JP4398644B2 - ＥｒｂＢ界面ペプチド擬態およびその使用方法 - Google Patents

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Description

本出願は、米国特許法(35 USC)第119条(e)項の下、それぞれがその全体で参照として本明細書に組み込まれている、2001年4月6日出願の米国仮出願第60/282,037号および2001年8月3日出願の同第60/309,864号の優先権の利益を主張するものである。
本発明は、哺乳動物の腫瘍の治療および診断に関する。より詳細には、本発明は、擬態(mimetics)および抗体を使用して哺乳動物の癌腫瘍を阻止、治療、および診断する方法に関する。
上皮成長因子受容体c-erbB1(EGFr、HER1)、c-erbB2(HER2、neu、p185)、c-erbB-3(HER3)、c-erbB-4(HER4)を含めた受容体チロシンキナーゼ遺伝子のc-erbB(erbB)ファミリーのメンバーは、細胞表面受容体タンパク質をコードする発癌遺伝子であることで知られている。受容体は、ある状況下では、細胞の増殖および形質転換を助長する異常なキナーゼ活性を示す。
ErbBファミリーの受容体チロシンキナーゼ(RTK)は、触媒としての活性があるホモ二量体、ヘテロ二量体、または場合によってはオリゴマー複合体を形成し、その結果、細胞外シグナルと結合して細胞の増殖および分化状態を変化させる。それらのリガンドに媒介されたシグナル伝達、および引き続く受容体に媒介されたシグナル伝達は、様々な種類の細胞の生存、増殖、および分化に関係付けられている(総説はDougall他、1994; O'Rourke他、1997; Pinkas-Kramarski他、1997; TzaharおよびYarden、1998による)。
erbBファミリーのメンバーすべてが、2つのシステインに富むサブドメイン、1つの両親媒性膜貫通ドメイン、および1つの細胞内キナーゼドメインを含めた、4つのサブドメインを含有する細胞外リガンド結合ドメインを含む構造的特徴を共有している。キナーゼドメインが、このファミリーのメンバー間で最も高いアミノ酸配列類似性(約80%)を示す。
多種のヒト癌でerbB受容体の過剰発現が見つかっており、これにより、受容体に関連した療法が癌管理療法として有用である可能性が高まった。このファミリーで最も頻繁に研究されているメンバーはEGFr(erbB1)である。このEGFr遺伝子は、グリア由来の多くのヒト脳腫瘍および一部の細胞系内で増幅され再編成される。Ullrich他は、トリ生存発癌遺伝子v-erb-BのEGFr細胞性類似体の遺伝子を発見した(Ullrich他、Nature、第309巻、頁418-425、1984)。EGFr受容体は約170kDaの膜貫通糖タンパク質である(Cohen、J. Biol. Chem.、第258巻、頁1523-1531、1982)。EGFrの過剰発現が、膀胱、食道、肺、グリア芽細胞種、および乳房を含めた様々な腫瘍中で見つかっている。乳癌では、40%を超える腫瘍がEGFr陽性であり、EGFrレベルはステロイド受容体(エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体)レベルと逆の相関関係にある。EGF受容体は、相互転換可能な2つの動態形(低親和性および高親和性受容体)で存在する(Fernandez-Pol、Biol. Chem.、第260巻、頁5003-5011、1985)。EGF受容体の発現は、腫瘍増殖の進行に関係付けられている。さらに、黒色腫発生の後期とEGFr遺伝子を保有する染色体の余分なコピーとの間に関連性が認められた(Koprowski他、Somatic Cell and Molecular Genetics、第11巻、頁297-302、1985)。
モノクローナル抗体、リガンドに連結した免疫毒素、チロシンキナーゼ阻害剤、およびアンチセンス手法を含めて、erbB1受容体を標的とする様々な戦略も開発されてきた(Zhang他、2000)。すべてのerbBファミリーメンバーのうちerbB2が、乳癌、卵巣癌、および膵臓癌に最も関連付けられてきた。発癌物質エチルニトロソ尿素によって誘発されるラットの神経グリア芽細胞種中で最初に同定されたneu(her2/erbB2としても知られる)は、EGFrとは異なるが高度に相同性のある、185kDaの受容体チロシンキナーゼをコードしているプロト発癌遺伝子である。erbB-2発癌遺伝子の翻訳産物は、チロシンキナーゼ活性を有し、この糖タンパク質の電気泳動を実施してその移動を既存の分子量を有するマーカータンパク質と比較することによって決定した分子量約185,000ダルトンの膜貫通糖タンパク質p185である。実験により、p185は、他のp185分子とホモ二量体を、または上皮成長因子受容体EGFR(erbB1)とヘテロ二量体を形成し、これら二量体はチロシンキナーゼ活性を上昇させ、これによりこのような二量体を有する細胞中では表現型の形質転換がもたらされることが示された。
原発性乳癌および卵巣癌の25〜30%で、erbB2遺伝子の増幅、neuのヒト相同体の増幅、およびそれに引き続いたポリペプチド産物p185の過剰発現が確認されたが、ヒト癌腫に関連したerbB2の発癌性点変異は検出されなかった。ネズミ線維芽細胞NIH3T3およびNR6では、erbB2の過剰発現は形質転換をもたらし、これは、erbB2には発癌性変異が必要ないことを示す。これまでの研究により、erbB2/neuの過剰発現は、亢進されたキナーゼ活性を有するオリゴマーをもたらす可能性があることが示されている。
ヒト乳癌中におけるerbB2遺伝子の過剰発現も、ホルモン治療および化学療法に対する予後不良および弱い抵抗力に関連している。大きな腫瘍、陽性リンパ節数の増加、ならびに生存期間の短縮や再発までの期間の短縮によって特徴付けられる悪性腫瘍の進行した段階は、neu遺伝子の増幅レベルの増加に直接関連付けられた。neuプロト発癌遺伝子は、正常なヒト組織では低レベルで発現される。
c-erbB3は上皮起源の様々な正常組織内で発現され、ヒト乳腺腫瘍のサブセット内で過剰発現される。c-erbB4(erbB3)はいくつかの乳癌細胞系中で主に発現され、正常な骨格筋、心臓、下垂体、および小脳中でも発現される。erbB3受容体は制限されたキナーゼ活性しか有さない。erbB3やerbB4の過剰発現は、リガンドの存在下でさえ、それだけではNIH3T3細胞を形質転換させることはできない。腫瘍原性に対するerbB3やerbB4の寄与がEGFrやerbB2とのヘテロ二量体化に依存していることが示唆される。
モノクローナル抗体(mAbs)およびそれ由来の断片は、数多くの様々なヒトの疾病の診断および治療に、臨床的に使用されてきた(Dougall他、1994、Oncogene、2109-23)。mAbsの抗腫瘍効果は、新生物(neoplastic)組織中で増強された発現を示す腫瘍抗原に対する特異性を要するだけでなく、所望の生物効果、すなわち腫瘍増殖の阻害を示さなければならない。たとえば米国特許第4,522,918号は、ヒト乳腺癌細胞の表面抗原に対するモノクローナル抗体を使用した癌の治療を開示している。
Capone他、JNCI、72: 673-677、1984は、抗原密度と固形腫瘍に対するモノクローナル抗体によって誘発された免疫療法的応答との関係を調査した。この研究者らは、ヒト乳癌に対する特異的なモノクローナル抗体を使用した。受動投与した(passively administered)モノクローナル抗体が、固形腫瘍に対する腫瘍退化応答を生じさせるのに有効となり得ることが見出された。モノクローナル抗体に伴った殺腫瘍応答は、細胞上の抗原密度に指数関数的に関係しているように見えた。米国特許第6,252,050号は、交差反応性抗体を作成する方法を記載している。p185に対する抗体およびこのような抗体を使用する方法は、本明細書中に参照として組み込まれている米国特許第6,165,464号、第5,772,997号、第5,770,195号、第5,725,856号、第5,720,954号、第5,677,171号に記載されている。米国特許第5,705,157号は、EGFRに対する抗体を記載している。米国特許第5,470,571号は、A431癌腫細胞系から作成したEGFrに対するモノクローナル抗体を使用した癌の治療を開示している。前記の米国特許のそれぞれは、その全体で本明細書中に参照として組み込まれている。
受容体の二量体化の場合、p185の細胞外ドメインと膜貫通ドメインを含有する構築体が、p185-EGFr二量体化を開始することができた(Qian他、PNAS、91、1500、1994)。後に、サブドメインIおよびIIのみを有するp185の代替転写産物がp185と二量体化することができることが見出された(Doherty他、PNAS、1999、96、10869)。
受容体の活性を無効にする手法は、受容体が機能するのに必要なタンパク質-タンパク質の相互作用を標的にすることである。タンパク質-タンパク質の相互作用は様々な細胞増殖および分化機構ならびにウイルス複製機構において重要な役割を果たすので、これらの相互作用を阻害することは、多数の細胞およびウイルス標的に対する合理的薬物設計法の有望な新規の手法である(Zutshi他、Curr Opin Chem Biol、1998、2、62-66; Peczuh他、Chem. Rev.、2000、100、2479-2494)。ポリペプチドホルモン、成長因子、またはサイトカインが細胞表面受容体に結合すると、受容体の二量体化(オリゴマー形成)が活性化され、細胞内部へのシグナル伝達がもたらされる(Heldin、Cell、1995、80、213-223)。現在までに開発された受容体阻害剤のほとんどは受容体-リガンドまたは酵素-基質の相互作用を遮断することに焦点を合わせているが、オリゴマー形成に伴う受容体-受容体の相互作用を抑制することも、受容体の機能を無効にするための重要な目的を表している。
完全長の未変性erbB受容体の、リガンド誘発性のホモおよびヘテロ二量体化が確立され、十分に立証されているが、これら受容体の細胞外ドメインの自己会合に関する実験データは幾分か矛盾している。分析用超遠心分離およびMALLSの研究では、erbB1およびerbB4でリガンド誘発性のホモ二量体化が実証されている(Ferguson他、EMBO J、2000、19、4632-4643)。しかし、erbB3受容体ではホモオリゴマー形成は観察されず、HRGβ1の存在下でヘテロ二量体を生成したerbB受容体の組合せはerbB2/erbB4、およびより低い程度でerbB2/erbB3のみであった。その一方で、erbB3ホモ二量体化およびerbB3/erbB2ヘテロ二量体化のどちらもで外部ドメインが報告されているが、これらの効果は、受容体の外部ドメインが膜に固着されている場合にのみ観察された(Tzahar他、EMBO J、1997、16、4938-4950)。LandgrafおよびEisenbergは、HRGβ1によって破壊され得る、erbB3外部ドメインのリガンド依存性でない自己会合を報告している。(Landgraf他、Biochemistry、2000、39、8503-8511)。erbB3の単量体形およびオリゴマー形のどちらもがHRGβ1の存在下で、サイズ排除クロマトグラフィーによって検出された。リガンドを加えることによって、低分子量種側へのシフトが生じた。
米国仮出願第60/282,037号 米国仮出願第60/309,864号 Dougall他、1994 O'Rourke他、1997 Pinkas-Kramarski他、1997 TzaharおよびYarden、1998 Ullrich他、Nature、第309巻、頁418-425、1984 Cohen、J.Biol.Chem.、第258巻、頁1523-1531、1982 Fernandez-Pol、Biol.Chem.、第260巻、頁5003-5011、1985 Koprowski他、Somatic Cell and Molecular Genetics、第11巻、頁297-302、1985 Zhang他、2000 Dougall他、1994、Oncogene、2109-23 米国特許第4,522,918号 Capone他、JNCI、72: 673-677、1984 米国特許第6,252,050号 米国特許第6,165,464号 米国特許第5,772,997号 米国特許第5,770,195号 米国特許第5,725,856号 米国特許第5,720,954号 米国特許第5,677,171号 米国特許第5,705,157号 米国特許第5,470,571号 Qian他、PNAS、91、1500、1994 Doherty他、PNAS、1999、96、10869 Zutshi他、Curr Opin Chem Biol、1998、2、62-66 Peczuh他、Chem. Rev.、2000、100、2479-2494 Heldin、Cell、1995、80、213-223 Ferguson他、EMBO J、2000、19、4632-4643 Tzahar他、EMBO J、1997、16、4938-4950 Landgraf他、Biochemistry、2000、39、8503-8511
本発明者らは、erbB1とのヘテロ二量体化に関与している特徴的なerbB2細胞外サブドメインを同定した(Kumagai他、Proc Natl Acad Sci U S A、2001、98、5526-5531)。サブドメインIVに対するペプチド擬態は、EGFRと会合した後にEGFに誘発される、ヘテロマーのシグナル伝達および形質転換活性を変化させる。したがって、サブドメインIVを標的にするペプチド擬態および抗体は、erbBを発現する腫瘍に対する治療薬として有用である。
本発明の特定の実施形態は、erbB1、erbB2、erbB3、erbB4のアセンブリ抗原決定基およびTNF受容体のアセンブリ抗原決定基に結合する抗体に関する。
本発明の特定の実施形態は、受容体のオリゴマー形成を遮断する抗体に関する。一部の好ましい実施形態では、抗体は、オリゴマー形成に関与する構造要素を含むペプチドまたはタンパク質サブドメインを免疫化することによって誘導される。一部の実施形態では、この構造要素はシスチンノット(knot)である。
本発明の特定の実施形態は、シスチンノットを含有するerbB1、erbB2、erbB3、erbB4、TNF受容体のサブドメインに結合する抗体、またはIgSFのメンバー、あるいはそのアセンブリに関する。
本発明の特定の実施形態は、erbB1、erbB2、erbB3、およびerbB4のシスチンノットに、またはTNF受容体のシスチンノットに結合する抗体に関する。
本発明の特定の実施形態は、erbB受容体やTNF受容体に結合するものを含む薬剤組成物に関する。一部の実施形態は、無菌であり発熱物質を含まない注射用の薬剤に関する。
本発明の特定の実施形態は、erbB受容体の細胞外ドメイン内の相互作用表面に、またはTNF受容体の細胞外ドメイン内の相互作用表面に結合する抗体に関する。
本発明の特定の実施形態は、erbB受容体やTNF受容体を模倣するペプチドに関する。一部の好ましい実施形態では、このペプチドは、erbB受容体の細胞外ドメインやTNF受容体の細胞外ドメインを模倣する。より好ましい実施形態では、このペプチドは、erbB受容体のサブドメインIVを模倣する。さらにより好ましい実施形態では、このペプチドは、erbB受容体のS22またはS23ループを模倣する。
本発明の特定の実施形態は、erbB受容体やTNF受容体の擬態に関する。一部の好ましい実施形態では、この擬態は、erbB受容体の細胞外ドメインの擬態またはTNF受容体の細胞外ドメインの擬態である。より好ましい実施形態では、この擬態は、erbB受容体のサブドメインIVの擬態である。さらにより好ましい実施形態では、この擬態は、erbB受容体のS22またはS23ループの擬態である。
本発明の特定の実施形態は、抗癌薬と組み合わせた、erbB受容体またはTNF受容体のペプチドまたは擬態を含む薬剤組成物に関する。このような実施形態の一部は、無菌であり発熱物質を含まない注射用の薬剤に関する。
本発明の特定の実施形態は、固形腫瘍を有するヒトの患者に、erbB受容体のペプチドや擬態、またはerbB受容体に対する抗体を投与することによって患者を治療する方法に関する。このような実施形態の一部では、ペプチド、擬態、または抗体の投与に続いて、任意選択で患者を治療上有効な量の抗癌放射線に暴露させることができる。他の実施形態の一部では、ペプチド、擬態、または抗体の投与を、治療上有効な量の化学療法剤の投与と組み合わせて実施することができる。一部の実施形態では、ペプチド、擬態、または抗体の投与を、治療上有効な量の化学療法剤の投与と組み合わせて実施し、続いて患者を治療上有効な量の抗癌放射線に暴露させることができる。
本発明の特定の実施形態は、固形腫瘍を有する患者に、放射性、化学療法、または光力学性の治療薬とコンジュゲートさせたerbB受容体のペプチドや擬態を投与することによって患者を治療する方法に関する。
本発明の特定の実施形態は、放射性剤または化学療法剤とコンジュゲートさせたerbBまたはTNF受容体に結合する抗体を含む薬剤組成物に関する。一部の実施形態は、無菌であり発熱物質を含まない注射用の薬剤に関する。
本発明の特定の実施形態は、ヒト患者に抗erbB抗体を投与することによって患者の腫瘍を阻止する方法に関する。
本発明の特定の実施形態は、ヒト患者にerbB受容体のペプチドまたは擬態を投与することによって患者の腫瘍を阻止する方法に関する。
本発明の特定の実施形態は、検出可能な抗erbB抗体を使用してこのような腫瘍を有するヒト患者内のerbB腫瘍をイメージングする方法に関する。
本発明の特定の実施形態は、erbB受容体、TNF受容体、またはIgSFのメンバーと結合させた検出可能な抗体を含む薬剤組成物に関する。一部の実施形態は、無菌であり発熱物質を含まない注射用の薬剤に関する。
本発明の特定の実施形態は、抗erbB抗体を使用して固形腫瘍をイメージングかつ/または検出する診断キットや方法に関する。
本発明の特定の実施形態は、実質的にerbBサブドメインIVからなるペプチド、サブドメインの1〜10個のアミノ酸が保存的アミノ酸で置換されている、実質的にerbBサブドメインIVペプチドからなるペプチド、および実質的にerbBサブドメインIVの10〜25個の連続したアミノ酸からなるペプチド、からなる群から選択される薬剤を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物中の腫瘍を阻止する方法に関する。
本発明の特定の実施形態は、実質的にerbBサブドメインIVからなるペプチド、サブドメインの1〜10個のアミノ酸が保存的アミノ酸で置換されている、実質的にerbBサブドメインIVペプチドからなるペプチド、および実質的にerbBサブドメインIVの10〜25個の連続したアミノ酸からなるペプチドからなる群から選択される活性薬剤と賦形剤とを含む、哺乳動物中の腫瘍を阻止するワクチンに関する。
本発明の一部の実施形態では、オリゴマー形成を促進する受容体の領域、好ましくは1つまたは複数のシスチンノットを含む受容体の領域の、ペプチドや擬態、およびこの領域に対する抗体を含む組成物が提供されている。本発明はさらに、このようなペプチドおよび抗体を使用した哺乳動物の腫瘍の治療、診断、およびイメージング方法を提供する。
定義
本明細書中で使用する用語「erbB」とは、それだけには限定されないが、erbB1(EGFr--上皮成長因子受容体、HER1)、erbB2(neu、p185、HER2)、erbB3(HER3)、およびerbB4(HER4)を含めて、ヘテロまたはホモ二量体へとアセンブリされる受容体チロシンキナーゼのerbBファミリー内の受容体をいう。
本明細書中で使用する用語「TNF」とは、オリゴマーへとアセンブリされる腫瘍壊死因子様リゴマーに結合する受容体をいう。TNF受容体には、それだけには限定されないが、TNF、FAS、RANK、TRAIL、およびCD40が含まれる。
本明細書中で使用する用語「p185/EGFr癌」、「p185/EGFr腫瘍」、「erbB2/EGFr癌」、「erbB2/EGFr腫瘍」とは、erbB2およびEGFrを発現する腫瘍細胞および新生物をいうことを意味する。erbB2/EGFr腫瘍は、その細胞表面にp185およびEGF受容体を有する。
本明細書中で使用する用語「erbB腫瘍」および「erbB癌」とは、1つまたは複数のerbB受容体を発現する腫瘍細胞および新生物をいうことを意味する。erbB腫瘍細胞や新生物の一部は、その細胞表面上にp185受容体を発現する場合がある。
本明細書中で使用する用語「TNF」および「TNF関連病態」とは、1つまたは複数のTNFファミリーの受容体に関わる病態をいうことを意味する。
本明細書中で使用する用語「オリゴマー形成」とは、単量体のアセンブリが多量体へと形成されるプロセスをいう。このプロセスを通じて形成されるアセンブリの例には、それだけには限定されないが、二量体、三量体、四量体などが含まれる。このようなアセンブリは、2つ以上の同一の単量体を含んでホモ二量体、ホモ三量体、ホモ四量体などを生じるか、または2つ以上の異なる単量体を含んでヘテロ二量体、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体などを生じることができる。
本明細書中で使用する用語「抗体」とは、抗体、ならびにFAbやF(Ab)2断片など抗体断片、組換え抗体や組換え抗体断片をいうことを意味する。一部の好ましい実施形態では、抗体は、モノクローナル、ヒト化、霊長類化、またはキメラ抗体であってよい。
本明細書中で使用する用語「シスチンノット」とは、少なくとも2つのジスルフィド結合およびそれらを連結するタンパク質鎖によって形成され、第3のジスルフィド結合によって貫通されているポリペプチドをいい、その全体が参照として組み込まれているMurzin他、J. Mol. Biol.、247: 536-540にさらに記載されている。たとえば、TNF受容体ファミリーでは、シスチンノットは、6個のシステイン残基が3つの鎖間ジスルフィド結合を形成して構造モチーフを作成している、42個のアミノ酸残基からなっている。
本明細書中で使用する表現「シスチンノット特異的抗体」とは、システインに富むドメイン、シスチンノット、またはシスチンノットループの一部分に結合する抗体をいう。一部の実施形態では、この抗体は、システインに富むドメイン内に見つかるシステインで結合されたループに結合する。
本明細書中で使用する表現「シスチンノットを含む領域」とは、1つまたは複数のシスチンノットを含む、受容体の一部分をいう。一部の実施形態では、このシスチンノットを含む領域は受容体の細胞外領域である。一部の好ましい実施形態では、このシスチンノットを含む領域はサブドメインIVである。より好ましい実施形態では、このシスチンノットを含む領域は、S22ループおよびS23ループからなる群から選択される。
本明細書中で使用する用語「領域」とは、少なくとも一部分を含む受容体の一部をいう。代表的な抗体領域には、それだけには限定されないが、細胞外領域、膜貫通領域、および細胞内領域が含まれる。
本明細書中で使用する用語「一部分」とは、少なくとも3〜5個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも8〜10個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも11〜15個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも17〜24個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも25〜30個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも30〜45個のアミノ酸をいう。
本明細書中で使用する用語「コンホメーション部位」とは、受容体のコンホメーションに影響を与える、受容体上の部位をいう。一部の実施形態では、コンホメーション部位に抗体、ペプチド、または擬態が結合すると、受容体のオリゴマー形成が阻止され、好ましくは受容体シグナル伝達が低下または排除されるように受容体のコンホメーションが変化する。一部の好ましい実施形態では、このコンホメーション部位は受容体-受容体の接触点である。
本明細書中で使用する用語「擬態(mimetic)」とは、ペプチドの活性を模倣する化合物をいうのに使用する。擬態はペプチドではないが、非ペプチド結合によって連結されたアミノ酸を含んでいてもよい。米国特許第5,637,677号およびその親出願が、擬態を生成する詳細な手引きを含む。手短に述べると、erbB受容体の三次元構造と特異的に相互作用するペプチドの三次元構造を、ペプチドでない分子によって複製する。
本明細書中で相互置き換え可能に使用する用語「コンホメーション限定ペプチド(conformationally restricted peptide)」、「束縛ペプチド(constrained peptide)」、および「コンホメーション束縛ペプチド(conformationally constrained peptide)」とは、たとえば分子間結合を介してコンホメーションが安定であり、十分に限定されたコンホメーションのままとどまるペプチドを意味する。この化合物はerbB受容体に対する親和性を有し、細胞上のerbB受容体に結合すると、erbBに媒介される形質転換表現型を有する細胞に生物活性効果を与える。
本明細書中で相互置き換え可能に使用する用語「芳香族アミノ酸」および「芳香族アミノ酸残基」とは、フェニルアラニンおよびチロシンをいうことを意味する。
本明細書中で使用する用語「環外アミノ酸残基」とは、環状ペプチドに連結しているが、環状構造を構成するペプチド部分内にはないアミノ酸残基をいうことを意味する。
本明細書中で使用する用語「環外部分」とは、環状ペプチドに連結しているアミノ酸残基を1つまたは複数有するが、環状構造を構成するペプチド部分内にはないアミノ酸配列をいうことを意味する。
本明細書中で使用する用語「連結部分(moiety)」とは、3つのアミノ酸と結合を形成することができる分子成分または官能基をいうことを意味する。
本明細書中で使用する用語「連結アミノ酸残基」とは、連結部分であるアミノ酸残基をいうことを意味する。
本明細書中で相互置き換え可能に使用する用語「活性配列」および「活性領域」とは、相互作用が活性部分とerbB受容体との親和性によって特徴付けられる、erbB受容体と直接相互作用する本発明の化合物の一部分のアミノ酸配列をいうことを意味する。
一部の実施形態では、このペプチドおよび擬態は、erbB受容体のサブドメインIV内に存在するループや反復の束縛擬態である。一部の実施形態では、このペプチドおよび擬態は、シスチンノットを含む領域、好ましくは1つのシスチンノットまたはその一部分を模倣する。一部の実施形態では、ペプチドまたは擬態をerbBまたはTNF受容体と結合させることで受容体の二量体化が阻止され、好ましくは、受容体シグナル伝達が低下または排除される。
本明細書中で使用する用語「二量体化部位」は、「相互作用部位」および「相互作用表面」と相互置き換え可能に使用され、2つの受容体が二量体化する際に別の受容体と結合を形成する、受容体上の部位をいう。一部の実施形態では、この二量体化部位はリガンド依存性でない、すなわち、この二量体化部位は、特定の結合したリガンドが存在することまたは存在しないことに依存しない。別の実施形態では、この二量体化部位はリガンド依存性であり、すなわち、この二量体化部位は、特定の結合したリガンドが存在することまたは存在しないことに依存する。一部の実施形態では、抗体、ペプチド、または擬態が二量体化部位に結合することによって受容体の二量体化が阻止され、好ましくは、受容体シグナル伝達が低下または排除される。一部の好ましい実施形態では、この二量体化部位は、erbB受容体のサブドメインIVまたはその一部分である。
本明細書中で使用する用語「アセンブリ」は、「アンサンブル」または「二量体」と相互置き換え可能に使用され、受容体のホモまたはヘテロオリゴマーをいう。このようなアセンブリは、erbB1、erbB2、erbB3、erbB4、またはその組合せ、あるいはそれだけには限定されないがFAS、RANK、TRAIL、およびCD40、またはその組合せを含めたTNF受容体ファミリー、あるいはそれだけには限定されないがICOSおよびCD28を含めたIgSFスーパーファミリーのメンバーを含有することができる。
本明細書中で使用する用語「危険性の高い個体」とは、以前にerbBまたはTNFに関連する病態あるいはIgSFメンバーに関連する病態を取り除いたことがあるまたは寛解中であり、したがって再発または再発生しやすい個体をいうことを意味する。erbBの場合は、危険性の高い個体の治療レジメンの一部として、再発生と闘うために、以前有していたと診断された腫瘍に対して、個体を予防的に治療することができる。したがって、個体が以前erbB癌を有していたことが分かった後は、正常細胞が腫瘍細胞に形質転換されるのを阻止するために、本発明に従って個体を治療することができる。
本明細書中で使用する用語「組み合わせて」とは、放射療法および/または化学療法と共に、本発明の抗体、ペプチド、または擬態組成物を投与することをいうことを意味する。抗体、ペプチド、または擬態組成物の投与は、放射療法および/または化学療法の前、同時に、または後に行うことができる。
本明細書中で使用する用語「治療上有効な量」とは、個体に抗体を治療上有効な量で投与した場合に、個体中の腫瘍細胞の腫瘍原性表現型の減少または逆転として観察される医療効果を生じる量の抗体、ペプチド、または擬態をいうことを意味する。治療上有効な量は通常、活性成分を含まない組成物を同様の状況下の個体に投与した場合に観察される効果に比べた、この組成物の効果によって決定される。
本明細書中で使用する用語「腫瘍の発生を阻止する」とは、正常な表現型または形質転換が不完全な表現型を有する細胞が、完全に形質転換された表現型に形質転換されるのを阻害することを含めて、正常細胞が腫瘍細胞に形質転換されるのを阻止することをいう。したがって、腫瘍の発生とは、表現型の形質転換が獲得される形質転換現象をいう。本発明の一部の態様によれば、抗体、ペプチド、または擬態を、腫瘍を発生する危険性がある個体に投与することができる。抗体、ペプチド、または擬態を危険性の高い個体に予防的に投与することによって、形質転換現象が起こるのを阻止することができる。正常な表現型を有する細胞は、形質転換された表現型を有する細胞に変換されない。この抗体、ペプチド、または擬態は、正常細胞が癌細胞になるのを阻止することによって、腫瘍が形成される前にそれを阻止する。
本明細書中で使用する用語「予防上有効な量」とは、個体に抗体、ペプチド、または擬態を予防上有効な量で投与した場合に、個体中で形質転換していない細胞が形質転換されるのを阻止することとして観察される医療効果を生じる量の抗体、ペプチド、または擬態をいうことを意味する。予防上有効な量は通常、活性成分を含まない組成物を同様の状況下の個体に投与した場合に観察される効果に比べた、この組成物の効果によって決定される。
本明細書中で使用する表現「注射用薬剤組成物」またはその変異形とは、米国薬局方の「注射用」の要件、すなわち、無菌であり、発熱物質および微粒子を含まず、特定のpH値および等張性の値を有することを満たす薬剤組成物をいう。
抗体
erbB1、erbB2、erbB3、erbB4のアセンブリ抗原決定基およびTNFまたはIgSF受容体のアセンブリ抗原決定基から設計した分子に加えて、本発明は、それだけには限定されないが、受容体の相互作用表面に基づいた抗体およびペプチド擬態を含めた分子も含む。
一部の実施形態では、抗体は、erbB、TNF、またはIgSF受容体の二量体化部位に特異的である。一部の実施形態では、抗体はerbB1またはerbB2の二量体化部位に特異的である。抗体が二量体化部位に結合することにより、受容体の二量体化が阻止され、好ましくは、受容体シグナル伝達が低下または排除される可能性がある。
一部の実施形態では、抗体は、erbB、TNF、またはIgSF受容体のコンホメーション部位に特異的である。好ましい一実施形態では、抗体はerbB1またはerbB2のコンホメーション部位に特異的である。一部の実施形態では、抗体はerbB1またはerbB2のコンホメーション部位に特異的である。抗体がコンホメーション部位に結合することにより、受容体が二量体化できないように受容体のコンホメーション部位が変化し、好ましくは、受容体シグナル伝達が低下または排除される。
一部の実施形態では、erbB、TNF、またはIgSF受容体内のシスチンノットを含む領域、シスチンノット、またはその一部分に結合する抗体が提供されている。一部の実施形態では、抗体は、erbB、TNF、またはIgSF受容体の細胞外ドメイン中のシスチンノットに特異的である。
ペプチド、擬態、および抗体
本発明は、とりわけ、様々な機構によってerbB受容体ポリペプチドまたはTNF受容体ポリペプチドのアセンブリを無効にすることができるペプチド擬態の、生化学的な結果を説明する。
本発明は、とりわけ、芳香族アミノ酸である環外アミノ酸を含めた環外部分、ならびにerbBと特異的に結合する活性領域を含む束縛ペプチドに関する。束縛ペプチドの例は、米国特許第6,100,377号に出ている。
本発明はまた、erbBに特異的に結合する擬態にも関する。
本発明は、形質転換された腫瘍細胞の表現型を逆転させるために、erbB腫瘍を有すると同定された個体を治療的に処置するのに有用である。本発明は、erbB腫瘍を発生しやすい個体、あるいは以前にerbB関連の腫瘍を有したことがあり、したがって再発または再発生しやすい個体を予防的に治療するのに有用である。本発明は、腫瘍表面上のerbB受容体について検出可能な程度にイメージングするのに有用である。本発明は、すべての表面上でerbBを検出および定量するのに有用である。
一部の実施形態では、本発明は、式R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7を有するペプチドを提供する。
(式中、
R1は、少なくとも1個がチロシンまたはフェニルアラニンである1〜6個のアミノ酸残基であり、
R2は、前記ペプチドの一部分が環状になるようにR1、R3およびR6と結合する連結部分であり、
R3は、0〜20個のアミノ酸であり、
R4は、6〜12個のアミノ酸であり、
R5は、0〜20個のアミノ酸であり、
R6は、前記ペプチドの一部分が環状になるようにR5、R7およびR2と結合する連結部分であり、
R7は、少なくとも1個がチロシンまたはフェニルアラニンである1〜6個のアミノ酸残基であり、
R1、R2、R3、R4、R5、R6およびR7は、全部あわせて30個以下のアミノ酸である。)
一部の実施形態では、R4は、F-P-D-E-E-G-A(配列番号1)を有する。一部の実施形態では、R4は、F-P-D-E-E-G-A(配列番号1)からなる。一部の実施形態では、R4は、F-Y-P-D-E-E-G-A(配列番号2)を含む。一部の実施形態では、R4は、F-Y-P-D-E-E-G-A(配列番号2)からなる。
本発明の化合物におけるR1の主な機能は、芳香族基を含む少なくとも1つのアミノ酸の存在、すなわちチロシンまたはフェニルアラニンの存在に起因する。R1位における芳香族アミノ酸の存在は、erbBに対するペプチドの親和性の増大、およびそれに付随する化合物の活性の増大をもたらす。追加のアミノ酸残基が存在する実施形態では、芳香族アミノ酸をより効果的な位置に提示して化合物の親和性および活性を増大させることができる。存在することができる追加のアミノ酸は、芳香族アミノ酸の親和性や活性に対する効果を除去してはならない。R1として使用することができるアミノ酸配列の例は、同時係属の米国特許第6,100,377号に開示されている。一部の実施形態では、追加のアミノ酸は、検出可能な標識または部分(moiety)に連結するための部位として存在する。一部の実施形態では、追加のアミノ酸は、他のペプチドと二量体化するため、すなわち、互いに二量体化してホモ二量体を形成するため、または他ペプチドと二量体化してヘテロ二量体を形成するためのいずれかの部位として存在する。
一部の好ましい実施形態では、R1は1〜5個のアミノ酸である。一部の好ましい実施形態では、R1は4個のアミノ酸である。一部の好ましい実施形態では、R1は3個のアミノ酸である。一部の好ましい実施形態では、R1は2個のアミノ酸である。一部の好ましい実施形態では、R1は1個のアミノ酸である。一部の好ましい実施形態では、R1はS-Yを含む。一部の好ましい実施形態では、R1はS-Yからなる。一部の好ましい実施形態では、R1はG-S-Yを含む。一部の好ましい実施形態では、R1はG-S-Yからなる。一部の好ましい実施形態では、R1はYからなる。一部の好ましい実施形態では、R1はKからなる。一部の好ましい実施形態では、R1はKを含む。R1の他の例には、G-G-S-Y(配列番号21)およびG-G-G-S-Y(配列番号22)が含まれる。企図される等価物には、チロシンやフェニルアラニンの一部ではない、R1における芳香族官能基が含まれる。
R2の機能は、R1と結合を形成すること、ならびにR6と結合を形成して分子を環状化するまたは他の方法で分子のコンホメーションを限定することである。R2とR6の間の結合により分子が環状化するので、R3-R4-R5、特にR4を、erbBに親和性がありそれと相互作用する、特異的に生物活性のある表面を生じる束縛されたコンホメーションに保つ。さらに、このような配置では、R1はペプチドの環外部分になる。したがって、R2は、R6、ならびにR1およびR3と結合を形成することができる任意の部分(moiety)でよい。
R2は、好ましくはアミノ酸残基、好ましくはシステインである。R2とR6のどちらもがシステインである場合、2つのシステイン間に形成されるジスルフィド結合が分子を環状化する。R2は、R6と一緒になって、R1-R2-R3-R4-R5-R6を含む分子の一部分を環状化するがR1およびR7をペプチドの環外部分として与えることができる、任意の部分(moiety)でよいことが企図される。当分野の技術者は、R2およびR6が互いに結合を形成できる部分(moiety)である本発明に従ったペプチドを、容易に調製することができる。隣接しないシステイン間のジスルフィド結合を用いた、直鎖ペプチドの環状化は周知である。同様に、他の隣接しないアミノ酸残基を連結してペプチド配列を環状化できること、およびその手法も同様に周知である。他の環状化方法には、それぞれを参照として本明細書中に組み込む、Di Blasio他、1993、Biopolymers、33: 1037-1049; Wood他、1992、J. Pep. Prot. Res.、39: 533-539; Saragovi他、1992、Immunomethods、1: 5-9; Saragovi他、1991、Science、253: 792-795; Manning他、1993、Reg. Peptides、45: 279-283; Hruby、1993、Biopolymers、33: 1073-1082; Bach他、1994、New Adv. Peptidomimetics Small Mol. Design、I: 1-26; Matsuyama他、1992、J. Bacteriol.、174: 1769-1776に記載されているものが含まれる。
R3の機能は、スペーサーとして働き、活性領域を正しいコンホメーションで提示するための構造を提供することである。一部の実施形態では、特定の連結部分によって活性領域が環状化されることにより活性領域が正しく折り畳まれて活性のあるコンホメーションになり、これにR3は必要ない。一部の実施形態では、特定の連結部分による活性領域の環状化には、活性コンホメーションにさせるために活性領域の正しい折り畳みを促進する、追加の間隔(spacing)やひねり(turn)が必要である。このような実施形態では、R3位にアミノ酸残基または配列を提供することができる。一部の好ましい実施形態では、R3は0〜10個のアミノ酸である。一部の好ましい実施形態では、R3は0〜5個のアミノ酸である。一部の好ましい実施形態では、R3は0個のアミノ酸である。
R4は、本発明のこの態様による化合物の活性領域である。本発明の化合物中では、活性領域の官能基は、それらがerbB受容体上のアミノ酸および官能基と相互作用し、そのような相互作用を介してerbB受容体に結合することを可能にする、特定の三次元配置に配置されるようなコンホメーションにある。ペプチド擬態では、これらの官能基は活性のある三次元配置で提供されるが、修飾されたまたは異なる主鎖に結合されている。各残基を、同等の体積(bulk)および疎水性モーメントに寄与し、やはり周囲の水分子または化合物が結合する残基と水素結合できる残基と変えることが可能である。
R5の機能は、活性領域を正しいコンホメーションで提示することである。一部の実施形態では、特定の連結部分によって活性領域が環状化されることにより活性領域が正しく折り畳まれて活性コンホメーションになり、これにR5は必要ない。一部の実施形態では、特定の連結部分による活性領域の環状化には、活性コンホメーションにさせるために活性領域の正しい折り畳みを促進する、追加の間隔やひねりが必要である。このような実施形態では、R5位にアミノ酸残基または配列を提供することができる。一部の好ましい実施形態では、R5は0〜10個のアミノ酸である。一部の好ましい実施形態では、R5は0〜5個のアミノ酸である。一部の好ましい実施形態では、R5は0個のアミノ酸である。
R6の機能は、R2と結合を形成して分子を環状化するまたは他の方法で分子のコンホメーションを限定することである。R6とR2の間の結合により分子が環状化するので、R3-R4-R5、特にR4を、erbBに親和性がありそれと相互作用する、特異的に生物活性のある表面を生じる束縛されたコンホメーションに保つ。したがって、R6は、R2、ならびにR5およびR7と結合を形成することができる任意の部分(moiety)でよい。R6は、好ましくはアミノ酸残基、好ましくはシステインである。R6とR2のどちらもがシステインである場合、2つのシステイン間に形成されるジスルフィド結合が分子を環状化する。R6は、R2と一緒になって分子の環状化を可能にする任意の部分(moiety)でよいことが企図される。当分野の技術者は、R2およびR6が互いに結合を形成することができる部分(moiety)である本発明に従ったペプチドを容易に調製することができる。隣接しないシステイン間のジスルフィド結合を用いた直鎖ペプチドの環状化は周知である。同様に、他の隣接しないアミノ酸残基を連結してペプチド配列を環状化できること、およびその手法も同様に周知である。他の環状化方法には、それぞれを参照として本明細書中に組み込む、Di Blasio他、1993、Biopolymers、33: 1037-1049; Wood他、1992、J. Pep. Prot. Res.、39: 533-539; Saragovi他、1992、Immunomethods、1: 5-9; Saragovi他、1991、Science、253: 792-795; Manning他、1993、Reg. Peptides、45: 279-283; Hruby、1993、Biopolymers、33: 1073-1082; Bach他、1994、New Adv. Peptidomimetics Small Mol. Design、I: 1-26; Matsuyama他、1992、J. Bacteriol.、174: 1769-1776に記載されているものが含まれる。
本発明の化合物におけるR7の主な機能は、芳香族基を含む少なくとも1つのアミノ酸の存在、すなわちチロシンまたはフェニルアラニンの存在に起因する。R7位における芳香族アミノ酸の存在は、erbBに対するペプチドの親和性の増大、およびそれに付随する化合物の活性の増大をもたらす。追加のアミノ酸残基が存在する実施形態では、芳香族アミノ酸をより効果的な位置に提示して化合物の親和性および活性を増大させることができる。存在することができる追加のアミノ酸は、芳香族アミノ酸の親和性や活性に対する効果を除去してはならない。R7として使用することができるアミノ酸配列の例は、米国特許第6,100,377号に開示されている。
一部の実施形態では、追加のアミノ酸は、検出可能な標識または部分(moiety)に連結する部位として存在する。一部の実施形態では、追加のアミノ酸は、他のペプチドと二量体化する、すなわち、互いに二量体化してホモ二量体を形成する、または他ペプチドと二量体化してヘテロ二量体を形成する部位として存在する。
一部の好ましい実施形態では、R7は1〜5個のアミノ酸である。一部の好ましい実施形態では、R7は4個のアミノ酸である。一部の好ましい実施形態では、R7は3個のアミノ酸である。一部の好ましい実施形態では、R7は2個のアミノ酸である、一部の好ましい実施形態では、R7は1個のアミノ酸である。一部の好ましい実施形態では、R7はY-G-G-S(配列番号27)を含む。一部の好ましい実施形態では、R7はY-G-G-S(配列番号27)からなる。一部の好ましい実施形態では、R7はY-G-G-G(配列番号23)を含む。一部の好ましい実施形態では、R7はY-G-G-G(配列番号23)からなる。一部の好ましい実施形態では、R7はY-G-G-G-S(配列番号24)を含む。一部の好ましい実施形態では、R7はY-G-G-G-S(配列番号24)からなる。一部の好ましい実施形態では、R7はYを含む。一部の好ましい実施形態では、R7はYからなる。一部の好ましい実施形態では、R7はY-G-Gを含む。一部の好ましい実施形態では、R7はY-G-Gからなる。R7の別の例はY-Gである。企図される等価物には、チロシンやフェニルアラニンの一部ではない、R7における芳香族官能基が含まれる。
一部の実施形態では、R1とR7は共同でチロシンとフェニルアラニンのどちらもを含む。すなわち、R1がチロシンを含む場合はR7がフェニルアラニンを含み、R1がフェニルアラニンを含む場合はR7がチロシンを含む。一部の好ましい実施形態では、R1とR7は、どちらもがチロシンまたはフェニルアラニンを含むことはない。すなわち、R1がチロシンを含みフェニルアラニンを含まない場合は、R7はフェニルアラニンを含みチロシンを含まず、R1がフェニルアラニンを含みチロシンを含まない場合は、R7がチロシンを含みフェニルアラニンを含まない。
一部の好ましい実施形態では、R1、R2、R3、R4、R5、R6およびR7は、合計で30個未満のアミノ酸である。一部の好ましい実施形態では、R1、R2、R3、R4、R5、R6およびR7は、合計で20個以下のアミノ酸である。一部の好ましい実施形態では、R1、R2、R3、R4、R5、R6およびR7は、合計で20個未満のアミノ酸である。一部の好ましい実施形態では、R1、R2、R3、R4、R5、R6およびR7は、合計で15個のアミノ酸である。一部の好ましい実施形態では、R1、R2、R3、R4、R5、R6およびR7は、合計で15個未満のアミノ酸である。一部の好ましい実施形態では、R1、R2、R3、R4、R5、R6およびR7は、合計で14個のアミノ酸である。一部の好ましい実施形態では、R1、R2、R3、R4、R5、R6およびR7は、合計で13個のアミノ酸である。一部の好ましい実施形態では、R1、R2、R3、R4、R5、R6およびR7は、合計で12個のアミノ酸である。一部の好ましい実施形態では、R1、R2、R3、R4、R5、R6およびR7は、合計で11個のアミノ酸である。一部の好ましい実施形態では、R1、R2、R3、R4、R5、R6およびR7は、合計で10個のアミノ酸である。
特定の実施形態では、ペプチドは以下からなる群から選択される。
Y-C-F-P-D-E-E-G-A-C-Y (配列番号3); S-Y-C-F-P-D-E-E-G-A-C-Y (配列番号4); G-S-Y-C-F-P-D-E-E-G-A-C-Y (配列番号5); G-G-S-Y-C-F-P-D-E-E-G-A-C-Y (配列番号6); G-G-G-S-Y-C-F-P-D-E-E-G-A-C-Y (配列番号7); Y-C-F-P-D-E-E-G-A-C-Y-G (配列番号8); Y-C-F-P-D-E-E-G-A-C-Y-G-G (配列番号9); Y-C-F-P-D-E-E-G-A-C-Y-G-G-G (配列番号10); Y-C-F-P-D-E-E-G-A-C-Y-G-G-G-S (配列番号11); Y-C-F-Y-P-D-E-E-G-A-C-Y (配列番号12); S-Y-C-F-Y-P-D-E-E-G-A-C-Y (配列番号13); G-S-Y-C-F-Y-P-D-E-E-G-A-C-Y (配列番号14); G-G-S-Y-C-F-Y-P-D-E-E-G-A-C-Y (配列番号15); G-G-G-S-Y-C-F-Y-P-D-E-E-G-A-C-Y (配列番号16); Y-C-F-Y-P-D-E-E-G-A-C-Y-G (配列番号17); Y-C-F-Y-P-D-E-E-G-A-C-Y-G-G (配列番号18); Y-C-F-Y-P-D-E-E-G-A-C-Y-G-G-G (配列番号19);およびY-C-F-Y-P-D-E-E-G-A-C-Y-G-G-G-S (配列番号20); YCFPDEEGACYK (配列番号25);およびYCFPDEEGACYGGS (配列番号26)
R1、R2、R3、R4、R5、R6およびR7の様々な組合せを含む他のペプチドが、本発明の範囲内に含められる。
一部の実施形態では、ペプチドの末端残基が修飾されている。一部の実施形態では、R1の末端残基が-OHで修飾されている。一部の実施形態では、R1の末端残基が-NH2で修飾されている。一部の実施形態では、R7の末端残基が-OHで修飾されている。一部の実施形態では、R7の末端残基が-NH2で修飾されている。
一部の実施形態によれば、R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7は一緒になってペプチドを形成する。
(式中、
R1は、少なくとも1個がチロシンまたはフェニルアラニンである1〜3個のアミノ酸残基であり、
R2は、システインまたはペンシラミンであり、
R3は、0個のアミノ酸であり、
R4は、7から8個のアミノ酸であり、
R5は、0個のアミノ酸であり、
R6は、システインまたはペンシラミンであり、
R7は、少なくとも1個がチロシンまたはフェニルアラニンである1〜5個のアミノ酸残基であり、
式中、
R1、R2、R3、R4、R5、R6およびR7は、他の点では上記で設定したとおりである、合計で30個以下のアミノ酸である。)
特定の実施形態では、このペプチドはB2-S23-BPT: P-C-P-I-N-C-T-H-S-C-V-D-L-D-D-K-G-C-P-A-E-Q-R-A-S-P-L-T-S-I(配列番号38)である。
IgSFメンバーに対する抗体を作成する一部の好ましい実施形態では、このペプチドはC-K-V-E-L-M-Y-P-P-P-Y-F-V-G-M-G-N-G-T-Q-I-Y-V-I-D-P-E-P-C(配列番号36)である。
IgSFメンバーに対する抗体を作成する一部の好ましい実施形態では、このペプチドはC-K-I-E-F-M-Y-P-P-P-Y-L-D-N-E-R-S-N-G-T-I-I-H-I-K-E-K-H-L-C(配列番号29)である。
一部の好ましい実施形態では、このペプチドはC-S-L-S-I-F-D-P-P-P-F-Q-E-R-N-L-S-G-G-Y-L-H-I-Y-E-S-Q-L-C(配列番号30)である。
一部の好ましい実施形態では、このペプチドはB2-S22-APE: Y-C-P-I-W-K-F-P-D-E-E-C-Y(配列番号31)である。
一部の好ましい実施形態では、このペプチドはB1-S22-ALG: Y-C-L-V-W-K-Y-A-D-A-G-C-Y(配列番号32)である。
一部の好ましい実施形態では、このペプチドはB3-S22-APQ: Y-C-P-I-Y-K-Y-P-D-V-Q-C-Y(配列番号33)である。
一部の好ましい実施形態では、このペプチドはB4-S22-AFD: Y-C-F-I-F-K-Y-A-D-P-D-C-Y(配列番号34)である。
一部の好ましい実施形態では、このペプチドはB2-S22-AFA: Y-C-F-P-D-E-E-G-A-C-Y(配列番号35)である。
当分野の技術者は、上式に従って容易に分子を構築し、この化合物がerbBに媒介される形質転換表現型を阻止および排除するerbB結合化合物として活性があるかどうかを決定することができる。
本発明のペプチドは、互いに二量体化してホモ二量体を形成する、または本発明の化合物を含めた他の化合物と二量体化してヘテロ二量体を形成することができる。好ましい二量体では、単量体を連結する化学結合に関与する残基は、本発明の化合物のR1位にある。
erbB、TNF、またはIgSF受容体を模倣するペプチドの擬態を生成することができる。このような擬態は、実施例で述べるアッセイで試験することができる。
本発明によれば、erbB、TNF、またはIgSF受容体上の部位を模倣するペプチドおよび擬態は、受容体の二量体化を阻止するので、受容体のキナーゼ活性を下方調節するのに有用である。ペプチドおよび擬態は、結合すると、細胞増殖レベルの除去または低下、ならびに形質転換していない静止状態の表現型をもたらすチロシンキナーゼ活性および/または受容体シグナル伝達を排除または低下させる。したがって、このペプチドおよび擬態は、erbB腫瘍またはTNFやIgSFに媒介される病態を有すると疑われる個体の治療、ならびにこのようなerbB腫瘍形成の阻止に有用である。治療しない個体では腫瘍に変わるであろう個体中の細胞は、完全に形質転換されず、この方法で治療した個体中では腫瘍にならない。腫瘍を発生しやすい、または他の点で腫瘍を発生する危険性があると同定された個体に投与した場合、このペプチドおよび擬態は、erbBまたはTNF単量体に結合する抗体を誘導し、その結果、受容体のオリゴマー形成に関連するチロシンキナーゼ活性やシグナル伝達の上昇を阻止する可能性がある。細胞中のチロシンキナーゼ活性がいつまでたっても十分上昇されず、細胞は形質転換されないまま維持されるかもしれない。
erbB受容体、TNFやIgSFファミリーの受容体のペプチドおよび擬態は、抗腫瘍組成物に有用であり、当業者は、容易に入手可能な出発物質を用いて生成することができる。米国特許第5,637,677号およびその親出願が、擬態の生成における詳細な手引きを開示している。
好ましい実施形態によれば、ペプチドまたは擬態は、erbB、TNF、またはIgSF受容体の既知の領域に基づいて設計される。一部の好ましい実施形態では、このペプチドまたは擬態は、erbB、TNF、またはIgSF受容体の細胞外ドメインを模倣する。一部のさらに好ましい実施形態では、このペプチドまたは擬態は、膜貫通ドメインに近位の第2のシステインに富むドメイン(S22ループ)を模倣する。一部の好ましい実施形態では、このペプチド擬態はS23ループを模倣する。一部の実施形態によれば、本発明のペプチド擬態はシスチンノット含有領域を模倣する。
一部の好ましい実施形態では、このペプチドおよび/または擬態は環外にある。一部の好ましい実施形態では、このペプチドおよび/または擬態はシスチンノットの全体を模倣する。一部の実施形態では、このペプチドおよび/または擬態は、シスチンノットの一部分を模倣する。
さらに、ペプチドおよび/または擬態は、erbB2とerbB1、erbB1とerbB3、erbB1とerbB4、erbB2とerbB3、erbB2とerbB4、erbB3とerbB4のアセンブリまたは機能的抗原決定基、TNF受容体のアセンブリまたは機能的抗原決定基、あるいはIgSFメンバーのアセンブリまたは機能的抗原決定基を模倣してもよい。
一部の実施形態では、erbB、TNF、またはIgSF受容体の二量体化部位を模倣し、抗体を誘導することがあるペプチドおよび/または擬態が提供されている。好ましい一実施形態では、このペプチドおよび/または擬態は、erbB1またはerbB2の二量体化部位を模倣する。ペプチドおよび/または擬態、あるいは誘導した抗体が二量体化部位に結合することにより、受容体の二量体化が阻止され、好ましくは、受容体のシグナル伝達が低下または排除される。
一部の実施形態では、erbB、TNF、またはIgSF受容体のコンホメーション部位を模倣し、抗体を誘導することがあるペプチドおよび/または擬態が提供されている。好ましい一実施形態では、このペプチドおよび/または擬態は、erbB1またはerbB2のコンホメーション部位を模倣する。ペプチドおよび/または擬態、あるいは誘導した抗体がコンホメーション部位に結合することにより、受容体のコンホメーション部位が変化して受容体の二量体化が阻止され、好ましくは、受容体シグナル伝達が低下または排除される。
本発明のペプチドおよび/または擬態は、患者に投与する組成物の成分として、放射療法および/または化学療法と組み合わせて患者に投与する組成物の成分として、あるいは放射性剤または化学療法剤とコンジュゲートさせたペプチドおよび/または擬態を含む、患者に投与する組成物の成分として、erbB腫瘍の治療に有用である。
本発明のペプチドおよび/または擬態は、患者に投与する組成物の成分として、放射療法および/または化学療法と組み合わせて患者に投与する組成物の成分として、あるいは放射性剤または化学療法剤とコンジュゲートさせたペプチドおよび/または擬態を含む、患者に投与する組成物の成分として、erbB腫瘍またはTNFやIgSFに媒介される病態を阻止するのに有用である。
本発明のペプチドおよび/または擬態は、抗体の産生に有用である。一部の実施形態では、適切な宿主を以下の群からなるペプチドで免疫化することによって抗体を生成する。
Y-C-F-P-D-E-E-G-A-C-Y (配列番号3); C-K-V-E-L-M-Y-P-P-P-Y-F-V-G-M-G-N-G-T-Q-I-Y-V-I-D-P-E-P-C (配列番号28); C-K-I-E-F-M-Y-P-P-P-Y-L-D-N-E-R-S-N-G-T-I-I-H-l-K-E-K-H-L-C (配列番号29); C-S-L-S-I-F-D-P-P-P-F-Q-E-R-N-L-S-G-G-Y-L-H-I-Y-E-S-Q-L-C (配列番号30); B2-S22-APE: Y-C-P-I-W-K-F-P-D-E-E-C-Y (配列番号31); BI-S22-ALG: Y-C-L-V-W-K-Y-A-D-A-G-C-Y (配列番号32); B3-S22-APQ: Y-C-P-I-Y-K-Y-P-D-V-Q-C-Y (配列番号33); B4-S22-AFD: Y-C-F-I-F-K-Y-A-D-P-D-C-Y (配列番号34); B2-S22-AFA: Y-C-F-P-D-E-E-G-A-C-Y (配列番号35).
一部の実施形態では、この抗体はerbB受容体のシステインに富むドメインに結合する。一部の実施形態では、このペプチドまたは擬態は、erbB、TNF、またはIgSFファミリー受容体の機能部位に結合する抗体を誘導する。
本発明はまた、配列番号1から37までからなる群から選択されたペプチドを用いて適切な宿主を免疫化することによって生成した抗体、ならびに、配列番号1から37までからなる群から選択された配列の逆の順番を有するペプチドを用いて適切な宿主を免疫化することによって生成した抗体も企図する。
抗体
本発明は、受容体アセンブリドメインに対する抗体を記載する。
特定の実施形態によれば、抗体は、たとえば、erbB1、erbB2、erbB3またはerbB4のいずれかに結合し、オリゴマー形成に媒介される受容体のシグナル伝達を阻止する結果受容体のキナーゼ活性を下方調節するのに有用である。この抗体は、結合すると、細胞増殖レベルの排除または低下、ならびに形質転換していない静止状態の表現型をもたらすチロシンキナーゼ活性を排除または低下させる。したがって、この抗体は、erbB腫瘍を有すると疑われる個体の治療、ならびにこのような腫瘍形成を阻止するのに有用である。治療中の個体の細胞(治療していない個体では普通なら腫瘍になる細胞)は形質転換されず、腫瘍にならない。腫瘍を発生しやすい、または他の点で腫瘍を発生する危険性があると同定された個体に投与した場合、この抗体は、たとえばerbB1、erbB2、erbB3またはerbB4に結合し、その結果、受容体の二量体化に関連するチロシンキナーゼ活性の上昇を阻止する。細胞中のチロシンキナーゼ活性がいつまでたっても十分に上昇されず、細胞は形質転換されないまま維持される。
抗腫瘍組成物に有用な抗体は、当業者によって、容易に入手可能な出発物質を用いて生成することができる。モノクローナル抗体を生成する技術は、標的タンパク質に特異的に結合するハイブリドーマおよびモノクローナル抗体を生成する詳細な手引きを提供する、Harlow, E.およびD. Lane、1988、「ANTIBODIES : A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーに概要が示されている。手短に述べると、目的タンパク質、たとえばげっ歯類またはヒトerbB2、あるいはそのタンパク質を発現する細胞を、マウスに注入する。その後、このタンパク質でこのマウスをブーストする。マウスの脾臓を取り除き、脾臓細胞を単離して不死化したマウス細胞と融合させた。この雑種細胞、すなわちハイブリドーマを培養し、抗体を分泌する細胞を選択する。抗体を分析し、目的タンパク質に特異的に結合することが見出された場合は、抗原特異的抗体の産生が連続的に供給されるように、それを産生するハイブリドーマを培養する。当業者に周知の技術を使用して、ヒト化またはラクダ化抗体を作成することができる。
一部の実施形態では、erbBまたはTNF受容体、あるいはその一部分を免疫化することによって抗体を誘導させる。より好ましい実施形態では、束縛有りまたは無しのシステインに富むドメイン由来のシスチンノットペプチド擬態またはペプチド擬態を用いて免疫化することによって抗体を誘導させる。
本発明の特定の実施形態では、抗体の相補性決定領域は免疫グロブリンの重鎖のみから、すなわち、免疫グロブリンの軽鎖なしで形成される。このような抗体は、たとえば、ラクダやラマなどラクダ科動物由来の抗体の重鎖を使用して誘導させることができる(Davies他、1996、Protein Engineering、9、531-537; Reichmann, L.、1996、J. Mol. Biol.、259、957-969; Davies他、1995、Biotechnology、13、475-479; Decanniere他、1999、Structure Fold Des.、7、361-370)。たとえばラクダ科動物の単一ドメイン抗体の構造は、抗イディオタイプの予防接種およびペプチド擬態を発現させる骨格として有用である(Muyldermans他、1999、J. Mol. Recognit.、12、131-140; Dumoulin他、2002、Prot. Sci.、11、500-515; Tanha他、2001、J. Biol. Chem.、276、24774-24780)。
一部の実施形態では、適切な宿主を以下の群からなるペプチドで免疫化することによって抗体を生成する。
Y-C-F-P-D-E-E-G-A-C-Y (配列番号3); C-K-V-E-L-M-Y-P-P-P-Y-F-V-G-M-G-N-G-T-Q-I-Y-V-I-D-P-E-P-C (配列番号28); C-K-I-E-F-M-Y-P-P-P-Y-L-D-N-E-R-S-N-G-T-I-I-H-I-K-E-K-H-L-C (配列番号29); C-S-L-S-I-F-D-P-P-P-F-Q-E-R-N-L-S-G-G-Y-L-H-I-Y-E-S-Q-L-C (配列番号30); B2-S22-APE: Y-C-P-I-W-K-F-P-D-E-E-C-Y (配列番号31); Bl-S22-ALG: Y-C-L-V-W-K-Y-A-D-A-G-C-Y (配列番号32); B3-S22-APQ: Y-C-P-I-Y-K-Y-P-D-V-Q-C-Y (配列番号33); B4-S22-AFD: Y-C-F-I-F-K-Y-A-D-P-D-C-Y (配列番号34); B2-S22-AFA: Y-C-F-P-D-E-E-G-A-C-Y (配列番号35)
一部の実施形態では、この抗体は、erbB受容体のシスチンノットに結合する。
本発明の一部の実施形態によれば、ヒト/ラットのerbB1、erbB2、erbB3、またはerbB4受容体に結合するモノクローナル抗体が提供されている。
好ましくは、抗原に対する結合親和性は少なくとも1×106Ka、より好ましくは1×107Ka、より好ましくは2×107Ka、より好ましくは1×108Kaである。
本発明の好ましい実施形態によれば、ヒト/ラットのTNF受容体に結合するモノクローナル抗体が提供されている。
好ましくは、TNF抗原に対する結合親和性は少なくとも1×106Kaである。好ましくは、TNF受容体に対する結合親和性は少なくとも5×106Ka、より好ましくは1×107Ka、より好ましくは2×107Ka、より好ましくは1×108Kaである。
本発明の好ましい実施形態によれば、ヒト/ラットのIgSFファミリー受容体に結合するモノクローナル抗体が提供されている。
好ましくは、IgSFファミリー抗原に対する結合親和性は少なくとも1×106Kaである。好ましくは、IgSFファミリー受容体の結合親和性は、少なくとも5×106Ka、より好ましくは1×107Ka、より好ましくは2×107Ka、より好ましくは1×108Kaである。
本発明は、erbB腫瘍および/またはTNFやIgSF病態にあると同定された個体を治療的に処置するのに有用である。本発明はまた、erbB腫瘍またはTNF/IgSFに関連する病態を発生しやすい個体、あるいは以前にerbB腫瘍またはTNF/IgSFに関連する病態になったことがあり、したがって再発または再発生しやすい個体を予防的に治療するのに有用である。本発明はまた、とりわけ、erbB腫瘍またはTNF/IgSFに関連する病態をイメージングする、あるいは他の方法で検出するのに有用である。
本発明の抗体は、患者に投与する組成物の成分として、放射療法および/または化学療法と組み合わせて患者に投与する組成物の成分として、あるいは放射性剤または化学療法剤とコンジュゲートさせた抗体を含む、患者に投与する組成物の成分としてのいずれかにおいて、erbB腫瘍またはTNF/IgSFに関連する病態を治療するのに有用である。
本発明の抗体は、患者に投与する組成物の成分として、放射療法および/または化学療法と組み合わせて患者に投与する組成物の成分として、あるいは放射性剤または化学療法剤とコンジュゲートさせた抗体を含む、患者に投与する組成物の成分としてのいずれかにおいて、erbB腫瘍またはTNF/IgSFに関連する病態を阻止するのに有用である。
本発明の抗体は、たとえば患者に投与する組成物の検出可能な成分として、erbB腫瘍またはTNF/IgSFに関連する病態をイメージングするのに有用である。
システインに富むドメイン(CRD)を有する受容体の全般的な特徴
複合体の形と複合体でない形のどちらのTNF受容体結晶構造も、この受容体ファミリーがどのようにそのリガンドに結合するかの全体像(Banner他、1993; EckおよびSprang、1989; Eck他、1992)、および会合したリガンドに誘発されるコンホメーション変化の全体像を提供する。受容体は、システインノットと呼ばれる構造要素によって会合する。TNF受容体ファミリー内のシスチンノットは、6個のシステイン残基が3つの鎖間ジスルフィド結合を形成して構造モチーフを作成する、42個のアミノ酸残基からなる。この三次元構造により、頭-尾に整列して受容体の一方の側にあるループを露出している、約30Å長のシステインノット反復が明らかとなった。これらのシステインノットは、オリゴマー形成とリガンド結合のどちらにも関与している(EckおよびSprang、1989; Eck他、1992)。複合体でないTNF受容体は二量体として観察される。二量体の形では、最初と最後のシステインドメインが二量体化の接触に関与する(Naismith他、1995)。TNF二量体受容体の形が三量体の形の機能を制御すると言われている(Naismith他、1995)。
ErbB受容体とTNF受容体は、システインに富むドメイン内の有意な相同性を共有する(Ward他、1995)。最近決定されたインスリン受容体の結晶構造(Garrett他、1998b)により、システインに富むドメイン(CRD)を有する受容体は、類似のコンホメーション、すなわちTNF受容体中で観察される「シスチンノット」の形になっていることが確認された。
抗HER2/p185c-neu抗体は外部ドメインに結合し、p185内部移行をもたらす
悪性表現型の維持を担っているタンパク質を無効化することにより、形質転換が逆転される。この一連の研究(Drebin他、1986、Symp Fundam Cancer Res 38: 277-289; Drebin他、1986、Proc Natl Acad Sci USA、83: 9129-9133)はその後立証され(Carter他、1992)、現在では「ハーセプチン(HERCEPTIN)」として臨床使用が認められている(Baselga他、1998; Pegram他、1998)。
p185の外部ドメインに対する抗体は、細胞表面受容体の急速な下方調節を導くことによって、形質転換した細胞の表現型を逆転させることができる(Drebin他、1986、Proc Natl Acad Sci USA、83: 9129-9133)。in vitroにおける細胞表面からの形質転換受容体の除去は、悪性表現型が低下すること、および細胞表現型がより正常な表現型に変換されることに関連しており、これは、細胞増殖、表現型、軟寒天中での増殖によって判断した。抗受容体抗体p185複合体を可視化し、これが細胞内に入ってp185の分解をもたらすことが示された(Brown他、1994)。その後のin vivoの研究により、抗受容体抗体を単体で投与すると腫瘍増殖の遅延が引き起こされることが示された。
相補体またはマクロファージを排除するように処置された小さな動物での研究により、抗体の効果は主に直接的であるが完全に直接的ではなく、受容体の下方調節に関連していることが明らかとなった(Drebin他、1988)。
in vitroで阻害剤として使用される擬態を作成する際の生化学的側面
高分子を同様の機能を有する低分子に分解するのは、一般的な化学的課題である。機能単位を適切な骨格に移植することによって(Vita他、1998)および抗体を単鎖抗体へと最小化することによって(Magliani他、1997)、ミニタンパク質を設計するいくつかの試みがなされてきた。
コンホメーション束縛ペプチドが束縛されていないペプチドより生物活性があることが確立された。近年では、固相合成および他の方法によるペプチドの環状化の化学が劇的に改良され(Burgess他、1996; GoodmanおよびShao、1996; Hanessian他、1997; KoskinenおよびHassila、1996; Kuhn他、1997; Waid他、1996; Zuckermann、1993)、ペプチドをペプチド擬態に発展させるより多くの機会が提供された。
環状ペプチド擬態を作成する一般的な原理が取り入れられ、一部の場合(糖タンパク質11b 111a阻害剤であるエプチフィチミド(eptifitimide)(インテグリリン(Integrilin))(COR Therapeutics)など)では、臨床的に利用可能になっている。環状に束縛された小さなペプチドの末端に配置した芳香族残基は、擬態の活性を増大させる(Takasaki他、1997; Zhang他、1996)。このような修飾を用いることによって、CDR(Park他、2000)、CD4(Zhang他、1997)に基づいた抗体擬態、IL4受容体ループ擬態、抗CD3抗体擬態、およびTNFαがその受容体に結合することに影響を及ぼすTNFシスチンノット擬態(Takasaki他、1997)の、高親和性擬態の作成が可能となった。
環状ペプチド擬態は優れた免疫原である
抗体に認識された抗原部位は、別々の三次元表面からなる(Van Regenmortel、1989; Van Regenmortel、1996)。タンパク質表面上の抗原性残基の空間分布は、多くの場合、束縛ペプチドによって再現されている(Nayak他、1998; Posthumus他、1991; Valero他、1995; van der Werf他、1994)。一例は、口蹄疫ウイルスに関する。主要な抗原性部位は柔軟性のあるループからなっており、このループを束縛ペプチドで免疫化すると、直鎖ペプチドによって誘発されたMAbに比べて、より高い親和性および中和力価を有する抗体が誘発される(Patel他、1999; Valero他、1995)。これらの研究は、抗原性領域にある強固であるが空間的な擬態が免疫原として有用な可能性があり、MAbをerb受容体相互作用表面に誘導するのに使用できることを示唆する。これらのMAbは、erbB病態の治療などの場合に有用である。
治療方法
本発明は、erbB腫瘍および/またはTNFやIgSFに関連する病態にあると同定された個体において、腫瘍細胞の形質転換した表現型を逆転させるかつ/または腫瘍細胞死を誘発させるために、療法的に処置するのに有用である。本発明は、erbB腫瘍および/またはTNFやIgSFに関連する病態を発生しやすい、あるいは以前にerbB腫瘍および/またはTNFやIgSFに関連する病態になったことがあり、したがって再発または再発生しやすい個体を予防的に治療するのに有用である。
erbB癌を有する個体に、本発明の抗体、ペプチドまたは擬態を治療上有効な量で投与した場合、腫瘍細胞の増殖速度が遅くなるまたは排除される。
erbB腫瘍および/またはTNFやIgSFに関連する病態を発生しやすい個体、あるいは以前にerbB腫瘍および/またはTNFやIgSFに関連する病態になったことがあり、したがって再発または再発生しやすい個体を治療するのには、予防的方法が有用である。
一部の実施形態では、この方法は、胃癌、肺癌、膵臓癌などヒトの腺癌、ヒト乳癌や卵巣癌、ならびにヒト前立腺癌を有する患者を治療する方法に関する。一部の実施形態では、この方法は、グリア細胞の腫瘍進行、特に最も悪性であるグリア腫瘍であるグリア芽細胞腫を有する患者を治療する方法に関する。一部の実施形態では、この方法は、ヒト上皮悪性赤血球病、線維肉腫、血管肉腫、および黒色腫を有する患者を治療する方法に関する。一部の実施形態では、本発明は、多量体に関連する疾病/疾患を有する患者を診断し、その後、本発明の他の方法に従ってその疾病/疾患を治療するステップを含む、このような疾病/疾患を治療する方法を提供する。
抗体またはペプチド擬態が受容体に結合するための十分な時間が経過した後いつでも、放射療法を開始することができる。一般的に、ある場合は抗体、ペプチドまたは擬態を投与した1〜10分間後、ある場合は1〜10時間後、ある場合は24〜72時間後までに、個体を放射線に暴露させる。ある場合では、放射線は単一用量で与えるが、一部の実施形態では、複数の用量を数時間、数日間および/または数週間かけて与える。抗体は、放射線耐性の腫瘍細胞を放射線感受性にさせる。標準の放射療法プロトコルに従って、標準の用量およびレジメンを使用してガンマ放射線を送達する。抗体、ペプチドまたは擬態の投与により、腫瘍細胞を根絶する際に放射線がより効果的となる。
治療的な量のガンマ放射線への暴露に加えて、またはその代わりに、細胞障害性化学療法剤と組み合わせた抗体、ペプチドまたは擬態を用いて個体を治療することができる。化学療法は、抗体またはペプチド擬態を投与する前または後のいつでも、あるいは抗体、ペプチドまたは擬態自体と一緒に開始することができる。一般的に、ある場合は抗体、ペプチドまたは擬態を投与した1〜10分間後、ある場合は1〜10時間後、ある場合は24〜72時間後までに、個体に化学療法を与える。ある場合では、化学療法は単一用量で与えるが、一部の実施形態では、複数の用量を数時間、数日間および/または数週間かけて与える。抗体は腫瘍細胞を細胞障害剤感受性にする。標準の放射療法プロトコルに従って、標準の薬剤用量およびレジメンを使用して化学療法剤を送達する。一部の実施形態では、この化学療法剤は、シスプラチン、ドキシルビシン、ダヌルビシン、タモキシフェン、タキソール、メトトレキセートからなる群から選択される。一部の実施形態では、それぞれ他の化学療法剤の前、同時に、または後に投与する、2つ以上の化学療法剤と組み合わせた本発明の抗体および/またはペプチドおよび/または擬態を用いて個体を治療する。一部の実施形態では、活性薬剤の投与に続いて、化学療法と放射治療のどちらもを使用する。このような実施形態では、2つ以上の治療様式の標準的な組合せを、抗体および/またはペプチドおよび/または擬態の投与と併せて使用する。
本発明の一部の実施形態によれば、本発明による薬剤組成物の投与と併せた放射線および/または他の化学療法を用いて患者を治療する。化学療法手法には、細胞阻害剤およびまたは細胞分裂抑制剤の投与が含まれる。erbBに関連する腫瘍中で本発明によるヌクレオチド分子を発現させることにより、腫瘍が放射線感受性になることが観察された。すなわち、本発明による薬剤組成物を用いて患者を治療した場合に、放射療法中に腫瘍が放射線によって破壊に対してより脆弱となる。複数の治療手法を使用することにより、より幅広い診療が患者に与えられる。一部の好ましい実施形態では、本発明による薬剤組成物を用いた治療の前に外科的診療を行う。好ましい実施形態では、本発明による薬剤組成物を投与した後に放射療法を実施する。好ましい実施形態では、放射線耐性腫瘍を放射線感受性腫瘍に変換する組成物を投与した後に、ガンマ放射線を使用した放射療法を与える。当業者は適切な照射療法レジメンを容易に処方できるであろう。本明細書中に参照として組み込むCarlos A PerezおよびLuther W Brady、「Principles and Practice of Radiation Oncology」第2版、JB Lippincott Co、フィラデルフィア、1992が、本発明中で使用できる放射療法プロトコルおよびパラメータを記載している。GBM(グリア芽細胞腫、最も悪性のグリア細胞脳腫瘍)では、本明細書中に参照として組み込むSimpson W. J.他、「Influence of location and extent of surgical resection on survival of patients with glioblastoma multiforms : Results of three consecutive Radiation Therapy Oncology Group (RTOG) clinical trials.」、Int J Radiat Oncol Biol Phys、26: 239-244、1993が、本発明の方法において有用な臨床プロトコルを記載している。同様に、脳腫瘍では、本明細書中に参照として組み込まれており、本発明の方法において有用な臨床プロトコルを記載するBorgelt他、「The palliation of brain metastases : Final results of the first two studies of the Radiation Therapy Oncology Group.」、Int J Radiat Oncol Biol Phys、6: 1-9、1980を参照されたい。
本発明の抗体、ペプチドまたは擬態を、このような腫瘍に敏感な個体内で腫瘍を阻止するために使用することができる。本発明の一態様によれば、抗体を、erbB腫瘍を発生しやすい個体に予防的に投与する。本発明の別の態様によれば、ペプチドを、erbB腫瘍および/またはTNFやIgSFに関連する病態を発生しやすい個体に予防的に投与する。本発明の別の態様によれば、擬態を、erbB腫瘍および/またはTNFやIgSFに関連する病態を発生しやすい個体に予防的に投与する。当業者は、個体がこのような腫瘍に敏感な可能性があるかどうかを容易に決定することができる。この方法は、たとえばerbB癌の家族歴を有する、または遺伝的素因を示す、危険性の高い個体で特に有用である。さらに、この方法は、以前に外科的切除によってerbB腫瘍を除去した、または寛解中のerbB癌を有すると診断された患者においてerbB腫瘍の再発を阻止するのに、特に有用である。一部の好ましい実施形態では、この癌はerbB2/erbB1癌である。
治療方法は、本発明の抗体、ペプチドまたは擬態を単一または複数用量投与することを含む。ヒトでの製薬的使用には、無菌であり発熱物質を含まず、製薬的に許容される担体または希釈剤と組み合わせた抗体、ペプチドまたは擬態を含む注射用の薬剤組成物が好ましい。
本発明の抗体、ペプチドまたは擬態を、erbB腫瘍を有する個体を治療するのに使用することができる。本発明の一態様によれば、このような腫瘍を有すると疑われる個体に抗体を投与する。本発明の別の態様によれば、このような腫瘍を有すると疑われる個体にペプチド擬態を投与する。当業者は、個体がerbB腫瘍である可能性のある腫瘍を有しているかどうかを容易に決定することができる。腫瘍試料を同定し、それがerbB腫瘍であるかどうかを決定するために、バイオプシープロトコルを実施することができる。一部の態様によれば、化学療法および/または放射療法と併せた抗体、ペプチドまたは擬態を用いて患者を治療する。たとえば、抗体、ペプチドまたは擬態を投与した後、治療上有効な量のガンマ放射線など抗癌放射線で治療することができる。さらに、一部の実施形態は、抗体、ペプチドまたは擬態と組み合わせた化学療法治療を提供する。本発明の他の態様は、化学療法および/または放射療法と併せた抗体、ペプチドまたは擬態の投与に関与する。一部の好ましい実施形態では、この癌はerbB2/erbB1癌である。
本発明は、erbB腫瘍の阻止、あるいはerbB腫瘍を阻止または治療するためのワクチンの形成にも有用である。本明細書中で使用する用語「ワクチン」とは、生物を感染性疾患から保護するために生物に投与することができる、任意の組成物を幅広くいう。本明細書中でワクチンを説明するために使用する用語「保護」とは、感染性疾患の阻止または治療を意味する。ワクチンは、病原菌や異常状態や疾病状態に移行した細胞に対する生物中の免疫応答を誘発または増加させることによって、疾病、たとえばerbB腫瘍から保護する。erbBワクチンは、たとえば異常細胞や形質転換された細胞上に見つかるようなerbB受容体を異常な量または形で発現する細胞に対する免疫応答を誘発する。
ワクチンは一般的に、治療上有効な用量の免疫原(たとえば抗原)、ならびに、好ましくは、アジュバントおよび/または製薬的に許容される担体を含む。
ワクチンは、たとえば吸入やガス注入(口または鼻のいずれかを通す)によって、あるいは経口、舌下錠、直腸、非経口(たとえば皮下、筋肉内、眼窩内、間接内、脊髄内、胸骨内、静脈内注射などによって)の投与によって生物に投与することができる。また、ワクチンは、粒子に媒介される移入(たとえば「パーティクルガン」を使用する)によって投与することもできる。たとえば、Gainer他、J. Neurooncol、2000、47: 23-30; Koide他、Jpn J. Pharmacol、2000、83: 167-174; Kuriyama他、Gene Ther.、2000、7: 1132-1136; Yamauchi他、J. Exp. Zool.、2000、287: 285-293参照。このような粒子移入方法、たとえば「遺伝子銃」を使用する方法は、DNAやベクターワクチン(下記)で特に好まれる。
本発明のワクチンは、たとえばポリペプチドワクチンまたはDNAワクチンを含むことができる。用語「ポリペプチドワクチン」とは、抗原であってよい免疫原性ポリペプチドを含み、したがって生物中で免疫応答を活性化させるワクチンをいう。用語「DNAワクチン」は当分野の非公式の用語であり、本明細書中では組換えベクターによって供給されるワクチンをいう。本明細書中で使用する代替用語は「ベクターワクチン」である(一部の潜在的なベクター、たとえばレトロウイルスやレンチウイルスはRNAウイルスであり、一部の場合ではDNAの代わりにウイルス性でないRNAを細胞に送達することがあるから)。
本明細書中に開示するペプチドおよび擬態をワクチンとして使用することができる。特定の実施形態では、このワクチンはerbB受容体のサブドメインIV配列を含む。好ましい一実施形態では、このerbB受容体サブドメインIV配列はヒトerbB由来である。最も好ましくは、このサブドメインIV配列は、配列番号39、配列番号40、配列番号41および配列番号42からなる群から選択される配列を有する。他の実施形態では、このワクチンは、erbB受容体サブドメインIVの10〜25個の連続したアミノ酸のペプチドを含む。別の実施形態では、このワクチンは、サブドメインの1〜10個のアミノ酸が保存的アミノ酸で置換されている、erbBサブドメインIVを含む。このような保存的アミノ酸の変化は、当分野で周知である。
ロイシンをイソロイシンまたはバリンと、アスパラギン酸をグルタミン酸と、スレオニンをセリンと置換する独立した置換、あるいは、あるアミノ酸を構造的に関連性のある別のアミノ酸と置換する類似の置換(すなわち等比体積および/または等電の変異)は、生じる分子の生物活性に大きな影響を与えないと予想するのは妥当である。保存的置換とは、その側鎖に関連性のあるアミノ酸ファミリー同士で起こる置換である。遺伝的にコードされているアミノ酸は4つのファミリーに分けることができる。(1)酸性=アスパラギン酸、グルタミン酸、(2)塩基性=リジン、アルギニン、ヒスチジン、(3)非極性=アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、および(4)非電荷極性=グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。同様に、アミノ酸のレパートリーを、(1)酸性=アスパラギン酸、グルタミン酸、(2)塩基性=リジン、アルギニン、ヒスチジン、(3)脂肪族=グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン(任意選択でセリンおよびスレオニンを脂肪性-ヒドロキシルとして別に分けることができる)、(4)芳香族=フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、(5)アミド=アスパラギン、グルタミン、(6)硫黄含有=システイン、メチオニンに分けることができる(たとえば、Biochemistry、第2版、L. Stryer編、WH Freeman and Co.、1981参照)。
哺乳動物の腫瘍をイメージングおよび診断する方法
本発明は、とりわけ、erbB腫瘍およびTNFやIgSFに関連する病態をイメージングする、ならびに他の方法でそれを検出または診断するのにも有用である。
本発明の抗体、ペプチドまたは擬態を標識する、または他の方法で検出可能にすることができる。たとえば、検出可能な抗体は、イメージング剤、および腫瘍を同定するのに使用する診断手順における試薬として有用である。標識した抗体を、erbB腫瘍および/またはTNFやIgSFに関連する病態にあると疑われる個体に投与することができる。標識した抗体は、細胞上の高密度な受容体に結合するので、腫瘍細胞上に蓄積する。標準のイメージング技術を使用して、腫瘍の部位を検出することができる。
したがって、本発明の一態様は、腫瘍をイメージングする方法に関する。このような方法は、erbB癌を有するまたはそれに敏感な個体に検出可能な抗体、ペプチドまたは擬態を投与するステップと、個体の身体内または前記個体から得た試料内の検出可能な抗体、ペプチドまたは擬態の位置を検出するステップとを含む。
この抗体、ペプチドまたは擬態は、細胞表面上に存在する受容体に結合するので、診断キット中の診断/特徴付け試薬として有用である。個体からの組織試料が抗体、ペプチドまたは擬態と接触すると、この抗体、ペプチドまたは擬態は細胞上に存在する受容体に結合する。標識した抗体、ペプチドまたは擬態も、細胞中に存在する受容体の量を定量するためのin vitro試薬として有用である。このような情報は、腫瘍がerbB関連であるかどうか、またしたがって特定の治療を施すべきか避けるべきかを示す。標準の技術を使用して、腫瘍細胞を含有すると考えられる試料を得、標識した抗体、ペプチドまたは擬態と接触させる。結合していない標識した抗体、ペプチドまたは擬態をすべて除去した後、細胞に結合した標識した抗体、ペプチドまたは擬態の量、あるいは結合していない、標識した抗体として除去された抗体、ペプチドまたは擬態の量を決定する。この情報は、受容体の量に直接関連する。この情報は、個体に与えるべき予後および治療の過程を考案するのに有用である。
イメージング剤は、診断手順、ならびに腫瘍の位置を同定するために用いる手順において有用である。イメージングは、当分野の技術者に周知の多くの手順によって実施することができ、このような手順において有用な適切なイメージング剤を周知の手段によって抗体にコンジュゲートさせることができる。イメージングは、たとえば放射性シンチグラフィー、核磁気共鳴イメージング(MRI)、またはコンピュータ断層撮影(CTスキャン)によって実施することができる。イメージング剤で最も多く使用される放射標識には、放射性ヨウ素およびインジウムが含まれる。CTスキャンによるイメージングには、鉄キレートなど重金属を使用してもよい。MRIスキャンには、ガドリニウムやマンガンのキレートを使用してもよい。さらに、酸素、窒素、鉄、炭素、またはガリウムの陽電子放出を使用した陽電子放出断層撮影(PET)も可能であるかもしれない。
別の実施形態では、本発明のモノクローナル抗体から調製した放射標識のF(ab)'断片を患者に投与する診断方法が提供されている。腫瘍の位置および大きさは、放射標識のF(ab')断片を検出するガンマシンチグラフィーによって決定される。
一部の実施形態では、腫瘍組織の一部分を、指示薬で標識した抗体と接触させることによって、腫瘍を診断することができる。この抗体は、組織の一部分の細胞中に存在するerbBオリゴマーに結合する。その後、指示薬を検出する。本発明の好ましい実施形態では、この指示薬は、ビオチン標識のウマ抗マウス免疫グロブリンおよびストレプトアビジン-ビオチン標識-ペルオキシダーゼを含む。この指示薬は、指示薬を、好ましくは3,3'-ジアミノベンジジン、過酸化水素およびイミダゾールを含む色素基質と接触させることによって検出される。その後、顕微鏡検査によって色素基質を検出する。
一部の実施形態では、腫瘍組織の一部分を、標識したペプチドや擬態と接触させることによって腫瘍を診断することができる。標識したペプチドや擬態は、組織の一部分の細胞中に存在するerbB受容体に結合する。その後、指示薬を検出する。本発明の好ましい実施形態では、この指示薬は、ビオチン標識のウマ抗マウス免疫グロブリンおよびストレプトアビジン-ビオチン標識-ペルオキシダーゼを含む。この指示薬は、指示薬を、好ましくは3,3'-ジアミノベンジジン、過酸化水素およびイミダゾールを含む色素基質と接触させることによって検出される。その後、顕微鏡検査によって色素基質を検出する。
薬剤組成物
本発明はさらに、細胞表面上にerbB受容体やTNF受容体を発現する細胞を有する哺乳動物の癌腫瘍を治療するための注射用の組成物を提供する。本発明によれば、この組成物は、共有の抗原決定基に特異的な抗体、ペプチドまたは擬態、および製薬的に許容される注射用の媒体を含む。
本発明の抗体、ペプチドまたは擬態を治療上有効な量でerbB癌またはTNFやIgSFに関連した病態にある個体に投与した場合、細胞の増殖速度が遅くなるまたは排除される。
哺乳動物の身体中の薬剤が作用する部位に、抗体、ペプチドまたは擬態が到達できるような任意の手段によって、本発明の薬剤組成物を投与することができる。タンパク質は経口投与した場合は消化されるので、吸収を最適にするために、非経口投与、すなわち静脈内、皮下、筋肉内投与が通常使用される。抗体、ペプチドまたは擬態を保護し、多くのタンパク質分解酵素に対する耐性を与えて経口的に利用可能にする配合を考案してもよい。
抗体、ペプチドまたは擬態を単体で、あるいは他の癌療法剤、治療的および診断的薬剤組成物と組み合わせて含む薬剤組成物に加えて、コンジュゲート組成物を含む薬剤組成物を使用しても、erbBおよび/またはTNF癌を有する個体を診断または治療することができる。
本発明の薬剤組成物は、個別の療法剤としてまたは他の療法剤と組み合わせて投与することができる。これらは単体で投与することができるが、一般的には、選択した投与経路および標準の薬務に基づいて選択された、製薬的担体と共に投与される。
より効果的にするために、この組成物に追加の成分を含めてもよい。たとえば、本発明の組成物に、複数の抗p185抗体を含めてもよい。この組成物に、たとえばシスプラチン、メトトレキセート、および/またはGM-CSFなど他の抗癌剤を含めてもよい。このような組成物は、erbBに関連する癌を診断された、および治療した患者に投与するのに、特に有用となる。
一般的に、等張にするための添加物には、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースを含めることができる。一部の場合では、リン酸緩衝生理食塩水など等張性溶液が使用される。安定剤にはゼラチンおよびアルブミンが含まれる。一部の実施形態では、配合物に血管収縮剤を加える。本発明による製剤組成物は、好ましくは無菌で発熱物質を含まずに提供される。
薬剤処方分野の技術者、たとえば薬剤学や薬学の修士や博士学位を有する技術者は、日常的な実験以上のことを行わずに本発明の組成物の様々な適切な剤形および配合物を調製することができる。当分野のいくつかの教科書、たとえばそれぞれがその全体で参照として組み込まれている「Remington's Pharmaceutical Sciences」および「The U. S. Pharmacopoeia/National Formulary」、最新版は、この点で重要な手引きとなっている。
製薬的に許容される配合物は、剤形の性質および組成ならびに配合環境や薬物送達系における薬物成分(または複数の成分)の特性に適した賦形剤、希釈剤、安定剤、保存料、および他の成分と一緒に、適切な物理的形状にある活性成分(または複数の成分)を提供する。
キット
本発明のキットは、検出可能な抗体、および/またはペプチド、および/または擬態、ならびに本発明のアッセイを実施するための指示書を含む。任意選択で、陽性対照を含む容器、陰性対照を含む容器、陽性結果の代表例の写真および陰性結果の代表例の写真のうち1つまたは複数をキットに含めてもよい。
コンジュゲート
抗体、ペプチドまたは擬態を、検出可能かつ/または細胞障害性の薬剤とコンジュゲートさせてもよい。コンジュゲート組成物では、本発明の抗体、ペプチドまたは擬態は、活性薬剤を細胞に送達する。したがって、受容体を有する細胞は他の細胞よりも多くの活性薬剤と接触する。この活性薬剤は細胞のイメージング、細胞の増殖を阻害するかつ/または細胞を死滅させるのに有用である。活性薬剤は療法剤またはイメージング剤であってよい。
一部の化学療法剤を活性薬剤として使用してもよく、これらは抗体、ペプチドまたは擬態とコンジュゲートされていてもよい。化学療法剤は通常、化学合成によって生成される小さな化学物質であり、細胞障害薬、細胞分裂抑制薬、ならびに形質転換した状態を分化した状態に逆転することなど他の方法で細胞に影響を与える抗体や、細胞の複製を阻害する抗体が含まれる。化学療法剤の例には、それだけには限定されないが、メトトレキセート(アメトプテリン)、ドキソルビシン(アドリマイシン)、ダウノルビシン、シトシンアラビノシド(cytosinarabinoside)、エトポシド、5-4フルオロウラシル、メルファラン、クロラムブシル、および他の窒素マスタード(たとえばシクロホスファミド)、シスプラチン、ビンデシン(および他のビンカアルカロイド)、マイトマイシン、およびブレオマイシンが含まれる。
活性薬剤は毒素、すなわち細菌、植物などを含めた様々な生物の複合毒性産物であってよい。毒素の例には、それだけには限定されないが、リシン(ricin)、リシン(ricin)A鎖(リシン毒素)、シュードモナス外毒素(PE)、ジフテリア毒素(DT)、ウェルシュ菌ホスホリパーゼC(PLC)、ウシ膵臓リボヌクレアーゼ(BPR)、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質(PAP)、アブリン、アブリンA鎖(アブリン毒素)、コブラ毒因子(CVF)、ゲロニン(gelonin)(GEL)、サポリン(SAP)、モデシン(modeccin)、ヴィスキュミン(viscumin)、オヨビヴォルケンシン(volkensin)が含まれる。組換えDNA技術を使用して、本発明のペプチドを含む融合タンパク質としてタンパク質毒素を生成することができる。また、タンパク質毒素を非ペプチド結合によって抗体にコンジュゲートさせてもよい。
療法剤として有用な、あるいはイメージング手順に有用な組成物を提供するために、抗体、ペプチドまたは擬態に放射性同位元素をコンジュゲートさせてもよい。放射性療法に有用な放射性同位元素の例には、47Sc、67Cu、90Y、109Pd、123I、125I、131I、186Re、188Re、199Au、211At、212Pb、212Biが含まれる。イメージング手順に有用な放射性同位元素には、43K、52Fe、57Co、67Cu、67Ga、68Ga、77Br、81Rb/81MKr、87MSr、90Y、99MTc、111In、113MIn、123I、125I、18F、86Y、127Cs、129Cs、131I、132I、197Hg、203Pb、206Biが含まれる。
放射標識は、当分野の技術者が必要以上の実験を行わずに容易に実施される様々な周知の技術によって抗体、ペプチドまたは擬態にコンジュゲートされている。放射標識は、コンジュゲーションに関係なくその放射活性を保持する。コンジュゲーションは、抗体、ペプチドまたは擬態と放射性同位元素との間で直接行うか、あるいは抗体、ペプチドまたは擬態と放射性同位元素との間に、連結する媒介分子群を提供しても良い。各部分(moiety)に結合部位を提供することによってコンジュゲーションを容易にするには、架橋剤が特に有用である。架橋剤には、両部分(moiety)が互いの活性を妨げるのを阻止するためにそれらを互いから隔てるスペーサーとして役立つ、追加の分子群を含めてもよい。多くの場合、光によって活性化されるフルオレセインを使用してイメージングを行うことができる。(たとえば、フルオレセイン(緑)、フィコエリトリン(オレンジ)、P-E-シアニン-5(赤)、P-E-テキサスレッド(赤)、シアニン-3(オレンジ)、シアナニン-5(赤)、AMCA(紫外検出)。
当分野の技術者は、周知の技術を使用して抗体、ペプチドまたは擬態を化学療法薬にコンジュゲートさせることができる。たとえば、本明細書中に参照として組み込むMagerstadt, M.、「Antibody Conjugates and Malignant Disease」、1991、CRC Press、米国ボーカラトン、頁110-152)は、様々な細胞分裂抑制薬と抗体のアミノ酸、ペプチドまたは擬態とのコンジュゲーションを教示している。このような反応は、化学療法薬を抗体、ペプチドまたは擬態にコンジュゲートさせるのに応用することができる。抗体、たとえば遊離アミノ基を有するペプチドは、その基の位置で活性薬剤にコンジュゲートされていてもよい。現在癌を治療するのに使用されている化学療法剤のほとんどは、タンパク質と直接化学的に架橋結合される官能基を有する。たとえば、遊離アミノ基は、メトトレキセート、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シトシンアラビノシド、シスプラチン、ビンデシン、マイトマイシンおよびブレオマイシン上で有効であり、遊離カルボン酸基は、メトトレキセート、メルファランおよびクロラムブシル上で有効である。これらの官能基、すなわち遊離アミノ酸およびカルボン酸は、これら薬物を直接、本発明の抗体の単一遊離アミノ基に架橋することができる、様々なホモ二官能基性およびヘテロ二官能基性の化学架橋剤の標的である。
薬剤組成物の投与
投与する本発明の組成物の用量は、もちろん、特定の薬剤の薬力学的特徴およびその投与方法や経路;レシピエントの年齢、健康状態、体重;症状の性質や程度、同時治療の種類、治療の頻度、所望する効果など、周知の要素に応じて変動する。一般に、活性成分の1日用量は体重1kgあたり約0.001から1グラム、一部の実施形態では体重1kgあたり約0.1から100ミリグラムにし得る。通常の用量は、体重1kgあたり0.5から50ミリグラムの範囲であり、好ましくは、1日あたり、体重1kgあたり1から10ミリグラムである。一部の実施形態では、日に1から6回に分けた用量で薬剤組成物を与え、あるいは、所望する結果を得るには除放形態が効果的である。一部の好ましい実施形態では、約5μgから5000mgの抗体、ペプチドまたは擬態を投与することができる。一部の好ましい実施形態では、50μgから500mgの抗体、ペプチドまたは擬態を投与することができる。他の好ましい実施形態では、500μgから50mgの抗体、ペプチドまたは擬態を投与することができる。好ましい一実施形態では、5mgの抗体、ペプチドまたは擬態を投与する。
たとえば経口、鼻腔内、筋肉内、腹腔内または皮下投与によってなど適切な経路によって、組成物を投与することができる。一部の実施形態では、静脈内投与が好ましい。一部の実施形態では、動脈内、皮内、非経口、または腫瘍内投与によって組成物を投与する。一部の好ましい実施形態によれば、個体は、この組成物が投与される前にバルク腫瘍塊を取り除く手術を受けている。
本発明の一部の実施形態によれば、この薬剤組成物は、腫瘍の部位に局部的に投与する。一部の実施形態では、この薬剤組成物は、腫瘍細胞内、およびその腫瘍に接して取り囲んでいる組織内に直接投与する。一部の実施形態では、この薬剤組成物は、たとえばグリア芽細胞腫など脳腫瘍内に送達される。一部の実施形態では、この薬剤組成物は、腫瘍の外科的切除の一部として脳腫瘍内に送達される。一部の実施形態では、この薬剤組成物は、ステレオタクティック外科技術を使用して脳腫瘍内に送達される。
最初の投与の後、再投与によって個体をブーストしてもよい。一部の好ましい実施形態では、投与を複数回実施する。
内部投与に適した剤形(組成)は、一般的に、1単位あたり約1ミリグラムから約500ミリグラムの活性成分を含む。これらの薬剤組成物中では、活性成分は通常、組成物の全重量に基づいて約0.5から95重量%の量で存在する。
コンジュゲートさせた抗体、ペプチドまたは擬態はerbB、TNF、またはIgSF受容体を有する細胞を特異的に標的とするので、化学療法剤または毒素を含むコンジュゲートさせた抗体、ペプチドまたは擬態を、コンジュゲートさせていない活性薬剤として化学療法剤または毒素を投与する場合に使用する用量より少ない用量、好ましくは約100倍まで少ない活性薬剤を含む用量で投与する。一部の実施形態では、化学療法剤または毒素を含むコンジュゲートさせた抗体、ペプチドまたは擬態を、コンジュゲートさせていない活性薬剤として投与する化学療法剤または毒素の用量より10から100倍少ない量の活性薬剤を活性薬剤として含む用量で投与する。適切な用量を決定するために、抗体、ペプチドまたは擬態の量は、好ましくは重量ではなくモル数で測定する。このようにすると、様々な抗体、ペプチドまたは擬態の可変重量が計算に影響を与えない。たとえば、本発明のコンジュゲート組成物中で抗体と活性薬剤の比1対1を想定した場合、投与するコンジュゲートさせていない抗体のモル数に比べて、少ないモル数、好ましくは100倍まで少ないモル数のコンジュゲートさせた抗体を投与してもよい。
非経口投与では、この抗体、ペプチドまたは擬態を、製薬的に許容される非経口媒体と会合した溶液、懸濁液、乳濁液、凍結乾燥粉末として配合することができる。このような媒体の例には、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、5%ヒト血清アルブミンが含まれる。リポソームまたは不揮発性油など非水性媒体を使用することもできる。この媒体または凍結乾燥粉末に、等張性(たとえば塩化ナトリウム、マンニトール)および化学的安定性(たとえば緩衝剤や保存料)を維持する添加剤を含めてもよい。通常使用される技術によってこの配合物を滅菌する。
適切な薬剤担体は、この分野の標準参考教科書であり、その全体で参照として組み込まれている「Remington's Pharmaceutical Sciences」、A. Osolの最新版に記載されている。
たとえば、注射による投与に適した非経口組成物は、1.5重量%の活性成分を0.9%の塩化ナトリウム溶液に溶かすことによって調製する。
この抗体、ペプチドまたは擬態を、局所的にまたは潅注法によって個体の組織に投与することができる。この抗体、ペプチドまたは擬態は、クリーム、軟膏(ointment)、軟膏剤(salve)、圧注、坐薬、または局所投与や洗浄用の溶液として配合することができる。薬剤組成物のこのような投与経路の配合物は周知である。
本発明は、どのような理論にも限定されるものではない。いかなる形でも限定することを意図しない以下の実施例によって、本発明をさらに説明する。
システインに富むサブドメインは、ホモ単量体またはヘテロ単量体erbB種のいずれかの二量体化の任を担っている
erbB系におけるホモ二量体化およびヘテロ二量体化のプロセスが記載されている(Wada他、1990、Cell、61: 1339-1347)。受容体分子の分子間会合およびリン酸基転移により、細胞基質結合に必要なリン酸化チロシン部位の定性的または定量的な差を与える、活性化されたヘテロ二量体キナーゼ複合体が生じる。p185がEGFrとヘテロ二量体化する基本的な特徴は、現在ではこのファミリーの他のメンバーでも見つかっている。erbB3とerbB4のどちらもがHER2/neuとヘテロ二量体化し、これは、この特徴が受容体機能の複雑さおよび多様性を増大させる全般的な機構を表すことを示す。二量体は、四量体やさらにより複雑なアセンブリの形成の核となっている可能性がある。
二量体化の研究を、(Kumagai他、2001)に記載のように行った。どのサブドメインがホモおよびヘテロ二量体化に必要であるかを決定するためにp185neuの誘導体を構築した。外部ドメインの一部分、膜貫通領域、およびタグに連結された内部ドメインの数残基を含有する、p185neuの外部ドメインの形の一連の欠失変異体を作成した(図1A)。すべての突然変異種をCos7細胞内に形質移入すると、比較可能な発現がもたらされた。neu種およびEGFrを用いて形質移入させた細胞の溶菌液を溶解し、neu種(あるいは、レーン1には抗EGFr)上に見つかるHisタグに特異的な抗体を用いて免疫沈降し、その後、EGF受容体上に置いたVSVG(水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質)タグ(上パネル)、およびneu受容体上に置いたMycタグ(中央パネル)に特異的な抗体を用いてブロットした。構築体は、EGFrホロ受容体と会合するサブドメインIVのみからなっていた(図1B、レーン4)。その外部ドメインとして遠位の6個のシステインを含むサブドメインIVの46個のアミノ酸の断片、(6CNレーン7)も、EGFrと会合する。
図1Aに示す概略図では、数字は、NeuまたはEGFrのN末端にある最初のMetから数えたアミノ酸の位置を指す。他の記号は: SP、シグナルペプチド; I、サブドメインI; II、サブドメインII; III、サブドメインIII; IV、サブドメインIV; TM、膜貫通ドメイン;斜線の四角、膜貫通ドメイン内に一点変異(V664G)を有するTM; TK、チロシンキナーゼドメイン; Myc、Myc抗原決定基; His、ポリヒスチジンタグ; VSVG、VSVGタグ; 破線、削除された領域を表す。図1Bでは、下に記載する抗体を用いて免疫ブロット(IB)を実施した。上パネルの膜は抗VSVGでブロットし、その後、中央パネルに示すように、抗Mycで再ブロットした。EGFrの外因性発現を決定するために、同じ全細胞溶解物をニトロセルロース膜(下パネル)で使用した(上記および下記)。
他の研究では、これらの変異体p185neu種も発現された場合に、EGFが、EGFrによるMAPキナーゼ活性化を刺激する能力を比較した。pTex6CN形がEGFrと会合してEGFrのキナーゼ活性化を阻害することが見出された(Kumagai他、2001)。末端の46アミノ酸領域は、シスチンノットからなる。これらの研究は、erbBのシスチンノット含有領域がerbB受容体複合体のアセンブリに重要であるという重大な性質を強調している。
これらの結果は、シスチンノット擬態の小さな形が、受容体オリゴマー形成の拮抗剤として使用できるかもしれないことを示唆している。また、これらの結果は、受容体の会合を無効にする手段としてp185のこの領域と反応性のある新しいMAbクラスを開発するためのフレームワークを、形質転換途中の複合体を先行回避する、または破壊する新しい手法として提供する。
erbBサブドメインIVシスチンノット擬態
様々なerbB受容体のS2ドメインのC末端部分中の潜在的な二量体化部位を模倣するために、二量体複合体の分子モデルを使用して一連のペプチドを設計した。このペプチドは、タイプ1インスリン様成長因子受容体(IGF-1R)の第2サブドメインを用いた比較モデリングによって構築したerbB受容体のサブドメインIVの分子モデル、ならびに同様のジスルフィド結合結合性を有するTNF受容体およびラミニンの構造に基づいて設計した(Garrett他、1998、Nature、394: 395-9; Naismith他、1995、J Biol. Chem、270: 13303-13307; NaismithおよびSprang、1998、Trends Biochem Sci、23: 74-9)。
以下のペプチドを構築した。
B1-S22-ALG(erbB1由来)YCLVWKYADAGCY(配列番号32)、
B2-S22-APE(erbB2由来)YCPIWKFPDEECY(配列番号31)、
B2-S22-AFA(erbB2由来)YCFPDEEGACY(配列番号35)、
B2-S23-BPT(erbB2由来): PCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLTSI(配列番号38)、
B3-S22-APQ(erbB3由来)YCPIYKYPDVQCY(配列番号33)、
B4-S22-AFD(erbB4由来)YCFIFKYADPDCY(配列番号34)
ペプチドB1-S22-ALG、B2-S22-APE、B2-S22-AFA、B3-S22-APQおよびB4-S22-AFDは、同じS22反復を模倣する。B2-S23-BPTは、膜近位のS23反復に由来していた。CD4受容体由来の環状ペプチドであるCD4-G(FCYIGEVEDQCY、配列番号43)を陰性対照として設計した。
図2は、HER2の第4サブドメインおよびこのサブドメインのC末端部分から誘導した擬態ペプチドの分子モデルを示す。B2-S22-AFAは、S22ループの一部を模倣する環状ペプチドである。B2-S23-BPTは、2つのジスルフィド結合によって束縛され、S23反復の全体およびそれに続く膜近傍アミノ酸残基を表す二環ペプチドである。分子モデリングは、束縛された擬態ペプチドと、受容体の対応するループとの密接なコンホメーション類似性を示す。存在する構造データおよび実験データにより、可能な受容体配置が提案され、S22ドメインは、複合体内の主要な受容体間相互作用部位として示唆された。
S22ペプチドの結合速度分析
可溶性のerbB-1およびerbB-3を使用した表面プラズモン共鳴(Biacore)技術(上に記載)を使用して、設計したerbBペプチドのerbB受容体に対する結合性を試験した。応答を実時間で、センサーグラム曲線の形でプロットした。記載のように解離定数(Kd)を決定した(Park他、2000、Nat. Biotechnol. 18: 194-198)。
センサーチップ上に固定したerbB受容体に対するB2-S22-APEペプチドの結合性のセンサーグラムを実施した(図3A)。速度定数は、力価曲線を1:1ラングムリアン(Langmurian)相互作用モデルのグローバルフィッティング分析によって推定し、3.24×103M-1s-1のkonおよび6.85×10-4s-1のkoffが得られた。このkoff/kon比から、解離定数(Kd)の値0.21μMを得た。実験データは計算した曲線によく一致し、これは、ペプチドと受容体との間の単純な偽一次相互作用を示唆する。
B2-S22-APEと同様の方法で分析した他のerbBペプチドのKd値を表1に示す。すべてのerbBペプチドで、様々なerbB受容体に対する結合性が示された。しかし、対照として使用した固定化TNF受容体では結合は観察されず、これは、erbB受容体ファミリーに対するerbBペプチドの選択性を示唆する。対照CD4-Gペプチドは、研究した受容体のどれにも結合しなかった。ある程度の結合特異性はerbBファミリー内の様々なペプチドでも観察された。したがって、erbB2由来のペプチドであるB2-S22-APEは、erbB2およびerbB3に結合するより強く、erbB1受容体に結合することができる。ErbB1由来のB1-S22-ALGは、erbB3に優先的に結合した。ErbB2由来のB2-S22-AFAペプチドは、erbB受容体内で高い特異性を有さなかったが、3つの受容体すべてに全体的に最も優れた結合親和性を示した。
Figure 0004398644
erbBペプチドがerbB受容体のSbd IVに結合することを実証するために、B2-S22-APEペプチドと組換え技術で発現させた、表面チップ上に固定したerbB2-SbdIVとの相互作用を決定した(図3B)。観察されたerbB2-SbdIVに対する結合は、全外部ドメインに対するerbB2の結合(図3A、表1)と類似した速度定数(kon、1.62×103M-1s-1; koff、3.07×10-3s-1)および親和性(KD、1.89μM)を有していた。erbB2-Sbd IVに対する他のerbBペプチドの結合は、完全な大きさのerbB2外部ドメインに対するの結合と見分けがつかず(データ示さず)、これは、サブドメインIVがすべてのerbBペプチドの結合部位であることを実証している。erbBペプチドは様々なerbB受容体のサブドメインIVに由来しているので、この事実は、サブドメインIVが、erbB受容体ファミリーのメンバー間の受容体-受容体相互作用に直接関与していることを示す。
受容体の自己会合の阻害
表面プラズモン共鳴の研究
受容体の自己会合に対するシステインノット擬態の効果を、erbB受容体外部ドメインを表面チップ上に固定し、erbB3の外部ドメインを300nMの濃度で、単体で、または5μMのヘレグリンHRGβ1の存在下でのいずれかで注入したBiacoreアッセイを使用して調査した。ヘレグリンが存在しない場合は、非常に限られた程度の受容体-受容体相互作用が観察された(図4、1'、2'、3')。しかし、erbB3を約17倍過剰モル濃度のHRGβ1とプレインキュベートした場合、3つのerbB受容体すべてに対する強力な結合が観察され(図4、1'''、2'''、3''')、これは、リガンド誘発性の、erbB受容体外部ドメインのホモマー化およびヘテロマー化を示す。対照として使用したTNF受容体では、ヘレグリンとプレインキュベートした場合に結合の増大は観察されなかった(データ示さず)。用量応答性曲線の速度分析(データ示さず)により、最も強力な結合はerbB3-erbB1ヘテロマー化で観察され(KD、2.3nM)、続いてerbB3-erbB3ホモマー化(KD、7.2nM)、erbB3-erbB2ヘテロマー化(KD、17.9nM)で観察されることが明らかになった。
平行実験では、類似のリガンド誘発性の受容体自己会合がEGFまたはTGFαの存在下で注入したerbB1受容体で観察されるかどうかを決定した。しかし、注入したerbB1外部ドメイン(150nM)と固定した受容体との相互作用は、erbB1リガンドを存在させても(5μM)存在させなくても検出されず、これは、このerbB1受容体濃度では、有意な二量体化は起こっていないことを示唆する。
ヘレグリン誘発性の受容体自己会合に対するerbBペプチドの効果は、これを10μMで事前に注入しておき、その後erbB3-HRGβ1を注入することによって研究した(図4、1''、2''、3'')。B2-S22-AFAペプチドは、固定化した3つの受容体すべてに対するerbB3の結合を有効に阻害した。最も高い阻害の程度はerbB3-erbB2ヘテロマー化で観察され(82.5%)、続いてerbB3-erbB1ヘテロマー化(78.4%)、erbB3-erbB3ホモマー化(61.7%)で観察された。対照としてランニング緩衝液または対照ペプチド(CD4-G)のいずれかをErbBペプチドの代わりに事前注入し、受容体自己会合に対する効果はまったく現れなかった(データ示さず)。
様々なerbBペプチドの二量体化の阻害における値を表2に示す。受容体結合親和性のデータから予測されるように、erbB1に対して最も優れた結合性を示したB2-S22-APE(表1)は、他の受容体に比べてerbB3とerbB1との相互作用を無効にするのにより有効であった(表2)。同様に、最も高いerbB3結合親和性を有するB1-S22-ALG(表1)は、erbB3ホモ二量体化の最も強力な阻害剤であった(表2)。研究した3つのerbB受容体に対して最も強力な全体的の親和性を有するB2-S22-AFA(表1)は、erbB3-erbB2およびerbB3-erbB1相互作用の有効な阻害剤である(表2)。erbB2のS23反復由来のB2-S23-BPTは、特に他の受容体に比べて最も高い親和性で結合するerbB3のホモマー化(表1)に対して、一番低いがそれでも有意な阻害効果を有していた(表2)。
Figure 0004398644
32D細胞系中の未変性erbB受容体の、リガンド誘発性二量体化の阻害
様々なerbB受容体で形質移入させた32D細胞系を使用して、生化学的に定義された未変性の完全長ErbB受容体の二量体化に対するErbBペプチドの効果を研究した。32D-E1細胞をerbB1で、32D-E2/E3をerbB2およびerbB3で、32D-E2/E4をerbB2およびerbB4で形質移入させた。図5Aおよび5Bに、32D-E2/E4細胞内におけるヘレグリン誘発性のerbB2-erbB4受容体ヘテロマー化に対する、10μg/mlのB3-S22-APQおよびB2-S22-AFAの阻害効果を示す。B3-S22-APQは有意な阻害効果を示したが、B2-S22-AFAはこの濃度で二量体化を完全に抑制した(図5A)。その一方で、対照として使用したCD4-Gペプチドでは阻害効果は全く観察されなかった。観察されたB2-S22-AFAによる受容体二量体化の阻害は、0.8μMの濃度で見かけのIC50であり、用量依存性であった(図5B)。32D-E2/E3細胞で、B3-S22-APQおよびB2-S22-AFAの受容体二量体化に対する類似の阻害効果が観察された(データ示さず)。
erbBペプチドの生物活性
MTTアッセイ
erbBペプチドの生物活性は、上に記載の標準の3,(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)2,5-ジフェニル-テトラゾリウムブロミド)(MTT)アッセイを使用して、細胞増殖を阻害するその能力によって評価した(Hansen他、J. Immunol. Methods、1989、119、203-210)。この目的のためには、HER2を発現している形質転換された腫瘍細胞(T6-17)を使用した(Park他、Nat Biotechnol.、2000、18、194-198)。MTTアッセイでは、このペプチドは、erbB2を過剰発現する形質転換された細胞系T6-17細胞の増殖を、0.01から10μg/mlの濃度範囲で用量に依存して阻害した(図6)。最適濃度1μg/mlにおけるerbBペプチドの生物活性を評価した。それぞれの値は少なくとも4つの試料の平均を表す。すべてのペプチドが細胞増殖に対する阻害効果を表している(図6)。最も高いerbB2受容体結合親和性を有するB2-S22-AFA(表1)は、MTTアッセイにおいても最も活性のあるペプチドであった(図6)。
観察されたT6-17細胞に対するerbB2ペプチドの生物活性が、その受容体結合特性や、その受容体-受容体相互作用に対する阻害活性と関連性があるかどうかを決定するために、研究したすべてのペプチドにおいて表1および表2に示す結合データをMTTアッセイデータに対してプロットした(図7Aおよび7B)。生物活性とerbB2に対する結合親和性との間には強い関連性があった(r=0.92)。他のerbB受容体(erbB1およびerbB3)に対する結合親和性との関連性は有意ではなかった(それぞれr=0.21および0.44)。同様に、細胞抑制活性とerbB3-erbB2相互作用に対する阻害活性との間には強い関連性が観察されたが(r=0.91)、erbB3-erbB1(r=0.29)やerbB3-erbB3(r=0.17)の相互作用に対しては観察されなかった(図7B)。
32D細胞系の生存度に対する影響
32D細胞系を使用して、erbB受容体を過剰発現している細胞に対するerbBペプチドの阻害効果を試験した。erbB受容体を用いて32D細胞を形質移入させることで、EGF(32D-E1)、HRGβ1(32D-E2/E3および32D-E2/E4)またはIL3(補充WEHI培地、3つの細胞系すべて)のいずれかを含む培地中で増殖することができる形質移入体が作成された(Wang他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1998、95、6809-6814)。図8Aに、erbBリガンド培地で増殖させた32D形質移入体の生存度に対する様々なerbBペプチドの効果を示す。最も強力な阻害効果は32D-E1細胞(EGF培地中で増殖)で観察された。32D-E2/E3および32D-E2/E4細胞(HRGβ1培地中で増殖)に対する効果はそれほど明白ではなかったが、これも有意であった(図8A)。しかし、同じ細胞系をIL3補充WEHI培地で増殖させた場合、研究したどのペプチドでも細胞生存度に対する有意な効果は検出されず(図8B)、これは、観察されたErbBペプチドによる細胞生存の阻害が、ErbB受容体シグナル伝達に対するその特異的効果に媒介されるがIL-3関連のシグナル伝達には媒介されないことを立証している。
本研究中で記載するErbBペプチドは、erbB受容体のサブドメインIV中に存在するループまたは反復の束縛された擬態を表し、本発明者らの分子モデリング研究に基づくと、鋳型受容体領域と高度な構造類似性を示す。erbBペプチドで観察される相互作用は、未変性erbB受容体の対応する部位によっても表示されており、これは、その代謝活性において特定の役割を果たす。B2-S23-BTEペプチドについて得られた情報は特に貴重である。設計した他のerbBペプチドとは異なり、これは単一のループを模倣するのではなく、むしろerbB2外部ドメインのC末端膜近位部分を表す。したがって、erbB2のC末端部分(B2-S23-BPT)は研究した3つの受erbB容体すべてと結合することができるので(表1)、この特性は、完全長の未変性erbB2受容体にも期待できる可能性が高い。erbBペプチドは特定のerbB受容体に特異的ではないが、erbBファミリーに高度に特異的であるという事実により(表1)、サブドメインIVのC末端部分は、すべてのerbB受容体に共通な受容体-受容体相互作用部位であることが示唆される。すべてのerbBペプチドがそれぞれの親受容体および他のerbB受容体に結合することができるので(表1)、これらの部位は、ホモおよびヘテロ受容体自己会合に関与することができる。
観察されたサブドメインIVのC末端部分を要する受容体間相互作用は、受容体の機能に重要である。erbBペプチドによる阻害は、細胞増殖を劇的に抑制した。MTTアッセイにおいて、erbB2に結合するペプチドと、erbB3-erbB2結合に対するその阻害と、erbB2を過剰発現しているT6-17細胞に対するその阻害活性との間に有意な関連性が見出された。
観察されたerbBペプチドの生物活性は、それがerbB2受容体に結合すること、およびerbBを要する受容体-受容体相互作用を遮断することによって媒介されていた。erbB受容体を用いて形質移入させた32D細胞中の細胞増殖に対するerbBペプチド誘発性の阻害もまた、erbB受容体経路によって特異的に媒介されることが示された。実際、細胞増殖に対する強力な阻害は、細胞をerbBリガンド培地中で増殖させた場合にのみ観察された。対照的に、細胞をIL3補充(WEHI)培地中で増殖させた場合には、erbB受容体依存性でない経路を介した阻害は起こらなかった。
要約すれば、erbB受容体シグナル伝達は、合理的に設計した、erbB受容体外部ドメインのサブドメインIV由来の界面ペプチド擬態によって阻害することができる。この擬態は、erbBファミリーの受容体に特異的に結合して、in vitroでHER2過剰発現細胞の増殖の阻害をもたらす受容体間の相互作用を遮断する。4つのerbB受容体すべてが治療標的を表しているので、この受容体ファミリーに選択的に結合してその活性を無効化するペプチド擬態は、erbBファミリーの単一のメンバーに特異的な薬物より有利である可能性がある。この研究は、erbBファミリーメンバーによるシグナル伝達に関与する受容体-受容体相互作用における、サブドメインIVのC末端部分の重要性もまた実証している。
S22-AFA類似体の溶解性および安定性
S22-AFA類似体の溶解性の増強は、活性に影響を与えないと考えられる特定の残基を改変することによって成すことができる。溶解性を増すために、以下の変化(太字)を加えた。
(1)YCF(Y)PDEEGACY-OH(配列番号3、配列番号12)、
(2)YCFPDEEGACYK-NH2(配列番号25)、
(3)YCFPDEEGACYGGS(配列番号26)、
(4)GGSYCFPDEEGACY-NH2(配列番号6)
相互作用表面に結合するMabの作成
二量体化ドメインに特異的なMAbは、(1)組換えによって精製したp185サブドメインIV断片、(2)改良したS22-AFA類似体、(3)他の免疫原から作成される。サブドメインIV断片とシステインノットのいずれもを使用すると、ペプチドは高品質の交差反応性MAbを産生する。これらの種は、Balb/cマウスを免疫化して特異的な二量体表面阻害性モノクローナル種を作成するのに使用することができる。S22-AFAは、既に記載されているように担体種に結合されている(Jacob他、1985; Williams他、1989、J. Immunol.、142: 4392-4400; Christodoulides他、1993、J. Genetic Microbiology、139: 1729-1738)。サブドメインIV断片は、そのままの状態で使用される。Mabの産生では、既に記載されているスキームを使用する(Drebin他、1986、Symp Fundam Cancer Res、38: 277-289; Drebin他、1986、Proc Natl Acad Sci USA、83: 9129-9133)。手短に述べると、100μgの最も有効なS22-AFA種または(等体積の完全フロイントアジュバント中の)可溶性サブドメインIVを用いてBALB/c(H-2d)マウスを皮下で免疫化し、その後、1回の注射あたり50μgを用いて腹腔内で3回ブーストする。最後のブーストから3日後、脾臓細胞および融合パートナーSp2/0-Ag14を使用して融合を実施する。融合物のスクリーニングでは、ウェルにS22-AFAを沈着させたELISAを使用する。使用すべき他のスクリーニングアッセイには、HER2/neuを発現しているT6-17細胞のFACS分析が含まれる。
MAbを作成し、S22-AFAペプチド形を結合する能力および細胞上のHer2/neuに結合する能力を有するものを選択し、in vitroで、足場依存性でないまたは依存性のタイプの研究で機能的に評価した。
EGFr、Her2/neu、およびEGFrとHer2/neuで形質転換させた細胞を使用して、in vivoで腫瘍に対するMAbの効果を評価した(上記参照)。腹腔内注射によって100μgのMAbを週に3回、腫瘍を異種移植した日から投与した。関係ない抗CD4 MAbまたはPBSの注射は、対照としての役割がある。オリゴマーの形の受容体の形成を阻害すると、表現型に影響が与えられる。抗体で処置した細胞に対する効果の増大を示したドキソルビシン/アドリアマイシンを用いた同時治療の効果(Park他、Nat Biotechnol.、2000、18、194-198)も調査した。腫瘍増殖は、体積測定によってモニターした。
システインに富むドメイン(CRD)に反応性のあるモノクローナル抗体の開発
システインに富むドメインに反応性のあるMAbを作成する免疫原としてerbB構築体を用いて形質移入した細胞系を使用し、このMAbの生物活性を擬態と比較した。pTex3-4、pTex4およびpTec6CNを用いて形質移入させたNR6細胞を免疫原として使用した(図1AおよびKumagai他、2001参照)。この融合スキームは以前に記載されている(Drebin他、1986、Symp Fundam Cancer Res、38: 277-289; Drebin他、1986、Proc Natl Acad Sci USA、83: 9129-9133)。手短に述べると、この細胞系を用いてBALB/c(H-2d)マウスを皮下的に免疫化し、その後、107個の細胞で3回、腹腔内でブーストした。最終のブーストから3日後、脾臓細胞および融合パートナーSp2/0-Ag14を使用して融合させる。SP2/0-Ag14融合パートナーは遊離軽鎖を分泌しない。pNeu、pTex3、pTex3-4(サブドメインIIIおよびIV)、pTex4(サブドメインIVのみ)、pTex6CNに対するFACS分析によってハイブリドーマ細胞系をスクリーニングする。対照には、単独のEGFrおよびpNex1、2、3(サブドメインI、II、III)を発現する細胞であるNR6細胞、ならびにサブドメインIのみを発現する細胞系であるpTex1細胞が含まれる。細胞系は、このMAbクラスにあいまいなスクリーニングアレイを提供する。所望する特異性の抗体を産生しているコロニーを、限界希釈法によって3回サブクローニングした。MAbのサブタイプは、Mouse Monoclonal Antibody Subtyping Kit(Gibco BRL)を使用して同定した。
実験手順
ペプチドの合成および環状化
直鎖ペプチド(純度95%)をペンシルベニア大学タンパク質化学研究室に注文した。ペプチドの純度およびそれが何であるかは、逆相高速液体クロマトグラフィー(RP HPLC)、および飛行時間質量分析器(MicroMass TofSpec、Micromass Inc.、マサチューセッツ州ベバリー)を使用したMALDI質量分析によって確認した。このペプチドを、pH8.0に調整した蒸留水中、0.1mg/mlの(NH4)2C03を用いた4℃での空気酸化によって環状化させた。酸化の進行は、5,5'-ジチオ-ビス(2-ニトロ安息香酸(DTNB)を用いて遊離チオールの量を測定することによって調節した。手短に述べると、0.4mlのペプチド(0.1mg/ml)および5μlのDTNB(20mM)を、0.2mlの0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH8.0に加えた。412nmでの吸光度を測定し、直鎖状の酸化していないペプチドと比較した。環状ペプチドを凍結乾燥させ、C18セミ分取カラム(Waters、マサチューセッツ州ミルフォード)を使用したRP HPLCによってその純度を分析した。大体において、95%より高い純度が環状ペプチドで得られた。各ペプチドで1mMストック溶液の一定分量(aliquotes)を調製し、結合またはバイオアッセイの研究の前に解凍するべく-20℃に保っておいた。ペプチド濃度は、各ペプチドについてGill他、(Anal Biochem、1989、182、319-326)に記載のように計算した280nmの吸光定数を使用したUV分光光度測定法によって確認した。
erbB2サブドメインIVのGST融合タンパク質の発現
erbB2サブドメインIV(erbB2-SbdIV)をコードするDNA断片をポリメラーゼ連鎖反応によって作成した。上流プライマーは、5'-CGCCCGGATCCTGGCCTGCCACCAGCTGTGC-3'[配列番号44]であり、下流プライマーは、5'-CGCCCGCGGCCGCCGCAGAGATGATGGAGTCAG-3'[配列番号45]であった。これら2つのプライマーは、BamHI/NotIで直鎖化したpGEX-5X-3ベクターへの枠内(inframe)挿入のために、それぞれBamHIおよびNotI制限部位を含むように設計された。組換えベクターを使用して大腸菌(Escherichia coli)BL-21(DE3)を感染させた。100mlの2XYT培地に、0.4から0.5のOD600が得られるまで37℃で増殖させた、10mlの終夜培養物を接種した。最終濃度0.1mMのIPTGを培地に加え2時間増殖させた。4,000g、10分間の遠心によって細胞を沈降させ、5mlの冷PBS(DTT、PMSFおよびアプロチニンはそれぞれ最終濃度5mM、1mMおよび1μg/mlを有する)中に再懸濁させた。氷上での超音波処理後、Triton X-100を最終濃度1%で加え、4℃で1時間揺り動かし、10,000gで10分間遠心分離した。その後、上清に100μlのグルタチオンセファロースビーズを加えた。これを4℃で2から4時間揺り動かし、遠心分離し、PBSで3回洗浄した。100μlの溶出緩衝液を加え、次いで室温で10分間回転させ、300gで1分間遠心分離し、上清を回収した。3回溶出を繰り返して溶出液を合わせた。
相互作用の研究
結合実験は、表面プラズモン共鳴に基づくバイオセンサー機器Biacore 3000(Biacore AB、スウェーデン、ウプサラ)を用いて25℃で実施した。精製した組換えerbB受容体は、Xcyte Therapeutics、ワシントン州シアトルのChe Law博士(erbB2)およびペンシルベニア大学医学部、生物化学および生物物理学科のMark A. Lemmon博士(erbB1およびerbB3)によって提供された。製造者の指示に従った標準アミン結合手順に従って、センサー表面中のerbB受容体の固定化を実施した。手短に述べると、センサーチップ表面上のカルボキシル基を活性化させるために、0.2MのN-エチル-N'-(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)および0.05MのN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を含む35μlの溶液を、5μl/分の流速で注入した。受容体(10mMのNaOAc緩衝液、pH5.0中に40ng/ml)をチップ表面上に20μl/分の流速で、所望するレベルの結合タンパク質が得られるまで流した。反応していないタンパク質を洗い流し、35μlの1Mエタノールアミンを5μl/分で注入することによって反応していない活性化された基を遮断した。各受容体の最終固定化応答は3,500RUであった。同時に、同条件だが受容体を注入せず、機器および緩衝液の人為的現象を補正するためのブランクとして使用した基準表面を作成した。ペプチドを様々な濃度、流速20μl/分で注入し、チップ上に固定した受容体に対する結合を実時間でモニターした。各センサーグラムは、受容体に対する注入したペプチドの結合を反映している会合段階(最初の240秒間)、およびそれに続く、ランニング緩衝液をチップ上に流し、結合したペプチドが受容体表面から洗い流される期間である解離段階(300秒間)からなる。
MTTアッセイ
MTTアッセイは、Hansen他、(J. Immunol. Methods、1989、119、203-210)に既に記載されているように細胞増殖を測定するために使用する。手短に述べると、T6-17細胞を96ウェルプレートに、終夜、10%のFBS(各ウェル1000)を含むDMEM中で播種する。T6-17は、ヒトerbB2受容体を過剰発現することによってNIH3T3から誘導される。1μg/mlのerbBペプチドを含む100μlの新しい培地中で細胞を48時間増殖させる。様々な類似体の阻害効果を測定するのには、このインキュベーション時間が最適であった。インキュベーション時間を増加させることによって阻害活性は改善されなかった。25μlのMTT溶液(PBS中5mg/ml)を各ウェルに加え、37℃で2時間インキュベートした後、100μlの抽出緩衝液(20% w/vのSDS、50%のN,N-ジメチルホルムアミド、pH4.7)を加えた。37℃、終夜のインキュベーションの後、ELISA読み取り器を使用して600nmでの光学濃度を測定した。
32D細胞系の細胞生存度および架橋結合の分析
ErbB受容体(国立がん研究所のJacalyn H. Pierce博士から寄贈)を用いた32D細胞形質移入体を、RPMI 1640、10%のFBS、および5%のWEHI培地(GenoQuest、インターロイキン-3補充)、およびそれぞれの抗体、すなわち32D-E1(gpt')、32D-E2/E3(neo'/gpt')および32D-E2/E4(neo'/gpt')(29)中で増殖させた。WEHI培地を取り除き、細胞をErbBペプチドと共に2時間、37℃でプレインキュベートした後、10μg/mlのEGF(32D-E1用、Collaborative Biomedical Products)または10μg/mlのHRGβ1(32D-E2/E3または32D E2/E4用、R & D Systems)を加え、さらに37℃で24から48時間インキュベートした。細胞生存度はヨウ化プロピジウム染色で検出し、その後流動細胞計測法で定量した。架橋結合の分析には、約2×106個の細胞を0.1%のBSAおよび10mMのHEPESを含むRPMI 1640培地に懸濁させ、ErbB ペプチドと共に37℃で2時間プレインキュベートした後、10μg/mlのEGFまたは10μg/mlのヘレグリン-β1 EGFドメインを加え、さらに37℃で10から15分間インキュベートした。細胞をPBSですすぎ、2mMのBS3/PBS中で4℃、45分間インキュベートした。抗ErbB2または抗ErbB3抗体(Santa Cruz)を用いて細胞溶解物を免疫沈降し、抗pTyr(PY20、Santa Cruz)を用いて免疫ブロットした。
モデルの構築
erbB2-SbdIVおよびerbB1外部ドメインの相同性モデリングは、erbB2-SbdIVではラミニンg1III3-5(1KLO)、erbB1ではインスリン様成長因子-1受容体(1IGR)の鋳型結晶構造に基づいて、Quanta/Protein design (Molecular Simulations Inc.)を用いて実施した。Sequence Viewerを使用し、保存的システイン残基の位置を一致させること、およびシステイン間の間隔の長さを調節するためにギャップを挿入することによって、配列を手動で整列させた。モデリングしたタンパク質の、手動で選択した一致する残基の鋳型構造の座標を使用することによって、分子モデルのフレームワークを作成した。鋳型構造中で相対を有していなかったペプチドセグメントの不足した座標は、「領域の均一化(Regularizing Region)」および「側鎖のモデリング(Model Side Chains)」ツールのいずれかによって(短いループ用)、または「同族化(Congen)」(Li他、1997、Protein Sci.、6、956-970; Tejero, R.他、1996、Protein Sci.、5、578-592)プログラムを使用してループコンホメーションをモデリングすることによって(より長いループ用)計算した。その後、RTFモードでCHARMmエネルギー最小化を実行することによって最終的な単量体の構造を得た。二量体erbB1-EGFモデルを構築するために、存在する実験証拠に基づいて以下の仮説を立てた。erbB1-EGF複合体は2:2の化学量論を有する(Lemmon M. A.他、1997、EMBO J.、16、281-294);サブドメインIVのC末端部分は二量体の相互作用部位である(下に記載する本発明者らの結果に基づく);結合したEGFのN末端は、erbB1のTyr101(サブドメインI)に近い(約15Å内)(Woltjer, R. L.他、1992、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89、7801-7805;結合したEGFのC末端Arg45は、erbB1のLys465(サブドメインIII)に近い(約15Å内)(Summerfield, A. E.他、1996、J. Biol. Chem.、271、19656-19659;erbB1に結合したEGFのN末端は、膜表面から約67Å(52から82Å)離れている(Carraway, K. L.、1990、Biochem.、29、8741-8747;erbB1の最大の長さは、単量体では約110Å、二量体では120Åでは(Tejero, R.他、1996、Protein Sci.、5、578-592);EGFは、サブドメインIIIの第2の表面に結合する(Jorissen, R. N.、2000、Protein Sci.、9、310-324。2つの異なる複合体の整列のモデルに基づいて上に記載した基準を満たすように、複合体を形成する2つのerbB1および2つのEGF(PDBコード、3EGF)分子の配向を手動で調節した。最終的な二量体モデルは、CHARMmエネルギー最小化ツールを使用して最小化した。これら二量体複合体モデルは低分解性の性質を有しており、互いに対する構成分子の配置にある程度のエラーを有するかもしれない。
当分野の技術者には理解されるように、本発明の精神から逸脱することなしに、本発明の好ましい実施形態に多数の変更および改変を与えることができる。このような変化すべてが本発明の範囲内に含まれることが意図される。
本明細書中で言及する各特許、特許出願、または他の出版物の開示全体が、本明細書中に参照として組み込まれる。
「参考文献」
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本明細書中で言及したそれぞれの参照文献は、その全体で参照として本明細書中に組み込まれる。
発現ベクターおよびEGFrとNeu変異体との間のヘテロ二量体形成の概略を示す図である。図1Aは、発現ベクターの概略図を示す。 発現ベクターおよびEGFrとNeu変異体との間のヘテロ二量体形成の概略を示す図である。図1BはEGFrとNeu変異体との間のヘテロ二量体形成を示す。 ErbB-2の分子モデル:膜貫通(S22)に近位の第2のシステインに富むドメインを示す図である(A)。このモジュールでは、TNF受容体のトポロジーと類似のトポロジーが用いられている。A2様ドメインから設計したペプチドは環外にあるが(S22-AFA、B)、B2様ドメイン由来のペプチド(S23-BPT、C)は、完全なシスチンノットとして作られている。 B2-S22-APEペプチドと、erbB2(A)またはerbB2-SbdIV(B)の外部ドメインとの相互作用の表面プラズモン共鳴分析を示す図である。用量応答。 erbB受容体のヘレグリン誘発性のオリゴマー形成に対するB2-S22-AFAペプチドの阻害効果の表面プラズモン共鳴分析を示す図である。ErbB1、erbB2、およびerbB3を表面チップ上に固定化し、300nMのerbB3を単体で(1'、2'、3')または5μMのHRGβ1の存在下で(1'''、2'''、3''')注入した。図形1''、2''および3''は、HRGβ1の存在下で、10μMのB2-S22-AFAを事前に注入した後の、erbB3の固定化した受容体への結合を示す。 ErbB受容体のヘレグリンによる活性化および二量体化に対する、B2-S22-AFAおよびB3-S22-APQペプチドの阻害効果を示す図である。(A)32D-E2/E4細胞を、10μg/mlのHRGβ1および10μg/mlのerbBペプチドを存在させずに(-)または存在させて(+)インキュベートし、実験手順に記載したような化学架橋結合および免疫ブロット実験によって分析した。(B)B2-S22-AFAペプチドによる阻害効果の用量依存性。 MTTアッセイで研究した、T6-17細胞の増殖に対するerbBペプチドの阻害活性を示す図である。 erbBペプチドの受容体結合性特性と、erbB2を過剰発現しているT6-17細胞に対する生物活性との関連性を示す図である。プロットは、MTTアッセイにおけるペプチドの活性とその受容体結合親和性との関連性を表す。 erbBペプチドの受容体結合性特性と、erbB2を過剰発現しているT6-17細胞に対する生物活性との関連性を示す図である。プロットは、MTTアッセイにおけるペプチドの活性とerbB受容体のオリゴマー形成に対する阻害活性との関連性を表す。 32D形質移入体の細胞生存度に対するErbBペプチドの阻害効果を示す図である。32D細胞形質移入体をErbB1リガンド培地(A)またはIl-3補充(WEHI)培地(B)のいずれか中で増殖させ、実験手順に記載したように細胞生存度を決定した。それぞれの実験で、標準誤差は10%を超えなかった。 erbB1ホモ二量体化の分子モデルを示す図である。モデル1(EGFは2つのerbB1単量体を架橋結合する、A)およびモデル2(EGFが1つのerbB1単量体に結合する、B)に従った、erbB1-EGF(2:2)複合体の可能な配置。

Claims (29)

  1. 以下の式：
    Y-C-LもしくはPもしくはF-VもしくはI-WもしくはYもしくはF-K-Yもしくは F-AもしくはP-D-AもしくはEもしくはVもしくはP-GもしくはEもしくはQもしくはD-C-Y；
    Y-C-F-P-D-E-E-G-A-C-Y；または
    P-C-P-I-N-C-T-H-S-C-V-D-L-D-D-K-G-C-P-A-E-Q-R-A-S-P-L-T-S-I
    のアミノ酸配列からなるペプチド。
  2. Y-C-P-I-W-K-F-P-D-E-E-C-Y (配列番号31); Y-C-L-V-W-K-Y-A-D-A-G-C-Y (配列番号32); Y-C-P-I-Y-K-Y-P-D-V-Q-C-Y (配列番号33); Y-C-F-I-F-K-Y-A-D-P-D-C-Y (配列番号34)
    からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる請求項1に記載のペプチド。
  3. 1つまたは複数の検出可能な薬剤、細胞障害剤、または化学療法剤に連結された請求項1に記載のペプチドを含む、腫瘍細胞をイメージング、腫瘍細胞増殖を阻害、または腫瘍細胞を死滅するための組成物。
  4. 前記ペプチドが、放射性同位元素である検出可能な薬剤に連結された、請求項3に記載の組成物。
  5. 請求項1に記載のペプチドを含む、腫瘍細胞表面に1つまたは複数のerbB受容体を有する腫瘍を検出するための組成物。
  6. 前記ペプチドが、細胞障害薬、毒素および細胞分裂抑制薬からなる群から選択される細胞障害剤と連結している、請求項3に記載の組成物。
  7. 請求項1に記載のペプチドおよび製薬的に許容される担体または希釈剤を含む薬剤組成物。
  8. 請求項1に記載のペプチドを含む、その表面にerbB受容体を有する腫瘍細胞を有する腫瘍を有したことがある個体、その腫瘍を手術で取り除いたことがある個体、および/または寛解中である個体中で、正常細胞が腫瘍細胞に形質転換されるのを阻止するための組成物。
  9. 請求項1に記載のペプチドを含む、その細胞表面にp185を有する腫瘍細胞によって特徴付けられる癌を有している個体を治療するための組成物。
  10. 請求項1のペプチドに結合する抗体。
  11. Y-C-P-I-W-K-F-P-D-E-E-C-Y (配列番号31); Y-C-L-V-W-K-Y-A-D-A-G-C-Y (配列番号32); Y-C-P-I-Y-K-Y-P-D-V-Q-C-Y (配列番号33); Y-C-F-I-F-K-Y-A-D-P-D-C-Y (配列番号34)
    からなる群から選択されるペプチドに結合する、請求項10に記載の抗体。
  12. 抗体がerbB受容体のシスチンノットに結合する、請求項11に記載の抗体。
  13. シスチンノットがerbB受容体のサブドメインIVである、請求項12に記載の抗体。
  14. シスチンノットがS22ループおよびS23ループからなる群から選択される請求項13に記載の抗体。
  15. 抗体が、erbB受容体の細胞外ドメイン中の相互作用表面に結合する、請求項10に記載の抗体。
  16. 抗体が、放射活性剤または化学療法化合物にコンジュゲートされている請求項10に記載の抗体。
  17. 抗体が、18F、47Sc、67Cu、86Y、90Y、109Pd、123I、125I、131I、186Re、188Re、199Au、211At、212Pb、および212Biにコンジュゲートされている、請求項16に記載の抗体。
  18. 抗体が、メトトレキセート(アメトプテリン)、ドキソルビシン(アドリマイシン)、ダウノルビシン、シトシンアラビノシド、エトポシド、5-4フルオロウラシル、メルファラン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シスプラチン、ビンデシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、タモキシフェン、タキソール、リシン、リシンA鎖、シュードモナス外毒素(PE)、ジフテリア毒素(DT)、ウェルシュ菌ホスホリパーゼC(PLC)、ウシ膵臓リボヌクレアーゼ(BPR)、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質(PAP)、アブリン、アブリンA鎖、コブラ毒因子(CVF)、ゲロニン(GEL)、サポリン(SAP)、モデシン、ヴィスキュミン、およびヴォルケンシンにコンジュゲートされている、請求項17に記載の抗体。
  19. 請求項10から15のいずれか一項に記載の抗体を含む薬剤組成物。
  20. 注射用の薬剤組成物である請求項19に記載の薬剤組成物。
  21. 化学療法剤をさらに含む請求項19または20に記載の薬剤組成物。
  22. 治療上有効な量のメトトレキセート(アメトプテリン)、ドキソルビシン(アドリマイシン)、ダウノルビシン、シトシンアラビノシド、エトポシド、5-4フルオロウラシル、メルファラン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シスプラチン、ビンデシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、タモキシフェン、またはタキソールをさらに含む、請求項21に記載の薬剤組成物。
  23. 以下の式：
    Y-C-LもしくはPもしくはF-VもしくはI-WもしくはYもしくはF-K-Yもしくは F-AもしくはP-D-AもしくはEもしくはVもしくはP-GもしくはEもしくはQもしくはD-C-Y；
    Y-C-F-P-D-E-E-G-A-C-Y；または
    P-C-P-I-N-C-T-H-S-C-V-D-L-D-D-K-G-C-P-A-E-Q-R-A-S-P-L-T-S-I
    のアミノ酸配列からなるペプチドを含む、哺乳動物で腫瘍を阻止するための組成物。
  24. 前記哺乳動物がヒトである請求項23に記載の組成物。
  25. (i)以下の式：
    Y-C-LもしくはPもしくはF-VもしくはI-WもしくはYもしくはF-K-Yもしくは F-AもしくはP-D-AもしくはEもしくはVもしくはP-GもしくはEもしくはQもしくはD-C-Y；
    Y-C-F-P-D-E-E-G-A-C-Y；または
    P-C-P-I-N-C-T-H-S-C-V-D-L-D-D-K-G-C-P-A-E-Q-R-A-S-P-L-T-S-I
    のアミノ酸配列からなるペプチドと、
    (ii)アジュバント
    とを含む、哺乳動物中で腫瘍を阻止するワクチン。
  26. 前記ペプチドが、細胞障害薬、毒素および細胞分裂抑制薬からなる群から選択される細胞障害剤と連結している、請求項5に記載の組成物。
  27. Y-C-P-I-W-K-F-P-D-E-E-C-Y (配列番号31)からなるペプチド。
  28. Y-C-P-I-Y-K-Y-P-D-V-Q-C-Y (配列番号33)からなるペプチド。
  29. Y-C-F-P-D-E-E-G-A-C-Y (配列番号35)からなるペプチド。
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