CN101208106A

CN101208106A - 癌症治疗剂

Info

Publication number: CN101208106A
Application number: CNA2006800220039A
Authority: CN
Inventors: 目加田英辅; 宫本新吾
Original assignee: Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University BIKEN
Current assignee: Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University BIKEN
Priority date: 2005-06-21
Filing date: 2006-06-20
Publication date: 2008-06-25
Anticipated expiration: 2026-06-20
Also published as: EP1894575B1; US7700546B2; JP5052338B2; KR101052090B1; US20090105135A1; AU2006260240B2; EP1894575A1; WO2006137398A1; CA2610281C; HK1110224A1; AU2006260240A1; EP1894575A4; JPWO2006137398A1; KR20080017093A; CN101208106B; CA2610281A1

Abstract

癌症治疗剂，其包含能与HB－EGF结合从而抑制HB－EGF与EGF受体结合的物质(特别是CRM197)作为活性成分，所述癌症选自膀胱癌、结肠癌或者胃癌及胰腺癌的弥散性腹膜转移癌症。

Description

癌症治疗剂

技术领域

本发明涉及用于膀胱癌、结肠癌和胃癌及胰腺癌的腹膜转移的癌症治疗剂。

背景技术

白喉毒素或其突变体如CRM197具有通过与可溶性及不溶性(锚定在膜上的)HB-EGF中的EGF样结构域结合而抑制HB-EGF与EGF受体结合的活性。白喉毒素中的受体结合结构域参与这种结合。

人们已对CRM197的抗癌效果进行了多种研究。例如，专利文件1中描述了，CRM197对乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和甲状腺癌有效。非专利文献1中公开了，对发生转移的癌症患者施用CRM197时，在乳腺癌和成神经细胞瘤中观察到完全应答(complete response)，而在非小细胞肺癌、结肠癌和膀胱癌的病例中癌症则继续发展。

对于胃癌和胰腺癌的腹膜转移而言，还没有有效的抗癌剂可供使用，公知其预后很差。没有了解到白喉毒素或其突变体如CRM197对这些癌症的效应。

专利文件1：JP 2004-155776-A

非专利文献1：S.Buzzi等Cancer Immunol.Immunother.(2004)53：1041-1048

发明内容

本发明待解决的问题

本发明的目的在于提供对膀胱癌、结肠癌和胃癌及胰腺癌的腹膜转移有效的抗癌剂。

解决问题的手段

由于对CRM197的抗肿瘤效应进行了广泛的研究，所以本发明人已发现CRM197对膀胱癌、结肠癌或者胃癌及胰腺癌的腹膜转移有效。

本发明涉及以下的癌症治疗剂。

[1]癌症治疗剂，其包含通过与HB-EGF结合而抑制HB-EGF与EGF受体结合的物质作为活性成分，其中所述活性成分为白喉毒素突变体，该突变体是具有抑制HB-EGF与EGF受体结合的活性并且基本无白喉毒素毒性的多肽，并且其中所述癌症选自结肠癌、膀胱癌和腹膜转移癌。

[2]根据[1]的癌症治疗剂，其为用于膀胱癌的治疗剂。

[3]根据[1]的癌症治疗剂，其为用于结肠癌的治疗剂。

[4]根据[1]的癌症治疗剂，其为用于腹膜转移癌的治疗剂。

[5]根据[4]的癌症治疗剂，其中所述腹膜转移癌是转移自胃癌或胰腺癌并且通过腹膜传播的癌症。

[6]根据[1]至[5]中任一项的癌症治疗剂，其中所述活性成分为CRM197。

本发明的效果

根据本发明，有效治疗膀胱癌、结肠癌和胃癌及胰腺癌的腹膜转移是可能的。

附图说明

图1是显示腹膜传播模型的图。对裸鼠腹膜内接种1×10⁷个人胃癌细胞系MKN28、MKN45和MKN74，并腹膜内施用CRM197五次(50mg/kg/周)。在接种后的第六周取出整个腹膜传播病灶，测量其总重量。

图2是显示CRM197效果的图。通过皮下注射将人膀胱癌细胞系KK47细胞(5×10⁶个细胞)接种至裸鼠背部。对一个组中的裸鼠，从接种细胞后第七天起以50mg/kg/周的量腹膜内施用CRM197(箭头)。使用未施用CRM197的裸鼠作为对照。

图3.通过皮下注射将人结肠癌细胞系HT29细胞或HCT116细胞(5×10⁶个细胞)接种至裸鼠背部。对一个组中的裸鼠，从接种细胞后第七天起以50mg/kg/周的量腹膜内施用CRM197(箭头)。使用未施用CRM197的裸鼠作为对照。

图4是显示腹膜传播模型的图。对裸鼠腹膜内接种1×10⁷个人胰腺癌细胞系PANC1细胞，并腹膜内施用CRM197五次(50mg/kg/周)。在所述接种后的第六周取出整个腹膜传播病灶，测量其总重量。

实施本发明的模式

本发明涉及用于治疗选自结肠癌、膀胱癌或者胃癌及胰腺癌的腹膜转移癌症中至少一种癌症的癌症治疗剂，其包含通过与HB-EGF结合而抑制HB-EGF与EGF受体结合的物质作为活性成分，特别是这样的多肽：其为白喉毒素突变体，具有抑制HB-EGF与EGF受体结合的活性并且基本无白喉毒素的毒性。

作为上述物质的实例，优选包含白喉毒素受体结合结构域的多肽。特别优选的以上物质为CRM97或DT52E148K。就CRM197中的氨基酸编号而言，通过去除SEQ ID NO：1中氨基酸序列的信号序列(1至25位)而将第26位氨基酸(Gly)编号为第1个。

白喉毒素中的受体结合结构域能通过与HB-EGF结合来抑制HB-EGF与EGF受体结合。作为上述多肽的实例，优选在白喉毒素的催化作用结构域中具有一个或多个(例如几个至几十个)损害其部分或全部催化作用的氨基酸缺失、替换、插入或添加的多肽，因为其毒性很低。可以包括或不包括所述25个氨基酸残基的信号序列。

在本发明的一个优选实施方案中，上述物质包括以下具有抑制HB-EGF与EGF受体结合的活性的多肽(a)、(b)或(c)中任一种：

(a)白喉毒素的部分构成的至少含有白喉毒素受体结合结构域的多肽；

(b)由在多肽(a)的受体结合结构域中具有一个或多个(例如几个或几十个)氨基酸缺失、替换或添加的氨基酸序列构成的多肽；或者

(c)包含蛋白质(a)或(b)的复合多肽。

受体结合结构域通常指从第378位至C端(535位)的区域，然而也有报道称C端侧约53个氨基酸残基的区域具有受体结合能力(J.Biol.Chem.，265：7331-7337，1990)。

优选将白喉毒素突变体如CRM197和DT52E148K作为本发明癌症治疗剂的活性成分，因为它们具有低毒性。

就消除副作用和增强安全性而言，本发明物质的毒性水平优选等于或低于CRM197。然而，本发明提出，毒性有助于制癌剂的效果，因此，就增强制癌效果而言也优选毒性在与CRM197相同的极低水平上。为此，可以根据制剂配方适当地选择白喉毒素的毒性水平。

可以通过突变ADP核糖基化所必需的催化作用结构域或者缺失部分或全部的催化作用结构域来控制白喉毒素的毒性水平。除此以外，在催化作用结构域和受体结合结构域之间存在的跨膜结构域中具有突变的白喉毒素会变为无毒性或低毒性，因为催化结构域不能被内化至胞质中。因此，有可能能够使用在该区域中具有突变的白喉毒素作为制癌剂。

在本发明的活性成分中，含有白喉毒素氨基酸序列中受体结合结构域相应的第378位至第535位残基所示氨基酸序列的多肽能够抑制HB-EGF与EGF受体结合。

作为本发明活性成分的优选物质包括(i)保留白喉毒素的受体结合结构域并突变(部分或全部替换、缺失、插入或添加)催化作用结构域的白喉毒素突变体。这样的突变体的具体实例包括CRM197、DT52E148K和GST-DT。这些突变体基本不具有白喉毒素的毒性，并且抑制HG-EGF与EGF受体结合。CRM197是52位(不计25个氨基酸残基的信号序列)由Gly突变为Glu的突变体；DT52E148K是除了上述突变外还在148位(不计信号序列)由谷氨酸突变为赖氨酸的突变体；GST-DT是与GST(谷胱甘肽-S-转移酶)结合的包含378位至535位(不计信号序列)氨基酸残基的蛋白质。CRM197的氨基酸序列(前25个氨基酸残基组成信号序列)示于SEQ ID NO：1，编码它的碱基序列示于SEQ ID NO：2。

已有报道称，CRM197不具有白喉毒素的毒性，即不具有ADP核糖基化活性(T.Uchida和A.M.Pappenheimer Jr.(1972)Science 175，901-903)。还已知在148E位置具有突变的148K突变体仅有极弱活性(J.T.Barbieri和R.J.Collier(1987)Infect.Immun.55，1647-1651)。DT52E148K优选作为更安全的突变体，它是双突变体，在52E突变体CRM197中还具有148K突变。

可以通过以下步骤制备含有受体结合结构域的片段：使用引入质粒的编码CRM197的基因(Pβ197)作为模板，通过PCR合成受体结合结构域部分的DNA序列；将该序列引入表达载体(pGEX-3X、pQE-30)的多克隆位点，以合成GST融合蛋白或组氨酸标签；将得到的质粒引入大肠杆菌并在大肠杆菌中合成由所述质粒编码的基因。

可按如下制得在催化作用结构域中具有突变的突变体。使用引入质粒的编码CRM197的基因(Pβ197)作为模板，使用待突变的部分作为引物进行PCR，以合成CRM197区域。通过引入待突变的点突变来合成所述引物并使用。可以通过以下步骤制得所述突变体：将合成DNA引入用于大肠杆菌的基因表达载体(pET-22b)、用该载体转化大肠杆菌，以在大肠杆菌中表达该突变体。

本发明的治疗剂对于膀胱癌和结肠癌的原发病灶以及胃癌和胰腺癌的转移病灶(腹膜转移)的治疗有效。

本发明的治疗剂对于癌症的治疗有效，在所述癌症中，EGF家族的生长因子中HB-EGF的表达尤其得到了提高。

本发明的治疗剂可由上述活性成分直接配制，或者可通过将所述成分与可药用载体组合而配制成药物。

上述治疗剂可以口服给药或肠胃外给药(例如，静脉内、肌内、腹膜内、皮下或皮内注射，或者直肠内给药、经粘膜给药、经呼吸道给药)。当应用于腹膜传播的恶性肿瘤如胃癌和胰腺癌的腹膜转移时，就直接送至癌细胞而言优选通过腹膜内注射给药。

口服给药的药物组合物配方可以包括但不限于如片剂、颗粒剂、胶囊剂、粉剂、液体剂、悬浮剂和糖浆剂，肠胃外给药的药物组合物配方可以包括但不限于如注射剂、输注剂、栓剂以及经皮吸收剂。

在所述治疗剂的生产中使用的制备添加剂的类型无特别的限制，可由本领域技术人员适当地选择。例如，可以使用赋形剂、崩解剂或崩解助剂、粘合剂、润滑剂、包衣剂、碱、溶解剂或溶解助剂、分散剂、助悬剂、乳化剂、缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、张度剂、pH调节剂、溶解剂和稳定剂，用于这些目的的各个具体成分是本领域技术人员熟知的。

作为用于制备口服给药制剂的制备添加剂，可以使用赋形剂如葡萄糖、乳糖、D-甘露醇、淀粉或结晶纤维素；崩解剂或崩解助剂如羧甲基纤维素、淀粉或羧甲基纤维素钙；粘合剂如羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或明胶；润滑剂如硬脂酸镁或滑石粉；包衣剂如羟丙基甲基纤维素、蔗糖、聚乙二醇或氧化钛；以及碱如凡士林、液体石蜡、聚乙二醇、明胶、高岭土、甘油、纯净水和硬脂(hard fat)。

作为可用于制备注射或输注制剂的制备添加剂，可以使用溶解剂或溶解助剂如用于注射用蒸馏水、可组成水性注射剂或溶解使用的注射剂的盐水和丙二醇；张度剂如葡萄糖、氯化钠、D-甘露醇和甘油；以及pH调节剂如无机酸、有机酸、无机碱或有机碱。

尽管本发明治疗剂中所包含的活性成分的量根据治疗剂的剂型或给药途径而变化，不能硬性定义，但是其通常通过在最终制剂中约0.0001％至70％的范围内进行适当选择来确定。

本发明的治疗剂可以施用于包括人的哺乳动物，特别是人。

本发明治疗剂的给药量应该根据以下条件而提高或降低，例如患者的年龄、性别、体重和症状以及给药途径，优选以每1kg体重约1μg至50mg的范围作为每个成年人每天的活性成分量。上述给药量的药物可以每天给药一次或分成几次给药。药物可以在6至8周中每周施用一次，或者在2至3周中每隔一天施用，或者每天施用10至14天。

作为能够与本申请的癌症治疗剂组合的制癌剂，示例有紫杉醇、泰索帝、5-氟尿嘧啶、顺铂、卡铂、阿霉素和喜树碱等。

实施例

下文将基于实施例更详细地描述本发明，但是显然本发明不限于这些实施例。

实施例1

腹膜传播模型。对裸鼠腹膜内接种1×10⁷个人胃癌细胞系MKN28、MKN45和MKN74细胞，并以腹膜内方式施用CRM197五次(50mg/kg/周)。在接种后的第6周取出整个腹膜扩散病灶，测量其总重量(图1)。

实施例2

使用裸鼠进行了肿瘤发生实验。用EDTA/PBS(-)洗涤在RPMI+10％FBS中培养的人膀胱癌细胞系KK47细胞，使用0.25％胰酶进行收集。所述细胞用RPMI+10％FBS洗涤两次并用RPMI(无血清)洗涤两次，将该细胞以5×10⁶加入250μL RPMI(含血清)。通过皮下注射将其接种至裸鼠背部。在一组裸鼠中，从接种细胞后的第7天开始以50mg/kg/周的量腹膜内施用CRM197。CRM197在3周中每周施用一次。未施用CRM197的裸鼠用作对照。施用时间和肿瘤体积的关系示于图2。肿瘤体积通过每周测量所产生肿瘤的长轴和短轴并计算(长轴)×(短轴)×(短轴)×1/2而获得。

实施例3

使用裸鼠进行了肿瘤发生实验。用EDTA/PBS(-)洗涤在RPMI+10％FBS中培养的人结肠癌细胞系HT29或HCT116细胞(可得自美国典型培养物保藏中心(ATCC))，使用0.25％胰酶进行收集。所述细胞用RPMI+10％FBS洗涤两次并用RPMI(无血清)洗涤两次，将该细胞以5×10⁶加入250μL RPMI(含血清)。通过皮下注射将其接种至裸鼠背部。在一组裸鼠中，从接种细胞后的第7天开始以50mg/kg/周的量腹膜内施用CRM197。CRM197在3周中每周施用一次。未施用CRM197的裸鼠用作对照。施用时间和肿瘤体积的关系示于图3。肿瘤体积通过每周测量所产生肿瘤的长轴和短轴并计算(长轴)×(短轴)×(短轴)×1/2而获得。

实施例4

腹膜传播模型。对裸鼠腹膜内接种1×10⁷个人胰腺癌细胞系PANC1细胞，并以腹膜内方式施用CRM197五次(50mg/kg/周)。在接种后的第6周取出整个腹膜扩散病灶，测量其总重量(图4)。

从这些实施例的结果中发现，施用CRM197在所有情况下均抑制肿瘤生长

序列表

<110>财团法人阪大微生物病研究会

<120>抗癌剂

<130>P06-61

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>560

<212>PRT

<213>CRM197

<400>1

Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly

1 5 10 15

Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala Gly Ala Asp Asp Val Val Asp

20 25 30

Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr

35 40 45

Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys

50 55 60

Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser

65 70 75 80

Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn

85 90 95

Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly

100 105 110

Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys

115 120 125

Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly

130 135 140

Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val

145 150 155 160

Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn

165 170 175

Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe

180 185 190

Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala

195 200 205

Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu

210 215 220

Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr

225 230 235 240

Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser

245 250 255

Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu

260 265 270

Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu

275 280 285

Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala

290 295 300

Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp

305 310 315 320

Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly

325 330 335

Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu

340 345 350

Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala

355 360 365

Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn

370 375 380

Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr

385 390 395 400

Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr Gln Pro Phe Leu His

405 410 415

Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg

420 425 430

Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu

435 440 445

Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly

450 455 460

Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr His Ile Ser Val Asn Gly Arg

465 470 475 480

Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys

485 490 495

Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu

500 505 510

His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile His Ser Asn Glu

515 520 525

Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp

530 535 540

His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser

545 550 555 560

<210>2

<211>1683

<212>DNA

<213>CRM197

<400>2

gtgagcagaa aactgtttgc gtcaatctta ataggggcgc tactggggat aggggcccca 60

ccttcagccc atgcaggcgc tgatgatgtt gttgattctt ctaaatcttt tgtgatggaa 120

aacttttctt cgtaccacgg gactaaacct ggttatgtag attccattca aaaaggtata 180

caaaagccaa aatctggtac acaaggaaat tatgacgatg attggaaaga gttttatagt 240

accgacaata aatacgacgc tgcgggatac tctgtagata atgaaaaccc gctctctgga 300

aaagctggag gcgtggtcaa agtgacgtat ccaggactga cgaaggttct cgcactaaaa 360

gtggataatg ccgaaactat taagaaagag ttaggtttaa gtctcactga accgttgatg 420

gagcaagtcg gaacggaaga gtttatcaaa aggttcggtg atggtgcttc gcgtgtagtg 480

ctcagccttc ccttcgctga ggggagttct agcgttgaat atattaataa ctgggaacag 540

gcgaaagcgt taagcgtaga acttgagatt aattttgaaa cccgtggaaa acgtggccaa 600

gatgcgatgt atgagtatat ggctcaagcc tgtgcaggaa atcgtgtcag gcgatcagta 660

ggtagctcat tgtcatgcat aaatcttgat tgggatgtca taagggataa aactaagaca 720

aagatagagt ctttgaaaga gcatggccct atcaaaaata aaatgagcga aagtcccaat 780

aaaacagtat ctgaggaaaa agctaaacaa tacctagaag aatttcatca aacggcatta 840

gagcatcctg aattgtcaga acttaaaacc gttactggga ccaatcctgt attcgctggg 900

gctaactatg cggcgtgggc agtaaacgtt gcgcaagtta tcgatagcga aacagctgat 960

aatttggaaa agacaactgc tgctctttcg atacttcctg gtatcggtag cgtaatgggc 1020

attgcagacg gtgccgttca ccacaataca gaagagatag tggcacaatc aatagcttta 1080

tcgtctttaa tggttgctca agctattcca ttggtaggag agctagttga tattggtttc 1140

gctgcatata attttgtaga gagtattatc aatttatttc aagtagttca taattcgtat 1200

aatcgtcccg cgtattctcc ggggcataaa acgcaaccat ttcttcatga cgggtatgct 1260

gtcagttgga acactgttga agattcgata atccgaactg gttttcaagg ggagagtggg 1320

cacgacataa aaattactgc tgaaaatacc ccgcttccaa tcgcgggtgt cctactaccg 1380

actattcctg gaaagctgga cgttaataag tccaagactc atatttccgt aaatggtcgg 1440

aaaataagga tgcgttgcag agctatagac ggtgatgtaa ctttttgtcg ccctaaatct 1500

cctgtttatg ttggtaatgg tgtgcatgcg aatcttcacg tggcatttca cagaagcagc 1560

tcggagaaaa ttcattctaa tgaaatttcg tcggattcca taggcgttct tgggtaccag 1620

aaaacagtag atcacaccaa ggttaattct aagctatcgc tattttttga aatcaaaagc 1680

tga 1683

Claims

1.癌症治疗剂，其包含通过与HB-EGF结合而抑制HB-EGF与EGF受体结合的物质作为活性成分，其中所述活性成分为白喉毒素突变体，该突变体是具有抑制HB-EGF与EGF受体结合的活性并且基本无白喉毒素毒性的多肽，并且其中所述癌症选自结肠癌、膀胱癌和腹膜转移癌症。

2.根据权利要求1的癌症治疗剂，其为用于膀胱癌的治疗剂。

3.根据权利要求1的癌症治疗剂，其为用于结肠癌的治疗剂。

4.根据权利要求1的癌症治疗剂，其为用于腹膜转移癌症的治疗剂。

5.根据权利要求4的癌症治疗剂，其中所述腹膜转移癌症是转移自胃癌或胰腺癌并且通过腹膜传播的癌症。

6.根据权利要求1的癌症治疗剂，其中所述活性成分为CRM197。