CN100549175C

CN100549175C - 一种具有抑癌作用的重组蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN100549175C
Application number: CNB2003801106041A
Authority: CN
Inventors: 朱冰
Original assignee: Shadong Biological Pharmaceutical (tianjin) Co Ltd
Current assignee: Beijing Sunbio Biotech Co Ltd
Priority date: 2003-11-03
Filing date: 2003-11-03
Publication date: 2009-10-14
Anticipated expiration: 2023-11-03
Also published as: JP2007536891A; WO2005042744A1; EP1688498A4; BR0318594A; BRPI0318594B1; ATE501256T1; CA2544473C; HK1089788A1; EP1688498A1; DE60336353D1; AU2003280921B2; US20080280821A1; NZ547274A; BRPI0318594B8; CA2544473A1; CN1860229A; AU2003280921A1; JP4688678B2; EP1688498B1; US7666989B2

Abstract

本发明公开了一种具有抑癌作用的重组蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的具有抑癌作用的重组蛋白是下列蛋白质之一：1)具有序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的蛋白质；2)与SEQ ID №：2的氨基酸残基序列同源性在90%以上且具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质；3)在SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的N-端增加或删除15个或15个以内氨基酸残基得到的具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQ ID№：2衍生的蛋白质；4)在SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的C-端增加或删除15个或15个以内氨基酸残基得到的具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质；5)将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。以上述重组蛋白为活性成分的药物对肿瘤细胞有明显的选择性抑制作用，不会引起正常组织细胞的凋亡，具有重要的应用价值。

Description

一种具有抑癌作用的重组蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及基因工程及药学领域中的一种重组蛋白，它的编码基因及以其为活性成分的基因工程药物，特别是涉及一种具有抑癌作用的重组蛋白，它的编码基因及以其为活性成分的治疗癌症的药物。

背景技术

在进化过程中，哺乳动物逐渐形成了一套凋亡信号机制，能够引导个体细胞发生凋亡，其原理是致死细胞的配基与细胞表面死亡受体相互作用，从而达到使细胞凋亡的目的。这种有益的凋亡对于去除免疫反应终端激活的淋巴细胞，以及去除病毒感染细胞和癌转细胞有着重要的生理作用。例如TNF与受体TNFR的相互作用，以及Fas与FASFas/Apol/CD95受体的相互作用。

死亡受体的激活直接参与细胞凋亡的级联反应。它们可以诱导多种肿瘤细胞的凋亡，是潜在的抗癌因子。虽然TNF和Fasl可以诱导癌细胞的凋亡，但它们在抗癌治疗中有着严重的毒副作用。TNF的注射能引起类似于感染性休克的致命的炎症反应，这种反应主要是由位于血管内皮细胞及巨噬细胞内的由TNF激活的前转录因子TNF-κB介导，抗Fas抗体可导致肝组织内Fas依赖的细胞凋亡，形成致命的肝损伤。

1995年Wiley等发现了肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配基(TNF relatedapoptosis inducing ligand简称TRAIL)，TRAIL的发现与它和TNF、FasL的序列具有同一性有关。TRAIL通过与死亡受体DR4的DR5相互作用引起细胞凋亡，与TNF和FasL不同，TRAIL的mRNA可以在人体许多正常组织中持续表达，这就意味着TRAIL在引起凋亡的同时存在着保护正常组织的生理机制。这些机制包括表达抑制性的受体，可以与DR4和DR5竞争结合配基，TRAIL可以与DCR1、DCR2和DPG等3种受体相互作用，因此TRAIL的毒性要小于TNF和FasL。

发明公开

本发明的目的是提供一种具有抑癌作用的重组蛋白及其以该蛋白为活性成分的能够有效治疗癌症的药物。

本发明所提供的具有抑癌作用的重组蛋白是下列蛋白质之一：

1)具有序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的蛋白质；

2)与SEQ ID №：2的氨基酸残基序列同源性在90％以上且具有与SEQ ID№：2相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质；

3)在SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的N-端增加或删除15个或15个以内氨基酸残基得到的具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质；

4)在SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的C-端增加或删除15个或15个以内氨基酸残基得到的具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质；

5)将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQID №：2衍生的蛋白质。

序列表中SEQ ID №：2的蛋白质为重组人TRAIL环化变构体(recombinant circularly permuted form of TRAIL，简称为CPT)，由166个氨基酸残基组成。

本发明所提供的治疗癌症的药物(CPT)，其活性成分是上述蛋白质之一。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。

本发明的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明所提供的治疗癌症药物(CPT)的活性成分(蛋白)的编码序列是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

4)编码由SEQ ID №：2衍生的蛋白质的DNA序列，所述由SEQ ID №：2衍生的蛋白质为在SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的N-端增加或删除15个或15个以内氨基酸残基得到的具有与SEQ ID №：2相同活性的多肽；

5)编码由SEQ ID №：2衍生的蛋白质的DNA序列，所述由SEQ ID №：2衍生的蛋白质为在SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的C-端增加或删除15个或15个以内氨基酸残基得到的具有与SEQ ID №：2相同活性的多肽；

6)编码由SEQ ID №：2衍生的蛋白质的DNA序列，所述由SEQ ID №：2衍生的蛋白质为将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2的氨基酸残基序列相同活性的多肽。

序列表中的SEQ ID №：1由501个碱基组成。它的编码框是自5’端第1位核苷酸到第498位核苷酸。

含有本发明基因的表达载体及细胞系(例如大肠杆菌，酵母等表达体系)均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1为不同处理条件下人神经胶质瘤U251的肿瘤体积曲线；

图2为不同处理条件下人神经胶质瘤U251的瘤体大小；

图3为不同处理条件下人肺癌NCI-H460的肿瘤体积曲线；

图4-1至4-6为不同处理条件下人肺癌NCI-H460的组织病理学切片(HE染色×100)；

图5为不同处理条件下人肺癌NCI-H460的瘤体大小；

图6为不同处理条件下人结肠癌COLO 205的肿瘤体积曲线；

图7-1至7-5为接种了人结肠癌COLO 205并经不同处理后的BLAB/c-nu裸小鼠。

实施发明的最佳方式

实施例1、重组人源TRAIL环化变构体编码基因的构建及表达

编码人TRAIL第121-281位氨基酸残基的基因序列来自于人脾脏cDNA文库，编码人源TRAIL第135-281位氨基酸残基的基因用人源TRAIL基因作模板用常规PCR方法获得，然后将编码TRAIL 135-281位氨基酸残基的DNA序列通过PCR方法在3’端连接上编码TRAIL氨基酸残基122-135的DNA序列，并将编码五个甘氨酸的DNA序列插入编码TRAIL135-281和TRAIL122-135氨基酸残基的序列之间，甘氨酸的灵活性可以保证蛋白质的正确折叠。这样得到的编码CPT基因用NcoI和BamHI连接到载体质粒pet28b上(也可以用其它的载体质粒)，得到表达质粒。经检测DNA序列正确。

将表达质粒转化进大肠杆菌菌株BL21(DE3)中，转化后的大肠杆菌接种到10ml含有20μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃摇床上培养12小时。然后将该10ml培养物接种到1L含20μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中继续培养，当其OD₆₀₀值达到0.6时，将0.2ml 1M的IPTG加入1L培养物中来诱导蛋白质表达。诱导3小时后离心收集细胞，将沉淀用100ml含100mM Tris(pH7.9)、150mM NaCl的缓冲液悬浮。

4℃下超声波裂解细胞后，用Beckman JA20转头在15,000rpm下离心。由于表达的蛋白质可以结合螯合金属树脂，可通过金属螯合层析来进行纯化。将离心后的上清泵入将含有树脂的固化Ni层析柱中，经过含50mM Tris(pH7.9)、0.5M NaCl和50mM咪唑的缓冲液冲洗来去除其中的杂蛋白。然后被结合上的蛋白质由含50mM Tris(pH7.9)、0.5M NaCl和200mM咪唑的缓冲液洗脱下来，被洗脱下来的蛋白质用PBS缓冲液进行透析。

最后，蛋白质通过装在AKTA HPLC系统(Pharmacia)中的离子交换柱和Superdex 200(Pharmacia)凝胶层析进行纯化。分析表明得到的是氨基酸残基序列为SEQ ID №：2的蛋白质。即本发明的抑癌药物，该产品呈白色粉末状，易溶于水。

实施例2、采用四氮唑盐还原法(MTT)测定本发明药物对癌细胞的杀伤作用

试剂：RPMI1640为GIBCO产品；MTT为Bebco产品；小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。

细胞株：COLO 205(人结肠癌细胞)、NCI-H460(人肺癌细胞)RPMI 8226(人多发性骨髓瘤细胞)、U251(人脑神经胶质瘤细胞)引自美国ATCC，HL-60(人早幼粒白血病细胞)、MDA-MB-231、MDA-MB-435(人乳腺癌细胞、SCLC(人小细胞肺癌)、H125(人肺癌细胞)、PC-3(人胰腺癌细胞)。

收集生长良好的肿瘤细胞，用含10％小牛血清的RPMI 1640培养基配制成1×10⁴/ml细胞悬液，接种于96孔培养板内，每孔100μl(含1000个肿瘤细胞)。置37℃，5％CO₂温箱内培养24小时后加药。

实验设空白对照、氟尿嘧啶或阿霉素阳性对照，受试样品设5个浓度，每浓度3个平行孔。于37℃，5％CO₂温箱内培养4天后弃培养液，每孔加入MTT溶液100μl(0.4mg/ml，RPMI 1640配制)，37℃继续孵育4小时。

弃去上清液，每孔加入DMSO 150μl以溶解Fomazan颗粒。轻度振荡后，用BIORAD 550型酶标仪在检测波长540nm，参考波长450nm下测定OD值。

以药物的不同浓度及对细胞的抑制率作图得到剂量反应曲线，从中求出半数抑制浓度(IC₅₀)。结果如表1所示，可以看出，CPT对人肿瘤细胞U251，COLO205，NCI-H460、MDA-MB-435细胞均有极强的杀伤活性，IC₅₀＜0.01μg/ml。对HL-60，MDA-MB-231，PC-3，H125细胞也有很强的杀伤作用，IC₅₀＜0.1μg/ml。对RPMI 8226细胞有较好活性，IC₅₀＜1μg/ml。对SCLC细胞生长也显示一定抑制作用。同野生型TRAIL相比，CPT诱导癌细胞凋亡的活性要强5-10倍。

表1.CPT对人肿瘤细胞株杀伤作用结果(x±SD)

注：FU为氟尿嘧啶对照 Adr为阿霉素对照

实施例3、本发明药物对裸小鼠人癌异种移植瘤的生长抑制作用

在本实施例中，所用动物为：BLAB/c-nu裸小鼠，6-8周大小，每次实验选用同一性别。

瘤株：人脑神经胶质瘤U251、人肺癌NCI-H460、人结肠癌COLO 205裸小鼠移植瘤，由体外培养细胞接种于裸鼠皮下成活，传代并保存。

实验过程：选择肿瘤生长良好，全身状况较好荷瘤动物，颈椎脱臼处死。无菌条件下取出瘤块，用手术刀切割成直径2-3mm的瘤块，套管针接种于裸小鼠腋后皮下。约7-10天后实验动物腋后可见肿瘤。用游标卡尺测量肿瘤长、宽径，按瘤体积大小分层分组。每组7-8只动物。

实验过程中，每周测量动物肿瘤长、宽径及体重2次。计算肿瘤体积(TV)及相对肿瘤体积(RTV)，绘制肿瘤体积生长变化图。实验结束时将动物处死后剥离肿瘤，称瘤重，计算药物对肿瘤生长抑制率。

肿瘤体积(TV)的计算公式为：长×宽²÷2。

相对肿瘤体积(RTV)的计算公式为：Vt/Vo(其中Vo为分笼给药时测量所得TV，Vt为以后每次测量时的TV。)

t检验法比较各组动物肿瘤重量、肿瘤体积、RTV等指标的统计学差别。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式为：

疗效评价标准：T/C(％)＞60为无效；

T/C(％)≤60，并经统计学处理P＜0.05为有效。

一、对人脑神经胶质瘤U251的抑制作用

以卡莫斯汀(天津氨基酸公司人民制药厂产品)为阳性对照药，以40mg/kg剂量腹腔注射给药1次。设0.6mg/kg、1.7mg/kg、5.0mg/kg、15.0mg/kg 4个剂量组，腹腔注射给药，实验疗程均为10次给药。

实验结果如表1、表2及图1、图2所示，表明，CPT对人脑神经胶质瘤U251裸小鼠移植性肿瘤生长具有明显的抑制作用，4剂量组肿瘤重量抑制率分别为30.5％、44.5％、64.8％和87.5％。各组肿瘤重量与对照组相比均显示明显或非常明显统计学差别。其抗肿瘤作用呈明显剂量依赖性。5.0mg/kg、15mg/kg组的相对肿瘤增殖率T/C(％)均＜60，相对肿瘤体积(RTV)在15.0mg/kg剂量给药组与对照组相比统计学差异显著。

表2.CPT对人神经胶质瘤U251生长抑制作用(x±SD)-

表3.CPT对人神经胶质瘤U251生长抑制作用(x±SD)

^*P＜0.05 ^**P＜0.01与阴性对照组比较

二、对人肺癌NCI-H460的抑制作用

以环磷酰胺(上海华联制药有限公司产品)为阳性对照药，应用剂量为100mg/kg，腹腔注射，2周后补加80mg/kg给药1次。设1.7mg/kg、5.0mg/kg、15.0mg/kg 3个剂量组，每日腹腔注射给药1次，给药10次。

实验结果如表4、表5及图3、图5所示，表明CPT对人肺癌NCI-H460裸小鼠移植性肿瘤生长具有明显的抑制作用，3剂量组肿瘤重量抑制率分别为52.2％、74.5％和87.0％。各组肿瘤重量与对照组相比均显示明显或非常明显统计学差别。中、高剂量组的相对肿瘤增殖率(％)均＜60、，相对肿瘤体积(RTV)与对照组相比统计学差异显著。

表4.CPT对人肺癌NCI-H460的生长抑制作用

表5.CPT对人肺癌NCI-H460的生长抑制作用

*P＜0.05 **P＜0.01与阴性对照组比较

组织病理学检查结果如图4-1至图4-6所示，图4-1、4-3、4-5为阴性对照组，图4-1显示肿瘤组织呈弥漫性团实片状，中央大片液化性坏死，边缘有薄层结缔组织包膜，无明显淋巴细胞浸润；图4-3显示肿瘤细胞呈巢索、片状实性，组织内毛细血管丰富，肿瘤边缘无明显淋巴细胞浸润；图4-5显示肿瘤细胞呈圆形、多角形，细胞核大、胞质少，染色质疏松，核仁明显，有2-3个核仁，有多数核分裂像；图4-2、4-4、4-6为CPT15mg/kg组，图4-2显示肿瘤组织呈团块实性，中央片状坏死，肿瘤内教多结缔组织增生，边缘有薄层结缔组织包膜，无明显淋巴细胞浸润；图4-4显示肿瘤细胞呈巢索状排列，组织内毛细血管少，中央坏死，边缘有薄层结缔组织包膜，少数淋巴细胞浸润；图4-6显示肿瘤细胞呈圆形、多角形，细胞核大、胞质少，染色质疏松，核分裂像，肿瘤组织内毛细血管少，多数点状、小灶性坏死。

可见本发明的药物对人肺癌NCI-H460细胞具有较强的抑制作用。

三、对人结肠癌COLO 205生长的抑制

以注射用羟基喜树碱(商品名：喜素，黄石李时珍药业集团武汉李时珍药业有限公司产品)为阳性对照药，应用剂量为1mg/kg，腹腔注射，每日给药1次，于连续给药15天后停药，因观察发现该组肿瘤增长较明显，于8天后补充给药1周应用剂量为100mg/kg，腹腔注射，2周后补加80mg/kg给药1次。设1.7mg/kg、5.0mg/kg、15.0mg/kg 3个剂量组，每日腹腔注射给药1次，给药15次。

实验结果如表6、表7、图6及图7-1至7-5所示，其中图7-1为阴性对照组；图7-2为15.0mg/kg实验组；图7-3为5.0mg/kg实验组；图7-4为1.7mg/kg实验组；图7-5为羟基喜树碱阳性对照组；结果表明，CPT对人结肠癌COLO 205裸小鼠移植性肿瘤生长具有明显的抑制作用，用药5天后可观察到高剂量组肿瘤体积较分组时明显缩小，随给药次数增多甚至消失，停药后继续观察4周，1/3的动物未发现肿瘤生长。大体解剖仅能于皮下见到接种痕迹。3剂量组肿瘤重量抑制率分别为79.6％、90.8％和97.4％。各组肿瘤重量与对照组相比均显示明显或非常明显统计学差别。各给药组的相对肿瘤增殖率T/C(％)均＜60，相对肿瘤体积(RTV)与对照组相比统计学差异显著。其中高剂量组的T/C(％)＜10，显示CPT对该肿瘤的高度活性。

表6.CPT对人结肠癌COLO 205生长抑制作用

表7.CPT对人结肠癌COLO 205生长抑制作用

*P＜0.05 **P＜0.01与阴性对照组比较

工业应用

采用四氮唑盐(MTT)还原法测定药物的抗癌作用，以不同浓度药品对肿瘤细胞抑制率作图，得到剂量效应曲线，计算半数有效浓度(IC₅₀)。多种人肿瘤细胞株观察证明：CPT制剂具有非常明显的抑制肿瘤细胞生长作用，对包括人肺癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、神经胶质瘤、血液细胞癌、膀胱癌、前列腺癌、直肠结肠癌、子宫颈癌和脑瘤细胞等10余种肿瘤细胞均有非常明显的体外杀伤活性，其对U251(人脑神经胶质瘤细胞)、COLO 205(人结肠癌细胞)，NCI-H460(人肺癌细胞)，MDA-MB-435(人乳腺癌细胞)的半数抑制浓度(IC₅₀)＜0.01μg/ml。对HL-60(人早幼粒白血病细胞)，MDA-MB-231(人乳腺癌细胞)，PC-3(人胰腺癌细胞)、H125(人肺癌细胞)的IC₅₀＜0.1μg/m1。对RPMI 8226(人多发性骨髓瘤细胞)IC₅₀＜1μg/ml。对SCLC(人小细胞肺癌)生长亦显示一定抑制作用。

体内试验结果显示：用15mg/kg/日剂量，连续10-15天给动物腹腔注射CPT，对人结肠癌COLO 205、人肺癌NCI-H460、人神经胶质瘤U251等肿瘤生长均显示非常明显的生长抑制作用。

与不给药对照组相比，CPT可明显减缓动物肿瘤生长速度，在移植瘤生长早期高剂量用药可使肿瘤体积缩小甚至消失。药物剂量效应关系明显，药效作用与给药疗程显示一定相关。在人结肠癌COLO 205裸鼠移植瘤模型观察到，给小鼠腹腔注射15mg/kg/日剂量的CPT 15次至停药4周后实验结束时，该组动物所荷肿瘤仍小于给药前肿瘤体积，其中1/3的动物肿瘤接种部位无法确认肿瘤存在，仅在解剖后见到接种痕迹。

所观察的各项指标证明，CPT给药对实验所选用的人癌裸鼠移植性肿瘤生长抑制作用显著。与对照组相比，CPT 15mg/kg给药对U251的瘤重抑制率分别为87.5％％和87.7％，对NCI-H460的瘤重抑制率分别为87.0％和88.8％，对COLO 205的瘤重抑制率分别为97.4.0％和97.8％，统计学差异非常显著；本发明利用3个模型进行了实验，结果显示，CPT以5.0mg/kg剂量，连续10-15天给药，3个动物模型的相对肿瘤体积(RTV)与阴性对照组相比均显示明显统计学差别，15mg/kg剂量与阴性对照组相比均显示非常明显统计学差别，T/C(％)均在25以下，甚至低于10，显示高度的抗肿瘤活性和良好的实验重现性。

CPT给药对动物无明显毒副作用，在实验观察期内除给药组小鼠荷瘤体积较小外，体重、存活数等生存状态与对照组比较无明显不同。证明CPT对肿瘤细胞有明显的选择性抑制作用，不会引起正常组织细胞的凋亡，因此可以用作安全有效的治疗癌症的药物，具有重要的理论意义及应用价值，市场前景广阔。

序列表

<160>2

<210>1

<211>501

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

acattgtctt ctccaaactc caagaatgaa aaggctctgg gccgcaaaat aaactcctgg 60

gaatcatcaa ggagtgggca ttcattcctg agcaacttgc acttgaggaa tggtgaactg 120

gtcatccatg aaaaagggtt ttactacatc tattcccaaa catactttcg atttcaggag 180

gaaataaaag aaaacacaaa gaacgacaaa caaatggtcc aatatattta caaatacaca 240

agttatcctg accctatatt gttgatgaaa agtgctagaa atagttgttg gtctaaagat 300

gcagaatatg gactctattc catctatcaa gggggaatat ttgagcttaa ggaaaatgac 360

agaatttttg tttctgtaac aaatgagcac ttgatagaca tggaccatga agccagtttt 420

tttggggcct ttttagttgg cggtggtggt ggtggtgtag cagctcacat aactgggacc 480

agaggaagaa gcaacacata a 501

<210>2

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys

1 5 10 15

Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn

20 25 30

Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr

35 40 45

Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu

50 55 60

Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr

65 70 75 80

Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys

85 90 95

Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly

100 105 110

Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn

115 120 125

Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe

130 135 140

Leu Val Gly Gly Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr

145 150 155 160

Arg Gly Arg Ser Asn Thr

165

Claims

1、一种具有抑癌作用的重组蛋白，如序列表中SEQ ID №：2所示。

2、一种具有抑癌作用的重组蛋白的编码基因，它是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中的SEQ ID №：1所示的核苷酸序列；或者

2)编码序列表中SEQ ID №：2所示氨基酸序列的核苷酸序列。

3、权利要求2所述的编码基因，其中所述基因的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID №：1所示。

4、一种以权利要求1所述重组蛋白为活性成分的治疗癌症的药物。

5、含有权利要求2或3所述基因的表达载体。

6、含有权利要求2或3所述基因的细胞系。

7、权利要求1所述的重组蛋白在制备治疗癌症的药物中的应用。

8、根据权利要求7的应用，其中所述癌症选自结肠癌、肺癌、多发性骨髓瘤、脑神经胶质瘤、白血病、乳腺癌、胰腺癌。

9、根据权利要求8的应用，其中所述癌症为多发性骨髓瘤。

10、根据权利要求8的应用，其中所述癌症为白血病。

11、根据权利要求8的应用，其中所述癌症为脑神经胶质瘤。

12、根据权利要求8的应用，其中所述癌症为肺癌。

13、根据权利要求8的应用，其中所述癌症为结肠癌。

14、根据权利要求12的应用，其中所述肺癌为小细胞肺癌。