JP2006232761A

JP2006232761A - 制癌剤

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Publication number: JP2006232761A
Application number: JP2005052165A
Authority: JP
Inventors: Eisuke Mekata; 英輔目加田; Shingo Miyamoto; 新吾宮本
Original assignee: Osaka University NUC; Kansai Technology Licensing Organization Co Ltd
Current assignee: Osaka University NUC; Kansai Technology Licensing Organization Co Ltd
Priority date: 2005-02-25
Filing date: 2005-02-25
Publication date: 2006-09-07
Also published as: CA2599150C; AU2005328131A2; US20110230418A1; CA2599150A1; US8507443B2; AU2005328131A1; AU2005328131B2; WO2006090494A1

Abstract

【課題】本発明は、悪性腫瘍、特に卵巣癌の治療に有効な制癌剤を提供する。
【解決手段】タキソール及びタキソール誘導体の少なくともいずれかと、ジフテリア毒素の変異体であってＨＢ−ＥＧＦとＥＧＦレセプターとの結合を阻害する活性を有しかつジフテリア毒素の毒性を実質的に有さないタンパク質とを、有効成分として含むことを特徴とする制癌剤である。
【選択図】なし

Description

本発明は、卵巣癌をはじめとする各種癌の治療に利用できる制癌剤及び癌治療方法に関する。

悪性腫瘍に対しては、各種の治療法及び治療薬が開発されているが、未だ充分な治療効果をあげることが出来ない場合が多い。特に、卵巣癌は婦人科領域の悪性腫瘍の中でも進行が早く、とりわけ予後の悪い悪性腫瘍である。
卵巣癌の治療法としては、現在タキソールを中心とした化学療法しか手立てが無いが、これらの化学療法も一時的効果はあるものの、後には再発を許すことが多く、新たな治療法の開発が求められている。

一方、ＨＢ−ＥＧＦはＥＧＦファミリーの細胞増殖因子で、身体の形成や再生過程に必須であると同時に、血管狭窄、動脈硬化症などの発症に関係する分子として知られている（例えば、非特許文献１参照）。この分子は膜結合型前駆体（ｐｒｏＨＢ−ＥＧＦ）として合成され、細胞表面でプロテアーゼにより切断されて分泌型ＨＢ−ＥＧＦを生じる。分泌型には、増殖促進作用があるが、膜型には増殖抑制作用が観察され、分泌型と膜型は適宜使い分けられることで、組織の形成と維持に働いているものと考えられている。

ＨＢ−ＥＧＦは、ＥＧＦリセプター（Ｈｅｒ１）及びＥＧＦリセプターファミリーのＨｅｒ４（ＥｒｂＢ−４）に結合し、活性化する。しかし、ＥＧＦリセプターファミリー（Ｈｅｒ１、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、Ｈｅｒ４）はホモダイマーを形成するほか、全ての組み合わせのヘテロダイマーを形成し得るので、結果的にＨＢ−ＥＧＦは全てのＥＧＦリセプターファミリー分子を活性化しうる。ＨＢ−ＥＧＦは種々の組織で発現されており、広範な細胞や組織で働いていると考えられているが、線維芽細胞、平滑筋細胞あるいはケラチノサイトの増殖をよく促進することが報告されている（例えば、非特許文献２参照）。

ＨＢ−ＥＧＦは前記のように膜結合型前駆体（ｐｒｏＨＢ−ＥＧＦ）として合成されるが、ｐｒｏＨＢ−ＥＧＦは、Ｎ末端から、シグナル配列、プロ配列、ヘパリン結合ドメイン、ＥＧＦ様ドメイン、ジャクスタメンブレンドメイン、トランスメンブレンドメイン、細胞質ドメインからなる（図１）。このｐｒｏＨＢ−ＥＧＦは、図中矢印の部分でプロテアーゼによる切断（エクトドメインシェディング）を受けて分泌型となる。ｐｒｏＨＢ−ＥＧＦのエクトドメインシェディングは、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）等がＧ蛋白共役型リセプターを介して、Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ経路を活性化する経路や、フォルボールエステルがＰＫＣを活性化する経路により刺激されることが提唱されている（例えば、非特許文献３参照）。

分泌型ＨＢ−ＥＧＦがＥＧＦリセプターに結合し、ＥＧＦリセプターのリン酸化を促す作用はＥＧＦ様ドメインに存在する（例えば、非特許文献１参照）。

ジフテリア毒素は、ジフテリア菌が産生する分子量約５９０００のタンパク質であるが、ＨＢ−ＥＧＦの膜結合型前駆体（ｐｒｏＨＢ−ＥＧＦ）を受容体とすることが知られている（例えば、非特許文献４参照）。また、ＣＲＭ１９７のようなジフテリア毒素の変異体は、分泌型ＨＢ−ＥＧＦの阻害剤として知られている（例えば、非特許文献５参照）。ジフテリア毒素のデータベース情報は、遺伝子についてはＥＭＢＬ；Ｋ０１７２２、アミノ酸配列はＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ；Ｐ００５８８、三次元構造はＰＤＢ；１ＭＤＴあるいは１ＸＤＴで見ることができる。ジフテリア毒素の遺伝子は菌体内に溶原化しているファージがコードしている。

ジフテリア毒素は、アミノ酸５３５個からなる単純タンパク質であり(ジフテリア毒素のアミノ酸配列（配列番号１）とそれをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号２）を図２及び図３に表し、イタリックはシグナル配列を表す)、還元剤で処理することにより分離されるフラグメントＡ部分とフラグメントＢ部分に分けられるが（図４）、立体構造解析等によれば、フラグメントＢ部分はさらに２つのドメインに分かれている。それぞれのドメインの機能は、フラグメントＡ部分に相当する触媒作用（catalytic）ドメイン（シグナル配列を除いたアミノ酸番号で１〜１９３）はＡＤＰリボシル化活性を、フラグメントＢ部分のＮ末端半分に相当する膜貫通（Transmembrane）ドメイン（シグナル配列を除いたアミノ酸番号で１９４〜３７８）はエンドソーム膜にチャネルを形成する性質を、フラグメントＢ部分のＣ末端半分に相当するレセプター結合（receptor-binding）ドメイン（シグナル配列を除いたアミノ酸番号で３８６〜５３５）は細胞表面のジフテリア毒素リセプターと結合する活性を有する。

ジフテリア毒素のフラグメントＡ（触媒作用ドメイン部分）は、ＮＡＤ存在下でＥＦ−２（ペプチド伸長因子２）をＡＤＰリボシル化する作用を有しており、これによりタンパク質合成を阻害する。したがって、ジフテリア毒素が毒性を発揮するためには、フラグメントＡが細胞質内に入らなければならない。
フラグメントＡが細胞質内に入る機構は、フラグメントＢにあるレセプター結合ドメインが細胞表面のリセプターであるｐｒｏＨＢ−ＥＧＦに結合することにより、ジフテリア毒素はエンドサイトーシスによりエンドソームに取り込まれ、エンドソーム内で膜貫通ドメインがエンドソーム膜に挿入され、最終的にはフラグメントＡがエンドソーム膜を通過して細胞質中に遊離され、そこでＥＦ−２を失活させる（例えば、非特許文献６参照）。
ジフテリア毒素が毒性を発揮するためには、フラグメントＡとフラグメントＢの両方が必要である。したがってどちらのフラグメントに変異があっても、ジフテリア毒素の毒性を有さないタンパク質ができる。
ジフテリア毒素には触媒作用ドメインに変異を有する無毒化された変異体、例えばＣＲＭ１９７が分離されている。

一方、ジフテリア毒素の変異体が、ＨＢ−ＥＧＦとＥＧＦレセプターとの結合を阻害する活性を有するのは、ジフテリア毒素が、分泌型ＨＢ−ＥＧＦのＥＧＦ様ドメインと結合するためである。また、この結合に関与するのはジフテリア毒素のレセプター結合ドメインである。ジフテリア毒素の５１６番目のＬｙｓ、５３０番目のＰｈｅがＨＢ―ＥＧＦの結合に重要であることが報告されている（例えば、非特許文献７参照）。また、ジフテリア毒素とＨＢ―ＥＧＦのＥＧＦドメインからなる複合体の結晶構造が解析されており、３８１−５３５までの間のＨＢ―ＥＧＦとの結合に重要なアミノ酸が報告されている（例えば、非特許文献８参照）。

このように、ジフテリア毒素変異体がＨＢ−ＥＧＦに結合し、ＨＢ−ＥＧＦの活性を阻害することが認められており、最近、ＨＢ−ＥＧＦを癌治療のターゲットとし、ジフテリア毒素変異体を癌治療薬に使用しようとする試みがなされているが未だ実用化には至っていない(特許文献１、非特許文献９)。

特開２００４−１５５７７６目加田英輔等著「遺伝子医学」株式会社メディカルドゥ社、vol.5 No.2 2001，p.131-134 Higashiyama, S. et al著 J.Cell Biol.（1993）122，p.933-940, Prenzel,N.et al著 Nature (1999) 402, p.884-888 J.G.Naglich et al著 Cell (1992) 69, p.1051-1061 T.Mitamura et al J.Biol.Chem.（1995） 270, p.1015 T.Umata et al著 J.Biol.Chem.（1998） 273, p.8351 Shen, HS et al著 J. Biol. Chem. (1994) 269, p.29077-29084 Gordon VL et al著 Molecular Cell (1997) 1, p.67-78 Miyamoto, S.et al著. Cancer Res. (2004) 64, 5720-5727.

本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、悪性腫瘍、特に卵巣癌の治療に有効な制癌剤を提供することを目的とする。

発明者らは、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ（タキソールＴａｘｏｌ））又はその誘導体とジフテリア毒素の変異体とを併用すると相乗的効果が得られるとの知見を得て、本発明に至った。
すなわち、本発明の前記課題を解決するための手段は以下の通りである。
＜１＞パクリタキセル及びパクリタキセル誘導体の少なくともいずれかと、ジフテリア毒素の変異体であってＨＢ−ＥＧＦとＥＧＦレセプターとの結合を阻害する活性を有しかつジフテリア毒素の毒性を実質的に有さないタンパク質とを、有効成分として含むことを特徴とする制癌剤である。
＜２＞タンパク質が、ジフテリア毒素のアミノ酸配列における少なくともレセプター結合ドメインを変異なしに含むことを特徴とする請求項１に記載の制癌剤である。
＜３＞タンパク質が、ジフテリア毒素のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である請求項１及び２のいずれかに記載の制癌剤である。
＜４＞タンパク質が、ＣＲＭ１９７及びＤＴ５２Ｅ１４８Ｋのいずれかである請求項３に記載の制癌剤である。
＜５＞パクリタキセル及びパクリタキセル誘導体の少なくともいずれかと、ジフテリア毒素の変異体であってＨＢ−ＥＧＦとＥＧＦレセプターとの結合を阻害する活性を有しかつジフテリア毒素の毒性を実質的に有さないタンパク質とを、併用することを特徴とする癌治療方法である。

本発明によると、悪性腫瘍、特に卵巣癌の治療に有効な制癌剤及び癌治療方法を提供することができる。

本発明の第一の態様の制癌剤は、パクリタキセル及びパクリタキセル誘導体の少なくともいずれかと、ジフテリア毒素の変異体であってＨＢ−ＥＧＦとＥＧＦレセプターとの結合を阻害する活性を有しかつジフテリア毒素の毒性を実質的に有さないタンパク質とを、有効成分として含むことを特徴とする。
前記ジフテリア毒素の変異体とは、ジフテリア毒素のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を表し、例えば１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である。また、ジフテリア毒素の２５個のシグナル配列は付いていても付いていなくてもよく、いずれの配列も本発明の範囲に含まれる。
また、パクリタキセル誘導体としては、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ(タキソテールＴａｘｏｔａｌｅ）等が挙げられる。

本発明の第二の態様の制癌剤は、パクリタキセル及びパクリタキセル誘導体の少なくともいずれかと、以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のいずれかのタンパク質であって、ＨＢ−ＥＧＦのＥＧＦレセプターへの結合を阻害する活性を有しかつジフテリア毒素の毒性を実質的に有さないタンパク質とを有効成分として含むことを特徴とする。（ａ）ジフテリア毒素の一部からなり、該ジフテリア毒素のレセプター結合ドメインを少なくとも含むタンパク質。（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｃ）（ａ）及び（ｂ）のいずれかのタンパク質を含む複合タンパク質。
前記タンパク質は、ジフテリア毒素の一部若しくはその変異体又はそれらのタンパク質を含む複合タンパク質であって、レセプター結合ドメインを保持するものをいう。

ここで、ジフテリア毒素の毒性とは、ジフテリア毒素が細胞表面の受容体に結合し、細胞内に侵入し、フラグメントＡが保持するＥＦ−２（ペプチド伸長因子２）をＡＤＰリボシル化する活性（ＡＤＰリボシル化活性）でもって、細胞の蛋白質合成機能を阻害することを意味し、これはタンパク質合成阻害の程度により容易に測定することができる。すなわち、培養細胞に一定量のジフテリア毒素を加えて２〜８時間程度培養し、続いて、放射性のアミノ酸存在下で短時間培養し、タンパク質に取り込まれた放射性アミノ酸量を測定する方法である。

具体的には、Ｖｅｒｏ細胞（１×１０^５細胞）を２４ウェルプレートに接種して、ＣＯ_２インキュベーターで１６時間培養する。細胞が十分にプレートに接着していることを確認してから、各ウェルに冷ＰＢＳ（１５０ｍＭ、ＮａＣｌ−２．７ｍＭＫＣｌ−１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２）で１回洗う。この時の液の出し入れは細胞をはがさないように慎重に行う。血清を含むアッセイ用培養液０．５ｍｌを加える。アッセイ用培養液は、通常の培地からロイシンの濃度を１／１０程度に減らしたものを使用する。これは後で加える［^３Ｈ］ロイシンの取り込み効率を高めるためである。但し、Ｈａｍ’ｓＦ１２培地は、ロイシン含量が少ないのでこれをアッセイ用培養液とすることもできる。血清は通常用いている濃度で加える。
次に、種々の濃度のジフテリア毒素を加えて、ＣＯ_２インキュベーターで２〜５時間培養する。３．７ＭＢｑ／ｍｌの［^３Ｈ］ロイシンを１０μｌ加えて更に１時間培養する。
培養液を捨て、ウェルをＰＢＳで１度洗った後、細胞を０．５ｍｌの０．１ＭＮａＯＨで溶解し、その溶液をチューブに集める。０．５ｍｌの０．１ＮＮａＯＨで再度ウェルを洗浄し、その溶液を同じチューブに集める。
これに２０％のトリクロロ酢酸溶液０．５ｍｌを加えて、Ｖｏｒｔｅｘミキサーでよく攪拌する。生じた沈殿をグラスフィルターでトラップし、フィルターをさらに５％トリクロロ酢酸溶液で洗浄する。
最後にフィルターを１００％エタノールで洗浄し、乾燥させる。
フィルターをトルエン−ＰＰＯのシンチレーターにつけて、フィルターにトラップされた放射能を液体シンチレーションカウンターで測定する。ジフテリア毒素を加えなかった試料の値を測定し、これを１００％として毒素を加えた時の値を％で求める。
ジフテリア毒素の毒性を実質的に有さないタンパク質とは、ジフテリア毒素の毒性を無毒化または極めて低レベルに弱毒化されたタンパク質をいい、本発明においては、ジフテリア毒素の毒性を１ｎｇ/ｍｌの濃度で上記Ｖｅｒｏ細胞の系で測定した場合、ジフテリア毒素を加えなかった試料または触媒作用ドメインを有しないジフテリア毒素変異体を加えた試料の値と有意差がないものをいう。前記有意差は、ｔ検定において有意水準５％として有意差が無いことが好ましく、有意水準１％として有意差が無いことがより好ましく、有意水準０．１％として有意差が無いことがさらに好ましい。

ただし、ＣＲＭ１９７やＤＴ５２Ｅ１４８Ｋのようなこれまでジフテリア毒素の毒性が全くないとされていた変異体であっても、きわめて微弱な毒性（例えばＣＲＭ１９７では野生型のジフテリア毒素の１０^１０分の１程度）が残存していることが証明されているが（特許文献１）、このような微弱な毒性を有している変異体が本発明から排除されるものではない。ジフテリア毒素の毒性レベルとしては、ＣＲＭ１９７と同じかそれ以下であることがジフテリア毒素の毒性による副作用を排除し、安全性を高める観点から好ましい。

ジフテリア毒素の毒性は、ペプチド伸長因子２をＡＤＰリボシル化するのに必須である触媒作用ドメインに変異を持たせること、または、触媒作用ドメインの一部または全部を欠損させることにより調整することができる。
変異させた触媒作用ドメインの機能は、ＡＤＰリボシル化活性を直接測定することで、正確に調べることができる。ＡＤＰリボシル化活性は、分離精製したＥＦ−２に、フラグメントＡあるいはＡＤＰリボシル化活性を測定したい蛋白質（変異させた触媒作用ドメイン等）とラジオアイソトープで標識したＮＡＤを加えて、試験管内でＥＦ−２をＡＤＰリボシル化させ、ＥＦ−２に取り込まれた放射能を測定することで、直接測定することができる。

具体的には、以下の文献(Moynihan, M.R. and Pappenheimer, A.M. Jr. Infect. Immun.(1981) 32, 575-582)で記載された方法で得たウサギ網状赤血球ＥＦ−２分画に、最終濃度２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）、1ｍＭＤＴＴ（ジチオスレイトール）、０．１〜１μｇ／ｍｌのフラグメントＡあるいは０．１−１００μｇ／ｍｌのＡＤＰリボシル化活性を測定したい蛋白質を加え、さらに最終的に３７０ＫＢｑ／ｍｌになるように[^３２Ｐ]ＮＡＤ(約７４０ＧＢｑ／ｍｍｏｌ)を加えて混和し、３７℃で１０分間反応させる。
その反応液に同容量の１０％−トリクロロ酢酸溶液を加えて蛋白質を沈殿させ、生じた沈殿をグラスフィルターでトラップし、フィルターをさらに５％トリクロロ酢酸溶液で洗浄する。

最後にフィルターを１００％エタノールで洗浄し、乾燥させる。
フィルターをトルエン−ＰＰＯのシンチレーターにつけて、フィルターにトラップされた放射能を液体シンチレーションカウンターで測定する。
測定された放射能がＡＤＰリボシル化活性の程度を示しており、変異を加えないフラグメントＡを用いたときの放射能を基準に、変異を加えた蛋白質のＡＤＰリボシル化活性の相対活性を求めることができる。

また、分泌型ＨＢ−ＥＧＦとＥＧＦレセプターとの結合を阻害する活性を有するという特徴は、発明者らが、ドメイン情報をもとに、より詳細に検討したところによると、レセプター結合ドメインを含む部分である３７８番目から５３５番目のアミノ酸配列を含んでいればよいことがわかった。すなわち、ＧＳＴ(Gluthathione-S-transferase)にジフテリア毒素の３７８番目から５３５番目までの配列を融合した遺伝子を作成し、これを大腸菌に発現させて、上記の構造を持つ融合タンパク質（ＧＳＴ−ＤＴ）を作成した。ＧＳＴ−ＤＴは、^１２５Ｉで標識したジフテリア毒素のＨＢ―ＥＧＦへの結合を、濃度依存的に阻害した。阻害の程度から、ＧＳＴ−ＤＴはジフテリア毒素と同程度の結合の強さで、ＨＢ―ＥＧＦに結合することがわかった。したがって、結合に必要なのは、３７８番目から５３５番目、すなわち、レセプター結合ドメインを含む部分であることがわかった。

ここで、ＨＢ−ＥＧＦとＥＧＦリセプターの結合を阻害する活性を有するかどうかは、前記のような、^１２５Ｉで標識したジフテリア毒素のＨＢ―ＥＧＦへの結合に対する阻害実験により測定することができる。

そこで、ＨＢ−ＥＧＦとＥＧＦレセプターとの結合を阻害する活性を有しかつジフテリア毒素の毒性を実質的に有さないタンパク質は、レセプター結合ドメインを保持しつつ、触媒作用ドメインに変異を持たせたジフテリア毒素変異体タンパク質や、ジフテリア毒素のレセプター結合ドメインを保持しつつ触媒作用ドメインの一部または全部を欠損させたジフテリア毒素の一部であるタンパク質を作成することにより得ることができる。

このような変異体の例としては、ＣＲＭ１９７、ＤＴ５２Ｅ１４８Ｋ及びＧＳＴ−ＤＴが挙げられる。これらはジフテリア毒素の毒性を実質的に持たず、ＨＢ−ＥＧＦのＥＧＦレセプターへの結合を阻害する。ＣＲＭ１９７は、２５個のシグナル配列を除いてカウントした場合の５２番目のＧｌｙがＧｌｕに変異した変異体であり、ＤＴ５２Ｅ１４８Ｋは、前記変異に加えてシグナル配列を除いてカウントした場合の１４８番目のＧｌｕがＬｙｓに変異した変異体である。また、ＧＳＴ−ＤＴはＧＳＴにジフテリア毒素のシグナル配列を除いてカウントした場合の３７８番目から５３５番目を含む蛋白質である。ＣＲＭ１９７に関するアミノ酸配列（最初の２５個の配列がシグナル配列を表す）を配列番号３に、それをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号４に表す。また、ＧＳＴ−ＤＴのアミノ酸配列（配列番号５）及びそれをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号６）を図５及び図６に表す。
ここで、ＣＲＭ１９７については、ジフテリア毒素の毒性を有さない、即ちＡＤＰリボシル化活性を有さないとの報告が既になされている（T. Uchida and A.M. Pappenheimer Jr. (1972) Science 175, 901-903)。また、１４８Ｅに変異を有する１４８Ｋ変異体が極めて弱い活性しか持たないことは知られており(J.T.Barbieri and R.J. Collier (1987) Infect. Immun. 55, 1647-1651)、５２Ｅ変異体であるＣＲＭ１９７にさらに１４８Ｋの変異を入れたダブルミュータントであるＤＴ５２Ｅ１４８Ｋは、さらに安全な変異体として好ましい。また、これらの変異体の毒性は、前記タンパク質合成阻害実験によってもジフテリア毒素を加えなかった試料の値と有意差がないことが確かめられた。なお、ＧＳＴ−ＤＴがジフテリア毒素の毒性を有しないことは、触媒作用ドメインを完全に欠如することから明らかである。

（配列番号３）
MSRKLFASILIGALLGIGAPPSAHAGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS

（配列番号４）
GTGAGCAGAAAACTGTTTGCGTCAATCTTAATAGGGGCGCTACTGGGGATAGGGGCCCCA
CCTTCAGCCCATGCAGGCGCTGATGATGTTGTTGATTCTTCTAAATCTTTTGTGATGGAA
AACTTTTCTTCGTACCACGGGACTAAACCTGGTTATGTAGATTCCATTCAAAAAGGTATA
CAAAAGCCAAAATCTGGTACACAAGGAAATTATGACGATGATTGGAAAGAGTTTTATAGT
ACCGACAATAAATACGACGCTGCGGGATACTCTGTAGATAATGAAAACCCGCTCTCTGGA
AAAGCTGGAGGCGTGGTCAAAGTGACGTATCCAGGACTGACGAAGGTTCTCGCACTAAAA
GTGGATAATGCCGAAACTATTAAGAAAGAGTTAGGTTTAAGTCTCACTGAACCGTTGATG
GAGCAAGTCGGAACGGAAGAGTTTATCAAAAGGTTCGGTGATGGTGCTTCGCGTGTAGTG
CTCAGCCTTCCCTTCGCTGAGGGGAGTTCTAGCGTTGAATATATTAATAACTGGGAACAG
GCGAAAGCGTTAAGCGTAGAACTTGAGATTAATTTTGAAACCCGTGGAAAACGTGGCCAA
GATGCGATGTATGAGTATATGGCTCAAGCCTGTGCAGGAAATCGTGTCAGGCGATCAGTA
GGTAGCTCATTGTCATGCATAAATCTTGATTGGGATGTCATAAGGGATAAAACTAAGACA
AAGATAGAGTCTTTGAAAGAGCATGGCCCTATCAAAAATAAAATGAGCGAAAGTCCCAAT
AAAACAGTATCTGAGGAAAAAGCTAAACAATACCTAGAAGAATTTCATCAAACGGCATTA
GAGCATCCTGAATTGTCAGAACTTAAAACCGTTACTGGGACCAATCCTGTATTCGCTGGG
GCTAACTATGCGGCGTGGGCAGTAAACGTTGCGCAAGTTATCGATAGCGAAACAGCTGAT
AATTTGGAAAAGACAACTGCTGCTCTTTCGATACTTCCTGGTATCGGTAGCGTAATGGGC
ATTGCAGACGGTGCCGTTCACCACAATACAGAAGAGATAGTGGCACAATCAATAGCTTTA
TCGTCTTTAATGGTTGCTCAAGCTATTCCATTGGTAGGAGAGCTAGTTGATATTGGTTTC
GCTGCATATAATTTTGTAGAGAGTATTATCAATTTATTTCAAGTAGTTCATAATTCGTAT
AATCGTCCCGCGTATTCTCCGGGGCATAAAACGCAACCATTTCTTCATGACGGGTATGCT
GTCAGTTGGAACACTGTTGAAGATTCGATAATCCGAACTGGTTTTCAAGGGGAGAGTGGG
CACGACATAAAAATTACTGCTGAAAATACCCCGCTTCCAATCGCGGGTGTCCTACTACCG
ACTATTCCTGGAAAGCTGGACGTTAATAAGTCCAAGACTCATATTTCCGTAAATGGTCGG
AAAATAAGGATGCGTTGCAGAGCTATAGACGGTGATGTAACTTTTTGTCGCCCTAAATCT
CCTGTTTATGTTGGTAATGGTGTGCATGCGAATCTTCACGTGGCATTTCACAGAAGCAGC
TCGGAGAAAATTCATTCTAATGAAATTTCGTCGGATTCCATAGGCGTTCTTGGGTACCAG
AAAACAGTAGATCACACCAAGGTTAATTCTAAGCTATCGCTATTTTTTGAAATCAAAAGC
TGA

なお、レセプター結合ドメインを含む断片は、プラスミッドに組み込まれたＣＲＭ１９７をコードする遺伝子(Ｐβ１９７)を鋳型にして、ＰＣＲ法にてレセプター結合ドメイン部分のＤＮＡ配列を合成して、これをＧＳＴ融合タンパク質やヒスチジンタグを合成させるための発現ベクター（pGEX-3X、pQE-30）のマルチクローニングサイトに挿入し、得られたプラスミッドを大腸菌に組み込み、プラスミッドがコードする遺伝子を大腸菌で合成させることで作成できる。
また、触媒作用ドメインに変異を有する変異体は、以下のようにして作成することができる。プラスミッドに組み込まれたＣＲＭ１９７をコードする遺伝子(Ｐβ１９７)を鋳型にして、変異を持たせたい部位をプライマーとして、ＰＣＲ法にてＣＲＭ１９７領域を合成する。プライマーは、変異を持つように点突然変異を導入したものを合成し、使用する。合成したＤＮＡを、大腸菌用の遺伝子発現ベクター（ｐＥＴ−２２ｂ）に組み込み、大腸菌に形質導入を行い、変異体を大腸菌で発現させて、作成することができる。

本発明の制癌剤は、乳癌、前立腺癌、甲状腺癌、卵巣癌等、悪性腫瘍全般の治療に用いることができるが、好ましくはＨＢ−ＥＧＦを発現している悪性腫瘍に用いることができ、特に卵巣癌に好適に用いることができる。

本発明の制癌剤は、上記有効成分をそのまま、または、薬学的に許容される医薬用担体と組合せて製剤化することができる。
前記制癌剤は、経口的又は非経口的（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下又は皮内等への注射、直腸内投与、経粘膜投与、経気道投与など）に投与することができる。卵巣癌等腹腔内に播種する悪性腫瘍に適用する場合には、腹腔内に注射により投与することが、癌細胞に直接運搬される点で好ましい。
経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などを挙げることができ、非経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤、経皮吸収剤などを挙げることができるが、剤形はこれらに限定されることはない。

前記制癌剤の製造に用いられる製剤用添加物の種類は特に限定されず、当業者が適宜選択可能である。例えば、賦形剤、崩壊剤又は崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、基剤、溶解剤又は溶解補助剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、緩衝剤、抗酸化剤、防腐剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、溶解剤、安定化剤などを用いることができ、これらの目的で使用される個々の具体的成分は当業者に周知されている。

経口投与用の製剤の調製に用いることができる製剤用添加物として、例えば、ブドウ糖、乳糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、又は結晶セルロース等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、デンプン、又はカルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤又は崩壊補助剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、又はゼラチン等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム又はタルク等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコール又は酸化チタン等のコーティング剤；ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、又はハードファット等の基剤を用いることができる。

注射あるいは点滴用の製剤の調製に用いることができる製剤用添加物としては、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール等の水性あるいは用時溶解型注射剤を構成しうる溶解剤又は溶解補助剤；ブドウ糖、塩化ナトリウム、D-マンニトール、グリセリン等の等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩基又は有機塩基等のｐＨ調節剤等の製剤用添加物を用いることができる。
前記本発明の制癌剤に含まれる有効成分の量は、制癌剤の製剤形態または投与経路によって異なり、一概に規定することはできないが、通常、最終製剤中に約０．０００１％から７０％の範囲から適宜選択して決定することができる。

本発明の制癌剤は、ヒトを含む哺乳動物に投与することができる。
本発明の制癌剤の投与量は、患者の年齢、性別、体重、症状、及び投与経路などの条件に応じて適宜増減されるべきであるが、成人一日あたりの有効成分の量として、有効成分のひとつであるジフテリア毒素の変異体タンパク質としては、体重１ｋｇあたり１μgから３０ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。また、パクリタキセル又はパクリタキセル誘導体としては、体重１ｋｇあたり０.２〜４ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。上記投与量の医薬は一日一回に投与してもよいし、数回に分けて投与してもよい。また、数日から数週間に１度又は単発的に投与してもよい。また、ステロイド等、副作用を抑える成分とともに投与することもできる。ジフテリア毒素の変異体タンパク質とパクリタキセル又はその誘導体とは、同時に投与してもよいし、時間差をつけて投与しても良い。

以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこの実施例に何ら限定されるものではない。

（実施例１）
（ＣＲＭ１９７タンパク質の生成）
Ｃ７（β１９７）の溶原菌のストック（Ｃ７(β１９７)ファージを溶原化したジフテリア菌Ｃ７(ｂｅｔａ１９７)Ｍ１としてＡＴＣＣ(American Type Culture Collection)Bacteria collection(No.39255)から入手可能）を培養し、対数増殖期の後期の菌液を、２％の濾過したマルトースを加えたＣ−Ｙ培地に、最初のＯＤ５９０が約０．０５になるように加える。このＯＤは、約５×１０^７菌体／ｍｌにあたる。フラスコは毎分２００回転のロータリーシェーカーに載せ、３５℃で１６時間から１７時間培養する。ＯＤが１０から１５になった時点で、培養を終了する。

前記Ｃ−Ｙ培地は、以下のように調製する。即ち、１０ｇのカサミノ酸、２０ｇの酵母抽出液、５ｇのＫＨ_２ＰＯ_４を１ｌの蒸留水に溶かす。２ｍｌの５０％ＣａＣｌ_２.２Ｈ_２Ｏを加えた後、ｐＨを７．４に調整する。沸騰させた後、濾過する。２ｍｌのＭｕｅｌｌｅｒとＭｉｌｌｅｒの溶液ＩＩ(２２．５ｇＭｇＳＯ_４、０．１１５ｇ βアラニン、０．１１５ｇニコチン酸、７．５ｍｇピメリン酸、１ｇＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、１ｇＺｎＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、１ｇＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ／１００ｍｌＨ_２Ｏ)と１ｍｌのＭｕｅｌｌｅｒとＭｉｌｌｅｒの溶液ＩＩＩ（２０ｇＬ−シスチン、２０ｍｌ濃塩酸／１００ｍｌＨ_２Ｏ）を加える。１００ｍＬずつ分注し、オートクレーブをかけることによりＣ−Ｙ培地を得た。

ＣＲＭタンパクの精製は、以下のようにして行う。
培養液は、１００００ｇで１５分間遠心する。培養上清に硫安を６５％の飽和状態になるように加える。氷室で２４から４８時間放置する。沈殿物を集めて０．０２ＭのｐＨ７．２のトリス−塩酸バッファーに溶かし、同液にて透析する。
遠心して、不溶物を除き、ＤＥ５２カラムに添加し、０．０２ＭのｐＨ７．２のトリス−塩酸バッファー中のＮａＣｌの濃度勾配により溶出する。ＣＲＭ１９７は、ＮａＣｌが０．０８Ｍのところで溶出する。溶出した液を硫安で６５％飽和状態にする。沈殿物を０．０１Ｍのトリス−塩酸バッファーに溶かし、再び平衡化する。そして、ＤＥ５２カラムに再び掛け、再度硫安沈殿する。続いて、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−２００のカラムにかけ、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．２、０．１５ＭＮａＣｌの溶液で溶出する。溶出されたＣＲＭ１９７をＤｅＴｏｘｉゲルにアプライして、ＣＲＭ１９７試料に含まれるＬＰＳ類似物質を取り除き、実験に使用する。ＣＲＭ１９７の２８０ｎｍにおける吸収は、１ＯＤが約０．６７ｍｇ／ｍｌに相当する。

（細胞株の準備）
卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ−３は、ＡＴＣＣ(American Type Culture Collection)から入手した。
ＳＫ−ＨＢ−１細胞は、ＳＫＯＶ３細胞に、ｐＲＣ／ＣＭＶベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に組み込まれたヒトＨＢ−ＥＧＦｃＤＮＡをトランスフェクションした。トランスフェクションはＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社)を用いて、製品に添付のマニュアルに従って行った。トランスフェクションされた細胞は、４００ｕｇ／ｍｌＧ４１８を含む培養液（ＲＰＭＩ１６４０−１０ＦＣＳ）で培養し、生き残った細胞を再度低密度でペトリ皿にまき直し、成長したコロニーを拾って、ＳＫ−ＨＢ−１細胞を得た。この細胞がＨＢ−ＥＧＦを高発現していることは、^１２５Ｉで標識したジフテリア毒素を細胞に加えて、細胞に結合したジフテリア毒素の放射活性をＳＫＯＶ３細胞と比較することで、確認した。

（ヌードマウスを用いた造腫瘍性実験）
ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳで培養した卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ−３（ＡＴＣＣから入手可）及びＳＫ−ＨＢ１を、それぞれ、ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）で洗浄し、０．２５％トリプシンで回収した。ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳで２回、ＲＰＭＩ（血清なし）で２回洗浄し、５×１０^６細胞ずつＲＰＭＩ（血清あり）２５０μＬへ添加し、これをヌードマウスの背部に皮下注射により接種した。

一群のヌードマウスについては、ＳＫＯＶ−３又はＳＫ−ＨＢ１細胞接種１０日後よりＣＲＭ１９７の投与を開始し、腹腔内に図７及び図８に表す量で、週１回、４週に渡って投与した。ＣＲＭ１９７を投与しないヌードマウスを対照実験とした。投与時期と腫瘍体積の関係を図７から図８に示す。ここで、腫瘍体積は、できた腫瘍の長径、短径を３〜４日ごとに測定し、長径×短径×短径×１／２で求めた。
次に、他の群のヌードマウスについては、ＳＫＯＶ−３又はＳＫ−ＨＢ１細胞接種７日後よりＣＲＭ１９７及びタキソール（ブリストル製薬株式会社製）を併用して投与を開始し、腹腔内に図９及び図１０に表す量で、週１回、４週に渡って投与した。ＣＲＭ１９７及びタキソールを投与しないヌードマウスを対照実験とした。投与時期と腫瘍体積の関係を図９から図１０に示す。
これらの結果から、タキソールとＣＲＭ１９７とを併用することにより、腫瘍の成長の抑制効果が相乗的に高くなることが分かった。

本発明は、卵巣癌をはじめとする各種癌の治療に有効な制癌剤の製造に利用できる。

図１は、ｐｒｏＨＢ−ＥＧＦの構造を表す模式図である。図２は、ジフテリア毒素のアミノ酸配列及び塩基配列を表す図である。図３は、ジフテリア毒素のアミノ酸配列及び塩基配列を表す図である（図２の続き）。図４は、ジフテリア毒素のドメイン構造を表す模式図である。図５は、ＧＳＴ−ＤＴのアミノ酸配列及び塩基配列を表す図である。図６は、ＧＳＴ−ＤＴのアミノ酸配列及び塩基配列を表す図である（図５の続き）。図７は、ＳＫＯＶ−３細胞注射ヌードマウスにおけるＣＲＭ１９７投与による腫瘍増殖に対する効果を表す図である。図８は、ＳＫ−ＨＢ１細胞注射ヌードマウスにおけるＣＲＭ１９７投与による腫瘍増殖に対する効果を表す図である。図９は、ＳＫＯＶ−３細胞注射ヌードマウスにおけるＣＲＭ１９７及びタキソール投与よる腫瘍増殖に対する効果を表す図である。図１０は、ＳＫ−ＨＢ１細胞注射ヌードマウスにおけるＣＲＭ１９７及びタキソール投与による腫瘍増殖に対する効果を表す図である。

Claims

パクリタキセル及びパクリタキセル誘導体の少なくともいずれかと、ジフテリア毒素の変異体であってＨＢ−ＥＧＦとＥＧＦレセプターとの結合を阻害する活性を有しかつジフテリア毒素の毒性を実質的に有さないタンパク質とを、有効成分として含むことを特徴とする制癌剤。
タンパク質が、ジフテリア毒素のアミノ酸配列における少なくともレセプター結合ドメインを変異なしに含むことを特徴とする請求項１に記載の制癌剤。
タンパク質が、ジフテリア毒素のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である請求項１及び２のいずれかに記載の制癌剤。
タンパク質が、ＣＲＭ１９７及びＤＴ５２Ｅ１４８Ｋのいずれかである請求項３に記載の制癌剤。