WO2006137398A1 - 癌治療薬 - Google Patents

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crm197
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Eisuke Mekada
Shingo Miyamoto
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The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis

Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent for peritoneal disseminated metastatic cancer of bladder cancer, colon cancer, gastric cancer and spleen cancer.
  • Diphtheria toxin or mutants such as CRM197 bind to the EGF-like domain of secreted and non-secreted (membrane-bound) HB-EGF and have the activity of inhibiting the binding between HB-EGF and the EGF receptor. Have. Involved in this binding is the receptor-binding domain of diphtheria toxin
  • Patent Document 1 describes that CRM197 is effective for breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer, thyroid cancer, etc.
  • Non-Patent Document 1 administers CRM197 to cancer patients with metastasis, and breast cancer.
  • Euroblastoma had a complete response, but it was disclosed that cancer progressed in non-small cell lung cancer (NSCLC), large intestine cancer, bladder cancer and the like.
  • NSCLC non-small cell lung cancer
  • Patent Document 1 JP 2004-155776
  • Non-Patent Document 1 S. Buzzi, et al. Cancer Immunol. Immunother. (2004) 53: 1041-1048 Disclosure of the Invention
  • An object of the present invention is to provide an anticancer agent effective for peritoneal disseminated metastatic cancer of bladder cancer, colon cancer, stomach cancer and spleen cancer.
  • CRM197 is effective for bladder cancer, colon cancer, or peritoneal disseminated metastasis of stomach cancer and knee cancer.
  • the present invention relates to the following cancer therapeutic agents.
  • a cancer therapeutic agent comprising as an active ingredient a substance that inhibits the binding of HB-EGF to an EGF receptor by binding to HB-EGF, wherein the active ingredient is a mutant of diphtheria toxin and HB- A polypeptide that has the activity of inhibiting the binding of EGF to the EGF receptor and has substantially no toxicity of diphtheria toxin, and the cancer is from the group consisting of colon cancer, bladder cancer, and peritoneal disseminated metastasis. Selected cancer drug.
  • the cancer therapeutic agent according to Item 1 which is a bladder cancer therapeutic agent.
  • the cancer therapeutic agent according to Item 1 which is a colorectal cancer therapeutic agent.
  • the cancer therapeutic agent according to Item 1 which is a therapeutic agent for peritoneal disseminated metastatic cancer.
  • peritoneal disseminated metastatic cancer is peritoneal disseminated metastatic cancer in which gastric cancer or splenic cancer has also metastasized.
  • FIG. 1 Peritoneal seeding model. 1 x 10 7 human gastric cancer cell lines MKN28, MKN45, and MKN74 cells were inoculated intraperitoneally into nude mice. CRM197 was administered intraperitoneally 5 times (50 mg / kg / week), and the abdomen was opened 6 weeks after the inoculation. All seeds in the abdominal cavity were excised and the total weight was measured.
  • FIG. 2 Human bladder cancer cell line KK47 (5 ⁇ 10 6 cells) was inoculated by subcutaneous injection on the back of nude mice. For a group of nude mice, 50 mg / kg / week of CRM197 was administered intraperitoneally 7 days after cell inoculation (arrow). Nude mice that did not receive CRM197 were used as a control experiment.
  • FIG. 3 Human colon cancer cell lines HT29 and HCT116 (5 ⁇ 10 6 cells) were inoculated subcutaneously on the back of nude mice.
  • CRM197 in an amount of 50 mg / kg / we ek was administered intraperitoneally 7 days after cell inoculation (arrow). Do not administer CRM197! A nude mouse was used as a reference experiment.
  • FIG. 4 Peritoneal seeding model. Inoculate nude mice with 1 x 10 7 human spleen cancer cell line PANK1 . CRM197 was administered intraperitoneally five times (50 mg / kg / week), and the abdomen was opened 6 weeks after inoculation. All seeds in the abdominal cavity were excised and the total weight was measured.
  • the present invention relates to a substance that inhibits the binding between HB-EGF and the EGF receptor by binding to HB-EGF, particularly a mutant of diphtheria toxin, which inhibits the binding between HB-EGF and the EGF receptor.
  • HB-EGF particularly a mutant of diphtheria toxin
  • the present invention relates to therapeutic agents for the treatment of certain types of cancer.
  • Preferred examples of the substance include a polypeptide containing a receptor binding domain of diphtheria toxin.
  • the particularly preferable substance is either CRM197 or DT52E148K.
  • CRM197 is numbered with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 excluding the signal sequence (1-25) and the amino acid at position 26 (Gly) as number 1! /
  • the receptor-binding domain of diphtheria toxin can inhibit the binding between HB-EGF and the EGF receptor by binding to HB-EGF.
  • polypeptide one or more (for example, several or a dozen or more) amino acids of the catalytic domain of diphtheria toxin are deleted, substituted, inserted or added, and part or all of the catalytic action is impaired. Polypeptides are preferred because of their low toxicity.
  • the 25 signal sequences for diphtheria toxin may or may not be included.
  • the substance has an activity of inhibiting the binding of HB-EGF to an EGF receptor according to any of the following (a), (b) and (c): Includes polypeptides:
  • a polypeptide comprising a part of diphtheria toxin and comprising at least a receptor binding domain of the diphtheria toxin.
  • polypeptide having an amino acid sequence ability in which one or more (for example, several or several tens of) amino acids of the receptor binding domain of the polypeptide of (a) are deleted, substituted or added.
  • the receptor binding domain generally refers to the region from the 378th force to the C-terminal (535th), but it has been reported that the receptor-binding ability is strong even with about 53 amino acids on the C-terminal side. (J. Biol. Chem. 265, 7331-7337, 1990).
  • Diphtheria toxin mutants such as CRM197 and DT52E148K are preferred as an active ingredient of the cancer therapeutic agent of the present invention because of low toxicity.
  • the toxicity level of the substance of the present invention is preferably the same as or lower than that of CRM197 from the viewpoint of eliminating side effects and enhancing safety.
  • the present invention suggests that the toxicity contributes to the effect of the anticancer agent, it is also preferable that the toxicity is as low as that of CRM197 to enhance the anticancer effect. Therefore, the toxicity level of diphtheria toxin can be appropriately selected according to the pharmaceutical formulation.
  • Toxicity of diphtheria toxin can be adjusted by mutating the catalytic domain essential for ADP-ribosyl cocoon, or by deleting part or all of the catalytic domain.
  • the catalytic domain cannot be sent into the cytoplasm, so it is non-toxic or low toxic. become. Therefore, diphtheria toxins with mutations in this region may be used as anticancer agents.
  • the activity of inhibiting the binding between the active ingredient of the present invention, HB-EGF, and the EGF receptor is a polypeptide comprising the amino acid sequence of 378th to 535th corresponding to the receptor binding domain in the amino acid sequence of diphtheria toxin.
  • a preferable substance serving as an active ingredient of the present invention it has a mutation (partial or total substitution, deletion, insertion or addition) in the catalytic domain while retaining the receptor binding domain of 0 diphtheria toxin.
  • mutants include CRM197, DT52E148K, and GST-DT, which are substantially free of diphtheria toxin toxicity, and are EGF of HB-EGF.
  • C RM197 is a mutant in which the 52nd Gly is changed to Glu when counted excluding 25 signal sequences, and DT52E148K is a signal sequence that can be used in response to the mutation.
  • the 148th Glu was mutated to Lys when counted except GST-DT, and GST-DT was obtained by removing the diphtheria toxin signal sequence from GST (Dartathione-S-transferase).
  • GST-DT was obtained by removing the diphtheria toxin signal sequence from GST (Dartathione-S-transferase).
  • This is a protein containing 378th to 535th.
  • the amino acid sequence of CRM197 (the first 25 sequences represent the signal sequence) is shown in SEQ ID NO: 1, and the base sequence of the gene encoding it is shown in SEQ ID NO: 2.
  • CRM197 does not have the toxicity of diphtheria toxin, that is, has no ADP ribosylation activity (T. Uchida and AM Pappenheimer Jr. (1972) Science 175, 901-903).
  • the 148K mutant having a mutation in 148E has extremely weak activity (JT Barbieri and RJ Collier (1987) Infect. Immun. 55, 1647-1651).
  • DT52E148K a double mutant with 148K mutation, is preferred as a safer mutant! /.
  • the fragment containing the receptor-binding domain is obtained by synthesizing the DNA sequence of the receptor-binding domain by PCR using the CRM197-encoding gene (P j8 197) incorporated in the plasmid as a saddle. Is inserted into the multicloning site of an expression vector (pGEX-3X, pQE-30) for synthesizing a GST fusion protein or histidine tag, the resulting plasmid is incorporated into E. coli, and the gene encoded by the plasmid is inserted into E. coli. It can be created by synthesizing with.
  • a mutant having a mutation in the catalytic domain can be prepared as follows.
  • the CRM197 region synthesized by PCR is synthesized using the CRM197-encoding gene ( ⁇
  • the primer is synthesized and used by introducing a point mutation so as to have a mutation.
  • the synthesized DNA is incorporated into a gene expression vector for E. coli (pET-22b), transduced into E. coli, and the mutant is expressed in E. coli.
  • the therapeutic agent of the present invention is a primary lesion of bladder cancer and colon cancer, or a metastatic lesion of stomach cancer and knee cancer.
  • the therapeutic agent of the present invention is particularly effective for the treatment of cancers with enhanced HB-EGF expression!
  • the therapeutic agent of the present invention can be formulated with the above active ingredient as it is or in combination with a pharmaceutically acceptable pharmaceutical carrier.
  • the therapeutic agent is orally or parenterally (for example, intravenous, intramuscular, intraperitoneal, subcutaneous or Can be administered by intradermal injection, rectal administration, transmucosal administration, airway administration, and the like.
  • parenterally for example, intravenous, intramuscular, intraperitoneal, subcutaneous or Can be administered by intradermal injection, rectal administration, transmucosal administration, airway administration, and the like.
  • intraperitoneal injection is preferable because it is directly delivered to cancer cells
  • Examples of the pharmaceutical composition suitable for oral administration include tablets, granules, capsules, powders, solutions, suspensions, syrups and the like, and pharmaceutical compositions suitable for parenteral administration.
  • Examples of the dosage forms that can include, for example, injections, drops, suppositories, and transdermal absorption agents are not limited thereto.
  • the type of formulation additive used for the production of the therapeutic agent is not particularly limited, and can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • excipients, disintegrants or disintegration aids, binders, lubricants, coating agents, bases, solubilizers or solubilizers, dispersants, suspension agents, emulsifiers, buffering agents are examples of excipients, disintegrants or disintegration aids, binders, lubricants, coating agents, bases, solubilizers or solubilizers, dispersants, suspension agents, emulsifiers, buffering agents
  • Antioxidants, preservatives, isotonic agents, PH regulators, solubilizers, stabilizers, etc., and the specific components used for these purposes are well known to those skilled in the art .
  • Pharmaceutical additives that can be used for the preparation of a preparation for oral administration include, for example, excipients such as bud sugar, lactose, D-manntol, starch, or crystalline cellulose; carboxymethyl cellulose, Disintegrants or disintegration aids such as starch or carboxymethylcellulose calcium; binders such as hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polybulurpyrrolidone, or gelatin; lubricants such as magnesium stearate or talc; Coating agents such as hydroxypropyl methylcellulose, sucrose, polyethylene glycol or titanium oxide; use bases such as petrolatum, liquid paraffin, polyethylene glycol, gelatin, kaolin, glycerin, purified water, or hard fat It is out.
  • excipients such as bud sugar, lactose, D-manntol, starch, or crystalline cellulose
  • carboxymethyl cellulose Disintegrants or disintegration aids
  • binders such as hydroxypropylcellulose,
  • Pharmaceutical additives that can be used for the preparation of a preparation for injection or infusion include aqueous solutions such as injectable distilled water, physiological saline, propylene glycol, etc. Or solubilizing agents; isotonic agents such as glucose, sodium chloride salt, D-mannthol, glycerin, etc .; pharmaceutical additives such as PH regulators such as inorganic acids, organic acids, inorganic bases or organic bases Can be used.
  • the amount of the active ingredient contained in the therapeutic agent of the present invention is the dosage form or administration of the therapeutic agent. Although it differs depending on the route and cannot be generally defined, a range force of about 0.001% to 70% in the final preparation can usually be determined by appropriate selection.
  • the therapeutic agent of the present invention can be administered to mammals including humans, particularly humans.
  • the dosage of the therapeutic agent of the present invention should be appropriately increased or decreased according to conditions such as the age, sex, body weight, symptoms, and administration route of the patient.
  • Per kg of body weight It is preferably in the range of L g to 50 mg.
  • the above-mentioned dose of the medicine may be administered once a day or may be divided into several times. You can also administer once a week for 6-8 weeks, or every other day for 2-3 weeks, or for 10 days every day for 14 days. May be administered!
  • anticancer agents examples include taquinol, taxotere, 5-FU, cisplatin, carpoplatin, adriamycin, camptotensin and the like.
  • Peritoneal seeding model 1 x 10 7 human gastric cancer cell lines MKN28, MKN45, and MKN74 cells were inoculated intraperitoneally into nude mice. CRM197 was intraperitoneally administered 5 times (50mg / kg / week), and the abdomen was opened 6 weeks after inoculation. All seeds in the abdominal cavity were excised and the total weight was measured (Fig. 1).
  • a tumorigenicity experiment was conducted using nude mice.
  • a tumorigenicity experiment was conducted using nude mice.
  • CRM197 was administered intraperitoneally 5 times (50mg / kg / we ek), and the abdomen was opened 6 weeks after inoculation. All seeds in the abdominal cavity were excised and the total weight was measured (Fig. 4).

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Abstract

　本発明は、HB-EGFに結合することによりHB-EGFとEGFレセプターとの結合を阻害する物質、特にCRM197を有効成分とする癌治療薬であって、癌が膀胱癌、大腸癌、あるいは、胃癌と膵癌の腹膜播種転移癌からなる群から選ばれる、癌治療薬を提供する。

Description

明 細 書
癌治療薬
技術分野
[0001] 本発明は、膀胱癌、大腸癌、胃癌と脾癌の腹膜播種転移癌に対する治療薬に関 する。
背景技術
[0002] ジフテリア毒素或いは CRM197などの変異体は、分泌型及び非分泌型 (膜結合型） HB- EGFの EGF様ドメインと結合し、 HB- EGFと EGFレセプターとの結合を阻害する活 性を有する。この結合に関与するのはジフテリア毒素のレセプター結合ドメインである
[0003] CRM197の抗癌作用については、種々の研究がなされている。例えば、特許文献 1 には、 CRM197が乳癌、卵巣癌、前立腺癌、甲状腺癌などに有効であることが記載さ れ、非特許文献 1には、 CRM197を転移を有する癌患者に投与し、乳癌及び-ユーロ ブラストーマには有効例 (complete response)があったが、非小細胞肺癌 (NSCLC)、大 腸癌、膀胱癌などでは癌が進行したことが開示されている。
[0004] 胃癌と脾癌の腹膜播種転移癌は有効な抗癌剤がなぐ予後も悪いことが知られて V、る。これらの癌に対するジフテリア毒素或いは CRM197などの変異体の作用は知ら れていなかった。
特許文献 1：特開 2004-155776
非特許文献 1 : S. Buzzi, et al. Cancer Immunol. Immunother. (2004) 53: 1041—1048 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明は、膀胱癌、大腸癌、胃癌と脾癌の腹膜播種転移癌に有効な抗癌剤を提 供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者は、 CRM197の抗腫瘍効果にっ 、て検討を重ねた結果、 CRM197が膀胱 癌、大腸癌、あるいは、胃癌と膝癌の腹膜播種転移癌に有効であることを見出した。 [0007] 本発明は、以下の癌治療薬に関する。
1. HB- EGFに結合することにより HB- EGFと EGFレセプターとの結合を阻害する物 質を有効成分とする癌治療薬であって、前記有効成分がジフテリア毒素の変異体で あって HB-EGFと EGFレセプターとの結合を阻害する活性を有し、かつ、ジフテリア毒 素の毒性を実質的に有さないポリペプチドであり、癌が大腸癌、膀胱癌および腹膜 播種転移癌からなる群から選ばれる、癌治療薬。
2. 膀胱癌治療薬である、項 1に記載の癌治療薬。
3. 大腸癌治療薬である、項 1に記載の癌治療薬。
4. 腹膜播種性転移癌の治療薬である、項 1に記載の癌治療薬。
5. 腹膜播種性転移癌が、胃癌または脾癌カも転移した腹膜播種転移癌である項 4 に記載の癌治療薬。
6. 有効成分力CRM197である、項 1〜5のいずれかに記載の癌治療薬。
発明の効果
[0008] 本発明によれば、膀胱癌、大腸癌、胃癌と脾癌の腹膜播種転移癌を有効に治療す ることがでさる。
図面の簡単な説明
[0009] [図 1]腹膜播種モデル。 1 X 107のヒト胃癌細胞株 MKN28、 MKN45、 MKN74細胞をヌ 一ドマウス腹腔内に接種。 CRM197を腹腔内に計 5回 (50mg / kg / week)投与し、接 種後 6週目に開腹。腹腔内の播種巣を全て切除し、総重量を計測した。
[図 2]ヒト膀胱癌細胞株 KK47 (5 X 106細胞）をヌードマウスの背部に皮下注射により接 種した。一群のヌードマウスについては、細胞接種 7日後より 50 mg/kg/week量の CR M197を腹腔内に投与した (矢印)。 CRM197を投与しないヌードマウスを対照実験とし た。
[図 3]ヒト大腸癌細胞株 HT29、 HCT116 (5 X 106細胞）をヌードマウスの背部に皮下注 射により接種した。一群のヌードマウスについては、細胞接種 7日後より 50 mg/kg/we ek量の CRM197を腹腔内に投与した (矢印)。 CRM197を投与しな!、ヌードマウスを対 照実験とした。
[図 4]腹膜播種モデル。 1 X 107のヒト脾癌細胞株 PANK1をヌードマウス腹腔内に接種 。 CRM197を腹腔内に計 5回 (50mg/kg/week)投与し、接種後 6週目に開腹。腹腔内の 播種巣を全て切除し、総重量を計測した。
発明を実施するための最良の形態
[0010] 本発明は、 HB- EGFに結合することにより HB- EGFと EGFレセプターとの結合を阻 害する物質、特にジフテリア毒素の変異体であって HB-EGFと EGFレセプターとの結 合を阻害する活性を有しかつジフテリア毒素の毒性を実質的に有さないポリペプチド を有効成分として含む、大腸癌、膀胱癌、あるいは、胃癌と脾癌の腹膜播種転移癌 力 なる群力 選ばれる少なくとも 1種の癌を治療するための治療薬に関する。
[0011] 前記物質としては、ジフテリア毒素のレセプター結合ドメインを含むポリペプチドを 好ましく例示できる。特に好ましい前記物質は、 CRM197及び DT52E148Kのいずれ かである。本明細書において、 CRM197の番号は、配列番号 1のアミノ酸配列におい てシグナル配列（1〜25)を除 、た 26位のアミノ酸（Gly)を 1番として番号付けして!/、る
[0012] ジフテリア毒素のレセプター結合ドメインは、 HB- EGFに結合することにより HB- EG Fと EGFレセプターとの結合を阻害することができる。前記ポリペプチドとしては、ジフ テリア毒素の触媒作用ドメインの 1又は複数 (例えば数個もしくは十数個）のアミノ酸 が欠失、置換、挿入若しくは付加され、該触媒作用の一部もしくは全てが損なわれた ポリペプチドが、低毒性のために好ましい。なお、ジフテリア毒素の 25個のシグナル 配列は付 ヽて 、ても付 ヽて 、なくてもょ 、。
[0013] 本発明の 1つの好ましい実施形態において、前記物質は、以下の（a)、（b)及び (c )のいずれかの、 HB- EGFの EGFレセプターへの結合を阻害する活性を有するポリべ プチドを包含する：
(a)ジフテリア毒素の一部からなり、該ジフテリア毒素のレセプター結合ドメインを少 なくとも含むポリペプチド。
(b) (a)のポリペプチドのレセプター結合ドメインの 1若しくは複数 (例えば数個もしく は数十個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列力もなるポリぺプ チド。
(c) (a)及び (b)の 、ずれかのタンパク質を含む複合ポリペプチド。 [0014] なお、レセプター結合ドメインは、一般的には 378番目力も C末端 (535番目）までの 領域を指すが、 C末端側 53アミノ酸程度でもレセプター結合能が力なりあるという報告 がなされている（J. Biol. Chem. 265, 7331-7337, 1990)。
[0015] CRM197、 DT52E148Kなどのジフテリア毒素の変異体は、低毒性であるため、本発 明の癌治療薬の有効成分として好まし 、。
[0016] 本発明の物質の毒性レベルとしては、 CRM197と同じかそれ以下であることが副作 用を排除し、安全性を高める観点から好ましい。しかし、該毒性が、制癌剤の効果に 寄与することが本発明により示唆されるため、 CRM197と同程度の極めて低レベルの 毒性を有することも、制癌効果を高める観点力 好ましい。したがって、製剤処方にあ わせて、適宜ジフテリア毒素の毒性レベルを選択することができる。
[0017] ジフテリア毒素の毒性は、 ADPリボシルイ匕に必須である触媒作用ドメインに変異を 持たせること、または、触媒作用ドメインの一部または全部を欠損させることにより調 整することができる。これにカ卩えて、触媒作用ドメインとレセプター結合ドメインの間に 存在する膜貫通ドメインに変異を持たせたものも、触媒作用ドメインを細胞質内に送 り込むことができな 、ので無毒または低毒性になる。したがつてこの部分に変異を起 こしたジフテリア毒素も制癌剤として使える可能性がある。
[0018] 本発明の有効成分の HB-EGFと EGFレセプターとの結合を阻害する活性は、ジフ テリア毒素のアミノ酸配列において、レセプター結合ドメインに対応する 378番目から 535番目のアミノ酸配列を含むポリペプチドが有している。
[0019] 本発明の有効成分となる好ましい物質としては、（0ジフテリア毒素のレセプター結 合ドメインを保持しつつ触媒作用ドメインに変異（一部又は全部の置換、欠失、挿入 または付加）を持たせたジフテリア毒素変異体が挙げられる。このような変異体の具 体例としては、 CRM197、 DT52E148K及び GST- DTが挙げられる。これらはジフテリア 毒素の毒性を実質的に持たず、 HB-EGFの EGFレセプターへの結合を阻害する。 C RM197は、 25個のシグナル配列を除いてカウントした場合の 52番目の Glyが Gluに変 異した変異体であり、 DT52E148Kは、前記変異にカ卩えてシグナル配列を除いてカウ ントした場合の 148番目の Gluが Lysに変異した変異体である。また、 GST- DTは GST( ダルタチオン- S-トランスフェラーゼ）にジフテリア毒素のシグナル配列を除 、てカウン トした場合の 378番目から 535番目を含む蛋白質である。 CRM197のアミノ酸配列（最 初の 25個の配列がシグナル配列を表す）を配列番号 1に、それをコードする遺伝子の 塩基配列を配列番号 2に表す。
[0020] ここで、 CRM197については、ジフテリア毒素の毒性を有さない、即ち ADPリボシル 化活性を有さないとの報告が既になされている（T. Uchida and A.M. Pappenheimer J r. (1972) Science 175, 901-903)。また、 148Eに変異を有する 148K変異体が極めて 弱い活性しか持たないことは知られており (J.T.Barbieri and R.J. Collier (1987) Infect. Immun. 55, 1647-1651)、 52E変異体である CRM197にさらに 148Kの変異を入れたダ ブルミュータントである DT52E148Kは、さらに安全な変異体として好まし！/、。
[0021] レセプター結合ドメインを含む断片は、プラスミドに組み込まれた CRM197をコード する遺伝子 (P j8 197)を铸型にして、 PCR法にてレセプター結合ドメイン部分の DNA配 列を合成して、これを GST融合タンパク質やヒスチジンタグを合成させるための発現 ベクター（pGEX-3X、 pQE-30)のマルチクロー-ングサイトに挿入し、得られたプラス ミドを大腸菌に組み込み、プラスミドがコードする遺伝子を大腸菌で合成させることで 作成できる。
[0022] また、触媒作用ドメインに変異を有する変異体は、以下のようにして作成することが できる。プラスミドに組み込まれた CRM197をコードする遺伝子 (Ρ |8 197)を铸型にして 、変異を持たせたい部位をプライマーとして、 PCR法にて CRM197領域を合成する。 プライマーは、変異を持つように点突然変異を導入したものを合成し、使用する。合 成した DNAを、大腸菌用の遺伝子発現ベクター (pET-22b)に組み込み、大腸菌に 形質導入を行い、変異体を大腸菌で発現させて、作成することができる。
[0023] 本発明の治療剤は、膀胱癌および大腸癌の原発巣、あるいは胃癌と膝癌の転移巣
(腹膜播種転移癌)の治療に有効である。
[0024] 本発明の治療薬は、 EGFファミリーの増殖因子の中でもとりわけ HB-EGFの発現が 亢進して!/、る癌の治療に有効である。
[0025] 本発明の治療薬は、上記有効成分をそのまま、または、薬学的に許容される医薬 用担体と組合せて製剤化することができる。
[0026] 前記治療薬は、経口的又は非経口的 (例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下又 は皮内等への注射、直腸内投与、経粘膜投与、経気道投与など）に投与することが できる。胃癌、脾癌の腹膜播種性転移等腹腔内に播種する悪性腫瘍に適用する場 合には、腹腔内に注射により投与することが、癌細胞に直接運搬される点で好ましい
[0027] 経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤 、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などを挙げることができ、非経口投与に適する医薬組 成物としては、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤、経皮吸収剤などを挙げることができる 力 剤形はこれらに限定されることはない。
[0028] 前記治療薬の製造に用いられる製剤用添加物の種類は特に限定されず、当業者 が適宜選択可能である。例えば、賦形剤、崩壊剤又は崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤 、コーティング剤、基剤、溶解剤又は溶解補助剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、緩衝剤
、抗酸化剤、防腐剤、等張化剤、 PH調節剤、溶解剤、安定化剤などを用いることが でき、これらの目的で使用される個々の具体的成分は当業者に周知されている。
[0029] 経口投与用の製剤の調製に用いることができる製剤用添加物として、例えば、ブド ゥ糖、乳糖、 D—マン-トール、デンプン、又は結晶セルロース等の賦形剤;カルボキ シメチルセルロース、デンプン、又はカルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩 壊剤又は崩壊補助剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセル口 ース、ポリビュルピロリドン、又はゼラチン等の結合剤;ステアリン酸マグネシウム又は タルク等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコー ル又は酸ィ匕チタン等のコーティング剤；ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコ ール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、又はハードフアット等の基剤を用いるこ とがでさる。
[0030] 注射あるいは点滴用の製剤の調製に用いることができる製剤用添加物としては、注 射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール等の水性あるいは用時溶解型注射 剤を構成しうる溶解剤又は溶解補助剤;ブドウ糖、塩ィ匕ナトリウム、 D-マン-トール、 グリセリン等の等張化剤;無機酸、有機酸、無機塩基又は有機塩基等の PH調節剤 等の製剤用添加物を用いることができる。
[0031] 前記本発明の治療薬に含まれる有効成分の量は、治療薬の製剤形態または投与 経路によって異なり、一概に規定することはできないが、通常、最終製剤中に約 0. 0 001%から 70%の範囲力も適宜選択して決定することができる。
[0032] 本発明の治療薬は、ヒトを含む哺乳動物、特にヒトに投与することができる。
[0033] 本発明の治療薬の投与量は、患者の年齢、性別、体重、症状、及び投与経路など の条件に応じて適宜増減されるべきである力 成人一日あたりの有効成分の量として 、体重 lkgあたり： L gから 50mg程度の範囲であることが好ましい。上記投与量の医 薬は一日一回に投与してもよいし、数回に分けて投与してもよい。また、 1週間に 1度 ずつ 6— 8週にわたつて投与してもよ 、し、又は一日おきに 2— 3週間にわたつて投与 してもょ 、し、又は 10日力も 14日間毎日投与してもよ!/、。
[0034] 本願の癌治療薬と併用可能な制癌剤としては、タキノール、タキソテール、 5—FU 、シスプラチン、カルポプラチン、アドリアマイシン、カンプトテンシンなどが例示される 実施例
[0035] 以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に 限定されな 、ことは言うまでもな 、。
(実施例 1)
腹膜播種モデル。 1 X 107のヒト胃癌細胞株 MKN28、 MKN45、 MKN74細胞をヌード マウス腹腔内に接種。 CRM197を腹腔内に計 5回 (50mg / kg / week)投与し、接種後 6週目に開腹。腹腔内の播種巣を全て切除し、総重量を計測した (図 1)。
(実施例 2)
ヌードマウスを用いた造腫瘍性実験を行った。
[0036] RPMI+10%FBSで培養したヒト膀胱癌細胞株 KK47を、 EDTA/PBS (-)で洗浄し、 0.25% トリプシンで回収した。 RPMI+10%FBSで 2回、 RPMI (血清なし)で 2回洗浄し、 5 X 106細 胞ずつ RPMI (血清あり )250 Lへ添カ卩し、これをヌードマウスの背部に皮下注射により 接種した。一群のヌードマウスについては、細胞接種 7日後より 50 mg/kg/week量の CRM197を腹腔内に投与した。週 1回を 3週に渡って投与した。 CRM197を投与しない ヌードマウスを対照実験とした。投与時期と腫瘍体積の関係を図 2に示す。ここで、腫 瘍体積は、できた腫瘍の長径、短径を 1週間ごとに測定し、長径 X短径 X短径 X 1/2 で求めた。
(実施例 3)
ヌードマウスを用いた造腫瘍性実験を行った。
[0037] RPMI+10%FBSで培養したヒト大腸癌細胞株 HT29、 HCT116 (American Type Cultur e Collection (ATCC)から入手可）を、 EDTA/PBS (-)で洗浄し、 0.25%トリプシンで回収 した。 RPMI+10%FBSで 2回、 RPMI (血清なし)で 2回洗浄し、 5 X 106細胞ずつ RPMI (血 清あり) 250 Lへ添加し、これをヌードマウスの背部に皮下注射により接種した。一群 のヌードマウスについては、細胞接種 7日後より 50 mg/kg/week量の CRM197を腹腔 内に投与した。週 1回を 3週に渡って投与した。 CRM197を投与しないヌードマウスを 対照実験とした。投与時期と腫瘍体積の関係を図 3に示す。ここで、腫瘍体積は、で きた腫瘍の長径、短径を 1週間ごとに測定し、長径 X短径 X短径 X 1/2で求めた。 (実施例 4)
腹膜播種モデル
1 X 107のヒト脾癌細胞株 PANK1をヌードマウス腹腔内に接種。 CRM197を腹腔内に 計 5回 (50mg/kg/week)投与し、接種後 6週目に開腹。腹腔内の播種巣を全て切除し 、総重量を計測した（図 4)。
[0038] これら実施例の結果から、いずれの場合も、 CRM197の投与により、腫瘍の成長が 抑えられることが分力つた。

Claims

請求の範囲
[1] HB-EGFに結合することにより HB-EGFと EGFレセプターとの結合を阻害する物質を 有効成分とする癌治療薬であって、前記有効成分がジフテリア毒素の変異体であつ て HB-EGFと EGFレセプターとの結合を阻害する活性を有しかつジフテリア毒素の毒 性を実質的に有さないポリペプチドであり、癌が大腸癌、膀胱癌および腹膜播種転 移癌からなる群から選ばれる、癌治療薬。
[2] 膀胱癌治療薬である、請求項 1に記載の癌治療薬。
[3] 大腸癌治療薬である、請求項 1に記載の癌治療薬。
[4] 腹膜播種性転移癌の治療薬である、請求項 1に記載の癌治療薬。
[5] 腹膜播種性転移癌が、胃癌または脾癌カゝら転移した腹膜播種転移癌である請求項 4 に記載の癌治療薬。
[6] 有効成分が CRM197である、請求項 1に記載の癌治療薬。
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