CN1860229A - 一种具有抑癌作用的重组蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents
一种具有抑癌作用的重组蛋白及其编码基因与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具有抑癌作用的重组蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的具有抑癌作用的重组蛋白是下列蛋白质之一：1)具有序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的蛋白质；2)与SEQ ID №：2的氨基酸残基序列同源性在90％以上且具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质；3)在SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的N－端增加或删除15个或15个以内氨基酸残基得到的具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQ ID№：2衍生的蛋白质；4)在SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的C－端增加或删除15个或15个以内氨基酸残基得到的具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质；5)将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。以上述重组蛋白为活性成分的药物对肿瘤细胞有明显的选择性抑制作用，不会引起正常组织细胞的凋亡，具有重要的应用价值。
Description
一种具有抑癌作用的重组蛋白及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及基因工程及药学领域中的一种重组蛋白， 它的编码基因及以 其为活性成分的基因工程药物， 特别是涉及一种具有抑癌作用的重组蛋白， 它的编码基因及以其为活性成分的治疗癌症的药物。
背景技术
在进化过程中， 哺乳动物逐渐形成了一套凋亡信号机制， 能够引导个体 细胞发生凋亡， 其原理是致死细胞的配基与细胞表面死亡受体相互作用， 从 而达到使细胞凋亡的目的。 这种有益的凋亡对于去除免疫反应终端激活的淋 巴细胞， 以及去除病毒感染细胞和癌转细胞有着重要的生理作用。 例如 TNF 与受体 TNFR的相互作用， 以及 Fas 与 FASFas/Apol/CD95受体的相互作用。
死亡受体的激活直接参与细胞凋亡的级联反应。 它们可以诱导多种肿瘤 细胞的凋亡， 是潜在的抗癌因子。 虽然 TNF和 Fasl可以诱导癌细胞的凋亡， 但它们在抗癌治疗中有着严重的毒副作用。 TNF 的注射能引起类似于感染性 休克的致命的炎症反应， 这 反应主要是由位于血管内皮细胞及巨噬细胞内 的由 TNF激活的前转录因子 TNF- B介导， 抗 Fas抗体可导致肝组织内 Fas 依赖的细胞凋亡， 形成致命的肝损伤。
1995年 Wiley等发现了月中瘤坏死因子相关凋亡诱导配基 （TNF related apoptosis inducing ligand 简称 TRAIL) , TRAIL的发现与它和 TNF、 F asL 的序列具有同一性有关。 TRAIL通过与死亡受体 DR4的 DR5相互作用引起细胞凋 亡， 与 TNF和 FasL不同， TRAJL的 mRNA可以在人体许多正常组织中持续表达， 这就意味着 TRAIL在引起凋亡的同时存在着保护正常组织的生理机制。这些机 制包括表达抑制性的受体，可以与 DR4和 DR5竞争结合配基， TRAIL可以与 DCR1、 DCR2和 DPG等 3种受体相互作用， 因此 TRAIL的毒性要小于 TNF和 FasL。
发明公开
本发明的目的是提供一种具有抑癌作用的重组蛋白及其以该蛋白为活性 成分的能够有效治疗癌症的药物。
本发明所提供的具有抑癌作用的重组蛋白是下列蛋白质之一- 1 )具有序列表中 SEQ ID No : 2氨基酸残基序列的蛋白质；
2)与 SEQ ID N2 : 2的氨基酸残基序列同源性在 90%以上且具有与 SEQ ID Na: 2相同活性的由 SEQ ID No : 2衍生的蛋白质；
3) 在 SEQ ID No : 2的氨基酸残基序列的 N-端增加或删除 15个或 15个 以内氨基酸残基得到的具有与 SEQ ID No : 2相同活性的由 SEQ ID Ns: 2衍 生的蛋白质；
4) 在 SEQ ID No : 2的氨基酸残基序列的 C-端增加或删除 15个或 15个 以内氨基酸残基得到的具有与 SEQ ID No : 2相同活性的由 SEQ ID N2 : 2衍 生的蛋白质；
5) 将 SEQ ID Na: 2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取 代、 缺失或添加且具有与 SEQ ID No : 2的氨基酸残基序列相同活性的由 SEQ
ID No : 2衍生的蛋白质。
序列表中 SEQ ID No : 2 的蛋白质为重组人 TRAIL 环化变构体 (recombinant circularly permuted form of TRAIL, 简禾尔为 CPT), 由 166 个氨基酸残基组成。
本发明所提供的治疗癌症的药物（CPT)，其活性成分是上述蛋白质之一。 需要的时候， 在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载 体。 所述载体包括药学领域常规的稀释剂、 赋形剂、 填充剂、 粘合剂、 湿 润剂、 崩解剂、 吸收促进剂、 表面活性剂、 吸附载体、 润滑剂等， 必要时 还可以加入香味剂、 甜味剂等。
本发明的药物可以制成注射液、 片剂、 粉剂、 粒剂、 胶囊、 口服液、 膏剂、 霜剂等多种形式。 上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规 方法制备。
本发明所提供的治疗癌症药物 (CPT)的活性成分（蛋白）的编码序列是下 列核苷酸序列之一：
1) 序列表中的 SEQ ID Na: 1；
2) 编码序列表中 SEQ ID No : 2蛋白质序列的多核苷酸；
3) 与序列表中 SEQ ID No : 1限定的 DNA序列具有 90%以上同源性， 且 编码相同功能蛋白质的 DNA序列；
4) 编码由 SEQ ID No : 2衍生的蛋白质的 DNA序列， 所述由 SEQ ID Na: 2衍生的蛋白质为在 SEQ ID No : 2的氨基酸残基序列的 N-端增加或删除 15 个或 15个以内氨基酸残基得到的具有与 SEQ ID No : 2相同活性的多肽；
5) 编码由 SEQ ID No : 2衍生的蛋白质的 DNA序列， 所述由 SEQ ID Na: 2衍生的蛋白质为在 SEQ ID No : 2的氨基酸残基序列的 C-端增加或删除 15 个或 15个以内氨基酸残基得到的具有与 SEQ ID No : 2相同活性的多肽；
6) 编码由 SEQ ID No : 2衍生的蛋白质的 DNA序列， 所述由 SEQ ID Na: 2衍生的蛋白质为将 SEQ ID No : 2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸 残基的取代、 缺失或添加且具有与 SEQ ID Na: 2的氨基酸残基序列相同活性 的多肽。
序列表中的 SEQ ID No : 1由 501个碱基组成。 它的编码框是自 5' 端第 1位核苷酸到第 498位核苷酸。
含有本发明基因的表达载体及细胞系 (例如大肠杆菌， 酵母等表达体系） 均属于本发明的保护范围。 附图说明
图 1为不同处理条件下人神经胶质瘤 U251的肿瘤体积曲线；
图 2为不同处理条件下人神经胶质瘤 U251的瘤体大小；
图 3为不同处理条件下人肺癌 NCI-H460的肿瘤体积曲线；
图 4一 1至 4一 6为不同处理条件下人肺癌 NCI- H460的组织病理学切片 (HE染色 X 100);
图 5为不同处理条件下人肺癌 NCI-H460的瘤体大小；
图 6为不同处理条件下人结肠癌 C0L0 205的肿瘤体积曲线；
图 7— 1 至 7— 5 为接种了人结肠癌 C0L0 205 并经不同处理后的 BLAB/c-nu 裸小鼠。
实施发明的最佳方式
实施例 1、 重组人源 TRAIL环化变构体编码基因的构建及表达
编码人 TRAIL第 121- 281位氨基酸残基的基因序列来自于人脾脏 cDNA文 库， 编码人源 TRAIL第 135-281位氨基酸残基的基因用人源 7 /Z基因作模 板用常规 PCR方法获得， 然后将编码 ¾471 ·^- ? 位氨基酸残基的 DNA序 列通过 PCR方法在 3' 端连接上编码 TRAIL氨基酸残基 122-135的 DNA序列， 并将编码五个甘氨酸的 DNA序列插入编码 TRAIL135- 281和 TRAIL122- 135氨 基酸残基的序列之间， 甘氨酸的灵活性可以保证蛋白质的正确折叠。 这样得
到的编码 CPT基因用 Ncol和 BamHI连接到载体质粒 pet28b上 （也可以用其 它的载体质粒）， 得到表达质粒。 经检测 DNA序列正确。
将表达质粒转化进大肠杆菌菌株 BL21 (DE3)中， 转化后的大肠杆菌接种 到 10ml含有 20 μ g/ml 卡那霉素的 LB液体培养基中， 在 37 °C摇床上培养 12小时。然后将该 10ml培养物接种到 1L含 20 μ g/ml 卡那霉素的 LB液体培 养基中继续培养， 当其 0D6。。值达到 0. 6时， 将 0. 2 ml 1M的 IPTG加入 培 养物中来诱导蛋白质表达。 诱导 3小时后离心收集细胞， 将沉淀用 100ml含 lOOmM Tris (pH7. 9)、 150 mM NaCl的缓冲液悬浮。
4°C下超声波裂解细胞后， 用 Beckman JA20转头在 15， OOOrpm下离心。 由于表达的蛋白质可以结合螯合金属树脂，可通过金属螯合层析来进行纯化。 将离心后的上清泵入将含有树脂的固化 Ni 层析柱中， 经过含 50mM Tris (PH7. 9)、 0. 5M NaCl和 50mM咪唑的缓冲液冲洗来去除其中的杂蛋白。 然后 被结合上的蛋白质由含 50mM Tris (pH7. 9)、 0. 5M NaCl和 200mM咪唑的缓 冲液洗脱下来， 被洗脱下来的蛋白质用 PBS缓冲液进行透析。
最后， 蛋白质通过装在 AKTA HPLC系统 （Pharmacia) 中的离子交换柱和
Superdex 200 (Pharmacia)凝胶层析进行纯化。 分析表明得到的是氨基酸残 基序列为 SEQ ID No : 2的蛋白质。 即本发明的抑癌药物， 该产品呈白色粉末 状， 易溶于水。
实施例 2、采用四氮唑盐还原法（ΜΓΓ)测定本发明药物对癌细胞的杀伤作 用
试剂： RPMI1640 为 GIBC0产品； MTT为 Bebco产品； 小牛血清购自杭 州四季青生物工程材料有限公司。
细胞株： C0L0 205 (人结肠癌细胞）、 NCI-H460 (人肺癌细胞） RPMI 8226 (人多发性骨髓瘤细胞）、 U251 (人脑神经胶质瘤细胞）引自美国 ATCC， HL-60 (人早幼粒白血病细胞）、 MDA- MB- 231、 MDA- MB- 435 (人乳腺癌细胞、 SCLC (人小细胞肺癌）、 H125 (人肺癌细胞）、 PC- 3 (人胰腺癌细胞）。
收集生长良好的肿瘤细胞， 用含 10%小牛血清的 RPMI 1640培养基配制 成 I X 107ml细胞悬液， 接种于 96孔培养板内， 每孔 ΙΟΟμΙ (含 1000个肿瘤 细胞）。 置 37°C， 5% C02温箱内培养 24小时后加药。
实验设空白对照、 氟尿嘧啶或阿霉素阳性对照， 受试样品设 5个浓度，
每浓度 3个平行孔。 于 37°C， 5% C02温箱内培养 4天后弃培养液， 每孔加入 MTT溶液 ΙΟΟμΙ (0. 4mg/ml, RPMI 1640配制）， 37°C继续孵育 4小时。
弃去上清液， 每孔加入 DMS0 150μ1以溶解 Fomazan颗粒。 轻度振荡后， 用 BI0RAD 550型酶标仪在检测波长 540nm， 参考波长 450nm下测定 0D值。
以药物的不同浓度及对细胞的抑制率作图得到剂量反应曲线， 从中求出 半数抑制浓度（IC5Q)。 结果如表 1所示， 可以看出， CPT对人肿瘤细胞 U251, C0L0205, NCI-H460. MDA-MB-435细胞均有极强的杀伤活性， IC5。<0. 01 g/ml。 对 HL- 60， MM-應- 231， PC- 3, H125细胞也有很强的杀伤作用， IC5。<0. l g/ml。 对 RPMI 8226细胞有较好活性， IC5。< g/ml。 对 SCLC细胞生长也显示一定 抑制作用。 同野生型 TRAIL相比， CPT诱导癌细胞凋亡的活性要强 5- 10倍。
CPT对人肿瘤细胞株杀伤作用结果 （x±SD)
IC60 ( g/ral )
瘤株
CPT Fu Adr
U251 <0. 001 0. 981 ±0. 077
C0L0 205 0. 006±0 0. 826±0. 051
醒- MB- 435 0. 008 ±0. 002 0. 199±0. 138
HL-60 0. 014±0. 013 0. 006±0
NCI-H460 0. 002±0. 001 0. 566±0. 016
MDA-MB-231 0. 043±0. 0131 0. 318±0. 055
PC-3 0. 067 ±0. 002 4. 928±0. 753
H125 0. 085 ±0. 006 0. 138±0. 031
RPMI 8226 0. 824±0. 093 <0. 1
SCLC 10±0 0. 617 ±0. 0257
注： FU为氟尿嘧啶对照 Adr为阿霉素对照
实施例 3、 本发明药物对裸小鼠人癌异种移植瘤的生长抑制作用 在本实施例中， 所用动物为： BLAB/c- nu 裸小鼠， 6-8 周大小， 每次实 验选用同一性别。
瘤株： 人脑神经胶质瘤 U251、 人肺癌 NCI- H460、 人结肠癌 COLO 205裸小鼠
移植瘤， 由体外培养细胞接种于裸鼠皮下成活， 传代并保存。
实验过程： 选择肿瘤生长良好， 全身状况较好荷瘤动物， 颈椎脱臼处死。 无菌条件下取出瘤块， 用手术刀切割成直径 2-3mm的瘤块， 套管针接种于裸小 鼠腋后皮下。 约 7— 10天后实验动物腋后可见肿瘤。 用游标卡尺测量肿瘤长、 宽径， 按瘤体积大小分层分组。 每组 7-8只动物。
实验过程中，每周测量动物肿瘤长、宽径及体重 2次。计算肿瘤体积 (TV) 及相对肿瘤体积（RTV)， 绘制肿瘤体积生长变化图。 实验结束时将动物处死后 剥离肿瘤， 称瘤重， 计算药物对肿瘤生长抑制率。
肿瘤体积 （TV) 的计算公式为： 长 X宽 2÷2。
相对肿瘤体积 (RTV) 的计算公式为： V t / V 0 (其中 V 0为分笼给药时测 m τν, v t为以后每次测量时的 τν。 )
t检验法比较各组动物肿瘤重量、 肿瘤体积、 RTV等指标的统计学差别。 抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率 T/C (%)， 计算公式为：
治疗组 （T) RTV
T/C (%) = X 100
阴性对照组（C) RTV
疗效评价标准： T/C (%) >60为无效；
T/C (%) 60， 并经统计学处理 P<0. 05为有效。 一、 对人脑神经胶质瘤 U251的抑制作用
以卡莫斯汀 (天津氨基酸公司人民制药厂产品）为阳性对照药，以 40mg/kg 剂量腹腔注射给药 1次。 设 0. 6mg/kg、 1. 7 mg/kg、 5. 0 mg/kg、 15. Omg/kg 4 个剂量组， 腹腔注射给药， 实验疗程均为 10次给药。
实验结果如表 1、 表 2及图 1、 图 2所示， 表明， CPT对人脑神经胶质瘤 U251裸小鼠移植性肿瘤生长具有明显的抑制作用， 4剂量组肿瘤重量抑制率分 别为 30. 5 %、 44. 5 %、 64. 8 %和 87. 5 %。 各组肿瘤重量与对照组相比均显示 明显或非常明显统计学差别。 其抗肿瘤作用呈明显剂量依赖性。 5. 0mg/kg、 15mg/kg 组的相对肿瘤增殖率 T/C ( % ) 均 <60， 相对肿瘤体积 （RTV ) 在 15. Omg/kg剂量给药组与对照组相比统计学差异显著。 表 2. CPT对人神经胶质瘤 U251生长抑制作用 （x±SD) -
动物数 （只） 体重 (g)
组别 瘤重 (g) 抑制率 （％) 开始 结束 开始 结束
阴性对照 8 8 21.9±1.1 22·3±2.6 1.28±0· 50
卡莫司汀对照 8 7 22.8±0.7 19.4±2· 1 0.09±0· 06** 93.0
CPT 0.6mg/kg 8 8 21.0±0.8 21.0±1.4 0.89±0· 49 30.5
1.7mg/kg 8 8 21.6±1·2 21.5±2.0 0.71±0· 22* 44.5
5. Omg/kg 8 8 22·0±1· 1 21.9±3.2 0.45+0.26** 64.8
15mg/kg 8 8 21.6±1.1 21.1±1.7 0.16±0· 15** 87.5 表 3. CPT对人神经胶质瘤 U251生长抑制作用 （x±SD)
二、 对人肺癌 NCI-H460的抑制作用
以环磷酰胺 （上海华联制药有限公司产品） 为阳性对照药， 应用剂量为 lOOmg/kg,腹腔注射， 2周后补加 80mg/kg给药 1次。设 1.7 mg/kg、 5.0 mg/kg、 15. Omg/kg 3个剂量组， 每日腹腔注射给药 1次， 给药 10次。
实验结果如表 4、 表 5及图 3、 图 5所示， 表明 CPT对人肺癌 NCI-H460 裸小鼠移植性肿瘤生长具有明显的抑制作用， 3剂量组肿瘤重量抑制率分别为 52.2%、 74.5%和 87.0%。 各组肿瘤重量与对照组相比均显示明显或非常明 显统计学差别。 中、 高剂量组的相对肿瘤增殖率 （％) 均〈 60、， 相对肿瘤体 积 （RTV) 与对照组相比统计学差异显著。
表 4. CPT对人肺癌 NCI-H460的生长抑制作用
* Ρ<0. 05 ** Ρ〈0. 01 与阴性对照组比较
组织病理学检查结果如图 4—1至图 4一6所示， 图 4—1、 4一3、 4-5为阴 性对照组， 图 4一 1显示肿瘤组织呈弥漫性团实片状， 中央大片液化性坏死， 边缘有薄层结缔组织包膜， 无明显淋巴细胞浸润； 图 4一 3显示肿瘤细胞呈巢 索、 片状实性， 组织内毛细血管丰富， 肿瘤边缘无明显淋巴细胞浸润； 图 4 一 5 显示肿瘤细胞呈圆形、 多角形， 细胞核大、 胞质少， 染色质疏松， 核仁 明显， 有 2—3个核仁， 有多数核分裂像； 图 4—2、 4—4、 4一6为 CPT15mg/kg 组， 图 4一 2显示肿瘤组织呈团块实性， 中央片状坏死， 肿瘤内教多结缔组只 增生， 边缘有薄层结締组织包膜， 无明显淋巴细胞浸润； 图 4一 4显示肿瘤细 胞呈巢索状排列， 组织内毛细血管少， 中央坏死， 边缘有薄层结締组织包膜， 少数淋巴细胞浸润； 图 4— 6显示肿瘤细胞呈圆形、 多角形， 细胞核大、 胞质 少， 染色质疏松， 核分裂像， 肿瘤组织内毛细血管少， 多数点状、 小灶' f生坏
死。
可见本发明的药物对人肺癌 NCI-H460细胞具有较强的抑制作用。
三、 对人结肠癌 C0L0 205生长的抑制
以注射用羟基喜树碱（商品名： 喜素， 黄石李时珍药业集团武汉李时珍 药业有限公司产品）为阳性对照药， 应用剂量为 lmg/kg， 腹腔注射， 每日给 药 1次，于连续给药 15天后停药， 因观察发现该组肿瘤增长较明显， 于 8天 后补充给药 1周应用剂量为 100mg/kg， 腹腔注射， 2周后补加 80mg/kg给药 1次。 设 1. 7 mg/kg、 5. 0 mg/kg、 15. Omg/kg 3个剂量组， 每日腹腔注射给 药 1次， 给药 15次。
实验结果如表 6、 表 7、 图 6及图 7—1至 7— 5所示， 其中图 7—1为阴 性对照组； 图 7—2为 15. Omg/kg实验组； 图 7— 3为 5. 0mg/kg实验组； 图 7 一 4为 1. 7mg/kg实验组； 图 7— 5为羟基喜树碱阳性对照组； 结果表明， CPT 对人结肠癌 C0L0 205裸小鼠移植性肿瘤生长具有明显的抑制作用， 用药 5天 后可观察到高剂量组肿瘤体积较分组时明显缩小，随给药次数增多甚至消失， 停药后继续观察 4周， 1/3的动物未发现肿瘤生长。 大体解剖仅能于皮下见 到接种痕迹。 3剂量组肿瘤重量抑制率分别为 79. 6% , 90. 8 %和 97. 4%。 各 组肿瘤重量与对照组相比均显示明显或非常明显统计学差别。 各给药组的相 对肿瘤增殖率 T/C (%)均〈60， 相对肿瘤体积 （RTV)与对照组相比统计学差 异显著。 其中高剂量组的 T/C (%)〈10, 显示 CPT对该肿瘤的高度活性。 表 6. CPT对人结肠癌 C0L0 205生长抑制作用
表 7. CPT对人结肠癌 C0L0 205生长抑制作用 组别 肿瘤体积 （mm3) RTV T/C (%)
开始 结束
阴性对照 151 ±79 2532± 1190 8. 30±5. 53
喜树碱对照 150±34 845 ±66** 3. 92± 1. 91* 47. 2
CPT1. 7mg/kg 205 ±47 582 ±408** 1. 62±0. 62** 19. 5
5. Omg/kg 180 ±63 314± 175** 0. 91 ±0. 35** 11. 0
15mg/kg 192 ±81 52 ±53** 0. 33 ±0. 7** 4. 0
* P<0. 05 ** P<0. 01 与阴性对照组比较
工业应用
采用四氮唑盐（MTT)还原法测定药物的抗癌作用，·以不同浓度药品对肿 瘤细胞抑制率作图， 得到剂量效应曲线， 计算半数有效浓度 （IC5。）。 多种人 肿瘤细胞株观察证明： CPT制剂具有非常明显的抑制肿瘤细胞生长作用，对包 括人肺癌、 结肠癌、 乳腺癌、 胃癌、 胰腺癌、 神经胶质瘤、 血液细胞癌、 膀 胱癌、 前列腺癌、 直肠结肠癌、 子宫颈癌和脑瘤细胞等 10余种肿瘤细胞均有 非常明显的体外杀伤活性， 其对 U251 (人脑神经胶质瘤细胞）、 C0L0 205 (人 结肠癌细胞）， NCI-H460 (人肺癌细胞）， MDA-MB-435 (人 L腺癌细胞） 的半 数抑制浓度（IC5。）<0. Ol g/ml。对 HL- 60(人早幼粒白血病细月包）， MDA- MB- 231 (人乳腺癌细胞）， PC- 3 (人胰腺癌细胞）、 H125 (人肺癌细胞）的 IC5。< 0. 1 g/ml。 对 RPMI 8226 (人多发性骨髓瘤细胞） IC5。<l g/ml。 对 SCLC (人 小细胞肺癌）生长亦显示一定抑制作用。
体内试验结果显示： 用 15mg/kg/日剂量， 连续 10— 15 天给动物腹腔注 射 CPT， 对人结肠癌 C0L0 205、 人肺癌 NCI- H460、 人神经胶质瘤 U251等肿 瘤生长均显示非常明显的生长抑制作用。
与不给药对照组相比， CPT可明显减缓动物肿瘤生长速度， 在移植瘤生 长早期高剂量用药可使肿瘤体积缩小甚至消失。 药物剂量效应关系明显， 药 效作用与给药疗程显示一定相关。在人结肠癌 C0L0 205裸鼠移植瘤模型观察 到， 给小鼠腹腔注射 15mg/kg/日剂量的 CPT 15次至停药 4周后实验结束时， 该组动物所荷肿瘤仍小于给药前肿瘤体积， 其中 1/3的动物肿瘤接种部位无 法确认肿瘤存在， 仅在解剖后见到接种痕迹。
所观察的各项指标证明， CPT给药对实验所选用的人癌裸鼠移植性肿瘤 生长抑制作用显著。 与对照组相比， CPT 15mg/kg给药对 U251的瘤重抑制率 分别为 87. 5 % %和 87. 7% , 对 NCI- H460的瘤重抑制率分别为 87. 0%和 88. 8
% , 对 COLO 205的瘤重抑制率分别为 97. 4. 0 %和 97. 8 % , 统计学差异非常 显著； 本发明利用 3个模型进行了实验， 结果显示， CPT以 5. 0mg/kg剂量， 连续 10— 15天给药， 3个动物模型的相对肿瘤体积 (RTV)与阴性对照组相比 均显示明显统计学差别， 15mg/kg剂量与阴'性对照组相比均显示非常明显统 计学差别， T/C ( % )均在 25以下， 甚至〈氐于 10， 显示高度的抗肿瘤活性 和良好的实验重现性。
CPT给药对动物无明显毒副作用， 在实验观察期内除给药组小鼠荷瘤体 积较小外， 体重、 存活数等生存状态与对照组比较无明显不同。 证明 CPT对 肿瘤细胞有明显的选择性抑制作用， 不会引起正常组织细胞的凋亡， 因此可 以用作安全有效的治疗癌症的药物， 具有重要的理论意义及应用价值， 市场 前景广阔。
Claims (1)
- 权利要求书1、 一种具有抑癌作用的重组蛋白， 是下列家族成员中的一种- 1)具有序列表中 SEQ ID No: 2氨基酸残基序列的蛋白质；2)与 SEQ ID No: 2的氨基酸残基序列同源性在 90%以上且具有与 SEQ IDNo: 2相同活性的由 SEQ ID No: 2衍生的蛋白质；3)在 SEQ ID No: 2的氨基酸残基序列的 N-端增加或删除 15个或 15个 以内氨基酸残基得到的具有与 SEQ ID No: 2相同活性的由 SEQ ID N2: 2衍 生的蛋白质；4)在 SEQ ID No: 2的氨基酸残基序列的 C-端增加或删除 15个或 15个 以内氨基酸残基得到的具有与 SEQ ID Na: 2相同活性的由 SEQ ID N2: 2衍 生的蛋白质；5)将 SEQ ID No: 2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取 代、 缺失或添加且具有与 SEQ ID N2: 2的氨基酸残基序列相同活性的由 SEQ ID a: 2衍生的蛋白质。2、根据权利要求 1所述的蛋白质，其特征在于： 所述蛋白质为序列表中 的 SEQ ID No: 2。3、一种具有抑癌作用的重组蛋白的编码基因，它是下列核苷酸序列之一: 1)序列表中的 SEQ ID No: 1；2)编码序列表中 SEQ ID N2: 2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中 SEQID No: 1限定的 DNA序列具有 90%以上同源性， 且 编码相同功能蛋白质的 DNA序列；4)编码由 SEQ ID No: 2衍生的蛋白质的 DNA序列， 所述由 SEQ ID Na: 2衍生的蛋白质为在 SEQ ID No: 2的氨基酸残基序列的 N-端增加或删除 15 个或 15个以内氨基酸残基得到的具有与 SEQ ID No: 2相同活性的多肽；5)编码由 SEQ ID No: 2衍生的蛋白质的 DNA序列， 所述由 SEQ ID Ns: 2衍生的蛋白质为在 SEQ ID a: 2的氨基酸残基序列的 C-端增加或删除 15 个或 15个以内氨基酸残基得到的具有与 SEQ ID No: 2相同活性的多肽；6)编码由 SEQ ID No: 2衍生的蛋白质的 DNA序列， 所述由 SEQ ID Na: 2衍生的蛋白质为将 SEQ ID No: 2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸 残基的取代、 缺失或添加且具有与 SEQ ID No: 2的氨基酸残基序列相同活性 的多肽。4、根据权利要求 3所述的编码基因， 其特征在于：所述基因是序列表中 的 SEQ ID No : 1。5、 一种以权利要求 1所述蛋白质为活性成分的治疗癌症的药物。6、 根据权利要求 5所述的药物， 其特征在于： 所述蛋白质是序列表中SEQ ID No : 2。7、根据权利要求 5或 6所述的药物，其特征在于：所述药物中还含有人 体可接受的药用载体。8、 含有权利要求 4所述基因的表达载体。9、 含有权利要求 4所述基因的细胞系。10、 权利要求 1所述的重组蛋白在制备治疗癌症的药物中的应用。11、 权利要求 2所述的重组蛋白在制备治疗癌症的药物中的应用。
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