JP2004155776A - 制癌剤 - Google Patents

Abstract

【課題】 本発明は、悪性腫瘍、特に卵巣癌の治療に有効な制癌剤を提供する。
【解決手段】 ジフテリア毒素の変異体であってＨＢ−ＥＧＦとＥＧＦレセプターとの結合を阻害する活性を有しかつジフテリア毒素の毒性を実質的に有さないタンパク質、或いは、ジフテリア毒素の一部からなり該ジフテリア毒素のレセプター結合ドメインを少なくとも含むタンパク質又は該タンパク質を含む複合タンパク質等であってＨＢ−ＥＧＦのＥＧＦレセプターへの結合を阻害する活性を有しかつジフテリア毒素の毒性を実質的に有さないタンパク質を、有効成分として含むことを特徴とする制癌剤である。
【選択図】 なし

Description

本発明は、卵巣癌をはじめとする各種癌の治療に利用できる制癌剤に関する。

悪性腫瘍に対しては、各種の治療法及び治療薬が開発されているが、未だ充分な治療効果をあげることが出来ない場合が多い。特に、卵巣癌は婦人科領域の悪性腫瘍の中でも進行が早く、とりわけ予後の悪い悪性腫瘍である。
卵巣癌の治療法としては、現在タキソールを中心とした化学療法しか手立てが無いが、これらの化学療法も一時的効果はあるものの、後には再発を許すことが多く、新たな治療法の開発が求められている。

ＨＢ−ＥＧＦはＥＧＦファミリーの細胞増殖因子で、身体の形成や再生過程に必須であると同時に、血管狭窄、動脈硬化症などの発症に関係する分子として知られているが（例えば、非特許文献１参照）、この因子を悪性腫瘍の治療のターゲットとすることは現在まで全く行われていなかった。この分子は膜結合型前駆体（ｐｒｏＨＢ−ＥＧＦ）として合成され、細胞表面でプロテアーゼにより切断されて分泌型ＨＢ−ＥＧＦを生じる。分泌型には、増殖促進作用があるが、膜型には増殖抑制作用が観察され、分泌型と膜型は適宜使い分けられることで、組織の形成と維持に働いているものと考えられている。

ＨＢ−ＥＧＦは、ＥＧＦリセプター（Ｈｅｒ１）及びＥＧＦリセプターファミリーのＨｅｒ４（ＥｒｂＢ−４）に結合し、活性化する。しかし、ＥＧＦリセプターファミリー（Ｈｅｒ１、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、Ｈｅｒ４）はホモダイマーを形成するほか、全ての組み合わせのヘテロダイマーを形成し得るので、結果的にＨＢ−ＥＧＦは全てのＥＧＦリセプターファミリー分子を活性化しうる。ＨＢ−ＥＧＦは種々の組織で発現されており、広範な細胞や組織で働いていると考えられているが、線維芽細胞、平滑筋細胞あるいはケラチノサイトの増殖をよく促進することが報告されている（例えば、非特許文献２参照）。

ＨＢ−ＥＧＦは前記のように膜結合型前駆体（ｐｒｏＨＢ−ＥＧＦ）として合成されるが、ｐｒｏＨＢ−ＥＧＦは、Ｎ末端から、シグナル配列、プロ配列、ヘパリン結合ドメイン、ＥＧＦ様ドメイン、ジャクスタメンブレンドメイン、トランスメンブレンドメイン、細胞質ドメインからなる（図１）。このｐｒｏＨＢ−ＥＧＦは、図中矢印の部分でプロテアーゼによる切断（エクトドメインシェディング）を受けて分泌型となる。ｐｒｏＨＢ−ＥＧＦのエクトドメインシェディングは、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）等がＧ蛋白共役型リセプターを介して、Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ経路を活性化する経路や、フォルボールエステルがＰＫＣを活性化する経路により刺激されることが提唱されている（例えば、非特許文献３参照）。

分泌型ＨＢ−ＥＧＦがＥＧＦリセプターに結合し、ＥＧＦリセプターのリン酸化を促す作用はＥＧＦ様ドメインに存在する（例えば、非特許文献１参照）。

一方ジフテリア毒素は、ジフテリア菌が産生する分子量約５９０００のタンパク質であるが、ＨＢ−ＥＧＦの膜結合型前駆体（ｐｒｏＨＢ−ＥＧＦ）を受容体とすることが知られている（例えば、非特許文献４参照）。また、ＣＲＭ１９７のようなジフテリア毒素の変異体は、分泌型ＨＢ−ＥＧＦの阻害剤として知られている（例えば、非特許文献５参照）。ジフテリア毒素のデータベース情報は、遺伝子についてはＥＭＢＬ；Ｋ０１７２２、アミノ酸配列はＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ；Ｐ００５８８、三次元構造はＰＤＢ；１ＭＤＴあるいは１ＸＤＴで見ることができる。ジフテリア毒素の遺伝子は菌体内に溶原化しているファージがコードしている。

ジフテリア毒素は、アミノ酸５３５個からなる単純タンパク質であり(ジフテリア毒素のアミノ酸配列（配列番号１）とそれをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号２）を図２及び図３に表し、イタリックはシグナル配列を表す)、還元剤で処理することにより分離されるフラグメントＡ部分とフラグメントＢ部分に分けられるが（図４）、立体構造解析等によれば、フラグメントＢ部分はさらに２つのドメインに分かれている。それぞれのドメインの機能は、フラグメントＡ部分に相当する触媒作用（catalytic）ドメイン（シグナル配列を除いたアミノ酸番号で１〜１９３）はＡＤＰリボシル化活性を、フラグメントＢ部分のＮ末端半分に相当する膜貫通（Transmembrane）ドメイン（シグナル配列を除いたアミノ酸番号で１９４〜３７８）はエンドソーム膜にチャネルを形成する性質を、フラグメントＢ部分のＣ末端半分に相当するレセプター結合（receptor-binding）ドメイン（シグナル配列を除いたアミノ酸番号で３８６〜５３５）は細胞表面のジフテリア毒素リセプターと結合する活性を有する。

ジフテリア毒素のフラグメントＡ（触媒作用ドメイン部分）は、ＮＡＤ存在下でＥＦ−２（ペプチド伸長因子２）をＡＤＰリボシル化する作用を有しており、これによりタンパク質合成を阻害する。したがって、ジフテリア毒素が毒性を発揮するためには、フラグメントＡが細胞質内に入らなければならない。
フラグメントＡが細胞質内に入る機構は、フラグメントＢにあるレセプター結合ドメインが細胞表面のリセプターであるｐｒｏＨＢ−ＥＧＦに結合することにより、ジフテリア毒素はエンドサイトーシスによりエンドソームに取り込まれ、エンドソーム内で膜貫通ドメインがエンドソーム膜に挿入され、最終的にはフラグメントＡがエンドソーム膜を通過して細胞質中に遊離され、そこでＥＦ−２を失活させる（例えば、非特許文献６参照）。
ジフテリア毒素が毒性を発揮するためには、フラグメントＡとフラグメントＢの両方が必要である。したがってどちらのフラグメントに変異があっても、ジフテリア毒素の毒性を有さないタンパク質ができる。
ジフテリア毒素には触媒作用ドメインに変異を有する無毒化された変異体、例えばＣＲＭ１９７が分離されている。

一方、ジフテリア毒素の変異体が、ＨＢ−ＥＧＦとＥＧＦレセプターとの結合を阻害する活性を有するのは、ジフテリア毒素が、分泌型ＨＢ−ＥＧＦのＥＧＦ様ドメインと結合するためである。また、この結合に関与するのはジフテリア毒素のレセプター結合ドメインである。ジフテリア毒素の５１６番目のＬｙｓ、５３０番目のＰｈｅがＨＢ―ＥＧＦの結合に重要であることが報告されている（例えば、非特許文献７参照）。また、ジフテリア毒素とＨＢ―ＥＧＦのＥＧＦドメインからなる複合体の結晶構造が解析されており、３８１−５３５までの間のＨＢ―ＥＧＦとの結合に重要なアミノ酸が報告されている（例えば、非特許文献８参照）。

このように、ジフテリア毒素変異体がＨＢ−ＥＧＦに結合し、ＨＢ−ＥＧＦの活性を阻害することは認められていたが、ＨＢ−ＥＧＦを癌治療のターゲットとすること自体が知られていなかったこと、及び、ＨＢ−ＥＧＦを含む制御機構の複雑さから、ジフテリア毒素変異体を癌治療薬に使用しようとする試みは全くなされていなかった。

目加田英輔等著「遺伝子医学」株式会社メディカルドゥ社、vol.5 No.2 2001，p.131-134 Higashiyama, S. et al著 J.Cell Biol.（1993）122，p.933-940, Prenzel,N.et al著 Nature (1999) 402,p.884-888 J.G.Naglich et al著 Cell (1992) 69,p.1051-1061 T.Mitamura et al J.Biol.Chem.（1995） 270,p.1015 T.Umata et al著 J.Biol.Chem.（1998） 273,p.8351 Shen, HS et al著 J. Biol. Chem. (1994) 269,p.29077-29084 Gordon VL et al著 Molecular Cell (1997) 1, p.67-78

本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、悪性腫瘍、特に卵巣癌の治療に有効な制癌剤を提供することを目的とする。

発明者らは、これまで身体の形成や再生過程に必須であると同時に、血管狭窄、動脈硬化症などの発症に関係するタンパク質として知られていた分泌型ＨＢ−ＥＧＦの機能を再検討し、癌細胞の増殖、転移過程にＨＢ−ＥＧＦが関与しているとの知見を得た。これに基づき、新たな治療法の開発を進め、その結果ＨＢ−ＥＧＦ中和能を有するＣＲＭ１９７が、ヌードマウスに接種したヒト卵巣癌由来細胞の増殖を有意に抑制することを明らかにし、本発明に至った。
すなわち、本発明の前記課題を解決するための手段は以下の通りである。
＜１＞ ジフテリア毒素の変異体であってＨＢ−ＥＧＦとＥＧＦレセプターとの結合を阻害する活性を有しかつジフテリア毒素の毒性を実質的に有さないタンパク質を、有効成分として含むことを特徴とする制癌剤である。
＜２＞ タンパク質が、ジフテリア毒素のアミノ酸配列における少なくともレセプター結合ドメインを変異なしに含むことを特徴とする前記＜１＞に記載の制癌剤である。
＜３＞ タンパク質が、ジフテリア毒素のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である前記＜１＞及び＜２＞のいずれかに記載の制癌剤である。
＜４＞ タンパク質が、ＣＲＭ１９７及びＤＴ５２Ｅ１４８Ｋのいずれかである前記＜３＞に記載の制癌剤である。
＜５＞ 前記ジフテリア毒素の変異体に残存するジフテリア毒素の毒性を中和する活性を有し、かつ、前記ジフテリア毒素の変異体の細胞への結合を抑制しない前記ジフテリア毒素の変異体のモノクローナル抗体をさらに含み、
前記ジフテリア毒素の変異体のモノクローナル抗体と、ジフテリア毒素の変異体とが複合体を形成する前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の制癌剤である。
＜６＞ 前記ジフテリア毒素の変異体のモノクローナル抗体が、＃２ ａｎｔｉ−ＤＴ ｍＡｂである前記＜５＞に記載の制癌剤である。
＜７＞ 以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のいずれかのタンパク質であって、ＨＢ−ＥＧＦのＥＧＦレセプターへの結合を阻害する活性を有しかつジフテリア毒素の毒性を実質的に有さないタンパク質を有効成分として含むことを特徴とする制癌剤である。
（ａ） ジフテリア毒素の一部からなり、該ジフテリア毒素のレセプター結合ドメインを少なくとも含むタンパク質
（ｂ） （ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ） （ａ）及び（ｂ）のいずれかのタンパク質を含む複合タンパク質
＜８＞ （ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のいずれかのタンパク質が、ジフテリア毒素の触媒作用ドメインを有しない前記＜７＞に記載の制癌剤である。
＜９＞ （ｃ）のタンパク質が、ＧＳＴ−ＤＴである前記＜８＞に記載の制癌剤である。

本発明によると、悪性腫瘍、特に卵巣癌の治療に有効な制癌剤を提供することができる。

発明者らは、ＨＢ−ＥＧＦの機能を検討する中で、ＨＢ−ＥＧＦには造腫瘍性があるとの知見を得たことに基づき、ＨＢ−ＥＧＦのＥＧＦレセプターへの結合阻害活性が知られているジフテリア毒素の無毒化変異体の制癌作用を実証した。

本発明の第一の態様の制癌剤は、ジフテリア毒素の変異体であってＨＢ−ＥＧＦとＥＧＦレセプターとの結合を阻害する活性を有しかつジフテリア毒素の毒性を実質的に有さないタンパク質を、有効成分として含むことを特徴とする。
前記ジフテリア毒素の変異体とは、ジフテリア毒素のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を表し、例えば１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である。また、ジフテリア毒素の２５個のシグナル配列は付いていても付いていなくてもよく、いずれの配列も本発明の範囲に含まれる。

本発明の第二の態様の制癌剤は、以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のいずれかのタンパク質であって、ＨＢ−ＥＧＦのＥＧＦレセプターへの結合を阻害する活性を有しかつジフテリア毒素の毒性を実質的に有さないタンパク質を有効成分として含むことを特徴とする。（ａ） ジフテリア毒素の一部からなり、該ジフテリア毒素のレセプター結合ドメインを少なくとも含むタンパク質。（ｂ） （ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｃ） （ａ）及び（ｂ）のいずれかのタンパク質を含む複合タンパク質。
前記タンパク質は、ジフテリア毒素の一部若しくはその変異体又はそれらのタンパク質を含む複合タンパク質であって、レセプター結合ドメインを保持するものをいう。

ここで、ジフテリア毒素の毒性とは、ジフテリア毒素が細胞表面の受容体に結合し、細胞内に侵入し、フラグメントＡが保持するＥＦ−２（ペプチド伸長因子２）をＡＤＰリボシル化する活性（ＡＤＰリボシル化活性）でもって、細胞の蛋白質合成機能を阻害することを意味し、これはタンパク質合成阻害の程度により容易に測定することができる。すなわち、培養細胞に一定量のジフテリア毒素を加えて２〜８時間程度培養し、続いて、放射性のアミノ酸存在下で短時間培養し、タンパク質に取り込まれた放射性アミノ酸量を測定する方法である。

具体的には、Ｖｅｒｏ細胞（１×１０^５細胞）を２４ウェルプレートに接種して、ＣＯ_２インキュベーターで１６時間培養する。細胞が十分にプレートに接着していることを確認してから、各ウェルに冷ＰＢＳ（１５０ｍＭ、ＮａＣｌ−２．７ｍＭ ＫＣｌ−１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２）で１回洗う。この時の液の出し入れは細胞をはがさないように慎重に行う。血清を含むアッセイ用培養液０．５ｍｌを加える。アッセイ用培養液は、通常の培地からロイシンの濃度を１／１０程度に減らしたものを使用する。これは後で加える［^３Ｈ］ロイシンの取り込み効率を高めるためである。但し、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地は、ロイシン含量が少ないのでこれをアッセイ用培養液とすることもできる。血清は通常用いている濃度で加える。
次に、種々の濃度のジフテリア毒素を加えて、ＣＯ_２インキュベーターで２〜５時間培養する。３．７ＭＢｑ／ｍｌの［^３Ｈ］ロイシンを１０μｌ加えて更に１時間培養する。
培養液を捨て、ウェルをＰＢＳで１度洗った後、細胞を０．５ｍｌの０．１Ｍ ＮａＯＨで溶解し、その溶液をチューブに集める。０．５ｍｌの０．１Ｎ ＮａＯＨで再度ウェルを洗浄し、その溶液を同じチューブに集める。
これに２０％のトリクロロ酢酸溶液０．５ｍｌを加えて、Ｖｏｒｔｅｘミキサーでよく攪拌する。生じた沈殿をグラスフィルターでトラップし、フィルターをさらに５％トリクロロ酢酸溶液で洗浄する。
最後にフィルターを１００％エタノールで洗浄し、乾燥させる。
フィルターをトルエン−ＰＰＯのシンチレーターにつけて、フィルターにトラップされた放射能を液体シンチレーションカウンターで測定する。ジフテリア毒素を加えなかった試料の値を測定し、これを１００％として毒素を加えた時の値を％で求める。
ジフテリア毒素の毒性を実質的に有さないタンパク質とは、ジフテリア毒素の毒性を無毒化または極めて低レベルに弱毒化されたタンパク質をいい、本発明においては、ジフテリア毒素の毒性を１ｎｇ/ｍｌの濃度で上記Ｖｅｒｏ細胞の系で測定した場合、ジフテリア毒素を加えなかった試料または触媒作用ドメインを有しないジフテリア毒素変異体を加えた試料の値と有意差がないものをいう。前記有意差は、ｔ検定において有意水準５％として有意差が無いことが好ましく、有意水準１％として有意差が無いことがより好ましく、有意水準０．１％として有意差が無いことがさらに好ましい。

ただし、本発明のなかで、ＣＲＭ１９７やＤＴ５２Ｅ１４８Ｋのようなこれまでジフテリア毒素の毒性が全くないとされていた変異体であっても、きわめて微弱な毒性（例えばＣＲＭ１９７では野生型のジフテリア毒素の１０^１０分の１程度）が残存していることが証明され、このような微弱な毒性を有している変異体が本発明から排除されるものではない。ジフテリア毒素の毒性レベルとしては、ＣＲＭ１９７と同じかそれ以下であることがジフテリア毒素の毒性による副作用を排除し、安全性を高める観点から好ましい。しかし、一方では該毒性が、制癌剤の効果に寄与することが本発明により示唆されるため、ＣＲＭ１９７と同程度の極めて低レベルの毒性を有することも、制癌効果を高める観点から好ましい。したがって、製剤処方にあわせて、適宜ジフテリア毒素の毒性レベルを選択することができる。

ジフテリア毒素の毒性は、ペプチド伸長因子２をＡＤＰリボシル化するのに必須である触媒作用ドメインに変異を持たせること、または、触媒作用ドメインの一部または全部を欠損させることにより調整することができる。
変異させた触媒作用ドメインの機能は、ＡＤＰリボシル化活性を直接測定することで、正確に調べることができる。ＡＤＰリボシル化活性は、分離精製したＥＦ−２に、フラグメントＡあるいはＡＤＰリボシル化活性を測定したい蛋白質（変異させた触媒作用ドメイン等）とラジオアイソトープで標識したＮＡＤを加えて、試験管内でＥＦ−２をＡＤＰリボシル化させ、ＥＦ−２に取り込まれた放射能を測定することで、直接測定することができる。

具体的には、以下の文献(Moynihan, M.R. and Pappenheimer, A.M. Jr. Infect. Immun.(1981) 32, 575-582)で記載された方法で得たウサギ網状赤血球ＥＦ−２分画に、最終濃度２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）、1ｍＭＤＴＴ（ジチオスレイトール）、０．１〜１μｇ／ｍｌのフラグメントＡあるいは０．１−１００μｇ／ｍｌのＡＤＰリボシル化活性を測定したい蛋白質を加え、さらに最終的に３７０ＫＢｑ／ｍｌになるように[^３２Ｐ]ＮＡＤ(約７４０ ＧＢｑ／ｍｍｏｌ)を加えて混和し、３７℃で１０分間反応させる。
その反応液に同容量の１０％−トリクロロ酢酸溶液を加えて蛋白質を沈殿させ、生じた沈殿をグラスフィルターでトラップし、フィルターをさらに５％トリクロロ酢酸溶液で洗浄する。

最後にフィルターを１００％エタノールで洗浄し、乾燥させる。
フィルターをトルエン−ＰＰＯのシンチレーターにつけて、フィルターにトラップされた放射能を液体シンチレーションカウンターで測定する。
測定された放射能がＡＤＰリボシル化活性の程度を示しており、変異を加えないフラグメントＡを用いたときの放射能を基準に、変異を加えた蛋白質のＡＤＰリボシル化活性の相対活性を求めることができる。

また、分泌型ＨＢ−ＥＧＦとＥＧＦレセプターとの結合を阻害する活性を有するという特徴は、発明者らが、ドメイン情報をもとに、より詳細に検討したところによると、レセプター結合ドメインを含む部分である３７８番目から５３５番目のアミノ酸配列を含んでいればよいことがわかった。すなわち、ＧＳＴ(Gluthathione-S-transferase)にジフテリア毒素の３７８番目から５３５番目までの配列を融合した遺伝子を作成し、これを大腸菌に発現させて、上記の構造を持つ融合タンパク質（ＧＳＴ−ＤＴ）を作成した。ＧＳＴ−ＤＴは、^１２５Ｉで標識したジフテリア毒素のＨＢ―ＥＧＦへの結合を、濃度依存的に阻害した。阻害の程度から、ＧＳＴ−ＤＴはジフテリア毒素と同程度の結合の強さで、ＨＢ―ＥＧＦに結合することがわかった。したがって、結合に必要なのは、３７８番目から５３５番目、すなわち、レセプター結合ドメインを含む部分であることがわかった。

ここで、ＨＢ−ＥＧＦとＥＧＦリセプターの結合を阻害する活性を有するかどうかは、前記のような、^１２５Ｉで標識したジフテリア毒素のＨＢ―ＥＧＦへの結合に対する阻害実験により測定することができる。

そこで、ＨＢ−ＥＧＦとＥＧＦレセプターとの結合を阻害する活性を有しかつジフテリア毒素の毒性を実質的に有さないタンパク質は、レセプター結合ドメインを保持しつつ、触媒作用ドメインに変異を持たせたジフテリア毒素変異体タンパク質や、ジフテリア毒素のレセプター結合ドメインを保持しつつ触媒作用ドメインの一部または全部を欠損させたジフテリア毒素の一部であるタンパク質を作成することにより得ることができる。

このような変異体の例としては、ＣＲＭ１９７、ＤＴ５２Ｅ１４８Ｋ及びＧＳＴ−ＤＴが挙げられる。これらはジフテリア毒素の毒性を実質的に持たず、ＨＢ−ＥＧＦのＥＧＦレセプターへの結合を阻害する。ＣＲＭ１９７は、２５個のシグナル配列を除いてカウントした場合の５２番目のＧｌｙがＧｌｕに変異した変異体であり、ＤＴ５２Ｅ１４８Ｋは、前記変異に加えてシグナル配列を除いてカウントした場合の１４８番目のＧｌｕがＬｙｓに変異した変異体である。また、ＧＳＴ−ＤＴはＧＳＴにジフテリア毒素のシグナル配列を除いてカウントした場合の３７８番目から５３５番目を含む蛋白質である。ＣＲＭ１９７に関するアミノ酸配列（最初の２５個の配列がシグナル配列を表す）を配列番号３に、それをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号４に表す。また、ＧＳＴ−ＤＴのアミノ酸配列（配列番号５）及びそれをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号６）を図５及び図６に表す。
ここで、ＣＲＭ１９７については、ジフテリア毒素の毒性を有さない、即ちＡＤＰリボシル化活性を有さないとの報告が既になされている（T. Uchida and A.M. Pappenheimer Jr. (1972) Science 175, 901-903)。また、１４８Ｅに変異を有する１４８Ｋ変異体が極めて弱い活性しか持たないことは知られており(J.T.Barbieri and R.J. Collier (1987) Infect. Immun. 55, 1647-1651)、５２Ｅ変異体であるＣＲＭ１９７にさらに１４８Ｋの変異を入れたダブルミュータントであるＤＴ５２Ｅ１４８Ｋは、さらに安全な変異体として好ましい。また、これらの変異体の毒性は、前記タンパク質合成阻害実験によってもジフテリア毒素を加えなかった試料の値と有意差がないことが確かめられた。ただし、前述のように、これらの変異体であっても、極めて微弱なジフテリア毒素の毒性が残存していることが、本発明の、より詳細な解析により明らかになっている。
なお、ＧＳＴ−ＤＴがジフテリア毒素の毒性を有しないことは、触媒作用ドメインを完全に欠如することから明らかである。

（配列番号３）
MSRKLFASILIGALLGIGAPPSAHAGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS

（配列番号４）
GTGAGCAGAAAACTGTTTGCGTCAATCTTAATAGGGGCGCTACTGGGGATAGGGGCCCCA
CCTTCAGCCCATGCAGGCGCTGATGATGTTGTTGATTCTTCTAAATCTTTTGTGATGGAA
AACTTTTCTTCGTACCACGGGACTAAACCTGGTTATGTAGATTCCATTCAAAAAGGTATA
CAAAAGCCAAAATCTGGTACACAAGGAAATTATGACGATGATTGGAAAGAGTTTTATAGT
ACCGACAATAAATACGACGCTGCGGGATACTCTGTAGATAATGAAAACCCGCTCTCTGGA
AAAGCTGGAGGCGTGGTCAAAGTGACGTATCCAGGACTGACGAAGGTTCTCGCACTAAAA
GTGGATAATGCCGAAACTATTAAGAAAGAGTTAGGTTTAAGTCTCACTGAACCGTTGATG
GAGCAAGTCGGAACGGAAGAGTTTATCAAAAGGTTCGGTGATGGTGCTTCGCGTGTAGTG
CTCAGCCTTCCCTTCGCTGAGGGGAGTTCTAGCGTTGAATATATTAATAACTGGGAACAG
GCGAAAGCGTTAAGCGTAGAACTTGAGATTAATTTTGAAACCCGTGGAAAACGTGGCCAA
GATGCGATGTATGAGTATATGGCTCAAGCCTGTGCAGGAAATCGTGTCAGGCGATCAGTA
GGTAGCTCATTGTCATGCATAAATCTTGATTGGGATGTCATAAGGGATAAAACTAAGACA
AAGATAGAGTCTTTGAAAGAGCATGGCCCTATCAAAAATAAAATGAGCGAAAGTCCCAAT
AAAACAGTATCTGAGGAAAAAGCTAAACAATACCTAGAAGAATTTCATCAAACGGCATTA
GAGCATCCTGAATTGTCAGAACTTAAAACCGTTACTGGGACCAATCCTGTATTCGCTGGG
GCTAACTATGCGGCGTGGGCAGTAAACGTTGCGCAAGTTATCGATAGCGAAACAGCTGAT
AATTTGGAAAAGACAACTGCTGCTCTTTCGATACTTCCTGGTATCGGTAGCGTAATGGGC
ATTGCAGACGGTGCCGTTCACCACAATACAGAAGAGATAGTGGCACAATCAATAGCTTTA
TCGTCTTTAATGGTTGCTCAAGCTATTCCATTGGTAGGAGAGCTAGTTGATATTGGTTTC
GCTGCATATAATTTTGTAGAGAGTATTATCAATTTATTTCAAGTAGTTCATAATTCGTAT
AATCGTCCCGCGTATTCTCCGGGGCATAAAACGCAACCATTTCTTCATGACGGGTATGCT
GTCAGTTGGAACACTGTTGAAGATTCGATAATCCGAACTGGTTTTCAAGGGGAGAGTGGG
CACGACATAAAAATTACTGCTGAAAATACCCCGCTTCCAATCGCGGGTGTCCTACTACCG
ACTATTCCTGGAAAGCTGGACGTTAATAAGTCCAAGACTCATATTTCCGTAAATGGTCGG
AAAATAAGGATGCGTTGCAGAGCTATAGACGGTGATGTAACTTTTTGTCGCCCTAAATCT
CCTGTTTATGTTGGTAATGGTGTGCATGCGAATCTTCACGTGGCATTTCACAGAAGCAGC
TCGGAGAAAATTCATTCTAATGAAATTTCGTCGGATTCCATAGGCGTTCTTGGGTACCAG
AAAACAGTAGATCACACCAAGGTTAATTCTAAGCTATCGCTATTTTTTGAAATCAAAAGC
TGA

なお、レセプター結合ドメインを含む断片は、プラスミッドに組み込まれたＣＲＭ１９７をコードする遺伝子(Ｐβ１９７)を鋳型にして、ＰＣＲ法にてレセプター結合ドメイン部分のＤＮＡ配列を合成して、これをＧＳＴ融合タンパク質やヒスチジンタグを合成させるための発現ベクター（pGEX-3X、pQE-30）のマルチクローニングサイトに挿入し、得られたプラスミッドを大腸菌に組み込み、プラスミッドがコードする遺伝子を大腸菌で合成させることで作成できる。
また、触媒作用ドメインに変異を有する変異体は、以下のようにして作成することができる。プラスミッドに組み込まれたＣＲＭ１９７をコードする遺伝子(Ｐβ１９７)を鋳型にして、変異を持たせたい部位をプライマーとして、ＰＣＲ法にてＣＲＭ１９７領域を合成する。プライマーは、変異を持つように点突然変異を導入したものを合成し、使用する。合成したＤＮＡを、大腸菌用の遺伝子発現ベクター（ｐＥＴ−２２ｂ）に組み込み、大腸菌に形質導入を行い、変異体を大腸菌で発現させて、作成することができる。

本発明の制癌剤は、乳癌、前立腺癌、甲状腺癌、卵巣癌等、悪性腫瘍全般の治療に用いることができるが、好ましくはＨＢ−ＥＧＦを発現している悪性腫瘍に用いることができ、特に卵巣癌に好適に用いることができる。
本発明の制癌剤は、前記ジフテリア毒素の変異体に残存するジフテリア毒素の毒性を中和する活性を有し、かつ、前記ジフテリア毒素の変異体の細胞への結合を抑制しない前記ジフテリア毒素の変異体のモノクローナル抗体をさらに含み、
前記ジフテリア毒素の変異体のモノクローナル抗体と、ジフテリア毒素の変異体とが複合体を形成することも好ましい。

前記ジフテリア毒素の変異体は、変異を導入することによりジフテリア毒素の毒性が弱毒化されており、実質的にジフテリア毒素の毒性を有しないものであるが、極めて厳格なレベルで見ればジフテリア毒素の毒性が残存している場合を含むことは前述のとおりである。そこで、ジフテリア毒素の変異体は、該ジフテリア毒素の変異体に残存するジフテリア毒素の毒性を中和する活性を有し、かつ、該ジフテリア毒素の変異体の細胞への結合を抑制しないモノクローナル抗体と複合体を形成することによってさらにジフテリア毒素の毒性を低下させることができる。

前記ジフテリア毒素の変異体のモノクローナル抗体であって、前記ジフテリア毒素の変異体に残存するジフテリア毒素の毒性を中和する活性を有し、ジフテリア毒素の変異体の細胞への結合を抑制しない（即ち、ｐｒｏＨＢ−ＥＧＦとの結合活性を阻害しない）モノクローナル抗体は、以下の文献(Hayakawa S, J. Biol. Chem. 258, 4311-4317, 1983) によって示されるような常法に従い作成することができる。すなわち、ジフテリア毒素の変異体に対する抗体を作成しているクローンの中で、最終的にジフテリア毒素の毒性を中和する活性は持つが、ジフテリア毒素の変異体の細胞への結合を抑制しない抗体を作成しているクローンを分離して作成できる。また、公知のジフテリア毒素モノクローナル抗体の中から、使用するジフテリア毒素変異体に対して前記性質を有するものを選択することもできる。

ジフテリア毒素の毒性を中和する活性は、ジフテリア毒素の変異体と該ジフテリア毒素モノクローナル抗体との複合体をＶｅｒｏ−Ｈ細胞に加えて、ジフテリア毒素の変異体を単体で加えたときに起きるコロニー形成の抑制が、阻害されるかどうかを見ることにより容易に測定できる。
一方、該モノクローナル抗体が、ジフテリア毒素の変異体の細胞への結合を抑制しないことは、前記^１２５Ｉで標識したジフテリア毒素のＨＢ―ＥＧＦへの結合の阻害や、後述するＩＬ−３依存的に増殖能を示す３２Ｄ ｃｅｌｌｓ（ＡＴＣＣより入手）に上皮細胞増殖因子受容体遺伝子を発現させた、ＤＥＲ ｃｅｌｌにおいて、ＨＢ−ＥＧＦの増殖活性阻害作用を測定すること等により調べることができる。
ジフテリア毒素の変異体に残存するジフテリア毒素の毒性を中和する活性を有し、ジフテリア毒素の変異体の細胞への結合を抑制しないジフテリア毒素の変異体のモノクローナル抗体としては、例えば＃２ ａｎｔｉ−ＤＴ ｍＡｂ（特許生物寄託センター 寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９５５１のハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体）が挙げられる。
ジフテリア毒素の変異体との複合体は、ジフテリア毒素の変異体とモノクローナル抗体とを適当な比により混合することにより作成できる。

本発明の制癌剤は、上記有効成分をそのまま、または、薬学的に許容される医薬用担体と組合せて製剤化することができる。
前記制癌剤は、経口的又は非経口的（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下又は皮内等への注射、直腸内投与、経粘膜投与、経気道投与など）に投与することができる。卵巣癌等腹腔内に播種する悪性腫瘍に適用する場合には、腹腔内に注射により投与することが、癌細胞に直接運搬される点で好ましい。
経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などを挙げることができ、非経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤、経皮吸収剤などを挙げることができるが、剤形はこれらに限定されることはない。

前記制癌剤の製造に用いられる製剤用添加物の種類は特に限定されず、当業者が適宜選択可能である。例えば、賦形剤、崩壊剤又は崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、基剤、溶解剤又は溶解補助剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、緩衝剤、抗酸化剤、防腐剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、溶解剤、安定化剤などを用いることができ、これらの目的で使用される個々の具体的成分は当業者に周知されている。

経口投与用の製剤の調製に用いることができる製剤用添加物として、例えば、ブドウ糖、乳糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、又は結晶セルロース等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、デンプン、又はカルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤又は崩壊補助剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、又はゼラチン等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム又はタルク等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコール又は酸化チタン等のコーティング剤；ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、又はハードファット等の基剤を用いることができる。

注射あるいは点滴用の製剤の調製に用いることができる製剤用添加物としては、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール等の水性あるいは用時溶解型注射剤を構成しうる溶解剤又は溶解補助剤；ブドウ糖、塩化ナトリウム、D-マンニトール、グリセリン等の等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩基又は有機塩基等のｐＨ調節剤等の製剤用添加物を用いることができる。
前記本発明の制癌剤に含まれる有効成分の量は、制癌剤の製剤形態または投与経路によって異なり、一概に規定することはできないが、通常、最終製剤中に約０．０００１％から７０％の範囲から適宜選択して決定することができる。

本発明の制癌剤は、ヒトを含む哺乳動物に投与することができる。
本発明の制癌剤の投与量は、患者の年齢、性別、体重、症状、及び投与経路などの条件に応じて適宜増減されるべきであるが、成人一日あたりの有効成分の量として、体重１ｋｇあたり１μgから３０ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。上記投与量の医薬は一日一回に投与してもよいし、数回に分けて投与してもよい。また、数日から数週間に１度又は単発的に投与してもよい。また、ステロイド等、副作用を抑える成分とともに投与することもできる。

以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこの実施例に何ら限定されるものではない。

（実施例１）
ＣＲＭ１９７タンパク質の生成
Ｃ７（β１９７）の溶原菌のストック（Ｃ７(β１９７)ファージを溶原化したジフテリア菌Ｃ７(ｂｅｔａ１９７)Ｍ１としてＡＴＣＣ(American Type Culture Collection)Bacteria collection(No.39255)から入手可能）を培養し、対数増殖期の後期の菌液を、２％の濾過したマルトースを加えたＣ−Ｙ培地に、最初のＯＤ５９０が約０．０５になるように加える。このＯＤは、約５×１０^７菌体／ｍｌにあたる。フラスコは毎分２００回転のロータリーシェーカーに載せ、３５℃で１６時間から１７時間培養する。ＯＤが１０から１５になった時点で、培養を終了する。

前記Ｃ−Ｙ培地は、以下のように調製する。即ち、１０ｇのカサミノ酸、２０ｇの酵母抽出液、５ｇのＫＨ_２ＰＯ_４を１ｌの蒸留水に溶かす。２ｍｌの５０％ＣａＣｌ_２.２Ｈ_２Ｏを加えた後、ｐＨを７．４に調整する。沸騰させた後、濾過する。２ｍｌのＭｕｅｌｌｅｒとＭｉｌｌｅｒの溶液ＩＩ(２２．５ｇ ＭｇＳＯ_４、０．１１５ｇ βアラニン、０．１１５ｇ ニコチン酸、７．５ｍｇ ピメリン酸、１ｇ ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、１ｇ ＺｎＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、１ｇ ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ／１００ｍｌ Ｈ_２Ｏ)と１ｍｌのＭｕｅｌｌｅｒとＭｉｌｌｅｒの溶液ＩＩＩ（２０ｇ Ｌ−シスチン、２０ｍｌ 濃塩酸／１００ｍｌ Ｈ_２Ｏ）を加える。１００ｍＬずつ分注し、オートクレーブをかけることによりＣ−Ｙ培地を得た。

ＣＲＭタンパクの精製は、以下のようにして行う。
培養液は、１００００ｇで１５分間遠心する。培養上清に硫安を６５％の飽和状態になるように加える。氷室で２４から４８時間放置する。沈殿物を集めて０．０２ＭのｐＨ７．２のトリス−塩酸バッファーに溶かし、同液にて透析する。
遠心して、不溶物を除き、ＤＥ５２カラムに添加し、０．０２ＭのｐＨ７．２のトリス−塩酸バッファー中のＮａＣｌの濃度勾配により溶出する。ＣＲＭ１９７は、ＮａＣｌが０．０８Ｍのところで溶出する。溶出した液を硫安で６５％飽和状態にする。沈殿物を０．０１Ｍのトリス−塩酸バッファーに溶かし、再び平衡化する。そして、ＤＥ５２カラムに再び掛け、再度硫安沈殿する。続いて、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−２００のカラムにかけ、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．２、０．１５Ｍ ＮａＣｌの溶液で溶出する。溶出されたＣＲＭ１９７をＤｅＴｏｘｉゲルにアプライして、ＣＲＭ１９７試料に含まれるＬＰＳ類似物質を取り除き、実験に使用する。ＣＲＭ１９７の２８０ｎｍにおける吸収は、１ＯＤが約０．６７ ｍｇ／ｍｌに相当する。

（実施例２）
ヌードマウスを用いた造腫瘍性実験を行った。
ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳで培養した卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ−３（ＡＴＣＣから入手可）を、ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）で洗浄し、０．２５％トリプシンで回収した。ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳで２回、ＲＰＭＩ（血清なし）で２回洗浄し、５×１０^６細胞ずつＲＰＭＩ（血清あり）２５０μＬへ添加し、これをヌードマウスの背部に皮下注射により接種した。

一群のヌードマウスについては、ＳＫＯＶ−３細胞接種１週間後よりＣＲＭ１９７の投与を開始し、腹腔内に２００μｇ／日で週５回を４週に渡って投与した（図７）。また、別の群のヌードマウスについては、ＳＫＯＶ−３細胞接種１週間後よりＣＲＭ１９７の投与を開始し、接種した腫瘍に直接１００μｇ／日で週５回を４週に渡って投与した（図８）。さらに、別の群のヌードマウスについては、ＳＫＯＶ−３細胞接種２０日後よりＣＲＭ１９７の投与を開始し、接種した腫瘍に直接１００μｇ／日で週５回を３週に渡って投与した（図９）。いずれの場合もＣＲＭ１９７を投与しないヌードマウスを対照実験とした。投与時期と腫瘍体積の関係を図７から図９に示す。ここで、腫瘍体積は、できた腫瘍の長径、短径を３〜４日ごとに測定し、長径×短径×短径×１／２で求めた。
これらの結果から、いずれの場合も、ＣＲＭ１９７の投与により、腫瘍の成長が抑えられることが分かった。

（実施例３）
卵巣癌細胞株ＲＭＧ−１（Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bankに登録）、卵巣癌細胞株ＯＶ４７、及び、卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ−３細胞にＨＢ−ＥＧＦ遺伝子をトランスフェクションして作製した細胞であるＳＫＯＶ−Ｈを、前記実施例２におけるＳＫＯＶ−３細胞と同様に回収し、ＳＫＯＶ−３細胞の代わりにヌードマウス背部に皮下注射により接種した。
いずれの細胞を接種した場合にも、細胞接種直後と一週間後にＣＲＭ１９７を腹腔内に１ｍｇ投与した。また、それぞれＣＲＭ１９７を投与しないヌードマウスを対照実験とした。
投与時期と腫瘍体積の関係を図１０から図１２に示す。図１０はＲＭＧ−１細胞、図１１はＯＶ４７細胞、図１２はＳＫＯＶ−Ｈ細胞を接種したヌードマウスの場合の結果を示す。
これらの結果からも、いずれの場合も、ＣＲＭ１９７の投与により、腫瘍の成長が抑えられることが分かった。

（実施例４）
ＣＲＭ１９７の細胞毒性試験
これまでの実験では、ＣＲＭ１９７のフラグメントＡにはＡＤＰリボース転移酵素活性が認められず、全く無毒の分子であると考えられてきたが、全く毒性がないか、わずかながらもジフテリア毒素としての毒性を有しているかを明らかにすることは、本発明において極めて重大であるので、ＣＲＭ１９７のＡＤＰリボース転移酵素活性について、さらに詳しく解析した。

まず、ＣＲＭ１９７の細胞毒性を調べるためにＶｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣから入手可能）、及びＶｅｒｏ細胞にＨＢ−ＥＧＦを高発現させたＶｅｒｏ−Ｈ細胞（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製ヒトＨＢ−ＥＧＦｃＤＮＡをｐＣＤＮＡ３．１プラスミド（インビトロゲン社製）にクローニングしたものを、トランスフェクションして作成した細胞）に種々の濃度のＣＲＭ１９７を加えて１週間培養し、コロニー形成率を調べた。
図１３はＶｅｒｏ細胞及びＶｅｒｏ−Ｈ細胞を６ｗｅｌｌプレートに３００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの密度で蒔き、１０時間培養し、これにＣＲＭ１９７を加えて２４時間培養し、その後ＣＲＭ１９７を含まない培養液で６日間培養してコロニー数をカウントした場合のコロニー形成率を示している。図１４はＶｅｒｏ細胞及びＶｅｒｏ−Ｈ細胞にＣＲＭ１９７を加えて一週間培養した場合のコロニー形成率を示している。その結果、Ｖｅｒｏ−Ｈ細胞は、ＣＲＭ１９７を加えて２４時間培養した場合には１μｇ／ｍｌのＣＲＭ１９７で、ＣＲＭ１９７存在下で一週間培養した場合には１００ｎｇ／ｍｌのＣＲＭ１９７で、コロニー数の減少が確認された。Ｖｅｒｏ細胞ではどちらの条件においても有意なコロニー数の減少は認められなかった。ＣＲＭ１９７がＶｅｒｏ細胞よりもＶｅｒｏ−Ｈ細胞に対して強い毒性を示したことから、この毒性がジフテリア毒素リセプター(ｐｒｏＨＢ−ＥＧＦ)に関係したものであることが示唆された。なお、ＣＲＭ１９７の代わりにジフテリア毒素を２４時間作用させ、その後ジフテリア毒素を含まない培養液で６日間培養した場合、ジフテリア毒素は約１ｆｇ／ｍｌの濃度でコロニーの出現をほとんど見なかった（毒素を加えない場合に得られるコロニー数の約３％）。したがって、ここで用いたコロニー形成法で測定されるＣＲＭ１９７の細胞毒性はジフテリア毒素の１０^１０以下であり、ＣＲＭ１９７の細胞毒性は極めて微弱なものであることがわかった。

（実施例５）
ＣＲＭ１９７によるタンパク合成阻害試験
ジフテリア毒素の毒素作用は、ＥＦ２のＡＤＰリボシル化に基づく、タンパク合成阻害作用である。そこで、ＣＲＭ１９７の毒性がタンパク質合成阻害によるものかどうかを検討するために、ＣＲＭ１９７によるタンパク合成阻害作用を調べた。実施例４で使用したのと同様のＶｅｒｏ細胞、及びＶｅｒｏ−Ｈ細胞にＣＲＭ１９７を３６時間暴露させ、そのタンパク質合成阻害能を[^３Ｈ]Ｌｅｕの蛋白への取り込み率から調べた。具体的には、２４ｗｅｌｌプレートにＶｅｒｏ細胞、Ｖｅｒｏ−Ｈ細胞を１×１０^５ｃｅｌｌ／ｍｌの密度で蒔き、１６時間培養後、ＣＲＭ１９７を加えて、さらに３６時間培養した。その後、[^３Ｈ]Ｌｅｕを添加し、１時間インキュベートしたのち、タンパク質に取り込まれた[^３Ｈ]Ｌｅｕの放射能量を液体シンチレーションカウンターにて測定し、タンパク質の合成阻害能を求めた。
その結果、Ｖｅｒｏ−Ｈ細胞では１００ ｎｇ／ｍｌ以上の濃度のＣＲＭ１９７でタンパク質合成の阻害が観察された。この条件でＶｅｒｏ細胞ではタンパク合成阻害作用はほとんど観察されなかった（図１５）。

（実施例６）
ＤＴ５２Ｅ１４８Ｋの細胞毒性試験
ジフテリアトキシンに２カ所の変異を持つ変異体であるＤＴ５２Ｅ１４８Ｋ及びリコンビナント蛋白ＧＳＴ−ＤＴについても実施例４と同様にその毒性をコロニー形成法で測定した。その結果、ＣＲＭ１９７よりもさらに微弱ではあるが、ＤＴ５２Ｅ１４８ＫはＶｅｒｏ−Ｈ細胞対して毒性を示した（図１６）。一方、Ｖｅｒｏ細胞には細胞毒性は認められなかった（図１７）。したがって、完全に毒性を消失させるためには、この２カ所の変異だけでは不十分であることが示された。ＧＳＴ−ＤＴはＶｅｒｏ細胞に対してもＶｅｒｏ−Ｈ細胞に対しても、全く毒性を示さなかった。

（実施例７）
Ｖｄｔｒ細胞のＣＲＭ１９７及びＤＴ５２Ｅ１４８Ｋに対する耐性
これまで示されたＣＲＭ１９７及びＤＴ５２Ｅ１４８Ｋの細胞毒性、タンパク質合成阻害作用がジフテリア毒素の持つＡＤＰリボシル化活性によるＥＦ−２の不活性化であるのかどうかを検討するために、ジフテリア毒素耐性株Ｖｄｔｒ細胞を作成した。具体的には以下の文献（Moehring JM and Moehring TJ, Somat. Cell Genet. 5, 453-468, 1979;
Kohno K et al., Somat. Cell Genet. 11, 421-423, 1985)に従って、Ｖｅｒｏ細胞をＥＭＳ処理した後、ジフテリア毒素を加えて培養し、生存する細胞を得た。これらの中から、高濃度のジフテリア毒素を加えても耐性である細胞を選別し、Ｖｄｔｒ細胞を得た。次ぎに、このＶｄｔｒ細胞にＨＢ−ＥＧＦを高発現させ、Ｖｄｔｒ−４Ｈ細胞を得た（OriGene Technologies社製ヒト由来ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子をｐＣＤＮＡ３．１プラスミッド（インビトロゲン社製）にクローニングしたものを、トランスフェクションして作成した細胞）。Ｖｄｔｒ−４Ｈ細胞にジフテリア毒素を加えたときの蛋白合成阻害率を図１８に、この細胞より得た細胞破砕液にフラグメントＡを加えたｃｅｌｌ−ｆｒｅｅのＡＤＰリボシル化アッセイの結果を図１９に示す。この細胞ではｃｅｌｌ−ｆｒｅｅのＡＤＰリボシル化アッセイにおいてもＥＦ２のＡＤＰリボシル化が全く認められないことから、この細胞ではジフテリア毒素耐性はＥＦ２に原因があることが示された。

ＣＲＭ１９７の持つ細胞毒性がＡＤＰリボシル化活性によるものかどうかを確認するために、このＶｄｔｒ細胞にＨＢ−ＥＧＦを高発現させたＶｄｔｒ−４Ｈ細胞に対する、ＣＲＭ１９７の毒性を検討した。Ｖｄｔｒ−４Ｈ細胞にＣＲＭ１９７を加え、実施例４と同様にコロニー形成法によってその毒性を検討した。その結果、１００μｇ／ｍｌのＣＲＭ１９７を加えてもＶｄｔｒ−４Ｈ細胞に全く毒性を示さなかった(図２０)。また、ＤＴ５２Ｅ１４８Ｋについても同様に全く毒性を示さなかった(図２０)。この結果からＣＲＭ１９７の示す細胞毒性、及びタンパク合成阻害はフラグメントＡのＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ活性によるものであることが明らかとなった。

（実施例８）
無細胞系でのＥＦ−２のＡＤＰリボシル化実験
実施例７のＶｄｔｒ細胞を用いた実験結果は、ＣＲＭ１９７及びＤＴ５２Ｅ１４８Ｋに存在する細胞毒性が、残存するＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ活性によるものであることを示している。これをさらに確認するために、Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅの条件下でＡＤＰリボシル化実験を行った。以下の文献Gill, DM and Pappenheimer, AM Jr. J. Biol. Chem. 246, 1492-1495,1971) に示された方法を用いて、ウサギ肝より抽出したＥＦ−２にＣＲＭ１９７又はＤＴ５２Ｅ１４８Ｋを加え、これに[^３２Ｐ]ＮＡＤを加えて、３７℃で１０分間インキュベートし、ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅでＡＤＰリボシル化反応を行った。その後、液体シンチレーションカウンターにて放射能量を測定した。その結果、極めて弱い活性であるが、ＣＲＭ１９７及びＤＴ５２Ｅ１４８ＫにＥＦ−２をＡＤＰリボシル化する活性が認められた(図２１及び図２２)。なお、図２１におけるの右上の図は、ＣＲＭ１９７のＡＤＰリボシル化活性を縦軸の尺度を拡大して示したものである。この結果から、ＣＲＭ１９７及びＤＴ５２Ｅ１４８Ｋの両者にＥＦ２をＡＤＰリボシル化する活性がわずかではあるが残存することが結論づけられた。

（実施例９）
ジフテリア毒素モノクローナル抗体＃２ ａｎｔｉ−ＤＴ ｍＡｂ（diphtheria toxin monoclonal antibodies ♯２）によるＣＲＭ１９７の細胞毒性の中和
ＣＲＭ１９７をＨＢ−ＥＧＦ増殖活性阻害物質として利用する場合、ＣＲＭ１９７に微弱ではあるが細胞毒性があることは、場合によっては望ましくない。そこで、次にＣＲＭ１９７に残る毒性を抑制する条件を検討した。ジフテリア毒素に対するモノクローナル抗体は、多数分離されている(Hayakawa S, J. Biol. Chem. 258, 4311-4317, 1983)。これらの中には、ジフテリア毒素の細胞毒性は抑制するが、ジフテリア毒素の受容体への結合は抑制しない抗体がある。これらの中で、＃２ ａｎｔｉ−ＤＴ ｍＡｂが、ジフテリア毒素の場合と同様にＣＲＭ１９７の毒性は中和するが、ＣＲＭ１９７のＨＢ−ＥＧＦへの結合は抑制しないことを見出した。

ＣＲＭ１９７と同時に＃２ ａｎｔｉ−ＤＴ ｍＡｂ（特許生物寄託センター 受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９５５１のハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体）を加え、ＣＲＭ１９７の毒性が中和されるかを検討した。
ジフテリア毒素に対するモノクローナル抗体の作成は、以下の文献(Hayakawa S,J. Biol. Chem. 258, 4311-4317, 1983) によって示されるが、簡単に記述すると以下のようになる。ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔に、ホルマリン処理したジフテリア毒素０．１ ｍｇを、フロインドアジュバントと共に接種し、これを１週間ごとに合計３回行った。最後の接種から数日後に、このマウスの脾臓細胞を取り出し、これをマウスミエローマ細胞ＳＰ２／０細胞と融合させた。融合反応後の細胞をＨＡＴ選択培地で培養し、増殖細胞の中から、ジフテリア毒素に対する抗体を作成しているクローンを分離した。ジフテリア毒素に対する抗体を作成しているクローンの中で、最終的にジフテリア毒素の毒性を中和する活性は持つが、ジフテリア毒素の細胞への結合を抑制しない抗体を作成しているクローンを分離した。

ＣＲＭ１９７／＃２ ａｎｔｉ−ＤＴ ｍＡｂ 複合体は、まず、ＣＲＭ１９７（１ｍｇ）と＃２ ａｎｔｉ−ＤＴ ｍＡｂ（１０ｍｇ）を混ぜ、３７℃で１時間インキュベートして、作成した。Ｖｅｒｏ−Ｈ細胞にこの複合体を種々の濃度で加えて１週間培養し、コロニー形成率を調べた。その結果、たとえば、ＣＲＭ１９７単独の場合は、１００ｎｇ／ｍｌのＣＲＭ１９７で死滅するが、ＣＲＭ１９７／＃２ ａｎｔｉ−ＤＴ ｍＡｂ 複合体の場合、最大量１０μｇ／ｍＬでもコロニーの形成は全く抑制されず、＃２ ａｎｔｉ−ＤＴ ｍＡｂがＣＲＭ１９７の細胞毒性を完全に阻害することがわかった(図２３)。

(実施例１０)
ＣＲＭ１９７／＃２ ａｎｔｉ−ＤＴ ｍＡｂ 複合体のＨＢ−ＥＧＦ増殖活性阻害作用
ＣＲＭ１９７／＃２ ａｎｔｉ−ＤＴ ｍＡｂ 複合体のＨＢ−ＥＧＦ増殖活性阻害作用（ＨＢ−ＥＧＦの増殖活性を阻害する作用）について検討した。ＩＬ−３依存的に増殖能を示す３２Ｄ ｃｅｌｌｓ（ＡＴＣＣより入手）に上皮細胞増殖因子受容体遺伝子（ＥＧＦＲ遺伝子、ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を発現させて、ＤＥＲ ｃｅｌｌを作成した（ＥＧＦＲ遺伝子を、ｐＣＤＮＡ３．１プラスミド（インビトロゲン社製）にクローニングしたものを、トランスフェクションして作成）。この細胞は、ＩＬ−３非存在下では、ＨＢ−ＥＧＦの増殖活性により増殖する。この細胞に対し、ＨＢ−ＥＧＦ存在下で、ＣＲＭ１９７及びＣＲＭ１９７／＃２ ａｎｔｉ−ＤＴ ｍＡｂ 複合体を添加した。細胞を４８時間培養し、増殖した細胞数をＭＴＴ ａｓｓａｙによって測定した。ＣＲＭ１９７及びＣＲＭ１９７／＃２ ａｎｔｉ−ＤＴ ｍＡｂ 複合体が存在しない条件ではＤＥＲ ｃｅｌｌは増殖したが、ＣＲＭ１９７やＣＲＭ１９７／＃２ ａｎｔｉ−ＤＴ ｍＡｂ 複合体が存在する条件では、ＤＥＲ ｃｅｌｌの増殖は抑制された（図２４）。ＣＲＭ１９７とＣＲＭ１９７／＃２ ａｎｔｉ−ＤＴ ｍＡｂ複合体の増殖活性阻害作用を比較したところ、両者にはほとんど違いはなく、同様の阻害効果を示した。すなわち、ＣＲＭ１９７／＃２ ａｎｔｉ−ＤＴ ｍＡｂ 複合体は、ＣＲＭ１９７が持つ細胞毒性は抑制されているが、ＨＢ−ＥＧＦの増殖活性阻害作用についてはＣＲＭ１９７単独と同様の阻害活性を保持していることがわかった。

(実施例１１)
ＣＲＭ１９７／＃２ ａｎｔｉ−ＤＴ ｍＡｂ 複合体による腫瘍抑制効果
一群のヌードマウス（３個体づつ）について、ＳＫＯＶ−Ｈ細胞をそれぞれ接種し、接種から１週間後よりＣＲＭ１９７（１ｍｇ／１個体／ｗｅｅｋ）、あるいはＣＲＭ１９７／＃２ ａｎｔｉ−ＤＴ ｍＡｂ 複合体(ＣＲＭ１９７ １ｍｇを含む／ｗｅｅｋ)の投与を開始し、腹腔内に週１回を４週に渡って投与した）。ＣＲＭ１９７／＃２ ａｎｔｉ−ＤＴ ｍＡｂ 複合体は１ｍｇのＣＲＭ１９７と８ ｍｇの＃２ ａｎｔｉ−ＤＴ ｍＡｂを１時間、室温でインキュベーションしたものを使用した。また、ＣＲＭ１９７を投与しないヌードマウスを対照実験とした。ＣＲＭ１９７、あるいはＣＲＭ１９７／＃２ ａｎｔｉ−ＤＴ ｍＡｂ 複合体投与と腫瘍体積の関係を図２５に示す。腫瘍体積の測定は実施例２と同様に行った。この実験から、ＣＲＭ１９７／＃２ ａｎｔｉ−ＤＴ ｍＡｂ 複合体は腫瘍の増殖を抑制することが明らかになったが、その効果はＣＲＭ１９７単独よりも弱いことが示された。

ＣＲＭ１９７／＃２ ａｎｔｉ−ＤＴ ｍＡｂ 複合体は、すでに示した図から、ＣＲＭ１９７の持つ微弱な細胞毒性を完全に抑えることから、ＣＲＭ１９７単独使用よりもより高い安全性が期待できる。一方、ＣＲＭ１９７を単独で用いると腫瘍の増殖を抑制する効果がより強い。これは、ＣＲＭ１９７がもつＨＢ−ＥＧＦ増殖活性阻害作用に加えて、ＣＲＭ１９７が持つ微弱な細胞毒性が加わった結果であると考えられる。したがって、ＣＲＭ１９７の使用にあたっては、安全性をより重視する場合には＃２ ａｎｔｉ−ＤＴ ｍＡｂと複合体として投与することも可能であり、効果をより重視する場合にはＣＲＭ１９７単独投与も有効であることが考えられる。

(実施例１２)
ＤＴ５２Ｅ１４８ＫとＣＲＭ１９７について、投与が週１回を３週にわたっての投与であった以外は、実施例１１と同様に腫瘍抑制効果を調べた。ＤＴ５２Ｅ１４８Ｋ又はＣＲＭ１９７と、腫瘍体積との関係を図２６に示す。この実験から、ＤＴ５２Ｅ１４８Ｋは腫瘍の増殖を抑制することが明らかになったが、その効果はＣＲＭ１９７よりも弱いことが示された。ＡＤＰリボース転移酵素活性を有するＡフラグメントに２箇所の変異があり、細胞毒性が低い（図１６）ＤＴ５２Ｅ１４８Ｋに関するこの結果は、前記、ＣＲＭ１９７においてはＣＲＭ１９７がもつＨＢ−ＥＧＦ増殖活性阻害作用に加えて、ＣＲＭ１９７が持つ微弱な細胞毒性が腫瘍の増殖の抑制に効果を有しているという推定を裏付けるものである。

（参考例）
一群のヌードマウス（１０個体づつ）について、ＳＫＯＶ−３細胞又はＳＫＯＶ−Ｈ細胞をそれぞれ接種し、接種から１週間後及び２週間後に、タキソール（Ｔａｘｏｌ）４０ｍｇ／ｋｇ／ｗｅｅｋを腹腔内に投与した。結果を図２７に示す。タキソールは、ＳＫＯＶ−３細胞には効果があるが、ＳＫＯＶ−Ｈ細胞には効果が少ないことが分かった。ＳＫＯＶ−Ｈ細胞は、ＨＢ−ＥＧＦを多く発現する性質があることから、タキソールは本発明の制癌剤とは作用機序が異なることが分かった。したがって、本発明の制癌剤は、タキソールがあまり有効でない症例にも効果があることが示唆される。

本発明は、卵巣癌をはじめとする各種癌の治療に有効な制癌剤の製造に利用できる。

図１は、ｐｒｏＨＢ−ＥＧＦの構造を表す模式図である。 図２は、ジフテリア毒素のアミノ酸配列及び塩基配列を表す図である。 図３は、ジフテリア毒素のアミノ酸配列及び塩基配列を表す図である（図２の続き）。 図４は、ジフテリア毒素のドメイン構造を表す模式図である。 図５は、ＧＳＴ−ＤＴのアミノ酸配列及び塩基配列を表す図である。 図６は、ＧＳＴ−ＤＴのアミノ酸配列及び塩基配列を表す図である（図５の続き）。 図７は、ＳＫＯＶ−３細胞注射ヌードマウスにおけるＣＲＭ１９７腹腔内注射による腫瘍増殖に対する効果を表す図である。 図８は、ＳＫＯＶ−３細胞注射ヌードマウスにおけるＣＲＭ１９７局所注射による腫瘍増殖に対する効果を表す図である。 図９は、ＳＫＯＶ−３細胞注射ヌードマウスにおけるＣＲＭ１９７局所注射による腫瘍増殖に対する効果を表す図である。 図１０は、ＲＭＧ−１細胞注射ヌードマウスにおけるＣＲＭ１９７注射後の癌増殖率に対する効果を表す図である。 図１１は、ＯＶ４７細胞注射ヌードマウスにおけるＣＲＭ１９７注射後の癌増殖率に対する効果を表す図である。 図１２は、ＳＫＯＶ−Ｈ注射ヌードマウスにおけるＣＲＭ１９７注射後の癌増殖率に対する効果を表す図である。 図１３は、ＣＲＭ１９７を２４時間作用させた場合のＶｅｒｏ細胞及びＶｅｒｏ−Ｈ細胞に対する毒性を表す図である。 図１４は、ＣＲＭ１９７を１週間作用させた場合のＶｅｒｏ細胞及びＶｅｒｏ−Ｈ細胞に対する毒性を表す図である。 図１５は、ＣＲＭ１９７によるタンパク合成阻害作用を表す図である。 図１６は、ＣＲＭ１９７、ＤＴ５２Ｅ１４８Ｋ及びＧＳＴ−ＤＴのＶｅｒｏ−Ｈ細胞に対する毒性を表す図である。 図１７は、ＣＲＭ１９７、ＤＴ５２Ｅ１４８Ｋ及びＧＳＴ−ＤＴのＶｅｒｏ細胞に対する毒性を表す図である。 図１８は、Ｖｄｔｒ−４Ｈ細胞のＤＴ耐性を表す図である。 図１９は、無細胞条件におけるＶｄｔｒ−４Ｈ細胞及びＶｅｒｏ−Ｈ細胞破砕液のＥＦ−２のＡＤＰ−リボシル化反応を表す図である。 図２０は、Ｖｄｔｒ−４Ｈ細胞のＣＲＭ１９７及びＤＴ５２Ｅ１４８Ｋに対する耐性を表す図である。 図２１は、ＣＲＭ１９７及びＤＴによるＥＦ−２のＡＤＰ−リボシル化を表す図である。 図２２は、ＤＴ５２Ｅ１４８ＫによるＥＦ−２のＡＤＰ−リボシル化を表す図である。 図２３は、＃２ ａｎｔｉ−ＤＴ ｍＡｂによるＣＲＭ１９７の毒性の中和を表す図である。 図２４は、ＣＲＭ１９７／＃２ ａｎｔｉ−ＤＴ ｍＡｂ複合体による、ＨＢ−ＥＧＦ細胞増殖活性の阻害を表す図である。 図２５は、ＣＲＭ１９７及びＣＲＭ１９７／＃２ ａｎｔｉ−ＤＴ ｍＡｂ複合体の腹腔内投与によるヌードマウスの癌細胞の増殖を表す図である。 図２６は、ＣＲＭ１９７及びＤＴ５２Ｅ１４８Ｋの腹腔内投与によるヌードマウスの癌細胞の増殖を表す図である。 図２７は、タキソール投与の投与によるＸｅｎｏｇｒａｆｔマウスの癌細胞の増殖を表す図である。

Claims (9)

1. ジフテリア毒素の変異体であってＨＢ−ＥＧＦとＥＧＦレセプターとの結合を阻害する活性を有しかつジフテリア毒素の毒性を実質的に有さないタンパク質を、有効成分として含むことを特徴とする制癌剤。
2. タンパク質が、ジフテリア毒素のアミノ酸配列における少なくともレセプター結合ドメインを変異なしに含むことを特徴とする請求項１に記載の制癌剤。
3. タンパク質が、ジフテリア毒素のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である請求項１及び２のいずれかに記載の制癌剤。
4. タンパク質が、ＣＲＭ１９７及びＤＴ５２Ｅ１４８Ｋのいずれかである請求項３に記載の制癌剤。
5. 前記ジフテリア毒素の変異体に残存するジフテリア毒素の毒性を中和する活性を有し、かつ、前記ジフテリア毒素の変異体の細胞への結合を抑制しない前記ジフテリア毒素の変異体のモノクローナル抗体をさらに含み、
   前記ジフテリア毒素の変異体のモノクローナル抗体と、ジフテリア毒素の変異体とが複合体を形成する請求項１から４のいずれかに記載の制癌剤。
6. 前記ジフテリア毒素の変異体のモノクローナル抗体が、＃２ ａｎｔｉ−ＤＴ ｍＡｂである請求項５に記載の制癌剤。
7. 以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のいずれかのタンパク質であって、ＨＢ−ＥＧＦのＥＧＦレセプターへの結合を阻害する活性を有しかつジフテリア毒素の毒性を実質的に有さないタンパク質を有効成分として含むことを特徴とする制癌剤。
   （ａ） ジフテリア毒素の一部からなり、該ジフテリア毒素のレセプター結合ドメインを少なくとも含むタンパク質
   （ｂ） （ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
   （ｃ） （ａ）及び（ｂ）のいずれかのタンパク質を含む複合タンパク質
8. （ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のいずれかのタンパク質が、ジフテリア毒素の触媒作用ドメインを有しない請求項７に記載の制癌剤。
9. （ｃ）のタンパク質が、ＧＳＴ−ＤＴである請求項８に記載の制癌剤。