KR20180015499A - 암 세포 증식용 조성물 및 이를 이용한 암 세포 증식 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 암 세포 증식용 조성물 및 암 세포 증식 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 조성물은 야생형 PTEN 단백질이 발현되어, 세포 증식이 불가능한 암 세포의 증식을 촉진하여 High Throughput Screening 및 유전정보 분석에 활용할 수 있는 충분한 양의 세포를 쉽고 빠르게 수득할 수 있다.
Description
본 발명은 조직 샘플에서 획득한 환자 유래 세포를 증식시켜 여러 가지 분석에 필요한 양의 세포를 얻는데 필요한 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 환자 유래 세포 중에 암 억제 유전자 중의 하나인 야생형 PTEN 단백질이 발현되어 배양이 어려운 세포들에 핵으로 내재화 될 수 있는 PTEN 단백질 변이체를 포함하는 조성물을 도입하는 암 세포 증식용 조성물에 관한 것이다.
PTEN (phosphatase and tensin homologue)은 암 억제 유전자로서, 10q23 유전자좌 (locus)에 위치하고 있으며 다양한 산발성 종양 (sporadic cancer)에서 빈번하게 방해를 받거나 Cowden disease (다발성 과오종 증후군, PTEN 돌연변이 환자의 80%에서 나타남)와 같은 암소인증후군 (cancer predisposition syndrome, 암과의 직접적인 연관성은 없으나 암이 있을 경우 함께 나타나는 것으로 알려진 여러 가지 병증)을 가진 환자에서 표적이 된다. PTEN은 암과 관련하여 야생형적인 세포의 공정을 조절할 뿐만 아니라 다양한 세포생물학적인 역할을 가지고 있는 것으로 연구되어 왔다. PTEN의 주요한 기능은 PtdIns(3,4,5)P3 (phosphatidylinositol-3,4,5-trsphosphate, PDK와 AKT의 활성화 기능 담당)의 탈인산화 (dephosphorylation)에 촉매 기능을 하는 것인데 따라서 PTEN 변이로 인하여 본래의 기능을 상실하게 되면 PtdIns(3,4,5)P3가 증가하게 되고 PI3K (phosphoinnositide-3-kinase)-AKT 경로를 활성화시켜 세포의 성장과 생존을 촉진하게 된다(Lindsay, Y. et al., J. Cell Sci. Vol. 119, pp. 5160-5168, 2006).
PTEN 유전자의 결실은 전립선암, 뇌종양, 폐암, 유방암 등의 종양에서 많이 발견된다. PTEN이 결실되면, AKT에 의한 CHEK1 단백질의 인산화 및 세포질로의 이동을 야기하여, G2-M 세포 주기 체크포인트를 방해하게 되고, 유전체의 불안정성을 증가시키며, 암 세포에서 DNA double-strand break(DSB)를 축적되게 한다(Puc. J. et al., Cancer Cell, VOl. 7, pp.193-204, 2005). 최근에는 핵에 존재하는 PTEN은 APC/C의 활성화 인자인 CDH1과의 결합을 촉진하여 E3 ligase 활성을 직접적으로 향상시킨다고 보고 되었으며, 이러한 기능은 APC/C-CDH1 복합체가 PLK1 및 AURKs와 같은 발암 단백질(oncoprotein)을 분해하는데 중요하다고 알려져 있다(Liu. X. S. et al., J. Biol. CHem. VOl. 286, pp. 35795-35800, 2011).
하지만, PTEN의 기능은 유전자 수(gene copy number)의 변화보다는 단백질의 발현이나 활성 수준으로 더 잘 설명할 수 있다. PTEN은 종양에서 결실이 빈번하게 발생하는 유전자임에도 불구하고 유전자의 변이가 없을 경우에는 야생형 단백질을 합성할 수 있으며, PTEN 변이가 있을 경우에는 야생형 단백질뿐만 아니라 변이체 또한 합성된다. 비야생형적인 PTEN 단백질은 야생형 PTEN 단백질과 결합하여 그 기능을 억제시킴으로서 야생형 PTEN 단백질의 기능을 무력화시킨다(Antonella Papa et al., cell. Vol. 157. pp.696-610. 2014).
최근 403개의 아미노산으로 구성된 PTEN의 개시 코돈 앞부분인 N-terminal에 173개의 아미노산이 추가되어 총 576개의 아미노산으로 구성된 PTEN-Long이 보고되었다. PTEN-Long의 경우 세포에서 분비되는 형태의 단백질로 세포내로 유입되어 세포의 성장 및 조직의 항상성을 저해하는 것으로 보고된 바가 있다(Hopkins et al., Science. Vol. 341. pp. 399-402).
이에, 본 발명자들은 야생형 PTEN 단백질에 의해 분열이 억제되는 환자 유래 암 세포 증식용 조성물을 개발하기 위해, 예의 노력한 결과, PTEN C124S 변이체를 세포의 핵 내로 운반할 수 있는 세포 투과성 펩타이드(CPP)와 융합한 융합 단백질을 포함하는 조성물을 세포 배양 배지에 도입할 경우, 환자 유래 암 세포의 증식을 촉진할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 세포 투과성 펩타이드(cell penetrating peptide, CPP)-PTEN C124S 융합 단백질을 포함하는 암 세포 증식용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 조성물을 이용한 암 세포 증식 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 단백질을 세포의 핵으로 수송할 수 있는 세포 투과성 펩타이드(cell penetrating peptide, CPP)의 단백질 전달 도메인(protein transduction domian) 및 CPP의 전달 도메인에 부착되고 PTEN C124S의 생물학적 활성을 갖는 PTEN C124S 단백질을 포함하는, CPP-PTEN C124S 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 암 세포 증식용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 암 세포를 조직으로부터 분리하는 단계 및 (b) 상기 조성물을 분리된 암 세포에 처리하는 단계를 포함하는 암 세포 증식 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 암 세포 증식용 조성물은 환자의 조직에서 유래한 암 세포에서 야생형 PTEN 단백질이 발현되어, 배양이 힘들 경우, dominant negative 효과를 발휘할 수 있는 변이체 PTEN 단백질(PTEN C124S)을 세포 핵 내부로 도입함으로서 환자 유래 암 세포의 증식을 촉진하여 High throughput screening 또는 유전자 분석 등에 필요한 양의 세포를 얻는데 효과적이며, 원하는 단백질의 발현을 위해 트랜스펙션을 수행하는 과정이 필요없고, 대장균을 이용하여 대량 생산하기 때문에 유도 방법이 간단하고 저렴하며, 단순한 배지 교환에 의해 변이체 PTEN 단백질을 제거할 수 있어 방법이 간단한 점에서 유용하다.
도 1은 본 발명에서 개발한 TAT-PTEN C124S 융합 단백질을 발현하는 벡터와 이를 이용한 융합 단백질의 정제 방법을 요약한 모식도이다.
도 2는 상기 방법으로 TAT-PTEN C124S 융합 단백질을 정제하는 과정에서 상기 융합단백질의 과발현을 IPTG로 유도한 것을 확인한 결과이다.
도 3은 TAT-PTEN C124S 융합 단백질이 TAT 단백질에 의해 세포의 핵으로 내재화 되는 것을 확인한 결과이다.
도 4는 TAT-PTEN C124S 융합 단백질이 세포의 핵 내로 도입되어 Akt 단백질의 인산화를 촉진한 것을 확인한 결과이다.
도 5는 환자 유래 세포 중, 세포 증식이 잘 일어나는 세포주, 세포 증식이 정지 되었거나 감소하는 세포주에 TAT-PTEN C124S 융합 단백질을 주입하고, 이들의 세포 증식을 확인한 결과이다.
도 2는 상기 방법으로 TAT-PTEN C124S 융합 단백질을 정제하는 과정에서 상기 융합단백질의 과발현을 IPTG로 유도한 것을 확인한 결과이다.
도 3은 TAT-PTEN C124S 융합 단백질이 TAT 단백질에 의해 세포의 핵으로 내재화 되는 것을 확인한 결과이다.
도 4는 TAT-PTEN C124S 융합 단백질이 세포의 핵 내로 도입되어 Akt 단백질의 인산화를 촉진한 것을 확인한 결과이다.
도 5는 환자 유래 세포 중, 세포 증식이 잘 일어나는 세포주, 세포 증식이 정지 되었거나 감소하는 세포주에 TAT-PTEN C124S 융합 단백질을 주입하고, 이들의 세포 증식을 확인한 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
PTEN의 효소활성 부위의 아미노산이 치환되는 돌연변이 (예를 들어, C124S 치환)의 경우, 야생형 PTEN 단백질에 dominant negative 효과로 인하여, Akt 인산화를 촉진하는 것으로 알려져 있다. 촉진된 Akt 경로는 종양 형성 및 성장능, 침습력 등을 증가시키는데 기여한다.
본 발명에서는 야생형적인 PTEN 단백질을 PTEN 변이체를 이용하여 무력화 시킴으로서 야생형 PTEN 단백질로 인하여 억제된 세포의 성장을 증가시키기 위하여, 세포 투과성 펩타이드(cell penetrating peptide, CPP)-PTEN C124S 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 암 세포 증식효과를 확인하고자 하였다.
본 발명에서는 PTEN 유전자가 야생형적으로 발현되어, 암 세포의 증식이 억제되고 있는 암 세포의 핵 내부로 CPP-PTEN C124S 융합 단백질을 도입할 경우, 암 세포 증식이 촉진되는 것을 확인하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는 환자 유래 암 세포주 중, 세포 증식이 잘 일어나는 세포주, 세포 증식이 정지된 세포주 및 세포 증식이 감소하는 세포주 각각에, TAT-PTEN C124S 융합 단백질을 도입하여 세포 증식이 정지되거나 감소하는 세포주에서 세포 증식이 향상되는 것을 확인하였다(도 5).
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 단백질을 세포의 핵으로 수송할 수 있는 세포 투과성 펩타이드(cell penetrating peptide, CPP)의 단백질 전달 도메인(protein transduction domian) 및 CPP의 전달 도메인에 부착되고 PTEN C124S의 생물학적 활성을 갖는 PTEN C124S 단백질을 포함하는, PTEN C124S의 생물학적 활성을 갖는 CPP-PTEN C124S 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 암 세포 증식용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 용어 “증식(proliferation)”은 가역적 방식으로 불사화된(예를 들어, PTEN C124S 변이체가 존재하는 경우, 무한정 분열하는) 세포의 분열을 일컬으며, 이로서 세포는 특정 조건 집합 하에 불사화되며, 상기 조건이 제거되는 경우, 세포는 더 이상 불사화되지 않고, 분열을 멈출 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 조성물 언급하는 경우, 세포 생존 및 증식을 억제하는 야생형 PTEN 단백질의 기능이 억제되는 경우(예를 들어, PTEN C124S 변이체에 의한 야생형 PTEN 단백질의 활성 억제) 세포가 불사화된 표현형을 보유하도록 야기한다. 다시 말해 세포는 배양물 중 무한정 성장 및 증가되고, 상기 조건이 제거되는 경우(예를 들어, 배지 교환에 의한 PTEN C124S 변이체의 소멸), 세포는 더 이상 불사화되지 않고, 분열을 멈추는 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 암 세포는 환자의 암 조직에서 유래한 암 세포 또는 암 줄기세포인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 암 세포는 다양한 공지된 방법으로 분리할 수 있으며, 바람직하게는 (a) 분리된 환자 유래 암 조직을 분쇄한 다음, 상기 분쇄물에서 세포분획을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득된 세포분획을 단백질 분해효소로 처리한 다음, 여과 및 원심분리하고 현탁하여 단세포화 하는 단계를 거쳐 수득되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 상기 암 세포는 공지된 다양한 동물 세포 또는 줄기 세포의 배양방법으로 배양하는 것을 특징으로 할 수 있고, 동물 세포의 배양에 적절한 배지를 사용할 수 있다. 본 발명에 따르는 동물 세포의 배양에 적절한 배지는 동물 세포 및 특히, 포유동물 세포의 배양을 위해 개발되거나, 또는 동물 세포 성장에 필요한 적절한 성분, 예컨대 동화성 탄소, 질소 및/또는 미량 영양소와 함께 실험실 내에서 제조될 수 있는 임의의 이용가능한 배지를 포함할 수 있다. 상기 배지는 동물 세포 성장에 적절한 임의의 기본 배지, 비제한적인 예로서, 이스코브 변형된 둘베코 배지 (Iscove's Modified Dulbecco's Medium, IMDM), 둘베코 변형된 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagles medium, DMEM), 알파 MEM (지브코, Gibco), RPMI 1640, 또는 임의의 기타 적절한 시판 배지를 포함한다. 기본 배지에, 탄소, 질소 및 미량 영양소의 동화성 공급원, 비제한적인 예로서, 혈청 공급원, 성장 인자, 아미노산, 항생제, 비타민, 환원제, 및/또는 당 공급원이 첨가된다. 기본 배지 및 동물 세포 성장에 필요한 다수의 추가의 성분을 포함하는 완전 배지가 시판되며, 일부 배지는 특정 유형의 세포 배양물에 이용 가능함이 주목된다. 또한, 다수의 무혈청 배지가 이용가능하며 본 발명에 따른 환자 유래 암 세포의 배양에 특히 적절할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 암 세포는 야생형 PTEN 유전자의 변이가 없는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 야생형 PTEN 유전자의 변이가 없다는 의미는 PTEN 유전자 또는 단백질에 암과 유관한 돌연변이가 없는 PTEN이 발현된다는 것을 의미한다.
본 발명의 야생형 PTEN 유전자의 발현은 당업계에 알려진 다양한 방식으로 확인할 수 있으며, 예를 들어, exon sequencing, FACS, western blotting 및 immunohistochemistry 등이 있을 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 세포 투과성 펩타이드(CPP)는 세포의 핵 내부로 융합된 단백질을 전달할 수 있는 펩타이드면 제한 없이 이용가능하나, 바람직하게는 TAT, Antennapedia(Penetratin), Transportan, VP22, Hph-1, R11(R9), KGF 유래 신호서열 및 Amhoipathic 펩타이드로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있고, 하기 표 1에 표시된 서열 중의 하나 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 고형암이면 모두 가능하나, 바람직하게는 흑색종, 갑상선암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 위암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암 및 폐암으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 세포 증식은 하나 이상의 세포의 분열이 CPP-PTEN C124S 융합 폴리펩타이드에 노출되지 않은 상응하는 세포와 비교했을 때 증가되는 것을 특징으로 할 수 있다.
이름 | 서열정보 |
TAT | YGRKKRRQRRR |
Antennapedia (Penetratin) |
RQIKIWFQNRRMKWKK |
Transportan | GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL |
VP22 | DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE |
Hph-1 | YARVRRRGPRR |
R11(R9) | RRRRRRRRRRR(RRRRRRRRR) |
KGF 유래 신호서열 |
AAVALLPAVLLALLAP |
Amphipathic 펩타이드 |
KLALKLALKALKAALKLA |
본 발명에 있어서, 상기 CPP-PTEN C124S 융합 단백질은 암 세포의 핵으로 내재화되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 CPP-PTEN C124S 융합 단백질을 5.5 내지 6.5nM의 농도로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 CPP-PTEN C124S 융합 단백질은 CPP 아미노산 서열 이외에, PTEN 단백질의 dominant negative 효과를 발휘하는 모든 변이체 서열을 포함할 수 있으나, 바람직하게는 PTEN 단백질의 124번째 시스테인(C)이 세린(S)으로 치환된 변이체인 것을 특징으로 할 수 있고, 더욱 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
서열번호 1
PTEN C124S 단백질의 아미노산 서열
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 EGF, bFGF와 같은 성장인자 또는 세포 분비물 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서는 TAT-PTEN C124S 융합 단백질을 코딩하는 벡터를 대장균에 형질전환하여, 대량 생산한 다음, 인간 교모세포종 세포주(U87MG)를 배양하는 배지에 처리할 경우, 세포의 핵 내부로 전달되고, Akt 단백질의 인산화를 촉진한다는 것을 확인하였다(도 3 내지 도 4).
따라서, 본 발명은 다른 관점에서 (a) 암 세포를 조직으로부터 분리하는 단계 및 (b) CPP-PTEN C124S 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물을 분리된 암 세포에 처리하는 단계를 포함하는 암 세포 증식 방법에 관한 것이다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
1: TAT-
PTEN
C124S
융합 단백질
클로닝
및 제조
융합 단백질을 얻기 위해 우선 plasmid 제작은 표 2과 같은 TAT 서열을 포함하는 프라이머를 이용하여 PTEN C124S mutant DNA(애드진, Addgene)를 템플릿으로 사용하여 PCR을 수행한 다음, 획득한 insert를 In-Fusion® HD cloning kit (Clontech)을 이용하여 pET6XHN-C 벡터에 클로닝 하였다(도 1).
도 1과 같이 클로닝 된 벡터를 BL21(DE3) 균주에 도입한 다음, 100ug/ml의 ampicillin이 들어간 LB 배양액에 넣어 0.7의 O.D 값까지 배양한 뒤, 1mM이 되도록 IPTG를 넣어 IPTG dependent하게 융합 단백질을 발현시킨 후, His60 Ni column(clontech)을 이용하여 융합 단백질만을 정제하였다. 정제 된 융합 단백질을 desalting (Thermo scientific, Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices)과 endotoxin removal 과정(Thermo scientific, Pierce High Capacity Endotoxin Removal Spin Column, 0.5ml)을 거쳐 분리하였다(도 2).
Primer (서열번호) | 서열 |
pET-TAT-F (2) | taaggcctctgtcgactatggtcgtaaaaacgtcgtcaacgtcgtcgtaagcttgcgaatttctg |
pET-TAT-R (3) | cagaattcgcaagcttacgacgacgttgacgacgttttttacgaccatagtcgacagaggcctta |
pET-TAT-PTEN-F (4) | taaggcctctgtcgactatggtcgtaaaaaacgtcgtcaacgtcgtcgtatgacagccatcatcaaagagatc |
pET-PTEN-R(5’ to 3;) (5) | cagaattcgcaagcttgacttttgtaatttgtgtatgctgatc |
실시예
2: TAT 단백질에 의한 핵 내재화 확인
실시예 1에서 수득한 TAT-PTEN C124S 융합 단백질을 알파 MEM 배지(지브코, Gibco) 배양중인 U87MG cell의 에 섞어준 다음, 30분간 배양한 후에 His antibody(에이비캠, Abcam)를 이용하여immunostaining을 한 결과, U87MG cell에 control protein인 TAT 뿐만 아니라 TAT-PTEN C124S 융합 단백질이 내재화 되는 것을 확인 할 수 있었다(도 3).
실시예
3: TAT-
PTEN
C124S
융합 단백질에 의한
Akt
단백질의 인산화 증가 여부 확인
TAT-PTEN C124S 융합 단백질의 야생형 PTEN에 대한 dominant negative 효과를 확인하기 위해 Akt 단백질의 인산화 레벨(p-Akt level)을 하기의 방법으로 측정하였다. Neurobasal 배지(Thermo scientific)에 배양한 NS07_464T 세포에 대조군 단백질 TAT와 TAT-PTEN C124S 융합 단백질을 0, 6.25, 12.5, 25, 50 nM의 농도로 처리하고, 72hr incubation 후에 세포 내 단백질을 NP40 cell lysis buffer(노벡스, Novex)를 이용하여 추출하였으며 western blot을 이용하여 p-Akt level을 측정하였다. 대조군 단백질인 TAT의 경우 처리 유무에 관계없이 p-Akt level의 변화가 없는 반면, TAT-PTEN C124S의 경우에는 6.25nM이상에서 p-Akt level이 증가함을 확인함으로써 fusion protein이 dominant negative 효과를 가지고 있는 것을 확인 하였다(도 4).
실시예
4: TAT-
PTEN
C124S
융합 단백질의 세포 증식 촉진 효과 확인
야생형 PTEN 단백질이 발현되는 환자 유래 세포(patient derived cell, PDC)를 선별하여 TAT-PTEN C124S의 세포 생장능 향상에 대한 효과를 확인하고자 하기의 실험을 수행하였다. Neurobasal 배지(Thermo scientific)에 배양한 세포(GBM14_549T3, GBM14_586T, MBT15_206T)를 384well에 seeding하였을 때와 6일 후의 proliferation 정도를 ATPlite(Perkin Elmer)를 사용하여 측정하였다. 7배 이상 proliferation된 cell (GBM14_549T3)과 proliferation이 정지 혹은 감소한 cell (GBM14_586T, MBT15_206T)에 대한 TAT-PTEN C124S에 대한 proliferation영향을 측정한 결과, Control protein (TAT)과 TAT-PTEN C124S fusion protein을 6.25nM로 처리하였을 경우 proliferation이 잘 일어나는 PDC의 경우에 TAT-PTEN C124S에 의한 proliferation enhance효과가 없었지만, proliferation이 정체되거나 감소된 cell에 대해서는 1.75배, 1.6배의 proliferation enhancing 효과를 확인할 수 있었다(도 5).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> SAMSUNG LIFE PUBLIC WELFARE FOUNDATION
<120> Composition for proliferating cancer cell and method of using the
same
<130> P16-B063
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 401
<212> PRT
<213> PTEN C124S protein
<400> 1
Met Thr Ala Ile Ile Lys Glu Ile Val Ser Arg Asn Lys Arg Arg Tyr
1 5 10 15
Gln Glu Asp Gly Phe Asp Leu Asp Leu Thr Tyr Ile Tyr Pro Asn Ile
20 25 30
Ile Ala Met Gly Phe Pro Ala Glu Arg Leu Glu Gly Val Tyr Arg Asn
35 40 45
Asn Ile Asp Asp Val Val Arg Phe Leu Asp Ser Lys His Lys Asn His
50 55 60
Tyr Lys Ile Tyr Asn Leu Cys Ala Glu Arg His Tyr Asp Thr Ala Lys
65 70 75 80
Phe Asn Cys Arg Val Ala Gln Tyr Pro Pro Glu Asp His Asn Pro Pro
85 90 95
Gln Leu Glu Leu Ile Lys Pro Phe Cys Glu Asp Leu Asp Gln Trp Leu
100 105 110
Ser Glu Asp Asp Asn His Val Ala Ala Ile His Ser Lys Ala Gly Lys
115 120 125
Gly Arg Thr Gly Val Met Ile Cys Ala Tyr Leu Leu His Arg Gly Lys
130 135 140
Phe Leu Lys Ala Gln Glu Ala Leu Asp Phe Tyr Gly Glu Val Arg Thr
145 150 155 160
Arg Asp Lys Lys Gly Val Thr Ile Pro Ser Gln Arg Arg Tyr Val Tyr
165 170 175
Tyr Tyr Ser Tyr Leu Leu Lys Asn His Leu Asp Tyr Arg Pro Val Ala
180 185 190
Leu Leu Phe His Lys Met Met Phe Glu Thr Ile Pro Met Phe Ser Gly
195 200 205
Gly Thr Cys Asn Pro Gln Phe Val Val Cys Gln Leu Lys Val Lys Ile
210 215 220
Tyr Ser Ser Asn Ser Gly Pro Thr Arg Arg Glu Asp Lys Phe Met Tyr
225 230 235 240
Phe Glu Phe Pro Gln Pro Leu Pro Tyr Cys Gly Asp Ile Lys Val Glu
245 250 255
Phe Phe His Lys Gln Asn Lys Met Leu Lys Lys Asp Lys Met Phe His
260 265 270
Phe Trp Val Asn Thr Phe Phe Ile Pro Gly Pro Glu Glu Thr Ser Glu
275 280 285
Lys Val Glu Asn Gly Ser Leu Cys Asp Gln Glu Ile Asp Ser Ile Cys
290 295 300
Ser Ile Glu Arg Ala Asp Asn Asp Lys Glu Tyr Leu Val Leu Thr Leu
305 310 315 320
Thr Lys Asn Asp Leu Asp Lys Ala Asn Lys Asp Lys Ala Asn Arg Tyr
325 330 335
Phe Ser Pro Asn Phe Lys Val Lys Leu Tyr Phe Thr Lys Thr Val Glu
340 345 350
Glu Pro Ser Asn Pro Glu Ala Asp Ser Ser Thr Ser Val Thr Pro Asp
355 360 365
Val Ser Asp Asn Glu Pro Asp His Tyr Arg Tyr Ser Asp Thr Thr Asp
370 375 380
Ser Pro Glu Asn Glu Pro Phe Asp Glu Gln His Thr Gln Ile Thr Lys
385 390 395 400
Val
<210> 2
<211> 65
<212> DNA
<213> pET-TAT-F
<400> 2
taaggcctct gtcgactatg gtcgtaaaaa cgtcgtcaac gtcgtcgtaa gcttgcgaat 60
ttctg 65
<210> 3
<211> 65
<212> DNA
<213> pET-TAT-R
<400> 3
cagaattcgc aagcttacga cgacgttgac gacgtttttt acgaccatag tcgacagagg 60
cctta 65
<210> 4
<211> 73
<212> DNA
<213> pET-TAT-PTEN-F
<400> 4
taaggcctct gtcgactatg gtcgtaaaaa acgtcgtcaa cgtcgtcgta tgacagccat 60
catcaaagag atc 73
<210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> pET-PTEN-R(5’ to 3;)
<400> 5
cagaattcgc aagcttgact tttgtaattt gtgtatgctg atc 43
Claims (8)
- 단백질을 세포의 핵으로 수송할 수 있는 세포 투과성 펩타이드(cell penetrating peptide, CPP)의 단백질 전달 도메인(protein transduction domian); 및 CPP의 전달 도메인에 부착되고 PTEN C124S의 생물학적 활성을 갖는 PTEN C124S 단백질;
을 포함하는, CPP-PTEN C124S 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 암 세포 증식용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 암 세포는 환자의 암 조직에서 유래한 암 세포 또는 암 줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 암 세포는 흑색종, 갑상선암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 위암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암 및 폐암으로 구성된 군에서 선택되는 암 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 암 세포는 야생형 PTEN 유전자를 발현하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 CPP는 TAT, Antennapedia(Penetratin), Transportan, VP22, Hph-1, R11(R9), KGF 유래 신호서열 및 Amhoipathic 펩타이드로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 CPP-PTEN C124S 융합 단백질은 암 세포의 핵으로 내재화되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 CPP-PTEN C124S 융합 단백질을 5.5-6.5nM 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물
- 다음 단계를 포함하는 암 세포 증식 방법:
(a) 암 세포를 조직으로부터 분리하는 단계; 및
(b) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 분리된 암 세포에 처리하는 단계.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020160099094A KR102063324B1 (ko) | 2016-08-03 | 2016-08-03 | 암 세포 증식용 조성물 및 이를 이용한 암 세포 증식 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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KR1020160099094A KR102063324B1 (ko) | 2016-08-03 | 2016-08-03 | 암 세포 증식용 조성물 및 이를 이용한 암 세포 증식 방법 |
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KR20180015499A true KR20180015499A (ko) | 2018-02-13 |
KR102063324B1 KR102063324B1 (ko) | 2020-01-07 |
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ID=61231858
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020160099094A KR102063324B1 (ko) | 2016-08-03 | 2016-08-03 | 암 세포 증식용 조성물 및 이를 이용한 암 세포 증식 방법 |
Country Status (1)
Country | Link |
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KR (1) | KR102063324B1 (ko) |
-
2016
- 2016-08-03 KR KR1020160099094A patent/KR102063324B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
IOVS, Vol. 53, No. 1, pages 379-386 (2012)* * |
Oncogene Vol. 29, pages 687-697 (2010)* * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR102063324B1 (ko) | 2020-01-07 |
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