HB-EGFの発現を抑制する化合物を有効成分とする薬剤として定義される。

本発明により，乳癌，胃癌及び卵巣癌を治療するための薬剤および薬剤の使用方法の提供が可能となった。すなわち，HB-EGF抑制薬とPPARγ作動薬を併用して用いることにより，乳癌等のHB-EGFが高発現する癌の，より効果的な治療が期待できる。

卵巣癌及び良性卵巣腫瘍組織におけるHB-EGF，CD36及びLOX1の発現解析 Pioglitazone（PTZ）によるCD36発現抑制効果 In vitroモデルにおけるPioglitazone（PTZ）及びCRM197による抗腫瘍効果 In vivoモデルにおけるPioglitazone（PTZ）及びCRM197による抗腫瘍効果

本発明のHB-EGF抑制薬およびPPARγ作動薬等について，説明を行う。

本発明に用いられるHB-EGF抑制薬は，直接的又は間接的にHB-EGFに作用することにより，HB-EGFの発現を抑制する化合物を有効成分とする薬剤として定義される。
この機能を果たす限り，HB-EGF抑制薬は，特に限定する必要はなく，種々の化合物を有効成分として用いることができる。このようなHB-EGF抑制薬として，例えば，CRM197やこのプロドラッグ体を有効成分とする薬剤などが挙げられる。

HB-EGF抑制薬については，有効性および安全性の観点から，HB-EGF抑制薬に応じた適切な使用方法を用いればよい。
CRM197を例に挙げると，１日あたり，0.5〜20mg/body/dayで，腹腔内投与を行うなどすればよい。この場合，月曜日から金曜日の５日間連続投与を行い，土曜日，日曜日の２日間休薬するなどして，投与間隔を調整する。また，投与対象の体重等や，後述するPPAR作動薬との組み合わせにより，適宜，調整することができる。

本発明に用いられるPPARγ作動薬は，直接的または間接的にPPARγに作用することにより，PPARγにアゴニスト活性を有する化合物を有効成分とする薬剤として定義される。
この機能を果たす限り，PPARγ作動薬は，特に限定する必要はなく，種々の化合物を有効成分として用いることができる。このようなPPARγ作動薬として，例えば，ピオグリタゾン，トログリタゾン，ロジクリタゾンなどのチアゾリジン誘導体やこれらのプロドラッグ体などが挙げられる。

PPARγ作動薬については，有効性および安全性の観点から，PPARγ作動薬に応じた適切な使用方法を用いればよい。
ピオグリタゾンを例に挙げると，１日あたり，15〜45mgで，1日1回，経口投与を行えばよい。また，投与対象の体重や，前述のHB-EGF抑制薬との組み合わせにより，適宜，調整することができる。

本発明におけるHB-EGF抑制薬ないしPPARγ作動薬については，これらを併用して用いる。
CRM197とピオグリタゾンを例に挙げると，CRM197を0.5〜20mg/body/dayで月曜から金曜日の５日間腹腔内投与を行い，土日を休薬日とする。この月曜日から日曜日までの投薬スケジュールを１クールとして，２クール行う。一方，ピオグリタゾンについては，投与量を15〜45mg/body/dayとして，同様の投薬スケジュールを４クール行う。
当然のことながら，HB-EGF抑制薬ないしPPARγ作動薬の組み合わせにより，投与量や投与間隔等を適宜調整することができる。

以下，本発明について，実施例を用いて詳細に説明するが，当然のことながら，本発明はこの内容に限定されるものではない。
なお，以下では，必要に応じ，下記の略語を用いる。

HB-EGF：heparin binding-epidermal growth factor-like growth factor
PPARγ：peroxisome proliferator-activated receptor γ
LOX1：lectin-like oxidized LDL rexepter-1
OxLDL：oxidized low-density lipoprotein
PTZ：Pioglitazone
CRM197：cross-reacting material 197

＜＜実験例１．卵巣癌及び良性卵巣腫瘍組織におけるHB-EGF，CD36及びLOX1の発現解析＞＞
＜方法＞
１．Informed consentの得られた卵巣癌患者組織44例及び良性卵巣腫瘍患者組織26例のRNA抽出及びcDNA合成を，TRIzolとSuperScript II reverse transcriptase（Invitrogen Corp.）を用いて行った。
２．HB-EGFと，スカベンジャー受容体であるCD36及びLOX1の発現は，TaqMan probeを用いたReal Time PCR法（Applied Biosystems）で行い，GAPDHを内在性コントロールとして解析した（mRNA Expression index＝それぞれのHB-EGF，CD36もしくはLOX1 mRNAのコピー数/GAPDH mRNAのコピー数×10000）。
３．統計学的解析はMann-Whitney検定を用い，P値は0.05以下を有意差ありとした。

＜結果＞
１．結果を図１に示す。
(1) HB-EGFのmRNA発現量は，卵巣癌患者で288.60±475.99，良性卵巣腫瘍患者で16.55±15.47と，卵巣癌患者で有意に高い値を示していた（p＜0.001）。
(2) また，CD36のmRNA発現量は，卵巣癌患者で89.48±148.03，良性卵巣腫瘍患者で13.40±7.93と，卵巣癌患者で有意に高い値を示していた（p＜0.05）。
(3) 一方，LOX1のmRNA発現量は，卵巣癌患者で10.06±19.02，良性卵巣腫瘍患者で3.07±2.19であり，統計学的に有意差は認められなかった。
(4) 卵巣癌患者におけるCD36のmRNA発現量はLOX1のmRNA発現量と比較し有意に高い値を示していた（p＜0.001）。

＜＜実験例２．PTZによるCD36発現抑制効果＞＞
１．卵巣癌細胞株MCASを，6cmの培養皿に5×10⁵個ずつ播種し，PTZを1nM，10nM，100nM，1μM，10μMの濃度でそれぞれ添加し，72時間培養後にRNA抽出及びcDNA合成をTRIzolとSuperScript II reverse transcriptase (Invitrogen Corp.）を用いて行った。
２．CD36の発現は特異的なプライマーを用いたPCR法で行った。

＜結果＞
１．結果を図２に示す。
２．PTZの濃度が０から100nMの間では，PTZ濃度が増加するにつれ，CD36の発現が増加していた。しかしながら，PTZの濃度が1μMを超えると，CD36の発現はほとんど見られなかった。
３．このことから，PTZの濃度が一定濃度に達すると，CD36の発現が抑制されることが分かった。よって，PPARγアゴニストにより，CD36の発現を抑制しうることが分かった。

＜＜実験例３．In vitroにおけるPTZとCRM197の併用による抗腫瘍効果の確認＞＞
１．卵巣癌細胞株MCASを6cmの培養皿に5×10⁵個ずつ播種し，PTZを1μM，CRM197を10μg/mLの濃度でそれぞれ添加し，72時間培養した。
２．アポトーシスの同定は細胞を回収し4％パラホルムアルデヒドと70％エタノールで固定した後，TdT (MEBSTAIN Apoptosis Kit Direct, MBL, Co.)を37℃で1時間反応させ，アポトーシス陽性細胞をフローサイトメトリー (Becton Dickinson, FACScalibur) で解析した。
３．統計学的解析はMann-Whitney検定を用い，P値は 0.05以下を有意差ありとした。

＜結果＞
１．結果を図３に示す。
(1) PTZでは，アポトーシス陽性細胞が1.02±0.78％と，ほとんど見られなかった。
(2) また，CRM197では，アポトーシス陽性細胞が10.11±1.24％であり，PTZと比較して，有意なアポトーシス誘導効果が認められた。
(3) さらに，PTZとCRM197の併用では，アポトーシス陽性細胞が18.88±3.35％であり，CRM197単独と比較しても，有意なアポトーシス誘導効果が認められた。
２．この結果から，In vitroにおいて，PTZとCRM197を併用することにより，CRM197単独の使用と比較して，より強いアポトーシス誘導効果が見られることが分かった。

＜＜実験例４．In vivoにおけるPTZとCRM197の併用による抗腫瘍効果の確認＞＞
１．卵巣癌細胞株MCASをNOD/SCIDマウスの背部皮下に1匹あたり5×10⁶個ずつ播種し，腫瘍形成を認めた後，PTZを40mg/kgで週に5日間連続投与を４週間経口投与，CRM197を1mg/kgで10日間連続腹腔内投与した。
２．腫瘍の長径・短径を測定により腫瘍体積量を算出（長径×長径×短径／２）し，造腫瘍能抑制効果を評価した。
３．統計学的解析はMann-Whitney検定を用い，P値は0.05以下を有意差ありとした。

＜結果＞
１．結果を図４に示す。
(1) control群とPTZ投与群では，腫瘍体積量が経時的に増加した。
(2) 一方，CRM197投与群では，これらcontrol群およびPTZ投与群と比較して，腫瘍体積量の増加が，有意に抑制された。
(3) さらに，PTZ+CRM197投与群では，control群，PTZ投与群，CRM197投与群と比較して，腫瘍体積量の増加が，有意に抑制された。
２．この結果から，In vivoにおいても，PTZとCRM197を併用することにより，CRM197単独の使用と比較して，より強い腫瘍抑制効果が見られることが分かった。

Claims (1)

1. CRM197、及びピオグリタゾンを含む、癌を治療するための薬剤